(57)【要約】【課題】  遺伝子工学的手法を用いてパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌からタンパク質を生産するのに有用なプラスミド、および当該プラスミドを用いて遺伝子工学的にタンパク質を生産する方法を提供すること。【解決手段】  パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）から得られた、全長５１７４塩基対のポリヌクレオチドからなるプラスミドのうち、プラスミド複製領域のポリヌクレオチドを少なくとも含むプラスミド、および前記プラスミドにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを用いてパラコッカス属細菌を形質転換することで、前記課題を達成することができた。【選択図】  図２
2011024444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【請求項２】
配列番号２に示すポリヌクレオチドからなるプラスミド。
【請求項３】
配列番号１に示すポリヌクレオチドの一部が置換および／または付加および／または欠失されたポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【請求項４】
パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属以外の細菌由来のプラスミド複製領域を含むポリヌクレオチドが挿入された、請求項１から３に記載のプラスミド。
【請求項５】
タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入された請求項１から４に記載のプラスミドを用いて細菌を形質転換することで得られる、前記タンパク質を発現可能な形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、前記タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なプラスミドおよびそれを用いたタンパク質生産方法に関する。特に本発明は遺伝子工学手法を用いてパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌からタンパク質を生産するのに有用なプラスミドの提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌の中には菌体内にカロテノイドを生産できる株が知られており（特許文献１から３、および非特許文献１）、特許文献４では前記菌株に対し、ｐＢＢＲ系プラスミドといった広宿主域プラスミドをベクターとして遺伝子組換えを行なうことで、アスタキサンチンを中心としたカロテノイドをより高濃度に菌体内に生産させることを可能にしている。
【０００３】
しかしながら、一般に広宿主域プラスミドはサイズが大きく、プラスミドコピー数が低いことや、宿主によっては安定に維持されないことが知られており、遺伝子組換え効率が悪い、目的タンパク質を高発現しにくいといった問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−１８４６６８号公報
【特許文献２】特開２００７−１８１４４９号公報
【特許文献３】特開２００７−１４３５１９号公報
【特許文献４】特開２００７−２４４２２２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａ．Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８，１８４２−１８４４（１９９４）
【非特許文献２】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
【非特許文献３】Ｋｏｖａｃｈ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６，８００−８０２（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、遺伝子工学的手法を用いてパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌からタンパク質を生産するのに有用なプラスミド、および当該プラスミドを用いて遺伝子工学的にタンパク質を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【０００８】
（１）配列番号１に示すポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【０００９】
（２）配列番号２に示すポリヌクレオチドからなるプラスミド。
【００１０】
（３）配列番号１に示すポリヌクレオチドの一部が置換および／または付加および／または欠失されたポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【００１１】
（４）パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属以外の細菌由来のプラスミド複製領域を含むポリヌクレオチドが挿入された、（１）から（３）のプラスミド。
【００１２】
（５）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挿入された（１）から（４）のプラスミドを用いて細菌を形質転換することで得られる、前記タンパク質を発現可能な形質転換体。
【００１３】
（６）（５）の形質転換体を用いることを特徴とする、前記タンパク質の生産方法。
【００１４】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１５】
本発明のプラスミドは配列番号１に示すポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。配列番号１は、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌のうちカロテノイドを生産できる株であるＮ−８１１０６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）（特許文献１）から新たに得られた配列番号２に示すポリヌクレオチドからなるプラスミド（全長５１７４塩基対）の部分配列である。配列番号２からなるプラスミドは公的データベースを用いてＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）検索を行なったところ、予想されたＯＲＦは３つあり、そのうちの一つのＯＲＦ（配列番号１）が他の細菌由来のプラスミドを自律複製するのに必須な領域（プラスミド複製領域）と相同性を示すことが判明した。パラコッカス属細菌を形質転換するのに用いるプラスミドとしての機能を有するには、少なくともパラコッカス属細菌由来のプラスミド複製領域、すなわち複製開始点およびプラスミド複製に必要な遺伝子を含んでいればよい。よって、少なくとも配列番号１に示すポリヌクレオチドをプラスミド中に含んでいれば、前記プラスミドを用いてパラコッカス属細菌を形質転換できるといえる。
