(57)【要約】      （修正有）【課題】生体高分子の検出及び／又は同定方法における、このような問題点を解決し、迅速・簡便かつ安価であって、更に、容易にハイスループット化することができ多検体処理を可能とする検出技術を提供すること。【解決手段】以下の工程を含む、検体中の標的生体高分子を検出及び／又は同定するための方法：（１）標的生体高分子より分子量が小さく該標的生体高分子と特異的に結合するプローブを検体に含まれる該標的生体高分子と特異的に反応させて複合体を形成する工程、（２）分子量分画手段によって該複合体を該プローブから分離する工程、（３）分離された該複合体を回収する工程、及び（４）回収された該複合体に含まれる該プローブを検出する工程。【選択図】図１
2011135799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、検体中の標的生体高分子を検出及び／又は同定するための方法：
（１）標的生体高分子より分子量が小さく該標的生体高分子と特異的に結合するプローブを検体に含まれる該標的生体高分子と特異的に反応させて複合体を形成する工程、
（２）分子量分画手段によって該複合体を該プローブから分離する工程、
（３）分離された該複合体を回収する工程、及び
（４）回収された該複合体に含まれる該プローブを検出する工程。
【請求項２】
工程（３）における分離が、該標的生体高分子、該プローブ、及び、該複合体を含む反応液を分子量分画手段である分子量分画膜に透過させ、該標的生体高分子及び該複合体の少なくとも一部を該分子量分画膜上に捕捉することによって行なわれる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分子量分画膜の分画分子量が少なくとも５０，０００ＭＷである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
標的生体高分子がポリヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡがＰＣＲ産物である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
プローブの分子量が３，０００〜２０，０００である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
プローブが塩基長１０〜５０ｂｐのオリゴヌクレオチドである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
プローブが標識されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
プローブが蛍光物質によって標識される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施する為に使用するキットであって、標的生体高分子より分子量が小さく該標的生体高分子と特異的に結合するプローブ、及び、分子量分画手段を含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸（ポリヌクレオチド）及び蛋白質等の生体高分子を検出及び／又は同定するための方法、特に、分子量分画の原理を利用して、該生体高分子と特異的に結合するプローブとの標的核酸の分子量の違いにより検体中の核酸を迅速かつ簡便に、特異的に検出及び／又は同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体高分子の検出及び／又は同定は、医学界や産業界等で重要な技術であり、安価で迅速かつ簡便な技術の確立が求められている。核酸の場合、塩基配列解読を行い微生物の検出や同定も行われるが通常２日程度を要する。
【０００３】
この他に、標的微生物又は遺伝子マーカーに特異的なプローブやプライマーを用いて、PCR やreal-time PCRにより増幅の有無や増幅量、増幅産物分子量の違いなどから微生物を検出・同定・定量する方法が記載されている（非特許文献１、非特許文献２）。又、PCRを介さず迅速・簡便な方法として、rRNAとプローブを交雑させ、そこにRNaseHを添加することで、RNAを配列特異的に切断し、微生物を特異的に検出・同定・定量するRNaseH配列特異的切断法（非特許文献３及び特許文献１）がある。
【０００４】
更に、特許文献２には、結合性核酸と非結合性核酸を含む溶液に、結合性核酸と複合体を形成可能であって、且つ、核酸よりも高分子となるような複合体を形成するような物質（具体的には、β−1,3−グルカン）を加えて高分子複合体を形成させ、結合性核酸複合体を分子量分画フィルターで分離する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2005-065535号公報
