(57)【要約】【課題】電気泳動やＨＰＬＣなどを用いた分離分析により得られた濃度波形において、物質が重なっていると思われる部分をそれぞれガウス曲線化し元の濃度波形になるようガウス曲線を作成した上で分画比を算出し、濃度値を求める。【解決手段】濃度波形からそれぞれのガウス曲線のピーク位置を、自動的または手動的に設定するだけで、元の濃度波形に近似させるガウス曲線群を遺伝的アルゴリズムを使用して作成して、ガウス曲線群の面積の総和で個々のガウス曲線の面積を除した面積比を算出すると共にそれに別途測定した被測定対象物質の濃度を乗じて個々のガウス曲線の濃度値を求める。【選択図】図３
2011123039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離分析した物質の濃度分布を表す濃度波形において、複数の特定の物質が存在すると推定される濃度波形上のピーク点の水平方向の位置を自動的又は手動的に確定するだけで、確定した位置を通る垂線を中心とする任意のガウス曲線が設定され、設定された複数個のガウス曲線の総和を示すガウス合成曲線の作成に次の２つのパラメータ
（１）各ガウス曲線のピーク点の高さ
（２）ガウス曲線の水平方向の広がり具合を示す標準偏差
を遺伝子とする遺伝的アルゴリズムの手法を適用することで、濃度波形に十分近いガウス合成曲線が得られるよう個々のガウス曲線を自動修正し、個々のガウス曲線の面積をガウス曲線の総和の面積で除して作成した分画比を算出またはその分画比に、別途他の測定法で計測した被対象物質の濃度値を分画比に乗ずることにより個々のガウス曲線で近似された物質の濃度を求めることを特長とする遺伝的アルゴリズムを使用する濃度波形の解析法及び定量法
【請求項２】
前項の濃度波形のピーク点を通る垂線を中心とする複数のガス曲線についてそのガウス合成曲線が、元の濃度波形を忠実に再現できていないと測定技術者が認識した場合、測定技術者の判断で一部のガウス曲線のピーク点を削除又は追加することまたは測定技術者が当該ガウス曲線をマウス操作でクリップし上下左右に微妙に移動させて当該ガウス曲線がさらに正しく元の濃度波形を近似するようガウス曲線群を作成することを特長とする請求項１の遺伝的アルゴリズムを使用する濃度波形の解析法及び定量法
【請求項３】
測定技術者の判断で、ピーク点が水平方向の同じ位置に高さが異なるガウス曲線があると判断した場合は、新しく別のガウス曲線のピーク点を設定し、その高さ及び標準偏差を決めることで自動的にガウス合成曲線が再作成されることを特長とする請求項１の遺伝的アルゴリズムを使用する濃度波形の解析法及び定量法
【請求項４】
複数の特定の物質が存在すると推定される濃度波形のピーク点の水平方向の位置を自動的に検出する方法が、電気泳動の移動度、分析法特有の時間間隔または波形の増加率が上昇から下降に転じた点や移動平均値が最小になる点を捉えることを特長とする請求項１の遺伝的アルゴリズムを使用する濃度波形の解析法及び定量法
【請求項５】
濃度波形から特定の物質の面積比を計算するとき、特定の範囲を指定することもなくガウス曲線の面積比により実施することを特長とする請求項１の遺伝的アルゴリズムを使用する濃度波形の解析法及び定量法
【請求項６】
分離分析の濃度波形と、作成した複数のガウス曲線群及びガウス曲線の合成曲線を同時にまたは個別にそれぞれが区別できる色調又は線で表示し、又は印刷することを特長とする請求項１の遺伝的アルゴリズムを使用する濃度波形の解析法及び定量法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】医学・薬学・農水畜産及び有機化学分野での検体検査や研究および品質管理において、目的とする蛋白質、脂質、炭水化物等を電気泳動法や液体クロマトグラフ法およびペーパークロマトグラフ法で分離分析し濃度分布波形を作り、その分画比を計算した上、濃度を測定する方法に関する分野。
【背景技術】
【０００２】分離分析法は蛋白質や脂質、炭水化物など物質が持っている電荷またはサイズ、反応性などにより分離分析できる大変有意義な方法である。一般的には分離したあと検出する目的物質ごと特定の染色法を適用したり特定の検出法で分析されている。例えば染色された支持体は光学濃度計で分析され、蛍光や放射線又は磁気で標識された場合はそれぞれ特定の物理化学的な方法で検出し、その濃度分布を波形として捉え物質の質や量を分析している。【０００３】分離分析法は分析対象物質や使用する支持体や担体により分離能が左右される。例えば血液中の蛋白質は、その種類だけで１００種類を越えるので、理論上分離される物質は当然１００種類を越えるものが分離されていることになるが、その濃度の差は有に数１００万倍を超えるため、量の少ない物質は多い物質に重なって見えないことになる。従って分析目的物質毎に特別な染色法が開発されそれぞれ使用されている。このように検出法により測定する物質が、ある程度取捨選択されているものの、近接した物質についてはそれぞれが混合された分析波形となって表れている。
