(57)【要約】【課題】甲状腺の、悪性腫瘍の成長及び転移に関係するタンパク質および酵素、例えばセリン-ペプチダーゼ、システイン-プロテアーゼ、メタロ-プロテアーゼおよびエンドペプチダーゼ・ファミリーの新規な活性阻害剤を提供する。【解決手段】本発明は、ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン・リガンドを含むシクロパラジウム化化合物およびそれらの相似体に関する。本発明の化合物は、それらの酵素へ作用およびそれらのDNA分子との相互作用によって免疫系を調節することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラジウム、シグマC-Pd結合、および以下の構造：
【化１】
2011052008.tif 000013
［式中、
− Xは以下の群：
ハロゲン（Cl、F、Br、I）；
擬ハロゲン（N3、NCO、NCS、SCN）；または
アセテート（H3C-COO-）；
から選ばれる元素を表し；そして
− Yは周期表のVまたはVI族の元素、例えばN、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Teを表し；
− Cはパラジウム原子に共有結合した、sp2またはsp3混成炭素原子を表し；C、YおよびDを含む環は3〜8個の原子で構成されることができ；
− 曲線で表されるCとYの間には、パラジウム原子を含む、3〜8個の原子で構成される、シクロパラジウム環と称する原子の連続があり；典型的には、他を排除することなく、この原子は炭素、窒素、酸素または硫黄から選ばれ；もう一方で、この環を構成するこれら原子の各々は、鎖式または環式の環外可変構造を形成する他の原子または基と結合するが、これに関して出願人は特段の制限をもたない；
− Lは、下記のスキーム（2）｛式中、略図L-Lは、このビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物の構造内の2個のリンカーLの存在を表し、一方、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は個別に以下のラジカル：水素（H）、アルキル、アリール、ジエニル、アルコキシ、シロキシ、ヒドロキシ（OH）、アミノ（-NH2）、イミド、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、イミノ、ニトロ（-NO2）を表し、これらは任意の順序で存在できる。｝に詳細を示したビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物内部にある周期表のV族由来の供与原子（N、P、As、Sb、Bi）である配位リガンドを表す。] に相当する化学式によって表される有機環を起源とする配位結合Y→Pdを含む有機金属化合物であるシクロパラジウム化化合物、
【化２】
2011052008.tif 000014
または医薬として許容されるその塩もしくはその付加化合物の1つ。
【請求項２】
パラジウム、シグマC-Pd結合、および以下の構造：
【化３】
2011052008.tif 000015
［式中、
− Xは以下の群：
ハロゲン（Cl、F、Br、I）；
擬ハロゲン（N3、NCO、NCS、SCN）；または
アセテート（H3C-COO-）；
から選ばれる元素を表し；そして
− Yは周期表のVまたはVI族の元素、例えばN、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Teを表し；
− Cはパラジウム原子に共有結合した、sp2またはsp3混成炭素原子を表し；C、YおよびDを含む環は3〜8個の原子で構成されることができ；
− 曲線で表されるCとYの間には、パラジウム原子を含む、3〜8個の原子で構成される、シクロパラジウム環と称する原子の連続があり；典型的には、他を排除することなく、この原子は炭素、窒素、酸素または硫黄から選ばれ；もう一方で、この環を構成するこれら原子の各々は、鎖式または環式の環外可変構造を形成する他の原子または基と結合するが、これに関して出願人は特段の制限をもたない；
− Lは、下記のスキーム（2）｛式中、略図L-Lは、このビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物の構造内の2個のリンカーLの存在を表し、一方、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は個別に以下のラジカル：水素（H）、アルキル、アリール、ジエニル、アルコキシ、シロキシ、ヒドロキシ（OH）、アミノ（-NH2）、イミド、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、イミノ、ニトロ（-NO2）を表し、これらは任意の順序で存在できる。｝に詳細を示したビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物内部にある周期表のV族由来の供与原子（N、P、As、Sb、Bi）である配位リガンドを表す。] に相当する化学式によって表される有機環を起源とする配位結合Y→Pdを含む有機金属化合物であるシクロパラジウム化化合物、
【化４】
2011052008.tif 000016
または医薬として許容されるその塩もしくはその付加化合物の1つ。
【請求項３】
3．  パラジウム、シグマC-Pd結合、および以下の構造：
【化５】
2011052008.tif 000017
［式中、
− Xは以下の群：
ハロゲン（Cl、F、Br、I）；
擬ハロゲン（N3、NCO、NCS、SCN）；または
アセテート（H3C-COO-）；
から選ばれる元素を表し；そして
− Yは周期表のVまたはVI族の元素、例えばN、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Teを表し；
− Cはパラジウム原子に共有結合した、sp2またはsp3混成炭素原子を表し；C、YおよびDを含む環は3〜8個の原子で構成されることができ；
− 曲線で表されるCとYの間には、パラジウム原子を含む、3〜8個の原子で構成される、シクロパラジウム環と称する原子の連続があり；典型的には、他を排除することなく、この原子は炭素、窒素、酸素または硫黄から選ばれ；もう一方で、この環を構成するこれら原子の各々は、鎖式または環式の環外可変構造を形成する他の原子または基と結合するが、これに関して出願人は特段の制限をもたない；
− Lは、下記のスキーム（2）｛式中、略図L-Lは、このビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物の構造内の2個のリンカーLの存在を表し、一方、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は個別に以下のラジカル：水素（H）、アルキル、アリール、ジエニル、アルコキシ、シロキシ、ヒドロキシ（OH）、アミノ（-NH2）、イミド、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、イミノ、ニトロ（-NO2）を表し、これらは任意の順序で存在できる。｝に詳細を示したビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物内部にある周期表のV族由来の供与原子（N、P、As、Sb、Bi）である配位リガンドを表す。] に相当する化学式によって表される有機環を起源とする配位結合Y→Pdを含む有機金属化合物であるシクロパラジウム化化合物、
【化６】
2011052008.tif 000018
または医薬として許容されるその塩もしくはその付加化合物の1つ。
【請求項４】
N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa）、およびN,N-ジメチル-ベンジルアミン誘導体、アルキン・ピリジニル-フェニル-エチンもしくは1-フェニル-3-N,N-ジメチルアミン-プロピンから成る群から選ばれる、請求項1〜3のいずれか1項に記載のシクロパラジウム化化合物、または医薬として許容されるその塩もしくはその付加化合物の一つ。
【請求項５】
N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa）である、請求項4に記載のシクロパラジウム化化合物。
【請求項６】
障害または疾患に関係したタンパク質の活性を阻害する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項７】
前記タンパク質が酵素である、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
前記酵素が、システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼ・ファミリーの酵素を含む、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
前記システイン-プロテアーゼが、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、エンドペプチダーゼ、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、例えばカルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫、例えばプラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種の生活環にとって必須のプロテアーゼを含む、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
前記酵素が、カテプシンB、クルザイン及びインターロイキン-1β変換酵素である、請求項9に記載の化合物。
【請求項１１】
前記セリンペプチダーゼが、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル−ペプチダーゼおよびオリゴペプチダーゼB、プロリル−オリゴペプチダーゼ、ならびにカテプシンDを含む、請求項8に記載の化合物。
【請求項１２】
前記酵素がカテプシンDである、請求項11に記載の化合物。
【請求項１３】
前記メタロ-プロテアーゼが、アンギオテンシン変換酵素、コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ−プロテアーゼおよびゲナチナーゼを含む、請求項8に記載の化合物。
【請求項１４】
タンパク質および酵素に関係した障害および疾患を治療するように意図された、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記疾患が、組織崩壊により引き起こされる疾患、例えば関節炎、筋ジストロフィー、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫による骨感染、パラサイトミー、歯周病および腫瘍転移；心房性ナトリウム利尿因子の分解に関与する心疾患；炎症性疾患、例えば気管支炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、急性膵炎および癌の進行；障害、例えば記憶喪失、鬱の制御および血圧；糖尿病、トリパノソーマ症、シャーガス病、食餌障害、神経性過食症および食欲不振；アルコール中毒、サイトカインおよびサイトカイン・レセプター、例えばインターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロン-γ（INFN-γ）、IL-1アンタゴニスト・レセプター（IL-1RA）、IL-10および顆粒球-マクロファージコロニー増殖刺激因子（GM-CSF）の産生に関係する疾患、心理的ストレス、HIVウイルスによって引き起こされる感染症（AIDS）に対する闘病；多発性硬化症および自己免疫脳脊髄炎を包含するミエリン崩壊を引き起こす中枢神経系の炎症性疾患；癌腫瘍、自己免疫疾患、乳房の腫瘍、骨髄腫、アデノーマ、甲状腺腫、メラノーマ、胃腫瘍、腸腫瘍、食道腫瘍および甲状腺腫瘍を含む腫瘍、ならびに神経芽細胞腫を含む、請求項14に記載の化合物。
【請求項１６】
前記疾患が、腹水または固形腫瘍、特に乳房の腫瘍、骨髄腫、アデノーマ、甲状腺腫、胃腫瘍、腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍および神経芽細胞腫である、請求項15に記載の化合物。
【請求項１７】
幼若骨髄細胞が細胞分裂（S期）に入るのを阻害する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１８】
抗血管形成物質である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。 
【請求項１９】
抗転移性物質である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項２０】
放射線療法による治療を補完するのに有用である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項２１】
DNAと相互作用する、請求項1に記載の化合物。
【請求項２２】
免疫調節物質である、請求項1に記載の化合物。
【請求項２３】
請求項1〜22のいずれか1項に記載の化合物、または医薬として許容されるその塩もしくはその付加化合物の一つのうちの少なくとも1種類を含む組成物。
【請求項２４】
前記化合物、またはその塩もしくは付加化合物の一つ、および少なくとも1種類の医薬として許容される担体を、当該組成物の総重量の約0.001〜99%含む、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
前記化合物、またはその塩もしくは付加化合物の一つ、および少なくとも1種類の医薬として許容される担体を、当該組成物の総重量の約0.01〜70%含む、請求項23に記載の組成物。
【請求項２６】
前記化合物、またはその塩もしくは付加化合物の一つ、および少なくとも1種類の医薬として許容される担体を、当該組成物の総重量の約0.1〜40%含む、請求項23に記載の組成物。
【請求項２７】
溶剤をさらに含む、請求項23に記載の組成物。
【請求項２８】
前記溶剤がDMSOである、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
固形剤形、例えばカプセル剤、錠剤もしくは散剤、または液体剤形、例えばエリキシル剤、シロップ剤、乳濁剤、溶液、懸濁剤、混合物および注入剤で提供される、請求項23に記載の組成物。
【請求項３０】
前記製剤がスケジュール化または延長放出製剤である、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
その投与が、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹膜内、局所、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、眼内または舌下手段を含む手段、またはリポソームを供給する装置によっておこなわれる、請求項29に記載の組成物。
【請求項３２】
その投与が、注射用手段、特に腹膜内注射によっておこなわれる、請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
特に、水、生理食塩液、および/またはリン酸緩衝液pH 7.4、ならびに0.1〜30%、より特に1〜10重量%組成物のDMSO、そして必要であれば、安定化剤または保存料を含む、請求項32に記載の組成物。
【請求項３４】
約0.0001〜250 mg、より特に約0.1〜100 mgの、請求項1〜22のいずれか1項に記載の化合物、または医薬として許容されるその塩もしくは付加化合物の1つのうちの少なくとも1種類を含む、請求項23に記載の組成物。
【請求項３５】
障害または疾患に関係したタンパク質の活性を阻害する、請求項23に記載の組成物。
【請求項３６】
前記タンパク質が酵素である、請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
前記酵素が、システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼ・ファミリーの酵素を含む、請求項36に記載の組成物。
【請求項３８】
前記システイン-プロテアーゼが、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、例えばカルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫、例えばプラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種の生活環にとって必須のプロテアーゼを含む、請求項37に記載の組成物。
【請求項３９】
前記酵素が、カテプシンB、クルザイン及びインターロイキン-1β変換酵素である、請求項38に記載の組成物。
【請求項４０】
前記セリンペプチダーゼが、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル−ペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼBおよびプロリル−オリゴペプチダーゼを含む、請求項37に記載の組成物。
【請求項４１】
前記酵素がカテプシンDである、請求項37に記載の組成物。
【請求項４２】
前記メタロ-プロテアーゼが、アンギオテンシン変換酵素、コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ−プロテアーゼおよびゲナチナーゼを含む、請求項37に記載の組成物。
【請求項４３】
タンパク質および酵素に関係した障害および疾患を治療するのに有用である、請求項37に記載の組成物。
【請求項４４】
前記疾患が、組織崩壊により引き起こされる疾患、例えば関節炎、筋ジストロフィー、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫による骨感染、パラサイトミー、歯周病および腫瘍転移；心房性ナトリウム利尿因子の分解の関与する心疾患；炎症性疾患、例えば気管支炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、急性膵炎および癌の進行；障害、例えば記憶喪失、鬱の制御および血圧；糖尿病、トリパノソーマ症、シャーガス病、食餌障害、神経性過食症および食欲不振；アルコール中毒、サイトカインおよびサイトカイン・レセプター、例えばインターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロン-γ（INFN-γ）、IL-1アンタゴニスト・レセプター（IL-1RA）、IL-10および顆粒球-マクロファージコロニー増殖刺激因子（GM-CSF）の産生に関係する疾患、心理的ストレス、HIVウイルスによって引き起こされる感染症（AIDS）に対する闘病；多発性硬化症および自己免疫脳脊髄炎を包含するミエリン崩壊を引き起こす中枢神経系の炎症性疾患；癌腫瘍、自己免疫疾患、乳房の腫瘍、骨髄腫、アデノーマ、甲状腺腫、メラノーマ、胃腫瘍、腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍を含む腫瘍、ならびに神経芽細胞腫を含む、請求項43に記載の組成物。
【請求項４５】
前記疾患が、腹水または固形腫瘍、特に乳房の腫瘍、骨髄腫、アデノーマ、甲状腺腫、メラノーマ、胃腫瘍、腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍および神経芽細胞腫である、請求項44に記載の組成物。
【請求項４６】
