(57)【要約】【課題】細胞寿命を延長するための方法を同定すること。【解決手段】増大した量のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を有する細胞およびタンパク質産生におけるそれらの使用を開示する。本発明は、タンパク質が細胞によって天然に産生されるタンパク質であるか、またはタンパク質が細胞に対して異種のタンパク質であるかに関わらず、細胞のタンパク質産生を増強するための手段として、細胞寿命を延長するための方法を提供する。従って、１つの局面において、本発明は、細胞によるタンパク質産生を増加させるための方法を提供し、この方法は、この細胞中で抗アポトーシス遺伝子の発現を増加させる工程を包含する。特定の実施形態において、この細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない。特定の実施形態において、この細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、昆虫細胞、または両生類細胞である。【選択図】図１７
2011004771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増加した量のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を含む細胞であって、該細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない、細胞。
【請求項２】
前記細胞が、ヒト細胞、マウス細胞またはハムスター細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が、懸濁液中での増殖のために適応され、そして／または無血清培地中での増殖のために適応される、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質が、ヒト、ネコ、ウシ、イヌ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ、ブタ、またはネズミＢｃｌ−ｘＬタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞が、該細胞中へと導入される第１の発現ベクター上でコードされるポリペプチドを発現する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、前記細胞中にトランスフェクトされる第１の発現ベクター上でコードされる、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記ポリペプチドに対する前記細胞の特異的産生性が、前記増加した量のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を含まない対応する細胞の特異的産生性よりも大きい、請求項５または６に記載の細胞。
【請求項８】
前記ポリペプチドが分泌されたタンパク質である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
前記第１の発現ベクターが、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、前記抗体の軽鎖または重鎖をコードする第２の発現ベクターをさらに含み、前記第１の発現ベクターおよび該第２の発現ベクターが、該細胞中で該抗体を一緒に発現する、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞を培養する工程、細胞培養物内で該ポリペプチドを発現する工程、および該細胞培養物から該ポリペプチドを精製する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：
増加した量の抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞を提供する工程、
ポリペプチドをコードする第１の発現ベクターを該細胞中に導入する工程、および
該細胞中で該ポリペプチドを発現する工程
を包含し、該抗アポトーシス遺伝子は、好ましくはＢｃｌ−ｘＬである、方法。
【請求項１３】
前記方法が、前記細胞を前記第１の発現ベクターでトランスフェクトする工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞によるポリペプチド産生を増加させるための方法であって、該方法は、該細胞中で抗アポトーシス遺伝子の発現を増加させる工程を包含し、該抗アポトーシス遺伝子は、好ましくはＢｃｌ−ｘＬである、方法。
【請求項１５】
前記方法は、抗アポトーシス遺伝子をコードする発現ベクターで前記細胞をトランスフェクトする工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、前記細胞培養物から前記ポリペプチドを精製する工程をさらに包含する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドに対する前記細胞の特異的産生性が、前記抗アポトーシス遺伝子の前記増加した発現を含まない対応する細胞の特異的産生性よりも大きい、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、ヒト細胞、マウス細胞またはハムスター細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、懸濁液中での増殖のために適応され、そして／または無血清培地中での増殖のために適応される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子が、ヒト、ネコ、ウシ、イヌ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ、ブタ、またはネズミＢｃｌ−ｘＬタンパク質をコードする、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが分泌されたタンパク質である、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする第１の発現ベクターを含む、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、前記抗体の軽鎖または重鎖をコードする第２の発現ベクターをさらに含み、前記第１の発現ベクターおよび該第２の発現ベクターが、該細胞中で該抗体を一緒に発現する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞により産生されるポリペプチドの量を増加させるための、抗アポトーシス遺伝子の増加した発現の使用。
【請求項２６】
細胞により産生されるポリペプチドの量を増加させるための、抗アポトーシス遺伝子をコードするベクターの使用。
【請求項２７】
前記細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない、請求項２５または２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗アポトーシス遺伝子は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記細胞が、ヒト細胞、マウス細胞またはハムスター細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記ポリペプチドに対する前記細胞の特異的産生性を増加させる、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記細胞が、前記ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、真核生物細胞によるタンパク質産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物細胞によって産生されるタンパク質は、有意な治療的価値を有し得る。このようなタンパク質は、真核生物細胞によって天然に産生され得るか、または真核生物細胞が、組換え分子生物学技術によって操作されて、異種タンパク質を産生し得る。天然または人工のいずれかによって産生されるタンパク質の非限定的な例としては、エリスロポエチン、インシュリン、および第ＩＸ因子が挙げられる。
【０００３】
真核生物細胞培養物において、培養された細胞からのタンパク質の産生は、比活性（すなわち、細胞当たりに産生されるタンパク質の量）およびバイオリアクター実施の過程にわたる生細胞質量の合計（ＩＣＡ）の関数である。しかし、培養細胞によるタンパク質の産生は、バイオリアクター中での細胞死によって制限される。２つの形態の細胞死（壊死およびアポトーシス）が存在する。壊死は、代表的に細胞に対する外傷性損傷または傷害に起因する細胞死の１つの形態である。剪断力および気泡は、バイオリアクターにおける壊死の推定される原因である。アポトーシス（プログラム細胞死としても公知）は、種々のシグナル伝達経路によって、細胞自体が破壊する細胞死の１つの形態である。アポトーシス刺激の例としては、増殖因子の除去、種々の栄養の制限および毒素への曝露が挙げられる。バイオリアクターにおける細胞死の問題についての最近の文献は、主要な寄与としてアポトーシスの概念を支持する（Ｍｏｏｒｅ  Ａら、”Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１，１９９５；Ｇｏｓｗａｍｉ  Ｊら、”Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｂａｔｃｈ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．６２：６３２−６４０，１９９９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
タンパク質が細胞によって天然に産生されるタンパク質であるか、またはタンパク質が細胞に対して異種のタンパク質であるかに関わらず、細胞のタンパク質産生を増強するための手段として、細胞寿命を延長するための方法を同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、タンパク質が細胞によって天然に産生されるタンパク質であるか、またはタンパク質が細胞に対して異種のタンパク質であるかに関わらず、細胞のタンパク質産生を増強するための手段として、細胞寿命を延長するための方法を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
増加した量のＢｃｌ−ｘＬを含む細胞であって、該細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない、細胞。
（項目２）
前記細胞が、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、昆虫細胞または両生類細胞である、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記細胞が、ヒト細胞、マウス細胞またはハムスター細胞である、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記細胞が、ハムスター細胞である、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目４に記載の細胞。