【００１６】
配列番号１に示すポリヌクレオチドを含むプラスミドの例としては、前述した配列番号２に示すポリヌクレオチドからなるプラスミドがあげられる。なお、前記プラスミドに、ＬａｃＺ遺伝子、抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、エリスロマイシンなど）耐性遺伝子などを挿入すると、形質転換体における前記遺伝子の表現型により、形質転換体のスクリーニングが容易となるため好ましい。また、配列番号１に示すポリヌクレオチドの一部が置換および／または付加および／または欠失されたとしても、パラコッカス属細菌由来のプラスミドを複製する機能を有している限り、本発明のプラスミドに含まれる。
【００１７】
本発明のプラスミドを用いて形質転換できるパラコッカス属細菌としては、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ａｌｋｅｎｉｆｅｒ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｏｔｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｕｎｄａｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｋａｍｏｇａｗａｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｋａｗａｓａｋｉｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｃｕｒｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｎｄｒａｔｉｅｖａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｃｕｓｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｕｔｅｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｒｉｎｉｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｌｖｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｒｓｕｔｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｙｅｅｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓを例示できるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明のプラスミドの別の態様として、配列番号１に示す（または、配列番号１の一部が置換および／または付加および／または欠失された）ポリヌクレオチドを含むプラスミドに、パラコッカス属以外の細菌由来のプラスミド複製領域を含むポリヌクレオチドを挿入したプラスミドをあげることができる。前記プラスミドはパラコッカス属細菌および挿入したプラスミド複製領域に由来するパラコッカス属以外の細菌内でプラスミドを自律複製することが可能となる。よって、前記プラスミドの調製および前記プラスミドにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入する操作を、前記パラコッカス属以外の細菌を用いて行なうことができる。前記パラコッカス属以外の細菌としては、通常当業者が形質転換に用いる細菌の中から適宜選択すればよいが、形質転換作業が容易かつ当業者が最も用いる大腸菌が好ましい。大腸菌由来のプラスミド複製領域を含むポリヌクレオチドを取得するには、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８といった大腸菌内で自律複製可能なプラスミドから取得すればよい。
【００１９】
本発明のプラスミドはパラコッカス属細菌内で自律複製できることから、本発明のプラスミドにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入し得られた組換えプラスミドを用いて、パラコッカス属細菌を形質転換することで得られる組換えパラコッカス属細菌は、前記タンパク質を発現させることができる。前記挿入するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、パラコッカス属細菌で発現可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば特に制限はなく、酵素、抗体、レセプター、構造タンパク質、蛍光タンパク質などをコードするポリヌクレオチドを例示することができる。なお、前記ポリヌクレオチドは目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドをそのまま用いてもよいが、前記ヌクレオチドのコドンをパラコッカス属細菌型に変換したポリヌクレオチドがより好ましい。前記コドン変換したポリヌクレオチドの一態様として、パラコッカス属細菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ、当該宿主におけるコドンの使用頻度が少ないもの）の全部または一部を、コードするアミノ酸を同一のまま、パラコッカス属細菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドがあげられる。また、前記組換え菌が酵素を発現する場合、培地に前記酵素の基質を添加して培養することで、酵素工学的に物質生産を行なうことができる。一例として、本発明のプラスミドにカロテノイド合成酵素群（ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＺ）をコードするポリヌクレオチドを挿入して得られるプラスミドを用いて、カロテノイドを生産できるパラコッカス属細菌を形質転換して得られた組換え菌を用いてアスタキサンチンなどのカロテノイドを効率的に生産する方法があげられる。
【００２０】
