(57)【要約】【課題】本発明は、ＦＲＥＴを利用したポリマー形態の酵素基質、及び、その製造方法の提供を目的とする。【解決手段】    本発明は、ＦＲＥＴの蛍光ドナーが結合している重合性化合物、ＦＲＥＴの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物、並びに、ＦＲＥＴの蛍光ドナー及びＦＲＥＴの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物を共重合させてポリマー形態の酵素基質を製造する方法であって、ＦＲＥＴの蛍光ドナー又はＦＲＥＴの蛍光アクセプターのいずれか１つの結合が酵素基質部分を介する結合である、ポリマー形態の酵素基質の製造方法である。また、該製造方法によって合成される酵素基質である。【選択図】図１
2011201943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）のポリマー形態の酵素基質。
【化１】
2011201943.tif 000013
（式（Ｉ）中、Ａ、Ｂ又はＣのいずれか１つにＦＲＥＴの蛍光ドナーが結合しており、他の２つのいずれか１つにＦＲＥＴの蛍光アクセプターが結合しており、該蛍光ドナー又は該蛍光アクセプターのいずれか１つは、酵素の基質部分を介して結合しており、ｘ、ｙ及びｚは１以上の整数である。ただし、蛍光ドナー及び蛍光アクセプターのいずれも結合していないＡ、Ｂ又はＣに対応するｘ、ｙ又はｚは、０もしくは１以上の整数である）
【請求項２】
前記酵素が加水分解酵素である請求項１に記載の基質。
【請求項３】
前記酵素がエステル加水分解酵素、リン酸エステル加水分解酵素、糖加水分解酵素又はペプチド結合加水分解酵素のいずれかである請求項２に記載の基質。
【請求項４】
前記酵素がアミラーゼである請求項２に記載の基質。
【請求項５】
前記Ａに対応する重合性化合物が式（ＩＩ）の化合物であり、前記Ｃに対応する重合性化合物が式（ＩＩＩ）の化合物であり、前記Ｂに対応する重合性化合物がアクリルアミドであることを特徴とする請求項４に記載の基質。
【化２】
2011201943.tif 000014
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の基質を含む酵素活性測定用キット。
【請求項７】
ＦＲＥＴの蛍光ドナーが結合している重合性化合物、ＦＲＥＴの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物、並びに、ＦＲＥＴの蛍光ドナー及びＦＲＥＴの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物を共重合させてポリマー形態の酵素基質を１工程で製造する方法であって、ＦＲＥＴの蛍光ドナー又はＦＲＥＴの蛍光アクセプターのいずれか１つの結合が酵素基質部分を介する結合である、ポリマー形態の酵素基質の製造方法。
【請求項８】
前記共重合が、ラジカル重合であることを特徴とする請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
ＦＲＥＴの蛍光ドナーが結合している重合性化合物が式（ＩＶ）の化合物であり、ＦＲＥＴの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物が式（Ｖ）の化合物であり、ＦＲＥＴの蛍光ドナー及びＦＲＥＴの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物がアクリルアミドであることを特徴とする請求項７又は８に記載の製造方法。
【化３】
2011201943.tif 000015
（式（ＩＶ）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、シアノ基であり、Ｒ４は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光ドナーである）
【化４】
2011201943.tif 000016
（式（Ｖ）中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、シアノ基であり、Ｒ８は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光アクセプターである）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素の基質及びその製造方法に関する。より具体的には、ＦＲＥＴを利用した酵素の基質及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光共鳴エネルギー移動（FRET; Fluorescence Resonance Energy Transfer）を誘導する分子は、ストライヤーらにより分子定規として初めて合成され、以来、様々な分野においてその効果が利用されている。ストライヤーらによって合成された分子は、１００Å以内の鎖長となるペプチドの両末端に蛍光ドナーと蛍光アクセプター導入したもので、ドナーからの蛍光をアクセプターが吸収し、ドナーとは異なる波長の蛍光を発するものである。このペプチドが鎖内で切断されると、ドナーからの蛍光をアクセプターが吸収できなくなるため、アクセプターからの蛍光が検出されなくなり、代わりにドナーからの蛍光が検出されるようになる。このように、ペプチドの切断により分子から発せられる蛍光の波長が変化するため、この波長変化を利用するとペプチダーゼなどの酵素活性を測定することが可能となる。
