(57)【要約】【課題】ヒトＬＡＴ１に結合でき、癌細胞に対して特異的に抗体依存性細胞障害を誘導する新規な抗体を有効成分として含有する、現在治療困難な固形腫瘍をはじめとした各種悪性腫瘍の予防または治療剤の提供。【解決手段】ヒトＬＡＴ１に対する抗体および該抗体を含む腫瘍の予防または治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
ＬＡＴ１を発現する細胞のＬＡＴ１に結合し、前記細胞に対する細胞障害活性を有する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記抗体またはその抗原結合断片が、：
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
を含む少なくとも１つの軽鎖、ならびに
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
サブクラスがＩｇＧである、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、それらのダイマー、ミニボディ（ｍｉｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、およびマルチマー、または二重特異性抗体断片である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
モノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８２３で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
【請求項１６】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８２３で特定されるハイブリドーマ細胞。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からＬＡＴ１に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１８】
請求項１５または１６に記載のハイブリドーマ細胞から抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１９】
前記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物であって、ＬＡＴ１を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
【請求項２２】
前記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２１に記載の医薬。
【請求項２３】
以下の（１）〜（６）からなる群から選択される単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（１）配列番号：１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＡＴ１細胞外領域に特異的に結合し、直接的にアミノ酸輸送活性を阻害、あるいはリンパ球と共同して間接的に細胞障害性因子を誘導することで腫瘍細胞を細胞死へと導く抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は生命の維持活動に必要な栄養素やシグナル伝達物質等を取得するために種々の機構を有しており、個々の細胞膜上に多様に存在する輸送体や受容体はその一例である。中でも生体を構成する主要要素であるアミノ酸の輸送については、１９６０年代から研究がなされてきた。１９９０年に入ってからアミノ酸輸送を担う分子が同定され始め、現在ではおよそ３０種類ほど支配遺伝子が同定されている。これら輸送体は輸送するアミノ酸の性質によって、塩基性アミノ酸輸送体、中性アミノ酸輸送体、酸性アミノ酸輸送体の３種に大別されるが、ヘテロ２量体型アミノ酸輸送体は以下で述べるＬＡＴ1を含め６種類である。
【０００３】
ＬＡＴ１は他の輸送体に対し比較的広い基質選択性を持つ、ナトリウム非依存的な中性アミノ酸輸送体である。１９９８年にクローニングされた１２回膜貫通型のタンパク質で、細胞膜表面に存在する。１回膜貫通タンパク質の４Ｆ２ｈｃ（ＣＤ９８）とジスルフィド結合することでヘテロ二量体を形成し、アミノ酸輸送の活性を示す６種類のＣＤ９８ｌｃのうちの一つである。４Ｆ２ｈｃは特定の輸送体に連結して細胞膜まで移行させるシャペロン様分子である（例えば、金井好克，  蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４６，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．６２９−６３７，  ２００１（非特許文献１））。
【０００４】
現在までにＬＡＴ１が腫瘍細胞において高発現しているという事例が多数報告されている（Ｙａｎａｇｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｖｏｌ．１５１４，  ｐｐ．  ２９１−３０２，  ２００１（非特許文献２）、Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．９９，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．１０００−１００７，  ２００８（非特許文献３）、Ｋａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．９９，  Ｎｏ．１２，  ｐｐ．２３８０−２３８６，  ２００８（非特許文献４）、Ｋａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．１００，  Ｎｏ．２，  ｐｐ．２４９−２５４，  ２００９（非特許文献５））。アミノ酸は細胞増殖において不可欠な物質であり、無秩序に増殖を繰り返す腫瘍細胞は通常より多くのアミノ酸を必要とすると考えられる。そのため、正常細胞よりも腫瘍細胞においてアミノ酸輸送体の発現量が増加しているものと推測される。従ってＬＡＴ１は腫瘍の治療における標的分子として有用であることが示唆される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】金井好克，  蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４６，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．６２９−６３７，  ２００１
【非特許文献２】Ｙａｎａｇｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｖｏｌ．１５１４，  ｐｐ．  ２９１−３０２，  ２００１
【非特許文献３】Ｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．９９，  Ｎｏ．５，  ｐｐ．１０００−１００７，  ２００８
【非特許文献４】Ｋａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．９９，  Ｎｏ．１２，  ｐｐ．２３８０−２３８６，  ２００８
【非特許文献５】Ｋａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  Ｖｏｌ．１００，  Ｎｏ．２，  ｐｐ．２４９−２５４，  ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＬＡＴ１特異的に結合し活性を阻害する、あるいは細胞障害を誘導するモノクローナル抗体は分子標的薬として有望であると考えられるが、抗体医薬の性質上、ＬＡＴ１の細胞外領域を認識する抗体である必要がある。しかし、数々の試みにも拘らずこれまでのところＬＡＴ１の細胞外領域をエピトープとする抗体は取得できていなかった。
【０００７】
したがって、ＬＡＴ１の細胞外領域をエピトープとする抗体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような状況に鑑み、本発明は、腫瘍細胞特異的に高発現の見られるＬＡＴ１の細胞外領域を認識し、その活性を阻害あるいは細胞障害性因子を誘導することで腫瘍細胞を細胞死へと導くモノクローナル抗体を提供する。本発明者らは作製の極めて困難であったＬＡＴ１細胞外領域を認識するモノクローナル抗体を世界で初めて作製し、該抗体が細胞障害誘導活性を有することを確認した。
【０００９】
本発明者らは、ＧＦＰ融合ＬＡＴ１を強制発現させた細胞を免疫原に用いてハイブリドーマを作製し、該細胞に特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を樹立し、該ハイブリドーマを動物に投与して腹水化して高濃度の抗体を採取、精製することによりモノクローナル抗体を得た。これを用いてＦＡＣＳ解析を行い、該モノクローナル抗体がＬＡＴ１細胞外領域に反応することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
［２］ＬＡＴ１を発現する細胞のＬＡＴ１に結合し、上記細胞に対する細胞障害活性を有する、上記［１］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［３］上記抗体またはその抗原結合断片が、：
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
