(57)【要約】【課題】優れたＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベルを抑制する効果を有するＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤、及び優れたＡｋｔ活性抑制効果を有するＡｋｔ活性抑制剤を提供する。【解決手段】ヒマワリ（Helianthus annuus  L.）の抽出物を含有する、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤及びＡｋｔ活性抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒマワリ（Helianthus annuus  L.）の抽出物を含有するＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤。
【請求項２】
ヒマワリ（Helianthus annuus  L.）の抽出物を含有するＡｋｔ活性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤及びＡｋｔ活性抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
スキンケアは老若男女を問わず高い関心を持たれている。このスキンケアの際に改善したい肌のトラブルとして、毛包の表皮への開口部である毛穴の目立ちが上位を占めている。毛穴の目立ちは、顔面、特に頬と鼻において、美容上大きな悩みの一つとなっている。
【０００３】
一般的に、頬の「目立つ毛穴」として認識されている毛穴は、脂腺性毛包である。この脂腺性毛包は、皮膚表面への開口部である漏斗状の形態を持った毛漏斗部の内腔が広く深いことを特徴とする。この毛漏斗部が広がっていたり、その周辺がすり鉢状に陥没していたりすると、皮膚表面に生じる窪みが毛穴として視覚的に認識され、「毛穴が目立つ」と認識されると考えられている。レプリカ法による毛穴周囲の皮膚表面形態解析からは、毛穴が加齢とともに目立つようになること、さらに頬ではたるみにより引き伸ばされて形状が楕円に変化することが分かっている。
【０００４】
この毛穴の目立ちの原因としては、毛穴に形成された角栓、色素沈着、毛穴開口部の広がり等が挙げられる。このうち角栓については、種々の角栓除去剤が開発され、広く用いられている。しかし、単に角栓を除去しただけでは毛穴が開いたままであり、毛穴が目立ったままの状態であるという欠点がある。
【０００５】
毛穴を目立たなくさせるために、ヒバマタ等天然由来の多糖（例えば、特許文献１参照）や炭素数８〜３２のアルキル基を有するリン酸化グリセリルエーテル誘導体（例えば、特許文献２参照）等種々の毛穴目立ち予防又は改善剤が提案されている。しかしながら、効果の点から必ずしも十分であるとはいえず、根本的に毛穴目立ちを改善するための毛穴目立ち予防又は改善剤の探索が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−１６９３２２号公報
【特許文献２】特開２００２−１８７８１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、本発明は、優れたＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベルを抑制する効果を有するＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤を提供することを課題とする。
さらに、本発明は、優れたＡｋｔ活性抑制効果を有する、Ａｋｔ活性抑制剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は上記課題に鑑み、毛穴目立ちの評価、及び毛穴目立ち予防又は改善剤の評価又は選択に利用できるパラメータについて検討した。その結果、血中ＩＧＦ−１量が毛穴面積及び皮膚内部構造の発達との間に相関関係を有していること、並びにある特定の種の植物の抽出物が、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベルを抑制する効果を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成させたものである。
【０００９】
また、本発明は、ヒマワリ（Helianthus annuus  L.）の抽出物を含有するＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、ヒマワリ（Helianthus annuus  L.）の抽出物を含有するＡｋｔ活性抑制剤に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＩＧＦ−１シグナル伝達活性抑制剤は、優れたＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性レベルを抑制する効果を有する。さらに、本発明のＡｋｔ活性抑制剤は、優れたＡｋｔ活性抑制効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）は、頬部の毛穴目立ちスコアと血中ＩＧＦ−１量との関係を示す。図１（ｂ）は、鼻部の毛穴目立ちスコアと血中ＩＧＦ−１量との関係を示す。