非特許文献１及び２にはリポ蛋白質を粒子の大きさで分けられた電気泳動法及びＨＰＬＣによる波形が掲載されており、この波形は種々の粒子のリポ蛋白質が実質このようなガウス曲線群の集まりであることを示しており、それをガウシャンフィッティングとして紹介している。このようにガウス波形で近似することが好ましいと論理的に説明されているが、その具体的な近似法が実用化されるには至っていなかった。【０００４】また血清蛋白質をセルロースアセテート膜やアガロースゲル電気泳動法で分析する測定法では、濃度波形から特定の癌細胞が作るＭ蛋白質を特異的に検出する方法が特許文献１、２に記載されている。Ｍ蛋白質はセルロースアセテート膜電気泳動法において、通常の蛋白成分の１つとしてγグロブリンのどこかの波形の一部分として現れることが多い。例えば特許文献１では出現したＭ蛋白質の波形の半値幅とその他の条件を組み合わせてＭ蛋白を識別している。また特許文献２では普通の蛋白質の波形から瘤の様に飛び出た部分を切り出す方法が述べられている。【０００５】特許文献３は、リポ蛋白質を特許文献８はアルカリ性ホスファターゼアイソザイムをそれぞれポリアクリルアミドのディスクゲルで電気泳動し、それぞれの成分を相対移動度ＲＭ値で判定している。
同様特許文献４、５、６には、リポ蛋白質を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離しコレステロールや中性脂肪などの脂質染色を行い比色測定した濃度波形をガウス分布曲線近似法を含む波形処理を行う方法が記載されている。結果的に非特許文献１に示すガウシャンフィッティングを得ようとしているが、実際は特許文献１や２に述べられた半値幅等を利用したり、特定の溶出時間間隔における位置でガウス曲線を作成すると書かれているがその具体的な実施方法の記載はない。【０００６】また特許文献７には、電気泳動法でＤＮＡの塩基配列の分析例が記載されており、綺麗なパターンを得るため標準化係数を使い、その標準化係数は遺伝的アルゴリズムを使用して決定するとされている。この分析法はＤＮＡの４個の塩基配列を決定するためのもので、電気泳動波形から物質の混在を区別するものではない。塩基配列を求める方法では塩基の順番が判かれば良いので、電気泳動波形のベースラインの不均一性や波形のギザギザにより特定の波形が在る又は無しの判定に迷いが生じないよう波形を綺麗なガウス曲線で近似している。その標準化するための手段として遺伝的アルゴリズムを使用していると記載されている。【０００７】遺伝的アルゴリズムは１９７５年に米国ミシガン大学のジョン・ホランドが適応・進化のモデルとして考案した方法で、生物遺伝メカニズムを模倣した学習的アルゴリズムといわれ、工学的にモデル化したものである。それは高次方程式や最小二乗法などの数学的計算式で解けないモデルに対して有効な手法とされている。簡単に説明すると、データ（解の候補）を遺伝子（記号）からなるコードとして表現し（これを染色体とみなす）、選択・交叉、突然変異などの遺伝的操作を繰り返しながら解を探索する手法である。
遺伝的アルゴリズムを使用する利点は、解の空間で一つの局所解に陥ることが避けられることもひとつの特長である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】  特開平５−３１２８１２
【特許文献２】  特開平６−２７３３１９
【特許文献３】  特開２００５−１２１６１９
【特許文献４】  特開平９−１５２２５
【特許文献５】  特開２００４−２６４０５１
【特許文献６】  特公表２００８−５２０９９３
【特許文献７】  特表平１１−５０９６２２
【特許文献８】  特願２００９−１３４４６８
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１０，ｐ１１０３−１１０７，１９９６
【非特許文献２】  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２５，ｐ．５７８−５８４，２００５
【発明の概要】
【発明が解決しょうとする課題】
【００１０】背景技術で述べたように分離分析により得た濃度波形は、多様な物質の寄り集まりの結果出現したものであり、得られた波形一つ一つにそれぞれの意味があることは事実である。
本願は電気泳動などで得られた濃度波形について、その波形を個々のガウス曲線からなるガウス合成曲線で近似する方法を具体的に提起し、個々のガウス曲線群の総和からそれぞれのガウス曲線の分画比を求め、さらに別途分光光度計や自動分析装置などで求めた被測定物質の定量値を分画比に乗ずることで当該物質の濃度を求めることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】本願の分離分析波形の解析法を論ずる前に、特許文献５と６が実施している波形の解析方法を検証する。特許文献５の請求項１１及び段落「００１８」と「００４２」には波形の分割方法として、混合ピークの高さと半値幅を勘案した上個別に定量した混合ピークの値を考慮して行うと記載されている。