なお、本発明のプラスミドを用いたタンパク質生産方法において、プラスミドの調製、ポリヌクレオチドの切断および連結、形質転換といった方法は、当業者に周知の方法（例えば非特許文献２に記載の方法）を用いればよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のプラスミドは、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌Ｎ−８１１０６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）より得られた、全長５１７４塩基対のポリヌクレオチド（配列番号２）からなるプラスミドのうち、プラスミド複製領域にあたる配列番号１に示すポリヌクレオチドを少なくとも含んでいることを特徴としている。本発明のプラスミドはパラコッカス属細菌内で高いプラスミドコピー数を実現し得るため、パラコッカス属細菌を形質転換するのに用いるプラスミドとして有用である。また本発明のプラスミドは、配列番号２に示すポリヌクレオチドからなるプラスミドをそのまま用いてもよいが、配列番号１に示すポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを欠失させても、パラコッカス属細菌内でプラスミドを複製する機能に変化はない。そのため、配列番号１に示すポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを欠失させることで、従来パラコッカス属細菌を形質転換するのに用いられていた広宿主域プラスミドと比較しプラスミドのサイズを小さくすることができ、前記プラスミドはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したときのパラコッカス属細菌内におけるプラスミド安定性が向上する。また、前記プラスミドはプラスミドのコピー数が特に高いため、前記プラスミドにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したプラスミドを用いてパラコッカス属細菌を形質転換することで得られる組換え菌により、前記タンパク質を大量かつ効率的に生産させることができる。
【００２２】
本発明のプラスミドの別の態様は、配列番号１に示すポリヌクレオチドおよびパラコッカス属細菌以外の細菌由来のプラスミド複製領域のポリヌクレオチドを含むプラスミドであり、前記プラスミドはパラコッカス属以外の細菌においてもプラスミドの自律複製が可能である。よって、前記細菌が大腸菌のとき、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのプラスミドへの挿入といった遺伝子工学的操作の一部を、操作が比較的容易な大腸菌を用いて行なえるため、組換えパラコッカス属細菌の調製をより簡便に行なえる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌Ｎ−８１１０６株から抽出したプラスミドの電気泳動写真。図中レーンＭは分子量マーカー、レーン１はパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株から抽出したプラスミドである。
【図２】プラスミドｐＨＭの制限酵素地図。
【図３】プラスミドｐＨＭＳ１の構築を示す図。
【図４】プラスミドｐＨＭＳ１により形質転換されたパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株から抽出したプラスミドの電気泳動写真。図中レーンＭは分子量マーカー、レーン１から５はパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株組換え体より抽出したプラスミド、レーンＰＣはプラスミドｐＨＭＳ１、レーンＮＣはプラスミドｐＨＭである。
【図５】プラスミドｐＨＭＳ１ＧＦＰの構築を示す図。
【図６】プラスミドｐＨＭＳ１ＧＦＰにより形質転換されたパラコッカス属細菌を用いて製造した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＥＬＩＳＡ測定結果。
【実施例】
【００２４】
以下に実施例をあげて本発明を説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００２５】
実施例１  プラスミドの取得
パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）（特許文献１）をＯＥＧ液体培地（表１）で培養（２５℃、３日間）し、遠心分離により菌体を回収後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。
【００２６】
【表１】
2011024444.tif 000003
抽出したプラスミドをアガロースゲル電気泳動によってサイズを調べた結果、約５ｋｂのプラスミドであった。図１に電気泳動写真を示す。
【００２７】
実施例２  プラスミドの塩基配列解析
実施例１で取得したプラスミドについて塩基配列解析を実施した。
（１）実施例１で取得したプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩを用いて消化することで、約３．５ｋｂと約１．７ｋｂの２つのＤＮＡ断片を得た。
（２）（１）のＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてアガロースゲルより抽出後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、事前にＳｐｈＩ処理したプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）に挿入した。
（３）（２）でＤＮＡ断片を挿入したｐＵＣ１９を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後（３７℃、１８時間）、プラスミドを抽出した。
（４）前記約３．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたｐＵＣ１９、および前記約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたｐＵＣ１９から配列番号３（５’―ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ―３’）および４（５’―ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ―３’）に記載のプライマーを用いて、前記２つのＤＮＡ断片をＰＣＲ反応により増幅した。