のうちの少なくとも１つを含む、上記［１］または［２］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［４］上記抗体またはその抗原結合断片が、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
を含む少なくとも１つの軽鎖、ならびに
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［５］サブクラスがＩｇＧである、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［６］上記ＩｇＧが、ＩｇＧ１である、上記［５］に記載の抗体またはその抗原結合断片。
［７］上記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、それらのダイマー、ミニボディ（ｍｉｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、およびマルチマー、または二重特異性抗体断片である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［８］モノクローナル抗体である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［９］ラット、マウス、霊長類、またはヒト抗体である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１０］キメラ抗体またはヒト化抗体である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
［１１］受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８２３で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【００１１】
［１２］上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
［１３］上記［１２］に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
［１４］上記［１２］に記載の核酸分子を含む、ハイブリドーマ細胞。
［１５］上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
［１６］受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８２３で特定されるハイブリドーマ細胞。
【００１２】
［１７］上記［１４］〜［１６］のいずれかに記載のハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からＬＡＴ１に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
［１８］上記［１５］または［１６］に記載のハイブリドーマ細胞から抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して上記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
［１９］上記宿主が、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または哺乳動物である、上記［１８］に記載の製造方法。
【００１３】
［２０］上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する組成物であって、ＬＡＴ１を発現する細胞に適用して該細胞のアポトーシスを誘導するために使用する、組成物。
［２１］上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬。
［２２］上記腫瘍が、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される少なくとも１つである、上記［２１］に記載の医薬。
【００１４】
［２３］以下の（１）〜（６）からなる群から選択される単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（１）配列番号：１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）配列番号：３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）配列番号：５のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＬＡＴ１を特異的に認識し、ＬＡＴ１の活性を阻害またはＬＡＴ１発現細胞において細胞障害性因子を誘導し、その細胞死を引き起こすことができる。本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＬＡＴ１の細胞外領域を特異的に認識することができることから、抗癌抗体医薬として特に有用である。本発明は、これまで取得することが非常に困難であったＬＡＴ１の細胞外領域を特異的に認識する抗体を提供する点で、格別顕著な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＬＡＴ１強制発現細胞のＦＡＣＳ解析によるＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体の特異性を示す図である。横軸：強制発現させた遺伝子のＧＦＰによる発現量、縦軸：ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体の反応性。
【図２】免疫沈降によるＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図３】ＬＡＴ１およびその他５種類のＣＤ９８  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ強制発現細胞のＦＡＣＳ解析によるＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体の特異性を示す図である。横軸：強制発現させた遺伝子のＧＦＰによる発現量、縦軸：ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体の反応性、を示す。
【図４】ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体を用いた、ＬＡＴ１とＣＤ９８ｈｃ複合体の検出を示す図であり、サンドイッチＥＬＩＳＡにより検出、確認した結果を示す。縦軸：４５０ｎｍにおける吸光度。
【図５】ヒトがん細胞株１９種におけるＬＡＴ１の発現量を示す図である。値は抗体反応時のＭＦＩ（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）からＣｏｎｔｒｏｌとして抗体を含まないときのＭＦＩを引いた値を示す。
【図６】ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体を用いたＡＤＣＣ活性を示す図である。Ｃｏｎｔｒｏｌは抗体を含まないエフェクター細胞と標的細胞のみの状態における細胞障害率を示す。値は細胞障害率（％）を示す。
【図７】ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体の結合によるＬＡＴ１のＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎを示す図であり、ＦＩＴＣ蛍光観察により検出、確認した結果を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌは抗体を反応させていないＨｅＬａ細胞で、ＬＡＴ１は細胞膜に局在する。
【図８】ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体によるヒト子宮頸がん細胞ＨｅＬａのＸｅｎｏｇｒａｆｔに対する抗腫瘍効果を示す図である。縦軸：ハイブリドーマ投与後と投与前の腫瘍容量の比の平均値。ＣｏｎｔｒｏｌはＨｅＬａに結合しないことを確認している抗マウスＣＤ４４抗体を産生するハイブリドーマ投与群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．ＬＡＴ１の細胞外領域を特異的に認識する抗体
本発明は、１つの実施形態において、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体（本明細書中、「抗ＬＡＴ１抗体」と呼ぶこともある。）およびその抗原結合断片を提供する。すなわち、本発明は、ＬＡＴ１の細胞外領域のアミノ酸配列の一部または全部をエピトープとする抗体およびその抗原結合断片を提供する。
【００１８】
本発明の抗体およびその抗原結合断片は、典型的には、ＬＡＴ１を発現する細胞（例：腫瘍細胞）に発現しているＬＡＴ１に結合し、ＬＡＴ１の活性を阻害するかまたは細胞障害性因子を誘導して、その細胞を細胞死（アポトーシス）に至らしめることができる。
【００１９】
