(57)【要約】【課題】野生型酵母や実用酵母株などで効率よく目的蛋白質・ペプチドを産生でき、さらに簡単な精製により目的配列のみを有した低分子ペプチドを純度良く得る手段を提供すること。【解決手段】恒常的発現プロモーター−分泌シグナル−２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列−フレキシブルリンカー配列−ＩＥＧＲ−目的蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターを利用することにより、効率よく培養上清から目的産物を得ることが可能となった。さらにタグ配列を指標としたアフィニティー精製と血液凝固第１０因子認識配列を用いることにより、蛋白質のみならず、僅かなアミノ酸の配列付加によっても性質の変化しやすい低分子ペプチドまでも、効率・純度よく回収できるシステムの構築に初めて成功した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
恒常的発現プロモーター配列−分泌シグナル配列−２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列−フレキシブルリンカー配列−ＩＥＧＲ配列−目的蛋白質・ペプチド配列をコードする塩基配列の構造を有するＤＮＡ断片。
【請求項２】
前記目的蛋白質・ペプチド配列がコラーゲン若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】
前記目的蛋白質・ペプチド配列が血液凝固第５因子若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項４】
酵母細胞において複製が可能であり、且つ請求項１〜３何れか１項に記載のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換酵母細胞。
【請求項６】
宿主となる酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択された請求項５に記載の形質転換酵母細胞。
【請求項７】
サッカロミセス・セレビシアエが、栄養要求性変異を持たない野生型酵母株または実用酵母株である請求項６記載の形質転換酵母細胞。
【請求項８】
請求項５〜７の何れか１項に記載の形質転換酵母細胞を培地中で培養し、当該培地中から親和性担体を用いて目的蛋白質・ペプチドを含む産生物を単離することを特徴とする蛋白質又はペプチドの製造方法。
【請求項９】
活性型の血液凝固第１０因子を用いて、前記産生物からＩＥＧＲを含む上流配列を除去することにより目的蛋白質・ペプチドのみを単離する請求項８記載の蛋白質又はペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母細胞を用いて目的の蛋白質・ペプチドを製造するための手段に関する。具体的には、本発明は、ＤＮＡ断片、形質転換した酵母細胞、及びこれらを用いた蛋白質またはペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えＤＮＡ技術により、目的の蛋白質やペプチド（以下、目的蛋白質・ペプチドと略する）を宿主細胞に産生させる場合、その宿主細胞が目的蛋白質・ペプチドを分泌発現することに多くに利点が見出される。例えば目的蛋白質・ペプチドが宿主細胞内で発現・蓄積されると宿主の増殖や生存に不都合な毒性を示す場合、目的蛋白質・ペプチドを分泌発現させることでこの毒性を回避することができる。また、目的蛋白質・ペプチドが宿主細胞内で発現・蓄積する発現系では、目的蛋白質・ペプチドが宿主細胞内で変性し、不溶化する現象が見られるが、分泌発現系ではこれを回避できる。また、商業的に組換えＤＮＡ技術を用いて目的蛋白質・ペプチドを生産する場合、目的蛋白質・ペプチドが細胞内に蓄積する系では目的蛋白質・ペプチドを精製するために細胞を破砕し、その破砕液から目的蛋白質を精製する必要がある。このような精製では、宿主由来の不純物や破砕されなかった組換え体の混入なども大きな問題となる。
【０００３】
一方、分泌発現系で目的蛋白質を生産する場合には、培養液から目的蛋白質を精製すればよく、組換え体由来の不純物や組換え体の混入を最小限に抑えることができ、大きなメリットとなる。また、蛋白質の多くは、糖鎖の付加、ジスルフィド結合の形成、特定アミノ酸のリン酸化などの修飾を受けるが、これらの中には各種細胞で共通に備わった機能もあり、これらの修飾のいくつかは分泌過程で生じる。従って、目的蛋白質を分泌発現で生産する場合、細胞内に蓄積する系に比較して、より自然な蛋白質に近い機能および構造を持った蛋白質の生産が期待される。