幼若骨髄細胞が細胞分裂（S期）に入るのを阻害する、請求項23〜37のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項４７】
抗血管形成物質である、請求項23〜37のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項４８】
抗転移性物質である、請求項23〜37のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項４９】
放射線療法による治療を補完するのに有用である、請求項23〜37のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５０】
DNAと相互作用する、請求項23に記載の組成物。
【請求項５１】
免疫調節物質である、請求項23に記載の組成物。
【請求項５２】
受容者の総血液容量および約0.01〜200 μM、特に0.1〜50 μM、より特に10〜25 μMの濃度未満の活性物質を含む、請求項23〜37のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５３】
請求項1〜22のいずれか1項に記載の化合物、または医薬として許容されるその塩もしくは付加化合物の1つのうちの少なくとも1種類を含む投与単位。
【請求項５４】
請求項23〜52のいずれか1項に記載の組成物の少なくとも1種類を含む投与単位。
【請求項５５】
化合物または組成物の量が、受容者の総血液容量中、約0.01〜200 μM、特に0.1〜50 μM、より特に10〜25 μMの活性物質の濃度を得るのに十分である、請求項53または54に記載の投与単位。
【請求項５６】
固体または液体形態を含む、請求項53〜55のいずれか1項に記載の投与単位。
【請求項５７】
カプセル剤、錠剤もしくは散剤、またはエリキシル剤、シロップ剤、乳濁剤、溶液、懸濁剤、混合物もしくは注入剤にような剤形を含む、請求項56に記載の投与単位。
【請求項５８】
前記製剤がスケジュール化または延長放出製剤である、請求項53に記載の投与単位。
【請求項５９】
少なくとも1層の被覆層を含む、請求項53に記載の投与単位。
【請求項６０】
請求項1〜22のいずれか1項に記載の化合物、請求項23〜52のいずれか1項に記載の組成物、または請求項53〜59のいずれか1項に記載の投与単位の有効量の投与を含む、障害または疾患に関係したタンパク質の活性の阻害方法。 
【請求項６１】
前記タンパク質が酵素である、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
請求項1〜22のいずれか1項に記載の化合物、請求項23〜52のいずれか1項に記載の組成物、または請求項53〜59のいずれか1項に記載の投与単位の有効量の投与を含む、障害または疾患の治療方法。
【請求項６３】
タンパク質または酵素活性に関係した障害または疾患が意図される、請求項62に記載の治療方法。
【請求項６４】
前記酵素が、システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼ・ファミリーの酵素を含む、請求項60または62に記載の方法。
【請求項６５】
前記システイン-プロテアーゼが、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、例えばカルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫、例えばプラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種の生活環にとって必須のプロテアーゼを含む、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
前記酵素が、カテプシンB、クルザイン及びインターロイキン-1β変換酵素である、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
前記セリンペプチダーゼが、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル−ペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼB、およびプロリル−オリゴペプチダーゼを含む、請求項64に記載の方法。
【請求項６８】
前記酵素がカテプシンDである、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
前記メタロ-プロテアーゼが、アンギオテンシン変換酵素、コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ−プロテアーゼおよびゲナチナーゼを含む、請求項64に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患が、組織崩壊により引き起こされる疾患、例えば関節炎、筋ジストロフィー、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫による骨感染、パラサイトミー、歯周病および腫瘍転移；心房性ナトリウム利尿因子の分解の関与する心疾患；炎症性疾患、例えば気管支炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、急性膵炎および癌の進行；障害、例えば記憶喪失、鬱の制御および血圧；糖尿病、トリパノソーマ症、シャーガス病、食餌障害、神経性過食症および食欲不振；アルコール中毒、サイトカインおよびサイトカイン・レセプター、例えばインターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロン-γ（INFN-γ）、IL-1アンタゴニスト・レセプター（IL-1RA）、IL-10および顆粒球-マクロファージコロニー増殖刺激因子（GM-CSF）の産生に関係する疾患、心理的ストレス、HIVウイルスによって引き起こされる感染症（AIDS）に対する闘病；多発性硬化症および自己免疫脳脊髄炎を包含するミエリン崩壊を引き起こす中枢神経系の炎症性疾患；癌腫瘍、自己免疫疾患、乳房の腫瘍、骨髄腫、アデノーマ、甲状腺腫、メラノーマ、胃腫瘍、腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍を含む腫瘍、ならびに神経芽細胞腫を含む、請求項63に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患が、腹水または固形腫瘍、特に乳房の腫瘍、骨髄腫、アデノーマ、甲状腺腫、メラノーマ、胃腫瘍、腸腫瘍、食道腫瘍、甲状腺腫瘍および神経芽細胞腫である、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
幼若骨髄細胞が細胞分裂（S期）に入るのを阻害する、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７３】
抗血管形成物質である、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７４】
抗転移性物質である、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７５】
放射線療法による治療を補完するのに有用である、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７６】
約0.0001〜約500 mg/kg体重での、約0.0001〜100 mg/kgの特別な用量での、そしてより特に0.0001〜約30 mg/kgでの有効成分の投与を含む、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７７】
受容者の総血液容量中、約0.01〜200 μM、特に0.1〜50 μM、より特に10〜25 μMを得るのに十分な活性物質の投与を含む、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７８】
前記投与が、請求項53〜59のいずれか1項に記載の投与単位によっておこなわれる、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７９】
前記投与が、連続的、非連続的、または周期的である、請求項60〜63のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８０】
請求項1〜22のいずれか1項に記載の化合物、請求項23〜52のいずれか1項に記載の組成物、または請求項53〜59のいずれか1項に記載の投与単位の有効量の投与を含む、免疫系の調節方法。
【請求項８１】
組成物の製造のための請求項1〜22のいずれか1項に記載の化合物の使用。
【請求項８２】
タンパク質または酵素の活性を阻害するための薬品の製造のための、請求項81に記載の使用。
【請求項８３】
タンパク質または酵素の活性を阻害するための薬品の製造のための、請求項23〜52のいずれか1項に記載の組成物の使用。
【請求項８４】
前記酵素が、システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼ・ファミリーの酵素を含む、請求項81〜83のいずれか1項に記載の使用。
【請求項８５】
前記システイン-プロテアーゼが、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、エンドペプチダーゼ、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、例えばカルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫、例えばプラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種の生活環にとって必須のプロテアーゼ;カテプシンDまたはエンセファリナーゼ、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル−ペプチダーゼおよびオリゴペプチダーゼB、ならびにプロリル−オリゴペプチダーゼ；アンギオテンシン変換酵素、コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ−プロテアーゼおよびゲナチナーゼ、を含む、請求項84に記載の使用。
【請求項８６】
前記疾患が、組織崩壊により引き起こされる疾患、例えば関節炎、筋ジストロフィー、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫による骨感染、パラサイトミー、歯周病および腫瘍転移；心房性ナトリウム利尿因子の分解の関与する心疾患；炎症性疾患、例えば気管支炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、急性膵炎および癌の進行；障害、例えば記憶喪失、鬱の制御および血圧；糖尿病、トリパノソーマ症、シャーガス病、食餌障害、神経性過食症および食欲不振；アルコール中毒、サイトカインおよびサイトカイン・レセプター、例えばインターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロン-γ（INFN-γ）、IL-1アンタゴニスト・レセプター（IL-1RA）、IL-10および顆粒球-マクロファージコロニー増殖刺激因子（GM-CSF）の産生に関係する疾患、心理的ストレス、HIVウイルスによって引き起こされる感染症（AIDS）に対する闘病；多発性硬化症および自己免疫脳脊髄炎を包含するミエリン崩壊を引き起こす中枢神経系の炎症性疾患；癌腫瘍、自己免疫疾患、腹水もしくは固形腫瘍、乳房の腫瘍、骨髄腫、アデノーマ、甲状腺腫、メラノーマ、胃腫瘍、腸腫瘍、食道腫瘍および甲状腺腫瘍を含む腫瘍、ならびに神経芽細胞腫を含む、請求項83に記載の使用。
【請求項８７】
タンパク質または酵素活性に関係した障害または疾患を治療のための薬品の製造のための、請求項81または83に記載の使用。
【請求項８８】
幼若骨髄細胞が細胞分裂（S期）に入るのを阻害する、請求項81または83に記載の使用。
【請求項８９】
抗血管形成物質である、請求項81または83に記載の使用。
【請求項９０】
抗転移性物質である、請求項81または83に記載の使用。
【請求項９１】
放射線療法による治療を補完するのに有用である、請求項81または83に記載の使用。
【請求項９２】
DNAと相互作用する、請求項81または83に記載の使用。
【請求項９３】
免疫調節物質である、請求項81または83に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ペプチドならびにセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼおよびエンドペプチダーゼ・ファミリーを含む酵素（これらの多くは悪性腫瘍の成長と転移の過程に必須である）の活性なインヒビターとしてのビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン配位リガンドを含むシクロパラジウム化化合物ならびにそれらの類似体に関するものである。これらの酵素に作用しDNA分子の挿入に貢献することでこれらの化合物は免疫系を調節する。
【背景技術】
【０００２】
発明の基礎
薬学分野における無機化学の研究は、一連の病理の処置のため、その利用が伝統的医薬に優る明らかな利点を有するが故に、研究者の特別な注目を受けてきた。
【０００３】
最も良く研究された無機薬物は、広範囲の腫瘍の処置に臨床使用されてきた薬物であるシスプラチンである。その作用はDNAとの相互作用によって生じ、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害すると考えられている（Lippard, Science 218:1075-1082(1982)：Rosenberg, Nature 222:385(1969)：Cleare et al, Bioinorg. Chem. 2:187(1973))。この化合物は様々な種類の腫瘍に対する闘いに有効であり、細胞毒性が高く、それは正常細胞にも及ぶ（Ebert, U., Loffler, H., Kirch, W., Pharmacology & Therapeutics, 74:(2)207-220 1997；Spencer C. M., Goa K. L., Drugs, 50:(6)1001-1031 DEC 1995)。
【０００４】
金ベースの複合体が関節炎の処置に利用されており、その作用経路はタンパク質のチオール基への結合を含んでおり、それによってジスルフィド架橋の出現を阻害し、それらの変性を惹起できる。
【０００５】
コバルトの金属複合体もまた、抗炎症性の他に抗ウイルス、抗腫瘍および抗菌活性を示す事が既に指摘されている。
【０００６】
タンパク質の機能部位に結合しまたはそれを変化させ、その生物活性の失活をもたらし得る金属化合物が米国特許5880149号に記載されている。この文書は、システインプロテアーゼの不可逆的インヒビターとしての、そして強力な抗腫瘍薬としての、そして、システインプロテアーゼの作用経路が関わっている数多くの感染プロセスにおいて極めて有効な薬物としての、或る種のパラジウム複合体（配位化合物のクラスに属する）を開示している。一例として、アメーバ症、トリパノソーマ症およびリーシュマニア症に対する活性薬物を構成する、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびCならびにインターロイキン変換酵素（ICE）に対するパラジウム複合体の惹起する酵素阻害がある。この米国特許は、化学元素パラジウムの化合物を含む抗腫瘍薬の開発とその作用経路に関して刊行された最新の業績である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、有機環を起源とするシグマC-PD結合と配位結合Y→Pdを含む革新的パラジウム複合体（有機金属化合物のファミリーに属する）を扱うものであり、そのためこれらの化合物はシクロパラジウム化された（cyclopalladated)（シクロパラデーション）と呼称される（palladacycleとしても知られる）。
【０００８】
本発明が扱う化合物は以下のスキーム1の一般的な構造A、BまたはCで定義することができる：
【０００９】
【化１】
2011052008.tif 000002
【００１０】
［式中、
− Xは以下の群：
ハロゲン（Cl、F、Br、I）；
擬ハロゲン（N3、NCO、NCS、SCN）；または
アセテート（H3C-COO-）；
から選ばれる元素を表し；そして
− Yは周期表のVまたはVI族の元素、例えばN、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Teを表し；
− Cはパラジウム原子に共有結合した、sp2またはsp3混成を有する炭素原子を表し；C、YおよびDを含む環は3〜8個の原子で構成されることができ；
− 曲線で表されるCとYの間には、パラジウム原子を含む、3〜8個の原子で構成される、シクロパラジウム環と称する原子の連続があり；典型的には、この原子は炭素、窒素、酸素または硫黄から選ばれるが、他の態様を排除する訳ではない。他方では、この環を構成するこれら原子の各々は、他の原子または基と結合して鎖式または環式の環外可変構造を形成するが、これらに関して出願人は特段の制限をもたない；
− Lは、下記のスキーム2｛式中、略図L-Lは、このビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物の構造内の2個のリンカーLの存在を表し、一方、R1、R2、R3、R4、R5、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は個別に以下のラジカル：水素（H）、アルキル、アリール、ジエニル、アルコキシ、シロキシ、ヒドロキシ（OH）、アミノ（-NH2）、イミド、ハロゲン（F、Cl、Br、I）、イミノ、ニトロ（-NO2）を表し、これらは任意の順序で存在できる。｝に詳細を示したビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン化合物内部にある周期表のV族由来の供与原子（N、P、As、Sb、Bi）である配位リガンドを表す。]
【００１１】
【化２】
2011052008.tif 000003
【００１２】
この合成に使用するビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンリガンドの比率および溶媒の比率に応じて、単核分子化合物（構造1A、単歯シクロパラジウム化化合物）、単核イオン（構造1B、キレート化している二歯シクロパラジウム化化合物）および二核分子（構造1C、架橋した二歯シクロパラジウム化化合物）が生成され得る。構造1Aおよび1Bの化合物は、出発複合体1molに対し2molの二座リガンドL-Lの比率を用いる時に得られる。1Cに示す化合物は、1:1のモル比を用いる時に得られる。
【００１３】
この仕事において、[Pd(C2, N-(S- dmpa)(dppf)Cl］という表現は、スキーム1Aに示すような、単歯dppfリガンドを有する単核分子パラジウム複合体を示し、［Pd(C2, N-(S- dmpa)(dppf)Cl］という表現は、スキーム1Bに示すような、二歯キレート化剤として作用するdppfリンカーを有するイオン性単核パラジウム複合体を示し、そして［Pd2(C2, N-R+ dmpa)2(μ -dppf)Cl2］は、架橋二歯リンカーとして作用するdppfリンカーを含む二核分子パラジウム複合体を示す。
【００１４】
本発明の或る特定態様では、得られるシクロパラジウム化化合物は下記のスキーム3および4で示され、それぞれN,N-ジメチル-ベンジルアミン（スキーム3）ならびにアルキン・ピリジニル-フェニル-エチン（スキーム4A）および1-フェニル-3-N,N-ジメチルアミン-プロピン（スキーム4B）から誘導される。
