(57)【要約】【課題】本発明は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のための方法、および検出方法に用いるサンプルを得るための方法を提供することを目的とする。【解決手段】サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法であって、サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対するバックグラウンド物質の非特異的結合を低減する物質と接触させること；サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること；および癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間で形成された複合体を検出し、複合体の検出が、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となることを含む方法を提供することにより、上記課題を解決する。【選択図】図１
2011039068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法であって、
サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対するバックグラウンド物質の非特異的結合を低減する物質と接触させること；
サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること；および
癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間で形成された複合体を検出し、複合体の検出が、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
“Methods for Detecting Oncofetal Fibronectin”と題されたRobert Hussa, Mark Fischer−Colbrie, Jerome Lapointe, Simon ShorterおよびAndrew Senyeiの、２００４年７月３０日出願の米国仮出願第６０／５９２，８２３号；“Oncofetal Fibronectin as a Marker for Pregnancy−Related Indications”と題された２００４年７月３０日出願の、Robert Hussa, Mark Fischer−Colbrie, Jerome LapointeおよびDurlin Hickokの米国仮出願第６０／５９２，８０３号；“Samples for Detection of Oncofetal Fibronectin and Uses Thereof”と題されたMark Fischer−Colbrie, Jerome LapointeおよびDurlin Hickokの、２００４年７月３０日出願の米国仮出願第６０／５９２，８２５号；“Oncofetal Fibronectin as a Marker for Health and Disease”と題されたRobert Hussa, Mark Fischer−Colbrie, Jerome LapointeおよびSimon Shorterの、２００４年７月３０日出願の米国仮出願第６０／５９２，８０４号；および、“Detection of Oncofetal Fibronectin for Selection of Concepti”と題されたRobert HussaおよびSimon Shorterの、２００４年７月３０日出願の米国仮出願第６０／５９２，８２４号に対して優先権の利益を主張する。
【０００２】
本出願はまた、各々本出願と同日に出願された米国特許出願（代理人整理番号１７１０１−０２６００１１／８２７、１７１０１−０２７００１／８２８、１７１０１−０２８００１／８２９、１７１０１−０２９００１／８３０および１７１０１−０８０００１／８３１）の各出願にも関係する。
【０００３】
許容されるとき、上記で示した仮出願、出願および国際出願の各々の主題は、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００４】
技術分野
サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチンタンパク質および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子を検出するための方法および製品を提供する。特に、身体組織、ならびに洗浄液サンプル、頸膣および尿サンプルなどの液体サンプルにおいて、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸および／またはそれらに対する自己抗体を検出するための方法および製品を提供する。これらの方法により、癌、炎症性疾患および妊娠関連状態を含む、疾病のリスクまたは疾病のスクリーニングまたは表示が可能となる。
【背景技術】
【０００５】
フィブロネクチンは単一遺伝子から発現されるタンパク質ファミリーを構成する。血漿、ならびに結合組織、皮膚、結腸、肝臓、脾臓および腎臓を含む成体組織にはフィブロネクチンの様々なイソ型が存在する(Matsuura and Hakomori, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6517−6521 (1985))。胎児組織および数種の腫瘍細胞およびその他の細胞は、「胎児性」または「癌胎児性」フィブロネクチンと総称されるフィブロネクチンのイソ型を含むか、または発現する。例えば、胎盤、羊水、胎児組織ならびに肝細胞腫および肉腫に由来する細胞系統には癌胎児性フィブロネクチン（ｏｎｆＦＮ）が存在する(Matsuura and Hakomori, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6517−6521 (1985))。癌胎児性フィブロネクチンは妊婦による早産のマーカーとして、また、数種の癌のマーカーとして用いられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌およびその他の疾病の早期検出ならびにリスク因子を伴う妊娠関連状態の予測は、有効な処置戦略を開発するのに重要であり、癌胎児性フィブロネクチンはこれらの症状のいくつかと関連があり、癌胎児性フィブロネクチンを検出するための改良試験、改良サンプル採取法、およびマーカーとしてのその使用を利用するための癌胎児性フィブロネクチン検出法の存在の必要がある。よって、本明細書の目的の中でもとりわけ、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸の検出のための方法および製品を提供すること、サンプル採取法を提供すること、ならびに診断試験およびそのための製品を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のための方法、および検出方法に用いるサンプルを得るための方法を提供する。また、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチンまたはその指標となる分子の検出方法に用いる製品も提供する。
【０００８】
種々の指標のいずれかに関して癌胎児性フィブロネクチンを検出することを含む方法、ならびに限定されるものではないが、急迫出産（impending delivery）および／または切迫出産(imminent delivery)のリスク、出産日の予測、妊娠継続の予測、早産防止法における使用、および分娩誘発における使用を含む、妊娠または出産に関連する使用を提供する。
【０００９】
本明細書で提供される方法の中には、妊娠対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、対象が切迫出産または早産の高い可能性を有するかどうかを評価するための方法があり、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が、その対象が切迫出産または早産の高い可能性を有することを示す。このような方法では、閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が、その対象が切迫出産または早産の高い可能性を有することを示し得る。このような方法の閾値レベルは、バッファー処理サンプルについては、１ｎｇ／ｍｌまたは約１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌまたは約２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌまたは約３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌまたは約４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌまたは約５ｎｇ／ｍｌ、または無処理（neat）サンプルについては、１ｎｇ／ｍｌまたは約１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌまたは約３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌまたは約５ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌまたは約７ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【００１０】
他の態様において、本明細書では、妊娠対象のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であるとき、その対象をオキシトシン誘発が経膣分娩に至る可能性が高いものと同定することによって、分娩誘発のためにオキシトシンを投与するかどうかを決定するための方法が提供される。このような方法を用いれば、対象をオキシトシン分娩誘発が好ましいものと同定すること、およびその対象に分娩誘発に有効なオキシトシン用量を投与することが可能となる。このような方法によれば、サンプルが癌胎児性フィブロネクチン指標分子陽性であるとき、その対象は、２４または４８時間以内に経膣分娩に至る可能性が高く、かつ／または１回の誘発処置の後に経膣分娩に至る可能性が高い。このような方法では、誘発処置は、膣の熟化、予備誘発剤の投与、または誘発剤の投与であり得る。ある場合には、対象は予備誘発剤を１回投与した後に分娩に至る可能性が高い。また、誘発処置下にある妊娠対象由来のサンプル中の胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であるとき、その対象を経膣分娩の可能性が高いものと同定することによって、誘発の有効性を評価するための方法も提供する。このような方法では、その対象は１回の誘発処置の後、または予備誘発剤を１回投与した後、４８時間または２４時間以内に経膣分娩に至る可能性が高い。誘発処置は膣の熟化、予備誘発剤の投与および誘発剤の投与から選択することができる。
【００１１】
また、本明細書では、妊娠対象由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定し、その対象の誘発結果の第二の指標を決定し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベルを超え、かつ、第二の指標が好ましい誘発結果を示すとき、その対象を誘発が成功する可能性が高いものと同定することによって、分娩誘発に関して対象を同定するための方法が提供される。このような方法を用いれば、対象を分娩誘発が成功する可能性が高いものと同定すること、およびその対象に誘発処置を施すことができる。誘発成功の可能性は、次のいずれかにより示すことができる：癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発時に経膣分娩の可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発開始と出産の間隔が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、分娩促進薬の投与と出産の間隔が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、オキシトシンの投与と出産の間隔が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発２４時間以内に出産に至る可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発４８時間以内に出産に至る可能性が高いこと；および、癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、予備誘発剤を２回以上投与する可能性が低いこと、およびそれらの組み合わせ。誘発結果の第二の指標は、妊娠対象の測定値または所見、胎児の測定値または所見、および妊娠対象の病歴のいずれであってもよい。このような指標としては、限定されるものではないが、子宮頸長、ビショップスコア、展退、出産歴、子宮口の開大、妊娠齢、肥満度指数、位置、硬度、経膣超音波、および指診、またはそれらの組合せが挙げられる。
【００１２】
また、妊娠対象のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定し、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量以下である多層閾値レベルの最高値を決定し（ここで、それぞれのより高い閾値は、それぞれのより低い閾値と比較して誘発成功の可能性が高いことを示す）、最高閾値によって示される可能性に従って対象の誘発成功の可能性を同定することによって、対象の誘発成功の可能性を決定するための方法が提供される。また、妊娠対象のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満であるとき、その対象をオキシトシン誘発により経膣分娩に至る可能性が低いものと同定することによって、分娩誘発が望ましくない対象を同定するための方法を提供する。
【００１３】
提供される方法では、誘発の成功は、低い閾値と比較して多層閾値指標の量が各々高いこと、すなわち、癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発時に経膣分娩の可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発開始と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、分娩促進薬の投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、オキシトシンの投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が高いこと；および癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、対象に予備誘発剤を２回以上投与する可能性が低いこと、またはそれらの組合せにより示すことができる。
【００１４】
このような方法では、サンプルは、可能性のある頸膣病巣点のスワブ、尿、血液、血漿、血清、身体組織、洗浄液、ならびに子宮頸管、子宮頸口、外頸部、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域、後膣円蓋、後膣円蓋より下部の膣部分、膣の下三分の一、陰唇、子宮頸間質液およびそれらの組合せの中から採取される頸膣分泌液のいずれかであり得る。特定の態様では、サンプルは、子宮頸管のスワブ、子宮頸口のスワブ、外頸部のスワブ、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域のスワブ、膣のスワブ、後膣円蓋のスワブ、後膣円蓋より下部の膣部分のスワブ、膣の下三分の一のスワブ、陰唇のスワブ、およびそれらの組合せのいずれかである。サンプルはポリエステルスワブ、綿スワブまたはレーヨンスワブを用いて採取することができる。サンプルが綿スワブであるとき、このスワブに対して本方法を行うことができる。サンプルが垂直流動により試験されるとき、そのサンプルは実質的に血液を含まないか、または５％もしくは約５％以下、１％もしくは約１％以下、０．５％もしくは約０．５％以下、０．１％もしくは約０．１％以下の血液しか含まない。
【００１５】
さらにこのような方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関する試験は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメントの存在を試験すること、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンもしくはそのフラグメントをコードする核酸分子に相補的な核酸分子の存在を試験すること、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に対する自己抗体、もしくは癌胎児性フィブロネクチンおよびそのフラグメントをコードする核酸分子に対する自己抗体の存在を試験することを含み得る。指標分子が核酸分子であるとき、これらの方法は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸合成条件下でサンプルを処理することをさらに含み得る。
【００１６】
このような方法は、サンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、結合相手と癌胎児性フィブロネクチンの複合体を検出することをさらに含むことができ、複合体の検出がサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の指標となる。この方法は、サンプルを第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、サンプルを第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること（ここで、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、検出可能または結合可能な部分とコンジュゲートされているか、または第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、固体支持体に固定されている）、そして第一の結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子と第二の結合相手の複合体を検出することをさらに含むことができ、複合体の検出が、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の指標となる。これらの方法は、対象由来のサンプルを非特異的結合化合物と接触させること、サンプルを、コンジュゲートまたは固定された結合相手などの第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることをさらに含み得る。一局面では、第一の結合相手は、例えば、金属コロイド、光検出可能なラテックスマイクロスフェア、発色団、蛍光部分、量子ドットおよび検出可能な酵素などの部分とコンジュゲートされる。この方法は、サンプルを、第一の結合相手と特異的に結合する検出可能な化合物と接触させることをさらに含むことができ、ここで、検出可能な化合物は抗体コンジュゲートまたは核酸コンジュゲートである。第一の結合相手または第二の結合相手は、抗フィブロネクチン抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。
【００１７】
本明細書で提供される方法は、多くの様式のいずれで行ってもよい。例えば、複合体は、第一の結合相手が第二の結合相手と空間的に近接しているかどうかを決定することにより検出することができ、第一の結合相手と第二の結合相手が空間的に近接して検出されることが、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示し、ここで、空間的近接は、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、および均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）などの非放射性エネルギー移動反応により決定することができる。他の方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子もしくはそのフラグメントまたは結合相手を、質量分析またはゲル電気泳動により検出することができる。いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出量は１以上の閾値と比較することができ、ここで、サンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出量以下である最高閾値に従って分類される。いくつかの方法では、サンプルは、非特異的結合化合物と、または固体支持体の非特異的結合表面と接触させる。本明細書に記載の方法では、複合体は、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合するか、またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントと結合する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより検出することができる。本明細書に記載の方法では、複合体は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合している化合物の重量を検出することにより検出することができ、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に相当する検出された重量は、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す。本明細書に記載の方法では、複合体を、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を検出することにより測定することができる。このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、蛍光、反射率、吸収、生物発光、酵素と結合した検出可能なシグナル、または放射性崩壊を検出することにより測定することができる。本明細書で提供される特定の方法では、少なくとも１つのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が試験ストリップに固定されている。
【００１８】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。
【００１９】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＢ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＢ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。
【００２０】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＩＩＩＣＳ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＩＩＩＣＳ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。このＩＩＩＣＳ部分は、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０のいずれであってもよい。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分であるとき、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の翻訳後修飾を認識することができる。一局面では、この翻訳後修飾は、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化であり得る。
【００２１】
一局面では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳを欠いているものとして同定される。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が欠失型として同定されるとき、このＩＩＩＣＳの部分は、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５、ＩＩＩＣＳアミノ酸９０〜１２０またはその双方である。
【００２２】
また、サンプルを、検出可能な部分とコンジュゲートされている可動性の癌胎児性フィブロネクチン結合相手および試験ストリップに固定されているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含有する試験ストリップと接触させること、そして第一の結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子と第二の結合相手の複合体を検出することを含み、複合体の検出が、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の指標となる方法も提供される。この癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、非癌胎児性フィブロネクチン指標分子よりも癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合する。
【００２３】
また、サンプルを検出可能な部分とコンジュゲートされている可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手および試験ストリップに固定されている癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含有する試験ストリップと接触させること、そして第一の結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子と第二の結合相手の複合体を検出することを含み、複合体の検出が、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の指標となる方法も提供される。この癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、非癌胎児性フィブロネクチン指標分子よりも癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合する。
【００２４】
また、本明細書では、妊娠対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することによって、分娩日予測の確実性を高めるための方法も提供され、ここで、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であるとき、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満であるサンプルを有する妊娠対象よりも、その対象が特定の期間内に分娩に至る可能性が高いことを示す。また、妊娠対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することによって、妊娠継続予測の確実性を高めるための方法も提供され、ここで、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満であるとき、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であるサンプルを有する妊娠対象よりも、その対象が特定の期間妊娠を継続する可能性が高いことを示す。この特定の期間は、３週間以内、２週間以内、１０日以内、１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内および１日以内のいずれであってもよい。この対象は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満であるサンプルを有する妊娠対象よりも、特定の期間内に分娩に至る可能性が少なくとも５０％高い場合がある。
【００２５】
また、本明細書で提供される方法を実施するための組合せ物およびキットを含む、組合せ物およびキットも提供される。一態様では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、分娩促進薬、およびその組合せ物に関する任意の使用説明書を含む組合せ物が提供される。組合せ物はまた、非特異的結合化合物も含み得る。本明細書で提供されるキットは、本明細書で提供される組合せ物、およびまた、１以上の閾値レベルに従ってサンプルを分類するための系、および／または使用説明書を含み得る。
【００２６】
本明細書では、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチンの存在または上昇したレベルを特徴とする健康障害の診断、造影および／または処置を含む、本明細書で提供されるいずれかの方法のための薬剤の製造に用いるための本明細書で提供されるいずれかの製品の使用が提供される。
【００２７】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のための方法および検出方法で用いるサンプルを得るための方法が提供される。また、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンまたはその指標となる分子の検出方法で用いるための製品も提供される。
【００２８】
種々のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法が提供される。本明細書で提供されるいくつかの方法では、このサンプルを試薬で処理し、かつ／または非特異的結合剤と接触させる。
【００２９】
本明細書では、サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対するバックグラウンド物質の非特異的結合を低減する物質と接触させること、そのサンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、そして癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間で形成された何らかの複合体を検出し、複合体の検出が、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となることによって、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法が提供される。また、サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対するバックグラウンド物質の非特異的結合を低減する物質を接触させること（ここで、前記フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合タンパク質である）、そのサンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合タンパク質と接触させること、そして癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合タンパク質の間で形成された複合体を検出し（ここで、前記癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそのフラグメントである）、複合体の検出が、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそのフラグメントの存在の指標となることによって、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそのフラグメントの存在を検出するための方法も提供される。また、サンプルを、サンプルのイオン強度を小さくする溶液と接触させ、それにより、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特異的結合を増強させ、この溶液に接触させたサンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、そして癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間で形成された複合体を検出し、複合体の検出が、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となることによって、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法も提供される。
【００３０】
このような方法では、この物質が固体支持体であってもよく、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が特異的には結合しない非特異的結合剤を含み得る。いくつかの方法では、この非特異的結合化合物は非特異的結合タンパク質または非特異的結合核酸分子であり得る。いくつかの方法では、物質と接触させた後のサンプルのイオン強度は、少なくとも１５０μもしくは約１５０μであるか、または５００μもしくは約５００μ以下である。例えば、このイオン強度は５０μ〜３５０μ、または約５０μ〜約３５０μ、または１５０μ〜２５０μの範囲、または約１５０μ〜約２５０μの範囲であり得る。このような方法では、サンプル中のバックグラウンド物質の量はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量よりも少なくてよいか、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量はサンプル中のバックグラウンド物質の量よりも多くてよい。いくつかの方法では、このサンプルは液体サンプルであり、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の溶質濃度は不変である。このようないくつかの方法では、バックグラウンド物質はフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の１０％以下としか結合しない。これらの方法は、サンプルを第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることをさらに含むことができ、ここでこの第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は検出可能または結合可能部分とコンジュゲートされているか、またはこの第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は固体支持体上に固定されており；そして、その検出工程は、第一の結合相手、第二の結合相手、および癌胎児性フィブロネクチン指標分子の複合体を検出することを含む。
【００３１】
本明細書で提供される方法で用いるサンプルは、尿、リンパ、血液、血漿、血清、唾液、精漿、洗浄液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、母乳、滑液、精液、精漿、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、腹腔液、腹水、汗、リンパ液、肺痰、洗浄液、またはその画分もしくは成分のいずれであってもよい。サンプルは、尿、洗浄液、母乳、頸膣スワブ、唾液、血清、血漿、血液、および間質液のいずれであってもよい。特定の態様では、サンプルは尿サンプルである。尿サンプルの例としては、無処理（採取したまま、すなわち、未改変または未処理)尿サンプルおよび冷凍尿サンプルが挙げられる。いくつかの方法では、接触または検出工程の少なくとも３０分もしくは約３０分前、または少なくとも１２時間もしくは約１２時間前に対象から尿サンプルを採取する。
【００３２】
本明細書で提供される方法では、非特異的結合化合物はアルブミン、カゼイン、ウシ胎児血清、ゼラチン、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的には結合しない抗体のいずれかであり、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり得る。本明細書で提供されるいくつかの方法では、第二の結合相手は試験ストリップの固体支持体に固定されている。第二の結合相手を試験ストリップの第一領域に固定することができ、非特異的結合化合物を試験ストリップの第二領域に固定することができ、ここでこの第一領域は、第二領域よりもサンプル液流経路の下流にある。
【００３３】
いくつかの態様では、これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を、サンプル中の１以上のノーマライゼーション分析物の濃度に従ってノーマライズすることを含み、ノーマライゼーション分析物の例としてはクレアチニンがある。本明細書で提供される方法は、サンプルを非特異的結合化合物と接触させること、およびそのサンプルを非特異的結合化合物から分離すること；そしてさらに、サンプルを非特異的結合化合物から分離した後に、そのサンプルを固体支持体と接触させ、それにより、そのサンプルのタンパク質および／または核酸成分が固体支持体上に固定されること、およびその固体支持体をフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることをさらに含むことができる。いくつかの場合には、サンプルからバックグラウンド物質が除去される。非特異的結合化合物を固体支持体上に固定することができる。
【００３４】
いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、そのサンプルが採取された対象を、癌（例えば、悪性新生物または転移）細胞を有するものと同定することができ、ある場合には、これらの癌細胞は、膀胱、腎臓、前立腺、子宮頸または卵巣起源のものであり得る。特定の局面では、この癌細胞は膀胱起源のものである。
【００３５】
他の方法では、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、サンプルが採取された対象を切迫出産または早産の高いリスクを有するものと同定する。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、そのサンプルが採取された対象を陣痛誘発に成功する可能性が高いものと同定する。提供される方法では、誘発の成功は、低い閾値よりも量が各々多いこと、すなわち、癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発時に経膣分娩の可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発開始と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、分娩促進薬の投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、オキシトシンの投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が高いこと；および、癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、対象に予備誘発剤を２回以上投与する可能性が低いこと、およびそれらの組合せにより示すことができる。
【００３６】
また、本明細書では、バッファー処理した尿サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定し、そのバッファー処理サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子が６０ｎｇ／ｍｌ以上または約６０ｎｇ／ｍｌ以上のとき、前記サンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として同定することにより、尿サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法も提供される。また、本明細書では、冷凍尿サンプルを解凍すること、およびその解凍尿サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定することによって、尿サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法も提供される。このようないくつかの方法では、決定工程は、サンプルを第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、そのサンプルを第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること（ここで、この第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は検出可能または結合可能な部分とコンジュゲートされているか、またはこの第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は固体支持体に固定されている）、そして第一の結合相手、癌胎児性フィブロネクチン指標分子、および第二の結合相手の複合体を検出することを含み得る。
【００３７】
これらの態様では、これらの方法はまた、サンプルを非特異的結合化合物と接触させることも含み得る。このような方法は、そのサンプルが採取された対象を、癌（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞を有するものとして同定するために使用することができ、例えば、これらの癌細胞は、膀胱、腎臓、前立腺、子宮頸または卵巣起源のものであり得る。特定の態様では、この癌細胞は膀胱起源のものである。
【００３８】
本明細書では、別の態様として、間質液サンプルにおける何らかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、間質液サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法が提供される。
【００３９】
本明細書では、さらに別の態様として、洗浄液サンプルにおける何らかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、洗浄液サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法が提供される。
【００４０】
このような態様では、これらの方法は、サンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、および癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間で形成された複合体を検出し、複合体の検出が、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となることをさらに含むことができる。洗浄液サンプルは管洗浄液サンプルであり得る。このような方法では、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、そのサンプルが採取された対象を、癌（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞を有するものと同定することができ、いくつかの場合には、これらの細胞は乳房起源のものであり得る。
【００４１】
本明細書で提供される方法では、複合体は、第一の結合相手が第二の結合相手と空間的に近接しているかどうかを決定することにより検出することができ、第一の結合相手と第二の結合相手が空間的に近接して検出されたとき、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示す。このような方法では、空間的近接は、非放射性エネルギー移動反応の結果として検出することができ、ここで、この非放射性エネルギー移動反応は蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）のいずれであってもよい。
【００４２】
また、このような方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的な核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に対する自己抗体、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体、およびそのフラグメントのいずれであってもよい。本明細書で提供される方法では、この結合相手は抗フィブロネクチン抗体、または核酸分子、またはそのフラグメントであり得る。本明細書で提供されるいずれの方法においても、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメント、癌胎児性フィブロネクチンもしくはそのフラグメントをコードする核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンもしくはそのフラグメントをコードする核酸分子に相補的な核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメントに対する自己抗体、または癌胎児性フィブロネクチンまたはそのフラグメントをコードする核酸分子に対する自己抗体のいずれであってもよい。
【００４３】
また、本明細書で提供される方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が閾値量未満であるとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陰性として分類することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が閾値量以上であるとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類することができる。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値量は、５０ｎｇ／ｍＬまたは約５０ｎｇ／ｍＬであり得る。このようないくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチンの検出量が２以上の閾値と比較され、サンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出量以下である最高閾値に従って分類することができる。例えば、第一の閾値は５０ｎｇ／ｍＬであり、第二の閾値は１５０ｎｇ／ｍＬである。サンプルが採取される対象が妊娠している場合の方法では、これら２以上の閾値量は妊娠期間の関数であり得る。本明細書で提供される方法では、複合体は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合している癌胎児性フィブロネクチン指標分子、またはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合している癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントを測定することにより検出することができる。
【００４４】
本明細書で提供される方法は、質量分析またはゲル電気泳動により、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合しているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を測定すること、および／または蛍光、反射率、吸収、生物発光、酵素と結合した検出可能なシグナル、または放射性崩壊を検出することにより癌胎児性フィブロネクチンを検出するために使用することができる。一局面では、少なくとも１つのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が試験ストリップに固定される。このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。
【００４５】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＢ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＢ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢと結合する自己抗体の部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。
【００４６】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＩＩＩＣＳ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＩＩＩＣＳ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。このＩＩＩＣＳ部分はＶ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０のいずれであってもよい。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分であるとき、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は癌胎児性フィブロネクチンタンパク質翻訳後修飾を認識することができる。一局面では、この翻訳後修飾は、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化であり得る。
【００４７】
一局面では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳを欠いているものとして同定される。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が欠失型として同定されるとき、このＩＩＩＣＳの部分は、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５、ＩＩＩＣＳアミノ酸９０〜１２０またはその双方である。
【００４８】
本明細書では、別の態様として、非特異的結合領域と、その上に固定されている第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む分析物結合領域とを含み、その分析物結合領域が非特異的結合領域よりもサンプル液流経路の下流にある試験ストリップが提供される。本明細書では、さらに別の態様として、非特異的結合領域と、その上に固定されている第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む分析物結合領域とを含み、その分析物結合領域が非特異的結合領域よりもサンプル液流経路の下流にある、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための試験ストリップが提供される。
【００４９】
本明細書で提供される試験ストリップはまた、サンプル適用部品としての働きをするコンジュゲートパッド、デバイスから連続的に液体を吸い出す働きをする吸収パッド（ここで、この膜系の物質は単一の液流経路を形成する）、ならびにこの吸収パッドおよびコンジュゲートパッドと液体が流通する多孔性または吸水性部材（この多孔性または吸水性部材は液体サンプルを収容し、分析物結合領域を含む）も含み得る。本明細書で提供される試験ストリップはまた、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む可動化領域も含むことができ、この第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、サンプルとの接触時に可動化され、かつ、この可動化領域は分析物結合領域の上流にある。これらの試験ストリップはまた、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合する生体分子を含む対照領域も含むことができ、この対照領域は分析物結合領域の下流にある。
【００５０】
本明細書で提供されるいくつかの試験ストリップでは、第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンよりも癌胎児性フィブロネクチンと結合する。本明細書で提供されるいくつかの試験ストリップでは、非特異的結合領域はその上に固定されている非特異的結合タンパク質を含み、この非特異的結合タンパク質は、例えば、ＢＳＡ、メチル化ＢＳＡ、Ｗ６３２またはマウスＩｇＧであり得る。
【００５１】
また、本明細書では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手および非特異的結合化合物を含む組合せ物も提供される。本明細書で提供される組合せ物は、本明細書で提供される方法を実施するために使用することができる。このような組合せ物では、非特異的結合剤は非特異的結合化合物であり得る。また、このような組合せ物では、非特異的結合剤は固体支持体の非特異的結合表面であり得る。これらの組合せ物は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手および非特異的結合表面を含む固体支持体をさらに含み得る。これらの組合せ物は、非特異的結合化合物が固定されている試験ストリップを含み得る。これらの組合せ物はサンプル採取デバイスを含み得る。
【００５２】
また、本明細書では、本明細書で提供される組合せ物を含み、また、使用説明書および／または複数の閾値に対して対象を分類するための系を含むキットも提供される。
【００５３】
また、本明細書では、対象から膣下部サンプルを採取すること、およびそのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチンを示すための方法が提供され、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が、その対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す。このような方法では、この膣下部サンプルは、後膣円蓋より下部の膣部分から採取されたサンプルを含み得る。いくつかの方法では、この膣下部サンプルは、膣の下三分の一から採取することができ、スワブで採取することができる。いくつかの方法では、このサンプルは陰唇サンプルを含み得る。いくつかの方法では、このサンプルは、場合により対象を含む、医療従事者でない者により採取される。
【００５４】
また、本明細書では、対象から陰唇サンプルを採取すること、およびそのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチンを示すための方法が提供され、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が、その対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す。このような方法では、このサンプルはさらに膣下部サンプルを含み得る。いくつかの方法では、この陰唇サンプルは、膣の下三分の一から採取することができ、スワブで採取することができる。いくつかの方法では、このサンプルは、場合により対象を含む、医療従事者でない者により採取される。
【００５５】
また、本明細書では、対象から頸膣サンプルを受動採取すること、およびそのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチンを示すための方法が提供され、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が、その対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す。このような方法では、頸膣サンプルを受動採取する工程は、膣にサンプル採取デバイスを挿入することをさらに含み得る。このような方法では、このサンプル採取デバイスは膣内に少なくとも５分もしくは約５分、少なくとも１５分もしくは約１５分、少なくとも１時間もしくは約１時間、または少なくとも２時間もしくは約２時間維持することができる。このような方法では、このサンプル採取デバイスは、膣の下三分の一に挿入することができる。このような方法では、このサンプル採取デバイスは、タンポンを挿入する方法と同様にして膣に挿入することができる。このサンプル採取デバイスは吸収性のものであってよく、かつ／またはタンポン様デバイスまたは生理用ナプキン様デバイスであってよい。このような方法では、この頸膣サンプルを受動採取する工程は、膣の外下部にサンプル採取デバイスを置くことをさらに含み得る。いくつかの方法では、このサンプル採取デバイスは陰唇に接触させることができる。いくつかの方法では、このサンプル採取デバイスは、陰唇または膣口と対象の下着の間に置くことができる。いくつかの方法では、このサンプル採取デバイスは、５分以上、１０分以上、１５分以上、１時間以上、または２時間以上その位置に維持することができる。
【００５６】
このような方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が閾値レベルを超えるとき、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示し得る。バッファー処理サンプルの場合の閾値レベルは、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、または２０ｎｇ／ｍｌであり得る。無処理サンプルの場合の閾値レベルは、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、または５０ｎｇ／ｍｌであり得る。
【００５７】
本明細書で提供される方法では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンの存在は、切迫出産または早産のリスク、誘発成功の可能性、対象における癌細胞の存在、対象の癌細胞発生リスク、対象の癌細胞の攻撃性、または対象における癌細胞処置の有効性を示し得る。
【００５８】
また、本明細書では、サンプル採取デバイスとフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とを含む組合せ物も提供される。このような組合せ物では、サンプル採取デバイスとしては、限定されるものではないが、尿採取デバイス、ディップスティック、スワブおよび受動式頸膣分泌液採取デバイスが挙げられる。ある組合せ物では、この受動式頸膣サンプル採取デバイスは膣に挿入可能である。別の組合せ物では、この受動式頸膣サンプル採取デバイスは、陰唇または膣口と対象の下着の間に置く。この組合せ物はまた、膣に挿入するには十分な長さであるが、子宮頸に接触するほどの長さではないスワブ（１０ｃｍ以下のスワブであり得る）も含み得る。別の組合せ物では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はサンプル採取デバイス上に固定することができる。
【００５９】
本明細書で提供される組合せ物はまた、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手も含み得る。このような組合せ物では、この第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は検出可能な標識とコンジュゲートさせることができる。
【００６０】
本明細書で提供される組合せ物は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベルを超えるとき、陽性結果を示すように構成することができる。本明細書で提供される組合せ物はまた、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベルを超えるとき、陽性結果を示すように構成された試験ストリップリーダーも含み得る。このようないくつかの組合せ物では、バッファー処理サンプルの場合の閾値レベルは、約１ｎｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌであるか、約２ｎｇ／ｍｌまたは２ｎｇ／ｍｌであるか、約３ｎｇ／ｍｌまたは３ｎｇ／ｍｌであるか、約５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌであるか、約７ｎｇ／ｍｌまたは７ｎｇ／ｍｌであるか、約１０ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌであるか、約１５ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌであるか、あるいは約２０ｎｇ／ｍｌまたは２０ｎｇ／ｍｌである。このようないくつかの組合せ物では、無処理サンプルの場合の閾値レベルは、約１ｎｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌであるか、約３ｎｇ／ｍｌまたは３ｎｇ／ｍｌであるか、約５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌであるか、約１０ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌであるか、約１５ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌであるか、約２５ｎｇ／ｍｌまたは２５ｎｇ／ｍｌであるか、約３５ｎｇ／ｍｌまたは３５ｎｇ／ｍｌであるか、あるいは約５０ｎｇ／ｍＬまたは５０ｎｇ／ｍｌである。また、本明細書では、本明細書で提供される組合せ物と、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の採取および／または測定に関する１以上の説明書、およびそのための試薬とを含むキットも提供される。
【００６１】
また、本明細書では、サンプルを採取すること、および本明細書で提供される組合せ物を用い、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するかどうか調べることを含む、対象において癌胎児性フィブロネクチンを示すための方法も提供される。このようないくつかの方法では、サンプルは、後膣円蓋より下部の膣部分から採取される。このようないくつかの方法では、サンプルは、膣の下三分の一から採取される。このようないくつかの方法では、サンプルは、陰唇から採取される。本明細書で提供される方法では、サンプルは、受動式サンプル採取デバイスを用いて採取することができる。本明細書で提供されるいくつかの方法では、サンプルは尿である。このような方法では、サンプルは、医療従事者でない者により採取することができる。このような方法では、サンプルは対象により採取することができる。本明細書では、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するかどうか調べる工程が、医療従事者でない者または対象により行われる方法が提供される。
【００６２】
また、尿サンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメンテーションのための条件下で処理すること、およびサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンのフラグメントを検出することによって、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を決定するための方法も提供され、癌胎児性フィブロネクチンフラグメントの検出が、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を示す。
【００６３】
また、身体表面または体腔を洗浄液と接触させること、およびその洗浄液において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を決定するための方法も提供される。
【００６４】
本明細書では、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチンの存在または上昇したレベルを特徴とする健康障害の診断、造影および／または処置を含む、本明細書で提供されるいずれかの方法のための薬剤の製造に用いる本明細書で提供されるいずれかの製品の使用が提供される。
【００６５】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のための方法、および検出方法で用いるサンプルを得るため方法が提供される。また、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンまたはその指標となる分子の検出方法で用いる製品も提供される。健康か疾病状態かを確認するため、また、疾病または症状を発症するリスクを評価するために対象を調べる方法が提供される。
【００６６】
本明細書では、対象由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関して試験することによって、対象における子宮頸癌の存在を同定するための方法が提供され、ここでは、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、その対象における子宮頸癌の存在を同定する。また、本明細書では、対象由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関して試験することによって、対象における癌性（例えば、新生物性、悪性または転移）子宮頸細胞の存在を検出する方法も提供され、ここでは、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、その対象における癌性（例えば、悪性、新生物性または転移）子宮頸細胞の存在が示される。
【００６７】
本明細書で提供される方法では、サンプルは、例えば、可能性のある頸膣病巣点のスワブ、子宮頸管のスワブ、子宮頸口のスワブ、外頸部のスワブ、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域のスワブ、膣のスワブ、後膣円蓋のスワブ、後膣円蓋より下部の膣部分のスワブ、膣の下三分の一のスワブ、陰唇のスワブ、子宮頸間質液、尿、血液、血漿、血清およびそれらの組合せであり得る。一局面では、サンプルは頸膣サンプルであり、このサンプルは次のうち１以上のものである：子宮頸口のスワブ、子宮頸病巣のスワブ、外頸部のスワブ、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域のスワブ、またはそれらの組合せ。別の局面では、サンプルは後膣円蓋より下部の膣部分のスワブである。いくつかの方法では、サンプルは、ポリエステルスワブ、綿スワブまたはレーヨンスワブを用いて採取する。サンプルが綿スワブであるとき、このスワブに対して本方法を行うことができる。
【００６８】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として同定する。いくつかの方法では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の不存在により、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陰性として同定する。本明細書で提供される他の方法では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上であるとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として同定する。いくつかの方法では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満であるとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陰性として同定する。いくつかの方法では、この閾値量は４０ｎｇ／ｍｌまたは約４０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌ、または５ｎｇ／ｍｌまたは約５ｎｇ／ｍｌである。
【００６９】
サンプルが垂直流動を用いてアッセイされるとき、そのサンプルは実質的に血液を含まない。このような方法では、このサンプルは、１％または約１％以下の血液、０．５％または約０．５％以下の血液、あるいは０．１％または約０．１％以下の血液しか含まない。
【００７０】
本明細書で提供される方法はまた、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関する試験工程が、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメントに関する試験、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的な核酸分子、もしくはそのフラグメントに関する試験、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に対する自己抗体、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体およびそのフラグメントに関する試験をさらに含む方法も含む。いくつかの方法では、この試験工程は、サンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、およびその結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子の複合体を検出することをさらに含む。いくつかの方法では、この試験工程は、サンプルを第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることをさらに含み、ここで、この第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は検出可能または結合可能な部分とコンジュゲートされているか、またはこの第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は固体支持体に固定されている。本明細書で提供される方法はまた、複合体を検出する前に、サンプルを非特異的結合化合物と接触させることも含み得る。
【００７１】
本明細書で提供される方法では、結合相手は、例えば、金属コロイド、光検出可能なラテックスビーズ、発色団、蛍光部分、量子ドットおよび検出可能な酵素などの部分とコンジュゲートさせることができる。本明細書で提供される方法は、第一の結合相手とサンプルを接触させた後に、そのサンプルを第一の結合剤と特異的に結合する検出可能な化合物と接触させることをさらに含み得る。このような方法では、この検出可能な化合物は抗体コンジュゲートまたは核酸コンジュゲートである。本明細書で提供されるいくつかの方法では、結合相手は抗フィブロネクチン抗体またはそのフラグメントであり得る。
【００７２】
本明細書で提供される方法では、複合体は、第一の結合相手が第二の結合相手と空間的に近接しているかどうかを決定することにより検出することができ、第一の相手と第二の結合相手が空間的に近接して検出されたとき、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示す。このようないくつかの方法では、空間的近接は、非放射性エネルギー移動反応の結果として検出される。このような方法では、この非放射性エネルギー移動反応は、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）であり得る。
【００７３】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、サンプルを非特異的結合化合物と接触させる。いくつかの方法では、サンプルを固体支持体の非特異的結合表面と接触させる。
【００７４】
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出量が２以上の閾値と比較され、ここで、サンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出量以下である最高閾値に従って分類される。
【００７５】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、複合体は、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合している癌胎児性フィブロネクチン指標分子、またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合している癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントを測定することにより検出される。いくつかの方法では、複合体は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合している化合物の分子量を検出することにより検出され、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に相当する分子量は、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示す。いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、質量分析またはゲル電気泳動により検出される。いくつかの方法では、複合体は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合しているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を検出することにより検出される。このようないくつかの方法では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、蛍光、反射率、吸収、生物発光、酵素と結合した検出可能なシグナル、または放射性崩壊を検出することにより検出される。いくつかの方法では、少なくとも１つのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が試験ストリップに固定されている。
【００７６】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡ部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。
【００７７】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＢ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＢ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード化部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード化部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。
【００７８】
このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＩＩＩＣＳ特異的部分と結合することができ、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＩＩＩＣＳ特異的部分は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード部分と結合する自己抗体の部分のいずれかである。このＩＩＩＣＳ部分はＶ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０のいずれであってもよい。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分であるとき、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の翻訳後修飾を認識することができる。一局面では、この翻訳後修飾は、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化であり得る。
【００７９】
一局面では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳを欠いているものとして同定される。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が欠失型として同定されるとき、このＩＩＩＣＳの部分は、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５、ＩＩＩＣＳアミノ酸９０〜１２０またはその双方である。
【００８０】
また、本明細書では、本明細書で提供される方法に従って、対象における癌の存在、または対象における癌細胞の存在を同定すること、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、そのコンジュゲートを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象の組織または細胞に局在させること、および対象内のコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象の組織または細胞中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、子宮頸癌または癌性子宮頸細胞の対象における位置を検出する方法も提供され、ここでは、検出が、癌胎児性フィブロネクチンの存在により特徴付けられる癌または病態の指標となる。一態様では、これらの組織または細胞は子宮頸組織または細胞である。このような方法は、子宮頸癌または癌性子宮頸細胞の対象における位置を検出すること、および対象に処置用フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、この処置用結合相手を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の領域に局在させ、それにより、局在した処置用結合相手が子宮頸癌または癌性子宮頸細胞の細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害することをさらに含み得る。
【００８１】
また、本明細書では、本明細書で提供される方法に従って、対象における子宮頸癌の存在、または対象における癌性子宮頸細胞の存在を同定すること、および処置用フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、この処置用結合相手を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の領域に局在させ、それにより、局在した結合相手が子宮頸癌または癌性子宮頸細胞の細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害することによって、子宮頸癌または癌性子宮頸細胞を有する対象を処置する方法も提供される。このような方法では、この処置用結合相手は治療用部分とコンジュゲートさせることができる。
【００８２】
いくつかの方法では、この造影用結合相手コンジュゲートまたは処置用結合相手は、例えば、核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ領域と結合する結合相手、および癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡ領域と結合する結合相手であり得る。いくつかの方法では、この造影用コンジュゲートまたは処置用結合相手は局所投与される。
【００８３】
また、本明細書では、本明細書で提供される方法を実施するための試験ストリップも提供される。また、本明細書では、固体支持体に固定されている第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む分析物結合領域を含む試験ストリップも提供される。本明細書で提供される試験ストリップはさらに非特異的結合領域を含むことができ、ここで、分析物結合領域はこの非特異的結合領域よりもサンプル液流経路の下流にある。本明細書で提供される試験ストリップはさらに、サンプル適用部品としての働きをするコンジュゲートパッド、デバイスから連続的に液体を吸い出す働きをする吸収パッド（ここで、この膜系の物質は単一の液流経路を形成する）、ならびにこの吸収パッドおよびコンジュゲートパッドと液体が流通する多孔性または吸水性部材（この多孔性または吸水性部材は液体サンプルを収容し、生体分子相互作用が生じた際に固体支持体として働き、この多孔性または吸水性部材は分析物結合領域を含む）も含み得る。
【００８４】
本明細書で提供されるいくつかの試験ストリップは、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む可動化領域をさらに含むことができ、この第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、サンプルとの接触時に可動化され、かつ、この可動化領域は分析物結合領域の上流にある。いくつかの試験ストリップは、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合する生体分子を含む対照領域をさらに含むことができ、この対照領域は分析物結合領域の下流にある。いくつかの試験ストリップでは、この第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンよりも癌胎児性フィブロネクチンに結合する。いくつかの試験ストリップでは、この非特異的結合領域は、固体支持体に固定されている非特異的結合タンパク質を含み、この非特異的結合タンパク質は、例えば、ＢＳＡ、メチル化ＢＳＡ、Ｗ６３２またはマウスＩｇＧであり得る。
【００８５】
また、本明細書では、本明細書で提供される方法を実施するための組合せ物も提供される。また、本明細書では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と非特異的結合化合物とを含む組合せ物も提供される。いくつかの組合せ物は、非特異的結合相手を含む試験ストリップをさらに含む。また、本明細書では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と、非特異的結合表面を含む固体支持体とを含む組合せ物も提供される。このような組合せ物はまた、固体支持体を含む試験ストリップも含み得る。また、本明細書では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とサンプル採取デバイスとを含む組合せ物も提供される。本明細書で提供される組合せ物はまた、サンプル採取デバイスも含み得る。
