(57)【要約】      （修正有）【課題】各種工業薬品、農薬，および医薬品の製造中間体として重要な光学活性α−アミノ酸を高品質かつ安価に製造するための製造法を提供する。【解決手段】Ｌ−α−アミノ酸とＤ−α−アミノ酸の混合物に、Ｄ体又はＬ体のどちらか一方の光学異性体と立体選択的に溶解度の低い塩を形成する分割剤を作用させ、Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸の一方をジアステレオマー塩の固体として分離し、残留するＬ体又はＤ体の富化したα−アミノ酸混合物にアミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物を作用させて光学純度を低下させ、これを再度ジアステレオマー塩形成による立体選択的分割に供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で示されるＬ−α−アミノ酸と一般式（２）で示されるＤ−α−アミノ酸の混合物に、Ｄ体又はＬ体のどちらか一方の光学異性体と立体選択的に溶解度の低い塩を形成する分割剤を作用させ、Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸の一方をジアステレオマー塩の固体として分離し、残留するＬ体又はＤ体の富化したα−アミノ酸混合物にアミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物を作用させて光学純度を低下させ、これを再度ジアステレオマー塩形成による立体選択的分割に供することでＤ体又はＬ体のα−アミノ酸を得ることを特徴とする光学活性α−アミノ酸の製造法。
【化１】
2011024572.tif 000012
【化２】
2011024572.tif 000013
【請求項２】
光学活性α−アミノ酸が、２−アミノ酪酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ属、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｇｅｍｍａｔａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ属又はＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属に由来するγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを含有する請求項１又は２に記載の光学活性α−アミノ酸の製造法。
【請求項４】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ
に属する菌に由来するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１５３０５、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３
に由来するものである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜５のいずれかに記載の方法：
（ａ）  配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法：
（ａ）  配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項８】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３由来であって、下記（ａ１）〜（ｃ１）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ１）  前記（ａ１）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ１）  前記（ａ１）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項９】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５由来であって、下記（ａ２）〜（ｃ２）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ２）  前記（ａ２）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ２）  前記（ａ２）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１０】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６由来であって、下記（ａ３）〜（ｃ３）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ３）  配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ３）  前記（ａ３）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ３）  前記（ａ３）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１１】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６由来であって、下記（ａ４）〜（ｃ４）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ４）  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ４）  前記（ａ４）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ４）  前記（ａ４）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１２】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８由来であって、下記（ａ５）〜（ｃ５）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ５）  配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ５）  前記（ａ５）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ５）  前記（ａ５）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１３】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６由来であって、下記（ａ６）〜（ｃ６）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ６）  配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ６）  前記（ａ６）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ６）  前記（ａ６）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１４】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３由来であって、下記（ａ７）〜（ｃ７）から選択されるポリペプチドである、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ７）  配列番号７または８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ７）  前記（ａ７）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ７）  前記（ａ７）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項１５】
