(57)【要約】【課題】特定の条件で細胞培養用基板の表面の性質を改変し、細胞ごとに接着させる領域と接着させない領域を制御できる手段を提供する。【解決手段】本発明は、導電性領域を有する基材、および導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板の導電性領域に正電圧を印加することにより細胞接着阻害性の膜を剥離する工程、および細胞接着阻害性の膜が剥離された領域上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性領域を有する基材、および導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板の導電性領域に正電圧を印加することにより細胞接着阻害性の膜を剥離する工程、および細胞接着阻害性の膜が剥離された領域で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
【請求項２】
導電性領域が、基材表面に酸化インジウム錫の膜が存在する領域である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞接着阻害性の膜が、有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
有機化合物がアルキレングリコールオリゴマーである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
導電性領域に、１〜１０Ｖの正電圧を印加する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
正電圧を０．５〜６０分間印加する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
導電性領域を有する基材、および導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板の膜上にタンパク質を固定化してタンパク質層を形成する工程、タンパク質層上で細胞を培養する工程、ならびに導電性領域に正電圧を印加することによりタンパク質層とともに細胞を剥離する工程、を含む細胞培養方法。
【請求項８】
導電性領域が、基材表面に酸化インジウム錫の膜が存在する領域である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞接着阻害性の膜が、有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜である、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
有機化合物がアルキレングリコールオリゴマーである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
導電性領域に、１〜１０Ｖの正電圧を印加する、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
正電圧を０．５〜６０分間印加する、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面の性質を改変可能な基板上で細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、様々な動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。
【０００３】
一部の細胞（特に多くの動物細胞）は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にし、細胞の形態に影響を与えることが知られている。
【０００４】
したがって、生体内で接着した状態で生存している細胞の機能を評価するためには、細胞を接着させた状態で培養する必要がある。細胞間の相互作用を評価する場合も、接着した状態の細胞を共培養して相互作用を評価することが好ましい。しかし、担体上の特定の領域のみを細胞接着性とすることにより、その領域に細胞を接着させることはできても、2種以上の細胞をそれぞれ別の領域に接着させることは困難であった。したがって、特定の条件で細胞接着性を改変することができ、細胞ごとに接着させる領域と接着させない領域を制御できるような技術が求められていた。
【０００５】
非特許文献１には、パターニングされていない全面が導電性の基板上で、特定の部位に接着していた細胞が、電圧の印加によりその部位から放出されて拡散したことが記載されている。しかし、電圧の印加により導電性領域が細胞接着性に変化することについては記載されておらず、細胞ごとに接着させる領域を制御することについても記載されていない。
【０００６】
非特許文献２には、導電性領域と絶縁性領域を有する基材に細胞接着阻害性の膜を形成し、特定の導電性領域に負電圧を印加することにより細胞接着阻害性の膜を細胞接着性に改変させて、その領域にのみ細胞を接着させて培養する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｉａｎｇ  Ｘ，Ｆｅｒｒｉｇｎｏ  Ｒ，Ｍｒｋｓｉｃｈ  Ｍ，Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ  ＧＭ．２００３．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｌｙ  ｒｅｌｅａｓｅｓ  ｐａｔｔｅｒｎｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：２３６６−７