【００８６】
また、本明細書では、本明細書で提供される組合せ物を含み、任意にさらに使用説明書を含むキットも提供される。また、本明細書では、本明細書で提供される組合せ物、およびまた、複数の閾値に対して対象を分類するための系を含むキットも提供される。
【００８７】
また、本明細書では、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、そのコンジュゲートを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の領域に局在させること、および対象内のコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法も提供され、ここで、この癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ領域と結合する結合相手、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡ領域と結合する結合相手である。また、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出し、それにより、対象における腫瘍組織を造影することによって、対象において腫瘍組織を造影する方法も提供される。また、本明細書では、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出し、それにより、対象における腫瘍細胞または癌細胞を造影することによって、対象において癌細胞を造影する方法が提供される。
【００８８】
また、本明細書では、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、そのコンジュゲートを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の子宮頸組織または細胞に局在させること、および対象内のコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象の子宮頸組織または細胞における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、対象の子宮頸組織または細胞において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法も提供される。また、本明細書では、対象の子宮頸組織または細胞における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出し、それにより、その対象における癌性子宮頸細胞の存在を示すことによって、対象において癌性（例えば、過形成または悪性新生物性）子宮頸細胞の存在を示す方法も提供される。また、対象の子宮頸組織または細胞における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出し、それにより、その対象における腫瘍性子宮頸組織または癌性子宮頸細胞を造影することを含む、対象において腫瘍性子宮頸組織または癌性子宮頸細胞を造影する方法も提供される。
【００８９】
本明細書で提供される方法では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、上記のように癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域と特異的に結合することができる。本明細書で提供される方法では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は抗体、またはそのフラグメント、または核酸分子であり得る。
【００９０】
本明細書で提供される方法では、腫瘍組織または細胞としては、例えば、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、甲状腺癌、下垂体癌、眼の癌、脳の癌、口腔癌、皮膚癌、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、肉腫および神経芽腫が挙げられる。
【００９１】
本明細書で提供される方法では、このコンジュゲートは静脈投与、局所投与、または経口投与することができる。いくつかの方法では、この造影法は、例えば、磁気共鳴画像法、超音波画像法、蛍光画像法、シンチグラフィー、コンピューター断層撮影法、コンピューター体軸断層撮影法、陽電子放射型断層撮影法、単光子放射コンピューター断層撮影法、超音波断層撮影法およびＸ線断層撮影法であり得る。いくつかの方法では、造影部分は、例えば、蛍光部分、放射性核種、磁気検出可能な同位元素または化合物、超音波造影剤、発色団、ラテックスマイクロスフェア、または量子ドットであり得る。
【００９２】
また、本明細書では、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に局所投与し、それにより、そのコンジュゲートを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象の表面に局在させること、および対象におけるコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法も提供される。また、本明細書では、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによって、対象における癌細胞の存在を示す方法も提供され、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、対象における癌細胞の存在を示す。いくつかの方法では、子宮頸表面の癌細胞が示される。
【００９３】
本明細書で提供される対象を処置する方法はまた、対象における癌細胞の位置を示すこと、および対象に処置用フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、その処置結合相手を、癌胎児性フィブロネクチンを含む対象内の領域に局在させ、それにより、局在した処置用結合相手が癌細胞の細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害することを含み得る。このようないくつかの方法では、癌は子宮頸癌であり、癌細胞は子宮頸悪性、新生物性または過形成細胞である。
【００９４】
また、本明細書では、対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、その結合相手を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の領域に局在させ、それにより、局在した結合相手が細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害し、それにより、その結合相手によって引き起こされる細胞死または細胞増殖阻害が、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を処置することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を処置する方法が提供され、ここで、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は治療部分とコンジュゲートされていない。また、本明細書では、対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、その結合相手を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の領域に局在させ、それにより、局在した結合相手が細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害し、それにより、その結合相手によって引き起こされる細胞死または細胞増殖阻害が、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を処置することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を処置する方法が提供され、ここで、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手核酸分子、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ領域と結合する結合相手、およびフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡ領域と結合する結合相手である。いくつかの方法では、対象の腫瘍組織または悪性、過形成または新生細胞はもはや増殖しないものである。
【００９５】
また、本明細書では、対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、その結合相手を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の領域に局在させ、それにより、局在した結合相手が細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害し、それにより、その結合相手によって引き起こされる細胞死または細胞増殖阻害が、対象における癌性子宮頸細胞の増殖を停止させることによって、子宮頸癌対象を処置する方法も提供される。また、本明細書では、対象における癌性子宮頸細胞の増殖を停止させ、それにより、対象における腫瘍性子宮頸組織を処置することによって、対象における腫瘍性子宮頸組織を処置する方法も提供される。
【００９６】
いくつかの方法では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、上記のように癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡ領域、ＥＤＢ領域またはＩＩＩＣＳ領域と特異的に結合する。いくつかの方法では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は抗体、またはそのフラグメント、または核酸分子である。
【００９７】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、腫瘍組織または細胞は、例えば、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、甲状腺癌、下垂体癌、眼の癌、脳の癌、口腔癌、皮膚癌、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、肉腫および神経芽腫に由来するものである。
【００９８】
いくつかの方法では、この結合相手は静脈投与、局所投与、または経口投与可能である。いくつかの方法では、この結合相手は治療部分とコンジュゲートされている。このようないくつかの方法では、治療部分は例えば、生物毒素、サイトカイン、光増感剤、毒素、抗癌抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、結合相手および生物発光化合物である。
【００９９】
また、本明細書では、対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を局所投与し、それにより、その結合相手を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象の表面に局在させること、および対象におけるコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象における癌細胞の存在を示すことによって、対象において癌細胞の存在を示す方法も提供される。また、本明細書では、対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を局所投与し、それにより、その結合相手を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象の表面に局在させ、それにより、局在した結合相手が細胞死を誘導するか、または細胞増殖を阻害し、それにより、その結合相手により引き起こされる細胞死または細胞増殖阻害が対象における腫瘍増殖を阻害することによって、対象において腫瘍組織を処置する方法も提供される。このようないくつかの方法では、子宮頸表面の癌細胞が処置される。
【０１００】
また、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関して試験し、それにより、そのサンプルにおいて、存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法も提供される。本明細書で示されるように、このような方法は種々の適用に使用することができ、その例は下記の段落に挙げられている。
【０１０１】
いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における癌細胞を示す方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、対象における癌細胞の存在を同定する。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象の癌発達リスクを決定する方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、その対象の新生物性、悪性または転移細胞の発達リスクを同定する。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における癌細胞の発達を予測する方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、対象が癌細胞を発症する可能性を同定する。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における癌細胞の攻撃性を評価する方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、それらの癌細胞を悪性として同定する。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における癌性疾患の処置の結果を予測する方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、癌性疾患の処置が成功すると予測されることを示す。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における癌性疾患の処置の結果を予測する方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、癌の処置が不成功であると予測されることを示す。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における癌性疾患の処置をモニタリングする方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、癌性疾患の処置が有効であることを示す。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における癌性疾患の処置をモニタリングする方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、癌性疾患の処置が有効でないことを示す。
【０１０２】
いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、細胞由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出することによって、細胞が癌化するリスクを決定するための方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、細胞が癌化するリスクを同定する。いくつかの方法では、これらの細胞は異常形態を有する。いくつかの方法では、これらの細胞は異形成細胞である。
【０１０３】
また、本明細書では、対象の癌を処置すること、および処置した対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、癌の発達を抑制することによって、対象において癌の発達を抑制するための方法も提供される。また、本明細書では、対象の癌を処置すること、および処置した対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、癌の再発を抑制することによって、対象において癌の再発を抑制するための方法も提供される。
【０１０４】
いくつかの方法では、癌細胞は、例えば、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、甲状腺癌、下垂体癌、眼の癌、脳の癌、口腔癌、皮膚癌、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、肉腫および神経芽腫細胞である。
【０１０５】
また、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子について試験し、それにより、存在するとすれば、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法も提供される。本明細書で示されるように、このような方法は、種々の適用に使用することができ、その例は下記の段落に挙げられている。
【０１０６】
いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象の全般的な健康状態を決定する方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、その対象が無病でないことを示す。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在について試験することによって、対象が無病であると決定する方法で使用することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の不存在が、その対象が無病であることを示す。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在について試験することを含む、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題に関して対象をスクリーニングする方法で使用することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が、その対象が癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を有することを示す。いくつかの方法では、この疾病は例えば、癌、妊娠関連障害、関節炎、糖尿病性網膜症およびデュプュイトラン拘縮である。いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在を試験する前に、その対象は疾病を有すると診断されていない。いくつかの方法は、疾病を同定するために１以上の付加的試験を行うことをさらに含む。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における関節炎の存在を示す方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、対象における関節炎の存在を同定する。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象における糖尿病性網膜症を示す方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、対象における糖尿病性網膜症の存在を同定する。いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することによって、対象におけるデュプュイトラン拘縮を示す方法で使用することができ、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、対象におけるデュプュイトラン拘縮の存在を同定する。
【０１０７】
いくつかの方法では、サンプルは例えば、尿、リンパ、リンパ液、血液、血漿、血清、唾液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、滑液、精液、精漿、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、洗浄液、組織、腹腔液、腹水および汗である。いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、例えば、質量分析、サンドイッチアッセイ、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、ＦＲＥＴ、蛍光偏光、蛍光測定法、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法、蛍光in situおよびin vivo画像法などの方法により検出される。いくつかの方法では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸および癌胎児性フィブロネクチンと優先的に結合する自己抗体である。
【０１０８】
本明細書では、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチンの存在、または上昇したレベルを特徴とする健康障害の診断、造影および／または処置を含む、明細書で提供されるいずれかの方法のための薬剤の製造に用いる本明細書で提供されるいずれかの製品の使用が提供される。
【０１０９】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のための方法および検出方法で用いるサンプルを得るための方法が提供される。また、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンまたはその指標となる分子の検出方法で用いる製品も提供される。
【０１１０】
本明細書では、１以上の第一のサンプル成分を１以上の第二のサンプル成分から分離する条件下でサンプルを処理すること（ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントは、存在するとすれば、１以上の第一のサンプル成分にある）、および癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントをその分子量により検出することによって、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための方法が提供される。
【０１１１】
このような方法では、その処理工程は、サンプルを、固体支持体上に固定されているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させてその複合体を形成されること、およびその後、その複合体から癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを遊離させるために固体支持体を処理することをさらに含むことができ、その検出工程は、遊離した癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを検出することをさらに含むことができる。いくつかの方法では、この検出工程は、検出された癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントの分子量を算出することをさらに含み得る。本明細書で提供される方法では、この検出工程は、検出された第一のサンプル成分を１以上の参照と比較することをさらに含むことができ、ここで、検出された第一のサンプル成分に一致する参照がフィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントに相当する。本明細書で提供される方法はまた、結合相手から癌胎児性フィブロネクチン指標分子を遊離させるために固体支持体を処理する前に、結合相手と特異的に結合していないサンプル成分から固体支持体を分離する条件下で固体支持体を処理することを含み得る。本明細書で提供されるいくつかの方法では、検出の前、サンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させた後に、この方法は、サンプルをフラグメンテーション試薬と接触させる工程をさらに含む。このような方法では、このフラグメンテーション試薬はプロテアーゼまたはヌクレアーゼであり得る。いくつかの方法では、このフラグメンテーション試薬は第二の固体支持体上に固定されており、サンプルをフラグメンテーション試薬と接触させる工程は、サンプルを第二の固体支持体と接触させることさらに含む。いくつかの方法では、検出の前、サンプルをフラグメンテーション試薬と接触させた後に、この方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを第二の固体支持体から遊離させる条件下でサンプルを処理する工程をさらに含む。いくつかの方法では、第二の固体支持体からの癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントの遊離は、マトリックス支援レーザー脱離またはエレクトロスプレー脱離によって達成される。
【０１１２】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントの質量に相当する質量が、例えば、１４ｋＤａ、３５ｋＤａ、５５ｋＤａ、６５ｋＤａ、８５ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、２００ｋＤａまたは２３５ｋＤａであり得る方法も提供される。いくつかの方法では、この癌胎児性フィブロネクチン結合相手はＩＩＩＣＳと結合し、サンプルはトリプシンと接触させ、そして癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントの質量に相当する質量は、例えば、５５ｋＤａ、６５ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、２００ｋＤａまたは２３５ｋＤａであり得る。他のいくつかの方法では、この癌胎児性フィブロネクチン結合相手はＩＩＩＣＳと結合し、サンプルはカテプシンＤと接触させ、そして癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントの質量に相当する質量は、例えば、８５ｋＤａまたは１１０ｋＤａであり得る。他のいくつかの方法では、この癌胎児性フィブロネクチン結合相手はＥＤＢと結合し、サンプルはサーモライシンと接触させ、そして癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントの質量に相当する質量は、例えば、３５ｋＤａ、８５ｋＤａまたは１２０ｋＤａであり得る。他のいくつかの方法では、この癌胎児性フィブロネクチン結合相手はＩＩＩＣＳと結合し、サンプルはアクロモバクタープロテアーゼＩと接触させ、ここで癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントの質量に相当する質量は１４ｋＤａである。
【０１１３】
本明細書で提供されるいくつかの方法は、サンプル中のＲＮＡからＤＮＡを分離することをさらに含む。このような方法は、サンプルを、癌胎児性フィブロネクチンをコードするヌクレオチド配列に相補的なプライマーと接触させること（このプライマーはサンプル中のＲＮＡと接触する）、およびそのサンプルを１以上の核酸合成工程で処理することをさらに含む。いくつかの方法では、このプライマーは、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡに相補的である。いくつかの方法では、第一の核酸合成工程は、逆転写酵素による核酸合成を含む。このようないくつかの方法では、この結合相手は癌胎児性フィブロネクチンをコードするヌクレオチド配列、癌胎児性フィブロネクチンをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはそのフラグメントと特異的に結合する。
【０１１４】
本明細書で提供される方法はまた、その結合相手が、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＡ領域をコードするヌクレオチド配列、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＡ領域をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＢ領域をコードするヌクレオチド配列、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＢ領域をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、癌胎児性フィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域をコードするヌクレオチド配列、癌胎児性フィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはそのフラグメントと特異的に結合する場合の方法も対象とすることができる。
【０１１５】
本明細書では、別の態様として、サンプルを、固体支持体に固定されている第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、その固体支持体を第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、その固体支持体を第三のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、ならびにサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子と第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、および第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手か、第三のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手のいずれか、あるいはその双方との間で形成された複合体を検出し、複合体の検出が、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となり、かつ、ここで、第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、および第三のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手のうち少なくとも１つが癌胎児性フィブロネクチン結合相手であることにより、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法が提供される。いくつかの方法では、この第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のある領域と結合し、それは例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ、またはその組合せであり得る。いくつかの方法では、この第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ以外の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のある領域と結合する。いくつかの方法では、この第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳまたはその組合せなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域と結合する。いくつかの方法では、第三の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳまたはその組合せなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域と結合する。いくつかの方法では、この第二および第三の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳまたはその組合せなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域と結合し、ここで、この第二および第三の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、同じ癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域とは結合しない。いくつかの方法は、サンプルを第四のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることをさらに含む。このようないくつかの方法では、この第四の胎児または癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳまたはその組合せなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域と結合する。いくつかの方法では、この第二、第三および第四の胎児または癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳまたはその組合せなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域と結合し、ここで、この第二、第三および第四の胎児または癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、同じ癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域とは結合しない。
【０１１６】
ＩＩＩＣＳ部分は、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０のいずれであってもよい。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分であるとき、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の翻訳後修飾を認識することができる。一局面では、この翻訳後修飾は、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化である。
【０１１７】
一局面では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳを欠いているものとして同定される。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が欠失型として同定される場合、このＩＩＩＣＳの部分は、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５、ＩＩＩＣＳアミノ酸９０〜１２０またはその双方である。
【０１１８】
いくつかの方法では、複合体は、核酸合成反応の産物を測定することにより検出される。いくつかの方法では、第一の結合相手は試験ストリップに固定されている。
【０１１９】
本明細書では、別の態様として、サンプルを第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、そのサンプルを第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、およびサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子と、第一の胎児または癌胎児性フィブロネクチン結合相手および第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手との間で形成された複合体をフローサイトメトリーにより検出し、複合体の検出が、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となることにより、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法が提供される。いくつかの方法では、複合体は、第一の結合相手と第二の結合相手との空間的近接を検出することにより検出される。いくつかの方法では、複合体は、２つの空間的に近接したシグナルを検出することにより検出され、ここで、第一の検出シグナルは第一の結合相手から生じたものであり、第二の検出シグナルは第二の結合相手から生じたものである。いくつかの方法では、この第一の結合相手と第二の結合相手は、細胞表面の同じかまたは異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合される。
【０１２０】
本明細書で提供される方法では、サンプルは、例えば、組織もしくは細胞サンプル、または液体サンプルであり得る。組織もしくは細胞サンプルは、次のもののいずれであってもよい：肺、乳房、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、子宮頸、子宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、甲状腺、下垂体、眼、脳、口腔、皮膚、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、肉腫、神経芽腫、精液、便およびその画分または成分。液体サンプルは、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、洗浄液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、母乳、滑液、精漿、痰、脳脊髄液、涙、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、腹腔液、腹水、汗、リンパ液、およびその画分または成分などの体液または組織であり得る。いくつかの方法では、サンプルは検出工程前に１以上の試薬で処理される。いくつかの方法は、複合体から癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを除去する工程の前に、結合相手と結合していないサンプル成分を除去することをさらに含む。
【０１２１】
本明細書で提供される方法では、結合相手はエネルギー吸収部分を含み得る。いくつかの方法では、この除去工程は、紫外線マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法、赤外線マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法、またはエレクトロスプレーイオン化法により達成される。いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントは、限定されるものではないが、タイム・オブ・フライト型、フーリエ変換型、または磁気セクター／磁気偏向型などの質量分析法により検出される。本明細書で提供されるいくつかの方法は、結合相手と結合している癌胎児性フィブロネクチン指標分子からのシグナルを増強する工程をさらに含み得る。本明細書で提供される方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を定量することをさらに含み得る。
【０１２２】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題のリスクを決定するか、または健康問題を同定するか、あるいは切迫出産または早産の高いリスクを示す。
【０１２３】
いくつかの態様では、対象由来のサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンに特異的な自己抗体の存在を検出することによって、対象において癌胎児性フィブロネクチンを示す方法が提供され、ここで、サンプルにおける抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の存在が、その対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す。いくつかの方法は、本明細書で提供される方法に従って、対象由来のサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンに特異的な自己抗体の存在を検出することにより、被験者において癌胎児性フィブロネクチン関連の健康問題を示すことを含んでもよく、ここで、サンプルにおける抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の存在が、その対象における癌胎児性フィブロネクチン関連の健康問題の存在を示す。いくつかの方法は、本明細書で提供される方法に従って、対象由来のサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンに特異的な自己抗体の存在を検出することにより、被験者において癌胎児性フィブロネクチンを示すことを含んでもよく、ここで、サンプルにおける抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の存在が、その対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す。このような方法は、サンプルを抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体結合相手と接触させること、およびその結合相手と抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の間で形成された複合体を検出することをさらに含み得る。
【０１２４】
また、本明細書では、本明細書で提供される方法に従って、対象における癌胎児性フィブロネクチンに特異的な自己抗体の存在を示すことによって、対象において癌胎児性フィブロネクチン関連の健康問題を示すための方法も提供され、ここで、対象における抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の存在が、対象における癌胎児性フィブロネクチン関連の健康問題の存在を示す。このようないくつかの方法では、結合相手は癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメント、またはヒト抗体と特異的に結合する抗体、もしくはそのフラグメントである。いくつかの方法はさらに第二の結合相手を含み、この第二の結合相手は癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメント、またはヒト抗体と特異的に結合する抗体、もしくはそのフラグメントである。
【０１２５】
本明細書で提供される方法は、サンプルを非特異的結合化合物と、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子がその非特異的結合化合物とは実質的に結合しない条件下で接触させる方法も含み得る。いくつかの方法では、サンプルを固体支持体の非特異的結合表面と、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子がその非特異的結合表面とは実質的に結合しない条件下で接触させる。いくつかの方法では、この非特異的結合表面は、そこに固定されている非特異的結合化合物を含む。いくつかの方法では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の１０％以下しか非特異的結合化合物または表面と結合しない。いくつかの方法は、サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対するバックグラウンド物質の非特異的結合を低減する溶液と接触させることをさらに含み得る。いくつかの方法では、結合相手と接触させた際のサンプルのイオン強度は５０μ〜３５０μまたは約５０μ〜約３５０μの範囲である。いくつかの方法は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対するサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特異的結合を増強する溶液とサンプルを接触させることをさらに含み得る。いくつかの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の相対量を高める工程をさらに含み得る。いくつかの方法は、癌胎児性フィブロネクチン結合相手と非特異的に結合するサンプル中のバックグラウンド物質の量を低下することをさらに含み得る。
【０１２６】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、サンプルは、例えば、尿、洗浄液、母乳、頸膣スワブ、唾液、血清、血漿、血液および間質液である。いくつかの方法では、検出工程前に１以上の試薬を尿サンプルに加える。いくつかの方法では、この非特異的結合化合物は、例えばアルブミン、カゼイン、ウシ胎児血清、ゼラチンおよび癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的には結合しない抗体であってよく、例えば、非特異的結合化合物はメチル化ウシ血清アルブミンであり得る。
【０１２７】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、そのサンプルが採取された対象を、癌性（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞を有するものと同定する。このようないくつかの方法では、癌性（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞は、膀胱、腎臓、前立腺、子宮頸または卵巣に起源のものである。特定の方法では、この癌細胞は膀胱起源のものである。
【０１２８】
本明細書で提供される他の方法では、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、そのサンプルが採取された対象を切迫出産または早産の高いリスクを有するものと同定する。このようないくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルにより、そのサンプルが採取された対象を分娩誘発に成功する可能性が高いものと同定する。このような方法は、対象を分娩誘発に成功する可能性が高いものと同定するため、また、対象に誘発処置を施すために使用することができる。誘発成功の可能性は次のもののいずれかによって示すことができる：癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発時に経膣分娩の可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発開始と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、分娩促進薬の投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、オキシトシンの投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が高いこと；癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が高いこと；および癌胎児性フィブロネクチン陰性であり、かつ／または誘発結果の第二の指標に関して陰性の結果を有する対象よりも、対象に予備誘発剤を２回以上投与する可能性が低いこと、およびそれらの組合せ。この誘発結果の第二の指標は、妊娠対象の測定値または所見、胎児の測定値または所見、および妊娠対象の病歴のいずれであってもよい。このような指標としては、限定されるものではないが、子宮頸長、ビショップスコア、展退、出産歴、子宮口の開大、妊娠齢、肥満度指数、位置、硬度、経膣超音波、および指診、またはその組合せが挙げられる。
【０１２９】
いくつかの方法では、第一の結合相手は、限定されるものではないが、金属コロイド、光検出可能なラテックスマイクロスフェア、発色団、蛍光部分、量子ドットおよび検出可能な酵素などの部分とコンジュゲートされている。いくつかの方法は、サンプルを、第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合する結合相手と接触させることをさらに含む。このようないくつかの方法では、この第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合する結合相手は抗体または核酸分子である。
【０１３０】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、抗フィブロネクチン抗体、またはそのフラグメントである。いくつかの方法では、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、抗フィブロネクチン抗体、またはそのフラグメントである。
【０１３１】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、複合体は、第一の結合相手が第二の結合相手と空間的に近接しているかどうかを決定することにより検出され、第一の結合相手と第二の結合相手が空間的に近接して検出されたとき、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン分子の存在を示す。このようないくつかの方法では、空間的近接は、非放射性エネルギー移動反応の結果として検出される。このようないくつかの方法では、非放射性エネルギー移動反応は、例えば、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）である。
【０１３２】
本明細書で提供される方法では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的な核酸分子、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に対する自己抗体、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体、およびそのフラグメントであり得る。
【０１３３】
いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が閾値レベル未満であるとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陰性として分類する。いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が閾値レベル以上である場合に、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類する。このようないくつかの方法では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は癌胎児性フィブロネクチンタンパク質であり、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値レベルは５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１３４】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出量は１以上の閾値と比較され、ここで、サンプルは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出量以下である最高閾値に従って分類される。このようないくつかの方法では、第一の閾値は５０ｎｇ／ｍＬであり、第二の閾値は１５０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの方法では、サンプルが採取される対象は妊娠しており、その１以上の閾値レベルは切迫(imminent)妊娠終了の高い可能性に相当する。
【０１３５】
いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の複合体は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを検出することにより測定される。いくつかの方法では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、質量分析またはゲル電気泳動により検出される。いくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手との複合体は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を検出することにより測定される。このような方法では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、蛍光、反射率、吸収、生物発光、酵素と結合した検出可能なシグナル、または放射性崩壊を検出することにより検出される。いくつかの方法では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は試験ストリップに固定されている。
【０１３６】
本明細書で提供される方法は、上記のように、そのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ特異的部分、ＥＤＢ特異的部分、またはＩＩＩＣＳ特異的部分と結合する場合の方法を含み得る。
【０１３７】
また、本明細書では、試験ストリップも提供される。試験ストリップの例としては、固体支持体上に固定されている第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む分析物結合領域が挙げられる。このような試験ストリップは非特異的結合領域を含むことができ、ここで、この分析物結合領域は、非特異的結合領域よりもサンプル液流経路の下流にある。いくつかの試験ストリップは、サンプル適用部品としての働きをするコンジュゲートパッド、デバイスから連続的に液体を吸い出す働きをする吸収パッド（ここで、この膜系の物質は単一の液流経路を形成する）、ならびにこの吸収パッドおよびコンジュゲートパッドと液体が流通する多孔性または吸水性部材（この多孔性または吸水性部材は液体サンプルを収容し、分子の相互作用が生じた際に固体支持体として働き、この多孔性または吸水性部材は分析物結合領域を含む）をさらに含み得る。いくつかの試験ストリップは、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む可動化領域もさらに含むことができ、この第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、サンプルとの接触時に可動化され、かつ、この可動化領域は分析物結合領域の上流にある。いくつかの試験ストリップは、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合する分子を含む対照領域もさらに含むことができ、この対照領域は分析物結合領域の下流にある。いくつかの試験ストリップでは、第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンよりも癌胎児性フィブロネクチンと結合する。いくつかの試験ストリップでは、この非特異的結合領域は、固体支持体に固定されている非特異的結合タンパク質を含み、この非特異的結合タンパク質は例えば、ＢＳＡ、メチル化ＢＳＡ、Ｗ６３２またはマウスＩｇＧである。
【０１３８】
また、本明細書では、第一の結合相手とサンプル採取デバイスを含む組合せ物も提供される。本明細書で提供される組合せ物は、第一の結合相手と固体支持体を含み得る。本明細書で提供される組合せ物は、第一の結合相手と第二の結合相手を含み得る。本明細書で提供される組合せ物は、第一の結合相手と非特異的結合化合物を含み得る。本明細書で提供される組合せ物は、第一の結合相手と分娩促進薬を含み得る。本明細書で提供される組合せ物はまた、非特異的結合化合物も含み得る。また、本明細書では、本明細書で提供される組合せ物を含み、さらに使用説明書および／またはサンプルを１以上の閾値レベルに従って分類するための系を含むキットも提供される。
【０１３９】
本明細書では、別の態様として、質量分析基板とその基板上に固定されているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するためのプローブが提供される。いくつかのプローブでは、この基板は、限定されるものではないが、ガラス、金属、セラミック、テフロンコート磁気物質、有機高分子、生体高分子および無機高分子などの物質を含む。
【０１４０】
また、本明細書では、サンプルを、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質よりも癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合する第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、サンプルを、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質よりも癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合する第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、および癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と、第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手または第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手のいずれか、または双方の結合相手との複合体を検出し、それにより、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の２つのドメインの存在または不存在を決定することにより、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を特性決定する方法も提供される。このような方法では、サンプル中の個々の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の２つのドメインの存在または不存在が決定される。
【０１４１】
また、本明細書では、サンプルを、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質よりも癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合する第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、サンプルを、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質よりも癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合する第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、サンプルを、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質よりも癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合する第三の癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、および癌胎児性フィブロネクチンと、第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手、第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手および第三の癌胎児性フィブロネクチン結合相手のいずれかの組合せとの複合体を検出し、それにより、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の３つのドメインの存在または不存在を決定することによって、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を特性決定する方法も提供される。このような方法では、サンプル中の個々の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の３つのドメインの存在または不存在を決定することができる。いくつかの方法では、第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、ＥＤＡドメイン、ＥＤＢドメイン、ＩＩＩＣＳドメイン、またはその組合せを含む癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と優先的に結合する。このようないくつかの方法では、第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、ＥＤＡドメイン、ＥＤＢドメイン、ＩＩＩＣＳドメイン、またはその組合せを含む癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と優先的に結合し、ここで、この第一の結合相手と第二の結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の同じ領域とは結合しない。このようないくつかの方法では、第三の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、ＥＤＡドメイン、ＥＤＢドメイン、ＩＩＩＣＳドメイン、またはその組合せを含む癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と優先的に結合し、ここで、この第一、第二および第三の結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の同じ領域とは結合しない。いくつかの方法では、複合体は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、またはそのフラグメントを測定することにより検出される。このようないくつかの方法では、癌胎児性フィブロネクチンを１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手から解離させ、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、またはそのフラグメントの質量を測定する。いくつかの方法では、複合体は、１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を検出することにより測定される。このようないくつかの方法では、第一、第二および／または第三の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、蛍光、反射率、吸収、生物発光、酵素と結合した検出可能なシグナルまたは放射性崩壊を検出することにより測定される。いくつかの方法では、少なくとも１つの癌胎児性フィブロネクチン結合相手が固体支持体に固定されている。
【０１４２】
また、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を２以上の閾値レベルと比較すること、およびサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量以下である最高閾値レベルに従って、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を分類することによって、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンのレベルを分類するための方法も提供される。このようないくつかの方法では、各閾値レベルは、サンプルが採取された対象に関する、急迫出産および／または切迫出産の高いリスク、高い分娩日予測能力、妊娠を継続する低い可能性、早産防止方法の使用による増加した利点、分娩誘発の成功の高い可能性、所定の期間内に分娩する高い可能性、癌性（例えば、悪性新生物性）疾患の存在、癌性疾患の発症または癌性疾患の再発の高いリスク、より速い癌性疾患の進行、または癌性疾患の高い攻撃性、または癌性疾患療法の低い有効性と相関がある。いくつかの方法では、１つの閾値レベルは、約５０ｎｇ／ｍＬまたは５０ｎｇ／ｍＬであるか、約１５０ｎｇ／ｍＬまたは１５０ｎｇ／ｍＬである。
【０１４３】
また、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、その測定されたサンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を閾値レベル１５０ｎｇ／ｍｌと比較すること、およびその癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であるとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類し、そうではないとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陰性として分類することによって、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性または陰性として分類するための方法も提供される。また、本明細書では、サンプルを第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手および第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、ならびに癌胎児性フィブロネクチン、第一の結合相手および第二の結合相手の複合体の形成を、非放射性エネルギー移動からの蛍光を検出することにより測定することによって、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法も提供される。いくつかの方法では、この非放射性エネルギー移動は、蛍光エネルギー移動（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）により生じたものである。いくつかの方法では、結合相手は蛍光色素または量子ドットとコンジュゲートされている。
【０１４４】
また、本明細書では、サンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させること、癌胎児性フィブロネクチン指標分子および結合相手の複合体の形成を、複合体形成の指標となる蛍光偏光を検出することにより測定することによって、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための方法も提供される。いくつかの方法では、蛍光偏光の測定値が、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を示す。いくつかの方法では、蛍光偏光の測定値が複合体の質量を示す。いくつかの方法では、この結合相手は蛍光色素または量子ドットとコンジュゲートされている。
【０１４５】
本明細書で提供されるいくつかの方法は、サンプルを接触させる前に、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を、蛍光色素または量子ドットとコンジュゲートされた癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体と接触させることをさらに含むことができ、ここで、シグナル消失または変化は、サンプルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合相手の複合体形成を示す。
【０１４６】
また、本明細書では、白血球結合相手と結合されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含むコンジュゲートも提供される。このようないくつかのコンジュゲートでは、この白血球結合相手は天然のキラー細胞結合相手である。いくつかのコンジュゲートでは、この白血球結合相手は抗体である。いくつかのコンジュゲートでは、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はＦＤＣ−６である。
【０１４７】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントの分子量を質量分析により検出し、それにより、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出することによって、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための方法も提供される。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメント、または癌胎児性フィブロネクチン核酸もしくはそのフラグメントであり得る。
【０１４８】
本明細書では、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチンの存在、または上昇したレベルを特徴とする健康障害の診断、造影および／または処置を含む、本明細書で提供されるいずれかの方法のための薬剤の製造に用いる本明細書で提供されるいずれかの製品の使用が提供される。
【０１４９】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のための方法および検出方法で用いるサンプルを得るための方法が提供される。また、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンまたはその指標となる分子の検出方法で用いる製品も提供される。
【０１５０】
移植用の受胎産物の適性を評価し、移植用の受胎産物を選択するための方法が提供される。癌胎児性フィブロネクチンを産生する受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチンを産生しない受胎産物よりも高い成功率で移植法に使用することができる。
【０１５１】
本明細書では、移植用の受胎産物を評価するための方法が提供される。これらの方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するために受胎産物サンプルを調べることを含み、サンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性である受胎産物が移植に適している。また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するために１以上の受胎産物サンプルを調べること、および癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプル得られた移植用の受胎産物を選択することによって、移植用受胎産物を選択するための方法も提供される。
【０１５２】
このようないくつかの方法では、サンプルが癌胎児性フィブロネクチン陰性である受胎産物は移植に適さない。いくつかの方法では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として同定する。他の方法では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が所定の閾値レベル以上であるとき、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として同定する。この閾値レベルは、受胎産物を移植することを示すと予め決定されたレベルであり得る。本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子がフィブロネクチンＩＩＩ結合セグメント（ＩＩＩＣＳ）、ＥＤＡもしくはＥＤＢセグメント、またはＩＩＩＣＳ、ＥＤＡもしくはＥＤＢと特異的に結合する自己抗体を含む場合が提供される。
【０１５３】
本明細書で提供される方法のいくつかの態様では、２以上の受胎産物からのサンプルをアッセイし、サンプルがより多量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む第一の受胎産物が、サンプルが少量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか含まない第二の受胎産物よりも移植に適しているとして同定される。本明細書で提供される方法の他の態様では、第一の受胎産物サンプルを調べた後、同じ受胎産物からの第二の受胎産物サンプルを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するために調べるが、ここで、第二のサンプルが第一のサンプルよりも多くの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる受胎産物が移植に適している。このような態様では、２以上の各受胎産物から２以上のサンプルをアッセイし、サンプルがより高い増加率の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を含む第一の受胎産物が、より低い増加率の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を含むか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の低下量を含む第二の受胎産物よりも移植に適しているとして同定される。受胎産物の移植適性は癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が増すにつれ高まり、あるいは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の増加率の上昇が移植用の受胎産物の適性を示し得る。
【０１５４】
本明細書で提供される方法では、受胎産物サンプルは、受胎産物抽出物、受胎産物の外部に由来するサンプル、および受胎産物由来細胞の抽出物の中から選択される。いくつかの方法では、サンプルは、受胎産物サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を調べる工程の前に、試薬で処理し、かつ／または分画することができる。サンプルの一例として、受胎産物の外部に由来するサンプルは、単一の受胎産物が培養された培養培地の抽出物である。
【０１５５】
本明細書で提供される方法は、付加的な母体マーカーまたは受胎産物マーカーを決定することをさらに含むことができ、ここで、有利な付加的マーカーを有する癌胎児性フィブロネクチン陽性受胎産物は、移植に有利な受胎産物として同定される。このような方法では、この付加的マーカーは受胎産物サンプルにおいて検出することができるか、受胎産物の視診により決定することができるか、または母体サンプルにおいて検出することができる。付加的マーカーの例としては、受胎産物の遺伝子組成、受胎産物の遺伝子発現、および受胎産物の形態の中から選択される。付加的マーカーが受胎産物の形態である場合の方法では、この受胎産物の形態は細胞数、フラグメンテーションの程度、細胞の規則正しさ、対称性、前核の形態、卵胞の大きさ、卵胞液の量、多核細胞の形成、液胞の存在、粒度およびそれらの組合せなどの因子に従って等級付けすることができる。
【０１５６】
本明細書では、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチンの存在、またはレベルの上昇を特徴とする健康障害の診断、造影および／または処置を含む、本明細書で提供されるいずれかの方法のための薬剤の製造に用いる本明細書で提供されるいずれかの製品の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】ドメイン構成、タンパク質相互作用部位、タンパク質分解部位およびリガンド相互作用部位を含むフィブロネクチンの概略図を示す。この図は、Pankov et al., J. Cell Science 2002 115:3861−3863が発表したものを複写したものである。
【図１Ａ】ドメイン構成、タンパク質相互作用部位、タンパク質分解部位およびリガンド相互作用部位を含むフィブロネクチンの概略図を示す。この図は、図１の一部を示したものである。
【図１Ｂ】ドメイン構成、タンパク質相互作用部位、タンパク質分解部位およびリガンド相互作用部位を含むフィブロネクチンの概略図を示す。この図は、図１の一部を示したものである。
【図１Ｃ】ドメイン構成、タンパク質相互作用部位、タンパク質分解部位およびリガンド相互作用部位を含むフィブロネクチンの概略図を示す。この図は、図１の一部を示したものである。
【図２】癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出用の試験ストリップ例の上面図である。
【図３】癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出用の試験ストリップ例の側面図である。
【図４】癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出用の試験ストリップホルダー例を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５８】
詳細な説明
概要
Ａ．定義
Ｂ．癌胎児性フィブロネクチンの検出
Ｃ．フィブロネクチンの構造および特性
１．フィブロネクチンの構造的特徴
２．フィブロネクチンの結合特性およびタンパク質分解
３．癌胎児性フィブロネクチン
ａ．癌胎児性フィブロネクチンの構造的特徴
ｂ．癌胎児性フィブロネクチンと結合する分子
ｃ．癌胎児性フィブロネクチンのタンパク質分解
Ｄ．生物マーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンの使用
１．妊娠の指標
ａ．早産の可能性
ｂ．早産の防止
ｃ．分娩日の予測因子
ｄ．誘発分娩との併用
ｉ．誘発方法および化合物
ｉｉ．誘発後の測定
ｅ．受胎産物の指標
ｉ．受胎産物による癌胎児性フィブロネクチン産生の検出
ｉｉ．生殖医療技術関連の使用
ｉｉｉ．測定後の工程
ａ．癌胎児性フィブロネクチン産生の増強
ｂ．癌胎児性フィブロネクチン産生に基づく受胎産物の同定
ｉ．受胎産物の選択
ｉｉ．選択基準
ｃ．癌胎児性フィブロネクチンと併用される他のマーカー
ｉ．受胎産物マーカー
ｉｉ．母体マーカー
ｉｖ．幹細胞関連の使用
２．癌の指標
ａ．膀胱癌
ｂ．乳癌
ｃ．子宮頸癌
ｄ．卵巣癌
ｅ．前立腺癌
ｆ．肺癌
ｇ．結腸直腸癌
ｈ．その他の癌
３．健康状態の評価
４．その他の健康問題
ａ．関節炎
ｂ．糖尿病性網膜症
ｃ．デュプュイトラン拘縮
Ｅ．サンプルの採取
１．スワブおよび頸膣サンプル
２．洗浄液サンプル
ａ．サンプル採取
ｂ．洗浄液
ｃ．洗浄による標識の適用
ｄ．管洗浄
ｉ．サンプル採取
ｉｉ．管への標識の適用
ｉｉｉ．洗浄液
３．尿サンプルの採取
ａ．サンプルの取扱い
ｂ．サンプル条件の改変
ｉ．イオン強度
ｉｉ．イオン強度試験
ｉｉｉ．ノーマライゼーション
ｃ．サンプルの処理
ｉ．非特異的結合
ｉｉ．濾過
４．間質液
Ｆ．癌胎児性フィブロネクチンの検出方法
１．癌胎児性フィブロネクチンを検出する化合物および組成物
ａ．癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す分子
ｂ．癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチン部分
ｃ．癌胎児性フィブロネクチンに対する、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に体する自己抗体
ｄ．結合相手
ｉ．抗体
ａ．癌胎児性フィブロネクチンに対する抗体
ｂ．抗体と標識のコンジュゲーション
ｉｉ．核酸分子
ｉｉｉ．自己抗体に対する結合相手
ｉｖ．その他の結合相手
ｖ．癌胎児性フィブロネクチンの領域と結合する結合相手
ｅ．非特異的結合剤
２．結合相手と複合体を形成した癌胎児性フィブロネクチンを検出するためのアッセイ
ａ．溶液検出
ｉ．複合体形成の指標となるシグナル
ｉｉ．複合体に相当する分子量
ｂ．固定サンプル
ｉ．ドットブロット分析
ｉｉ．ウエスタンブロット分析
ｉｉｉ．サザンおよびノーザンブロット分析
ｉｖ．in situ分析
ａ．組織または臓器サンプル
ｂ．対象での検出
ｃ．対象の処置
ｃ．固定結合相手
ｉ．サンドイッチアッセイ
ｉｉ．試験デバイス
ａ．試験ストリップ
ｂ．試験ストリップハウジング
ｃ．試験デバイスによる分析
ｉｉｉ．定量
ｉｖ．癌胎児性フィブロネクチンの親和性に基づく単離
ｄ．癌胎児性フィブロネクチン領域の検出
３．質量分析による癌胎児性フィブロネクチンの検出
ａ．サンプル操作
ｉ．結合相手との接触
ｉｉ．フラグメンテーション化合物との接触
ａ．トリプシンによるタンパク質分解
ｂ．カテプシンＤによるタンパク質分解
ｃ．サーモライシンによるタンパク質分解
ｄ．アクロモバクタープロテアーゼＩによるタンパク質分解
ｉｉｉ．固体支持体
ｉｖ．コンディショニング
ｖ．サンプル操作工程の組合せ
ｂ．質量分析用基板
ｃ．質量分析
ｉ．気相におけるイオン形成
ｉｉ．検出
ｉｉｉ．サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンを検出するための質量分析の使用
ａ．直接測定
ｂ．シグナル増強を行う場合
ｉｖ．癌胎児性フィブロネクチン領域の検出
ｖ．癌胎児性フィブロネクチンの定量
４．核酸分子の検出
ａ．検出方法
ｂ．ＲＮＡの検出
ｉ．逆転写
ｉｉ．ｃＤＮＡの増幅
ｉｉｉ．その他の成分
ｉｖ．核酸合成工程
ｖ．検出
ａ．ＤＮＡ検出法
ｂ．定量
ｃ．癌胎児性フィブロネクチン領域の検出
５．癌胎児性フィブロネクチンに対する自己抗体の検出
６．その他の分析物の測定
ａ．ノーマライゼーション
ｂ．その他のマーカーとの組合せ
ｉ．破水の指標
ａ．インスリン様増殖因子結合タンパク質
ｂ．次亜塩素酸
ｉｉ．エストリオール
ｉｉｉ．その他の腫瘍指標
Ｇ．検出測定値の解析
１．定量
２．閾値
３．組織起源の同定
Ｈ．組合せ、プローブ、コンジュゲートおよびキット
Ｉ．実施例
【０１５９】
Ａ．定義
特に他に記載のない限り、本明細書で用いる技術用語および科学用語は全て、当業者が共通に理解しているものと同義である。本明細書の開示の全体に引用されている特許、特許出願、公開出願および公報、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、ウェブサイトならびにその他の刊行物は全て、特に他に記載のない限り、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。本明細書の用語に関して複数の定義が存在するときは、本節の定義が優先する。引用がＵＲＬまたは他のそのような識別子もしくはアドレスで示されているときは、そのような識別子は変更されることがあり、インターネット上の特定の情報は移り変わることがあるが、同等の情報が既知であり、インターネットおよび／または適当なデータベースを検索するなどにより容易に入手できるものと理解される。それらの引用はそのような情報が入手可能であること、および広く流布していることを証明するものである。
