(57)【要約】    【課題】  正常細胞に影響を及ぼすことなく病的な新生血管の原因となる血管内皮細胞の増殖を抑制可能かつ安価に提供可能な、血管内皮細胞増殖抑制剤を提供すること。    【解決手段】  トレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤とする。特にトレハロース濃度を２．５〜１０．０重量％以上とすることができる。トレハロースを有効成分とする血管内皮細胞増殖抑制効果は、トレハロース濃度に依存する。血管内皮細胞増殖抑制剤は、新生血管退縮促進、結膜や角膜における新生血管退縮促進、脈絡膜新生血管退縮促進、硝子体切除手術時またはその他の場合における出血抑制などに用いることができる。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
トレハロース濃度が２．５重量％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
新生血管退縮促進のための、請求項１または２に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
結膜や角膜における新生血管退縮促進のための、請求項１または２に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
脈絡膜新生血管退縮促進のための、請求項１または２に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
硝子体切除手術時またはその他の場合における出血抑制のための、請求項１または２に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
結膜や角膜その他の眼球表面に発生する病的新生血管に対する点眼治療に用いるための、請求項１または２に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
網膜または脈絡膜に発生する病的新生血管に対する局所注射薬として用いるための、請求項１または２に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
眼科手術または治療において、被検体と連続する空間に対してトレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤を供給する、血管内皮細胞増殖抑制剤方法。
【請求項１０】
人間以外の動物の眼科手術または治療において、被検体と連続する空間に対してトレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤を供給する、血管内皮細胞増殖抑制剤方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管内皮細胞増殖抑制剤および増殖抑制方法に係り、特に、正常細胞に影響を及ぼすことなく、新規に増殖する血管内皮細胞に対して特異的に増殖抑制作用を発揮でき、しかも安価に提供可能な、血管内皮細胞増殖抑制剤および増殖抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トレハロースは、生体に無害な二単糖として、広く医薬品や化粧品、さらには食品にも使用されている。トレハロースには、極度に乾燥した状態でも、細胞や他の化学物質を安定した状態に保存するという特性がある。眼科領域においても、ドライアイに対する角膜上皮保護効果や、冷凍羊膜の保存効果が既に知られており、後掲特許文献開示のものなど、トレハロース点眼薬としての技術的提案もなされている。
【０００３】
このうち特許文献１は、シェーグレン症候群における眼の臨床症状の治療・予防剤として、トレハロースを有効成分として含有する眼科用医薬組成物を技術開示するものである。また特許文献２は、角膜保護作用を有する安全な眼科用医薬組成物として、トレハロースを用いる医薬組成物を開示するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１６１０３８号公報「眼科用医薬組成物」
【特許文献２】特開平９−２３５２３３号公報「トレハロースを含有する眼科用医薬組成物」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし眼科領域では、上述の事例以外の目的でトレハロースが単独に治療薬として使用されることはなく、また、細胞保護以外の効果の存在も知られていない。一方、病的な新生血管の原因となる血管内皮細胞の増殖を抑制するためには、従来、血管内皮細胞増殖因子に対するモノクローナル抗体の使用が臨床応用されている。しかしこれは、高額である点が問題となっている。
【０００６】
