(57)【要約】      （修正有）【課題】骨芽細胞増殖促進活性を有する新規なペプチドおよびこれを含有する骨形成促進用医薬を提供するとともに、当該ペプチドを利用する優れた用途を提供する。【解決手段】Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、特定のアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチド、またはそれらの薬学的に許容される塩。当該ペプチドのスレオニン残基、アスパラギン残基およびセリン残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖には単糖または糖鎖が結合していてもよい。当該ペプチドは骨形成促進用医薬の有効成分として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなり、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
（ａ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
【請求項３】
スレオニン残基、アスパラギン残基およびセリン残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖に単糖または糖鎖が結合していることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
アスパラギン残基の側鎖に結合する単糖、またはアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ−アセチルグルコサミンであることを特徴とする請求項３に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
セリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する単糖、またはセリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびキシロースから選ばれる１種であることを特徴とする請求項３に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に記載のペプチドからなる群より選ばれる１種である請求項２〜５のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
（Ａ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列の第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３〜１２のペプチド
（Ｂ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列において第９６位のプロリンがバリンに置換されたアミノ酸配列の第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３〜１２のペプチド
（Ｃ）以下の式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表わされるペプチド
【化１】
2011211979.tif 000012
（式中、Ｒ１は以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）
【化２】
2011211979.tif 000013
を表す。）
【請求項７】
請求項１または２に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
【請求項１２】
骨形成促進剤である請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
骨形成促進剤を製造するための請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１４】
哺乳動物に対して請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする骨形成促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドおよび当該ペプチドを含有する骨形成促進用医薬、並びにこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症は、骨量または骨塩量の減少によって骨の微細構造が破綻し、骨強度が低下して骨折のリスクが高まった全身性疾患である。日本では骨粗鬆症の患者は約１，１００万人と言われており、その８割は女性である。さらに、骨粗鬆症は中年以降に多く見られる疾患であるため、近年の高齢化に伴い今後患者数が増加すると推測される。また、近年、小中学生の骨折率が増加しており、骨粗鬆症を予防するという見地からも若年期にしっかりと骨塩量を高めて、より高い最大骨量を得ることは非常に重要である。このように、今や骨の健康を保つことは性別や年齢に関係なく全社会的な関心事である。
【０００３】
従来、骨の疾患を予防あるいは治療する方法として、食餌療法によるカルシウム補給、軽い運動、日光浴、薬物治療等が行われている。食餌療法によるカルシウム補給としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や、牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されているが、溶解性や吸収性、呈味性の点で必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。適度な運動は骨量を増やし、骨を強化するので、散歩やウオーキングは骨の健康によいとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものである。まして寝たきりの老人ではほとんど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ３の補給と言う点ではよいとされているが、これだけでは不十分である。
【０００４】
本発明者らの過去の研究により、卵黄水溶性画分および卵黄タンパク質加水分解物に骨強化作用があることが知られている（特許文献１，２参照）。しかしながら、卵黄水溶性画分や卵黄タンパク質加水分解物に含有される骨強化活性を有する成分は特定されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２１０８７号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／０７５５５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、骨芽細胞増殖促進活性を有する新規なペプチドおよびこれを含有する骨形成促進用医薬を提供するとともに、当該ペプチドを利用する優れた用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなり、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［２］以下の（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有することを特徴とするペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
（ａ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
