(57)【要約】【課題】哺乳類より免疫力の高い鳥類を用いて抗体を産生する技術は従来からあり、特に鶏は実用的に利用されている。鶏は卵が小さく大量に抗体を産生する場合は、多数の鶏を用意する必要があり、個体ごとの抗体の品質の差があった。【解決手段】鳥の中でもダチョウを用いてインフルエンザウイルスに対する抗体を産生することで、同一個体から大量の抗体を産生することができる。またダチョウの卵は鶏卵のような臭いがなく、特異的抗体含有物としても利用しやすい。抗体として季節性インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１型を用いて得た抗体は豚インフルエンザウイルスやヒトに対する最近流行のＨ１Ｎ１型に対しても中和特性を示した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスのＨＡ抗原を免疫したダチョウの雌が産卵した卵の黄身から抽出したＩｇＹ。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルスは、季節性インフルエンザウイルスソ連型（Ｈ１Ｎ１）である請求項１に記載されたＩｇＹ。
【請求項３】
前記インフルエンザウイルスは、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｋｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）である請求項１または２に記載されたＩｇＹ。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの請求項に記載されたＩｇＹを染み込ませたフィルター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｈ１Ｎ１タイプのインフルエンザウイルスに対する抗体に関する。より詳しくは鳥類特にダチョウを用いその卵からインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１型）に対する抗体を産生する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類と比べ鳥類は大変高い免疫能力を持つことが知られている。これは鳥類が哺乳類とは全く異なった進化の過程を経てきているからといわれている。また鳥類の雌が有する抗体は卵となって体外に排出されるので、抗体の作製にも利用されている。
【０００３】
鶏は従来からこのような抗体産生のために検討され、実際に利用されている動物である。例えば、鶏に抗原を接種し、抗原に特異的な抗体を鶏体内に形成させる。抗体が形成された後、この鶏が産卵した卵の全卵、卵黄または卵白より特異的抗体を含有する材料を大量に得る方法が開示されている（特許文献１参照）。
【０００４】
この抗原にはインフルエンザウイルスを用いた場合も検討されており、鶏卵から得られた抗体をスプレーで粘膜に噴霧する技術の開示がある（特許文献２参照）。また、鶏卵から得られた抗体を担持するマスクといった技術もある（特許文献３参照）。
【０００５】
また、鶏卵から得られる抗体を含有する卵黄には、鶏卵特有の色や臭いがあるため、使いづらいという課題に対して鶏への飼料からカロチノイドを抜き、鶏卵特有の色や臭いのない白色化卵黄を得る技術の開示もある（特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−２１５５３４号公報
【特許文献２】特開昭６２−１７５４２６号公報
【特許文献３】特開２００５−１６９１０５号公報
【特許文献４】特開平４−１０３５３９号公報
【特許文献５】特開２００９−２３９８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
鶏は１つの卵が小さく、大量に抗体を産生する場合は多くの鶏を用いる必要がある。鶏は個体が違えば免疫力も異なり、産生される抗体もそれぞれ異なる。従って同じ抗原を用いても免疫した個体が異なれば、全くの同一物ではない。それゆえ、得られた抗体は、個体の違いによるロット差が発生してしまうという課題があった。抗体を利用する場合はできるだけ、均一な品質でロット間による違いのないものが望ましい。
【０００８】
また、鶏卵に対するアレルギーを有する人は比較的多いので、鶏卵から得ることのできる特異的抗体含有物を経口摂取し、予防若しくは治療効果を図る場合は、アレルギー反応に注意しなければならないという課題もある。
【０００９】
また、カロチノイドを除いた飼料を与えたとはいえ、鶏卵特有の臭いは完全にはなくならず、卵から得られる特異的抗体含有物の利用には、個人的な嗜好上の課題が残る場合もある。
【００１０】
この課題を解決するために発明者は鳥類（ダチョウ）を使った抗体の産生についての発明を提案した（特許文献５）。しかし、現在世界的に流行し始めているＨ１Ｎ１型インフルエンザウイルスに対して、ダチョウによる抗体の効果については実証されていなかった
