(57)【要約】 【課題】  ラジオアイソトープを用いない高感度な核酸検出系として知られている、ジゴキシゲニンを標識した系よりも高感度に核酸を検出する方法および核酸検出試薬を提供すること。【解決手段】  オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをエストラジオールで標識後エストラジオールを認識する物質で検出する核酸検出方法、およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにエストラジオールを標識したプローブとエストラジオールを認識する物質を含んだ核酸検出試薬により、前記課題を解決することができた。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをエストラジオールで標識後、エストラジオールを認識する物質で検出する、核酸検出方法。
【請求項２】
エストラジオールを認識する物質がエストラジオールを認識する抗体である、請求項１に記載の核酸検出方法。
【請求項３】
エストラジオールを認識する抗体がウサギモノクローナル抗体である、請求項２に記載の核酸検出方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにエストラジオールを標識したプローブと、エストラジオールを認識する物質を含んだ、核酸検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はラジオアイソトープを用いることなく、高感度に核酸を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出する方法として、サザンブロッティング法やノーザンブロッティング法が広く実施されている。前記方法は、膜上に固定化したポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、前記ヌクレオチドと相補的な配列を持ったポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（プローブ）で検出する手法である。具体的には、ＤＮＡまたはＲＮＡを電気泳動後、拡散または吸引によってニトロセルロースやナイロンなどの膜に転写し、転写した核酸を紫外線または加熱によりメンブレン上に固定し、何らかの方法で標識したプローブとハイブリダイズさせることで目的のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの存在を検出する。
【０００３】
プローブの標識としては、従来３２Ｐなどのラジオアイソトープが用いられてきたが、取扱いが煩雑であることから、近年はラジオアイソトープ以外の標識が用いられてきている。ラジオアイソトープ以外の標識の例としてはビオチンがある。ビオチンはアビジンとの間に強い結合力があるため、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにビオチンを標識することにより、ラジオアイソトープを用いた場合と同等の検出感度が得られる。しかしながら、ビオチンはビタミンの一種であり、生物学的物質中に存在する場合が多く、ビオチン−アビジン相互作用が妨害されやすいという問題があった。また、ビオチン化されたタンパク質が生体内に存在するため、検出の際、バックグラウンドの増加や非特異的シグナルを検出する問題もあった。ラジオアイソトープ以外の標識の他の例としてはジゴキシゲニンがある。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにジゴキシゲニンを標識し、ジゴキシゲニンを認識する抗体（抗ジゴキシゲニン抗体）を用いて検出する（特許文献１）ことにより、前述したビオチン−アビジン系と同等以上の検出感度が得られる。ジゴキシゲニンは、ビオチン−アビジン系のような妨害物質による影響を受けないため、現在、種々のアプリケーションに適応した試薬が市販されている。ラジオアイソトープ以外の標識のさらに他の例としては、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにＴ３（トリヨードサイロニン）またはＴ４（サイロキシン）を標識し、Ｔ３またはＴ４を認識する抗体を用いて検出する例がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平７−０３１１９４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】松葉隆雄ら、東ソー研究報告、５３、３−９（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したように、サザンブロッテイング法やノーザンブロッティング法といった核酸検出方法において、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを標識する分子としてラジオアイソトープ以外の分子を用いる方法がこれまで知られている。特に、ジゴキシゲニンを標識する方法は、ラジオアイソトープと同等以上の感度を有し、かつ妨害物質の影響がない方法であるため、広く用いられている。しかしながら、核酸検出においてはさらなる高感度検出が求められている。特に、ゲノム中に非常に少ないコピー数しか存在しない遺伝子を検出する目的で、または再現性の高いデータの取得する目的では、さらなる高感度の検出系が求められており、ジゴキシゲニンを標識する方法よりも高感度な核酸検出方法が求められている。
【０００７】
