(57)【要約】【課題】アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体を用いた免疫応答関連疾患の処置および望ましくない免疫応答を阻害すること。【解決手段】本発明は、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体に関し、該抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ連結部位における修飾を特徴としている。本発明はまた、このようなアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体を用いた免疫応答関連疾患の処置および望ましくない免疫応答の阻害に関する。特に本発明は、ＣＤ１５４を認識するアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体を提供する。より詳細には、本発明はヒト化アグリコシル化抗ＣＤ１５４抗体、すなわち「アグリコシルｈｕ５ｃ８」、およびマウスアグリコシル化抗ＣＤ１５４抗体、すなわち「アグリコシルｍｕＭＲ１」を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明はＣＤ１５４およびＣＤ４０分子の相互作用をブロックするアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体に関する。さらにまた、本発明はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体および抗体誘導体を産生するための方法を提供する。本発明の抗体および抗体誘導体は望ましくない免疫応答が関与し、そしてＣＤ１５４−ＣＤ４０相互作用により媒介される疾患の治療および防止において有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
体液性および細胞媒介性の免疫の発生は抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびエフェクターＴ細胞との活性化ヘルパーＴ細胞の相互作用により調整されている。ヘルパーＴ細胞の活性化は抗原特異性Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とその同属体ペプチドＭＨＣリガンドとの相互作用に依存しているのみならず、多くの細胞接着および同時刺激分子による協調的な結合および活性化を必要とする［Ｓａｌａｚａｒ−Ｆｏｎｔａｎａ，２００１］。
【０００３】
重要な同時刺激分子はＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０Ｌ、ｇｐ３９、Ｔ−ＢＡＭ、Ｔ細胞活性化分子、ＴＲＡＰとしても知られている）、すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞の表面において活性化依存性の一時的に制限される態様において発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ１５４はまた一部のＣＤ８＋Ｔ細胞、好塩基球、肥満細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞および血小板上においても活性化後に発現される。
【０００４】
ＣＤ１５４のカウンターレセプターであるＣＤ４０はＡＰＣを含む多くの細胞型の表面上で構成的に広範に発現されるＩ型膜タンパク質である［Ｆｏｙ，１９９６］。
【０００５】
ＣＤ１５４によるＣＤ４０を介したシグナリングはＣＤ４０レセプター担持細胞の活性化および旨適ＣＤ４＋Ｔ細胞プライミングをもたらす事象のカスケードを開始させる。より詳しくは、ＣＤ１５４およびＣＤ４０の同属体相互作用はＢ細胞の抗体分泌細胞およびメモリーＢ細胞への分化を促進する［Ｂｕｒｋｌｙ，２００１］。さらに、ＣＤ１５４−ＣＤ４相互作用はマクロファージおよび樹状細胞の活性化およびナチュラルキラー細胞および細胞毒性Ｔリンパ球の発生を介して細胞媒介免疫を促進する［Ｂｕｒｋｌｙ，２００１］。
【０００６】
体液性および細胞媒介性の免疫応答の両方の機能の調節におけるＣＤ１５４の重要な役割は治療的免疫モジュレーションのためのこの経路の阻害剤の使用に関する関心を大いに高めた［米国特許５，４７４，７７１］。抗ＣＤ１５４抗体自体は他の治療用タンパク質または遺伝子療法、アレルゲン、自己免疫および移植に対する免疫応答の種々のモデルにおいて有益であることがわかっている［米国特許５，４７４，７７１；Ｂｕｒｋｌｙ，２００１］。
【０００７】
ＣＤ４０−ＣＤ１５４相互作用は幾つかの実験的に誘導された自己免疫疾患、例えばコラーゲン誘導関節炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、卵巣炎、結腸炎、薬剤誘導性ループス腎炎において重要であることがわかっている。特に、これらのモデルのすべてにおける疾患の誘導は抗原投与の時点においてＣＤ１５４拮抗剤によりブロックできることがわかっている［Ｂｕｒｋｌｙ，２００１］。
【０００８】
抗ＣＤ１５４拮抗剤を用いた疾患のブロックはまた自発的自己免疫疾患、例えばインスリン依存性糖尿病およびループス腎炎の動物モデルにおいて、並びに、移植片対宿主疾患、移植臓器、肺線維症およびアテローム性動脈硬化症のモデルにおいても観察されている［Ｂｕｒｋｌｙ，２００１］。
【０００９】
グリコシル化抗ＣＤ１５４抗体は幾つかの免疫応答関連の疾患の防止および治療のために有用であることが解っているが、一部の被験体においては、これらを用いた治療が場合によっては血栓塞栓性の活性により合併症を起こす場合がある［Ｂｉｏｇｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００１；ＩＤＥＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００１］。この副作用の機序は不明であるが、血小板上のＦｃｇＲＩＩａおよびＣＤ１５４の抗ＣＤ１５４抗体またはその凝集物による結合が関わっており、これが不適切な血小板活性をもたらすと考えられる。他のＦｃγレセプターおよび補体への結合もまたこの作用を強化する。すなわち、エフェクターレセプターに結合しない抗ＣＤ１５４抗体はより安全であり、そして／または治療用途のためにより効果的である。
【００１０】
抗ＣＤ１５４抗体が免疫機能を阻害する機序は単にＣＤ１５４に結合してＣＤ４０との相互作用をブロックすることよりもさらに複雑であり、そして実際、エフェクター経路による寄与が関与すると考えられる。例えば、抗体抗原結合はＦｃγまたは補体成分へのＦｃドメインの結合を介して活性化Ｔ細胞の欠失を誘導する。或は、ＣＤ１５４への抗体の結合はＦｃγレセプター担持細胞上の抗体の細胞表面スカフォールドの形成により増強される。さらに、抗体のその作用部位への接近はＦｃγレセプター結合相互作用により促進される。
【００１１】
抗ＣＤ１５４抗体を含むグリコシル化抗体においては、Ｆｃ二量体のＣＨ２ドメインの保存されたＮ連結部位に結合したグリカンはＣＨ２ドメイン間に封入され、糖残基は対向するＣＨ２ドメイン上の特定のアミノ酸残基と連絡している［Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，１９９８］。種々のグリコシル化抗体を用いたインビトロの試験ではＣＨ２グリカンの除去により、Ｆｃレセプターおよび補体タンパク質Ｃ１Ｑへの抗体の結合が大きく提言されるようにＦｃ構造が改変されることがわかった［Ｎｏｓｅ，１９８３；Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ，１９８５；Ｔａｏ，１９８９；Ｌｕｎｄ，１９９０；Ｄｏｒａｉ，１９９１；Ｈａｎｄ，１９９２；Ｌｅａｄｅｒ，１９９１；Ｐｏｕｎｄ，１９９３；Ｂｏｙｄ，１９９５］。インビボの試験ではアグリコシル抗体のエフェクター機能の低下が確認された。例えばアグリコシル抗ＣＤ８抗体はマウスにおいてＣＤ８担持細胞を枯渇させることができず［Ｉｓａａｃｓ，１９９２］、そして、アグリコシル抗ＣＤ３抗体はマウスおよびヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘導しない［Ｂｏｙｄ，１９９５；Ｆｒｉｅｎｄ，１９９９］。
【００１２】
ＣＨ２ドメインにおけるグリカンの除去はエフェクター機能に対して顕著な作用を有すると考えられるが、抗体の他の機能および物理的特性は未改変のままである。特に、グリカンの除去は血清中半減期および抗原への結合に対して殆ど乃至は全く影響しない［Ｎｏｓｅ，１９８３；Ｔａｏ，１９８９；Ｄｏｒａｉ，１９９１；Ｈａｎｄ，１９９２；Ｈｏｂｂｓ，１９９２］。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明において、抗ＣＤ１５４抗体の作用機序に関与するＦｃエフェクター機能は、Ｆｃ二量体のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ連結部位の修飾によりＦｃエフェクター機能が低減されて「アグリコシル」の抗ＣＤ１５４抗体となっている抗ＣＤ１５４抗体の使用を介して解明される。このような修飾の例はＦｃ二量体のＣＨ２ドメインにおける保
存されたＮ連結部位の突然変異、ＣＨ２ドメインにおけるＮ連結部位に結合したグリカンの除去およびグリコシル化の防止を包含する。
【００１４】
抗ＣＤ１５４抗体の阻害の機序がそのＦｃエフェクター相互作用に依存しているかどうかを調べるために、抗ＣＤ１５４抗体およびそのアグリコシルの対応物を、ＣＤ１５４−ＣＤ４０相互作用のブロッキングを介した幾つかの疾患の阻害の能力に関して比較した。本明細書において報告した結果は抗ＣＤ１５４抗体のアグリコシル化された形態が抗ＣＤ１５４抗体のグリコシル化された形態と等しく保護的であることを明らかにしている。
【００１５】
本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は減衰したエフェクター機能を特徴としているため、これらの抗体は特に望ましくない血栓塞栓性の活性の危険性が存在する被験体における使用のために望ましい。さらにまた、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体の減衰したＦｃエフェクター機能は抗ＣＤ１５４抗体治療の他の潜在的副作用、例えば活性化Ｔ細胞および単球／マクロファージのＣＤ１５４またはＦｃ依存性の活性化を発現するように誘導された細胞の他の集団の欠失を低減または排除する。
【００１６】
特に本発明はＣＤ１５４を認識するアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体を提供する。より詳しくは、本発明はヒト化アグリコシル化抗ＣＤ１５４抗体、すなわち「アグリコシルｈｕ５ｃ８」、および、マウスアグリコシル化抗ＣＤ１５４抗体、すなわち「アグリコシルｍｕＭＲ１」を提供する。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、アグリコシルｈｕ５ｃ８抗体は２００３年１月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａに受託（受託番号ＰＴＡ−４９３１）されているＮＳ０アグリコシルｈｕ５ｃ８細胞株から産生され、そしてアグリコシルＭＲ１抗体は２００３年１月１４日にＡＴＣＣに受託（受託番号ＰＴＡ−４９３４）されているＮＳ０アグリコシルマウスＭＲ１細胞株から産生される。
【００１８】
本発明の１つの実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体はＣＤ１５４とＣＤ４０との間の相互作用を阻害することができる。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体はＣＤ４０担持細胞の活性化を直接または間接的にブロックする態様においてＣＤ１５４と会合することができる。
【００２０】
本発明はまたアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体を被験体に投与することを含む被験体における免疫応答を阻害する方法を提供し、ここで抗体または抗体誘導体は被験体における免疫細胞の活性化を阻害するために有効な量で投与される。
【００２１】
本発明はまたアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体を被験体に投与することを含む免疫応答依存性の状態または疾患を被験体において治療または防止する方法を提供し、抗体または抗体誘導体は、被験体における免疫細胞の活性化を阻害し、これにより免疫応答依存性の状態または疾患を治療または防止するのに有効な量で投与される。
本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体であって、該抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ連結部位での修飾により特徴付けられる、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目２）
前記修飾が、重鎖グリコシル化部位における突然変異を含み、該突然変異が、該部位におけるグリコシル化を防止する、項目１に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目３）
前記修飾が、Ｎ２９８Ｑ（ＥＵ  Ｋａｂａｔナンバリングを使用してＮ２９７）の突然変異を含む、項目２に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目４）
前記修飾が、前記ＣＨ２ドメイングリカンの除去を含む、項目１に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目５）
前記修飾が、前記ＣＨ２ドメインにおけるグリコシル化の防止を含む、項目１に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目６）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体が、エフェクターレセプターに結合しない、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目７）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体が、血栓を引き起こさない、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目８）
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マウス抗体、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体からなる群より選択される、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目９）
前記抗体が、多量体抗体、ヘテロ二量体抗体、ヘミ二量体抗体、４価抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆａｂ'  抗体フラグメント、Ｆａｂ'２抗体フラグメント、Ｆ（ｖ）抗体フラグメントおよび単鎖抗体またはその誘導体からなる群より選択される、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１０）
前記抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８である、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１１）
前記抗体または抗体誘導体が、検出可能なマーカーで標識されている、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１２）
前記検出可能なマーカーが、放射性同位体、酵素、色素またはビオチンである、項目１１に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１３）
前記抗体または抗体誘導体が、治療剤に結合体化されている、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１４）
前記治療剤が、放射性同位体、放射性核種、毒素、トキソイドまたは化学療法剤である、項目１３に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１５）
前記抗体または抗体誘導体が、画像化剤に結合体化されている、項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１６）
前記画像化剤が、標識部分である、項目１５に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１７）
前記画像化剤が、ビオチン、蛍光部分、放射性部分、ヒスチジンタグまたはペプチドタグである、項目１５に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体。
（項目１８）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体を含有する薬学的組成物。
（項目１９）
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含有する、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２０）
免疫抑制性化合物または免疫調節性化合物をさらに含有する、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２１）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体を産生する細胞株。
（項目２２）
前記細胞株が、アグリコシルｈｕ５ｃ８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１）を産生する、項目２１記載の細胞株。
（項目２３）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または、該抗体または抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって、該被験体における免疫応答を阻害するための方法。
