(57)【要約】【課題】傾斜内面に付着して残る細胞を低減して、分離された細胞を高い回収率で回収する。【解決手段】先端に向かって先細になるように傾斜した傾斜内面２ｂを底部２ａに有し細胞懸濁液Ａを収容する遠心分離容器２と、該遠心分離容器２を底部２ａが半径方向外方に向かうように回転させる回転機構３と、該回転機構３によって回転させられた結果、遠心分離容器２内に分離された上清Ｂを吸引する上清吸引部４と、回転機構３を作動させて細胞懸濁液Ａを遠心分離し、上清吸引部４を作動させて遠心分離容器２内の上清Ｂを除去した後、さらに回転機構３を作動させて遠心分離容器２を回転させるよう回転機構３および上清吸引部４を制御する制御部６とを備える細胞分離装置１を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端に向かって先細になるように傾斜した傾斜内面を底部に有し細胞懸濁液を収容する遠心分離容器と、
該遠心分離容器を前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる回転機構と、
該回転機構によって回転させられた結果、前記遠心分離容器内に分離された上清を吸引する上清吸引部と、
前記回転機構を作動させて細胞懸濁液を遠心分離し、前記上清吸引部を作動させて前記遠心分離容器内の上清を除去した後、さらに前記回転機構を作動させて前記遠心分離容器を回転させるよう前記回転機構および前記上清吸引部を制御する制御部とを備える細胞分離装置。
【請求項２】
先端に向かって先細になるように傾斜した傾斜内面を底部に有し細胞懸濁液を収容する遠心分離容器を前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる第１の回転ステップと、
該第１の回転ステップによって前記遠心分離容器内に分離された上清を吸引する上清除去ステップと、
該上清除去ステップによって上清が除去された状態の前記遠心分離容器を、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる第２の回転ステップとを備える細胞分離方法。
【請求項３】
前記第１の回転ステップを４００〜５００Ｇの加速度で３〜７分間行う請求項２に記載の細胞分離方法。
【請求項４】
前記第２の回転ステップを４００〜５００Ｇの加速度で１〜７分間行う請求項２または請求項３に記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置および細胞分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織から分離された細胞を洗浄し、濃縮するために、生体組織を生体適合性のある塩類溶液中に懸濁し、消化酵素を添加することによって、生体組織を消化して得られた細胞懸濁液を遠心分離機を用いる処理装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。この処置装置では、遠心分離容器内に細胞懸濁液を貯留して、遠心分離容器の底部が半径方向外方に向かうように回転させることにより、細胞懸濁液内に含まれる成分をその比重が大きい順に底部側から細胞群と上清とに積層状態に分離することができる。
遠心分離容器の底部に分離された細胞群は、その上層の上清を吸引除去することにより回収することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の処理装置は、遠心分離容器の先端中央に分離された細胞を集めて細胞の回収を容易にするために、遠心分離容器の底部に先端中央に向かって先細になるテーパ状の傾斜内面が設けられている。このため、遠心分離される際に、多くの細胞は、傾斜内面に沿って移動して遠心分離容器の底部の先端中央に集められるが、その一部は傾斜内面に付着してしまい、遠心分離容器の底部先端に集められないままとなり、回収率が低下するという不都合がある。