(57)【要約】      （修正有）【課題】食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息などの激烈な症状を伴うアレルギー疾患の発症リスクを正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供する。【解決手段】NLRP3遺伝子の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてアレルギー疾患における劇症化を検査する方法。特定の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するアレルギー疾患劇症化検査用プローブ。特定の塩基を含む領域を増幅することのできるアレルギー疾患劇症化検査用プライマー。NLRP3遺伝子の発現量を分析し、該分析結果に基づいてアレルギー疾患劇症化を検査する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
NLRP3遺伝子の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてアレルギー疾患における劇症化を検査する方法。
【請求項２】
前記一塩基多型が、配列番号１〜５のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における多型である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アレルギー疾患における劇症化がアナフィラキシーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アレルギー疾患が食物アレルギーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記アレルギー疾患における劇症化が薬物過敏症である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記アレルギー疾患が喘息である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するアレルギー疾患劇症化検査用プローブ。
【請求項８】
配列番号１〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできるアレルギー疾患劇症化検査用プライマー。
【請求項９】
NLRP3遺伝子の発現量を分析し、該分析結果に基づいてアレルギー疾患劇症化を検査する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食物アナフィラキシーやアスピリン喘息などのアレルギー疾患における劇症化を予測するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーとは、「原因食物を摂取した後に免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状（皮膚、粘膜、消化器、呼吸器、アナフィラキシーなど）が惹起される現象」と定義され、我が国における有病率は乳児の5〜10%、学童以降の1〜2%の疾患である。ここ数年、食物アレルギーの有病率が上昇傾向にあり、その原因は明らかになっていない。この食物アレルギーの診断を確定するためには、現在のところ食物負荷試験を実施する以外に方法はない。しかしながら、この食物負荷試験を実施するにあたり、重篤な全身症状であるアナフィラキシーが惹起される危険性もあり、その発生を予測する手段はこれまでに存在しなかった。さらに、アレルギー患者に対する治療法の一つとして、微量なアレルゲン投与の繰り返しによって抗原に対する抵抗性を獲得させる減感作療法が実施されているが、その際にも突発的なアナフィラキシーが惹起される危険性があり、食物アレルギーにおける食物負荷試験と同様にその発生を予測する手段はこれまでに存在しなかった。
食物アレルギーは他のアレルギー疾患と同様に、遺伝要因と環境要因の総合的な寄与により発症する多因子疾患であると考えられているが、これまでに食物アレルギーの遺伝要因に関する研究は双生児研究以外にはほぼ実施されず、食物アナフィラキシーに関しても同様である。
【０００３】
また、アスピリン喘息（NSAIDs過敏症、NSAIDs不耐症）とは、プロスタグランディン合成酵素阻害（＝シクロオキシゲナーゼ阻害）作用を持つNSAIDs（解熱鎮痛薬）全般に対する過敏症状のことを指すが、成人気管支喘息患者の約１割にこの症状がみられ、鼻症状（鼻汁、鼻閉、鼻茸）および激烈な喘息症状が特徴である。成人気管支喘息に対する遺伝要因の研究はこれまでにも数多く報告されてきているが、アスピリン喘息に関してもまた、遺伝要因の研究は報告が僅かであり、その発生を遺伝的背景より予測する手段は未だに無い。
【０００４】
一方、NLRP3 (別名：NALP3, CIAS1, CRYOPYRIN, PYPAF1) は細胞内のNOD-like receptor familyであり、inflammasome形成によりCaspase-1を活性化させる。このCaspase-1活性化は、炎症性サイトカインであるIL-1β, IL-18の活性化および分泌を促す。
また、これまでにNLRP3遺伝子の非同義置換のSNP （一塩基多型）(Val198Met, Arg260Trp, Asp303Asn, Phe309Ser, Ala352Val, Leu353Pro, Ala439Val, Gly569Arg, Phe573Ser,
Glu627Gly) が、Familial cold autoinflammatory syndrome, Muckle-Wells Syndrome, CINCA syndrome発症の原因であることが報告され、さらに、NLRP3のSNP (4240T>C, rs3806265)とpsoriatic juvenile idiopathic arthritisの疾患感受性との関連や、NLRP3のintron 4に存在するVNTR (variable number tandem repeat)と本態性高血圧感受性との関連を示した報告もある（非特許文献１〜７）。
しかしながら、食物アナフィラキシーやアスピリン喘息などのアレルギー疾患における劇症化と、NLRP3遺伝子との関連はこれまで報告されてはいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Petrilli V. et al. The inflammasome: a danger sensing complex triggering innate immunity. Curr Opin Immunol. 19: 615-622, 2007.