これまでに、ＦＲＥＴを利用した酵素活性の測定方法、並びに酵素基質に関する報告は数多く知られている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１及び非特許文献２など）。このようなＦＲＥＴを利用した酵素基質及び酵素活性測定方法は、比較的検出感度が高いなどの利点を有する反面、基質の製造及び精製段階が煩雑であり、コストの面においても負担が大きいなど、改善すべき点も多く指摘されている。
【０００３】
これまでに報告のあるＦＲＥＴ を利用した酵素基質は、比較的低分子のものがほとんどで、ポリマー状の基質で実用的なものはこれまでにほとんど知られていない。例えば、ＦＲＥＴではなく、蛍光寿命の増減を検出して酵素活性を測定するポリマー状の基質の報告は存在するが、感度の点において、ＦＲＥＴには劣ることが予想される（特許文献３）。
以上のようにＦＲＥＴは酵素活性の基質に応用する技術として、極めて優れた技術ではあるが、検出可能なＦＲＥＴを惹起する基質を簡易にしかも低コストで製造する実用的な方法は、これまでの所知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−３３３６８１
【特許文献２】特表２００１−５０１１７０
【特許文献３】特表２００５−５２７２１２
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｙｏｓｈｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７  （１９９０）  ９５４−９５８
【非特許文献２】Ｍａｔｓｕｏｋａら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｓｙｍｅｔｒｙ，  ５  （１９９４）  ２２３５−２２３８．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来、ＦＲＥＴを利用した酵素基質は、低分子性のものが多く、その製造のために多くの工程と費用が必要とされていた。そのため、酵素活性の検出感度において優れているＦＲＥＴを、酵素基質として汎用性の高い技術として使用する上で、より簡易でコストも低い製造方法に改善する必要があった。
そこで、本発明は、ＦＲＥＴを利用したポリマー形態の酵素基質、及び、その製造方法の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＦＲＥＴ効果を利用した酵素基質の開発を行っていたところ、ＦＲＥＴの蛍光ドナー及び蛍光アクセプターを担持したモノマーからなるポリマーの合成に成功し、さらに、該ポリマーが酵素基質となり得ることを見出して本発明を完成させた。
ＦＲＥＴの蛍光ドナーと蛍光アクセプターを担持させたモノマーを使用し、ラジカル重合反応などを利用すると、１つの工程で短時間のうちにＦＲＥＴ感受性ポリマーを調製することが可能である。ここで調製されたポリマーには、酵素の認識部分を介して蛍光ドナー又はアクセプターが結合するモノマーが構成要素として含まれている。該ポリマーを基質として酵素活性を測定すると、非常に良好なＦＲＥＴ効果を確認することができた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の式（Ｉ）のポリマー形態の酵素基質である。
【化１】
2011201943.tif 000003
（式（Ｉ）中、Ａ、Ｂ又はＣのいずれか１つにＦＲＥＴの蛍光ドナーが結合しており、他の２つのいずれか１つにＦＲＥＴの蛍光アクセプターが結合しており、該蛍光ドナー又は該蛍光アクセプターのいずれか１つは、酵素の基質部分を介して結合しており、ｘ、ｙ及びｚは１以上の整数である。ただし、蛍光ドナー及び蛍光アクセプターのいずれも結合していないＡ、Ｂ又はＣに対応するｘ、ｙ又はｚは、０もしくは１以上の整数である。）