（５）（４）で得られた前記２つのＤＮＡ断片について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列解析用ＤＮＡを調製後、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）より塩基配列解析を行なった。なお、前記約３．５ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を解析するためのプライマーとしては、配列番号５（５’―ＣＣＧＴＴＴＣＣＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＧ―３’）、配列番号６（５’―ＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧ―３’）、配列番号７（５’―ＴＣＣＡＧＡＴＣＣＣＧＣＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧ―３’）、配列番号８（５’―ＡＡＡＡＣＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＧＧ―３’）、配列番号９（５’―ＴＧＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧ―３’）、配列番号１０（５’―ＴＣＡＣＧＴＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＣＴＧＣＴＧＧＣ―３’）からなるプライマーを用いた。一方、前記約１．７ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を解析するためのプライマーとしては、配列番号１１（５’―ＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＣＧＧＧ―３’）および１２（５’―ＡＴＣＡＣＧＧＣＣＡＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣ―３’）からなるプライマーを用いた。さらに、実施例１で得られたプラスミドから、配列番号１３（５’―ＣＣＧＴＧＧＣＧＴＴＧＡＡＴＧＧＧＣＴＡＡＣＡＴ―３’）、配列番号１４（５’―ＣＧＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＧＣＣＡＡＣＴＴＧＣＧＣ―３’）、配列番号１５（５’―ＧＧＣＧＣＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＴＴＴ―３’）および配列番号１６（５’―ＴＡＴＴＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＧＣＡＴＡＧＡＣＣＣ―３’）からなるプライマーを用いて、前記２つのＤＮＡ断片の連結部分の塩基配列を解析した。
【００２８】
塩基配列解析の結果、実施例１で得られたプラスミドは５１７４塩基からなる二本鎖の環状ＤＮＡであることが判明した。全塩基配列を配列番号２に示す。なお実施例１で得られたプラスミドを、以降プラスミドｐＨＭと命名する。プラスミドｐＨＭの制限酵素地図を図２に示す。
【００２９】
実施例３  プラスミドｐＨＭの塩基配列の解析
実施例２で得られたプラスミドｐＨＭの塩基配列から、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ、ＢＬＡＳＴＰ  ２．２．１６［Ｍａｒ−１１−２００７］、アクセス日：２００８年１１月２９日）を用いてＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）解析を行なった。結果、プラスミドｐＨＭには少なくとも３種類のＯＲＦが存在することが判明した（図２）。すなわち、１８６アミノ酸をコードするＯＲＦ１、２９７アミノ酸をコードするＯＲＦ２、４５６アミノ酸をコードするＯＲＦ３である。ＯＲＦ１から３の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１、１７および１８にそれぞれ示す。
【００３０】
さらに、プラスミドｐＨＭのＯＲＦ１についてＢＬＡＳＴによる相同性検索を行なった結果、表２に示すようにパラコッカス属以外の細菌由来のプラスミド複製領域と比較的高い相同性を有していることが判明した。なおパラコッカス属細菌の一つである、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＤＳＭＺ１１０７２株由来のｐＷＫＳ１プラスミド複製領域（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿６９０５７９）との相同性を比較したところ、相同性は１０％程度と低かった。よってプラスミドｐＨＭのＯＲＦ１の塩基配列は、パラコッカス属細菌において従来知られていない新規な配列であることが判明した。
【００３１】
【表２】
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なお、プラスミドｐＨＭのＯＲＦ２および３について同様にＢＬＡＳＴによる相同性検索を行なった結果を表３および４に示す。
【００３２】
【表３】
2011024444.tif 000005
【００３３】
【表４】
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実施例４  大腸菌由来のプラスミド複製領域の挿入
実施例３で示したように、プラスミドｐＨＭのＯＲＦ１がプラスミド複製領域である可能性が高いことから、前記複製領域を含むプラスミドが大腸菌内でも複製できるよう、大腸菌由来のプラスミド複製領域を前記プラスミドに挿入した（図３）。
（１）ｐＵＣ１９中の複製タンパク質領域を配列番号１９（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＣＧＡＴＡＴＣＧＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣ−３’）および２０（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣ−３’）からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅した。反応液組成および反応条件を以下に示す。
【００３４】
（反応液組成）
１０％（ｖ／ｖ）  １０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）
０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（タカラバイオ社製）
各１μＭ  増幅用プライマー
