(57)【要約】【課題】正確な乾癬の診断方法及び乾癬治療剤のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】皮膚試料のクローディン−７の発現を測定することを特徴とする乾癬の判定方法及び皮膚におけるクローディン−７の発現を指標とする乾癬治療剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚試料のクローディン−７の発現を測定することを特徴とする乾癬の判定方法。
【請求項２】
クローディン−７の発現量が、皮膚の健常部に比べて高い場合に乾癬と判定する請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
皮膚におけるクローディン−７の発現を指標とする乾癬治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
皮膚試料又は動物に被験物質を投与し、当該皮膚試料又は動物の皮膚におけるクローディン−７の発現を測定し、当該クローディン−７の発現量を指標とするものである請求項３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾癬の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、皮膚が赤く盛りあがり、その上に乾燥した白い垢が厚く付着し、それがぽろぽろとはがれ落ちる症状を呈し、痒みを伴なう皮膚疾患である。好発部位としては、肘、膝、腰などであるが、それ以外にも頭、脇の下、陰部、下肢などにも見受けられる。また、皮膚炎以外にも、爪の変形や関節の痛みなどの症状が現れることもある。根本的な原因は未だ解明されておらず、素因のある人に、ストレス、感染症などの種々因子が加わって発症すると考えられている。
乾癬の治療法としては、ステロイド外用薬、ビタミンＤ3外用薬、紫外線療法の他、重症の患者にはビタミンＡの誘導体であるエトレチナートや免疫抑制剤であるシクロスポリンの投与が行なわれているが、どれも治療効果と副作用の両面を満足するものではない。
【０００３】
通常、乾癬の診断は、特徴的な発疹とその分布、経過より行うが、アトピー性皮膚炎、白癬、サルコイドーシス、表皮内癌等の炎症を伴なう皮膚疾患と症状が類似しているため、診断が困難な場合も多く、他の皮膚疾患と診断された場合には、治療法も誤ることになり、症状が悪化してしまうこともある。特に頭部、爪、関節などの乾癬は専門医でも診断が難しい時がある（非特許文献１、２、３）。
また、前記のように乾癬の原因は不明であることから、その治療剤の開発も困難である。
【０００４】
一方、上皮あるいは内皮細胞における細胞間接着部位であるタイトジャンクションには、タイトジャンクション構成タンパクが存在しており、これらタンパクの一般的な機能としては、隣接する細胞を面と面で接着させることによって細胞間隙輸送をコントロールすることなどが知られている。タイトジャンクション構成タンパクとしては、例えば、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎ）−１、クローディン−３、クローディン−４、クローディン−５、クローディン−６、クローディン−７、クローディン−１１、クローディン−１２、クローディン−１８、オクルディン（ｏｃｃｌｕｄｉｎ）、ＪＡＭ−Ａ、ＺＯ−１、ＺＯ−２、チングリン（ｃｉｎｇｕｌｉｎ）、ＭＵＰＰ−１、シンプレキン（ｓｙｍｐｌｅｋｉｎ）、ａＰＫＣ、Ｐａｒ３、Ｐａｒ６などが確認されているが（非特許文献２）、それらの発現箇所はタイトジャンクション構成タンパクの種類によって大きく異なる。
また、様々な皮膚疾患においてタイトジャンクション構成タンパクの発現量が変化することも知られており、例えば、尋常性魚鱗癬、扁平紅色苔癬においてはオクルディン、クローディン−４、ＺＯ−１の発現が亢進していること、尋常性乾癬においてはクローディン−１の発現が抑制されていることが報告されている（非特許文献４、５）。
更に、タイトジャンクション構成タンパクの１種であるクローディン−７については、食道癌由来細胞においてノックダウンするとＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）の減少と細胞増殖が導かれること（非特許文献６）、正常肺上皮細胞と比べて肺ガン細胞においてクローディン−７遺伝子の発現が増加していることから、クローディン−７が肺ガンの診断マーカーになりうること（特許文献１）などの報告もあるが、皮膚における役割及び疾患に伴った発現変化などに関する報告についてはほとんどない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ２００３／０１４８９９３９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＪＩＭ  １８巻６号.４６２−４６５、２００８
【非特許文献２】病理と臨床  ２３（７）、７２３−７２９、２００５
【非特許文献３】Ｖｉｓ Ｄｅｒｍａｔｏｌ. ４（６）、５９６−５９７、２００５
【非特許文献４】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．７２（２）２００９，２８９−９４
【非特許文献５】Ｓｋｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９（２）２００６，７１−７
【非特許文献６】Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１７０（２）２００７，７０９−２１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、正確な乾癬の診断方法及び乾癬治療剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、乾癬を生じている皮膚試料における種々のタンパク質の発現量を測定してきたところ、上記のクローディン−７が乾癬皮膚の表皮上層で強く発現しており、正常皮膚ではほとんど発現しないこと、及び当該クローディン−７の皮膚における発現を指標とすれば乾癬の正確な診断及び乾癬治療剤のスクリーニングができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、皮膚試料のクローディン−７の発現を測定することを特徴とする乾癬の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、皮膚におけるクローディン−７の発現を指標とする乾癬治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の判定方法によれば、乾癬を正確に診断可能であり、的確な治療方針が決定できる。また、本発明によれば、原因不明の乾癬治療剤がスクリーニングできるとともに、乾癬の原因究明の材料も提供可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】同一人での乾癬病変部と非病変部（健常部）におけるクローディン−７の発現を示す図である。
