(57)【要約】      （修正有）【課題】増加した比率のアラキドン酸を有する（微生物）油を製造する新規な方法を提供する。【解決手段】二段階発酵方法で微生物を培養する工程を含む微生物油の製造方法であり、発酵の終了に先立つ最終段階で、炭素源が、培地への炭素源の添加速度を上回る速度で微生物によって消費され、炭素源が≦０．３０Ｍ炭素／ｋｇ培地で添加され、又は、微生物の成長に制限的な速度である。微生物は、アラキドン酸（ＡＲＡ）以外の脂肪又は脂質を優先的に代謝するように制限された炭素源を有し、細胞中のＡＲＡの割合を増加させる。次いで、溶媒としてヘキサンを使用して、微生物油を微生物から回収し、上記微生物油は、少なくとも５０％のＡＲＡ及び少なくとも９０％のトリグリセリドを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造方法であって、発酵容器内部の培地中で微生物を培養する工程を含み、それによって発酵の終了に先立つ段階で、
ａ）炭素源が、前記培地に添加されるより早い速度で、微生物によって消費され、
ｂ）前記炭素源を、１時間当たり≦０．３０Ｍ炭素／ｋｇ培地の速度で添加し、
ｃ）前記炭素源が、微生物の成長に対して速度制限的であるか、又は前記微生物が脂肪及び／又は脂質を代謝するように制限され、
ｄ）前記炭素源の添加速度が減少されるか、又は前記微生物による前記炭素源の消費速度以下であり、又は
ｅ）発酵の終了に又は発酵の終了の前に、前記炭素源が全て使用されるか、又は前記培地中の濃度が、約０となり、
ｆ）前記炭素源の添加が停止されるが、発酵を継続させ、及び／又は
ｇ）前記微生物が、それらが、アラキドン酸（ＡＲＡ）に優先して、１種以上の脂肪又は脂質を代謝又は消費する条件におかれる、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
ｈ）この段階における、炭素源の濃度が、平均≦１０ｇ／ｋｇ及び／又は≦０．１７Ｍ炭素／ｋｇ培地であり、
ｉ）前記炭素源が、グルコース、及び／又は
ｊ）前記ＰＵＦＡが、微生物油に存在する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｋ）第二段階が、発酵終了の１５時間から２時間前に、又は発酵始めの１０日未満の後に開始する、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｌ）（全体の）発酵を、≧２２℃及び／又は≦３０℃で実施し、
ｍ）前記発酵が、添加油の不存在下で実施され、及び／又は
ｎ）前記発酵が、９日以下で持続される、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｎ）前記ＰＵＦＡが、アラキドン酸（ＡＲＡ）を含み、及び／又は
ｏ）前記容器が、１０リットル以上の容量を有する、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、クサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、任意にモルティエレーラ・アルピーナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）であり、及び／又は非遺伝的に修飾されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも５０％のアラキドン酸（ＡＲＡ）を含み、及び、
ａ）少なくとも９０％のトリグリセリド含有量を有し、
ｂ）２．５以下の過酸化物価（ＰＯＶ）を有し、
ｃ）１．０以下のアニシジン値（ＡｎＶ）を有し、
ｄ）ヘキサン抽出され、及び／又は
ｅ）５％以下のリン脂質含有量を有する、
ことを特徴とする微生物油。
【請求項８】
ｆ）５％未満のＣ２０及び／又はＣ２４ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、及び／又は
ｇ）５％未満のＣ２２＋ＰＵＦＡ、
を有する請求項７に記載の油。
【請求項９】
ｈ）遊離脂肪酸含有量が、≦０．４％、
ｉ）前記トリグリセリド含有量が、少なくとも９５％又は９８％、及び／又は
ｊ）前記油が、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって調製され得る、
請求項７又は８に記載の油。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法によって入手できる微生物油及び／又は請求項７〜９のいずれか１項に記載の微生物油を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
食物（特殊調製粉乳など）、食品、飼料、又は飼料サプリメント、医薬、獣医組成物又は化粧品組成物である請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、任意に微生物油中のＰＵＦＡの製造方法に関し、微生物を２段階の方法で培養する工程、及び続いて、微生物から微生物油を回収する工程を含む。本発明は、さらにそのような方法から得られる新規な（例えば、微生物）油に関する。上記油中では、５０％以上の脂質（又はＰＵＦＡ、例えば上記油中）は、アラキドン酸（ＡＲＡ）である。上記油が、２．５又は２．０より低い低過酸化物価（ＰＯＶ）及び／又は１．０以下の低アニシジン値（ＡｎＶ）を有してもよい。本発明は、さらに本発明の微生物油を含む食物及び飼料サプリメント又はそれから生じる使用に関する。
（序）