【０００４】
また、現在までに酵母細胞を宿主として、分泌シグナルを用いることにより目的産物を分泌生産した例としては、例えば特許文献１〜６などが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公平８−２９１１１号公報
【特許文献２】特公平７−７９６９９号公報
【特許文献３】特公平７−７９７１０号公報
【特許文献４】特許第３１５８５６６号公報
【特許文献５】特許第２７９９３４８号公報
【特許文献６】特許第４１８０１１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述のように、これまでにも酵母細胞由来ではない異種の蛋白質・ペプチドを酵母細胞を用いて産生する方法は示されてきていた。しかしながら、ペプチドはより大きな分子である蛋白質に比べて分子全体のアミノ酸数が絶対的に少ない為に、ベクター由来の付加配列やタグ由来の付加配列など、目的産物以外の配列に対する影響を強く受けることは容易に予想される。よって精製段階では、出来る限りタグ配列やベクター由来の配列を含まないようにプロテアーゼ切断後の残存配列を考慮しなければならない。さらにペプチドは低分子であるために精製後の脱塩や濃縮が困難であることからも、精製前、つまりプロテアーゼ切断の直前に濃縮と目的の蛋白質・ペプチドを除去できるシステムを用いて効率良く培養上清から回収する方法が望ましい。しかしながら、そのような精製システムまで考慮したＤＮＡ断片はこれまで存在しなかった。
【０００７】
本発明は上記現状に鑑み、低分子の蛋白質やペプチドでも、目的の蛋白質やペプチド配列のみを含む形で、少ないステップ数で効率よく製造でき、かつ純度よく精製できる手段として、ＤＮＡ断片、形質転換酵母細胞、及びこれらを用いた蛋白質またはペプチドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では上記課題を解決するために鋭意探索を重ねた結果、酵母細胞にとって通常の培養条件で高発現・分泌可能な「恒常的発現プロモーター」を用い、さらにその下流に「分泌シグナル配列」、ペプチドが培地中で安定的に存在・蓄積でき及び精製を容易にするための「２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列」、プロテアーゼ切断を効率よくするための「フレキシブルリンカー配列」、プロテアーゼ切断配列である「ＩＥＧＲ配列」、そして「目的蛋白質・ペプチド配列をコードする塩基配列」を連結したＤＮＡ断片を用いることにより上記問題点を克服できることを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）の係るものである。
（１）恒常的発現プロモーター配列−分泌シグナル配列−２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列−フレキシブルリンカー配列−ＩＥＧＲ配列−目的蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列の構造を有するＤＮＡ断片。
（２）前記目的蛋白質・ペプチド配列がコラーゲン若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である前記（１）記載のＤＮＡ断片。
（３）前記目的蛋白質・ペプチド配列が血液凝固第５因子若しくはその変種、又はその一部をコードする塩基配列である前記（１）記載のＤＮＡ断片。
（４）酵母細胞において複製が可能であり、且つ前記（１）〜（３）何れか１項に記載のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクター。
（５）前記（４）に記載の発現ベクターを含む形質転換酵母細胞。
（６）宿主となる酵母細胞がサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択された前記（５）に記載の形質転換酵母細胞。
（７）サッカロミセス・セレビシアエが、栄養要求性変異を持たない野生型酵母株または実用酵母株である前記（６）記載の形質転換酵母細胞。
