(57)【要約】      （修正有）【課題】癌、血管新生関連障害、およびリンパ管新生関連障害の新規な処置の提供。【解決手段】止血を実質的に達成せず、他のプロテアーゼも実質的に阻害しないで、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質（クニッツドメインは、少なくとも二つのポリマー部分、例えば各１級アミンに結合したポリマー部分を含むことができる）を被験体に投与する、癌、血管新生関連障害、およびリンパ管新生関連障害を処置する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願は、２００４年１１月２２日に出願された、米国特許出願第６０／６３０，２２６号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／６３０，２２６号の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（概要）
プラスミンは、体内では主にその不活性チモーゲン型（プラスミノゲン）で存在するセリンプロテアーゼである。活性化されると、プラスミンは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のチモーゲンを含むタンパク質を加工することができる。線維素溶解（プラスミノゲン／プラスミン）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）タンパク質分解系はＥＣＭ分解の一因であり、治療的介入の魅力的な標的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様として、本開示は、転移性障害または他の癌性障害を処置する方法を特徴とする。本方法は、プラスミン阻害剤（例えばプラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質）を被験体に投与することを含む。一実施形態では、プラスミン阻害剤は、止血を実質的に達成しないものである。一実施形態では、プラスミン阻害剤は、他のプロテアーゼを実質的に阻害しない。一実施形態では、クニッツドメインは、少なくとも二つのポリマー部分（例えば各１級アミンに結合したポリマー部分）を含むことができる。一実施形態では、クニッツドメインを、担体タンパク質、例えばアルブミンまたはその断片、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはその断片に融合させることができる。被験体は、転移性障害もしくは他の癌性障害の危険があるもの、転移性障害もしくは他の癌性障害を持つと疑われるもの、または転移性障害もしくは他の癌性障害を持つものであることができる。例えば本方法は、転移性癌または潜在的に転移性の癌が存在するかどうかを決定するために、被験体を評価することを含むことができる。一実施形態では、癌細胞が、プラスミンの過剰な生成につながる高レベルのウロキナーゼを発現させる。
【０００４】
一実施形態では、クニッツドメインが、２０ｎＭ、２ｎＭ、または０．２ｎＭ未満のＫｉでプラスミンを阻害することができる。クニッツドメインはプラスミンに対して高い特異性を持つことができる。例えばクニッツドメインは、１００ｎＭ〜１ｍＭのＫｉでカリクレインも阻害しうるが、プラスミノゲン、ｕＰａ、またはｔＰａを５００ｎＭ未満のＫｉでは阻害しない。
【０００５】
一実施形態では、クニッツドメインが、インビトロでＬＮＣＡＰまたはＨＴ−１０８０細胞浸潤を阻害すること、および／またはインビトロで内皮細胞による管形成を阻害することができる。
【０００６】
一実施形態では、クニッツドメインが、
【０００７】
【数１】
2011184453.tif 000002
を含む。Ｘａａは任意のアミノ酸（例えば非システインアミノ酸）であるか、特定の位置ではＸａａは存在しないことができる。特定の位置で有用なアミノ酸は本明細書に記載する。クニッツドメインはヒトフレームワーク領域を含むことができる。一実施形態では、クニッツドメインがＤＸ−１０００のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、クニッツドメインがＤＸ−１０００と少なくとも８０％同一である。一実施形態では、クニッツドメインがＤＸ−１０００と少なくとも９０％同一である。一実施形態では、クニッツドメインがＤＸ−１０００と少なくとも９５％同一である。一実施形態では、クニッツドメインがＤＸ−１０００と同一である。一実施形態では、クニッツドメインとＤＸ−１０００との相違点が３アミノ酸未満の相違である。
【０００８】
一実施形態では、プラスミン阻害剤が凝固もしくは血小板機能を損なわないか、または凝固もしくは血小板機能を損なわない濃度で投与される。例えば、プラスミン阻害剤の濃度は、７００、５００、または２００ｎＭ未満である。
【０００９】
本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１０】
他の態様として、本開示は、癌（例えば線維肉腫、線維肉腫由来の転移、前立腺癌、前立腺癌由来の転移、乳癌、乳癌由来の転移、血管新生依存性癌、血管新生依存性癌由来の転移、リンパ管新生関連癌または本明細書に記載する他の癌）を処置する方法を特徴とする。本方法は、プラスミンを阻害するタンパク質の有効量を被験体に投与することを含む。例えばタンパク質は、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含む。
【００１１】
本方法は、第２の抗癌剤を被験体に投与することを、さらに含むことができる。例えば第２の抗癌剤は、ロイプロリド、ゴセレリン、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、ケトコナゾールまたはアミノグルテチミドである。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１２】
本方法は、血漿カリクレイン阻害剤（例えばＤＸ−８８）を被験体に投与することを、さらに含むことができる。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１３】
他の態様として、本開示は、本明細書に記載するプラスミン阻害剤をアジュバント療法として例えば被験体に投与する方法を特徴とする。アジュバント療法は、被験体が腫瘍の全部または一部を摘除するための手術を受けた後（例えば前立腺癌または乳癌または血管新生依存性癌を処置するための手術後）に被験体に投与される術後療法であることができる。例えばプラスミン阻害剤は、プラスミンを阻害するタンパク質、例えばクニッツドメインを含むタンパク質である。一実施形態では、プラスミン阻害剤が、手術の６、１２、２４、４８、または１００時間以内に投与される。プラスミン阻害剤は、手術後だけでなく、手術前、手術中にも投与することができる。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１４】
他の態様として、本開示は、過剰なプラスミン活性に起因すると考えられる障害を処置する方法を特徴とする。本方法は、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質のプラスミン阻害量をヒトまたは動物被験体に投与することを含む。例えばタンパク質は少なくとも二つのポリマー部分を含む。タンパク質はＤＸ−１０００および３個または４個のＰＥＧ部分を含むことができる。一実施形態では、タンパク質は、止血を実質的に達成しないものである。一実施形態では、タンパク質は、他のプロテアーゼを実質的に阻害しない。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１５】
他の態様として、本開示は、過剰なプラスミン活性に起因すると考えられる障害を処置する方法を特徴とする。本方法は、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質のプラスミン阻害量をヒトまたは動物被験体に投与することを含む。例えばタンパク質は、アルブミンまたはその断片に融合されたＤＸ−１０００を含む。一実施形態では、タンパク質は、止血を実質的に達成しないものである。一実施形態では、タンパク質は、他のプロテアーゼを実質的に阻害しない。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１６】
他の態様として、本開示は、癌（例えば転移性癌）の危険または存在に関して被験体を評価し、癌（特に転移性癌）の徴候が検出される場合は、その被験体に、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質の有効量を投与することを含む方法を特徴とする。一実施形態では、癌が、前立腺癌または本明細書に開示する別の癌である。例えば、評価ステップは、被験体から採取した試料中の前立腺特異抗原を検出することを含むことができる。評価ステップは、前立腺特異抗原に結合する試薬を被験体に投与して被験体を撮像することを含むことができる。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１７】
他の態様として、本開示は、被験体における血管新生を阻害する方法を特徴とする。一実施形態では、本方法は、プラスミン阻害剤、例えばプラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質であって、クニッツドメインが少なくとも二つのポリマー部分を含むものを被験体に投与することを含む。例えば、タンパク質はＤＸ−１０００および３個または４個のＰＥＧ部分を含む。例えば、タンパク質は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはその断片に融合されたＤＸ−１０００を含む。一実施形態では、プラスミン阻害剤は、止血を実質的に達成しないものである。一実施形態では、プラスミン阻害剤は、他のプロテアーゼを実質的に阻害しない。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１８】
他の態様として、本開示は、血管新生関連障害（例えば眼内血管新生性疾患、炎症、または血管新生依存性の癌もしくは腫瘍）を処置する方法を特徴とする。本方法は、有効量のプラスミン阻害剤（例えばプラスミンを阻害するタンパク質）を被験体に投与することを含む。例えば、タンパク質は、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含む。例えば、タンパク質は、少なくとも二つのポリマー部分を含む。タンパク質は、ＤＸ−１０００および３個または４個のＰＥＧ部分を含むことができる。一実施形態では、タンパク質は、止血を実質的に達成しないものである。一実施形態では、タンパク質は他のプロテアーゼを実質的に阻害しない。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００１９】
他の態様として、本開示は、リンパ管新生関連障害（例えば癌、例えば転移性癌、例えば転移性乳癌、転移性卵巣癌または転移性直腸結腸癌）を処置する方法を特徴とする。一実施形態では、本方法は、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質のプラスミン阻害量をヒトまたは動物被験体に投与することを含む。例えば、タンパク質は、少なくとも二つのポリマー部分を含む。タンパク質はＤＸ−１０００および３個または４個のＰＥＧ部分を含むことができる。一実施形態では、タンパク質は、止血を実質的に達成しないものである。一実施形態では、タンパク質は、他のプロテアーゼを実質的に阻害しない。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００２０】
他の態様として、本開示は、被験体におけるＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄ活性を減少させる方法を特徴とする。一実施形態では、本方法は、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質（例えばＤＸ−１０００）のプラスミン阻害量をヒトまたは動物被験体に投与することを含む。本方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
【００２１】
本明細書に記載するタンパク質（例えばクニッツドメインを含むタンパク質）は、本明細書に記載する特定のタンパク質と比較して、タンパク質機能（例えばプラスミンを阻害する能力）に実質的な影響を及ぼさない突然変異（例えば保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）を持ちうると理解される。ある特定の置換が許容されるかどうか、すなわち望ましい生物学的性質（例えば結合活性）に有害な影響を及ぼさないかどうかは、Ｂｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０に記述されているように決定することができる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似する側鎖を持つアミノ酸残基で置き換えられる置換である。当技術分野では、類似する側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。多くのフレームワークアミノ酸残基およびＣＤＲアミノ酸残基は、１以上の保存的置換を含むことができる。
【００２２】
二つの配列間の配列比較および一致率の決定は、数学的アルゴリズムを使って行うことができる。典型的には、二つのヌクレオチド配列間の一致率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムにより、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアリング行列を使って、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５で決定される。
【００２３】
「非必須」アミノ酸残基が、生物学的活性を破壊せずに、より好ましくは生物学的活性を実質的に変化させずに、結合剤（例えば抗体）の野生型配列から変化させることができる残基であるのに対して、「必須」アミノ酸残基はそのような変化をもたらす。
【００２４】
「アルキル」という用語は、直鎖でも分枝鎖でもよい、表示した数の炭素原子を含有する炭化水素鎖である。例えばＣ１−Ｃ１２アルキルは、その中に１〜１２（１および１２を含む）個の炭素原子を持ちうる基を示す。
【００２５】
「アリール」という用語は、芳香族単環式、二環式、または三環式炭化水素環系を指し、置換が可能な任意の環原子は置換基で置換することができる。アリール部分の例には、フェニル、ナフチル、およびアントラセニルなどがあるが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
結合親和力は、ＢＩＡ−ＣＯＲＥ解析または同等なアッセイを使って、ｐＨ７．２のリン酸緩衝食塩水中で決定することができる。
【００２７】
添付の図面および以下の説明では、本発明の１以上の実施形態の詳細を述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書および図面、ならびに特許請求の範囲から明白になるだろう。本明細書で言及する公開特許出願、特許、および参考文献は全て、参照により、そのまま本明細書に組み入れられる。特に、米国特許第５，６６３，１４３号、第５，２２３，４０９号、第６，０１０，０８０号、第６，１０３，４９９号および第６，３３３，４０２号ならびに米国特許出願第１０／９３１，１５３号は、参照により、そのまま本明細書に組み入れられる。
本発明はまた、以下の項目も提供する。
（請求項１）
被験体における前立腺癌または前立腺癌由来の転移を処置するための医薬の製造のための、ＤＸ−１０００の結合ループ、またはＤＸ−１０００の結合ループとは２個以下のアミノ酸が異なっているループを含むクニッツドメインを含むタンパク質の使用。
（請求項２）
被験体における乳癌または乳癌由来の転移を処置するための医薬の製造のための、ＤＸ−１０００の結合ループまたはＤＸ−１０００の結合ループとは２個以下のアミノ酸が異なっているループを含むクニッツドメインを含むタンパク質の使用。
