(57)【要約】【課題】  ＡＢＣ法（アビジンビオチンコンプレックス法）以上の感度を有し、かつＡＢＣ法で問題となった試料中の夾雑物の影響を受けないタンパク質の検出方法を提供すること。【解決手段】  タンパク質を認識する物質をエストラジオールで標識後エストラジオールを認識する物質で検出するタンパク質検出方法、およびタンパク質を認識するエストラジオールを標識した物質とエストラジオールを認識する物質を含んだタンパク質検出試薬により、前記課題を解決することができた。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を認識する物質をエストラジオールで標識後、エストラジオールを認識する物質で検出する、タンパク質検出方法。
【請求項２】
タンパク質を認識する物質がタンパク質を認識する抗体である、請求項１に記載のタンパク質検出方法。
【請求項３】
エストラジオールを認識する物質がエストラジオールを認識する抗体である、請求項１または２に記載のタンパク質検出方法。
【請求項４】
エストラジオールを認識する抗体がウサギモノクローナル抗体である、請求項３に記載のタンパク質検出方法。
【請求項５】
タンパク質を認識するエストラジオールを標識した物質と、エストラジオールを認識する物質を含んだ、タンパク質検出試薬。
【請求項６】
担体にタンパク質を固定化する際に、担体にエストラジオールを認識する物質を固定化後、エストラジオールを標識した前記タンパク質を固定化させる、タンパク質の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来より知られているビオチン−アビジン系以上の特異性および検出感度を有するタンパク質検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を定性的または定量的に検出する方法として、ウエスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法といった抗原抗体反応を利用した検出が広く実施されている。前記方法は、膜や担体上に固定化したタンパク質を、前記タンパク質を認識する標識抗体で検出する方法である。
【０００３】
前記方法において、従来抗体の標識としては、アルカリホスファターゼなどの酵素を用い、結合した酵素標識抗体の酵素活性を測定することでタンパク質を検出していたが、近年、より高感度にタンパク質を検出する方法が求められている。高感度なタンパク質検出方法の例としてはＡＢＣ法（アビジンビオチンコンプレックス法）がある。ＡＢＣ法は、膜や担体上に固定化したタンパク質を、ビオチンで標識した前記タンパク質を認識する抗体と反応後、酵素で標識したストレプトアビジンと反応させ、前記標識した酵素の活性を測定することでタンパク質を検出する方法である。通常、ビオチンは抗体あたり数分子標識されるため、酵素で標識したストレプトアビジンも抗体あたり数分子結合することができる。結果として、前記タンパク質に結合した酵素の数が増加するため、ＡＢＣ法は従来の方法と比較し測定感度を向上させることができる。
【０００４】
しかしながら、ＡＢＣ法で使用するビオチンは生体内で比較的高濃度に存在するため、生体試料中に存在するビオチンにより測定結果に影響を受ける問題があった。よって、ＡＢＣ法を用いてタンパク質を検出する場合、緩衝液やブロッキング剤を完全にビオチンフリーのものにする必要があった。さらに、ビオチンが付加されたタンパク質も多数存在することが知られているため、生体試料中に存在するビオチンが付加されたタンパク質の影響も考慮する必要があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】松葉隆雄ら、東ソー研究報告、５３、３−９（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＡＢＣ法（アビジンビオチンコンプレックス法）以上の感度を有し、かつＡＢＣ法で問題となった試料中の夾雑物の影響を受けないタンパク質の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を鑑み発明者が鋭意検討した結果、タンパク質を認識する物質をエストラジオール（Ｅ２）で標識し、Ｅ２を認識する物質で検出することにより、ＡＢＣ法（アビジンビオチンコンプレックス法）より高感度かつ高特異的にタンパク質を検出することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち第一の発明は、タンパク質を認識する物質をエストラジオールで標識後、エストラジオールを認識する物質で検出する、タンパク質検出方法である。
【０００９】
また第二の発明は、タンパク質を認識する物質がタンパク質を認識する抗体である、第一の発明に記載のタンパク質検出方法である。
【００１０】
また第三の発明は、エストラジオールを認識する物質がエストラジオールを認識する抗体である、第一または第二の発明に記載のタンパク質検出方法である。
【００１１】
また第四の発明は、エストラジオールを認識する抗体がウサギモノクローナル抗体である、第三の発明に記載のタンパク質検出方法である。
【００１２】
また第五の発明は、タンパク質を認識するエストラジオールを標識した物質と、エストラジオールを認識する物質を含んだ、タンパク質検出試薬である。
【００１３】
また第六の発明は、担体にタンパク質を固定化する際に、担体にエストラジオールを認識する物質を固定化後、エストラジオールを標識した前記タンパク質を固定化させる、タンパク質の固定化方法である。
