(57)【要約】【課題】本発明の課題は、工業レベルで効率良く安価に生産可能であり、十分に高い氷結晶化阻害活性を有し、安全かつ実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有する氷結晶化阻害物質を提供することである。また、本発明は、当該氷結晶化阻害物質の活性部分であるポリペプチド、並びに当該氷結晶化阻害物質またはポリペプチドを含む抗体、組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品を提供することも目的とする。【解決手段】本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物由来のものであり、且つ特定のタンパク質を少なくとも一つ含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来のものであり、且つ下記（１）〜（４）の何れかのタンパク質を少なくとも一つ含有することを特徴とする氷結晶化阻害物質。
（１）  配列番号１のアミノ酸配列を有し、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が１９，０００±２００Ｄａであるタンパク質
（２）  配列番号２のアミノ酸配列を有し、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が２２，０００±２５０Ｄａであるタンパク質
（３）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が５９，０００±６００Ｄａであり、且つそのＮ末端が修飾を受けているタンパク質
（４）  上記（１）〜（３）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたタンパク質であり、且つ氷結晶化阻害活性を有するタンパク質
【請求項２】
植物が、アブラナ科、セリ科、ユリ科およびキク科に属する植物からなる群より選ばれる１以上の植物、または、これらの類縁品種もしくは改良品種である請求項１に記載の氷氷結晶化阻害物質。
【請求項３】
アブラナ科に属する植物が、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、シロナ、野沢菜、広島菜、ミズナおよびマスタードからなる群より選ばれる１以上の植物、または、これらの類縁品種もしくは改良品種である請求項２に記載の氷結晶化阻害物質。
【請求項４】
アブラナ科に属する植物が、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、または、これの類縁品種もしくは改良品種である請求項３に記載の氷結晶化阻害物質。
【請求項５】
アブラナ科に属する植物がカイワレダイコンである請求項４に記載の氷結晶化阻害物質。
【請求項６】
アセトン分画において、アセトン濃度が３０容量％の濃度で沈殿する画分に含まれるものである請求項１〜５のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質を解離して得られるものであり、且つ氷結晶化阻害活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質および／または請求項７に記載のポリペプチドと特異的に反応することを特徴とする抗体。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質および／または請求項７に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質および／または請求項７に記載のポリペプチドを含む食品。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質および／または請求項７に記載のポリペプチドを含む生体試料保護剤。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の氷結晶化阻害物質および／または請求項７に記載のポリペプチドを含む化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、氷結晶化阻害物質、その活性部分であるポリペプチド、並びに当該氷結晶化阻害物質またはポリペプチドを含む抗体、組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
氷結晶化阻害物質は、不凍タンパク質やＡＦＰとも呼ばれる物質であり、氷結晶の表面に吸着してその成長を妨げる働きをもつタンパク質であり、生物においては細胞の凍結から身を守るために利用されている。このような氷結晶化阻害物質は、例えば、魚類、昆虫、植物、菌類、微生物などから見出されている（特許文献１〜２，非特許文献１〜４）。
【０００３】
