(57)【要約】      （修正有）【課題】ガン治療するための新規組成物の提供及び阻害する薬剤のスクリーニング方法の提供。【解決手段】ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤を含むか、あるいは、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む、ガンを治療するための組成物。阻害する薬物は、（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子を発現する細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養する工程；（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現のレベルを測定する工程；及び（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定される発現のレベルと比較したとき、発現のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害するための薬剤として選択する工程からなるスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＢＤ１関連クロマチン因子１（ＭＣＡＦ１）遺伝子又は特異性タンパク質１（Ｓｐ１）遺伝子の発現を阻害する薬剤を含む、ガンを処置するための医薬組成物。
【請求項２】
前記薬剤が、
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害又は抑制する核酸；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸又はその一部分；及び
（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物を特異的に切断するためのリボザイム活性を有する核酸
からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む、ガンを治療するための医薬組成物。
【請求項４】
前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質とＳｐ１タンパク質との間の結合を阻害する薬剤である、請求項３又は４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ガンが、胃ガン、乳ガン又は肺ガンである、請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子を発現する細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養する工程；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現のレベルを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定される発現のレベルと比較したとき、発現のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【請求項８】
（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質及びＳｐ１タンパク質を試験化合物の非存在下及び存在下で所望の溶液において混合する工程；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の間での結合のレベルを試験化合物の非存在下及び存在下で測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定される結合のレベルと比較したとき、結合のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【請求項９】
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子、Ｓｐ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子を発現する細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養する工程；
（ｉｉ）ＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定されるＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルと比較したとき、ＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【請求項１０】
（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質、Ｓｐ１タンパク質及びテロメラーゼを試験化合物の非存在下及び存在下で所望の溶液において混合する工程；
（ｉｉ）テロメラーゼ活性のレベルを測定する工程；
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定されるテロメラーゼ活性のレベルと比較したとき、テロメラーゼ活性のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【請求項１１】
前記混合する工程が、ＭＣＡＦ１遺伝子、Ｓｐ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子を発現することができる細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ガン性細胞又はインビトロ不死化細胞の増殖を阻害する薬剤についてスクリーニングするために使用される、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ガン性細胞のアポトーシスを促進させる薬剤についてスクリーニングするために使用される、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ガンを治療するための薬剤についてスクリーニングするために使用される、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガンが、胃ガン、乳ガン又は肺ガンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤を含む組成物。
【請求項１７】
前記薬剤が、
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害又は抑制する核酸；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸又はその一部分；及び
（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物を特異的に切断するためのリボザイム活性を有する核酸
からなる群より選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む組成物。
【請求項１９】
前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質とＳｐ１タンパク質との間の結合を阻害する薬剤である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ガン性細胞又は不死化細胞の増殖を阻害するために使用される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ガン性細胞又は不死化細胞のアポトーシスを高めるために使用される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＢＤ１関連クロマチン因子１（ＭＣＡＦ１）及び特異性タンパク質１（Ｓｐ１）の治療用途に関する。具体的には、本発明は、ガン細胞の増殖を阻害すること、ガン細胞のアポトーシスを高めること、及び／又は、ガンを治療することのための、ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤の使用、及び、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメラーゼは、テロメアのヘキサマー反復を染色体の末端に付加するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含有する多サブユニット複合体である（１、２）。この酵素活性は通常、ほとんどの体細胞には存在せず、そのため、テロメアの段階的な喪失が細胞分裂により生じる。対照的に、８５％を越えるガン性細胞及びインビトロ不死化細胞は、際限のない増殖のために要求されるテロメラーゼ活性を獲得する（３から６）。テロメラーゼ活性の再活性化は、遺伝的及び後成的な欠陥の潜在的危険性を増大させることによって細胞の形質転換の一因となり得る（７）。テロメラーゼ酵素は、２つの必須成分から、すなわち、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ；これはＴＥＲＴ遺伝子によってコードされる）、及び、テロメアのＤＮＡ合成のためのテンプレートとして役立つテロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＲ；これはＴＥＲＣ遺伝子によってコードされる）からなる。ＴＲはほとんどの組織において普遍的に発現し、これに対して、ＴＥＲＴはテロメラーゼ陽性細胞においてだけ発現する（８、９）。外因性ＴＥＲＴの導入は初代ヒト細胞を不死化することができ（１０、１１）、また、ＴＥＲＴ及びＴＲの両方の過剰発現はテロメラーゼ活性を相乗的に増大させる（１２）。テロメラーゼサブユニット遺伝子は生体内では適切に調節される必要があるので、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子の異常な発現は細胞の脱調節を誘導する。
【０００３】
特異性タンパク質１（Ｓｐ１）はＴＥＲＴ遺伝子の転写制御において非常に重要な役割を果たす（１３）。ＴＥＲＴコアプロモーターにおけるＳｐ１の連続する結合部位である５つのＧＣボックスが存在する（１４）。加えて、Ｓｐ１は、ＴＥＲＴ遺伝子を細胞タイプ特異的な様式でトランスに活性化するためにｃ−Ｍｙｃと協同することが知られている（１５）。Ｓｐ１は、コアプロモーター及びエンハンサーの両方を標的とする遍在性タンパク質であるが、このタンパク質が、胃、結腸及び直腸、膵臓、乳房ならびに甲状腺の様々なガンにおいて高度に発現すること（１６）は興味深いことである。従って、ＴＥＲＴ遺伝子のＳｐ１依存的発現は、ガン発生に向かう頻繁な経路を提供しているかもしれない。しかしながら、テロメラーゼ発現のＳｐ１依存的制御の正確な機構は未だ解明されていない。
【０００４】
本発明者らは、メチル化ＤＮＡ結合ドメインタンパク質１（ＭＢＤ１）がＭＢＤ１関連クロマチン因子１（ＭＣＡＦ１）（これはまた、ＡＴＦａ関連調節因子（ＡＭ）及びＡＴＦ７結合タンパク質（ＡＴＦ７ＩＰ）として知られている（１８））と相互作用することを最初に見出した（１７）。ＭＣＡＦ１は、メチル化されたＤＮＡ領域における遺伝子サイレンシングのために、ＭＢＤ１の転写抑制ドメインと結合し、さらにはＳＥＴドメイン二叉化１（SET domain bifurcated 1）（ＳＥＴＤＢ１）を動員する（１７、１９）。ＡＭ／ＭＣＡＦ１は、ＳＥＴドメインを有するＥＲＧ関連タンパク質（ＥＳＥＴ）（ヒトＳＥＴＤＢ１のマウスホモログ（２０））によるリシン残基９（Ｈ３Ｋ９）におけるジメチルヒストンＨ３からトリメチルヒストンＨ３への変換を促進させる。従って、ＭＣＡＦ１は、ヘテロクロマチンアセンブリーを介するＭＢＤ１依存的な転写抑制に関与する。以前の解析結果では、ＭＣＡＦ１及びＳｐ１が機能的に関連づけられることが示唆されている（１７、１９、２１）；例えば、ＭＣＡＦ１は、エプスタイン・バールウイルスのＲｔａタンパク質によるＳｐ１媒介の転写を高める（２２）。加えて、Ｓｐ１は、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＥ、ＴＢＰ／ＴＦＩＩＤを含む様々な基礎的転写因子と、また、さらには、様々な転写メディエーター、例えば、Ｓｐ１のために要求される補因子（ＣＲＳＰ）、と相互作用することが知られている（２３）。これらの転写メディエーターは、調節情報を、Ｓｐ１と、コアＲＮＡポリメラーゼＩＩを含む基礎的転写装置との間において伝達する（２４）。
【発明の概要】
【０００５】
テロメラーゼサブユニット遺伝子におけるＭＣＡＦ１及びＳｐ１の転写役割を調べることは非常に興味深いことである。
【０００６】
本発明者らの研究中に、本発明者らは、ＭＣＡＦ１が、多くの異なる組織に由来したヒトのガンにおいて高度に発現することを見出しており、このことは、ＭＣＡＦ１が腫瘍形成において重要な役割を有することを示唆している。一貫して、本発明者らのデータは、ＭＣＡＦ１が、ガン細胞におけるテロメラーゼ活性のＳｐ１依存的維持のために要求されることを明らかにしている。ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の特異的なノックダウンはＴＥＲＴ及びＴＥＲＣの両方の発現を低下させ、その結果、テロメラーゼ活性の低下をもたらした。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの活性型及び基本転写因子がＭＣＡＦ１又はＳｐ１の喪失によってＴＥＲＴプロモーターから放出された。ＭＣＡＦ１の２つの進化的に保存されたドメインがＳｐ１及び基本転写装置との直接的な相互作用に関わっていた。これらのデータは、腫瘍形成における一般的な機構であり得るテロメラーゼサブユニット遺伝子のＳｐ１依存的発現を促進するＭＣＡＦ１の転写メディエーター様機能について解明した。
【０００７】
すなわち、本発明は下記を提供する：
［１］ＭＢＤ−１関連クロマチン因子１（ＭＣＡＦ１）遺伝子又は特異性タンパク質１（Ｓｐ１）遺伝子の発現を阻害する薬剤を含む、ガンを治療するための医薬組成物。
【０００８】
［２］前記薬剤が、
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害又は抑制する核酸；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸又はその一部分；及び
（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物を特異的に切断するためのリボザイム活性を有する核酸
からなる群より選択される、項目［１］による医薬組成物。
【０００９】
［３］ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む、ガンを治療するための医薬組成物。
【００１０】
［４］前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質に特異的に結合する抗体である、項目［３］による医薬組成物。
【００１１】
［５］前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質とＳｐ１タンパク質との間の結合を阻害する薬剤である、項目［３］又は項目［４］による医薬組成物。
【００１２】
［６］前記ガンが、胃ガン、乳ガン又は肺ガンである、項目［１］から項目［５］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００１３】