そこで本発明が解決しようとする課題は、かかる従来技術の状況を踏まえ、正常細胞に影響を及ぼすことなく病的な新生血管の原因となる血管内皮細胞の増殖を抑制することの可能な、しかも安価に提供可能な、血管内皮細胞増殖抑制剤および増殖抑制方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
さて本願発明者らは、培養条件下でヒト血管内皮細胞を発育・増殖させ、培養液に各濃度のトレハロースを添加して培養細胞の活性度を評価したところ、トレハロースの濃度に依存して血管内皮細胞の増殖が抑制されるという事実を発見した。これにより、結膜や角膜などの眼球表面に発生する病的新生血管に対する点眼治療や、網膜および脈絡膜に発生する病的新生血管に対する局所注射薬として、トレハロースを利用可能であることを見出し、本発明の完成に至った。すなわち、上記課題を解決するための手段として本願で特許請求される発明、もしくは少なくとも開示される発明は、以下のとおりである。
【０００８】
〔１〕  トレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤。
〔２〕  トレハロース濃度が２．５重量％以上であることを特徴とする、〔１〕に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
〔３〕  新生血管退縮促進のための、〔１〕または〔２〕に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
〔４〕  結膜や角膜における新生血管退縮促進のための、〔１〕または〔２〕に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
〔５〕  脈絡膜新生血管退縮促進のための、〔１〕または〔２〕に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
【０００９】
〔６〕  硝子体切除手術時またはその他の場合における出血抑制のための、〔１〕または〔２〕に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
〔７〕  結膜や角膜その他の眼球表面に発生する病的新生血管に対する点眼治療に用いるための、〔１〕または〔２〕に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
〔８〕  網膜または脈絡膜に発生する病的新生血管に対する局所注射薬として用いるための、〔１〕または〔２〕に記載の血管内皮細胞増殖抑制剤。
〔９〕  眼科手術または治療において、被検体と連続する空間に対してトレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤を供給する、血管内皮細胞増殖抑制剤方法。
〔１０〕  人間以外の動物の眼科手術または治療において、被検体と連続する空間に対してトレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤を供給する、血管内皮細胞増殖抑制剤方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤および増殖抑制方法は上述のように構成されるため、これによれば、新規に発見されたトレハロースの血管内皮細胞増殖抑制機能を利用して、既存の正常細胞に対する増殖抑制等の影響を何ら引き起こすことなく、新規に増殖する血管内皮細胞に対して特異的に増殖抑制作用を発揮して、病的な血管新生に起因する各種疾患に対する治療を、効果的に行うことが可能となる。また、トレハロースは大量生産技術が確立しているため、本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤を用いることによって、血管内皮細胞の増殖抑制効果を従来よりも安価に提供することができる。
【００１１】
本発明によれば、たとえば、結膜や角膜の新生血管に対してトレハロースを点眼薬として使用すること、病的新生血管を伴う増殖糖尿病網膜症に対する硝子体切除手術前にトレハロースを硝子体内に注射し、これによって病的新生血管を退縮させ、手術時の出血を抑制して手術成功率を高めること、さらに加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管に対し、硝子体注射により退縮促進させること等が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例で、無処置の血管内皮細胞（黒く染色された細胞）と線維芽細胞（染色されない細胞）を示す顕微鏡写真。
【図２】ＶＥＧＦ添加により血管内皮細胞の増殖を刺激した増殖刺激群を示す顕微鏡写真。
【図３】ＶＥＧＦとともにｓｕｒａｍｉｎを添加して血管内皮細胞の増殖を抑制した状態（陰性対照）を示す顕微鏡写真。
【図４】ＶＥＧＦとともに２．５％トレハロースを添加した状態を示す顕微鏡写真。
【図５】ＶＥＧＦとともに５．０％トレハロースを添加した状態を示す顕微鏡写真。
【図６】ＶＥＧＦとともに７．５％トレハロースを添加した状態を示す顕微鏡写真。