前記分割剤が酒石酸、マンデル酸及び２−フェノキシプロピオン酸から選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は化学式（１）または（２）で示される光学活性α−アミノ酸の製造法に関する。光学活性アミノ酸は各種工業薬品、農薬、および医薬品の製造中間体として重要な物質である。
【化１】
2011024572.tif 000002
【化２】
2011024572.tif 000003
【背景技術】
【０００２】
光学活性脂肪族α−アミノ酸の製造法としては、ＤＬ−α−アミノ酸のＮ−アシル体にアミノアシラーゼを作用させて、残存したＮ−アシル−α−アミノ酸をアシルアミノ酸ラセマーゼにてラセミ化して再び原料に供することで、所望の光学活性α−アミノ酸を取得する方法（特許文献1）、ＤＬ−α−アミノ酸アミドにアミダーゼを作用させて所望の光学活性α−アミノ酸を取得し、残存するα−アミノ酸アミドをラセミ化して再び原料に供する方法（特許文献２、特許文献３）などがある。また、アミノ酸アミドラセマーゼを使用して、残存するα−アミノ酸アミドをラセミ化する方法（特許文献４、特許文献５）もある。アミノアシラーゼを使用する方法では、アミノ酸を一度アシル化する必要があるため効率のよい製造法ではない。また、アミダーゼを使用する方法では、α−アミノ酸アミドを合成する必要があり、また、分割後残存するα−アミノ酸アミドをラセミ化する反応工程が煩雑であることから、効率の良い製造法ではない。
【０００３】
さらに、α−アミノ酸のラセミ混合物を出発原料とし、Ｌ−α−アミノ酸と立体選択的に塩を形成する分割剤を作用させ、Ｌ−α−アミノ酸を分離精製する方法（特許文献６）が知られているが、除去したＤ−α−アミノ酸が残ってしまうため満足できる方法ではない。この除去したα−アミノ酸を化学的に誘導体化することなくラセミ化することは困難である。
【０００４】
その他、ヒダントイナーゼ、ヒダントインラセマーゼ、カルバモイラーゼを使用し、ヒダントインを経由して光学活性アミノ酸を合成する方法（特許文献７）が知られている。
一方、アミノ酸をラセミ化する酵素として、アラニンラセマーゼやグルタミン酸ラセマーゼといった酵素が知られている。これらの酵素は一般的に基質特異性が高く、通常は問題にならないが、その酵素の基質となりうる光学活性アミノ酸を生産する際には障害となる。例えば光学活性アラニンを取得するという目的においては、このアミノ酸ラセマーゼが目的とするアミノ酸の光学純度を低下させてしまうため、発酵生産時にアミノ酸ラセマーゼ活性を除去する方法が用いられている（特許文献８）。
この様なアミノ酸ラセマーゼを光学活性アミノ酸の製造に用いた例として、Ｌ−グルタミン酸にグルタミン酸ラセマーゼを作用させてＤＬ−グルタミン酸とした後に、Ｌ−グルタミン酸脱炭酸酵素によりＬ体のみを消費して残存するＤ−グルタミン酸を取得する方法があるが（特許文献９）（特許文献１０）、この方法は原料の半分を消費するために理論収率は５０％が上限であり製造方法として好ましくない。またアミノトランスフェラーゼによる反応系と、アミノ酸デヒドロゲナーゼとアミノ酸ラセマーゼとNADHによるアミノ基供与体再生系を組み合わせたＤ−アミノ酸製造方法も知られているが（特許文献１１）、この方法は３つの酵素を用いる複雑な系である上に、補酵素としてNADHを消費するために優れた製造方法とは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０１−１３７９７３号公報
【特許文献２】特開昭６０−０３６４４６号公報
【特許文献３】特開２００１−３２８９７０号公報
【特許文献４】国際公開第２００５／０８０５８４号
【特許文献５】特表２００５−５２９６１１号公報
【特許文献６】特開２００６−１６９１５８号公報
【特許文献７】特開２００５−２７８４６８号公報
【特許文献８】特許第３０２９８６８号公報
【特許文献９】特許第２９１８６１９号公報
【特許文献１０】特許第３２６０８２２号公報
【特許文献１１】特公平０７−０８５７１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、従来技術における上記したような課題を解決し、各種工業薬品、農薬，および医薬品の製造中間体として重要な光学活性α−アミノ酸を高品質かつ安価に製造するための製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、高品質かつ安価に光学活性α−アミノ酸を製造するための製造法に関して鋭意検討を行った結果、幅広いアミノ酸をラセミ化する活性を持つ酵素の存在を見出した。さらに検討を深めて、通常は光学活性アミノ酸製造において疎まれうるこのアミノ酸ラセミ化活性酵素と、Ｄ体およびＬ体のα−アミノ酸の混合物にＤ体或いはＬ体のα−アミノ酸と立体選択的に塩を形成する分割剤を作用させて、Ｄ体或いはＬ体のα−アミノ酸と分割剤の塩を形成せしめ、Ｄ体或いはＬ体のα−アミノ酸を分離回収するジアステレオマー塩分割法を組み合わせる事で、残存する対掌体のα−アミノ酸をＤＬ体混合物として、再度立体選択的分割に供することで、高品質かつ安価に光学活性α−アミノ酸を製造できることを見いだし、本発明に到達した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕一般式（１）で示されるＬ−α−アミノ酸と一般式（２）で示されるＤ−α−アミノ酸の混合物に、Ｄ体又はＬ体のどちらか一方の光学異性体と立体選択的に溶解度の低い塩を形成する分割剤を作用させ、Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸の一方をジアステレオマー塩の固体として分離し、残留するＬ体又はＤ体の富化したα−アミノ酸混合物にアミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物を作用させて光学純度を低下させ、これを再度ジアステレオマー塩形成による立体選択的分割に供することでＤ体又はＬ体のα−アミノ酸を得ることを特徴とする光学活性α−アミノ酸の製造法。
【化３】
2011024572.tif 000004
【化４】
2011024572.tif 000005
〔２〕光学活性α−アミノ酸が、２−アミノ酪酸である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕アミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物が、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ属、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｇｅｍｍａｔａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ属又はＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属に由来するするγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを含有する〔１〕又は〔２〕に記載の光学活性α−アミノ酸の製造法。
〔４〕γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ
に属する菌に由来するものである、〔３〕に記載の方法。
〔５〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１５３０５、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３