【図２】図２（ａ）は、毛穴総面積と血中ＩＧＦ−１量との関係を示す。図２（ｂ）は、毛穴平均面積と血中ＩＧＦ−１量との関係を示す。図２（ｃ）は、毛穴周囲の皮膚内部構造スコアと血中ＩＧＦ−１量との関係を示す。
【図３】図３Ａは、ヒト顔面脂腺性毛包部におけるＩＧＦ−１Ｒの発現の様子を示す。図３Ｂは、表皮基底層の表皮隆起領域（Ａ図の点線で囲まれた領域）の拡大図を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、活性型ビタミンＤ３（ＶＤ３）添加によるＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベルの変化を示す。図４Ａは、ウェスタンブロッティング写真（ＨａＣａＴ細胞）を示す（−はＩＧＦ−１無添加、＋はＩＧＦ−１添加を示し、上段から、リン酸化型ＩＧＦ−１Ｒ量、全ＩＧＦ−１Ｒ量、及びＩＧＦＢＰ−３発現量を示す）。図４Ｂは、ＨａＣａＴ細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ活性の活性型ビタミンＤ３濃度依存的変化を示す。図４Ｃは、正常ヒト表皮培養細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ活性の活性型ビタミンＤ３濃度依存的変化を示す。
【図５】図５（Ａ）は、正常ヒト表皮培養細胞における、化合物１によるＡｋｔの活性化レベルの変化を示す（左：ウェスタンブロッティング写真、右：及び活性抑制率）。図５（Ｂ）は、正常ヒト表皮培養細胞における、化合物１によるＩＧＦ−１Ｒの活性化レベルの変化を示す（左：ウェスタンブロッティング写真、右：及び活性抑制率）。−：ＩＧＦ−１無添加、＋：ＩＧＦ−１添加、化合物１：１０μＭ  化合物１添加を示す。
【図６】化合物１のヒト毛穴目立ち改善効果を示す。化合物１塗布後０週に対する塗布後４週における平均毛穴面積の比。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「毛穴目立ち」とは、毛穴周囲の皮膚表面に窪みが形成されるか、又はその窪みが拡大し、その結果その窪みが毛穴として外見的に認識されやすくなった状態をいう。毛穴目立ちの「改善」とは、上記毛穴周囲の窪みが縮小することにより、毛穴が外見的に認識されにくくなることをいい、毛穴目立ちの「予防」とは、上記毛穴周囲の窪みの拡大を防止することをいう。
【００１４】
本発明における「ＩＧＦ−１（Insulin-like  growth  factor-1）」とは、主に肝臓で合成され、血中を介して輸送されて各臓器に作用する分子である。ＩＧＦ−１は、輸送先の各臓器においてレセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合してそれを活性化させ、種々の作用を誘発する。皮膚におけるＩＧＦ−１の機能としては、表皮での増殖亢進（例えば、Tavakkolら，J．Invest．Dermatol．(1992)，99，p．343-349参照）、真皮でのコラーゲン合成促進（例えば、Jeschke  MGら，Am．J．Physiol．Regul．Integr．Comp．Physiol．(2004)，286，R958-66参照）等が報告されている。皮膚のしわ、たるみの軽減及び育毛の促進等の効果を有するＩＧＦ−１分泌促進剤（例えば、特開２００６−１５１９７１号公報参照）、ＩＧＦ−１を有効成分とする、種々の皮膚疾患やシミ、そばかす、老人斑、小皺の改善効果を有する組成物（例えば、特開２００３−８９６２９号公報参照）もまた知られている。しかしながら、毛穴目立ちとＩＧＦ−１との関係については、知られていなかった。
【００１５】
ＩＧＦ−１は、合成された後血中を介して体内各所に到達し、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）の活性化を介して、一連のＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化を引き起こす。したがって、血中ＩＧＦ−１量は、体内ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベルを反映する指標である。本発明者は、この血中ＩＧＦ−１量と毛穴面積および皮膚内部構造等の毛穴目立ちの指標との関係について調べた。すると後述の実施例に示すように、血中ＩＧＦ−１量と毛穴面積および皮膚内部構造との間に相関関係が見出された（図１（ａ）〜（ｂ）及び図２（ａ）〜（ｃ）参照）。すなわち、毛穴目立ち予防又は改善剤の毛穴目立ち予防又は改善効果を、血中ＩＧＦ−１量等の生体内ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベルを測定することによって評価することができる。
