(57)【要約】      （修正有）【課題】血液中のｐ３−Ａｌｃを測定する方法を提供する。具体的には、被験者の血液を有機溶媒処理することを特徴とする血液中のｐ３−Ａｌｃを測定する方法に関する。【解決手段】低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物と血液試料とを接触させることにより、血液を有機溶媒処理することを特徴とする血液中のｐ３−Ａｌｃを効率的に測定することができる。また、血液中のｐ３−Ａｌｃを測定することを含むアルツハイマー病の診断方法に関する。具体的には、被験者から得た血液試料の前処理として有機溶媒処理を行うことにより、血液中のｐ３−Ａｌｃの測定が可能となり、血液検体を用いてアルツハイマー病を診断することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液試料中のｐ３−アルカデイン量を測定する方法であって、血液試料を有機溶媒処理すること、及び試料中のｐ３−アルカデイン量を測定することを含んでなる方法。
【請求項２】
血液試料を有機溶媒処理することが、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物と血液試料とを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
低極性有機溶媒が双極子モーメント１．１０〜１．２０の有機溶媒であり、親水性有機溶媒が双極子モーメント１．６５〜１．７５の有機溶媒である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
低極性有機溶媒がクロロホルムであり、親水性有機溶媒がメタノールである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物が、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との比が１：２〜４：１である、請求項２〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
血液試料を有機溶媒処理することが、更に、水を接触させた後、水層を回収することを含む、請求項２〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
血液試料が、血清又は血漿である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アルツハイマー病の診断のための情報を提供する方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
ａ）被験者由来の血液試料を調製するステップ、
ｂ）被験者由来の血液検体を有機溶媒処理するステップ、
ｃ）少なくとも１つのｐ３−アルカデインを認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｄ）ｐ３−アルカデインへの該抗体の結合を検出してｐ３−アルカデインのレベルを測定するステップ、及び、
ｅ）ｐ３−アルカデインのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
【請求項９】
ｐ３−アルカデインを測定するための血液試料の処理方法であって、血液試料を有機溶媒処理することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液中のアルカデイン濃度を効率よく測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）は、種々の認知機能が進行しながら障害を受ける神経変性疾患である。アルツハイマー病の病態解明及び病因メカニズムの解明が進むにつれて根本的治療（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）の開発が進展している。このような治療方法の開発が進むにつれて、アルツハイマー病の早期診断・発見が求められるようになってきている。近年、アルツハイマー病を診断するためのマーカとして、アミロイドβタンパク質前駆体（ａｍｙｌｏｉｄ  β  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：以下、「ＡＰＰ」という）がβセクレターゼにより切断された分解物のＣ末端断片が、更にγセクレターゼにより切断されて生じるアミロイドβペプチド（以下、「Ａβ」という）が注目を集めている。
【０００３】
アルカデイン（Ａｌｃａｄｅｉｎ：以下、「Ａｌｃ」という）は、主に神経細胞に発現している、進化的に保存されているＩ型膜タンパク質のファミリーから構成される。Ａｌｃは、神経特異的アダプタータンパク質Ｘ１１Ｌの結合タンパク質として単離・同定されてきた（非特許文献１参照）。また、別の実験から後シナプスに存在するのＣａ２＋結合タンパク質（カルシンテニン（ｃａｌｓｙｎｔｅｎｉｎ）とも呼ばれている）（非特許文献２参照）。哺乳類では、Ａｌｃには次の４つのアイソフォームが報告されている：Ａｌｃα１（ヒトでは９７１アミノ酸）、Ａｌｃα２（ヒトでは９８１アミノ酸）、Ａｌｃβ（ヒトでは９５６アミノ酸）、及び、Ａｌｃγ（ヒトでは９５５アミノ酸）（非特許文献１参照）。Ａｌｃα、Ａｌｃβ、及び、Ａｌｃγは、独立した遺伝子によりコードされる一方、Ａｌｃα１及びＡｌｃα２はＡｌｃα遺伝子のスプライスバリアントである。
【０００４】
Ａｌｃは、Ｘ１１Ｌとの相互作用を介して、代謝的に安定化し、かつ、非直接的にＡＰＰと複合体を形成する。Ａｌｃ及びＡＰＰは、Ｘ１１Ｌと三量体を形成している場合、いずれもタンパク質切断代謝に抵抗性を示す（非特許文献１参照）。Ｘ１１Ｌ遺伝子欠失マウスの脳中においては、Ａβを含むＡＰＰ代謝物のレベルが上昇しており、ＡＰＰとＸ１１Ｌ間の相互作用が脳において生理学的重要であると考えられている（非特許文献３参照）。Ａｌｃ−Ｘ１１Ｌ−ＡＰＰ複合体中のＡｌｃはタンパク質切断に抵抗性を示すが、複合体を形成しないＡｌｃは連続したタンパク質分解により切断されて短鎖ペプチドを生成することが報告されている（非特許文献４参照）。
【０００５】
Ａｌｃの一次切断は細胞外膜近傍領域で起こり、Ａｌｃの細胞外ドメイン（可溶性Ａｌｃ（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｌｃ）：ｓＡｌｃ）を放出する。切断後のＡｌｃの細胞結合型Ｃ末端断片（ａｌｃａｄｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、以下「ＣＴＦ」という）は、膜間部切断プロテアーゼにより切断され、Ａｌｃ由来の短鎖ペプチド（以下、「ｐ３−Ａｌｃ」という）を生じる。Ａｌｃ切断の両方が上記ＡＰＰにおいて対応する切断と調和していることが報告されており（非特許文献４参照）、体液中のｐ３−Ａｌｃ量の測定がアルツハイマー病の診断に利用可能であると考えられている（特許文献１、特許文献２、及び非特許文献５参照）。
【０００６】
