(57)【要約】【課題】保有の有無と空腹時血中インスリン濃度との相関性が十分に高く、空腹時血中インスリン濃度評価、引いてはインスリン抵抗性のリスク評価に用いることができる遺伝子多型からなる遺伝子マーカー、空腹時血中インスリン濃度の評価方法及びインスリン抵抗性のリスク評価方法、並びに該遺伝子多型のタイピングに用いるキットの提供。【解決手段】遺伝子マーカーを用いて、インスリン抵抗性のリスクを評価する方法であって、（ａ）ヒト個体から採取された核酸の遺伝子多型をタイピングする工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体のインスリン抵抗性のリスクを評価する工程と、を有し、前記遺伝子多型が、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とする、インスリン抵抗性のリスク評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子マーカーを用いて、インスリン抵抗性のリスクを評価する方法であって、
（ａ）ヒト個体から採取された核酸の遺伝子多型をタイピングする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体のインスリン抵抗性のリスクを評価する工程と、
を有し、
前記遺伝子多型が、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とする、インスリン抵抗性のリスク評価方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）が、さらに、アディポネクチン遺伝子の−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）をタイピングする工程であることを特徴とする請求項１記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）において、アポリポプロテインＥ遺伝子の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）がＴＴ型、ＧＴ型、ＧＧ型の順にインスリン抵抗性となるリスクが高いと評価することを特徴とする、請求項１記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法。
【請求項４】
前記工程（ｂ）において、アディポネクチン遺伝子の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）がＧＧ型の場合にインスリン抵抗性となるリスクが高く、ＡＧ型又はＡＡ型の場合にリスクが低いと評価することを特徴とする、請求項２記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）において、アディポネクチン遺伝子の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）が、両アレルにＣＡが挿入されているホモ型の場合にインスリン抵抗性となるリスクが高く、ヘテロ型又は両アレルでＣＡが欠損しているホモ型の場合に低いと評価することを特徴とする、請求項２記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法。
【請求項６】
遺伝子マーカーを用いて、空腹時血中インスリン濃度のリスクを評価する方法であって、
（ａ）ヒト個体から採取された核酸の遺伝子多型をタイピングする工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の空腹時血中インスリン濃度のリスクを評価する工程と、
を有し、
前記遺伝子多型が、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とする、空腹時血中インスリン濃度のリスク評価方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）が、さらに、アディポネクチン遺伝子の−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）をタイピングする工程であることを特徴とする、請求項６記載の空腹時血中インスリン濃度のリスク評価方法。
【請求項８】
アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、
前記遺伝子多型が−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とするインスリン抵抗性の遺伝子マーカー。  
【請求項９】
アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、
前記遺伝子多型が−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とする空腹時血中インスリン濃度の遺伝子マーカー。  
【請求項１０】
アディポネクチン遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、
前記遺伝子多型が、−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）であることを特徴とするインスリン抵抗性の遺伝子マーカー。  
【請求項１１】
アディポネクチン遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、前記遺伝子多型が、−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）であることを特徴とする空腹時血中インスリン濃度の遺伝子マーカー。
【請求項１２】
下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有し、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【請求項１３】
下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有し、アディポネクチン遺伝子の−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号５で表される塩基配列、又は配列番号５で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【請求項１４】
下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有し、アディポネクチン遺伝子の−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列、又は配列番号７で表される塩基配列の第８１番目及び第８２番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目及び第８２の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列、又は配列番号８で表される塩基配列のうち第８０番目及び第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８０番目及び第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【請求項１５】