また同特許文献５の請求項１２及び段落「００１９」と「００５９」「００６０」「００６１」にはピークが無い場合の方法として液体クロマトグラフィーの溶出時間を使用するとも記載されている。以上より特許文献５は元の濃度波形を決めた溶出時間毎にごとに適当なガウス曲線を作成したもので、元の濃度波形に合せるガウス曲線を得るというものではない。
【００１２】特許文献６の請求項６や段落「０００７」にはコンポーネントピークに対応する近似波形を算出すると記載されているが、その近似波形を算出する方法は、段落「０００８」に近似波形が５種類の成分に由来する信号と記載されているに過ぎない。そして段落「０００９」にはアンカーピークは実験的に決められるもので、数学的にピークの位置と幅が決まるものであると記載されている。またそれに続く段落「００１０」〜「００１２」から近似波形を算出する方法は、ＨＰＬＣ独特の溶出時間に関係する方法であることが分かる。また波形処理については段落「００３９」〜「００４１」にコンピュータを実行させ２０個の独立したピークに分離すると記載されておりそれが溶出時間で決められるピーク位置を指している。特に段落「００４１」及び図３にその２０個のコンポーネントピークの各ピーク位置は溶出時間で決めるとも記載されている。また段落「００５６」〜「００６４」にはガウス波形処理計算アルゴリズムを適用すると記載されているが、具体例としてピーク数、ピーク位置、幅を求めるｃｕｒｖｅｆｉｔｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄで、基は非線形最小二乗法だと記載されている。その欠点を指摘した別の４個の解析法も列記されている。
【００１３】本願は濃度波形の分離そのものの良し悪しや分解能・正確度はあくまでも分離分析法固有の技術であり、濃度波形そのものの波形解析技術とは別のものであるとの認識に基づいて、あらゆる分離分析濃度波形共通の解析に使用できる新しい方法を提供しょうとするものである。
具体的には、電気泳動法やＨＰＬＣ法で得られた濃度波形は、個々のガウス曲線の合成波形といわれており（非特許文献１，２）個々のピーク点の水平方向の位置に対応する点を自動または手動的に確定するだけでそのピーク点に予め用意されたガウス曲線を自動的に設定し、その合成波形が元の濃度波形に近似するように個々のガウス曲線の形状を自動的に変える方法を遺伝的アルゴリズムを使用することにより実現した。
【００１４】最初に濃度波形の山の頂点いわゆるピーク点の自動検出であるが、従来の分離分析技術ではピーク点より谷位置の検出がより重要でありそれは特許文献１、特許文献２ですでに公知となっている。例えば特許文献１などでは、変曲点法や傾斜法、差分法などが示されている。差分法の一つが移動平均値が最小になる点として捉えることも出来る。
平坦部分が多い波形では最小値の中間を選びピーク点とすることもできる。今までは、これらの検出方法で濃度波形の谷の位置を検出し、そこでベースラインまで垂線を立て、それと次の谷位置の垂線とに囲まれる部分を１つの区分として面積を計算していた。谷位置がベースラインに近ければ近い程計算された面積は正しく計算される。しかし一般的には全ての波形がベースラインに一致することはなく、谷の部分で垂線を立てる手法が採られていた。さらに問題は近接した例えば二子山の波形では、谷を形成せず単なるショルダー（肩）状を示す場合がある。この場合波形の肩の部分で強制的に区分しベースラインまで垂線を立てて強制的に範囲を設定して面積を求めていた。
非特許文献１及び２には分離分析の濃度波形は、いくつかのガウス曲線に分解できる（ガウシャンフィッテング）と図示されているが、これは模式図的に作られたもので実際に濃度波形をガウス波形で近似して分析した実施例では無い。従ってそれぞれの面積比を求めるには、結局全て特許文献１の図１８が示すように谷の部分で垂直に区切って（フラクション）その次のフラクションの間に囲まれた範囲の面積を求める方法が一般的であった。
【００１５】一方本願においては、谷の検出はあまり重要ではないが、ピーク点の検出もこの技術の活用で実施できることは明らかである。従ってピーク点を指定する方法として、従来の方法例えば増加率が上昇から下降に転ずる点や移動平均が最小値を示す部分を自動的に濃度波形の山の頂上いわゆるピーク点として検出できる場合はその方法で、自動でピーク点が検出出来ない場合はマウスなどでマーキングしてそこにピーク点があると推定する方法、または特許考文献３や特許文献８に示すような電気泳動の移動度を表す相対移動度ＲＭ値を使用する方法、特許文献４、５、６のＨＰＬＣ固有の溶出時間間隔を指定する方法などがあり、ピーク点の位置の指定にそれぞれ適用することができる。本願の場合はピーク点の水平方向の位置だけの指定で、高さ方向の指定は特に必要ではなく任意で良い。