（請求項３）
被験体における血管新生関連障害またはリンパ管新生関連障害を処置するための医薬の製造のための、ＤＸ−１０００の結合ループまたはＤＸ−１０００の結合ループとは２個以下のアミノ酸が異なっているループを含むクニッツドメインを含むタンパク質の使用。
（請求項４）
前記血管新生関連障害が眼内血管新生性疾患である、請求項３に記載の使用。
（請求項５）
前記血管新生関連障害が炎症である、請求項３に記載の使用。
（請求項６）
前記血管新生関連障害が血管新生依存性癌または腫瘍である、請求項３に記載の使用。
（請求項７）
前記リンパ管新生関連障害が、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄを高度に発現させる乳癌、卵巣癌または結腸直腸癌である、請求項３に記載の使用。
（請求項８）
前記クニッツドメインが静脈内投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
（請求項９）
前記クニッツドメインがモノＰＥＧ化される、請求項１〜８に記載の使用。
（請求項１０）
前記クニッツドメインがポリＰＥＧ化される、請求項１〜８に記載の使用。
（請求項１１）
前記クニッツドメインがアルブミンまたはその断片に融合される、請求項１〜８に記載の使用。
（請求項１２）
前記クニッツドメインが血漿カリクレイン阻害剤と組み合わせて投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用
（請求項１３）
前記クニッツドメインが凝固または血小板機能を損なわない、上記請求項にいずれか一項に記載の使用。
（請求項１４）
前記クニッツドメインが術後アジュバント療法の一部として、腫瘍を摘除するための手術を受けた被験体に投与される、請求項１、２、６、または７に記載の使用。
（請求項１５）
前記クニッツドメインがＤＸ−１０００とは３アミノ酸未満の相違で異なっている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
（請求項１６）
前記クニッツドメインがＤＸ−１０００と同一である、上記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】プラスミンの機能を他のタンパク質と関連づけて説明する図である。
【図２】ＤＸ−１０００の存在下および不在下での細胞移動の変化を示すグラフである。
【図３】ＬＮＣａＰ細胞浸潤に対するＤＸ−１０００の阻害効果を示すグラフである。
【図４】ＨＴ−１０８０細胞浸潤に対するＤＸ−１０００の阻害効果のグラフである。
【図５】ＨＴ−１０８０細胞浸潤に対するＤＸ−１０００の阻害効果のグラフである。
【図６】ＬＮＣａＰ細胞（図６）およびＨＴ−１０８０細胞（図７）に対するＤＸ−１０００および４−ＰＥＧ  ＤＸ−１０００の阻害効果を比較したグラフである。
【図７】ＬＮＣａＰ細胞（図６）およびＨＴ−１０８０細胞（図７）に対するＤＸ−１０００および４−ＰＥＧ  ＤＸ−１０００の阻害効果を比較したグラフである。
【図８】正常マウスにおけるＤＸ−１０００および４−ＰＥＧ５−ＤＸ−１０００の体内分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（詳細な説明）
プラスミン（プラスミノゲンの活性化型）は線維素溶解に重要なセリンプロテアーゼである。プラスミンは血管新生または血管リモデリングにおけるキー酵素でもある。プラスミンの阻害剤は、新生物細胞の転移を、例えば血管リモデリングの阻害、細胞外マトリックスの改変および他の機序などによって、防止し、または減少させるために、使用することができる。血管リモデリングは、血行力学的刺激に呼応して血管壁の持続的構造変化をもたらす。血管リモデリングは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解、細胞増殖および細胞移動を必要とする多くの病態生理学的過程の一構成要素である。このリモデリング過程を阻害する方法は、新生物障害、特に転移性癌に関係する障害を処置するために使用することができる。代表的な癌として、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、直腸結腸癌および線維肉腫が挙げられる。関連する他の癌として、肺、リンパ系、胃腸路（例えば結腸）および尿生殖路、卵巣、ならびに咽頭に由来する癌を挙げることができる。
【００３０】
代表的なプラスミン阻害剤として、ＤＸ−１０００およびクニッツドメインを含む他のタンパク質が挙げられる。
【００３１】
ＤＸ−１０００
ＤＸ−１０００は、ヒトプラスミン阻害剤を阻害するクニッツドメインである（Ｋｉ＝８８ｐＭ）。クニッツドメインの詳細については後述する。ＤＸ−１０００タンパク質は、ヒトＬＡＣＩのフレームワーク領域を含むが、他のフレームワークを使用することもできる。ＤＸ−１０００の配列は、以下のアミノ酸配列（配列番号２２）を含むことができる。
【００３２】
【数２】
2011184453.tif 000003
この配列に二つのＮ末端アミノ酸（「ＥＡ」）を先行させて以下の配列（配列番号２３）が含まれるようにすることができる。
【００３３】
【数３】
2011184453.tif 000004
いくつかの機能的細胞系活性アッセイで試験したところ、ＤＸ−１０００は強力な阻害活性を示した。第１に、ＤＸ−１０００（１ｎＭ）は、マトリゲルを通したＬＮＣａＰ（前立腺癌）およびＨＴ−１０８０（線維肉腫）のＤＨＴ刺激による浸潤（プラスミノゲン／プラスミン系に依存することが知られている過程）を、どちらも阻害した。興味深いことに、ＤＸ−１０００は、癌細胞浸潤およびＥＣＭタンパク質分解に直接関与するゼラチナーゼ類の発現および活性化を、効率よくダウンレギュレートした。また、ＤＸ−１０００（１〜１０ｎＭ）は、ヒトおよびマウス内皮細胞の管形成を、マトリゲル上に播種したか、コラーゲンＩ型上に播種したかに関わらず、効率よく阻止した。止血面に関して、ＤＸ−１０００は、包括的凝固スクリーニング検査にも血小板機能スクリーニング検査にも、臨床的に有意な効果を示さなかった。
【００３４】
ＤＸ−１０００は、例えばＰＥＧ化などによって修飾することができる。ｍＰＥＧによる修飾には三つのリジンおよびＮ−末端を利用することができ、これらの位置のうち１箇所、２箇所またはそれ以上を修飾することができる（例えばこれら４箇所の全てを修飾することができる）。化合物４×ＰＥＧ  ＤＸ−１０００は、４個のＰＥＧ部分を含む代表的な修飾ＤＸ−１０００分子である。ＤＸ−１０００は、約５ｋＤａまたは７ｋＤａの平均分子量を持つｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸と化合させることができる。
【００３５】
ＤＸ−１０００をアルブミンまたはその断片と融合させて、その生体内半減期、治療活性、または貯蔵寿命を延ばすこともできる。アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）またはその断片を含み、Ｃ末端部分としてＤＸ−１０００を含むことができる。もう一つの選択肢として、アルブミン融合タンパク質は、Ｃ末端部分としてアルブミン（例えばヒト血清アルブミン）またはその断片を含み、Ｎ末端部分としてＤＸ−１０００を含んでもよい。さらにまた、ＤＸ−１０００を、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）またはその断片の内部領域に挿入することもできる。
【００３６】
ＤＸ−１０００変種および他の阻害性クニッツドメイン
米国特許第６，１０３，４９９号には、ＱＳ４、ＮＳ４、ＳＰＩ１１、ＳＰＩ１５、ＳＰＩ０８、ＳＰＩ２３、ＳＰＩ２２、ＳＰＩ６０、ＳＰＩ４３、ＳＰＩ５１、ＳＰＩ５４、ＳＰＩ４７、ＳＰＩ４１、ＤＰＩ−１．１．１、ＤＰＩ−１．１．２、ＤＰＩ−１．１．６などといった種々のクニッツドメインを含む、さらなるプラスミン阻害剤が記載されている。この特許には、結合ループ中の特定位置における変異の例も示されており、プラスミンを阻害するＤＸ−１０００変種が記載されている。本明細書に記載する治療方法では、この特許に記載されているクニッツドメインも使用することができる。
【００３７】
式：
【００３８】
【数４】
2011184453.tif 000005
を持つクニッツドメインを含むタンパク質の代表的なプラスミン阻害量。
【００３９】
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７および／またはＸａａ５８は、存在しなくてもよい。Ｘａａ１０は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、またはＧｌｎであることができる。Ｘａａ１１は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｓｐであることができる。Ｘａａ１３は、Ｐｒｏ、ＬｅｕまたはＡｌａであることができる。Ｘａａ１５は、ＬｙｓまたはＡｒｇであることができる。Ｘａａ１６は、ＡｌａまたはＧｌｙであることができる。Ｘａａ１７は、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＳｅｒであることができる。Ｘａａ１８は、ＰｈｅまたはＩｌｅであることができる。Ｘａａ１９は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＩｌｅであることができる。Ｘａａ２１は、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐであることができる。Ｘａａ２２は、ＴｙｒまたはＰｈｅであることができる。Ｘａａ２３は、ＴｙｒまたはＰｈｅであることができる。Ｘａａ３１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎまたはＡｌａであることができる。Ｘａａ３２は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、またはＧｌｎであることができる。Ｘａａ３４は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ａｌａ、またはＳｅｒであることができる。Ｘａａ３５は、ＴｙｒまたはＴｒｐであることができる。Ｘａａ３６は、ＧｌｙまたはＳｅｒであることができる。Ｘａａ３９は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、またはＭｅｔであることができる。Ｘａａ４０は、ＧｌｙまたはＡｌａであることができる。Ｘａａ４３は、ＡｓｎまたはＧｌｙであることができ；あるいはＸａａ４５は、ＰｈｅまたはＴｙｒであることができる。指定しない場合、Ｘａａは任意のアミノ酸、特に任意の非システインアミノ酸であることができる。
【００４０】
さらに、Ｘａａ１０はＡｓｐまたはＧｌｕであることができる。Ｘａａ１１は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＳｅｒであることができる。Ｘａａ１３はＰｒｏである。Ｘａａ１５はＡｒｇである。Ｘａａ１６はＡｌａである。Ｘａａ１７はＡｒｇである。Ｘａａ１８はＰｈｅである。Ｘａａ１９はＧｌｕまたはＡｓｐであることができる。Ｘａａ２１はＰｈｅまたはＴｒｐであることができる。Ｘａａ２２はＴｙｒまたはＰｈｅであることができる。Ｘａａ２３はＴｙｒまたはＰｈｅであることができる。Ｘａａ３１はＡｓｐまたはＧｌｕであることができる。Ｘａａ３２は、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＧｌｕであることができる。Ｘａａ３４は、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＴｈｒであることができる。Ｘａａ３５はＴｙｒである。Ｘａａ３６はＧｌｙである。Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであることができる。Ｘａａ４０はＧｌｙまたはＡｌａであることができる。Ｘａａ４３はＡｓｎまたはＧｌｙであることができ；あるいはＸａａ４５はＰｈｅまたはＴｙｒであることができる。
【００４１】
一実施形態では、タンパク質が、ＤＸ−１０００の第１および／または第２結合ループのアミノ酸配列の少なくとも８０、８５、９０、９５％、または１００％を含む。一実施形態では、タンパク質が、ヒトクニッツドメイン（例えば本明細書に記載するヒトクニッツドメイン）に由来するフレームワーク領域を含む。
【００４２】
代表的なＤＸ−１０００変種として、（例えば置換、挿入、または消去などによって）ＤＸ−１０００のアミノ酸配列（例えば配列番号２３）または配列番号２２のアミノ酸配列とは少なくとも一つのアミノ酸が異なるが、相違するアミノ酸は８個、６個、５個、４個、３個、または２個未満であるようなアミノ酸配列を持つタンパク質が挙げられる。相違は、第１結合ループ以外の領域、または第１および第２結合ループ以外の領域、例えばフレームワーク領域中に存在することができる。典型的には、そのクニッツドメインは、自然界においてヒトには存在しないが、ヒトクニッツドメイン（例えば本明細書に記載するヒトクニッツドメイン）との相違が１０、７、または４アミノ酸未満であるアミノ酸配列を含みうる。
【００４３】
一実施形態では、プラスミンに関する化合物のＫｉが、プラスミンに関するＤＸ−１０００のＫｉの０．５〜１．５倍、０．８〜１．２倍、０．３〜３．０倍、０．１〜１０．０倍、または０．０２〜５０．０倍の範囲にある。
【００４４】
クニッツドメイン
ＤＸ−１０００はプラスミンを阻害するクニッツドメインを含む。ＤＸ−１０００および関連クニッツドメインをここに説明する。
【００４５】
クニッツドメインは、少なくとも５１個のアミノ酸を持ち、少なくとも２個、好ましくは３個のジスルフィドを含有する、ポリペプチドドメインである。このドメインは、第１システインと第６システイン、第２システインと第４システイン、そして第３システインと第５システインがジスルフィド結合を形成するように折りたたまれる（例えば５８個のアミノ酸を有するクニッツドメインでは、システインが、以下に記載するＢＰＴＩ配列の番号で、アミノ酸５、１４、３０、３８、５１、および５５に相当する位置に存在することができ、ジスルフィドは、５位と５５位、１４位と３８位、そして３０位と５１位にあるシステイン間に形成することができる）か、あるいは二つのジスルフィドが存在する場合、それらのジスルフィドは、その対応するシステインサブセット間に形成することができる。各システイン間の間隔は、以下に記載するＢＰＴＩ配列の番号付けで５と５５、１４と３８、および３０と５１に相当する位置の間の間隔に対して７、５、４、３または２アミノ酸以内であることができる。ＢＰＴＩ配列は、任意の一般クニッツドメインにおける特定位置を指すための基準として使用することができる。関心被験体のクニッツドメインとＢＰＴＩとの比較は、整列したシステインの数が最大になるような最適アラインメントを同定することによって行うことができる。
【００４６】
ＢＰＴＩのクニッツドメインの３Ｄ構造（高分解能）が知られている。Ｘ線構造の一つは、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに「６ＰＴＩ」として登録されている。いくつかのＢＰＴＩホモログの３Ｄ構造が知られている（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（７）：５９１−５９８；Ｈｙｎｅｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１００１８−１００２２）。少なくとも７０のクニッツドメイン配列が知られている。既知のヒトホモログには、ＬＡＣＩの三つのクニッツドメイン（Ｗｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６００１−６００４；Ｇｉｒａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５１８−２０；Ｎｏｖｏｔｎｙら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（３１）：１８８３２−１８８３７）、インター−α−トリプシンインヒビター、ＡＰＰ−Ｉの二つのクニッツドメイン（Ｋｉｄｏら，（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（３４）：１８１０４−１８１０７）、コラーゲン由来のクニッツドメイン、およびＴＦＰＩ−２の三つのクニッツドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９１：３３５３−３３５７）などがある。ＬＡＣＩは、三つのクニッツドメインを含有する分子量３９ｋＤａのヒト血清リン酸化糖タンパク質（表１のアミノ酸配列）である。
