(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトアッシャー症候群関連ＵＳＨ２Ａ遺伝子における突然変異体の提供。【解決手段】ポリヌクレオチド、又は上記突然変異のいずれか１つ以上を含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドに関する。ＵＳＨ２Ａの変異解析を行い、１１種の新規遺伝子変異を同定するとともに、日本人で高頻度に認められる変異（ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇ）を更に同定することによって、日本人のＵＳＨ２を早期に診断することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子における下記の突然変異：
配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドにおける下記の突然変異：
位置９４４９のＧがＡに置換されている、
位置３８９１のＴが欠失している、
位置４１０４〜４１０６のＴＴＣが欠失している、
位置５１５８のＣが欠失している、
位置７８８３のＣが欠失している、
位置６３２６〜６４８５のエキソン３３に対応するゲノムＤＮＡにおけるエキソン３３の３’末端のＡから下流のイントロン３３における５番目のＧがＡに置換されている、
位置８５５９〜８６８１のエキソン４３に対応するゲノムＤＮＡにおけるエキソン４３の５’末端のＡから上流のイントロン４２における２番目のＡがＧに置換されている、
位置５３８のＴがＣに置換されている、
位置２０７２のＧがＡに置換されている、
位置８２５４のＧがＡに置換されている、
位置１０５４４のＡがＧに置換されている、
位置１０７１２のＣがＴに置換されている、
位置１１２４０のＡがＧに置換されている、及び／又は
位置１３８３２のＣがＴに置換されている、
ポリヌクレオチド、又は上記突然変異のいずれか１つ以上を含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＵＳＨ２Ａ突然変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アッシャー症候群（Ｕｓｈｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＵＳＨ）は、難聴に網膜色素変性症を合併する常染色体劣性遺伝性疾患である。本疾患は、難聴に視覚障害を合併する疾患（視聴覚障害）の中で、全患者数の約半数を占める最多の疾患である（３．５〜６．２／１０万人）。ＵＳＨは、難聴の程度と前庭障害の有無などの臨床症状により、タイプ１からタイプ３の３つのタイプに分類されている。タイプ１（ＵＳＨ１）は、重度難聴に前庭機能障害を合併するもの、タイプ２（ＵＳＨ２）は、中等度〜高度難聴はあるが前庭機能障害を合併しないもの、タイプ３（ＵＳＨ３）は難聴が進行するもので前庭機能に関しては様々である。
【０００３】
現在までに、ＵＳＨ２の原因遺伝子として、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｃ（ＧＰＲ９８）、ＵＳＨ２Ｄ（ＤＦＮＢ３１）の３つの原因遺伝子が同定されている。欧米からの報告によるとＵＳＨ２はＵＳＨの５０％以上を占めており、またＵＳＨ２患者の７４〜９０％において、ＵＳＨ２Ａに遺伝子変異が認められる。これらのことより、ＵＳＨ２Ａは、ＵＳＨ患者において、最も高頻度に遺伝子変異が認められる原因遺伝子であると考えられている。
【０００４】
ＵＳＨ２Ａには、アイソフォームＡ、Ｂの２つのアイソフォームが知られている。アイソフォームＡは、エキソン１〜２１、アイソフォームＢはエキソン１〜７２から構成されている。アイソフォームＡ、Ｂともにエキソン１〜２１は共通しており、アイソフォームＢでは、アイソフォームＡにエキソン２２から７２が追加された構造をしている（図１）。アイソフォームＢは２００４年に新たに発見され、アッシャー症候群の発症には、アイソフォームＢが重要であると考えられている。
【０００５】
欧米の症例では、ＵＳＨ２ＡアイソフォームＢの遺伝子変異解析が行われ、ｐ．Ｇｌｕ７６７ｆｓ（ｃ．２２９９ｄｅｌＧ）が高頻度に認められることが報告されてきた（非特許文献１〜３）。一般に、同じ疾患であっても、遺伝子変異の種類は人種特異的であることが多いので、ＵＳＨでも日本をはじめとするアジア諸国では、欧米とは異なる遺伝子変異が存在することが予測される。しかし、日本の症例ではＵＳＨ２Ａを含め、ＵＳＨの原因遺伝子の変異解析に関しては未だ報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Aller E, Jaijo T, Beneyto M et al. Identification of 14 novel mutations in the long isoform of USH2A in Spanish patients with Usher syndrome type II. J Med Genet 2006: 43 (11): e55.