ピーク点が、自動検出できない場合として、２つのピーク点が高低を異にして重なっている場合（特許文献１）または相当近接している場合がある。この場合は測定する技術者が目視で新しくピーク点を設定しその高さ及び標準偏差を決め自動的にガウス曲線の波形の一つとして加えられる。他のガウス曲線とは別扱いとすることも出来る。
また面積の確定において本願は、ガウス曲線を用いるため、従来行われていた谷の位置を確定しなければならないことや波形の裾や肩（ショルダー）の部分で経験に基づき強制的に分画の確定（フラクション）を行う必要がなくなった。
【００１６】ガウス曲線の初期設定法
濃度波形上に設定したピーク点を通る垂線上に、任意または予め定められた標準偏差をもつようなガウス曲線を自動的に設定する。一般的にガウス曲線とは、中央の水平方向の位置とピーク点の高さ及び標準偏差の３つの値を決めればガウス曲線の形状は自ずと定まることを利用したものである。
これらの３つの値を「ガウス曲線の属性値」と呼ぶ。濃度波形のガウス曲線群による近似処理は各ガウス曲線の中央位置のみがそれぞれの初期位置に固定化され、他の２つの属性値は近似処理により変化する。
なお、各ガウス曲線の頂点は濃度波形のピーク点またはピーク点を通る垂線上に存在するが、近似処理の結果、濃度波形の対応するピーク点の上にくることはない。
【００１７】特許文献７は、本当の遺伝子の分析を行った例で、遺伝子をキャピラリー電気泳動法で分析し得られた濃度波形について綺麗なガウス曲線をつくるために遺伝的アルゴリズムを使用すると記載されており、標準化係数を使用すると記載されＦＩＧ８．にその結果が示されている。このガウス曲線群は元々４種類の塩基を区別するために塩基ごと異なる蛍光標識物を結合させ、その標識された蛍光標識物が出す４個の波長の強度を測定して遺伝子の塩基の種類を判読している。遺伝的アルゴリズムは波形整形の手段としてそれを使用しているに過ぎず、本願の近似濃度波形を作成することを目的にしたものとは大きく異なっている。
【００１８】一般的に、遺伝的アルゴリズムは数学的計算式で解くのが困難なモデルに対して有効な手法であると前述したとおり、その中でも特に解空間の探索において望ましくない局所解を導くことを避けることができる方法である。例えば２個の局所解を持つ図１の曲線ｙ＝ｆ（ｘ）（１）の最小値を求める場合、解として局所解１  ｘ＝ｘ１（２）ではなく、局所解２  ｘ＝ｘ２（３）が得られるようにする場合の対策に効果がある。具体的には、遺伝的アルゴリズムは生物学的な遺伝子の理論を応用し、選択・交叉・突然変異などの遺伝学的操作をプログラミングに取り入れることにより問題の解決を図る方法である。
【００１９】表１の値を属性値とするガウス曲線は、図２においてガウス曲線（４）、ガウス曲線の頂点（５）、変曲点（６）（７）としたとき、ガウス曲線（４）は水平方向の中央位置ｍ（９）、高さｈ（１０）及び曲線の広がり具合を示す標準偏差σ（８）の３つの属性値（遺伝子）で決定される。
一般的に水平方向の中心位置をｍ（９）、高さをｈ（１０）、標準偏差をσ（８）とすると、図２の曲線の関数式は数式１で与えられる。標準偏差σ（８）は変曲点（６）（７）を端点とする線分の長さの１／２である。
【００２０】
【表１】
2011123039.tif 000003
【数１】
2011123039.tif 000004
【００２１】いま、ｎ個のガウス曲線Ｇ１（ｘ），Ｇ２（ｘ），・・・，Ｇｎ（ｘ）を考えた場合その総和を数式２（ガウス合成曲線と呼ぶ）で表すことができる。
各ガウス曲線の属性値を変えることでガウス合成曲線を濃度波形に近づける手段として遺伝的アルゴリズムを用いる。
【数２】
2011123039.tif 000005
【００２２】ここで、ガウス合成曲線を構成するそれぞれのガウス曲線は中心位置ｍ（９）、高さｈ（１０）、標準偏差σ（８）の属性値で形状や位置が決まるが、この内、ガウス合成曲線はｎ個の属性値の組の並び数式３として与えられる。
本願では、中心位置ｍ（９）は濃度波形のピーク点の水平位置で固定されているので、ガウス曲線は高さｈ（１０）及び標準偏差σ（８）で決まる。
さてガウス曲線Ｇｉ（ｉ＝０，１，・・・，ｎ）の属性値の組を［ｈｉσｉ］とすると、数式２で与えられるガウス合成曲線は遺伝的アルゴリズムにおいてはｎ個の属性値の組の並び数式３として与えられる。
【数３】
2011123039.tif 000006
これらのガウス曲線の並びを考え、濃度波形に最適な近似波形となるガウス合成曲線（数式３）を遺伝的アルゴリズムを用いて求める。
遺伝的アルゴリズムにおいて属性値ｈｉ、σｉは遺伝子とみなすことができる。それぞれのガウス合成曲線は固体であり、各個体（ガウス合成曲線）のそれぞれの遺伝子の組［ｈｉ、σｉ］は染色体である。これにより数式３はガウス合成曲線（個体）の染色体の列と見なすことができる。以下の説明では遺伝的アルゴリズムに立脚し、用語「属性値」の代わりに用語「遺伝子」を用いるものとする。
遺伝的アルゴリズムにおいて個々の染色体はビット列で表される。例えば高さを４ビット、標準偏差を５ビットで表現すると、各個体の染色体は表２のビット列で表現される。
【表２】
2011123039.tif 000007
