(57)【要約】【課題】 本発明はＣ型肝炎ウイルスの複製を阻害することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの感染に伴う疾患を治療するために有用な医薬を提供する。【解決手段】ｃｄｋ阻害活性を有する化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤、及び該阻害剤を有効成分として含むＣ型肝炎ウイルスによる感染症治療のための医薬。さらに、該医薬を使用したＣ型肝炎ウイルス感染症の治療方法。【選択図】図５
2011207764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｄｋ阻害活性を有する下記一般式（１）又は（２）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤。
【化１】
2011207764.tif 000009
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基、Ｒ３は炭素数１〜６のアルキル基である］
【化２】
2011207764.tif 000010
［式（２）中、Ｒ４はハロゲン原子である］
【請求項２】
前記アリール基がフェニル基又はベンジル基である請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤。
【請求項３】
前記Ｒ２が、下記の式（３）又は（４）で表される置換基である請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤。
【化３】
2011207764.tif 000011
【化４】
2011207764.tif 000012
【請求項４】
前記Ｒ３がイソプロピル基である請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤。
【請求項５】
前記一般式（１）で表される化合物が下記式（５）で表される、２−（Ｒ）（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリン、又は下記式（６）で表される、（２Ｒ）−２−（（６−（（３−アミノ−５−クロロフェニル）アミノ）−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−ブタノールである請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤。
【化５】
2011207764.tif 000013
【化６】
2011207764.tif 000014
【請求項６】
前記一般式（１）で表される化合物が下記式（７）で表される、２−ブロモ−１２，１３−ジヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオンである請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤。
【化７】
2011207764.tif 000015
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤を有効成分とする、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染症治療のための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤＫ阻害活性を有する化合物若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製抑制又は阻害剤に関する。また、本発明が該抑制又は阻害剤を有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の治療に有用な医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）に感染することで発病し、その患者数は全世界で１億７０００万人にものぼる重篤な感染症である。ＨＣＶは１型から６型までの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）に分けられ、その中で亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）は現在４０種類以上単離されている。日本や欧米諸国では１、２、３型が多く、エジプト、南アフリカ、東南アジアではそれぞれ４、５、６型が多く蔓延している。ＨＣＶへの暴露から７、８週間で黄疸、倦怠、悪心などの兆候が急性肝炎の症状として表れることがあるが、多くの場合は自覚症状のないまま持続感染する。一度持続感染が成立すると自然治癒は稀で、肝炎、肝線維症、肝硬変を経て肝臓癌に至る。
【０００３】
ＨＣＶは、１９８９年にカイロン社のグループによって同定された、フラビウイルス科ヘパシウイルス属の、脂質二重膜で覆われた粒子構造を持つウイルスである。ヒト以外の宿主はチンパンジー、マーモセット、ツパイのみが知られており、血液・体液を介して肝臓及びＢ細胞、Ｔ細胞などの血球細胞特異的に感染する。ゲノムは約９．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡであり、約３４０塩基の５’ＵＴＲと約９０００塩基のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）、約２６０塩基の３’ＵＴＲからなる。ＯＲＦは一本のポリプロテインとして翻訳された後、細胞内のシグナルペプチダーゼ及びそれ自身にコードされているプロテアーゼによるプロセシングを受ける。その結果、最終的にｃｏｒｅ（コア）、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７の４つの構造タンパク質、さらにＮＳ２、３、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂの６つの非構造タンパク質が生成する。ｃｏｒｅは、ＲＮＡ結合能を持つヌクレオキャプシドであり、粒子生成の際ＲＮＡと非構造タンパク質をｌｉｐｉｄ  ｄｒｏｐｌｅｔ（ＬＤ）膜に集める。Ｅ１とＥ２は膜貫通ドメインを持つ糖タンパク質であり、Ｅ２はＨＣＶレセプターであるＣＤ８１やｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｌａｓｓ  Ｂ  ｔｙｐｅ  Ｉ（ＳＲ−ＢＩ）などと結合しうる。ｐ７はイオンチャネルであり、ウイルス粒子の組み立てや出芽に重要な役割を果たす。ＮＳ２はプロセシング後の機能は知られていないが、ポリペプチド状態ではＮＳ２／３プロテアーゼとして自己を切断する。ＮＳ３はＮ末端側がＲＮＡヘリカーゼで、Ｃ末端側がセリンプロテアーゼである。ＮＳ４ＡはＮＳ３プロテアーゼのコファクターである。ＮＳ４Ｂは疎水性のタンパク質であるが、その機能はよく知られていない。ＮＳ５Ａはｐ５６とｐ５８の２種類のリン酸化状態を持つタンパク質であり、ＮＳ５Ｂと結合しポリメラーゼ活性を調節する、複製複合体のサブユニットである。ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼとして働き、ウイルスＲＮＡの複製を行う。
【０００４】
ＨＣＶの培養細胞における感染増殖系が長らく確立できていなかったことや、扱いやすい動物モデルが不在であることから、ウイルスの複製機構の解明や抗ウイルス薬の開発が立ち遅れてきた。１９９９年にｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂのＣｏｎ１株の５’非翻訳領域（ＵＴＲ；ｕｎｔｒａｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）及びＮＳ３から３’ＵＴＲまでを用いたサブゲノミックレプリコン（ＳＧＲ；ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ）システムが構築され、細胞内での複製機構の解析が可能となった。また、２００５年にはｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａのＪＦＨ−１株全長の培養細胞での感染増殖系が確立され、ウイルスの感染から分泌まで全てのステップが培養細胞で観察可能となった。
