(57)【要約】【課題】癌治療剤及び抗癌剤の効果増強剤を提供する。【解決手段】HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はHCP-1タンパク質の機能を阻害する物質を含む、癌治療剤又は抗癌剤の効果増強剤。HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質として、該遺伝子に対するアンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA、shRNA、siRNA及びアプタマーからなる群から選択される少なくとも1種が使用され、HCP-1タンパク質の機能を阻害する物質として、HCP-1タンパク質に対する抗体が使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はHCP-1タンパク質の機能を阻害する物質を含む、癌治療剤。
【請求項２】
HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質が、該遺伝子に対するsiRNA、shRNA、マイクロRNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸及びアプタマーからなる群から選択される少なくとも1種である請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
HCP-1タンパク質の機能を阻害する物質が、HCP-1タンパク質に対する抗体又はポルフィン環構造物である請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はHCP-1タンパク質の機能を阻害する物質を含む、抗癌剤の効果増強剤。
【請求項５】
HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質が、該遺伝子に対するsiRNA、shRNA、マイクロRNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸及びアプタマーからなる群から選択される少なくとも1種である請求項４に記載の増強剤。
【請求項６】
HCP-1タンパク質の機能を阻害する物質が、HCP-1タンパク質に対する抗体又はポルフィン環構造物である請求項４に記載の増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HCP-1タンパク質の機能を阻害することにより癌化学療法剤の治療効果を増強する方法、及び増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、以前、ラットの胃粘膜出血性病変形成に伴って自家蛍光物質が形成されること、及び蛍光物質がポルフィリンであることを世界で初めて見いだした（Matsui H et al. Dig Dis Sci. 1994 Jan; 39(1):116-23：非特許文献１）。
消化器癌の治療法として、光化学療法（Photodynamic therapy, PDT）が本邦において施行され、現在でも実施されている。PDTは癌特異的なポルフィリン蓄積現象を利用し、ポルフィリンとレーザーとの反応によって活性酸素を発生させ、癌細胞特異的なアポトーシスを誘導する治療法である。この治療法において投与される薬剤は2種類に大別される。１つは、precursorであるアミノレブリン酸（ALA）であり、もう１つはポルフィン環構造を有する色素（ポルフィリン類やクロリン類）である。
【０００３】
上記癌特異的なポルフィリン環構造物の集積現象の機序について、以下の通りこれまでいくつかの報告がなされている。
(i)アルブミンと鉄結合性グロブリンによる架橋により、蛍光がアップレギュレートされる(Hamblin MR et al., J Photochem Photobiol B. 26, 45-56, 1994：非特許文献２）。
(ii)ヒアルロン酸がポルフィリン取り込みに対し増感効果を持っている (Kakehashi A et al., Ophthalmic Res. 26, 51-9, 1994：非特許文献３）
(iii)ポルフィリンに対して拘束力のある血漿因子ヘモペキシンがヘマトポルフィリンと複合体を作り細胞に蓄積している（Sery TW et al., Cancer Res. 39, 96-100, 1979：非特許文献４）
(iv) LDLレセプターの働きにより、癌細胞優位に蛍光が蓄積する(Misawa J et al., J Dermatol Sci. 40, 59-61, 2005：非特許文献５）。
(v) MDRの変異がポルフィリン排泄を阻害する(Gibson SL et al., Cancer Res. 54(10), 2556-9, 1994：非特許文献６）。
【０００４】
しかし、いずれの報告も科学的説明が困難であり、定説とされるに至っていない。
他方、本発明者は、この癌特異的ポルフィリンの集積現象について長年関心を持ち、その解明を試みてきた。この成果として、上記ALA投与による癌固有の機序が、癌細胞内における高濃度NOによるヘム合成最終酵素であるフェロキレターゼの失活によってもたらされることを見いだした（Yamamoto F et. al., BBRC 353, 541-546, 2007：非特許文献７）。
