(57)【要約】【課題】ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン測定用カラム充填剤を提供する。また、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるカラム充填剤であって、平均粒径値が１〜３０μｍであり、粒度分布を測定した際に得られる度数分布のピークが２つ以上存在し、かつ、前記度数分布のピークのうち、最大粒径を示すピークの粒径値が、最小粒径を示すピークの粒径値の１．１〜３．０倍であるヘモグロビン類測定用カラム充填剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるカラム充填剤であって、
平均粒径値が１〜３０μｍであり、
粒度分布を測定した際に得られる度数分布のピークが２つ以上存在し、かつ、
前記度数分布のピークのうち、最大粒径を示すピークの粒径値が、最小粒径を示すピークの粒径値の１．１〜３．０倍である
ことを特徴とする、ヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【請求項２】
粒度分布を測定した際に得られる度数分布のピークが２つであることを特徴とする、請求項１記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【請求項３】
アクリル系ポリマーを主成分とすることを特徴とする、請求項１又は２記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤。
【請求項４】
請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項５】
請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類測定用カラム充填剤に関する。また、本発明は、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、糖尿病診断の指標としてヘモグロビンＡ１ｃの測定が汎用的に行なわれている。ヘモグロビンＡ１ｃは、液体クロマトグラフィー、免疫法、酵素法等により測定されているが、なかでも液体クロマトグラフィーは精度が良く、短時間に測定できるため、特に糖尿病患者のヘモグロビンＡ１ｃ値の管理に用いられている。
【０００３】
液体クロマトグラフィーでヘモグロビンＡ１ｃを測定する際、ヘモグロビンＡ１ｃを短時間かつ高精度に測定でき、しかもカラム耐久性を高くする（カラム寿命を長くする）ために、カラム充填剤に必要な要件の１つは、測定初期において分離性能が良いこと、及び圧力の変動が少ないことである。測定初期の分離性能が悪いと、測定値が変化しやすく、ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度が低下する。また、圧力が変動すると、得られるクロマトグラムが変形してヘモグロビンＡ１ｃ値の測定精度が低下する。その結果、カラム耐久性が低くなり、カラム寿命が短くなる。
【０００４】
このような測定値の変動を抑制し、カラム寿命を長くする方法としては、カラム充填剤に用いられる充填剤粒子の粒径を小さくし、より均一にする方法が挙げられる。例えば、特許文献１には、粒径が３〜４μｍの微小な充填剤を用いてヘモグロビン類を測定する方法が開示されている。しかしながら、特許文献１に開示されている方法により得られたカラムは、カラム圧力が３．９〜５．９ＭＰａと大きいため、耐圧性に優れた装置を必要とするという問題がある。
【０００５】
特許文献２には、シード重合法を用いて粒径の揃った充填剤粒子を調製する方法が開示されている。特許文献２に開示されている方法で調製した充填剤粒子を用いた場合、優れた分離性能を示すことができるとされている。しかしながら、通常、シード重合法では平均粒径値が最大でも５μｍ程度の粒子しか得られないため、充填剤粒子として用いた場合、カラム圧力が増大する。また、調製方法が煩雑であり、製造再現性が悪いという問題がある。
【０００６】
臨床検査の現場においては、ヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類を、短時間で高精度に測定したいという強い要望がある。従って、ヘモグロビン類を測定するための、液体クロマトグラフィーに用いられるカラム充填剤としては、簡便に調製でき、より高い分離性能とより長いカラム寿命を有するものが要望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−５７３０号公報
【特許文献２】特開２００１−２７１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるカラム充填剤であって、平均粒径値が１〜３０μｍであり、粒度分布を測定した際に得られる度数分布のピークが２つ以上存在し、かつ、上記度数分布のピークのうち、最大粒径を示すピークの粒径値が、最小粒径を示すピークの粒径値の１．１〜３．０倍であるヘモグロビン類測定用カラム充填剤である。
また、本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法も本発明の１つである。
更に、本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法も本発明の１つである。
以下に本発明を詳述する。
【００１０】
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤（以下、単に充填剤ともいう）は、粒子状の充填剤からなる。
本発明の充填剤の平均粒径値の下限は１μｍ、上限は３０μｍである。充填剤の平均粒径値が１μｍ未満であると、溶離液をカラムに流すために必要となる圧力が増大し、液体クロマトグラフィーの装置に耐圧性付与のための特殊な部品等が必要となる。充填剤の平均粒径値が３０μｍを超えると、カラム内の空隙率が増大し、試料が拡散しやすくなり、ピークがブロード化すること等により測定精度が低下する。本発明の充填剤の平均粒径値の好ましい下限は２μｍ、好ましい上限は２５μｍであり、より好ましい下限は５μｍ、より好ましい上限は２０μｍである。