これまで脳脊髄液中においてｐ３−Ａｌｃが測定可能であること、及びその測定方法が報告されている（特許文献２参照）が、血液中のｐ３−Ａｌｃを測定可能な方法については報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００５／０４４８４７
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｒａｋｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４９４４８−４９４５８．
【非特許文献２】Ｖｏｇｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，１５１−１６６．
【非特許文献３】Ｓａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，３７８５３−３７８６０．
【非特許文献４】Ａｒａｋｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，２４３４３−２４３５４．
【非特許文献５】Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ  ２００９  Ｏｃｔ.２８  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ  ＰＭＩＤ：  １９８６４４１３．Ａｌｃａｄｅｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｂｙ  ＡＰＰ  α−  ａｎｄ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐ３−Ａｌｃｓ  ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．
【発明の概要】
【０００９】
現在、実際に血液サンプルによって測定可能なアルツハイマー病診断マーカとしては、Ａβ以外に知られていない。しかしながら、Ａβは凝集性が高いため、正確な血中変化を捉えることが困難であるという問題が指摘されている。本発明は、血液検体を利用した効果的なアルツハイマー病の診断方法を提供することを目的とする。アルカデインは、ＡＰＰと類似もしくは同等の構造、代謝、機能、分布、病理変化を示す、脳に特異的に発現するタンパク質である。本発明は、血液中のｐ３−Ａｌｃを測定する方法、及び、当該方法を利用したアルツハイマー病の診断方法を提供するものである。具体的には、本発明は、被験者の血液からｐ３−Ａｌｃペプチドを有機溶媒処理により抽出することを特徴とする血液中のｐ３−Ａｌｃを測定する方法等に関し、例えば、本発明は、以下の（１）〜（２１）に記載の発明に関する。
（１）  血液試料中のｐ３−Ａｌｃ量を測定する方法であって、血液試料を有機溶媒処理すること、及び試料中のｐ３−Ａｌｃ量を測定することを含んでなる方法。
（２）  血液試料を有機溶媒処理することが、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物と血液試料とを接触させることを含む、（１）に記載の方法。
（３）  低極性有機溶媒が双極子モーメント１．１０〜１．２０の有機溶媒であり、親水性有機溶媒が双極子モーメント１．６５〜１．７５の有機溶媒である、（２）に記載の方法。
（４）  低極性有機溶媒がクロロホルムであり、親水性有機溶媒がメタノールである、（２）に記載の方法。
（５）  低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物が、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との比が１：２〜２：１である、（２）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）  血液試料を有機溶媒処理することが、更に、水を接触させた後、水層を回収することを含む、（２）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）  血液試料が、血清又は血漿である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）  アルツハイマー病の診断のための情報を提供する方法、又は、アルツハイマー病の診断方法であって、以下のステップを含んでなる方法：
ａ）被験者由来の血液試料を調製するステップ、
ｂ）被験者由来の血液検体を有機溶媒処理するステップ、
ｃ）少なくとも１つのｐ３−Ａｌｃを認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｄ）ｐ３−Ａｌｃへの該抗体の結合を検出してｐ３−Ａｌｃのレベルを測定するステップ、及び、
ｅ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
（９）  被験者由来の血液検体を有機溶媒処理するステップが、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物と血液試料とを接触させることを含む、（８）に記載の方法。
（１０）  低極性有機溶媒が双極子モーメント１．１０〜１．２０の有機溶媒であり、親水性有機溶媒が双極子モーメント１．６５〜１．７５の有機溶媒である、（９）に記載の方法。
（１１）  低極性有機溶媒がクロロホルムであり、親水性有機溶媒がメタノールである、（９）に記載の方法。
（１２）  低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物が、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との比が１：２〜２：１である、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）  血液試料を有機溶媒処理することが、更に、水を接触させた後、水層を回収することを含む、（９）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）  血液試料が、血清又は血漿である、（９）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）  ｐ３−Ａｌｃを測定するための血液試料の処理方法であって、血液試料を有機溶媒処理することを含んでいる方法。
（１６）  血液試料を有機溶媒処理することが、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物と血液試料とを接触させることを含む、（１５）に記載の方法。
（１７）  低極性有機溶媒が双極子モーメント１．１０〜１．２０の有機溶媒であり、親水性有機溶媒が双極子モーメント１．６５〜１．７５の有機溶媒である、（１６）に記載の方法。
（１８）  低極性有機溶媒がクロロホルムであり、親水性有機溶媒がメタノールである、（１６）に記載の方法。