【図７】ＶＥＧＦとともに１０．０％トレハロースを添加した状態を示す顕微鏡写真。
【図８】ＣＤ３１にて染色された領域のうち、管腔面積を比較したグラフ。
【図９】ＣＤ３１にて染色された領域のうち、管腔ネットワーク総延長を比較したグラフ。
【図１０】ＣＤ３１にて染色された領域のうち、血管分岐点の数を比較したグラフ。
【図１１】ＣＤ３１にて染色された領域のうち、血管分岐点から分かれる分枝の数を比較したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について、さらに詳細に説明する。
本発明のトレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤は、トレハロース濃度に限定されないが、実施例に後述するように、特にトレハロース濃度を２．５重量％（以下、単に「２．５％」等とする。）以上としてもよい。トレハロースを有効成分とする血管内皮細胞増殖抑制効果は、トレハロース濃度に依存すると認められるからである。なお実施例に述べるように、特に７．５％を中心とした５．０％以上１０．０％以下の濃度範囲とすればさらに良好な結果が得られる。
【００１４】
本発明の血管内皮細胞増殖抑制剤の用途としては、たとえば、新生血管退縮促進、結膜や角膜における新生血管退縮促進、脈絡膜新生血管退縮促進、硝子体切除手術時またはその他の場合における出血抑制、結膜や角膜その他の眼球表面に発生する病的新生血管に対する点眼治療、網膜または脈絡膜に発生する病的新生血管に対する局所注射用途などがある。
【００１５】
眼科手術または治療において、被検体と連続する空間に対してトレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤を供給することにより、本発明の血管内皮細胞増殖抑制作用を被検体において実現させる。
【００１６】
なお本発明は、主として人間の眼科手術や治療における利用を想定したものであるが、人間以外の動物、たとえば犬・猫といった愛玩動物の眼科手術・治療においても同様に、被検体と連続する空間に対してトレハロースを用いた血管内皮細胞増殖抑制剤を供給し、これにより本発明の血管内皮細胞増殖抑制作用を被検体において実現させることが可能である。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明がかかる実施例に限定されるものではない。なお実施例は、本願発明者による実験の概要を記すものである。
＜１  実験目的＞
トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）による血管新生の抑制の有無につき、細胞培養（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における評価を行う。
【００１８】
＜２  実験方法＞
トレハロースの血管内皮細胞増殖への抑制効果を検証するために、ヒト正常臍帯静脈内皮細胞（Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（ＨＵＶＥＣ）、ＫＵＲＡＢＯ社製、品番ＫＺ−１０００）と正常皮膚ヒト線維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＮＨＤＦ）、ＫＵＲＡＢＯ社製、品番ＫＺ−１０００）とを共培養して、培養液中に各濃度のトレハロース（ナカライテスク社製、品番３４４１３−９２）を添加した。なお、内皮細胞の増殖を促進するために血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＫＵＲＡＢＯ社製、品番ＫＺ１０００）を添加した群と、陰性対照として血管新生の抑制因子ｓｕｒａｍｉｎ（ＫＵＲＡＢＯ社製、品番ＫＺ−１３００）を添加した群と設けた。
【００１９】
前者すなわち増殖刺激群では、ＶＥＧＦとしてＶＥＧＦ−Ａ（ＫＵＲＡＢＯ社製、品番ＫＺ１０００）を１０ｎｇ／ｍｌ濃度で用いた。これは、血管生成が最も強くなる濃度である。本実験ではすべて、この濃度を用いた。また、後者すなわち増殖抑制対照群では、Ｓｕｒａｍｉｎ５０μＭを用いた。トレハロース添加の群を、これら二つの群と比較した。
【００２０】
培養１１日目に血管内皮細胞を染色するためＣＤ３１（ＫＵＲＡＢＯ社製、品番ＫＺ−１２２５）による免疫染色を行い、内皮細胞を定性的に観察（黒色に染色されるのが、内皮細胞）した。加えて、血管面積や分岐数などを計測して、定量的に判定した。なお、観察は実体顕微鏡にて行い、１００倍と２００倍の画像を写真撮影した。
【００２１】
＜２  実験結果と考察＞
図１〜７に、実験結果の顕微鏡写真を示す。各図とも複数の観察写真を挙げるが、いずれも上２段が倍率１００倍での観察、下２段が２００倍での観察結果である。なお、表１に各図実験結果に係る培養条件を示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
