(57)【要約】【課題】  より毒性の低い、局所投与および全身投与可能で、核酸医薬品の治療患部への到達効率と導入効率を高め、かつ患部での効果が持続する臨床応用可能な核酸徐放担体を提供する。【解決手段】  自己組織化ペプチドを含む核酸徐放担体【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己組織化ペプチドを含む核酸の徐放担体。
【請求項２】
自己組織化ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す自己組織化ペプチドである、請求項１に記載の核酸の徐放担体。
【請求項３】
前記ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニンの繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドである、請求項１に記載の核酸の徐放担体。
【請求項４】
請求項１−３のいずれか１項に記載の核酸の徐放担体及び核酸を含む、局所投与又は全身投与用医薬品。
【請求項５】
請求項１の核酸徐放担体で、核酸導入による治療効果を長期にわたり持続させることができる徐放型核酸医薬品。
【請求項６】
請求項２の核酸徐放担体で、核酸導入による治療効果を長期にわたり持続させることができる徐放型核酸医薬品。
【請求項７】
請求項３の核酸徐放担体で、核酸導入による治療効果を長期にわたり持続させることができる徐放型核酸医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、自己組織化ペプチド含む核酸の徐放担体に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、短い２本鎖ＲＮＡによって特定遺伝子の発現が抑制される現象で、疾患の治療への応用が期待されている。現在の技術では、ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）やｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を核酸医薬として用いる際の移送担体は、カチオン性のリン脂質が主体であるが、その毒性が指摘されている。また、アテロコラーゲンを移送担体に用いる研究も行われているが、その治療効果の向上にはさらなる改善が必要である。【０００３】  ｓｉＲＮＡをはじめとする核酸医薬の臨床における応用を考慮すると、核酸医薬品の患部への移送担体は、限りなく毒性が低いことが望まれ、また同時に患部までの到達効率や標的遺伝子の抑制効率が高く、かつ全身投与可能な担体の開発が待たれている。【０００４】  本発明の自己組織化ペプチドは、一価のイオンの存在下または中性ｐＨ付近の水溶液が自己組織化し、ハイドロゲルを形成することが知られている。また、これまでに、水溶液にタンパク質を混和し、ハイドロゲルに内包させることでタンパク質の徐放効果をもたらすことが知られている（特許文献１）。しかし、核酸の徐放担体としての用途はこれまで知られていなかった。
【特許文献１】ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ７０９８０２８
【発明の開示】
【０００５】  本発明が解決しようとする課題は、より毒性の低く、患部への到達効率と標的遺伝子の抑制効率が高く、かつ、導入した核酸の効果を患部で長期間保持することのできる臨床応用可能な核酸徐放担体を提供することである。
【０００６】  本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、自己組織化ペプチドがトランスフェクション剤として有用であり、かつ、患部での核酸の滞留性を向上させることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】  したがって、本発明は、
１．自己組織化ペプチドを含む毒性の低く、かつ患部への到達効率と標的遺伝子の抑制が高い核酸徐放担体、
２．自己組織化ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す［１］に記載する、上記１に記載の核酸徐放担体、
３．自己組織化ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニンの繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドであって、好ましくは、アミノ酸残基を１６有する自己組織化ペプチドである、上記１に記載の核酸徐放担体である。
４．上記１−３のいずれか１に記載する核酸徐放担体で、徐放型の核酸医薬品。
５．上記４に記載する医薬品で、注射可能な徐放型の核酸医薬品。
【０００８】  本発明において、自己組織化ペプチドとは、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に会合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す自己組織化ペプチドを主要成分とする。
【０００９】  本発明の自己組織化ペプチドは、例えば、以下の４つの一般式で表すことができる。
（（ＸＹ）１−（ＺＹ）ｍ）ｎ    （Ｉ）
（（ＹＸ）１−（ＹＺ）ｍ）ｎ    （ＩＩ）
（（ＺＹ）１−（ＸＹ）ｍ）ｎ    （ＩＩＩ）
（（ＹＺ）１−（ＹＸ）ｍ）ｎ    （ＩＶ）
（式（Ｉ）〜（ＩＶ））中、Ｘは酸性アミノ酸、Ｙは疎水性アミノ酸、Ｚは塩基性アミノ酸を表し、１、ｍおよびｎは共に整数（ｎ×（１＋ｍ）＜２００）である。）
また、そのＮ末端はアセチル化されていてもよく、Ｃ末端はアミド化されていてもよい。
【００１０】  ここで、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニンまたはグリシンを使用することができる。
【００１１】  これらの自己組織化ペプチドの中でも、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニン（ＲＡＤＡ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドを好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＲＡＤＡ）ｐ−ＮＨ２（ｐ＝２〜５０）で表される。
【００１２】  本発明における自己組織化ペプチドの好ましい具体例としては、（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＮＨ２）配列を有するペプチドＲＡＤ１６−Ｉが挙げられ、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）としてその水溶液が市販されている。