【００１５】
【化３】
2011052008.tif 000004
【００１６】
【化４】
2011052008.tif 000005
【００１７】
本発明のさらなる具体的態様は、N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa）である。下記のスキーム5は、N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン(dmpa)-エナンチオマーR(+)およびエナンチオマーS(-）の異性体によって生成されたシクロ金属環(cyclometal ling)を表す。
【００１８】
【化５】
2011052008.tif 000006
【００１９】
単なる説明として、上記のスキーム3〜5の例示はシクロパラジウム環を示しており、これらは下記のスキーム6に説明する配置によって理解すべきである（スキーム3の構造を例に挙げる）：
【００２０】
【化６】
2011052008.tif 000007
【００２１】
この図では、シクロパラジウム環は、前記説明のように内部結合した、A1〜A5で示される5個の原子を含んでいる。即ち、
− 炭素原子（A1）は、シクマ結合によりパラジウム（A5）と結合している。
− 窒素原子（A4、一般式ではYとして包括定義される）は、共有結合供与体結合によりパラジウム（A5）と結合している。
− 原子A2は炭素であり、A1と合してシクロパラジウム環の「外部」にあるベンゼン環の一部でもある。
− 窒素原子A4はシクロパラジウム環の「外部」にある2個のエチルラジカルと結合している。
【００２２】
− 原子A3は、シクロパラジウム環の「外部」にある2個の水素原子に結合したもう一つの炭素原子である。
− パラジウム、原子A5は、ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンに結合しており、ここでR1〜R12は水素原子である。
− スキーム6の点線部分はパラジウムと共にシクロパラジウム環を形成している原子を示す。
実例を補足して、このシクロパラジウム化化合物は1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンリガンドと合して、提供できる可能性の１つとして以下に示される複合体構造を生成し得る：
【００２３】
【化７】
2011052008.tif 000008
【００２４】
本発明により得られるシクロパラジウム化化合物の大きな群、とりわけ（dmpa）で示される有機化合物N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（トリエチルアミン）のエナンチオマーR(+)およびS(-)から誘導され、その構造内に配位リガンド1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンを含む化合物は、広範囲の疾患の処置のための医薬として多くの利点を示し得る。
【００２５】
この事実は、システインプロテアーゼ（カテプシンB）およびセリンペプチダーゼ（プロリル-オリゴペプチダーゼ）ファミリーの両方に属する酵素およびタンパク質、ならびにアンギオテンシン変換酵素（ACE）およびカテプシンDを含む酵素およびタンパク質を阻害する、該化合物の能力に依るものである。シクロパラジウム化複合体によるこれらの酵素またはタンパク質のインヒビターはかつて記載されたことがなく、また、該複合体は既知の方法で合成されるものの、ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンリガンドを含む化合物は全く新規である。
【００２６】
本発明化合物の作用経路は、酵素またはタンパク質に対し主として可逆的であって、特に酵素-基質複合体に作用する。このような可逆性は、薬物として投与された時の低い細胞毒性と望ましくない副作用の低減を意味するが、医薬としてのそれらの有効性には影響しない。
【００２７】
例えばカテプシンB、プロピル-オリゴペプチダーゼファミリー、カテプシンDおよびアンギオテンシン変換酵素（ACE）が属している範囲の酵素群に対するシクロパラジウム化複合体が呈する阻害効果は、これらの化合物の免疫調節性を導く。阻害および免疫調節効果は、問題のシクロパラジウム化化合物に抗転移、抗血管形成および細胞アポトーシスへの関与の性質を付与し、それらを、薬物、特にこれらのタンパク質に関係する疾患の処置のための薬物、より具体的には充実性または腹水の悪性腫瘍（血液およびリンパ系）に対する薬物とする。
【００２８】
本発明に係るシクロパラジウム化化合物は、これまでのところ特定の化学療法が無い甲状腺癌、および神経芽腫に対する医薬となる。これは主に、シクロパラジウム化化合物と免疫系の干渉が惹起する、カテプシンDに対する阻害と骨髄細胞の防御が不可能である事に起因する。これらの特性が、放射線治療の使用を含む処置のための本明細書に記載の化合物に、望ましくない二次的効果に対する免疫学的防御作用を付与する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】カテプシンBの活性に対するシクロパラジウム化化合物の効果を示す。
【図２】それぞれCDスペクトル/DNA分子との相互作用を示す。
【図３】非処置被験動物のウォーカー腫瘍（10日間）を示す。
【図４】腫瘍（ウォーカー腫瘍）の痕跡の無い処置被験動物（10日間）を示す。
【図５】ウォーカー腫瘍（10日間）を持つ被験動物を示し、ここで右側は処置しておらず（腫瘍質量12g）、左側は局所処置をした（腫瘍質量2g）。
【図６】エールリッヒの腹水腫瘍があり、化合物［Pd(C2,N-(S- dmpa)(dppf)Cl］または［Pd(C2,N-(S- dmpa)(dppf)(N3)2］1 mg/kgで連続4日間処置（皮下）した動物の生存延長を示す。動物に腫瘍細胞（1x106細胞/ml）を接種し、被験化合物による処置を、前記処置の72時間後に開始した（p<0.05カプラン-マイヤー、Cox-Mantel）。
【図７】シクロパラジウム化化合物［Pd(C2,N-(S- dmpa)(dppf)Cl］1 mg/kgと共にインキュベートした長時間培養の上清に付着しない細胞数を示す。非付着細胞を取り除き毎週定量した（*P<0.05 ANOVA、Tukey）。
【図８】シクロパラジウム化化合物［Pd(C2,N-(S- dmpa)(dppf)Cl］1 mg/kgで処置した正常動物由来の骨髄細胞の長時間培養の上清中に得られた顆粒球/マクロファージの造血前駆細胞（CFU-GM）のコロニー数を示す。非付着細胞を毎週取り除き、CFU-GMの数を定量した（P<0.05 ANOVA、Tukey）。
【図９】シクロパラジウム化化合物［Pd(C2,N-(S- dmpa)(dppf)Cl］1 mg/kgで毎週処置した正常動物由来の骨髄細胞の長時間培養における付着細胞数を示す。培養終了時（9週目）までに付着細胞を除去した（P<0.05 - Wilcoxon）。
【図１０】様々なシクロパラジウム化化合物と共に72時間インキュベートしたHL60細胞の細胞寿命延長のパーセンテージを示す。
【図１１】様々なシクロパラジウム化化合物と共に72時間インキュベートしたK-562細胞の細胞寿命延長のパーセンテージを示す。
【図１２】シクロパラジウム化化合物［Pd(C2,N-(S- dmpa)(dppf)Cl］と共に72時間インキュベートしたHL60細胞の形態学的側面を示す。アポトーシス細胞の局面、例えば核凝縮の形成を伴う核の断片化が明瞭に観察できる（色素：ハリーのヘマトキシリン - 倍率400x）。
【図１３】シクロパラジウム化化合物の細胞毒性効果を示す。
【図１４】10 μMにおけるシクロパラジウム化化合物のインビボ抗腫瘍活性を示す。
【図１５】30 μMにおけるシクロパラジウム化化合物のインビボ抗腫瘍活性を示す。
【図１６】シクロ金属環として官能基化したアルキンを含む、薬物1に類似の化合物のインビボ抗腫瘍活性を示す。
【００３０】
システイン-プロテアーゼに対する阻害効果
カテプシンB
システイン-プロテアーゼは活性部位にチオール基（-SH）を有する酵素のファミリーを構成する。これらは、既知の経路により、特定のシステインと活性部位のヒスチジンの間の共同相互作用によりアミド結合を開裂することができる（米国特許5880149）。これらのタンパク質は、4またはそれ以上のスーパーファミリーを有する細菌、ウイルス、真核微生物、植物および動物に見出されている。本発明に係るシクロパラジウム化化合物によるカテプシンB酵素の阻害は、これらの化合物により示される抗腫瘍活性の主たる原因として最初に指摘された。しかしながら、本発明化合物の活性はこのシステイン-プロテアーゼに限定されず、医薬としてのその用途は癌に対する闘いに限定すべきではない。
【００３１】
本明細書に記載のシクロパラジウム化化合物は、システイン-プロテアーゼ：カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、例えばカルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫の生活環にとって必須のプロテアーゼ、例えばプラスモジウム（Plasmodium）、エンタモエバス（Entamoebas）、オンコセラス（Onchoceras）、レイスマニアス（Leishmanias）、ハエモンクス（Haemonchus）、ジクチオステリウム（Dictyostelium）、テリレリウム（Therilerium）、スキストソマ（Schistosoma）およびトリパノソマ（Tripanosoma）種（T.クルザイ（T. cruzi）。この酵素はクルザインまたはクルジパインとしても知られる）由来のプロテアーゼ、の活性インヒビターである。これらの化合物によって阻害され得るシステイン-プロテアーゼの完全なリストは、Rawlings et al（J. Biochem. 290:205-218, 1993）およびSajid M. et al（Molecular and Biochem. Parasitology, 120:(1)1-21, 2002）に記載されている。
【００３２】
故に、医薬としてのシクロパラジウム化化合物の用途は広範なスペクトルを含む。特に、カテプシンB、L、S、クルザインおよびインターロイキン-1β変換酵素（これらはリソソームのプロテアーゼである）のインヒビターとしてのその作用は、組織分解により惹起される数々の疾患プロセス、即ち、特に関節炎、筋ジストロフィー、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫による骨感染症、歯周病および腫瘍転移を含む群に関係している。
【００３３】
Schotte et al.はJBCのための論文において（Vol.276, no24, Issue of June 15, pp.21153-21157, 2001）、カテプシンBインヒビターがインターロイキン-1α、インターロイキン-1βおよび腫瘍壊死因子の産生を転写レベルで妨げる事、そしてそれは遺伝子発現がもたらす核因子kB（NF-kB）のトランス活性化能の阻害に関係する事を証明している。故に、カテプシンBおよびNF-kBに対して阻害活性を示すシクロパラジウム化化合物は、気管支炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、急性膵炎および癌の進行といった数多くの炎症性疾患のための活性な医薬を構成する。
【００３４】
セリンペプチダーゼに対する阻害効果
プロリル-オリゴペプチダーゼ
プロリル-オリゴペプチダーゼは30以上の残基を有するペプチドを加水分解できないセリンペプチダーゼの群に属する酵素の1ファミリーを構成する。この群は、基本型のプロリル-オリゴペプチダーゼの他にジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル-ペプチダーゼおよびオリゴペプチダーゼBを含む。最近決定されたプロリル-オリゴペプチダーゼの結晶構造（80kDa）は、この酵素が、折り畳まれたα/βヒドロラーゼを伴うペプチダーゼ領域を有し、その触媒性三つ組が、大ペプチドのフィルターとして作用する領域である、稀な7枚のβ折り畳み構造を持つ中央トンネルで構成されている事を示している。プロリル-オリゴペプチダーゼは記憶喪失、鬱病および血圧の制御といった数多くの障害に関わっており、また小胞体およびミトコンドリアの膜を介したタンパク質輸送のための重要なシャペロンとしても作用していることから、このファミリーの酵素の阻害は新薬開発の重要な源である（Sharova, E. I.；Russian Journal of Plant Physiology, 49(2), 255, 2002）。
【００３５】
ジペプチジル-ペプチダーゼIVは糖尿病に関わっており、オリゴペプチダーゼ-Bはトリパノソーマ症に関わっている - Polgar L., Cellular and Molecular Life Sciences, 59(2), 349-62, 2002およびFolop, V. et al, Cell, 94(2), 161-70, 1998。さらに、Maes, M. et al（Psychoneuroendocrinology, 26(1), 17-26, 2001）は、この酵素が食餌障害、神経性過食症および食欲不振に関与していることを証明している。サイトカインおよびサイトカインレセプター、例えばインターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（INF-α）、インターフェロン-γ（INFN-γ）、IL-1アンタゴニスト・レセプター（IL-1RA）、IL-10および顆粒球-マクロファージコロニー増殖刺激因子（GM-CSF）である。故に、アルコール中毒におけるプロリル-エンドペプチダーゼ（PEP）とジペプチジル-ペプチダーゼIV（DPP IV）の作用もまた証明されており、また、PEPおよびDPP IVの濃度の低下は、これら因子の産生を増大させる（Maes, M. et al, Alcohol. 17(1), 1-6, 1999）。Maes, M.および貢献者（Psychoneuroendocrinology, 23(5), 485-495, 1998）によれば、ヒト有機体におけるこれらの酵素の高い活性は、心理学的ストレスにも関係している。
【００３６】
DPP IV（CD26、EC3.4.14.5としても知られる）は、細胞接着、細胞外マトリックスを介した細胞輸送、およびT細胞の活性化中の潜在的共同刺激物質を包含する複数の特徴を有する糖タンパク質レセプターである。これはエキソペプチダーゼであるため、ホルモン性ペプチドの代謝のための重要調節因子となる。この酵素の選択的インヒビターは、とりわけII型糖尿病の処置に適応を有し、その場合この酵素は、Hildebrandtおよび貢献者（Clinical Science, 99(2), 93-104, 2000）が記載したように、複雑な調節サイクルに参加している。
【００３７】
総説は、DPP IVの性質とそのインヒビターの治療上の可能性を示しており（Augustyns, K.; Bal, G.; Thonus, G.; Belyaev, A. et al. Current Medicinal Chemistry, 6(4), 311-327, 1999）、白血球CD26の抗原としてのその特徴と、新基質グルカゴンケモカインに対するその作用を証明している。この論文はさらに、HIVウイルスの惹起する感染症（AIDS）に対するそのインヒビターの治療上の可能性、および、免疫系との相関を論じている。
【００３８】
これに対し、Joyeauおよび貢献者は、特定のプロリル-オリゴペプチダーゼTc80がTripanosoma cruziの代謝に必須であり、そのインヒビターがシャーガス病に対する潜在的医薬であることを証明した（European Journal of Medicinal Chemistry, 35(2), 257-266, 2000）。
【００３９】
オリゴペプチダーゼBは、グラム陰性菌およびトリパノソーマ類において発見されたセリンペプチダーゼの新ファミリーの一員である（Juhasz, T.; Szeltner, Z.; Renner, V.; Polgar, L., Biochemistry, 4(12), 4096-4106, 2002）。Tripanosoma bruceiは、Tripanosoma africaneの感染中に宿主が血流に放出するセリン-オリゴペプチダーゼ（OP-Tb）を含んでいる（Morty, R. E.; Lonsdale-Eccles, J.D.; Morehead, J. et al, Journal of Biological Chemistry, 274(37), 26149-156, 1999）。
【００４０】
さらに中性エンドペプチダーゼはアンギオテンシンIIの調節性の原因であり（Maric, C.; Walther, T., FASEB JOURNAL, 16(4), A93, Part 1, 2002）、ACEについて記載されている性質へのこれらの関与、および免疫調節との関係もまた明らかにされつつある（Inguimbert, N. et al.; Journal of Medicinal Chemistry, 45(7), 1477, 2002）。
【００４１】
カテプシンD
カテプシンDは酸性エンドペプチダーゼであって、乳癌の診断用因子として役立ち（Kraimps, J. L., Metaye, T., Millet, C., Margerit, D., Ingrand. P., Goujon, J. M., Levillain, P., Babin, P., Begon, F., Barbier, J., Surgery 1995 Dec., 118(6): 1036-40）、骨髄癌腫と甲状腺腫瘍において高濃度に発現される（Holm, R., Hoie, J., Kaalhus, O., Nesland, J. M., Virchows Arch 1995; 427(3): 289-94）。カテプシンDの活性は腫瘍細胞と正常細胞の両者に存在するが、正常細胞よりもそれぞれ癌細胞、腺腫および重篤な甲状腺疾患においてより高い（Metaye, T., Kraimps, J. L., Goujon, J. M., Fernandez, B., Quellard, N., Ingrand, P., Barbier, J., Begon, F., J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997 Oct; 82(10): 3383-8）。皮膚の癌腫（メラノーマおよび神経）では、カテプシンBとLの活性が高い。カテプシンDはメラノーマでのみ高レベルに発現される。カテプシンHの活性は損傷の浸潤可能性に逆相関する（Frohlich, E., Schlagenhauff, B., Mohrle, M., Weber, E., Klessen, C., Rassner, G., Cancer, 2001 Mar 1; 91(5): 972-82）。カテプシンD、nm23、EGFRおよびLR（免疫組織化学的に検出）は、陰性結節を持つ乳癌の転移による拡延の距離に対する潜在的マーカーであって、最初の3者の組み合わせはより有望なアプローチである（Niu, Y., Fu, X., Lv, A., Fan, Y., Wang, Y., Int. J. Cancer, 2002 Apr 10; 98(5): 754-60）。免疫組織化学的分析は、癌細胞によるカテプシンDの発現が、胃および腸の腫瘍浸潤の深さに結び付いていることを示している（Ikeguchi, M., Fukuda, K., Oka, S., Yamaguchi, K., Hisamitsu, K., Tsujitani, S., Sakatani, T., Ueda, T., Kaibara, N., Oncology 2001; 61(1): 71-8）。免疫組織化学的分析によれば、カテプシンDの発現は咽喉癌細胞におけるタンパク質p53の発現に結び付いている。カテプシンDは正常な咽喉細胞には検出されなかった。カテプシンDの高発現は、腫瘍の浸潤性成長に有意に結び付いている（Ikeguchi, M., Sakatani, T., Ueta, T., Fukuda, K., Oka, S., Hisamitsu, K., Yamaguchi, K., Tsujitani, S., Kaibara, N., J. Clin. Pathol.. 2002 Feb; 55(2): 121-6）。ラットによる検定は、カテプシンDが、乳癌中のヒトカテプシンDの発現ベクターの移動を介する腫瘍転移プロセスと直接結び付いている事を示している。当該シクロパラジウム化化合物が包含される該酵素のインヒビターは、腫瘍の転移の低下または阻害に直接影響を及ぼす（Marcel Garcia, Nadine Platet, Emmanuelle Liaudet, Valerie Laurent, Danielle Derocq, Jean-Paul Brouillet, Henri Rochefort, Stem Cells 1996; 14: 642-650）。
