(57)【要約】【課題】天然の植物抽出物からなり、安価、安全でかつ有効性の高いセリンプロテアーゼ阻害剤、ならびにセリンプロテアーゼ阻害該作用によりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を有する美白用化粧料組成物および美白用医薬組成物を提供する。【解決手段】リュウキュウツチトリモチ抽出物を有効成分として含有するセリンプロテアーゼ阻害剤、ならびにセリンプロテアーゼ阻害作用によりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を美白用化粧料組成物および美白用医薬組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツチトリモチ科植物抽出物を有効成分として含有する、セリンプロテアーゼの阻害剤。
【請求項２】
ツチトリモチ科植物がリュウキュウツチトリモチである、請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
セリンプロテアーゼがトリプシンおよび／またはトリプターゼである、請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤を有効成分として含有する美白用化粧料組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の阻害剤を有効成分として含有する美白用医薬組成物。
【請求項６】
セリンプロテアーゼを阻害することによりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を有する、請求項４に記載の美白用化粧料組成物または請求項５に記載の美白用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツチトリモチ科植物抽出物を有効成分として含有するセリンプロテアーゼ阻害剤、ならびに該阻害剤を有効成分として含み、セリンプロテアーゼ阻害作用によりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を有する美白用化粧料組成物および美白用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から市場にある美白化粧品の多くは、メラノサイト（表皮メラニン細胞ともいう）においてメラニンの生成に働くチロシナーゼ（またはポリフェノールオキシダーゼ）の活性を阻害するなどの働きを持つ。チロシナーゼ阻害活性のある物質としては、コウジ酸、アルブチン、L-アスコルビン酸がよく知られている。チロシナーゼ阻害活性のある物質としては、ほかにフェルラ酸、カフェー酸、o-クマル酸、p-クマル酸、ケイ皮酸およびその誘導体などが古くから報告されている（非特許文献1、2、3）。このほかにも、トウモロコシふすまから分離されたN,N’-ジフェルロイルプトレシンのマッシュルームチロシナーゼ阻害活性、B16メラノーマ細胞でのメラニン生成阻害活性（非特許文献4）、ベニバナ種子から分離されたN-フェルロイルセロトニン、N-(p-クマロイル)セロトニンのマッシュルームチロシナーゼ阻害活性、B16メラノーマ細胞でのメラニン生成阻害活性が報告されている（非特許文献5）。コーヒー果粒化粧組成物及び方法の公開特許公報（特許文献１）があり、調製物がコーヒー酸、コーヒーポリフェノール、必須単糖類、コーヒー粘液多糖類、及びトリゴネリンからなる群から選択される化合物であり、紫外線保護効果、肌美白作用が言及されている。また、本特許出願との関連ではリュウキュウツチトリモチの葉、モクセンナの葉など沖縄県産植物のマッシュルームチロシナーゼ阻害作用が報告されている（特許文献8、非特許文献6）。
【０００３】
このように、メラニン生成阻害剤として、種々の化合物や植物抽出物が研究されているが、これまでの研究は前述のようにチロシナーゼ阻害やB16細胞でのメラニン生成阻害が主であった。一方、皮膚におけるメラニン生成は先ず細胞増殖因子やホルモン（例えばbFGF、エンドセリン-1、α-メラノサイト刺激ホルモン）などの生体内物質がメラノサイトを刺激することによって引き起こされることから、かかる細胞増殖因子やホルモンなどの働きを阻害する、またはかかる細胞増殖因子やホルモンなどの産生を阻害する物質の探索、化学合成も広く行われている。
【０００４】
