(57)【要約】【課題】インフルエンザウイルス捕捉用途に用いることのできる新規な糖ペプチド結合ポリマーを提供すること。【解決手段】Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を含有する１１糖ジシアリルオリゴペプチドのアミノ基と、カルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基とが共有結合してなり、  前記カルボキシル基含有ポリマーが、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ペクチン酸、コンドロイチン、カルボキシメチルキチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、並びに下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）を構造単位として含むポリエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、糖ペプチド結合ポリマー。  式（Ｉ）：2011052139.tif 000023  式（ＩＩ）：2011052139.tif 000024【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を含有する１１糖ジシアリルオリゴペプチドのアミノ基と、カルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基とが共有結合してなり、
前記カルボキシル基含有ポリマーが、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ペクチン酸、コンドロイチン、カルボキシメチルキチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、並びに下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）を構造単位として含むポリエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、糖ペプチド結合ポリマー。
式（Ｉ）：
【化１】
2011052139.tif 000020
式（ＩＩ）：
【化２】
2011052139.tif 000021
【請求項２】
前記カルボキシル基含有ポリマーが、前記ポリエーテルである、請求項１に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
【請求項３】
前記１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドが、鳥類卵脱脂卵黄から精製された糖ペプチドである、請求項１又は２に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
【請求項４】
前記１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドを、０．００１〜１０質量％の割合で含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
【請求項５】
架橋マトリクス構造を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
【請求項６】
前記カルボキシル基含有ポリマーの重量平均分子量が、１，０００〜４００，０００である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
【請求項７】
前記カルボキシル基含有ポリマーが、前記式（Ｉ）を０．１〜５０モル％含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
【請求項８】
前記１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドが下記式（ＩＩＩ）で表わされる糖ペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2011052139.tif 000022
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖ペプチド結合ポリマーを含むインフルエンザウイルス捕捉剤。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖ペプチド結合ポリマーを用いてインフルエンザウイルスを捕捉する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖ペプチド結合ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命分子として、核酸（ＤＮＡ）及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。
膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。そして、細胞間の認識や相互作用における変化が、癌、慢性疾患、感染症、及び老化などを引き起こす原因であるとも考えられている。
例えば、癌化した細胞においては、糖鎖に構造変化が起こっていることが知られている。また、インフルエンザウイルスなどの病原性ウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
【０００３】
中でも、エンベロープ上に存在するヘマグルチニンが宿主細胞膜上の複合型糖鎖に存在するα２→６結合型又はα２→３結合型シアリルラクトサミンを認識することにより、インフルエンザウイルスが、宿主細胞に感染することが知られている。
非特許文献１及び２には、これらの受容体認識糖鎖構造に対応する糖鎖を用いたインフルエンザウイルス捕捉型感染阻害剤などが開示されている。
また、特許文献１には、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃの多価誘導体が開示され、該誘導体を非適応化ヒトインフルエンザウイルスのウイルス性接着阻害剤として使用することが開示されている。
さらに、特許文献２には、アグリコン部分にホルミル基を有するグリコシドのアルデヒド基がキトサンの少なくとも一つ以上のアミノ基に還元縮合したことを特徴とするアスパラギン結合型糖タンパク質糖鎖含有キトサン誘導体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５１４１８６号公報
【特許文献２】特開２００３−３０１００２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】梅村 舞子、伊藤 正恵、牧村 裕、芦田 久、山本 憲二、日本農芸化学会２００８年会講演要旨集、p.179, 講演番号 3A05a09