【非特許文献２】Baux D, Larrieu L, Blanchet C et al. Molecular and in silico analyses of the full-length isoform of usherin identify new pathogenic alleles in Usher type II patients. Hum Mutat 2007: 28 (8): 781-789.
【非特許文献３】Dreyer B, Brox V, Tranebjaerg L et al. Spectrum of USH2A mutations in Scandinavian patients with Usher syndrome type II. Hum Mutat 2008: 29 (3): 451.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＵＳＨ２の早期診断に有用なヒトＵＳＨ２Ａ突然変異体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本邦で初めてＵＳＨ２Ａの変異解析を行い、１１種の新規遺伝子変異を同定するとともに、日本人で高頻度に認められる変異（ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇ）を同定し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記のとおりである。
［１］ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子における下記の突然変異：
配列番号１で表されるＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチドにおける下記の突然変異：
位置９４４９のＧがＡに置換されている、
位置３８９１のＴが欠失している、
位置４１０４〜４１０６のＴＴＣが欠失している、
位置５１５８のＣが欠失している、
位置７８８３のＣが欠失している、
位置６３２６〜６４８５のエキソン３３に対応するゲノムＤＮＡにおけるエキソン３３の３’末端のＡから下流のイントロン３３における５番目のＧがＡに置換されている、
位置８５５９〜８６８１のエキソン４３に対応するゲノムＤＮＡにおけるエキソン４３の５’末端のＡから上流のイントロン４２における２番目のＡがＧに置換されている、
位置５３８のＴがＣに置換されている、
位置２０７２のＧがＡに置換されている、
位置８２５４のＧがＡに置換されている、
位置１０５４４のＡがＧに置換されている、
位置１０７１２のＣがＴに置換されている、
位置１１２４０のＡがＧに置換されている、及び／又は
位置１３８３２のＣがＴに置換されている、
ポリヌクレオチド、又は上記突然変異のいずれか１つ以上を含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子における突然変異を同定することによって、日本人のＵＳＨ２を早期に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子解析にて同定された疾患原因変異の分布である。上図は、ＵＳＨ２Ａ  ｃＤＮＡを示している。下図は、ＵＳＨ２ＡによりコードされるＵｓｈｅｒｉｎタンパク質をタンパク質機能ドメインとともに示している。全ての疾患原因変異は、ＵＳＨ２Ａの全長に渡って分布しおり、明らかなＨｏｔ  ｓｐｏｔは認めなかった。矢印は、エキソン上にある疾患原因変異を示し、白抜き矢印は、イントロン上にある疾患原因変異を示している。
【図２】図２の（ａ）は、ゴールドマン視野計による視野検査の結果である。４人の患者（Ｃ７１２、Ｃ４５２、Ｃ２１２、Ｃ３３２）は、左右対称の求心性視野狭窄を示していた。黒色の領域は絶対暗点を示し、灰色の領域は比較暗点を示している。（ｂ）は、疾患原因変異を同定した患者の良聴耳オージオグラムである。疾患原因変異を同定することができた８人の患者は、中等度から高度の高音漸傾型の感音難聴を示していた。（ｃ）は、２人の患者（Ｃ１５２、Ｃ２３７）におけるオージオグラムの変化である。Ｃ１５２では、右耳に軽度の難聴進行を認めた。Ｃ２３７では、両耳に高度の難聴の進行を認めた。
【実施例１】
【００１２】
患者について
臨床症状よりＵＳＨ２と診断した日本人患者１０人を対象として、ＵＳＨ２Ａの遺伝子解析を行った。患者は、日本全国から当大学病院を受診しており、地域的な偏りはない。ＵＳＨ２の診断には、「網膜色素変性症」と「中等度〜高度感音難聴」と「前庭機能障害を合併していないこと」の３つを満たしていることを条件とした。臨床症状の評価として、病歴の聴取、および眼科・耳鼻科的検査を行った。病歴に関しては、難聴と診断された年齢、難聴の進行の有無、夜盲の出現した年齢、網膜色素変性症と診断された年齢を重点的に聴取した。
【００１３】
