(57)【要約】【課題】本発明は、様々ながん細胞の浸潤を効果的に抑制することができる浸潤抑制剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係るがん細胞の浸潤抑制剤は、下記式（Ｉ）で表されるアミロライド化合物を含有することを特徴とする。2011231023.tif 000005［式中、Ｒ1はハロゲン原子を示し；Ｒ2〜Ｒ5は、独立して水素原子等を示す］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるアミロライド化合物を含有することを特徴とする、がん細胞の浸潤抑制剤。
【化１】
2011231023.tif 000004
［式中、Ｒ1はハロゲン原子を示し；Ｒ2〜Ｒ5は、独立して、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基、または、置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示す］
【請求項２】
がん細胞が神経膠腫細胞である請求項１に記載の浸潤抑制剤。
【請求項３】
Ｃ1-6アルキル基の置換基が、アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、カルバモイル基、シアノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子からなる群より選択される１種または２種以上の置換基である請求項１または２に記載の浸潤抑制剤。
【請求項４】
Ｃ6-12アリール基およびヘテロアリール基の置換基が、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、カルバモイル基、シアノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子からなる群より選択される１種または２種以上の置換基である請求項１〜３の何れかに記載の浸潤抑制剤。
【請求項５】
アミロライド化合物として５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライドを含有する請求項１〜４の何れかに記載の浸潤抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞の浸潤抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
各国、特に先進国において「がん」は死亡原因の上位を占めているが、その根本的な治療法はいまだ確立していないのが現状である。がんの治療方法としては、外科的手術や放射線治療があるが、さらに、単独で或いは外科的手術や放射線治療と並行して、抗がん剤の投与といった化学療法が行われる場合もある。
【０００３】
化学療法は、外科的手術や放射線治療と比べて患者に与える苦痛や負担は比較的少ないと考えられる。しかし、未だにがんの特効薬というものは存在しておらず、より良い抗がん剤の探索が継続されている。
【０００４】
特に悪性のがんが良性腫瘍に比べ問題となる理由としては、がん細胞が正常な制御に反して増殖することのほか、他の組織に転移する性質を有することがある。例えば上皮組織で発生したがん細胞は、その場で増殖した後に基底層まで浸潤してやがては毛細血管へ浸入する。そして血液により運搬されて他組織の毛細血管壁に付着し、そこから組織内へ浸潤して転移がん巣を形成する。このように、外科的手術などにより大部分のがんを除去しても、がん細胞がわずかでも残れば再発や転移のおそれがある。
【０００５】
特に、神経膠腫の中でも最も悪性度の高い膠芽腫は、壊死と微小血管増生を伴う上に脳への浸潤性が極めて高く、外科的手術での全摘出は困難である。かかる事情から、膠芽腫患者の外科的手術後の生存率は、１年後で５１．６％、３年後で１３．１％、５年後で７．８％と、予後が非常に悪い。
【０００６】
よって、がんの治療においては、がん病巣の除去や縮小のみならず、がん細胞の転移を抑制することも非常に重要である。
【０００７】
しかし、がん細胞の転移を阻害するための薬剤は、未だ実用化されていない。かつては、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤（ＭＭＰ阻害剤）が、がん細胞の転移の初期である浸潤を抑制するものとして期待されたが、臨床研究においてはＭＭＰ阻害剤の有効性は認められなかった（非特許文献１）。