【０１６０】
本明細書において、フィブロネクチンとは、単一の遺伝子によってコードされている高分子量の糖タンパク質の一ファミリーを意味する。フィブロネクチンは血漿およびその他の体液中には可溶形態で、また、細胞外マトリックス中には細胞様形態で存在する。このフィブロネクチンファミリーには少なくとも１２のイソ型が含まれる。これらは単一の遺伝子の一次転写物の領域における選択的スプライシングから（例えば、配列番号３７参照)、また、一般にはＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ領域における翻訳後修飾から生じるものである。ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ（Ｖ６４スプライス変異体）領域を含む典型的なフィブロネクチンタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３８に示されている。配列番号１５は、完全なＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ（Ｖ１２０スプライス変異体）ドメインを含むフィブロネクチンのアミノ酸配列を示す。
【０１６１】
細胞フィブロネクチンおよび血漿フィブロネクチンは多くの場合、類似のポリペプチドを含むヘテロ二量体として存在する。選択的スプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体の少なくとも２つの領域で起こり、内部一次配列に変異を生じる。これにより、フィブロネクチンサブユニット間に違いが生じる(Kornblihtt et al. EMBO J. 4(7): 1755−1759 (1985))。血漿フィブロネクチンは、一般にフィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）領域を欠失している。細胞フィブロネクチンは、細胞内内容物および細胞外内容物に依存して、ＥＤＡおよび／またはＥＤＢを含むかまたは含まない。もう１つの可変領域であるフィブロネクチンＩＩＩ結合セグメント（ＩＩＩＣＳ）領域は特定のフィブロネクチンに、選択的スプライシングのために変異型で見られる。このコード核酸は複数のスプライス部位を含み、Ｖ０、Ｖ１２０、Ｖ９５、Ｖ８９およびＶ６４と呼ばれるものを含むヒト変異体をもたらす（例えば、Khan et al. Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science 45(1): 287−295 (2004)参照）。
【０１６２】
癌胎児性フィブロネクチンと呼ばれるフィブロネクチンは細胞フィブロネクチンのサブセットを構成する。これらの癌胎児性フィブロネクチンは１以上のＥＤＡ、ＥＤＢおよび／またはＩＩＩＣＳ領域を含むか、またはそのコード遺伝子の選択的スプライシングにより末端切断型のフィブロネクチンを産生するなど、発現または変化した発現により癌胎児性フィブロネクチンであるものと決定される（例えば、Schor et al. (2003) Cancer Research 63:8827−883参照；例えば、配列番号２６および２７参照）。癌胎児性フィブロネクチンは正常な細胞および組織よりも腫瘍細胞において、また、胎児細胞および組織でも、高いレベルで発現する場合があり(Kaczmarek et al. Int. J. Cancer 58: 11−16 (1994); Castellani et al., Int. J. Cancer 59: 612−618 (1994);およびTavian et al. Int. J. Cancer 56: 820−825 (1994))、あるいは腫瘍細胞または特定の疾病を有する対象の他の細胞および組織においても選択的スプライシングにより産生され得る。フィブロネクチンはまた腫瘍と関係し、突然変異により転移能を獲得することもある。例えば、単一の点突然変異を含むフィブロネクチンを含む腫瘍細胞は、野生型フィブロネクチンを発現する腫瘍細胞よりもフィブロネクチンマトリックスの形成能が低下し、転移能が高まることが分かっている(Wang et al., J. Exp. Med., 195: 1397−1406 (2002))。
【０１６３】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチンとは、特徴的なドメインおよび／または発現パターンを共通に持つ、フィブロネクチンタンパク質のヘテロなサブセットを意味する。癌胎児性フィブロネクチンは一般に細胞フィブロネクチンである。腫瘍細胞および組織では、この細胞外ドメイン部分は切断（shed）されるか（例えば、Mardon et al., J. Cell Sci. 104: 783−792 (1993)参照）、またはそのコード核酸のスプライシングが変更される場合がある。癌胎児性フィブロネクチンは、腫瘍、他の病態に関与する組織または細胞、ならびに胎児細胞または組織（胎児フィブロネクチンとも呼ばれる）において発現されるか、またはそれらによって遊離（shed）されるフィブロネクチンを含む。ゆえに、癌胎児性フィブロネクチン、典型的には細胞フィブロネクチンは、特定のスプライス変異体の発現により、疾病状態および妊娠関連状態と関連して検出され、過剰発現またはタンパク質分解切断または他の機構によりそのような組織および細胞からの発現および／または遊離が増強され得る。
【０１６４】
本明細書の目的では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、エキストラドメインＡ（ＥＤＡ）、エキストラドメインＢ（ＥＤＢ）、もしくはフィブロネクチンＩＩＩ結合セグメント（ＩＩＩＣＳ）、またはそのいずれかの組合せを含むか、あるいは腫瘍細胞および組織における選択的スプライシングまたは翻訳後修飾事象の結果として産生され、例えば末端切断型フィブロネクチンが産生される。この癌胎児性フィブロネクチン群は、フィブロネクチン内のこれら３つの領域（ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ）の選択的スプライシングから、また、翻訳後修飾およびそのコード核酸のスプライシングにおけるその他のバリエーションから生じるフィブロネクチンを含む。癌胎児性フィブロネクチンのスプライシングおよび発現は、細胞および組織において種々の発達段階で示差的に調節される。胎児組織において、また、いくつかの異常な細胞および組織において、フィブロネクチンの発現は癌胎児性フィブロネクチンと呼ばれるものを産生するように変更されているか、または癌胎児性フィブロネクチンの発現が、対応する正常な成体細胞および組織よりも増強されている。いくつかの正常な成体細胞、組織およびサンプル種においては、癌胎児性フィブロネクチンは抗体アッセイによって検出可能な量では存在しない。よって、癌胎児性フィブロネクチンの検出のためには、検出された量を対照または所定の量と比較することにより、癌胎児性フィブロネクチンの異常なレベルを決定することができる。ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ領域（それぞれ、配列番号４、６および８）ならびにそのコード核酸分子（それぞれ、配列番号３、５および７）を含むヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は当技術分野で公知のものであり、公開データベースで入手することができる。ヒトＥＤＡ領域の配列例は、配列番号２のアミノ酸残基１４３２〜１６２１としても示される。ヒトＥＤＢ領域の配列例は、配列番号２のアミノ酸残基９６３〜１１０９としても示される。ヒトＩＩＩＣＳ領域の配列例は、配列番号２のアミノ酸残基１８３０〜１９４９としても示される。
【０１６５】
典型的な癌胎児性フィブロネクチンのアミノ酸配列およびそのコード核酸分子の配列は、配列番号１、１４、１６、１８、２０、２２、２４および２６で示され、コードされるアミノ酸分子は配列番号２、１５、１７、１９、２１、２３、２５および２７で示される。抗体に基づくアッセイによって検出されたように、正常な組織および細胞には一般に存在しない癌胎児性フィブロネクチン変異体の例としては、ＩＩＩＣＳスプライシング領域におけるＯ−グリコシル化により生じた癌胎児性フィブロネクチン、ならびに例えば、それぞれ配列番号２５および２４で示されるアミノ酸配列およびコード核酸分子の配列などのフィブロネクチンを含む癌胎児性ＥＤ−Ｂが挙げられる（例えば、Kaczmarek et al. Int. J. Cancer 58: 11−16 (1994); Castellani et al., Int. J. Cancer 59: 612−618 (1994); Midulla et al., Cancer Res. 60:164−169 (2000)参照）。
【０１６６】
完全なヒトｆｎ１遺伝子の核酸配列は、配列番号３７で示されている。例えば、ラット、マウス、ニワトリ、ウシおよびアフリカツメガエルなどの様々な種のタンパク質およびコード核酸分子が知られており、公開データベースで容易に入手することができる。癌胎児性フィブロネクチンは、ハイブリドーマ（American Type Culture CollectionにＡＴＣＣ ＨＢ ９０１８として寄託；また、１９９０年１月１６日に公開されたMatsuura et al.の米国特許第４，８９４，３２６号も参照）により産生されるＦＤＣ−６モノクローナル抗体と特異的に結合するフィブロネクチンを含む（例えば、Matsuura and S. Hakomori, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6517−6521 (1985)参照）。
【０１６７】
フィブロネクチンＩＩＩ結合セグメント（ＩＩＩＣＳ）は、特定の組合せで発現され得る３つの独立したスプライス領域を含み、これにより、癌胎児性フィブロネクチンに存在するＩＩＩＣＳ領域の大きさおよび配列は様々に異なる。これら３つのセグメントは２５個のアミノ酸のＮ末端セグメント、６４個のアミノ酸の中央セグメントおよび３１個のアミノ酸のＣ末端セグメントをコードし、６４個のアミノ酸、８９個のアミノ酸、９５個のアミノ酸、または１２０個のアミノ酸を含み得るＩＩＩＣＳ領域が生じる。典型的な配列は、それぞれ配列番号３５、３３、３１および２９で示され、これらはそれぞれ配列番号３４、３２、３０および２８で示される核酸配列によりコードされている。
【０１６８】
癌胎児性フィブロネクチンは、１以上の抗癌胎児性フィブロネクチン抗体の特異的結合によって同定することができる。このような抗体は、非癌胎児性フィブロネクチンとは低い親和性でしか結合しないか、または結合しない。様々な抗癌胎児性フィブロネクチン抗体が当技術分野で公知であり、例えば、ＩＳＴ−９(Carnemolla et al., FEBS Lett. 215:269−273 (1987); Accurate Chemical ＆ Sci. Corp., Westbury, NYから入手可能)、ＤＨ１(Vartio et al., J. Cell Sci. 88:419−430 (1987))、ＢＣ−１(Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108:1139−1148 (1989))、Ｌ１９(米国特許出願第２００３０１７６６６３号)、ＭＥ４Ｃ（Giovannoni et al., Nucleic Acids Res. 29:e27 (2001); ＭＥ４Ｃ ｓｃＦｖ組換え抗体の核酸コード配列およびアミノ酸配列はそれぞれ配列番号９および１０で示される；これらの配列はまたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２９７９６０としても入手可能）、Ａ１３４(Islami et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 97:40−45 (2001))、ＦＤＣ−６（米国特許第４，８９４，３２６号；ＡＴＣＣ ＨＢ ９０１８)、５Ｃ１０(Mandel et al., APMIS 100:817−826 (1992))、ならびにＸ１８Ａ４、Ｘ２０Ｃ４およびＸ８Ｅ３（米国特許第５，５２３，２２９号；それぞれＡＴＣＣ ＨＢ−１１５８７、ＨＢ−１１５８９およびＨＢ−１１５８８）が挙げられる。癌胎児性フィブロネクチンと特異的かつ優先的に結合する抗体もまた作製可能である。このような抗癌胎児性フィブロネクチン抗体の作製方法は、米国特許第４，８９４，３２６号およびＷＯ０２／４６４５５に例示されているように、当技術分野で公知のものである。
【０１６９】
癌胎児性フィブロネクチンは、インテグリン、ヘパリンまたは抗フィブロネクチン抗体などのほとんどの、または全てのフィブロネクチンと結合するフィブロネクチン結合相手を用いて捕捉することができるか、あるいは癌胎児性フィブロネクチンは、抗癌胎児性フィブロネクチン抗体などの癌胎児性フィブロネクチン結合相手を用いて捕捉することができる。
【０１７０】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチンのマーカーとしての使用とは、癌胎児性フィブロネクチンの検出を意味する。これは、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンもしくはその相補物をコードする核酸分子、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子と特異的に結合する自己抗体、および癌胎児性フィブロネクチンの指標となるそのフラグメントを含むいずれかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出を意味する。
【０１７１】
本明細書において、胎児限定抗原（fetal-restricted antigen）とは、妊婦に独特に、または妊婦ではない人と比べて実質的に多量に存在する抗原を意味する。胎児限定抗原は、母体の血清、血漿、尿、唾液、汗、涙および他の体液中に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチンは胎児限定抗原を含む場合があり、胎盤、羊水および胎児結合組織に見られる。
【０１７２】
本明細書において、結合相手とは、特定の分子または分子種と特異的に結合する化合物である。結合相手としては、タンパク質、核酸分子、炭水化物、脂質、リガンド、薬物、イオンおよび特定の分子と特異的に結合することができる他のいずれの化合物も含み得る。フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、フィブロネクチンタンパク質またはフィブロネクチンをコードする核酸またはその相補物に対する自己抗体、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸に対する自己抗体、フィブロネクチンをコードする核酸またはその相補物、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸またはその相補物、およびこれらいずれかのフラグメントを含む、いずれのフィブロネクチン指標分子とも特異的に結合する。
【０１７３】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチン結合相手とは、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と特異的に結合する分子、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸に対する自己抗体、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸またはその相補物、およびこれらいずれかのフラグメントである。特に、癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳなどの癌胎児性フィブロネクチンに独特な癌胎児性フィブロネクチン指標分子の部分と結合し、また、ＦＮＩＩＩ９領域のような、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質および核酸分子に存在する癌胎児性フィブロネクチンの部分とも結合することができ、このような領域の結合は、その分子中にＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳが存在することによって起こる（例えば、Carnemolla et al. J. Biol. Chem. 267:24689−24692 (1992)参照）。
【０１７４】
本明細書において、結合相手の選択的結合とは、結合相手が特定の分子に、他の分子に対するよりも少なくとも約２倍、一般には少なくとも約５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上倍率の高い親和性（ＫａまたはＫｅｑ）で、あるいは他の分子に対するよりも少なくとも２倍、一般には少なくとも５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれを超える倍率の高い親和性（ＫａまたはＫｅｑ）で結合することを意味する。結合親和性定数を検出および決定するため、または結合選択性を決定するための典型的な条件としては、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）などの生理学的条件が挙げられる。特異的に結合する結合相手は、一般に少なくとも約１０７ｌ／ｍｏｌ、１０８ｌ／ｍｏｌまたはそれを超える結合親和性Ｋａで結合する。一般に、結合相手とは、選択的かつ特異的に結合する結合相手を意味する。
【０１７５】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と優先的に結合する化合物とは、非癌胎児性フィブロネクチン分子と結合するよりも優先して癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合する化合物であり、その優先性は、少なくとも約２倍の高い親和性、典型的には少なくとも約５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれを超える倍率の高い親和性、または少なくとも２倍の高い親和性、一般には少なくとも５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれを超える倍率の高い親和性として表すことができる。優先的結合は選択的であり、また、一般には特異的であり、交差反応性の非特異的結合は約２５％未満または１０％未満、一般には約５％未満、または２５％未満もしくは１０％未満、一般には５％未満しか示さない。例えば、ＦＤＣ−６などの抗体は非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質よりも癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に優先的に結合するが、これはＦＤＣ−６が、ＩＩＩＣＳを含む癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と、ＦＤＣ−６がＩＩＩＣＳ領域を含まないフィブロネクチンタンパク質と結合するよりもはるかに高い親和性で結合することができるためである。このような結合を行うため、または優先的結合を決定するための典型的な条件としては、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）などの生理学的条件が挙げられる。
【０１７６】
本明細書において、非癌胎児性フィブロネクチンとは、本明細書の方法によって検出した場合に、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳドメインを含まない、またはコードしていないフィブロネクチンタンパク質または核酸分子を意味する。
【０１７７】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とは、癌胎児性フィブロネクチンの発現または存在と関連するいずれかの分子を意味する。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子としては、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそのフラグメント、ＲＮＡまたはｃＤＮＡなどの癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸もしくはその相補物、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体またはその抗体フラグメント、およびそれらの１つ、または複数のフラグメントが挙げられる。
【０１７８】
本明細書において、癌とは、無制御の身体の異常な細胞増殖を意味し、良性腫瘍とは異なり、これらは周囲組織へ浸潤し、血流やリンパ系を通じて身体の離れた部位に拡散する傾向を有する。癌とはまた、周囲の組織へ浸潤し、身体の新たな部位へ転移する傾向を有する未分化細胞の増殖を特徴とする種々の悪性新生物を意味する。癌は固形腫瘍または血液性癌であり得る。本明細書において、腫瘍とは、無制御の進行性細胞増幅から生じ、生理作用を持たない組織の異常な増殖または新生物を意味する。本明細書において、癌細胞とは、無制御で身体において異常な増殖を示す悪性新生物性、未分化、転移、過形成、異形成、新生物性、悪性腫瘍（固形または血液性）細胞を意味する。癌は、肺、前立腺、膀胱、子宮頸、腎臓または子宮組織の癌であり得る。
【０１７９】
本明細書において、新生物とは組織の新たな異常な増殖を意味し、悪性腫瘍などの癌性のものであり得る。
【０１８０】
本明細書において、新生物性疾患とは、身体における新生物の存在によってもたらされる疾患を意味する。
【０１８１】
本明細書において、転移とは、身体の他の部分への癌細胞の移動を意味する。本明細書において、過形成とは、肥大をもたらす、臓器または組織の細胞数の異常な増加を意味する。本明細書において、新生物および異形成とは、組織、臓器または細胞の異常な増殖を意味する。本明細書において、悪性とは、癌性または転移傾向を意味する。本明細書において、未分化とは、分化が不十分となった細胞を意味する。
【０１８２】
本明細書において、白血病とは、血液細胞の癌を意味する。白血球の無制御な増殖が起こる骨髄の種々の急性または慢性新生物性疾患ではいずれの場合も、通常、貧血、血液凝固障害、ならびにリンパ節、肝臓および脾臓の肥大を伴う。白血病は、幹細胞のＤＮＡの突然変異によって骨髄細胞が異常に複製する際に起こる。本明細書において、骨髄幹細胞とは、赤血球および白血球へと分化する未分化の幹細胞を意味する。白血病は、異常な白血球の過剰生産、骨髄の過密化、および末梢血への溢出を特徴とする。種々のタイプの白血病がリンパ節、脾臓、肝臓、中枢神経系およびその他の臓器および組織へ拡散する。
【０１８３】
本明細書において、リンパ腫とは、一般に、リンパ節またはその他のリンパ組織に生じる悪性腫瘍である。
【０１８４】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチンの検出とは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出を意味し、限定されるものではないがタンパク質分解もしくはＰＣＲなど、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の方法を用いてフラグメントを生じさせることができる。この表現に関してさらに、当業者ならば、本明細書に明示されていなくとも、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはフラグメントを検出するための方法が、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、またはそのフラグメント、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸に対する自己抗体、またはその抗体フラグメントなどの他の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するためにも使用可能であることを認識している。癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するためにどの方法を選択するかはデザイン選択の問題であり、当業者ならば、検出する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の性質（例えば、タンパク質、核酸）に応じ、どの方法（例えば、ＰＣＲ、質量分析、サンドイッチアッセイ）を選択すればよいかが分かるであろう。
【０１８５】
本明細書において、対象としては、診断、スクリーニング、モニタリングまたは処置が意図されるいずれの動物も含む。動物としては、霊長類および家畜などの哺乳類を含む。霊長類の例としては、ヒトである。患者とは、病態に罹患している、または病態が決定される、または病態のリスクが決定される哺乳類、霊長類、ヒトまたは家畜対象などの対象を意味する。
【０１８６】
本明細書において、サンプルとは一般に、分析物アッセイが実施される分析物を含むいずれのものも意味する。例えば、サンプルは、対象由来の検体であってよく、ここでは、その検体における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在が、例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法を用いて決定される。サンプルは無処理形態（例えば、改変無し）で使用することもできるし、あるいはバッファーなどの１以上の試薬の添加により、かつ／または１以上の分画もしくは分離工程により改変することもできる。サンプルは、生物学的サンプルもしくは体液サンプルまたは生物学的組織サンプルなどの生物学的サンプルであり得る。生物学的サンプルもしくは体液サンプルの例としては、尿、リンパ、血液、血漿、血清、唾液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、母乳、滑液、精液、精漿、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、腹腔液、腹水、汗、リンパ液、肺痰および洗浄液またはそれらに由来するサンプル（例えば、試薬で改変し、かつ／または分画したサンプル）が挙げられる。尿サンプルは無処理または冷凍物であり得る。液体サンプルは、それが放出される際に分析することもできるし（例えば、尿流ディップスティック）、容器に採取することもできるし、あるいはスワブで採取することもできる。スワブサンプルの例としては、限定されるものではないが、可能性のある頸膣病巣点、子宮頸管、子宮頸口、外頸部、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域（すなわち、扁平円柱上皮接合部）、膣、後膣円蓋、後膣円蓋より下部の膣部分（膣の下三分の一など）、陰唇、またはそれらの組合せのスワブを含む、頸膣スワブサンプルが挙げられる。生物学的組織サンプルは、結合組織、上皮組織、筋肉組織および神経組織を含む、ヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造の構造物質の１つを形成する細胞間物質とともに、通常は特定の種類の細胞の凝集物を含むサンプルである。生物学的組織サンプルの例としてはまた、臓器（例えば、乳房）、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞も含む。例えば、サンプルは、癌性であると疑われる組織サンプルであり得る。本明細書において上記液体種または組織または細胞サンプルという場合には、試薬で改変したサンプルおよび分画したサンプルも含む。従って、頸膣サンプルという場合には、バッファー処理した頸膣サンプルも含み、また、組織サンプルという場合には、その組織のホモジネートの上清も含む。
【０１８７】
本明細書において、ノーマライズ分析物とは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を、サンプル中の１以上のノーマライゼーション分析物の濃度に従ってノーマライズするために用いられる分析物を意味する。ノーマライズ剤としては、例えば、クレアチニンがある。膣スワブサンプルでは、例えば、サンプルは、後膣円蓋または後膣円蓋より下部の膣部分（例えば、膣の下三分の一など）を含む膣のいずれかの部分のスワブであり得る。
【０１８８】
本明細書において、後膣円蓋より下部とは、膣前庭と膣前庭より上部であるが、後膣円蓋より下部の膣領域（これは膣円蓋、膣の下三分の一および膣括約筋を含み得る）を含む膣部分を意味する。従って、後膣円蓋より下部の膣スワブとは、膣前庭と膣前庭より上部であるが、後膣円蓋より下部の膣領域（これは膣円蓋、膣の下三分の一および膣括約筋を含み得る）のスワブを意味する。陰唇スワブの場合、このスワブは小陰唇または大陰唇からのものであってよく、一般には小陰唇のスワブを含む。
【０１８９】
本明細書において、頸膣分泌液とは、子宮頸分泌液、膣分泌液またはそれらの組合せを含み得る。
【０１９０】
本明細書において、in vivo法とは、対象の生体内で行われる方法を意味する。
【０１９１】
本明細書において、コンジュゲートまたはある部分とコンジュゲートされた結合相手とは、ある部分に結合された結合相手を含む複合体を意味し、ここでは、結合相手とその部分の間の結合は、水素結合または静電気相互作用などの１以上の共有結合または非共有結合的相互作用から生じたものであり得る。コンジュゲートはまた、結合相手とその部分を接続するリンカーを含み得る。コンジュゲートの範囲内には、固体支持体などの支持体上に固定されている結合相手も含まれる。コンジュゲートの例としては、検出可能な標識などの検出可能な部分、または結合可能な化合物などの結合可能な部分とコンジュゲートされた結合相手が挙げられる。
【０１９２】
本明細書において、検出可能な部分または造影部分とは、本明細書で提供されるいずれかの方法において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を造影するために用いられる部分を意味する。造影部分としては、例えば、蛍光部分、放射性核種、磁気検出可能な同位元素または化合物、超音波造影剤、発色団、ラテックスマイクロスフェア、または量子ドットが挙げられる。
【０１９３】
本明細書において、固体支持体などの支持体上に固定されている結合相手とは、共有結合的または非共有結合的相互作用によって支持体に結合された結合相手を意味する。支持体への結合は、結合相手と支持体を接続するリンカーによって達成することもできるし、あるいは結合相手を直接支持体に結合させることもできる。
【０１９４】
本明細書において、検出可能な標識または検出可能な部分とは、原子、分子または組成物の存在が直接的または間接的に測定可能な原子、分子または組成物を意味する。このような標識は、例えば、視診、蛍光分光法、反射率測定、フローサイトメトリー、または質量分析により検出することができる。検出可能な標識の直接検出とは、その部分自体のエネルギーまたは粒子放出または吸収などの物理的現象の測定を意味する。間接検出とは、検出可能な部分と直接的または間接的に結合する原子、分子または組成物の、エネルギーまたは粒子放出または吸収などの物理的現象の測定を意味する。間接検出の例では、検出可能な標識はビオチンであってよく、これはアビジンと結合させることにより検出することができ、アビジンは、アビジンを、フルオレセインと結合させた第二のビオチン分子と結合させることにより検出することができる。よって、検出可能な標識または検出可能な部分の範囲内には結合可能な標識または結合可能な部分が含まれ、それらは原子、分子または組成物を意味し、その原子、分子または組成物の存在は、その標識または部分が別の原子、分子または組成物と結合した結果として検出することができる。
【０１９５】
検出可能な標識はフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とコンジュゲートさせることができるか、あるいはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合することができる。例えば、金コロイドまたはラテックスマイクロスフェア中の色素などの検出可能な標識を、抗癌胎児性フィブロネクチン抗体とコンジュゲートさせることができる。別の例では、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体などの検出可能な標識は、マウスＩｇＧ抗体フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合することができる。
【０１９６】
本明細書において、結合(bind, bound and binding)とは、１０−２〜１０−１５モル／Ｌ、一般に、１０−６〜１０−１５、１０−７〜１０−１５および典型的には１０−８〜１０−１５の範囲のＫｄ（かつ／または１０５〜１０１２、１０７〜１０１２、１０８〜１０１２Ｌ／モルのＫａ）での原子間または分子間の結合を意味する。
【０１９７】
本明細書において、複合体とは一般に、種間の相互作用の性質（すなわち、イオン的、共有結合的、または静電気的）を問わず、２種以上の間の結合を意味する。
【０１９８】
本明細書において、質量分析は、当業者に公知のいずれの質量分析形式も包含する。特に、質量分析とは、一連または三連四重極モード（ＭＳ／ＭＳ）のタイム・オブ・フライト型、フーリエ変換型、誘導結合型プラズマ型、イオントラップ型、磁気セクター／磁気偏向型装置を含み、また、それらの組合せも含み得る。質量分析器としてタイム・オブ・フライト型（ＴＯＦ）の構成を用いる場合には、ＳＥＬＤＩおよびＭＡＬＤＩ型質量分析が特に注目される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析は、Hillenkamp et al., ”Matrix Assisted UV−Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules,” Biological Mass Spectrometry, (Burlingame and McCloskey, editors), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 49−60 (1990))によって紹介されたものである。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ法は、Merchant et al., Electrophoresis 21:1164−1177 (2000)に要約されている。
【０１９９】
本明細書において、脱離(desorb, desorbed and desorbing)とは、ある種をその種の表面および／または注入口から気相中へ送り出すことを意味する。特に、分析物は、例えば、紫外線（ＵＶ）および赤外線（ＩＲ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ；例えば、公開国際ＰＣＴ出願ＷＯ９９／５７３１８および米国特許第５，１１８，９３７号参照）、電解脱離（ＦＤ）または高速原子衝突（ＦＡＢ）など、種々の技術のいずれかを用いて基板から脱離させることができる。ＭＡＬＤＩ脱離／イオン化法では、多くのマトリックス／レーザーの組合せが使用できる。その他の脱離法としては、表面増強無処理脱離（surface−enhanced neat desorption, SEND；例えば、米国特許第５，８９４，０６３号参照）および表面増強感光性結合および遊離（surface−enhanced photolabile attachment and release, SEPAR;例えば、米国特許第６，１２４，１３７号参照)がある。
【０２００】
本明細書において、質量分析に関してイオン化とは、気相中で電荷を有する粒子を作り出す方法を意味する。イオン化法としては、上記で示したＳＥＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ、ＦＤおよびＦＡＢなどの脱離法が挙げられる。イオン化法はまた、エレクトロスプレー（ＥＳ）、電子衝撃（ＥＩ）および化学的イオン化（ＣＩ）などの非脱離的方法も含む。ＥＳ法では、水または揮発性バッファーに溶解させたサンプルを大気圧イオン化インターフェース（ＡＰＩ）中に連続的または断続的に注入する。このようなイオンは四重極により分析される質量となり得る。複数のイオンピークを生じさせれば（ＥＳ型質量分析を用いて得ることができる）、質量決定の精度を高めることができる。
【０２０１】
本明細書において、マトリックス物質とは、質量分析基板上で乾燥させた際に、マトリックスに包埋されている分析物の分子が固相（例えば、水晶）から気相または蒸気相へと上手く脱離およびイオン化され、無傷な分子イオンとして加速されるような方式で、溶液中で分析物（例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子）と混合可能な数種の小さな光子吸収化合物のいずれかを意味する。ＭＡＬＤＩ法では、サンプルを化学マトリックスの調製溶液と混合し（例えば、マトリックスとサンプルのモル比は約１０，０００：１、または１０，０００：１）、質量分析基板上に置き、乾燥させればよい。あるいは、サンプルを、マトリックスを含んだ質量分析基板上に置いた後、乾燥させてもよい。飽和付近の濃度のマトリックスが高倍過剰で存在すれば、分析物の結晶形性および捕捉が容易となる。
【０２０２】
本明細書において、エネルギー吸収分子とは、質量分析基板の表面に存在するときに、その後の検出のために、固相（すなわち、プローブの表面）から気相または蒸気相への分子の正味の脱離を容易にする数種の小さな光子吸収化合物のいずれをも意味する。
【０２０３】
本明細書において、質量分析に用いるときの基板とは、サンプル成分の質量測定の過程でそこからサンプルが脱離およびイオン化される表面として働き得る不溶性の支持体を意味する。
【０２０４】
本明細書において、組合せ物とは、２種以上の集合のいずれかを意味する。
【０２０５】
本明細書において、検出(detect, detected and detecting)とは、一般に、蛍光もしくは吸収などのシグナル、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子もしくは結合相手などの物質の存在を発見または決定する様式のいずれをも意味する。
【０２０６】
本明細書において、洗浄とは、一般に、ある生体領域または表面を液体と接触させることにより、その領域または表面からサンプルを得るための方法を意味する。
【０２０７】
本明細書において、管洗浄とは、一般に、排泄物または分泌物が通過する生体流路からサンプル（例えば、乳房の乳管からのサンプル）を得るための方法を意味する。
【０２０８】
本明細書において、穿刺吸引とは、管腔を含む針を用いてサンプルを得る技術を意味する。この針は一般に皮膚を通って組織に達し、サンプルを採取する（例えば、疑われる腫瘍）。少量の組織液を、一般に遊離細胞とともに針内に抜き取るために針に負圧をかけることができる。次に、針を組織から抜く。穿刺吸引については、例えば、米国特許第５，９６４，７３５号（１９９９年１０月１２日）および同第５，６４５，５３７号（１９９７年７月８日）に記載されている。
【０２０９】
本明細書において、フラグメンテーション化合物とは、タンパク質または核酸分子などの分子をフラグメント化するために使用することができる化合物を意味する。例えば、フラグメンテーション化合物は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸もしくはその相補物をフラグメント化するために使用することができる。フラグメンテーション化合物は、高分子を含む分子、特に生体分子をフラグメント化することができるタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはその他の化合物であり得る。例えば、フラグメンテーション化合物は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質をフラグメント化するために使用することができるプロテアーゼまたはその他の化合物であり得る。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質をフラグメント化するための化合物の例としては、カテプシンＤ、トリプシン、サーモライシン、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（Ｓ−シアニル化のため）、アクロモバクタープロテアーゼ１、黄色ブドウ球菌(S. aureus)Ｖ８プロテアーゼおよびヒドロキシルアミンが挙げられる。別の例では、フラグメンテーション化合物は、ヌクレアーゼ、リボザイム、ＤＮＡザイム、または癌胎児性フィブロネクチン核酸分子またはその相補物をフラグメント化するために使用することができるその他の化合物であり得る。核酸分子をフラグメント化するための化合物の例としては、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、ハンマーヘッドリボザイムおよびＲＮアーゼが挙げられる。
【０２１０】
本明細書において、フラグメントとは、全長種より小さいその種の誘導体を意味する。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のフラグメントは一般に、翻訳されたフィブロネクチンタンパク質に存在するアミノ酸の総量よりも少ないアミノ酸を含むポリペプチドである。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物のフラグメントは一般に、転写された癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に存在する核酸の総量よりも少ない核酸を含むオリゴヌクレオチドである。
【０２１１】
本明細書において、イムノアッセイとは、抗原のエピトープと特異的または優先的に結合する第二の物質（すなわち、結合相手、通常には、抗体、抗体フラグメントまたは抗原結合部位を有する別の物質）と抗原の特異的または優先的結合を用いる方法と定義される。本明細書で提供されるイムノアッセイ方法としては、限定されるものではないが、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、凝集アッセイ、または沈降アッセイを含む、当業者に公知のいずれのものも含む。
【０２１２】
本明細書において、抗体とは、天然型であれ、または部分的もしくは完全に組換えまたは合成生産されたものであれ、免疫グロブリンを意味し、その抗体の特異的結合能を保持するその誘導体も含む。よって、抗体として、免疫グロブリン結合ドメインまたは免疫グロブリン結合ドメインと相同もしくは実質的に相同な結合ドメインを有するタンパク質を含む。本明細書の目的では、抗体としては、軽鎖および重鎖の可変領域からなるＦａｂフラグメントなどの抗体フラグメントを含む。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、いずれの免疫グロブリン種のメンバーも含む。
【０２１３】
本明細書において、モノクローナル抗体とは、ハイブリドーマクローンなどのトランスフェクトまたはクローン化細胞によって分泌される抗体を意味する。このような各ハイブリドーマクローンは、単一のＢ細胞から誘導されることから、全ての抗体分子が同一である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の標準的な方法を用いて作製することができる（例えば、Kohler et al., Nature 256:495−497 (1975), Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511−519 (1976)およびＷＯ０２／４６４５５参照）。例えば、標準的な方法により動物を免疫化して抗体を分泌する体細胞を作出する。これらの細胞を次に、免疫動物から取り出し、骨髄腫細胞と融合させる。
【０２１４】
抗体産生能を有する体細胞、特にＢ細胞を骨髄腫細胞系統との融合のために使用することができる。これらの体細胞は、抗原刺激した動物のリンパ節、脾臓および末梢血から誘導することができる。ハイブリドーマ作出融合法で用いるための特殊な骨髄腫細胞系統がリンパ腫瘍から開発されている(Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511−519 (1976); Shulman et al., Nature, 276:269−282 (1978); Volk et al., J. Virol., 42:220−227 (1982))。これらの細胞系統は３つの有用な特性を有している。第一に、それらは、ハイブリドーマの増殖を助ける選択培地で増殖できないようにする酵素欠損を有することにより、融合していない、また同様に明瞭でない自律増殖する骨髄腫細胞から、融合ハイブリドーマを選択することを容易にする。第二に、それらは抗体産生能を有し、内因性の免疫グロブリン軽鎖または重鎖を産生することができない。第三の特性として、それらは他の細胞と効率的に融合する。ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を作出するための他の方法も当業者に周知である。
【０２１５】
本明細書において、抗体フラグメントとは、全長抗体より小さく、少なくとも全長抗体の特異的結合能の部分を保持している抗体の誘導体を意味する。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、小免疫タンパク質、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディーおよびＦｄフラグメントが挙げられる。このフラグメントは、ジスルフィド架橋などによりともに連結された複数の鎖を含み得る。抗体フラグメントは一般に、少なくとも約５０のアミノ酸、典型的には少なくとも約２００のアミノ酸、または少なくとも５０のアミノ酸、典型的には少なくとも２００のアミノ酸を含む。
【０２１６】
本明細書において、Ｆｖ抗体フラグメントは、非共有結合的相互作用により連結された１つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）と１つの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインからなる。
【０２１７】
本明細書において、ｄｓＦｖとは、ＶＨ−ＶＬ対を安定化させるよう操作された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを意味する。
【０２１８】
本明細書において、ｓｃＦｖとは、いずれの順序でもよいが、ポリペプチドリンカーにより共有結合された可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）と可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む抗体フラグメントを意味する。このリンカーは、この２つの可変ドメインが実質的な支障なく架橋するような長さである。リンカーの例としては、溶解度を高めるためにいくらかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基を散在させた（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ残基がある。
【０２１９】
本明細書において、ダイアボディーは二量体ｓｃＦｖであり、ダイアボディーは一般にｓｃＦｖｓよりも短いペプチドリンカーを有し、それらは優先的に二量体を形成する。
【０２２０】
本明細書において、小免疫タンパク質（ＳＩＰ）は、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインなど、抗体の二量体形成ドメインと結合したｓｃＦｖフラグメントである。例えば、ＳＩＰは、ｓｃＦｖｓを短いリンカーを介してヒト免疫グロビン１γＨ−鎖のＣＨ３ドメインまたはヒトＩｇＥのＣＨ４ドメインなどの類似のドメインと結合させることにより形成することができる（例えば、Li et al., Protein Engineering 10:731−736 (1997)およびBorsi et al., Int. J. Cancer 102:75−85 (2002)参照）。
【０２２１】
本明細書において、Ｆａｂフラグメントは、１つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、１つの可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、１つの定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）および１つの定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを含む抗原結合抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは、免疫グロブリンをパパインで消化することにより作製することができる、Ｆａｂフラグメントはまた、組換え生産することもできる。
【０２２２】
本明細書において、ｈｓＦｖとは、Ｆａｂフラグメントに通常存在する定常ドメインがヘテロ二量体コイルドコイルドメインで置換された抗体フラグメントを意味する。（例えば、Arndt et al. J. Mol. Biol. 7:312:221−228 (2001)参照）。
【０２２３】
本明細書において、Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、２つの可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン、２つの定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）および２つの定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを含む抗体フラグメントである。Ｆ（ａｂ）２は、免疫グロブリンをｐＨ４．０〜４．５にてペプシンで消化することにより作製することができ、Ｆ（ａｂ）２フラグメントはまた、組換え生産することもできる。
【０２２４】
本明細書において、ヒト化抗体とは、ヒトに投与しても免疫応答を誘発しないようにアミノ酸の「ヒト」配列を含むように改変されている抗体を意味する。このような抗体の作製方法は公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づいている抗体を発現するように組換えＤＮＡ技術により変更する。このような領域を同定するコンピュータープログラムは当技術分野で公知のものである。
【０２２５】
本明細書において、自己抗体とは、対象により産生される、その対象の内因性抗原と結合する抗体を意味する。例えば、自己抗体は、対象の腫瘍、癌または癌性症状の存在に応答して産生され得る。自己抗体は、内因性抗原に応答して対象により産生されるが、自己抗体と、組換え技術によるものを含む様々な供給源から産生または取得される試験抗原などの結合相手との反応により検出または測定することができる。抗フィブロネクチン自己抗体とは、フィブロネクチンと特異的に結合する抗体を意味する。抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体とは、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸分子と特異的かつ優先的に結合する抗体を意味し、すなわち、この自己抗体は、非癌胎児性フィブロネクチン分子よりも癌胎児性フィブロネクチン分子と特異的に結合する。
【０２２６】
本明細書において、核酸分子に関して増幅(amplify, amplified and amplifying)とは、ＤＮＡフラグメントなどの特定の核酸分子のコピー数を増すための方法を意味する。特に、増幅(amplify, amplified and amplifying)は、例えば、クローニング、転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および鎖置換などの技術を用いて核酸分子のコピー数を増すプロセスを含む。
【０２２７】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相当する増幅核酸分子とは、いずれかの増幅方法を用い、鋳型核酸分子として癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子を用いて形成された増幅核酸分子を意味する。このような増幅核酸分子は、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子の核酸分子の全部もしくは一部、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的なヌクレオチド分子の全部もしくは一部を含み得る。例えば、増幅核酸分子は、フィブロネクチンのＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域をコードする核酸分子の全部または一部を含み得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する相補物は、フィブロネクチンのＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域をコードする核酸分子に相補的な核酸分子の全部または一部を含み得る。
【０２２８】
本明細書において、変換(convert, converted and converting)とは、ある種が、例えば、化学的、物理的および／または生物的反応を用いて変換されるプロセスを意味する。
【０２２９】
本明細書において、リスクとは、特定の結果の確率が評価される予測プロセスを意味する。
【０２３０】
本明細書において、急迫出産および切迫出産とは、約７日、１４日、２１日、もしくは２８日以内、または７日、１４日、２１日、もしくは２８日以内といった所定の時間枠内での分娩を意味する。
【０２３１】
本明細書において、早産とは、妊娠約２０週〜妊娠約３７週、または妊娠２０週〜妊娠３７週に起こる分娩を意味する。妊娠週数（すなわち、妊娠齢）はいくつかの従来法のうちのいずれかを用いて決定することができる。例えば、妊娠齢は最後の月経の第一日から算出することができる。
【０２３２】
本明細書において、支持体とは、目的の分子、一般には生体分子または有機分子または生体特異的リガンドが結合されているか、または接触している固体または半固体または不溶性の支持体をいずれかを意味する。一般に、支持体はそこに固定されている１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む。支持体物質としては、限定されるものではないが、有機または無機高分子、生体高分子、天然および合成高分子、限定されるものではないが、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、その他のセルロース誘導体、デキストラン、デキストラン誘導体およびデキストラン共重合体、その他の多糖類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、レーヨン、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン(polybutlyene)、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアミド、ビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリスチレンおよびポリスチレン共重合体、ジビニルベンゼンなどと架橋しているポリスチレン、アクリル樹脂、アクリレートおよびアクリル酸、アクリルアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミドブレンド、ビニルとアクリルアミドの共重合体、メタクリレート、メタクリレート誘導体および共重合体、種々の官能基を有するその他のポリマーおよび共重合体、ゴム、ラテックス、ブチルゴムおよびその他の合成ゴム、ケイ素、ガラス（例えば、細孔性ガラス（ＣＰＧ））、シリカゲル、セラミックス、紙、天然海綿、不溶性タンパク質、界面活性剤、赤血球、金属（金属イオン；例えば、スチール、金、銀、アルミニウムおよび銅を含む）、メタロイド、磁気物質（テフロン（登録商標）コート磁気物質および磁性ビーズを含む）、Ｗａｎｇ樹脂、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、セファデックス（登録商標）、セファロース（登録商標）、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、軽石、デンドリマー、バッキーボール、またはその他の市販の媒体といった、化学分子および生物分子の合成および分析のために親和性マトリックスまたは支持体として使用することができるいずれの物質も含む。支持体の例としては、限定されるものではないが、ガラス繊維フィルター、ケイ素表面、ガラス表面、磁性ビーズ、金属表面（スチール、金、銀、アルミニウムおよび銅）およびプラスチック物質などの平滑な支持体が挙げられる。
【０２３３】
この支持体は様々な形態のいずれをとってもよい。例えば、基板はプレート；ホイスカー；単一結晶；セラミックス；自己形成単層；ビーズまたはマイクロビーズ（例えば、シリカゲル、細孔性ガラス、磁気、セファデックス／セファロース、セルロース）；平滑表面またはチップ（例えば、ガラス繊維フィルター、ガラス表面、スライドガラス、金属表面（スチール、金、銀、アルミニウム、銅およびケイ素））；キャピラリー；メンブランまたはマイクロタイタープレート（例えば、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリド、またはニトロセルロース膜またはマイクロタイタープレート）；ピンまたはコーム；ウエハー（例えば、シリコンウエハー）；およびそれらの組合せ（例えば、平滑表面のピンに配置したビーズ）として形成することができる。
【０２３４】
微粒子のとき、一般に、この支持体は少なくとも一寸法が５〜１００μｍの範囲であるか、またはそれより小さい。このような支持体は本明細書ではビーズと総称し、必ずしもそうである必要はないが、多くの場合球形である。しかしながら、このような言及は支持体の幾何学を制約するものではなく、それは無作為な形状、針状、繊維状および細長いものなど、いずれの形状であってもよい。液相（liquid phase）で使用することができるほぼ球形のビーズ、特にマイクロスフェアを採用することができる。ビーズは、付加的成分が本明細書の方法および分析の妨げとならない限り、磁石を用いて分離するために磁性または常磁性粒子（例えば、ダイナビーズ（登録商標）(Dynal, Oslo, Norway)）などの付加的成分を含んでもよい。
【０２３５】
本明細書において、支持体粒子とは、個別粒子の形態である支持体物質を意味する。これらの粒子はいずれの形状および寸法であってもよいが、一般には、少なくとも一寸法が１００ｍｍ以下、５０ｍｍ以下、１０ｍｍ以下、５ｍｍ以下、４ｍｍ以下、３ｍｍ以下、２ｍｍ以下、１ｍｍ以下、９００μｍ以下、８００μｍ以下、７００μｍ以下、６００μｍ以下、５００μｍ以下、４００μｍ以下、３００μｍ以下、２００μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、４０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、４μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下および１０ｎｍ以下である。これらの粒子の大きさは一般に、１００ｍｍ３以下、５０ｍｍ３以下、１０ｍｍ３以下および５ｍｍ３以下、４ｍｍ３以下、３ｍｍ３以下、２ｍｍ３以下および１ｍｍ３以下、９００μｍ３以下、８００μｍ３以下、７００μｍ３以下、６００μｍ３以下、５００μｍ３以下、４００μｍ３以下、３００μｍ３以下、２００μｍ３以下、１００μｍ３以下、５０μｍ３以下、４０μｍ３以下、３０μｍ３以下、２０μｍ３以下、１０μｍ３以下、５μｍ３以下、４μｍ３以下、３μｍ３以下、２μｍ３以下、１μｍ３以下、９００ｎｍ３以下、８００ｎｍ３以下、７００ｎｍ３以下、６００ｎｍ３以下、５００ｎｍ３以下、４００ｎｍ３以下、３００ｎｍ３以下、２００ｎｍ３以下、１００ｎｍ３以下、５０ｎｍ３以下、４０ｎｍ３以下、３０ｎｍ３以下、２０ｎｍ３以下、１０ｎｍ３以下、５ｎｍ３であり、ｎｍ３の大きさであってよく、一般にこれらの粒子の直径は約１．５ミクロン、約１５ミクロン未満、例えば、約４〜６ミクロン、または１．５ミクロン、１５ミクロン未満、例えば、４〜６ミクロンである。このような粒子はビーズと総称する。
【０２３６】
本明細書において、試験ストリップに関して上流とは、少なくとも２つの領域間の関係を表し、第一の領域が第二の領域の上流にある場合には、サンプルが第二の領域と接触する前にサンプルが第一の領域に接触する。同様に、下流というのも少なくとも２つの領域間の関係を表し、第一の領域が第二の領域の下流にある場合には、サンプルが第二の領域と接触した後にサンプルが第一の領域に接触する。
【０２３７】
本明細書において、フィブロネクチンに存在するエピトープとは、抗体またはそのフラグメントと結合するフィブロネクチンに存在するいずれの領域も意味する。例えば、フィブロネクチンに存在するエピトープは、非癌胎児性フィブロネクチンに存在するエピトープ、例えば、ＦＮＩＩＩ７リピート中のエピトープを含み得る。抗体ＨＦＮ３６．３およびＨＦＮ７．１（Schoen RC , et al. “Monoclonal antibody against human fibronectin which inhibits cell attachment.” Hybridoma 1: 99−108, 1982;それぞれＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６０５およびＣＲＬ−１６０６）、Ｐ３ＮＰ／ＰＦｎ（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９１）、３Ｅ３(Borsi et al., FEBS Lett. 192:71−74 (1985))およびＩＳＴ−４(Sekiguchi et al., J. Biol. Chem. 260:5105−5114 (1985)); Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY)を含む、フィブロネクチン上に存在するエピトープと結合する多数の抗体が当技術分野で公知である。
【０２３８】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチンに存在するエピトープとは、抗癌胎児性フィブロネクチン抗体またはそのフラグメントと結合する癌胎児性フィブロネクチンに存在するいずれの領域も意味する。例えば、癌胎児性フィブロネクチンに存在するエピトープは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的なスプライス領域、例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ内のエピトープを含んでもよく、また、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳの１以上の存在により抗癌胎児性フィブロネクチン抗体が結合する癌胎児性フィブロネクチン指標分子内の他の領域も含み得る（例えば、ＥＤＢが存在するときにはＦＮＩＩＩ９リピート）。ＩＳＴ−９(Carnemolla et al., FEBS Lett. 215:269−273 (1987); Accurate Chemical ＆ Sci. Corp., Westbury, NYから入手可能)、ＤＨ１(Vartio et al., J.  Cell Sci. 88:419−430 (1987))、ＢＣ−１(Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108:1139−1148 (1989))、Ｌ１９（米国特許出願第２００３０１７６６６３号）、ＭＥ４Ｃ（配列番号９）(Giovannoni et al., Nucleic Acids Res. 29:e27 (2001))；ＭＥ４Ｃ  ｓｃＦｖ組換え抗体配列は配列番号１０として示されている（また、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２９７９６０も参照)、Ｈ１０（米国特許出願第２００３０１７６６６３号）、Ａ１３４(Islami et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 97:40−45 (2001))、ＦＤＣ−６（米国特許第４，８９４，３２６号；ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９０１８）、５Ｃ１０(Mandel et al., APMIS 100:817−826 (1992))ならびにＸ１８Ａ４、Ｘ２０Ｃ４およびＸ８Ｅ３（米国特許第５，５２３，２２９号；それぞれＡＴＣＣ番号ＨＢ−１１５８７、ＨＢ−１１５８９およびＨＢ−１１５８８）を含む、癌胎児性フィブロネクチンに特異的に結合する多数の抗体が当技術分野で公知である。
【０２３９】
本明細書において、ＦＥＴ（蛍光エネルギー移動）アッセイ、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、蛍光偏光アッセイおよびＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）などの非放射性エネルギー移動反応は、供与発光標識と受容標識の間のエネルギー移動に基づく均一発光アッセイである（例えば、Cardullo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8790−8794 (1988); Peerce et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:8092−8096 (1986);米国特許第４，７７７，１２８号；米国特許第５，１６２，５０８号；米国特許第４，９２７，９２３号；米国特許第５，２７９，９４３号；および国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０１２２５号参照）。
【０２４０】
本明細書において、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）とは、化学蛍光および／またはタンパク質蛍光間の非放射性エネルギー移動を意味する。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、ある蛍光団（受容体）は、電気的に励起された第二の蛍光団（供与体）との量子の物理的結合とその第二の蛍光団からのエネルギーの受け取りによって励起電気状態へと誘導することができるという当技術分野で認知されているプロセスである。このエネルギー移動の結果、供与体による可視的な蛍光放出が低下し、受容体による蛍光放出が高まる。
【０２４１】
ＦＲＥＴを効率的に行うには、供与体と受容体間の吸収および放出スペクトルが重複していなければならない。色素対はそれらのスペクトルの重複特性を特徴とするものである。供与体の放出スペクトルは受容体の吸収スペクトルと重複していなければならない。重複の程度はエネルギー移動の効率を左右する。重複の程度はまた、そのアッセイが感知する最適距離も左右する。スペクトルの重複が大きい場合、移動は効率的となり、従ってより長い距離を感知する。供与体／受容体の選択は検討する距離によって異なる。
【０２４２】
エネルギー移動の効率は供与蛍光団と受容蛍光団の間の距離に著しく依存することから、供与体と受容体が十分近接している場合にのみ有意なエネルギー移動が起こり得る。これらの蛍光団は化学蛍光および／またはタンパク質蛍光であり得る。例えば、生理学的リポーターとしての２つの蛍光タンパク質間のＦＲＥＴエネルギー移動が報告されており(Miyawaki et al. Nature 388:882−887 (1997))、ここでは、２つの異なる蛍光タンパク質がカルモジュリンのカルボキシル末端とアミノ末端に融合されている。カルシウムイオン濃度の変化が、これら蛍光タンパク質部分間のエネルギー移動のレベルを変化させるのに十分なコンフォメーション変化をカルモジュリンにもたらした。
【０２４３】
本明細書において、蛍光偏光または蛍光偏光異方性（例えば、Jameson et al. Methods Enzymol. 246:283−300 (1995)参照）とは、蛍光標識分子を溶液中で平面偏光によって発光させる手法を意味する。溶液中の蛍光標識分子をこのように発光させたとき、それらの分子が動かない限り、放出された蛍光は同じ平面にある。溶液中の全ての分子は衝突運動の結果として回転運動をしているので、偏光解消現象は分子の回転緩和時間に比例しており、３ηＶ／ＲＴで定義される。溶液の粘度（η）および温度（Ｔ）が一定のとき、偏光は分子体積（Ｖ）に直接比例する（Ｒは普遍気体定数）。従って、結合相互作用による分子体積または分子量の変化を、偏光の変化として検出することができる。例えば、蛍光標識リガンドとその受容体の結合の結果、測定されるリガンドの蛍光偏光値に有意な変化が生じる。測定は、結合リガンドと遊離リガンドを物理的に分離せずに、「mix and measure」方式で行うことができる。これらの偏光測定は、適度な光学強度の溶液で行えば、蛍光強度の変動に比較的鈍感である。
【０２４４】
本明細書において、発光とは、エネルギー発生性の化学的プロセスの励起産物が光の放出を伴ってその基底状態に戻る際に生じる検出可能なＥＭ放射、一般に、ＵＶ、ＩＲまたは可視ＥＭ放射を意味する。化学発光は化学反応から生じる発光である。生物発光は、基質としての生体分子（または合成形態もしくはその類似体）および／または酵素を用いる化学反応から生じる化学発光である。
【０２４５】
本明細書において、化学発光とは、ある分子に特異的にエネルギーをチャネリングし、それを電気的に励起させ、次に光子を放出させ、それにより可視光を放出する化学反応を意味する。このチャネリングエネルギーには温度は関与しない。従って、化学発光は化学エネルギーの光エネルギーへの直接的変換を伴う。
【０２４６】
本明細書において、化学発光の一種である生物発光とは、生体分子、特にタンパク質による光の放出を意味する。生物発光の必須条件は、オキシゲナーゼ、すなわち、基質ルシフェリンに対して働くルシフェラーゼの存在下の酸素分子（結合型または遊離型のいずれか）である。生物発光は、酸素分子の存在下で基質ルシフェリン（生物発光基質）に対して働き、基質を励起状態に変換し、低エネルギーレベルに戻る際にエネルギーを光の形で放出するオキシゲナーゼである酵素または他のタンパク質（ルシフェラーゼ）によって生じる。
【０２４７】
本明細書において、生物発光を生じさせるための基質および酵素は一般にそれぞれルシフェリンおよびルシフェラーゼと呼ばれる。その特定の種を指す場合、明瞭なように、例えば、細菌ルシフェリンまたはホタルルシフェラーゼなど、それが由来する生物の名称を添えて、各一般名が用いられる。
【０２４８】
本明細書において、ルシフェラーゼとは、光放出反応を触媒するオキシゲナーゼを意味する。例えば、細菌ルシフェラーゼはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）および脂肪族アルデヒドの酸化を触媒し、この反応が光を生じる。海洋節足動物に見られる別種のルシフェラーゼはウミホタル(Cypridina (Vargula))ルシフェリンの酸化を触媒し、また別種のルシフェラーゼは甲虫目ルシフェリンの酸化を触媒する。
【０２４９】
従って、ルシフェラーゼとは、生物発光反応（生物発光を生じる反応）を触媒する酵素または発光タンパク質である。ホタル、海洋カイアシ類(Gaussia)およびウミシイタケ(Renilla)・ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼは触媒的に作用する酵素であり生物発光生成反応の際に変化しない。ルシフェリンが非共有結合しているエクオリン発光タンパク質などのルシフェラーゼ発光タンパク質は、生物発光生成反応の際にルシフェリンの放出などにより変化する。ルシフェラーゼは生物中に天然に存在するタンパク質、または天然に存在するタンパク質とは異なり、熱安定性などの１以上の特性を有する、突然変異誘発により作出された変異体などのその変異体または突然変異体である。ルシフェラーゼおよびその修飾突然変異体または変異体は周知のものである。本明細書の目的では、ルシフェラーゼという場合には発光タンパク質またはルシフェラーゼのいずれかを意味する。
【０２５０】
よって、例えば、ウミシイタケ・ルシフェラーゼという場合には、ウミシイタケ属のメンバーから単離された酵素、または別の近縁カイアシ類などの他の供給源から得られた、もしくは合成により調製された同等の分子を意味する。活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を有するウミシイタケ・ルシフェラーゼも包含するものとする。保存的アミノ酸置換は当業者に公知であり、一般に、結果として得られる分子の生物活性を変化させずに行うことができる。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの非必須領域における一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224参照）。
【０２５１】
本明細書において、生物発光基質とは、ルシフェラーゼと必要なアクチベーターの存在下で酸化されて光を生じる化合物を意味する。これらの基質は本明細書ではルシフェリンと呼び、生物発光反応において酸化を受ける基質である。これらの生物発光基質としては、いずれかのルシフェリンもしくはその類似体、またはルシフェラーゼと相互作用して光を生じる合成化合物を含む。典型的な基質としては、光生成反応においてルシフェラーゼまたはタンパク質の存在下で酸化されるものを含む。従って、生物発光基質としては、当業者がルシフェリンとして認識している化合物を含む。ルシフェリンとしては、例えば、ホタル・ルシフェリン、ウミホタル（Cypridina、Vargulaとしても知られる）、ルシフェリン（セレンテラジン（coelenterazine））、細菌ルシフェリン、ならびにこれらの基質の合成類似体、または生物発光を
生じる反応においてルシフェラーゼの存在下で酸化されるその他の化合物が挙げられる。
【０２５２】
本明細書において、生物発光基質への変換能とは、生物発光基質を生じる酸化または還元などの化学反応を受けやすいことを意味する。例えば、生物発光細菌の発光生成反応は、フラビンレダクターゼ酵素によるフラビンモノヌクレオチド基（ＦＭＮ）の還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮＨ２）への還元を含む。この還元型フラビンモノヌクレオチド（基質）は次に酸素（アクチベーター）および細菌ルシフェラーゼと反応して中間体ペルオキシフラビンを形成し、これが長鎖アルデヒドの存在下でさらに反応を受けて光を生じる。この反応に関しては、還元型フラビンと長鎖アルデヒドが基質である。
【０２５３】
本明細書において、生物発光生成系とは、生物発光反応を行うのに必要な試薬セットを意味する。従って、生物発光反応を遂行するために必要となり得る特定のルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびその他の基質、溶媒および他の試薬が生物発光系をなす。よって、生物発光生成系とは、適当な反応条件下で生物発光を生じる試薬セットのいずれをも意味する。適当な反応条件とは、ｐＨ、塩濃度および温度など、生物発光反応が起こるのに必要な条件を意味する。一般に、生物発光系としては、生物発光基質ルシフェリン、ルシフェラーゼ酵素と発光タンパク質を含むルシフェラーゼ、および１以上のアクチベーターを含む。特定の生物発光系は、そのルシフェラーゼが由来する特定の生物を引用することにより同定することがきる。例えば、ウミシイタケ生物発光系は、ウミシイタケから単離された、または組換え法を用いて産生されたルシフェラーゼ、またはこれらのルシフェラーゼの修飾物といったウミシイタケ・ルシフェラーゼを含む。この系はまた、酸素など、生物発光反応を遂行するために必要な特定のアクチベーターと、その酸素の存在下でルシフェラーゼと反応して光を生じる基質も含む。
【０２５４】
本明細書において、蛍光タンパク質（ＦＰ）とは、蛍光を発する（すなわち、ある波長でエネルギーを吸収し、別の波長でそれを放出する）能力を有するタンパク質を意味する。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とは、発光スペクトルにおいて５１０ｎｍまたは約５１０ｎｍにピークを有するポリペプチドを意味する。当技術分野では、様々な波長で発光する様々なＦＰが公知である。
【０２５５】
本明細書において、オワンクラゲ(Aequora)ＧＦＰとは、オワンクラゲ属由来のＧＦＰおよびその突然変異体または変異体を意味する。このような変異体および他種に由来するＧＦＰは周知のものであり、当業者ならば入手可能であり、知っている。
【０２５６】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の定量とは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度、質量またはモル量を算出することを意味する。
【０２５７】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベルとは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量と比較した癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルを意味し、ここで、測定量が閾値レベル以上である場合に、測定量が閾値レベル未満である場合とは異なった分類がされる。例えば、測定量が閾値レベル以上である場合は癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類することができ、測定量が閾値レベル未満である場合は癌胎児性フィブロネクチン陰性として分類することができる。複数の閾値の場合には、測定量は、その測定量以下である最高レベルに従って分類することができる。本明細書において、１以上の閾値とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える閾値を意味する。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、閾値レベルなどのレベルは、生の濃度値（すなわち、ノーマライズされていないもの）、ノーマライズ濃度、質量、モル量、またはその他の定量的量として表される参照量であり得る。例えば、閾値レベルは、正常な個体集団からの、または異なる時点での対象からのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルであり得る。例えば、本明細書において、癌胎児性フィブロネクチン陰性である対象とは、正常な癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルを有意に超える癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルを示さない対象を意味する。当業者が理解しているように、この閾値レベルは採取した組織または液体によって、サンプル種によって、検出法によって、対象の年齢、性別または生物学的状態（例えば、妊娠しているかいないか）によって異なり得る。いくつかの場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベルはゼロである（すなわち、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するとき、そのサンプルは癌胎児性フィブロネクチン陽性である)。
【０２５８】
本明細書において、プライマーとは、１以上の付加的ヌクレオチドを酵素的に付加することができるオリゴヌクレオチドを意味する。一般に、プライマーは遊離型の３’ヒドロキシ部分を含む。
【０２５９】
本明細書において、増幅可能なシグナル伝達核酸とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの公知の増幅方法を用いて増幅することができる核酸を意味し、その存在は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手との複合体形成を示す。
【０２６０】
本明細書において、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題とは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないか、もしくは閾値未満の量しか含まない対象に比べて、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するか、もしくは閾値以上の量で含む対象に多いか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するか、もしくは閾値以上の量で含む対象に比べて、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないか、もしくは閾値未満の量でしか含まない対象に少ない、疾病または妊娠問題などの有害な健康状態を意味する。癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題は、身体組織または体液サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在、またはレベルの上昇を特徴とする。この癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在またはレベルの上昇は、必ずしも、その健康問題が癌胎児性フィブロネクチン指標分子によって引き起こされていることを示すわけではないが、組織および／または体液サンプル中で癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルの上昇が見られることを示す。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は癌の指標として役立ち、早産または切迫出産の指標として役立ち、また、限定されるものではないが、関節炎、糖尿病性網膜症、腎疾患およびデュプュイトラン拘縮などの症状の指標としても役立ち得る。身体組織または体液サンプルにおいて、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が１以上の閾値以上で、または特定の個体に対する基準を超えるレベルで検出される場合は、様々な健康問題またはそのリスクの指標となり得る。同様に、その不存在または１以上の閾値未満での存在は、これら様々な疾病および障害（すなわち、健康問題）がいずれも存在しないという指標となり得る。
