(57)【要約】 【課題】  ストレスに起因する不調の治療薬用に、ホスファチドまたはホスファチド塩、ホスファチジン酸とホスファチジルセリンとを含むホスファチドの複合体を提供する。【解決手段】  本発明の製造方法は、（ａ）基質としての原材料のレシチンと、粒子サイズが０．０１ｍｍ以上の非水溶性の界面活性剤マトリックス材料とを用いるステップと、（ｂ）前記の非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料と原材料のレシチンとの混合物と、ホスホリパーゼＤ、ラセミ酸または異性体的に純粋なアミノ酸、またはアミンと塩とを、ｐＨ−バッファ水溶液内で、酵素処理するステップとを有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチドまたはホスファチド塩の製造方法において、
（ａ）  基質としての原材料のレシチンと、粒子サイズが０．０１ｍｍ以上の非水溶性の界面活性剤マトリックス材料とを用いるステップと、
（ｂ）  前記の非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料と原材料のレシチンとの混合物と、グループ「ホスホリパーゼＤ、ラセミ酸または異性体的に純粋なアミノ酸、またはアミンと塩」から選択された材料を、ｐＨ−バッファ水溶液内で、酵素処理するステップと、
を有し、
前記ステップ（ｂ）は、単一層の反応環境内で行われ、
その結果、前記原材料レシチンから派生した構造的脂肪酸鎖（structural fatty-acid chain）を有する
ことを特徴とするホスファチドまたはホスファチド塩の製造方法。
【請求項２】
（ｉ）  前記原材料のレシチンは、野菜レシチンと野菜以外のレシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉ）  前記野菜レシチンは、大豆レシチンと、ヒマワリ・レシチンと、菜種レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉｉ）  前記野菜以外のレシチンは、ミルクのリン脂質と、卵黄のレシチンと、魚レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｖ）  前記非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料は、非水溶性有機界面活性剤−マトリックス材料と、非水溶性無機界面活性剤−マトリックス材料とからなるグループから選択され、
（ｖ）  前記ホスホリパーゼDは、野菜ホスホリパーゼDと、バクテリア由来の酵素ホスホリパーゼDと、野菜ホスホリパーゼDとバクテリア−生来の酵素ホスホリパーゼDの化合物からなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記（ｂ）ステップは、ｐＨが４．５−８．０の範囲内にあるバッファ液の存在下で実行される
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
前記バッファ液は、Ｃ２−Ｃ８の鎖長のカルボキシル酸を有し、
前記カルボキシル酸の最終濃度は、前記ｐＨバッファされた水溶液内で、０．０１Ｍ−０．３Ｍの範囲内にある
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
前記（ｂ）ステップは、カルシウム塩の存在下で実行される
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
前記（ｂ）ステップは、２５−６０℃の範囲内の温度で実行される
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項７】
前記ホスホリパーゼDは、前記非水溶性界面活性剤−マトリックス材料に結合しているか、または前記ｐＨバッファされた水溶液内で遊離している
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１の製造方法で製造したホスファチドまたはホスファチド塩
【請求項９】
ホスファチジン酸とホスファチジルセリンとを含むホスファチドの複合体またはその塩の製造方法において、
（ａ）  基質としての原材料のレシチンと、粒子サイズが０．０１ｍｍ以上の非水溶性の界面活性剤マトリックス材料とを用いるステップと、
（ｂ）  前記の非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料と原材料のレシチンとの混合物と、グループ「ホスホリパーゼＤ、ラセミ酸または異性体的に純粋なアミノ酸、またはアミンと塩」から選択された材料を、ｐＨ−バッファ水溶液内で、酵素処理するステップと、
を有し、
前記ステップ（ｂ）は、単一層の反応環境内で行われ、
