(57)【要約】【課題】簡便、迅速かつ正確にトールフェスクの品種識別を行うためのＳＳＲプライマー対、特定マーカー遺伝子、及びその品種の識別方法を提供する。【解決手段】イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて設計したプライマー対、識別対象となるトールフェスクをバルクすることで、個体間の遺伝子のばらつきを無くし、品種特異的なＳＳＲをＰＣＲで特異的に増幅させた特定マーカー遺伝子、増幅された特定マーカー遺伝子断片の長さの違いを検出することで、品種の識別を行うトールフェスクの品種識別方法。【効果】トールフェスク５品種２系統の品種識別に有用なＳＳＲプライマー対、特定マーカー遺伝子及び品種識別方法を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トールフェスクの品種識別用のプライマーであって、トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
【請求項２】
トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１３のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号４〜６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするトールフェスクの品種識別用プライマーセット。
【請求項５】
トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する請求項１から４のいずれかに記載のプライマーからＰＣＲ増幅させた特定の増幅産物からなることを特徴とする特定マーカー遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号７〜９のいずれかの塩基配列を有する、請求項５に記載の特定マーカー遺伝子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の特定マーカー遺伝子を使用して、識別対象のトールフェスクＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするトールフェスクの品種識別方法。
【請求項８】
請求項５又は６に記載のマーカー遺伝子を使用して、識別対象のトールフェスク遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするトールフェスク品種識別方法。
【請求項９】
対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したトールフェスク遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
フォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロス、九州１４号、九州１５号の５品種２系統からなるトールフェスク品種を識別する、請求項７から９のいずれかに記載の品種識別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トールフェスクの品種の識別のために、特定のＳＳＲ領域を増幅させる遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対に関するものであり、更に詳しくは、トールフェスク５品種２系統を識別することを可能とする、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用のＦプライマー及びＲプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカーの塩基配列、該マーカーを利用してトールフェスクの品種を識別する方法に関するものである。本発明は、トールフェスクの品種識別用のＳＳＲプライマー、該プライマーを利用してトールフェスクのゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅させ、その増幅断片のマーカーを比較することで品種を識別することを可能とするトールフェスク品種の識別方法に関する新技術・新製品を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
トールフェスク（Ｆｅｓｔｕｃａ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ  Ｓｃｈｒｅｂ．）は、寒地型牧草として利用される他にも道路の方面等の緑化用にも使用される多年生イネ科の植物である。
【０００３】
トールフェスクは、染色体の基本数が７の異質６倍体（２ｎ＝４２）とされているが、４、８、１０倍体も存在している。本発明で使用する育成品種のすべてが６倍体である。
【０００４】
イタリアンライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ  Ｌａｍ．）は、短年生のイネ科植物である。このイタリアンライグラスは、トールフェスクとは近い類縁関係であるため、イタリアンライグラスのプライマーの一部は、トールフェスクの遺伝子の増幅にも使用可能である。
【０００５】
先行技術として、主に飼料作物として利用される他殖性のイネ科牧草の品種識別法として、イタリアンライグラスにおいて、１２品種を識別する方法が開発されている（特許文献１参照）。
【０００６】
この方法は、イタリアンライグラスのゲノム上のＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ    Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域をＰＣＲで増幅させ、増幅された断片の長さの違いを検出することで品種を識別するものである。しかし、トールフェスクにおいては、このような品種識別法が開発されていない。
【０００７】
このため、トールフェスクの品種識別は、これまで、圃場での特性調査により行われてきた。圃場での特性調査とは、例えば、一検体につき１０個体６反復計６０個体を栽培し、草丈、出穂月日、草型、葉身長等の形質を調査し、共に栽培した６０個体の標準個体と比較して同品種かどうか判定を行う方法である。しかしながら、このような圃場での特性調査は、１）調査のための圃場が必要である、２）調査に多くの労力が必要である、３）調査結果が判明するまでに多くの時間が必要である、等の問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２３７１８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、短期間で、簡便且つ正確にトールフェスク５品種２系統を識別できる新しい手法を開発することを目標として鋭意研究を重ねた結果、トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマーから増幅される特定マーカーを用いることにより所期の目的を達成し得ることを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとしたトールフェスクの品種識別を可能にするＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）用のＳＳＲプライマー対を提供することを目的とするものである。
【００１１】
更に、本発明は、労力及び時間が必要な従来の圃場での特性調査に代わり、短期間で、簡便且つ正確にトールフェスクの品種識別を可能にするＰＣＲ用のプライマー対、該プライマー対からＰＣＲ増幅させた識別対象の遺伝子の特定マーカー塩基配列、該マーカーを利用したトールフェスクの品種識別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）トールフェスクの品種識別用のプライマーであって、トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対。
