(57)【要約】      （修正有）【課題】肝ガンの予後予測に有用なポリヌクレオチドを提供する。【解決手段】特定の塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、及びそれらのいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド又はその断片、からなる群から選択される複数のポリヌクレオチドを含む肝ガン患者予後予測用組成物、キット又はＤＮＡチップ、ならびに、該組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて肝ガン患者の予後を予測する方法。【選択図】図２
2011211955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、またはその断片からなる群から選択される１または複数のポリヌクレオチドを含む、肝ガン患者予後予測用組成物。
（ａ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｂ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｄ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または１５以上の連続した塩基を含むその断片。
【請求項２】
下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、またはその断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１のいずれか１項に記載の組成物：
（ｆ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｇ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｉ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
【請求項３】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、および/またはその断片の１または複数を含む、肝ガン患者予後予測用診断用キット。
【請求項４】
請求項２に記載の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、および/またはその断片をさらに含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはそれらの１５以上の連続した塩基を含む断片である、請求項３〜４に記載のキット。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、別個にまたは任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項７】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、および/またはその断片の１または複数を含む、肝ガン患者予後予測用ＤＮＡチップ。
【請求項８】
請求項２に記載の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、および/またはその断片をさらに含む、請求項７に記載のＤＮＡチップ。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、請求項７〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ、またはそれらの組み合わせを用いて、請求項１〜２のいずれかに記載の組成物中のポリヌクレオチドの遺伝子発現量から因子番号１〜９、および１１の、ガン病変部の遺伝子発現量、正常組織部の遺伝子発現量、及びガン病変部の遺伝子発現量と正常組織部の遺伝子発現量の比率から構成される因子を算出し、この因子の３以上を測定することを含む、肝ガン患者予後予測用の方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の組成物、請求項４〜６のいずれかに記載のキット、請求項８に記載のＤＮＡチップ、またはそれらの組み合わせを用いて、因子番号１０からなるガン病変部の遺伝子発現量から算出される因子をさらに含む、肝ガン患者予後予測のための方法。
【請求項１１】
請求項１〜２のいずれかに記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、またはそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の試料における標的核酸の発現量を測定することによって、被験者の治療後のミラノ基準内再発の可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定する肝ガン患者予後予測のための方法。
【請求項１２】
ＤＮＡチップを用いる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜２のいずれかに記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、請求項７〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ、またはそれらの組み合わせを用いて、被験者のミラノ基準内再発の可能性が既知の複数の試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量を測定し、該標的核酸の発現量から算出される肝ガン病変部における遺伝子発現量、正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン組織の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の比率を教師とした判別式（Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた回帰式）を作成する第２の工程、被験者の手術時又は内視鏡検査時に採取した試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量から算出した肝ガン病変部における遺伝子発現量、正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン組織の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の比率を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、被験者のミラノ基準内再発の可能性を判定する第４の工程を含む、肝ガン患者予後予測のための方法。
【請求項１４】
請求項１〜２のいずれかに記載の組成物、請求項３〜６のいずれかに記載のキット、請求項７〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ、またはそれらの組合せの、被験者の治療後のミラノ基準内再発の可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定するための肝ガン患者予後予測用組成物及び方法への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝ガン患者の予後の予測、判定、検出又は診断に有用な予測、判定、検出又は診断用組成物、該組成物を利用した肝ガン患者の予後の予測、判定、検出又は診断方法、及び該組成物を利用した肝ガン患者の予後の予測、判定、検出又は診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、腹部の右上に位置する体内で最大の臓器であり、正常成人の肝重量は体重の約５０分の１を占める。また、肝臓は肝動脈と門脈の２つの血管により栄養を受け、胆管を通じ十二指腸へ、胆管下部ですい臓に接続する。生体内では代謝、排出、解毒、体液の恒常性の維持などにおいて重要な役割を担う。
【０００３】
日本人の２００８年のガンによる死亡率は１０万人中５４７．７人である。死亡原因の中で肝ガンが占める割合は年々増加しており、２００８年度の肝ガン死亡率は男性が９．５％、女性が８．４％を占め、肝ガン罹患率は男性が女性の約３倍を示す。また、肝ガンは生存率が低く、罹患数と死亡数の差は小さい。肝ガンへの発症、進展には、主にＢ型肝炎ウイルス、もしくはＣ型肝炎ウイルスの持続感染と、ウイルス感染が引き起こす肝細胞の長期にわたる炎症と再生の繰り返しが重要と考えられている。
【０００４】
肝ガンの治療は進行度や転移、全身状態を考慮して決定され（日本肝臓研究会編  原発性肝癌取扱い規約  臨床・病理  ２００９年）、肝ガンの標準的な治療法は日本肝臓学会編「科学的根拠に基づく肝癌診療ガイドライン ２００９年版」に示されている。現在最も一般的な療法は、外科療法、穿刺療法（経皮的エタノール注入療法、ラジオ波焼灼療法）、肝動脈塞栓術の３療法であり、他に放射線療法や抗癌剤による化学療法がある。また、ミラノ基準（脈管浸潤がなく、リンパ節転移がない５ｃｍ以下の単発性ガン、もしくは脈管浸潤がなく、リンパ節転移がない３個以内の３ｃｍ以下の多発性ガン）を満たす場合は肝移植が適合する。しかし、脳死移植ドナーが少ない日本での肝移植は生体肝移植が中心的であり、生体肝移植は健常人ドナーに身体的・精神的負担が大きい治療法であるため、肝移植の実施には慎重な判断が必要となっている。
【０００５】
また、最も一般的な療法を肝ガン患者に行ったとしても、その治療後に肝ガンが再発するケースも知られ、再発肝ガンであったとしても、その再発状態がミラノ基準を満たせば肝移植を適用できる。しかし、再発肝ガンが進行する速さには個人差があり、再発肝ガンの発見が遅れてしまうと肝ガンはミラノ基準外となってしまい、患者は有効な治療法である肝移植を適用できる機会を失ってしまう。従って、肝ガンの治療後に短期間で肝ガンが再発する患者をミラノ基準内で発見する予測法が、現在の臨床現場で強く求められている。
【０００６】
現在までに、肝ガン患者の肝切除後の生存期間または無再発生存期間を予測するための、臨床検査項目を用いた方法が提案されている。たとえば生存期間について、性別、年齢、肝硬変の有無、もしくはアルコール乱用の有無（非特許文献１）、再発までの期間について多発性、腫瘍径、肝内転移の有無、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｖａｔｉｏｎ、ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｒｇｉｎ、もしくはｒｅｓｅｃｔｉｏｎのタイプ（非特許文献２）、同じく再発までの期間についてＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｖａｔｉｏｎ、ＡＦＰ、もしくはＮｏｎ−ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ（非特許文献３）、などの基準値・基準カテゴリーによってＣｏｘ比例ハザード回帰分析を行うことにより、患者の生存または無再発生存期間の比較的長い群と比較的短い群を統計学的に有意に分けることができると報告されている。しかし、肝ガン患者の治療後の予後予測として肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性を予測するという段階には至っていない。
【０００７】
肝ガン患者に特異的に含まれるマーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は迅速で客観的な結果をもたらし、迅速な診断の助けとなる。これまでに肝ガンの臨床検査用マーカーとして血清中のタンパク質マーカーであるＡＦＰやＨＢｓＡｇ量（非特許文献１〜３）、ｄｅｓ−γ−ｃａｒｂｏｘｙ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（非特許文献３）などが肝ガン患者の治療後の予後予測として報告されている。しかし、肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性を予測するという段階には至っていない。
【０００８】
さらに単独の遺伝子発現を指標としたマーカーとしては特許文献１に示されるｍｉＲ−１００、特許文献１に示されるｍｉＲ−２４、非特許文献１に示されるｍｉＲ−９９ｂ、特許文献１に示されるｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、非特許文献４に示されるｍｉＲ−９６、非特許文献１に示されるｍｉＲ−１２５ｂ、特許文献１に示されるｍｉＲ−９９ａ、非特許文献５に示されるｍｉＲ−２１などが報告されている。しかし、これらによっても、肝ガン患者の治療後の予後予測として肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性を予測するには十分でない。
【０００９】
具体的には、非特許文献１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、性別、年齢、ＡＦＰ、肝硬変の有無、ＨＢｓＡｇ量、およびアルコール乱用の有無と肝ガン患者の肝ガン再発との関連性は、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析により、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂの発現量を患者群内の測定値メジアンを基準として２群に分けた場合に、低発現群において生存までの期間が有意ではないが（Ｐ＝０．０６１）短いことが示されている。また同様に肝硬変があることによって生存期間が短いこと（Ｐ＝０．００３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂの発現量と肝硬変の有無を組み合わせることによってさらに危険率低く生存期間の長短を分けることが可能（Ｐ＝０．０００３９）であるとされている。しかしながら、この検討においては患者の生存期間を予測しており、再発後肝ガンの治療抵抗性などの因子を含んだ検討であるため、本検討の結果を用いて、肝ガンの治療後に短期間で肝ガンが再発することを予測するものではない。