【非特許文献２】Makoto Ogata, Takeomi Murata, Kouki Murakami, Takashi Suzuki, Kazuya I.P.J. Hidari, Yasuo Suzuki, Taichi Usui, Bioorg. Med. Chem., 2007, vol.15, p.1383-1393
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、いずれの複合糖質も工程数を要する糖鎖合成や酵素による糖転移合成手法といった複雑な合成反応系を用い多糖や合成ポリマー担体との複合体を調製している。
本発明が解決しようとする課題は、インフルエンザウイルス捕捉用途に用いることのできる新規な糖ペプチド結合ポリマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を含有する１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドのアミノ基と、特定のカルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基と、が共有結合してなる、新規な糖ペプチド結合ポリマーとすることにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下のとおりである。
［１］
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を含有する１１糖ジシアリルオリゴペプチドのアミノ基と、カルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基とが共有結合してなり、
前記カルボキシル基含有ポリマーが、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ペクチン酸、コンドロイチン、カルボキシメチルキチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、並びに下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）を構造単位として含むポリエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種である、糖ペプチド結合ポリマー。
式（Ｉ）：
【化１】
2011052139.tif 000002
式（ＩＩ）：
【化２】
2011052139.tif 000003
［２］
前記カルボキシル基含有ポリマーが、前記ポリエーテルである、［１］に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
［３］
前記１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドが、鳥類卵脱脂卵黄から精製された糖ペプチドである、［１］又は［２］に記載の糖ペプチド結合ポリマー。
［４］
前記１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドを、０．００１〜１０質量％の割合で含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の糖ペプチド結合ポリマー。
［５］
架橋マトリクス構造を有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の糖ペプチド結合ポリマー。
［６］
前記カルボキシル基含有ポリマーの重量平均分子量が、１，０００〜４００，０００である、［１］〜［５］のいずれかに記載の糖ペプチド結合ポリマー。
［７］
前記カルボキシル基含有ポリマーが、前記式（Ｉ）を０．１〜５０モル％含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の糖ペプチド結合ポリマー。
［８］
前記１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドが下記式（ＩＩＩ）で表わされる糖ペプチドである、［１］〜［７］のいずれかに記載の糖ペプチド結合ポリマー。
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2011052139.tif 000004
［９］
［１］〜［８］のいずれかに記載の糖ペプチド結合ポリマーを含むインフルエンザウイルス捕捉剤。
［１０］
［１］〜［８］のいずれかに記載の糖ペプチド結合ポリマーを用いてインフルエンザウイルスを捕捉する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、インフルエンザウイルス捕捉用途に用いることのできる新規な糖ペプチド結合ポリマーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】製造例１において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】製造例１において製造された糖ペプチドの１Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】製造例２において製造された糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】実施例１において製造された糖ペプチド結合ポリマーのＧＰＣチャートを示す。
【図５】実施例１で用いたポリエーテルのＧＰＣチャートを示す。
【図６】実施例２において製造された糖ペプチド結合ポリマーのＧＰＣチャートを示す。
【図７】実施例２で用いたポリアクリル酸のＧＰＣチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１２】
本実施の形態の糖ペプチド結合ポリマーは、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を含有する１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドのアミノ基と、カルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基と、が共有結合してなる糖ペプチド結合ポリマーである。
【００１３】
（１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチド）
本実施の形態において用いられるＮｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を含有する１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドとは、非還元末端に、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ糖鎖構造を有する糖ペプチド（以下、単に「糖ペプチド」と記載する場合がある。）である。