請求項１２記載のインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド、請求項１３記載のインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド、及び請求項１４記載のインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチドからなる群より選択される１以上を含むことを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用遺伝子多型タイピングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空腹時血中インスリン濃度と相関性が高く、インスリン抵抗性評価や空腹時血中インスリン濃度評価に用いることができる遺伝子多型からなる遺伝子マーカー、該遺伝子マーカーを検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができるポリヌクレオチド、当該遺伝子マーカーを用いた空腹時血中インスリン濃度の評価方法及びインスリン抵抗性のリスク評価方法、並びに該遺伝子多型のタイピングに用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、主に、インスリン分泌が著しく低下したことによって発症するインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）と、インスリン分泌はある程度保たれているものの、血糖値が高くなるインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）とに分類される。ＮＩＤＤＭの特徴的な病態として、インスリン分泌不全とインスリン抵抗性（血中にインスリンが存在していても、標的組織である肝、筋肉、脂肪組織等において十分な作用が発現できない状態）が挙げられる。ＮＩＤＤＭは生活習慣病の１種と考えられているが、これは、遺伝的原因のほかにも、運動不足、肥満等の生活習慣によってインスリン抵抗性が引き起こされるためである。このように、インスリン抵抗性は、ＮＩＤＤＭの発症と深い関係がある。このため、インスリン抵抗性を評価することが非常に重要である。
【０００３】
インスリン抵抗性を正確に評価する方法としては、例えば、グルコースクランプ法、ＳＳＰＧ（ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ｐｌａｓｍａ  ｇｌｕｃｏｓｅ）法等が挙げられるが、これらの方法は被験者への負担が大きく、操作も複雑である。そこで、一般的には、ＨＯＭＡ−ＩＲ（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ−Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）をインスリン抵抗性指数として用いている。ＨＯＭＡ−ＩＲは、下記の計算式で求めることができ、より簡便にインスリン抵抗性を評価することができる。ＨＯＭＡ−ＩＲ値は、空腹時血糖値と空腹時インスリン値のいずれもが正常である場合に、１となるように規定されている。
ＨＯＭＡ−ＩＲ＝〔空腹時血糖値（mg/dl）〕×〔空腹時インスリン値（μU/ml）〕/ 405
【０００４】
一方で、最近、ＮＩＤＤＭの遺伝的リスクに関する研究も報告されている。例えば、特許文献１によれば、Coagulation factor III（Ｆ３）遺伝子のＳＮＰ（一塩基多型）（ｒｓ１３６１６００）、Angiotensin 1-converting enzyme（ＡＣＥ）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４２９１）、Paraoxonase 1（ＰＯＮ１）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１３３０６６９８）、Monocyte differentiation antigen CD14（ＣＤ１４）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ２５６９１９０）、Adipocyte, CIQ, and collagen domain containing（ＡＤＩＰＯＱ）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１５０１２９９）、ATP-binding cassette, subfamily A, member 1（ＡＢＣＡ１）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４１４９３１３）、Chemokine, CX3C motif, receptor 1（ＣＸ３ＣＲ１）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ３７３２３７８）、Insulin promoter factor 1（ＩＰＦ１）遺伝子のＳＮＰ（−１０８位の３つのＧが４つのＧへの挿入多型）、Thrombospondin II（ＴＨＢＳ２）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ８０８９）、Factor VII（Ｆ７）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ６０４６）、Protein phosphatase 1, regulatory subunit 3A（ＰＰＰ１Ｒ３Ａ）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１７９９９９９）、Platelet-endothelial cell adhesion molecule 1（ＰＥＣＡＭ１）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１１３１０１２）、及びpolycystic kidney disease 1-like（ＰＫＤ１−ｌｉｋｅ）遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６３５７１２）が、ＮＩＤＤＭの発症と強い相関が観察されたことが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２６７７２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、ＮＩＤＤＭの発症と相関性の高い遺伝子多型については幾つか報告があるものの、インスリン抵抗性自体に対する遺伝的リスクについては、十分な研究がなされていない。
【０００７】
本発明は、保有の有無と空腹時血中インスリン濃度との相関性が十分に高く、空腹時血中インスリン濃度評価、引いてはインスリン抵抗性のリスク評価に用いることができる遺伝子多型からなる遺伝子マーカー、該遺伝子多型を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができるポリヌクレオチド、該遺伝子マーカーを用いた空腹時血中インスリン濃度の評価方法及びインスリン抵抗性のリスク評価方法、並びに該遺伝子多型のタイピングに用いるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、原則として５０歳以上の４５０人以上から採取されたゲノムＤＮＡを対象として、インスリン抵抗性の指標として汎用されているＨＯＭＡ−ＩＲ値及び空腹時血中インスリン濃度と、遺伝子多型との関連性を解析したところ、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）、アディポネクチン遺伝子の−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）、及び同じくアディポネクチン遺伝子の−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）の３種類の遺伝子多型が、ＨＯＭＡ−ＩＲ値及び空腹時血中インスリン濃度と強い相関があり、インスリン抵抗性評価や空腹時血中インスリン濃度評価のための遺伝子マーカーとして非常に有用であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）    遺伝子マーカーを用いて、インスリン抵抗性のリスクを評価する方法であって、（ａ）ヒト個体から採取された核酸の遺伝子多型をタイピングする工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体のインスリン抵抗性のリスクを評価する工程と、を有し、前記遺伝子多型が、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とする、インスリン抵抗性のリスク評価方法、
（２）  前記工程（ａ）が、さらに、アディポネクチン遺伝子の−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）をタイピングする工程であることを特徴とする前記（１）記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法、
