(57)【要約】【課題】  臓器に特異的に集積する核酸を提供する。【解決手段】  動物に候補核酸を投与した後、前記動物の臓器から、前記臓器に特異的に集積した候補核酸を、目的の核酸として採取する。この核酸をデリバリー用タグ核酸と使用し、デリバリー対象物質との複合体として体内に投与すれば、前記核酸を採取した臓器と同様の臓器に、特異的に前記デリバリー対象物質をデリバリーすることが可能となる。前記候補核酸としては、例えば、アプタマーを使用することが好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物に候補核酸を投与する投与工程、および、
前記動物の臓器から、前記臓器に特異的に集積した候補核酸を、目的の核酸として採取する採取工程を含む、核酸の製造方法。
【請求項２】
前記採取工程で採取した核酸が、デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能なデリバリー用タグ核酸である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記投与工程において、動物の血管およびリンパ管の少なくとも一方に候補核酸を導入する、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
前記候補核酸が、アプタマーである、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記投与工程において、複数種類の候補核酸を導入する、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記採取工程において、複数の臓器から、前記各臓器に特異的に集積した候補核酸を、それぞれ目的の核酸として採取する、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記採取工程において、前記動物から臓器を摘出し、前記臓器に集積した候補核酸を、目的の核酸として採取する、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
さらに、前記採取工程で得られた目的の核酸を増幅する増幅工程を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
さらに、前記増幅工程で得られた増幅核酸について、前記投与工程および採取工程を施す、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記動物が、非ヒト哺乳類動物および鳥類からなる群から選択された少なくとも一つの動物である、請求項１から９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記非ヒト哺乳類動物が、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシおよびヒヒからなる群から選択された少なくとも一つの動物である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記動物が、免疫反応抑制動物である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記動物が、ヌードマウスである、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
前記動物が、細胞が移植された動物であり、
前記採取工程において、前記細胞を移植した臓器から、前記目的核酸を採取する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記動物に移植された細胞が、正常細胞、変異細胞および分化細胞からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
前記分化細胞が、ｉＰＳ細胞から分化した分化細胞である、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
前記動物に移植された細胞が、ヒト細胞である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の製造方法により得られる、核酸。
【請求項１９】
前記核酸が、アプタマーである、請求項１８記載の核酸。
【請求項２０】
請求項１８または１９記載の核酸を含む、デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能なデリバリー用タグ核酸。
【請求項２１】
請求項２０記載のデリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能なデリバリー用タグ核酸と、前記デリバリー対象物質とを含む複合体を含有する、前記デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能な組成物。
【請求項２２】
前記複合体において、前記デリバリー対象物質と前記デリバリー用タグ核酸とが結合している、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記複合体が、さらに、前記デリバリー対象物質のデリバリーを補助するキャリアーを含み、
前記キャリアーが、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、逆ミセル、ポリカチオン、細胞膜透過性ペプチド、磁気粒子およびリン酸カルシウムからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２１または２２記載の組成物。