【非特許文献２】Ｓｕｎｎｙ  Ｓ．Ｓｈａｈ，Ｊｉ  Ｙｏｕｎ  Ｌｅｅ，Ｓｔａｎｉｓｌａｖ  Ｖｅｒｋｈｏｔｕｒｏｖ，Ｎａｚｇｕｌ  Ｔｕｌｅｕｏｖａ，Ｅｍｉｌｅ  Ａ．Ｓｃｈｗｅｉｋｅｒｔ，Ｅｒｌａｎ  Ｒａｍａｎｃｕｌｏｖ，ａｎｄ  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｒｅｖｚｉｎ．２００８．Ｅｘｅｒｃｉｓｉｎｇ  Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２４：６８３７−６８４４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、非特許文献２に記載される方法に従い、導電性領域を有する基材に細胞接着阻害性の膜を形成し、導電性領域に負電圧を印加することにより細胞接着阻害性の膜を細胞接着性に改変させることを試みた。しかし、負電圧の印加により細胞接着阻害性の膜を細胞接着性に改変させることは不可能であり、細胞を播種しても細胞を接着させることができないこと、さらに、負電圧印加により導電性領域が黒変してしまい、培養細胞の観察が困難であることを見出した。
【０００９】
本発明は、特定の条件で細胞培養用基板の表面の性質を改変し、細胞ごとに接着させる領域と接着させない領域を制御できる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板の導電性領域に正電圧を印加することにより、細胞接着阻害性の膜を分解でき、細胞接着性に改変できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）導電性領域を有する基材、および導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板の導電性領域に正電圧を印加することにより細胞接着阻害性の膜を剥離する工程、および細胞接着阻害性の膜が剥離された領域上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
（２）導電性領域が、基材表面に酸化インジウム錫の膜が存在する領域である、（１）記載の方法。
（３）細胞接着阻害性の膜が、有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜である、（１）または（２）記載の方法。
（４）有機化合物がアルキレングリコールオリゴマーである、（３）記載の方法。
（５）導電性領域に、１〜１０Ｖの正電圧を印加する、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）正電圧を０．５〜６０分間印加する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）導電性領域を有する基材、および導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板の膜上にタンパク質を固定化してタンパク質層を形成する工程、タンパク質層上で細胞を培養する工程、ならびに導電性領域に正電圧を印加することによりタンパク質層とともに細胞を剥離する工程、を含む細胞培養方法。
（８）導電性領域が、基材表面に酸化インジウム錫の膜が存在する領域である、（７）記載の方法。
（９）細胞接着阻害性の膜が、有機化合物を含む細胞接着阻害性の親水性膜である、（７）または（８）記載の方法。
（１０）有機化合物がアルキレングリコールオリゴマーである、（９）記載の方法。
（１１）導電性領域に、１〜１０Ｖの正電圧を印加する、（７）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）正電圧を０．５〜６０分間印加する、（７）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、特定の条件で細胞培養用基板の表面の性質を改変し、細胞ごとに接着させる領域と接着させない領域を制御することができ、異なる細胞の共培養および相互作用の評価が可能になるとともに、接着させて培養した細胞の回収も実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１の工程を説明する図である。
【図２】基板の導電性領域に正電圧を印加すると、細胞接着阻害性の膜が剥離して細胞接着性の領域となり、細胞が遊走して新たに接着することを示す写真である。
【図３】タンパク質層を形成した基板に正電圧を印加することにより、タンパク質層が剥離したことを示す図である。
【図４】基材表面の酸化インジウム錫の膜（ＩＴＯ膜）に負電圧を印加すると、透明なＩＴＯ膜が黒変することを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一実施形態において、本発明の細胞培養方法は、導電性領域を有する基材、および導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板を用いることを特徴とし、該基板の導電性領域に正電圧を印加することにより細胞接着阻害性の膜を剥離する工程、および細胞接着阻害性の膜が剥離された領域上で細胞を培養する工程を含む。
【００１５】
（基材）
本発明で用いられる基材としては、導電性領域を形成可能な材料からなるものであれば特に制限されない。導電性領域と絶縁性領域を有する基材がより好ましい。導電性領域を、絶縁性領域によって隔てられた複数の独立した領域としてパターン状に形成することにより、特定の領域にのみ正電圧を印加することが可能になり、特定の領域のみを細胞接着性に改変することができる。導電性領域と絶縁性領域を有する基材は、例えば、絶縁性材料からなる基材上に導電性領域を形成することにより作成することができる。また、その表面に有機化合物の被膜を形成することが可能な材料からなるものであることが好ましい。導電性領域はまた、細胞接着性であることが好ましい。
【００１６】