（３）  前記工程（ｂ）において、アポリポプロテインＥ遺伝子の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）がＴＴ型、ＧＴ型、ＧＧ型の順にインスリン抵抗性となるリスクが高いと評価することを特徴とする、前記（１）記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法、
（４）  前記工程（ｂ）において、アディポネクチン遺伝子の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）がＧＧ型の場合にインスリン抵抗性となるリスクが高く、ＡＧ型又はＡＡ型の場合にリスクが低いと評価することを特徴とする、前記（２）記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法、
（５）  前記工程（ｂ）において、アディポネクチン遺伝子の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）が、両アレルにＣＡが挿入されているホモ型の場合にインスリン抵抗性となるリスクが高く、ヘテロ型又は両アレルでＣＡが欠損しているホモ型の場合に低いと評価することを特徴とする、前記（２）記載のインスリン抵抗性のリスク評価方法、
（６）  遺伝子マーカーを用いて、空腹時血中インスリン濃度のリスクを評価する方法であって、（ａ）ヒト個体から採取された核酸の遺伝子多型をタイピングする工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体の空腹時血中インスリン濃度のリスクを評価する工程と、を有し、前記遺伝子多型が、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とする、空腹時血中インスリン濃度のリスク評価方法、
（７）  前記工程（ａ）が、さらに、アディポネクチン遺伝子の−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）をタイピングする工程であることを特徴とする、前記（６）記載の空腹時血中インスリン濃度のリスク評価方法、
【００１０】
（８）  アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、前記遺伝子多型が−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とするインスリン抵抗性の遺伝子マーカー、
（９）  アポリポプロテインＥ遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、前記遺伝子多型が−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）であることを特徴とする空腹時血中インスリン濃度の遺伝子マーカー、
（１０）  アディポネクチン遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、前記遺伝子多型が、−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）であることを特徴とするインスリン抵抗性の遺伝子マーカー、
（１１）  アディポネクチン遺伝子の遺伝子多型を含む部分塩基配列又は全塩基配列と相同的又は相補的な配列からなり、前記遺伝子多型が、−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）又は−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）であることを特徴とする空腹時血中インスリン濃度の遺伝子マーカー、
【００１１】
（１２）  下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有し、アポリポプロテインＥ遺伝子の−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列；
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（１３）  下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有し、アディポネクチン遺伝子の−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド；
（ａ）配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
（ｄ）配列番号５で表される塩基配列、又は配列番号５で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列；
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（１４）  下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有し、アディポネクチン遺伝子の−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができることを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド；
（ａ）配列番号７で表される塩基配列、又は配列番号７で表される塩基配列の第８１番目及び第８２番目の塩基を含む部分配列である塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目及び第８２の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列、又は配列番号８で表される塩基配列のうち第８０番目及び第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列；
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列；
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８０番目及び第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
（１５）  前記（１２）記載のインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド、前記（１３）記載のインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチド、及び前記（１４）記載のインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチドからなる群より選択される１以上を含むことを特徴とするインスリン抵抗性リスク評価用遺伝子多型タイピングキット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子マーカーは、空腹時血中インスリン濃度との相関性が十分に高い遺伝子多型からなるマーカーである。このため、これらの遺伝子マーカーを用いることを特徴とする、本発明の空腹時血中インスリン濃度のリスク評価方法及びインスリン抵抗性のリスク評価方法により、インスリン抵抗性の遺伝的リスクについて、より信頼性の高い評価をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）の各遺伝子型におけるＨＯＭＡ−ＩＲ値を示した図である。
【図２】ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）{図２（Ａ）}及び−１１１５６位の塩基の多型{図２（Ｂ）}の各遺伝子型におけるＨＯＭＡ−ＩＲ値を示した図である。
【図３】ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）の各遺伝子型における空腹時血中インスリン濃度を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明及び本願明細書において、「ｒｓＸＸＸＸＸＸ（Ｘは任意の数字）」は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＳＮＰデータベース（ｄｂＳＮＰ  ＢＵＩＬＤ１２４）のリファレンス番号であるｒｓ番号を示す。