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造とは、Ｎｅｕ５Ａｃがα２→６結合により、ＬａｃＮＡｃに結合していることを意味し、具体的には、Ｎ−アセチルノイラミン酸の２位とＮ−アセチルラクトサミンの６位とがα−グリコシド結合により結合していることを意味する。
ＬａｃＮＡｃは、ガラクトースがＮ−アセチルグルコサミンとβ１→４結合によりグリコシド結合した、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃを意味し、ＬａｃＮＡｃの６位水酸基は、ＬａｃＮＡｃのガラクトースの６位水酸基を意味する。
【００１４】
糖ペプチドは、１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドであり、鳥類卵脱脂卵黄から精製される糖ペプチドであることが好ましく、１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドとしては、下記式（ＩＩＩ）で表される糖ペプチドであることが好ましい。
【００１５】
式（ＩＩＩ）：
【化４】
2011052139.tif 000005
【００１６】
上記式（ＩＩＩ）で表わされる糖ペプチドにおいては、糖鎖部分が、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＴｈｒのＡｓｎ残基に結合している。
本実施の形態において、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。
【００１７】
（カルボキシル基含有ポリマー）
本実施の形態に用いられるカルボキシル基含有ポリマーは、アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ペクチン酸、コンドロイチン、カルボキシメチルキチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、並びに下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）を構造単位として含むポリエーテルからなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【００１８】
式（Ｉ）：
【化５】
2011052139.tif 000006
【００１９】
式（ＩＩ）：
【化６】
2011052139.tif 000007
【００２０】
カルボキシル基含有ポリマーとしては、上記カルボキシル基を含有するポリマーであれば特に限定されるものではないが、生体に取り込まれても安全であること又は生分解性であることが好ましく、天然由来のカルボキシル基含有ポリマーであることも好ましい。
【００２１】
アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ペクチン酸、及びコンドロイチンは、もともとカルボキシル基をポリマー構造中に有しているので、そのまま天然に由来するものを用いてもよく、架橋構造を有するように誘導体化したものであってもよい。
カルボキシル基含有ポリマーとして、ヘパリンを用いる場合、血液抗凝固活性を軽減させる目的で、必要に応じて、例えばDanishefskyなどの方法に従い、脱Ｎ−硫酸化工程を経て、抗凝固活性を失活させた後にカルボキシル基含有ポリマーとして用いてもよい（Methods in Carbohydrate Chemistry, 2007, vol 5, p.407-409を参照）。
【００２２】
カルボキシメチルキチンはキチンに対しアルカリ条件下でモノクロル酢酸を処理することによりカルボキシメチル基を導入することができる (Biol. Pharm. Bull., 2001, vol 24, p.535-543を参照) 。
【００２３】
ポリアクリル酸やポリメタクリル酸は、合成ポリマーであるが安全性の面で好適に用いることができる。ポリアスパラギン酸やポリグルタミン酸は生分解性の点で好適に用いることができる。
【００２４】
カルボキシル基含有ポリマーは、１種で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２５】
カルボキシル基含有ポリマーが、下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）を構造単位として含むポリエーテル（以下、単に「ポリエーテル」と記載する場合がある。）である場合には、
【００２６】
式（Ｉ）：
【化７】
2011052139.tif 000008
【００２７】
式（ＩＩ）：
【化８】
2011052139.tif 000009
【００２８】
ポリエーテルの構造単位のモル比は、（Ｉ）及び（ＩＩ）の構造単位の全量を１００モル％として、（Ｉ）のモル比は、０．１〜５０モル％であることが好ましい。この場合、（ＩＩ）のモル比は、５０〜９９．９モル％であることが好ましい。
【００２９】
ポリエーテルは、特開２００９−１４９７２８号公報に記載の方法により製造することができる。
【００３０】
カルボキシル基含有ポリマーの重量平均分子量は、有機溶媒−水混合系において、該ポリマーの種類に関わらずその溶解性においては、１，０００〜４００，０００であることが好ましい。
本実施の形態において、重量平均分子量は、下記実施例に記載の方法により測定することができる。
【００３１】
（糖ペプチド結合ポリマーの製造方法）
本実施の形態の糖ペプチド結合ポリマーは、糖ペプチドと、カルボキシル基含有ポリマーとを縮合させることにより製造することができる。
糖ペプチド及びカルボキシル基含有ポリマーを縮合させる方法としては、アミド結合を形成させる公知の方法を用いることができるが、例えば、水中又は含水有機溶媒液中で、カルボキシル基含有ポリマーを、ペプチド合成用縮合剤を用いてカルボキシル基を活性化させた後、糖ペプチドのアミノ基との間で縮合反応を行うことにより得ることができる。
ペプチド合成用縮合剤としては、特に限定されないが、ＨＢＴＵ（1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluoro phosphate）、ＥＥＤＱ（N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline）ＷＳＣ（Water-soluble carbodiimid）、及びＥＤＣ（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）などが挙げられる。
【００３２】
含水有機溶媒としては、５〜７５質量％の、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ジオキサン、及びアセトンなどの有機溶媒の水溶液であることが好ましい。
縮合反応を行う温度としては、特に限定されるものではないが、０〜２５℃で行うことができる。
また、反応時間としては、特に限定されるものではないが、０．５〜２４時間で行うことができる。
【００３３】