【請求項２４】
前記ナノ粒子が、カーボンナノホーンおよびカーボンナノチューブの少なくとも一方のナノカーボンである、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
前記キャリアーに、前記デリバリー対象物質と前記デリバリー用タグ核酸とが担持されている、請求項２３または２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記デリバリー対象物質が、疾患に対する治療用薬物または予防用薬物である、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記デリバリー対象物質が、抗ガン物質および免疫抑制物質の少なくとも一方である、請求項２６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能な核酸の製造方法、デリバリー用タグ核酸およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な疾患を治療または予防するために、例えば、抗がん剤および免疫抑制剤等の各種疾患に応じた薬物が、体内に投与されている。前記薬物の投与方法は、一般に、経口投与、静脈投与、患部への直接投与等がある。しかしながら、経口投与や静脈投与の場合、薬剤が、目的の患部だけでなく、体内の他の部位にもデリバリーされてしまう。このため、目的の患部に対する必要量よりも多くの薬剤を投与する必要があり、コスト高、正常な他の部位が薬剤によってダメージを受けること等が問題視されている。また、患部への直接投与の場合も、前記薬剤が患部から他の部位に拡散するおそれがあるため、結果的に同様の問題がある。
【０００３】
そこで、必要最小量の薬剤を必要な患部に選択的にデリバリーするドラッグデリバリーシステムの構築が試みられており、特に、薬剤を標識化する方法が、効果的な方法として提案されている。例えば、ガン細胞は、通常、その表面に特異的な受容体が存在する。このため、前記ガン細胞を標的とする場合、前記受容体に結合するリガンドで前記薬剤を標識化することにより、前記薬物を効率良く標的ガン細胞にデリバリーすることが可能と考えられている（特許文献１）。しかしながら、このシステムによって、標的ガン細胞へのデリバリーの効率が向上するものの、やはり、前述のような静脈投与等を行った場合、患部以外の部位へのデリバリー自体を防止することが困難である。つまり、前記システムでは、目的の臓器へデリバリーされた場合には、正常細胞ではなく、目的のガン細胞等に特異的に薬物を作用させることが可能であるが、前述のような静脈投与を行った際に、目的の臓器以外へのデリバリーは、回避が困難であり、同様の問題が危惧される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公表２００６−５０２９６６号公報
【特許文献２】特公表２００７−５１１５１３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｈｒｕｂａ  Ｊ  Ｂｈａｒａｌｉ，  Ｍａｒｉａｎｎｅ  Ｋｈａｌｉｌ，  Ｍｕｊｇａｎ  Ｇｕｒｂｕｚ，  Ｔｅｓｓａ  Ｍ  Ｓｉｍｏｎｅ，  ａｎｄ  Ｓｈａｋｅｒ  Ａ  Ｍｏｕｓａ，  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  ｃｏｎｃｉｓｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ．    Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２００９；  ４：  １−７．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２００９  Ａｐｒｉｌ  １．
【非特許文献２】Ｋｅ−Ｔａｉ  Ｇｕｏ，  Ａｎｇｅｌａ  Ｐａｕｌ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｓｃｈｉｃｈｏｒ，  Ｇｅｒｈａｒｄ  Ｚｉｅｍｅｒ，  ａｎｄ  Ｈａｎｓ  Ｐ．  Ｗｅｎｄｅｌ．ＣＥＬＬ−ＳＥＬＥＸ：  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．  ２００８  Ａｐｒｉｌ；  ９（４）：  ６６８−６７８．  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２００８  Ａｐｒｉｌ  ２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の目的は、例えば、デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリーすることが可能な核酸の製造方法、デリバリー用タグ核酸、およびその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の製造方法は、動物に候補核酸を投与する投与工程、および、前記動物の臓器から、前記臓器に特異的に集積した候補核酸を、目的の核酸として採取する採取工程を含む、核酸の製造方法である。
【０００８】
本発明の核酸は、前記本発明の製造方法により得られる核酸である。
【０００９】
本発明のデリバリー用タグ核酸は、前記本発明の核酸を含む、デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能なデリバリー用タグ核酸である。
【００１０】