（１９）  低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物が、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との比が１：２〜４：１である、（１６）〜（１８）のいずれか１項に記載の方法。
（２０）  血液試料を有機溶媒処理することが、更に、水を接触させた後、水層を回収することを含む、（１６）〜（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１）  血液試料が、血清又は血漿である、（１５）〜（２０）のいずれか１項に記載の方法。
【００１０】
より更に具体的には、本発明は、血清又は血漿に対し、クロロホルム：メタノール＝１：２〜４：１混合液を加え撹拌するステップ；室温に静置するステップ；蒸留水を加えて撹拌するステップ；遠心分離を行うステップ；水層を回収するステップ；遠心濃縮するステップ；濃縮液に希釈用緩衝液を加えて撹拌・溶解するステップを備える、ｐ３−Ａｌｃを測定するための血液試料の処理方法に関する。より好ましくは、本発明は、血清又は血漿に対し、約４倍量のクロロホルム：メタノール＝１：２〜４：１混合液を加え撹拌するステップ；０．５〜２時間室温に静置するステップ；蒸留水を加えて撹拌するステップ；約４℃、約１５０００ｒｐｍで１０〜２０分間遠心を行うステップ；水層を回収するステップ；遠心濃縮する（好ましくは、遠心濃縮により水層に残存する有機溶媒を気化除去する、より好ましくは全溶媒を乾燥させる）ステップ；濃縮液に希釈用緩衝液を加えて撹拌・溶解するステップを備える、ｐ３−Ａｌｃを測定するための血液試料の処理方法に関する。
【００１１】
本発明において、「アルカデイン（Ａｌｃ）」は、好ましくはヒトアルカデインであり、Ａｌｃα１（配列番号１）、Ａｌｃα２（配列番号２）、Ａｌｃβ（配列番号３）、及び、Ａｌｃγ（配列番号４）を含む。
「ｐ３−アルカデイン（ｐ３−Ａｌｃ）」とは、Ａｌｃがα−セクレターゼにより一次切断を受けた後、生じたＡｌｃの細胞結合型Ｃ末端断片（ａｌｃａｄｅｉｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、以下「ＣＴＦ」という）が、更に膜間部切断プロテアーゼ（γ−セクレターゼ）により二次切断されて生じたペプチド断片のうち、Ｎ末端側のペプチドのことである。アルカデインのαセクレターゼ切断部位及びγセクレターゼ切断部位として複数の部位が存在する（国際公開公報ＷＯ２００５／０４４８４７及び国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４参照）ことから、ｐ３−Ａｌｃとしては複数種類が存在する。例えば、具体的には、ｐ３−Ａｌｃとして、国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４に記載のペプチドが存在する。検出対象であるｐ３−Ａｌｃ種は、使用する抗体を適宜選択することにより適宜決定することができる。本発明においてｐ３−Ａｌｃは、ｐ３−Ａｌｃ種の全て又は所望のｐ３−Ａｌｃ種であってもよい。
【００１２】
また、別の態様において、本発明は、少なくとも１つのｐ３−Ａｌｃと結合する物質（好ましくは、ｐ３−Ａｌｃを特異的に認識する抗体）及び有機溶媒処理剤を含む、ｐ３−Ａｌｃ測定用キットに関する。ｐ３−Ａｌｃ測定用キットに含まれる有機溶媒処理剤は、好ましくは、低極性有機溶媒及び親水性有機溶媒であり、より好ましくは、双極子モーメント１．１０〜１．２０の有機溶媒及び双極子モーメント１．６５〜１．７５の有機溶媒であり、最も好ましくは、クロロホルム：メタノールである。また、ｐ３−Ａｌｃ測定用キットに含まれるｐ３−Ａｌｃを特異的に認識する抗体は、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識が結合していてもよい。この場合、本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノクロマト、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的方法、又は、ウエスタンブロット等を挙げることができる。本予測キットによる分析は、定性的、定量的又は半定量的に行うことができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法の処理を施すことにより、血液中のｐ３−Ａｌｃ量を正確に測定することができる。また、本発明の処理方法は、血液検体を使用したアルツハイマー病の診断を可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】化学合成したｐ３−Ａｌｃα３５ペプチド添加／非添加の、ヒト血清（ＨＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液中のｐ３−Ａｌｃα３５を検出したウェスタンブロッティングの写真である。「ｌｏｎｇ  ｅｘｐｏｓｅ」は、約３０分のフィルムへの露光を示す。
【図２】図２Ａは、化学合成したｐ３−Ａｌｃα３５ペプチド添加／非添加の、ヒト血清（ＨＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を有機溶媒処理後、ｐ３−Ａｌｃαを検出したウェスタンブロッティングの写真である。「ｌｏｎｇ  ｅｘｐｏｓｅ」は、約３０分のフィルムへの露光を示す。図２Ｂは図２Ａの写真から計算した回収率を示すグラフである。
【図３】合成ｐ３−Ａｌｃαペプチドを、希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）（ｓｔａｎｄａｒｄ）、ヒト血清（×１）、希釈用緩衝液でヒト血清を２倍希釈した溶液（×２）、及び希釈用緩衝液でヒト血清を４倍希釈した溶液（×４）に溶解したサンプルをｓＥＬＩＳＡで測定した結果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はサンプルが含有する合成ｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【図４】１％ＢＳＡ溶液に溶解した合成ｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドを、有機溶媒処理後、ｓＥＬＩＳＡ測定を行った結果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はサンプルが含有する合成ｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。矢印は、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液に溶解した合成ｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドサンプルを示し、その他のひし形印は、標準物質を用いた検量線を示す。