【００１４】
以降、本発明について詳細に説明する。
【００１５】
タンパク質を高感度かつ高特異的に検出するための標識分子には、以下の４つの要件が求められる。
【００１６】
（１）標識分子が低分子量であること
標識分子が高分子量の化合物であると、立体障害などにより、タンパク質との結合（例えば抗原抗体反応）を阻害する可能性があり、検出感度および特異性が低下するため好ましくない。なお、ビオチンの分子量が２４４．３であることから、これと同程度の分子量を有する分子が標識分子としては好ましいことが考えられる。
【００１７】
（２）標識分子が極端な電荷を有していないこと
標識分子が極端な電荷を有していると、タンパク質との結合（例えば抗原抗体反応）を阻害する可能性が生じるため好ましくない。
【００１８】
（３）標識分子に対して親和性の高い物質が存在すること
ＡＢＣ法では、ビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）間の結合量が強いため、高感度にタンパク質を検出することができる。
【００１９】
（４）生体試料中における標識分子の濃度が低く、かつ標識分子を付加したタンパク質が生体試料中に存在しないこと
標識分子または標識分子を付加したタンパク質が生体試料中に存在すると、検出する際、バックグラウンド増加の原因になり、結果的にはＳ／Ｎ比の低下、ひいては検出感度の低下の原因になる。
【００２０】
そこで、前述した４つの要件に該当する標識分子について鋭意検討を行なった結果、エストラジオール（Ｅ２）が標識分子の候補としてあがった。Ｅ２は、
（１）ビオチンとほぼ同じ分子量（２７９．３９）であり、
（２）電荷を有しておらず、
（３）標識分子に対して親和性の高い物質として、Ｅ２を認識する抗体（ウサギモノクローナル抗体、非特許文献１）が存在し、
（４）生体試料中（例えば血液中）には測定系を妨害するほどの濃度は含まれておらず、かつＥ２を付加したタンパク質も存在しない、
ため、従来知られているＡＢＣ法と比較しタンパク質を高感度かつ高特異的に検出することができると予想された。そこで実際にＢＮＰ（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸（ＢＮＣ）（配列番号１）を付加したタンパク質を膜または担体に固定化し、ＢＮＣを認識するＥ２を標識した抗体と反応後、ウサギモノクローナル抗Ｅ２抗体を用いて前記タンパク質をウエスタンブロッティング法またはＥＬＩＳＡ法で検出した結果、いずれの方法においても、ビオチンを標識した系と比較し高感度かつ高特異的にタンパク質を検出することができた（実施例４から８および図２から６参照）。以上の結果より、タンパク質を高感度かつ高特異的に検出するための標識分子としてＥ２が好ましいことが判明した。
【００２１】
本発明における、タンパク質を認識する物質としては、タンパク質を認識するモノクローナル抗体・ポリクローナル抗体・抗血清が例示できるが、ロット間差の考慮が不要なモノクローナル抗体が、安定的な検出ができる点で好ましい。なお、前記タンパク質がＨｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＢＮＣタグ（配列番号１）といったタグペプチドを付加している場合は、前記ペプチドを認識する物質をタンパク質を認識する物質として用いてもよい。
【００２２】
本発明における、Ｅ２を認識する物質としては、Ｅ２を認識するモノクローナル抗体・ポリクローナル抗体・抗血清が例示できるが、ロット間差の考慮が不要なモノクローナル抗体が、安定的な検出ができる点で好ましい。Ｅ２を認識するモノクローナル抗体としては、親和性の高い非特許文献１に記載のウサギモノクローナル抗Ｅ２抗体を用いてもよいし、新たにモノクローナル抗体を単離してもよい。
【００２３】
タンパク質を認識する物質へのＥ２の標識はビオチンを標識する系で行なわれている方法と同様な方法で標識すればよい。またＥ２の導入数は、タンパク質との反応（例えば、抗原抗体反応）を阻害しない程度であればよく、タンパク質を認識する物質１分子あたり通常１から１０分子であるが、使用するタンパク質を認識する物質の特性および分子量によっては、さらに多くの分子を標識することも可能である。また、Ｅ２を認識する物質への標識も通常よく知られている方法で行なえばよく、一例として、市販のキットを用いてＥ２を認識する物質に直接酵素などを標識する方法（例えば、同仁化学社製ＨＲＰ標識キットといった市販のキットを用いてＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を標識することができる）があげられる。なお、検出感度を向上させるために、Ｅ２を認識する物質に標識する酵素を重合させたり、前記標識分子を検出する試薬を高感度のものに変更してもよい。
【００２４】
ＡＢＣ法は様々なアプリケーションが報告されており、また様々な試薬キットとして上市されているが、前記試薬キットの構成成分のうち、タンパク質を認識する物質の標識分子をビオチンからＥ２に、検出物質をアビジン（ストレプトアビジン）からＥ２を認識する物質に、それぞれ変更するだけで、本発明のタンパク質測定試薬を構築することが可能である。そのため、ＡＢＣ法と同様、様々なアプリケーションに適用できる。
【００２５】