【００１６】
また実施例に示すように、顔面の目立つ毛穴部位の表皮組織では、その特異的皮膚内部構造と一致してＩＧＦ−１Ｒの発現が観察された（図３Ａ及び図３Ｂ参照）。すなわち、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の毛穴目立ち成因との関連性が示された。そこで、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路に対する毛穴目立ち予防又は改善剤の影響を、培養表皮細胞株を用いて調べたところ、毛穴目立ち予防又は改善剤の投与量に応じて、ＩＧＦ−１の標的であるＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のリン酸化（活性化）レベルは低下し、一方、ＩＧＦ−１結合タンパク質でありＩＧＦ−１と受容体との結合を阻害するＩＧＦＢＰ−３（Insulin-like  growth  factor  Binding  Protein-3）の発現量は上昇した（図４Ａ〜図４Ｃ参照）。同様に、毛穴目立ち予防又は改善剤の投与に伴って、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路のタンパク質であるＡｋｔ及びＩＧＦ−１Ｒのリン酸化（活性化）レベルが低下することが分かった（図５Ａ及び図５Ｂ参照）。
すなわち、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路に関わる一連の分子（例えば、上記ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦＢＰ−３、Ａｋｔ等）をパラメータとして当該伝達経路の活性化レベルを測定することで、被験物質の毛穴目立ち予防又は改善の評価又は選択、及び被験体の毛穴目立ちの評価が可能である。
【００１７】
「ＩＧＦ−１伝達経路」とは、公知の文献（例えば、Levineら、Genes  &  Dev．(2006)，20，p．267-275）に記載されるようなカスケードとして知られる、ＩＧＦ−１とその受容体との結合に始まる一連の経路であり、生体内において、細胞増殖、タンパク質合成、糖取り込み、アポトーシス（細胞死）抑制などの機序に関与している（Decraeneら、J．Biol．Chem．(2002)，277，p．32587-32595）。「ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベル」は、当該伝達経路の活性化に影響を与え得る任意の因子を測定することによって、決定される。当該因子としては、例えば、ＩＧＦ−１の量及び局在、ＩＧＦＢＰ−３の量及び局在、ＩＧＦ−１Ｒの量及び局在、ＩＧＦ−１とＩＧＦ−１Ｒとの結合量、ＩＧＦ−１Ｒ活性化（例えば、リン酸化ＩＧＦ−１Ｒ量）、ならびにＰＩ３キナーゼ、ＥＲＫ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ等の当該伝達経路の下流に位置するタンパク質の発現量及び活性化レベル（例えば、リン酸化レベル）等が挙げられる。
【００１８】
ヒマワリ（Helianthus annuus  L.）は、北アメリカ原産の、キク（Asteraceae)科ヒマワリ（Helianthus）族の双子葉植物である。この種子を原料とする生薬はヒュウガアオイシ（向日葵子）と呼ばれ、出血性の下痢の治療に用いられる他、種子に含まれる油は食用に広く利用されている。
【００１９】
本発明における上記植物は、その植物の全ての任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、全草、根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、花弁、蕾、果実、果皮、殻、種子等の任意の部分、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ又は複数を使用することができる。
【００２０】
本発明においてヒマワリの抽出物を得るためには、ヒマワリの種子を抽出することが好ましい。
【００２１】
本発明において用いる、ヒマワリの抽出物の製造方法については特に限定はなく、通常の方法により上記植物を抽出することにより抽出物を得ることができる。
具体的には、上記植物を乾燥させた乾燥物、その粉砕物、それら自身を圧搾抽出することにより得られる搾汁、水、又はアルコール、エーテル及びアセトンなどの有機溶媒による粗抽出物、並びに粗抽出物を分配又はカラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで精製して得られた抽出物画分などを本発明における抽出物として用いることができる。これらは単独で用いても良く、また２種以上混合して用いても良い。本発明においては、上記植物を乾燥させた乾燥物又はその粉砕物から、水、アルコール、又はこれらの混合液を用いて得られた抽出物を用いることが好ましい。