（８）前記（５）〜（７）の何れか１項に記載の形質転換酵母細胞を培地中で培養し、当該培地中から親和性担体を用いて目的蛋白質・ペプチドを含む産生物を単離することを特徴とする蛋白質又はペプチドの製造方法。
（９）活性型の血液凝固第１０因子を用いて、前記産生物からＩＥＧＲを含む上流配列を除去することにより目的蛋白質・ペプチドのみを単離する前記（８）記載の蛋白質又はペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明を用いることで、低分子の蛋白質やペプチドでも酵母細胞の培養培地中に安定的に分泌・蓄積させることができる。さらに培養培地中から簡便に目的の蛋白質やペプチドの精製も可能である。したがって、本発明によれば、これまで目的の蛋白質やペプチドの分解により回収率が低かったり、精製方法が困難であった低分子の蛋白質やペプチドの生産率向上が期待できる。
【００１１】
また、本発明は、目的の蛋白質やペプチドが菌体外に分泌されること、かつ栄養要求性変異を持たない野生型酵母や実用酵母での利用も可能であるため、医療分野や創薬の分野のみならず、食品工業の分野においても貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１の方法により作製されたＤＮＡ断片を含むベクターを用いて実施例２の方法により食用酵母を形質転換し、１、２、４、７日間培養した後の培地上清中に分泌・蓄積されたコラーゲンの部分配列を含むＧＳＴ融合蛋白質を抗ＧＳＴ抗体で検出したものである。
【図２】図２は、ネガティブコントロール及びＧＳＴとコラーゲンの部分配列を含む各ベクターで形質転換された酵母培養上清を回収し、さらに実施例４記載の方法によりＧＳＴアフィニティータグと特異的に結合する担体を用いて１ステップ精製したときの、蛋白質電気泳動による解析を行った図である。図２（ａ）はＣＢＢ染色した結果を示したものであり、図２（ｂ）は抗ＧＳＴ抗体で検出した結果を示したものである。
【図３】図３は、図２（ａ）で示された図の構成と同じであるが、コラーゲンの代わりに血液凝固第５因子の部分配列を含むベクターで形質転換された酵母由来の培地上清を用いた場合の図を示している。
【図４】図４は、実施例３の方法に従い精製されたコラーゲンペプチド（ＣＰ：計算上の分子量は８５２．８６）をゲル濾過カラムに負荷したときのクロマトグラフィーを示した図であり、破線はマーカーのみを負荷したときのピークであり、実線は精製ペプチドのみを負荷したときのピークを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（ＤＮＡ断片）
本発明のＤＮＡ断片は、恒常的発現プロモーター配列−分泌シグナル配列−２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列−フレキシブルリンカー配列−ＩＥＧＲ配列−目的蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列の構造を有するものである。
【００１４】
本発明で用いられる恒常的発現プロモーターとしては、野生型酵母株、あるいは実用酵母株において、通常の培養条件で高発現・分泌可能なものであればよい。このような恒常的発現プロモーターを使用することで、従来の薬剤などを必要とする誘導発現プロモーターを用いた場合に比べて、工業的な生産を効率よく安定して行うことができる。
【００１５】
前記恒常的発現プロモーターとしては、酵母細胞で機能できるものであればよく、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＰプロモーターなどが利用可能であるが、中でも恒常的に発現量の強さが期待できるものとして、ＰＧＫプロモーターやＧＡＰプロモーターが好適に利用される。
これらの恒常的発現プロモーター配列は、各国内外のＤＮＡバンクから入手できる。
【００１６】
前記恒常的発現プロモーター配列の下流には分泌シグナル配列が連結されている。本発明において分泌シグナル配列とは、発現ベクターから翻訳された目的の蛋白質・ペプチドを含む産物を宿主である酵母細胞の外へ分泌させることを可能とするシグナル配列をいう。分泌シグナル配列の種類は酵母細胞の種類に応じて適宜決定すればよい。分泌シグナル配列としては、後述の前記発現ベクターに予め入っている発現ベクターを使用してもよい。