に由来するものである、〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔６〕  γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法：
（ａ）  配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔７〕  下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを用いて、光学活性なα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる、光学活性α−アミノ酸のラセミ化方法：
（ａ）  配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔８〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３由来であって、下記（ａ１）〜（ｃ１）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法：
（ａ１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ１）  前記（ａ１）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ１）  前記（ａ１）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔９〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５由来であって、下記（ａ２）〜（ｃ２）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法：
（ａ２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ２）  前記（ａ２）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ２）  前記（ａ２）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔１０〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６由来であって、下記（ａ３）〜（ｃ３）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法：
（ａ３）  配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ３）  前記（ａ３）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ３）  前記（ａ３）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔１１〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６由来であって、下記（ａ４）〜（ｃ４）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法：
（ａ４）  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ４）  前記（ａ４）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ４）  前記（ａ４）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔１２〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８由来であって、下記（ａ５）〜（ｃ５）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法：
（ａ５）  配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ５）  前記（ａ５）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ５）  前記（ａ５）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔１３〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６由来であって、下記（ａ６）〜（ｃ６）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法：
（ａ６）  配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ６）  前記（ａ６）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ６）  前記（ａ６）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔１４〕  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３由来であって、下記（ａ７）〜（ｃ７）から選択されるポリペプチドである、〔３〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法：
（ａ７）  配列番号７または８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ７）  前記（ａ７）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ７）  前記（ａ７）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
〔１５〕前記分割剤が（Ｒ）―２−フェノキシプロピオン酸であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
Ｄ体およびＬ体のα−アミノ酸の混合物の水溶液に光学分割剤を作用させ、溶解度差により分離が可能なジアステレオマー塩を製造し、所望の光学活性Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸を取得し、除去したα−アミノ酸にラセミ化する活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物を作用させ再び原料に供することで、所望の光学活性α−アミノ酸を好収率で取得することが可能となる。なお、α−アミノ酸をラセミ化する活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物を使用することで、α−アミノ酸の誘導体化等の工程を経ることなくラセミ化が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の光学活性α−アミノ酸の製造法は、一般式（１）で示されるＬ−α−アミノ酸と一般式（２）で示されるＤ−α−アミノ酸の混合物に、Ｄ体又はＬ体のどちらか一方の光学異性体と立体選択的に溶解度の低い塩を形成する分割剤を作用させ、Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸の一方をジアステレオマー塩の固体として分離する工程（光学分割工程）と、ジアステレオマー塩分離後のＬ体又はＤ体の富化したα−アミノ酸混合物にアミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体または該生菌体の処理物を作用させて光学純度を低下させる工程（ラセミ化工程）を含むものであり、ラセミ化工程で得られたＤ体とＬ体の混合物を再度光学分割工程に供することでＤ体又はＬ体のα−アミノ酸を得ることができる。
