(57)【要約】【課題】乳酸菌が存在する飲食品等の試料において、存在する乳酸菌の影響を受けずに乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定する方法、及び該汚染菌の生菌数測定方法に用いる汚染菌の生菌数測定用寒天培地を提供すること。【解決手段】乳酸菌が存在する飲食品等の試料において、存在する乳酸菌の影響を受けずに乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定する方法として、乳酸菌増殖抑制剤として、塩化リチウム及びリン酸塩、硝酸リチウム、又は乳酸リチウムを添加した乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地を用いることにより、乳酸菌の増殖を特異的に抑制し、乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
平板寒天培地に、乳酸菌増殖抑制剤として、塩化リチウム及びリン酸塩、硝酸リチウム、又は乳酸リチウムを添加することを特徴とする乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地。
【請求項２】
リン酸塩が、リン酸水素二カリウムであることを特徴とする請求項１記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地。
【請求項３】
塩化リチウム及びリン酸塩に、クエン酸を添加することを特徴とする請求項１又は２記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地。
【請求項４】
平板寒天培地に、吸収剤としてカルボキシメチルセルロースを添加することを特徴とする請求項１〜３記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地。
【請求項５】
汚染菌識別剤として、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライドを添加することを特徴とする請求項１〜４記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地。
【請求項６】
生菌数測定用寒天培地が、乳酸菌含有試料を塗抹法により汚染菌数を測定するためのものであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の生菌数測定用寒天培地。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により乳酸菌以外の汚染菌数を測定することを特徴とする乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数迅速測定方法。
【請求項８】
生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により乳酸菌以外の汚染菌数を測定するに際し、平板寒天培地に乳酸菌含有試料を塗抹する前に、予めＵＶ照射を行うことにより、乳酸菌含有試料以外の微生物のコンタミネーションを防止することを特徴とする請求項７記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数迅速測定方法。
【請求項９】
生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により乳酸菌以外の汚染菌数を測定する場合の乳酸菌含有試料の平板寒天培地への塗抹量が０．５〜１ｍｌであることを特徴とする請求項７又は８記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数迅速測定方法。
【請求項１０】
乳酸菌含有試料が、乳を含む乳酸菌含有飲食品であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数迅速測定方法。
【請求項１１】
汚染菌が、セレウス菌、大腸菌群、リステリア菌、黄色ブドウ球菌、シュードモナス、アシネトバクター、又はセパシア菌であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれか記載の乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数迅速測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌が存在する飲食品等の試料において、存在する乳酸菌の影響を受けずに乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速に測定する方法、及び該汚染菌の生菌数測定方法に用いる汚染菌の生菌数測定用寒天培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌利用飲食品、特に発酵乳、チーズ、乳酸菌飲料等の乳酸菌含有物の製造においては、品質管理上、乳酸菌以外の細菌等の汚染菌による汚染の検査は重要であり、該検査については、従来、一般に、汚染菌測定用の平板寒天培地等を用いて培養を行い、汚染菌の生菌数の存在を確認する検査が行われていた。
【０００３】
ヨーグルトや発酵乳或いはチーズ等の乳酸菌を含有する飲食品の製品における汚染菌の生菌数を測定するには、共存する乳酸菌の影響を受けて、正確な汚染菌の生菌数を測定するのが難しい。したがって、従来より、乳酸菌含有飲食品の汚染菌生菌数の測定には、各種の選択培地を用いた測定法が提示されている。例えば、食品衛生法には、成分規格の項目の一つとして、一般細菌数が規定されており、その測定法として標準寒天培地を使用する方法が記載されている。
【０００４】
