(57)【要約】【課題】  新規な骨再生促進剤の製造方法を提供すること。【解決手段】  間葉系幹細胞の細胞集団に対して細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することによって細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を添加した後、細胞の発光強度を指標にしてその細胞集団のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を発光強度の分布として調べるとともに、その細胞集団に対してアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤と前記の基質を添加して同様にして発光強度の分布を調べ、両者の分布を比較し、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、後者の細胞集団で観察される発光強度よりも強い発光強度を示す細胞を分取し、有効成分として使用することを特徴とする。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の細胞集団に対して細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することによって細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を添加した後、細胞の発光強度を指標にしてその細胞集団のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を発光強度の分布として調べるとともに、その細胞集団に対してアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤と前記の基質を添加して同様にして発光強度の分布を調べ、両者の分布を比較し、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、後者の細胞集団で観察される発光強度よりも強い発光強度を示す細胞を分取し、有効成分として使用することを特徴とする骨再生促進剤の製造方法。
【請求項２】
発光が蛍光であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
基質としてＢＯＤＩＰＹ−アミノアセトアルデヒドを用いることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
間葉系幹細胞の細胞集団に対して細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することによって細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を添加した後、細胞の発光強度を指標にしてその細胞集団のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を発光強度の分布として調べるとともに、その細胞集団に対してアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤と前記の基質を添加して同様にして発光強度の分布を調べ、両者の分布を比較し、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、後者の細胞集団で観察される発光強度よりも強い発光強度を示す細胞を有効成分とすることを特徴とする骨再生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な骨再生促進剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日の高齢化社会の進展とともに、高齢者の骨折や大腿骨頭壊死症などに対する治療方法の確立が望まれている。その期待される手段の１つに骨再生を促進させる方法がある。例えば特許文献１では、多血小板血漿（ＰＲＰ）を含んでなる骨再生促進剤が提案されている。しかしながら、骨再生促進剤の有効成分に関する報告は多くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−５５２３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、新規な骨再生促進剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、間葉系幹細胞の細胞集団に含まれる細胞の中で、細胞内のアルデヒドを酸化してカルボン酸やアシル基に変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い細胞が、優れた骨再生促進作用を有することを知見した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の骨再生促進剤の製造方法は、請求項１記載の通り、間葉系幹細胞の細胞集団に対して細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することによって細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を添加した後、細胞の発光強度を指標にしてその細胞集団のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を発光強度の分布として調べるとともに、その細胞集団に対してアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤と前記の基質を添加して同様にして発光強度の分布を調べ、両者の分布を比較し、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、後者の細胞集団で観察される発光強度よりも強い発光強度を示す細胞を分取し、有効成分として使用することを特徴とする。
また、請求項２記載の製造方法は、請求項１記載の製造方法において、発光が蛍光であることを特徴とする。
また、請求項３記載の製造方法は、請求項２記載の製造方法において、基質としてＢＯＤＩＰＹ−アミノアセトアルデヒドを用いることを特徴とする。
また、本発明の骨再生促進剤は、請求項４記載の通り、間葉系幹細胞の細胞集団に対して細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することによって細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を添加した後、細胞の発光強度を指標にしてその細胞集団のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を発光強度の分布として調べるとともに、その細胞集団に対してアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤と前記の基質を添加して同様にして発光強度の分布を調べ、両者の分布を比較し、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、後者の細胞集団で観察される発光強度よりも強い発光強度を示す細胞を有効成分とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新規な骨再生促進剤の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例におけるＦＡＣＳによるＭＳＣの細胞集団領域に対して設定したゲートを示したスキャッタグラムである。