インフルエンザウイルスを捕捉するために、糖ペプチド結合ポリマー中にＮｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を適切な量含むことが好ましく、糖ペプチドの含有量としては、糖ペプチド結合ポリマーに対して、０．０００１〜５０質量％であることが好ましく、０．００１〜２０質量％であることがより好ましく、０．００１〜１０質量％であることがさらに好ましい。
糖ペプチド結合ポリマー中の糖ペプチドの含有量は、下記実施例に記載の方法により測定することができる。
【００３４】
糖ペプチド結合ポリマーは、糖ペプチドのアミノ基と、カルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基とが、アミド結合により縮合しているポリマーである。糖ペプチド結合ポリマーは、カルボキシル基含有ポリマーを介して架橋マトリクス構造により、糖ペプチド結合ポリマーマトリクスとして得ることもできる。
本実施の形態において、糖ペプチド結合ポリマーマトリクスとは、カルボキシル基含有ポリマーと糖ペプチド結合ポリマーとの比較において、ＧＰＣによる溶出曲線のプロファイルが高分子量側に変化する場合、あるいは重量平均分子量が高分子量側に変化する場合の糖ペプチド結合ポリマーをいう。
【００３５】
糖ペプチド結合ポリマーの製造方法は、糖ペプチドと、カルボキシル基含有ポリマーと、を縮合させる工程を含む方法であれば、特に限定されないが、鳥類卵脱脂卵黄から糖ペプチドを精製する工程をさらに含むことが好ましい。
糖ペプチド結合ポリマーの製造方法としては、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して抽出液を得る工程、前記抽出液にエタノールを添加してエタノール沈殿する工程、更にＯＤＳ樹脂(オクタデシル基結合シリカゲル樹脂)に吸着させ水で洗うことで脱塩させる工程、及び糖ペプチドとカルボキシル基含有ポリマーとを縮合させる工程を含む製造方法であってもよい。
【００３６】
本実施の形態の製造方法において、糖ペプチドを精製する工程において、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して抽出液を得る工程、前記抽出液にエタノールを添加してエタノール沈殿する工程に加え、エタノール沈殿して得られた沈殿物を脱塩する工程をさらに含むことが好ましく、その工程にＯＤＳ樹脂を用いることが好ましく、ＯＤＳ樹脂に吸着させ水で洗浄することで脱塩ができることから好ましく、さらに希有機溶媒水溶液により溶出する工程で純度向上が可能であることから更に好ましい。
本実施の形態の製造方法において、鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で選択的に１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドを精製することができ、安価且つ簡便に１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドを製造することができる。
【００３７】
本実施の形態において、１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドとは、非還元末端に、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ糖鎖構造を有する糖ペプチドであり、１１糖ジシアリルオリゴ糖ペプチドとしては、下記式（ＩＩＩ）で表される糖ペプチドが挙げられる。
【００３８】
式（ＩＩＩ）：
【化９】
2011052139.tif 000010
【００３９】
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して抽出液を得る工程（以下、「抽出工程」と記載する場合がある。）とは、鳥類卵脱脂卵黄を、水又は塩溶液に懸濁し、糖ペプチドの混合物などを抽出する工程である。
鳥類卵脱脂卵黄としては、市販の脱脂卵黄を用いてもよく、鳥類卵から調製した鳥類卵脱脂卵黄を用いてもよい。
鳥類卵としては、特に限定されるものではないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、アヒル、カモ、ダチョウ、及びハトなどの卵が挙げられ、卵黄内に含まれる糖ペプチドの量が多いので、ニワトリの卵である鶏卵などが好ましい。
鳥類卵脱脂卵黄は、鳥類卵の全卵又は卵黄を、有機溶媒により脱脂処理することにより得ることができる。
鳥類卵としては、生の卵であってもよく、乾燥して得られる卵の乾燥粉末であってもよく、鶏卵卵黄及び鶏卵卵黄粉末などを用いることが好ましい。
【００４０】
脱脂処理する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、鳥類卵に有機溶媒を添加して、沈殿物と有機溶媒層を分離する方法などが挙げられる。
脱脂処理に用いられる有機溶媒としては、アセトン、メタノール、エタノール、及び２−プロパノールなどが挙げられ、これらの溶媒は単独で用いてもよく、２種の混合溶媒として用いてもよい。
鳥類卵に添加する有機溶媒の量としては、特に限定されるものではないが、鳥類卵に対して、質量で、１〜５倍の有機溶媒を用いることにより脱脂処理を行うことができる。
また、脱脂処理を行う温度としては、特に限定されるものではないが、０〜２５℃で行うことができる。
【００４１】
鳥類卵に有機溶媒を添加した後、有機溶媒と鳥類卵とをよく撹拌することにより、有機溶媒により鳥類卵に含まれる脂分を除去することができる。
有機溶媒と沈殿物とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
有機溶媒を用いた脱脂処理は、２〜６回行うことが好ましい。
【００４２】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加して、鳥類卵脱脂卵黄から糖ペプチドなどを抽出する方法としては、特に限定されるものではない。
抽出工程において用いられる塩溶液としては、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝液などが挙げられ、これらの塩溶液は単独で用いてもよく、２種の混合溶媒として用いてもよい。
塩溶液の濃度としては、０．０００１〜２．０％（ｗ／ｖ）であってもよく、鳥類卵脱脂卵黄に添加する水又は塩溶液の量としては、特に限定されるものではないが、鳥類卵脱脂卵黄に対して、質量で、０．１〜５０倍の水又は塩溶液を用いることにより糖ペプチドの抽出を行うことができる。
また、糖ペプチドの抽出を行う温度としては、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００４３】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加した後、鳥類卵脱脂卵黄と水又は塩溶液とをよく撹拌することにより、水又は塩溶液により鳥類卵脱脂卵黄に含まれる糖ペプチドを抽出することができる。
