(57)【要約】【課題】酵素活性の検出または識別において、高感度、迅速、低コスト化を可能にする、酵素基質の発色増強方法およびそれに用いる試薬を提供することを課題とする。【解決手段】基質に酵素を作用させ発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する発色法において、発色増強剤として卵黄または卵黄から調製された溶液を用いることを特徴とする発色増強方法およびその方法に用いる試薬。前記の試薬を用いて微生物を検出または識別する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の基質に１種以上の酵素を作用させ発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する発色法において、発色増強剤として卵黄または卵黄から調製された溶液を用いることを特徴とする発色増強方法。
【請求項２】
酵素がホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼおよびホスホリパーゼから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
卵黄が鳥類由来であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
微生物の検出または識別における使用のための請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法に使用するための発色増強剤であって、卵黄または卵黄から調製された溶液を有効成分として含む発色増強剤。
【請求項６】
１種以上の基質に１種以上の酵素を作用させ発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する発色法に用いる試薬であって、発色増強剤として卵黄または卵黄から調製された溶液を含むことを特徴とする発色試薬。
【請求項７】
酵素がホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼおよびホスホリパーゼから選択されることを特徴とする請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
卵黄が鳥類由来であることを特徴とする請求項６または７に記載の試薬。
【請求項９】
微生物の検出または識別における使用のための請求項６から８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１０】
請求項９に記載の試薬を用いてホスファターゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼ活性およびホスホリパーゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物を検出または識別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質に酵素を作用させる発色法における発色増強方法に関する。より詳細には、ホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼ、ホスホリパーゼなどの作用により基質が加水分解され、発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する発色法における、発色増強方法およびそれに用いる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素の作用により基質が加水分解され、発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する反応は、目視または装置により発色や蛍光を簡易かつ高感度に測定可能であるため、生化学、免疫学、分子生物学、微生物学など幅広い分野において、酵素活性検出を目的として応用されている。特に微生物学分野では、酵素活性を測定することにより微生物を検出または識別する方法に応用され、コロニー所見の鑑別のような熟練を要さず、煩雑な微生物確認試験を省略できる簡易で迅速な方法として汎用されている。例えば、特許文献１には、発色基質である５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルホスフェートを培地に含有させ、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus、以下、黄色ブドウ球菌という。）のホスファターゼ活性を検出する方法が記載されている。また、特許文献２には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−グルコシドを培地に含有させてエンテロコッカス（Enterococcus）属細菌のβ−グルコシダーゼ活性を検出する方法、特許文献３には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを培地に含有させてカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性を検出する方法、さらに特許文献４には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファチジルミオイノシトールを培地に含有させてリステリア・モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）およびリステリア・イヴァノヴィ（Listeria ivanovii）のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（phosphatidylinositol-specific phospholipase C、以下、PI-PLCという。）活性を検出する方法が記載されている。
【０００３】
しかし、発色基質や蛍光基質の価格が非常に高価なため、酵素基質を含む培地は高コストであるという問題がある。そのため、特に食品衛生や環境検査における黄色ブドウ球菌測定など、検査数の多い現場では、酵素基質を含有する、より低コストの培地が求められている。
【０００４】