【００１０】
また、非特許文献２に記載のｄｅｓ−γ−ｃａｒｂｏｘｙ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ、ＡＦＰ、多発性、腫瘍径、肝内転移の有無、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｖａｔｉｏｎ、ｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｒｇｉｎ、およびｒｅｓｅｃｔｉｏｎのタイプと肝ガン患者の肝ガン再発との関連性は、肝ガン患者の１年後の治療後の予後予測が最も高くなる予測方法でも感度が６３．４％、特異度が７５．６％である。また、非特許文献３に記載の肝ガン患者は手術時に腫瘍径が５ｃｍ以下の、より軽度な肝ガン患者だけを対象としており、汎用的に肝ガンの治療後に短期間で肝ガンが再発する患者をミラノ基準内で発見するための方法とはいえない。
【００１１】
また、非特許文献３に記載のＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｖａｔｉｏｎ、ＡＦＰ、およびＮｏｎ−ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎと肝ガン患者の２年以内の肝ガン再発との関連性は、肝ガン患者の治療後の予後予測が最も高くなるＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｖａｔｉｏｎ、ＡＦＰとＮｏｎ−ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎの３種類を組み合わせた場合、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析による２年後の再発率は低リスク群で３３．７％、高リスク群で５５．５％で（ｐ＝０．０１）である。
【００１２】
しかしながら、これらの先行文献において報告されている方法は診断の確率を示しているものではなく、実用における評価は確定されていない。また、ＤＮＡチップ測定のように一度にマーカーを測定することは不可能であり、複数の臨床指標を独立に測定する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＵＳ２００９／０１８６３５３Ａ１
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｌｉ，Ｘ．ら、２００８年、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、第１２３巻、ｐ．１６１６−１６２２
【非特許文献２】Ｉｍａｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９９年、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第８６巻、ｐ．１０３２−１０３８
【非特許文献３】Ｉｍａｍｕｒａ，Ｈ．ら、２００３年、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第３８巻、ｐ．２００−２０７
【非特許文献４】Ｌａｄｅｉｒｏ，Ｙ．ら、２００８年、ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ、第４７巻、ｐ．１９５５−１９６３
【非特許文献５】Ｗａｎｇ，Ｂ．ら、２００９年、ＨＥＰＡＴＯＬＯＧＹ、第５０巻、ｐ．１１５２−１１６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、上記の既存の指標は肝ガンの発見や治療効果の判定に利用されているが、肝ガン患者の治療後の予後予測として肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性を予測するために最適な指標でないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、特異性及び感受性が高い肝ガン患者予後予測マーカーが切望されている。
【００１６】
本発明は、肝ガン患者予後予測に有用な疾患判定用組成物、該組成物を用いた肝ガン患者予後の予測、判定、検出又は診断方法、及び該組成物を利用した肝ガン患者予後の予測、判定、検出又は診断キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
マーカー探索の方法としては、手術時に患者由来の肝ガン病変部と正常組織部における遺伝子の発現やタンパク質の発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や治療後の予後が良い患者と治療後の予後が悪い患者の両方から得られる体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法が挙げられる。
【００１８】
ＤＮＡチップを用いた遺伝子発現量解析は、近年、このようなマーカー探索の手法として特に汎用されている。ＤＮＡチップには数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブが固定されている。被検試料をＤＮＡチップに添加することによって試料中の遺伝子がプローブと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被検試料中の遺伝子量を知ることができる。ＤＮＡチップ上に固定化するプローブに対応した遺伝子の選択は自由であり、また手術時又は内視鏡検査時に採取した試料である肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部を用いて、試料中の遺伝子発現量を比較することによって肝ガンマーカーとなりうる遺伝子群を推定することが可能である。
【００１９】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、部分肝切除手術を行った肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部から得られた遺伝子発現量をＤＮＡチップによって解析し、肝ガン患者予後予測マーカーに使用可能な因子とそれを構成する遺伝子を見出し、さらにそれらの遺伝子発現量が、ミラノ基準内で肝ガンが再発する可能性が高い患者において、肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の比率が減少、低減もしくは増加、増大していることを見出し、本発明を完成させた。
【００２０】
１．発明の概要
本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は、第１の態様において、下記の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体またはその断片からなる群から選択される１または複数のポリヌクレオチドを含む、肝ガン患者予後予測用組成物を提供する。
（ａ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてu（ウラシル）がt（チミジン）である塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｂ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｄ）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
その実施形態において、上記組成物は、下記の（ｆ）〜（ｊ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、またはその断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドをさらに含む。
（ｆ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｇ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
（ｉ）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または１５以上の連続した塩基を含むその断片
本発明は、第２の態様において、上記のいずれかに記載の（ａ）〜（ｅ）に示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び/又はその断片の１または複数を含む、肝ガン患者予後予測用キットを提供する。
【００２１】
その実施形態において、上記キットは、上記の（ｆ）〜（ｊ）のいずれかに示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び/又はその断片をさらに含む。
【００２２】
別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上の連続した塩基の１以上、好ましくは２以上を含む断片である、上記のキットを提供する。
【００２３】
さらに別の実施形態において、上記ポリヌクレオチドが、別個に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されている、上記のキットを提供する。
【００２４】
本発明は、第３の態様において、上記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び/又はその断片の１または複数を含む、肝ガン患者予後予測用診断用ＤＮＡチップを提供する。
【００２５】
その実施形態において、上記ＤＮＡチップは、上記の（ｆ）〜（ｊ）のいずれかに示すポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び/又はその断片をさらに含む。
【００２６】
本発明は、第４の態様において、上記の組成物のポリヌクレオチドのガン病変部の遺伝子発現量、正常組織部の遺伝子発現量、及びガン病変部の遺伝子発現量と正常組織部の遺伝子発現量の比率から構成される因子を算出し、この因子の３以上を測定することを含む、被験者の肝ガン治療後のミラノ基準内再発の可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定する肝ガン患者予後予測のための方法を提供する。
【００２７】
その実施形態において、上記の方法は、本発明の第２の態様に記載のキットを使用する。
【００２８】
別の実施形態において、上記の方法は、本発明の第３の態様に記載のＤＮＡチップを使用する。
【００２９】
本発明はさらに、第５の態様において、上記のいずれかの組成物、上記のいずれかのキット、上記のいずれかのＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者の肝ガン治療後のミラノ基準内再発の可能性が既知の複数の試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の肝ガン患者の肝ガン病変部における遺伝子発現量、肝ガン患者の正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率を測定し、そこから算出される因子を教師とした判別式（Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いた判別式）を作成する第２の工程、被験者の肝臓由来の試料中の該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値を代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、被験者の肝ガン治療後のミラノ基準内再発の可能性を判定する第４の工程を含む、肝ガン患者予後予測のための方法を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、第６の態様において、上記のいずれかの組成物、上記のいずれかのキット、又は上記のいずれかのＤＮＡチップの、被験者の肝ガン治療後のミラノ基準内再発の可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定するための肝ガン患者予後予測用組成物および方法への使用を提供する。
【００３１】
２．定義
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。
【００３２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれも包含する核酸に対して用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００３３】
本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、および２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００３４】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片、およびヒトゲノムのいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「核酸」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「核酸」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜９で示されるいずれかの塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「核酸」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。