［６ａ］前記ガンが、乳ガン、脳ガン、頭頸部ガン、骨ガン、皮膚ガン、メラノーマ、口腔ガン、舌ガン、鼻咽頭ガン、咽頭ガン（pharyngeal cancer、laryngeal cancer）、食道ガン、甲状腺ガン、肺ガン、胃ガン、肝ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、胆嚢ガン、胆管ガン、副腎ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、前立腺ガン、精巣ガン、卵巣ガン、子宮ガン、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、腸ガン、結腸ガン、直腸ガン、肛門ガン、リンパ腫、白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ性白血病、毛様細胞性白血病、大顆粒リンパ芽球性白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、慢性好中球性白血病、骨髄線維症又は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫である、項目［１］から項目［５］のいずれか一項による医薬組成物。
【００１４】
［６ｂ］放射性同位体、治療タンパク質、低分子量医薬品、又は、治療遺伝子を含むベクターをさらに含む、項目［１］から項目［５］のいずれか一項による医薬組成物。
【００１５】
［７］下記の工程：
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子を発現する細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養する工程；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現のレベルを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定される発現のレベルと比較したとき、発現のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【００１６】
［８］下記の工程：
（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質及びＳｐ１タンパク質を試験化合物の非存在下及び存在下で所望の溶液において混合する工程；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の間での結合のレベルを試験化合物の非存在下及び存在下で測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定される結合のレベルと比較したとき、結合のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【００１７】
［９］下記の工程：
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子、Ｓｐ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子を発現する細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養する工程；
（ｉｉ）ＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定されるＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルと比較したとき、ＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【００１８】
［１０］下記の工程：
（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質、Ｓｐ１タンパク質及びテロメラーゼを試験化合物の非存在下及び存在下で所望の溶液において混合する工程；
（ｉｉ）テロメラーゼ活性のレベルを測定する工程；
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定されるテロメラーゼ活性のレベルと比較したとき、テロメラーゼ活性のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程
を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法。
【００１９】
［１１］前記混合する工程が、ＭＣＡＦ１遺伝子、Ｓｐ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子を発現することができる細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養することを含む、項目［１０］による方法。
【００２０】
［１２］ガン性細胞又はインビトロ不死化細胞の増殖を阻害する薬剤についてスクリーニングするために使用される、項目［７］から項目［１１］のいずれか一項による方法。
【００２１】
［１３］ガン性細胞のアポトーシスを促進させる薬剤についてスクリーニングするために使用される、項目［７］から項目［１１］のいずれか一項による方法。
【００２２】
［１４］ガンを治療するための薬剤についてスクリーニングするために使用される、項目［７］から項目［１１］のいずれか一項による方法。
【００２３】
［１５］前記ガンが、胃ガン、乳ガン又は肺ガンである、項目［１４］による方法。
【００２４】
［１５ａ］前記ガンが、乳ガン、脳ガン、頭頸部ガン、骨ガン、皮膚ガン、メラノーマ、口腔ガン、舌ガン、鼻咽頭ガン、咽頭ガン、食道ガン、甲状腺ガン、肺ガン、胃ガン、肝ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、胆嚢ガン、胆管ガン、副腎ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、前立腺ガン、精巣ガン、卵巣ガン、子宮ガン、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、腸ガン、結腸ガン、直腸ガン、肛門ガン、リンパ腫、白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ性白血病、毛様細胞性白血病、大顆粒リンパ芽球性白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、慢性好中球性白血病、骨髄線維症又は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫である、項目［１４］による方法。
【００２５】
［１６］ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤を含む組成物。
【００２６】
［１７］前記薬剤が、
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害又は抑制する核酸；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸又はその一部分；及び
（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物を特異的に切断するためのリボザイム活性を有する核酸
からなる群より選択される、項目［１６］による組成物。
【００２７】
［１８］ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む組成物。
【００２８】
［１９］前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質とＳｐ１タンパク質との間の結合を阻害する薬剤である、項目［１８］による組成物。
【００２９】
［２０］前記薬剤が、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質に特異的に結合する抗体である、項目［１９］に記載の組成物。
【００３０】
［２１］ガン性細胞又は不死化細胞の増殖を阻害するために使用される、項目［１６］から項目［２０］のいずれか一項による組成物。
【００３１】
［２２］ガン性細胞又は不死化細胞のアポトーシスを高めるために使用される、項目［１６］から項目［２０］のいずれか一項による組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】進化的に保存されたドメインを介するＳｐ１とのＭＣＡＦ１複合体を示す。（Ａ）ＭＣＡＦ１及びＳｐ１の機能的ドメイン。ＭＣＡＦ１は２つの進化的に保存されたドメイン(Domain)（ドメイン１及びドメイン２）を有する。Ｓｐ１は、セリン及びトレオニンが多い領域（Ｓ／Ｔ）を伴う２つの転写活性化ドメイン（Activation domain）と、ＤＮＡ結合活性を有する３つのジンクフィンガー（Zinc finger）とを含有する。ＭＣＡＦ１及びＳｐ１の細菌により発現させた部分がプルダウンアッセイのために示される。（Ｂ）ＭＣＡＦ１と、Ｓｐ１との間での直接的な相互作用。固定化されたＧＳＴ融合ＭＣＡＦ１（Δ１０、Δ１８及びΔ８）をＨｅＬａ核抽出物とインキュベーションした（左側）。ＭＣＡＦ１のドメイン１（Δ１８）及びドメイン２（Δ８）の両方がＳｐ１のジンクフィンガードメインに結合した（右側）。（Ｃ）ＭＣＡＦ１及びＳｐ１の複合体形成。内因性のＭＣＡＦ１及びＳｐ１をＨｅＬａ細胞において免疫沈殿させた。インプット（Input）は反応混合物におけるタンパク質の１０％を示す（Ｂ及びＣ）。
【図２】ＭＣＡＦ１がＳｐ１依存的様式でテロメラーゼサブユニット遺伝子プロモーターに存在することを示す。（Ａ）ヒトのＴＥＲＴプロモーター領域及びＴＥＲＣプロモーター領域の概略図。両方の遺伝子が、多数のＳｐ１結合部位（Sp1-binding site）（白四角）及びエキソン（黒四角）を含有するプロモーター関連ＣｐＧアイランドを有していた。ＣｈＩＰ分析のために、ＰＣＲ増幅フラグメントが灰色の線により示される。（Ｂ）テロメラーゼサブユニット遺伝子プロモーターにおけるＭＣＡＦ１及びＳｐ１の局在化。ＴＥＲＴ遺伝子プロモーター及びＴＥＲＣ遺伝子プロモーターにおけるＭＣＡＦ１及びＳｐ１のＣｈＩＰ分析。ＭＣＡＦ１及びＳｐ１をＤＮＡに架橋し、特異的な抗体により沈殿させ、その後、特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行った。ゲノムＤＮＡをコントロール（Control）として使用した（インプット）。（Ｃ及びＤ）ＭＣＡＦ１及びＳｐ１の特異的なｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン。ウエスタンブロット分析のために、β−チューブリン（β-tubulin）がコントロールとして示される（Ｃ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲのために、コントロールｓｉＲＮＡの使用による相対的なｍＲＮＡレベル（Relative mRNA level）が１に正規化された（normalized）（Ｄ）。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｅ）ＴＥＲＴプロモーター（TERT promoter）におけるＭＣＡＦ１のＳｐ１依存的局在化。コントロールｓｉＲＮＡ、及び、種が一致するＩｇＧをコントロールとして使用した。値が、４つ以上の独立した実験からの平均及び標準偏差として示される。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３】ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体がテロメラーゼ活性及び細胞増殖のために要求されることを示す。（Ａ）ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体によるテロメラーゼサブユニット遺伝子のトランス活性化。テロメラーゼサブユニット遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析をＭＣＡＦ枯渇細胞又はＳｐ１枯渇細胞において行った。コントロールｓｉＲＮＡの使用による相対的なｍＲＮＡレベルが１に正規化された。（Ｂ）ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体によるテロメラーゼ活性の維持。テロメラーゼ活性の定量的ＰＣＲ分析をＭＣＡＦ１枯渇細胞又はＳｐ１枯渇細胞において行った。コントロールｓｉＲＮＡ及び１．０μｇの細胞溶解物（cell lysate）による相対的なテロメラーゼレベルが１に正規化された。値が、４つ以上の独立した実験からの平均及び標準偏差として示される（Ａ及びＢ）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ及びＤ）ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体による細胞増殖の維持。細胞数（cell number）を、ＭＣＡＦ１、Ｓｐ１又はＴＥＲＴのノックダウンの後の示された時点で測定した。結果を３つの独立した実験から得た。誤差バーは標準偏差を示す。
【図４】ＭＣＡＦ１のＳｐ１共役した転写メディエーター様機能を示す。（Ａ及びＢ）ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体によるＴＥＲＴプロモーターへの基本転写装置の導入。ＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンはＴＥＲＴプロモーターにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩの活性型［Ｐｏｌ  ＩＩ（Ｓｅｒ  ５Ｐ）］及びＥＲＣＣ３を低下させた。値が、４つ以上の独立した実験からの平均及び標準偏差として示される（Ａ及びＢ）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＭＣＡＦ１、基本転写因子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩの複合体形成。ＭＣＡＦ１を抗ＭＣＡＦ１抗体によりＨｅＬａ核抽出物から沈殿させた（左側）。ＥＲＣＣ３、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）、ＴＦＩＩＥα及びＴＦＩＩＥβを同様に免疫沈殿させた（右側）。これらの免疫複合体を、示された抗体によりプローブ探査した。（Ｄ）ＭＣＡＦ１の保存されたドメインとの基本転写因子の相互作用。ＧＳＴ融合ＭＣＡＦ１（Δ１０、Δ１８及びΔ８）をＨｅＬａ核抽出物とインキュベーションした。結合したタンパク質を、示された抗体によりプローブ探査した。（Ｅ）ＭＣＡＦ１と、基本転写因子との間での直接的な相互作用。グルタチオン−アガロース上のＧＳＴ−ＥＲＣＣ３及びＧＳＴ−ＥＲＣＣ２をＨｉｓタグＭＣＡＦ１（Δ１０及びΔ８）とインキュベーションした。逆に、固定化されたＧＳＴ−ＭＣＡＦ１（Δ１０、Δ１８及びΔ８）をＨｉｓタグＴＦＩＩＥα及びＨｉｓタグＴＦＩＩＥβと混合した。インプットは反応混合物におけるタンパク質の１０％を示す（ＣからＥ）。
【図５】ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体がＴＥＲＴプロモーター領域におけるＣｐＧメチル化に影響を及ぼすことを示す。ＴＥＲＴ遺伝子のプロモーター及び第１エキソンにおける３８個のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を重亜硫酸ゲノム配列決定によってＨｅＬａ細胞において分析した。ＣｐＧジヌクレオチドが示される（部位１から３８）。ＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンは、Ｓｐ１結合部位及びＣＴＣＦ結合部位（CTCF-binding site）に近いＣｐＧでのメチル化状態を変化させた。白丸、メチル化されていないＣｐＧ；黒丸、メチル化された（methylated）ＣｐＧ。