さらに、本発明は、ＦＲＥＴの蛍光ドナーが結合している重合性化合物、ＦＲＥＴの蛍光アクセプターが結合している重合性化合物、並びに、ＦＲＥＴの蛍光ドナー及びＦＲＥＴの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物を共重合させてポリマー形態の酵素基質を１工程で、一気に製造する方法であって、蛍光ドナー又は蛍光アクセプターのいずれか１つの結合が酵素基質部分を介する結合である、ポリマー形態の酵素基質の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の基質は、ＦＲＥＴ効果を利用して酵素活性を検出するものであり、共重合反応により煩雑な工程を経ることなく製造することが可能であり、また、製造コストも安価に抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の酵素基質の作用機序を模式的に示した図である。
【図２】図２は、本発明の製造方法により合成したアミラーゼの基質を用いて、活性測定をした結果である。経時的に、５２０ｎｍ付近の蛍光（蛍光アクセプター由来）が減少し、３４０ｎｍ付近の蛍光（蛍光ドナー由来）が増加している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施形態の１つは、ＦＲＥＴの蛍光ドナーが酵素基質部分を介し、又は介さずに結合した重合性化合物と、ＦＲＥＴの蛍光アクセプターが酵素基質部分を介し、又は介さずに結合した重合性化合物を共重合させてポリマー形態の酵素基質を製造する方法、あるいは、ＦＲＥＴの蛍光ドナー及びＦＲＥＴの蛍光アクセプターのいずれも結合していない重合性化合物をさらに加えて共重合させたポリマー形態の酵素基質を製造する方法である。
これらの重合性化合物をモノマーとして共重合させる場合、当業者によって容易に選択される重合方法であれば、いかなるものであってもよいが、重合反応を可能な限り短時間で、一気に進行させることができる重合方法が望ましい。重合方法として、例えば、付加重合反応（ラジカル重合反応、イオン重合反応）、開環重合反応、重縮合反応、重付加反応、付加縮合反応などが挙げられ、特に、ラジカル重合反応が簡便で好ましい方法である。また、本発明において使用される重合性化合物は、重合可能な官能基がモノマー内に存在し、溶媒に可溶であれば、いかなる化合物であってもよく、このような化合物は当業者により容易に選択可能なものを、目的に応じて適宜選択することができる。特に限定はしないが、本発明のモノマーとして例を挙げるとすれば、例えば、スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー、アクリルアミドなどのアクリル系モノマー、メタクリル系モノマー、アクリロニトリル、酢酸ビニルなどを挙げることができる。モノマーとして脂溶性のもの、例えば、スチレンなどを使用すると脂溶性の高いポリマーへの誘導が可能になるため、このように製造された酵素基質は、プラスチックなどの支持体に対して疎水性相互作用により、予め固定することも可能であり、酵素活性の測定キットなどの作製にも利用できる。
【００１２】
重合条件は、使用する重合性化合物や重合方法によって異なるが、当業者であれば適切な重合条件を選択することが可能である。また、各重合性化合物の混合比率についても、予め予備的な重合実験などを行うことにより、当業者において容易に決定することができる。例えば、アクリルアミドなどのアクリル系モノマーを重合性化合物として使用した場合、蛍光アクセプターが結合したモノマーと蛍光ドナーが結合したモノマーの混合比率は、アクセプター結合モノマー１に対してモル比で、１〜１００、２〜５０、好ましくは、５〜２０、より好ましくは１０程度である。また、アクセプターとドナーのいずれも結合していない重合性化合物をモノマーとして重合系に添加する場合の混合比率は、ドナー結合モノマーを１に対してモル比で、１〜５０、より好ましくは、５〜２０程度である。
【００１３】
本発明のポリマー形態の酵素基質を製造するためのモノマーは、ＦＲＥＴの蛍光ドナー又は蛍光アクセプターが、活性測定対象である酵素による認識部分（つまり、基質部分。例えば、ペプチダーゼであれば切断部位として認識されるアミノ酸配列を含むペプチド部分）を介して結合している重合性化合物である。このようなモノマーを使用すると、ポリマー骨格部分と蛍光ドナー又は蛍光アクセプターのいずれか１つとの間に酵素認識部分が複数介在する構造を持つポリマーが合成される。このようなポリマー形態の酵素基質に対して、例えば、酵素認識部分を切断するような酵素が作用すると、蛍光ドナー又は蛍光アクセプターのいずれかがポリマー骨格部分から分離されることになるため、ＦＲＥＴに変化が生じることになる。このＦＲＥＴ変化を検出することで酵素活性を検出、測定することが可能となる。本発明のポリマー形態の酵素基質は、共重合反応のような容易で一気に反応が進む工程を利用して構築されるものであるため、従来のＦＲＥＴ利用基質に比較して、簡便、かつ、安価に合成することが可能となる。また、本発明の酵素基質を合成するために使用する各モノマーの混合比率を変えることで、ＦＲＥＴの蛍光ドナーと蛍光アクセプターの組成比を容易に変更することができ、酵素活性の測定感度などの調節が可能となる。