【００１５】
本発明において、「インスリン抵抗性のリスク」とは、インスリン抵抗性へのなり易さ、すなわち、血中にインスリンが存在していても、標的組織である肝、筋肉、脂肪組織等において十分な作用が発現できない状態へのなり易さをいう。すなわち、本発明において、あるヒト個体が「インスリン抵抗性の高リスク群である」とは、該ヒト個体がインスリン抵抗性となる危険率が高いと予想されることを意味し、「インスリン抵抗性の低リスク群である」とは、該ヒト個体がインスリン抵抗性となる危険率が低いと予想されることを意味する。
【００１６】
同様に、本発明において、「空腹時血中インスリン濃度のリスク」とは、空腹時血中インスリン濃度の高くなり易さをいう。すなわち、本発明において、あるヒト個体が「空腹時血中インスリン濃度の高リスク群である」とは、該ヒト個体が、空腹時血中インスリン濃度が高くなる危険率が高いと予想されることを意味し、「空腹時血中インスリン濃度の低リスク群である」とは、該ヒト個体が、空腹時血中インスリン濃度が高くなる危険率が低いと予想されることを意味する。なお、本発明において、「空腹時血中インスリン濃度が高い」とは、健常者（ＨＯＭＡ−ＩＲ値が１近傍の値であるヒト）の平均的な空腹時血中インスリン濃度よりも明らかに高いことを意味する。例えば、空腹時血中インスリン濃度が１５μＵ／ｍｌ以上の場合に、空腹時血中インスリン濃度が高い、ということができる。
【００１７】
本発明のインスリン抵抗性の遺伝子マーカーは、アポリポプロテインＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ、以下、「ＡＰＯＥ」）遺伝子の全塩基配列又は−２１９位の塩基の一塩基多型（−２１９Ｇ／Ｔ、ｒｓ４０５５０９）を含む部分塩基配列と、相同的又は相補的な配列からなることを特徴とする。
【００１８】
ＡＰＯＥは、ＨＤＬ（Ｈｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、カイロミクロン、ＶＬＤＬ（Ｖｅｒｙ  Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）等のリポタンパク質を構成している主要なアポリポタンパク質の１つである。ヒトの第１９番染色体上に遺伝子がコードされており、３１７アミノ酸からなるタンパク質をコードしている。この３１７アミノ酸からなるタンパク質は、翻訳後修飾によりＮ末端が切断され、２９９アミノ酸からなる成熟タンパク質として、細胞外に分泌される。ＡＰＯＥ遺伝子には、３つの対立遺伝子があり、それぞれに対応するアイソフォーム（ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、ＡＰＯＥ４）がある。これらのアイソフォームには、１１２位のアミノ酸（Ｃｙｓ１１２Ａｒｇ）と１５８位のアミノ酸（Ａｒｇ１５８Ｃｙｓ）に違いがある。
【００１９】
ＡＰＯＥ遺伝子の−２１９位の塩基は、プロモーター領域の塩基であり、当該塩基の遺伝子多型であるＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）は、Ｇ／Ｔ多型である。配列番号３の塩基配列において、２０１番目の塩基がＡＰＯＥ遺伝子の−２１９位の塩基に相当する。すなわち、Ｇアレルの場合は、配列番号３の塩基配列の２０１番目の塩基がＣであり、Ｔアレルの場合は、配列番号３の塩基配列の２０１番目の塩基がＡである。後記実施例１の結果から明らかであるように、本発明者らによって、ＡＰＯＥ遺伝子の−２１９位の塩基の遺伝子型がＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が高くなることが確認された。空腹時血中インスリン濃度も、同様に、ＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に高くなることが確認された。つまり、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）において、Ｇアレルを保有しているヒトよりも、Ｔアレルを保有しているヒトのほうが、ＨＯＭＡ−ＩＲ値及び空腹時血中インスリン濃度が高く、よって、インスリン抵抗性のリスクと空腹時血中インスリン濃度のリスクのいずれも高い。
【００２０】
なお、糖尿病の有病率は、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）がＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に高くなることが確認された。これに対して、高血圧の有病率は、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）の遺伝子型との相関は観察されなかった。
【００２１】
本発明においては、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｅ、以下、「ＡＤＩＰＯＱ」）遺伝子の全塩基配列、又は−１１４２６位の塩基の一塩基多型（−１１４２６Ａ／Ｇ、ｒｓ１６８６１１９４）若しくは−１１１５６位の塩基の多型（−１１１５６ｉｎｓＣＡ、ｒｓ６０８０６１０５）を含む部分塩基配列と、相同的又は相補的な配列からなるものを、インスリン抵抗性の遺伝子マーカーとしてもよい。
【００２２】
ＡＤＩＰＯＱ遺伝子の−１１４２６位の塩基のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）は、Ａ／Ｇ多型である。配列番号６の塩基配列において、２０１番目の塩基がＡＤＩＰＯＱ遺伝子の−１１４２６位の塩基に相当する。すなわち、Ａアレルの場合は、配列番号６の塩基配列の２０１番目の塩基がＡであり、Ｇアレルの場合は、配列番号６の塩基配列の２０１番目の塩基がＧである。後記実施例１の結果から明らかであるように、本発明者らによって、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子の−１１４２６位の塩基の遺伝子型がＡＡ型及びＡＧ型の場合には、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が１程度であり、ほぼ正常値であるが、ＧＧ型の場合には、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が高くなることが確認された。空腹時血中インスリン濃度も、同様に、ＡＡ型及びＡＧ型の場合には、比較的低いものの、ＧＧ型の場合には高くなることが確認された。
【００２３】
ＡＤＩＰＯＱ遺伝子の−１１１５６位の塩基の多型（ｒｓ６０８０６１０５）は、−１１１５６位に２塩基（ＣＡ）が挿入されている挿入多型（Ｉアレル）と、２塩基（ＣＡ）が欠損している欠損型（Ｄアレル）とからなる。配列番号９の塩基配列は、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＩアレルの−１１１５６位の塩基の近傍の塩基配列を示したものであり、２０１番目の塩基Ｃと２０２番目の塩基Ａが、Ｄアレルでは欠損している２塩基に相当する。すなわち、この２塩基（ＣＡ）を欠損した配列がＤアレルの塩基配列となる。後記実施例１の結果から明らかであるように、遺伝子型がＤＤ型（Ｄアレルのホモ型）及びＤＩ型（ヘテロ型）の場合には、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が１程度であり、ほぼ正常値であるが、ＩＩ型の場合には、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が高くなることが確認された。空腹時血中インスリン濃度も、同様に、ＤＤ型及びＤＩ型の場合には、比較的低いものの、ＩＩ型の場合には高くなることが確認された。
【００２４】
なお、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）と多型（ｒｓ６０８０６１０５）は、互いに完全な連鎖不平衡（ｒ２＝１．００）にある。よって、本発明においては、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）と多型（ｒｓ６０８０６１０５）とのいずれを遺伝子マーカーとして用いてもよく、両方を遺伝子マーカーとして用いてもよい。
【００２５】