【０００５】
現在のところ、ＨＣＶに対する治療法は、ペグインターフェロンα（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ（ｐｅｇ）−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα）とリバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）による併用療法が主である。
インターフェロンαはウイルス感染によって誘導されるタンパク質で、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ；ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）や２’，５’−オリゴアデニレートシンテターゼ（ＯＡＳ；２’，５’−Ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）などを誘導する。ＰＫＲは、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ２（ｅＩＦ２）のαサブユニットをリン酸化することで翻訳を阻害し、ＯＡＳは、ＡＴＰより２−５Ａ［ｐｘ５’Ａ（２’ｐ５’Ａ）ｎ；ｘ＝１〜３；ｎ≧２］を合成し、２−５Ａ依存的にＲＮａｓｅ  Ｌが活性を持つ二量化となりＲＮＡを切断する。また、インターフェロンにポリエチレングリコール（ｐｅｇ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）化を施すことにより、腎臓での代謝を遅らせ半減期を延長することができる。
リバビリン（１−α−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）はプリンヌクレオシドアナログで広範に抗ウイルス活性を持つ。ＨＣＶに対しては、ＨＣＶ感染の慢性化と関連すると考えられている２型ヘルパーＴ細胞を１型ヘルパーＴ細胞に転換させる、リン酸化を受けリバビリントリホスフェートとなりウイルスポリメラーゼを阻害する、ゲノムに取り込まれ、突然変異を起こす、などの作用機序が考えられている。
【０００６】
しかし、この併用療法によるＳＶＲ（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；治療を受けてから６ヶ月後にもＨＣＶ  ＲＮＡが検出されない患者の割合）は５０％程度にとどまり、また自己免疫疾患などの副作用が起こりやすいことや治療費が高額になることなどからも新しい治療法の開発が望まれている。また、欧米におけるｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）患者の約３０％はＨＣＶと共感染を起こしており、単独で感染するよりも免疫不全や肝臓病の進行が早まり、治療によるＨＣＶに対するＳＶＲも最大で４０％程度である。
ウイルスの生活環の中で増殖阻害の標的となりうるステップは、宿主細胞へのエントリー、プロセシング、ＲＮＡ複製、ウイルス粒子の組み立て、粒子の分泌である。その中で現在研究が進んでいるのは主にＮＳ３プロテアーゼ阻害剤とＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であり、例えばプロテアーゼ阻害剤のテラプレビア（ｔｅｌａｐｒｅｖｉｒ）やポリメラーゼ阻害剤のＲ−１６２６などの治験が行われている。その他にも宿主免疫応答を促すｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）のアゴニストであるＣＰＧ１０１０１やＡＮＡ９７５や、ＮＳ５Ｂと結合し、ＲＮＡへの結合能を高める宿主因子であるｃｙｃｌｏｐｈｏｌｉｎ  Ｂに対する阻害剤ＮＩＭ−８１１などの研究が進んでいる。またＨＣＶに対する有効なワクチンは未だ開発されておらず、チンパンジーに関してはウイルス血症をワクチンにより抑えられたという報告があるが、ヒトに関しては、Ｔ細胞の応答を高めることができるものの、血清中のＨＣＶ  ＲＮＡの減少がほとんど見られないのが現状である。
【０００７】
ところで、１つの細胞が染色体ＤＮＡなどの中身を倍加し、分裂して２つの細胞になるサイクルを細胞周期と呼ぶ。細胞周期は、細胞分裂からＤＮＡ合成までのＧ１期、ＤＮＡ合成を行うＳ期、Ｓ期から細胞分裂までの間のＧ２期、細胞分裂を行うＭ期から成り、各時期への遷移はサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ；ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ）とその調節因子サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）によって制御される。ｃｄｋは１１の遺伝子が知られており、サイクリンと呼ばれる調節サブユニットと結合して酵素活性を持つようになるセリン／スレオニンキナーゼである。サイクリンはサイクリンボックスと呼ばれる１５０アミノ酸ほどの保存された領域を持つ、２９の遺伝子からなるファミリーである。
Ｇ１期に細胞が分裂シグナルを受けるとサイクリンＤが発現し、ｃｄｋ４またはｃｄｋ６と結合しｐＲｂ、ｐ１０７、ｐ１３０というレチノブラストーマ（Ｒｂ；ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）ファミリーをリン酸化する。インビトロの研究ではｃｄｋ４とｃｄｋ６の間や、３種類あるサイクリンＤの間に大きな違いは見られていない。
【０００８】
Ｒｂは転写因子であるＥ２Ｆファミリーやヒストン脱リン酸化酵素（ＨＤＡＣ；ｈｉｓｔｏｎ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）、クロマチンリモデリング複合体（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）などと結合し、転写活性を抑制する。ｃｄｋ４，６／サイクリンＤ複合体によるＲｂのリン酸化によりＲｂとＥ２Ｆとの結合が弱まり、乖離したＥ２ＦがサイクリンＥの転写を行う。ｃｄｋ２はサイクリンＥと結合することでさらにＲｂをリン酸化し、このことによって細胞周期がＳ期に入ると考えられる。Ｓ期にはサイクリンＡが合成され、ｃｄｋ２と結合することで転写因子やＤＮＡ複製に必要な遺伝子等のリン酸化を行い、Ｓ期が進行する。Ｇ２期に蓄積したサイクリンＢがｃｄｋ１と結合することで、ｃｄｋ１が７０以上のタンパク質をリン酸化し、Ｍ期が進行する。
【０００９】
ＨＣＶの発現によって細胞周期に影響を及ぼす例がいくつも知られている。例えばＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質を発現させたトランスジェニックマウスでサイクリンＤ１、Ｅやｃｄｋ２、４の発現量が上昇していることや、Ｅ２やＮＳ３によってＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ；ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）が活性化され細胞増殖が起きること、又は、ＮＳ２により細胞周期の進行が阻害されることなどが報告されている。ＨＣＶを発現する細胞においてサイクリンの発現量やｃｄｋの発現量及び活性が上昇していることが観察され（非特許文献１）、また、ＨＣＶ患者の肝臓においても、正常あるいは高分化な組織より病状の進んだ組織の方がサイクリンやｃｄｋを高発現していることが報告されている（非特許文献２）。