アミノ酸輸送系Ｌの第一のアイソフォームである「ヒトＬＡＴ１（Ｌ−ｔｙｐｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｐｓｏｒｔｅｒ  １）」は、５０７アミノ酸残基からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質である。ヒトＬＡＴ１のアミノ酸配列、ｍＲＮＡ配列等の情報は、それぞれＡＡＤ２０４６４、ＡＦ１０４０３２等のアクセッション番号でＧｅｎＢａｎｋ等の公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。また、マウスや他の哺乳動物（例えば、ラット、ウシなど）のＬＡＴ１も同様に、公にアクセス可能なデータベースから入手することができる。
【００２０】
本明細書中、単に「ＬＡＴ１」という場合、ＬＡＴ１タンパク質のことを指すものとする。場合によっては、ＬＡＴ１タンパク質をコードする遺伝子（または単にＬＡＴ１遺伝子）を単にＬＡＴ１と呼ぶ場合もありうるが、その場合には当業者にとっては文脈からＬＡＴ１遺伝子を指すことが明らかであろう。本明細書中、ＬＡＴ１は、典型的には、ヒトＬＡＴ１であるが、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウシなど）のＬＡＴ１であってもよい。
【００２１】
本明細書中、「ＬＡＴ１の細胞外領域」とは、細胞表面にＬＡＴ１が発現された場合に、細胞膜の細胞質とは反対側（すなわち、細胞の外側）の細胞表面に露出するＬＡＴ１の領域をいい、ＵｎｉＰｒｏｔ等の公にアクセス可能なデータベースでは、例えば、７１位〜８３位のアミノ酸残基、１４１位〜１４５位のアミノ酸残基、１９１位〜１９８位のアミノ酸残基、２６４位〜２７３位のアミノ酸残基、３４０位〜３９５位のアミノ酸残基、４５２位〜４５７位のアミノ酸残基にわたる領域がそれに該当するとアミノ酸配列から予測されている。本発明の抗体またはその抗原結合断片が、ＬＡＴ１の細胞外領域に結合しているか否かは、例えば、本願明細書の実施例２に記載されるように、ＬＡＴ１強制発現細胞やヒトがん細胞株を用いたＦＡＣＳ解析によって確認することができる。
【００２２】
本明細書中、抗体またはその抗原結合断片が、ＬＡＴ１の細胞外領域に「特異的に結合する」とは、その抗体または抗原結合断片が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらの領域の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能なほどに高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００２３】
本明細書中、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリンの全てのクラスおよびサブクラスを含むものとする。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧサブクラスのものであり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。「抗体」は、特に、モノクローナル抗体を含む。
【００２４】
本明細書中、「抗原結合断片」は、インタクトな、および／またはヒト化された、および／またはキメラな抗体の抗原結合領域または可変領域を有するフラグメント、たとえば、上記抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントを含む。従来、こうしたフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解によって、たとえばパパイン分解によって（たとえば、国際公開ＷＯ９４／２９３４８を参照）作製されているが、遺伝子組換えによる形質転換宿主細胞から直接産生させることもできる。ＳｃＦｖの作製については、Ｂｉｒｄら、（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２，  ４２３−４２６に記載の方法が使用できる。さらに、抗体フラグメントは、下記のさまざまな遺伝子工学技術を用いて作製することができる。
【００２５】
Ｆｖフラグメントは、その２つの鎖の相互作用エネルギーがＦａｂフラグメントより低いと思われる。ＶＨおよびＶＬドメインの結合を安定化するために、これらのドメインは、ペプチド（Ｂｉｒｄら、（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，  ４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ，  ８５，  ５８７９−５８８３）、ジスルフィド架橋（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら、（１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２９，  １３６２−１３６７）、および「ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ」変異（Ｚｈｕら、（１９９７），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  ６，  ７８１−７８８）によって連結されている。ＳｃＦｖフラグメントは、当業者によく知られている方法によって作製することができる（Ｗｈｉｔｌｏｗら、（１９９１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ２，  ９７−１０５およびＨｕｓｔｏｎら、（１９９３）  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０，  １９５−２１７を参照）。ＳｃＦｖは、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）などの細菌細胞内で産生させることができるが、真核細胞内で産生させる方が好ましい。ＳｃＦｖの不利な点は、産物が一価であること、そのために多価結合による結合力の増加が不可能になること、ならびに半減期が短いことである。こうした問題を克服するための試みには、二価（ＳｃＦｖ’）２があるが、これは、追加のＣ末端システインを含有するＳｃＦｖから、化学的カップリングによって（Ａｄａｍｓら、（１９９３）  Ｃａｎ．Ｒｅｓ  ５３，  ４０２６−４０３４、およびＭｃＣａｒｔｎｅｙら、（１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ８，  ３０１−３１４）、または不対Ｃ末端システイン残基を含有するＳｃＦｖの、自然発生的な部位特異的二量体化によって（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９５）  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２６，  １８７−２０４を参照）作製される。あるいはまた、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短縮して「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」を形成することによって、ＳｃＦｖに多量体を形成させることができる。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ  （１９９３），  ９０，  ６４４４−６４４８を参照。リンカーをさらに小さくすることで、ＳｃＦｖ三量体（「トリアボディ」、Ｋｏｒｔｔら、（１９９７）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，  １０，  ４２３−４３３を参照）および四量体（「テトラボディ」、Ｌｅ  Ｇａｌｌら、（１９９９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  ４５３，  １６４−１６８を参照）をもたらすことができる。二価ＳｃＦｖ分子の構築は、「ミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）」（Ｐａｃｋら、（１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，  １５７９−１５８４を参照）および「ミニボディ」（Ｈｕら、（１９９６），  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６，  ３０５５−３０６１を参照）を形成することができるタンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合によっても、達成することができる。ＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（（ＳｃＦｖ）２）は、第３のペプチドリンカーによって２つのＳｃＦｖ単位を連結することによって作製することもできる（Ｋｕｒｕｃｚら、（１９９５）  Ｊ．Ｉｍｍｏｌ．１５４，  ４５７６−４５８２を参照）。二重特異性ダイアボディは、ある抗体のＶＬドメ��ンに短いリンカーで連結された、別の抗体由来のＶＨドメインからなる、２つの一本鎖融合産物の非共有結合によって作製することができる（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９８），  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎ  ７７，  ７６３−７７２を参照）。