（２）トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーからなる、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両端の塩基配列を用いて設計した遺伝子増幅用プライマー対であって、配列表の配列番号１〜１３のＦ（Ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号４〜６のＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーを１対とするプライマー対である、前記（１）に記載のプライマー対。
（４）前記（２）又は（３）に記載のプライマー対の単数又は複数の組合せからなることを特徴とするトールフェスクの品種識別用プライマーセット。
（５）トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する前記（１）から（４）のいずれかに記載のプライマーからＰＣＲ増幅させた特定の増幅産物からなることを特徴とする特定マーカー遺伝子。
（６）配列表の配列番号７〜９のいずれかの塩基配列を有する、前記（５）に記載の特定マーカー遺伝子。
（７）前記（５）又は（６）に記載の特定マーカー遺伝子を使用して、識別対象のトールフェスクＤＮＡのＰＣＲ増幅の増幅産物の多型を確認することで品種の識別を行うことを特徴とするトールフェスクの品種識別方法。
（８）前記（５）又は（６）に記載のマーカー遺伝子を使用して、識別対象のトールフェスク遺伝子のＰＣＲ増幅産物のサイズ又はバンドパターンに基づいて、品種の識別を行うことを特徴とするトールフェスク品種識別方法。
（９）対象品種のバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとして使用したトールフェスク遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に、数品種の識別を行う、前記（７）又は（８）に記載の方法。
（１０）フォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロス、九州１４号、九州１５号の５品種２系統からなるトールフェスク品種を識別する、前記（７）から（９）のいずれかに記載の品種識別方法。
【００１３】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、トールフェスクの品種識別用のプライマーであって、トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマー対の点に特徴を有するものである。また、本発明は、トールフェスクの品種識別方法であって、トールフェスクのゲノム上におけるＳＳＲ領域を増幅する上記のプライマーから増幅される特定マーカーを使用し、識別対象のトールフェスクＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物の多型を確認することで、品種の識別を行うことを特徴とするものである。
【００１４】
本発明では、イタリアンライグラスのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いてプライマー対を設計し、識別対象のトールフェスク遺伝子の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズ、及びバンドパターン（複数の遺伝子座のバンドの有無による組み合わせ）を確認することで品種を識別する。
【００１５】
対象品種のバルクＤＮＡを使用することで１個体毎の解析を行わないため、トールフェスクの遺伝子のＰＣＲによる増幅を行い、同時に数品種の解析が行える。
【００１６】
本発明により、トールフェスクの品種を識別するイタリアンライグラスのＳＳＲマーカーが提供され、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、トールフェスクのフォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロス、九州１４号、九州１５号の５品種２系統間の品種識別を行うことができる。
【００１７】
他殖性のトールフェスクは遺伝的に個体間で異なるが、バルクＤＮＡをテンプレートとして用いることで、品種の非特異的な個体間の差異を無くし、かつ効率よく品種の識別が可能となる。
【００１８】
本発明では、表１に示した２〜３塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計した遺伝子増幅用プライマーの３対の単数又は複数のプライマー対を使用し、対象となるトールフェスク５品種２系統についてＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を比較することで品種を識別する。
【００１９】
本発明では、実際の使用時に、バルクＤＮＡをテンプレートとすることを想定し、品種特異的なＳＳＲマーカーを選抜するため、対象品種のゲノムＤＮＡを複数個体混合するバルクしたＤＮＡをテンプレートとすることにより識別が行われる。そのため、本発明では、例えば、濃度を一定にしたトールフェスクＤＮＡを１０個体合わせて、バルクＤＮＡテンプレートとして使用する。
【００２０】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、プライマー設計ソフトウエア「ｐｒｉｍｅｒ  ０．５，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用して作成した。本発明で、トールフェスクの品種識別に有用なプライマー対の配列を、次の表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
次に、上記表１のプライマー対の５品種２系統内での増幅型の詳細について説明する（表２参照）。
【００２３】
「Ｄ０１Ｍ２２」は、５品種を同時に識別するプライマー対で、１４５ｂｐ〜１７５ｂｐの間で、５品種の全てが異なる増幅パターン、すなわち、品種特異的なバンドパターンを示す。しかし、九州１４号、九州１５号は、同パターンを示すため、「Ｄ０５Ｐ０９」プライマー対を使用し、比較する必要がある。
【００２４】
「Ｄ０５Ｐ０９」は、５品種を同時に識別するプライマー対で、２００ｂｐ付近で、５品種の全てが異なる増幅パターン、すなわち、品種特異的な増幅があること、もくしは品種特異的なバンドパターンを示す。しかし、九州１４号、九州１５号は、ほぼ同パターンを示すため、「Ｄ０５Ｐ０９」プライマー対を使用し、比較する必要がある。
【００２５】
「Ｂ０１Ｍ０６」は、２００ｂｐ付近の増幅が、九州１４号と九州１５号の間で区別性がある。
【００２６】
上記のプライマー対を、５品種２系統で比較した場合に見られるバンドパターンを、次の表２にまとめて示す。
【００２７】
【表２】
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【発明の効果】
【００２８】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、トールフェスクの品種を識別するトールフェスクのＳＳＲマーカーが提供される。
（２）単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを検証することにより、トールフェスクの品種識別を行うことができる。
（３）本発明により、フォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロス、九州１４号、九州１５号の５品種２系統相互での品種識別を行うことができる。
（４）個体単位の解析ではなく、複数個体のＤＮＡを混合するバルクＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより、解析時間の短縮及び正確な品種識別が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例におけるＤ０１Ｍ２２を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。Ｍはサイズマーカーを示し、１４５〜２００ｂｐのサイズを記載した。それぞれの品種４サンプルの電気泳動の結果を示す。図２〜３も同様である。