（項目６）
前記細胞が、懸濁液中での増殖のために適応される、項目１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目７）
前記細胞が、無血清培養液中での増殖のために適応される、項目１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
（項目８）
前記培養液がブチレートを含む、項目７に記載の細胞。
（項目９）
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質が、細胞中へと導入される発現ベクターから発現される、項目１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
（項目１０）
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質が、前記細胞以外の異なる種である、項目１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
（項目１１）
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒトである、項目１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
（項目１２）
前記細胞が、ポリペプチドをコードする第１の発現ベクターをさらに含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
（項目１３）
前記ポリペプチドが分泌されたタンパク質である、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖または重鎖、項目１２に記載の細胞。
（項目１５）
前記第１の発現ベクターが、前記抗体の前記軽鎖および前記重鎖の両方をコードする、項目１４に記載の細胞。
（項目１６）
前記細胞が、前記抗体の前記軽鎖または前記重鎖をコードする第２の発現ベクターをさらに含み、前記第１のおよび該第２の発現ベクターが、該細胞中で該抗体を一緒に発現する、項目１４に記載の細胞。
（項目１７）
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、項目１〜９のいずれか１項に記載の細胞を培養する工程および細胞培養物から該ポリペプチドを精製する工程を包含する、方法。
（項目１８）
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：
増大した量のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を含む細胞を提供する工程であって、該細胞が、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない、工程；
ポリペプチドをコードする第１の発現ベクターを該細胞中に導入する工程；および
該細胞中で該ポリペプチドを発現する工程
を包含する、方法。
（項目１９）
前記細胞の培養物から前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ポリペプチドが、前記細胞培養物の培地から単離される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞が、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、昆虫細胞または両生類細胞である、項目１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が、ヒト細胞、マウス細胞またはハムスター細胞である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記細胞が、ハムスター細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞が、培養液中での増殖のために適応される、項目１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記細胞が、無血清培養液中での増殖のために適応される、項目１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記培養液が、ブチレートを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質が、前記細胞中へと導入される発現ベクターから発現される、項目１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質が、前記細胞以外の異なる種である、項目１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒトである、項目１８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記ポリペプチドが、分泌されたタンパク質である、項目１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記ポリペプチドが、抗体の軽鎖または重鎖である、項目１８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の発現ベクターが、前記抗体の前記軽鎖および前記重鎖の両方をコードする、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記抗体の軽鎖または重鎖をコードする第２の発現ベクターを細胞中に導入する工程をさらに包含し、前記第１および該第２の発現ベクターが、該細胞中で該抗体を一緒に発現する、項目３２に記載の方法。
【０００６】
従って、１つの局面において、本発明は、細胞によるタンパク質産生を増加させるための方法を提供し、この方法は、この細胞中で抗アポトーシス遺伝子の発現を増加させる工程を包含する。特定の実施形態において、この細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない。特定の実施形態において、この細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、昆虫細胞、または両生類細胞である。
【０００７】
別の局面において、本発明は、細胞による異種タンパク質の産生を増加させるための方法を提供し、この方法は、この細胞中で抗アポトーシス遺伝子の発現を増加させる工程を包含し、ここで、この細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、細胞によるタンパク質産生を増加させるための方法を提供し、この方法は、この細胞中でのＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を増加させる工程を包含し、ここで、この細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない。
【０００９】
特定の実施形態において、この細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、昆虫細胞、または両生類細胞である。
【００１０】
別の局面において、本発明は、細胞による異種タンパク質の産生を増加させるための方法を提供し、この方法は、この細胞中でのＢｃｌ−ｘＬ遺伝子の発現を増加させる工程を包含し、ここで、この細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない。
【００１１】
さらなる局面において、本発明は、抗アポトーシス遺伝子の増加した発現を含むが、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない細胞を提供し、ここで、この細胞は、抗アポトーシス遺伝子の増加した発現を含まない細胞と比較して、増加した量のタンパク質を産生する。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増加した発現を含むが、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない細胞を提供し、ここで、この細胞は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増加した発現を含まない細胞と比較して、増加した量のタンパク質を産生する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、抗アポトーシス遺伝子および目的のタンパク質をコードする遺伝子の増加した発現を含むが、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない細胞を提供し、ここで、この細胞は、抗アポトーシス遺伝子の増加した発現を含まない細胞と比較して、増加した量の目的のタンパク質を産生する。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子および目的のタンパク質をコードする遺伝子の増加した発現を含むが、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない細胞を提供し、ここで、この細胞は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子の増加した発現を含まない細胞と比較して、増加した量の目的のタンパク質を産生する。
【００１５】
本発明は、増加した量のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を含む細胞を提供し、ここで、この細胞は、異種サイクリン依存性キナーゼインヒビターを発現しない。この細胞は、哺乳動物、げっ歯類、昆虫、または両生類の細胞（例えば、ヒト、マウスまたはハムスターの細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞））であり得る。さらに、この細胞は、懸濁液中での増殖または無血清培地（例えば、ウシ胎仔血清）中での増殖のために適合され得る。無血清であるか否かに関わらず、細胞を培養するために使用される培地は、さらに、タンパク質の収量を増加させるために、ブチレート（例えば、酪酸ナトリウム）を含み得る。
【００１６】
Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質は、細胞内に導入される発現ベクターから発現され得るか、または例えば、遺伝子の内因性プロモーターを導入することによって、細胞の内因性Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を過剰発現するように作製され得る。Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質は、細胞の種とは異なる種であり得る。例えば、以下に示されるように、ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質は、細胞を得るために、チャイニーズハムスター卵巣細胞中で、本発明の方法で発現され得る。
【００１７】
