(57)【要約】【課題】安全性が高く、細胞種を限定せず、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを高効率で導入することが可能であり、また所定の導入量を所定の回数導入した場合、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造効率及び安定性を向上させることができ、少量の細胞からでも製造可能な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法を提供すること。【解決手段】Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを、自動化マイクロインジェクション手段を用いて体細胞に導入する体細胞導入工程を含むことを特徴とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、
並びに、
化合物
の少なくともいずれかを、自動化マイクロインジェクション手段を用いて体細胞に導入する体細胞導入工程を含むことを特徴とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法。
【請求項２】
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、
並びに、
化合物
の少なくともいずれかを、１つの体細胞に複数回導入することによる請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、
並びに、
化合物
の少なくともいずれかの合計導入量が、０．０５ｐｇ〜２５ｐｇである請求項１から２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項４】
合計導入量が、１回の導入量が０．０１ｐｇ〜５．０ｐｇであり、該導入を３回〜７回行うことにより導入される請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、
並びに、
化合物
の少なくともいずれかの導入効率が、８０％以上である請求項１から４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
体細胞導入工程で得られた体細胞を培養する培養工程を含む請求項１から５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、
並びに、
化合物
の少なくともいずれかが、体細胞に導入されたか否かを確認する確認工程を含む請求項１から６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
体細胞が、ヒトの体細胞である請求項１から７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
１回の自動化マイクロインジェクション手段に使用する体細胞の数が、２００細胞以下である請求項１から８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種が、遺伝子及び該遺伝子のｍＲＮＡの少なくともいずれかである請求項１から９のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを導入することによる誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞とは、同じ性質を維持したまま増殖することができる自己複製能と、異なる機能や性質を有する細胞に分化することができる多分化能を有する細胞である。ＥＳ細胞（胚性幹細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、未分化な状態で長期間増殖できる自己複製能を有すると共に、生体内の全ての細胞に分化することができる多分化能を有する細胞であることから、パーキンソン病や白血病など種々の疾患に対する再生医療への応用に向けて研究がなされてきた。
しかしながら、ＥＳ細胞の樹立にはヒト胚を破壊しなければならないことから倫理的な面で問題があった。また、ＥＳ細胞は臓器移植と同様に拒絶反応が起こることから、臨床へ応用することができない点で問題であった。
【０００３】
そこで、近年、ＥＳ細胞に近い細胞として、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が樹立された（特許文献１参照）。特許文献１では、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞に４種の遺伝子、即ち、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の遺伝子を導入することで、分化した体細胞が初期化され未分化な細胞と同様の状態に戻り（脱分化）、また未分化な状態で増殖可能な自己複製能を有し、更に多分化能を有する細胞を作製できることを報告している。なお、前記４種の遺伝子の中で、脱分化を担う遺伝子は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃであり、多分化能を担う遺伝子はＳｏｘ２であると考えられている。
このように、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞から誘導できることから倫理的な問題はなく、更に患者自身の分化した体細胞を利用することで拒絶反応を防ぐことができることから、再生医療への応用に有効である。
また、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞に、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇの４種の遺伝子を導入することでも作製できることが報告されている（非特許文献１参照）。
これら事実より、最近では、腫瘍化の問題が指摘されているｃ−Ｍｙｃを除いた、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇの少なくともいずれかの組合せで、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製することが注目されている。
【０００４】
動物細胞への遺伝子導入法としては、一般に、化学的遺伝子導入法、物理的遺伝子導入法、生物学的遺伝子導入法が知られている。
前記化学的遺伝子導入法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などが挙げられる。前記リン酸カルシウム法は、特殊な技術を必要とせず、操作が簡単であるが、浮遊細胞への遺伝子導入効率が低く適用できる細胞種が限定され、また再現性も乏しいため、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造には不向きである。前記リポフェクション法も、特殊な技術を必要とせず、操作が簡単であり、トランスフェクション効率が高いが、付着細胞を対象とするため適用できる細胞種が限定される点や、一般にトランスフェクションの至適条件（細胞密度、ＤＮＡ量、リポソーム量、培養時間など）の検討が必要であり、更に前記至適条件の範囲が狭い点などが問題である。
前記物理的遺伝子導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。前記エレクトロポレーション法は、遺伝子導入効率が高く、幅広い細胞に適用できるが、細胞へのダメージが大きいため細胞生存率が低い点で問題である。前記パーティクルガン法は、植物細胞への遺伝子導入にも用いられ、細胞種を限定せず幅広い細胞に遺伝子導入することができるが、最終的な導入断片に組換えや欠失が起こりやすく、形質転換体がキメラになりやすいなどの問題がある。