また、本発明者はポルフィン環構造物の一つであるヘムを選択的に輸送するタンパク質Heme carrier protein 1（HCP-1）に着目した。HCP-1は1996年、マウス十二指腸より単離されたタンパク質である（Diatchenko L et. al. , PNAS, 93, 6025-6030, 1996：非特許文献８）。このタンパク質は、2005年、ヒト十二指腸におけるヘムを含むポルフィン環構造物の輸送担体であることが報告された（Shayeghi.M et. al. , Cell, 122, 789-801, 2005：非特許文献９）。加えて、2006年、HCP-1はヒト十二指腸における葉酸の輸送担体であることも報告された（Qiu.A et. Al., Cell, 127, 917-928, 2006：非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Matsui H et al. Dig Dis Sci. 1994 Jan; 39(1):116-23
【非特許文献２】Hamblin MR et al., J Photochem Photobiol B. 26, 45-56, 1994
【非特許文献３】Kakehashi A et al., Ophthalmic Res. 26, 51-9, 1994
【非特許文献４】Sery TW et al., Cancer Res. 39, 96-100, 1979
【非特許文献５】Misawa J et al., J Dermatol Sci. 40, 59-61, 2005
【非特許文献６】Gibson SL et al., Cancer Res. 54(10), 2556-9, 1994
【非特許文献７】Yamamoto F et. al., BBRC 353, 541-546, 2007
【非特許文献８】Diatchenko L et. al. , PNAS, 93, 6025-6030, 1996
【非特許文献９】Shayeghi.M et. al. , Cell, 122, 789-801, 2005
【非特許文献１０】Qiu.A et. Al., Cell, 127, 917-928, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、HCP-1タンパク質の機能又はHCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質を含む、癌治療剤及び抗癌剤の効果増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、HCP-1が癌特異的に発現するならば、ヘムのみならずポルフィリンのようなポルフィン環構造物も癌細胞内に輸送する可能性があると考え、ラット胃粘膜正常細胞培養系RGM-1を自ら樹立し、その細胞系を親株とする癌様変異株RGK-1、さらにヒト胃癌由来培養細胞型MKN45及び AGSの4種類の細胞でHCP-1発現を検討した。その結果、(i)癌細胞においてHCP-1の発現が亢進していること、及び(ii)HCP-1のノックダウンにより癌細胞内へのヘマトポルフィリン取り込みが減少することを見いだした（4thSoel National University Bungdang Hospital PDT Colloquium, 2009, July 8th）。 
【０００８】
そして、本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、HCP-1を阻害すると癌細胞を効率よく死滅させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
(1) HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はHCP-1タンパク質の機能を阻害する物質を含む、癌治療剤。
(2) HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質、又はHCP-1タンパク質の機能を阻害する物質を含む、抗癌剤の効果増強剤。
本発明の癌治療剤又は効果増強剤において、HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害する物質としては、例えば前記遺伝子に対するsiRNA、shRNA、マイクロRNA、アンチセンス核酸、デコイ核酸及びアプタマーからなる群から選択される少なくとも1種が挙げられる。また、HCP-1タンパク質の機能を阻害する物質としては、例えばHCP-1タンパク質に対する抗体又はポルフィン環構造物が挙げられる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、HCP-1タンパク質の機能、又は該タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する物質を含む、癌治療薬、及び抗癌剤（例えば化学療法剤等の抗癌剤）の効果増強剤が提供される。本発明の治療薬及び増強剤は、各種癌に対して毒性を増強し、癌細胞を効率的に死滅させることができる。例えば、HCP-1が発現している癌細胞では、抗癌剤の効果が増強する。従って、本発明の増強剤は、HCP-1を発現する癌の治療に極めて有用である。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】HCP-1 siRNAの配列を示す図である。これら3配列が全て等量混和されているカクテルを実験に用いた（B-Bridge社製siTrio）。
【図２】HCP-1に対するsiRNAの効果を示す図である。HCP-1のsiRNA（左）、scrambled RNA（右）を抗HCP-1抗体（Abcam、Rabbit polyclonal antibody）で染色した（VECTASTAIN ABC-AP Rabbit IgG kit使用）。二次染色はVector Redを使用した。siRNAによってHCP-1の発現は明らかに抑制されている。