【非特許文献２】Dinarello CA. Interleukin-1β, interleukin-18, and the interleukin-1β converting enzyme. Ann NY Acad Sci 856: 1-11, 1998.
【非特許文献３】Day TG. et al. Autoinflammatory genes and susceptibility to psoriatic juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 58: 2142-2146, 2008.
【非特許文献４】Omi T. et al. An intronic variable number of tandem repeat polymorphisms of the cold-induced autoinflammatory syndrome 1 (CIAS1) gene modifies gene expression and is associated with essential hypertension. Eur J Hum Genet. 14: 1295-1305, 2006.
【非特許文献５】Hoffman HM. et al. Mutation of a new gene encoding a putative pyrin-like protein causes familial cold autoinflammatory syndrome and Muckle-Wells syndrome. Nature Genet. 29: 301-305, 2001.
【非特許文献６】Dode C. et al. New mutations of CIAS1 that are responsible for Muckle-Wells syndrome and familial cold urticaria: a novel mutation underlies both syndromes. Am. J. Hum. Genet. 70: 1498-1506, 2002.
【非特許文献７】Feldmann J. et al. Chronic infantile neurological cutaneous and articular syndrome is caused by mutations in CIAS1, a gene highly expressed in polymorphonuclear cells and chondrocytes. Am. J. Hum. Genet. 71: 198-203, 2002.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息などの激烈な症状を伴うアレルギー疾患の発症リスクを正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、ヒトNLRP3遺伝子中に存在するSNPが食物アナフィラキシーの発症に関連することを同定し、さらにそのうち１カ所はアスピリン喘息の発症にも関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息などの激烈な症状を伴うアレルギー疾患の易罹患性の推定を正確に実施することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）NLRP3遺伝子の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてアレルギー疾患における劇症化を検査する方法。
（２）前記一塩基多型が、配列番号１〜５のいずれかの塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における多型である、（１）の方法。
（３）前記アレルギー疾患における劇症化がアナフィラキシーである、（１）または（２）の方法。
（４）前記アレルギー疾患が食物アレルギーである、（３）の方法。
（５）前記アレルギー疾患における劇症化が薬物過敏症である、（１）または（２）の方法。
（６）前記アレルギー疾患が喘息である、（５）の方法。
（７）配列番号１〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有するアレルギー疾患劇症化検査用プローブ。
（８）配列番号１〜５のいずれかの塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできるアレルギー疾患劇症化検査用プライマー。
（９）NLRP3遺伝子の発現量を分析し、該分析結果に基づいてアレルギー疾患劇症化を検査する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、これまでに予測が不可能であった食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息などの激烈な症状を伴うアレルギー疾患の易罹患性を正確かつ簡便に予測することができるようになった。このことは、患者の生命に関わる危険な状態を避けることができるようになるばかりか、今後の治療薬開発や、減感作療法におけるアナフィラキシーの発症リスクの予測に寄与すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（A）ヒトNLRP3遺伝子の構造と各SNPの位置を示す図。（B）NLRP3遺伝子領域に存在する５つの食物アナフィラキシー関連SNPsの連鎖不平衡（LD）マップ。LDは遺伝子タイピングデータから計算した。SNPｓのすべての組み合わせに対するPairwise r2 値をグレースケールで示す。
【図２】THP-1細胞を用いたrs4612666多型の機能解析。（A）トランスフェクションに用いたプラスミド。（B）トランスフェクション24時間後のルシフェラーゼ活性に基づいて測定したrs4612666の転写エンハンサー活性。相対的ルシフェラーゼ活性を平均値±標準偏差で示した。*P < .05 (Student's t-test)。（C）rs4612666のEMSAを示す図（写真）。非ラベルプローブを競合物（competitor）として加えた。