前記生物学的遺伝子導入法としては、例えば、アデノウイルス（ＤＮＡウイルス）ベクター法、レトロウイルス（ＲＮＡウイルス）ベクター法などが挙げられる。前記アデノウイルスベクター法は、静止期の細胞にも感染することができ、また長い遺伝子を導入できるが、ベクターを増幅する中で野生型のウイルスが出現する可能性があるなどの安全性の面で問題がある。前記レトロウイルスベクター法は、前記アデノウイルスベクターの問題点を解消し、ウイルス由来の遺伝子を有さず、染色体内に安定に組み込まれ、長期発現が可能であるため、現在、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造には一般にこのレトロウイルスベクター法が用いられている。
【０００５】
しかしながら、前記４種の遺伝子をレトロウイルスベクター法で導入した場合、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）に由来するキメラマウスでは腫瘍形成が認められることが報告されている（特許文献１参照）。これは、癌原遺伝子であるｃ−Ｍｙｃが、標的細胞の染色体に導入され、レトロウイルスが再活性化を起こしたことに起因すると考えられている。
また、レトロウイルスベクターは遺伝子を導入する細胞を選択することができないため、例えば、前記４種の遺伝子を４種のレトロウイルスベクターで導入した場合、前記４種全ての遺伝子が１つの細胞に導入される確立は非常に低いものとなり、遺伝子導入効率が悪いため、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の樹立のために大量の細胞と多くの時間を要する点で問題である。
【０００６】
したがって、安全性が高く、細胞種を限定せず、高効率でＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子の少なくともいずれかを導入することが可能であり、少量の細胞からでも製造可能な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２８３９７２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ  Ｊ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＧＦ，  Ｓｏｅｒｅｎｓ  ＡＧ，  Ｋｏｏｎｃｅ  ＣＨ，  Ｙｕ  Ｊ，  Ｐａｌｅｃｅｋ  ＳＰ，  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，  Ｋａｍｐ  ＴＪ．，  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，  ２００９，  Ｖｏｌｕｍｅ  １０４（４）２７，  Ｆｅｂｒｕａｒｙ，  ｐｐ  ｅ３０−ｅ４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、安全性が高く、細胞種を限定せず、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを高効率で導入することが可能であり、また、所定の導入量を所定の回数導入した場合、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造効率及び安定性を向上させることができ、少量の細胞からでも製造可能な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するための手段としては、後述する付記に記載した通りである。
即ち、本発明の一つは、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを、自動化マイクロインジェクション手段を用いて体細胞に導入する体細胞導入工程を含むことを特徴とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法である。
前記マイクロインジェクション手段は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかが導入されたか否かを、細胞を観察することにより確認でき、また、狙った細胞に確実に導入することができるため、１つの体細胞に所定の導入量を所定の回数導入した場合、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造効率及び安定性を向上させることができ、少量の細胞からでも高効率に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を製造することができる。更に、前記マイクロインジェクション手段は、細胞種を限定することなく幅広い細胞に導入でき、安全性も高いため、臨床に応用可能な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を製造することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、安全性が高く、細胞種を限定せず、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを高効率で導入することが可能であり、また、所定の導入量を所定の回数導入した場合、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造効率及び安定性を向上させることができ、少量の細胞からでも製造可能な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造）
本発明の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法は、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを、自動化マイクロインジェクション手段を用いて体細胞に導入する体細胞導入工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
なお、本明細書において、「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」は、ＥＳ細胞に近い性質、即ち、未分化な細胞であって自己複製能及び多分化能を有する細胞であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１３】
＜体細胞導入工程＞
前記体細胞導入工程は、前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかを、自動化マイクロインジェクション手段を用いて体細胞に導入する工程である。
【００１４】
−Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８−
前記Ｏｃｔ３／４は、ＰＯＵファミリーに属する転写因子であり、未分化マーカーとして報告されている（Ｋ．  Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ６０，  ｐ．４６１−７２，  １９９０）。また、Ｏｃｔ３／４は多能性維持にも関与しているとの報告もある（Ｊ．  Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ９５，  ｐ．３７９−９１，  １９９８）。
前記Ｋｌｆ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ  ｌｉｋｅ  ｆａｃｔｏｒ−４）は、腫瘍抑制因子として報告されている（Ａ．  Ｍ．  Ｇｈａｌｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ，  １５，  ｐ．９２−６，  ２００５）。