そこで、本発明の目的は、ラジオアイソトープを用いない高感度な核酸検出系として知られている、ジゴキシゲニンを標識した系よりも高感度に核酸を検出する方法および核酸検出試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を鑑み発明者が鋭意検討した結果、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをエストラジオール（Ｅ２）で標識し、Ｅ２を認識する物質で検出することにより、ジゴキシゲニンなどを標識する従来の方法と比較し、高感度に核酸を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち第一の発明は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをエストラジオールで標識後、エストラジオールを認識する物質で検出する、核酸検出方法である。
【００１０】
また第二の発明は、エストラジオールを認識する物質がエストラジオールを認識する抗体である、第一の発明に記載の核酸検出方法である。
【００１１】
また第三の発明は、エストラジオールを認識する抗体がウサギモノクローナル抗体である、第二の発明に記載の核酸検出方法である。
【００１２】
また第四の発明は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにエストラジオールを標識したプローブと、エストラジオールを認識する物質を含んだ、核酸検出試薬である。
【００１３】
以降、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
核酸を高感度に検出するための標識分子には、以下の４つの要件が求められる。
【００１５】
（１）標識分子が低分子量であること
標識分子が高分子量の化合物であると、立体障害などにより、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの結合を阻害する可能性があり、検出感度および特異性が低下するため好ましくない。なお、ジゴキシゲニンの分子量は３９０．５１であることから、これよりも小さい分子量の方が標識分子としては好ましいと考えられる。
【００１６】
（２）標識分子が耐熱性であること
ハイブリダイゼーションは比較的高温（６０℃程度）で一昼夜反応させる場合もあるため、少なくとも前記条件下で安定な物質であることが必要である。
【００１７】
（３）標識分子が電荷を有した官能基を有してしないこと
標識分子が電荷を有していると、核酸同士の静電的な相互作用を阻害する可能性が生じるため好ましくない。
【００１８】
（４）標識分子に対して親和性の高い物質が存在すること
従来から知られているビオチンを標識する系は、ビオチン−アビジン間の結合量が強いため、高感度に核酸を検出することができる。
【００１９】
そこで、前述した４つの要件に該当する標識分子について鋭意検討した結果、エストラジオール（Ｅ２）が標識分子の候補としてあがった。Ｅ２は、
（１）ジゴキシゲニンよりも低分子量（分子量：２７９．３９）であり、
（２）耐熱性を有しており、
（３）電荷を有しておらず、
（４）標識分子に対して親和性の高い物質として、Ｅ２を認識する抗体（ウサギモノクローナル抗Ｅ２抗体、非特許文献１）が存在する、
ため、従来知られているビオチンまたはジゴキシゲニンを標識した系と比較し核酸を高感度に検出することができると予想された。そこで実際にオリゴヌクレオチドにＥ２を標識したプローブを作製し、ウサギモノクローナル抗Ｅ２抗体を用いて検出した結果、ジゴキシゲニンを標識した系と比較し、シグナル強度が増大し、また検出感度も最大で１０倍程度向上した（実施例２および図３参照）。以上の結果より、核酸を高感度に検出するための標識分子としてＥ２が好ましいことが判明した。
【００２０】
本発明におけるＥ２を認識する物質としては、Ｅ２を認識するモノクローナル抗体・ポリクローナル抗体・抗血清が例示できるが、ロット間差の考慮が不要なモノクローナル抗体が、安定的な検出ができる点で好ましい。Ｅ２を認識するモノクローナル抗体としては、親和性の高い非特許文献１に記載のウサギモノクローナル抗Ｅ２抗体を用いてもよいし、新たにモノクローナル抗体を単離してもよい。
【００２１】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへのＥ２の標識はジゴキシゲニンを標識する系で行なわれている方法と同様な方法で標識すればよい。また、Ｅ２を認識する物質への標識も通常よく知られている方法で行なえばよく、例えば、市販のキットを用いてＥ２を認識する物質に直接酵素などを標識する方法、ビオチンーアビジンを介した標識方法があげられる。なお、検出感度を向上させるために、Ｅ２を認識する物質に標識する酵素を重合させたり、前記標識分子を検出する試薬を高感度のものに変更してもよい。
【００２２】
前述したように、ジゴキシゲニンを標識した系は試薬として市販されているが、構成成分のうち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの標識分子をジゴキシゲニンからＥ２に、検出物質をジゴキシゲニンを認識する物質からＥ２を認識する物質に、それぞれ変更するだけで、本発明の核酸測定試薬を構築することが可能である。そのため、ジゴキシゲニンを標識した系と同様なアプリケーションに適用できる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は核酸を検出する際、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにエストラジオール（Ｅ２）を標識後、Ｅ２を認識する物質で検出することを特徴としており、ビオチン−アビジン系やジゴキシゲニンを標識した（ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体）系といった、従来から知られている高感度な核酸検出系よりもさらに高感度に核酸を検出することができる。よって、本発明の測定方法は、ゲノム中に非常に少ないコピー数しか存在しない遺伝子を検出する目的で、または再現性の高いデータの取得する目的で好ましく用いることができる。特に、Ｅ２を認識する物質としてＥ２を認識する抗体（さらに好ましくはＥ２に対する親和性の高いウサギモノクローナル抗体）を用いることで、さらに高感度に核酸を検出することができる。
