(57)【要約】【課題】タンパク質同士の相互作用をアッセイする方法として知られているＢｉＦC法では、目的とするタンパク質同士が相互作用をした際に蛍光タンパク質も再会合して発光することが必要である。しかし、タンパク質同士よりも蛍光タンパク質の断片同士のアフィニティが強いと、相互作用を行わないのに蛍光が観察されるという課題があった。【解決手段】観察したいタンパク質に結合する蛍光タンパク質の断片のアミノ酸を部分的に他のアミノ酸に置き換え、蛍光タンパク質の断片同士のアフィニティを調節しタンパク質同士のアフィニティに合わせる。【選択図】図１
2011211983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光タンパク質のＮ末端側断片に接続された第１のタンパク質分子と、前記蛍光タンパク質のＣ末端側断片に接続された前記第２のタンパク質分子とからなる融合タンパク質分子対において、
前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片の少なくとも一方の断片で、少なくとも１箇所以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、
前記Ｎ末端側断片とＣ末端側断片同士のアフィニティは、アミノ酸の置換を受けない場合と比較し、前記アミノ酸の置換によって調節されたことを特徴とする融合タンパク質分子対。
【請求項２】
前記置換されるアミノ酸は、前記蛍光タンパク質のβ−シート上のアミノ酸である請求項１に記載された融合タンパク質分子対。
【請求項３】
前記変更されるアミノ酸は、ロイシンであり、変更されたアミノ酸はイソロイシン、バリン、アラニンである請求項１または２のいずれかの請求項に記載された融合タンパク質分子対。
【請求項４】
前記蛍光タンパク質は配列番号１の蛍光タンパク質である請求項１乃至３のいずれか１の請求項に記載された融合タンパク質分子対。
【請求項５】
前記変更されるアミノ酸は、Ｃ末端側断片のアミノ酸であって配列番号１のＮ末端側から２０１番目若しくは２０７番目のロイシンである請求項３に記載された融合タンパク質分子対。
【請求項６】
請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載された融合タンパク質分子対のそれぞれをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の融合タンパク質分子対のそれぞれを含む遺伝子導入／発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子導入／発現ベクターが導入された請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載された融合タンパク質分子対を産生する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質同士の相互作用を観察するＢｉＦＣ法において用いられる蛍光タンパク質分子対とその蛍光タンパク質分子対をコードする遺伝子、該遺伝子導入ベクターおよびその遺伝子導入ベクターが導入され、目的の蛍光タンパク質分子対を産生する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質間相互作用を解析する技術の１つに、ＢｉＦＣ  （Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ：  二分子蛍光相補性）法がある。ＢｉＦＣとは、蛍光タンパク質を２つの分割断片にすることで失われた蛍光が、相補的な分割断片の再会合により回復する現象である。この現象を利用して、生きた細胞内でのタンパク質間相互作用を可視化することができる。ＢｉＦＣ法を用いると、翻訳後修飾されたタンパク質の細胞内局在や機能解析など、タンパク質が機能している状態に近い条件でのタンパク質間の相互作用を調べることができる。
【０００３】
蛍光タンパク質の分割断片を用いる手法は、２０００年に初めて報告され、逆並行ロイシンジッパーと融合させたＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の分割断片が、大腸菌で、ロイシンジッパーの形成とそれに伴うＧＦＰ断片の会合によって蛍光回復することが明らかにされた（非特許文献１）。
【０００４】
動物細胞内での蛍光回復は、ＧＦＰよりも蛍光強度が大きいＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）で報告され（非特許文献２）、ＢｉＦＣ  アッセイ（ａｓｓａｙ）という術語が初めて使用された。その後、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの複数の蛍光タンパク質を用いたマルチカラーＢｉＦＣ（非特許文献３）が報告された。
【０００５】
ＣＦＰを改良したＣｅｒｕｌｅａｎ（非特許文献４）、ＹＦＰを改良したＣｉｔｒｉｎｅ（非特許文献５）とＶｅｎｕｓ（非特許文献６）は、生理的条件下（３７℃）での発色団形成効率が高く、これらの蛍光タンパク質を用いたマルチカラーＢｉＦＣ（非特許文献７）も報告されている。
【０００６】
近年では、ＢｉＦＣ法で用いられる蛍光タンパク質も増え（非特許文献８、非特許文献９）、また、ユビキチン化されたタンパク質の検出（非特許文献１０）、薬剤によるタンパク質間相互作用の誘導（非特許文献１１）など、ＢｉＦＣ法の応用的な利用も進歩してきている。
【０００７】
また、特許文献１では、時間経過に伴って発光色が変化する蛍光タンパク質をＮ末端側断片とＣ末端側断片にわけて、相互作用を調べたいそれぞれのタンパク質と融合させ、当該タンパク質間の相互作用の際に、分割された蛍光タンパク質が再会合して発色する技術が開示されている。ここでは、蛍光タンパク質としてＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ｍＫＯ）が選択され、特にＮ末端から７０番目のアミノ酸であるブロリンが他のアミノ酸に置換された蛍光タンパク質であることを特徴としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−３０８５６８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】インドラニール  ゴーシュ（Ｉｎｄｒａｎｅｅｌ  Ｇｈｏｓｈ），  アンドリュー  Ｄ．  ハミルトン（Ａｎｄｒｅｗ  Ｄ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、とライニー  レーガン（Ｌｙｎｎｅ  Ｒｅｇａｎ）、「アンチパラレル  ロイシン  ジッパー−ディレクテッド  プロテイン  リアセンブリー：アプリケーション  ツー  ザ  グリーン  フローレセント  プロテイン（Ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ  Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ−Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」，アメリカン  ケミカル  ソサイアティ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、２０００年、１２２、Ｐ．５６５８−５６５９
【非特許文献２】フュウ  Ｃ．Ｄ．（Ｈｕ，  Ｃ．Ｄ．），  シネノフ  Ｙ．（Ｃｈｉｎｅｎｏｖ，  Ｙ．），  とケルポラ  Ｔ．Ｋ．（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，  Ｔ．Ｋ．）「ビジュアリゼーション  オブ  インターラクション  アマング  ビーズィーアイピー  アンド  アールイーエル  ファミリー  プロテインズ  イン  リビング  セルズ  ユージング  バイモレキュラー  フローレセンス  コンプリメンテーション（  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｍｏｎｇ  ｂＺＩＰ  ａｎｄ  Ｒｅｌ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．）」  モル  セル（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ）  ９，  ７８９−７９８  （２００２）．