［３］スレオニン残基、アスパラギン残基およびセリン残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖に単糖または糖鎖が結合していることを特徴とする前記［１］または［２］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［４］アスパラギン残基の側鎖に結合する単糖、またはアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ−アセチルグルコサミンであることを特徴とする前記［３］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［５］セリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する単糖、またはセリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびキシロースから選ばれる１種であることを特徴とする前記［３］に記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
［６］  以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に記載のペプチドからなる群より選ばれる１種である前記［２］〜［５］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
（Ａ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列の第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３〜１２のペプチド
（Ｂ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列において第９６位のプロリンがバリンに置換されたアミノ酸配列の第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３〜１２のペプチド
（Ｃ）以下の式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表わされるペプチド
【化１】
2011211979.tif 000002
（式中、Ｒ１は以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）
【化２】
2011211979.tif 000003
を表す。）
［７］前記［１］または［２］に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［８］前記［７］に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
［９］前記［８］に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
［１０］前記［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドに対する抗体。
［１１］前記［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含有することを特徴とする医薬。
［１２］骨形成促進剤である前記［１１］に記載の医薬。
［１３］骨形成促進剤を製造するための前記［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
［１４］哺乳動物に対して前記［１］〜［６］のいずれかに記載のペプチドまたはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする骨形成促進方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、骨芽細胞増殖促進活性を有する新規なペプチドおよびこれを含有する骨形成促進用医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】卵黄タンパク加水分解物を分画分子量１０ｋＤａのＵＦ膜で分画し、それぞれの画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図２】卵黄タンパク加水分解物の分子量１０ｋＤａ以下の画分を分画分子量３ｋＤａのＵＦ膜で分画し、それぞれの画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図３】卵黄タンパク加水分解物の分子量３ｋＤａ−１０ｋＤａの画分をＯＤＳカラムに供し、各メタノール濃度（２０、４０、６０、８０％）で溶出して得られた画分の骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図４】図３において強い骨芽細胞増殖活性が認められたメタノール２０％溶出画分についてゲルろ過を行って分取した画分を示す図である。
【図５】図４に示した７画分についてＧＰＣ分析を行った結果を示す図である。
【図６】図４に示した７画分のうち６画分について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図７】図６において強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクション１についてＨＰＬＣを行い、検出されたピーク、分取したフラクションの範囲を示した図である。
【図８】図７に示した範囲で分取したフラクションについて骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図９】図８において強い骨芽細胞増殖活性が認められた２０−４０分のフラクションに存在する各ピークを分取し、各ピークの骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１０】図９において強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクションＮｏ．９をさらにＨＰＬＣで分画した結果を示す図である。
【図１１】図１０に示された２つのピークを分取し、それぞれの骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１２】骨芽細胞増殖活性を有するフラクション（Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９）に含まれるペプチドのアミノ酸配列を解析した結果を示す図である。
【図１３】Ｎｏ．９−０に含まれるペプチドのＥＳＩ−ＭＳ解析結果を示す図である。
【図１４】Ｎｏ．９に含まれるペプチドのＥＳＩ−ＭＳ解析結果を示す図である。
【図１５】Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９に含まれるペプチドのＣＥおよびＭＳ解析結果を示す図である。
【図１６】解析の結果明らかとなったペプチドの構造を示す図である。
【図１７】化学合成した１２種類のペプチドについて骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１８】化学合成したペプチド（Ｎｏ．１３）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図１９】化学合成したペプチド（Ｎｏ．１４）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【図２０】化学合成したトリペプチド（ＡＥＳ）およびジペプチド（ＡＥ）について骨芽細胞増殖活性を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
〔ペプチド〕
本発明のペプチドは、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなり、骨芽細胞増殖促進活性を有するトリペプチドである。