水又は塩溶液に抽出した糖ペプチドを含有する抽出液と鳥類卵脱脂卵黄とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
水又は塩溶液を用いた抽出処理は、２〜６回行うことが好ましい。
【００４４】
抽出液にエタノールを添加してエタノール沈殿する工程（以下、「エタノール沈殿工程」と記載する場合がある。）とは、糖ペプチドを含有する抽出液にエタノールを添加することにより、糖ペプチドを沈殿物として得るエタノール沈殿工程である。
エタノール沈殿に用いられるエタノールの量としては、特に限定されるものではないが、抽出液に対して、質量で、２〜２０倍のエタノールを用いることにより糖ペプチドの抽出を行うことができる。
また、糖ペプチドの抽出を行う温度としては、特に限定されるものではないが、４〜２５℃で行うことができる。
【００４５】
抽出処理により得られた抽出液は、ろ過することで、清澄な抽出液とすることもでき、また、減圧濃縮などにより濃縮した抽出液として用いてもよい。
【００４６】
抽出液と糖ペプチドとを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
得られた糖ペプチドを、水又は塩溶液に溶解し、再度エタノール沈殿を行うことにより、より精製された糖ペプチドを得ることができる。
【００４７】
本実施の形態においては、エタノール沈殿により得られた糖ペプチドをさらに精製する工程を含むことが好ましい。
糖ペプチドをさらに精製する方法としては、公知の糖ペプチドの精製方法を用いることができるが、例えば、カラムクロマトグラフィーなどが挙げられる。
カラムクロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えば、オクタデシル基結合シリカゲル（ＯＤＳ樹脂）、イオン交換樹脂などが挙げられる。
【００４８】
ＯＤＳ樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、エタノール沈殿により得られた糖ペプチド中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程を含んでいてもよい。
糖ペプチドを添加吸着させたＯＤＳ樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いてＯＤＳ樹脂を洗浄することにより糖ペプチドの脱塩を行うことができる。
【００４９】
脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより糖ペプチドを得ることができる。
糖ペプチドを添加吸着させたＯＤＳ樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いてＯＤＳ樹脂を溶出することにより糖ペプチドを得ることができる。
【００５０】
有機溶媒水溶液としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種との水溶液などが挙げられ、有機溶媒水溶液の濃度は、好ましくは０．１〜２０％(ｖ／ｖ)であり、より好ましくは１０％(ｖ／ｖ)以下、さらに好ましくは５％(ｖ／ｖ)以下である。
有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき、有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
【００５１】
溶出された糖ペプチドは、希有機溶媒水溶液を凍結乾燥など減圧濃縮することにより糖ペプチドとして得ることができる。
本実施の形態において、得られた糖ペプチドは、再度エタノール沈殿を行ってさらに精製してもよい。
【００５２】
（糖ペプチド結合ポリマー）
以上の操作により、糖ペプチドのアミノ基とカルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基とが共有結合した糖ペプチド結合ポリマーを得ることができる。
カルボキシル基含有ポリマーに対して糖ペプチドを多数導入することで、糖ペプチド単独でのウイルス捕捉効果に比べてクラスター効果により格段のウイルス捕捉性能の向上が期待されることになる。
糖ペプチド結合ポリマーとしては、例えば、以下の糖ペプチド結合ポリマーを挙げることができる。
糖ペプチド結合ポリマーとしては、例えば、下記式（ＩＶ）で表される重量平均分子量４００，０００以下のカルボキシメチルキチンに結合した糖ペプチドが挙げられる。
【００５３】
式（ＩＶ）：
【化１０】
2011052139.tif 000011
Ｒは、糖ペプチドのアミノ基以外の残基を意味する。
【００５４】
また、糖ペプチド結合ポリマーとしては、下記式（Ｖ）及び（ＶＩ）を構造単位として含む糖ペプチド結合ポリマーが挙げられる。
【００５５】
式（Ｖ）：
【化１１】
2011052139.tif 000012
Ｒは、糖ペプチドのアミノ基以外の残基を意味する。
【００５６】
式（ＶＩ）：
【化１２】
2011052139.tif 000013
【００５７】
糖ペプチド結合ポリマー中の式（Ｖ）のモル比は０．１〜５０モル％であることが好ましい。式（Ｖ）として、糖ペプチドが結合している構造を例示しているが、上記式（Ｖ）のモル比としては、糖ペプチドが結合していない式（Ｉ）である構造単位を含めたモル比である。
【００５８】
上記式（ＩＶ）及び（Ｖ）中の、Ｒは、式（ＩＩＩ）のアミノ基以外の残基を意味することが好ましい。
【００５９】
糖ペプチド結合ポリマーとしては、糖ペプチド結合ポリマーマトリクスであってもよく、糖ペプチドとして、式（ＩＩＩ）で表される１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドである場合を例示すると、糖ペプチド中の３個のアミノ基とカルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基との結合により構成される、以下のような複合糖鎖マトリクスが挙げられる。
【００６０】
【化１３】
2011052139.tif 000014
【００６１】
上記式中、(Ｐｏｌｙｍｅｒ)は、糖ペプチドにアミド結合しているカルボキシル基含有ポリマーを意味する。
【００６２】
糖ペプチド結合ポリマーマトリクスとしては、例えば、糖ペプチドを架橋点としカルボキシル基含有ポリマーと共有結合してなる、以下のような複合糖鎖マトリクスであってもよい。
【００６３】
【化１４】
2011052139.tif 000015
【００６４】
上記式中、糖ペプチドとしては、式（ＩＩＩ）で表される糖ペプチドを、カルボキシル基含有ポリマーとしては、ポリエーテルを例示して説明すると、（ＳＧＰ）は、以下のように糖ペプチドのアミノ基以外の残基を意味し、(Ｐｏｌｙｍｅｒ)は、以下のように、糖ペプチドにアミド結合しているカルボキシル基含有ポリマーのカルボキシル基以外の残基を意味する。
【００６５】
【化１５】
2011052139.tif 000016
【００６６】
【化１６】
2011052139.tif 000017
【００６７】
上記式中、ｐ〜ｔは、ｐ＋ｒ＋ｔ＝０．１〜５０モル％、ｑ＋ｓ＝５０〜９９．９モル％である。