前記ｃ−Ｍｙｃは、細胞の分化及び増殖に関与する転写制御因子であり（Ｓ．  Ａｄｈｉｋａｒｙ，  Ｍ．  Ｅｉｌｅｒｓ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ６，  ｐ．６３５−４５，  ２００５）、多能性維持に関与しているとの報告もある（Ｐ．  Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  １３２，  ｐ．８８５−９６，  ２００５）。
前記Ｓｏｘ２は、初期発生過程で発現し、転写因子をコードする遺伝子である（Ａ．  Ａ．  Ａｖｉｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  １７，  ｐ．１２６−４０，  ２００３）。
前記Ｎａｎｏｇは、分化多様性維持に関与していることが知られている転写因子であり、未分化マーカーとして使用されている（Ｋ．  Ｍｉｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １１３，  ｐｐ６３１−４２，  ２００３、  Ｉ．  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １１３，  ｐｐ６４３−５５，  ２００３）。
前記Ｌｉｎ２８は、ＤＮＡ結合ドメインを持つ転写因子であり、未分化細胞で高い発現が認められる（Ｊ．  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８，  ｐｐ１９１７−２０，  ２００７、  Ｈ．  Ｄａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｎｏｖ  ２８，  ２００８  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）。
【００１５】
本明細書において、前記Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質のいずれかを、以下、「６種の因子」と称することがある。
前記６種の因子の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遺伝子形態、該遺伝子のｍＲＮＡの形態、及びタンパク質の形態などが挙げられる。
前記６種の因子の形態の組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、全てが同一の形態であってもよいし、それぞれ異なる形態であってもよい。
前記６種の因子は、いずれもヒトを含む哺乳動物に共通して存在する因子であるため、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製に利用するためには、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどに由来するものを用いることができるが、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を疾病の治療に用いる場合は、患者自身から得ることが、拒絶反応を防ぐことができる点で好ましい。
【００１６】
−−タンパク質−−
前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種のタンパク質の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を用いる方法、合成により得る方法、遺伝子組換え技術により得る方法、細胞より調製する方法などが挙げられる。
前記６種のタンパク質の導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記６種のタンパク質を導入する比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｏｃｔ３／４：Ｋｌｆ４：ｃ−Ｍｙｃ：Ｓｏｘ２：Ｎａｎｏｇ：Ｌｉｎ２８が、質量比で１：０．２：０．２：０．１：１：１〜１：１０：５：５：５：５が好ましい。
前記６種のタンパク質をコードするアミノ酸配列としては、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を製造する能力を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、野生型のアミノ酸配列の全体又は一部において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
また、前記６種のタンパク質は、６種のタンパク質そのものであってもよいし、その他の成分を含む組成物の状態であってもよい。前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
−−遺伝子、ｍＲＮＡ−−
前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種のタンパク質をコードする遺伝子及び該遺伝子のｍＲＮＡを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を用いる方法、合成により得る方法、遺伝子組換え技術により得る方法、細胞より調製する方法などが挙げられる。
前記６種の遺伝子及び該遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共のデータベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＯｃｔ３／４遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００２７０１で入手可能であり、ヒトＫｌｆ４遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００４２３５で入手可能であり、ヒトｃ−Ｍｙｃ遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００２４６７で入手可能であり、ヒトＳｏｘ２遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００３１０６で入手可能であり、ヒトＮａｎｏｇ遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０２４８６５で入手可能であり、ヒトＬｉｎ２８遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００３１０６で入手可能である。
前記６種の遺伝子及び該遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列としては、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を製造する能力を有する限りは、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、野生型の塩基配列の全体又は一部において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、若しくは付加された塩基配列からなるものであってもよい。
【００１８】
−−−遺伝子−−−
前記６種の遺伝子の導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｐｇ〜０．２ｐｇが好ましい。
前記６種の遺伝子を導入する比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｏｃｔ３／４：Ｋｌｆ４：ｃ−Ｍｙｃ：Ｓｏｘ２：Ｎａｎｏｇ：Ｌｉｎ２８が、質量比で１：０．２：０．２：０．１：１：１〜１：１０：５：５：５：５が好ましい。