食品衛生法に掲載されている乳酸菌含有粉末清涼飲料の成分規格の生菌数は、乳酸菌を除いた生菌数と規定しており、乳酸菌を除く方法として、ペニシリンＧを１μｇ／ｍｌ添加した標準寒天培地を用いて測定する検査法が掲載されている（平成１７年９月２２日、新日本法規出版発行、食品衛生研究会編集、食品衛生小六法平成１８年版、食品の規格基準（Ｄ−各条）粉末清涼飲料、５６５〜５６７頁）。しかしながら、この検査法では、チーズ製造等に利用されるスターター乳酸菌の発育が抑制されると同時に、食品由来の汚染細菌の発育も抑制されてしまい、乳酸菌以外の細菌の生菌数を正しく測定することが難しいという問題がある。
【０００５】
乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定法としては、従来より乳酸菌の生育抑制培地を用いたいくつかの方法が知られている。例えば、チーズやヨーグルトのような乳製品において、乳酸菌を含有する試料中における乳酸菌以外の細菌の生菌数を測定するために、乳酸菌以外の細菌の生菌数測定用寒天培地に、塩化リチウムを０．４〜０．６％添加して、乳酸菌の発育を抑制し、セレウス菌の生菌数を測定する方法が開示されている（特開２００７−２７４９５８号公報）。また、乳酸菌の増殖抑制剤として、プロピオン酸又はその塩を使用して、ビフィドバクテリウムの菌数を測定する方法が開示されている（特開平１１−２８０９８号公報）。
【０００６】
また、ビフィドバクテリウム菌と乳酸菌とを含有する飲食物等において、乳酸菌は実質的に増殖させずにビフィドバクテリウム菌を優先的に増殖させることができる選択培地を用いて、該飲食物中のビフィドバクテリウム菌数を測定する方法として、例えば、塩化リチウムとペニシリンを添加したＭＧＬＰ培地を（食品衛生学雑誌第２３巻(１９８２)第３９〜４４頁）、或いは、プロピオン酸ナトリウムと塩化リチウムとを添加したＲＢ培地を（Journal of Microbiological Methods 27 (1996)33-43）用いる方法が報告されているが、この種の選択培地では乳酸菌だけでなく、一部のビフィドバクテリウム菌やそれ以外の菌についても増殖が抑制される傾向があって、正確な測定値が得られないという問題がある。
【０００７】
一方で、従来、発酵乳、ベース乳などの乳酸菌含有の製品及び半製品の汚染菌（大腸菌群、黄色ブドウ球菌、リステリアなど）の検査には、個々の選択培地を用いその汚染菌について検査が行われてきた。これらは、個々の選択培地を用いることから、培養時間が早いもので大腸菌群の１８時間、遅いものはリステリア４８時間と判定時間にバラツキがあり、乳酸菌含有飲食品の製品における製造管理を行う上で、迅速性に問題があった。また、乳酸菌を含む飲食品工業の製品は通常、微生物汚染があった場合でも、製品出荷時において汚染菌数はかなり少なく、汚染菌の検出感度不良による微生物事故を防ぐためには汚染菌の検出感度を上げることが要求され、従来の方法では、かかる汚染菌の検出感度の点でも必ずしも満足のいくものではなかった。
【０００８】
また、乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を測定するための選択培地として、前記のとおり、塩化リチウム添加寒天培地の有効性は知られてはいるものの、該培地を用いた従来の検査方法は検査の迅速性という点では問題があった。更に、塩化リチウム添加寒天培地は、乳酸菌含有試料中の汚染菌の検出にある程度有効ではあるが、種々の乳酸菌や複数の乳酸菌を使用する乳酸菌スターター或いは、汚染菌の種類もしくは乳酸菌と汚染菌の組み合わせ状況においては、塩化リチウムは万能なものではなく、期待するほどの効果が得られない場合があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１１−２８０９８号公報
【特許文献２】特開２００７−２７４９５８号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】平成１７年９月２２日、新日本法規出版発行、食品衛生研究会編集、食品衛生小六法平成１８年版、食品の規格基準（Ｄ−各条）粉末清涼飲料、５６５〜５６７頁
【非特許文献２】食品衛生学雑誌第２３巻(１９８２)第３９〜４４頁
【非特許文献３】Journal of Microbiological Methods 27 (1996)33-43
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、乳酸菌が存在する飲食品等の試料において、存在する乳酸菌の影響を受けずに乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定する方法、及び該汚染菌の生菌数測定方法に用いる汚染菌の生菌数測定用寒天培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、乳酸菌が存在する飲食品等の試料において、存在する乳酸菌の影響を受けずに乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定する方法として、乳酸菌増殖抑制剤として、塩化リチウム及びリン酸塩、硝酸リチウム、又は乳酸リチウムを添加した乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地を用いることにより、乳酸菌の増殖を特異的に抑制し、乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、平板寒天培地に、乳酸菌増殖抑制剤として、塩化リチウム及びリン酸塩、硝酸リチウム、又は乳酸リチウムを添加することを特徴とする乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用寒天培地からなる。リン酸塩としてはカリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等いずれでも使用できるが、リン酸水素二カリウムを特に好適に使用することができる。又、リン酸塩は単独でも良いが、乳酸菌増殖抑制効果をアップさせる為にクエン酸、アスコルビン酸、乳酸、酢酸、塩酸、リン酸など各種酸と同時に使用することができ、特にクエン酸と一緒に使用することが好ましい。より好適な例としては、リン酸水素二カリウム：クエン酸＝５〜９：１を例示することができる。汚染菌の生菌数測定用平板寒天培地に、該乳酸菌増殖抑制剤を添加することにより、乳酸菌含有試料中の乳酸菌の増殖を特異的に抑えることができる。本発明においては、平板寒天培地を用いた平板塗抹法により汚染菌数を測定する培地の形態とすることにより、簡便で精度の良い測定を可能とする。