【図３】HCP-1に対するsiRNAの効果を示す図である。各処置細胞の450nmにおける吸光度を測定した（リファレンス：630nm）。抗癌剤非投与群において有意に差が付いており、HCP-1が癌の機能・恒常性維持に重要であることが示された。なお、縦軸のCell viabilityは、MTT assayにおける吸光度を表す。
【図４】HCP-1に対するsiRNAの効果を示す図である。TC-1法（MTT assay変法）で得られた結果を抗癌剤非投与群の吸光度を1として、各処置細胞の吸光度を除した。CDDP投与、5-FU投与群においてHCP-1の阻害により抗癌剤の細胞毒性が有意に増強している。また、ADR投与群も細胞毒性効果が増強している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．概要
本発明は、HCP-1（タンパク質又は遺伝子）を阻害する物質を含む、癌治療薬、及び抗癌剤の効果増強剤である。これまでの知見によれば、HCP-1は癌特異的に発現して細胞内にヘムや葉酸を輸送していると結論づけることが可能である。また、ヘムや葉酸は細胞のredox、解毒、細胞増殖等に関与する重要な物質である。そこで本発明者は、この癌特異的なタンパクの作用を阻害することにより、癌選択的な細胞障害性を示すことができるのではないかと考え、HCP-1の阻害の有無による抗癌剤の癌細胞毒性の差異を検討した。
その結果、HCP-1遺伝子又はタンパク質の機能又は発現を阻害することにより、癌を治療し得ること、及び抗癌剤（例えば化学療法剤）の効果を増強させることを見出すに至った。すなわち、本発明は、HCP-1の作用を、干渉RNA、抗体、競合阻害剤など特に手法を限定しない方法によって阻害することにより、抗癌剤の細胞毒性を亢進させることを特徴とする。
【００１４】
理想的な抗癌剤とは、癌細胞にのみ抗癌採用を示すものであるが、ほぼすべての薬剤は正常細胞にも毒性を示す。抗癌剤は、抗癌作用と正常細胞への毒性とのかい離が大きいほど理想的である。本発明は、HCP-1が癌特異的に発現していることを利用し、抗癌剤の毒性を増強するものである。
本発明において、HCP-1のRNAiを利用することで、HCP-1遺伝子の発現を阻害し、癌治療効果及び抗癌剤の治療効果を高めることができる。また、HCP-1に対する抗体又は核酸阻害剤を単独で、あるいは抗癌剤と同時に、又は抗癌剤投与の前若しくは後に投与することで、癌細胞に対する細胞毒性を癌選択的に高めることができる。HCP-1阻害剤としては、例えばHCP-1を介して癌細胞内に取り込まれるポルフィン環構造物（ヘマトポルフィリン誘導体、あるいはタラポルフィリンナトリウム）などが挙げられる。
【００１５】
２．HCP-1
前記の通り、Heme carrier protein 1（HCP-1）は、ポルフィン環構造物の一つであるヘムを選択的に輸送するタンパク質であり、ヒト十二指腸においてプロトンと共輸送で葉酸を取り込むトランスポーターであることが知られている。
【００１６】
本発明においては、上記HCP-1タンパク質又はHCP-1をコードする遺伝子を標的として癌治療を行うものである。以下、本明細書において「HCP-1」というときは、便宜上、HCP-1タンパク質及びHCP-1をコードする遺伝子の両者を意味するものとして使用することもある。
HCP-1タンパク質のアミノ酸配列、及びHCP-1をコードする遺伝子の塩基配列は公知であり（NCBI）、アクセッション番号を以下に示す。
遺伝子配列：NM_080669.3 （配列番号１）
アミノ酸配列：NP_542400.2（配列番号２）
【００１７】
３．HCP-1機能阻害物質
本発明は、HCP-1をコードする遺伝子の発現を阻害すること、及びHCP-1タンパク質の機能を阻害することを「HCP-1機能阻害」といい、これらの阻害物質を「HCP-1機能阻害物質」という。
【００１８】
「HCP-1機能阻害」とは、HCP-1に作用してHCP-1の活性化を阻害すること、HCP-1の細胞上への発現を阻害すること、HCP-1の産生を阻害すること、HCP-1のシグナル伝達を阻害すること、あるいはHCP-1の輸送機能を阻害することを意味する。
従って、上記HCP-1の機能を阻害する限り、その「HCP-1機能阻害物質」に限定はない。例えば、HCP-1機能阻害物質として、HCP-1に対する抗体、HCP-1をコードする遺伝子（「HCP-1遺伝子」ともいう）に対する阻害性核酸（例えばsiRNA 、shRNA又はアプタマー、アンチセンス核酸、デコイ核酸、マイクロRNA）、ポルフィン環構造物（ヘマトポルフィリン誘導体、あるいはタラポルフィリンナトリウム）などが挙げられる。
【００１９】
3-1.  HCP-1遺伝子に対する阻害性核酸
HCP-1遺伝子に対する阻害性核酸は、その遺伝子機能又は遺伝子発現を抑制する核酸を意味し、例えば、RNA干渉に利用される核酸（マイクロRNA、shRNA、siRNA）、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はアプタマーなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記遺伝子の発現を抑制することが可能である。阻害の対象となるHCP-1遺伝子の塩基配列は上記の通り公知であり、それぞれ配列情報を入手することができる。本発明において、HCP-1遺伝子の塩基配列は配列番号１に示すものであるが、HCP-1のコード領域のみならず、非コード領域を使用することも可能である。
【００２０】
(i) RNA干渉
本発明においては、HCP-1遺伝子に対するRNA干渉（RNAi）を利用して遺伝子発現を阻害することができる。このようなRNAiとして用いられる核酸としては、例えばsiRNA、マイクロRNA（miRNA）及びshRNAが挙げられる。