【００４７】
【表１】
2011184453.tif 000006
上記クニッツドメインをＬＡＣＩ−Ｋ１（残基５０〜１０７）、ＬＡＣＩ−Ｋ２（残基１２１〜１７８）、およびＬＡＣＩ−Ｋ３（２１３〜２７０）と呼ぶ。ＬＡＣＩのｃＤＮＡ配列は、Ｗｕｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３（１３）：６００１−６００４）に報告されている。Ｇｉｒａｒｄら（Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３３８：５１８−２０）には、三つのクニッツドメインのそれぞれのＰ１残基を変化させた突然変異研究が報告されている。ＬＡＣＩ−Ｋ１は、第ＶＩＩａ因子（Ｆ．ＶＩＩａ）が組織因子と複合体を形成した時にＦ．ＶＩＩａを阻害し、ＬＡＣＩ−Ｋ２は第Ｘａ因子を阻害する。
【００４８】
代表的なクニッツドメインを含有するタンパク質には、以下に挙げるものがある（カッコ内はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴアクセッション番号）：
【００４９】
【数５】
2011184453.tif 000007
【００５０】
【数６】
2011184453.tif 000008
表２：１９のヒトクニッツドメインのアミノ酸配列（１９のヒトクニッツドメイン結合ループのアミノ酸配列に下線を引く）
【００５１】
【数７】
2011184453.tif 000009
【００５２】
【数８】
2011184453.tif 000010
さまざまな方法を使って配列データベースからクニッツドメインを同定することができる。例えば、クニッツドメインの既知のアミノ酸配列、コンセンサス配列、またはモチーフ（例えばＰｒｏＳｉｔｅ  Ｍｏｔｉｆ）を、ＧｅｎＢａｎｋ配列データベース（国立バイオテクノロジー情報センター、米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）に対して、例えばＢＬＡＳＴを使って検索したり、ＨＭＭ（隠れマルコフモデル）のＰｆａｍデータベースに対して、例えばＰｆａｍ検索用のデフォルトパラメータを使って検索したり、ＳＭＡＲＴデータベースに対して検索したり、またはＰｒｏＤｏｍデータベースに対して検索したりすることができる。例えば、Ｐｆａｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ９のＰｆａｍアクセッション番号ＰＦ０００１４は、数多くのクニッツドメインと、クニッツドメインを同
定するためのＨＭＭを与える。Ｐｆａｍデータベースの説明はＳｏｎｈａｍｍｅｒら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２８（３）：４０５−４２０に見出すことができ、ＨＭＭの詳細な説明は、例えばＧｒｉｂｓｋｏｖら（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４３５５−４３５８；Ｋｒｏｇｈら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１５０１−１５３１；およびＳｔｕｌｔｚら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３０５−３１４などに見出すことができる。Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５８５７およびＳｃｈｕｌｔｚら（２０００）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８：２３１に記載されているＨＭＭのＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，ＥＭＢＬ，ドイツ・ハイデルベルク）。ＳＭＡＲＴデータベースには、ＨＭＭｅｒ２検索プログラムの隠れマルコフモデルを使ったプロファイリングによって同定されるドメインが含まれている（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎら（１９９８）「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」ケンブリッジ大学出版局）。このデータベースはアノテーションが付され、モニターされる。ＰｒｏＤｏｍタンパク質ドメインデータベースは相同ドメインの自動編集物からなる（Ｃｏｒｐｅｔら（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２６３−２６７）。ＰｒｏＤｏｍの最新バージョンは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ３８およびＴＲＥＭＢＬタンパク質データベースの反復的ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索を使って構築される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｇｏｕｚｙら（１９９９）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：３３３−３４０）。このデータベースは各ドメインについてコンセンサス配列を自動的に生成する。Ｐｒｏｓｉｔｅでは、クニッツドメインがモチーフとして列挙され、クニッツドメインを含むタンパク質が同定される。例えばＦａｌｑｕｅｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：２３５−２３８（２００２）を参照されたい。
【００５３】
プロテアーゼ阻害剤を選択するのに有用なクニッツドメインとしては、特定のリジン残基数を持つフレームワーク領域を有するクニッツドメインを挙げることができる。ある実施態様では、４個のリジン残基を持つフレームワークが有用であり、それらを、例えば３〜８ｋＤａ（例えば約５ｋＤａ）の平均分子量を持つＰＥＧ部分の結合などによって、修飾することができる。例えばＩＴＩフレームワークは４個のリジンを持っている。もう一つの実施態様では、３個のリジンを持つフレームワークが有用であり、それらを、例えば４〜１０ｋＤａ（例えば約５ｋＤａまたは７ｋＤａ）の平均分子量を持つＰＥＧ部分の結合などによって、修飾することができる。ＬＡＣＩはそのようなフレームワークの一つである。フレームワークには、含まれるリジンの数が増減するように、例えば結合ループの５、４、または３残基以内にあるリジンの数を減らすために、または小さなＰＥＧ部分（例えば３〜８ｋＤａのＰＥＧ部分）でタンパク質を修飾することによってタンパク質のサイズおよびインビボでのタンパク質の安定性を増加させることができるように十分な数のリジンを導入するために、改変を加えることもできる。
【００５４】
クニッツドメインは、主に二つのループ領域（「結合ループ」）中のアミノ酸を使って、標的プロテアーゼと相互作用する。第１ループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸１１〜２１にほぼ相当する残基間にある。第２ループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸３１〜４２にほぼ相当する残基間にある。クニッツドメインの代表的なライブラリーでは、第１および／または第２ループ領域中の１以上のアミノ酸位置を変化させる。変化させるのに特に有用な位置には以下に挙げる位置がある：ＢＰＴＩの配列に関して１３、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４、および３９位。これらの位置の少なくとも一部は、標的プロテアーゼと密接に接触すると予想される。
【００５５】
クニッツドメインの「フレームワーク領域」は、クニッツドメインの一部を成す残基であるが、第１および第２結合ループ領域中の残基（例えばＢＰＴＩのアミノ酸１１〜２１およびＢＰＴＩのアミノ酸３１〜４２にほぼ相当する残基）は特に除外した残基であると定義される。フレームワーク領域はヒトクニッツドメイン（例えばＬＡＣＩ）に由来することができる。代表的なフレームワークは、少なくとも１個、２個、または３個のリジンを含むことができる。一実施形態では、それらのリジンがＬＡＣＩのフレームワーク内に見出される位置に相当する位置、またはそのような位置から少なくとも３、２、または１アミノ酸以内にある位置に存在する。
【００５６】
逆に、これらの特定位置にない残基またはループ領域中にない残基は、これらのアミノ酸位置よりも、広範囲にわたるアミノ酸置換（例えば保存的および／または非保存的置換）を許容しうる。
【００５７】
特定の特異性を持つクニッツドメインをスクリーニングし単離するための代表的方法には、例えばＵＳ２００４−０２０９２４３、ＵＳ５，２２３，４０９、およびＵＳ６，４２３，４９８に記載されている方法がある。クニッツドメインを含むタンパク質は、組換え技法を使って、細菌（例えば大腸菌）、酵母（例えばサッカロミセスまたはピキア）、昆虫細胞、哺乳動物細胞、またはトランスジェニック動物（例えば乳汁中に分泌させるため）で産生させることができる。
【００５８】
プラスミン阻害剤−抗体
プラスミン阻害剤の一種類には抗体が含まれる。代表的な抗体は、プラスミンに特異的に結合する。抗体はいくつかの方法でプラスミンを阻害することができる。例えば、活性部位の１以上の残基と接触したり、活性部位を立体的に障害または妨害したり、プラスミンの成熟を防いだり、触媒活性に必要なコンフォメーションを不安定化したりすることができる。
【００５９】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）を含むことができる。もう一つの例では、抗体が二つの重（Ｈ）鎖可変領域と二つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体」という用語は、完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合性断片（例えば単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片）も包含する。
【００６０】
ＶＨ領域およびＶＬ領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変領域と、その中に点在する保存度の高い「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる領域とに、さらに細分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲは精密に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版，米国保険社会福祉省，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照されたい）。ここではＫａｂａｔの定義を使用する。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲから構成され、それらがアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００６１】
「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変ドメインまたは定常ドメインに由来するドメインを指す。免疫グロブリンドメインは、典型的には、およそ七つのβストランドと保存されたジスルフィド結合とから形成される二つのβシートを含有する（例えばＡ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照されたい）。
【００６２】
本明細書にいう「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。例えばその配列は、天然可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含むことができる。例えばその配列は、１個、２個またはそれ以上のＮ末端またはＣ末端アミノ酸、内部アミノ酸を欠くか、１以上の挿入または追加末端アミノ酸を含むか、あるいは他の改変を含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドが、もう一つの免疫グロブリン可変ドメイン配列と会合して、標的結合構造（または「抗原結合部位」）（例えば、非活性型構造と比較して、活性型インテグリン構造または活性型インテグリン構造の模倣物と優先的に相互作用する構造）を形成することができる。
【００６３】
抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、さらに、重鎖または軽鎖定常領域の全部または一部を含むことにより、それぞれ免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖を形成することができる。一実施形態では、抗体が、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖の四量体であって、それらの免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖が、例えばジスルフィド結合によって互いに連結されている。重鎖定常領域は三つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域はＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、典型的には、例えば免疫系のさまざまな細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体活性化経路の第１成分（Ｃ１ｑ）などといった宿主組織または宿主因子に対する抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（ならびにそのサブタイプ）の完全な免疫グロブリンを包含する。免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ型またはラムダ型であることができる。一実施形態では、抗体は、グリコシル化される。抗体は、抗体依存性細胞傷害および／または補体媒介性細胞傷害に関して機能的であっても非機能的であってもよい。
【００６４】
抗体の１以上の領域は、ヒト型または事実上ヒト型であることができる。例えば可変領域の１以上は、ヒト型または事実上ヒト型であることができる。例えばＣＤＲの１以上はヒト型、例えばＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３であることができる。軽鎖ＣＤＲのそれぞれはヒト型であることができる。ＨＣ  ＣＤＲ３はヒト型であることができる。フレームワーク領域の１以上はヒト型、例えばＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４であることができる。一実施形態では、全てのフレームワーク領域が、ヒト体細胞（例えば免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞）などに由来するヒト型である。一実施形態では、ヒト配列が、生殖系列核酸などによってコードされる生殖系列配列である。定常領域の１以上はヒト型または事実上ヒト型であることができる。もう一つの実施形態では、抗体全体の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、または９８％が、ヒト型または事実上ヒト型であることができる。「事実上ヒト型」の免疫グロブリン可変領域とは、その免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原応答を誘発しないように、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含んでいる免疫グロブリン可変領域である。「事実上ヒト型」の抗体とは、その抗体が正常なヒトにおいて免疫原応答を誘発しないように、十分な数のヒトアミノ酸位置を含んでいる抗体である。