具体的には、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラス、セラミック、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状、ならびに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１〜１０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。
【００１７】
特に、細胞の大きさよりも小さい１ｎｍ〜１０μｍ程度の微細な凹凸が表面に付加された基材を用い、導電性領域や絶縁性領域上の細胞接着性の領域も同様の形状となる場合には、接着した細胞の形状や挙動を制御して、試験を効果的に行うことが可能である。微細な凹凸とは例えば、ラインパターンの場合、深さ１ｎｍ〜１０μｍ、ライン凸部の幅１ｎｍ〜１０μｍ、ライン凹部の幅１ｎｍ〜１０μｍのことを指す。
【００１８】
絶縁性材料からなる基材上に導電性領域を形成する場合、公知のパターニング技術を利用できる。公知のパターニング技術としては、例えば、グラビア印刷法、スクリーン印刷法、オフセット印刷法、フレキソ印刷法およびコンタクトプリンティング法などの各種印刷法による方法、各種リソグラフィー法を用いる方法、ならびにインクジェット法による方法、他に微細な溝を彫刻等する立体整形の手法などが挙げられる。具体的には、絶縁性材料からなる基材、例えばガラス基材に、導電性材料、例えば金属膜または金属酸化物膜を成膜し、これをフォトリソグラフィー技術等の公知の技術を用いてパターニングすることにより、導電性領域と絶縁性領域を形成することができる。
【００１９】
基材上への導電性材料の成膜は、公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。成膜は、塗布により実施してもよい。スピンコートや各種の印刷方式も使用できる。
【００２０】
導電性領域を構成する導電性材料の膜として、金属膜または金属酸化物膜、金属微粒子や金属ナノファイバーが絶縁体に分散された膜、導電性の有機材料からなる膜などが挙げられる。金属酸化物としては、ＩＴＯ（酸化インジウム錫）、ＩＺＯ（酸化インジウム亜鉛）などが挙げられ、金属微粒子としては、銀、金、銅などの微粒子、金属ナノファイバーとしてはカーボンナノチューブ、導電性の有機材料としては、ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）などが挙げられる。
【００２１】
導電性材料の膜としては特に制限されないが、透明な膜であることが好ましく、例えば、ＩＴＯ膜、ＩＺＯ膜、導電性高分子のポリエチレンジオキシチオフェン膜などが挙げられる。本発明においては、ＩＴＯ膜をスパッタリング法により成膜して、その後パターニングすることにより、導電性領域を形成することが好ましい。
【００２２】
導電性材料の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。
【００２３】
上記のような導電性領域のパターニングは、具体的には、成膜した金属膜または金属酸化物膜に、レジスト塗布、フォトマスクを介した露光、現像およびエッチングを行って実施することができる。
【００２４】
導電性領域のパターンの形状は、二次元のパターンであれば特に制限されず、細胞の種類、形成させる組織等によって選択することができる。例えば、ライン状、ツリー状（樹状）、網目状、格子状、円形、四角形のパターン、円形および四角形等の図形の内部がすべて導電性領域または絶縁性領域となっているパターンなどを形成することができる。
【００２５】
（細胞接着阻害性の膜）
細胞接着阻害性の膜は、シランを介して基材の導電性領域に結合されており、好ましくは、有機化合物により形成される細胞接着阻害性の親水性膜である。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する有機化合物、好ましくは炭素酸素結合を有する有機化合物を主原料とする薄膜であり、導電性領域に正電圧が印加される前は細胞接着阻害性を有し、正電圧が印加された後は分解されて剥離するものであれば特に限定されない。
【００２６】
本発明において炭素酸素結合とは、炭素と酸素との間に形成される結合を意味し、単結合に限らず二重結合であってもよい。炭素酸素結合としてはＣ−Ｏ結合、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ結合、Ｃ＝Ｏ結合が挙げられる。
【００２７】
主原料となる有機化合物としては、水溶性高分子、水溶性オリゴマー、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、これらが相互に物理的または化学的に架橋し、基材の導電性領域とシランを介して結合することにより親水性薄膜となる。
【００２８】
具体的な水溶性高分子材料としては、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその誘導体、ポリメタクリル酸およびその誘導体、ポリアクリルアミドおよびその誘導体、ポリビニルアルコールおよびその誘導体、双性イオン型高分子、多糖類、等を挙げることができる。分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。より具体的には、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体、デキストラン、およびヘパリンが挙げられるがこれらには限定されない。
【００２９】