【図２】同、分離したＡｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗを示すヒストグラムである。
【図３】同、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈの骨再生促進作用を示すＸ線写真である（Ｈｉｇｈの表示のもの）。
【図４】同、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈの骨再生促進作用を示す骨密度測定結果のグラフである（同）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の骨再生促進剤の製造方法は、間葉系幹細胞の細胞集団に対して細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することによって細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を添加した後、細胞の発光強度を指標にしてその細胞集団のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を発光強度の分布として調べるとともに、その細胞集団に対してアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤と前記の基質を添加して同様にして発光強度の分布を調べ、両者の分布を比較し、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、後者の細胞集団で観察される発光強度よりも強い発光強度を示す細胞を分取し、有効成分として使用することを特徴とするものであるが、これは、要すれば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い間葉系幹細胞の細胞集団に含まれる細胞の中で、自家発光などに基づく擬似陽性の影響を排除することで真にアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い細胞を分取して骨再生促進剤の有効成分として使用することを意味する。
【００１０】
本発明において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、臍帯血、骨髄、胎盤などに由来する体性幹細胞であって、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞などの間葉系に属する細胞への分化能を有し、細胞表面マーカーであるＣＤ７１，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，ＨＬＡ−ＡＢＣの発現に陽性であって、ＣＤ１４，ＣＤ１９，ＣＤ３４，ＣＤ４５，ＨＬＡ−ＤＲの発現に陰性である細胞を意味する。間葉系幹細胞については、臍帯血、骨髄、胎盤などから接着性単核細胞を単離し、そこから蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて分取することができることや、ウシ胎児血清や線維芽細胞増殖因子などを添加したＩＭＤＭなどの培地を用いて培養することができることが当業者によって知られている（必要であれば例えばＬｅｅ  ＯＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３：１６６９−１６７５やその参照文献などを参照のこと）。また、間葉系幹細胞は、臍帯血、骨髄、胎盤などから単離した接着性単核細胞からＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込み性およびＣＤ４５の発現の両者において陰性である細胞として分取することもできる（後述する実施例を参照のこと）。
【００１１】
細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することによって細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質としては、例えば、下記の化学式で表されるＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−５−プロピオン酸）−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）が挙げられ、これはＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）として知られている（必要であれば例えばＵＳ６９９１８９７Ｂ２やＤａｖｉｄ  Ａ．Ｈａｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０４：１６４８−１６５５などを参照のこと）。本発明の骨再生促進剤の製造方法は、このＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬を用いた細胞染色と蛍光励起細胞分取装置を用いて実施することができる。具体的には、間葉系幹細胞の細胞集団に対してＢＡＡＡを添加して染色し、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼによってＢＡＡＡをＢＯＤＩＰＹ−アミノアセテート（ＢＡＡ）に変換させることでＢＡＡアニオンとして細胞内に留まらせ、細胞内のＢＡＡアニオンに基づく蛍光強度を指標にして細胞のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定し、それをヒストグラムに展開することでその細胞集団のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を蛍光強度の分布として調べるとともに（蛍光強度を横軸にして細胞数を縦軸にした凸状の分布）、その細胞集団に対してアルデヒドデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えばジエチルアミノベンズアルデヒドなど）とＢＡＡＡを添加して同様にして蛍光強度の分布を調べ、両者の分布を比較する。後者の蛍光発光は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に基づかない細胞内のゴルジ体などによる自家発光などに基づくものであるので、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、後者の細胞集団で観察される蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞が、擬似陽性の影響を排除した真にアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い細胞であり、この細胞を分取して骨再生促進剤の有効成分として使用する。
【００１２】
【化１】
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【００１３】