【０００８】
ところで、アミロライドやその誘導体は、細胞内のｐＨ制御に寄与するＮａ+−Ｈ+エクスチェンジャー１（以下、「ＮＨＥ１」という）を阻害することにより、利尿作用を示すことが知られている。また、アミロライド誘導体である５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライドは、日本では認証されていないものの、欧米ではリドル症候群の治療薬として実用化されている。
【０００９】
その他、特許文献１には、哺乳動物のがんを治療するための組成物の一成分の一つとして、アミロライドが開示されている。しかし、当該組成物の主要成分はアルカリ金属塩であり、アミロライドは腫瘍部位の酸性度と患者全身の酸性度を低くするためのものであるに過ぎない上に、当該特許文献にはアミロライドを含む組成物の製造例が無いどころか、当該組成物ががん治療に有効であることを実証するための試験データが全く記載されていない。
【００１０】
また、特許文献２には、アミロライドが血管新生抑制剤の一つとして開示されている。しかし、当該特許文献にもアミロライドを含む組成物の製造例は無く、また、組成物が腫瘍やがんに有効であることを実証するための試験データの記載も無い。
【００１１】
最も重要なことには、これら何れの特許文献にも、本発明の対象であるがん細胞の浸潤の抑制は全く記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Coussens Lら，サイエンス（Science），第２９５号，第２３８７〜２３９２頁（２００２年）
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２００３−５０８４５４号公報
【特許文献２】特表２００５−５３０７１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、がん細胞の転移を効果的に抑制できる薬剤は、未だ実用化されていない。
【００１５】
しかし、単に細胞増殖を抑制する薬剤では正常細胞にもダメージを与えるおそれが大きいため、がん細胞に特有の挙動である転移、殊更にその初期段階である浸潤を抑制できる薬剤に対する要求は強い。特に、脳神経外科分野における臨床現場では、がん細胞の転移は患者にとり致命的になり得ることから、浸潤抑制剤が渇望されている。
【００１６】
ところが、がん細胞は遺伝学的・形態学的に多様性を有している。そうした多様性と浸潤機構との関連は未だ詳らかでなく、がん浸潤に共通する分子機構があるのか否かも不明であるため、浸潤抑制剤をデザインしようにもそのターゲットが絞れないという問題がある。例えば乳癌細胞の浸潤においては、低分子量Ｇタンパク質スーパーファミリーに属するＡＤＰリボシル化因子６（Ａｒｆ６）の異常な発現亢進が関与することが明らかにされているが、本発明者は、神経膠腫細胞に分類される細胞間では、その浸潤がＡｒｆ６の発現亢進を伴うものと伴わないものがあること、また、浸潤を誘引する物質に依存するものと依存しないものがあることを見出している。従って、ある浸潤機構を阻害できたとしても、他のがん細胞の浸潤を阻害できるとは限らない。
【００１７】
そこで本発明の目的は、様々ながん細胞の浸潤を効果的に抑制することができる浸潤抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、Ｎａ+−Ｈ+交換輸送体１（ＮＨＥ１）が正常細胞よりも様々ながん細胞で高レベルに発現しており、また、ＮＨＥ１のノックダウンによりがん細胞の浸潤性が低減することを実証し、さらに、ＮＨＥ１阻害剤によりがん細胞の浸潤を抑制できることを見出して、本発明を完成した。
【００１９】
本発明に係るがん細胞の浸潤抑制剤は、下記式（Ｉ）で表されるアミロライド化合物を含有することを特徴とする。
【００２０】
【化１】
2011231023.tif 000002
［式中、Ｒ1はハロゲン原子を示し；Ｒ2〜Ｒ5は、独立して、水素原子、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基、または、置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示す］
【００２１】