その結果、前記原材料レシチンから派生した構造的脂肪酸鎖（structural fatty-acid chain）を有する
ことを特徴とするホスファチジン酸とホスファチジルセリンとを含むホスファチドの複合体またはその塩の製造方法。
【請求項１０】
（ｉ）  前記原材料のレシチンは、野菜レシチンと野菜以外のレシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉ）  前記野菜レシチンは、大豆レシチンと、ヒマワリ・レシチンと、菜種レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉｉ）  前記野菜以外のレシチンは、ミルクのホスファチジン酸と、卵黄のレシチンと、魚レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｖ）  前記非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料は、非水溶性有機界面活性剤−マトリックス材料と、非水溶性無機界面活性剤−マトリックス材料とからなるグループから選択され、
（ｖ）  前記ホスホリパーゼDは、野菜ホスホリパーゼDと、バクテリア由来の酵素ホスホリパーゼDと、野菜ホスホリパーゼDとバクテリア−生来の酵素ホスホリパーゼDの化合物からなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記（ｂ）ステップは、ｐＨが４．５−８．０の範囲内にあるバッファ液の存在下で実行される
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１２】
前記バッファ液は、Ｃ２−Ｃ８の鎖長のカルボキシル酸を有し、
前記カルボキシル酸の最終濃度は、前記ｐＨバッファされた水溶液内で、０．０１Ｍ−０．３Ｍの範囲内にある
ことを特徴とする請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
前記（ｂ）ステップは、カルシウム塩の存在下で実行される
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１４】
前記（ｂ）ステップは、２５−６０℃の範囲内の温度で実行される
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１５】
前記セリーンのホスファチドに対するモル比率は、最大で２０：１で、前記複合体を製造するよう調整される
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１６】
前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を少なくとも３％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１７】
前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１８】
前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を２０−７０％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１９】
前記ホスホリパーゼDは、前記非水溶性界面活性剤−マトリックス材料に結合しているか、または前記ｐＨバッファされた水溶液内で遊離している
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項２０】
請求項９記載の製造方法で生成したホスファチドの複合体又はその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチド（phosphatide: phophatidic acidの旧名）を生成する方法に関する。特に本発明は、非水溶性で安定した界面活性剤マトリックス材料（water-insoluble stationary surfactant-matrix material）の存在下で反応する標準の天然のリン脂質（phosphalipid）から得られる特殊なリン脂質の製造プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
特殊なリン脂質（phophalipid例えば、ホスファチジルセリン（phophatidylserine）、ホスファチジン酸（phophatidic acid）、ある種のホスファチジルグリロール（phophatidylglycerol））は、医薬の成分、栄養的化合物、機能食品で使用される。
【０００３】
