(57)【要約】【課題】複数の走査系の座標間における誤差の調整を容易に行う。【解決手段】集光レンズ３２により形成される一次結像面３４に配置された蛍光試料３４ｂに対し、第１の走査系１６−１の座標系に基づいて、第２の走査系１６−２を介して照射されるレーザ光の照射箇所の座標が設定される。そして、第２の走査系１６−２を介して照射箇所にレーザ光を照射させた後、第１の走査系１６−１を介して蛍光試料３４ｂにレーザ光を走査させて、レーザ光の走査領域の画像を取得し、その画像において第２の走査系１６−２を介してレーザ光が実際に照射された箇所の座標が検出される。これにより、設定された座標と、検出された座標とに基づいて、第２の走査系１６−２の座標系を第１の走査系１６−１の座標系に一致させる補正を行うための補正係数が求められる。本発明は、例えば、複数の走査系を備えたレーザ走査顕微鏡に適用できる。【選択図】図３
2011008219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡において、
前記レーザ光を走査する複数の走査手段と、
前記複数の走査手段から射出される前記レーザ光の光路が合成された共通の光路上に配置され、前記レーザ光を集光して、前記試料側に配置される対物レンズとの間に一次結像面を形成する集光手段と
を備え、
前記一次結像面に配置された蛍光試料に対し、前記複数の走査手段のうちの、特定の走査手段の座標系に基づいて、他の走査手段を介して照射される前記レーザ光の照射箇所の座標を設定し、
前記他の走査手段を介して前記照射箇所に前記レーザ光を照射させ、
前記特定の走査手段を介して前記蛍光材料に前記レーザ光を走査させて、前記レーザ光の走査領域の画像を取得させ、
前記画像において前記他の走査手段を介して前記レーザ光が実際に照射された箇所の座標を検出し、
前記設定された座標と、前記検出された座標とに基づいて、前記他の走査手段の座標系を前記特定の走査手段の座標系に一致させる補正を行うための補正係数を求める
ことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
【請求項２】
前記蛍光試料を前記一次結像面に配置するための位置決め手段
をさらに備え、
前記蛍光試料は、前記位置決め手段に対し貼着される
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項３】
前記他の走査手段を介して照射される前記レーザ光の照射箇所は、前記画像を取得する際の所定の倍率ごとに、各倍率の視野内の所定位置となるように設定される
ことを特徴とする請求項１または２に記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項４】
前記他の走査手段を介して前記蛍光試料にレーザ光が照射される１照射箇所あたりの大きさは、前記画像の１画素に対応する前記蛍光試料上の範囲よりも大きく設定される
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の走査型レーザ顕微鏡。
【請求項５】
レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡の制御方法において、
前記走査型レーザ顕微鏡は、前記レーザ光を走査する複数の走査手段と、前記複数の走査手段から射出される前記レーザ光の光路が合成された共通の光路上に配置され、前記レーザ光を集光して、前記試料側に配置される対物レンズとの間に一次結像面を形成する集光手段とを備え、
前記一次結像面に配置された蛍光試料に対し、前記複数の走査手段のうちの、特定の走査手段の座標系に基づいて、他の走査手段を介して照射される前記レーザ光の照射箇所の座標を設定し、
前記他の走査手段を介して前記照射箇所に前記レーザ光を照射させ、
前記特定の走査手段を介して前記蛍光材料に前記レーザ光を走査させて、前記レーザ光の走査領域の画像を取得させ、
前記画像において前記他の走査手段を介して前記レーザ光が実際に照射された箇所の座標を検出し、
前記設定された座標と、前記検出された座標とに基づいて、前記他の走査手段の座標系を前記特定の走査手段の座標系に一致させる補正を行うための補正係数を求める
ステップを含むことを特徴とする制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ走査顕微鏡および制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、複数の走査手段を備え、それぞれの走査手段において走査されるレーザ光を同一の観察面に照射して試料の観察を行うレーザ走査顕微鏡がある。
【０００３】
一般的に、レーザ光を走査する走査手段は、機械的または光学的な様々な要因により、理想的な座標系を設定しても、想定している設定上の座標系と実際に走査される物理的な座標系との間にズレが発生することがある。そのため、複数の走査手段を備えるレーザ走査顕微鏡では、それぞれの走査手段の座標を完全に一致させることが困難であり、各走査手段の座標間で誤差が発生してしまう。
【０００４】
例えば、観察用レーザ光を走査する走査手段と、刺激用レーザ光を走査する走査手段とを備えたレーザ走査顕微鏡では、まず、観察用レーザ光を利用して観察面の画像が取得される。そして、その画像に基づいた観察用レーザ光の走査手段の座標で、刺激用レーザ光の走査手段に刺激箇所を設定した場合、走査手段の座標間の誤差により、設定された刺激箇所とは異なる位置に刺激用レーザ光が照射される。
【０００５】
例えば、特許文献１には、走査手段における光路に光学的条件を変更させる要素（例えば、波長選択フィルタなど）が挿入され、複数の走査手段間の光学的条件が異なっている場合においても、各走査手段の座標間に生じる誤差による影響を軽減することができる走査型レーザ顕微鏡が開示されている。
【０００６】
しかしながら、複数の走査手段を備えるレーザ走査顕微鏡では、各走査手段における光学的条件だけが誤差の要因となるのでなく、例えば、異なる機械的な可動部を備えていることや、異なる駆動用電気回路により駆動されることなどが誤差の要因となっているため、各走査手段の座標間に生じる誤差による影響を抑制することは困難である。
【０００７】
例えば、ＸスキャナおよびＹスキャナを備えて構成されるガルバノスキャナやレゾナントスキャナなどの走査手段では、ＸスキャナおよびＹスキャナの各々が有する誤差や、ＸスキャナとＹスキャナとの光学的配置に関する誤差、対物レンズによる誤差、走査光学系と対物レンズ光学系との光軸ずれによる誤差、複数の走査手段の光路を合成させることに関わる誤差などが、各走査手段の座標間に誤差が発生する要因となる。