また、本発明のタンパク質検出方法を応用することで、タンパク質を担体に固定化させることもできる。タンパク質を直接水不溶担体に固定化すると、立体構造の変化がおきやすく、活性が失われる場合が多い。そこで、Ｅ２を認識する物質を水不溶性担体に固定化後、Ｅ２を介してタンパク質を固定化させることにより、立体構造の変化がおきにくく、活性を有した状態でタンパク質を固定化することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明はタンパク質を検出する際、タンパク質を認識する物質をエストラジオール（Ｅ２）で標識後、Ｅ２を認識する物質で検出することを特徴としており、従来から高感度なタンパク質検出方法として知られているＡＢＣ法（アビジンビオチンコンプレックス法）と比較し、さらに高感度にタンパク質を検出することができる。よって、本発明の測定方法は、試料中に非常に少ない量しか存在しないタンパク質を検出する目的で好ましく用いることができる。特に、タンパク質を認識する物質としてタンパク質を認識する抗体および／またはＥ２を認識する物質としてＥ２を認識する抗体（さらに好ましくはＥ２に対する親和性の高いウサギモノクローナル抗体）を用いることで、さらに高感度にタンパク質を検出することができる。
【００２７】
従来から知られているＡＢＣ法は、生体試料中に存在するビオチンやビオチンが付加されたタンパク質により、高バックグラウンドなど測定結果に影響を受ける問題があった。一方、本発明の検出方法で標識分子として用いるＥ２は、生体試料中には測定系を妨害するほどの濃度が含まれておらず、かつＥ２を付加したタンパク質も存在しないため、ＡＢＣ法と比較し特異性高くタンパク質を検出することができる。
【００２８】
なお、市販されているタンパク質測定試薬の構成成分のうち、タンパク質を認識する物質の標識分子をＥ２に、検出物質をＥ２を認識する物質に、それぞれ変更するだけで、本発明のタンパク質測定試薬が得られる。したがって、本発明のタンパク質測定試薬は、従来のタンパク質測定試薬より高感度・高特異性であることはもちろん、市販されているタンパク質測定試薬と同様なアプリケーションにも適用できる。
【００２９】
さらに本発明の応用技術として、Ｅ２を認識する物質を水不溶性担体に固定化後、Ｅ２を介してタンパク質を固定化させる本発明のタンパク質固定化方法があり、前記方法は立体構造の変化がおきにくく、活性を有した状態でタンパク質を固定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例２の結果を示すものである。
【図２】実施例４の結果を示すものである。図中左側のグラフのうち、ひし形はＥ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法（本発明のタンパク質検出方法）の結果であり、四角はビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法の結果である。図中右側はＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図３】実施例５の結果を示すものである。図中左側のグラフのうち、黒丸はＥ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法（本発明のタンパク質検出方法）の結果であり、白丸はビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法の結果である。図中右側はＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【図４】実施例６の結果を示すものである。図中右側はドットブロットのアッセイフォーマットを示す。
【図５】実施例７の結果を示すものである。図中右側はウエスタンブロッティングのアッセイフォーマットを示す。
【図６】実施例８の結果を示すものである。図中右側はウエスタンブロッティングのアッセイフォーマットを示す。
【図７】実施例９の結果を示すものである。図中右側はＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを示す。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１  タグペプチドを付加したタンパク質を発現可能な形質転換体の調製
マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）のＣ末端側にタグペプチドを付加したタンパク質を発現可能な形質転換体を以下の方法で調製した。
（１）  ニューイングランドレイブス社製のｐＭＡＬ−ｃ４Ｘベクターを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理した。
（２）ＢＮＰのＣ末端側７アミノ酸からなるタグペプチド（ＢＮＣ、配列番号１）をコードするオリゴヌクレオチドをそれぞれ１０μＭとなるようにＴＥで希釈し、それらを混合後、９５℃で５分間熱処理し、その後２５℃まで徐々に冷却することで、アニーリングを行なった。なお、使用したオリゴヌクレオチドとして、配列番号２（相同鎖）および３（相補鎖）を用いた。
（３）（２）で得られたＢＮＣをコードするオリゴヌクレオチド（二本鎖ＤＮＡ）を、（１）で処理したｐＭＡＬ−ｃ４Ｘベクターに挿入した。挿入方法は、（１）で処理したベクター６７ｎｇと（２）のオリゴヌクレオチド１００ｎｇに、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を４μＬ添加し、１６℃で３０分間ライゲーション反応を行なうことで挿入した。