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、傾斜内面に付着して残る細胞を低減して、分離された細胞を高い回収率で回収することができる細胞分離装置および細胞分離方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、先端に向かって先細になるように傾斜した傾斜内面を底部に有し細胞懸濁液を収容する遠心分離容器と、該遠心分離容器を前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる回転機構と、該回転機構によって回転させられた結果、前記遠心分離容器内に分離された上清を吸引する上清吸引部と、前記回転機構を作動させて細胞懸濁液を遠心分離し、前記上清吸引部を作動させて前記遠心分離容器内の上清を除去した後、さらに前記回転機構を作動させて前記遠心分離容器を回転させるよう前記回転機構および前記上清吸引部を制御する制御部とを備える細胞分離装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、細胞懸濁液が遠心分離容器に収容された状態で、制御部が回転機構を作動させて遠心分離容器を回転させることにより、遠心分離容器内に収容されている細胞懸濁液の各成分が比重によって分離され、比重の大きな細胞が底面の先端に向かって移動する一方、比重の小さな上清は細胞群の上層に分離される。この過程において、細胞は底部に設けられた傾斜内面に沿って移動させられるので、その一部が傾斜内面に付着する。
そして、制御部が上清吸引部を作動させて上清を吸引除去することにより、遠心分離容器内には細胞群が残される。
【０００８】
この状態において、制御部は、回転機構を再度作動させて遠心分離容器を回転させる。これにより、遠心分離容器内に残っていた細胞が再度遠心力を受ける。この場合において、遠心分離容器内からは上清が除去されているので、傾斜内面に付着している細胞が受ける力は、回転による遠心力および傾斜内面との間の摩擦力であり上清との間の摩擦力がなくなっている分、遠心力に抗して引き留める力が弱い。したがって、傾斜内面に付着している細胞も底部の中央先端に向かって集められ、容易に、高い回収率で回収することができる。
【０００９】
また、本発明は、先端に向かって先細になるように傾斜した傾斜内面を底部に有し細胞懸濁液を収容する遠心分離容器を前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる第１の回転ステップと、該第１の回転ステップによって前記遠心分離容器内に分離された上清を吸引する上清除去ステップと、該上清除去ステップによって上清が除去された状態の前記遠心分離容器を、前記底部が半径方向外方に向かうように回転させる第２の回転ステップとを備える細胞分離方法を提供する。
【００１０】
本発明によれば、第１の回転ステップにおいて、遠心分離容器内における細胞懸濁液が細胞群と上清とに分離され、上清除去ステップにおいて、分離された上清が遠心分離容器内から除去される。そして、第２の回転ステップにおいては、上清が存在しない状態で細胞群に遠心力がかけられるので、上清との間の摩擦力が存在しない分、細胞は遠心力によって遠心分離容器の底部に向かって移動しやすくなっており、傾斜内面に付着していた細胞についても底部の中央先端に向かって集められ、容易に、高い回収率で回収することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記第１の回転ステップを４００〜５００Ｇの加速度で３〜７分間行うことが好ましい。
また、上記発明においては、前記第２の回転ステップを４００〜５００Ｇの加速度で１〜７分間行うこととしてもよい。
このようにすることで、傾斜内面に付着していた細胞についてもその大部分を遠心分離容器の底部の中央先端に寄せ集めることができ、細胞の回収率を向上することができるとともに、過度の遠心力を細胞に作用させないので、細胞が受けるダメージを低減して、細胞を健全な状態で分離回収することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、傾斜内面に付着して残る細胞を低減して、分離された細胞を高い回収率で回収することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置を示す模式的な構成図である。