【図３】THP-1細胞を用いたrs10754558多型の機能解析。（A）トランスフェクションに用いたプラスミド。（B）ルシフェラーゼ活性に基づいて測定したmRNA安定性に対するrs10754558多型の効果。相対的ルシフェラーゼ活性を平均値±標準偏差で示した。*P < .0005 (Student's t-test)。（C）rs10754558のアレル特異的転写量解析（ASTQ）。結果を平均値±標準偏差で示した。*P < .05 (Mann-Whitney's U-test)。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、NLRP3遺伝子上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいてアレルギー疾患の劇症化を検査する方法である。「アレルギー疾患における劇症化」としては、アレルギー疾患における薬物過敏症やアナフィラキシーなどが例示され、より具体的には、アスピリン喘息および食物アナフィラキシーが例示される。なお、本発明において、「検査」とは劇症化アレルギー疾患のリスクの検査及びアレルギー疾患発症の有無の検査を含む。
【００１２】
NLRP3遺伝子としては、ヒトNLRP3遺伝子が好ましく、例えば、GenBank Accession No. NC_000001.9の245646098..245679033の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。なお、NLRP3遺伝子の塩基配列は人種の違いなどにより劇症化アレルギー疾患に関連する塩基以外の塩基において置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。
【００１３】
アレルギー疾患における劇症化に関連するNLRP3遺伝子の一塩基多型は、以下に示すSNP-1〜SNP-5が挙げられる。
【００１４】
【表１】
2011024478.tif 000002
【００１５】
表１において、例えば、SNP-1はGenBank Accession No. NT_004836.17の12341864番目の塩基におけるグアニン（G）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がAである場合はアレルギー疾患における劇症化の可能性が高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、SNP-1がAA＞GA＞GGの順でアレルギー疾患における劇症化の可能性が高い。SNP-1はNLRP3遺伝子のイントロン３に存在するSNPである。dbSNPはNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。
その他のSNPについても同様であるが、SNP-2の場合、T/CのうちTの場合がアレルギー疾患における劇症化の可能性が高く、SNP-3の場合、C/TのうちCの場合がアレルギー疾患における劇症化の可能性が高く、SNP-4の場合、C/GのうちGの場合がアレルギー疾患における劇症化の可能性が高く、SNP-5の場合、C/TのうちCの場合がアレルギー疾患における劇症化の可能性が高い。
【００１６】
なお、SNP-1〜SNP-5について、SNP塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１〜５に示した。それぞれ６１番目の塩基が多型を有する。
これらの塩基に相当する塩基を本発明においては解析する。ここで、「相当する」とは、ヒトNLRP3遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。
【００１７】
上記SNPの塩基の種類を調べることによって、アレルギー疾患における劇症化を検査することができる。検査するSNPの数は、一種類でもよいし、複数（ハプロタイプ解析）でもよい。なお、SNP-1〜SNP-3およびSNP−4〜SNP-5は連鎖不平衡の関係にあるため、それぞれから1種類ずつ選択してハプロタイプ解析してもよい。なお、NLRP3遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５の関係を満たす塩基をいう。
【００１８】
NLRP3遺伝子の遺伝子多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、肝細胞などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。遺伝子多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００１９】
NLRP3遺伝子の遺伝子多型の解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００２１】
また、PCRによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許2843586号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００２２】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、NLRP3遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００２３】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
このようにしてSNPがいずれの塩基であるかを決定することで、アレルギー疾患の劇症化を検査するためのデータを得ることができる。
【００２４】