【０００８】
ＸスキャナおよびＹスキャナの各々が有する誤差としては、駆動電圧と回転角度の関係が一次関数とならないことによる直線性誤差、駆動電圧範囲と回転角度範囲が同じ変化をしないことによる倍率誤差、および、スキャナの回転軸とレーザ光の光軸とが一致していないことによる中心ずれがある。また、ＸスキャナとＹスキャナとの光学的配置に関する誤差としては、Ｘスキャナの回転軸とＹスキャナの回転軸が精密に直交していないことにより走査面上の座標軸が直交しないことによる直交度誤差がある。
【０００９】
対物レンズによる誤差としては、レンズの歪みによる誤差、および走査系により異なる波長の光源を使用する場合にレンズの収差に基づく波長差による位置ずれがある。また、複数の走査手段の光路を合成させることに関わる誤差としては、光路合成のためのハーフミラーや波長選択フィルタなどの反射または屈折面の倒れによる誤差がある。
【００１０】
そして、これらの要因が総合的に作用し、各走査手段の座標間に誤差が発生する。そのため、通常、レーザ走査顕微鏡は、スキャナの機械的な取り付け位置や電気的な駆動制御などが調整可能となるような構造となっており、各走査手段において走査されるレーザ光により取得された画像を比較しながら、製造時に、誤差が最小になるような機械的な調整が行われる。さらに、機械的な調整の後に、レーザ光を走査させて得られた画像から求められる各走査手段の座標に対する基準座標系との誤差を、補正係数としてレーザ走査顕微鏡に保持させることで、その補正係数を用いた電気的な調整が行われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００７−２３３２４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ところで、一般的に、レーザ走査顕微鏡は、光源や走査手段などを有する走査部と、対物レンズや試料が載置されるステージなどを有する顕微鏡部とが別々の装置として構成されている。そして、複数の走査系の座標間における誤差の調整は、最終画像位置に基づいて行う必要があるため、走査部と顕微鏡部を組み合わせた状態で調整を行う必要がある。
【００１３】
しかしながら、走査部と顕微鏡部を組み合わせた状態では、走査部に起因する誤差と、顕微鏡部に起因する誤差とが複合されてしまうため、誤差を解消するための調整が複雑となってしまう。
【００１４】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、複数の走査系の座標間における誤差の調整を容易に行うことができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の走査型レーザ顕微鏡は、レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡であって、前記レーザ光を走査する複数の走査手段と、前記複数の走査手段から射出される前記レーザ光の光路が合成された共通の光路上に配置され、前記レーザ光を集光して、前記試料側に配置される対物レンズとの間に一次結像面を形成する集光手段とを備え、前記一次結像面に配置された蛍光試料に対し、前記複数の走査手段のうちの、特定の走査手段の座標系に基づいて、他の走査手段を介して照射される前記レーザ光の照射箇所の座標を設定し、前記他の走査手段を介して前記照射箇所に前記レーザ光を照射させ、前記特定の走査手段を介して前記蛍光材料に前記レーザ光を走査させて、前記レーザ光の走査領域の画像を取得させ、前記画像において前記他の走査手段を介して前記レーザ光が実際に照射された箇所の座標を検出し、前記設定された座標と、前記検出された座標とに基づいて、前記他の走査手段の座標系を前記特定の走査手段の座標系に一致させる補正を行うための補正係数を求めることを特徴とする。
【００１６】
本発明の制御方法は、レーザ光を試料上で走査し、前記試料からの光を用いて前記試料の画像を取得する走査型レーザ顕微鏡の制御方法であって、前記一次結像面に配置された蛍光試料に対し、前記複数の走査手段のうちの、特定の走査手段の座標系に基づいて、他の走査手段を介して照射される前記レーザ光の照射箇所の座標を設定し、前記他の走査手段を介して前記照射箇所に前記レーザ光を照射させ、前記特定の走査手段を介して前記蛍光材料に前記レーザ光を走査させて、前記レーザ光の走査領域の画像を取得させ、前記画像において前記他の走査手段を介して前記レーザ光が実際に照射された箇所の座標を検出し、前記設定された座標と、前記検出された座標とに基づいて、前記他の走査手段の座標系を前記特定の走査手段の座標系に一致させる補正を行うための補正係数を求めるステップを含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明の走査型レーザ顕微鏡および制御方法においては、一次結像面に配置された蛍光試料に対し、複数の走査手段のうちの、特定の走査手段の座標系に基づいて、他の走査手段を介して照射されるレーザ光の照射箇所の座標が設定され、他の走査手段を介して照射箇所にレーザ光が照射される。また、特定の走査手段を介して蛍光材料にレーザ光を走査させて、レーザ光の走査領域の画像が取得され、その画像において他の走査手段を介してレーザ光が実際に照射された箇所の座標が検出される。そして、設定された座標と、検出された座標とに基づいて、他の走査手段の座標系を特定の走査手段の座標系に一致させる補正を行うための補正係数が求められる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の走査型レーザ顕微鏡および制御方法によれば、複数の走査系の座標間における誤差の調整を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】複数の走査系を備えるレーザ走査顕微鏡の構成例を示す図である。
【図２】注目箇所の座標と検出箇所の座標との誤差について説明する図である。
【図３】本発明を適用したレーザ走査顕微鏡における走査装置の構成例を示す図である。
【図４】結合部を利用して蛍光試料が固定された状態を示す図である。
【図５】一次結像面の近傍を拡大して示した図である。
【図６】第１の走査系における最大走査範囲で取得した画像における座標系を示す図である。
【図７】走査倍率が１倍であるときのマーキングを行う点を示す図である。
【図８】走査倍率が１．５倍であるときのマーキングを行う点を示す図である。
【図９】各倍率での走査範囲を示す図である。
【図１０】より複雑なマーク座標を組み合わせた例を示す図である。