本発明の組成物は、前記本発明のデリバリー用タグ核酸と、前記デリバリー対象物質とを含む複合体を含有する、前記デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能な組成物である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、所望の臓器に特異的に集積する核酸を得ることができる。このような核酸は、例えば、体内に投与すると、前記核酸を採取した臓器と同じ種類の臓器に対して、特異的に集積するという特性を示す。このため、得られた核酸を、デリバリー対象物質をデリバリーするためのタグ核酸として使用することにより、前記デリバリー対象物質を、前記核酸を採取した臓器と同じ種類の臓器に対して、特異的にデリバリーすることが可能となる。このため、本発明によれば、効率良いドラッグデリバリーが可能となることから、特に医療分野において、極めて有用な技術といえる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、生体を用いて、臓器特異的または、疾患患部特異的に集積する核酸を効率よく見出す手法および、そのようにして得られる核酸である。分子に結合する機能性核酸の一例としては試験管内進化法を用いて選抜されるアプタマーが知られているが、本発明では試験管内の選抜を行わない。本発明は、例えば、ヌードマウスなどの生体を用い、特定の臓器や疾患部位または移植された組織片や各種腫瘍細胞、または分化誘導前や誘導後のｉＰＳ細胞ないしＥＳ細胞などに対して、望ましくはヒト由来の移植細胞や組織に特異的に集積する核酸と、その取得方法（製造方法）が対象となる。本発明の核酸のターゲット分子は既知の場合もあるし、未知の場合もある。また、このような新規に取得される核酸は、単独においても特定臓器の酵素、接着分子、受容体、さらには機能性分子の活性を中和、阻害、あるいは刺激、活性増強を起こす新しい機能性核酸をも包括する。
【００１３】
本発明の核酸は、特定の臓器、腫瘍、移植片、または分化したｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞由来の臓器に特異的に集積する機能性核酸である。このため、このような核酸は、生体内、望ましくはヒト生体内において特定の臓器または疾患部位、あるいは特定部位に、薬物、毒物、またはｓｉＲＮＡ、または生理機能に影響を与えるすべての分子を単独もしくは複数、または水性もしくは脂溶性の膜につつまれた、またはナノパーティクルやナノ構造体に封入して送達ができる。本発明により、一般的に副作用が強い分子や薬剤を特定部位、または疾患部位に送達させ副作用を軽減させ薬効を高める新たな分子の送達方法を具現化する。本発明の産業的な優位性としては、正常な他の部位が薬剤によってダメージを受けること等が問題視されている課題を解決できることにある。
【００１４】
＜核酸の製造方法＞
本発明の製造方法は、前述のように、動物に候補核酸を投与する投与工程、および、前記動物の臓器から、前記臓器に特異的に集積した候補核酸を、目的の核酸として採取する採取工程を含む。また、本発明の核酸は、本発明の製造方法により得られる核酸である。このような方法により得られた本発明の核酸は、前述のように、デリバリー対象物質を、目的の臓器への特異的なデリバリーが可能であることから、デリバリー用タグ核酸として使用することが好ましい。なお、以下、本発明の核酸および製造方法について説明するが、これらの説明は、本発明のデリバリー用タグ核酸についても同様である。
【００１５】
前記動物に投与する候補核酸の種類は、特に制限されず、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸、ならびに、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸があげられる。本発明において、候補核酸は、いずれか一種類を用いてもよいし、二種類以上を用いてもよい。前記核酸が、後者の二本鎖核酸の場合、例えば、動物への導入に先立って、変性等により一本鎖にすることが好ましい。前記核酸は、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよく、前記二次構造としては、例えば、ステムループ構造があげられる。
【００１６】
前記候補核酸は、例えば、天然由来の核酸配列であってもよいし、合成した核酸配列であってもよい。合成方法は、何ら制限されず、例えば、ＤＮＡ合成機やＲＮＡ合成機により、ｄＮＴＰ等を材料として、末端塩基から化学合成する方法等があげられる。前記核酸としては、例えば、前述のように、ＤＮＡやＲＮＡ等があげられ、また、例えば、ＰＮＡ等のペプチド核酸を含んでもよい。前記核酸は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ等の天然核酸（非人工核酸）を含んでもよいし、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等の人工核酸を含んでもよい。
【００１７】
前記候補核酸の長さは、特に制限されない。前記長さの下限は、特に制限されないが、例えば、１０塩基以上であり、好ましくは２０塩基以上であり、より好ましくは２５塩基であり、上限は、特に制限されないが、例えば、１５０塩基であり、好ましくは１００塩基であり、より好ましくは７０塩基である。長さの範囲は、例えば、１０〜１５０塩基であり、好ましくは２０〜１００塩基であり、より好ましくは２５〜７０塩基である。
【００１８】