また、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus、以下、MRSAという。）、バンコマイシン耐性腸球菌（Vancomycin-Resistant Enterococci）などの院内感染原因菌や黄色ブドウ球菌などの食中毒原因菌の検査においては、短時間で感度良く菌を検出することが重要である。
【０００５】
特許文献５には、乳化安定化剤（TWEEN（登録商標）20）と溶媒（ジメチルスルホキシド（DMSO））を培地に添加して基質溶解性を高めることにより、発色または蛍光強度を増強して対象微生物の検出感度を上昇させることや基質含量を低減した培地を提供することが記載されている。
【０００６】
一方、卵黄を添加した培地上でスタフィロコッカス（Staphylococcus)属細菌(以下、ブドウ球菌という。)、バチルス(Bacillus)属細菌、クロストリジウム(Clostridium）属細菌などを培養すると、増殖した菌体の周辺に白濁環が生じることが知られており（いわゆる卵黄反応）、前記の菌を検出するために卵黄添加培地が利用されている（例えば、特許文献６）。さらに、黄色ブドウ球菌による卵黄反応を識別しやすくするために、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌のコロニーを着色する発色基質を培地に含有させる方法が開示されている（特許文献７）。しかし、検出対象菌のコロニーを着色する酵素基質培地に卵黄を添加して発色を増強させた例は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５３７８５２号公報
【特許文献２】特表２００４−５２８８５６号公報
【特許文献３】特表２００１−５１４９０２号公報
【特許文献４】特表２００１−５１００５４号公報
【特許文献５】特表２００４−５１６８２７号公報
【特許文献６】特開昭６２−１１５２９６号公報
【特許文献７】特開平１１−９２６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の現状に鑑みてなされたものであり、酵素活性の検出または識別において、高感度、迅速、低コスト化を可能にする、酵素基質の発色増強方法およびそれに用いる試薬を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、発色基質であるホスフェート化合物、β−グルコピラノシド化合物、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニド化合物、ホスファチジルミオイノシトール化合物、ミオイノシトールホスフェート化合物およびコリンホスフェート化合物から選択される１種以上の化合物を含有する培地に卵黄を添加すると、培養後の検出対象菌コロニーの発色が増強されることを見出した。さらに、本発明者は、卵黄の添加による検出対象菌コロニーの発色増強が、蛍光基質である前記の化合物を含有する培地においても認められることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなるものである。
（１）１種以上の基質に１種以上の酵素を作用させ発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する発色法において、発色増強剤として卵黄または卵黄から調製された溶液を用いることを特徴とする発色増強方法。
（２）酵素がホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼおよびホスホリパーゼから選択されることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）卵黄が鳥類由来であることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）微生物の検出または識別における使用のための上記（１）から（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）上記（１）から（４）のいずれか１項に記載の方法に使用するための発色増強剤であって、卵黄または卵黄から調製された溶液を有効成分として含む発色増強剤。
（６）１種以上の基質に１種以上の酵素を作用させ発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する発色法に用いる試薬であって、発色増強剤として卵黄または卵黄から調製された溶液を含むことを特徴とする発色試薬。
（７）酵素がホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼおよびホスホリパーゼから選択されることを特徴とする上記（６）に記載の試薬。
（８）卵黄が鳥類由来であることを特徴とする上記（６）または（７）に記載の試薬。
（９）微生物の検出または識別における使用のための上記（６）から（８）のいずれか１項に記載の試薬。
（１０）上記（９）に記載の試薬を用いてホスファターゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼ活性およびホスホリパーゼ活性から選択される酵素活性を有する微生物を検出または識別する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の発色増強方法および試薬を用いることにより、従来法に比べ測定に必要な酵素基質含量を低減し、試薬を低コスト化することが可能となる。また、従来法に比べ判定時間の短縮や高感度化も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌ＥＫＮ３０８８株のホスファターゼ活性検出における、１４時間培養後の発色状況を卵黄液添加の有無で比較した写真である。（実施例１．Ａ）
【図２】図２は２０時間培養後の図１と同様の写真である。（実施例１．Ａ）
【図３】図３は２４時間培養後の図１と同様の写真である。（実施例１．Ａ）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、酵素の作用により基質が加水分解され、発色団化合物および／または蛍光発色団化合物を遊離する発色法において、発色増強剤として卵黄または卵黄から調製された溶液を用いることを特徴とする。
【００１４】