【図２】図１の細胞分離装置に備えられる遠心分離容器の一例を示す縦断面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る細胞分離方法を示すフローチャートである。
【図４】図１の細胞分離装置を用いた細胞分離方法の実施例により回収された細胞群の細胞数と、従来の方法による比較例により回収された細胞群の細胞数とを比較して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１について図面を参照して、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、細胞懸濁液Ａを収容する遠心分離容器２と、該遠心分離容器２をその底部２ａが半径方向外方に向かうように回転させる遠心分離機３と、遠心分離容器２内に分離された上清Ｂを吸引除去する上清吸引部４と、遠心分離容器２内に洗浄液Ｃを供給する洗浄液供給部５と、遠心分離機３、上清吸引部４および洗浄液供給部５を制御する制御部６とを備えている。
【００１５】
遠心分離容器２は、図２に示されるように、その底部近傍に、先端中央に向かって先細になるテーパ内面状の傾斜内面２ｂを有している。
遠心分離機３は、モータ７と、該モータ７により水平回転させられるアーム８とを備え、アーム８の両端に設けられた水平軸線９回りに遠心分離容器２を揺動可能に取り付けるようになっている。また、アーム８にはロータリージョイント１０が取り付けられており、アーム８と一体的に回転させられる可動部１０ａと、図示しないベース側に固定された固定部１０ｂとを相対回転させつつ、両者間における流路の接続を維持するようになっている。
【００１６】
上清吸引部４は、図２に示されるように、遠心分離容器２内の深さ方向の途中位置に吸引口１１ａを配置した吸引管１１と、該吸引管１１に接続された配管１２と、該配管１２内の上清Ｂに送りをかけるポンプ１３、例えば、ペリスタルティックポンプとを備えている。配管１２は、ロータリージョイント１０の可動部１０ａと吸引管１１との間を接続する可動配管１２ａと、ロータリージョイント１０の固定部１０ｂから外部に接続される固定配管１２ｂとを備えている。ポンプ１３を作動させることによって固定配管１２ｂ内の圧力を低下させ、遠心分離容器２内に分離された上清Ｂを吸引し、外部に排出することができるようになっている。
【００１７】
洗浄液供給部５は、遠心分離容器２の底部２ａ近傍に吐出口１４ａを配置した供給管１４と、該供給管１４に接続された配管１５と、該配管１５内の洗浄液Ｃに送りをかけるポンプ１６、例えば、ペリスタルティックポンプとを備えている。配管１５は、ロータリージョイント１０の可動部１０ａと供給管１４との間を接続する可動配管１５ａと、ロータリージョイント１０の固定部１０ｂから外部に接続される固定配管１５ｂとを備えている。ポンプ１６を作動させることによって固定配管１５ｂ内の圧力を低下させ、図示しない外部の洗浄液容器から供給されてきた洗浄液Ｃを吐出口１４ａから遠心分離容器２内に吐出することができるようになっている。
【００１８】
制御部６は、遠心分離機３を作動させて遠心分離容器２を回転させることにより、内部の細胞懸濁液Ａを上清Ｂと細胞群Ｄとに遠心分離させる工程と、上清吸引部４を作動させて遠心分離容器２内の上清Ｂを排出させる工程と、洗浄液供給部５を作動させて遠心分離容器２内に洗浄液Ｃを供給して細胞群Ｄを再懸濁させる工程とを繰り返させた後に、上清吸引部４を作動させて遠心分離容器２内の上清Ｂを排出させた上で、再度遠心分離機３を作動させて遠心分離容器２を回転させるよう制御するようになっている。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離装置１を用いた細胞分離方法について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１を用いて細胞懸濁液Ａから濃縮された細胞群Ｄを分離回収するには、図３に示されるように、遠心分離容器２内に細胞懸濁液Ａを収容した状態で、制御部６が遠心分離機３を作動させて遠心分離容器２を回転させ、遠心分離容器２内に収容されている細胞懸濁液Ａを細胞群Ｄと上清Ｂとに遠心分離させる（遠心分離ステップＳ１）。