前記６種の遺伝子は、６種の遺伝子そのものであってもよいし、その他の成分を含む組成物の状態であってもよい。前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１９】
前記６種の遺伝子は、プラスミドの状態であってもよい。
前記プラスミドに含有させる前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１種の遺伝子のみを含有させてもよいし、２種以上の遺伝子を組み合わせて含有させてもよい。
前記プラスミドを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を用いる方法、任意のプラスミドに、前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の少なくともいずれかの遺伝子を挿入することにより得る方法などが挙げられる。
前記６種の少なくともいずれかの遺伝子を含有させるプラスミドとしては、特に制限はなく、標的とする体細胞の種類、安全性、遺伝子導入効率などに応じて適宜選択することができる。
前記６種のプラスミドの導入量としては、特に制限はなく、導入する遺伝子の量に応じて適宜選択することができる。
前記プラスミドは、プラスミドそのものであってもよいし、その他の成分を含む組成物の状態であってもよい。前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２０】
−−−ｍＲＮＡ−−−
前記６種のｍＲＮＡの導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｐｇ〜５ｐｇが好ましい。
前記６種のｍＲＮＡを導入する比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｏｃｔ３／４：Ｋｌｆ４：ｃ−Ｍｙｃ：Ｓｏｘ２：Ｎａｎｏｇ：Ｌｉｎ２８が、質量比で１：０．２：０．２：０．１：１：１〜１：１０：５：５：５：５が好ましい。
前記６種のｍＲＮＡは、６種のｍＲＮＡそのものであってもよいし、その他の成分を含む組成物の状態であってもよい。前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２１】
−化合物−
前記化合物としては、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を製造することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５’−シチジン、５’−デオキシシチジン、トリコスタチンＡ、バルプロ酸（ＨＤＡＣ阻害剤）などが挙げられる。
前記化合物の入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販品を用いる方法、合成により得る方法などが挙げられる。
前記化合物の導入量としては、特に制限はなく、化合物の種類などに応じて適宜選択することができる。
前記化合物の組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１種単独で導入してもよいし、２種以上を組み合わせて導入してもよい。
前記化合物は、化合物そのものであってもよいし、その他の成分を含む組成物の状態であってもよい。前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
−自動化マイクロインジェクション手段−
前記自動化マイクロインジェクション手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、自動化マイクロインジェクション装置（ＣＥＬＬＩＮＪＥＣＴＯＲ  ＣＩ−２５００、富士通（株）製）を用いる手段が、操作を簡単に行うことができる点で好ましい。
前記自動化マイクロインジェクション手段は、前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかを、どのような細胞種にも確実に導入することができるため、導入効率が高い点で有利である。また、細胞数が少量で足りるため、例えば、疾病の治療のために患者から体細胞を入手する際、大量の細胞を得ることができない場合でも好適に利用可能である。更に、レトロウイルスベクターなどを用いて目的とする遺伝子を体細胞へ導入した場合と比較して、ウイルスに関連する遺伝子が標的細胞内に残存することがなく、安全性が高い点で好ましい。
【００２３】
前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかを導入する体細胞内の場所としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞質内、核内などが挙げられる。
前記６種の因子が遺伝子の場合、核内に導入することが、導入した遺伝子が発現しやすい点で好ましい。
前記６種の因子がタンパク質の場合、細胞質内に導入すると、核移行シグナルを含有しないタンパク質は核内に移行できない場合があるため、核内に導入することが好ましい。
前記６種の因子がｍＲＮＡの場合、細胞質内に導入することが、ｍＲＮＡの翻訳がより容易になる点で好ましい。
【００２４】
前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかを導入する時期としては、特に制限はなく、導入する因子の形態、組合せなどに応じて適宜選択することができる。
【００２５】
前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかの、合計導入量としては、特に制限はなく、６種の因子の形態、化合物の種類、細胞種などに応じて適宜選択することができるが、０．０５ｐｇ〜２５ｐｇが好ましい。これらの中でも、前記６種の因子が遺伝子の場合、０．０５ｐｇ〜１．０ｐｇがより好ましく、前記６種の因子がｍＲＮＡの場合、０．５ｐｇ〜２５ｐｇがより好ましい。
前記合計導入量は、１回で導入されてもよく、複数回で導入されてもよいが、１回の導入量が０．０１ｐｇ〜５ｐｇであり、該導入を３回〜７回行うことが好ましい。これらの中でも、前記６種の因子が遺伝子の場合、１回の導入量が０．０１ｐｇ〜０．２ｐｇであり、該導入を５回行うことがより好ましく、前記６種の因子がｍＲＮＡの場合、１回の導入量が０．１ｐｇ〜５ｐｇであり、該導入を５回行うことがより好ましい。
前記好ましい導入量及び導入回数で導入すると、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造効率が向上し、更に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の安定性を向上させることができる点で好ましい。
【００２６】
前記自動化マイクロインジェクション手段による導入効率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
前記自動化マイクロインジェクション手段により導入を行う際の二酸化炭素（ＣＯ２）濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５％が好ましい。
前記自動化マイクロインジェクション手段により導入を行う際の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３７℃が好ましい。
【００２７】
−体細胞−
前記体細胞としては、特に制限はなく、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。ヒトの疾病の治療目的で誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を使用する場合は、ヒトの体細胞が好ましく、これらの中でも患者自身の体細胞を使用することが、拒絶反応を防ぐことができる点でより好ましい。