本発明のインスリン抵抗性のリスク評価方法は、遺伝子マーカーとして、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）を用いることを特徴とする。前述したように、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）は、多型ごとにインスリン抵抗性が統計学上有意に異なるため、同定されたＳＮＰの遺伝子型から、インスリン抵抗性のリスクを評価することができる。ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）がＴＴ型、ＧＴ型、ＧＧ型の順にインスリン抵抗性となるリスクが高いと評価することができる。
【００２６】
本発明のインスリン抵抗性のリスク評価方法は、遺伝子マーカーとして、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）又は多型（ｒｓ６０８０６１０５）を用いてもよい。具体的には、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）がＧＧ型の場合にインスリン抵抗性となるリスクが高く、ＡＧ型又はＡＡ型の場合にリスクが低いと評価することができる。一方、多型（ｒｓ６０８０６１０５）がＩＩ型の場合にインスリン抵抗性となるリスクが高く、ＤＤ型又はＤＩ型の場合にリスクが低いと評価することができる。本発明においては、特に、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）と併用することにより、より信頼性の高い評価をすることが可能となる。
【００２７】
具体的には、（ａ）ヒト個体から採取された核酸の遺伝子多型をタイピングする工程と、（ｂ）前記工程（ａ）により得られたタイピング結果に基づき、前記ヒト個体のインスリン抵抗性のリスクを評価する工程とを行う。
【００２８】
また、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）及びＡＤＩＰＯＱ遺伝子の多型（ｒｓ６０８０６１０５）は、空腹時血中インスリン濃度とも高い相関がある。このため、これらの遺伝子多型を遺伝子マーカーとすることにより、インスリン抵抗性のリスク評価と同様にして、空腹時血中インスリン濃度のリスクを評価することができる。
【００２９】
具体的には、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）がＴＴ型、ＧＴ型、ＧＧ型の順に空腹時血中インスリン濃度が高くなり易いと評価することができる。同様に、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）がＧＧ型の場合に空腹時血中インスリン濃度が高くなり易く、ＡＧ型又はＡＡ型の場合に高くなり難いと評価することができる。また、多型（ｒｓ６０８０６１０５）がＩＩ型の場合に空腹時血中インスリン濃度が高くなり易く、ＤＤ型又はＤＩ型の場合に高くなり難いと評価することができる。本発明においては、特に、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子の多型（ｒｓ６０８０６１０５）からなる群より選択される２以上を併用することにより、より信頼性の高い評価をすることが可能となる。
【００３０】
本発明において、遺伝子多型をタイピングするとは、核酸の塩基配列を解析し、遺伝子多型を同定することを意味する。例えば、判定対象である核酸のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）が、ＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型のいずれであるのかを同定する。
【００３１】
遺伝子多型タイピングに供される核酸は、ヒト個体から採取されたものであれば、特に限定されるものではなく、血液や体液等の生体試料（検体）中に含有される核酸や、これらの生体試料等から抽出された核酸であってもよく、これらの核酸を鋳型として増幅された核酸であってもよい。また、生体試料中に含有されるＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。
【００３２】
遺伝子多型のタイピング方法は、通常ＳＮＰ等の遺伝子多型の検出に用いられている方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標、Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）法、ＴａｑＭａｎ（商標、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、マイクロアレイ法、シークエンス法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等の塩基配列増幅法を利用した検出法等が挙げられる。特に、ＴａｑＭａｎ法、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法等のように、各多型に特異的にハイブリダイズするプライマーやプローブを用いてＳＮＰを検出する方法であることが好ましい。例えば、ＰＣＲ法では、野生型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを野生型プライマーとし、変異型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを変異型プライマーとした場合に、遺伝子多型を含む核酸を鋳型として各プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物が得られるか否かにより遺伝子多型の遺伝子型を同定することができる。同様に、野生型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを野生型プローブとし、変異型アレルにのみ完全に相補的なポリヌクレオチドを変異型プローブとした場合に、遺伝子多型を含む核酸が固定されたマイクロアレイを用いて各プローブを用いた場合にハイブリダイズするか否かにより遺伝子多型の遺伝子型を同定することができる。これらの各遺伝子多型に特異的なプローブやプライマーを用いる方法は、シークエンス法等と異なり、遺伝子多型を直接識別するため、より信頼性が高く、また、遺伝子多型タイピングに要する時間が短く済み、簡便である。
【００３３】
なお、各遺伝子多型に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った場合に得られるＰＣＲ産物の検出は、ＰＣＲ産物を検出・定量する場合に通常用いられるいずれの方法によって行っても良い。例えば、電気泳動法により検出してもよく、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ等の蛍光インターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲにより検出してもよく、一分子蛍光分析法により検出してもよい。
【００３４】
遺伝子多型を検出するためのプライマー又はプローブとして用いることができるポリヌクレオチドは、該ＳＮＰを含む遺伝子の該ＳＮＰを含む部分領域又はその相補鎖にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであれば、特に限定されるものではない。また、ポリヌクレオチドの塩基長やＴｍ値等は、タイピング方法や反応条件等を考慮して、適宜決定することができるが、遺伝子多型検出用のポリヌクレオチドの塩基長としては、１０〜６０塩基長であることが好ましく、１５〜５０塩基長であることがより好ましい。
【００３５】
このような遺伝子多型検出用のポリヌクレオチドの設計は、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても行うことができる。例えば、公知のゲノム配列データと汎用されているプライマー設計ツールを用いて、簡便に設計することができる。該プライマー設計ツールとして、例えば、Ｗｅｂ上で利用可能なＰｒｉｍｅｒ３等がある。また、公知のゲノム配列データは、通常、国際的な塩基配列データベースである、ＮＣＢＩや、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）等において入手することができる。