【図６】ヒトのガン組織におけるＭＣＡＦ１の過剰発現を示す。非ガン性組織及びガン性組織の連続切片：胃（Ａ；ａからｄ）、乳房（Ｂ；ｅからｈ）及び肺（Ｃ；ｉからｎ）。正常な組織はＭＣＡＦ１の検出不能な発現又は非常に低い発現を示す（ｂ、ｆ及びｊ）。対照的に、ＭＣＡＦ１が、胃の腺ガン（ｄ）、乳房の浸潤性腺管ガン（ｈ）、ならびに、肺の腺ガン及び扁平上皮細胞ガン（それぞれ、ｌ及びｎ）において高度に染色された。ヘマトキシリン及びエオシンによる染色（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ、ｋ及びｍ）；ＭＣＡＦ１についての免疫染色（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｌ及びｎ）。スケールバー、２００μｍ。
【図７】（補充図１）ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１がＢＲＣＡ１遺伝子プロモーターに存在することを示す。（Ａ）ヒトのＢＲＣＡ１プロモーター領域の概略図。ＢＲＣＡ１遺伝子は、多数のＳｐ１結合部位（白四角）及びエキソン（黒四角）を含有するプロモーター関連ＣｐＧアイランドを有した。ＣｈＩＰ分析のために、ＰＣＲ増幅フラグメントが灰色の線により示される。（Ｂ）ＢＲＣＡ１遺伝子プロモーターにおけるＭＣＡＦ１及びＳｐ１の局在化。ＢＲＣＡ１遺伝子プロモーターにおけるＭＣＡＦ１及びＳｐ１のＣｈＩＰ分析。ＭＣＡＦ１及びＳｐ１をＤＮＡに架橋し、特異的な抗体により沈殿させ、その後、特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅を行った。ゲノムＤＮＡをコントロールとして使用した（インプット）。
【図８】（補充図２）ＨＣＴ１１６細胞におけるテロメラーゼ遺伝子発現に対するＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンの影響を示す。（Ａ）ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の特異的なｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン。定量的ＲＴ−ＰＣＲのために、コントロールｓｉＲＮＡの使用による相対的なｍＲＮＡレベルが１に正規化された。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体によるテロメラーゼサブユニット遺伝子のトランス活性化。テロメラーゼサブユニット遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析をＭＣＡＦ１枯渇細胞又はＳｐ１枯渇細胞において行った。コントロールｓｉＲＮＡの使用による相対的なｍＲＮＡレベルが１に正規化された。値が、４つ以上の独立した実験からの平均及び標準偏差として示される。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図９】（補充図３）テロメラーゼ活性に対するＴＥＲＴノックダウンの影響を示す。（Ａ）ＴＥＲＴの特異的なｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン。定量的ＲＴ−ＰＣＲのために、コントロールｓｉＲＮＡの使用による相対的なｍＲＮＡレベルが１に正規化された。＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＴＥＲＴによるテロメラーゼ活性の維持。テロメラーゼ活性の定量的ＰＣＲ分析をＴＥＲＴ枯渇細胞において行った。コントロールｓｉＲＮＡ及び１．０μｇの細胞溶解物による相対的なテロメラーゼレベルが１に正規化された。値が、４つ以上の独立した実験からの平均及び標準偏差として示される。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図１０】（補充図４）ヒストン修飾に対するＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンの影響を示す。ＭＣＡＦ１枯渇下又はＳｐ１枯渇下でのＴＥＲＴプロモーターにおける転写活性な特徴。Ｈ３アセチル化だけがＳｐ１ノックダウン細胞において低下し、一方で、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の枯渇は、何ら有意でない変化をＨ３Ｋ４メチル化及びＨ４アセチル化において示した（Ａ及びＢ）。これらの特徴は、ＧＡＰＤＨプロモーター（GAPDH promoter）（Ｃ及びＤ）と比較した場合、ＴＥＲＴプロモーターでは低いレベルで見出された。種が一致するコントロールＩｇＧを使用した。値が、４つ以上の独立した実験からの平均及び標準偏差として示される。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１１】（補充図５）ヒトのガン組織におけるＭＣＡＦ１の過剰発現を示す。（Ａ）ヒトのガン組織におけるＭＣＡＦ１の免疫染色レベルの概要。７０％を越える調べられたガンがＭＣＡＦ１の高まった発現を示す。（Ｂ）発現状態が乳ガン組織によって表される。ガン細胞の核において見出されるＭＣＡＦ１染色について、陰性（−）、陽性（＋）及び強い陽性（＋＋）。スケールバー、２００μｍ。
【図１２】（補充表１）実施例において使用されるｓｉＲＮＡの一覧表を示す。
【図１３】（補充表２）実施例に記載される定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されるプライマーの一覧表を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
ＭＣＡＦ１タンパク質のアミノ酸配列、及び、ＭＣＡＦ１タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。例えば、ヒトのＭＢＤ１関連クロマチン因子−１（ＭＣＡＦ１、これは以前には「ＭＣＡＦ」と呼ばれる）がＮＣＢＩデータベースにおいてＡＦ４２５６５０の登録番号により登録されており、また、Mol. Cell. Biol., Vol. 23, pp. 2834-2843 （2003年）などにも記載される。従って、当業者は、ＭＣＡＦ１タンパク質、及び、ＭＣＡＦ１タンパク質をコードする遺伝子を容易に得る。本明細書中では、ＭＣＡＦ１タンパク質は時には、単に「ＭＣＡＦ１」として示される。
【００３４】
Ｓｐ１タンパク質のアミノ酸配列、及び、Ｓｐ１タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。例えば、ヒトの特異性タンパク質１（Ｓｐ１）が、ＮＣＢＩデータベースにおいて、ＮＰ＿６１２４８２（タンパク質）、ＮＭ＿１３８４７３（ｍＲＮＡ）又はＮＣ＿００００１２（遺伝子）の登録番号により登録されており、また、Cell, 51, 1079-1090, 1987などにも記載される。従って、当業者は、Ｓｐ１タンパク質、及び、Ｓｐ１タンパク質をコードする遺伝子を容易に得る。本明細書中では、Ｓｐ１タンパク質は時には、単に「Ｓｐ１」として示される。
【００３５】
ＴＥＲＴタンパク質のアミノ酸配列、及び、ＴＥＲＴタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は公知である。例えば、ヒトのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）が、ＮＣＢＩデータベースにおいて、ＮＰ＿９３７９８３、ＮＰ＿９３７９８６（タンパク質）、ＮＭ＿１９８２５３、ＮＭ＿１９８２５５（ｍＲＮＡ）又はＮＣ＿０００００５（遺伝子）の登録番号により登録されており、また、Science, 276 (5312), 561-567 (1997)などにも記載される。従って、当業者は、ＴＥＲＴタンパク質、及び、ＴＥＲＴタンパク質をコードする遺伝子を容易に得る。本明細書中では、ＴＥＲＴタンパク質は時には、単に「ＴＥＲＴ」として示される。
【００３６】
ＴＥＲＣのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ヒトのテロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）が、ＮＣＢＩデータベースにおいて、ＮＲ＿００１５６６（ＲＮＡ）又はＮＣ＿０００００３（遺伝子）の登録番号により登録されており、また、Science, 269 (5228), 1236-1241 (1995)などにも記載される。従って、当業者はＴＥＲＣを容易に得る。
【００３７】
１．ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現の阻害
本発明は、ＭＢＤ−１関連クロマチン因子１（ＭＣＡＦ１）遺伝子又は特異性タンパク質１（Ｓｐ１）遺伝子の発現を阻害する薬剤を含む、ガンを治療するための医薬組成物を提供する。
【００３８】
本明細書中で使用される用語「薬剤（"ａｇｅｎｔ"又は"ａｇｅｎｔｓ"）」は、本発明の目的のためにインビトロ又はインビボで使用することができる、任意の形態での任意の１つ又はそれ以上の化学物質、化合物、医薬品又は他の物質を指す。
【００３９】
本明細書中で使用される用語「ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤」は、ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害又は抑制する任意の薬剤を示し、これには、典型的には、（ｉ）ＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡ又はＳｐ１  ｍＲＮＡへのＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写をそれぞれ阻害又は抑制する薬剤、及び、（ｉｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質へのＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡ又はＳｐ１  ｍＲＮＡの翻訳をそれぞれ阻害又は抑制する薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
ＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡ又はＳｐ１  ｍＲＮＡへのＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写をそれぞれ阻害又は抑制する薬剤の例には、
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子に対するアンチセンス核酸又はその一部分；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子に対するデコイ核酸又はその一部分；
（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子に対して優性ネガティブに作用する変化体遺伝子又はその一部分；
（ｉｖ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写を阻害又は抑制する任意の他の化合物；など
が含まれる。
【００４１】
ＭＣＡＦ１タンパク質へのＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡの翻訳を阻害又は抑制する薬剤の例には、
（ｉ）ＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡ又はＳｐ１  ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する核酸又はポリヌクレオチドあるいはその一部分（例えば、ｓｉＲＮＡ）；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡ又はＳｐ１  ｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸又はアンチセンスポリヌクレオチドあるいはその一部分；
（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡ又はＳｐ１  ｍＲＮＡに対するリボザイム活性を有する核酸又はポリヌクレオチドあるいはその一部分；
（ｉｖ）ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質へのＭＣＡＦ１  ｍＲＮＡ又はＳｐ１  ｍＲＮＡの翻訳をそれぞれ阻害又は抑制する任意の他の化合物；など
が含まれる。
【００４２】
用語「核酸」又は用語「ポリヌクレオチド」は本明細書中では交換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ（例えば、化学合成ＤＮＡ）、及び、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）を含有する核酸アナログを含めて、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができる。核酸は二本鎖又は一本鎖（すなわち、センス鎖又はアンチセンス一本鎖）が可能である。ポリヌクレオチドの限定されない例には、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー、ならびに、核酸アナログが含まれる。
【００４３】
アンチセンス技術は当分野では周知である。この技術において、内因性遺伝子に由来する核酸セグメントがクローン化され、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに機能的に連結される。その後、組換えベクターが標的細胞に形質転換され、ＲＮＡのアンチセンス鎖が産生される。核酸セグメントは、抑制されることになる内因性遺伝子の完全な配列である必要はなく、しかし、典型的には、抑制されることになる内因性遺伝子の少なくとも一部又は一部分に対して実質的に同一である。一般に、より高い相同性が、より短い配列の使用を補うために使用され得る。典型的には、少なくとも３０ヌクレオチドの配列が使用される（例えば、少なくとも４０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、５００ヌクレオチド又はそれ以上）。従って、例えば、本明細書中において使用される核酸は、ＭＣＡＦ１ポリペプチド又はＳｐ１ポリペプチドをコードする上記核酸の１つに対するアンチセンス核酸であり得る。
【００４４】
触媒作用ＲＮＡ分子又はリボザイムもまた、発現を阻害又は抑制するために使用することができる。具体的には、様々なリボザイムを、事実上任意の標的ＲＮＡと特異的に対形成し、ホスホジエステル骨格を特定の場所で切断し、それにより、標的ＲＮＡを機能的に不活性化するために設計することができる。リボザイム配列をリボザイム内に含むことはＲＮＡ切断活性をリボザイムに与え、それにより、その抑制活性を増大させる。標的ＲＮＡに特異的なリボザイムを設計及び使用するための様々な方法が当業者には公知である。
【００４５】