ｃｄｋ２、３、４、６の基質であるｐＲｂは培養細胞系でＨＣＶのＮＳ５Ｂを介してＥ６ＡＰ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅと結合し、プロテアソーム依存に分解を受けることが示されている。癌抑制遺伝子であるｐＲｂが分解を受けることが、ＨＣＶによる肝発癌の原因の１つであると考えられる。またＨＣＶがキャップ構造の代わりにリボソームをリクルートするために用いるｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）は、Ｓ期において最も翻訳活性が高まることが知られている。
【００１０】
【非特許文献１】Ｋｏｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．，２７９（１５），１４５３１−１４５４１，２００４
【非特許文献２】Ｍａｓａｋｉら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３７，５３４−５４３，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記状況に鑑み、細胞周期とＨＣＶの増殖との関連に着目した上で、Ｃ型肝炎ウイルスの複製抑制又は阻害剤、並びにＣ型肝炎ウイルスの感染に対する有効な治療薬及び治療方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、ＨＣＶと細胞周期との関連性から、ｃｄｋ活性がＨＣＶの増殖を上方制御する可能性を考え、ｃｄｋの活性を阻害することがＨＣＶの増殖に如何なる影響を及ぼすかを検討した。その結果、ｃｄｋ阻害剤によるＨＣＶタンパク質及びＲＮＡ量の減少が見出され、ｃｄｋ阻害剤がＨＣＶの増殖抑制に有効であることが明らかとなった。発明者らは、以上の結果に基づき、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、ｃｄｋ阻害活性を有する下記一般式（１）又は（２）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物を有効成分として含むＣ型肝炎ウイルス複製阻害剤、及び該阻害剤を有効成分として含むＣ型肝炎ウイルスによる感染症治療のための医薬である。
【化８】
2011207764.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基、Ｒ３は炭素数１〜６のアルキル基である］
【化９】
2011207764.tif 000004
［式（２）中、Ｒ４はハロゲン原子である］
【発明の効果】
【００１４】
本発明の阻害剤は、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制又は阻害することができる。その結果、本発明の医薬はＣ型肝炎ウイルスによる感染疾患を治癒せしめることができる。
【００１５】
本発明の医薬を用いることにより、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染疾患を有効に治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
一般式（１）において、Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基、Ｒ２は炭素数１〜１０、より好ましくは、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基、Ｒ３は炭素数１〜１０、より好ましくは、炭素数１〜６のアルキル基である。ここでＲ１の「アリール基」は、１又は２以上の置換基を有しても良く、２以上の置換基を有する場合、各置換基は互いに同じものであっても良いし、異なるものであっても良い。上記置換基は、限定はしないが、例えばメチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基等のアルコキシ基、ハロゲン基等のほか、ニトロ基、アミノ基、スルホン基等であっても良い。これらの中でも、フェニル基又はベンジル基が好ましく、フェニル基の場合には、特に、３−アミノ−クロロフェニル基が好ましい。また、Ｒ２の「アルキル基」及び「ヒドロキシアルキル基」並びにＲ３の「アルキル基」は、好ましくは、直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、限定はしないが、例えば、直鎖状ではメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基等、環状ではシクロプロペニル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等及びこれらのアルキル基の一部が水酸基で置換されたヒドロキシアルキル基が挙げられる。Ｒ２は、例えば、下記式（３）又は（４）が好ましい。
【化１０】
2011207764.tif 000005
【化１１】
2011207764.tif 000006
また、Ｒ３はイソプロピル基が特に好ましい。
一般式（２）において、Ｒ４はハロゲン原子であり、ここで「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよいが、特に、臭素原子が好ましい。
本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と言う場合には、その置換基の個数又は置換位置は特に限定されない。
また、本発明に係るＣ型肝炎ウイルス複製抑制又は阻害剤及び医薬の有効成分として含まれる一般式（１）又は（２）で表される化合物には、特に断らない限り、その幾何異性体（例えば、Ｅ体、Ｚ体など）及び光学異性体も含まれる。
【００１７】
一般式（１）で示される化合物及びその塩としては、限定はしないが、例えば次のものが挙げられる。
２−（Ｒ）（１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリン及びその許容される塩、
（２Ｒ）−２−（（６−（（３−アミノ−５−クロロフェニル）アミノ）−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−ブタノール及びその許容される塩。
一般式（２）で示される化合物及びその塩としては、限定はしないが、例えば、次のものが挙げられる。
２−ブロモ−１２，１３−ジヒドロ−５Ｈ−インドロ［２，３−ａ］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−５，７（６Ｈ）−ジオン及びその許容される塩。
【００１８】
本発明の一般式（１）及び（２）で表わされる化合物は、いずれも公知の文献又は通常の化学的合成方法を用いて得ることができ、あるいは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社等から市販されているものを購入することもできる。
【００１９】
本発明は、一般式（１）及び（２）で表される化合物によりｃｄｋ活性を阻害することによって、Ｃ型肝炎ウイルスの複製が有効に阻害（抑制）されることを初めて見出したことに基づいて完成されたものである。
ここで「ｃｄｋ（ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ）」は、現在の１１の遺伝子が知られており、調節サブユニットであるサイクリンと結合して酵素活性を発揮するセリン／スレオニンキナーゼのことである。例えば、ＨＣＶの増殖との関連において、ｃｄｋ２、３、４、６の関与が示唆されているが、特に、ここではこれらのファミリーに限定するものではない。
本発明の化合物の阻害対象である「ｃｄｋ」は、いかなる細胞又は組織に由来するものであってもよく、ヒト又は、ヒト以外の動物種、限定はしないが、例えば、好ましくは、霊長類（特にチンパンジー、マーモセット）、ツパイなどの細胞又は組織等に由来するものであってもよい。特に、好ましくは、ヒトである。
【００２０】
本発明の医薬の有効成分としては、上記一般式（１）又は（２）で表される化合物のほか、生理学的に許容されるその塩を用いてもよい。塩としては、例えば、酸性塩基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；又はリジン、δ− ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。