眼科的検査として、視力測定、細隙灯顕微鏡検査、眼底鏡検査、ゴールドマン視野計による視野測定、網膜電図測定（electroretinography: ERG）を行った。視野測定では、V/4e、III/4e、I/4eのイソプター（等感度曲線）を測定した。ERGは、国際臨床視覚電気生理学会（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision: ISCEV）が提唱するプロトコールに従って測定した。
【００１４】
聴覚検査として、耳鏡検査・標準純音聴力検査（１２５〜８０００Ｈｚ）・ティンパノメトリー検査を行った。難聴の程度は、良聴耳の標準純音聴力検査における５００、１０００、２０００、４０００Ｈｚの聴力閾値を平均し、次のように分類した。正常：２０ｄＢ以下、軽度難聴：２１〜４０ｄＢ、中等度難聴：４１〜７０ｄＢ、高度難聴：７１〜９０ｄＢ、重度難聴：９１ｄＢ以上。難聴の進行に関する評価は、過去５〜１０年間に記録された右・左耳の標準純音聴力検査における５００、１０００、２０００、４０００Ｈｚの聴力閾値を平均し、最新の平均値と５〜１０年前の平均値を比較し、次のように分類した。進行なし：１０ｄＢ以下の低下、軽度進行：１０〜１５ｄＢの低下、中等度進行：１５〜２０ｄＢの低下、高度進行：２５〜３５ｄＢの低下、重度進行：３５ｄＢ以上の低下。５年以内の聴力検査の結果しか得られなかった症例では、聴力の進行に関する評価は行わなかった。
【００１５】
前庭機能の評価は、幼少時の運動発達歴、およびカロリックテストの結果を用いて行った。カロリックテストに用いる刺激として、２０℃・５ｍｌの水を用い、結果は、最大緩徐相速度値を基準として次のように分類した。正常：最大緩徐相速度が２０°／ｓ以上、半規管麻痺：最大緩徐相速度が２０°／ｓ未満。
【００１６】
正常コントロールとして、視覚・聴覚障害のない日本人１３５人から血液を採取し、本研究で同定した塩基変化の頻度を評価するために使用した。本研究は、浜松医科大学ヒトゲノム・遺伝子解析研究倫理審査委員会および医の倫理委員会にて承認されており、本研究に参加する全ての患者には、事前に本研究に関して充分な説明を行い、文書にてインフォームド・コンセントを得ている。
【００１７】
遺伝子変異解析
患者から末梢血を採血し、標準的な手技を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＵＳＨ２Ａの全エキソン１〜７２、およびエキソン近傍のイントロンをポリメラーゼ連鎖反応にて増幅した。ＰＣＲ産物は、Wizard（登録商標）SV Gel and PCR Clean-Up System、またはエキソヌクレアーゼＩ・アンタークティックホスファターゼを用いた酵素処理により精製した。Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いてシーケンス反応を行い、ＡＢＩ３１００シーケンサーにて塩基配列を解析した。１８個のエキソンのＰＣＲに用いるプライマー、および２個のエキソンのシーケンスに用いるプライマーは新たに設計し、その他のＰＣＲ・シーケンスに用いるプライマーは、過去に報告された論文に記載されているプライマーを使用した。本発明で使用したプライマーを配列番号２〜１４３に示した。各配列は、それぞれ、エキソン１〜７２のフォワードプライマーとリバースプライマーに対応する。ただし、エキソン２８と２９は、合わせて１つのプライマー対を用いた。本研究で新たに同定した塩基変化については、ＰＣＲダイレクトシーケンシング法、または、制限酵素処理法により、日本人の正常コントロールにおける存否およびその頻度を評価した。
【００１８】
スプライススコアーの予測について
スプライス部位またはスプライス部位近傍の塩基変化が、どの程度、スプライシングに影響するか、Splice Site Prediction by Neural Networkソフトウェア（http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html）を用いて推測した。このソフトウェアでは、まず、入力された塩基配列がスプライスドナー部位・スプライスアクセプター部位として認識されるか評価する。塩基変化がスプライスドナー部位・アクセプター部位として認識された場合には、その塩基変化がどの程度、スプライスドナー部位・アクセプター部位として適切であるか、０〜１の範囲で得点が付けられる。数値が１に近いほど、入力された塩基変化がスプライスドナー部位・アクセプター部位として適切であることを意味している。
【００１９】
結果
遺伝子変異解析
我々は、１０人のＵＳＨ２患者においてＵＳＨ２Ａの遺伝子解析を行い、８人の患者において、１４種の遺伝子変異を同定した（表１、２）。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
【表２】
2011024467.tif 000003
【００２２】