【００６５】
抗体の全部または一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによってコードされうる。代表的なヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）が可変領域遺伝子によってコードされ、ＣＯＯＨ末端がカッパまたはラムダ定常領域によってコードされる。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）も同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記定常領域遺伝子の一つ、例えばガンマ（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされる。
【００６６】
プラスミンに結合してプラスミンを阻害する抗体を同定するための代表的方法の一つは、非ヒト動物をプラスミンまたはその断片で免疫することを含む。小さなペプチドでも免疫原として使用することができる。一実施形態では、触媒活性が低下しているか触媒活性を持たない突然変異型プラスミンを、免疫原として使用する。免疫した動物から脾細胞を単離し、それを使ってハイブリドーマ細胞を標準的方法で作出することができる。一実施形態では、非ヒト動物が１以上のヒト免疫グロブリン遺伝子を含む。
【００６７】
プラスミンに結合してプラスミンを阻害するタンパク質を同定するためのもう一つの代表的方法は、タンパク質のライブラリーを用意し、そのライブラリーから、プラスミンまたはその断片に結合する１以上のタンパク質を選択することを含む。選択はいくつかの方法で行うことができる。例えばライブラリーは、ディスプレイライブラリーまたはタンパク質アレイの形式で用意することができる。選択に先だって、非標的分子（例えばプラスミン以外のプロテアーゼまたは活性部位にアクセスできない（例えばアプロチニンなどの阻害因子によって結合されている）プラスミン）と相互作用するメンバーを除去するために、ライブラリーを予備選別（例えば消耗）することができる。
【００６８】
抗体ライブラリー（例えば抗体ディスプレイライブラリー）は、いくつかの方法で構築することができる（例えばｄｅ  Ｈａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−８を参照されたい）。さらに、各方法の構成要素を他の方法の構成要素と併用することもできる。単一の免疫グロブリンドメイン（例えばＶＨもしくはＶＬ）または複数の免疫グロブリンドメイン（例えばＶＨおよびＶＬ）に変異が導入されるような形で、これらの方法を使用することができる。変異は、免疫グロブリン可変ドメインの、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４（重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの一方または両方のこれらの領域を指す）の１以上の領域内に、導入することができる。一実施形態では、与えられた可変ドメインの三つのＣＤＲの全てに、変異が導入される。もう一つの好ましい実施形態では、変異が（例えば重鎖可変ドメインの）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２内に導入される。任意の組み合わせを実施することができる。抗体（例えば完全長抗体またはその抗原結合性部分）を組換え発現させるための代表的な系では、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウムトランスフェクションによって、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞に導入される。組換え発現ベクター内では、遺伝子の高レベルな転写が起こるように、抗体重鎖遺伝子および抗体軽鎖遺伝子のそれぞれが、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなど、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス、その他に由来するもの）に作動可能に連結される。組換え発現ベクターは、ベクターがトランスフェクトされているＣＨＯ細胞をメトトレキサート選択／増幅で選択することを可能にするＤＨＦＲ遺伝子も保持する。選択された形質転換体宿主細胞を培養して、抗体重鎖および抗体軽鎖を発現させ、完全な抗体を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技法を使って、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。例えば一部の抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧを使ったアフィニティクロマトグラフィーによって単離することができる。抗体は、トランスジェニック動物に産生させることもできる。
【００６９】
プラスミン阻害剤−ペプチド
結合性リガンドは、標的分子に独立して結合する３２アミノ酸以下のペプチドを含むことができる。そのようなペプチドの一部は、１以上のジスルフィド結合を含むことができる。他のペプチド、いわゆる「線状ペプチド」は、システインを欠いている。一実施形態では、ペプチドが人工ペプチド、すなわち自然界には存在しないか、１以上の関心被験体ゲノム（例えばヒトゲノム）によってコードされるタンパク質中には存在しないペプチドである。合成ペプチドは、溶解状態ではほとんどまたは全く構造を持たない（例えば無構造）か、不均一な構造を持つか（例えば選択的コンフォメーションもしくは「柔構造」）を持つか、または唯一のネイティブ構造を持つ（例えば共同的に折りたたまれる）ことができる。一部の合成ペプチドは、標的分子に結合した時に、特定の構造をとる。代表的な合成ペプチドのいくつかは、少なくとも一つのジスルフィド結合と、例えば約４〜１２個の非システイン残基のループとを持つ、いわゆる「環状ペプチド」である。代表的なペプチドは、２８、２４、２０、または１８アミノ酸未満の長さである。
【００７０】
プラスミンに独立して結合するペプチド配列は、さまざまな方法のいずれかによって同定することができる。例えばそれらは、ディスプレイライブラリーまたはペプチドのアレイから選択することができる。同定後は、それらのペプチドを、合成的に、または組換え手段によって、製造することができる。それらの配列は、より長い配列に組み入れる（例えば挿入する、付け加える、または結合する）ことができる。
【００７１】
代表的なファージライブラリーをスクリーニングすることにより、本明細書に記載するペプチドリガンドの少なくとも一部を見出すことができる。各ライブラリーは、短い変化に富む外因性ペプチドを、Ｍ１３ファージの表面にディスプレイすることができる。これらのライブラリーの五つのペプチドディスプレイは、システイン残基が隣接するそれぞれ４、５、６、７、８、１０、１１、または１２アミノ酸のセグメントを持つ親ドメインに基づくことができる。システインの対は、安定なジスルフィド結合を形成して、環状ディスプレイペプチドをもたらすと考えられる。それらの環状ペプチドを、ファージ表面上のプロテインＩＩＩのアミノ末端にディスプレイさせることができる。２０アミノ酸線状ディスプレイを持つファージライブラリーをスクリーニングすることもできる。
【００７２】
Ｋａｙら「Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，サンディエゴ  １９９６）および米国特許第５，２２３，４０９号で論じられている技法は、選択した親テンプレートに対応する潜在的結合剤のライブラリーを調製するのに有用である。そのような技法に従ってライブラリーを調製し、例えばプラスミンに結合してプラスミンを阻害するペプチドを求めて、そのライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００７３】
また、ファージライブラリーまたはファージライブラリーから選択した集団を、例えば、アプロチニンの結合または他のプラスミン阻害剤の結合などによって失活させたプラスミンを使って、対抗選択することもできる。そのような手順は、活性部位と接触しないペプチドを捨てるために用いることができる。
【００７４】
代替的主鎖（例えばペプトイド主鎖）を使ってペプチドを合成することにより、例えば増加したプロテアーゼ耐性を持つ化合物を製造することもできる。特にこの方法は、プラスミンに結合してプラスミンを阻害する化合物であって、それ自体はプラスミンによる効果的な切断を受けない化合物を製造するために使用することができる。
【００７５】
その他のプラスミン阻害剤として小分子（例えば７００ダルトンより小さい分子または４個未満のペプチド結合を含む分子）が挙げられる。さらなる代表的プラスミン阻害剤としてアルファ２−プラスミンインヒビターおよびアルファ２−マクログロブリンが挙げられる。
【００７６】
薬学的組成物
プラスミン阻害剤（例えばプラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質（例えばＤＸ−１０００））を含む化合物を含む組成物（例えば薬学的に許容できる組成物）も特徴の一つである。一実施形態では、タンパク質を例えばＰＥＧなどのポリマーで修飾する。薬学的組成物には、治療用または予防用化合物だけでなく、診断（例えばインビボ撮像）用化合物（例えば標識化合物）も包含される。
【００７７】
薬学的に許容できる担体には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などが含まれる。一実施形態では、担体が水以外である。好ましくは、担体は、（例えば注射または注入による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または表皮投与に適する。投与経路によっては、化合物を酸や化合物を失活させうる他の自然条件から保護するための素材で、活性化合物を被覆してもよい
薬学的に許容できる塩は、親化合物の望ましい生物学的活性を保っていて、望ましくない毒性効果を付与しない塩である（例えばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、ホスホン酸などの無毒性無機酸から誘導されるもの、ならびに例えば脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性有機酸から誘導されるものが含まれる。塩基付加塩には、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から誘導されるもの、ならびに例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性有機アミンから誘導されるものが含まれる。
【００７８】
本組成物はさまざまな形態をとりうる。それらには、例えば、溶液剤（例えば注射用および注入用溶液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソームおよび坐剤などの、液体、半固体および固体剤形が含まれる。形態は意図する投与様式および治療用途に依存しうる。典型的な組成物は、注射用または注入用溶液剤（例えば抗体をヒトに投与する際に用いられるものと同様の組成物）の形態をとる。投与は非経口投与であることができる。非経口投与の例には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射が含まれる。一実施形態では、化合物が静脈内注入または静脈内注射によって投与される。もう一つの実施形態では、化合物が筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【００７９】
薬学的組成物は、典型的には、無菌であり、製造条件下および貯蔵条件下で安定である。薬学的組成物が投与に関する規制基準および工業規格を満たすことを保証するために、薬学的組成物を検査することもできる。例えば、ＵＳＰ  ２４／ＮＦ  １９の方法に従い、リムルス変形細胞溶解物アッセイを使って（例えばＢｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒのキット、ロット番号７Ｌ３７９０，感度０．１２５ＥＵ／ｍＬを使って）、調製物中のエンドトキシンレベルを検査することができる。薬学的組成物の無菌性は、ＵＳＰ  ２４／ＮＦ  １９の方法に従い、チオグリコール酸培地を使って決定することができる。例えば、調製物を使ってチオグリコール酸培地に接種し、３５℃で１４日以上インキュベートする。
微生物の成長を検出するために、培地を定期的に点検する。
【００８０】
組成物は、溶液剤、マイクロエマルション剤、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則正しい構造物として調剤することができる。滅菌注射用溶液剤は、必要量の活性化合物を、適当な溶媒に、上に列挙した成分の一つまたは組み合わせと共に組み入れた後、必要に応じて、滅菌濾過することによって、製造することができる。一般に分散剤は、活性成分を、基礎分散媒および上に列挙した成分から選択される必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤に組み入れることによって製造される。滅菌注射用溶液剤を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、活性成分と、他の任意の望ましい成分（前もって滅菌濾過しておいたその溶液に由来するもの）との粉末が得られる。溶液剤の適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用などによって維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えばモノステアリン酸塩およびゼラチン）を組成物に含めることによって、引き起こすことができる。
【００８１】
本明細書に記載するプラスミン阻害剤は、さまざまな方法によって投与することができる。多くの用途では、投与経路／投与様式が、静脈内注射、皮下注射、または注入である。例えば治療用途では、化合物を、静脈内注入により、例えば３０、２０、１０、５または１ｍｇ／分未満の速度で、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量に達するまで投与することができる。投与経路および／または投与様式は所望する結果に依存して変化しうる。
【００８２】
一定の実施形態では、プラスミン阻害剤が、その阻害剤を急速な放出から保護するであろう担体を使って調製される（例えば、インプラントを含む制御放出製剤、およびマイクロカプセル化送達システムなど）。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を製造するための方法は数多く特許され、または広く知られている。例えば「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク，１９７８などを参照されたい。薬学的調剤は確立された技術であり、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」第２０版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌら「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」第７版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ編「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，第３版（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）に詳述されている。