しかしながら、これまでに報告されている氷結晶化阻害物質は、魚類、植物、昆虫、菌類、細菌などの生体内に微量しか存在せず抽出効率が非常に悪かったり、多量に存在していても、生物自体の捕獲や培養が難しいといった問題を有し、工業的に生産し食品用途として利用できるものではなかった。
【０００４】
そこで、一年中安定かつ安価に不凍活性を有する氷結晶化阻害物質を提供する方法として、低温保存したカイワレ大根を水などにより抽出する方法が提案されている（特許文献３）。しかし、特許文献３に記載の方法で得られる氷結晶化阻害物質は、氷結晶化阻害活性が必ずしも十分ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２４２３７号公報
【特許文献２】特開２００４−２７５００８号公報
【特許文献３】特開２００７−１５３８３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】生物物理，第４３巻，第３号，第１３０〜１３５頁（２００３年）
【非特許文献２】Plant Physiology（プラント・フィジオロジー），第１１９巻，第１３６１〜１３６９頁（１９９９年）
【非特許文献３】Biochem．J．（バイオケミカル・ジャーナル），第３４０巻，第３８５〜３９１頁（１９９９年）
【非特許文献４】Can．J．Microbiol．（カナディアン・ジャーナル・オブ・ミクロバイオロジー），第１４４巻，第６頁（１９９８年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、工業レベルで効率良く安価に生産可能であり、十分に高い氷結晶化阻害活性を有し、安全かつ実用にかなう優れた氷結晶化阻害活性を有する氷結晶化阻害物質を提供することである。また、本発明は、当該氷結晶化阻害物質の活性部分であるポリペプチド、並びに当該氷結晶化阻害物質またはポリペプチドを含む抗体、組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった。その結果、例えば、カイワレダイコンから得られる特定の分子量を有するタンパク質が、高い氷結晶化阻害効果を有することを見出し、本願発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物由来のものであり、且つ下記（１）〜（４）の何れかのタンパク質を少なくとも一つ含有することを特徴とする。
（１）  配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１）のアミノ酸配列を有し、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が１９，０００±２００Ｄａであるタンパク質
（２）  配列番号２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２）のアミノ酸配列を有し、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が２２，０００±２５０Ｄａであるタンパク質
（３）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が５９，０００±６００Ｄａであり、且つそのＮ末端が修飾を受けているタンパク質
（４）  上記（１）〜（３）のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたタンパク質であり、且つ氷結晶化阻害活性を有するタンパク質。
【００１０】
本発明に係る氷結晶化阻害物質を含む植物は、アブラナ科、セリ科、ユリ科およびキク科に属する植物からなる群より選ばれる１以上の植物、または、これらの類縁品種もしくは改良品種がある。また、アブラナ科に属する植物としては、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、シロナ、野沢菜、広島菜、ミズナおよびマスタードからなる群より選ばれる１以上の植物、または、これらの類縁品種もしくは改良品種を挙げることができる。さらに、アブラナ科に属する植物としては、ダイコン（Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、または、これの類縁品種もしくは改良品種を、さらに、ダイコンのスプラウトであるカイワレダイコンを挙げることができる。
【００１１】
また、本発明に係る氷結晶化阻害物質として、より具体的には、アセトン分画において、アセトン濃度が３０容量％の濃度で沈殿する画分に含まれるものを挙げることができる。
【００１２】
本発明に係るポリペプチドは、上記本発明に係る氷結晶化阻害物質を解離して得られるものであり、且つ氷結晶化阻害活性を有することを特徴とする。
【００１３】