【図２】図１の乾癬病変部の拡大図である。
【図３】アトピー性皮膚炎病変部におけるクローディン−７の発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の判定方法に用いる皮膚試料は、乾癬が疑われる皮膚の表皮上部であればよく、皮膚剥削術、テープストリッピング、皮膚生検等の手法により採取できる。
【００１３】
皮膚試料におけるクローディン−７の発現の測定手段は、クローディン−７の発現量を測定できる方法であれば特に制限されないが、クローディン−７に特異的に結合する抗体（抗クローディン−７抗体）又はその標識物、クローディン−７のｍＲＮＡを検出するためのプライマーセット若しくはプローブ又はその標識物、免疫クロマトグラフィー等が挙げられる。クローディン−７の発現量の測定手段としては、ＥＬＩＳＡ等の免疫反応を利用する方法、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる。このうち、抗クローディン−７抗体及び／又はその標識物を用いた免疫学的測定法が簡便かつ正確であることから好ましい。
【００１４】
抗クローディン−７抗体としてはポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれも用いることができる。またその標識物としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素や、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などが挙げられる。かかる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法等の方法を挙げることができる。
【００１５】
皮膚試料中のクローディン−７の発現量が、正常皮膚における発現量に比べて高い場合には、当該皮膚は乾癬を発症していると判定できる。判定の基準としては、正常皮膚に対して定性的に陽性であれば乾癬であると判定することができる。特に、免疫学的測定法による肉眼観察が簡便な判定方法である。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法は、乾癬を生じている動物の皮膚試料又は動物自体を用いて行なうことができる。乾癬を生じている動物としては、ＳＴＡＴ３トランスジェニックマウス（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（１）：４３−９，２００５）、ヒト乾癬移植ＳＣＩＤマウス（Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ．１７（２）８５−９２，１９９８）等が挙げられる。
【００１７】
被験物質の投与は、皮膚試料の場合には、皮膚試料を被験物質含有液に浸漬する方法等により行なわれる。また、動物の場合には、経口投与、注射、皮膚局所投与等により行なわれる。更に、単回又は複数回に分けて、予防的あるいは治療的に症状を観察しながら、任意の期間投与することでもよい。
【００１８】
被験物質投与後に、前述と同様の手段により、乾癬皮膚の表皮上部のクローディン−７発現量を測定する。なお、あらかじめ被験物質投与前の乾癬皮膚のクローディン−７発現量も測定しておくのが好ましい。被験物質投与前後の皮膚のクローディン−７発現量を対比し、被験物質投与後のクローディン−７発現量が、投与前に比べて低下していれば、当該被験物質は乾癬治療剤として有用であると判定できる。
【実施例】
【００１９】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２０】
実施例１
（１）皮膚組織の入手
疾患関連皮膚組織は包括同意が得られている皮膚生検あるいは手術切除における余剰組織を用いた。正常皮膚組織は包括同意の得られたボランティアから採取されたものを用いた。
【００２１】
（２）クローディン−７発現の測定方法
４％中性ホルマリンで固定されパラフィンに包埋された皮膚組織を、ミクロトームを用いて３μｍにて薄切にした。スライドグラス上でキシレン及びアルコールを用いて脱パラフィン処理をしたのち、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて５分づつ３回洗浄した。次に内因性ペルオキシダーゼのブロッキング処理（３％Ｈ2Ｏ2）を行い、再度ＰＢＳにて５分づつ３回の洗浄を行った。引き続き、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）にてブロッキングを行い、抗クローディン−７抗体（Ａｂｃａｍ，ＵＳＡ）で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄したのち、Ｃｈｅｍ  ｍａｔｅ  ＥＮＶＩＳＩＯＮ  ｋｉｔ（ＤＡＫＯ，ＵＳＡ）を用いてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）による発色を行い、クローディン−７を可視化した。
【００２２】
（３）結果
図１及び２に示すように、同一人において乾癬の病変部では表皮上層にクローディン−７の高発現が認められたが、非病変部ではほとんど発現が認められなかった。
一方、図３に示すように、同じ皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎の病変部ではクローディン−７の発現は認められなかった。
従って、皮膚のクローディン−７の発現量を指標にすれば、乾癬の診断及び乾癬治療剤のスクリーニングが可能である。
【図１】
2011122959.tif 000002
【図２】
2011122959.tif 000003
【図３】
2011122959.tif 000004