また、本発明のペプチドは、以下の（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するものでもよい。
（ａ）Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ
（ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｆ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（ｈ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
なお、本発明における「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを意味し、結合するアミノ酸の数は問わない。すなわち、本発明における「ペプチド」にはポリペプチドが含まれる。
【００１１】
本発明者らは、卵黄タンパク質を加水分解したペプチド混合物から、強い骨芽細胞増殖活性を有するペプチドの同定を試み、目的のペプチドが「Val−Asp−Gly−Ala−Glu−Ser−Pro−Thr−Ala−Asn−Ile−Ser」（配列番号４）のアミノ酸配列を有し、第１０位のアスパラギンに糖鎖が結合した糖ペプチドであることを特定した。また、糖鎖が結合していなくても骨芽細胞増殖活性を有することを確認した。
【００１２】
また、本発明者らは、配列番号４のアミノ酸配列において、Ｎ末端側およびＣ末端側からそれぞれ数個のアミノ酸を欠失させても骨芽細胞増殖活性を有するが、配列番号４の第４位のアラニンを欠失させると骨芽細胞増殖活性が失われることを確認した。具体的には、配列番号１で表わされるアミノ酸配列（Val−Asp−Gly−Ala−Glu−Ser）からなるペプチド、配列番号２で表わされるアミノ酸配列（Asp−Gly−Ala−Glu−Ser−Pro−Thr−Ala）からなるペプチド、および配列番号３で表わされるアミノ酸配列（Ala−Glu−Ser−Pro−Thr−Ala−Asn−Ile−Ser）からなるペプチドは、骨芽細胞増殖活性を有していることを確認した。
【００１３】
さらに、本発明者らは、配列番号４のアミノ酸配列において、骨芽細胞増殖活性を発現する最小ペプチドの特定を試みた結果、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒで表わされるアミノ酸配列からなるトリペプチドが骨芽細胞増殖活性を有していることを見出した。
【００１４】
すなわち、骨芽細胞増殖促進活性に必須のアミノ酸配列は、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ３アミノ酸からなる配列であることが明らかとなった。したがって、配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１〜３個のアミノ酸が欠失したペプチド、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失したペプチド、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において１〜６個のアミノ酸が欠失したペプチド、配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失したペプチドを含むペプチドも骨芽細胞増殖活性を有することが容易に理解できる。
【００１５】
また、本発明者らは、配列番号４の第７位のプロリンがバリンに置換されても骨芽細胞増殖活性を有することを確認した。したがって、「Val−Asp−Gly−Ala−Glu−Ser−Pro−Thr−Ala−Asn−Ile−Ser」（配列番号４）のペプチドにおいて、第４位のアラニン、第５位のグルタミン酸および第６位のセリン以外のアミノ酸が他のアミノ酸に置換しても、骨芽細胞増殖活性を有すると考えられる。なお、配列番号１〜３は配列番号４の一部であるので、配列番号１〜３のアミノ酸配列のペプチドについても同様であると考えられる。好ましいアミノ酸置換としては、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＰｒｏおよびＩｌｅの中での置換、ヒドロキシル残基を有するＳｅｒとＴｈｒとの置換、酸性残基を有するＡｓｐとＧｌｕとの置換、塩基性残基を有するＬｙｓとＡｒｇとの置換、芳香族残基を有するＰｈｅとＴｙｒとの置換などが挙げられるが、これらに限定されず、骨芽細胞増殖活性を維持できる限りどのようなアミノ酸置換であってもよい。
【００１６】
本発明のペプチドは、上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドであればよく、（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有していてもよい。（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列は特に限定されない。付加的なアミノ酸配列としては、タグ配列（例えば、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなど）、マーカーペプチド（例えば、ＧＦＰなど）等が挙げられる。
【００１７】
配列番号４のアミノ酸配列は、卵黄タンパク質の一種であるβ−リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の一部であることが明らかとなった。したがって、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒまたは配列番号１〜４のいずれかで表わされるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、β−リベチンの全長またはβ−リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含むフラグメントであることが好ましい。また、配列番号１５で表わされるβ−リベチンのアミノ酸配列において、第９６位のプロリンがバリンに置換された配列であってもよく、配列番号１５の第９６位のプロリンがバリンに置換された配列の全長または第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含むフラグメントも好適である。フラグメントのアミノ酸残基数は特に限定されないが、好ましくは３〜５０残基、より好ましくは３〜３０残基、さらに好ましくは３〜２０残基、特に好ましくは３〜１２残基である。
【００１８】
本発明のペプチドは、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。また、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。また、本発明のペプチドを一部に含むペプチド（例えば、β−リベチン）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いてペプチドを取得し、これを適当なプロテアーゼやペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００１９】
得られたペプチドが骨芽細胞増殖促進活性を有することは、細胞増殖を測定する公知の方法から適宜選択した試験系において骨芽細胞を使用し、ペプチドを添加した場合とペプチドを添加していない場合とを比較して、ペプチドを添加した場合の方が骨芽細胞の増殖レベルが高いことを確認すればよい。例えば、骨芽細胞由来の細胞株を用いる細胞培養系において、ＭＴＴアッセイやセルカウント法を用いる方法が挙げられる。
【００２０】
本発明のペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。