（４）（３）で得られた、ＢＮＣをコードするオリゴヌクレオチドを挿入したｐＭＡＬ−ｃ４Ｘベクターで、定法に従い大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。
【００３３】
実施例２  タグペプチドを付加したタンパク質の調製
実施例１で得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地で培養し、６００ｎｍの濁度が０．５になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加後、さらに３７℃で４時間培養した。その後大腸菌を集菌し、アミロースカラムを使ったアフィニティークロマトグラフィーにより、発現したＢＮＣを付加したＭＢＰを精製した。精製した前記タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１に示す。
【００３４】
実施例３  ＢＮＣ認識抗体の単離、およびビオチンまたはエストラジオールの標識
ＢＮＣを認識する抗体、および前記抗体への標識は以下の方法で行なった。
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるＢＮＣ  ２０ｍｇを、１０ｍｇのマレイミドで活性化された１０ｍｇのオボアルブミン（ＰＩＥＲＣＥ社製、７７１２５）に、添付された説明書に従い結合後、ＰＢＳで透析し、１ｍｇ／ｍＬに調製した。
（２）（１）で調製したタンパク質とＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）とを等量混合したエマルジョンを、１００μＬ／匹でマウス腹腔内に注射した（１回目の免疫）。
（３）２回目以降は、ＦＣＡをＦＩＣＡ（フロイント不完全アジュバント）に変更したほかは、（２）と同様に毎週免疫を行ない、これを３回繰り返した。
（４）免疫後のマウスから脾臓Ｂ細胞を取り出し、ミエローマ細胞株とＰＥＧ法による細胞融合を行ない、ＢＮＣに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを樹立した（ＢＣ２３−１１）。
（５）得られたハイブリドーマ（ＢＣ２３−１１）を培養し、抗体を精製後、２ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで調製した。
（６）抗体１ｍｏｌに対して２０ｍｏｌのＮＨＳで活性化したビオチンまたはＮＨＳで活性化したエストラジオール（Ｅ２）を反応させることで、ビオチン標識ＢＣ２３−１１またはＥ２標識ＢＣ２３−１１を得た。なお、ＮＨＳで活性化したビオチンまたはＮＨＳで活性化したＥ２の、抗体に対する添加比率を揃えることで、ビオチンまたはＥ２導入量を揃えた。
【００３５】
実施例４  ＥＬＩＳＡによる検出感度の比較（その１）
（１）実施例２で精製したＢＮＣを付加したＭＢＰをＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウェルで固定化し、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）実施例３で得られたビオチン標識ＢＣ２３−１１またはＥ２標識ＢＣ２３−１１を濃度を変化させて添加し反応させた。
（３）ビオチン標識ＢＣ２３−１１の場合はＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ社製、４３−４３２３）を１０００倍希釈して反応させ、Ｅ２標識ＢＣ２３−１１の場合は非特許文献１に記載のＥ２を認識するウサギモノクローナル抗体（Ｕ１６Ａ１４）１００μｇをＨＲＰ標識キット（同仁化学、ＬＫ１１）でプロトコルに従い標識したものを１０００倍希釈して反応させた。
（４）定法に従いＨＲＰの酵素活性を測定した。
【００３６】
結果を図２に示す。Ｅ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法（本発明のタンパク質検出方法）が、ビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法と比較し、より少ないＢＮＣ認識抗体でＢＮＣを付加したＭＢＰを検出できることが判明した。
【００３７】
実施例５  ＥＬＩＳＡによる検出感度の比較（その２）
（１）実施例２で精製したＢＮＣを付加したＭＢＰをＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウェルからの２倍希釈系列で固定化し、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）実施例３で得られたビオチン標識ＢＣ２３−１１またはＥ２標識ＢＣ２３−１１を１μｇ／ｍＬの濃度で添加し反応させた。
（３）実施例４と同様な方法でＨＲＰ酵素活性を測定した。
【００３８】
結果を図３に示す。Ｅ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法（本発明のタンパク質検出方法）が、ビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法と比較し、ＢＮＣを付加したＭＢＰをより高感度に検出することが判明した。また、ブロッキングだけのウエル（ＢＮＣを付加したＭＢＰを固定化しないウェル）におけるシグナルを比較すると、ビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法の方がシグナルが高かった。これは、スキムミルクに含まれるビオチン、ビオチンが付加されたタンパク質またはストレプトアビジンによる高い非特異的吸着の影響によるものと推測される。一方、Ｅ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法では、シグナルは非常に低く、非特異的吸着がほとんどないことがわかる。