【図５】合成ｐ３−Ａｌｃαを添加した血清を有機溶媒処理後、ｓＥＬＩＳＡ法で測定を行った結果を示すグラフである。「検量線」は、合成ｐ３−Ａｌｃを希釈用緩衝液に溶解した標準物質、「×１」は、合成ｐ３−Ａｌｃαを添加した血清を有機溶媒処理したサンプル、「×２」は「×１」のサンプルを希釈用緩衝液で二倍に希釈したサンプル、「×４」は「×１」のサンプルを希釈用緩衝液で二倍に希釈したサンプルを示す。いずれも縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はサンプルが含有する合成ｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図５Ａは、それぞれのサンプルの結果を示す。図５Ｂは「検量線」と「×２」を同一グラフ上に表わしたものである。
【図６】本発明の有機溶媒処理方法を用いて健常人の血清サンプル中のｐ３−ＡｌｃαをｓＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。グラフにおいて、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はサンプルが含有するｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。また、表中のｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）は、平均値±標準偏差で示している。
【図７】合成ｐ３−Ａｌｃαを添加した血漿を有機溶媒処理後、ｓＥＬＩＳＡ法で測定を行った結果を示すグラフである。「検量線」は、合成ｐ３−Ａｌｃを希釈用緩衝液に溶解した標準物質、「×１」は、合成ｐ３−Ａｌｃαを添加した血清を有機溶媒処理したサンプル、「×２」は「×１」のサンプルを希釈用緩衝液で二倍に希釈したサンプル、「×４」は「×１」のサンプルを希釈用緩衝液で二倍に希釈したサンプルを示す。いずれも縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はサンプルが含有する合成ｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。図７Ａは、それぞれのサンプルの結果を示す。図７Ｂは「検量線」と「×２」を同一グラフ上に表わしたものである。
【図８】本発明の有機溶媒処理方法を用いてアルツハイマー病患者及び健常人の血漿サンプル中のｐ３−ＡｌｃαをｓＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。図８Ａは、ｓＥＬＩＳＡ測定の結果を表わすグラフである。グラフにおいて、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示し、横軸はサンプルが含有するｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。また、グラフ中、矢印で示した「サンプル」は、ＡＤ患者のＳａｍｐｌｅ  Ｎｏ.１の実際のＯＤ値を示す。図８Ｂは、ｓＥＬＩＳＡ測定の結果得られた、各サンプルのｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）、並びにＡＤ患者及び健常者のｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）の平均値を、平均値±標準偏差で示した表である。図８Ｃは、図８Ｂの結果をグラフに示したものである。グラフ中、縦軸はサンプルが含有するｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、棒線は平均値を示す。
【図９】本発明の有機溶媒処理方法を用いてアルツハイマー病患者（ＡＤ）、及び、非アルツハイマー病患者（ＮＯＮＡＤ）から採取した血液の血漿中のｐ３−Ａｌｃ量をｓＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。表は、各血漿サンプルの測定値、平均値、標準偏差（ＳＤ）を示す。グラフは測定結果をプロットしたものであり、縦軸はサンプルが含有するｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、棒線は平均値を示す。
【図１０】図９の測定結果を性別に分類した結果を示す図である。「Ａｌｌ  ｓａｍｐｌｅ」は全てのサンプルを、「Ｍａｌｅ」は男性から得た血漿サンプルを、「Ｆｅｍａｌｅ」は女性から得た血漿サンプルを示す。グラフ中、縦軸はサンプルが含有するｐ３−Ａｌｃαペプチド濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、棒線は平均値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の処理方法は、血液試料を有機溶媒処理することを特徴とする。「血液試料」は、被験者から採取した血液又は該血液の処理物を含み、好ましくは、血清及び血漿である。「有機溶媒処理する」とは、血液試料を有機溶媒で処理することにより、ｐ３−Ａｌｃを含む成分を回収することを意味する。有機溶媒処理は、血液試料中に存在し、ｐ３−Ａｌｃの測定に影響を与える物質を除去するために望ましい方法であればいかなる方法をも採用し得る。血液試料の有機溶媒処理は、例えば、以下の方法により行うことができる：
（ｉ）血液試料と、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒の混合物とを接触させた後、タンパク質を含む試料を得るステップ；
（ｉｉ）（ｉ）により得られたタンパク質を含む試料と水とを接触させるステップ；及び、
（ｉｉｉ）水層を回収するステップ。
【００１６】
有機溶媒処理において使用する低極性有機溶媒は、例えば、双極子モーメントが１．１０〜１．２０の有機溶媒であり、好ましくは、双極子モーメントが１．１３〜１．１７の有機溶媒であり、より好ましくは、双極子モーメントが１．１５の溶媒であり、最も好ましくは、クロロホルムである。また、有機溶媒処理において使用する親水性有機溶媒は、例えば、双極子モーメントが１．６５〜１．７５の有機溶媒であり、好ましくは、双極子モーメントが１．６８〜１．７２の有機溶媒であり、より好ましくは、双極子モーメントが１．７０の有機溶媒であり、最も好ましくは、メタノールである。有機溶媒処理において使用する低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との比は、例えば、１：２〜４：１であり、好ましくは、１：１〜３：１であり、より好ましくは、２：１である。
【００１７】