【特許文献２】特開2005-112828号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Song et al.,, FEMS Lett, vol. 187, 167-173, (2000)
【非特許文献２】Fanget al., JCM, vol. 40, No. 1, 287-291 (2002)
【非特許文献３】Uyenoet al., AEM, vol. 70, No. 6, 3650-3663 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
PCRを用いる上記の従来方法は感度が高いが、２種類以上のプライマー又はプローブを用いるため実験条件の設定に多大な労力が必要である。更に、PCRバイアス（増幅効率が一定でないこと等に基因する）により定量結果が試料中の存在量と一致しないことが知られている。
【０００８】
又、従来のRNaseH配列特異的切断法は外部標準を必要とせず、迅速・簡便であるが、一塩基ミスマッチを識別することが出来ないため、プローブ設計の条件が非常に厳しいものとなる。またrRNA以外の核酸を標的とすることは難しい、という問題点があった。
【０００９】
本発明は、従来の生体高分子の検出及び／又は同定方法における、このような問題点を解決し、迅速・簡便かつ安価であって、更に、容易にハイスループット化することができ多検体処理を可能とする検出技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決すべく研究の結果、核酸及び蛋白質等の生体高分子と該生体高分子を標的として特異的に結合するプローブとの分子量の違いに基づき、分子量分画手段を用いることによって検体中の生体高分子を迅速かつ簡便に検出及び／又は同定することが出来ることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
即ち、本発明は以下に示す各態様に係るものである。
［態様１］
以下の工程を含む、検体中の標的生体高分子を検出及び／又は同定するための方法：
（１）標的生体高分子より分子量が小さく該標的生体高分子と特異的に結合するプローブを検体に含まれる該標的生体高分子と特異的に反応させて複合体を形成する工程、
（２）分子量分画手段によって該複合体を該プローブから分離する工程、
（３）分離された該複合体を回収する工程、及び
（４）回収された該複合体に含まれる該プローブを検出する工程。
［態様２］
工程（３）における分離が、該標的生体高分子、該プローブ、及び、該複合体を含む反応液を分子量分画手段である分子量分画膜に透過させ、該標的生体高分子及び該複合体の少なくとも一部を該分子量分画膜上に捕捉することによって行なわれる、態様１記載の方法。
［態様３］
分子量分画膜の分画分子量が少なくとも５０，０００ＭＷである、態様２記載の方法。
［態様４］
標的生体高分子がポリヌクレオチドである、態様１〜３のいずれか一項に記載の方法。
［態様５］
ポリヌクレオチドがＤＮＡ又はＲＮＡである、態様４記載の方法。
［態様６］
ＤＮＡがＰＣＲ産物である、態様５記載の方法。
［態様７］
プローブの分子量が３，０００〜２０，０００である、態様１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［態様８］
プローブが塩基長１０〜５０ｂｐのオリゴヌクレオチドである、態様７記載の方法。
［態様９］
プローブが標識されている、態様１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［態様１０］
プローブが蛍光物質によって標識される、態様９記載の方法。
［態様１１］
態様１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施する為に使用するキットであって、標的生体高分子より分子量が小さく該標的生体高分子と特異的に結合するプローブ、及び、分子量分画手段を含む前記キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明方法によれば、１時間程度の極めて短時間で標的生体高分子の検出及び／又は同定が可能となる。更に、安価な分子量分画手段である分子量分画膜等を使用することによって検出に要するコストも他の検出技術に比べて非常に低くすることが出来る。更に、容易にハイスループット化することができるので多検体処理が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明方法の一例の概略を示す。