【００１３】  ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）はアミノ酸１６残基（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＣＯＮＨ２）で長さが約５ｎｍのオリゴペプチドであって、その溶液はｐＨ５．０以下であると液状を示すが、ｐＨ５．０以上に変化させることでペプチドの自己組織化が生じ、直径１０ｎｍほどのナノファイバーを形成し、結果としてペプチド溶液はゲル化する。
【００１４】  自己組織化ペプチドの製造法は、固相合成法によって合成される。当該ペプチドは人工合成可能であるため、生体由来物質を含まず、感染リスクの心配がない。
【００１５】  本発明において、核酸徐放担体とは、ｓｉＲＮＡ等のポリヌクレオチドや遺伝子を、生体の意図する組織への徐放、遺伝子導入する際に用い、その到達効率と導入効率を高めることができる組成物をいう。
【実施例１】
【００１６】マウス局所投与モデルにおけるＲＮＡｉ効果およびその持続効果の検討
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞を持つマウスにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡと自己組織化ペプチドを混合した溶液を腫瘍へ直接注射し、ｓｉＲＮＡの導入と遺伝子抑制効果をルシフェラーゼ発光のイメージングで解析したところ、ｓｉＲＮＡ／自己組織化ペプチド混合液による遺伝子抑制効果を確認した。また、自己組織化ペプチドに混和されたｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効果は長期間持続することを確認した。【００１７】＜材料＞
・ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）
配列：Ａｃ−（ＲＡＤＡ）４−ＮＨ２、ＣＰＣ社製
・ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）濃度
５００μｇ／ｍＬ
・ルシフェラーゼ遺伝子抑制ｓｉＲＮＡ
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社製
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ（Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）【００１８】＜方法＞
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養する。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に３×１０６細胞／２００μｌを２６Ｇ注射針にて移植し、腫瘍マウスを作成する。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＧＬ３  ｓｉＲＮＡ  ５０μｇとＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）を等量混合し（最終投与量が１匹あたり２００μＬになるよう調製）、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群には、ｓｉＲＮＡ／ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）混合液を腫瘍部位あたりに２００μｌ投与した。一方、コントロール群はＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）（５００μｇ／ｍＬ）のみを２００μｌ投与した。
・Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
ルシフェリン投与前に動物の体重を測定し、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍｇ／ｋｇで２６Ｇ注射針（テルモ社）にて腹腔内投与した。ルシフェリン投与から１０分後、ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にてイメージングした。イメージングデータはＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にて解析した。ルシフェラーゼ発光イメージングは、ｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０よりｄａｙ１１までを行い、発光量の変化をｓｉＲＮＡの抑制効果とした。【００１９】＜結果＞
結果を図１に示した。コントロール群（ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）のみ）では投与後にルシフェラ−ゼ発光量が増加しているが、試験群では発光量が減弱していた。また、コントロール群では、投与後の１１日目まで、ルシフェラーゼ発光量が増加しているが、試験群では減少した発光量が投与後の１１日目まで増加していない。このことから、ｓｉＲＮＡをＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）と混合することで腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入が促進され、遺伝子発現が抑制されると考えられた。また、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）に内包することで導入されたｓｉＲＮＡの効果は長期間持続すると考えられた。
＜総合考察＞
実施例１の結果とから、自己組織化ペプチドが、局所投与でｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制に有用であり、かつ導入したｓｉＲＮＡの効果を長期間保持する効果があると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】  自己組織化ペプチドによるｓｉＲＮＡの局所投与における遺伝子発現抑制効果の確認である。「ｓｉ−」は自己組織化ペプチドにｓｉＲＮＡを加えなかった実験群を意味し、もう一方の群では自己組織化ペプチドにｓｉＲＮＡを添加している。
【図１】
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