【図１１】解像度、走査範囲、およびスポット径の関係について説明する図である。
【図１２】倍率ごとのマーキングの例を示す図である。
【図１３】Ｙ方向にも複数のスポットによるマーキングを行う例を示す図である。
【図１４】注目箇所に光刺激をして観察を行う処理を説明するフローチャートである。
【図１５】光刺激の前後で取得される画像の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２１】
図１を参照して、複数の走査系を備えるレーザ走査顕微鏡について説明する。
【００２２】
図１に示されているレーザ走査顕微鏡１１は、試料の観察面１２上でレーザ光を走査し、観察面１２からの光を用いて観察面１２の画像を取得する。また、レーザ走査顕微鏡１１は、走査部１３と顕微鏡部１４とが別体で構成されており、結合部１５により走査部１３と顕微鏡部１４とが結合された状態で、観察面１２の画像を取得する機能を備える。
【００２３】
そして、レーザ走査顕微鏡１１は、第１の走査系１６−１および第２の走査系１６−２を走査部１３に備えており、第１の走査系１６−１および第２の走査系１６−２により観察面１２に照射されるレーザ光が走査される。
【００２４】
第１の走査系１６−１では、レーザ光源２１−１から射出されるレーザ光が、集光レンズ２２−１により平行光とされてダイクロイックミラー３５を透過し、Ｘ軸走査手段２３−１、Ｘ軸走査ミラー２４−１、Ｙ軸走査手段２５−１、Ｙ軸走査ミラー２６−１を有して構成されるスキャナ（ガルバノスキャナやレゾナントスキャナなど）に入射する。
【００２５】
Ｘ軸走査ミラー２４−１およびＹ軸走査ミラー２６−１は、Ｘ軸走査手段２３−１およびＹ軸走査手段２５−１の駆動軸にそれぞれ取り付けられており、Ｘ軸走査手段２３−１の駆動軸とＹ軸走査手段２５−１の駆動軸とは、互いに直交するように配置される。従って、Ｘ軸走査ミラー２４−１およびＹ軸走査ミラー２６−１がレーザ光を反射しつつ、駆動軸を中心に回動することで、観察面１２のＸ−Ｙ方向（観察面１２に照射されるレーザ光の光軸をＺ方向として、Ｚ方向に直交する方向）にレーザ光が走査される。
【００２６】
第１の走査系１６−１において走査されたレーザ光は、ダイクロイックミラー３１により観察面１２に向かって反射され、集光レンズ３２により集光されて一旦結像された後、対物レンズ３３により集光されて観察面１２上にスポットを形成する。集光レンズ３２によりレーザ光が結像される一次結像面３４は、実際には何もない空間であるが、一次結像面３４の位置に走査光が結像しているため二次的な光源として機能し、その二次的な光源からの光が、対物レンズ３３により観察面１２に結像される。
【００２７】
観察面１２上に配置された試料にレーザ光源２１−１からのレーザ光の波長に反応して、蛍光放射を行う物質が含まれている場合、観察面１２で発生した蛍光は、対物レンズ３３により、一次結像面３４に結像され、集光レンズ３２により平行光とされ、ダイクロイックミラー３１で反射して第１の走査系１６−１に導入される。そして、その蛍光は、Ｘ軸走査ミラー２４−１およびＹ軸走査ミラー２６−１によりデスキャンされた後、ダイクロイックミラー３５で反射され、結像レンズ３６により集光されて光検出器３７に入射する。
【００２８】
光検出器３７は、受光した蛍光の強度に応じた電気信号である強度信号を出力して、図示しない画像化回路に供給する。画像化回路は、Ｘ走査ミラー２４−１およびＹ走査ミラー２６−１の走査動作（角度）に応じた時系列順に、光検出器３７から出力される強度信号をサンプリングして、Ｘ走査ミラー２４−１およびＹ走査ミラー２６−１による走査位置と、強度信号が示す蛍光の強度とを関連付けることで、観察面１２の画像を二次元的に画像化する。そして、画像化回路により画像化された観察面１２の画像は、図示しない表示装置に表示され、これにより計測が行われる。
【００２９】
また、第２の走査系１６−２は、第１の走査系１６−１と同様に、レーザ光源２１−２、集光レンズ２２−２、並びに、Ｘ軸走査手段２３−２、Ｘ軸走査ミラー２４−２、Ｙ軸走査手段２５−２、およびＹ軸走査ミラー２６−２を有して構成されるスキャナを備えている。そして、第２の走査系１６−２において走査されるレーザ光は、ミラー３８により観察面１２に向かって反射され、ダイクロイックミラー３１を透過して、集光レンズ３２により一次結像面３４に集光されて一旦結像された後、対物レンズ３３により集光されて観察面１２上にスポットを形成する。ダイクロイックミラー３１は、第１の走査系１６−１からのレーザ光の光路と、第２の走査系１６−２からのレーザ光の光路とを合成する光路合成手段として機能する。
【００３０】
このようにレーザ走査顕微鏡１１は、第１の走査系１６−１と第２の走査系１６−２とを備えており、同一の試料に対して、それぞれの走査系からのレーザ光を走査させることができる。従って、レーザ走査顕微鏡１１では、例えば、ある波長のレーザ光を第１の走査系１６−１により走査して観察面１２の画像を取得するのと同時に、他の波長のレーザ光を第２の走査系１６−２により走査させることができる。
【００３１】
例えば、レーザ走査顕微鏡１１は、第１の走査系１６−１によりレーザ光（励起光）のラスタ走査を行って、観察面１２の矩形領域の画像化を行わせ、その画像に基づいてレーザ光による刺激を行わせる箇所を特定し、第２の走査系１６−２によりベクトル走査を行わせて、その箇所にレーザ光（刺激光）を照射させるような観察に用いられる。
【００３２】
ところが、上述したように、第１の走査系１６−１における座標と、第２の走査系１６−２における座標との間で誤差が発生するため、第１の走査系１６−１を用いて取得した画像の座標を、そのまま第２の走査系１６−２に設定しても、設定した座標と、実際にレーザ光が照射される座標とにズレが発生する。即ち、第１の走査系１６−１を用いて取得した画像において刺激を与えようと注目している注目箇所と、その注目箇所の座標を第２の走査系１６−２に設定して刺激光を照射した箇所を、再度画像を取得することにより検出した検出箇所とが異なる位置になる。
【００３３】
図２を参照して、注目箇所の座標と検出箇所の座標との誤差について説明する。図２Ａには、５点の注目箇所が白丸（○）で示されており、図２Ｂには、５点の検出箇所が黒丸（●）で示されている。
【００３４】