【００６８】
ところで、糖ペプチド結合ポリマーを被覆、添加又は固定化した複合材料は医療用具として好適に用いられる。従って、糖ペプチド結合ポリマーを基材へ被覆、添加、又は固定化した場合は、多数の糖ペプチドを長期間基材に保持することが可能である。多数の糖ペプチドを基材に保持させることにより、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造によるインフルエンザウイルス捕捉効果を持続することが可能である。
医療用具として、例えば、糖ペプチド結合ポリマーを被覆、添加、又は固定化した不織布及びフィルターなどは、インフルエンザウイルス吸着性に優れることから、ウイルス感染予防マスク又はウイルス感染予防材料などの吸着素材・材料として用いることができ、優れたインフルエンザ感染予防効果を発揮することができる。
本実施の形態において、「医療用具」とは、人又は動物の、疾病の診断、治療、又は予防に使用されること、及び人又は動物の、身体の構造又は機能に影響を及ぼすことを目的とされている器具機械を意味する。
【００６９】
本実施の形態において、糖ペプチド結合ポリマーを医療用具に、被覆、添加、又は固定化する方法としては、以下の方法が挙げられる。本実施の形態の糖ペプチド結合ポリマーの希釈溶液を用いて、浸漬法、スプレー法、フローコーター法などの公知の方法により基材に溶液を被覆し、乾燥することにより行われる。被覆した際の被膜の膜厚は限定されないが、好ましくは１ｍｍ以下である。溶媒の例としては、水、エタノール、アセトン、イソプロパノール、ＴＨＦなどの有機溶媒及びそれらの含水溶媒などが挙げられる。また、糖ペプチド結合ポリマーを基材に対して、０．００１〜１０質量％の範囲で添加する。このようにして得られる糖ペプチド結合ポリマー含有基材は、例えば、フィルム、中空糸を含む糸、編織物、不織布、その他三次元成形体などに成形される。
【００７０】
糖ペプチド結合ポリマーには、固定化されたＮｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造が存在する。インフルエンザウイルスのヘマグルチニンが該構造を認識して、糖ペプチド結合ポリマー上にインフルエンザウイルスが捕捉されることで、糖ペプチド結合ポリマーを用いることにより、ヒトへのインフルエンザウイルスの感染を軽減することができる。
本実施の形態の糖ペプチド結合ポリマーは、インフルエンザウイルス捕捉用糖ペプチド結合ポリマーとして、好適に用いることができる。また、本実施の形態において、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンがＮｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を認識して、糖ペプチド結合ポリマー上にインフルエンザウイルスが捕捉されるので、糖ペプチド結合ポリマーを用いてインフルエンザウイルスを捕捉することができる。本実施の形態のインフルエンザウイルスを捕捉する方法により、ヒトなどの哺乳動物や鳥類へのインフルエンザウイルスの感染を軽減することができる。
【実施例】
【００７１】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００７２】
（ＨＰＬＣの測定）
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８  (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ  ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ３ＣＮ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００７３】
（１Ｈ−ＮＭＲ測定）
Ｄ２Ｏ  ０．４ｍＬに試料  ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で１Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００７４】
（ポリエチレンオキサイド及びプルラン換算重量平均分子量の測定）
アルギン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン、ペクチン酸、コンドロイチン及びカルボキシメチルキチン等の天然多糖および多糖誘導体の重量平均分子量を測定する場合は、天然多糖であるプルランを分子量マーカーとして用いた。
ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリエーテル等の重量平均分子量を測定する場合は、直鎖の合成高分子であるポリエチレンオキサイドを分子量マーカーとして用いた。
以下の測定条件により、ＧＰＣを行った。
島津製ＨＰＬＣ  ＬＣ−１０Ａシステム
カラム：Ｇ４０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
移動相：２０％アセトニトリル ｉｎ ５０ｍＭ塩化リチウム
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２１４ｎｍ及び屈折率
カラム温度：４０℃
【００７５】
重量平均分子量を算出するための検量線は、スタンダードポリエチレンオキサイド（ＴＯＳＯＨ製、重量平均分子量が２．４ｘ１０４，５．００ｘ１０４，１０．７ｘ１０４，１４．０ｘ１０４）、及びプルランスタンダード（Ｓｈｏｄｅｘ製、重量平均分子量が１２，２００，２３，７００，４８，０００，１００，０００、１８６，０００）を使用した。
【００７６】
（糖ペプチドの含有量の測定）
糖ペプチド結合ポリマー中の糖ペプチドの含有量は以下のようにして測定した。
糖ペプチド結合ポリマー（５ｍｇ）を０．８％トリフルオロ酢酸（５０μＬ）中、８０℃で４０分間加熱することにより、部分酸分解しシアル酸を遊離させた。遊離したシアル酸を標準シアル酸（雪印乳業（株）、N−Acetyl neuraminic acid）による検量線を用いＨＰＬＣで定量した。
ＨＰＬＣは逆相カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、４．６×１５０ｍｍ、ＧＬサイエンス社製）を用い１０．２ｍＭリン酸水溶液を溶出液として、ＵＶ２２０ｎｍで検出した。
【００７７】
［製造例１］
鶏卵卵黄１０個にエタノール３５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
得られた上記脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール７００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド１．５８ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇを用い、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド１．５ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１１７ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（太陽化学製）との比較により上記式（ＩＩＩ）で表される構造であることが分かった。