【００２３】濃度波形が５個のガウス曲線で構成されている場合、ガウス合成曲線の遺伝子のビット列を表３に示す。
【表３】
2011123039.tif 000008
のようになる。
【００２４】図３において点線で示した元の濃度波形（１１）を表４に示す５個のガウス曲線で近似する方法を説明する。ガウス曲線のピーク点は、それぞれ濃度波形のピーク点を通る垂線上にあり、高さｈ、標準偏差σが表４の場合、初期の太い実線のガウス合成波形（１２）が求まる。元の濃度波形（１１）と初期のガウス合成波形（１２）との誤差（１３）を求めそれを近似度とし、その近似度が高くなるように遺伝子情報（表４）をランダムに変更し、新しい近似度を求める。この操作を繰り返すことで、近似度の高いガウス合成曲線を残していく。
【００２５】
【表４】
2011123039.tif 000009
【００２６】遺伝的アルゴリズムにおける遺伝子演算
表４の５個のガウス曲線のビット列は（４＋５）×５＝４５ビットでビットの値を変えれば、それに対応するガウス曲線が変わり、ガウス合成曲線が変わる。これによりガウス合成曲線の濃度波形に対する近似度が変わる。
ビットの変化のさせ方として、本願では突然変異と交叉の２つの遺伝子演算を使用する。
【００２７】  ａ．突然変異
突然変異は、表５のビット列の並びにおいてランダムに選択されたビットアドレス６番のビットを反転させる（１⇔０）。すなわちガウス曲線（この場合は一番最初のガウス曲線Ｇ１）の高さまたは標準偏差を変えることでガウス合成曲線の形状を変化させる。
【表５】
2011123039.tif 000010
【００２８】  ｂ．交叉
交叉は表６に示すように、ガウス合成曲線の別々の個体に対し、ランダムに選択された特定の範囲のビット列を入れ替える。
【表６】
2011123039.tif 000011
【００２９】  遺伝演算による個体の自然淘汰
遺伝演算が実施される毎に個体の濃度波形に対する各ガウス合成曲線の誤差の大小に基づいて固体が並べ替えられる。表７で個体番号Ｎ以下は自然淘汰により消えてく。
【表７】
2011123039.tif 000012
【００３０】遺伝的アルゴリズムの実施
遺伝的アルゴリズムは段落「００２７」と「００２８」の遺伝子演算に基づいて各個体（ガウス合成曲線）の形状が変化し、段落「００２９」の自然淘汰によりその中で濃度波形に対する近似度が最も良い個体が残っていく。その処理は以下のように行う。
Ｓｔｅｐ０  初期設定
濃度波形に基づいてガウス曲線群からガウス合成曲線を作り、濃度波形に対する近似度を求め、段落「００２９」の自然淘汰のテーブル（表７）の個体番号０に登録する。
Ｓｔｅｐ１：表７のテーブル上の各個体（固体番号０の固体は除く）に遺伝子演算（突然変異や交叉）を施し、固体番号０を除く各個体に対し、濃度波形に対する近似度を求める。
Ｓｔｅｐ２：固体番号０を除くテーブル上の個体全体に対し、近似度の高い順に並べ替えを行う。ここで、最良の近似度をもつ個体が固体番号０の個体の近似度よりも良い場合は、固体番号０の個体と入れ替える。なお、表７のテーブル上に入りきらない固体は捨てる（自然淘汰）。
Ｓｔｅｐ３：固体番号０に登録された固体の濃度波形に対する近似度が予め定められた値より小さくなったか、または固体番号０の値が変化しない状態が予め定められた回数を超えた場合は処理終了とする。
Ｓｔｅｐ４：Ｓｔｅｐ１に戻り、処理を繰り返す。
【００３１】以上の遺伝的アルゴリズムの計算の結果、図３に示すＧ１（１４）、Ｇ２（１５）、Ｇ３（１６）、Ｇ４（１７）、Ｇ５（１８）の５個のガウス曲線が求まる。
従って初期のガウス合成曲線（１２）は遺伝的アルゴリズムの計算の結果、元の濃度波形（１１）に限りなく一致するよう姿を変えていくことになる。
但し元の濃度波形（１１）のピーク点の設定が完全でない場合、当然作成されたガウス合成曲線は元の濃度波形（１１）と一致しない場合がある。この場合新しくピーク点を測定技術者の判断で追加または削除することまたは当該ガウス曲線をマウスでクリツプし上下左右に移動させるなど微調整してより元の濃度波形に近づけることは容易である。
【発明の効果】
【００３２】分離分析法は、蛋白質や炭水化物などをそれぞれの物理化学的な性質により分離し染色などを施し濃度計で濃度波形を求めるのが一般的である。
分離分析の手段により数個から数十個の濃度波形が連なった形で出現することが多い。
電気泳動等により得られた濃度波形は分離分析法の性能が良ければ単独のピークを持った正規分布するガウス曲線が得られれば完全であるが、そのような分離分析用支持体や方法はほとんど無く、２子山や３子山、連なった団子状またはショルダー状に重なった波形になる。まれに大きな団子状の波形の中に別のいくつかのピークがあることもある。
従来の波形分析では例えば２子山の波形があった場合、その谷と思われる部分で強制的に区切って（フラクションを入れる）垂線を立て、前後のフラクションの間で挟まれた２つの山を確定した上で、それぞれの面積を百分率（分画比）で計算し別に求めた物質の濃度を乗じて濃度を求めていた。また山の形がショルダー（肩）状になっている場合も測定技術者が経験でそこに別の物質が存在していると判断した場合、強制的にフラクションを入れ分画し分画比を算出した上でそれぞれの濃度を求めていた。