前記候補核酸としては、例えば、送達機能性核酸があげられる。送達機能性核酸とは、目的とする場所に、物質を送達する機能を有する核酸である。前記送達機能性核酸としては、例えば、アプタマーがあげられる。前記アプタマーとは、一般的に、特定の標的物質に特異的に結合可能な核酸分子を意味する。なお、本発明において、前記アプタマーは、例えば、特異的に結合する標的物質が不明なものであってもよいし、前記標的物質が分かっているものであってもよい。後者のアプタマーとしては、例えば、デリバリー対象物質を作用させる標的細胞に存在する特有の標的物質に対して結合可能なアプタマーがあげられる。具体例としては、前記標的細胞が、例えば、ガン細胞の場合、前記ガン細胞の表面に存在する受容体、増殖シグナルを細胞内に入れる全ての分子、酵素、接着分子、特定の糖鎖、および、細胞表面に存在する脂質分子等の標的物質に結合するアプタマーであることが好ましい。このようなアプタマーを候補核酸として動物に投与し、臓器特異的に集積する候補アプタマーを目的の核酸として回収し、これをデリバリー用タグ核酸として用いて、薬物等のデリバリー対象物質を体内に導入すれば、臓器特異的なデリバリーを実現するだけでなく、さらに、デリバリーした薬物を、高い親和性で標的細胞に作用させることもできる。
【００１９】
前記アプタマーは、前述のように、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ等の一本鎖核酸、二本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ等の二本鎖核酸でもよい。前記アプタマーは、例えば、天然由来の核酸配列であってもよいし、合成した核酸配列であってもよく、ＰＮＡ等のペプチド核酸を含んでもよく、前記天然核酸（非人工核酸）を含んでもよいし、前記人工核酸を含んでもよい。
【００２０】
前記アプタマーの製造方法は、特に制限されず、例えば、前述の公知の合成方法によって製造できる。また、前述のように、本発明において、例えば、標的物質に結合可能なアプタマーを動物に導入する場合、前記アプタマーの製造には、例えば、公知のＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等が採用できる。
【００２１】
ＳＥＬＥＸ法によるアプタマーの調製は、特に制限されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。まず、複数の核酸を含む核酸プールを準備し、前記核酸ライブラリーと標的物質とを結合（会合）させ、前記核酸プールと前記標的物質との複合体を形成する。そして、前記複合体から、前記複合体の形成に関与した核酸プールのみを回収することにより、前記二次試薬に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製できる。以下に、一例として、ＳＥＬＥＸ法を用いて、標的物質に特異的に結合可能な核酸アプタマーを調製する方法をあげるが、本発明は、これらには何ら制限されない。
【００２２】
前記核酸プールとは、例えば、ランダム領域を有する核酸のライブラリー（混合物）である。前記ライブラリーにおける前記核酸は、例えば、ＲＮＡやＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記ランダム領域とは、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、および、ＵまたはＴの塩基をランダムに連結した領域であり、その長さは、例えば、２０〜１２０ｍｅｒである。前記核酸プールは、例えば、４２０〜４１２０種類（約１０１２〜１０７２）種類の核酸を含むことが好ましく、より好ましくは、４３０〜４６０（約１０１８〜１０３６）種類である。
【００２３】
前記核酸プールに含まれる前記ポリヌクレオチドは、例えば、前記ランダム領域を有していればよく、その他の構造は、特に制限されない。前記ポリヌクレオチドは、前記ランダム領域に加えて、例えば、前記ランダム領域の５’末端および３’末端の少なくとも一方に、後述する核酸増幅で利用するプライマー領域、ポリメラーゼが認識するポリメラーゼ認識領域等を有することが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、アプタマー調製における後述の核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、前記ポリメラーゼの認識領域は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識領域であるＴ７プロモーター等があげられる。前記ＲＮＡプールの具体例としては、例えば、５’末端側から、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と前記プライマー領域（以下、「５’末端側プライマー領域」ともいう）とを、この順序で連結し、前記５’末端側プライマー領域の３’末端側に、前記ランダム領域を連結し、さらに、前記ランダム領域の３’末端側にプライマー領域（以下、「３’末端側プライマー領域」ともいう）を連結した構造があげられる。前記ＲＮＡにおける前記５’末端側プライマー領域とは、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’末端に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、前記ＲＮＡプールは、例えば、さらに、標的物質である二次試薬への結合を補助する領域を有してもよい。また、前記核酸プールに含まれるポリヌクレオチドは、それぞれ、異なるランダム領域を有してもよいし、一部の配列が共通するランダム領域を有してもよい。前記ポリヌクレオチドにおいて、前記各領域は、例えば、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
【００２４】