【００７８】
［製造例２］
鶏卵卵黄粉末（キューピータマゴ製）１２０ｇに水２００ｍＬ及びエタノール３００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール４００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を２度繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄１５０ｇを得た。
得られた上記脱脂卵黄１５０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水２００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、１００ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール８００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。ここで生じた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加し、遠心分離することで沈殿物を回収した。この操作を３回繰り返した。得られた沈殿物を水に溶解し凍結乾燥することで粗精製糖ペプチド２．０ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇを用い、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド２．０ｇを水５ｍＬに溶解し水で置換した樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１３０ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで６２．３ｍｇの糖ペプチドを得た。再度、３ｍＬの水に溶解し２０ｍＬのエタノールに注加することにより生じた沈殿物を回収し２０ｍＬの水に溶解し凍結乾燥することで、５６ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣの測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度では９２％であった。得られた糖ペプチドは標品（太陽化学製）との比較により上記式（ＩＩＩ）で表される構造であることが分かった。
【００７９】
［製造例３］
鶏卵卵黄粉末（キューピータマゴ製）３０ｇにアセトン１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、デカンテーションにより上清を除去した。再度アセトン５０ｍＬを添加し、よく撹拌後、デカンテーションにより上清を除去する操作を２度繰り返した。
アセトン洗浄後、エタノール５０ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール５０ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去することで、沈殿物として脱脂卵黄４０ｇを得た。
得られた上記脱脂卵黄４０ｇに水２００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水１００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、５０ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール３００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。ここで生じた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加し、遠心分離して粗精製糖ペプチド２９７ｍｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）２５ｇを用い、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド２９７ｍｇを水２ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで１０ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチド（データ未開示）は標品（太陽化学製）との比較により上記式（ＩＩＩ）で表される構造であることが分かった。
【００８０】
［実施例１］
カルボキシル基含有ポリマーとして、特開２００９−１４９７２８号公報に記載の方法により製造した、下記式（Ｉ）及び（ＩＩ）を構造単位として含むカルボキシル基を有するポリエーテルを用いた。
【００８１】
式（Ｉ）：
【化１７】
2011052139.tif 000018
【００８２】
式（ＩＩ）：
【化１８】
2011052139.tif 000019
【００８３】
式（Ｉ）で表される構造単位を２．１モル％含み、標準ポリエチレンオキサイド換算重量平均分子量が５１，０００であった。
上記ポリエーテル（１０１ｍｇ）及びＥＥＤＱ（５０ｍｇ）を５０％ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）水溶液６ｍＬに添加し、次いで、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）に製造例１で得た糖ペプチド（１０．３ｍｇ）を溶解した水溶液を添加した。得られた溶液を室温で２時間撹拌した。この反応液を透析膜（分子量カットオフ１２，０００〜１４，０００、米国スペクトラム社製）を用い、精製水に対して４℃で３日間透析した。
得られた内液を凍結乾燥して、糖ペプチド結合ポリマー（１０３ｍｇ）を得た。
糖ペプチド結合ポリマーのＧＰＣの測定結果を図４に示す。図５には、糖ペプチドと結合する前のポリエーテルのＧＰＣの測定結果を示す。
糖ペプチド結合ポリマー中の糖ペプチドの含有量は、２．８質量％であった。
【００８４】
［実施例２］
カルボキシル基含有ポリマーとしてポリアクリル酸（Aldrich, Poly(acrylic acid), ＧＰＣによるポリエチレンオキサイド換算重量平均分子量５，１００）を用いた。
ポリアクリル酸（５３．８ｍｇ）及びＥＥＤＱ（４０．０ｍｇ）を５０％ＤＭＦ水溶液４ｍＬに溶解し、次いで、水（０．５ｍＬ）に製造例１で得た糖ペプチド（４．９ｍｇ）を溶解した水溶液を添加した。得られた溶液を室温で２時間撹拌した。この反応液を透析膜（分子量カットオフ３，５００、米国スペクトラム社製）を用い、精製水に対して４℃で２日間透析した。