また、本発明においては、上記SNP-3およびSNP-4においては、リスクアレルがNLRP3のmRNAの量の増加を引き起こし、それによりアレルギー疾患における劇症化のリスクが高まっていることが考えられた。このことから、NLRP3遺伝子の発現量を指標にしてアレルギー疾患における劇症化を予測をすることも可能である。例えば、NLRP3の発現量が健常者と比較して多いとき、アレルギー疾患における劇症化のリスクが高いなどと判定することができる。NLRP3遺伝子の発現を特異的に検出するためには、例えば、配列番号１に示されるヒトNLRP3遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーまたはプローブを用いてRT-PCRやハイブリダイゼーションなどを行い、NLRP3の発現量を測定すればよい。
【００２５】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、アレルギー疾患における劇症化を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、NLRP3遺伝子における上記多型部位を含み、ハイブリダイズの有無によって多型部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜５において塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さはより好ましくは、１５〜３５塩基であり、さらに好ましくは２０〜３５塩基であ
る。
【００２６】
また、プライマーとしては、NLRP3遺伝子における上記多型部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記多型部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜５の塩基配列の６１番目の塩基含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００２８】
（１）NLRP3遺伝子領域のSNP
NLRP3遺伝子領域には、以下の15カ所のtag SNPがあり、これらの遺伝子型決定をすることで、NLRP3遺伝子領域のその他のSNPの遺伝子型をも決定することができる。
-3656C>T (rs2027432), -2189G>A (rs12079994), -1529C>T (rs4925648), 1979G>A (rs4925650), 2495G>A (rs12048215), 2547C>G (rs10754555), 4240T>C (rs3806265), 13754C>T (rs10925019), 13961G>A (rs4925654), 16974C>T (rs4612666), 22162A>C (rs10925026), 27232C>T (rs12565738), 29231T>C (rs4378247), 29940C>G (rs10754558), 31792C>T (rs10733112) (図１A)。
これらのSNPは、それぞれのalleleの周辺配列に特異的なTaqMan （商標）probeを用いて遺伝子型タイピングを実施した。
【００２９】
（２）NLRP3のSNPと食物アナフィラキシーの疾患感受性との関連
アナフィラキシーをした経験のある食物アレルギー患者98例および経験したことの無い食物アレルギー患者222例（臨床情報：表２）の末梢血よりゲノムDNAを抽出し、上記の方法で遺伝子型タイピングを実施した。
【００３０】
【表２】
2011024478.tif 000003
【００３１】
その結果、1979G>A (rs4925650), 4240T>C (rs3806265), 16974C>T (rs4612666), 29940C>G (rs10754558), 31792C>T (rs10733112)の５カ所のSNPsにおいて、食物アナフィラキシーの疾患感受性との有意な関連を示した（表３）。なお、統計解析は、カイ二乗検定にて実施した。
【００３２】
【表３】
2011024478.tif 000004
【００３３】
上記５カ所のSNPsは、前半３カ所（1979G>A (rs4925650), 4240T>C (rs3806265), 16974C>T (rs4612666)）および後半２カ所（29940C>G (rs10754558), 31792C>T (rs10733112)）がそれぞれr2>0.8の連鎖不平衡状態にあった(図１Ｂ)。それぞれの連鎖不平衡ブロックを形成するSNPsのうち、最も関連の強い１カ所ずつ（16974C>T (rs4612666), 29940C>G (rs10754558)）を責任SNPとし、さらなる解析を行った。
【００３４】
これら２カ所の責任SNPを用いてハプロタイプ解析を行った結果、発症危険性の高いアレル（感受性アレル）の組み合わせにより、食物アナフィラキシーに対してさらに強い関連を示した。すなわち、rs4612666 C アレルおよびrs10754558 G アレルを併せ持つ場合に、より高いオッズ比とより低いP値を観察した（表４）。
【００３５】
【表４】
2011024478.tif 000005
【００３６】
（３）NLRP3のSNPとアスピリン喘息の疾患感受性との関連
アスピリン喘息を発症した成人気管支喘息患者（AIA+）79例、アスピリン喘息を発症していない成人気管支喘息患者（AIA-）470例および健常対照者730例（臨床情報：表５）の末梢血よりゲノムDNAを抽出し、上記の食物アナフィラキシーの疾患感受性と関連する５カ所のSNPについて、同様の方法で遺伝子型タイピングを実施した。
【００３７】
【表５】
2011024478.tif 000006
【００３８】
その結果、16974C>T (rs4612666)とアスピリン喘息の疾患感受性との関連が検出され、食物アナフィラキシーと同様にアスピリン喘息を発症している患者におけるrs4612666 C alleleの頻度が上昇していた（表６）。なお、統計解析は、カイ二乗検定にて実施した。
【００３９】
【表６】
2011024478.tif 000007
【００４０】
（４）NLRP3 16974C>T (rs4612666) の機能解析