中でも、α因子や各分泌性蛋白質のシグナルペプチドなどが好適に利用される。
これらの分泌シグナル配列は、各国内外のＤＮＡバンクから入手できる。
【００１７】
前記分泌シグナル配列の下流には２０ｋＤ以上のタグ蛋白質をコードする塩基配列が連結されている。このような大きさのタグ蛋白質をコードする塩基配列を、前記分泌シグナル配列と後述のフレキシブルリンカー配列との間に挿入することで、産生される蛋白質・ペプチドの分解を防ぎ安定化させることができる。本発明で用いられるタグ蛋白質としては、２０ｋＤ以上の大きさのものであればよく、精製可能な特異的担体が知られたものであれば特に限定はされない。例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグなどが挙げられる。
これらのタグ蛋白質をコードする塩基配列は、各国内外のＤＮＡバンクから入手できる。
【００１８】
前記タグ蛋白質をコードする塩基配列の下流には、フレキシブルリンカー配列が連結されている。フレキシブルリンカーとしては、数アミノ酸からなる配列であれば、アミノ酸の種類や数について特に限定はないが、目的蛋白質・ペプチドの可溶化切断認識配列がタグ蛋白質による影響を最小限にする観点から、３〜５残基のグリシンからなる配列が好ましい。したがって、フレキシブルリンカー配列は、これらのフレキシブルリンカーをコードする塩基配列をいう。
【００１９】
前記フレキシブルリンカー配列の下流にＩＥＧＲ配列が連結されている。本発明で用いられるＩＥＧＲは、イソロイシン（Ｉ）−グルタミン酸（Ｅ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）からなる、血液凝固第１０因子によって認識されるプロテアーゼ切断認識配列である。血液凝固第１０因子によってＩＥＧＲのうち、Ｒ末端で切断されるため、切断後の残存アミノ酸配列がＩＥＧＲの下流にある目的蛋白質・ペプチドに付加されていない状態で得ることが可能になる。本発明では、前記のＩＥＧＲをコードする塩基配列をＩＥＧＲ配列という。
【００２０】
前記ＩＥＧＲ配列の下流に目的の蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列が連結されている。本発明における蛋白質・ペプチドとしては、低分子量のもの、例えば、１００ｋＤａ以下の大きさのものであればよく、特に制限はない。食品、医療、農業、工業などの産業に利用する上で有用な機能を有する蛋白質・ペプチドが好ましく、例えば、ヒト凝固因子蛋白質群（例えば、血液凝固第５因子）、コラーゲン、又はこれら蛋白質の機能的な類似物が挙げられる。
なお、本明細書に関して、「機能的な類似物」とは、本来の蛋白質と同様な機能をある目的に対して有するペプチドを意味する。ペプチドは、本来の蛋白質と同一なアミノ酸配列であっても、あるいは１以上のアミノ酸が変異・欠失・付加されているような変種でもよいし、その一部でもよい。
【００２１】
また、本発明のＤＮＡ断片は、Ｎ末端とＣ末端側に任意の制限酵素認識配列を有していたり、前記目的の蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列の下流にストップコドンが連結されていることが好ましい。
【００２２】
また、本発明のＤＮＡ断片は、前記の各配列どうしが直接連結されていてもよいし、配列の間にフレームシフトを起こさないような１塩基以上の欠失や挿入、あるいはマルチクローニングサイトなどの機能的なドメインが存在してもよい。
マルチクローニングサイトとしては、複数の公知の制限酵素認識部位を集めた配列であればよい。
【００２３】
なお、前記ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ、制限酵素などの公知の遺伝子組み換え手法に基づいて、各配列を連結することで製造することができる。
【００２４】
（組換え発現ベクター）
本発明の組換え発現ベクターは、酵母細胞において複製が可能であり、且つ前記ＤＮＡ断片を含むものである。このような組換え発現ベクターは、酵母細胞を形質転換することに使用される。
【００２５】
本発明の組換え発現ベクターは、酵母細胞において複製可能であるベクターであればよい。例えば、取り扱い易さ及び複製のし易さの観点から、プラスミドベクターが好ましい。プラスミドベクターは、２μｍの複製開始点を持つものであれば好ましい。また、組換え発現ベクターの挿入配列のシーケンスを簡便にする目的で、大腸菌で複製可能な複製開始点をさらに持つシャトルベクターが好適に利用される。