【００３５】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
【００３６】
また、本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５〜２５塩基、好ましくは２１〜２４塩基、の非コーディングＲＮＡを意図して用いられる。また本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含有し、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、具体的には、ｍｉＲＢａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ１３（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、後に記載したストリンジェントな条件下で、上記の配列番号１〜９で示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。
【００３７】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００３８】
本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００３９】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号によって定義される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００４０】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。
【００４１】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異などに起因した天然の変異体、あるいは配列番号１〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその部分配列において１、２もしくは３又はそれ以上、好ましくは１もしくは２個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは配列番号１〜９のｍｉＲＮＡの前駆体ＲＮＡの塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその部分配列において１又は２以上、好ましくは１又は数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該塩基配列の各々又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、あるいは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００４２】
本明細書において「数個」とは、約６、５、４、３又は２個の整数を意味する。
本明細書において、変異体は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法を利用した突然変異導入法などの周知の技術を用いて作製可能である。
【００４３】
本明細書において「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ.、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ.、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８）。
【００４４】
本明細書において「誘導体」とは、修飾核酸、非限定的に例えば、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｐ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，    １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；  Ｏｂｉｋａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３９：５４０１）などを含むことを意味する。
【００４５】
本明細書において「予測、判定、検出又は診断用組成物」とは、肝ガンの罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、また肝ガンの予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものをいう。これには肝ガンの罹患に関連して生体内、特に肝組織において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを包含する。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００４６】
本明細書でおいて「予測」とは、予測、判定、検出又は診断を指す。
本明細書において予測、判定、検出又は診断の対象となる「試料」とは、肝ガンの発生にともない本発明の遺伝子が発現変化する組織を指す。具体的には肝組織及びその周辺の脈管、リンパ節及び臓器、また転移が疑われる臓器、および血液、尿、唾液、便、毛髪、皮膚、汗などを指す。
【００４７】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１００遺伝子」又は「ｍｉＲ−１００」という用語は、配列番号１に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１００遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００９８）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１００遺伝子は、Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ，Ｚ.ら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、第１６巻、ｐ.７２０−７２８に記載される方法によって得ることができる。
【００４８】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２７ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−２７ａ」という用語は、配列番号２に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００８４）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ.ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ.８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。
【００４９】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２４遺伝子」又は「ｍｉＲ−２４」という用語は、配列番号３に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２４遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００８０）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２４遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ.ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ.８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。
【００５０】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−９９ｂ遺伝子」又は「ｍｉＲ−９９ｂ」という用語は、配列番号４に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００６８９）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ.ら、２００２年、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．、第１２巻、ｐ.７３５−７３９に記載される方法によって得ることができる。
【００５１】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ」という用語は、配列番号５に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４４３）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ.ら、２００２年、Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．、第１２巻、ｐ.７３５−７３９に記載される方法によって得ることができる。
【００５２】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−９６遺伝子」又は「ｍｉＲ−９６」という用語は、配列番号６に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−９６遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００９５）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−９６遺伝子は、Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ，Ｚ.ら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、第１６巻、ｐ.７２０−７２８に記載される方法によって得ることができる。
【００５３】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子」又は「ｍｉＲ−１２５ｂ」という用語は、配列番号７に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００００４２３）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子は、Ｃａｉ，Ｘら、２００５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ.、 第１０２巻、５５７０−５５７５に記載される方法によって得ることができる。
【００５４】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−９９ａ遺伝子」又は「ｍｉＲ−９９ａ」という用語は、配列番号８に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００９７）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−１００遺伝子は、Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ，Ｚ.ら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、第１６巻、ｐ.７２０−７２８に記載される方法によって得ることができる。
【００５５】
本明細書で使用される「ｍｉＲ−２１遺伝子」又は「ｍｉＲ−２１」という用語は、配列番号９に記載のｈｓａ−ｍｉＲ−２１遺伝子（ｍｉＲｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ０００００７６）やその他生物種ホモログなどが包含される。ｈｓａ−ｍｉＲ−２１遺伝子は、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ，Ｍ.ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２９４巻、ｐ.８５３−８５８に記載される方法によって得ることができる。
【００５６】
本明細書で使用される「予後」とは、肝ガン患者の治療後の再発の有無、および再発までの期間を指す。
【００５７】
本明細書で使用される「ミラノ基準」とは、肝臓ガンの腫瘍条件が単発ガンならば５ｃｍ以下、多発ガンなら３ｃｍ以下で３個以内、を満たすことを指標とする肝移植の国際基準を示す（ｈｔｔｐ：／／ｇａｎｊｏｈｏ．ｎｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｐｕｂｌｉｃ／ｃａｎｃｅｒ／ｄａｔａ／ｌｉｖｅｒ．ｈｔｍｌ）。
【００５８】
本明細書で使用される「肝ガンの治療」とは、日本肝臓学会編「科学的根拠に基づく肝癌診療ガイドライン ２００９年版」に示されている肝臓ガンの治療法を指す。
【００５９】
本明細書で使用される「因子」とは、肝ガン患者の肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、肝ガン患者の正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率を指す。
【００６０】
本明細書で使用される「平均ＡＵＲＯＣ」とは、ＬＯＯＣＶ法による予測した肝ガン患者治療予後の再発の可能性に対するＡＵＲＯＣを年次ごとに計算し、生存期間を通じてのＡＵＲＯＣの平均値を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「Ｐ」または「Ｐ値」とは、統計学的検定において、統計量が仮定した分布の中で、仮定に反する値となる確率を示す。したがって「Ｐ」または「Ｐ値」が小さいほど、仮定が真に近いことが想定される。