【００２１】
さらに、本発明のペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。
【００２２】
本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していてもよく、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
【００２３】
本発明のペプチドは、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒからなるペプチドおよび上記（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドにおいて、スレオニン残基、アスパラギン残基およびセリン残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の側鎖に単糖または糖鎖が結合していることが好ましい。糖鎖が結合していることにより、酵素分解に対する抵抗性が向上し、例えば、生体において血中半減期を長くすることができ、作用の持続性を図ることができる。
【００２４】
単糖または糖鎖は、アミノ酸の側鎖官能基に直接またはリンカーを介して結合することができる。単糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、シアル酸、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルコサミン、ガラクトサミンおよびこれらの硫酸化物、リン酸化物、硝酸化物等が挙げられる。糖鎖は、上記例示した単糖が２個以上グリコシド結合したものであれば限定されず、結合している単糖の個数は問わない。
【００２５】
アスパラギン残基の側鎖に結合する単糖、またはアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖は、Ｎ−アセチルグルコサミンであることが好ましい。また、セリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する単糖、またはセリン残基もしくはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖の還元末端の糖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびキシロースから選ばれる１種であることが好ましい。
【００２６】
本発明のペプチドのアスパラギン残基の側鎖に結合する糖鎖（Ｎ結合型糖鎖）としては、例えば、以下の（１）〜（３２）などが挙げられる。
【化３】
2011211979.tif 000004
【００２７】
【化４】
2011211979.tif 000005
【００２８】
【化５】
2011211979.tif 000006
【００２９】
本発明のペプチドのセリン残基またはスレオニン残基の側鎖に結合する糖鎖（Ｏ結合型糖鎖）としては、例えば、以下の（１）〜（１１）などが挙げられる。なお、下記（１）〜（８）に示す糖鎖（コア構造）の非還元末端側の糖に、さらにガラクトース（Ｇａｌ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸（ＮｅｕＡｃ）などが付加されていてもよい。
【化６】
2011211979.tif 000007
【００３０】
単糖または糖鎖が結合したペプチドは、例えば、（１）ｓｔｅｐｗｉｓｅ法、（２）ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ法、（３）酵素−化学合成法などの公知の方法により製造することができる。得られた糖ペプチドが骨芽細胞増殖促進活性を有することは、上述の方法で確認することができる。
【００３１】
（１）ｓｔｅｐｗｉｓｅ法は、糖アミノ酸を合成単位として用いる方法であり、糖アミノ酸にアミノ酸を結合させて伸長させ糖ペプチドを合成する。ペプチド鎖の伸長は、一般的なペプチド合成のプロトコールに従って固相合成法（Fmoc法、Boc法）により行うことができる。
【００３２】
Ｎ−結合型糖アミノ酸は、糖アミンとアスパラギン酸誘導体のβ−カルボキシル基との縮合により合成することができる。縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）（Kunz, H. (1987) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 294-308）、２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン−１−カルボキシレイト（EEDQ）（Kunz, H., and Unverzagt, C. (1988) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 27, 1697-1699、Kisch, P., Kusunose, N., Aikawa, J., Kitagawa, T., Yokoyama, S., and Ogawa, T. (1995) Bioorg. Med. Chem. 3, 1631-1636）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロポキシル）カルボジイミド（EDC）（Teshima, T., Nakajima, K., and Shiba, T. (1996) in Peptide Chemistry 1995 (Nishi, N. ed.) pp.141-144, Protein Research Foundation, Osaka）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト（TBTU）（Zang,H., Wang Y., Thurmer, R., Meisenbach, M., and Voelter, W. (1997) Liebig Ann., 9, 1871-1877、Arsequell, G., Krippner, L., Dwek, R. A., and Wong, S.Y.C. (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 2383-2384）、ペンタフルオロフェニルエステル（Urgge, L., Otvos, L. Jr., Lang, E., Wroblewski, K., Laczko, I., and Hollosi, M. (1992) Carbohydr. Res. 235, 83-93、Otvos, L. Jr., Urgge, L., Hollisi, M., Wroblewski, K., Graczyk, G., Lang, E., Fasman, G.D., and Thurin, J (1990) Tetrahedron Lett. 31, 5889-5892、Urgge, L., Kollat, E., Hollosi, M., Laczko, I., Wroblewski, K., Thurin, J. Otvos, L. Jr. (1991) Tetrahedron Lett. 32, 3445-3448）などが挙げられる。
【００３３】
