(57)【要約】【課題】HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックすることなく、そして効果的にHIV誘導のシンシチウム形成をブロックし得る抗CD4抗体を提供すること、および、ＣＤ４+細胞間のＨＩＶに誘導されるシンシチウム形成を阻害する、および／またはＣＤ４+細胞のＨＩＶ感染を阻害する、５Ａ８擬態ペプチドまたは半ペプチド化合物を提供すること。【解決手段】HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックすることなく、そして効果的にHIV誘導のシンシチウム形成をブロックし得る抗CD4抗体が提供される。さらに、ＣＤ４+細胞間のＨＩＶに誘導されるシンシチウム形成を阻害する、５Ａ８擬態ペプチドまたは半ペプチド化合物、ならびにＣＤ４+細胞のＨＩＶ感染を阻害する、５Ａ８擬態ペプチドまたは半ペプチド化合物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、抗CD4抗体ホモログ、それらのホモログをコードするDNA配列、それらのホモログを含有する、予防用、免疫治療用および診断用の組成物、ならびに一次標的物がCD4+リンパ球である感染因子によって生じる、ヒトを含む哺乳動物の疾病を予防あるいは治療する方法に関する。このような疾病には、後天性免疫不全症候群(「AIDS」)、AIDS関連の合併症、およびヒト免疫不全ウイルス感染症が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
（従来の技術）
HIV感染では、CD4+リンパ球は非機能性になり、枯渇する。このＴ細胞の枯渇は、感染細胞の溶解により生じる感染の再循環サイクル、およびCD4+の感染細胞と非感染細胞との融合(シンシチウム形成)の両者に原因してきた（J.Sodroskiら、「Role  Of  The  HTLV−III/LAV  Envelope  ln  Syncytium  Formation  And  Cytopathicity」、Nature,322,PP.470−74(1986)）。CD4+リンパ球の消滅は、免疫抑制を導き、患者は、広範囲の日和味感染症および悪性腫瘍に罹患しやすくなる。このような免疫抑制は、後天性免疫不全症候群(「AIDS」)にかかっている患者に認められる。いくつかの場合では、AIDSは、CD4+脳細胞のHIV感染に直接に原因すると考えられている、中枢神経系異常を伴う。AIDSの完全な臨床上の症状発現には、通常、慢性のリンパ腺症、発熱、および体重減少などの症状に特徴のある症候群、すなわちAIDS関連の合併症(「ARC」)が先行する。HIVは、AIDSおよびその前駆体であるARCの病因学的因子と考えられている（M.G.Sangadharanら、「Detection,Isolation  And  Continuous  Production  Of  Cytopathic  Retroviruses(HTLV−III)  From  Patients  With  AIDS  And  Pre−AIDS」、Science,224,PP.497−508(1984)）。
【０００３】
HIVの主要な表面(エンベロープ)タンパク質は、前駆体ポリペプチド(gp160)として生産される。これは、成熟型で、約481アミノ酸の大きなグリコシル化外膜タンパク質gp120、およびグリコシル化され得る約345アミノ酸の比較的小さな貫膜タンパク質gp41に開裂される（L.Ratnerら、「Complete  Nucleotide  Sequence  Of  The  AIDS  Virus,HTLV−III」、Nature、313,PP.277−84(1985)）。
【０００４】
HIV  gp120は、CD4エピトープに選択的に結合し、従って、HIVはCD4+細胞を標的すると考えられている（A.G.Dalgleishら、「The  CD4(T4)Antigen  Is  An  Essential  Component  Of  The  Receptor  For  The  AIDS  Retrovirus」、Nature,  312,pp,763−67(1984);D.Klatzmannら、「T−Lymphocyte  T4  Molecule  Behaves  As  The  Receptor  For  Human  Retrovirus  LAV」、Nature,312,pp.767−68(1984)）。HIV  gp120の細胞表面CD4への結合は、CD4+細胞の感染を起こすと考えられている。さらに、感染CD4+細胞の非感染CD4+細胞との膜融合(すなわち、シンシチウム形成)を起こすと考えられている。これにより、ウイルスの細胞から細胞への伝染、そしてその細胞変性効果に寄与する（J.A.HabeshowおよびA.G.Dalgleish,「The  Relevance  Of  HIV  env/CD4  Interactions  To  The  Pathogenesis  Of  Acquired  Immune  Deficiency  Syndrome」、J.AIDS,2,pp.457−68(1989);J.D.LifsonおよびE.G.Engleman,「Role  Of  CD4  In  Normal  Immuniry  And  HIV  Infection」、Immunol.Rev.,109,PP.93−117(1989)）。
【０００５】
成熟CD4(T4としても知られている)は、分子の大きさが55,000から62,000ダルトンであり、細胞外ドメイン(ほぼAA1−AA375)、膜間ドメイン(ほぼAA376−AA395)、および細胞質側末端(ほぼAA396−AA433)を有する433アミノ酸の糖タンパク質である。CD4は、25アミノ酸のシグナル配列を有するpre−タンパク質として合成される。そのヒトCD4の全長をコードするcDNAのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、報告されている（非特許文献１;D.R.Littmanら、）Corrected  CD4  Sequence）、Cell,55,P.541(1988)）。CD4の細胞外ドメインは、免疫グロブリンV領域、すなわちV1(ほぼAA1−AA100の広がり)、V2(ほぼAA101−AA180の広がり)、V3(AA181−AA290の広がり)およびV4(ほぼAA291−AA375の広がり)に相同性を有する4つの縦並の領域からなる（非特許文献１;J.Wangら、「Atomic  Structure  Of  A  Fragment  Of  Human  CD4  Containing  Two  lmmunoglobulin−Like  Domains」,Nature,348,PP.411−18(1990)）。
【０００６】
CD4のV1領域は、HIVgp120の結合部位として同定されている（J.Arthosら、「Identification  Of  The  Residues  ln  Human  CD4  Critical  For  The  Binding  Of  HIV」,Ce11,57,pp.469−81(1989);T.Mizukamiら、「Binding  Region  For  Human  Immunodeficiency  Virus(HIV)  And  Epitopes  For  HIV−B  locking  Monoclonal  Antibodies  Of  The  CD4  Molecule  Defined  By  Site−Directed  Mutagenesis」,Proc.Nat1.Acad.Sci.USA,85,PP.9273−77(1988);A.PetersonandB.Seed,「Genetic  Analysis  Of  Monoclonal  Antibody  And  HIV  Binding  Sites  On  The  Human  Lymphocyte  Antigen  CD4」,Cell,54,pp.65−72(1988);N.R.Landauら、「The  Envelope  Glycoprotein  Of  The  Human  Immunodeficiency  Virus  Binds  To  The  Immunoglobulin−Like  Domain  Of  CD4」,Nature,334,pp.159−62(1988);L.K.Claytonら、「Substitution  Of  Murine  For  Human  CD4  Residues  Identifies  Amino  Acids  Critical  For  HIV−gp120  Binding」,Nature,335,pp.363−66(1988)）。
【０００７】
HIVgp120のCD4への結合をブロックすることによりHIV感染を予防あるいは治療するための抗CD4抗体の可能な能力は、多くの研究者を、ある種の抗CD4抗体がCD4+細胞間のHIV誘導のシンシチウム形成をブロックする能力、およびこれらのいくつかの抗体の免疫抑制性の研究に導いた。
【０００８】
例えば、CD4  VIに特異的な抗体Leu3AおよびOKT4Aは、HIV誘導のシンシチウム形成の効果的なブロッカーであることが報告されている（非特許文献２;B.A.Jamesonら、「Location  And  Chemical  Synthesis  Of  A  Binding  Site  For  HIV−l  On  The  CD4  Protein」,Science,240,pp.1335−39(1988);PetersonおよびSeed,Cell,前述）。しかし、これらの抗体は、HIV感染の治療のための薬学的な使用には深刻な欠点を有している。例えば、OKT4AおよびLeu3Aは、gp120結合部位と重複するCD4エピトープを認識するので、すでにHIVgp120に結合しているCD4分子に結合あるいは作用し得ない（例えば、P.A.Batesら、「A  Predicted  Three−Dimensional  Structure  For  The  Human  Immunodeficiency  Virus  Binding  Domains  Of  CD4  Antigen」,Prot.Engng,3,pp.13−21(1989);J.S.McDougalら、「Binding  Of  The  Human  Retrovirus  HTLV−III/LAV/ARV/HIV  To  The  CD4(T4)Molecule:Conformation  Dependence,Epitope  Mapping,Antibody  Inhibition,And  Potential  For  Idiotypic  Mimicry」,J.Immunol.,137,pp.2937−44(1986);Landauら、Nature,前述;A.G.Dalgleishら、「Neutralisation  Of  HIV  Isolates  By  Anti−Idiotypic  Antibodies  Which  Mimic  The  T4(CD4)Epitope:A  Potential  AIDS  Vaccine」,Lancet,2,PP.1047−50(1987)」。
【０００９】
さらに、OKT4Aは、完全に免疫抑制性であることが報告されていて、これは考えられるAIDS治療にとっては望ましくない特性である（D.Lamarreら、「Class  II  MHC  Molecules  And  The  HIV  gp120  Envelope  Protein  Interact  With  Functionally  Distinct  Regions  Of  The  CD4  Molecule」,EMBO  J.,8,pp.3271−77(1989);W.E.Biddisonら、「Possible  Involvement  Of  The  OKT4  Molecule  In  T  Cell  Recognition  Of  Class  II  HLA  Antigens」,J.Ex.Med.,156,pp.1065−76(1982)）。
【００１０】
CD4の他のエピトープあるいはドメインに特異的な抗CD4モノクローナル抗体が研究されているが、これらの抗体に関してAIDS治療用としての使用には明かな欠点も報告されている。このような抗体の1つであるOKT4Bは、CD4のV2ドメインに特異的であることが報告されている（T.Kieber−Emmonsら、「The  gp120−CD4  Interface:Structura1,lmmunological  And  Pathological  Considerations」,Biochim.Biohs.Acta,989,pp.281−300(1989)）。OKT4Bが、HIVgp120のCD4への結合を有意に障害するかどうかについての相反する報告がある（McDouga1ら、J.Immunol.,前述;K.Lundinら、「A  Specific  Assay  Measuring  Binding  Of  125I−Gp120  From  HIV  To  T4+/CD4+  細胞」,J.Immuno1.Methods,97,PP.93−100(1987);Lamarreら、EMBOJ.,前述）。そして、OKT4Bが、OKT4Aよりも有意に免疫抑制性にまさることが報告されている（Lamarreら、EMBO  J.,前述）。さらに、OKT4Bは、OKT4Aに比較してHIV誘導のシンシチウム形成に対して相対的に弱いブロッカーである（非特許文献２）。
【００１１】
HIV誘導のシンシチウム形成になんらかの効果を有することが報告されていて、そしてさらに、OKT4AおよびLeu3Aに結合されるエピトープとは別のCD4エピトープに結合することが報告されている他の抗CD4抗体には、MT151、VIT4、およびMT321が含まれる（非特許文献２）。しかし、最近の数個の個別の研究では、これらに密接に関連する抗体は、gp120結合に含まれるCD4エピトープと重複するコンフォメーションに依存のCD4エピトープを認識することが示されている（Q.J.Sattentauら、「Structural  Analysis  Of  The  Human  Immunodeficiency  Virus−Binding  Domain  Of  CD4」,J.Exp.Med.,170,pp.1319−34(1989);Batesら、Prot.Engng.,前述:Landauら、Nature,前述,M.Merkenschlagerら、「Functional  Epitope  Analysis  Of  The  Human  CD4  Molecule」,J.Immuno1.,9,pp.2839−45(1990)）。
【００１２】
研究されているもう1つの抗CD4抗体は、OKT4である。これは、CD4のV3V4ドメインに特異的である（E.A.Bergerら、「A  Soluble  Recombinant  Polypeptide  Comprising  The  Amino−Terminal  Half  Of  The  Extracellular  Region  Of  The  CD4  Molecule  Contains  An  Active  Binding  Site  For  Human  Immunodeficiency  Virus」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,PP.2357−61(1988)]。OKT4は、OKT4A、Leu3A、OKT4Bおよび他の公知の抗CD4抗体よりもHIV感染に対する治療剤として大きな欠点を有する。例えば、OKT4は、HIV誘導のシンシチウム形成に対しては「ブロッカーではない」ことが報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】P.J.Maddonら、「The  Isolation  And  Nucleotide  Sequence  Of  A  cDNA  Encoding  The  T  cell  Surface  Protein  T4:  A  New  Member  Of  The  Immunoglobulin  Gene  Family」,Ce11,(1985)42,pp.93−104
【非特許文献２】Q.J.Sattentau,「Epitopes  Of  The  CD4  Antigen  And  HIV  Infection」,Science,(1986)234,PP.1120−23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
我々の発明以前に、HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックすることなく、そして効果的にHIV誘導のシンシチウム形成をブロックすることの両方ともをなし得ることが報告されている抗CD4抗体はない。このような抗体は、HIVのCD4への結合後、介入するために、あるいはHIVgp120−CD4結合事象をブロックする薬剤と組み合わせて使用されれば、AIDS、ARCおよびHIV感染への治療介入に明かな利点を提供する。従って、AIDS、ARCおよびHIV感染の治療および予防のための使用に、高度に必要とされる特性の組み合わせを有する、抗CD4抗体の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するために、本発明は、以下を提供する。
（項目１）抗体ホモログであって、
（ａ）ヒトＣＤ４に結合し；
（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ１２０のヒトＣＤ４への結合を有意にブロックしない；
そして
（ｃ）ＣＤ４＋細胞間のＨＩＶ誘導のシンシチウム形成を少なくともＯＫＴ４Ａと同程度にブロックする、抗体ホモログ。
（項目２）抗体ホモログであって、
（ａ）ヒトＣＤ４に結合し；
（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ１２０のヒトＣＤ４への結合を有意にブロックしない；
（ｃ）ＣＤ４＋細胞間のＨＩＶ誘導のシンシチウム形成をＯＫＴ４よりは良好にブロックし；そして
（ｄ）インビトロでの破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイにおいて、ＯＫＴ４Ａよりも免疫抑制性に劣る、
抗体ホモログ。
（項目３）抗体ホモログであって、
（ａ）ヒトＣＤ４に結合し；
（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ１２０のヒトＣＤ４への結合を有意にブロックしない；
（ｃ）ＣＤ４＋細胞間のＨＩＶ誘導のシンシチウム形成を少なくともＯＫＴ４Ａと同程度にブロックし；そして
（ｄ）インビトロでの破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイにおいて、ＯＫＴ４Ａよりも免疫抑制性に劣る、
抗体ホモログ。
（項目４）上記抗体ホモログが、ヒトＣＤ４  Ｖ１からなるポリペプチドに結合しない、項目１から３のいずれかに記載の抗体ホモログ。
（項目５）上記抗体ホモログが、ヒトＣＤ４  Ｖ１Ｖ２からなるポリペプチドに結合する、項目４に記載の抗体ホモログ。
（項目６）上記抗体ホモログが、ＣＤ４  Ｖ１に特異的な抗体のヒトＣＤ４への結合を有意にブロックしない、項目１から３のいずれかに記載の抗体ホモログ。
（項目７）上記抗体ホモログが、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を阻害する、項目１から３のいずれかに記載の抗体ホモログ。
（項目８）上記抗体ホモログが、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）から選択される１つ以上の特性を示す、項目１から３のいずれかに記載の抗体ホモログ：
（ａ）インビボでの循環ＣＤ４＋細胞数の有意な減少を生じない；
（ｂ）インビボでのＣＤ４＋細胞表面からの有意なＣＤ４調節を生じない；
（ｃ）インビボでの循環末梢白血球の数の有意な減少を生じない；および
（ｄ）インビボでの外来抗原に対する応答において誘発される、抗体力価の有意な減少を生じない。
（項目９）受託番号ＨＢ  １０８８１（５Ａ８）、ＨＢ  １０８８２（１Ｆ８）、およびＨＢ  １０８８３（５Ｆ２）のハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマ由来の抗体ホモログ。
（項目１０）受託番号ＨＢ  １０８８１（５Ａ８）のハイブリドーマ由来である、項目９に記載の抗体ホモログ。
（項目１１）上記抗体ホモログが、完全なモノクローナル抗体である、項目１から３、あるいは９から１０のいずれかに記載の抗体ホモログ。
（項目１２）上記抗体ホモログが、Ｆａｂフラグンメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ｖ）フラグメントからなる群から選択される、項目１から３あるいは９のいずれかに記載の抗体ホモログ。
（項目１３）上記抗体ホモログが、ヒト型組み換え抗体ホモログである、項目１から３のいずれかに記載の抗体ホモログ。
（項目１４）ＣＤＲｓのアミノ酸配列が、
（ａ）Ｌ鎖ＣＤＲ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のＡＡ２４−ＡＡ４０である；
（ｂ）Ｌ鎖ＣＤＲ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のＡＡ５６−ＡＡ６２である；
（ｃ）Ｌ鎖ＣＤＲ３が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５のＡＡ９５−ＡＡ１０２である；
（ｄ）Ｈ鎖ＣＤＲ１が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＡＡ３１−ＡＡ３５である；
（ｅ）Ｈ鎖ＣＤＲ２が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＡＡ５０〜ＡＡ６６である；および（ｆ）Ｈ鎖ＣＤＲ３が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＡＡ９９−ＡＡ１１１である、
項目１３に記載のヒト型組み換え抗体ホモログ。
（項目１５）項目１４に記載のヒト型組み換え抗体ホモログであって、
（ａ）上記Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のＡＡ１−ＡＡ１１２であり、そして
（ｂ）上記Ｈ鎖の可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のＡＡ１−ＡＡ１２２である、ヒト型組み換え抗体ホモログ。
（項目１６）項目１５に記載のヒト型組み換え抗体ホモログであって、
（ａ）上記Ｌ鎖のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のＡＡ１−ＡＡ２１９であり、そして
（ｂ）上記Ｈ鎖のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５のＡＡ１〜ＡＡ４４８である、ヒト型組み換え抗体ホモログ。
（項目１７）キメラ型組み換え抗体ホモログである、項目１から３に記載の抗体ホモログ。
（項目１８）項目１７に記載のキメラ型組み換え抗体ホモログであって、
（ａ）上記Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５であり、そして（ｂ）上記Ｈ鎖の可変領域のアミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である、キメラ型組み換え抗体ホモログ。
（項目１９）項目１から３および９から１０のいずれかに記載の抗体ホモログを含む誘導体化抗体ホモログであって、項目１から３および９から１０に記載の抗体ホモログ、項目３７から３９に記載の５Ａ８擬態物質、検出可能物質、細胞毒性物質および薬剤物質からなる群から独立して選択される、１つ以上のメンバーに結合されている、誘導体化抗体ホモログ。
（項目２０）上記薬剤物質が、ヒトのペプチド、ポリペプチドあるいはタンパク質に結合する免疫グロブリンおよびその一部からなる群から選択される、項目１９に記載の誘導体化抗体ホモログ。
（項目２１）一次標的物がＣＤ４＋細胞である感染因子よって生じる哺乳動物の疾病を予防あるいは治療するための組成物であって、項目１から１８に記載の抗体ホモログ、項目１９から２０に記載の誘導体化抗体ホモログ、および項目３７から３９に記載の５Ａ８擬態物質からなる群から選択される１つ以上のメンバーの免疫治療的に有効な量、および薬学的に受容可能なキャリアーを含有する、組成物。
（項目２２）上記哺乳動物がヒトであり、そして上記感染因子がＨＩＶである、項目２１に記載の組成物。
（項目２３）ＨＩＶ  ｇｐ１２０のＣＤ４への結合を有意にブロックする、１種以上の物質をさらに含有する、項目２１あるいは２２に記載の組成物。
（項目２４）上記物質が、ＣＤ４  Ｖ１に特異的な抗体ホモログ、ＣＤ４  Ｖ１ポリペプチド、および抗ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗体ホモログから選択される、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）一次標的物がＣＤ４＋リンパ球である感染因子よって生じる哺乳動物の疾病を予防あるいは治療するための方法であって、項目１から１８に記載の抗体ホモログ、項目１９から２０に記載の誘導体化抗体ホモログ、および項目３７から３９に記載の５Ａ８擬態物質からなる群から選択される１つ以上のメンバーの免疫治療的に有効な量、および薬学的に受容可能なキャリアーを上記哺乳動物に投与することを包含する、方法。
（項目２６）上記哺乳動物がヒトであり、そして上記感染因子がＨＩＶである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４（５Ａ８  Ｌ鎖可変領域）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（５Ａ８  Ｈ鎖可変領域）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５（ｐｒｅ−５Ａ８ヒト型Ｌ鎖）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４（ｐｒｅ−５Ａ８ヒト型Ｈ鎖）；項目１から３に記載の抗体ホモログをコードする前述の任意のＤＮＡ配列；および前述の任意のＤＮＡ配列になるＤＮＡ配列からなる群から選択される、ＤＮＡ配列。
（項目２８）項目２７に記載の１つ以上のＤＮＡ配列、および機能するようにそれに結合する１つ以上の発現制御配列を含む、組み換えＤＮＡ分子。
（項目２９）ｐＭＤＲ１００７（ＡＴＣＣ  ６８８４６）およびｐＭＤＲ１００２（ＡＴＣＣ  ６８８４７）から選択される、項目２８に記載の組み換えＤＮＡ分子。
（項目３０）項目１から１８に記載の抗体ホモログから選択される抗体ホモログを産生する、細胞。
（項目３１）ハイブリドーマ細胞である、項目３０に記載の細胞。
（項目３２）受託番号ＨＢ  １０８８１（５Ａ８）、ＨＢ  １０８８２（１Ｆ８）、およびＨＢ  １０８８３（５Ｆ２）の細胞群から選択される、項目３１に記載の細胞。
（項目３３）項目２８あるいは２９に記載の１つ以上の組み換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞である、項目３０に記載の細胞。（項目３４）項目１から１８に記載の抗体ホモログから選択される抗体ホモログを生産する方法であって、項目３０から３３に記載のいずれかの細胞から選択される細胞を培養することを包含する、方法。
（項目３５）項目３１に記載の細胞を生産する方法であって、ヒトＣＤ４の全長をコードするＤＮＡで、ＣＤ４−哺乳類組織培養細胞を形質転換することにより生産された、その表面でＣＤ４を発現する、ＣＤ４＋細胞で、ヒト以外の哺乳動物を免疫する工程を包含する、方法。
（項目３６）上記ＣＤ４＋細胞が、受託番号ＣＲＬ  １０８８４を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）ＣＤ４＋細胞間のＨＩＶに誘導されるシンシチウム形成を阻害する、５Ａ８擬態物質。
（項目３８）ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を阻害する、５Ａ８擬態物質。
（項目３９）請求墳１から８に記載の抗体ホモログから選択される抗体ホモログの特性を示す、５Ａ８擬態物質。