本発明の細胞は、すぐ上に記載されるように、細胞によって既に産生されているか、またはタンパク質（例えば、分泌タンパク質）をコードする発現ベクターを誘導することによって外来的に発現されるかのいずれかである、タンパク質の力強い産生に特に有用である。本発明の細胞がクローン化されたモノクローナル抗体を発現するために使用される場合、この細胞は、重鎖および軽鎖の両方、または２つのベクターを発現する１つのベクターを含み得、各々が、重鎖または軽鎖を発現する。
【００１８】
従って、本発明は、さらに、本発明の細胞を培養することによってポリペプチドを産生し、そして細胞培養物からポリペプチドを精製する方法を包含する。
本開示において引用される全ての刊行物または他の文書は、本明細書によって参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、本発明の非限定的なベクターである、Ｂｃｌ−ｘＬ−ｎｅｏプラスミドの概略的表示である。このベクター中のＢｃｌ−ｘＬの発現は、ＣＭＶ極初期プロモーターによって駆動され、そしてネオマイシン遺伝子が、選択マーカー（Ｇ４１８の存在下での耐性のため）を提供する。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、１０個の非制限Ｂｃｌ−ｘＬトランスフェクトチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＧ４４細胞のうちの５個および２つのコントロール（すなわち、非トランスフェクトＤＧ４４宿主および空のベクターでトランスフェクトしたＤＧ４４）についての、時間にわたる生細胞密度（ＶＣＤ）（図２Ａ）および時間にわたる生存能力パーセント（生存能力％）を示す増殖曲線の概略的表示である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、示される時間にわたる生細胞密度（ＶＣＤ）（図３Ａ）おおび生存能力パーセント（生存能力％）（図３）によって測定される、Ｇ４１８の非存在下で培養された、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬクローン＃３（本発明の非制限的なクローン）および２つのコントロール（すなわち、非トランスフェクトＤＧ４４  ＣＨＯ宿主および空のベクターでトランスフェクトされたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞）を示す増殖曲線の概略的表示である。
【図４】図４は、本発明の非制限的なＢｃｌ−ｘＬをトランスフェクトされた細胞（ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３（黒棒））、空のベクターでトランスフェクトされたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞（中程度の灰色の棒）、および非トランスフェクトＤＧ４４  ＣＨＯ宿主細胞（明るい灰色の棒）において、１２日間、毎日測定した、カスパーゼ−３活性を示す棒グラフである。
【図５】図５は、ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を用いて、本発明の以下の非制限的な細胞の細胞溶解物をプローブするウェスタンブロット分析の表示である：ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３細胞（左レーン）、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８細胞（中間レーン）、および空のベクターでトランスフェクトされたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞（右レーン）。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、本発明の以下の非制限的な細胞についての、時間にわたる生細胞密度（ＶＣＤ）（図６Ａ）および時間にわたる生存能力パーセント（生存能力％）（図６Ｂ）を示す増殖曲線の概略的表示である：ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３（黒丸）、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８（青三角）、および非トランスフェクトＤＧ４４宿主（白丸）。
【図７Ａ】図７Ａは、Ｂｃｌ−ｘＬ−ｚｅｏプラスミド（本発明の非制限的なベクター）の概略的表示である。このベクター中のＢｃｌ−ｘＬの発現は、ＣＭＶ極初期プロモーターによって駆動され、そしてゼオシン遺伝子が、選択マーカー（ゼオシンの存在下での耐性のため）を提供する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＡＱＣ２に特異的に結合する抗体を用いて染色することによって決定される、親１００ＡＢ−３７細胞（灰色［緑色］線）およびＢｃｌ−ｘＬトランスフェクトされた１００ＡＢ−３７細胞のプール（太字黒色［青色］線）によるＡＱＣ２の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムの概略的表示である。コントロール（黒線）は、同じ抗ＡＱ２抗体を用いて染色されたＤＧ４４宿主細胞であった。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、本発明の以下の非制限的な細胞についての、時間にわたる生細胞密度（ＶＣＤ）（図８Ａ）および時間にわたる生存能力パーセント（生存能力％）（図８Ｂ）を示す増殖曲線の概略的表示である：１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃１１（紫色菱形）、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２１（黒色三角）、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２５（赤色丸）、および１００ＡＢ−３７親（青色丸）。
【図９】図９は、本発明の以下の非制限的な細胞についての、ＡＱＣ２力価を示す線グラフである：１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃１１（紫色菱形）、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２１（黒色三角）、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２５（赤色丸）、および１００ＡＢ−３７親（青色丸）。１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物は、スピナーフラスコにおいて培養されたスループットにおいて、有意に高い力価および８０％までの増加を実証した。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、本発明の以下の非制限的な細胞についての、時間にわたる生細胞密度（ＶＣＤ）（図１０Ａ）および時間にわたる生存能力パーセント（生存能力％）（図１０Ｂ）を示す増殖曲線の概略的表示である：２リットルモデルバイオリアクター中の、１００ＡＢ−３７親実施１（塗り潰されていない青色菱形）、１００ＡＢ−３７親実施２（塗り潰されていない赤色四角）、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２１、実施１（黒色三角）、および１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２１、実施２（赤色四角）。これらの結果は、より小さいスケールのスピナー培養物中で得られた先の結果と一致した。
【図１１】図１１は、本発明の以下の非制限的な細胞についての、ＡＱＣ２力価を示す線グラフである：２リットルモデルバイオリアクター中の、１００ＡＢ−３７親実施１（白色三角）、１００ＡＢ−３７親実施２（白色四角）、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２１、実施１（黒色三角）、および１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離物＃２１、実施２（赤色四角）。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、本発明の以下の非制限的な細胞についての、時間にわたる生細胞密度（ＶＣＤ）（図１２Ａ）および時間にわたる生存能力パーセント（生存能力％）（図１２Ｂ）を示す増殖曲線の概略的表示である：化学規定増殖培地（ＣＤＭ）においてスピナーで培養された、１００ＡＢ−３７／２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬ（緑色四角）および３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬ（白色菱形）。
【図１３】図１３は、本発明の以下の非制限的な細胞についての、ＡＱＣ２力価を示す線グラフである：化学規定増殖培地（ＣＤＭ）においてスピナーで培養された、１００ＡＢ−３７／２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬ（緑色四角；リードＢｃｌ−ｘＬ発現サブクローン）および３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬ（白色菱形；親のリードサブクローン）。
【図１４】図１４は、本発明の以下の非制限的な細胞において、１２日間、毎日測定した、カスパーゼ−３活性を示す棒グラフである：２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬ（赤色棒；リードＢｃｌ−ｘＬ−発現サブクローン）および３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬ（灰色棒；親のリードサブクローン）。
【図１５】図１５は、本発明の以下の非制限的な細胞による、ＡＱＣ２分泌の量を示す棒グラフである：振盪フラスコ中での２ｍＭ酪酸ナトリウムの非存在下（白色棒）または存在下（黒色棒）での、１００ＡＢ−３７親細胞、１００ＡＢ−３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬ細胞（親のリードサブクローン）、１００ＡＢ−３７．２１  Ｂｃｌ−ｘＬ細胞、および１００ＡＢ−３７−２１．１５  Ｂｃｌ−ｘＬ細胞（リードＢｃｌ−ｘＬ発現サブクローン）。
【図１６】図１６は、本発明の以下の非制限的な細胞についての生存能力％の棒グラフである：振盪フラスコ中での２ｍＭ酪酸ナトリウムの非存在下（白色棒）または存在下（赤色棒）での、１００ＡＢ−３７親細胞、１００ＡＢ−３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬ細胞（親のリードサブクローン）、１００ＡＢ−３７．２１  Ｂｃｌ−ｘＬ細胞、および１００ＡＢ−３７−２１．１５  Ｂｃｌ−ｘＬ細胞（リードＢｃｌ−ｘＬ発現サブクローン）。