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、ジスルフィド架橋、もしくは上記の「ｋｎｏｂ  ｉｎ  ｈｏｌｅ」変異を導入することによって、または２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して連結される、一本鎖ダイアボディ（ＳｃＤｂ）を形成することによって、高めることができる（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら、（１９９９）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２６  １７９−１８８を参照）。四価の二重特異性分子は、たとえば、ＳｃＦｖフラグメントを、ＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインに、またはヒンジ領域を介してＦａｂフラグメントに、融合することによって得られる（Ｃｏｌｏｍａら、（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １５，  １５９−１６３を参照）。あるいはまた、四価の二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディの融合によって作製されている（Ａｌｔら、（１９９９）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５４，  ９０−９４を参照）。より小さい四価の二重特異性分子は、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ含有リンカーによるＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデムの二量体化（ＤｉＢｉミニ抗体、Ｍｕｌｌｅｒら、（１９９８）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４３２，  ４５−４９を参照）、または分子内対合を妨げる配向で４つの抗体可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子の二量体化（タンデムダイアボディ、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２９３，  ４１−５６を参照）のいずれかによって、作製することもできる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学的カップリングによって、またはロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作製することができる（Ｓｈａｌａｂｙら、（１９９２）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １７５，  ２１７−２２５、およびＫｏｓｔｅｌｎｙら、（１９９２），  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８，  １５４７−１５５３を参照）。また、単離されたＶＨおよびＶＬドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ  ｐｌｃ）も利用できる。
【００２６】
本明細書中、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（または抗体断片）を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。概して異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性の他に、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる混入がないという点で、モノクローナル抗体は有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方法による抗体の産生を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：  ４９５  ［１９７５］に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成してもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２：  ６２４−６２８  ［１９９１］およびＭａｒｋｓ等，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：  ５８１−５９７  （１９９１）  に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離した抗体断片（Ｆｖクローン）を含む抗原認識および結合部位のクローンを含む。
【００２７】
「モノクローナル抗体」は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されたまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導されたまたは他の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、それらの抗体の断片の対応する配列と同一または相同である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：  ６８５１−６８５５  ［１９８４］）。
【００２８】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントＣＤＲ由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ、霊長類（例えば、サル）などのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性および容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移植されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有しうる。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有しうる。
【００２９】
本明細書中、「ＬＡＴ１の活性」とは、中性アミノ酸輸送活性、アミノ酸類似薬物輸送活性等を意味する。ＬＡＴ１のアミノ酸輸送活性は、例えば、標識アミノ酸の細胞内取り込みによって測定することができる。「ＬＡＴ１の活性を阻害する」とは、上記のＬＡＴ１の活性を顕著に低下させるかまたは除くことを意味する。「ＬＡＴ１の活性を顕著に低下させるかまたは除く」とは、ＬＡＴ１の生物学的活性の少なくとも５％またはそれ以上低下させることを意味する。
【００３０】
本明細書中、「細胞障害活性」とは、細胞に対して細胞障害を引き起こす能力を意味し、本発明の場合、ＬＡＴ１発現細胞に本発明の抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合して、該細胞に細胞障害性因子を誘導して、該細胞を細胞死またはアポトーシスに至らしめる能力をいうものとする。細胞障害活性は、例えば、本発明の実施例２に記載される方法で測定し、細胞障害率として評価することができる。
【００３１】
本明細書中、「細胞死」は「アポトーシス」を意味する。「アポトーシス」は、個体発生のプログラム、デス因子刺激、放射線などによる染色体ＤＮＡの重度の損傷、異常タンパク質の蓄積などによる重度の処方体ストレスなどさまざまな生理的、病理的要因により誘導される機能的、能動的な細胞死の典型であり、細胞体や核の膨潤を伴う壊死（ネクローシス）とは逆に、細胞体や核の収縮や断片化が起こる。
【００３２】
本発明の抗体またはその抗原結合断片の例としては、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
のうちの少なくとも１つを含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
【００３３】
本明細書中、「１個または数個のアミノ酸残基の変異」とは、元となるアミノ酸配列中の１個または数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入、または付加されていることを意味する。本明細書中、そのような変異を元となるアミノ酸配列中の対応する位置に有するアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片は、元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片と同等の生物学的活性を有する。ここで、「同等の生物学的活性」としては、（ｉ）元となるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合断片が特異的に結合する抗原に対して特異性をもって結合する能力、（ｉｉ）ＬＡＴ１のアミノ酸輸送活性に対する阻害能力、（ｉｉｉ）ＬＡＴ１発現細胞上のＬＡＴ１に結合した場合における、該細胞に対する細胞障害活性、または（ｉｖ）これらのいずれか２つ以上もしくは全てが挙げられる。最も好ましくは、「同等の生物学的活性」とは、上記（ｉｖ）を意味する。また、上記の「１個または数個のアミノ酸残基の変異」における変異したアミノ酸残基の数の上限は、このような同等の特異性を保持することができるか否かという基準（ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって制限される。