本発明で用いられる抽出物を得るための抽出時間及び抽出温度については特に制限はないが、例えば水、アルコール類又は水−アルコール混液により抽出する場合、ヒマワリ１質量部に対して１〜５０容量部の溶剤を用い、４〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃の温度で、１時間〜４０日間、より好ましくは５日〜２５日間抽出するのが好ましい。
【００２２】
前記植物の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。
また、液々分配等の技術により、上記抽出物から不活性な夾雑物を除去して用いることもでき、本発明においてはこのようなものを用いることが好ましい。これらは、必要により公知の方法で脱臭、脱色等の処理を施してから用いてもよい。
本発明の植物又はそれらの抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。また、前記抽出処理物の他、市販品を用いても良い。
【００２３】
後記実施例のように、前記植物の抽出物は、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制作用、Ａｋｔ活性抑制作用を示すことから、毛穴目立ち予防又は改善作用があるといえる。
従って、前記植物の抽出物は、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤又はＡｋｔ活性抑制剤として使用することができ、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤又はＡｋｔ活性抑制剤を製造するために使用できる。そして、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤及びＡｋｔ活性抑制剤は、毛穴を目立たなくさせる効果を発揮する医薬品、医薬部外品、化粧品として使用可能である。
【００２４】
本発明のＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤又はＡｋｔ活性抑制剤を医薬品、医薬部外品又は化粧料として用いる場合は、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の医薬品、医薬部外品や化粧料は、前記植物の抽出物を単独で、又は医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料及び洗浄料に配合される、植物油、動物油等の油性基剤、収斂剤、皮膚軟化剤、ホルモン剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類等）、香料、樹脂、防腐剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
当該医薬品、医薬部外品、化粧料中の前記植物の抽出物の含有量は、０．０００１〜２０質量％が好ましく、０．００１〜１０質量％がより好ましい。
【００２５】
本発明のＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤又はＡｋｔ活性抑制剤の塗布量は特に制限はなく、適宜選択、決定される。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２７】
試験例１  ＩＧＦ−１の発現量と毛穴目立ち状況との相関関係
（１．血中ＩＧＦ−１の測定）
２２〜４１歳の健常女性４０名を被験者とした。測定日の朝に各被験者より採血した血液（約６ｍＬ）を、ベノジェクト真空採血管（血清分離剤入り  VP-AS106）中で約３０分間静置後、遠心し（３０００回転×２０分間）、血清を分離した。分離した血清は−８０℃に保存し、外部臨床検査機関へ分析を依頼した。
具体的には、血中ＩＧＦ−１値の測定にはＩＲＭＡ法（Immunoradiometric  assay：免疫放射定量測定法）を用いた。換言すると、Ｉ１２５標識した抗ＩＧＦ−１抗体を血清に添加し、血清中ＩＧＦ−１と標識抗体とを結合させ、その放射活性と検量線から濃度を読み取った。
【００２８】
（２．毛穴評価）
各被験者の毛穴目立ちの評価を、頬部及び鼻部の皮膚で行った。評価は、室温２０℃、湿度４０％の条件下で行った。
（I）フォトスケールによる毛穴評価
被験者の顔の正面写真をロボスキンアナライザー（インフォワード）を用いて撮影し、頬及び鼻の毛穴目立ちを下記の基準でそれぞれ５段階に分類し、得られたスコアを各種測定値と比較した。
【００２９】
【表１】
2011121880.tif 000002
【００３０】
【表２】
2011121880.tif 000003
【００３１】
（II）皮膚内部構造観察
頬部の肉眼的に明瞭な毛穴が存在する領域を選択し、In  vivo  confocal  laser  microscopy（Viva  scope  1500：Lucid社）で４×４ｍｍ範囲の表皮水平断面の共焦点画像を取得した。深さは角層−顆粒層の境界領域を０μｍとし、皮膚表面画像として約８μｍ深さの画像を、皮膚内部観察画像として約７５μｍ深さの画像を取得した。