血液試料と、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒の混合物との接触は、血液試料中のｐ３−Ａｌｃの測定に影響を与える物質（例えば、脂質成分）を有機溶媒に移動させることが可能な方法であれば、いかなる方法でも採用することができ、例えば、単純に血液試料と、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物とを混合し、攪拌又は超音波処理することにより行うことができる。また、血液試料と、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒の混合物との接触は、例えば、４〜４０℃で行うことができる。
【００１８】
血液試料と、低極性有機溶媒と親水性有機溶媒との混合物とを接触させた後、得るタンパク質を含む試料（以下、「タンパク質含有溶液」という）は、単純に血液試料、低極性有機溶媒及び親水性有機溶媒を混合した溶液そのものであってもよいし、当該混合物から抽出、分離又は精製して得られたタンパク質を含む溶液であってもよい。タンパク質含有溶液と水との接触は、タンパク質含有溶液中の水溶性成分を水に移動させることが可能な方法であれば、いかなる方法でも採用することができ、例えば、単純にタンパク質含有溶液と水とを混合し、攪拌又は超音波処理することにより行うことができる。
【００１９】
本発明のおける有機溶媒処理方法は、血液試料中に存在するｐ３−Ａｌｃの測定に影響を与える物質を除去し、かつｐ３−Ａｌｃの測定に影響しない方法であれば、上記方法に限定されず、その他の有機溶媒（例えば、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、キシレン、キシレン：メタノール、キシレン：エタノール、キシレン：イソプロピルアルコール、ベンゼン、クロロホルム、クロロホルム：エタノール、クロロホルム：イソプロピルアルコール）を用いた抽出、ろ過、遠心等を使用する様々な方法により達成されてもよい。
【００２０】
本発明者により血液中のｐ３−Ａｌｃ量はアルツハイマー病の発症と関連があることが示されたことから、本発明はアルツハイマー病の診断のための情報を提供する方法又はアルツハイマー病の診断方法を提供するものである。具体的には、本発明はアルツハイマー病の診断のための情報を提供する方法又はアルツハイマー病の診断方法であって、以下のステップを含んでなる方法に関する：
ａ）被験者由来の血液試料を調製するステップ、
ｂ）被験者由来の血液検体を有機溶媒処理するステップ、
ｃ）少なくとも１つのｐ３−Ａｌｃを認識する抗体に該試料を接触させるステップ、
ｄ）ｐ３−Ａｌｃへの該抗体の結合を検出してｐ３−Ａｌｃのレベルを測定するステップ、及び、
ｅ）ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップ。
【００２１】
被験者由来の血液試料を調製するステップは、遠心分離等の診断の分野において当業者が通常行う方法により行うことができる。また、被験者由来の血液検体を有機溶媒処理するステップは、上述の血液試料の有機溶媒処理方法に準じて行うことができる。少なくとも１つのｐ３−Ａｌｃを認識する抗体に該試料を接触させるステップ、及び、ｐ３−Ａｌｃへの該抗体の結合を検出してｐ３−Ａｌｃのレベルを測定するステップは、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティークロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を用いて行うことができる。
【００２２】
ＥＩＡ法により測定する場合、ｐ３−Ａｌｃと特異的に結合する物質と有機溶媒処理した試料中のｐ３−Ａｌｃとを反応させた後、標識したｐ３−Ａｌｃを認識する抗体を結合させ、非結合抗体を除去後、標識物質に適した方法で測定することにより、複合体の形成を測定することができる。例えば、ＥＩＡ法として、ビオチン標識抗体を用いてｐ３−Ａｌｃを検出する場合、有機溶媒処理した試料及びビオチン標識抗体溶液を、ｐ３−Ａｌｃと特異的に結合する抗体を固相化した９６穴プレートの各ウェルに加えて室温で反応後、各ウェルを洗浄液で洗浄し、基質液（ＴＭＢ）を加えて室温で反応させた後、反応停止液（２Ｍ  ＨＣｌ）を加え、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することにより測定することができる。サンプル中のｐ３−Ａｌｃの濃度は、標準液で作成した検量線を利用して計算することができる。
【００２３】
イムノクロマト法により測定する場合、サンプルを標識抗体と結合させた後、ニトロセルロース膜の毛細管現象を利用したクロマトグラフィを行い、固相化された抗原特異的抗体と結合させることにより検出することができる。なお、イムノクロマト法において、標識として金コロイドを利用することにより、固相化抗体とサンプル／標識抗体複合体との結合を目視により確認することもできる。また、例えば、化学発光測定法としてＣＬＩＡ法を用いる場合、ルミノール誘導体又はアクリジニウム誘導体により標識されたｐ３−Ａｌｃを特異的に認識する抗体と有機溶媒処理した試料中のｐ３−Ａｌｃとを反応させた後、非結合の抗体を分離した後、固相に吸着した化学発光性の標識体を発光させることにより検出することができる。
【００２４】
ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップは、血液試料中のｐ３−Ａｌｃの量が大きい被験者をアルツハイマー病に罹患している又は罹患の程度が高い患者として判定することを含むことができる。又は、ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップは、血液試料中の各種ｐ３−Ａｌｃ種の生成量の比を指標として診断を行うことができる。例えば、全ｐ３−Ａｌｃα量に対する、ｐ３−Ａｌｃα３５の割合を利用することができる。この場合、全ｐ３−Ａｌｃα量に対する、ｐ３−Ａｌｃα３５の割合が高い患者をアルツハイマー病に罹患している又は罹患の程度が高い患者として判定することができる。
【００２５】
ｐ３−Ａｌｃのレベルと被験者におけるアルツハイマー病の有無又は程度との関連付けを行うステップにおいて用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者の血液におけるｐ３−Ａｌｃの存在、レベル、又は、存在比を、アルツハイマー病患者又はアルツハイマー病であろうことが知られている患者、あるいは、アルツハイマー病ではなかった患者又はアルツハイマー病ではないと信じられている患者におけるｐ３−Ａｌｃの存在、レベル、又は、存在比と比較することを意味する。比較対象となる患者におけるｐ３−Ａｌｃのレベル又は比は、例えば、本発明の開示により、又は、既にアルツハイマー病又はその程度が判明している患者由来の検体におけるｐ３−Ａｌｃのレベルを測定することにより、あるいは、他のアルツハイマー病の指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。ｐ３−Ａｌｃのレベル又は比を利用して、患者がアルツハイマー病に罹患している可能性又は罹患の程度を判定することができる。ｐ３−Ａｌｃのレベル又は比とアルツハイマー病との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｄ，１９８３）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。好ましくは、ｐ３−Ａｌｃは、その存在量又は存在比によりアルツハイマー病又はその程度と関連付けることができる。例えば、ｐ３−Ａｌｃについてアルツハイマー病への罹患の指標としての閾値レベル又は当該疾患への罹患の程度の指標として各程度に対する閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるｐ−Ａｌｃのレベルを、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。