【発明の効果】
【００６２】
本発明は、肝ガンの予後の予測、判定、検出又は診断に有用な予測、判定、検出又は診断用組成物、該組成物を利用した肝ガンの予後の予測、判定、検出又は診断方法、及び該組成物を利用した肝ガンの予後の予測、判定、検出又は診断キットを提供するものであり、これによって、肝ガンの治療後の予後に対して特異的かつ高予測率の、及び迅速でかつ簡便な、予測、判定、検出又は診断方法を提供するという格別の作用効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】表１に記載の因子及び遺伝子を決定するための解析の流れを示す。
【図２】図１に記載の流れに従ってＬＯＯＣＶ法を用いて表１に記載の因子をＣｏｘ比例ハザードモデルに組み入れて解析した場合の肝ガン患者予後予測である平均ＡＵＲＯＣが最大となった６種類の因子用いた場合の予測結果を示す。縦軸は、肝ガン患者の生存率、横軸は、肝ガン患者の無再発生存期間を示し、細線は、７３症例の肝ガン患者に対して行ったＬＯＯＣＶ法による予測結果が再発する可能性が高いと予測したＨｉｇｈ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐの生存曲線、太線は、７３症例の肝ガン患者に対して行ったＬＯＯＣＶ法による予測結果が再発しない可能性が高いと予測したＬｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐの生存曲線を示す。ｐ値は７３症例の肝ガン患者に対して行ったＬＯＯＣＶ法による予測結果が再発する可能性が高いと予測したＨｉｇｈ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐと再発しない可能性が高いと予測したＬｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐの間のＣｏｘ比例ハザード分析による有意差を示し、平均ＡＵＲＯＣは肝ガン治療後から０．５年から５年における予測精度の平均ＡＵＲＯＣを示す。
【図３】表１に記載の遺伝子に対応する肝ガン患者の肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量の底が２の対数値と肝ガン患者の正常組織部から得られた遺伝子発現量の底が２の対数値、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率の底が２の対数値からなる因子を１、２、３、４、５、及び６種類用いた場合の、７３症例の肝ガン患者に対して行ったＬＯＯＣＶ法によるＣｏｘ比例ハザード回帰モデルで予測した平均ＡＵＲＯＣの推移を示す。
【図４】図１に記載の流れに従ってＬＯＯＣＶ法を用いて肝ガン患者の臨床情報をＣｏｘ比例ハザードモデルに組み入れて解析した場合の肝ガン患者予後予測の精度として平均ＡＵＲＯＣが最大となった３３種類の臨床情報を用いた場合の予測結果を示す。縦軸は、肝ガン患者の生存率、横軸は、肝ガン患者の無再発生存期間を示し、細線は、７３症例の肝ガン患者に対して行ったＬＯＯＣＶ法による予測結果が再発する可能性が高いと予測したＨｉｇｈ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐの生存曲線、太線は、７３症例の肝ガン患者に対して行ったＬＯＯＣＶ法による予測結果が再発しない可能性が高いと予測したＬｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐの生存曲線を示す。ｐ値は７３症例の肝ガン患者に対して行ったＬＯＯＣＶ法による予測結果が再発する可能性が高いと予測したＨｉｇｈ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐと再発しない可能性が高いと予測したＬｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐの間のＣｏｘ比例ハザード分析による有意差を示し、平均ＡＵＲＯＣは肝ガン治療後から０．５年から５年における予測精度の平均ＡＵＲＯＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下に本発明をさらに具体的に説明する
１．肝ガンの標的核酸
本発明の上記定義の肝ガン患者予後予測用組成物及びキットを使用して肝ガン治療後のミラノ基準内再発の可能性を予測するための肝ガンマーカーとしての標的核酸には、例えば、配列番号１〜９で表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、及びｍｉＲ−２１）、それらの同族体、あるいはそれらの変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。好ましい標的核酸は、配列番号１〜９で表される塩基配列を含むヒト遺伝子、それらの転写産物、より好ましくは該転写産物、すなわちｍｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡであるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。
【００６５】
本発明において肝ガン予後予測の標的となる上記遺伝子はいずれも、肝ガンの治療後の予後が良い被験者と比べて肝ガンの治療後の予後が悪い被験者において、肝ガン患者の肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン病変部の遺伝子発現量と正常組織部の遺伝子発現量の比率が減少、低減もしくは増加、増大しているものである（後述の実施例の表１参照）。
【００６６】
第１の標的核酸は、ｍｉＲ−１００遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−１００遺伝子は原発性肝ガンと転移性肝ガンの間で遺伝子発現量が異なることがしられているが（特許文献１）、これまでにｍｉＲ−１００遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００６７】
第２の標的核酸は、ｍｉＲ−２７ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでにｍｉＲ−２７ａ遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００６８】
第３の標的核酸は、ｍｉＲ−２４遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−２４遺伝子は原発性肝ガンと転移性肝ガンの間で遺伝子発現量が異なることがしられているが（特許文献１）、これまでにｍｉＲ−２４遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００６９】
第４の標的核酸は、ｍｉＲ−９９ｂ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−９９ｂ遺伝子は原発性肝ガンと転移性肝ガンの間で遺伝子発現量が異なることがしられているが（非特許文献１）、これまでにｍｉＲ−９９ｂ遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７０】
第５の標的核酸は、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子は原発性肝ガンと転移性肝ガンの間で遺伝子発現量が異なることがしられているが（特許文献１）、これまでにｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７１】
第６の標的核酸は、ｍｉＲ−９６遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−９６遺伝子はＢ型肝炎ウィルスに感染した肝ガン患者において発現が高いことがしられているが（非特許文献４）、これまでにｍｉＲ−９６遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７２】
第７の標的核酸は、ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−１２５ｂ遺伝子は原発性肝ガンの再発予測マーカーとしての可能性が示されている（非特許文献１）。
【００７３】
第８の標的核酸は、ｍｉＲ−９９ａ遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−９９ａ遺伝子は原発性肝ガンと転移性肝ガンの間で遺伝子発現量が異なることがしられているが（特許文献１）、これまでにｍｉＲ−９９ａ遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない。
【００７４】
第９の標的核酸は、ｍｉＲ−２１遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。ｍｉＲ−２１遺伝子は早期肝ガン患者において発現が上昇することが知られているが（非特許文献５）、これまでにｍｉＲ−２１遺伝子又はその転写産物の発現が肝ガンのミラノ基準内再発の予測マーカーになりうるという報告は知られていない
【００７５】
２．肝ガン患者予後診断用組成物
本発明において、肝ガン患者予後を予測するための、あるいは肝ガン患者予後を診断するために使用可能な核酸組成物は、肝ガンの標的核酸としての、ヒト由来のｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、及びｍｉＲ−２１、それらの同族体、それらの転写産物又、あるいはそれらの変異体又は誘導体の存在、遺伝子発現量又は存在量を定性的及び/又は定量的に測定することを可能にする。
【００７６】
上記の標的核酸は、いずれも、肝ガンの治療後の予後が良い被験者と比べて肝ガンの治療後の予後が悪い被験者において、肝ガン患者の肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン病変部の遺伝子発現量と正常組織部の遺伝子発現量の比率が減少、低減もしくは増加、増大する。それゆえ、本発明の組成物は、肝ガンの治療後の予後が良い被験者の肝ガン病変部と正常組織部と肝ガンの治療後の予後が悪い被験者の肝ガン病変部と正常組織部について標的核酸の発現量を測定し、肝ガン患者予後が良いこと／又は肝ガン患者予後が悪いことを比較するために有効に使用することができる。
【００７７】
本発明で使用可能な組成物は、肝ガンに罹患した患者の試料において配列番号１〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、ならびにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において１５以上、好ましくは２１〜２４の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた１以上、好ましくは２以上のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。これらのポリヌクレオチドは、標的核酸である上記肝ガンマーカーを検出するためのプローブおよびプライマーとして使用できる。
【００７８】
具体的には、本発明の組成物は、以下の１以上、好ましくは２以上のポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又はその断片を含むことができる。
（１）配列番号１〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（２）配列番号１〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群。
（３）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【００７９】
（４）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（５）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（６）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
【００８０】
（７）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（８）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列の各々からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（９）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【００８１】
（１０）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（１１）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（１２）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【００８２】
（１３）配列番号７で表される塩基配列においてuがtである塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（１４）配列番号７で表される塩基配列においてuがtである塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【００８３】
上記（１）〜(１４)のポリヌクレオチドの断片は、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、２１〜２４塩基などの範囲の塩基数を含むことができるが、これらに限定されないものとする。
【００８４】
本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。