例えば、Ｄ体とＬ体の混合物に、Ｌ体と立体選択的に溶解度の低い塩を形成する分割剤を作用させ、Ｌ体をジアステレオマー塩の固体として分離し、残りのＤ体若しくはＤ体とＬ体の混合物にアミノ酸ラセミ化活性を有する微生物の生菌体等を作用させることにより得られたＬ体の富化した混合物を再度光学分割することにより新たなＬ体が得られる。これを繰り返すことにより、Ｄ体とＬ体の混合物からＬ体のα−アミノ酸を得ることができる（同様にＤ体のα−アミノ酸を得ることもできる）。
【化５】
2011024572.tif 000006
【化６】
2011024572.tif 000007
【００１０】
本発明の原料のα−アミノ酸を示す一般式（１）または（２）におけるＲは、低級アルキル基である。低級アルキル基に特に制限はないが、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ノルマルブチル基、セカンダリーブチル基などの炭素数１から４の直鎖または分岐した低級アルキル基が好適である。中でもエチル基が特に好ましい。
【００１１】
一般式（１）で示されるＬ−α−アミノ酸と一般式（２）で示されるＤ−α−アミノ酸の混合物としてはラセミ体が好適に利用される。該混合物はＬ体又はＤ体のどちらか一方に偏った混合物であってもよい。また該混合物はＬ体又はＤ体のどちらか一方の光学活性α−アミノ酸をラセミ化して得られたものであってもよい。
本発明で使用する化学式（１）、（２）で示されるα−アミノ酸のラセミ混合物は、その製法および品質等に特に制限はなく、例えばシュトレッカー法によって容易に得られるα−アミノニトリルを加水分解する方法によって得ることができる。
【００１２】
α−アミノ酸の光学分割は、種々の方法があり、α−アミノ酸と分割剤のジアステレオマー塩の性質によって適宜選択されれば良い。例えば、ラセミの２−アミノ酪酸と半当量の（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸を水に加熱溶解した後、冷却、晶析することでＬ−２−アミノ酪酸／（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸を取得することができる。
分割剤には、酒石酸、マンデル酸、２−フェノキシプロピオン酸などが挙げられ、目的とするアミノ酸に応じて適宜選択されれば良いが、後処理の容易さから２−フェノキシプロピオン酸が特に好適である。
【００１３】
本発明のラセミ化工程に使用される微生物は、Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸をラセミ化する活性を有する微生物であれば良いが、種々のα−アミノ酸をラセミ化するような酵素、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをもつものが望ましい。このような酵素として例えば、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ属、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｏｓｔｏｃ属、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ属、Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ属、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ属、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｇｅｍｍａｔａ属、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ属、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ属又はＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ属に由来するものであり、好ましくは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属又はＴｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ属に由来するものであり、より好ましくは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属に由来するものである。
【００１４】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ
本発明において用いられるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸をラセミ化する活性を有するものである。
【００１５】
目的とする酵素（又はポリペプチド）がこのようなラセミ化する活性を有するか否かは、慣用の方法にしたがって測定することができ、例えば、後述する実施例（実施例１〜５）に記載の方法により確認することができる。ラセミ化する活性を有するか否かの確認に関してより具体的には、実施例の記載に従って所望の酵素を使い、Ｌ体又はＤ体のα−アミノ酸を基質として反応させ、反応後にＬ体とＤ体の比率に変動が起こった場合に活性があると判断できる。この場合の変動は、光学活性が低下するような変動である。確認されたＬ体とＤ体の比率の変動が少ない場合でも、菌体量や酵素量を変更することでその変動幅を増減できる。
【００１６】
本発明のより好ましい態様によれば、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉに由来するものであり、
さらに好ましくは、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ１５３０５、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６、
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６、
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８、
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６、又は
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３
に由来するものである。
【００１７】
本発明におけるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、下記（ａ）〜（ｃ）から選択されるポリペプチドである：
（ａ）  配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ）  前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ）  前記（ａ）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【００１８】
前記（ｂ）のポリペプチド（以下において「改変ポリペプチド」ということがある）は、
配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる。このとき、前記（ａ）のポリペプチドと同様に、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有する。ここで、欠損、置換もしくは付加されてもよいアミノ酸の数は、例えば１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜８個であり、最も好ましくは１〜４個である。
【００１９】
「欠損」（欠失）には、アミノ酸配列の端からアミノ酸残基を欠失したもの及びアミノ酸配列の途中のアミノ酸残基が欠失したものも含まれる。
また「付加」には、アミノ酸配列の端にアミノ酸残基を付加したもの及びアミノ酸配列の途中にアミノ酸残基を付加（挿入）したものも含まれる。