（項目２４）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または薬学的組成物が、ＣＤ４０へのＣＤ１５４の結合を阻害する、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または薬学的組成物が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に認識されるタンパク質に特異的に結合することができる、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または薬学的組成物が、アグリコシルｈｕ５ｃ８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１）が特異的に結合するエピトープに特異的に結合する、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の、有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体における炎症応答を阻害するための方法。
（項目２８）
前記炎症応答が、関節炎、接触性皮膚炎、高ＩｇＥ症候群、炎症性腸疾患、アレルギー性喘息および特発性炎症性疾患からなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記関節炎が、関節リューマチ、非リューマチ様炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎および炎症性変形性関節症からなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記特発性炎症性疾患が、乾癬および全身性狼瘡からなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の、有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体における移植拒絶を阻害するための方法。
（項目３２）
前記移植拒絶が、移植された、心臓、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓島細胞または骨髄を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体における移植片対宿主疾患を阻害するための方法。
（項目３４）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体におけるアレルギー応答を阻害するための方法。
（項目３５）
前記アレルギー応答が、枯草熱またはペニシリンまたは他の薬剤に対するアレルギーからなる群より選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体における自己免疫応答を阻害するための方法。
（項目３７）
前記自己免疫応答が、感染性疾患から由来する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記自己免疫応答が、ライター症候群、脊椎関節炎、ライム病、ＨＩＶ感染症、梅毒または結核から由来する、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記自己免疫応答が、関節リューマチ、重症筋無力症、全身エリテマトーデス、グレーブス病、特発性血小板減少症、紫斑病、溶血性貧血、真性糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症、乾癬、薬剤誘導性自己免疫疾患、および薬剤誘導性狼瘡からなる群より選択される、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体における線維症を阻害するための方法。
（項目４１）
前記線維症が、肺線維症および線維性疾患からなる群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記肺線維症が、成人呼吸窮迫症候群に二次的な肺線維症、薬剤誘導性肺線維症、特発性肺線維症および過敏性肺炎からなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記線維性疾患が、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝硬変、毒物発作に二次的な肝硬変、ウィルス感染に二次的な肝硬変および自己免疫疾患に二次的な肝硬変からなる群より選択される、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によってＨＴＬＶ  Ｉウィルスによる該被験体のＴ細胞のウィルス感染を阻害するための方法。
（項目４５）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体における胃腸疾患を阻害するための方法。
（項目４６）
前記胃腸疾患が、食道運動不全、炎症性腸疾患および硬皮症からなる群より選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって該被験体における脈菅疾患を阻害するための方法。
（項目４８）
前記脈菅疾患が、アテローム性動脈硬化症または再灌流傷害からなる群より選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によって、Ｔ細胞癌に罹患した該被験体におけるＴ細胞腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法。
（項目５０）
項目１〜５のいずれか１項に記載のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物の有効阻害量を被験体に投与する工程によってＨＴＬＶ  Ｉによる該被験体のＴ細胞のウィルス感染を阻害するための方法。
（項目５１）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、マウス抗体、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群より選択される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体が、多量体抗体、ヘテロ二量体抗体、ヘミ二量体抗体、４価抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ抗体フラグメント、Ｆａｂ'抗体フラグメント、Ｆａｂ'２抗体フラグメント、Ｆ（ｖ）抗体フラグメント、および単鎖抗体またはその誘導体からなる群より選択される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、医学的に受容可能であるいずれかの様式で前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄内注射、脳室内注射、硬膜内注射、動脈内注射、脈菅内注射、関節内注射、滑液内注射、胸骨内注射、髄腔内注射、肝臓内注射、脊椎内注射、腫瘍内注射、頭蓋内注射、経腸注射、肺内注射、経粘膜注射、子宮内注射、舌下注射または炎症または腫瘍生育の部位での局所的注射によって前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体もしくはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、経口経路、経鼻経路、眼内経路、直腸内経路および局所的経路からなる群より選択される経路により前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体、または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、カプセル剤、錠剤、水性の懸濁液または溶液の形態で経口的に前記被験体に投与される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、クリーム、軟膏などの適用により局所的に前記被験体に投与される、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、ネブライザー、乾燥粉末吸入器または計量用量吸入器の使用を介した吸入により前記被験体に投与される、項目５５に記載の方法。
（項目５９）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、除放性投与により前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、治療剤と一緒に前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、一日当たり複数回投与において前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、毎日〜１ヶ月おきの範囲の間隔で反復して前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、数日または数週間〜被験体の生涯の範囲で医学的に指示されるような長さの間隔で前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体または該抗体もしくは抗体誘導体を含有する薬学的組成物が、免疫調節性化合物または免疫抑制性化合物と一緒に前記被験体に投与される、項目２３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
項目６４に記載の方法であって、前記免疫調節性化合物または免疫抑制性化合物が、以下：
（ａ）ＣＤ２８を介したＴ細胞同時刺激シグナリングを中断させる薬剤；
（ｂ）カルシニューリンシグナリングを中断させる薬剤；
（ｃ）コルチコステロイド；
（ｄ）抗増殖剤；および、
（ｅ）ＣＤ４５、ＣＤ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＲＡＮＫ  ＦｃＲ、Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ、ＬＴβおよびＶＬＡ−４が挙げられるが、これらに限定されない、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体；
からなる群より選択される、方法。
（項目６６）
前記免疫抑制性化合物または免疫調節性化合物が、タクロリムス、シロリムス、マイコフェノレートモフェチル、ミゾルビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナールナトリウム、レフルノミド、ラパマイシンおよびアザスピランからなる群より選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に認識されるタンパク質を発現する、被験体における腫瘍細胞または新生物細胞を画像化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該抗体または抗体誘導体と、該腫瘍細胞または新生物細胞の表面上のタンパク質との間の複合体形成を可能にする条件下で項目１８に記載の薬学的組成物の有効量を該被験体に投与する工程；および
（ｂ）任意の形成された、抗体／タンパク質複合体または抗体誘導体／複合体を画像化することにより、該被験体における任意の腫瘍細胞または新生物細胞を画像化する工程；を包含する方法。
（項目６８）
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に認識されるタンパク質を発現する被験体における腫瘍細胞または新生物細胞の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該抗体または抗体誘導体と該タンパク質との間の複合体形成を可能にする条件下で項目１８に記載の薬学的組成物の有効量を該被験体に投与する工程；
（ｂ）いかなる未結合の画像化剤を該被験体から除去する工程；および
（ｃ）任意の形成された、抗体／タンパク質複合体または抗体誘導体／複合体の存在を検出する工程であって、このような複合体の存在は該被験体における腫瘍細胞または新生物細胞の存在を示す、工程；
を包含する方法。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１はアグリコシルｈｕ５ｃ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂが同じ相対的親和性でヒトＣＤ１５４に結合することを示している。ビオチニル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂの細胞表面ＣＤ１５４への結合を未標識のグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂまたはアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの滴定試料により競合させた。ストレプトアビジン−ＰＥで検出したビオチニル化抗体の平均蛍光強度を未標識抗体の濃度に対してプロットした。４パラメーターの曲線フィットをまとめて示した。
【図２】図２はアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂが損なわれたＦｃＲ結合能力を有することを示している。抗ＣＤ１５４抗体、すなわちアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂがｈｕＣＤ１５４とＦｃγＲＩ＋細胞との間（ａ）またはｈｕＣＤ１５４＋ＣＨＯ細胞とＦｃγＲＩＩＩ＋細胞との間（ｂ）に架橋を形成する能力を評価した。グリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂまたはアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂを予めＣＤ１５４に結合させたものが入ったマイクロプレートに蛍光標識ＦｃγＲ＋細胞を添加した。結合ＦｃγＲ＋細胞は励起／発光スペクトル４８５／５３０ｎｍを用いて各ウェル中の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定することにより検出した。
【図３】図３はグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂおよびアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂがカニクイザルにおいて同様の結成中半減期を有することを示している。グリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂおよびアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの濃度は単回２０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与の後のカニクイザルの血清中において測定した。各投与群の平均血清中濃度±標準偏差（ＳＤ）で示す。
【図４】図４はグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂおよびアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂが破傷風トキソイド（ＴＴ）に対する一次免疫応答を阻害することを示している。グリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂ試験（黒丸）およびアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ（白丸）におけるｍＡｂ投与群および生理食塩水対照群のカニクイザルに関する結果を示す。
【図５】図５はアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂがＴＴに対する二次免疫応答を阻害することを示している。個々のカニクイザルのＴＴに対する一次（黒バー）および二次（白バー）の全体的抗体応答（ＥＡＵＣ）を示す。群１Ａの動物には一次および二次ＴＴ攻撃の両方の前に生理食塩水を投与した。群１Ｂの動物には一次ＴＴ攻撃の前には生理食塩水、二次ＴＴ攻撃の前にはアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂを投与した。
【図６】図６はＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるグリコシル化マウスキメラＭＲ１（ｍｕＭＲ１）およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体の薬物動態を示す。グリコシル化ｍｕＭＲ１抗体（ひし形）およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体（四角）に関する結果を示す。
【図７】図７（ＡおよびＢ）はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体がＳＮＦ１マウスにおいて１本鎖（Ａ）および２本鎖（Ｂ）ＤＮＡに対する自己抗体応答を低減させることを示す。ｍｕＭＲ１抗体（ひし形）およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体（四角）に関する結果を示す。対照のｍｕＩｇＧ２ａ抗体は三角で示す。
【図８】図８はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体がＳＮＦ１マウスにおいて糸球体腎炎の発症を低減することを示している。複合組織学的評点をｍｕＩｇＧ２ａ（対照）、ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１投与マウスについて記載する。
【図９】図９はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体がＳＮＦ１マウスにおいて糸球体腎炎の発症時期を遅延させることを示す。ｍｕＭＲ１抗体（ひし形）およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体（四角）に関する結果を示す。対照のｍｕＩｇＧ２ａ抗体は三角で示す。
【図１０】図１０はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体がＳＮＦ１マウスにおける血清中クレアチニンの増大を防止することを示している。ｍｕＭＲ１抗体（ひし形）およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体（四角）に関する結果を示す。対照のｍｕＩｇＧ２ａ抗体は三角で示す。
