(57)【要約】【課題】鳥インフルエンザＨ５Ｎ１型は、重度の症状、病変をもたらすだけでなく、これらの変化を特に誘発することなく、短期間で鶏を死亡させるものがある。これは、感染したウイルスの増殖だけが原因ではなく、サイトカインストームのような他の異常な動態によるものと考えられる。このような急死に対しては、ウイルスのエンベロープの生成を阻害する抗ノイラミニダーゼ薬では効果がないおそれがある。【解決手段】急死の原因はウイルス感染によって誘発されるエンドセリンが引き起こす血管収縮であることを見出し、エンドセリン受容体拮抗薬を鳥インフルエンザウイスル治療薬に含有させる。具体的にはボセンタン水和物を用いる。また、エンドセリン受容体に結合する抗体を用いることもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドセリン受容体拮抗物を含有する高病原性鳥インフルエンザ治療薬。
【請求項２】
前記エンドセリン受容体拮抗物はボセンタン水和物である請求項１に記載された高病原性鳥インフルエンザ治療薬。
【請求項３】
前記エンセドリン受容体拮抗物は抗原をエンドセリン受容体ＥＴＡとして得られる抗体であることを特徴とする請求項１に記載された高病原性鳥インフルエンザ治療薬。
【請求項４】
前記エンドセリン受容体拮抗物は、エンドセリン受容体ＥＴＡの合成ペプチドを感作させた鳥の卵から得たＩｇＹである請求項１または３に記載された高病原性鳥インフルエンザ治療薬。
【請求項５】
前記鳥がダチョウである請求項４に記載された高病原性鳥インフルエンザ治療薬。
【請求項６】
ダチョウにエンドセリン受容体ＥＴＡ合成ペプチドを免疫させる工程と、
前記ダチョウの卵から得た卵黄に５倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と前記卵黄と同量の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分間攪拌し攪拌物を得る工程と、
前記攪拌物に、１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを前記卵黄と同量加えさらに攪拌し、１２時間静置した静置物を得る工程と、
前記静置物を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収する工程と、
前記上清に最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置し、第２の静置物を得る工程と、
前記第２の静置物を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物を回収する工程と、
前記沈殿物を前記卵黄と同量のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する工程を有するダチョウ抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高病原性鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１型）感染の治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
鳥インフルエンザとは、Ａ型インフルエンザウイルスが鳥類に感染して起きる鳥類の感染症である。鳥インフルエンザウイルスは、野生の水禽類を自然宿主として存在しており、若鳥に２０％の感染が見出されることもある。
【０００３】
このインフルエンザウイルスは、水禽類の腸管で増殖し、鳥間では（水中の）糞を媒介に感染する。水禽類では感染しても宿主は発症しない。しかし、家禽類のニワトリ・ウズラ・七面鳥等に感染すると非常に高い病原性をもたらすものがあり、そのタイプを高病原性鳥インフルエンザと呼ぶ。現在、世界的に養鶏産業の脅威となっているのはこのウイルスである。
【０００４】
この種のウイルスのうち、Ｈ５Ｎ１亜型ウイルスでは家禽と接触した人間への感染、発病が報告されている。但し、感染者はヒト型とトリ型のインフルエンザウイルスに対するレセプターを有していた。従って、今のところ、一般の人に感染する危険性はきわめて低いとされている。しかし、ウイルスは一般的にＤＮＡの塩基配列を容易に変化させるため、ヒトインフルエンザウイルスと混じり合い、人間の間で感染する能力を持つウイルスが生まれることが懸念されている。
【０００５】
事実これまでに、インドネシアやベトナムなどを含めた東南アジアやエジプトにおいて鳥からヒトへの感染例が多発し、その致死率は６０％を超えている。従って、将来、高病原性鳥インフルエンザが爆発的感染（パンデミック）になりうる可能性がある。
【０００６】
ヒトの場合にインフルエンザの治療薬としては、タミフル（登録商標）（りん酸オセルタミビル）やリレンザ（登録商標）（サナミビル）が挙げられる。いずれも、ノイラミニダーゼという酵素を阻害することで、ウイルスがエンベロープを形成できなくし、感染細胞からの放出を阻害することで、ウイルスの増殖を阻害する（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３６２２９８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところで、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１にも、重度の症状、病変をもたらすものから、これらの変化を特に誘発することなく、短期間で鶏を死亡させるものがある。例えば、アジアで発生するＨ５Ｎ１型インフルエンザの例が後者にあたる。