さらに、本発明の医薬の有効成分として、一般式（１）又は（２）で表される化合物、又はその塩の溶媒和物若しくは水和物を用いることもできる。
【００２１】
本発明の医薬は、有効成分である一般式（１）又は（２）で表される化合物及び薬理学的に許容されるその塩、又はそれらの溶媒和物若しくはそれらの水和物自体を投与してもよいが、一般式（１）又は（２）で表される化合物の他、製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。本発明の医薬の有効成分としては、一般式（１）又は（２）で表される化合物に含まれる２種以上を組み合わせて用いることができ、上記医薬組成物には、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染疾患に対する他の医薬の有効成分を含有せしめても良い。
【００２２】
医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。液体製剤の場合には、使用時に、水又は他の溶媒に溶解又は懸濁する形態であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。また、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。
【００２３】
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、又は医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機又は有機物質、あるいは固体又は液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、ショ糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００２４】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸− メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、或いはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、又はグリセリン、ポリエチレングリコール等に溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００２５】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ 調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２６】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２７】
皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。
【００２８】
本発明の医薬の投与量及び投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止及び／又は治療の目的、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は０．０１〜１０００ｍｇ（有効成分重量）程度であり、一日１回又は数回に分けて、或いは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量０．００１〜１００ｍｇ（有効成分重量）を連続投与又は間欠投与することが望ましい。
【００２９】
本発明の医薬は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００３０】
本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
【００３１】
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
【００３２】
さらに、本発明には、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した哺乳動物の感染疾患に関する治療方法も含まれる。
ここで「治療」とは、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した哺乳動物において、該感染疾患の病態の進行及び悪化を阻止又は緩和することを意味し、これによって該感染疾患の諸症状等の進行及び悪化を阻止又は緩和することを目的とする治療的処置の意味として使用される。
【００３３】
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、チンパンジー、マーモセット、ツパイなどの動物も含まれるが、特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００３４】
次に本発明を具体例によって説明するがこれらの例によって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００３５】
１．材料・方法
１−１．細胞培養
１−１−１．バッファー  試薬
（ｉ）完全培地
・ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ  ＃１１８８５−０９２）
・１０％  熱処理ウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ）
・１％  ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  ＃１５０７０−０６３）
（ｉｉ）レプリコン完全培地
完全培地に０．３ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（ＧＩＢＣＯ  ＃１０１３１−０３５）を添加したものを用いた。
（ｉｉｉ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） 
・１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ
・８．１  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ
・２．６８  ｍＭ  ＫＣｌ
・１．４７  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４ 
また、細胞の植え継ぎには、０．２５％トリプシンを使用した。
【００３６】
１−１−２．細胞
（ｉ）ｈｕｈ７：ヒト肝臓癌由来細胞。
（ｉｉ）ｈｕｈ７．５．１：ＨＣＶ感受性の高い、ｈｕｈ７由来細胞（Ｍｏｒａｄｐｏｕｒら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，Ｊｕｌｙ  ２００４，７４００−７４０９；Ｚｈｏｎｇら，ＰＮＡＳ  ９２９４−９２９９  Ｊｕｎｅ  ２８，２００５  ｖｏｌ．１０２（２６）；Ｓｕｍｐｔｅｒら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  Ｍａｒ．２００５，２６８９−２６９９；Ｂｌｉｇｈｔら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，Ｄｅｃ．２００２，１３００１−１３０１４。
（ｉｉｉ）ｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１：ｈｕｈ７．５．１にＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａ  ＪＦＨ−１株を感染させた細胞。 
全長のＨＣＶゲノムＲＮＡを導入した細胞から細胞上清を濃縮し、非感染細胞の培地に濃縮液を添加することによって感染させた。