【００３６】
このようにして設計した遺伝子多型検出用のポリヌクレオチドは、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても合成することができる。例えば、合成メーカーに合成を依頼してもよく、市販の合成機を用いて独自に合成してもよい。
【００３７】
ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）を検出するためのプライマー又はプローブとしては、特に、下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチド（以下、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチドという。）を用いることが好ましい。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００３８】
なお、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有しているＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）のＧアレルを検出し得るポリヌクレオチドであり、上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）のＴアレルを検出し得るポリヌクレオチドである。
【００３９】
ＳＳＰ−ＰＣＲにおいて各アレル特異的なプライマー（ＳＳＰプライマー）として使用されるＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチドの一例を表１に示す。表中、下線を付した塩基が、ＡＰＯＥ遺伝子の−２１９位の塩基とハイブリダイズする。また、「Ｆｗ：Ｃ」及び「Ｒｅｖ：Ｇ」がＧアレルを特異的に検出し得るＳＳＰプライマーであり、「Ｆｗ：Ａ」及び「Ｒｅｖ：Ｔ」がＴアレルを特異的に検出し得るＳＳＰプライマーである。なお、言うまでもなく、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチドの塩基配列は、表１記載の塩基配列に限定されるものではない。
【００４０】
【表１】
2011024457.tif 000002
【００４１】
ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）を検出するためのプライマー又はプローブとしては、特に、下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチド（以下、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチドという。）を用いることが好ましい。
（ａ）配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号５で表される塩基配列、又は配列番号５で表される塩基配列の第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４２】
なお、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有しているＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）のＡアレルを検出し得るポリヌクレオチドであり、上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチドは、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）のＧアレルを検出し得るポリヌクレオチドである。
【００４３】
ＳＳＰプライマーとして使用されるＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチドの一例を表２に示す。表中、下線を付した塩基が、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子の−１１４２６位の塩基とハイブリダイズする。また、「Ｆｗ：Ａ」及び「Ｒｅｖ：Ｔ」がＧアレルを特異的に検出し得るＳＳＰプライマーであり、「Ｆｗ：Ｇ」及び「Ｒｅｖ：Ｃ」がＴアレルを特異的に検出し得るＳＳＰプライマーである。なお、言うまでもなく、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチドの塩基配列は、表２記載の塩基配列に限定されるものではない。
【００４４】
【表２】
2011024457.tif 000003
【００４５】
ＡＤＩＰＯＱ遺伝子の多型（ｒｓ６０８０６１０５）を検出するためのプライマー又はプローブとしては、特に、下記の（ａ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有しているポリヌクレオチド（以下、多型（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチドという。）を用いることが好ましい。
（ａ）配列番号７で表される塩基配列、又は配列番号７で表される塩基配列の第８１番目及び第８２番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列において、第８１番目及び第８２の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ａ）又は（ｂ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列、又は配列番号８で表される塩基配列のうち第８０番目及び第８１番目の塩基を含む部分配列である塩基配列。
（ｅ）前記（ｄ）の塩基配列と相補的な塩基配列。
（ｆ）前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列において、第８０番目及び第８１番目の塩基以外の１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列であって、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが、前記（ｄ）又は（ｅ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４６】
なお、上記（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列を有している多型（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチドは、多型（ｒｓ６０８０６１０５）のＩアレルを検出し得るポリヌクレオチドであり、上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかの塩基配列を有している多型（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチドは、多型（ｒｓ６０８０６１０５）のＤアレルを検出し得るポリヌクレオチドである。
【００４７】
ＳＳＰプライマーとして使用されるＳＮＰ（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチドの一例を表３に示す。「Ｆｗ：ＩＮ」がＩアレルを特異的に検出し得るＳＳＰプライマーであり、「Ｆｗ：ＤＥＬ」がＤアレルを特異的に検出し得るＳＳＰプライマーである。表中、下線を付した２塩基が、プライマー又はプローブとして用いた場合に、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＩアレルにおいて挿入されている２塩基〔ＣＡ〕とハイブリダイズする。なお、言うまでもなく、ＳＮＰ（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチドの塩基配列は、表３記載の塩基配列に限定されるものではない。
【００４８】
【表３】
2011024457.tif 000004
【００４９】
本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）＋０．３％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で熱変性した後、６５℃で４〜１６時間のハイブリダイゼーションし、常温の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、及び、２×ＳＳＣでそれぞれ５分間洗浄し、０．０５×ＳＳＣでリンスすること等が挙げられる。