【００２０】
前記（ｂ）の改変ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が保存的置換されたアミノ酸配列からなり、かつ、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有するポリペプチドであることができる。
【００２１】
ここで「保存的置換」とは、ペプチドの活性を実質的に改変しないように、１又は複数個（好ましくは数個）のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００２２】
なお、アミノ酸の欠損、置換又は付加による改変は、例えばそれをコードするＤＮＡに、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Nucleic Acid Research, Vol.10, No.20, p.6487-6500, 1982参照）を施すことにより行うことが出来る。他の方法としては、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加及び／又は置換し、次いで連結する方法などがある。
【００２３】
前記（ｃ）のポリペプチド（以下において「相同ポリペプチド」ということがある）は、
配列番号１、２、３、４、５、６、７及び８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列、すなわち、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列に関して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる限り、特に限定されるものではない。該「同一性」の％は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。この（ｃ）における相同ポリペプチドは、前記（ａ）のポリペプチドと同様に、光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有する。
【００２４】
本明細書において、「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool）http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。
【００２５】
本発明におけるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼは、下記の（ｉ）〜（vii）のいずれかであることが好ましい：
（ｉ）  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３由来であって、下記（ａ１）〜（ｃ１）から選択されるポリペプチド：
（ａ１）  配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ１）  前記（ａ１）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ１）  前記（ａ１）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
【００２６】
（ii）  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５由来であって、下記（ａ２）〜（ｃ２）から選択されるポリペプチド：
（ａ２）  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ２）  前記（ａ２）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ２）  前記（ａ２）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
【００２７】
（iii）  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６由来であって、下記（ａ３）〜（ｃ３）から選択されるポリペプチドである：
（ａ３）  配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ３）  前記（ａ３）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ３）  前記（ａ３）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；
【００２８】
（iv）  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６由来であって、下記（ａ４）〜（ｃ４）から選択されるポリペプチド：
（ａ４）  配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ４）  前記（ａ４）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ４）  前記（ａ４）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド；  又は
【００２９】
（ｖ）  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８由来であって、下記（ａ５）〜（ｃ５）から選択されるポリペプチド：
（ａ５）  配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ５）  前記（ａ５）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ５）  前記（ａ５）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【００３０】
（vi）  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６由来であって、下記（ａ６）〜（ｃ６）から選択されるポリペプチド：
（ａ６）  配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ６）  前記（ａ６）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ６）  前記（ａ６）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【００３１】
（vii）  γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３由来であって、下記（ａ７）〜（ｃ７）から選択されるポリペプチド：
（ａ７）  配列番号７または８で表されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、
（ｂ７）  前記（ａ７）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、欠損、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、ポリペプチド、又は
（ｃ７）  前記（ａ７）のアミノ酸配列に対して７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
なお、ここで（ｂ１）〜（ｂ７）及び（ｃ１）〜（ｃ７）のポリペプチドは光学活性α−アミノ酸をラセミ化する活性を有するものであり、これらにおける欠損、置換もしくは付加されるアミノ酸の数及び同一性の％は、前記（ｂ）と（ｃ）に従って確認できる。
【００３２】
Ｄ体又はＬ体のα−アミノ酸のラセミ化方法
本発明のＤ体又はＬ体のα−アミノ酸のラセミ化方法は、前記したγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の生菌体もしくはその処理物を用いて、Ｄ体又はＬ体のなα−アミノ酸をラセミ化することを含んでなる。