機能性原料としてのホスファチジルセリンの重要性は２００３年に例証された。２００３年は、米国食品医薬品局（ＵＳ ＦＤＡ：U.S. Food and Drug Administration)は、ホスファチジルセリンの使用は、高齢者の認識障害のリスクと高齢者の認知症の減少に関連するという２つの効能表示(ＱＨＣ：Qualified Health Claims)を公認した年である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６４９２１４６号明細書
【特許文献２】ＷＯ２０００／０５６８６９号公報
【特許文献３】ＷＯ２００２／０９０５６０号公報
【特許文献４】米国特許第６４１０５２２号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】The International Journal on the Biology of Stress, Vol. 7, No. 2, 119-126, June, 2004
【非特許文献２】Methods in Enzymology, Vol. 72, pages: 632-639, 1981
【０００６】
従来、ヘルハマー（Hellhammer)他は、精神的なストレスに対する内分泌反応と心理的反応に関する大豆レシチンのホスファチジン酸とホスファチジルセリンの複合体（ＰＡＳ：Soy Lecithine Phophatidic Acid and Phophatidyleserine Complex）の影響を強調している。非特許文献１は、ホスファチジン酸とホスファチジルセリンの複合体の経口投与は、精神的ストレス、感情的なストレスに対する下垂体副腎反応（ＡＣＴＨ、コルチゾール）と精神的な反応（Spielberger's State-Trait Anxiety Inventory (STAI)stress subscale）の低下に結び付くことを報告している。この結果は、ホスファチジン酸とホスファチジルセリンの合成物の経口投与は、ストレスに起因する不調の治療薬として用いることができることを示している。
【０００７】
アイブル（Eibl)他は、非特許文献２において「ホスホリパーゼD（phospholipase-D）によるリン脂質の類似体（analogs=analogues: アナローグもしくは類似体；構造的に似ているが組成の異なる化合物の総称）の製剤」を記載している。
「ホスホリパーゼD」：ホスファチジルコリンの加水分解によりコリンとホスファチジン酸を生成させる酵素。
【０００８】
特許文献１は、ラセミ酸(racemic)または異性体的に純粋なセリン（enantiomerically pure serice）（即ち、Ｌ−セリン）を、酵素であるホスホリパーゼ−Ｄ（ＰＬＤ：enzyme phopholipaseＰＬＤ）と界面活性剤の存在下で製造する方法を開示する。界面活性剤は、基質１ｇ当たり０．４ｇ未満の量であり、そこでの反応媒体は、有機溶剤を含有しない水分散液（aqueous dispersion free of organic solvent）である。同特許文献によれば、この製造方法の主な利点は、ホスファチジルコリンのリン酸基転移（transphosphatidylation)反応と水性溶媒中の類似のホスファチドのリン酸基転移反応が行われて、高純度のホスファチジルセリンを極めて高い収率で得られ、副産物としてのホスファチジン酸が最小となる点である。
【０００９】
一般的に、溶剤は、このような反応中に、レシチン（lecithin）を完全に分解するために用いられる。分解された溶液は、縣濁液とは異なり、プロセスをより管理し易くする。
【００１０】
特許文献２は、疎水性有機媒体中で、油と脂肪を、非水溶性のマトリックスに固定化された界面活性剤−コートされたリパーゼの複合体（insoluble matrix-immobolized surfactant-coated-lipase complex）を生体触媒として用いて、エステル交換（interesterification=transesterification: ある有機酸エステルのアルコール部を入れ換えて、別のエステルに転化する反応）の準備方法を開示する。非水溶性のマトリックスに固定化された界面活性剤−コートされたリパーゼの複合体の準備方法は、好ましい順番で、以下のステップを含む：リパーゼを界面活性剤と接触させるステップと；リパーゼをある濃度の非水溶性のマトリックスと接触させるステップである。これによりリパーゼをマトリックス上に固定化させる。
【００１１】