なお、本明細書において上記平均粒径値は、個数カウント法の原理に基づく粒度分布測定装置により得られた測定結果によるものである。ただし、他の測定原理に基づく測定装置であっても、個数カウント法の原理との相関又はキャリブレーションが成されている装置であれば用いることができ、このような装置としては、例えば、遠心沈降法、動的光散乱法、レーザー回折光散乱法、超音波減衰法、キャピラリー法、コールター法等の公知の原理に基づく装置等が挙げられる。
【００１１】
本発明の充填剤は、粒度分布を測定した際に得られる度数分布のピーク（以下、単に粒度分布のピークともいう）が２つ以上存在する。上記粒度分布のピークが２つある充填剤の粒度分布図の一例を図１に示す。図１は、一般的な粒度分布測定装置を用いて測定を行った際に得られる度数分布図であり、図１において、グラフの横軸は粒径値、縦軸は各粒径値における度数を示している。図１では、約１４μｍのところにピーク１１があり、約１０μｍのところにピーク１２がある。
本発明の充填剤は、上記粒度分布のピークを２つ〜４つ有することが好ましく、２つ有することがより好ましい。
なお、本明細書において上記ピークとは、隣接する左右の測定点よりも度数の大きい測定点を意味する。即ち、上記粒度分布のピークとは、図１のような粒度分布を示すグラフにおける各山の頂点のことである。
【００１２】
本発明の充填剤において、上記粒度分布のピークのうち、最小粒径を示すピークの粒径値に対する最大粒径を示すピークの粒径値の比率（最大粒径を示すピークの粒径値／最小粒径を示すピークの粒径値、以下、ピークの粒径値の倍率ともいう）の下限は１．１、上限は３．０である。例えば、図１の場合、図中のピーク１１が最大粒径を示すピーク、ピーク１２が最小粒径を示すピークである。ピークの粒径値の倍率が１．１未満の場合、これらのピークを有する充填剤は単一ピークを有する充填剤と同等の挙動を示す。即ち、平均粒径値が小さい場合は圧力が高くなり、平均粒径値が大きい場合は分離性能が悪化する。ピークの粒径値の倍率が３．０を超える場合は、粒度分布幅が広くなりすぎて、分離性能が悪化する。ピークの粒径値の倍率の好ましい下限は１．２、好ましい上限は２．５である。
なお、本明細書において上記粒度分布は、個数カウント法（単一粒子光学検知法）の原理に基づく粒度分布測定装置により得られた体積分布の測定結果によるものである。ただし、他の測定原理に基づく測定装置であっても、個数カウント法の原理との相関又はキャリブレーションが成されている装置であれば用いることができ、このような装置としては、例えば、遠心沈降法、動的光散乱法、レーザー回折光散乱法、超音波減衰法、キャピラリー法、コールター法等の公知の原理に基づく装置等が挙げられる。
【００１３】
本発明の充填剤を製造する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、粒度分布が単一ピークを有する２種以上の充填剤を、上述した条件に適合するように混合する方法、複数のピークを有する充填剤を重合により得る方法等が挙げられる。
【００１４】
本発明の充填剤の素材としては、シリカ系、セラミックス系、ガラス系等の無機系素材、アクリル系ポリマー、スチレン系ポリマー等の有機合成系素材等、公知の充填剤の素材を用いることができる。なかでも、有機合成系素材を用いることが好ましく、アクリル系ポリマーを主成分とすることがより好ましい。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリロイルオキシ基又はメタクリロイルオキシ基を有することを意味し、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル又はメタクリル」を意味する。
【００１５】
上記アクリル系ポリマーを素材とした場合の充填剤の製造方法としては、アクリル系モノマーを公知の重合法により重合する方法を用いることができる。
上記アクリル系モノマーとしては、例えば、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート類、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート類、アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類等の、分子内に少なくとも２個の（メタ）アクリロイルオキシ基を有する架橋性のアクリル系モノマー等が挙げられる。
上記アクリル系ポリマーは、上記架橋性のアクリル系モノマーを重合する方法や、上記架橋性のアクリル系モノマーと、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート類、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等の非架橋性のアクリル系モノマーとを共重合する方法等により調製することができる。
【００１６】
本発明の充填剤は、イオン交換基を有することが好ましい。
上記イオン交換基としては、カチオン交換基であることが好ましく、スルホン酸基であることがより好ましい。上記イオン交換基を有する充填剤は、例えば、充填剤の主成分を上記アクリル系ポリマーとする場合、アクリル系モノマーとイオン交換基を有する単量体とを重合してアクリル系ポリマーを調製する方法、アクリル系ポリマーを調製した後にイオン交換基を導入する方法等、公知の方法により調製することができる。
【００１７】
本発明の充填剤を用いれば、液体クロマトグラフィーによって種々のヘモグロビン類を測定することができる。具体的には、本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いれば、液体クロマトグラフィーにより、ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ１ｃ、ヘモグロビンＦ（胎児性ヘモグロビン）やヘモグロビンＡ２を測定することができる。本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃの測定方法もまた、本発明の一つである。
