(57)【要約】【課題】ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌおよびｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの下方制御を、各Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子変種を発現するマウス３２Ｄ細胞で、ヒト白血病ＭＥＧ−０１、Ｋ５６２、およびＳＵＰ−Ｂ１５細胞で、そして、白血病を患うヒト対象から新たに単離された細胞で誘導する短いｄｓＲＮＡを包含する方法および薬物を提供すること。【解決手段】本発明は、Ｂｃｒ−Ａｂｌの発現を調節する組成物および方法に関し、より詳細には、ＲＮＡ干渉を介した、オリゴヌクレオチド、例えば化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドによる、Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｍＲＮＡおよびＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質のレベルの下方制御に関する。【選択図】図１Ｂ
2011201927.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂｃｒ−Ａｂｌの発現を調節する組成物および方法に関し、より詳細には、
ＲＮＡ干渉を介した、オリゴヌクレオチド、例えば化学的に修飾されたオリゴヌクレオチ
ドによる、Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｍＲＮＡおよびＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質のレベルの下方制
御に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願の相互参照）
この出願は、２００４年１１月２４日出願の米国特許仮出願第６０／６３０８７８号お
よび２００４年１２月１日出願の米国特許仮出願第６０／６３２４０３号に基づく優先権
を主張する。これらの仮出願の全内容を本願明細書に援用する。
【０００３】
ＲＮＡ干渉、もしくは「ＲＮＡｉ」は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が線虫の体内に導
入された際に、それが遺伝子発現をブロックすることがあるという観察を説明するのに、
ファイヤー（Ｆｉｒｅ）および共同研究者らによって最初に造られた用語である（非特許
文献１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含めた多くの生物において遺伝子特異的な転写
の後にサイレンシングを引き起こすものであり、遺伝子機能を研究するための新規なツー
ルを提供している。
【０００４】
フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）の発見は、特定のヒト癌を引き起こす最初の一貫した
染色体異常を表した（非特許文献２）。Ｐｈ染色体は、９番染色体および２２番染色体の
長腕間の相互転座によって生成される（非特許文献３）。これは、慢性骨髄性白血病（Ｃ
ＭＬ）のほとんどすべての患者、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）に罹患した成人の約
１０〜２０％（非特許文献４）、そして急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に罹患した約２％の
患者で起こっている。ｔ（９；２２）転座は、２２番染色体からのＢｃｒ遺伝子と、９番
染色体からのＡｂｌ遺伝子とを融合させ、その結果、発癌性のＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子
を生じる（非特許文献５）。２２番染色体におけるＢｃｒ遺伝子中の切断点の相違によっ
て、様々なタンパク質、すなわちｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｍｒ１９００００）、ｐ２１
０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｍｒ２１００００）、およびｐ２３０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｍｒ２３００
００）をコードする様々なＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子変種の形成が誘導される。ＣＭＬ患
者の約９５％でＢｃｒ−Ａｂｌ融合転写産物であるｅ１４ａ２（以前はｂ３ａ２）および
ｅ１３ａ２（以前はｂ２ａ２）を検出することができる。（非特許文献６に概説されてい
る）。いずれの場合も、翻訳産物はｐ２１０ｋＤのＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質である。Ｐ
ｈ＋ＡＬＬを患っている患者では、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅｌａ２と称される、さらに短い形
態の転写産物が優勢である（非特許文献７に概説されている）。この変種の翻訳によって
、いくらか小さいｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質が生じる。両方のＢｃｒ−Ａｂｌタ
ンパク質、すなわちｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質およびｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌタ
ンパク質は、正常なＡｂｌタンパク質と比較して、チロシンキナーゼ活性が劇的に増大し
ており、それによって、下流標的分子の異常なリン酸化がもたらされることを特徴として
いる。
【０００５】
Ｂｃｒ−Ａｂｌのキナーゼ活性は、特異的なチロシンキナーゼ阻害剤であるメシル酸イ
マチニブ（ＳＴＩ５７１、グリベック（Ｇｌｉｖｅｃ））により阻害され、この阻害剤は
、Ｐｈ＋白血病の治療に有効である（非特許文献８に概説されている）。それにもかかわ
らず、ＡＬＬ患者及び進行したＣＭＬ患者のいずれも、初期応答後に主としてＢｃｒ−Ａ
ｂｌキナーゼドメイン中の点変異またはＢｃｒ−Ａｂｌの過剰発現などの遺伝子異常によ
って引き起こされる薬物耐性を高い頻度で発生させている（非特許文献９に概説されてい
る）。したがって、Ｂｃｒ−Ａｂｌを阻害する代替的な戦略を開発する重要性が増大して
いる。
【０００６】
Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｍＲＮＡの切断点は、独特で、かつ白血病に特異的なヌクレオチド配
列を示している。発癌性タンパク質をコードするそのような融合転写産物は、疾病に特異
的なＲＮＡｉアプローチの理想的な標的を表している。Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２転写
産物変種、および他の発癌性融合タンパク質を特異的に分解するためにＲＮＡｉを使用す
ることの可能性が最近になって実証されている（非特許文献１０乃至１６）。Ｂｃｒ−Ａ
ｂｌ特異的なｓｉＲＮＡ処置による、メシル酸イマチニブに対するＢｃｒ−Ａｂｌ発現細
胞の感受性を増大させる作用を、ウィルダらは観測しなかったが、他の研究者はそのよう
な効果を観測したので、提示されている結果は決定的なものではない。したがって、ＲＮ
Ａｉアプローチによって、ｅ１４ａ２転写産物変種以外の２つの重要なＢｃｒ−Ａｂｌ転
写産物（ｅ１３ａ２およびｅ１ａ２）の発現を下方制御できるかどうかはこれまでは明ら
かではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ファイヤーら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、８０６〜８１１頁、１９９８年
【非特許文献２】ノウェル  ピーシー（Ｎｏｗｅｌｌ  ＰＣ）ら、１９６０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１３２巻、１４６７頁
【非特許文献３】ローリー  ジェイディー（Ｒｏｗｌｅｙ  ＪＤ）、１９７３年、Ｎａｔｕｒｅ、第２４３巻、２９０〜２９３頁
【非特許文献４】ウェストブルック  シーエー（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ  ＣＡ）ら、１９９２年、Ｂｌｏｏｄ、第８０巻、２９８３頁
【非特許文献５】ハイスターカンプ  エヌ（Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ  Ｎ）ら、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ、第３０６巻、２３９頁
【非特許文献６】バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）ら、２００２年、Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、第１０８巻、１８０〜２０２頁
【非特許文献７】ファダール（Ｆａｄｅｒｌ）ら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ、第９８巻、１３３７頁
【非特許文献８】カーズロック（Ｋｕｒｚｒｏｃｋ）ら、２００３年、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．第１３８巻、８１９頁
【非特許文献９】ロスバーグ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）、２００３年、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓ．第２７巻、９７７頁
【非特許文献１０】ウィルダ（Ｗｉｌｄａ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００２年、第２１巻、５７１６頁
【非特許文献１１】シェル（Ｓｃｈｅｒｒ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、第１０１巻、１５６６頁
【非特許文献１２】ハイデンライヒ（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、第１０１巻、３１５７頁
【非特許文献１３】ヴォールボルト（Ｗｏｈｌｂｏｌｄ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、第１０２巻、２２３６頁
【非特許文献１４】リッター  ユー（Ｒｉｔｔｅｒ  Ｕ）ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３年、第１３巻、３６５頁
【非特許文献１５】リ（Ｌｉ）ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、２００３年、第１３巻、４０１頁
【非特許文献１６】チェン  ジェー（Ｃｈｅｎ  Ｊ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４年、第１１３巻、１７８４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌおよびｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの下方制御を、各Ｂｃｒ−Ａｂｌ遺伝子変種を発現するマウス３２Ｄ細胞で、ヒト白血病ＭＥＧ−０１、Ｋ５６２、およびＳＵＰ−Ｂ１５細胞で、そして、白血病を患うヒト対象から新たに単離された細胞で誘導する短いｄｓＲＮＡを包含する方法および薬物を提供することによって、技術を前進させるものである。これらの方法および薬物は、特定の癌の研
究および治療に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ｉＲＮＡ薬剤を用いたＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子の研究と、Ｂｃｒ−Ａｂｌ
切断点変種の融合部位を標的とするｉＲＮＡ薬剤のさらなる試験とに基づいている。これ
らの新知見に基づいて、本発明は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｍＲＮＡレベルと、Ｂｃｒ−Ａｂｌ
融合タンパク質レベルと、対象、例えば、ヒトなどの哺乳動物における望ましくない細胞
増殖とを低減するのに有用な組成物および方法を提供する。
【００１０】
本発明は、表１、薬剤番号１〜６に記載の薬剤のうちの１つにおける少なくとも１５の
連続したヌクレオチドからなるか、あるいはそれを含むｉＲＮＡ薬剤を特に提供する。上
記ｉＲＮＡ薬剤は、１鎖当たり３０未満のヌクレオチド、例えば２１〜２３ヌクレオチド
からなることが好ましい。２本鎖ｉＲＮＡ薬剤は、平滑末端を有することができ、より好
ましくは薬剤の一方または両方の３’末端からの１〜４ヌクレオチドの突出部分（ｏｖｅ
ｒｈａｎｇ）を有する。
【００１１】
さらに、上記ｉＲＮＡ薬剤は、天然に存在するリボヌクレオチドサブユニットだけを含
有するものでもよく、あるいは、上記薬剤に含有されているリボヌクレオチドサブユニッ
トのうちの１つまたは複数の糖または塩基への１つまたは複数の修飾を含有するように合
成されたものでもよい。上記ｉＲＮＡ薬剤は、さらに、上記薬剤の安定性、分配、または
細胞性摂取を改善するように選択されたリガンド、例えばコレステロール、に結合するよ
うに修飾することができる。上記薬剤は、単離形態にあるものでもよく、あるいは本明細
書に記載の方法に使用される医薬組成物の部分であってもよい。
【００１２】
本発明は、細胞内のＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡのレベルを低減する方法をさらに提供
する。この方法は、細胞内のＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡを選択的に分解するために、Ｒ
ＮＡ干渉に用いられる細胞機構を利用し、細胞を、本発明のｉＲＮＡ薬剤の１つと接触さ
せる工程からなる。そのような方法は、細胞に直接的に実施することができ、また、本発
明のｉＲＮＡ薬剤の１つを対象に投与することによって、哺乳動物対象に実施することも
できる。細胞内のＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡの減少は、産生されるＢｃｒ−Ａｂｌ融合
タンパク質の量の減少をもたらし、生物体内では、望ましくない細胞増殖の減少をもたら
す可能性があり、また、別の薬剤、例えば細胞増殖抑制性または細胞傷害性の薬剤、例え
ばメシル酸イマチニブまたはγ線照射の活性に対する、増殖中の細胞の感受性を増大させ
る可能性がある。
【００１３】
本発明の方法および組成物、例えば方法およびｉＲＮＡ組成物は、本明細書に記載のい
かなる用量および／または処方でも、また、本明細書に記載のいかなる投与経路でも使用
できる。
【００１４】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付図面および以下の説明に記載する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、この説明、図面、および特許請求の範囲から明
らかになるであろう。引用されたすべての参考文献、特許、および特許出願を、あらゆる
目的に、全体として本願明細書に援用する。
本願発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
配列番号２、６、１２、１４、１６または２０のうちの１つにおける１５以上の連続したヌクレオチドの配列との相違が１、２、または３ヌクレオチド以下であるアンチセンス鎖からなるｉＲＮＡ薬剤。
（項目２）
前記アンチセンス鎖が、配列番号２、６、１２、１４、１６または２０のうちの１つにおける少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する、項目１に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目３）
配列番号１、５、１１、１３、１５または１９のうちの１つにおける１５以上の連続したヌクレオチドの配列との相違が１、２、または３ヌクレオチド以下であるセンス鎖をさらに含む、項目１または２に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目４）
配列番号１、５、１１、１３、１５または１９のうちの１つにおける１５の連続したヌクレオチドの配列を有するセンス鎖をさらに含む、項目１または２に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目５）
前記薬剤が薬剤番号３、４、または５のうちの１つである、項目１乃至４のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目６）
前記センス鎖が、薬剤番号３、４、または５のセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が、薬剤番号３、４、または５のアンチセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有する、項目１に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目７）
前記ｉＲＮＡ薬剤が、前記薬剤と共にインキュベーションした後の培養ヒト細胞中に存在するＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質レベルの量を、前記薬剤と共にインキュベートされていない細胞と比較して有意に低減し、同細胞が、好ましくは３２Ｄｐ２１０／ｅ１４ａ２、３２Ｄｐ２１０−Ｔ３１５Ｉ、３２Ｄｐ２１０−Ｈ３９６Ｐ、３２Ｄｐ２１０／ｅ１３ａ２、３２Ｄｐ１９０／ｅ１ａ２、Ｍ０７ｐ２１０／ｅ１４ａ２、Ｋ５６２、ＭＥＧ−０１、またはＳＵＰ−Ｂ１５であるか、あるいは白血病患者から単離されたものである、項目１乃至６のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目８）
前記アンチセンスＲＮＡ鎖の長さが３０ヌクレオチド以下であり、かつｉＲＮＡ薬剤の２本鎖領域の長さが１５から３０ヌクレオチド対である、項目１乃至７のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目９）
前記ｉＲＮＡ剤に生物試料中での高い安定性を付与する修飾を含んでなる、項目１乃至８のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１０）
ホスホロチオエートまたは２’修飾ヌクレオチドを含む、項目９に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１１）
ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ｕａ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ｕｇ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ｃａ−３’）ジヌクレオチド；または５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ｕｕ−３’）ジヌクレオチドを含む、項目１０に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１２）
前記２’修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択された修飾を含む、項目１０または１１に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１３）
１から４個の不対ヌクレオチドを有するヌクレオチド突出部分を含む、項目１乃至１２のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１４）
前記ヌクレオチド突出部分が、２または３個の不対ヌクレオチドを有する、項目１３に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１５）
前記ヌクレオチド突出部分が、前記ｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス鎖の３’末端にある、項目１３または１４に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１６）
リガンドを含む、項目１乃至１５のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１７）
前記リガンドが、ｉＲＮＡ薬剤のセンス鎖の３’末端に結合している、項目１６に記載のｉＲＮＡ薬剤。
（項目１８）