【非特許文献３】フュウ  Ｃ．Ｄ．（Ｈｕ，  Ｃ．Ｄ．），  シネノフ  Ｙ．（Ｃｈｉｎｅｎｏｖ，  Ｙ．），  とケルポラ  Ｔ．Ｋ．（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，  Ｔ．Ｋ．）「シミュルテイニアス  ビジュアリゼーション  オブ  マルチプル  プロテイン  インターラクションズ  イン  リビング  セルズ  ユージング  マルチカラー  フローレセンス  コンプレメンテイション  アナリシス（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．）ナット  バイオテクノル（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２１，  ５３９−５４５  （２００３）．
【非特許文献４】リッゾ  Ｍ．Ａ．（Ｒｉｚｚｏ，  Ｍ．Ａ．），  スプリンガー  Ｇ．Ｈ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｇ．Ｈ．），  グラナダ  Ｂ．（Ｇｒａｎａｄａ，  Ｂ．），  と  ピストン  Ｄ．Ｗ．（Ｐｉｓｔｏｎ，  Ｄ．Ｗ．）「アン  インプルーブド  シアン  フローレセント  プロテイン  バリアント  ユースフル  フォア  フレッツ（  Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｒｉａｎｔ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ＦＲＥＴ．）ナット  バイオテクノル（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２２，  ４４５−４４９  （２００４）．
【非特許文献５】グリエスベック  Ｏ．（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，  Ｏ．），  バイルド  Ｇ．Ｓ．（Ｂａｉｒｄ，  Ｇ．Ｓ．），  キャンベル  Ｒ．Ｅ．（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｒ．Ｅ．），  ザハリアスＤ．Ａ．（Ｚａｃｈａｒｉａｓ，  Ｄ．Ａ．），  と  ツジエン  Ｒ．Ｙ．（Ｔｓｉｅｎ，  Ｒ．Ｙ．）「リデューシング  ザ  エンバイロメンタル  センシティビィティ  オブ  イエロー  フローレセント  プロテイン（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ．）」Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２９１８８−２９１９４  （２００１）．
【非特許文献６】ナガイ  Ｔ．（Ｎａｇａｉ，  Ｔ．），  イバタ  Ｋ．（Ｉｂａｔａ，  Ｋ．），  パーク  Ｅ．Ｓ．（Ｐａｒｋ，  Ｅ．Ｓ．），  クボタ  Ｍ．（Ｋｕｂｏｔａ，  Ｍ．），  ミコシバ  Ｋ．（Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ，  Ｋ．），  と  ミヤワキ  Ａ．（Ｍｉｙａｗａｋｉ，  Ａ．）「ア  バリアント  オブ  イエロー  フローレセント  プロテイン  ウイズ  ファースト  アンド  エフィシェント  マチュレーション  フォア  セル−バイオロジカル  アプリケーション（Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．）」ナット  バイオテクノ（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）  ２０，  ８７−９０  （２００２）．
【非特許文献７】シュー  Ｙ．Ｊ．（Ｓｈｙｕ，  Ｙ．Ｊ．），  リー  Ｈ．（Ｌｉｕ，  Ｈ．），デング  Ｘ．（  Ｄｅｎｇ，  Ｘ．），  と  フュウ  Ｃ．Ｄ．（Ｈｕ，  Ｃ．Ｄ．）「アイデンティフィケーション  オブ  ニュー  フローレセント  プロテイン  フラグメンツ  フォア  バイモレキュラー  フローレセンス  コンプリメンテーション  アナライシス  アンダー  フィシオロジカルコンディションズ（  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．）  バイオテクニークス（  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）  ４０，  ６１−６６  （２００６）．
【非特許文献８】ファン  Ｊ．Ｙ．（Ｆａｎ，  Ｊ．Ｙ．），  キュイ  Ｚ．Ｑ．（Ｃｕｉ，  Ｚ．Ｑ．），  ウェイ  Ｈ．Ｐ．（Ｗｅｉ，  Ｈ．Ｐ．），  ザングＺ．Ｐ．（Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．Ｐ．），  ズウ  Ｙ．Ｆ．（Ｚｈｏｕ，  Ｙ．Ｆ．），  ワング  Ｙ．Ｐ．（Ｗａｎｇ，  Ｙ．Ｐ．），  と  ザング  Ｘ．Ｅ．（Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．Ｅ．）「スプリット  ｍチェリー  アズ  ア  ニュー  レッド  バイモレキュラー  フローレセンス  コンプリメンテーション  システム  フォア  ビジュアリジング  プロテイン−プロテイン  インターラクションズ  イン  リビング  セルズ（  Ｓｐｌｉｔ  ｍＣｈｅｒｒｙ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｒｅｄ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．）」  バイオケム  バイオフィズ  レス  コミュ  （Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．）  ３６７，  ４７−５３  （２００７）．
【非特許文献９】チュー  Ｊ．（Ｃｈｕ，  Ｊ．），  ザング  Ｚ．（Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．），  ゼング  Ｙ．（Ｚｈｅｎｇ，  Ｙ．），ヤング  Ｊ．（  Ｙａｎｇ，  Ｊ．），  キン  Ｌ．（Ｑｉｎ，  Ｌ．），  リュー  Ｊ．（Ｌｕ，  Ｊ．），フアング  Ｚ．Ｌ．（  Ｈｕａｎｇ，  Ｚ．Ｌ．），  ゼング  Ｓ．（Ｚｅｎｇ，  Ｓ．），  と  ルオ  Ｑ．（Ｌｕｏ，  Ｑ．）「  ア  ノベル  ファー−レッド  バイモレキュラー  フローレセンス  コンプリメンテション  システム  ザット  アローズ  フォア  エフィシェント  ビジュアリザション  オブ  プロテイン  インターラクションズ  アンダー  フィジオロジカル  コンディションズ（  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｒ−ｒｅｄ  ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈａｔ  ａｌｌｏｗｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．）バイオセンス  バイオエレクトロン  （Ｂｉｏｓｅｎｓ．  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．）  ２５，  ２３４−２３９  （２００９）．