siRNA（small interfering RNA）分子は、標的となるHCP-1遺伝子に対応する種々のRNAである。そのようなRNAとしては、mRNA、HCP-1遺伝子の転写後修飾RNA等が挙げられる。
一般に、mRNA上の標的配列は、mRNAに対応するcDNA配列から選択することができる。但し、本発明においてはこの領域に限定されるものではない。
siRNA分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的mRNAの標的セグメントは、好ましくはAA、TA、GA又はCAで始まる連続する15〜30塩基、好ましくは19〜25塩基のセグメントを選択することができる。siRNA分子のGC比は、30〜70％、好ましくは35〜55％である。
siRNAは、２本鎖部分を生成するために自身の核酸上で折り畳む一本鎖ヘアピンRNA分子として生成することができる。siRNA分子は、通常の化学合成により得ることができるが、発現ベクターを用いて生物学的に生成することも可能である。
siRNAを細胞に導入するには、合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本鎖RNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００２１】
また、本発明は、RNAi効果をもたらすためにshRNAを使用することもできる。shRNA とは、ショートヘアピンRNAと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。
【００２２】
shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Aとし、配列Aに対する相補鎖を配列Bとすると、配列A、スペーサー、配列Bの順でこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するように連結し、全体で45〜60塩基の長さとなるように設計する。スペーサーの長さも特に限定されるものではない。
配列Aは、標的となるHCP-1遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Aの長さは19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基である。
【００２３】
さらに、本発明は、マイクロRNAを用いてHCP-1遺伝子の発現を阻害することができる。マイクロRNA(miRNA)とは、細胞内に存在する長さ20〜25塩基ほどの1本鎖RNAであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているncRNA（non coding RNA）の一種である。miRNAは、RNAに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
miRNAも、RNAiに基づく阻害性核酸であるため、shRNA又はsiRNAに準じて設計し合成することができる。
【００２４】
(ii) アンチセンス核酸
本発明の別の態様において、HCP-1遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンス核酸を使用することができる。アンチセンス核酸は、HCP-1遺伝子のmRNA又はDNA配列に結合できる一本鎖核酸配列（RNA又はDNAのいずれか）である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも14ヌクレオチドであり、好ましくは14〜100ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、HCP-1遺伝子の転写又は翻訳を抑制する。
アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。アンチセンス核酸は、例えば、各種DNAトランスフェクション又はエレクトロポレーション等の遺伝子導入方法によりHCP-1を発現する癌細胞に導入される。
【００２５】
(iii) デコイ核酸
本発明の別の態様では、デコイ核酸と呼ばれるおとり核酸を使用することにより、HCP-1遺伝子の発現を阻害することができる。
デコイ核酸は、HCP-1遺伝子又はHCP-1受容体遺伝子の転写因子に結合してプロモーター活性を抑制することにより、HCP-1遺伝子発現を抑制する核酸であって、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味する。この核酸が癌細胞内に導入されると、転写因子がこの核酸に結合する。これにより、転写因子のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、転写因子の発現が抑制される。
【００２６】
本発明の好ましいデコイ核酸としては、例えばHCP-1遺伝子のプロモーターに結合する核酸、あるいはHCP-1のmRNAやHCP-1の上流に存在する因子のプロモーターに結合する核酸などが挙げられる。デコイ核酸は、HCP-1遺伝子のプロモーター配列をもとに、１本鎖又は２本鎖として設計することができる。デコイ核酸の長さは特に限定されるものではなく、15〜60塩基、好ましくは20〜30塩基である。
デコイ核酸は、DNAでもRNAでもよく、修飾された核酸が含まれていてもよい。