分取した所望の細胞は、例えばゼラチンスポンジやコラーゲンスポンジなどに播種し、骨折部位や壊死した大腿骨頭部位に移植することによって優れた骨再生促進作用を発揮する。この場合、骨再生促進剤の有効成分とする細胞は、患者本人のものが望ましい。その投与量は患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定することが望ましい。なお、使用する細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が異なる細胞からなる細胞集団であってもよいし、単一のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を示すクローン細胞であってもよい。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例では、間葉系幹細胞をＭＳＣと略称する。
【００１５】
（１）ＭＳＣの単離
国立大学法人筑波大学倫理規則の厳守のもと、Ｎａｇａｎｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００７）１１０：１５１−１６０に従って、ヒト臍帯血より血球細胞を除き、接着性単核細胞を単離し、ＩＭＤＭに１０％のＦＢＳと２ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンと１０ｎｇ／ｍｌのヒトｂ−ＦＧＦと０．１％（ｖ／ｖ）のペニシリンとストレプトマイシンの混合液（ペニシリン：１００Ｕ／ｍｌ，ストレプトマイシン：０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加した培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養した後、蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込み性およびＣＤ４５の発現の両者において陰性である細胞として分取した。この細胞がＭＳＣであることは、この細胞が有する多分化能（骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞への分化）と細胞表面マーカーの発現プロファイルに基づいて確認した。
【００１６】
（２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に従ったＭＳＣの分離
ＢＡＡＡを基質とするＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を用い、その取扱説明書に従ってＭＳＣに対して添加して染色した後、蛍光励起細胞分取装置（同上）にかけ、図１に示すように、前方散乱光（ＦＳＣ）を横軸にして側方散乱光（ＳＳＣ）を縦軸にしたスキャッタグラムを作成し、ＭＳＣの細胞集団領域に対するゲート設定を行い、細胞の蛍光強度と細胞数の関係をヒストグラムに展開して細胞集団の蛍光強度の分布を調べ、蛍光強度を横軸（ＡＬＤＨ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）にして細胞数を縦軸（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒ）にした凸状の分布を得た（図２の太線）。また、アルデヒドデヒドロゲナーゼの特異的阻害剤であるジエチルアミノベンズアルデヒド（最終濃度：１５μＭ）とＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬をＭＳＣに対して添加して同様にして蛍光強度の凸状の分布を得た（図２の細線）。両者の分布を比較し、図２に示すように、前者の細胞集団に含まれる細胞の中で、ネガティブコントロールである後者の細胞集団で観察される蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞（後者のヒストグラムの右端の裾野部分にかからない細胞）をアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い細胞集団として分取するとともに（Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ）、それよりも蛍光強度が弱いが最も多くの細胞が示す蛍光強度よりも強い蛍光強度を示す細胞をアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の弱い細胞集団として分取した（Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ）。細胞数頻度はＡｌｄｅ−Ｈｉｇｈが１．８±１．７％、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗが１２．８±７．９％であった（ｎ＝４）。
【００１７】
（３）Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈの骨再生促進作用
Ｔａｇｕｃｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（２００５）３３１：３１−３６を参考にして、麻酔下の成体Ｃ５７／ＢＬ６マウスの大腿骨中央付近に骨折部を形成し、ピンで固定した。その後、骨折部の皮下にＡｌｄｅ−Ｈｉｇｈ（５×１０５ｃｅｌｌ：溶媒はＰＢＳ）を播種した２ｍｍ×２ｍｍのゼラチンスポンジ（Ｇｅｌｆｏｒｍ：Ｐｆｉｚｅｒ）を移植した。なお、移植の２日前から試験最終日まで、毎日、シクロスポリンＡを２０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内投与して免疫抑制を行った。２８日後、骨折部の骨石灰化の程度をＸ線で観察するとともに、画像処理ソフトウェア（ＮＩＨ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて骨折部の骨密度を測定することで、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈの骨再生促進作用を評価した（Ｈｉｇｈ）。また、同数のＡｌｄｅ−Ｌｏｗを播種したゼラチンスポンジを埋め込んだ場合（Ｌｏｗ）、同数の骨髄由来のＭＳＣを播種したゼラチンスポンジを埋め込んだ場合（ＢＭ）、ＰＢＳを含浸させたゼラチンスポンジを埋め込んだ場合（ＰＢＳ）についても、それぞれの骨再生促進作用を同様にして評価した。図３にＸ線観察の結果を示し、図４に骨密度測定の結果を示す（ＰＢＳを含浸させたゼラチンスポンジを埋め込んだ場合の骨密度を１として相対値で表示。ｎ＝３。＊＊Ｐ＜０．０１）。図３と図４から明らかなように、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈは骨折部の骨石灰化を顕著に促すとともに骨密度を顕著に増加させたが、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗにはこのような作用はなく、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈのみが骨再生促進剤の有効成分として有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明は、新規な骨再生促進剤の製造方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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