【００８３】
一定の実施形態では、例えば不活性希釈剤または同化可能な食用担体などを使って、組成物を経口投与してもよい。化合物（および所望であれば他の成分）は、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入するか、錠剤に圧縮するか、被験体の食餌に直接組み入れることもできる。治療的経口投与には、化合物を賦形剤と共に組み入れて、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用することができる。化合物を非経口投与以外の方法で投与するには、化合物を、その失活を防止する素材でコーティングするか、化合物と、その失活を防止する阻害とを、同時投与することが必要かもしれない。
【００８４】
薬学的組成物は医用装置を使って投与することができる。代表的な医用装置には、ニードルレス皮下注射装置、注入ポンプ、浸透圧送達システムなどがある。
【００８５】
プラスミン阻害剤は、有効量（障害を改善することができる量または障害のさらなる悪化を防止することができる量）の阻害剤を与えるために投与することができる。最適な所望の応答（例えば治療的応答）が得られるように、投薬レジメンを調節することができる。投薬量は、例えば個々の状況および／または利用できるインビボデータもしくはインビトロデータを考慮するなどして、担当医師および／または薬剤師の判断に基づくことができる。例えば、治療的状況に応じて、単回ボーラスを投与したり、時間をかけて数回の分割投与を行ったり、用量を比例的に増減したりすることができる。投与を容易にし、投薬量を均一にするために、非経口組成物を投薬単位剤形に調剤することは、特に有利である。投薬単位剤形は、処置被験体に単一の投薬量を与えるために使用することができ、各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を、必要な薬学的担体と一緒に含有する。投薬単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物に特有の特徴および達成されるべき治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性を処置する目的でそのような活性化合物を配合する際につきまとう制限によって定められ、それらに直接依存しうる。
【００８６】
一定の実施形態では、インビボでの適正な分布が保証されるように、化合物を調剤することができる。例えば、リポソームを使って、または血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って送達するための適当な部分に結合させることによって、化合物を調剤することができる。リポソームは、特別な細胞または器官に選択的に輸送される１以上の部分を含むことができ、それゆえに標的薬物送達を増進することができる（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。
【００８７】
本開示は、プラスミン阻害剤（例えば本明細書に記載するプラスミン阻害剤）および使用（例えば処置、予防、または診断的使用）のための指示を含むキットも提供する。一実施形態では、キットが、（ａ）化合物、例えば化合物を含む組成物と、任意に（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載する方法および／または本明細書に記載する方法のための化合物の使用に関する記述的資料、指示資料、マーケティング資料または他の資料であることができる。例えば情報資料には、転移性癌または血管新生関連障害を調整する目的で化合物を投与するための方法が記述される。
【００８８】
一実施形態では、情報資料が、化合物を適切な方法（例えば適切な用量、剤形、または投与様式（例えば本明細書に記載する用量、剤形、または投与様式））で投与するための指示を含みうる。もう一つの実施形態では、情報資料が、適切な被験体（例えばヒト、例えば過剰なプラスミン活性を特徴とする障害を持っているヒト、またはそのような障害のリスクがあるヒト）を同定するための指示を含みうる。情報資料は、化合物の製造、化合物の分子量、濃度、使用期限、バッチまたは生産拠点情報などに関する情報を含みうる。キットの情報資料の形態に制限はない。
【００８９】
キットは、少なくとも一つの追加試薬、例えば診断剤または治療剤、例えば本明細書に記載する診断または治療剤、および／または転移性癌または血管新生関連障害を処置するための１以上の追加薬剤を、さらに含有することができる。
【００９０】
ポリマー
さまざまな部分を使って、クニッツドメインを含むタンパク質または他のプロテアーゼ阻害剤の分子量および／または半減期を増加させることができる。一実施形態では、その部分がポリマー（例えば水溶性および／または実質的に非抗原性のポリマー、例えばホモポリマー、または非生体ポリマー）である。実質的に非抗原性のポリマーには、例えばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドが含まれる。この部分は、循環、例えば血液、血清、リンパ、または他の組織におけるクニッツドメインの安定性および／または貯留を、例えば少なくとも１．５、２、５、１０、５０、７５、または１００倍改善しうる。複数の部分がクニッツドメインに結合される。例えば、タンパク質は少なくとも三つのポリマー部分に結合される。タンパク質の各リジンを、ポリマー部分に結合することができる。一般に、本明細書に記載するクニッツドメインは、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１０／９３１，１５３に記述されているように修飾することができる。ＵＳ６，１０３，４９９に記載の配列を持つかそのモチーフに合致するクニッツドメインは、本明細書に記載するように修飾することができる。
【００９１】
適切なポリマーは実質的に重量が異なりうる。例えば、約２００ダルトン〜約４０ｋＤａ、例えば１〜２０ｋＤａ、４〜１２ｋＤａまたは３〜８ｋＤａの範囲（例えば約４、５、６、または７ｋＤａ）の平均分子量を持つポリマーを使用することができる。一実施形態では、化合物に結合される個々のポリマー部分の平均分子量が、２０、１８、１７、１５、１２、１０、８、または７ｋＤａ未満である。最終的な分子量は、コンジュゲートの望ましい有効サイズ、ポリマーの性質（例えば線状または分岐などの構造）、および誘導体化度にも依存しうる。
【００９２】
限定するわけではないが、代表的なポリマーの一覧には、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーが含まれる（ただしブロックコポリマーの水溶性は維持されるものとする）。ポリマーは親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンであることができる。他の有用なポリマーには、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ポリ乳酸；ポリグリコール酸；ポリメタクリレート；カルボマー；糖モノマーＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸、またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸を含む分岐または非分岐多糖（ラクトース、セルロース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖の多糖サブユニット（例えばヒアルロン酸）などのホモ多糖およびヘテロ多糖を含む）；糖アルコールのポリマー、例えばポリソルビトールおよびポリマンニトール；ヘパリンまたはヘパロン（ｈｅｐａｒｏｎ）などがある。一部の実施形態では、ポリマーが種々の異なるコポリマーブロックを含む。
【００９３】
クニッツドメインを含むタンパク質は、様々な方法で、ポリマーと物理的に結合させることができる。典型的にはタンパク質をポリマーに複数の部位で共有結合する。例えばタンパク質を、複数の１級アミン（例えば全ての利用可能な１級アミンまたは全ての１級アミン）で、ポリマーにコンジュゲートする。他の化合物、例えば細胞毒、ラベル、またはもう一つのターゲティング剤、例えばクニッツドメインと同じ標的に結合するもう一つのリガンドまたは別の標的に結合するリガンド、例えば無関係なリガンドなどを、同じポリマーに結合することもできる。他の化合物はタンパク質に結合してもよい。
【００９４】
一実施形態では、タンパク質へのコンジュゲーション前に、ポリマーが水溶性である（ただしそうである必要があるわけではない）。一般に、タンパク質へのコンジュゲーション後は、生成物は水溶性であり、例えば少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。加えて、ポリマーは、コンジュゲートの形態で高度に免疫原性であってはならないし、コンジュゲートを静脈内注入または静脈内注射で投与しようとする場合には、そのような経路に適合しない粘性を持ってはならない。
【００９５】
一実施形態では、ポリマーが反応性の基を一つだけ含有する。これは、一つのポリマーが複数のタンパク質分子にコンジュゲートすることを避けるのに役立つ。タンパク質へのコンジュゲーションには、モノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えばモノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）；Ｃ１−４アルキル末端ポリマー；およびビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を使用することができる。例えばＵ．Ｓ．５，９５１，９７４を参照されたい。
【００９６】
ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧは、その最も一般的な形態では、ヒドロキシル基を末端とする線状または分岐ポリエーテルである。線状ＰＥＧは以下の一般構造を持つことができる：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ＰＥＧは、エポキシド環への水酸化物イオンの求核攻撃によって開始されるエチレンオキシドのアニオン開環重合によって合成することができる。タンパク質修飾に特に有用なものは、一般構造：
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
を持つモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）である。
【００９７】
さらなる説明については、例えばＲｏｂｅｒｔｓら（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６を参照されたい。一実施形態では、コンジュゲーションに用いられるポリマー単位が単分散であるか、さもなければ高度に均一である（例えば９５％の分子または全ての分子が互いに７、５、４、３、２、または１ｋＤａ以内にあるような調製物中に存在する）。もう一つの実施形態では、ポリマー単位が多分散である。
【００９８】
ポリマー単位間の架橋または複数のタンパク質へのコンジュゲーションを減少させる反応条件を選択し、実質的に均一な誘導体（例えばクニッツドメインタンパク質を一つだけ含む誘導体）を回収するために、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーによって反応生成物を精製することが可能である。別の実施形態では、ポリマーが、複数のタンパク質（例えば複数ユニットのクニッツドメインタンパク質）をポリマーに連結する目的で、２個以上の反応性基を含有する。この場合も、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを使って、所望の誘導体を実質的に均一な形態で回収することができる。
【００９９】
クニッツドメインを含むタンパク質は、一般に、複数のＰＥＧ分子に結合される。例えば、２０または３０ｋＤａより大きい化合物を形成させるために、クニッツドメイン（約７ｋＤａ）を、少なくとも三つの、８ｋＤａのＰＥＧ分子に結合させることができる。例えば少なくとも２分子、４分子、または５分子のＰＥＧなど、他の組み合わせも可能である。ＰＥＧ分子の分子量は、化合物の最終的分子量が望ましい分子量（例えば１７〜３５、または２０〜２５、または２７〜３３ｋＤａ）と同等か、それ以上になるように選択することができる。複数のＰＥＧ分子は、クニッツドメインの任意の領域に、好ましくは標的と相互作用する領域から少なくとも５、１０、または１５Åの位置に、または標的と相互作用するアミノ酸から少なくとも２、３、または４残基の位置に、結合させることができる。ＰＥＧ分子は、例えばリジン残基またはリジン残基とＮ末端との組み合わせに、結合させることができる。
【０１００】
タンパク質（例えばクニッツドメインを含むタンパク質）をポリマーに結合させるには、共有結合（例えばＮ末端アミノ基およびリジン残基上に見出されるイプシロンアミノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたは他の親水性基へのコンジュゲーション）を用いることができる。ポリマーは、多官能性（通常は二官能性）架橋剤を使用せずに、タンパク質に直接的に共有結合することができる。アミノ基への共有結合は、塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセチル；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび酢酸無水物、またはＰＥＧ塩化物＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル、活性化ジチオカーボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく既知の化学によって達成することができる。カルボキシル基は、カルボジイミドを使ってＰＥＧ−１級アミンをカップリングすることによって、誘導体化することができる。スルフヒドリル基は、マレイミド置換ＰＥＧ（例えばＷＯ９７／１０８４７）またはＰＥＧ−マレイミド（例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（アラバマ州ハンツビル）から販売されているもの）へのカップリングによって誘導体化することができる。もう一つの選択肢として、例えばＰｅｄｌｅｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１２６−１１３０（１９９４）に記述されているように、タンパク質上の遊離アミノ基（例えばリジン残基上のイプシロンアミノ基）を２−イミノ−チオレート（トラウト試薬）でチオール化した後、それをＰＥＧのマレイミド含有誘導体にカップリングすることもできる。
【０１０１】
クニッツドメインを含むタンパク質に結合させることができる官能化ＰＥＧポリマーとして、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒ，Ｉｎｃ．（アラバマ州ハンツビル）などから市販されているポリマーが挙げられる。そのようなＰＥＧ誘導体には、例えばアミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシネート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジルカーボネートなどがある。これらのＰＥＧ誘導体をカップリングするための反応条件は、タンパク質、所望するＰＥＧ化度、および利用するＰＥＧ誘導体に応じて、さまざまでありうる。ＰＥＧ誘導体の選択に関与する因子には、例えば、望ましい結合点（リジンまたはシステインＲ基など）、誘導体の加水分解安定性および反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、解析への適性などがある。
【０１０２】
クニッツドメインを含むタンパク質とポリマーとのコンジュゲートは、クロマトグラフィー法を使って、例えばゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣにより、未反応の出発物質から分離することができる。同じ方法で異種のコンジュゲート種が相互に精製される。未反応アミノ酸のイオン特性の相違により、異なる種（例えば一つまたは二つのＰＥＧ残基を含有するもの）の分割も可能である。例えばＷＯ９６／３４０１５を参照されたい。