糖アミンは、パラジウムブラック（Thiem, J., and Wiemann, T. (1990) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 29, 80-82）、リンドラー触媒（Nakabayashi, S., Warren, C.D., and Jeanloz, R.W. (1988) Carbohydr. Res. 174, 279-289）、酸化白金（Marks, G.S., Marshall, R.D., and Neuberger, A. (1963)  Biochem. J. 87, 274-281）、ラネーニッケル（Mcdonald, F. E., and Danishefsky, S.J. (1992) J. Org. Chem. 57, 7001-7002）などの触媒を用いた糖アジドの接触還元、またはプロパンジチオールによる還元（Unverzagt, C. (1996) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 35, 2350-2353）により合成できる。また、トリアルキルホスフィン存在下、糖アジドとアスパラギン酸誘導体から糖アスパラギンを得る方法（Mizuno, M., Muramoto, I., Kobayashi, K., Yaginuma, H., and Inazu, T. (1999) Synthesis, 162-165、Inazu, T., and Kobayashi, K. (1993) Synlett., 869-870）、糖イソチオシアネート（Kholrlin, A.Y., Zurabyan, S. E., and Macharadze, R.G. (1980) Carbohydr. Res. 85, 201-208、Gunther, G., and Kunz, H. (1990) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 29, 1050-1051）、ペンテニルグリコシド（Handlon, A. L., and Fraser-Reid, B. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 3796-3797、Radcliffe, A. J., Konradsson, P., and Fraser-Reid, B. (1991) Carbohydr. Res. 216, 323-335）を用いる方法が知られている。
【００３４】
Ｏ−結合型糖アミノ酸は、ハロゲン糖（Luning, B., Norberg, T., River-Baeza, C., and Tejbrant, J. (1991) Glycoconjugate J. 8, 450-455、Kunz, H., Birnbach, S., and Wernig, P. (1990) Carbohydr. Res. 202, 207-213、Ciommer, M., and Kunz, H. (1991) Synlett., 593-594、Paulsen, H., and Paal, M. (1984) Carbohydr. Res. 135, 71-84）、グリコシルトリクロロアセトイミデート（Fukase, K., Hase, S., Ikenaka, T., and Kusumoto, S. (1992) Bull. Chem. Soc. Jpn. 65, 436-445、Kinzy, W., and Schmidt, R. R. (1989) Carbohydr. Res. 193, 33-47、Barchi, J. J., Russ, P., Johnson, B., Otaka, A., Nomizu, M., and Yamada, Y. (1995) Bioorg. Med. Chem. Lett. 5, 711-714）、チオグリコシド（Halander, A., Kenne, L., Oscarson, S., Peters, T., and Brisson, J. R. (1992) Carbohydr. Res. 230, 299-318、Elofsson, M., and Kihlberg, J. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 7499-7502、Paulsen, H., Merz, G., Weichert, U. (1988) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1364-1365）、アセチル化糖（Seitz, O., and Wong, C-H. (1997) J. Am. Chem. Soc. 119, 8766-8776、Elofsson, M., Roy, S., Salvador, L. A., and Kihlberg, J. (1996) Tetrahedron Lett. 37, 7645-7648）などを糖供与体としたグリコシル化反応により合成することができる。特にＦｍｏｃ−セリンやＦｍｏｃ−スレオニンのペンタフルオロフェニルエステルを糖受容体として用いる方法は、そのまま糖ペプチド合成に用いることができる有用な方法である（Jansson, A. M., Meldal, M., and Bock, K. (1992) J. Chem. Soc. Perkins Trans I, 1699-1707）。
【００３５】
（２）ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ法は、糖鎖部分とペプチド部分をそれぞれ合成しておき、それらを縮合させて糖ペプチドを合成する方法である。ペプチド鎖中のアスパラギン残基のβカルボキシル基と、７糖（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）からなる糖鎖アミンとの縮合例がある（Cohen-Abisfeld, S. T., and Lansbury, P. T. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 1053-10537）。
【００３６】
（３）酵素−化学合成法は、ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖ペプチドを合成し、これを糖鎖受容体とし、糖鎖供与体として、天然の糖タンパク質（卵白、卵黄、血清トランスフェリン、リボヌクレアーゼＢなど）から調製される糖アミノ酸や糖ペプチドを用い、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｍ、Ｅｎｄｏ−αなど）を用いて、糖鎖転移反応を行う方法である。Ｅｎｄｏ−Ｍは、Ｎ−結合型糖鎖の転移（K. Yamamoto, J. Biosci. Bioeng. 2001, 92, 493）、Ｅｎｄｏ−αは、Ｏ−結合型糖鎖（コア１）の転移（H. Ashida, K. Yamamoto, T. Murata, T. Usui, H. Kumagai, Arch. Biochem. Biophys. 2000, 373, 394、T. Katayama, K. fujita, K. Yamamoto, J.Biosci. Bioeng. 2005, 99, 457）に利用できる。
【００３７】
本発明のペプチドは、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）に記載のペプチドからなる群より選ばれる１種であることが好ましい。
（Ａ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列（β−リベチン）の第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３〜１２のペプチド
（Ｂ）配列番号１５で表わされるアミノ酸配列（β−リベチン）において第９６位のプロリンがバリンに置換されたアミノ酸配列の第９３位−第９５位のＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒを含みアミノ酸残基数が３〜１２のペプチド
（Ｃ）以下の式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表わされるペプチド
【００３８】
【化７】
2011211979.tif 000008