（ｉｖ）Ｙ１９：ｈｕｈ７にＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａ  ＪＦＨ−１株のｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎをトランスフェクションし、選択培養したもの（Ｋａｔｏら，ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２００３；１２５：１８０８−１８１７）。
（ｖ）Ｙ１９ｃ：Ｙ１９をインターフェロン処理によりレプリコンＲＮＡを検出限界以下に抑えたもの（Ｂｌｉｇｈｔら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，Ｄｅｃ．２００２，１３００１−１３０１４）。
（Ｖｉ）２−３：ｈｕｈ７にＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ  ＨＣＶ−Ｎ株のｆｕｌｌｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎをトランスフェクションし、選択培養したもの（Ｉｋｅｄａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  Ｍａｒ．２００２，２９９７−３００６）。
（ｖｉｉ）２−３ｃ：２−３をインターフェロン処理によりレプリコンＲＮＡを検出限界以下に抑えたもの（Ｂｌｉｇｈｔら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  Ｄｅｃ．２００２，１３００１−１３０１４）。
【００３７】
１−１−３．培養方法
ｈｕｈ７細胞及びｈｕｈ−７．５．１細胞、ｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１、Ｙ１９ｃは完全培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。レプリコン導入細胞Ｙ１９はセレクションの為、０．３ｍｇ／ｍｌのジェネティシンを加えたレプリコン完全培地で培養を行った。ただし、レプリコン導入細胞でも阻害剤等を添加する実験においてはレプリコン活性が減少しジェネティシン耐性が消失する可能性が考えられるので、ジェネティシンを含まない培地で培養した。
【００３８】
１−２．プラスミド構築
１−２−１．用いたプラスミド
（ａ）ｐＣＭＶ６  ＸＬ５  ｃｄｋ４：（ｏｒｉｇｅｎｅ  ＃ＳＣ１１３１０９）
（ｂ）ｐＣＭＶ６  ＸＬ５：（ａ）を元に、ｃｄｋ４遺伝子の両端にあるＮｏｔＩ制限酵素サイトを切断し、セルフライゲーションさせたもの。
（ｃ）ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）：（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ｖ７９０−２０）
（ｄ）ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＦＬＡＧ：（ｃ）のマルチクローニングサイト上流に、ＫＯＺＡＫ配列、開始コドン及びＦＬＡＧタグ配列を持ったオリゴＤＮＡを挿入したもの。
（ｅ）ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＨＡ：（ｃ）のマルチクローニングサイト上流に、ＫＯＺＡＫ配列、開始コドン及びＨＡタグ配列を持ったオリゴＤＮＡを挿入したもの。
（ｆ）ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＦＬＡＧ−ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１：（ｄ）のＦＬＡＧタグ配列の直下にヒトサイクリンＤ１配列を挿入したもの。
（ｇ）ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＨＡ−ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１：（ｅ）のＨＡタグ配列の直下にヒトサイクリンＤ１配列を挿入したもの。
プラスミド作成に用いたプライマーの配列は表１に示す。
【００３９】
【表１】
2011207764.tif 000007
【００４０】
１−２−２．大腸菌・プラスミド抽出
プラスミドを殖やす際及び変異体を作製する際は大腸菌ＤＨ５αを用い、培養条件はＬＢプレート、液体ＬＢ培地どちらも１００μｇ／ｍｌのアンピシリン濃度で３７℃とした。
１−２−３．クローニング
サイクリンＤ１のクローニングを以下の方法で行った。
ｈｕｈ７．５．１細胞から後述する方法によりＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行いｃＤＮＡ  ライブラリーを作成した。ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ  ＃ＫＯＤ−２０１）とｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ１を用いてサイクリンＤ１のコード領域を増幅し、Ａ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃２３１９９４）を用いて３’末端にＡ残基を付加し、ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ａ１３６０）に組み込んだ（ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｃｙｃｌｉｌｎＤ１）。ここで得られた遺伝子の塩基配列は、ｃｅｌｅｒａ社により報告されたヒト１１番染色体ゲノム配列（ＮＷ＿９２５１０６）のサイクリンＤ１コード領域のエクソンをつなぎ合わせて作られるサイクリン  Ｄ１  ｍＲＮＡ配列と同一であった。このプラスミドに制限酵素サイトＮｈｅＩを加えるためｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ２を用いインバースＰＣＲを行った。ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＦＬＡＧ（又はＨＡ）プラスミドに制限酵素サイトＮｈｅＩとＸｈｏＩの２箇所で切断し組み込んだ（ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＦＬＡＧ（又はＨＡ）−ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１）。
ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＦＬＡＧ（又はＨＡ）はｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ｖｅｃｔｏｒをＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｏｌｉｇｏｍｅｒ１、２とライゲーションさせることによって作成した。
ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔ（プライマーセット）及びｏｌｉｇｏｍｅｒ（オリゴマー）の配列は表１に示す。
【００４１】
１−３．阻害剤処理
１−３−１．用いた阻害剤
本研究で用いたｃｄｋ阻害剤は３種類あり、下記の式（５）（以下、阻害剤Ａとする）、（６）（以下、阻害剤Ｅとする）及び（７）（以下、阻害剤Ｂとする）で表される化合物である。いずれもｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。各々、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解して実験に用いた。阻害剤の各ｃｄｋに対するＩＣ５０を表２にまとめる。
【表２】
2011207764.tif 000008
【００４２】
１−３−２．阻害剤処理
６ウェルプレートに細胞をまき、目的の最終濃度となるように各阻害剤を１６μｌのＤＭＳＯに溶解して培地中に添加した。２日以上の阻害剤処理を行う場合には、阻害剤処理から２４時間後に培地を除きＰＢＳ洗浄を行ってから培地を加え、再び阻害剤を培地中に添加した。
【００４３】
１−４．細胞増殖試験
１−４−１．試薬・器具類