本発明に係る抗体、組成物、食品、生体試料保護剤および化粧品は、上記本発明に係る氷結晶化阻害物質および／またはポリペプチドを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、例えば、食品であるカイワレダイコンから安価かつ大量に得ることが可能であり、氷結晶化阻害活性が高い。また、本発明の氷結晶化阻害物質を食品に添加することにより、冷凍食品の品質維持などに役立てることができる。さらに、本発明の氷結晶化阻害物質は、臓器や細胞、血液（血小板）の凍結保存における低温保護剤や化粧品（皮膚の保護剤）にも有効に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物に由来するものであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量１９，０００±２００Ｄａ、２２，０００±２５０Ｄａまたは５９，０００±６００Ｄａのタンパク質のうち少なくとも１つを含む。
【００１６】
本発明において、氷結晶化阻害物質は、氷結晶の成長を阻害する機能を有する物質を広く意味するものであり、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷結晶化阻害活性の測定など公知のいずれかの方法によって氷結晶化阻害活性を示す限りにおいては、本発明に含まれる。熱ヒステリシスとは、氷結晶化阻害物質水溶液中で平衡融点以下の温度であっても氷が成長できない温度域をいい、氷が水溶液中で成長を開始する温度を凝固点と定義すれば、熱ヒステリシスは平衡融点と凝固点の差として検出される。
【００１７】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物から得ることができる。植物としては、特に限定されるものではないが、例えば、アブラナ科、セリ科、ユリ科またはキク科に属する植物が挙げられる。アブラナ科に属する植物は、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、チンゲンサイ、コマツナ、カブ、シロナ、野沢菜、広島菜、ミズナ、マスタード等が挙げられる。セリ科に属する植物はニンジン等が、ユリ科に属する植物はネギ等が、キク科に属する植物は春菊等が挙げられる。これらの植物の類縁品種および改良品種も適宜使用することができる。本発明に係る氷結晶化阻害物質は、特に限定されるものではないが、例えばダイコン種から好適に得ることができる。ダイコン種としては、特に限定されるものではないが、例えば、ダイコン、ハマダイコン、ノダイコンが例示できる。また、上記植物のスプラウト、特にダイコンのスプラウトであるカイワレダイコンを用いれば、本発明に係る氷結晶化阻害物質を効率よく得ることができる。
【００１８】
これらの植物を低温馴化するなど公知の方法によって植物中の氷結晶化阻害物質を誘導した状態で使用してもよい。低温馴化の温度としては、特に限定されるものではないが、下限温度は０℃以上が好ましく、上限温度は２０℃以下が好ましい。また低温馴化の期間としては、特に限定されるものではないが、３日間以上行うことが好ましい。
【００１９】
以下、本発明に係る氷結晶化阻害物質の性状について詳細に説明する。氷結晶化阻害物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量１９，０００±２００Ｄａ、２２，０００±２５０Ｄａまたは５９，０００±６００Ｄａのタンパク質のうち少なくとも１つを含む。
【００２０】
分子量１９，０００±２００Ｄａのタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、２２，０００±２５０Ｄａのタンパク質は、配列番号２と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、５９，０００±６００Ｄａのタンパク質は何らかのＮ末端修飾を受けている。ここでアミノ酸配列が実質的に相同であるとは、アミノ酸配列の少なくとも８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５〜１００％が重複することを意味する。
【００２１】
また、本発明に係る氷結晶化阻害物質は、上記のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたタンパク質であり、且つ氷結晶化阻害活性を有するタンパク質を含むものであってもよい。上記アミノ酸配列において、欠失、置換または付加されるアミノ酸の数としては、１以上、３以下がより好ましく、１または２がさらに好ましく、１が特に好ましい。
【００２２】
氷結晶化阻害活性を有するとは、そのタンパク質溶液において、氷の結晶化を阻害したり氷結晶形状を制御することによって、氷結晶の成長や粗大化を抑制する活性を有することをいうものとする。
【００２３】