【００８５】
本発明の組成物としてのポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
【００８６】
ＤＮＡ組換え技術、部位特異的突然変異導入法、ＰＣＲ法などの技術は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＵＳ  （１９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
【００８７】
ヒト由来の、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−９９ａ、及びｍｉＲ−２１遺伝子は公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、これらの遺伝子をクローニングすることによって、本発明の組成物としてのポリヌクレオチドを作製することができる。
【００８８】
本発明の組成物を構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって全長のｍｉｃｒｏＲＮＡに相当する一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社などから市販されている。
【００８９】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｗａｋｏなどを利用できる。
【００９０】
３．肝ガン患者予後診断用キット
本発明はまた、本発明の組成物に含まれるものと同じポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の１以上、好ましくは２以上、を含む肝ガン患者予後予測用キットを提供する。
【００９１】
本発明のキットは、上記２に記載したポリヌクレオチド類から選択される、１以上、好ましくは２以上、のポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、及び/又はその断片を含む。ここで、変異体及び誘導体は上で定義されたものを含む。
【００９２】
本発明のキットは、配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片、その変異体、もしくはその誘導体、の１以上、好ましくは２以上を含むことができる。
【００９３】
本発明のキットは、さらに配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド、その相補的配列を含むポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチドの断片をさらに含むことができる。
【００９４】
本発明のキットに含むことができるポリヌクレオチド断片は、例えば下記の（１）〜（４）からなる群より選択される、１以上、好ましくは２以上のＤＮＡである：
（１）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（２）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、２１以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（３）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、および配列番号７で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、それぞれ１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
（４）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、および配列番号７で表される塩基配列においてuがtである塩基配列又はその相補的配列において、それぞれ２１以上の連続した塩基を含むＤＮＡ。
【００９５】
好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１〜６、および８〜９のいずれかで表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上、好ましくは２１〜２４、の連続した塩基を含む断片である。
【００９６】
別の好ましい実施形態では、本発明のキットは、上記のポリヌクレオチドに加えて、配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、その相補的配列からなるポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらの１５以上、好ましくは２１〜２４、の連続した塩基を含む断片をさらに含むことができる。
【００９７】
本発明はまた、本発明の組成物に含まれるものと同じポリヌクレオチド、その変異体及び/又はその断片の遺伝子発現量から算出される肝ガン患者の肝ガン病変部における遺伝子発現量、肝ガン患者の正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率の３以上、を測定することを含む肝ガン患者予後予測用キットを提供する。
【００９８】
本発明において、ポリヌクレオチドの断片のサイズは、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５〜配列の全塩基数、２１〜２４塩基などの範囲の塩基数である。
【００９９】
本発明のキットには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片に加えて、肝ガン患者予後予測を可能とする既知の又は将来見出されるポリヌクレオチドも包含させることができる。
【０１００】
本発明のキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、個別に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装される。
【０１０１】
４．ＤＮＡチップ
本発明はさらに、本発明の組成物及び/又はキットに含まれるものと同じポリヌクレオチド(或いは、上記の２節の組成物及び/又は３節のキットに記載されたポリヌクレオチド)、変異体、断片及びそれらの組み合わせを含む肝ガン患者予後予測用ＤＮＡチップを提供する。
【０１０２】
ＤＮＡチップの基板としては、ＤＮＡを固相化できるものであれば特に制限はなく、スライドガラス、シリコン製チップ、ポリマー製チップ及びナイロンメンブレンなどを例示することができる。またこれらの基板にはポリＬリジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理がされていてもよい。
【０１０３】
また固相化法については一般に用いられる方法であれば特に制限はなく、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いてＤＮＡをスポットする方法や、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射する装置（インクジェット）を用いてＤＮＡを基板に吹き付ける方法、又は基板上で順次ヌクレオチド合成を行う方法を例示することができる。高密度分注機を用いる場合には、例えば多数のウェルを持つプレートのおのおののウェルに異なった遺伝子溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットすることによる。インクジェット法では、ノズルより遺伝子を噴射し、基板上に高速度で遺伝子を整列配置することによる。基板上でのＤＮＡ合成は、基板上に結合した塩基を光又は熱によって脱離する官能基で保護し、マスクを用いることにより特定部位の塩基だけに光又は熱を当て、官能基を脱離させる。その後、塩基を反応液に加えて、基板上の塩基とカップリングさせる工程を繰り返すことによって行われる。
【０１０４】
固相化されるポリヌクレオチドは、上記で説明した本発明の全てのポリヌクレオチドである。
【０１０５】
例えば、そのようなポリヌクレオチドは、以下の１以上、好ましくは２以上のポリヌクレオチド又はその断片を含むことができる。
（１）配列番号１〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（２）配列番号１〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群。
（３）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【０１０６】
（４）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（５）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド群、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（６）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド群。
【０１０７】
（７）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列の各々と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（８）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列においてuがtである塩基配列の各々からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド群、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（９）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチド、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
【０１０８】
（１０）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、を含むポリヌクレオチド、それらの変異体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（１１）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、それらの変異体、それらの誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（１２）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【０１０９】
（１３）配列番号７で表される塩基配列においてuがtである塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（１４）配列番号７で表される塩基配列においてuがtである塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又は１５以上の連続した塩基を含むそれらの断片。
（１５）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列の各々において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【０１１０】
（１６）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列の各々において、２１以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
（１７）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列の各々において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
（１８）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列の各々において、２１以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【０１１１】
好ましい実施形態によれば、本発明のＤＮＡチップは、配列番号１〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列を含むポリヌクレオチドの１以上、好ましくは２以上、から全部を含むことができる。
【０１１２】
本発明において、固相化されるポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡのいずれでもよいし、あるいは１本鎖でもよいし又は２本鎖でもよい。ここで、合成ＤＮＡおよび合成ＲＮＡは、上記「誘導体」の定義で説明したような修飾核酸を含む。
【０１１３】
標的遺伝子、ＲＮＡ又はｃＤＮＡの遺伝子発現量を検出、測定することができるＤＮＡチップの例としては、東レ株式会社の３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ、Ａｇｉｌｅｎｔ社のＨｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｖ２）、ＥＸＩＱＯＮ社のｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（登録商標）  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＡＲＲＡＹなどを挙げることができる。
【０１１４】