特許文献３は、グリセロリン酸（glycerophospholipids）とその合成物または天然の類似体を製造する酵素−触媒化した合成方法（enzyme-catalyzed sythetic process）を開示する。この合成方法は、グロセロリン酸コリン（ＧＰＣ：glycerophosphorylcholine）とその類似派生物を基質（substrate）として、脂肪酸派生物と共に、用いて、１，２−ジアシル化(diacylated)−リゾリン脂質（lysophospholipids)と、１−アシル化(acylated)−２−リゾリン脂質（lysophospholipids)を製造する、酵素のエステル化／エステル交換のプロセスを開示する。この類似派生物においては、コリンの半分が、エタノールアミン（ethanolamine）、セリン（serine）、イノシトール（inositol）、グリセロール（glycerol）、あるいは他のアルコール類で置換されている。反応は、溶剤中、又は微少水溶液のサブシステム（microaqueous sub-system)が生成されるような溶剤−水系と溶剤中で、ホスホリパーゼの存在下で行われる。このホスホリパーゼは、固定化されておらず、界面活性剤でコートされるか、あるいは好ましくは、非水溶性のマトリックス上に固定化され、選択的事項として界面活性剤でコート（変形）される。このプロセスは、１−アシル(acyl)−２−リゾ(lyso)−グリセロリン脂質と１，２−ジ(di)−アシル化グリセロリン脂質を高い変換率で形成できることになる。
【００１２】
特許文献４は、抗鬱薬、ストレス抑制薬、気分改善薬を開示する。これらの薬剤は、血中コルチソル・レベル（blood cortisol level）とセロトニンの再摂取（serotonin reuptake）を減少させ、気分改善薬を投与された患者の憂鬱、精神的ストレス、情緒的ストレスに関連する症状を軽減する効果を有することを開示する。
【００１３】
ホスファチドとその塩をを生成する方法において、反応は、溶剤を含まない水性溶媒中で、触媒として機能する非水溶性で安定した非界面活性剤−マトリックス材料の存在下で行われるのが好ましい。このプロセスにより、ホスファチドの生成と分離が行われるが、その際、界面活性剤を溶剤等の反応混合物から抽出する高価なステップは必要はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、ホスファチドとその塩を生成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一実施例によれば、ホスファチジン酸とホスファチジルセリンが、レシチンから、酵素変換により得られる。この変換は、ｐＨバッファされた水溶液、ラセミ酸または異性体的に純粋なセリン、好ましくは（Ｌ）−セリンとホスホリパーゼDを用いた塩で、行われる。反応は、触媒として機能する非水溶性の有機または無機の安定した界面活性剤−マトリックス材料の存在下で行われる。遊離した酵素（free enzyme）を使用することにより、基質へのより良好なアクセスが可能となる。このような反応プロセスは、反応に触媒作用する酵素の効率を改善する。、これは非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料が存在しない状態で行われた反応に比較すると、酵素の効率は、改善されている。
【００１６】
本発明の一実施例では、ホスファチジン酸とホスファチジルセリンを、低コストで食料用あるいは機能食品の材料として、同時に生成できるプロセスを提供する。この方法は安全で、界面活性剤を反応混合物から抽出する高価なステップを必要としない。
【００１７】
本発明によれば、ホスファチドまたはホスファチド塩の製造方法は、（ａ）基質としての原材料のレシチンと、粒子サイズが０．０１ｍｍ以上の非水溶性の界面活性剤マトリックス材料とを用いるステップと、（ｂ）前記の非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料と原材料のレシチンとの混合物と、ホスホリパーゼＤ、ラセミ酸または異性体的に純粋なアミノ酸、またはアミンと塩とを、ｐＨ−バッファ水溶液内で、酵素処理するステップとを有する。前記ステップ（ｂ）は、単一層の反応環境内で行われ、その結果、前記原材料レシチンから派生した構造的脂肪酸鎖（structural fatty-acid chain）を有するホスファチドまたはホスファチド塩を製造する。
【００１８】
好ましくは、（ｉ）前記原材料のレシチンは、野菜レシチンと野菜以外のレシチンからなるグループから選択される。（ｉｉ）前記野菜レシチンは、大豆レシチンと、ヒマワリ・レシチンと、菜種レシチンからなるグループから選択される。（ｉｉｉ）前記野菜以外のレシチンは、ミルクのリン脂質と、卵黄のレシチンと、魚レシチンからなるグループから選択される。（ｉｖ）前記非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料は、非水溶性有機界面活性剤−マトリックス材料と、非水溶性無機界面活性剤−マトリックス材料とからなるグループから選択される。（ｖ）前記ホスホリパーゼDは、野菜ホスホリパーゼDと、バクテリア由来の酵素ホスホリパーゼDと、野菜ホスホリパーゼDとバクテリア−生来の酵素ホスホリパーゼDの化合物からなるグループから選択される。