【００１６】
本発明において、ＣＤ４+細胞間のＨＩＶに誘導されるシンシチウム形成を阻害する、５Ａ８擬態ペプチドまたは半ペプチド化合物、ならびにＣＤ４+細胞のＨＩＶ感染を阻害する、５Ａ８擬態ペプチドまたは半ペプチド化合物が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックすることなくヒトCD4に結合し、そして、以下の性質の1つを示す抗体ホモログ、５Ａ８擬態ペプチドまたは半ペプチド化合物を提供する:(1)少なくともOKT4A(市販の、CD4  VIに特異的な抗CD4モノクローナル抗体)と同程度に、HIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成をブロックする;(2)OKT4(市販の、CD4  V3V4に特異的な抗CD4モノクローナル抗体)よりもHIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成をブロックし、そしてインビトロにおける破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイではOKT4Aよりも免疫抑制性に劣る;あるいは(3)少なくともほぼOKT4Aと同程度に、HIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成をブロックし、そしてインビトロにおける破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイではOKT4Aよりも免疫抑制性に劣る。
【００１８】
（発明の実施の形態）
CD4は、CD4+Tリンパ球(ヘルパー/インデューサー細胞)の細胞表面の糖タンパク質である。CD4+リンパ球は、ヒト免疫系の重要な調節細胞である。それらは、Ｔ細胞の増殖、リンフォカインの放出、および免疫グロブリンの放出に影響を与えるヘルパー細胞の相互作用を媒介する。ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)を含むある種の感染因子の一次標的物は、CD4糖タンパク質を有する細胞である。*このような細胞には、CD4+リンパ球、マクロファージおよびある種の脳細胞が含まれる。
【００１９】
本明細書および請求の範囲で用いられている一般的な用語「ヒト免疫不全ウイルス(HIV)」は、AIDS患者からの個別の単離物、およびそれらに由来する実験用の株を指す。用語「HIV」には、そのほか、ヒトＴ細胞リンパ栄養ウイルスIII型(「HTLV一III」)、リンパ腺症関連ウイルス(「LAV」)、およびAIDS関連レトロウイルス(「ARV」)が含まれる。専門用語HIVは、International  Committee  On  Taxonomy  Of  Virusesのヒトレトロウイルス小委員会により採用された。
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は概して、まず、HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックすることなくヒトCD4に結合し、そして、以下の性質の1つを示す抗体ホモログ、好ましくはモノクローナル抗体を提供することにより、前記の多くの問題を解決する:(1)少なくともOKT4A(市販の、CD4  VIに特異的な抗CD4モノクローナル抗体)と同程度に、HIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成をブロックする;(2)OKT4(市販の、CD4  V3V4に特異的な抗CD4モノクローナル抗体)よりもHIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成をブロックし、そしてインビトロにおける破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイではOKT4Aよりも免疫抑制性に劣る;あるいは(3)少なくともほぼOKT4Aと同程度に、HIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成をブロックし、そしてインビトロにおける破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイではOKT4Aよりも免疫抑制性に劣る。
【００２１】
本発明の抗CD4抗体ホモログのあるものは、CD4  AA1−AA180(すなわち、それらはVIV2に特異的である)からなるヒトCD4フラグメントには結合するが、CD4  AA1−AA113(すなわち、それらは単独ではV1に特異的ではない)からなるヒトCD4フラグメントには結合しない。同様に、本発明の抗体ホモログのあるものは、CD4  VIに特異的な抗体のヒトCD4への結合を有意には阻害しない。さらに、本発明の好ましい抗CD4抗体ホモログは、CD4+細胞のHIV感染を阻害する。
【００２２】
本発明の他の好ましい抗体ホモログは、以下の(a)〜(d)から選択される1つ以上を有意には生じない、特性を示す:(a)インビボでの循環CD4+細胞数の減少;(b)インビボでのCD4+細胞表面からのCD4調節;(c)インビボでの末梢白血球数の減少;および(d)インビボでの外来抗原に対する応答で誘発される抗体力価の減少。
【００２３】
本発明は、数多くのタイプの抗CD4抗体ホモログを提供する。これらには、モノクローナル抗体、組み換え抗体、組み換えキメラ型抗体、および組み換えヒト型抗体が含まれる。提供される抗体ホモログは、好ましくは、H鎖およびL鎖の各々2つを有する完全な免疫グロブリン分子であるが、1つ以上のL鎖、1つ以上のH鎖あるいはその組み合わせからなり得る。さらに、本発明の抗CD4抗体ホモログは、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab)2フラグメント、F(v)フラグメント、あるいは前述の特性を有する任意の他の免疫グロブリンフラグメントの形態であり得る。
【００２４】
本発明の好ましい抗CD4抗体ホモログとして提供されるものは、5A8、1F8、5F2と呼ばれるマウスモノクローナル抗体である。5A8が最も好ましい。
【００２５】
本発明は、5A8H鎖の可変領域および5A8L鎖可変領域をコードするDNA配列を提供する。さらに、それらのDNA配列あるいはその一部を用いた5A8キメラ型および5A8ヒト型組み換え抗体、およびそれらのDNA配列によりコードされるポリペプチドが提供される。それらのDM配列、および機能するように連結された発現制御配列を含む組み換えDNA分子もまた提供される。
【００２６】
本発明は、モノクローナル抗体5A8のヒトCD4への結合を有意にブロックする、ペプチド、セミペプチド化合物あるいは非ペプチド化合物である5A8擬態物質を提供する。本発明の5A8擬態物質は、HIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成を阻害するか、CD4+細胞のHIV感染を阻害するか、あるいはその両者を阻害する。好ましくは、5A8擬態物質は、本発明の抗体ホモログの特性を示す。
【００２７】
本発明はまた、本発明の抗体ホモログおよび5A8擬態物質、検出物質、細胞毒性物質および薬剤物質から選択される、1つ以上の物質に連結されている抗CD4抗体ホモログを提供する。
【００２８】
さらに、本発明の抗体ホモログを産生する細胞、それらの細胞を培養することにより抗体ホモログを生産する方法、およびヒト以外の哺乳動物を、その表面でCD4を発現するCD4+細胞で免疫することにより本発明のハイブリドーマ細胞を生産する方法を提供する。このCD4+細胞は、ヒトCD4全長をコードするDNAでCD4`組織培養細胞を形質転換することにより生産される。
【００２９】
本発明の抗CD4ホモログおよび5A8擬態物質の特性は、一次標的物がCD4+細胞である感染因子により生じる疾病、例えば、HIV関連疾病であるARCおよびAIDSのヒトにおける、検出、予防および治療に有用である。従って、本発明は、一次標的物がCD4+細胞である感染因子により生じる疾病、例えば、HIV関連疾病であるARCおよびAIDSのヒトにおける、検出、予防および治療に有用な、上記の抗CD4抗体ホモログおよび5A8擬態物質を含有する、診断、予防および治療用の組成物およびこれらの組成物の使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図1は、緩衝液の存在下(図1A)、無標識のLeu3A存在下(図1B)、CD4  VIに特異的なモノクローナル抗体OKT4Aの存在下(図lC)、CD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体OKT4の存在下(図1D)あるいは、本発明のモノクローナル抗体5A8の存在下(図1E)の、フルオレッセインイソチオシアネートで標識したCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体Leu3A(「Leu3A−FITC」)で染色した、ヒト末梢血リンパ球の蛍光活性化細胞選別(「FACS」)のプロフィールを示す。データは、蛍光強度の対数(y軸)に対して外への広がり(x軸)の関数として示した。
【図１Ｂ】図1は、緩衝液の存在下(図1A)、無標識のLeu3A存在下(図1B)、CD4  VIに特異的なモノクローナル抗体OKT4Aの存在下(図lC)、CD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体OKT4の存在下(図1D)あるいは、本発明のモノクローナル抗体5A8の存在下(図1E)の、フルオレッセインイソチオシアネートで標識したCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体Leu3A(「Leu3A−FITC」)で染色した、ヒト末梢血リンパ球の蛍光活性化細胞選別(「FACS」)のプロフィールを示す。データは、蛍光強度の対数(y軸)に対して外への広がり(x軸)の関数として示した。
【図１Ｃ】図1は、緩衝液の存在下(図1A)、無標識のLeu3A存在下(図1B)、CD4  VIに特異的なモノクローナル抗体OKT4Aの存在下(図lC)、CD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体OKT4の存在下(図1D)あるいは、本発明のモノクローナル抗体5A8の存在下(図1E)の、フルオレッセインイソチオシアネートで標識したCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体Leu3A(「Leu3A−FITC」)で染色した、ヒト末梢血リンパ球の蛍光活性化細胞選別(「FACS」)のプロフィールを示す。データは、蛍光強度の対数(y軸)に対して外への広がり(x軸)の関数として示した。
【図１Ｄ】図1は、緩衝液の存在下(図1A)、無標識のLeu3A存在下(図1B)、CD4  VIに特異的なモノクローナル抗体OKT4Aの存在下(図lC)、CD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体OKT4の存在下(図1D)あるいは、本発明のモノクローナル抗体5A8の存在下(図1E)の、フルオレッセインイソチオシアネートで標識したCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体Leu3A(「Leu3A−FITC」)で染色した、ヒト末梢血リンパ球の蛍光活性化細胞選別(「FACS」)のプロフィールを示す。データは、蛍光強度の対数(y軸)に対して外への広がり(x軸)の関数として示した。
【図１Ｅ】図1は、緩衝液の存在下(図1A)、無標識のLeu3A存在下(図1B)、CD4  VIに特異的なモノクローナル抗体OKT4Aの存在下(図lC)、CD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体OKT4の存在下(図1D)あるいは、本発明のモノクローナル抗体5A8の存在下(図1E)の、フルオレッセインイソチオシアネートで標識したCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体Leu3A(「Leu3A−FITC」)で染色した、ヒト末梢血リンパ球の蛍光活性化細胞選別(「FACS」)のプロフィールを示す。データは、蛍光強度の対数(y軸)に対して外への広がり(x軸)の関数として示した。
【図２Ａ】図２Ａは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、過剰のHIVgp120と前もってインキュベートしたものおよびインキュベートしていない、ヒトCD4+細胞株H9の、本発明の抗体ホモログ(5A8)、および抗CD4モノクローナル抗体Leu3A、OKT4AおよびOKT4による免疫蛍光染色を示す。点線は、過剰のHIVgp120の否存在下(左のプロフィール)あるいは存在下(右のプロフィール)での、抗CD4モノクローナル抗体による染色、そして実線は、関連のない負コントロールのマウス抗体による染色を示す。
【図３】図３は、本発明のモノクローナル抗体(5A8)および2つのCD4  V1に特異的なモノクローナル抗体(Leu3AおよびOKT4A)に対する抗体濃度(O.026−2,000ng/ml)の関数として、シンシチウム形成の阻害パーセント(51Cr放出を定量)を示す。
【図４】図４は、本発明のモノクローナル抗体(5A8)、CD4  V1に特異的な2つのモノクローナル抗体(Leu3AおよびOKT4A)、およびCD4  V3V4(2−103−D11)に特異的な「OKT4様」モノクローナル抗体に対する抗体濃度(3.2−10,000ng/ml)の関数として、シンシチウム形成の阻害パーセント(51Cr放出を定量)を示す。
【図５】図５は、本発明の抗体ホモログ(モノクローナル抗体5A8)および種々のコントロール抗体(CD4  VIに特異的な抗体OKT4AおよびLeu3A、およびアイソタイプのあったコントロール抗体MOPC21およびUPC10)により生じたヒト末梢血リンパ球の破傷風トキソイド(「TT」)誘導の増殖阻害(3H−チミジンの取り込みで定量され、「cpm×10E3(1000)」で同定される)の、アッセイの4日目(図5)および5日目(図6)を示している。「TTコントロール」と示した棒は、TT刺激なしの細胞増殖基準(白の棒)および抗体なしのTT応答(黒の棒)を示す。TT刺激なしの抗体のみの増殖に対する効果は、大きな斑点を付けた棒で示す。さらに、図5は、TT刺激(すなわち、TTに対する応答抑制)後の、10μg/ml(斑点を付けた棒)(MOPC21および5A8のみ)、1μg/ml(水平の線を付けた棒)(全ての抗体)、および0.1μg/ml(斜線を付けた棒)(全ての抗体)の種々の濃度の抗体により生じた、増殖に対する効果を示す。
【図６】図６は、本発明の抗体ホモログ(モノクローナル抗体5A8)および種々のコントロール抗体(CD4  VIに特異的な抗体OKT4AおよびLeu3A、およびアイソタイプのあったコントロール抗体MOPC21およびUPC10)により生じたヒト末梢血リンパ球の破傷風トキソイド(「TT」)誘導の増殖阻害(3H−チミジンの取り込みで定量され、「cpm×10E3(1000)」で同定される)の、アッセイの4日目(図5)および5日目(図6)を示している。「TTコントロール」と示した棒は、TT刺激なしの細胞増殖基準(白の棒)および抗体なしのTT応答(黒の棒)を示す。TT刺激なしの抗体のみの増殖に対する効果は、大きな斑点を付けた棒で示す。さらに、図6は、TT刺激(すなわち、TTに対する応答抑制)後の、10μg/ml(斑点を付けた棒)(MOPC21および5A8のみ)、1μg/ml(水平の線を付けた棒)(全ての抗体)、および0.1μg/ml(斜線を付けた棒)(全ての抗体)の種々の濃度の抗体により生じた、増殖に対する効果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、5A8(実線、Mn  261−85およびMn  251−87)あるいはアイソタイプのあったコントロールのモノクローナル抗体MOPC21(破線、Mn265−85およびMn265−87)による処理の前、処理中、および処理後の種々の時点における、アカゲザルの末梢白血球数を示す。y軸は、血液1マイクロリッター当りの白血球数(1000単位)を示す。x軸は、日数を示し、5A8あるいはMOPC21を0日目、2日目および4日目に注射した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、5A8(実線、Mn  261−85およびMn  251−87)あるいはアイソタイプのあったコントロールのモノクローナル抗体MOPC21(破線、Mn265−85およびMn265−87)による処理の前、処理中、および処理後の種々の時点における、アカゲザルの末梢白血球数を示す。y軸は、血液1マイクロリッター当りの白血球数(1000単位)を示す。x軸は、日数を示し、5A8あるいはMOPC21を0日目、2日目および4日目に注射した。
【図８Ａ】図８Ａは、5A8(実線、Mn261−85(上のパネル)およびMn251−87(下のパネル)あるいはアイソタイプのあったコントロールのモノクローナル抗体MOPC21(破線、Mn265−85(上のパネル)およびMn265−87(下のパネル))による処理の前、処理中、および処理後の種々の時点における、アカゲザルの末梢CD4+リンパ球数を示す。CD4+細胞数は、蛍光標識のCD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体FITC−OKT4(白丸および黒丸)で染色後のFACS分析により、あるいは、単離細胞を過剰の5A8とともにインビトロでインキュベート後、次に蛍光標識のヤギ抗マウスIg(白の三角および黒の三角)で染色後のFACS分析によて定量する。y軸は、1マイクロリッター当りのCD4+細胞数を示す。x軸は、日数を示し、5A8あるいはMOPC21を0日目、2日目および4日目に注射した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、5A8(実線、Mn261−85(上のパネル)およびMn251−87(下のパネル)あるいはアイソタイプのあったコントロールのモノクローナル抗体MOPC21(破線、Mn265−85(上のパネル)およびMn265−87(下のパネル))による処理の前、処理中、および処理後の種々の時点における、アカゲザルの末梢CD4+リンパ球数を示す。CD4+細胞数は、蛍光標識のCD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体FITC−OKT4(白丸および黒丸)で染色後のFACS分析により、あるいは、単離細胞を過剰の5A8とともにインビトロでインキュベート後、次に蛍光標識のヤギ抗マウスIg(白の三角および黒の三角)で染色後のFACS分析によて定量する。y軸は、1マイクロリッター当りのCD4+細胞数を示す。x軸は、日数を示し、5A8あるいはMOPC21を0日目、2日目および4日目に注射した。
【図９】図９は、5A8(実線、Mn261−85およびMn251−87)あるいはアイソタイプのあったコントロールのモノクローナル抗体MOPC21(点線、Mn265−85およびMn265−87)による処理の前、処理中、および処理後の種々の時点における、アカゲザルの抗破傷風トキソイドの力価を示す。y軸は、標準の抗破傷風トキソイド免疫血清に比例して確立される抗破傷風トキソイド抗体の、血液1ミリリッター当りのユニット数を示す。x軸は、日数を示し、5A8あるいはMOPC21を0日目、2日目および4日目に注射し、そして破傷風トキソイドを3日目および21日目に注射した。0日から9日の下の棒は、インビボにおける、5A8によるCD4の飽和コーティングの時期を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4」は、天然に出現するCD4遺伝子によってコードされるあらゆるCD4タンパク質を意味する。
【００３２】
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4+細胞」は、その表面にCD4糖タンパク質が存在する細胞である。そのような細胞には、CD4+Tリンパ球およびCD4+哺乳動物組織培養細胞、例えば、H9およびC8166細胞が含まれる。
【００３３】
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4  V1」は、AA1−AA113にわたるCD4の領域である。
【００３４】
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4  VIV2」は、AA1−AA180にわたるCD4の領域である。
【００３５】
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4  V3V4」は、AA181−AA375にわたるCD4の領域である。
【００３６】
本明細書および請求の範囲で使用されている「組換え可溶性CD4」または「rsCD4」は、ヒトCD4のAA1−AA375(すなわち、V1−V4領域)からなるポリペプチドである。
【００３７】
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4  V1に特異的な抗体」は、CD4のV1領域内のエピトープに結合する抗体である。
【００３８】
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4  V3V4に特異的な抗体」は、CD4のV3V4領域内のエピトープに結合する抗体である。
【００３９】
本明細書および請求の範囲で使用されている「抗体ホモログ」は、免疫グロブリンL鎖、免疫グロブリンH鎖、およびその抗原に結合するそれらのフラグメントから選択される1つ以上のポリペプチドを包含するタンパク質であり、それらは1つ以上の抗原と結合することができる。1つを越えるポリペプチドを包含する抗体ホモログの成分ポリペプチドは、必要に応じてジスルフィド結合か、または共有結合により架橋結合し得る。従って、抗体ホモログには、完全な免疫グロブリンであるIgA、IgG、IgE、IgD、IgM(およびそれらのサブタイプ)型が含まれ、ここでこの免疫グロブリンのL鎖はκまたはλの型であり得る。抗体ホモログはまた、抗原結合特異性、例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(V)フラグメント、H鎖のモノマーまたはダイマー、L鎖のモノマーまたはダイマー、1本のH鎖および1本のL鎖からなるダイマー、およびそれらのようなものを保持する完全な免疫グロブリンを含む。
【００４０】
本明細書および請求の範囲で使用されている「ヒト型の組換え抗体ホモログ」とは、もともとはヒト以外の哺乳動物由来の抗体ホモログであって、そこでCD4結合に必要とされないアミノ酸の幾つかまたは全てを、ヒト免疫グロブリンのL鎖またはH鎖の対応する領域のアミノ酸と置換するために組換えDNA技術が用いられた。
【００４１】
本明細書および請求の範囲で使用されている「キメラ組換え抗体ホモログ」は、もともとはヒト以外の哺乳動物に由来する抗体ホモログであり、そこにおいて組換えDNA技術は、L鎖、H鎖またはその両方のヒンジ部および定常部の全てまたは一部を、哺乳動物の異なる種、好ましくはヒトの免疫グロブリンのL鎖またはH鎖からの対応する領域と置換するために使用された。
【００４２】
本明細書および請求の範囲で使用されている「CD4  V1に特異的な抗体がヒトCD4に結合するのを有意にブロックしない」抗体ホモログは、CD4  VIに特異的な抗体が、ヒトrsCD4(CD4  V1−V4)またはCD4+細胞上に表現されるヒトCD4のいずれかに結合するのを30%のみ減少させるに過ぎないものである。
【００４３】
本明細書および請求の範囲で使用されている「HIVgp120がヒトCD4に結合するのを有意にブロックしない」抗体ホモログは、HIVgp120が、ヒトrsCD4(CD4  V1−V4)またはCD4+細胞上に表現されるヒトCD4のいずれかに結合するのを30%のみ減少させるに過ぎないものである。
【００４４】
本明細書および請求の範囲で使用されている「OKT4」は、Ortho  Diagnostic  Systems社(ニュージャージー州ラリタン)からカタログ番号7042で入手し得る抗CD4マウスモノクローナル抗体である。
【００４５】
本明細書および請求の範囲で使用されている「OKT4A」は、Ortho  Diagnostic  Systems社(ニュージャージー州ラリタン)からカタログ番号7142で入手し得る抗CD4マウスモノクローナル抗体である。
【００４６】
本明細書および請求の範囲で使用されている「5A8擬態物質」は、モノクローナル抗体5A8が、ヒトrsCD4(CD4  V1−V4)またはCD4+細胞上に表現されているヒトCD4のいずれかに結合するのを少なくとも30%減少させる化合物である。
【００４７】
本明細書および請求の範囲で使用されている「インビボでの循環CD4+細胞の数を有意に減少させない」抗体ホモログは、正常な免疫機能を有する哺乳動物に投与後24時間以内に、その循環CD4+細胞数が、その哺乳動物の投与前の数と比較して、または関連のない特異性を有するアイソタイプのあった抗体ホモログが本発明の抗体ホモログの代わりに投与されたコントロールの哺乳動物における数と比較して、50%未満減少させる抗体ホモログである。
【００４８】
本明細書および請求の範囲で使用されている「インビボでCD4+細胞表面の有意なCD4調節を起こさない」抗体ホモログは、正常な免疫機能を有する哺乳動物に投与後24時間以内に、哺乳動物のCD4+細胞表面上のCD4分子の数を、その投与前の数と比較して、または関連のない特異性を有するアイソタイプのあった抗体ホモログが本発明の抗体ホモログの代わりに投与されたコントロールの哺乳動物における数と比較して、10倍未満減少させる抗体ホモログである。
【００４９】
本明細書および請求の範囲で使用されている「インビボで循環末梢白血球数を有意に減少させない」抗体ホモログは、正常な免疫機能を有する哺乳動物に投与後24時間以内に循環末梢白血球の数を、その投与前の数と比較して、または関連のない特異性を有するアイソタイプのあった抗体ホモログが本発明の抗体ホモログの代わりに投与されたコントロールの哺乳動物における数と比較して、50%未満減少させる抗体ホモログである。この文脈において、「末梢白血球」は、Bリンパ球、Tリンパ球(CD4+またはCD8+)、および単球を含む。本明細書および請求の範囲で使用されている「外来抗原に応答して誘発される抗体の力価を有意に減少させない」抗体ホモログは、後続して投与される外来抗原に応答して誘発される抗体の力価を、関連のない特異性を有するアイソタイプのあった抗体ホモログが本発明の抗体ホモログの代わりに投与されたコントロールの哺乳動物における外来抗原によって誘発された抗体力価と比較して、10倍未満減少させる抗体ホモログである。この文脈において、「外来抗原」は、その哺乳動物のゲノムによってコードされない分子(例:ウィルスまたは細菌のポリペプチド)である。
【００５０】
（本発明に従う抗体ホモログ）
本発明の1つの実施態様に従う抗体ホモログは、(a)ヒトCD4に結合し;(b)HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックせず;および(c)CD4+間のHIVによって誘発されるシンシチウム形成を少なくともOKT4Aと同程度にブロックする。
【００５１】
本発明の他の実施態様は、(a)ヒトCD4に結合し;(b)HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックせず;(c)CD4+間のHIVによって誘発されるシンシチウム形成をOKT4よりも良好にブロックし;(d)インビトロでの破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイにおいてOKT4Aよりも免疫抑制性に劣る、抗体ホモログに関する。
【００５２】
更に他の実施態様は、(a)ヒトCD4に結合し;(b)HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックしない;(c)CD4+間のHlVによって誘発されるシンシチウム形成を、少なくともOKT4Aと同程度にブロックし;そして(d)インビトロの破傷風トキソイド特異的な増殖アッセイでOKT4Aよりも免疫抑制性に劣る、抗体ホモログに関する。
【００５３】
本発明のある種の抗体ホモログは、ヒトCD4  VIV2(即ち、それらはVIV2に特異的である)からなるポリペプチドに結合するが、ヒトCD4  VI(即ち、それらは単独でV1に特異的ではない)からなるポリペプチドには結合しない。同様に、本発明のある種の抗体ホモログは、OKT4AおよびLeu3AのようなCD4  V1に特異的な抗体のヒトCD4への結合を有意にはブロックしない。