ＲＮＡ干渉は、遺伝子の発現及びウイルスの複製を調節するための細胞機構である。この機構は、二本鎖の小さい干渉するＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される。細胞は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を含有するすべての内部ｍＲＮＡを破壊することによって、細胞に導入された外来の二本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に対して応答する。標的ｍＲＮＡを標的とするためにｓｉＲＮＡを設計及び調製するための様々な方法が当業者には公知である。例えば、干渉するＲＮＡに転写される配列を含む構築物を調製することができる。そのようなＲＮＡは、自身にアニーリングすることができるＲＮＡ（例えば、ステム・ループ構造を有する二本鎖ＲＮＡ）であり得る。二本鎖ＲＮＡのステム部分の一方の鎖が、目的とするポリペプチドのセンスコード配列に対して類似又は同一で、長さが約１０ヌクレオチドから約２，５００ヌクレオチドである配列を含む。センスコード鎖に対して類似又は同一である配列の長さは、１０ヌクレオチドから５００ヌクレオチド、１５ヌクレオチドから３００ヌクレオチド、２０ヌクレオチドから１００ヌクレオチド、又は、２５ヌクレオチドから１００ヌクレオチドが可能である。二本鎖ＲＮＡのステム部分の反対鎖は、目的とするＭＣＡＦ１ポリペプチド又はＳｐ１ポリペプチドのアンチセンス配列を含み、センス配列の対応する長さよりも短い長さ、又は、センス配列の対応する長さと同じ長さ、又は、センス配列の対応する長さよりも長い長さを有することができる。二本鎖ＲＮＡのループ部分は１０ヌクレオチドから５，０００ヌクレオチドが可能であり、例えば、１５ヌクレオチドから１，０００ヌクレオチド、２０ヌクレオチドから５００ヌクレオチド、又は、２５ヌクレオチドから２００ヌクレオチドが可能である。ＲＮＡのループ部分はイントロンを含むことができる。
【００４６】
その後、化学合成、インビトロ転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター及びＰＣＲ発現カセットを、設計されたｓｉＲＮＡを調製するために使用することができる。
【００４７】
さらには、核酸以外の任意の化合物を、ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写活性を阻害又は抑制するために使用することができる。そのような化合物は、ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現又は転写に関与する薬剤に作用することができる。そのような薬剤は、天然に存在する化合物、又は、合成化合物であり得る。そのような化合物は、本明細書中の他のところで記載される本発明のスクリーニング方法によって得ることができる。
【００４８】
２．ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性の阻害
本発明はまた、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む、ガンを治療するための医薬組成物を提供する。
【００４９】
本明細書中で使用される用語「ＭＣＡＦ１」又は用語「ＭＣＡＦ１タンパク質」は、全長のＭＣＡＦ１タンパク質だけでなく、ＭＣＡＦ１タンパク質の１つ又はそれ以上の機能的ドメインもまた指す。そのような機能的ドメインの例には、ＭＣＡＦ１の２つの進化的に保存されたドメイン、すなわち、ドメイン１及びドメイン２が含まれ、これらは、ＭＣＡＦ１タンパク質の５６２番目のアミノ酸から８１７番目のアミノ酸までの連続する残基、及び、１１５４番目のアミノ酸から１２７０番目のアミノ酸までの連続する残基からそれぞれなる（図１Ａを参照のこと）。
【００５０】
同様に、用語「ＭＣＡＦ１遺伝子」は、全長のＭＣＡＦ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドだけでなく、ＭＣＡＦ１タンパク質の機能的ドメインをコードするポリヌクレオチドもまた指す。
【００５１】
本明細書中で使用される用語「Ｓｐ１」又は用語「Ｓｐ１タンパク質」は、全長のＳｐ１タンパク質だけでなく、Ｓｐ１タンパク質の１つ又はそれ以上の機能的ドメインもまた指す。そのような機能的ドメインの例には、２つの転写活性化ドメイン、及び、３つのジンクフィンガーモチーフから主として構成される領域が含まれる。２つの活性化ドメインは、Ｓｐ１タンパク質の１３９番目のアミノ酸から２５０番目のアミノ酸までの連続する残基、及び、３４６番目のアミノ酸から４９２番目のアミノ酸までの連続する残基からそれぞれなる（図１Ａを参照のこと）。３つのジンクフィンガーモチーフは、Ｓｐ１タンパク質の６２６番目のアミノ酸から７０８番目のアミノ酸までの連続する残基を含む（図１Ａを参照のこと）。
【００５２】
同様に、用語「Ｓｐ１遺伝子」は、全長のＳｐ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドだけでなく、Ｓｐ１タンパク質の機能的ドメインをコードするポリヌクレオチドもまた指す。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「ＭＣＡＦ１タンパク質の活性」には、Ｓｐ１タンパク質、ＭＢＤ１、ＳＥＴＤＢ１、ＡＴＦ７、ＺＮＦ３３１、ＲＰＢ３又はウイルスのオンコプロテインなどに結合する活性が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「Ｓｐ１タンパク質の活性」には、ＭＣＡＦ１タンパク質、ｐ５３、ＨＤＡＣ１、ＲＥＬＡ、ＪＵＮ、ＳＭＡＤ３、ＭＹＣ、ＳＰＲ−２、ＳＭＡＤ４、ＥＲＫ１、ＥＴＳ１又は基本転写因子などに結合する活性が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤」は、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害又は抑制する任意の薬剤を指し、これには、典型的には、（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質と、Ｓｐ１タンパク質との間での結合を阻害する薬剤、（ｉｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質及びＳｐ１タンパク質を分解又は修飾する薬剤、（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及びＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤、及び（ｉｖ）ＭＣＡＦ１及びＳｐ１の、それらの標的遺伝子に対する結合活性を阻害する薬剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
ＭＣＡＦ１タンパク質と、Ｓｐ１タンパク質との間での結合を阻害する薬剤には、例えば、（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質と、Ｓｐ１タンパク質との間での結合を阻害するように、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質に特異的に結合する抗体；及び（ｉｉ）本明細書中の他のところで記載される本発明のスクリーニング方法によって得ることができる薬剤などが含まれる。
【００５７】
ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の特異的な抗体を、当分野では公知である技術に従って調製することができる。例えば、ポリクローナル血清を調製するために、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の抗原性部分（これは、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１に由来するペプチドからなる）、例えば、保存されたドメイン、又は、タンパク質全体までもが、場合により、アジュバントの存在下で、又は、免疫刺激剤、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、にコンジュゲート化されて、哺乳動物（例えば、マウス又はウサギなど）に注射される。典型的には、１週間間隔での追加抗原刺激注射の後、動物は採血され、血清が単離される。この血清はそのまま使用することができ、あるいは、ポリクローナル抗体を得るために、プロテインＡ−セファロース、抗原セファロース又は抗マウスＩｇＧ−セファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む様々な方法によって使用前に精製することができる。
【００５８】
合成ペプチドが、抗体を調製するために使用されるとき、最も一般的な実施は、タンパク質抗原のカルボキシル末端配列又はアミノ末端配列に対応する１０個から１５個のアミノ酸残基のペプチドを選ぶこと、及び、そのようなペプチドをキャリア分子、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン又はＢＳＡ、に化学的に架橋することである。しかしながら、内部配列のペプチドが所望されるならば、ペプチドの選択は、可能性のある抗原性部位又は他の所望される特徴、例えば、Ｓｅｒ−３５、Ｓｅｒ−３７及びＳｅｒ−２３８の１つ又はそれ以上を含むペプチド、を予測するアルゴリズムの使用に基づく。このアルゴリズムは、典型的には、疎水性の予測（Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157, 105-132；Hopp and Woods, 1983, Mol. Immunol., 20, 483-489）、又は、二次構造の予測（Chou and Fasman, 1978a, Annu. Rev. Biochem., 47, 251-276；Chou and Fasman, 1978b, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47, 45-148）に基づく。その目的は、表面に露出するタンパク質の領域、例えば、親水性領域、又は、構造の残部部分に対して立体配座的に柔軟であるタンパク質の領域、例えば、ループ領域、あるいは、β−ターンを形成することが予測される領域を選ぶことである。選択プロセスはまた、ペプチドをキャリアタンパク質に結合するために使用されるカップリング手順の化学反応により課される制約によって制限される場合がある。
【００５９】
モノクローナル抗体を、類似する確立された手順に従って調製することができる。モノクローナル抗体の短縮化体もまた、所望のモノクローナル抗体フラグメントを適する宿主において発現させるプラスミドが作製される組換え技術によって調製することができる。
【００６０】
ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質に対する抗体はまた、化合物を組織の特定のところに標的化するために、様々な化合物、例えば、放射性核種又は蛍光性化合物に、又は、診断的画像化及び治療のためのリポソームにカップリングするために使用することができる。このことは、正常な細胞及び組織には有害である抗ガン薬物による悪性組織の特異的な標的化のために特に有益である。
【００６１】
３．ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現、あるいは、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む医薬品の配合
ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現、あるいは、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤は、ガンを治療するための医薬品として有用である。そのようなガンには、乳ガン、脳ガン、頭頸部ガン、骨ガン、皮膚ガン、メラノーマ、口腔ガン、舌ガン、鼻咽頭ガン、咽頭ガン、食道ガン、甲状腺ガン、肺ガン、胃ガン、肝ガン、肝臓ガン、膵臓ガン、胆嚢ガン、胆管ガン、副腎ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、前立腺ガン、精巣ガン、卵巣ガン、子宮ガン、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、腸ガン、結腸ガン、直腸ガン、肛門ガン、リンパ腫、白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ性白血病、毛様細胞性白血病、大顆粒リンパ芽球性白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板増加症、慢性好中球性白血病、骨髄線維症及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫などが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
薬剤は、液体調製物として直接に、又は、適切な調製物形態での医薬組成物として、ヒト又は他の温血動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に経口投与又は非経口投与により投与することができる。用量は、投与されるべき対象、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変化し得る。例えば、薬剤が、成人のガン患者を治療するために使用されるときには、薬剤を、通常の場合には約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、１日あたりおよそ１回から５回、好ましくは１日あたりおよそ１回から３回、静脈内注射の形態で投与することが好都合である。他の非経口投与及び経口投与において、薬剤を、上記で示された用量に対応する用量で投与することができる。状態が特に重篤であるときには、用量を、状態に従って増大させることができる。
【００６３】
本発明の薬剤は、そのまま直接に、又は、適切な医薬組成物として投与することができる。上記で記載される投与のために使用される医薬組成物は、上記化合物又はその塩、希釈剤又は賦形剤とともに、薬理学的に許容され得るキャリアを含有する。そのような組成物は、経口投与又は非経口投与のために適する調製物において提供される。
【００６４】
すなわち、経口投与のための組成物の例には、固体又は液体の調製物、具体的には、錠剤（糖衣錠及びフィルム被覆錠剤を含む）、ピル、顆粒、粉末調製物、カプセル（ソフトカプセルを含む）、シロップ、エマルション、懸濁物などが含まれる。そのような組成物は公知の方法によって製造することができ、医薬調製物の分野で従来から使用されるビヒクル、希釈剤又は賦形剤を含有する。錠剤のためのビヒクル又は賦形剤の例が、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウムなどである。
【００６５】