本発明で対象とする酵素は加水分解酵素であり、特にホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼおよびホスホリパーゼから選択することが好ましい。なお、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼにはＮ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼおよびＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼが含まれ、ホスホリパーゼにはPI-PLCおよびホスファチジルコリン特異的ホスホリパーゼＣ（phosphatidylcholine-specific phospholipase C、以下、PC-PLCという。）が含まれる。また、本発明で対象とする酵素の由来生物は特に限定されない。ヒト、他の動物、植物、微生物などに由来する天然の酵素、遺伝子組み換え技術などにより人工的に合成された酵素などが対象酵素として挙げられる。
【００１５】
本発明で用いる酵素基質には発色基質および蛍光基質が含まれ、本発明における発色には、発色団化合物の遊離による発色と蛍光発色団化合物の遊離による蛍光発色が含まれる。本発明で用いる発色基質は、酵素によって加水分解されうるように発色団化合物と結合しているホスフェート化合物、β−グルコピラノシド化合物、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニド化合物、ホスファチジルミオイノシトール化合物、ミオイノシトールホスフェート化合物またはコリンホスフェート化合物であれば、特に限定されない。なお、ミオイノシトールホスフェート化合物には、ミオイノシトール−１−ホスフェート化合物などが含まれる。結合している発色団化合物の具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−３−インドキシル、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、６−クロロ−３−インドキシル、５−ヨード−３−インドキシル、３−インドキシル、Ｎ−メチルインドキシルなどのインドキシル誘導体、２−クロロ−４−ニトロフェニル、２−ニトロフェニル、３−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、フェノールフタレインなどのフェニル誘導体が挙げられる。一方、本発明で用いる蛍光基質は、酵素によって加水分解されうるように蛍光発色団化合物と結合しているホスフェート化合物、β−グルコピラノシド化合物、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニド化合物、ホスファチジルミオイノシトール化合物、ミオイノシトールホスフェート化合物またはコリンホスフェート化合物であれば、特に限定されない。結合している蛍光発色団化合物の具体例としては、７−ブロモ−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボキシアミド（ナフトールAS−BI）、３−ヒドロキシ−２−ナフトアニリド（ナフトールAS）、６−ブロモ−２−ナフチル、１−ナフチル、２−ナフチルなどのナフチル誘導体、４−メチルウンベリフェリル、４−ブロモメチル−７−メトキシクマリン、４−ブロモメチル−７−アセトキシクマリン、７−ヒドロキシクマリン−６−イル、７−ヒドロキシクマリン、７−エトキシクマリン、７−メトキシクマリンなどのクマリン誘導体、８−ヒドロキシキノリンなどのキノリン誘導体、２−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）−６−クロロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン（ELF-97）などのキナゾリノン誘導体が挙げられる。また、本発明では、基質を単独で用いることも可能であるが、検出目的に応じて適宜組み合わせて用いることも可能である。
【００１６】
本発明で用いる卵黄は、鶏、合鴨、アヒル、七面鳥、ウズラ、ダチョウなどの鳥類由来のものであれば、特に限定されない。卵黄は、周知の方法により取り出す。即ち、卵の外殻を消毒し、予め滅菌したピンセットや卵黄取り出し器具を用いて卵黄を無菌的に取り出す。取り出した卵黄は、必要に応じて無菌フィルターや、電子線照射などによる滅菌操作を適宜行った後、本発明の発色増強剤として用いる。
【００１７】
本発明では、卵黄をそのまま発色増強剤として用いることができるが、卵黄から調製された溶液もまた発色増強剤として用いることができる。卵黄から調製された溶液とは、卵黄全体または卵黄から抽出した成分を水、塩化ナトリウム溶液または緩衝液で希釈した溶液のことである。希釈に用いる塩化ナトリウム溶液は、目的とする酵素の検出に適した種々の濃度とすることができる。また、緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液など、目的とする酵素の検出に適した種々の緩衝液を種々の濃度で適用することができる。発色反応液中の卵黄量は実施例に示した様に、５０％卵黄液として０．１〜２００ｍＬ／Ｌとすることが好ましく、３〜１００ｍＬ／Ｌとすることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明で検出対象となる標的微生物は、加水分解酵素、特にホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼ、ホスホリパーゼから選択される酵素を有するものであれば限定されない。ホスファターゼを有する微生物の具体例としては、黄色ブドウ球菌およびクロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens、以下、ウェルシュ菌という。）