【００５４】
本発明のこの好ましい抗体ホモログは、HIVによるCD4+細胞への感染を抑制する。本発明の他の好ましい抗体ホモログは、(a)インビボで循環CD4+細胞数の有意な減少を生じない;(b)インビボでCD4+細胞の表面からの有意なCD4調節を生じない;(c)インビボでの末梢循環白血球数の有意な減少を生じない;(d)インビボでの外来抗原に対する応答が誘導される、抗体力価の有意な減少を生じない;(e)エクソビボ(ex  vivo)での、マイトジェンまたは異種間細胞に対するＴ細胞の増殖反応を不変にまたは持続的に抑制しない、この中から選択される1つ以上の特性を発揮する。
【００５５】
本発明の最も好まれる抗体ホモログは、上述の特性の全てを発揮する。
【００５６】
本発明に従う特異的な抗体ホモログは、下記に示されるように、5A8(IgG1)、1F8(lgG1)、5F2(IgG1)と呼ばれるマウスモノクローナル抗体を含む。5A8が好ましい。
【００５７】
理論に拘束されるのは望まないが、我々は、本発明の抗体ホモログが、CD4+細胞間のHIVによって誘発されるシンシチウム形成を阻害し、その結果このウィルスが非感染細胞に伝染して行くのを遅らせるので、AIDS、ARC、およびHIV感染の予防または治療に役立つものと考えている。
【００５８】
我々は、本発明の抗体ホモログが、HIVgp120がCD4+リンパ球表面に示されるCD4に結合した後でもシンシチウム形成を妨げるので、特に有効であると考えている。HIVによるCD4+感染もまた抑制する本発明の抗体ホモログは、特に有用である。さらに、本発明の抗体ホモログは、ウィルスの結合とは非競合的なプロッカーであるため、我々は、それらの治療的および予防的な効果は血漿ウィルスレベルに独自のものと考えている。
【００５９】
（本発明に従う抗体ホモログのスクリーニングアッセイ）
当業者は、既知の方法を使用することにより、特定の抗体ホモログ(または抗体ホモログを包含する調製物)が上述した特性を発揮するかどうか容易に決定し得、その結果、本発明に従う抗体ホモログを同定し得る。
【００６０】
特定の抗体ホモログがヒトCD4に結合するかどうかを確かめるために、あらゆる慣用的な結合アッセイが使用され得る。有用なCD4結合アッセイは、FACS分析、ELISAアッセイ、ラジオイムノアッセイ、その他を含み、これらは抗体ホモログのヒトCD4への結合を検出する。そのようなアッセイに有用な充分な長さおよび可溶性形態のヒトCD4は、PCT特許出願PCT/US88/02940に開示されており、これは本明細書に参考として援用されている。D.R.Littmanら、Ce11、55、p.541(1988)もまた参照されるべきで、これはpreヒトCD4の正しいシグナル配列開裂部位を記述し、PCT/US88/02940の出願後に出版されたものである。CD4への抗体ホモログの結合、またはrsCD4のようなその可溶性フラグメントヘの抗体ホモログの結合は、抗体ホモログが誘起された種の免疫グロブリンに特異的な二次抗体の使用を介して慣用的に検出し得る。
【００６１】
特定の抗体ホモログが、HIVgp120のヒトCD4への結合を有意にブロックしないかどうかを測定するために、あらゆる適切なアッセイを使用し得る。有用なアッセイには、例えば、ELISAアッセイ、ラジオイミュノアッセイなどのような、HIVgp120のヒトCD4への結合を交差ブロックする抗体ホモログの能力を定量するものが含まれる。好ましくは、過剰のHIVgp120が標識ヒトrsCD4が固定化抗体ホモログに結合するのをブロックする能力が測定される。
【００６２】
好ましくは、ヒトCD4に結合する抗体ホモログの能力は、ヒトCD4+細胞へ結合するその能力をテストすることによって、評価される。特定の抗体ホモログがヒトCD4に結合するかどうかを測定するために使用するための好ましいCD4+細胞は、全長のヒトCD4をコードするDNAで形質転換され、その表面にCD4を発現している哺乳動物の組織細胞である。そのような細胞には例えば、R.A.Fisherら、「HIV  Infection  Is  Blocked  In  vitro  By  Recombinant  Soluble  CD4」,Nature,331,PP.76−78(1988)(「r−CD4−CHO  cells」)に記載されている、全長のCD4をコードするDNAで形質転換されたCHO細胞を含む。適切なトCD4−CHO細胞は、メリーランド州リンチカムにあるIn  Vitro  International,Inc.  culture  collectionに寄託され、受託番号IVI−10260が付けられていて、メリーランド州ロックビルにあるAmerican  Type  Culture  Collectionに移送され、受託番号CRL10884が付けられた。
【００６３】
抗体ホモログのCD4+細胞への結合は、好ましくは、テストされた抗体ホモログが誘導された同じ種の免疫グロブリンに特異的な蛍光標識した二次抗体で細胞を染色することによって検出される。蛍光活性化細胞選別機(「FACS」)は、あらゆる結合を検出し定量するために使用される。一般的には、H.M.Shapiro,Practical  Flow  Cytometry,Alan  R.Liss,lnc.,NewYork,NewYork(1985)を参照のこと。
【００６４】
最も好ましくは、HIVgpl20のヒトCD4への結合をブロックする抗体ホモログの能力は、過剰HIVgp120をCD4+細胞で予めインキュベートし、抗体ホモログが細胞に結合するのを結合HIVgp120がブロックする度合いを定量することによって、決定される。抗体ホモログのCD4+細胞への結合は、テストされる抗体ホモログが誘導される同じ種の免疫グロブリンに特異的な蛍光標識した二次抗体を使うことによって、FACS分析により定量される。
【００６５】
上記アッセイで使用されるHIVgp120は、HIV感染細胞、HIVそれ自身、HIVgp120遺伝子で形質転換された宿主細胞、または分離されたgp120によって、提供し得る。好ましくは、HIVgp120をコードする切断型HIVgp160遺伝子で形質転換された単細胞宿主から分離される、精製された可溶性HIVgp120が使用される。精製された組換えHIVgp120は、例えばRepligen社(ケンブリッジ、マサチューセッツ州)およびCelltech社(バークシャー、英国)から市販されている。組換えgpl20を産生する細胞は、例えば、Laskyら、「Neutralization  Of  The  AIDS  Retrovirus  By  Antibodies  To  A  Recombinant  Envelope  Glycoprotein,Science,233,pp.209−12(1986)」に記載されている。適切な可溶性HIVgp120は、配列番号3で定義されるDNA配列を有する組換えバキュロウィルスで形質転換されたSodoptera  frugiperdaによって産生される。
【００６６】
特定の抗体ホモログが、CD4+細胞間のHIV誘導のシンシチウム形成を、OKT4以上に、あるいは少なくともOKT4Aと同程度にブロックするかどうかを測定するために、あらゆる既知のシンシチウムアッセイが使用し得る。好ましくは、HIV実験室分離株、HIV感染CD4+組織培養細胞(例えば、H9)がC8166細胞の培養物に加えられ、そして様々な量の抗体ホモログがコントロールの培養を除く全てに加えられる。コントロールの培養には、同様な様々な量のOKT4またはOKT4Aが添加される。いくつかのコントロールの培養(陰性コントロール)は、何も補充されないか、あるいは、抗体ホモログと同じアイソタイプの関連する抗体で補充される。インキュベーションの後、全ての培養物は、シンシチウムの目視検査により点数化される。このようにして、シンシチウム形成をブロックする抗体ホモログの能力が、OKT4およびOKT4Aのシンシチウムブロック能力と比較される。
【００６７】
抗体ホモログのシンシチウムブロック能力と、OKT4およびOKT4Aの同じ能力とを比較する別の方法を下記に示す。表面に組換えHIVエンベロープ糖タンパク質(即ち、HIVgp160の翻訳後の開裂の後のHIVgp120/gp41)を発現する形質転換された組織培養細胞を、OKT4、OKT4A、テストされる抗体ホモログの存在、または抗体が全くない状況下で、検出可能な物質(例えば、51Crで標識したJurkat細胞)を含むヒトCD4+細胞とともにインキュベートする。インキュベーションの後、培養上清を検出可能な物質についてアッセイする(例えば、51Crのτ照射測定)。細胞溶解は、HIV誘導のシンシチウム形成に避け難い事象である。それ故に、細胞溶解の結果としての培養上清中に遊離される検出可能な物質は、シンシチウム形成と正比例する。このようにして、OKT4、OKT4Aおよび特定の抗体ホモログがシンシチウム形成をブロックする度合いは、容易に定量し比較し得る。
【００６８】
上記アッセイのための最も好まれる形質転換組織培養細胞は、その表面に組換えHIVエンベロープ糖タンパク質を発現するCHO細胞(「r−gp160−CHO細胞」)である。そのようなr−gp160−CHO細胞は、メリーランド州リンチカムにあるIn  Vitro  International,Inc.  culture  collectionに寄託され、受託番号IVI−10261が付けられ、メリーランド州ロックビルにあるAmerican  Type  Culture  Collectionに移送され、受託番号CRL10885が付けられている。寄託細胞は、本明細書に配列番号1で定義されるDNA配列により形質転換されている。
【００６９】
特定の抗体ホモログが、インビトロの破傷風トキソイドに特異的な増殖アッセイにおいてOKT4Aよりも免疫抑制性が低いかどうか決定するためには、E.G.Englemanら、「Activationof  Human  T  Lymphocyte  Subsets:Helper  And  Supppressor/Cytotoxic  T  Cells  Recognize  And  Respond  to  Distinct  Histocompatibility  Antigens」,J.Immunol.,127,pp.2124−29(1981)に記載の一般的なプロトコールが好ましい。そのような破傷風トキソイドアッセイでは、破傷風トキソイド誘導のＴ細胞増殖を減少させる抗体ホモログおよびOKT4Aの能力が定量される。典型的には、増殖は、Ｔ細胞による3H−チミジン取り込みによって測定される。
【００７０】
特定の抗体ホモログが、ヒトCD4  VI領域を構成するポリペプチドに結合しないかどうか、あるいは、それがヒトCD4  VlV2領域を構成するポリペプチドに結合するかどうかを決定するには、ELISAアッセイ、ラジオイミュノアッセイ(RIAs)、FACS分析などが有用である。そのようなアッセイでは、抗体ホモログのこれらのポリペプチドのいずれかに結合する能力は、抗体ホモログが由来する種の免疫グロブリンに特異的な二次抗体の使用により検出し得る。
【００７１】
好ましくは、結合は、あらゆる阻害を定量するFACS分析を使用して、CD4+細胞の表面に示されるヒトCD4細胞に対する抗体ホモログの結合競合物として作用するCD4  V1およびCD4  V1V2ポリペプチドの、阻害の研究によって決定される。
【００７２】
あるいは、特定の抗体ホモログがCD4  VIまたはCD4  VIV2のポリペプチドに結合するか、しないかの決定は、抗体ホモログがプレートに結合し、検出可能な標識されたrsCD4を用いて、CD4  VIまたはCD4  VIV2が同時に抗体ホモログへの結合に競合するRIA競合アッセイを用いて達成される。結合rsCD4の量は、CD4  V1またはCD4  VIV2のポリペプチドが存在しない状況でのrsCD4の量と比較され、CD4  V1またはCD4  VIV2ポリペプチドによるrsCD4結合阻害のパーセントの計算が可能となる。
【００７３】
ヒトCD4  V1またはCD4  VIV2領域を構成している好ましいポリペプチドは、PCT特許出願番号PCT/US88/02940または上記Maddonら、Cellに記載されているCD4配列のそれぞれ、CD4  AA3−AA115またはCD4  AA3−AA182である。上記Littmanら、Cellの訂正番号システムにより、これらのポリペプチドはそれぞれ、ヒトCD4  AAl−AA113およびヒトCD4  AA1−AA180に対応する。適切なCD4  VIポリペプチドは、B.H.Chaoら、「A113−Amino  Acid  Fragment  Of  CD4  Produced  ln  Escherichia  coli  Blocks  Human  Immunodeficiency  Virus−Induced  Cell  Fusion」,J.Biol.Chem.,264,pp.5812−17(1989)に記載されている。適切なCD4  VIV2ポリペプチドは、R.L.Garlickら、「Escherichia  coli  Expression,Purification,And  Biological  Activity  Of  A  Truncated  Soluble  CD4」,AIDS  Res.Hum.Retrovirus,6,pp.465−79(1990)に記載されている。
【００７４】
特定の抗体ホモログが、HIVによるCD4+細胞の感染を阻害するかどうか決定するために、HIV感染のあらゆる指標をモニターし得た。HIV感染の有用な指標には、例えば、HIVで慢性的に感染された細胞によるHIVコア抗原p24の分泌およびHIV誘導のシンシチウム形成が含まれる。好ましくは、HIV感染の阻害は、HIV感染のCD4+細胞培養物中の抗体ホモログの存在かまたは存在しない条件でのHIVp24レベルを比較することによって測定される。
【００７５】
特定の抗体ホモログが、インビボでの循環CD4+細胞数の有意な減少を生じるかどうかを測定するために、抗体ホモログを正常免疫機能を有する哺乳動物に投与後24時間以内にその哺乳動物から分離される循環CD4+細胞の数を定量し、投与前の数または、本発明の抗体ホモログの代わりに特異性に関連のないアイソタイプのあった抗体ホモログを投与したコントロールの哺乳動物における数と比較した。CD4+細胞の定量は、例えば、抗体ホモログのCD4(例えば、OKT4)結合を交差ブロックしない蛍光標識した抗CD4抗体で細胞を染色することによって達成し得、その後FACS分析を行う。
【００７６】
特定の抗体ホモログがインビボでのCD4+細胞表面からの有意なCD4調節を起こさないかどうか測定するために、抗体ホモログを正常免疫機能を有する哺乳動物に投与後24時間以内にその哺乳動物から分離されるCD4+細胞上のCD4分子の数を定量し、投与前の数または、本発明の抗体ホモログの代わりに特異性に関連のないアイソタイプのあった抗体ホモログを投与したコントロールの哺乳動物における数と比較した。細胞表面CD4の定量は例えば、抗体ホモログのCD4(例えば、OKT4)結合を交差ブロックしない蛍光標識した抗CD4抗体で細胞を染色することによって達成し得、その後FACS分析を行う。
【００７７】
特定の抗体ホモログが、インビボで循環末梢白血球数における有意な減少を生じないかどうかを測定するために、正常な免疫機能を有する哺乳動物に抗体ホモログを投与後24時間以内に採取した血液を、慣用的な手段を用いて分画し、白血球数の計測を行う(例えば、染色血スミアにより)。その数は、その哺乳動物の投与前の数、または本発明の抗体ホモログの代わりに特異性に関連しないアイソタイプのあった抗体ホモログを投与したコントロールの哺乳動物の数と比較する。特定の抗体ホモログが、インビボで外来抗原に応答して誘発される抗体力価の有意な減少を生じるかどうかを測定するために、正常な免疫機能を有する哺乳動物で外来抗原により誘発された抗体力価を抗体ホモログの投与後に測定し、本発明の抗体ホモログの代わりに特異性に関連のないアイソタイプのあった抗体ホモログを投与したコントロールの哺乳動物で誘発された力価と比較する。外来抗原に対する抗体力価は例えば、外来抗原でコートしたマイクロタイタープレートを使用して都合よく、ELIZA法によって測定し得る。
【００７８】
特定の抗体ホモログが、マイトジェンおよび異種細胞に対するインビトロでのＴ細胞の増殖反応を有意に阻害するかどうかを測定するために、抗体ホモログの投与前または投与後の様々な時点で分離されるＴ細胞の増殖反応が測定される。
【００７９】
この目的のための有用なマイトジェンは、コンカナバリンAおよびフィトヘマグルチニンを含む。有用な異種細胞は、抗体ホモログが投与された哺乳動物の種以外の種から由来のあらゆる細胞(例えば、リンパ球)を含む。増殖反応は例えば、マイトジェンまたは放射線照射された異種細胞など増殖できないものと共にインビトロでインキュベーションしたあと、様々なＴ細胞試料への3H−チミジンの取り込みによって、測定し得る。
【００８０】
（本発明に従うホモログのタイプおよびそれらの産生）
決定的な基準は上述の特性の組み合わせの1つを示すことであるので、本発明に従う抗体ホモログは多くのタイプが有り得る。例えば、本発明の抗体ホモログは、完全なモノクローナル抗体、完全な組換え抗体、完全なキメラ組換え抗体、完全なヒト型組換え抗体、または前記抗体の抗原結合部位であり得る。
【００８１】
（A.モノクローナル抗体）
本発明の最も好ましい抗体ホモログは、ハイブリドーマ細胞によって産生された完全なモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体を産生するための技術は、公知である(一般に、E.A.Lerner、「How  To  Make  A  Hybridoma」,Yale  J.Biol.Med.,54,pp.387−402(1981);M.L.Gefterら、「A  Simple  Method  For  Polyethylene  Glycol−Promoted  Hybridization  Of  Mouse  Myeloma  Cells」,Somatic  Cell  Genet.,3,pp.231−36(1977)を参照)。簡潔に言えば、永久細胞様(典型的には、ミエローマ細胞)はヒトCD4またはそれのVIV2含有フラグメントを含む調製物で免疫された哺乳動物からのリンパ球(典型的には、脾臓細胞)に融合され、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清は、上記のように、本発明に従う抗体ホモログについてスクリーニングされる。
【００８２】
有用なCD4含有調製物には、ヒトCD4保持細胞(例えば、CD4+リンパ球)、CD4を含有するそのような細胞の分画、天然源から分離される未精製の、部分的に精製された、または実質的に純粋なヒトCD4、および部分的に精製されたまたは実質的に純粋なヒトCD4または組換え宿主細胞から得られるVIV2を含有するそれらのフラグメントが含まれる。CD4のVIV2含有フラグメントを発現する組換え宿主細胞は、例えば、PCT特許出願番号PCT/US88/02940に記載されている。
【００８３】
好ましい免疫原は、CD4一哺乳動物組織培養細胞を、ヒトCD4の全長をコードするDNAで形質転換することによって産生されるCD4+細胞である。最も好ましくは、免疫原は、上記Maddonら、Cellに記載されているCD4のAA−23−AA435(即ち、上記Littmanら、Cellに記載の訂正番号システムでは、CD4のAA−25−AA433)である。そのような細胞は、本明細書では「r−CD4−CHO細胞」として示され、メリーランド州リンチカムのIn  Vitro  International,Inc.culture  collectionに寄託され、受託番号IVI−10260が付けられ、メリーランド州ロックビルにあるAmerican  Type  Culture  Collectionに移送され、受託番号CRL10884が付けられた(上記Fisherら、Natureも参照)。
【００８４】
理論に束縛されることは望まないが、「天然の」CD4+細胞、分離CD4または切断型のCD4よりは、免疫原としてのr−CD4−CHO細胞を使用することが、特定の融合物から本発明に従う抗CD4抗体ホモログを得る可能性を増大すると我々は考えている。r−CD4−CHO細胞の表面に示されるCD4以外に天然のＴ細胞表面の分子はなく、あったとしてもCD4に関連し、その関連の故にある種のCD4エピトープを受け入れ難くさせるという事実のために、「天然」CD4+細胞に比較してこれは可能性を増大させたと、我々は考えている。単離されたCD4およびそのフラグメントによって想定される高次構造よりもr−CD4−CHO細胞表面上のCD4によって想定されるより好ましい高次構造のために、単離されたCD4またはそのフラグメントと比較して、これは可能性を増大させたと、我々は考えている。
【００８５】
免疫化は、標準的手法を使って達成し得る。このユニット用量および免疫化統制法は、免疫される哺乳動物の種、その免疫状態、その哺乳動物の体重、および投与されるCD4調製物のCD4量に依存する。典型的には、CD4調製物は、フロイントの完全または不完全アジュバントのような、アジュバントと共に投与する。
【００８６】
好ましい実施態様においては、マウスの免疫化に使用される各用量のCD4の調製物は、少なくとも約2×105個の細胞、好ましくは約3×106から2×107個のr−CD4−CHO細胞を含む。最も好ましくは、1ユニット用量は、約5×106個のr−CD4−CHO細胞を含む。典型的には、マウスは第0日に、フロイント完全アジュバントと共にr−CD4−CHO細胞を腹腔内投与して免疫される。最初の免疫から14日から6月後に、好ましくは第1回目の免疫から15日から20日後に、マウスは第1回目の追加免疫として、アジュバントなしでr−CD4−CHOを腹腔内投与される。所望されるならば、追加の追加免疫が投与し得る。融合の3日前に、最後の追加免疫(アジュバントなしのr−CD4−CHO細胞)が腹腔内投与される。典型的には、この最後の追加免疫が、最初の免疫より1から6か月後、好ましくは39から44日後に投与される。最後の追加免疫投与より3日後、この哺乳動物は殺されて、その脾臓が摘出され、脾臓細胞(リンパ球を含む)が永久細胞株との融合のために調製される。
【００８７】
この免疫された哺乳動物は追加免疫と追加免疫の間に採血され、各血液サンプルからの血清は本発明に従い、上記のスクリーニングアッセイを使用して、抗体ホモログについてアッセイされる。ハイブリドーマ細胞の産生に使用されるリンパ球は、典型的には、血清が本発明に従う抗体ホモログの存在について既に陽性を示す、免疫された哺乳動物から単離される。
【００８８】
リンパ球と永久細胞を融合させるあらゆる既知のプロトコールは、本発明の抗体ホモログを生み出す目的に有用である(例えば、G.Galfreら、「Antibodies  To  Major  Histocompatibility  Antigens  Produced  By  Hybrid  Cell  Lines」,Nature,266,pp.550−52(1977);上記Gefterら、Somatic  Cell  Genet.;上記Lerner,YaleJ.Biol.Med.を参照)。さらに当業者には、有用でもあるそのような方法に多くの多様性があることは明らかである。
【００８９】
典型的には、永久細胞は、このリンパ球と同じ哺乳動物の種に由来する。有用な哺乳動物には、マウスおよびラットが含まれる。
【００９０】
最も好ましくは、永久細胞株およびリンパ球の両方ともがBALB/c(JacksonLabs、メイン州バーハーバー)の同系マウスから誘導された。好ましい永久細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培養培地(「HAT培地」)に感受性を有するマウスミエローマ細胞株である。最も好ましいマウスミエローマ細胞系は、P3X63−AG8.653(メリーランド州ロックビル、ATCC、カタログ番号CRL1580)である。典型的には、HAT感受性マウスミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール(「PEG」)、好ましくはPEG−3350を使用して、マウス脾臓細胞に融合される。融合によって得られるハイブリドーマ細胞は次に、非融合ミエローマ細胞および非生産的融合ミエローマ細胞(非融合脾臓細胞は、形質転換しなかったために数日後に死滅する)を死滅させるHAT培地を使って選択する。
【００９１】
本発明に従う、抗体ホモログ(モノクローナル抗体)を産生するハイブリドーマ細胞は、上記のスクリーニングアッセイを用いて、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることによって検出される。好ましくは、一次スクリーニングは、CD4+細胞表面上に示されるヒトCD4に結合する抗体を選択する。そのような結合は、マウス免疫グロブリンに特異的な蛍光標識した二次抗体を使用して検出される。
【００９２】
完全なモノクローナル抗体である、本発明の抗体ホモログを産生するために、上記スクリーニングアッセイで陽性であったハイブリドーマ細胞を、このハイブリドーマ細胞にモノクローナル抗体を培養培地に分泌させるのに充分な時間と条件下で培養する。ハイブリドーマ細胞に適切な組織培養技術と培養培地は、公知である(例えば、上記、Lerner、Yale  J  Biol.Med.を参照)。抗体ホモログを含有する馴化されたハイブリドーマ培養が集められる。
【００９３】
あるいは、所望の抗体ホモログは、ハイブリドーマ細胞を非免疫マウスの腹膜腔に注入することによって産生し得る。ハイブリドーマ細胞は、腹膜腔で増殖し、抗体ホモログを分泌し、それは腹水液として蓄積する(上記、Lerner、Yale  J  Bio1.Med.を参照)。この抗体ホモログは、腹膜腔から注射機を使って腹水液を取り出すことによって回収される。
【００９４】
本発明に従う抗体ホモログであるモノクローナル抗体は、馴化されたハイブリドーマ培養上清または腹水から容易に精製されることは、当業者に理解される。
【００９５】
（B.組え抗体およびそれらをコードするDNA）
本発明に従う抗体ホモログは、本発明に従う免疫グロブリンのL鎖およびH鎖をコードするDNAで形質転換された宿主細胞で産生される組換えモノクローナル抗体であり得る。組換え抗体は、公知の遺伝子工学技術によって産生し得る。例えば、本明細書に援用されている米国特許第4,816,397号を参照。
【００９６】
例えば、組換え抗体は、本発明の抗体ホモログを産生するハイブリドーマから、所望の抗体の免疫グロブリンのL鎖およびH鎖をコードするcDNAあるいはゲノムDNAをクローニングすることにより産生し得る。これらのポリペプチドをコードするcDNAまたはゲノムDNAは次に、両方の遺伝子がそれら自身の転写または翻訳発現制御配列に機能するように連結されるように、発現ベクターに挿入される。発現ベクターおよび発現制御配列が、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。典型的には、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。
【００９７】
本発明は、5A8のL鎖の可変領域(配列番号14)および5A8のH鎖の可変領域(配列番号9)をコードするDNA配列、即ち本発明に従う抗体ホモログをコードするそれらの一部分、およびこれらのDNA配列を生じるあらゆるDNA配列を提供する。上記のDNA配列の1つ以上を含む組換えDNA分子および、それに機能するように連結する1つ以上の発現制御配列がまた、提供される。
【００９８】
原核または真核細胞が、発現宿主として使用し得る。真核宿主細胞での発現は、そのような細胞が原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体を集めて分泌するので、好ましい。しかし、産生された抗体で不適切な折り畳みのために不活性なものは、公知の方法(P.S.KimおよびR.L.Baldwin、「Specific  Intermediates  In  The  Folding  Reactions  Of  Small  Proteins  And  The  Mechanism  Of  Protein  Folding」,Ann.Rev.Biochem.,51,pp.459−89(1982))に従って復元し得る。宿主細胞が、L鎖ダイマーまたはH鎖ダイマーのような完全な抗体の一部分を産生することは可能である。これもまた本発明に従う抗体ホモログである。
【００９９】