【非特許文献１０】ファング  Ｄ．（Ｆａｎｇ，  Ｄ．），  と  ケルポラ  Ｔ．Ｋ．（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，  Ｔ．Ｋ．）「アビクイチン−メディエーティッド  フローレセンス  コンプリメンテション  リビールズ  ザット  ジュン  アビクイティネイテッド  バイ  イッチ／エイアイピー４  イズ  ローカライズド  ツー  リソソーム  （Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈａｔ  Ｊｕｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｄ  ｂｙ  Ｉｔｃｈ／ＡＩＰ４  ｉｓ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｔｏ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ．）」      Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  １０１，  １４７８２−１４７８７  （２００４）．
【非特許文献１１】ロビダ  Ｍ．Ａ．（Ｒｏｂｉｄａ，  Ｍ．Ａ，）と  ケルポラＴ．Ｋ．（Ｋｅｒｐｐｏｌａ，  Ｔ．Ｋ．）「バイモレキュラー  フローレセンス  コンプリメンテーション  アナライシス  オブ  インデューシブル  プロテイン  インターラクション：エフェクト  オブ  ファクターズ  アフェクティング  プロテイン  フォールディング  オン  フローレセント  プロテイン  フラグメント  アソシエーション（Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．）        Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３９４，  ３９１−４０９  （２００９）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＢｉＦＣ法は、１つの蛍光タンパク質を分断し、それぞれの断片を２つの相互作用を調べたいタンパク質（目標タンパク質）にそれぞれ融合させておき、２つの目標タンパク質が相互作用を行った時に、蛍光タンパク質断片同士が会合し発光する現象を利用したタンパク質間相互作用を評価する方法の１つである。従って、２つの目標タンパク質が相互作用を行わない場合には、蛍光タンパク質断片同士は会合せず、発光しないという事が前提となっている。
【００１１】
しかし、タンパク質は複雑な３次元構造を有しており、ペプチド主鎖の多彩な折れ曲がり構造と、アミノ酸側鎖の官能基が存在する。そして、これらペプチド主鎖の形状とアミノ酸側鎖の官能基間の相互作用によって、タンパク質間のアフィニティ（親和力）が決定されることが知られている。従って、２つの目標タンパク質間に相互作用がなくても、分断された蛍光タンパク質断片同士のアフィニティが強ければ、断片同士の会合が生じることが考えられる。その結果、目標タンパク質同士の相互作用がなくても発光してしまうという現象が生じる事が考えられる。この状態は、２つの目標タンパク質間の会合を示していることにならず、タンパク質間の相互作用を評価する方法として好ましくない状態であるといえる。本発明者は、事実このような状態を観測し、上記の課題を把握するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、上記の課題に鑑みて想到されたものであり、分断された蛍光タンパク質間のアフィニティを調節する方法を提供するものである。より具体的には、
蛍光タンパク質のＮ末端側断片に接続された第１のタンパク質分子と、前記蛍光タンパク質のＣ末端側断片に接続された前記第２のタンパク質分子とからなる融合タンパク質分子対において、
前記Ｎ末端側断片と前記Ｃ末端側断片の少なくとも一方の断片で、少なくとも１箇所以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、
前記Ｎ末端側断片とＣ末端側断片同士のアフィニティは、アミノ酸の置換を受けない場合と比較し、前記アミノ酸の置換によって調節されたことを特徴とする融合タンパク質分子対を提供する。
【００１３】
また、本発明の融合タンパク質分子対では、前記置換されるアミノ酸は、前記蛍光タンパク質のβ−シート上のアミノ酸である。
【００１４】
また、本発明の融合タンパク質分子対では、前記変更されるアミノ酸は、β−シート上のロイシンであり、変更されたアミノ酸はイソロイシン、バリン、アラニンである。
【００１５】
また、本発明の融合タンパク質分子対では、前記蛍光タンパク質は配列番号１の蛍光タンパク質である。
【００１６】
また、本発明の融合タンパク質分子対では、前記変更されるアミノ酸は、Ｃ末端側断片のアミノ酸であって配列番号１のＮ末端側から２０１番目若しくは２０７番目のロイシンである。
【００１７】
また、本発明は、上記の融合タンパク質分子対をコードする遺伝子を提供する。また、上記遺伝子のそれぞれを含む遺伝子導入／発現ベクターを提供する。さらに、その遺伝子導入／発現ベクターが導入され、上記の融合タンパク質分子対を産生する細胞を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、蛍光タンパク質の分断された断片同士のアフィニティを調節するので、目標タンパク質同士が相互作用を行った時だけ、蛍光タンパク質が再会合し発光させることができる融合タンパク質分子対と、その融合タンパク質分子対を産生する細胞を提供することができる。これによって細胞内の活動はもとより、細胞外であっても、タンパク質同士の相互作用をアッセイするＢｉＦＣ法を、より正確に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のタンパク質の相互作用の概念を示す図である。
【図２】蛍光タンパク質の構造を例示する図である。
【図３】本実施例に用いた蛍光タンパク質の構造とアミノ酸配列の関係を示す図である。
【図４】アミノ酸の置き換え点を求めるために相互作用を行うアミノ酸同士の距離を計算した結果を示す図である。
【図５】本実施例に用いたベクターの構成を示す図である。
【図６】メガ・プライマー法を説明する概念図である。
【図７】本実施例に用いたベクターを作製する工程を示す概念図である。
【図８】本実施例の結果（蛍光回復率）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の概要を図１を用いて説明する。図１（ａ）を参照して、目標タンパク質１０、１１のそれぞれには、蛍光タンパク質のＮ末端側断片１２とＣ末端側断片１３がそれぞれ結合されている。本発明では、これらタンパク質の対を融合タンパク質分子対と呼ぶ。目標タンパク質同士が接近して相互作用を及ぼしあうと、蛍光タンパク質のＮ末端側断片とＣ末端側断片も接近し会合する。図１（ｂ）の符号１４は、目標タンパク質が相互作用により会合していることを示す。この会合によって蛍光タンパク質断片同士１２，１３が会合し、蛍光タンパク質として発光機能を回復する（１５）。これがＢｉＦＣ法の原理である。従って、目標タンパク質同士が相互作用を行っても、蛍光タンパク質の断片同士が会合せず、発光を生じない場合は、タンパク質間の相互作用を評価する方法として利用することはできない。図１（ｃ）は、この様子を模式的に表している。
【００２１】
一方、目標タンパク質間の相互作用がないにも係らず、蛍光タンパク質の断片同士が会合し発光機能を回復する場合も、タンパク質間の相互作用を評価する方法として利用することはできない。図１（ｄ）は、この様子を表している。すなわち、ＢｉＦＣ法においては、目標タンパク質同士のアフィニティと蛍光タンパク質の断片同士のアフィニティを適切に調節することが必要である。言い換えると、図１（ｃ）または図１（ｄ）で示した状態にならず、図１（ｂ）に示したように目標タンパク質間の相互作用に応じて蛍光タンパク質の断片同士が会合して発光すること必要となる。本発明では、蛍光タンパク質断片の一部のアミノ酸を他のアミノ酸に置換し、上記のような目標タンパク質の相互作用に応じて発光するように蛍光タンパク質断片同士のアフィニティを調節する。ここで調節するとは、蛍光タンパク質断片同士のアフィニティを強くする若しくは弱くすることをいう。