【００１４】
特に、本発明においては、汚染菌の生菌数測定用平板寒天培地に、吸収剤としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を添加することにより、汚染菌の生菌数の検出感度と、迅速な測定を可能とすることができる。すなわち、汚染菌の検出感度を上げるためには、平板寒天培地への乳酸菌含有試料の塗抹量を増やすことが必要になるが、吸収剤として、ＣＭＣを添加することにより塗抹量を従来の０．１ｍｌから１ｍｌに増やすことができる。更に、汚染菌の検出を迅速に行なうためには、平板培地の乾燥処理の時間を短縮することが要求されるが、本発明においては、吸収剤としてのＣＭＣの使用と、平板培地の乾燥処理の組み合わせにより、乾燥時間を４０℃で、５時間と大幅に短縮することができる。本発明において、ＣＭＣの培地への添加量は、培地中のＣＭＣ濃度として、培地中に０．１〜１％含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の汚染菌の生菌数測定用寒天培地において、乳酸菌以外の菌を染色し、その検出精度を上げるために、培地中に２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）を添加し、乳酸菌以外の菌を赤く染色し、見やすくすることができる。該ＴＴＣの添加率は、特に限定されないが、培地中に０．００５％〜０．０００５％加えることが好ましい。
【００１６】
本発明の汚染菌の生菌数測定用寒天培地を用いた乳酸菌含有試料における汚染菌の生菌数迅速測定方法は、平板寒天培地への乳酸菌含有試料の塗抹量を増やすことにより、汚染菌の検出感度を上げることができたために従来混釈法で分析していた微生物、具体的には、大腸菌群及び一般細菌（Enterobacteriaceae、S. aureus, B. cereus, B. cepacia, L. monocytogenes, A. jejunii, P. aeruginosa等）も本発明の塗抹法で分析することができる。特に、好気性菌、通性嫌気性菌においては、塗抹法に変更することにより、微生物の生育速度が早くなるという利点がある。
【００１７】
本発明の汚染菌の生菌数測定用寒天培地を用い、乳酸菌含有試料における汚染菌の生菌数を測定するには、該生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により実施することができる。本発明の汚染菌の生菌数迅速測定方法において、生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により乳酸菌以外の汚染菌数を測定するに際しては、平板寒天培地に乳酸菌含有試料を塗抹する前に、予めＵＶ照射を行うことにより、乳酸菌含有試料以外の微生物のコンタミネーションを防止することができる。本発明の汚染菌の生菌数迅速測定方法において、塗抹法により乳酸菌以外の汚染菌数を測定する場合の乳酸菌含有試料の平板寒天培地への塗抹量は、０．５〜１ｍｌの塗抹量で実施することができる。
【００１８】
本発明の汚染菌の生菌数迅速測定方法は、広範囲の汚染菌に対して適用することができ、例えば、セレウス菌、大腸菌群、リステリア菌、黄色ブドウ球菌、シュードモナス、アシネトバクター、又はセパシア菌のような汚染菌に対して適用することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、乳酸菌が存在する飲食品等の試料において、存在する乳酸菌の影響を受けずに乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定する方法、及び該汚染菌の生菌数測定方法に用いる汚染菌の生菌数測定用寒天培地を提供する。すなわち本発明は、乳酸菌存在下において、セレウス菌、大腸菌群、リステリア菌、黄色ブドウ球菌等の汚染微生物を２４時間以内で迅速に精度良くかつ効率的に検出する汚染微生物の検査方法を提供する。本発明の汚染微生物の迅速測定方法は、乳酸菌増殖抑制剤として、塩化リチウム及びリン酸塩、硝酸リチウム、又は乳酸リチウム、汚染菌識別剤としてＴＴＣ、吸収剤としてＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を含み、培地を部分乾燥することにより調製し、試料１ｍｌを塗抹することができる寒天培地を用いることにより、通常、汚染菌数が少ない飲食品工業における乳酸菌を含有する製品や半製品、原材料の汚染微生物の検出を精度よく、かつ、迅速に検出する手段を提供する。特に、本発明の汚染菌の生菌数迅速測定方法を用いることにより、発育が遅いリステリア菌でも、２４時間程度で検出することが可能であり、その他の菌では１５時間程度で菌を検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法でのスターター１添加時のS.aureusのコロニー径の推移について示す図である。
【図２】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、混釈法でのスターター１添加時のS.aureusのコロニー径の推移について示す図である。
【図３】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法でのスターター２添加時のS.aureusのコロニー径の推移について示す図である。
【図４】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、混釈法でのスターター２添加時のS.aureusのコロニー径の推移について示す図である。