【００２６】
また、本発明のアルツハイマー病の診断方法等は、既にアルツハイマー病の指標として用いられているその他の指標と組み合わせて行ってもよい。
【００２７】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００２８】
（実施例１）ウェスタンブロッティングによる血液中のｐ３−Ａｌｃの検出
血液中にｐ３−Ａｌｃが存在するかどうかを確認するため以下の実験を行った。１０ｎｇの化学合成したｐ３−Ａｌｃα３５ペプチド（ＡＱＰＱＦＶＨＰＥＨＲＳＦＶＤＬＳＧＨＮＬＡＮＰＨＰＦＡＶＶＰＳＴＡＴ：配列番号５）を添加し又は添加していない、ヒト血清（ＨＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを加えて前処理することでＩｇＧを除去した。その後、抗ｐ３−Ａｌｃαモノクローナル抗体３Ｂ５（国際公開公報ＷＯ２００９／０７５０８４；Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ  ２００９  Ｏｃｔ.２８  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ  ＰＭＩＤ：  １９８６４４１３．Ａｌｃａｄｅｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ｂｙ  ＡＰＰ  α−  ａｎｄ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐ３−Ａｌｃｓ  ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．）を加えて免疫沈降を行い、内在性ｐ３−Ａｌｃα及び添加したｐ３−Ａｌｃα３５を回収した。回収した沈降物についてＵＴ１３５抗体を用いたウェスタンブロッティングを行いｐ３−Ａｌｃα３５を検出した。
【００２９】
ウェスタンブロッティングの結果を図１に示す。ＦＢＳからは内在性のｐ３−Ａｌｃαを検出することができたが、ＨＳ及びＣＳからは検出することができなかった。化学合成したｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドを添加した溶液においても、ＨＳ及びＣＳからの回収率が極めて低く、誕生後の血液中には、反応阻害物質があることが明らかとなった。
【００３０】
（実施例２）ｐ３−Ａｌｃを検出するための血液検体の前処理方法の検討
血清からｐ３−Ａｌｃを抽出する方法を種々検討した。その結果、以下の前処理方法が適していることを見出した。
実施例１で使用した化学合成ｐ３−Ａｌｃα３５ペプチド添加、ヒト血清（ＨＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液２００μＬに４倍量（８００μＬ)のクロロホルム：メタノール＝２：１の溶媒を加え、ボルテックスで撹拌（又は、超音波処理１０秒）後、室温に１時間放置し、１６０μＬのＤＤＷ（蒸留水）を加え、再度ボルテックスで撹拌し、４℃、１５、０００ｒｐｍで１５分間遠心した。遠心により三層（有機溶媒層、中間層、水層）に分離したサンプルから各層全量を回収した。有機溶媒層及び水層は、溶媒を蒸発させ濃縮した。中間層は、x2 サンプルバッファー(８％ＳＤＳ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、０．０４％ＣＢＢ、２４％グリセロール、４％β−メルカプトエタノール)と蒸留水を等量加え、超音波処理により可溶化させた。各層のサンプルについて、実施例１と同様にｐ３−Ａｌｃαをウェスタンブロッティングにより検出した。
【００３１】
ウェスタンブロッティングの結果及び水層への回収率を図２に示す。この結果から、水層に回収されるｐ３−Ａｌｃα３５は、どの血清を用いた場合でも８０％以上の高率であること、また、この操作により、微量（１０μＬ）のヒト血清からも内在性のｐ３−Ａｌｃαを検出することができることが示された。
【００３２】
（実施例３）ｐ３−ＡｌｃαのｓＥＬＩＳＡ測定における血清による発色阻害
ｐ３−Ａｌｃα測定ｓＥＬＩＳＡキットは、株式会社免疫生物研究所より提供を受けた。標準物質として化学合成したｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドを使用した。合成されたｐ３−Ａｌｃαペプチドを前記希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解して、３９．０６ｐｇ／ｍＬ、７８．１３ｐｇ／ｍＬ、１５６．２５ｐｇ／ｍＬ、３１３ｐｇ／ｍＬ、及び６２５ｐｇ／ｍＬの希釈標準液を調製した。また、同量の合成されたｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドを、ヒト血清、希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）でヒト血清を２倍希釈した溶液（×２）、及び希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）でヒト血清を４倍希釈した溶液（×４）に溶解し、サンプルを調製した。検量線を作製した。１００μＬの希釈標準液又は検体をウサギ抗ｐ３−Ａｌｃα（８３９）抗体を固相化した９６ウェルプレートのウェルに加え、４℃で一晩静置した。ウェルをＰＢＳで７回洗浄後、ＨＲＰ標識ウサギ抗ｐ３−Ａｌｃα（８１７）抗体を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で３０分間反応させた。各ウェルをＰＢＳで９回洗浄後、ＴＭＢ基質液を１００μＬ添加し、遮光して室温で３０分間反応させた。全てのウェルに停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）を１００μＬ／ウェルで添加し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。希釈用緩衝液を使用した測定結果を利用して検量線を作成した。
【００３３】