【図１１】図１１はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体がＳＮＦ１マウスにおいて上昇した血中尿素態窒素（ＢＵＮ）の発症時期を遅延させることを示している。ｍｕＭＲ１抗体（ひし形）およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体（四角）に関する結果を示す。対照のｍｕＩｇＧ２ａ抗体は三角で示す。
【図１２】図１２はアイソタイプの対照Ｐ１．１７抗体を投与したマウスと比較した場合に、ｍｕＭＲ１抗体を投与したマウスが実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の症状を発症しなかったことを示している。ｍｕＭＲ１抗体（白丸）およびＰ１．１７対照抗体（黒丸）に関する結果を示す。
【図１３】図１３は、アグリコシルｍｕＭＲ１抗体を投与したマウスにおいてアグリコシルｍｕＭＲ１抗体がｍｕＭＲ１抗体と同様にＥＡＥ臨床兆候の阻害において有効であったことを示している。結果は無能力評点（平均＋平均の標準誤差−ＳＥＭ）および疾患の誘導後の日数に関連付けた初期体重の％（平均＋ＳＥＭ）として示した。Ｐ１．１７は対照Ｉｇである。
【図１４】図１４は同種異系島細胞移植の後のアカゲザルにおける絶食時の血中グルコース（ＦＢＧ）を示す。急性の拒絶反応はＦＢＧ＞１００ｍｇ／ｄｌと定義した。アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ（破線）およびグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂ（実線）を投与した動物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載した本発明をより理解するために、以下の詳細な説明を記載する。特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的および専門的な用語は本発明が関係する技術分野の当業者が一般的に理解している意味と同様の意味を有する。例示される方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載するものと同様または同等の方法および材料もまた本発明の実施において使用でき、そして当業者には明らかなものである。
本明細書全体を通じて、種々の出版物および参考文献を括弧内で示す。これらの出版物および参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、これにより本発明が関係する技術分野をより詳細に説明するものとする。これらの参考文献の目録的引用は本文中に記載するか、または、実験の説明の項目の後に番号により列挙する。矛盾がある場合は、本明細書を優先する。材料、方法および実施例は説明のためのものであり、限定を意図しない。
【００２４】
当業者の知る組み換えＤＮＡ技術の一般的原理を説明する標準的な参考書は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００１）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）；  Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（１９９５）；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｅｄ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）を包含する。
【００２５】
当業者の知る免疫学の一般的原理を説明する標準的な参考書は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９９９）；Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，  Ｌｏｎｄｏｎ（１９９３）を包含する。当業者の知る医学生理学および薬理学の一般的原理を説明する標準的な参考書は、Ｆａｕｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ'ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９８）を包含する。
【００２６】
本発明の試薬および方法は免疫応答を阻害するため、および、免疫応答により誘導される疾患および状態、例えば自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶反応、炎症、移植片対宿主疾患、線維症およびアテローム性動脈硬化症を治療するためのアグリコシル抗体またはその抗体誘導体の使用を意図している。
【００２７】
より詳しくは、治療、特にヒトの治療のために使用されるアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体および多量体抗体を包含する。
【００２８】
（抗体）
抗体は身体内の外来性分子の存在に応答して脊椎動物の免疫系の体液性の作動により産生される約ＭＷ１５０ｋＤの糖タンパク質である。機能的抗体または抗体誘導体はインビトロおよびインビボでその特異的抗原を認識して結合することが可能であり、そして、いずれかのその後の抗体結合関連の作用、例えば直接の細胞毒性、補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ））、抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗体の産生を開始させる。
【００２９】
抗原に結合することにより、抗体は感染微生物または他の抗原含有の実体、例えば癌細胞の中和、破壊および排除に寄与する免疫系の多くのエフェクター系１つ以上を活性化させる。
【００３０】
天然に存在する抗体は単一の種から誘導されるが、操作された抗体および抗体フラグメントは１種より多い動物から誘導される場合があり、例えばキメラ抗体が挙げられる。今日までマウス（マウス）／ヒトキメラおよびマウス／非ヒト霊長類抗体が作製されているが、他の種の組み合わせも可能である。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体はキメラ抗体である。典型的には、キメラ抗体は他の種（典型的にはヒト）の定常領域に融合したある種（典型的にはマウス）の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレーム枠残基の両方を含む重鎖および／または軽鎖の可変領域を含む。これらのキメラマウス／ヒト抗体は約７５％のヒトおよび２５％のマウスアミノ酸配列をそれぞれ含んでいる。ヒト配列は抗体の定常領域を表し、マウス配列は抗体の可変領域を表す（そしてこれにより抗原結合部位を含む）。
【００３２】
このようなキメラの使用の根拠は、マウス抗体の抗原特異性を保持するがマウス抗体の免疫原性を低下させる（マウス抗体はマウス以外の種においてはそれに対する免疫応答を誘発する）ことであり、これにより、ヒトの治療におけるキメラの使用が可能となる。
【００３３】
別の特定の実施形態においては本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は１つの抗体のフレーム枠領域および別の抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体を包含する。
【００３４】
より特定の実施形態においては、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は異なるヒト抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体を包含する。
【００３５】
別の特定の実施形態においては、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は、少なくとも２つの異なるヒト抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体を包含する。
【００３６】
上記のキメラ抗体の全てを製造する方法は当該分野でよく知られている［米国特許５，８０７，７１５；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８４；Ｓｈａｒｏｎ，１９８４；Ｔａｋｅｄａ，１９８５］。
【００３７】
本発明の別の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体はまた霊長類化、ヒト化および完全ヒト化の抗体を包含する。霊長類化およびヒト化抗体は典型的には通常はさらにヒト定常領域を含む非ヒト霊長類またはヒトの抗体Ｖ領域フレーム枠に移植されたマウス抗体に由来する重鎖および／または軽鎖のＣＤＲを包含する［Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９８８；Ｃｏ，１９９１；米国特許６，０５４，２９７；５，８２１，３３７；５，７７０，１９６；５，７６６，８８６；５，８２１，１２３；５，８６９，６１９；６，１８０，３７７；６，０１３，２５６；５，６９３，７６１；および６，１８０，３７０］。
【００３８】
（１．ヒト化抗体）
ヒト化抗体は組み換えＤＮＡ技術により産生された抗体であり、それにおいては、抗原結合に必要とされないヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸の一部または全て（例えば定常領域および可変ドメインのフレーム枠領域）を用いて同属体非ヒト抗体の軽鎖または重鎖の相当するアミノ酸を代替する。例えば、ある抗原に対するマウス抗体のヒト化バージョンはその重鎖および軽鎖の両方の上に（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメインのフレーム枠領域；および（３）マウス抗体のＣＤＲを有する。必要に応じて、抗原に対するヒト化抗体の結合親和性が温存されるようにヒトフレーム枠領域の残基１つ以上をマウス抗体の相当する位置における残基に変更することができる。この変更は「復帰突然変異」と称される場合がある。ヒト化抗体は一般的にはかなり少ない非ヒト成分を含有することからキメラヒト抗体と比較してヒトにおいて免疫応答を示す可能性は低い。ヒト化抗体を製造する方法は抗体の分野でよく知られている［欧州特許２３９４００；Ｊｏｎｅｓ，１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，１９８８；Ｑｕｅｅｎ，１９８９；Ｏｒｌａｎｄｉ，１９８９；米国特許６，１８０，３７０］。
【００３９】
本発明の１つの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト抗体へのマウス（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植により作製される。より詳細には、これは以下の通り、すなわち、（１）重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードするｃＤＮＡをハイブリドーマから単離する；（２）ＣＤＲを含む可変ドメインのＤＮＡ配列を配列決定により調べる；（３）ＣＤＲをコードするＤＮＡを部位指向性の突然変異誘発によりヒト抗体の重鎖または軽鎖の可変ドメインのコーディング配列の相当する領域に転移させる；および（４）所望のアイソタイプのヒト定常領域の遺伝子セグメント（例えばＣＨにはｌ、およびＣＬにはｋ）を付加することにより達成される。最後に、ヒト化重鎖および軽鎖の遺伝子を哺乳類宿主細胞（例えばＣＨＯまたはＮＳ０細胞）において同時発現することにより、可溶性のヒト化抗体が製造される。
【００４０】
場合によりヒトフレーム枠へのＣＤＲの直接の転移では得られる抗体の抗原結合親和性の損失が起こる。これは、一部の同属態抗体においてフレーム枠領域内の特定のアミノ酸がＣＤＲと相互作用し、これにより抗体の全体的抗原結合親和性に影響するためである。このような場合は、同属体抗体の抗原結合活性を保持するためにはアクセプター抗体のフレーム枠領域内に「復帰突然変異」を導入することが重要である。復帰突然変異を起こすための一般的方法は当該分野でよく知られている［Ｑｕｅｅｎ，１９８９；Ｃｏ，１９９１；ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０７８６１；Ｔｅｍｐｅｓｔ，１９９１］。
【００４１】
（２．ヒト抗体）
本発明の１つの実施形態において、抗体および抗体誘導体は完全ヒトアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体である。
【００４２】
本発明のより特定の実施形態において、完全ヒト抗体はインビトロプライミングヒト脾細胞［Ｂｏｅｒｎｅｒ，１９９１］またはファージディスプレイ抗体ライブラリ［米国特許６，３００，０６４］を用いて製造する。
【００４３】
本発明のより特定の実施形態においては、完全ヒト抗体はレパートリークローニングにより製造する［Ｐｅｒｓｓｏｎ，１９９１；Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌｅｒ，１９９１］。さらに米国特許５，７９８，２３０はヒトＢ細胞由来のヒトモノクローナル抗体の製造を記載しており、そこにおいては、不朽化に必要なタンパク質であるエプスタイン・バーウィルス核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するエプスタイン・バーウィルスまたはその誘導体で感染させることによりヒト抗体産生Ｂ細胞を不朽化している。ＥＢＮＡ２機能はその後シャットオフされ、これにより抗体の産生が増大する。
【００４４】
完全ヒト抗体を産生するための他の方法では、非再配列ヒト抗体の重鎖および軽鎖遺伝子に関して不活性化された内因性Ｉｇ遺伝子座を有し、そしてトランスジェニックである非ヒト動物を使用する。このようなトランスジェニックな動物は活性化Ｔ細胞またはＤ１．１タンパク質で免疫化することができ［米国特許５，４７４，７７１；米国特許６，３３１，４３３；米国特許６４５５，０４４］、そして、ハイブリドーマはそれらが由来するＢ細胞から作製できる。これらの方法の詳細は当該分野で報告されている。例えば、ヒトＩｇミニ遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスに関する種々のＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄｅｒａｘ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）出版物／特許、例えば米国特許５，７８９，６５０；ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスに関する種々のＡｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）出版物／特許、例えば米国特許６，０７５，１８１、６，１５０，５８４および６，１６２，９６３；Ｇｒｅｅｎ，１９９７；Ｍｅｎｄｅｚ，１９９７；および「トランソミック」マウスに関する種々のＫｉｒｉｎ（Ｊａｐａｎ）出版物／特許、例えば欧州特許８４３９６１およびＴｏｍｉｚｕｋａ，１９９７を参照できる。
【００４５】
（脱グリコシル化抗体の作製）
現在、ｍＡｂのＦｃ部分の他の価値ある属性を保持しつつそのエフェクター機能を低減するためには２通りの方法がある。抗体を修飾するための１つの方法はエフェクター結合相互作用に関与するｍＡｂの表面上のアミノ酸を突然変異させることである［欧州特許２３９４００；Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ，１９９８］。突然変異の幾つかの組み合わせはエフェクター機能の十分な低減をもたらすが、試験されている表面突然変異体抗体はこれまで残余活性を保持していると考えられている。この方法に関する他の問題点はｍＡｂの表面上のアミノ酸の変化が免疫原性を誘発する可能性がある点である。
【００４６】
本発明は低減されたエフェクター機能を有するアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体に関し、これは該抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ連結部位における修飾を特徴とする。
【００４７】
本発明の１つの実施形態において、修飾は重鎖グリコシル化部位における突然変異を含み、これによりその部位におけるグリコシル化を防止する。すなわち、本発明の１つの好ましい実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体は重鎖グリコシル化部位の突然変異により、すなわちＮ２９８Ｑ（ＥＵ  Ｋａｂａｔナンバリングを用いればＮ２９７）の突然変異により製造し、適切な宿主細胞中で発現させる。例えば、この突然変異はＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｔｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）より入手可能なユニーク部位突然変異誘発キットに関する製造元の推奨プロトコルに従って行える。突然変異した抗体は宿主細胞（例えばＮＳ０またはＣＨＯ細胞）内で安定に発現させ、次に精製する。一例として精製はプロテインＡおよびゲル濾過クロマトグラフィーを用いて実施できる。当業者の知る通り、別の発現および精製の方法も使用してよい。
【００４８】
本発明の別の実施形態においてはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体は低減されたエフェクター機能を有し、ここで該抗体または抗体誘導体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ連結部位における修飾はＣＨ２ドメイングリカンの除去、すなわち脱グリコシル化を含む。これらのアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は従来の方法で作製してよく、そして次に酵素的に脱グリコシル化する。抗体の酵素的脱グリコシル化の方法は当該分野でよく知られている［Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９７３；Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ＆Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，１９７６］。
【００４９】