上記方法の様々なものが、本発明の範囲内にあることは理解される。例えば、宿主細胞を本発明の抗体ホモログのL鎖またはH鎖のいずれか(両方ではない)をコードするDNAで形質転換することが望ましい。組換えDNA技術はまた、CD4結合に必要ではないL鎖およびH鎖のいずれか、または両方をコードするDNAのいくつか、または全てを除くために使用され得る。そのような切断型DNA分子により発現される分子は、本発明に従う抗体ホモログである。さらに、1つのH鎖と1つのL鎖が本発明の抗体ホモログであり、他のH鎖およびL鎖がCD4以外の抗原またはCD4の他のエピトープである、二機能性抗体ホモログを産生し得る。
【０１００】
（C.キメラ型およびヒト型組換え抗体およびそれらをコードするDNA）
上記の組換え抗体をコードするDNAは、キメラ型またはヒト型組換え抗体を産生するための開始点として使用され得る。キメラ型組換え抗体は、所望の免疫グロブリンのL鎖およびH鎖をコードするDNAを含む適切な発現ベクターで宿主を形質転換することによって産生され、その中ではヒンジ部およびH鎖および/またはL鎖の不変領域をコードするDNAの全てまたはいくらかは、異なる種の免疫グロブリンのL鎖またはH鎖に対応する領域からのDNAで置換された。初めの組換え抗体が非ヒト型の時は、対応するヒトの配列での置換が好ましい。適例となるキメラ型組換え抗体は、マウスの可変領域、およびヒトのヒンジ部および不変領域を有する。一般には、米国特許第4,816,397号、およびS.L.Morrisonら、「Chimeric  Human  Antibody  Molecules:Mouse  Antigen−Binding  Domains  With  Human  Constant  Region  Domains」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,pp.6851−55(1984)を参照のこと。
【０１０１】
本発明の好ましい5A8キメラ型組換え抗体では、それぞれに、L鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号15、H鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号10である。
【０１０２】
ヒト型組換え抗体は、所望の非ヒト型免疫グロブリンのL鎖およびH鎖をコードするDNAを含む適切な発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによって産生され、この中ではCD4結合に関わっていないアミノ酸をコードするDNAの全てまたはいくらかは、所望のヒト免疫グロブリンのL鎖またはH鎖の対応する領域からのDNAで置換された。一般には、P.T.Jonesら、「Replacing  The  Complementarity−Determining  Regions  In  A  Human  Antibody  With  Those  From  A  Mouse」,Nature,321,pp.522−25(1986)を参照のこと。
【０１０３】
本発明の最も好ましいヒト型組換え抗体は、5A8の相補性決定領域(「CDRs」)を有している。これらは、ヒト型組換え抗体を含んでおり、その中では:
(a)L鎖CDR1は、配列番号15のAA24−AA40である。
(b)L鎖CDR2は、配列番号15のAA56−AA62である。
(c)L鎖CDR3は、配列番号15のAA95−AA102である。
(d)H鎖CDR1は、配列番号10のAA31−AA35である。
(e)H鎖CDR2は、配列番号10のAA50−AA66である。
(f)H鎖CDR3は、配列番号10のAA99−AA111である。
他の好ましい実施態様は、5A8のCDRsを有するヒト型組換え抗体を提供し、その中ではL鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号56のAA1−AA112であり、H鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号45のAA1−AA122である。
【０１０４】
さらに好ましい実施態様は、5A8のCDRsを有するヒト型組換え抗体ホモログを提供し、その中ではL鎖のアミノ酸配列は配列番号56のAA1−AA219であり、H鎖のアミノ酸配列は配列番号45のAA1−AA449である。
【０１０５】
本発明は、pre−5A8ヒト型L鎖(配列番号55)およびpre−5A8ヒト型H鎖(配列番号44)をコードするDNA配列、本発明に従う抗体ホモログをコードする前記DNA配列の一部分、および前記DNA配列を生じるDNA配列を提供する。1つ以上の前記DNA配列および、それに対して機能するように連結される1つ以上の発現制御配列を含む組換えDNA分子もまた提供される。好ましい組換えDNA分子には、pMDR1007(pre−5A8ヒト型L鎖)pMDR1002(pre−5A8ヒト型H鎖)が含まれ、これはメリーランド州ロックビルにあるAmerican  Type  Culture  Collectionに寄託されていて、それぞれ受託番号ATCC68846およびATCC68847が付けられている。
【０１０６】
（D.完全な抗体ではない本発明に従うホモログ）
本発明はまた、完全な抗体ではない抗体ホモログを提供する。そのようなホモログは、上記のあらゆる抗体ホモログから由来し得る。例えば、抗原結合フラグメントおよび上記抗体に由来する、全長を有するモノマー、ダイマー、トリマーのポリペプチドは、それ自身本発明に従う抗体ホモログである。このタイプの有用な抗体ホモログは、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(v)フラグメント、H鎖のモノマーまたはダイマー、L鎖のモノマーまたはダイマー、1本のH鎖および1本のL鎖からなるダイマー、などを含む。5A8のFabフラグメント以外の上記フラグメントは一般に、本発明に従う有用な抗体ホモログであると我々は考えている。
【０１０７】
抗体フラグメントは化学的方法、例えば、完全な抗体をペプシンまたはパパインのようなプロテアーゼで分解し、そしてこの分解産物を必要に応じて還元剤で処理することによって、産生し得る。あるいは、有用なフラグメントは、切断型のH鎖および/またはL鎖遺伝子で形質転換された宿主細胞を使って産生し得る。H鎖およびL鎖のモノマーは、完全な抗体をジチオスレイトールのような還元剤で処理することによって産生し得、その後この鎖を分離するための精製が行われる。H鎖およびL鎖のモノマーもまた、所望のH鎖またはL鎖の両方ではなくいずれかをコードするDNAで形質転換された宿主細胞により産生し得る。例えば、E.S.Wardら、「Binding  Activities  Of  A  Repertoire  Of  Single  lmmunoglobulin  Variable  Domains  Secreted  From  Escherichia  coli,Nature,341,pp.544−46(1989);L.Sastryら、「Cloning  Of  The  Immunological  Repertoire  in  Escherichia  coli  For  Generation  Of  Monoclonal  Catalytic  Antibodies:Construction  Of  A  Heavy  Chain  Variable  Region−Specific  cDNA  Library」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.5728−32(1989)を参照。
【０１０８】
（本発明に従う誘導体化された抗体ホモログ）
１つの実施態様において、本発明は、本発明のあらゆる抗体ホモログが、本発明の抗体ホモログ、本発明の5A8擬態物質、検出可能物質、細胞毒性物質、および薬剤からなる群がら独立に選択される1以上のメンバーと機能的に連結(化学的カップリング、遺伝子融合その他によって)されるように、誘導体化された抗体ホモログを提供する。誘導体化された1つのタイプの抗体ホモログは、2つ以上の(同じタイプまたは異なるタイプの)抗体ホモログを架橋結合させることによって、産生される。適切な架橋リンカーは、ヘテロ二官能性で適切なスペーサー(例えば、m−マレイミドベンゾイルーN一ヒドロキシスクシニミドエステル)により分離される異なる反応基を有するものか、またはホモ二官能性であるもの(例えば、ジスクシニミジルスベリン酸)を含む。そのようなリンカーは、イリノイ州ロックフォードのPierce  Chemical  Companyから入手される。
【０１０９】
有用な検出可能物質は、蛍光化合物を含む。適例の蛍光検出可能物質は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5−ジメチルアミン−1−ナフタレンスルホニルクロライド、フィコエリスリンなどを含む。
【０１１０】
本発明の抗体ホモログはまた、アルカリフォスファターゼ、ワサビダイコンペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどのような検出可能な酵素で誘導体化し得る。抗体ホモログが検出可能な酵素で誘導体化されるとき、酵素が検出可能な反応産物を産生するために使用する別の試薬を添加することによって検出される。例えば、検出物質であるワサビダイコンペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加は、検出可能な発色反応産物を導く。抗体ホモログはまた、ビオチンとともに誘導体化し得、そして間接的なアビジン結合の測定によって検出し得る。
【０１１１】
本発明はまた、1つ以上の薬剤と連結する抗体ホモログを提供する。有用な薬剤は、CD4以外のヒトのポリペプチドに特異的な抗体ホモログのような、生物学的に活性なペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。他の有用な薬剤は、HIV逆転写酵素阻害剤(例えば、3’−アジド−2’,3’−ジデオキシチミジン(「AZT」)および2’,3’−ジデオキシイノシン(「DDI」))および他の抗ウィルス化合物のような非タンパク質性薬剤、または免疫抑制剤(例えば、サイクロスポリンまたはFK506)を含む。
【０１１２】
（本発明に従う抗体ホモログを産生する細胞）
本発明はまた、本発明の抗体ホモログを産生する細胞および細胞培養物を提供する。そのような細胞は、本発明の抗体ホモログであるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞および本発明の組換え抗体ホモログを産生する形質転換された宿主細胞を含む。
【０１１３】
本発明に従う好ましい細胞は、本明細書で「5A8」「1F8」および「5F2」として示されるモノクローナル抗体を産生するものを含む。この最も好ましい細胞系は、モノクローナル抗体5A8を産生する。5A8、1F8および5F2を産生するハイブリドーマ細胞系は、メリーランド州リンチカムにあるIn  Vitro  International,Inc.culture  collectionに寄託され、それぞれ受託番号IVI−10257、IVI−10258およびIVI−10259が付けられ、メリーランド州ロックビルにあるAmerican  Type  Culture  Collectionに移送され、それぞれ受託番号HB1O881、HB10882およびHB1O883が付けられている。
【０１１４】
他の好ましい細胞は、上記の5A8キメラ型およびヒト型組換え抗体を産生する宿主細胞である。pMDR1007(pre−5A8ヒト型L鎖)およびpMDR1002(pre−5A8ヒト型H鎖)で形質転換された真核宿主細胞は、5A8のヒト型抗体を産生するために最も好ましい。
【０１１５】
さらに、本発明は、抗体ホモログを産生する本発明の細胞を培養することによって、本発明の抗体ホモログを産生する方法を提供する。そのような細胞を培養し、それらが産生する抗体ホモログを単離する方法は、公知である。これらの方法は、組織培養技術および腹水の産生を含む。
【０１１６】
ハイブリドーマ細胞である本発明の細胞を産生する方法もまた提供される。この方法には、全長のヒトCD4をコードする一DNAでCD4一哺乳動物組織培養細胞を形質転換することによって産生される、細胞がその表面上にCD4を発現するCD4+細胞で、ヒト以外の哺乳動物を免疫する工程を包含する。このプロセスのための免疫原として使用される好ましい細胞は、上記のr−CD4−CHO細胞である。
【０１１７】
（５Ａ８擬態物質）
本発明は5A8擬態物質を提供する。これはモノクローナル抗体5A8による、CD4+細胞表面上に発現されているヒトrsCD4またはヒトCD4への結合を少なくとも30%減少させる化合物である。5A8擬態物質は、ペプチド、半ペプチド化合物または非ペプチド化合物である。好ましい5A8擬態物質は、CD4+間のHIV誘導シンシチウム形成を阻害し、HIVによるCD4+細胞の感染を阻害するか、あるいはその両方である。最も好ましい5A8擬態物質は、本発明の1つ以上の抗体ホモログの特性を示す。
【０１１８】
本発明の5A8擬態物質は多数の、ペプチド(例えば、5−20個の長さのアミノ酸)、半ペプチド化合物または非ペプチド有機化合物を合成し、次にこれらの化合物を、その能力、即ち(1)5A8を用いてヒトCD4への結合を交差ブロックする、(2)CD4+間のHIV誘導シンシチウム形成を阻害する、および(3)HIVによるCD4+細胞感染を阻害する、能力によってスクリーニングし得る。一般には、本明細書に援用されている、米国特許第4,833,092号、J.K.ScottおよびG.P.Smith,「Searching  For  Peptide  Ligands  With  An  Epitope  Library」,Science,249,pp.386−90(1990),およびJ.J.Devlinら、「Random  Peptide  Libraries:A  Source  Of  Specific  Protein  Binding  Molecules」,Science,249,pp.404−07(1990)を参照のこと。
【０１１９】
（本発明に従う薬剤組成物および薬学的方法）
本発明の抗体ホモログおよび5A8擬態物質は、その一次標的物がCD4+リンパ球である感染因子により起こる疾病を予防および治療するための予防用および治療用組成物に有用である。そのような疾病は、AIDS、ARCおよびHIV感染を含む。
【０１２０】
抗体ホモログとしてヒトに投与するための本発明の好ましい薬剤組成物は、マウスモノクローナル抗体5A8、1F8、または5F2、5A8マウス/ヒトキメラ型組換え抗体、5A8ヒト型組換え抗体、またはこれらの抗体の抗原結合部分の、1つ以上を含む。5A8マウス/ヒトキメラ型組換え抗体または5A8ヒト型組換え抗体を含む薬剤組成物が、最も好ましい。
【０１２１】
本発明の薬剤組成物はさらに、AIDS、ARC、およびHIV感染の予防または治療のための他の治療法を包含し得る。例えば、本発明の抗体ホモログは、AZT、DDI、HPA−23、ホスホノホルメート、スラミン、リバビリン、およびジデオキシシチジンのような逆転写酵素をブロックする抗レトロウイルス剤、またはHIVプロテアーゼを阻害する物質と組み合わせて、使用し得る。さらに、本発明の薬剤組成物はさらに、α型インターフェロン、β型インターフェロン、γ型インターフェロンのようなインターフェロンまたはカスタノスペルミンのようなグルコシダーゼ阻害剤のような抗ウィルス剤、または副腎コルチコステロイド、アザチオプリン、サイクロスポリン、またはFK506のような免疫抑制物質を包含し得る。さらに、本発明の抗体ホモログは、HIVgp120のCD4に対する結合を有意にブロックする物質と組み合わせて好ましく投与し得る。そのような物質には、例えば、V1に特異的(例えば、Leu3A)である抗CD4抗体、CD4  VIポリペプチドおよびHIVgp120に特異的な抗体(抗イディオタイプまたはその他)を含む。
【０１２２】
さらに、抗体ホモログまたは5A8擬態物質の1つ以上が、前記治療物質の2つ以上と組み合わせて使用し得る。そのような組み合わせ療法は、投与される治療物質がより低い用量で好ましく活用し得、この結果、様々な単一療法に伴う毒性または合併症の可能性を回避する。
【０１２３】
本発明の薬剤組成物は、本発明に従う抗体ホモログまたは5A8擬態物質、またはそれらの誘導体化された形態(単数または複数)、および好ましくは薬学的に受容可能な担体の1つ以上の免疫治療学的な有効量を包含する。「免疫治療学的な有効量」とは、AIDS、ARC、HIV感染、あるいはその一次標的物がCD4+リンパ球である感染因子によって引き起こされる他の疾病の、蔓延、重篤度、または免疫不全を低減させるのに可能な量を意味する。「薬学的に受容可能な担体」とは、それが投与される患者にアレルギー反応または他の好ましくない効果を引き起こさない担体を意味する。
【０１２４】
適切な薬学的に受容可能な担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせの1つ以上を含む。薬学的に受容可能な担体はさらに、抗体ホモログまたは5A8擬態物質の貯蔵寿命または有効性を高める、浸潤剤または乳化剤、保存料、または緩衝液のような二次的物質の少量を含有し得る。
【０１２５】
本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには例えば、錠剤、カプセル、粉末、液状溶液、コロイド状溶液、懸濁液のような固体、半固体、液体の投与形態、リボソーム、座薬、注射可能な注入用溶液を含む。好ましい形態は、投与および治療的利用の意図された様態に依存する。
【０１２６】
本発明の好ましい薬剤組成物は、ヒトを他の抗体で受動免疫するのに使用されるものと類似している。投与の好ましい様態は、非経口的投与である。
【０１２７】
本発明の免疫治療学的に有効な量の抗体ホモログまたは5A8擬態物質は、なかんずく、投与スケジュール、投与される抗体ホモログまたは5A8擬態物質のユニット投与量、抗体ホモログまたは5A8擬態物質が他の治療剤と組み合わせて投与されるかどうか、患者の免疫状態および健康状態、および投与される特定の抗体ホモログまたは5A8擬態物質の治療状の活性に依存することは、当業者には明らかである。
【０１２８】
HIV感染、ARC、またはAIDSの治療または予防の単独療法として、完全な抗体である抗体ホモログのユニット投与量毎の免疫治療学的な有効量は、0.1から10mg/kg患者体重、好ましくは2mg/kg患者体重である。ユニット投与量は、抗ウィルス効果が観察されるまで、1日2回から2週間毎に1回の範囲一で投与され、好ましくは2週間に1回である。抗ウィルス効果は、ウィルス負荷量、リンパ球数および臨床上の兆候と症候群を含む様々な方法で測定し得る。しかし、より低いまたはより高い投与量および他の投与スケジュールが使用し得ることは認識される。
【０１２９】
完全な抗体ではない抗体ホモログに対する、および5A8擬態物質に対する治療統制法は、それらのサイズおよび薬学的な特性に依存して異なり得る。
【０１３０】
本発明がより理解され得るように、下記の実施例が記述される。これらの実施例は、例示のみを目的としており、いかなる意味でも本発明の範囲が制限されるものではない。
【実施例】
【０１３１】
（本発明の抗体ホモログの産生および最初のスクリーニング）
モノクローナル抗体1F8、5A8、および5F2を産生するために使用される免疫原は、細胞表面に発現される全長のヒトCD4をコードするDNAで形質転換されるCHO細胞(「r−CD4−CHO細胞」)であった。このCHO細胞を形質転換させるために使用されるCD4配列は、上記Maddonら、Cellに記載されている。これらの細胞は、R.A.Fisherら、「HIV  Infection  Is  Blocked  ln  Vitro  By  Recombinant  Soluble  CD4」,Nature,331,PP.76−78  (1988)に記載されており,そしてメリーランド州リンチカムにあるIn  Vitro  lnternationa1  Inc.  culture  collectionに寄託され、受託番号IVI−10260が付けられていて、メリーランド州ロックビルにあるAmerican  Type  Culture  Collectionに移送されて受託番号CRL10884が付けられた。
【０１３２】
r−CD4−CHO細胞は、10%の透析された胎児ウシ血清(「FCS」)(フロリダ州マイアミ、North  American  Biologics、カタログ番号33189)が補足されたα一MEM倍地(ニューヨーク州グランドアイランド、Gibco)で、5%  CO2、37℃、そして30nMメトトレキセートで維持した。細胞は、5mMEDTA補足のリン酸緩衝(Ca+およびMg+が遊離)生理食塩水(「PBS」)を含む上記培養培地で置換され、その緩衝液で細胞を回収することによって、注入用に調製した。回収された細胞は、500×gavで5分間遠心してペレット化し、PBS中でこのペレットを再懸濁し、前回と同様に遠心することによって洗浄し、計数し、PBS中でこの細胞ペレットを再懸濁することによって注入用の適切な体積に調整した。
【０１３３】
約4から6週齢の2匹のメスのBALB/cJマウス(メイン州バーハーバー、JacksonLabs)を、r−CD4−CHO細胞で下記のように免疫した。1匹目のマウスは、第0日にフロイント完全アジュバント(「CFA」)(コロラド州デンバー、Colorado  Serum  Co.、カタログ番号C51450)とPBS中のr−CD4−CHO細胞との1:1乳濁液で、腹腔内投与により(i.p.)初回抗原刺激を受け、第20日目にアジュバントなしのPBS中のr−CD4−CHO細胞でi.p.により追加免疫され、そして最後に第４４日目にアジュバントなしのPBS中のr−CD4−CHO細胞で静脈内に追加免疫された。もう1匹のマウスは、第o日にi.p.により初回抗原刺激を受け、第15日目にi.p.により追加免疫され、そして最後に第39日目に静脈内に追加免疫された(全ての注入に、アジュバントなしのPBS中のr−CD4−CHOを用いる)。両方のマウスとも、各注入物は、約250μ1の体積中に約3×106から2×107個のr−CD4−CHO細胞を含んでいた。
【０１３４】
最後の注入より3日後に、両方のマウスを殺して脾臓をそれぞれ摘出し、ペトリ皿中の、血清を含まない約5mlのDMEM(Gibco、カタログ番号430−2100)の中に置いた。脾臓の被膜を切り開き、脾臓細胞を培地中で細片にした。この脾臓細胞懸濁液を、1本の15mlコニカルチューブに移して、約5分間静置した。上清を新しい15m1のコニカルチューブに取り除き、そして融合させるときまでインキュベーター(37℃、5%CO2)中に置いた。両方のマウスからの、この脾臓細胞をプールした。
【０１３５】
コントロールの脾臓供給細胞の単一化細胞による5mlの懸濁液を、基本的には、上述の免疫された脾臓細胞のように免疫されていないマウスから調製し、必要とされるまでインキュベーター(37℃、5%CO2)中に置いた。
【０１３６】
この免疫された脾臓細胞と融合される相手は、ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン(「ＨＡＴ」)感受性の、非分泌型マウスミエローマ細胞系−−P3×63−AG8.653(メリーランド州ロックビル、ATCC、カタログ番号CRL1580)であった。融合される前に、P3×63−AG8.653細胞はDMEM/10%FCS(37℃、5%CO2)中に維持され、融合される日には対数増殖期に保持された。
【０１３７】
使用される融合のプロトコールは、上記Lerner、Yale  J.Bio1.Med.,および上記Gefterら、Somatic  Cell  Genet.,に記載されているプロトコールのハイブリッドであった。特に、融合の直前に、上記のように調製したプールしていた脾臓細胞は、PBSで3回洗浄し、約10m1のPBSで再懸濁し、そして計数した。また、融合の直前に、対数的フェーズにあるP3×63−AG8.653細胞は、PBSで3回洗浄し、そして計数した。このミエローマ細胞は、PBS中に1x107細胞/mlになるまで再懸濁した。各融合について、1.5x108個の脾臓細胞が、50m1のポリエチレン製コニカルチューブ中の3×107個のミエローマ細胞と混合し、そしてこの細胞はPBSで1回洗浄した。脾臓細胞のミエローマ細胞に対する割合は、5:1である。これらのチューブは500×gavで5分間遠心して、細胞をペレットにする。上清の吸引の後、このペレットはチューブの底をたたくことによって穏やかに再懸濁した。これらのチューブは次に、37℃の水の入ったビーカー中に置いた。後に続く全ての融合工程は、このビーカー中で遂行した。
【０１３８】
次に、ゆっくりとチューブを揺らしながら、血清の入っていないDMEM中の0.8m1の37℃融合培地(50w/v%ポリエチレングリコール3350(ニュージャージー州フィリップスバーグJ.T.BakerCo.,からの「Baker」等級))を、各ペレットに約1分間かけてゆっくりと添加した。血清の入っていないDMEM  １mlを各ペレットに、少しずつ、もう1分間かけて添加し、続いて血清の入っていないDMEM  20mlを各ペレットに次の5分間にわたり添加した。両方のチューブとも室温で600gxavで10分間遠心し、そして上清を吸引した。コントロールの脾臓供給細胞の5m1懸濁液の400μ1を含む「HAT選択培地」50m1を段階的に各ペレットに、ときどき混合しながら、添加した。「HAT選択培地」は、DMEM/10%FCS(最終濃度:10μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン)で50×HAT  stock(ミズーリ州セントルイスSigma  Chemical  Co.、カタログ番号H−0262)を50倍に希釈することによって、調製した。
【０１３９】
50ml細胞懸濁液のそれぞれを、約100μ1/ウェルで、5個の96ウェルの平底マイクロタイタープレートに入れた。このプレートは、37℃  5%CO2のインキュベーター中に静置した。第2日目に、この細胞に、ウェル毎に100μ1のHAT選択培地の添加により栄養を供給した。第IO日目に、この培地を吸引し、200μ1のHAT選択培地を各ウェルに添加した。上清を、クローンを含むウェルから、一次スクリーニングのために、融合より12、14、16、そして19日後に回収した。この融合効率は34%(960の適切なウェルのうち、327がスクリーニングされるクローンを生み出していた)であった。
【０１４０】
使用された一次スクリーニングは、ヒトrsCD4に結合する抗体を検出するために設計されたラジオイミュノアッセイ(RIA)であった。
【０１４１】
このRIAを遂行するために、アフィニティー精製されたPBS中のヤギ抗マウスlgG(Fcフラグメントに特異的)(ペンシルベニア州コクランビル、Cappell、カタログ番号22950)を96ウェルPVCマイクロタイタープレート(50μ1/ウェル)に添加し、4℃で一晩インキュベートした。ヤギ抗マウスIgGをプレートから取り除き、そしてそのウェルを5%FCS/PBSの100μ1/ウェルで、1時間室温でブロックした。ブロッキング溶液を除去した後、混合物のないハイブリドーマ培養上清をウェルに加えて(501μ/ウェル)、室温で1時間インキュベートした。このプレートをPBS/0.05%  Tween−20で3回洗浄した。次に、PBS/5%FCS中の50μ1の125Ｉ−rsCD4(約20,000cpm)を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。最後に、ウェルをPBS/0.05%Tween−20で3回洗浄した。全ての洗浄液緩衝液を振り落とした後、ウェルはプレートをカットすることにより分離し、ガンマカウンターで分析した。培養上清の代わりに5%FCS/PBSを添加したウェルを、バックグラウンドのウェルとした。
【０１４２】
一次のスクリーニングアッセイに使用された125Ｉ−rsCD4は、上記Maddonら、Cellに記述されている、CD4配列の精製された125Ｉ標識ヒトCD4のAA3−AA377(即ち、上記LittmanらCellの訂正番号に従うとヒトCD4のAA1−AA375)を含んでいた。このrsCD4は、上記Fisherら、Natureに基本的には記載されているCHO細胞で形質転換することにより産生した。それらの細胞によって産生されたこのrsCD4は、上記Fisherら、Natureに記載のように精製し得る。
【０１４３】
この精製されたrsCD4は、Bolton−Hunter法に従って、実質的にはBolton−Hunter試薬(マサチューセッツ州ボストン、New  England  Nuclear)の供給者によって記載されているように、125Ｉで標識した。125Ｉ−rsCD4の質を、標識化手順が市販されているCD4  V1に特異的なモノクローナル抗体であるLeu3A(カリフォルニア州、マウンテンビュー、Becton  Dickinson、カタログ番号7326)およびOKT4A(ニュージャージー州ラリタン、Ortho  Diagnostic  Systems、カタログ番号7124)、およびCD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体であるOKT4(Ortho  Diagnostic  Systems、カタログ番号7024)により認識されるエピトープを破壊しないことを確認することによって、モニターする。