具体的な水溶性オリゴマー材料や水溶性低分子化合物としては、アルキレングリコールオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、メタクリル酸オリゴマーおよびその誘導体、アクリルアミドオリゴマーおよびその誘導体、酢酸ビニルオリゴマーの鹸化物およびその誘導体、双性イオンモノマーからなるオリゴマーおよびその誘導体、アクリル酸およびその誘導体、メタクリル酸およびその誘導体、アクリルアミドおよびその誘導体、双性イオン化合物、水溶性シランカップリング剤、水溶性チオール化合物等を挙げることができる。より具体的には、エチレングリコールオリゴマー、（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）オリゴマー、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンオリゴマー、低分子量デキストラン、低分子量ヘパリン、オリゴエチレングリコールチオール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、２−〔メトキシ（ポリエチレンオキシ）−プロピルトリメトキシシラン、およびトリエチレングリコール−ターミネーティッド−チオールが挙げられるがこれらには限定されない。
【００３０】
細胞接着阻害性の膜は、正電圧印加前は高い細胞接着阻害性を有し、正電圧印加後は剥離されるものであることが望ましい。
【００３１】
細胞接着阻害性の膜の平均厚さは、０．８ｎｍ〜５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ〜１００μｍがより好ましく、１ｎｍ〜１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ〜１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、基板表面の膜で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。
【００３２】
細胞接着阻害性の膜は、結合層としてのシランを介して基材表面に結合される。好ましい方法としては、基材上に結合層としてのシランの層を形成し、次いで有機化合物をコーティングする方法を挙げることができる。基材の導電性領域上にシランを介して結合させた細胞接着阻害性の膜は、導電性領域への正電圧の印加により分解除去することが可能であり、基材表面の性質を改変することができる。シランを介した結合は、導電性領域を有する基材を、有機化合物が有する官能基と共有結合可能な官能基を有するシランカップリング剤でコーティングし、さらに有機化合物でコーティングすることにより形成することができる。共有結合可能な官能基の組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ−ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。好ましくは、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤（エポキシシラン）で基材をコーティングすることによりシランの層を形成し、次に酸触媒存在下アルキレングリコール系材料（ポリアルキレングリコール、アルキレングリコールオリゴマー、およびその誘導体を含む）、好ましくはエチレングリコール系材料（好ましくはトリエチレングリコール）等でコーティングする。
【００３３】
有機化合物を含む細胞接着阻害性の膜を形成する前のシラン層の表面の水接触角は、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°〜４３°、望ましくは１５°〜４０°とすることが好ましい。
【００３４】
（細胞接着阻害性膜の剥離）
本発明では、導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板の導電性領域に正電圧を印加することにより細胞接着阻害性の膜を剥離して細胞接着性の領域とする。
【００３５】
本発明において細胞接着性とは、細胞が接着すること、または細胞が接着しやすいことを意味する。細胞接着阻害性とは、細胞が接着しにくいこと、または細胞が接着しないことを意味する。したがって、細胞接着性領域と細胞接着阻害性領域とがパターン化された基板上に細胞を播くと、細胞接着性領域には細胞が接着するが、細胞接着阻害性領域には細胞が接着しないため、基板表面には細胞がパターン状に配列されることになる。
【００３６】
細胞接着性は、接着しようとする細胞によって異なる場合もあるため、細胞接着性とは、ある種の細胞に対して細胞接着性であることを意味する。したがって、細胞培養用の基板には、複数種の細胞に対する複数の細胞接着性領域が存在する場合、すなわち細胞接着性が異なる細胞接着性領域が２水準以上存在する場合もある。細胞接着阻害性についても同様である。
【００３７】
本発明者らは、導電性領域に正電圧を印加することにより、シランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を分解でき、細胞接着性に改変できることを見出した。ここで、分解とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。本発明では、導電性領域に正電圧を印加することにより、シランと有機化合物との結合が切断され、それによって細胞接着阻害性の膜を構成する有機化合物の少なくとも一部が分解または除去されるものと考えられる。
【００３８】
基材上にシランを介して結合された有機化合物の密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。したがって、細胞接着阻害性の膜を剥離することには、高密度の有機化合物を含む膜を、細胞が接着できる程度に低い密度の有機化合物を含む膜に改変することが含まれる。
【００３９】
細胞接着阻害性の膜および細胞接着性の膜の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。膜における有機化合物の密度が高いほど、好ましくは炭素量が多いほど細胞は接着しにくくなることから、細胞接着性および細胞接着阻害性を炭素量を測定することにより評価できる。したがって、Ｘ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）を好ましく用いることができる。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）で算出される。具体的な測定は、特開２００７−３１２７３６に記載されるとおりに実施できる。