ＤＮＡチップの作製について、例えば予め調製したプローブを固相表面に固定化する方法を使用することができる。予め調製したポリヌクレオチドプローブを固相表面に固定化する方法では、官能基を導入したポリヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｊ．Ｂ．Ｌａｍｔｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．２１２１−２１２５、Ｚ．Ｇｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年、第２２巻、ｐ．５４５６−５４６５）。ポリヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサ-やクロスリンカーを介して共有結合される。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成ポリヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｇ．Ｙｅｒｓｈｏｖら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ.、１９９６年、第９４巻、ｐ．４９１３）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ポリクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ.、１９９７年、第９４巻、ｐ．１１１９―１１２３）。
【０１１５】
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記診断用組成物をＤＮＡプローブ（一本鎖又は二本鎖）として基板に貼り付けたＤＮＡチップを用いる。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般にＤＮＡチップ及びＤＮＡアレイという名称があり、ＤＮＡチップにはＤＮＡマクロアレイとＤＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではＤＮＡチップといった場合、該ＤＮＡアレイを含むものとする。
【０１１６】
５．肝ガン患者予後の検出法
本発明は、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、肝ガン患者の治療後の予後予測として肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性を予測する可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定する方法であって、手術時又は内視鏡検査時に採取した試料である肝ガン患者の肝ガン病変部と正常組織部を用いて、試料中の遺伝子発現量を該診断用組成物で構成されるＤＮＡチップによって解析し、予後が良い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量と予後が悪い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量を比較して、該試料中の標的核酸の発現量から算出される、肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン病変部の遺伝子発現量と正常組織部の遺伝子発現量の比率、が減少、低減もしくは増加、増大している場合、肝ガン患者の治療後の予後予測として肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性を予測することを含み、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、方法を提供する。
【０１１７】
本発明はまた、本発明の組成物、組成物の遺伝子発現量を測定することによって構成される因子、キット又はＤＮＡチップの、肝ガン患者の治療後の予後予測として肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ判定するための使用を提供する。
【０１１８】
本発明の上記方法において、組成物、キット又はＤＮＡチップは、上で説明したような、本発明のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を単一であるいはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。
【０１１９】
本発明の肝ガン患者予後の予測において、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、プライマーとして又はプローブとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓなどを利用できるが、この方法に限定されない。
【０１２０】
本発明の組成物又はキットに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片は、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、定法に従ってプライマー又はプローブとして利用することができる。測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の肝ガン病変部、及び正常組織部の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した試料から回収する。さらにそこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１２１】
あるいは、採取した試料における本発明の遺伝子、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどの核酸の発現量は、ＤＮＡチップを用いて検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の組成物又はキットはＤＮＡチップのプローブとして使用することができる。かかるＤＮＡチップを試料から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識ＤＮＡ又はＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡ又はＲＮＡの標識を指標として検出することにより、試料中での本発明肝ガン関連遺伝子の発現の有無又は発現した遺伝子の量（遺伝子発現量）を評価することができる。本発明の方法では、ＤＮＡチップを好ましく使用できるが、これは、ひとつの試料について同時に複数遺伝子の発現の有無又は遺伝子発現量の評価が可能である。
【０１２２】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップは、肝ガン患者予後の予測のために有用である。具体的には、該組成物、キット又はＤＮＡチップを使用した肝ガン患者予後予測は、手術時又は内視鏡検査時に採取した試料である肝ガン患者の肝ガン病変部と正常組織部を用いて、試料中の遺伝子発現量を該診断用組成物の遺伝子発現量を測定し、予後が良い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量と予後が悪い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量を比較して、該試料中の標的核酸の発現量から算出される、肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン病変部の遺伝子発現量と正常組織部の遺伝子発現量の比率が減少、低減もしくは増加、増大していることを比較することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現量の違いには、該診断用組成物の遺伝子発現の有無も含む。
【０１２３】
本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップを利用した肝ガン患者予後が良いこと／又は予後が悪いことの検出方法は、被験者の試料の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した試料である肝ガン患者の肝ガン病変部と正常組織部を用いて、試料中の遺伝子発現量を該診断用組成物のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数のポリヌクレオチド、その変異体又はその断片を用いて測定し、予後が良い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量と予後が悪い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量を比較して、該試料中の標的核酸の発現量から算出される、肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン病変部の遺伝子発現量と正常組織部の遺伝子発現量の比率が減少、低減もしくは増加、増大していることを比較することにより、肝ガン患者予後が良いこと／又は肝ガン患者予後が悪いことを予測することを含む。また本発明の肝ガン患者予後予測方法は、例えば肝ガン患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与した場合における該疾患の再発の可能性を予測することもできる。
【０１２４】
本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程：
（ａ）被験者由来の試料を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと接触させる工程、
（ｂ）試料中の標的核酸の発現量を、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、該肝ガン患者予後が良い又は悪いことを予測する工程、
を含むことができる。
【０１２５】
本発明方法で用いられる試料としては、被験者の試料、例えば肝組織及びその周辺組織、肝ガンが疑われる組織など、から調製される試料を挙げることができる。具体的には該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、或いはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料は、被験者の試料の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって摘出した試料から回収して調製することができる。
【０１２６】
ここで被験者とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
【０１２７】
本発明の方法は、測定対象として用いる試料の種類に応じて工程を変更することができる。
【０１２８】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、肝ガン患者予後の予測は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）被験者の試料から調製されたＲＮＡ又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明の組成物、キット又はＤＮＡチップのポリヌクレオチドと結合させる工程、
（ｂ） 該ポリヌクレオチドに結合した試料由来のＲＮＡ又は該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記ポリヌクレオチドをプローブとして用いて測定する工程、
（ｃ） 上記（ｂ）の測定結果に基づいて、肝ガン患者予後が良いこと又は悪いことを予測する工程、
を含むことができる。
【０１２９】
本発明によって肝ガン患者予後を予測するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。かようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。
【０１３０】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の診断用組成物をプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中の各遺伝子発現の有無やその遺伝子発現量を検出、測定することができる。具体的には、本発明の予後予測のための診断用組成物（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなど）や蛍光物質（シアン系、ローダミン系、フルオレサミン系など）などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被検者の試料由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成された診断用組成物（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を診断用組成物の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ-１８００ＩＩ、富士写真フィルム株式会社、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ８６０、ＧＥヘルスケア社、などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
【０１３１】
定量ＲＴ―ＰＣＲ法を利用する場合には、本発明の上記診断用組成物中のポリヌクレオチドをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその遺伝子発現量を検出、測定することができる。具体的には、被検者の試料由来のＲＮＡから常法にしたがってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の組成物から調製した１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせて標識した診断用組成物中のポリヌクレオチドをプローブとしてこれとハイブリダイズさせて検出する方法をとることができる。