共焦点画像から、目視により毛穴目立ちをスコア化した。すなわち、上記手法で採取した深さ約７５μｍ、４×４ｍｍの表皮水平断面の共焦点画像を用いて、皮膚内部構造の目視判定を行った。毛穴周囲に存在する真皮乳頭構造の存在範囲、真皮乳頭の数（複雑さ）を指標に判定した。判定基準は下記の５段階とした。
【００３２】
【表３】
2011121880.tif 000004
【００３３】
（III）レプリカによる毛穴形状解析
洗顔後、皮膚を環境に馴化させた後、安静、仰臥位で、肌用のシリコン印象剤（アサヒバイオメッド製：ABS-01スカイブルー）を使用し、共焦点画像取得領域を含む約１×１ｃｍ範囲のレプリカを採取した。
ＣＣＤカメラ（CV-10：オリンパス）によりレプリカの画像を取得し、Greenの色成分をグレイスケールに変換し、スライスレベル１００にて二値化した。二値化画像を細線化して皮溝を除去し、その後残った成分を膨張させて元の大きさに戻し、０．０２ｍｍ２以上の面積のものを抽出した。得られた各毛穴形状について面積を測定し、測定範囲内（５×５ｍｍ）にある毛穴形状の総面積、平均面積を算出し、毛穴総面積及び毛穴平均面積とした。
【００３４】
（３．結果）
フォトスケールにより求めた毛穴目立ちスコアは、頬、鼻においてともに、血中ＩＧＦ−１量に対して正の相関（Spearman-test，P<0.05）またはその傾向を有していた（図１（ａ）〜（ｂ）参照）。毛穴総面積（t-test，P<0.05）、毛穴平均面積及び毛穴周囲皮膚内部構造スコア（Spearman-test，P<0.05）と血中ＩＧＦ−１量との間には有意な正の相関が見られた（図２（ａ）〜（ｃ）参照）。これらの結果は、血中ＩＧＦ−１量測定により被験体の毛穴の状態や面積、及び皮膚内部構造を評価できること、さらにこれらの結果を通じて毛穴目立ち予防又は改善剤の毛穴目立ち予防又は改善効果を評価できることを示す。
【００３５】
試験例２  ヒト毛穴組織におけるＩＧＦ−１Ｒの発現
（１．試験方法）
Caucasian女性（30〜40代）の顔面に存在する視覚的に目立つ毛穴部位の組織の凍結切片を定法に従い作製した。作製した凍結切片を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、その後、０．３％Ｈ２Ｏ２（メタノール溶液）で３０分間処理した。１０％ヤギ血清を用いて、室温１時間ブロッキング後、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Gene  Tex：100倍希釈）で、４℃、一晩処理した。ＰＢＳで洗浄後、２次抗体（ヒストファインシンプルステイン：ニチレイ）で、室温、３０分間処理し、ＤＡＢ発色にてＩＧＦ−１Ｒを検出した。
【００３６】
（２．結果）
顔面に存在する脂腺性毛包部において、表皮、毛包漏斗部、皮脂腺の基底層細胞にＩＧＦ−１Ｒの発現が検出された（図３Ａ参照）。特に毛包漏斗部で強い発現が認められた。表皮基底層細胞に関しては、皮膚内部構造を構成する表皮隆起領域で、発現が高い傾向が認められた（図３Ｂ参照）。
したがって、目立つ毛穴において特異的な皮膚内部構造の発達にＩＧＦ−１Ｒが関与していることが示された。
【００３７】
試験例３  公知の毛穴目立ち改善剤の、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベル（リン酸化ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦＢＰ−３の発現量）への影響
公知の毛穴目立ち改善剤と、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベルとの相関関係を評価するため、ＩＧＦ−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、及びＩＧＦ−１阻害因子であるＩＧＦＢＰ−３を指標として用いた。
【００３８】
（１．ＩＧＦ−１Ｒの測定）
（I）細胞抽出液の作製（１）
ヒト表皮株化細胞であるＨａＣａＴ細胞（DKFZより供与）の培養は１０％牛血清を加えたDulbecco's  Modified  Eagle  Medium（(＋)D-MEM：Invitrogen）を用いた。ＨａＣａＴ細胞を３５ｍｍプレートに０．５×１０４個／ｃｍ２で播種し、２４時間後に血清無添加D-MEM（(-)D-MEM）培地に交換した。ここに、公知の毛穴目立ち改善剤として活性型ビタミンＤ３（ＶＤ３特開2004-339120号公報参照）を終濃度０、１０及び１００ｎＭで各々添加した。４８時間培養後、１００ｎｇ／ｍｌリコンビナントＩＧＦ−１（R&D  systems）を添加するか又はＩＧＦ−１添加なしで１０分間処理し、細胞を２００μｌのcell  lysis  buffer（Cell  signaling）で回収した。
【００３９】
（II）細胞抽出液の作製（２）