項目１乃至１７のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤と、
薬学的に許容される担体と
からなる医薬組成物。
（項目１９）
対象の細胞内にあるＢＣＲ−ＡＢＬ  ＲＮＡの量を低減する方法であって、同細胞を、項目１乃至１８のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤と接触させることからなる方法。
（項目２０）
項目１乃至１７のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤を作製する方法であって、前記方法は前記ｉＲＮＡ薬剤を合成することからなり、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、ヌクレオチド鎖分解に対してｉＲＮＡ薬剤を安定化させる少なくとも１つの修飾を含む方法。
（項目２１）
増殖性障害を有するか、同増殖性障害を発症する危険性のあるヒトを治療する方法であって、前記方法は項目１乃至１７のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ薬剤を投与することからなり、好ましくは、前記ｉＲＮＡ薬剤が、薬剤番号１、２、３、４、５または６のｉＲＮＡ薬剤のセンス鎖配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、薬剤番号１、２、３、４、５または６のｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とからなる方法。
（項目２２）
前記ｉＲＮＡ薬剤の前記センス鎖が、薬剤番号３、４または５のセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなり、前記ｉＲＮＡ薬剤の前記アンチセンス鎖が、薬剤番号３、４または５のアンチセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ｉＲＮＡ薬剤の前記センス鎖が、薬剤番号３または４のセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなり、前記ｉＲＮＡ薬剤の前記アンチセンス鎖が、薬剤番号３または４のアンチセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなり、前記増殖性障害が慢性骨髄性白血病である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ｉＲＮＡ薬剤の前記センス鎖が、薬剤番号５のセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなり、前記ｉＲＮＡ薬剤の前記アンチセンス鎖が、薬剤番号５のアンチセンス配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドからなり、前記増殖性障害がＰｈ＋急性リンパ芽球性白血病である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記ヒトの細胞または組織内のＢＣＲ−ＡＢＬ  ＲＮＡレベルを低下させるのに十分な量で、前記ｉＲＮＡ薬剤が投与される、項目２１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】約２．５Ｍｉｏの３２Ｄｐ２１０／ｅ１３ａ２細胞を、指示したｓｉＲＮＡにて２４時間間隔で１〜３回エレクトロポレーションした結果を示す図。ＢＡＦ３／ＢＡＦ１５／ＢＡＦ１７／ＢＡＦ１９：ｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１３ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＢＡＦ９：対照として使用するｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１４ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＥＰＣ：エレクトロポレーション対照。３２Ｄｐ２１０／ｅ１３ａ２中のｐ２１０Ｂｃｒ−ａｂｌ（ｅ１３ａ２）の、ｓｉＲＮＡ処理から約２４時間後のウェスタンブロット分析。ＧＡＰＤＨのレベルをローディングコントロールとして使用。レーン１：ＥＰＣ、レーン２：ＢＡＦ９、レーン３：ＢＡＦ３、レーン４：ＢＡＦ１５、レーン５：ＢＡＦ１７、レーン６：ＢＡＦ１９。
【図１Ｂ】約２．５Ｍｉｏの３２Ｄｐ２１０／ｅ１３ａ２細胞を、指示したｓｉＲＮＡにて２４時間間隔で１〜３回エレクトロポレーションした結果を示す図。ＢＡＦ３／ＢＡＦ１５／ＢＡＦ１７／ＢＡＦ１９：ｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１３ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＢＡＦ９：対照として使用するｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１４ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＥＰＣ：エレクトロポレーション対照。ｓｉＲＮＡ  ＢＡＦ１５ならびにＢＡＦ１９で長時間処理すると、３２Ｄｐ２１０／ｅ１３ａ２細胞で生存率の低下が生じた。指示した回数でｓｉＲＮＡ処理して約４０時間後、細胞の生存率をＭＴＴによって測定した。値は、３連の平均値±ＳＤである。
【図２Ａ】約５Ｍｉｏの３２Ｄｐ１９０／ｅ１３ａ２細胞を、指示したｓｉＲＮＡにて２４時間間隔で２回エレクトロポレーションした結果を示す図。ＢＡＦ２２／ＢＡＦ２４：ｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＢＡＦ９：対照として使用するｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１４ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＢＡＦ１９：対照として使用するｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１３ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＥＰＣ：エレクトロポレーション対照。３２Ｄｐ１９０／ｅ１ａ２細胞中のｐ１９０Ｂｃｒ−ａｂｌ（ｅ１ａ２）の、２回目のｓｉＲＮＡ処理から約２４時間後のウェスタンブロット分析。ローディングコントロールとして使用したＧＡＰＤＨのレベル。レーン１：ＥＰＣ、レーン２：ＢＡＦ９、レーン３：ＢＡＦ１９、レーン４：ＢＡＦ２２、レーン５：ＢＡＦ２４。
【図２Ｂ】約５Ｍｉｏの３２Ｄｐ２１０／ｅ１３ａ２細胞を、指示したｓｉＲＮＡにて２４時間間隔で２回エレクトロポレーションした結果を示す図。ＢＡＦ２２／ＢＡＦ２４：ｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＢＡＦ９：対照として使用するｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１４ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＢＡＦ１９：対照として使用するｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１３ａ２−特異的ｓｉＲＮＡ；ＥＰＣ：エレクトロポレーション対照。ｓｉＲＮＡ  ＢＡＦ２２で繰り返し処理すると、３２Ｄｐ１９０／ｅ１ａ２細胞で生存率の低下が生じた。２回目のｓｉＲＮＡ処理から約４０時間後、細胞の生存率をＭＴＴによって測定した。値は、３連の平均値±ＳＤである。
【図３】ヒトＢ細胞前駆体白血病細胞株ＳＵＰ−Ｂ１５細胞（ＡＣＣ３８９、ＤＳＭＺ［ブラウンシュワイク所在］、切断点変種ｅ１ａ２）を、ｅ１ａ２特異的ｓｉＲＮＡ（ＢＡＦ２２）または対照として他の切断点変種（ＢＡＦ１９、ｅ１３ａ２に特異的）に対して指向するｓｉＲＮＡで処理した結果を示す図。２４時間間隔で３回ＢＡＦ２２処理すると、エレクトロポレーション対照（ＥＰＣ）またはＢＡＦ１９対照と比較してｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの著しい減少が生じた。
【図４】新たに診断された、未治療のフィラデルフィア染色体陽性ｂｃｒ−ａｂｌ−ｅ１４ａ２陽性慢性型ＣＭＬ患者３人から、フィコールハイパック密度勾配遠心およびアフィニティーカラム精製によって単離されたＣＤ３４陽性細胞を、ｓｉＲＮＡ  ＢＡＦ７（ｅ１４ａ２特異的、患者１）、ＢＡＦ８（ミスマッチ対照、患者１）、ＢＡＦ１２（ｅ１４ａ２特異的、患者２＋３）およびＢＡＦ１６（ｅ１３ａ２特異的、患者２＋３）で処理した結果を示す図。細胞を増殖培地８００μｌで密度２．５×１０６個に希釈し、４ｍｍエレクトロポレーションキュベット内でそれぞれのｓｉＲＮＡの５０μＭ溶液１２．８μｌと混合し、シングルパルス法（２５０Ｖ、１８００μＦ）を使用してエレクトロポレーションした。この処理を２４時間後に繰り返し、細胞を洗浄して、さらに２４時間インキュベートして、ウェスタンブロット分析のために収集した。ＢＡＦ７またはＢＡＦ１２処理したものは、ミスマッチ対照（ＢＡＦ８）またはｅ１３ａ２（ＢＡＦ１６）に相同なｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較してＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの著しい減少が生じた。さらに、ＢＡＦ１２処理はＢｃｒ−Ａｂｌ活性を損なわせた。Ｂｃｒ−Ａｂｌのすぐ下流の基質であるＣＲＫＬのリン酸化は、ＢＡＦ１２で処理した細胞では著しく減少した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
解説を容易にするために、本明細書では時として、「ヌクレオチド」または「リボヌク
レオチド」という用語を、ＲＮＡ薬剤の１つまたは複数の単量体サブユニットに関して使
用する。本明細書では、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用
は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替物に関する場合、以下でさらに記載するように、
１つまたは複数の位置における、修飾ヌクレオチドまたは代替置換部分も指すことがある
と理解されよう。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ薬剤」は、無修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌ
クレオシド代替物であり、これらはすべて本明細書に記載されているか、もしくはＲＮＡ
合成技術分野でよく知られている。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオチド代替物が記載さ
れているが、好ましいものの例には、ヌクレアーゼ分解に対して、無修飾ＲＮＡが有する
ものより大きな抵抗性を有するものが含まれる。好ましいものの例には、２’糖修飾、単
一鎖突出部分内、好ましくは３’単一鎖突出部分内の修飾、あるいは、特に一本鎖の場合
、１つもしくは複数のリン酸基または１つもしくは複数のリン酸基類似体を含有する５’
修飾を有するものが含まれる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ｉＲＮＡ薬剤」（「干渉ＲＮＡ薬剤」の略）は、標的遺
伝子、例えばＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子の発現を下方制御できるＲＮＡ薬剤である。理論
に拘泥するものではないが、ｉＲＮＡ薬剤は、当技術分野では時にＲＮＡｉと呼ばれる標
的ｍＲＮＡの転写後の切断、または転写前もしくは翻訳前の機構を含めた多数の機構のう
ちの１つまたは複数によって作用し得る。ｉＲＮＡ薬剤は、２本鎖ｉＲＮＡ薬剤であり得
る。
【００１９】
「ｄｓ  ｉＲＮＡ薬剤」（「２本鎖ｉＲＮＡ薬剤」の略）は、本明細書で使用される場
合、複数、好ましくは２本の鎖を含み、その中で鎖間ハイブリダイゼーションが２本鎖構
造領域を形成できるｉＲＮＡ薬剤である。本明細書では、「鎖」は、連続したヌクレオチ
ド（天然には存在しないヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドも含まれる）の配列を指す
。２本以上の鎖が別々の分子であっても、それらの各鎖が別々の分子の一部を形成しても
よく、また、それらが、例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーによっ
て共有結合で相互連結され、１分子のみを形成していてもよい。少なくとも１本の鎖は、
標的ＲＮＡに十分に相補的な領域を含むものであり得る。そのような鎖は「アンチセンス
鎖」と称される。アンチセンス鎖に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ薬剤中に含まれている
第２の鎖は「センス鎖」と称されている。しかしながら、ｄｓ  ｉＲＮＡ薬剤は、少なく
とも一部が自己相補的であり、２本鎖領域を含む、例えばヘアピンまたはフライパンハン
ドル構造を形成する単一のＲＮＡ分子から形成されていてもよい。そのような場合、「鎖
」という用語は、同一ＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の領域の１つを指す。
【００２０】
哺乳動物細胞では、長いｄｓ  ｉＲＮＡ薬剤によってインターフェロン応答が誘導され
ることがあり、それがしばしば有害であるが、短いｄｓ  ｉＲＮＡ薬剤は、インターフェ
ロン応答を、少なくとも細胞および／または宿主に有害となる程度までには誘導しない（
マンシュ  エル（Ｍａｎｃｈｅ，Ｌ．）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２年、
第１２巻、５２３８頁；リー  エスビー（Ｌｅｅ，ＳＢ）、エステバン  エム（Ｅｓｔｅ
ｂａｎ，Ｍ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９４年、第１９９巻、４９１頁；キャステリ  ジ
ェーシー（Ｃａｓｔｅｌｌｉ，ＪＣ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７年、第１８６巻
、９６７頁；チェン  エックス（Ｚｈｅｎｇ、Ｘ．）、ベビラクア  ピーシー（Ｂｅｖｉ
ｌａｃｑｕａ，ＰＣ）、ＲＮＡ、２００４年、第１０巻、１９３４頁；ハイデル（Ｈｅｉ
ｄｅｌ）ら、「Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ａｎ
ｉｍａｌｓ  ｔｏ  ｎａｋｅｄ  ｓｉＲＮＡｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．先
行オンライン出版、２００４年１１月２１日、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１０３８
）。本発明のｉＲＮＡ薬剤は、十分に短い分子を含有しており、それらは正常な哺乳動物
細胞で有害な非特異的インターフェロン応答を誘発しない。したがって、対象へのｉＲＮ
Ａ薬剤組成物（例えば本明細書に記載の通り製剤されたもの）の投与を用いて、インター
フェロン応答、特にＢｃｒ−Ａｂｌを発現しない他の細胞による応答を回避しながら、上
記対象に含まれているＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子の発現
をサイレンシングすることができる。十分に短くて、有害なインターフェロン応答を誘発
しない分子を、本明細書では、ｓｉＲＮＡ薬剤またはｓｉＲＮＡと称する。「ｓｉＲＮＡ
薬剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、十分に短くて、ヒト細胞で
有害なインターフェロン応答を誘導しないｉＲＮＡ薬剤、例えばｄｓ  ｉＲＮＡ薬剤を指
し、それは例えば６０ヌクレオチド対未満、好ましくは５０、４０、または３０ヌクレオ
チド対未満の２本鎖領域を有する。
【００２１】
ｄｓ  ｉＲＮＡ薬剤およびｓｉＲＮＡ薬剤を含めた、本明細書に記載の単離されたｉＲ
ＮＡ薬剤は、例えばＲＮＡ分解によるＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子のサイレンシングを媒介
することができる。便宜のために、そのようなＲＮＡは、本明細書では、サイレンシング
されるＲＮＡとも称される。そのような遺伝子は、標的遺伝子とも称される。サイレンシ
ングされるＲＮＡは、内因性Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子の遺伝子産物であることが好まし
い。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉを媒介する」という用語は、薬剤が標的遺伝子
を配列特異的な様式でサイレンシングする能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングす
る」とは、それによって、上記薬剤に接触していないときに標的遺伝子の特定の産物を含
有および／または分泌する細胞が、上記薬剤に接触しているときに、上記薬剤に接触して
いない同様な細胞と比較して、そのような遺伝子産物を少なくとも１０％、２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％少なく含有および／または
分泌するであろう過程を意味する。標的遺伝子のそのような産物は、例えば、メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質、または調節エレメントであり得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分
子、例えばＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡ分子との間で安定かつ特異的な結合が生じるのに
十分な程度の相補性を示すのに使用される。特異的な結合は、特異的な結合が望ましい条
件下で、すなわちインビボアッセイまたは治療処置の場合には生理条件下で、あるいはイ
ンビトロアッセイの場合ではアッセイが実施される条件下で、非標的配列へのオリゴマー
化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、
通常、少なくとも４ヌクレオチドの相違を有する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、ｉＲＮＡ薬剤が標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ（例えば
標的Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡ）に「十分に相補的である」のは、上記ｉＲＮＡ薬剤に
よって、細胞内での、上記標的ＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生が減少する
場合である。上記ｉＲＮＡ薬剤は、標的ＲＮＡに「正確に相補的」であってもよく、例え
ば上記標的ＲＮＡと上記ｉＲＮＡ薬剤とがアニールするものでもよい。正確に相補的な領
域では、ワトソンクリック塩基対のみでハイブリット形成されていることが好ましい。「
十分に相補的な」ｉＲＮＡ薬剤は、標的Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ＲＮＡに正確に相補的な内部
領域（例えば少なくとも１０ヌクレオチド）を含み得る。さらに、一部の実施形態では、
上記ｉＲＮＡ薬剤が単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この場合、上記ｉＲＮ
Ａ薬剤は、単一ヌクレオチド相違の（例えば７ヌクレオチド以内の）領域で正確な相補性
が存在する場合にのみＲＮＡｉを媒介する。好ましいｉＲＮＡ薬剤は、表１、薬剤番号１
〜６に示すセンス配列およびアンチセンス配列に基づいているか、もしくはそれからなる
か、もしくはそれを含むであろう。
【００２５】
本明細書での使用において、「本質的には同一」は、第２のヌクレオチド配列と比較し
て第１のヌクレオチド配列に関して使用される場合、最大１、２、または３ヌクレオチド
までの置換（例えばアデノシンがウラシルで置換されている）を除いて、第１のヌクレオ
チド配列が第２のヌクレオチド配列に同一であることを意味する。「培養ヒトＢｃｒ−Ａ
ｂｌ発現細胞でＢｃｒ−Ａｂｌ融合体発現を阻害する能力を本質的に保持している」とい
うことは、ヌクレオチドの欠失、添加または置換によって、表１、薬剤番号１〜６のｉＲ
ＮＡ薬剤のうちの１つに同一ではないが、それに由来するｉＲＮＡ薬剤に関して本明細書
で使用される場合、それが由来した表１、薬剤番号１〜６のｉＲＮＡ薬剤との比較におけ
る、得られたｉＲＮＡ薬剤の阻害活性の低下が２０％阻害以下であることを意味する。例