さらに、上述のようなメカニズムによるメラニン生成の阻害だけでは必ずしも十分ではなく、表皮へのメラニンの移動を抑制する美白剤の検討も種々行われている。メラニンは、メラノサイトに存在するメラノソームと呼ばれる小胞の中で、合成・貯蔵される。メラニン色素を貯蔵したメラノソームは細胞内を移動し、メラノサイト樹状突起（デンドライト）を介して表皮のケラチノサイトに取り込まれる（貪食される）。このとき、ケラチノサイトの膜表面上の蛋白質Protease-Activated Receptor 2（PAR-2）がトリプシンやトリプターゼのようなセリンプロテアーゼにより開裂、活性化されることにより、貪食が活性化される（非特許文献7、8、特許文献2）。そこで、デンドライト伸長抑制剤が種々検討され、セイヨウノコギリソウに含有されるセンタウレイジン（centaureidin）などが報告されている（非特許文献9）。
【０００５】
また、メラノソームの貪食の抑制や、PAR-2経路に作用（セリンプロテアーゼ阻害、PAR-2アンタゴニスト）する化合物、植物抽出物（トウガン、プルーン、アマドコロなど）、食品由来物質（カゼイン加水分解物）などが種々検討されている（特許文献2〜7）。
【０００６】
このように美白作用のある物質は様々な原理に基づいて検討されているが、チロシナーゼ阻害に基づくものが主流で、メラニンの移動、貪食を抑制する美白剤の探索はまだ十分には行われておらず、天然物由来で強力かつ安全性の高い美白剤は常に求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2007-532539号公報
【特許文献２】特表2001-502360号公報
【特許文献３】特開2006-124355号公報
【特許文献４】特開2006-273808号公報
【特許文献５】特開2006-273809号公報
【特許文献６】特開2006-347926号公報
【特許文献７】特開2008-143796号公報
【特許文献８】特開2009-227612号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Agricultural and Food Chemistry，1993年，41巻，pp. 526-531
【非特許文献２】Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996年，44巻，pp. 1668-1675
【非特許文献３】Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002年，50巻，pp. 1400-1403
【非特許文献４】Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007年，55巻，pp. 3920-3925
【非特許文献５】Biological & Pharmaceutical Bulletin，2004年，27巻，pp. 1976-1978
【非特許文献６】沖縄県工業技術センター研究報告書，2008年，10号，pp. 61-63
【非特許文献７】Experimental Cell Research，2000年，254巻，pp.25-32
【非特許文献８】Journal of Cell Science，2000年，113巻，pp.3093-3101
【非特許文献９】Biochimica et Biophysica Acta，2006年，1760巻，pp.487-494
【非特許文献１０】Abstract of the 1999 annual meeting of the society of investigative dermatology., J. Invest. Dermatol., 1999年, 112巻, p. 629
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、天然の植物抽出物からなり、安価、安全でかつ有効性の高いセリンプロテアーゼ阻害剤、ならびにセリンプロテアーゼ阻害作用によりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を有する美白用化粧料組成物および美白用医薬組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、各種の亜熱帯植物の抽出物を材料に、セリンプロテアーゼ阻害作用、ヒト皮膚３次元モデルを用いた実験でケラチノサイトへのメラニンの取り込み抑制作用、および当該作用に基づく美白作用を表す抽出物を特に亜熱帯植物を材料に鋭意探索した結果、ツチトリモチ科植物抽出物が該作用を有することを見出し、本発明を完成させた。なお、これまでにツチトリモチ科植物抽出物のセリンプロテアーゼ阻害作用、ケラチノサイトへのメラニンの取り込み抑制作用についてはまったく知られていなかった。
【００１１】
本発明は以下のとおりである。