【図２】分子量分画膜を用いる本発明方法を示す。
【図３】実施例３において、アプライした16S rRNA遺伝子サンプル (PCR産物) 別のキャピラリー電気泳動の結果を示す。
【図４】実施例４において、アプライした16S rRNAサンプル (人工合成RNA) 別にキャピラリー電気泳動した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る検体中の標的生体高分子を検出及び／又は同定するための方法は以下の工程を含む。
（１）標的生体高分子より分子量が小さく該標的生体高分子と特異的に結合するプローブを検体に含まれる該標的生体高分子と特異的に反応させて複合体を形成する工程、
（２）分子量分画手段によって該複合体を該プローブから分離する工程、
（３）分離された該複合体を回収する工程、及び
（４）回収された該複合体に含まれる該プローブを検出する工程。
【００１５】
本明細書において、検出及び／又は同定の対象となる「生体高分子」の構造に特に制限はなく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの各種修飾体等の各種ポリヌクレオチド（核酸）、蛋白質（ポリペプチド）、リポ蛋白質、糖蛋白質、糖脂質、多糖、及びそれらの複合体等を挙げることが出来る。従って、生体高分子の分子量に特に制限はなく、例えば、十数万〜数百万の範囲をとり得る。尚、検出は定性的、半定量的、及び定量的測定として行なうことが可能である。
【００１６】
又、生体高分子はヒト、動物、植物、微生物及びウィルス等の広義の生物に元来含まれる由来の物質に加えて、例えば、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ等の遺伝子工学的手段及び化学合成等で人工的に調製された物質も含む。
【００１７】
「検体」とは、このような検出及び／又は同定の対象となる生体高分子を含む任意の試料を意味し、例えば、各種生物種から採取された血液及び尿等の各種体液又は抽出物、並びに、土壌、河川水及び海水等の自然環境から採取された微生物を含む各種試料、更には人工的に調製された生体高分子を含む試料等を意味する。
【００１８】
本発明方法の工程（２）で使用する分子量分画手段としては、分子量の相違に基づき該複合体と該プローブとを有効に分離することができる限り当業者に公知の任意の適当なものを使用することが出来る。即ち、標的生体高分子及び／又はそれとプローブとの複合体の少なくとも一部、好ましくは５０％程度以上、より好ましくは９５％以上がプローブとは異なる別の画分（例えば、「Ｂ／Ｆ分離におけるＢ（Bound）画分」）として分離されるようにすることが望ましい。
【００１９】
分子量分画手段の代表例として、限外濾過膜等の各種分子量分画膜等を挙げることが出来る。分子量分画膜の分画分子量は、検出及び／又は同定の対象となる生体高分子の種類及び大きさ、プローブの種類及び大きさ、並びに、分離等の操作条件等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。通常、５０，０００ＭＷ程度以上が好適である。
【００２０】
一方、プローブ、標的生体高分子の種類及び大きさ等に応じて、それと特異的に反応するような化合物を当業者が適宜選択することが出来、その種類及び構造に特に制限はない。標的生体高分子がポリゴヌクレオチドの場合にはオリゴヌクレオチドからなるプローブが好適である。又、標的生体高分子が蛋白質の場合にもオリゴヌクレオチドからなるプローブを「アプタマー」として使用することが出来る。
【００２１】
標的生体高分子又は該標的生体高分子と該プローブとの複合体から分子量の相違に基づきプローブが分離可能であるように、プローブはそれらに対して有意に小さな分子量を有する。例えば、プローブの分子量は通常、３，０００〜２０，０００程度であることが好ましい。又、プローブがオリゴヌクレオチドである場合には、通常、１０〜５０ｂｐ程度の塩基長であることが好ましい。
【００２２】
本発明の効果を十分に奏効する為には、分子量分画手段及びプローブの分子量を適当に組み合わせて選択することによって、好ましくは該プローブの９０％以上、より好ましくは９９．５％以上が標的生体高分子と該プローブとの複合体とは別の画分（例えば、「Ｂ／Ｆ分離におけるＦ（Free）画分」）として分離されるようにすることが望ましい。
【００２３】