本発明の別の実施形態においては、グリコシル化阻害剤ツニカマイシンを使用して脱グリコシル化を行ってよい［Ｎｏｓｅ＆Ｗｉｇｚｅｌｌ，１９８３］。すなわち、修飾は該抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメインにおける保存されたＮ連結部位におけるグリコシル化の防止である。
【００５０】
本発明の他の実施形態においては、組み換えＣＤ１５４ポリペプチド（またはそのポリペプチドを含有する細胞または細胞膜）を抗原として使用することにより抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体を作製し、それを次に脱グリコシル化してよい。抗原は抗体産生を増大させるためにアジュバントと混合するか、または、ハプテンに連結してよい。
【００５１】
本発明のアグリコシル抗体または抗体誘導体の修飾が部位指向性突然変異によるか、または上記した酵素的脱グリコシル化方法によるかに関わらず、抗体の作製の基本は当業者の知るとおりである。例えば非ヒト哺乳類の免疫化のためのプロトコルは当該分野で確立されている［Ｈａｒｌｏｗ，１９９８；Ｃｏｌｉｇａｎ，２００１；Ｚｏｌａ，２０００］。
【００５２】
免疫化の後、本発明の抗体または抗体誘導体はいずれかの従来の技術を用いて製造することができる。例えばＨｏｗａｒｄ，２０００；Ｈａｒｌｏｗ，１９９８；Ｄａｖｉｓ，１９９５；Ｄｅｌｖｅｓ，１９９７；Ｋｅｎｎｅｙ，１９９７を参照できる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態においては、宿主細胞は例えば（１）細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、カウロバクター・クレセンタス、ストレプトマイセス種およびマウスチフス菌；（２）酵母細胞、例えばサッカロマイセス・セレビシアエ、シキゾサッカロマイセス・ポンベ、ピチア・パストリス、ピチア・メタノリカ；（３）昆虫細胞株、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、例えばＳｆ９およびＳｆ２１細胞株、およびｅｘｐｒｅｓｓＳＦＴＭ細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）−ショウジョウバエＳ２細胞およびＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ；または（４）哺乳類細胞であってよい。典型的な哺乳類細胞はＣＯＳ１およびＣＯＳ７細胞、チャイニーズハムスター卵（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８、ネズミＥＳ細胞株（例えば系統１２９／ＳＶ、Ｃ５７／ＢＬ６、ＤＢＡ−１、１２９／ＳＶＪ由来のもの）、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＢＷ５１４７を包含する。他の有用な哺乳類細胞株はよく知られており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＩＧＭＳ）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ．ＵＳＡ）から入手可能である。これらの細胞型は代表例であるのみであり、網羅的列挙ではない。
【００５４】
本発明の別の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体を無細胞翻訳により製造する。
【００５５】
本発明の別の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体は大規模産生を容易にするために抗体発現細胞を含有するバイオリアクター内で製造する。
【００５６】
本発明の別の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体の大規模産生を容易にするために乳汁中で抗体を発現するトランスジェニック哺乳類（例えばヤギ、ウシまたはヒツジ）において製造する［米国特許５，８２７，６９０；Ｐｏｌｌｏｃｋ，１９９９］。
【００５７】
上記した通り、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体は原核細胞および真核細胞において製造できる。すなわち本発明は本発明の抗体を発現する細胞、例えば本発明の抗体を発現するように組み換えにより修飾されたハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、プラズマ細胞並びに宿主細胞を提供する。
【００５８】
一部上記したその他の問題点のうち、宿主細胞株は所望の態様で発現されたＣＤ１５４タンパク質をプロセシングする能力があるものを選択してよい。アグリコシル化のほかに、このようなポリペプチドの翻訳後修飾としては、例えばアセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、脂質化およびアシル化が挙げられ、そしてこれらの翻訳後修飾の１つ以上を有するアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体を提供することは本発明の特徴である。
【００５９】
（抗体の修飾）
投与された場合に、抗体はしばしば循環系から急速に排除され、従って比較的短命な薬理学的活性を示す場合がある。その結果、抗体投与の治療効果を持続するためには比較的大用量の抗体の頻繁な注射が必要となる場合がある。
【００６０】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体はインビボで抗体の一体性および持続性を増大させるために修飾（すなわち他の分子に結合）してよい。例えば、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体は安定性を増大させる部分が含まれるように修飾することにより抗体の血清中半減期を延長させてよい。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は、全て相当する未修飾タンパク質よりも静脈内注射後に血中半減期を実質的に延長することがわかっている水溶性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンまたはポリプロリン等の共有結合により修飾される［Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，１９８１；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２；Ｎｅｗｍａｒｋ  １９８２；Ｋａｔｒｅ，１９８７］。
【００６２】
抗体の修飾はまた、水溶液中のタンパク質の溶解度を増大させ、凝集を排除し、タンパク質の物理的および化学的安定性を増大させ、そして、タンパク質の免疫原性および抗原性を大きく低下させる。その結果、未修飾のタンパク質よりも低頻度または低用量におけるそのような重合体タンパク質付加物の投与により所望のインビボの生物学的活性が達成されるのである。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は検出可能なマーカー、例えば放射性同位体、酵素、色素またはビオチンにより標識することにより修飾する。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体は治療薬、例えば放射性同位体または放射性核種（例えば１１１Ｉｎまたは９０Ｙ）、毒素部分（例えば破傷風トキソイドまたはリシン）、トキソイドまたは化学療法剤と結合体化することにより修飾する［米国特許６，３０７，０２６］。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態においてはアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体は画像化剤に結合体化することにより修飾する。画像化剤は単離または検出が容易になるように例えば標識部分（例えばビオチン、蛍光部分、放射性部分、ヒスチジンタグまたは他のペプチドタグ）を含んでよい。
【００６６】
（抗体誘導体）
本発明はまたアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体に関する。アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体に関して上記した全ての方法および試薬は本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体の製造のために使用してよい。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体はヘテロメリックの抗体複合体および抗体融合物、例えば二重特異性の抗体、ヘミ二量体の抗体、多価の抗体（すなわち４価抗体）および一重鎖の抗体を包含する。ヘミ二量体抗体はＦｃ部分および１つのＦａｂ部分よりなる。一重鎖抗体は一重タンパク質鎖中のタンパク質スペーサーにより連結された可変領域よりなる。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態においては、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体誘導体は１つ以上の免疫グロブリンの軽鎖および／または重鎖を含有するタンパク質を包含し、これらの鎖の単量体およびホモまたはヘテロ多量体（例えば二量体または三量体）が挙げられ、その場合、これらの鎖は場合によりジスルフィド結合するか、または他の態様で交差結合している。これらの抗体誘導体は抗原１つ以上に結合することができる。
【００６９】
別の実施形態によれば、本発明はＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦ（ｖ）抗体フラグメントのような全抗体のアグリコシル化抗原結合フラグメントを包含する。さらに別の実施形態においては、本発明はＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２およびＦ（ｖ）抗体フラグメントのような全抗体の抗原結合フラグメントを包含する。
【００７０】
（細胞株）
本発明はまた本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体を産生する細胞株を提供する。アグリコシルｈｕ５ｃ８抗体を産生するこのような細胞株の１つは特許手続きの目的のための微生物の受託の国際認識のためのブタペスト条約の条項の下、２００３年１月１４日にＡＴＣＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡに受託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１で登録されている。キメラマウスアグリコシルｍｕ５ｃ８抗体を産生する第２のこのような細胞株は特許手続きの目的のための微生物の受託の国際認識のためのブタペスト条約の条項の下、２００３年１月１４日にＡＴＣＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０−２２０９，ＵＳＡに受託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３４で登録されている。
【００７１】
（治療方法）
本発明の１つの実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は被験体における免疫応答を阻害することが可能である。抗体、抗体誘導体または薬学的組成物は有効阻害量で被験体に投与する。
【００７２】
抗体、抗体誘導体または薬学的組成物の「有効阻害量」とは、それを投与する被験体におけるＣＤ１５４−ＣＤ４０相互作用を阻害するために有効であるいずれかの量である。「阻害量」を決定する方法は当該分野でよく知られており、例えば関与する被験体の型、被験体の体格および送達する治療薬などのような要因により異なる。
【００７３】
本発明の特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＣＤ１５４タンパク質分子に結合することができる。
【００７４】
本発明の特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に結合されるＣＤ１５４タンパク質に結合することができる。
【００７５】
本発明の特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に結合されるＣＤ１５４エピトープに結合することができ、ここでアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体はＮ２９８Ｑ（ＥＵＫａｂａｔナンバリングを用いればＮ２９７）の突然変異を特徴としている。
【００７６】
本発明の特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はエフェクターレセプターに結合しない。本発明のより特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に結合されるＣＤ１５４タンパク質に結合することができ、ここでアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体または薬学的組成物はエフェクターレセプターに結合しない。
【００７７】
本発明の特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は血栓症を誘発しない。本発明のより特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に結合されるＣＤ１５４タンパク質に結合することができ、ここでアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体または薬学的組成物は血栓症を誘発しない。
【００７８】
本発明の別の特定の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＣＤ１５４−ＣＤ４０相互作用を阻害することにより免疫応答を阻害することができる。
【００７９】
本発明の１つの実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は炎症を阻害することができる。本発明の目的のためには、炎症応答は浮腫および貪食性白血球の遊走を伴った毛細血管の拡張の結果としての発赤、むくみ、灼熱感および疼痛を特徴とする。炎症応答の一例には、関節炎、接触性皮膚炎、ＩｇＥ亢進症候群、炎症性腸疾患、アレルギー性喘息および特発性炎症性疾患が包含される［Ｇａｌｌｉｎ，１９８９］。関節炎の一例は関節リューマチ、非リューマチ様炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎および炎症性骨関節炎を包含する。特発性炎症性疾患の一例は乾癬および全身性狼瘡を包含する。
【００８０】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は移植された臓器の被験体による拒絶反応を阻害することができる。
【００８１】
本発明のより特定の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は移植された心臓、腎臓、肝臓、皮膚、膵島細胞または骨髄の被験体による拒絶反応を阻害することができる。
【００８２】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は被験体における移植片対宿主疾患を阻害することができる。
【００８３】
本発明の１つの実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は被験体におけるアレルギー応答、例えば枯草熱またはペニシリンまたは他の薬剤に対するアレルギーを阻害することができる。
【００８４】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は自己免疫疾患に罹患した被験体における自己免疫応答を阻害することができる。自己免疫疾患の例は関節リューマチ、重症筋無力症、全身エリテマトーデス、グレーブス病、特発性血小板減少症、紫斑病、溶血性貧血、真性糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症、乾癬、薬剤誘導性の自己免疫疾患、例えば薬剤誘導性の狼瘡を包含する。
【００８５】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は感染性疾患から誘導される自己免疫応答に罹患した被験体における自己免疫応答を阻害することが可能である。
【００８６】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はライター症候群、脊椎関節炎、ライム病、ＨＩＶ感染症、梅毒または結核から誘導される自己免疫応答に罹患した被験体における自己免疫応答を阻害することができる。
【００８７】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は被験体における線維症を阻害することができる。
【００８８】
線維症のいくつかの例は肺線維症または線維性疾患を包含する。肺線維症の一例は成人呼吸窮迫症候群に二次的な肺線維症、薬剤誘導性肺線維症、特発性肺線維症および過敏性肺炎を包含する。線維性疾患の一例はＣ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝硬変、毒物発作に二次的な肝硬変、ウィルス感染に二次的な肝硬変および自己免疫疾患に二次的な肝硬変を包含する。
【００８９】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は胃腸疾患を阻害することができる。胃腸疾患の一例は食道運動不全、炎症性腸疾患および硬皮症を包含する。
【００９０】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物は脈菅疾患を阻害することができる。脈菅疾患の一例はアテローム性動脈硬化症または再灌流傷害を包含する。
【００９１】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＴ細胞癌、例えばＴ細胞白血病またはリンパ腫に罹患した被験体におけるＴ細胞腫瘍の増殖を阻害することができる。このようなアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体または薬学的組成物はそのような被験体におけるＴ細胞腫瘍の増殖を阻害するために有効な量で被験体に投与してよい。