正常ヒト表皮細胞の培養は添加剤を加えたEpiLife（(+)EpiLife：Kurabo）を用いた。正常ヒト表皮細胞を３５ｍｍプレートに０．５×１０４個／ｃｍ２で播種し、２４時間後に脳下垂体抽出物、ＥＧＦ（Epidermal  growth  factor）及びインスリン無添加EpiLife（(-)EpiLife）培地に交換した。ここに、公知の毛穴目立ち改善剤として前記活性型ビタミンＤ３を０又は１００ｎＭ添加し、４８時間培養した。その後１００ｎｇ／ｍｌリコンビナントＩＧＦ−１(R&D  systems)を添加するか又はＩＧＦ−１添加なしで１０分間処理し、細胞を２００μｌのcell  lysis  buffer（Cell  signaling）で回収した。
【００４０】
（III）検出
得られた細胞を超音波破砕し、４℃にて１５分静置した後、１５０００回転、１０分間遠心し、上清を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Cell  Signaling：200倍希釈）を加え、４℃で一晩静置した。翌日Protein  G  Sepharose（Amasham）を１０μｌ加え、４℃で２時間結合させた。その後ビーズをcell  lysis  bufferで３回洗浄し、７．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥでビーズに結合していた蛋白質を分離した。一次抗体及び二次抗体を用いたウェスタンブロッティング法により、ＩＧＦ−１Ｒを検出した。リン酸化型ＩＧＦ−１Ｒの検出には、一次抗体として抗リン酸化チロシン認識抗体（upstate  cell  signaling  solutions：clone  ♯  4G10：1000倍希釈）を、二次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）を用いた。全ＩＧＦ−１Ｒの検出には、一次抗体として抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Cell  Signaling：1000倍希釈）を、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）を用いた。検出試薬には化学発光法であるＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出試薬（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用い、Ｘ線フィルムに露光を行った。
【００４１】
（２．ＩＧＦＢＰ−３の測定）
（I）細胞抽出液の作製
ＨａＣａＴ細胞の培養は１０％牛血清を加えたDulbecco's  Modified  Eagle  Medium（(＋)D-MEM：Invitrogen）を用いた。ＨａＣａＴ細胞を３５ｍｍプレートに０．５×１０４個／ｃｍ２で播種し、２４時間後に血清無添加D-MEM（(-)D-MEM）培地に交換した。ここに、公知の毛穴目立ち改善剤として前記活性型ビタミンＤ３を終濃度０、１０及び１００ｎＭで各々添加した。４８時間培養後、１００ｎｇ／ｍｌリコンビナントＩＧＦ−１（R&D  systems）を添加するか又はＩＧＦ−１添加なしで１０分間処理し、培地を回収した。
【００４２】
（II）検出
回収した細胞培養培地はスピンカラム（マイクロコンＹＭ−１０：ミリポア）で１０倍濃縮した。１２．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで培地中の蛋白質を分離し、一次抗体：抗ＩＧＦＢＰ−３抗体（SantaCruz：２５０倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（R&D  systems：1000倍希釈）を用いたウェスタンブロッティング法によりＩＧＦＢＰ−３を検出した。検出試薬には化学発光法であるＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用い、Ｘ線フィルムに露光を行った。
【００４３】
（３．結果）
ＩＧＦ−１Ｒ活性（リン酸化ＩＧＦ−１Ｒ量）は、ＨａＣａＴ細胞及び正常ヒト表皮培養細胞のいずれにおいても、公知の毛穴目立ち改善剤である活性型ビタミンＤ３の添加に伴って濃度依存的に抑制された（図４Ａ上段、ならびに図４Ｂ及びＣ参照）。一方、ＩＧＦＢＰ−３の発現量は、活性型ビタミンＤ３の添加に伴って濃度依存的に増加した（図４Ａ下段参照）。
これらの結果は、毛穴目立ち予防又は改善剤の毛穴目立ち予防又は改善効果を、ＩＧＦ−１Ｒ活性やＩＧＦＢＰ−３の発現量の測定によって評価可能であることを示している。
【００４４】
試験例４  公知の毛穴目立ち改善剤の、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化レベル（Ａｋｔ及びＩＧＦ−１Ｒの発現量）への影響
公知の毛穴収縮剤（１−ｎ−テトラデシル−３−エチルグリセリル−２−リン酸アルギニン塩（以下、「化合物１」ともいう）、特開２００８−１０５９７５号公報参照）の、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路のタンパク質であるＡｋｔ及びＩＧＦ−１Ｒの活性に対する効果を調べた。化合物１は特開２００８−１０５９７５号公報に記載の方法により製造したものを使用した。