ポリ不飽和脂肪酸、即ち、ＰＵＦＡは、天然に見出される。多彩な異なるＰＵＦＡが、異なる単細胞生物（藻類、菌類など）によって産生される。一つの特に重要なＰＵＦＡは、アラキドン酸（ＡＲＡ）であり、多くの長鎖ポリ不飽和脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡ）の一つである。化学的にアラキドン酸は、シス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（２０：４）であり、ＬＣ−ＰＵＦＡの（ｎ−６）ファミリーに属する。
アラキドン酸は、エイコサノイド、すなわち、プロスタグランジン、トロンボキサン及びロイコトリエンを含む群として集団的に既知な多彩な生物活性化合物の主な前駆体である。アラキドン酸は、ヒト母乳の脂質フラクションの成分の一つであり、また幼児の最適な神経発達に必要不可欠と考えられる。アラキドン酸は、特殊調製粉乳、食物及び動物の飼料における使用を含む多彩な異なる用途を有する。
【０００２】
アラキドン酸は、微生物及び特に繊維状菌類クサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）を使用して産生され得る。しかし、産生された微生物油中のアラキドン酸の百分率は、通常低すぎる。クサレケカビからアラキドン酸の収量を増加させるために多くの試みがなされたが、成功の度合いは様々である。アラキドン酸レベルを増加させる多くの試みは、工業環境では容易に使用できない工程を含む。
例えば、Ｅｒｏｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  （３５）  ２０００，ｐｐ  １１７１−１１７５は、発酵の終了後、約１週間の期間、培地をそのままにしておく。引用されるＡＲＡの量は、この文献が、どんな油の抽出も記載しないので、バイオマス（それから抽出された油ではなく）に基づく。Ｔｏｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｏｉｌｓ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｃａｍｐａｉｇｎ，  １９９２，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，  ｐｐ  ５２−６０  ａｎｄ  Ｌｉｐｉｄｓ，  ｖｏｌ．  ２２  Ｎｏ．  １２（１９８７）  ｐａｇｅｓ  １０６０−１０６２は、発酵が相当に遅らせられることを意味する、異常に低い発酵温度の使用を提言する。ここでＡＲＡ含有量は、クロロホルム／メタノール溶媒混合物での抽出に基づく。ＡＲＡ産生分野における別の文献は、ＷＯ  ９６／２１０３７である。
ＥＰ−Ａ−１０３５２１１（サントリー）は、Ｍ．アルピーナ（ａｌｐｉｎｅ）からＡＲＡ及びＤＨＧＬＡ脂質を産生するための方法を開示する。しかし、ＡＲＡ含有量の計算は、バイオマス（それから抽出された油でなく）に基づくか、又はポリ不飽和脂肪酸が最初にエステル化され、その後溶媒を使用して抽出される解析方法（最初に抽出して、油を製造し、ついでＡＲＡ含有量をこの油に基づき決定するのではなく）から得られる。
ＡＲＡのより高い収量の一つの報告は、Ｍ．アルピーナの１Ｓ−４菌株を使用して約７０％の収穫された菌糸の濃度を主張する  （Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ．  ，  Ｏｉｌｓ−Ｆａｔｓ−  Ｌｉｐｉｄｓ  １９９５，  Ｐｒｏｃ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒ．  Ｉｎｔ．  Ｓｏｃ．  Ｆａｔ  Ｒｅｓ．，２１５ｔ  （１９９６），  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９５，  Ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐａｇｅｓ  １０３−１０９  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌ．  １５０（１），１９８８，  ｐａｇｅｓ  ３３５−４４１）。しかし、この百分率は、上記細胞に基づくものであり微生物油中のＡＲＡ割合と同一でない。実際、上記の製造された油は、３９．０％の含有量のＡＲＡを提供する（表２７．２、頁１０５）（この技術は、必ずしも、ＡＲＡ含有量を測定する種々の異なる方法を使用し、本明細書の後で引用される図と同じ単位であるか又は分析プロトコルに基づくものではない。）。さらに、これは、Ｍ．アルピーナ細胞が発酵後さらに６日間室温で、放置されると得られ、明らかに工業生産方法に実施可能な選択でない。
従って、微生物油中アラキドン酸の割合（及び収量）を増加させる方法、特に工業規模で使用でき得る方法を特定する必要がある。
【発明の概要】
【０００３】
（本発明の概要）
本発明は、増加した比率のアラキドン酸を有する（微生物）油を製造する新規な方法を提供する。これは、アラキドン酸が、減少したコスト及び増加した速度で製造されることを意味する。さらに、本発明は、アラキドン酸の産生を高めるために関連する微生物の遺伝子修飾を依存しないので、本発明は、天然の、非遺伝子修飾食品原料に対する増加した需要に合致する助けになり得る。さらに、この油は、低い酸化電位を有し、毒性が特に重要であるヒト食品、例えば特殊調製粉乳（ｉｎｆａｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａ）への配合に好適である。