【０１４４】
クローンは、それらがRIAでのバックグラウンドに対して約10倍であれば、一次スクリーニングで陽性であると考えられた。この基準によると、クローン(21)の約6%が陽性だった。この21の陽性クローンが引き出され、拡大が試みられた;13のクローンが拡大を生き延び、凍結保存された。これら13のクローンのうちの多くが成功裏にサブクローニングされ、それらには1F8、5A8および5F2を含んでいた。拡大、サブクローニング、および細胞の凍結は、基本的には、上記Lerner、Yale  J.BiolMed.に記載されているように行った。
【０１４５】
一次スクリーニングの後単離したこの13の陽性クローンは、下記の一連のテストに従った。それらのアッセイに基づいて、本発明に従う抗体ホモログを産生した3つのハイブリドーマ細胞系−−1F8、5F8および5F2を同定した。クローン1F8、5A8および5F2のスクリーニングアッセイの結果を、下記に示す。他の10の抗体のデータは、示していない。
【０１４６】
我々が行った最初の二次スクリーニングは、この抗体が天然のCD4エピトープを認識するかどうかを測定するために設計した。これは実質的に下記に示すように、CD4+Jurkat細胞に発現される細胞表面CD4および、モノクローナル抗体染色のr−CD4−CHOを蛍光標識したヤギ抗マウス二次抗体との結合を視覚化して、FACS分析することによって完了した。13の抗体全てが細胞表面CD4を認識した。次に、我々の抗体により結合しいるCD4エピトープの位置を決めるために、下記のように、CD4  V1ポリペプチドおよびCD4  VIV2ポリペプチド、市販のCD4  V1に特異的およびCD4  V3V4に特異的な抗体およびHIVgp120とともに競合アッセイを行った。多くの抗体はまた次に、CDゲ細胞間のHIV誘導のシンシチウム形成およびHIVによるCD4+細胞の感染を抑制する能力について、およびインビトロの破傷風トキソイド特異性な増殖アッセイにおけるそれらの免疫抑制活性を、評価した。
【０１４７】
競合アッセイに基づいて、我々は13の陽性のクローンの中から3つがCD4  VIに特異的である抗体を、5つがCD4  V3V4に特異的抗体を、そして5つがCD4  VIV2に特異的な抗体を分泌したことを確認した。CD4  VIV2に特異的な抗体の中で、3つのみ−−1F2、5A8および5F2−−が、HIVgp120のCD4への結合を有意にブロックした。
【０１４８】
マウスをヒトrsCD4で免疫した後で行われた単一の融合において、他の抗CD4モノクローナル抗体は産生されたが、どのハイブリドーマも本発明の抗体ホモログである抗体の産生は見出されなかった。我々は、本発明に従う抗CD4抗体ホモログはrsCD4での免疫によって生み出される；しかし、r−CD4−CHO細胞を免疫原として使用すると、そのような抗体を得る可能性を増大する、と考える。
【０１４９】
（CD4  VIおよびCD4  VIV2ポリペプチドに対する特異性）
本発明の抗体ホモログにより認識されるCD4エピトープを特徴づけるために、我々は、いくつかの抗体ホモログがヒトCD4のVIV2領域のエピトープ、またはCD4  VIのみにより確定されるエピトープを認識するかどうか測定した。特に、ヒトCD4のAA1−AA113および/またはAA1−AA111(「CD4−V1」)およびヒトCD4のAAl−AA180(「CD4−VIV2」)からなるポリペプチドが、本発明の3つの抗CD4抗体ホモログ(モノクローナル抗体1F8、5A8、および5F2)、２つのCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体(Leu3AおよびOKT4A)および１つのCD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体(OKT4)へのヒトrsCD4による結合を阻害する能力を研究した。
【０１５０】
簡潔に言うと、各マイクロタイタープレートのウェルを抗マウス免疫グロブリンでコートしてにRIAを行い、ブロックし、そして次にテストされるべきハイブリドーマ培養上清の１つでインキュベートした。次に、CD4  VIまたはCD4  VIV2および125Ｉ−rsCD4の混合物を添加した。インキュベートの後、ウェルを洗浄し、そして結合した125Ｉ−rsCD4をガンマカウンター中で検出した。
【０１５１】
特に、マイクロタイタープレート(96ウェル)を、50μ1/ウェルのアフィニティー精製されたヤギ抗マウスIgG(Fcフラグメントに特異的)(Cappell)で、4℃で一晩コートした。ウェルを、PBS/0.05%  Tween−20で3回洗浄し、そして次に5%FCS/PBSの100μ1/ウェルとともに1時間インキュベートすることによって、ブロックした。ブロック用緩衝液を取り除いた後、ウェルを、50μ1/ウェルの混合物のないハイブリドーマ培養上清(5−20μg/mlのIg)とともに室温で1時間インキュベートした。コントロールのウェルは、50μ1/ウェルのOKT4(PBS/5%  FCS中の10μg/m1)、OKT4A(PBS/5%FCS中の500ng/ml免疫グロブリン)またはLeu3A(PBS/5%FCS中の500ng/m1)とともにインキュベートした。このプレートを、PBS/0.05%  Tween−20で3回洗浄した。CD4−V1およびCD4−VIV2(最終濃度5μg/ml)を別々に、約20,000cpm  125Ｉ−rsCD4(上記のように調製された)で、約35〜45分間室温で、予めインキュベートした。これらの予めインキュベートした混合物を次に、ウェル中で室温で1−2時間インキュベートした。インキュベートに続いて、ウェルをPBS/0.05%  Tween−20で3回洗浄し、続いて放射能活性をカウントした。
【０１５２】
この実験に使用されるCD4−V1は、PCT特許出願PCT/US88/02940の図16に記載されているCD4配列のAA3−AAll5および/またはAA3−AA113から構成されていたもので、それらの各々は、上記Littmanら、Cellの訂正番号システムに従ってCD4のAA1−AA113およびAA1−AAIHに対応する。これらのCD4  VIポリペプチドを、B.H.Chaoら、「A  113−Amino  Acid  Fragment  Of  CD4  produced  In  Escherichia  coli  Blocks  Human  Immunodeficiency  Virus−Induced  Cell  Fusion」、J.Biol.Chem.,264,pp.5812−17(1989)に記載のように産生し、精製した。
【０１５３】
この実験で使用されたこのCD4−VIV2は、PCT特許出願PCT/US88/02940の図16に記載されているCD4配列のAA3−AA182から構成されていたもので、これは上記Littmanら、Cellの訂正番号システムに従うと、CD4AA1−AA180に対応する。
【０１５４】
このCD4  VIV2ポリペプチドを、上記Chaoら、J.Biol.Chem.に記載のCD4  VIポリペプチドの産生のために使用されるプロトコールに類似する様式で、標準的な分子生物学の技術を用いて、細菌により産生した。CD4  VIV2ポリペプチドをコードするDNAを有するプラスミドを、E.coli株A89にトランスフェクトした(S.A.Goffら、「Heat  Shock  Regulatory  Gene  htpR  Influences  Rates  of  Protein  Degradation  And  Expression  Of  The  lon  Gene  In  Escherichia  coli」、Proc.NatlAcad.Sci.USA、81、pp.6647−51(1984))。この細胞を、10リットルの発酵槽中で標準的な条件下で発酵し、Pelikon濃度システムを使用して回収し、その後BeckmanJ−6M遠心機中で3000rpmで遠心した。この細胞ペレットは、使用するまで、−２０℃に冷凍した。
【０１５５】
このCD4−VIV2を精製するために、この細胞を融解し、細胞湿重量グラム当たり8mlの緩衝液(20mMトリス−HCl、pH7.7/1mM  Na2EDTA)中で懸濁した。この細胞を、フレンチプレスに3回通して壊した。CD4−VIV2を含む不溶性物質を遠心によってペレットにした。このペレットを1M尿素/15mM酢酸ナトリウム、pH5.5(細胞湿重量グラム当たり15−20m1)で3回洗浄し、続いて20mMトリス−HCl、pH7.7/lmMNa2EDTAで2回洗浄した。得られた洗浄ペレットは、6MグアニジンーHCl/10mMDTT/20mMトリス−HClpH7.7を用いて、細胞湿重量グラム当たり25m1で、室温で一晩抽出した。この抽出物を、48,000xga、で45分間遠心して透明に分離した。
【０１５６】
このCD4−VIV2を復元するために、この分離した抽出物を、冷やした(4℃)20mMトリス−HCl、pH7.7で1:60v/vに希釈し、そしてウシ血清アルブミン(「BSA」)を最終濃度0.5mg/mlになるまで添加した。全てのこれに続く工程は、4℃で行った。このpHを6N  HClで7.0まで低下させ、そしてこの懸濁液を5ミクロンのMillidiskフィルター(マサチューセッツ州ベッドフォード、Millipore、カタログ番号MCSC40SO1)に通して分離し、続いてDuraporeO.2ミクロンフィルター(Millipore、カタログ番号CVGLOITP3)に通した。この分離した調製物をS−Sepharose  Fast  Flowカラム(ニュージャージー州ピスカタウェイ、Pharmacia  LKB  Biotechnology)に負荷し、100体積の負荷毎に1体積のS−Sepharose  Fast  Flowゲルの率で、20mMトリス−HCl、pH7.0で予め平衡化した。このカラムを20mMトリス−HCl、pH7.0で洗浄し、そしてこの結合したタンパク質を20mMトリス−HCl、pH7.7/300mM  NaC1で溶出した。
【０１５７】
CD4−VIV2を含むこの溶出プールを等体積の20mMトリス−HCl、pH7.7で希釈し、そして抗CD4モノクローナル抗体アフィニティーカラム(下記)に負荷し、20mMトリス−HCl、pH7.7/150mMNaC1で予め平衡化した。このカラムを20mMトリス−HCl、pH7.7/150mMNaClで、続いて20mMトリス−HCl、pH7.7/1MNaC1で洗浄した。この結合したタンパク質を50mMグリシン/250mMNaC1、pH3.0で溶出した。この溶出した物質を20mMHEPES、pH6.8に透析し、そしてAmiconの限外ろ過セルのPM10膜で凝縮した。この精製、凝縮したCD4  VIV2(約0.5−3.Omg/ml)を使用するまで、−70℃で保存した。
【０１５８】
この抗CD4モノクローナル抗体のアフィニティーカラムを上記の融合から産生されたCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体の１つを使用して、調製した。このモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム分画と陰イオン交換クロマトグラフィによって腹水から精製し、限外ろ過によって凝縮し、O.1Mホウ酸ナトリウム(pH8.0)/O.5M塩化ナトリウム中に透析し、そして再び約5mg/mlの濃度まで、限外ろ過によって凝縮した。この精製した抗CD4モノクローナル抗体(約50mgタンパク質を含む10ml)を手順書(SigmaChemicalCo.、カタログ番号C9142)の指示に従って、4gのCNBr−Sepharoseと結合し、12mlの誘導体化樹脂を回収した。
【０１５９】
これらの実験の結果を表1および表IIに概略する。
【０１６０】
表I
【０１６１】
【表１】
2011024593.tif 000002
この種のアッセイにおいて見られる標準偏差のため、この数字は、CD4−V1が、rsCD4の抗CD4モノクローナル抗体への結合を本当に阻害したわけではないことを示していると、我々は考える。
【０１６２】
表II
【０１６３】
【表２】
2011024593.tif 000003
この種のアッセイにおいて見られる標準偏差のため、この数字は、CD4−VIV2が、rsCD4抗体の抗CD4モノクローナル抗体への結合を本当に阻害したわけではないことを示していると、我々は考える。
【０１６４】
表1およびIIに示したデータから、モノクローナル抗体1F8、5A8、および5F2は、ヒトCD4  VIからなるポリペプチドとは結合せず、ヒトCD4  VIV2からなるポリペプチドと結合することがわかる。
【０１６５】
（5A8と、CD4  VIに、特異的な抗体ならびにCD4  V3V4に、特異的的な抗体である抗体とによる交差ブロック）
本発明の抗体ホモログによって認識されるCD4エピトープをさらに特徴づけるために、抗体ホモログである5A8、2つのCD4  V1に特異的な抗体(OKT4AおよびLeu3A)、およびCD4  V3V4に特異的な抗体(OKT4)とrsCD4との交差ブロック実験を行った。また、5A8と、本発明の他の抗体ホモログとの間の同様の交差ブロック実験も行った。さらに、Leu3Aおよび5A8による、ヒ,ト末梢血リンパ球の表面に示された天然CD4との交差ブロック実験も行った。これらの交差ブロック実験の結果を表IIIおよびIV、ならびに図1に示す。
【０１６６】
表IIIに示されたrsCD4交差ブロック実験に関しては、CD4−V1およびCD4−VIV2の交差ブロック実験について上述したものと本質的に同様に、RIAを行った。すなわち、各マイクロタイタープレートウェルを抗マウスIgでコートし、ブロックし、その後5A8培養上清(5〜20μg/m1)、OKT4A(500ng/ml)、OKT4(10μg/m1)またはLeu3A(500ng/ml)とともにインキュベートした。その後、ウェルを洗浄し、PBS中の100μ1/ウェルのマウスIg(50μg/ml)によって室温で30分から1時間ブロックした。競合抗体(すなわち、上記濃度の2倍のOKT4A、OKT4またはLeu3A)を、125Ｉ−rsCD4とともに予めインキュベートし、そしてそれぞれの混合物を、50μ1/ウェルずつ加えた。室温で1時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、結合した125Ｉ−rsCD4をガンマカウンターによって定量した。
【０１６７】
表IIIは、可溶性抗CD4抗体であるLeu3A、OKT4AおよびOKT4による、固定化された抗CD4抗体である5A8、OKT4、OKT4AおよびLeu3Aに対する125Ｉ−rsCD4の結合の阻害をパーセントで示している。
【０１６８】
表III
【０１６９】
【表３】
2011024593.tif 000004
この種のアッセイに見られる標準偏差により、この数字は、行の先頭部に示した抗CD4モノクロナール抗体が、その列の抗CD4モノクロナール抗体に対するrsCD4の結合を本当には阻害していないことを示していると考える。
【０１７０】
表IIIに示されたデータは、Leu3A、OKT4AおよびOKT4が、rsCD4の5A8への結合を有意に阻害していないことを示している。
【０１７１】
これらの結果は、5A8が、Leu3A、OKT4AおよびOKT4によって認識されるものとは異なるCD4エピトープ(1つまたは複数)を認識することを示している。
【０１７２】
表IVに示したrsCD4の交差ブロック実験に関しては、5A8のみを固定化したことを除けば、表IIIに示した実験について上述したものと本質的に同様にRIAを行い、そして可溶性競合抗.体は、1F8(5〜20μg/m1)、5A8(5〜20μg/m1)、5F2(約5μg/ml)、OKT4(10μg/ml)およびLeu3A(500ng/ml)であった。さらに、この実験で用いられた125Ｉ−rsCD4は、(MaddonらCell、上記に述べられた配列よりむしろ)PCT特許出願PCT/US88/02940の図16に示されたCD4配列の、精製された125Ｉ標識化ヒトCD4AA3−AA377からなっており、これは、LittmanらCell、上記の訂正番号システムによるCD4AA1−AA375に一致する。
【０１７３】
表IVは、可溶性抗CD4抗体である1F8、5F2、5A8、OKT4およびLeu3Aによる固定化された5A8への、125Ｉ−rsCD4の結合阻害をパーセントで示している。
【０１７４】
表IV
【０１７５】
【表４】
2011024593.tif 000005
表IVに示されたデータは、1F8および5F2がrsCD4の5A8への結合をブロックすることを表わしており、5A8、1F8および5F2が同一の、重複する、または近位のCD4エピトープ(1つまたは複数)を認識することを暗示している。
【０１７６】
図1は、細胞表面CD4の交差ブロック実験の結果を示している。ヒト末梢血リンパ球(「PBL」)を、緩衝液(図1A)、Leu3A(図1B)、OKT4A(図1C)、OKT4(図1D)あるいは5A8(図1E)とともにインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートで標識したLeu3A(「Leu3A−FITC」)とともにインキュベートした。再洗浄の後、FACStar蛍光活性化細胞選別機を用いて細胞を分析した。このFACS分析の結果を図1に示す。データから、5A8は、V1に特異的な抗体Leu3Aの細胞表面CD4に対する結合を有意にブロックしないことがわかる。この実験のプロトコールを以下に述べる。
【０１７７】
つまり、10mlの血液を、非補足RPMI−1640培地で2倍に希釈し、室温で、混合物を50m1チューブ内で10mlのリンパ球選別培地(Lymphocyte  Separation  Media)(Organon  Teknika、Durham,NC,カタログ番号36427)上に積層することによって、ヒトPBLを単離した。このチューブを室温で30分間、400xgavで遠心した。PBLを界面から収集し、非補足PRMl−1640培地で2回洗浄し、計数した。各サンプルに対して、3×105のPBLをチューブあたり50μ1の染色緩衝液(PBS/1%BSA/0.02%アジ化ナトリウム)に懸濁し、染色緩衝液で1回洗浄した。染色緩衝液をペレット状の細胞から吸引し、抗体試薬を各ペレットに加えた。5A8に関しては、抗体試薬は、約5〜20μg/m1の5A8を含有する、馴化ハイブリドーマ細胞培養上清50μ1であった。コントロール抗体の抗体試薬は、Leu3Aには60μ1/チューブ；OKT4Aには30μ1/チューブ；OKT4には30μ1/チューブの、染色緩衝液中の2.5μg/mlの溶液であった。
【０１７８】
もう１つのコントロールとして、１つの細胞サンプルに、抗体を含まない染色緩衝液50μ1を添加した。
【０１７９】
サンプルを氷上で30分間インキュベートし、１ｍｌの染色緩衝液中で3回洗浄した。次に、66μ1のFITC結合Leu3A(Becton  Dickinson,カタログ番号7323)を1:10の希釈度で染色緩衝液に加え;その後、サンプルを氷上で20分間インキュベートし、2回洗浄し、FACStar蛍光活性化細胞選別機(Becton  Dickinson  Immunocytometry  Systems,マウンテンビュー。カリフォルニア州)で分析した。
【０１８０】
（HIVgp120による交差ブロック）
本発明の抗体ホモログがHIVgp120のヒトCD4への結合をブロックするかどうかを判断するために、われわれは、ヒトrsCD4を用いたRIAと、ヒトCD4+組織培養細胞を用いたFACS分析という、２つの方法を用いた。
【０１８１】
これらのアッセイで用いた可溶性組み換えHIVgp120(「r−gp120」)は、バキュロウイルスベクター/昆虫細胞培地システムを用いて産生した。切断型のHIV−1gp120遺伝子を、Autographa  californica核多角体病ウイルス(バキュロウイルス)へ形質転換するのに用いたベクターは、ベクターpAc373（G.E.Smithら、「Modification  And  Secretion  of  Human  Interleukin  2  Produced  In  Insect  Cells  By  A  Baculovirus  Expression  Vector」、,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,PP.8404−08(1985)）の誘導体であった。
【０１８２】
シグナルペプチドおよびヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のプロペプチドおよびC末端メチオニンをコードするDNA配列を、pAc373ベクター内で、gpl60のAAl3−AA471をコードするHIV−1DNA配列にフレームに合うように連結し(配列番号1および配列番号2参照)、続いてロイシンおよびセリンをコードするDNA(配列番号3)で同様に行った。得られたベクターおよび野生型バキュロウイルスを、Spodoptera  frugiperda(sf9)細胞に同時トランスフェクションし、そして2つのHIV  r−gp120ポリペプチドを発現する組み換えバキュロウイルスを、M.D.SummersとG.E.SmithがA  Manual  Of  Methods  For  Baculovirus  Vectors  And  Insect  Cell  Culture  Procedures、Texas  Agricultural  Experiment  Station  Bulletin  No.1555に記載している方法に従って分離した。組み換えウイルスは、HIV−1抗血清によって特異的に免疫沈降され.一得るタンパク質を産生する能力によって識別される。Spodoptera  frugiperda細胞における配列番号3の発現によって、２つの異なったr−gp120ポリペプチドが産生された:配列番号4のAA33からAA498の範囲のポリペプチドの70%および、配列番号4のAA23からAA498の範囲のポリペプチドの30%である。
【０１８３】
精製工程はすべて4℃で行われた。馴化昆虫細胞培養上清を、ミリポアデュラポア(Millipore  Durapore)の親水性の2ミクロンフィルターカートリッジを用いた濾過によって分離した。分離した濾過物を等量の40mMのMES、pH5.5で希釈し、S−Sepharose  Fast  Flowカラム(20mMのMES、pH5.5で前もって平衡化したもの)に、馴化培養上清100mlにつきlm1の樹脂の割合で充填した。カラムを20mMのMES、pH5.5で、引き続いて20mMのトリス−HCl、pH7.0で洗浄した。結合タンパク質を20mMのトリス−HCl、pH7.0/300mMのNaClで溶出した。HIVr−gp120を含有する溶出物プールを等量の20mMのトリス−HCl、pH7.0で希釈し、ヒトrsCD4アフィニティカラムにかけた。アフィニティカラムは、基本的には樹脂製造業者の指示(Bio−Rad  Laboratories,リッチモンド,カリフォルニア州,カタログ番号153−6046)に従って、樹脂1mlあたり5mgのrsCD4の割合でアフィーゲル(Affi−Gel)10樹脂に固定化された、精製ヒトrsCD4(上述)を含有していた。カラムを、カラム体積分の5倍のPBSで、その後、カラム体積分の5倍のPBS/500mMのNaClで、そしてカラム体積分の5倍のPBSで洗浄した。結合HIVr−gp120ポリペプチドを、50mMのクエン酸ナトリウム、pH3.0/250mMNaClで溶出した。溶出された分画を、1Mのトリス−HCl、pH7の10分の1を加えることによって、直ちに中和した。
【０１８４】
精製HIVr−gp120ポリペプチド(約0.2〜0.3mg/ml)は、使用するまで−７０℃で保存した。
【０１８５】
CD4−V1およびCD4−VIV2競合実験に関して上述したものと本質的に同様に、RIA競合実験を行った。つまり、各マイクロタイタープレートウェルを抗マウスIgでコートし、ブロックし、次に上述のように、ハイブリドーマ培養上清(1F8、5A8または5F2)、OKT4、OKT4AまたはLeu3Aとインキュベートした。
【０１８６】
精製されたバキュロウイルスr−gp120(最終濃度2.5μg/ml)および125Ｉ−rsCD4とを共に0.5時間、予めインキュベートし、そしてこの混合物を各ウェルに加えた。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、結合125Ｉ−rsCD4をガンマカウンターを用いて検出した。
【０１８７】
ELISA交差ブロック実験の結果を表Vに示すが、この表は、本発明の３つの抗体ホモログ(1F8、5A8および5F2)、２つのCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体(Leu3AおよびOKT4A)およびCD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体(OKT4)に対する、精製HIVr−gp120によるヒトrsCD4の結合の阻害パーセントを示している。
【０１８８】
表V
【０１８９】
【表５】
2011024593.tif 000006
表Vに示されたデータは、HIVgp120とヒトrsCD4とを予めインキュベートすることにより、モノクローナル抗体1F8、5A8または5F2のr−gpl20/rsCD4複合体に対する結合が、有意にブロックされないことを示している。反対に、r−gp120は、CD4  V1に特異的な抗体OKT4AおよびLeu3AのヒトrsCD4に対する結合をほとんどなくしてしまった。
【０１９０】
第二の方法において、精製HIVr−gp120が、CD4+ヒト細胞系(H9)への結合に関して、5A8、２つのCD4  VIに特異的な抗体(Leu3AおよびOKT4A)およびCD4  V3V4に特異的な抗体(OKT4)に競合するかどうかを測定するために、免疫蛍光染色法を用いた。2組の細胞サンプルを並行して染色した。1組は、抗CD4モノクローナル抗体によってのみ染色した。もう1組は、抗CD4モノクローナル抗体で染色する前に飽和HIVr−gp120で予めインキュベートした。
【０１９１】
つまり、各サンプルに関して、2x105のH9細胞(Dr.RobertT.Schooley,University  of  Colorado  Medical  School,デンバー,コロラド州により提供)を、50μ1の染色緩衝液PBS/2%FCS/0.02%アジ化ナトリウム内に懸濁し、そして50μ1の抗体試薬を加えた。5A8に関しては、抗体試薬は、約5〜20μg/mlの5A8を含有する馴化ハイブリドーマ細胞培養上清であった。コントロール抗体の抗体試薬は、染色緩衝液中の、Leu3A、OKT4AまたはOKT4の10μ1/ml溶液であった。陰性コントロールとしては、MOPC21細胞から精製されたマウスミエローマタンパク質(IgG1)(Litton  Bionetics,Inc.,チャ_ルストン,サウスカロライナ州,カタログ番号8402−03)、またはUPC−10細胞から精製したマウスミエローマタンパク質(IgG2a)(Litton  Bionetics,Inc.,カタログ番号8402−24)という、特異性に関連のない抗体を染色緩衝液中に10μg/m1含有する抗体試薬を、２つの細胞サンプルに添加した。
【０１９２】
サンプルを氷上で30分間インキュベートし、その後１mlの染色緩衝液内で3回洗浄した。次に、2μ1のFITC結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Jackson  Immunoresearch,ウェストグローブ,ペンシルベニア州,カタログ番号115−006−062)を1:50の最終希釈度で染色緩衝液(30μg/ml)に加え、そしてサンプルを氷上で20分間インキュベートし、2回洗浄し、FACStar蛍光活性化細胞選別機で分析した。
【０１９３】
(同様に１つのチューブにっき2x105のH9細胞を用いた)並行実験において、細胞サンプルを、抗CD4モノクローナル抗体で上記のように染色する前に、(細胞表面CD4分子を飽和する)過剰r−gp120とともにインキュベートした。つまり、10μgのr−gp120を含有する染色緩衝液50μ1を各細胞サンプルに加えた。氷上でr−gp120とともに30分間、予めインキュベートした後、上記の抗体試薬を加え、上記のような染色工程を続けた。  細胞は、上記のように、FACStarで分析した。