【００２６】
本発明では、例えば、酵母細胞において複製が可能な発現ベクターにおいて、第１０因子のようなプロテアーゼ認識配列の下流に前記ＤＮＡ断片を公知の手段で挿入することで、これらを含むベクターとして調製することができる。
【００２７】
（形質転換酵母細胞）
本発明の形質転換酵母細胞は、前記組換え発現ベクターを含むものである。
【００２８】
宿主となる酵母細胞としては、培養系において大量の目的蛋白質・ペプチドを産生することができる酵母細胞であればよい。酵母の種類としては、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・クルイビリ、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・ウバルム、クルイベロミセス・ラクチス、ピチア系、カンジダ系などが挙げられる。好ましくはサッカロミセス・セレビシアエであり、経口摂取可能な食品工業的な観点から、栄養要求性変異を持たない野生型酵母株または実用酵母株（ビール酵母やパン酵母）がより好ましい。
【００２９】
宿主となる酵母細胞の形質転換は、前記組換え発現ベクターを用いて、公知の方法、例えばリチウム法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などにより行えばよい。
【００３０】
本発明の形質転換酵母細胞は、公知の培地で培養することで、培地中に目的蛋白質またはペプチドを含む蛋白質またはペプチド産生物が分泌される。
【００３１】
（蛋白質又はペプチドの製造方法）
本発明の蛋白質又はペプチドの製造方法は、前記形質転換酵母細胞を培地中で培養し、当該培地中から親和性担体を用いて目的蛋白質・ペプチドを含む産生物を単離することを特徴とする。
【００３２】
形質転換酵母細胞の培養条件としては、酵母細胞の種類に応じて適当な条件を選択すればよい。例えば、１５℃〜４３℃（好適には３０℃程度）で２０〜２００時間程度行い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。
【００３３】
前記培養するための培地としては、ＹＮＢ培地やＹＰＤ培地などの栄養培地が例示される。これらの培地は、予めオートクレーブなどで殺菌処理を施しておく。
【００３４】
本発明では、殺菌処理を施しておいた培地中に、種菌となる形質転換酵母細胞を接種し、適当な条件下で培養を開始する。培養状態は、経時的に培地のｐＨを測定したり、培地の濁度を測定しながら調整すればよい。
【００３５】
また、本発明では、前記培地を入れ替える連続培養を行うことも可能である。連続培養法は、公知の手法によればよい。例えば、連続培養を行う場合には、培地中の酵母細胞の濃度を予め決めておき、所定の濃度に達したときに所定の容量の酵母細胞を含む培地を取り出して、同量の新しい培地を入れ替えるようにすればよい。
【００３６】
本発明では、培養初期から目的蛋白質・ペプチドを含む蛋白質・ペプチド産生物が培地中に分泌される。そして、培養を続けることで、培地中の形質転換酵母細胞が増殖するにしたがって、培地中への前記蛋白質・ペプチド産生物の濃度も増大することになる。前記のように、培地中に分泌される蛋白質・ペプチド産生物は、目的蛋白質・ペプチドを含むものであり、具体的には、２０ｋＤ以上のタグ蛋白質−フレキシブルリンカー−ＩＥＧＲ−目的蛋白質・ペプチドの構造を有するものである。
【００３７】
次いで、培地から培養上清を回収し、親和性担体を用いて前記蛋白質・ペプチド産生物を精製する。
【００３８】
培地から培養上清を回収する方法としては、遠心分離、ろ過などの公知の手段が挙げられる。遠心分離、ろ過の具体的な条件としては、酵母細胞が破砕しない程度のものであればよい。また、培地から分離された形質転換酵母細胞は、新たな培養に再利用してもよい。
【００３９】
前記親和性担体としては、タグ蛋白質を指標としたアフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法で使用される担体であればよく、例えば、ヒスチジンタグ用担体、マルトース結合蛋白質用担体、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）用担体等が挙げられる。