前記体細胞は、マーカーを含有していてもよい。前記体細胞にマーカーを含有させることで、前記自動化マイクロインジェクション手段により、同じ細胞に前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかを複数回導入することができる点で有利である。
前記マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）などが挙げられる。
前記自動化マイクロインジェクション手段で１回に使用する体細胞の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ディッシュあたり２００細胞以下であることが好ましく、１００細胞〜２００細胞であることがより好ましい。疾病の治療に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を使用する場合、前記体細胞は、患者自身から得ることが好ましいため、大量に入手することは困難であり、また、入手した細胞を培養して増殖させることも可能であるが、培養コストや時間がかかるなどの問題があるため、使用する体細胞の数は少ない方が好ましい。
【００２８】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養工程、確認工程などが挙げられる。
【００２９】
−培養工程−
本発明の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法は、前述した体細胞導入工程に、更に培養工程を含んでいてもよい。
前記培養工程は、前記体細胞導入工程で得られた体細胞を培養する工程である。前記誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が製造されたか否かは、第１段階としてコロニーの形成で判断されることがある。そのため、前記培養工程によりコロニーを形成させることが好ましい。また、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を疾病の治療に用いるためには、複数の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が必要となるため、前記培養工程により増殖させることが好ましい。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト細胞培養用培地中で前記体細胞導入工程より得られた体細胞を培養する方法、フィーダー細胞と共に前記ヒト細胞培養用培地を用いて培養する方法などが挙げられる。これらの中でも、前記体細胞導入工程より得られた体細胞を前記ヒト細胞培養用培地で３０日間〜４０日間維持した後、前記フィーダー細胞と共に培養する方法が好ましい。
前記フィーダー細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、増殖を停止させる処理を施した細胞などが挙げられる。
前記フィーダー細胞の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス由来の細胞、ヒト胎児由来の細胞、繊維芽細胞などが挙げられる。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３７℃が好ましい。
前記培養のＣＯ２濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５％が好ましい。
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養などが挙げられる。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、例えば、コロニーの形成状態などを確認しながら、適宜選択することができる。なお、前記培養期間中は、２日置きに半量ずつ培地交換をすることが好ましい。
【００３０】
−確認工程−
本発明の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法は、前述した体細胞導入工程、及び前述した培養工程に、更に確認工程を含んでいてもよい。
前記確認工程は、前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかが、体細胞に導入されたか否かを確認する工程である。
前記導入を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質、並びに、前記化合物にマーカーを含有させる方法などが挙げられる。マーカーを含有させることにより、マーカーを指標にして前記Ｏｃｔ３／４、前記Ｋｌｆ４、前記ｃ−Ｍｙｃ、前記Ｓｏｘ２、前記Ｎａｎｏｇ、及び前記Ｌｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、前記化合物の少なくともいずれかが導入されたか否かを確認することができる。
前記マーカーの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光マーカー、薬剤耐性、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、これらの中でも蛍光マーカーが、自動化マイクロインジェクション装置で簡便に観察できる点で好ましい。
前記蛍光マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ、Ａｌｅｘａ５９４  ｄｅｘｔｒａｎなどが挙げられる。
【００３１】
（誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の確認）
＜未分化の確認＞
前記誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が未分化な性質を有しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化マーカーを指標に確認する方法などが挙げられる。
前記未分化マーカーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内在性のアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、Ｅｓｇ１などが挙げられる。
前記未分化マーカーを検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡを検出する方法、免疫学的検出法などが挙げられる。前記免疫学的検出法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫染色法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。
【００３２】
＜多分化能の確認＞
前記誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が、多分化能を有しているか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、免疫不全モデル動物に誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を移植し、テラトーマ（奇形腫）形成の有無を確認する方法などが挙げられる。前記誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が多分化能を有している場合、前記テラトーマ内で誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から三胚葉に由来した細胞集団（組織）の形成が観察できる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００３４】