【０１３２】
ハイブリダイゼーション条件は、限定されないが、例えば３０℃〜６０℃で、ＳＳＣと界面活性剤を含む溶液中で１〜２４時間の条件とする。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）であり、界面活性剤はＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ、もしくはＴｗｅｅｎなどを含む。ハイブリダイゼーション条件としては、より好ましくは３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、例えば、３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した洗浄などの条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【０１３３】
本発明の組成物又はキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣＬ、１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍの計算方法としてＴｍ＝２×(アデニン残基数+チミン残基数)＋４×(グアニン残基数+シトシン残基数)などが挙げられる。
【０１３４】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． & Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． 著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の 第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
【０１３５】
本発明はまた、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、被験者由来の試料中の標的核酸又は遺伝子の発現量を測定し、そこから算出される因子を教師サンプルとしたＣｏｘ比例ハザード回帰モデルを判別式として、肝ガン患者予後が良いこと及び／又は悪いことを予測する方法を提供する。
【０１３６】
すなわち、本発明はさらに、本発明の組成物、キット、ＤＮＡチップ、又はそれらの組み合わせを用いて、肝ガン患者予後が良いこと／又は悪いことを予測することが既知の複数の試料中の標的核酸の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１の工程、前記第１の工程で得られた該標的核酸の発現量の測定値から因子を算出し、算出した因子を教師サンプルとしたＣｏｘ比例ハザード回帰モデルによる判別式を作成する第２の工程、被験者の肝ガン病変部から得られる該標的核酸の発現量と正常組織部から得られる該標的核酸の発現量を第１の工程と同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３の工程、前記第２の工程で得られた判別式に第３の工程で得られた該標的核酸の発現量から因子を算出し、算出した因子を判別式に代入し、該判別式から得られた結果に基づいて、肝ガン患者予後が良いこと／又は悪いことを予測する第４の工程を含む、ここで、該標的核酸が該組成物、キット又はＤＮＡチップに含まれるポリヌクレオチド、その変異体又はその断片によって検出可能なものである、前記方法を提供する。
【０１３７】
あるいは、本発明の方法は、例えば下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）肝ガン患者予後が良いこと及び／又は肝ガン患者予後が悪いことが既知の試料中の標的遺伝子の発現量を、本発明による診断（検出）用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定する工程、
（ｂ）（ａ）で測定された遺伝子発現量の測定値を、下記の手順に従って数２〜数９の式に代入し、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルと呼ばれる判別式を作成する工程、
（ｃ）被験者由来の試料中の該標的遺伝子の発現量を、本発明による予測用組成物、キット又はＤＮＡチップを用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて肝ガン患者予後が良いこと又は悪いことを予測する工程、
を含むことができる。
【０１３８】
Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルは重回帰分析型の手法で生存分析の行う解析（Ｃｏｘ，ＤＲ．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｄ  ｌｉｆｅ  ｔａｂｌｅｓ．、Ｊ．Ｒ．１９７２年、Ｓｔａｔ．  Ｓｏｃ．、第３４巻、１８７−２２０）であり、本質的にはログランク検定に等しく、一連の予後変数に基づく線形予測因子を用いて全追跡期間に亘る平均相対危険度の対数を推定する。回帰係数（β）を指数化して計算することでそれに対応する変数の相対危険度が得られる。変数が２つ以上の場合は、ある１つの回帰係数を指数化するとその方程式の他のすべての予測変数で補正した相対危険度が得られ、値のある組み合わせに対して、すべての線形予測因子を指数化することでその組み合わせの総相対危険度が求められる。
【０１３９】
本発明の判別式の因子は、上記２節に記載したポリヌクレオチド類から選択されるポリヌクレオチド又はその断片を測定することによって得られる値に対し、以下に記載の方法で算出される肝ガン患者診断用因子を含む。
【０１４０】
本発明の判別式の因子は、上記２節に記載したポリヌクレオチド類から選択されるポリヌクレオチド又はその断片を、上記３節に記載した肝ガン患者予後予測用組成物及びキットを使用して測定することによって得られる値に対し、以下に記載の方法で算出される肝ガン患者診断用因子を含む。
【０１４１】
具体的には、本発明の肝ガン患者診断用因子は、例えば下記の（１）〜（４）からなる群より選択される因子である：
（１）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又は配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列の相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定される肝ガン患者の肝ガン病変部における遺伝子発現量、肝ガン患者の正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率。
（２）配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又は配列番号１〜６、および８〜９で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列の相補的配列において、２１以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定される肝ガン患者の肝ガン病変部における遺伝子発現量、肝ガン患者の正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率。
【０１４２】
（３）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列を含み、かつ１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定される肝ガン患者の肝ガン病変部における遺伝子発現量、肝ガン患者の正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率。
（４）配列番号７で表される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列を含み、かつ２１以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定される肝ガン患者の肝ガン病変部における遺伝子発現量、肝ガン患者の正常組織部における遺伝子発現量、および肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率。
【０１４３】
さらに具体的には、本発明の肝ガン患者診断用因子は、因子番号１〜１１で表される、下記の（１）〜（１１）からなる群より選択される３以上の因子である：
（１）因子番号１によって示される、肝ガン患者の肝ガン病変部のｈｓａ−ｍｉＲ−１００の遺伝子発現量。
（２）因子番号２によって示される、肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａの遺伝子発現量。
（３）因子番号３によって示される、肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−２４の遺伝子発現量。
（４）因子番号４によって示される、肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂの遺伝子発現量の比率。
【０１４４】
（５）因子番号５によって示される、肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−１００の遺伝子発現量の比率。
（６）因子番号６によって示される、肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐの遺伝子発現量の比率。
（７）因子番号７によって示される、肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−９６の遺伝子発現量。
（８）因子番号８によって示される、肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂの遺伝子発現量の比率。
【０１４５】
（９）因子番号９によって示される、肝ガン患者の肝ガン病変部のｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａの遺伝子発現量。
（１０）因子番号１０によって示される、肝ガン患者の肝ガン病変部のｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂの遺伝子発現量。
（１１）因子番号１１によって示される、肝ガン患者の正常組織部のｈｓａ−ｍｉＲ−２１の遺伝子発現量。
【０１４６】
上記の組み合わせの例は、因子番号１〜１１で表される因子を任意に組み合わせて用いることにより、肝ガン患者治療予後予測から算出される平均ＡＵＲＯＣが０．７１以上、より好ましくは０．８０となって肝ガン患者予後予測が可能である（図２）。
【０１４７】
従って、本発明の実施形態において、より好ましい組み合わせは、配列番号１〜５に示した塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片の遺伝子発現量を測定することによって構成される因子の組み合わせにおいて、ｍｉＲ−２７ａ（配列番号２）の肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の底が２の対数値、ｍｉＲ−１００（配列番号１）の肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部位の遺伝子発現量の底が２の対数値、ｍｉＲ−９９ｂ（配列番号４）の肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の比率の底が２の対数値、ｍｉＲ−２４（配列番号３）の肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の底が２の対数値、ｍｉＲ−１００（配列番号１）の肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の比率の底が２の対数値、及びｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ（配列番号５）の肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の比率の底が２の対数値の因子の組み合わせであり、それを構成する各ポリヌクレオチド又は断片は、配列番号１〜５に示した塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその相補的配列を含むポリヌクレオド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、及び/又はその断片から構成される。また、そのときに規定される後述の数９で定義できるＣｏｘ比例ハザードモデルは数１である。
【０１４８】
【数１】
2011211955.tif 000003
【０１４９】
本発明のキットを構成する上記の組み合わせは、あくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
【０１５０】
本発明の方法で使用可能な判別式の算出例を以下に示す。
Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを決めるためには、肝ガン患者の治療後の再発までの期間が既知の試料中の標的遺伝子の遺伝子発現量から算出される因子を教師サンプルとして用意し、以下の手順によって肝ガンの予後を示す生存曲線を示すＣｏｘ比例ハザード回帰モデルの定数を決定する。
【０１５１】
肝ガン患者の治療後の再発までの期間が既知のサンプルが、肝ガン患者予後が良い患者群、又は肝ガン患者予後が悪い患者群のいずれかに属しているとする。これらのサンプルを教師サンプルとしたとき、教師サンプルがＣｏｘ比例ハザード回帰モデルで重回帰できるとき、肝ガン患者予後の識別関数は例えば数２〜数９で決定できる。
【０１５２】