【０００９】
この短期間での死亡（急死）は体内でのウイルス増殖だけではなく、ウイルス感染に誘発される過剰な生体反応に起因することが示唆されている。人での感染例においても、サイトカインの異常な動態が観察されており（いわゆるサイトカインストーム）、鳥インフルエンザの高い致死率の原因の一つであると報告されている。
【００１０】
インフルエンザＨ５Ｎ１がもたらす急死が、ウイルス増殖だけでなく、サイトカインストームのような異常動態が原因であるとすると、上述した抗ノイラミニダーゼによる阻害作用を目的とする薬剤では効果的な治療薬となりえないおそれが高い。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１感染による「急死」を誘発するのは、血管内皮細胞由来のペプチドであるエンドセリンによる血管収縮による虚血が原因である可能性を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
より具体的には、本発明は、エンドセリン受容体拮抗物（ボセンタン水和物）を含有する鳥インフルエンザの治療薬を提供する。
【００１３】
また、本発明はエンドセリン受容体に結合する抗体を含有する鳥インフルエンザの治療薬を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明はエンドセリン受容体拮抗物をインフルエンザ治療薬として用いるので、ウイルス感染により誘発されるエンドセリンが引き起こす血管収縮を抑制することができ、ウイルス感染による急死を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｈ５Ｎ１型インフルエンザウイルスを感染させた鶏のヒナ鳥にボセンタン水和物をりん酸緩衝液と混和させたものを注射した場合の５日までの生存率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に用いるエンドセリン受容体拮抗物としては、ボセンタン水和物が好適に用いられるが、これに限定されるものではない。ボセンタン水和物は、化学名が４−（１，１−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−Ｎ−［６−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）−５−（２−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｘｙ）−２−（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｙｌ］  ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅであり、以下の構造を有する。
【００１７】
【化１】
2011231107.tif 000002
【００１８】
ボセンタン水和物（Ｂｏｓｅｎｔａｎ  ｈｙｄｒａｔｅ）はエンドセリンのＥＴＡとＥＴＢの両受容体に非選択的に結合するエンドセリン受容体拮抗物である。両受容体を阻害することにより、ＥＴ−１の上昇に伴う種々の有害作用、特に血管収縮を抑制する。ボセンタン水和物はヒトの肺動脈性肺高血圧症の治療薬（トラクリア：登録商標）として実用化されている。
【００１９】
一方、エンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）は、血管内皮細胞由来のペプチドで、強力な血管収縮作用を有する。エンドセリンは、ブタ大動脈の血管内皮細胞培養上清から、強力な血管収縮作用を有する生理活性物質として、単離、精製、および遺伝子の同定がなされた。この物質をラットに静注すると、１時間以上も持続する強力な昇圧反応が観察された。
【００２０】
エンドセリンは２１個のアミノ酸で構成され、分子内に２個のジスルフィド結合を有する。２０３個のアミノ酸より成る前駆体がプロセッシングされることにより生成する。多くの哺乳類には、異なる遺伝子によってコードされるＥＴ−１、ＥＴ−２、そしてＥＴ−３という３種のペプチド異性体が存在する。エンドセリンは一過性の血管拡張作用と、それに引き続く持続的な血管収縮作用を有する。
【００２１】
エンドセリンの受容体はＥＴＡとＥＴＢの２種類が存在する。ＥＴＡはＥＴ−１とＥＴ−２に高い親和性が高く、ＥＴ−３に対しては低い親和性をしめす。ＥＴＢは３種のアイソペプチドに同等の親和性をしめす。血管系においてはＥＴＡは血管収縮作用、ＥＴＢは血管内皮細胞におけるＮＯの放出を介した血管拡張作用に関与しているとされているが、一部の血管ではＥＴＢ受容体も血管収縮に関与している。ボセンタンはＥＴＡとＥＴＢの両受容体に非選択的に結合する。
【００２２】
なお、エンドセリンは肺高血圧、心不全、腎不全といった病態との関連が指摘されており、そもそもボセンタンは、上記のようにエンドセリン受容拮抗薬（ＥＴＡ受容体とＥＴＢ受容体の両方を阻害する）として肺高血圧の治療薬として使用されている薬剤である。
【００２３】
また、エンセドリン受容体拮抗物としては、エンセドリン受容体であるＥＴＡと結合する抗体を用いることもできる。急死を回避するためには、エンセドリンが受容体と結合することを阻害できればよいからである。このような抗体は、ＥＴＡを抗原とする抗体の作製方法で得ることができる。