０．５ｎｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡ
０．０５Ｕ／μＬ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）
（反応条件）
９４℃で５分加熱後、９４℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・１分の温度サ
イクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で７分反応させた。
（２）ｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（非特許文献３）中のカナマイシン遺伝子領域を配列番号２１（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＧ−３’）および２２（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＣＧＴＣＧ−３’）からなるプライマーを用いて（１）と同様の方法でＰＣＲ反応により増幅した。
（３）（１）および（２）で調製したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製した。前記精製ＤＮＡは制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで処理し、挿入断片を調製した。
（４）（３）で調製した挿入断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて事前にＨｉｎｄＩＩＩ処理したプラスミドｐＨＭに挿入した。
（５）（４）でＤＮＡ断片を挿入したプラスミドｐＨＭを用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後（３７℃、１８時間）、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドを抽出した。
【００３５】
抽出したプラスミドは適切な制限酵素にて処理後、アガロースゲル電気泳動によりｐＵＣ１９中のプラスミド複製領域およびカナマイシン遺伝子領域が挿入されていることを確認した。なお本実施例で得られたプラスミドを、以降プラスミドｐＨＭＳ１と命名する。プラスミドｐＨＭＳ１の制限酵素地図を図３に示す。
【００３６】
実施例５  プラスミドｐＨＭＳ１を用いたパラコッカス属細菌の形質転換
実施例４で得られたプラスミドｐＨＭＳ１を用いてパラコッカス属細菌を形質転換した。
（１）パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）をＯＥＧ液体培地（表１）により培養後（２５℃、１８時間）、前記培養液を植継ぐことで対数増殖期の菌体を調製した。
（２）遠心分離により（１）で調製した菌体を回収後（４℃、１００００ｒｐｍ、１分間）、０．２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により２回洗浄した。前記洗浄菌体は、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液を添加し、室温で１時間反応させることで菌体の細胞壁を破砕後、０．２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再度洗浄することで、形質転換用菌体を調製した。
（３）プラスミドｐＨＭＳ１は適当な濃度となるように滅菌水に溶解後、（２）で調製した菌体に添加し、エレクトロポレーションにより遺伝子導入を行なった（装置：Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）、電圧：２．２ｋＶ）。遺伝子導入後、直ちに１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、２５℃で２時間穏やかに振とうすることで、再生培養した。
（４）培養後、培養液の一部を７５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＯＥＧ寒天培地（ＯＥＧ液体培地（表１）に寒天１．５％添加したもの）に塗布し、２５℃で３から５日間培養することで、カナマイシン耐性を示す形質転換体を得た。
（５）（４）で得られた形質転換体を７５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＯＥＧ液体培地（表１）により培養し、定法に従って菌体からプラスミドを抽出した。
【００３７】
抽出したプラスミドを０．９％アガロースゲル電気泳動により解析したところ、パラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４０２３）が元来保有していたプラスミドｐＨＭは菌体から放出され、導入したプラスミドｐＨＭＳ１のみ存在していることが判明した（図４）。よって、プラスミドｐＨＭＳ１を用いてパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株を形質転換できることを確認した。
【００３８】
実施例６  プラスミドｐＨＭＳ１のベクター機能の評価
実施例４で得られたプラスミドｐＨＭＳ１がベクターとしてタンパク質の発現ができるか評価した。なお、タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしてＪｅｌｌｙ  ｆｉｓｈ由来のＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を用いた。
（１）配列番号２３（５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＧＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＧ−３’）および２４（５’−ＣＴＴＴＡＣＴＣＡＴＧＣＧＡＡＡＣＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣ−３’）からなるプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりプラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ２（図３）中のカナマイシン耐性遺伝子上流領域を増幅することで、ＧＦＰ遺伝子を発現させるためのプロモーターを調製した。なお、反応液組成および反応条件は実施例４（１）に記載と同様である。また、増幅したプロモーターのうち、３’末端側は後述のＧＦＰ遺伝子との重複領域（１０塩基）である。