【０２６１】
本明細書において、プロゲステロン療法とは、妊娠に有利である、もしくは妊娠を助ける、または早産を抑制する、または誕生後の乳児の生存能力、特に早産児の生存能力を高める１以上の治療方法を意味する。プロゲステロン療法は、妊娠対象の安静臥床などの方法を含み、また、子宮収縮を低減または抑制する、もしくは妊娠を延長させる、もしくは早産児の生存力を高める１以上の薬剤の投与も含み得る。例えば、プロゲステロン療法は、子宮収縮抑制剤の投与を含み得る。
【０２６２】
本明細書において、子宮収縮抑制剤とは、対象に投与した際に子宮収縮を低減または抑制するか、あるいはそうではなければ早産を抑制する化合物または組成物を意味する。
【０２６３】
本明細書において、受胎産物とは、精子による卵子の受精の結果として生じる、受精の瞬間から誕生までの細胞、細胞塊、および組織のいずれをも意味する。これらのものとしては、限定されるものではないが、接合子、胚、芽細胞、および胎児が挙げられる。
【０２６４】
本明細書において、受胎産物は複数の受胎産物である。
【０２６５】
本明細書において、受胎産物サンプルとは、受胎産物により産生される化合物を含むサンプルを意味する。受胎産物サンプルとしては、受胎産物抽出物、培養培地などの受胎産物外に由来するサンプル、細胞および組織抽出物、ならびに細胞が挙げられ、ここでは、受胎産物から１以上の細胞を取り出し、その後の培養、移植および／または発達に関して能力のある残りの受胎産物を残す。受胎産物サンプルは無処理で分析することもできるし、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出前に試薬で処理し、かつ／または分画することもできる。
【０２６６】
本明細書において、付加的母体または受胎産物マーカーとは、移植成功のマーカーであると予め決定されたマーカーを意味する。この付加的マーカーは受胎産物サンプルにおいて検出することができるか、受胎産物の視診により決定されるか、または母体サンプルにおいて検出される。このようなマーカーはいずれのものでも利用することができる。マーカーの例としては、限定されるものではないが、受胎産物の遺伝子組成、受胎産物の遺伝子発現、および受胎産物の形態が挙げられる。１つの付加的マーカーは例えば受胎産物の形態であってもよく、受胎産物の形態は細胞数、フラグメンテーションの程度、細胞の規則正しさ、対称性、前核の形態、卵胞の大きさ、卵胞液の量、多核細胞の形成、液胞の存在、粒度、およびそれらの組合せなどの因子に従って等級付けされる。
【０２６７】
本明細書において、配偶子とは、卵子および精子を意味する。
【０２６８】
本明細書において、受精とは、精子細胞と卵子の融合を意味する。
【０２６９】
本明細書において、子宮、子宮壁または子宮内膜層に関して移植とは、このような細胞および／または組織中、または上への受胎産物（または複数の受胎産物）および／または受胎産物（または複数の受胎産物）の細胞の挿入および／または着床を意味する。
【０２７０】
本明細書において、栄養芽層とは、胚盤胞の内部細胞塊を取り巻く上皮細胞の外層を意味する。この栄養芽層はまた外細胞塊とも呼ばれる。栄養芽層は胚体外細胞、ならびに胎盤、羊膜および臍帯を含む組織へと発達し得る。
【０２７１】
本明細書において、非特異的結合剤、または非特異的結合を低減する物質とは、サンプル中の少量、一般に、アッセイまたは適用によって１％、２％、５％もしくは１０％未満、または約１％、２％、５％もしくは１０％未満を超える癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合することなく、サンプル中のバックグラウンド物質の少なくとも一部と結合する物質である。非特異的結合剤としては、例えば、非特異的結合化合物、または非特異的結合表面を含む固体支持体を含み得る。
【０２７２】
本明細書において、非特異的結合化合物は、サンプル中の少量（例えば、１０％未満）を超える癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合することなく、サンプル中のバックグラウンド物質の少なくとも一部と結合することができる。非特異的結合化合物は、限定されるものではないが、溶液中で可溶な形態、溶媒中で可動な形態、エマルション中に存在する形態、ゲル中に存在する形態、固体支持体上に存在する形態（例えば、固体支持体上に固定されている形態を含む）を含む様々な形態のいずれで存在してもよい。使用可能な非特異的結合化合物の非限定的な例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびウマ血清アルブミンなどのアルブミン；ならびにオボアルブミン、フィブリノゲン、トロンビン、トランスフェリン、糖タンパク質、カゼイン、癌胎児性フィブロネクチン指標分子およびその他のタンパク質に対して特異的でない抗体などの他のタンパク質を含む非特異的結合タンパク質が挙げられる。非特異的結合タンパク質としてはまた、例えば、リシン、グルタミン酸、アラニン、ヒスチジン、メチオニンおよびプロリンなどの１以上のアミノ酸のポリマーといった水溶性ポリアミノ酸も含み得る。非特異的結合化合物としてはまた、ウシ胎児血清などの血清、ゼラチンおよび乾燥乳を含むタンパク質含有組成物も含み得る。
【０２７３】
非特異的結合剤としては、１以上の成分を含み得る固体構造である非特異的結合表面が挙げられ、ここで、この非特異的結合表面は、サンプル中の少量（例えば、１０％未満）を超える癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合することなく、サンプル中のバックグラウンド物質の少なくとも一部と結合する。非特異的結合表面のための固体支持体の例としては、紙、セルロース誘導体（セルロースエステルおよびセルロースエーテルなど）、天然および合成高分子物質（ラテックス、ビニルポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレンおよび部分的に加水分解された誘導体、重縮合物、共重合体および無機物質など）が挙げられる。例えば、非特異的結合表面は、試験ストリップに沿って液体サンプルを送ることができる多孔性または吸水性部材である。非特異的結合表面は、限定されるものではないが、アルブミン（ウシ血清アルブミン、またはＢＳＡを含む）、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的でない抗体および本明細書に示される、または当技術分野で公知の他のものなど、その上に固定されている１以上の非特異的結合化合物を含み得る。
【０２７４】
本明細書において、治療薬とは、疾病もしくは障害の症状を改善する、または疾病もしくは障害を改善する薬剤である。治療薬としては、限定されるものではないが、細胞増殖を阻害するか、もしくは細胞死を誘発する部分、細胞増殖の阻害もしくは細胞死の誘発を活性化する部分、または細胞増殖を阻害するか、もしくは細胞死を誘発する別の薬剤を活性化する部分が挙げられる。所望により、この治療薬は、本明細書の他所に記載されているように、造影剤としてのその使用を可能とする特性などの付加的特性を示す、または表し得る。治療薬としては、限定されるものではないが、例えば、サイトカインおよび増殖因子、光増感剤、毒素、抗癌抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、脈管形成阻害剤、シグナル伝達調節剤、生物発光化合物またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２７５】
サイトカインおよび増殖因子としては、限定されるものではないが、例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−６およびインターロイキン−１２などのインターロイキン；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などの腫瘍壊死因子；インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）などのインターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、アンギオゲニン、ならびに組織因子が挙げられる。
【０２７６】
光増感剤の例としては、限定されるものではないが、例えば、インドシアニングリーン；トルイジンブルー；アミノレブリン酸；タキサフィリン；ベンゾポルフィリン；フェノチアジン；フタロシアニン；ナトリウムポルフィマーなどのポルフィリン；テトラ（ｍ−ヒドロキシフェニル）クロリンまたはスズ（ＩＶ）クロリンｅ６などのクロリン；スズエチルエチオプルプリンなどのプルプリン；プルプリンイミド；バクテリオクロリン；フェオフォルビド、ピロフェオフォルビド；または陽イオン色素が挙げられる。
【０２７７】
抗癌剤としては、限定されるものではないが、例えば、ポルフィロマイシン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、またはダウノルビシンおよび化学療法化合物が挙げられる。
【０２７８】
放射性核種は、その放射性核種、量および適用にもよるが、診断および／または処置に使用することができる。放射性核種としては、限定されるものではないが、例えば、３２リン酸塩、６０コバルト、９０イットリウム、９９テクネチウム(Technicium)、１０３パラジウム、１０６ルテニウム、１１１インジウム、１１７ルテチウム、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１３７セシウム、１５３サマリウム、１８６レニウム、１８８レニウム、１９２イリジウム、１９８金、２１１アスタチン、２１２ビスマスまたは２１３を含有する化合物または分子が挙げられる。毒素としては、限定されるものではないが、５−フルオロウリジン、カリチェアミシンおよびマイタンシンなどの化学療法化合物が挙げられる。シグナル伝達調節剤としては、限定されるものではないが、例えば、マクロファージ阻害因子の阻害剤、トール様受容体アゴニストおよびｓｔａｔ３阻害剤が挙げられる。
【０２７９】
化学療法化合物としては、限定されるものではないが、チオテパおよびシクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド(trietylenephosphoramide)、トリエチレンチオホスホルアミド(triethylenethiophosphaoramide)、およびクロラムブシル(chiorambucil)、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなトリメチルオロメラミンナイトロジェンマスタードを含むエチレンイミンおよびメチルメラミン(methylamelamine)；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチェアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンのようなピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗アドレナリン作用薬；フォリン酸(frolinic acid)のような葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；多糖−Ｋ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；シトシンアラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記いずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン作用薬；およびフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン作用薬；ならびに上記いずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体といった腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する働きをする抗ホルモン薬も含まれる。本明細書で使用可能なこのような化学療法化合物には、毒性によりその化合物が一般の全身化学療法に使用できない化合物も含まれる。
【０２８０】
本明細書において、予備誘発剤または誘発処置とは、頸膣熟化、プロスタグランジン、フォーリーカテーテル、または妊娠対象の陣痛誘発準備に用いるPrepidilおよびCervidilなどのジノプロストン剤といった薬剤またはプロセスを意味する。
【０２８１】
本明細書において、誘発剤とは、陣痛を開始させるために投与する薬剤を意味する。
【０２８２】
本明細書において、誘発処置とは、陣痛を誘発させるために用いるいずれの処置も意味する。誘発処置としては、限定されるものではないが、フォーリー(foley)バルーンカテーテル法またはアタッド(Atad)バルーンカテーテル法などのバルーンカテーテル法、羊膜剥離、羊膜外生理食塩水注入、羊膜切開および／または乳頭刺激、ならびに誘発剤投与が挙げられる。
【０２８３】
本明細書において、誘発剤とは、陣痛を誘発する薬剤を意味し、例えば、オキシトシンを含む。オキシトシンは、陣痛の誘発に役割を果たし、陣痛の際に子宮の平滑筋の収縮を刺激し、授乳の際に乳房からの母乳の放出を助ける。
【０２８４】
本明細書において、分娩促進薬とは、予備誘発、子宮頸の熟化、または誘発のための、当技術分野で公知の様々な化合物または組成物のいずれをも意味する。分娩促進薬の例としては、限定されるものではないが、ＰＧＥ１（ミソプロストル）およびＰＧＥ２（ジノプロストン）などのプロスタグランジン；オキシトシンなどのオキシトシンホルモン；ならびにＲＵ４８６（ミフェリプリストン）などのステロイドが挙げられる。
【０２８５】
本明細書において、誘発成功とは、誘発がない場合に比べて、経膣分娩に至る、または分娩までの時間が短い、または誘発剤もしくは予備誘発剤の投与が少ない誘発である。誘発成功の可能性とは、誘導を行った対象に対して、誘導が成功する可能性を意味する。これに関して、癌胎児性フィブロネクチンの陽性決定は誘発の成功に相関し、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間よりも短い一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間を示すことで現れる。陽性決定は閾値量に対して、または類似の対象と比較して測定することができる。癌胎児性フィブロネクチンの陰性決定は、癌胎児性フィブロネクチン陽性を決定する対象、または閾値を超える量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含むサンプルに対して、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間より長い、一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間が見られることと相関する。
【０２８６】
本明細書において、誘発結果の第二の指標とは、妊娠対象の測定値または所見、胎児の測定値または所見、および／または妊娠対象の病歴を意味する。第二の指標としては、限定されるものではないが、例えば、子宮頸長ビショップスコア、展退、出産歴、子宮口の開大、妊娠齢、肥満度指数、位置、硬度、経膣超音波、および／または指診が挙げられる。
【０２８７】
本明細書において、膀胱癌の病期および悪性度は、国際対癌連合(the Union Internationale Centre le Cancer (UICC)（１９９７年）の病期分類に従うものである。Ｔｉｓ：上皮内癌（ＣＩＳ）、Ｔａ：乳頭腺癌、病期１（Ｔ１）：乳頭腺癌が基底膜に浸潤した場合、病期２（Ｔ２ａ）：乳頭腺癌が表剤筋に浸潤した場合、病期３（Ｔ２ｂ）：乳頭腺癌が深在筋に浸潤した場合、病期３：顕微鏡的膀胱周囲組織浸潤が見られる場合（Ｔ３ａ）、または著しい膀胱周囲組織浸潤が見られる場合（Ｔ３ｂ）、および病期４：骨盤臓器（前立腺、子宮、膣；Ｔ４ａ）浸潤が見られる場合、または骨盤壁もしくは腹壁浸潤が見られる場合（Ｔ４ｂ）。病期Ｎ（リンパ節の状態）および病期Ｍ（転移部位）も記載する。移行上皮癌は悪性度１（十分な分化）、悪性度２（中程度の分化）および悪性度３（不十分な分化）に分類することができる。
【０２８８】
開示を明瞭にするため、限定されるものではないが、以下、詳細な説明をサブセクションに分ける。
【０２８９】
Ｂ．癌胎児性フィブロネクチンの検出
本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出方法が提供される。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、全身の健康状態、癌、妊娠および分娩などのマーカーとして役立ち得る。本明細書で提供される方法による癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出の、精度、迅速性および／または利便性を向上させることができる。本明細書の検出方法はまた、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子、検出された癌胎児性フィブロネクチン指標分子中に存在するドメイン、および検出された癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の翻訳後修飾の量またはレベルといったさらなる情報を提供することができる。
【０２９０】
いくつかの態様では、検出方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を１以上の結合相手と接触させること、およびその癌胎児性フィブロネクチン指標分子と１以上の結合相手の間の複合体形成を検出することによって行うことができる。これらの検出方法は様々な方法で行うことができ、例えば、サンプル成分またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手のいずれかを固体支持体上に固定することもできるし、いずれも固定しなくてもよい。別の例では、検出は、in vivoで、例えば、in vivo診断法で行うことができる。in vivo法はまた、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題の処置にも使用することができる。
【０２９１】
癌胎児性フィブロネクチンの存在は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に特異的な自己抗体またはそのフラグメントなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより決定することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するには、様々なタンパク質、核酸分子および抗体検出法のいずれを用いてもよい。検出方法の例としては、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡまたはそのフラグメントを検出するためのＲＴ−ＰＣＲ、および癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそのフラグメントを検出するための質量分析が挙げられる。さらに、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチンに対する自己抗体を検出するためにイムノアッセイなどの方法も提供される。
【０２９２】
いくつかの態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が検出でき、これにより、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の部分の存在または不存在を同定することができる。本明細書において記載されているように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子はドメインＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳの１以上を含み得る。本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子中のＥＤＡ、ＥＤＢおよび／またはＩＩＩＣＳの存在または不存在を決定するために使用することができる。このような決定は、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の組織源を同定するために使用することができる。
【０２９３】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しているかいないか決定するために使用することができ、またはサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定するために使用することができる。量を測定する場合には、その測定量を１以上の閾値レベルと比較することができる。単一の閾値レベルを用いる場合では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量が閾値を超える場合に、例えば、全般的な健康状態、切迫出産もしくは早産、分娩日、または癌症状もしくは関節炎などの健康問題を示し得る。２以上の閾値レベルを用いる場合では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を用いて、サンプルを提供した対象を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量以下の最高閾値に従って分類することができ、ここで、このような分類は、例えば、異なる全般的な健康状態、異なる妊娠および分娩の予測結果、異なる分娩日予測の確実性、または癌症状もしくは関節炎などの健康問題の異なる重篤度を示し得る。
【０２９４】
Ｃ．フィブロネクチンの構造および特性
本明細書では、癌胎児性フィブロネクチンの検出タンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸またはその相補物、癌胎児性フィブロネクチンに対する自己抗体およびそのフラグメントを含む方法が提供される。よって、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそれらのタンパク質をコードする核酸の構造および特性および独自性に関する知識が本明細書の方法を実施する助けとなり得る。例えば、この分子のタンパク質加水分解フラグメントに関する知識は、グリコシル化パターンに関する知識同様、質量分析検出の助けとなり得る。癌胎児性フィブロネクチン分子をコードする核酸および／またはそのドメインの配列に関する知識は、特異的増幅を必要とする方法の助けとなり得る。癌胎児性フィブロネクチンドメイン、および癌胎児性フィブロネクチンドメインと特異的かつ優先的に結合する分子に関する知識は、癌胎児性フィブロネクチンを検出するための反射率法などの方法において、また、癌胎児性フィブロネクチンを特徴付けするための方法において、癌胎児性フィブロネクチンを検出するための装置の設計の助けとなり得る。
【０２９５】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、最大のマルチドメインタンパク質の１つである(Pankov et al., Journal of Cell Science, 115:3861−3863, (2002))。フィブロネクチン（ＦＮ）は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との様々な細胞相互作用を媒介し、細胞の接着、移動、増殖および分化において重要である(Mosher, D.F., ”Fibronectin,” San Diego: Academic Press, Inc.,(1989); Carsons, S.E., ”Fibronectin in Health and Disease,” Florida: CRC Press, Inc., (1989); Hynes, R.O., ”Fibronectins,” New York: Springer−Verlag, (1990); Yamada and Clark, ”The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair,” (ed. R.A.F. Clark) pp 51−93, New York: Plenum Press, (1996))。ＦＮは複数の細胞種により発現され、ＦＮ遺伝子が標的不活性化されたマウスの初期の胚致死性によって実証されたように(George et al., ”Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin,” Development, 119:1079−1091, (1993)、脊椎動物の発生において重要なものである。
【０２９６】
１．フィブロネクチンの構造的特徴
フィブロネクチン構造については様々な特徴が知られている：このような特徴の概要は(Pankov et al., Journal of Cell Science, 115:3861−3863, (2002))から得られ、そこに要約されている。フィブロネクチンは通常、１対のジスルフィド結合によりＣ末端付近で共有結合された、およそ２５０ｋＤａのほぼ同じ２つのサブユニットを含む二量体として存在している。各モノマーは、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型という３種類の反復単位（ＦＮリピートと呼ばれる）を含む。フィブロネクチンは１２のＩ型リピートと２つのＩＩ型リピートと１５〜１７のＩＩＩ型リピートを含み、合わせてフィブロネクチン配列のおよそ９０％を占める。Ｉ型リピートは約４０のアミノ酸残基長であり、２つのジスルフィド結合を含み；ＩＩ型リピートはおよそ６０のアミノ酸ストレッチと２つの鎖内ジスルフィド結合を含み；ＩＩＩ型リピートは約９０残基長であり、ジスルフィド結合は含まない。
【０２９７】
フィブロネクチンは単一遺伝子によりコードされており、その産物は単一のｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングから生じる複数の形態で存在することができ、この選択的スプライシングにより、ヒトフィブロネクチンでは、２０個もの多数の変異体が生じる（例えば、French−Constant, C., ”Alternative splicing of fibronectin − many different proteins but few different functions,” Exp. Cell Res., 221:261−271, (1995); Kosmehl et al., ”Molecular variants of fibronectin and laminin: structure, physiological occurrence and histopathological aspects,” Virchows Arch, 429:311−322, (1996)参照）。スプライシングはＩＩＩ型リピートの中央セットＦＮ  ＩＩＩ７〜ＦＮ  ＩＩＩ１５の間で起こる。エキソンを利用するか飛ばすかで、２つのＩＩＩ型リピート、すなわち、ＥＤＢ（ＥＩＩＩＢまたはＥＤＩＩとも呼ばれ、ＦＮリピートのＩＩＩ７とＩＩＩ８の間に存在する）およびＥＤＡ（ＥＩＩＩＡまたはＥＤＩとも呼ばれ、ＦＮリピートのＩＩＩ１１とＩＩＩ１２の間に存在する）、またはその両者を含んだり含まなかったりする。このフィブロネクチンＥＤドメインのスプライシングは、ツメガエル、ニワトリ、ラット、およびヒトを含む多くの脊椎動物で見られる。
【０２９８】
選択的スプライシングの第三の領域は、Ｖ（長さが異なる）またはＩＩＩＣＳ（ＩＩＩ型結合セグメント）領域と呼ばれる、ＦＮＩＩＩリピートとは相同でないフィブロネクチン部分に存在する。この領域における構造のバリエーションはスプライス変異体を含み、種依存的である。ほとんどの種では、この領域は部分的にまたは完全に含まれているかいないかのいずれかであり、例えば、ヒトフィブロネクチンでは、５つの異なるＶ領域変異体が存在し得る。ニワトリでは、Ｖ領域の１２０のアミノ酸残基の全てが含まれ、あるいは５’末端のアミノ酸４４個のセグメントが含まれない場合があるが（Ｖ７６となる）、ニワトリフィブロネクチンのＶ領域全体が存在しない場合はない。ラットにおけるスプライシングでは、アミノ酸２５個のフラグメントが欠損してＶ９５となり、これがＶ０型およびＶ１２０型と同様に検出できる。ヒトにおけるＶ領域のスプライシングは、アミノ酸２５個を含むもの、アミノ酸６４個を含むもの、およびアミノ酸３１個を含むものの、３つの異なる領域の組合せを含み得る。ヒトにおいてはスプライシングの違いから少なくとも５つの変異体が生じ、５’末端（２５ａａ）および３’末端（３１ａａ）のセグメントは独立に除かれるか（それに応じてＶ９５およびＶ８９となる）、または一緒に除かれる場合があり（Ｖ６４）、あるいは３つ全ての領域が存在しない場合もあり（Ｖ０）、５つの異なるＶスプライス変異体が生じる。
【０２９９】
ＦＮは、細胞起源に応じて４〜９％の炭水化物を含む糖タンパク質である。主としてＩＩＩ型リピートとコラーゲン結合ドメインにＮ−結合およびＯ−結合グリコシル化部位が存在する。
【０３００】
いくつかのフィブロネクチン形態の存在量が多く、血漿（３００μｇ／ｍｌ）および他の体液に可溶であり、また、不溶性細胞外マトリックスの一部でもある。
【０３０１】
２．フィブロネクチンの結合特性およびタンパク質分解
ＦＮは、インテグリン受容体ファミリーの多くのメンバーのリガンドであり得る(例えば、Plow et al., ”Ligand binding to integrins,” J. Biol. Chem., 275:21785−21788, (2000)参照)。インテグリンは、ＥＣＭと細胞内の細胞骨格とを連結する構造上また機能上関連のある細胞表面ヘテロ二量体受容体である。ＦＮ受容体α５β１を含む、いくつかの異なるインテグリンがＦＮと結合する。いくつかのインテグリン認識配列が知られている。例えば、インテグリンα５β１は、ＦＮリピートＩＩＩ１０に存在するＲＧＤ配列により認識される。この単純なトリペプチド配列の認識には、残基のフランキング、トリペプチドの三次元提示およびインテグリン結合ポケットの個々の特徴によって影響を及ぼすことができる。ＦＮリピートＩＩＩ９（「相乗作用部位」ＰＨＳＲＮ）において、第二の部位は、α５サブユニットとの相互作用を介して、α５β１インテグリンのＦＮへ特異的結合を促進する。また、このＦＮ受容体α５β１は、リピートＩ１−９およびＩＩ１，２を含むＮ末端フラグメントとも相互作用し、これにより、α５β１−インテグリンを媒介とする細胞接着も促進することができる。このＮ末端領域との相互作用は、ＲＧＤ配列との連結に応答して生じるものとはまた異なるインテグリン媒介細胞内シグナルを誘起する。
【０３０２】
また、α４β１インテグリンが結合するもう１つのフィブロネクチン配列セットも知られている。このような２つの細胞認識配列（ＬＤＶおよびＲＥＤＶ）は選択的にスプライシングされるＶ領域に存在する。両者ともα４β１およびα４β７により認識される。α４β１インテグリンにより認識されるさらなる部位、すなわち、ＩＤＡＰＳおよびＫＬＤＡＰＴもそれぞれリピートＩＩＩ１４およびＩＩＩ５に存在する（ＫＬＤＡＰＴはα４β７インテグリンとも結合する）。ＥＤＡのＥＤＧＩＨＥＬ配列はα４β１だけでなくα９β１とも結合することができる(Liao et al.,” The EIIIA segment of fibronectin is a ligand for integrinsα９β１ and α４β１ providing a novel mechanism for regulating cell adhesion by alternative splicing," J. Biol. Chem., 277:14467−14474, (2002))。
【０３０３】
フィブロネクチンは、制限タンパク質加水分解消化を受けた際に既知の場所で切断され得る（Mosher, D.F., ”Fibronectin,”San Diego: Academic Press, Inc.,(1989); Hynes, R.O., ”Fibronectin,” New York: Springer−Verlag, (1990)に概説）。多数の部位でタンパク質を切断可能なプロテアーゼ（プロナーゼなど）であっても、最初に特異性の高い場所でＦＮを切断する。主要なタンパク質分解切断部位の簡略スキームを図１に示す。ＦＮの結合活性はこのようなタンパク質分解後でも保存されており、特定のフラグメント内に確認することができる。
【０３０４】
フィブロネクチンは、インテグリンを介して細胞表面に結合する他、様々な機能的活性を有する。フィブロネクチンは、ヘパリン、コラーゲン／ゼラチンおよびフィブリンなどの生物学的に重要な分子とも結合することができる。これらの相互作用は、タンパク質加水分解フラグメンテーションまたは組換えＤＮＡ分析によって定義されている、構造および機能の異なるいくつかのドメインにより媒介される（図１およびMosher, D.F., ”Fibronectin,” San Diego: Academic Press, Inc., (1989); Hynes, R.O., ”Fibronectins,” New York: Springer−Verlag, (1990);およびYamada and Clark, ”The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair,” (ed. R.A.F. Clark), pp. 51−93, New York: Plenum Press, (1996)参照）。
【０３０５】
フィブロネクチンは、ヘパリン硫酸プロテオグリカンと相互作用する２つの主要なヘパリン結合ドメインを含む。強力なヘパリン結合部位はＣ末端部分に存在し（ヘパリンＩＩ）、弱い結合ドメインはこのタンパク質のＮ末端に存在する（ヘパリンＩ）。高親和性ヘパリンＩＩドメインはまた、広く分布しているグリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸とも結合することができ、弱いヘパリン結合ドメインは、ＦＮの細菌との相互作用を媒介する黄色ブドウ球菌(Staphylococus aureus)結合部位を含む。グリコサミノグリカン結合部位は、フィブロネクチンのＶ領域内に存在する(Mostafavi−Pour et al., 2001)（Ｖドメインにヘパリンと表示されている）。少なくともいくつかの細胞種で、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは細胞接着を媒介する。
【０３０６】
コラーゲン結合ドメインはリピートＩ６−９とＩＩ１，２を含み、これらのリピートは天然コラーゲンよりも変性コラーゲン（ゼラチン）と効率的に結合する。このフィブロネクチンドメインはまた、in vivoにおいては天然コラーゲンとも相互作用することができる。
【０３０７】
フィブロネクチンはまた、２つの主要なフィブリン結合部位（フィブリンＩおよびフィブリンＩＩ）も含む。フィブリンＩ結合部位はＮ末端ドメイン内にあり、Ｉ型リピート４と５からなる。フィブロネクチンとフィブリンの相互作用は、フィブリン凝集物との細胞接着またはフィブリン凝集物への細胞移動に関与している。両場合とも、フィブロネクチンとフィブリンの間の架橋は因子ＸＩＩＩトランスグルタミナーゼにより媒介される（図１のフィブロネクチン分子上の架橋部位は因子ＸＩＩＩａと矢印により表示されている）。
【０３０８】
フィブロネクチンはまた、分子中に同定されている複数の結合部位において自己会合して凝集塊および原繊維となり得る（図１）。これらの自己相互作用部位は露出していて結合に利用できるものもあるが、隠れていて、コンフォメーション変化、例えばフィブロネクチン分子の機械的引っ張りの後にのみ接近可能となるものもある。
【０３０９】
３．癌胎児性フィブロネクチン
癌胎児性フィブロネクチンは、ある特徴を共通に持つヘテロなフィブロネクチンタンパク質群である。示したように、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質はエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）、エキストラドメインＢ（ＥＤＢ）、もしくはフィブロネクチンＩＩＩ結合セグメント（ＩＩＩＣＳ）、またはそのいずれかの組合せを含む。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質はまた、特定の細胞もしくは組織で発現するか、または特定の細胞もしくは組織から放出され、それらの発現もしくは放出パターンまたは発現レベルは組織によって異なる。これらの癌胎児性フィブロネクチン群はフィブロネクチンにおけるこれら３つの領域（ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ）の選択的スプライシングから生じ、また、翻訳後修飾からも生じる。癌胎児性フィブロネクチンのスプライシングおよび発現は細胞および組織により、また、種々の発達段階で異なる調節を受ける。胎児組織において、また、いくつかの異常な細胞および組織においては、正常な成体細胞および組織よりも癌胎児性フィブロネクチンの発現が高い。いくつかの正常な成体細胞、組織およびサンプル種においては、癌胎児性フィブロネクチンは、抗体アッセイによって検出可能な量では存在しない。よって、癌胎児性フィブロネクチンの検出のためには、異常なレベルの癌胎児性フィブロネクチンは、検出された量を対照または所定の量と比較することにより決定することができる。ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳを含むヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列およびフィブロネクチンをコードする核酸分子は当技術分野で公知であり、公開データベースで入手することができる。ヒト癌胎児性フィブロネクチン、ならびにＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ領域の配列例は配列番号４、６および８で示されている。ヒト癌胎児性フィブロネクチンＩＩＩＣＳ領域Ｖ１２０、Ｖ９５、Ｖ８９およびＶ６４の配列例は、それぞれ配列番号２９、３１、３３および３５で示されている。例えば、ラット、マウス、ニワトリ、ウシおよびアフリカツメガエルを含むさらなる種々の種に由来するタンパク質およびコード核酸分子もまた知られており、公開データベースで容易に入手することができる。癌胎児性フィブロネクチンの例としては、ＦＤＣ−６モノクローナル抗体と特異的に結合するタンパク質がある（Matsuura and S. Hakomori, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6517−6521 (1985)参照）。ＦＤＣ−６抗体を産生するハイブリドーマ（the American Type Culture Collectionに受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９０１８として寄託）の作出については、１９９０年１月１６日に公開されたMatsuuraらの米国特許第４，８９４，３２６号に記載されている。癌胎児性フィブロネクチンの別の例としては、Carnemolla et al., J. Cell. Biol., 108:1139−1148 (1989)により記載されているＢＣ−１モノクローナル抗体と優先的に結合するタンパク質がある。癌胎児性フィブロネクチンのもう１つの例としては、Carnemolla et al., FEBS Lett., 215:269−273 (1987)により記載されているＩＳＴ−９モノクローナル抗体と優先的に結合するタンパク質がある。
【０３１０】
ａ．癌胎児性フィブロネクチンの構造的特徴
癌胎児性フィブロネクチンはエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）、エキストラドメインＢ（ＥＤＢ）、またはフィブロネクチンＩＩＩ結合セグメント（ＩＩＩＣＳ）、またはそれらのいずれかの組合せを含む。ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳを含むヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列ならびにそのフィブロネクチンをコードする核酸分子は当技術分野で公知であり、公開データベースで入手することができ、そのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はまた本明細書では、それぞれ配列番号１と２、１４と１５、１６と１７、１８と１９、２０と２１、２２と２３、および２４と２５として示される。限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシおよびアフリカツメガエルを含む他種に由来する様々な癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子も知られており、公開データベースで容易に入手することができる。
【０３１１】
ヒトフィブロネクチンはそれぞれ配列番号１および２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列によりコードされる。ＥＤＡは、配列番号１（配列番号３）のヌクレオチド４４０５〜４６７４、および配列番号２（配列番号４）のアミノ酸１４３２〜１６２１によりコードされる。ＥＤＢは、配列番号１（配列番号５）のヌクレオチド３０３７〜３３０９、および配列番号２（配列番号６）のアミノ酸９６３〜１１０９によりコードされる。全長ＩＩＩＣＳは、配列番号１（配列番号７）のヌクレオチド５４８８〜５８４７、および配列番号２（配列番号８）のアミノ酸１８３０〜１９４９によりコードされる。
【０３１２】
ＩＩＩＣＳは種々の組合せのスプライス領域を含み、これにより５つの異なるスプライス変異体を生じる（表１参照）。ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５番はスプライス領域Ａ（Ａ）を構成する。ＩＩＩＣＳのアミノ酸２６〜８９番はスプライス領域Ｂ（Ｂ）を構成する。ＩＩＩＣＳのアミノ酸９０〜１２０番はスプライス領域Ｃ（Ｃ）を構成する。ＩＩＩＣＳは、可変ドメインまたはドメインとも呼ばれ、ＩＩＩＣＳのアミノ酸を含まないＶ０、ＩＩＩＣＳのアミノ酸２６〜８９を含むＶ６４（Ｄ；配列番号３５）、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜８９を含むＶ８９（Ｅ；配列番号３３）、ＩＩＩＣＳのアミノ酸２６〜１２０を含むＶ９５（Ｆ；配列番号３１）またはＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜１２０を含むＶ１２０（Ｇ；配列番号２９）を含む、少なくとも５つの異なるスプライス変異体のいずれかであり得る（例えば、Pankov et al., J. Cell Science 115:3861−3863 (2002)参照）。
【０３１３】
ＩＩＩＣＳの部分はまた、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５を含むＣＳ１（Ｈ）、ＩＩＩＣＳのアミノ酸２３〜４７を含むＣＳ２（Ｉ）、アミノ酸４５〜６８を含むＣＳ３（Ｊ）、ＩＩＩＣＳのアミノ酸６６〜９２を含むＣＳ４（Ｋ）、ＩＩＩＣＳのアミノ酸９０〜１０９を含むＣＳ５（Ｌ）、およびＩＩＩＣＳのアミノ酸１０７〜１２０を含むＣＳ６（Ｍ）としても表すことができる（表１参照）。
【０３１４】
ＩＩＩＣＳは１以上の部位でグリコシル化することができる。グリコシル化のための１つの部位がＩＩＩＣＳのトレオニン３３であり、これはＯ−グリコシル化される（表１のＮ参照）。トレオニン３３をグリコシル化する酵素は、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−Ｔ２である。Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−Ｔ２のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列および推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１１、１２および１３で示され、また、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１０３４５（ゲノム配列）、Ｘ９２６８９（ｍＲＮＡ配列）、またはＣＡＡ６３３７１（ｍＲＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列）で入手することもできる（Wandall et al., J. Biol. Chem. 272: 23503−23514 (1997)参照）。
【表１】
2011039068.tif 000003
【０３１５】
ｂ．癌胎児性フィブロネクチンと結合する分子
癌胎児性フィブロネクチンには１以上の抗癌胎児性フィブロネクチン抗体が特異的に結合することができる。当技術分野では、ＩＳＴ−９(Carnemolla et al., FEBS Lett. 215:269−273 (1987)；Accurate Chemical ＆ Sci. Corp., Westbury, NYで入手可能)。ＤＨ１(Vartio et al., J. Cell Sci. 88:419−430 (1987))、ＢＣ−１(Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108:1139−1148 (1989))、Ｌ１９（米国特許出願第２００３０１７６６６３号）、ＭＥ４Ｃ(Giovannoni et al., Nucleic Acids Res. 29:e27 (2001))；ＭＥ４Ｃ  ｓｃＦｖ組換え抗体配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２９７９６０で入手可能）、Ｈ１０（米国特許出願第２００３０１７６６６３号）、ＦＤＣ−６（米国特許第４，８９４，３２６号）、５Ｃ１０(Mandel et al., APMIS, 100:817−826 (1992))およびＸ１８Ａ４、Ｘ２０Ｃ４およびＸ８Ｅ３（米国特許第５，５２３，２２９号、それぞれＡＴＣＣ番号ＨＢ−１１５８７、ＨＢ−１１５８９およびＨＢ−１１５８８）を含む様々な抗癌胎児性フィブロネクチン抗体が公知である。
【０３１６】
ＩＳＴ−９およびＤＨ１は、ＥＤＡが存在する場合に癌胎児性フィブロネクチンと結合することができる。ＩＳＴ−９およびＤＨ１は、少なくともＥＤＡのアミノ酸Ｉｌｅ−４３およびＨｉｓ−４４と結合することができる。ＩＳＴ−９およびＤＨ１はアミノ酸３１〜４４を含むＥＤＡの領域と結合することができる。
【０３１７】
ＢＣ−１、Ｌ１９、ＭＥ４Ｃ、Ｈ１０、Ｃ６およびＡ１３４は、ＥＤＢが存在する場合に癌胎児性フィブロネクチンと結合することができる。ＢＣ−１は、フィブロネクチンリピートＩＩＩ−７（ＦＮＩＩＩ−７）とＥＤＢが存在する場合、癌胎児性フィブロネクチンと結合することができる。Ｃ６は、ＥＤＢとフィブロネクチンリピートＩＩＩ−８（ＦＮＩＩＩ−８）が存在する場合、癌胎児性フィブロネクチンと結合することができる。Ｌ１９はＥＤＢと結合することができる。
【０３１８】
ＦＤＣ−６はＩＩＩＣＳと結合することができる。ＦＤＣ−６は、ＩＩＩＣＳのヘキサペプチドＶＴＨＰＧＹ（ＩＩＩＣＳアミノ酸３２〜３７；配列番号３９）がＴｈｒ−３３でＯ−グリコシル化されている場合に、そのヘキサペプチドと結合することができる。一般に、Ｔｈｒ−３３のグリコシル化は、そのトレオニン側鎖の酸素原子と結合したα−Ｎ−アセチルガラクトサミンを有する。このＴｈｒ−３３グリコシル部分は、ＮｅｕＡｃα２−＞３Ｇａｌβ１−＞３ＧａｌＮａｃ、または３Ｇａｌβ１−＞３ＧａｌＮａｃであり得る。５Ｃ１０は、ＦＤＣ−６ヘキサペプチドと重複するＩＩＩＣＳ配列と結合することができる。Ｘ１８Ａ４は、ＦＤＣ−６が結合するヘキサペプチドとは異なるＩＩＩＣＳ配列と結合することができる。
【０３１９】
ＥＤＢは１以上のＮ−結合グリコシル化部位を含み得る。ＩＩＩＣＳは、１以上のＯ−結合グリコシル化部位と１〜６個または約６個のＮ−結合グリコシル化部位を含み得る。
【０３２０】
ＥＤＡはα４β１インテグリンおよびα９β１インテグリンと結合することができる。ＥＤＡのアミノ酸配列ＥＤＧＩＨＥＬ（ＥＤＡアミノ酸４０〜４６）はα４β１インテグリンおよびα９β１インテグリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳはα４β１インテグリン、α４β７インテグリンおよびヘパリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳのＶ９５スプライス変異体はヘパリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳのＣＳ１およびＣＳ５はα４β１インテグリンおよびα４β７インテグリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳアミノ酸配列ＬＤＶ（ＩＩＩＣＳアミノ酸２０〜２２）はα４β１インテグリンおよびα４β７インテグリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳアミノ酸配列ＲＥＤＶ（ＩＩＩＣＳアミノ酸１００〜１０３）はα４β１インテグリンおよびα４β７インテグリンと結合することができる。
【０３２１】
ｃ．癌胎児性フィブロネクチンのタンパク質分解
癌胎児性フィブロネクチンは、癌胎児性フィブロネクチンの様々な特性に従って検出することができる。癌胎児性フィブロネクチンを同定するための１つの方法は、特徴的な質量および／または結合特性を有するタンパク質フラグメントを含む、特徴的なタンパク質分解パターンによる。フラグメントの質量は当技術分野で公知の、または本明細書の他所で示された様々な方法のいずれかにより測定することができ、測定質量法の一例として質量分析がある。
【０３２２】
タンパク質分解パターンの一例は、トリプシンを用いて作製することができる。癌胎児性フィブロネクチンのトリプシン消化により、２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａおよび／または５５ｋＤａのトリプシンフラグメントを得ることができる。一般に、これら６つのトリプシンフラグメントの各々が抗体ＦＤＣ−６と結合する。一例では、癌胎児性フィブロネクチンのトリプシンフラグメントは２００ｋＤａ、１２０ｋＤａまたは５５ｋＤａであり得、ここで、各小さなフラグメントは大きなフラグメントのさらなるトリプシン切断産物に相当する。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンのトリプシンフラグメントは２３５ｋＤａ、１６０ｋＤａまたは６５ｋＤａであり得、ここで、各小さなフラグメントは大きなフラグメントのさらなるトリプシン切断産物に相当する。
【０３２３】
別のタンパク質分解パターン例は、カテプシンＤを用いて作製することができる。癌胎児性フィブロネクチンのカテプシンＤ消化により、１１０ｋＤａおよび／または８５ｋＤａのフラグメントを得ることができる。一般に、これら２つのカテプシンＤフラグメントは、抗体ＦＤＣ−６と結合することができる。
【０３２４】
別のタンパク質分解パターン例は、サーモライシンを用いて作製することができる。癌胎児性フィブロネクチンのサーモライシン消化により、１２０ｋＤａ、８５ｋＤａおよび／または３５ｋＤａのフラグメントを得ることができる。一般に、１２０ｋＤａおよび８５ｋＤａフラグメントは抗体ＢＣ−１と結合することができ、８５ｋＤａフラグメントは、１２０ｋＤａフラグメントのさらなるサーモライシン切断産物に相当する。
【０３２５】
別のタンパク質分解パターン例は、アクロモバクタープロテアーゼＩを用いて作製することができる。癌胎児性フィブロネクチンのアクロモバクタープロテアーゼＩ消化により、１４ｋＤａフラグメントを得ることができ、ここで、このフラグメントは、一般に、抗体ＦＤＣ−６と結合することができる。
【０３２６】
Ｄ．生物マーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンの使用
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、全身の健康状態、癌、妊娠および分娩など、現在または未来の様々な健康状態の生物マーカーとして役立つ。本明細書で提供される生物マーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンのいずれの使用も、本明細書で提供される、または当技術分野で公知のサンプル種のいずれかを用い、本明細書で提供される、または当技術分野で公知の癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法のいずれかと組み合わせて遂行することができる。例えば、限定されるものではないが、組織サンプル、臓器サンプル、尿、リンパ、血液、血漿、血清、唾液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、母乳、滑液、精液、精漿、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、腹腔液、腹水、汗、リンパ液、肺痰および洗浄液を含む、様々なサンプルのいずれのものを癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関して測定してもよい。さらに、限定されるものではないが、ドットブロット分析、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ法、質量分析法、試験ストリップに基づくサンドイッチアッセイなどのサンドイッチアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、蛍光偏光法、ＦＲＥＴ法およびフローサイトメトリー法を含む、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々な方法のいずれのものを、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するために用いてもよい。癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するためにどの方法を選択するかはデザイン選択の問題であり、当業者ならば、検出する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の性質（例えば、タンパク質、核酸）に基づいて、適当なアッセイまたは検出（例えば、ＰＣＲ、質量分析、サンドイッチアッセイ）を選択することができる。同様に、どのサンプル種を選択するかも当業者の選択の問題であり、例えば、その診断目的に対してそのサンプル種が適切であるかどうかやサンプルの採取または取扱いの容易性や使用する検出方法などの基づいた様々な基準のいずれかを基にすることができる。
【０３２７】
サンプルまたは対象は測定された癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量に従って分類することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値の分類は、組織サンプルか液体サンプルか、サンプル種、検出方法、対象の年齢、性別または生物学的状態（例えば、妊娠しているかいないか）を含む当業者に公知の様々な因子に従って異なる。
【０３２８】
ある場合には、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が検出される場合に測定値を癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなす。他の場合には、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が１以上の閾値レベル以上である場合に測定値を癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなす。一例では、試験ストリップを用いてアッセイしたバッファー処理頸膣サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値レベルは５０ｎｇ／ｍＬであり得る。別の例では、試験ストリップを用いてアッセイしたバッファー処理頸膣サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値レベルは１５０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０３２９】
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を閾値レベルと比較する態様では、この閾値レベルは非改変サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量であってもよいし、またはこの閾値レベルは改変サンプル（例えば、バッファー溶液と混合した後の頸膣スワブサンプルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃縮物）中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量であってもよい。本明細書において、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルまたは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベルという場合には、一般に、改変サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルを意味する。例えば、頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定値など、いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値の、サンプル改変型に従うものは当技術分野で公知であり、よって、頸膣スワブサンプルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルおよび閾値レベルとは、一般に、改変サンプルのレベルを意味する。
【０３３０】
いくつかの態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を１以上の閾値と比較することができる。一般に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値レベル以上である場合に、サンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示す。一態様では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ以上）、または約５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示す。一般に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値レベル未満である場合に、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陰性であることを示す。一態様では、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が５０ｎｇ／ｍｌ未満（または無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ）、または約５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陰性であることを示す。
【０３３１】
異なるサンプル種の閾値レベルは異なり得る。本明細書では、関連した閾値レベルを持ち得る異なるサンプル種も提供される。例えば、膣の下三分の一などの後膣円蓋より下部の膣部分から採取した頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、同じ対象から採取した後膣円蓋の頸膣スワブ中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の三分の一または約三分の一であり得る。従って、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが１つの閾値レベルと比較される本明細書で提供される方法では、膣の下三分の一などの、膣の下方部分のスワブの閾値レベルは、後膣円蓋スワブの閾値レベルの三分の一または約三分の一であり得る。例えば、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが６０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは６００ｎｇ／ｍｌ）、または約６０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約６００ｎｇ／ｍｌ）である場合、膣の下三分一などの、膣の下方部分のバッファー処理スワブの閾値レベルは、２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは２００ｎｇ／ｍｌ）、または約２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約２００ｎｇ／ｍｌ）であり得る。同様に、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが３００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３０００ｎｇ／ｍｌ）、２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）、１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１０００ｎｇ／ｍｌ）、５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ）、３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３００ｎｇ／ｍｌ）、１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５０ｎｇ／ｍｌ）、または１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１００ｎｇ／ｍｌ）である場合、膣の下三分一などの、膣の下方部分のバッファー処理スワブの閾値レベルは、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１０００ｎｇ／ｍｌ）、６０〜７０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは６００〜７００ｎｇ／ｍｌ）、５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ）、３０〜４０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３００〜４００ｎｇ／ｍｌ）、１５〜２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）、１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１００ｎｇ／ｍｌ）、５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは５０ｎｇ／ｍｌ）、または３〜４ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３０〜４０ｎｇ／ｍｌ）であり得る。同様に、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが約３００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３０００ｎｇ／ｍｌ）、約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）、約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）、約１００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１０００ｎｇ／ｍｌ）、約５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ）、約３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３００ｎｇ／ｍｌ）、約１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５０ｎｇ／ｍｌ）または約１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１００ｎｇ／ｍｌ）である場合、膣の下三分一などの、膣の下方部分のバッファー処理スワブの閾値レベルは、それぞれ約１００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１０００ｎｇ／ｍｌ）、約６０〜７０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約６００〜７００ｎｇ／ｍｌ）、約５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ）、約３０〜４０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３００〜４００ｎｇ／ｍｌ）、約１５〜２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）、約１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１００ｎｇ／ｍｌ）、約５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約５０ｎｇ／ｍｌ）、または約３〜４ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３０〜４０ｎｇ／ｍｌ）であり得る。
【０３３２】
別の例では、尿サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、同じ対象から採取した後膣円蓋の頸膣スワブ中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の十分の一または約十分の一であり得る。従って、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが１つの閾値レベルと比較される本明細書で提供される方法では、尿サンプル中の閾値レベルは後膣円蓋スワブの閾値レベルの十分の一または約十分の一であり得る。例えば、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが６０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは６００ｎｇ／ｍｌ）または約６０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約６００ｎｇ／ｍｌ）である場合、膣の下三分一などの、膣の下方部分のバッファー処理スワブの閾値レベルは６ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは６０ｎｇ／ｍｌ）または約６ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約６０ｎｇ／ｍｌ）であり得る。同様に、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが３００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３０００ｎｇ／ｍｌ）、２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）、１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１０００ｎｇ／ｍｌ）、５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ）、３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３００ｎｇ／ｍｌ）、１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５０ｎｇ／ｍｌ）、または１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１００ｎｇ／ｍｌ）である場合、尿サンプルの閾値レベルは、それぞれ３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３００ｎｇ／ｍｌ）、２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは２００ｎｇ／ｍｌ）、１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５０ｎｇ／ｍｌ）、１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１００ｎｇ／ｍｌ）、５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは５０ｎｇ／ｍｌ）、３ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３０ｎｇ／ｍｌ）、１．５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５ｎｇ／ｍｌ）、または１ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１０ｎｇ／ｍｌ）であり得る。同様に、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが約３００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３０００ｎｇ／ｍｌ）、約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）、約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）、約１００ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１０００ｎｇ／ｍｌ）、約５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ）、約３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３００ｎｇ／ｍｌ）、約１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５０ｎｇ／ｍｌ）、または約１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１００ｎｇ／ｍｌ）である場合、尿サンプルの閾値レベルは、それぞれ約３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３００ｎｇ／ｍｌ）、約２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約２００ｎｇ／ｍｌ）、約１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５０ｎｇ／ｍｌ）、約１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１００ｎｇ／ｍｌ）、約５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約５０ｎｇ／ｍｌ）、約３ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３０ｎｇ／ｍｌ）、約１．５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５ｎｇ／ｍｌ）、または約１ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１０ｎｇ／ｍｌ）であり得る。
【０３３３】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの閾値癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）または約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）であり、ここで、対象のサンプルにおける測定量が１５０ｎｇ／ｍｌの閾値以上である場合に、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示し、対象のサンプルにおける測定量が１５０ｎｇ／ｍｌの閾値未満である場合に、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陰性であることを示す。
【０３３４】
切迫出産または早産の種々の可能性を示し得るバッファー処理サンプルの閾値の例としては、５０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌおよび約１０００ｎｇ／ｍｌが挙げられる。切迫出産または早産の種々の可能性を示し得る無処理サンプルの閾値の例としては、５００ｎｇ／ｍｌ、１５００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、３０００ｎｇ／ｍｌ、５０００ｎｇ／ｍｌ、７５００ｎｇ／ｍｌおよび１００００ｎｇ／ｍｌ、または約５００ｎｇ／ｍｌ、約１５００ｎｇ／ｍｌ、約２０００ｎｇ／ｍｌ、約３０００ｎｇ／ｍｌ、約５０００ｎｇ／ｍｌ、約７５００ｎｇ／ｍｌおよび約１００００ｎｇ／ｍｌが挙げられる。
【０３３５】
他の場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値に多層閾値を適用することができ、ここで、多層閾値は２以上の閾値レベルを含み、それぞれより高い閾値レベルが個別の健康状態分類を示し、例えば、それぞれより高い閾値レベルは、より重篤な健康問題、切迫出産の高い可能性、分娩日の高い確実性、または腫瘍の高い攻撃性を示し得る。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に関して多層閾値の一例として、バッファー処理サンプルについて、下方閾値が５０ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値が１５０ｎｇ／ｍＬである、二層閾値がある。別の多層閾値例では、無処理サンプルについて、下方閾値レベルが５００ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値レベルが１５００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルを含む。また別の多層閾値例では、バッファー処理サンプルについて、下方閾値レベルが５０ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値レベルが２００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルを含む。多層閾値の一例では、無処理サンプルについて、下方閾値レベルが５００ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値レベルが２０００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルを含む。別の多層閾値例では、バッファー処理サンプルについて、下方閾値レベルが５０ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値レベルが３００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルを含む。多層閾値の一例では、無処理サンプルについて、下方閾値レベルが５００ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値レベルが３０００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルを含む。
【０３３６】
いくつかの態様では、閾値レベルは経時的に、例えば、妊娠期間、疾病の進行、または対象の年齢の関数として変化し得る。この変化する閾値レベルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベルが時間（例えば、妊娠週数）の関数として変化する閾値曲線として表すことができる。ある場合には、閾値レベルは、妊娠１２〜２０週の間など、経時的に低下することがある。他の場合には、閾値レベルは、例えば癌症状の進行の場合など、経時的に上昇することがある。従って、一例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を、ある定義された期間の中でサンプルが採取された時点によって、閾値レベルより大きいか閾値レベルより小さいとして分類することができる。同様に、２以上の閾値レベルが経時的に変化して、それぞれ異なる健康分類を分ける２以上の閾値曲線となる場合もある。これら２以上の閾値レベルは経時的に低下する場合もあるし、経時的に上昇する場合もある。従って、一例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を、ある定義された期間の中でサンプルが採取された時点によって、異なる分類をすることができる。
【０３３７】
よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、およびその量を２以上の閾値レベルまたは閾値曲線と比較することによって、対象の健康状態を分類するための方法が提供され、ここで、測定量が最低の閾値未満である場合に、より好ましい健康状態を示し、測定量がより高い閾値レベルのそれぞれよりも高い場合に、健康状態が好ましくなくなるか、または好ましくない健康問題が高まることを示す。
【０３３８】
いくつかの態様では、対象サンプルの測定量に適用される１以上の閾値レベルまたは１以上の閾値曲線は、様々な対象特異的因子のいずれに従って決定してもよい。一例では、対象特異的因子は、対象に由来する１以上のサンプルの測定量であり得る。ある場合には、単一のサンプル測定値を用いて、１以上の対象特異的閾値レベルまたは１以上の対象特異的閾値曲線を定義することができる。単一のサンプル測定値を用いて、例えば、１以上の所定の閾値レベルまたは１以上の閾値曲線えを改変することができる。例えば、測定されたサンプル量を標準量の平均値または中央値と比較することができ、そのサンプル量：正常量の比を１以上の所定の閾値レベルまたは１以上の閾値曲線に当てはめて、そのレベルまたは曲線を引き上げたり引き下げたりすることができる（例えば、正常量の２倍のサンプル量を適用して、１以上の標準閾値レベルまたは曲線を２倍量にすることができる）。
【０３３９】
ある場合には、対象由来の特定のサンプル種（例えば、頸膣スワブ）中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変化率を用いて、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性または陰性として同定するか、またはサンプルを２つ以上の集団に分類することができる。サンプル種における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変化率は、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の安定した増加または減少を示すことができる。場合によっては、その変化率が１以上の閾値率以上であるとき、その変化率はそのサンプルにおいて測定された変化率以下の最高閾値率に従って分類することができる。変化率の例としては、１週間に１０％以上の増加、１週間に２０％以上の増加、１週間に３０％以上の増加、１週間に４０％以上の増加、１週間に５０％以上の増加、１週間に６０％以上の増加、１週間に７０％以上の増加、１週間に８０％以上の増加、１週間に９０％以上の増加、または１週間に１００％以上の増加が挙げられる。他の場合には、測定された変化率を１以上の閾値曲線または１以上の閾値率と比較することができ、測定された変化率を、閾値曲線の最大の傾き、または同じ期間内で測定された変化率以下の最高率に従って分類することができる。
【０３４０】
また、付加的な因子を適用して、１以上の所定の閾値レベル、１以上の閾値曲線、または１以上の閾値変化率を引き上げたり引き下げたりすることができる。このような付加的因子としては、他の健康状態マーカー、例えば、本明細書で例示されているか、またはそうでなければ当技術分野で公知のように、全般的健康マーカー、癌マーカー、妊娠もしくは分娩マーカー、または遺伝マーカーが挙げられる。
【０３４１】