肝ガン患者予後が良いこと又は悪いことを予測する遺伝子発現量を遺伝子数がｍ個のときＸで定義し（数２）、今、Ｘがｋ個の遺伝子発現量から構成されるとき、肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量、好ましくは遺伝子発現量の底が２の対数値をＸＴ（数３）、肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量、好ましくは遺伝子発現量の底が２の対数値をＸＮとする（数４）。このとき、ＸＴとＸＮから肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率、好ましくは肝ガン患者の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン患者の正常組織部の遺伝子発現量の比率の底が２の対数値であるＸＲを算出する（数５）。このＸＴ、ＸＮ、ＸＲからなるＸＡＬＬ（数６）を因子としたとき、因子の平均値は数７、そしてその平均偏差は数８となり、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルは数９で定義できる。
【０１５３】
このとき、λ（ｔ）は，共変量Ｘが平均値をとったときの瞬間死亡率を示し、このＣｏｘ比例ハザード回帰モデルを肝ガン患者予後に対して作製する場合、新たに与えられる肝ガン患者予後が良いか悪いか未知の患者の試料（肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部）を測定して得られる遺伝子発現量から因子をこの関数に代入することによって、新たに与えられた肝ガン患者予後が良いか悪いか未知の患者の時間ｔにおける再発の確率（λ（ｔ；Ｚ））を算出することができ、肝ガン患者予後が良いか悪いか未知の患者が時間ｔにおいて肝ガン患者予後が良いこと及び／又は悪いことを識別できる。
数２〜数９は、以下の式からなる。
【０１５４】
【数２】
2011211955.tif 000004
【０１５５】
【数３】
2011211955.tif 000005
【０１５６】
【数４】
2011211955.tif 000006
【０１５７】
【数５】
2011211955.tif 000007
【０１５８】
【数６】
2011211955.tif 000008
【０１５９】
【数７】
2011211955.tif 000009
【０１６０】
【数８】
2011211955.tif 000010
【０１６１】
【数９】
2011211955.tif 000011
【０１６２】
上に示すように、未知試料のクラス分けを行うためのＣｏｘ比例ハザード回帰モデルによる判別式の作成には２群の教師サンプルが必要となる。この教師サンプルは例えば今回の発明の場合、「予後が良い肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部から得られた遺伝子発現量」の各患者に対応した遺伝子発現量、及び「予後が悪い肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部から得られた遺伝子発現量」の各患者に対応した遺伝子発現量、の２群である。これらの遺伝子発現量から算出される因子の数（Ｋ）は実験のデザインによって様々ではあるが、個々の因子は、どのような実験においても２群間で大きく差がある場合と、比較的差が少ない、あるいは差がない場合が観察される。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルによる判別式の精度を上げるためには、教師サンプルとなる２群に、明確な差があることが条件となるため、２群間で遺伝子発現量に差がある因子のみを抽出して利用することが必要である。
【０１６３】
また、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルによる判別式に用いる因子の抽出は、図１に示すようなＬｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（ＬＯＯＣＶ）法を用いることが好ましい。すなわち、まず教師サンプルを学習セットとテストセットに分け、学習セットにおいて無再発生存期間を用いて因子に対する単因子のＣｏｘ比例ハザード回帰分析を行い、各々の因子に対してｐ値を算出する。次に、ここで求めたｐ値の小さい順に因子の１個ずつを因子としてＣｏｘ比例ハザード回帰モデルに組み込み、その都度、テストセットの算出されるハザード比と学習セットから算出される生存曲線を用いてテストセットの生存曲線を予測する。この生存曲線の予測を複数の組合せにおいて、望ましくは教師セットに含まれる試料の回数で繰り返し、年次ごとの生存率を算出する。そして、肝ガン患者治療予後と年次ごとに算出した生存率からＡＵＲＯＣを算出し、生存期間を通じてのＡＵＲＯＣの平均である平均ＡＵＲＯＣを算出する。この因子を組み込んだ学習セットを用いたテストセットの生存曲線の予測は、算出される平均ＡＵＲＯＣが最大となるまで繰り返し、平均ＡＵＲＯＣを最大にする因子の組み合わせ、およびこの因子を構成する遺伝子セットを採用する。
【０１６４】
本発明の方法において、例えば、肝ガン患者の肝ガン病変部と肝ガン患者の正常組織部に対して、上に記載したような配列番号１〜６、８〜９に基づく１以上、好ましくは２以上の上記ポリヌクレオチド、並びに/或いは、上に記載したような配列番号７に基づくポリヌクレオチド、の遺伝子発現量を測定し、配列番号１〜９の遺伝子の遺伝子発現量から因子番号１〜１１の因子（表１）を算出する。
【０１６５】
【表１】
2011211955.tif 000012
【０１６６】
そして、これらの因子の任意の６種類の因子の組み合わせを用いて、かつ上記の因子がすべて肝ガン治療予後の良い患者と肝ガン治療予後の悪い患者間で異なり、因子が肝ガン治療予後の良い患者と肝ガン治療予後の悪い患者間で増加又は減少していることを指標にすることにより、肝ガン患者治療予後を平均ＡＵＲＯＣ値として０．８０の精度で見分けることができる（図２）。
【実施例】
【０１６７】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
【０１６８】
［実施例１］
１．被験者の臨床病理学的所見
インフォームドコンセントを得た７３名の肝ガン患者から、肝ガンの部分肝切除手術によって肝ガン組織を得た。摘出肝ガン組織について肉眼的及び／又は病理組織学的に肝ガン患者を判断し、肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部と肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部を分けてただちに凍結し、液体窒素中で保存した。
【０１６９】
２．ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
試料として上の「１」で得た、７３症例の肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部と肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部にたいし、Ｔｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、同社の定める手順に基づいてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
【０１７０】
３．遺伝子発現量の測定
オリゴＤＮＡマイクロアレイとしては東レ株式会社の３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐを用いて遺伝子の絞込みを行った。東レ株式会社の３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐは、同社の定める手順に基づいて操作した。ハイブリダイゼーションを行ったＤＮＡチップをＤＮＡアレイスキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ、パーキンエルマージャパン）を用いてスキャンし、画像を取得してＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ５．０（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅ）にて蛍光強度を数値化した。統計学的処理はＳｐｅｅｄ Ｔ．著「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｄａｔａ」Ｃｈａｐｍａｎ & Ｈａｌｌ/ＣＲＣ，及びＣａｕｓｔｏｎ Ｈ．Ｃ．ら著「Ａ ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参考にし、ハイブリダイズ後の画像解析から得られたデータの対数値を用いて解析した。
【０１７１】
その結果、肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部における遺伝子発現量が、肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量よりも減少、低減もしくは増加、増大している遺伝子、予後が良い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量と予後が悪い肝ガン患者の試料中の遺伝子発現量を比較して、該試料中の標的核酸の発現量から算出される、肝ガン組織の肝ガン病変部から得られた遺伝子発現量、肝ガン組織の正常組織部から得られた遺伝子発現量、および肝ガン組織の肝ガン病変部の遺伝子発現量と肝ガン組織の正常組織部の遺伝子発現量の比率が減少、低減もしくは増加、増大している遺伝子を見出すことができた。これらの遺伝子を肝ガン予後予測用遺伝子として利用できると考えられる。
【０１７２】
４．予測スコアリングシステム
７３症例の患者から得た試料を教師サンプルとして、Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ社）を用いて判別式を作成した。また肝ガン患者の肝ガン組織の肝ガン病変部と肝ガン患者の肝ガン組織の正常組織部から得られた遺伝子発現量から因子を算出し、因子の組み合わせ、およびこの因子を構成する遺伝子をＬｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（ＬＯＯＣＶ）法を用い決定した（図１）。
【０１７３】
すなわち、まず７３症例の教師サンプルを７２症例の学習セットと１症例のテストセットに分け、学習セットを構成する因子に対して無再発生存期間に対する単因子のＣｏｘ比例ハザード回帰分析を行い、各々の因子に対してｐ値を算出する。次に、ここで求めたｐ値の小さい順に因子の１個ずつを因子としてＣｏｘ比例ハザード回帰モデルに組み込み、その都度、テストセットの算出されるハザード比と学習セットから算出される生存曲線を用いてテストセットの生存曲線を予測する。この生存曲線の予測を７３症例の教師サンプルから分けることができる７３通りの学習セットとテストセットの組合せに対して行い、７３症例について年次ごとの生存率を算出する。そして、肝ガン患者治療予後と年次ごとに算出した生存率からＡＵＲＯＣを算出し、生存期間を通じてのＡＵＲＯＣの平均である平均ＡＵＲＯＣを算出する。この因子を組み込んだ学習セットを用いたテストセットの生存曲線の予測のために、算出される平均ＡＵＲＯＣが最大となるまで繰り返した。
【０１７４】
その結果、肝ガン患者予後が良い患者と肝ガン患者予後が悪い患者を予測する平均ＡＵＲＯＣは、１因子のときに０．４８、２因子のときに０．６０、３因子のときに０．７１、４因子のときに０．７８、および５因子のときに０．７７となり、６因子のときに平均ＡＵＲＯＣが０．８０と最大となった。６因子のときに７３回のＬＯＯＣＶ法で選ばれてくる総因子数は、因子番号１〜１１の１１種の因子であり、これらの１１因子を構成する遺伝子は配列番号１〜９の９種の遺伝子であった。また、７３症例の肝ガン患者のうち、Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルが再発すると予測したＨｉｇｈ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐと再発しないと予測したＬｏｗ  Ｒｉｓｋ  Ｇｒｏｕｐの有意差はＣｏｘ比例ハザード解析からｐ＝３．４３×１０−７となった（図２）。
【０１７５】
［実施例２］
さらに、実施例１で求めた平均ＡＵＲＯＣには図３のように推移し、３因子のときに７３回のＬＯＯＣＶ法で選ばれてくる総因子数、およびこれらの総因子を構成する遺伝子の構成を決定した。その結果を表２に示した。
【０１７６】
【表２】
2011211955.tif 000013
【０１７７】
このとき、判別式の平均ＡＵＲＯＣは比較例に示す臨床情報のＡＵＲＯＣよりも高くなったため、現在の予測法よりも高い予測精度を示す最少の因子の組み合わせは表２から任意に選択される３因子となり、このときの最少の遺伝子の組み合わせは配列番号２〜５、及び８〜１０から選ばれる１種の遺伝子と配列番号１の組み合わせであるため、配列番号１〜９から選択される１以上、好ましくは２以上の肝ガン患者予後予測用組成物が最少の組合せとなる。
【０１７８】
上記の実施例から、本発明の肝ガン患者予後予測用組成物と本発明の方法は非特許文献１〜３に比較して優位であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明は、特異性、感受性に優れた肝ガン患者予後予測用組成物を提供することができるため、少なくとも肝ガン患者の治療後の予後予測として肝ガン患者のミラノ基準内での再発の可能性を可能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定するために非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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