【００９２】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＨＴＬＶＩウィルスによる被験体のＴ細胞のウィルス感染を阻害することができる。このようなアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体または薬学的組成物はそのような被験体におけるウィルス感染を阻害するために有効な量で被験体に投与してよい。
【００９３】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に認識されるタンパク質を発現する被験体における腫瘍細胞または新生物細胞を画像化することができる。被験体における腫瘍細胞または新生物細胞を画像化するための方法は、以下の工程、すなわち、抗体または抗体誘導体と腫瘍細胞または新生物細胞表面上のタンパク質との間の複合体の形成を可能にする条件下でアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体または薬学的組成物の有効量を被験体に投与すること；および、形成された抗体／タンパク質複合体または抗体誘導体／複合体のいずれかを画像化することにより被験体における腫瘍細胞または新生物細胞のいずれかを画像化すること；
を含む。
【００９４】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗体、抗体誘導体または抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４９３１を有する細胞株により産生されるアグリコシルｈｕ５ｃ８により特異的に認識されるタンパク質を発現する被験体における腫瘍細胞または新生物細胞の存在を検出することができる。被験体における腫瘍細胞または新生物細胞の存在を検出するための１つのこのような方法は、以下の工程、すなわち：抗体または抗体誘導体とタンパク質との間の複合体の形成を可能にする条件下でアグリコシル抗体、抗体誘導体または薬学的組成物の有効量を被験体に投与すること；未結合の画像化剤を被験体から除去すること；および、形成された抗体／タンパク質複合体または抗体誘導体／複合体のいずれかの存在を検出すること、ただし該複合体の存在は被験体における腫瘍細胞または新生物細胞の存在を示すものであることを含む。
【００９５】
（薬学的組成物）
本発明は本明細書に開示したアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体を含む薬学的組成物を提供する。
【００９６】
本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物はアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体または抗体誘導体１つ以上を含む。
【００９７】
本発明の別の実施形態において、薬学的組成物はさらに薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、送達ベヒクル、緩衝剤または安定化剤を含んでよい。
【００９８】
本発明のより特定の実施形態においては製薬上許容しうるキャリアはリン酸塩緩衝食塩水、生理食塩水、水、クエン酸／スクロース／Ｔｗｅｅｎ処方およびエマルジョン−例えば油／水エマルジョンである。
【００９９】
本発明の１つの実施形態において薬学的組成物はタンパク質に対する宿主の免疫応答を低減または防止できるようにマイクロカプセル化装置内において送達してよい。抗体または抗体誘導体はまたリポソームのような膜内にマイクロカプセル化して送達してもよい。
【０１００】
本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は滅菌された注射可能な製剤、例えば滅菌された注射可能な水性または油性の懸濁液の形態であってよい。このような懸濁液は適当な分散剤、水和剤および懸濁剤を用いながら当該分野で知られた技術に従って製剤してよい。
【０１０１】
本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は、経口的、局所的または静脈内で送達され得る。
【０１０２】
本発明のより特定の実施形態において、経口投与のためには、薬学的組成物は適当なカプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液に製剤する。経口投与用の組成物の固体形態は適当なキャリアまたは賦形剤、例えばコーンスターチ、ゼラチン、乳糖、アカシア、スクロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸ジカルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウムまたはアルギン酸を含有できる。使用できる錠剤崩壊剤は、例えば、微結晶セルロース、コーンスターチ、ナトリウム澱粉グリコレートおよびアリギン酸を包含する。使用できる錠剤バインダーはアカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（ＰｏｖｉｄｏｎｅＴＭ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロース、澱粉およびエチルセルロースを包含する。使用できる潤滑剤はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン液、タルク、ワックス、油類およびコロイド状シリカを包含する。
【０１０３】
本発明のより特定の実施形態においては、局所適用のためには、薬学的組成物は適当な軟膏に製剤してよい。局所用途の組成物の製剤の一例は、活性成分および種々の補助剤およびベヒクルを含有するドロップ剤、チンキ剤、ローション、クリーム、溶液および軟膏を包含する。
【０１０４】
本発明の１つの実施形態においては、局所用の半固体の軟膏製剤は典型的には医薬品用クリーム基剤のようなキャリア中、約１〜２０％、例えば５〜１０％の活性成分の濃度を有する。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態においては、吸入用の薬学的組成物および経皮組成物もまた用意に製造できる。
【０１０６】
本発明の１つの実施形態において、水および他の水性のベヒクル中に製造された経口投与用の薬学的組成物の液体製剤は種々の懸濁剤、例えばメチルセルロース、アルギネート、トラガカント、ペクチン、ケルギン、カラギーナン、アカシア、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコールを含有できる。本発明の薬学的組成物の液体製剤もまた、活性化合物と共に水和剤、甘味料および着色料およびフレーバー剤を含有する溶液、乳液、シロップおよびエリキシルを包含する。薬学的組成物の種々の液体および粉末の製剤は治療すべき哺乳類の肺内への吸入のための従来の方法により製造できる。
【０１０７】
本発明の１つの実施形態において、注射のための薬学的組成物の液体製剤は、種々のキャリア、例えば植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール、すなわちグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等を含むことができる。いくつかの実施形態においては、組成物はクエン酸塩／スクロース／ツイーンキャリアを含む。静脈内注射のためには組成物の水溶性の形態を点滴により投与することができ、これにより抗カビ剤および生理学的に許容される賦形剤を含有する医薬品製剤を注入できる。生理学的に許容される賦形剤は例えば５％デキストロース、０．９％食塩水、リンゲル溶液または他の適当な賦形剤を含むことができる。組成物の適当な不溶性形態は、水性の基剤または製薬上許容しうる油性基剤、例えば長鎖脂肪酸、例えばオレイン酸エチル中の懸濁液として製造し、投与することができる。
【０１０８】
本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は製薬上許容しうるキャリア中、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体約０．１〜９０重量％（例えば１〜２０％、または１〜１０％）を含む。
【０１０９】
本発明の１つの実施形態において、各薬学的組成物中の抗体または抗体誘導体の旨適パーセントは、製剤自体、および、特定の病態および関連する治療方法において望まれる治療効果により変動する。医薬品製剤は当該分野でよく知られている［Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００；Ａｎｓｅｌ，１９９９；Ｋｉｂｂｅ，２０００］。医学分野の当業者の知る従来の方法を用いて被験体に薬学的組成物を投与できる。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態においては、薬学的組成物はさらに免疫抑制性または免疫調節性の化合物を含む。例えば、このような免疫抑制性または免疫調節性の化合物は以下のもの、すなわち：ＣＤ２８を介したＴ細胞同時刺激シグナリングを中断させる薬剤、カルシニューリンシグナリングを中断させる薬剤、コルチコステロイド、抗増殖剤およびＣＤ４５、ＣＤ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＲＡＮＫ  ＦｃＲ、Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ、ＬＴβおよびＶＬＡ−４等を含む免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体のうちの１つであってよい。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態においては、免疫抑制性または免疫調節性の化合物はタクロリムス、シロリムス、マイコフェノレートモフェチル、ミゾルビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナールナトリウム、レフルノミド、ラパマイシンおよびアザスピランである。
【０１１２】
本発明の他の実施形態において、抗体、抗体誘導体またはこれらを含む薬学的組成物は容器、パッケージディスペンサー内に単独で含まれるか、または、投与のためのラベルおよび使用上の注意を伴ったキットの一部であってよい。
【０１１３】
（投与および送達経路）
本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体またはその抗体誘導体および薬学的組成物は医学的に受容可能ないずれかの態様において被験体に投与してよい。本発明の目的のためには、「投与」とは当業者の知る抗体、抗体誘導体または薬学的組成物を投与する標準的な方法のいずれかを意味し、そして本明細書に記載した例に限定されない。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は、注射により静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、骨髄内、脳室内、硬膜内、動脈内、脈菅内、関節内、滑液内、肋骨内、髄腔内注射、肝臓内、脊椎内、腫瘍内、頭蓋内、経腸、肺内、経粘膜、子宮内、舌下または局所的に炎症または腫瘍生育の部位において、標準的な方法を用いることにより被験体に投与される。
【０１１５】
本発明のいくつかの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は経口、経鼻、眼内、直腸内および局所的経路により被験体に投与してよい。
【０１１６】
より特定の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物はカプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液の形態で被験体に投与してよい。
【０１１７】
より特定の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物はクリーム、軟膏等の適用により局所的に被験体に投与してよい。
【０１１８】
本発明の他の実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は、ネブライザー、乾燥粉末吸入器または計量用量吸入器の使用を介した吸入により投与してよい。
【０１１９】
本発明のさらなる実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は、手術中に直接適用される腐食性インプラントのデポ注射のような手段により、または、被験体への注入ポンプまたは生態分解性除放性インプラントの移植により、除放性投与により被験体に投与してよい。
【０１２０】
より特定の実施形態においては、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は、１，３または６ヶ月のデポ注射または生態分解性の材料および方法を用いることによるなどして、注射デポ経路の投与により被験体に投与してよい。
【０１２１】
より特定の実施形態においては、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は、抗体、抗体誘導体または薬学的組成物を含有する経皮パッチを被験体の皮膚に適用すること、および、パッチあたり一般的に１〜５時間、パッチを被験体の皮膚と接触させたままにすることにより、被験体に投与してよい。
【０１２２】
本発明の他の実施形態において、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は医学的に受容可能ないずれかの体重あたり用量およびいずれかの投与頻度において被験体に投与してよい。許容される用量は被験体のｋｇ体重あたり約０．０１〜２００ｍｇの範囲である。
【０１２３】
さらなる実施形態においては、本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は毎日〜一箇月おきの範囲の時間間隔において反復して被験体に投与してよい。
【０１２４】
本発明の１つの実施形態においては、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、抗体誘導体および薬学的組成物は合計の所望の一日当たり用量を達成するために所望により一日当たり複数回投与において投与することができる。治療方法の有効性は疾患の知られた兆候または症状について被験体をモニタリングすることにより評価できる。
【０１２５】
本発明の全ての実施形態について、所望の作用をもたらすために有効な本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、その抗体誘導体および薬学的組成物の用量および投与比率は、種々の要因、例えば治療すべき疾患の性質、患者の体格、治療の目標、使用する特定の薬学的組成物および担当医師の判断により異なる。
【０１２６】
本発明のアグリコシル抗ＣＤ１５４抗体、その抗体誘導体および薬学的組成物は特定の適応症に対する単回用量として、例えば短時間被験体が曝露される抗原、例えば治療の単一日において投与される外因性抗原への免疫応答を防止するために投与してよい。このような治療の例は、治療薬、例えば抗原性の医薬品、アレルゲンまたは血液製剤または遺伝子療法ベクターと共に本発明の抗体または抗体誘導体を同時投与することを包含する。抗原が慢性的に存在するような適応症の場合、例えば移植された組織または慢性的に投与された抗原性の医薬品への免疫応答を制御する場合には、本発明の抗体、抗体誘導体または薬学的組成物は数日または数週間乃至は被験体の生涯の範囲の、医療上指示される長期に渡る時間間隔で投与する。
【０１２７】
本発明の１つの実施形態において、上記した方法により治療できる被験体は動物である。好ましくは、動物は哺乳類である。治療してよい哺乳類の例は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えばラット、マウス、ハムスターおよびモルモット）、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌおよびネコを包含する。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【０１２８】
本発明は以下の実施例に基づいてさらに良好に理解される。しかしながら、当業者の知るとおり記載した特定の方法および結果はその後に記載する本発明の実施形態においてより詳細に説明するとおり、本発明の説明を目的とするのみである。
【０１２９】
（実験の詳細）
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は本発明の方法および生成物を説明する。当業者の知る分子生物学の分野において通常遭遇する記載した条件およびパラメーターの適当な変更および適合は本発明の精神および範囲に包含される。
【０１３１】
（実施例１：アグリコシルｈｕ５ｃ８抗体の作製および評価）
（アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの発現および特性化）
ｈｕ５ｃ８ｍＡｂのエフェクター機能を低減するために、重鎖ＣＨ２ドメイン内のカノニカルなＮ連結Ａｓｎ部位をＧｌｎ残基に変更することによりアグリコシル型を作製した。
【０１３２】
競合的結合試験によれば、細胞表面ＣＤ１５４に結合するアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの能力はグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂと比較して改変されていなかった（図１）。
【０１３３】
エフェクター機能の低減は架橋形成試験フォーマットを用いてインビトロで測定した。ＦｃγＲＩへのアグリコシルｈｕ５ｃ８の相対的結合はグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂと比較して２５倍減少していた（図２Ａ）。ＦｃγＲＩＩＩへのアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの残存結合は５ｍｇ／ｍｌの濃度までは観察されなかったが、正常なグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂは同じ試験フォーマットにおいて５０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０を示した（図２Ｂ）。
【０１３４】
（カニクイザルにおけるアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの薬物動態）