（１）ツチトリモチ科植物抽出物を有効成分として含有する、セリンプロテアーゼの阻害剤。
（２）ツチトリモチ科植物がリュウキュウツチトリモチである、（１）の阻害剤。
（３）セリンプロテアーゼがトリプシンおよび／またはトリプターゼである、（１）または（２）の阻害剤。
（４）（１）〜（３）のいずれかの阻害剤を有効成分として含有する美白用化粧料組成物。
（５）（１）〜（３）のいずれかの阻害剤を有効成分として含有する美白用医薬組成物。
（６）セリンプロテアーゼを阻害することによりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を有する、（４）の美白用化粧料組成物または（５）の美白用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、天然の植物抽出物からなり、安価、安全でかつ有効性の高いセリンプロテアーゼ阻害剤、ならびにセリンプロテアーゼ阻害作用によりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を有する美白用化粧料組成物および美白用医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はリュウキュウツチトリモチ抽出物のヒト皮膚３次元モデルでのメラニン産生阻害を確認した図である。皮膚モデルカップの横にメラニン量の相対値を示した。
【図２】図２はリュウキュウツチトリモチ抽出物がヒト皮膚３次元モデルでケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制し、その結果メラノサイトにのみメラニンが存在することを確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、上記発明について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜実施し得る。
【００１５】
本発明は、ツチトリモチ科植物抽出物を有効成分として含有するセリンプロテアーゼ阻害剤、およびセリンプロテアーゼ阻害作用によりケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制する効果を有する美白用化粧料組成物および美白用医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明において用いられるツチトリモチ科植物には、特に限定されることなく、リュウキュウツチトリモチ（Balanophora fungosa(= B. kuroiwai Makino)）、ツチトリモチ（Balanophora japonicaMakino）、オオスミツチトリモチ（Balanophora mashimoi Akuzawa）、ミヤマツチトリモチ（Balanophora nipponica Makino）、キイレツチトリモチ（Balanophora tobiracola Makino）、ヤクシマツチトリモチ（Balanophora yakushimensis Hatsu. et Masam.）、ユワンツチトリモチ（Balanophora yuwanensis Agusawa et Sakuta）等が含まれるが、好ましくはリュウキュウツチトリモチである。
【００１７】
リュウキュウツチトリモチは ツチトリモチ科ツチトリモチ属に属する寄生植物で、雌雄同株、高さ10cm前後、沖縄本島ほか沖縄諸島以南に広く分布する。同属の植物ツチトリモチ（Balanophora japonica Mak.）は民間療法で、服用することにより解熱、解毒などに用いられている。
【００１８】
本発明に使用するツチトリモチ科植物の品種と産地は、特に限定されるものではないが、自然保護の立場から栽培されたものを使用するのが望ましい。
【００１９】
本発明に使用するツチトリモチ科植物抽出物は根、茎、葉のうちのいずれの抽出物が含まれていてもよいが、当該抽出物の割合が高いほど好ましい。当該抽出物は、液状、粉末状、ペースト状、固形状、半固形状などいずれの形状であっても良いが、好ましくは粉末状である。粉末状のツチトリモチ科植物抽出物は、以下の手法によって得ることができる。すなわち、ツチトリモチ科植物の全草、あるいは根、茎、葉を別々にして細断あるいはミキサー等で細かく破砕した後、抽出溶媒を加えて超音波を30分ほど照射して抽出後、遠心分離、ろ過を行って上清または濾液を抽出液として回収する。あるいは高速溶媒抽出装置を用いて溶媒抽出を行うことで抽出液を得ることもできる。この抽出液を減圧下で乾燥することによりツチトリモチ科植物抽出物を粉末として得ることができる。上記抽出溶媒としては水あるいは水を含む任意の有機溶媒を用いることができる。有機溶媒として、例えばエタノール、メチルアルコール、エチルアルコール、酢酸エチル、1,3-ブタンジオールなどを１種または２種以上を用いることができる。有機溶媒は３０〜７０％、好ましくは４０〜６０％、さらに好ましくは５０％の濃度で使用する。