本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術に一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、PCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。
【００２７】
なお、デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、RT-PCR等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばpromega dual luciferase assay kit）。
【００２８】
(iv) アプタマー
さらに、本発明は、アプタマーを用いてHCP-1遺伝子の発現を阻害することができる。
アプタマーとは、特異的に標的物質に結合する能力を持つ合成DNA又はRNA分子及びペプチド性分子であり、試験管内において化学的に短時間で合成することができる。従って、配列番号１に示す塩基配列を基準にして、あるいは、in vitro selection法又はSELEX法として知られている進化工学的手法により得ることができる。
核酸アプタマーは、血流中ではヌクレアーゼにより速やかに分解及び除去されるため、必要に応じてポリエチレングリコール（PEG）鎖などによる分子修飾を行って半減期を伸ばしておくことが好ましい。
【００２９】
3-2. HCP-1に対する抗体
本発明の治療剤又は増強剤に含まれるHCP-1に対する抗体は、以下のようにして作製することができる。
【００３０】
(i) ポリクローナル抗体の作製
上記抗体を作製するに当たり、まず、免疫源（抗原）として用いるHCP-1タンパク質を調製する。抗原タンパク質は、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列に基づいて遺伝子工学的にHCP-1を作製することができる。あるいは、配列番号１に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつHCP-1活性を有するタンパク質を用いることもできる。「HCP-1活性」とは、ポルフィン環構造物のトランスポーター活性を意味し、例えば中心鉄を放射標識したヘムの取り込み実験や[3H]標識した葉酸の取り込み実験によりトランスポーター活性を測定することができる。
なお、HCP-1タンパク質のアミノ酸配列情報は、上記NCBIデータベースから取得することができる。また、精製HCP-1抗体は、市販のものを用いることもできる（例えば、Abcam社製）。
【００３１】
次に、得られた精製HCP-1を動物に免疫する。免疫は、精製HCP-1を含む溶液を、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ等）に投与することにより行う。投与は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入して行う。必要に応じて適宜アジュバントを添加することもできる。続いて、免疫により得られる血清（抗血清）を採取する。血清の採取は限定されるものではなく、常法に従い、最終投与日から1〜28日後に免疫した動物の血液から採取することができる。採取した抗血清の中から、公知の免疫検定法(immunoassay)を用いて目的の抗血清をスクリーニングする。上記スクリーニングによる目的の抗血清に含まれる抗体はポリクローナル抗体である。当該抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を単独で、又は2種以上を組み合わせることができる。
【００３２】
(ii) モノクローナル抗体の作製
抗原及びその溶液の調製、並びに免疫方法は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができる。
【００３３】
上記免疫により得られる抗体を産生する細胞（抗体産生細胞）の採取は、限定はされないが、例えば、最終投与の日から1〜14日後に行うことが好ましく、より好ましくは2〜4日後である。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が好ましく、脾臓細胞がより好ましい。採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞（ハイブリドーマ）を得る。
ミエローマ細胞としては、マウス等の哺乳動物において一般に入手可能な株化細胞、例えば、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン含有培地）で生育できないが、抗体産生細胞と融合した状態では生育できる性質の株化細胞が挙げられる。マウスミエローマ細胞としては、例えば、PAI、P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、NS-Iなどを用いることができる。上記細胞融合は、例えば、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合して融合反応させることにより行う。抗体産生細胞とミエローマ細胞との混合比は任意であり、例えば5：1である。
【００３４】
融合反応は、一般には、細胞融合促進剤の存在下で行うことが好ましく、当該促進剤としては、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００３５】
融合反応後の細胞は、例えばHAT選択培地による培養を行う。上記培養後、HAT選択培地での増殖が認められる細胞が融合細胞（ハイブリドーマ）となる。
【００３６】