【図１７】図１７は、本発明の以下の非制限的な細胞中のカスパーゼ−３活性を示す棒グラフである：振盪フラスコ中での２ｍＭ酪酸ナトリウムの非存在下（青色棒）または存在下（赤色棒）での、１００ＡＢ−３７親細胞、１００ＡＢ−３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬ細胞（親のリードサブクローン）、１００ＡＢ−３７−２１  Ｂｃｌ−ｘＬ細胞、および１００ＡＢ−３７−２１．１５  Ｂｃｌ−ｘＬ細胞（リードＢｃｌ−ｘＬ発現サブクローン）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中で引用される特許および科学的文献は、当業者に利用可能である知識を確立する。本明細書中で引用されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む発行された米国特許、認可された出願、公開された外国出願、および参考文献が、各々が具体的にかつ個別に参考として援用されるように示されるのと同じ程度に、参考として本明細書により援用される。
【００２１】
本発明は、抗アポトーシス遺伝子（例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ）が細胞中で発現される場合、この細胞はより多くのタンパク質を産生するという発明者の予期されない発見から生じた。驚くべきことに、抗アポトーシス遺伝子および第２のタンパク質（例えば、異種タンパク質）を同時発現する細胞は、生存細胞数の増大を示さない。本発明は、インビトロ（すなわち、組織培養物中）およびインビボの両方において、細胞によるタンパク質産生を増大させる方法を可能にする。
【００２２】
多くの異なる遺伝子が、アポトーシスおよび壊死を含む細胞死の誘導および予防に関する。２つの遺伝子（Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ｘＬ）が、抗アポトーシス活性を有すると同定された。例えば、Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６（５）：４６８−７２，１９９８）は、３つの異なるタンパク質（Ｂｃｌ−ｘＬ、ｐ２７（サイクリン依存キナーゼインヒビター）およびＳＥＡＰ（分泌型アルカリンホスファターゼ））を誘導性により発現するよう操作された、操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞を記載する。これらのタンパク質発現の誘導において、これらの細胞は、ｐ２７によりＧ１期に保たれ、これは、ＳＥＡＰ産生における増大を可能にした。Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  Ａ．Ｊ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７（５）：５４４−５５４，２０００）は、ＩＬ−１２タンパク質を発現するよう操作された組換えαウイルスベクターでの感染によりＢＨＫ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の細胞死の誘導を記載する。これらの感染した細胞の寿命は、これらの細胞におけるＢｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬの過剰発現により延長され、これにより細胞がより多くのＩＬ−１２を産生することを可能にする。実際、他の非αウイルス感染が細胞死刺激（ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｓｔｉｍｕｌｉ）を誘導した後に、ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞におけるＢｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬの過剰発現が、グルコース欠乏の期間延長、血清投与中止および塩化アンモニウムでの処置を含めて、細胞の寿命を延長することが出来た（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  Ａ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７（５）：５５５−５６４，２０００）。
【００２３】
従って、本発明に従って使用されるように、「抗アポトーシス遺伝子」は、遺伝子が由来する種に関わらず、Ｂｃｌ−２タンパク質をコードする遺伝子もしくはＢｃｌ−ｘＬタンパク質をコードする遺伝子（または、Ｂｃｌ−２タンパク質もしくはＢｃｌ−ｘＬタンパク質をそれぞれコードする、他の核酸（例えば、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡ））を意味する。例えば、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子は、ヒト由来であり得る（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ２３１１５またはＬ２０１２１；Ｂｏｉｓｅら、Ｃｅｌｌ  ７４（４）：５９７−６０８，１９９３）。本発明の他の非限定的なＢｃｌ−ｘＬ抗アポトーシス遺伝子としては、ネコＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０８０９５１）；ウシＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２４５４８９）；イヌＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０７３９８３）；Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿４９４１３４）；ブタＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２１６２０５またはＡＪ００１２０３）；マウスＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５１２７８，Ｙａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７（５）：６２９−６３９，１９９７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ８３５７４；およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３５０４９）；ならびにラットＢｃｌ−ｘＬ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３４９６３；Ｔｉｌｌｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６（１）：２３２−２４１，１９９５）が挙げられる。
【００２４】
同様に、Ｂｃｌ−２遺伝子は、ヒト由来であり得る（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４７４５；Ｃｌｅａｒｙら、Ｃｅｌｌ  ４７（１）：１９−２８，１９８６）。本発明の他の非限定的な抗アポトーシスＢｃｌ−２遺伝子としては、ラットＢｃｌ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３４９６４；Ｔｉｌｌｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６（１）：２３２−２４１，１９９５）；ウシＢｃｌ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９２４３４）；ニワトリＢｃｌ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１１９６１；Ｃａｚａｌｓ−Ｈａｔｅｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３２（１）：１０９−１１３，１９９２）；ならびにネズミＢｃｌ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００９７４１，Ｍ１６５０６，およびＬ３１５３２；Ｎｅｇｒｉｎｉ，Ｃｅｌｌ  ４９（４）：４５５−４６３，１９８７）が挙げられる。
【００２５】
生物薬剤学の分野において、培養された細胞の死滅期の遅延についていくつかの利点が存在する。１つのこのような利点が産物を収集する機会である一方、細胞生存能力は依然として高く、これにより産物の破片（ｄｅｂｒｉｓ）および細胞溶解により産生される分解酵素に対する露出を減少させる。他の利点としては、より高い力価の結果として、高価なバイオリアクターの減少、スケールアップにおけるより良好な効率、単純化した下流プロセス、および改善した費用効果が挙げられる。
【００２６】
さらに、本発明は、化学的に規定された培地（ＣＤＭ）またはＰＦＭタンパク質非含有培地（ＰＦＭ）（これらは、細胞により産生されるタンパク質を精製するのに有用であるが、タンパク質非含有培地または化学的に規定された培地において増殖した細胞がアポトーシスに高度に感受性であるために、好まれない）のいずれかにおいて頑健であり得る細胞株の作製を可能にする。このような培地においてより頑健である細胞株の使用は、これが培地の費用に影響を与え、従って、現在の処方物においてより高価な（かつ規定の厳しい）培地成分を、除外するために、非常に好ましい。
【００２７】
従って、１つの局面において、本発明は、細胞によるタンパク質の産生を増大させるための方法を提供し、この方法は、細胞中の抗アポトシース遺伝子の発現を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、細胞は、異種サイクリン依存キナーゼインヒビターを発現しない。特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、昆虫細胞、または両性類細胞である。
【００２８】
別の局面において、本発明は、細胞による異種タンパク質の産生を増大するための方法を提供し、この方法は、細胞中の抗アポトーシス遺伝子の発現を増大させる工程を包含する。いくつかの実施形態において、細胞は、異種サイクリン依存キナーゼインヒビターを発現しない。
【００２９】
本明細書中で使用されるように、用語「細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）、昆虫、両生類（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、およびトリ由来の細胞を含むが、これらに限定されない全ての真核生物細胞を包含することに留意のこと。本発明における使用のための細胞の非限定的な実施例としては、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＩＨ−３Ｇ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｓｆ９細胞およびＡ５４９細胞（これら全ては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから市販されている）が挙げられる。
【００３０】
本明細書中で使用されるように、「発現を増大する」は、細胞中の抗アポトーシス遺伝子の発現レベルが最初の細胞中の発現レベルと比較して増大されることを意味する。例えば、抗アポトーシス遺伝子の発現が、抗アポトーシス遺伝子によりコードされる任意のタンパク質も発現しない細胞（例えば、以下に記載される親ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を参照のこと）において、抗アポトーシス遺伝子によりコードされるタンパク質の任意の発現が、抗アポトーシス遺伝子の発現を増大している。しかし、親細胞が抗アポトーシス遺伝子によりコードされるタンパク質のあるレベルを自然に発現する場合、アポトーシス遺伝子の「発現を増大する」と、親細胞により発現されたレベルと比較してタンパク質の増大したレベルを生じる。