えば、培養ヒトＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞中に存在するＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡの量を
７０％低下させる、表１、薬剤番号１〜６のｉＲＮＡ薬剤に由来するｉＲＮＡ薬剤は、培
養ヒトＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞中でＢｃｒ−Ａｂｌ融合体発現を阻害する能力を本質的に
保持しているものとみなされるためには、それ自体が、培養ヒトＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞
中に存在するＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡの量を少なくとも５０％低下させなければなら
ない。選択的に、本発明のｉＲＮＡ薬剤は、培養ヒトＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞中に存在す
るＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡの量を少なくとも５０％低下させるものでもよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「対象」は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質発現によって
媒介された障害の治療を受けている哺乳類生物を指す。対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラ
ット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類など、いかなる哺乳動物でもよい。好ましい実施
形態では、対象はヒトである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合発現に関連した障害は、１）Ｂｃｒ−
Ａｂｌ融合タンパク質の存在によって一部媒介され、かつ２）存在しているＢｃｒ−Ａｂ
ｌ融合タンパク質のレベルを低減することによって結果に影響を与えることができるいか
なる生物学的または病理学的状態も指す。Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合発現に関連した特定の障害
について以下に述べる。
（１  ｉＲＮＡ薬剤の設計および選択）
【００２８】
【表１】
2011201927.tif 000003
本発明は、ｉＲＮＡ薬剤でインキュベートした後の培養細胞における、インビトロでの
Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子サイレンシング、およびその結果である細胞増殖の低減の実証
に基づいている。
【００２９】
配列情報と望ましい特徴とに基づいて、ｉＲＮＡ薬剤を合理的に設計することができる
。例えば、候補となる２本鎖の相対的融解温度に従ってｉＲＮＡ薬剤を設計することがで
きる。通常、２本鎖は、アンチセンス鎖の３’末端より、アンチセンス鎖の５’末端で、
より低い融解温度を有するはずである。
【００３０】
また、例えば、標的遺伝子として働くであろう遺伝子の遺伝子歩行分析を行うことによ
っても、候補となるｉＲＮＡ薬剤を設計することができる。転写領域のすべてまたは一部
に相当する、オーバーラップ、隣接、または近接した候補薬剤を生成させ、試験すること
ができる。各ｉＲＮＡ薬剤を、標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して試験および評
価することができる（下記、「候補となるｉＲＮＡ薬剤の評価」を参照）。
【００３１】
ここでは、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合体変種であるＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２、Ｂｃｒ−Ａ
ｂｌ−ｅ１３ａ２、およびＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１ａ２を標的とした潜在的ｉＲＮＡ薬剤を
、それぞれの融合部位の既知配列（非特許文献６及び７）を用いて設計した。得られた結
果に基づいて、本発明は、これらのＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子切断点変種をサイレンシン
グするｉＲＮＡ薬剤を提供する。
【００３２】
表１は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合体、詳細には薬剤番号１〜６を標的とする活性ｉＲＮＡ薬
剤を提示する。下記の実施例に示す通り、表１、薬剤番号１〜６のｉＲＮＡ薬剤は、これ
らの薬剤と共にインキュベーションした後の培養ヒトＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞中に存在す
るＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡの量を、上記薬剤と共にインキュベートされていない細胞
と比較して５０％超（そして一部の薬剤では８０％超）低減し、かつ／または培養ヒトＢ
ｃｒ−Ａｂｌ発現細胞によって細胞培養上清中に分泌されるＢｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク
質の量を５０％超低減するという長所および驚くべき能力を有する。
【００３３】
これらの結果に基づいて、本発明は、表１、薬剤番号１〜６に示されている薬剤のセン
ス鎖配列における少なくとも１５の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖と、表１、薬
剤番号１〜６に示されている薬剤のアンチセンス鎖配列における少なくとも１５の連続し
たヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とを含有するｉＲＮＡ薬剤を特にに提供する。
【００３４】
表１に示したｉＲＮＡ薬剤は、長さ２１ヌクレオチドのセンス鎖と、長さ２３ヌクレオ
チドのアンチセンス鎖とで構成されており、本発明は、これらの薬剤からの１５の連続し
たヌクレオチドを含む薬剤を提供する。しかしながら、これらの長さは潜在的に最適であ
り得るが、上記ｉＲＮＡ薬剤はこれらの長さに限定されない。長さが特定の範囲内である
場合には、有効性は鎖の長さより、むしろヌクレオチド配列の関数であるので、当業者は
、より短いｉＲＮＡ薬剤またはより長いｉＲＮＡ薬剤も同様に有効であり得ることを十分
に認識している。例えば、ヤン  ディ（Ｙａｎｇ，Ｄ．）ら（ＰＮＡＳ、２００２年、第
９９巻、９９４２〜９９４７頁）は、長さが２１塩基対と３０塩基対との間にあるｉＲＮ
Ａ薬剤が同様な効力を有することを実証した。他では、長さ約１５塩基対にまで短くした
ｉＲＮＡ薬剤による効果的な遺伝子サイレンシングが示されている（バイロム  ダブリュ
．エム．（Ｂｙｒｏｍ，Ｗ．Ｍ．）ら、「Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＲＮＡｉ  ｗｉｔｈ  ｓｉ
ＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ」、Ｔｅ
ｃｈ  Ｎｏｔｅｓ、第１０（１）巻、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、米国テ
キサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）所在）。
【００３５】
したがって、表１、薬剤番号１〜６に提示した配列の１つに由来するｉＲＮＡ薬剤を産
生するために、表１、薬剤番号１〜６に提示した配列から、１５〜２２ヌクレオチドの間
の部分配列を選択することが可能であり、かつ本発明で企図されている。代替的に、表１
、薬剤番号１〜６に提示した配列の１つ、またはこれらの薬剤の１つからの１５の連続し
たヌクレオチド、からなる薬剤に１個または数個のヌクレオチドを添加してもよい。この
場合、必須ではないが、添加されたヌクレオチドが標的遺伝子、例えばＢｃｒ−Ａｂｌ融
合体のそれぞれの配列に相補的となるような様式が好ましい。例えば、上記薬剤の１つに
おける最初の１５ヌクレオチドを、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡでこれらの配列の５’側
にある８ヌクレオチドと連結させて、センス鎖およびアンチセンス鎖に２３ヌクレオチド
を有する薬剤を得ることができる。このようにして派生するすべてのｉＲＮＡ薬剤もそれ
らが培養ヒトＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ融合発現を阻害する能力を
本質的に保持するという場合には、本発明のｉＲＮＡ薬剤に含まれる。
【００３６】
ｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス鎖は、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５
、２９、４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記アンチセンス鎖は、長
さが６０、５０、４０、または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの
範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００３７】
ｉＲＮＡ薬剤のセンス鎖は、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９
、４０または５０ヌクレオチド以上であるべきである。上記センス鎖は、長さが６０、５
０、４０または３０ヌクレオチド以下であるべきである。好ましい長さの範囲は、１５〜
３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチドである。
【００３８】
ｉＲＮＡ薬剤の２本鎖部分は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３、２４、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド対以上であるべきである。上
記２本鎖部分は、長さが６０、５０、４０または３０ヌクレオチド対以下であるべきであ
る。好ましい長さの範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌ
クレオチド対である。
【００３９】
通常、本発明のｉＲＮＡ薬剤は、それぞれのＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子と十分な相補性
を有する領域を含み、上記ｉＲＮＡ薬剤またはその断片がＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子の下
方制御を媒介できる十分なヌクレオチドの長さを有する。表１、薬剤番号１〜６のｉＲＮ
Ａ薬剤のアンチセンス鎖は、それぞれのＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子のｍＲＮＡ配列に完全
に相補的であり、それらのセンス鎖は、上記アンチセンス鎖上の２つの３’末端ヌクレオ
チドを除いて、上記アンチセンス鎖に完全に相補的である。しかしながら、上記ｉＲＮＡ
薬剤と上記標的との間に完全な相補性が存在している必要はなく、但し、それらの対応性
は、上記ｉＲＮＡ薬剤またはそれの切断産物が、例えばＢｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡのＲ
ＮＡｉ切断による配列特異的なサイレンシングを誘導するのを可能にするのに十分でなけ
ればならない。
【００４０】
したがって、本発明のｉＲＮＡ薬剤には、培養ヒトＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞におけるＢ
ｃｒ−Ａｂｌ発現を阻害する能力を本質的に保持しながら、それぞれ、鎖当たり１、２、
または３つ以下のヌクレオチドが他のヌクレオチドで置換されている（例えばアデノシン
がウラシルで置換されている）ことを除いて、下記に定義する通り、それぞれが、表１、
薬剤番号１〜６の配列の１つに本質的に同一である少なくとも１６、１７または１８ヌク
レオチドの配列からなるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる薬剤が含まれる。したが
って、これらの薬剤は、表１、薬剤番号１〜６の配列の１つに同一であるが、標的Ｂｃｒ
−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡ配列に関して、もしくはセンス鎖とアンチセンス鎖との間に、１、
２または３塩基のミスマッチが導入されている少なくとも１５ヌクレオチドを有している
であろう。標的Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡ配列とのミスマッチ、特にアンチセンス鎖に
おけるミスマッチは、末端領域で最もよく許容され、存在する場合には、１箇所または複
数の端末領域内、例えば５’および／または３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチ
ド以内にあることが好ましく、センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端の６
、５、４、または３ヌクレオチド以内にあることが最も好ましい。上記センス鎖は、分子
の全体的な２本鎖特性を維持するのに十分なだけアンチセンス鎖に相補的であればよい。
【００４１】
上記センス鎖およびアンチセンス鎖は、上記ｉＲＮＡ薬剤が、その分子の一端または両
端に単一鎖または不対領域を含有するように選択されることが好ましい。したがって、ｉ
ＲＮＡ薬剤は、好ましくは突出部分（ｏｖｅｒｈａｎｇ）、例えば１または２つの５’ま
たは３’突出部分、但し好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部分１つを含有するよ
うに対合したセンス鎖およびアンチセンス鎖を含有する。ほとんどの実施形態は３’突出
部分を有するであろう。好ましいｓｉＲＮＡ薬剤は、上記ｉＲＮＡ薬剤の一端または両端
に長さが１〜４ヌクレオチド、好ましくは２または３ヌクレオチドの１本鎖の突出部分、
好ましくは３’突出部分を有するであろう。上記突出部分は、一方の鎖がもう一方より長
い結果、または同じ長さの２本の鎖がずれている結果であり得る。５’末端はリン酸化さ
れていることが好ましい。
【００４２】
２本鎖領域の好ましい長さは、１５から３０ヌクレオチドの間、最も好ましくは１８、
１９、２０、２１、２２および２３ヌクレオチドの長さ、例えば上記に論じたｓｉＲＮＡ
薬剤の範囲である。ｓｉＲＮＡ薬剤は、長いｄｓＲＮＡからの天然Ｄｉｃｅｒ調製物に長
さおよび構造が類似したものでよい。ｓｉＲＮＡ薬剤の２本の鎖が、例えば共有結合によ
って、連結されている実施形態も含まれる。ヘアピン構造、または必要な２本鎖領域と、
好ましくは３’突出部分とを提供する他の１本鎖構造も本発明に包含される。
（２  候補となるｉＲＮＡ薬剤の評価）
候補となるｉＲＮＡ薬剤を、それが標的遺伝子発現を下方制御する能力に関して評価す
ることができる。例えば、候補となるｉＲＮＡ薬剤を用意し、標的遺伝子、例えばＢｃｒ
−Ａｂｌ融合遺伝子を内因的に発現するか、あるいはＢｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質をそ
れから発現することができるコンストラクトでトランスフェクションされていることによ
って発現する細胞に接触させることができる。上記候補となるｉＲＮＡ薬剤との接触の前
および後の標的遺伝子発現のレベルを、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで比較す
ることができる。標的遺伝子から発現されたＲＮＡまたはタンパク質の量が、上記ｉＲＮ
Ａ薬剤と接触した後に低下していると判定された場合、上記ｉＲＮＡ薬剤が標的遺伝子発
現を下方制御すると結論付けることができる。細胞中の標的Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ＲＮＡま
たはＢｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質のレベルは、いかなる望ましい方法でも測定できる。
例えば、標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、逆転写連結ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイで測定することができる
。タンパク質のレベルは、例えば、ウェスタンブロット解析または免疫蛍光によって測定
することができる。
（ｉＲＮＡ薬剤の安定性試験、修飾、および再試験）
候補となるｉＲＮＡ薬剤を、そのｉＲＮＡ薬剤が対象の体内に導入された際などの安定
性、例えばエンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる切断に対する感受性に関
して評価することができる。同方法は、修飾、特に切断、例えば対象の体内に存在する成
分による切断の影響を受けやすい部位を同定する方法を利用することができる。
【００４３】
切断の影響を受けやすい部位が同定された場合、例えば切断部位への２’修飾、例えば
２’−Ｏ−メチル基の導入によって、上記潜在的切断部位が切断に抵抗性を有するように
作製された、さらなるｉＲＮＡ薬剤を設計および／または合成することができる。このさ
らなるｉＲＮＡ薬剤を、安定性に関して再試験することができ、あるｉＲＮＡ薬剤が望ま
しい安定性を示すことが見出されるまで、この工程を繰り返すことができる。
（インビボ試験）
Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子発現を阻害できるものとして同定されたｉＲＮＡ薬剤を、動
物モデル（例えばマウスまたはラットなどの哺乳動物）中でのインビボでの機能に関して
試験することができる。例えば、上記ｉＲＮＡ薬剤を動物に投与して、その生体内分布、
安定性、およびそれがＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子発現を阻害する能力または望ましくない
細胞増殖を低減する能力に関して評価することができる。
【００４４】
上記ｉＲＮＡ薬剤は、注射などによって標的組織に直接投与することができ、あるいは
上記ｉＲＮＡ薬剤を、それがヒトに投与されるのと同じ様に動物モデルに投与することも
できる。
【００４５】
上記ｉＲＮＡ薬剤を細胞内分布に関して評価することもできる。この評価には、上記ｉ
ＲＮＡ薬剤が細胞内に摂取されたかどうかの判定も含めることができる。この評価には、
上記ｉＲＮＡ薬剤の安定性（例えば半減期）の測定も含めることができる。ｉＲＮＡ薬剤
のインビボ評価は、追跡可能なマーカー（例えば、フルオレセインなどの蛍光マーカー：
３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、もしくは３Ｈなどの放射性標識；金粒子；または免疫組織化学
用抗原粒子）に結合したｉＲＮＡ薬剤の使用によって容易に行うことができる。
【００４６】
上記ｉＲＮＡ薬剤を、それがＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子発現を下方制御する能力に関し
て評価することができる。インビボでのＢｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子発現のレベルは、例え
ば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または上記ｉＲＮＡ薬剤への組織の曝露の
前および後における同組織からのＲＮＡの単離によって測定することができる。組織を採
取するために動物を屠殺する必要がある場合、未処置のコントロール動物が比較対象とな
ろう。標的Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡは、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、
ノーザンブロット、分岐ＤＮＡアッセイ、またはＲＮアーゼプロテクションアッセイを含
めたいかなる望ましい方法でも検出することができる。代替的又は付随的に、上記ｉＲＮ
Ａ薬剤で処置された組織抽出物のウェスタンブロット解析を行うことによって、Ｂｃｒ−
Ａｂｌ融合遺伝子発現をモニタリングすることもできる。
【００４７】
特定の望ましい効果を実現するのに必要な濃度（例えばＥＣ５０）を確定するのに、動
物モデルを用いることができる。そのような動物モデルには、ヒト遺伝子、例えば標的ヒ
トＢｃｒ−Ａｂｌ融合ＲＮＡを産生する遺伝子を発現するトランスジェニック動物が含ま