【００１９】
好ましくは、前記（ｂ）ステップは、ｐＨが４．５−８．０の範囲内にあるバッファ液の存在下で実行される。
【００２０】
好ましくは、前記バッファ液は、Ｃ２−Ｃ８の鎖長のカルボキシル酸を有し、前記カルボキシル酸の最終濃度は、前記ｐＨバッファされた水溶液内で、０．０１Ｍ−０．３Ｍの範囲内にある。前記（ｂ）ステップは、カルシウム塩の存在下で実行される。前記（ｂ）ステップは、２５−６０℃の範囲内の温度で実行される。前記ホスホリパーゼDは、前記非水溶性界面活性剤−マトリックス材料に結合しているか、または前記ｐＨバッファされた水溶液内で遊離している。上記の製造方法で製造したホスファチドまたはホスファチド塩。
【００２１】
好ましくは、ホスファチジン酸とホスファチジルセリンとを含むホスファチドの複合体またはその塩の製造方法は、（ａ）基質としての原材料のレシチンと、粒子サイズが０．０１ｍｍ以上の非水溶性の界面活性剤マトリックス材料とを用いるステップと、（ｂ）前記の非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料と原材料のレシチンとの混合物と、ホスホリパーゼＤ、ラセミ酸または異性体的に純粋なアミノ酸、またはアミンと塩とを、ｐＨ−バッファ水溶液内で、酵素処理するステップとを有する。前記ステップ（ｂ）は、単一層の反応環境内で行われ、その結果、前記原材料レシチンから派生した構造的脂肪酸鎖（structural fatty-acid chain）を有するホスファチジン酸とホスファチジルセリンとを含むホスファチドの複合体またはその塩を製造する。
【００２２】
好ましくは、（ｉ）  前記原材料のレシチンは、野菜レシチンと野菜以外のレシチンからなるグループから選択される。（ｉｉ）前記野菜レシチンは、大豆レシチンと、ヒマワリ・レシチンと、菜種レシチンからなるグループから選択される。（ｉｉｉ）前記野菜以外のレシチンは、ミルクのホスファチジン酸と、卵黄のレシチンと、魚レシチンからなるグループから選択される。（ｉｖ）前記非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料は、非水溶性有機界面活性剤−マトリックス材料と、非水溶性無機界面活性剤−マトリックス材料とからなるグループから選択される。（ｖ）前記ホスホリパーゼDは、野菜ホスホリパーゼDと、バクテリア由来の酵素ホスホリパーゼDと、野菜ホスホリパーゼDとバクテリア−生来の酵素ホスホリパーゼDの化合物からなるグループから選択される。
【００２３】
好ましくは、前記（ｂ）ステップは、ｐＨが４．５−８．０の範囲内にあるバッファ液の存在下で実行される。前記バッファ液は、Ｃ２−Ｃ８の鎖長のカルボキシル酸を有し、前記カルボキシル酸の最終濃度は、前記ｐＨバッファされた水溶液内で、０．０１Ｍ−０．３Ｍの範囲内にある。前記（ｂ）ステップは、カルシウム塩の存在下で実行される。前記（ｂ）ステップは、２５−６０℃の範囲内の温度で実行される。前記セリーンのホスファチドに対するモル比率は、最大で２０：１で、前記複合体を製造するよう調整される。
【００２４】
好ましくは、前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を少なくとも３％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する。前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を少なくとも１０％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する。前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を２０−７０％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する。前記ホスホリパーゼDは、前記非水溶性界面活性剤−マトリックス材料に結合しているか、または前記ｐＨバッファされた水溶液内で遊離している。上記の製造方法で生成したホスファチドの複合体又はその塩。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２５】
大豆レシチンを原材料として用いて、ホスファチジル基−Ｌ−セリン（phosphatidyl-L-serine）と、ホスファチジン酸とを以下のプロセスで同時に生成した。
弱酸性の陽イオン交換体（Amberlite IRC-50 resin; Sigma-Aldrich Fluka）５０ｇを５００ｍｌのガラス瓶の中に入れて、塩化チオニル（thionychloride）１００ｇと、室温で１２時間反応させた。その後、この流体を静かに注ぎ、残留物を過剰のドデシルアミン(dodecylamine)１５０ｇで、さらに１２時間４℃で処理した。この液体を静かに注ぎ、残留物を水で４回洗浄し減圧状態で乾燥させて、界面活性剤−マトリックス材料を得た。