例えば、ミリポア社のマイクロコンYM-100を分子量分画手段として使用する場合、該膜は分子量１万程の物質を１%しか回収できないのに対し、分子量１５万程の物質は約９５%以上の回収が可能である(ミリポア社公開データ)。そこで、例えば、標的生体高分子として16S rRNA（分子量約５０万）を検出したい場合、まず２０塩基程度の蛍光標識遺伝子プローブ（分子量約7,000）を使用することが好ましい。溶液中で該RNAにプローブを反応（交雑・ハイブリダイズ）させた後、分子量分画膜の一種であるマイクロコンYM-100にアプライする。該プローブの殆どはYM-100を透過するので、YM-100では殆ど回収されないのに対し、RNAは分子量がYM-100の分画分子量より大きいためにその多くが回収可能であり、その結果、該RNAと交雑したプローブは該RNAと結合して複合体を形成しているため分子量分画膜上にRNAと共にトラップ（捕捉）される。
【００２４】
該複合体に含まれる該プローブを検出する為に、プローブは当業者に公知の任意の物質によって標識されていることが好ましい。このような標識物質として、３２Ｐ等の放射標識、Cy2, Cy3及びCy5のようなシアニン類、フルオレセイン（FITC）並びにテトラメチルローダミン（TRITC）のようなローダミン系色素に代表される蛍光物質、並びに、化学発光物質等を上げることが出来る。尚、プローブの標識は当業者に公知の任意の方法で行なうことが出来る。
【００２５】
工程（３）における分離された該複合体の回収、及び、工程（４）における回収された該複合体に含まれるプローブの検出は、標的生体高分子、プローブ及び分子量分画手段等の修理・性質等に応じて当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。
【００２６】
本発明方法の特徴は、標的生体高分子の分子量と該プローブの分子量の相違に基づき、分子量分画によってそれらを迅速かつ簡便に分離することである。本発明方法の一例の概略を図１に示す。更に、より具体的な例として分子量分画膜を用いる本発明方法（図２）を以下に概説する。
【００２７】
工程（１）：
工程（１）を実施するに先立ち、検体の種類等に応じて、粉砕、破砕、溶解及び抽出操作等の当業者に公知の適当な前処理を適宜実施することによって標的生体高分子を含む検体を以降の反応に適した形態、例えば、標的生体高分子を含む溶液として調製することが出来る。同様に、使用するプローブも、通常、適当な緩衝液等を用いて適当な濃度の溶液として調製することが好ましい。
【００２８】
標的生体高分子とプローブとの特異的な反応の形式に特に制限はなく、それらの構造及び性質等に応じて様々な反応様式をとることが可能である。例えば、標的生体高分子がポリヌクレオチドであり、プローブがオリゴヌクレオチドである場合には、交雑（ハイブリダイズ）反応と呼ばれる反応によって、それらの間に特異的な結合が生じる。
上記の特異的反応は、標的生体高分子とプローブの種類及び量、並びに反応系の種類等に応じて、適当な温度及び時間等の反応条件下で実施することが出来る。例えば、ハイブリダイズ反応の場合は、通常、３０〜６０℃、２〜１０分程度反応させることが好ましい。
【００２９】
工程（２）：
標的生体高分子とプローブとの複合体をプローブから分離するには、例えば、工程（１）で反応が終了した反応液を分子量分画膜上にかけて、適当な条件、例えば遠心分離処理あるいは吸引濾過等により反応液を透過させ、更に、必要に応じて、該分子量分画膜上に適当な洗浄液を滴下して、適当な条件、例えば遠心分離処理あるいは吸引濾過等により洗浄液を透過させることで膜を洗浄することによって、Ｂ／Ｆ分離に基づき、標的生体高分子とプローブとの複合体をプローブから有効に分離することが出来る。
【００３０】
工程（３）：
工程（２）で処理した分子量分画膜を、例えば、適当な条件下で逆遠心処理することによって、該分子量分画膜上に捕捉された該複合体を適当な溶液として回収することが出来る。
【００３１】
工程（４）：
工程（３）で回収された該複合体に含まれる該プローブは、その性質、例えば、標識物質の特性等に応じて、蛍光分光光度計等の当業者に公知の任意の適当な検出装置・手段を用いることによって容易に検出することが出来る。尚、検出に先立ち、該複合体を電気泳動等の適当な分離手段によって分離した後、検出することも可能である。
【００３２】
上記の本発明方法を実施する為に使用するキットは、標的生体高分子より分子量が小さく該標的生体高分子と特異的に結合するプローブ、及び、分子量分画手段を含む。更に、その使用目的等に応じて、例えば、当業者に公知の任意の適当なプローブ検出装置・手段、緩衝液、バイアル、及び、その他の必要なその他の物質・器具・装置類を適宜含むことが出来る。
【００３３】
以下に実施例を参照して本発明を具体的に説明するが、これらは単に本発明の説明のために提供されているものである。従って、これらの実施例は、本願で開示する発明の範囲を限定し、又は制限するものではない。本発明では、特許請求の範囲の請求項に記載された技術的思想に基づく様々な実施形態が可能であることは当業者には容易に理解される。