【０１０３】
一実施形態では、非タンパク質部分（例えば本明細書に記載のポリマー）を、クニッツドメイン上の利用可能な１級アミン（例えばＮ末端１級アミンおよび溶媒の接近が可能な任意の１級アミン、例えばクニッツドメイン中のリジン側鎖の接近可能な１級アミン）のそれぞれに結合させる。例えば、考えうる１級アミンの全てを非タンパク質部分の一つにコンジュゲートする。クニッツドメインは、少なくとも１個、２個、３個、または４個のリジンを持ちうる。例えばクニッツドメインは、リジン残基を１個だけ、２個だけ、３個だけ、４個だけ、または５個だけ持ちうる。一実施形態では、タンパク質がＮ末端１級アミンを持つ。もう一つの実施形態では、タンパク質がＮ末端１級アミンを含まない（例えば、非ポリマー化合物などを使って、タンパク質をそのＮ末端１級アミンで化学的に修飾することにより、タンパク質がその位置に１級アミンを含まないようにすることができる）。
【０１０４】
タンパク質中の１級アミンのうち、二つ以上に、非タンパク質部分（例えばポリマー）を結合させることができる。例えば全てのリジンまたは溶媒の接近が可能な１級アミンを持つ全てのリジンが、非タンパク質部分に結合される。好ましくは、クニッツドメインは、その結合ループの一つ（例えばＢＰＴＩのアミノ酸１１〜２１およびＢＰＴＩの３１〜４２に対応する残基付近）の中に、リジンを含まない。そのような結合ループ内のリジンは、例えばアルギニン残基で置き換えることができる。例えばタンパク質を少なくとも三分子のポリマーに結合させる。タンパク質の各リジン、またはリジンの１個、２個、３個もしくはそれ以上を、１分子のポリマーに結合させることができる。
【０１０５】
１級アミン（例えば特定のリジンのもの、またはＮ末端にあるもの）が修飾されている、またはそこに非タンパク質部分が結合されていると言った場合、別段の表示がない限り、調製物中の全ての分子上の指定した１級アミン位置が、そのように修飾されているわけではないかもしれないと解釈される。調製物は完全に均一である必要はない。一部の実施形態では均一であることが望ましいものの、それが絶対的に必要なわけではない。好ましい実施形態では、修飾されるとした１級アミンの少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９、または１００％に、非タンパク質部分が結合しているだろう。しかし、他の実施形態には、分子の大半、例えば少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９７、９８、９９、または１００％が、二つ以上の部位でＰＥＧ化されているが、調製物中の分子上の部位（および場合によっては修飾部位の数）はさまざまであるような分子種の混合物を含有する調製物が含まれる。例えば一部の分子は修飾されたリジンＡ、Ｂ、およびＤを持ち、他の分子は修飾されたアミノ末端ならびにリジンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを持つだろう。このような調製物は、例えば本明細書に記載する処置方法または治療方法に従って、被験体に投与することができる。
【０１０６】
一実施形態では、非タンパク質部分が、親水性ポリマー、例えば実質的に均一なポリマーを含む。ポリマーは分岐していても、分岐していなくてもよい。例えばポリマー部分は、２０、１８、１５、１２、１０、８、７、もしくは６ｋＤａ未満、または少なくとも１．５、２、２．５、３、５、６、１０ｋＤａ、例えば約５ｋＤａの分子量（例えば化合物に付加される部分の平均分子量）を持つ。一実施形態では、化合物上のＰＥＧ部分の分子量の和が、少なくとも１５、２０、２５、３０、もしくは３５ｋＤａ、および／または６０、５０、４０、３５、３０、２５、もしくは２３ｋＤａ未満である。
【０１０７】
一実施形態では、ポリマーがポリアルキレンオキシドである。例えば、そのポリマーのコポリマーブロックの少なくとも２０、３０、５０、７０、８０、９０、または９５％は、エチレングリコールである。一実施形態では、ポリマーがポリエチレングリコールである。
【０１０８】
一実施形態では、化合物が以下の構造を持つ：Ｐ−Ｘ０−［（ＣＲ’Ｒ”）ｎ−Ｘ１］α−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ２−Ｒｔ［式中、Ｐはタンパク質であり、Ｒ’およびＲ”のそれぞれは独立してＨまたはＣ１−Ｃ１２アルキルである；Ｘ０はＯ、Ｎ−Ｒ１、Ｓであるか、存在せず（この場合、Ｒ１はＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールである）、Ｘ１はＯ、Ｎ−Ｒ２、Ｓであり（この場合、Ｒ２はＨ、アルキルまたはアリールである）、Ｘ２はＯ、Ｎ−Ｒ３、Ｓであるか、存在せず（この場合、Ｒ３はＨ、アルキルまたはアリールである）、各ｎは１〜５（例えば２）であり、ａは少なくとも４であり、ｍは０〜５であり、ＲｔはＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールである］。Ｒ’およびＲ”はＨであることができる。一実施形態では、Ｒ’またはＲ”が独立してＨ，またはＣ１−Ｃ４，Ｃ１−Ｃ６、もしくはＣ１−Ｃ１０アルキルである。
【０１０９】
一実施形態では、化合物が以下の構造を持つ：Ｐ−Ｘ０−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ａ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ２−Ｒｔ［式中、Ｐはタンパク質であり、ａは少なくとも４であり、ｍは０〜５であり、Ｘ２はＯ、Ｎ−Ｒ１、Ｓであるか、存在せず（この場合、Ｒ１はＨ、アルキルまたはアリールである）、Ｘ０はＯ、Ｎ−Ｒ２、Ｓであるか、存在せず（この場合、Ｒ２はＨ、アルキルまたはアリールである）、ＲｔはＨ、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアリールである］。例えばＸ２はＯであり、ＲｔはＣＨ３である。（ｍＰＥＧの使用は好ましい。）一実施形態では、クニッツドメインタンパク質の分子量が１４、８、または７ｋＤａ未満である。一実施形態では、クニッツドメインタンパク質がクニッツドメインを一つだけ含む。一般に、化合物はクニッツドメインを一つだけ含むが、一部の実施形態では、含まれるクニッツドメインが一つより多い場合もある。
【０１１０】
一実施形態では、クニッツドメインがＤＸ−１０００のアミノ酸配列を含むか、ＤＸ−１０００のアミノ酸配列とは、アミノ酸の相違（例えば置換、挿入、または欠失）が少なくとも一つはあるが、アミノ酸の相違は６、５、４、３、または２個未満であるようなアミノ酸配列を含む。典型的には、このクニッツドメインは、ヒトに、天然には存在しないものである。クニッツドメインは、ヒトクニッツドメインとは１０、７、または４個未満のアミノ酸が異なっているアミノ酸配列を含みうる。
【０１１１】
一実施形態では、エラスターゼに対する化合物のＫｉが、未修飾タンパク質のＫｉの０．５〜１．５、０．８〜１．２、０．３〜３．０、０．１〜１０．０、または０．０２〜５０．０倍の範囲にある。例えばｈＮＥに対するＫｉは、１００、５０、１８、１２、１０、または９ｐＭ未満であることができる。
【０１１２】
一実施形態では、化合物は、ウサギまたはマウスモデルにおいて、その最も寿命の長い成分の循環半減期（「最長期循環半減期」）が、ポリマーを含まない実質的に同一の化合物よりも、少なくとも１．５、２、４、または８倍大きい。化合物は、ウサギまたはマウスモデルにおいて、非タンパク質部分を含まない実質的に同一な化合物と比較して少なくとも１．５、２，２．５、または４倍の大きさを持つ最長期循環半減期を持つことができる。化合物は、ウサギまたはマウスモデルにおいて、非タンパク質部分を含まない実質的に同一の化合物と比較して少なくとも２０、３０、４０、または５０％小さい大きさを持つα期循環半減期を持つことができる。例えば化合物は、少なくとも４０、４５、４６、５０、５３、５４、６０、または６５％の大きさを持つ最長期循環半減期を持つ。一実施形態では、化合物が、マウスまたはウサギモデルにおいて、少なくとも２、３、４、５、６、または７時間というβ期循環半減期を持つ。一実施形態では、化合物が、７０ｋｇのヒトにおいて、少なくとも６時間、１２時間、２４時間、２日、５日、７日、または１０日という最長期循環半減期を持つ。
【０１１３】
血清アルブミン融合物
プラスミン阻害剤（例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質）を担体タンパク質（例えば血清アルブミン）またはその断片に融合することにより、アルブミン融合タンパク質のプラスミン阻害剤部分を安定化し、そのインビボ半減期、治療活性または貯蔵寿命を、非融合状態にあるプラスミン阻害剤のインビボ半減期、治療活性または貯蔵寿命と比較して延長し、または拡大することができる（例えばＵＳ−２００４−０１７１７９４を参照されたい）。
【０１１４】
本明細書にいう「アルブミン」は、アルブミンタンパク質もしくはアルブミンアミノ酸配列、またはアルブミンの機能的活性（例えば生物学的活性）を一つ以上持っているアルブミン断片もしくはアルブミン変種を集合的に指す。アルブミンの一例は、ヒトアルブミンまたはその断片である（例えばＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７を参照されたい）。
【０１１５】
特に、本願方法のアルブミン融合タンパク質は、ヒトアルブミンおよびヒトアルブミン断片、例えばＥＰ３２２０９４に開示されている断片（すなわちＨＡ（Ｐｎ）、この場合、ｎは３６９〜４１９である）の天然多型変種を含みうる。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来しうる。非哺乳類アルブミンには、例えばニワトリおよびサケのアルブミンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、プラスミン阻害剤タンパク質とは異なる動物に由来しうる。
【０１１６】
本願方法のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、少なくとも一つの、アルブミンのサブドメインもしくはドメイン、またはその保存的変形を含みうる。融合物がサブドメインに基づく場合は、プラスミン阻害剤に連結するために、要すれば、隣接するリンカーの一部または全部を使用してもよい。
【０１１７】
アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミンを、Ｃ末端部分としてプラスミン阻害剤を含みうる。もう一つの選択肢として、アルブミン融合タンパク質は、Ｃ末端部分としてアルブミンを、Ｎ末端部分としてプラスミン阻害剤を含むこともできる。
【０１１８】
アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端にもＣ末端にも融合したプラスミン阻害剤を含みうる。一実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端に融合したプラスミン阻害剤が同じプラスミン阻害剤である。もう一つの実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端に融合したプラスミン阻害剤が異なるプラスミン阻害剤である。
【０１１９】
癌の処置
プラスミン阻害剤、例えばプラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００は、さまざまな癌、特に転移性癌もしくは転移期に進行する危険がある癌または血管新生依存性癌もしくはリンパ管新生関連癌を処置するために使用することができる。癌とは、正常な成長制御に対する応答性を失っている１以上の細胞を指し、典型的には、対応する正常細胞ほど多くの調節を受けずに増殖する。
【０１２０】
癌障害の例には、例えば固形腫瘍、軟組織腫瘍、および転移性病変などがあるが、これらに限定されるわけではない。固形腫瘍の例には、悪性疾患、例えばさまざまな器官系の肉腫、腺癌および癌腫、例えば肺、乳房、リンパ組織、胃腸管（例えば結腸）および尿生殖路（例えば腎細胞、尿路上皮細胞）、咽頭、前立腺、卵巣を冒すもの、ならびにほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝癌、非小細胞肺癌、小腸癌などの悪性疾患を含む腺癌などがある。上述した癌の転移性病変も、本明細書に記載の方法を使って処置または予防することができる。一部の癌は、高レベルのウロキナーゼを発現させることができ、それがプラスミンの過剰な生成につながりうる。高レベルのウロキナーゼを発現させるそのような癌も、本明細書に記載の方法を使って処置または予防することができる。
【０１２１】
例えば、プラスミン阻害剤を使って、さまざまな器官系の悪性疾患、例えば肺、乳房、リンパ組織、胃腸管（例えば結腸）および尿生殖路、前立腺、卵巣、咽頭を冒すもの、ならびにほとんどの結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣癌、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌などの悪性疾患を含む腺癌を処置することができる。処置することができる代表的固形腫瘍には以下に挙げるものがある：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢包腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。
【０１２２】
線維肉腫は、紡錘状線維芽細胞様細胞の束から構成される軟組織腫瘍である。骨の線維肉腫は、悪性紡錘細胞ストロマから構成されることが多く、それが、多くの場合、豊富なコラーゲンを産生する。
【０１２３】
癌腫は、呼吸系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む上皮組織または内分泌組織の悪性疾患である。代表的な癌腫には、子宮頸、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されるものがある。この用語には、例えば癌腫性組織および肉腫性組織から構成される悪性腫瘍を含む癌肉腫も含まれる。腺癌は、腺組織に由来する癌腫、または腫瘍細胞が認識しうる腺構造を形成する癌腫である。
【０１２４】
一実施形態では、処置が、（ｉ）プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００と、（ｉｉ）第２の治療剤、例えば抗癌剤とを投与することを含む。代表的抗癌剤には、例えば抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達経路を妨害する能力を持つ薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、放射線、および他の腫瘍関連抗原に対する抗体（裸の抗体、イムノトキシンおよび放射性コンジュゲートを含む）などがある。特定クラスの抗癌剤の例を以下に詳述する：抗チューブリン／抗微小管剤、例えばパクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えばトポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、塩酸ピロキサントロン；代謝拮抗物質、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキセート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホンアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、ａｒａ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール；他の作用機序によって作用する薬剤、例えばジヒドロレンペロン（ｄｉｈｙｄｒｏｌｅｎｐｅｒｏｎｅ）、スピロムスチン、およびデシペプチド；生物学的応答調整物質、例えば抗腫瘍応答を増進するためのもの、例えばインターフェロン；アポトーシス剤、例えばアクチノマイシンＤ；および抗ホルモン剤、例えばタモキシフェンなどの抗エストロゲン、または例えば４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲン。