・ＷＳＴ−１（ｒｏｃｈｅ  ＃１  ６４４  ８０７）
・マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯ  ＭＸ／Ｌｉｇｈｔ）
１−４−２．細胞増殖試験
９６ウェルプレートに１００μｌの培地を加えて細胞を培養した。１０μｌのＷＳＴ−１試薬を加え、３７℃で９０分から１２０分インキュベートした後、プレートを２，０００ｒｐｍ、室温で遠心し、１分間室温で振盪し、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
吸光度測定は４５０ｎｍを測定し、同一ウェルの６２０ｎｍの波長をリファレンス波長として差し引き、さらに培地・阻害剤だけを含むウェルからの波長をブランクとして差し引いた。
【００４４】
１−５．ウェスタンブロッティング
培養細胞からのタンパク質の抽出は以下のように行った。
培養細胞の入った６ウェルプレートを２回ＰＢＳで洗浄し、ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ｐＨ８．０，１％  ノニデット  Ｐ−４０，１０％  グリセロール，２ｍＭ  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ），１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ），２ μｇ／ｍｌ  アプロチニン，２μｇ／ｍｌ  ロイペプチン，２ μｇ／ｍｌ  ペプスタチン，１ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４）を１ウェルに１５０μｌずつ加えた。４℃で３０分振盪した後、４℃で３０分、  １５ｋｒｐｍで遠心し、上清を用いて実験を行った。タンパク質の濃度はＢＳＡをスタンダードとしてｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｒａｄ  ＃５００−０００６ＪＡ）を用いて求めた。使用方法はキット添付のプロトコルに従った。
得られたタンパク質サンプルに対し、定法に従い、下記の抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
（抗体）
・ａｎｔｉ−ｃｏｒｅ：マウスモノクローナル抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ  ＃  ＭＡ１−０８０）
・ａｎｔｉ−ＮＳ３：マウスモノクローナル抗体（ｖｉｒｏｓｔａｔ  ＃１８２８）
・ａｎｔｉ−ａｃｔｉｎ：マウスモノクローナル抗体（ａｂｃａｍ  ＃ａｂ９４８４）
・ａｎｔｉ−ｃｄｋ４：マウスモノクローナル抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ−２３８９６）
・ａｎｔｉ−ｃｙｃｌｉｎＤ１：マウスモノクローナル抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ＃２００４４）  
・Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）：マウスモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５４１３６）
・Ｒｂ（ｐＳ７８０）：ウサギモノクローナル抗体（ＥＰＩＴＯＭＩＣＳ  ＃１１８２−１）  
・ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ：ヤギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ  ＃Ｐ０４４７）
・ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ：ヤギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ  ＃Ｐ０４４８）
【００４５】
１−６．定量的ＲＴ−ＰＣＲ
細胞の培地を除き０．２５％  トリプシン処理を行って細胞を回収した。ＰＢＳで洗い、細胞を１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ  ＃  ３１１−０２５０１）に溶解した後０．２ｍｌのクロロホルムを加えてフェノール・クロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿、エタノール沈殿を行ってＲＮＡを精製し、ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＴＥにとかし、ＵＶ測定で定量を行った。
次に、細胞から抽出したＲＮＡ  １０ｎｇにｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１８４１８−０１２）を用いてｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１８０８０−０９３）で逆転写を行った。方法はキット添付のプロトコルに従った。
ＨＣＶ  ＲＮＡのコピー数測定には、細胞から抽出したＲＮＡを１０ｎｇ用いた。反応溶液は全量２０μｌで、組成は以下の通りである。
Ｈ２Ｏ                                                        ２．２μｌ
５０  ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）２                                  １．３μｌ
５μＭ  ＦＩＴＣ標識ハイブリダイゼーションプローブ            １．０μｌ
５μＭ  ＬＣ−Ｒｅｄ６４０標識ハイブリダイゼーションプローブ  １．０μｌ
１０μｌ  上流プライマー                                      １．０μｌ
１０μｌ  下流プライマー                                      １．０μｌ
ＲＮＡ  ｍａｓｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ  ７．５μｌ
ＲＮＡ  サンプル                                              ５．０μｌ
上記サンプルをＬｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ（ｒｏｃｈｅ  ＃２０１１４６８）キャピラリーに加え、Ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ装置本体のカローセルにセットした。リアルタイムＰＣＲの反応プログラムは以下の通りである。
逆転写  ６１℃  ２０分
熱変性  ９５℃    ２分
ＰＣＲ４５サイクル（９５℃  ５秒、５５℃１０秒、７２℃１３秒）
クーリング  ４０℃  ３０秒
プライマー、プローブの配列は表１に示す。
【００４６】
１−７．トランスフェクション
１−７−１．過剰発現
発現コンストラクトの導入方法はキット添付のプロトコルに従った。
ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃３１９８５−０６２）とＦｕＧＥＮＥ６（ｒｏｃｈｅ  ＃１１  ９８８  ３８７  ００１）を混和して５分静置後、ＤＮＡを混ぜて２５分静置し、細胞培養プレートに加えた。
【００４７】
２．結果
２−１．ｃｄｋ阻害剤のＨＣＶレプリコン活性に対する影響
ｃｄｋの活性を阻害する薬剤を用いて、ＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ  ＨＣＶ−Ｎ株由来のフルゲノミックレプリコン（ＦＧＲ；ｆｕｌｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を発現するｒｅｐｌｉｃｏｎ細胞２−３を処理した（図１ｃ）。ここでＦＧＲとは、ネオマイシン耐性遺伝子を含むＨＣＶの全長ゲノムＲＮＡの自律的な複製が行われるＨＣＶ複製モデル系のことを指す。また、ＦＧＲを発現している細胞にインターフェロン処理をしてレプリコンＲＮＡを除去した細胞をｃｕｒｅｄ細胞と呼ぶ。