更に、本発明の充填剤を用いれば、一般に異常ヘモグロビンと呼ばれるヘモグロビン類の一部を測定することもできる。本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビンの測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明のヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビンの測定方法により測定できる異常ヘモグロビン類としては、例えば、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＥ等が挙げられる。
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いて液体クロマトグラフィーによりヘモグロビンＡ１ｃ等のヘモグロビン類の測定を行なう場合には、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた公知の液体クロマトグラフィーシステムに、本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を充填したカラムを接続し、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行なうことができる。
【００１８】
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーに用いられる溶離液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、有機酸、無機酸、及び、これらの塩類、アミノ酸類、グッドの緩衝液等が挙げられる。
上記有機酸は特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸は特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は特に限定されず、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
【００１９】
ヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は１０００ｍｍｏｌ／Ｌである。緩衝液の塩濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビン類を分離することができなくなることがある。緩衝液の塩濃度が１０００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出してシステムに悪影響を及ぼすことがある。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のヘモグロビン類測定用カラム充填剤は、充填剤粒子の平均粒径値が１〜３０μｍであり、粒度分布を測定した際に得られる度数分布のピークが２つ以上存在し、上記度数分布のピークのうち、最大粒径を示すピークの粒径値が、最小粒径を示すピークの粒径値の１．１〜３．０倍である。
２つ以上のピークを有することで、粒度分布幅が広くても良好な分離性能を実現できる。また、長期間の使用においても圧力上昇を抑制できる。その結果、高精度な測定及びカラム耐久性能の向上が可能となる。特に、ヘモグロビンＡ１ｃの測定において、高精度測定及びカラム耐久性の向上が達成される。
つまり、本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】粒度分布のピークが２つある充填剤の粒度分布図の一例である。
【図２】実施例１のカラム充填剤を用いて、健常人血のヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図３】比較例２のカラム充填剤を用いて、健常人血のヘモグロビンＡ１ｃの測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図４】実施例１のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図５】比較例２のカラム充填剤を用いて異常ヘモグロビン類の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図６】実施例１のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図７】比較例２のカラム充填剤を用いてヘモグロビンＡ２の測定を行なった際に得られたクロマトグラムである。
【図８】実施例２、実施例４、及び、比較例１の充填剤を用いてカラム耐久性の評価を行った際の圧力値の推移である。
【図９】実施例２、実施例４、及び、比較例１の充填剤を用いてカラム耐久性の評価を行った際のヘモグロビンＡ１ｃ値の推移である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（製造例１）
テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、及び、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇを含有する単量体混合物に、過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液２Ｌに分散させ、羽根長６０ｍｍの撹拌羽根を用いて３５０ｒｐｍで攪拌しながら、窒素雰囲気下で８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。１時間後に反応系にアクリルアミド−ｔｅｒｔ−ブチルスルホン酸（東亞合成社製）８０ｇを溶解した水溶液２００ｍＬを添加して更に８０℃で１時間重合反応を行った。
得られた重合体粒子を洗浄した後、粒度分布測定装置（パーティクルサイジングシステム社製、「アキュサイザー７８０」）により、平均粒径値及び粒度分布を測定した。光源としては半導体レーザーを、センサとしてはＬＥ４００−０５を用い、１２０秒間測定を行って体積分布表示（１２８分割表示）を行い、平均粒径値を算出した。その結果、平均粒径値は３．２μｍ、粒度分布は単一ピーク状であった。