【０１２５】
一実施形態では、処置が、（ｉ）プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００と、（ｉｉ）第２の治療剤、例えば血漿カリクレイン阻害剤、例えばＤＸ−８８またはＤＸ−８８と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８％、または１００％同一なタンパク質とを投与することを含む。ＤＸ−８８のアミノ酸配列はＵＳ−２００５−００８９５１５に記載されている。
【０１２６】
他の態様として、本開示は、プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００を、アジュバント療法として、例えば被験体に投与することを特徴とする。アジュバント療法は、被験体が腫瘍の全部または一部を摘除するための手術を受けた後（例えば前立腺癌または乳癌または膠芽腫または結腸直腸癌または肺癌を処置するための手術後）に被験体に投与される術後療法であることができる。一実施形態では、クニッツドメインを含むタンパク質が、手術の６、１２、２４、４８、または１００時間以内に投与される。本タンパク質は、手術後だけでなく、手術前、手術中にも投与することができる。
【０１２７】
前立腺癌の処置
前立腺癌は、前立腺に由来する癌性細胞を特徴とする。初期では、癌性細胞は前立腺に限定されるが、転移が起こると、細胞は、近傍のリンパ節、精嚢、および身体の遠隔部位に、移動することができる。
【０１２８】
前立腺癌を検出するための診察および検査には、デジタル直腸内触診、経直腸的超音波、膀胱鏡検査、血液または感染を調べるための尿検査診断、ＰＳＡレベルを測定するための血液検査、および生検を含めることができる。
【０１２９】
前立腺癌は四つの病期のうちの一つに割り当てることができる。病期Ｉは、直腸内診では触れることができない癌である。これは、別の理由（通常はＢＰＨ）で手術が行われた時に、偶然に見出される。癌は前立腺にしか見出されない。病期ＩＩは、より進行した癌であるが、前立腺の外には拡がっていない。病期ＩＩＩは、前立腺の外層を越えて拡がっている癌である。これは、精嚢には見出されうるが、リンパ節までは拡がっていない。病期ＩＶは以下の特徴の一つ以上を特徴とする：膀胱、直腸、または他の近傍構造（精嚢を除く）に既に浸潤している癌；既にリンパ節に拡がっている癌；および既に身体の他の部分、例えば骨に拡がっている癌。プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００は、これらの病期の任意の段階（特に病期ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ）にある前立腺癌を処置するために使用することができる。
【０１３０】
前立腺癌は、病理学的試料のグリーソンスコアリングを使って病期分類することもできる。スコアは２〜１０の範囲にあり、腫瘍が拡がる可能性がどれくらいあるかを示す。低いグリーソンスコアは、癌細胞が正常前立腺細胞に似ていて、拡がる可能性が低いことを意味するのに対して、高いグリーソンスコアは、癌細胞が正常とは著しく異なり、拡がる可能性が高いことを意味する。プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００は、３以上（例えば少なくとも５、６、７、または８）のグリーソンスコアを特徴とする前立腺癌を処置するために使用することができる。
【０１３１】
前立腺癌の処置は、少なくとも二つの治療法の併用、例えばプラスミン阻害剤（例えば本明細書に記載するもの）を第２の治療法と組み合わせて投与することを含みうる。第２の治療法の例には、手術、放射線療法、およびホルモン療法などがある。代表的な外科的治療には、例えば恥骨後式根治的前立腺摘除術、会陰式根治的前立腺摘除術、および経尿道的前立腺切除（ＴＵＲＰ）などがある。放射線療法は体内法または体外法であることができる。体内放射線療法（インプラント照射または近接照射療法）は、癌性組織の中または近傍への放射線源（例えばシードまたはニードル）の植込みを含むことができる。
【０１３２】
一実施形態では、治療が、（ｉ）プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００と、（ｉｉ）ホルモン療法剤とを投与することを含む。代表的なホルモン療法には、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）アゴニスト（例えばロイプロリドおよびゴセレリン）、抗アンドロゲン（例えばフルタミド、ビカルタミド、およびニルタミド）、ならびに副腎がテストステロンを産生しないようにすることができる薬剤（例えばケトコナゾールおよびアミノグルテチミド）などがある。
【０１３３】
他の態様として、本開示は、プラスミン阻害剤（例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質）を、アジュバント療法として、例えば被験体に投与することを特徴とする。アジュバント療法は、被験体が腫瘍の全部または一部を摘除するための手術を受けた後（例えば前立腺癌または乳癌または膠芽腫または結腸直腸癌または肺癌を処置するための手術後）に被験体に投与される術後療法であることができる。一実施形態では、プラスミン阻害剤が、手術の６、１２、２４、４８、または１００時間以内に投与される。プラスミン阻害剤は、手術後だけでなく、手術前、手術中にも投与することができる。
【０１３４】
乳癌の処置
乳癌は、米国で、そして世界中で、重大な健康問題である。これは、正常な乳房上皮が浸潤癌へと病理学的トランスフォーメーションを起こした結果として発生する。
【０１３５】
乳癌は病期０〜ＩＶに分類される。病期０は非浸潤癌または上皮内癌と呼ばれることもあり、小葉癌（ＬＣＩＳ）および非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）をどちらも包含する。病期Ｉおよび病期ＩＩは初期であって、癌が葉または乳管を越えて拡がっていて、近傍組織に浸潤している。病期ＩＩＩは局所進行癌と呼ばれる。ここでは、癌が腋窩リンパ節または乳房に近い他のリンパ節まで拡がっている。病期ＩＶは乳房および腋窩リンパ節を越えて身体の他の部分に拡がった転移性癌である。乳癌は、例えばリンパ節、骨、肺、脳、肝臓、髄膜、肋膜、皮膚、眼、および膀胱などに転移することができる。再発癌とは、初期処置にもかかわらず、疾患が再発したことを意味する。主な乳癌タイプは、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、上皮内小葉癌、浸潤性小葉癌、髄様癌、および乳房パジェット病である。
【０１３６】
プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質は、上述した病期および／または上述した乳癌タイプのうち、任意の乳癌を処置するために、使用することができる。一実施形態では、乳癌の処置が、少なくとも二つの治療法の併用、例えばプラスミン阻害剤（例えば本明細書に記載するもの）を第２の治療法と組み合わせて投与することを含みうる。第２の治療法の例には、手術、放射線療法、およびホルモン療法などがある。
【０１３７】
他の態様として、本開示は、プラスミン阻害剤（例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質）を、アジュバント療法として、例えば被験体に投与することを特徴とする。アジュバント療法は、被験体が腫瘍の全部または一部を摘除するための手術を受けた後（例えば乳癌、または前立腺癌、または膠芽腫、または結腸直腸癌、または肺癌を処置するための手術後）に被験体に投与される術後療法であることができる。一実施形態では、プラスミン阻害剤、例えばプラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質が、手術の６、１２、２４、４８、または１００時間以内に投与される。プラスミン阻害剤は、手術後だけでなく、手術前、手術中にも投与することができる。
【０１３８】
血管新生関連障害の処置
プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質は、インビボの細胞（例えば内皮細胞）を阻害する（例えば、細胞の少なくとも一つの活性を阻害し、細胞の増殖、移動、成長または生存能を低下させる）ために使用することができる。この方法には、プラスミン阻害剤を単独で、または別の治療剤と組み合わせて、そのような処置を必要とする被験体に投与することが含まれる。
【０１３９】
プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質は、血管新生関連障害、特に血管新生依存性の癌および腫瘍を処置または予防するために使用することができる。血管新生関連障害には、例えば固形腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍（例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；慢性関節リウマチ）；乾癬；眼内血管新生性疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；オスラー・ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク新血管形成；毛細血管拡張症；血友病関節症；線維性血管腫；および創傷肉芽形成などがあるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４０】
「血管新生依存性の癌および腫瘍」とは、その成長（体積および／または質量の拡大）に、それらに血液を供給する血管の数および密度の増加を必要とするような癌および腫瘍である。プラスミン阻害剤は、そのような癌および腫瘍の退縮を引き起こすための処置に使用することができる。「退縮」とは、腫瘍の質量および大きさの減少、例えば少なくとも２、５、１０、または２５％の減少を指す。
【０１４１】
プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質は、アジュバント療法として、例えば被験体に投与することができる。アジュバント療法は、被験体が腫瘍の全部または一部を摘除するための手術を受けた後（例えば血管新生依存性癌を処置するための手術後）に被験体に投与される術後療法であることができる。一実施形態では、プラスミン阻害剤が、手術の６、１２、２４、４８、または１００時間以内に投与される。プラスミン阻害剤は、手術後だけでなく、手術前、手術中にも投与することができる。
【０１４２】
リンパ管新生関連障害の処置
ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３を活性化することにより、組織および腫瘍におけるリンパ管新生および血管新生を刺激する。これらの成長因子は、ＮＨ２−およびＣＯＯＨ−末端プロペプチドならびに受容体結合部位を含有する中央のＶＥＧＦホモロジードメインからなる完全長不活性型として分泌される。タンパク質分解的切断により、プロペプチドが除去されて、完全長型よりはるかに強い親和力で受容体を結合するＶＥＧＦホモロジードメインの二量体からなる成熟型が生成する。プラスミンは、ヒトＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦホモロジードメインから両プロペプチドを切断することにより、完全長物質と比較して著しく強化されたＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３の結合および架橋を示す成熟型を生成させる。プラスミンはＶＥＧＦ−Ｃも活性化する。リンパ管新生性成長因子はリンパ管を介した癌の転移拡大を促進するので、これらの分子のタンパク質分解による活性化は、抗転移剤の潜在的標的になる。ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄが共に高度に発現され、それがリンパ節転移に関係している乳癌、卵巣癌および結腸直腸癌では特に、プラスミン阻害剤を抗転移剤として処置に使用することができる（Ｎａｋａｍｕｒａら，２００３，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１６：３０９−３１４；Ｙｏｋｏｙａｍａら，２００３，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８８：２３７−２４４；Ｗｈｉｔｅら，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：１６６９−１６７５；Ｎａｋａｍｕｒａら，２００３．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：７１６−７２１）。
【０１４３】
プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載する他のタンパク質は、リンパ管新生関連障害、例えば癌、例えば転移性乳癌、卵巣癌または結腸直腸癌に使用することができる。一実施形態では、リンパ管新生関連障害の処置が、少なくとも二つの治療法の併用、例えばプラスミン阻害剤（例えば本明細書に記載するもの）を第２の治療法と組み合わせて投与することを含みうる。第２の治療法の例には、手術、放射線療法、およびホルモン療法などがある。
【０１４４】
他の態様として、本開示は、被験体におけるＶＥＧＦ−Ｃおよび／またはＶＥＧＦ−Ｄ活性を低下させる方法を特徴とする。一実施形態では、本方法は、ヒトまたは動物被験体に、プラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質（例えばＤＸ−１０００）のプラスミン阻害量を投与することを含む。
【０１４５】
他の態様として、本開示は、プラスミン阻害剤、例えばクニッツドメインを含むタンパク質、例えばＤＸ−１０００または本明細書に記載の他のタンパク質を、アジュバント療法として、例えば被験体に投与することを特徴とする。アジュバント療法は、被験体が腫瘍の全部または一部を摘除するための手術を受けた後（例えば乳癌、卵巣癌、または結腸直腸癌を処置するための手術後）に被験体に投与される術後療法であることができる。一実施形態では、プラスミン阻害剤、例えばプラスミンを阻害するクニッツドメインを含むタンパク質が、手術の６、１２、２４、４８、または１００時間以内に投与される。プラスミン阻害剤は、手術後だけでなく、手術前、手術中にも投与することができる。
【実施例】
【０１４６】
（実施例１）
本発明者らは、ＤＸ−１０００が、（ｉ）プラスミンによるＭＭＰの活性化を阻害し、（ｉｉ）腫瘍細胞のインビトロ浸潤性を減少させ、（ｉｉｉ）インビトロ血管新生を減少させ、（ｉｖ）移動を阻害せず、（ｖ）インビトロで止血に有意な影響を及ぼさないことを観察した。これらの性質は、癌、特に転移性癌の処置および予防に、ＤＸ−１０００および類似のプラスミン阻害剤を使用できるということを示している。
【０１４７】
方法
腫瘍細胞株の細胞培養：ＨＴ−１０８０（線維肉腫）細胞株およびＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性前立腺癌）細胞株は、１０％ＦＣＳ、グルタミン（２９２ｍｇ／ｍｌ）、重炭酸ナトリウム（２．１ｇ／ｌ）、アスコルビン酸（５０ｇ／ｍｌ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、８０％コンフルエントまで成長させた。ＬＮＣａＰ細胞はジヒドロテストステロン（ＤＨＴ，１０ｎＭ）で刺激した。非付着性ＨＬ−６０（急性骨髄性白血病）細胞株は、２０％ＦＣＳ、グルタミン４ｍＭ、重炭酸ナトリウム（１．５ｇ／ｌ）およびＰ／Ｓ（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ培地で成長させた。培養物を１ｅ５〜１ｅ６／ｍｌの細胞濃度に保った。
【０１４８】