ｃｄｋ１、２に対する阻害剤Ａと、ｃｄｋ４に対する阻害剤Ｂを用いて実験を行った（表２）。この２種類のｃｄｋ阻害剤をｒｅｐｌｉｃｏｎ細胞及びｃｕｒｅｄ細胞に２４時間処理し、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ及びａｃｔｉｎに対する抗体でウエスタンブロットを行った（図２ａ）。Ａｃｔｉｎは各ウェルにロードしたタンパク量のコントロールである。ウイルスタンパク質であるＮＳ５ＡとＮＳ５ＢはＲｅｐｌｉｃｏｎ細胞でのみ検出される。２０μＭの阻害剤Ｂを２４時間添加することで、ＮＳ５ＡとＮＳ５Ｂのタンパク量が低下した（図２ａ、レーン１２）。一方、阻害剤Ａを処理した細胞では１００μＭの濃度で処理をするとＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ共にタンパク量の減少が若干みられたが、阻害剤Ｂ程の効果は見られなかった（図２ａ、レーン６）。また、この時のリン酸化状態をリン酸化状態特異的抗体によるウエスタンブロットで確認すると、阻害剤Ａ、Ｂどちらを処理してもリン酸化状態のＲｂは減少していた（図２ｂ）。
この実験結果は、特に、ｃｄｋ阻害剤Ｂがｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ  ＨＣＶ−Ｎ株のＦＧＲのレプリコン活性を減少させる、という新しい知見を示している。
【００４８】
次に、このｃｄｋ阻害剤による抗ＨＣＶレプリコン活性のｇｅｎｏｔｙｐｅ特異性を調べるために、ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａ  ＪＦＨ−１株由来のサブゲノミックレプリコン（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ）（図１ｂ）を発現するＹ１９細胞とそのｃｕｒｅｄ細胞Ｙ１９ｃ用いて実験を行った。
ウイルスタンパク質であるＮＳ３はｒｅｐｌｉｃｏｎ細胞でのみ検出される。ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａ  ＪＦＨ−１株ＳＧＲでも、阻害剤ＡによるＨＣＶタンパク質の減少は、１００μＭの濃度で若干観察されたのに対し、阻害剤Ｂを５μＭ、あるいは、２０μＭ処理した細胞ではＨＣＶのＮＳ３のタンパク量が減少していた（図３ａ  レーン９、１０）。２０μＭ処理した細胞の方が、ＮＳ３が大きく減少していたので、量依存的な傾向が見られる。
次に、ＨＣＶレプリコンのＲＮＡ量の増減を調べるために、阻害剤を２日間処理したＹ１９細胞からＲＮＡを抽出し、１μｇ  総ＲＮＡあたりのＨＣＶレプリコンのＲＮＡコピー数を測定した。この時新たに阻害剤Ｅを加えて実験を行った。阻害剤Ｅはｃｄｋ１、２、５に対する阻害活性を示す（表２）。
阻害剤Ａ、Ｂ及びＥを添加して、ＤＭＳＯだけを加えた細胞から取られたサンプルと比較すると、ＨＣＶレプリコンＲＮＡの減少が認められた（図３ｂ、ｃ）。阻害剤Ａの抗ＨＣＶレプリコン活性は、ＮＳ３のタンパク質の減少は少なかったものの（図３ａ）、ＲＮＡ量の減少は認められた（図３ｂ）。これは薬剤の処理日数が違うこと、タンパク質量とＲＮＡ量の挙動が違い得ること、ＲＮＡの内部標準を測定して補正をしていないことなどの複合要因が考えられる。阻害剤Ｅは阻害剤Ｂと同等か、それ以上のレプリコンＲＮＡ量の減少を示した（図３ｃ）。
そこで、阻害剤ＢとＥの薬剤を１日処理した細胞からタンパク質とＲＮＡを抽出し、それぞれＮＳ３とａｃｔｉｎに対するウエスタンブロット（図４ａ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った（図４ｂ）。いずれの実験でも、実験した条件においては阻害剤Ｂを２０μＭの濃度で１日処理した条件で最も高い抗ＨＣＶレプリコン活性が見られた。
以上より、ｃｄｋ阻害剤はｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ、２ａのいずれのＨＣＶに対しても、そのレプリコン活性をタンパク質・ＲＮＡレベルにおいて減少させる。
阻害剤Ｂ、Ｅによる細胞増殖への影響を調べてみると、長期間、高濃度で薬剤処理をすると細胞の増殖を阻害することが示された。例えば、阻害剤Ｂを２０μＭの濃度で１日処理する条件ではＹ１９、Ｙ１９ｃ細胞のいずれもＤＭＳＯだけ加えた条件に比べ２０％程度の細胞しか生存していない（図６）。この結果を元に、阻害剤処理実験の期間は１日あるいは２日とした。
【００４９】
２−２．ｃｄｋ阻害剤による感染細胞中におけるＨＣＶの増殖抑制効果
レプリコン発現細胞で見られた抗ＨＣＶ活性が実際のウイルスに対しても観察されることを確かめるために、ｈｕｈ７．５．１細胞にＨＣＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａ  ＪＦＨ−１株を持続感染させたｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１細胞にｃｄｋ阻害剤を処理した。細胞を回収し、ＨＣＶ  ｃｏｒｅタンパク質とａｃｔｉｎに対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。ｃｏｒｅはｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１感染細胞からのみ検出される（図５ａ、ｂ）。ＳＧＲの実験（図３ａ、ｂ）と同様、阻害剤Ｂの濃度依存的に感染細胞のｃｏｒｅタンパク質が減少していくことが観察された（図５ａ）。阻害剤Ｅを１日処理してもｃｏｒｅのタンパク量の減少が観察されなかったが、阻害剤Ｅを１０μＭで２日間処理するとｃｏｒｅタンパク質の減少が観察された（図５ｂ、レーン８）。一方、阻害剤Ｂを２μＭで２日間処理すると抗ＨＣＶ活性が見られなかったが（図５ｂ、レーン６）、これは阻害剤Ｂを５μＭあるいは２０μＭの濃度で１日処理するという条件に比べ、低い濃度で処理したために起きたと考えられる。また、薬剤を１日処理した細胞からＲＮＡを抽出したところ、Ｂ、Ｅのどちらの阻害剤でも量依存的に抗ＨＣＶ活性を示し、阻害剤Ｂを２０μＭの濃度で１日処理した条件でＨＣＶ  ＲＮＡの１／６程度の減少が見られた（図５ｃ）。
このことから、ｃｄｋ阻害剤による抗ＨＣＶ効果は、レプリコンシステムに限らず感染培養系で起こることが示された。また薬剤による細胞増殖への影響を調べた（図７）  。この結果を元に、阻害剤処理実験の期間は１日あるいは２日とした。
【００５０】
２−３．ｃｄｋ４の過剰発現によるＨＣＶの増殖促進効果
一連のｃｄｋ阻害剤を用いた実験の中で最も抗ＨＣＶ活性が高かった条件は、阻害剤Ｂを２０μＭで２４時間処理した時である（図３、４及び５）。阻害剤Ｂはｃｄｋ４に対する阻害剤なので（表２）、ｃｄｋ４がウイルスの増殖に対して有利に働いている可能性が考えられる。そこで感染細胞にｃｄｋ４とその調節サブユニットサイクリンＤ１を過剰発現させ、ＨＣＶタンパク質量の増減を調べた。サイクリンＤ１の発現コンストラクト、ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＦＬＡＧ  ｃｙｃｌｉｎＤ１は、ｈｕｈ７．５．１細胞よりクローニングし、ｃｄｋ４の発現コンストラクトであるｐＣＭＶ６  ＸＬ５  ｃｄｋ４は、Ｏｒｉｇｅｎｅ社より購入した。
非感染細胞ｈｕｈ７．５．１と感染細胞ｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１にそれぞれサイクリンＤ１、ｃｄｋ４発現コンストラクトをトランスフェクションし、２日後に細胞を回収し、サイクリン、ｃｄｋ４及びｃｏｒｅとａｃｔｉｎに対するウエスタンブロットを行った（図８）。感染細胞にｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）  ＦＬＡＧ  ｃｙｃｌｉｎＤ１とｐＣＭＶ６  ＸＬ５  ｃｄｋ４をトランスフェクションしたサンプルでは、それぞれｃｙｃｌｉｎＤ１とｃｄｋ４が大量に発現していることが観察される（図８、レーン１０、１２、１４）。一方、非感染細胞にそれぞれの発現プラスミドをトランスフェクションしたサンプルではサイクリンＤ１とｃｄｋ４の量があまり変動していない（図８、レーン３、５、７）。これは非感染細胞と感染細胞でトランスフェクション効率が異なるため、遺伝子の挙動に変化が起きていると考えられる。