従って、本発明の第一の態様は、微生物油又はポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造方法に関する。本方法は、発酵容器内で、好ましくは培地で、発酵の終了の前（又はそれに先行する段階で）微生物を発酵（又は培養）する工程を含み、
ａ）上記炭素源が、前記培地に添加されるより早い速度で、微生物によって消費され、
ｂ）上記炭素源を、１時間当たり≦０．３０Ｍ炭素／ｋｇ培地の速度で添加し、
ｃ）上記炭素源を、微生物の成長に対し速度制限的であるか、又は前記微生物が（それ自身の）脂肪及び／又は脂質を代謝するように制限され、
ｄ）上記炭素源の添加速度が前記微生物による上記炭素源の消費速度まで減少されるか、又はそれ以下であり、
ｅ）  発酵の終了に又は発酵の終了の前に、上記炭素源を全て使用するか、又は培地中の濃度が、約０となり、
ｆ）上記炭素源の添加が停止されるが、発酵を継続させ、及び／又は
ｇ）上記微生物が、それらが、アラキドン酸（ＡＲＡ）に優先して、ＡＲＡ以外の脂肪（例えば、細胞内部、ＰＵＦＡ等）を代謝する条件におかれる、
ことを特徴とする。
【０００４】
本発明の第二の態様は、微生物油に関し、
その微生物油が、少なくとも５０％（又は少なくとも５０．５、５１又は５２％）のアラキドン酸（ＡＲＡ）を含む。それは、５５、５７又は６０％までのＡＲＡを有してよい。この油は、
ａ）少なくとも９０％のトリグリセリドの含有量を有し、
ｂ）２．５未満のＰＯＶを有し、
ｃ）１．０未満のＡｎＶを有し、及び／又は
ｄ）５％以下（ｂｅｌｏｗ）のリン脂質含有量を有する
を有し得る。
この油は、第一の態様の方法によって調製できる。それは、ヘキサンで抽出できる。
いったん炭素源の濃度が、減少又は制限されると、細胞は、細胞内の脂肪又は脂質を代謝し始めると考えられる。しかし、細胞は、最初にＡＲＡではなく脂肪を消費する。このように、細胞内の脂肪又は脂質中のＡＲＡ比率は増加する。従って、このように、最初の態様の方法は、第二の態様のより高いＡＲＡ含有量の油を導く。
（本発明の詳細な発明）
微生物
使用される微生物は、細菌、酵母、藻類又は菌類でよい。好ましくは、菌類が使用され、また特に糸状菌が使用される。好ましくは、菌類は、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）である。菌類は、クサレケカビ属（モルティエレーラ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ヒゲカビ属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、エントモプアトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、コウガイケカビ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）  又はアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）でよい。好適な菌類は、クサレケカビ・アルピーナ（モルティエレーラ・アルピーナ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）種である。好適な酵母は、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）例えば、ピチア・シフェリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ）である。細菌は、プロピオニバクテリウム属でよい。好適な藻類は、渦鞭毛藻類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）であり及び／又はクリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、チノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）又はニッチア（Ｎｉｔｓｃｈｉａ）に属し、例えばクリプテコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）種である。
本発明で使用される微生物菌株は、天然に由来するものでよく又は一般に使用される工業的菌株である。上記菌株は、遺伝子変換されてなくてもよく、例えば、ベクターで変換されなくてもよく、また異種の遺伝子を含まなくてもよい。遺伝子工学的に加工された成分を含まない食物に対する、四分のいくつかには、最近の嗜好が提供されれば、使用される微生物は、修飾されていない菌株でよい。
【０００５】
ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）
ＰＵＦＡは、単一ＰＵＦＡでもよく、又は２以上異なるＰＵＦＡでもよい。
そのＰＵＦＡ又は各ＰＵＦＡは、ｎ−３又はｎ−６ファミリーとなり得る。好ましくは、それは、Ｃ１８、Ｃ２０又はＣ２２ＰＵＦＡである。それは、少なくとも１８個の炭素原子及び／又は３又は４個の二重結合を有するＰＵＦＡでよい。ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸、塩の形態で脂肪酸エステル（例えばメチル又はエチルエステル）として、リン脂質として及び／又はモノ−、ジ−又はトリグリセリドの形態で、単離され得る。
好適な（ｎ−３及びｎ−６）ＰＵＦＡは、
藻類又は菌類例えば、（渦鞭毛藻類）クリプテコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）又は  （菌類）  ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）  から好適なドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，  ２２：６  Ω３）  ；  