【００３３】濃度波形の谷がベースラインに接している場合は、その濃度波形に現れる物質の濃度は正確に測定することができる。しかし全ての濃度波形の谷がベースラインに一致することはない。分離分析上の濃度波形は、非特許文献１にあるように、理論上ガウス曲線で近似できると記載されている。しかし実際に多種多様な濃度波形をガウス曲線で近似することは非常に難しく、実際は予想図で説明していたに過ぎなかった。
【００３４】本願は今まで実施されてこなかった濃度波形をガウス曲線の集合体と断定し、個々のガウス曲線のピーク点があると思われる水平方向の位置を自動的又は手動的に指定するだけで、遺伝的アルゴリズムを使用してガウス曲線を自動的に算出し、濃度波形と共に表示したりそのガウス曲線に基づき各々の面積比を算出できることを発見した。
被測定物質全体の濃度が分かれば、面積比を分画比に乗ずることでそれぞれの物質の濃度が定量できることは既に明らかなことである。
【００３５】本願の最大の利点は不完全な濃度波形でも、個別の物質を個々のガウス曲線を求め分離された物質の特定や濃度の測定をより正確に予測することができるところである。さらに特に面積を特定する場合、従来は面積の範囲を確定しないと計算できなかったが、本願ではガウス曲線の面積を用いるため谷の位置や経験による強制的な範囲の確定は必要ではなくなった。
また、ある波形の中に別の物質が潜んでいる場合、例えば実施例１の図４の（２５）の波形は、特定の癌胞が産生したＭ蛋白質と言われ、この蛋白質専用の高価な測定試薬使わずＭ蛋白質の量が簡単にかつ安価に定量できるので、治療する医師にとっては前回測定時に較べ減ったのか増えたのかが数字で判断できるようになりかつ余分な経費を使わないで良いので、医療に多大な貢献が出来ると考えられる。特許文献１でも波形の飛び出た部分の量や半値幅などから計算しょうとしていたが正確では無かった。
また実施例２では示さなかったが、小粒子ＬＤＬ（ｓｄ−ＬＤＬ）は超悪玉のリポ蛋白質と言われ普通ＬＤＬの陽極側にショルダー状にくっついて出現することが多くその存在も不明であったが、本願の適用により始めてその区分が出来ることは動脈硬化の治療に大きな効果をもたらすと考えられる。
ここでは医療に限ってその効果を説明したが、その他の分野例えば化学や薬品工業、農林水産業などありとあらゆる分野での本技術を適用することができる。
【００３６】本願発明の効果をまとめると、全ての分離分析で得た貴重なデータの波形解析に本願を使用することにより構成成分の種類や濃度をより真の姿として捉え面積比を求め結果的に測定対象物質の正確な濃度を求めることができるようになり、結局技術の進歩に貢献しかつ医療では人の命を救う一助になると思われる。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００３７】セルロースアセテート膜（セア膜）による血清蛋白分画濃度波形上に現れるＭ蛋白質の定量。
健常な人のセア膜電気泳動法で血清蛋白質を分離分析すると、図４に示すように普通５つの分画に分かれる。それぞれアルブミン（１９）、α１（２０）、α２（２１）、β（２２）、γ（２３）グロブリンと呼ばれている。
人が癌細胞に犯されるとある特定の組織の中の特定の細胞が異常に増殖する。
この増殖した細胞（Ｍｎｏ−Ｃｌｏｎｅ）が産生する蛋白質をＭ蛋白質と言う。このＭ蛋白質の波形が特許文献１の図１に示されており濃度波形は正常なγグロブリンの波形の中にＭ蛋白質が重なって出現している例である。この濃度波形に本願の遺伝的アルゴリズムを使用した波形解析法を適用してガウス曲線を作成すると図４のように正常のγグロブリン（２４）と癌細胞が産生したＭ蛋白質（２５）が区別できる。正常なγグロブリン（２４）はなだらかな山の形を示すがＭ蛋白質（２５）はそのなだらかな山の上から一部が特出したような波形が現われる。従って元のγグロブリン（２３）は正常なγグロブリン（２４）と癌細胞が産生したＭ蛋白質（２５）の合成曲線であったことがわかる。【００３８】特許文献１や２もこのＭ蛋白質を特異的に切り出す方法が記載されているが、自然な波形の重なりを無視した不正確な方法であったことは間違いない。濃度波形は元々２つの山が重なった形であることを考えると実質本願のようにガウス曲線に分割した上で、それぞれの濃度比を算出することが望ましいことは明らかである。
本願ではそれぞれのガウス曲線の面積を、ガウス曲線群の総面積で除した分画比をパーセントで表しかつこの患者の血清総蛋白質を生化学自動分析装置などで定量した結果が７．６ｇ／ｄＬであったので、表８に示すようにそれぞれ分画比を乗じて蛋白量を算出することができた。
【表８】
2011123039.tif 000013