ここでＦＲＥＴの蛍光ドナー及び蛍光アクセプターは、ＦＲＥＴを生じさせる蛍光分子ペアであれば如何なる組合せの蛍光分子ペアであってもよく、例えば、ドナー・アクセプターのペアとして、ナフチル基とダンシル基、ＥＤＡＮＳ基とＤＡＢＣＹＬ基などを挙げることができる。より詳細には、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１８，１−１３（１９９４）などを参照のこと。
【００１４】
本発明の製造方法で使用される蛍光ドナーを結合した重合性化合物を、より具体的に示すと、例えば、以下の式（ＩＶ）のようなビニル化合物を挙げることができる。
【化２】
2011201943.tif 000004
（式（ＩＶ）中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキメチル基、シアノ基であり、Ｒ４は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光ドナーである）
また、本発明で使用される蛍光アクセプターを結合した重合性化合物を、より具体的に示すと、例えば、以下の式（Ｖ）のようなビニル化合物を挙げることができる。
【化３】
2011201943.tif 000005
（式（Ｖ）中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が同一又は異なる、水素、塩素、フッ素、メチル基、アセチル基、カルボキシル基、カルボキメチル基、シアノ基であり、Ｒ８は、酵素認識部分を介して、又は介さず結合する蛍光ドナーである）
【００１５】
上記式（ＩＶ）及び式（Ｖ）で示されるような化合物とアクリルアミドのような重合性化合物を使用して重合反応を行った場合、図１に模式的に示されるようなポリマー基質が合成される。図１では、例として、励起波長２９０ｎｍで３４０ｎｍの発光を生じる蛍光ドナーを結合させたモノマー、励起波長３４０ｎｍで５４０ｎｍの発光を生じる蛍光アクセプターを結合させたモノマー及びアクリルアミドを用いて合成した酵素基質を示してある。合成されたポリマーは、励起波長２９０ｎｍで発光させるとドナーからは３４０ｎｍの発光が生じるが、この発光波長は、アクセプターの励起波長と重なるため、ＦＲＥＴ効果により５４０ｎｍの発光がアクセプターから観測される。ここで、蛍光ドナーが任意の加水分解酵素の認識部分を介してポリマー基質に結合している場合、このポリマー基質に加水分解酵素を作用させると酵素認識部分が切断されてドナーが脱離する。その結果、ＦＲＥＴ効果が消失して、代わりにドナー本来の発光（３４０ｎｍ）が観測されるようになる。
以上のように、本発明のポリマー形態の酵素基質を使用すれば、観測される蛍光の発光波長の変化を指標にして酵素活性を検出、測定することができる。
【００１６】
本発明の範囲には、上記製造方法によって製造されるポリマー形態の酵素基質も含まれる。
本発明の酵素基質は、例えば、以下の式（Ｉ）のポリマー形態の化合物として示すことができる。
【化４】
2011201943.tif 000006
（式（Ｉ）中、Ａ、Ｂ又はＣのいずれか１つにＦＲＥＴの蛍光ドナーが結合しており、他の２つのいずれか１つにＦＲＥＴの蛍光アクセプターが結合しており、該蛍光ドナー又は該蛍光アクセプターのいずれか１つは、酵素の基質部分を介して結合しており、ｘ、ｙ及びｚは１以上の整数である。ただし、蛍光ドナー及び蛍光アクセプターのいずれも結合していないＡ、Ｂ又はＣに対応するｘ、ｙ又はｚは、０もしくは１以上の整数である）
【００１７】
本発明の酵素基質は、ＦＲＥＴ効果を利用した活性測定が可能な酵素であれば如何なる酵素も基質とすることが可能である。特に限定はしないが、例えば、加水分解酵素など、例えば、カルボン酸エステル加水分解酵素（カルボキシルエステラーゼ、コリンエステラーゼ、ホスホリパーゼなど）、リン酸エステル加水分解酵素（ホスファターゼ、ヌクレアーゼなど）などのエステル加水分解酵素、糖加水分解酵素（（α−、β−）アミラーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼ、グルカナーゼ、グリコシダーゼ、シアリダーゼ、リゾチーム、マルターゼ、ガラクトシダーゼ、サッカラーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼなど）、ペプチド結合加水分解酵素（ペプチダーゼ、プロテアーゼなど）、エーテル・チオエーテル加水分解酵素、ペプチド以外のＣＮ結合加水分解酵素などの基質として使用することができる。
【００１８】