【００３１】
本明細書中で使用されるように、「発現する」または「発現」は、抗アポトーシス遺伝子が細胞に転写され、および／または翻訳されてタンパク質を産生することを意味する。例えば、ヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子がマウス細胞中で発現される場合、このマウス細胞は、ヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質を産生する。当然、細胞が、本発明に従って、細胞における抗アポトーシス遺伝子の発現を増大させることによりタンパク質の産生を増大するように誘導される場合、細胞がその産生を増大させているタンパク質は、抗アポトーシス遺伝子によりコードされないことが理解される。例えば、ネイティブＢｃｌ−ｘＬ遺伝子が、マウス細胞中で発現される場合、本発明に従って、そのネイティブなマウスＢｃｌ−ｘＬタンパク質の増大したレベルを発現するマウス細胞がまた、非Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の産生を増大する。
【００３２】
従って、本発明に従って、本発明の細胞が目的のタンパク質の産生を増大させる場合、このタンパク質は、この細胞中で発現される抗アポトーシス遺伝子によりコードされるタンパク質を除く任意のタンパク質であり得る。タンパク質は、分泌型タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質であり得る。従って、タンパク質の非限定的な例としては、抗体、ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン）、インスリン、核タンパク質、リボソームタンパク質、エリスロポエチン、サイトカイン（例えば、インターロイキン−２またはβ−インターフェロン）、および血液因子（例えば、第ＩＸ因子）が挙げられる。このタンパク質は、細胞に対してネイティブなタンパク質であり得るか、または細胞に対して異種のタンパク質であり得る。
【００３３】
本明細書中で使用されるように、用語「ネイティブなタンパク質」は、細胞中で自然に生じる核酸分子によりコードされるタンパク質を意味する。従って、細胞がヒト細胞である場合、ヒトタンパク質は、細胞に対してネイティブなタンパク質であり得る。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「異種タンパク質」は、細胞中で自然に生じる核酸分子によりコードされないタンパク質を意味する。例えば、細胞がマウス細胞である場合、ヒト化マウス抗体は、その細胞に対して異種である抗体である。本発明の異種タンパク質の１つの非限定的な例は、ＡＱＣ２抗体であり、これは、細胞表面タンパク質、ＶＬＡ−１（例えば、ヒトＶＬＡ−１）と特異的に結合する。ＡＣＱ２抗体は、好ましくは、以下のハイブリドーマ細胞株の１つにより産生される抗体と同じ重鎖配列および／または軽鎖配列を含み、この全てが、ブダペスト条約に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）に寄託された：ｍＡＱＣ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ３２７３、２００１年４月１８日に寄託された）；ｈＡＱＣ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ３２７５、２００１年４月１８日に寄託された）；ｈａＡＱＣ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ３３５６、２００１年５月４日に寄託された）；およびｈｓＡＱＣ２（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ３２７４、２００１年４月１８日に寄託された）。これらの抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／０８３８５４に記載される。
【００３５】
本発明が、ハイブリドーマ細胞を含む細胞による抗体の増加した産生を包含することに留意のこと。例えば、ハイブリドーマ細胞が特定のモノクローナル抗体をコードする核酸分子を含む場合、この細胞によるモノクローナル抗体の改善された産生が、このハイブリドーマ細胞中の抗アポトーシス遺伝子の発現により、本発明に従って達成され得る。
【００３６】
非限定的な例において、ヒトＢ細胞は、特定の抗体をコードする核酸を含むと同定される。このＢ細胞は、当該分野で公知の標準的方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスでの感染）に従って不死化される。次に、ここで不死化されたＢ細胞による抗体の産生を改善するために、抗アポトーシス遺伝子が、Ｂ細胞中で発現され得る。例えば、抗アポトーシス遺伝子をコードする発現プラスミドが、細胞中に導入され得る。このようなプラスミドは、以下の実施例に記載される。あるいは、ネイティブなタンパク質が、細胞中で発現され、これにより、抗体の増大した産生を生じるように、Ｂ細胞自身の抗アポトーシス遺伝子によりコードされるタンパク質が、アップレギュレートされ得る。
【００３７】
本発明に従って、抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞は、異種サイクリン依存キナーゼインヒビター（すなわち、細胞中で自然に発生しない核酸分子によりコードされるサイクリン依存キナーゼインヒビター）を発現しない。特定の実施形態において、異種サイクリン依存キナーゼインヒビターは、ｐ２７である。特定の実施形態において、異種サイクリン依存キナーゼインヒビターは、ｐ２１である。
【００３８】
本発明に従って、２つの非限定的な異なるアプローチが、タンパク質の産生を増大するために採られ得る。１つのアプローチにおいて、新しい細胞株が作製され、これは抗アポトーシス遺伝子の増大した発現を有する。以下に記載されるように、１つのこのような非限定的な細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞を、作製した。抗アポトーシスヒト遺伝子、Ｂｃｌ−ｘＬが、これらの細胞において発現させ、安定にＢｃｌ−ｘＬを発現する細胞株を作製した。
【００３９】
このような細胞を作製する別の非限定的なアプローチにおいて、抗アポトーシス遺伝子がまた、この遺伝子を有する細胞中で見られ得るが、この遺伝子によりコードされるタンパク質を発現しない。例えば、ヒト細胞は、ヒトＢｃｌ−ｘＬ遺伝子を含むが、ヒトＢｃｌ−ｘＬを発現せず、ヒトＢｃｌ−ｘＬを発現するよう誘導され得る。このようなヒト細胞は、本発明の範囲内に含まれる。
【００４０】
一旦このような抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞株が確立されると、そのタンパク質が細胞に対して異種であるかまたは細胞に対してネイティブであるかに関わらず、増大した量のタンパク質を発現する状態である。例えば、Ｂｃｌ−ｘＬを発現するＣＨＯ細胞を使用して、増大した量のハムスタータンパク質を産生し得る。あるいは、異種タンパク質をコードする（例えば、ヒトβ−インターフェロンをコードする）核酸分子が、Ｂｃｌ−ｘＬを発現するＣＨＯ細胞中に（例えば、トランスフェクション、感染または形質転換によって）導入され得、ここで、Ｂｃｌ−ｘＬを発現しないＣＨＯ細胞と比較して、より多くの異種タンパク質がＢｃｌ−ｘＬ発現細胞により産生される。
【００４１】
従って、さらなる局面において、本発明は、抗アポトーシス遺伝子の増大した発現を含み、異種サイクリン依存キナーゼインヒビターを発現しない細胞を提供し、ここでこの細胞は、抗アポトーシス遺伝子の増大した発現を含まない細胞と比較して増大した量のタンパク質を産生する。
【００４２】
本発明の第２のアプローチにおいて、抗アポトーシス遺伝子の発現が、既に目的のタンパク質を産生している細胞において増大される。本発明の１つの非限定的な実施例において、ネズミＢｃｌ−ｘＬ遺伝子は、細胞がより多くのインスリンを産生するように、ヒトβ島細胞中で発現され得る（すなわち、既にヒトインスリンを産生している）。別の非限定的な実施例において、抗アポトーシス遺伝子が、異種タンパク質を既に発現している細胞（例えば、ヒトβ−インターフェロンを発現しているＣＨＯ細胞）中で発現され得、その結果、抗アポトーシス遺伝子の増大した発現を有する細胞が、抗アポトーシス遺伝子の増大した発現を有さない細胞よりもより多くの異種タンパク質を産生する。
【００４３】
従って、さらなる局面において、本発明は、抗アポトーシス遺伝子および目的のタンパク質をコードする遺伝子の増大した含む細胞を提供し、そして異種サイクリン依存キナーゼインヒビターを発現せず、ここで細胞は、抗アポトーシス遺伝子の増大した発現を含まない細胞と比較して、増大した量の目的のタンパク質を産生した。
【００４４】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態をさらに例示するよう意図され、本質的には限定しない。当業者は、慣習的に過ぎない実験法のみを使用して、本明細書中に記載される特定の物質および手順に対する多数の等価物を認識し、または確かめ得る。
【実施例】
【００４５】
（実施例Ｉ）
（高められたＣＨＯ細胞宿主の作製）
異種タンパク質の改善された発現のために潜在的に使用され得る、改善した増殖特性を有するＣＨＯ宿主を作製するために、Ｂｃｌ−ｘＬを、ＣＨＯ細胞中で発現させた。
【００４６】
これを行うために、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を、Ｂｏｉｓｅ  Ｌ．Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ  ７４：５９７−６０８：１９９３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ２３１１５をまた参照のこと）において提供されるＢｃｌ−ｘＬの配列に基づくオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’末端および３’末端にアニールするように設計されるオリゴヌクレオチドを使用することにより、単離した。使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである：５’ＰＣＲプライマー
【００４７】
【数１】
2011004771.tif 000003
（配列番号１）（ここで斜体の配列が、ＸｈｏＩ部位を有する加えられたリンカー領域である）および３’ＰＣＲプライマー
【００４８】
【数２】
2011004771.tif 000004
（配列番号２）（ここで斜体の配列は、ＸｂａＩ部位を有する加えられたリンカー領域である）。
【００４９】
Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子（ヒト脳由来、全Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから市販のＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、カタログ番号６００２５０を使用する）を使用して作製した。発現ベクターである、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから市販されている）を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてＢｃｌ−ｘＬ  ＰＣＲフラグメントを、直鎖状ベクター（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ）中に連結した。これは、図１Ａに模式的に描かれるプラスミドｐＢｃｌ−ｘＬ−ｎｅｏを生じる。
【００５０】
ｐＢｃｌ−ｘＬ−ｎｅｏプラスミドを使用して、標準的技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＩＮｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，ＮＹ，１９９３を参照のこと）に従うエレクトロポレーションを使用してＣＨＯ−ＤＧ４４宿主細胞をトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞が、ＡＴＣＣから市販されていることに留意のこと。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞は、Ｕｒｌａｕｂら、Ｃｅｌｌ  ３３：４０５−４１２，１９８３に記載されている通りである。コントロールとして、空のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターをまた、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。
【００５１】
エレクトロポレーション後、細胞を、Ｇ４１８非含有培地にて４８時間増殖させ、次いで４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ネオマイシン）の存在下で選択した。培地を変えたときに、接着生細胞を選択した一方、非接着性の死細胞を除去した。およそ２週間後、安定な単離株（ｉｓｏｌａｔｅ）を、選択した。
【００５２】
（実施例ＩＩ）
（高められたＣＨＯ細胞宿主の改善した増殖）
実施例Ｉに記載されるこれらのＢｃｌ−ｘＬトランスフェクト化細胞の細胞死速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を、次に元の改変されていない宿主細胞と比較した。
【００５３】
これを行うために、５０の単離株からの１０のＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ、空のベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、代表的にＧ４１８の非存在下で培養されたトランスフェクトされていない宿主ＣＨＯ細胞と並行して、Ｇ４１８を補充した無血清培地中で培養した。細胞を１０日間培養し、毎日計数した。流加様式について、培養物を、培養懸濁物を除去することなく、基質の容積の１５分の１を１日おきに供給した。図２Ａ（生存細胞濃度）および図２Ｂ（生存率パーセンテージ）に示されるように、両方のコントロール（すなわち、トランスフェクトされていないＤＧ４４宿主および空のベクターでトランスフェクトされたＤＧ４４）が、４日目におよそ２．６×１０６／ｍｌの最大ＶＣＤを示した。これに比べて、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬクローン番号２、３、８および９が、５日目に３．０×１０６／ｍｌ〜３．９×１０６／ｍｌにわたるピークＶＣＤに達し、クローン番号５が、６日目に３．１×１０６／ｍｌのピークに達した。クローン番号２、３および５に対する生存率パーセンテージが、６日目でそれぞれ９５％、９６％および８７％と高く保たれる一方、ＤＧ４４（すなわち、トランスフェクトされていない宿主）およびＤＧ４４ベクターのみ（すなわち、空のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞）コントロールについての生存率パーセンテージは、それぞれ５９％および５４％に落ちた。８日目までに、クローン番号２、３および５についての生存率パーセンテージは、それぞれ７６％、７９％および８１％であった一方、ＤＧ４４／ｎｅｏ（すなわち、空のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞）およびＤＧ４４コントロール（すなわち、トランスフェクトされていない宿主）についての生存率は、それぞれ４６％および１４％であった。
【００５４】
積分細胞面積（ＩＣＡ）は、一連の培養実験（ｒｕｎ）中の生存細胞の総数を表す成長プロフィール曲線より下の面積として定義される。８日目のＩＣＡの推定値（生存可能な細胞密度データに基づく）は、単離体＃２、＃３、＃５、および＃８が、ベクターコントロール（すなわち、空のベクターでトランスフェクトした宿主細胞）に対して、それぞれ、３８％、５１％、５２％、および５１％の増加したＩＣＡを有したことを示した。単離体＃２、＃３、＃５、および＃８について、コントロール培養物に対して上記で観察された増強した生存率の安定性は、少なくとも１０継代まで再現されかつ一貫していた（図５および図６における単離体＃８についてのデータを参照のこと）。平均して、ベクターのみのコントロールに対するＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ細胞のＩＣＡにおける増加は、トランスフェクトしていないＤＧ４４宿主コントロールに対して４０〜７５％、および３０〜１００％であった。増加した最大細胞密度および延長した細胞生存率のいずれも、増強したＩＣＡに寄与した。
【００５５】
次に、Ｇ４１８の存在または非存在が、Ｂｃｌ−ｘＬトランスフェクト細胞の増殖に何らかの効果を有するかどうかを決定するために、この細胞をＧ４１８の非存在下で培養した。これを行うために、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体および空のベクターでトランスフェクトしたコントロールならびにトランスフェクトしていないコントロールを、Ｇ４１８の非存在下で培養した。再度、時間に対する生存可能な細胞密度（ＶＣＤ）を表す成長曲線および時間に対する百分率生存率（％生存率）をモニターした。
【００５６】
図３Ａに示したように、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬクローン＃３（１つの例示的なＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体）は、８日目まで、４×１０６細胞／ｍｌの高くかつ延長した最大細胞密度を維持した。さらに、パーセント生存率は、１０日目に、ベクターコントロールにおいて２５％であったのと比較して、９０％であり（図３Ｂ）、そしてＩＣＡ（１１〜１２日間の実験について約３０×１０６細胞／ｍｌ）は、最大でＤＧ４４宿主より３倍高かった。この特性は、単離体＃２、＃３、および＃５について少なくとも７継代まで安定したが、＃８については安定しなかった（以下を参照のこと）。
【００５７】
（実施例ＩＩＩ）
（増強したＣＨＯ細胞宿主のさらなる特徴付け）
アポトーシスを検出し定量するための１つの手段は、サンプル溶解物におけるカスパーゼ−３のタンパク質分解活性の測定によるものである。カスパーゼ−３は、細胞のタンパク質分解性の分解によってアポトーシスの実行において重要な役割を果たす１つのカスパーゼである。アポトーシスを阻害することに対するＢｃｌ−ｘＬの公知の能力を考慮して、次に、Ｂｃｌ−ｘＬでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、カスパーゼ−３アッセイを使用してカスパーゼ活性について試験した。
【００５８】
カスパーゼタンパク質は、アスパラギン酸の後ろでタンパク質を切断する。アスパラギン酸より前の３つまたは４つのアミノ酸が、特異性を与えることが公知である。このことは、４つのアミノ酸を標識化したペプチドを、カスパーゼについての基質として使用することを可能にする。カスパーゼアッセイについて、使用したペプチド基質は、蛍光定量マーカーＡＭＣ（カタログ番号Ｐ−４１１、ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）で標識化したＤ（すなわち、アスパンラギン酸残基）を有する、アミノ酸配列ＤＥＶＤを有した。一旦切断が生じると、このマーカーは蛍光を発する。従って、切断がなければ、シグナルはほとんど観察されないか、または全く観察されなかった。
【００５９】
カスパーゼ−３タンパク質分解活性を、実施例ＩＩで記載したように培養したＣＨＯ細胞の溶解物から、１２日間、毎日決定した。サンプルからのＡＭＣの蛍光を、切断不可能なアナログＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ＢＩＯＭＯＬ  カタログ番号Ｐ−４１０）で処理したサンプルと比較し、カスパーゼ−３活性における増加の決定を可能にした。
【００６０】
ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３（実施例ＩおよびＩＩに従って生成した非制限Ｂｃｌ−ｘＬトランスフェクトＣＨＯ細胞）は、空のベクターコントロール細胞（すなわち、空のベクターでトランスフェクトしたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞）およびＤＧ４４  ＣＨＯコントロール細胞（すなわち、トランスフェクトしていない細胞）と比較した場合、最大カスパーゼ−３タンパク質分解活性の遅れた開始を示した。図４に示したように、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３における最大カスパーゼ−３タンパク質分解活性の開始は、１１日目に生じ、他の日では最小限の活性を示した。対照的に、ＤＧ４４宿主単独は、早くも５日目に２倍以上の高い最大活性を示したが、ＤＧ４４／ベクター単独コントロールは、開始８日目に最大に近い活性を示した（図４を参照のこと）。これらの結果は、抗アポトーシス遺伝子を用いる宿主細胞株の遺伝子操作が、延長した細胞生存率を導くことを実証した。
【００６１】
次に、Ｂｃｌ−ｘＬが実際にＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３において発現したか否かを決定するために、ウェスタンブロット分析を実施した。Ｂｃｌ−ｘＬの存在を、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３と同時に生成したＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８、Ｇ４１８耐性ＤＧ４４
ＣＨＯクローンにおいてもまた、評価した。これを行うために、ウェスタンブロットを、標準的な方法（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出、を参照のこと）に従って実施した。簡単に述べると、細胞溶解物を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅによって分解し、ニトロセルロース膜またはＰＶＤＦ膜へ転写した。この膜を、ヒトＢｃｌ−ｘＬに対して特異的に結合するマウスモノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ  ２Ｈ１２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販）を使用してブロットした。