【００２０】
ツチトリモチ科植物抽出物は、下記実施例にて詳細に記載されるようにセリンプロテアーゼ阻害作用を有し、セリンプロテアーゼ阻害剤として利用することができる。特に、ツチトリモチ科植物抽出物は、下記実施例にて詳細に記載されるようにトリプシンおよびトリプターゼの阻害作用を有し、トリプシン阻害剤および／またはトリプターゼ阻害剤として利用することができる。
【００２１】
またツチトリモチ科植物抽出物は、そのセリンプロテアーゼ阻害作用により、皮膚に適用された場合にケラチノサイトへのメラニンの取り込みを抑制することができる。すなわち、ツチトリモチ科植物抽出物は、ケラチノサイトへのメラニンの取り込み阻害剤として利用することができる。
【００２２】
さらにツチトリモチ科植物抽出物は、そのケラチノサイトへのメラニンの取り込み阻害作用により、明瞭な美白作用を奏する。「美白作用」とは皮膚におけるメラニンの沈着によるシミ、ソバカス、くすみ等を予防または改善することを意味する。
【００２３】
従って、ツチトリモチ科植物抽出物を化粧料組成物または医薬組成物の有効成分として、ケラチノサイトへのメラニンの取り込みおよび蓄積により生じる被検体の状態、症状または疾患を改善、予防または治療に用いることができる。このような状態、症状または疾患としては、皮膚の黒色化、シミ、ソバカス等が挙げられるが、これらには限定されない。
【００２４】
ツチトリモチ科植物の抽出物は、美白作用を有する化粧料組成物または医薬組成物の有効成分として以下の形態で使用することができる。
【００２５】
ツチトリモチ科植物抽出物は、ケラチノサイトへのメラニンの取り込み抑制作用のある美白用化粧料組成物の有効成分として使用することができる。美白用化粧料組成物としては、ツチトリモチ科植物抽出物それ自体を直接適用してもよく、また、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状にして、化粧水、乳液、クリーム、パック、軟膏等として、例えば皮膚外用剤の形態で、皮膚に適用することができる。
【００２６】
また、当該美白用化粧料組成物には必要に応じてツチトリモチ科植物抽出物が有する上記効果を損なわない範囲で、通常、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等の製剤に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、pH調整剤等を加えることができる。ツチトリモチ科植物抽出物を含有する美白用化粧料組成物は、その包装に皮膚の美白作用を奏する旨の表示が付されたものであってよい。
【００２７】
ツチトリモチ科植物抽出物（乾燥重量）の美白用化粧料組成物（全重量）中の含有量は、0.05重量％〜20重量％が好ましく、より好ましくは0.1重量％〜0.4重量％である。
【００２８】
ツチトリモチ科植物抽出物を美白用化粧料組成物の有効成分として用いる場合、当該抽出物の投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、皮膚に直接塗布して用いる場合には当該抽出物を0.1重量％〜1重量％含有する化粧料組成物を1日あたり1〜4回塗布することにより投与される量であり得る。
【００２９】
ツチトリモチ科植物抽出物はまた、ケラチノサイトへのメラニンの取り込み抑制作用のある美白用医薬組成物の有効成分として使用することもできる。
【００３０】
美白用医薬組成物としては、ツチトリモチ科植物抽出物それ自体を直接適用してもよく、また公知の薬理学的に許容される担体と組み合わせて製剤化しても良い。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００３１】
美白用医薬組成物の投与形態は、特に制限なく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、軟膏剤、貼付剤、坐剤、吸入剤、注射剤、点滴剤等の非経口剤として、または錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤として使用される。経皮吸収剤は、例えば外用医薬品等の製剤に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、pH調整剤等を加えることができる。経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法に従って製造される。