れ得る。別の実施形態では、試験用の組成物は、少なくとも内部領域において、動物モデ
ルにおける標的Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ＲＮＡと、ヒトにおける標的Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ＲＮ
Ａとの間で保存されている配列に相補的なｉＲＮＡ薬剤を含有できる。
（３  ｉＲＮＡ化学）
ここでは、ＲＮＡｉを媒介して、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子の発現を阻害する単離され
たｉＲＮＡ薬剤、例えばｄｓＲＮＡ薬剤について述べる。
【００４８】
ここで論じるＲＮＡ薬剤には、他には無修飾のＲＮＡに加えて、例えば効力を向上させ
るために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオチド代替物のポリマーも含まれる。無修飾の
ＲＮＡは、その中で、核酸成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が天然に存在し
ているもの、好ましくはヒト体内に生来的に存在しているものと同じであるか、もしくは
本質的に同じである分子を指す。当技術分野は、まれであるか、もしくは一般的でないが
、天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと称することがある。例えば、リンバッハ（Ｌｉｍ
ｂａｃｈ）ら（１９９４年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２２巻、２１８
３〜２１９６頁を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと称される（明らかに、それらが通
常は転写後修飾の結果であるため）、そのようなまれであるか、もしくは一般的でないＲ
ＮＡは、本明細書で使用される場合、無修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本明細書
で使用される場合、修飾ＲＮＡは、その中で、１つまたは複数の核酸成分、すなわち、糖
、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在しているもの、好ましくはヒト体内に生来的に
存在しているものと異なる分子を指す。それらは修飾「ＲＮＡ」と称されるが、それらに
は修飾によりＲＮＡではない分子も当然ながら含まれる。ヌクレオチド代替物は、その中
で、ハイブリダイゼーションが実質的にリボリン酸骨格で見られるものと類似するように
、それらの塩基の正しい空間的関係での提示が可能となっている非リボリン酸骨格構造物
、例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣体で、リボリン酸骨格が置換されている分子である
。上記のすべての例が本明細書に論じられている。
【００４９】
本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のいかなる２本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子
、例えばｉＲＮＡ薬剤にも組み入れら得る。上記修飾は、ｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス鎖
およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい。核酸が重合体のサブユニッ
トまたは単量体である場合には、下記の修飾の多くは核酸中で反復される位置で起こり、
例えば、塩基もしくはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合性Ｏの修飾である。一部の
場合には、上記修飾が核酸中の対象となる位置のすべてで起こるであろうが、多くの場合
、そして実際にはほとんどの場合には、そうならないであろう。一例として、修飾は、３
’または５’末端位置でのみ起こることもあり、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌク
レオチドの位置または最終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることも
ある。修飾は、２本領域に起こっても、１本鎖領域に起こっても、あるいはそれら両方に
起こってもよい。例えば、非結合性Ｏの位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または
両方の末端で起こることも、あるいは末端領域、例えば鎖の末端ヌクレオチドの位置また
は最終２、３、４、５、または１０ヌクレオチドでのみ起こることも、あるいは２本鎖お
よび１本鎖領域、特に末端で起こることもある。同様に、修飾は、センス鎖で起こること
も、アンチセンス鎖で起こることも、それら両方で起こることもある。一部の場合には、
センス鎖およびアンチセンス鎖が同じ修飾または同じクラスの修飾を有するであろう。し
かしながら、他の場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なった修飾を有するであ
ろう。例えば、一部の場合には、一方の鎖、例えばセンス鎖のみを修飾することが望まし
い場合がある。
【００５０】
ｉＲＮＡ薬剤に修飾を導入する２つの主要な目的は、生物学的環境における分解に対す
るそれらの安定化、および下記に詳細に論じる薬理学的特性、例えば薬動力学的特性の改
良である。ｉＲＮＡ薬剤の糖、塩基、または骨格への他の適当な修飾は、共有されている
２００４年１月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３号パンフレッ
トに記載されている。ｉＲＮＡ薬剤は、共有されている２００４年４月１６日出願の国際
出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２号パンフレットに記載の塩基のような天然に
存在しない塩基を含有することもできる。ｉＲＮＡ薬剤は、非糖質環状担体分子のような
天然に存在しない糖を含むこともできる。ｉＲＮＡ薬剤で使用する天然に存在しない糖の
例示的特性は、共有されている２００３年４月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０
０４／１１８２９号パンフレットに記載されている。
【００５１】
ｉＲＮＡ薬剤は、ヌクレアーゼ抵抗性の増強に有用なヌクレオチド間結合（例えばキラ
ルホスホロチオエート結合）を含有できる。付随的に、又は代替的に、ヌクレアーゼ抵抗
性を増強させるために、ｉＲＮＡ薬剤にリボース摸倣体を含有させることができる。ヌク
レアーゼ抵抗性を増強させるための例示的ヌクレオチド間結合およびリボース模倣体は、
共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０
号パンフレットに記載されている。
【００５２】
ｉＲＮＡ薬剤は、リガンド結合単量体サブユニットおよびオリゴヌクレオチド合成用の
単量体を含有できる。例示的な単量体は、共有されている２００４年８月１０日出願の米
国特許出願第１０／９１６１８５号明細書に記載されている。
【００５３】
ｉＲＮＡ薬剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２
００４／０７０７０号パンフレットに記載されているようなＺＸＹ構造を有することがで
きる。
【００５４】
ｉＲＮＡ薬剤は、両親媒性部分と複合体形成され得る。ｉＲＮＡ薬剤と共に使用するた
めの例示的な両親媒性部分は、共有されている２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣ
Ｔ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００５５】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ薬剤は、モジュール複合体の特性を有する送達薬剤と複合
体形成され得る。この複合体は、（ａ）濃縮剤（例えば、核酸を、例えばイオンまたは静
電気相互作用を介して、誘引、例えば結合できる薬剤）；（ｂ）融合誘導剤（例えば、細
胞膜に融合し、かつ／またはそれを通って輸送される性能を有する薬剤）：および、（ｃ
）標的化化学基、例えば細胞または組織標的化剤、例えば特定の細胞型に結合するレクチ
ン、糖タンパク、脂質、またはタンパク質（例えば抗体）、のうちの１つまたは複数（好
ましくは２つ以上、より好ましくは３つすべて）に結合される担体物質を含み得る。送達
物質と複合体形成されるｉＲＮＡ薬剤は、共有されている２００４年３月８日出願の国際
出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されている。
【００５６】
ｉＲＮＡ薬剤は、ｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列とアンチセンス配列との間などに、非標
準的な対合を備え得る。非標準的なｉＲＮＡ薬剤の例示的特徴は、共有されている２００
４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載
されている。
（ヌクレアーゼ抵抗性の強化）
ｉＲＮＡ薬剤、例えばＢｃｒ−Ａｂｌ融合体を標的とするｉＲＮＡ薬剤は、同薬剤が有
するヌクレアーゼ抵抗性を強化することができる。
【００５７】
抵抗性を強化する方法の１つは、共有されている同時係属中の出願である米国特許仮出
願第６０／５７４７４４号明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３１
号パンフレットに記載の通り、切断部位を同定し、そのような部位を修飾して、切断を阻
害することである。例えば、ジヌクレオチド５’−ｕａ−３’、５’−ｃａ−３’、５’
−ｕｇ−３’、５’−ｕｕ−３’、又は５’−ｃｃ−３’を切断部位として利用できる。
特定の実施形態では、ｉＲＮＡ薬剤のすべてのピリミジンが、センス鎖、アンチセンス鎖
、または両方の鎖に２’修飾を有し、そのため、そのｉＲＮＡ薬剤は、エンドヌクレアー
ゼに対する抵抗性が強化される。ヌクレアーゼ抵抗性の強化は、例えば、共有されている
２００５年５月２７日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３１号パンフレ
ットに記載の通り、ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウ
リジン−アデニン−３’（５’−ｕａ−３’）ジヌクレオチド；５’−シチジンが２’修
飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ｃａ
−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１
つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ｕｇ−３’）ジヌクレオチド；５’−ウリ
ジンが２’修飾ヌクレオチドである、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’
（５’−ｕｕ−３’）ジヌクレオチド；または５’−シチジンが２’修飾ヌクレオチドで
ある、少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ｃｃ−３’）ジヌクレ
オチドをもたらす５’ヌクレオチド修飾を行うことによって実現できる。上記ｉＲＮＡ薬
剤は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのその
ようなジヌクレオチドを含み得る。特に好ましい実施形態では、センス鎖、アンチセンス
鎖、またはそれら両鎖のいずれかに存在する５’−ｕａ−３’および５’−ｃａ−３’と
いう配列モチーフすべてにおける５’ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。好ましく
は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれら両鎖のいずれかに存在する５’−ｕａ−３
’、５’−ｃａ−３’、および５’−ｕｇ−３’という配列モチーフのすべてにおける５
’ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。より好ましくは、センス鎖におけるすべての
ピリミジンヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、かつアンチセンス鎖に存在する５’
−ｕａ−３’および５’−ｃａ−３’という配列モチーフすべてにおける５’ヌクレオチ
ド、または上記アンチセンス鎖が５’−ｕａ−３’も５’−ｃａ−３’モチーフも含まな
い場合には、存在する５’−ｕｇ−３’という配列モチーフのすべてにおける５’ヌクレ
オチドが修飾ヌクレオチドである。
【００５８】
ヌクレアーゼ抵抗性および／または標的への結合親和性を増大させるために、ｉＲＮＡ
薬剤、例えば上記ｉＲＮＡ薬剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、例えば２’
修飾されたリボース単位および／またはホスホロチオエート結合を含有し得る。例えば２
’ヒドロキシ基（ＯＨ）を、種々の異なった「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾
または置換することができる。
【００５９】
「オキシ」−２’ヒドロキシ基修飾の例には、アルコキシもしくはアリールオキシ（Ｏ
Ｒ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール
、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわちＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ
Ｈ２ＣＨ２ＯＲ；例えばメチレン架橋によって２’ヒドロキシ基が同じリボース糖の４’
炭素に連結されている「ロックト」核酸（ＬＮＡ）、Ｏ−ＡＭＩＮＥ、およびアミノアル
コキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルア
ミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、
ヘテロアリールアミノ、またはジへテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ
）が含まれる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）
のみを含有するオリゴヌクレオチドは、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたもの
に匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは、注目に値する。
【００６０】
「デオキシ」修飾には、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これらは部分的ｄｓＲ
ＮＡの突出部分に特に重要である）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２
；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールア
ミノ、ヘテロアリールアミノ、ジへテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ
２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジ
アルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロア
リールアミノ、またはジへテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シ
クロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト
；アルキル−チオ−アルキル：チオアルコキシ；及びアルキル、シクロアルキル、アリー
ル、アルケニル、およびアルキニルが含まれ、これらは、選択的に、例えばアミノ官能基
で置換することができる。
【００６１】
好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’
−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
ヌクレアーゼ抵抗性を最大にするために、２’修飾を、１つまたは複数のリン酸リンカ
ー修飾（例えばホスホロチオエート）と併用することができる。いわゆる「キメラ」オリ
ゴヌクレオチドは、２つ以上の異なった修飾を含有するものである。
【００６２】
オリゴヌクレオチド骨格におけるフラノース糖の包含も、エンドヌクレオチド鎖切断を
低減できる。ｉＲＮＡ薬剤は、さらに３’陽イオン基を包含させることによって、あるい
は３’−３’連結を伴う３’末端でのヌクレオシドの反転によって修飾され得る。別の代
替法では、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴで３’末端をブロ
ックすることができる。他の３’結合体も、３’−５’エキソヌレチド分解性の切断を阻
害できる。理論に拘泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの３
’結合体は、エクソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’末端に結合するのを立体的
にブロックすることによって、エキソヌレチド分解性の切断を阻害し得る。小さなアルキ
ル鎖、アリール基、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボー
ス、グルコースなど）でさえも、３’−５’エクソヌクレアーゼをブロックすることがで
きる。
【００６３】
同様に、５’結合体は、５’−３’エキソヌレチド分解性の切断を阻害できる。理論に
拘泥するものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’結合体は、エク
ソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’末端に結合するのを立体的にブロックするこ
とによって、エキソヌレチド分解性の切断を阻害し得る。小さなアルキル鎖、アリール基
、または複素環式結合もしくは修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースな
ど）でさえも、３’−５’エクソヌクレアーゼをブロックすることができる。
【００６４】
ｉＲＮＡ薬剤は、２本鎖ｉＲＮＡ薬剤が少なくとも一方の末端に１本鎖ヌクレオチド突
出部分を含有している場合に、ヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。
好ましい実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、１乃至４個の、好ましくは２乃至
３個の不対ヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、末端ヌクレオチド対に直接
隣接している上記１本鎖の突出部分の不対ヌクレオチドがプリン塩基を含有し、上記末端
ヌクレオチド対がＧ−Ｃ対であるか、もしくは相補的な最終４ヌクレオチド対のうち少な
くとも２対がＧ−Ｃ対である。さらに別の実施形態では、上記ヌクレオチド突出部分は、
１または２つの不対ヌクレオチドを有することがあり、例示的実施形態では、上記ヌクレ
オチド突出部分が５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態では、上記ヌクレオチド突
出部分が、上記アンチセンス鎖の３’端にある。一実施形態では、上記ｉＲＮＡ薬剤は、
２ｎｔの突出部分５’−ＧＣ−３’が形成されるように、上記アンチセンス鎖の３’末端
に５’−ＣＧＣ−３’というモチーフを含有する。
【００６５】
したがって、ｉＲＮＡ薬剤は、例えば対象の体内に存在するヌクレアーゼ、例えば、エ
ンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアーゼによる分解を阻害するように修飾された単量
体を含有できる。これらの単量体は、本明細書ではＮＲＭすなわちヌクレアーゼ抵抗性促
進単量体と称され、対応する修飾は、ＮＲＭ修飾と称される。多くの場合、これらの修飾
は、ｉＲＮＡ薬剤の他の特性、例えばタンパク質、例えば運搬体タンパク質、例えば血清
アルブミンまたはＲＩＳＣのメンバー、と相互作用する能力、または第１の配列および第
２の配列の、お互いと２本鎖を形成する能力、もしくは別の配列、例えば標的分子と２本
鎖を形成する能力、も調節するであろう。
【００６６】
上述した好ましいヌクレアーゼ抵抗性の規準を満たすｉＲＮＡ薬剤を産生するのに有用