γ−リノレン酸  （ＧＬＡ，  １８：３  Ω６）  ；
α−リノレン酸  （ＡＬＡ，  １８：３  Ω３）  ；  
共役リノレン酸  （オクタデカン二酸，  ＣＬＡ）；  
ジホモ（ｄｉｈｏｍｏ）−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ，  ２０：３  Ω６）  ；  
アラキドン酸  （ＡＲＡ，  ２０：４  Ω６）  ；  及び
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，  ２０：５  Ω３）．を
含む。
好適なＰＵＦＡは、アラキドン酸  （ＡＲＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）  及び／又は  γ−リノレン酸（ＧＬＡ）を含む。特に、ＡＲＡが好適である。
【０００６】
発酵
発酵／培養は、（液体、通常水性）培地を含む好適な発酵槽（又は発酵容器）内に典型的に、実施される。主な発酵容器は、小さい飼料発酵槽から無菌でイノキュレートされる。典型的に、水浸された及び／又は好気性の発酵方法が使用される。これは深いタンク発酵槽で生じ得る。発酵槽は、ｐＨ及び温度を監視（モニター）し及び／又は変化させる装置が備え付けられ得る。上記容器は、さらにエアレーション及び／又は細胞及び液体の混合、例えば溶液の攪拌の実行又は実施に適用されるようになっている。これは、攪拌でよく、例えば機械的手段を使用して達成される。
上記発酵槽の容積は、好適には少なくとも１０、２０、４０又はさらに６０ｍ３である。１００又はさらに１５０ｍ３ほど大きい容積が使用され得る。
上記発酵は、典型的に１０日以下、好ましくは９日以下、より好ましくは８日以下持続するだろう。それは少なくとも４、５、６又は７日間でもよい。
任意に、上記発酵は、１５０〜２００時間、例えば１６０〜１９０時間程度、例えば、１７０〜１８０時間でよい。発酵の終了は、通常攪拌及び／又はエアレーションが停止する時点である。これは、発酵槽、及び／又は補助的な装置が（効果的に）スウィッチが切れたときなり得る。その後、微生物は、発酵槽から取り出され得る。
上記発酵槽は、２０〜４０℃の温度でよい。
【０００７】
炭素及び窒素源
いかなる好適な培地も発酵槽で使用され、例えば使用される微生物に適当な培地が使用され得る。炭素源は、（複合源、例えば）マルトデキストリン、オート麦、糖蜜、植物（例えば大豆）油、麦芽エキス、デンプン、エタノール又は大豆油を含み得る。好適な（非複合の）炭素源は、炭水化物又は糖、例えばフルクトース、マルトース、スクロース、キシロース、マンニトール、グルコース又はラクトース又はグリセリン（例えば植物源から）、シトレート、アセテート、グリセロール、エタノール又は（例えばナトリウム）アスコルベートを含む。本発明の好適な態様において、炭素源は、グルコースでも、グルコースを含んでもよく、特にグルコースシロップである。
好適な窒素源は、酵母抽出物、尿素及びペプトンを含む。上記培地は、寒天を除き得る。
好適な窒素及び／又は炭素源は、水性又は水混和性である。
上記培地の個々の成分（例えば窒素源及び／又は炭素源）は、発酵の開始時に（すべて）存在し、発酵の間継続的に添加されるか、又は段階的に又はバッチで添加されてもよい。特に、培地に存在する炭素源の量は、典型的に以下に記載のように、好適には炭素源の添加速度を制御することにより制御され得る。
【０００８】
窒素源及び／又は炭素源は、別々に供給され（又は添加され）、又は同時に供給され、又は組み合わせた調製物として供給され得る。従って、それらは、好適には液体である同一組成物中（必要と思えば）に存在させてもよい。炭素源及び／又は窒素源は、（発酵容器に）真菌細胞が添加される前、いわゆるイノキュレーション前に又は発酵の最中に（上記容器に）添加されてよく、上記とは別に発酵の前及び最中の両方に添加されてよい。
培地
培地は、好適には水性液体である。これは、発酵を補助する他の物質、例えばキレート剤（例えばクエン酸）、抗発泡剤（例えば大豆油）、ビタミン（例えばチアミン及び／又はリボフラビン）、すべての必要な触媒金属（例えばアルカリ土類金属、マグネシウム又はカルシウム、又は亜鉛又は鉄など及び／又は他の金属、コバルト及び銅など）、リン（例えばホスフェート）及び／又は硫黄（例えばサルフェート）を追加的に含んでよい。上記培地は、必要であれば、添加油、例えばオリーブ油又は大豆油を含んでもよいが、好適には上記培地は、そのような油を含まない。
（最適）成長（又は発酵）温度は、使用される微生物により変動し得る。しかし、２０℃〜４０℃が好適であり、さらに、２２〜３０℃又は３２℃が好適である。特に、発酵が実行される温度は、≧２２℃又は≦２５℃、例えば２２〜３０℃、２３〜２８℃程度であろう。発酵中の水溶液のｐＨは、４〜１０、例えば５〜１０、好ましくは６〜７である。
上記培地は、典型的に発酵中に攪拌されて、エアレーションの促進を助けるだろう。上記水性液体及び細胞は、好適に混合され又は攪拌される。これは、エアレーションが提供されると、例えば空気などの気体を水性液体にバブリングすることによって達成され得る。これは、酸素を真菌細胞に提供する追加の目的を果たし、従って発酵は好ましくは好気性発酵である。攪拌又は混合の他の方法は、例えばインペラを使用する攪拌を含む。これは、ハイドロフォイル軸流デザイン又は水性培地がインペラ（例えばタービン）から半径方向に外に迅速に向けられるように設計され得る。たとえ攪拌しないとしても、微生物細胞は、発酵中酸素が提供されることが好適であり、またエアレーション（例えば、空気、酸素又は他の酸素含有気体をバブリングすることによる）が有利である。エアレーションは、０．１〜２．０、例えば０．５〜１．０ｖｖｍでよい。