【００４０】
導電性領域に印加する正電圧は、通常１〜１０Ｖ、好ましくは２〜５Ｖであり、正電圧を印加する時間は、通常０．５〜６０分間、好ましくは１〜１０分間である。
【００４１】
本発明者らは、透明なＩＴＯの導電性領域に負電圧を印加すると黒変して細胞の観察が難しくなること、一方、上記のような条件で正電圧を印加してもＩＴＯは透明なままであり、細胞観察を良好に実施できることを見出した。また、細胞接着阻害性の膜が結合した導電性領域に負電圧を印加しても膜を剥離できないのに対し、正電圧を印加すれば膜を剥離できることを見出した。
【００４２】
（細胞）
本発明において培養の対象となる細胞は、血球系細胞やリンパ系細胞などの浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、本発明は、接着性を有する細胞に対して好適に使用される。また遊走する性質を有する細胞に対して好適に使用される。そのような細胞としては、例えば、肝がん細胞、グリオーマ細胞、結腸癌細胞、腎がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、大腸がん細胞、乳癌細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞などのがん細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞などの内皮細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞などの表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞などの上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞などの筋細胞、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞などの神経細胞、軟骨細胞、骨細胞などが挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらにこれら細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞などの多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞などの単能性幹細胞、分化が終了した細胞の何れであってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし二種以上の細胞を共培養してもよい。
【００４３】
目的の細胞を含む培養試料は、予め、生体組織を細かくして液体中に分散させる分散処理や、生体組織中の目的の細胞以外の細胞その他細胞破片等の不純物質を除去する分離処理などを行っておくことが好ましい。
【００４４】
基板への細胞の播種に先だって、目的とする細胞を含む培養試料を、予め、各種の培養方法で予備培養して、目的とする細胞を増やすことが好ましい。予備培養には、単層培養、コートディシュ培養、ゲル上培養などの通常の培養方法が採用できる。予備培養において、細胞を支持体表面に接着させて培養する方法の一つに、いわゆる単層培養法として既に知られている手段がある。具体的には、例えば、培養容器に培養試料と培養液を収容して一定の環境条件に維持しておくことにより、特定の生細胞のみが、培養容器などの支持体表面に接着した状態で増殖する。使用する装置や処理条件などは、通常の単層培養法などに準じて行う。細胞が接着して増殖する支持体表面の材料として、ポリリシン、ポリエチレンイミン、コラーゲンおよびゼラチン等の細胞の接着や増殖が良好に行われる材料を選択したり、ガラスシャーレ、プラスチックシャーレ、スライドガラス、カバーガラス、プラスチックシートおよびプラスチックフィルム等の支持体表面に、細胞の接着や増殖が良好に行われる化学物質、いわゆる細胞接着因子を塗布しておくことも行われる。
【００４５】
予備培養後に、培養容器中の培養液を除去することで、培養試料中の支持体表面に接着しない塊状や線維状の不純物等の不要成分が除去され、支持体表面に接着した生細胞のみを回収できる。支持体表面に接着した生細胞の回収には、ＥＤＴＡ−トリプシン処理などの手段が適用できる。
【００４６】
上記のように予備培養した細胞を、培養液中の基板上に播種する。細胞の播種方法や播種量については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。細胞を細胞培養用基板上で増殖させる必要がない程度に十分な量で、細胞が単層で接着するように播種することが好ましい。通常、培養液１ｍｌ当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましく、また、基板１ｃｍ２当り１０４〜１０６個のオーダーで細胞が含まれるように播種するのが好ましい。細胞が凝集すると細胞の組織化が阻害され、対象材料に転写して培養しても機能が低下するからである。具体的には、４００ｍｍ２あたり２×１０５個程度で播種する。
【００４７】
細胞を播種した基板を培養液中で培養することにより、細胞接着性に改変された領域に細胞を接着させることが好ましい。培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。
【００４８】
細胞を培養する時間は、培養時の細胞操作の有無などに左右されるが、通常６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間である。培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。培養した後、基板を洗浄することにより、接着していない細胞が洗い流され、細胞接着性の領域にのみ細胞を接着させることができる。