【００４０】
前記親和性担体は、前記蛋白質・ペプチド産生物に含まれるタグ蛋白質を選択的に認識して吸着することができる。したがって、前記親和性担体を用いることで、目的蛋白質・ペプチドを含む産生物のみを効率よく精製することが可能になる。
【００４１】
また、本発明では、活性型の血液凝固第１０因子などのプロテアーゼを用いて前記蛋白質・ペプチド産生物を処理することで、ＩＥＧＲを含む上流配列を除去して目的蛋白質・ペプチドを得ることができる。
【００４２】
プロテアーゼによる目的蛋白質・ペプチドのタグ蛋白質からの分離は、所望のプロテアーゼに好適な水系溶媒条件で行えばよく、特に限定はされない。
【００４３】
プロテアーゼ処理後の目的蛋白質・ペプチドは、水系溶媒中に溶解しているため、カラム処理、限外濾過膜、塩析などの手法により濃縮したり、乾燥して粉末状にしてもよい。
【実施例】
【００４４】
次に本発明をその実施例によって具体的に説明する。
（実施例１）
基本ベクターとしては酵母と大腸菌の複製起点と選抜可能な薬剤耐性遺伝子を持ち、プロモーターとしてＰＧＫプロモーターと、ターミネーターを備えたベクターをｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）から作製して使用した。さらにこのベクターは、ＰＧＫプロモーターとターミネーターの間に、下記のマルチクローニングサイトを有するものである。
５´−ｇｇｔａｃｃｃｇｇｇｔｃｇａｃｔｃｇａｇｃｔｃｔａｇａｇｇｔｔａａｃ−３´（配列番号１）
【００４５】
この配列により、ＫｐｎＩ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ−ＸｂａＩ−ＨｐａＩの制限酵素サイトが含まれることになる。このマルチクローニングサイトに次のように挿入配列と組換え反応を行った。α因子を有する鋳型ＤＮＡから、下記のプライマーセットを用いてα因子をＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反応）により増幅した。
なお、ＰＣＲ条件としては、ステップダウンＰＣＲを用い、６８℃から５３℃まで1サイクルごとに１℃アニーリング温度を下げていき（１６サイクル）、さらに５３℃のアニーリング温度で２０サイクルの反応を行った。なお、１本鎖への解離は９５℃、３０秒、伸長反応は７２℃、１分間で行った。
プライマー１：５´−ｇｇｇｇｔａｃｃａｔｇａｇａｔｔｔｃｃｔｔｃａａｔｔ−３´（配列番号２）
プライマー２：５´−ａａａｃｇａｇｃｔｃｇａｇｔｃｇａｃｃｃｇｇｇｔｔｃａｇｃｔｔｃａｇｃｃｔｃｔｃｔｔｔｔ−３´（配列番号３）
【００４６】
このプライマーセットで増幅したα因子は、Ｎ末端側にＫｐｎＩ配列、Ｃ末端側にＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ配列が付加してあるので、得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＳａｃＩを用いて前記ベクターに挿入することにより、もう一度α因子の下流にＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩのマルチクローニングサイトが挿入されることになる。このように作製されたベクターを改変ベクター（１）とした。
なお、ベクターが所望の塩基配列の構造を有することは、ＤＮＡシーケンスにより確認した。
【００４７】
次にＧＳＴを有する鋳型ＤＮＡからＧＳＴを増幅した。なお、鋳型ＤＮＡとしては複数の候補が入手可能である中で、ｐＧＥＸ（ＧＨヘルスケア社製）を選択した。下記のプライマーセットを用いてＧＳＴをＰＣＲにより増幅した。なお、ＰＣＲは、前記α因子の場合と同様の条件で行った。
プライマー３：５´−ａａａｇａｔａｔｃａｔｇｔｃｃｃｃｔａｔａｃｔａｇｇｔ−３´（配列番号４）
プライマー４：５´―ａａａｃｇａｇｃｔｃｇａｇｔｃｇａｃｃｃｇｇｇａｔｃｃｇａｔｔｔｔｇｇａｇｇａｔｇｇｔｃ−３´（配列番号５）
【００４８】
このプライマーセットで増幅したＧＳＴは、Ｎ末端側にＥｃｏＲＶ配列、Ｃ末端側にＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ配列が付加してあるので、得られたＤＮＡ断片をＧＳＴ側はＥｃｏＲＶとＳａｃＩ、上記作製した改変ベクター（１）はα因子の下流のＳｍａＩとＳａｃＩで切断することによりＧＳＴ断片を挿入することができる。さらにこのようにして得られた改変ベクター（２）は、ＧＳＴのＮ末端側がＥｃｏＲＶとＳｍａＩの平滑末端同士で繋いだために、すでにＳｍａＩでは切断されなくなり、ＧＳＴのＣ末端側にあるマルチクローニングサイトのＳｍａＩのみを再度利用できるようになる。