【００５０】
ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチド、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチド、及び多型（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチドは、本発明のインスリン抵抗性のリスク評価方法や、空腹時血中インスリン濃度のリスク評価方法において、各遺伝子多型をタイピングする際に用いるインスリン抵抗性リスク評価用ポリヌクレオチドや空腹時血中インスリン濃度リスク評価用ポリヌクレオチドとして用いることができる。
【００５１】
その他、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチド、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチド、多型（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチド等の遺伝子多型検出用のポリヌクレオチドは、検出対象の遺伝子の塩基配列と相補的又は相同的な配列以外にも、遺伝子多型タイピングを阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列や、核酸の標識に供される配列等がある。また、各遺伝子多型検出用のポリヌクレオチドは、遺伝子多型タイピング結果の検出や解析を容易にするために、遺伝子多型タイピングを阻害しない程度において、標識物質を付加することができる。該標識物質は、通常ポリヌクレオチドの標識に用いられる化合物であれば特に限定されるものではない。該標識物質として、例えば、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等の低分子化合物等がある。
【００５２】
また、ヒト個体から採取された核酸、遺伝子多型検出用のポリヌクレオチド等の、遺伝子多型タイピングにおいて用いられる量は、特に限定されるものではなく、通常用いられる量で用いることができる。また、ポリメラーゼ等の酵素や、ヌクレオチド、反応用バッファー等は、特に限定されるものではなく、通常遺伝子多型タイピングを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。  
【００５３】
その他、本発明の遺伝子マーカーは、他の遺伝子マーカーと組み合わせて使用することもできる。組み合わせる遺伝子マーカーは、特に限定されるものではなく、公知の遺伝子マーカーを組み合わせてもよい。
【００５４】
また、工程（ａ）における遺伝子多型タイピングに用いる遺伝子多型検出用のポリヌクレオチド等をキット化することにより、より簡便に工程（ａ）の遺伝子多型タイピングを行うことが可能となる。例えば、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）検出用ポリヌクレオチド、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）検出用ポリヌクレオチド、及び多型（ｒｓ６０８０６１０５）検出用ポリヌクレオチドからなる群より選択される１以上を含むキットとすることが好ましい。
【実施例】
【００５５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５６】
[実施例１]  
２００５年５月から２００７年１２月の間に北名古屋市の自治体健康診断を受けた４５０名以上を対象とし、遺伝子型とインスリン抵抗性及び空腹時血中インスリン濃度との相関を調べた。この研究の参加者は５０歳から８０歳であり、すべてが日本人であった。検査及びＤＮＡ抽出のための血液検体は、一晩絶食の後、対象から採血したものを用いた。ＢＭＩ、腹囲、血圧、空腹時血糖（ＦＰＧ）、空腹時血清免疫学的インスリン濃度（ＩＲＩ）、ＨｂＡ１ｃ、血清脂質値、及び尿酸値を、すべての対象に対して測定した。ＨＯＭＡ−ＩＲは、次の式〔ＦＰＧ×ＩＲＩ／４０５〕に基づいて算出した。
【００５７】
測定された各種データに基づき、糖尿病、高血圧、及び高尿酸血症の有病率を算出した。本実施例においては、ＦＰＧ≧１２６ｍｇ／ｄｌであり、かつＨｂＡ１ｃ≧６．５％である場合、又は糖尿病治療薬を使用している場合に、糖尿病に罹患しているとした。また、収縮期圧≧１４０ｍｍＨｇであり、かつ拡張期圧≧９０ｍｍＨｇである場合、又は降圧薬を使用している場合に、高血圧に罹患しているとした。また、尿酸値≧７．０ｍｇ／ｄｌである場合、又は高尿酸血症の治療を受けている場合に、高尿酸血症に罹患しているとした。本研究は名古屋大学医学部倫理委員会により承認され、全対象から文書によるインフォームドコンセントを得た上で行った。
【００５８】
＜多型選択＞
ＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄｃｅｎｔｒａｌ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）とＯＭＩＭ(Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／)を含む公共データベースを用いて、ＨＯＭＡ−ＩＲ値及び空腹時血中インスリン濃度との関連が予想される８０の遺伝子多型を解析した（総ジェノタイピング数７３２７２個）。
【００５９】
＜各遺伝子多型のタイピング＞
各対象から、７ｍｌの静脈血を、ＥＤＴＡ  ５０ｍｍｏｌ／ｌとなるように調節した採血管に採取し、キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡを分離した。
遺伝子多型のうち、ＳＮＰは、融解曲線法(ＩＦＰ法)を用いて解析した（東洋紡ジーンアナリシス社に依頼）。まず、遺伝子の多型を含む領域をＰＣＲ法により増幅した。反応混合物は、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、２０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、２ｐｍｏｌのリバースプライマー、２０ｐｍｏｌのＴｘＲ  ｌａｂｅｌ  Ｐｒｏｂｅ、２０００倍希釈ＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ社）２．５μｌ、０．２ｍｍｏｌ／ｌの各々のデオキシヌクレオシド三リン酸、２．５ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ２及び１．２５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴａｑ又はＫＯＤｐｌｕｓ、Ｔｏｙｏｂｏ社製）を含む。増幅プロトコールは以下の通りである。すなわち、まず、９５℃で５分間の最初の変性を行い、その後、９５℃で３０秒間の変性、６５又は７０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを、３５又は４５サイクル行い、そして最後に７２℃で２分間の伸長反応を行った。なお、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）を含む領域をＰＣＲ増幅する場合には、アニーリング温度を７０℃とし、１サイクルの繰り返し回数は３５とした。一方、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）を含む領域をＰＣＲ増幅する場合には、アニーリング温度を６５℃とし、１サイクルの繰り返し回数は４５とした。
ＩＦＰ法による多型解析は以下のようにして行った。すなわち、増幅反応液２５μｌをＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ７９００にセットし、９５℃ で３０秒間、４０℃で１分間、４０℃から８０℃へ１０分間で昇温し、ＳＴＥＰで蛍光強度を測定することにより、融解曲線を作成した。
【００６０】