（実施例１：遺伝子（プラスミド）の導入）
＜プラスミドの作製＞
４種の遺伝子、即ち、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の遺伝子を含有するプラスミドを、以下の方法により作製し、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造に用いた。
【００３５】
−Ｏｃｔ３／４プラスミド−
ヒト胎児性癌細胞ＮＣＲ−Ｇ３株（国立成育医療センター  生殖医療研究部にて樹立）より抽出したｍＲＮＡを元に、ファーストストランドｃＤＮＡを調製した。これを鋳型に用い、Ｏｃｔ３／４遺伝子特異的な配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、該遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを中心として、上流にＣＡＧプロモーターを、下流にポリ（Ａ）鎖付加シグナルを配した、哺乳動物細胞過剰発現ベクタープラスミド（ｐＣＡＧ−ＭＣＳ（国立成育医療センター  生殖医療研究部にて作製））、即ちＯｃｔ３／４プラスミドを構築した。
前記Ｏｃｔ３／４プラスミドは、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  トリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））あるいは滅菌した蒸留水に懸濁し、５００μｇ／μＬに調製した。
【００３６】
−Ｋｌｆ４プラスミド−
ヒト胎児性癌細胞ＮＣＲ−Ｇ３株より抽出したｍＲＮＡを元に、ファーストストランドｃＤＮＡを調製した。これを鋳型に用い、Ｋｌｆ４遺伝子特異的な配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、該遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを中心として、上流にＣＡＧプロモーターを、下流にポリ（Ａ）鎖付加シグナルを配した、哺乳動物細胞過剰発現ベクタープラスミド（ｐＣＡＧ−ＭＣＳ）、即ちＫｌｆ４プラスミドを構築した。
前記Ｋｌｆ４プラスミドは、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒあるいは滅菌した蒸留水に懸濁し、５００μｇ／μＬに調製した。
【００３７】
−ｃ−Ｍｙｃプラスミド−
ヒト胎児性癌細胞ＮＣＲ−Ｇ３株より抽出したｍＲＮＡを元に、ファーストストランドｃＤＮＡを調製した。これを鋳型に用い、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子特異的な配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、該遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを中心として、上流にＣＡＧプロモーターを、下流にポリ（Ａ）鎖付加シグナルを配した、哺乳動物細胞過剰発現ベクタープラスミド（ｐＣＡＧ−ＭＣＳ）、即ちｃ−Ｍｙｃプラスミドを構築した。
前記ｃ−Ｍｙｃプラスミドは、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒあるいは滅菌した蒸留水に懸濁し、５００μｇ／μＬに調製した。
【００３８】
−Ｓｏｘ２プラスミド−
ヒト胎児性癌細胞ＮＣＲ−Ｇ３株より抽出したｍＲＮＡを元に、ファーストストランドｃＤＮＡを調製した。これを鋳型に用い、Ｓｏｘ２遺伝子特異的な配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、該遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを中心として、上流にＣＡＧプロモーターを、下流にポリ（Ａ）鎖付加シグナルを配した、哺乳動物細胞過剰発現ベクタープラスミド（ｐＣＡＧ−ＭＣＳ）、即ちＳｏｘ２プラスミドを構築した。
前記Ｓｏｘ２プラスミドは、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒあるいは滅菌した蒸留水に懸濁し、５００μｇ／μＬに調製した。
【００３９】
＜体細胞の調製＞
体細胞は、初代培養細胞ＰＬ５５１Ａｒ細胞（ヒト胎盤動脈細胞、国立成育医療センター  生殖医療研究部にて樹立）を用いた。ゼラチンコートした３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩガラスボトム、ＩＷＡＫＩ社製）に、ＥＢＭ２（Ｌｏｎｚａ社製）に懸濁した前記ＰＬ５５１Ａｒ細胞を３×１０３細胞／ディッシュ播種した。なお、前記ＰＬ５５１Ａｒ細胞の細胞周期は、２．０日〜３．０日である。
【００４０】
＜体細胞への導入物質の調製＞
前記Ｏｃｔ３／４プラスミド、前記Ｋｌｆ４プラスミド、前記ｃ−Ｍｙｃプラスミド、及び前記Ｓｏｘ２プラスミド（以下、「４種の遺伝子」と称することがある。）を確実に前記ＰＬ５５Ａｒ細胞に導入するため、体細胞への導入物質として、４種の遺伝子とマーカーとの混合液を調製した。
前記マーカーとしては、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を用いた。ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣｐＧ−ＥＧＦＰ、国立成育医療センター  生殖医療研究部にて作製）は、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒあるいは滅菌済みの蒸留水に懸濁し、５００μｇ／ｍＬに調製した。
ぞれぞれ５００μｇ／μＬに調製した、前記Ｏｃｔ３／４プラスミド、前記Ｋｌｆ４プラスミド、前記ｃ−Ｍｙｃプラスミド、前記Ｓｏｘ２プラスミド、及び前記ＥＧＦＰプラスミドを、１：０．５：１：０．５：０．５（Ｏｃｔ３／４：Ｋｌｆ４：ｃ−Ｍｙｃ：Ｓｏｘ２：ＥＧＦＰ）の混合比で混合し、更に導入を確認するため、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ（１０，０００Ｄａ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を５００μｇ／ｍＬとなるように混合することにより、前記混合液（以下、「プラスミド混合液」と称することがある。）を得た。
【００４１】
＜体細胞導入工程＞
自動マイクロインジェクション装置（ＣＥＬＬＩＮＪＥＣＴＯＲ  ＣＩ−２５００、富士通（株）製）により、前記プラスミド混合液を、前記ＰＬ５５１Ａｒ細胞の核内へ１細胞あたり０．４ｐＬ導入した。なお、前記プラスミド混合液の導入量は、前記Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎにより、前記自動化マイクロインジェクション装置でキャリブレーションされる。
【００４２】
導入環境は、以下の通りである。
ＣＯ２濃度：５％
温度：３７℃
針：Ｆｅｍｔｏｔｉｐ（エッペンドルフ社製）
【００４３】
導入スケジュールとしては、２日置きに５回まで前記プラスミド混合液の導入を繰り返した。この間、前記プラスミド混合液導入した細胞（以下、「プラスミド混合液導入細胞」と称することがある。）は、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で維持し、ＥＢＭ２は、２日置きに半量ずつ新鮮な培地と交換した。