【００４５】
（１．Ａｋｔの測定）
（I）細胞抽出液の作製
正常ヒト表皮細胞の培養には、添加剤を加えたEpiLife（(+)EpiLife：Kurabo）を用いた。表皮細胞を３５ｍｍプレートに０．５×１０４個／ｃｍ２で播種し、２４時間後に脳下垂体抽出物、ＥＧＦ及びインスリン無添加EpiLife（(-)EpiLife）培地に交換した。４８時間培養後、前記化合物１を１０μＭ添加し、１時間培養した。その後１００ｎｇ／ｍｌリコンビナントＩＧＦ−１(R&D  systems)を添加するか又はＩＧＦ−１添加なしで５分間処理し、細胞を１００μｌのcell  lysis  buffer（Cell  signaling）で回収した。
【００４６】
（II）検出
得られた細胞を超音波破砕し、４℃にて１５分静置した後、１５０００回転、１０分間遠心し、上清を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液中の蛋白質を１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、一次抗体：抗リン酸化Ａｋｔ認識抗体（Cell  Signaling：1000倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）又は、一次抗体：抗Ａｋｔ認識抗体（Cell  Signaling：1000倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）を用いたウェスタンブロッティング法により検出した。検出試薬には化学発光法であるＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用い、Ｘ線フィルムに露光を行った。得られたバンドを、ソフトウェアLane  &  Spot  Analyzer（アトー株式会社）を用いて定量し、リン酸化Ａｋｔ／Ａｋｔの値をＡｋｔの活性化レベルとし、被験物質無添加、ＩＧＦ-１刺激時のＡｋｔの活性化レベルを１００とした場合の抑制率として求めた。
【００４７】
（２．ＩＧＦ−１Ｒの測定）
（I）細胞抽出液の作製
正常ヒト表皮細胞の培養には、添加剤を加えたEpiLife（(+)EpiLife：Kurabo）を用いた。表皮細胞を３５ｍｍプレートに０．５×１０４個／ｃｍ２で播種し、２４時間後に脳下垂体抽出物、EGF及びインスリン無添加EpiLife（(-)EpiLife）培地に交換した。４８時間培養後、被験物質（化合物１）１０μＭ添加し、１時間培養した。その後１００ｎｇ／ｍｌリコンビナントＩＧＦ−１(R&D  systems)を添加するか又はＩＧＦ−１添加なしで５分間処理し、細胞を１００μｌのcell  lysis  buffer（Cell  signaling）で回収した。
【００４８】
（II）検出
得られた細胞を超音波破砕し、４℃にて１５分静置した後、１５０００回転、１０分間遠心し、上清を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Cell  Signaling：200倍希釈)を加え、４℃で一晩静置した。翌日Protein  G  Sepharose（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を１０μｌ加え、４℃、２時間結合させた。その後ビーズをcell  lysis  bufferで３回洗浄し、７．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥでビーズに結合していた蛋白質を分離し、一次抗体：抗リン酸化チロシン認識抗体（upstate  cell  signaling  solutions：clone  ♯  4G10：1000倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）または、一次抗体：抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Cell  Signaling：1000倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）を用いたウェスタンブロッティング法により検出した。検出試薬には化学発光法であるＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用い、Ｘ線フィルムに露光を行った。得られたバンドを、ソフトウェアLane  &  Spot  Analyzer（アトー株式会社）を用いて定量し、リン酸化ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＧＦ−１Ｒの値をＩＧＦ−1Ｒの活性化レベルとし、被験物質無添加、ＩＧＦ−1刺激時のＩＧＦ−1Ｒの活性化レベルを１００とした場合の抑制率として求めた。