発酵槽の容積は、好ましくは少なくとも２又は５リットル、好ましくは少なくとも１０リットルである。しかし、工業的に又は工業規模で使用される発酵槽では、容器容積は、好ましくは少なくとも５０、１００、５００又は１０００リットルである。
【０００９】
発酵の最終（又は第二）段階
発酵方法は、少なくとも２つの段階に分けられ得る。発酵の終了の直前の段階である第二の、即ち、最後の段階は、微生物が利用できる炭素源の量を減少させること、又は第一の態様で示される（ａ）〜（ｇ）の特徴のいずれかで特徴づけられる。典型的に、この段階は、発酵の終了前１５〜２時間、好ましくは発酵の終了から１０時間以下、より好ましくは発酵の終了から３〜５時間前に開始し得る。好ましくは、この段階は、発酵の開始後、典型的に１０日未満、好ましくはこの段階は、９日未満後に、さらに好ましくは８日未満後に開始する。
発酵の第一又は初期段階の間、炭素源は過剰でよい。従って利用できる炭素源の量は、微生物の成長を制限しないかも知れない。炭素源の添加速度は、微生物によって炭素源が消費される速度を上回るかも知れない。発酵の第二又は最後の段階において、添加される炭素源の量は、減少され又は全体的に停止され得る。これは、微生物に利用可能な炭素源の量は、発酵の第二又は最終段階で減少させることを意味する。典型的には、第二の、最終又は最後の段階で又は発酵の終了に向けて、炭素源は、
・培地に添加されるよりも早い速度で、微生物によって消費され（例えば、添加速度は、消費速度より遅い。）、
・１時間あたり≦０．３０Ｍ炭素／ｋｇ培地の速度で、例えば≦０．２５又は≦０．２０、しかし少なくとも０．０１、０．０２又は０．０５Ｍ炭素／ｋｇ培地／ｈｒ（ここでの単位は、炭素源自身の質量又はモルではなく、炭素源中の炭素のモル又はモル質量を意味する。）で添加し、
・微生物の成長及び／又は（ＰＵＦＡ）生成について速度制限的となり得る。
【００１０】
典型的には、第二段階での炭素源の濃度は、≦１０ｇ炭素源／ｋｇ培地、好ましくは０．０１又は０．１〜８又は１０ｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜５ｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１又は２〜４又は５ｇ／ｋｇである。これは、発酵の最終段階の平均で、≦０．３０Ｍ炭素源／ｋｇ培地、好ましくはｋｇあたり０．００３Ｍ〜０．３Ｍ炭素であることを意味する。有利とするには、これは、０．０１５Ｍ〜０．１７Ｍ炭素／ｋｇ、より好ましくは０．０３Ｍ〜０．１７Ｍ炭素／ｋｇである。
炭素源がグルコースを含む場合、典型的にはグルコース（最終段階）の濃度は、平均≦１０ｇ／ｋｇ培地、好ましくは０．０１又は０．１〜８又は１０ｇ／ｋｇであろう。有利とするには、０．５〜５ｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１又は２〜４又は５ｇ／ｋｇ培地である。この意味で、培地は、細胞及び水性培地をすなわち、「ブロス」（細胞及び周囲液体）含む。
最終段階の炭素源の添加速度は、好適には０．０３Ｍ以下の炭素／ｋｇ、好ましくは０．０２５又は０．０２Ｍ炭素／ｋｇ（培地）である。好ましくは、添加速度は、約０．０１５Ｍ炭素／ｋｇである。炭素源がグルコースの場合、好適には、グルコースの添加速度は、１．０未満、例えば０．８未満、例えば０．５ｇグルコース／ｋｇ培地／時間である。
好ましくは、最終段階の炭素源の添加速度は、微生物による炭素源の消費速度の約半分である。しかし、添加速度：減少速度の比率は、１：１〜３、例えば１：１．５〜２．５、好ましくは１：１．８〜２．２と変化し得る。上記とは別に、添加速度は、消費速度の３０〜７０％、例えば４０〜６０％、好ましくは４５〜５５％である。
発酵の第二段階での適当な炭素源の濃度は、炭素源の添加速度を注意深く制御することにより達成され得る。典型的に、これは、最終段階の間で又は適切に減少又は最終段階の開始を早めるようにされる。定期的に培地のサンプリングし、かつ分析することにより、炭素源の濃度を決定し、炭素源の添加速度を必要に応じて調整することができる。これは、コンピュータシステムを使用して自動的になされ得る。
【００１１】
低温殺菌（ｐａｓｔｅｕｒｉｚａｔｉｏｎ）の方法
発酵が終了した後、低温殺菌を通常行う。好適な態様において、低温殺菌は、低温殺菌中、熱が細胞を殺すので、発酵を終了させる。従って低温殺菌は、発酵ブロス（又は液体（水性）培地中の細胞）で実施するが、ブロスから得られる微生物バイオマスに対して実施してもよい。前者の場合、微生物細胞をそのまま発酵槽内部に置きながら、低温殺菌が生じさせ得る。低温殺菌が、微生物細胞のさらなるプロセシング、例えば顆粒化（例えば押出による）細片、又は混練の前に好ましくは生じる。
好ましくは、低温殺菌のプロトコルは、ＰＵＦＡ又は微生物油に悪影響を生じさせ、又はこれを低下させる１種以上の酵素、例えばリパーゼを抑制させ、又は不活性化させるのに十分である。
一旦発酵が終了すると、発酵ブロスが、濾過され、又は別に水又は水性液体を除去するように処理してもよい。水を除去した後、バイオマス「ケーク」を得るだろう。低温殺菌が生じないと、脱水された細胞（又はバイオマスケーク）を、低温殺菌に付してもよい。
油抽出