【００３４】
本発明の抗体またはその抗原結合断片のより好ましい例としては、
（１）（ｉ）配列番号：１のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号１の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）、
（２）（ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号２の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）、および
（３）（ｉ）配列番号：３のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号３の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）、
を含む少なくとも１つの軽鎖、ならびに
（４）（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号４の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）、
（５）（ｉ）配列番号：５のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号５の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）、および
（６）（ｉ）配列番号：６のアミノ酸配列、または（ｉｉ）１個もしくは数個のアミノ酸残基の変異を配列番号６の対応する位置に有するアミノ酸配列、を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）、
を含む少なくとも１つの重鎖
を含む、抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
【００３５】
本発明の抗体またはその抗原結合断片の最も好ましい例としては、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００９年６月２３日付で寄託された、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８２３で特定されるハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。
【００３６】
２．本発明の抗体をコードする核酸
本発明は、別の実施形態において、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の核酸分子は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作製するために使用することができる。
【００３７】
したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、本発明のハイブリドーマ細胞から抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体をコードする遺伝子を単離し、該遺伝子を含む発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主に導入して前記モノクローナル抗体を発現せしめ、得られる宿主、宿主の培養上清または宿主の分泌物からＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
【００３８】
本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離されて、配列決定される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦分離されると、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成するために、このＤＮＡを発現ベクターへ挿入し、それをこの状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、ヒトＨＥＫ２９３胎児腎由来細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞へトランスフェクトしうる。例えば、相同的なマウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインの配列で置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８１：６８５１［１９８４］）、または免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることによって、このＤＮＡを修飾しうる。本発明の抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体の結合特異性を有するように、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体は調製される。
【００３９】
３．本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
本発明はさらに別の実施形態において、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞を提供する。本発明はまた、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片をコードする核酸分子を含有するハイブリドーマを提供する。最も好ましい本発明のハイブリドーマ細胞としては、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに２００９年６月２３日付で寄託された、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１８２３で特定されるハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【００４０】
本発明のハイブリドーマ細胞の調製は、具体的には、以下のように行うことができるが、この方法に限定されるわけではない。
【００４１】
（１）抗原の調製
抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、ＬＡＴ１を産生する細胞あるいはその細胞画分、またはＬＡＴ１をコードするＤＮＡにより形質転換された宿主細胞、すなわち、大腸菌などの原核性宿主細胞および昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞中に、ＬＡＴ１をコードするｃＤＮＡの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、そのままあるいは融合蛋白として発現、精製された蛋白質、さらには、ペプチド合成機を用いて合成されたＬＡＴ１の部分ペプチド等を用いることができる。
【００４２】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
６〜２４週令のマウスまたはラットに、（１）に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバントまたは、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１回目の投与の後２〜３週間おきに３〜７回行う。各投与後５〜１０日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年〕などで調べる。免疫に用いたペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜４日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で２〜３分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。
【００４３】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ６，  ５１１−５１９（１９７６）〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ  ２７６，  ２６９−２７０  （１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２３，  １５４８−１５５０  （１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７  （１９７５）〕などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【００４４】