第１の走査系１６−１を用いて取得した画像に基づいて、図２Ａに示すように、第１の走査系１６−１の座標でのＸ軸上およびＹ軸上の５箇所を、注目箇所Ｐ０乃至Ｐ４を特定としたとする。そして、第２の走査系１６−２に対して、第１の走査系１６−１の座標で注目箇所Ｐ０乃至Ｐ４を設定し、適切な時間で第２の走査系１６−２を介したレーザ光による刺激を行うと、蛍光物質の励起光放射により蛍光物質の量が変化する。その後、第１の走査系１６−１を用いて画像を再度取得すると、第２の走査系１６−２によるレーザ光の照射位置において蛍光発光が減少するので、輝度の低い点として、検出箇所Ｐ０’乃至Ｐ４’が検出される。
【００３５】
第１の走査系１６−１の座標と第２の走査系１６−２の座標とに誤差が生じていなければ、注目箇所Ｐ０乃至Ｐ４と検出箇所Ｐ０’乃至Ｐ４’とは一致するが、実際には誤差が生じているため、図２に示すように、検出箇所Ｐ０’乃至Ｐ４’が、注目箇所Ｐ０乃至Ｐ４とは異なる位置で検出される。なお、実際の誤差は僅かな量であるが、図２では誤差が誇張して示されている。
【００３６】
このような注目箇所Ｐ０乃至Ｐ４と検出箇所Ｐ０’乃至Ｐ４’との差は、第１の走査系１６−１と第２の走査系１６−２との同一座標に対する物理位置の違いを反映しているため、その差を解析することにより、例えば、第１の走査系１６−１の座標に対する第２の走査系１６−２の座標の関係性を求めることができる。
【００３７】
ここでは、第１の走査系１６−１の座標系を基準として、第２の走査系１６−２の座標系を第１の走査系１６−１に一致させるための手法について説明する。なお、同じ手法を用いて、仮想の座標系に対して、第１の走査系１６−１および第２の走査系１６−２の座標系を一致させるようにしてもよい。また、以下、適宜、第１の走査系１６−１の座標に基づいて第２の走査系１６−２を利用して観察面１２の注目箇所にレーザ光を照射し、その退色位置を形成することをマーキングと称する。
【００３８】
そして、注目箇所の座標と検出箇所の座標とを比較することにより、Ｘ軸の伸縮係数Ｓｘ、Ｙ軸の伸縮係数Ｓｙ、座標系の中心についてのＸ方向へのズレ量０ｘおよびＹ方向へのズレ量０ｙ、並びに、座標系の直交度についてのＸ軸のズレ角θｘおよびＹ軸のズレ角θｙが求められる。
【００３９】
Ｘ軸の伸縮係数Ｓｘは、第１の走査系１６−１上の２点のＸ軸方向の距離と、それらの２点に対応する第２の走査系１６−２上のＸ軸方向の距離との伸縮率を示す係数である。Ｙ軸の伸縮係数Ｓｙは、第１の走査系１６−１上の２点のＹ軸方向の距離と、それらの２点に対応する第２の走査系１６−２上のＹ軸方向の距離との伸縮率を示す係数である。
【００４０】
座標系の中心についてのＸ方向へのズレ量０ｘは、第１の走査系１６−１の原点と、第２の走査系１６−２の原点とのＸ方向の距離の差を示す値である。座標系の中心についてのＹ方向へのズレ量０ｙは、第１の走査系１６−１の原点と、第２の走査系１６−２の原点とのＹ方向の距離の差を示す値である。
【００４１】
座標系の直交度についてのＸ軸のズレ角θｘは、第２の走査系１６−２のＸ軸上の検出点を直線補完した線分（図２Ｂの検出箇所Ｐ１’およびＰ２’を通る直線）の第１の走査系１６−１のＸ軸に対する角度を示す値である。座標系の直交度についてのＹ軸のズレ角θｙは、第２の走査系１６−２のＹ軸上の検出点を直線補完した線分（図２Ｂの検出箇所Ｐ３’およびＰ４’を通る直線）の第１の走査系１６−１のＹ軸に対する角度を示す値である。
【００４２】
そして、第１の走査系１６−１により取得された画像に基づいて指定される注目箇所の座標（Ｘ１，Ｙ１）と、マーキング後に再度取得された画像から計測される検出箇所の座標（Ｘ２，Ｙ２）との関係は、次の式（１）および式（２）で表される。なお、伸縮率が座標位置によらない定数であり、各軸の傾斜角が固定されているものとする。
【００４３】
Ｘ２＝Ｓｘ×Ｘ１×ｃｏｓ（θｘ）＋Ｓｙ×Ｙ１×ｓｉｎ（θｙ）＋０ｘ
・・・（１）
Ｙ２＝Ｓｘ×Ｘ１×ｓｉｎ（θｘ）＋Ｓｙ×Ｙ１×ｃｏｓ（θｙ）＋０ｙ
・・・（２）
【００４４】
そして、第２の走査系１６−２によりマーキングが施された検出箇所を、第１の走査系１６−１での座標系において注目箇所に一致させるためには、式（１）および式（２）において、検出箇所の座標（Ｘ２，Ｙ２）を注目箇所の座標（Ｘ１，Ｙ１）に変換するような変換係数Ｘ’およびＹ’を求めればよい。即ち、次の式（３）および式（４）を満たすような変換係数Ｘ’およびＹ’を求めればよい。
【００４５】
Ｘ１＝Ｓｘ×Ｘ’×ｃｏｓ（θｘ）＋Ｓｙ×Ｙ’×ｓｉｎ（θｙ）＋０ｘ
・・・（３）
Ｙ１＝Ｓｘ×Ｘ’×ｓｉｎ（θｘ）＋Ｓｙ×Ｙ’×ｃｏｓ（θｙ）＋０ｙ
・・・（４）
【００４６】
ここで、Ｘ軸の伸縮係数Ｓｘ、Ｙ軸の伸縮係数Ｓｙ、座標系の中心についてのＸ方向へのズレ量０ｘおよびＹ方向へのズレ量０ｙ、並びに、座標系の直交度についてのＸ軸のズレ角θｘおよびＹ軸のズレ角θｙは、第１の走査系１６−１により取得された２枚の画像を適切に画像処理することにより計測することができ、既知の定数として扱うことができる。
【００４７】
従って、Ｓｘ×ｃｏｓ（θｘ）を定数ａとし、Ｓｙ×ｓｉｎ（θｙ）を定数ｂとし、０ｘを定数ｃとし、Ｓｘ×ｓｉｎ（θｘ）を定数ｄとし、Ｓｙ×ｃｏｓ（θｙ）を定数ｅとし、０ｙを定数ｆとすると、式（３）および式（４）は、次の式（５）および（６）で表される。
【００４８】
Ｘ１＝ａ×Ｘ’＋ｂ×Ｙ’＋ｃ
・・・（５）
Ｙ１＝ｄ×Ｘ’＋ｅ×Ｙ’＋ｆ
・・・（６）
【００４９】
そして、式（５）および（６）において、注目箇所の座標（Ｘ１，Ｙ１）も既知の値（ユーザにより注目箇所として指定される値）であるので、変換係数Ｘ’およびＹ’についての一次式の連立として解くことができ、変換係数Ｘ’およびＹ’を求めることができる。このようにして求められる変換係数Ｘ’およびＹ’を用いて、第１の走査系１６−１の座標系と第２の走査系１６−２の座標系とを一致させることができる。
【００５０】
このように、第１の走査系１６−１の座標系と第２の走査系１６−２の座標系とを一致させるためには、第１の走査系１６−１の座標系上での注目箇所の座標（Ｘ１，Ｙ１）を指定して、その注目箇所の座標（Ｘ１，Ｙ１）を第２の走査系１６−２の座標系に設定してマーキングを行わせる必要がある。
【００５１】
ここで、走査部１３と顕微鏡部１４とを組み合わせた状態で、観察面１２に蛍光材料を配置してマーキングを行う場合には、上述したように、走査部１３に起因する誤差と顕微鏡部１４に起因する誤差とが複合されてしまう。これにより、単純な変換係数を定義することが困難となる。そこで、レーザ走査顕微鏡１１では、走査部１３に起因する誤差と顕微鏡部１４に起因する誤差とを別け、走査部１３に起因する誤差を補正するためのマーキングが行われる。
【００５２】
次に、図３乃至図５を参照して、レーザ走査顕微鏡１１において、マーキングを実現する方法について説明する。
【００５３】