【００３３】
本発明のＤ体又はＬ体のα−アミノ酸の生化学的ラセミ化に使用される微生物は、α−アミノ酸のラセミ化活性を有するγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物であれば良い。また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等の何れの株であっても上記能力を有するものであれば本発明に使用できる。本発明では、前記γ-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出するように改変された遺伝子組換え菌が好適に利用できる。
【００３４】
より詳しくは、本発明において、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物は、例えば、モレキュラー・クローニング第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．（ｅｄ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１）等に記載された方法等にしたがって、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、宿主細胞において発現できるよう遺伝子組み換えすることによって得ることができる。
【００３５】
すなわち、所望の構造遺伝子を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えＤＮＡを作製する。該組換えＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明におけるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを生産する形質転換体を得ることができる。
【００３６】
宿主細胞としては、細菌、放線菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。好ましくは、大腸菌Escherichia coli、放線菌Streptomyces等の細菌が挙げられる。
【００３７】
組換えＤＮＡとしては、上記宿主細胞において自立複製ないしは染色体中への組み込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００３８】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含有してなる組換えＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換えＤＮＡであることが好ましい。また、該組換えＤＮＡには、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。
【００３９】
使用可能な発現ベクターとしては、例えば、ｐＴＡ２（東洋紡績株式会社製）、Ｈｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ２４（ノバジェン社製）、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９［Gene,33,103(1985)］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造株式会社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）、ｐＩＪ６９０２［Mol.Microbiol.,58,1276(2005)］、ｐＳＥＴ１５２［J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,4、417(2002)］等を例示することができる。
【００４０】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能し得るものであれば特に制限はなく、いずれのものでも使用可能である。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、Ｔ７プロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーター等を挙げることができる。
【００４１】
宿主細胞としての原核生物としては、エシェリシア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ストレプトミセス属等に属する微生物が挙げられる。
【００４２】
具体例として、本発明者らが新たに作製した、配列番号１又は２で表されるγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを発現する能力を有するエシェリシア  コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の作製方法を、以下に示す。
ＤＮＡ供与体微生物であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５の培養は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須な無機塩、栄養素等を含有させた培地を用いて行われる。培養時のｐＨは４〜１０の範囲が好ましく、温度は２０〜５０℃が好ましい。培養は１日〜１週間程度好気的に行われる。
なお、本発明において、培養する微生物の培養条件(培地組成、培地ｐＨ、培養温度、培地への菌体播種量、培養時間等)は、微生物種に応じた文献や、寄託や保存機関において示された情報に基づいて、適宜決定することができる。
【００４３】
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５のゲノムＤＮＡ塩基配列情報を元に、プライマーを設計する。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５より抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを増幅し、プラスミドベクター（ｐＵＣ１９）と結合する。これを前者に対してｐＡＴ８、後者に対してｐＡＴ１５と命名する。ｐＡＴ８、又はｐＡＴ１５をＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に形質転換し、γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを発現する組換え菌をＤＨ５α／ｐＡＴ８、ＤＨ５α／ｐＡＴ１５と命名する。
【００４４】
上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としてのＥ．ｃｏｌｉの取扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、例えば、モレキュラー・クローニング第３版に従えば容易に実施できる。使用する酵素、試薬類も全て市販の製品を用いることができ、特に断らない限り製品で指定されている使用条件に従えば完全にそれらの目的を達成することができる。該菌からの全ＤＮＡ抽出は、例えばＳａｉｔｏら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９−６２９，１９６３）の方法に準じて行うことができる。
【００４５】
γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼを産出する微生物の培養は、用いる菌により至適な生育条件が異なるため、培養条件は特に限定されず用いる菌に合わせて適宜設定されればよい。例えば大腸菌ＤＨ５αを宿主とした遺伝子組換え菌であれば、一般的にｐＨ７、温度３７℃が好適な培養条件となる。このようにして培養した微生物は、生菌体又は該生菌体の処理物、さらには精製した酵素として反応に使用される。