【００４９】
（３．結果）
正常ヒト表皮培養細胞において、Ａｋｔ活性（Ａｋｔリン酸化）及びＩＧＦ−１Ｒ活性（ＩＧＦ−１Ｒリン酸化）は、公知の毛穴目立ち改善剤である化合物１の添加により顕著に抑制された（図５Ａ及び図５Ｂ参照）。
これらの結果は、毛穴目立ち予防又は改善剤の毛穴目立ち予防又は改善効果を、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性レベルの測定によって評価可能であることを示している。
【００５０】
試験例５  化合物１のヒト毛穴目立ち改善効果
（I）試験方法
前記試験例４で評価した化合物１のヒト毛穴目立ち改善効果を実際に測定した。男性１０名（２５〜４０歳：平均年齢３０．５歳）を被験者とし、化合物１の１％溶液と溶媒のみのプラセボ溶液をサンプルとして用いた。溶媒は９５．０％エタノール：１，３−ＢＧ：精製水＝２０：１０：７０を用いた。サンプル塗布を１日２回、週５日行った。１回の塗布量は点眼瓶から２滴分（約１００μｌ）とした。
試験では、片側頬部に１％化合物１配合サンプルを、他方にプラセボ溶液を４週間塗布した後、レプリカによる毛穴形状測定を行った。レプリカは塗布前、４週間塗布後に頬部の同じ領域から採取し、同一毛穴の変化率を化合物１配合サンプル側とプラセボ側とで比較した。
【００５１】
（II）結果
解析範囲内の平均毛穴面積について０週の値を基準とし、その変化率を算出した（図６参照）。化合物１の４週間の塗布によって、プラセボ側と比較して毛穴面積が約１０％減少した（P=0.055：t-test）。
【００５２】
製造例  ヒマワリ抽出物の製造
ヒマワリの種子（中国河北省産）４０ｇに対し５０％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、室温下２２日間浸漬した後、濾過して、抽出液２８８ｍＬを得た。蒸発残分値は０．８２％（ｗ／ｖ）であった。
【００５３】
試験例６  ヒマワリ抽出物のＡｋｔ活性化抑制効果
（I）細胞抽出液の作製
正常ヒト表皮細胞の培養には、添加剤を加えたEpiLife（(+)EpiLife：Kurabo）を用いた。表皮細胞を６穴プレートに０．５×１０4個／ｃｍ２で播種し、２４時間後に脳下垂体抽出物、ＥＧＦ及びインスリン無添加EpiLife（(-)EpiLife）培地に交換した。４８時間培養後、前記ヒマワリ抽出物を１０μＭ添加し、１時間培養した。その後１００ｎｇ／ｍｌリコンビナントＩＧＦ−１(R&D  systems)を添加するか又はＩＧＦ−１添加なしで５分間処理し、細胞を１００μｌのcell  lysis  buffer（Cell  signaling）で回収した。
【００５４】
（II）Ａｋｔの検出
得られた細胞を超音波破砕し、４℃にて１５分静置した後、１５０００回転、１０分間遠心し、上清を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液中の蛋白質を、１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、一次抗体：抗リン酸化Ａｋｔ認識抗体（Cell  Signaling：1000倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）又は、一次抗体：抗Ａｋｔ認識抗体（Cell  Signaling：1000倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社：5000倍希釈）を用いたウェスタンブロッティング法により検出した。検出試薬には化学発光法であるＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出試薬（GEヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）を用い、Ｘ線フィルムに露光を行った。得られたバンドを、ソフトウェアLane  &  Spot  Analyzer（アトー株式会社）を用いて定量し、リン酸化Ａｋｔ／Ａｋｔの値をＡｋｔの活性化レベルとし、前記抽出物無添加、ＩＧＦ-１刺激時のＡｋｔの活性化レベルを１００とした場合のＡｋｔのリン酸化抑制率として求めた。その結果、前記ヒマワリ抽出物のＡｋｔのリン酸化抑制率は４５．７％であった。
【００５５】
したがって、ヒマワリ抽出物は、正常ヒト表皮細胞のＩＧＦ-１刺激時のＡｋｔの活性化を抑制し、ＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化を抑制することが認められた。また、上記結果から、ヒマワリ抽出物を含有する本発明のＩＧＦ−１シグナル伝達経路の活性化抑制剤及びＡｋｔ活性抑制剤は、毛穴目立ちの予防又は改善のために好適に用いることができることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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