【００２０】
これにより、細胞懸濁液Ａ内に浮遊していた細胞は、遠心力により、液体成分との比重の相違によって半径方向外方に移動する一方、液体成分は半径方向内方に移動する。これにより、細胞群Ｄが遠心分離容器２の底部２ａ側に分離され、その上層に上清Ｂが分離される。細胞は、遠心分離容器２内を移動する際に、遠心分離容器２に設けられた傾斜内面２ｂに沿って移動することで、先端中央に集められ、ペレット状の細胞群Ｄが構成される。
【００２１】
このとき、一部の細胞は傾斜内面２ｂに付着してその場に留まる。
次に、制御部６は上清吸引部４を作動させて、吸引口１１ａから上清Ｂを吸引し外部に排出する（上清除去ステップＳ２）。これにより、遠心分離容器２内には、細胞群Ｄが若干の上清とともに残留する。このとき、細胞群Ｄの一部は、遠心分離容器２の先端中央に集められ、他の一部は、傾斜内面２ｂに付着した状態となる。
【００２２】
この状態で、制御部６は洗浄液供給部５を作動させて、吐出口１４ａから遠心分離容器２内に洗浄液Ｃを供給する（洗浄液供給ステップＳ３）。吐出口１４ａが遠心分離容器２の底部２ａ近傍に配置されているので、吐出口１４ａから吐出された洗浄液Ｃによってペレット状に分離されている細胞群Ｄが解されて再懸濁される。これにより、細胞に付着している消化酵素のような薬剤や塵埃が細胞から洗い流される。
【００２３】
この後に、制御部６は第１の回転ステップＳ１から洗浄液供給ステップＳ３までを繰り返させる（繰り返しステップＳ４）。
そして、制御部６が遠心分離機３を作動させて遠心分離容器２を回転させ、遠心分離容器２内に収容されている細胞懸濁液Ａを細胞群Ｄと上清Ｂとに遠心分離させる（第１の回転ステップＳ５）。
【００２４】
次いで、制御部６は、上清吸引部４を作動させて、吸引口１１ａから上清Ｂを吸引し外部に排出する（上清除去ステップＳ６）。これにより、遠心分離容器２内には、洗浄された細胞群Ｄが若干の上清Ｂとともに残留する。このとき、細胞群Ｄの一部は、遠心分離容器２の先端中央に集められ、他の一部は、傾斜内面２ｂに付着した状態となる。
【００２５】
本実施形態に係る細胞分離方法においては、この状態から、制御部６が再度遠心分離機３を作動させて遠心分離容器２を回転させる（第２の回転ステップＳ７）。
この第２の回転ステップＳ７においては、遠心分離容器２内には上清Ｂがほとんど存在していないので、遠心分離ステップＳ１とは異なり、遠心力を受けた細胞群Ｄが遠心分離容器２内面との間の摩擦に抗して底部２ａの方向に向けて移動させられるようになる。
【００２６】
すなわち、遠心分離ステップＳ１および第１の回転ステップＳ５においては、細胞群Ｄは液体成分が存在している状態で傾斜内面２ｂに沿って移動しなければならないので、傾斜内面２ｂとの間の摩擦のみならず、液体成分との間の摩擦も存在している。このため、傾斜内面２ｂに付着している細胞を遠心分離容器２の先端側に移動させるには、傾斜内面２ｂとの間の摩擦力に液体成分との間の摩擦力を加えた力を超える遠心力を作用させる必要がある。これに対して、第２の回転ステップＳ７においては、液体成分が存在していないので、細胞群Ｄは傾斜内面２ｂとの間の摩擦力を超える遠心力が作用するだけで、遠心分離容器２の先端側に向かって容易に移動することができる。
【００２７】
その結果、本実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法によれば、遠心分離ステップＳ１および第１の回転ステップＳ５においては、過度の遠心力をかけることなく傾斜内面２ｂに細胞が付着した状態で細胞群Ｄと上清Ｂとを分離することができる。また、第２の回転ステップＳ７において傾斜内面２ｂに付着していた細胞群Ｄを、同じく過度の遠心力をかけることなく遠心分離容器２の先端中央に向かって移動させることができる。したがって、本実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法によれば、高い回収率で、濃縮された細胞群Ｄを回収することができるという利点がある。