【００２２】
本発明で利用できる蛍光タンパク質は特に制限はない。ＣＦＰ、ＧＦＰばかりでなく、近赤外領域や、近紫外域の光を発光する蛍光タンパク質でもよい。図２（ａ）には、後述する実施例で用いた黄色を発色する蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓの立体構造モデルを示す。蛍光タンパク質には、β−シート（２０）構造を形成する部分と、α−へリックス（２１）およびループ（２２）の部分が存在する。そして、全ての蛍光タンパク質には図２と同様なβ−シート構造の部分が存在する。例えば、図２（ｂ）には、赤色蛍光を発色する蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙの構造を示す。図２（ａ）同様のβ−シート構造を有している。なお、図２の構造は、以下のＵＲＬで知られるプロテインデータベースでることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｅｘｐｌｏｒｅ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｄｏ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅＩｄ＝１ＭＹＷ
蛍光タンパク質のＮ末端側断片とＣ末端側断片との切断点は特に限定するものではないが、β−シート以外の部分が望ましい。特にループの部分が望ましい。切断された蛍光タンパク質が再会合するには、疎水性相互作用が必要と考えられる。そして、β−シート部分での疎水性相互作用は、分割された切断片同士の会合に寄与すると考えられるので、β−シート部分は切断されずに残っているのが好ましいからである。
【００２３】
本発明では、Ｎ末端側断片若しくはＣ末端側断片の少なくとも一方の断片で、少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸と置換する。置換するアミノ酸はβ−シート上のアミノ酸が望ましい。蛍光タンパク質は、図２に例示したように、並列したβ−シート構造を有している。分断された蛍光タンパク質断片同士が引きあって会合するには、このβ−シート部分の疎水性結合が最も有効に働くと考えられるからである。
【００２４】
置換するアミノ酸は、ロイシンが望ましい。ロイシンは、３つの炭素原子が結合した直鎖構造を有する。そして、直鎖構造の炭素原子の数が３（イソロイシン）、２（バリン）、１（アラニン）であるアミノ酸への置換によって、両断片間のアフィニティを調節しやすいからである。ただし、ロイシン以外のアミノ酸の選択を棄却するものではない。また、置換後のアミノ酸がイソロイシン、バリン、アラニン以外のアミン酸である事を排除するものでもない。
【００２５】
本発明で蛍光タンパク質の断片と融合される目標タンパク質は特に限定されるものではない。また、本発明を利用する温度やｐＨ等の環境も、目標タンパク質やその断片が変性しない範囲であれば特に制限されない。上記条件を満たせば、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏであってもよい。
【００２６】
蛍光タンパク質の断片と目標タンパク質の融合方法については、両タンパク質遺伝子のコドンフレームが一致（インフレーム）すれば特に制限はない。公知の組換え技術を用いてこの融合タンパク質遺伝子を作製できる。より具体的には、蛍光タンパク質の断片をコードするＤＮＡと目標タンパク質をコードするＤＮＡを、インフレームで直接もしくはリンカーを介して結合すれば、目標タンパク質と蛍光タンパク質の断片が融合したタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００２７】
同様にして、蛍光タンパク質の他方の断片ともう一方の目標タンパク質とが融合した融合タンパク質遺伝子を作製できる。さらに、この融合タンパク質遺伝子をこの遺伝子を導入する細胞に適したプラスミドに、発現ユニットと共に組み込んで、融合タンパク質遺伝子を該細胞で発現させるための組換えプラスミドを得ることができる。これら融合タンパク質遺伝子およびこれを組み込んだ組み換えプラスミドの作製は公知の方法、例えば、Ｍａｎｉａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法で作製できる。
【００２８】
これらの組換えプラスミドを有する微生物、動物若しくは植物の細胞に導入・発現することで、蛍光タンパク質のいずれかの断片がそれぞれ融合された２つの目標タンパク質／蛍光タンパク質断片融合タンパク質を産生させることができる。また、組換えプラスミドを細胞に導入して、目的の目標タンパク質／蛍光タンパク質断片融合タンパク質を産生させることは、公知の方法を利用することができる。
【００２９】
なお、プラスミドに組み込む蛍光タンパク質の断片をコードするＤＮＡの少なくとも一方は、当該蛍光タンパク質断片中のβ−シート上のアミノ酸を置換した蛍光タンパク質断片をコードするＤＮＡである。本発明は、蛍光タンパク質断片のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、蛍光タンパク質の断片同士の会合のアフィニティを調節するからである。
【実施例】
【００３０】
以下に本発明のタンパク質分子対について実施例を参考し、より詳細に説明する。実施例の概略は以下の通りである。
（１）目標タンパク質と蛍光タンパク質の断片が融合した融合タンパク質分子対をコードする遺伝子を含む組換えプラスミドを作製した。
（２）これらの組換えプラスミドで大腸菌形質転換し、形質転換した大腸菌を培養し組換えプラスミドＤＮＡを抽出し精製した。
（３）精製したプラスミドＤＮＡ２種類を同時にマウス細胞に導入した。
（４）マウス細胞を固定した後、顕微鏡観察し、蛍光の有無を確認した。
【００３１】
目標タンパク質同士のアフィニティと蛍光タンパク質同士のアフィニティの程度を知るために、本実施例では予め結合することが知られているタンパク質同士とそれらの一方の形を変えたミュータントを用意した。一方がミュータントである組では目標タンパク質同士は決して相互作用を行わない。また、蛍光タンパク質の断片の１つのアミノ酸も複数種類のアミノ酸に置換したものを用意した。アフィニティの程度を変えるためである。
【００３２】
目標タンパク質としては、ｂＦｏｓとｂＪｕｎを使用した。これらの２つのタンパク質は、ロイシンジッパーを構成することで相互作用を行うことが知られている。
【００３３】
蛍光タンパク質は配列番号１で示すアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質を用いた。これは、Ｖｅｎｕｓと呼ばれる蛍光タンパク質であり、黄色に発光する。このＮ末端断片をｂＪｕｎに融合させ、アミノ酸を置換したＣ末端断片をｂＦｏｓに融合させた。アミノ酸の置き換えは、Ｃ末端側断片で行い、Ｎ末端側断片にはアミノ酸の置き換えを行わなかった。
【００３４】
図３には、蛍光タンパク質の構造とアミノ酸配列の概念図を示す。蛍光タンパク質の構造は図２（ａ）と同じものである。図３（ａ）には、蛍光タンパク質の構造を、図３（ｂ）にはＮ末端から番号をつけたアミノ酸配列を、そして図３（ｃ）にはアミノ酸配列の切断を概念的に示す模式図を示した。図３（ａ）で示したβ−シート構造の番号と図３（ｂ）で示したアミノ酸配列中の番号はそれぞれ対応する。
【００３５】