前記核酸プールの調製方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＤＮＡを含む初期プールを使用し、前記ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、核酸プールのＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記ＤＮＡを含む初期プールとしては、例えば、前記ＲＮＡプールにおける前記ランダム領域の相補鎖のＵをＴに置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記ランダム領域のＵをＴに置換した配列を有するＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。この初期プールのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製できる。
【００２５】
また、前記ランダム領域のＵをＴに置換したＤＮＡを含む初期プールを準備し、これを鋳型として、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、前記５’末端側プライマー領域に相補的な配列とを含むプライマーをアニーリングさせ、核酸増幅を行うことにより、ＲＮＡの核酸プールを調製することもできる。
【００２６】
そして、前記核酸プールと標的物質とを反応させ、前記核酸と前記標的物質との複合体を形成する。前記アプタマーの調製において、前記核酸プールと反応させる前記標的物質は、例えば、前記標的物質そのものであってもよいし、前記標的物質の分解物であってもよい。前記核酸プールと前記標的物質との結合形式は、特に制限されず、例えば、水素結合等の分子間力等があげられる。前記核酸プールと前記標的物質との結合処理は、例えば、前記両者を溶媒中で一定時間インキュベートする方法があげられる。前記溶媒としては、特に制限されないが、前記両者の結合等が保持されるものが好ましく、例えば、各種緩衝液があげられる。
【００２７】
続いて、前記核酸プールと標的物質との複合体を回収する。なお、前記複合体形成のために前記両者を反応させた反応液には、前記複合体の他に、例えば、前記複合体形成に関与しない核酸プール（以下、「未反応核酸プール」という）が含まれる。このため、例えば、前記反応液から、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを、分離することが好ましい。前記分離方法としては、特に制限されないが、例えば、前記標的物質と前記核酸プールとの吸着性の違いや、前記複合体と前記核酸プールとの分子量の違いを利用する方法等があげられる。
【００２８】
前者の吸着性の違いを利用する方法としては、例えば、以下の方法が例示できる。すなわち、まず、前記標的物質に吸着性を有する担体と、前記複合体を含む前記反応液とを接触させる。この際、前記未反応核酸プールは、前記担体に吸着せず、他方、前記標的物質と前記核酸プールとの複合体は、前記担体に吸着する。これによって、前記未反応核酸プールと前記複合体とを分離することができる。そして、前記未反応核酸プールを除去後、前記担体に吸着した前記複合体を回収すればよい。また、前記担体から前記複合体を回収する前に、例えば、前記未反応核酸プールを十分に除去するため、前記担体を洗浄することが好ましい。前記標的物質に吸着性を有する担体としては、特に制限されず、例えば、標的物質の種類に応じて適宜選択できる。前記標的物質が、例えば、抗体等のタンパク質の場合、前記吸着性を有する担体としては、例えば、ニトロセルロース膜等があげられる。
【００２９】
後者の分子量の違いを利用する方法としては、例えば、担体を使用する方法が例示できる。前記担体としては、例えば、前記核酸プールが通過し且つ前記複合体が通過できないようなサイズのポアを有する担体があげられる。このような担体を利用して、前記複合体と、前記未反応核酸プールとを分離できる。前記分離は、例えば、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルを用いた電気的な分離であってもよい。
【００３０】
この他にも、例えば、前記複合体の形成時において、担体に固定化した標的物質を使用する方法もあげられる。すなわち、前記標的物質を予め担体に固定化し、前記担体と前記核酸プールとを接触させ、前記固定化標的物質と核酸プールとの複合体を形成させる。そして、前記固定化標的物質に結合していない未反応の核酸プールを除去した後、前記担体から、前記標的物質と前記核酸プールとの複合体を解離させればよい。前記標的物質の担体への固定化方法は、何ら制限されず、公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、前記標的物質に標識を結合しておき、前記標識との結合基を有する担体に、前記標識を結合した標的物質を接触させる方法があげられる。前記標識としては、例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇ等があげられ、前記結合基としては、例えば、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）等の金属イオンがあげられる。前記担体の具体例としては、例えば、前記金属イオンをベースとするＮｉ−アガロース、Ｎｉ−セファロース等があげられる。
【００３１】
つぎに、回収した前記複合体から、前記複合体形成に関与した核酸プールを回収する。前記複合体形成に関与した核酸プールは、例えば、前記複合体について、前記標的物質と核酸プールとの結合を解除することによって回収できる。
【００３２】