上記培養により得られたハイブリドーマから、目的のハイブリドーマをスクリーニングする。スクリーニング方法は特に限定されるものではなく、ELISA等により行うことができる。上記スクリーニングによる目的のハイブリドーマの樹立（クローニング）は、限界希釈法を用いた培養等により、1細胞由来のコロニーを選択することによって行うことができる。
【００３７】
上記クローニングにより得られたハイブリドーマから、モノクローナル抗体を採取する方法は、一般には、細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。これらの方法は当分野において周知である。また、モノクローナル抗体の採取時又は採取後に当該抗体の精製を必要とする場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、単独で、又は適宜組み合わせることができる。
【００３８】
また、本発明においては、ヒト型化抗体、ヒト抗体、前記抗体の断片も使用することが可能である。
ヒト型化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域（CDR）の一部又は全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域のフレームワーク領域（FR）がヒト免疫グロブリン由来の可変領域のFRであり、かつその定常領域がヒト免疫グロブリン由来の定常領域である抗体である。ヒト型抗体は、当該分野で周知の方法により作製することができる。
ヒト抗体とは、免疫グロブリンを構成する全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体をいう。ヒト抗体は、当該分野で周知の方法により、例えばヒト抗体を産生するトランスジェニック動物を作製し、当該トランスジェニック動物を抗原で免疫感作することにより製造することができる。
抗体断片とは、上記抗体の抗原結合領域を含む部分断片を意味し、具体的にはF(ab')２、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、scFv（single chain Fv）、dsFv（disulphide stabilised Fv）等が挙げられる。
【００３９】
3-3. ポルフィン環構造物
本発明においては、HCP-1タンパク質の機能を阻害するためにポルフィン環構造物を使用することができる。すでに医薬品として2カ国以上の国で認可され臨床使用されているポルフィン環構造物としては、ヘマトポルフィリン誘導体（フォトフリン(登録商標)：ワイス社）、あるいはタラポルフィリンナトリウム(レザフィリン(登録商標)：明治製菓社)などが挙げられる。
これらのポルフィン環構造物は、すでに厚労省保険承認を得た薬剤として国内で自由に入手可能である。
【００４０】
４．癌治療剤、及び抗癌剤の効果増強剤
本発明において、HCP-1の阻害物質は、癌治療剤（癌治療用医薬組成物）として、あるいは抗癌剤の効果増強剤として使用することができる。
本発明の治療剤及び増強剤を使用する対象となる患者は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。被験者がヒトの場合は、好ましくは各種癌患者である。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ペット、動物園の動物、家畜等であり、具体的には、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、霊長類等が挙げられる。
治療の対象となる癌は細胞表面にHCP-1を発現するものである限り特に限定されるものではなく、例えば、消化器系、呼吸器系、脳神経系、皮膚科系、泌尿器系、産婦人科系、血液系等に含まれる各種癌が挙げられる。
具体的には、脳腫瘍、頭頸部癌、頚癌、口腔癌、咽頭癌、食道癌、膵癌、胃癌、胆道癌、小腸又は十二指腸の癌、大腸癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌を含む）、卵巣癌、甲状腺癌、各種肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、悪性リンパ腫（ホジキン型リンパ腫、非ホジキン型リンパ腫を含む）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）および急性リンパ性白血病（ALL）、リンパ腫、多発性骨髄腫（MM）、骨髄異型成症候群などを含む）、皮膚癌及びメラノーマなどを挙げることができる。
【００４１】
本発明の治療剤又は増強剤（以下「治療剤等」という）は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により生体に導入することができる。
さらに、本発明の治療剤等は、他の抗癌剤（化学療法剤等）と併用することも可能である。この場合、本発明の治療剤等と他の抗腫瘍剤とを同時に投与することもできるし、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法も採用することができる。
【００４２】
本発明の治療剤等は、経口投与又は非経口投与の態様に応じて、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態にすることができる。