【図５】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法でのスターター３添加時のS.aureusのコロニー径の推移について示す図である。
【図６】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、混釈法でのスターター３添加時のS.aureusのコロニー径の推移について示す図である。
【図７】本発明の実施例における塗抹平板培地の殺菌方法の試験において、ＵＶ殺菌によるセレウス菌の殺菌効果について示す写真である。
【図８】本発明の実施例における塗抹平板培地の殺菌方法の試験において、ＵＶ殺菌によるセレウス菌の発育への影響について示す写真である。
【図９】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法での硝酸リチウム使用時のスターター別コロニー径の推移について、L. monocytogenes添加、Ｒ−７０３の場合の結果について示す図である。
【図１０】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法での硝酸リチウム使用時のスターター別コロニー径の推移について、L.monocytogenes添加、Ｒ−７０７の場合の結果について示す図である。
【図１１】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法での硝酸リチウム使用時のスターター別コロニー径の推移について、L.monocytogenes添加、ＣＨ−Ｎ−１９の場合の結果について示す図である。
【図１２】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法での硝酸リチウム使用時のスターター別コロニー径の推移について、L.monocytogenes添加、スターター１の場合の結果について示す図である。
【図１３】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法での硝酸リチウム使用時のスターター別コロニー径の推移について、L.monocytogenes添加、スターター２の場合の結果について示す図である。
【図１４】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、塗抹法での硝酸リチウム使用時のスターター別コロニー径の推移について、L.monocytogenes添加、スターター３の場合の結果について示す図である。
【図１５】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、Ｒ−７０３使用時のS.aureus 添加乳酸リチウムＳＰＣ濃度別コロニー径の推移について示す図である。
【図１６】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、Ｒ−７０７使用時のS.aureus 添加乳酸リチウムＳＰＣ濃度別コロニー径の推移について示す図である。
【図１７】本発明の実施例における汚染菌の検出状況についての試験例において、ＣＨ−Ｎ−１９使用時のS.aureus 添加乳酸リチウムＳＰＣ濃度別コロニー径の推移について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、平板寒天培地に、乳酸菌増殖抑制剤として、塩化リチウム及びリン酸塩、硝酸リチウム、又は乳酸リチウムを添加することを特徴とする乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌の生菌数測定用の寒天培地、及び、該生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌数を測定することを特徴とする汚染菌の生菌数の迅速測定方法からなる。
【００２２】
本発明において用いられる平板寒天培地は、微生物検出用の平板寒天培地であれば特に限定はされないが、例えば、大腸菌群等の検出用培地としてはデソキシコーレイト寒天培地を用いることができる。デソキシコーレイト寒天培地を用いて大腸菌群の検出を行なうに際しては、培地に生育促進剤としてポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ８０）、及び大豆ペプチド、ホエイペプチドのようなペプチドを単独または組み合わせて用いることにより、微生物の生育を促進して検出時間を短縮することができる。本発明においては、乳酸菌含有試料中の乳酸菌以外の汚染菌数を測定するために、乳酸菌増殖抑制剤として、塩化リチウム及びリン酸塩、硝酸リチウム、又は乳酸リチウムを添加するが、該乳酸菌増殖抑制剤の添加量は、０．４〜１．２重量％の濃度範囲で添加するのが好ましい。
【００２３】
本発明においては、本発明で調製される汚染菌の生菌数測定用寒天培地を用いて、平板塗抹法により、汚染菌の検出・菌数の測定を行うが、従来では、平板寒天培地のような平板湿潤培地を用いて平板塗抹法により微生物の検出を行う場合に、試料液の塗布量が０．１ｍｌと制約されていたので、特に本発明の場合のように汚染菌数が少ない試料のような場合には、試料液の塗布量が少ないことに起因する分析精度の関係から、正確な汚染菌の生菌数の測定が困難であった。そこで本発明においては、平板寒天培地に吸収剤としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を添加することにより、試料液の塗布量を１ｍｌと増量することを可能とし、平板塗抹法による精度の高い汚染菌の検出・測定を可能とした。
【００２４】
すなわち、本発明の微生物の迅速検出方法で用いられる平板寒天培地（平板湿潤培地）は、吸収剤として培地に対して、カルボキシメチルセルロース０．１〜１重量％を添加し、該培地を乾燥による培地の減重量が５〜１５重量％であるように乾燥して調製することにより、培地における試料溶液の塗抹量を従来の０．１ｍｌから０．５〜１ｍｌに増やすことを可能として、汚染菌数が少ない本発明における試料の場合でも、精度良く汚染菌数を検出することを可能とした。