続いて、回収した前記複合体形成に関与した核酸プールについて、核酸増幅を行う。前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、核酸プールの種類に応じて、公知の方法により行うことができる。前記核酸プールがＲＮＡプールの場合、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られた増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡの転写を行うことができる。これによって、前述の前記複合体形成に関与したＲＮＡプールの増幅を行うことができる。
【００３３】
前記ＲＮＡプールが、例えば、前述のように、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域、前記５’末端側プライマー領域、前記ランダム領域および前記３’末端側プライマー領域を有する場合、これらの領域を利用する増幅方法があげられる。前記ＲＮＡを鋳型として前記ｃＤＮＡを調製するための逆転写反応では、例えば、プライマーとして、前記ＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な配列を含むポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、前記ｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡの増幅には、例えば、プライマーとして、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。得られたＤＮＡの増幅産物を鋳型とするＲＮＡの増幅には、前記ＤＮＡ増幅産物を鋳型として、前記ＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域および３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅を行う。この際、プライマーとしては、例えば、前記５’末端側プライマー領域を含むポリヌクレオチドと、前記３’末端側プライマー領域の相補鎖を含むポリヌクレオチドとを使用することが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、例えば、さらに、５’末端側に前記ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有し、その３’側に、前記５’末端側プライマー領域を有することが好ましい。そして、得られた増幅産物を鋳型として、前記増幅産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写反応を行うことによって、前記複合体形成に関与するＲＮＡプールの核酸増幅を行うことができる。増幅産物のうち、例えば、アンチセンス鎖のＤＮＡは、その３’末端側に、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を有するため、この領域に前記ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが結合し、前記アンチセンス鎖を鋳型として、前記ＲＮＡを合成できる。前記逆転写反応に使用するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されないが、例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）等が使用できる。
【００３４】
なお、前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ法や、各種等温増幅法等が採用できる。また、その条件も、特に制限されない。
【００３５】
このように、標的物質と複合体を形成した核酸プールを回収し、さらに、前述と同様にして、標的物質を用いた複合体の形成、複合体の回収、前記複合体形成に関与した核酸プールの分離、前記分離した核酸プールの増幅等を繰り返し行うことで、最終的に、標的物質に結合性を有する核酸アプタマーを得ることができる。
【００３６】
本発明の製造方法において、候補核酸として、配列の異なる複数の核酸を投与することが好ましい。動物１体に投与する候補核酸の種類の数は、特に制限されないが、例えば、１０１２〜１０３６種類であることが好ましい。
【００３７】
本発明の製造方法において、前記候補核酸を投与する動物は、特に制限されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒヒ等の非ヒト哺乳類動物、鳥類等があげられる。また、前記動物は、例えば、免疫反応抑制動物でもよく、具体例として、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス等があげられる。
【００３８】
また、前記動物は、例えば、細胞が移植された動物であってもよい。この場合、前記採取工程において、前記細胞を移植した臓器から、前記目的核酸を採取することが好ましい。前記動物に移植する細胞は、特に制限されないが、例えば、正常細胞、ガン細胞等の変異細胞、分化細胞等があげられる。前記分化細胞としては、特に制限されないが、例えば、ｉＰＳ細胞から分化した分化細胞、ＥＳ細胞から分化した各種臓器特異性を示す細胞群、さらには筋肉に分化する筋原細胞、ガンのステムセル、ヒト白血病細胞等があげられる。前記細胞は、例えば、ヒト細胞、または、前述の非ヒト哺乳類動物、鳥類由来の細胞等があげられ、前記細胞の由来は、前記細胞を移植する動物と、同じであってもよいし、異なっていてもよい。前記移植する細胞は、例えば、移植先の臓器と同じ種類の臓器細胞であることが好ましい。このように、細胞が移植された動物を使用する場合には、前述のような免疫反応抑制動物を使用することが好ましい。