【００４２】
本発明に係るパラジウム化合物はカテプシンDの有効なインヒビターである。さらにこれらは、約1〜約10μgの用量において甲状腺腫瘍の有効なインヒビターである事が示されている。これらの腫瘍由来の3種類のセルライン：WRO、NPA、AROを検討したところ、本明細書に記載の化合物は、事実上化学療法による処置法の無い或る種の腫瘍に対する有効な医薬の開発に利用できる事が示された。幼若骨髄細胞が細胞分裂（S期）に入ることを阻害する、このシクロパラジウム化化合物の免疫調節作用に加わったこの事実によって、この有望な薬用化合物が、放射線治療を含み且つ白血病のような望ましくない副作用を防ぐ、甲状腺腫瘍の併用処置となる。
【００４３】
酵素インヒビターによるリソソームプロテアーゼの阻害は神経芽腫細胞の死を誘起することが証明されている（Castino, R., Pace, D., Demoz, M., Gargiulo. M., Ariatta, C., Raiteri, E., Isidoro, C., Int. J. Cancer 2002 Feb 20; 97(6): 775-9）。この局面の下で、本明細書に示すシクロパラジウム化化合物は、極めて攻撃的で既知化合物の使用の結果生ずる問題の無い、主として小児におけるこの種の癌の処置のための１つの選択肢を示すものである。
【００４４】
メタロ-プロテアーゼに対する阻害効果
アンギオテンシン変換酵素（ACE）
アンギオテンシン変換酵素は、その部位の１つに亜鉛を含むメタロ-プロテアーゼの群の一部であって、アンギオテンシンIからアンギオテンシンIIへの変換に関係している。この酵素は、領域Cおよび領域Nと称する二つの領域を持つ、即ち二つの活性中心を持っている。アンギオテンシンIIは造血系（HPC）由来の前駆細胞の増殖を誘導し、一方アンギオテンシンIはこの増殖を阻害する。他方では、ECA酵素の基質でもあるペプチド アセチル-N-Ser-Asp-Lys-Pro（AcSDKP）は造血系由来の親細胞の増殖の調節物質である。
【００４５】
文献には、免疫系の調節におけるこれらの基質（アンギオテンシンI、アンギオテンシンIIおよびペプチドAcSDKP）の影響と経路に関する数多くの報告を見出すことができ、それらは例えば以下に述べるようなものである：
− Chisi et al（Inhibitory Action of the Peptide AcSDKP …., Stem Cells 1997; 15: 455-460）は、造血細胞の増殖をインビトロで調節するための、AcSDKPと適当なACEインヒビターの組み合わせの使用を記載している。有効なACEインヒビターであるカプトプリルの存在下におけるペプチドAcDSKPの作用により、該酵素の活性部位Nに対する効果と共に、幼若細胞周期の顕著な阻害が認められる。
【００４６】
− 別の論文において、やはりChisi（Captopryl inhibits the proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells ……, Stem Cells 1999; 17: 339-344）は、高血圧を処置するために使用されるACEインヒビターのような薬物は汎血球減少を惹起し得るが、その理由はまだ分かっていないという事を開示している。研究により、カプトプリルは骨髄細胞に毒性を呈さないという事が示されたが、それはS期マクロファージの比率を低下させる。これらの結果はカプトプリルが骨髄抑制を惹起することを示している。
【００４７】
− Azizi et al（Angiotensin I - converting Enzyme ……, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2001 Dec; 28(12): 1066-9）は、AcSDKPは、ACEによりインビトロ加水分解され、該酵素の活性部位のN末端に選択的な基質であるが、ACEの活性部位のN末端によりインビボ加水分解される天然ペプチドでもあることを記載している。するとACEは、S期細胞内を循環しているこの天然インヒビターの恒久的分解により、造血を調節できる。ホスフィンペプチドRXP407（インビトロでACEのN領域に選択的なインヒビター）は血圧調節を妨害しない。
【００４８】
− Aidoudiおよび貢献者（The Tetrapeptide AcSDKP Reduces ……., Int. J. Hematol. 1998 Aug; 68(2): 145-55）は、インビトロおよびインビボ検定の両方で、低用量のシトシンアラビノシド（Ara-C）で処置したマウスにおいて、CFU-MKおよびCFU-GMの前駆細胞におけるAcSDKP防御を試験した。Ara-C処置の開始前のAcSDKP投与は、最初のAra-C注射の6日後および8日後の間にCFU-GM、CFU-MKおよびMK細胞数の成熟の顕著な増加をもたらすという事が示された。結果は、Ara-Cによる処置の間に、前駆細胞に対するAcSDKPの防御効果を示した。
【００４９】
− Rousseau-Plasse（Lisinopryi. an Angiotensin I - conterting Enzyme Inhibitor…., Exp. Hematol. 1998 Oct; 26(11); 1074-9）は、人間へのACEインヒビターの経口投与がAcSDKPの血漿中濃度を増加させた事を報告している。放射線で惹起したS期のマウス造血細胞の増殖状態におけるリシノプリルの効果がインビボで研究された。照射の1時間後のリシノプリル投与は、AcSDKPの体内血漿レベルの増加によりACEのマウス血漿活性を100%阻害した。
【００５０】
− Li et al（Production and Consumption of the Tetrapeptide AcSDKP ……, Exp. Hematol. 1997 Feb; 25(2); 140-6）は、長期骨髄細胞培養（LTMC）を利用して、AcSDKPの代謝におけるヒト細胞微小環境の役割を解析した。得られた結果は、マクロファージがAcSDKPを合成しこれを上清中に放出し；ストロマ細胞がACEによってこのペプチドを分解し；そして、細胞外マトリックスの成分およびLTMCがこのペプチドの貯蔵体として働く、という事を示した。
【００５１】
幼若骨髄細胞（幹細胞）の維持を担う骨髄ストロマ（とりわけ線維芽細胞、脂質シグナル伝達細胞および内皮細胞で形成される組織）の形成に対する該化合物の効果の評価を可能にする、長期液体培養系における本発明化合物の効果を評価する時、該化合物、特に本明細書に記載の一般的な構造AおよびBで示される配位リガンド1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンを含有する化合物への長時間暴露が、対照に比して骨髄ストロマへの付着細胞を顕著に増加させることが判明した。他方では、液体培養の上清中の非付着細胞数の低下、および、これらの培養の上清から得られる細胞コロニー（CFU-GM）数の低下が観察された。この応答標準は、カプトプリルのようなアンギオテンシン変換酵素（ACE）を阻害する薬物に観察された。上述の研究は、この薬物がACEを阻害し、骨髄ストロマ細胞によって産生され骨髄由来の多能性細胞が細胞周期に入るのを阻害するよう働くテトラペプチドAcSDKP（ACE基質）の濃度を高めるという事を示している。化学療法薬は特に細胞周期のS期（DNA合成）に働き、悪性細胞のみならず骨髄のような迅速に更新される組織由来の細胞にも到達することから、この事実は特に興味深い。このシクロパラジウム化化合物により導かれる細胞周期の一時的中断は、常套的化学療法の骨髄毒性効果に対する骨髄細胞の優れた防御に結び付いている。
【００５２】
骨髄細胞増殖（顆粒球とマクロファージ）の可逆的低下が、低い食細胞活性、およびマクロファージによるインターロイキン1の放出低下（その結果、他方では自己免疫疾患の進行にも関与しているリンパ球刺激が低下する）に結び付くことから、本発明化合物は免疫調節物質である。故に、本明細書に記載の化合物は免疫抑制剤として有用である。
【００５３】
経路
本発明化合物の作用経路は主として可逆的であり、よって低い細胞毒性と望ましくない副作用の低下がもたらされる。
【００５４】
理論的見地に拘束されることなく、酵素阻害経路は、例えば［Pd(C2,N- dmpa)(dppf)]X型のbiidentated dppfリガンドを含むイオン性シクロパラジウム化複合体で示される。まず、ビホスフィンリンカーのリン原子とイオンPd（II）の間の配位結合が、溶媒DMSOの分子の配位と同時に崩壊し、複合体［Pd(C2,N-dmpa)(dppf)(DMSO)]Xが生成する。溶液中のX-イオンが金属配位球体の外へと移動して、DMSO（またはジメチルホルムアミド、ピリジン、THF等のような他の配位溶媒）を含む同じ複合体が、分子タイプ［Pd(C2,N-dmpa)(dppf)X］のシクロパラジウム化複合体によって生成し得る。［Pd2(C2,N-dmpa)2(μ-dppf)2X2］型の架橋dpfリンカーを示すシクロパラジウム化複合体から、DMSO溶液中での安定性の欠如のため、DMSO/水溶液中での該複合体の部分的分解により、恐らくは複合体［Pd(C2,N-dmpa)(dppf)(DMSO)]Xが生成する。この事実は、DMSO溶液中の複合体の溶解の数分後にPd(0)が生成する時、より明らかとなる。複合体［Pd2(C2,N-dmpa)2(μ-dppf)2(N3)2]のニトロメタン溶液は、数滴のDMSOを添加することにより、25℃で9.3S.cm2から60S.cm2へのモル伝導率の増加を示す。
【００５５】
次の段階では、複合体［Pd(C2,N-dmpa)(dppf)(DMSO)]Xは、配位結合N-Pdの破断と新たなDMSO分子の配位により、恐らくは複合体［Pd(C2,N-dmpa)(dppf)(DMSO)2]Xを生成する。溶液中で生成したこの最後の有機金属分子が、酵素作用の最も可能性あるインヒビターである。
【００５６】
遊離dppfリガンドは酵素活性を阻害でき、他のクラスのビホスフィンリガンドにより形成された他の複合体のいずれもが酵素活性を阻害できなかった事実を考慮して、本発明者等は、この阻害現象は、dppfビホスフィンリガンドに、そしてパラジウム複合体の化学構造に極めて依存しているという結論に至った。このようにして本発明者等は、溶液中で生成した有機金属インヒビター、即ち［Pd(C2,N-dmpa)(dppf)(DMSO)]Xは、チオラート-イミダゾールイオンの対と基質の間の結合によって生成した四面体の中間体複合体との動的平衡に到達すると信ずるものである。この相互作用は、複合体中に存在する二つの金属中心（Pd、Fe）の参加と共に起こる。このモデルでは、負電荷を持つ高密度アシル基が、DMSO分子の同時置換によりイオンPd(II)と相互作用し、システイン基由来の高活性化硫黄原子に配位し、他方でこれがdppfリガンド由来の鉄原子と相互作用する。溶液中でのこれらの種の均衡が可逆的阻害経路を創成する。
【００５７】
本発明は、ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンリンカー、および、タンパク質インヒビター活性物質、特に酵素と同じリン基由来のドナー原子を含むその他の類似結合を含む、シクロパラジウム化化合物に関するものである。これらの酵素に対して作用しDNA分子に挿入されることでこれらの化合物は免疫系を調節する。
【００５８】
或る特別の態様では、本発明化合物によって活性が阻害される酵素は、セリンペプチダーゼ、システインプロテアーゼ、メタロ-プロテアーゼおよびエンドペプチダーゼのファミリーに属する。
【００５９】
より具体的な本発明の態様では、本明細書に開示する化合物によって阻害されるシステイン-プロテアーゼは、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼであるカルパインIおよびII、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、例えばカルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫の生活環にとって必須のプロテアーゼ、例えばプラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種（T.クルザイ。この酵素はクルザインまたはクルジパインとしても知られる）由来のプロテアーゼである。
【００６０】
さらに具体的な態様では、本発明化合物により阻害されるシステイン-プロテアーゼは、カテプシンB、クルジパインおよびインターロイキン-1β変換酵素である。
【００６１】
本発明のより具体的な態様では、本明細書に開示する化合物により阻害されるセリンペプチダーゼは、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル-ペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼBおよびプロリル-オリゴペプチダーゼである。
【００６２】
本発明のより具体的な態様では、本明細書に開示の化合物により阻害されるメタロ-プロテアーゼはアンギオテンシン変換酵素（ACE）である。4つのクラスのマトリックス-メタロプロテアーゼ（MMP）、即ちコラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ-プロテアーゼおよびゲナチナーゼがこれらの化合物によって阻害され得る。故に、本化合物は、多発性硬化症および自己免疫脳脊髄炎を包含するミエリン崩壊を惹起する中枢神経系の炎症性疾患の処置に有効となり得る（Cuzner, M. L., Opdenakker, G.; Journal of Neuroimmunology, 94, 1-14, 1999）。
【００６３】
別の具体的態様では、本明細書に開示の化合物により阻害されるエンドペプチダーゼはカテプシンDである。エンセファリナーゼまたはエンドペプチダーゼ24.11もまた記載化合物による阻害を受ける。故に、これらは心房性ナトリウム利尿因子（ANF）の分解を含む心疾患に適応を有する。Varin, J., Duboc, D., Weber, S., Fouchard, J., Schwartz, J. C., Muffatjoly, M., Guerin, F.; Archives Des Maladies Du Coeur Et Des Vaisseaux; 84, 1465-1471, 1991。
【００６４】
或る特別の態様では、本発明化合物によって処置できる疾患は、組織崩壊により引き起こされる疾患、例えば関節炎、筋ジストロフィー、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫による骨感染、パラサイトミー（parasitomies）、歯周病および腫瘍転移、とりわけ心房性ナトリウム利尿因子の分解を含む心疾患、炎症性疾患、例えば気管支炎、関節リウマチ、骨粗鬆症、急性膵炎および癌の進行；記憶喪失のような疾患、鬱および血圧の制御；糖尿病、トリパノソーマ症、シャーガス病、食餌障害、神経性過食症および食欲不振；アルコール中毒、サイトカインおよびサイトカイン・レセプター、例えばインターロイキン-6（IL-6）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロン-γ（INFN-γ）、IL-1アンタゴニスト・レセプター（IL-1RA）、IL-10および顆粒球-マクロファージコロニー増殖刺激因子（GM-CSF）の産生に関係する疾患、心理的ストレス、HIVウイルスの惹起する感染症（AIDS）に対する闘病；多発性硬化症および自己免疫脳脊髄炎を包含する、ミエリン崩壊を惹起する中枢神経系の炎症性疾患、を含む。さらに他方では、免疫系の調節に関係するACE阻害には、造血系由来の前駆細胞の増殖調節および幼若細胞周期の顕著な阻害；骨髄抑制の無い高血圧症が包含される。本明細書に開示のシクロパラジウム化化合物の作用は、腫瘍、例えば乳房、骨髄、腺腫、甲状腺、メラノーマ、胃、腸、咽喉癌および甲状腺腫瘍の侵襲的成長の阻害をも惹起する。甲状腺癌の場合、これらは放射線治療と共に使用すると、望ましくない副作用、例えば白血病を抑制する。これらは神経芽腫に対しても利用できる。記載のシクロパラジウム化化合物は、悪性腫瘍の処置に関して抗血管形成性および抗転移性を呈する。
【００６５】
これらの酵素に対して作用しDNA分子の挿入に参加することにより、これらの化合物は免疫系を調節し、そのようにして、主に悪性腫瘍に対する闘いにおける有効な抗腫瘍薬のみならず、組織崩壊と結び付いているその他の疾患、炎症プロセスにより惹起される疾患、および/またはウイルス、細菌または寄生虫に源を発する疾患、自己免疫疾患、糖尿病、記憶喪失、神経および食餌障害、ストレス、アルコール中毒ならびにとりわけ高血圧症における活性物質を構成する。本発明に係る薬物は、免疫調節物質および免疫抑制剤として極めて有効である事に加えて、低い細胞毒性の下で低濃度で働くことができ、特定の癌処置の症例において抗血管形成性および抗転移性を呈する。
【００６６】
合成
azida（N3）基を含む本発明に係るパラジウム複合体を、該複合体のイオンまたは分子特性およびそれらの単核または二核性に対する正確な構造特性決定のために、この基が赤外領域に「分光プローブ」を構成するよう合成した。この基は、2040-2060cm-1（非対称性伸縮）および1400-1500cm-1（対称性伸縮）の領域にIVの基準振動モードを持ち、前記属性を促進する。この複合体は抗腫瘍および酵素インヒビターとしての生物学的効果をも現すが、これらは細胞呼吸周期に影響を及ぼす望ましくない細胞毒性と副作用を示すため、医薬として使用するための最も適切な化合物とはならない。azida基を含む合成された全複合体について塩化物（Cl-）イオンを伴う類似体を取得したが、前記の二次的効果を示さず、同じように活性な薬物ともならなかった。
【００６７】
この化合物の合成は、市販の高純度試薬を使用して室温で実施し、さらなる精製は行わなかった。元素分析はIQ-USP-SP-Brazil Analytical Centerにより実施した。FT-IRスペクトルは、錠剤型KBr標本を用い4000-400cm-1の範囲でPerkin-Elmer Spectrum-One分光光度計で取得した。1Hおよび31P｛1H｝ NMRスペクトルは、各々300および81MHzで、多核分光計Bruker Avance DPX-300で取得した。プロトンNMRデータはレファランスとして0.00ppmのTMSを使用しppmで記録した。31P｛1H｝化学的置換はH3PO4に関して測定した。全てのNMR測定値はCDCl3溶媒中で取得した。この複合体に対するモル伝導率の測定は、ニトロメタン溶媒を用いて伝導率計Metrohm mod. 712で行った。出発複合体を実施例1に示す。本発明に係る個々の態様は、出発複合体の製造およびさらなる実施例で確認できる。