所望であれば、例えば発酵が終了した後、微生物が殺菌し又は低温殺菌され得る。これは、すべての望ましくない酵素、例えば上記油を分解し又はＰＵＦＡの収量を減少させる酵素を不活性化させ得る。
培養又は発酵が完了又は終了した後、発酵ブロス（細胞及び水性液体）は、発酵容器から取り出され得、また必要であれば液体（通常水）をそこから取り出す。すべての好適な固液分離技術を使用し得る。これ（脱水）は、遠心沈殿法及び／又は濾過による。細胞は例えば水溶液（水など）を使用して洗浄され、例えば細胞外水性化合物又は水分散性化合物を分離する。次いで、油が溶媒抽出、好ましくはヘキサンで抽出されるように、油を微生物から、例えば溶媒を使用して回収し得る。
上記油は、ＧＬＡ及び／又はＤＧＬＡを有さない（又は実質的にない）かもしれない。
【００１２】
ＰＵＦＡ抽出方法
ＰＵＦＡ（又は通常ＰＵＦＡを含む微生物油）は、（例えば、乾燥）顆粒（例えば押出物）含有細胞から抽出され得る。抽出は、溶媒を使用して行われ得る。好ましくは、非極性溶媒が使用され、例えばＣ１−８、例えばＣ２−６アルカン、例えばヘキサンが使用される。（液体形態で、例えば超臨界状態での）二酸化炭素を使用してもよい。
従って、細胞は、例えば有機溶媒、好ましくは窒素流の下で抽出に付される。他の使用可能な有機溶媒は、エーテル、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン及び／又は石油エーテルを含む。メタノール及び石油エーテルでの抽出及び／又はクロロホルム、メタノール、及び水からなる１層溶媒系での抽出も使用され得る。減圧下での抽出物からの有機溶媒の揮発によって、高濃度のアラキドン酸を含む微生物油が得られる。
好ましくは、溶媒は、乾燥顆粒上を浸透する。好適な微生物顆粒化及び抽出技術及び続く微生物ＰＵＦＡ含有油の抽出は、ＷＯ−Ａ−９７／３７０３２に開示される。
上記溶媒は、粗ＰＵＦＡ含有油を得られるようにする。この油は、さらに処理せずにその状態で使用されるか、又は１以上の精製工程に付され得る。好適な精製プロトコルは、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ０１／０８９０２に開示されている（この文献の内容及びここで開示された他のすべては、ここに参考として取り込まれる）。例えば、上記油は、酸処理又はデガミング（ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ）、アルカリ処理又は遊離脂肪酸除去、漂白又は顔料除去、濾過、ウィンテリゼーション（ｗｉｎｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）（又は冷却、例えば飽和トリグリセリドの除去）、臭気除去（又は遊離脂肪酸の除去）及び／又はポリッシング（又は油不溶性物質の除去）に施され得る。
得られた油は、特に栄養上の目的において好適であり、（ヒト）食品又は（動物）食糧に添加され得る。例として、ミルク、特殊調製粉乳、ドリンク剤、パン及び動物飼料が挙げられる。
【００１３】
精製／仕上げ
微生物油は、仕上げ及び精製され得る。これは、リン脂質、微量金属、顔料、炭水化物、タンパク質、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、油不溶性物質、水不溶性物質、石けん又はケン化物質、酸化生成物、硫黄、モノ又はジグリセリド、顔料分解生成物、溶媒及び／又はステロール、の１種以上の除去を含む。精製は、「オフ−フレーバー（ｏｆｆ−ｆｌａｖｏｕｒｓ）」を低減又は除去し及び／又は油の安定性を改良するかも知れない。
これを達成するために、上記方法（例えば精製）は、デガミング（又は酸処理）、中和（又はアルカリ処理）、水洗、漂白、濾過、臭気除去、ポリッシング及び又は冷却（又はウィンテリゼーション）を含む。好ましくは、精製は、酸処理及び／又はアルカリ処理（デガミング及び中和）を含む。これとは別に、精製方法は、漂白及び／又は臭気除去を含み得る。好ましくは、精製は、漂白及び／又は臭気除去にまた、好ましくは、さらに酸及び／又はアルカリ処理に関連する。
【００１４】
油
本発明の第二の態様は、ＡＲＡのような少なくとも１種のＰＵＦＡを３５又は４０％含む微生物油を提供することである。この油は、ＡＲＡのような、このＰＵＦＡを少なくとも５０、５５又は６０％以上含む。それは９０％以上のトリグリセリド含有量を有し得る。好ましくは、上記微生物油は、５０、５５又は６０〜９０％のアラキドン酸、より好ましくは６０〜８０％及びさらに好ましくは６０〜７０％のアラキドン酸を含む。
好ましくは、微生物油が９０〜１００％の、例えば少なくとも９０又は９６％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最良としては、９９．５％以上のトリグリセリド含有量を有する。典型的に、微生物油は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）含有量を、５％以下、好ましくは１％以下、より好ましくは０．５％以下を有する。この油は、５％未満、２％未満、１％未満の各Ｃ２０、Ｃ２０：３、Ｃ２２：０及び／又はＣ２４：０のポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を有する。遊離脂肪酸（ＦＥＡ）含有量は、≦０．４、０．２又は０．１％でもよい。
トリグリセリドの内、好ましくは少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、及びより好ましくは少なくとも６０％の存在するＰＵＦＡは、１又は３位とも知られるグリセロール（トリグリセリドバックボーンに存在する）のα位に存在する。少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％のＰＵＦＡは、β（２）位である。