など、β−グルコシダーゼを有する微生物の具体例としては、エンテロコッカス属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌およびエンテロバクター（Enterobacter）属細菌など、Ｎ−アセチル−β−ヘキソサミニダーゼを有する微生物の具体例としては、カンジダ・アルビカンスなど、PI-PLCを有する微生物の具体例としては、リステリア・モノサイトジェネス、リステリア・イヴァノヴィなどのリステリア属病原性細菌、黄色ブドウ球菌、ウェルシュ菌、クロストリジウム・ノビイ（Clostridium novyi）、レジオネラ（Legionella）属細菌、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）およびバチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）など、PC-PLCを有する微生物の具体例としては、リステリア・モノサイトジェネス、黄色ブドウ球菌、ウェルシュ菌、クロストリジウム・ノビイ、バチルス・セレウス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、カンジダ・アルビカンスおよびアスペルギルス・フミガタスなどが挙げられる。本発明では、酵素を単独で検出することも可能であるが、１つの反応系内で複数の酵素を同時に検出または識別することも可能である。
【００１９】
本発明の発色増強剤を含む試薬は、培地である場合と培地以外である場合を想定することができる。培地である場合には、標的微生物の培養に適した種々の基礎培地、酵素基質、選択剤、その他の成分が含有されている培地に本発明の発色増強剤を添加して用いる。本発明の発色増強剤は発色増強作用を有する他の物質と組み合わせて使用することも可能である。通常の微生物培養に使用されうる成分が共存していても、本発明の作用が影響されることはない。
【００２０】
本発明の発色増強剤を含む試薬が培地である場合は、標的微生物の存在が疑われる試料を接種して培養後、発色を調べることで対象微生物を検出することができる。一方、発色増強剤を含む試薬が培地以外である場合は、標的酵素の存在が疑われる試料を前処理せずに試薬に接種し、適温で反応させた後、発色を調べることで対象酵素を検出することができる。また、試薬への接種の前に濃縮などの前処理操作を適宜行うことも可能である。
【００２１】
本発明の発色増強剤を含む試薬が培地である場合、培地の形態は特に限定されない。液体、半流動、固形、シート状などのいずれの形態もとりうるが、検出のしやすさなどの観点から、固形培地が好ましく、より好ましくは平板固形培地の形態である。固形培地の固化剤としては、寒天、アガロースなど通常使用されているものが挙げられる。
【００２２】
本発明に使用される試料は、酵素を含む可能性のある試料であれば特に限定されない。ヒト、他の動物の生体由来、食品、環境由来の検体、それらの培養液などが試料として挙げられる。これらの試料は、抽出、濃縮などの前処理を行っても良い。
【００２３】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
なお、各実施例で使用した供試菌株一覧を以下の表１に示す。
【００２４】
【表１】
2011083237.tif 000002
【実施例１】
【００２５】
（Ａ．５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出）
酵素基質として５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出において、卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
【００２６】
（１）培地の準備
以下に示した培地成分を秤量し、精製水に懸濁後、ｐHを７．０±０．１に調整し、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００２７】
【表２】
2011083237.tif 000003
【００２８】
（２）卵黄液添加量
５０％卵黄液の最終添加量を５ｍＬ／Ｌとした。
【００２９】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を８０ｍｇ／Ｌとし、対照として卵黄液を添加せず、酵素基質最終濃度を８０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌとした培地も調製した。
【００３０】
（４）酵素基質および卵黄液の添加
（１）で高圧滅菌後、５０℃に冷却した後、濾過滅菌した酵素基質液および卵黄液を添加して撹拌した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００３１】
（５）菌の接種と培養
前培養した菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．１の菌液を作製した。その後、前記菌液を画線し、３５℃で好気培養を行い、発色強度を調べた。
【００３２】
（６）結果
酵素基質添加量８０ｍｇ／ＬにおけるＥＫＮ３０８８株の１４、２０、２４時間培養後の発色状況を卵黄液添加の有無で比較した写真を図１〜３に、また、全菌株の１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間後の５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートの分解による青色発色強度を表３に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００３３】
【表３】
2011083237.tif 000004
【００３４】
図１〜３は、それぞれシャーレ２枚のうち左が卵黄液添加なし、右が卵黄液添加ありである。１４、２０、２４時間培養のいずれにおいても、卵黄液添加ありで明らかな発色増強が認められていた。また、表３に示した様に、検討したすべての菌株において酵素基質添加量８０ｍｇ／Ｌ、１４時間以上の培養で卵黄液添加による発色増強作用が認められ、卵黄液添加ありの発色強度は、卵黄液添加なし酵素基質添加量１５０ｍｇ／Ｌにおける発色と比べて同等以上であった。このことから、発色増強剤としての卵黄液添加により、培地に添加する酵素基質量を５０％以下に低減できることが示唆された。さらに、酵素基質添加量８０ｍｇ／Ｌにおいて発色が認められるまでに要した培養時間は、卵黄液添加ありの方が卵黄液添加なしに比べて２〜４時間短かった。発色が認められるまでの時間は、卵黄液添加なし酵素基質添加量１５０ｍｇ／Ｌに比べても短時間であった。このことから、発色増強剤としての卵黄液添加により、判定までの培養時間を短縮できることが示唆された。
【００３５】