実施例１ではγグロブリン（２３）の真ん中にＭ蛋白質（２５）が出現しているが、α１位（２０）、α２位（２１）やβ位（２２）に限らず他部分にも出現することがある。分画％では癌細胞が産生した特殊なＭ蛋白質（２５）の経時的な増減が把握し難い欠点があったが本願のようにより正確なＭ蛋白質（２５）の値が濃度波形から算出されることは大変意義深い。
血清蛋白分画測定法以外でも実施例として示さなかったが、癌細胞が産生した蛋白質であるオリゴクローナールバンドの検出も行われているが本実施例同様本願が適用できる。またＭ蛋白質でないが、例えばある種の感染症の場合や肝疾患の波形、溶血、血漿などにはそれぞれ特異的な波形が出ることがあるがそれらも同様に定量することができる。
【実施例２】
【００３９】特許文献３では、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）デイスク電気泳動法を使用してリポ蛋白質を分析している。この分析法では電気泳動の濃度波形について陰極側の始点と陽極側終点に現れる山の頂点間の移動度を１とした時の、分画したそれぞれの山の頂点（ピーク）までの距離を相対移動度ＲＭで表す方法である。
ピーク位置の判定はＲＭ値以外例えば、特許文献４に示すＨＰＬＣの分析技術では、これを溶出時間で表しているが、これも移動度の一種と見なすことができる。
今までは濃度波形の谷または谷と思われる位置を指定し、その位置でｘ軸に垂線を立て（フラクション）次の垂線との間で囲まれた範囲の面積を計算し全体的な分画％として算出していた。波形の谷が何となく分かれば良い方で、全く分からない例えば肩（ショルダー）状の場合が多々あり測定技術者が日常判断に困ることが多かった。【００４０】リポ蛋白質は粒子状で血液中に存在し、ＰＡＧディスク電気泳動法では図５に示すような濃度波形が得られ、陰極からＶＬＤＬ（２６）、ＬＤＬ（２７）、ＨＤＬ（２８）と言われている。粒子の小さいＨＤＬ粒子が一番早く電気泳動される。正常なリポ蛋白粒子は左右対称な奇麗な３本の濃度波形が得られる。しかし脂質異常症の患者のリポ蛋白粒子は、種々サイズのリポ蛋白質が産生され幾つもの山が時には二子山、三ツ山、時には肩（ショルダー）状のような形に現れる。
現在ＶＬＤＬとＬＤＬの中間位置に出現するバンドをＩＤＬまたはミッドバンド呼び、ＬＤＬの少し陽極側に泳動される分画は小粒子ＬＤＬまたはｓｄ−ＬＤＬと呼ばれている。【００４１】実施例２の図５はＩＤＬやｓｄ−ＬＤＬがないＬＤＬが二子山を呈した特殊例を取り上げた。ここで示すＬＤＬ（２７）は山の途中でくびれがありガウス曲線に分割すると移動度が遅くサイズの大きいＬＤＬ１（２９）と移動度が早くサイズが小さいＬＤＬ２（３０）に区分されていることがわかる。
従来はこの２つのＬＤＬは区分されずに単にＬＤＬ（２７）とされるかＩＤＬまたはｓｄ−ＬＤＬと間違って表記されていた。
このＬＤＬ１（２９）ＬＤＬ２（３０）について本願に基づいて２つのガウス曲線を作成しそれぞれのガウス曲線の面積を、ガウス曲線の総面積で除した分画比をパーセントを計算しＰＡＧディスク電気泳動法によるリポ蛋白質の分析結果とすることができた。この実施例ではＬＤＬコレステロールの自動分析装置の測定値が１４９ｍｇ／ｄＬであったのでＬＤＬ１（２９）とＬＤＬ２（３０）のコレステロール値はそれぞれ簡単に計算できる。これら測定結果を表９に示した。
【表９】
2011123039.tif 000014
【００４２】リポ蛋白質は肝臓で作られ血液中に分泌された瞬間から色々な酵素や蛋白質、糖質、電解質等の作用により異化される。非特許文献１に疾患によっては多型成のリポ蛋白質が発生し、それはガウス曲線の集合体であると報告されており、それが本願により実用化できるようになった。
本実施例ではＩＤＬやｓｄ−ＬＤＬのない例を示したが、ＩＤＬやｓｄ−ＬＤＬは超悪玉のリポ蛋白質と呼ばれ、虚血性心疾患や動脈硬化の患者に多発する。特許文献３にはこれらの物質の存在をピーク点またはフラクションの位置を相対移動度ＲＭ値を利用して判定していた。しかし濃度波形の裾の部分で強制的に区切るなどしており少々信頼性が乏しかったが、本願適用により正確な定量ができるようになった。特許文献４、非特許文献２には同じリポ蛋白質をＨＰＬＣで測定した解析法があるが、これも理論上２０個のガウス曲線に分けることができると記載されている。しかし実際濃度波形からのを分析や定量を行う方法の記載はなく、非特許文献１と同様単なる作図を示しているに過ぎない。
【実施例３】
【００４３】特許文献８には、ＰＡＧディスク電気泳動法を使用してアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）アイソザイムを分析する方法が記載されている。これも実施例２と同様ピーク点の確定に相対移動度ＲＭを求めてアイソザイムの型を判定している。しかしたとえＲＭ値でピーク位置を決めたとしても分画比を算出するには前後の谷の範囲を確定をしなければならなかったが、本実施例では図６のようにいくつもの波形が重なって波形が存在する場合でも、ピーク点をあらかじめ指定しておけば自動的に濃度波形に近似するガウス曲線が出来るため、波形の範囲指定など非科学的な作業を解消する画期的な手法となった。