。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明はかかる課題の解決のために想到されたものである。本発明では現在世界的に流行の兆しを示している以下の５種類の新型インフルエンザウイルスに対応すべく、季節性インフルエンザウイルスを抗原として鳥類（ダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ  ｃａｍｅｌｕｓ））を用いて、その卵から抗体を得た。
【発明の効果】
【００１２】
ダチョウの卵は鶏卵のおよそ２０〜３０倍であり、その卵から得ることのできる抗体の量も同等倍である。従って、１羽のダチョウから大量の抗体を得ることができ、これはすなわちロット間の差を少なくすることができるという効果を得る。
【００１３】
また、ダチョウの卵は鶏卵と比較しアレルギーが少ないという特徴がある。従って、卵から得られた抗体含有物を経口摂取し、予防若しくは治療効果を図る場合には、アレルギー反応というリスクを回避しやすいという効果を得る。
【００１４】
また、ダチョウの卵は鶏卵のような臭いがなく、例えばマスクなどに用いてもほとんどの人に対して問題なく利用できる。
【００１５】
そして、ダチョウから得た下記の５つのインフルエンザウイルスに対する抗体は、いずれもウイルスに対する中和力を示した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＭＤＣＫ細胞にウイルスおよびウイルスと本発明の抗体を感染させた状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ダチョウに抗原を免疫すれば血液に特異抗体が産生され、そのうちＩｇＹが卵黄に移行し、産卵と同時に排出される。この卵黄よりＩｇＹを抽出すれば特異的で高感度の抗体を大量に得ることができ、それを診断・検査薬や治療薬として利用できる。一個の卵黄から２〜４ｇのＩｇＹの精製が可能であり、１羽のダチョウから年間４００ｇの抗体を得ることが可能である。つまり１羽で約４０００万人分以上のロット差の少ない診断キットの作製が可能になる。多数のダチョウを使用すれば莫大な量の抗体の生産も可能であり、工業用としての利用価値がある。
【実施例１】
【００１８】
本実施例では、現在世界的に流行の兆しを示しているＨ１Ｎ１型インフルエンザウイルスを、国内で分離した５種類と豚のインフルエンザウイルスと、ヒトの季節性インフルエンザウイルスの臨床分離株の計７種のウイルスを用いた。用いたウイルスを表１に示す。
【００１９】
【表１】
2011020927.tif 000002
【００２０】
＜抗体の作製法＞
雌のダチョウにＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９  （Ｈ１Ｎ１）のＨＡ抗原免疫した。初回免疫はＨＡ抗原３０μｇをフロイントの完全アジュバントに混和し雌ダチョウの腰部筋肉内に接種した。２週間後および４週間後に追加免疫（ＨＡ抗原３０μｇをフロイントの不完全アジュバントに混和）した。初回免疫から６週目以降に産卵されたダチョウ卵の卵黄よりダチョウＩｇＹを精製した。卵黄の精製は以下のように行った。
【００２１】
まず、卵黄に５倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と同量の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分攪拌する。
【００２２】
そして１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量加え攪拌し、１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し上清を回収する。
【００２３】
次に、最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置する。その後、１５０００ｒｐｍで２０分遠心し、沈殿物を回収する。最後に、卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する。
【００２４】
この課程により９０％以上の純度のＩｇＹの回収が可能となった。１個の卵黄より２〜４ｇのＩｇＹを精製することができた。
【００２５】
＜培養実験＞
上記のウイルスを培養細胞に感染させる実験を行った。培養細胞はＭＤＣＫ細胞を用いた。ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザウイルスの分離同定やウイルス力価の測定に用いられる一般的な培養細胞である。この細胞は通常敷石状に単層に培養でき、例えばウイルスに感染することで細胞に何らかの変化が生じる球形に変形するため細胞変性効果（ＣＰＥ：ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を顕微鏡下で容易に観察することができる。