まず図１は、培養液中にＶＥＧＦやｓｕｒａｍｉｎを添加せずに培養された無処置の血管内皮細胞（黒く染色された細胞）と、線維芽細胞（染色されない細胞）を示す写真である。また図２は、培養液中にＶＥＧＦ添加して血管内皮細胞の増殖を刺激した増殖刺激群、図３は、ＶＥＧＦとともにｓｕｒａｍｉｎを添加して血管内皮細胞の増殖を抑制した増殖抑制対照群（陰性対照）を、それぞれ示す写真である。
【００２４】
図４以降の各図は、培養液中にＶＥＧＦとともに２．５％以上のトレハロースを添加した状態を示す写真である。各図に示した状態は、順に、トレハロース濃度２．５％、５．０％、７．５％、１０．０％である。これらに示されるように、トレハロースを添加した群ではいずれも、図２に示した増殖刺激群と比較して血管内皮細胞の増殖が抑制された。そして、トレハロース濃度が高くなるにしたがい、増殖抑制作用は強くなる傾向がうかがえた。
【００２５】
７．５％トレハロース添加群では、それより低濃度の添加群と比べ、増殖刺激群と比較した血管内皮細胞の増殖抑制効果が一層高かった。また、図３に示したＳｕｒａｍｉｎを用いた増殖抑制対照群と同等以上の増殖抑制効果の可能性がうかがえた。さらに１０．０％トレハロース添加群では、増殖刺激群と比較して血管内皮細胞の増殖が顕著に抑制されたのみならず、Ｓｕｒａｍｉｎを用いた増殖抑制対照群よりも高い増殖抑制効果の可能性がうかがえた。また、線維芽細胞もその大半が死滅していることが観察された。
【００２６】
図８〜１１に、定量解析結果のグラフを示す。各図中の表示については、下記のとおりである。
Ｖ（＋）：ＶＥＧＦ添加、Ｖ（−）：ＶＥＧＦ非添加、
Ｓ（＋）：Ｓｕｒａｍｉｎ添加、Ｓ（−）：Ｓｕｒａｍｉｎ非添加、
２．５％Ｔ：２．５％トレハロース添加、
５．０％Ｔ：５．０％トレハロース添加、
７．５％Ｔ：７．５％トレハロース添加。
したがって各図の棒グラフは、左から順に、図１〜６に顕微鏡写真で示した各群と符合する。
【００２７】
まず図８は、ＣＤ３１にて染色された領域のうち、管腔面積（ａｒｅａ）を比較したグラフである。図中、管腔面積はピクセルにて表示している。図示するようにトレハロース添加により、濃度に関わらず管腔面積が抑制された。特に７．５％添加群では、Ｓｕｒａｍｉｎを用いた増殖抑制対照群よりも高い管腔面積抑制効果が示された。
【００２８】
図９は、ＣＤ３１にて染色された領域のうち、管腔ネットワーク総延長（ｌｅｎｇｔｈ）を比較したグラフである。図中、管腔ネットワーク総延長はピクセルにて表示している。図示するようにトレハロース添加により、濃度に関わらず管腔ネットワークが抑制された。特に５．０％添加群では、Ｓｕｒａｍｉｎを用いた増殖抑制対照群と同等の、また７．５％添加群ではそれよりも顕著に高い管腔ネットワーク形成抑制効果が示された。
【００２９】
図１０は、ＣＤ３１にて染色された領域のうち、血管分岐点（ｊｏｉｎｔ）の数を比較したグラフである。図示するようにトレハロース添加により、濃度に関わらず血管分岐点の発生が抑制された。特に、５．０％添加群では、Ｓｕｒａｍｉｎを用いた増殖抑制対照群よりも高い血管分岐点発生抑制効果、また７．５％添加群では顕著に高い同効果が示された。
【００３０】
図１１は、ＣＤ３１にて染色された領域のうち、血管分岐点から分かれる分枝（ｐａｔｈ）の数を比較したグラフである。図示するようにトレハロース添加により、濃度に関わらず分枝の発生が抑制された。特に５．０％添加群では、Ｓｕｒａｍｉｎを用いた増殖抑制対照群と同等の、また７．５％添加群ではそれよりも顕著に高い分枝発生抑制効果が示された。
【００３１】
本実験の結果、細胞培養（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における評価により、トレハロースが血管新生を抑制する作用を有すること、またそれは濃度に依存すること、そして、濃度によってはＳｕｒａｍｉｎを用いた増殖抑制対照群を超える増殖抑制効果を得られることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、従来まったく知られていなかったトレハロースの新しい機能として、血管内皮細胞の増殖抑制作用を発見したことに基づくものである。本発明により、病的な血管新生に起因する諸疾患に対する新たな治療薬・治療法を提供できることとなった。たとえば、点眼薬としての継続投与使用、増殖糖尿病網膜症に対する硝子体切除手術用の安全かつ効果的な補助剤としての利用、あるいは、脈絡膜新生血管に対して従来行われている抗血管内皮細胞増殖因子抗体や光線力学的治療の補助治療用途などに、本発明は臨床応用可能である。またトレハロースは安価であることも相まって、本発明は関連産業上の利用性が高い発明である。
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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