【００３２】
美白用医薬組成物におけるツチトリモチ科植物抽出物（乾燥重量）の含有量は、当該組成物の適用対象の種類、大きさおよび範囲、投与経路、あるいは剤形等の諸条件によって異なるが、例えば、医薬組成物（全重量）中に0.05重量％〜40重量％含有させる。ツチトリモチ科植物抽出物（乾燥重量）の投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、皮膚の黒色化、シミ、ソバカス等の程度、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができる。例えば、経皮吸収投与の場合には1日あたり1〜4回塗布することが好ましい。
【００３３】
本発明の美白用化粧料組成物または美白用医薬組成物は、メラノサイトにおけるメラニンの生成量を、当該美白用化粧料組成物または美白用医薬組成物を適用しなかった場合と比較して、10％、20％、30％、40％、45％、50％又はそれ以上、抑制することができる。
【００３４】
また、本発明の美白用化粧料組成物または美白用医薬組成物は、ケラチノサイトへのメラニンの取り込みを当該美白用化粧料組成物または美白用医薬組成物を適用しなかった場合と比較して、40％、50%、60%、70％、80％、90％、95％、99％又はそれ以上、抑制することができる。
【００３５】
さらにツチトリモチ科植物の抽出物は、トリプターゼの阻害作用により掻痒、しわ、たるみ、肌荒れ改善のための外用剤、及び全身アナフィラキシー疾患、アスピリン過敏性喘息、喘息、間質性肺疾患、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、アレルギー性疾患、アトピー性疾患、皮膚水疱症、知覚過敏症、疼痛、掻痒症、歯肉炎、浮腫、乾癬、肺繊維症、慢性間接リウマチ、関節炎、歯周病、血液凝固障害、腎間質線維化、Ｘ線造影剤の副作用としての血管透過性亢進又は肺浮腫、及び花粉症からなる群から選ばれる疾患の治療又は予防のための外用剤、服用剤または飲食品組成物の有効成分として使用することもできる。トリプターゼ阻害剤が上記疾患の治療又は予防に有用であることは公知である（特開2007−186457号公報）。当該外用剤、服用剤または飲食品組成物は、通常、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等の製剤に使用される成分、または薬理学的に許容される担体と組み合わせて、上記美白用化粧料組成物や美白用医薬組成物と同様に調製することができる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３７】
（実施例１）リュウキュウツチトリモチ抽出物の製造法
リュウキュウツチトリモチ全草を適当な大きさに裁断した後、それぞれを60℃で12時間乾燥させ、これを遠心粉砕機（MRK-Retsch, ZM-100）で粉砕した。0.5 mmのスクリーンを通過した粉末を集め、この粉末を高速溶媒抽出装置（日本ダイオネクス社製、ASE-200）を用いて溶媒抽出を行った。即ち、乾燥重量2.0 gの粉末を8.0 gのケイソウ土とともに抽出セルに装填し、50%エタノールにより、抽出温度80℃、抽出時間10分、圧力1500 psi、抽出回数2回で、合計50 mLの抽出液を得た。この抽出液を遠心エバポレータを用いて減圧下で乾燥することにより1.3 gの抽出物を得た。
【００３８】
（実施例２）リュウキュウツチトリモチ抽出物のセリンプロテアーゼ（トリプシン）阻害活性
セリンプロテアーゼとしてブタ膵臓由来トリプシン（和光純薬工業より購入）、合成基質としてBAPA（ベンゾイル-アルギニン-p-ニトロアニリド）を用い、96穴のマイクロプレートを使用して実験を行った。試験試料溶液（実施例1で得られたリュウキュウツチトリモチ抽出物を0.25〜2.0 mg/mlの濃度で蒸留水に溶解したもの、または対照として蒸留水）10μlをマイクロプレートの各穴に入れ、これに30μg/mlのブタ膵臓由来トリプシン（10mM CaCl2を含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に溶解）50μlを加えて25℃で５分間振とうした。次に、0.75 mM BAPA（10mM CaCl2、1.0% (v/v) DMSO含む50 mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）に溶解）100μlを加えて25℃で20分間振とうした。45%酢酸50μlを加えて反応を停止させた後、BAPAの分解で生じるパラニトロアニリンの405 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。n=4で行ったこの実験において、トリプシンの活性を50％阻害する試験試料の濃度をIC50値とした。リュウキュウツチトリモチ抽出物はトリプシンの活性を阻害し、IC50値は75μg/mlであった。