非経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されるものではなく、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤等のいずれであってもよい。各種注射剤の場合は、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供することができる。非経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形剤や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有することができる。例えば、各種注射剤の場合は、水、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
経口剤として用いる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれであってもよいし、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。当該経口剤には、前述した有効成分のほかに、各種形態に応じ、公知の各種賦形剤や添加剤を上記有効成分の効果が損なわれない範囲で含有させることができる。例えば、結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、ポリビニルピロリドン等）、充填剤（乳糖、糖、コーンスターチ、馬鈴薯でんぷん、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（各種でんぷん等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。
【００４３】
さらに、本発明の治療剤等は、溶媒和物の形態とすることもできる。溶媒和物は、例えば、水和物、非水和物などを挙げることができ、好ましくは水和物である。溶媒は、例えば、水、アルコール（例えばメタノール、エタノール、n-プロパノール等）、ジメチルホルムアミドなどを挙げることができる。
【００４４】
さらに、本発明の治療剤等は、酸又は塩基と薬理学的に許容される塩を形成したものでもよい。酸との塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、あるいはギ酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸塩などを挙げることができる。また、塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、N, N’-ジベンジルエチレンジアミン、アルギニン、リジンなどの有機塩基塩、あるいはアンモニウム塩などを挙げることができる。さらに、本発明の治療剤等においては、結晶でも無結晶でもよく、また、結晶多形が存在する場合には、それらのいずれかの結晶形の単一物であっても混合物であってもよい。
【００４５】
本発明の治療剤等の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、臨床状態、過去の治療履歴のみならず、治療しようとする疾患の部位や程度における本発明の治療剤等の蓄積の程度や速度に応じて適宜変更することができる。
【００４６】
本発明の治療剤等の投与量は、一般には、製剤中の有効成分（HCP-1遺伝子の阻害性核酸、抗HCP-1抗体又はポルフィリン誘導体）の配合割合を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重、病気の種類又は進行状況、さらには投与経路、投与回数、投与期間等を勘案し、適宜設定することができる。
【００４７】
非経口剤の投与量（1日あたり）は、限定はされないが、例えば各種注射剤であれば、一般には、前述した有効成分（siRNAの場合）は、適用対象（患者）の体重1kgあたり10μg〜100mg/日、好ましくは50μg〜50mg/日である。
【００４８】
経口剤の投与量（1日あたり）は、一般には、前述した有効成分を、適用対象（患者）の体重1kgあたり100μg〜2000mg/日、好ましくは1mg〜1g/日である。
例えば、siRNA、shRNA又はmiRNAを投与する場合は、その有効量は、標的mRNAのRNAi媒介分解を引き起こすのに十分な量であれば特に限定されるものではない。当業者は、被験者に投与すべき有効量を、被験者の身長及び体重、年齢、性別、投与経路、又は局所若しくは全身投与などの要素を考慮して容易に決定することができる。一般に、siRNA、shRNA又はmiRNAは、非経口投与（例えば静注）の場合約50pM〜約100nM、好ましくは1nM〜10nMの細胞内濃度である。
【００４９】
本発明の別の態様では、本発明の治療剤等と、抗癌剤（例えば癌化学療法剤）との併用を行うことで、抗癌剤の治療効果を増強することができる。「増強」とは、抗癌剤の治療効果である癌の縮小率又は癌細胞の減少率が、単独で使用するときよりも少なくとも10％以上であることを意味する。
【００５０】
本発明において使用される抗癌剤は特に限定されるものではなく、活性の種類により以下のものを挙げることができる。
アルキル化活性：カルボコン、ブスルファン、ニムスチン、シクロフォスファミド等
代謝拮抗活性：メトトレキサート、メルカプトプリン、シタラビン、フルオロウラシル、テガフール等
抗生物質：アクチノマイシンD、ブレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン等
微小管阻害活性：ドセタキセル、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン等
トポイソメラーゼ阻害活性：イリノテカン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド等
血管新生阻害活性：ベバシズマブ（アバスチン）、ソラフェニブ（ネクサバル）、スニチニブ（スーテント）等