【００２６】
ウイルスは、以下のようにしてＭＤＣＫ細胞に感染させた。上記５種のインフルエンザウイルスを１０２ＴＣＩＤ５０／ｍＬ（１０の２乗Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ
ｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ：１００倍したら組織培養細胞の半数（５０％）が感染する量）に調整し、ＭＤＣＫ細胞に１時間３７℃で吸着させた。その後、トリプシン含有培養液（ＧＩＴ培地）を加え３５℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。培養３日目に顕微鏡でＣＰＥの有無を観察した。
【００２７】
抗体の効果を確認するために、様々な濃度（４倍段階希釈）のダチョウ抗体を上記ウイルス液に混合し、３７℃で１時間反応させた。そして、その後に培養細胞に吸着させた。吸着後の手順は上記の通りである。ＣＰＥが観察される抗体の最大希釈倍率を観察した。
【００２８】
図１に観察結果の写真を例示する。図１（ａ）を参照して、感染前のＭＤＣＫ細胞は、培養すると培養皿の底面に敷石状に一層で培養されている。写真は黒線が５０μｍであり、均一であるため写真では細胞の有無さえ識別しにくい。
【００２９】
図１（ｂ）は、ＭＤＣＫ細胞にＡ／Ｈ１Ｎ１／Ｏｓａｋａ／４７／２００９  （Ｈ１Ｎ１）を感染させ、培養を行った場合の写真である。感染したＭＤＣＫ細胞は丸く変形し（細胞変性効果）、培養皿の底面から浮き上がる。なお、これは感染２日目の写真である。
【００３０】
図１（ｃ）は、Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｏｓａｋａ／４７／２００９  （Ｈ１Ｎ１）にダチョウ抗体１０マイクログラム／ＭＬを反応させた後に細胞に感染させた場合の感染２日目の写真である。ＭＤＣＫ細胞には、細胞変性効果が現れず、感染前の状態と同じ状態であった。この効果は表１で示した全てのインフルエンザウイルスについて確認することができた。
【００３１】
＜抗体価の測定＞
上記ウイルス感染および抗体の反応性を見る試験は、９６穴培養プレートで行った。ＭＤＣＫ細胞を全てのｗｅｌｌ（つまり９６穴）に培養させ、全てにウイルス（または抗体反応後のウイルス）を感染させた。抗体の各濃度には４穴を用いた（たとえば、２ｍｇ／ｍＬは４穴）。ＣＰＥの有無を記録し、定法、「ｂｅｈｒｅｎｓ−ｋaｒｂｅｒ変法」に
従って５０％感染抑制値を算出した。５０％感染抑制値は少ない値ほど抗体としてウイルス中和効果があることを示す。抗体価の結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
表２から、ダチョウに季節性インフルエンザソ連型Ｈ１Ｎ１ウイルスのＨＡ抗原を注射（免疫）して作製した抗体は、新型インフルエンザウイルスに対して２０μｇ／ｍＬ代という低い抵抗価を確認できた。これはこの抗体が新型インフルエンザウイスルに対する高い中和作用を有するものであることを示している。
【００３４】
この原因は、ダチョウ抗体がインフルエンザウイルスのＨＡ抗原に結合するので、ウイルスが細胞表面の受容体に引っ付くのがブロックされ結果的に感染が抑制されたということであると考えられる。
【実施例２】
【００３５】
ダチョウ抗体を担持させたフィルターを作製した。ダチョウ抗体５０μｇを１５ｃｍ×７ｃｍの不織布に染みこませ熱乾燥させた。
【００３６】
抗体フィルターのウイルス不活化能の測定：上記抗体フィルター（１５ｃｍ×７ｃｍ）にウイルス液（１０５ＴＣＩＤ５０／ＭＬ）を１００μＬを添加し、３７℃で１０分反応させた。リン酸緩衝液２ｍＬで洗浄し、その洗浄液を濾過滅菌後、段階希釈し、ＭＤＣＫ細胞に感染させ、３日後のＣＰＥの有無を観察し感染力価を計測した。フィルター処理後の感染力価をフィルター未処理のウイルス力価で割ることにより、フィルターによる感染抑制率（％）を算出した。結果を表３に示す。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
表３より、本発明の抗体をしみ込ませたフィルターは、すべてのウイルスに対して９９％以上の感染抑制率を示した。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のダチョウから得た抗体は、インフルエンザウイルスに対する抗体価や高い感染抑制率を有するので、フィルターなどに用いることにより、新型インフルエンザ感染防御を目的とするマスクや空気清浄機などに応用が可能である。
【００４０】
また、衣料繊維に用いることにより防疫服としても応用可能であり、さらに、液体そのものとしてとして用いればスプレー剤や、洗浄用の濡れティッシュとしても利用可能である。
【図１】
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