であり得る修飾は、以下に示す糖、塩基、および／またはリン酸骨格の１つまたは複数の
化学修飾および／または立体化学修飾を含有し得る。
【００６７】
（ｉ）キラル（Ｓｐ）チオ酸塩。したがって、好ましいＮＲＭは、特定のキラル形態に
ある、架橋部以外の位置、例えば通常は酸素が占めている位置である位置ＸにＳｐまたは
Ｒｐのようなヘテロ原子を含有する修飾リン酸基に関して豊富または純粋であるヌクレオ
チド２量体を含有する。位置Ｘの原子は、Ｓ、Ｓｅ、Ｎｒ２、またはＢｒ３でもよい。Ｘ
がＳである場合、Ｓｐ連結に関して豊富であるか、純粋なキラルであることが好ましい。
豊富であるとは、少なくとも７０、８０、９０、９５、または９９％が好ましい形態であ
ることを意味する。
【００６８】
（ｉｉ）糖、塩基および／またはリン酸若しくは修飾リン酸骨格部分のリン原子への１
つまたは複数の陽イオン基の結合。したがって、好ましいＮＲＭは、陽イオン基で誘導体
化された単量体を末端位置に含有する。アンチセンス配列の５’末端は、末端ＯＨ基また
はリン酸基を有するべきであるので、アンチセンス配列の５’末端では、このＮＲＭの使
用が好ましくない。この陽イオン基は、Ｈ結合形成およびハイブリダイゼーションの干渉
を最小にする塩基上の位置、例えばもう一方の鎖の相補的塩基と相互作用する面から離れ
ている位置、例えばピリミジンの５’位またはプリンの７位に結合させるべきである。
【００６９】
（ｉｉｉ）末端における非リン酸結合。したがって、好ましいＮＲＭは、非リン酸結合
、例えば、切断に対してリン酸結合よりも大きな抵抗性を与える４原子の結合を含有する
。一例としては、３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−５’および３’ＣＨ２−ＮＨ−（
Ｏ＝）−ＣＨ２−５’が含まれる。
【００７０】
（ｉｖ）３’架橋チオリン酸塩および５’架橋チオリン酸塩。したがって、好ましいＮ
ＲＭはこれらの構造を含有し得る。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、逆方向結合、ａ−ヌクレオシド。したがって、他
の好ましいＮＲＭには、Ｌ−ヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシドから派生した２量体ヌ
クレオチド；２’−５’リン酸結合、非リン酸結合、および修飾リン酸結合（例えば、チ
オリン酸、ホスホラミデート、およびボロノホスフェート）；逆方向結合、例えば３’−
３’結合または５’−５’結合を有する２量体；糖の１’部位にα結合を有する単量体、
例えばα結合を有する本明細書に記載の構造が含まれる。
【００７１】
（ｖｉ）結合基。したがって、好ましいＮＲＭには、例えば、単量体に、例えば糖、塩
基、または骨格を介して結合される本明細書に記載の標的化部分または結合リガンドが含
まれる。これらに関しては、以下に、より詳細に論じる。
【００７２】
（ｖｉ）無塩基結合。したがって、好ましいＮＲＭには、無塩基単量体、例えば無塩基
単量体（例えば、ヌクレオチド塩基を含まない単量体）；芳香族または複素環式または芳
香族多環複素環式単量体が含まれ得る。
【００７３】
（ｖｉｉ）５’−ホスホネートおよび５’−リン酸塩プロドラック。したがって、好ま
しいＮＲＭには、好ましくは末端位置、例えば５’位に、リン酸基の１つまたは複数の原
子が保護基で誘導体化されている単量体を含有し、上記１つまたは複数の保護基は、対象
の体内にある成分、例えばカルボキシエステラーゼまたは対象の体内に存在している酵素
の作用の結果、除去される。例えば、その中で、カルボキシエステラーゼが、保護された
分子を切断し、その結果、チオ酸陰イオンの産生がもたらされ、このチオ酸陰イオンがリ
ン酸のＯに隣接する炭素を攻撃し、その結果保護のないリン酸塩の産生をもたらすリン酸
塩プロドラック。
【００７４】
１つまたは複数の異なったＮＲＭ修飾を、ｉＲＮＡ薬剤の中、または、ｉＲＮＡ薬剤の
配列の中に導入することができる。１つの配列中またはｉＲＮＡ薬剤中で１つのＮＲＭ修
飾を複数回用いることができる。
【００７５】
ＮＲＭ修飾には、末端にのみ配置できる一部のものも、いかなる位置にも配置できる他
のものも含めることができる。一部のＮＲＭ修飾は、ハイブリダイゼーションを抑制する
可能性があり、したがって、それらは末端領域のみで使用するのが好ましく、それらを切
断部位、または対象の配列もしくは遺伝子を標的とする配列、特にアンチセンス鎖上の切
断領域にて用いないことが好ましい。それらは、上記ｄｓ  ｉＲＮＡ薬剤の２つの鎖の間
で十分なハイブリダイゼーションが維持される場合に、センス鎖の任意の場所にて使用で
きる。一部の実施形態では、ＮＲＭが標的外のサイレンシングを最小にし得るので、ＮＲ
Ｍを切断部位またはセンス鎖の切断領域に配置するのが望ましい。
【００７６】
ほとんどの場合、ＮＲＭ修飾は、それらがセンス鎖に含まれるか、もしくはアンチセン
ス鎖に含まれるかに応じて異なって分配されるであろう。アンチセンス鎖に含まれる場合
には、エンドヌクレアーゼ切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣ媒介の切断を受け
る領域、例えば切断部位または切断領域に挿入されるべきでない（本願明細書に援用する
、エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、２００１年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．第１
５巻、１８８頁に記載されている）。標的の切断は、２０または２１ｎｔのアンチセンス
鎖のほぼ中央、すなわち上記アンチセンス鎖に相補的な標的ｍＲＮＡの最初のヌクレオチ
ドの上流のほぼ１０または１１ヌクレオチドで起こる。本明細書で使用される場合、切断
部位は、標的またはそれにハイブリダイズするｉＲＮＡ薬剤の鎖における、切断部位のい
ずれかの側のヌクレオチドを指す。切断領域は、いずれかの方向における、上記切断部位
の１、２、または３ヌクレオチド以内にあるヌクレオチドを意味する。
【００７７】
そのような修飾は、末端領域、例えばセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端位置、また
は上記末端の２、３、４、もしくは５番目の位置を含めた位置に導入することができる。
（テザーリガンド）
薬理学的特性を含めたｉＲＮＡ薬剤の特性は、リガンド、例えば、テザーリガンドを導
入することによって、影響を受け、調整され得る。
【００７８】
多種多様な構成要素、例えば、リガンドを、ｉＲＮＡ薬剤、例えば、リガンド結合単量
体サブユニットの担体に連結することができる。リガンド結合単量体サブユニットの場合
について以下にその例を説明するが、これは単に好適な例に過ぎず、同構成要素はｉＲＮ
Ａ薬剤のその他の点にも結合することができる。
【００７９】
好ましい部分は、干渉テザー（ｔｅｔｈｅｒ）を介して直接的または間接的に担体に、
好ましくは共有結合するリガンドである。好ましい実施形態では、このリガンドは干渉テ
ザーを介して担体に結合される。リガンド結合単量体が伸長する鎖に取り込まれるとき、
リガンドまたはテザーリガンドは、リガンド結合単量体上に存在し得る。いくつかの実施
形態では、このリガンドは、「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットが伸長する鎖に
取り込まれた後で、同「前駆体」リガンド結合単量体サブユニットに取り込まれる。例え
ば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２などのアミノ末端テザーなどを有する単量体は、伸長す
るセンスまたはアンチセンス鎖に取り込まれてよい。その後の操作において、すなわち、
前駆体単量体サブユニットが鎖に取り込まれた後で、求電子基、例えば、ペンタフルオロ
フェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、リガンドの求電子基と前駆体
リガンド結合単量体サブユニットテザーの末端求核基との結合によって、その後前駆体リ
ガンド結合単量体に結合され得る。
【００８０】
好ましい実施形態では、リガンドは、取り込まれたｉＲＮＡ薬剤の分布、標的化または
寿命を改変する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドを備
えていない種と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞種、細胞区画も
しくは器官区画などの区画、組織、器官または身体の領域に対する親和性を増強する。
【００８１】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性の特性を改善するこ
とができ、得られた天然もしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書で説明し
た単量体および／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマ
ー分子のヌクレアーゼ抵抗性も改善することができる。
【００８２】
一般的に、リガンドは、例えば、取り込みを高めるための治療調節剤、例えば、分布を
モニタリングするための診断用化合物もしくはレポーター群、架橋剤、ヌクレアーゼ抵抗
性を付与する部分および天然もしくは通常にはない核塩基を含むことができる。一般的な
例には、脂溶性分子、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇ
ｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲ
ニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン、炭水化
物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリ
ンまたはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的化分子、ポ
リカチオン、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣体が含まれる。
【００８３】
リガンドは、天然物質または組換えもしくは合成分子、例えば、合成ポリアミノ酸など
の合成ポリマーであり得る。ポリアミノ酸の例には、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−ア
スパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ
−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマ
ー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（
２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファ
ジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、ス
ペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチドポリアミン、ペプチド様ポリア
ミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン部分、例
えば、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはアルファヘ
リックスペプチドが含まれる。
【００８４】
リガンドにはまた、標的化化学基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、肝細胞
もしくは空腸細胞などの特異的細胞型に結合する抗体、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細
胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水
化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホン酸、ポリグルタミン
酸、ポリアスパラギン酸、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体が含まれ
る。
【００８５】
リガンドのその他の例には、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、
ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリ
ン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンド
ヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、脂溶性分子、例えば、コレステロール、コール酸、
アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール（例えば、
それらのエステルおよびエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、
Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０アルキル、例えば、１，３−ビス
−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ビス−Ｏ−（オクタデシル）グリセロール
）、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール
、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（
オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉ
ｄ）、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン）およびタンパク質またはペプチド結合
体（例えば、抗体、リポタンパク質、例えば、低密度リポタンパク質、アルブミン、例え
ば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、
ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル
、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収
促進剤（例えば、アスピリン、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、
ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール結
合体）、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋複合体、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰ
が含まれる。
【００８６】
リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小
繊維および／または中間径繊維を破壊することによって、細胞へのｉＲＮＡ薬剤の取り込
みを増加させることができる物質、例えば、薬剤であり得る。この薬剤は、例えば、タキ
ソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノ
リド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホラ
イドＡ、インダノシンまたはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
【００８７】
リガンドは、例えば、炎症応答を活性化することによって細胞内へのｉＲＮＡ薬剤の取
り込みを増加させることができる。このような効果を有するリガンドの例には、腫瘍壊死
因子アルファ（ＴＮＦアルファ）、インターロイキン−１ベータ、またはガンマインター
フェロンが含まれる。
【００８８】
一態様では、リガンドは脂質または脂質をベースにした分子である。このような脂質ま
たは脂質をベースにした分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ
）に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、肝臓の実質細
胞を含めた肝組織との結合体の分布を可能にする。ＨＳＡに結合できるその他の分子もリ
ガンドとして使用できる。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリン
を使用できる。脂質または脂質をベースにしたリガンドは、（ａ）結合体の分解に対する
抵抗性を増強し、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増強し、および／
または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することが
できる。
【００８９】
脂質をベースにしたリガンドは、標的組織に対する結合体の結合を調節するために、例
えば、制御するために使用され得る。例えば、ＨＳＡに一層強力に結合する脂質または脂
質をベースにしたリガンドは、腎臓を標的とする傾向が少なく、したがって、身体から排
出される傾向が低い。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質をベースにしたリガ
ンドは、結合体を腎臓に対する標的とするために使用することができる。
【００９０】
好ましい実施形態では、脂質をベースにしたリガンドはＨＳＡに結合する。これは、結
合体が好ましくは腎臓以外の組織に分布するような十分な親和性で同ＨＳＡに結合するこ
とが好ましい。しかしながら、この親和性はＨＳＡリガンドの結合が離れることできない
ほど強力ではないことが好ましい。
【００９１】
他の態様では、リガンドは、標的細胞によって、例えば増殖細胞によって取り込まれる
部分、例えば、ビタミンまたは栄養素である。これらは、例えば、悪性型または非悪性型
の、例えば、癌細胞の、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するために特に有
用である。ビタミンの例には、ビタミンＡ、ＥおよびＫが含まれる。その他のビタミンの
例は、ビタミンＢ群、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール
または癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンもしくは栄養素である。
【００９２】
他の態様では、リガンドは、細胞透過性薬剤、好ましくはヘリックス細胞透過性薬剤で
ある。この薬剤は両親媒性であることが好ましい。薬剤の例は、ｔａｔまたはアンテナペ
ディアなどのペプチドである。この薬剤がペプチドの場合、修飾可能であり、ペプチジル
模倣体、反転異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチドまたは偽ペプチド結合が含ま
れ、Ｄアミノ酸も使用できる。ヘリックス剤は、親油性相および疎油性相を有するアルフ
ァヘリックス剤であることが好ましい。
【００９３】
糖、例えば、ガラクトースおよび／またはそれらの類似体を取り込む標的化剤は特に有
用である。これらの薬剤は、特に、肝臓の実質細胞を標的とする。例えば、標的化部分は
、互いに約１５オングストロームの間隔がある複数の、好ましくは２個または３個のガラ
クトース部分を含み得る。あるいは、標的化部分は、ガラクトースに結合したグルコース
であるラクトース（例えば、３個のラクトース部分）であり得る。標的化部分はまた、Ｎ
−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミン、多価ラクトース、多価ガラクト
ース、多価マンノースまたは多価フコースであり得る。マンノースまたはマンノース−６
−リン酸標的化部分は、マクロファージ標的化に使用することができる。
（５’−リン酸修飾）
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ薬剤は、５’がリン酸化されているか、または５’プ
ライム末端にホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５’−リン酸修飾には、ＲＩＳ
Ｃ媒介遺伝子サイレンシングに適合したものが含まれる。適切な修飾には、５’−モノホ
スファート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−ジホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ
）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−トリホスファート（（ＨＯ）２（Ｏ）
Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャ
ップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−
（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａ
ｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（
ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モ
ノチオホスファート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モ
ノジチオホスファート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）
、５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄で置換され
たモノホスファート、ジホスファートおよびトリホスファートの任意の更なる組み合わせ
（例えば、５’−アルファ−チオトリホスファート、５’−ガンマ−チオトリホスファー
トなど）、５’−ホスホロアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（Ｎ
Ｈ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エ
チル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ
）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキル
エーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル、など、例えば、ＲＰ（
ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が含まれる。
【００９４】
センス鎖は、同センス鎖を不活性化し、活性型ＲＩＳＣの形成を阻止し、それによって
標的外効果を潜在的に減少させるために修飾され得る。これは、センス鎖の５’−リン酸
化を阻止する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで修飾すること
によって実現することができる（ニカネン（Ｎｙｋａｅｎｅｎ）ら、２００１年、「ＡＴ
Ｐ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｔｈｗ
ａｙ．」Ｃｅｌｌ、第１０７巻、３０９〜３２１頁を参照のこと）。リン酸化を阻止する
その他の修飾、例えば、Ｏ−ＭｅよりもＨによる５’−ＯＨの簡単な置換も使用され得る
。代替的に、大きな嵩高い基を５’−リン酸塩に添加して、ホスホジエステル結合に変更
してもよい。
（ｉＲＮＡ薬剤の細胞への輸送）
理論に結びつけることは望まないが、コレステロール結合ｉＲＮＡ薬剤とリポタンパク
質のある種の成分（例えば、コレステロール、コレステリルエステル、リン脂質）との間
の化学的類似性は、ｉＲＮＡ薬剤と血液中のリポタンパク質（例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ）
との結合および／またはｉＲＮＡ薬剤とコレステロールに親和性を有する細胞成分、例え
ば、コレステロール輸送経路の成分との相互作用を引き起こす可能性がある。リポタンパ
ク質ならびにその成分は、細胞によって、様々な能動的および受動的輸送機構によって、
例えば、限定はしないが、ＬＤＬ受容体結合ＬＤＬのエンドサイトーシス、酸化された、
もしくはその他の修飾をされたＬＤＬのスカベンジャー受容体Ａとの相互作用によるエン
ドサイトーシス、肝臓におけるＨＤＬコレステロールのスカベンジャー受容体Ｂ１の媒介
による取り込み、ピノサイトーシスまたはＡＢＣ（ＡＴＰ結合カセット）輸送タンパク質
、例えば、ＡＢＣ−Ａ１、ＡＢＣ−Ｇ１もしくはＡＢＣ−Ｇ４によるコレステロールの膜
通過輸送によって取り込まれ、処理される。したがって、コレステロール結合ｉＲＮＡ薬
剤は、このような輸送機構を有する細胞、例えば、肝臓の細胞による取り込みの促進を受
けることができた。このように、本発明は、このような成分（例えば、コレステロール）
の天然リガンドをｉＲＮＡ薬剤に結合させるか、またはこの成分（例えば、ＬＤＬ、ＨＤ
Ｌ）の天然リガンドと関連する、もしくは結合するｉＲＮＡ薬剤に化学的部分（例えば、
コレステロール）を結合させることによって、ある種の細胞表面成分、例えば、受容体を
発現する細胞にｉＲＮＡ薬剤を標的化させる証拠および一般的方法を提供する。
（４  その他の実施形態）
ＲＮＡ、例えば、ｉＲＮＡ薬剤は、インビボにおいて、例えば、細胞に送達された外来
ＤＮＡ鋳型から細胞内で産生され得る。例えば、このＤＮＡ鋳型は、ベクターに挿入され
、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、
局所投与によって（米国特許第５３２８４７０号）、または定位注射によって（例えば、
チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、第９１巻、３
０５４〜３０５７頁、１９９４年）対象に送達され得る。遺伝子治療ベクターの医薬調製
物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達担
体が包埋された徐放性マトリックスを含み得る。ＤＮＡ鋳型は、例えば、２個の転写単位
を含むことができ、一方はｉＲＮＡ薬剤の上鎖を含む転写物を生成し、他方はｉＲＮＡ薬
剤の下鎖を含む転写物を生成する。この鋳型が転写されたとき、ｉＲＮＡ薬剤が生成され
、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ薬剤断片に処理される。
（５  製剤）
本明細書で説明したｉＲＮＡは、対象に投与するために製剤化することができる。
【００９５】
説明を容易にするために、この項における製剤、組成物および方法は、ほとんどは無修
飾ｉＲＮＡ薬剤に関して論じる。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、そ
の他のｉＲＮＡ薬剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ薬剤で実施することができ、このような実施
は本発明の範囲内であることを理解されたい。
【００９６】
製剤化されたｉＲＮＡ薬剤組成物は、様々な状態をとることができる。いくつかの例で
は、この組成物は少なくとも部分的な結晶、均一な結晶、および／または無水物（例えば
、水分が８０、５０、３０、２０または１０％未満）である。他の例では、ｉＲＮＡ薬剤
は水相、例えば、水を含む溶液に含まれている。
【００９７】
水相または結晶組成物を、例えば、送達媒体、例えば、リポソーム（特に水相用）また
は粒子（例えば、結晶組成物に適し得る微粒子）に取り込むことができる。一般的に、ｉ
ＲＮＡ薬剤組成物は、企図した投与方法に適合する方法で製剤化される。
【００９８】
ｉＲＮＡ薬剤調製物は、他の薬剤、例えば、他の治療剤またはｉＲＮＡ薬剤を安定化す
る薬剤、例えば、ｉＲＮＰを形成するためにｉＲＮＡ薬剤と複合体化するタンパク質と、
組み合わせて、製剤化することができる。さらに他の薬剤には、キレート剤、例えば、Ｅ
ＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２＋などの２価陽イオンを除去するため）、塩、ＲＮアーゼ阻害剤
（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの特異性の広いＲＮアーゼ阻害剤）などが含まれる。
【００９９】
一実施形態では、ｉＲＮＡ薬剤調製物には、２個以上のｉＲＮＡ薬剤（類）、例えば、
同一遺伝子もしくは遺伝子の異なる対立遺伝子に関して、または異なる遺伝子に関してＲ
ＮＡｉを媒介することができる２個以上のｉＲＮＡが含まれる。このような調製物には、
少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個または１００個以上の異なるｉＲＮＡ薬
剤種を含めることができる。このようなｉＲＮＡ薬剤は、同数の異なる遺伝子に関してＲ
ＮＡｉを媒介することができる。
【０１００】
このような調製物中の２個以上のｉＲＮＡが同一遺伝子を標的とする場合、この標的配
列は重複も隣接もしていない標的配列を有すること可能で、あるいはこの標的配列は重複
していても隣接していてもよい。
（６  Ｂｒｃ−Ａｂｌ融合発現に関連した障害）
Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合物を標的とするｉＲＮＡ薬剤、例えば、本明細書で説明したｉＲＮ
Ａ薬剤は、対象、例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合遺伝子発現に関連した疾患または障害、例
えば、望ましくない細胞増殖もしくは癌、またはより具体的には白血病を発症しているヒ
ト又はその危険性のあるヒトを治療するために使用することができる。
【０１０１】
例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合ｍＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ薬剤は、望ましくない細胞
増殖に関連した障害、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ
）、または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）などの白血病を治療するために使用され得
る。この対象は、細胞増殖抑制性または細胞障害性の薬剤で現在治療されている対象、過
去に細胞増殖抑制性または細胞障害性の薬剤で治療されたことのある対象、または細胞増
殖抑制性または細胞障害性の薬剤での治療に適さない対象であることが可能である。
（７  治療方法および送達経路）
ｉＲＮＡ薬剤、例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合物を標的とするｉＲＮＡ薬剤を含む組成物
は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路には、クモ膜下、実
質、静脈内、経鼻、経口および眼内送達が含まれる。本発明のｉＲＮＡ薬剤を投与する好
ましい手段は、非経口投与によるものである。
【０１０２】
ｉＲＮＡ薬剤は、投与に適した医薬組成物に取り込むことができる。例えば、組成物は
、１種または複数種のｉＲＮＡ薬剤および薬学的に許容される担体を含むことができる。
本明細書では、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬品投与に適合した任意の
、およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤及び
吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性のある物質のためにこのような媒体およ
び作用物質を使用することは、当該技術分野では周知である。従来の媒体または作用物質
が活性化合物に不適合である場合を除いて、それらは組成物に使用されるものとする。補
充的な活性化合物もこの組成物に組み入れることができる。
【０１０３】
本発明の医薬品組成物は、局所治療または全身治療が望ましいかどうかに応じて、およ
び治療する部位に応じていくつかの方法で投与することが可能である。投与は、局所投与
（眼内、経鼻、経皮を含む）、経口投与又は非経口投与であり得る。非経口投与には、静
脈点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、またはクモ膜下腔内もしくは心室内投与が含
まれる。
【０１０４】
送達の経路は、患者の障害に応じて変更され得る。一般的に、本発明のｉＲＮＡの送達
は、対象への全身送達を実現するために実施される。これを実現する好ましい手段は、非
経口投与による。
【０１０５】
非経口投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤およびその他の適切な添加物も含有できる滅菌
水性溶液が含まれる。静脈内での使用では、溶質の総濃度は、調製物を等張にするために
制御されるべきである。
【０１０６】
投与は、対象によって提供され得るか、または例えば治療奉仕者のような別の人によっ
て提供され得る。治療奉仕者は、人に治療を提供することに関与する任意の存在、例えば
、病院、ホスピス、診療所、外来患者向け診療所で医療に従事する人、例えば、医者、看
護師もしくはその他の専門家などの医療従事者、または配偶者または親などの保護者であ
り得る。投薬は、測定された用量で、または計測された用量を送達する分配器で提供され
得る。
【０１０７】
「治療有効量」という用語は、望ましい生理学的応答をもたらすために、治療する対象
において所望するレベルの薬剤を提供するのに必要な、組成物中に存在する量のことであ
る。
【０１０８】
「生理学的有効量」という用語は、所望とする緩和または治療的効果を与えるために対
象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、その担体が肺に著しく有害な毒性効果を与
えず肺に取り込まれることが可能であることを意味する。
【０１０９】
「共投与」という用語は、２種以上の薬剤、特に２種以上のｉＲＮＡ薬剤を対象に投与
することである。薬剤は、単一の医薬組成物に含有され、同時に投与され得るか、または
薬剤は別々の製剤に含有され、順番に対象に投与され得る。２種の薬剤が同時に対象にて
検出されることができる限り、２種の薬剤は共投与されたと言える。
【０１１０】
担体として有用な医薬賦形剤の種類には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの安定化
剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの賦形剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩
化ナトリウムなどの塩などがある。これらの担体は、結晶形であっても、アモルファス形
であってもよく、２つの混合物であってもよい。
【０１１１】
特に有用である賦形剤には、適合性のある炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはそ
れらの組合せが含まれる。適切な炭水化物には、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボ
ースなどの単糖類、ラクトース、トレハロースなどの二糖類、２−ヒドロキシプロピル−
β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン、およびラフィノース、マルトデキス
トリン、デキストランなどの多糖類、マンニトール、キシリトールなどのアルジトール類
が含まれる。好ましい炭水化物群には、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マル
トデキストリンおよびマンニトールが含まれる。適切なポリペプチドには、アスパルテー
ムが含まれる。アミノ酸には、アラニンおよびグリシンが含まれ、グリシンが好ましい。
【０１１２】
適切なＰＨ調整剤または緩衝剤には、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム
などの有機酸および塩基から調製された有機塩が含まれ、クエン酸ナトリウムが好ましい
。
【０１１３】
投与量。ｉＲＮＡ薬剤は、体重１ｋｇ当たり約７５ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり
約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５
、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇ未満の単位用量で、および
体重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ薬剤２００ｎｍｏｌ未満（例えば、約４．４×１０１６コピー
）の単位用量で、または体重１ｋｇ当たりｉＲＮＡ薬剤１５００、７５０、３００、１５
０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．
００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満の単位用量で投
与され得る。例えば、この単位用量は、注射（例えば、静脈内もしくは筋肉内注射、クモ
膜下注射、または臓器への直接注射）によって、吸入投与、または局所塗布によって投与
され得る。
【０１１４】
臓器へ直接（例えば、肝臓に直接）ｉＲＮＡ薬剤を送達することは、臓器当たり約０．
００００１ｍｇ〜約３ｍｇ、または好ましくは臓器当たり約０．０００１〜約０．００１
ｍｇ、臓器当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、眼当たり約０．１〜３．０ｍｇまたは臓器当
たり約０．３〜３．０ｍｇの程度の投与量であり得る。
【０１１５】
投与量は、疾患または障害を治療または予防するのに有効な量であり得る。
一実施形態では、単位用量を１日１回より少ない頻度で、例えば、２日、４日、８日ま
たは３０日毎に１回より少ない頻度で投与する。他の実施形態では、単位用量は一定頻度
（例えば、規則正しい頻度）では投与されない。例えば、単位用量を１回で投与すること
が可能である。ｉＲＮＡ薬剤が媒介するサイレンシングは、ｉＲＮＡ薬剤組成物を投与し
た後、数日間維持され得るので、多くの場合、１日１回より少ない頻度で、場合によって
は全治量期間中１回のみ組成物を投与することが可能である。
【０１１６】
一実施形態では、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ薬剤、またはｓｉＲＮＡ薬剤（例えば、前駆
体、例えば、ｓｉＲＮＡ薬剤中に処理されることができるより大きなｉＲＮＡ薬剤、また
はｉＲＮＡ薬剤、例えば、２本鎖ｉＲＮＡ薬剤、もしくはｓｉＲＮＡ薬剤、もしくはそれ
らの前駆体をコードするＤＮＡ）の初回量および１回または複数の維持用量が対象に投与
される。一回又は複数回の維持用量は、一般的に初回量よりも少なく、例えば、初回量の
２分の１少ない。維持治療計画は、１日当たり体重１ｋｇに対して０．０１〜７５ｍｇの
範囲、例えば、１日当たり体重１ｋｇに対して７０、６０、５０、４０、３０、２０、１
０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または
０．０００５ｍｇの一回又は複数回の用量で対象を治療することを含み得る。維持用量は
、５、１０または３０日毎に１回以下投与することが好ましい。さらに、治療計画は、特
定の疾患の性質、重症度および患者の全体的状態に応じて変化し得る期間の間、維持され
得る。好ましい実施形態では、投与量は１日１回以下、例えば、２４、３６、４８時間以
上に１回以下、例えば、５日または８日毎に１回以下にて送達され得る。処置後、患者の
状態の変化および疾患状態の徴候の軽減をモニタリングすることができる。化合物の投与
量は、患者が現在の用量レベルに有意に応答しない場合増加させることができ、あるいは
疾患状態の徴候の軽減が認められた場合、疾患状態が消失した場合、または望ましくない
副作用が認められた場合、用量を減少させることができる。
【０１１７】
効果的な用量は、特定の環境下で所望するように、または適切だと考えられるように、
単回投与で、または２回以上の投与で投与することができる。反復注入又は頻繁な注入を
促進することが望ましい場合、送達装置、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば、
静脈内、腹腔内、嚢内または関節包内）またはリザーバを埋め込むことが適切であり得る
。
【０１１８】
処理が成功した後、疾患状態の再発を防ぐために、本発明の化合物を体重１ｋｇ当たり
０．００１ｇ〜１００ｇの範囲の維持用量で投与する維持治療を患者に受けさせることが
望ましい（米国特許第６１０７０９４号）。
【０１１９】
ｉＲＮＡ薬剤組成物の濃度は、障害を治療もしくは予防するのに有効であるか、または
ヒトの生理学的状態を調節するために十分な量である。投与するｉＲＮＡの薬剤の濃度ま
たは量は、薬剤について測定されたパラメータ、および経鼻、頬側または肺投与などの投
与方法に依存される。例えば、経鼻用製剤は、鼻孔の刺激または灼熱感を回避するために
、いくつかの成分をはるかに低い濃度にしなければならない傾向がある。適切な経鼻用製
剤を提供するために、経口用製剤を１０〜１００倍希釈することが時として望ましい。
【０１２０】
非限定的ではあるが、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療法、対象の一般的健康状
態および／または年齢、その他の既存の疾患を含めたある種の因子が、対象を効果的に治