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞を洗浄用培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１，５００（ＰＥＧ−１，５００）２ｇ、洗浄用培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０８抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎に洗浄用培地１〜２ｍｌを数回加え、全量が５０ｍｌになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、ＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えば（５）に述べる酵素免疫測定法あるいはＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇの略）などを用いて、ＬＡＴ１タンパク質に特異的に反応する抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００４５】
したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、ハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物からＬＡＴ１に特異的に結合する抗体を採取することを含む、ＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
【００４６】
４．本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬
本発明はまた、さらに別の実施形態において、上記の本発明の抗体またはその抗原結合断片を含有する、腫瘍の予防または治療のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体を含有する。
【００４７】
後述の実施例に示されるように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＬＡＴ１を発現する細胞（例：腫瘍細胞）のＬＡＴ１の細胞外領域に特異的に結合して、ＬＡＴ１の活性を阻害するか、または細胞障害因子を誘導し、該細胞を細胞死に至らしめることができる。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含有する医薬組成物は、ＬＡＴ１を細胞表面に発現する腫瘍細胞を死滅させるため、またはそのような細胞で特徴付けられる腫瘍および、同様の機序により生ずる疾患の予防または治療のために使用することができる。
【００４８】
上記「腫瘍」の例としては、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、黒色腫、腎細胞癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、食道癌、肝臓癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、前立腺癌、絨毛癌、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、口腔癌、胆嚢癌、甲状腺癌、中皮腫、胸膜腫、男性胚腫、子宮内膜過形成、子宮内膜症、胚芽腫、線維肉腫、カポジ肉腫、血管腫、海綿状血管腫、血管芽腫、網膜芽腫、星状細胞腫、神経線維腫、稀突起謬腫、髄芽腫、神経芽腫、神経膠腫、横紋筋肉腫、謬芽腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、甲状肉腫、およびウィルムス腫瘍等が挙げられる。より好ましくは、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、リンパ腫、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、および前立腺癌が挙げられる。本発明の抗体またはその抗原結合断片を医薬として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該抗体またはその抗原結合断片は、水溶液もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用でき、また、該抗体をＩｇＡ化し、分泌成分を結合した後に必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に例えば、該抗体またはその抗原結合断片を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００４９】
「薬学的に許容し得る」という用語は、正常な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比を有し、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症を示すことのない、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書において利用される。
【００５０】
本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬組成物の投与経路は、周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、皮下、筋肉内、眼内、動脈内、脳内脊髄、または病巣内経路での注射または注入、または徐放系による。またさらに、該抗体またはその抗原結合断片を直接腫瘍部位へ投与する手段として、カテーテル等による投与等も可能である。
【００５１】
また、本発明の腫瘍の予防または治療のための医薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、ヒトを含む哺乳動物に対して投与することができる。該抗体またはその抗原結合断片またはその塩の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、子宮内膜症患者または子宮腺筋症患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば６０ｋｇの患者に対して、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与することができる。
【００５２】
以下、実施例により本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００５３】
［実施例１］
（１）免疫原の調製
抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体を作製するために必要な抗原として、ＧＦＰ融合ＬＡＴ１発現ラット肝がん細胞株ＲＨ７７７７細胞株を樹立した。ＬＡＴ１をコードするｃＤＮＡの全長を公知の方法を用いて組み込み融合蛋白として発現させ、発現が強いものを薬剤選択性および限界希釈法にて単一クローン化し安定発現株とした。
【００５４】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
ラットに、（１）に示した方法で作製された抗原を免疫して、その脾臓より抗体産生細胞を採取した。免疫は、ラットの皮下、腹腔、または静脈内に抗原としてＧＦＰ−ＬＡＴ１発現ＲＨ７７７７細胞３×１０６個を投与することにより行った。抗原の投与は、１回目の投与の３週間後および６週間後に２回行った。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原の最終投与後３日後に、免疫したラットより脾臓を摘出し脾細胞を採取した。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で２〜３分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として用いた。
【００５５】
（３）ハイブリドーマの作製
実施例１（２）で得られたマウスまたはラット脾細胞とマウス骨髄腫細胞株Ｘ６３とを４：１の比率で混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１５００（ＰＥＧ−１５００）２ｇ、ＤＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液を０．２〜１ｍｌ／１０８個マウス脾細胞の割合で加え、さらに１〜２分間毎にＤＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＤＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるようにした。９００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てＨＡＴ培地１００ｍｌ中に細胞をゆるやかに懸濁した。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。
【００５６】
（４）抗体スクリーニング
実施例１（３）で得られたハイブリドーマ培養上清をＧＦＰ−ＬＡＴ１トランスフェクタントと反応させ、ＦＡＣＳ解析を行うことによりＬＡＴ１特異的抗体を産生しているかの１次スクリーニングを行った。ＦＡＣＳの反応は９６ウェルプレートにて行った。トランスフェクタントを２．５×１０５〜３×１０６個／ウェルになるように５０μｌずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にハイブリドーマの培養上清５０μｌを加え、氷冷化で６０分反応させた。チューブに０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ２００〜５００μｌを加え、１９０ｇ、４℃で５分間遠心し上清を捨てる操作を３回繰り返して洗浄した後、２次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラット抗体を添加し遮光氷冷下で４５分間反応させた。ウェルを遠心し洗浄した後０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ５００μｌに懸濁し、４０μｌのナイロンメッシュを通した。死細胞を除くために測定直前にＤＡＰＩを１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう添加し、ＢＤＬＳＲ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて蛍光強度を測定した。陽性反応が得られたクローンを選別し、抗ＬＡＴ１抗体産生ハイブリドーマ株を樹立した。