（２）配列番号２５に示すＧＦＰ遺伝子を人工的に合成した。なお発現タンパク質を容易に検出するために、ＧＦＰ遺伝子の停止コドンの直前に６つのヒスチジンをコードするＤＮＡ（配列番号２５の７２７から７４４番目の塩基）を付加している。
（３）（２）で合成したＧＦＰ遺伝子を、配列番号２６（５’−ＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＡＴＧＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＧ−３’）および２７（５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣ−３’）からなるプライマー用いてＰＣＲ反応により増幅した。なお、増幅したＧＦＰ遺伝子のうち、５’末端側は（１）で調製したプロモーター領域との重複領域（１０塩基）である。
（４）（１）で調製したプロモーターと（３）で調製したＧＦＰ遺伝子とを下記に示す二段階のＰＣＲ反応を用いて連結した。
（４−１）下記反応液組成および反応条件にて一段階目のＰＣＲ反応を行なった。
【００３９】
（反応液組成）
１０％（ｖ／ｖ）  １０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）
０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（タカラバイオ社製）
０．５ｎｇ／μＬ  （１）で調製したプロモーター
０．５ｎｇ／μＬ  （３）で調製したＧＦＰ遺伝子
０．０５Ｕ／μＬ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）
（反応条件）
９４℃・５分の加熱後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・２分間の温
度サイクルを５回繰り返し、最後に氷冷した。
（４−２）一段階目のＰＣＲ反応後の反応液に、終濃度各１μＭとなるよう配列番号２３および２７からなるプライマーをそれぞれ添加後、下記反応条件にて二段階目のＰＣＲ反応を行なった。
【００４０】
（反応条件）
９４℃で５分加熱後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１分の温度サ
イクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で７分反応した。
（５）（４）で得られたプロモーター結合ＧＦＰ遺伝子を制限酵素ＫｐｎＩで処理後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて事前にＫｐｎＩ処理したプラスミドｐＨＭＳ１に挿入した。
（６）（５）でプロモーター結合ＧＦＰ遺伝子を挿入したプラスミドｐＨＭＳ１を用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換後、５０μｇ/ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地を用いて培養し（３７℃、１８時間）、培養液からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてプラスミドを抽出して配列を確認した。なお本操作で得られたプラスミドを、以降プラスミドｐＨＭＳ１ＧＦＰと命名する。プラスミドｐＨＭＳ１ＧＦＰの制限酵素地図を図５に示す。
（７）プラスミドｐＨＭＳ１ＧＦＰを用いてパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株を実施例５と同様の方法で形質転換を行なった。すなわち、エレクトロポレーションにより７５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＯＥＧ寒天培地に菌体を塗付し、２５℃で３から５日間培養後、カナマイシン耐性を示す形質転換体を得た。
【００４１】
得られたパラコッカス属細菌Ｎ−８１１０６株形質転換体を１週間程度培養後、培養液に紫外線を照射した結果、ＧＦＰに由来する蛍光を確認した。
【００４２】
実施例７  パラコッカス属細菌形質転換体からのＧＦＰ調製
実施例６で調製したパラコッカス属細菌形質転換体を用いてＧＦＰを調製した。
（１）実施例６で調製した形質転換体培養液からＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社）を用い、培養後の形質転換体から全タンパク質を抽出した。
（２）実施例６で調製した形質転換体より発現されるＧＦＰのＣ末端側に存在するＨｉｓタグを利用し、下記に示す抗ＧＦＰ抗体と抗Ｈｉｓタグ抗体によるサンドウィッチ法ＥＬＩＳＡを行なった。
（２−１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に、１μｇ／ｍＬから段階的に希釈した抗ＧＦＰ抗体（インビトロジェン社製）を各ウェルに１００μＬずつ添加後、４℃で１８時間静置することで抗体を固相に固定した。
（２−２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ―ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（２−３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、形質転換株から調製したタンパク質溶液を適宜希釈し、固定化抗体と反応させた（３０℃、２時間）。
（２−４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（２−５）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４３】
ＥＬＩＳＡの結果、実施例６で調製した形質転換体によりＧＦＰを発現していることを確認した（図６）。以上より、プラスミドｐＨＭＳ１ＧＦＰを用いてパラコッカス属細菌を形質転換することで、ＧＦＰを発現可能な組換えパラコッカス属細菌が調製できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のプラスミドにより、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌の遺伝子組換えを効率よく行なうことができる。また、前記組換え菌で発現したタンパク質は、抗体、レセプター、構造タンパク質、蛍光タンパク質としてそのまま用いることもできるし、酵素を発現させることで酵素工学的に物質生産させることもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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