この蛍光タンパク質の全長は２３８個のアミノ酸からなる。切断箇所は７番目のバレル構造の終端となる１５４番目のアミノ酸（アラニン）と１５５番目のアミノ酸（アスパラギン酸）の間とした。また、Ｎ末端側断片には１５５番目から１７３番目までの重複部分を有している。ここで、Ｎ末端側断片をＶＮ１７３と呼び、Ｃ末端側断面をＶＣ１５５と呼ぶ。
【００３６】
蛍光タンパク質の断片同士のアフィニティの調節は配列のアミノ酸の置き換えで行う。置き換えを行うアミノ酸は以下のようにして決定した。図４には、蛍光タンパク質の構造中のアミノ酸同士の存在箇所と距離を計算で求めた表を示す。例えば、Ｃ末端側断片にある１８２番目のチロシン（Ｔｙｒ）は９番目のβ−シート上にあり、Ｖ末端側断片の４番目のβ−シート上にある９９番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）と３．８４３オングストロームの距離関係にある。
【００３７】
この結果からＣ末端側断片に存在する（Ｎ末端側から）２０１番目のロイシン（Ｌｅｕ）（符号３０）と２０７番目のロイシン（Ｌｅｕ）（符号３１）は、疎水性相互作用の相手になると考えられるＮ末端側断片のアミノ酸がそれぞれ４つ、３つと多い。そこで、２０１番目と２０７番目のロイシンを置き換えるアミノ酸とした。
【００３８】
置き換えたアミノ酸は、イソロイシン、バリン、アラニンとした。これらは、それぞれ直鎖の炭素数が３、２、１と少なくなる。すなわち、疎水性相互作用は炭素数の減少に従って小さくなると考えた。疎水性相互作用の相手との距離が大きくなるからである。また、ロイシンはその直鎖の末端にメチル基が２つあるのに対して、イソロイシンの直鎖の末端にはメチル基は１つである。従って、イソロイシンはロイシン同様その直鎖の炭素数が３であるが、相互作用は若干小さくなると考えた。
【００３９】
図５には作製したベクターの構造の概念図を示す。図５（ａ）を参照して、ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５（Ｌ２０１Ｉ）は、ｂＦｏｓと２０１番目のロイシンをイソロイシンに置換したＶＣ１５５をコードする塩基配列が組み込まれたベクターである。なお、元々のｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５はパリュー大学由来である。サイトメガロウイルス由来のプロモータであるＰＣＭＶ−ＩＥと検出用のタンパク質であるＨＡ−ｔａｇをコードする塩基配列の後、ｂＦｏｓと２０１番目のアミノ酸が置換されたＶＣ１５５をコードする塩基配列が続く構造である。
【００４０】
同様に、２０１番目のロイシンをバリン、アラニンに置換したものと、２０７番目のロイシンをイソロイシン、バリン、アラニンに置換したものを用意した。それぞれ、ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５（Ｌ２０１Ｖ）、ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５（Ｌ２０１Ａ）、ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５（Ｌ２０７Ｉ）ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５（Ｌ２０７Ｖ）、ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５（Ｌ２０７Ａ）のように表す。
【００４１】
これらの相手方となる融合タンパク質分子は、ｂＪｕｎと蛍光タンパク質のＮ末端側断片である（図５（ｂ）参照）。ベクターは、ｐＦＬＡＧ−ｂＪｕｎ−ＶＮ１７３であり、ｂＪｕｎと蛍光タンパク質のＮ末端断片をコードする塩基配列が組み込まれたベクターである。ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５（Ｌ２０１Ｉ）などと同様に、サイトメガロウイルス由来のプロモータであるＰＣＭＶ−ＩＥと検出用のタンパク質であるＦＬＡＧ−ｔａｇをコードする塩基配列の後、ｂＪｕｎとＶＮ１７３をコードする塩基配列が続く構造である。
【００４２】
また、ネガティブコントロールとして、相互作用を起こさない目標タンパク質を用意した。これはｂＦｏｓをミュータント化してｂＪｕｎと相互作用を起こさないようにしたタンパク質である。これをｂＦｏｓ（ｍ）とした。
【００４３】
また、上記の組換えプラスミドＤＮＡが導入されたことを確認するために、図２（ｂ）で示した赤色の蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡも用意した。この蛍光タンパク質はｍＣｈｅｒｒｙと呼ばれる蛍光タンパク質で配列番号２番で示すアミノ酸配列を有する。
【００４４】
＜組換えプラスミドＤＮＡの作製＞
図６と図７を用いて、組換えプラスミドＤＮＡの作製の工程を説明する。パリュー大学由来のｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５をＡｓｐ７１８とＮｏｔＩで制限酵素処理し、ＶＣ１５５部分１０を切り出し、塩基配列１３を得た（図７（ａ、ｃ））。一方、ｐＨＡ−ｂＦｏｓ−ＶＣ１５５由来のプラスミドのＶＣ１５５部分の所定アミノ酸を図６で示したメガ・プライマー法で置き換えたプラスミド１７を作製した（図７（ｂ））。メガ・プライマー法で用いたプライマーを表１に示す。
【００４５】
【表１】
2011211983.tif 000003
【００４６】
なお、上記のプライマー１は配列番号３、プイライマー２（Ｌ２０９Ｉ）は配列番号４、プイライマー２（Ｌ２０１Ｖ）は配列番号５、プイライマー２（Ｌ２０１Ａ）は配列番号６、プイライマー２（Ｌ２０７Ｉ）は配列番号７、プイライマー２（Ｌ２０７ＶＩ）は配列番号８、プイライマー２（Ｌ２０７Ａ）は配列番号９、プライマー３は配列番号１０である。
【００４７】
図６を参照して、メガ・プライマー法について概説しておく。図６（ａ）は、図７（ｂ）で示すＶＣ１５５部分のＤＮＡを示す。プライマーＰ１は、この２本鎖ＤＮＡのうち、片方のＤＮＡ鎖の３´末端部分に対応するプライマーであり、プライマーＰ２は、もう片方のＤＮＡ鎖に対応し、置き換えたい塩基４０を含み、その前後の塩基で構成されるプライマーである。
【００４８】
ＶＣ１５５部分のＤＮＡを鋳型とし、プライマーＰ１およびプライマーＰ２を用いてＰＣＲを行うと、図６（ｂ）で示すように、置換したい部分の塩基が、塩基４０とそれに対応する塩基に置き換えられた２本鎖ＤＮＡが大量に得られる。これがメガ・プライマーＭＰである。
【００４９】
そして、図６（ｃ）で示すように、ＶＣ１５５部分のＤＮＡを鋳型とし、このメガ・プライマーＭＰとプライマーＰ３を用いて再度ＰＣＲを行うと、図６（ｄ）で示すような、ＶＣ１５５部分のＤＮＡであって、所定の場所の塩基が、塩基４０とそれに対応する塩基に置換された２本鎖ＤＮＡを得ることができる。従って、所定箇所のアミノ酸を置き換えるのは、そのアミノ酸に対応する箇所の塩基配列を変更したプライマーＰ２を用いる。以上の工程で、所定の箇所をイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）やアラニン（Ａ）に置き換えた。
【００５０】
ＶＣ１５５の所定のアミノ酸を置き換えたプラスミドから置き換えられたＶＣ１５５部分だけをＡｓｐ７１８とＮｏｔＩで制限酵素処理し切り出し塩基配列１７を得た（図７（ｂ））。なお、図７（ｂ）（ｄ）でバツ印の部分は、アミノ酸が置き換えられた部位を示す。そして、塩基配列１３と塩基配列１７をライゲーションして、所定のプラスミド１９を得た。
【００５１】
なお、塩基配列１３と１７は読み枠が合うようにＭＣＳ（マルチクローニングサイト）内にある２種類の制限酵素で処理し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液処理後、エタノール沈殿により回収した。さらに電気泳動を行った後、ゲルから切り出し、Ｍａｇ  ＥｘｔｒａｃｔｏｒＴＭ  （ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて抽出し、以下のように反応液１０μＬを作製し、１６℃で１６時間ライゲーションを行った。