【００４６】
ここで、該処理物としては、例えば、培養液（培養物）、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体（分離菌体）、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、菌体破砕物（例えば、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物）、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、又は該菌体より抽出して得られる酵素標品などを挙げることができる。また、常法に従って菌体又は酵素を固定化して使用することもできる。
【００４７】
培養物（発現細胞や培養上清）から所望のポリペプチドを精製する方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥などを挙げることができる。また、合成法の場合は、液相法、固相法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は常法により行なうことができる。
【００４８】
α−アミノ酸の生化学的ラセミ化反応の条件は対象とする基質アミノ酸と酵素の反応性を見て適宜選択すれば良く、一般的にはα−アミノ酸の濃度は０．１ｗｔ％〜飽和濃度、酵素量は、該酵素を含む微生物の乾燥菌体基準で、原料α−アミノ酸重量の０．００００１〜３倍が好ましく、０．００２〜０．５倍がより好ましい。反応温度は１０〜７０℃が好ましく、より好ましくは３０〜６０℃であり、ｐＨは４〜１３が好ましく、より好ましくは５〜１０、さらに好ましくは６〜９である。反応終了後、反応液からの菌体または菌体処理物の除去は、遠心分離、濾過などの公知の方法を用いて行うことで、α−アミノ酸のラセミ混合物を含む水溶液が得られる。これはα−アミノ酸の光学分割の原料として再利用する。
【実施例】
【００４９】
次に本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。
【００５０】
なお、反応液の分析におけるＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
ＨＰＬＣ分析条件
溶離液        １ｍＭ  ＣｕＳＯ４  水溶液
流量          １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム        ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００
カラム恒温槽  ３０℃
検出器        ＵＶ２５４ｎｍ
【００５１】
製造例１
Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５のゲノムＤＮＡ情報（http://gib.genes.nig.ac.jp/）から得られたγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子とされる塩基配列に基づき、プライマーを設計した。
ここでの「γ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子とされる塩基配列」とはアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］により相同性検索を行った結果、４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅに分類される塩基配列である。ＢＬＡＳＴの具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。
【００５２】
ＡＴＣＣにより指定された培地及び培養温度でＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ １５３０５を培養し、それらより抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＴ８−ＦとＡＴ８−Ｒ（配列番号９及び配列番号１０）又はＡＴ１５−ＦとＡＴ１５−Ｒ（配列番号１１及び配列番号１２）を用いてＰＣＲを行った。
【表１】
2011024572.tif 000008
【００５３】
得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＵＣ１９（宝酒造（株）社製）に連結してｐＡＴ８及びｐＡＴ１５を作製後、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に塩化カルシウム法で導入した。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して形質転換株ＤＨ５α／ｐＡＴ８及びＤＨ５α／ｐＡＴ１５を得た。
【００５４】
製造例２
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３のゲノムＤＮＡ情報（ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐｐ：／／ｇｉｂ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）から得られたγ−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子とされる塩基配列に基づき、製造例１と同様にして、プライマーを設計した。
【００５５】
指定された培地及び温度でＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６、又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３を培養しそれらより抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマーＡＴ９−ＦとＡＴ９−Ｒ（配列番号１３及び配列番号１４）、ＡＴ１０−ＦとＡＴ１０−Ｒ（配列番号１５及び配列番号１１６）、ＡＴ１１−ＦとＡＴ１１−Ｒ（配列番号１７及び配列番号１８）、ＡＴ１２−ＦとＡＴ１２−Ｒ（配列番号１９及び配列番号２０）、ＡＴ１３−ＦとＡＴ１３−Ｒ（配列番号２１及び配列番号２２）又はＡＴ１４−ＦとＡＴ１４−Ｒ（配列番号２３及び２４）を用いてＰＣＲを行った。
【表２】
2011024572.tif 000009
【００５６】
得られたＰＣＲ反応生成物を精製し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＩＦＯ  ３９５６、Ｓｔａｐｈｙlｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８、又はＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＮＢＲＣ  １０２４７６の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌ1で消化した。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  ＯＴ−３に関してはＡＴ１３−Ｆ及びＡＴ１３−Ｒをプライマーとして、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＡＴ１４−Ｆ及びＡＴ１４−Ｒをプライマーとして、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応生成物に対しては制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。
【００５７】