【００３９】
（実施例３）リュウキュウツチトリモチ抽出物のセリンプロテアーゼ（トリプターゼ）阻害活性
セリンプロテアーゼとしてヒト肺由来トリプターゼ（シグマ社より購入）、合成基質としてBAPA（ベンゾイル-アルギニン-p-ニトロアニリド）を用いて実験を行った。試験試料溶液（実施例1で得られたリュウキュウツチトリモチ抽出物を0.25〜1.0 mg/mlの濃度で蒸留水に溶解したもの、または対照として蒸留水）10μlを500μlのマイクロテストチューブに入れ、これに60μg protein /mlのヒト肺由来トリプターゼ（シグマ社より購入、0.15 M NaCl、10 mM CaCl2、50μg/ml ヘパリンを含む40 mM Tris-HCl緩衝液（pH8.1）に溶解）50μlを加えて混合し、30℃で５分間保温した。次に、0.75 mM BAPA（0.15 M NaCl、10 mM CaCl2、50μg/ml ヘパリン、1.0% (v/v) DMSOを含む40 mM Tris-HCl緩衝液（pH8.1）に溶解）100μlを加えて30℃で60分間保温した。45%酢酸50μlを加えて反応を停止させ、BAPAの分解で生じるパラニトロアニリンを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。なお、HPLCは、カラムとして、μBondasphere  5μC18  300Åカラム（3.9×150 mm；ウォーターズ社製）を使用し、溶出液として、0.1％トリフルオロ酢酸を含む0〜63％（V/V）のアセトニトリル水溶液の直線濃度勾配（20分間）を使用し、流速1 ml／minの条件で、405 nmの紫外部吸収を検出することにより、実施した。n=2で行ったこの実験において、トリプターゼの活性を50％阻害する試験試料の濃度をIC50値とした。リュウキュウツチトリモチ抽出物はトリプターゼの活性を阻害し、IC50値は44μg/mlであった。同じ試験で、陽性対照物質として試験した6μg/mlのロイペプチンはトリプターゼの活性を96％阻害した。
【００４０】
（実施例４）リュウキュウツチトリモチ抽出物のヒト皮膚３次元モデルでの表皮へのメラニン移動抑制作用ならびにメラニン生成阻害作用
クラボウ株式会社から購入した正常ヒト皮膚３次元モデル（MEL-300-Bキット、Black donor）を用いて試験を行った。6穴プレートの各穴に長期維持培地EPI-100LLMM（bFGF及びα-メラノサイト刺激ホルモン含有、クラボウ株式会社から購入）を0.9 mlずつ添加した。この6穴プレートへ皮膚モデルカップをピンセットで移し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO2存在下の加湿状態で、37℃で1時間培養した。次に、別の6穴プレートの各穴の中央にステンレスワッシャーを２枚重ねて置き、これに長期維持培地EPI-100LLMMを5 mlずつ入れた。このワッシャー上に、皮膚モデルカップをピンセットで移し、モデルカップ内に試験試料溶液（12.5%（v/v）グリセロール水溶液に溶解した0.5から2 mg/mlのリュウキュウツチトリモチ抽出物、12.5%（v/v）グリセロール水溶液に溶解した1 mg/mlのアルブチン、対照として12.5%（v/v）グリセロール水溶液）100μlを添加し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO2存在下の加湿状態で、37℃で10日間培養した。培養期間中、試験試料溶液、培地は2日ごとに交換した。培養10日目に皮膚モデルカップをピンセットで24穴のプレートに移し、各カップをDulbecco-PBS溶液で3回洗浄し、洗浄液を除去した後に24穴プレートに並べたカップの写真撮影を行った。また、顕微鏡写真を撮影した。それらを図１、２に示す。
【００４１】