【００５２】
＜  反応液の組成  ＞
ベクター                                      ｘ  μＬ
インサート                                    ｙ  μＬ
Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ                ０．４  μＬ
１０×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ          １  μＬ
ＡＴＰ  （５．０  ｍＭ）                      １  μＬ
ベクターとインサートのモル比が１：３となるように加え、滅菌水で１０μＬにｆｉｌｌ  ｕｐした。
【００５３】
＜塩基配列の確認＞
作製したベクターの塩基配列は、以下の手順によりシークエンシング反応によるキャピラリー電気泳動によって確認した。
【００５４】
０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに鋳型ＤＮＡ（５０−１００ｐｍｏＬ／μＬに調製）を４μＬ移し、サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて９６℃で１分間加熱後、直ちに氷上に置いた。これにＣＥＱ  ＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を４μＬ、プライマーを１μＭとなるように加え、反応液量を１０μＬとした。この反応液をサーマルサイクラーで以下の条件で反応を３０サイクル行った。
【００５５】
＜  反応条件  ＞
Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ    ９６  ℃       ２０ｓｅｃ
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ          ５０  ℃        ２０ｓｅｃ  ×３０  ｃｙｃｌｅ
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ          ６０  ℃          ４  ｍｉｎ
４  ℃        ∞
ＰＣＲで増幅させたベクターを次の手順でキャピラリー電気泳動を行った。１．５ｍＬマイクロチューブにＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３Ｍ酢酸ナトリウム  １μＬ、２０ｍｇ／ｍＬ  グリコーゲン溶液０．５μＬを入れておき、反応終了後のシークエンシング反応液を１０μＬ加え、よく攪拌した。冷１００％エタノールを３０μＬを加えて攪拌した後、直ちに４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除き、冷７０％エタノールを２００μＬを加えて、ペレットを洗浄した後、４℃、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、上清を除去した後、ペレットを真空乾燥し、３０μＬのＳａｍｐｌｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  に溶解した。
【００５６】
サンプルを９６−ｗｅｌｌサンプルプレートに移し、Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を１滴加えた。９６−ｗｅｌｌ  バッファープレートに、ＣＥＱ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）をｗｅｌｌの８割程度加えた。これらのサンプルプレートとバッファープレート、そして、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｌ−ＬＰＡ  Ｉを、ＣＥＱＴＭ２０００ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製）にセットして、キャピラリー電気泳動を行った。塩基配列の結果はこのシステムの出力としてテキストデータで得ることができる。
【００５７】
次に作製した組換えプラスミドを大腸菌を用いて増幅させた。これは、以下の手順によった。
（１）コンピテントセルを作製した。
（２）大腸菌（コンピテントセル）に組換えプラスミドを導入し培養させた。
以下にその手順を詳細に説明する。
【００５８】
＜コンピテントセルの作製＞
大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）を、ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。この培地から単一コロニーを選び、Ｌ字型試験管に入れたＬＢ液体培地２０ｍＬに植菌して、３７℃で一晩振盪培養した。一晩振盪培養したＬＢ液体培地２ｍＬを、坂口フラスコに入れたＬＢ液体培地２００ｍＬに加えた。坂口フラスコ内のＬＢ液体培地を３７℃に保ち、波長６６０ｎｍで測定した濁度（Ｏ．Ｄ．６６０）が０．６になるまで振盪培養した。その後坂口フラスコを氷上に２０分間静置した。
【００５９】
この振盪培養した大腸菌を洗浄した。具体的には、以下の手順を行った。フラスコ内のＬＢ液体培地を遠心チューブに移し、０℃、５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離後、上清を取り除いた。上清を取り除いた遠心チューブに、オートクレーブ滅菌した氷冷超純水１５０ｍＬを加えて懸濁した。懸濁した後、遠心チューブを、０℃、５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離後、上清を取り除いた。そして、再度遠心チューブに、オートクレーブ滅菌した氷冷超純水７５ｍＬを加えて懸濁した。懸濁した後、遠心チューブを、０℃、５０００ｒｐｍでの条件で１０分間遠心分離後、上清を取り除いた。以上のように、大腸菌を氷冷超純水で２回洗浄した。
【００６０】
次に、遠心チューブにオートクレーブ滅菌した１０％グリセロール１２ｍＬを加えて、懸濁した。グリセロールで懸濁した後、０℃、６０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離後、１０％グリセロールを取り除いた。そして再び、遠心チューブにオートクレーブ滅菌した１０％グリセロール１．６ｍＬを加え、懸濁した。
【００６１】
以上の手順で、振盪培養された大腸菌を、ＤＮＡに対する膜透過性が増大した大腸菌であるコンピテントセルとした。保存するコンピテントセルは、遠心チューブ中の懸濁液を１．５ｍＬマイクロチューブに４０μＬずつ分注し、液体窒素に入れて凍結させた。この保存するコンピテントセルは、−８０℃で保存した。
【００６２】
＜エレクトロポレーション法による大腸菌の形質転換＞
氷上で融解させたコンピテントセル４０μＬに、プラスミドＤＮＡ溶液１μＬを加えて、混合し混合溶液とした。この混合溶液を氷上で冷やしておいたキュベット（電極間隔２．０ｍｍ）に移し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｕｌｓｅｒ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、パルス（電圧２．１ｋＶ）をかけた。
【００６３】
この混合溶液にＳＯＣ培地１ｍＬを加えて懸濁し、１．５ｍＬマイクロチューブに移した。これを適当な抗生物質を添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
【００６４】
＜プラスミドＤＮＡの抽出と精製＞
次に増殖させた大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出し精製した。プラスミドＤＮＡを導入した大腸菌を培養したＬＢ寒天培地から単一コロニーを選び、適当な抗生物質を添加したＬＢ液体培地３ｍＬに植菌して、３７℃で一晩振盪培養した。