金属錯体：シスプラチン、カルボプラチン等
本発明の治療剤等としてポルフィン環構造物を使用する場合は、ポルフィン環構造物を患者に投与し、当該誘導体が哺乳動物の癌組織又は癌細胞に集積したときに光を照射する工程を含む。この場合は、上記抗癌剤と併用してもよく、抗癌剤の投与スケジュールに合わせて、上記ポルフィン環構造物の投与及び光照射を行うことができる。従って、抗癌剤の投与のタイミングと、ポルフィン環構造物の投与及び光照射のタイミングとは特に限定されるものではなく、両者を同時に、あるいは一方を先に、他方を後に処置することができる。
【００５１】
５．キット
本発明は、HCP-1の発現阻害物質と抗癌剤とを含む、癌治療用キットを提供する。本発明のキットには、上記HCP-1の発現阻害物質のほかに、抗癌剤を含むものである。従って、本発明のキットは、抗癌剤の抗癌作用増強効果を目的として、抗癌剤と本発明のHCP-1の発現阻害物質とを併用するために使用することができる。
本発明のキットには、さらに、緩衝液、溶解液、注射器、取扱説明書、添付文書等を含んでいてもよい。取扱説明書又は添付文書等には、HCP-1の発現阻害物質と抗癌剤とを併用して用いるための組み合わせを記載することができ、また、別々の物質を投与時に併用する形態又は混合物としての形態について、用法、用量などを記載することができる。
【００５２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
＜実験方法＞
細胞
ラット胃粘膜細胞の癌様変異株RGK-36を用いた。この細胞株は発明者が樹立したラット正常胃粘膜培養細胞系RGM-1からさらに発癌剤MNNGを用いて樹立した癌様の性質を持つ変異株である(Shimokawa O, Matsui H, et al. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 44: 26-30. 2008)。
培地
抗生物質無添加のDMEM/F12（1:1） 培地（w/t 10% FBS）を用いた。
培養条件
96wellプレートに2×104個の細胞を播き、100μL/wellの培地で24時間培養した。
siRNA
4pg/wellのHCP-1 siRNAカクテル（配列は以下の通り）の3種類のsiRNAが混和されているもの）またはコントロールとしてscrambled RNA（配列：ランダム）を使用した。
センス鎖
(i) ccaaaguccacgaggcuuuTT（配列番号３）
(ii) ggguacuggagaagguuaaTT（配列番号４）
(iii) gaguaaaggagauggcauuTT（配列番号５）
アンチセンス鎖
(i) aaagccucguggacuuuggTT（配列番号６）
(ii) uuaaccuucuccaguacccTT（配列番号７）
(iii) aaugccaucuccuuuacucTT（配列番号８）
トランスフェクション
北海道システムサイエンス社製LIPO TRUST 0.5μL/wellを使用した。無血清培地10μLにsiRNA 4pgを加え、混和した後、LIPO TRUST 0.5μLを加え、混和した。これらを20分間の室温でインキュベートした。一旦培養していた培地を抜き、血清含有培地100μL/wellと混和し、各wellに投与した。細胞は48hr培養した。
細胞毒性試験
培養していた培地を捨て、PBSで1度washした。1, 5, 10μg/mLのアドリアマイシン(ADR)（Wako社製、ドキソルビシン塩酸塩）、シスプラチン(CDDP)（Wako社製）、1, 10μg/mLのフルオロウラシル(5-FU)（Wako社製）を投与した。なお、ADRとCDDPはDMSOにて、5-FUはDMFにて溶解させ、これらを1,000倍以上希釈して用いた。投与後、細胞を24時間培養した。
培養していた培地を除去し、PBSで2度washした。各wellに培地50μL、MTT変法であるTC-1法による細胞毒性試験実施のためTetra Color-1（生化学バイオビジネス株式会社製、TetraColor ONE-Cell Proliferation Assay System）10μLを投与し、約1時間インキュベートした後、450nmの吸光度を測定した。（リファレンス：630nm）
＜結果＞
siRNA投与によって、図２に示すようにHCP-1の発現は明らかに抑制された。図２は、RGK36のHCP-1発現量に対するsiRNAの効果を示すものである。
【００５４】
さらに、得られた細胞毒性試験の結果は図３の通りであった（n=6）。図３は、HCP-1のsiRNAによる各種抗癌剤の癌毒性増強効果を示すものである。
また、各抗癌剤非投与群のCell viability（吸光度）を1として、抗癌剤添加時におけるCell viabilityの比をとった（n=6）。結果を図４に示す。
以上HCP-1のsiRNAは非特異的なRNAを投与した群と比較して有意にADR, CDDP, 5-FUの癌細胞に対する毒性を増強することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のHCP-1阻害物質は、癌の治療剤、及び抗癌剤の効果増強剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号３：合成DNA/RNA
配列番号４：合成DNA/RNA
配列番号５：合成DNA/RNA
配列番号６：合成DNA/RNA
配列番号７：合成DNA/RNA
配列番号８：合成DNA/RNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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