改変ベクター（２）の塩基配列の構造は、
ＫｐｎＩ−α因子−ＧＳＴ−ＳｍａＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＳａｃＩ−ＸｂａＩ−ＨｐａＩとなる。
【００４９】
本発明ではさらに、次のようなコラーゲンの部分配列を含むオリゴＤＮＡセットを、常法に従い熱変性−自然冷却により２本鎖にし、上記改変ベクター（２）のＧＳＴの下流部分に挿入した。
オリゴ１：５´―ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｇａａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔｇｇｔｃｃｔｔｃｔｇｇｔｇａａｃｇｔｇｇｔｃｃｔｃｃｔｔｇａｔｃｔａｇａｇｃ−３´（配列番号６）
オリゴ２：オリゴ１の相補鎖
【００５０】
このオリゴ２本鎖は、ＳｍａＩ配列−Ｇｌｙ×３−血液凝固第１０因子切断配列「ＩＥＧＲ」−コラーゲン由来ペプチド配列「ＧＰＳＧＥＲＧＰＰ」をコードする塩基配列−ストップコドン−ＸｂａＩ配列となっており、上記改変ベクター（２）のＳｍａＩ配列−ＸｂａＩ配列間に挿入することで目的のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターが得られた。
なお、ＤＮＡ断片の構造は、ＫｐｎＩ配列−恒常的発現プロモーター配列（ＰＧＫ）−分泌シグナル配列（α因子）−タグ蛋白質をコードする塩基配列（ＧＳＴ）−フレキシブルリンカー配列（Ｇｌｙ×３）−ＩＥＧＲ配列−コラーゲン由来ペプチド配列「ＧＰＳＧＥＲＧＰＰ」をコードする塩基配列−ストップコドン−ＸｂａＩ配列となっていた。
【００５１】
（実施例２）
実施例１で使用したコラーゲン由来ペプチド配列をコードする塩基配列とは別に、次のような血液凝固第５因子の部分配列を含むものを作製した。具体的にはヒト型血液凝固第５因子を有する鋳型ＤＮＡから、下記のプライマーセットを用いて血液凝固第５因子の部分配列をＰＣＲにより増幅した。
プライマー５：５´−ｔｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｇａａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔａｃｔａｃｔｃｔｔｇｇａｔｔｃｔｇｃｔｔｔｇａｔｇａｃａｃｔ−３´（配列番号７）
プライマー６：５´―ｇｃｔｃｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｔｔｃｃｔａａｔｇｃｔｇｃａｇｃ−３´（配列番号８）
【００５２】
このプライマーセットで増幅した血液凝固第５因子部分配列は、Ｎ末端側にＳｍａＩ配列−Ｇｌｙ×３−血液凝固第１０因子切断配列「ＩＥＧＲ」、Ｃ末端側にＸｂａＩ配列が付加してあるので、得られたＤＮＡ断片を上記改変ベクター（２）のＳｍａＩとＸｂａＩサイトに挿入することで目的のＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターが得られた。
このＤＮＡ断片の構造は、
ＫｐｎＩ配列−恒常的発現プロモーター配列（ＰＧＫ）−分泌シグナル配列（α因子）−タグ蛋白質をコードする塩基配列（ＧＳＴ）−フレキシブルリンカー配列（Ｇｌｙ×３）−ＩＥＧＲ配列−血液凝固第５因子部分配列−ストップコドン−ＸｂａＩ配列となっていた。
【００５３】
実施例１及び２で、最終的に得られた全ての配列を含む各ＤＮＡ断片及び組換え発現ベクターは、ＤＮＡシーケンスにより挿入配列とフレームが正しいことを確認した。
【００５４】
（実施例３）
実施例１、２で作製された各組換え発現ベクターは、リチウム法により定法に従い実用酵母株であるサッカロミセス・セレビシアエの細胞に遺伝子導入された。