プライマーＮｄｅＦ、ＮｄｅＲ（配列番号２５及び配列番号２６）とＱｕｉｋＣｈａｎｇeＲ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用してｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造株式会社製）のｌａｑＺαの開始コドン（ＡＴＧ）の位置に制限酵素ＮｄｅＩ切断配列（ＣＡＴＡＴＧ）を導入したｐＴＶ１１８Ｎ−ＮｄｅＩを作製した。
【表３】
2011024572.tif 000010
【００５８】
ＡＴ９−ＦとＡＴ９−Ｒ、ＡＴ１０−ＦとＡＴ１０−Ｒ、ＡＴ１１−ＦとＡＴ１１−Ｒ、ＡＴ１２−ＦとＡＴ１２−Ｒ及びＡＴ１４−ＦとＡＴ１４−Ｒを用いたＰＣＲ反応の生成物を消化した制限酵素であるＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ−ＮｄｅＩに各ＰＣＲ産物を連結してｐＡＴ９、ｐＡＴ１０、ｐＡＴ１１、ｐＡＴ１２及びｐＡＴ１４を作製した。さらにＡＴ１３−ＦとＡＴ１３−Ｒを用いたＰＣＲ反応の生成物を消化した制限酵素であるＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１９に該ＰＣＲ産物を連結してｐＡＴ１３を作製した。その後、ｐＡＴ９、ｐＡＴ１０、ｐＡＴ１１、ｐＡＴ１２、ｐＡＴ１３及びｐＡＴ１４をＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）に塩化カルシウム法で形質転換した。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に形質転換株を塗布し、生育したクローンを取得して形質転換株ＤＨ５α／ｐＡＴ９、ＤＨ５α／ｐＡＴ１０、ＤＨ５α／ｐＡＴ１１、ＤＨ５α／ｐＡＴ１２、ＤＨ５α／ｐＡＴ１３及びＤＨ５α／ｐＡＴ１４を得た。
【００５９】
実施例１
＜工程１＞
特開２００６−１６９１５８号公報に記載の方法に従って行った。具体的には、ラセミの２−アミノ酪酸１００ｇ、（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸をＬ−２−アミノ酪酸と等モル量の８０ｇ、蒸留水９００ｇを混合して終夜還流撹拌した。溶液の温度を２０〜３０℃まで冷却し、生じた結晶をろ過リンス後乾燥し、ジアステレオマー結晶１１０．５ｇを得た。結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より９９％ｅｅ以上であった。
【００６０】
＜工程２＞
工程１で得られたジアステレオマー結晶５０ｇに対して酢酸エチル２００ｍｌ、水２００ｍｌを加え、室温下で２時間撹拌した。その後分液し、水層に酢酸エチル２００ｍｌを加え、室温下で２時間撹拌した。水相を濃縮してＬ−２−アミノ酪酸を１７．２ｇ（収率９５％）得た。得られたＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より９９％ｅｅ以上であった。
また、酢酸エチル層を濃縮して定量的に（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸を回収した。
【００６１】
＜工程３＞
製造例１で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ８を５００ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１７時間培養した。遠心分離にて集菌後、以降のラセミ化反応に供した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解して、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ８を添加した。４０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．９９：１であった。
【００６２】
＜工程４＞
工程３で得られた２−アミノ酪酸水溶液に、工程２で回収した（Ｒ）−２−フェノキシプロピオン酸をＬ−２−アミノ酪酸と等モル量の４０ｇ加え、終夜還流撹拌した。溶液の温度を２０〜３０℃まで冷却し、生じた結晶をろ過リンス後乾燥し、ジアステレオマー結晶５５．３ｇを得た。結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より９９％ｅｅ以上であった。
【００６３】
実施例２〜５
工程３において、ＤＨ５α／ｐＡＴ８の代わりに製造例２で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ９、ＤＨ５α／ｐＡＴ１０、ＤＨ５α／ｐＡＴ１１、又は製造例１で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１５を使用した以外は実施例１と同様にして実施した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解して、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ９、ＤＨ５α／ｐＡＴ１０、ＤＨ５α／ｐＡＴ１１又はＤＨ５α／ｐＡＴ１５を添加した。４０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣにて分析した結果を表４に示す。
この反応液（２−アミノ酪酸水溶液）に対し、実施例１＜工程４＞と同様にして光学分割を行った。得られたジアステレオマー結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より、いずれも９９％ｅｅ以上であった。
【００６４】
【表４】
2011024572.tif 000011
【００６５】
実施例６
工程３において、ＤＨ５α／ｐＡＴ８の代わりに製造例２で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１２を使用し、かつ培養温度を３０℃とした以外は実施例１と同様にして実施した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解し、ピリドキサール５‘リン酸（ＰＬＰ）を終濃度１００μＭ添加して、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ１２を添加した。４０℃で２４時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は１：１であった。
この反応液（２−アミノ酪酸水溶液）に対し、実施例１＜工程４＞と同様にして光学分割を行った。得られたジアステレオマー結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より、いずれも９９％ｅｅ以上であった。
【００６６】
実施例７、８
工程３において、ＤＨ５α／ｐＡＴ８の代わりに製造例２で作製したＤＨ５α／ｐＡＴ１３又はＤＨ５α／ｐＡＴ１４を使用した以外は実施例１と同様にして実施した。
工程１で得られた、ろ液を濃縮し、５０％アセトン水溶液に懸濁し、室温で２ｈ撹拌した。ろ過乾燥後、得られた結晶５０ｇを蒸留水４５０ｇに溶解し、集菌したＤＨ５α／ｐＡＴ１３又はＤＨ５α／ｐＡＴ１４を添加した。４０℃で９６時間撹拌し、遠心分離にて除菌した。この反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、ＤＨ５α／ｐＡＴ１３を使用した場合Ｌ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．４４５：１、ＤＨ５α／ｐＡＴ１４を使用した場合のＬ−２−アミノ酪酸とＤ−２−アミノ酪酸の比は０．２４８：１であった。
この反応液（２−アミノ酪酸水溶液）に対し、実施例１＜工程４＞と同様にして光学分割を行った。得られたジアステレオマー結晶中のＬ−２−アミノ酪酸の光学純度はＨＰＬＣ分析より、いずれも９９％ｅｅ以上であった。
【配列表】
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