【００２４】
なお、市販されている核酸検出試薬の構成成分のうち、プローブ中のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに標識する分子をＥ２に変更し、標識分子を認識する物質をＥ２を認識する物質に変更するだけで、本発明の核酸検出試薬が得られる。したがって、本発明の核酸検出試薬は、従来の核酸検出試薬よりも高感度であることはもちろん、市販されている核酸検出試薬と同様なアプリケーションにも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＤＩＧ−Ｍ１３と、ｂｉｏ−Ｍ１３プローブで検出した結果。左側のレーンが、ＤＩＧ−Ｍ１３をプローブとしてＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体で検出した結果。右側のレーンがｂｉｏ−Ｍ１３をプローブとしてＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出した結果。左側の数値はドットあたりに固定化したＤＮＡの量を示す。
【図２】ＤＩＧ−Ｍ１３と、Ｅ２−Ｍ１３プローブで検出した結果。一番左側のレーンが、ＤＩＧ−Ｍ１３をプローブとしてＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体で検出した結果。右側の３つのレーンは、Ｅ２−Ｍ１３をプローブとして使用し、３種類の動物由来のＨＲＰ標識抗Ｅ２モノクローナル抗体で検出した結果。マウスはマウス由来のモノクローナル抗体、ラットはラット由来のモノクローナル抗体、Ｕ１６Ａ１４はウサギ由来モノクローナル抗体を示す。
【図３】ＤＩＧ−Ｍ１３と、Ｅ２−Ｍ１３プローブで検出した結果。一番左側のレーンが、ＤＩＧ−Ｍ１３をプローブとして抗ジゴキシゲニン抗体で検出した結果。右側の３つのレーンは、Ｅ２−Ｍ１３をプローブとして使用し、ＨＲＰ標識Ｕ１６Ａ１４の希釈倍率を図に示す濃度で反応させた結果。
【図４】Ｅ２−Ｍ１３プローブで検出した結果。左から３種類のウサギモノクローナル抗体（Ｕ１６Ａ１４、Ｕ１４Ｃ１５、Ｕ１２−２）で検出した結果。
【実施例】
【００２６】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  検出感度の比較
本発明の核酸測定方法と、ビオチンまたはジゴキシゲニンで標識する従来の核酸測定方法とで、検出感度を比較した。
【００２８】
（１）オリゴヌクレオチドプローブの作製
（１−１）Ｍ１３プライマー（配列番号１）の５’末端を、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ−Ｍ１３）、ビオチン（ｂｉｏ−Ｍ１３）、アミノ基（ＮＨ２−Ｍ１３）でそれぞれ標識したオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ作製した。ＤＩＧ−Ｍ１３、ｂｉｏ−Ｍ１３、ＮＨ２−Ｍ１３の作製は受託業者に依頼した。なお、標識分子の性能差を明確にするため、今回作製したプローブはいずれも、通常のランダムプライム法などで作製したプローブと比較すると検出感度は大幅に低下する、前記プライマー１分子に対し標識分子を１分子を標識したプローブを作製している。
（１−２）ＤＭＳＯで１００μＭに調製した１００μＬのＮＨ２−Ｍ１３溶液（１０ｎｍｏｌ）と、６位をＮＨＳで活性化したエストラジオール（Ｅ２−ＮＨＳ）溶液（３３ｎｍｏｌ／μＬ）５μＬとを反応させた。
（１−３）室温で２時間放置後、ＴＥ緩衝液を９５μＬ添加し、未反応のＥ２−ＮＨＳを不活化することで、エストラジオールを標識したＭ１３プライマー（Ｅ２−Ｍ１３）を調製した。
【００２９】
（２）ゼータープローブ膜へのＤＮＡの固定化
（２−１）ｐＵＣ１１８を１μｇ／ｍＬになるように緩衝液Ａ（０．４Ｎ  ＮａＯＨ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で調製後、９５℃で１０分間加熱した。
（２−２）緩衝液Ａで３倍希釈系列を作製した。
（２−３）ＢｉｏＲａｄ社製ドットブロット装置にゼータープローブ膜をセットし、５００μＬのＴＥ緩衝液を加え吸引することで各ウエルを洗浄した。
（２−４）１ウェルあたり各種濃度のｐＵＣ１１８溶液を５００μＬアプライした。
（２−５）吸引後、５００μＬのＴＥ緩衝液を加え、さらに吸引することで各ウエルを洗浄した。
（２−６）装置から膜を取り出し、８０℃で３０分加熱することで、ＤＮＡを膜に固定化した。なお、一番下のウェルは固定化しなかった。
【００３０】
（３）オリゴヌクレオチドプローブとの反応
（３−１）（２）で調製したゼータープローブ膜を東洋紡績社製ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（ＨＹＢ−１０１）に浸し、３７℃で２０分間ブロッキングした。
（３−２）２ｐｍｏｌ／ｍＬになるようにＨＹＢ−１０１で希釈したプローブ（ＤＩＧ−Ｍ１３、ｂｉｏ−Ｍ１３またはＥ２−Ｍ１３）を３７℃で１６時間反応させた。