本発明において、「ハロゲン原子」にはフッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が含まれ、より好ましくは塩素原子または臭素原子、さらに好ましくは塩素原子である。
【００２２】
「Ｃ1-6アルキル基」は、炭素数が１〜６の直鎖状または分枝鎖状の飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等である。好ましくはＣ1-4アルキル基であり、より好ましくはＣ2-3アルキル基である。
【００２３】
「Ｃ6-12アリール基」は、炭素数が６〜１２の芳香族炭化水素を意味する。例えば、フェニル基、インデニル基、ナフタレニル基、ビフェニル基等を挙げることができる。好ましくはフェニル基である。
【００２４】
「ヘテロアリール基」は、窒素原子、酸素原子または硫黄原子等のヘテロ原子を少なくとも１つ有する５員、６員または縮合多環の芳香族ヘテロシクリル基を意味する。例えば、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、テトラゾリル基、チエニル基、フリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基等の５員ヘテロアリール基；ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の６員ヘテロアリール基；およびインドリル基、イソインドリル基、キノリル基、イソキノリル基、ベンゾフラニル基、クロメニル基、ベンゾチエニル基等の縮合多環ヘテロアリール基である。
【００２５】
上記Ｃ1-6アルキル基、Ｃ6-12アリール基およびヘテロアリール基は、置換基を有していてもよい。置換基数は、置換可能であれば１つであっても２以上であってもよく、２以上である場合、互いに同一であっても或いは異なっていてもよい。
【００２６】
Ｃ1-6アルキル基の置換基としては、例えば、アミノ基（−ＮＨ2基）、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、カルバモイル基、シアノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子を挙げることができる。Ｃ1-6アルキルアミノ基およびジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基は、アミノ基に上記Ｃ1-6アルキル基が１つまたは２つ置換している基であり、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基の場合、２つのＣ1-6アルキル基は互いに同一であっても異なっていてもよい。
【００２７】
Ｃ6-12アリール基およびヘテロアリール基の置換基としては、例えば、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ2-6アルケニル基、Ｃ2-6アルキニル基、Ｃ1-6アルコキシ基、アミノ基、Ｃ1-6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、カルバモイル基、シアノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子からなる群より選択される１種または２種以上の置換基を挙げることができる。
【００２８】
「Ｃ2-6アルケニル基」は、１以上の炭素原子間二重結合を有する、炭素数が２〜６の直鎖状または分枝鎖状の不飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、エテニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等であり、好ましくはＣ2-4アルケニル基、より好ましくはＣ2-3アルケニル基である。
【００２９】
「Ｃ2-6アルキニル基」は、１以上の炭素原子間三重結合を有する、炭素数が２〜６の直鎖状または分枝鎖状の不飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等であり、好ましくはＣ2-4アルキニル基、より好ましくはＣ2-3アルキニル基である。
【００３０】
「Ｃ1-6アルコキシ基」は、炭素数が１〜６の直鎖状または分枝鎖状の飽和脂肪族炭化水素オキシ基を意味する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペントキシ基、ヘキソキシ基等であり、好ましくはＣ1-4アルコキシ基であり、より好ましくはＣ1-2アルコキシ基であり、さらに好ましくはメトキシ基である。