結果を図３に示す。検量線と比較して、血清を含むサンプルの測定結果は傾きが小さく、両者の傾きが異なることが判明した。即ち、検量線と比べて、血清を含む反応液では発色が抑制されていることが示された。本結果は、血液をサンプルとしてそのまま用いてＥＬＩＳＡ系によりｐ３−Ａｌｃ量を測定した場合には、正確な血液中のｐ３−Ａｌｃ量を定量できないことを示している。
【００３４】
（実施例４）血液（血清及び血漿）からｐ３−Ａｌｃを抽出する方法の検討
実施例３の結果から、血液サンプルをそのまま用いてＥＬＩＳＡ測定を行った場合には、血中のｐ３−Ａｌｃ量を正確に定量できないことが判明したため、血中のｐ３−Ａｌｃ量を正確に定量可能な方法を検討した。
合成したｐ３−Ａｌｃα３５ペプチドを１％ＢＳＡ溶液に溶解し、４００ｐｇ／ｍＬのサンプル溶液を作製した。このサンプル溶液２００μＬに対し、８００μＬのクロロホルム：メタノール＝２：１混合液を加え、ボルテックス又はマイクロチップで超音波処理を１０秒間行うことにより良く撹拌し、１時間室温に静置した。蒸留水（ＤＤＷ）１６０μＬを加えてボルテックスにより撹拌後、微量冷却高速遠心機(ＴＯＭＹ社等）を用いて、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心を行った。遠心後のチューブ内は、上から「水層」、「中間層」、「有機溶媒層」の三層に分離した。このうち、水層５００μＬを別のコニカル遠心チューブに回収し、遠心エバポレーターを用いて半分量（２５０μＬ)に濃縮して、水層に残存する有機溶媒を気化除去した。濃縮液に２５０μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を加えて容量を５００μＬとしたものをサンプルとして、実施例３と同様の方法によりｓＥＬＩＳＡ測定を行った。
【００３５】
ｓＥＬＩＳＡ測定の結果を図４に示す。ｓＥＬＩＳＡで定量した回収率は８３±１．４％であった。これはウェスタンブロッティングにより見積もった回収率約８０〜９０％（実験例１の図２）とほぼ同等の量であった。この結果から、ウェスタンブロッティングとｓＥＬＩＳＡの回収率がほぼ等しいことから、抗原抗体反応が正しく行われている事が示された。
【００３６】
（実施例５）ｐ３−Ａｌｃ抽出法を用いた血清中の添加ｐ３−Ａｌｃα測定
１．５ｍＬのコニカル遠心チューブ中のヒト血清２００μＬに対し、８００μＬのクロロホルム：メタノール＝２：１混合液を加え、ボルテックス又はマイクロチップで超音波処理を１０秒間行うことにより良く撹拌し、１時間室温に静置した。蒸留水（ＤＤＷ）１６０μＬを加えてボルテックスにより撹拌後、微量冷却高速遠心機(ＴＯＭＹ社等）を用いて、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心を行った。遠心後のチューブ内は、上から「水層」、「中間層」、「有機溶媒層」の三層に分離した。このうち、水層５００μＬを別のコニカル遠心チューブに回収し、遠心エバポレーターを用いて半分量（２５０μＬ)に濃縮して、水層に残存する有機溶媒を気化除去した（水層に残存する有機溶媒を気化除去するのが目的のため、全溶媒を乾燥して希釈用緩衝液で溶解しても差し支えない）。濃縮液に２５０μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を加えて容量を５００μＬとし、撹拌・溶解したものを測定用原液（×１）とした。測定用原液（×１）に希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を加えて二倍希釈液（×２）及び四倍希釈液（×４）を調製した。測定用原液、二倍希釈液、及び四倍希釈液のそれぞれに、合成ｐ３−Ａｌｃα３５を溶解し、実施例３記載の方法に従ってｓＥＬＩＳＡ法で測定を行った。また、標準サンプルとして合成ｐ３−Ａｌｃα３５を希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解し、検量線を作成した。
【００３７】
結果を図５に示す。測定用原液（×１）及び二倍希釈液（×２）、四倍希釈液（×４）の反応直線は、検量線と同じ傾きを示した（図５Ａ）。図５Ｂは、検量線と二倍希釈液の反応直線を重ねた結果を示す。本実験結果より、本実験において使用した処理方法を採用することにより、血清中に存在した反応阻害成分が除去され、血清中におけるｐ３−Ａｌｃαの測定効率が向上することが示された。
【００３８】
（実施例６）ｐ３−Ａｌｃ抽出法を用いた健常人の血清中のｐ３−Ａｌｃα測定
健常人５人の血清２００μＬをサンプルとして用いて、実施例４の方法に従って処理して二倍希釈液を調製し、実施例３と同様の方法によりｓＥＬＩＳＡ測定を行った。測定は、デュプリケートで行った。
【００３９】
結果を図６に示す。本測定の結果、健常人の血清には、約２５０〜３３０ｐｇ／ｍＬ（平均２８２±３１ｐｇ／ｍＬ）のｐ３−Ａｌｃα３５が含まれていた。図中、サンプルは、サンプルＮｏ.１の人の測定値を示す。なお、サンプルは２倍に希釈して測定しているため、表の値は測定値の倍量を示すものである。
【００４０】
（実施例７）ｐ３−Ａｌｃ抽出法を用いた血漿中の添加ｐ３−Ａｌｃα測定
１．５ｍＬのコニカル遠心チューブ中のヒト血漿２００μＬに対し、８００μＬのクロロホルム：メタノール＝２：１混合液を加え、ボルテックス又はマイクロチップで超音波処理を１０秒間行うことにより良く撹拌し、１時間室温に静置した。蒸留水（ＤＤＷ）１６０μＬを加えてボルテックスにより撹拌後、微量冷却高速遠心機(ＴＯＭＹ社等）を用いて、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心を行った。遠心後のチューブ内は、上から「水層」、「中間層」、「有機溶媒層」の三層に分離した。このうち、水層５００μＬを別のコニカル遠心チューブに回収し、遠心エバポレーターを用いて半分量（２５０μＬ)に濃縮して、水層に残存する有機溶媒を気化除去した（水層に残存する有機溶媒を気化除去するのが目的のため、全溶媒を乾燥して希釈用緩衝液で溶解しても差し支えない）。濃縮液に２５０μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を加えて容量を５００μＬとし、撹拌・溶解したものを測定用原液（×１）とした。測定用原液（×１）に希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を加えて二倍希釈液（×２）及び四倍希釈液（×４）を調製した。測定用原液、二倍希釈液、及び四倍希釈液のそれぞれに、合成ｐ３−Ａｌｃα３５を溶解し、実施例３記載の方法に従ってｓＥＬＩＳＡ法で測定を行った。また、標準サンプルとして合成ｐ３−Ａｌｃα３５を希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解し、検量線を作成した。
【００４１】
結果を図７に示す。測定用原液（×１）及び二倍希釈液（×２）、四倍希釈液（×４）の反応直線は、検量線と同じ傾きを示した（図７Ａ）。図７Ｂは、検量線と二倍希釈液の反応直線を重ねた結果を示す。本実験結果より、本実験において使用した処理方法を採用することにより、血漿中に存在した反応阻害成分が除去され、血漿中におけるｐ３−Ａｌｃαの測定効率が向上することが示された。