【００４９】
本発明では、導電性領域を、絶縁性領域によって隔てられた複数の独立した領域として形成することにより、特定の領域にのみ正電圧を印加してその領域のみを細胞接着性に改変することができる。細胞を播種すると、その領域のみに細胞を接着させて培養することができ、特定の細胞を接着させて培養する領域を制御することができる。次に別の導電性領域に正電圧を印加すれば、今度はその別の領域に細胞を接着させて培養することができる。したがって、本発明によれば、単一の基板上において、異なる領域に２種以上の細胞を接着させて同時に培養することができる。単一の基板上の異なる領域において２種以上の細胞を共培養することにより、細胞の相互作用を評価することもできる。
【００５０】
（タンパク質層の形成）
一実施形態において、本発明の細胞培養方法は、導電性領域を有する基材、および導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板を用いることを特徴とし、該膜上にタンパク質を固定化してタンパク質層を形成する工程、タンパク質層上で細胞を培養する工程、ならびに導電性領域に正電圧を印加することによりタンパク質層とともに細胞を剥離する工程を含む。
【００５１】
導電性領域を有する基材、導電性領域にシランを介して結合された細胞接着阻害性の膜を含む基板、導電性領域への正電圧の印加、用いる細胞等については、上記の細胞培養方法と同様である。
【００５２】
本実施形態は、細胞接着阻害性の膜上にタンパク質、好ましくは細胞接着性のタンパク質を固定化してタンパク質層を形成し、タンパク質層上で細胞を培養するものであり、正電圧の印加によりシラン層と細胞接着阻害性膜を構成する有機化合物との結合が切断され、それによって有機化合物の少なくとも一部が剥離・除去されることを利用して、タンパク質層とともに細胞を剥離することを特徴とする。正電圧の印加により基板表面の性質が改変される点において、上記の細胞培養方法と同様である。
【００５３】
タンパク質は、細胞接着阻害性の膜に固定可能であって、タンパク質層上で細胞を培養可能なものであれば特に制限されないが、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ニドジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド因子、オステオポンチン、フィブリノーゲンなどの細胞接着性タンパク質などが挙げられる。
【００５４】
本実施形態によれば、タンパク質層に接着させて細胞を培養し、所望の組織を形成させた後、導電性領域に正電圧を印加してタンパク質層とともに細胞を剥離することが可能であり、組織化した細胞も簡便に回収することができる。トリプシンのようなタンパク質分解酵素や化学薬品で処理する場合のように、処理工程が煩雑ではなく、またコンタミネーションの可能性も低い。また、細胞が変性若しくは損傷し、細胞本来の機能が損なわれるという問題も回避することができる。
【００５５】
また、基材表面に微細な凹凸が形成されていると、凹凸のパターン形状によって様々な効果が得られる。具体的には、細胞の剥離を短時間で効率的に行えたり、凹凸パターンに沿って細胞を配向させて、配向した組織を回収することができる場合がある。特開2008-011766で記載されているように、微細な凹凸が形成された基材を用いることで、細胞シート形成速度が速く、形成された細胞シートの剥離が容易であることが知られている。
【００５６】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
１．電極基材の作製
１０ｃｍ角の無アルカリガラス上に酸化インジウム錫（ＩＴＯ）を１５０ｎｍにスパッタ製膜し、レジスト塗布、フォトマスクを介した露光、現像、エッチングを経て、線幅１００μｍの櫛型ＩＴＯ電極を有する基材を準備した（図１（１））。図１（１）ａは、ＩＴＯ膜からなる導電性領域を示す。
【００５８】
２．細胞培養用基板の作製
（一段階目の反応）
トルエン３９．０ｇおよびエポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）７５０μｌの混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。ＵＶ洗浄したＩＴＯ基材を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、１９時間室温で振盪した。その後、下地処理されたＩＴＯ基材をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。
【００５９】
（二段階目の反応）
テトラエチレングリコール１５ｇを攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシシラン処理された基材を上記のテトラエチレングリコールに浸漬し、８０℃で６０分間反応させた。反応後、基材をよく水洗いし、次いで乾燥した。これにより親水性薄膜が形成された基板が得られた（図１（２））。
【００６０】
（酸化処理）
表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、２５０μｍ角の開口部が５００μｍピッチで形成されたスクウェアパターンで、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチサイズのものを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。照度は２５ｍＷ／ｃｍ２であった。親水性薄膜が形成されたＩＴＯ基板と上記触媒付き石英板を、親水性薄膜とフォトマスクの光触媒層が対向するように、且つＩＴＯ基板の櫛型導電性領域の櫛歯部とフォトマスクのスクエアパターンが直交するように設置し、フォトマスクの裏面側から光が照射されるよう露光機内に設置した。１２０秒間露光し、酸化処理を行い、親水性薄膜を部分的に分解した（図１（３）ｂ）。その後、培養に使いやすいように、２５ｍｍ角に切断した。