【００６８】
ビホスフィンリガンドを有する複合体の製造
実施例1に記載の出発複合体から、本発明の特定態様に従い、1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン（dppf）との反応により、数多くのシクロパラジウム化複合体を合成した。得られる生成物は、使用した化学量論および溶媒に依存する。1または2個の金属中心を持ち、パラジウムイオン（II）に関して単歯または二歯のビホスフィン配位リガンドを含む分子およびイオン複合体を単離した。
【００６９】
一般法
［Pd(C2,N-dmpa)(L)]X（L=二座リガンド）型のキレート化ビホスフィンリガンドを示すイオン化合物を、出発シクロパラジウム化複合体とビホスフィンリンカー（L-L）間の反応から合成した。ビホスフィンリンカーと各パラジウム複合体間のモルreason 2:1を使用した。即ち、二量体シクロパラジウム化化合物0.2mmolをエルレンマイヤー中のアセトン50mlに部分的に溶解した。次いで（L-L) 0.4mmolを得られた懸濁液に添加した。混合物を室温で1時間絶えず振盪した。最終混合物の溶媒をほぼ乾燥圧力下に蒸発させ、得られた固体をヘキサンを添加して沈殿させた。この固体を引き続きEt2Oで洗浄し、減圧乾燥した。
【００７０】
［Pd(C2,N-dmpa)(L)X］（L=一座リガンド）型のビホスフィン一座リガンドを示す分子化合物を、溶媒にジクロロメタンを使用し類似の方法で合成した。
【００７１】
［Pd2(C2,N-dmpa)2(μ-L)X2］（L=架橋ビホスフィンリンカー）型の架橋ビホスフィンリンカーを示す二核シクロパラジウム化複合体を、溶媒にジクロロメタンを使用し、モル比1:1のビホスフィンリンカーおよび各パラジウム化複合体を用いて取得した。本発明に係るこの好ましい態様は実施例2〜4に示す。
【００７２】
化合物と酵素の相互作用
カテプシンBおよびパパインはCalbiochem Co.社により供給され、活性酵素の濃度はE-64として知られるシステインプロテアーゼインヒビターを用いるtitulationによって決定した。カテプシンBとパパインは、10μM MMTSを含有する50mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）内に4℃で梱包されていた。蛍光生成基質アミドメチルクマリルZ-Phe-Arg-MCA、トリプシンおよび非可逆的パパインインヒビターE-64はSigmaにより供給された。
【００７３】
この有機金属化合物がエンドペプチダーゼカテプシンBの活性に及ぼす効果を、蛍光生成基質Z-Phe-Arg-MCAを用いる分光蛍光分析によって測定した。このペプチドはkcat/KS=4.5 105M-1.s-1を有するカテプシンBの優れた基質であり、残基PheおよびArgが各々P2およびP1に位置するよう選択した。この基質はパパインと同様、システインプロテアーゼとの主たる結合部位S2、S1およびS'1をカバーしている（Turk, D. et al, Revised definition of substrate binding sites of papain-like cysteine proteases, J. Biol. Chem.; 1998, 379, 137-147）。
【００７４】
蛍光シグナルの強度は温度自動調節分光蛍光分析Hitachi F-2000により監視した。波長は励起380nm、発光440nmに検定した。NaCl 200mM、EDTA 1mMおよびDTT 2mMを含有する50mMリン酸ナトリウム（pH6.4）の緩衝液中、37℃で5分間インキュベートすることにより、酵素の活性化を行った。同じカテプシンBの活性化緩衝液中で測定を行い、異なる濃度の有機金属化合物の存在下または不在下で、様々な基質濃度での初期加水分解速度を採用することにより、速度標準を設定した。結果をソフトウェアGraFit 3.01（Erithacus Software Ltd.）を用いる非線形回帰により解析した。
【００７５】
スキーム1の速度モデルは、カテプシンBによるZ-Phe-Arg-MCAの加水分解に対するヘパリンの効果を示す：
【００７６】
【化８】
2011052008.tif 000009
【００７７】
式中、Sは基質Z-Phe-Arg-MCAを表し；Iはシクロ金属化合物を表し；EはカテプシンBを表し；Ksは基質の解離定数を表し；KIは有機金属の見掛けの解離定数を表し；αはKsの妨害標準であり；そしてβはVmax（kcat）の妨害標準であり、これらの標準は以下の式に従う。
【００７８】
【数１】
2011052008.tif 000010
【００７９】
シクロパラジウム化複合体［Pd(C2,N-(R+dmpa)(dppf)N3］について速度論的研究を行った。図1Aに示すように、カテプシンBの反応速度試験に有機金属を存在させると、Z-Phe-Arg-MCAの加水分解についてのkcat値が低下した。これに対して図1Bは、該化合物はまた、基質Z-Phe-Arg-MCAによるカテプシンBの親和性を顕著に増大させる事を示している。エンドペプチダーゼカテプシンBの活性に対する有機金属の効果は、スキーム1に示すような阻害標準を伴う混成双曲線によって説明できる。基質加水分解系の有効性は、KS（パラメータα）またはVmax（パラメータβ）の増減によって変化し得る。式1に従い非線形回帰を用いてデータを処理し、その定数についての数値を算出した。結果は、［Pd(C2,N-(R+dmpa)(dppf)]N3が解離定数KH=12±1μMをもってカテプシンB（E）と結合しており、該化合物が解離定数αKH=2.4±0.3μMをもって酵素-基質（ES）複合体と結合している事を示す。この複合体はさらに、カテプシンBと基質Z-Phe-Arg-MCAの間の親和性に5.3倍の増大を誘発し；Ks値は有機金属化合物の存在下で110±15から21±2μMに低下し、α=0.19±0.02（図1B）、一方、［Pd(C2,N-(R+dmpa)(dppf)]N3の存在下でのKcat値もまた5.6倍低下し、β=0.18±0.02であった。シクロパラジウム化化合物は、基質Z-Phe-Arg-MCAによるカテプシンBの親和性を増大させつつ（α=0.19±0.02）、生成物の生成定数を同率で36に低下させ（β=0.18±0.02）、即ちα=βであった。カテプシンBは有機金属複合体により強く阻害された（81%阻害）にも拘わらず、有機金属複合体存在下でのその基質に対する有効性は変化せず、β/α=1.1±0.1であった。二次基質の加水分解速度は、［Pd(C2,N-(R+dmpa)(dppf)]N3の存在下でも不在下でも同じであり、kcat/KS=4.5 105 M-1.s-1であった。
カテプシンBとパパイン・スーパーファミリーに属するその他のシステインプロテアーゼは高度に保存された折り畳み構造を含んでいる（Turk, V.; Bode, W., Lysosomal cysteine proteinases and their inhibitors cystatins.  Innovations in Proteases and their inhibitors.  Aviles, F. X.(Ed.), Walter de Gruyter & Co., Berlin, Germany, 1993）。これらの酵素がペプチド基質に結合し、チオラート-イミダゾリウムのイオン対を利用してそのタンパク質分解活性を働かせる。システイン残基とヒスチジンの間のこの結び付きが、システインの活性部位に高い求核性を付与する（Michaud, S.; Gour, B. J., Cathepsin B inhibitors as potential anti-metastatic agents.  Exp. Opin. Patents., 1998, 8, 645-672）。基質のアミド結合の破壊は、中間体アシル酵素の形成を含む。ミカエリスの非共有複合体の形成の後、活性部位のチオラートがペプチド結合を攻撃してオキシアニオンを形成し、これがグルタミン残基によるいわゆる「オキシアニオンチャネル」中で安定化される。四面体中間体の崩壊は、結果としてアシル酵素を生成し、生成物を放出する。その後このアシル酵素の加水分解が触媒性イオン対を再生し、新たな生成物、即ちカルボン酸を放出する。実施例5は、本発明化合物による酵素阻害検定を示している。
【００８０】
この結果は、本発明化合物の作用に関する陳述、特に酵素-基質複合体において可逆的である事を追認している。
【００８１】
化合物とDNAの間の相互作用
（挿入）
円二色性技術による研究（図2）は、時間および薬物濃度に依存する、DNA分子中のシクロパラジウム化化合物の惹起する構造変化を示している。これは、それらがアポトーシスと細胞周期調節プロセスに関与している事を意味している。
【００８２】
抗腫瘍効果
本発明化合物を、被験動物としてのラットと、充実性、浸潤性および転移性腫瘍のモデルとしてのWalker-256乳癌、「ウォーカー腫瘍」を用いるインビボモデルで試験したところ、この化合物は大きな活性を示した。実施例6ならびに図3、4および5に実験および得られた結果を示す。
【００８３】
本発明者等は、この化合物が、腫瘍の成長を阻害する他に、症例の90%において腫瘍の成長をうまく元に戻す事に気付いた。前記のウォーカー腫瘍について、この化合物は、インビボモデルにおいて腫瘍細胞に対する選択的細胞毒性を呈し、該薬物を正常組織に適用した場合には炎症の慢性シグナルを示さなかった。もう一つの重要な作用は、培養における内皮細胞増殖に及ぼす阻害効果であって、重要な抗血管形成作用を示した。さらにこの化合物はインビボモデルにおいてカテプシンBとカテプシンDに対する大きな阻害作用を示し、骨格筋における腫瘍転移を回避する有効な抗転移剤であった。
【００８４】
いかなる処置によっても動物試験において副作用が観察されなかったという事実は強調すべきであり、よって高い薬物特異性を表す。下記の図3、4および5に、得られた結果の幾つかを示す。
【００８５】
免疫系に及ぼす効果
エールリッヒ腹水腫瘍（EAT）
本発明化合物で処置した動物の防御可能性を観察する目的で、処置したまたはしなかったエールリッヒ腹水腫瘍を持つ動物を考慮して生存延長曲線を描いた。
【００８６】
カプラン-マイヤーの生存延長曲線を用いて生存の可能性を解析した。Log-Rank法 - 非パラメータ法（Cox-Mantel）によって両群（腫瘍保持動物対腫瘍保持/処置動物）の比較を行った。様々な群の解析にANOVA変異解析を使用した。有意差があった場合にはTukey検定を適用した。二つの群の試料数が少ない場合はWilcoxonの非パラメータ検定を使用した。
【００８７】
実施例7および図6に示した試験は、本発明化合物による動物の処置はエールリッヒ腹水腫瘍を持つ動物の生存延長を増大させる結果となり、これらの薬物が腫瘍の進行を妨害する事を示した。
【００８８】
毒性
マウス骨髄由来の造血前駆体（CFU-C）のクローン培養
リガンド1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンを含有するシクロパラジウム化化合物で連続4日間処置した動物の骨髄の顆粒球およびマクロファージの造血前駆体（CFU-GM）の数を、1:2の構造（スキームC（一般的な構造）による）で評価した時（この方法は実施例8に示した）、1mg/kg未満の用量で骨髄毒性の欠如が確認できた。何故なら対照群に比して処置動物では顆粒球/マクロファージの造血前駆体（CFU-GM）の数に有意差が無く、よってこの用量未満では骨髄毒性が無い事が示された。同様の結果が同用量のインビトロ試験（正常動物細胞を当該化合物と共にインキュベート）で確認された。他方では、5mg/lより高い用量では用量依存的なCFU-GM数の減少が惹起され、骨髄に対するこの化合物の効果が用量依存的であることを示した。
【００８９】
長期持続液体培養系における骨髄ストロマの形成
長期持続液体培養系における1:2構造（スキームC（一般的な構造）による）のリガンド1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンを含有するシクロパラジウム化化合物の効果を、骨髄ストロマの形成に及ぼす該化合物の効果を評価できる実施例9に示した方法に従って評価した時、これらの細胞を該化合物に長時間暴露すると、この液体培養の上清由来の非付着細胞の数（図7）、およびこの培養の上清から得た細胞コロニー数（図8）の両者が減少する事が確認できた。他方では、対照に比してシクロパラジウム化生成物の存在下では、骨髄ストロマ由来の付着細胞数に顕著な増加があった（図9）。この応答標準は、骨髄の多能性細胞（幹細胞）が細胞周期に入るのを阻害するよう働く、アンギオテンシン変換酵素（ECA）、例えばカプトプリルを阻害する薬物で観察されている。故に、細胞周期の一時的中断は、化学療法の骨髄毒性効果に対する骨髄細胞の優れた防御に結びつき得る。
【００９０】
1:2構造（スキームC（一般的な構造）による）のリガンド1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンを含有するシクロパラジウム化化合物がECAインヒビターである事を考慮すると、長期持続液体培養系における骨髄ストロマの形成に関する結果、例えば付着細胞の増加は前駆細胞コロニーCFU-GMの減少に結び付き、それは、たとえ低濃度（1mg/kg）であってもこの薬物が幼若骨髄細胞が細胞周期に入ることを阻害できる事を示すものである。
【００９１】
これらの結果はさらに、本発明化合物が免疫調節物質である事を示しており、何故なら、骨髄細胞増殖（顆粒球とマクロファージ）の可逆的低下は、低い食細胞活性と、マクロファージによるインターロイキン-1の放出低下、そして結果としてのリンパ球刺激の低下と結びついており、それらが自己免疫疾患の進行に関与しているためである。故に本発明化合物は免疫抑制剤としても有用である。
【００９２】
この結果で証明されたもう一つの局面は、骨髄ストロマには赤血球の性質を持つコロニーが数多く存在するという事であり、この事は、細胞代謝を妨害し得る、鉄の存在によると思われる赤血球系に対する該化合物の刺激活性を示すものである。
【００９３】
急性毒性の評価
この試験に使用する本発明に係るシクロパラジウム化化合物の濃度を固定用量試験の実施により決定する。この試験では、被験物質を、統治機関による分類に従って先に定められた用量から選択した特定の用量でマウスに投与するが、最大被験濃度は2000mg/kgを超えてはならない。LD50試験ではなく固定用量試験を使用する利点は、固定用量試験では、評価された標準は必ずしも動物の死を必要とせず、したがって各実験に用いられる動物の苦痛および数を最小にできる事である（Barros & Davion, 1996）。
【００９４】
薬物の投与後、14日間の観察期間をとる。急性毒性の徴候、例えば毛、粘膜および皮膚の変化、ならびに下痢および痙攣、結膜炎、興奮または緩徐運動の発来が観察された用量を、その被験材料の等級付けまたは分類に使用する。
【００９５】
実施例10に示したプロトコールで得られた結果は、1:1または1:2の比率（構造A、BおよびC（一般的な構造）による）の、dmpa由来のエナンチオマーS(-)とリガンドdppfによって生成されたシクロパラジウム化化合物が、それぞれ500および200mg/kgまでの用量において急性毒性が無い事を示しており、この事は、低い中毒可能性と、結果として副作用の発生数がより低い事を示すものである。市場にある入手可能な薬物の全身毒性はしばしば化学療法処置の開始時に人間に死をもたらすことから、この結果は特に興味深い。
【００９６】
白血病系HL-60およびK-562におけるインビトロ細胞毒性およびプロトオンコジーンBCL-2の発現
ミトコンドリアオキシ還元系による細胞増殖と細胞毒性の両者が評価できる、MTT-テトラゾリウム（ジフェニルテトラゾリウム3-(4,5-ジメチアゾール-2-イル-2,5-ブロミド)）還元の方法による細胞毒性の評価を使用した。この方法により、テトラゾリウムが生存細胞によって還元され、Formazan塩を生成し、これを可溶化して（Mosmman, 1983）ELISAを介して560nmの吸光度を読み取る。
【００９７】
実施例11に示す実験で得られた結果から、検討した両方の系におけるシクロパラジウム化化合物の細胞毒性を証明したが、そこでは、二つの化合物で得られた結果は似通ったものであった（図10および11）。これらの系は現在市場で入手できる化学療法剤に対して大きな抵抗性を持つ細胞を示すことから、これらの薬物は抗白血病薬である事が示された。さらに、評価化合物の１つである、1:2の比率（構造A（一般的な構造）による）の、dmpa由来のエナンチオマーS(-)と配位リガンドdppfによって生成されたシクロパラジウム化化合物は、12.5μg/mlの用量で、白血病細胞HL-60のタンパク質オンコジーンbcl-2の発現を低下させる事ができ、この事は、この薬物が白血病細胞をアポトーシスプロセスに導く事を示すものである。何故ならbcl-2の高発現はスケジュール化された細胞死プロセスまたはアポトーシスの妨害によって化学療法に対する応答プロセスを妨害するためである。azidaを含む化合物で処置した細胞の形態学的局面を評価すると、壊死の特性（スライド上に崩壊した膜および細胞フラグメントの存在）を持つ多数の細胞が認められ、これはazida化合物が酸化代謝を妨害している事を示し、この事は急性毒性試験で得られた結果と合致する。他方では、シクロパラジウム化化合物で処置した白血病細胞HL60の形態学的局面は、図12に示すように、スケジュール化された細胞死のプロセスまたはアポトーシスにある細胞の形態である。
【００９８】
メラノーマで実施した生物検定
マウスメラノーマB16F10-Nex2細胞に対するシクロパラジウム化化合物の細胞毒性効果を証明するため、インビトロ生物検定を実施し、この細胞を薬物と共に24時間インキュベートした。雌性マウスC57Bl/6におけるインビボ検定もまた実施し、105の腫瘍細胞を皮下移植した。腫瘍の移植後、10μM濃度のシクロパラジウム化化合物を週に3回腹腔内に適用することにより、処置を開始した。
この結果を実施例12および図13、14、15および16に示す。
【００９９】
細胞培養で実施した検定
甲状腺腫瘍
WRO、NPAおよびARO系由来の甲状腺腫瘍細胞培養で検定を実施した。［Pd(C2,N-(S(-)dmpa)(L)X］型の分子化合物は、WRO系で0.48μg、NPA系で0.59μg、そしてARO系で0.60μgの阻害用量（IC50）を示した。化合物［Pd2(C2,N-(S(-)dmpa)2(μ-L)X2］は類似の阻害用量（IC50）を示した。dmpa由来のエナンチオマーR(+)により製造した類似のシクロパラジウム化化合物については以下の阻害用量（IC50）が得られた：WRO系で5.56μg、NPA系で6.04μg、そしてARO系で7.57μg。さらに本発明者等は、［Pd2(C2,N-(R(+)dmpa)2(μ-L)X2］型の化合物について、これらの阻害用量が著しく変化しないことを観察した。記載した結果から、R(+)エナンチオマーに関しては、阻害用量IC50はS(-)エナンチオマーで観察された用量に比して約10倍高いことが明らかとなった。この事実は、該化合物の惹起する細胞毒性プロセス由来のエナンチオ選択的依存性を示しており、dmpa由来のS(-)異性体を構造内に有する該化合物の高い有効性を示すものである。
【０１００】
記載した結果は、このような化合物を甲状腺癌腫の治療に成功裏に使用できることを示している。これらの腫瘍は、とりわけより多くのカテプシンDを発現し、これらに対して特異的且つ有効な化学療法薬は未だ得られていない。この疾患に対する本発明に係るパラジウム複合体の有効性は、証明されているように、これらの複合体が免疫系をも調節する事を考慮する時、さらに高くなる。この事は、これらの腫瘍の処置への希望を与えるという事の他に、本明細書に記載のシクロパラジウム化化合物が、放射線療法のための重要なアジュバントとして働き得、白血病、脱毛および中枢神経系細胞の破壊といった望ましくない副作用の多くを阻害するという事を意味する。