【０１９４】
図2にこの実験の結果を示す。各プロフィールは、H9細胞の対数蛍光強度に対する相対細胞数(等分目盛り、x軸)を示している。対数蛍光強度は、細胞1個あたりの染色された分子の密度に正比例している。左側のプロフィールは、抗CD4抗体をH9細胞に直接加えた組の実験に関するものである。右側のプロフィールは、抗CD4抗体を加える前に、細胞を過剰HIVr−gp120で予めインキュベートした組の実験に関するものである。点線は、抗CD4モノクローナル抗体による染色を示す。
【０１９５】
実線は、関連のない陰性コントロールのマウスIgG抗体による染色を示す。UPC−10免疫グロブリン(IgG2)はOKT4A(IgG2a)およびOKT4(IgG2b)のコントロールとしての役割を果たし、MOPC−21免疫グロブリン(IgG1)は5A8(IgG1)のコントロールとしての役割を果たした。
【０１９６】
この結果は、CD4+H9細胞に対する5A8の結合が、過剰HIVr−gp120による細胞の予めのインキュベーションに影響されないことを示している。反対に、CD4  VIに特異的な抗体Leu3AおよびOKT4Aの結合は、過剰HIVr−gp120による予めのインキュベーションによって完全にブロックされた。予想通り、CD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体OKT4は、HIVr−gp120による予めのインキュベーションに影響されなかった。
【０１９７】
（HIV誘導のシンシチウム形成のブロック我々）
我々は、AIDS、ARCおよびHIV感染の予防および治療における、潜在的な治療上の利点を評価するために、本発明の抗体ホモログの、HIV誘導のCD4+細胞間のシンシチウム形成をブロックする能力を研究した。
【０１９８】
第一の方法において、我々は、B.D.Walkerら,「Inhibition  Of  Human  Immunodeficiency  Virus  Syncytium  Formation  And  Virus  Replication  By  Castanospermine」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA、  84,PP.8120−24(1984)に示されたように、本発明のいくつかの抗体ホモログの、HIV感染H9細胞と非感染C8166細胞との間のシンシチウム形成をブロックする能力をテストした。HIV感染H9細胞とC8166細胞(Walkerら,ProcNatl.Acad.Sci.USA上記参照)は、CD4+ヒトＴ細胞系である。C8166は、J.Sodroskiら,「Role  Of  The  HTLV−III/LAV  Envelope  In  Syncytium  Formation  And  Cytopathicity」,Nature,322,pp.470−74(1986)に述べられているように、CD4+形質転換ヒト臍帯血リンパ球細胞系である。双方の細胞株は、Dr.RobertT.Schooley,University  of  Colorado  Medical  School,デンバー,コロラド州,から提供され、また、AIDS  Reference  Reagent  Program,National  Institutes  of  Health,ベセスダ,メリーランド州,からも入手可能である。
【０１９９】
つまり、各サンプルにっき、5×103の慢性HIV感染H9細胞を、100μ1の「R−20培地」(10mMのHEPES(pH6.8)と2mMのグルタミンを含有し、20%FCSを補足した、RPMl1640培養培地)中、5%のCO2雰囲気下で37℃で30分間、約5〜20μg/mlの本発明の抗体ホモログを含有する50μ1のハイブリドーマ細胞培養上清とともに、インキュベートした。培養上清は、1:2から1:256の割で、R−20培地での一連の2倍希釈度でテストした。そして、100μ1のR−20培地に、15×103の非感染C8166細胞を加え、各ウェルの最終体積を200μ1にした。サンプルにC8166細胞を加えた後、37℃で、5%CO2雰囲気下でインキュベートし、次に各ウェルのシンシチウムの数を、光学顕微鏡で視覚的検査によって計数した。
【０２００】
ウェルごとのシンシチウムの数は、添加された抗CD4抗体含有培養上清がない場合に最高であった。１つのサンプルでは、約5〜20μg/mlのアイソタイプのあった関連のないマウス免疫グロブリン(ハイブリドーマ培養上清)を含有する、100μ1の培養上清を、すべての非特異的ブロック効果の陰性コントロールとして加えた。陽性コントロールとしては、CD4Vlに特異的なモノクローナル抗体であるLeu3Aを、2.5μg/mlから0.04μg/mlの範囲でのさまざまの濃度でテストした。
【０２０１】
この実験の結果を、表VIに示す。データは、シンシチウム形成の50%をブロックする結果を出した、ハイブリドーマ培養上清希釈度の逆数として示されている。
【０２０２】
表VI
【０２０３】
【表６】
2011024593.tif 000007
0.04μg/mlまで、80%以上のブロック。
【０２０４】
上記のアッセイを用いたいくつかの独立した実験において、シンシチウム形成の50%をブロックするために必要とされたOKT4(CD4  V3V4に特異的な抗体)の濃度は、1〜10μg/mlの範囲であった。
【０２０５】
上記のアッセイは、精製5A8、精製Leu3A、および精製Leu3Aと精製5A8とをともに用いても数回行われた。Leu3Aと5A8を共に用いた場合には、相乗阻害が観察された。例えば、1つの実験では、単独で用いた場合にはLeu3Aも5A8も、0.02μg/mlの濃度においてシンシチウム形成を50%阻害した。O.008μg/mlのLeu3Aまたは5A8単独では、それぞれ、30%および20%のシンシチウムブロックが観察された。しかし、Leu3Aおよび5A8を共に用いた場合には、50%阻害には、それぞれO.004μg/mlが必要なだけであった。4つの追加的実験の中で３つにおいて同様の相乗効果が観察された。
【０２０６】
もう1つのシンシチウムアッセイにおいて、我々は、精製5A8が、ヒトCD4+ジャーカット(Jurkat)細胞と、表面上に組み換えgp160を発現する形質転換されたCHO細胞(「r−gp160−CHO細胞」)との間の、HIV誘導によるシンシチウム形成をブロックする能力を正確に計測した。ジャーカット細胞は、Dr  Timothy  Springer,Dana  Farber  Cancer  Institute,ボストン,マサチューセッツ州,により提供され、またAmerican  Type  Culture  Collection,ロックビル,メリーランド州,カタログ番号TIB152からも入手可能である。r−gp160−CHO細胞を、In  Vitro  International  Inc.culture  collectionリンチカム,メリーランド州,に寄託し、受託番号IVI−10261が付けられて、そしてAmerican  Type  Culture  Collection,ロックビル,メリーランド州,に移送して受諾番号CRLlo885が付けられた。これらの細胞を形質転換するために用いられたHIVgp160遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号1に記されており、それがコードするgp120/gp41ポリペプチドのアミノ酸配列も配列番号1に、さらに配列番号2にも記されている。比較のために、２つのCD4  VIに特異的なモノクローナル抗体(OKT4AおよびLeu3A)および１つのCD4  V3V4に特異的なモノクローナル抗体(2−103−D11、作用はOKT4に類似)のシンシチウムブロック能力をテストするために、このアッセイを用いた。
【０２０７】
このアッセイに用いた精製5A8抗体は、以下のように調製した。5A8ハイブリドーマ細胞(1×106)を(プリスタンで感作した)Balb/cマウスの腹腔内に注射し、腹水を産生させた。5A8腹水は、使用するまで−２０℃で凍結して保存した。解凍後、5A8腹水を、約500×gavで20分間、室温で遠心した。上清を0.45μMミリポアフィルターで濾過し、そして6倍に希釈し、そしてアフィーゲルプロテインA(Affi−GelProteinA)MAPSHカラム(Bio−Rad  Laboratories,カタログ番号1536159)を用いて製造者の指示に従って精製した。そして、サンプルを、リン酸緩衝生理食塩水によって4℃で徹底的に透析した。透析された5A8調製物を、一定部分に分割し、使用するまで−７０℃で保存した。
【０２０８】
つまり、r−gp160−CHO細胞を、100μ1培地(10%透析FCS、4mMのLグルタミンおよび500nMのメトトレキサートを補足したα−MEM)において、各ウェル1.5x104細胞ずつ、96ウェルの(平底)マイクロタイタープレートにプレートし、5%のCO2雰囲気下、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、プレートを吸い取り紙上で裏返し、ウェルから培地を取り除き、100μ1の抗体試薬を各ウェルに加えた(各抗体濃度は3倍でテストした);これらのサンプルで「テストcpm」を得た。抗体試薬としては、精製5A8、Leu3A、OKT4または2−103−D11(5A8について上述したように精製したもの)を、0.026から10,000ng/mlの範囲の濃度で加えた。その後、10%加熱不活化FCS、2mMのグルタミンおよび100U/m1のペニシリンGおよびストレプトマイシンを補足した100μlRPMI培地内の6×104 51Cr標識CD4+ジャーカット細胞(下記と同様に調製)を、加えた。ジャーカット細胞からの非特異的な51Cr放出を制御するために、6×104 51Cr標識ジャーカット細胞を200μ1の体積でウェルに加えた;このサンプルで「バックグラウンドのcpm」を得た。
【０２０９】
マイクロタイタープレートを5%のCO2雰囲気下、37℃で17〜19時間インキュベートした。インキュベーション後、光学顕微鏡によって陽性コントロールのウェル内のシンシチウム溶解と、シンシチウム形成をブロックすると考えられる抗CD4抗体を含有するウェル内の細胞溶解阻害とを視覚的に検査した。プレートを、約400xgavで、3から4分遠心した。上清(100μ1)を、底にふれないようにして各ウェルから吸引し、タイターチューブマイクロチューブ(Titertube  Microtubes)(Bio−Rad  Laboatories,カタログ番号223−9390)に入れた。
【０２１０】
その後、マイクロチューブを個別に計数バイアルに移し、各バイアルから放射されたcpmをガンマカウンター(Beckman)で計測した。
【０２１１】
各アッセイに加えられた合計数(「総cpm数」)を測定するために、6×104の51Cr標識化ジャーカット細胞をシンチレーションバイアルに加え、その後、0.2NNaOHおよびPBS内の1%ドデシル硫酸ナトリウムを加えることによって、バイアル内で溶解させた。このコントロールバイアルから放出されたcpmをガンマカウンターで計測した。
【０２１２】
51Cr標識化ジャーカット細胞を以下のように調製した。フラスコから取り出したジャーカット細胞をスピンダウンし、新鮮な増殖培地(10%の加熱不活化FCS、2mMのLグルタミンおよび100U/mlのペニシリンGおよびストレプトマイシンで補足したRPMI培地)に再懸濁し、計数した。新鮮な51Crを以下の割合で50mlのコニカルボトム無菌チューブに加えた:(1)100μCi  51Cr  (100μ1)を5×106までの細胞を含有する900μ1の培地に加える;(2)200〜250μCi  51Cr  (200〜250μ1)を5×106から10×106までの細胞を含有する800〜750μ1の培地に加える。細胞は5%CO2雰囲気下で37℃で、ゆるくキャップをしめて、時々ゆっくりと振りながら、45分間インキューベートした。インキュベーション後、細胞を増殖培地で3回（1回につき30m1）洗浄した。洗浄した細胞を、１mlの増殖培地内で再懸濁し、計数し、シンシチウムアッセイに加えた。
【０２１３】
細胞は、調製後30分以内でアッセイに用いた。
【０２１４】
阻害パーセントは以下のように計算した。
（テストcpm−バックグラウンドcpm）／（合計cpm−バックグラウンドcpm）×100=シンシチウム溶解％  阻害％=(1−（抗CD4MAb存在下のシンシチウム溶解％）／（抗CD4Mab非存在下のシンシチウム溶解％）)×１００。
【０２１５】
図3および4は、抗体濃度(ng/ml)に対するシンシチウム阻害パーセント(上述のように計算)を図示して、これらの実験の結果を示している。図3は、0.026〜2,000ng/mlの5A8、Leu3AおよびOKT4Aのシンシチウム形成への効果を示している。
【０２１６】
予想とは異なり、図3によると、5A8の効力は、約10ng/m1で50%のシンシチウムブロックを達成し、Leu3AおよびOKT4Aに匹敵する。図4は、3.2から10,000ng/m1の5A8、Leu3A、OKT4Aおよび「OKT4様」モノクローナル抗体である2−103−D11のシンシチウム形成への効果を示している。図4は、CD4  V3V4に特異的な抗体(2−103−D11)が、5A8に必要な濃度より数桁高い濃度でのみ、シンシチウム形成をブロックしたことを示す。
【０２１７】
（CD4+のHIV感染のブロック）
我々は、AIDS、ARCおよびHIV感染の予防および治療における、潜在的治療上の利点を評価するために、本発明の抗体ホモログが、CD4+細胞のHIVによる感染をブロックする能力を研究した。これらの計測のために、我々は、M.Robert−Guroffら、「HTLV−III−Neutralizing  Antibodies  In  Patients  With  AIDS  And  AIDS−Related  Complex」、Nature,316,PP.72−74(1985)に示されたプロトコールに基づいたマイクロアッセイを用いた。
【０２１８】
最初の実験において、R−20培地内のHIV分離物HTLV−IIIB（Robert−Guroffら,Nature,上記）の200TCID50(接種された培養物の半分に再現的に感染するウイルスの最低希釈度の200倍)を、抗CD4モノクローナル抗体を含有する20μ1の希釈していないハイブリドーマ培養上清、または10μ1のR−20培地内の4×104のC8166細胞および関連のないマウスIgG1含有培養上清20μ1に加えた。HTLV−IHBは、Dr.RobertT.Schooley,University  of  Colorado  Medica1  School,デンバー,コロラド州,から提供されたが、AIDS  Reference  Reagent  Program,National  Institutes  of  Health,ベセスダ,メリーランド州,からも入手可能である。各混合物を分割して、3つのウェル(各ウェル15μ1)に加え、各ウェルをR−20培地で総体積200μ1にした。第二の実験において、HIVの100TCID50を加える前に、細胞を、ハイブリドーマ培養上清とともに30分間、37℃で予めインキュベートした。予めのインキュベーションは、5A8の感染ブロックに明白な効果を及ぼさなかった。
【０２１９】
双方の実験から得たウェルについて、感染開始から4から8日間、シンシチウムの存在によって証明されるものとして視覚的に計測した。5つ以上のシンシチウムを含有し、各シンシチウムが3細胞直径以上の直径を有するウェルを感染陽性と見なした。
【０２２０】
我々は、2から3の陽性ウェルがあれば完全な感染とみなし、陽性ウェルが0または1の場合には効果的なブロックが行われたと考えた。
【０２２１】
表VIIは、細胞と抗体を予めインキュベートしなかった場合の、CD4+C8166細胞のHIVの200TCID50による感染に対する、5A8(5〜20μg/m1)、1F8(5〜20μg/m1)、5F2(約5μg/ml)、CD4  V3V4に特異的なマウスモノクローナルIgGiである2−103−D11(約5μg/ml)および関連のないマウスIgGl培養上清(5〜20μg/ml)の効果を示している。表VIIlは、細胞および抗体を予めインキュベートした場合の、同上の抗体の同上濃度での、HIVの100TCID50による感染に対する効果を示している。
【０２２２】
表VII
【０２２３】
【表７】
2011024593.tif 000008
表VIII
【０２２４】
【表８】
2011024593.tif 000009
表VIIおよびVIIIから、5A8が、CD4+細胞における、HIVの感染を再現的にブロックし得ることがわかる。1F8および5F2も、ＨＩＶ感染をブロックし得る証拠を示した。
【０２２５】
我々は、上記の実験に用いた実験株(HTLV−IIIB)の代わりに、1人の最近の患者からのHIV分離物(分離物0108E、Massachusetts  General  Hospital  Phase  I  Reception  Clinical  Tria1:R.T.Schooleyら,「A  Phase  I/II  Escalating  Dose  Trial  Of  Recombinant  Soluble  CD4  Therapy  In  Patients  With  AIDS  or  AIDS−Related  Complex」,Ann.Int.Med.,112,pp.247−53(1989))を用いて、さらに感染実験を行った。
【０２２６】
この実験において、500μ1の抗体試薬を、5〜10TCID50のHIV分離物0108Eと1×106のフィトヘマグルチニン(「PHA」)活性化ヒト末梢血リンパ球(「PBL」)(下記のように調製)を含有する250μ1のR−3培地とを含有する、250μ1の「R−3培地」（Biogen,Inc.,ケンブリッジ,マサチューセッツ州,により製造の、25U/mlの組み換えＴ細胞増殖因子(「r−IL2」または「r−TCGF」)により捕足されたR−20培地）に加えた。表IXに示した実験で用いた抗体試薬は、双方ともがR−20培地で希釈された、5A8含有ハイブリドーマ培養上清(5〜20μg/ml)、および陰性コントロールとしてのアイソタイプのあったIg伍含有培養上清(5〜20μg/ml)であった。表Xに示される実験に用いられた抗体試薬は、すべてR−20培地で希釈した、精製5A8(上記)、陽性コントロールとしての精製Leu3A、および陰性コントロールとしてのアイソタイプのあった精製マウス19GIMOPC−21(Litton  Bionetics,カタログ番号8402−031)であった。
【０２２７】
PHAで活性化したヒトPBLは、以下のように調製された。全血(赤十字)をHistopaque(SigmaChemicalCo.,カタログ番号1077−1)上に積層し、400×gavで、40分間、室温で遠心した。界面からPBLを採集し、非捕足RPMI−1640培地で3回洗浄し、計数した。その後、PBLを、1μg/mlPHA−P(Difco,スプリングフィールド,ニュージャージー州,カタログ番号DF3110564)で捕足されたR−3培地において、4×106細胞/m1で再懸濁し、3日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を凍結し(R−20培地内の10%DMSO)、そして使用するまで−８０℃で保存した。使用する前に、活性化したPBLを解凍し、R−3培地で5日間培養した。
【０２２８】
精製5A8を用いた実験(表X)において、PHAにより活性化したPBLは、ウイルスを加える前に、抗体試薬とともに37℃で1時間予めインキュベートした。5A8ハイブリドーマ培養上清を用いた、もう一方の実験(表IX)においては、このような予めのインキュベーションは行わなかった。いずれの実験においても、細胞を、抗体試薬とウイルスとともに、5%CO2雰囲気下、37℃で24時間インキュベートした。細胞の各サンプルを、R−20培地とともに3回洗浄し、２つのウェルに分割し、R−3培地において5%CO2雰囲気下、37℃でインキュベートした。3〜4日ごとに、450μ1の細胞上清を回収して、HIV核抗原p24(HIV感染の指標)の存在をアッセイした。このような各回収の後、500μ1のR−3培地を各ウェルに加えた。
【０２２９】
我々は、サンプル中に存在するp24核抗原を捕えるためにマイクロタイタープレートウェルに固定化された抗p24モノクローナル抗体を活用する市販のキット(NEN  Research  Products,E.1.DuPont  de  Nemours  and  Co.,Inc.,ボストン,マサチューセッツ州,「HIV  Core  Profile  ELISA」,カタログ番号.NEK−060,NEK−060A,NEK−060B)を用いた、固相ELISAによって、HIVp24をアッセイした。このキットは、キットに添付された使用説明書の付録Cに示された標準曲線の範囲で、製造者によって指示された通りに用いた。
【０２３０】
0.1ng/ml以上のHIVp24を含有するウェルは、「感染」と分類した。
【０２３１】
これらの実験の結果を表IXおよびXに示す。
【０２３２】
表IX
【０２３３】
【表９】
2011024593.tif 000010
表X
【０２３４】
【表１０】
2011024593.tif 000011
表IXおよびXから、5A8が、あるHIV患者の分離物による感染を非常に効果的にブロックすることがわかる。5A8含有培養上清は、1:16の希釈度でも感染をブロックした。精製5A8は、テストした中で最も低い濃度である、0.08μg/m1という低い濃度で、この患者のウイルス分離物による感染をブロックしたが、これはLeu3Aに匹敵するものであった。
【０２３５】
（免疫抑制性）
我々は、E.G.Englemanら,「Activation  Of  Human  T  Lymphocyte  Subsets:Helper  and  SupPressor/Cytotoxic  T  Cells  Recognize  And  Respond  To  Distinct  Histocompatibility  Antigens」,J.Immunol.,127,pp.2124−29(1981)(「破傷風トキソイド」または「TT」アッセイ)に示されたプロトコールに従って修正された、Ｔ細胞増殖アッセイを用いて、本発明の抗体ホモログ(5A8)の免疫抑制性を、2つのCD4  VIに特異的な抗CD4抗体(Leu3AおよびOKT4A)の免疫抑制性と比較した。このアッセイでは、ヒトPBLを破傷風トキソイドで処理するが、これはヒトPBLの増殖を刺激する。免疫抑制物質が存在する場合には、破傷風トキソイドを加えると、増殖は妨げられる。増殖は、細胞による3Hチミジンの取り込みによって定量される。
【０２３６】
非捕足9PMI−1640培地によって10mlの血液を2倍に希釈し、この混合物を室温で50mlのチューブ内の10m1のリンパ球選別培地に積層することによって、ヒトPBLを単離した。このチューブを室温で30分間、400xgavで遠心した。PBLを界面から採集し、非捕足RPMI−1640培地で2回洗浄し、計数し、そして以下のように破傷風トキソイドアッセイに用いた。
【０２３７】
破傷風トキソイドアッセイは、各ウェルがヒトPBLと破傷風トキソイドを含有する、96ウェルの平底マイクロタイタープレートで行われた。各ウェル内での合計体積が200μ1になるように、抗体試薬をいくつかのウェルに加えた。細胞のみを含有する(抗体試薬も破傷風トキソイドも有さない)ウェルは、このアッセイの「バックグラウンド」となる。
【０２３８】
アッセイは3回行われた。アッセイの成分は以下の順番で加えられた:(1)50μ1の「アッセイ培地」(10%の加熱不活化ウシ胎児血清(Hazelton  Biologics,Inc.,レネキサ,カンサス州,カタログ番号12−10378P)、2mMのLグルタミンおよび100単位/mlペニシリンGおよびストレプトマイシンで捕足したRPMI−1640);(2)50μ1のアッセイ培地(「バックグラウンド」のウェル用)または抗体試薬(最終TTアッセイの濃度が10から0.1μg/mlの範囲の、精製した5A8、Leu3A、OKT4A、MOPC21またはUPClO;(3)40μg/ml破傷風トキソイドをアッセイ培地で希釈したもの50μ1(最終TTアッセイ濃度は10μg/mlであった);および(4)上述のように調製した1.5x105のPHAにより活性化したPBL。
【０２３９】
破傷風トキソイドを、Massachusetts  Public  Health  Biologic  Laboratory,ジャマイカプレイン,マサチューセッツ州,から濃縮物として入手し、使用前に、4℃で4LのPBSに48時間透析した。CD4  VIに特異的な抗体OKT4A(アイソタイプIgG2a)およびLeu3A(アイソタイプIgG1)を、それぞれOrtho  Diagnostic  SystemsおよびBecton  Dickinsonから得た。精製5A8(アイソタイプIgG1)を上記のように産生した。精製したMOPC21コントロール抗体(Litton  Bionetics)は、5A8およびLeu3Aにアイソタイプが一致する。精製UPC10抗体はOKT4Aにアイソタイプが一致する。
【０２４０】
すべての試薬をアッセイに加えた後、プレートを5%CO2雰囲気下、37℃で4日および5日間インキュベートした。4日目と5日目に、プレートを5%CO2雰囲気下、6〜18時間37℃で1μCiの3Hチミジン(NEN  Research  Products,カタログ番号NET−027)に露出した。標識とともにインキュベートした後、プレートをPHD細胞回収機(Cambridge  Technologies,Inc.,ケンブリッジ,マサチューセッツ州)で回収し、そして放射性DNAを含有するフィルターをシンチレーションバイアルに移し、そこにシンチレーション液を加えた(各バイアルに3m1)(Scintiverse,Fisher  Scientific  Co.,カタログ番号SK12−4)。バイアルの放射性をβカウンター(Beckman  Model  LS3801)で計測した。
【０２４１】
TTアッセイの結果を図5(4日)および図6(5日)に示す。図5および図6は、5A8および様々なコントロール抗体の、増殖に対する効果(cpm×103で表示)を示している。「TTコントロール」と記された棒は、TT刺激なしの細胞の基線となる細胞増殖(白抜きの棒)および抗体がない場合のTTの反応(黒棒)を示している。TT刺激なしの、抗体のみによる増殖の効果は、大きな点のついた棒で表している。また、これらの図は、10μg/ml(斑点をつけた棒)(MOPC21および5A8のみ)、1μg/ml(水平の線をつけた棒)(各抗体)および0.1μg/m1(斜線をつけた棒)(各抗体)の様々な濃度の抗体の、TT刺激後の増殖に対する効果(つまりTTに対する応答抑制)も示している。
【０２４２】
図5および図6のデータは、5A8の免疫抑制性が、4日および5日のいずれのアッセイにおいても、OKT4Aに劣ったことを示している。5A8の免疫抑制性は、これらのアッセイではLeu3Aに匹敵した。
【０２４３】
（5A8エピトープのマッピング）
5A8の作用メカニズムを特徴づけるために、5A8に結合したCD4エピトープをマップするための研究をいくつか行った。これらの研究の結果を、以下のようにまとめる。
【０２４４】
5A8は、ウエスタンプロットでの非還元の、SDS変性CD4を認識することができた。しかし、5A8は、還元CD4またはCD4のタンパク質分解フラグメントには結合しなかった(5つの異なるプロテアーゼを使用した)。従って、5A8は、CD4のエピトープの高次構造を認識するようである。この結果は、5A8が、変性CD4またはCD4フラグメントに対してではなく、その天然の高次構造を有するCD4を示すであろう、r−CD4+−CHO細胞に対して誘起されたという事実に合致している。
【０２４５】
マウス/ヒトキメラCD4分子のパネルに対する、5A8の結合を研究した。5A8は、マウスCD4を認識しない。従って、様々なマウス/ヒトキメラCD4分子に対する、5A8の結合を研究することによって、5A8結合に必要なヒトCD4残基を同定することを期待できた。
【０２４６】
マウス/ヒトCD4キメラをコードする遺伝子構築物は、Howard  Hughes  Medical  Institute,University  of  California、San  Francisco,CAのDaniel  R.Littmanによって提供され、N.R.Landauら、「The  Envelope  Glycoprotein  Of  The  Human  Immunodeficiency  Virus  Binds  To  The  Immunoglobulin−LikeDomain  Of  CD4」、Nature、334、pp.159−62(1988)によって記載されている。COS−7細胞を、これらの構築物を含む発現ベクターで、一時的に形質転換し、FACS分析を用いて、様々に発現されたキメラヘの5A8の結合能力を評価した。コントロールとして、抗ヒトCD4モノクローナル抗体Leu3aおよびOKT4、ならびに抗マウスCD4モノクローナル抗体GK1.5を使用した。各キメラ型に対して、飽和濃度以下で、5A8またはコントロール抗体を滴定することによって、抗体結合を評価した。