非経口投与のための組成物の例が、注射可能な調製物、坐薬などである。注射可能な調製物には、様々な投薬形態物、例えば、静脈内注射物、皮下注射物、皮内注射物及び筋肉内注射物、点滴注入剤などが含まれ得る。これらの注射可能な調製物は公知の方法によって調製することができる。注射可能な調製物は、例えば、上記で記載された薬剤又はその塩を、注射剤のために従来から使用される無菌の水性媒体又は油性媒体に溶解、懸濁又は乳化することによって調製することができる。注射剤のための水性媒体として、例えば、生理学的な生理的食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張性溶液などがあり、これらは、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルバート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ひまし油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物））、との組合せで使用することができる。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられ、これらは、可溶化剤、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール、との組合せで使用することができる。このように調製された注射剤は好ましくは、適切なアンプルに満たされる。直腸投与のために使用される坐薬は、上記薬剤又はその塩を坐薬のための従来の基剤と混合することによって調製することができる。
【００６６】
好都合なことに、上記で記載される、経口使用又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に合わせるために適した単位服用量での医薬調製物に調製される。そのような単位服用量調製物には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射剤（アンプル）、坐薬などが含まれる。含有される上記薬剤の量は一般に、投薬形態物あたり約５ｍｇから５００ｍｇである；特に注射の形態では、上記薬剤が約５ｍｇから１００ｍｇで含有されることが好ましく、それ以外の形態では約１０ｍｇから２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【００６７】
上記で記載されるそれぞれの組成物はさらに、配合が、上記で記載される薬剤との何らかの有害な相互作用を引き起こさない限り、他の活性な成分を含有することができる。
【００６８】
４．ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の発現又は活性を阻害する薬剤についてのスクリーニング
本発明はさらに、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現、あるいは、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングする方法を提供する。
【００６９】
一実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法を提供する：
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子を発現する細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養する工程；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現のレベルを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定される発現のレベルと比較したとき、発現のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１遺伝子及び／又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害するための薬剤として選択する工程。
【００７０】
別の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法を提供する：
（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質及びＳｐ１タンパク質を試験化合物の非存在下及び存在下で所望の溶液において混合する工程；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の間での結合のレベルを試験化合物の非存在下及び存在下で測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定される結合のレベルと比較したとき、結合のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程。
【００７１】
さらに別の実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法を提供する：
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子、Ｓｐ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子を発現する細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養する工程；
（ｉｉ）ＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルを測定する工程；及び
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定されるＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルと比較したとき、ＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＴＥＲＣ遺伝子の発現のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程。
【００７２】
なおさらにさらなる実施形態において、本発明は、下記の工程を含む、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤についてスクリーニングするための方法を提供する：
（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質、Ｓｐ１タンパク質及びテロメラーゼを試験化合物の非存在下及び存在下で所望の溶液において混合する工程；
（ｉｉ）テロメラーゼ活性のレベルを測定する工程；
（ｉｉｉ）試験化合物の非存在下で測定されるテロメラーゼ活性のレベルと比較したとき、テロメラーゼ活性のレベルを低下させる試験化合物を、ＭＣＡＦ１タンパク質及び／又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害するための薬剤として選択する工程。
【００７３】
好ましい実施形態において、混合する工程は、ＭＣＡＦ１遺伝子、Ｓｐ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子を発現することができる細胞を試験化合物の非存在下及び存在下で培養することを含む。
【００７４】
様々な供給源に由来する様々な薬剤を、本発明の方法を使用することによって、ガン性細胞のアポトーシスを促進させるために、及び／又は、ガン性細胞の増殖を阻害するために、ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現、あるいは、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害することについてスクリーニングすることができる。スクリーニングされる薬剤は、天然に存在する分子、又は、合成分子であり得る。スクリーニングされる薬剤はまた、天然の供給源から得ることができ、例えば、海洋微生物、藻類、植物、菌類などから得ることができる。代替として、スクリーニングされる薬剤は、ペプチド又は小分子を含めて、薬剤のコンビナトリアルライブラリーに由来し得るか、あるいは、例えば、化学産業、医薬品産業、環境産業、農産業、水産業、化粧品産業、製薬産業及びバイオテクノロジー産業によって工業的に合成された化学化合物の既存のレパートリーに由来し得る。薬剤には、例えば、医薬品、治療剤、環境薬剤、農業薬剤又は工業薬剤、汚染物質、化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、キメラ分子などが含まれ得る。
【００７５】
コンビナトリアルライブラリーを、段階的様式で合成することができる多くのタイプの化合物について作製することができる。そのような化合物には、ポリペプチド、タンパク質、核酸、β−ターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン類、ステロイド類、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン系化合物、オリゴマー状のＮ−置換グリシン及びオリゴカルバマートが含まれる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーを、国際特許出願公開ＷＯ９５／１２６０８、同ＷＯ９３／０６１２１、同ＷＯ９４／０８０５１、同ＷＯ９５／３５５０３及び同ＷＯ９５／３０６４２に記載されるコード化合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構築することができる（これらのそれぞれがすべての目的のためにその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレー法によって作製することができる。
【００７６】
様々な技術を、シグナルを生じさせるために、また、ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現、あるいは、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性に対する薬剤の影響を検出及び評価するために、一緒に、又は、別々に使用することができる。シグナルは、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション、特定のタンパク質の抗体染色によって生じさせることができる。
【００７７】
テロメラーゼの酵素活性のレベルにおける変化を、当業者には周知である様々な手段によって検出することができ、これらには、ＴＲＡＰ（テロメア反復増幅プロトコル）、テロメア−ＦＩＳＨ、テロメア結合タンパク質の免疫染色、及び、市販の検出キット（例えば、ＴＲＡＰ−ｅｚｅ（登録商標）Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国））などが含まれるが、これらに限定されない。Kim et al., Science, Vol. 266, 1994, 2011-2015、及び、Kang et al., Oncogen (2008), 1-10もまた参照のこと（これらのそれぞれがすべての目的のためにその全体において参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００７８】
本発明のスクリーニング方法は典型的には、ガン性細胞又はインビトロ不死化細胞の増殖を阻害する薬剤についてスクリーニングすることにおいて、ガン性細胞のアポトーシスを促進させる薬剤についてスクリーニングするために、ガンを治療するための薬剤についてスクリーニングするためなどに有用である。
【００７９】
５．ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現、あるいは、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む組成物
本発明はまた、ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現を阻害する薬剤を含む組成物を提供する。
【００８０】
好ましくは、薬剤は、
（ｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって阻害又は抑制する核酸；
（ｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸又はその一部分；及び
（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１遺伝子又はＳｐ１遺伝子の転写産物を特異的に切断するためのリボザイム活性を有する核酸
からなる群より選択される。
【００８１】
本発明はさらに、ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質の活性を阻害する薬剤を含む組成物を提供する。
【００８２】
好ましくは、薬剤は、（ｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質とＳｐ１タンパク質との間の結合を阻害する薬剤、あるいは、（ｉｉ）ＭＣＡＦ１タンパク質又はＳｐ１タンパク質に特異的に結合する抗体である。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ガン性細胞又は不死化細胞の増殖を阻害するために、あるいは、ガン性細胞又は不死化細胞のアポトーシスを高めるために使用することができる。本発明の組成物はインビトロ又はインビボで使用することができる。
【００８４】
６．考察
テロメラーゼ活性を維持することに関わる機構は、細胞の不死化及びガンの発達を理解するために非常に重要である（３、３３、３４）。本発明者らの本研究では、（ｉ）ＭＣＡＦ１及びＳｐ１がＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子の発現を維持し、その結果、正のテロメラーゼ活性がもたらされること；（ｉｉ）Ｓｐ１がＭＣＡＦ１をＴＥＲＴプロモーターに実質的につなぎ留めること；（ｉｉｉ）ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体がＲＮＡポリメラーゼＩＩの活性型及びＥＲＣＣ３をＴＥＲＴプロモーターに協同して動員すること；（ｉｖ）ＭＣＡＦ１の２つの進化的に保存されたドメインがＳｐ１及び基本転写装置に直接に結合すること；及び（ｖ）ＭＣＡＦ１が高レベルでほとんどのガン組織において高頻度に発現されることが明らかにされる。従って、過剰発現したＭＣＡＦ１は、基本転写装置をテロメラーゼサブユニット遺伝子に負荷することによってテロメラーゼ活性のＳｐ１依存的維持を媒介する（これは、増殖性ガン細胞における一般的な機構であり得る）。
【００８５】
ＭＣＡＦ１はテロメラーゼサブユニット遺伝子のＳｐ１依存的発現を媒介する。テロメラーゼ活性の増大はガンの特徴であり、腫瘍形成のために非常に重要であるテロメアの短縮化及び腫瘍細胞の老化を妨げる（３、３４、３５）。ガンにおけるテロメラーゼのアップレギュレーションについては少なくとも２つの機構が考えられる。１つが、ヒト染色体の５ｐ１５．３３及び３ｑ２６．３にそれぞれ位置するＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子の増大したコピー数である（３６）。５ｐ（１３．２％）及び３ｑ（１６．４％）を伴う染色体の増加及び増幅が、比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用して固形腫瘍において検出されている（３７）。もう一方の機構が、テロメラーゼサブユニット遺伝子の増大した発現である。ＴＥＲＴ及びＴＲの両方の外因性発現は、単独でのいずれかと比較した場合、テロメラーゼ活性を顕著に増大させた。この理由のために、Ｓｐ１が一般にはＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子を活性化することは注目される（１５、３８）。ＴＥＲＴの発現はガン細胞における正のテロメラーゼ活性のために不可欠である（５、３９）ので、本発明者らは、Ｓｐ１によるＴＥＲＴ遺伝子の転写調節を特徴づけることに焦点を当てた。ＴＥＲＴプロモーターはＴＡＴＡボックス又はＴＡＴＡ様配列のいずれも有していないが、ＴＡＴＡ非存在プロモーターが、それでもなお、これらの遺伝子の転写開始のためにＴＡＴＡ因子を利用することが明らかにされており（４０）、また、Ｓｐ１が、ＴＡＴＡ非存在プロモーターの転写開始を引き起こすＴＡＴＡ因子をつなぎ留めることが明らかにされている（４１）。本研究において、本発明者らは、ＭＣＡＦ１及びＳｐ１がＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び基本転写因子をＴＥＲＴプロモーターに負荷するために要求されることを示した。ＭＣＡＦ１はＳｐ１のＤＮＡ結合能に影響を及ぼさなかったが、Ｓｐ１によってＴＥＲＴプロモーターに動員された。従って、ＭＣＡＦ１は、Ｓｐ１と相互作用することによるテロメラーゼサブユニット遺伝子の転写活性化（このことは、ガンにおけるテロメラーゼ活性の維持のために必要である）に相乗的に関係する。これらのデータは、ＭＣＡＦ１及びＳｐ１のアップレギュレーションがガンにおけるテロメラーゼの維持での基本的な事象であり得ることを示唆している。