【００５７】
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雄マウス（ＫＳＮ）に実施例１（４）で得られたハイブリドーマ株を１×１０７細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜１５日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから腹水を採取し、２０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心し、５０％飽和硫酸アンモニウムにて塩析し、沈渣を溶かして１００００ｇで１０分間、４℃でした。プレフィルター、メンブランフィルター（０．２２μｍ）を通過させた後、ＰｒｏｔｅｉｎＧ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）を用いて液体クロマトグラフィーシステムAＫＴＡにより精製し、抗ＬＡＴ１モノクローナル抗体とした。
【００５８】
［実施例２］
（１）免疫沈降によるモノクローナル抗体の特異性の検討
ＨｅＬａ細胞に０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６’−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｅ）−６−ｈｅｘａｎａｍｉｄｅｈｅｚａｎｏａｔｅ（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，  Ｐｉｅｒｃｅ）-ＰＢＳ（ｐＨ  ８．０）溶液２００μＬを加え、室温で３０分反応させ、細胞表面のビオチン標識を行った。ＨｅＬａ細胞に３．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ［ＰＢＳ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ナカライテスク）およびｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）］を加え、氷上で６０分間インキュベートすることにより可溶化したのち、１４，５００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心した上清を細胞可溶化物として免疫沈降に用いた。得られた細胞可溶化物にＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体５μｇを加えた後、二次抗体としてＲａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｔ  Ｉｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）５μｇを加え、４℃で一時間反応させた。続いてＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の５０％懸濁液を２５μＬ加え、４℃にて終夜反応させた。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合した抗原−抗体複合体をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒにて５回洗浄後、ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ６．８，  １％  ＳＤＳ，  ５０ｍＭ  ＤＴＴ，  １０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，および０．０１％  ＢＰＢ）と混合し、９５℃で５分間処理することによりタンパクを溶出した。可溶化された細胞可溶化物はｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（４５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ６．８，  １％  ＳＤＳ，  ５０ｍＭ  ＤＴＴ，  １０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ａｎｄ  ０．０１％  ＢＰＢ）と混合し、９５℃で５分間処理した。ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｇｅｌ［１０％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ｂｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （２９：１），  ０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．８），  ０．１％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  （ＳＤＳ），  ０．０３％Ａｍｉｎｏ  ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ  （ＡＰＳ），  ０．０００５％  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＴＥＭＥＤ）］とｓｔａｃｋｉｎｇ  ｇｅｌ  ［１０％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ｂｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２９：１），  ０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．８），  ０．２％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  （ＳＤＳ），  ０．６％  Ａｍｉｎｏ  ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ  （ＡＰＳ），  ０．００２％  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  （ＴＥＭＥＤ）］を用いて２０ｍＡ定電流にて分離した。分離されたアクリルアミドゲルは、３０分間１．５Ｖ定電圧にてＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）上に転写した。転写後、膜をｂｌｏｃｋｉｎｇｍｉｌｋで４℃、終夜ブロッキングした。細胞表面を標識したビオチンをＥｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。図２に示すように、ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体はＬＡＴ１に反応した。��ＡＴ１の理論値は４０Ｋダルトンで、実測値として３５Ｋダルトン前後の特異的バンドとして認められた。
【００５９】
（２）ＦＡＣＳによるモノクローナル抗体の特異性の検討
細胞をＰＢＳにて２．５×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように調整し、５０μＬずつチューブに分注した。この細胞浮遊液にＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体５０μＬを加え、氷冷下で６０分反応させた。０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ  ２００〜５００μＬを加え、１２０ｇで５分間、４℃で遠心する洗浄を３回行い、細胞ペレットにＦＩＴＣ標識またはＰＥ標識の二次抗体（１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍希釈）を５０μＬ加え、遮光氷冷下４５分間反応させた。遠心洗浄後、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ５００μＬにサスペンドし、４０μｍのナイロンメッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  ＃３５−２３４０）を通した後、死細胞を除くため測定直前にＤＡＰＩを１μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、ＢＤ  ＬＳＲ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定した。図３に示すように、ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体はＬＡＴ１のファミリーであるＣＤ９８ｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ強制発現細胞には反応せず、ＬＡＴ１の強制発現細胞にのみに特異的反応を示した。