【００２５】
本発明の汚染菌の生菌数測定用寒天培地においては、汚染菌の検出を行なうに際して、平板培地上で汚染菌を見やすくするために、汚染菌識別剤として、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）を添加することができる。該ＴＴＣの添加量は、特に限定されないが、０．００５〜０．０００５重量％の範囲で添加するのが好ましい。
【００２６】
本発明において、生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により乳酸菌以外の汚染菌数を測定するに際しては、平板寒天培地に乳酸菌含有試料を塗抹する前に、予めＵＶ照射を行うことにより、乳酸菌含有試料以外の微生物のコンタミネーションを防止することができる。また、本発明の生菌数測定用寒天培地を用い、塗抹法により乳酸菌以外の汚染菌数を測定する場合に、乳酸菌含有試料の平板寒天培地への塗抹量は、本発明培地における試料溶液の塗抹量の増加を可能としたことから、０．５〜１ｍｌの範囲でも行うことができ、汚染菌数が少ない本発明のような試料の場合でも、精度良く汚染菌数を検出することができる。
【００２７】
本発明の汚染菌の生菌数迅速測定方法は、ヨーグルトや、チーズのような乳を含む乳酸菌含有飲食品の乳酸菌含有試料に適用することができる。該汚染菌の生菌数迅速測定方法で検出の対象となる汚染菌としては、汚染細菌類が検出の対象となるが、例えば、汚染細菌類として、セレウス菌、大腸菌群、リステリア菌、黄色ブドウ球菌、シュードモナス、アシネトバクター、又はセパシア菌等を挙げることができる。
【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、実施例で示すリン酸塩はリン酸水素二カリウムのことを意味している。
【実施例１】
【００２９】
＜１．検討培地＞
（１）リン酸塩、塩化リチウム添加ＳＰＣ培地（以後、ＰＬ−ＳＰＣ培地ともいう）＋ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド）検討培地は０．３重量％塩化リチウム、リン酸塩及びクエン酸を７：１の割合で０．６重量％添加とした。
（２）硝酸リチウム添加ＳＰＣ培地（以後、ＮＬ−ＳＰＣ培地ともいう）＋ＴＴＣ。
（３）乳酸リチウム添加ＳＰＣ培地（以後、ＬＬ−ＳＰＣ培地ともいう）＋ＴＴＣ。
（４）塩化リチウムＳＰＣ培地（以後、Ｌ−ＳＰＣ培地ともいう）＋ＴＴＣ。
（５）ＳＰＣ培地（以後、Ｔ−ＳＰＣ培地ともいう）＋ＴＴＣ。
なお、ＳＰＣ培地（標準寒天培地）は、日水製薬製を使用し、培地２３．５ｇ（酵母エキス：２．５ｇ；ペプトン：５．０ｇ；ブドウ糖：１．０ｇ；カンテン：１５．０ｇ；ｐＨ：７．０±０．２）を滅菌水に溶かし１Ｌとした。
【００３０】
汚染菌の判定を明確にするためにＴＴＣを添加し、菌の検出を迅速化するため塗抹法を開発（従来法の培地の添加は０．１ｍｌ→改良法の培地の添加は１．０ｍｌ）した。又、平板培地の殺菌法を開発した。
【００３１】
＜２．乳酸菌スターター＞
本発明に使用した乳酸菌スターター名と乳酸菌名の内訳を以下に示す。
【００３２】
（ヨーグルトスターター）
スターター１：Lactobacillus acidophilus Ａ株、Streptococcus thermophilus Ｇ株、Bifidobacterium lactis Ｅ株。
スターター２：Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus及びStreptococcus thermophilus の混合スターター。
スターター３：Lactobacillus casei YIT 9029 (シロタ株)、Streptococcus thermophilus及びLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusの混合スターター。
【００３３】
（チーズスターター）
Ｒ−７０３、Ｒ−７０７、ＣＨＮ−１９（ＣＨ−Ｎ−１９と記載することもある）はいずれも市販（クリスチャンハンセン社製）のものを使用した：［「Ｒ−７０３」：Lactococcus lactis subsp. lactis 及びLactococcus lactis subsp. cremoris の混合スターター；「Ｒ−７０７」：Lactococcus lactis subsp. lactis 及び Lactococcus lactis subsp. cremoris の混合スターター；「ＣＨＮ−１９」：Lactococcus lactis subsp. lactis 及び Lactococcus lactis subsp. cremoris；Lactococcus lactis subsp. diacetylactis 及びLeuconostoc mesenteroides subsp. cremoris の混合スターター］
【００３４】
＜３．汚染菌の検出状況（塗抹法）＞
【００３５】
（試験方法）
各スターターを生理食塩水で１０倍希釈したもの（各汚染菌を１０１〜１０２個／ｍｌ程度含む）を原液として各培地に１ｍｌずつ塗抹した。３４℃にて１５〜４８時間培養後に汚染菌の検出状況等から評価を実施した。平板培地へ１ｍｌ塗抹する技術は本発明の発明技術の一部であり、詳細は“６．１ｍｌ塗抹培地の調製”に記載した方法で作成した平板培地を使用した。
【００３６】
尚、培地中の乳酸菌増殖抑制剤の濃度は、重量％で、０％、０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、１．０％、１．２％について検討を実施した。表１［汚染菌の検出状況（塗抹法）］では、上記の濃度のうち最適濃度％での結果を記載した。尚、乳酸菌スターターの種類によって乳酸菌増殖抑制剤の最適濃度は異なり、表１には、スターター１では０．２〜１．０％、スターター２では０．２〜１．０％、スターター３では０．４〜１．２％、Ｒ−７０３では０．６〜１．２％、Ｒ−７０７では０．２〜１．０％、ＣＨＮ−１９では０．４〜０．８％の時の結果を示している。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