（Ｂ．５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出）
酵素基質として５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出において、卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
以下に示す実施例１．Ｂから実施例７における酵素基質および卵黄液の添加、菌の接種操作は、実施例１．Ａと同様に行った。
【００３６】
（１）培地の準備
実施例１．Ａと同様とした。
【００３７】
（２）卵黄液添加量
実施例１．Ａと同様とした。
【００３８】
（３）酵素基質添加濃度
実施例１．Ａと同様とした。
【００３９】
（４）結果
全菌株の１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間培養後の５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシルホスフェートの分解による赤色発色強度を表４に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００４０】
【表４】
2011083237.tif 000005
【００４１】
表４に示す様に、検討したすべての菌株において酵素基質添加量８０ｍｇ／Ｌ、１６時間以上の培養で卵黄液添加による発色増強作用が認められ、卵黄液添加ありの発色強度は卵黄液添加なし酵素基質添加量１５０ｍｇ／Ｌにおける発色と比べて同等以上であった。このことから、発色増強剤としての卵黄液添加により、培地に添加する酵素基質量を５０％以下に低減できることが示唆された。また、酵素基質添加量８０ｍｇ／Ｌにおいて発色が認められるまでに要した培養時間は、卵黄液添加ありの方が４〜８時間短かった。発色が認められるまでの時間は、卵黄液添加なし酵素基質添加量１５０ｍｇ／Ｌに比べても短時間であった。このことから、発色増強剤としての卵黄液添加により、判定までの培養時間を短縮できることが示唆された。
【実施例２】
【００４２】
（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドを使用したエンテロコッカス属細菌のβ−グルコシダーゼ活性検出）
酵素基質として５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドを使用したエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)のβ−グルコシダーゼ活性検出において、卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
【００４３】
（１）培地の準備
実施例１．Ａと同様とした。
【００４４】
（２）卵黄液添加量
実施例１．Ａと同様とした。
【００４５】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を５０ｍｇ／Ｌとし、対照として卵黄液を添加せず、酵素基質最終濃度を５０ｍｇ／Ｌとした培地も調製した。
【００４６】
（４）結果
全菌株の２４、４０時間培養後の５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドの分解による赤色発色強度を表５に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００４７】
【表５】
2011083237.tif 000006
【００４８】
表５に示す様に、β−グルコシダーゼ活性検出においても卵黄液添加による発色増強作用が認められ、また、発色までに要する培養時間が短縮されることが示唆された。
【実施例３】
【００４９】
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドを使用したカンジダ・アルビカンスのＮ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ活性検出）
酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドを使用したカンジダ・アルビカンスのＮ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ活性検出において、卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
【００５０】
（１）培地の準備
以下に示した培地成分を秤量し、精製水に懸濁後、ｐHを７．０±０．１に調整し、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００５１】
【表６】
2011083237.tif 000007
【００５２】
（２）卵黄液添加量
５０％卵黄液の最終添加量を５、５０ｍＬ／Ｌとした。
【００５３】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を１００ｍｇ／Ｌとし、対照として卵黄液を添加せず、酵素基質最終濃度を１００ｍｇ／Ｌとした培地も調製した。
【００５４】
（４）結果
各菌株の１５、２０、２２、４５時間培養後の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニドの分解による青緑色発色強度を表７に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００５５】
【表７】
2011083237.tif 000008
【００５６】
表７に示す様に、Ｎ−アセチル−β−ガラクトサミニダーゼ活性検出においても卵黄液添加による発色増強作用が認められ、また、発色までに要する培養時間が短縮されることが示唆された。
【実施例４】
【００５７】
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを使用したカンジダ・アルビカンスのＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ活性検出）
酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを使用したカンジダ・アルビカンスのＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ活性検出において、卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
【００５８】
（１）培地の準備
実施例３と同様とした。
【００５９】
（２）卵黄液添加量
実施例３と同様とした。
【００６０】
（３）酵素基質添加濃度
実施例３と同様とした。
【００６１】
（４）結果
各菌株の１５、２０、２２、４５時間培養後の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドの分解による青緑色発色強度を表８に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００６２】
【表８】
2011083237.tif 000009
【００６３】
表８に示す様に、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ活性検出においても卵黄液添加による発色増強作用が認められ、また、発色までに要する培養時間が短縮されることが示唆された。
【実施例５】
【００６４】
（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオイノシトール−１−ホスフェートを使用したリステリア属細菌のPI-PLC活性検出）
酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオイノシトール−１−ホスフェート，アンモニウム塩を使用したリステリア・モノサイトジェネス、リステリア・イヴァノヴィのPI-PLC活性検出において、卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
【００６５】
（１）培地の準備
以下に示した培地成分を秤量し、精製水に懸濁後、ｐHを７．０±０．１に調整し、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００６６】
【表９】
2011083237.tif 000010
【００６７】
（２）卵黄液添加量
実施例３と同様とした。
【００６８】
（３）酵素基質添加濃度
実施例３と同様とした。
【００６９】
（４）結果
各菌株の１２、１６、２０、３６、４５時間培養後の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ミオイノシトール−１−ホスフェートの分解による青緑色発色強度を表１０に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００７０】
【表１０】
2011083237.tif 000011
【００７１】
表１０に示す様に、PI-PLC活性検出においても卵黄液添加による発色増強作用が認められ、また、発色までに要する培養時間が短縮されることが示唆された。
【実施例６】
【００７２】
（卵黄由来種の検討）  
酵素基質として５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出において、鶏、合鴨、七面鳥、ウズラ、ダチョウ由来の卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
【００７３】
（１）培地の準備
実施例１．Ａと同様とした。
【００７４】
（２）卵黄液添加量
実施例１．Ａと同様とした。
【００７５】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を８０ｍｇ／Ｌとし、対照として卵黄液を添加せず、酵素基質最終濃度を８０ｍｇ／Ｌとした培地も調製した。
【００７６】
（４）結果
２４時間培養後の５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートの分解による青色発色強度を表１１に示す。発色強度は目視により、任意スケールで表した。
【００７７】
【表１１】
2011083237.tif 000012
【００７８】
表１１に示す様に、検討したすべての種の卵黄液添加培地において発色増強作用が認められた。このことから、鳥類由来の卵黄であれば、発色増強作用を示すことが示唆された。
【実施例７】
【００７９】
（卵黄添加量の検討）
酵素基質として５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出において、発色増強作用を示す卵黄液添加量を調べた。
【００８０】
（１）培地の準備
実施例１．Ａと同様とした。
【００８１】
（２）卵黄液添加量
５０％卵黄液の最終添加量を０．１、１、２、３、１００、２００、５００ｍＬ／Ｌとした。
【００８２】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を８０ｍｇ／Ｌとし、対照として卵黄液を添加せず、酵素基質最終濃度を８０ｍｇ／Ｌとした培地も調製した。
【００８３】
（４）結果
各添加量の卵黄液について、１４、１８、２４時間培養後の５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートの分解による青色発色強度を表１２に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００８４】
【表１２】
2011083237.tif 000013
【００８５】
表１２に示す様に、卵黄液０．１〜２００ｍＬ／Ｌ添加において、発色増強作用が認められ、いずれの菌株においても、３〜１００ｍＬ／Ｌ添加の場合に特に強い発色増強作用が認められた。
【実施例８】
【００８６】
（液体培地による検討）
酵素基質として５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出において、液体培地における発色増強作用を調べた。
【００８７】
（１）培地の準備
以下に示した培地成分を秤量し、精製水に懸濁後、ｐHを７．０±０．１に調整し、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００８８】
【表１３】
2011083237.tif 000014
【００８９】
（２）卵黄液添加量
実施例１．Ａと同様とした。