１４種の遺伝子変異の中で、１１種は新規の遺伝子変異であった（表２）。その中の１つの変異ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇは、１０人中４人、１５アリル中４アリル（２６．７％）において同定された。その他の遺伝子変異は、全て１人の患者に認められるのみであった。これらのことから、ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇは日本人のＵＳＨ２患者において、高頻度に認められる遺伝子変異と考えられた。
【００２３】
見つかった遺伝子変異は、ＵＳＨ２Ａの全長に渡って、ほぼ均一に分布しており、遺伝子変異が集中している部位（mutation hot spot）はなかった。唯一の例外は、エキソン７０〜７２によってコードされる細胞膜貫通部位、および細胞内部位であり、これらの領域では、遺伝子変異は同定されなかった。この結果は、欧米の症例に関する報告と同じである。
【００２４】
遺伝子変異を同定することができた８人の患者の中で５人の患者（Ｃ７１２、Ｃ１１６、Ｃ１５２、Ｃ４５２、Ｃ５５７）では、それぞれ２つの遺伝子変異を同定し、さらに家族の検体を用いて、それらの遺伝子変異が異なるアリルにあることを確認した。２人の患者（Ｃ２３７、Ｃ２１２）では、家族の検体を採取することが困難であったため、家族の検体を用いて変異と発症の対応解析（segregation analysis）を行うことが出来なかった。そのため、Ｃ２３７においては、２種の変異（ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇ、ｐ．Ｔｒｐ３１５０Ｘ）が異なるアリルにあるのか、同じアリルにあるのか評価することはできなかった。しかし、２種の変異がスプライシング変異とナンセンス変異であることを考えると、両方とも疾患原因変異であると思われる。同様に、Ｃ２１２においても（家族の検体を採取することが困難であったため、変異と発症の対応解析を行うことができず）、３種の変異（ｐ．Ｃｙｓ６９１Ｔｙｒ、ｐ．Ｇｌｙ２７５２Ａｒｇ、ｐ．Ｔｙｒ３７４７Ｃｙｓ）が異なるアリルにあるのか、どの変異が疾患原因であるのか評価することができなかった。一方、Ｃ３３２では、家族の検体を用いて２種の塩基変化（ｐ．Ｓｅｒ１３６９ｄｅｌ、ｐ．Ａｌａ４６１１Ｖａｌ）が同じアリルに存在していることが分かった。これらのうち、ｐ．Ｓｅｒ１３６９ｄｅｌが欠失変異、ｐ．Ａｌａ４６１１Ｖａｌがミスセンス変異であることを考えると、ｐ．Ｓｅｒ１３６９ｄｅｌが疾患原因である可能性が高いと思われた。この患者では、もう一方のアリルにある変異は、まだ同定できていない。
【００２５】
我々が同定した１４種の遺伝子変異は、日本人の正常コントロールにおいて同定されなかった。
【００２６】
我々は、Ｃ１５２において、２種のスプライシング変異（ｃ．６４８５＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇ）を同定した。これらの変異は、日本人の正常コントロール２７０人において認められなかった。コンピュータプログラム（Splice Site Prediction by Neural Network）を用いて、これらの変異が生じることによって、どの程度、スプライシングに影響があるのか推測した。
【００２７】
ｃ．６４８５＋５Ｇ＞Ａ（イントロン３３の５’側末端近傍）に関しては、当該遺伝子変異がないときには、スプライシングドナー部位としてのスプライススコアーは０．９３であるが、遺伝子変異が生じると０．４３になる。ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇ（イントロン４２の３’側末端近傍）に関しては、遺伝子変異がないときには、スプライスアクセプター部位としてのスプライスコアーは、０．９９であるが、遺伝子変異が生じた際には、スプライシングアクセプター部位として認識されなくなる。
【００２８】
これらの結果（遺伝子変異が生じた際には、スプライススコアーが高度に低下する、またはスプライス部位として認識されなくなること）より、上記の遺伝子変異がスプライシングに強い影響を与えると考えられ、これらの遺伝子変異が疾患原因変異であることを裏付けるものと考えられる。
【００２９】
表２に記載した１４種の遺伝子変異に加えて、４３種の塩基変化を同定した（表３）。
【００３０】
【表３】
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【００３１】