【００２３】
（製造例２）
製造例１における撹拌時の回転数を３５０ｒｐｍから２５０ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作し、得られた重合体粒子の平均粒径値及び粒度分布を測定した。その結果、平均粒径値は１０．２μｍ、粒度分布は単一ピーク状であった。
【００２４】
（製造例３）
製造例１における撹拌時の回転数を３５０ｒｐｍから１５０ｒｐｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作し、得られた重合体粒子の平均粒径値及び粒度分布を測定した。その結果、平均粒径値は１５．５μｍ、粒度分布は単一ピーク状であった。
【００２５】
（製造例４）
製造例１における撹拌時の回転数を３５０ｒｐｍから１５０ｒｐｍに変更し、更に撹拌羽根の羽根長６０ｍｍを５０ｍｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作し、得られた重合体粒子の平均粒径値及び粒度分布を測定した。その結果、平均粒径値は２３．８μｍ、粒度分布は単一ピーク状であった。
【００２６】
（製造例５）
製造例１における撹拌時の回転数を３５０ｒｐｍから１００ｒｐｍに変更し、更に撹拌羽根の羽根長６０ｍｍを４０ｍｍに変更したこと以外は、製造例１と同様に操作し、得られた重合体粒子の平均粒径値及び粒度分布を測定した。その結果、平均粒径値は３５．２μｍ、粒度分布は単一ピーク状であった。
【００２７】
製造例１〜５で得られた重合体粒子の平均粒径値及び粒度分布ピーク数を表１に示す。
【００２８】
【表１】
2011209040.tif 000002
【００２９】
（実施例１〜４及び比較例１〜５）
製造例１〜５で得られた重合体粒子を単独で、又は、表２に示した混合比で混合して、実施例１〜４、及び、比較例１〜５の９種類のカラム充填剤を得た。得られたカラム充填剤の平均粒径値、粒度分布ピークの数、各ピークのうち、最小粒径を示すピークの粒径値、最大粒径を示すピークの粒径値、及び、ピークの粒径値の倍率を表２に示す。
【００３０】
【表２】
2011209040.tif 000003
【００３１】
比較例１及び比較例２は、製造例１で得られた重合体粒子及び製造例４で得られた重合体粒子をそれぞれ単独で用いたため、粒度分布ピークを一つしか有さなかった。比較例３はピークの粒径値の倍率が１．０４と低く、比較例４はピークの粒径値の倍率が３．１１と高いものであった。また、比較例５は平均粒径値が３１．２μｍと大きいものであった。
【００３２】
＜評価＞
実施例及び比較例の充填剤を、内径４．６ｍｍ、長さ３０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン測定用カラムを得た。これらのカラムを用いて、以下の評価を行った
【００３３】
（１）カラム圧力の測定
ヘモグロビン測定用カラムを、液体クロマトグラフィーシステム（島津製作所社製、「ＬＣ−１０Ａ」）に接続した。溶離液として２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）を流速１．０ｍＬ／分で送液して圧力表示値を読み取った。結果を表３に示す。
【００３４】
【表３】
2011209040.tif 000004
【００３５】
表３より、平均粒径値がほぼ同等の実施例３と比較例３、及び、実施例４と比較例２において、いずれも実施例の充填剤を用いた方が低圧化していることが分かる。また、比較例１の充填剤を用いた場合は圧力値が非常に大きくなった。
【００３６】
（２）健常人血の測定
実施例１の充填剤を用いて、健常人血の測定を行った。
測定試料として、フッ化ナトリウム採血した健常人血を、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）により２００倍に溶血希釈したものを用いた。溶離液Ａとして２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）、及び、溶離液Ｂとして４００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）の２種の溶離液を用い、流速１．０ｍＬで送液して溶離液Ａから溶離液Ｂへのステップワイズグラジエント法により分離し、４１５ｎｍの吸光度を測定した結果、図２のクロマトグラムを得た。図２中、１がヘモグロビンＡ１ｃ、２がヘモグロビンＡ０である。実施例１の充填剤を用いた場合、ヘモグロビンＡ１ｃと他のヘモグロビン分画とが短時間内に良好に分離された。実施例２〜４の充填剤を用いた場合でも実施例１と同様の良好なクロマトグラムが得られた。また、圧力値が非常に大きいものとなった比較例１の充填剤を用いた場合でも実施例１と同様に良好なクロマトグラムが得られた。一方、比較例２の充填剤を用いた場合は、図３に示したように分離が悪いものとなった。比較例３〜５の充填剤を用いた場合も比較例２と同様に分離が悪いものとなった。
【００３７】
（３）修飾ヘモグロビン類の測定
上記（２）における健常人血の代わりに、修飾ヘモグロビン類を含む試料を人為的に調製して測定し、修飾ヘモグロビン類とヘモグロビンＡ１ｃとの分離性能を評価した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料としては、レイバイルヘモグロビンＡ１ｃ含有試料（試料Ｌ）、アセチル化ヘモグロビン含有試料（試料Ａ）、カルバミル化ヘモグロビン含有試料（試料Ｃ）の３種類を、公知の方法により調製した。
即ち、試料Ｌは、健常人血に、グルコースを２０００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温することにより調製した。試料Ａは、健常人血に、アセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。試料Ｃは、健常人血に、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で２時間加温することにより調製した。