なお、前記プラスミド混合液導入細胞は、前記各遺伝子の導入後１０日目からフィーダー細胞と共培養を行った。共培養は、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦｂを添加したｉＰＳｅｌｌｏｎ（（株）ｃａｒｄｉｏ製）を用いた。前記フィーダー細胞は、放射線照射処理により増殖を停止させたマウス胎児線維芽細胞を、前記ゼラチンコートした３５ｍｍディッシュに播種し、付着させた細胞である。
【００４４】
＜確認工程＞
−プラスミド混合液の導入確認（第１回目）−
第１回目の導入により得られた前記プラスミド混合液導入細胞は、前記自動化マイクロインジェクション装置により、前記Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ蛍光を観察することにより、プラスミド混合液が導入されたか否かを確認した。
前記プラスミド混合液の導入を行った４ディッシュの、導入回数、導入細胞数、及び導入率（％）を、下記表１に示す。
前記導入回数は、導入の実施回数である。
前記導入細胞数（以下、「プラスミド混合液導入細胞数１」と称することがある。）は、プラスミド混合液の導入が確認された細胞の数である。
導入率（％）は、下記計算式１により算出した。
導入率（％）＝プラスミド混合液導入細胞数１／導入回数×１００    （計算式１）
【００４５】
【表１】
2011004674.tif 000002
表１より、プラスミド混合液の導入率の平均は９５％以上であり、良好であった。
【００４６】
−プラスミド混合液導入細胞の培養−
前記プラスミド混合液導入細胞数１は、前記プラスミド混合液の導入後２日間、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で、ＥＢＭ２で維持し、前記プラスミド混合液導入細胞数１が増殖した細胞を含めてＥＧＦＰを発現している細胞が、１ディッシュあたり１００細胞以上存在するディッシュを選別し、２回目以降、ＥＧＦＰが発現している細胞にのみ、同様にプラスミド混合液を導入した。
【００４７】
−プラスミド混合液の導入確認（第２回目）−
第２回目の導入により得られた前記プラスミド混合液導入細胞について、前記自動化マイクロインジェクション装置により、前記Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎの蛍光を観察することにより、導入細胞を確認した。
前記プラスミド混合液導入細胞数（以下、「プラスミド混合液導入細胞数２」と称することがある。）、発現率（％）、導入回数、及び細胞当たりの導入回数の結果を下記表２に示す。
前記プラスミド混合液導入細胞数２は、前記ＥＧＦＰの発現があり、かつ前記プラスミド混合液を導入した細胞の数である。
前記発現率（％）は、下記計算式２により算出した。
前記導入回数は、導入の実施回数である。
前記細胞あたりの導入回数は、下記計算式３により算出した。
発現率（％）＝プラスミド混合液導入細胞数２／プラスミド混合液導入細胞数１×１００    （計算式２）
細胞あたりの導入回数＝導入回数／プラスミド混合液導入細胞数２    （計算式３）
【００４８】
【表２】
2011004674.tif 000003
【００４９】
−プラスミド混合液の導入確認（第３回目〜第５回目）−
第３回目〜第５回目の導入により得られた前記プラスミド混合液導入細胞について、前記自動化マイクロインジェクション装置により、前記Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎの蛍光を観察することにより、導入細胞を確認した。
前記プラスミド混合液導入細胞数（以下、３回目のプラスミド混合液導入細胞数を「プラスミド混合液導入細胞数３」、４回目のプラスミド混合液導入細胞数を「プラスミド混合液導入細胞数４」、５回目のプラスミド混合液導入細胞数を「プラスミド混合液導入細胞数５」と称することがある。）、増加率（％）、導入回数、及び細胞当たりの導入回数の結果を下記表３〜５に示す。
前記プラスミド混合液導入細胞数３〜５は、前記ＥＧＦＰの発現があり、かつ前記プラスミド混合液を導入した細胞の数である。
前記増加率（％）は、各回のプラスミド混合液導入細胞数（プラスミド混合液導入細胞数３〜５）を、前回のプラスミド混合液導入細胞数（プラスミド混合液導入細胞数２〜４）で割り、１００を乗じて算出した。即ち、下記計算式４により算出した。
前記導入回数は、導入の実施回数である。
前記細胞あたりの導入回数は、各回下記計算式５により算出した。
増加率（％）＝今回プラスミド混合液導入細胞数（３〜５）／前回プラスミド混合液導入細胞数（２〜４）×１００    （計算式４）
細胞あたりの導入回数＝今回（第３回目〜第５回目）導入回数／今回プラスミド混合液導入細胞数（３〜５）    （計算式５）
【００５０】
【表３】
2011004674.tif 000004
【００５１】
【表４】
2011004674.tif 000005
【００５２】
【表５】
2011004674.tif 000006
【００５３】
＜培養工程＞
前記確認工程で、前記プラスミド混合液が導入したか否かを確認しながら、併せて形態観察を行った。また、この期間中、前記プラスミド混合液導入細胞は、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で維持し、ＥＢＭ２は、２日置きに半量ずつ新鮮な培地と交換した。
５回導入を繰り返した後、２５日間培養を継続することで、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）のコロニーを得ることができた。なお、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の完成までに、前記４種の遺伝子は、合計１ｐｇ導入した。
【００５４】
＜誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の確認＞
前記培養工程で得られた誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の未分化及び多分化能の確認を以下の方法で行った。
【００５５】
−未分化の確認−
前記誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）からＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ（株）製）を用いて、製造者のマニュアルに基づいて、全ＲＮＡを抽出した。次いで、前記ＲＮＡから、逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（株）製）を用いてｃＤＮＡを合成した。前記ｃＤＮＡを用いて未分化マーカー（アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＥＲａｓ、Ｅｓｇ１）のプライマーを用いてＰＣＲを行い、各未分化マーカーの発現を確認した。
【００５６】
実施例１おいて、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の遺伝子を導入することにより得られた誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、前記未分化マーカーのｍＲＮＡの発現が認められ、未分化能を有していることが確認された。
【００５７】
−多分化能の確認−
コラゲナーゼ処理を行い、フィーダー細胞が混入しないよう、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を回収し、８００×ｇ、３分間遠心した。上清を除去し、ヒトＥＳ培養液ｉＰＳｅｌｌｏｎ（（株）ｃａｒｄｉｏ製）に再懸濁し、８００×ｇ、３分間遠心することで洗浄した。上清を除去し、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦｂを添加したｉＰＳｅｌｌｏｎに再懸濁後、細胞数をカウントし、５×１０７細胞／ｍＬに調製した。