【００６５】
培養液を１．５ｍＬマイクロチューブに移し、４℃、１００００ｒｐｍの条件で１分間遠心分離して、上清を取り除き集菌した。これにＳｏｌｕｔｉｏｎＩを１００μＬ加えて懸濁後、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩを２００μＬ加えて穏やかに混合し、氷上に５分間置いた。ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩを入れることで大腸菌は溶菌し、細胞内のプラスミドＤＮＡが取り出せる。マイクロチューブ内の溶液を中和させるために、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩを１５０μＬ加えて穏やかに混合し、氷上に５分間置いた。
【００６６】
なお、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩは、Ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ８）にグルコースを５０ｍＭになるように加えた溶液である。また、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩは、０．２Ｎの水酸化ナトリウムに１％のＳＤＳ（ラウリル酸ナトリウム）を加えた溶液である。また、ＳｏｌｕｔｉｏｎＩＩＩは、３Ｍの酢酸カリウムと１１．５％の酢酸を加えた溶液である。
【００６７】
次に１．５ｍＬマイクロチューブごと４℃、１５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離後、ペレットを取り除いた。ペレットを取り除いた溶液に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液を５００μＬ加えて穏やかに混合し、プラスミドＤＮＡを抽出した。
【００６８】
２０℃、１５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離後、上清を別のマイクロチューブに移した。２／３倍量のイソプロパノールを加えて穏やかに混合し、室温で１０分間置いた。
【００６９】
さらに、２０℃、１５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離後、上清を取り除いた。上清を取り除いたペレットは、エタノール沈殿によって得たプラスミドＤＮＡである。ペレットを冷７０％エタノール４００μＬでリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で３分間遠心分離後、上清を取り除き、１５分間真空乾燥した。
【００７０】
抽出したプラスミドＤＮＡ中のＲＮＡを除去するために次のプロセスを行った。ペレットをＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ８．０）５０μＬに溶解し、ＲＮａｓｅＡ溶液（０．５μｇ／ｍＬ）を１μＬ加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。さらに、２０％ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを３０μＬ加えて、よく混合し、氷上に１時間置いた。
【００７１】
そして、４℃、１５０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離後、上清を取り除いた。ペレットを冷７０％エタノール４００μＬでリンスし、４℃、１５０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を取り除き、１５分間真空乾燥した。ペレットをＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ８．０）５０μＬに溶解した。以上の手順で精製したプラスミドＤＮＡを得た。
【００７２】
次に精製したプラスミドＤＮＡをマウス細胞に導入した。具体的な手順は以下による。
（１）マウス細胞を培養した。
（２）リポフェクション法を用いてマウス細胞に遺伝子を導入した。
以下に詳細を説明する。
【００７３】
まず、マウスの細胞は以下のようにして培養した。マウスＣ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞を、Ｄ−ＭＥＭ培地を８ｍＬ入れた１００ｍｍシャーレの中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベーターを用いて培養した。継代は、対数増殖期の細胞が、７０−９０％コンフルエントした時に行った。シャーレ内のＤ−ＭＥＭ培地を取り除き、１×ＰＢＳ（−）を４ｍＬ入れて洗浄し、これを取り除いた。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を１ｍＬ入れて、細胞をシャーレからはがし、球形になったことを確認してから、Ｄ−ＭＥＭ培地を４ｍＬ入れて懸濁した。
【００７４】
この単一細胞浮遊液０．５ｍＬを、あらかじめＤ−ＭＥＭ培地を８ｍＬ入れた別のシャーレに播種し、細胞をシャーレ全体に均一になるように分散させて、３７℃、５％  ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベーターを用いて培養した。
【００７５】
凍結ストック細胞の作製は、対数増殖期の細胞が、７０−９０％コンフルエントした時に、継代と同様にして細胞を１００ｍｍシャーレからはがした。細胞が球形になったことを確認してから、Ｄ−ＭＥＭ培地を４ｍＬ入れて懸濁した。この単一細胞浮遊液を遠心チューブに移し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上清を取り除いた。無血清タイプ細胞凍結保存液バンバンカーＴＭ（リンフォテック社製）を細胞凍結保存用チューブ（クライオチューブ）１本につき０．５ｍＬとなるように加えて、懸濁した。この細胞懸濁液をクライオチューブに移し、−８０℃で保存した。
【００７６】
−８０℃で凍結保存された細胞を培養する時は、まず、クライオチューブを３７℃の恒温槽内で軽く揺すりながら細胞懸濁液を半解凍し、その後、室温で解凍を行った。この細胞懸濁液０．５ｍＬを、あらかじめＤ−ＭＥＭ培地を８ｍＬ入れた１００ｍｍシャーレに播種し、細胞をシャーレ全体に均一になるように分散させて、３７℃、５％ＣＯ２存在下のＣＯ２インキュベーターを用いて培養した。
【００７７】
培養した細胞にプラスミドＤＮＡをリポフェクション法で導入した。継代と同様にして細胞を１００ｍｍシャーレからはがし、細胞が球形になったことを確認してから、Ｄ−ＭＥＭ培地を４ｍＬ入れて懸濁した。この単一細胞浮遊液をトランスフェクション時に５０−８０％コンフルエントになるように、１２−ｗｅｌｌプレートに１サンプルにつき（以下同様）、１μＬ播いた。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭRＩＲｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入したいＤＮＡ１μｇを加え、合計が２００μＬとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭRＩＲｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍを加えて、穏やかに混合した。
【００７８】
ここで導入したいＤＮＡとは、先に作製したベクターである。より具体的には、ＢｉＦＣを行わせる目標タンパク質と蛍光タンパク質の断片がコードされたプラスミドＤＮＡと、赤色の蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡである。ＢｉＦＣを行わせるプラスミドＤＮＡは、赤色の蛍光タンパク質の３倍量となるように配合した。また、混合した溶液に３μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて、穏やかに混合後、３０分間室温で静置した。このＤＮＡ−ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ＬＴＸ複合体２００μＬをｗｅｌｌに加えて、穏やかにプレートを振動させて混合した。