【実施例１】
【００３４】
１．使用する分子量分画膜によるオリゴヌクレオチドプローブの透過性能評価
１．１．実験概要
塩基長の異なる蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブを分子量分画膜（YMシリーズ）に滴下し、14,000gで遠心分離を行った後、分子量分画膜を反転させ、逆遠心することで分子量分画膜上にトラップされたプローブを回収した。
【００３５】
１．２．実験方法
１．２．１実験手順
・蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（表１）を約1000fmol/μL（1000nM）に調整した。
・分子量分画膜（YMシリーズ）上にプローブ溶液を100μL滴下し、分子量分画膜ユニットを14,000×gで遠心分離した（YM-3: 20min, YM-10: 6min, YM-30,50,100: 3min）。
・ろ液を捨て，Milli Qを500μL分子量分画膜上に滴下し、14,000×gで遠心分離した（YM-10: 30min, YM-30,50,100: 12min）（洗浄）。
・分子量分画膜を反転させ、Milli Qを10μL滴下し、1,000×gで遠心分離した（3min）（逆遠心分離。）
【００３６】
１．２．２測定および評価方法
約1000nMに調整した蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ溶液および逆遠心分離後に回収された溶液について蛍光スペクトロメータ（NanoDrop ND-3300）により測定した。ND-3300の検出感度はサンプルを2μL使用した場合に5fmol（2.5nM）であり、検出範囲は2.5〜3000nMである。
プローブ溶液100μLが分子量分画膜を通過し、分子量分画膜上に残るプローブが逆遠心分離後の溶液10μLに回収されて10倍に濃縮されると仮定し、プローブの分子量分画膜透過率（％）を次式で評価した。
【００３７】
【数１】
2011135799.tif 000003
【００３８】
【表１】
2011135799.tif 000004
【００３９】
１．３．結果のまとめ
表２に分子量分画膜（YMシリーズ）における塩基長別オリゴヌクレオチドプローブの分子量分画膜（YMシリーズ）透過率をまとめた。分子量分画膜YM-100において、塩基長がそれぞれ10，18，25のプローブの透過率は99.5%以上であった。
また、1000nMのEco327-18を用いて、溶液中に0〜1,000mMのNaCl、0〜6Mのureaを含んだ系でも同様に99.5%以上の透過率を得た。
【００４０】
【表２】
2011135799.tif 000005
【実施例２】
【００４１】
２．PCR産物あるいは人工合成RNAのYM-100透過性能評価
２．１．実験概要
塩基長の異なるPCR産物あるいは人工合成RNAを分子量分画膜（YM-100）に滴下し、3,000gで遠心分離を行った後、分子量分画膜を反転させ、逆遠心することで分子量分画膜上にトラップされたPCR産物あるいは人工合成RNAを回収した。
【００４２】
２．２．実験方法
２．２．１実験手順（PCR産物）
1) E. coli K12より抽出したゲノムDNAを鋳型DNAに、16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーセット（表３）を用いて塩基長の異なるPCR産物を得た。
2) 分子量分画膜（YM-100）上に適切な濃度（0.15ng/μL程度）に希釈したPCR産物を100μL滴下し、500×gで遠心分離した（10min）。
3) ろ液を捨て、Milli Qを500μL分子量分画膜上に滴下し、500×gで遠心分離した（46min）。
4) 分子量分画膜を反転させ、Milli Qを10μL滴下し，1,000×gで遠心分離した（3min）（逆遠心分離）。
【００４３】
２．２．２実験手順（人工合成RNA）
1) T7プロモーター(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’)をforward primerの5’末端に付加したprimerを用いて２．２．１と同様に塩基長の異なるPCR産物を得た。
2) T7由来のRNAポリメラーゼによりRNAを合成（転写反応）し、塩基長の異なる人工合成RNAを得た。
3) 分子量分画膜（YM-100）上に適切な濃度（0.5ng/μL程度）に希釈した人工合成RNAを100μL滴下し，500×gで遠心分離した（10min）。
以下は２．２．１の3), 4)と同様。
【００４４】
【表３】
2011135799.tif 000006
【００４５】