免疫不全モデルマウス（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ、日本クレア（株））の皮下に、１×１０７細胞／匹の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を、２６Ｇ注射針付きシリンジ（テルモ（株）製）を用いて注射（移植）した。
６週間〜７週間後、免疫不全モデルマウスを安楽殺し、直径２ｃｍ〜３ｃｍ程度に成長したテラトーマを回収して、組織標本を作製した。前記組織標本をＨＥ（ヘマトキシリン  エオジン）染色したものを観察し、三胚葉に由来した細胞集団が形成されていることを確認した。
実施例１において、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の遺伝子を導入することにより得られた誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、多分化能を有していることが確認された。
【００５８】
１ディッシュあたり約１５０個のＥＧＦＰ発現細胞を用い、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の遺伝子を導入することで、３個の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を得ることができ、その製造効率は、２％であった。
なお、プラスミド混合液導入細胞数２〜５（表２〜５）は、２回目（培養２日目）が１９６細胞、３回目（培養４日目）が３３３細胞、４回目（培養６日目）が３９９細胞、５回目（培養８日目）が６０６細胞と、４日置きに大幅な増加が認められた。これは、ＰＬ５５１Ａｒ細胞の細胞周期が２．０日〜３．０日であることによるものと考えられる。
【００５９】
実施例１より、従来のレトロウイルスベクターを用いた手法における誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造効率は０．１％であったため、本発明の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法は、従来技術と比較して高効率で誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を得ることができることが認められた。
また、実施例１では、自動化マイクロインジェクション装置によりプラスミドを複数回導入したにも関わらず、長期間培養することが可能であったことから、細胞へのダメージも少ないことが認められた。
【００６０】
本発明の好ましい態様を付記すると、以下の通りである。
（付記１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを、自動化マイクロインジェクション手段を用いて体細胞に導入する体細胞導入工程を含むことを特徴とする誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法。
（付記２）体細胞導入工程が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを、同時に導入することによる付記１に記載の製造方法。
（付記３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを、１つの体細胞に複数回導入することによる付記１から２のいずれかに記載の製造方法。
（付記４）  Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかの、合計導入量が、０．０５ｐｇ〜２５ｐｇである付記１から３のいずれかに記載の製造方法。
（付記５）  合計導入量が、１回の導入量が０．０１ｐｇ〜５．０ｐｇであり、該導入を３回〜７回行うことにより導入される付記４に記載の製造方法。
（付記６）体細胞導入工程が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子が、体細胞の核内に導入されることによる付記１から５のいずれかに記載の製造方法。
（付記７）体細胞導入工程が、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種のｍＲＮＡが、体細胞の細胞質内に導入されることによる付記１から６のいずれかに記載の製造方法。
（付記８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかの導入効率が、８０％以上である付記１から７のいずれかに記載の製造方法。
（付記９）体細胞導入工程で得られた体細胞を培養する培養工程を含む付記１から８のいずれかに記載の製造方法。
（付記１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかが、体細胞に導入されたか否かを確認する確認工程を含む付記１から９のいずれかに記載の製造方法。
（付記１１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質、並びに、化合物が、マーカーを含有する付記１から１０のいずれかに記載の製造方法。
（付記１２）確認工程が、マーカーを指標にすることによる付記１０から１１のいずれかに記載の製造方法。
（付記１３）マーカーが、マイクロインジェクション装置により確認できる付記１１から１２のいずれかに記載の製造方法。
（付記１４）体細胞が、ヒトの体細胞である付記１から１３のいずれかに記載の製造方法。
（付記１５）体細胞が、マーカーを含有する付記１から１４のいずれかに記載の製造方法。
（付記１６）１回の自動化マイクロインジェクション手段に使用する体細胞の数が、２００細胞以下である付記１から１５のいずれかに記載の製造方法。
（付記１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種が、遺伝子及び該遺伝子のｍＲＮＡの少なくともいずれかである付記１から１６のいずれかに記載の製造方法。
（付記１８）組合せが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の４種である付記１から１７のいずれかに記載の製造方法。
（付記１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の４種が、遺伝子及び該遺伝子のｍＲＮＡの少なくともいずれかである付記１８に記載の製造方法。
（付記２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２の４種の遺伝子が、１種のプラスミドに含有される付記１８から１９のいずれかに記載の製造方法。
（付記２１）プラスミドが４種であり、該４種のプラスミドが、Ｏｃｔ３／４プラスミド、Ｋｌｆ４プラスミド、ｃ−Ｍｙｃプラスミド、及びＳｏｘ２プラスミドである付記１８から２０のいずれかに記載の製造方法。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造方法は、安全性が高く、細胞種を限定せず、少量の細胞に高効率でＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の６種の遺伝子、該遺伝子のｍＲＮＡ、及びタンパク質の少なくとも２種の組合せ、並びに、化合物の少なくともいずれかを導入することができ、臨床に応用可能な誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の製造に好適に用いることができる。