図３は、本発明を適用したレーザ走査顕微鏡１１における走査部１３の構成例を示す図である。
【００５４】
図３に示すように、走査部１３では、マーキングを行うための蛍光試料３４ｂが試料固定アダプタ３４ａに固定されて、集光レンズ３２によりレーザ光が集光される一次結像面３４に配置される。そして、第１の走査系１６−１の座標系上での注目箇所の座標（Ｘ１，Ｙ１）が第２の走査系１６−２に対して設定され、第２の走査系１６−２を介して蛍光試料３４ｂに対するマーキングが行われる。その後、第１の走査系１６−１を介して蛍光試料３４ｂに照射される画像を取得し、レーザ光が実際に照射された箇所が検出され、変換係数Ｘ’およびＹ’が求められる。
【００５５】
また、図４は、結合部１５を利用して蛍光試料３４ｂが固定された状態を示す図である。図４に示すように、試料固定アダプタ３４ａは、走査部１３を収納する筐体１３’に端に設けられる結合部１５を利用して、筐体１３’の内部に配置される。
【００５６】
図５は、一次結像面３４の近傍を拡大して示した図である。
【００５７】
結合部１５は、例えば、フランジ状の金物であり、筐体１３’の外側に装着されている。試料固定アダプタ３４ａは、結合部１５に挿入可能な略円柱形状の構造で、その先端部に蛍光試料３４ｂが取り付け可能となっている。また、試料固定アダプタ３４ａには、先端部の反対側の一部の外径が結合部１５の内径よりも大きな外径部３４ａ’が形成されており、試料固定アダプタ３４ａを筐体１３’の外側から結合部１５に挿入していき、外径部３４ａ’の先端側の面が結合部１５に当接したときに、蛍光試料３４ｂが一次結像面３４に配置されるような長さに形成されており、蛍光試料３４ｂの位置を決定する位置決め機構として機能する。これにより、蛍光試料３４ｂを一次結像面３４に容易に一致させることができる。
【００５８】
また、蛍光試料３４ｂは、その裏面に粘着剤が塗布されており、試料固定アダプタ３４ａの先端面に貼着され、容易に交換可能となっている。これにより、蛍光試料３４ｂを交換して、試料固定アダプタ３４ａを繰り返し利用することができるとともに、蛍光試料３４ｂの交換を短時間で行うことができる。
【００５９】
次に、図６乃至図１０を参照して、マーキングを行う座標の選択（座標配置）について説明する。
【００６０】
図６には、第１の走査系１６−１における最大走査範囲で取得した画像における座標系が示されている。走査部１３では、最大走査範囲内の複数の箇所にマーキングを行う。
【００６１】
ここで一次結像面３４に配置される蛍光試料３４ｂにマーキングを行うには、蛍光試料３４ｂの材質にもよるが、安価な蛍光シールを採用することができ、そのような蛍光シールに対して、１点のマーキングを行うのに数秒の時間が必要となる。また、第１の走査系１６−１によるラスタス走査により画像を取得する際の走査倍率を変更すると、通常、スキャナを駆動する振幅が変化することにより諸特性が変化するため、上述の変換原理式（式（５）および（６））より求められる変換係数Ｘ’およびＹ’も変化することになる。
【００６２】
従って、単一の走査倍率ごとに、それぞれ適応させる変換係数Ｘ’およびＹ’を求める必要がある。そこで、例えば、観察を行う代表的な走査倍率について、個別に変換係数Ｘ’およびＹ’を取得する処理が行われる。
【００６３】
なお、走査倍率とは、走査系による走査可能な最大の範囲である最大走査範囲に対する、観察時の走査範囲の比率の逆数である。例えば、観察時の走査範囲が、最大走査範囲の半分である場合、観察により得られる画像を、最大走査範囲において得られる画像と同一の大きさで取得（表示）すると、２倍の倍率で観察したときと同様の効果が得られるため、一般的に、走査倍率と呼ばれる。
【００６４】
さらに、走査倍率ごとに変換係数Ｘ’およびＹ’を取得する他、例えば、走査部１３の光学的特性ごとに変換係数Ｘ’およびＹ’が取得される。即ち、走査部１３では、ダイクロイックミラー３１や３５などを交換することができるように構成されており、観察に使用するレーザ光の波長および蛍光材料の組み合わせに応じて、ダイクロイックミラー３１や３５などが切り替えられる。このようなダイクロイックミラー３１や３５などを変更に伴って、走査部１３の光学的特性が変化して、第１の走査系１６−１の座標系と第１の走査系１６−２の座標系との誤差が変化するため、走査部１３の光学的特性ごとに変換係数Ｘ’およびＹ’を取得する必要がある。
【００６５】
具体的には、検出箇所を５点とし、７つの倍率（１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、６倍、８倍）のそれぞれで、６種類の波長選択フィルタを使用するときにおいて変換係数Ｘ’およびＹ’を取得するとした場合、マーキングを行う箇所は、２１０箇所（２１０＝５×７×６）となる。そして、１点のマーキングに必要な時間を３秒とすると、２１０箇所のマーキングを行うには、６２０秒が必要となる。
【００６６】
さらに、走査倍率および波長選択フィルタの種類ごとに蛍光試料を交換してマーキングを行うとした場合、４２回（４２＝７×６）の交換作業が必要となる。全てのマーキングに必要な時間である６２０秒と、蛍光試料を４２回交換する手間は、製造効率を低下させる原因となる。さらに、変換係数Ｘ’およびＹ’を取得する処理を、メンテナンスなどでレーザ走査顕微鏡１１が設置されているユーザ先で行う場合は、大きな問題となる恐れがある。即ち、マーキングの手間を削減することは、実用上重要な用件である。
【００６７】
そこで、図６に示されるような座標系において、全ての倍率（１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、６倍、８倍）のマーキングを一度に一枚の蛍光試料に行い、計測のみ倍率を変更して行うようにすることで、倍率による蛍光試料の交換を不要とすることができる。また、各倍率で共通となる座標が存在する場合は、その座標点数が、総マーキング数の削減にも貢献するため、マーキング時間を削減することができる。
【００６８】
図６に示すように、最大走査範囲を座標（ｘ，ｙ）で表現すると、-1.0 ≦ｘ≦ +1.0、-1.0 ≦ｙ≦ +1.0の範囲となるように、第１の走査系１６−１での座標系を設定する。
【００６９】
そして、マーキングを行う座標は、第１の走査系１６−１での座標系上で、各倍率での検出箇所の配置が重なり合うように決定される。以下では、図２に示したような５つの注目箇所に応じた点、即ち、座標系の原点に対応する点Ｐ０、Ｘ軸上の走査範囲の両端近傍の点Ｐ１および点Ｐ２、並びに、Ｙ軸上の走査範囲の両端近傍の点Ｐ３および点Ｐ４を、マーキングを行う点として説明する。
【００７０】