【０２４７】
5A8/キメラCD4結合を研究した結果を以下に示す:(1)ヒトCD4  VIV2残基は、両方とも、5A8結合に必要かつ十分である;(2)ヒトV1残基(アミノ酸83まで)は、有効な5A8結合には必要でない;(3)V1とV2(AA83−AA105)とを結合するロッド様βストランドのヒト残基は、5A8結合に著しい影響を与える(J.Wangら、Nature、348、pp.411−18(1990)for  human  CD4  crystal  structure);および(4)ヒトCD4V2残基AA105−AA131(V2のストランドBおよびC)は、5A8結合に絶対的に必要である。
【０２４８】
さらに、rsCD4のマウス/ヒト置換変異体の様々な部位およびクラスターへの、5A8の結合も研究した。変異体の置換されたアミノ酸部分は、以下の通りである:AA60(V1)、AA121−AA124(V2)、AA127−AAl34(V2)、AA165(V2)、AA220−AA226(V3)およびAA240−AA252(V3)。特に、CD4  V3V4に特異的な抗体OKT4のCD4+細胞への結合をブロックする能力と比較して、5A8のCD4+細胞への結合をブロックするこれらの変異体の能力を評価した。
【０２４９】
1μg/mlの濃度では、すべての変異型が、OKT4結合に匹敵してブロックした(約60%に匹敵する)。これに対して、AA121−AA124(V2のストランドBとストランドCとの間の結合ループ)およびAA127−AA134(V2のストランドC)は、5A8のCD4+細胞への結合をブロックしなかった。これらのデータにより、5A8結合に重要な残基がV2内に存在することが発見され、マウス/ヒトキメラを使用して同定された残基と一致していることが分かった。さらに、5A8がCD4を認識するのに、残基165が寄与していることを同定した。しかし、残基165は、AA121−AA124およびAA127−AA134よりはあまり重要ではなかった。
【０２５０】
（アカゲザルにおける、5A8の免疫システムの効果）
インビボにおける、通常の免疫機能に対する5A8の影響を評価するために、モノクローナル抗体5A8またはコントロールのアイソタイプのあったモノクローナル抗体(MOPC21)をアカゲザルに投与した。5A8またはMOPC21の注射前、および注射後に様々な時間間隔をおいて、免疫機能の変化を調べた。特に、(a)インビボにおいて循環CD4+細胞の数の減少、(b)CD4+細胞表面からのCD4の調節、(c)インビボでの循環末梢白血球数の減少、または(d)インビボにおける外来抗原に応答して誘発された抗体力価の減少を、5A8が引き起こしたか否かを評価した。
【０２５１】
5A8は、インビボにおける免疫抑制の指標にはなんらかの重要な影響を与えないと判断した。従って、5A8は、インビボにおける免疫システムに悪影響を与えないようである。
【０２５２】
（1．注射およびサンプリングのプロトコール）
2匹の成体アカゲザル(Mn261−85およびMn251−87)に、上記のように、精製した3mg/kgの5A8またはコントロールのMOPC21(Mn265−85およびMn265−87)(全部で4匹のサル)を、0日目、2日目および4日目に静脈内注射により注射した。3日目および21日目には、0.5mlのミョウバンに吸着た破傷風トキソイド(Squibb−Connaught)(標準的なヒト投与量)を、筋肉内注射により投与した。最初の5A8を注射する前と、0−4日目、6日目、9日目、14日目、21日目または24日目、28日目、35日目および42日目に、各サルから血液を採取し、以下のように分析した。
【０２５３】
（2.末梢血白血球）
血液スミアの標準的な染色を使用して、白血球細胞の数を調べるために、両グループのサル(5A8を注射したおよびMOPC21を注射した)からの血液サンプルをアッセイした。その結果を図7に示す。
【０２５４】
図7に示すように、5A8を注射したものと、コントロールのグループとの間には、モノクローナル抗体の注射前または注射後において、白血球の数にあまり差異はなかった。
【０２５５】
（3.循環CD4+細胞数および細胞表面CD4の調節）
CD4+細胞数を調べるために、両グループのサル(5A8を注射したおよびMOPC21を注射した)からの血液サンプルをアッセイした。FITC−OKT4で直接的に染色した後、および5A8で間接的に染色(すなわち、過剰の5A8、次いで、FITCヤギ抗マウスlgでインビトロでインキュベーション)した後、FACS分析によってCD4+細胞数を決定した。使用したプロトコールは、上記のFACSのプロトコールに類似したものであった。これらの実験の結果を図8に示す。
【０２５６】
図8に示すように、5A8を注射した動物およびコントロールの動物中で循環するCD4+細胞の数は、抗体注射後、あまり変化しなかった。さらに、CD4の染色強度は、5A8を注射したサルとコントロールのサルとの間ではあまり違いはなかった。
【０２５７】
CD2、CD8およびCD20染色を含む、その他のすべての血液細胞パラメーターは、5A8を注射した動物と、コントロールの動物との間で同様であった(データは示していない)。
【０２５８】
これらの結果は、5A8が、CD4+細胞を有意に枯渇せず、循環CD4+細胞の表面からのCD4を有意に調節しなかったことを示している。
【０２５９】
（4.インビボにおける、5A8のアカゲザルCD4+細胞への結合）
サルのCD4+末梢Ｔ細胞におけるCD4結合部位の飽和を、(1)FITCヤギ抗マウスIgで染色した後のFACS分析、(2)さらに5A8およびFITCヤギ抗マウスIgを加えた後のFACS分析(染色強度は増加せず)、および(3)5A8を注射したサルから回収した細胞の、FITC−5A8の測定可能量への結合不能によって、測定した。
【０２６０】
5A8を注射したアカゲザルのすべての循環CD4+細胞上でのCD4結合部位の飽和を、1日に一回、少なくとも9日間観察した。さらに、4日目には、5A8を注射したサルのリンパ節バイオプシーによって、リンパ節CD4+細胞の5A8による完全な浸透およびコーティングが示された。FITCヤギ抗マウスIgでの間接的な染色によって測定されるように、5A8によるCD4+細胞コーティングは、14日目以降には、検出されなかった。
【０２６１】
（5.5A8および抗5A8の血清レベル）
抗マウスIgサンドイッチELISAを使用して、5A8のレベルが、9日目までは高く(約10−100μg/ml)、9日目と14日目の間に著しく減少しているのが分かった。逆に、サル抗マウスIg力価(5A8をコートしたプレートでのELISAによって検出した)は、9日目と14日目の間に現れた。結合5A8が、9日目以降に存在した否かは明確ではない。なぜなら、抗マウスIgトラップは、それを検出しなかったと思われるからである。
【０２６２】
（6.破傷風トキソイドに対する抗体応答）
外来抗原である破傷風トキソイドを注射した際の、サルが抗体を生産する能力に対する5A8の効力を評価した。5A8を注射した動物において、CD4+細胞のコーティングが完全に成し遂げられた後3日目、および21日目に、ミョウバンに(i.m.)吸着した破傷風トキソイドを用いて、5A8を注射した動物およびコントロールの動物を免疫した。この期間に誘発されたサルの抗破傷風トキソイド力価を図9に示す。  
【０２６３】
図9に示すように、すべてのサルにおいて、抗破傷風トキソイド血清抗体が、匹敵する反応速度および力価を示すことが観察された。抗破傷風トキソイド力価を、破傷風トキソイドでコートしたプレートを使用したELISAで測定し、次いで、酵素を結合したヤギ抗ヒト/サルIgM+Gで検出した。従って、5A8は、B細胞およびヘルパーＴ細胞の機能には影響を与えなかった。
【０２６４】
（5A8のH鎖可変領域をコードするDNA）
実質的に、J.Sambrookら、Molecular  Cloning、ch.9(Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  1989)に記載されるように、ネズミハイブリドーマ細胞系5A8(ATCC受託番号第HB10881号)からゲノムDNAを調製した。5A8免疫グロブリンH鎖(5A8VH)の可変領域をコードするDNAを、以下に記載するように、このゲノムDNAライブラリーから単離した。
【０２６５】
5A8のH鎖可変領域をコードするDNAを、プライマーとしてVHO1(配列番号5)およびVHO2(配列番号6)を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、ゲノムDNAから増幅した。これらのプライマーは、Orlandiら、「Cloning  Immunoglobulin  Variable  Domains  For  Expression  By  The  Polymerase  Chain  Reaction」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.3833−37(1989)に記載されているように、VHO2が、VHIFORの2つの3’ヌクレオチドを欠いていること以外は、VHIBACKおよびVHIFORプライマーとそれぞれ同一である。
【０２６６】
VHOlおよびVHO2(各400pmoles)を乾燥し、次いで、50μ1の1×キナーゼ緩衝液(10×キナーゼ緩衝液は、0.66Mトリス−HCl、pH7.6、10mMATP、10mMスペルミジン、100mMMgCl2、150mMジチオスレイトール、2mg/mlゼラチンである)中に再懸濁した。T4ポリヌクレオチドキナーゼ(1μ1)(New  England  Biolabs、10U/μ1)を加え、反応物を37℃で30分間、次いで70℃で5分間インキュベートした。
【０２６７】
PCR反応混合物は、lxPCR緩衝液(10xPCR緩衝液は、100mMトリス−HCl、pH8.3、500mM  KC1、15mM  MgCl2、0.01%ゼラチンである)中に、各キナーゼ処理したプライマー(VHLO1およびVHO2)を50pmoles、1μgのゲノム5A8DNA、および各dXTPを1.25mM含んでいた。初期のインキュベーションサイクルの72℃でのインキュベーション中に、Taqポリメラーゼ(0.5μ1)(perkinElmer−Cetus、5U/μ1)を加えた。PCR反応条件は、94℃で2分間、65℃で2分間、および72℃で2分間のインキュベーションを30サイクルであった。
【０２６８】
PCR反応産物を、標準の方法を用いて、1%アガロースゲル上で分画し、免疫グロブリン可変領域(330bp)の予想サイズに対応するバンドを切り出した。このバンド中のDNAを、GENECLEAN  II（登録商標）方法(BiolOl  Inc.,LaJolla,CA)によって溶出し、エタノールで沈澱させ、次いで10μ1のTE緩衝液(10mMのトリス−HCl、1mMのNa2EDTA)中に再懸濁した。
【０２６９】
精製したPCRフラグメントを、DNAポリメラーゼ1(1μ1)のクレノウフラグメント(New  England  Biolabs、5U/μ1)および各dXTPを0.125mM用いて、1x連結用緩衝液(10x連結用緩衝液は、0.5Mトリス−HCl、pH7.6、100mMMgCl2、100mMジチオスレイトール、500μg/m1ゼラチンである)中で、室温で20分間インキュベートし、最終反応容積を15μ1とした。この反応を、65℃で5分間インキュベートすることによって停止した。
【０２７０】
次に、PCRフラグメントをベクターpNNO3に連結した。エンドヌクレアーゼ開裂によって、pUC8(Pharmacia  Piscataway,NJ)の合成ポリリンカー配列を除去し、それを新規の合成ポリリンカーと置換することによって、ベクターpNNO3を構築した。pNNO3のDNA配列を配列番号7として示す。EcoR5で直線化し、仔ウシのアルカリホスファターゼで5’末端を脱リン酸化し、低融点アガロースゲル上で分画し、直線化したpNNO3(2.7kb)に対応するバンドを切り出すことによって、ベクターpNNO3を連結用に調製した。次いで、直線化し、脱リン酸化したpNNO3を、T4DNAリガーゼを用いて、クレノウで処理したPCR5A8VHフラグメントに連結した。
【０２７１】
連結混合物を使用して、E.coliJA221(ATcc33875)をアンピシリン耐性に形質転換した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。組換えプラスミドをスクリーニングして、約450bpのSac2挿入物の存在を調べた。さらに、PCRフラグメントによってコードされたアミノ酸配列を、実験的に決定した、5A8H鎖のアミノ末端アミノ酸配列と比較した。これらの手段によって、ベクターpMDR904挿入物が、5A8H鎖可変領域のAA2−AA122をコードするDNA配列を含んでいることを確認した。pMDR904を有するE.coliを、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、MDに、受託番号第ATCC68848号で寄託した。
【０２７２】
配列番号8は、pMDR904挿入物のDNA配列を示す。配列番号8のヌクレオチド3から365までは、5A8VH配列のAA2−AA122をコードする。ベクターpMDR904は、5A8VHのAA1のコドンを含まない。5A8VH発現ベクターを形成したときに、このコドンを、オリゴヌクレオチドを使用して、「再構築」(built  back)する。
【０２７３】
pMDR904は、5A8VHのAA1のコドンを欠いているが、アミノ酸配列結果から、このアミノ酸が判明する。5A8VH(AA1−AA122)の完全なアミノ酸配列を、配列番号10として示す。5A8VHアミノ酸配列をコードするDNA配列(AA1については仮定)を、配列番号9に示す。
【０２７４】
既知の相補性決定部位(CDR)配列および枠組み構造領域(FR)配列を比較することによって、以下を、5A8H鎖のCDRとして同定した:CDR1は、AA31−AA35、CDR2は、AA50−AA66、CDR3は、AA99−AA111で、これらはすべて配列番号10に対応する。
【０２７５】
（5A8のL鎖可変領域をコードするDNA）
従来のグアニジニウムイソチオシアネートプロトコールに従って、全RNAを、ネズミハイブリドーマ細胞系5A8(ATCC受託番号第HB1088号)から調製した。また、従来の手法に従って、オリゴーd(T)カラム(Clontech)を使用して、全RNAからポリ(A)+を調製した。
【０２７６】
cDNAを以下のように、ポリ(A)+RNAから調製した。オリゴヌクレオチドACEl49(配列番号11)およびACE150(配列番号12)(各200pmoles)を、100μ1の1xキナーゼ緩衝液中で、1μ1のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New  England  Biolabs、10U/μ1)を用いて、別々にインキュベートした。5A8ポリ(A)+RNA(25μg)を乾燥させ、次いで、5μ1の各キナーゼ処理したオリゴヌクレオチド、2μ1の25mM水酸化メチル水銀、およびIOμ1の水の混合物で、室温で10分間インキュベートした。10分間インキュベートした後、2μ1の50mMジチオスレイトールを加え、この混合物を室温でさらに5分間インキュベートした。次いで、以下を加えた:10μ1のM−MLV逆転写酵素(BRL80255B、200U/μ1)、20μ1の2.5mMdXTP、26μ1の水、および20μ1の5x逆転写酵素緩衝液(250mMのトリス−HCl、pH8.3、375mMKCl、50mMジチオスレイトール、15mMMgC12)。37℃で1時間インキュベートした後、逆転写酵素反応を、凍結によって停止した。
【０２７７】
プライマーとしてACE149(配列番号11)およびACE150(配列番号12)を使用するPCRによって、5A8のL鎖可変領域をコードするDNAを、5A8cDNAから増幅した。PCR反応混合物は、各キナーゼ処理したプライマーを50pmoles、5μ1の5A8cDNA、8μ1の2.5mMdXTP、O.5μ1のTaqポリメラーゼ(5U/μ1)、および10μ1の10xPCR緩衝液を含んでいた。PCR反応条件は、94℃で1分間、37℃で1分間、および72℃で2分間のインキュベーションを30サイクルであった。
【０２７８】
完成したPCR反応混合物を、エーテルで一度抽出し、TE緩衝液飽和のフェノール:クロロホルム(1:1)で一度抽出し、次いで、エタノールで沈澱させた。エタノール沈澱物を、0.5mMのdXTP、100mMのNaCl、10mMのトリス−HCl、pH8.0、1mMのNa2EDTA、100μg/mlのゼラチン、および10mMのジチオスレイトールを含む100μ1の緩衝液に再懸濁した。DNAポリメラーゼ1(1μ1、5U/μ1)のクレノウフラグメントを加え、その混合物を室温で10分間インキュベートした。反応混合物を、標準の方法によって2%のアガロースゲル上で分画し、免疫グロブリン可変領域(350bp)の予想サイズに対応するバンドを切り出した。そのバンド中のDNAを、GENECLEAN  II（登録商標）方法によって溶出した。
【０２７９】
次に、PCRフラグメントをベクターpUC19(New  England  Biolabs)に連結した。SmaIで直線化し、5’末端を、仔ウシのアルカリホスファターゼで脱リン酸化し、低融点アガロースゲル上で分画し、直線化したpUC19(2.7kb)に対応するバンドを切り出すことによって、連結用のベクターpUC19を調製した。次いで、直線化し脱リン酸化したpUC19を、T4DNAリガーゼを用いて、クレノウで処理したPCR  5A8VLフラグメントに連結した。
【０２８０】
連結混合物を使用して、E.coli  JA221をアンピシリン耐性に形質転換した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。組換えプラスミドをスクリーニングし、約400bpのEcoRI/Hind3フラグメントの存在を調べた。さらに、PCRフラグメントによってコードされたアミノ酸配列を、実験的に決定した、5A8L鎖のアミノ末端アミノ酸配列と比較した。これらの手段によって、ベクターpMDR927挿入物が、5A8のL鎖可変領域のAA1−AA111をコードするDNA配列を含んでいることを確認した。pMDR927を有するE.coliを、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、MDに、受託番号第ATCC68849号で、寄託した。
【０２８１】
配列番号13は、pMDR927挿入物のDNA配列を示す。配列番号13のヌクレオチド4から336までは、5A8VL配列のAA1−AA111をコードする。ベクターpMDR927は、5A8VLのAA112のコドンを含んでいない。5A8VL発現ベクターを形成するときに、このコドンを、オリゴヌクレオチドを使用して「再構築」する。
【０２８２】
pMDR927は、5A8VLのAAH2のコドンを欠いているが、アミノ酸配列結果から、このアミノ酸が判明する。5A8Vしの完全なアミノ酸配列を、配列番号15に示す。5A8VLアミノ酸配列をコードするDNA配列(AA112については仮定)を、配列番号14として示す。
【０２８３】
既知のCDRおよびFR配列と比較することによって、以下を、5A8のL鎖のCDRとして同定した:CDR1は、AA24−AA40、CDR2は、AA56−AA62、CDR3は、AA95−AA102であり、これらはすべて配列番号15に対応している。
【０２８４】
（5A8のＨおよびＬ鎖のヒト型化）
5A8  VHおよびVL領域のアミノ酸配列を、既知のヒト免疫グロブリン配列と比較し、ネズミ5A8枠組み配列と最も適合するヒト枠組み配列を発見した。次いで、5A8VHおよびVしのCDRをヒト枠組みに移すことによって、5A8HおよびL鎖可変領域のヒト型を設計した。これらのヒト型可変領域を、次いで、ヒトIgG4H鎖領域およびκL鎖不変領域をコードするDNAにそれぞれ連結させ、真核細胞用発現ベクターに挿入した。
【０２８５】
（1.  5A8のＨ鎖可変領域のヒト型化）
5A8のH鎖可変領域を、PCR変異誘発によって、ヒト型化した。3回のPCR反応を、異なる3対のオリゴヌクレオチドPCRプライマー:(a)プライマー312−56(配列番号16)および312−57(配列番号17);(b)プライマー312−58(配列番号18)および312−59(配列番号19);ならびに(c)312−60(配列番号20)および312−61(配列番号21)を使用して行った。各PCR反応は、適切な各プライマーを30pmoles、1μgのpMDR904(挿入配列は、配列番号8)、16μ1の1.25mMdXTP、0.5μ1のTaqポリメラーゼ(5U/μ1)、および10μ1の10xPCR緩衝液を含んでいた。PCRのインキュベーション条件は、94℃で3分間、45℃で2分間、および72℃で2分間のインキュベーションを10サイクルであった。PCR産物を、2%アガロースゲルで分画し、約160bp、175bpおよび165bpに対応するバンドを切り出した。３つのPCRフラグメントをGENECLEAN  II（登録商標）を用いて、100μ1ずつのTE緩衝液に別々に溶出した。
【０２８６】
３つの溶出したPCRフラグメント(各10μ1)を組み合わせて、1回目のPCRと同一反応条件下で、2回目のPCRにかけた。このとき、オリゴヌクレオチドプライマー312−56(配列番号16)および312−61(配列番号21)を使用し、94℃で3分間、72℃で2分間および72℃で2分間のインキュベーションで20サイクル行った。PCR産物を2%のアガロースゲルで分画し、約365bpに対応するバンドを切り出した。PCRフラグメントを、GENECLEAN  II（登録商標）を用いて溶出し、この溶出物を、20μ1のTE緩衝液に再懸濁し、上記のように、DNAポリメラーゼ1のクレーノウフラグメントで処理した。
【０２８７】
次に、PCRフラグメントをベクターpNNO3(配列番号7)に連結した。EcoR5で直線化し、仔ウシのアルカリホスファターゼで5’末端を脱リン酸化し、低融点アガロースゲルで分画し、直線化したpNNO3(2.7kb)に対応するバンドを切り出すことによって、ベクターpNNO3を連結用に調製した。次いで、直線化し、脱リン酸化したpNNO3を、T4DNAリガーゼを用いて、クレノウで処理したPCR5A8ヒト型VHフラグメントに連結した。
【０２８８】
連結混合物を使用して、E.coli  JA221(Iq)をアンピシリン耐性に形質転換した。E.coli  JA221(Iq)を、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、MDに、受託番号第ATCC68845号で寄託した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。組換えプラスミドをスクリーニングし、約400bpのSac2フラグメントの存在を調べた。DNA配列分析により、1つのプラスミド、pMDR989−15(挿入配列は、配列番号22)が、ネズミ5A8VH配列を設計されたヒト型配列に変換する必要のある変異体を約50%有していたことを除けば、他のプラスミドはすべて正しい配列を有していることが分かった。従って、上記のように、pMDR989−15を、2回目のPCRに2度かけた。その後、ベクターpMDR991挿入物を、DNA配列分析によって同定し、設計された5A8VHヒト型配列を作製した。
【０２８９】
配列番号23は、pMDR991挿入物のDNA配列を示す。配列番号23のヌクレオチド1から357は、ヒト型5A8VH配列のAA2−AA12Bをコードする。ベクターpMDR991は、ヒト型5A8VHのAA1およびAAl21−AA122のコドンを含んでいない。下記のように、ヒト型5A8VH真核細胞用発現ベクターを作製したときに、オリゴヌクレオチドを使用して、これらのコドンを「再構築」した。
【０２９０】
（2.  5A8のＬ鎖可変領域のヒト型化）ヒト型5A8VL領域全体に広がる、10個のオリゴヌクレオチドを連結し、そして正しい配列を有する構築物をスクリーニングすることによって、ヒト型5A8のL鎖可変領域を調製した。以下に、プロトコールの詳細を示す。
【０２９１】
オリゴヌクレオチドの312−62を312−71にわたるもの(それぞれ、配列番号24から配列番号33)(各20pmoles)を乾燥させ、1mMATPおよび1μ1のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μ1)を含む20μ1の1xキナーゼ緩衝液に別々に再懸濁した。キナーゼ反応混合物を、37℃で1時間インキュベートした。70℃で5分間インキュベートすることによって、この反応を停止した。
【０２９２】
キナーゼで処理したオリゴヌクレオチド(各0.4μg)を互いに、25μ1の10mMATPおよび2μ1のT4DNAリガーゼ(10U/μ1)と組合わせて、反応混合物を、室温で6時間インキュベートした。連結混合物を、TE緩衝液で飽和したフェノール:クロロホルム(1:1)で抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。
【０２９３】
エタノール沈澱物を、50μ1の1x150mM制限酵素緩衝液(10x150mMの制限酵素緩衝液は、100mMトリス−HCl、pH8.0、1.5MNaC1、100mMMgC12、1mg/mlゼラチン、10mMジチオスレイトール)で再懸濁し、制限酵素Bgl2およびAsp718を用いて、37℃で16時間インキュベートした。消化産物を2%アガロースゲルで電気泳動にかけ、330bpに対応するバンドを切り出した。GENECLEAN  II（登録商標）を使用してこのフラグメントを溶出し、溶出物をエタノール沈澱させた。エタノール沈澱物を20μ1のTE緩衝液に再懸濁した。
【０２９４】
次に、330bpフラグメントをベクターpNNO3(配列番号7)に連結した。Asp718およびBgl2で直線化し、仔ウシのアルカリホスファターゼでポ末端を脱リン酸化し、低融点アガロースゲルで分画し、直線化したpNNO3(2.7kb)に対応するバンドを切り出すことによって、連結用のベクターpNNO3を調製した。次いで、直線化し脱リン酸化したpNNO3を、T4DNAリガーゼを用いて、ヒト型VL領域をコードする330bpのオリゴヌクレオチドフラグメントに連結した。
【０２９５】
連結混合物を用いて、E.coli  JA221(Iq)をペニシリン耐性に形質転換した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。組換えプラスミドをスクリーニングして、約400bpのSac2フラグメントの存在を調べた。DNA配列の分析によって、ベクターpMDRIOO3が、5A8κL鎖可変領域に設計されたヒト型配列を有することが認められた。
【０２９６】
配列番号34は、pMDRlOO3挿入物のDNA配列を示す。配列番号34のヌクレオチド11から343は、ヒト型5A8VL配列のAA1−AAlt1をコードする。ベクターpMDR1003は、ヒト型5A8VLのAAt12のコドンを含んでいない。下記のように、ヒト型5A8VL真核細胞用発現ベクターを作製したときに、オリゴヌクレオチドを使用して、コドンを「再構築」した。
（3.  5A8ヒト型Ｈ鎖発現ベクター）
中間プラスミドpMDRlOO1、pBAGIO1およびpSAB132を連結させることによって、5A8ヒト型H鎖(pMDR1002)を有する真核細胞用発現ベクターを以下のように構築した。
【０２９７】
（A.  中間プラスミドpMDRlOO1）
ヒトHG3免疫グロブリンH鎖シグナル配列(Seuence  of  Proteins  of  Immunoloical  Interest、p.460(4th  ed.)を参照のこと)、ヒト型5A8H鎖可変領域のAA1−AA122、次いで、RNA5’スプライス部位をコードするDNAを有するように、中間プラスミドpMDR1001を構築した。pLCB7およびpMDR991から、プラスミドpMDR1001を構築した。pLCB6およびpMDR904から、プラスミドpLCB7を構築した。
【０２９８】