食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息との関連が検出されたこのSNPは、intron 7に存在するため、アミノ酸置換ではなく、NLRP3の発現量を調節するenhancer領域にあたる可能性が考えられた。
よって、このSNPによる発現調節を検討するためにluciferase assayを実施した。pGL3-promoter vector（Promega）のluciferase遺伝子およびSV40 promoterの上流にこのSNPを含むintron 7の約1kbのDNA配列をサブクローニングしたコンストラクトをそれぞれのalleleについて作製し（図２Ａ）、これをNLRP3発現が認められる単球系の細胞腫であるTHP-1細胞へFugene 6（Roche）を用いて遺伝子導入し、24時間後のluciferaseタンパクの発する蛍光を定量した。遺伝子導入の標準化のために、ウミシイタケの蛍光タンパクを同時に遺伝子導入した。その結果、食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息患者において健常者よりも頻度の高いrs4612666 C alleleを持つコンストラクトを導入した細胞において、より強いluciferase活性が観察された（図２Ｂ）。
さらに、複数の転写因子結合部位予測サイトを用いてこのSNP領域に結合しうる転写因子を検索したところ、疾患感受性alleleであるrs4612666 C alleleによってGATA2の弱い結合部位が形成される可能性が示唆されたため、この領域へのGATA2結合をゲルシフト・アッセイにて検討した。このSNPを含む30bpのブローブをDIG（ジゴキシゲニン）で標識し、THP-1細胞の核抽出物と反応させたところ、rs4612666 C alleleを含むプローブを用いた場合は比較的強いバンドのシフトが観察された（図２Ｃ）。しかしながら、GATA2抗体を用いてGATA2との特異的な反応の検討したところ、supershiftは検出されなかったため（データは示さず）、rs4612666 C alleleによって未知の転写因子の結合部位が形成される可能性が示唆された。
【００４１】
以上より、食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息患者において頻度の高いrs4612666 C alleleを有する集団では、より強いNLRP3のenhancer活性のためにNLRP3発現量が上昇し、そのことが炎症性サイトカインであるIL1β, IL18の活性化・分泌を促し、食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息へとつながる可能性が示唆された。すなわちこれらの機能解析の結果は、食物アナフィラキシーおよびアスピリン喘息と16974C>T (rs461266
6)との関連解析の結果を補強するものである。
【００４２】
（５）NLRP3 29940C>G (rs10754558) の機能解析
食物アナフィラキシーとの関連が検出されたこのSNPは3'非翻訳領域に存在するため、NLRP3 mRNAの安定性に寄与する可能性が考えられた。
まず、このSNPによるNLRP3発現量の差を検討するため、luciferase assayを実施した。pGL3-promoter vectorのluciferase遺伝子の3'側末端にこのSNPを含むNLRP3 3'非翻訳領域のDNA配列をサブクローニングしたコンストラクトをそれぞれのalleleについて作製し（図３Ａ）、これをNLRP3発現が認められる単球系の細胞腫であるTHP-1細胞へFugene 6を用いて遺伝子導入し、24時間後のluciferaseタンパクの発する蛍光を定量した。遺伝子導入の標準化のために、ウミシイタケの蛍光タンパクを同時に遺伝子導入した。その結果、アナフィラキシー患者における頻度の高いrs10754558 G alleleを持つコンストラクトを導入した細胞において、より強いluciferase活性が観察された。（図３Ｂ）
【００４３】
次に、rs10754558 G alleleとrs10754558 C alleleをheteroで持つ３名の末梢血より単球（CD14陽性細胞）をMACSにより分取し、ここからmRNAを採取した。また、これらのゲノムDNAも併せて採取した。これらのmRNAとゲノムDNAを用いて、rs10754558 G alleleとrs10754558 C alleleのゲノムDNAにおける量比とそれぞれのalleleを有するmRNAにおける転写産物の量比とを比較するASTQ (Allele specific transcript quantification) を実施した。ここから、同一検体におけるそれぞれのalleleの転写産物の量比が外的要因による影響を受けずに計測可能となる。検出にはNLRP3 29940C>G (rs10754558)の遺伝子型タイピングに使用するタイピング用TaqMan（商標） probeを用いて、real-time定量的RT-PCRにより測定した。この結果、やはりrs10754558 G alleleを有するmRNA量が、rs10754558 C alleleを有するmRNA量よりも有意に上昇していた。（図３Ｃ）
以上より、食物アナフィラキシーにおいて頻度の高いrs10754558 G alleleを有する集団では、より強いNLRP3の安定性のためにNLRP3発現量が上昇し、そのことが炎症性サイトカインであるIL1β, IL18の活性化・分泌を促し、これらの疾患へとつながる可能性が示唆された。すなわちこれらの機能解析の結果は、食物アナフィラキシーとNLRP3 29940C>G
(rs10754558)との関連解析の結果を補強するものである。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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