上記のガラス瓶内の界面活性剤−マトリックス材料に、５０ｇの大豆レシチン（EpikuronTM 130P powder; Cargill Europe BVBA）と、７５ｇのアミノ酸Ｌ−セリン（amino acid L-serine）と、４ｇの塩化カルシウム（calcium chloride）と、１５０ｍｌのバッファ液（0.1M ヘキサン酸（hexanoic acid), pH 5.0）を添加し、激しく攪拌し、４５℃に３０分間加熱した。
【００２６】
キャベツからのホスホリパーゼD（P 8398 phospholipase-D; Sigma）５００単位を前記の混合物に添加して、１．５時間４５℃で攪拌機で攪拌させながら反応させた。反応溶液内で酵素を不活性化するために、反応溶液を入れたガラス瓶を熱湯中に沈めた。その後、反応溶液を氷で冷却した。リン脂質を抽出するために、７５ｍｌの蒸留水を前記混合物に添加して、その後３０分間攪拌した。その後、この溶液を３０分間遠心分離し、２層に分けた。下層は廃棄し、その後、残り上層を減圧状態で乾燥させた。ホスファチドの最終組成は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ)で、次のとおりと決定した：ＰＡ２１．６％；ＰＳ１２．３％；ＰＣ５．３％；ＰＥ６．８％である。
【００２７】
大豆レシチンを原材料として用いた第２の方法においては、ホスファチジン酸とホスファチジル基−Ｌ−セリンは、第１の方法と同一のプロセスで同時に生成した。ただし安定した界面活性剤は用いなかった。リン脂質の最終組成は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ)で次のとおり決定した。ＰＡ１５．１；ＰＳ８．１％；ＰＣ１４．１％；ＰＥ８．６％である。
【実施例２】
【００２８】
大豆レシチンを原材料として用いて、ホスファチジル基−Ｌ−セリン（phosphatidyl-L-serine）を以下のプロセスで生成した。
弱酸性の陽イオン交換体（Amberlite IRC-50 resin; Sigma-Aldrich Fluka）５０ｇを５００ｍｌのガラス瓶の中に入れて、塩化チオニル（thionychloride）１００ｇと、室温で１２時間反応させた。その後、この流体を静かに注ぎ、残留物を過剰のドデシルアミン(dodecylamine)１５０ｇで、さらに１２時間４℃で処理した。この液体を静かに注ぎ、残留物を水で４回洗浄し減圧状態で乾燥させて、界面活性剤−マトリックス材料を得た。
上記のガラス瓶内の界面活性剤−マトリックス材料に、５０ｇの大豆レシチン（EpikuronTM 130P powder; Cargill Europe BVBA）と、７５ｇのアミノ酸Ｌ−セリン（amino acid L-serine）と、４ｇの塩化カルシウム（calcium chloride）と、１５０ｍｌのバッファ液（0.1M ヘキサン酸（hexanoic acid), pH 5.0）を添加し、激しく攪拌し、４５℃に３０分間加熱した。
【００２９】
ストレプトミセス属（非運動性で好気性グラム陽性菌の一族）からのホスホリパーゼD（P 4912 Streptomyces sp; Sigma-Aldrich）５００単位を前記の混合物に添加して、１．５時間４５℃で攪拌機で攪拌させながら反応させた。反応溶液内で酵素を不活性化するために、反応溶液を入れたガラス瓶を熱湯中に沈めた。その後、反応溶液を氷で冷却した。リン脂質を抽出するために、７５ｍｌの蒸留水を前記混合物に添加して、その後３０分間攪拌した。その後、この溶液を３０分間遠心分離し、２層に分けた。下層は廃棄し、その後、残り上層を減圧状態で乾燥させた。ホスファチドの最終組成は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ)で、次のとおりと決定した：ＰＡ６．６％；ＰＳ２７．３％；ＰＣ４．３％；ＰＥ５．３％である。
【００３０】
大豆レシチンを原材料として用いた第２の方法においては、ホスファチジル基−Ｌ−セリンは、第１の方法と同一のプロセスで同時に生成した。ただし安定した界面活性剤は用いなかった。リン脂質の最終組成は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ)で次のとおり決定した。ＰＡ４．３；ＰＳ１８．５％；ＰＣ１３．２％；ＰＥ７．５％である。
【実施例３】
【００３１】
卵黄レシチンを原材料として用いて、ホスファチジル基−Ｌ−セリン（phosphatidyl-L-serine）と、ホスファチジン酸とを以下のプロセスで同時に生成した。