【００３１】
本発明に係る浸潤抑制剤の対象がん細胞としては、神経膠腫細胞を挙げることができる。神経膠腫細胞としては、毛様性星細胞腫細胞、びまん性星細胞腫細胞、退形成性星細胞腫細胞および膠芽腫細胞がある。本発明者の発見は、これらの細胞のうち最も浸潤性が高く臨床的に重要である神経膠芽腫細胞群に限ってみても、その浸潤機構が多様であることを明らかにしたものであり、その実験により、本発明に係る浸潤抑制剤がこれら全ての様式の神経膠腫細胞の浸潤を抑制できることが実験的に証明されている。
【００３２】
本発明に係る浸潤抑制剤の有効成分であるアミロライド化合物としては、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライドを挙げることができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係る浸潤抑制剤の適用範囲は広く、様々な種類のがん細胞、特にＮＨＥ１発現が異常亢進しているがん細胞に対して優れた浸潤抑制作用を発揮することが期待できる。また、本発明剤の作用機序は細胞を殺傷するものではないため、がんの退縮は目的としないものの、がん細胞に特有の浸潤を抑制するものであるため、制がん剤に多く見られる副作用の懸念が少ない。しかしながら、本発明の浸潤抑制剤により、がんの致命的な進行が食い止められるので、例えば細胞増殖抑制剤などと組合せることにより、がんの根治への道筋が開拓される可能性も期待できる。さらに、本発明の浸潤抑制剤は、がん細胞の転移の初期段階である浸潤を抑制できるため、有効な治療手段として外科的切除に強く依存している脳腫瘍など特にがん細胞の転移が問題となる疾患の臨床現場にとり福音となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、浸潤様式の異なる神経膠腫細胞に共通して発現している物質の探索実験の結果を示す図であり、図１ａはリアルタイムＰＣＲによる結果を示し、図１ｂは免疫ブロッティングによる結果を示す。
【図２】図２は、ＮＨＥ１遺伝子をノックダウンした神経膠腫細胞の浸潤性を試験した結果を示す図であり、図２ａはＮＨＥ１遺伝子のノックダウンを確認するための免疫ブロッティングの結果を示し、図２ｂは神経膠腫細胞の浸潤性を試験した結果を示す。
【図３】図３は、細胞の浸潤性試験に用いた実験システムを説明するための模式図である。
【図４】図４は、本発明に係るアミロライド化合物による神経膠腫細胞の浸潤性の変化を試験した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明に係る式（Ｉ）に含まれるアミロライド化合物のうち、下記のアミロライド自体は、ＣＡＳ  Ｎｏ．２０１６−８８−８の公知化合物である。
【００３６】
【化２】
2011231023.tif 000003
【００３７】
本発明に係るアミロライド化合物のうち、６位のハロゲン原子が塩素原子以外の化合物は、アミロライドと同様に、当業者公知の方法により製造可能である。また、３位と５位のアミノ基に、置換基を有していてもよいＣ1-6アルキル基、置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基および／または置換基を有していてもよいヘテロアリール基が導入された化合物は、保護基の導入と脱保護の繰り返しと共に、例えば塩基とハロゲン化アルキルを用いたアミノ基への一般的なアルキル基導入反応などにより、アミロライドまたはその合成中間体から製造することができる。なお、５位のアミノ基へエチル基とイソプロピル基が導入された５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライドは、欧米では販売もされている。
【００３８】
本発明に係る浸潤抑制剤は、がん治療のため、特にがん細胞の転移を抑制するために用いられる。
【００３９】