療するために必要な投与量に影響を及ぼし得る。治療に使用するｓｉＲＮＡなどのｉＲＮ
Ａ薬剤の効果的投与量は、特定の治療の期間中、増加または減少し得ることも理解された
い。投与量の変化は、診断試験法の結果から得られ、明らかとなり得る。例えば、ｉＲＮ
Ａ薬剤組成物投与後に対象をモニタリングすることができる。モニタリングからの情報に
基づいて、ｉＲＮＡ薬剤組成物の追加量を投与することができる。
【０１２１】
投薬は、数日から数ヶ月続く治療期間中、または全治するまで、もしくは疾患状態の消
失が実現するまで、治療する疾患状態の重症度および応答性に左右される。最適な投薬計
画は、患者の身体における薬剤蓄積の測定によって作製することができる。当業者であれ
ば、最適な投与量、投薬方法および反復率を容易に決定することができるだろう。最適な
投与量は、個々の化合物の相対的能力に応じて変更可能であり、前述したようにインビト
ロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが発見されたＥＣ５０に基づいて
一般的に判断することができる。
【０１２２】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、それらはさらに限定するもので
はない。
【実施例】
【０１２３】
試薬の入手先
試薬の入手先が本明細書に具体的に挙げられていない場合、このような試薬は、分子生
物学用試薬の任意の供給元から、分子生物学での適用に標準的な量／純度で入手すること
ができる。
【０１２４】
実施例１：ｓｉＲＮＡ合成
ｓｉＲＮＡ合成
１本鎖ＲＮＡは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９合成機（アプライドバイオシステムズ、
アプレラドイチュランド社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ  
Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ）、［ドイツ国、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａ
ｄｔ）所在］および固相担体として微細孔性ガラス（ＣＰＧ、５００Å、グレンリサーチ
社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅｒａｃｈ）、［米国バージニア州スターリング（Ｓｔａｒｌｉｎ
ｇ）所在］）を使用して、１μｍｏｌｅのスケールで固相合成によって作製された。ＲＮ
Ａおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡは、それぞれ対応するホスホラ
ミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを使用して固相合成によって作製され
た（プロリゴバイオケミ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、［ドイ
ツ国、ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ）所在］）。これらの構成単位を、「Ｃｕｒｒｅｎｔ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、ボカ
ージュ  エス．エル．（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．）ら（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ
＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．［アメリカ合衆国ニューヨーク］に記載されたような標準的ヌ
クレオシドホスホラミダイト化学物質を使用してオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選
択部位に取り込ませた。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液をアセトニトリル
（１％）に溶解したボカージュ試薬（クルアケム社（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ  Ｌｔｄ）［英
国グラスゴー（Ｇｌａｓｇｏｗ）所在］）の溶液と置換することによって導入された。他
の付随する試薬は、マリンクロットベーカー社（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ
）［ドイツ国、グリサイム（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ）所在］から入手した。
【０１２５】
粗オリゴリボヌクレオチドの陰イオン交換ＨＰＬＣによる脱保護および精製は、確立さ
れた方法に従って実施された。収率および濃度は、分光光度計（ＤＵ  ６４０Ｂ、ベック
マンコールター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ）、［ドイツ国、アンタ
ーシュリースハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｉｅβｈｅｉｍ）所在］）を使用して、波長２
６０ｎｍでそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって測定した。２本鎖ＲＮＡは、アニ
ーリング緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１００ｍＭの塩化ナトリウ
ム）中において相補鎖の等モル溶液を混合し、８５〜９０℃の水浴中で３分間加熱し、３
〜４時間かけて室温まで冷却することによって作製した。精製したＲＮＡ溶液を使用する
まで−２０℃で保存した。
【０１２６】
実施例２：Ｂｃｒ−Ａｂｌ切断点変種を発現する細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌ発現の阻
害
核酸配列は、標準的名称、具体的には表２の略語を使用して以下に表した。
【０１２７】
【表２】
2011201927.tif 000004
【０１２８】
【表３】
2011201927.tif 000005
表３に、合成されたＢｃｒ−Ａｂｌ融合体変種Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２、Ｂｃｒ−
Ａｂｌ−ｅ１３ａ２およびＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１ａ２に特異的なｓｉＲＮＡの核酸配列を
挙げる。
【０１２９】
Ｂｃｒ−ＡｂｌｍＲＮＡのＢｃｒおよびＡｂｌ配列の正確な融合部位は、白血病特異的
ヌクレオチド配列を示す。疾患特異的タンパク質をコードするこのような融合転写物は、
腫瘍特異的ＲＮＡｉ法の理想的な標的である。本研究の目的は、最適なインビトロＢｃｒ
−Ａｂｌ  ＲＮＡｉ法を開発することであった。したがって、いくつかの化学合成非対称
ｓｉＲＮＡ、ならびに臨床的に関係のあるＢｃｒ−Ａｂｌ転写物変種（ｅ１４ａ２、ｅ１
３ａ２またはｅ１ａ２）の融合部位を標的とする安定発現ｓｈＲＮＡを評価した。ＲＮＡ
ｉ効率は、主にＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルのウェスタンブロット分析および処理細
胞の白血病増殖に対する影響の評価によって測定した。
【０１３０】
この研究の結果は、化学合成された２１ｎｔ（センス鎖）−２３ｎｔ（アンチセンス鎖
）ｓｉＲＮＡで２４時間間隔で繰り返しトランスフェクションすると、Ｂｃｒ−Ａｂｌタ
ンパク質の下方制御および細胞死の誘導の両方においてより効果的であった。３２Ｄｐ２
１０／ｅ１４ａ２をＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２特異的ｓｉＲＮＡであるＢＡＦ７で１回
処理すると、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの著しい減少が生じ、その後３２Ｄｐ２１
０／ｅ１４ａ２細胞の生存率がエレクトロポレーション対照細胞（ＥＰＣ、１００％）と
比較して約５９％に減少した。対照的に、ＢＡＦ７で細胞を４回連続的に処理すると、Ｂ
ｃｒ−Ａｂｌタンパク質の量が検出限界まで減少し、生存能力の実質的な損失が引き起こ
された。最後の処理の４８時間後の総細胞数の測定によって同様の結論に達した。ミスマ
ッチ対照ｓｉＲＮＡ（ＢＡＦ８）でトランスフェクションした細胞の数は、４８時間以内
に２．５Ｍｉｏの細胞から２５Ｍｉｏの細胞を上回るまで増加した一方で、ＢＡＦ７の１
回トランスフェクションは増殖を約４０％減少させるのに十分で、Ｂｃｒ−Ａｂｌ特異的
ＢＡＦ７ｓｉＲＮＡで４回処理を繰り返すと、細胞数増加の９０％以上の阻害が生じた。
【０１３１】
曝露を延長するとｓｉＲＮＡの効率が著しく増加するという所見は、Ｂｃｒ−Ａｂｌの
長い半減期によって少なくとも部分的に説明され得る。例えば、スピラー（Ｓｐｉｌｌｅ
ｒ）およびその共同研究者（スピラー  ディージー（Ｓｐｉｌｌｅｒ  ＤＧ）ら、Ａｎｔ
ｉｓｅｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、１９９８年、第８巻２８
１頁）は、ヒトＫＹＯ−１細胞におけるｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１３ａ２）の半減期
が４８時間を上回ることを測定した。標的タンパク質の半減期は、従来のアンチセンス、
（ａｓ）−オリゴデスオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の効果に重要であることが示された
。ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（Ｅ１３ａ２）タンパク質レベルは、ｍＲＮＡレベルが早期の
時点で実質的に減少していても、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１３ａ２ｍＲＮＡを標的とするａｓ
−ＯＤＮでの処理によって影響を受けなかった。第２に、哺乳類細胞で実現されたｓｉＲ
ＮＡの標的遺伝子下方制御効果は、一般的に一時的である（概説についてはミタール  ブ
イ（Ｍｉｔｔａｌ  Ｖ）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．、２００４年、第５巻、３５５
頁）。したがって、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルは、この研究で使用した細胞株をｓ
ｉＲＮＡで最後に処理してから４８時間以内に回復した。しかしながら、本研究の結果は
、化学合成ｓｉＲＮＡによって２４時間間隔で繰り返し処理することによって、または安
定なｓｈＲＮＡ発現によって、この限界を克服できることを示している。この最適な方法
によって、実現したＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの減少は８６％までであり、９６％
までの生存率の低下を伴っていた。
【０１３２】
Ｂｃｒ−ＡｂｌのＲＮＡｉ依存性不活性化がＢｃｒ−Ａｂｌ発現細胞の臨床治療薬への
感作を導くかどうかを評価するために、３２Ｄｐ２１０／ｅ１４ａ２細胞をａｎｔｉ−Ｂ
ｃｒ−ＡｂｌｓｉＲＮＡで繰り返し処理した後、イマチニブおよびγ線照射に対する感受
性を測定した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ発現への影響によって、γ線照射およびイマチニブメシレ
ートの両方に対する細胞の感受性を高めることが可能であることを示すことができた。
【０１３３】
５０％細胞死滅を引き起こすγ線照射線量は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ相同体ｓｉＲＮＡで処理
された３２Ｄｐ２１０／ｅ１４ａ２細胞では２．５Ｇｙであったが、一方、ミスマッチ対
照で処理された細胞は約２．５倍高い用量（６Ｇｙ）に耐性であった。Ｂｃｒ−Ａｂｌタ
ンパク質の量によっても、イマチニブメシレートに対するこれらの細胞の感受性は測定さ
れた。ｓｉＲＮＡでＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルを減少させた後では、３２Ｄｐ２１
０／ｅ１４ａ２細胞において、対照と比較して、イマチニブメシレートのＩＣ５０の３．
４倍の減少が認められた。この現象はまた、ヒトＭ０７ｐ２１０／ｅ１４ａ２細胞で認め
られた。イマチニブメシレート０．０５μＭはＢＡＦ７処理細胞においてアポトーシスの
著しい誘導をもたらし、一方同濃度ではエレクトロポレーション対照細胞にはそれほど影
響を及ぼさなかった。
【０１３４】
これらの結果は、Ｋ５６２細胞においてイマチニブメシレートとＢｃｒ−Ａｂｌ特異的
ｓｉＲＮＡ薬剤とで一緒に処理しても、アポトーシスの誘導にそれ以上の効果は認められ
なかったという以前に公表されたデータ（非特許文献１０）のいくつかと矛盾している。
前述の非特許文献１０によって使用されたＫ５６２細胞は、イマチニブメシレート単独で
４８時間処理した後８％しかアポトーシスを受けなかったという事実から明らかなように
、イマチニブメシレートに対して非常に高いレベルの耐性を示した。このような高耐性細
胞系は、その他の潜在的阻害剤による他の可能性のある効果を評価するために不十分であ
る。対照的に、我々の発見を支持する結果が、チェン（Ｃｈｅｎ）およびその共同研究者
によって最近発行され（非特許文献１６）、ＲＮＡ干渉による融合タンパク質ＴＥＬ−Ｐ
ＤＧＦβＲの下方制御は、イマチニブメシレートおよびラパマイシンについてＴＥＬ−Ｐ
ＤＧＦβＲ発現細胞を感作し、したがって薬剤耐性に拮抗することが示された。切断点特
異的ｓｉＲＮＡはいずれかの側の切断点と重複しなければならないので、約１０個の異な
る潜在的ｓｉＲＮＡ配列のうち限られた数のみを融合配列のＲＮＡｉ特異的サイレンシン
グ用に選択することができる。
【０１３５】
さらに、ｓｉＲＮＡ処理は、イマチニブ耐性を与えられたＢｃｒ−Ａｂｌ変種Ｈ３９６
Ｐを発現する細胞においてイマチニブ感受性を回復した。イマチニブに初応答後、再発し
た白血病患者で見いだされたイマチニブ耐性を引き起こすＢｃｒ−Ａｂｌ変種の２種は、
Ｂｃｒ−Ａｂｌ−Ｔ３１５ＩおよびＢｃｒ−Ａｂｌ−Ｈ３９６Ｐである。これらのタンパ
ク質は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｗｔ）と比較して、キナーゼドメインにおける１個のアミノ酸
変化を示し、イマチニブに接近しにくくなっている。したがって、３２Ｄ細胞におけるＢ
ｃｒ−Ａｂｌ−Ｔ３１５Ｉの発現は、イマチニブメシレートに対する完全な耐性をもたら
し、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−Ｈ３９６Ｐの発現は、３２Ｄｐ２１０−ｗｔと比較したとき、イマ
チニブメシレートに対してそれぞれの細胞の感受性を約４．７倍低下させた。ｓｉＲＮＡ
処理によって、３種の細胞株すべてにおいてＢｃｒ−Ａｂｌの著しい下方制御が引き起こ
された。ｓｉＲＮＡ薬剤を使用するこのＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの下方制御は、
イマチニブメシレートに対する３２Ｄｐ２１０ｗｔでは３．４倍の感作および３２Ｄｐ２
１０−Ｈ３９６Ｐでは４倍の感作を引き起こした。対照的に、イマチニブメシレートに対
する耐性が高い３２Ｄｐ２１０−Ｔ３１５Ｉ細胞のイマチニブメシレート感受性は、おそ
らく、非特許文献１０によって観察されたような著しい効果の欠如について前記と同様の
理由のため、ｓｉＲＮＡ処置によってあまり影響を受けなかった。さらに、コービン（Ｃ
ｏｒｂｉｎ）らは、Ｔ３１５Ｉ変異Ａｂｌキナーゼドメインは、ＷＴキナーゼのＩＣ５０
値よりも２００倍高いイマチニブ濃度でもあまり阻害を示さなかったことを示し、野生型
タンパク質に対してＡＴＰ親和性が２倍増加していることも示した（コービン  エイ  エ
ス（Ｃｏｒｂｉｎ  ＡＳ）、ブフダンガー  イー（Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ  Ｅ）、ヒュー
レ  ピー（Ｆｕｒｅｔ  Ｐ）、ドラカー  ビー  ジェー（Ｄｒｕｋｅｒ  ＢＪ）、「Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｙ  ＳＴＩ５７１」、Ｊ  Ｂｉｏ
ｌ  Ｃｈｅｍ、２００１年、第２７７巻、３２２１４〜９頁）。前述：３２Ｄｐ２１０Ｔ
３１５Ｉにおけるイマチニブ処理の効果自体は、ｓｉＲＮＡ処理によって媒介されるイマ
チニブ感受性の増加を観察するには小さすぎる。
【０１３６】
生理学的なｃ−ＡｂｌおよびＢｃｒ遺伝子発現の同時下方制御を導く任意の標的外への
ｓｉＲＮＡ効果は、本研究では除外された。ＲＮＡｉ効果の高い特異性は、ｓｉＲＮＡ配
列に１カ所変異があってもｓｉＲＮＡ効果の著しい損失が引き起こされたという事実によ
って確認された。また、切断点変種ｅ１３ａ２およびｅ１４ａ２を標的とするｓｉＲＮＡ
は、それぞれの標的ＲＮＡだけでなく、同じａ２部分を有するその他の切断点変種にも影
響を及ぼした。このことは、転座から生じる融合遺伝子がＲＮＡｉの特異的な標的となる
という見解を強く支持する。それでも、ｓｉＲＮＡ分子の効果を予測することは困難と思
われる。本研究で使用した様々なｓｉＲＮＡの標的領域は、かなりの重複を示した。さら
に、ｓｉＲＮＡ効果は大きく変化した。例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１３ａ２特異的ｓｉ
ＲＮＡ  ＢＡＦ３の標的配列は、ＢＡＦ１５と比較して融合部位のＡｂｌ部分のわずか２
ｎｔ下流に移動しただけである。それにもかかわらず、ＢＡＦ１５と対照的に、ＢＡＦ３
には完全に効果がなかった。同様のことがＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１ａ２特異的ｓｉＲＮＡ  
ＢＡＦ２２およびＢＡＦ２４についても言えた。ＢＡＦ２４の配列は、ＢＡＦ２２と非常
に類似しており、融合転写物のＡｂｌ領域にわずか３ｎｔ移動していただけである。ＢＡ
Ｆ２２は、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１ａ２遺伝子発現を積極的にサイレンシングしたが、ＢＡ
Ｆ２４はしなかった。結局、これらの結果は、癌遺伝子融合タンパク質の切断点部位を標
的とするｓｉＲＮＡの効果は予測できないことを示している。
【０１３７】
【表４】
2011201927.tif 000006
細胞は、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ／１０
％ＦＣＳで培養した。初代ＣＤ３４陽性細胞は、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマ
イシン、２０％ＦＣＳ、組換えヒトＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＧ−ＣＳＦ（２０
ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＦＬＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ培地で増殖さ
せた。
【０１３８】
タンパク質試験：最後のｓｉＲＮＡ処理の約２４時間後、または前述のようなｐＳＵＰ
ＥＲ  ｓｉＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクションした約９６時間後、ウェスタンブ
ロット分析を実施した（ゲッツ  エイダブリュ（Ｇｏｅｔｚ  ＡＷ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  
Ｒｅｓ．、２００１年、第６１巻、７６３５頁）。
【０１３９】
生存試験：最後のｓｉＲＮＡ処理後、細胞を９６ウェルプレートに接種し、さらに約４
８時間培養した。次に、細胞生存率を前述のようにＭＴＴ試験によって測定した（ファン
デルキップ  エイチ（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｕｉｐ  Ｈ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００１年、第
９８巻、１５３２頁）。
【０１４０】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション：エレクトロポレーションを使用して、ｓｉＲＮＡを
マウス細胞株３２Ｄｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２、−ｅ１３ａ２、３２Ｄｐ１９
０Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１ａ２およびヒト白血病細胞株ＭＥＧ−０１にトランスフェクショ
ンした。細胞密度は、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２．５〜５×１０６／ｍｌに調整した。