これらの塩基変化は、次に挙げる理由により、疾患原因ではない（すなわち、多型）と考えられた。４３種の塩基変化の中で、いくつかの塩基変化はすでに多型として報告されている。また、新たにエキソン内に同定した塩基変化のうち、ｃ．５１４２Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ａｓｎ１７４１Ａｓｎ）以外のすべてについて、日本人の正常コントロールでも同定された。ｃ．５１４２Ｔ＞Ｃのみは、日本人の正常コントロール６４アリルにおいては、まったく同定されなかった。しかし、この塩基変化が同定されたＣ２３７においては、２つの疾患原因変異ｃ．８５５９−２Ａ＞Ｇとｐ．Ｔｒｐ３１５０Ｘが同定されており、ｃ．５１４２Ｔ＞Ｃは疾患原因ではないと考えられた。スプライス部位、またはスプライス部位近傍のイントロンにある塩基変化で、ＵＳＨ２患者において新規に同定された３種の塩基変化（ｃ．８４８＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．４７５８＋３Ａ＞Ｇ、ｃ．１５２９８−２４Ｔ＞Ｃ）は、すべて、日本人の正常コントロールでも認められた。ｃ．８４８＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．４７５８＋３Ａ＞Ｇに関しては、上記のコンピュータプログラムを用いて評価した。ｃ．８４８＋５Ｇ＞Ａにおいては、塩基変化がないときと、塩基変化があるときのスプライススコアーは、それぞれ、１．００と０．９６であり、ｃ４７５８＋３Ａ＞Ｇにおいては、０．９８と０．７３であった。塩基変化がないときと、塩基変化がある時のスコアーの差が小さく、これらの塩基変化（ｃ．８４８＋５Ｇ＞Ａ、ｃ．４７５８＋３Ａ＞Ｇ）は、スプライシングに与える影響は少ないと考えられた。
【００３２】
また、８人のＵＳＨ２患者において同定した変異は７種のミスセンス変異を含んでいた（表２）。これらの遺伝子変異は、日本人の正常コントロール２６０人において１人にも認められなかった。ミスセンス変異によって置換されるアミノ酸と、他の脊椎動物（イヌ、ラット、マウス、ニワトリ、ゼブラフィッシュ）のＵＳＨ２Ａ相同遺伝子の当該アミノ酸において、相同性に関する比較ゲノム解析を行った。その結果、全ての動物種において、これらの当該アミノ酸は完全に保存されていた。逆に、多型と考えられるアミノ酸置換を伴う塩基変化（non-synonymuous）や、アミノ酸置換を伴わない塩基変化（synonymous）では、比較ゲノム解析で当該アミノ酸は生物種間で保存されていなかった。この結果は、これらの塩基変化が多型であることを示唆している。
【００３３】
臨床症状
少なくとも１種の遺伝子変異を同定することが出来た８人の患者では、夜盲は１２〜１７歳（平均±標準偏差：１４．４±２．０歳）の時に自覚され、１６〜３０歳（２３．８±４．９）歳の時に、眼科で網膜色素変性症と診断されていた（表１）。遺伝子変異を同定することができた全ての患者においては、視野は左右とも対称的に狭窄しており、（眼底検査にて）眼底には、網膜色素変性症に特徴的な骨小体様色素沈着を伴う網膜変性所見を認めた。さらに、ＥＲＧは、全症例において消失していた。現在の視野は、Ｃ７１２の比較暗点を伴う２５〜６５°の求心性視野狭窄（ＩＩＩ／４ｅイソプター）から、Ｃ２３７のＶ／４ｅでイソプターを描出することができないほどの重度視野狭窄まで、様々であった。矯正視力は、１．２から指数弁であった。２人の患者（Ｃ１５２、Ｃ５５７）では、白内障が認められ（２５％）、Ｃ５５７は左眼の白内障手術を受けている。
【００３４】
遺伝子変異を同定することができた８人の患者は、３〜７歳（５．１±１．６歳）の時に耳鼻咽喉科で難聴と診断されていた（表１）。これらの患者は、補聴器を装用し、言語発達に問題は認められなかった。（全患者において）ティンパノグラムはＡ型であり、この結果は、鼓膜・鼓室内が正常であるという耳鏡検査所見と矛盾していなかった。オージオグラム（標準純音聴力検査の結果のグラフ）は、両側とも高音漸傾型の中等度〜高度感音難聴（平均聴力閾値：６２．６±１３．８ｄＢ：表１、図２ｂ）を示唆する所見であった。２人の患者（Ｃ１５２、Ｃ２３７）は、難聴の進行を自覚していた。Ｃ１５２のオージオグラムでは、左耳において難聴の軽度進行を認め、Ｃ２３７のオージオグラムでは、両耳において難聴の高度進行を認めた。２人の患者とも、騒音曝露歴や、内耳毒性のある薬物の服用歴はなかった。
【００３５】
また、遺伝子変異を同定することができた全患者において、（幼少時の）運動発達障害は認められず、生後１８ヶ月までには歩行を開始していた。カロリックテストは、全患者において正常であった。その他の前庭機能検査（回転検査など）を行ってはいないが、これらの結果より、全患者において前庭機能は正常であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明の突然変異体は、日本人のＵＳＨ２の早期診断のために有用である。
【図１】
2011024467.tif 000005
【図２】
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【配列表】
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