本発明に係る浸潤抑制剤の剤形等は特に制限されず、治療対象であるがんの種類などに応じて、本発明に係るアミロライド化合物（Ｉ）を、経口投与または非経口投与に適する有機または無機の固体または液体の賦形剤など薬学上許容される基材等と混合して、適切な形態の製剤とすればよい。剤形としては、例えば、カプセル剤、錠剤、糖衣錠、顆粒、吸入剤、座薬、溶液、分散液、エマルション等の剤形とすることができる。必要な場合には、助剤、安定化剤、湿潤剤や乳化剤、緩衝剤や他の一般的に用いられる添加剤をこれら製剤に配合してもよい。なお、本発明に係るアミロライド化合物（Ｉ）のうち水溶性に優れるものは、水や生理食塩水などに溶解して注射剤として使用することができる。
【００４０】
治療に有効なアミロライド化合物（Ｉ）の投与量は、患者の年齢、性別、重篤度などにもよるが、通常、一日当り０．０５ｍｇ／ｋｇ体重以上、３．０ｍｇ／ｋｇ体重以下程度投与すればよい。投与は一日当り一回に限定されず、複数回に分けて投与してもよい。また、投与方法も特に制限されず、患者の重篤度などに応じて錠剤などの経口投与や液剤の注射投与など、適宜選択すればよい。
【００４１】
本発明の浸潤抑制剤は、特にがん細胞の浸潤を抑制する。本発明に係るアミロライド化合物（Ｉ）は、Ｎａ+−Ｈ+エクスチェンジャー１の阻害剤であることから、本発明者は、がん細胞が浸潤するに当たっては極性を認識する機構が重要であり、本発明に係るアミロライド化合物（Ｉ）は、この機構を阻害することにより浸潤を抑制するのではと考えている。従って、本発明の浸潤抑制剤は、正常細胞にはなく、がん細胞に特異な挙動である転移を抑制することにより、がんの拡散や再発を選択的に防ぐことが可能である。
【００４２】
本発明の抗がん剤が治療すべきがんの種類は特に制限されない。本発明に係る抗がん剤の治療対象としては、例えば、毛様性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫、膠芽腫などの神経膠腫；神経膠腫以外の脳腫瘍および脊髄腫瘍；白血病や悪性リンパ腫などの血液がん；咽頭がんや口腔がんなどの頭頚部がん；食道がん；胃がん；虫垂がん；大腸がん；肝がん；胆嚢がん；膵臓がん；中皮腫；甲状腺がん；腎臓がん；肺がん；骨肉種；前立腺がん；悪性精巣腫瘍や睾丸がん；腎細胞がん；膀胱がん；メラノーマなどの皮膚がん；乳がん、子宮頸がん、卵巣がんなどを挙げることができる。少なくとも、本発明に係る浸潤抑制剤による各種神経膠腫に対する効果は、実験的に証明されていることから、本発明の浸潤抑制剤は、特に神経膠腫の治療剤として非常に有用である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４４】
試薬と抗体等
５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）はＳｉｇｍａ社から、抗ＮＨＥ１モノクローナル抗体はベクトン−ディッキンソン社から入手した。特記していない場合、他の薬品は全てＳｉｇｍａ社から入手した。
【００４５】
細胞培養
実験に用いた細胞は、以下のとおり準備した。３７℃の５％ＣＯ2のインキュベーター中にて、ラット神経膠腫細胞であるＣ６と、ヒト神経膠芽腫細胞であるＳＦ２６８およびＴ９８Ｇを、１０％非働化ＦＢＳ（ＨＹＣＬＯＮＥ社）と１００Ｕ／ｍｌペニシリン−１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯTM，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」という）中に維持した。
【００４６】
また、がん化していない初代培養ラット星状細胞（以下、「アストロサイト」という）は、二日齢の雄ラット脳を細切により分散し、上記培養条件にて１０日間培養した後、振盪によって混入しているマイクログリア細胞などの非アストロサイト細胞を除いて得た。
【００４７】
試験例１  神経膠腫細胞に共通して発現している物質の探索
本発明者による実験的知見によれば、神経膠腫細胞のうち、ラット神経膠腫細胞であるＣ６細胞の浸潤にはＡＤＰリボシル化因子６（Ａｒｆ６）の異常発現亢進が伴うのに対して、他細胞の浸潤にはＡｒｆ６の異常発現亢進が伴わず、また、神経膠芽腫細胞であるＵ２５１とＳＦ２６８の浸潤は浸潤誘導物質である血清により促進されるのに対して、同じく神経膠芽腫細胞であるＬＮ２２９とＴ９８Ｇの浸潤は血清をもってしても促進されない（データ示さず）。このように、神経膠腫細胞に分類される細胞の間でも、その浸潤機構は多様である。そこで、これら神経膠腫細胞に共通して発現している物質を探索した。
【００４８】
（１）  定量的ＰＣＲ