図７には、走査倍率が１倍であるときのマーキングを行う５つの点Ｐ０乃至Ｐ４が示されている。図７に示すように、走査倍率が１倍であるときのマーキングを行う点の座標は、原点に対応する点Ｐ０(0.0,0.0)、Ｘ軸上の２つの点Ｐ１(-0.9,0.0)および点Ｐ２(0.9,0.0)、Ｙ軸上の２つの点Ｐ３（0.0,-09）および点Ｐ４（0.0,0.9）となる。
【００７１】
そして、走査倍率が１．５倍であるときには、１倍の倍率での点Ｐ０乃至Ｐ４の座標を、倍率（１．５）で割った値に決定することで、１．５倍の倍率での点Ｐ０乃至Ｐ４が、１倍の倍率での点Ｐ０乃至Ｐ４と同様に配置される。
【００７２】
図８には、走査倍率が１．５倍であるときのマーキングを行う５つの点Ｐ０乃至Ｐ４が示されている。図８に示すように、走査倍率を１．５倍としたときのマーキングを行う座標は、原点に対応する点Ｐ０(0.0,0.0)、Ｘ軸上の２つの点Ｐ１(-0.6,0.0)および点Ｐ２(0.6,0.0)、Ｙ軸上の２つの点Ｐ３（0.0,-0.6）および点Ｐ４（0.0,0.6）となる。
【００７３】
このようにマーキングを行う座標を決定することで、１倍の倍率での走査範囲Ｔ１に対するマーキングを行う箇所の配置（図７）と、１．５倍の倍率での走査範囲Ｔ１．５に対するマーキングを行う箇所の配置（図８）とが、相対的に同一の配置とされる。
【００７４】
以下、同様に、走査倍率を２倍としたときのマーキングを行う座標を、原点に対応する点Ｐ０(0.0,0.0)、Ｘ軸上の２つの点Ｐ１(-0.45,0.0)および点Ｐ２(0.45,0.0)、Ｙ軸上の２つの点Ｐ３（0.0,-0.45）および点Ｐ４（0.0, 0.45）とすることで、１倍の倍率での走査範囲Ｔ１に対するマーキングを行う箇所の配置と、２倍の倍率での走査範囲Ｔ２（図９）に対するマーキングを行う箇所の配置とが、相対的に同一の配置とされる。
【００７５】
また、走査倍率を３倍としたときのマーキングを行う座標を、原点に対応する点Ｐ０(0.0,0.0)、Ｘ軸上の２つの点Ｐ１(-0.3,0.0)および点Ｐ２(0.3,0.0)、Ｙ軸上の２つの点Ｐ３（0.0,-0.3）および点Ｐ４（0.0,0.3）とすることで、１倍の倍率での走査範囲Ｔ１に対するマーキングを行う箇所の配置と、３倍の倍率での走査範囲Ｔ３（図９）に対するマーキングを行う箇所の配置とが、相対的に同一の配置とされる。
【００７６】
また、走査倍率を４倍としたときのマーキングを行う座標を、原点に対応する点Ｐ０(0.0,0.0)、Ｘ軸上の２つの点Ｐ１(-0.225,0.0)および点Ｐ２(0.225,0.0)、Ｙ軸上の２つの点Ｐ３（0.0,-0.225）および点Ｐ４（0.0,0.225）とすることで、１倍の倍率での走査範囲Ｔ１に対するマーキングを行う箇所の配置と、４倍の倍率での走査範囲Ｔ４（図９）に対するマーキングを行う箇所の配置とが、相対的に同一の配置とされる。
【００７７】
また、走査倍率を６倍としたときのマーキングを行う座標を、原点に対応する点Ｐ０(0.0,0.0)、Ｘ軸上の２つの点Ｐ１(-0.15,0.0)および点Ｐ２(0.15,0.0)、Ｙ軸上の２つの点Ｐ３（0.0,-0.15）および点Ｐ４（0.0,0.15）とすることで、１倍の倍率での走査範囲Ｔ１に対するマーキングを行う箇所の配置と、６倍の倍率での走査範囲Ｔ６（図９）に対するマーキングを行う箇所の配置とが、相対的に同一の配置とされる。
【００７８】
また、走査倍率を８倍としたときのマーキングを行う座標を、原点に対応する点Ｐ０(0.0,0.0)、Ｘ軸上の２つの点Ｐ１(-0.1125,0.0)および点Ｐ２(0.1125,0.0)、Ｙ軸上の２つの点Ｐ３（0.0,-0.1125）および点Ｐ４（0.0,0.1125）とすることで、１倍の倍率での走査範囲Ｔ１に対するマーキングを行う箇所の配置と、８倍の倍率での走査範囲Ｔ８（図９）に対するマーキングを行う箇所の配置とが、相対的に同一の配置とされる。
【００７９】
このように、１倍の倍率での点Ｐ０乃至Ｐ４の座標を、各倍率で割った値に決定することで、走査範囲に対するマーキングを行う箇所の配置が各倍率で同一となるように、マーキングを行う箇所が設定される。このように同一となるような配置とすることにより、マーキングされた位置を計測する処理を簡便化することができる。なお、必ずしもこのような関係とする必要はない。
【００８０】
従って、レーザ走査顕微鏡１１において、変換係数Ｘ’およびＹ’を求める際に、各倍率でのマーキングを１枚の蛍光試料に対して行うことができるので、倍率ごとに蛍光試料を交換する手間を省くことになり、作業効率を著しく向上させることができる。
【００８１】
また、各倍率において、マーキングを行う箇所は、点Ｐ０乃至点ｐ４の５箇所に限られるものではなく、補正を精度よく行うために、さらに多くの箇所に対して、様々な組み合わせでマーキングを行っても良い。即ち、図６乃至９での説明は、処理を簡略化および単純化したときの例であり、このような例でもって、本発明の主旨に影響をあたえることはない。例えば、図１０は、より複雑なマーク座標を組み合わせた例を示している。
【００８２】
このように、蛍光試料３４ｂに対する複数箇所のマーキングを行うことにより、レーザ走査顕微鏡１１の走査部１３において、第１の走査系１６−１の座標系と第２の走査系１６−２の座標系との誤差を解消する処理が行われる。
【００８３】
即ち、まず、蛍光試料３４ｂを試料固定アダプタ３４ａの先端に貼着させ、結合部１５に試料固定アダプタ３４ａを挿入して、一次結像面３４に蛍光試料３４ｂを配置する作業が行われる。次に、図６乃至図１０を参照して説明したような走査倍率ごとの所定箇所の座標（第１の走査系１６−１の座標系での座標）を設定し、第２の走査系１６−２を駆動させて、レーザ光源２１−２から出力されるレーザ光を蛍光試料３４ｂに照射して、マーキングする作業が行われる。その後、第１の走査系１６−１を駆動させて、走査倍率ごとに走査範囲の画像を取得する作業が行われる。
【００８４】
そして、走査倍率の画像ごとに、その走査倍率の補正で使用するマーキングを検出して、第１の走査系１６−１の座標系におけるマーキングの座標を求める作業が行われる。このようにして検出された座標（検出箇所の座標）と、マーキングにおいて設定した座標（注目箇所の座標）とに基づいて、第２の走査系１６−２の座標系を、第１の走査系１６−１の座標系に一致させるような変換係数を算出する作業が行われ、レーザ走査顕微鏡１１を制御する制御装置に記憶される。
【００８５】