本発明の氷結晶化阻害物質は、ｐＨ８．０の条件で、陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーにより吸着画分として得られる。また、アセトン濃度３０容量％以下で、好適に沈殿する。ここで陰イオン交換体としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＤＥＡＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）やＱ（Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ）などが挙げられる。また、アセトン沈殿の上限濃度は８０容量％以下が好ましく、６０容量％以下がさらに好ましく、４０容量％以下が極めて好ましく、３０容量％以下が最も好ましい。
【００２４】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、植物からそのまま抽出してもよいし、低温馴化などの方法により植物において氷結晶化阻害物質を誘導した後に抽出してもよい。
【００２５】
低温馴化の温度としては、とくに限定されるものではないが、下限温度は０℃以上が好ましく、上限温度は２０℃以下が好ましい。また低温馴化の期間としては、特に限定されるものではないが、３日間以上行うことが好ましい。
【００２６】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、容易に抽出、精製、回収することが可能である。
【００２７】
その抽出方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、水または有機溶媒を用いた公知の抽出法により得ることができる。
【００２８】
抽出に用いる植物の形態は、特に限定されるものではなく、種子および植物体の全体でもよく、例えば、種子、芽、葉、葉柄などの一部分でもよい。
【００２９】
氷結晶化阻害物質を抽出する溶媒は特に限定されるものではないが、水、親水性有機溶媒、超臨界二酸化炭素、亜臨界水などからなる群より選ばれる１以上の溶媒を好適に組み合わせて使用できる。
【００３０】
親水性有機溶媒としては、例えば、メタノールやエタノールなどが挙げられるが、食品加工に使用可能なものであることが好ましく、エタノールなどが例示される。
【００３１】
これらの溶媒の中でも水、エタノールが好ましい。また、水と有機溶媒を混合して用いることも可能である。
【００３２】
水を用いる場合は、加温した水、特に、熱水を用いることが好ましく、有機溶媒を用いる場合は、加温した有機溶媒を用いることが好ましい。
【００３３】
加温した水または有機溶媒の温度は特に限定されない。下限は、０℃以上が好ましく、２０℃以上がさらに好ましい。上限は、１６０℃以下が好ましく、１２０℃以下がさらに好ましい。その他、水性溶媒としては酢酸ナトリウムなどの種々の緩衝液や、アルコールと水との混合溶媒などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。抽出溶媒の種類や量は、抽出に処する植物体の種類や量などにより適宜選択することができる。
【００３４】
精製方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、逆浸透、限外濾過、精密濾過などを好適に組み合わせて用いることができる。
【００３５】
膜分離の分画分子量は、特に限定されるものではない。目的物を膜非透過物の中に回収する場合の分画分子量の下限は５，０００以上が好ましく、８，０００以上がさらに好ましく、１０，０００以上が極めて好ましく、１５，０００以上が最も好ましく、上限が１９，０００を超えない限り好適に用いることができる。
【００３６】
膜分離法では分子量の小さい成分が選択的に膜を透過し、その結果、溶液中の分子量の大きい成分の精製、濃縮が達成されるが、実際には溶液中の溶質の膜表面付近への蓄積（濃度分極）や膜表面や細孔内への吸着などにより経時的にその透過性能は低下する。
【００３７】
本発明の氷結晶化阻害物質を高分子側に回収する場合、使用する膜の分画分子量が５，０００未満では溶液中の夾雑成分の除去が不充分であり、また膜が目詰まりを起こしやすくなるため好ましくない。また、分画分子量が１９，０００を超えると分子量が約１９ｋＤａである当該氷結晶化阻害物質の精製、回収が実質的に困難となる。
【００３８】
本発明の氷結晶化阻害物質は、必要に応じて、さらに精製を行ってもよい。例えば、デカンテーション、濾過、遠心分離等を好適に組み合わせて夾雑成分を除去してもよい。また例えば、塩析や有機溶媒による沈殿や、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過等による精製、透析や限外濾過などによる濃縮を好適に組み合わせて行ってもよい。
【００３９】
さらに必要により、粉末状または顆粒状など任意の形態に固形化してもよい。固形化の方法は特に限定されないが、例えば、上記の抽出物を噴霧乾燥や凍結乾燥などの常法に従って粉末化する方法や、抽出物を賦形剤に吸着、担持させて粉末または顆粒状に固形化する方法などを挙げることができる。これらの操作は当業者に公知のものであり、用途に応じて適宜選択して用いることができる。
【００４０】