【００８６】
ＴＥＲＴプロモーター領域における後成的状態が、転写された遺伝子におけるトリメチル化ヒストンＨ３Ｋ４、ならびに、アセチル化されたＨ３及びＨ４を含めて、転写調節のために重要である（４２）。しかしながら、テロメラーゼ陽性のガン細胞において、本発明者らは、これらの修飾されたヒストンは元来、低いレベルにあり、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンのもとで著しく変化しなかったことを見出した。それにもかかわらず、アセチル化Ｈ３だけは、おそらくは、Ｓｐ１媒介による遺伝子活性化に関与するヒストンアセチルトランスフェラーゼのために、Ｓｐ１枯渇細胞において減少する傾向があった（４３）。いくつかの研究では、プロモーターのメチル化もまた、ガン細胞におけるＴＥＲＴ調節における重要な機構の１つであることが報告されている（３２、４４）。ＴＥＲＴプロモーター領域のＣｐＧメチル化は、遺伝子の第１エキソンの中にある結合部位へのリプレッサーＣＴＣＦの接近を阻止することによって転写のために必要である。加えて、ＴＥＲＴ遺伝子の転写開始部位のすぐ上流側の部分的にメチル化されてないＣｐＧ部位は転写を可能にする（３１、３２）。これらの研究と一致して、本発明者らの結果は、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の枯渇が、ＣｐＧのメチル化状態における変化と一緒に、ＴＥＲＴの転写を低下させたことを示した。このことは、ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体がＴＥＲＴ遺伝子のＤＮＡメチル化に影響を及ぼすことを示唆している。ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の枯渇がテロメラーゼ活性を低下させ、細胞増殖を阻害したという本発明者らの知見は、Ｓｐ１と協同することによる、テロメラーゼ活性及び増殖活性の両方におけるＭＣＡＦ１の積極的な関与を示唆している。
【００８７】
ＭＣＡＦ１は、Ｓｐ１と共役した転写メディエーター様機能を有する。本発明者らの以前の研究では、ＭＢＤ１−ＭＣＡＦ１−ＳＥＴＤＢ１の複合体が、転写抑制的なクロマチン形成における重要な役割を果たすことが示されている（１７、１９）。対照的に、本発明者らは今回、ＭＣＡＦ１が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び基本転写因子と相互作用することを介してＳｐ１による転写活性化を促進させたことを示した。ＭＣＡＦ１は、相互作用の相手に依存して、また、ＤＮＡ含有量に依存して、正の調節因子及び負の調節因子として機能し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される遺伝子のプロモーター領域は多くの場合、Ｓｐ１により標的化されるいくつかのＧＣボックス配列を通常の場合には含有する離れたＣｐＧアイランドを有する（２７、４５）。転写メディエーターは、遺伝子発現を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＤＮＡ結合能を有する活性化因子、及び、コアプロモーターに負荷された基本転写因子との直接的な相互作用を介して制御する（２４、４６）。本発明者らの結果は、ＭＣＡＦ１が、その２つの進化的に保存されたドメインを介して、Ｓｐ１、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び基本点転写因子と相互作用したことを示していた。ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体は基本転写装置をＴＥＲＴ遺伝子に動員し、このことはテロメラーゼ活性のその後の産生をもたらす。従って、ＭＣＡＦ１は、ＴＥＲＴ遺伝子に対する機能的に別個の転写調節分子に足場を設けることによって転写を促進させる。このことは、ＭＣＡＦ１が、Ｓｐ１を基本転写装置に安定に共役させるための転写メディエーター様機能を有することを示唆している。
【００８８】
ＭＢＤ１−ＭＣＡＦ１−ＳＥＴＤＢ１複合体が転写抑制のためにＣｐＧのメチル化によって動員され（１７、１９）、これに対して、ＣｐＧアイランド関連プロモーターが基本転写装置と一緒にＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体によって活性化される。ＨｅＬａ細胞では、ＣｐＧがメチル化されたｐ５３ＢＰ２腫瘍抑制因子遺伝子がＭＢＤ１−ＭＣＡＦ１−ＳＥＴＤＢ１複合体の関与によって不活性化され（１９）、一方で、テロメラーゼサブユニット遺伝子が、基本転写装置と共役したＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体によってトランス活性化される。これらの知見は、ＭＣＡＦ１の両方の役割がガン表現型に相乗的に寄与することを示唆している。さらには、ＭＣＡＦ１と、ＭＢＤ１との間での会合が、ＭＢＤ１のＳＵＭＯ修飾によって高められる（４７）。Ｓｐ１のいくつかの修飾、例えば、リン酸化、アセチル化、ＳＵＭＯ化は、ＭＣＡＦ１の動員を誘導することができ、ＭＣＡＦ１自身のある種の修飾は相互作用の相手を決定することができる。本研究の結果は、ガンに関連したテロメラーゼ活性をＳｐ１依存的様式で維持することに寄与するＭＣＡＦ１のメディエーター様機能に光を当てた。ＭＣＡＦ１の過剰発現は、天然に存在するヒトのガンにおける共通する特徴として、Ｓｐ１がテロメラーゼサブユニット遺伝子を強化することを可能にし得る。
【００８９】
ヒトのガンにおけるＭＣＡＦ１の過剰発現。本発明者らは、ＭＣＡＦ１が、非ガン性組織においてではなく、多くの異なる組織に由来するガンにおいて過剰発現することを確認した。このことは、腫瘍形成におけるＭＣＡＦ１についての役割を示唆している。ＭＣＡＦ１は、細胞成長及び細胞周期進行に関与する多くの遺伝子（これらには、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β及びその受容体（Ｅ２Ｆ１及びサイクリンＤ１）、ならびに、テロメラーゼ成分が含まれる）の発現を調節するＳｐ１と相互作用する（１６、４８）。本発明者らのデータはさらに、ＭＣＡＦ１のアップレギュレーションがＳｐ１によるテロメラーゼサブユニット遺伝子の転写活性化に関係することを明らかにした。加えて、ガンの進行では、アポトーシスに対する抵抗性、及び、血管形成の刺激が要求される（４９）。多くの前アポトーシス遺伝子、抗アポトーシス遺伝子及び血管形成遺伝子のプロモーターはＳｐ１結合部位を含有すること（５０）が見出されているので、過剰発現したＭＣＡＦ１はまた、これらの遺伝子に影響を及ぼしているかもしれず、従って、このことはガンの発達を加速させる。現在、腫瘍細胞におけるＭＣＡＦ１過剰発現の機構は不明であるが、これは、増殖表現型を維持するために要求される、ヒトのガンにおける共通する事象の１つであるかもしれない。
【実施例】
【００９０】
以下に、本発明が、実施例を参照して詳しく記載されるが、本発明の範囲は、実施例に限定されることはない。
【００９１】
１．実験手順
細胞培養。ＨｅＬａ細胞を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンが補充された、ダルベッコ改変イーグル最少必須培地及びハムＦ−１２栄養培地（Ｓｉｇｍａ）の１：１混合物において培養した。
【００９２】
抗体。抗ＭＣＡＦ１抗体は以前の記載の通りであった（１７）。利用された抗体は、抗Ｓｐ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗β−チューブリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＧＳＴ（ＤＡＫＯ）、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩ  ＣＴＤ４Ｈ８（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）、抗ＥＲＣＣ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＥＲＣＣ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＴＦＩＩＥα（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗ＴＦＩＩＥβ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。ウエスタンブロット分析及び免疫蛍光分析を、他のところで記載されるように行った（１７、１９）。
【００９３】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイ。細菌発現のＧＳＴ及びＧＳＴ融合タンパク質（１μｇ）をグルタチオン−アガロースビーズに固定化し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液において４℃で１時間、ＨｅＬａ核抽出物（６０μｇ）又はＨｉｓタグタンパク質（１μｇ）とインキュベーションした。インプットは反応混合物におけるタンパク質の１０％を示した。
【００９４】
免疫沈殿。ＨｅＬａ核抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＤＴＴ及び２５％グリセロール）により１０倍希釈し、抗ＭＣＡＦ１抗体、抗Ｓｐ１抗体又はコントロールＩｇＧと４℃で１時間混合し、その後、３０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えた後、１時間インキュベーションした。洗浄後、結合したタンパク質をウエスタンブロット分析によって検出した。
【００９５】
Ｓｐ１、ＭＣＡＦ１及びＴＥＲＴのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン。ＨｅＬａ細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡ  ｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、トランスフェクション後６０時間で集めた。２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖を、ヒトのＳｐ１、ＭＣＡＦ１又はＴＥＲＴをコードしたｍＲＮＡを標的化するために設計した。選択されたｓｉＲＮＡ標的の配列を、標的特異性を保証するためにヒトゲノムデータベース及びＥＳＴデータベースに提示した。これらの配列が補充表１に記載される（図１２を参照のこと）。ＧＬ３についてのｓｉＲＮＡは以前の通りであった（１９）。
【００９６】
クロマチン免疫沈殿（ＣｈＩＰ）及び定量的ＰＣＲ。ＨｅＬａ細胞（１×１０６個）を３７℃で１０分間、１％ホルムアルデヒドにより架橋した。粗細胞溶解物を超音波処理して、２００ｂｐから１０００ｂｐのフラグメントを作製した。ＣｈＩＰを、製造者のプロトコル（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に従って抗Ｓｐ１抗体又は抗ＭＣＡＦ１抗体又はコントロールＩｇＧを用いて行った。ＴＥＲＴ遺伝子プロモーターのＰＣＲ増幅を、９８℃で２０秒、６５℃で３０秒及び７２℃で３０秒の条件で２０サイクル（第１のＰＣＲ）及び２６サイクル（第２のＰＣＲ）にわたって行った。ＴＥＲＣ遺伝子プロモーターの増幅を、９８℃で２０秒、５８℃で３０秒及び７２℃で３０秒の条件で３５サイクルにわたって行った。ＴＥＲＴ遺伝子の上流側約８ｋｂ（〜8kb upstream of the TERT gene）の増幅を、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒及び７２℃で３０秒の条件で３０サイクルにわたって行った。定量的ＰＣＲを、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＡＢＩ  ７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法によってＣｈＩＰの生成物に対して三連で行った。標準曲線を、インプットＤＮＡの連続希釈物を使用して作製した（１０．０％、２．０％、０．４％及び０．０８％）。それぞれの反応のＣｔを標準曲線に対して定量した。プライマー組が補充表２に列挙される（図１３を参照のこと）。
【００９７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ。総ＲＮＡを、Ｉｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）を使用して単離した。ｃＤＮＡ合成のために、３μｇの総ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴプライマーを使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により逆転写した。標的ｃＤＮＡの定量的ＰＣＲを、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法によって行った。それぞれの実験を少なくとも３回行った。β−アクチン（β-actin）のレベルによる正規化と合わせて、相対的な富化倍数を定量化した。プライマー組が補充表２に列挙される。
【００９８】
テロメラーゼ活性の測定。テロメラーゼ活性を、定量的テロメア反復増幅プロトコル（Ｑ−ＴＲＡＰ）アッセイ（２５）を使用して測定した。簡単に記載すると、細胞ペレットを溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭベンズアミジン、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．５％ ＣＨＡＰＳ及び１０％グリセロール）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベーションした。遠心分離を１２，０００ｇにおいて４℃で２０分間行った後、上清のアリコートを急速冷凍し、−８０℃で保存した。溶解物のタンパク質濃度をＧｅｎｅＱｕａｎｔ  Ｐｒｏ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により求めた。コントロール溶解物を調製するために、テロメラーゼを８５℃での１０分間のインキュベーションによって不活化した。ＳＹＢＲグリーンＱ−ＴＲＡＰアッセイを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を伴う２５μｌにおいて、細胞溶解物（１．０μｇ、０．５μｇ、０．２μｇ及び０．１μｇ）、０．１μｇのテロメラーゼプライマーＴＳ、及び、０．１μｇの固定されたリターンプライマーＡＣＸを用いて行った。プライマー配列が補充表２に列挙される。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７３００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、サンプルを２５℃で２０分間インキュベーションし、９５℃で３０秒及び６０℃で９０秒の３５サイクルで増幅した。サンプル、不活化サンプル及び溶解緩衝液をすべてのＰＣＲプレートにおいて使用した。それぞれのサンプルを少なくとも二連で分析した。テロメラーゼ活性が、コントロール細胞における活性に対して相対的に示される。