【００４２】
（実施例８）ｐ３−Ａｌｃ抽出法を用いたアルツハイマー病患者及び健常人の血漿中のｐ３−Ａｌｃα測定（１）
アルツハイマー病患者３人及び同年代健常人３人の血漿２００μＬを、実施例４の方法に従って処理して二倍希釈液を調製し、実施例３と同様の方法によりｓＥＬＩＳＡ測定を行った。測定は、ｑｕａｄｒｕｐｌｅで行った。
【００４３】
結果を図８に示す。健常人の血漿には、平均３３２±９ｐｇ／ｍＬのｐ３−Ａｌｃα３５が含まれるのに対し、アルツハイマー病患者の血漿には、平均４８７±１２３ｐｇ／ｍＬのｐ３−Ａｌｃα３５が含まれる事が明らかとなった。健常人の血漿中のｐ３−Ａｌｃα３５値は、血清中のｐ３−Ａｌｃα３５値とほぼ同じレベルであった。本実験結果により、アルツハイマー病患者の血中ｐ３−Ａｌｃα濃度が、健常人に比較して高いことが明らかになった。また、本実施例により測定された血中のｐ３−Ａｌｃα３５の量は、アルツハイマー病発症に関わる因子とされるＡβ４０の血中における量（１００〜１５０ｐｇ／ｍＬ）よりも高い値であり、本発明の方法を採用することにより診断マーカとして十分に利用可能な量のｐ３−Ａｌｃを検出することができることが示された。
【００４４】
（実施例９）ｐ３−Ａｌｃ抽出法を用いたアルツハイマー病患者及び非アルツハイマー病患者の血漿中のｐ３−Ａｌｃα測定（２）
以下の表１に記載のアルツハイマー病患者（ＡＤ）、及び、表２に記載の非アルツハイマー病患者（ＮＯＮＡＤ）から採取した血液の血漿中のｐ３−Ａｌｃ量を測定した。各血漿２００μＬを、実施例４の方法に従って処理して二倍希釈液を調製し、実施例３と同様の方法によりｓＥＬＩＳＡ測定を行った。以下の表において、「ＡＤ」はアルツハイマー病を、「ＣＨ」は慢性肝炎を、「Ｎｏｒｍａｌ」は健常者を示す。
【００４５】
【表１】
2011107031.tif 000002
【００４６】
【表２】
2011107031.tif 000003
【００４７】
結果を図９に示す。非アルツハイマー病患者の血漿には、平均１２０±３９ｐｇ／ｍＬのｐ３−Ａｌｃα３５が含まれるのに対し、アルツハイマー病患者の血漿には、平均１６９±３２ｐｇ／ｍＬのｐ３−Ａｌｃα３５が含まれる事が示された。本実験結果により、アルツハイマー病患者の血中ｐ３−Ａｌｃα濃度が、非アルツハイマー病患者に比較して高いことが確認された。また、ｐ３−Ａｌｃ量の性別による影響を分析した結果を図１０に示す。本結果から、ｐ３−Ａｌｃ量の測定において性別による差はほとんどないことが示された。
【００４８】
（実施例１０）ｐ３−Ａｌｃα抽出法における残留メタノール量の影響
ｐ３−Ａｌｃを抽出後の溶液にメタノールが混入していた場合の反応阻害効果の有無を検討した。希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）にメタノールを終濃度が１、５、１０、２０、３０、４０、又は５０％となるように添加したメタノール溶液、及び各メタノール溶液にｐ３−Ａｌｃα３５を加えたサンプルを使用して、実施例３と同様の方法によりｓＥＬＩＳＡ測定を行った。
【００４９】
希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）にメタノールを添加し、ＯＤ４５０を測定すると、メタノールによりバックグラウンドが若干高くなった（非図示）。メタノールを添加しなかった場合のｐ３−Ａｌｃα３５の回収率を１００％とした場合の各濃度のメタノールを添加した場合のｐ３−Ａｌｃα３５の回収率を表３に示す。ｐ３−Ａｌｃ溶液にメタノールを添加した実験の結果、４０％までの混入は反応に影響しないことが示された。
【００５０】
【表３】
2011107031.tif 000004
【００５１】
（実施例１１）水層中の溶媒の除去方法の検討
実施例１０の結果から、水層中に溶媒が残留していると測定結果に影響を及ぼす可能性があることが明らかとなったことから、ｐ３−Ａｌｃの測定に適した水層中の溶媒の除去方法を検討した。血漿２００μＬに対し、８００μＬのクロロホルム：メタノール＝２：１混合液を加え、ボルテックス又はマイクロチップで超音波処理を１０秒間行うことにより良く撹拌し、１時間室温に静置した。蒸留水（ＤＤＷ）１６０μＬを加えてボルテックスにより撹拌後、微量冷却高速遠心機(ＴＯＭＹ社等）を用いて、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心を行った。遠心後のチューブ内は、上から「水層」、「中間層」、「有機溶媒層」の三層に分離した。このうち、水層を回収し、以下の溶媒除去操作を行った。
【００５２】
（ａ）５００μＬの水層を回収し、スピードバックで約２倍に濃縮後、希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を２５０μＬ添加した（最終量５００μＬ）。
（ｂ）５００μＬの水層を回収し、スピードバックで完全に溶媒を飛ばした後、５００μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解させた。
（ｃ）水層を全量回収し、スピードバックで完全に溶媒を飛ばした後、２５０μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解させた。
（ｄ）５００μＬの水層を回収し、スピードバックで約２倍に濃縮後、５００μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解させた。
（ｅ）５００μＬの水層を回収し、スピードバックで完全に溶媒を飛ばした後、５００μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解させた。
（ｆ）５００μＬの水層を回収し、スピードバックで完全に溶媒を飛ばした後、２５０μＬの希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）に溶解させた。
以上において、（ａ）〜（ｃ）は健常者コントロール血漿１、（ｄ）〜（ｆ）は健常者コントロール血漿２を示す。
【００５３】
結果を表４に示す。溶媒を完全に飛ばすことで定量値が変化することが示された。また、２５０μＬの希釈バッファーで可溶化することで感度が高くなることが示された。特に、（ｃ）及び（ｆ）の方法が適していることが明らかとなった。
【００５４】
【表４】
2011107031.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の血液試料の有機溶媒処理方法は、血液試料中のｐ３−Ａｌｃの測定を可能とすることから、アルツハイマー病の診断の分野において利用可能である。
【図４】
2011107031.tif 000006
【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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