この油のリン脂質含有量は、好適には最大で５％、３％又は２％及び／又は最小で０．１、０．５又は１．０％でよい。
典型的に、微生物油は、第一の態様の発明の方法によって入手できるものだろう。好ましくは、この油は、菌類から単離され、より好ましくはこの油は、モルティエーラ及び特にＭ．アルピーナから単離される。上記油は、好適にヘキサン抽出される。
【００１５】
ＡＲＡ含有量
単に明瞭さのために、特に文献が、時として異なる基準でＡＲＡ含有量を計算できるので、ＡＲＡ含有量の割合の計算を説明する。ＡＲＡの百分率は、バイオマス自体ではなく、油（バイオマスから抽出される）に基づく。それは質量／質量に基づく。それは、ヘキサンによって抽出された油に基づき、従って、ヘキサン抽出可能な脂質（ＨＥＬ）に基づく。それは、油の全量に基づくが、脂肪酸の全量（時々、より高い値の誤解を招き得る）に基づかない。ＡＲＡ含有量は、周知のＦＡＭＥ解析プロトコル（脂肪酸メチルエステルを使用する）によって決定され、ＡＯＣＳ  Ｃｅｌ  ｂ８９に詳述される。異なる溶媒は異なる脂質を抽出する。この場合において、油は最初ヘキサンで抽出され、次いで、油のＡＲＡ含有量はＦＡＭＥ解析によって決定される。これは、初めに、アラキドン酸（例えば細胞中の）をエステル化し、次いでさらなる解析のための得られたメチルエステルを抽出することによって異なる結果が得られる。
過酸化物価（ＰＯＶ）
好ましくは、微生物油のＰＯＶは、３．０、２．５又は２．０以下である。しかし、より小さいＰＯＶ値は、本発明の方法を使用して得られ、これらの値は、１．５未満又は１．０未満である。０．８未満及び０．４未満の値が、得られる。
アニシジン値（ＡｎＶ）
微生物油のアニシジン値は、好ましくは１．０以下、例えば０．６、０．３以下又は０．１以下である。
用途及び生成物
本発明の第三の態様は、第二の態様の油を含む組成物及び適当な場合には、１種以上の（追加の）物質に関する。この組成物は、動物又はヒト用の食品及び／又は食品サプリメントでもよい。ヒトの消費に対する本発明の態様において、油は、典型的には微生物から得られる油の仕上げ又は精製によって、ヒトの消費に対して好適にされ得る。
上記組成物は、特殊調製粉乳又は（ヒト）食品でもよい。ここで、上記調乳の組成物は、通常の母乳と類似の脂質又はＰＵＦＡを有するように調節され得る。これは、妥当な組成物を獲得するために、本発明の微生物油と他の油とのブレンドに関する。
上記組成物は、動物又は海洋飼料組成物又はサプリメントでもよい。そのような飼料及びサプリメントは、いかなる家畜、特に羊、牛及び家禽類に与えられる。さらに、飼料又はサプリメントは、養殖海洋生物、例えば魚及び貝類に与えられる。上記組成物は、そのような動物に対する１種以上の飼料物質又は構成成分を含み得る。
本発明の油は、油として直接販売され、また適切な包装、典型的にエポキシフェノールラッカーで内部を被覆され、窒素でフラッシュされたワンピースアルミニウム瓶に含まれ得る。この油は、１種以上の抗酸化剤（例えばトコフェノール、ビタミンＥ、パルミテート）をそれぞれ例えば５０〜８００ｐｐｍ、例えば１００〜７００ｐｐｍの濃度で含み得る。
好適な組成物は、例えば経口で投与される医薬組成物又は獣医組成物又は化粧品組成物を含み得る。この油は、そのまま投与されるか、又は例えばシェルに封入してもよく、又はカプセルの形態でもよい。シェル又はカプセルは、ゼラチン又はグリセロールを含み得る。上記組成物は、他の成分、例えば香味（例えばレモン又はライム香料）又は医薬的又は獣医学的担体又は賦形剤を含み得る。
本発明の一つの態様の好ましい特徴及び性状は、必要な変更を加えて、別の態様に等しく適用される。
以下の例は、本発明を単に説明するために提供され、また制限されると解釈されない。
【実施例】
【００１６】
（比較例１及び２及び実施例３及び４）
（アラキドン酸（ＡＲＡ）の製造）
モルティエレーラ・アルピーナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）菌株ＣＢＳ１６８．９５（オランダ国、２６００  ＭＡ  ＤｅｌｆｔのＤＳＭ  Ｎ．Ｖ．は、この寄託された生物材料に言及することを許可し、寄託番号ＤＳ  ３０３４０として、１９９５年２月２０日、オランダ国、Ｃｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）（Ｐ．  Ｏ．  Ｂｏｘ  ８５１６７，３５０８  ＡＤ  Ｕｔｒｅｃｈｔ）に寄託した。）を−８０℃で、無菌で保存された。内容物を使用して、以下の成分を１００ｍｌの培地を有する５００ｍｌフラスコに接種した。
・グルコース，２０（ｇ／ｌ）、
・酵母抽出物（Ｇｉｓｔｅｘ（登録商標）ペースト（固形分８０％、タンパク質（Ｎｘ６．２５）４６％，ＮａＣｌ１６％、ｐＨ（２％溶液）５．６、灰分２２％、全プレートカウント１０４／ｇ、エンテロバクテリアセア（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科＜１０／ｇ、Ｅ．ｃｏｌｉ＜ｌ／ｇ、酵母及びかび＜１００／ｇ、ＤＳＭ  Ｎ．  Ｖ．
（Ｓａｖｏｒｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ＰＯ  Ｂｏｘ  １，２６００  ＭＡ  Ｄｅｌｆｔ）から入手可能、１２．５（ｇ／ｌ）、
・消泡剤（Ｂａｓｉｌｄｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｋｉｍｂｅｒ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｉｎｇｄｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＯＸ１４  ＩＲＺ）製造者指示書に従って使用されたＢａｓｉｌｄｏｎ８６／０１３Ｋ  ケイ素／非シリコーン消泡剤化合物）、０．２（ｇ／ｌ）。
この培地のｐＨは、オートクレーブ処理前に７．０に調整した。
上記培地を、２５０ｒｐｍで振盪しながら、２５℃、４８時間で成長させ、５００ｍｌの培地を伴う４つの２０００ｍｌ−フラスコのイノキュレーション用に使用した。グルコース、２０（ｇ／ｌ）、酵母抽出物（Ｇｉｓｔｅｘ（登録商標））２５（ｇ／ｌ）；消泡剤（Ｂａｓｉｌｄｏｎ８６／０１３Ｋ）０．２（ｇ／ｌ）を含む。
滅菌前のｐＨは、７．０であった。
これらの培地を、２５℃、２４時間で成長させ、５ｍ３のイノキュレーション発酵槽をシーディングのために使用し、上記発酵槽は、２０００ｍｌ−フラスコと同一の組成物の２４００リットルの培地を含んでいた（滅菌前のｐＨは、６．０であった。）。
発酵温度は、２５℃に設定し、１５０ｒｐｍの攪拌、５００Ｐａ（０．５バール）の容器圧及び０．５ＶＶＭのエアレーション速度に設定した。
生物種菌の発酵槽からの培地を、約３６時間後（酸素取り込み速度は＞３ｍｍｏｌ／ｋｇ／ｈである）主発酵槽へ移した。
上記主発酵槽は、
・グルコース３５（ｇ／ｌ）、
・酵母抽出物（Ｅｘｐｒｅｓａ  ２２００（登録商標）粉末、低ナトリウム発酵酵母（ｌｏｗ  ｓｏｄｉｕｍ  ｂｒｅｗｅｒ’ｓ  ｙｅａｓｔ）、ペプトン（抽出物）、固形分＞  ９６％、全Ｎ＞１０％、アミノＮ  ６−７％、ＮａＣｌ＜１％、ｐＨ（２％溶液５．３−６．３）、灰分＜１２．５％、ＤＳＭ  Ｎ．  Ｖ．（Ｓａｖｏｒｙ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）社製の均質的な粉末）、５．０（ｇ／ｌ）；
・ＮａＨ２Ｐ０４・２Ｈ２０、１．０（ｇ／ｌ）、
・ＫＨ２Ｐ０４、２．０（ｇ／ｌ）、
・ＭｇＳ０４・７Ｈ２０、０．５（ｇ／ｌ）、
・Ｂａｓｉｌｄｏｎ８６／０１３Ｋ、０．３；クエン酸・１Ｈ２Ｏ、０．６（ｇ／ｌ）；
・ＺｎＣｌ２、０．０１０（ｇ／ｌ）、
・Ｆｅ２（ＳＯ４）３２０％Ｈ２０、０．０２５（ｇ／ｌ）、
・ＭｎＳ０４・１Ｈ２０、０．０１０（ｇ／ｌ）；（滅菌前のｐＨは５．０）
を含んでいた（ｇ／ｌ）。
【００１７】
このグルコースは、別々に滅菌し、滅菌後主発酵槽に添加した。
発酵は１７５時間続いた。上記培地のｐＨは、０．５ＶＶＭのエアレーション（気流）、８００Ｐａ（０．８バール）の気圧及び７０ｒｐｍの攪拌の下で、約ｐＨ６（＋／−０．１）で持続した。酸素レベルは、１００ｒｐｍまで連続して増加する攪拌速度及び０．９ＶＶＭまでの気流によって、Ｄ．Ｏ．＞３０％で維持した。
約５０％（ｗ／ｗ）の滅菌されたグルコース溶液を発酵槽に入れ、グルコース濃度を１０ｇ／ｌ以上で約３０〜７８時間維持し、６２５ｋｇの２５％酵母抽出溶液をアンモニア濃度が＜３０ｍｇ／ｌとなるように制御された供給速度で、発酵槽に供給した。
実験を４回実施し（実施例１〜４）、培地のグルコース濃度を経時的にモニターした。発酵への時間数に対する、グルコース濃度（ｇ／ｋｇ）を図１に示した。これは、実施例４の最後の値が１７２時間で２．２ｋｇであったことを示す。これは、発酵終了（ＥｏＦ）前３時間であった。グルコースレベルは、ＥｏＦ前約１時間で０であった。
比較例１及び２において、炭素源（グルコース）の濃度は、発酵の最後で５ｇ／ｋｇよりかなり上であった。実際、ＥｏＦの１０時間前、グルコース濃度は、約２０ｇ／ｋｇであった。従って実施例１及び２において、グルコース濃度は、微生物の群又はＡＲＡの生成に制限的でないようなものであった。
実施例３及び４において、ＥｏＦの直前の、発酵の最終段階におけるグルコース濃度は、ＥｏＦ前約１０時間、グルコースの濃度が約５ｇ／ｋｇであるように制御した。この最後の段階で、１０時間に渡って、グルコースは０．５ｇ／ｋｇ／ｈｒの添加速度で添加した。上記グルコース濃度は、ＥｏＦで、ほとんど０であった。この期間、グルコースの消費速度は、添加速度の約２倍、すなわち約１ｇ／ｋｇ／ｈｒであった。
発酵の間、経時的な培地のグルコース濃度（ｇ／ｋｇ）を表１〜４に示した（これは実施例１〜４に対応する）。
【００１８】
【表１】
2011024582.tif 000002
【００１９】
【表２】
2011024582.tif 000003
【００２０】
【表３】
2011024582.tif 000004
【００２１】
【表４】
2011024582.tif 000005
【００２２】
発酵の最後において、微生物及び周りの水性液体（発酵ブロス）を発酵槽から取り出した。上記ブロスは、固液分離して、いくらかの水を除去した。残った細胞を押出し、ヘキサンを用いた溶媒抽出に付した。ＡＲＡを含有する微生物油（ヘキサン抽出可能な脂質）を細胞から得、４種の異なる発酵プロトコルにそれぞれ付した。
上記油のＡＲＡ含有量百分率（質量基準に対する質量）は、周知のＦＡＭＥ分析プロトコルを使用して決定した（ＡＯＣＳ  Ｃｅ１ｂ８９に詳述）。実施例３において、微生物油中のＡＲＡ濃度は、５０８ｇ／ｋｇ（５０．８％）であった。実施例４に対する等価な数値は、５４５ｇ／ｋｇ（５４．５％ＡＲＡ）であった。対照的に、比較例１及び２における細胞から抽出された微生物油は、はるかに低く、それぞれ３６．８％及び３６．７％であった。
【外国語明細書】
2011024582000001.pdf