２つの独立した試験から得られたｈｕ５ｃ８ｍＡｂおよびアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの単回２０ｍｇ／ｋｇ投与の後の血清中濃度ｖｓ時間の特徴を一次消失速度定数を用いた２コンパートメントモデルを用いた薬物動態試験に付した（ＷｉｎＮｏｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．１，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）。図３は薬物動態の特徴を示し、そして表１はｈｕ５ｃ８ｍＡｂおよびアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの平均の薬物動態パラメーターを示す。ｈｕ５ｃ８ｍＡｂのクリアランスおよび分布容量はアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂよりも僅かに高値であった。
【０１３５】
【表１】
2011231119.tif 000002
（方法−実施例１）
（１．抗体の作製）
ｈｕ５ｃ８ｍＡｂの選択、クローニングおよびヒト化は以前に記載されている通りである。Ｌｅｄｅｒｍａｎ，１９９２およびＫａｒｐｕｓａｓ，２００１をそれぞれ参照できる。ｈｕ５ｃ８ｍＡｂハイブリドーマはＡＴＣＣ（ＨＢ１０９１６）より入手可能である。重鎖グリコシル化部位突然変異Ｎ２９８Ｑ（ＥＵナンバリングを用いればＮ２９７）は製造元の推奨するプロトコルに従ってＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）より入手したキットを用いたユニーク部位排除突然変異誘発によりグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂにおいて行った。得られたアグリコシルｈｕ５ｃ８はＮＳ０ミエローマ細胞において安定に発現され、そして、プロテインＡおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。アグリコシルｈｕ５ｃ８抗体を産生する細胞株はＡＴＣＣより入手可能である（ＰＴＡ−４９３１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析用ゲル濾過クロマトグラフィーによれば、タンパク質は予測されたジスルフィド結合４量体を形成していた。
【０１３６】
（２．ＣＤ１５４結合試験）
ＦＡＣＳ系の競合的結合試験は、ｈｕＣＤ１５４＋Ｄ１．１細胞（Ｄｒ．Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｃｈｅｓｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより寄贈、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１０９１５）からも入手可能）に対して行った。細胞表面ＣＤ１５４へのビオチニル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂ０．１ｍｇ／ｍｌの結合をｈｕ５ｃ８ｍＡｂおよびアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの滴定試料により競合させた。細胞結合ビオチニル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂはストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＰＥ）（ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて検出した。相対結合親和性は４パラメーター曲線フィットのＩＣ５０値から推定した。
【０１３７】
（３．ＣＤ１５４−ＦｃγＲ結合試験）
ＦｃγＲ結合親和性は抗原とＦｃγＲ担持細胞との間の「架橋」を形成する抗体の能力に基づいた試験を用いて測定した（下記参照）。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）結合試験はＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの組み換え可溶性ヒトＣＤ１５４（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｋａｒｐｕｓａｓ，１９９５）と共に４℃で一夜９６穴Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）をコーティングし、次にＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロッキングすることにより実施した。次にｈｕ５ｃ８ｍＡｂ（グリコシル化またはアグリコシル）の滴定試料を３７℃で３０分間ＣＤ１５４に結合させ、プレートを洗浄し、そして蛍光標識Ｕ９３７（ＣＤ６４＋）細胞の結合を測定した。Ｕ９３７細胞は１０％ＦＢＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン、スプリット比１：２のＲＰＭＩ培地中に生育させ、ＦｃγＲＩ発現を増大させるためにＩＦＮγ１０００単位／ｍｌを用いて試験１日前に活性化させた。
【０１３８】
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）結合試験は９６穴の組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）中に生育させたＣＤ１５４発現チャイニーズハムスター卵（ＣＨＯ）細胞（Ｂｉｏｇｅｎ）の単層を用いて実施し、その際、ＣＤ１６（寄贈元：Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）でトランスフェクトした蛍光標識Ｊｕｒｋａｔ細胞のｍＡｂ依存性結合を測定した。ＣＨＯ−ＣＤ１５４＋細胞は１ｘ１０５個／ｍｌで９６穴プレートに播種し、１０％透析ＦＢＳ、１００ｎＭメトトレキセート、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ中でコンフルエントとなるまで生育させた（全試薬ともＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）。１０％ＦＢＳ、４００ｍｇ／ｍｌゲネチシン、１０ｍＭＨＥＰＳ、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ中に生育させたＣＤ１６＋Ｊｕｒｋａｔ細胞は試験実施前１日に１：２のレシオでスプリットした（全試薬ともＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ）。
【０１３９】
ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩレセプターの両方に関する試験において、Ｆｃレセプター担持細胞は３７℃で２０分間、２'，７'−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）で標識した。過剰なＢＣＥＣＦ−ＡＭを除去するために洗浄した後、標識細胞１ｘ１０５個を３７℃で３０分間試験においてインキュベートした。未結合のＦｃγＲ＋細胞は数回洗浄することにより除去し、そしてプレートは励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３０ｎｍでＣｙｔｏｆｌｕｏｒ２３５０蛍光マイクロプレートリーダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上で読み取った。
【０１４０】
（実施例２：アグリコシルｈｕ５ｃ８抗体は一次および二次体液性応答を阻害する）
（カニクイザルにおける破傷風トキソイド（ＴＴ）への一次体液性応答の阻害）
実施例１の通り製造した各アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂおよびグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂの各々の単回２０ｍｇ／ｋｇ用量がＴＴに対する一次抗体応答を阻害する能力を個別の試験において評価した。アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂまたはグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂの投与は、食塩水投与対照群と比較して全体的一次免疫応答をそれぞれ７０％および７７％低下させた（ＥＡＵＣ）。図４はグラフ形式の第４２日までのＴＴ抗体力価を示しており、アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂがその低減されたＦｃγＲ結合能力にも関わらずグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂと同等の程度まで一次体液性応答を阻害したことを明らかにしている。
【０１４１】
ヒト化ｍＡｂの免疫原性はこの非ヒト霊長類モデルにおけるその薬効のもう１つの尺度である。アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの単回２０ｍｇ／ｋｇ用量を投与した４匹のうち３匹は血清中から薬剤が消失したすぐ後である概ね第８２日において抗ｈｕ５ｃ８抗体の低力価を示し、アグリコシルｍＡｂが存在していた一方で体液性の応答を阻害したことと合致していた（データ示さず）。
【０１４２】
一次応答阻害のさらに別の尺度として、鼡径部リンパ節生検によれば、アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ投与動物における胚中心（ＧＣ）の存在は対照と比較して大きく低減していた。投与動物においては、ＧＣは希少で小型であり、皮質の２０％未満を占有するのみであった。対照動物は中等度乃至は顕著に反応性の二次卵胞を有する複数のＧＣを有していた。中等度〜重度のリンパ節低形成が観察されたことは、グリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂで以前に観察された結果と合致していた（データ示さず）。
【０１４３】
カニクイザルへのグリコシル化またはアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの単回２０ｍｇ／ｋｇ投与後の血液学的パラメーターには肉視的変化は観察されず、そして、リンパ球の総数には有意な変化は無かった。さらにまた、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞比は一定のままであり、広範なＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は起こらなかったことを示している（データ示さず）。
【０１４４】
（カニクイザルにおける破傷風トキソイド（ＴＴ）に対する二次体液性応答の阻害）
アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの単回２０ｍｇ／ｋｇ用量が二次免疫応答を阻害する能力について、アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ試験の以前に記載した段階において正常な一次応答を示した８匹の食塩水対照動物に対し二次ＴＴ攻撃を行うことにより評価した。二次ＴＴ攻撃の前に、これらの動物４匹にアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ２０ｍｇ／ｋｇを投与し（群１Ｂ），そして４匹に食塩水を投与した（群１Ａ）。
【０１４５】
二次免疫応答は一次免疫応答よりも早期に発生し、より高い強度であることを特徴とする。個体別の動物について一次応答と比較した場合の二次応答の強度（ＥＡＵＣ二次／ＥＡＵＣ一次）を計算した（表２）。図５は全体的な一次および二次の個体別免疫応答を示す。動物個体内で免疫応答の程度にかなりの変動があることに留意しなければならない。平均して食塩水対照群（群１Ａ）における二次ＴＴ攻撃はこの抗原へのその一次応答よりも６．５倍高値の全体的抗体応答をもたらしたのに対し、アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂを投与した動物（群１Ｂ）は平均してその一次応答よりも僅か２．０倍高値の全体的二次抗体応答を示したのみであった。従って、アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの投与は食塩水対照群と比較して二次抗体応答の強度の７０％低減をもたらした。
【０１４６】
【表２】
2011231119.tif 000003
（方法−実施例２）
（１．ＴＴに対する体液性免疫応答）
２つの独立した試験を実施例１に記載した同じサルを用いながらカニクイザルにおいて実施した。各試験から得た血清試料をあわせ、免疫表現型タイピングのための全血を周囲温度に維持し、分析は採血日に実施した。
【０１４７】
本アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ試験では２投与群を用いた。雄４匹および雌４匹よりなる群１には第１日に食塩水を与え、未投与対照群とした。雄２匹および雌２匹よりなる群２には第１日に静脈内投与によりアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ単回２０ｍｇ／ｋｇ用量を与えた（上記）。投与後４時間に、全動物に吸着ＴＴの５Ｌｆ（凝集閾値用量）の筋肉内（ＩＭ）投与を行った。血液は第１日の投与の前後と投与後１９０日までの所定の日に採取した。リンパ節の生検試料を第１５日に採取した。
【０１４８】
グリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂ試験では雌３匹を各々含む５投与群を使用した。第１日において、群１には食塩水（未投与対照）を、そして群２〜５にはＡＴＣＣより入手可能（ＣＲＬ−１０９１５）なグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂをそれぞれ単回投与で０．２、１、５または２０ｍｇ／ｋｇ与えた。投与後４時間に、全ての動物に吸着ＴＴ５Ｌｆの単回ＩＭ注射を行った。第１日の投与の前後および投与後４２日までの所定の日に全群から採血した。これらの２つの独立した試験の比較が可能となるように、一部の血清試料を抗ＴＴＥＬＩＳＡにおいて平行して分析した。
【０１４９】
上記したアグリコシル試験において一次ＴＴ攻撃の２３０日後に対照群１を２群に分割した。群１Ａを未投与対照群年、群１Ｂにはアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂを投与することにより二次免疫応答を阻害するその能力を評価した。動物への投与は以下の通り、すなわち群１Ｂにはアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂの単回２０ｍｇ／ｋｇ用量を筋肉内で第１日に投与した。群１Ａには第１日にリン酸塩緩衝食塩水を等しい容量で静脈内投与した。投与後４時間に全動物に吸着ＴＴ５ＬｆをＩＭ投与した。第１日の投与の前後および投与後８５日までの所定の日に採血した。
【０１５０】
（２．免疫応答の評価）
免疫応答はノンコンパートメント分析を用いて評価した。計算した免疫パラメーターには最大抗体力価値（Ｅｍａｘ）、この最大値に到達するまでの時間（ｔｍａｘ）、および抗原投与から最終サンプリング時点までの投与抗原に対する全体的抗体応答（ＥＡＵＣ（０−ｌａｓｔ））が包含された。薬物動態分析は一次消失速度定数において２コンパートメントモデルを用いて行った（ＷｉｎＮｏｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．１，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）。測定した薬物動態パラメーターには最大血清中濃度（Ｃｍａｘ）、全身クリアランス速度（Ｃｌ）、定常状態における分布容量（Ｖｓｓ）および抗体の終末期半減期（ｔ１／２）が包含された。統計学的分析、例えば算術平均、標準偏差および幾何平均はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌのバージョン５．０ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｓｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１５１】
（３．カニクイザルの免疫表現型タイピング）
リンパ球の免疫表現型タイピングをＦＡＣＳ分析に従って２色全血染色プロトコルを用いて行った。慨すれば、ＥＤＴＡ投与全血液１００μｌを以下の標識ｍＡｂの組み合わせの１つ、すなわち、ＣＤ２０−ＦＩＴＣクローン２Ｈ７（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＣＤ２−ＰＥクローンＲＰＡ−２．１０（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ−ＦＩＴＣクローンＳＰ−３４（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＣＤ４−ＰＥクローンＯＫＴ４（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）またはＣＤ３−ＦＩＴＣおよびＣＤ８−ＰＥクローンＤＫ−２５（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、室温で２０分間インキュベートした。赤血球を、１ｘＦＡＣＳ溶血溶液２ｍｌを用いて溶血させた（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）。リンパ球を１％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウエアを装着したＦＡＣＳｃａｎを用いて分析した（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。総リンパ球数はＣＤ２およびＣＤ２０陽性細胞の全てを合算することにより求めた。Ｂ細胞はＣＤ２０陽性細胞として識別した。Ｔ細胞のサブセットはＣＤ３およびＣＤ４またはＣＤ３およびＣＤ８について二重陽性として識別した。総リンパ球、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞はリンパ球分析ゲート内での陽性細胞のパーセントとして表示した。ＣＤ４／ＣＤ８比は各データセットについて計算した。
【０１５２】