（３−３）０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液を用いて３７℃で４回洗浄した。
【００３１】
（４）酵素標識抗体の作製
ウサギモノクローナル抗Ｅ２抗体（Ｕ１６Ａ１４）、ラットモノクローナル抗Ｅ２抗体（Ｒａ０１）、マウスモノクローナル抗Ｅ２抗体（Ｍ−１）各１００μｇを、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識キット（同仁化学社製、ＬＫ１１）でプロトコルに従い標識した。また、対照として、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンはＺＹＭＥＤ社製４３−４３２３を、ＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体はロシュ社製１２０７７３３を、それぞれ使用した。
【００３２】
（５）検出抗体との反応と検出
（５−１）ゼータープローブ膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳ緩衝液で１時間ブロッキングした。
（５−２）ＤＩＧ−Ｍ１３プローブと反応させた場合は前述したＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体を取扱説明書に記載されている濃度で希釈したものを、Ｅ２−Ｍ１３を反応させた場合は（４）で調製したＨＲＰ標識した抗Ｅ２抗体を１０００倍希釈したものを、それぞれ反応させた。なお抗体は全てＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で希釈した。
（５−３）室温で１時間反応後、ＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製、ＲＰＮ２１３２）で検出した。
【００３３】
ＤＩＧ−Ｍ１３プローブをＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体で検出する場合と、ｂｉｏ−Ｍ１３プローブをＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する場合とで感度を比較した結果を図１に示す。この結果から、前者の方が検出感度が高いという結果が得られた。本結果は特許文献１に開示されている結果と同じであり、今回の実験は操作上問題ないことを示している。
【００３４】
ジゴキシゲニン標識プローブをＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体で検出する場合と、エストラジオール標識プローブを３種類の動物由来のＨＲＰ標識抗Ｅ２モノクローナル抗体で検出する場合とで、検出感度を比較した結果を図２に示す。図中マウスおよびラットと記載したものが，それぞれの動物由来のマウスモノクローナル抗体で、Ｕ１６Ａ１４はウサギモノクローナル抗体である。３種類の抗Ｅ２抗体を比較すると、ウサギモノクローナル抗体を使った場合の検出感度が一番高いことがわかる。さらに、抗ジゴキシゲニン抗体とウサギモノクローナル抗体を比較すると、明らかに、ウサギモノクローナル抗体を使った方がシグナル強度も強く検出感度も高いことがわかった。
【００３５】
実施例２  抗体濃度の違いによる検出感度の改善
実施例１のＨＲＰ標識した抗Ｅ２モノクローナル抗体（Ｕ１６Ａ１４）を、１０００倍、５００倍、２５０倍で希釈し反応させた結果を図３に示した。抗体の濃度を高めると検出感度が向上することが示され、さらに非特異的な吸着の増加は観察されなかった。なお、抗体濃度にも依存するが、ジゴキシゲニン標識プローブをＨＲＰ標識抗ジゴキシゲニン抗体で検出する場合と比較して検出感度は３倍から９倍向上していることがわかる。
【００３６】
実施例３  様々なウサギモノクローナル抗体を用いた検出感度の比較
種々のウサギモノクローナル抗体を検出抗体として検出感度を比較した。
（１）実施例１（５）に記載の方法と同様な方法で、プローブ（Ｅ２−Ｍ１３）の反応を行なった。
（２）酵素標識していない３種類のウサギモノクローナル抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で反応後、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（１０００倍希釈）と反応させた。その後ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製、ＲＰＮ２１３２）キットで検出した。
【００３７】
結果を図４に示す。図４に示すように、今回使用した３種類のウサギモノクローナル抗体はいずれも実施例１および２で用いたＵ１６Ａ１４と同等の感度を示すことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明は、これまでの核酸検出感度よりも高感度な検出を可能にする技術である。この方法は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの標識分子をエストラジオールに置き換え、検出物質をエストラジオールを認識する物質に変更することで達成されるため技術的な壁は無い。本発明の核酸検出方法および核酸検出試薬は、今まで検出が困難であった核酸を検出できるため、非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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