本発明に係る氷結晶化阻害物質は、水が氷結晶化することで障害が生じる様々な分野において、この障害を抑制する目的で利用可能である。例えば、食品分野、機械分野、土木分野、化粧品分野、生体試料を用いる医療分野等で利用可能である。
【００４１】
食品分野では、食品に含まれる水の氷結晶化を抑制することで、当該食品の味の劣化などを防ぐことができる。例えば、澱粉老化を防止したり、食品中の水が氷結晶化して、タンパク質や油脂成分などを物理的に圧迫し、その構造を変化させることによる味や品質などの劣化を、抑制したりすることができる。
【００４２】
機械分野、土木分野では、機械の可動部、道路、地盤などの凍結防止剤として利用できる。
【００４３】
化粧品分野では、化粧品の品質の劣化などを防ぐための添加剤として利用できる。例えば、油脂成分を含む化粧品を凍結させると、当該化粧品に含まれる水が氷結晶化して、当該油脂成分を物理的に圧迫してその構造を壊すことがあり、品質と使用感が劣化する。本発明に係る氷結晶化阻害物質を用いれば、水の氷結晶化を防ぐことで油脂成分の構造が保持されるため、品質の劣化などを抑制することができる。
【００４４】
医療分野では、生体試料を凍結保存する際の保護剤として用いることができる。例えば、細胞、血液、臓器などの組織等の生体試料を従来公知の保存液に入れて凍結保存すると、保存液中の水分が凍結して氷結晶を生じ、当該氷結晶により生体試料が損傷することがある。しかし、本発明に係る抽出物を添加すれば、氷結晶の発生や成長を抑制することができるので、生体試料を氷結晶による損傷から保護することができる。
【００４５】
本発明の氷結晶化阻害物質の形態は、その用途に応じて様々であり、そのまま、溶液、濃縮液、懸濁液、凍結乾燥物、粉末、顆粒、錠剤などであってもよい。
【００４６】
また、本発明に係る抗体は、上記氷結晶化阻害物質および／または上記ポリペプチドと特異的に反応するものであり、植物における当該氷結晶化阻害物質とポリペプチドの有無を試験したり、タンパク質混合物から当該氷結晶化阻害物質とポリペプチドを特定したりするために用いることができる。
【００４７】
本発明に係る抗体の調製は常法に従えばよい。例えば、上記氷結晶化阻害物質やポリペプチドを用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、上記氷結晶化阻害物質またはポリペプチドへ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
【００４８】
次に、本発明に係る氷結晶化阻害物質の活性測定法とタンパク質量の測定法について説明する。
【００４９】
本発明の氷結晶化阻害物質の氷結晶化阻害活性の測定方法は、植物の種類などに応じて適宜適したものを用いる。例えば、熱ヒステリシスの測定、氷結晶構造の観察、氷結晶化阻害活性の測定などの公知の方法にて行うことができ、何れかの方法で氷結晶化阻害活性の向上が認められる場合は、本発明範囲に含まれるものとする。氷結晶化阻害活性の測定は、例えば、ショ糖を３０ｗ／ｖ％含む植物抽出物溶液を−４０℃に冷却した後に−６℃まで温度を上げ、顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積を測定することにより行うことができる。氷結晶化阻害活性が強いほどこの氷結晶の平均面積は小さくなることから、この数値を指標として、植物抽出物の氷結晶化阻害活性を定量的に評価することができる。対照に比べて、氷結晶化阻害物質を添加したときに氷結晶の形成が少しでも阻害されれば、氷結晶化阻害活性を有すると判断する。
【００５０】
本発明の氷結晶化阻害物質におけるタンパク質量の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えばＬｏｗｒｙ法やビシンコニン酸（ＢＣＡ）法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ法）などの公知の方法にて行うことができる。標準タンパク質としては、特に限定されないが、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を好適に用いることができる。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００５２】
製造例１  抽出
カイワレダイコン抽出物乾燥粉末３００ｍｇをＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５ｍＭ，ｐＨ８．０）６０ｍｌに溶解し、粗抽出液とした。
【００５３】
製造例２  遠心分離
製造例１で得られた粗抽出液６０ｍｌを３００ｍｌ容ビーカーに入れ、ウォーターバス（ＥＹＥＬＡ社製）を用いて５０℃で３０分間熱処理した後、１５分間遠心分離を行った（１０，０００×ｇ）。遠心分離後の上清を回収した。
【００５４】
製造例３  アセトン分画