弱酸性の陽イオン交換体（Amberlite IRC-50 resin; Sigma-Aldrich Fluka）５０ｇを５００ｍｌのガラス瓶の中に入れて、塩化チオニル（thionychloride）１００ｇと、室温で１２時間反応させた。その後、この流体を静かに注ぎ、残留物を過剰のドデシルアミン(dodecylamine)１５０ｇで、さらに１２時間４℃で処理した。この液体を静かに注ぎ、残留物を水で４回洗浄し減圧状態で乾燥させて、界面活性剤−マトリックス材料を得た。
上記のガラス瓶内の界面活性剤−マトリックス材料に、５０ｇの卵黄レシチン（Ds-PL95E; Doosan Corp. venture BG Biotech BU, Korea）と、７５ｇのアミノ酸Ｌ−セリン（amino acid L-serine）と、４ｇの塩化カルシウム（calcium chloride）と、１５０ｍｌのバッファ液（0.1M ヘキサン酸（hexanoic acid), pH 5.0）を添加し、激しく攪拌し、４５℃に３０分間加熱した。
【００３２】
ストレプトミセス属からのホスホリパーゼD（P 4912 Streptomyces sp; Sigma-Aldrich）２５０単位と、キャベツからのホスホリパーゼD（P 8398 phospholipase-D; Sigma）２５０単位を前記の混合物に添加して、５．５時間４５℃で攪拌機で攪拌させながら反応させた。
反応溶液内で酵素を不活性化するために、反応溶液を入れたガラス瓶を熱湯中に沈めた。その後、反応溶液を氷で冷却した。リン脂質を抽出するために、７５ｍｌの蒸留水を前記混合物に添加して、その後３０分間攪拌した。その後、この溶液を３０分間遠心分離し、２層に分けた。下層は廃棄し、その後、残り上層を減圧状態で乾燥させた。ホスファチドの最終組成は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ)で、次のとおりと決定した：ＰＡ４２．６％；ＰＳ４３．３％；ＰＣ３．３％；ＰＥ２．２％である。
【００３３】
卵黄レシチンを原材料として用いた第２の方法においては、ホスファチジン酸とホスファチジル基−Ｌ−セリンは、第１の方法と同一のプロセスで同時に生成した。ただし安定した界面活性剤は用いなかった。リン脂質の最終組成は、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ)で次のとおり決定した。ＰＡ３５．３％；ＰＳ３７．６％；ＰＣ１２．２％；ＰＥ４．２％である。
【００３４】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【手続補正書】
【提出日】平成22年5月11日(2010.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチドまたはホスファチド塩の製造方法において、
（ａ）  基質としての原材料のレシチンと、粒子サイズが０．０１ｍｍ以上の非水溶性の界面活性剤マトリックス材料とを用いるステップと、
（ｂ）  前記の非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料と原材料のレシチンとの混合物と、グループ「ホスホリパーゼＤ、ラセミ酸または異性体的に純粋なセリン、アミノ酸、またはアミンと塩」から選択された材料を、ｐＨ−バッファ水溶液内で、酵素処理するステップと、
を有し、
前記ステップ（ｂ）は、単一層の反応環境内で行われ、
その結果、前記原材料レシチンから派生した構造的脂肪酸鎖（structural fatty-acid chain）を有する
ことを特徴とするホスファチドまたはホスファチド塩の製造方法。
【請求項２】
（ｉ）  前記原材料のレシチンは、野菜レシチンと野菜以外のレシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉ）  前記野菜レシチンは、大豆レシチンと、ヒマワリ・レシチンと、菜種レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉｉ）  前記野菜以外のレシチンは、ミルクのリン脂質と、卵黄のレシチンと、魚レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｖ）  前記非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料は、非水溶性有機界面活性剤−マトリックス材料と、非水溶性無機界面活性剤−マトリックス材料とからなるグループから選択され、
（ｖ）  前記ホスホリパーゼDは、野菜ホスホリパーゼDと、バクテリア由来の酵素ホスホリパーゼDと、野菜ホスホリパーゼDとバクテリア−生来の酵素ホスホリパーゼDの化合物からなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記（ｂ）ステップは、カルシウム塩とｐＨが４．５−８．０の範囲内にあるバッファ液の存在下で、２５−６０℃の範囲内の温度で、実行される