【００６０】
（３）酵素免疫測定法によるモノクローナル抗体の特異性の検討
ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｒｏｌｉｄｅ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）に抗原捕捉抗体としてＨＨ２５ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ９８ｈｃｈｕｍａｎｍＡｂ，１０μｇ／ｍＬを５０μＬ、３ウェルずつ４℃にて終夜固相化したのち、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎｎ）にてブロッキングした。抗原にはＨｅＬａ細胞可溶化物（３ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を用い、検出抗体（１０μｇ／ｍＬ）とあらかじめプレインキュベートしたものを５０μＬずつ各ウェルに加えた。１時間３７℃にてインキュベート、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）洗浄後に、ビオチン標識抗ラットＩｇＧ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いた。各抗体間はＰＢＳ−Ｔにて洗浄した。その後、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて２００倍希釈したＥｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｖｅｃｔｏｒ）を加えて、３７℃で４５分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（０．１ｍｇ／ｍＬ）と０．０１％Ｈ２Ｏ２を含む０．１Ｍｃｉｔｒｉｃ−ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を用いて呈色したのち、０．５ＭＨ２ＳＯ４  ７５μＬを加えて反応を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度はＭｏｄｅｌ５５０ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）にて測定した。４５０ｎｍにおける吸光度はＭｏｄｅｌ５５０ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒを用いて測定した。図４に示すように、ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体がＬＡＴ１とＣＤ９８ｈｃ複合体に結合することが認められた。
【００６１】
（４）がん細胞株におけるＬＡＴ１の発現量の検討
ＦＡＣＳ法によりＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体を用いてヒトがん細胞株２６種におけるＬＡＴ１の発現量を測定した。図５に示すように、ＬＡＴ１は種々のがん細胞株で発現し、その中でＨｅＬａ細胞で最も高い発現量が認められた。
【００６２】
（５）モノクローナル抗体による抗体依存性細胞障害活性の検討
ＫＳＮヌードマウスより脾臓を摘出し、培地中でほぐしてリンパ球を分取する。１５０ｇで５分間遠心し、ペレットをＴｒｉｓ−ＨＣｌ５ｍＬで懸濁し、赤血球を溶血させる。３７℃で５分間インキュベートし、ペレットを培地５ｍＬに懸濁後３０秒間静置する。組織片が沈殿したら上清を分取し、再度沈殿物に培地５ｍＬを加え、３０秒間静置し、上清を分取する。最終濃度が５００Ｊ．Ｕ．／ｍＬになるようＩＬ２５０μＬ加え、終夜培養した細胞をエフェクター細胞とした。一方、標的細胞としてＨｅＬａ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ｍＬの培地で調整し、１ｍｇ／ｍＬのｃａｌｓｅｉｎ−Ａｍ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ５０μＬを加え、３７℃で３０間インキュベートする。培地を５ｍＬ加え、１５０ｇで５分間遠心し、上清を捨てる。さらに培地１０ｍＬで懸濁し、１５０ｇで５分間遠心し、上清を捨てる工程を２回繰り返す。培地５ｍＬで懸濁し、丸底９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに５０μＬずつ分注する。エフェクター／ターゲット比が３０になるように、ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体１００μＬ、エフェクター細胞５０μＬを順に加え、３７℃で２時間インキュベートする。テラスキャン（ＭＩＮＥＲＶＡＴＥＣＨ）を用いて５２０ｎｍ蛍光波長を測定し、次の式で細胞障害率を算出した。細胞障害率（％）＝（ｓａｍｐｌｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  -  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｔｏｔａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  -  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）×１００。図６に示すようにＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体のＡＤＣＣ活性が検出された。エフェクター細胞と標的細胞を混合したＣｏｎｔｒｏｌで３．５％であり、抗体を加えることにより、ＡＤＣＣが起こり、３０．４％の細胞障害率が認められた。
【００６３】
（６）モノクローナル抗体によるＬＡＴ１のＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎの検討
ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体存在下にて、ＨｅＬａ細胞を終夜培養。４％ＰＦＡ固定後、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体を用いて染色したのち、ＬＥＩＴＺＤＭＲ蛍光顕微鏡を用いて観察する。図７に示すように、ＣｏｎｔｒｏｌではＬＡＴ１の局在を示すＦＩＴＣシグナルが細胞膜に局在しているのに対し、ＬＧｔｒａ０１−０１産生モノクローナル抗体の結合によりＬＡＴ１のＩｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎが起こり、細胞内に局在していることが示された。
【００６４】
（７）免疫組織染色法による乳がん組織におけるＬＡＴ１発現量の検討
市販のＬＡＴ１ポリクローナル抗体Ａｎｔｉ  Ｈｕｍａｎ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １  （ＬＡＴ１）  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｒａｂｂｉｔ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ＃ＫＥ０２６）を用い、添付のプロトコルに従って、乳がん組織アレイ
【００６５】
（８）モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果の検討
ヒト子宮頚がん細胞ＨｅＬａをＫＳＮヌードマウスに皮下投与し、腫瘍を形成させた。腹腔内にプリスタン５００ｕｌ／匹を投与後、マウスを各４匹の２群に分けた。一方の群の腹腔内にハイブリドーマＬＧｔｒａ０１−０１を投与し、もう一方群の腹腔内に陰性コントロールとして、ＨｅＬａに結合しない抗マウスＣＤ４４抗体を産生するハイブリドーマを投与し、腹水が貯留した時点で各マウスの腫瘍容量を測定した。図８に示すように、陰性コントロール群に比べ、ハイブリドーマＬＧｔｒａ０１−０１投与群で腫瘍の増殖抑制が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、ＬＡＴ１を高発現する腫瘍細胞のアポトーシス誘導、またはＬＡＴ１を高発現する腫瘍細胞で特徴付けられる腫瘍の病態解析、予防、治療等に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６７】
配列番号：１  軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）
配列番号：２  軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）
配列番号：３  軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）
配列番号：４  重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）
配列番号：５  重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）
配列番号：６  重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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