本発明者は、がん細胞の浸潤における極性の出現に着目し、細胞極性に関与するＮａ+−Ｈ+エクスチェンジャー１（ＮＨＥ１）に着目し、その発現状況を調べた。
【００４９】
ラット神経膠腫細胞であるＣ６、およびヒト神経膠芽腫細胞であるＳＦ２６８とＴ９８Ｇを用い、がん化していないラットアストロサイトとの比較において、リアルタイムＰＣＲ法を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ＮＨＥ１のｍＲＮＡ量を検討した。
【００５０】
詳しくは、各培養細胞より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用い、取扱説明書に従って全ＲＮＡを調製した後、ゲノムＤＮＡの混入を防ぐためにＤＮＡａｓｅ（宝酒造社製）処理を行った。得られた全ＲＮＡより、ＭＭＬＶ（宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡを調製し、β−アクチンに対するプライマー（フォーワードプライマー：配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１），リバースプライマー：配列番号２）を用いたＰＣＲにより逆転写反応の確認を行った。次いで、β−アクチンのＲＴ−ＰＣＲ産物をリファレンスとして、各培養細胞より得たｃＤＮＡより増幅させたＮＨＥ１のＲＴ−ＰＣＲ産物量を、サイバーグリーン（ＲＯＣＨ社製）をインターカレーターとして用いたＭｉｎｉ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  ＭＪ  Ｍｉｎｉ測定器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）によるリアルタイムＰＣＲ法により測定した。ラットアストロサイトおよびラット神経膠腫細胞であるＣ６のＮＨＥ１ｃＤＮＡ量の測定においては、ラットＮＨＥ１に対するプライマー（フォーワードプライマー：配列番号３，リバースプライマー：配列番号４）を用い、また、ヒト神経膠芽腫瘍細胞であるＳＦ２６８およびＴ９８ＧのＮＨＥ１ｃＤＮＡ量の測定においては、ヒトＮＨＥ１に対するプライマー（フォーワードプライマー：配列番号５，リバースプライマー：配列番号６）を用い、同様に試験した。結果を、β−アクチンのＲＴ−ＰＣＲ産物量に対するＮＨＥ１  ＲＴ−ＰＣＲ産物量の比（％）として、図１ａに示す。
【００５１】
（２）  免疫ブロッティング
上記各細胞におけるＮＨＥ１の発現状況を免疫ブロッティングでも確認した。詳しくは、各培養細胞より、ＲＩＰＡ緩衝液（組成：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  ＮＰ−４０，１％  Ｎａ−Ｄｅｏｘｙｃｈｌａｔｅ，０．１％  ＳＤＳ）中にてタンパク質抽出液を調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社）へ電気的に転写した。そのＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク（和光純薬社）／ＴＢＳＴ（組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）溶液中にてブロッキング後、抗ＮＨＥ１モノクローナル抗体を０．２５μｇ／ｍｌにて４℃で一昼夜反応させた。ＴＢＳＴにて洗浄後、０．１％  ＢＳＡ／ＴＢＳＴ中にて西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を反応させた。ＴＢＳＴにて洗浄後、化学発光試薬（ミリポア社）にて標識部位を発光させ、ＣＣＤカメラ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  ＬＡＳ１０００ｍｉｎｉ）にて撮影した。結果を図１ｂに示す。
【００５２】
図１ａおよび図１ｂのとおり、ラット神経膠腫細胞であるＣ６細胞、およびヒト神経膠芽腫細胞であるＳＦ２６８細胞とＴ９８Ｇ細胞では、がん化していないアストロサイトに比べて、ＮＨＥ１が過剰発現していることが明らかとなった。
【００５３】
試験例２  ＮＨＥ１と浸潤性との関係の確認
（１）  ＮＨＥ１遺伝子のノックダウン