【００７９】
次にマウス細胞を観察し、蛍光発光の有無を確認した。これは以下の手順によった。
（１）細胞の固定およびＤＡＰＩによる核の染色を行った。
（２）標本を作製した。
（３）顕微鏡による細胞観察を行った。
以下に具体的な手順を説明する。
【００８０】
＜細胞の固定およびＤＡＰＩによる核の染色＞
培養細胞への遺伝子導入から２４時間後に、固定と染色を行った。３５ｍｍシャーレ内のＤ−ＭＥＭ培地を取り除き、４％パラホルムアルデヒドをカバーガラス全体に広がるように加えた。室温で１５分間静置して固定後、４％パラホルムアルデヒドを取り除き、１×ＰＢＳ（−）をカバーガラスがひたる程度に加えて、１０分間振盪し洗浄した。１×ＰＢＳ（−）を取り除き、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１ｍＬ加えて、室温で５分間静置した。
【００８１】
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を取り除き、１×ＰＢＳ（−）をカバーガラスがひたる程度に加えて、１０分間振盪して洗浄した。１×ＰＢＳ（−）を取り除き、ＤＡＰＩ染色液をカバーガラス全体に広がるように加え、室温で５分間静置して染色した。ＤＡＰＩ染色液を取り除き、１×ＰＢＳ（−）をカバーガラスがひたる程度に加えて、１０分間振盪し洗浄した。
【００８２】
＜標本の作製＞
マウント用グリセロールを１０μＬのせたスライドガラスの上に、細胞を固定・染色したカバーガラスを、気泡が入らないようにしてのせた。カバーガラスの上に濾紙を置き、垂直に押して余分な水分を取り除いた後、カバーガラスの周囲に黒いマニキュアを塗布し、遮光して乾燥させた。
【００８３】
＜蛍光顕微鏡による細胞の観察＞
標本を、冷却型ＣＣＤカメラＯＲＣＡ−ＥＲ（浜松ホトニクス社製）を装備した蛍光顕微鏡Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００  （Ｎｉｋｏｎ社製）を用いて観察した。フィルターブロックは、ＤＡＰＩ染色の観察用にＵＶ−１Ａフィルター（ＥＸ：３６０−３７０ｎｍ、ＤＭ：４００ｎｍ、ＢＭ：４００ｎｍ、Ｎｉｃｏｎ社製）、蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ）の観察用にＦＩＴＣフィルター（ＥＸ：４６５−４９５ｎｍ、ＤＭ：５０５ｎｍ、ＢＭ：５１５−５５５ｎｍ、Ｎｉｃｏｎ社製）、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）の観察用にＴｘＲｅｄフィルター（ＥＸ：５４０−５８０ｎｍ、ＤＭ：５９５ｎｍ、ＢＭ：６００−６６０ｎｍ、Ｎｉｃｏｎ社製）を用いた。画像の取り込みと解析は、画像解析ソフトウェア  Ｌｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍａｃ（三谷商事社製）を用いて行った。
【００８４】
次に図８を参照して、観察結果を説明する。図８（ａ）は、横軸にサンプルの種類を示し、縦軸は蛍光回復の割合（％）を示す。蛍光回復率は、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）の発光をする細胞の数に対して、それらの細胞の中で緑黄色の蛍光発光をしている細胞の数の割合で評価した。ＢｉＦＣを行わせるための緑黄色の蛍光タンパク質（Ｖｅｎｕｓ）は、赤色の蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）の３倍量が導入されている。したがって、赤色の蛍光発光をする細胞の全てにＢｉＦＣを行わせるためのプラスミドＤＮＡが導入されていると推定できる。言い換えると、赤色を発光していて緑黄色を発光していない細胞は、ＢｉＣＦを行わせるためのプラスミドＤＮＡは導入されているにもかかわらず、蛍光回復しなかったケースと判断できる。
【００８５】
横軸のサンプルは、図８（ａ）、（ｂ）ともに同じ順で表示されている。サンプルは横軸左から、ｂＦｏｓの野生種（ｂＦｏｓＶＣ（ｗｔ））、２０１番目のアミノ酸を変更したもの（ｂＦｏｓＶＣ（Ｌ２０１Ｉ）、ｂＦｏｓＶＣ（Ｌ２０１Ｖ）、ｂＦｏｓＶＣ（Ｌ２０１Ａ））と２０７番目のアミノ酸を変更したもの（ｂＦｏｓＶＣ（Ｌ２０７Ｉ）、ｂＦｏｓＶＣ（Ｌ２０７Ｖ）、ｂＦｏｓＶＣ（Ｌ２０７Ａ））の７種類である。ｂＦｏｓの野生種は２０１番目および２０７番目のアミノ酸がロイシンである。
【００８６】
図８（ｂ）は、ｂＦｏｓをミュータントにした場合である。サンプルはｂＦｏｓがミュータントになっている以外は、図７（ａ）と同じ蛍光タンパク質のＣ末端側断片が融合されたサンプルである。
【００８７】
図８（ａ）を参照して、ｂＦｏｓＶＣの野生種では、目標タンパク質の相互作用によってほとんどの細胞内で蛍光発光が回復していることが観察された。一方、図８（ｂ）を参照すると、目標タンパク質が相互作用を行わない場合であるにもかかわらず、およそ半分の細胞で蛍光回復が観察された。すなわち、目標タンパク質のアフィニティより蛍光タンパク質の断片同士のアフィニティが強いために、目標タンパク質の相互作用の有無に係らず、蛍光回復が行われた。
【００８８】
再び図８（ａ）を参照して、本発明のタンパク質結合体である野生種以外のサンプルでは、置換したアミノ酸がイソロイシン、バリン、アラニンとアミノ酸の直鎖の炭素数が３、２、１と減るにしたがって、蛍光回復の割合が減少した。アラニンでは、全く蛍光が回復しなかった。これは、炭素数が減少するに従って、疎水性相互作用をする相手との距離が長くなるために、蛍光タンパク質の断片同士が再会合しにくくなるためと考えられた。すなわち、イソロイシン、バリン、アラニンへのアミノ酸置換によって蛍光タンパク質の断片同士のアフィニティが調節できた。
【００８９】
再度図８（ｂ）を参照すると、本発明のサンプルは目標タンパク質が相互作用を行わない時は、全く発光回復が認められなかった。従って、本発明のサンプルは、目標タンパク質の相互作用が行われた場合は蛍光発光を回復し、目標タンパク質が相互作用を行わない場合は蛍光発光を回復しなかった。これはＢｉＦＣ法を用いてタンパク質同士の相互作用をアッセイするために必要不可欠な特性である。言い換えると、ｂＦｏｓとｂＪｕｎを目標タンパク質としてＢｉＦＣ法を用いる場合は、配列番号１の蛍光タンパク質の野生種を用いるのではなく、本発明のサンプルのように蛍光タンパク質の断片同士のアフィニティを調節しなければ、正しいアッセイができないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、たんぱく質の相互作用をアッセイするＢｉＦＣ法に利用することができる。
【符号の説明】
【００９１】
１０、１１  目標タンパク質
１２、１３  蛍光タンパク質の断片
１４  目標タンパク質同士の相互作用
１５  蛍光復活した蛍光タンパク質
２０  蛍光タンパク質のβ−シート
２１  蛍光タンパク質のα−へリックス
２２  蛍光タンパク質のアミノ酸のループ部分
３０  ２０１番目のロイシン
３１  ２０７番目のロイシン
４０  アミノ酸の修正点
【図１】
2011211983.tif 000004
【図２】
2011211983.tif 000005
【図３】
2011211983.tif 000006
【図４】
2011211983.tif 000007
【図５】
2011211983.tif 000008
【図６】
2011211983.tif 000009
【図７】
2011211983.tif 000010
【図８】
2011211983.tif 000011
【配列表】
2011211983000001.app