この細胞懸濁液８００μｌを４ｍｍエレクトロポレーションキュベット内でｓｉＲＮＡと
混合した。細胞は、イージージェクト（ＥａｓｙＪｅｃｔ）エレクトロポレータ（ペクラ
ボ社（ｐｅｑｌａｂ）［ドイツ国、エアランゲン（ｅｒｌａｎｇｅｎ）所在］によって、
シングルパルス法（２５０Ｖ、１８００μＦ、８）を使用してエレクトロポレーションし
た。この処理を、指示したように２４時間間隔で繰り返した。
【０１４１】
使用した細胞株すべてが、Ｂｃｒ−Ａｂｌの活性に厳密な依存性を示す。３２Ｄｐ２１
０Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２、−ｅ１３ａ２および３２Ｄｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ
１ａ２では、Ｂｃｒ−Ａｂｌの阻害は培地に外来性増殖因子を添加することによって補う
ことができる。したがって、組換えマウスＩＬ−３（１ｎｇ／ｍｌ）をこれらの細胞株の
ｓｉＲＮＡ処理中に増殖培地に添加した。最後のｓｉＲＮＡ処理の後、細胞を洗浄し、様
々な試験操作（ウェスタンブロット／ＭＴＴ）を開始する前に因子を除去した。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡ分子をヒトＫ５６２細胞にトランスフェクションするために、リポフェクタ
ミンＴＭ２０００（インビトロゲン社（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［カールスルーエ（Ｋａ
ｒｌｓｒｕｈｅ）所在］）を使用した。１．５Ｍｉｏの細胞を６ウェルプレートのＲＰＭ
Ｉ／１０％ＦＣＳ  ｗ／ｏ抗生物質１．５ｍｌに接種した。各ウェルに、ＯＰＴＩ−ＭＥ
Ｍ  Ｉ還元血清培地（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）［カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）
所在］）に溶かしたｓｉＲＮＡ８．４μｇおよびリポフェクタミン２１μｌを含有するト
ランスフェクション溶液５００μｌを調製した。細胞をトランスフェクション溶液と共に
５時間インキュベートし、次いでこの培地をペニシリン／ストレプトマイシンを補充した
ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳと交換した。数回処理する際、細胞数は処理して約２４時間後に
計数し、１Ｍｉｏ／ｍｌまで希釈し、６ウェルプレートに再度接種した（ウェル当たり細
胞懸濁液１．５ｍｌ）。次いで、トランスフェクションは前日のように正確に繰り返した
。
【０１４３】
これらのヒトＢｃｒ−Ａｂｌ融合切断点変種のそれぞれをサイレンシングするｓｉＲＮ
Ａの効果を研究するために、ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１４ａ２）、ｐ２１０Ｂｃｒ−
Ａｂｌ（ｅ１３ａ２）またはｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１ａ２）のいずれかを発現する
３種の３２Ｄマウス造血細胞株を使用した。さらに、実験はヒトＰｈ＋白血病細胞（Ｋ５
６２、ＭＥＧ−０１）でも実施した。使用したｓｉＲＮＡはすべて、それぞれのＢｃｒ−
Ａｂｌ  ｍＲＮＡのＢｃｒおよびＡｂｌ配列の切断点に特異的である。ＲＮＡｉ−効果は
、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの分析によって、およびＭＴＴ生存率試験を使用して
生物学的効果をモニタリングすることによって試験した。
【０１４４】
ＲＮＡ干渉に最適な条件を決定するために、２４時間間隔で１回から４回ｓｉＲＮＡ処
理を繰り返した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２特異的ｓｉＲＮＡであるＢＡＦ７で３２Ｄ
ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１４ａ２）を１回処理すると、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レ
ベルの著しい減少が生じた。しかしながら、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルは、処理前
のレベルに迅速に回復した。
【０１４５】
短時間にもかかわらず、対照細胞（ＥＰＣ、１００％）に対して約５９％まで細胞の生
存率を減少させるのに活性はまだ十分であった。Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質の下方制御お
よび細胞死の誘導の両方のために、繰り返し処理するとより効果的であった。細胞を４回
ＢＡＦ−７で処理すると、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質のほとんど完全な消失が生じ、生存
能力の実質的に完全な損失が引き起こされた。ＢＡＦ７で４回処理した細胞に残存する生
存率レベルは、ＭＴＴ試験法で測定すると、対照細胞のレベルの約２．５％以下であった
。最後の処理の４８時間後の細胞数を生物学的効果の評価のために使用したとき、同じ結
果が得られた。モック（ｍｏｃｋ）で処理した細胞およびミスマッチｓｉＲＮＡで処理し
た細胞の両方とも、４８時間以内に依然として細胞数が２．５Ｍｉｏ細胞から２５Ｍｉｏ
細胞に増加した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２（ＢＡＦ７）に相同なｓｉＲＮＡを１回ト
ランスフェクションした細胞では、増殖が約４０％減少した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ特異的ＢＡ
Ｆ７ｓｉＲＮＡで２回または４回繰り返し処理すると、Ｂｃｒ−Ａｂｌ依存性細胞増殖が
より効果的に減少し、増殖阻害は９０％を上回った。さらに、これらの３２Ｄｐ２１０Ｂ
ｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１４ａ２）細胞では、ｓｉＲＮＡ配列の１点の変異によりサイレンシン
グ効果を損なうことが可能であることを示すことができた。ＢＡＦ７と比較して１個のミ
スマッチがあるｓｉＲＮＡ分子（ＢＡＦ１）を使用した。ＢＡＦ１で処理すると、３２Ｄ
ｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１４ａ２）細胞における切断点特異的ｓｉＲＮＡ（ＢＡＦ７
）による処理と比較してＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの下方制御効果が低かった（図
２Ａ）。ＢＡＦ１の効果の低さは、ＢＡＦ１の生物学的効果を評価したとき、さらに明ら
かになった。ＢＡＦ１で４回処理した細胞でも、生存率はＥＰＣに関して５２％と中程度
の減少しか示されなかった。この大きさは、最適ｓｉＲＮＡによる処理１回の効果に匹敵
した。
【０１４６】
ｓｉＲＮＡ処理を延長すると、ヒトＫ５６２細胞におけるＢＡＦ７の生物学的効果の研
究によってＲＮＡ干渉に対して一層効果的である、という所見が確認された。Ｋ５６２細
胞は、本発明の発明者らのエレクトロポレーション法に対してより感受性が高いことが証
明されたので、リポフェクタミン２０００を使用して細胞をトランスフェクションした。
ｓｉＲＮＡで１回処理して４８時間後、細胞は最小限の増殖の低減しか示さなかった。対
照的に、２４時間間隔でｓｉＲＮＡでリポフェクションを３回実施した後の４８時間後、
Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２  ｍＲＮＡ（ＢＡＦ７）に相同なｓｉＲＮＡで処理した細胞
において、生存率は４５％まで著しく減少した。
【０１４７】
３種の主要なＢｃｒ−Ａｂｌ癌遺伝子変種、−ｅ１４ａ２、−ｅ１３ａ２および−ｅ１
ａ２のすべてがＲＮＡ干渉により標的化され得る。ＣＭＬに関係する第２の主要なＢｃｒ
−Ａｂｌ融合遺伝子Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１３ａ２を阻害するのに効果的なｓｉＲＮＡを同
定するために、Ｂｃｒ−Ａｂ１３ａ２  ｍＲＮＡ切断点の様々な配列を標的とする４種の
ｓｉＲＮＡ（ＢＡＦ３、ＢＡＦ１５、ＢＡＦ１７、ＢＡＦ１９）で３２Ｄｐ２１０Ｂｃｒ
−Ａｂｌ（ｅ１３ａ２）細胞を処理した。対照として、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２融合
配列（ＢＡＦ９）に指向するｓｉＲＮＡを使用した。ＢＡＦ３、ＢＡＦ１５、ＢＡＦ１７
およびＢＡＦ１９は、Ｂｃｒ−Ａｂｌの下方制御に非常に異なる効果を示した。ｓｉＲＮ
Ａ  ＢＡＦ１５およびＢＡＦ１９を繰り返しエレクトロポレーションすると、Ｂｃｒ−Ａ
ｂｌタンパク質レベルの効果的な下方制御が引き起こされた。標的配列がかなり重複して
いるにもかかわらず、ＢＡＦ１７およびＢＡＦ３はＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルに影
響を全く与えなかった。ＭＴＴ−生存率試験によってこれらのｓｉＲＮＡの生物学的効果
を研究すると、同等の結果が得られた。効果的なｓｉＲＮＡ  ＢＡＦ１５およびＢＡＦ１
９で３２Ｄｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１３ａ２）細胞を３回処理すると、生存能力がほ
とんど完全に損失した。３回目の処理の４８時間後、生存率は対照（ＥＰＣ）の約１０％
（ＢＡＦ１５）および約１４％（ＢＡＦ１９）しかなかった。したがって、Ｂｃｒ−Ａｂ
ｌタンパク質レベルの下方制御に効果がないｓｉＲＮＡであるＢＡＦ３およびＢＡＦ１７
はまた、細胞の生存率にも影響を及ぼさなかった。同じ方法を使用して、ｓｉＲＮＡ  Ｂ
ＡＦ１９はＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１３ａ２  ＲＮＡを発現するヒト巨核球性ＣＭＬ細胞株、
ＭＥＧ−０１細胞株におけるＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１３ａ２発現を効果的にサイレンシング
した。Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｅ１３ａ２特異的ｓｉＲＮＡであるＢＡＦ１９で３回処理したと
き、それぞれのミスマッチ対照（ＢＡＦ２８）でエレクトロポレーションした細胞と比較
して、細胞はＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの著しい損失を示した。ＲＮＡｉによるＢ
ｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの下方制御はまた、ＭＥＧ−０１細胞の生存能力の実質的
な損失を引き起こした。効果的なＢＡＦ１９  ｓｉＲＮＡで３回処理したＭＥＧ−０１細
胞では、生存率は対照細胞（ＥＰＣ、１００％）のレベルと比較して約２８％のレベルに
減少した。
【０１４８】
第３の主要なＢｃｒ−Ａｂｌ変種であるｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１ａ２）は、成人
型ＡＬＬのＰｈ＋患者の２０〜５０％で、Ｐｈ＋小児型ＡＬＬ患者の約９０％で検出する
ことができる。このＢｃｒ−Ａｂｌ融合部位もＲＮＡｉの標的として使用できるかどうか
を評価するために、２種の異なる配列に特異的なｓｉＲＮＡ（ＢＡＦ２２、ＢＡＦ２４）
を用いて３２Ｄｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１ａ２）細胞を２回処理した。対照として、
Ｂｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１４ａ２（ＢＡＦ９）およびＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１３ａ２（ＢＡＦ１
９）に指向する活性型ｓｉＲＮＡを使用した。２４時間間隔で繰り返し処理すると、ｓｉ
ＲＮＡ  ＢＡＦ２２で処理した細胞においてのみ、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの著
しい下方制御が引き起こされた。ＢＡＦ２４  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、全
く影響を及ぼさなかった。３２Ｄｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１ａ２）では、ＢＡＦ２２
ｓｉＲＮＡで２回目に処理した後のＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの効果的な減少は
、ＥＰＣ（１００％）と比較して１５％のレベルに達する生存率の減少を引き起こした。
【０１４９】
ｓｉＲＮＡ  ＢＡＦ２２もＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１ａ２  ＲＮＡを発現するヒトＢ細胞前
駆体白血病細胞株であるＳＵＰ−Ｂ１５細胞株におけるＢｃｒ−Ａｂｌ−ｅ１ａ２の発現
を効果的にサイレンシングした。ヒトＢ細胞前駆体白血病細胞株ＳＵＰ−Ｂ１５は、急性
リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞前駆体ＡＬＬ）の９歳の男子の骨髄から元々確立されており
、Ｂｃｒ−Ａｂｌ−融合遺伝子（ｅ１ａ２）のＡＬＬ変種（ｍ−ｂｃｒ）を保持している
。この細胞株は、ＤＳＭＺ細胞培養保存施設から入手した（ＡＣＣ３８９、ＤＳＭＺ［ブ
ラウンシュワイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）所在］）。
【０１５０】
ＳＵＰ−Ｂ１５細胞を、前述のようにｅ１ａ２特異的ｓｉＲＮＡ（ＢＡＦ２２）または
対照として他の切断点変種に指向するｓｉＲＮＡ（ＢＡＦ１９）を用いてエレクトロポレ
ーションによって処理した。２４時間間隔でＢＡＦ２２によって３回処理すると、エレク
トロポレーション対照（ＥＰＣ）またはＢＡＦ１９対照と比較してｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂ
ｌタンパク質レベルの著しい減少が生じた（図３参照）。
【０１５１】
長時間ｓｉＲＮＡ処理するとＲＮＡｉに関してはより効果的であるという傾向はまた、
３２Ｄｐ２１０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ１３ａ２）および３２Ｄｐ１９０Ｂｃｒ−Ａｂｌ（ｅ
１ａ２）細胞株においても認められた。２４時間間隔で繰り返しｓｉＲＮＡのエレクトロ
ポレーションを実施することは、Ｂｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの明確な下方制御を実
現するのに必要であり、１回の処理と比較してさらなる生存能力の損失を引き起こした。
【０１５２】
したがって、主要なＢｃｒ−Ａｂｌ切断点変種すべての発現は、インビトロにおいて、
細胞のｓｉＲＮＡ処理によって影響を受け得ることが明らかとなった。一群のｓｉＲＮＡ
分子を試験して、ｅ１４ａ２、ｅ１３ａ２およびｅ１ａ２切断点変種について効果的なｓ
ｉＲＮＡを同定することができた。これらのデータは、ｅ１４ａ２融合物を有するＢｃｒ
−Ａｂｌ転写物の下方制御に関して他者および我々のグループによって公表された以前の
実験に適用される。
【０１５３】
実施例３：ヒト白血病患者から単離された細胞におけるＢｃｒ−Ａｂｌの下方制御
切断点変種ｅ１４ａ２に対して陽性の初代患者細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬの下方制御
新たに診断された、未治療のフィラデルフィア染色体陽性ＣＭＬ慢性患者３人から、Ｃ
Ｄ３４陽性細胞を単離した。細胞を採取する前に患者からインフォームドコンセントを得
た。単核細胞をフィコールハイパック密度勾配遠心（セロメッド社（Ｓｅｒｏｍｅｄ）［
ドイツ国、ベルリン所在］）によって収集した。ＣＤ３４陽性細胞は、幹細胞単離キット
およびＭＡＣＳカラム（ミルテニーバイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
）［ドイツ国、ベルギッシュグラートバハ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ）所在
］）を使用して、製造者の指示に従って単離した。細胞純度は、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３４
抗体（ビーディ  バイオサイエンスィーズ  イムノサイトメトリーシステムズ（ＢＤ  Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）［アメリカ
合衆国カリフォルニア州サンホゼ所在］）を使用してＦＡＣＳ分析によって調べた。ＣＤ
３４陽性細胞の画分は、９６〜９９％の範囲であった。
【０１５４】
ＣＤ３４陽性細胞は、ＦＣＳ２０％、組換えヒトＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ、ストラト
マンバイオテック（Ｓｔｒａｔｍａｎｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社［ドイツ国、ハンブルク所
在］）、ヒトＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、アムゲン（Ａｍｇｅｎ）社［ドイツ国、ミュ
ンヘン所在］）、およびヒト組換えＦＬＴ３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ、リサーチダイ
アグノスティックス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）社［米国
マサチューセッツ州コンコード所在］）を補充したＲＰＭＩ培地で５０００００細胞／ｍ
ｌの密度まで増殖させた。ｓｉＲＮＡ処理前に、Ｂｃｒ−Ａｂｌ切断点変種を決定するた
めに、少量の細胞を使用した。全ＲＮＡは、ＲＮイージーミニキット（ＲＮｅａｓｙ−Ｍ
ｉｎｉＫｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社［ドイツ国、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）所
在］）を使用して、製造者の指示に従って単離し、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃ
ｒｉｐｔ）逆転写酵素（ギブコ  ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社［米国カリフ
ォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在］）を使用して、製造者の方法に従
ってｃＤＮＡを作製するためにＲＮＡ１μｇを使用した。次に、切断点特異的Ｂｃｒ−Ａ
ｂｌプライマー５’−Ｂｃｒ−Ａｂｌ（５’−ＣＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧ−
３’）および３’−Ｂｃｒ−Ａｂｌ（５’−ＣＡＴＴＧＴＧＡＴＴＡＴＡＧＣＣＴＡＡＧ
Ａ−３’）によるＰＣＲのために１マイクロリットルのｃＤＮＡを使用し、３９０ｂｐ断
片（ｅ１４ａ２）または２９０ｂｐ断片（ｅ１３ａ２）を作製した。
【０１５５】
細胞培養２日目に、細胞をｓｉＲＮＡで処理した。細胞を増殖培地８００μｌ中で２．
５×１０６個の密度まで希釈し、４ｍｍエレクトロポレーションキュベット内でアニーリ
ング緩衝液（２０ｍＭのＮａＰＯ４、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９）に溶解したそ
れぞれの５０μＭのｓｉＲＮＡ溶液１２．８μｌと混合した。次に、イージージェクトエ
レクトロポレーション、シングルパルス法（２５０Ｖ、１８００μＦ）を使用して、細胞
をエレクトロポレーションした。この処理を２４時間後に繰り返した。２回目の処理後、
細胞を洗浄し、因子を除去した。２４時間さらに培養した後、ウェスタンブロット分析の
ために細胞を収集した。
【０１５６】
ＢＡＦ７またはＢＡＦ１２（いずれもｅ１４ａ２特異的）処理によって、ミスマッチ対
照（ＢＡＦ８）またはｅ１３ａ２（ＢＡＦ１６）に相同なｓｉＲＮＡで処理した細胞と比
較してＢｃｒ−Ａｂｌタンパク質レベルの著しい減少が生じた。さらに、ＢＡＦ１２処理
はＢｃｒ−Ａｂｌの活性を弱めた。Ｂｃｒ−Ａｂｌのすぐ下流の基質であるＣＲＫＬのリ
ン酸化は、ＢＡＦ１２で処理した細胞で著しく減少した（図４参照）。
【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図１Ａ】
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【図２Ａ】
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【外国語明細書】
2011201927000001.pdf