【図２】実施例におけるＤ０５Ｐ０９を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図３】実施例におけるＢ０１Ｍ０６を用いたＰＣＲの電気泳動の結果を示す。
【図４】本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
次に、本発明の実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
国内で育成されたトールフェスクのフォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロス、九州１４号、九州１５号以上５品種２系統から、ＣＴＡＢ法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【００３２】
抽出したＤＮＡ溶液は、滅菌水でＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌに調整し、１０個体を混合しバルクしたものを、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。
【００３３】
本発明で使用した機器は、以下の通りである。
すなわち、本実施例では、Ｔ  ＧＲＡＤＩＥＮＴ  Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＴＰ６００（タカラバイオ株式会社）、ｉ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、及び、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ）、ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（ＬＩ−ＣＯＲ）、を用いた。
【００３４】
本発明で使用した試薬は、以下の通りである。
〈５０％アクリルアミドゲル〉
すなわち、本実施例では、アクリルアミドゲルとして、尿素（和光純薬工業株式会社）、Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｇｅｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、１０ｘＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光純薬工業株式会社）、を用いた。
【００３５】
〈ＰＣＲ反応液〉
ＰＣＲ反応液として、Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（和光純薬工業株式会社）もしくはＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＢＩＯ  ＮＥＥＲ）、１ｐｍｏｌ／ｕｌ  Ｍ１３  Ｆｏｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）、を用いた。サイズマーカーとして、５０−３５０ｂｐ  ＳＩＺＩＮＧ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用した。本発明では、ＬＩ−ＣＯＲのプロトコールに基づいて、ゲルと色素マーカーの作成を行った。
【００３６】
〈ＰＣＲ反応液：計１０μｌ〉
ＰＣＲ反応液は、以下の通り調製した。
トールフェスク対象品種から抽出したバルクＤＮＡ：１μｌ
１０×Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｒｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３  Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）  Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（５  ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
ＢＩＯ  ＮＥＥＲｎｏＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用する場合にも、同様にＰＣＲ反応液を調製した。
【００３７】
〈ＰＣＲ条件〉
９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで、安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して、電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認した。
【００３８】
本実施例では、特に記載しない限り、トールフェスクのフォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロス、九州１４号、九州１５号の５品種２系統をテンプレートとして使用した。
【００３９】
本実施例では、トールフェスクの５品種２系統それぞれのバルクしたＤＮＡを４サンプル使用して、電気泳動を行い、５品種２系統を同時に比較した。
【００４０】
プライマー「Ｄ０１Ｍ２２」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を、図１に示す。このプライマー対では、１４５ｂｐ〜１７５ｂｐの間で、５品種それぞれが異なる増幅パターンを示し、フォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロスを同時に比較できるため、識別に有効であった。
【００４１】
プライマー「Ｄ０５Ｐ０９」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を、図２に示す。このプライマー対では、２００ｂｐ付近で、５品種それぞれが異なる増幅パターンを示し、フォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロスを同時に比較できるため、識別に有効であった。
【００４２】
プライマー「Ｂ０１Ｍ０６」を使用し、ＰＣＲを行った。その電気泳動の結果を、図３に示す。このプライマー対では、２００ｂｐ付近の増幅が、九州１４号と九州１５号の間で区別性があり、プライマー「Ｄ０１Ｍ２２」及び「Ｄ０５Ｐ０９」の結果とともに比較することで、九州１４号と九州１５号の区別ができるため、識別に有効であった。本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ増幅した特定マーカー遺伝子の塩基配列を、図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
以上詳述したように、本発明は、トールフェスクの品種識別に有用なＳＳＲプライマー対及びその利用に係るものであり、本発明により、トールフェスク５品種２系統において、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対を提供することができる。
【００４４】
更に、本発明は、単数又は複数のプライマー対を使用したＰＣＲによる識別対象の遺伝子を増幅させた特定マーカー遺伝子を提供することができ、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを確認することにより、トールフェスクの品種を識別することができる。本発明により、フォーン、ホクリョウ、ナンリョウ、ウシブエ、サザンクロス、１４号、九州１５号からなる５品種２系統での品種識別を行うことができる。本発明は、短時間で正確なトールフェスク品種の識別を可能にする新しい品種の識別方法を提供するものとして有用である。
【符号の説明】
【００４５】
１  フォーン
２  ホクリョウ
３  ナンリョウ
４  ウシブエ
５  サザンクロス
６  九州１４号
７  九州１５号
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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