また、本明細書では、対象の健康状態を示すための方法が提供され、その方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定を含み、また、１以上の他の健康マーカーの考慮も含み得る。健康マーカーとしては、全般的な健康に関するマーカー、妊娠もしくは分娩マーカー、または癌もしくは腫瘍マーカーを含む既知の様々なマーカーのいずれをも含み得る。全般的な健康に関する様々なマーカーはいずれも当技術分野で公知であるか、または本明細書の他所で示されており、マーカーの例としては、限定されるものではないが、血圧、脈拍、体重、既往歴、家族歴またはサンプル試験が挙げられる。様々な検出可能な腫瘍マーカーは当技術分野で公知であるか、または本明細書の他所で示されており、マーカーの例としては、限定されるものではないが、ＡＥ１／ＡＥ３、ＢＣＡ−２２５、カテプシンＤ、Ｅ−カドヘリン、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、Gross Cystic Disease Fluid Protein 15（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＯＸ−Ｂ３、Ｋｉ−６７、ｐ６５、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）およびトランスグルタミナーゼＫ（ＴＧＫ）、ｐ２１、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＲＣＡ−３、ｐ１６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩａ、ＭＥＮ−ＩＩｂ、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｐ５３、ｃ−ｅｒｂＢ２、ｃ−ｍｙｃ、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｂｃｌ−２、ｂａｘ、ＰＳＡ、ＣＹＦＲＡ  ２１−１、ＰＴＨ−ＲＰ、ＣＡ１２５、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー、プロガストリン、ガストリンＧ１７、ガストリンＧ３４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７−２９、ＣＡ  ７２−４、ＡＰＣ、ＳＣＣ、ＨＰＶサブタイプ、ＴＫ、αＦＰ、ｐ６２、カリクレイン、ｒａｓ、バソプレシン、ガストリン放出ペプチド、アネキシンＩ、アネキシンＩＩ、ＨｕおよびＫＯＣが挙げられる。妊娠または分娩に関連する様々なマーカーは当技術分野で公知であるか、または本明細書の他所で示されており、マーカーの例としては、限定されるものではないが、多胎妊娠、子宮頸管無力症、子宮奇形、羊水過多、過去の早期破水または早期陣痛、子癇前症、妊娠初期の膣出血、妊婦検診の少なさまたは皆無、子宮頸長、ビショップスコア、展退、出産歴（すなわち、対象の過去の経膣分娩）、子宮口の開大、妊娠齢、肥満度指数（ＢＭＩ）、位置、硬度、経膣超音波、指診、母体の肥満、胎児の大きさ、母体の齢、過去の過期分娩、胎児性別、特定の遺伝疾患、胎児奇形、異常な胎盤の形成、母体の感染症、内分泌障害、心血管性腎性高血圧、自己免疫疾患およびその他の免疫疾患、栄養不良、ならびに腹痛、腰痛、子宮頸粘液の通過および収縮などの症状が挙げられる。サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定およびまた１以上の他の健康マーカーの考慮を含む対象の健康状態を示す方法は、意志決定支援システムを含め、当技術分野で公知のものである。一例では、ニューラルネットワークなどの意志決定支援システムにより、患者のデータまたは情報、一般には患者の履歴や臨床データを解析し、さら��る試験または対象の処置の指針を得ることができる（米国特許第６，６７８，６６９号および同第６，２６７，７２２号参照）。
【０３４２】
１．妊娠の指標
本発明の方法およびプローブ用い、早産防止法に用いるため、または分娩誘発に用いるため、妊婦が早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクを有するかどうかを決定すること、分娩日を予測すること、妊娠継続を予測することができる。
【０３４３】
癌胎児性フィブロネクチン（ｏｎｆＦＮ）は胎児限定抗原を含み、胎盤、羊水および胎児結合組織中に見出すことができる。例えば、妊娠１２週後の対象の頸膣分泌液サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標の存在は、妊婦における、例えば、自然流産（１２〜２０週）、早産（２０〜３７週）、正期分娩（３７〜４２週）および過期分娩（４２週後）を含む、急迫出産のリスクに関連する。さらに、例えば、頸膣サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在により、妊娠２０週後の陣痛および破水の高いリスクを決定する方法が提供される。羊膜剥離の指標は陣痛の真偽を見極める上で重要なものであり、剥離が小さい場合は羊水の流出量が少なく、剥離も識別されないことが多い。本明細書においてこれらの方法および系は、妊娠および分娩関連状態を高い信頼性で評価する方式を提供する。
【０３４４】
妊娠関連の指標として、様々なサンプルのいずれを用いてもよく、サンプルの例としては、血液、血漿、血清、間質液、尿、頸膣洗浄液、頸膣スワブ、膣の下方部分のスワブ、膣の下三分の一のスワブ、陰唇スワブ、受動式頸膣分泌液採取物、または子宮頸分泌液および／もしくは膣分泌液の採取物が挙げられる。例えば、サンプルは頸膣スワブであり得る。妊娠関連の指標としては、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための様々な方法が使用でき、限定されるものではないが、ドットブロット分析、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ法、質量分析法、試験ストリップに基づくサンドイッチアッセイなどのサンドイッチアッセイ、およびＥＬＩＳＡ法が挙げられる。例えば、ブルーラテックス粒子とコンジュゲートされた可動性のマウス抗癌胎児性フィブロネクチン抗体と試験ストリップに固定されたポリクローナル抗ヒトフィブロネクチン抗体を含む試験ストリップを用いて、妊娠関連の指標とともに癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を検出することができる。
【０３４５】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が少ないか、検出可能でない場合には、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが低いことを示すか、分娩日予測能力を引き下げるか、妊娠を継続する可能性が高いことを予測するか、早産防止法の使用からの利益が小さいことを示すか、または分娩誘導に成功する可能性が低いことを示す。本明細書で提供される方法は高感度かつ特異的であり、高い陰性適中率を有し得る。例えば、早期分娩に至らない対象、予測分娩日の確実性が低い対象、妊娠を継続する対象、早産防止法を必要としない対象、または誘発の成功率が低い対象の高いパーセンテージのものが、低い癌胎児性フィブロネクチン指標分子値を有する。この試験はそれ自体、妊婦の有効なスクリーニング法である。
【０３４６】
一態様では、妊婦由来のサンプルで検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が高い場合は、より低いレベルを有する妊婦よりも、その妊婦の、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが高いこと、予測分娩日の確実性が高いこと、妊娠を継続する可能性が低いこと、早産防止法の使用からの利益が小さいこと、または分娩誘発の成功の可能性が高いことを示す。例えば、分娩間近の、３９週付近の妊婦由来のサンプルで検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、３９週付近の妊婦のレベルよりも高い。別の例では、分娩間近の、臨月を超えた妊婦由来のサンプルで検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、臨月を超えた妊婦のレベルよりも高い。また別の例では、早産のリスクが高い妊婦由来のサンプルで検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、早産のリスクが低い、同じ妊娠期の妊婦のレベルよりも高い。また別の例では、分娩日予測の確実性が高い妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩日予測の確実性が低い妊婦のレベルよりも高い。また別の例では、妊娠を継続する可能性が高い妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を継続する可能性が低い妊婦のレベルよりも低い。また別の例では、早産防止法からの利益が小さい妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、早産防止法からの利益が大きい妊婦のレベルよりも低い。また別の例では、誘発成功の可能性が高い妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、誘発成功の可能性が低い妊婦のレベルよりも高い。
【０３４７】
いくつかの態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を１以上の閾値と比較することができる。一般に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値レベル以上である場合に、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示す。一態様では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ）または約５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、妊婦の、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが高いこと、分娩日の確実性が高いこと、妊娠を継続する可能性が高いこと、早産防止法からの利益が小さいこと、または分娩誘発の成功の可能性が高いことを示す。
【０３４８】
別の態様では、妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が低い場合は、高いレベルを有する妊婦よりも、その妊婦の、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが低いこと、予測分娩日の確実性が低いこと、妊娠を継続する可能性が高いこと、早産防止法の使用からの利益が小さいこと、または分娩誘導に成功する可能性が低いことを示す。例えば、分娩間近でない、３９週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近の、３９週付近の妊婦のレベルよりも低い。別の例では、分娩間近でない、臨月を超えた妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近の、臨月を超えた妊婦のレベルよりも低い。また別の例では、早産のリスクが低い妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、早産のリスクが高い同じ妊娠期の妊婦のレベルよりも低い。また別の例では、分娩日予測の確実性が低い妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩日予測の確実性が高い妊婦のレベルよりも低い。また別の例では、妊娠を継続する可能性が低い妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を継続する可能性が高い妊婦のレベルよりも高い。また別の例では、早産防止法からの利益が大きい妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、早産防止法からの利益が小さい妊婦のレベルよりも高い。また別の例では、誘発成功の可能性が低い妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、誘発成功の可能性が高い妊婦のレベルよりも低い。
【０３４９】
一般に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値レベル未満である場合に、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陰性であることを示す。一態様では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が５０ｎｇ／ｍｌ未満（または無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ未満）または約５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ未満）である場合に、妊婦の、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが低いこと、分娩日の確実性が低いこと、妊娠を継続する可能性が低いこと、早産防止法からの利益が大きいこと、または分娩誘導に成功する可能性が低いことを示す。
【０３５０】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値に多層閾値を適用することができ、ここで、多層閾値は２以上の閾値を含み、それぞれより高い閾値が、より低い閾値に比べて、さらに、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが高いこと、予測分娩日の確実性が高いこと、妊娠を継続する可能性が低いこと、早産防止法の使用からの利益が大きいこと、または分娩誘発の成功の可能性が高いことを示す。多層閾値の例では２つの閾値レベルを含み、ここで、バッファー処理サンプルについて、下方閾値レベルは５０ｎｇ／ｍＬであり、上方閾値レベルは１５０ｎｇ／ｍＬである。多層閾値の例では、無処理サンプルについて、下方閾値レベルが５００ｎｇ／ｍＬであり、上方閾値レベルが１５００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルが含まれる。別の多層閾値例では、バッファー処理サンプルについて、下方閾値レベルが５０ｎｇ／ｍＬであり、上方閾値レベルが２００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルが含まれる。多層閾値の一例では、無処理サンプルについて、下方閾値レベルが５００ｎｇ／ｍＬであり、上方閾値レベルが２０００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルが含まれる。別の多層閾値例では、バッファー処理サンプルについて、下方閾値レベルが５０ｎｇ／ｍＬであり、上方閾値レベルが３００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルが含まれる。多層閾値の一例では、無処理サンプルについて、下方閾値レベルが５００ｎｇ／ｍＬであり、上方閾値レベルが３０００ｎｇ／ｍＬである、２つの閾値レベルが含まれる。
【０３５１】
多層閾値を含むこれらの方法によれば、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、およびそのサンプルを２以上の閾値と比較することによってサンプルを分類するための方法が提供され、ここで、それぞれより高い閾値の分類が、より低い閾値よりもさらに、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが高いこと、予測分娩日の確実性が高いこと、妊娠を継続する可能性が低いこと、早産防止法の使用からの利益が高いこと、または分娩誘発の成功の可能性が高いことを示す。
【０３５２】
また、本明細書では、妊娠および分娩関連指摘のための方法が提供され、その方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定を含み、また、１以上の他の妊娠または分娩マーカーの考慮を含む。妊娠または分娩に関連する様々なマーカーは当技術分野で公知であるか、または本明細書の他所で示されており、マーカーの例としては、限定されるものではないが、多胎妊娠、子宮頸管無力症、子宮奇形、羊水過多、過去の早期破水または早期陣痛、子癇前症、妊娠初期の膣出血、妊婦検診の少なさまたは皆無、子宮頸長、ビショップスコア、展退、出産歴（すなわち、対象の過去の経膣分娩）、子宮口の開大、妊娠齢、肥満度指数（ＢＭＩ）、位置、硬度、経膣超音波、指診、母体の肥満、胎児の大きさ、母体の齢、過去の過期分娩、胎児の性別、特定の遺伝疾患、胎児奇形、異常な胎盤の形成、母体の感染症、内分泌障害、心血管性腎性高血圧、自己免疫疾患およびその他の免疫疾患、栄養不良、ならびに腹痛、腰痛、子宮頸粘液の通過および収縮などの症状が挙げられる。よって、本明細書では、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスク、予測分娩日の確実性、妊娠を継続する可能性、早産防止法の使用からの利益、または分娩誘導に成功する可能性を決定する方法が提供され、ここで、これらの方法はサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、および１以上の付加的妊娠または分娩関連マーカーを決定することを含み、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と１以上の妊娠または分娩関連マーカーの存在、またはより高い量が、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の不存在またはより低い量および／または１以上の付加的妊娠または分娩関連マーカーに関する陽性結果よりも、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが高いこと、予測分娩日の確実性が高いこと、妊娠を継続する可能性が低いこと、早産防止法の使用からの利益が大きいこと、または分娩誘発の成功の可能性が高いことを示す。また、本明細書では、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスク、予測分娩日の確実性、妊娠を継続する可能性、早産防止法の使用からの利益、または分娩誘導に成功する可能性を決定する方法が提供され、ここで、これらの方法は、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、および１以上の付加的妊娠または分娩関連マーカーを決定することを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子および１以上の妊娠または分娩関連マーカーの不存在またはより低い量が、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在またはより高い量および／または１以上の付加的妊娠または分娩関連マーカーに関する陽性結果よりも、早産、急迫出産および／または切迫出産のリスクが低いこと、予測分娩日の確実性が低いこと、妊娠を継続する可能性が高いこと、早産防止法の使用からの利益が小さいこと、または分娩誘導に成功する可能性が低いことを示す。
【０３５３】
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定およびまた１以上の他の妊娠または分娩関連マーカーの考慮を含む、対象の健康状態を示す方法は、意志決定支援システムを含め、当技術分野で公知のものである。一例では、神経ネットワークなどの意志決定支援システムにより、患者のデータまたは情報、一般には患者の履歴や臨床データを解析し、さらなる試験または対象の処置の指針を得ることができる（米国特許第６，６７８，６６９号および同第６，２６７，７２２号参照）。
【０３５４】
これらの方法は、妊娠１２週または約１２週以降分娩までの全ての妊婦に実施することができる。本方法は約１２週以降、約１３週以降、約１４週以降、約１５週以降、約１６週以降、約１７週以降、約１８週以降、約１９週以降、約２０週以降、約２１週以降、約２２週以降、約２３週以降、約２４週以降、約２５週以降、約２６週以降、約２７週以降、約２８週以降、約２９週以降、約３０週以降、約３１週以降、約３２週以降、約３３週以降、約３４週以降、約３５週以降、約３６週以降、約３７週以降、約３８週以降、約３９週以降、約４０週以降、約４１週以降、約４２週以降、約４３週以降、約４４週以降、または約４５週以降のいずれの妊婦にも用いることができる。
【０３５５】
例えば、本方法は、妊娠約８０日以降、約８１日以降、約８２日以降、約８３日以降、約８４日以降、約８５日以降、約８６日以降、約８７日以降、約８８日以降、約８９日以降、約９０日以降、約９１日以降、約９２日以降、約９３日以降、約９４日以降、約９５日以降、約９６日以降、約９７日以降、約９８日以降、約９９日以降、約１００日以降、約１０１日以降、約１０２日以降、約１０３日以降、約１０４日以降、約１０５日以降、約１０６日以降、約１０７日以降、約１０８日以降、約１０９日以降、約１１０日以降、約１１１日以降、約１１２日以降、約１１３日以降、約１１４日以降、約１１５日以降、約１１６日以降、約１１７日以降、約１１８日以降、約１１９日以降、約１２０日以降、約１２１日以降、約１２２日以降、約１２３日以降、約１２４日以降、約１２５日以降、約１２６日以降、約１２７日以降、約１２８日以降、約１２９日以降、約１３０日以降、約１３１日以降、約１３２日以降、約１３３日以降、約１３４日以降、約１３５日以降、約１３６日以降、約１３７日以降、約１３８日以降、約１３９日以降、約１４０日以降、約１４１日以降、約１４２日以降、約１４３日以降、約１４４日以降、約１４５日以降、約１４６日以降、約１４７日以降、約１４８日以降、約１４９日以降、約１５０日以降、約１５１日以降、約１５２日以降、約１５３日以降、約１５４日以降、約１５５日以降、約１５６日以降、約１５７日以降、約１５８日以降、約１５９日以降、約１６０日以降、約１６１日以降、約１６２日以降、約１６３日以降、約１６４日以降、約１６５日以降、約１６６日以降、約１６７日以降、約１６８日以降、約１６９日以降、約１７０日以降、約１７１日以降、約１７２日以降、約１７３日以降、約１７４日以降、約１７５日以降、約１７６日以降、約１７７日以降、約１７８日以降、約１７９日以降、約１８０日以降、約１８１日以降、約１８２日以降、約１８３日以降、約１８４日以降、約１８５日以降、約１８６日以降、約１８７日以降、約１８８日以降、約１８９日以降、約１９０日以降、約１９１日以降、約１９２日以降、約１９３日以降、約１９４日以降、約１９５日以降、約１９６日以降、約１９７日以降、約１９８日以降、約１９９日以降、約２００日以降、約２０１日以降、約２０２日以降、約２０３日以降、約２０４日以降、約２０５日以降、約２０６日以降、約２０７日以降、約２０８日以降、約２０９日以降、約２１０日以降、約２１１日以降、約２１２日以降、約２１３日以降、約２１４日以降、約２１５日以降、約２１６日以降、約２１７日以降、約２１８日以降、約２１９日以降、約２２０日以降、約２２１日以降、約２２２日以降、約２２３日以降、約２２４日以降、約２２５日以降、約２２６日以降、約２２７日以降、約２２８日以降、約２２９日以降、約２３０日以降、約２３１日以降、約２３２日以降、約２３３日以降、約２３４日以降、約２３５日以降、約２３６日以降、約２３７日以降、約２３８日以降、約２３９日以降、約２４０日以降、約２４１日以降、約２４２日以降、約２４３日以降、約２４４日以降、約２４５日以降、約２４６日以降、約２４７日以降、約２４８日以降、約２４９日以降、約２５０日以降、約２５１日以降、約２５２日以降、約２５３日以降、約２５４日以降、約２５５日以降、約２５６日以降、約２５７日以降、約２５８日以降、約２５９日以降、約２６０日以降、約２６１日以降、約２６２日以降、約２６３日以降、約２６４日以降、約２６５日以降、約２６６日以降、約２６７日以降、約２６８日以降、約２６９日以降、約２７０日以降、約２７１日以降、約２７２日以降、約２７３日以降、約２７４日以降、約２７５日以降、約２７６日以降、約２７７日以降、約２７８日以降、約２７９日以降、約２８０日以降、約１８２日以降、約２８２日以降、約２８３日以降、約２８４日以降、約２８５日以降、約２８６日以降、約２８７日以降、約２８８日以降、約２８９日以降、約２９０日以降、約２９１日以降、約２９２日以降、約２９３日以降、約２９４日以降、約２９５日以降、約２９６日以降、約２９７日以降、約２９８日以降、約２９９日以降、約３００日以降、約３０１日以降、約３０２日以降、約３０３日以降、約３０４日以降、約３０５日以降、約３０６日以降、約３０７日以降、約３０８日以降、約３０９日以降、約３１０日以降、約３１１日以降、約３１２日以降、約３１３日以降、約３１４日以降、または約３１５日以降のいずれの妊婦にも用いることができる。
【０３５６】
ａ．早産の可能性
本明細書で提供される方法は、妊娠対象の早産の可能性を決定するために使用することができる。例えば、早産に至らない対象の高いパーセンテージのものが、低い癌胎児性フィブロネクチン指標分子値を有する。よって、本明細書で提供される方法は高感度かつ特異的であり、高い陰性適中率を有し得る。本明細書で提供される方法は、サンプルにおいて測定された癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従い、切迫出産または早産の高いまたは低い可能性を示し得る。例えば、切迫出産または早産の可能性が低い対象は、切迫出産または早産の可能性が高い妊婦のレベルより低い癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定量を有する可能性があり、切迫出産または早産の可能性が高い対象は、切迫出産または早産の可能性が低い妊婦のレベルよりも高い癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定量を有する可能性がある。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量はまた、１以上の閾値と比較することもでき、ここで、それぞれの閾値レベルが高くなるほど切迫出産または早産の可能性が高くなる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量はまた、切迫出産または早産の可能性を決定する際に、１以上の他の妊娠または分娩関連マーカーとともに検討することもできる。
【０３５７】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の高いレベルは、早産リスクが高いことを示し得る。一態様では、分娩間近の、妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない妊婦のレベルよりも高い。例えば、早産のリスクが高い妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、早産のリスクが低い同じ妊娠期の妊婦のレベルよりも高い。
【０３５８】
一般に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値以上である場合に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値未満である場合よりも、切迫出産または早産の可能性が高いことを示す。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が５０ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍｌ未満である場合よりも、切迫出産または早産の可能性が高いことを示す。
【０３５９】
別の態様では、分娩間近でない、妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近の妊婦のレベルよりも低い。例えば、早産のリスクが低い妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、早産のリスクが高い同じ妊娠期の妊婦のレベルよりも低い。
【０３６０】
一般に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値未満である場合に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値以上である場合よりも、切迫出産または早産の可能性が低いことを示す。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ）または約５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ）未満である場合に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が５０ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍｌ以上である場合よりも、切迫出産または早産の可能性が低いことを示す。
【０３６１】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの閾値癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度は１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）または約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）であり、ここで、対象のサンプルにおける測定量が閾値の１５０ｎｇ／ｍｌ以上である場合に切迫出産または早産のより高いリスクを示し、対象のサンプルにおける測定量が閾値の１５０ｎｇ／ｍｌ未満である場合に切迫出産または早産のより低いリスクを示す。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、５％、１０％、１５％、２０％またはそれを超える切迫出産または早産の可能性を示し得る。一例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であること、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であること、２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であること、または１週間または約１週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が１０％以上であること、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が１０％以上であること、または２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が１０％以上であることを示し得る。また別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が２０％以上であること、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が２０％以上であること、または４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が２０％以上であることを示し得る。また別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、１０週間または約１０週間以内に分娩に至る可能性が２５％以上であること、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が２５％以上であること、または６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が２５％以上であることを示し得る。また別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、１０週間または約１０週間以内に分娩に至る可能性が３０％以上であること、または８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が３０％以上であることを示し得る。また別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、１０週間または約１０週間以内に分娩に至る可能性が３５％以上であることを示し得る。また別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、１２週間または約１２週間以内に分娩に至る可能性が４０％以上であることを示し得る。
【０３６２】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの閾値癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度は２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）であり、ここで、対象サンプルにおける測定量が２００ｎｇ／ｍｌの閾値以上である場合に切迫出産または早産のより高いリスクを示し、対象サンプルにおける測定量が２００ｎｇ／ｍｌの閾値未満である場合に切迫出産または早産のより低いリスクを示す。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、５％、１０％、１５％、２０％以上の切迫出産または早産の可能性を示し得る。一例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であること、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であること、２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であること、または１週間または約１週間以内に分娩に至る可能性が５％以上であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が１０％以上であること、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が１０％以上であること、または２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が１０％以上であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が２０％以上であること、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が２０％以上であること、または４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が２０％以上であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、１０週間または約１０週間以内に分娩に至る可能性が２５％以上であること、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が２５％以上であること、または約６週間以内に分娩に至る可能性が２５％以上であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、１０週間または約１０週間以内に分娩に至る可能性が３０％以上であること、または８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が３０％以上であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、１０週間または約１０週間以内に分娩に至る可能性が３５％以上であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ）または約２００ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ）である場合に、１２週間または約１２週間以内に分娩に至る可能性が４０％以上であることを示し得る。
【０３６３】
早産スクリーニングの対象の例としては、妊娠８０日もしくは約８０日以降、または妊娠１２週または約１２週以降分娩まで、または少なくとも早産のリスクがなくなるまで（すなわち、３７週または約３７週まで）の妊娠齢の対象である。一般に、これらの対象は健全な羊膜を有している。
【０３６４】
ある場合には、対象を複数の場合において試験することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値を超える場合には、その後、その対象を、頸膣分泌液中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在について再び試験することができる。癌胎児性フィブロネクチン陽性の対象に対しては、癌胎児性フィブロネクチン陰性決定の対象に行うよりも多く決定を行うことができる。さらに、癌胎児性フィブロネクチン陽性対象に対しては、胎児の肺の成熟度を決定もしくは増進する、または妊娠を延長させる手段を講じることができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子アッセイが陰性であれば、その対象をモニタリングし、次の来所時にその対象の癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルを繰り返し評価することができる。一般に、対象は１２〜３６週または約１２〜３６週は２週間ごと、３６週または約３６週からは１週間ごとに検査することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験が陰性であれば、決定が陽性となるか、またはその対象が分娩するまで、その後の検診来所時に試験を繰り返すことができる。
【０３６５】
ｂ．早産の防止
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出する方法ははまた、妊婦の早産を防止するためにも使用することができる。他の妊娠または分娩関連の方法の場合と同様に、妊婦由来のサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性である場合に、癌胎児性フィブロネクチン陰性のサンプルを有する妊婦よりも切迫出産または早産の可能性が高いことを示し得る。切迫出産または早産の可能性が高いこのような妊婦に対しては、妊娠を有利にさせ得る、もしくは延長させ得る、または早産児の生存力を高め得る方法を行うことができる。例えば、対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量をモニタリングすることにより、早産または切迫出産の高い可能性の指標となる癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの上昇が測定された場合に、その対象に子宮収縮抑制剤などのプロゲステロン療法を施すことができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量はまた、１以上の閾値と比較することもでき、ここで、それぞれの閾値レベルが高くなるほど早産防止法の使用からの利益が大きくなる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量はまた、切迫出産または早産の可能性を決定する際に、１以上の他の妊娠または分娩関連マーカーとともに検討することもできる。
【０３６６】
よって、本明細書では、対象からサンプルを得ること、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、および癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが、早産または切迫出産の高い可能性の指標となる閾値レベル以上であるかどうかを評価し、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であれば、その対象に治療上有効な量のプロゲステロン剤などのプロゲステロン療法を施すことによって、妊娠対象をスクリーニングし、適当であれば、処置する方法が提供される。本明細書で提供される、早産のリスクのある妊娠対象をスクリーニングし、その対象を子宮収縮抑制剤などのプロゲステロン療法で処置するための方法は、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる同時係属出願である米国特許出願第１０／７７４，１４４号に示されている方法と併用することもできる。
【０３６７】
子宮収縮抑制剤投与などのプロゲステロン療法は妊娠に有利であるか、または妊娠を助けるか、または例えば子宮収縮を抑制することにより早期陣痛を抑制するか、または早産児の生存力を高める。本明細書で提供される方法に従って施すことができるプロゲステロン療法としては、妊娠を延長させる、早期陣痛を抑制する、または早産児の生存力を高めるための様々な技術のいずれをも含み得る。プロゲステロン療法は、妊娠対象の安静臥床などの方法を含み、また、子宮収縮を低減または抑制する、もしくは妊娠を延長させる、もしくは早産児の生存力を高める１以上の薬剤の投与も含み得る。例えば、プロゲステロン療法は、子宮収縮抑制剤の投与を含み得る。
【０３６８】
子宮収縮抑制剤は、早期陣痛を抑制することが知られている何らかの薬剤群を含む。このような薬剤はいずれも使用可能である。本明細書の方法に従って用いられる子宮収縮抑制剤の例としては、限定されるものではないが、次のいずれのものも含む：硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩；インドメタシン、スリンダック、ナプロキセン、アスピリンおよびフェノプロフェンなどの非ステロイド系抗炎症化合物を含むプロスタグランジン合成阻害剤；リトドリン、テルブタリン、アルブテロール、フェノテロール、ヘキソプレナリン、イソクスプリン(isoxuprine)、メタプロテレノール、ニリドリン、オルシプレナリンおよびサルブタモール、またはその他のエピネフリンまたはノルエピネフリン類似体もしくは誘導体などのβ−アドレナリン作用薬；ニフェジピンおよびニカルジピンなどのカルシウムチャネル遮断薬；アトシバンなどのオキシトシン拮抗薬；ニトログリセリンなどの一酸化窒素供与体；ジドロゲステロン、二酢酸エチノジオール、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ノレシンドロン、酢酸ノレシンドロン、ノレシノドレル、ノルゲストレル、酢酸メゲステロール、ゲストデン、デソゲストレル、シンゲストール(cingestol)、リネストレノール、酢酸キンゲスタノール(quingestanol)、レボノルゲストレル、３−ケトデソゲストレル(3−ketodesogestrel）、ノルゲスチメート、オサテロン、酢酸シプロテロン、トリメゲストン、ジエノゲスト、ドロスピレノン、ノメゲストロール、（１７−デアセチル）ノルゲスチメート(norgestimnate)、１９−ノルプロゲステロン、メレンゲステロール、エチステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、１７−α−ヒドロキシプロゲステロン、ジメチステロン、エチニルエストレノール、デメゲストン(demegestone)、プロゲステロン、クロルマジノン、プレグン−４−エン−３，２０−ジオン（プロゲステロン）、１９−ノル−プレグン−４−エン−３，２０−ジオン、１７−ヒドロキシ−１９−ノル−１７α−プレグン−５（１０）−エン−２０−イン−３−オン、ジ−１１α−エチル−１７−エチニル−１７−α−ヒドロキシゴン−４−エン−３−オン、１７−エチニル−１７−ヒドロキシ−５（１０）−エストレン−３−オン、１７α−エチニル−１９−ノレストステロン、６−クロロ−１７−ヒドロキシプレグナ−４，６−ジエン−３，２０−ジオン、１７α−ヒドロキシ−６α−メチル−１７（−１−プロピニル(propynl)−アンドロスト−４−エン−３−オン、９α，１０α−プレグナ−４，６−ジエン−３，２０−ジオン、１７−ヒドロキシ−１７α−プレグン−４−エン−２０−イン−３−オン、１９−ノル−１７α−プレグ−４−エン−２０−イエン−３，１７−ジオール、１７−ヒドロキシ−プレグン−４−エン−３，２０−ジオン、１−７−ヒドロキシ−６α−メチルプレグン−４−エン−３，２０−ジオンならびにそれらの誘導体および混合物を含む、アラタ体、胎盤および副腎皮質により分泌されるホルモンならびにその誘導体（例えば、米国特許第５，２１１，９５２号参照）。子宮収縮抑制剤としてはまた、天然のものであれ合成により生成されたものであれ、ω−３脂肪酸およびその誘導体も含む。ω−３脂肪酸の例としては、例えば、ドコサ��キサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。
【０３６９】
子宮収縮抑制剤は当技術分野で公知の様々な方法のいずれによっても投与することができる。例えば、子宮収縮抑制剤は、経口投与、注射（例えば、ボーラス注射または持続的注入による）による非経口投与、経皮投与、鼻腔内投与、または吸入による投与が可能である。子宮収縮抑制剤の治療上有効な量は、例えば、特定の薬剤および／または用いる医薬組成物、投与様式および処置経過によって異なる。所与の条件セットに対する至適用量は通常の用量決定試験を用いて確認することができる。さらに、子宮収縮抑制剤の投与は適当な間隔（例えば、毎日、毎週など）で繰り返すことができる。一態様では、用量は、循環血液中の子宮収縮抑制剤の濃度を測定し、それに応じて投与様式および／または処置経過を調整することによって決定される。
【０３７０】
ｃ．分娩日の予測因子
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出する方法は、妊婦の分娩日を予測するために使用することができる。本明細書で提供される早産または切迫出産の予測を目的に提供される方法の場合と同様、分娩間近の妊婦由来のサンプルにおいて検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない妊婦のレベルよりも高い。本明細書で提供される方法は、切迫出産の可能性が高い対象、ならびに特定の時間枠内で分娩に至る可能性が高い対象を示すために使用することができる。本明細書で提供される方法はまた、対象が間もなく分娩に至るか、または特定の時間枠内で分娩に至る可能性を示すために使用することができる。本明細書で提供される方法はまた、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を１以上の閾値と比較することを含んでもよく、ここで、それぞれの閾値レベルが高くなるほど切迫出産の可能性が高くなるか、または、それぞれの閾値レベルが高くなるほど特定の時間枠内で分娩に至る可能性が高まる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量はまた、切迫出産の可能性または特定の時間枠内で分娩に至る可能性を決定する際に、１以上の他の妊娠または分娩関連マーカーとともに検討することもできる。
【０３７１】
さらに、本明細書では、妊娠を継続する妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近の妊婦のレベルよりも低い方法が提供される。本明細書で提供される方法は、臨月まで妊娠を継続する可能性が高い対象、ならびに特定の時間枠の間妊娠を継続する可能性が高い対象を示すために使用することができる。本明細書で提供される方法はまた、対象が臨月まで妊娠を継続するか、または特定の時間枠の間妊娠を継続する可能性を示すために使用することができる。本明細書で提供される方法はまた、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を１以上の閾値と比較することを含んでもよく、ここで、それぞれの閾値レベルが低くなるほど妊娠を継続する可能性が高くなるか、またはそれぞれの閾値レベルが低くなるほど特定の時間枠の間妊娠を継続する可能性が高くなる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量はまた、臨月まで妊娠を継続する可能性、または特定の時間枠の間妊娠を継続する可能性を決定する際に、１以上の他の妊娠または分娩関連マーカーとともに検討することもできる。
【０３７２】
一態様では、分娩間近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない妊婦のレベルよりも高い。例えば、分娩間近の、妊娠２４週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、妊娠２４週付近の妊婦のレベルよりも高い。例えば、分娩間近の、妊娠３５週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、妊娠３５週付近の妊婦のレベルよりも高い。別の例では、分娩間近の、妊娠３７週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、妊娠３７週付近の妊婦のレベルよりも高い。別の例では、分娩間近の、妊娠３９週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、妊娠３９週付近の妊婦のレベルよりも高い。別の例では、分娩間近の、臨月を超えた妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、臨月を超えた妊婦のレベルよりも高い。このような例では、閾値レベルは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、その対象が間もなく分娩に至る可能性が高いことを示し、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、その対象がすぐには分娩に至らない可能性が高いことを示すように定義することができる。
【０３７３】
一態様では、妊娠を継続する妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を継続しない妊婦のレベルよりも低い。例えば、妊娠を継続する、妊娠２４週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を継続しない、妊娠２４週付近の妊婦のレベルよりも低い。例えば、妊娠を継続する、妊娠３５週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を継続しない、妊娠３５週付近の妊婦のレベルよりも低い。別の例では、妊娠を継続する、妊娠３７週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を維持しない、妊娠３７週付近の妊婦のレベルよりも低い。別の例では、妊娠を継続する、妊娠３９週付近の妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を継続しない、妊娠３９週付近の妊婦のレベルよりも低い。別の例では、妊娠を継続する、臨月を超えた妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、妊娠を継続しない、臨月を超えた妊婦のレベルよりも低い。このような例では、閾値レベルは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、その対象が妊娠を継続する可能性が高いことを示し、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、その対象が妊娠を継続しない可能性が高いことを示すように定義することができる。
【０３７４】
一般に、特定の期間内に分娩に至る妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、特定の期間内に分娩に至らない妊婦のレベルよりも高い。例えば、特定の期間内に分娩に至る、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩間近でない、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦のレベルよりも高い。このような例では、閾値レベルは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、その対象が特定の期間内に分娩に至る可能性が高いことを示し、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満の場合に、その対象が特定の期間内に分娩に至らない可能性が高いことを示すように定義することができる。分娩に至る可能性を示し得る期間の例としては、５か月以内、４か月以内、１４週間以内、３か月以内、１２週間以内、１１週間以内、１０週間以内、９週間以内、２か月以内、８週間以内、７週間以内、６週間以内、５週間以内、１か月以内、４週間以内、３週間以内、２週間以内、１０日以内、１週間以内、６日以内、５日以内、４日以内、３日以内、２日以内、または１日以内が挙げられる。
【０３７５】
関連する方法では、特定の期間妊娠を継続する妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、その期間妊娠を継続しない妊婦のレベルよりも低い。例えば、特定の期間妊娠を継続する、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近または臨月を超えた妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、その期間妊娠を継続しない、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦のレベルよりも低い。このような例では、閾値レベルは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、その対象が特定の期間妊娠を継続する可能性が高いことを示し、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、その対象がその期間妊娠を維持しない可能性が高いことを示すように定義することができる。分娩に至る可能性を示し得る期間の例としては、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週、少なくとも１０日、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも２か月、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、少なくとも３か月、少なくとも１４週間、少なくとも４か月、または少なくとも５か月が挙げられる。
【０３７６】
ある場合には、対象のサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従って、分娩に至る可能性の程度を示すことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が高い妊婦由来のサンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが低い妊婦よりも切迫出産の可能性が高いことを示す。例えば、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が高い場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの低い、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦よりも、切迫出産の可能性が高いことを示す。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が高い妊婦由来のサンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの低い妊婦よりも、特定の期間内に分娩に至る可能性が高いことを示す。例えば、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が高い場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの低い、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦よりも、特定の期間内に分娩に至る可能性が高いことを示す。分娩に至る高い可能性の例としては、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％（例えば、２倍）、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、または５０倍高い分娩可能性であり得る。特定の期間に分娩に至る高い可能性の例としては、２週間または約２週間以内に少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍高い、３０倍、または４０倍高い分娩可能性；６週間または約６週間に少なくとも５０％、７５％、２倍、５倍、１０倍、または１５倍高い分娩可能性；３か月または約３か月以内に少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％または３倍高い分娩可能性が挙げられる。
【０３７７】
同様に、対象のサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従って、妊娠を継続する可能性の程度も示すことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が低い妊婦由来のサンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが高い妊婦よりも、妊娠を継続する可能性が高いことを示す。例えば、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が低い場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが高い、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦によりも、妊娠を継続する可能性が高いことを示す。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が低い妊婦由来のサンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの高い妊婦よりも、特定の期間妊娠を継続する可能性が高いことを示す。例えば、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が低い場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが高い、妊娠２４週、３５週、３７週、３９週付近、または臨月を超えた妊婦よりも、特定の期間妊娠を継続する可能性が高いことを示す。妊娠を維持する高い可能性の例としては、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％、１７５％、または２００％高い妊娠継続可能性であり得る。特定の期間妊娠を継続する可能性の例としては、少なくとも２週間または約２週間の間、少なくとも１％、２％、３％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、または５０％高い妊娠継続可能性；少なくとも６週間または約６週間の間、少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７５％高い妊娠継続可能性；少なくとも３か月または約３か月の間、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％高い妊娠継続可能性が挙げられる。
【０３７８】
このような例では、閾値レベルは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、その対象が間もなく分娩に至る可能性が高いことを示し、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満の場合に、その対象がすぐには分娩に至らない可能性が高いことを示すように定義することができる。
【０３７９】
本明細書では分娩日および妊娠継続予測法と併用するために、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が１以上の閾値レベル以上である場合に、対象を癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなす。当業者が認識しているように、閾値レベルは測定するサンプル種および選択する試験のストリンジェンシーによって異なり得る。一例では、試験ストリップを用いてアッセイする頸膣サンプルの閾値レベルは５０ｎｇ／ｍＬであり得る。別の例では、試験ストリップを用いてアッセイする頸膣サンプルの閾値レベルは１５０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０３８０】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定値に多層閾値を適用することができ、ここで、多層閾値は２以上の閾値レベルを含み、それぞれより高い閾値レベルが切迫出産の可能性、または特定の期間内に分娩に至る可能性がさらに高いことを示し、あるいはそれぞれより低い閾値レベルが妊娠を継続する可能性、または特定の期間妊娠を継続する可能性がさらに高いことを示す。多層閾値の一例として、バッファー処理サンプルについて、下方閾値が５０ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値が１５０ｎｇ／ｍＬである二層閾値がある。また、多層閾値の一例として、無処理サンプルについて、下方閾値が５００ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値が１５００ｎｇ／ｍＬである二層閾値がある。
【０３８１】
本明細書で示されるように、特定の閾値レベルを、分娩に至る可能性または妊娠を継続する可能性とともに同定することができ、これらは特定の期間内に分娩に至る可能性または妊娠を継続する可能性であり得る。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、所定の期間内に分娩に至る可能性を示し得る。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、１週間または約１週間以内に切迫出産または早産に至る可能性が５％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が１０％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が２０％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が２５％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が３０％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が４０％であることを示し得る。
【０３８２】
別の例では、妊娠２４週または約２４週目に妊婦を癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関して試験することができ、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦が切迫出産または早産のリスクが高いことを示し得る。例えば、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、１週間または約１週間以内に分娩に至る可能性が５％または約５％であり得る。別の例では、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が１０％または約１０％であり得る。別の例では、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が２０％または約２０％であり得る。別の例では、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が２５％または約２５％であり得る。別の例では、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が３０％または約３０％であり得る。別の例では、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ以上）または約１５０ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、１２週間または約１２週間以内に分娩に至る可能性が４０％または約４０％であり得る。
【０３８３】
他の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、所定の期間内に分娩に至る可能性を示し得る。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、１週間または約１週間以内に切迫出産または早産に至る可能性が５％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が１０％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が２０％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が２５％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が３０％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合に、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が４０％であることを示し得る。
【０３８４】
一例では、妊娠２４週または約２４週目に妊婦を癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関して試験することができ、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは２０００ｎｇ／ｍｌ以上）または約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦が切迫出産または早産のリスクが高いことを示し得る。例えば、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、１週間または約１週間以内に分娩に至る可能性が５％または約５％であり得る。例えば、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、２週間または約２週間以内に分娩に至る可能性が１０％または約１０％であり得る。例えば、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、４週間または約４週間以内に分娩に至る可能性が２０％または約２０％であり得る。例えば、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、６週間または約６週間以内に分娩に至る可能性が２５％または約２５％であり得る。例えば、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、８週間または約８週間以内に分娩に至る可能性が３０％または約３０％であり得る。例えば、妊娠２４週または約２４週目で、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が約２００ｎｇ／ｍｌ以上（または無処理スワブサンプルでは約２０００ｎｇ／ｍｌ以上）である妊婦は、１２週間または約１２週間以内に分娩に至る可能性が４０％または約４０％であり得る。
【０３８５】
他の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）または約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）未満である場合に、所定の期間妊娠を継続する可能性を示し得る。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）または約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）未満である場合に、少なくとも１週間または約１週間妊娠を継続する可能性が９９％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）または約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）未満である場合に、少なくとも２週間または約２週間妊娠を継続する可能性が９８％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）または約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）未満である場合に、少なくとも４週間または約４週間妊娠を継続する可能性が９７％であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の濃度が１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは１５００ｎｇ／ｍｌ）または約１５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理スワブサンプルでは約１５００ｎｇ／ｍｌ）未満である場合に少なくとも１０週間または約１０週間妊娠を継続する可能性が９５％であることを示し得る。
【０３８６】
ｄ．誘発分娩との併用
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出する方法はまた、妊婦の分娩誘発と併用することができる。本明細書で示されるように、分娩のリスクが高い妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、分娩のリスクが低い妊婦のレベルよりも高い。同様に、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも、誘発後の分娩のリスクが高いか、または誘発と分娩の間の時間が短いか、または必要な分娩促進薬の投与回数が少ないか、または帝王切開分娩の可能性が低い。
【０３８７】
いくつかの態様では、分娩のリスクが高い妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、ある閾値と比較して高いか、または、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が１以上の閾値レベル以上である場合に、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子陽性とする。別の態様では、妊婦由来のサンプル中で検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量がある閾値と比較して低い場合に、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン陰性とみなす。当業者が認識しているように、閾値レベルは測定するサンプル種および選択する試験のストリンジェンシーによって異なり得る。
【０３８８】
よって、誘発法を行う前に対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、分娩誘発の起こり得る結果を予測することができ、誘発が分娩の促進をもたらす可能性を評価することができる。例えば、誘発法を行う前に対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、分娩促進薬の投与または誘発処置と分娩の間の時間を評価すること、またはオキシトシン投与と分娩の間の時間を評価することが可能である。さらに、誘発法を行う前に対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、分娩誘発後２４時間または約２４時間以内に対象が分娩に至る可能性を評価すること、または分娩誘発後４８時間または約４８時間以内に対象が分娩に至る可能性を評価することが可能である。さらに、誘発法を行う前に対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、分娩誘発に分娩促進薬または誘発処置の２回以上の施与が必要となる可能性を評価することが可能である。さらに、誘発法を行う前に対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、経膣分娩が遂行され、出産帝王切開を必要としない可能性を評価すること、あるいはまた、経膣分娩が遂行されず、代わりに帝王切開によって出産が達成される可能性を評価することが可能である。
【０３８９】
本明細書で提供される方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出し、そしてそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、対象に分娩を誘発することにより、陣痛誘発法を実施するかどうかを決定するための方法を含む。また、本明細書では、対象を分娩誘発に適した候補として同定する方法が提供され、その方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、およびそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、その対象を分娩誘発の適した候補として同定することを含む。また、本明細書では、分娩誘発に成功する可能性高い対象を同定する方法が提供され、その方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、およびそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、その対象を分娩誘発に成功する可能性が高いものとして同定することを含む。また、本明細書では、誘発の開始または予備誘発剤もしくはオキシトシンなどの分娩促進薬の投与後の時間が比較的短い可能性が高い対象を同定する方法が提供され、その方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、およびそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、その対象を、誘発の開始または予備誘発剤もしくはオキシトシンなどの分娩促進薬の投与後の時間が、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値未満である対象よりも短い可能性が高いものとして同定することを含む。また、本明細書では、誘発開始後の時間が２４時間以内である可能性が高い対象を同定する方法が提供され、その方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、およびそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、その対象を、誘発開始後の時間が２４時間以内である可能性が高いものと同定することを含む。また、本明細書では、誘発開始後の時間が４８時間以内である可能性が高い対象を同定する方法が提供され、その方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、およびそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、その対象を、誘発開始後の時間が４８時間以内である可能性が高いものと同定することを含む。また、本明細書では、分娩誘発が経膣分娩をもたらす可能性が高い対象を同定する方法が提供され、その方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、およびそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、その対象を、分娩誘発が経膣分娩をもたらす可能性が高いものとして同定することを含む。また、本明細書では、誘発処置または分娩促進薬投与の回数が比較的少ない対象を同定する方法が提供され、その方法は、対象由来のサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、およびそのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が閾値レベル以上のレベルで存在するとき、その対象を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値レベル未満である対象よりも誘発処置または分娩促進薬投与の回数が比較的少ない可能性が高いものとして同定することを含む。
【０３９０】
本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満であるサンプルよりも、誘発後に経膣分娩に至る可能性が高い。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも誘発後に経膣分娩に至る可能性が少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％高いものであり得る。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも誘発後に経膣分娩に至る可能性が約３〜３０％、約５〜２５％、約７〜２２％、約８〜２０％、約９〜１８％、約１０〜１６％、約１１〜１５％、または約１２〜１４％、または約１３％高い。
【０３９１】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値を超えるサンプルよりも誘発後に帝王切開を必要とする可能性が高い。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも誘発後に帝王切開を必要とする可能性が少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３２％、少なくとも約３４％、少なくとも約３６％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％高いものであり得る。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも誘発後に帝王切開を必要とする可能性が約２０〜６０％、約２１〜５５％、約２２〜５０％、約２３〜４５％、約２４〜４０％、約２５〜３８％、約２６〜３６％、約２７〜３４％、約２８〜３２％、または約２９〜３０％高い。
【０３９２】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象が、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満であるサンプルよりも誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が高い場合が提供される。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４２％、少なくとも約４４％、少なくとも約４６％、または少なくとも約５０％高いものであり得る。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が約２０〜６０％、約２２〜５５％、約２４〜５０％、約２６〜４８％、約２８〜４６％、約３０〜４４％、約３２〜４３％、約３４〜４２％、約３５〜４１％、約３６〜４０％、約３７〜３９％、または約３８％高い。
【０３９３】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値を超えるサンプルよりも誘発２４時間以降に分娩に至る可能性が高い。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも誘発２４時間以降に分娩に至る可能性が少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４８％、少なくとも約５０％、少なくとも約５２％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％高いものであり得る。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも誘発２４時間以降に分娩に至る可能性が約３０〜９０％、約３２〜７５％、約３４〜６５％、約３６〜６０％、約３８〜５５％、約３９〜５３％、約４０〜５１％、約４１〜５０％、約４２〜４９％、約４３〜４８％、約４４〜４７％、または約４５〜４６％高い。
【０３９４】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象が、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満であるサンプルよりも誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が高い場合が提供される。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％高い。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が約５〜３５％、約７〜３０％、約８〜２５％、約９〜２２％、約１０〜２０％、約１１〜１９％、約１２〜１８％、約１３〜１７％、約１４〜１６％、または約１５％高い。
【０３９５】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値を超えるサンプルよりも誘発４８時間以降に分娩に至る可能性が高い。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも誘発４８時間以降に分娩に至る可能性が少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３２％、少なくとも約３４％、少なくとも約３６％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％高いものであり得る。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも誘発４８時間以降に分娩に至る可能性が約２０〜６０％、約２１〜５５％、約２２〜５０％、約２３〜４５％、約２４〜４０％、約２５〜３８％、約２６〜３６％、約２７〜３４％、約２８〜３２％、または約２９〜３０％高い。
【０３９６】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間が、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満であるサンプルの、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間よりも短い場合が提供される。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間よりも少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４２％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７５％、または少なくとも約６時間、少なくとも約６．５時間、少なくとも約７時間、少なくとも約７．５時間、少なくとも約８時間、少なくとも約８．５時間、少なくとも約９時間、少なくとも約９．５時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１３時間もしくは少なくとも約１５時間短い。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間よりも２５〜７５％または約２５〜７５％、２６〜６０％または約２６〜６０％、２７〜５０％または約２７〜５０％、２８〜４５％または約２８〜４５％、２９〜４０％または約２９〜４０％、３０〜３８％または約３０〜３８％、３１〜３６％または約３１〜３６％、３２〜３４％もしくは約３２〜３４％、または３３％もしくは約３３％、または６〜２０時間もしくは約６〜２０時間、６．５〜１５時間もしくは約６．５〜１５時間、７〜１４時間もしくは約７〜１４時間、７．５〜１３時間もしくは約７．５〜１３時間、８〜１２時間もしくは約８〜１２時間、８．５〜１１時間もしくは約８．５〜１１時間、９〜１０時間もしくは約９〜１０時間、または９．５もしくは約９．５時間短い。