得られた修飾ヘモグロビン類を含む試料（試料Ｌ、試料Ａ、試料Ｃ）と、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いた健常人血（非修飾品）とを、実施例及び比較例で調製した充填剤を用いて、上記（２）と同様の方法によって測定し、ヘモグロビンＡ１ｃの測定値を比較した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンＡ１ｃ値から非修飾品のヘモグロビンＡ１ｃ値を差し引いた値（Δ値）を算出して比較することにより評価した。結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
2011209040.tif 000005
【００３９】
表４に示した実施例１〜４、及び、比較例１のΔ値は０．２％以下であり、これらの充填剤を用いた場合、修飾ヘモグロビン類が含まれる試料においても、正確にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることがわかる。一方、比較例２〜５の充填剤を用いた場合では、修飾ヘモグロビン類が存在すると、ヘモグロビンＡ１ｃ値が大きく変動し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を正確に測定することができなかった。
【００４０】
（３）異常ヘモグロビン類の測定
実施例及び比較例で調製した充填剤を用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを含む試料（ヘレナ研究所社製、「ＡＦＳＣヘモコントロール」）の測定を行った。
実施例１の充填剤を用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図４に示す。図４中、１はヘモグロビンＡ１ｃ、２はヘモグロビンＡ０、３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、４はヘモグロビンＳ、５はヘモグロビンＣを示す。実施例１の充填剤においては、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを良好に分離することができた。実施例２〜４及び比較例１の充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例２の充填剤を用いた場合は、図５に示したように異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。比較例３〜５の充填剤を用いた場合も比較例２と同様にヘモグロビンＳ及びヘモグロビンＣを分離することはできなかった。
【００４１】
（４）ヘモグロビンＡ２の測定
実施例及び比較例で調製した充填剤を用いて、ヘモグロビンＡ２を含む試料として、Ａ２コントロール（レベル２）（バイオラッド社製）を測定した。
実施例１の充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図６に示す。図６中、１はヘモグロビンＡ１ｃ、２はヘモグロビンＡ０、３はヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）、６はヘモグロビンＡ２を示す。実施例１の充填剤を用いた場合、ヘモグロビンＡ２を良好に分離することができた。実施例２〜４及び比較例１の充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。一方、比較例２の充填剤を用いた場合は、図７に示したようにヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。比較例３〜５の充填剤を用いた場合も比較例２と同様にヘモグロビンＡ２を分離することはできなかった。
【００４２】
（５）カラム耐久性の評価
上記（２）〜（４）の評価において、ヘモグロビン類の分離性能が良好であった実施例２、４、及び比較例１の充填剤を用いて、同一の健常人血試料を繰り返し測定し、圧力値及びヘモグロビンＡ１ｃ値の推移を確認した。それぞれの結果を図８及び図９に示す。
実施例２、及び４の充填剤を用いた場合は、圧力値は安定であった。比較例１では、圧力上昇が大きく、測定回数が１０００回未満で１０ＭＰａを超え、１０００回を過ぎると圧力上限を超えて測定不能となった。
ヘモグロビンＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃ（％））は、実施例２、及び、実施例４の充填剤を用いた場合は２０００回測定しても安定していた。一方、比較例１の充填剤を用いた場合では圧力上昇に伴ってＨｂＡ１ｃ値も上昇し、正確な測定ができなくなり、カラム寿命が短いことが確認された。
実施例の充填剤は、圧力値が低く、かつ、安定した状態で、比較例１のような微小粒径の充填剤の同等の分離性能を持ち、また、その高分離性を長期間に亙って維持できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、ヘモグロビン類を短時間で高精度に測定することができ、かつ、カラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類測定用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類測定用カラム充填剤を用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、並びに、ヘモグロビンＡ１ｃ及び異常ヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００４４】
１  ヘモグロビンＡ１ｃ
２  ヘモグロビンＡ０
３  ヘモグロビンＦ（胎児性Ｈｂ）
４  ヘモグロビンＳ
５  ヘモグロビンＣ
６  ヘモグロビンＡ２
１１  最大粒径を示すピーク
１２  最小粒径を示すピーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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