例えば、アミラーゼの基質として、以下の式（ＶＩ）で示される化合物を例示することができる。式（ＶＩ）のポリマー化合物は、Ａに対応するモノマーとして式（ＩＩ）の化合物を使用し、Ｃに対応するモノマーとして式（ＩＩＩ）の化合物を使用し、Ｂに対応するモノマーとしてアクリルアミドを使用し、本発明の製造方法によって合成することができる。ここで、式（ＩＩ）の化合物には、アミラーゼの基質部分を介して蛍光ドナーが結合しており、式（ＩＩＩ）の化合物には蛍光アクセプターが結合している。
【化５】
2011201943.tif 000007
【化６】
2011201943.tif 000008
【００１９】
本発明の酵素基質は、適当な容器又はパック中に使用説明書と共に酵素アッセイ用のキットとして提供することができる。本発明のキットとして供給される場合、本発明の酵素基質の他、酵素活性を測定するために必要なバッファーなどの試薬等が含まれていてもよい。酵素基質の安定性を保持するために、当業者によって適宜選択される保存方法によって、本発明の酵素基質をキット中に収納することが望ましい。本発明の酵素基質を収納する容器としては、酵素基質の物理化学的な安定性が保持されるような材質からなるものであればいかなる形状のものであってもよい。例えば、９６穴プレートなどのプラスチック製の基板等に分注し、場合によっては、該基質を基板状に固定（疎水性相互作用などにより）し、必要に応じて乾燥させた状態で提供してもよい。また、キットに使用説明書が添付される場合、その使用説明は、紙又は他の材質上に印刷されて供給されてもよく、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。あるいは、キットの製造者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００２０】
以下の実施例は、本発明の酵素基質として、アミラーゼ活性測定用基質の合成例とアミラーゼ活性測定結果を示すものである。本発明の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２１】
１．アミラーゼ基質合成
１−１. マルトテトラオース誘導体（ドナー）の合成
マルトテトラオース（１）を完全アセチル化した後、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏをプロモータして４−ペンテン−１−オールとのグリコシル化により、ペンテニル基をアノマー位に導入した。Ｚｅｍｐｌeｎ（ツェンプレン）条件下、脱アセチル化し、非還元末端の４位と６位をナフチリデン保護してから、残った水酸基を完全アセチル化した。さらに、Ｍｅ３Ｎ・ＢＨ３とＡｌＣｌ３を用いて選択的還元開裂させ、Ｚｅｍｐｌeｎ条件下で脱アセチル化した。ＵＶ照射下、２−アミノエタンチオールとラジカル付加反応をした後、アクリロイル化、精製のため完全アセチル化、さらに脱アセチル化して重合性蛍光ドナー（２）の合成を達成した（スキーム１）。
【化７】
2011201943.tif 000009
【００２２】
１−２．ダンシルクロライド誘導体（アクセプター）の合成
ダンシルクロライド（３）により、エチレンジアミンをダンシル化しアミン４へと誘導後、アクリロイル化して重合性蛍光アクセプター（５）を合成した（スキーム２）。
【化８】
2011201943.tif 000010
【００２３】
１−３．ドナーとアクセプターの重合反応
蛍光ドナー（２）、蛍光アクセプター（５）、およびアクリルアミドをＡＰＳ−ＴＥＭＥＤによるラジカル共重合反応によりポリマー（６）へと誘導した（スキーム３）。
【化９】
2011201943.tif 000011
【００２４】
合成例のポリマーの組成を表１に示す。
【表１】
2011201943.tif 000012
【００２５】
２．アミラーゼ活性の測定
上記のように合成した基質を１００μｌのＤＭＳＯに溶解させた後、１０μｌの溶液を６ｍｌのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）に拡散したものを基質溶液とし、活性測定には、そのうち３ｍｌ使用した。また、酵素溶液は、０．１ｍｇのアミラーゼを１ｍｌのＨＥＰＥＳに溶解させたものを１０μｌ使用した。基質溶液と酵素溶液を混合したのち、３７℃にて、経時的に蛍光スペクトルを測定した。その結果、時間の変化と共に５２０ｎｍの蛍光アクセプター由来の蛍光が減少し、３４０ｎｍ付近の蛍光ドナー由来の蛍光が増加することが明らかとなった。また、この蛍光スペクトルの変化は、３７０ｎｍ付近に等発光点が観測されたことから、単なる蛍光消光や希釈による現象ではないことも確かめられた（図２）。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によれば、ポリマー形態の酵素基質を簡易、かつ、安価に製造することができるため、酵素活性の検出に要するコストを削減することが可能となる。その結果、酵素活性の検出手段を利用する各分野に多大な貢献をすることが期待される。
【図１】
2011201943.tif 000017
【図２】
2011201943.tif 000018