【００３９】
実施例６  ドットブロットによる検出感度の比較
（１）実施例２で精製したＢＮＣを付加したＭＢＰを２μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで調製し、同緩衝液で３倍希釈系列を作製した。
（２）ＢｉｏＲａｄ社のドットブロット装置に、ＰＶＤＦ膜をセットし、５００μＬのＰＢＳを加え、吸引することで各ウエルを洗浄した。
（３）（１）で調製した各種濃度のＢＮＣを付加したＭＢＰを５００μＬ／ウェル添加した。なお、一番下のウエルはＢＮＣを付加したＭＢＰを固定化しなかった。
（４）吸引後、５００μＬのＰＢＳを加え、さらに吸引することで各ウェルを洗浄した。
（５）ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）中で、４℃で一晩放置することでブロッキングした。
（６）実施例３で得られたビオチン標識ＢＣ２３−１１またはＥ２標識ＢＣ２３−１１を０．５μｇ／ｍＬの濃度になるように５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈後、各ウェルに添加した。
（７）室温で２時間反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄し、ビオチン標識ＢＣ２３−１１の場合はＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ社製、４３−４３２３）を１０００倍希釈して反応させ、Ｅ２標識ＢＣ２３−１１の場合はＥ２認識ウサギモノクローナル抗体（Ｕ１６Ａ１４）１００μｇをＨＲＰ標識キット（同仁化学、ＬＫ１１）でプロトコルに従い標識したものを１０００倍希釈して使用した。
（８）ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製：ＲＰＮ２１３２）を用い、検出した。
【００４０】
結果を図４に示す。Ｅ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法（本発明のタンパク質検出方法）が、ビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法と比較し、約９倍高感度であることが判明した。
【００４１】
実施例７  ウエスタンブロッティングによる比較（その１）
（１）マウスミエローマ細胞（ＳＰ２／０）の４×１０７個を１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、超音波で破砕後、１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清を回収することで希釈液を調製した。なお、今回調製した希釈液中のタンパク質濃度は２８０ｎｍの吸光度から測定した結果７ｍｇ／ｍＬであった。
（２）実施例２で精製したＢＮＣを付加したＭＢＰを３３ｎｇ／レーン、１０ｎｇ／レーン、３．３ｎｇ／レーンとなるように（１）の希釈液で希釈した。
（３）定法に従いタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写後、以下に示す方法でウエスタンブロッティングを行なった。
（３−１）転写後のＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳ中で、４℃で一晩放置することでブロッキングした。
（３−２）実施例３で得られたビオチン標識ＢＣ２３−１１またはＥ２標識ＢＣ２３−１１を１μｇ／ｍＬの濃度になるように５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈後、各ウェルに添加した。
（３−３）室温で２時間反応後、膜をＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ビオチン標識ＢＣ２３−１１の場合はＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ社製、４３−４３２３）を２５００倍希釈して反応させ、Ｅ２標識ＢＣ２３−１１の場合はＥ２認識ウサギモノクローナル抗体（Ｕ１６Ａ１４）１００μｇをＨＲＰ標識キット（同仁化学、ＬＫ１１）でプロトコルに従い標識したものを５０００倍希釈して使用した。
（３−４）ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製、ＲＰＮ２１３２）を用い、検出した。
【００４２】
結果を図５に示す。図５において、白三角で示すバンドがＢＮＣを付加したＭＢＰに相当するバンドであり、黒三角で示すバンドがＢＮＣを付加したＭＢＰのダイマーに相当するバンドである。左右の図を比較すると、左側の図つまりＥ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法（本発明のタンパク質検出方法）の方が、検出感度が高いことがわかる。なお、右側の図における矢印で示すバンドは、ＢＮＣを付加したＭＢＰの濃度が変化してもバンドの強度が変化しないことから、動物細胞中に含まれる内在性のビオチンが付加されたタンパク質と考えられる。よって、ビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法は、本来検出したくない内在性のビオチンが付加されたタンパク質もバンドとして検出してしまう。一方、Ｅ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法は左側の図からも分かるように矢印で示すバンドは存在しなかった。