ゼラチンザイモグラフィー：ＨＬ−６０細胞を無血清培地（Ｕｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ培地）で培養した。さまざまな条件を検討した：１μＭのＤＸ−１０００有りおよび無し；プロ−ＭＭＰ−９活性化因子（プラスミン＋プロ−ＭＭＰ−３）有りまたは無し。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４８時間培養した。次に、条件培地（ＣＭ）の一部を収集し、遠心分離によって清澄化し、還元剤を含まない電気泳動試料緩衝液と混合し、ゼラチン（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する１０％アクリルアミドゲルに適用した。活性組換えゼラチナーゼを標準とした。試料を２０ｍＡで分割し、２％トリトンＸ−１００で１時間洗浄し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する活性化緩衝液中、３７℃で１６時間インキュベートした。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０による染色後に、ゼラチン分解活性が、青色の背景に対する透明なバンドとして検出された。
【０１４９】
化学浸潤（ｃｈｅｍｏ−ｉｎｖａｓｉｏｎ）：ＨＴ−１０８０細胞およびＬＮＣａＰ細胞を１０６／ウェル（２４ウェルクラスタープレート）の密度で播種し、終夜インキュベートした。次にそれらをある用量範囲のＤＸ−１０００の存在下で２４時間インキュベートした。周知のプラスミン阻害剤、アプロチニン（ＴＲＡＳＹＬＯＬ（登録商標））およびＴＩＭＰ−４を対照として使用した。化学浸潤は、低成長因子型（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ）マトリゲル（登録商標）（ＧＲＦ−マトリゲル（登録商標））被覆フィルターを持つトランスウェル細胞培養チャンバーインサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使って評価した。トリプシン処理後に、細胞を浸潤チャンバーの上側に播種した（１ｅ４／インサート）。ＨＴ−１０８０細胞およびＬＮＣａＰ細胞用の化学誘引物質として、５％ＦＣＳおよび１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ培地およびＮＩＨ３Ｔ３  ＣＭをそれぞれ使用した。３７℃で２４時間インキュベートした後、フィルターをチャンバーから取り出し、染色し、浸潤細胞の％を評価した。各条件を２重に行った。
【０１５０】
管形成アッセイ：ＨＵＶＥＣを、ゼラチン被覆培養皿上、ＲＰＭＩ培地で培養した。細胞（継代数２）を、その培養培地（１０％ＦＣＳを添加したＥＧＭ−２完全培地）中のＩ型コラーゲン（１．５ｍ／ｍｌ，ＳＥＲＶＡ）上に、８ｅ４／ウェル（９６ウェルプレート）の密度で播種し、１時間拡がらせた。次に培養培地を捨て、細胞を、コラーゲンＩ型（１．５ｍｇ／ｍｌ，新しく調製）の新しい層で覆った。ゲルの重合後に、ＤＸ−１０００（１ｎＭ〜１０μＭ）またはアプロチニンの存在下または不在下で、培養培地を各ウェルに加え、３７℃／５％ＣＯ２で１６〜１８時間インキュベートした。マウス内皮細胞（ＥＣ）（ＬＥＩＩ細胞株）を、ある用量範囲のＤＸ−１０００の存在下で、その培養培地（１０％ＦＣＳを添加したＩＭＤＭ）中のＧＦＲ−マトリゲル（ＢＤ）上に、２ｅ４／ウェル（９６ウェルプレート）の密度で播種し、３７％／５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。倒立顕微鏡写真機（Ａｎａｌｉｓ）で内皮管形成を評価した。各ウェルの中心部の低倍率（４０×）の顕微鏡写真を、イメージング−キャプチャソフトウェア（ニコン）の助けを借りて、ニコンカメラで撮影した。ＭｅｔａＶｕｅ（商標）ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使って、顕微鏡写真における管形成を、定量的に解析した。完全な内皮細胞成長培地における無処理ＨＵＶＥＣによる管形成を対照として使用した。ＩＣ５０値をＳＩＧＭＡＰＬＯＴ（商標）で決定した。
【０１５１】
本発明者らの観察によれば、ＨＵＶＥＣによる管形成を阻害するＩＣ５０値は１．４±０．３ｎＭだった。
【０１５２】
擦過アッセイ：ＨＴ−１０８０細胞を、完全培地に、２ｅ６／ウェル（６ウェルプレート）の密度で播種した。コンフルエント細胞をＤＸ−１０００またはアプロチニン（１〜１０μＭ）の存在下で５時間インキュベートした。次に細胞層をプラスチックチップで擦過した。無処理細胞が擦過領域を完全に覆うのに必要な時間に相当する６時間にわたって、１時間ごとに写真を撮影した。
【０１５３】
結果
本発明者らは、ＤＸ−１０００が腫瘍細胞のインビトロ浸潤性を低下させることを観察した。例えば図３〜７を参照されたい。ＨＴ−１０８０細胞（線維肉腫）およびＬＮＣａＰ（アンドロゲン依存性前立腺癌）を使って浸潤を評価した。ＤＸ−１０００は、インビトロでの浸潤の阻害に、ナノモル濃度およびサブナノモル濃度で有効だった。ＤＸ−１０００はこれらのアッセイではアプロチニンより強力な阻害剤でもあった。
【０１５４】
本発明者らは、ＤＸ−１０００がＭＭＰの発現および活性化をダウンレギュレートすることも観察した。本発明者らは、ゼラチンザイモグラフィーを使って、ＤＸ−１０００が、ＨＬ−６０細胞において、プラスミンによるプロ−ＭＭＰ−９の活性化を阻害することを観察した（６４％阻害）。同様の結果は４−ＰＥＧ  ＤＸ−１０００でも観察された（９２％阻害）。
【０１５５】
ゼラチンザイモグラフィーの他に、本発明者らは、ＢＩＯＴＲＡＫ（登録商標）アッセイキットを使ってプラスミン阻害剤を評価した。ＨＬ６０を４×１０５細胞／ウェル（２４ウェルプレート）の密度で無血清培地（ＵｌｔｒａＣｕｌｔｕｒｅ培地）に播種した。翌日、さまざまな条件を評価した：プロ−ＭＭＰ９の活性化因子を含む試料および含まない試料（プラスミンおよびプロ−ＭＭＰ−３）ならびにＤＸ−１０００および４−ＰＥＧ−ＤＸ−１０００（１μＭ）を含む試料および含まない試料。２日間の培養後に、条件培地を収集し、ＢＩＯＴＲＡＫ（登録商標）アッセイキットを使ってＭＭＰ−９の活性を評価した。アッセイ時間は標準条件下で約１時間だった。ＤＸ−１０００および４−ＰＥＧ  ＤＸ−１０００は、１μＭ濃度で、プラスミン活性化ＭＭＰ−９活性の約６８〜７０％の減少をもたらした。
【０１５６】
二つの異なるアッセイ、すなわち擦過アッセイおよびマトリゲルを用いないボイデンチャンバーアッセイを使って、細胞移動に対するＤＸ−１０００の効果を評価した。ＤＸ−１０００は、インビトロでＨＴ−１０８０細胞の二次元移動を阻害しない（図２）。同様の結果がアプロチニンでも観察された。
【０１５７】
ＤＸ−１０００を、インビトロ内皮管形成アッセイ（「方法」に記載の「管形成アッセイ」）におけるその活性についても調べた。本発明者らは、これがインビトロで管形成の強力な阻害剤であり、管形成の阻害に関して少なくともアプロチニンと同程度に効果的であることを観察した。４−ＰＥＧ  ＤＸ−１０００も管形成を阻害した。観察されたＩＣ５０値は以下のとおりだった：
【０１５８】
【数９】
2011184453.tif 000011
本発明者らは、インビボ研究に進む前に、薬物に対するヒト腫瘍の感受性を測定するためのアッセイでも、ＤＸ−１０００を評価した。ＳＷ−４８０細胞を軟寒天中、インビトロで成長させることで、細胞運動を減少させ、個々の細胞を、単一コロニーとして同定される細胞クローンに発展させる。３０００個のＳＷ４８０細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。各処理を３重に行った。定量のために、ＭＥＴＡＶＩＥＷ（登録商標）ソフトウェアを使って、各ウェルから５枚の４倍画像を撮影した。ＤＸ−１０００および４−ＰＥＧ  ＤＸ−１０００はどちらも、０．１〜５０μＭの範囲の濃度で、ＳＷ４８０細胞によるコロニー形成を阻害しなかった（これに対して、シスプラチンは３３μＭで、コロニー形成を阻害した）。
【０１５９】
ＤＸ−１０００および４−ＰＥＧ  ＤＸ−１０００は、ＨＬ−６０細胞およびＳＷ−４８０細胞におけるアポトーシスを誘導しない。カスパーゼ３／７基質を使ってカスパーゼ３／７活性を検出するためのアッセイを用いて、アポトーシスを評価した。ＦＡＣＳアッセイでもアポトーシスは検出されなかった。
【０１６０】
本発明者らは、包括的凝固スクリーニング検査でも、ＤＸ−１０００に関して、臨床的に有意な効果を検出しなかった。低濃度のＤＸ−１０００は、血塊溶解を阻害することなく使用することができる。血塊溶解の阻害は７００ｎＭを上回るＤＸ−１０００濃度で観察された。
【０１６１】
止血評価の包括的方法であるトロンボエラストグラフィ（ＴＥＧ）では、正常上限値を持つ二人の被験者で、２８０〜５６０ｎＭのＤＸ−１０００による線維素溶解の阻害を示す証拠が得られた。ｔＰＡ：２８０〜５６０ｎＭ  ＤＸ−１０００で線維素溶解の減少。
【０１６２】
ＤＸ−１０００は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＴＰＰ）に対して、さらに高い用量（１．４〜５．６μＭ）で、弱い用量依存的作用を示した。凝固時間はまだ正常範囲内に留まっていた。プロトロンビン時間（ＰＴ）、Ｃｌａｕｓｓフィブリノゲンアッセイに対するＤＸ−１０００の効果は、５．６μＭを上回る濃度で、観察されなかった。
【０１６３】
（実施例２）
以下の薬物動態研究は、正常マウスおよび正常ウサギにおけるＤＸ−１０００および４ＰＥＧ−ＤＸ−１０００の血漿クリアランス、安定性および体内分布を示す。
【０１６４】
方法：
ラベリング：５００〜７００ｍｇのタンパク質およびＩｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）法を使用した（約１．７ｍＣｉ）。
【０１６５】
精製：Ｄ−ｓａｌｔポリアクリルアミドカラムを使用し、画分を集めた。総回収率は約９０％だった。高収率画分を注射用にプールした。
【０１６６】
マウス：尾静脈を通して５ｍｇ／匹を注射した。１時点／匹；４匹／時点。以下の時点を使用した：ＰＥＧなし、０、７、１５、３０、および９０分；ＰＥＧ、０、７、１５、３０、および９０分、４、８、１６、および２４時間。総血漿カウントを解析し、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２でのＨＰＬＣを使用し（安定性）、体内分布を解析した。
【０１６７】
ウサギ：左耳静脈を通して８０ｍｇ／匹を注射した。以下の時点で右耳から採血した：ＰＥＧなし、０、７、１５、３０、９０分、４、８、１６、２４、４８、７２、および９６時間；ＰＥＧ、０、７、１５、３０、９０分、４、８、１６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、および１９２時間。以下の解析を行った：４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、および１９２時間の時点で、総血漿カウントおよびＳｕｐｅｒｏｓｅ１２でのＨＰＬＣ（安定性）。
【０１６８】
結果
ヨード化されたＤＸ−１０００および４ＰＥＧ−ＤＸ１０００を使ったマウスにおけるインビボ薬物動態研究は、ＤＸ−１０００とそのＰＥＧ化誘導体の間に見られる半減期の有意な増加を示す（ＤＸ−１０００：０．４５時間；４ＰＥＧ−ＤＸ１０００：１３時間）。図８は正常マウスにおける体内分布研究の結果を示す。
【０１６９】
ヨード化されたＤＸ−１０００および４ＰＥＧ−ＤＸ１０００を使ったウサギにおけるインビボ薬物動態研究は、ＤＸ−１０００とそのＰＥＧ化誘導体の間に見られる半減期の有意な増加を示す（ＤＸ−１０００：約１時間；４ＰＥＧ−ＤＸ１０００：５９時間）。アロメトリーによる外挿から、ヒトでは９日間という安定性を予想すべきである。
【０１７０】
（実施例３）
以下のインビトロ実験を使って、タンパク質を、腫瘍浸潤を調整するその能力について評価することができる。評価することができるタンパク質の例には、プラスミン阻害剤、例えばＤＸ−１０００、ＰＥＧ化ＤＸ−１０００、およびアルブミンまたはその断片に融合したＤＸ−１０００がある。
【０１７１】
ＤＸ−１０００は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌細胞）およびＰＣ−３（ヒト前立腺癌細胞）腫瘍細胞浸潤アッセイで試験することができる。これらのアッセイは、マトリゲル浸潤アッセイの確立されたプロトコルに従って行うことができる。腫瘍細胞浸潤能力を変化させるＤＸ−１０００の能力を評価するために、賦形剤対照、アプロチニン、およびＤＸ−１０００の希釈液３種類を３重に試験することができる。これらの研究は３回繰り返すことができる。
【０１７２】
３種類のＤＸ−１０００濃度を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＣ−３腫瘍細胞浸潤および移動アッセイで試験することもできる。賦形剤対照およびＤＸ−１０００を３重に試験することができる。これらの実験は３回繰り返すことができる。
【０１７３】
（実施例４）
以下のインビボ実験を使って、タンパク質を、腫瘍の成長および浸潤を調整するその能力について評価することができる。評価することができるタンパク質の例には、プラスミン阻害剤、例えばＤＸ−１０００、ＰＥＧ化ＤＸ−１０００、およびアルブミンまたはその断片に融合したＤＸ−１０００がある。
【０１７４】
緑色蛍光タンパク質をトランスフェクトしたヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＧＦＰ）を、雌ＢＡＬＢ．ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの乳房脂肪体に接種することができる。動物を腫瘍成長について監視することができる。腫瘍細胞接種の４〜５週後に、３〜５０ｍｍ３の腫瘍を持つ動物を選択し、無作為化して４群に分割することができる。動物を賦形剤のみまたは２種類の用量のＤＸ−１０００で処置することができる。適当な陽性対照（ＤＯＸ、タキソテール）を研究の一部に含めることができる。投薬量、投与経路および頻度は、例えば動物モデルおよびインビトロ研究から得られる指針に従って決定することができる。
【０１７５】
ヒト前立腺癌ＰＣ−３−ＧＦＰ細胞を、雌ＢＡＬＢ．ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの頸骨または左心室に接種することができる。週１回の放射線（Ｆａｘｉｔｒｏｎ）解析により、動物を腫瘍成長について監視することができる。動物は賦形剤のみまたは２種類の用量のＤＸ−１０００で処置することができる。適当な陽性対照（ＤＯＸ、タキソテール）を研究の一部に含めることができる。
【０１７６】
組織解析：
１：上述した研究の全てが終了した時点で、原発腫瘍およびさまざまな器官を、少なくとも６匹／群から、顕微鏡的腫瘍転移を検出および定量するために摘出することができる。
【０１７７】
２：ＰＣ−３−ＧＦＰ研究の全動物を定期的に放射線解析に付すことができる。
【０１７８】
３：これらの研究の終了時に、動物を屠殺することができ、代表的長骨がマイクロＣＴ解析によって解析されるだろう。
【０１７９】
４：代表的（各群６個）原発腫瘍および長骨を摘出し、組織学的解析および骨組織形態計測的解析に付して、腫瘍体積対組織体積比を決定することができる。
【０１８０】
５：原発腫瘍および長骨の免疫組織学的解析を行って、ＤＸ−１０００による処理後の腫瘍進行に関与するさまざまな遺伝子の発現（ｕＰＡ、プラスミノゲン、ＣＤ３１、Ｋｉ６７）の変化を評価することができる。
【０１８１】
以下の請求項には他の実施形態も包含される。
【図１】
2011184453.tif 000012
【図２】
2011184453.tif 000013
【図３】
2011184453.tif 000014
【図４】
2011184453.tif 000015
【図５】
2011184453.tif 000016
【図６】
2011184453.tif 000017
【図７】
2011184453.tif 000018
【図８】
2011184453.tif 000019
【配列表】
2011184453000001.app
【外国語明細書】
2011184453000001.pdf