【実施例１】
【００２４】
ボセンタン水和物をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）と混和させ、鶏のヒナ鳥（ホワイトレグホン種、体重約１００ｇ）の大腿部に注射した。用量はボセンタン０ｍｇ（つまりＰＢＳのみ）、８ｍｇ、１６ｍｇである。各容量を５羽のヒナ鳥に注射した。ボセンタンの注射の２時間まえに、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のインドネシア野外株（ウイルス感染価は１０５ＴＣＩＤ５０であったもの）を鼻腔内接種した。
【００２５】
図１に示すグラフは、ウイルス接種５日後までのヒナ鳥の生存率を示している。横軸はボセンタンの注射量であり、縦軸は生存率を表す。ボセンタン非注射（０ｍｇ）では生存率が０％（すなわち死亡率１００％）であったが、ボセンタンを８ｍｇ注射したヒナ鳥は生存率が４０％であり、１６ｍｇ注射したヒナ鳥は生存率が７６％と顕著に上昇した。
【００２６】
これは、ボセンタンによりエンドセリン受容体が阻害され、ウイルス感染により誘発されるエンドセリンの血管収縮が抑制されたためであると考えられる。これによりボセンタンを含む薬剤が鳥インフルエンザの治療薬になりうることが示された。
【実施例２】
【００２７】
以下にエンドセリン受容体拮抗物として抗体を用いた場合の実施例について説明する。なお、抗体は鳥であるダチョウから得る例を示すが、他の動物を用いてもよい。抗体は以下のようにして作製した。まず、初回免疫として、フロイントの完全アジュバントに３０μｇのＥＴＡ合成ペプチドを混和し、雌のダチョウの腰部筋肉内に接種した。つぎに、追加免疫として初回免疫後、隔週毎に３回追加免疫した。この時の追加免疫は、フロイントの不完全アジュバントに３０μｇのＥＴＡ合成ペプチドを混和し、同じ雌ダチョウの腰部筋肉内に注射した。
【００２８】
上記のようにしてＥＴＡ合成ペプチドで免疫を施した雌ダチョウから得た卵から以下のようにして抗体を精製した。
【００２９】
＜抗体の精製＞
上記の雌ダチョウから得た卵の卵黄（Ｗｍｌであったとする）に５倍量のＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌ，０．５％ＮａＮ３）と卵黄と同量（Ｗｍｌ）の１０％デキストラン硫酸／ＴＢＳを加え２０分間攪拌し、攪拌物を得た。そして、その攪拌物に１ＭＣａＣｌ２／ＴＢＳを卵黄と同量（Ｗｍｌ）加え攪拌し、１２時間静置し、第１の静置物を得る。その後、第１の静置物を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を回収する。
【００３０】
次に、その上清に最終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを加え４℃で１２時間静置し、第２の静置物を得る。その後、第２の静置物を１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物を回収する。最後に、その沈殿物に、卵黄と同量（Ｗｍｌ）のＴＢＳに再懸濁し、ＴＢＳにて透析する。なお、ここで「ＴＢＳにて透析する」とは、再懸濁したものを透析膜のチューブに入れ、それをＴＢＳ中に浸漬させることで、チューブのなかに抗体のみを残すことである。
【００３１】
この過程により、９０％以上の純度のダチョウのＩｇＹ（以後「ダチョウ抗体」と呼ぶ。）の回収が可能となった。１個のダチョウ卵黄より２〜４ｇのＩｇＹが得られた。このダチョウ抗体（ＩｇＹ）はＥＬＩＳＡ（ＥＴＡ合成ペプチドを固相化し、ＨＲＰ標識抗ダチョウＩｇＹウサギＩｇＹを２次抗体とした反応系）により、２５００００倍希釈してもＥＴＡとの反応することを確認した。
【００３２】
上記のようにして得たダチョウ抗体の治療効果を以下のようにして調べた。まず、ダチョウ抗体を生理食塩水に希釈し、鶏のヒナ鳥（ホワイトレグホン種、体重１００ｇ）の大腿部に注射した。容量は１羽につき０μｇ（つまり生理食塩水のみ）、２５μｇ、５０μｇである。各容量を５羽のヒナ鳥に注射した。なお、ダチョウ抗体注射の２時間前に、高病原性鳥インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１のインドネシア野外株（ウイルス感染価は１０５ＴＣＩＤ５０であったもの）を鼻腔内接種した。
【００３３】
表１は、ウイルス接種５日後までのヒナ鳥の生存率を示している。抗体非注射（０μｇ）では生存率が０％（つまり死亡率１００％）であったが、ダチョウ抗体２５μｇおよび５０μｇ注射したヒナ鳥は生存率が１００％（つまり死亡率０％）と顕著に上昇した。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
これにより、ダチョウ抗体の注射によりエンドセリン受容体が阻害され、ウイルス感染により誘発されるエンドセリンの血管収縮が抑制され、結果としてショック死が抑制されたと考えられる。エンドセリン受容体に対するダチョウ抗体を含む薬剤はダチョウ抗体の高病原性鳥インフルエンザに対する治療薬・予防薬として応用化可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、鳥インフルエンザウイルス治療薬として利用することができる。
【図１】
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