（結果）
スターター１でのＰＬ−ＳＰＣ培地及び塩化リチウム添加ＳＰＣ培地で使用した汚染菌、エンテロバクター・クロアカ、セレウス、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、シュードモナス、アシネトバクター全菌種において、１５時間程度で判別可能であったが、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウスにおいてコロニーが小さく判別しづらいという問題があった。増菌時間を２４時間まで延ばすことで全ての汚染菌の確認が可能であった。また、ＮＬ−ＳＰＣ培地、ＬＬ−ＳＰＣ培地においても良好な結果が得られた。
【００３９】
チーズスターターの場合、ＰＬ−ＳＰＣ培地では殆ど乳酸菌の抑制効果がなく、汚染菌の発育はできなかったが、それ以外の培地では満遍なく汚染菌の確認はできた。但し、チーズスターターと汚染菌の種類によって、乳酸菌増殖抑制剤のリチウム塩濃度を調節しなければ、汚染菌の発育に繋がらないことが確認できた。スターター２は増殖が著しく早いことから、他のスターターに比べ若干判別しづらい傾向にあった。
【００４０】
［比較例１］
［混釈法を用いた汚染菌の検出（比較例）］
【００４１】
＜試験方法＞
各スターターを生理食塩水で１０倍希釈したもの（各汚染菌を１０１〜１０２個／ｍｌ程度含む）を原液としてシャーレに１ｍｌずつ分注し、各培地について混釈培養を行った。３４℃にて１５〜４８時間培養後に汚染菌の検出状況等から評価を実施した：乳酸菌スターターとしては、実施例１で用いたスターター１、スターター２、スターター３（ヨーグルトスターター）；Ｒ−７０３、Ｒ−７０７、ＣＨＮ−１９（チーズスターター）を用いた。各製品中に単一の菌種を１０１〜１０２個／ｍｌ程度添加し、混釈法にて検出状況を確認した。但し、菌種によって乳酸菌増殖抑制剤の濃度が個々に異なるものもあるが、最適条件で評価を記載した。
【００４２】
＜結果＞
結果を表２（汚染菌の検出状況：混釈法：比較例）に示す。混釈法においては汚染菌のエンテロバクター・クロアカ、セレウスは１８時間程度で確認可能であるが、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウスなどは２４時間以上の培養が必要であった。更に、スターターに添加しているラクトコッカス・ラクティス及びクレモリスの一部に培地の底部（嫌気状態）にＴＴＣを介して赤色に変色するものが稀に散見されることから、この混釈法での運用は不向きと判断された。
【００４３】
【表２】
2011004618.tif 000003
【実施例２】
【００４４】
＜４．リン酸塩、塩化リチウムの添加量の検討（塗抹法）＞
今回検討したヨーグルトスターターの中で発酵時間が最も長くなることから、最も雑菌に汚染される確率の高いスターター１を対象にして、リン酸塩および塩化リチウムの添加量はどの程度が適しているかを調べるために試験を実施した。
【００４５】
（試験方法）
スターター１乳酸菌１０７〜１０８個程度の存在下において、重量％において、塩化リチウム０、０．３、０．６％に対し、リン酸塩およびクエン酸を７：１の割合で０、０．６、１．２％での条件で培地を作成し（ＴＴＣ不使用）、スタフィロコッカス・アウレウス（ＭＳＡ）を用い、菌数、コロニーの大きさについて、２回の繰り返し検査を実施した。スターター１を生理食塩水で１０倍希釈したもの（スタフィロコッカス・アウレウス（S.aureus ）を１０１〜１０２個／ｍｌ程度含む）を原液として各培地に０．１ｍｌずつ摂取しコンラージ棒で塗抹した。３４℃、１５〜４８時間培養後判定を行った。
【００４６】
（結果）
結果を表３（スターター１を使用したリン酸塩、塩化リチウムの添加量の検討結果）に示す。スターター１に汚染が想定される菌が確実に検出でき、短時間で検出することが重要である。この条件をすべて網羅できた乳酸菌増殖抑制剤はリン酸塩と塩化リチウムを組み合わせたものであった。コロニーの大きさは判別し易さに繋がり、今回の条件においては、塩化リチウム０．３重量％、リン酸塩及びクエン酸０．６重量％濃度が最も良好な結果が得られた。リン酸塩及びクエン酸１．２重量％での組合せの検出率は非常に悪く、この濃度の使用はできないことが確認できた。塩化リチウム及びリン酸塩が添加されていない系では、乳酸菌が増殖し、スタフィロコッカス・アウレウスのコロニーの形状が小さく、発育に影響を及ぼすことが確認された。
【００４７】
【表３】
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【実施例３】
【００４８】
＜５．ＴＴＣ添加及び塗抹法による培地の調製（塗抹法と混釈法との比較）＞
乳酸菌が１０７〜１０８オーダー存在下において、微量の汚染菌を確認するにはある程度、コロニーの大きさが必要になる。微少のコロニーでの識別を目的とし、ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド）を培地に添加することにより乳酸菌以外の汚染菌はピンク色或いは濃赤色のコロニーを呈し培地上で容易に鑑別ができる。
【００４９】
ＴＴＣ０．５ｇを１００ｍｌの水に溶解し、遮光の試験管に３ｍｌずつ分注し、沸騰浴中で殺菌する。４００ｍｌの培地に対して1本(０．０１５ｇ（０．００３７５重量％）)の割合で添加して使用した。各スターターを生理食塩水で１０倍希釈したもの（S.aureusを１０１〜１０２個／ｍｌ程度含む）ものを原液として各培地に１ｍｌずつ摂取した。３４℃、１２〜３６時間培養後判定を行った。
【００５０】
＜結果＞