（式中、Ｒ１は以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）
【００３９】
【化８】
2011211979.tif 000009
を表す。）
【００４０】
〔ポリヌクレオチド〕
本発明のポリヌクレオチドは、上記Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒからなるペプチドまたは（ａ）〜（ｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含み、骨芽細胞増殖促進活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドであればよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ポリヌクレオチドは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡと ＲＮＡとのハイブリッドのいずれであってもよい。一本鎖の場合は、コード鎖（センス鎖）または非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側または３’側でタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。さらに、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００４１】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して組み合わせることにより任意にデザインすることができる。また、配列番号１〜４のいずれかで表わされるアミノ酸配列は、上述のように卵黄タンパク質の一種であるβ−リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の一部であるので、β−リベチンをコードする遺伝子の塩基配列に基づいてデザインすることができる。ここで、β−リベチンは、卵黄タンパク質の前駆体であるビテロゲニンの切断により生成することが知られている。すなわち、ビテロゲニンは、肝臓で合成された後、血流中に分泌され卵巣へと輸送されて卵母細胞内へ取り込まれ、卵母細胞内のリソソームに局在するアスパラギン酸プロテアーゼ（カテプシンＤ）により、リポビテリン−１、ホスビチン、リポビテリン−２、β−リベチンに切断される（Deeley RG, Mullinix DP, Wetekam W, Kronenberg HM, Meyers M, Eldridge JD, Goldberger RF. Vitellogenin synthesis in the avian liver. Vitellogenin is the precursor of the egg yolk phosphoproteins. J Biol Chem. 1975 Dec 10;250(23):9060-6.）。β−リベチンのアミノ酸配列は、ビテロゲニンの全アミノ酸配列（アクセッション番号：ＣＡＡ３１９４２）の１５６７位から１８５０位に該当する（特開２００６−１１５７６１号公報）。したがって、ビテロゲニンをコードする遺伝子の塩基配列（アクセッション番号：Ｘ１３６０７）に基づいて、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列をデザインすることができる。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成法やＰＣＲ法等によって取得することができる。具体的には、例えば、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいて、各アミノ酸のコドンを適宜選択して塩基配列をデザインし、市販のＤＮＡ合成機を用いて化学合成すればよい。また、ビテロゲニンをコードする遺伝子の塩基配列（アクセッション番号：Ｘ１３６０７）中の本発明のペプチドをコードする領域を増幅するためのプライマーを設計し、これらプライマーを用いてニワトリゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ等を鋳型にしてＰＣＲ等を行うことにより、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００４３】
〔発現ベクター〕
本発明は、上記本発明のペプチドを製造するために使用される発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものであれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼの認識配列を有するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が好ましい。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択することができる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。本発明の発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物などから慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、本発明のペプチドを回収、精製することができる。
【００４４】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明のペプチドを融合ペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明のペプチドをＧＦＰ融合ペプチドとして発現させてもよい。
【００４５】
宿主は特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）などが挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００４６】
〔形質転換体〕
本発明は、上記本発明の発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。本発明の形質転換体は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含む。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞として例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。本発明の形質転換体は、本発明のペプチドが発現されていることを特徴とする。本発明の形質転換体は、本発明のペプチドが安定的に発現することが好ましいが、一過性に発現してもよい。
【００４７】
〔抗体〕
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、本発明のペプチドの検出や分離に使用することができる。
本明細書において「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ（鶏卵抗体）およびこれらのフラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメントなど））を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1988）」、岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（1991）」、「Makoto S．et al，Biosci. Biotech. Biochem.，56(2): 270-274， 1992」）に従えば作製することができる。