【０３９７】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値を超えるサンプルの、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間よりも長い。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間よりも少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５２％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、または少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５２％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも６時間、少なくとも６．５時間、少なくとも７時間、少なくとも７．５時間、少なくとも８時間、少なくとも８．５時間、少なくとも９時間、少なくとも９．５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１３時間もしくは少なくとも１５時間、または少なくとも約６時間、少なくとも約６．５時間、少なくとも約７時間、少なくとも約７．５時間、少なくとも約８時間、少なくとも約８．５時間、少なくとも約９時間、少なくとも約９．５時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１３時間もしくは少なくとも約１５時間長い。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、一回目の予備誘発剤投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、一回目の分娩促進薬の投与と分娩の間の平均時間よりも３０〜９０％もしくは約３０〜９０％、３５〜８０％もしくは約３５〜８０％、４０〜７５％もしくは約４０〜７５％、４２〜７０％もしくは約４２〜７０％、４４〜６５％もしくは約４４〜６５％、４５〜６０％もしくは約４５〜６０％、４６〜５８％もしくは約４６〜５８％、４７〜５６％もしくは約４７〜５６％、４８〜５４％もしくは約４８〜５４％、４９〜５２％もしくは約４９〜５２％、または５０％もしくは約５０％、または６〜２０時間もしくは約６〜２０時間、６．５〜１５時間もしくは約６．５〜１５時間、７〜１４時間もしくは約７〜１４時間、７．５〜１３時間もしくは約７．５〜１３時間、８〜１２時間もしくは約８〜１２時間、８．５〜１１時間もしくは約８．５〜１１時間、９〜１０時間もしくは約９〜１０時間、または９．５もしくは約９．５時間長い。
【０３９８】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間が、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満であるサンプルの、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間よりも短い場合が提供される。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間よりも少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２８％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％もしくは少なくとも６０％、または少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２８％、少なくとも約３０％、少なくとも約３２％、少なくとも約３４％、少なくとも約３６％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％もしくは少なくとも約６０％、または少なくとも３時間、少なくとも３．２時間、少なくとも３．４時間、少なくとも３．６時間、少なくとも３．８時間、少なくとも４時間、少なくとも４．２時間、少なくとも４．４時間、少なくとも４．６時間、少なくとも４．８時間、少なくとも５時間、少なくとも５．５時間、少なくとも６時間、少なくとも６．５時間、少なくとも７時間もしくは少なくとも８時間、または少なくとも約３時間、少なくとも約３．２時間、少なくとも約３．４時間、少なくとも約３．６時間、少なくとも約３．８時間、少なくとも約４時間、少なくとも約４．２時間、少なくとも約４．４時間、少なくとも約４．６時間、少なくとも約４．８時間、少なくとも約５時間、少なくとも約５．５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約６．５時間、少なくとも約７時間もしくは少なくとも約８時間短いものであり得る。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間よりも１５〜６０％もしくは約１５〜６０％、１８〜５０％もしくは約１８〜５０％、２０〜４５％もしくは約２０〜４５％、２１〜４０％もしくは約２１〜４０％、２２〜３５％もしくは約２２〜３５％、２３〜３２％もしくは約２３〜３２％、２４〜３０％もしくは約２４〜３０％、２５〜２８％もしくは約２５〜２８％、または２６〜２７％もしくは約２６〜２７％、または２〜１０時間もしくは約２〜１０時間、３〜８時間もしくは約３〜８時間、３．５〜７時間もしくは約３．５〜７時間、３．８〜６時間もしくは約３．８〜６時間、４〜５時間もしくは約４〜５時間、４．１〜４．８時間もしくは約４．１〜４．８時間、４．２〜４．６時間もしくは約４．２〜４．６時間、または４．４時間もしくは約４．４時間短い。
【０３９９】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値を超えるサンプルの、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間よりも長い。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間よりも少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％もしくは少なくとも７５％、または少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４２％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７５％、または少なくとも３時間、少なくとも３．２時間、少なくとも３．４時間、少なくとも３．６時間、少なくとも３．８時間、少なくとも４時間、少なくとも４．２時間、少なくとも４．４時間、少なくとも４．６時間、少なくとも４．８時間、少なくとも５時間、少なくとも５．５時間、少なくとも６時間、少なくとも６．５時間、少なくとも７時間もしくは少なくとも８時間、または少なくとも約３時間、少なくとも約３．２時間、少なくとも約３．４時間、少なくとも約３．６時間、少なくとも約３．８時間、少なくとも約４時間、少なくとも約４．２時間、少なくとも約４．４時間、少なくとも約４．６時間、少なくとも約４．８時間、少なくとも約５時間、少なくとも約５．５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約６．５時間、少なくとも約７時間、または少なくとも約８時間長い。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象の、オキシトシン投与と分娩の間の平均時間よりも２０〜７５％もしくは約２０〜７５％、２５〜６０％もしくは約２５〜６０％、２８〜５５％もしくは約２８〜５５％、３０〜５０％もしくは約３０〜５０％、３１〜４５％もしくは約３１〜４５％、３２〜４０％もしくは約３２〜４０％、３３〜３８％もしくは約３３〜３８％、３４〜３６％もしくは約３４〜３６％、３５％もしくは約３５％、または２〜１０時間もしくは約２〜１０時間、３〜８時間もしくは約３〜８時間、３．５〜７時間もしくは約３．５〜７時間、３．８〜６時間もしくは約３．８〜６時間、４〜５時間もしくは約４〜５時間、４．１〜４．８時間もしくは約４．１〜４．８時間、４．２〜４．６時間もしくは約４．２〜４．６時間、または４．４時間もしくは約４．４時間長い。
【０４００】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満であるサンプルよりも予備誘発剤の投与回数が少ない可能性が高い場合が提供される。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも予備誘発剤の投与回数が少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６２％、少なくとも６４％、少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％、または少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６２％、少なくとも約６４％、少なくとも約６６％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも０．４、少なくとも０．４５、少なくとも０．５、少なくとも０．５５、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０もしくは少なくとも１．１、または少なくとも約０．４、少なくとも約０．４５、少なくとも約０．５、少なくとも約０．５５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．６５、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０もしくは少なくとも約１．１少ないものと予測できる。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象よりも予備誘発剤の投与回数が４０〜９０％もしくは約４０〜９０％、４５〜８０％もしくは約４５〜８０％、４８〜７０％もしくは約４８〜７０％、５０〜６８％もしくは約５０〜６８％、５２〜６６％もしくは約５２〜６６％、５４〜６４％もしくは約５４〜６４％、５５〜６２％もしくは約５５〜６２％、５６〜６０％もしくは約５６〜６０％、または５７〜５８％もしくは約５７〜５８％、または０．３〜１．１もしくは約０．３〜１．１、０．３５〜１．０もしくは約０．３５〜１．０、０．４〜０．８５もしくは約０．４〜０．８５、０．４５〜０．７５もしくは約０．４５〜０．７５、０．５〜０．７もしくは約０．５〜０．７、０．５２〜０．６８もしくは約０．５２〜０．６８、０．５４〜０．６６もしくは約０．５４〜０．６６、０．５８〜０．６２もしくは約０．５８〜０．６２、または０．６もしくは約０．６少ないものと予測される。
【０４０１】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値を超えるサンプルよりも、予備誘発剤の投与回数が多い可能性が高い。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも予備誘発剤の投与回数が少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％もしくはは少なくとも１３０％、または少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約７７％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％もしくは少なくとも約１３０％、または少なくとも０．４、少なくとも０．４５、少なくとも０．５、少なくとも０．５５、少なくとも０．６、少なくとも０．６５、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０もしくは少なくとも１．１、または少なくとも約０．４、少なくとも約０．４５、少なくとも約０．５、少なくとも約０．５５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．６５、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０もしくは少なくとも約１．１多いものであり得る。一般に、癌胎児性フィブロネクチン陰性試験対象は、癌胎児性フィブロネクチン陽性試験対象よりも予備誘発剤の投与回数が５０〜１５０％もしくは約５０〜１５０％、５５〜１２５％もしくは約５５〜１２５％、６０〜１１０％もしくは約６０〜１１０％、６２〜１００％もしくは約６２〜１００％、６４〜９０％もしくは約６４〜９０％、６６〜８５％もしくは約６６〜８５％、６８〜８０％もしくは約６８〜８０％、７０〜７５％もしくは約７０〜７５％、７１〜７３％もしくは約７１〜７３％、または７２％もしくは約７２％、０．３〜１．１もしくは約０．３〜１．１、０．３５〜１．０もしくは約０．３５〜１．０、０．４〜０．９もしくは約０．４〜０．９、０．４５〜０．７５もしくは約０．４５〜０．７５、０．５〜０．７もしくは約０．５〜０．７、０．５２〜０．６８もしくは約０．５２〜０．６８、０．５４〜０．６６もしくは約０．５４〜０．６６、０．５８〜０．６２もしくは約０．５８〜０．６２、または０．６もしくは約０．６高い。
【０４０２】
一態様では、誘発法と併用する目的で、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が１以上の閾値レベル以上である場合に、対象を癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなす。当業者が認識しているように、閾値レベルは測定するサンプル種および選択する試験のストリンジェンシーによって異なり得る。一例では、試験ストリップを用いてアッセイするバッファー処理頸膣サンプルの閾値レベルは５０ｎｇ／ｍＬであり得る。別の例では、試験ストリップを用いてアッセイするバッファー処理頸膣サンプルの閾値レベルは１５０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０４０３】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定値に多層閾値を適用することができ、ここで、多層閾値は２以上の閾値レベルを含み、それぞれより高い閾値レベルがさらに誘発の成功の可能性が高いこと、誘発の際に経膣分娩に至る可能性が高いこと、誘発開始と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと、予備誘発剤投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと、オキシトシン投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと、誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が高いこと、誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が高いこと、および対象に予備誘発剤を２回以上投与する可能性が低いことを示す。多層閾値の一例として、バッファー処理サンプルについて、下方閾値が５０ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値が１５０ｎｇ／ｍＬである二層閾値がある。また、多層閾値の一例として、無処理サンプルについて、下方閾値が５００ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値が１５００ｎｇ／ｍＬである二層閾値がある。
【０４０４】
多層閾値を含む方法に従い、本明細書では、誘発結果の可能性を分類するための方法が提供され、これらの方法は、対象由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、および存在すれば、そのサンプルがどの多層閾値レベル以上であるかを決定し、誘発結果の可能性を分類することを含み、ここで、その多層閾値におけるそれぞれの量が高くなるほど、誘発成功の可能性が高い、誘発の際に経膣分娩の至る可能性が高い、誘発開始と分娩の間の時間が短い可能性が高い、分娩促進薬投与と分娩の間の時間が短い可能性が高い、オキシトシン投与と分娩の間の時間が短い可能性が高い、誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が高い、誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が高い、また、対象に予備誘発剤を２回以上投与する可能性が低い、またはそれらの組合せとしてその結果を分類する。
【０４０５】
別の態様では、陣痛誘発と組み合わせて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための方法を、誘発結果に関する１以上の付加的指標またはマーカーとさらに組み合わせることができる。よって、本明細書では、誘発の成功を決定する方法が提供され、これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出すること、および誘発結果の１以上の付加的指標またはマーカーを決定することを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と誘発結果の１以上の指標またはマーカーの存在（または閾値を超えるレベル）が、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の不存在（または閾値未満のレベル）、かつ／または誘発結果の１以上の付加的指標またはマーカーに関する陽性結果よりも、誘発成功の可能性が高いこと、誘発の際に経膣分娩の至る可能性が高いこと、誘発開始と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと、分娩促進薬投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと、オキシトシン投与と分娩の間の時間が短い可能性が高いこと、誘発２４時間以内に分娩に至る可能性が高いこと、誘発４８時間以内に分娩に至る可能性が高いこと、また、対象に予備誘発剤を２回以上投与する可能性が低いこと、またはそれらの組合せであることを示し得る。
【０４０６】
誘発結果の様々な指標またはマーカーは本明細書で提供されているか、またはそうでなければ当技術分野で公知のものであり、一般に、妊娠対象もしくは胎児の測定値もしくは所見、または妊娠対象の病歴が挙げられる。指標の例としては、限定されるものではないが、子宮頸長、ビショップスコア、展退、出産歴（すなわち、対象の過去の経膣分娩）、子宮口の開大、妊娠齢、肥満度指数（ＢＭＩ）、位置、硬度、経膣超音波、および指診が挙げられる。一例では、指標は出産歴である。別の例では、指標はＢＭＩである。
【０４０７】
ｉ．誘発方法および化合物
誘発は、分娩促進薬の投与および誘発処置の実施を含む当技術分野で公知の様々な方法のいずれによって実施することもできる。限定されるものではないが、フォーリーバルーンカテーテル法またはアタッドバルーンカテーテル法などのバルーンカテーテル法、羊膜剥離、羊膜外生理食塩水注入、羊膜切開、または乳頭刺激を含む、様々な誘発処置が当技術分野で公知である。さらに、分娩促進薬を投与することもでき、この分娩促進薬は、予備誘発、子宮頸の熟化、または誘発のための当技術分野で公知の様々な化合物または組成物のいずれであってもよい。分娩促進薬の例としては、限定されるものではないが、ＰＧＥ１（ミソプロストル）およびＰＧＥ２（ジノプロストン）などのプロスタグランジン、オキシトシンなどのオキシトシンホルモン、ならびにＲＵ４８６（ミフェリプリストン）などのステロイドが挙げられる。
【０４０８】
本明細書で提供される、対象の誘発結果を予測するため、または誘発成功の可能性が高い対象を同定するための方法は、上記の誘発法および化合物ならびにそれらの組合せのいずれにも適用することができる。一例では、対象由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在（または、閾値を超えるレベル）が、癌胎児性フィブロネクチン指標分子陰性対象（または、閾値未満のレベル）よりも、オキシトシンでの誘発後の時間が短いことを示し得る。
【０４０９】
ｉｉ．誘発後の測定
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定することにより誘発成功をモニタリングすることができる。オキシトシンホルモンまたはプロスタグランジンなどの分娩促進薬の投与を含む種々の方法により妊婦に陣痛を誘発することができる。誘発後、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベルを超える場合に、その誘発が有効でること、およびその妊婦の分娩が切迫していることを示し得る。よって、本明細書ではまた、誘発後の妊婦の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量をモニタリングすることにより、妊婦の誘発の有効性をモニタリングするための方法も提供される。例えば、誘発後の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定値が閾値レベルを超える場合に、その妊婦の誘発が有効であり、その妊婦が間もなく分娩に至ることを示し得る。一般に、切迫出産または妊婦が間もなく分娩に至る可能性は、誘発後に関して用いる場合、妊婦が誘発後４８時間または約４８時間以内に、または癌胎児性フィブロネクチン測定値が陽性となった後４８時間または約４８時間以内に分娩に至ることを意味する。誘発後の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定値が閾値レベル未満である場合は、その妊婦の誘発が有効でなく、その妊婦はすぐには分娩に至らないことを示し得る。誘発後の癌胎児性フィブロネクチン測定が陰性であることを受けて、その妊婦に経膣分娩を達成させるために、または代わりに帝王切開により出産させることを選択するためにさらなる誘発処置を投与するかどうかを決定することができる。よって、本明細書では、誘発対象由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、およびその癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、経膣分娩のためにさらなる誘発が必要でないと決定することを含む、対象の誘発後の処置方法を決定するための方法が提供される。
【０４１０】
また、本明細書では、誘発対象由来のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定すること、およびその癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、さらに１回以上の誘発を施すことを決定するか、または帝王切開による出産のプロセスを採ることを決定することを含む、対象の誘発後の処置方法を決定するための方法が提供される。
【０４１１】
誘発後の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定は、いずれのサンプルで行ってもよく、また、本明細書で提供される予備誘発法で用いられるいずれの方法によって行ってもよい。さらに、誘発後の癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、予備誘発測定値に関して本明細書で示したような多層閾値と併用することができ、また、予備誘発測定値に関して本明細書で示したような誘導結果の１以上の付加的指標と併用することもできる。
【０４１２】
ｅ．受胎産物の指標
本明細書では、移植用の受胎産物を選択するための方法が提供される。この方法では、受胎産物の入ったウェルもしくは他の容器から、または受胎産物自体からなどの受胎産物サンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関して試験する。所定のレベルを超える量、または他の受胎産物の量を超える量を有する、あるいはこのような量の増加率が所定のレベルよりも、またはある群内の他の受胎産物に比べて高いサンプルを含む受胎産物を、移植に有利であると特定し、かつ／または移植用に選択することができる。
【０４１３】
本明細書で提供される方法、組合せ物、組成物およびキットは様々な受胎産物の指標として使用することができ、これらの方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定することを含み、ここで、受胎産物は受胎産物により産生される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従って同定かつ／または選択される。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして、または閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして同定された受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しない、または閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しない受胎産物よりも、移植成功の能力が高い、または可能性が高い受胎産物として同定することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして、または閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして同定された受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しない、または閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しない受胎産物よりも、移植された後の胎児発達の成功の能力が高い、または可能性が高い、受胎産物として同定することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして、または閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして同定された受胎産物を、移植に用いるために選択することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして、または閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして同定された受胎産物を、細胞培養に用いるために選択することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして、または閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生するとして同定された受胎産物を、幹細胞として用いるために選択することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しないとして、または閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しないとして同定された受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する、または閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物よりも移植成功の能力が低い、または可能性が低い受胎産物として同定することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しないとして、または閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しないとして同定された受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する、または閾値レベル以上量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物よりも、移植された後の胎児発達の成功の能力が低い、または可能性が低い受胎産物として同定することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しないとして、または閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しないとして同定された受胎産物を、移植には用いないとして選択することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しないとして、または閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しないとして同定された受胎産物を、細胞培養に用いるために選択することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しないとして、または閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しないとして同定された受胎産物を、幹細胞として用いるために選択することができる。
【０４１４】
精子が卵子に侵入した後、受精が完了し、雄性前核と雌性前核が融合して接合子を形成する。この接合子は急速に細胞分裂し、発達を始める。受精後約４〜５日で桑実胚として知られる細胞塊にまで発達する。さらに発達約５〜６日で、細胞は胚盤胞へと発達する。この胚盤胞がさらに発達すると、明瞭に異なる細胞層が形成される。この内細胞塊が胚本体（胚芽細胞としても知られる）となる。外細胞塊は栄養芽層として知られ、胚を取り巻く上皮細胞の層として発達する。
【０４１５】
受胎産物は一般に、受精後６〜７日で子宮壁に着床する。胚盤胞の外表にある上皮細胞層である栄養芽層は、この胚盤胞の、子宮細胞の内膜層への着床に関与する。栄養芽層の胚極の細胞は分化して合胞栄養芽層を形成し、ここから子宮着床のプロセスが始まる。
【０４１６】
栄養芽層は、胎盤組織、羊膜および臍帯を含む、その後の胚体外膜の発達の主要な供給源となる。受胎産物の栄養芽層は癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を合成し、分泌する。癌胎児性フィブロネクチンは初期段階の胚を含む初期段階の受胎産物で産生され、受胎産物の子宮壁への着床、および／または着床した受胎産物の血管新生に役割を果たす。癌胎児性フィブロネクチンは、胎盤−子宮結合部の胎盤付着部位に存在する。
【０４１７】
本明細書で提供される方法は、受胎産物により産生される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を１以上の時点で測定し、それにより、子宮着床の成功の可能性が高い受胎産物を同定するために使用することができる。よって、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しない受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が高い。また、本明細書で示されるように、より高い量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物は、より低い量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が高い。また、本明細書で示されるように、閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物は、閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しない受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が高い。また、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生量がより急速に高まる受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生量があまり急速に高まらないか、または低下する受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が高い。
【０４１８】
同様に、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生しない受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が低い。また、本明細書で示されるように、より低い量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物は、より高い量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が低い。また、本明細書で示されるように、閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しない受胎産物は、閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を産生する受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が低い。また、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生量があまり急速に高まらないか、または低下する受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生量がより急速に高まる受胎産物よりも子宮着床の成功の可能性が低い。本明細書で提供される方法は、受胎産物により産生される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を１以上の時点で測定し、それにより、子宮着床の成功の可能性が低い受胎産物を同定するために使用することができる。
【０４１９】
ある場合には、受胎産物は、受胎産物サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子が検出された場合に癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類することができる。他の場合には、受胎産物は、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従って分類することができる。他の場合には、受胎産物は、受胎産物サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が１以上の閾値レベル以上である場合に癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類することができる。一例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、試験ストリップを用いてアッセイされる受胎産物培養培地中での閾値レベルは５０ｎｇ／ｍＬであり得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の、試験ストリップを用いてアッセイされる受胎産物培養培地中での閾値レベルは１５０ｎｇ／ｍＬであり得る。受胎産物を分類するための閾値の例としては、５０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌおよび約１０００ｎｇ／ｍｌが挙げられる。
【０４２０】
ｉ．受胎産物による癌胎児性フィブロネクチン産生の検出
受胎産物により産生される癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するためには、限定されるものではないが、ドットブロット分析、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ法、質量分析法、試験ストリップに基づくサンドイッチアッセイなどのサンドイッチアッセイおよびＥＬＩＳＡ法を含む、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々な方法のいずれもが使用可能である。例えば、受胎産物（例えば、接合子および胚）は個別に培養培地に置床することができる。
【０４２１】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は様々な受胎産物サンプルのいずれにおいても検出することができる。受胎産物サンプルとしては、受胎産物抽出物、培養培地などの受胎産物外に由来するサンプル、細胞および組織抽出物、ならびに細胞が挙げられ、ここでは、受胎産物から１以上の細胞を取り出し、その後の培養、移植および／または発達に関して能力のある残りの受胎産物を残す。サンプルは無処理で分析することもできるし、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出前に試薬で処理し、かつ／または分画することもできる。一例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子はin vitroで検出することができる。in vitro検出としては、単離された細胞および組織ならびに培養細胞および組織において、このような細胞および組織によって分泌される癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することを含む。検出のための細胞および組織としては、限定されるものではないが、接合子、桑実胚、胚盤胞、胚芽細胞、胚、および胎盤、限定されるものではないが、細胞栄養芽層、栄養芽層、合胞栄養芽層、胚盤葉下層および胚盤葉上層を含む受胎産物の細胞および細胞層を含む、いずれかの段階の受胎産物、またあらゆる段階の受胎産物が挙げられる。
【０４２２】
いくつかの態様では、受胎産物により産生される癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、受胎産物外の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより測定することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、受胎産物を含む培養培地中に存在し得る。受胎産物を含む培地中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、受胎産物により分泌された癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る。一例では、受胎産物により産生かつ／または分泌された癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量は、受胎産物を含む培養培地中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより測定することができる。培養培地中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、当業者には明らかなように、付加的な胚または接合子を含まない培養培地を含む対照との比較を含む。
【０４２３】
一態様では、このような癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法の培地は単一の受胎産物を含む。このような方法では、培地中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定値が、受胎産物による癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生を示し得る。
【０４２４】
別の態様では、このような癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法の培地は２以上の受胎産物を含む。本明細書で示されるように、培養培地中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、受胎産物における癌胎児性フィブロネクチンの産生を刺激することができる。よって、２以上の受胎産物を含有する培地中の受胎産物の存在は、それらの受胎産物が刺激されて癌胎児性フィブロネクチンを産生することを示すことができ、従って、癌胎児性フィブロネクチンを産生するものと同定することができる。
【０４２５】
他の態様では、受胎産物により産生される癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、受胎産物の細胞中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより測定することができる。例えば、細胞抽出物中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することができる。細胞抽出物は、例えばシリンジを用いて細胞質などの細胞液の一部を取り出すことにより、あるいは細胞採取により採取することができる。細胞採取は、例えば、その後の発達および移植のために十分に完全で能力のある受胎産物を残しつつ、受胎産物から１以上の細胞を取り出すことによって行うことができる。取り出した細胞中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、細胞を取り出した（例えば、細胞採取により）直後に行ってもよいし、あるいは取り出した細胞を培養した後に行ってもよい（この場合、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は１以上の時点で行うことができる）。
【０４２６】
他の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のために受胎産物抽出物を用いることができる。受胎産物は、限定されるものではないが、卵割腔(blastoceol)を含む１以上の空洞を含み得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子はこれらの空洞中に存在する場合がある。受胎産物の空洞中の液体のサンプルは、例えば、マイクロシリンジでの抽出によるなど、公知の方法を用いて採取することができる。
【０４２７】
検出は、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在、量、産生率および／または分泌率の測定を含む。量または率は１つの閾値量と比較することもできるし、あるいは他の受胎産物に由来する１以上の量または率と比較することもできる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子産生の量または率は２以上の受胎産物と比較することができ、その受胎産物を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生量または癌胎児性フィブロネクチン指標分子産生の増加率で最高から最低まで分類することができる。
【０４２８】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子が検出されるサンプルは配偶子の単離後のいずれの時点で採取してもよく、受精直後、および受精後から受胎産物の移植時（移植時も含む）までの検出を含む。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、受精直後、ならびに受精後１、２、３、４、５、６、７、８、１６、２４、３０、３６、４０、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、および１６８時間およびその間のいずれかの時点で行うことができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出はまた、限定されるものではないが、移植当日、ならびに移植１日、２日、３日、４日および５日前を含む、母体への移植前の時点で行うこともできる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、このような時点のいずれか１以上で行うことができる。
【０４２９】
ｉｉ．生殖医療技術関連の使用
本明細書で提供される、癌胎児性フィブロネクチン指標分子方法を検出するための組成物およびキットは、生殖支援技術(Assisted Reproduction Technologies, ART)に使用することができ、予測試験として、また、ＡＲＴの成功を示すために含まれる。ＡＲＴは、限定されるものではないが、試験管内受精(in vitro fertilization , IVF)、接合子卵管内移植(zygote intra−fallopian transfer, ZIFT)、配偶子卵管内移植(gamete intra−fallopian transfer, GIFT)、胚盤胞移植、ＩＶＦと組み合わせた卵母細胞の試験管内成熟、および冷凍胚移植(frozen embryo transfer, FET)を含み、これらの方法は当技術分野で公知のものである。これらの誘発処置では、配偶子（卵子および精子）を採取し、in vitroで操作した後、１以上の配偶子または配偶子由来の細胞を母体に移植する。ＡＲＴの一例である試験管内受精（ＩＶＦ）は、卵子と精子の採取、卵子の試験管内受精、受精細胞の培養、およびin vitroにおいて受精細胞を分裂および発達させること、およびその後１以上の培養受精細胞（一般に、胚）を子宮に移植することを含む。もう１つのＡＲＴ例である接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ）は、卵子と精子の採取、卵子の試験管内受精、および１つの接合子（または２以上の接合子）の卵管への移植を含む。受胎産物（例えば、接合子または胚）を母体へ移植した後、次に、その受胎産物を子宮壁に着床させてもさせなくともよく、子宮壁に着床する受胎産物はさらに発達することができる。受胎産物が子宮壁にうまく着床できることが、これらの手法の成功に重要な役割を果たすが、これは受胎産物がうまく着床できなければ、発達は止まり、妊娠は進行しないからである。
【０４３０】
よって、本明細書では、本明細書で提供される方法を用い、子宮着床能力が高いとして、または子宮着床に成功する可能性が高いとして、かつ／または移植後の胎児発達に成功する可能性が高いとして同定された受胎産物を母体に移植することによりＡＲＴを実施する方法が提供される。
【０４３１】
試験管内受精および他のＡＲＴ法における受胎産物の発達は、いくつかの段階が移植前にin vitroで起こり、残りの段階が移植後に完了することを除けば、生体内受精の発達と同様である。ＡＲＴ法では、一般に受精後約２〜６日、通常は受精後約３〜５日の受胎産物を子宮へ移植する。また、一般に受精後１、２および／または３日の受胎産物を卵管に移植することもできる。受胎産物の移植は２細胞、２〜４細胞、４細胞、４〜８細胞および８細胞よりも多い段階の受胎産物の移植を含み、胚盤胞の段階で移植することも含み得る。移植は、１以上の受胎産物の移植を含み、通常には、１〜５、２〜５、３〜５および２〜３個の受胎産物が移植される。場合によっては、単一胚移植など、１個の受胎産物だけを母体に移植する。ＡＲＴはまた冷凍胚移植を含み、ここで、胚は受精および所望により細胞培養期間の後に、例えばその後の母体へ移植などの後の使用に備えて冷凍する。このような胚は、液体窒素中での保存などの冷凍条件下で無期限に保存することができる。
【０４３２】
ｉｉｉ．測定後の工程
本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生を測定することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は受胎産物を同定するために使用することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、閾値レベル以上である、または産生の増加率が高い受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、閾値レベル未満である、または生産率が低下している受胎産物よりも子宮着床能力が高いとして、または子宮着床に成功する可能性が高いとして、かつ／または移植後の胎児発達に成功する可能性が高いとして同定することができる。
【０４３３】
ａ．癌胎児性フィブロネクチン産生の増強
また、本明細書では、受胎産物において癌胎児性フィブロネクチンの産生を増強するための方法が提供される。本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチンを十分低いレベルまたは率で産生する受胎産物は、一般に移植用としては選択されない。本明細書で提供される方法は、閾値レベルまたは閾値率未満の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか産生しない受胎産物を移植用として選択するために使用することができ、その受胎産物を受胎産物中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生を増強するための１以上の方法で処理する。一例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生のためのこのような処置の後、１回以上受胎産物をモニタリングすることができ、閾値レベルまたは閾値率を超える産生量または産生率が測定された際に、その受胎産物を移植に好適であるとすることができる。
【０４３４】
癌胎児性フィブロネクチンの合成は、外部刺激によって合成量および／または率を増強することができる。癌胎児性フィブロネクチンの合成は、培養系で経時的に高めることができる。例えば、数種の単離されたヒト栄養芽層は、単離後のしばらくの間は培養系で検出可能な癌胎児性フィブロネクチンを分泌することはほとんどない。癌胎児性フィブロネクチンの合成はin vitroで培養すると経時的に高まる。限定されるものではないが、ヒトおよびその他哺乳類の血清などの血清、ならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βを含むトランスフォーミング増殖因子を含む、培養培地の様々な成分が癌胎児性フィブロネクチンの産生を刺激することができる。癌胎児性フィブロネクチンの合成はまた、限定されるものではないが、細胞を細胞外マトリックス、合成マトリックス、またはプラスチックとともにインキュベーションすることを含む細胞付着により刺激することができる。
【０４３５】
ｂ．癌胎児性フィブロネクチン産生に基づく受胎産物の同定
本明細書で提供される方法では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、受胎産物による癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生に従った受胎産物の分類と組み合わせることができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子産生の存在、量または率は、受胎産物の着床能力、または受胎産物が着床に成功する可能性、または移植後の胎児発達に成功する可能性を示し得る。よって、本明細書で提供される方法は、受胎産物を、子宮着床能力が高い、または子宮着床に成功する可能性が高い、かつ／または移植後の胎児発達に成功する可能性が高いものと分類するために使用することができ、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、量が多い、または増殖率がより高い受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、量が少ない、または増殖率が低い、もしくは低下している受胎産物よりも、子宮着床能力が高い、または子宮着床に成功する可能性が高い、かつ／または移植後の胎児発達に成功する可能性が高い。同様に、本明細書で提供される方法は、受胎産物を移植に好適であると同定するために使用することができ、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値レベル以上で存在する、または産生が増加している受胎産物は、十分に高い子宮着床能率、子宮着床に成功する可能性、および／または移植後の胎児発達に成功する可能性を有し、従って、移植に好適であると同定することができる。
【０４３６】
ｉ．受胎産物の選択
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、限定されるものではないが、受胎産物の着床、ならびに移植試験管内受精法、接合子卵管内移植および冷凍胚移植を含むＡＲＴ法の実行可能性を予測および向上させるために使用することができる。本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在、量、産生率および／または分泌率は、受胎産物の子宮着床能力および／またはこのような着床がうまく発達し、維持されるかどうかの指標として使用することができる。子宮着床能力が高い、または子宮着床に成功する可能性が高い、かつ／または移植後の胎児発達に成功する可能性が高い受胎産物は、母体への移植（例えば、子宮または卵管への移植）のために選択することができる。
【０４３７】
一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、移植用の１以上の受胎産物（例えば、胚および接合子）を選択するために使用することができる。例えば、卵子を採取し、試験管内受精させて受胎産物を形成させることができる。受精後、胎児性フィブロネクチン指標分子は、１以上の受胎産物に対応する１以上のサンプルにおいて検出することができ、それらのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を用いて、子宮着床能力が高い、または子宮着床に成功する可能性が高い、かつ／または移植後の胎児発達に成功する可能性が高い１以上の受胎産物を選択することができる。
【０４３８】
さらに別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、冷凍保存用の受胎産物を選択するために使用することができる。ＡＲＴ法では、母体へ移植するよりも多くの受胎産物をin vitro生産する場合が多い。移植されない受胎産物は液体窒素タンクなどの冷凍保存で無期限に保存することができる。受胎産物は、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベル、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生率および／または分泌率の検出、および／または他の受胎産物による癌胎児性フィブロネクチン指標分子の産生と比較した選択と組み合わせた検出に基づいて冷凍保存用に選択することができる。
【０４３９】
ｉｉ．選択基準
本態様の一局面では、最高の癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルを有する受胎産物および／または他の１以上の受胎産物の中で最高レベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を有する受胎産物（２以上の受胎産物）が移植用に選択される。別の局面では、最低の癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルを有する１以上の受胎産物を排除し、かつ／または移植用としては選択しない。さらに別の局面では、最低の癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルを有する受胎産物を、移植前に癌胎児性フィブロネクチンを産生するように刺激する。
【０４４０】
別の態様では、検出可能な癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベルを用いて移植用の受胎産物（例えば、胚および接合子）を選択することができる。本態様の一局面では、閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合に、受胎産物を移植用に選択することを示す。本態様の別の局面では、閾値レベル未満の量しか存在しない場合を用いて受胎産物を排除し、かつ／または受胎産物を移植に好ましくないものと同定することができる。さらに別の態様では、閾値レベル未満の量しか存在しない場合を用いて、移植前に癌胎児性フィブロネクチンを産生するように刺激するための受胎産物を選択することができる。このような方法では、閾値レベル以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合に陽性結果となり、閾値レベル未満の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子である場合に陰性結果となり得る。
【０４４１】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子産生の増加率が検出され、移植用の受胎産物を選択するために用いられる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は受精後の２以上の時点で検出することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルの経時的変化に基づき癌胎児性フィブロネクチン指標分子の合成率および／または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の分泌率を求めることができる。本態様の一局面では、他の受胎産物の中で最高の癌胎児性フィブロネクチン指標分子産生率を示す１以上の受胎産物を選択する。別の局面では、選択された閾値率以上の率の癌胎児性フィブロネクチン指標分子産生を示す１以上の受胎産物を選択する。本態様の別の局面では、他の受胎産物の中で、または閾値率と比較してより低い率の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を示す受胎産物を排除し、かつ／または移植用の受胎産物としては選択しない。
【０４４２】
ｃ．癌胎児性フィブロネクチンと併用される他のマーカー
本明細書のいずれの態様においても、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、受胎産物および／または母体受容者をモニタリングし、かつ／またはその決定基準を選択する他の試験方法と組み合わせることができる。
【０４４３】
ｉ．受胎産物マーカー
例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、受胎産物の移植前特徴付けおよび／または診断と組み合わせることができる。このような特徴付けは遺伝的特徴、遺伝子発現、および／または受胎産物の形態に基づき得る。特徴付けおよび／または診断は受精後、移植までのいずれの時点で行ってもよく、一般には、受精後１〜７日、例えば、受精後２〜３日の間に行う。
【０４４４】
一例では、遺伝的特徴付けおよび／または診断を行うことができる。このような手法では、受胎産物から１以上の細胞、一般には単細胞を取り出し、遺伝マーカーの不存在および／または存在に関して試験する。一態様では、受胎産物は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出と少なくとも１つの遺伝マーカーの検出に基づいて移植用に選択することができる。組合せ検出の別の例では、癌胎児性フィブロネクチン（ｏｎｆＦＮ）検出を、付加的な細胞外マトリックスタンパク質などの付加的な移植能力マーカーの検出と組み合わせる。組合せ検出の別の例では、ｏｆｎＦＮ検出を、限定されるものではないが、酸化ストレス遺伝子（例えば、ＭｎＳＯＤ、ＣｕＺｎＳＯＤ、ＳＯＸ）、アポトーシス遺伝子（例えば、Ｂａｘ）、母体の妊娠認識遺伝子（例えば、ＩＮＦ−ｔａｕ）、ギャップ結合を介して情報交換に関する遺伝子（例えば、Ｃｘ３１およびＣｘ４３）、および／または分化・着床遺伝子（例えば、ＬＩＦおよびＬＲ−β）の発現を含む少なくとも１つの質的マーカーの検出と組み合わせる。Reese et al., J. Biol. Chem., 276:44137−44145 (2001);およびYoshioka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272:531−538 (2000)に例示されているように、様々なマーカーが当技術分野で公知である。
【０４４５】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出を、受胎産物の形態学的特徴付けおよび／または診断と組み合わせることができる。受胎産物の形態学的特徴は、受胎産物の着床および妊娠への進展に成功する可能性を示し得る。着床および妊娠への進展に成功する可能性が高い受胎産物に特徴的な様々な形態学的特徴が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、細胞数、フラグメンテーションの程度、細胞の規則正しさ、対称性、前核の形態、卵胞の大きさ、卵胞液の量、多核細胞の形成、液胞の存在、および粒度が挙げられる。
【０４４６】
ｉｉ．母体マーカー
本発明のいずれの態様においても、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、母体受容者をモニタリングし、かつ／またはその決定基準を選択する他の試験法と組み合わせることができる。例えば、母体受容者を、受胎産物の移植およびその後の着床の成功に対する受容性と相関するマーカーに関して試験することができる。このようなマーカーとしては、ムチン糖タンパク質（例えば、ＭＵＣ１）およびヘパリン硫酸結合タンパク質の検出が挙げられる。使用のためのさらなるマーカーとしては、受精および受胎産物の発達の成功に関与する卵母細胞の能力および生存力に寄与する可能性のある卵胞の表現型が挙げられ、限定されるものではないが、顆粒膜細胞による１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの発現、卵丘細胞の接着および増殖、卵丘のステロイド合成活性、ならびに毛包周囲の血管分布、および顆粒膜細胞および卵丘細胞と結合した血管上皮細胞増殖因子が挙げられる。
【０４４７】
ｉｖ．細胞培養および幹細胞の使用
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のための方法およびプローブは、細胞培養での使用および幹細胞としての使用を含む、非移植利用のための細胞および組織を選択するために使用することができる。一例では、移植用に選択しない細胞または受胎産物を、胚幹細胞の供給源としてさらなるin vitro培養で用いるために選択することができる。このような細胞は、限定されるものではないが、パーキンソン病、狼瘡、糖尿病、卒中、関節リウマチ、心臓外傷などの免疫疾患および神経変性疾患を含む疾病および症状の研究および処置に、また、細胞置換療法および組織再生に有用である。
【０４４８】
一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、母体に移植する能力のない、または能力の低い受胎産物を選択するために用いられる。受胎産物はさらに、例えば培養系でのそれらの生存能力に基づき、細胞培養での使用および幹細胞としての使用のために選択することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、本明細書におけるいずれの検出方法、アッセイおよび選択も含むことができ、選択としては、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量、閾値レベル、合成率および／または分泌率の検出に基づく選択が含まれる。
【０４４９】
２．癌の指標
本明細書で示されるように、身体組織または体液サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量は腫瘍、癌、転移または新生物に関連する可能性がある。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の、存在、発症リスク、進行もしくは退縮、再発、攻撃性、または処置のマーカーとして役立ち得る。本明細書で提供される方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在、または量を決定するために使用することができ、また、対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルを経時的にモニタリングするために使用することもできる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または閾値を超える高い量は、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の、存在、高い発症リスク、進行、再発、高い攻撃性、または処置の無効性を示し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の不存在または閾値未満の低い量は、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の不存在、低い発症リスク、退縮、再発の欠如、低い攻撃性、処置の有効性を示し得る。
【０４５０】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、限定されるものではないが、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、甲状腺癌、下垂体癌、眼の癌、脳の癌、口腔癌、皮膚癌、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、肉腫および神経芽腫を含む様々な癌（例えば、新生物性）疾患の生物マーカーとして使用することができる。種々の癌性（例えば、新生物性）症状を示す癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知のものを含む、様々な身体組織および体液サンプルいずれでも検出することができ、当業者に理解されているように、検討下の組織または臓器に適当ないずれのサンプル採取法を用いてもよい。本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出はいずれも、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を検出するために使用することができる。本明細書の以下に、癌関連の癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法の限定されない例として、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、または結腸直腸癌の存在、リスク、発症、再発の可能性、進行もしくは退縮、攻撃性、または処置の有効性を示すために使用可能な血液、血漿、血清、尿、洗浄液、痰、組織、吸引液、便、またはスワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出についての説明を示す。
【０４５１】
本明細書で提供される方法は、サンプルを採取すること、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を測定すること、および／またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定し、所望によりサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けすることを含み得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が１以上の閾値以上である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量以下の最高閾値に従って、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性として、または特定の群に入るとして特徴付けすることができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が１以上の閾値未満である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を超える最低の閾値に従って、そのサンプルを癌胎児性フィブロネクチン陰性として、または特定の群に入るとして特徴付けすることができる。
【０４５２】
採取されるサンプルは、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知のいずれの供給源から採取してもよい。サンプル供給源の例としては、限定されるものではないが、組織サンプル、癌性ではないかと疑われる領域のスワブ、洗浄液サンプル、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、間質液サンプル、リンパサンプル、リンパ液サンプル、および尿サンプルが挙げられる。本明細書で提供されるサンプル採取のための方法により、従来用いられてきた方法よりも高い感受性、多いサンプル数またはその組合せが可能となる。サンプルは当技術分野で公知の、または本明細書で提供される方法を用いて保存および／または処理することができる。サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。方法例としては、ドットブロット分析、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ法、質量分析法、試験ストリップに基づくサンドイッチアッセイなどのサンドイッチアッセイ、およびＥＬＩＳＡ法が挙げられる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定方法により、癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出の高い感受性が可能となるとともに付加的な利点が得られる。よって、本明細書で開示される方法は、例えば、サンプル中のより低レベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出可能なことにより、またはより頻繁な癌診断を容易にすることにより、癌（例えば、過形成、新生物性、悪性または転移）細胞の存在の早期診断のために使用することができる。
【０４５３】
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、対象における固形腫瘍、白血病（すなわち、血液性の癌）、癌、転移、過形成または新生物の存在を示し得る。サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、対象における固形腫瘍、白血病、癌、転移、過形成または新生物の病期または重篤度を示し得る。明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、様々な癌（固形および血液性）、腫瘍、転移および新生物に存在する。よって、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルを用いて、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の存在および／または病期を示すことができ、あるいは対象において癌（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞の存在を示すことができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の検出は、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の存在および／または病期を示すために使用することができ、あるいは対象において癌（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞の存在を示し得る。別の態様では、１以上の閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が検出された場合に、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の存在および／または病期、あるいは対象における癌（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞の存在を示し得る。
【０４５４】
サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないか、または閾値未満のレベルである場合に、対象に腫瘍、癌、転移または新生物が存在しないことを示し得る。本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は多くの癌（新生物性）疾患の身体組織および体液中に存在することから、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないことは、その対象に癌（新生物性）疾患が存在しないことを示し得る。例えば、癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルを用いて、対象に腫瘍、癌、転移または新生物が存在しないことを示すために使用することができ、あるいは対象に癌（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞が存在しないことを示すことができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないこと、または閾値未満のレベルであることは、対象に腫瘍、癌、転移または新生物が存在しないことを、あるいは対象に癌（例えば、過形成(hyperplastinc)、新生物性、悪性または転移）細胞が存在しないことを示し得る。また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が１以上の閾値レベル未満である場合に、対象に腫瘍、癌、転移または新生物が存在しないことを、あるいは対象に癌（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞が存在しないことを示し得る。
【０４５５】
別の態様では、本明細書で提供される方法は、対象が腫瘍、癌、転移または悪性新生物を発症する高いリスクを示すために使用することができる。例えば、本明細書で提供される方法は、正常な集団よりも、または特定の個体よりも、臓器、組織または細胞が癌性（新生物性、悪性または転移）となるリスクが高いことを示すために使用することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子または正常レベルを超える量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む、または含む領域に隣接する臓器、組織または細胞は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子、または正常を超えるレベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含まない、または含む領域に隣接しない臓器、組織または細胞よりも、癌（新生物性、悪性または転移増殖）を発症するリスクが高いことを示し得る。よって、本明細書で提供される方法を用いれば、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルを用いて、癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルを有する対象よりも、または癌胎児性フィブロネクチンの量が閾値未満であるサンプルよりも、対象が腫瘍、癌、転移または悪性新生物を発症するリスクが高いことを、あるいは正常、異常、異形成または過形成細胞を含む細胞が癌（新生物性、悪性または転移）細胞へ進展するリスクが高いことを示すことができる。サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、または閾値レベル未満であるサンプルを有する対象よりも、対象の臓器、組織または細胞が癌性（新生物性、悪性または転移）となるリスクが高いこと、あるいは正常、異常、異形成または過形成細胞が癌性（新生物性、悪性または転移）となるリスクが高いことを示し得る。一局面では、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、その対象の基準サンプルよりも、対象の臓器、組織または細胞が癌性（新生物性、悪性または転移）となるリスクが高いこと、あるいは正常、異常、異形成または過形成細胞が癌性（新生物性、悪性または転移）となるリスクが高いことを示し得る。
【０４５６】
別の態様では、本明細書で提供される方法は、対象が腫瘍、癌、転移または新生物を発症する低いリスクを示すために使用することができる。例えば、本明細書で提供される方法は、臓器、組織または細胞が癌性（例えば、生物性、悪性または転移）となる低いリスクを示すために使用することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、もしくは存在しない領域に隣接する、または整序レベル以下の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか含まない臓器、組織または細胞は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子または正常を超える量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む、または含む領域に隣接する臓器、組織または細胞よりも、将来癌性（例えば、新生物性、悪性または転移）増殖を発症するリスクが低いことを示し得る。よって、本明細書で提供される方法を用いれば、癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルは、胎児性フィブロネクチン陽性サンプルを有する対象よりも、または癌胎児性フィブロネクチンの量が閾値以上であるサンプルよりも、対象が腫瘍、癌、転移または新生物を発症するリスクが低いことを示すために、あるいはまた正常、異常、異形成または過形成細胞を含む細胞が癌性（例えば、新生物性、悪性または転移）細胞へ進展するリスクが低いことを示すために使用することができる。サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、もしくは閾値レベル以上である対象よりも、またはその対象由来の基準サンプルよりも、対象の臓器、組織または細胞が癌性（例えば、新生物性、悪性または転移）となるリスクが低いこと、あるいは正常、異常、異形成または過形成細胞が癌性（例えば、新生物性、悪性または転移）となるリスクが低いことを示し得る。
【０４５７】
さらに本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより、癌の発症を示すための方法が提供され、ここで、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、臓器、組織または細胞の癌性臓器、組織または細胞への進展を示し得る。癌性臓器、組織または細胞を定義するための標準的な方法には、臓器、組織または細胞の形態の組織学的検査が必要である。本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定は、形態学的に癌であるとは定義されない臓器、組織または細胞が癌性または前癌性の臓器、組織または細胞へ進展している、または進展したことを、形態学的分類によらずに示すのに役立ち得る。
【０４５８】
さらに本明細書では、癌細胞（正常細胞、異常細胞、異形成細胞、過形成細胞、前癌状態の新生細胞、悪性細胞または転移細胞）の、ますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞への進展を示すための方法が提供される。正常な細胞が癌細胞へ進展することがあり、この変化の過程は、正常細胞がより原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠く増殖を示すようになることで進行し得る。正常な細胞の癌細胞への進展は、例えば、正常細胞の異常細胞への進展、異常細胞の異形成細胞への進展、異形成細胞の過形成細胞への進展、過形成細胞の新生細胞への進展、新生細胞の悪性細胞への進展、および悪性細胞の転移細胞への進展などの様々な移行を含み得る。本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン陽性結果は、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展している、または進展する可能性が高いことを示す。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展していることを示すための方法が提供され、存在する場合、または閾値以上の量である場合に、それらの細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展していることを示す。また、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展する可能性が高いことを示すための方法が提供され、存在する場合、または閾値以上の量である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在していない、または閾値未満である対照サンプルよりも、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展する可能性が高いことを示す。一例では、異常、異形成もしくは過形成細胞、または異常、異形成または過形成細胞を含む領域のスワブのサンプルを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量に関して調べることができ、ここで、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルは、異常、異形成または過形成細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展していることを示し得る。