【００６２】
図５に示したように、左のレーンで、Ｂｃｌ−ｘＬは、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３においてはっきりと発現された。しかし、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８（図５、中央のレーン）と、空のベクターでトランスフェクトしたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞（図５、右のレーン）のいずれによっても、Ｂｃｌ−ｘＬは発現されなかった。この結果は、Ｇ４１８選択の存在下または非存在下のいずれかで増殖させた単離体からの結果と同一であった。
【００６３】
実際に、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８を、選択についてＧ４１８の非存在下で増殖させた場合、トランスフェクトしていないＤＧ４４  ＣＨＯコントロール細胞と比較して、増強した生存を示さなかった。これを行うために、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８を、Ｇ４１８選択から取り出し、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３およびＤＧ４４宿主コントロールに対して評価した。時間に対する生存可能な細胞密度（ＶＣＤ）を表す成長曲線および百分率生存率（％生存率）を、実施例Ｉに記載したように評価した。ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８は、約５０％の向上したＩＣＡを伴ってＧ４１８耐性であり、同じ細胞を選択の非存在下で培養した場合、ＩＣＡにおける増加は、有意ではなかった（図６Ａを参照のこと）。さらに、時間に対するパーセント生存率は、向上されず、実際にはコントロールよりも悪くなった（図６Ｂを参照のこと）。
【００６４】
これらの結果は、発現がはっきりと検出されたＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃３のような他の単離体と比較した場合、ＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８における検出不可能なＢｃｌ−ｘＬ発現と、ＩＣＡにおける増強の欠如との間の相関を実証する。この結果はまた、Ｂｃｌ−ｘＬ発現が増強した増殖および増強した生存率と結び付けられることを実証する。選択的条件下でのＤＧ４４／Ｂｃｌ−ｘＬ＃８について、ＩＣＡにおいて観察された増加は、Ｇ４１８富化のプロセスが、Ｇ４１８の存在下での生存のためにさらなる強力な増殖伴って、ネオマイシン遺伝子（しかし、常にＢｃｌ−ｘＬ遺伝子ではない）を発現する細胞を生成することを示す。
【００６５】
（実施例ＩＶ）
（異種タンパク質を分泌するＢｃｌ−ｘＬトランスフェクト細胞株の作製）
上記の実施例は、細胞中に抗アポトーシス遺伝子であるＢｃｌ−ｘＬを発現することによる細胞死の遅延を介して、延長した細胞生存率を有するより強力なＣＨＯ宿主を生成することの実行可能性を確立した。Ｂｃｌ−ｘＬの用途をさらに拡大するために、次なる目標は、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子を用いて異種タンパク質を発現する確立したＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株をトランスフェクトし、そして予期された延長した生存率に起因する異種タンパク質の増加した生成について、Ｂｃｌ−ｘＬトランスフェクト細胞を試験することであった。
【００６６】
これを行うために、第２の構築物を上記実施例Ｉに記載したように生成したが、ゼオシン耐性遺伝子を用いた。簡単に述べると、Ｂｃｌ−ｘＬ  ＰＣＲフラグメント（実施例Ｉを参照のこと）を、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏＩ部位およびＸｂａＩ部位中にクローン化して（ここで、発現は、ＣＭＶ最初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によって駆動され、ゼオシン遺伝子は選択マーカーを提供する）、最終的なプラスミドｐＢｃｌ−ｘＬ−ｚｅｏを得た。このプラスミドの概略図を、図７Ａに示す。
【００６７】
ｐＢｃｌ−ｘＬ−ｚｅｏプラスミドは、細胞株１００ＡＢ−３７を（エレクトロポレーションによって）トランスフェクトするために使用し、この細胞株１００ＡＢ−３７は、モノクローナル抗体であるＡＱＣ２をコードする核酸分子で予めトランスフェクトしたＤＧ４４  ＣＨＯ細胞である。１００ＡＢ−３７親は、１０ｐｇ／細胞／日の比生産性（ｓ．ｐ．）でＡＱＣ２モノクローナル抗体を分泌する。
Ｂｃｌ−ｘＬ−ｚｅｏプラスミドでトランスフェクトした１００ＡＢ−３７細胞を、６００μｇ／ｍｌのゼオシンの存在下で培養した。次に、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の非存在下で培養したトランスフェクト体のプール、および選択的ゼオシンの存在下で培養したトランスフェクト体のプールを、ＡＱＣ２分泌について分析した。フローサイトメトリー分析を、結合抗体を使用してＡＱＣ２に対して実施した。図７Ｂに示したように、Ｂｃｌ−ｘＬトランスフェクト体から分泌されたＡＱＣ２（太い黒のヒストグラム）を、トランスフェクトしていない親（灰色）のＡＱＣ２およびコントロール（黒色）のＡＱＣ２と比較した。図７Ｂに示した結果は、ＡＱＣ２を発現しかつ分泌する能力は、Ｂｃｌ−ｘＬの存在によって抑制されなかったことを実証した。上記の細胞からサンプリングした馴化培地のＥＬＩＳＡによる力価分析は、フローサイトメトリーのデータを追認した。実際に、生産性は、改変していない親株（２．１×１０６細胞／ｍｌ）について１０５μｇ／ｍｌであったのに対して、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬプール（２．２４×１０６／ｍｌの細胞）について１５０μｇ／ｍｌで、Ｂｃｌ−ｘＬトランスフェクト細胞について高かった。
【００６８】
次に、Ｂｃｌ−ｘＬトランスフェクト１００ＡＢ−３７細胞の個々の単離体を生成し、ＡＱＣ２の分泌についてスクリーニングし、ＡＱＣ２力価（すなわち、単離体によって分泌されたＡＱＣ２抗体の量）に従って順位付けした。最も高い力価を発現する８つの１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体を、ゼオシン選択から取り出し、そしてスピナーフラスコ中での増殖および力価（以下を参照のこと）についての試験の前に、安定のためにさらに培養した。実施例Ｉに記載したように、フィードバッチモード（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ
ｍｏｄｅ）（上記）において１４日間の期間にわたり、成長曲線および％生存率を細胞死動力学のパラメーターとしてモニターし、親コントロールと比較した。図８Ａに示したように、６日目に、親株の％生存率は９５％であり、これは徐々に減少して１３日目に６２％であったが、上位３つのＢｃｌ−ｘＬ単離体（＃１１、＃２１、および＃２５）は、８４％〜９６％の範囲にわたる高い％細胞生存率を維持した。興味深いことに、保持された高い％生存率は、全体の細胞密度が増加しなかったため、改変していない親に対してＩＣＡにおける有意な増加を生じなかった（図８Ｂ）。Ｂｃｌ−ｘＬクローン＃２５のみが、ＩＣＡにおいて中程度の２０％の増加を示した（図８Ｂを参照のこと）。
【００６９】
生存率が保持されたことが理由で生産性が向上したのかどうかを評価するために、分泌されたＡＱＣ２の力価を、上記のように評価した８つの１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体上に結合するプロテインＡ−ＨＰＬＣによってアッセイした。試験した８つの単離体のうち５つもの多くが、培養の１２日目に、親コントロールの２３６μｇ／ｍｌと比較して、３０６〜４３４μｇ／ｍｌの範囲にわたる向上した力価を有した（以下を参照のこと）。図９に示したように、予めより高い％生存率を維持することを示したクローン１１、２１、および２５からのプロテインＡ力価データ（図８Ａおよび８Ｂを参照のこと）は、生産性において有意な増強を示した。
【００７０】
１４日目のプロテインＡ力価データは、以下の表Ｉに示したようであった。
【００７１】
（表１）
【００７２】
【表１】
2011004771.tif 000005
（スループットは、ｇ／Ｌ／日（すなわち、総力価に到達するまでに要した日数＋２日（バイオリアクター転換時間として）で除算した総力価）であることに留意すること。従って、力価におけるパーセント増加は、スループットにおけるパーセント増加と同値である）。
【００７３】
表Ｉが実証するように、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体＃１１、＃２１、および＃２５（８４％以上の％生存率）は、親（％生存率  ６２％）からの２８８μｇ／ｍｌと比較して、それぞれ、３６８μｇ／ｍｌ、４４１μｇ／ｍｌ、および５２２μｇ／ｍｌの力価を生じた。クローンのスループット（すなわち、力価）における増加は、単離体＃１１についての２８％から最高値の単離体＃２１についての８１％までの範囲であった。比生産性もまた、１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体において増強された（９ｐｇ／細胞／日と比較して１２〜１４ｐｇ／細胞／日）。
【００７４】
力価において特徴的な増加を示す先の結果の妥当性を評価するために、２Ｌ規模のバイオリアクターの制御した環境下で、評価を繰り返した。このサイズのバイオリアクターは、代表的には、２００Ｌの製造規模のバイオリアクターをモデルとするために使用される。最も望ましい１００ＡＢ−３７／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体である＃２１を、１００ＡＢ−３７親と並んで二連のバイオリアクター中で実験した。成長曲線および％生存率を、フィードバッチモードで実験した培養物において１３日間の期間にわたり、親コントロールと比較した細胞死動力学のパラメーターとしてモニターした。Ｂｃｌ−ｘＬ含有細胞は、１３日目に、依然として８４〜８９％で％生存率が高かったが、親細胞株生存率は、すでに減少しており、１３日目に６０〜６６％であった（図１０Ｂ）。上記のスピナーデータ（図８Ａおよび図８Ｂを参照のこと）から予測されるように、維持されたより高い％生存率は、全体の細胞密度が増加しなかったため、改変していない親に対してＩＣＡにおける有意な増加を生じなかった（図１０Ａ）。
【００７５】
さらに、小規模のスピナーデータ（図９を参照のこと）と一致して、１００ＡＢ−３７．２１／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体＃２１はまた、プロテインＡ結合によって決定されるように、有意に高い力価および２Ｌバイオリアクター中で増殖されたスループットにおいて６０％までの増加を生じた（図１１）。
【００７６】