ヒト免疫グロブリンH鎖シグナル配列、RNA5’スプライス部位、およびPstIおよびBstE2の制限部位をコードするDNAを有するように、プラスミドpLCB6を設計した。pLCB6を形成するために、オリゴヌクレオチド312−45(配列番号35)、312−50(配列番号36)、および312−49にわたる312−46(それぞれ、配列番号58から配列番号61)を、ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、上記のように連結した。次いで、連結したオリゴヌクレオチド自身を、プラスミドpNNO3の2701bpのAsp718/BamH1フラグメントに連結させ、pLCB6を作製した。pLCB6挿入物のDNA配列は、配列番号37である。
【０２９９】
プラスミドpLCB6をPstIおよびBstE2で開裂し、2820bpのフラグメントを単離した。そのフラグメントを、pMDR904の346bpの逃⊥1/阯E2フラグメントに連結した。397bpのStyI制限フラグメントによって、プラスミドpLCB7を同定した。pLCB7挿入物のDNA配列は、配列番号38である。
【０３００】
プラスミドpLCB7およびpMDR991を別々にPst1およびBstE2で開裂し、2820bp(ベクター)および337bp(挿入物)フラグメントをそれぞれ低融点アガロースで別々に分画することによって単離した。次いで、これらのフラグメントを連結した。特徴的なHae2制限パターン(1871bp、523bp、393bpおよび370bp)の存在により、プラスミドpMDR1001を同定した。pMDRIOO1挿入物のDNA配列は、配列番号39である。
【０３０１】
プラスミドpMDR1001をNot1およびHind3で開裂し、プラスミド挿入物を含む443bpのフラグメントを、低融点アガロースで分画することによって単離した。
【０３０２】
（B.中間プラスミドpSABl32）
中間プラスミドpSABl32を、汎用真核細胞用発現シャトルベクターとなるように構築した。このベクターは、ヒトサイトメガロウイルス極(immediate)初期プロモーターおよびエンハンサーを有する。pSAB132の構築は、同一譲受人の米国特許出願第07/770,967号の55−56ページに記載されている。pSAB132の全配列は、配列番号40として示す。
【０３０３】
ベクターpSAB132を、NotIで直線化した。次いで、7913bpの直線化したベクターを脱リン酸化し、低融点アガロースで分画することによって単離した。
【０３０４】
（C.  中間プラスミドpBAG101）
ヒトIgG4H鎖不変領域をコードするゲノムDNAを有するように、中間プラスミドpBAG101を構築した。
【０３０５】
J.Sambrookら、Molecular  Cloning、ch.9(Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  1989)の記載に実質的に従って、ゲノムDNAをヒト胎盤から調製した。IgG4不変領域をコードするDNAを、オリゴヌクレオチド370−38(配列番号41）および370−40(配列番号42)をプライマーとして使用するPCRによって、上記のように、ゲノムDNAから増幅した。
【０３０６】
約2109bpのPCRフラグメントをゲル電気泳動によって単離し、EcoR5で直線化したpNNO3に連結した。3887bpおよび3896bp  Bgl2制限フラグメントの存在によって、プラスミドpBAG101を同定した。pBAG101挿入物のDNA配列は、配列番号43である。pBAGIO1挿入物中のヒトIgG4H鎖不変領域をコードするDNA配列を、Genbank受託番号第KO1316−PR:HUMIGCD2の対応配列から得た。
【０３０７】
プラスミドpBAG1O1をNot1およびHind3で開裂し、プラスミド挿入物を含む2109bpフラグメントを、低融点アガロースで分画することにより単離した。
【０３０８】
（D.ベクターpMDR1OO2の最終構築）
pMDR1002を作製するために、３つのフラグメント:(a)pMDR1001の443bp  NotI/Hind3フラグメント;(b)7913bp  NotIで直線化したpSAB132;および(c)pBAG101の2109bp  Not1/Hind3フラグメントを連結した。連結混合物を使用して、E.coli  JA221(Iq)を、アンピシリン耐性に形質転換した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。組換えプラスミドをスクリーニングして、pMDR1002を同定する、約1276bpおよび9160bpのEcoR1フラグメントの存在を調べた。
【０３０９】
pMDR1002の挿入物のDNA配列は、配列番号44として示す。このDNA配列によってコードされたアミノ酸配列は、配列番号45として示す。pMDRlOO2挿入物は、5’から3’の順に、(1)免疫グロブリンシグナル配列(配列番号45のAA−19−AA−1に対応する、配列番号44のヌクレオチド12−68)、(2)5A8のH鎖可変領域に設計されたヒト型配列のAA1−AA122(配列番号45のAA1−AA122に対応する、配列番号44のヌクレオチド69−434)、次いで、ヒトIgG4H鎖(すなわち、H鎖不変領域)(配列番号45のAA123−AA448に対応する、配列番号44のヌクレオチド712−1005、1396−1431、1550−1879、および1977−2296)のAA114−AA478(Kabat番号)をコードするゲノムDNA(Genbank受託番号第KO1316号のヌクレオチド27から2525)をコードするDNAを含んでいる。
【０３１０】
PMDR1002を有するE.coliを、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、MDに、受託番号第ATCC68847号で寄託した。
【０３１１】
（4.5A8ヒト型Ｌ鎖発現ベクター）
中間プラスミドpMDR1006およびpSAB132を連結することによって、5A8ヒト型L鎖(pMDR1007)を有する真核細胞用発現ベクターを構築した。中間プラスミドpMDR985、pMDR986およびpMDR1003を連結することによって、プラスミドpMDR1006を構築した。特定の構築方法については、以下に記載する。
【０３１２】
（A.中間プラスミドpMDR985）
プロトタイプのヒト免疫グロブリンκL鎖シグナル配列をコードするDNAを有するように、中間プラスミドpMDR985を構築した。
【０３１３】
プラスミドpMDR985を作製するために、オリゴヌクレオチド360−81(配列番号46)および360−82(配列番号47)をポリヌクレオチドキナーゼで処理し、上記のように連結した。
【０３１４】
次いで、連結したオリゴヌクレオチド自身を、仔ウシのアルカリホスファターゼで脱リン酸化したプラスミドpNNO3の2707bpのHind3/EcoR5フラグメントに連結した。連結混合物を使用して、E.coli  JA221(Iq)をアンピシリン耐性に形質転換した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。
【０３１５】
組換えプラスミドをスクリーニングして、pMDR985を同定する、約461bpおよび2321bpのEcoO1091フラグメントの存在を調べた。
【０３１６】
pMDR985挿入物のDNA配列は、配列番号48として示す。DNA配列分析によって、pMDR985が、シグナル配列(配列番号48のヌクレオチド9から77)の正しいコドンを有していることが確認されたが、クローニング産物であるため、設計されたHind3部位(挿入物の5’)は、pMDR985内には再構成されなかった。
【０３１７】
プラスミドpMDR985をAat2およびEcoR5で開裂し、プラスミド挿入物を含む572bpフラグメントを、低融点アガロースで分画することによって、単離した。
【０３１８】
（B.  中間プラスミドpMDR986）
ヒトκL鎖(すなわち、L鎖不変領域)のAA108−AA214(Kabat番号)をコードするゲノムDNAを有するように、中間プラスミドpMDR986を構築した。
【０３１９】
J.Sambrookら、Molecular  Cloning、ch.9(Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press1989)の記載に実質的に従って、ヒト胎盤からゲノムDNAを調製した。ゲノムDNAをEcoRIで開裂し、κ鎖不変領域(Genbank受託番号第JOO241−PR:HUMIGKC3)を含む2.5kbのEcoRlフラグメントを、pUC8のEcoR1部位にクローン化し、pAB8を作製した。
【０３２０】
プライマーとして、オリゴヌクレオチド370−54(SEQIDNO:49)および370−55(配列番号50)を使用するPCRによって、上記のように、κ不変領域(AA108−AA214)をコードするDNAをpAB8から増幅した。約1240bpのPCRフラグメントを単離し、脱リン酸化した、EcoR5で直線化したpNNO3に連結した。1314bp  XmnI制限フラグメントの存在によって、プラスミドpSAB153を同定した。pSAB153のDNA配列は、配列番号51である。
【０３２１】
プラスミドpMDR986をpSAB153から以下のように構築した。  プライマーとしてオリゴヌクレオチド360−83(配列番号52)および370−55(配列番号50)を使用するPCRによって、κ不変領域をpSAB153から増幅した。約1276bpのPCRフラグメントをGENECLEAN  II（登録商標）溶出、次いでアガロース電気泳動によって単離し、エタノール沈澱させ、20μ1のTE緩衝液に再懸濁した。精製したPCRフラグメントを、DNAポリメラーゼIのクレノゥフラグメントで処理し、仔ウシのアルカリホスファターゼによって脱リン酸化した、EcoR5で直線化したpNNO3に連結した。
【０３２２】
連結混合物を使用して、E.coli  JA221(Iq)細胞を形質転換した。DNAをアンピシリン耐性コロニーから調製し、EcoO1091制限消化によりスクリーニングした。1122bpのEcoO1091制限フラグメントの存在により、プラスミドpMDR986を同定した。次いで、pMDR986プラスミドを使用して、E.coli  GM2929を形質転換した。これは、そのDNA(dam−13、dcm−6株)をメチル化しない。
【０３２３】
pMDR986挿入物のDNA配列は、配列番号53である。DNA配列分析により、pMDR986が、ヒトκ鎖のAA108−AA214をコードするために正しいエクソンを有していることが確認された。しかし、クローニング産物であるため、不変領域の設計されたNotI部位3’は、pMDR986中には再構成されず、代わりに、Pvu1部位が作製された。
【０３２４】
プラスミドpMDR986をAat2およびBcl1で開裂し、仔ウシのアルカリホスファターゼで処理し、3443bpのフラグメントを、低融点アガロースで分画することによって単離した。
【０３２５】
（C.中間プラスミドpMDR1003）
プラスミドpMDR1003の構築は、上記の通りである。このプラスミドは、ヒト型5A8κL鎖可変領域をコードするDNAを有する。pMDRIOO3のDNA配列は、配列番号34として示す。
【０３２６】
プラスミドpMDR1003をEcoR5およびBgl2で開裂し、プラスミド挿入物を含む326bpのフラグメントを、低融点アガロースで分画することによって単離した。
【０３２７】
（D.ベクターpMDR1007の最終構築）
ベクターpMDRIOO7をpSAB132(配列番号40)およびpMDR1006(挿入DNA配列は、配列番号54である)から構築した。
【０３２８】
3つのフラグメント:(a)pMDR985の572bp  Aat2/EcoR5フラグメント;(b)pMDR986の3442bp  Aat2/Bc11フラグメント;および(c)pMDR1003の326bp  EcoR5/Bgl2フラグメントを連結し、pMDR1006を作製した。連結混合物を使用して、E.coli  JA221(Iq)(源？)をアンピシリン耐性に形質転換した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。組換えプラスミドをスクリーニングし、特徴的なEcoO1091制限フラグメント(2741bp、767bpおよび461bp、243bpおよび129bp)の存在を調べ、pMDR1006を同定した。pMDR1006の挿入物のDNA配列は、配列番号54として示す。
【０３２９】
プラスミドpMDR1006をNot1で開裂し、1693bpフラグメントを単離した。Not1フラグメントを、仔ウシのアルカリホスファターゼで予め脱リン酸化した、Not1で直線化したpSAB132(配列番号40)に連結した。脱リン酸化した反応混合物を低融点アガロースで分画し、次いで、これを使用してE.coli  JA221(Iq)をアンピシリン耐性に形質転換した。コロニーを増殖させ、ミニプレップDNAを調製した。組換えプラスミドをスクリーニングして、特徴的なApaL1消化パターン(6249bp、1593bp、1246bpおよび498bpの断片)を調べ、pMDR1007を同定した。
【０３３０】
pMDR1007挿入物のDNA配列は、配列番号55として示す。このDNA配列によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号56として示す。pMDRIOO7挿入物は、5’から3’の順に、(1)免疫グロブリンκ鎖シグナル配列(配列番号56のAA−22−AA−1に対応する、配列番号55のヌクレオチド35−100)、(2)5A8のL鎖可変領域(配列番号56のAA1−AA112に対応する、配列番号55のヌクレオチド101−436)、次いで、ヒトκL鎖(すなわち、L鎖不変領域)(配列番号56のAA113−AA219に対応する、配列番号55のヌクレオチド437および782−1101)のAA108−AA214(Kabat番号)をコードするゲノムDNA(Genbank受託番号第JOO241−PR:HUMIGKC3のヌクレオチド1から1201)をコードするDNAを含んでいる。
【０３３１】
pMDRloo7を有するE.coliを、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、MDに、受託番号第ATCC68846号で寄託した。
【０３３２】
（5.ヒト型5A8の発現）
予備実験において、COS7細胞を発現ベクターpMDRlOO7およびpMDR1002で、エレクトロポレーションによりトランスフェクトし、細胞を48時間培養した。次いで、この細胞を35S−メチオニンで放射標識した。次いで、細胞抽出物および馴化培養物培地をプロテインA−セファロースとともにインキュベートした。プロテインA−セファロースを洗浄し、結合タンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)負荷緩衝液で溶出し、PAGEで分析した。免疫グロブリンL鎖のプロテインA沈澱によって証明されるように、馴化培地では、免疫グロブリン凝集分子が、非常に低い収率で検出された。
【０３３３】
（寄託物）
本発明による細胞および抗体ホモログを、1990年11月20日付けで、Linthicum、Maryland、U.S.A.のIn  Vitro  International、lnc.culture  collectionに、ブダペスト条約の下で寄託され、以下のように同定される培養物により例示する:
「5A8−2F6」
「7−27−1F8−2B4」
「7−27−5F2−2C5」
「CHO  379  clone  12.1」
「CHO−160」
これらの培養物には、それぞれ、IVI−10257からIVI−10261までの受託番号が与えられた。これらの寄託物は、1991年6月20日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Marylandに移され、アメリカンタイプカルチャーコレクーションにより、ブダペスト条約の下で、受託番号第HB10881号、第HB10882号、第HB10883号、第CRL1O884号および第CRL1O885号でそれぞれ保管されている。
【０３３４】
本発明によるDNA配列および組換えDNA分子、ならびにこれらを調製するのに有用な微生物を、1991年11月21日付けで、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville、Maryland、U.S.A.に、ブダペスト条約の下で寄託され、以下のように同定される培養物により例示する:
「E.coliK12JA221(Iq)」
「E.coliK12JA221(Iq)/pMDR1007」
「E.coliK12JA221(Iq)/pMDR1002」
「E.coliK12JA221(Iq)/pMDRgO4」
「E.coliK12JA221(Iq)/pMDR927」
これらの培養物には、それぞれ、受託番号第ATCC68845号から第ATCC68849号までが与えられた。
【０３３５】
（配列）
下記のものは配列一覧表に記載されている配列のまとめである:
配列番号1  pre−HIVgp160のDNA配列
配列番号2  pre−HIVgp160のアミノ酸配列
配列番号3  可溶性HIVgp120のDNA配列
配列番号4  可溶性HIVgpl20のアミノ酸配列
配列番号5  VHO1  PCRプライマーのDNA配列
配列番号6  VHO2  PCRプライマーのDNA配列
配列番号7  pNNO3のDNA配列
配列番号8  pMDR904挿入物(5A8VH)のDNA配列
配列番号9  5A8のH鎖可変領域のDNA配列
配列番号10  5A8のH鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号11  ACE149  PCRプライマーのDNAの配列
配列番号12  ACE150  PCRプライマーのDNAの配列
配列番号13  pMDR927挿入物(5A8  VL)のDNA配列
配列番号14  5A8のL鎖可変領域のDNA配列
配列番号15  5A8のL鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号16  312−56  PCRプライマーのDNA配列
配列番号17  312−57  PCRプライマーのDNA配列
配列番号18  312−58  PCRプライマーのDNA配列
配列番号19  312−59  PCRプライマーのDNA配列
配列番号20  312−60  PCRプライマーのDNA配列
配列番号21  312−61  PCRプライマーのDNA配列
配列番号22  pMDR989−15挿入物のDNA配列
配列番号23  pMDR991挿入物のDNA配列
配列番号24  312−62のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号25  312−63のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号26  312−64のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号27  312−65のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号28  312−66のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号29  312−67のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号30  312−68のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号31  312−69のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号32  312−70のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号33  312−71のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号34  pMDR1003挿入物のDNA配列
配列番号35  312−45のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号36  312−50のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号37  pLCB6挿入物のDNA配列
配列番号38  pLCB7挿入物のDNA配列
配列番号39  pMDR1001挿入物のDNA配列
配列番号40  pSAB132のDNA配列
配列番号41  370−38  PCRプライマーのDNA配列
配列番号42  370−40  PCRプライマーのDNA配列
配列番号43  pBAG101挿入物のDNA配列
配列番号44  pMDR1002挿入物のDNA配列  (pre−5A8ヒト型H鎖)
配列番号45  pMDR1002挿入物のアミノ酸配列  (pre−5A8ヒト型H鎖)
配列番号46  360−81のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号47  360−82のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号48  pMDR985挿入物のDNA配列
配列番号49  370−54  PCRプライマーのDNA配列
配列番号50  370−55  PCRプライマーのDNA配列
配列番号51  pSAB153挿入物のDNA配列
配列番号52  360−83  PCRプライマーのDNA配列
配列番号53  pMDR986挿入物のDNA配列
配列番号54  pMDR1006挿入物のDNA配列
配列番号55  pMDR1007挿入物のDNA配列  (pre−5A8ヒト型L鎖)
配列番号56  pMDR1OO7挿入物のアミノ酸配列  (pre−5A8ヒト型L鎖)
配列番号57  pNNO3合成ポリリンカーのDNA配列
配列番号58  312−46のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号59  312−47のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号60  312−48のオリゴヌクレオチドのDNA配列
配列番号61  312−49のオリゴヌクレオチドのDNA配列。
【０３３６】
前述に数多くの実施態様を示したが、本発明の組成物および方法を用いる他の実施態様を提供するために、われわれの基本的な実施態様を改変し得ることは明白である。従って、多くの実施態様の変法の全ては、前述の明細書および添付の請求の範囲で明示されている本発明の範囲に含まれることは明白である。
【０３３７】
（配列表）
【０３３８】
【化１】
2011024593.tif 000012
【０３３９】
【化２】
2011024593.tif 000013
【０３４０】
【化３】
2011024593.tif 000014
【０３４１】
【化４】
2011024593.tif 000015
【０３４２】
【化５】
2011024593.tif 000016
【０３４３】
【化６】
2011024593.tif 000017
【０３４４】
【化７】
2011024593.tif 000018
【０３４５】
【化８】
2011024593.tif 000019
【０３４６】
【化９】
2011024593.tif 000020
【０３４７】
【化１０】
2011024593.tif 000021
【０３４８】
【化１１】
2011024593.tif 000022
【０３４９】
【化１２】
2011024593.tif 000023
【０３５０】
【化１３】
2011024593.tif 000024
【０３５１】
【化１４】
2011024593.tif 000025
【０３５２】
【化１５】
2011024593.tif 000026
【０３５３】
【化１６】
2011024593.tif 000027
【０３５４】
【化１７】
2011024593.tif 000028
【０３５５】
【化１８】
2011024593.tif 000029
【０３５６】
【化１９】
2011024593.tif 000030
【０３５７】
【化２０】
2011024593.tif 000031
【０３５８】
【化２１】
2011024593.tif 000032
【０３５９】
【化２２】
2011024593.tif 000033
【０３６０】
【化２３】
2011024593.tif 000034
【０３６１】
【化２４】
2011024593.tif 000035
【０３６２】
【化２５】
2011024593.tif 000036
【０３６３】
【化２６】
2011024593.tif 000037
【０３６４】
【化２７】
2011024593.tif 000038
【０３６５】
【化２８】
2011024593.tif 000039
【０３６６】
【化２９】
2011024593.tif 000040
【０３６７】
【化３０】
2011024593.tif 000041
【０３６８】
【化３１】
2011024593.tif 000042
【０３６９】
【化３２】
2011024593.tif 000043
【０３７０】
【化３３】
2011024593.tif 000044
【０３７１】
【化３４】
2011024593.tif 000045
【０３７２】
【化３５】
2011024593.tif 000046
【０３７３】
【化３６】
2011024593.tif 000047
【０３７４】
【化３７】
2011024593.tif 000048
【０３７５】
【化３８】
2011024593.tif 000049
【０３７６】
【化３９】
2011024593.tif 000050
【０３７７】
【化４０】
2011024593.tif 000051
【０３７８】
【化４１】
2011024593.tif 000052
【０３７９】
【化４２】
2011024593.tif 000053
【０３８０】
【化４３】
2011024593.tif 000054
【０３８１】
【化４４】
2011024593.tif 000055
【０３８２】
【化４５】
2011024593.tif 000056
【０３８３】
【化４６】
2011024593.tif 000057
【０３８４】
【化４７】
2011024593.tif 000058
【０３８５】
【化４８】
2011024593.tif 000059
【０３８６】
【化４９】
2011024593.tif 000060
【０３８７】
【化５０】
2011024593.tif 000061
【０３８８】
【化５１】
2011024593.tif 000062
【０３８９】
【化５２】
2011024593.tif 000063
【０３９０】
【化５３】
2011024593.tif 000064
【０３９１】
【化５４】
2011024593.tif 000065
【０３９２】
【化５５】
2011024593.tif 000066
【０３９３】
【化５６】
2011024593.tif 000067
【０３９４】
【化５７】
2011024593.tif 000068
【０３９５】
【化５８】
2011024593.tif 000069
【０３９６】
【化５９】
2011024593.tif 000070
【０３９７】
【化６０】
2011024593.tif 000071
【０３９８】
【化６１】
2011024593.tif 000072
【図１Ａ】
2011024593.tif 000073
【図１Ｂ】
2011024593.tif 000074
【図１Ｃ】
2011024593.tif 000075
【図１Ｄ】
2011024593.tif 000076
【図１Ｅ】
2011024593.tif 000077
【図２Ａ】
2011024593.tif 000078
【図２Ｂ】
2011024593.tif 000079
【図２Ｃ】
2011024593.tif 000080
【図２Ｄ】
2011024593.tif 000081
【図２Ｅ】
2011024593.tif 000082
【図２Ｆ】
2011024593.tif 000083
【図２Ｇ】
2011024593.tif 000084
【図２Ｈ】
2011024593.tif 000085
【図３】
2011024593.tif 000086
【図４】
2011024593.tif 000087
【図５】
2011024593.tif 000088
【図６】
2011024593.tif 000089
【図７Ａ】
2011024593.tif 000090
【図７Ｂ】
2011024593.tif 000091
【図８Ａ】
2011024593.tif 000092
【図８Ｂ】
2011024593.tif 000093
【図９】
2011024593.tif 000094
【配列表】
2011024593000001.app