【０４５９】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満である場合に、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展していない、または進展する可能性が低いことを示す。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展していないことを示すための方法が提供され、存在しない場合、または閾値未満の量である場合に、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展していないことを示す。また、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することにより、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展する可能性が低いことを示すための方法が提供され、存在しない場合、または閾値未満の量である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値以上であるサンプルよりも、細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展する可能性が低いことを示す。一例では、異常、異形成もしくは過形成細胞、または異常、異形成または過形成細胞を含む領域のスワブのサンプルを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量に関して調べることができ、ここで、癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルは、異常、異形成または過形成細胞がますます原始的な、分化を欠く、未分化の、かつ／または調節を欠いた増殖を示す細胞へ進展していないことを示し得る。
【０４６０】
別の態様では、本明細書で提供される方法は、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の進行を示すために使用することができる。例えば、本明細書で提供される方法は、臓器、組織または細胞の癌の進行を示すために使用することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または閾値以上の量である場合に、癌または転移の進行を示すことができ、ここで、対象の癌または転移は悪性または転移であり続けているか、または悪性または転移を増している。よって、本明細書で提供される方法を用い、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルを用いて、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の進行を示すこと、または対象における癌細胞の進行を示すことができる。サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の進行、または対象における癌細胞の進行を示し得る。
【０４６１】
別の態様では、本明細書で提供される方法は、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の退縮を示すために使用することができる。例えば、本明細書で提供される方法は、臓器、組織または細胞の癌の退縮を示すために使用することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または閾値未満の量である場合に、癌または転移の退縮を示すことができ、ここで、対象の癌または転移は悪性または転移でなくなっているか、または悪性または転移が低くなっていることを示し得る。よって、本明細書で提供される方法を用いれば、癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルを用いて、対象における癌または転移の退縮を示す、または対象における癌細胞の退縮を示すことができる。サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満である場合に、対象における腫瘍、癌、転移または新生物の退縮、または対象における癌の退縮を示し得る。
【０４６２】
別の態様では、本明細書で提供される方法は、攻撃性の癌と非攻撃性の癌（例えば、固形腫瘍または白血病）を識別するために使用することができる。急速増殖性を有する癌（固形または白血病）は、低増殖性を有する癌とは異なる組成を持ち得る。例えば、星状細胞腫などの攻撃性または急速増殖性または高悪性度の癌は癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含むか、または閾値以上の量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み、一方、非攻撃性または低増殖性または低悪性度の癌は癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含まないか、または閾値未満の量しか含まないと考えられる。よって、本明細書で提供される方法を用いれば、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定を用い、攻撃性または急速増殖性または高悪性度の癌と非攻撃性または低増殖性または低悪性度の癌を識別することができる。これらの方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することを含んでよく、ここで、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、攻撃性または急速増殖性または高悪性度の癌を示し、同様に、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満である場合に、非攻撃性または低増殖性または低悪性度の癌を示し得る。本明細書で提供される方法はまた、正常、異常、異形成、過形成、新生物性、悪性または転移細胞を含む攻撃性または急速増殖細胞と非攻撃性または低増殖性または低悪性度の細胞を識別するために使用することができる。これらの方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することを含み、ここで、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、攻撃性または急速増殖の正常、異常、異形成、過形成、新生物性、悪性または転移癌細胞を示し、同様に、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満である場合に、非攻撃性または低増殖性の正常、異常、異形成、過形成、新生物性、悪性または転移癌細胞を示し得る。
【０４６３】
さらに本明細書では、癌の再発または再発の可能性を示すための方法が提供される。癌は自然に鎮静する場合もあるし、あるいは治療の結果として鎮静する場合もある。また、癌は対象に再発することもある。本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルは、対象に癌が再発したことを示し得る。癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルはまた、対象に癌が再発する可能性が高いことを示し得る。また、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン陽性サンプルが、対象に再び癌細胞が存在すること、または対象に再び癌細胞が存在する可能性が高いことを示し得る。これらの方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することを含み、ここで、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、対象における癌の再発、または対象における癌細胞の再発を示す。これらの方法はまた、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することを含み、ここで、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値以上である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、または閾値未満であるサンプルを有する対象における再発の可能性よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または存在しない、または閾値未満である対照サンプルに再発の可能性よりも、対象における癌の再発の可能性が高いこと、または対象における癌細胞の再発の可能性が高いことを示す。
【０４６４】
同様に、癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルは、対象に癌（腫瘍性、転移または新生物性疾患）が再発していないことを示し得る。癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルはまた、対象に癌が再発する可能性が低いことを示し得る。また、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン陰性サンプルは、対象に癌細胞はまだ存在していないこと、または対象に再び存在する可能性が低いことを示し得る。これらの方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することを含み、ここで、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満である場合に、対象に癌の再発がないこと、または対象に癌細胞の再発がないことを示す。これらの方法はまたサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定することを含み、ここで、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値未満である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値以上であるサンプルを有する対象における再発の可能性よりも、あるいは癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値以上である対照サンプルにおける再発の可能性よりも、対象における癌の再発の可能性が低いこと、または対象における癌細胞の再発の可能性が低いことを示す。
【０４６５】
別の態様では、本明細書で提供される方法は、癌（例えば、固形腫瘍、白血病、転移、または新生物性疾患）の処置の成功または成功の可能性を決定するために使用することができる。癌には化学療法化合物などの１以上の化合物の投与といった療法による処置で好結果が得られるものもあるが、このような化合物に応答が低いか、または別の療法に応答性のあるものもある。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値レベル以上である癌は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、または閾値レベル未満である癌とは処置に対する感受性が異なる場合がある。よって、本明細書で提供される方法を用いれば、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定を用いて、癌処置の成功を予測すること、または癌処置の成功の可能性を示すことができる。この成功の可能性は特定の療法の関数であり得る。例えば、療法は新血管新生を標的とするもの、またはヌクレオチド合成を標的とするものであり得、当業者ならば、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量が癌治療の成功の可能性にどのように影響を及ぼし得るかが分かるであろう。癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、または閾値レベル未満であるサンプルよりも、特定の治療処置が成功する可能性が高いことを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上の場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない、または閾値レベル未満であるサンプルよりも、特定の治療処置が成功する可能性が低いことを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値レベル以上であるサンプルよりも、特定の治療処置が成功する可能性が低いことを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値レベル以上であるサンプルよりも、特定の治療処置が成功する可能性が高いことを示し得る。
【０４６６】
別の態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定を用いて、癌（例えば、固形腫瘍、白血病、転移、または悪性新生物）の治療処置の成功をモニタリングすることができる。例えば、治療処置後、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値レベル以上である場合に、治療処置の実施が無効であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値レベル以上である場合に、治療処置の実施が有効であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値レベル未満である場合に、治療処置の実施が有効であることを示し得る。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値レベル未満である場合に、治療処置の実施が無効であることを示し得る。
【０４６７】
別の態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定を用い、癌（例えば、固形腫瘍、白血病、転移または悪性新生物）の処置方法を選択することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値レベル以上である場合を用いて、癌胎児性フィブロネクチンに関連する癌により有効な治療法を選択することができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが閾値レベル未満である場合を用いて、癌胎児性フィブロネクチンに関連する癌により有効な処置方法を選択することができる。
【０４６８】
いくつかの態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、１以上の付加的癌（すなわち、腫瘍関連）マーカーの検出と組み合わせて実施することができる。検出可能な様々な癌マーカーが当技術分野で公知であるか、または本明細書の他所で示されており、マーカーの例としては、限定されるものではないが、ＡＥ１／ＡＥ３、ＢＣＡ−２２５、カテプシンＤ、Ｅ−カドヘリン、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、Gross Cystic Disease Fluid Protein １５（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＯＸ−Ｂ３、Ｋｉ−６７、ｐ６５、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）およびトランスグルタミナーゼＫ（ＴＧＫ）、ｐ２１、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＲＣＡ−３、ｐ１６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩａ、ＭＥＮ−ＩＩｂ、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｐ５３、ｃ−ｅｒｂＢ２、ｃ−ｍｙｃ、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｂｃｌ−２、ｂａｘ、ＰＳＡ、ＣＹＦＲＡ  ２１−１、ＰＴＨ−ＲＰ、ＣＡ１２５、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー、プロガストリン、ガストリンＧ１７、ガストリンＧ３４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７−２９、ＣＡ  ７２−４、ＡＰＣ、ＳＣＣ、ＨＰＶサブタイプ、ＴＫ、αＦＰ、ｐ６２、カリクレイン、ｒａｓ、バソプレシン、ガストリン放出ペプチド、アネキシンＩ、アネキシンＩＩ、ＨｕおよびＫＯＣが挙げられる。Rhodes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004 101: 9309−9314に例示されているように、さらなる癌マーカー、特定の癌の癌マーカーの存在、および他の癌マーカーを伴う癌マーカーの存在が当技術分野で公知である。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とＨｅｒ−２／ｎｅｕが存在する場合には、対象が乳癌を有することを示し、胎児性フィブロネクチン指標分子とＰＳＡが存在する場合には、対象が前立腺癌を有することを示し得る。本明細書で提供される方法の中には、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／またはレベルが測定され、１以上の付加的癌マーカーの存在および／またはレベルが決定される方法がある。このような方法は癌をさらに特徴付けし、癌（異形成、新生物性、悪性または転移）細胞の細胞源または組織源を同定するために役立ち得る。
【０４６９】
ある場合には、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、その時点での、または将来の癌性（新生物性）症状の陽性適中率は強いが、陰性適中率は弱いことがあるが、このような場合には、本明細書で提供される方法など、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによりその時点での、または将来の癌性（新生物性）症状を同定または予測するための方法を、強い陰性適中率を有する第二のマーカーの使用と組み合わせることができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定と第二のマーカーの測定が合致した場合には、それぞれのマーカーを単独で用いる場合よりも高い確実性で、その対象のその時点での、または将来の癌（新生物性）症状を示すことができる。例えば、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチンタンパク質が存在する場合には、膀胱癌の陽性適中率が９０％または約９０％であり得、サンプル中に膀胱腫瘍抗原が存在しない場合には、膀胱癌の陰性適中率は９０％または約９０％であり得、両マーカーを互いに組み合わせて用いた場合には、両試験のいずれかが陽性または陰性のいずれかである結果は対象の９５％または約９５％で正しいものとなる。
【０４７０】
他の場合では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、その時点での、または将来の癌性（新生物性）症状の陰性適中率は強いが、陽性適中率は弱いことがあるが、このような場合には、本明細書で提供される方法など、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによりその時点での、または将来の癌性（新生物性）症状を同定または予測するための方法を、強い陽性適中率を有する第二のマーカーの使用と組み合わせることができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定と第二のマーカーの測定が合致した場合には、それぞれのマーカーを単独で用いる場合よりも高い確実性で、その対象のその時点での、または将来の癌（新生物性）症状を示すことができる。
【０４７１】
ある場合には、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が１以上の閾値レベル以上である場合に測定値を癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなす。いくつかの態様では、この閾値レベルは、例えば、疾病の進行、対象特異的な分類、または対象の年齢の関数として異なり得る。第二の因子の関数として変化する閾値レベルは閾値曲線として表すことができる。ある場合には、対象由来の特定のサンプル種における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変化率を用いて、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性または陰性として同定すること、またはサンプルを２つ以上の集団に分類することができる。あるサンプル種中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変化率は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の不変、増加または減少を示し得る。
【０４７２】
いくつかの態様では、本明細書で提供される癌性（悪性新生物性、腫瘍性または転移）疾患診断法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を経時的にモニタリングすることをさらに含み得る。例えば、同じサンプル種を毎日、毎週、毎月または毎年、対象から採取することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値を比較することができる。このような場合、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の増加、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の減少、または対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの不変を同定することができる。本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の増加率、または閾値率以上の増加率を、本明細書で提供される癌性疾患診断法で癌胎児性フィブロネクチン陽性測定値としてみなすことができる。同様に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の減少率、または閾値率以上の減少率を、本明細書で提供される癌性疾患診断法で癌胎児性フィブロネクチン陽性測定値としてみなすことができる。この増加率または減少率の大きさはまた、癌診断の重篤度の上昇もしくは低下または可能性も示し得る。例えば、増加率が大きいほど、増加率が小さい場合、または減少率の場合より、より重篤度の高い新生物性疾患、癌発症または癌再発のより高いリスク、より速い癌の進行、またはより攻撃性の高い癌、または癌治療の有効性の低下を示し得る。別の例では、増加率が小さいほど、増加率が大きい場合より、より重篤度の低い新生物性疾患、癌発症または癌再発のより低いリスク、より遅い癌の進行、またはより攻撃性の低い癌、または癌治療の有効性の上昇を示し得る。別の例では、減少率は、増加率よりも、より重篤度の低い癌、癌発症または癌再発のより低いリスク、より遅い癌の進行、またはより攻撃性の低い癌、または癌治療の有効性の上昇を示し得る。
【０４７３】
ある場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値に多層閾値を適用することができ、ここで、多層閾値は２以上の閾値レベルを含み、それぞれより高い閾値レベルが個々の癌の分類を示し、例えば、それぞれより高い閾値レベルは、癌を有する可能性が高いこと、癌のリスクが高いこと、細胞の癌への進展度が高いこと、癌再発の可能性が高いこと、癌の攻撃性が高いこと、または癌治療の成功もしくは不成功の可能性が高いことを示す。別の例では、それぞれより小さい閾値レベルは個々の癌の分類を示し、例えば、それぞれより小さい閾値レベルは、癌を有する可能性が低いこと、癌のリスクが低いこと、細胞の癌への進展度が低いこと、癌再発の可能性が低いこと、癌の攻撃性が低いこと、または癌治療の成功もしくは不成功の可能性が低いことを示し得る。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に関する多層閾値の一例として、バッファー処理サンプルについて、下方閾値が５０ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値が１５０ｎｇ／ｍＬである二層閾値がある。
【０４７４】
別の態様では、検出された癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に存在する癌胎児性フィブロネクチンドメインおよび／または翻訳後修飾に従って特徴付けすることができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳのうち１以上を含むとして特徴付けすることができる。別の例では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード部分と結合する自己抗体の部分として特徴付けすることができる。別の例では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード部分と結合する自己抗体の部分として特徴付けすることができる。別の例では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード部分と結合する自己抗体の部分として特徴付けすることができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、ＩＩＩＣＳスプライス変異体Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５または増幅として特徴付けすることができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化などの１以上の翻訳後修飾を含むとして特徴付けすることができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳを欠いているものとして特徴付けすることができる。別の例では、ＩＩＩＣＳは、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５、もしくはＩＩＩＣＳの９０〜１２０、またはその双方を欠いているものとして同定される。サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けを用い、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の細胞または組織源を同定することができる。
【０４７５】
ａ．膀胱癌
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を膀胱癌のマーカーとして使用することを含む。膀胱癌の最も多い発生部位は膀胱三角と膀胱の側壁である。乳頭状、無茎性、固形または潰瘍性の増殖をし得る。ほとんどの膀胱癌は移行上皮癌（ＴＣＣ）である。特に筋肉浸潤腫瘍の中には相当な量の変性形質が存在し得る。膀胱癌の５％は純粋な扁平上皮癌であり、通常、長期留置カテーテル、結石、または住血球虫の侵入などの刺激因子に関連したものである。純粋な膀胱腺癌は少なく、別の原発癌からの転移は除外すべきである。上皮内癌（ＣＩＳ)は、細胞極性の欠如を示し、未分化の特徴を有する平坦な上皮病巣である。この病巣は局部型またはびまん性であり得る。膀胱癌がびまん性病巣を呈する場合は、通常悪性の経過をたどる。
【０４７６】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は膀胱癌を有する対象に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、本明細書で提供される癌診断のいずれにおいても膀胱癌のマーカーとして使用することができる。例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性（悪性新生物性または転移）膀胱細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、対象が癌性膀胱細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないとき、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満であるとき、対象が癌性膀胱細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成膀胱細胞などの膀胱細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、正常、異常、異形成または過形成膀胱細胞などの膀胱細胞の、発達不全または未分化の膀胱細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、膀胱腫瘍、癌、転移または新生物の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、悪性膀胱腫瘍と非悪性膀胱腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性膀胱細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、膀胱癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０４７７】
膀胱癌決定のために採取するサンプルは、本明細書で示すようないずれの供給源から採取してもよい。サンプルの供給源の例としては、膀胱組織、尿サンプル、リンパサンプル、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプルおよび間質液サンプルが挙げられる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、膀胱癌を有する対象の尿において検出することができる。一態様では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性膀胱細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。別の態様では、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性膀胱細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。膀胱癌の指標としての、バッファー処理尿サンプル（希釈液２５０μｌ〜１０００μｌまたは約２５０μｌ〜約１０００μｌ）における癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値例は、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌもしくは２０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌである。あらゆる形態の膀胱癌が本明細書で提供される方法を用いて診断できる。膀胱癌の形態の例としては、移行上皮癌、扁平上皮癌および腺癌が挙げられる。
【０４７８】
一態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌性膀胱細胞によって産生されたものかどうかを示し得る。いくつかの場合では、尿または膀胱組織などのサンプル中に存在する１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳおよび／または翻訳後修飾が異なる）が癌性膀胱細胞により産生されることが知られている。例えば、膀胱癌を有する対象由来の尿サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、尿のフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域にＯ−グリコシル化されたトレオニン３３を含み(Wunderlich et al., Oncol. Rep. 8:669−672 (2001))、また、膀胱癌を有する対象由来の尿サンプル中のフィブロネクチンタンパク質は、異常なグリコシル化を含むことがある(Guo et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127:512−519 (2001))。他の場合には、１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、尿または膀胱組織などのサンプル中に存在するが、これらは癌性膀胱細胞によって産生されたものではなく、違う組織または臓器源によって産生されたものである。本明細書の方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができ、このような特徴付けは、サンプル中に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子が膀胱癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子形態であるかどうかを示し得る。サンプルが膀胱癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、膀胱癌を有する対象と一致する。サンプルが膀胱癌に見られない癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合には、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、膀胱癌を有する対象とは一致しない。
【０４７９】
ｂ．乳癌
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を乳癌のマーカーとして使用することを含む。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は乳癌を有する対象に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、本明細書で提供される癌（腫瘍、転移または悪性新生物性）診断のいずれにおいても乳癌マーカーとして使用することができる。例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性乳房細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、対象が癌性乳房細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、対象が癌性乳房細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成乳房細胞などの乳房細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成乳房細胞などの乳房細胞の、癌細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、悪性乳房腫瘍と非悪性乳房腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、乳癌（例えば、腫瘍または転移）の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性乳房細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、乳癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０４８０】
乳癌決定のために採取するサンプルは、本明細書で示すようないずれの供給源から採取してもよい。サンプルの供給源の例としては、乳房組織サンプル、穿刺吸引サンプル、乳管洗浄液サンプル、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、リンパサンプルまたは間質液サンプルが挙げられる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、乳癌を有する対象から採取した乳管洗浄液において検出することができる。一態様では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性乳房細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。別の態様では、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性乳房細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。乳癌の指標としての乳管洗浄液サンプル（希釈液２５０μｌ〜１０００μｌまたは約２５０μｌ〜約１０００μｌ）における癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値例は、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌもしくは２０ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌもしくは約２０ｎｇ／ｍｌである。あらゆる形態の乳癌が本明細書で提供される方法を用いて診断できる。乳癌の形態の例としては、浸潤性乳管癌(infiltrating ductal carcinoma）、浸潤性乳管癌(invasive ductal carcinoma)、他の形態の乳管癌、小葉癌、乳頭腺癌および未分化乳癌が挙げられる。
【０４８１】
一態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌性乳房細胞によって産生されたものかどうかを示し得る。いくつかの場合では、乳管洗浄液または乳房組織などのサンプル中に存在する１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳおよび／または翻訳後修飾が異なる）が癌性乳房細胞により産生されることが知られている。例えば、浸潤性乳管癌を有する対象由来の乳房組織サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、ＥＤＢと、その組織サンプルのフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域にＯ−グリコシル化されたトレオニン３３を含んでおり(Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 59:11−16 (1994))、また、癌性乳房組織サンプルは、ＥＤＡ＋癌胎児性フィブロネクチンを含むことも見出されている(Matsumoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 90:320−325 (1999))。他の場合には、１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、乳管洗浄液または乳房組織などのサンプル中に存在するが、これらは癌性乳房細胞によって産生されたものではなく、違う組織または臓器源によって産生されたものである。本明細書の方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができ、このような特徴付けは、サンプル中に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子が乳癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子形態であるかどうかを示し得る。サンプルが乳癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、乳癌を有する対象と一致する。サンプルが乳癌に見られない癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合には、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、乳癌をする対象とは一致しない。
【０４８２】
ｃ．子宮頸癌
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を子宮頸癌のマーカーとして用いることを含む。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は子宮頸癌を有する対象に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、本明細書で提供される癌（腫瘍、転移または悪性新生物性）診断のいずれにおいても子宮頸癌マーカーとして使用することができる。例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性（悪性新生物性または転移）子宮頸細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、対象が癌性子宮頸細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、対象が癌性子宮頸細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成子宮頸細胞などの子宮頸細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成子宮頸細胞などの子宮頸細胞の癌性子宮頸細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、子宮頸癌の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、悪性子宮頸腫瘍と非悪性子宮頸腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性子宮頸細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、子宮頸癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０４８３】
子宮頸癌決定のために採取するサンプルは、本明細書で示されるようないずれの供給源から採取してもよい。サンプルの供給源の例としては、子宮頸または膣組織サンプル、尿、リンパ、リンパ液、血液、血清、血漿、間質液および頸膣分泌液が挙げられる。頸膣分泌液は様々な頸膣部のいずれかからスワブなどの様々な方法のいずれかによって採取することができる。頸膣スワブサンプルの例としては、可能性のある頸膣病巣点、子宮頸管、子宮頸口、外頸部、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域（すなわち、扁平円柱上皮接合部）、膣、後膣円蓋、膣の下三分の一などの後膣円蓋より下部の膣部分、陰唇のスワブ、またはそれらの組合せが挙げられる。頸膣サンプルはまた、膣から頸膣分泌液漏出物として採取することもできる。一例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、子宮頸癌を有する対象の子宮頸口のスワブにおいて検出することができる。サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性子宮頸細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。別の態様では、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性子宮頸細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。子宮頸癌の指標としての、子宮頸口スワブバッファー処理サンプルにおける、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、もしくは２５ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、もしくは約２５ｎｇ／ｍｌである。子宮頸癌の指標としての、子宮頸口スワブ無処理サンプルにおける、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、もしくは７５ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、もしくは約７５ｎｇ／ｍｌである。子宮頸癌の指標としての、膣下部スワブバッファー処理サンプルにおける、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、もしくは２５ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、もしくは約２５ｎｇ／ｍｌである。子宮頸癌の指標としての、子宮頸口スワブ無処理サンプルにおける、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、２ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、もしくは５０ｎｇ／ｍｌ、または約２ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、もしくは約５０ｎｇ／ｍｌである。あらゆる形態の子宮頸癌が当技術分野で公知の、または本明細書で示される方法を用いて診断できる。子宮頸癌の形態の例としては、扁平上皮癌および腺癌が挙げられる。
【０４８４】
一態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌性子宮頸細胞によって産生されたものかどうかを示し得る。いくつかの場合では、頸膣分泌液または子宮頸組織などのサンプル中に存在する１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳおよび／または翻訳後修飾が異なる）が癌性子宮頸細胞により産生されることが知られている。例えば、本明細書で示されるように、子宮頸癌を有する対象由来の子宮頸口スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、そのサンプルにおけるフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域にＯ−グリコシル化されたトレオニン３３を含んでいる。他の場合には、１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、頸膣分泌液または子宮頸組織などのサンプル中に存在するが、これらは癌性子宮頸細胞によって産生されたものではなく、違う組織または臓器源によって産生されたものである。本明細書の方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができ、このような特徴付けは、サンプル中に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子が子宮頸癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子形態であるかどうかを示し得る。サンプルが子宮頸癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、子宮頸癌を有する対象と一致する。サンプルが子宮頸癌に見られない癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合には、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、子宮頸癌を有する対象とは一致しない。
【０４８５】
ｄ．卵巣癌
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を卵巣癌のマーカーとして用いることを含む。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は卵巣癌を有する対象に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、本明細書で提供される癌（腫瘍、転移または悪性新生物性）診断のいずれにおいても卵巣癌マーカーとして使用することができる。例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性（悪性新生物性または転移）卵巣細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であるとき、対象が癌性卵巣細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満であるとき、対象が癌性卵巣細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成卵巣細胞などの卵巣細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成卵巣細胞などの卵巣細胞の癌性卵巣細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、卵巣癌（腫瘍、転移または悪性新生物）の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、悪性卵巣腫瘍と非悪性卵巣腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性卵巣細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、卵巣癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０４８６】
卵巣癌決定のために採取するサンプルは、本明細書で示されるようないずれの供給源から採取してもよい。サンプルの供給源の例としては、卵巣組織サンプル、腹水、腹腔液、尿、便、血漿、血液、血清、リンパ、リンパ液および間質液サンプルが挙げられる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、卵巣癌を有する対象から採取した腹腔液において検出することができる。サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、癌性卵巣細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。別の態様では、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性卵巣細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。卵巣癌の指標としての、腹腔サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは３０ｎｇ／ｍｌ、または約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは約３０ｎｇ／ｍｌである。あらゆる形態の卵巣癌が当技術分野で公知の、または本明細書で示される方法を用いて診断できる。卵巣癌の形態の例としては、漿液性嚢腫、ムチン性嚢腫、子宮内膜腫瘍(endometriod tumor)、類中腎腫瘍、未分化胚細胞腫、内胚葉洞腫瘍、胎児性癌、多胚芽腫(polyembroma)、絨毛癌および奇形腫が挙げられる。
【０４８７】
一態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子癌性卵巣細胞によって産生されたものかどうかを示し得る。いくつかの場合では、腹腔液または卵巣組織などのサンプル中に存在する１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳおよび／または翻訳後修飾が異なる）が癌性卵巣細胞により産生されることが知られている。例えば、卵巣癌を有する対象由来の腹腔サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、そのサンプルのフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域にＯ−グリコシル化されたトレオニン３３とフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域の少なくとも別の領域を含んでいる（例えば、米国特許第５，５２３，２２９号；Menzin et al., Cancer 82:152−158 (1998)参照）。他の場合には、１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、腹腔液または卵巣組織などのサンプル中に存在するが、これらは癌性卵巣細胞によって産生されたものではなく、違う組織または臓器源によって産生されたものである。本明細書の方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができ、このような特徴付けは、サンプル中に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子が卵巣癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子形態であるかどうかを示し得る。サンプルが卵巣癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、卵巣癌を有する対象と一致する。サンプルが卵巣癌に見られない癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合には、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、卵巣癌を有する対象とは一致しない。
【０４８８】
ｅ．前立腺癌
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を前立腺癌のマーカーとして使用することを含む。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は前立腺癌を有する対象に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、本明細書で提供される癌（腫瘍、転移または悪性新生物性）診断のいずれにおいても前立腺癌マーカーとして使用することができる。例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性（悪性新生物性または転移）前立腺細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、対象が癌性前立腺細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、対象が癌性前立腺細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、正常、異常、異形成または過形成前立腺細胞などの前立腺細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成前立腺細胞などの前立腺細胞の癌性前立腺細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、前立腺癌の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、悪性前立腺腫瘍と非悪性前立腺腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性前立腺細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、前立腺癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０４８９】
前立腺癌決定のために採取するサンプルは、本明細書で示されるようないずれの供給源から採取してもよい。サンプルの供給源の例としては、前立腺組織サンプル、精液、尿、便、血漿、血液、血清、リンパ、リンパ液および間質液サンプルが挙げられる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、前立腺癌を有する対象から採取した前立腺組織サンプルにおいて検出することができる。サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、癌性前立腺細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。別の態様では、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性前立腺細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。前立腺癌の指標としての、穿刺吸引液サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは３０ｎｇ／ｍｌ、または約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは約３０ｎｇ／ｍｌである。あらゆる形態の前立腺癌が当技術分野で公知の、または本明細書で示される方法を用いて診断できる。前立腺癌の形態の例としては、腺癌が挙げられる。
【０４９０】
一態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌性前立腺細胞によって産生されたものかどうかを示し得る。いくつかの場合では、穿刺吸引液または前立腺組織などのサンプル中に存在する１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳおよび／または翻訳後修飾が異なる）が癌性前立腺細胞により産生されることが知られている。例えば、前立腺癌を有する対象由来の組織サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、そのサンプルにフィブロネクチンのＥＤ−Ｂ領域を含んでいる（例えば、Albrecht et al., Histochem. Cell. Biol. 112:51−61 (1999)参照）。他の場合には、１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、穿刺吸引液または前立腺組織などのサンプル中に存在するが、これらは癌性前立腺細胞によって産生されたものではなく、違う組織または臓器源によって産生されたものである。本明細書の方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができ、このような特徴付けは、サンプル中に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子が前立腺癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子形態であるかどうかを示し得る。サンプルが前立腺癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、前立腺癌を有する対象と一致する。サンプルが前立腺癌に見られない癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合には、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、前立腺癌を有する対象とは一致しない。
【０４９１】
ｆ．肺癌
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を肺癌のマーカーとして使用することを含む。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は肺癌を有する対象に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、本明細書で提供される癌（腫瘍、転移または悪性新生物性）診断のいずれにおいても肺癌マーカーとして使用することができる。例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性（悪性新生物性または転移）肺細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、対象が癌性肺細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、対象が癌性肺細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、正常、異常、異形成または過形成肺細胞などの肺細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成肺細胞などの肺細胞の癌性肺細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、肺癌の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、悪性肺腫瘍と非悪性肺腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性肺細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、肺癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０４９２】
肺癌決定のために採取するサンプルは、本明細書で示されるようないずれの供給源から採取してもよい。サンプルの供給源の例としては、肺組織サンプル、痰、血液、血清および血漿サンプルが挙げられる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、肺癌を有する対象から採取した痰において検出することができる。サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、癌性肺細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。別の態様では、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性肺細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。肺癌の指標としての、痰サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは３０ｎｇ／ｍｌ、または約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは約３０ｎｇ／ｍｌである。あらゆる形態の肺癌が当技術分野で公知の、または本明細書で示される方法を用いて診断できる。肺癌の形態の例としては、小細胞癌、腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌が挙げられる。
【０４９３】
一態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌性肺細胞によって産生されたものかどうかを示し得る。いくつかの場合では、痰または肺組織などのサンプル中に存在する１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳおよび／または翻訳後修飾が異なる）が癌性肺細胞により産生されることが知られている。例えば、肺癌を有する対象由来の組織サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンは、そのサンプルにおいてフィブロネクチンのＥＤＢ領域を含んでいる(Santimaria et al., Clin Cancer Res 9:571−579 (2003))。他の場合には、１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、痰または肺組織などのサンプル中に存在するが、これらは癌性肺細胞によって産生されたものではなく、違う組織または臓器源によって産生されたものである。本明細書の方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができ、このような特徴付けは、サンプル中に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子が肺癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子形態であるかどうかを示し得る。サンプルが肺癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、肺癌を有する対象と一致する。サンプルが肺癌に見られない胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合には、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、肺癌を有する対象とは一致しない。
【０４９４】
ｇ．結腸直腸癌
本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を結腸直腸癌のマーカーとして使用することを含む。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は結腸直腸癌を有する対象に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値は、本明細書で提供される癌（腫瘍、転移または悪性新生物性）診断のいずれにおいても結腸直腸癌マーカーとして使用することができる。例えば、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性（悪性新生物性または転移）結腸直腸細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、対象が癌性結腸直腸細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、対象が癌性結腸直腸細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、正常、異常、異形成または過形成結腸直腸細胞などの結腸直腸細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、正常、異常、異形成または過形成結腸直腸細胞などの結腸直腸細胞の癌性結腸直腸細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、結腸直腸癌の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、悪性結腸直腸腫瘍と非悪性結腸直腸腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象が癌性結腸直腸細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、結腸直腸癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０４９５】
結腸直腸癌決定のために採取するサンプルは、本明細書で示されるようないずれの供給源から採取してもよい。サンプルの供給源の例としては、結腸直腸組織サンプル、便、血漿、血液、血清、リンパ、リンパ液および間質液サンプルが挙げられる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、結腸直腸癌と診断された対象から採取した便において検出することができる。サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、癌性結腸直腸細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。別の態様では、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が、癌性結腸直腸細胞の、存在、リスク、進展、進行、攻撃性、再発、または処置の有効性を示し得る。結腸直腸癌の指標としての、便サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値例は、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは３０ｎｇ／ｍｌ、または約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、もしくは約３０ｎｇ／ｍｌである。あらゆる形態の結腸直腸癌が当技術分野で公知の、または本明細書で示される方法を用いて診断できる。結腸直腸癌の形態の例としては、ムチン性（膠様）腺癌、印環腺癌、硬性腫瘍、カルチノイド腫瘍、扁平上皮腫瘍、平滑筋肉腫(leiomyoscarcoma)が挙げられる。
【０４９６】
一態様では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が癌性結腸直腸細胞によって産生されたものかどうかを示し得る。いくつかの場合では、便または結腸直腸組織などのサンプル中に存在する１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳおよび／または翻訳後修飾が異なる）が癌性結腸直腸細胞により産生されることが知られている。例えば、結腸直腸癌を有する対象由来の組織サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、フィブロネクチンのＥＤＢ領域を含んでいる（例えば、Midulla et al., Cancer Res. 60:164−169 (2000)参照）。
【０４９７】
他の場合には、１以上の形態の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、便または結腸直腸組織などのサンプル中に存在するが、これらは癌性結腸直腸細胞によって産生されたものではなく、違う組織または臓器源によって産生されたものである。本明細書の方法はサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができ、このような特徴付けは、サンプル中に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子が結腸直腸癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子形態であるかどうかを示し得る。サンプルが結腸直腸癌に見られる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、結腸直腸癌を有する対象と一致する。サンプルが結腸直腸癌に見られない癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合には、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、結腸直腸癌を有する対象とは一致しない。
【０４９８】
ｈ．その他の癌
本明細書で提供される方法を用いれば、その他の様々な癌のいずれに関する情報も得ることができる。個々の癌種に関する情報を得る上で癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するために使用可能な癌種およびサンプルの例の非限定的な群としては、尿、リンパ、リンパ液、血液、血清、血漿、間質液または組織サンプルを用いて示される腎臓癌；穿刺吸引液などの組織、リンパ、リンパ液、血液、血清、血漿および間質液を用いて示される甲状腺癌；間質液、リンパ、リンパ液、血液、血清、血漿および組織サンプルを用いて示される皮膚癌；口咽頭スワブ、血液、血清、血漿および組織サンプルを用いて示される口咽頭癌；リンパ、血液、血清、血漿およびリンパ節サンプルなどの組織サンプルを用いて示されるリンパ腫；ならびに血漿、血液または血清を用いて示される白血病が挙げられる。
【０４９９】
よって、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象がこれらの組織種の癌性（悪性新生物性または転移）細胞を有するかどうかを示すために使用することができる。これらの方法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量を決定すること、およびそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に従い、またはそのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量に従ってサンプルを特徴付けすることを含み、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上である場合に、対象がこれらの組織種の癌細胞を有することを示し、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しない場合、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル未満である場合に、対象がこれらの組織種の新生物性、悪性または転移細胞を有さないことを示し得る。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、これらの組織種の正常、異常、異形成または過形成細胞などの細胞が癌化するリスクを、またはリスクがないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、これらの組織種の正常、異常、異形成または過形成細胞などの細胞の、これらの組織種の癌性細胞への進展を、または進展がないことを決定するために使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法はまた、これらの組織種の癌の進行を示すため使用することもできる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、これらの組織種の悪性腫瘍と非悪性腫瘍を識別するために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、対象がこれらの組織種の新生物性、悪性または転移細胞の再発を有するかどうか、または有する可能性があるかないかを示すために使用することができる。本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、これらの組織種の癌処置の有効性の可能性もしくは実際の有効性または有効性がないことを示し得る。
【０５００】
３．健康状態の評価
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在は、ある個体の健康状態を示し得る。１以上の閾値レベルに対する、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、ある個体の健康状態の重篤度を示し得る。身体組織または体液サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、様々な健康問題またはそのリスクの指標となり得る。細胞、組織および／または体液サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在またはレベルの上昇は、その健康問題が癌胎児性フィブロネクチン指標分子によって引き起こされることを必ずしも示さないが、細胞、組織および／または体液サンプルにおいて高レベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子が見られることを示す。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は癌の指標として役立ち、早産または切迫出産の指標として役立ち、また、関節炎(Kriegsman et al., Rhematol Int. 24:25−33 (2004))、糖尿病性網膜症(Khan et al., Invest. Opthamol. Vis. Sci. 45:287−295 (2004))、腎疾患、およびデュプュイトラン拘縮(Howard et al., J. Surg. Res. 117:232−238 (2004))の指標として役立つ可能性がある。身体組織または体液サンプルにおける１以上の閾値以上での、または特定の個体の基準を超えるレベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、様々な健康問題またはそのリスクの指標となり得る。同様に、その不存在、または１以上の閾値未満での、もしくは特定の個人の基準未満のレベルでの存在は、これら様々な疾病および障害がいずれも存在しない指標となる。
【０５０１】
本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関して対象をスクリーニングし、そのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在しないか、または閾値レベル未満でしか存在しないとき、その対象が癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関連するか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの上昇に関連する健康問題を有さないと決定する方法が提供される。同様に、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関して対象をスクリーニングし、そのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在するか、または閾値レベル以上で存在するとき、その対象が癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関連するか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルの上昇に関連する健康問題を有すると決定する方法が提供される。
【０５０２】
一態様では、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に関して試験することにより、対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題がないことを示すための方法が提供され、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の不存在（または閾値未満での存在）が、対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題がないことを示す。別の態様では、対象由来のサンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在に関して試験することにより、対象を癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題に関してスクリーニングするための方法が提供され、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が、対象が癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を有することを示す。
【０５０３】
同様に、全身の健康状態、または癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題の存在または不存在を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の変化率の増加によって示すことができ、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の増加は癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を示し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の減少は癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題が存在しないことを示し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は１以上の閾値と比較することができ、閾値の増加は癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題の可能性が高いこと、または重篤度が高いことを示し、また、閾値の減少は、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題の可能性が低いこと、または重篤度が低いことを示し得る。
【０５０４】
本明細書で提供される方法は、定期健康診断を含む様々な状況または様々な目的で、あるいは対象の未確認の疾病または病気の決定を試みるための総合診断手段として実施することができる。基準レベルは集団における平均値に基づいて設定することもできるし、あるいは特定の個体において設定することもできる。平均値からの、または個体の基準からのずれが、その個体の健康状態の変化または変化のリスクを示し得る。
【０５０５】
いくつかの態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関する試験を行う前に、対象は健康問題を有するとは診断されていないか、または癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題を有するとは診断されていない。他の態様では、対象は未同定の健康問題を有している可能性があり、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関する試験を、その健康問題を示す、または診断するためのスクリーンとして用いることができる。よって、本明細書では、対象の定期試験を行うことを含む方法が提供され、それらの試験は、対象のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在および／または量を決定すること、および癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在（または１以上の閾値との比較）または検出量に従って対象の健康状態を決定することを含む。
【０５０６】
一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、血圧、脈拍、体重、健康歴、家族歴またはサンプル試験などの通常の診断試験を含む１以上の付加的診断試験と組み合わせて実施することができる。別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、または閾値レベル以上である場合に、その対象の健康問題を診断するための１以上の付加的診断試験を行うことができる。このような診断試験は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関する試験の前、試験と同時、または試験の後に行うことができる。一例では、対象は癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する、または閾値レベル以上であると同定することができ、次にその対象をさらに、その対象の健康問題を同定するための１以上の二次診断試験で試験することができる。