結果を図１〜６に示す。図中、ＰＬ−ＳＰＣは、リン酸塩、塩化リチウム添加ＳＰＣ培地を；Ｌ−ＳＰＣは、塩化リチウム添加ＳＰＣ培地を；Ｐ−ＳＰＣは、リン酸塩添加ＳＰＣ培地を；Ｔ−ＳＰＣは、乳酸菌増殖抑制剤なしの培地を示す。図１は、塗抹法でのスターター１添加時のS.aureusのコロニー径の推移について；図２は、混釈法でのスターター１添加時のS.aureusのコロニー径の推移について；図３は、塗抹法でのスターター２添加時のS.aureusのコロニー径の推移について；図４は、混釈法でのスターター２添加時のS.aureusのコロニー径の推移について；図５は、塗抹法でのスターター３添加時のS.aureusのコロニー径の推移について；図６は、混釈法でのスターター３添加時のS.aureusのコロニー径の推移について示す。
【００５１】
塗抹法と混釈法を比較した場合、容易に識別可能な大きさ０．４ｍｍ程度を目安にした場合、塗抹法では、どのスターターにおいても１８〜２２時間程度でコロニーは成長している。
一方、混釈法では、３０時間以上要することが確認された。今回の実験はコロニーの形成が遅いスタフィロコッカス・アウレウスに絞って行っていることから、他の汚染菌（食中毒菌）の判別は容易に可能である。通常、ベース乳等は、１５〜１８時間での判定後に充填を行っていることから、スタフィロコッカス・アウレウスを含む全ての汚染菌の確認が必要である。
ＰＬ−ＳＰＣ培地、塩化リチウム添加ＳＰＣ培地について比較調査を行った結果、塗抹法及び混釈法いずれにおいてもコロニーの形成は遅い。スターター２のような短時間（５時間前後）で発酵が終了する条件においては、乳酸菌が１０７〜１０８となるため乳酸菌を抑制しなければ、汚染菌は確認できない。
【実施例４】
【００５２】
＜６．１ｍｌ塗抹培地の調製＞
通常の平板培地は、試料０．１ｍｌを吸収できる程度であることから、精度的に問題がある。今回検討した平板培地は、試料を１．０ｍｌ吸収できるための工夫が成されている。
【００５３】
（平板培地の作製方法）
以下の（１）〜（７）のようにして、平板培地を作製する：
（１）５００ｍｌの三角フラスコに、ＳＰＣ培地９．４ｇにリン酸水素２カリウム２．１ｇ（無水）及びクエン酸（無水）、塩化リチウム１．２ｇを加え、ＣＭＣ溶液全量を加え、水で４００ｍｌとする。該ＣＭＣ溶液は、３００ｍｌのビーカーにカルボキシメチルセルロース０．８ｇを加え、６０〜８０℃の温水２００ｍｌで溶解することによって調製した。
（２）スターラで３０分程度溶解させる。
（３）１２１℃で１５分間滅菌させ、５５℃のインキュベーターで放冷・保持させる。
【００５４】
（４）上記の三角フラスコに、試験管に分注・殺菌したＴＴＣ溶液を加える。該ＴＴＣ溶液は、ＴＴＣ０．５ｇを１００ｍｌの水に溶解し、遮光の試験管に３ｍｌ分注し、沸騰浴中で殺菌することにより調製した。
（５）上記のように調製した培地を、シャーレに１５ｍｌ程度注ぎ、平板培地を作成する。
（６）平板培地が固化冷却後、インキユベーターで反転させ３９〜４２℃で４〜５時間程度乾燥する（目安として２．０ｇ〜３．０ｇ減）。
（７）調製した培地は、使用直前にクリーンベンチのＵＶ灯を培地の寒天の表面に対して１０分間照射させる。
【実施例５】
【００５５】
＜７．塗抹平板培地の調製：殺菌方法の開発＞
汚染菌の生菌数測定用寒天培地として、塗抹平板培地の調製における殺菌方法について開発した：ＰＬ−ＳＰＣ培地は、乳酸菌以外の汚染菌はすべて発育する特徴を要することから、あらゆる菌種のコンタミネーションのリスクが大きい。そこで使用前の乾燥操作（１ｍｌ吸収用培地の調製目的）での汚染を排除するため、ＵＶを用いた殺菌方法を試みた。本実験において、ＰＬ−ＳＰＣ培地に接種した汚染菌の殺菌効力の確認、及びＵＶ照射による汚染菌の発育阻害の確認を行った。
【００５６】
（殺菌効果試験）
（１）予め作成した平板培地の表面に各種（セレウス菌、大腸菌群（エンテロバクター・クロアカ）、リステリア菌、黄色ブドウ球菌）汚染菌を５０〜１００個／ｍｌ程度培地に接種させる。
（２）クリーンベンチのＵＶを用い、照射時間および照射位置、距離の条件を設定し殺菌を試みた。
（３）ＵＶ照射後３４℃で、４８ｈ培養を行い、各種条件を評価した。
【００５７】
（発育への影響試験）
（１）予め作成した平板培地の表面をクリーンベンチのＵＶを用い、照射時間及び照射位置、距離の条件を設定し殺菌を試みた。
（２）生乳ヨーグルト（小岩井乳業（株））を１０倍希釈したものに、汚染菌（セレウス菌、大腸菌群（エンテロバクター・クロアカ）、リステリア菌、黄色ブドウ球菌）を５０〜１００個／ｍｌ程度培地に接種した。
（３）ＵＶ照射後３４℃で４８ｈ培養を行い、表４（ＵＶ照射時間とシャーレ１枚当りのコロニー数）に示す条件について評価した。
【００５８】
【表４】
2011004618.tif 000005
【００５９】
（結果）
結果を、表４（エンテロバクターでの殺菌・発育試験結果）及び図７（セレウス菌の殺菌効果）、図８（セレウス菌での発育影響結果）に示す。ＰＬ−ＳＰＣ培地の汚染菌をＵＶ殺菌することで、セレウス菌、大腸菌群、リステリア菌、黄色ブドウ球菌などヨーグルトの製造における汚染菌を確実に殺菌（キルレート２）できることが確認できた。また、これらの菌種はＵＶ殺菌後、発育に影響がでないことも確認できた。この結果をもとに試験を実施した結果、ＵＶ殺菌を行わなかった平板培地（４１枚中５件コンタミネーション）に対してＵＶ殺菌を行った平板培地（５５枚中０件コンタミネーション）では良好な結果が得られた。
【００６０】
（ＰＬ−ＳＰＣ培地での塗抹について）
通常、ヨーグルト製造において、所謂汚染菌は偏性好気性菌（セレウス菌、シュードモナス、枯草菌、カビ゛など）及び通性嫌気性菌（殆どの食中毒菌、腸内細菌、酵母）であることから、好気培養で行うことが適している。しかしながら、一般的に行われているＳＰＣ培地での培養法は、混釈法であり、培地内部の菌のコロニー形成において、塗抹法での培地表面のコロニー形成状況と比較した場合、菌種によって違いがあるが、かなり遅れる傾向にある。塗抹法に用いる試料は、０．１ｍｌが基本であるが、今回開発している塗抹法は、試料１ｍｌで実施している。このことから、混釈法と比較した場合、検出感度が１０倍以上、更に好気培養であることから、検出感度的には数字的には数十倍から数百倍と考えられる。