次に、皮膚モデルカップのメラニンを公知（Abstract of the 1999 annual meeting of the society of investigative dermatology., J. Invest. Dermatol., 1999年, 112巻, p. 629）の方法に従い、以下のとおり抽出、定量した。皮膚モデルカップを24穴のプレートに移し、各皮膚モデルカップ内に1% SDS、0.05 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 6.8)を0.45 ml添加し、これに5 mg/mlのプロテアーゼKを20μl添加し、密閉して室温で3時間反応させた。カップ中の溶液と細胞を全て1.5 mlのチューブに回収し、45℃で一晩反応させた。次に、リュウキュウツチトリモチ抽出物に微量に含まれている色素を洗浄、除去する目的で、対照区を含めてすべての1.5 mlチューブを15000rpmで15分間遠心し、上清を捨てた。このチューブに0.05 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 6.8)を0.45 ml添加し、攪拌したのち、再度同じ条件で遠心、上清を捨てた。このチューブに、1% SDS、0.05 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl 緩衝液(pH 6.8)を0.45 ml添加し、さらに5 mg/mlのプロテアーゼKを20μl添加し、45℃で4時間反応させた。次に、500 mM炭酸ナトリウムを50μl添加し、次いで30％過酸化水素水を10μl添加、80℃で30分間反応させた後、冷却した。次に、クロロホルム：メタノール（2:1）を100μl添加、10,000 x gで10分間遠心した。上清100μlを回収し、96穴のプレートに移し、マイクロプレートリーダーで405 nmの吸光度を測定した。メラニン量は対照区（12.5%（v/v）グリセロール水溶液）のメラニン量を100％とした相対値（n=3の平均値±標準偏差）で図１の皮膚モデルカップの横に示した。また、試験試料添加区と対照区との間に有意差が認められた場合は*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001で示した。
【００４２】
図１の皮膚モデルカップの写真とメラニンの抽出・定量の比較によりリュウキュウツチトリモチ抽出物添加区とアルブチン添加区に明瞭なメラニン生成阻害作用が認められた。また、図２の顕微鏡写真に示すように対照区ではメラニンがメラノサイトの周辺に拡散し、アルブチン添加区でもメラニン量は少ないものの周辺に拡散している。一方、リュウキュウツチトリモチ抽出物添加区ではメラノサイトにのみメラニンが存在し、リュウキュウツチトリモチ抽出物が表皮へのメラニンの移動を抑制することが明らかになった。
【００４３】
次に、試験試料溶液の細胞毒性を検査する目的で、上記と同じ方法で別途、皮膚モデルカップに被検試料（12.5%（v/v）グリセロール水溶液に溶解した4 mg/mlのリュウキュウツチトリモチ抽出物、12.5%（v/v）グリセロール水溶液に溶解した1 mg/mlのアルブチン、対照として12.5%（v/v）グリセロール水溶液、いずれもn=3）100μlを加えて10日間培養した。24穴プレートの各穴に300μlのMTT溶液（MTT-100キット、クラボウ株式会社から購入）を入れ、これにDulbecco-PBS溶液で3回洗浄した皮膚モデルカップをピンセットで移し、炭酸ガスインキュベーターにて5％ CO2存在下の加湿状態で、37℃で3時間静置した。次に、皮膚モデルカップをPBS溶液で軽く洗浄したのち、別の24穴プレートに移した。この各穴に、2 mlのMTT抽出液（MTT-100キット、クラボウ株式会社から購入）を入れ、振とうしながら室温で2時間抽出した。この抽出液を96穴プレートの各穴にそれぞれ200μlずつ入れ、マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を測定した。対照区の570 nmの吸光度を100％とした4 mg/mlのリュウキュウツチトリモチ抽出物添加区の吸光度の相対値は107±4％、1 mg/mlのアルブチン添加区の吸光度の相対値は98±7％であり、リュウキュウツチトリモチ抽出物は図１より高い濃度でも細胞毒性は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明により、天然の植物抽出物からなり、安価、安全でかつ有効性の高い、セリンプロテアーゼ阻害剤ならびに美白用化粧料組成物および美白用医薬組成物を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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