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
前記バッファ液は、Ｃ２−Ｃ８の鎖長のカルボキシル酸を有し、
前記カルボキシル酸の最終濃度は、前記ｐＨバッファされた水溶液内で、０．０１Ｍ−０．３Ｍの範囲内にある
ことを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記ホスホリパーゼDは、前記非水溶性界面活性剤−マトリックス材料に結合しているか、または前記ｐＨバッファされた水溶液内で遊離している
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１の製造方法で製造したホスファチドまたはホスファチド塩
【請求項７】
ホスファチジン酸とホスファチジルセリンとを含むホスファチドの複合体またはその塩の製造方法において、
（ａ）  基質としての原材料のレシチンと、粒子サイズが０．０１ｍｍ以上の非水溶性の界面活性剤マトリックス材料とを用いるステップと、
（ｂ）  前記の非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料と原材料のレシチンとの混合物と、グループ「ホスホリパーゼＤ、ラセミ酸または異性体的に純粋なセリン、アミノ酸、またはアミンと塩」から選択された材料を、ｐＨ−バッファ水溶液内で、酵素処理するステップと、
を有し、
前記ステップ（ｂ）は、単一層の反応環境内で行われ、
その結果、前記原材料レシチンから派生した構造的脂肪酸鎖（structural fatty-acid chain）を有する
ことを特徴とするホスファチジン酸とホスファチジルセリンとを含むホスファチドの複合体またはその塩の製造方法。
【請求項８】
（ｉ）  前記原材料のレシチンは、野菜レシチンと野菜以外のレシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉ）  前記野菜レシチンは、大豆レシチンと、ヒマワリ・レシチンと、菜種レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｉｉ）  前記野菜以外のレシチンは、ミルクのホスファチジン酸と、卵黄のレシチンと、魚レシチンからなるグループから選択され、
（ｉｖ）  前記非水溶性の界面活性剤−マトリックス材料は、非水溶性有機界面活性剤−マトリックス材料と、非水溶性無機界面活性剤−マトリックス材料とからなるグループから選択され、
（ｖ）  前記ホスホリパーゼDは、野菜ホスホリパーゼDと、バクテリア由来の酵素ホスホリパーゼDと、野菜ホスホリパーゼDとバクテリア−生来の酵素ホスホリパーゼDの化合物からなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記（ｂ）ステップは、カルシウム塩とｐＨが４．５−８．０の範囲内にあるバッファ液の存在下で、２５−６０℃の範囲内の温度で実行される
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
前記バッファ液は、Ｃ２−Ｃ８の鎖長のカルボキシル酸を有し、
前記カルボキシル酸の最終濃度は、前記ｐＨバッファされた水溶液内で、０．０１Ｍ−０．３Ｍの範囲内にある
ことを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
前記セリーンのホスファチドに対するモル比率は、最大で２０：１で、前記複合体を製造するよう調整される
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１２】
前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を少なくとも３％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１３】
前記複合体は、全リン脂質の内、ホスファチジン酸を２０−７０％（ｗ／ｗ）、ホスファチジルセリンを少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を含有する
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１４】
前記ホスホリパーゼDは、前記非水溶性界面活性剤−マトリックス材料に結合しているか、または前記ｐＨバッファされた水溶液内で遊離している
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項７記載の製造方法で生成したホスファチドの複合体又はその塩。