【０１０１】
本発明に係るシクロパラジウム化化合物、特にN,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa）および配位リガンド1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン（dppf）由来のR(+)およびS(-)エナンチオマーであるシクロパラジウム化化合物は、特に白血病系および幾つかのメラノーマ系における極めて顕著な抗腫瘍能力を示し、細胞を細胞アポトーシスプロセスに導くことができる。
【０１０２】
本発明化合物は低い毒性能力を示し、その結果、副作用の発生数がより低く、また、骨髄毒性がある殆どの化学療法薬とは逆に、本発明者等は該化合物に骨髄毒性徴候の無い事を証明した。結果は、これらの薬物の造血に対する用量依存的効果を示し、低用量ではシクロパラジウム化化合物は常套的化学療法薬よりも正常細胞に対する毒性が低い。
【０１０３】
長期持続液体培養系に対するこの同じ薬物の効果を評価する時、アンギオテンシン変換酵素（ACE）を阻害する薬物に観察された応答標準が証明され、そのようにして、常套的化学療法薬の骨髄毒性作用に対する骨髄細胞のより優れた防御に結び付いた、細胞周期の一時的中断が導かれた。
これらの結果はさらに、免疫調節物質および免疫抑制剤としての本発明化合物の活性を示すものである。
これらの同じ検定において、本発明者等は、多くの骨髄ストロマコロニーが赤血球系由来の特性を示す事を証明したが、それは赤血球系に対する刺激活性の可能性を示している。
【０１０４】
用量および製剤
本発明の目的のため、受容者は動物または人間、特に人間とすることができる。
本発明に係るシクロパラジウム化化合物および少なくとも一つの本発明化合物を含む組成物は、該投与に対して当分野で知られる任意の薬学上許容し得る用量を用いることにより、経口的に、注射手段により、特に腹腔内に投与することができる。或る特定の態様では、該化合物および本発明化合物を含む組成物は、注射として供給された場合に消化系による変化を受けない。
【０１０５】
活性成分は、固体剤型、例えば乾燥粉末、顆粒、錠剤もしくはカプセル剤、または液体剤型、例えばシロップまたは水懸濁液で供給できる。本発明化合物の投与はさらに、例えば経口、皮下、静脈内、鼻内、経皮、腹腔内、局所、筋肉内、肺内、腟内、直腸内、眼内または舌下手段で実施できるが、これらに限定される訳ではない。幾つかの場合、この化合物は例えばスプレーまたは溶液により、局所適用することができる。
【０１０６】
活性成分は単一の形態で投与できるが、一般には薬用担体と共に投与する。本発明の目的は、本明細書に開示した内容に従う少なくとも一つのシクロパラジウム化化合物が一部を構成する薬用組成物を含む。薬用剤型の貴重な試験がRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishingに記載されている。
【０１０７】
本発明化合物およびそれらに基づく組成物は、経口剤型、例えば錠剤、カプセル剤（これらの各々はスケジュール化または延長放出製剤を包含する）、ペレット、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、精油、懸濁剤、シロップ剤および乳濁剤で投与できる。同様に、これらはまた静脈内（混合物または注入で）、腹腔内、皮下または筋肉内投与することもでき、使用する剤型は薬学分野の専門家に周知である。主として悪性腫瘍、組織崩壊につながる疾患、炎症プロセスが惹起するおよび/またはウイルス、細菌もしくは寄生虫に起因する疾患、自己免疫疾患、糖尿病、記憶障害、神経および食餌siaoeswea、ストレス、アルコール中毒および特に高血圧症に対する闘いにおいて、所望効果を引き出す有効且つ非毒性の該化合物の量を使用して、腫瘍を回避または処置することができる。
【０１０８】
本発明化合物の用量計画は、既知の因子、例えば個々の物質の薬動力学的性質ならびにその投与方法および経路；受容者の種、年齢、性別、健康状態、医学的状態および体重；症状の性質および期間；現在行われている処置のタイプ；処置の頻度；投与経路；受容者の全身状態および所望の効果に応じて当然変わるであろう。通常の知識を有する医師または獣医師は、その状態の進行を予防し、対抗し、または停止させるのに必要な薬物の有効量を容易に決定し処方することができる。
【０１０９】
本発明化合物は、1回の日用量で有利に投与でき、または総日用量を1日に2、3、4回またはそれ以上の分割用量で投与できる。しかしながら幾つかの処置では、周期的または非周期的に、隔日適用が適切であることもある。
【０１１０】
本発明化合物は、適当な鼻内担体の局所使用により鼻内に、または、当業者に周知の経皮パッチのようなものを用いる経皮経路によって投与できる。経皮供給系として投与するためには、この投与は当然投与計画に沿って連続的となり、間欠的ではない。
【０１１１】
錠剤またはカプセル剤としての経口投与のためには、例えば活性薬物成分を薬学上許容し得る経口不活性担体、例えばラクトース、でんぷん、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトール等と合し；液体形態での経口投与のためには、経口薬物成分を任意の薬学上許容し得る経口不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と合することができる。さらに、所望または必要である場合、適当な凝着剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤もまたこの混合物に添加できる。適当な凝着剤は、でんぷん、ゼラチン、天然糖、例えばグルコースまたはβ-ラクトース、トウモロコシ甘味料、天然および合成ゴム、例えばアラビアゴム、トラガカントゴムまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ロウ等を包含する。これらの剤型に使用する潤滑剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を包含する。崩壊剤は、でんぷん、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等を包含するがこれらに限定されない。
【０１１２】
本発明化合物はさらに、リポソーム供給系、例えば小型の単層小胞、大型の単層小胞および多層小胞として投与できる。リポソームはまた、一連のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから生成できる。
【０１１３】
本発明化合物はさらに、可能性のある薬物担体として可溶性ポリマーと結合させることができる。これらのポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリ-ヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリ-ヒドロキシエチルアスパルタミドフェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド-ポリリジンを包含できる。さらに本発明化合物は、薬物の制御放出を実現するために、或るクラスの有用な生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグルコール酸、ポリ乳酸とポリグルコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリ-ヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル類、ポリアセタール類、ポリジ-ヒドロピラン類、ポリシアノアシラートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと結合させることができる。
【０１１４】
ゼラチンカプセルは活性成分と粉末担体、例えばラクトース、でんぷん、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等を含有できる。類似の希釈剤を用いて圧縮錠剤を製造できる。錠剤とカプセル剤はいずれも、数時間にわたって薬物を持続的に放出させるための遅延放出生成物の形態に製造することができる。圧縮錠剤は、望ましくない味である時それを覆い隠し、錠剤を大気から保護するために、糖または薄膜で被覆することができ、または、胃腸系における選択的崩壊のために腸溶性被覆を行うことができる。
【０１１５】
経口投与用液体剤型は、受容者に受容されるために着色料と香料を含有させることができる。一般に、水、適当な油、生理食塩水、水デキストロース（グルコース）、関係する糖溶液およびグリコール類、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール類、リン酸緩衝液は、液体剤型、非経口溶液、または腹腔内適用のための適当な担体であり、その他DMSOまたは任意の配位溶媒、水を包含する群がある。
【０１１６】
非経口投与のための溶液は特に、活性成分の可溶性塩およびDMSO、またはその他の配位溶媒、適当な安定化剤および必要ならば緩衝剤物質を含有する。単独であれ合したものであれ、抗酸化剤、例えば重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸は適切な安定化剤である。クエン酸とその塩類およびEDTAナトリウムもまた使用される。さらに、非経口溶液は、保存剤、例えば塩化ベンザルコニウム、メチルプロピルパラベンおよびクロロブタノールを含有できる。
【０１１７】
腹腔内適用のための組成物は特に、水、生理食塩水および/またはリン酸緩衝液（pH7.4）および0.1〜30%、より具体的には該組成物の1〜10%（重量）のDMSO、ならびに必要ならば安定剤または保存剤を含む。
【０１１８】
適当な薬用担体は、この分野の標準的参考文献であるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companyに記載されており、その内容を本明細書の一部とする。
【０１１９】
活性成分の日用量は約0.0001〜約500mg/kg（体重）であると予想でき、具体的な用量は約0.0001〜100mg/kg、より具体的には0.0001〜約30mg/kgである。日用量はまた、0.01〜200μM、具体的には0.1〜50μM、より具体的には10〜25μMを達成するために、投与される患者の血液体積中の最終濃度に呼応させて算出することができる。
【０１２０】
投与にとって適当な組成物の剤型は、単位あたり約0.0001〜250mg、より具体的には約0.1〜100mgの活性成分を含有する。これらの薬用組成物において、活性成分は通常、組成物の総重量に対して約0.001〜99%（重量）、具体的には約0.1〜70%、より具体的には約0.1〜40%（重量）の量で存在し、該組成物はさらに少なくとも一つの薬学上許容し得る担体をも含む。活性成分は、例えばカプセル剤、錠剤または散剤といった固体剤型で、または、エリキシル剤、シロップ剤、溶液および懸濁液といった液体剤型で経口投与できる。これは無菌液体剤型で非経口投与または腹腔内適用することもできる。
【０１２１】
本発明に係る好ましい薬用剤型は注射による投与、特に腹腔内投与のための液体組成物に相当する。注射による投与のための適当な非経口製剤は、例えば、10%（容量）のDMSOおよびリン酸緩衝液（pH7.4）中で1.5%（重量）の活性成分を振盪することによって製造できる。この溶液を、通常採用されている方法で滅菌する。
【０１２２】
活性成分の一つが腸溶被覆されている本発明に係る組み合わせ生成物の剤型は、腸溶被覆成分が或る錠剤層に圧縮され、別の活性成分は別の層に圧縮されるよう、腸溶被覆された成分と他の活性成分を混和せず、後に錠剤等に圧縮する、錠剤の形態で存在できる。所望により両層をさらに分離するため、プラセボ層が活性成分層の間に存在するように1またはそれ以上のプラセボ層を存在させることができる。さらに、本発明に係る剤型はカプセル剤の形態で存在でき、その場合、活性成分の一方を錠剤に、または幾つかの微小錠剤、粒子、顆粒または非球体に圧縮し、次いでこれらを腸溶被覆する。次にこれらの腸溶被覆された微小錠剤、粒子、顆粒または非球体を、カプセルに入れ、または、他の活性成分の顆粒と共にカプセル剤に圧縮する。
【０１２３】
本発明に係る組み合わせ生成物の成分間の接触を最小化するためのこれらのおよびその他の形態は、単一剤型で投与されるのであれ、同時に同じ方法で別の剤型で投与されるのであれ、本明細書の記載に基づくならば当業者にとっては容易に明らかとなるであろう。
【０１２４】
定義
「造血系」とは、血液細胞の形成に関係する系を意味する。
【０１２５】
「免疫系」とは、抗体を産生することにより、化学的または生物学的起源の異物に対する生体の防御を直接および/または間接的に担う、白血球により形成される生体防御細胞の系を意味する。
【０１２６】
「タンパク質インヒビター」とは、一般にタンパク質の二次および三次構造および/またはその活性部位に引き起こされる損傷により、タンパク質によるその生体機能の発揮を阻害できる物質を意味する。
【０１２７】
「選択的インヒビター」とは、膨大な数の分子（例えばタンパク質）の中で、ただ1つの特異的分子および/または類似の活性部位を持つファミリーのみを阻害できるインヒビターを意味する。
【０１２８】
「幼若細胞周期」とは、組織培養のような迅速な細胞成長の間に起こる周期的構造的および生化学的事象を意味する。この周期はG0、裂孔1（G1）、合成（S）、裂孔2（G2）および有糸分裂（M）と呼ばれる期間に分かれる。例えば顆粒球系由来の幼若細胞、骨髄単球に起こる時、これを幼若細胞周期と称する。
【０１２９】
「骨髄抑制」とは、骨髄球、即ち、通常骨髄に存在し、循環血液中には存在しない（幾つかの疾患を除いて）顆粒球系由来の幼若細胞の産生の抑制を意味する。
【０１３０】
「骨髄毒性」とは、骨髄細胞において毒性を惹起できる物質の作用を意味する。
【０１３１】
「自己免疫疾患」とは、生体の免疫系由来の防御細胞が、その生体を構成している臓器および/または組織由来の正常な自己細胞を認識しない時に引き起こされるあらゆる疾患を意味する。
【０１３２】
「免疫抑制剤」とは、免疫抑制、即ち、免疫反応発現の防止または妨害を惹起できるあらゆる物質を意味し、それは、免疫反応の欠如の結果（寛容）であり得、化学的、生物学的または物理的物質により人工的に誘発され得、または疾患により惹起され得る。
【０１３３】
「免疫調節物質」とは、細胞の環境条件の変化に応答した、免疫系由来の細胞の機能的および形態的変動を惹起できるあらゆる物質を意味する。
【０１３４】
「キレート化ビホスフィンリガンド」とは、配位結合を供与することにより同じ金属中心に結合している遊離電子対を伴う2原子のリンを含むあらゆる有機リンカーを意味する。
【０１３５】
「DNA挿入」とは、DNA分子の二重らせんを形成している一対の基底の間への化学的分子の配位を意味する。
【０１３６】
「類似リンカー」とは、全ての同種構造リンカー、即ち類似の幾何学構造を有するものを意味する。本発明においては、1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンのシクロペンタジエニル環にリン原子に代わって結合した化学元素の周期表V族由来の任意の元素であり、N、As、SbまたはBiであってよい。
「受容者血液の総体積」とは、受容者の生体に循環している血液の総体積を意味する。人間の場合、この体積は6および8リットルの間である。
【０１３７】
当業者は理解できるであろうが、上記教示に照らして本発明の数多くの修飾および変形が可能である。故に、付記した請求項の範囲内で、本発明は本明細書に具体的に記載した内容の他に、別の態様でも具体化できる事を理解すべきである。
本発明の具体的態様の単なる実例となる実施例を以下に述べるが、付記した請求項に内包した範囲を除けば、その範囲にいかなる限定も創成してはいない。
【実施例】
【０１３８】
実施例１
保存用複合体の製造
- [Pd（C2, N-dmpa）μ-Cl]2;dmpa＝N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa）のR（+）およびS（-）エナンチオマーを、Ryabov et al （Reaction paths in the cyclopalladated NN-dialkylbenzylamine-substituted styrene system in acetic acid as solvent. The structure of palladated 2-dialkylaminomethylstilbenes. J. Chem. Soc., Perkin Trans; 1983, 2, 1503-1509）および（Enantioselective cleavage of activated amino acid esters promoted by chiral palladacycles. Inorg. Chim. Acta; 1988, 280, 57-61）に従って準備した。%分析（計算値）C20H28N2Cl2Pd2）：a） R（+）: C, 40.4 （40.6）; H, 4.8 （4.7）; N, 4.8（4.4）. b） S（-）: C,40.4 （40.9）; H,4.8 （4.2）; N,4.8 （4.3）。
- [Pd（C2, N-dmpa）μ-N3]2-これらの化合物を、イオン交換反応によって[Pd （C2, N-dmpa）μ-Cl]2のR（+）およびS（-）ダイマー・エナンチオマーを製造した。THF（100 mL）中[Pd（C2, N-dmpa）μ-Cl]2（1.740 g、3.0 mmol）の溶液に、メタノール（20 mL）中NaN3溶液（0.390 g、6.00 mmol）を加えた。得られた黄色固体を、ろ過して、Et20で洗浄して、真空下で乾燥させた。トルエンからの再結晶化が微細結晶性産物を形成した。（95% R（+）；87% S（-））。%分析（計算値 C20H28N8Pd2）： a） R（+）： C, 40.6 （40.2）； H, 4.7 （4.4）； N, 18.9 （18.3）. IR: vasN32066 cm-1, vsimN3 1447 cm-1 b） S（-）: C, 40.6 （41. 1）; H, 4.7 （4.5）; N, 18.9 （18.4）. IR: vasN32058 cm-1, vsimN31443 cm-1。 
【０１３９】
実施例2
タイプ[Pd（C2, N-DMPA）（L）]X （X=CL, N3, L=二座リガンド）のキレート化ビホスフィンリガンドを示すイオン化合物
見解：これらの化合物は時々以下の説明文で現われる：Pd R（+）またはS（-） dmpa dppf 1：2（N3またはClを伴う）。
（2a） [Pd（C2, N-（R+ dmpa）（dppf）]N3
%分析（計算値）: C, 60.9 （62.1）; H, 4.8 （5.0）, N, 6.1 （6. 6）.1H-NMR （ppm）: -CH-CH3* （6H, d, 1.55）; -N（CH3）2 （3H, s, 2.16）; Cp（5H, m, 3.99） Cp （5H, m, 4.25） -CH*-CH3 （2H, q, 3.99）; H-芳香族環 35）. 31P｛1H｝-NMR （ppm）: 2シグナル: 23.0, 32.1. ΛM = 44.5S.cm2.mol-1。
【０１４０】
[Pd（C2,N-（R+ dmpa）（dppf）] CI （同様）。
（2b） [Pd（C2,N-（S- dmpa）（dppf）]N3