【００３９】
本発明の製造方法において、前記候補核酸の動物への投与方法は、特に制限されず、例えば、動物の血管およびリンパ管の少なくとも一方への投与があげられる。前記血管は、例えば、静脈および動脈のいずれであってもよいが、静脈であることが好ましい。動物の静脈に前記核酸を導入する際、その部位は、特に制限されないが、例えば、マウス等の尾部を有する動物は、尾部の静脈から導入することが好ましい。また、前記候補核酸は、例えば、動物の体内に局所投与してもよい。この場合、例えば、投与部位から特定の領域に集積した候補核酸を採取してもよいし、周囲に拡散することなく投与部位に残存した候補核酸を、集積した候補核酸として採取してもよい。
【００４０】
本発明の製造方法は、前記採取工程において、複数の臓器から、前記各臓器に特異的に集積した核酸を、それぞれ採取することが好ましい。このようにすれば、動物１体に対する前記候補核酸の投与によって、複数の臓器について、それぞれに特異的に集積する核酸を得ることができる。
【００４１】
前記採取工程において、前記動物から臓器を摘出し、前記臓器に集積した核酸を採取することが好ましい。
【００４２】
本発明の製造方法は、さらに、前記採取工程で得られた目的核酸を増幅する増幅工程を含むことが好ましい。このように前記目的核酸を増幅することで、前記臓器に集積した核酸を大量に得ることができる。
【００４３】
本発明の製造方法は、さらに、前記増幅工程で得られた増幅核酸について、前記投与工程および採取工程を施すことが好ましい。これによって、より確実に臓器に集積する核酸を選別することができる。
【００４４】
本発明の製造方法について、前記候補核酸として複数種類の核酸を含む核酸プールを、マウス静脈から投与する一例をあげて説明する。
【００４５】
まず、前述のアプタマーの製造方法で説明した方法によって、複数種類の核酸を含む核酸プールを作製し、これをマウスの尾静脈に投与する。マウスに投与する前記核酸プールの全量は、特に制限されないが、例えば、１匹あたり１０１２〜１０３６個である。前記核酸プールは、例えば、溶媒に混合した状態で投与することが好ましく、前記溶媒としては、特に制限されないが、例えば、生体に影響を与えないものが好ましく、具体例としては、生理食塩水、ＨＥＰＥＳ，ＴＲＩＳ等の緩衝液、細胞培養用の無血清培地等があげられる。
【００４６】
つぎに、前記核酸プールの投与から所定時間経過後に、前記マウスから各種臓器を摘出する。前記所定時間は、特に制限されないが、例えば、１０〜１８０分である。
【００４７】
そして、摘出した各種臓器から、集積した核酸を採取する。前記臓器からの核酸の採取方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。ここで採取した核酸が、本発明の核酸となる。
【００４８】
また、より確実に特定の臓器に集積する核酸を製造する際には、さらに、採取した核酸に、以下のような処理を施すことが好ましい。すなわち、まず、前記採取した核酸を増幅させる。核酸の増幅方法は、特に制限されず、前述したアプタマーの製造における増幅と同様の方法により行うことができる。前記アプタマーが、例えば、ＲＮＡアプタマーの場合、逆転写反応の後、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲがあげられる。前記アプタマーが、例えば、ＤＮＡアプタマーの場合には、前記ＤＮＡアプタマーを鋳型として増幅を行うことが好ましく、具体例としては、ＰＣＲがあげられる。
【００４９】
そして、得られた核酸の増幅物を、前述と同様にして、新たなマウスの尾部より投与した後、各種臓器を摘出して、集積した核酸を採取する。これによって、より確実に臓器特異的に集積する核酸を選択できる。本発明において、投与工程と採取工程との回数は、特に制限されないが、例えば、前記投与工程と採取工程とを１サイクルとして、合計２サイクル以上行うことが好ましく、より好ましくは３〜１５サイクルである。
【００５０】
＜デリバリー用タグ核酸＞
本発明のデリバリー用タグ核酸は、前述のように、本発明の核酸を含む、デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能なデリバリー用タグ核酸である。本発明のデリバリー用タグ核酸は、前述の本発明の製造方法において説明した本発明の核酸と同様である。なお、本発明のデリバリー用タグ核酸の使用方法について、本発明の組成物において説明する。
【００５１】
＜組成物＞
本発明の組成物は、デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能な前記本発明のデリバリー用タグ核酸と、前記デリバリー対象物質とを含む複合体を含有する、前記デリバリー対象物質を臓器特異的にデリバリー可能な組成物である。
【００５２】
前記複合体において、前記デリバリー対象物質と前記デリバリー用タグ核酸とは結合していてもよく、前記結合は、例えば、直接的でも、間接的でもよい。後者の場合、例えば、リンカー等を介した結合でもよいし、後述するようなキャリアーを介した結合であってもよい。なお、前記両者の結合形式は、何ら制限されず、例えば、共有結合等の化学的な結合であってもよいし、吸着等の物理的な結合であってもよい。
【００５３】