ｃｏｒｅタンパク質はｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１細胞からのみ検出された。その中で特にｃｄｋ４を過剰発現させた細胞でｃｏｒｅタンパク質発現量の上昇が見られた。サイクリンＤ１を過剰発現させた細胞からはｃｏｒｅタンパク質発現量の上昇は見られなかった。また、サイクリンＤ１とｃｄｋ４を共に過剰発現させた細胞において、ｃｄｋ４のみを過剰発現させた細胞よりｃｏｒｅタンパク質の増加量が少ないのは、ｃｄｋ４の発現量が少ないことを反映していると考えられる。
以上の結果は、過剰発現したｃｄｋ４がＨＣＶの増殖を促進していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のＣ型肝炎ウイルスの複製阻害剤は、Ｃ型肝炎感染症の治療及び治療薬の進展及び開発に大きく貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＨＣＶとＨＣＶ  ＳＧＲの構造を示す。（ａ）ＨＣＶゲノム構造を示す。５’ＵＴＲからｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）、構造タンパク質、非構造タンパク質、３’ＵＴＲの順に構成される。（ｂ）サブゲノミックレプリコン構造を示す。ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ、Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＥＭＣＶ）  ＩＲＥＳ、ＨＣＶ  ＮＳ３以後の非構造タンパク質、ＨＣＶ  ３’ＵＴＲの順に構成される。（ｃ）フルゲノミックレプリコン構造を示す。ＨＣＶ  ５’ＵＴＲ、Ｎｅｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、  ＨＣＶ  ＯＲＦの全長、３’ＵＴＲの順に構成される。
【図２】ｃｄｋ阻害剤のｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂにおける抗ＨＣＶ活性を示す。（ａ）ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ由来ＨＣＶ−Ｎ株のフルゲノミックレプリコン（Ｆｕｌｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を発現する細胞に、阻害剤ＡあるいはＢを２４時間処理し、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ、ａｃｔｉｎに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ａｃｔｉｎは内部標準として用いている。（ｂ）ｃｄｋ阻害剤はＲｂのリン酸化を抑制する。（ａ）と同様に調製したサンプルを、リン酸化型Ｒｂ特異的抗体、リン酸化状態非依存Ｒｂ抗体、ａｃｔｉｎに対する抗体を用いウエスタンブロットを行った。
【図３】ｃｄｋ阻害剤のＨＣＶ  レプリコン活性に対する影響。（ａ）ｃｄｋ阻害剤はＨＣＶ  レプリコン  ＲＮＡを減少させる。ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａ  由来ＳＧＲを発現するＹ１９細胞と、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃｕｒｅをしたＹ１９ｃ細胞に各阻害剤を１日処理し、細胞を回収してウエスタンブロットにより、ウイルス由来のＮＳ３タンパク質の発現量を調べた。ａｃｔｉｎは内部標準として示してある。（ｂ）及び（ｃ）Ａ、Ｂ及びＥ阻害剤を２日間処理したＹ１９細胞からＲＮＡを抽出し、総ＲＮＡ  １μｇあたりのＨＣＶ  レプリコンのコピー数を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。定量はｎ＝４で行い、値は平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図４】ｃｄｋ阻害剤のＨＣＶ  レプリコン活性に対する影響。（ｄ）阻害剤Ｂ、Ｅを１日処理したＹ１９細胞のタンパク質抽出液をウエスタンブロットにより、ウイルス由来のＮＳ３タンパク質の発現量を調べた。ａｃｔｉｎは内部標準として示してある。（ｅ）阻害剤Ｂ、Ｅを１日処理したＹ１９細胞からＲＮＡを抽出し、総ＲＮＡ  １μｇあたりのＨＣＶ  レプリコンのコピー数を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。定量はｎ＝４で行い、値は平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】ｃｄｋ阻害剤は持続感染細胞モデルにおいてＨＣＶ増殖活性を減少させる。（ａ）ヒト肝臓癌由来ｈｕｈ７．５．１細胞と、それにｇｅｎｏｔｙｐｅ  ２ａ由来のＪＦＨ−１株粒子に持続感染させたｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１細胞に阻害剤Ｂ、Ｅを１日処理し、ｃｏｒｅとａｃｔｉｎに対する抗体でウエスタンブロット行った。（ｂ）（ａ）と同様の実験を、濃度を変え処理時間を２日にしておこなった。４ｃ阻害剤Ｂ、Ｅで処理したｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１細胞からＲＮＡを抽出し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇあたりの    ＨＣＶ  レプリコンのコピー数を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。定量はｎ＝４で行い、値は平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】ｃｄｋ阻害剤が細胞増殖に与える影響（１）。  Ｙ１９、Ｙ１９ｃ細胞に各阻害剤について濃度を分け、１、２、３日間処理したものに、ＷＳＴ−１試薬を加え、ＷＳＴ−１の代謝産物によるＯＤ４５０の吸光度を測定した。値は薬剤の溶媒であるＤＭＳＯだけを加えた条件に対する相対値で示してある。値は３つの独立した実験の平均値を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図７】ｃｄｋ阻害剤が細胞増殖に与える影響（２）。  図６と同様の実験を、ｈｕｈ７．５．１、ｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１細胞について行った。
【図８】ｃｄｋ４の過剰発現がＨＣＶの増殖を促進することを示す結果である。  ｈｕｈ７．５．１細胞及びｈｕｈ７．５．１＋ＪＦＨ−１細胞にサイクリンＤ１、ｃｄｋ４の発現プラスミドをトランスフェクションし、２日後に細胞を回収、サイクリンＤ１、ｃｄｋ４、ｃｏｒｅ、ａｃｔｉｎに対する抗体でウェスタンブロッティングを行った。レーン２、９は、ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）ＦＬＡＧ、レーン４、１１は、ｐＣＭＶ６  ＸＬ５、レーン６、１３は、ｐｃＤＮＡ３．１  ｚｅｏ（＋）ＦＬＡＧとｐＣＭＶ６  ＸＬ５の両方を、それぞれトランスフェクションした細胞である。
【図６】
2011207764.tif 000016
【図７】
2011207764.tif 000017
【図１】
2011207764.tif 000018
【図２】
2011207764.tif 000019
【図３】
2011207764.tif 000020
【図４】
2011207764.tif 000021
【図５】
2011207764.tif 000022
【図８】
2011207764.tif 000023
【配列表】
2011207764000001.app