【００９９】
重亜硫酸塩によるゲノムＤＮＡの配列決定。ゲノムＤＮＡを精製し、ＢｉｓｕｌＦａｓｔ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ）（２６）を使用して重亜硫酸ナトリウムで処理し、その後、ＰＣＲ増幅を、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、ＣｐＧ配列を含有しない特異的なプライマーのそれぞれを用いて行った。増幅された領域は、修飾されていないヒトＴＥＲＴ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０９７３６５）のヌクレオチド３７９１からヌクレオチド４１０５に対応した。ＰＣＲを、９８℃で３０秒、５６℃で３０秒及び７２℃で６０秒の条件で３２サイクルにわたって行った。ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン化し、配列決定した（少なくとも１５個の個々のクローン）。使用されたプライマーが補充表２に示される。
【０１００】
免疫組織化学。免疫組織化学を、胃、乳房及び肺の腫瘍、ならびに、様々な正常な組織を含むヒトのＴｕｍｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｒｒａｙ（ＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．及びＩＳＵ  Ａｂｘｉｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて行った。アレイスライドを脱パラフィン化し、その後、０．３％の過酸化水素を含むメタノールにおいて３０分間インキュベーションして、内因性のペルオキシダーゼ活性を阻止した。その後、組織切片をＰＢＳにおける１．０％ ＢｌｏｃｋＡｃｅ（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に３０分間浸け、抗ＭＣＡＦ１抗体により覆い、室温で１時間インキュベーションした。免疫反応の可視化を、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｔａｉｎ  ＭＡＸ−ＰＯ（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（Ｄａｋｏ）を使用して行った。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、Ｍａｌｉｎｏｌ（Ｍｕｔｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）により固定した。
【０１０１】
統計学的分析。群間の違いを、スチューデントｔ検定を使用して分析した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有意であると見なした。
【０１０２】
２．結果
進化的に保存されたドメインを介するＳｐ１とのＭＣＡＦ１複合体。ＭＣＡＦ／ＡＭファミリーのタンパク質は、ショウジョウバエからヒトまで進化的に保存される２つの機能的なドメイン（ドメイン１及びドメイン２）によって特徴づけられる（図１Ａ）（１７、１９）。ＤＮＡ結合モチーフがＭＣＡＦ１には見出されない。他方で、Ｓｐ１は、２つの転写活性化ドメインと、３つのジンクフィンガーモチーフから主に構成される領域とを有する（２７）。以前の観測結果では、ＭＣＡＦ１及びＳｐ１が機能的に関連づけられることが示唆されている（１７、１９、２１、２２）。ＭＣＡＦ１と、Ｓｐ１との間での直接的な相互作用をドメインレベルで調べるために、本発明者らは、ＧＳＴに融合されたか、又はＨｉｓタグ化された、ＭＣＡＦ１及びＳｐ１の細菌発現の欠失変異体を調製した。代表例には、ＭＣＡＦ１（Δ１０、Δ１８及びΔ８）（１７）及びＳｐ１（Δ５、Δ６及びΔ７）が含まれた。ＧＳＴ及びＭＣＡＦ１のＧＳＴ融合部分をグルタチオン−アガロースビーズに固定化し、ＨｅＬａ核抽出物とインキュベーションした（図１Ｂ、左側）。Ｓｐ１はＭＣＡＦ１のドメイン１（Δ１８）及びドメイン２（Δ８）の両方と結合し、しかし、アミノ末端領域（Δ１０）とは結合しなかった。ＭＣＡＦ１と相互作用することに関わるＳｐ１の領域をさらに明らかにするために、本発明者らは、Ｓｐ１のＧＳＴ融合部分と、ＨｉｓタグＭＣＡＦ１とを使用した（図１Ｂ、右側）。グルタチオン−アガロースビーズ上のＧＳＴ及びＳｐ１のＧＳＴ融合部分をＨｉｓタグＭＣＡＦ１（Δ１８又はΔ８）と混合した。ＭＣＡＦ１のドメイン１（Δ１８）がＳｐ１のΔ５及びΔ６と結合し、一方で、ドメイン２（Δ８）がＳｐ１のΔ６及びΔ７と結合した。活性化ドメインを含有するＳｐ１のアミノ末端領域はＭＣＡＦ１と結合しなかった（データは示されず）。ＭＣＡＦ１がＳｐ１との複合体を形成したかどうかを確認するために、抗ＭＣＡＦ１抗体及び抗Ｓｐ１抗体を使用する免疫沈殿分析をＨｅＬａ細胞において行った（図１Ｃ）。ＭＣＡＦ１が、Ｓｐ１との免疫沈殿物に見出された。逆に、Ｓｐ１がＭＣＡＦ１免疫沈殿物に存在した。これらの結データは、ＭＣＡＦ１の保存されたドメインがＳｐ１のジンクフィンガー領域と直接に結合し、これにより、ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体の形成をもたらすことを示唆している。
【０１０３】
テロメラーゼサブユニット遺伝子プロモーターにおけるＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体の形成。内因性遺伝子の調節におけるＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体の関与を調べるために、ＣｈＩＰ分析をＨｅＬａ細胞に対して行った。テロメラーゼに関連するＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子は、コアプロモーター領域内の５つの結合部位及び４つの結合部位を介してそれぞれＳｐ１によってトランス活性化されることが報告される（図２Ａ）（２８、２９）。タンパク質及びＤＮＡの、ホルムアルデヒドに基づく架橋の後、超音波処理によりフラグメント化されたクロマチンを抗ＭＣＡＦ１抗体又は抗Ｓｐ１抗体により免疫沈殿し、その後、ＰＣＲ増幅を、プロモーター配列について特異的なプライマーを使用して行った（図２Ｂ）。ＭＣＡＦ１及びＳｐ１がＴＥＲＴプロモーター領域及びＴＥＲＣプロモーター領域において見出された。加えて、ＴＥＲＴ遺伝子の上流側約８ｋｂの部位には、これらのタンパク質が結合しなかった。種が一致するＩｇＧをコントロールとして免疫沈殿のために使用した。加えて、両方のタンパク質がまた、異なったＳｐ１依存性ＢＲＣＡ１遺伝子のプロモーターにおいて見出された（補充図１（図７））。これらのデータは、ＭＣＡＦ１及びＳｐ１がＴＥＲＴ遺伝子プロモーター及びＴＥＲＣ遺伝子プロモーターに同時に存在することを示し、このことは、Ｓｐ１依存的なテロメラーゼ発現におけるＭＣＡＦ１についての役割を示唆している。
【０１０４】
ＭＣＡＦ１及びＳｐ１の機能的関係性を検討するために、本発明者らは、それぞれのタンパク質について特異的な３つ以上のｓｉＲＮＡを使用することによってＭＣＡＦ１又はＳｐ１をノックダウンした。ＨｅＬａ細胞をこれらのｓｉＲＮＡによりトランスフェクションし、その後、６０時間増殖させた。ウエスタンブロット分析及び定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、ＭＣＡＦ１及びＳｐ１がタンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方で枯渇したことが示された（図２Ｃ及び図２Ｄ）。コントロールｓｉＲＮＡの著しい影響は何らなかった。それぞれのｓｉＲＮＡの影響が基本的には類似していたので、本発明者らはその後に、ＭＣＡＦ１−２及びＳｐ１−２のｓｉＲＮＡによるデータを提示した。ノックダウン条件のもとで、本発明者らは、ＴＥＲＴプロモーターにおけるＭＣＡＦ１及びＳｐ１の量を、定量的ＣｈＩＰ分析を使用して調べた（図２Ｅ）。ＭＣＡＦ１のノックダウンは、遺伝子プロモーターに結合したＳｐ１ではなく、遺伝子プロモーターに結合した自身のタンパク質を低下させた（灰色棒、Ｐ＜０．０１）。対照的に、Ｓｐ１の喪失は、コントロールと比較して、ＴＥＲＴプロモーターにおいて、Ｓｐ１と同様に、ＭＣＡＦ１を著しく低下させた（白棒、Ｐ＜０．０１）。このことは、ＭＣＡＦ１が、これらのタンパク質の複合体形成を介して、Ｓｐ１依存的な様式でＴＥＲＴ遺伝子プロモーターに局在化することを示唆している。
【０１０５】
ＭＣＡＦ１及びＳｐ１が、テロメラーゼ活性を維持するために要求される。テロメラーゼ成分の転写制御におけるＭＣＡＦ１及びＳｐ１の役割を明確にするために、本発明者らは、ＴＥＲＴ及びＴＥＲＣのｍＲＮＡについての定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った（図３Ａ）。ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子の転写物がＨｅＬａ細胞においてＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンによって著しくダウンレギュレーションされた（Ｐ＜０．０１又はＰ＜０．０５）。類似する結果がＨＣＴ１１６細胞において得られた（補充図２（図８））。これらのデータは、ＭＣＡＦ１がＳｐ１と協同して、ＴＥＲＴ遺伝子及びＴＥＲＣ遺伝子からの転写を活性化することを示唆している。本発明者らは、ＴＥＲＴタンパク質を検出することが困難であった。これは、おそらくは、抗ＴＥＲＴ抗体の認識が不十分であったためである。従って、本発明者らは、Ｑ−ＴＲＡＰアッセイ（２５）を使用して、内因性のテロメラーゼ活性に対するＭＣＡＦ１及びＳｐ１の影響を評価した。細胞溶解物を、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンのもとでのＨｅＬａ細胞から調製し、ＴＲＡＰアッセイのために連続希釈し、その後、定量的ＰＣＲを、テロメア反復についての特異的なプライマーを使用して行った（図３Ｂ）。コントロールと比較した場合、テロメラーゼ活性がＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウン細胞では著しく低下した（Ｐ＜０．０１又はＰ＜０．０５）。これらの結果は、ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体が、ＴＥＲＴ及びＴＥＲＣの発現を誘導することによってテロメラーゼ活性を維持することを示唆している。
【０１０６】
細胞増殖に対するＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体の影響をさらに評価するために、本発明者らは、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンのもとでの細胞数を計数した（図３Ｃ）。ＭＣＡＦ１枯渇細胞又はＳｐ１枯渇細胞は、コントロールとの比較で、より低い増殖活性を示した。これらのデータは、２つの特異的なｓｉＲＮＡを使用することによるＴＥＲＴのノックダウンと非常に類似していた（図３Ｄ）。予想されるように、ＴＥＲＴのノックダウンは自身のｍＲＮＡ及び生じるテロメラーゼ活性を減少させた（補充図３（図９））。まとめると、これらのデータは、ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体が、ガン細胞におけるテロメラーゼ活性及び増殖を維持するために要求されることを示唆している。
【０１０７】
ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体はＴＥＲＴプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び基本転写因子の動員を媒介する。ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体による転写制御を調べるために、本発明者らは、ＴＥＲＴプロモーターにおける修飾されたヒストンの状態を、特異的な抗体を使用する定量的ＣｈＩＰ分析によって分析した（補充図４（図１０））。試験された転写活性な特徴の中で、Ｈ３のアセチル化だけがＳｐ１ノックダウン細胞において減少し、一方で、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の枯渇は、Ｈ３Ｋ４のメチル化及びＨ４のアセチル化における著しい変化を何らもたらさなかった。これらの結果は、ＴＥＲＴプロモーターにおける元々低いレベルのこれらの修飾されたヒストンによって引き起こされていたかもしれない。不活性な特徴、例えば、Ｈ３Ｋ９及びＨ３Ｋ２７のメチル化もまた、低いレベルで検出された（データは示されず）。ＭＣＡＦ１及びＳｐ１はＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び基本転写因子と会合する（１８、２３）ので、本発明者らは、その後、転写活性型のＲＮＡポリメラーゼＩＩ［Ｐｏｌ  ＩＩ（Ｓｅｒ  ５Ｐ）］の存在、及び、欠陥を相補する除去修復について、ＴＥＲＴプロモーターにおけるチャイニーズハムスター３／色素性乾皮症Ｂ（ＥＲＣＣ３／ＸＰＢ）において試験した（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンは遺伝子プロモーターにおけるＰｏｌ  ＩＩ（Ｓｅｒ  ５Ｐ）及びＥＲＣＣ３の両方の著しい低下をもたらした（Ｐ＜０．０１又はＰ＜０．０５）。従って、ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体はＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＥＲＣＣ３をＴＥＲＴコアプロモーターに協同して動員する。このことは、ＭＣＡＦ１のＳｐ１共役した転写機能を示唆している。
【０１０８】
ＭＣＡＦ１の基本的な役割を確認するために、本発明者らは、基本転写装置と結合するタンパク質の能力の特徴づけを行った。ＨｅＬａ核抽出物におけるＭＣＡＦ１を抗ＭＣＡＦ１抗体により免疫沈殿させた。細胞ＥＲＣＣ３及びＰｏｌ  ＩＩがＭＣＡＦ１免疫沈殿物に見出された（図４Ｃ、左側）。ＭＣＡＦ１免疫沈殿物はまた、ＴＦＩＩＥα、ＴＦＩＩＥβ及びＥＲＣＣ２／ＸＰＤを含有した（データは示されず）。本発明者らは次に、ＥＲＣＣ３、Ｐｏｌ  ＩＩ、ＴＦＩＩＥ−α及びＴＦＩＩＥ−βを、適切な抗体を用いた核抽出物から免疫沈殿させ、ＭＣＡＦ１の存在がこれらの免疫沈殿物において検出された（図４Ｃ、右側）。基本転写因子と相互作用したＭＣＡＦ１の領域をさらに明らかにするために、ＧＳＴ−ＭＣＡＦ１欠失体を、核抽出物を用いたプルダウンアッセイのために使用した（図４Ｄ）。ＥＲＣＣ３及びＥＲＣＣ２の両方がＭＣＡＦ１のドメイン２（Δ８）と会合した。対照的に、ＴＦＩＩＥ−α及びＴＦＩＩＥ−βはこのタンパク質のドメイン１（Δ１８）及びドメイン２（Δ８）の両方と結合した。ＭＣＡＦ１と、基本転写因子との間での直接的な相互作用を調べるために、プルダウン分析を、精製されたタンパク質を使用して行った（図４Ｅ）。グルタチオン−アガロースビーズ上のＧＳＴ融合ＥＲＣＣ３及びＧＳＴ融合ＥＲＣＣ２をＨｉｓタグＭＣＡＦ１（Δ１０及びΔ８）とインキュベーションした。ＥＲＣＣ３及びＥＲＣＣ２の両方が、ＭＣＡＦ１のΔ１０ではなく、ＭＣＡＦ１のΔ８と直接に結合した。このことは、図４Ｄにおける結果と一致していた。逆に、固定化されたＧＳＴ−ＭＣＡＦ１（Δ１０、Δ１８及びΔ８）をＨｉｓタグＴＦＩＩＥ−α及びＨｉｓタグＴＦＩＩＥ−βと混合した。ＴＦＩＩＥ−αは、Δ１８だけと結合することが見出され、一方で、ＴＦＩＩＥ−βはＭＣＡＦ１のΔ１８及びΔ８の両方と結合した。まとめると、これらのデータは、ＭＣＡＦ１の２つの保存されたドメインが、転写メディエーターのように、Ｓｐ１及び基本転写装置と直接に結合することを示唆している。