２．３測定および評価方法
適切な濃度（0.1-0.2ng/μL）に希釈したPCR産物あるいは人工合成RNAおよびそれぞれの逆遠心後に回収された溶液について、高感度核酸染色剤（PCR産物の場合：Sybr（商標） Green I，人工合成RNAの場合：RiboGreen（商標））を用いて染色し、蛍光スペクトロメータ（NanoDrop ND-3300）により測定した。ND-3300の検出範囲は，Sybr（商標） Green Iの場合0.002-2ng/μL，RiboGreen（商標）の場合0.02-2ng/μLである。
PCR産物あるいは人工合成RNA溶液100μLが分子量分画膜上に残り、逆遠心分離後の溶液10μLに回収されて10倍に濃縮されると仮定し、PCR産物あるいは人工合成RNAの分子量分画膜透過率（％）を次式で評価した。
【００４６】
【数２】
2011135799.tif 000007
【００４７】
２．４  結果のまとめ
表４に分子量分画膜（YM-100）における塩基長別PCR産物あるいは人工合成RNAの分子量概算値および分子量分画膜回収率をまとめた（回収率50%を基準とし評価）。尚、YM-100における公称分子分画量は100,000MWである。
塩基長の異なる全てのPCR産物あるいは人工合成RNAの５０％以上が分子量分画膜上にトラップされ、回収できることを確認した。
【００４８】
【表４】
2011135799.tif 000008
【実施例３】
【００４９】
３．Eco327-18-D3プローブを用いたEscherichia coliの16S rRNA遺伝子の検出
３．１．実験概要
Escherichia coliあるいはMethanococcus maripaludisのほぼ全長の16S rRNA遺伝子（約1500塩基）とE. coliの16S rRNAに特異的な蛍光標識プローブ（Eco327-18-D3）（Eco327-18を蛍光物質（Beckman Dye3）で標識したプローブ）を液中で交雑させ、分子量分画膜（YM-100）にアプライし、プローブの余剰分を遠心分離により除去した。その後、YM-100上に残ったE. coliの16S rRNA遺伝子に特異的に交雑したプローブをキャピラリー電気泳動（CEQ8000）により検出した。
【００５０】
３．２．実験方法
３．２．１サンプルの準備（PCR産物）
E. coli K12およびM. maripaludis S2より抽出したゲノムDNAを鋳型DNAに、16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーセット（EUB8f-UNIV1500r又はARC21f-UNIV1500r）を用いて16S rRNA遺伝子のほぼ全長のPCR産物を得た。
【００５１】
３．２．２液中交雑
16S rRNA遺伝子サンプルとEco327-18-D3プローブを全量15μLのhybridization buffer (20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1M urea)中４６℃で5分間反応させた。その反応溶液全量を135μLのhybridization bufferに移し、４６℃で1分間反応させた。
【００５２】
３．２．３分子量分画膜によるプローブ余剰分の洗浄
分子量分画膜（YM-100）上に液中交雑反応溶液を全量アプライし、500×gで遠心分離した（3min）。さらに500μL のhybridization bufferをYM-100上にアプライし、500×gで遠心分離した（45min）。その後、逆遠心によりYM-100上に残った16S rRNA遺伝子およびE. coliの16S rRNA遺伝子に特異的に交雑したプローブが10μL中に回収された。
【００５３】
３．２．４キャピラリー電気泳動による解析
３．２．３で回収された溶液1μLをSample Loading Solution: 39.8μLおよびDNA size standard 80 kit: 0.2μLと混合し，CEQ8000により6kVで16minの電気泳動を行ない、蛍光標識プローブ（Eco327-D3）をCEQ8000システムのフラグメント解析ソフトウェアにより解析した。
【００５４】
３．３実験結果
アプライした16S rRNA遺伝子サンプル別にキャピラリー電気泳動した結果を図３(a)-(c)に示す。図３(a)はE. coli の16S rRNA遺伝子（約280ng）のみ、図３(b)はM. maripaludisの16S rRNA遺伝子（約300ng）のみ、図３(c)は両者の半量ずつ（E. coli : 約140ng，M. maripaludis : 約150ng）である。M. maripaludisのみの系ではEco327-18-D3によるピークは全く検出されず（図３(b)）、E. coliとM. maripaludisの両者を半量ずつ混合させた系（図３(c)）では，Eco327-18-D3によるピークエリア（3469）がE.coliのみの系（図３(a)）のピークエリア（6630）のほぼ1/2になっていることがわかる。