製造例２で得られた遠心分離後の上清５６ｍｌに−３０℃に冷やしたアセトンを少量ずつ滴下し、終濃度が３０容量％となるまで加え続けた。１５分間遠心分離を行い（１０，０００×ｇ）、沈殿物を回収した。得られた沈殿物を凍結乾燥し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５ｍＭ，ｐＨ８．０）６ｍｌに溶解した。
【００５５】
製造例４  イオン交換カラムクロマトグラフィー
製造例３で得られた濃縮液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．０）５０ｍｌでメスアップした。この溶液５０ｍｌを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥカラム（１．６×１０ｃｍ，ＧＥヘルスケア社製）にチャージし、０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配をつけて、流速５ｍｌ／ｍｉｎの条件で溶出し、吸着画分を回収した。
【００５６】
製造例５  ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
上記製造例４で得られたＤＥＡＥ非吸着の活性画分５２ｍｌの溶媒を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５ｍＭ，ｐＨ８．０）２ｍｌに置換した。この溶液をゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，ＧＥヘルスケア社製）にチャージし、流速１．３ｍｌ/ｍｉｎの条件で溶出した。その結果、２５ｋＤａ付近にピークが見られるタンパク質が得られた。
【００５７】
試験例１  タンパク質濃度と氷結晶化阻害活性の測定
製造例１〜４のそれぞれの溶液について、タンパク質濃度と氷結晶化阻害活性を測定した。
【００５８】
（１）タンパク質濃度の測定
ＢＣＡ法により行った。
【００５９】
（２）  氷結晶化阻害活性の測定
製造例１〜４のそれぞれの溶液に、３０ｗ／ｖ％の割合でショ糖を加えた。冷却調節機能が付いたステージを有する顕微鏡下で、当該溶液を−４０℃に冷却した後に−６℃まで温度を上げ、−６℃を保った状態で３０分間顕微鏡により観察した氷結晶の平均面積を測定した。対照として、３０ｗ／ｖ％ショ糖溶液を同様に測定した。結果を表１に示す。なお、表中の値は対照の氷結晶面積を１．０とした時の相対面積を示しており、この氷結晶の平均面積が小さいほど、氷結晶化阻害活性が強いことを示している。
【００６０】
【表１】
2011231089.tif 000002
【００６１】
表１より、製造例４のタンパク質あたりの活性は製造例１の活性より上昇しており、氷結晶化阻害物質が濃縮されたことは明らかである。
【００６２】
試験例２  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定
製造例４のＤＥＡＥカラムクロマトグラフィー活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２．５％ゲル，アトー社製）を用い、２０ｍＡにて９０分間電気泳動した。電気泳動後のゲルを銀染色し、タンパク質のバンドを視覚化した。ゲルの染色結果から、約１９ｋＤａ、約２２ｋＤａおよび約５９ｋＤａのタンパク質が含まれていることが確認された。
【００６３】
試験例３  アミノ酸配列の決定
試験例２で得られた精製カイワレ不凍タンパク質５０μｇを含む溶液２０μｌとサンプルバッファー（ＡＴＴＯ社製，ＥｚＡｐｐｌｙ）２０μｌ（溶量比１：１）とを混合し、９９℃で３分間熱処理を行った。１５％ポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ株式会社製，ｅ‐Ｐａｇｅｌ）にサンプルをアプライし、２０ｍＡで９０分間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。セミドライ法にてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製，イモビロンＰＳＱ）に転写し、ＣＢＢ染色を行った。染色されたスポットを切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列をエドマン法により決定した（島津製作所製，プロテインシーケンサＰＰＳＱ−３３Ａ）。得られた配列は、以下のとおりであった。
【００６４】
配列番号１（約１９ｋＤａ）：Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
配列番号２（約２２ｋＤａ）：Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ
【００６５】
一方、約５９ｋＤａのタンパク質は配列が得られなかった。これは、当該タンパク質のＮ末端が何らかの修飾を受けているためであると考えられた。
【配列表】
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