【００９０】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を０、８０、１６０、２４０、３２０、４００ｍｇ／Ｌとし、各酵素基質濃度について対照として卵黄液を添加しない培地も調製した。
【００９１】
（４）酵素基質および卵黄液の添加
（１）で高圧滅菌後、室温まで冷却した後、滅菌小試験管に５ｍＬずつ分注した。その後、濾過滅菌した酵素基質液および卵黄液を添加して撹拌した。
【００９２】
（５）菌の接種と培養
前培養した菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．１の菌液を作製した。その後、前記菌液を培地に１０μＬ接種し、３５℃で好気培養を行い、発色強度を調べた。
【００９３】
（６）結果
ＥＫＮ３０８８株の１４、１８、２４時間培養後の５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートの分解による青色発色強度を表１４に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【００９４】
【表１４】
2011083237.tif 000015
【００９５】
液体培地においても、表１４に示す様に、酵素基質濃度１６０ｍｇ／Ｌ以上で卵黄液添加による発色増強作用が認められた。また、卵黄液添加あり酵素基質添加量１６０ｍｇ／Ｌにおける発色は、いずれの培養時間においても卵黄液添加なし酵素基質添加量４００ｍｇ／Ｌにおける発色よりも強度が上であった。このことから、発色増強剤としての卵黄液添加により、培地に添加する酵素基質量を４０％以下に低減できることが示唆された。さらに、発色が認められるまでに要した培養時間は、酵素基質添加量１６０ｍｇ／Ｌにおいて卵黄液添加ありの方が卵黄液添加なしに比べて１０時間短く、酵素基質添加量２４０ｍｇ／Ｌ以上では、卵黄液添加ありの方が４時間短かった。このことから、発色増強剤としての卵黄液添加により、判定までの培養時間を短縮できることが示唆された。
【実施例９】
【００９６】
（４−メチルウンベリフェリルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出）
酵素基質として４−メチルウンベリフェリルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出において、卵黄液添加による発色増強作用を調べた。
【００９７】
（１）培地の準備
実施例８と同様とした。
【００９８】
（２）卵黄液添加量
実施例１．Ａと同様とした。
【００９９】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を０、１００、２００、４００ｍｇ／Ｌとし、各酵素基質濃度について対照として卵黄液を添加しない培地も調製した。
【０１００】
（４）酵素基質および卵黄液の添加
実施例８と同様とした。
【０１０１】
（５）菌の接種と培養
実施例８と同様とした。
【０１０２】
（６）結果
各菌株の４、６、８、１０、１２時間培養後の４−メチルウンベリフェリルホスフェートの分解による蛍光強度（３６５ｎｍで観察）を表１５に示す。蛍光強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【０１０３】
【表１５】
2011083237.tif 000016
【０１０４】
表１５に示した様に、蛍光基質においても８時間培養（２株とも）および１０時間培養（２株中１株）において、卵黄液添加による発色増強作用が認められ、培地に添加する酵素基質量を低減できることが示唆された。また、卵黄液添加ありの場合は、検討した２株とも８時間培養により蛍光発色が認められたのに対し、卵黄液添加なしの場合は、ＥＫＮ４９７６株において８時間培養では蛍光発色が認められず、このことから、卵黄液添加により判定までの培養時間を短縮できることが示唆された。
【実施例１０】
【０１０５】
（卵黄液添加による検出感度に対する影響）
酵素基質として５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートを使用した黄色ブドウ球菌のホスファターゼ活性検出において、検出感度に対する卵黄液添加の影響を調べた。
【０１０６】
（１）培地の準備
実施例８と同様とした。
【０１０７】
（２）卵黄液添加量
実施例１．Ａと同様とした。
【０１０８】
（３）酵素基質添加濃度
卵黄液添加培地の酵素基質最終濃度を１６０ｍｇ／Ｌとし、対照として卵黄液を添加せず、酵素基質最終濃度を１６０ｍｇ／Ｌとした培地も調製した。
【０１０９】
（４）酵素基質および卵黄液の添加
実施例８と同様とした。
【０１１０】
（５）菌の接種と培養
前培養した菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．１の菌液を作製した。その後、１０倍連続希釈液を作製し、１０0〜１０-6希釈の菌液をそれぞれ培地に１０μＬ接種し、３５℃で好気培養を行い、発色強度を調べた。
【０１１１】
（６）結果
ＥＫＮ３０８８株の１８、２０、２４時間培養後の５−ブロモ−３−インドキシルホスフェートの分解による青色発色強度を表１６に示す。発色強度は目視により、培養時間ごとに一定の任意スケールで表した。
【０１１２】
【表１６】
2011083237.tif 000017
【０１１３】
表１６に示した様に、卵黄液添加培地では１０-6希釈菌液接種、１８時間培養において発色が認められたが、卵黄液添加なしの場合は１０0希釈菌液接種、２４時間培養でも発色が認められなかった。このことから、卵黄液添加により検出感度が改善されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明の発色増強方法および試薬は、発色増強剤として卵黄または卵黄から調製された溶液を用いることにより、従来法に比べ測定に必要な酵素基質含量を低減し、試薬を低コスト化することが可能となる。また、従来法に比べ判定時間の短縮や高感度化も可能になる。そのため、本発明の方法および試薬は、臨床をはじめ、食品、環境などの幅広い分野の微生物検出において有用である。
【図１】
2011083237.tif 000018
【図２】
2011083237.tif 000019
【図３】
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