神経膠腫細胞のうちヒト神経膠芽腫細胞であるＳＦ２６８において、ＮＨＥ１遺伝子をノックダウンした。詳しくは、ＮＨＥ１遺伝子に相補的なｓｉＲＮＡ（センス鎖：配列番号７，アンチセンス鎖：配列番号８）２分子を、北海道システムサイエンス社にて合成した。当該ｓｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を取扱説明書に従って用い、ＳＦ２６８細胞にトランスフェクションした。４０時間の培養後、浸潤アッセイとタンパク質発現確認のイムノブロッティグに供した。また、陰性対照として、ＮＨＥ１と無関係なｓｉＲＮＡ（センス鎖：配列番号９，アンチセンス鎖：配列番号１０）を用い、同様の実験を行った。結果を図２ａに示す。
【００５４】
図２ａのとおり、ＮＨＥ１遺伝子に関係のないｓｉＲＮＡを作用させた場合には、ＮＨＥ１の発現は保持されていた。一方、ＮＨＥ１遺伝子に干渉するｓｉＲＮＡを作用させた場合には、ＮＨＥ１遺伝子の発現はノックダウンされ、ＮＨＥ１の発現は抑制されることが確認された。
【００５５】
（２）  浸潤性試験
ＮＨＥ１遺伝子に関係のないｓｉＲＮＡを作用させたＳＦ２６８細胞と共に、ＮＨＥ１遺伝子をノックダウンしたＳＦ２６８細胞の浸潤性を試験した。
【００５６】
具体的には、図３に示すよう互いに重ね合わせることのできる、内径１．６ｃｍ、高さ１．８ｃｍのプラスチック製下部チャンバーと、外径０．９ｃｍ、高さ１．７ｃｍで、下部チャンバーと重ね合わせる際に落下しないようにするための幅２ｍｍの耳を有し、且つ底面が８μｍ径の細孔を有するＰＥＴ製膜の上にマトリゲルを敷いた上部チャンバー（ベクトン−ディキンソン社製，商品名「ＢｉｏＣｏａｔ」）を用意した。下部チャンバーに、浸潤性誘導物質である血清を１０質量％含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（０．７５ｍＬ）を加えた。上部チャンバーには、０．５％牛血清アルブミンを含むＤＭＥＭ（０．４ｍＬ）を加え、下部チャンバーと重ね合わせた。この際、上部チャンバーの底面は、下部チャンバーのＤＭＥＭ溶液に浸漬させた。
【００５７】
上部チャンバーのＤＭＥＭ溶液に、上記（１）で調製したＮＨＥ１遺伝子ノックダウンＳＦ２６８細胞、または非ノックダウンＳＦ２６８細胞（３×１０4ｃｅｌｌ／ｍＬ）を加え、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、上部チャンバーの下面に浸潤した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、クリスタルバイオレットにて染色した。顕微鏡撮影し、顕微鏡写真において細胞数を計測し、上部チャンバーに添加した細胞に対し、下部チャンバーへ浸潤した細胞の割合を算出した。結果を図２ｂに示す。
【００５８】
図２ｂのとおり、ＮＨＥ１遺伝子をノックダウンしていないＳＦ２６８細胞は、その約２．５％が擬似基底膜であるマトリゲル中を浸潤してＰＥＴ膜の小孔を透過する一方で、ＮＨＥ１遺伝子がノックダウンされたＳＦ２６８細胞は、約０．２％が透過するに過ぎず、浸潤性は１０分の１未満まで抑制された。かかる結果より、ＮＨＥ１は、がん細胞の浸潤性に大きく関与していることが証明された。
【００５９】
実施例１  ＮＨＥ１阻害剤であるＥＩＰＡによる浸潤性阻害作用
異なる浸潤様式を示す三種類の神経膠腫細胞、即ち、Ｃ６細胞、ＳＦ２６８細胞およびＴ９８Ｇ細胞に対する５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロライド（ＥＩＰＡ）の効果を、上記試験例２における浸潤性試験システムを使って検討した。
【００６０】
ＥＩＰＡの２５ｍＭジメチルスルホキシド溶液（７．５μＬ）を下部チャンバーのＤＭＥＭ溶液に添加し、また、各細胞の親株細胞を用いた以外は上記試験例２と同様の実験を行った。なお、Ｔ９８Ｇ細胞は血清非存在下での浸潤活性が高いため、Ｔ９８Ｇ細胞を用いた場合には、下部チャンバーのＤＭＥＭから化学誘引物質である血清を除いた。また、対照として、ＥＩＰＡ溶液の溶媒であるジメチルスルホキシドのみを下部チャンバーへ同量添加し、同様の実験を行った。結果を図４に示す。
【００６１】
図４のとおり、何れの神経膠腫細胞でも、本発明に係るアミロライド化合物により、その浸潤性が顕著に抑制されることが実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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