【実施例４】
【００５５】
４．Eco327-18-D3プローブを用いたEscherichia coliの16S rRNAの検出
４．１．実験概要
Escherichia coliあるいはMethanococcus maripaludisのほぼ全長の16S rRNA（約1500塩基）とE. coliの16S rRNAに特異的な蛍光標識プローブ（Eco327-18-D3）を液中で交雑させ、分子量分画膜（YM-100）にアプライし、プローブの余剰分を遠心分離により除去した。その後，YM-100上に残ったE. coliの16S rRNAに特異的に交雑したプローブをキャピラリー電気泳動（CEQ8000）により検出した。
【００５６】
４．２．実験方法
４．２．１サンプルの準備（PCR産物）
E. coli K12およびM. maripaludis S2より抽出したゲノムDNAを鋳型DNAに、16S rRNA遺伝子に特異的なT7付プライマーセット（T7EUB8f-UNIV1500rあるいはT7ARC21f-UNIV1500r）を用いて16S rRNA遺伝子のほぼ全長のPCR産物を得て、T7由来のRNAポリメラーゼによりほぼ全長の16S rRNAを合成した。
【００５７】
４．２．２液中交雑
16S rRNAサンプルとEco327-D3プローブを全量15μLのhybridization buffer (20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1M urea)中46℃で5分間反応させた。その反応溶液全量を135μLのhybridization bufferに移し、46℃で1分間反応させた。
【００５８】
４．２．３分子量分画膜によるプローブ余剰分の洗浄
分子量分画膜（YM-100）上に液中交雑反応溶液を全量アプライし、500×gで遠心分離した（3min）。つづいて500μL のhybridization bufferをYM-100上にアプライし、500×gで遠心分離した（45min）。さらに100μL のhybridization bufferをYM-100上にアプライし、500×gで遠心分離した（10min）。逆遠心によりYM-100上に残った16S rRNAおよびE. coliの16S rRNAに特異的に交雑したプローブが10μL中に回収された。
【００５９】
４．２．４キャピラリー電気泳動による解析
２．３で回収された溶液1μLをSample Loading Solution: 39.8μLおよびDNA size standard 80 kit: 0.2μLと混合し，CEQ8000により6kVで16minの電気泳動を行ない、蛍光標識プローブ（Eco327-D3）をCEQ8000システムのフラグメント解析ソフトウェアにより解析した。
【００６０】
４．３実験結果
アプライした16S rRNAサンプル別にキャピラリー電気泳動の結果を図４に示す。図４(a)はE. coli の16S rRNA（約320ng）のみ、図４(b)はM. maripaludisの16S rRNA（約340ng）のみ、図４(c)は両者の半量ずつ（E. coli : 約160ng，M. maripaludis : 約170ng）である。M. maripaludisのみの系ではEco327-18-D3によるピークは全く検出されず（図４(b)），E. coliとM. maripaludisの両者を半量ずつ混合させた系（図４(c)）では，Eco327-18-D3によるピークエリア（20630）がE.coliのみの系（図４(a)）のピークエリア（42387）のほぼ1/2になっていることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明を利用することによって、例えば、環境微生物分野において実用的な検出限界である、100個中１個程度の微生物（感度１％）（DNAあるいはRNA）が検出可能である。又、本発明方法は各種遺伝子配列情報に基づく診断方法にも応用することが出来る。更に、本発明方法は、SNIPS（１塩基変異）の検出や多種核酸混合系で利用することも可能である。
【図１】
2011135799.tif 000009
【図３】
2011135799.tif 000010
【図４】
2011135799.tif 000011
【図２】
2011135799.tif 000012
【配列表】
2011135799000001.app