（４．ｈｕ５ｃ８ｍＡｂ薬物動態に関するＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を４℃で一夜ＰＢＳ中組み換え可溶性ヒトＣＤ１５４（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｋａｒｐｕｓａｓ１９９５も参照）５μｇ／ｍｌでコーティングし、２％ロバ血清でブロッキングした（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ−カタログ番号０１７−０００−１２１）。血清の連続希釈および８〜５００ｎｇ／ｍｌのｈｕ５ｃ８ｍＡｂの標準曲線を室温で１時間インキュベートする間に捕獲した。結合ｈｕ５ｃ８ｍＡｂはロバ抗ヒトＩｇＧセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて検出し、その後３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて発色させた。プレートをＳｐｅｃｔｒｏｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて標準物質の４パラメーター曲線フィットの直線部分に希釈血清を逆フィットさせた。
【０１５３】
（５．抗ｈｕ５ｃ８抗体応答を測定するためのＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）は４℃で一夜ｐＨ９．６の重炭酸塩緩衝液中アグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ（上記）１μｇ／ｍｌでコーティングし、１％ＢＳＡでブロッキングした。カニクイザルの血清の連続希釈物を室温で１．５時間インキュベートした。結合した抗ｈｕ５ｃ８ｍＡｂをビオチニル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂ１００ｎｇ／ｍｌ、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検出し、そしてＴＭＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて発色させた。プレートをＳｐｅｃｔｒｏｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。抗体価は予備採血の値を超えて＞０．１００のＯ．Ｄ．単位を与えた最高希釈度の逆数として定義した。
【０１５４】
（６．抗ＴＴ応答に関するＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ）は４℃で一夜ｐＨ９．６の重炭酸塩緩衝液中ＴＴ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｌａｂｏｒａｏｒｉｅｓ  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，ＵＳＡ）５μｇ／ｍｌでコーティングした。連続希釈したカニクイザル血清を室温で２時間ブロッキングされたプレートに添加した。結合した抗ＴＴ抗体はウサギ抗サルＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃａｐｐｅｌ−Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）を用いて検出し、そしてＴＭＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて発色させた。プレートはＳｐｅｃｔｒｏｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔｍａｘＰｒｏソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて各連続希釈血清試料について４パラメーター曲線フィットを作製した。抗体力価は予備採血の値を超えて０．１００のＯＤ単位を与えた希釈度の逆数として定義した。
【０１５５】
（７．血液学的検査）
カリウムＥＤＴＡ抗凝固血液試料を以下の血液学的パラメーター、すなわち、総白血球数、赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット値、平均血球容量、平均血球ヘモグロビン、平均血球ヘモグロビン濃度、血小板数および血液スミア評価（分画を含む）に関して毎月採取して分析した。
【０１５６】
（８．リンパ節の生検）
鼡径部リンパ節をアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂ一次ＴＴ応答試験の第１５日に全動物より採取した。リンパ節組織をトリミングし、パラフィン包埋し、切片化し、そしてスライドガラス上に搭載した。スライドをヘマトキシリンエオシン染色した。スライドを目視により分析して胚中心の存在を調べ、そして胚中心の出現頻度と大きさに基づいて定量的に調べた。
【０１５７】
（実施例３：アグリコシルｍｕＭＲ１抗体によるループス腎炎の阻害）
全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）は自発的に生じる自己免疫疾患であり、雌性に多く、種々の病原性抗核自己抗体の産生を特徴とする。ループス腎炎においては、腎の損傷は腎糸球体内に付着し補体カスケードを活性化し、糸球体腎炎を起こす免疫複合体の形成を含む細胞性および体液性の免疫機序の両方により媒介される。抗核自己抗体の産生はヒトおよびマウスＳＬＥの両方において自己免疫Ｔｈ細胞およびＢ細胞の特定集団間の同属体相互作用により駆動されることがすでにわかっている〔Ｋａｌｌｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８〕。
【０１５８】
以前の試験によれば、確立されたループス腎炎を有する（ＳＷＲｘＮＺＢ）Ｆ１（ＳＮＦ１）マウスについて、５．５ヶ月齢から開始した抗ＣＤ１５４ｍＡｂハムスターＭＲ１（ｈａＭＲ１）の長期投与は生存を延長し、重度の腎炎の発生率を低下させることがわかっている。
【０１５９】
本実施例においては、本モデルにおける２種のマウスキメラＭＲ１ｍＡｂの薬効を説明する。マウスキメラＭＲ１（ｍｕＭＲ１）はマウスＩｇＧ２ａ重鎖およびカッパ軽鎖定常ドメインに融合した元のハムスター重鎖および軽鎖の可変ドメインよりなる。ｍｕＭＲ１のアグリコシル型はＩｇＧ２ａＦｃのＣＨ２ドメインにおけるＮ連結グリコシル化部位の突然変異により作製した。これらの２抗体を用いながら、抗ＣＤ１５４ｍＡｂの力価に対するＦｃグリコシル化の役割をループス腎炎において評価した。
【０１６０】
本実施例の結果によれば、キメラｍＡｂ、ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１の両方とも自己抗体応答を阻害する能力を保持していたことがわかった。特に、野生型の親ハムスターＭＲ１と同様、両方のマウス化抗体は、マウスＩｇＧ２ａ対照ｍＡｂを投与したマウスと比較して、それらを投与したマウスにおいて、腎炎症、線維症、硬化症および血管炎を低減する能力を保有していた。
【０１６１】
（ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１の薬物動態）
ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体の薬物動態の分析によれば、両方の抗体はＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中で同様の速度論的特徴を示したことがわかる（図６）。特に正常マウスにおけるこれらのキメラ分子の半減期は〜９日と推定され、ハムスターＭＲ１と同様である（データ示さず）。
【０１６２】
（自己抗体応答の分析）
ｍｕＭＲ１またはアグリコシルｍｕＭＲ１の投与により対照動物と比較してｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの両方に対する自己抗体応答は大きく低減した（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１６３】
（組織学的分析）
腎の組織学的分析によれば、５アイソタイプの対照動物のうち３種が評点方法において概説する多くの特徴を有する重度で末期の腎症を有していた。投与群の動物は僅かな例外を除いて明らかに重症度の低い疾患を有していた。野生型（ｎ＝１１）およびアグリコシル（ｎ＝１２）形態のｍｕＭＲ１を投与した動物の間の差は、野生型の複合疾患評点が僅かに低値であったものの、最小であった。図８は腎に関する群の複合組織評点を示す。アグリコシルｍｕＭＲ１を投与した動物のうち、大部分は軽度で早期の糸球体の変化を示し、尿細管−間質の有意な変化は殆ど或は全く無かった。ｍｕＭＲ１を投与した全動物（ｎ＝１１）とも軽度で早期の変化を示し、有意な尿細管−間質の変化は無かった。これらの結果から、ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１は両方ともループス腎炎に特徴的な組織学的変化の防止において有効であることが明らかである。
【０１６４】
ＢおよびＴ細胞の領域におけるリンパ系拡大の程度は投与動物の各脾臓に関する組織学的検討により評価した。二次卵胞の識別は、凍結切片調製に伴う人為的要素により困難であった。脾リンパ系領域拡大と腎疾患評点との間には見かけ上の相関は無かった。しかしながら、動脈周囲リンパ球鞘（ＰＡＬＳ）の拡大の程度はｍｕＭＲ１を投与した動物と比較してアイソタイプの対照群およびアグリコシルｍｕＭＲ１投与動物において顕著に高値であるように観察された（データ示さず）。
【０１６５】
（腎機能の分析）
腎機能を分析するために、タンパク質尿（ＰＵ）の程度、ならびに、血清中クレアチニンおよび血中尿素態窒素（ＢＵＮ）の測定を各動物について行った。キメラｍｕＭＲ１ｍＡｂの両方とも、尿中のタンパク質の含量で測定した場合に、ＳＮＦ１動物において重度の腎炎の発症時期を遅延させた。対照群動物と比較して、抗ＣＤ１５４投与マウスは６〜９ヶ月の時点ではより低値のＰＵ値を有していた（図９）。しかしながら、〜１０ヶ月齢においては、全群とも腎障害を示すＰＵ値を有していた（図９）。これらの結果は抗ＣＤ１５４投与がタンパク質尿の発症時期を遅延させることを示唆している。
【０１６６】
図１０はＳＮＦ１マウスの血清中のクレアチニン濃度を示しており、図１１はＳＮＦ１マウスの血清中のＢＵＮの濃度を示している。対照群の動物は７．２５〜１０．５ヵ月齢の範囲では上昇した血清中のクレアチニンおよびＢＵＮ濃度を有していた。これとは対照的に、グリコシル化ｍｕＭＲ１を投与したマウスは試験期間全体を通じて安定しており、血清中クレアチニンおよびＢＵＮのいずれも、殆ど上昇または下降することは無かった。アグリコシルｍｕＭＲ１投与動物は〜９ヶ月齢まで正常濃度の血清中クレアチニンを維持していたが、その後僅かな上昇が観察された。同様に、この群のＢＵＮ濃度は１１ヶ月齢時では上昇していた。
【０１６７】
（生存性の試験）
抗ＣＤ１５４ｍＡｂ投与はＳＮＦ１マウスの生存を延長した。１１ヶ月齢において、投与マウスの９０％超が生存していたのに対し、対照群では５６％であった。１４ヶ月までに、全対照マウスは死亡したのに対し、ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１マウスのそれぞれ８６％および７５％がなお生存していた（データ示さず）。
【０１６８】
総括すれば、これらの実験はｍｕＭＲ１またはアグリコシルｍｕＭＲ１のいずれかを用いた腎炎ＳＮＦ１マウスの長期治療により生存が延長され、自己抗体産生が低減され、そして、腎症の発症が遅延することを示している。グリコシル化およびアグリコシルのｍｕＭＲ１を用いた場合に達成された結果が僅かに異なることは、ループスにおける抗ＣＤ１５４ｍＡｂの薬効に対するＦｃグリコシル化の役割が僅かにあることを示している。すなわち、アグリコシル抗ＣＤ１５４ｍＡｂはループス腎炎に対する効果的な治療法である。
【０１６９】
（方法−実施例３）
（１．マウス）
ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＷＲおよびＮＺＢマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）より購入した。（ＳＷＲｘＮＺＢ）Ｆ１（ＳＮＦ１）ハイブリッドは従来のバリア条件下でＢｉｏｇｅｎにおける動物施設において交配した。雌性ＳＮＦ１マウスを全ループス試験において使用した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを薬物動態（ＰＫ）試験に使用した。
【０１７０】
（２．抗体）
アルメニアンハムスター抗マウスＣＤ１５４ｍＡｂを産生するＭＲ１ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２５８０）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入した。
【０１７１】
（３．処置プロトコル）
全注射とも腹腔内経路にて行った。ループス試験ではＰＩ．１７ｍｕＩｇＧ２ａを与えたＳＮＦ１マウスの対照群およびキメラ抗ＣＤ１５４ｍＡｂを単回投与した投与ＳＮＦ１群を設けた。週当たり１回のｍＡｂ５００μｇの単回投与を最初の６週間行い、その後、動物が死亡するか、試験の終了時まで、月当り５００μｇを単回注射した。試験は動物が〜５．５ヶ月齢になった時点で開始し、血清試料は毎月採取した。ＰＫ試験のためには、ＢＡＬＢ／ｃマウスにはｍｕＭＲ１またはアグリコシルｍｕＭＲ１の単回１００μｇ用量を与え、血液試料は４時間後、および、第１、２、４、７、９、１１および１４日に採取した。
【０１７２】
（４．ＥＬＩＳＡ試験）
血清中のキメラＭＲ１ｍＡｂを検出するためにＮＵＮＣのＭａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で一夜、５μｇ／ｍｌの組み換え可溶性マウスＣＤ１５４でコーティングした。翌日プレートをブロッキングし、希釈した血清を添加し、その後セイヨウワサビパーオキシダーゼ結合体化抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し、ＴＭＢ基質で発色させた。２Ｎ硫酸で反応を停止し、そしてプレートをＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー上で４５０ｎｍで読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）。抗１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）および抗２本鎖（ｄｓＤＮＡ）のＥＬＩＳＡをＮＵＮＣＭａｘｉＳｏｒｐプレートを用いて実施した。プレートは１０μｇ／ｍｌメチル化ＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で４℃一夜、次に５μｇ／ｍｌのＩ等級ウシ胸腺ＤＮＡ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で２５℃２時間コーティングした。ウシ胸腺ＤＮＡは超音波処理により除去し、次いでＳＩヌクレアーゼにより消化した後に使用した。抗ｓｓＤＮＡ試験のためにはＤＮＡを１０分間煮沸し、氷上冷却した後に使用した。ブロッキングの後、血清試料を連続希釈したものを添加し、２時間室温でインキュベートした。自己抗体をヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ（ＳＩＧＭＡ，ＳＴ．ＬＯＵＩＳ，ＭＯ）で検出し、１Ｍジエタノールアミン緩衝液中ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＳＩＧＭＡ，ＳＴ．ＬＯＵＩＳ，ＭＯ）を用いて発色させた。プレートを４０５ｎｍで読み取り、そしてｓｓおよびｄｓＤＮＡの両方に特異的な抗ＤＮＡｍＡｂ２０５およびｍＡｂ５ｃ６の既知量を用いて標準曲線を得た。抗ＤＮＡ力価はバックグラウンドを超える０．１ＯＤ単位における逆数希釈地として定義した。
【０１７３】
（５．組織学）
腎および脾の低温調製切片およびホルマリン固定パラフィン包埋組織を炎症の浸潤についてヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した。腎はさらにＭａｓｓｏｎ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで線維症について染色し、そして、過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）により基底膜肥厚について調べた。染色された組織の切片を獣医組織学専門家により評点した。ループス腎炎の組織病理学的等級付けに関する全体的評点は糸球体、間質および尿細管の変化に基づいて行った。等級０〜４＋は検査する構造体（例えば糸球体、血管等）のパーセント関与に基づいて行い、以下の通り、すなわち：０は有意な患部無し；１＋は罹患した構造物１％〜３０％；２＋は罹患した構造物３０％〜６０％；３＋はある程度まで罹患した構造物６０％超；４＋は重度に罹患した構造物６０％超とした。
【０１７４】
（６．尿および血清の分析）
各マウスの尿をＡｌｂｕｓｔｉｘ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を用いて毎週モニタリングすることにより、タンパク質尿（ＰＵ）を測定した。タンパク質尿の程度は以下の通り、すなわち０．５＋は１５〜３０ｍｇ／ｄｌ；１＋は３０ｍｇ／ｄｌ；２＋は１００ｍｇ／ｄｌ；３＋は３００ｍｇ／ｄｌ；４＋は２０００ｍｇ／ｄｌ超とした。クレアチニンおよび血中尿素態窒素（ＢＵＮ）は試験期間を通じて間歇的にＣＯＢＡＳ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）上で血清中値を測定し、ＰＵ以外に腎機能の尺度とした。
【０１７５】
（実施例４：実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のアグリコシルｍｕＭＲ１抗体による阻害）
免疫化の時点におけるＣＤ４０リガンドのブロックはＥＡＥの発症を阻害することがわかっている［Ｓａｍｏｉｌｏｖａ、１９９７］。本実施例においては、ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体のＥＡＥ阻害能力について分析した。本実施例はまた、抗ＣＤ１５４ｍＡｂによるＥＡＥの阻害が能動的阻害機序に関連しているかどうか、そして、どの程度まで抗体のＦｃ依存性相互作用に依存した機序により媒介されているかを調べるものである。
【０１７６】