１４日目でのプロテインＡ力価データは、以下の表ＩＩに示すようであった。
【００７７】
（表２）
【００７８】
【表２】
2011004771.tif 000006
プロテインＡ結果は、１００ＡＢ−３７．２１／Ｂｃｌ−ｘＬ単離体＃２１が、１３日目に、親株についてわずか３６８ｍｇ／Ｌに対して、５９１ｍｇ／Ｌを生じたことを示し、このことは、力価およびスループットにおける６０％増加を表す（図１１および表ＩＩ）。力価における有意な増加は、開始７日目および９日目に顕著であり、そして実験を通して継続した（図１１を参照のこと）。上記で観察されたように、０日目〜１３日目までのＩＣＡは、有意に異ならなかった；さらに、比活性は、１１．５〜２２ｐｇ／細胞／日まで２倍であった（表ＩＩ）。
【００７９】
さらに、ウェスタン分析（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）およびこれらのバイオリアクター実験に由来するＡＱＣ２  ｍＡＢ生成物の糖質分析は、生成物の質における変化を示さなかった。
【００８０】
（実施例Ｖ）
（異種タンパク質を分泌するＢｃｌ−ｘＬトランスフェクト細胞株のさらなる特徴づけ）
１００ＡＢ−３７．２１／Ｂｃｌ−ｘＬ分離株（＃２１）を、クローンであると確認しなかったので、ΔＢｃｌ−ｘＬ１００ＡＢ−３７分離株とこの１００ＡＢ−３７．２１／Ｂｃｌ−ｘＬ分離株（＃２１）との両方をさらにサブクローニングすると、このΔＢｃｌ−ＸＬ１００ＡＢ−３７分離株は、トランスフェクトされていない親１００ＡＢ−３７細胞株でのサブクローンであった。これを行ったのは、各々の細胞から最も所望されるサブクローンの比較によって、Ｂｃｌ−ｘＬ分離株とΔＢｃｌ−ｘＬ分離株との間のより厳密の比較が提供されるからである。これを行うために、等価な数のサブクローンを、細胞株の各々についてスクリーニングした。生成し、そして、より優れた増殖性および高い力価を生じる能力にしたがって順位付けした、選択されたサブクローンについて比活性を決定した（データ示さず）。次いで、このリードサブクローンＢｃｌ−ＸＬ分離株＃２１、すなわち、２１．１５を、スピナー管（ｓｐｉｎｎｅｒｓ  ｖｅｓｓｅｌ）中の非改変親１００ＡＢ−３７のリードサブクローン３７．３２に対して、評価および比較した。この評価のために選択された増殖培地は、殆ど動物由来成分を有さない化学規定増殖培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉａ；ＣＤＭ）であった。ＣＤＭは、規定されていない成分の除去、原料の変化量の低減、下流プロセスの複雑性の低減、および動物起源の潜在的な夾雑物の除去のために、大規模製造に所望される（Ｊａｙｍｅ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３３：２７−３６，２０００）。さらに、タンパク質含有量が著しく低減された環境によって、細胞を前処理してアポトーシスさせることが可能である（Ｍｏｏｒｅ  Ａ．ら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１−１１，１９９５  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．６４：１０８−１１９，１９９９）。したがって、Ｂｃｌ−ｘＬ発現の存在によって、このような培地条件の下でも頑強であることが維持される細胞株を提供し得る。
【００８１】
増殖曲線および生存率を、フェドバッチ形式で実施した培養物中で１４日間の期間に亘って親コントロールと比較する細胞致死速度論のパラメーターとして参照した（図１２Ａ）。しかし、図１２Ｂに示されるように、２１．１５  Ｂｃｌ−ｘＬ細胞は、１４日目までの培養の期間全体に亘って９０％を超える十分に高い生存率を維持したが、他方、３７．３２Ｂｃｌ−ＸＬサブクローンにおいて細胞死が、第９日目で起こり（７２％生存率）、そして、第１４日目までに４３％まで著しく低下した。これらの結果によって、Ｂｃｌ−ＸＬ過剰発現によって、特に細胞がアポトーシスを受けやすい培地条件の下で細胞死の時期を遅らせる。上述の観察から予測されるように、ＩＣＡにおいて有意な差異は存在しなかった。
【００８２】
次に、細胞生産性を評価するために、この分泌ＡＱＣ２の力価を、プロテインＡ−ＨＰＬＣ結合によって評価した。図１３に示されるように、リードサブクローン１００ＡＢ−３７／２１．１５Ｂｃｌ−ＸＬは、化学規定増殖培地（ＣＤＭ）中で培養した場合でさえ、著しく高い力価を生じ、リードサブクローン３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬと比較して８９％までのスループット（すなわち、力価）の増加を生じた。
【００８３】
第１４日目におけるプロテインＡ力価データを、以下に表ＩＩＩに示す。
【００８４】
【表３】
2011004771.tif 000007
表ＩＩＩが示すように、図１２Ａおよび１２Ｂに記載の培養物からとったサンプルのプロテインＡの結果は、親のリードサブクローンであるクローン３７．３２について３４１μｇ／ｍｌのみとは対照的に、Ｂｃｌ−ｘＬ  ２１．１５が第１４日目に６６７μｇ／ｍｌを産生したことを示した。このことは、スループットにおける８９％増加ほども示すときに、２１．１５細胞が、４３％として低い３７．３２細胞と比較して９３％というパーセント生存能力でいまだに高いということを示す（図１３および表ＩＩＩ）。さらに、この特異的な生産性は、１２〜２２ｐｇ／細胞／日（表ＩＩＩを参照のこと）から殆ど二倍になった。したがって、リードサブクローン１００ＡＢ−３７／２１．１５  Ｂｃｌ−ｘＬは、劇的に高い力価を生じ、そして、化学的規定増殖培地（ＣＤＭ）中で培養される場合でされも、リードサブクローン３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬと比較して８９％まで増加した。
【００８５】
Ｂｃｌ−ｘＬの過剰発現が、力価において観察された強化について原因となっている否かについて言及するために、Ｂｃｌ−ｘＬ発現およびカスパーゼ−３活性の検出および定量を含むアッセイを、実施した。フローサイトメトリーおよびウェスタン分析の両方によって、１００ＡＢ−３７／２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬ細胞における第３日の発現の増加から第５日における定常レベルの発現（データ示さず）を実証した。次に、１００ＡＢ−３７／２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬおよび３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬにおけるカスパーゼ活性を、評価した。カスパーゼ３アッセイは、図１３において記載されるように培養した（カスパーゼ３アッセイは、上述のように実施した）。
【００８６】
これらの結果は、カスパーゼ−３を、クローン２１．１５ＢＣｌ−ｘＬの産生の実施に亘りコントロールレベルと比較して劇的に抑制したが、他方、３７．３２における活性は、１４日間において、２１．１５における活性のほぼ１０倍に増大した（図１４を参照のこと）。２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬ発現細胞は、最小限のカスパーゼ−３活性をＣＤＭでの産生実行に亘って提示し、アポトーシスの活性抑制を実証した。このデータは、明らかに、Ｂｃｌ−ｘＬを過剰発現する細胞株におけるアポトーシスにおいて有意な遅延を示した。
【００８７】
（実施例ＶＩ）
（酪酸ナトリウムを含む培地中で培養された、異種タンパク質を分泌する細胞株をトランフェクトしたＢｃｌ−ｘＬの増加した生産性および生存率）
酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）を、試みとして一般的に使用して、転写を増大することによって、特定の異種タンパク質発現を増大させる（Ｃｈａｎｇら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｅｓ．３０：８５−９１，１９９９；Ｐａｌｅｒｍｏら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５−４７，１９９１；およびＬａｕｂａｃｈ，Ｖ．Ｅ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１８：８０２−８０７，１９９６）。しかし、増大した発現に必要なＮａＢｕの高い濃度に対する重大な欠点は、ＣＨＯ細胞中に生じることが公知のアポトーシスの迅速な誘発のネガティブな競合的効果である（Ｃｈａｎｇら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ  Ｅｓ  ３０：８５−９１，１９９９；ならびにＫｉｍおよびＬｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１：１８４−１９３，２０００−２００１）。この結果について、ＮａＢｕは、全ての細胞株において増大した力価に一般的に効果的でない。
【００８８】
Ｂｃｌ−ｘＬが成熟前のアポトーシスから細胞を保護する能力をさらに分析するために、細胞を、２ｍＭ  ＮａＢｕを含むか含まないＣＤＭ懸濁培養液に培養した振盪フラスコ中で４日間まで評価した。図１５に示されるように、付加的なＮａＢｕが、親１００ＡＢ−３７および単離物を発現する＃２１のＢｃｌ−ｘＬならびにそれぞれのサブクローン（３７．３２ＡＢｃｌ−ｘＬおよび２１．１５）の両方のＡＱＣ２生産性を実際に増大した。
【００８９】
さらに、上記の条件下で４日間、ＮａＢｕは、親および３７．３２ΔＢｃ１−ｘＬサブクローン中の力価を増大させたが、生存率の割合は、それぞれ、４１％および４６％まで有意に減少した（図１６を参照のこと）。対照的に、＃２１のＢＣｌ−ｘＬについての生存率の割合は、８０％以上のままであり、Ｂｃｌ−ｘＬ２１．１５細胞における生存率は、未変化の９６％のままであった（図１６を参照のこと）。これらの生存率の割合の結果は、＃２１のＢｃｌ−ｘＬ単離物およびサブクローン２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬにおけるＢｃｌ−ｘＬの発現によるＮａＢｕ誘導性アポトーシスの活性抑制を示す。
【００９０】
培養３日目に（すなわち、振盪フラスコ中ＣＤＭ懸濁培養物中）、アポトーシスのマーカーであるカスパーゼ３活性を、細胞中で測定した。図１７に示されるように、アポトーシスの有意な遅延が、Ｂｃｌ−ｘＬを発現する細胞株中で観察された。＃２１および２１．１５Ｂｃｌ−ｘＬ中のカスパーゼ活性が、２ｍＭブチレートの存在下で完全に抑制されなかったが、１００ＡＢ−３７および３７．３２ΔＢｃｌ−ｘＬと比較して有意に減少され、これは、４倍多い活性を示した（図１７）。これらの結果は、Ｂｃｌ−ｘＬ発現とＮａＢｕによって化学的に誘導されるアポトーシスの活性遅延との間のポジティブな相関を示す。
【００９１】
（等価物）
当業者は、通常の実験法しか使用せずに、本明細書中に詳細に記載される特定の実施形態に対する多数の等価物を、認識するかまたは確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【００９２】
（配列表）
【数１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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