【００４３】
実施例８  ウエスタンブロッティングによる比較（その２）
（１）大腸菌（ＪＭ１０９株）を２０ｍＬのＬＢ培地で一晩培養後、回収した大腸菌を１ｍＬのＰＢＳに懸濁し、超音波で破砕後、１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離した上清を回収し（タンパク質濃度：１２ｍｇ／ｍＬ（２８０ｎｍの吸光度より測定））、タンパク質濃度として７ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したものを希釈液とした。
（２）実施例２で精製したＢＮＣを付加したＭＢＰを３３ｎｇ／レーン、１０ｎｇ／レーン、３．３ｎｇ／レーン、１ｎｇ／レーン、０．３３ｎｇ／レーン、０．１ｎｇ／レーンとなるように（１）の希釈液で希釈した。
（３）定法に従いタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、以下の方法でウエスタンブロッティングを行なった。
（３−１）転写後のＰＶＤＦ膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳ中で、４℃で一晩放置することでブロッキングした。
（３−２）実施例３で得られたビオチン標識ＢＣ２３−１１またはＥ２標識ＢＣ２３−１１を１μｇ／ｍＬの濃度になるように５％スキムミルクを含むＴＢＳで希釈後、各ウェルに添加した。
（３−３）室温で２時間反応後、膜をＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ビオチン標識ＢＣ２３−１１の場合はＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ社製、４３−４３２３）を２５００倍希釈して反応させ、Ｅ２標識ＢＣ２３−１１の場合はＥ２認識ウサギモノクローナル抗体（Ｕ１６Ａ１４）１００μｇをＨＲＰ標識キット（同仁化学、ＬＫ１１）でプロトコルに従い標識したものを５０００倍希釈して使用した。
（３−４）ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製、ＲＰＮ２１３２）を用い、検出した。
【００４４】
結果を図６に示す。図６において、白三角で示すバンドがＢＮＣを付加したＭＢＰに相当するバンドであり、黒三角で示すバンドがＢＮＣを付加したＭＢＰのダイマーに相当するバンドである。左右の図を比較すると、左側の図つまりＥ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法（本発明のタンパク質検出方法）の方が、低濃度域までバンドがあることから検出感度が高いことがわかる。なお、右側の図における矢印で示すバンドは、ＢＮＣを付加したＭＢＰの濃度が変化してもバンドの強度が変化しないことから、大腸菌中に含まれる内在性のビオチンが付加されたタンパク質と考えられる。よって、ビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法は、本来検出したくない内在性のビオチンが付加されたタンパク質もバンドとして検出してしまう。一方、Ｅ２で標識した抗体をＨＲＰ標識ウサギモノクローナル抗体で検出する方法は左側の図からも分かるように矢印で示すバンドは存在しなかった。実施例７および本実施例の結果より、本発明のタンパク質測定方法は、特異性においてもビオチンで標識した抗体をＨＲＰ標識ストレプトアビジンで検出する方法と比較し優れていることがわかる。
【００４５】
実施例９  エストラジオール（Ｅ２）を介したタンパク質の固定化
（１）ＥＬＩＳＡプレートに、１００ｎｇ／ウェル、１０ｎｇ／ウェル、１ｎｇ／ウェル、０．１ｎｇ／ウェル、０．０１ｎｇ／ウェルのＥ２認識ウサギモノクローナル抗体（Ｕ１６Ａ１４）を固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）実施例３で得られたＥ２標識ＢＣ２３−１１を１μｇ／ｍＬの濃度になるように０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで希釈後、各ウェルに添加し、１時間反応させた。
（３）十分に洗浄後、アルカリホスファターゼで標識された抗マウス抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、ＡＰ１２４Ａ）を０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで１００００倍希釈して１時間反応させた。
（４）十分に洗浄後、定法によりＡＬＰの酵素活性をＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸）で検出した。
【００４６】
結果を図７に示す。図７から明らかなように、Ｅ２を介して抗体すなわちタンパク質の固定化が可能なことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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