%分析 （計算値）: C, 61.9 （62.1）; H, 5.5 （5.0）, N, 5.9 （6. 6）. 1H-NMR （ppm）: -CH-CH3* （6H, d, 1.55）; -N（CH3）2 （3H, s, 2.16）; Cp （5H, m, 4.21） Cp （5H, m, 4.49） -CH*-CH3 （2H, q, 3.97）; H-芳香族環 （24, m, 7.25-7. 32. 31p｛1H｝-NMR （ppm） : 2 シグナル : 23.0, 32.1. ΛM = 51.1 S.cm2.mol-1。
[Pd（C2, N-（S- dmpa）（dppf）Cl （同様）。
【０１４１】
実施例3
タイプ[Pd（C2, N-DMPA）（L）]X （X=CL, N3, L=二座リガンド）のキレート化ビホスフィンリガンドを示す分子化合物
見解：これらの化合物は時々以下の説明文で現われる：Pd R（+）またはS（-） dmpa dppf 1：2（N3またはClを伴う）。
（3a） [Pd（C2,N-（R+ dmpa）dppf）N3]
%分析 （計算値）: C, 61.3 （62.1）; H, 4.9 （5.0）, N, 6.1 （6. 6）. 1H-NMR （ppm）:-CH-CH3* （6H, d, 1.55）; -N（CH3）2 （3H, s, 2.16）; Cp （5H, q, 3.99） Cp （5H, t, 4. 25） -CH*-CH3 （2H, q, 3.77）; H-芳香族環 （24, m, 7.25-7.32. 31P｛1H｝-NMR （ppm）: 2シグナル: 31.9; -16.0. ΛM = 15.5 S. cm2.mol-1。
[Pd（C2,N-｛R+ dmpa）（dppf）Cl] （同様）。
【０１４２】
（3b） [Pd（C2, N-（S-dmpa）（dppf]N3]
%分析 （計算値）: C, 61.9 （62.1）; H, 4.5 （5.0）, N, 5.9 （6.6）. 1H-NMR （ppm）:-CH-CH3* （6H, d, 1.55） ; -N （CH3） 2 （3H, s, 2.16） ; Cp （5H, q, 3.99） Cp （5H, t, 4. 25）-CH*-CH3 （2H, q, 3.77）; H-芳香族環 （24, m, 7.25-7.32）. 31P｛1H｝-NMR （ppm）: 2シグナル: 31.9; -16.0. ΛM = 13.2 S.cm2.mol-1。
[Pd（C2, N- （S- dmpa）（dppf）Cl] （同様）。
【０１４３】
実施例4
タイプ[Pd（C2, N-DMPA）2（μ-L）X2] （X=CL, N3, L=二座リガンド）のキレート化ビホスフィンリガンドを示す分子化合物
見解：これらの化合物は時々以下の説明文で現われる：Pd R（+）またはS（-） dmpa dppf 1：1（N3またはClを伴う）。
（4a） [Pd2（C2 ,N- S- dmpa）2（μ-dppf）Cl2]
%分析 （計算値）: C, 56.7 （57.1）; H, 5.2 （5.0）, N, 2.4 （2.5）. 1H-NMR （ppm）:-CH-CH3* （6H, d, 2.60）; CH-CH3* （6H, d, 2.90）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.61）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.63）; P（CH2）2-P（4H, m, 2.57-2.85）; Cp （2H, sr-br, 4.23）, Cp （2H, sr-br, 4.57）, Cp （3H, m, 4.96）, Cp （3H, m, 5. 00）, -CH*-CH3 （2H, q, 4.10） ; H-芳香族環 （24, m, 6.25-7.57. 1P｛1H｝-NMR （ppm）: 1サンプル: 32.7. ΛM = 9.3 S.cm2.mol-1。
[Pd2（C2, N- S- dmpa）2（μ-dppf）（N3）2] （同様）。
【０１４４】
（4b） [Pd2（C2, N- R+ dmpa）2（-dppf）Cl2]
%分析 （計算値）: C, 54.3 （57.1）; H, 4.9 （5.0）, N, 2.3 （2.5）. 1H-NMR （ppm）:-CH-CH3* （6H, d, 2.60）; CH-CH3* （6H, d, 2.90）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.61）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.63）; P（CH2）2-P（4H, m, 2.57-2.85）; Cp （2H, sr-br, 4.23）, Cp （2H, sr-br, 4.57）, Cp （3H, m, 4.96）, Cp （3H, m, 5. 00）, -CH*-CH3 （2H, q, 4.10）; H-芳香族環 （24, m, 6.25-7.57. 31P｛1H｝-NMR （ppm）: 1サンプル: 32.7. ΛM = 2.4 S.cm2.mol-1。
[Pd2（C2, N-R+ dmpa）2（μ-dppf）（N3）2] （同様）。
【０１４５】
（4c） [Pd2（C2,N- S- dmpa）2（μ-dppf）（N3）2]
%分析 （計算値）: C, 55.1 （55.9）; H, 4.0 （4.5）, N, 9.5 （10. 0）. 1H-NMR （ppm）:-CH-CH3* （6H, d, 2.70）; CH-CH3* （6H, d, 3.00）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.61）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.65）; P（CH2）2-P （4H, m, 2.60-2.90）; Cp （2H, sr-br, 4.20）, Cp （2H, sr-br, 4.61）, Cp （3H, m, 4.93）, Cp （3H, m, 5. 10）, -CH*-CH3 （2H, q, 4.20）; H-芳香族環 （24, m, 6.05-7.77 31P｛1H｝-NMR （ppm）: 1サンプル: 32.7. ΛM = 7.5 S.cm2.mol-1。
[Pd2（C2, N- S- dmpa）2（μ-dppf）Cl2] （同様）。
【０１４６】
（4d） [Pd2（C2, N-R+ dmpa）2（μ-dppf）（N3）2]
%分析 （計算値）: C, 54.8 （55.9）; H, 4.1 （4.5）, N, 9.7 （10. 0）. 1H-NMR （ppm） : -CH-CH3* （6H, d, 2.70）; CH-CH3* （6H, d, 3.00）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.61）; -N（CH3）2 （6H, s-br, 1.65）; P（CH2）2-P （4H, m, 2.60-2.90）; Cp （2H, sr-br, 4.20）, Cp （2H, sr-br, 4.61）, Cp （3H, m, 4.93）, Cp （3H, m, 5. 10）, -CH*-CH3 （2H, q, 4.20）; H-芳香族環 （24, m, 6.05-7.77）. 31P｛1H｝-NMR （ppm）: 1サンプル : 32.7. ΛM = 4.4 S.cm2.mol-1。
[Pd2（C2, N-R+ dmpa）2（μ-dppf）Cl2] （同様）。
【０１４７】
実施例5
セリンペプチダーゼ、メタロ-プロテアーゼ酵素のファミリーを用いた酵素阻害アッセイ
我々は、構造A、B、およびCを有する複合体を用いて成される以下のアッセイを含む。これらのパラジウム複合体は、N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa）のR（+）およびS（-）異性体によって形成されるシクロ金属環によって、そして配位リガンド1,1'-ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセン（dppf）によって構成される。酵素の阻害定数を、分光蛍光分析技能と間接的な計算を使うことによって、古典的な方法によって得た。アッセイにおいて、アッセイによって、2〜5 ngの既知の総量を含む1 mlの量の酵素溶液を使用した。以下に列挙された酵素阻害定数値を計算した： セリンペプチダーゼ：
プロリル・オリゴペプチド （POP）および2つの変種（β-プロペラの4番目のブレード由来の変種Cys255The、および機能上の変種Tyr473Phe）。POPについて、私用した緩衝液は、Tris/HCl 20 mM、pH 7.5だった。標準的な基質は、Abz-GFSPFRQ-EDDnp（Km 0.38 μM）だった。
【０１４８】
（5a） dmpa由来のR（+）異性体による複合体（1:1の構成）:
:1/Kiapp= 0.0977//Kiapp = 10.24 ng//Ki =変種Cys255Theに関して4.51 ng。
:1/Kiapp= 0.1234//Kiapp = 8.10 ng//Ki =変種Tyr473Pheに関して3.57 ng。
（5b） dmpa由来のR（+）異性体による複合体（2:1の構成）:
:1/Kiapp= 8. 7242//Kiapp = 0.1146 ng//Ki =変種Cys255Theに関して34.01 pg。
:1/Kiapp= 14.1677//Kiapp = 0. 0706//Ki =変種Tyr473Pheに関して20.94 pg。
（5c） dmpa由来のS（-）異性体による複合体（1:1の構成）:
:1/Kiapp= 6.9164//Kiapp = 0.1496 ng//Ki =変種Cys255Theに関して42.90 pg。
:1/Kiapp= 9. 8914//Kiapp = 0.1011ng//Ki =変種Tyr473Pheに関して30 pg。
（5d） dmpa由来のS（-）異性体による複合体（2:1の構成）:
:1/Kiapp= 180.3018//Kiapp = 0.004982 ng//Ki =変種Cys255Theに関して1.65 pg。
:1/Kiapp= 4.4990//Kiapp = 0.2223 ng//Ki =変種Tyr473Pheに関して65.96 pg。
【０１４９】
メタロ-プロテアーゼ：
ACE（アンギオテンシン変換酵素） - 使用した濃度： 0.1〜1.0 nM。
使用した緩衝液は、0.1 Mのリン酸ナトリウム緩衝液、pH 8.0＋200 mM NaClだった。標準的な基質は、Abz-YRK（Dnp）-P-OH （Km： 7.0 μM）だった。
（5e） dmpa由来のR（+）異性体による複合体（1:1の構成）
: 1/Kiapp= 18.7138//Kiapp= 0.05344 ng//Ki = 22.27 pg。
（5f） dmpa由来のR（+）異性体による複合体（2:1の構成）
: 1/Kiapp= 1.1578//Kiapp= 0.8637 ng//Ki= 0.36 ng。 
（5g） dmpa由来のS（-）異性体による複合体（1:1の構成）
: 1/Kiapp= 2.0989//Kiapp= 0.4764 ng//Ki = 198.51 pg。
（5h） dmpa由来のS（-）異性体による複合体（2:1の構成）
: 1/Kiapp = 3.3136//Kiapp= 0. 3018 ng//Ki = 112.28 pg。
【０１５０】
エンドペプチダーゼ： 
CATD （カテプシンD） - 使用した濃度： 0.05-0.5 nM。使用した緩衝液は、0.1 mMクエン酸ナトリウム緩衝液、pH 4.0だった。標準的な基質は、Abz-AIAFFSRQ-EDDnp （Km 0.17 μM）だった。
（5i） dmpa由来のS（-）異性体による複合体（1:1の構成）
: 1/Kiapp= 3.3136//Kiapp= 0.3018 ng//Ki= 122.98 pg。
（5j） dmpa由来のS（-）異性体による複合体（2:1の構成）
: 1/Kiapp= 3.5696//Kiapp= 0.2801 ng//Ki = 104.22 pg.
【０１５１】
実施例6
抗腫瘍アッセイ - ウォーカー腫瘍
抗腫瘍活性アッセイのために、その全てが1%ジメチルスルホキシド（DMSO）を含む、pH = 7.4の、水溶液、生理食塩液、およびリン酸緩衝液中に化合物を希釈した。試験動物の血液の総量（30 mlと推定される）中のそれらの濃度が、合計で生体内で15 μMの薬物濃度になるように、化合物の同等分量の適用がなされ、しれが動的ステップに非常に有益であるとみなされた。
腹膜内、皮下、そして腫瘍移植部位への直接的な適用、さらに本発明パラジウム化合物と一緒に、腫瘍細胞を用いた腫瘍移植によって、実験をおこなった。
【０１５２】
腫瘍成長が90%の症例（合計60匹の試験動物）で回復しうることが認められた。106腫瘍細胞の皮下接種が、12日後、試験動物に4.0 （+/-）1.0 gの質量の固形腫瘍を生み出した。前記薬物の適用によって、この質量が0.3 （+/-）0.1 gに減少した。腫瘍成長を抑えることに加えて、前記化合物は、症例の85%で以前に存在した腫瘍を回復させた。ウォーカー腫瘍について言及されるように、前記化合物は、生体内モデルにおいて、薬物が正常組織に適用された場合、慢性炎症シグナルなしに、腫瘍細胞に選択的な細胞毒性を示した。これらのアッセイで、15 μM/ラット×日数の注射が連続した10 （十）日間適用された。もう1つの重要な活性は、重要な抗血管形成作用を示す、培養における内皮細胞増殖に対する阻害作用だった。前記化合物は、同様に生体内モデルにおいて、骨格筋における腫瘍転移を回避する、有力な抗転移作用物質である）カテプシンBおよびカテプシンDに対する高い阻害作用を示した。
【０１５３】
あらゆる処置による動物実験においても副作用が観察されなかった事実は、注目されるべきであり、従って、薬物の高い特異性を明らかにする。以下の図3、4および5は得られた結果のいくつかを示す。
【０１５４】
実施例7
エールリッヒ腹水腫瘍を成長させるために、保持マウスの腹膜腔由来の、106細胞を含む腫瘍細胞の懸濁液0.1 mlを、マウスに腹腔内接種する。エールリッヒの腫瘍を持つマウスの腹膜から腹水を取り出した後に、ノイバウエル・チェンバでトリパンブルー染色材を使って、細胞の数および生存率を測定した。
【０１５５】
（スキームCに一般的な構造で示されるような）化合物[Pd2（C2, N-S- dmpa）2（μ-dppf）Cl2]および[Pd2（C2, N-S- dmpa）2（μ-dppf）（N3）2]で処置された動物の見込まれる防御を観察する目的で、生命延長曲線を作った。12匹の動物から成る3つの実験群を以下の通り検討した：エールリッヒの腹水腫瘍だけ保有する動物；腫瘍を保有し、かつ、皮下的にシクロパラジウム化化合物（1 mg/kg）の4回の連続服用により処置した。
【０１５６】
この実験は以下の通りなされた：
エールリッヒ腫瘍細胞を保持動物の腹膜腔から取り出し、そして細胞生存率を測定するためにトリパンブルー溶液中に希釈した（1：100）。濃度を1×106細胞/動物に、生理食塩液で調節した。そして、0.2 mlのこの溶液（1×106細胞を含む）を研究される動物に接種した。腫瘍接種の72時間後に、シクロパラジウム化化合物による処置を開始し、そして連続した4日間続けた。死亡率を管理するために前記動物を毎日観察した。
【０１５７】
生体内アッセイにおいて、両化合物[Pd（C2, N-（S-dmpa）（dppf）Cl]および[Pd2（C2, N-S- dmpa）2（μ-dppf）（N3）2]が、1 mg/kg未満の量で、エールリッヒの腹水腫瘍を保有する動物の生存延長を促進し、これらの薬物が腫瘍進行を妨げることができることを示した（図6）。
【０１５８】
実施例8
マウスの骨髄由来の造血前駆体（CFU-C）をクローン培養
これらのクロージェニック細胞を数えるために、培養物中にある全ての多能性細胞が増殖するように誘導され、そして培養条件が、それらの結果的な重ね合わせによる各々のペトリ板上での多すぎるコロニーを避けるように、各々のコロニーの同定を可能にするように、調節されることが重要である。同様に、成長刺激因子（GSF）が最大濃度を上回って使われることが重要である。我々は、顆粒球およびマクロファージ-のために組み換え造血性増殖因子 - GM-CSFを使う。さらに、様々なバッチと市場で入手可能な商標の活性に見られた変動性のために、ウシ胎児血清の選択は慎重にされるべきである。
【０１５９】
正常なマウス、あるいは（スキームAとBの一般的な構造のとおり）1:2の比のdmpaとリガンドdppfによって形成されたシクロパラジウム化化合物によって、皮下的に連続した4日間処置されたマウスを頚椎脱臼によって屠殺した後、皮膚をヨウ素化アルコールで洗浄した。大腿部を露出させた後に、遠心端の開口部上の軟骨を取り除き、そして骨を上方接合部で切断される。骨髄を針および注射器の助けにより、培地または平衡化生理食塩液を含むチューブに移す。懸濁液中の細胞数を、10%エオシン中への細胞の1：10希釈後に、血球算定チェンバによって数える。その後、30%の2倍濃縮IMDM培地（Sigma）、20%ウシ胎児血清、および50%の寒天（0.6%）から成る追加の寒天培地（bacto-agar、Difco）を準備する。その後、追加寒天培地が37℃のときに、適当量の細胞を加える。細胞を再懸濁し、そして1.0 ml量を、適切な刺激因子をすでに含んだ各々のペトリ板に散布する。生体外アッセイにおいて、（スキームAとB-一般的な構造のとおり）1：2の比でdmpaとリガンドdppfによって形成されるシクロパラジウム化化合物のシリアル濃度を加えた。内容物はペトリ板の表面全体にわたって分布して、そしてゲル状になる。空気中5%のC02の存在下、37℃で7日間インキュベートされ、続いてコロニー数が40倍の倍率（Metcalf, 1984）での解剖顕微鏡によってその後数えられる。
【０１６０】
実施例9
長期持続骨髄細胞液体培養手順による骨髄ストロマ形成の評価
この培養は、骨髄のストロマ細胞由来の接着細胞の単層の形成に完全に依存している。接着細胞のこの層の形成は、ストロマ細胞の細胞外マトリックスの形成に関与する造血性増殖因子の合成および分泌によって生じる。よって、より未熟な細胞が接着細胞のその層の中に残っていて、そして造血を維持するという目的で、培地に放出される。このため、液体培地中の始原細胞の数は、外因性造血性増殖因子の存在により、効果的なクローン培養後に定量される（Spooncer et al, 1993）。
【０１６１】
頚椎脱臼により動物（約8匹）を屠殺した後に、大腿部を露出させ、上方接合部の骨に切り込みを入れた。骨髄と骨髄基質細胞を、針および注射器の助けにより、2 mM L−グルタチオン、20%のウマ血清（cult-lab）、および 10-2 Mのヒドロコルチゾンを補った培地rpmi-1640 （Sigma）を含むチューブに移した。細胞と培地を合わせた量を、培養フラスコ（t25） （10 mlの培地＋各々のフラスコ中の細胞）に分配した。その後、培養フラスコを、空気中5%のC02を有するウェット・オーブン内でインキュベートした。15日後、骨髄ストロマがすでに集密になり始めるので、始原細胞の増殖を誘発するために、8匹のマウスの骨髄由来の新しい細胞集団を培養フラスコに加えた。そして我々は、培養フラスコ増殖の15日後に、試験管内で培養された骨髄ストロマ由来の接着細胞によって生産された造血前駆体の数の定量を目的としてクローン培養（cfu-c）を行った。非接着細胞と始原細胞の定量のために、毎週飽和した培地の50%を取り除き、新鮮な培地を加えた。前記新鮮な培地には、（スキームAとB-一般的な構造のとおり）1：2の比のdmpaとリガンドdppfによって形成したシクロパラジウム化化合物1 mg/lがすでに含まれているべきである。
長期持続液体培養培地中に得られた始原細胞からの造血前駆体（CFU-C）のクローン培養