組換え発現ベクターが導入された酵母細胞は、ベクター上の薬剤耐性を指標に選抜され、得られた複数コロニーを形質転換酵母株として寒天培地上にストックした。寒天培地上のコロニーを白金耳により少量採取し、１０ｍＬのＹＰＤ培地（ペプトン２％、酵母エキス１％、グルコース２％）に植菌した。３０℃で1日培養後に、１０００倍希釈となるように１ＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で１−７日間の本培養を行った。各日数で培養した培養上清を遠心により回収し、さらに不溶物を除去するために０．４５μｍのフィルターによる濾過を行った。このようにして得られた画分を培養上清として実験に用いた。
【００５５】
実施例１の方法により作製されたＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターを用いて、実施例３の方法により食用酵母を形質転換し、１，２，４、７日間培養した後の培地上清中に分泌・蓄積されたコラーゲンの部分配列を含むＧＳＴ融合蛋白質を抗ＧＳＴ抗体で検出した結果を図１に示す。このように、ＧＳＴ及び目的ＤＮＡ断片を含まないベクター（ネガティブコントロール）と比較してＧＳＴ及び目的ＤＮＡ断片を含む組換え発現ベクターで形質転換された酵母の培養上清からは、目的分子サイズの位置に抗ＧＳＴ抗体と反応するバンドを検出することができたことを示しており、少なくとも培養1日目から７日目までは分解されることなく、培地中に目的蛋白質が分泌・蓄積されることも示している。
【００５６】
（実施例４）
実施例３で得られた培養上清を用いて、さらに精製を行った。培養上清１Ｌに対して１ｍＬの「Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ担体」（ＧＥヘルスケア社製、商品名）を添加した。
マニュアルに従いバッチ法により培養上清中のＧＳＴ融合蛋白質を上記担体に結合させた後に、５ｍＬの５０ｍＭ  トリスバッファー（ｐＨ９．６）で３回担体を洗浄し、最終的に同バッファーに還元型グルタチオンを添加した溶出バッファーで担体からのＧＳＴ融合蛋白質の溶出を行った。
【００５７】
また目的のペプチドのみを溶出する場合は、ＧＴＳ融合蛋白質が結合した上記担体を、５ｍＬの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ2で３回洗浄した。次に同バッファーに５０ユニットの血液凝固第１０因子（ＧＥヘルスケア社製）を添加したプロテアーゼ溶液を前記担体と等量添加し、室温で一昼夜攪拌した。その後、遠心により上清画分を回収し、これをペプチド溶液とした。
【００５８】
ネガティブコントロール及びＧＳＴとコラーゲンの部分配列を含むベクターで形質転換された酵母培養上清を回収し、さらに実施例４記載の方法によりＧＳＴアフィニティータグと特異的に結合する担体を用いて１ステップ精製したときの、蛋白質電気泳動による解析を行った結果を図２に示す。図２（ａ）のＣＢＢ染色の写真から、非常に純度良く回収されていることが確認できる。また、図２（ｂ）の抗ＧＳＴ抗体で検出した結果より、実施例４において精製された蛋白質は間違いなく目的蛋白質であることが確認された。
【００５９】
また、図３は、コラーゲンの代わりに、実施例２で得られた血液凝固第５因子の部分配列を含むベクターで形質転換された酵母由来の培養上清から、ＧＳＴアフィニティータグと特異的に結合する担体を用いて１ステップ精製したときの抗ＧＳＴ抗体で検出した場合の結果を示している。図２（ｂ）の場合と同様に、精製された蛋白質は間違いなく目的蛋白質であることが確認された。
【００６０】
図４は、実施例４の方法に従い精製されたコラーゲンペプチド（ＣＰ：計算上の分子量は８５２．８６）をゲル濾過カラムに負荷したときのクロマトグラフィーの結果を示した図であり、破線はマーカーのみを負荷したときのピークであり、実線は精製されたコラーゲンペプチドのみを負荷したときのピークを示している。このようにペプチドのみを負荷したときのクロマトグラフィーからは、目的分子サイズの溶出時間のみに１ピークであることからも、純度良く精製されたことが確認できた。
【００６１】
なお、目的の蛋白質・ペプチドとして、前記コラーゲン、血液凝固第５因子の部分配列以外にも、低分子の蛋白質・ペプチドをコードする塩基配列を用いたり、前記実験酵母のかわりに栄養要求性変異を持たない野生型酵母株を用いることは当業者であれば適宜なし得ることである。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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