一方、ｒｓ１６８６１１９４等の繰り返し回数の多型は、フラグメント解析により決定した。具体的には、まず、ゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を鋳型とし、５’末端を６−カルボキシ−フルオレセインでラベルしたフォワードプライマーとリバースプライマーとを用いて、１．２ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ２を含有する反応混合物（最終容量は２５μｌ）とし、その反応混合物を、以下の増幅プロトコールによりＰＣＲを行った。すなわち、まず、９５℃で５分間の最初の変性を行い、その後、９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５サイクル行い、そして最後に７２℃で２分間の伸長反応を行った。
その後、増幅反応液の１μｌを、９μｌのホルムアミドと０．２μｌのＲＯＸ−５００  ｓｉｚｅ  ｍａｒｋｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）と混和した後に９４℃で２分間加熱し、ＡＢＩ３１００システムを用いたキャピラリー電気泳動により分画した。
【００６１】
なお、表４に、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）、及びＡＤＩＰＯＱ遺伝子の多型（ｒｓ６０８０６１０５）を含む各領域をＰＣＲ増幅する際に用いた各プライマー及びプローブの配列を示す。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
＜統計解析＞
アレル頻度は、ｇｅｎｅ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄで評価し、さらに、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡からの逸脱をχ二乗検定により確認した。遺伝子型ごとのＨＯＭＡ−ＩＲ及び空腹時インスリン値は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で比較した。解析にはＳＰＳＳバージョン１４．０Ｊソフトウェア（ＳＰＳＳ、シカゴ、イリノイ)を用い、Ｐ値０．０５未満を統計学的に有意と判断した。
【００６４】
＜各遺伝子多型とＨＯＭＡ−ＩＲ値との相関＞
同定された各遺伝子多型の遺伝子型とＨＯＭＡ−ＩＲ値との関連を、分散分析により確認した。この結果、８０の遺伝子多型のうち、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）、及びＡＤＩＰＯＱ遺伝子の多型（ｒｓ６０８０６１０５）の３多型が、遺伝子型ごとに統計的に有意な差があることが確認された。
図１は、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）の各遺伝子型におけるＨＯＭＡ−ＩＲ値を示した図である。図中、括弧内の数値は測定者数を示し、エラーバーはＳＥ（標準誤差）を示す。この結果、ＧＧ型は、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が約１とほぼ正常値であったのに対して、ＧＴ型、ＴＴ型の順に、ＨＯＭＡ−ＩＲ値は有意に大きかった。
【００６５】
図２は、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）｛図２（Ａ）｝及び多型（ｒｓ６０８０６１０５）｛図２（Ｂ）｝の各遺伝子型におけるＨＯＭＡ−ＩＲ値を示した図である。図中、括弧内の数値は測定者数を示し、エラーバーはＳＥ（標準誤差）を示す。この結果、両遺伝子多型は、互いに完全な連鎖不平衡にあることが確認された。また、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）のＡＡ型及びＡＧ型、並びに多型（ｒｓ６０８０６１０５）のＤＤ型及びＤＩ型では、ＨＯＭＡ−ＩＲ値が約１とほぼ正常値であったのに対して、ＳＮＰ（ｒｓ１６８６１１９４）のＧＧ型及び多型（ｒｓ６０８０６１０５）のＩＩ型は、ＨＯＭＡ−ＩＲ値は有意に大きかった。
【００６６】
図３は、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）の各遺伝子型における空腹時血中インスリン濃度を示した図である。図中、括弧内の数値は測定者数を示し、エラーバーはＳＥ（標準誤差）を示す。この結果、ＨＯＭＡ−ＩＲ値と同様に、ＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に、空腹時血中インスリン濃度は高くなる傾向が確認された。この結果から、ＨＯＭＡ−ＩＲ値で観察された相関は、ＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）が空腹時血中インスリン濃度と関連するためであることが強く示唆された。
【００６７】
なお、糖尿病の治療歴がない集団、すなわち、血中インスリン値に影響を与える薬剤投与およびインスリン投与を受けたことのない集団（３７９例）を対象とした場合であっても、ＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に、空腹時血中インスリン濃度は高くなる傾向が確認された。つまり、インスリン投与の有無とは関係なく、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）と空腹時血中インスリン濃度は相関することが明らかである。
【００６８】
表５は、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）の遺伝子型別に、臨床検査情報の調査を行った結果を示したものである。これにより、ＨＯＭＡ−ＩＲ値及び空腹時血中インスリン濃度以外にも、ＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に、ＴＧ（中性脂肪）値が増加し、ＨＤＬ値が低下する傾向が観察された。
【００６９】
【表５】
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【００７０】
一方、表６は、ＡＰＯＥ遺伝子のＳＮＰ（ｒｓ４０５５０９）の遺伝子型別に、疾患有病率の調査を行った結果を示したものである。なお、表中、「性別（ｍａｌｅ）」は、男性被験者の比率を示している。これにより、ＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に、糖尿病の有病率が顕著に高いことがわかった（Ｃｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅ検定でｐ＜０．０５）。一方、高血圧の有病率は遺伝子型による違いは観察されなかった。その他、インスリン抵抗性との関連が報告されている高尿酸血症の有病率は、糖尿病と同様に、ＧＧ型、ＧＴ型、ＴＴ型の順に高いことがわかった。
これらの結果から、本発明のンスリン抵抗性のリスク評価方法や空腹時血中インスリン濃度の評価方法を用いることにより、インスリン抵抗性と関連する疾患の発症リスクを評価することもできることが示唆された。
【００７１】
【表６】
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【００７２】
表７は、ＡＤＩＰＯＱ遺伝子の多型（ｒｓ６０８０６１０５）の遺伝子型別に、臨床検査情報の調査を行った結果を示したものであり、表８は、疾患有病率の調査を行った結果を示したものである。表中、「性別（ｍａｌｅ）」は、男性被験者の比率を示している。この結果、ＤＤ型及びＤＩ型に比べて、ＩＩ型において、糖尿病の有病率が高くなる傾向が確認された。
【００７３】
【表７】
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【００７４】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のインスリン抵抗性のリスク評価方法や空腹時血中インスリン濃度の評価方法を用いることにより、インスリン抵抗性のリスクをより適確に判定し得るため、医療機関等における検体の遺伝子解析等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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