本実施例の結果によれば、アグリコシルｍｕＭＲ１ｍＡｂは、臨床疾患の発症のブロッキングにおいて、野生型のグリコシル化ハムスターＭＲ１ｍＡｂと同様に有効なＥＡＥの阻害剤であることを示している。より典型的には、全てのＭＲ１ｍＡｂは、平均最大臨床評点および平均疾患重症度で評価すれば、ハムスターＭＲ１投与群の１匹のマウスを除き、完全に疾患の発症を阻害した。これらの結果は、抗ＣＤ１５４ｍＡｂによるＥＡＥに対抗した保護の根幹である機序にはＴ調節の誘導は関与していない可能性を示唆している。さらにまた、ｍＡｂのＦｃ依存性エフェクター機能は臨床効果に関しては主要な役割を果たしていないが、ＥＡＥの自己免疫セッティングにおける阻害の根幹機序には寄与していると考えられる。
【０１７７】
（グリコシル化ｍｕＭＲ１による臨床ＥＡＥの阻害）
図１２はアイソタイプの対照Ｐ１．１７を投与したマウスと比較した場合にｍｕＭＲ１を投与したマウスは一次ペプチド免疫化の後に疾患の兆候を発症しなかったことを示している。ｍｕＭＲ１投与マウスはまた、８０日のフォローアップ期間に臨床兆候を発症しなかった（データ示さず）。完全フロインドアジュバント中に乳化したＰＬＰ１３９−１５１でマウスを再免疫化した場合、Ｐ１．１７投与動物においては臨床兆候の重症度が増大した。第０、２および４日にｍｕＭＲ１を投与していたマウスは、再攻撃後にＥＡＥを発症し、その重症度はＰ１．１７投与マウスにおけるＥＡＥの第１期と等しかった。これらの結果は抗ＣＤ１５４ｍＡｂ投与が能動的阻害をもたらさないことを示している。本発明者等はさらにまた、ＥＡＥ誘導とｍｕＭＲ１投与後１〜３週のマウスから収集した２０ｘ１０６個の脾細胞の転移によりネイティブのレシピエントマウスがその後の能動的ＥＡＥ誘導に対して耐性となりえるかどうかを調べた。そうではなかった（データ示さず）。
【０１７８】
（アグリコシルｍｕＭＲ１による臨床ＥＡＥの阻害）
図１３および表３はｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１ｍＡｂは対照のＩｇＰ１．１７と比較して２００μｇの３投薬として投与した場合に全フォローアップ期間にわたりＥＡＥの臨床兆候の阻害において有効であったことを示している。この点に関し、ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１抗体はハムスターＭＲ１と等しく有効であった（データ示さず）。これらの抗体をより低用量で投与したところ、ＥＡＥの阻害能力に関しては抗体間には大きな差は観察されなかった。
【０１７９】
（ＣＮＳ炎症浸潤の阻害）
抗体が中枢神経系（ＣＮＳ）内における炎症浸潤の阻害において差があるかどうかを調べるために、異なる量の抗体（ｍｕＭＲ１およびアグリコシルｍｕＭＲ１、または３投薬の２００μｇおよびＰ１．１７対照Ｉｇ）を投与した４〜５匹のマウスの個別の群を、アイソタイプ対照抗体を投与したマウスにおける疾患の活動性のピーク時において第１６日に屠殺した。
【０１８０】
【表３】
2011231119.tif 000004
表４に示すとおり、抗体は疾患の発症の早期の段階においてＣＮＳ内の炎症性浸潤の発生を阻害するその能力に関して差が無かった。マウスがＥＡＥの兆候の非存在下において臨床未満の活動性を発生させたかどうかは不明であったため、群あたり６〜１４匹のマウスのＣＮＳ組織を本試験終了時において分析した（第５８日）。
【０１８１】
２００μｇのｍｕＭＲ１を投与したマウスとは対照的に、ｐ１．１７投与マウスおよび２００μｇのａｇｌｙＭＲ１投与マウスは共に小脳に優先的に局在化した軽度の炎症性浸潤（表５）の徴候を示していた。しかしながら、より低用量の抗体の投与ではａｇｌｙＭＲ１は同様であるか、そうでない場合でもそのグリコシル型よりも幾分保護性が高値であるのみであった。これらの結果は両方の抗体が臨床ＥＡＥの発症を等しく阻害することを示している。
【０１８２】
（方法−実施例４）
（１．ＥＡＥの誘導）
雌性ＳＪＬマウス（１０〜１２週齢、Ｈａｒｌａｎ）を完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中に乳化したＰＬＰ１３９−１５１の５０μｇで皮下免疫化した。３日後、マウスに１０９熱殺傷百日咳菌（ＲＩＶＭ，Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を静脈内注射した。ＥＡＥの発症は体重および無能力評点を毎日評価することによりモニタリングした。この評点は０：無症状、０．５：尾部緊張の部分的な消失、１：尾部緊張の完全な消失、２：四肢の脆弱化、２．５：部分的麻痺、３：後肢の完全な麻痺、３．５：横隔膜および後肢の完全な麻痺、失禁、４：瀕死〜５：ＥＡＥによる死亡、の範囲とした。
【０１８３】
【表４】
2011231119.tif 000005
【０１８４】
【表５】
2011231119.tif 000006
（２．抗体の作製）
ハムスター抗マウスＣＤ１５４ｍＡｂＭＲ１の重鎖および軽鎖の可変ドメインをハイブリドーマ由来の全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。ハムスター／マウスキメラｍＡｂに対する発現ベクターは、マウスＩｇＧ２ａまたはマウスカッパ定常領域ｃＤＮＡ（抗ヒトＣＤ１５４ｍＡｂ由来の重鎖および軽鎖の完全長ｃＤＮＡクローンから誘導、すなわちグリコシル化ｈｕ５ｃ８）から標準的組み換えＤＮＡ技術を用いたそれぞれ重鎖および軽鎖の可変ドメイン上に操作することにより構築した。ｍｕＭＲ１と命名された一過性に発現されたキメラＭＲ１ｍＡｂはフローサイトメトリーおよび免疫沈降によればハムスターｍＡｂのＣＤ１５４結合特性を反復することが明らかになった。
【０１８５】
ａｇｌｙＭＲ１と命名されたアグリコシルキメラＭＲ１は重鎖の部位指向性突然変異誘発によりＦｃのＮ連結グリコシル化部位（ＫａｂａｔＥＵ命名法ではＮ２９７）におけるアスパラギン残基をグルタミン残基に変えることにより構築した。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖および選択マーカーとしてのグルタミン合成酵素遺伝子に対するＣＭＶ−ＩＥプロモーター駆動直列転写カセットを含有する安定な発現ベクターはｍｕＭＲ１およびアグリｍｕＭＲ１ＩｇＧ２ａカッパｍＡｂの両方について構築した。発現ベクターをＮＳ０細胞にトランスフェクトし、そして安定なクローンをグルタミン非含有培地中で選択することにより単離した。
【０１８６】
ｍｕＭＲ１およびａｇｌｙＭＲ１をバイオリアクター細胞上澄みからプロテインＡセファロース上でアフィニティー精製し、その後セファクリル３００上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより凝集物を除去した。クロマトグラフィー樹脂はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。ｍＡｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば＞９５％純度であることがわかり、内毒素分析によればこれらの試薬がインビボの使用に安全であることが確認された。ｍｕＭＲ１およびａｇｌｙＭＲ１は細胞表面ｍｕＣＤ１５４インビトロ試験について同様の相対的親和性、および、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて同様のインビボ薬物動態半減期を有することが解った（データ示さず）。マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照ｍＡｂ、Ｐ１．１７（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−１０）はＢｉｏｇｅｎと契約しているＰｒｏｔｏｓ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）において腹水から精製したプロテインＡであった。
【０１８７】
（３．抗ＣＤ１５４抗体の送達）
第０、２および４日に各マウスに２００μｌのＰＢＳを腹腔内投与し、その際にそれらが下記成分、すなわち、群１＝ＰＢＳ（対照）；群２＝２００μｇｍｕＭＲ１；群３＝２００μｇハムスターＩｇ（Ｉｇ対照）；群４＝２００μｇマウス化ＭＲ１；群５＝２００μｇＰ１．１７ＩｇＧ２ａ対照；群６＝２００μｇアグリコシルｍｕＭＲ１を含有するようにした。
【０１８８】
いくつかの実験においては、マウスを完全フロイントアジュバント中に乳化した５０μｇのＰＬＰ１３９−１５１で第８０日に再免疫化した。
【０１８９】
（４．疾患の評価）
５６日間の期間を通じてマウスは毎日体重測定し、以下の評点体系、すなわち、０＝症状無し；０．５＝尾部緊張の部分的な消失、１：尾部緊張の完全な消失、２：四肢の脆弱化、２．５：部分的麻痺、３：後肢の完全な麻痺、３．５：横隔膜および後肢の完全な麻痺、失禁、４：瀕死〜５：ＥＡＥによる死亡、に従って臨床活動性をモニタリングした。
【０１９０】
（５．組織学）
各個体マウスの脳組織および脊髄を１０％ホルマリン中に固定し、パラフィン包埋した。各個体マウスから、１００μｍ離れた３〜６個の脊髄切片（４μｍ）および６個の脳切片（各々小脳、大脳、脳幹およびくも膜下腔を含む）のヘマトキシリン染色後の炎症性浸潤の範囲について分析した。
【０１９１】
各個体切片を以下の尺度、すなわち、０＝浸潤無し；１＝散発性の軽度の血管周囲の浸潤（切片あたり炎症患部２個未満）；２＝複数病巣、軽度の血管周囲浸潤；４＝複数病巣、重度の血管周囲浸潤と実質への拡張、に従って評点した。全ての切片の平均に基づいて、マウスを浸潤無し、散発性、中等度または重度に分類した。
【０１９２】
（６．統計学的分析）
結果は一元配置分散分析、次いでＬＳＤ試験を用いたｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析に付した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０１９３】
（実施例５：アグリコシルｈｕ５ｃ８抗体は島細胞移植片を阻害する）
以前の試験によれば、グリコシル化ｈｕ５ｃ８の２０ｍｇ／ｋｇの誘導／維持投与用法で治療されたアカゲザルは腎同種異系移植片機能を維持し、６ヶ月の投与期間中に拒絶エピソードを示したものは無かったが、腎同種異系移植片を移植された未投与のサルは８日以内にもその移植片を拒絶した［Ｋｉｒｋ，１９９９］。Ｋｉｒｋの研究グループによる関連の試験においては、アグリコシルｈｕ５ｃ８は移植片拒絶反応の治療のためには有効ではなかった。
【０１９４】
Ｋｉｒｋの所見とは全く対照的に、本発明の結果はｈｕ５ｃ８ｍＡｂのアグリコシル化形態が実際に他のセッティングにおいて移植片拒絶反応の治療に有効であることを示している。
【０１９５】
（アカゲザルにおける島細胞同種異系移植片の移植）
以前にグリコシル化ｈｕ５ｃ８は島細胞の移植を可能とし、同種異系移植片の生存を維持したことが明らかにされている［Ｋｅｎｙｏｎ，１９９９］。
【０１９６】
２０ｍｇ／ｋｇの誘導／維持用法で投与されたアカゲザル４匹は移植後＞２１３、＞２５５、＞２６９および＞３１４日間インスリン非依存性を達成した。この試験の結果によれば、第１１〜１４日までの持続性の高血糖症およびｃ−ペプチド産生の欠如（内因性インスリン生成の産物）から明らかな通り、島細胞同種異系移植片を移植された未投与の対照サルは第８日までに急性の拒絶反応を示した（データ示さず）。
【０１９７】
未処置の対照動物とは対照的に、図１４はアグリコシルｈｕ５ｃ８の誘導／維持用法により投与したアカゲザル２匹のうちの１匹の良好な治療結果を示している（上記）。両方のサルとも、サルにインスリンを投与しアグリコシルｈｕ５ｃ８投与を継続した場合には、高血糖症および第７日の初期拒絶を示したが、２匹のサルのうち１匹は第２８日（白菱形）においてｃ−ペプチドの存在により測定される同種異系移植片の部分的機能を示しており、そして第４５日まで維持された。
【０１９８】
これらの結果は、アグリコシル化抗ＣＤ１５４ｍＡｂは移植片の定着における治療用法において有用であることを示している。しかしながら、移植中の免疫応答は強力な応答であり、すなわち体液性、細胞性および炎症性の免疫応答を含んでいるため、アグリコシル抗ＣＤ１５４抗体は免疫抑制性または免疫調節性の化合物と組み合わせて送達されれば最も効果的であると考えられる。例えば、ＣＤ２８を介したＴ細胞の同時刺激シグナリングを妨害する薬剤；カルシニューリンシグナリングを妨害する薬剤、コルチコステロイド、抗増殖剤、または、例えばＣＤ４５、ＣＤ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ４、ＣＤ８およびＲＡＮＫＦｃＲ、Ｂ７、ＣＴＬＡ４、ＴＮＦ、ＬＴβおよびＶＬＡ−４を含む免疫細胞の表面上で発現されるタンパク質に特異的に結合する他の抗体が挙げられる。
【０１９９】
（方法−実施例５）
（１．島細胞同種異系移植片の移植）
これらの試験は以前に記載されている通り実施した［Ｋｅｎｙｏｎ，１９９９］。慨すれば、アカゲザルの同種異系活性ドナー−レシピエント対を陽性混合リンパ球培養反応性に基づいて選択した。第０日に、レシピエントを全膵臓摘出し、門脈内同種異系島細胞移植を行った。
【０２００】
（２．抗体処置）
投薬は第−１、０、３、１０および１８日における２０ｍｇ／ｋｇよりなる導入期および第２８日から開始する１ヶ月当たり単回２０ｍｇ／ｋｇ投薬よりなる維持期により行った。
【０２０１】
（３．移植片機能の評価）
島細胞移植片の機能を空腹時および食後の血中グルコース濃度を通して毎日モニタリングした。島細胞の障害（一次非機能または急性の拒絶）は空腹時および促進時のｃ−ペプチドの産生（内因性インスリン産物）の非存在として定義した。一次非機能は移植直後の期間において移植組織が機能不能であることとして定義し、そして、持続性の高血糖症および不安定な血糖制御を特徴とした。急性拒絶のエピソードは空腹時グルコース＞１００ｍｇ／ｄＬおよび食後血中グルコース＞１５０〜１７５ｍｇ／ｄＬと定義した。全体的な移植片機能は正常な血中グルコース濃度を維持するために必要な外因性インスリンの量をモニタリングすることにより評価した。
【０２０２】
（実施例６：抗ＣＤ１５４媒介Ｔ細胞同種異系反応性を阻害するためのアグリコシル化ｈｕ５ｃ８（抗ＣＤ１５４）抗体の使用）
Ｔ細胞に対するＣＤ１５４ターゲティングモノクローナル抗体はインビトロ並びにインビボの同種異系反応性を部分的に阻害することがわかっている。しかしながら抗ＣＤ１５４ｍＡｂの阻害活性が刺激性ＣＤ４０−ＣＤ１５４相互作用の遮断に依存するか、或はＣＤ１５４を介した阻害シグナルの直接の送達に依存しているかどうかは不明である。
【０２０３】
インビトロのヒトＴ細胞同種異系反応性に対するＣＤ１５４の刺激（すなわちＣＤ１５４を介した阻害シグナルの直接の送達）とは逆に刺激性ＣＤ４０−ＣＤ１５４相互作用の遮断の作用を評価するために、未分画のＰＢＭＣ、または、精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、可溶性または培養ウェルに固定化されたヒト化抗ＣＤ１５４ｍＡｂ（ｈｕ５ｃ８、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ＭＡ，ＵＳＡ）の存在下、同種異系ＨＬＡミスマッチ刺激スティミュレーター細胞（ＣＤ４０陽性細胞）と共に培養した。大部分のブロッキング実験は低減されたＦｃエフェクター機能を有し、従ってＣＤ１５４に交差結合する能力が低下している可溶性抗ＣＤ１５４（アグリコシル化ｈｕ５ｃ８）の遺伝子操作された変異体を用いて実施した。本実験に使用したアグリコシル化ｈｕ５ｃ８は本出願全体を通して記載したアグリコシルｈｕ５ｃ８ｍＡｂと同様である。例えば上記の実施例１、１５および８３を参照できる。可溶性であるがコーティングされていない抗ＣＤ１５４抗体は一次混合リンパ球培養物（ＭＬＣ）において同種異系Ｔ細胞増殖を阻害した（４０±２３％ｖｓ３±１８％阻害、ｎ＝４）。同様に、二次ＭＬＣ（ｎ＝５実験）における同種異系特異的Ｔリンパ球の増殖はＣＤ１５４遮断（可溶性抗体使用）を用いてプライミングすることにより阻害されたのに対し、ＣＤ１５４刺激（コーティングされた抗体）により増大した。さらにまた、コーティングされた抗ＣＤ１５４抗体による刺激は同種異系特異的ＣＴＬエフェクターの生成を強力に増強したのに対し、ＣＴＬはＣＤ１５４遮断による影響を受けなかった。
【０２０４】
抗ＣＤ１５４の刺激活性がＢ７−ＣＤ２８同時刺激相互作用を必要としたかどうかを調べるために、ＣＤ２８へのＢ７分子の結合を防止する分子であるＣＴＬＡ４−Ｉｇの存在下にＭＬＣを実施した。ＣＴＬＡ４−Ｉｇの存在下のプライミングは一次および二次ＭＬＣにおいて、それぞれ７５±１４％（ｎ＝３）および６４±２８％（ｎ＝６）、同種異系特異的Ｔリンパ球の増殖を低減し、そして４８±２３％（ｎ＝２）ＣＴＬ生成を阻害した。コーティングされた抗ＣＤ１５４抗体のシグナリングは一次（５８±０．６％、ｎ＝２）および二次（６１±４９％、ｎ＝６）ＭＬＣの両方において同種異系特異的Ｔ細胞の残存ＣＤ２８依存性増殖を有意に増大させたが、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ誘導阻害を完全には排除しなかった。しかしながら、ＣＴＬの生成に対するＣＴＬＡ４−Ｉｇの阻害作用はＣＤ１５４刺激により排除された（コーティング抗ＣＤ１５４抗体媒介）。同種異系反応性Ｔ細胞上のＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ９５の発現はＣＴＬＡ４−Ｉｇの存在下または非存在下において対照培養と比較した場合にＣＤ１５４の刺激により強力に増大した（ｎ＝２）。
【０２０５】
本発明者等のデータは抗ＣＤ１５４抗体が培養プレートに固定化されればＴ細胞の同種異系反応性をブロックするのではなくむしろ増強できることを示している。可溶性アグリコシル化ｈｕ５ｃ８ｍＡｂによるＣＤ１５４の遮蔽はインビトロのＴ細胞の活性化を増強できず、従って、インビボで好都合であり、そして、これらの所見に基づけば、インビボの同種異系Ｔ細胞応答を低減するために移植実験モデルにおいて、または、他の同時刺激経路をブロックする分子と組み合わせた場合に、有効であると考えられる。
【０２０６】
当業者の知るとおり、本発明の精神から外れることなく本発明の好ましい実施形態に対して多くの変更や改造が可能である。このような変形例は全て本発明の範囲内に包含されるものとする。
【０２０７】
【表６】
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【０２０８】
【表７】
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【０２０９】
【表８】
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【０２１０】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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