長期持続液体培養系から非接着細胞を得た後に、これらを培地RPMI 1640 （Sigma）により洗浄し、2×105細胞/mlの最終濃度で再懸濁した。先の項目に記載のとおり、その後これらの細胞をクローン培養（CFU-C）プロトコールに供した。
【０１６２】
実施例10
急性毒性についての評価
アッセイした化合物を、10%のDMSOを含む生理食塩液中に希釈し、そして0.2 mlのその溶液を動物に腹腔内投与する。これにより、動物10匹の群（5匹の雄と5匹の雌）を様々な量の検討される化合物で処理した。対照動物には、10%のDMSOを含む生理食塩液だけを与えた。処置終了後に、前記動物は14日間の観察は続いた。
【０１６３】
表1
シクロパラジウム化化合物の急性毒性についての評価。動物に、以下に記載の化合物の1服用量を腹腔内投与し、そしてこの手順の後14日間観察した。
【０１６４】
【表１】
2011052008.tif 000011
【０１６５】
実施例11
白血病株HL-60とK-562、および癌原遺伝子BCL-2の発現における生体外の細胞毒性。
2 mMのL-グルタミンと20%のウシ胎児血清を補った培地RPMI-1640 （Sigma）中で維持した細胞株HL-60とK-562からの細胞を、前もって洗浄（3回）して、そしてRPMI培地中に再懸濁した。その後、それらを96穴（オリフィス）の培養プレート（1×106細胞/オリフィス）上で、検討される化合物の9つの濃度（160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25および0.65 μg/ml）と一緒にインキュベートした。それらをウェット・オーブン（空気中5%のC02）内で72時間インキュベートした。この期間の後に、MTT溶解（5 mg/ml）（Sigma）を加え、そして培養プレートをさらに4時間インキュベートした。その後、MTT安定化溶液（0.04 Nのイソプロピル酸）を加えて、そして30分後、ELISAの読み取りを3つのコピーで560 nmにておこなった（Mosmann, 1983）。検討される化合物の存在下での細胞生存百分率を以下の通り計算した：
【０１６６】
【数２】
2011052008.tif 000012
【０１６７】
実施例12
メラノーマを用いてなされる生物学的アッセイ
生体外アッセイ
げっ歯類のメラノーマB16F10-Nex2細胞のシクロパラジウム化の細胞障害効果を確認するために生体外アッセイをおこなった。異なる濃度下で24時間前記細胞をインキュベートした。細胞生存率を、MTTを用いたアッセイによって測定した。図13に示されるように、100%の有効性は、エタンビホスフィンを含む薬物（薬物1, 2および3）の1.25 μMの濃度下で観察される。同じ有効性は、ビス-ジフェニルホスフィン-フェロセンを含む薬物で、しかしより高い濃度である10 μM（薬物6）で、そして官能化アルキンを含むシクロパラジウム化化合物（薬物10）については、約20 μMで、示される。図13は、細胞生存百分率の減少が薬物なしの細胞を用いた対照と比較して棒の上に表される、前述の細胞障害効果を示す。
【０１６８】
生体内アッセイ 
生体内アッセイを雌マウスC57Bl/6でおこなった。105個の腫瘍細胞を皮下に植え込んだ。移植の4日後に、動物の処置を開始した。一方群に10 μMを与え、そして他には以下の通り30 μMの最も有効な薬物を与えた：薬物1, 2, 3, 6および10を腹腔内に、1週間につき3回、そしてこれらの日に腫瘍量を定量した。腫瘍量が3000 mm3に達したら、動物を屠殺した。以下の図で、（A）に薬物を注射した動物と対照動物に関する死亡率曲線、（B）に各々の群における腫瘍を患った動物の腫瘍量が示された。
【０１６９】
図14で、10 μMの濃度未満で与えられた薬物の中から、Aにおいて、薬物1, 3, 6および10で処置した動物について10日の延命が観察される。Bにて、全ての薬物の中から、薬物1および6が他の薬物を約60%上回る腫瘍成長阻害作用をもつことを我々は見つけることができた。
【０１７０】
図15で、30 μMの濃度未満で与えられた薬物の中から、Aにおいて、全ての薬物で処置された動物について、約7日の延命が観察され、薬物6で処置した群でより少ない死亡数に至った。図Bで、我々は、薬物1が腫瘍成長を阻害するのに最も有効なものであることがわかる。薬物6は、18日で有意な阻害作用を示すが、しかしこの効果は23日後に反転する。
【０１７１】
同様に、官能化アルキンを含む薬物を、同じプロトコールに従って生体外にて試験した（図16）、そして100%の細胞障害効果が、約100 μmにて示された。この効果は、以下の図で示され、同様に、それらの中で、薬物11および14が、約1 pMにて、40〜50%の有意な阻害を示したことも示された。
【０１７２】
結果分析が化学構造と薬物作用の間のいくつかの重要な相互関係を提供する。100%の有効性は、約1.25 μMの濃度の、エタン-ビホスフィンを含む薬物（薬物1, 2および3）で観察された。官能化アルキンを含むシクロパラジウム化化合物（薬物10）について同じことは起きず、約20 μMの濃度が必要とされる。全ての試験薬物から、我々は、薬物1および6が他の薬物を60%上回る腫瘍成長に対する阻害作用を示すものであることがわかった。我々は、薬物1が腫瘍成長を阻害するのに最も有効なものであるが、薬物6で処置した試験動物がより低い死亡数を示すことがわかった。官能化アルキンを含む複合体から、薬物11および14が1 μMにて、40〜50%の有意な阻害を示すものであった。
【０１７３】
本明細書中に示される本発明の記載、ならびに記載の実施例は、当業者に、添付の請求項に記載の本発明の範囲から逸脱することなしに、彼らまたは彼女らの常識内の補正を含んだ本発明の具体化を可能にさせることは認識される。
【図１】
2011052008.tif 000019
【図２】
2011052008.tif 000020
【図６】
2011052008.tif 000021
【図７】
2011052008.tif 000022
【図８】
2011052008.tif 000023
【図９】
2011052008.tif 000024
【図１０】
2011052008.tif 000025
【図１１】
2011052008.tif 000026
【図１３】
2011052008.tif 000027
【図１４】
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【図１５】
2011052008.tif 000029
【図１６】
2011052008.tif 000030
【図３】
2011052008.tif 000031
【図４】
2011052008.tif 000032
【図５】
2011052008.tif 000033
【図１２】
2011052008.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月13日(2010.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラジウム、シグマC-Pd結合および配位結合Y→Pdを含む有機金属化合物であるシクロパラジウム化化合物であって、以下の構造に相当する式：
【化１】
2011052008.tif 000035
［式中、
− Xは、Cl、F、Br、I、N3、NCO、NCS、SCNまたはアセテートから選ばれる成分を表し；そして
− Yは、N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa)、ピリジニル-フェニル-エテンおよび1-フェニル-3-N,N-ジメチルアミン-プロペンから成る群から選択される部分中のNであり；
− Cは、該dmpaのオルト位における炭素原子、該ピリジニル-フェニル-エテン中の炭素原子、および該1-フェニル-3-N,N-ジメチルアミン-プロペン中の炭素原子から成る群から選択され；そして該炭素原子はパラジウム原子と共有結合しており；CおよびYを含む環は3〜8個の原子で構成されることができ；
− 曲線で表されるCとYの間には、シクロパラジウム環として表される一連の原子が存在し；
− Lは、N、P、As、Sb又はBi由来の供与原子である配位リガンドを表し、かつ下記のスキーム2により表される構造を更に形成し、
【化２】
2011052008.tif 000036
模式的表現L-Lは構造中の２つのリンカーLの存在を表し、R1およびR2は各々フェニル基であり、そしてR3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は個別に以下のいずれかのラジカル：H、アルキル、アリール、ジエニル、アルコキシ、シロキシ、ヒドロキシ、アミン、イミド、F、Cl、Br、I、イミン、ニトロを表す] によって表される有機環を有するシクロパラジウム化化合物、または医薬として許容される1つのその塩。
【請求項２】
パラジウム、シグマC-Pd結合および配位結合Y→Pdを含む有機金属化合物であるシクロパラジウム化化合物であって、以下の構造に相当する式：
【化３】
2011052008.tif 000037
［式中、
− Xは、Cl、F、Br、I、N3、NCO、NCS、SCNまたはアセテートから選ばれる成分を表し；そして
− Yは、N、P、As、Sb、Bi、O、S、SeまたはTeから選ばれる成分を表し；
− Cはパラジウム原子に共有結合した、sp2またはsp3混成炭素原子を表し；Cを含む環は3〜8個の原子で構成されることができ；
− 曲線で表されるCとYの間には、シクロパラジウム環として表される一連の原子が存在し；
− Lは、N、P、As、Sb又はBi由来の供与原子である配位リガンドを表し、かつ下記のスキーム2により表される構造を更に形成し、
【化４】
2011052008.tif 000038
模式的表現L-Lは構造中の２つのリンカーLの存在を表し、R1およびR2は各々フェニル基であり、そしてR3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11およびR12は個別に以下のいずれかのラジカル：H、アルキル、アリール、ジエニル、アルコキシ、シロキシ、ヒドロキシ、アミン、イミド、F、Cl、Br、I、イミン、ニトロを表す] によって表される有機環を有するシクロパラジウム化化合物、または医薬として許容される1つのその塩。
【請求項３】
N,N-ジメチル-1-フェネチルアミン（dmpa）、およびN,N-ジメチル-ベンジルアミンの誘導体から成る群から選ばれる化合物に由来する、請求項1または2に記載のシクロパラジウム化化合物、または医薬として許容される1つのその塩。
【請求項４】
システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼのファミリー由来の酵素の活性を阻害する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５】
前記システイン-プロテアーゼが、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、エンドペプチダーゼ、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、カルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫、プラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種の生活環にとって必須のプロテアーゼを含む、請求項4に記載の化合物。
【請求項６】
前記酵素が、カテプシンB、クルザイン及びインターロイキン-1β変換酵素である、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
前記セリンペプチダーゼが、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル−ペプチダーゼおよびオリゴペプチダーゼB、プロリル−オリゴペプチダーゼ、ならびにカテプシンDを含む、請求項4に記載の化合物。
【請求項８】
前記酵素がカテプシンDである、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
前記メタロ-プロテアーゼが、アンギオテンシン変換酵素、コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ−プロテアーゼおよびゲナチナーゼを含む、請求項4に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物、または医薬として許容されるその塩の一つのうちの少なくとも1種類を含む組成物。
【請求項１１】
前記化合物、またはその塩の一つ、および少なくとも1種類の医薬として許容される担体を、当該組成物の総重量の0.01〜70%含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
前記化合物、またはその塩の一つ、および少なくとも1種類の医薬として許容される担体を、当該組成物の総重量の0.1〜40%含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項１３】
溶剤をさらに含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項１４】
前記溶剤がDMSOである、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
固形剤形、カプセル剤、錠剤もしくは散剤、または液体剤形、エリキシル剤、シロップ剤、乳濁剤、溶液、懸濁剤、混合物および注入剤で提供される、請求項10に記載の組成物。
【請求項１６】
前記製剤がスケジュール化または延長放出製剤である、請求項14に記載の組成物。
【請求項１７】
その投与が、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、経皮、腹膜内、局所、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、眼内または舌下手段を含む手段、またはリポソームを供給する装置によっておこなわれる、請求項14に記載の組成物。
【請求項１８】
その投与が、注射用手段によっておこなわれる、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
その投与が、腹膜内注射用手段によっておこなわれる、請求項17に記載の組成物。
【請求項２０】
水、生理食塩液、および/またはリン酸緩衝液pH 7.4、ならびに0.1〜30%のDMSOを含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２１】
1〜10重量%の組成物、および必要であれば安定化剤または保存料を含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２２】
0.0001〜250 mgの請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物、または医薬として許容されるその塩の1つのうちの少なくとも1種類を含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項２３】
0.1〜100 mgの請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物、または医薬として許容されるその塩の1つのうちの少なくとも1種類を含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項２４】
システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼのファミリー由来の酵素の活性を阻害する、請求項10に記載の組成物。
【請求項２５】
前記システイン-プロテアーゼが、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、カルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫、プラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種の生活環にとって必須のプロテアーゼを含む、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
前記酵素が、カテプシンB、クルザイン及びインターロイキン-1β変換酵素である、請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
前記セリンペプチダーゼが、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル−ペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼBおよびプロリル−オリゴペプチダーゼを含む、請求項24に記載の組成物。
【請求項２８】
前記酵素がカテプシンDである、請求項24に記載の組成物。
【請求項２９】
前記メタロ-プロテアーゼが、アンギオテンシン変換酵素、コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ−プロテアーゼおよびゲナチナーゼを含む、請求項24に記載の組成物。
【請求項３０】
受容者の総血液容量および0.01〜200 μMの濃度の活性物質を含む、請求項10〜24のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３１】
受容者の総血液容量および0.1〜50 μMの濃度の活性物質を含む、請求項10〜24のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３２】
受容者の総血液容量および10〜25 μMの濃度の活性物質を含む、請求項10〜24のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項３３】
組成物の製造のための請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物の使用。
【請求項３４】
システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼのファミリー由来の酵素の活性を阻害するための薬品の製造のための、請求項33に記載の使用。
【請求項３５】
前記システイン-プロテアーゼが、カテプシンB、H、J、L、N、S、TおよびC（ジペプチジル-ペプチダーゼ-I）、インターロイキン変換酵素（ICE）、カルシウムにより活性化される中性プロテアーゼ、カルパインIおよびII、エンドペプチダーゼ、ウイルスのシステイン-プロテアーゼ、カルジオウイルス・エンドペプチダーゼ、アデノウイル・スエンドペプチダーゼおよびアフトウイルス・エンドペプチダーゼ、ならびに寄生虫、プラスモジウム、エンタモエバス、オンコセラス、レイスマニアス、ハエモンクス、ジクチオステリウム、テリレリウム、スキストソマおよびトリパノソマ種の生活環にとって必須のプロテアーゼ;カテプシンDまたはエンセファリナーゼ、ジペプチジル-ペプチダーゼIV、アシルアミナシル−ペプチダーゼおよびオリゴペプチダーゼB、ならびにプロリル−オリゴペプチダーゼ；アンギオテンシン変換酵素、コラゲナーゼ、ストロメリシン、膜型メタロ−プロテアーゼおよびゲナチナーゼ、を含む、請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
システイン-プロテアーゼ、セリンペプチダーゼおよびメタロ-プロテアーゼのファミリー由来の酵素に関係した障害または疾患を治療のための薬品の製造のための、請求項34又は35に記載の使用。
【請求項３７】
幼若骨髄細胞が細胞分裂（S期）に入るのを阻害する、請求項34又は35に記載の使用。
【外国語明細書】
2011052008000001.pdf