前記複合体は、さらに、前記デリバリー対象物質のデリバリーを補助するキャリアーを含んでもよい。この場合、前記複合体の形態は、特に制限されず、例えば、前記キャリアーに、前記デリバリー用タグ核酸および前記デリバリー対象物質が担持されていることが好ましい。前記キャリアーへの担持の形態は、例えば、キャリアーの種類に応じて適宜決定できるが、特に制限されず、例えば、前記キャリアーへの結合でもよいし、前記キャリアー内への分散であってもよい。前記結合は、例えば、共通結合等の化学的な結合でもよいし、吸着等の物理的な結合でもよい。前記複合体の形態としては、例えば、下記のような形態があげられる。
（１）前記キャリアーに、前記デリバリー用タグが担持され、前記デリバリー用タグ核酸に前記デリバリー対象物質が担持されている形態
（２）前記キャリアーに、前記デリバリー対象物質が担持され、前記デリバリー対象物質に前記デリバリー用タグ核酸が担持されている形態
（３）前記キャリアーに、前記デリバリー対象物質および前記デリバリー用タグ核酸がそれぞれ担持されている形態
（４）前記デリバリー対象物質と前記デリバリー用タグとが、前記キャリアーに分散された形態
【００５４】
前記キャリアーとしては、特に制限されないが、例えば、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、逆ミセル、ポリカチオン、細胞膜透過性ペプチド、磁気粒子、リン酸カルシウム等があげられる。これらのキャリアーは、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
【００５５】
前記ナノ粒子としては、特に制限されないが、例えば、カーボンナノホーンおよびカーボンナノチューブ等のナノカーボンが使用できる。ナノカーボンは、例えば、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を使用してもよい。前記ナノ粒子の中でも、カーボンナノホーンが好ましい。カーボンナノホーンは、例えば、抗原提示細胞であるマクロファージ系細胞に特異的に取り込まれるという性質を有する。このため、カーボンナノホーンに前記デリバリー用タグ核酸および前記デリバリー対象物質を担持させれば、例えば、前記デリバリー用タグ核酸により、前記デリバリー対象物質を特異的に所望の臓器にデリバリーし、且つ、前記カーボンナノホーンにより、前記臓器におけるマクロファージ系細胞に前記デリバリー対象物質を取り込ませることができる。このため、前記デリバリー対象物質として、例えば、免疫反応を制御する薬剤を担持させることで、免疫関連疾患をより確実に治療することが可能となる。前記カーボンナノホーンは、例えば、単体でもよいし、集合体であってもよく、集合体の大きさは、特に制限されないが、例えば、最大直径が１０〜１００ｎｍである。
【００５６】
前記デリバリー対象物質は、特に制限されず、臓器へのデリバリーが望まれる種々の物質があげられる。医療分野においては、例えば、前記デリバリー対象物質として、例えば、疾患に対する治療用薬物または予防用薬物等があげられ、前記疾患は、特に制限されないが、例えば、ガン、アレルギー、リウマチ、ぜんそく、骨粗鬆症、炎症等の免疫関連疾患等があげられる。前記治療用薬物および予防用薬物の具体例としては、例えば、抗ガン物質、プレドニゾロン、ＦＫ５０６、ＮＦκＢデコイ等の免疫抑制物質、抗ウイルス物質、Ｔ細胞誘導物質、遺伝子の転写抑制物質、遺伝子の発現抑制物質等があげられる。
【００５７】
前記デリバリー対象物質の構成は、特に制限されず、例えば、低分子化合物、抗体等のタンパク質、抗体の機能的断片等のペプチド、アミノ酸、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。前記抗体の機能的断片とは、例えば、各種Ｉｇを酵素処理して得られる活性フラグメントがあげられる。前記活性フラグメントとしては、例えば、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、およびこれらの重合体等があげられる。
【００５８】
前記デリバリー対象物質と前記デリバリー用タグ核酸とを含む複合体の形成方法は、特に制限されず、例えば、デリバリー対象物質の種類に応じて適宜決定でき、公知の方法により行うことができる。
【００５９】
本発明の組成物は、例えば、前記複合体以外に、例えば、体内への投与形態に応じて、適宜、各種添加物を含んでもよい。また、その形態も、特に制限されず、体内への投与形態に応じて、適宜決定できる。
【００６０】
＜治療・予防方法＞
本発明の治療方法および予防方法は、前記本発明の組成物を体内に投与する工程を含む。前記組成物において、前記デリバリー対象物質は、治療および予防目的に応じて適宜決定でき、前述のような治療用物質および予防用物質が例示できる。
【００６１】
前記組成物の投与方法は、特に制限されないが、例えば、経口投与および非経口投与があげられる。前記非経口投与としては、例えば、静脈投与、動脈投与、リンパ管への投与、筋肉投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。前記組成物の投与対象は、特に制限されず、ヒト、または、マウス、ラット等のヒトを除く哺乳類等があげられる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明によれば、所望の臓器に特異的に集積する核酸を得ることができる。このような核酸は、例えば、体内に投与すると、前記核酸を採取した臓器と同じ種類の臓器に対して、特異的に集積するという特性を示す。このため、得られた核酸を、デリバリー対象物質をデリバリーするためのタグ核酸として使用することにより、前記デリバリー対象物質を、前記核酸を採取した臓器と同じ種類の臓器に対して、特異的にデリバリーすることが可能となる。このため、本発明によれば、効率良いドラッグデリバリーが可能となることから、特に医療分野において、極めて有用な技術といえる。