【００４８】
少数のアミノ酸（例えば、約２０残基以下）からなるペプチドに特異的に結合する抗体を作製する場合は、キャリアタンパク質（例えば、KLH(Keyhole limpet hemocyanin)、BSA(Bovine Serum Albumin)、OVA（Ovalbumin）等）に抗原ペプチドを結合させて免疫する方法、ＭＡＰｓ（Multiple Antigenic Peptides）法などの公知の方法を好適に用いることができる。
【００４９】
〔医薬〕
本発明のペプチドまたはその塩は、骨形成促進用の医薬として使用することができる。本発明の医薬は骨形成促進作用を有しているので、例えば、骨折、骨粗鬆症、骨形成不全、発達期における成長阻害などの予防または治療に好適に使用することができる。
【００５０】
本発明の医薬は、本発明のペプチドを有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００５１】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００５２】
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、体重約６０ｋｇのヒトにおいては、１日当たり約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤では、通常例えば体重約６０ｋｇのヒトにおいては、１日当たり約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
また、本発明は、骨形成促進剤を製造するための本発明のペプチドの使用も提供する。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
〔実施例１：卵黄タンパク加水分解物中の骨芽細胞増殖促進活性成分の同定〕
（１）卵黄タンパク加水分解物の調製
脱脂卵黄粉末（キユーピー株式会社製）１００質量部に、水５００質量部を加えて均一に撹拌した後、商品名「アルカラーゼ」（Bacillus licheniformis由来のプロテアーゼ、ノボザイムズ・ジャパン株式会社製）５質量部を加え、ｐＨ７で５５〜６０℃にて３時間反応させた。反応終了後、９０℃で１０分間の熱処理により酵素を失活させてから、濾過を行い、濾液を回収した。濾液をスプレー乾燥して、卵黄タンパク加水分解物を得た。
なお、脱脂卵黄粉末は、市販の卵黄粉末（例えば、キユーピー株式会社製）から調製することもできる。具体的には、市販の卵黄粉末１質量部に、エタノール（またはｎ−ヘキサン）５〜１０質量部を加え、ブレンダーで３０分間程度撹拌した後、濾過して固形物を回収する。この操作を３回ほど繰り返して卵黄から脱脂を行う。脱脂した卵黄を風乾することにより乾燥粉末を調製することができる。
【００５５】
（２）骨芽細胞増殖活性の測定方法
マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１ Ｓｕｂｃｌｏｎｅ−４（ATCC No.CRL-2593）を、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ培養液を用いて、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下でコンフルエントになるまで培養した後、トリプシン処理により細胞を集めた。集めた細胞を、上記α−ＭＥＭ培養液に懸濁して細胞懸濁液（1×104個／mL）を調製した。この細胞懸濁液を２４穴プレートに１ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で前培養した。翌日、Ｃａ濃度が５００μｇ／ｍＬになるようにＣａＣｌ２を添加したα−ＭＥＭ培養液９５０μＬにサンプルまたはＰＢＳ（−）を５０μＬ加えてよく混和した培養液に交換し、更に７２時間培養した。骨芽細胞の増殖活性は、ＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl) -2,5- Diphenyltetrazolium Bromide）アッセイ法および／またはセルカウント法にて測定した。サンプルの骨芽細胞の増殖促進活性は、ＰＢＳ（−）の増殖値を１００とした時の相対値で表した。
【００５６】
（３）ＵＦ膜による分画（１回目）
卵黄タンパク加水分解物１ｋｇを水１０Ｌに溶解し、ＵＦ膜（分画分子量：１０ｋＤａ、日本ミリポア株式会社製）を用いて分画し、分子量１０ｋＤａ以下の画分と分子量１０ｋＤａ以上の画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。分子量１０ｋＤａ以下の画分と分子量１０ｋＤａ以上の画分については、分画していない卵黄タンパク加水分解物中のそれぞれの画分の含量に相当する量（卵黄タンパク加水分解物相当量）を添加した。また、それぞれの画分を１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。
結果を図１に示した。図１から明らかなように、分子量１０ｋＤａ以下の画分に骨芽細胞増殖活性が認められた。
【００５７】
（４）ＵＦ膜による分画（２回目）
上記（３）で骨芽細胞増殖活性が認められた分子量１０ｋＤａ以下の画分を、さらにＵＦ膜（分画分子量：３ｋＤａ、日本ミリポア株式会社製）を用いて分画し、分子量３ｋＤａ−１０ｋＤａの画分と分子量３ｋＤａ以下の画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。また、上記（３）で得られた分子量１０Ｋ以下の画分についても測定した。
結果を図２に示した。図２から明らかなように、分子量３ｋＤａ−１０ｋＤａの画分に骨芽細胞増殖活性が認められた。
【００５８】
（５）ＯＤＳカラムによる分画
上記（４）で骨芽細胞増殖活性が認められた分子量３ｋＤａ−１０ｋＤａの画分をＯＤＳカラム（樹脂：商品名「ODS-A」、株式会社ワイエムシィ製、オープンカラムサイズ：φ35mm×200mm）に供し、各メタノール濃度（２０、４０、６０、８０％）で溶出して、分画した。得られた各画分について骨芽細胞増殖活性を測定した。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
結果を図３に示した。図３から明らかなように、メタノール２０％溶出画分に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
【００５９】
（６）ゲルろ過による分画
上記（５）で最も強い骨芽細胞増殖活性が認められたメタノール２０％溶出画分についてゲルろ過（樹脂：商品名「Superdex30 prep grade」、ＧＥヘルスケアジャパン株式会社製、オープンカラムサイズ：35mm×410mm、移動相：30％アセトニトリル、流速：0.6mL/min）を行い、７画分を分取した。
ゲルろ過により分取した画分を図４に示した。また、得られた７画分について、ＧＰＣ（Gel Permeation Chromatography：ゲル浸透クロマトグラフィー）分析を行った結果を図５に示した。ＧＰＣの条件は以下のとおりである。
カラム：商品名「YMC-Pack Diol-60(500×8.0mmI.D.)」（株式会社ワイエムシィ製）
移動相：0.1M KH2PO4-K2HPO4 containing 0.2M NaCl/Acetonitrile=70/30
流速：0.7mL/min
温度:室温
検出:UV215nm
サンプル濃度：2mg/ml
インジェクション量:10μL
【００６０】
ゲルろ過分画により得られた７画分のうち、フラクション１、３〜７の６画分について、骨芽細胞増殖活性を測定した（フラクション２は回収量が少なすぎたこととフラクション１とパターンが同じだったためアッセイを行わず）。陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。結果を図６に示した。図６から明らかなように、フラクション１に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