以上のように、レーザ走査顕微鏡１１では、一次結像面３４に配置される蛍光試料３４ｂを使用して、第１の走査系１６−１の座標系と第２の走査系１６−２の座標系との間の誤差を解消可能な変換係数を求めることができる。従って、第１の走査系１６−１の座標系に基づいて入力される注目箇所の座標を、変換係数を使用して変換し、その変換後の座標に従って第２の走査系１６−２によりレーザ光を照射することで、入力された注目箇所に第２の走査系１６−２を介してレーザ光を確実に照射することができる。
【００８６】
また、このような変換係数を求める処理は、走査部１３側だけで行うことができ、走査部１３と顕微鏡部１４とを組み合わせた状態で変換係数を求める場合よりも変換係数を容易に求めること、即ち、誤差の調整を容易に行うことができる。
【００８７】
即ち、走査部１３と顕微鏡部１４とを組み合わせた状態では、それぞれに起因する誤差が複合されてしまい、第１の走査系１６−１の座標系と第２の走査系１６−２の座標系との関係を単純な係数で定義することは困難である。これに対し、走査部１３側だけで変換係数を求めることにより、単純な係数で定義することができ、誤差の調整が容易となる。このように、様々な誤差要因のうち、対物レンズ３３を含む顕微鏡部１４に起因する誤差以外を走査系単独で補正し、誤差の要因を単純化することにより、レーザ走査顕微鏡１１による最終画像による補正量を最小にすることができるとともに、補正を単純化または不要とすることができる。
【００８８】
また、走査部１３と顕微鏡部１４とを組み合わせた状態でマーキングを行うには、プレパラートに試料を乗せ、かつ、実際の観察試料と同程度の厚みでなければならないなど、変換係数を求めるための制限が多かった。これに対し、本実施の形態では、一次結像面３４に配置される蛍光試料３４ｂを利用するので、そのような制限もなく、また、上述のように蛍光シールを採用することで作業を容易に行うことができる。
【００８９】
また、通常、走査部１３と顕微鏡部１４とが組み合わされるのは、レーザ走査顕微鏡１１の設置時であり、従来、レーザ走査顕微鏡１１が納入されるユーザ先で、変換係数を求めて誤差を調整する処理を行う必要があった。これに対し、走査部１３だけで変換係数を求めて誤差を調整する処理を行うことができるので、例えば、レーザ走査顕微鏡１１の出荷前に工場などで処理を行うことができる。
【００９０】
なお、蛍光試料３４ｂの画像からマーキングの位置を求める処理を行うとき、走査倍率ごとに適切な大きさのマーキングを行うことにより、マーキングされた箇所の座標をより正確に求めることができる。
【００９１】
図１１乃至図１３を参照して、走査倍率ごとに適切な大きさのマーキングを行うための補助マーキング座標について説明する。
【００９２】
第１の走査系１６−１において走査されるレーザ光の走査範囲を画像として認識するために、観察面１２上の走査位置と光検出器３７の強度信号が示す蛍光の輝度を時間的に関連付ける処理が行われる。そして、レーザ光が走査される走査速度と、取得される画像の解像度との関係に基づいて、観察面１２から発せられる蛍光の輝度は、一定の範囲からの輝度の積分値として検出される。
【００９３】
また、観察面１２上で走査されるレーザ光には一定の大きさ（以下、適宜、観察面１２に照射されるレーザ光の大きさをスポット径と称する）があり、観察面１２とレーザ光源２１との光学的な関係により、スポット径は決定される。従って、解像度、走査範囲、およびスポット径の関係に基づいて、観察面１２におけるスポットの位置を分解することの限界が存在する。
【００９４】
図１１を参照して、解像度、走査範囲、およびスポット径の関係について説明する。
【００９５】
図１１には、Ｘ軸の走査による時間変化と解像度により決定される１画素の輝度積算範囲と、その輝度積算範囲ごとに得られる輝度値の変化が示されており、輝度値の変化は、横軸を画素位置とし縦軸を蛍光の輝度として表されている。また、図１１Ａおよび図１１Ｂには、１画素に相当する輝度積算範囲内の異なる位置にスポットがある例が示されており、図１１Ｃには、２画素の輝度積算範囲に跨る位置にスポットがある例が示されている。
【００９６】
Ｘ軸方向の輝度積算範囲は、画像の解像度に応じて決定され、スポット径が輝度積算範囲より小さい場合、図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、１画素に相当する輝度積算範囲内の異なる位置にマーキングが行われていても、検出される輝度値が同じであるため、１画素に相当する輝度積算範囲内でのマーキングの位置情報は変化しないことになる。即ち、１画素に相当する輝度積算範囲内の異なる位置にマーキングが行われていても、同一の位置にマーキングが行われたとして検出される。
【００９７】
これに対し、図１１Ｃに示すように、図１１Ａおよび図１１Ｂに示されているスポットと同一の大きさのスポットであっても、２画素の輝度積算範囲に跨る位置にマーキングが行われているとき、その２画素で検出される輝度値に差が発生する。即ち、それぞれの輝度積算範囲におけるスポットの大きさによって、それぞれの画素で検出される輝度値が変化する。従って、この輝度値の比率から、微小なスポット位置の差を演算により算出することができる。
【００９８】
このように、マーキングによるスポットが、複数の画素に必ず跨るようなマーキングを行うことで、例えば、隣接するように複数のスポットによるマーキングを行い、複数の画素で検出される輝度値の差から、そのマーキングの中心位置を精密に算出することができる。
【００９９】
図１２には、倍率ごとのマーキングの例が示されている。
【０１００】
例えば、倍率が１倍であるときの輝度積算範囲のＸ方向の長さが、スポット径の２倍以上であり３倍以下であるとき、１倍の倍率では、３つのスポットが隣接するようなマーキングが行われる。これにより、３つのスポットからなるマーキングは、２つの輝度積算範囲に必ず跨るようになり、そのマーキングが跨る輝度積算範囲の差から、マーキングの中心位置（この場合、中央のスポットの中心の位置）が求められる。
【０１０１】
そして、倍率が１．５倍および２倍の場合には、２つのスポットが隣接するようなマーキングを行うことで、そのマーキングが跨る輝度積算範囲の差から、マーキングの中心位置（この場合、２つのスポットの中間の位置）が求められる。また、倍率が３倍および８倍の場合には、１つのスポットによるマーキングを行っても、そのマーキングは、２つの輝度積算範囲に必ず跨るようになり、そのマーキングが跨る輝度積算範囲の差から、マーキングの中心位置（スポットの中間の位置）が求められる。
【０１０２】
なお、図１２では、Ｘ軸方向について説明したが、Ｙ軸方向についても同様に、隣接するように複数のスポットによるマーキングを行うことで、マーキングの中心位置を精密に算出することができる。