図６はＰＡＧディスク電気泳動法を使用してＡＬＰアイソザイムを分析した濃度図を示す。元の濃度波形（３１）を黒い太線で示した。本願でこの元の濃度波形（３１）からガウス曲線を求め、肝臓型ＡＬＰ（３２）、骨型ＡＬＰ（３３）、小腸型ＡＬＰ（３４）、その他のＡＬＰ（３５）のガウス曲線を得た。【００４４】本実施例では肝臓型ＡＬＰ（３２）と骨型ＡＬＰ（３３）は境界面にショルダーがあるので骨型ＡＬＰ（３３）の存在は何となく分かる。しかし、骨型ＡＬＰ（３３）と小腸型ＡＬＰ（３４）の間は、殆ど山があるかないか判断できないくらいの分離能である。特許文献８ではこれを分析するのに熱処理を行ってバンドの確認をした上でＲＭの判定技術を取り入れてピークの存在を予測している。ＲＭの技術でここに小腸型ＡＬＰ（３４）が存在することは分かるがその量的比の算出を実施するとなるとそれぞれの範囲を確定させなければならないが、電気泳動で得られた濃度波形ではとてもその区分をすることが出来ず、相当乱暴な区分していた。
ＲＭ値でピーク位置が指定されれば、本願の技術では難しい分画の範囲を確定する必要はなく、それぞれのガウス曲線から得られる面積比（分画比）の算出を行い各アイソザイムの濃度値を活性値で表現することができる。
実際の測定結果の例を表１０に示した。
【表１０】
2011123039.tif 000015
【実施例４】
【００４５】実施例３と同様ＡＬＰアイソザイムをアガロースゲル電気泳動法を用いて分析した例を図７に示す。アガロースゲル電気泳動法は、ＡＬＰアイソザイム自体の荷電により分離分析する方法である。
濃度波形（３６）は陽極側から２型（肝臓由来）、３型（骨由来）、５型（小腸由来）と呼ばれている。本願を適用して作成したガウス波形を点線で表記しそれぞれ２型（３７）、３型（３８）、５型（３９）とした。この測定結果から分画％及び分画活性値を算出した例を表１１に示した。
【表１１】
2011123039.tif 000016
【産業上の利用可能性】
【００４６】本願の遺伝的アルゴリズムを使用する濃度分布波形の解析法及び分離分析定量法は、支持体電気泳動法の濃度波形、キャピラリー電気泳動法の濃度波形、液体やペーパークロマトグラフの分析波形、実施例には示さなかったがＲＩＡの濃度波形、核磁気の波形、音声や音波波形、光波形、地震波、津波、風波などの解析にも利用することはできる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】２個の局所解を持つ曲線
【図２】ガウス曲線の属性値
【図３】５個のガウス曲線
【図４】セア膜による蛋白分画定量
【図５】ＰＡＧディスク電気泳動法によるリポ蛋白質の定量
【図６】ＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの定量
【図７】アガロースゲル電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの定量
【符号の説明】
【００４８】（１）    曲線ｙ＝ｆ（ｘ）
（２）    局所解１
（３）    局所解２
（４）    ガウス曲線
（５）    ガウス曲線の頂点（ピーク）
（６）    変局点（Ｌ）
（７）    変局点（Ｒ）
（８）    標準偏差（σ）
（９）    中心位置（ｍ）
（１０）    高さ（ｈ）
（１１）    元の濃度波形
（１２）    初期のガウス合成曲線
（１３）    誤差
（１４）    ガウス曲線Ｇ１
（１５）    ガウス曲線Ｇ２
（１６）    ガウス曲線Ｇ３
（１７）    ガウス曲線Ｇ４
（１８）    ガウス曲線Ｇ５
（１９）    アルブミン
（２０）    α１グロブリン
（２１）    α２グロブリン
（２２）    βグロブリン
（２３）    γグロブリン
（２４）    正常なγグロブリン
（２５）    Ｍ蛋白質
（２６）    ＶＬＤＬ
（２７）    ＬＤＬ
（２８）    ＨＤＬ
（２９）    ＬＤＬ１
（３０）    ＬＤＬ２
（３１）    ＰＡＧディスク電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの濃度波形
（３２）    肝臓型ＡＬＰ
（３３）    骨型ＡＬＰ
（３４）    小腸型ＡＬＰ
（３５）    その他のＡＬＰ
（３６）    アガロースゲル電気泳動法によるＡＬＰアイソザイムの濃度波形
（３７）    ２型ＡＬＰ
（３８）    ３型ＡＬＰ
（３９）    ５型ＡＬＰ
【図１】
2011123039.tif 000017
【図２】
2011123039.tif 000018
【図３】
2011123039.tif 000019
【図４】
2011123039.tif 000020
【図５】
2011123039.tif 000021
【図６】
2011123039.tif 000022
【図７】
2011123039.tif 000023