【００６１】
３．細胞培養
上記のように切断した基板をエチレンオキサイドガスで滅菌した。この基板に滅菌済みφ８ｍｍのクローニングリングを設置し、その中に５ｘ１０４個のマウス繊維芽細胞を播種した。１０％血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度のインキュベータ内で２４時間培養した。位相差顕微鏡で観察したところ、細胞は酸化処理により親水性薄膜が分解された部分にのみコンフルエントの状態で接着していた（図１（４）ｃ）。
【００６２】
４．電圧印加
上記櫛型ＩＴＯを回路に接続し、＋２Ｖの電圧を２分間印加した（図１（Ａ））。正の電圧が印加された電極上のみで、時間経過とともに親水性薄膜が剥離し（図１（５）ｄ）、それまでフォトマスクのスクエアパターン通りに接着していた細胞が、パターンを崩しながら遊走していく様が観察された（図１（６）および図２）。７．５時間後には、１００μｍ幅の電極上を１００μｍほど細胞が遊走して接着していることが確認できた。
【００６３】
（実施例２）
本実施例は、ガラス表面にエポキシ基を導入する工程、前記エポキシ基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合させる工程、前記ＰＥＧの自由末端に存在するヒドロキシル基に無水コハク酸を反応させ、カルボキシル基を形成する工程、前記カルボキシル基を活性エステルに変換する工程、活性エステルにタンパク質を反応させる工程、未反応の活性エステルをエタノールアミンによって不活性化する工程、からなる。以下、具体的な手順を説明する。
【００６４】
１．電極基材の作製
１０ｃｍ角の無アルカリガラス上に酸化インジウム錫（ＩＴＯ）を１５０ｎｍにスパッタ製膜し、レジスト塗布、フォトマスクを介した露光、現像、エッチングを経て、図３（１）に示すパターンのＩＴＯ膜の導電性領域を有する基材を準備した。（図３（１））。図３（１）ａは、ＩＴＯ膜からなる導電性領域を示す。
【００６５】
２．親水性薄膜の形成
トルエン３９．０ｇおよびエポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）７５０μｌの混合液を攪拌しながら触媒量のトリエチルアミンを加え、さらに室温で数分間攪拌した。ＵＶ洗浄したＩＴＯ基材を、上記のエポキシシラン溶液に浸漬し、１９時間室温で振盪した。その後、下地処理されたＩＴＯ基材をエタノールで洗浄し、次いで水洗し、乾燥した。
【００６６】
１５ｇのＰＥＧ４０００(関東化学)を攪拌しながら、触媒量の濃硫酸をゆっくり添加し、さらに室温で数分間攪拌した。上記のエポキシシラン処理された基材を上記のＰＥＧに浸漬し、８０℃で６０分間反応させた。反応後、基材をよく水洗いし、次いで乾燥した。これにより前記エポキシ基にＰＥＧが反応し、共有結合が形成された。
【００６７】
３．アミン反応性活性基の付与
次に、５０ｍｇの無水コハク酸（ＳｕＡ、関東化学）と６０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、和光純薬）を４３ｇのトルエンに溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって開環ハーフエステル化反応が進行してＰＥＧの自由末端にカルボキシル基が導入された。次に、５８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、和光純薬）と７８μｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純薬）を４３ｇのトルエンに溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってＰＥＧの自由末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）が導入された。
【００６８】
４．タンパク質層の形成
まず、５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＢＳＡ溶液（ＰＢＳとグリセロールの１：１混合溶液）を基板と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって基板表面の活性エステルとＨＲＰが反応し、基板表面にＦＩＴＣ−ＢＳＡが固定化された。次に、前記基板表面を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下洗浄バッファーとする）で３回洗浄した後、５０ｍＭエタノールアミン（ＥＡ）と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって、未反応の活性エステルがほぼ完全に不活性化された。洗浄バッファーで３回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いてＦＩＴＣの蛍光を観察した（図３（２））。
【００６９】
５．電圧印加
ＩＴＯの導電性領域を回路に接続し、＋３Ｖの電圧を３０秒間印加した。正の電圧が印加された電極上のみで、時間経過とともにＦＩＴＣの蛍光消失が確認され、タンパク質層が剥離していることが示唆された（図３（３）ｂ）。
【００７０】
（比較例）
１０ｃｍ角の無アルカリガラス上に酸化インジウム錫（ＩＴＯ）を１５０ｎｍにスパッタ製膜した。左半分にのみ負電圧を印加した（−３Ｖ、２分間）。その結果、当初透明であったＩＴＯ膜が黒変することが確認された（図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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