【０１０９】
ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体はＴＥＲＴプロモーター領域におけるＣｐＧのメチル化状態に影響を及ぼす。最近の研究では、ヒトのＴＥＲＴプロモーター領域がテロメラーゼ陽性の細胞株では独特にメチル化されることが報告されており（３、３０）、また、転写開始部位のすぐ上流側のメチル化されていない領域が腫瘍細胞においてＴＥＲＴ遺伝子の低い転写活性を可能にし得ることが報告されている（３１、３２）。加えて、リプレッサータンパク質のＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）が第１エキソン内のメチル化されていないモチーフと結合して、ＴＥＲＴの転写を阻害し、一方で、結合部位におけるＣｐＧのメチル化はＣＴＣＦの結合を阻害し、これにより、ガン細胞におけるＴＥＲＴ遺伝子の転写を引き起こすことが示されている（３２）。ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体の後成的な役割を調べるために、本発明者らは、重亜硫酸ゲノム配列決定を使用して、ＴＥＲＴ遺伝子のプロモーター及び第１エキソンにおける３８個のＣｐＧジヌクレオチドでのメチル化状態を調べた（図５）。コントロール細胞と比較した場合、Ｓｐ１結合モチーフ間のＣｐＧ部位５からＣｐＧ部位９が、ＴＥＲＴの発現が低下したＭＣＡＦ１又はＳｐ１のノックダウンＨｅＬａ細胞では選択的にメチル化される傾向を有していた。加えて、第１エキソン領域は、ＣＴＣＦ結合部位を含有しており、コントロールでは密にメチル化され、一方で、ＭＣＡＦ１又はＳｐ１の枯渇のもとでは、いくつかのＣｐＧ部位において部分的にメチル化されない傾向を有していた。従って、ＭＣＡＦ１−Ｓｐ１複合体の喪失はＴＥＲＴ遺伝子におけるＤＮＡメチル化状態に影響を及ぼし得る。
【０１１０】
ＭＣＡＦ１がヒトのガン組織において過剰発現する。ガンの発達におけるＭＣＡＦ１の関与を明確にするために、本発明者らは最後に、免疫組織化学的分析を使用して、ヒトのガン組織におけるＭＣＡＦ１の発現を調べた（図６）。使用されたウサギ（rabbit）抗ＭＣＡＦ１抗体の特異性は以前に明らかにされた（１７、１９）。ＭＣＡＦ１の染色が、胃、乳房及び肺の非ガン性組織では検出不能であったか、又は、低いレベルであった（図６；ｂ、ｆ及びｊ）。同じ実験条件を使用した場合、対照的に、ＭＣＡＦ１が、対応するガン性組織において非常に高いレベルで検出された。このデータは、胃ガン（ｄ）、乳ガン（ｈ）、ならびに、腺ガン（ｌ）及び扁平上皮細胞ガン（ｎ）を含む肺ガンを表しており、この場合、ＭＣＡＦ１がガン細胞の核において濃く染色された。本発明者らの研究は、１４８の原発性ヒトガン（胃（stomach）の５３の腺ガン、乳房（breast）の５２の浸潤性線管ガン、ならびに、肺（lung）の１４の腺ガン（Adenocarcinoma）及び２９の扁平上皮細胞ガン（Squamous cell carcinoma））の中で、ＭＣＡＦ１が、７０％を越える試験されたガン組織において陽性で検出されたことを明らかにした（補充図５（図１１）に要約される）。これらのデータは、ＭＣＡＦ１の高まった発現が様々な組織起原におけるガンの発達と少なくとも相関することを示唆している。
【０１１１】
参考文献
1.Colgin, L. M., and Reddel, R. R. (1999) Curr Opin Genet Dev 9, 97-103
2.Nugent, C. I., and Lundblad, V. (1998) Genes Dev 12, 1073-1085
3.Kim, N. W., Piatyszek, M. A., Prowse, K. R., Harley, C. B., West, M. D., Ho, P. L., Coviello, G. M., Wright, W. E., Weinrich, S. L., and Shay, J. W. (1994) Science 266, 2011-2015
4.Kumakura, S., Tsutsui, T. W., Yagisawa, J., Barrett, J. C., and Tsutsui, T. (2005) Cancer Res 65, 2778-2786
5.Nakamura, T. M., Morin, G. B., Chapman, K. B., Weinrich, S. L., Andrews, W. H., Lingner, J., Harley, C. B., and Cech, T. R. (1997) Science 277, 955-959
6.Herbert, B., Pitts, A. E., Baker, S. I., Hamilton, S. E., Wright, W. E., Shay, J. W., and Corey, D. R. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 14276-14281
7.Bellon, M., and Nicot, C. (2008) J Natl Cancer Inst 100, 98-108
8.Yi, X., Tesmer, V. M., Savre-Train, I., Shay, J. W., and Wright, W. E. (1999) Mol Cell Biol 19, 3989-3997
9.Avilion, A. A., Piatyszek, M. A., Gupta, J., Shay, J. W., Bacchetti, S., and Greider, C. W. (1996) Cancer Res 56, 645-650
10.Bodnar, A. G., Ouellette, M., Frolkis, M., Holt, S. E., Chiu, C. P., Morin, G. B., Harley, C. B., Shay, J. W., Lichtsteiner, S., and Wright, W. E. (1998) Science 279, 349-352
11.Yang, J., Chang, E., Cherry, A. M., Bangs, C. D., Oei, Y., Bodnar, A., Bronstein, A., Chiu, C. P., and Herron, G. S. (1999) J Biol Chem 274, 26141-26148
12.Cristofari, G., and Lingner, J. (2006) EMBO J 25, 565-574
13.Cong, Y S., Wright, W. E., and Shay, J. W. (2002) Microbiol Mol Biol Rev 66, 407-425
14.Takakura, M., Kyo, S., Kanaya, T., Hirano, H., Takeda, J., Yutsudo, M., and Inoue, M. (1999) Cancer Res 59, 551-557
15.Kyo, S., Takakura, M., Taira, T., Kanaya, T., Itoh, H., Yutsudo, M., Ariga, H., and Inoue, M. (2000) Nucleic Acids Res 28, 669-677
16.Safe, S., and Abdelrahim, M. (2005) Eur J Cancer 41, 2438-2448
17.Fujita, N., Watanabe, S., Ichimura, T., Ohkuma, Y., Chiba, T., Saya, H., and Nakao, M. (2003) Mol Cell Biol 23, 2834-2843
18.De Graeve, F., Bahr, A., Chatton, B., and Kedinger, C. (2000) Oncogene 19, 1807-1819
19.Ichimura, T., Watanabe, S., Sakamoto, Y., Aoto, T., Fujita, N., and Nakao, M. (2005) J Biol Chem 280, 13928-13935
20.Wang, H., An, W., Cao, R., Xia, L., Erdjument-Bromage, H., Chatton, B., Tempst, P., Roeder, R. G., and Zhang, Y. (2003) Mol Cell 12, 475-487
21.Gunther, M., Laithier, M., and Brison, O. (2000) Mol Cell Biochem 210, 131-142
22.Chang, L. K., Chung, J. Y., Hong, Y. R., Ichimura, T., Nakao, M., and Liu, S. T. (2005) Nucleic Acids Res 33, 6528-6539
23.Wierstra, I. (2008) Biochem Biophys Res Commun 372, 1-13
24.Myers, L. C., and Kornberg, R. D. (2000) Annu Rev Biochem 69, 729-749
25.Wege, H., Chui, M. S., Le, H. T., Tran, J. M., and Zern, M. A. (2003) Nucleic Acids Res 31, E3-3
26.Aoto, T., Saitoh, N., Ichimura, T., Niwa, H., and Nakao, M. (2006) Dev Biol 298, 354-367
27.Suske, G (1999) Gene 238, 291-300
28.Horikawa, I., Cable, P. L., Afshari, C., and Barrett, J. C. (1999) Cancer Res 59, 826-830
29.Zhao, J. Q., Hoare, S. F., McFarlane, R., Muir, S., Parkinson, E. K., Black, D. M., and Keith, W. N. (1998) Oncogene 16, 1345-1350
30.Devereux, T. R., Horikawa, I., Anna, C. H., Annab, L. A., Afshari, C. A., and Barrett, J. C. (1999) Cancer Res 59, 6087-6090
31.Yi, X., Shay, J. W., and Wright, W. E. (2001) Nucleic Acids Res 29, 4818-4825
32.Renaud, S., Loukinov, D., Abdullaev, Z., Guilleret, I., Bosman, F. T., Lobanenkov, V., and Benhattar, J. (2007) Nucleic Acids Res 35, 1245-1256
33.Hahn, W. C., Counter, C. M., Lundberg, A. S., Beijersbergen, R. L., Brooks, M. W., and Weinberg, R. A. (1999) Nature 400, 464-468
34.Shay, J. W., and Bacchetti, S. (1997) Eur J Cancer 33, 787-791
35.Janknecht, R. (2004) FEBS lett 564, 9-13
36.Cao, Y., Bryan, T. M., and Reddel, R. R. (2008) Cancer Sci 99, 1092-1099
37.Rooney, P. H., Murray, G. I., Stevenson, D. A., Haites, N. E., Cassidy, J., and McLeod, H. L. (1999) Br J Cancer 80, 862-873
38.Zhao, J. Q., Glasspool, R. M., Hoare, S. F., Bilsland, A., Szatmari, I., and Keith, W. N. (2000) Neoplasia 2, 531-539
39.Kyo, S., and Inoue, M. (2002) Oncogene 21, 688-697
40.Smale, S. T. (1997) Biochim Biophys Acta 1351, 73-88
41.Pugh, B. F., and Tjian, R. (1991) Genes Dev 5, 1935-1945
42.Berger, S. L. (2007) Nature 447, 407-412
43.Wang, X., Pan, L., Feng, Y., Wang, Y., Han, Q., Han, L., Han, S., Guo, J., Huang, B., and Lu, J. (2008) Oncogene 27, 1894-1904
44.Guilleret, I., Yan, P., Grange, F., Braunschweig, R., Bosman, F. T., and Benhattar, J. (2002) Int J Cancer 101, 335-341
45.Antequera, F., and Bird, A. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90, 11995-11999
46.Woychik, N. A., and Hampsey, M. (2002) Cell 108, 453-463
47.Uchimura, Y., Ichimura, T., Uwada, J., Tachibana, T., Sugahara, S., Nakao, M., and Saitoh, H. (2006) J Biol Chem 281, 23180-23190
48.Cairney, C. J., and Keith, W. N. (2008) Biochimie 90, 13-23
49.Hanahan, D., and Weinberg, R. A. (2000) Cell 100, 57-70
50.Black, A. R., Black, J. D., and Azizkhan-Clifford, J. (2001) J Cell Physiol 188, 143-160
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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