【０１０３】
図１３には、Ｙ方向にも複数のスポットによるマーキングを行う例が示されている。
【０１０４】
例えば、倍率が１倍であるときには、中央のスポットの上下および左右にスポットが隣接するような５つのスポットによるマーキングが行われる。また、倍率が１．５倍および２倍であるときには、スポットが接する点を中心に上下および左右に２つずつスポットが隣接するような４つのスポットによるマーキングが行われる。
【０１０５】
このようなマーキングを行うことにより、マーキングの中心位置を、Ｘ方向およびＹ方向に精密に算出することができる。即ち、マーキングによるスポット径が一定の大きさであったとしても、倍率と解像度に応じて適切な大きさとなるように連続的にスポットを形成することで、複数の画素に跨るような大きさのマーキングを行うことができる。このようなマーキングを行うことが、精度の高いマーキング位置情報の計測を行うのに重要となる。
【０１０６】
次に、図１４は、図１のレーザ走査顕微鏡１１を使用して、注目箇所に光刺激をして観察を行う処理を説明するフローチャートである。
【０１０７】
レーザ走査顕微鏡１１の制御装置には、上述したように、一次結像面３４に配置される蛍光試料３４ｂに対するマーキングから求められた補正係数が記憶されている。ステップＳ１１において、レーザ光源２１−１が観察用のレーザ光を射出し、第１の走査系１６−１が観察面１２でレーザ光を走査させ、光検出器３７からの出力に基づいて、観察面１２の画像が取得される。これにより、例えば、図１５に示すような視野の画像５１が取得されて、図示しない表示装置に表示される。
【０１０８】
そして、ユーザが、画像５１に写されている観察対象５２において、レーザ光による刺激を行う注目箇所を指定すると、ステップＳ１２において、その注目箇所の座標（Ｘｔ，Ｙｔ）が特定される。このとき、注目箇所は、画像５１に対応付けられた座標系で表されるため、注目箇所の座標（Ｘｔ，Ｙｔ）は、計測された画像５１の座標系、即ち、第１の走査系１６−１の座標系に従って取得される。
【０１０９】
ステップＳ１３において、予め記憶されている補正係数を用いた補正計算により、第２の走査系１６−２の座標系における注目箇所の座標（Ｘｔ，Ｙｔ）に一致する座標に補正する演算を行い、その補正後の補正座標を取得する。
【０１１０】
ステップＳ１４において、ステップＳ１３で取得した補正座標を、第２の走査系１６−２に対する走査位置情報として与え、その走査位置情報に基づいて、第２の走査系１６−２を駆動させるための走査信号が設定される。
【０１１１】
ステップＳ１５において、レーザ光源２１−２が刺激用のレーザ光を射出し、第２の走査系１６−２が、ステップＳ１４で設定された走査信号に従って駆動してレーザ光を走査することで、注目箇所に光刺激が行われる。
【０１１２】
ステップＳ１６において、ステップＳ１１と同様に、観察用のレーザ光が第１の走査系１６−１により再走査し、光刺激が行われた後の画像が取得され、処理は終了する。このとき、図１５に示すように、ステップＳ１２において特定された座標に一致する座標（Ｘｔ，Ｙｔ）に、光刺激により退色した箇所が検出される。
【０１１３】
以上のように、レーザ走査顕微鏡１１では、補正係数を用いた補正計算により、第１の走査系１６−１で得た画像に基づいて座標から第２の走査系１６−２における補正座標を求めることができるので、第１の走査系１６−１で得られた画像上の意図した箇所に、第２の走査系１６−２を介したレーザ光の照射を確実に行うことができる。
【０１１４】
即ち、従来のレーザ走査顕微鏡では、第１の走査系で得た座標を第２の走査系にそのまま設定すると、第１の走査系の座標と第２の走査系の座標との間の誤差によって、第１の走査系で得られた画像上の意図した箇所とは異なる位置に、第２の走査系を介したレーザ光が照射されていた。これに対し、レーザ走査顕微鏡１１では、そのような座標間の誤差を解消することができるので、目標箇所と、実際にレーザ光が照射される箇所とを一致させることができる。
【０１１５】
なお、本実施の形態においては、一次結像面３４において第１の走査系の座標と第２の走査系の座標とが一致するように補正が行われており、このような走査部１３における補正では、顕微鏡部１４の対物レンズ３３に起因する誤差は補正されないため、実際には、対物レンズ３３の歪なども補正する必要がある。しかしながら、対物レンズ３３に起因する誤差によるズレ量は、走査部１３における誤差に対する補正（本実施の形態における補正）が行われない場合に比較して僅かなものであり、かつ、同一の対物レンズ３３に対しては同一の補正を適用することができるため、観察を行うたびに補正値を取得する必要がない。これにより、レーザ走査顕微鏡１１の利便性を著しく向上させることができる。
【０１１６】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【０１１７】
１１  レーザ走査顕微鏡，  １２  観察面，  １３  走査部，  １４  顕微鏡部，  １５  結合部，  １６−１  第１の走査系，  １６−２  第２の走査系，  ２１−１および２１−２  レーザ光源，  ２２−１および２２−２  集光レンズ，  ２３−１および２３−２  Ｘ軸走査手段，  ２４−１および２４−２  Ｘ軸走査ミラー，  ２５−１および２５−２  Ｙ軸走査手段，  ２６−１および２６−２  Ｙ軸走査ミラー，  ３１  ダイクロイックミラー，  ３２  集光レンズ，  ３３  対物レンズ，  ３４  一次結像面，  ３４ａ  試料固定アダプタ，  ３４ｂ  蛍光試料，  ３５  ダイクロイックミラー，  ３６  結像レンズ，  ３７  光検出器
【図１】
2011008219.tif 000003
【図２】
2011008219.tif 000004
【図３】
2011008219.tif 000005
【図４】
2011008219.tif 000006
【図５】
2011008219.tif 000007
【図６】
2011008219.tif 000008
【図７】
2011008219.tif 000009
【図８】
2011008219.tif 000010
【図９】
2011008219.tif 000011
【図１０】
2011008219.tif 000012
【図１１】
2011008219.tif 000013
【図１２】
2011008219.tif 000014
【図１３】
2011008219.tif 000015
【図１４】
2011008219.tif 000016
【図１５】
2011008219.tif 000017