【００６１】
（７）ＨＰＬＣよる分画（１回目）
上記（６）で最も強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクション１についてＨＰＬＣで分画し、２０分ごとにフラクションを分取した。得られた４フラクションについて骨芽細胞増殖活性を測定した。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
カラム：商品名「5C18-AR-300（50×4.6mmI.D.）」（ナカライテスク株式会社製）
移動相：（A）5％Acetonitrile/0.5% TFA
（B）10％Acetonitrile/0.5% TFA
B 0%→100％（0-60min）Gradient
温度：40℃
検出：UV220nm
サンプル濃度：2mg/ml
インジェクション量：10μL
【００６２】
ＨＰＬＣにより検出されたピークおよび分取したフラクションの範囲を図７に示した。
骨芽細胞増殖活性を測定した結果を図８に示した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。図８から明らかなように、２０−４０分のフラクションに最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
そこで、２０−４０分のフラクションに存在する６〜１０の各ピークを分取し（図７参照）、各ピークの骨芽細胞増殖活性を測定した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。結果を図９に示した。図９から明らかなように、ピーク９（フラクションＮｏ．９）に最も強い骨芽細胞増殖活性が認められた。
【００６３】
（８）ＨＰＬＣよる分画（２回目）
上記（７）で最も強い骨芽細胞増殖活性が認められたフラクションＮｏ．９をさらにＨＰＬＣで分画した。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
ＯＤＳカラム：商品名「YMC-Pack ODS-A（250×4.6mm I.D.）」
株式会社ワイエムシィ製
移動相：7％Acetonitrile/0.5％TFA
流速：0.8mL/min
温度：40℃
検出：UV220nm
【００６４】
ＨＰＬＣの結果を図１０に示した。フラクションＮｏ．９から、さらに２つのピーク（Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９）が得られた。この２つのピーク（Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９）を分取し、それぞれについて骨芽細胞増殖活性を測定した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、いずれのピークにも骨芽細胞増殖活性が認められた。
【００６５】
（９）ペプチドの同定
Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９に含まれるペプチドのアミノ酸配列を、プロテインシークエンサを用いて解析した。その結果、Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９には、いずれも１２アミノ酸からなる同一の配列を有するペプチドが検出された。また、第１０位のアミノ酸に糖鎖が結合している可能性が示唆された（図１２参照）。
そこで、Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９に含まれるペプチドをノイラミニダーゼおよびペプチドＮ−グリカナーゼ（PNGase F、ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン製）で処理し、ＥＳＩ−ＭＳ（ナノ−エレクトロスプレイ質量分析計）、ＣＥ（キャピラリー電気泳動）およびＭＳ（質量分析計）を用いて糖鎖構造を解析した。
Ｎｏ．９−０のＥＳＩ−ＭＳ解析結果を図１３に、Ｎｏ．９のＥＳＩ−ＭＳ解析結果を図１４に、両者のＣＥおよびＭＳ解析結果を図１５にそれぞれ示した。これらの解析結果から、Ｎｏ．９−０およびＮｏ．９に含まれるペプチドは、図１６（Ａ）および（Ｂ）に示す糖ペプチドであることが明らかとなった。また、得られたペプチドのアミノ酸配列は、卵黄タンパク質であるβ−リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の第９０位−第１０１位に該当する部分配列であった。
【００６６】
〔実施例２：骨芽細胞増殖促進活性に必須のペプチドの解析〕
実施例１で同定された骨芽細胞増殖促進活性を有する糖ペプチドにおいて、糖鎖が結合していないペプチド、およびそのＮ末端側またはＣ末端側のアミノ酸を欠失させた各種ペプチドを化学合成し、骨芽細胞増殖促進活性を測定した。ペプチドの合成には、ペプチド自動合成装置Ｓｙｒｏ ＩＩ（バイオタージ・ジャパン株式会社製）を使用した。合成したペプチドを表１に示した。
【表１】
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【００６７】
各ペプチドの骨芽細胞増殖促進活性を測定した結果を図１７に示した。なお、各ペプチドの濃度は１μＭ、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。図１７から明らかなように、Ｎｏ．１１およびＮｏ．１２以外のペプチドは、骨芽細胞増殖促進活性を有していた。この結果から、少なくともＮｏ．１のペプチド（配列番号４）の第４位のアラニンは骨芽細胞増殖促進活性に必須であることが示唆された。
【００６８】
さらに、表２に示す２種類のペプチドを合成し、骨芽細胞増殖促進活性を測定した。
【表２】
2011211979.tif 000011
【００６９】
Ｎｏ．１３の結果を図１８に、Ｎｏ．１４の結果を図１９にそれぞれ示した。図１８および図１９から明らかなように、いずれのペプチドも骨芽細胞増殖促進活性を有していた。この結果から、Ｎｏ．１３のペプチドにおいてプロリンをバリンに置換しても骨芽細胞増殖促進活性に影響を及ぼさないことが確認された。
【００７０】
以上の結果を踏まえて、トリペプチド（ＡＥＳ）およびジペプチド（ＡＥ）をそれぞれ合成し、骨芽細胞増殖促進活性を測定した。なお、陽性対照として分画していない卵黄タンパク加水分解物（１ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
結果を図２０に示した。図２０から明らかなように、トリペプチド（ＡＥＳ）は、強い骨芽細胞増殖促進活性を有していた。一方、ジペプチド（ＡＥ）は骨芽細胞増殖活性をほとんど有していないことが分かる。この結果から、「ＡＥＳ」の３アミノ酸からなる配列が骨芽細胞増殖促進活性に必須であることが明らかとなった。なお、「ＡＥＳ」の３アミノ酸からなる配列は、β−リベチンのアミノ酸配列（配列番号１５）の第９３位−第９５位に該当する。
【００７１】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図４】
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【図７】
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【図１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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