【００６１】
（本塗抹法の特徴）
（１）本塗抹法では試料０．１ｍｌが限界であったが、１．０ｍｌを可能にした。
（２）乳酸菌の抑制剤に、塩化リチウムとリン酸塩を組み合わせた。
（３）汚染菌の識別に、ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド）を加えた。
（４）塗抹平板培地の簡易的な殺菌方法を提供した。
【実施例６】
【００６２】
＜８．チーズスターターへの適用＞
チーズスターターの乳酸菌の存在下において、ＰＬ−ＳＰＣ培地では確実に乳酸菌の抑制ができないことが確認された。この場合、リン酸塩＋クエン酸濃度を０．６重量％から１．０重量％まで増加を試みたが、満足できる結果には至らなかった。そこで硝酸リチウム及び乳酸リチウムについて検討を行った。
【００６３】
（硝酸リチウムによるチーズスターター抑制効果と汚染菌検出状況（塗抹法））
各スターターを生理食塩水で１０倍希釈したもの（各汚染菌を１０１〜１０２個／ｍｌ程度含む）ものを原液として各培地に１ｍｌずつ摂取した。３４℃、１５〜４８時間培養後判定を行った。
【００６４】
＜結果＞
結果を、表５（硝酸リチウム使用時の乳酸菌増殖抑制の可否）及び表６（硝酸リチウム使用培地での各種汚染菌のコロニー数（平板培地１枚当り））に示す。表５の条件において、乳酸菌の抑制が十分に可能な場合は○、不十分な場合は×で表示した。表６において、生理食塩水を用いてスタフィロコッカス・アウレウス又はセレウス菌を希釈し１ｍｌ塗抹したものをコントロールとした。コントロールの菌数はスタフィロコッカス・アウレウスが４８、セレウス菌が１０９であった。
【００６５】
硝酸リチウム濃度を０．５〜１．０重量％の系で、各チーズスターターとスタフィロコッカス・アウレウス、セレウスでの菌の検出状況を確認した。その結果、０．６〜１．０重量％まで、各チーズスターターの乳酸菌を確実に抑制し、目的の汚染菌であるスタフィロコッカス・アウレス及びセレウスは検出することが確認できた。各汚染菌の選択培地を用い、検出状況について確認した結果、硝酸リチウム０．６〜１．０重量％まで同等のコロニーが計数された。
【００６６】
【表５】
2011004618.tif 000006
【００６７】
【表６】
2011004618.tif 000007
【実施例７】
【００６８】
＜９．各種スターターへの適用＞
硝酸リチウムを用い各種スターターでの汚染菌の検査について試験した。
【００６９】
（試験方法）
スターター１を生理食塩水で１０倍希釈したもの（L. monocytogenes を１０１〜１０２個／ｍｌ程度含む）を原液として各培地に１ｍｌずつ摂取した。３４℃で、１６〜３６時間培養後判定を行った。なお、試験において、硝酸リチウムは、０．４〜１．２重量％の範囲で添加した。また、Ｌ−Ｓでは、塩化リチウムを０．６重量％添加した。
【００７０】
結果を、図９〜図１４（硝酸リチウムでのスターター別コロニー径の推移：塗抹法）に示す。図中、図９は、L. monocytogenes添加、Ｒ−７０３の場合の結果について；図１０は、L. monocytogenes添加、Ｒ−７０７の場合の結果について；図１１は、L.monocytogenes添加、ＣＨ−Ｎ−１９の場合の結果について；図１２は、L.monocytogenes添加、スター  ター１の場合の結果について；図１３は、L.monocytogenes添加、スターター２の場合の結果について；図１４は、L.monocytogenes添加、スターター３の場合の結果について、それぞれ示す。
【００７１】
今回の結果では、Ｌ−Ｓ：塩化リチウムを０．６重量％添加において、一番優れた結果が得られた。硝酸リチウムは、塩化リチウムと同様に全てのスターターに適用することができ、汚染菌を迅速に確認することができた。チーズスターターの場合、硝酸リチウムは、塩化リチウムと同様に満遍なく汚染菌の確認が可能であることが確認できた。
【実施例８】
【００７２】
＜１０．乳酸リチウムによるチーズスターターでの乳酸菌増殖抑制効果と汚染菌の検出＞
乳酸リチウムを用いチーズスターターでの乳酸菌増殖抑制効果と汚染菌の検出について試験した。
【００７３】
（試験方法）
各種チーズ用スターターを生理食塩水で１０倍希釈した（スタフィロコッカス・アウレウスを１０１〜１０２個／ｍｌ程度含む）ものを原液として各培地に１ｍｌずつ摂取した。３４℃、１６〜３６時間培養後判定を行った。なお、図１５〜図１７中の０、０．４、０．６、０．８、１、１．２は、ＳＰＣ培地中の乳酸リチウムの重量％を示している。
【００７４】
（結果）
結果を、図１５〜１７に示す。図中、図１５は、Ｒ−７０３使用時のS. aureus添加（塗抹）、乳酸リチウムＳＰＣ濃度別コロニー径の推移について；図１６は、Ｒ−７０７使用時のS.aureus添加（塗抹）、乳酸リチウムＳＰＣ濃度別コロニー径の推移について；図１７は、ＣＨ―Ｎ−１９使用時のS. aureus添加（塗抹）、乳酸リチウムＳＰＣ濃度別コロニー径の推移について示す。
【００７５】
この実験の結果からは、乳酸菌の抑制剤として用いている乳酸リチウムは、チーズスターターでの検査において、スタフィロコッカス・アウレウスに対して、その発育を抑制していることが推測された。またデータは示さないが、リステリア菌の検出には適さないものの、エンテロバクター、セレウスの場合にも、適合した検査方法として用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、ヨーグルトや発酵乳或いはチーズ等の乳酸菌を含有する飲食品の製品や半製品、原料の品質管理に重要となる、汚染菌の生菌数を迅速かつ精度良く測定する方法を提供する。本発明の汚染菌の生菌数測定方法により、存在する乳酸菌の影響を受けずに乳酸菌以外の汚染菌の生菌数を迅速に測定することができる。
【図１】
2011004618.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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