【実施例】
【００２８】
ここで、本実施形態に係る細胞分離装置１を用いた細胞分離方法の一実施例について説明する。
この実施例においては、以下の方法で細胞懸濁液Ａ１，Ａ２を作成した。
【００２９】
（１）消化容器に脂肪組織２００ｇと乳酸リンゲル液２００ｍＬとを入れ、攪拌した。
（２）脂肪組織と乳酸リンゲル液とが分離するまで静置し、乳酸リンゲル液のみを廃液した。
（３）（１）、（２）のステップを３回繰り返した。
（４）脂肪組織の入っている消化容器に乳酸リンゲル液を１００ｍＬ入れた。
（５）消化容器にコラゲナーゼを０．５ＷＵ／ｍＬ、サーモライシン２１４caseinaseＵ／ｍＬ添加した。
（６）１５分間攪拌しながら消化した。
（７）消化後、脂肪層と液層とが分離するまで静置し、液層を５０ｍＬ回収して細胞懸濁液Ａ１とした。
（８）消化容器に乳酸リンゲル液２００ｍＬを入れ攪拌した。
（９）脂肪層と液層とが分離するまで静置し、液層を１００ｍＬ回収して細胞懸濁液Ａ２とした。
【００３０】
次に、以下のステップに従って、細胞群Ｄを回収した。
（１）細胞懸濁液Ａ１を２つの遠心分離容器２に２５ｍＬずつ入れた。
（２）遠心分離容器２を４００Ｇで５分間回転させて細胞懸濁液Ａ１を遠心分離した。
（３）沈殿している細胞群Ｄを吸引しないように上清Ｂを２３．５ｍＬずつ廃液した。
（４）細胞懸濁液Ａ２を２つの遠心分離容器２に５０ｍＬずつ入れた。
（５）遠心分離容器２を４００Ｇで５分間回転させて細胞懸濁液Ａ２を遠心分離した。
（６）沈殿している細胞群Ｄを吸引しないように上清Ｂを５０ｍＬずつ廃液した。
（７）各遠心分離容器２に新しい乳酸リンゲル液を３５ｍＬずつ入れた。
（８）各遠心分離容器２を４００Ｇで３分間回転させて遠心分離した。
（９）沈殿している細胞群Ｄを吸引しないように上清Ｂを３５ｍＬずつ廃液した。
（１０）（７）〜（９）のステップを３回繰り返した。
（１１）各遠心分離容器２を４００Ｇで３分間回転させた。
（１２）各遠心分離容器２内に残留している細胞群Ｄを１．５ｍＬずつを回収した。
（１３）回収した細胞群Ｄに含まれる細胞数を計数した。
【００３１】
上記ステップ（１１）を含まない同様の細胞分離方法を比較例として行い、本実施例との比較結果を図４に示す。
本実施例に係る細胞分離方法によれば、回収された細胞群Ｄ内に含まれる細胞数は、比較例において回収された細胞群Ｄの２倍以上であり、傾斜内面２ｂに残る細胞数はほとんど存在しないことがわかる。一方、比較例においては、遠心分離された細胞群Ｄの半分以上が、回収されずに傾斜内面２ｂに残留することがわかった。
【００３２】
このように、本実施形態に係る細胞分離装置１および細胞分離方法によれば、過度の遠心力をかけずに細胞を分離でき、細胞の健全性を維持することができる。そして、遠心分離容器２の傾斜内面２ｂに残留する細胞数を大幅に減らして、高い回収率で、洗浄され濃縮された細胞群Ｄを回収することができるという利点がある。
【００３３】
なお、本実施形態においては、細胞にダメージを与えることなく細胞群Ｄを分離するための遠心力として４００Ｇ、３〜５分間を例示したが、これに限定されるものではなく、遠心力としては、４００〜５００Ｇ、１〜７分間の範囲で任意に選択しても同様の効果を得ることができる。
【符号の説明】
【００３４】
Ａ，Ａ１，Ａ２  細胞懸濁液
Ｂ  上清
Ｃ  洗浄液
Ｄ  細胞群
Ｓ５  第１の回転ステップ
Ｓ６  上清除去ステップ
Ｓ７  第２の回転ステップ
１  細胞分離装置
２  遠心分離容器
２ａ  底部
２ｂ  傾斜内面
３  遠心分離機（回転機構）
４  上清吸引部
６  制御部
【図１】
2011004705.tif 000003
【図２】
2011004705.tif 000004
【図３】
2011004705.tif 000005
【図４】
2011004705.tif 000006