得られた内液を凍結乾燥し、糖ペプチド結合ポリマー（４０．４ｍｇ）を得た。
糖ペプチド結合ポリマーのＧＰＣの測定結果を図６に示す。図７には、糖ペプチドと結合する前のポリアクリル酸のＧＰＣの測定結果を示す。
糖ペプチド結合ポリマー中の糖ペプチドの含有量は４．５質量％であった。
【００８５】
［実施例３］
高分子量カルボキシル基含有ポリマーとして、ポリアクリル酸（Aldrich, Poly(acrylic acid), ＧＰＣによるポリエチレンオキサイド換算重量平均分子量１，０００，０００）を用いた。ポリアクリル酸（５０．２ｍｇ）及びＥＥＤＱ（４２．０ｍｇ）を５０％ＤＭＦ水溶液４ｍＬに溶解し、水（０．５ｍＬ）に製造例２で得た糖ペプチド（４．７ｍｇ）を溶解した水溶液を添加した。この反応液を室温で２時間撹拌した。この反応液を透析膜（分子量カットオフ１２，０００〜１４，０００、米国スペクトラム社製）を用い、精製水に対して４℃で２日間透析した。
得られた内液を凍結乾燥し、糖ペプチド結合ポリマー（４３．４ｍｇ）を得た。
糖ペプチド結合ポリマー中の糖ペプチドの含有量は４．２質量％であった。
【００８６】
［実施例４］
カルボキシル基含有ポリマーとして、ポリアクリル酸（Aldrich, Poly(acrylic acid)、ＧＰＣによるポリエチレンオキサイド換算重量平均分子量５，１００）とポリメタクリル酸（Aldrich, Poly(methacrylic acid)、ＧＰＣによるポリエチレンオキサイド換算重量平均分子量９，５００）を用いた。
ポリアクリル酸（２５．５ｍｇ）、ポリメタクリル酸（２５．０ｍｇ）及びＥＥＤＱ（５０．５ｍｇ）を５０％ＤＭＦ水溶液４ｍＬに溶解し、水（０．５ｍＬ）に製造例２で得た糖ペプチド（５．１ｍｇ）を溶解した水溶液を添加した。この反応液を室温で２時間撹拌した。この反応液を透析膜（分子量カットオフ３，５００、米国スペクトラム社製）を用い、精製水に対して４℃で２日間透析した。
得られた内液を凍結乾燥し、糖ペプチド結合ポリマー（３８．７ｍｇ）を得た。
糖ペプチド結合ポリマー中の糖ペプチドの含有量は３．９質量％であった。
【００８７】
［実施例５］
カルボキシル基含有ポリマーとして、天然多糖由来のカルボキシメチルキチン(Biol. Pharm. Bull., 2001, vol 24, p.535-543を参照)、ＧＰＣによるプルラン換算重量平均分子量５０，０００、糖残基あたりのカルボキシメチル基導入率０．６を用いた。
カルボキシメチルキチン（５０ｍｇ）及びＥＥＤＱ（５０ｍｇ）を５０％ＤＭＦ水溶液６ｍＬに溶解し、水（０．５ｍＬ）に製造例２で得た糖ペプチド（５ｍｇ）を溶解した水溶液を添加した。この反応液を室温で２時間撹拌した。この反応液を透析膜（分子量カットオフ１２，０００〜１４，０００、米国スペクトラム社製）を用い、精製水に対して４℃で２日間透析した。
得られた内液を凍結乾燥し、糖ペプチド結合ポリマー（３５ｍｇ）を得た。
糖ペプチド結合ポリマー中の糖ペプチドの含有量は２．２質量％であった。
【００８８】
［実施例６］
５％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＥＭＥＭ培地で単層培養したＭＤＣＫ細胞をＥＭＥＭ培地(０．２％ＢＳＡ)で洗浄した後、インフルエンザウイルス、実施例１で得られた糖ペプチド結合ポリマーを処理したインフルエンザウイルス、陽性対照としてシアル酸含有糖蛋白質であるＦｅｔｕｉｎを処理したインフルエンザウイルスを含むＥＭＥＭ培地中３４．５℃で５時間培養した。
インフルエンザウイルスは、ヒトインフルエンザＡウイルス (H1N1)株を使用し、接種量は１００×ＴＣＩＤ５０(５０％ Tissue−culture infectious dose)とした。糖ペプチド結合ポリマー中に含有される糖ペプチドの添加量は、培地中の濃度が0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000, 10,000μg/ｍＬになるようにした。ウイルス接種後のＭＤＣＫ細胞を２回無血清ＥＭＥＭ培地で洗浄した後、５％ＦＣＳを含むＥＭＥＭ培地で３４．５℃、２０時間再度単層培養した。
ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザウイルス感染により、細胞傷害を受け、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が漏出する。従って、培地中のＬＤＨを定量することにより、間接的にウイルス感染阻害効果を知ることができる。そこで、プロメガ社の細胞毒性試験キット（CytoTox 96 Assay）を用い、培地中のＬＤＨを比色法により定量した(４９２ｎｍにおける吸光度)。ヒトインフルエンザＡウイルス (H1N1)株に対して、糖ペプチド結合ポリマーは、対照として用いたＦｅｔｕｉｎに比べ５０％感染阻害を引き起こす有効濃度がおよそ１／１００であった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の糖ペプチド結合ポリマーは、糖ペプチドの非還元末端にＮｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃ構造を有するので、インフルエンザウイルス捕捉用途に用いることにより、ヒトへのインフルエンザウイルスの感染を軽減することができる。
【図１】
2011052139.tif 000025
【図２】
2011052139.tif 000026
【図３】
2011052139.tif 000027
【図４】
2011052139.tif 000028
【図５】
2011052139.tif 000029
【図６】
2011052139.tif 000030
【図７】
2011052139.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月14日(2010.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
上記式（ＩＩＩ）で表わされる糖ペプチドにおいては、糖鎖部分が、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＴｈｒのＡｓｎ残基に結合している（配列番号１）。
本実施の形態において、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＴｈｒは、アミノ    酸の３文字表記であり、それぞれ、リジン、バリン、アラニン、アスパラギン、及びスレオニンを意味する。
アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸であっても、Ｄ−アミノ酸であってもよく、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の任意の比率の混合物であってもよいが、Ｌ−アミノ酸であることが好ましい。また、各アミノ酸は、各アミノ酸と等価な誘導体であってもよい。