【０５０７】
一態様では、サンプルを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または不存在（または１以上の閾値との比較）および／または量に関して試験することができ、また、１以上のさらなるサンプル成分の存在を含む１以上のさらなる特性に関して試験することもできる。対象からのサンプルの採取、およびサンプル中のイオンまたは分子などの複数の成分の存在または不存在といった特性に関する、またはサンプル中のイオンまたは分子などの成分のレベルに関するサンプルのスクリーニングは当技術分野で周知のものである。例えば、血液サンプル採取を用いれば、ナトリウムイオン含量などのイオン含量、ＬＤＬおよびＨＤＬ含量などの脂質含量を決定することができ、また、尿サンプルは代謝産物または糖の存在に関して試験することができ、また、唾液はホルモンに関して試験することができる。当技術分野で公知のように、様々なイオンまたは分子のいずれかの存在および／または量を測定するためには、様々なサンプルを使用することができる。
【０５０８】
一例として、血液を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子および１以上の付加的特性に関して試験することができる。通常試験される血液の特性の例としては、限定されるものではないが、赤血球数、白血球数（好中球数、リンパ球数、Ｔ細胞数、Ｂ細胞数、単球数、好酸球数および好塩基球数を含む）、血小板数、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血液型、Ｒｈ因子、グルコース、ラクトースデヒドロゲナーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、血中尿素窒素、クレアチニン、二酸化炭素、ナトリウム、カリウム、クロライド、カルシウム、リン、アルカリ性ホスファターゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、総タンパク質、フィブリノゲン、プロトロンビン、コレステロール、グロブリン、ビリルビン、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、超低密度リポタンパク質、遊離テストステロン、総テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、前立腺特異的(protstate−specific)抗原、エストラジオール、プロゲステロン、ホモシステイン、Ｃ反応性タンパク質、尿酸、アミラーゼおよびリパーゼが挙げられる。
【０５０９】
別の例では、尿を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子および１以上の付加的特性に関して試験することができる。通常試験される尿の特性の例としては、限定されるものではないが、色、外観、比重、ｐＨ、総タンパク質、グルコース、ケトン、ヘモグロビン、胆汁、ウロビリノーゲン、硝酸塩、ウログロビン、白血球細胞、白血球、赤血球、上皮細胞、細菌、結晶、粘液および円柱が挙げられる。別の例では、唾液を、胎児性フィブロネクチン指標分子および１以上の付加的特性に関して試験することができる。通常試験される唾液の特性の例としては、限定されるものではないが、エストラジオール、テストステロン、ＤＨＥＡ−Ｓ、コルチゾール、ナトリウム、カリウム、クロライドが挙げられる。
【０５１０】
一態様では、サンプルパネルの成分として癌胎児性フィブロネクチン指標分子を決定する。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、血液パネル、尿パネルまたは唾液パネルの成分として決定することができる。
【０５１１】
４．その他の健康問題
癌胎児性フィブロネクチン指標分子はまた、関節炎、糖尿病性網膜症およびデュプュイトラン拘縮などのその他の健康問題を有する対象にも存在し得る。いくつかの態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、関節炎、糖尿病性網膜症およびデュプュイトラン拘縮などの健康問題の存在を示し得る。他の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、関節炎、糖尿病性網膜症およびデュプュイトラン拘縮などの健康問題を発症するリスクを示し得る。さらに他の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、関節炎、糖尿病性網膜症およびデュプュイトラン拘縮などの健康問題の重篤度を示し得る。さらに、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在がこのような健康問題の発症リスクまたは重篤度の存在を示すことに加え、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が１以上の閾値より高い、等しい、または低いことがあり、それぞれ高い閾値ほど、それぞれ低い閾値よりもこのような健康問題の存在の可能性が高いこと、発症リスクが高いこと、または重篤度が高いことを示す。サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の増加率または減少率は、このような健康問題の存在の可能性の程度、発症リスクの程度、または重篤度の程度を示し、大きい増加ほど、小さい増加または減少よりも健康問題の高い可能性または高い重篤度に相当する。
【０５１２】
ａ．関節炎
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は関節に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、関節炎を有する個体の滑液、滑膜組織および／または軟骨に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、関節リウマチを有する対象に、閾値未満の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を有する対照サンプルよりも高いレベルで存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、変形性関節症を有する対象に、閾値未満の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を有する対照サンプルよりも高いレベルで存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、関節リウマチを有する対象に、変形性関節症を有する対象に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルよりも高いレベルで存在し得る。
【０５１３】
関節炎対象は、患部に高レベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る。よって、一態様では、対象の滑液、滑膜組織または軟骨において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、関節炎存在を決定することができる。関節炎対象はまた、血流中にも高レベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る。よって、血液、血清または血漿において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによっても関節炎の存在を決定することができる。
【０５１４】
また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象が関節炎を発症するリスクの指標ともなり得る。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することにより、対象が関節炎を発症するリスクを決定するための方法が提供され、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合に、関節炎を発症するリスクが高いことを示す。また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象の関節炎の重篤度も示し得る。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することにより、対象の関節炎の重篤度を決定するための方法が提供され、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が閾値以上である場合に、癌胎児性フィブロネクチン陰性（または閾値未満）であるサンプルよりも、対象の関節炎の重篤度が高いことを示す。
【０５１５】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、サンプル中のＥＤＡ＋、ＥＤＢ＋および／またはＩＩＩＣＳ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を決定することにより測定することができる。いくつかの態様では、滑膜組織中のＥＤＢの存在は、対象における関節リウマチの存在を示す。他の態様では、ＦＤＣ−６と結合するＩＩＩＣＳスプライス変異体などのＩＩＩＣＳのスプライス変異体の存在は、滑膜過形成の存在を示す。
【０５１６】
ｂ．糖尿病性網膜症
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は糖尿病性網膜症に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、眼房水、硝子体液、または眼の種々の組織に存在し得る。糖尿病性網膜症を有する対象は、糖尿病性網膜症を有さない対象よりも高いレベルのＥＤＡ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子を有し得る。糖尿病性網膜症を有する対象は、糖尿病性網膜症を有さない対象よりも高いレベルのＥＤＢ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子を有し得る。糖尿病性網膜症を有する対象は、糖尿病性網膜症を有さない対象よりも高いレベルのＩＩＩＣＳ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子を有し得る。よって、糖尿病性網膜症に関連する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための方法は、ＥＤＡ＋、ＥＤＢ＋および／またはＩＩＩＣＳ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することを含み得る。
【０５１７】
一態様では、糖尿病性網膜症の存在は、対象の眼房水、硝子体液、または眼組織サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより決定することができる。糖尿病性網膜症を有する対象はまた、血流中にも高レベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る。よって、血液、血清または血漿において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによっても糖尿病性網膜症の存在を決定することができる。
【０５１８】
また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象が糖尿病性網膜症を発症するリスクの指標ともなり得る。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することにより、対象が糖尿病性網膜症を発症するリスクを決定するための方法が提供され、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合に、糖尿病性網膜症を発症するリスクが高いことを示す。また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が１以上の閾値以上で存在する場合に、対象の糖尿病性網膜症の重篤度も示し得る。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することにより、対象の糖尿病性網膜症の重篤度を決定するための方法が提供され、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が１以上の閾値以上で存在する場合に、癌胎児性フィブロネクチン陰性（または閾値未満）であるサンプルよりも、対象の糖尿病性網膜症の重篤度が高いことを示す。
【０５１９】
ｃ．デュプュイトラン拘縮
癌胎児性フィブロネクチン指標分子はデュプュイトラン拘縮に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、デュプュイトラン拘縮を有する対象の血液、血清、血漿または組織サンプルに存在し得る。デュプュイトラン拘縮を有する対象は、デュプュイトラン拘縮を有する対象よりも高いレベルのＩＩＩＣＳ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子を有し得る。よって、デュプュイトラン拘縮に関連する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための方法は、ＩＩＩＣＳ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することを含み得る。
【０５２０】
一態様では、デュプュイトラン拘縮の存在は、デュプュイトラン拘縮を有することが疑われる領域からの組織サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより決定することができる。デュプュイトラン拘縮を有する対象はまた、血流中にも高レベルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る。よって、血液、血清または血漿において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することによってもデュプュイトラン拘縮の存在を決定することができる。
【０５２１】
また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象がデュプュイトラン拘縮を発症するリスクの指標ともなり得る。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することにより、対象がデュプュイトラン拘縮を発症するリスクを決定するための方法が提供され、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合に、デュプュイトラン拘縮を発症するリスクが高いことを示す。また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が１以上の閾値以上で存在する場合に、対象のデュプュイトラン拘縮の重篤度も示し得る。よって、本明細書では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することにより、対象のデュプュイトラン拘縮の重篤度を決定するための方法が提供され、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が１以上の閾値以上で存在する場合に、癌胎児性フィブロネクチン陰性（または閾値未満）であるサンプルよりも、対象のデュプュイトラン拘縮の重篤度が高いことを示す。
【０５２２】
Ｅ．サンプルの採取
本明細書で開示される方法によれば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は様々なサンプル種のいずれにおいても検出することができる。例えば、サンプルとしては、リンパ、血液、血漿、血清、唾液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、母乳、滑液、精液、精漿、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、腹腔液、腹水、汗、リンパ液、肺痰および洗浄液が挙げられる。さらに、このサンプルは、生検などの組織検体を含み得る。サンプルが組織生検などの固形物質を含む場合、溶液とするため、あるいはそうでなければ本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の方法で用いるためにサンプル成分の利用性を高めるためにサンプルをホモジナイズすることができる。組織生検サンプルの例としては、頸膣組織および乳房組織生検サンプルが挙げられる。
【０５２３】
サンプルは様々な技術のいずれによって採取してもよい。所与の手順に用いる特定の技術は少なくとも一つには、分析すべきサンプル種によって異なる。一般に、組織サンプルは吸引（例えば、穿刺吸引）、洗浄（例えば、管洗浄）、生検、拭き取り（例えば、組織採取用ブラシ、ポリエステルスワブ、レーヨンスワブまたは綿スワブなどの繊維チップスワブの使用）、吸引(suction)、経皮抽出(transcutaneous or transdermal extraction)およびその他の方法を用いて採取することができる。液体サンプルは、吸引(suction)、針を介した抜き取り(needle−mediated withdrawal）、拭き取り（例えば、組織採取用ブラシ、ポリエステルスワブ、レーヨンスワブまたは綿スワブなどの繊維チップスワブの使用）およびその他の方法により採取することができる。サンプルを綿スワブで採取する場合、本明細書で提供される方法は、そのスワブ自体に行う。当業者により認識されるように、サンプルにもよるが、サンプル採取は医療従事者、非訓練者および／またはサンプルが採取される対象によって行うことができる。例えば、生検または穿刺吸引液サンプルはおそらくは医療従事者により採取される。別の例では、尿サンプルまたは膣スワブサンプルは、家族などの非訓練者により、またはサンプルが採取される対象により採取することができる。非訓練者により、またはサンプルが採取される対象により採取可能なサンプルは、自宅など、臨床現場以外の場所で採取することができる。例えば、サンプルはホームテスト手順の一環として採取することができる。ホームテスト手順は、例えば、本明細書で提供されるキットなどのホームテストキットを用いて行うことができる。
【０５２４】
本明細書で提供されるサンプル採取技術はいずれも、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出の診断使用またはその他の使用のいずれかを目的に、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法のいずれかと組み合わせて用いることができる。以下に採取法および採取源の例を示す。
【０５２５】
１．スワブおよび頸膣サンプル
対象からスワブサンプルを採取し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することができる。スワブサンプルは対象の体液、対象の細胞、または体液と細胞を含み得る。スワブサンプルは、限定されるものではないが、口腔、耳、鼻腔、肛門、尿道、頸膣、眼、皮膚、消化管（食道、胃、腸、結腸など）、またはスワブが利用可能な他のいずれかの表面、または上記のいずれかの病巣を含む様々な領域のいずれからでも採取することができる。
【０５２６】
スワブサンプルは、採取するサンプルと実施する癌胎児性フィブロネクチン指標分子試験に応じ、医療従事者、家族などの非訓練者、またはサンプルを提供する対象によって採取することができる。例えば、質量分析により癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を調べる子宮頸口のスワブは一般に医療従事者により採取されるが、試験ストリップアッセイにより癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を調べる膣および／または陰唇スワブサンプルは非訓練者により、またはサンプルを提供する対象により採取することができ、例えば、ホームテスト法において使用することができる。スワブサンプルの採取に使用可能なデバイスとしては、限定されるものではないが、組織採取用ブラシ、ポリエステルスワブ、レーヨンスワブまたは綿スワブなどの繊維チップスワブなど、目的の身体領域からのサンプル採取を補助する構成となっている、当技術分野で公知のスワブサンプル採取デバイスであり得る。一態様では、このスワブサンプルは頸膣スワブサンプルである。
【０５２７】
頸膣スワブサンプルを含む頸膣サンプルは、様々な頸膣領域のいずれかからのサンプルおよびそれらの組合せを含み得る。頸膣サンプルは頸膣分泌液を含み、所望により頸膣腔由来の細胞を含み得る。頸膣分泌液などの頸膣サンプルは、頸膣の拭き取り、または例えば吸収パッドなどの吸収性の採取媒体を用いる頸膣分泌液漏出物の採取を含む様々な方法のいずれかによって採取することができる。頸膣スワブサンプルの例としては、限定されるものではないが、可能性のある頸膣病巣点、子宮頸管、子宮頸口、外頸部、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域（すなわち、扁平円柱上皮接合部）、膣、後膣円蓋、膣の下三分の一などの後膣円蓋より下部の膣部分、陰唇のスワブ、またはそれらの組合せが挙げられる。膣スワブサンプルの場合、サンプルは、後膣円蓋、または例えば膣の下三分の一などの後膣円蓋より下部の膣部分を含む、いずれの膣部分のスワブであってもよい。陰唇スワブの場合、スワブは小陰唇または大陰唇から採取することができ、一般に小陰唇のスワブを含む。
【０５２８】
頸膣サンプルに関しては、一般に、アッセイする組織または液体サンプルを、可能性のある頸膣病巣点、子宮頸管、子宮頸口、外頸部、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域（すなわち、扁平円柱上皮接合部）、膣、後膣円蓋、膣の下三分の一などの後膣円蓋より下部の膣部分、陰唇の近傍またはそれらの組合せにおいて取り出すことができる。頸膣サンプルはまた、ダグラス窩穿刺サンプルを含み得る。頸膣サンプルは、受動式採取法によって採取されたサンプルを含む。受動式採取法は、体液および所望により粒状物と接触し、一般にはそれを吸収する位置にサンプル採取媒体を置くことにより、頸膣分泌液および所望により細胞などの粒状物を採取することを含む。受動式採取媒体の例としては、頸膣腔へ挿入されるサンプル採取デバイス（例えば、頸膣サンプルを採取可能なタンポン様デバイス）およびサンプルが頸膣腔を出た際に採取できるサンプル採取デバイス（例えば、生理用ナプキン様デバイスなどの吸収パッド様デバイス）が挙げられる。Alary et al., J. Clin. Microbiol. 39:2508−2512 (2001)に例示されているように、生理用ナプキンを改良したものなど、診断目的の受動式採取デバイスの使用が当技術分野で公知である。
【０５２９】
いくつかの態様では、本明細書で示されるように、膣の下三分の一などの後膣円蓋より下部または上部の膣部分から採取した頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、同じ対象から採取した後膣円蓋の頸膣スワブ中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の三分の一または約三分の一であり得る。よって、本明細書で提供される、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルが、ある閾値レベルと比較される方法では、膣の下三分の一などの膣の下方部分のスワブの閾値レベルは、後膣円蓋スワブの閾値レベルの三分の一または約三分の一であり得る。例えば、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが６０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは６００ｎｇ／ｍｌ）、または約６０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約６００ｎｇ／ｍｌ）である場合、膣の下三分一などの膣の下方部分のバッファー処理スワブの閾値レベルは、２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは２００ｎｇ／ｍｌ）または約２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約２００ｎｇ／ｍｌ）であり得る。同様に、後膣円蓋のバッファー処理スワブの閾値レベルが５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ）または約５０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ）、３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３００ｎｇ／ｍｌ）または約３０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３００ｎｇ／ｍｌ）、１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５０ｎｇ／ｍｌ）または約１５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５０ｎｇ／ｍｌ）、または１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１００ｎｇ／ｍｌ）または約１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１００ｎｇ／ｍｌ）である場合、膣の下三分一などの膣の下方部分のバッファー処理スワブの閾値レベルは、それぞれ１５〜２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）または約１５〜２０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）、１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは１００ｎｇ／ｍｌ）または約１０ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約１００ｎｇ／ｍｌ）、５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは５０ｎｇ／ｍｌ）または約５ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約５０ｎｇ／ｍｌ）、または３〜４ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは３０〜４０ｎｇ／ｍｌ）または約３〜４ｎｇ／ｍｌ（または無処理サンプルでは約３０〜４０ｎｇ／ｍｌ）であり得る。
【０５３０】
頸膣サンプルは一般に体液と粒状固体を含み、膣もしくは子宮頸粘液、その他の膣もしくは子宮頸分泌液、細胞もしくは細胞残渣、羊水、またはその他の胎児または母体物質を含み得る。
【０５３１】
本明細書で提供されるいくつかの方法では、サンプルは実質的に血液を含まない。例えば、本方法がＥＬＩＳＡアッセイまたは水平流動などのイムノアッセイである場合、これらのサンプルは実質的に血液を含まない。サンプルは５％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、もしくは０．１％以下、または約５％以下、約２％以下、約１％以下、約０．５％以下、もしくは約０．１％以下の血液しか含まない。サンプルは、限定されるものではないが、組織採取用ブラシ、ポリエステルスワブ、レーヨンスワブまたは綿スワブなどの繊維チップスワブ（例えば、ＷＯ９１／１６８５５、ＷＯ８９／１０７２４、米国特許第４，７５９，３７６号、同第４，７６２，１３３号および同第４，７００，７１３号参照）、吸引器、吸引デバイス、洗浄デバイス、針、または当技術分野で公知のその他のデバイスの使用を含む様々な技術のいずれかを用いて取り出すことができる。免疫沈降、ウエスタンブロット法、ドットブロット法などの他の方法では、アッセイ方法はサンプル中に血液が存在しても影響を受けない。当業者ならば、そのアッセイ法に基づき、血液が汚染物となるかどうかを経験的に決定することができる。
【０５３２】
頸膣サンプル採取は採取する頸膣領域に応じて行うことができる。例えば、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域のスワブは、膣鏡を用いて医療従事者により採取することができる。別の例では、膣の下三分の一のスワブなどの膣スワブおよび／または陰唇スワブは、家族などの非訓練者により、または医療従事者により採取することができる。
【０５３３】
膣サンプルを対象とするいくつかの態様では、膣サンプルを膣の同じ部分で採取することでサンプル採取の再現性を高めることができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定結果の信頼性を高めることができる。本明細書で示されるように、膣中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度は、膣の場所が異なれば異なり得る。よって、膣の同じ場所から採取した２つ以上のサンプルは、膣の異なる部分から採取した２つ以上のサンプルよりも、同じまたは実質的に同じ濃度の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含有する可能性が高い。よって、本明細書では、膣サンプルを採取するための方法または膣サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を決定するための方法が提供され、これらの方法は、これらの方法は２以上の膣サンプル（同じまたは違う対象から）を採取することを含み、ここで、これらのサンプルは膣の同じ場所から採取される。膣の同じ場所から採取された、また、同じ対象から違う機会に（例えば、違う日または違う週に）採取された２以上のサンプルは、同じ対象の膣の違う場所から採取された２以上のサンプルによりも、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量の経時的変化をより高い信頼性で示すことができる。よって、本明細書で提供される方法は、同じ対象の膣の同じ場所から２以上のサンプルを採取することにより、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量の経時的な測定変化の信頼性を高めるための方法を含む。また、本明細書では提供されるものでは、膣の特定の場所から採取されたサンプルを、その場所で採取されたサンプルに特異的に関連する１以上の閾値と比較することができ、このような１以上の閾値以上のサンプルが、その膣の特定の場所に関連のないサンプルおよび閾値よりも、対象の健康状態または結果の可能性をより高い信頼性で反映し得る。よって、本明細書で提供される方法は、１以上の閾値と特異的に関連づけられる場所と同じ膣の場所から膣サンプルを採取することにより、示される健康状態または健康状態の結果の可能性の信頼性を高めるための方法を含む。また、本明細書で提供されるものでは、膣の同じ場所からサンプルを採取することで、サンプル採取手順（例えば、サンプルを採取する個人間のばらつき）またはサンプル採取技術（例えば、適切でないまたは不注意なサンプル採取技術）におけるばらつきによる、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変動を小さくすることができる。サンプル採取による癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変動を小さくすると、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の有／無および／または量と健康状態または健康状態の結果の可能性との相関を高めることができる。よって、本明細書では、２個体以上の対象の膣の同じ場所からサンプルを採取すること、および健康状態または健康状態結果の可能性とサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の有／無および／または量とを相関させることにより、対象の健康状態または健康結果とサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の有／無および／または量とを相関させる方法が提供される。膣の同じ場所から膣サンプルを採取するための方法は当技術分野で公知のものであり、例えば、過挿入防止デバイスが取り付けられたスワブサンプル採取デバイスを用いて達成することができ、ここで、この過挿入防止デバイスにより、サンプルが採取される膣の場所が標準化される。
【０５３４】
採取後、そのサンプルは保存用容器に移し、試験所に輸送することができる。試験サンプルは所望により、採取組成物中では不安定である可能性のあるタンパク質または核酸などの生体分子分析物を保存する液体中に分散させてもよい。このような保存および輸送媒体によれば、保存および輸送中のタンパク質分析物レベルの低下が最小となる。例えば、この保存および輸送媒体は、プロテアーゼ活性またはヌクレアーゼ活性などの分解酵素活性を低下させる、阻害する、または防ぐ試薬または条件（例えば、ｐＨ、イオン強度またはイオン組成）を含み得る。保存および輸送用の保存溶液の例としては、当技術分野で公知のように、また、１９９０年４月２４日発行の米国特許第４，９１９，８８９号に例示されているように、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニン、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。この溶液は、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する場合に使用することができる。採取したサンプルの、液体を用いたさらなる希釈を考慮した計算も、そのアッセイ法の解釈の一環として行うことができる。
【０５３５】
一態様では、サンプルを即処理するための家庭・現場用デバイスが使用可能である。これを用いれば、サンプルをデバイスに直接載せ、サンプル採取から数分以内に試験を行うことができる。このような場合、分析物を安定化させる必要は最小となり、アッセイの実施を補助し、かつ、分析物の安定性や使用者の安全性に悪影響のない溶液はいずれも使用可能である。即時処理における家庭用または現場用の溶液の例としては、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。
【０５３６】
一態様では、頸膣サンプルのホームテスト用キットが提供される。このキットは、スワブまたは受動式サンプル採取媒体などのサンプル採取デバイス、および所望により、サンプルと混合するための溶液を含むことができ、一般には、１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と使用および／または結果の解釈に関する説明書を含む。
【０５３７】
本明細書では、様々な診断系およびキットが提供され、米国特許第６，３９４，９５２号および第６，２６７，７２２号に例示されているものなど、当技術分野で公知のものである。このような診断系およびキットは、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の方法に従い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベル決定するために使用することができ、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の診断目的のいずれのためにも使用可能である。
【０５３８】
２．洗浄液サンプル
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は対象の身体または身体の様々な領域に存在し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る、対象由来の体液、細胞、またはその他のサンプルは、洗浄法を用いて体腔および管を含む様々な領域から採集することができる。よって、本明細書で示されるように、対象から洗浄液サンプルを採取することができ、その洗浄液サンプルをその中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関して調べることができる。洗浄液サンプルの採取には、様々な身体表面、体腔、および／または管のいずれを用いてもよい。洗浄液サンプルの例としては、腹腔洗浄液、管洗浄液、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液、口腔洗浄液、鼻腔洗浄液、耳洗浄液、眼洗浄液、膀胱洗浄液、結腸洗浄液、胃洗浄液、頸膣(cerviovaginal)洗浄液サンプルが挙げられる。洗浄液サンプルの採取には当技術分野で公知の様々な洗浄法および洗浄装置がいずれも使用可能である。洗浄法は一般に、対象の身体領域と液体を接触させ、その液体を採取することを含む。これらの方法はまた、その領域を液体で洗う、またはその領域上で液体を移動させる工程を含み得る。これらの方法はまた、必ずしも必要ではないが、液体を吸引する(aspirating)、または減圧して液体を採取する工程を含み得る。
【０５３９】
ａ．サンプル採取
洗浄液サンプルは公知の方法を用いて採取することができる。一般に、対象の身体領域から洗浄液サンプルを探診および／または採取するために洗浄器具が用いられる。目的の領域が位置決定されれば、洗浄器具に送り込んだ洗浄液をその領域と接触させることができる。次に、サンプルを得るために洗浄液の少なくとも一部を採取することができる。
【０５４０】
一態様では、アクセス器具は二重管カテーテルを含む。洗浄液はこのカテーテル管の一方から対象の身体領域と接触させることができ、洗浄液はもう一方のカテーテル管から取り出し、採取することができる。洗浄液の採取にはさらに、対象の身体領域からの洗浄液の抜き取りを助ける目的で第二のカテーテル管への吸引の適用、およびアッセイ可能な形態でのサンプルの蓄積を含み得る。吸引は、管内に吸引力を作り出すためのいずれかの装置を用いてかけることができる。例えば、吸引力は、対象の身体領域から洗浄液を抜き取る管と操作可能に接続されたシリンジまたは他の吸引デバイスを用いてかけることができる。吸引力は、当業者が意図する手順に従って短時間または長時間かけることができる。洗浄液の導入は、所望により、第二のカテーテル管から最初の洗浄液が出始めた後も継続してよい。
【０５４１】
洗浄液の使用容量は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を採取することができる量であればよく、限定されるものではないが、当業者に理解されているように、接触させる対象の領域、測定方法、および用いるサンプル操作方法を含む様々な因子によって異なり得る。一般に、この容量は少なくとも、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る液体またはその液体が接触した細胞もしくは他の成分を運び、かつ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定のために対象から取り出すのに十分なものである。一般に、この容量は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が希釈可能な量より、選択された癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定方法によって癌胎児性フィブロネクチン指標分子が測定できないほどに多くないものである。容量例としては、少なくとも０．５ｍＬまたは約０．５ｍＬ、および多い場合では２５ｍＬまたは約２５ｍＬである。
【０５４２】
洗浄液は領域の表面に導入することもできるし、あるいは、身体領域の組織、臓器または膜を破壊しないよう十分に低い圧力、かつ、身体領域から体液、細胞および／または他の物質が分離でき、洗浄液によって運ばれるよう十分に高い圧力で体腔中に導入することもできる。例えば、洗浄液は０．１ｍＬ／ｓ〜５ｍＬ／ｓまたは約０．１ｍＬ／ｓ〜約５ｍＬ／ｓの速度で導入することができる。
【０５４３】
ｂ．洗浄液
洗浄液は、当技術分野で公知の様々な成分のいずれを含んでもよい。洗浄液は、Ｈ２Ｏ、アルコール、または対象との接触および癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出に適合する他の液体を含み得る。例えば、サンプルは水性であって、生理食塩水と、例えば、麻酔薬、膠質浸透圧剤、浸透圧剤、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、防腐剤、開口拡張剤(orifice dilating agent）、血管拡張剤、血管収縮剤、筋弛緩剤、筋肉収縮剤、抗虚血剤、β遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、または色素もしくは染色剤などの１以上の任意選択成分を含み得る。洗浄液はまた、所望により、１種類以上の気体（例えば、空気および／または窒素）も含み得る。気体の存在は細胞および体液の回復を高めるのに役立ち得る。この気体は、加圧容器からの気体の導入を含む様々な標準的方法のいずれによって洗浄液に導入してもよい。
【０５４４】
麻酔薬は、対象のある領域を麻酔することができる麻酔剤のいずれかである。麻酔薬は局所的、全身的、局部的、またはそのいずれかの組合せで作用し得る。麻酔薬としては、限定されるものではないが、次のものが挙げられる：リドカイン、プロロカイン(prolocaine)、プレベリカイン(prevericaine)、またはマーカイン。麻酔薬はまた、麻酔剤の組合せまたは混合物であってもよい。
【０５４５】
膠質浸透圧剤としては、限定されるものではないが、高分子量ヒドロキシエチルデンプン（例えば、Hespan (DuPont)）および低分子量ヒドロキシエチルデンプン（例えば、Pentaspan (DuPont)）の調製物などの、既存の市販無菌膠質浸溶液が挙げられる。また、ヒドロキシメチルα置換（１−４）または（１−６）ポリマーを含む他の多糖誘導体、およびヒドロキシプロピル置換βまたはγシクロデキストリンを含むシクロデキストリンも膠質浸透圧剤として使用することができる。
【０５４６】
浸透圧剤は当技術分野で公知である。浸透圧剤の例としては、限定されるものではないが、オスモポリマーおよびオスマジェント(osmagents)が挙げられる。米国特許第５，４１３，５７２号に例示されているように、様々な膠質浸透圧剤が当技術分野で公知である。
【０５４７】
防腐剤は、洗浄液と接触した対象の領域において敗血症の機会を減らし得るいずれかの薬剤である。防腐剤は敗血症を防ぐまたは妨げる予防目的を果たし得る。防腐剤としては、限定されるものではないが、次の１以上のものであり得る：薬用アルコール（例えば、エチルアルコールまたはイソプロピルアルコール）、局所用抗生物質（例えば、ネオスポリンまたはバクテリオマイシン）およびそれらの組合せ。
【０５４８】
管口拡張剤は、管口などの開口部の拡張を促す薬剤である。管口拡張剤としては、限定されるものではないが、次の１以上のものであり得る：赤トウガラシ科の植物（カプシカム(Capsicum)属、この場合、薬剤は例えばカプサイシンであり得る）由来の薬剤、開口部における反応を促進または遅延させ得るホルモン（例えば、プロラクチンまたはオキシトシン）およびそれらの組合せ。
【０５４９】
血管拡張剤は、血管拡張、すなわち、血管の開放を促進し、接触した領域への、または接触した領域内の血流を増すいずれかの薬剤である。血管拡張剤としては、限定されるものではないが、次の１以上のものが挙げられる：一般に心臓組織に用いられる血管拡張剤、表面または開口部で働き得る血管拡張剤、およびそれらの組合せ。
【０５５０】
筋弛緩剤は、括約筋など、採取される身体領域または身体領域近傍の弛緩を引き起こし得るいずれかの薬剤である。筋弛緩剤は、限定されるものではないが、次の１以上のものが挙げられる：平滑筋弛緩剤、カルシウムチャネル遮断剤（例えば、ニフェジピン）、鎮痙剤（例えば、ジトロパン（オキシブチニン）、ウロスパス(urospas)、またはターブチリン(terbutyline)）およびそれらの組合せ。例えば、筋弛緩剤は、括約筋（例えば、乳管括約筋）の弛緩に有効な括約筋弛緩剤が挙げられる。筋肉収縮剤は、括約筋など、採取される身体領域の、または身体領域近傍の収縮を引き起こし得るいずれかの薬剤である。
【０５５１】
母乳分泌刺激剤は、授乳中の女性において母乳分泌を刺激し得るいずれかの薬剤である。例えば、薬剤を、非授乳中の女性の乳頭表面および乳房に塗布すると、乳管からの採取可能な乳管液を増やす働きをすると考えられている。母乳分泌刺激剤は、限定されるものではないが、次の１以上のものが挙げられる：オキシトシン、プロラクチンおよびそれらの組合せ。
【０５５２】
分泌刺激剤は、採取される身体領域からの液体および／または物質の分泌を刺激し得るいずれかの薬剤である。分泌刺激剤としては、限定されるものではないが、次の１以上のものが挙げられる：オキシトシン、プロラクチンおよびそれらの組合せ。
【０５５３】
抗虚血剤は、虚血を防ぐ、または軽減し得るいずれかの薬剤である。抗虚血剤は、抗虚血作用を達成するために様々な手段で働くことができ、その薬剤の使用はその作用様式に限定されるものではない。抗虚血剤は採取される身体領域への血流および酸素流を増す働きをし得る。
【０５５４】
β遮断剤は、採取される身体領域（例えば、乳房）に対して、有効にその身体領域への血流および酸素流を増す働きをし得るいずれかのβ遮断剤である。カルシウムチャネル遮断剤は、採取される身体領域（例えば、乳房）に対して、有効にその身体領域への血流および酸素流を増す働きをし得るいずれかのカルシウムチャネル遮断剤である。
【０５５５】
色素または染色剤は、洗浄液が接触した身体領域を同定するために使用することができるいずれかの薬剤である。
【０５５６】
得られる管洗浄液サンプルは、採取される身体領域由来の上皮細胞、その領域に存在する通常分泌される、また、分泌されない液体、ならびにタンパク質、ペプチド、核酸分子、抗体、および採取される身体領域に分泌され得る、またはそうでなければ存在し得る他の化学種を含み得る。
【０５５７】
ｃ．洗浄による標識の適用
所望により、検出法および／または治療法において洗浄を行うことができる。身体領域における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の同定および癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む身体領域の処置は、洗浄液に検出可能な、かつ／または治療用のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを含めることによって容易にすることができる。対象の身体領域の表面に洗浄液を接触させ、コンジュゲートを検出し、そのコンジュゲートが結合している領域に治療作用をもたらすことができる。いくつかの態様では、所望により、その身体領域をブロックする、またはブロックしない溶液でこの身体領域を洗浄し、結合相手コンジュゲートの、身体領域中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子への特異的結合を容易にする、または可能にすることができる。例えば、開口部はケラチン含有物質で塞ぐことができ、医薬用送達ビヒクル中で混合した酢酸（例えば、５〜５０重量％または約５〜約５０重量％）などのケラチン分解溶液を用いた洗浄により、結合相手の結合を可能とするに十分な癌胎児性フィブロネクチン指標分子部位を露出させることができる。検出可能な、または治療用のコンジュゲートは、様々な常法技術のいずれかを用いて液体（例えば、水溶液）として処方することができる。例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートは水溶液であり得る。フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む様々な検出可能な、または治療用のコンジュゲート、またはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は本明細書で提供されているか、または当技術分野で公知である。
【０５５８】
ｄ．管洗浄
例示として、本明細書では管洗浄法が示される。管洗浄は、管からサンプルを採取するため、または管を標識するために使用することができる。当業者ならば、選択された癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法と本明細書の教示により示される指針に従って管洗浄法を選択することができる。
【０５５９】
ｉ．サンプル採取
サンプルは、公知の方法を用いて管から採取することができる。一般に、管口を探す際には、管アクセス器具を用いて表面を探診する。管口が位置決定されれば、管アクセス器具に送り込んだ洗浄液をその管内に注ぐことができる。この洗浄液は、管口とアクセスおよび洗浄液のための管系を準備することができ、かつ／または管からの物質採取のために使用することができる。一態様では、この洗浄液は、実質的にその管ネットワーク全体を通るように管に導入する。次に、サンプルまたは検体を得るために、その管から洗浄液の少なくとも一部を採取することができる。いくつかの場合には、単一の管ネットワークのみから検体を採取することを選択することもできる。２以上の子宮頸管ネットワークにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を同定するためにこれらの工程を繰り返すことができる。例えば、女性の乳房には一般に６〜９本の乳管が存在し、それらの各々から個々に、または同時に採取することができる。様々な管洗浄技術が当技術分野で公知である。管洗浄技術の例は、米国特許第６，１６８，７７９号（２００１年１月２日発行）および米国特許出願第２００２／００１９０１７号（２００２年２月１４日公開）および同第２００２／００３７２６５号（２００２年３月２８日公開）に記載されている。
【０５６０】
一態様では、管アクセス器具は二重管カテーテルを含む。洗浄液はこのカテーテル管の一方から管系に導入する。洗浄液は、カテーテル管に作動か様なように接続されたシリンジにより管系へ導入することができる。管系が洗浄液で満たされたところで、余分な洗浄液がもう一方のカテーテル管を通じてあふれ出すので、これを採取する。
【０５６１】
液体の採取はさらに、管系からの洗浄液の抜き取りを助ける目的で第二のカテーテル管への吸引(suction)の適用を含み得る。吸引は、管内に吸引力を作り出し得るいずれかの装置を用いてかけることができる。例えば、吸引力は、管系から洗浄液を抜き取る管と作動可能なように接続されたシリンジまたは他の吸引デバイスを用いてかけることができる。吸引力は短時間（例えば、管の中から外へ向かう管内の液体の流れを確立するに十分な時間）かけることができる。あるいは、吸引は長時間（例えば、洗浄液の連続注入に対応する時間）かけることもできる。
【０５６２】
管系は、所望により、まず、０．０１４インチ（０．０３６ｃｍ）ガイドワイヤーなどのガイドワイヤーで最初のアクセスを行ってもよい。ガイドワイヤーを管口に挿入した後（例えば、開口部を０．２５ｃｍ〜２．５ｃｍまたは約０．２５ｃｍ〜約２．５ｃｍ通過した際）、このガイドワイヤーをたどって管口へ管アクセス器具を導入する。管アクセス器具が管口の適切な位置に来たところで、所望によりこのガイドワイヤーを抜いてもよい。
【０５６３】
乳管サンプルを採取する際には、例えば、サンプル採取を容易にするために乳房に外圧をかける。外圧の適用は手動であっても機械的なものであってもよい。この圧力は、洗浄液と細胞と他の管内容物を管内でより効率的に混合するために用いられる。外圧は乳房の底部から始めて乳輪および乳頭に達するようにかけることができる。この圧力は乳房に、洗浄液の注入中および／または注入後に定期的、連続的、または周期的にかけることができる。
【０５６４】
例えば乳管サンプルでは、管系に導入する洗浄液の量は一般に少なくとも５ｍＬまたは約５ｍＬ、より一般的には５ｍＬ〜２５ｍＬまたは約５ｍＬ〜約２５ｍＬの間、多くの場合には１０ｍＬまたは約１０ｍＬである。洗浄液は一般に低圧（すなわち、管ネットワークを破壊することのない圧力）で管系に導入する。例えば、洗浄液は、０．１ｍＬ／ｓ〜５ｍＬ／ｓまたは約０．１ｍＬ／ｓ〜約５ｍＬ／ｓの間、多くの場合には０．５ｍＬ／ｓ〜１ｍＬ／ｓまたは約０．５ｍＬ／ｓ〜約１ｍＬ／ｓの間の範囲の速度で導入することができる。さらに、洗浄液は一般に、比較的短時間（例えば、１分〜５分または約１分〜約５分の間）で導入する。洗浄液の導入は、所望により、第二のカテーテル管から最初の洗浄液が出始めた後も継続してよい。
【０５６５】
ｉｉ．管への標識の適用
表面上での管口の同定は、所望により管口のいくつか、または全てを最初に標識することによって容易になる。管口を標識するための方法は公知である（例えば、米国特許第６，１６８，７７９号参照）。要するに、管口で露出している上皮内層の部分を可視的な、またはそうでなければ検出可能なマーカーで標識するのであるが、これにより処置の専門家であれば、各管ネットワークの開口部を同定することができる。よって、管口の１以上の組織マーカーを、管口領域に優先的に結合し得る検出可能な化合物で特異的に標識することができる。一態様では、例えば、管口領域に対する標識の結合は、他の領域に対する標識の結合の少なくとも２倍、一般に、５倍、１０倍、５０倍、１００倍もしくはそれを超える倍率、または約２倍、一般に、約５倍、１０倍、５０倍、１００倍もしくはそれを超える倍率である。開口部に対する標識の結合はそれ自体、開口部の位置の認識可能な指標となる。
【０５６６】
ある態様では、表面を、所望により、管口の組織マーカーに対する標識剤の結合を容易にするかまたは可能にするよう、開口部をブロックしない溶液で洗浄してもよい。例えば、開口部はケラチン含有物質でふさぐことができ、医薬用送達ビヒクル中で混合した酢酸（例えば、５〜５０重量％または約５〜約５０重量％）などのケラチン分解溶液を用いた洗浄により、管口の標識を可能とするに十分なマーカー部位を露出させることができる。
【０５６７】
標識試薬は、様々な常法技術のいずれかを用いて液体（例えば、水溶液）として調製することができる。例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は水溶液とすることができる。結合相手は、所望により、組織表面の検出可能な視覚的変化またはその他の変化を生じさせることができるシグナル生成系の一員と結合させることができる。シグナル生成系としては、限定されるものではないが、蛍光系、発色系、発光系、磁気共鳴検出系、放射性核種系および超音波画像系が挙げられる。例えば、単一の蛍光標識を含む蛍光系を使用することができる。あるいは、酵素、基質、触媒およびエンハンサーを含む２以上の成分を含むその他の系も使用することができる。シグナル生成系の少なくとも１つの成分が結合相手と結合されている。あるいは、組織マーカーに特異的な一次抗体と標識された二次抗体を用いて、標識を組織マーカーに直接結合させることもできる。例えば、一次抗体はマウスＩｇＧであり得、標識された二次抗体はＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇＧ(Zymed)であり得る。
【０５６８】
特定の態様では、組織マーカーはまたはマーカーは乳管の上皮内層に特徴的な抗原部位またはエピトープ部位である。上皮内層は一般に、一般的に通常の免疫組織化学的標識試薬および技術を用いて上手く標識できるに十分、管の開口部領域から内部へ長く伸びている。組織マーカーの例としては、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチン指標分子により定義される抗原およびエピトープが挙げられる。他の乳房上皮組織マーカーとしては、サイトケラチン８およびサイトケラチン１８など、上皮細胞質内層に存在するサイトケラチン；ならびにＥカドヘリンおよび上皮膜抗原（ＥＭＡ）など、膜内層に存在する分子、および例えばMoll et al., Cell 30:11−19 (1982); Gown and Vogel, Am. J. Pathol., 114:309−321 (1984);およびJohnson, Cencer Metastasis Rev., 10:11−22 (1991)に記載されている他のものが挙げられる。
【０５６９】
ｉｉｉ．洗浄液
洗浄液は一般に、生理食塩水と例えば、麻酔薬、膠質浸透圧剤、浸透圧剤、オキシトシン、プロラクチン、防腐剤、管口拡張剤、血管拡張剤、血管収縮剤、筋弛緩剤、筋肉収縮剤、抗虚血剤、β遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、管口を除く表面をマークするための色素または染色剤、管口の周囲をマークするための色素または染色剤、および管口をマークするための色素または染色剤などの１以上の任意選択の成分を含む。洗浄液はまた所望により１以上の気体（例えば、空気および／または窒素）も含み得る。気体の存在は細胞および体液の回復を高めるのに役立つと考えられる。この気体は、加圧容器からの気体の導入を含む様々な標準的方法のいずれによって洗浄液に導入してもよい。
【０５７０】
母乳分泌刺激剤は、授乳中の女性において母乳分泌を刺激し得るいずれかの薬剤である。例えば、薬剤を、非授乳中の女性の乳頭表面および乳房に塗布すると、乳管からの採取可能な乳管液を増やす働きをすると考えられている。母乳分泌刺激剤は、限定されるものではないが、次の１以上のものが挙げられる：オキシトシン、プロラクチンおよびそれらの組合せ。
【０５７１】
表面の非管口領域をマークするための色素または染色剤は、管口を除いて表面の非管口領域を同定することができるいずれかの薬剤である。
【０５７２】
管口の周囲領域をマークするための色素または染色剤は、１以上の管口を取り巻く環または領域を同定することができるいずれかの薬剤である。
【０５７３】
管口をマークするための色素または染色剤は、表面の他の領域を除いて管口をマークすることができるいずれかの薬剤である。管口をマークするための色素または染色剤としては、限定されるものではないが、蛍光タグを有する１以上のケラチンリガンドが挙げられる。実際に、ケラチンリガンドは管口部でケラチンプラグと結合し、その管口部には蛍光タグが見られるが、表面の非角質化領域には見られない。
【０５７４】
得られた管洗浄液サンプルは、管の内層に由来する上皮細胞、管内に存在する通常は分泌される、また分泌されない液体、ならびにタンパク質、ペプチド、核酸分子、および同定される疾病または他の問題に応答して管内に分泌される、またはそうでなければ放出され得る他の化学種を含み得る。乳管に関連して、終末乳管小葉単位からの物質、ならびに洗浄液の浸透の深さおよび管系へ導入される液体がその管系内で液体と物質を混合した後に回収される程度にもよるが、乳頭表面に近接する乳管部分に接近する管路内の深くに存在する物質も洗浄法で採取することができる。管系としては、終末乳管小葉単位、および管系と接続しているか、または管系に流入して、乳頭表面で接近する主乳管に至る従属管路を含む。
【０５７５】
３．尿サンプルの採取
尿は当技術分野で公知の、または本明細書で開示される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法に従って検査し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子などの分析物の存在に関してスクリーニングすることができ、これを全般的な健康、癌または分娩などの健康問題の指標として用いることができる。
【０５７６】
ａ．サンプルの取扱い
尿サンプルは当技術分野で公知の様々な技術のいずれを用いて得てもよい。例えば、対象がサンプル容器に排尿することによりサンプルを採取することができ、膀胱内に導入したカテーテルからサンプルを採取することができ、または容器に採取する必要なく、尿流に試験デバイスを接触させることによりサンプルを得ることができる。
【０５７７】
尿サンプルはサンプル容器からのプール採取であってもよいし、または尿流からのサンプルであってもよい。プールサンプルまたは尿流サンプルはいずれも、全排尿からの尿または排尿の一部だけを含んでもよい。排尿の一部は、当技術分野で公知のように、種々の試験目的で、当技術分野で公知の方法により分離することができる。例えば、排尿の最初の部分を採れば、排尿初期の部分が含まれる。当業者の望む目的によって、サンプルは最初の採尿を含んでもよいし、または最初の採尿を含まなくてもよい。
【０５７８】
尿サンプルは対象からいずれに時間に採取してもよい。一般に、サンプルは直近の排尿から少なくとも１時間後または約１時間後に採取される。サンプルは直近の排尿から少なくとも２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、または約２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後またはそれ以上の後に採取することができる。一例では、採取されるサンプルは朝一番の排尿である。カテーテルから採取されるサンプルは、採尿バッグから採取される貯留排尿であってもよいし、または膀胱からの排尿流としてカテーテルから採取される新鮮な排尿であってもよい。サンプル容量は実施する試験の種類および数によって異なり、１００マイクロリットル以下といった少量から５０ミリリットル以上までの範囲であり得る。
【０５７９】
サンプルは当技術分野で公知の様々な容器のいずれに保存してもよい。一般に、容器は、サンプルの漏れおよびサンプルの汚染を防ぐ液体不透性シールを形成することができ、かつ、所望により滅菌することができるプラスチック（例えば、ポリプロピレンまたはポリエチレン）容器である。いくつかの態様では、この容器はポリプロピレンまたはポリエチレンなど、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が接着しない物質からなる。他の態様では、ガラス、ポリカーボネートまたはポリスチレンなど、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が接着する物質からなっていてもよく、このような態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のアッセイはこの容器内で実施することができる。一例としての容器では、米国特許第５，８９７，８４０号に開示されているものなど、残りのサンプルを汚染することなくサンプルの一部を使用することができる容器にサンプルを保存することができる。
【０５８０】
サンプルは室温、室温より低い温度（４℃など）で保存することができるし、または凍結させること、および凍結より低い温度（−２０℃または−７０℃など）で保存することもできる。
【０５８１】
一般に、本明細書に記載の垂直流動アッセイ法において用いられる尿サンプルは採取直後、採取後０．５時間以内、１時間以内、２時間以内、４時間以内、８時間以内もしくは１２時間以内、または採取後約０．５時間以内、約１時間以内、約２時間以内、約４時間以内、約８時間以内または約１２時間以内に試験される。一般に、本明細書に記載のもの（例えば、ドットブロット法、水平流動法およびウエスタンブロット法）を含む他のアッセイ法で用いられ、室温で保存することができる尿サンプルは、採取直後、採取後０．５時間内または約０．５時間以内、１時間以内、２時間以内、４時間以内、８時間以内もしくは１２時間以内、または採取後約１時間以内、約２時間以内、約４時間以内、約８時間以内もしくは約１２時間以内に試験することができる。室温より低い温度（４℃など）で保存されるサンプルは、採取直後、採取後０．５時間以内または約０．５時間以内、採取後１時間以内、２時間以内、４時間以内、８時間以内もしくは１２時間以内、または約１時間以内、約２時間以内、約４時間以内、約８時間以内もしくは約１２時間以内、またはそれ以降、例えば、採取後１日、採取後３日、採取後１週間、またはそれ以降に試験することができる。当業者ならば、アッセイ法に基づき、その尿サンプルが狭い時間枠で（例えば、採取後１２時間以内）試験しなければならないかどうかを経験的に決定することができる。
【０５８２】
サンプルを凍結させる場合には、液体凍結に関して当技術分野で公知のいずれの方法によって凍結させてもよい。例えば、サンプルは、サンプルを−５℃以下の容器内に１時間以上置くことにより凍結させることができる。一般に、サンプルは、−２０℃、−５０℃、−７０℃またはそれより低い温度で冷凍庫などの容器内に置く。当業者ならば、サンプルを凍結させるための、サンプルを凍結させるのに必要な時間は、サンプルを置く容器の温度を引き下げれば短くなることが分かるであろう。凍結後、サンプルは、尿サンプルの凍結を維持する温度以下で保存することができる。一般に、保存温度は−５℃、−２０℃、−５０℃、−７０℃、または約−５℃、約−２０℃、約−５０℃、約−７０℃またはそれより低い温度である。凍結サンプルは採取後１週間、採取後２週間、採取後１か月、採取後２か月、採取後３か月、採取後４か月、採取後５か月、採取後６か月、または採取後約１週間、採取後約２週間、採取後約１か月、採取後約２か月、採取後約３か月、採取後約４か月、採取後約５か月、採取後約６か月、またはそれより長く保存することができる。凍結サンプルは、室温またはそれより低い温度、例えば４℃などを含む様々な温度で解凍することができる。凍結サンプルは一般に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関してサンプルを分析する前に完全に解凍する。凍結サンプルが受ける凍結／解凍は通常３回以下である。一般に、凍結サンプルが受ける凍結／解凍は１回のみである（すなわち、凍結サンプルを解凍して試験し、解凍して再凍結し、再解凍して試験することはしない）。
【０５８３】
一般に、本明細書に記載の他のアッセイ法（水平流動法、ドットブロット法、ウエスタンブロット法など）で用いられる尿サンプルが使用可能である。
【０５８４】
ｂ．サンプル条件の改変
尿サンプルは「無処理」（すなわち、さらなる試薬を添加しない）で使用することもできるし、あるいは保存剤、または当技術分野で公知のプロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤など、サンプルの分解を阻害するまたは化合物などの１以上の試薬を加えたものであってもよい（例えば、０．０５ＭＴｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニン、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する抗プロテアーゼバッファー（ＡＰＢ）などのバッファーで希釈することによる）。１以上の試薬の添加は、限定されるものではないが、サンプルと試薬の直接混合、透析、希釈、濾過およびバッファー交換を含む様々な条件改変法のいずれによって行ってもよい。サンプル条件を改変する場合、改変はサンプル採取の際、サンプル分析の際、またはその間の時間に行うことができる。サンプルを凍結させる場合には、サンプル条件の改変はサンプルを凍結させる前、サンプルを凍結させる際、サンプルを解凍する際、またはサンプルを解凍させた後に行うことができる。
【０５８５】
尿サンプルは対象ごと、または同じ対象のサンプルごとに異なり得る。サンプル条件の改変によりこれらのばらつきに取り組むことができる。サンプルのばらつきに取り組むために、当技術分野で公知の様々な試薬および方法のいずれかを用いてサンプルの改変を行うことができる。一般に、条件変更（例えば、透析）のための希釈液または液体は蒸留水または１以上の化合物の水溶液である。一例では、条件変更のための希釈液または液体はＡＰＢバッファー：０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍｍ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニン、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０５８６】
ｉ．イオン強度
ＡＰＢなどのバッファーによるサンプル条件の改変の結果、非改変サンプルのイオン強度およびＡＰＢバッファーに応じて、サンプルのイオン強度が変わる。条件改変の量が増すほど、サンプルのイオン強度は希釈液または液体交換バッファーのイオン強度はますます近似してくる。
【０５８７】
サンプルを癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的な結合相手と接触させることにより癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を調べるサンプルは、イオン強度が異なれば異なる試験結果を生じ得る。例えば、イオン強度が低いと、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的な結合相手と容易に結合することができるが、イオン強度が低ければ、非癌胎児性フィブロネクチン分子などの他のバックグラウンド物質もこのような結合相手と結合することができるので、偽陽性結果を生じる可能性がある。イオン強度が高いと、非癌胎児性フィブロネクチン分子は癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的な結合相手と容易には結合しないが、癌胎児性フィブロネクチン指標分子もこのような結合相手と強い結合（検出可能な結合）ができないので、偽陰性結果が生じる可能性がある。癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の特異的結合を可能とし、同時にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に対する非癌胎児性フィブロネクチン分子などのバックグラウンド物質の結合を抑制する中間的なイオン強度を選択することができる。
【０５８８】
尿サンプルはイオン強度を変更することができる。このような方法では、サンプル条件の改変を行わない無処理サンプルを使用すれば、偽陽性または偽陰性シグナルのいずれかを生じる可能性がある。尿サンプル条件をＡＰＢなどバッファーで改変すれば、幅広く異なる尿サンプルからのイオン強度は、特異的結合相手の結合を可能とし（偽陰性結果を少なくする）、同時に非特異的結合を抑制する（偽陽性結果を少なくする）ように決定した中間的なイオン強度に近づけることができる。よって、尿サンプルの条件を適当なバッファーで改変することで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法の信頼性を高めることができる。
【０５８９】
サンプルは、サンプルと改変する物質の様々な比率のいずれを用いて改変してもよい。サンプルにバッファーを加えるとき、癌胎児性フィブロネクチン指標分子などのサンプル成分を過度に希釈することなく所望のイオン強度が達成されるようにバッファーを加えることができる。当業者ならば、所望のイオン強度またはその範囲、サンプルのイオン強度、サンプルに加える試薬、およびサンプル成分の濃度に従って、所望の希釈率を決定することができる。いくつかの態様では、所望のイオン強度またはイオン強度範囲に到達するように最少量の試薬を加え、これにより最少量のサンプル希釈とする。他の態様では、ほとんどの、または全ての尿サンプルを所望のイオン強度またはイオン強度範囲に調整するために使用可能な希釈率および試薬を選択することができる。典型的な希釈率としては、１：１．５（希釈前の容量：希釈後の容量）、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、約１：１．５、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１２、約１：１５および約１：２０である。典型的な希釈率は１：４である。
【０５９０】
一態様では、尿サンプルに加える試薬は、改変ＡＰＢバッファーなどのバッファー溶液である。一般に、バッファー溶液のイオン強度の主因は塩であり得、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＢｒ、ＫＢｒなどの一価の塩、ならびに当技術分野で公知の様々な他の塩が挙げられる。塩濃度は、尿に加えた際に所望のイオン強度を達成する様々な濃度のいずれであってもよい。塩濃度範囲の例としては、５０ｍＭ〜３５０ｍＭ、１００ｍＭ〜２５０ｍＭ、または１５０ｍＭが挙げられる。塩濃度範囲のさらなる例としては、約５０ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、または約１５０ｍＭが挙げられる。このようなバッファー溶液は、限定されるものではないが、バッファー化合物（例えば、Ｔｒｉｓまたはリン酸塩）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦまたはアプロチニン）、洗剤（例えば、ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、その他の安定剤（例えば、ＰＥＧまたはＢＳＡ）、またはそれらの組合せを含む、様々な付加的成分含み得る。一例では、バッファー溶液は、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニン、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含み得る。
【０５９１】
ｉｉ．イオン強度試験
一般に、尿中の主要なイオン成分は塩化ナトリウムである。ナトリウム、クロライドのいずれか、またはその双方濃度、あるいは総イオン強度は、試験ストリップ、ガラス膜電極、伝導率の測定、原子吸収、レーザー誘導蛍光またはＸ線蛍光の使用を含む当技術分野で公知の様々な試験法を用いて測定することができる。イオン組成試験の結果は、尿サンプルのイオン強度を直接測定するものであってもよいし、または近似値を求めるものであってもよい。尿サンプルのイオン強度が最大許容量よりも高ければ、そのイオン強度測定値を用いて、分析前にそのサンプルにおいて選択されたイオン強度を達成するために必要な希釈の最少量、または分析前にそのサンプルにおいて選択されたイオン強度を達成するために必要な液体交換（例えば、透析）の最少量を算出することができる。尿サンプルのイオン強度が最小許容量よりも低ければ、そのイオン強度測定値を用いて、分析前にそのサンプルにおいて選択されたイオン強度を達成するために尿に加える塩溶液または固体塩の最少量、または分析前にそのサンプルにおいて選択されたイオン強度を達成するための液体交換（例えば、透析）の最少量を算出することができる。当業者が認識しているように、結合相手を癌胎児性フィブロネクチン指標分子に結合させるために選択されるイオン強度はある範囲のイオン強度を含み、結合相手の性質を含む様々な因子に基づいて変更することができる。一般に、結合アッセイのために選択されるイオン強度の範囲は５０μ〜５００μ、７５μ〜４００μ、１００μ〜３００μ、多くの場合には１５０μ〜２５０μである。あるいは、結合アッセイのために選択されるイオン強度の範囲は約５０μ〜約５００μ、約７５μ〜約４００μ、約１００μ〜約３００μ、多くの場合には約１５０μ〜約２５０μである。
【０５９２】
ｉｉｉ．ノーマライゼーション
尿の成分の濃度は、尿サンプルごとに、尿サンプルの条件改変（例えば、希釈または透析）および対象の排尿の頻度を含む様々な因子の関数として異なり得る。いくつかの方法の１つを用いて、尿サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子などの分析物の、サンプルばらつきによらない濃度を概算することができ、ここで、この概算濃度はサンプル間のばらつきの感度が低い。サンプル間のばらつきによらない濃度を概算するこのような方法をノーマライゼーションと呼ぶ。
【０５９３】
ノーマライゼーションは当技術分野で公知の、または本明細書で提供される様々な方法のいずれを用いて行ってもよい。尿サンプルのノーマライゼーションの１つの方法は、目的の分析物（癌胎児性フィブロネクチン指標分子）と一般に一定の割合で尿に流入する第二の分析物の濃度を測定するものである。当技術分野では、様々な一定流入分析物が公知である。このような分析物の一例がクレアチニンであり、定常状態で尿に流入する。このクレアチニンの濃度を用いて尿中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度をノーマライズすることができる。米国特許第５，８０４，４５２号および同第６，４３６，７２１後に例示されているように、様々な異なるノーマライゼーション法が当技術分野で公知である。
【０５９４】
ｃ．サンプルの処理
ｉ．非特異的結合
尿サンプルは、尿サンプルを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出することができる分子と接触させる前に、１以上の非特異的結合化合物または１以上の非特異的結合剤と接触させることができる。
【０５９５】
非特異的結合化合物は、サンプル中の少量（例えば、１０％未満）を超える癌胎児性フィブロネクチン指標分子化合物とは結合することなく、サンプル中のバックグラウンド物質の少なくとも一部と結合する化合物である。一般に、非特異的結合化合物は、その非特異的結合化合物が癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合するよりも容易にバックグラウンド物質と結合する。使用可能な非特異的結合化合物としては、非特異的結合タンパク質が挙げられる。非特異的結合タンパク質は一般に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびウマ血清アルブミンなどのアルブミン；ならびにオボアルブミン、フィブリノゲン、トロンビン、トランスフェリン、糖タンパク質、カゼイン、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的でない抗体および他のタンパク質などの他のタンパク質を含む水溶性タンパク質である。非特異的結合タンパク質はまた、例えば、リシン、グルタミン酸、アラニン、ヒスチジン、メチオニンおよびプロリンなどの１以上のアミノ酸のポリマーといった水溶性ポリアミノ酸を含み得る。非特異的結合表面に使用可能なタンパク質の例としては、ＢＳＡ、メチル化ＢＳＡまたはマウス抗ＭＨＣ−１抗体（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  Ｗ６３２）もしくはマウスＩｇＧなどの抗体が挙げられる。非特異的結合化合物はまた、ウシ胎児血清などの血清、ゼラチンおよび乾燥乳を含むタンパク質含有組成物も含み得る。
【０５９６】
非特異的結合剤としては、１以上の成分を含み得る固体構造である非特異的結合表面が挙げられ、ここで、この非特異的結合表面は、サンプル中の少量（例えば、１０％未満）を超える癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合することなく、サンプル中のバックグラウンド物質の少なくとも一部と結合する。一般に、非特異的結合化合物は、その非特異的結合化合物が癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合するよりも容易にバックグラウンド物質と結合する。非特異的結合表面のための固体支持体の例としては、紙およびセルロース誘導体（セルロースエステルおよびエーテルなど）、天然および合成高分子物質（ラテックス、ビニルポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレンおよび部分的に加水分解された誘導体、重縮合物、共重合体および無機物質など）が挙げられる。一態様では、非特異的結合表面は、試験ストリップに沿って液体サンプルを送ることができる多孔性または吸水性部材である。使用可能な非特異的結合表面としては、限定されるものではないが、アルブミン（ウシ血清アルブミン、またはＢＳＡを含む）、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的でない抗体および本明細書に示される、または当技術分野で公知の他のものなど、その上に１以上の非特異的結合タンパク質が固定されている固体支持体が挙げられる。非特異的結合表面に使用可能なタンパク質の例としては、ＢＳＡ、メチル化ＢＳＡまたはＷ６３２もしくはマウスＩｇＧなどの抗体が挙げられる。一例では、非特異的結合表面は、その上にメチル化ＢＳＡが固定されているニトロセルロース膜であり得る。
【０５９７】
ｉｉ．濾過
尿サンプルはまた、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出する前にバックグラウンド物質の少なくとも一部を除去するために濾過することができる。使用可能なフィルターは、尿サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子と少量（１０％未満）を超えては結合することのない低タンパク質結合フィルターである。一般に、本明細書で提供される方法で用いられるフィルターは、その非特異的結合化合物が癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合するよりも容易にバックグラウンド物質と結合する。低タンパク質結合フィルターの例としては、ポリエステル、ポリウレタン、繊維ガラス、ポリアセテート、ポリビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、セルロース、セルロースアセテート、セルロース混合エステルおよびその親水性修飾物が挙げられる。低タンパク質結合フィルターの一例は、セルロースアセテートである。この繊維の孔径は癌胎児性フィブロネクチン指標分子を通過させるに十分大きく、バックグラウンド物質の少なくとも一部の通過を妨げるに十分小さいものであり得る。フィルター孔径は２０μｍ〜０．０１μｍ、１０μｍ〜０．０２μｍ、５μｍ〜０．０５μｍ、１μｍ〜０．１μｍおよび０．５μｍ〜０．２μｍの範囲であり得る。フィルター例としては、孔径０．２μｍである。
【０５９８】
４．間質液
間質液もまた採取して、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を試験することができる。間質液は組織細胞間の空間にある液体であり、体重の約１６％を占め得る。間質液は、その成分の１つとして癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る。正常な間質液は癌胎児性フィブロネクチンを含まないか、または少量の癌胎児性フィブロネクチンしか含まないので、間質液サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象における癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題の存在を示し得る。間質液は、当技術分野で周知のように、身体の様々な場所から採取することができる。一態様では、間質液は、検査下の組織もしくは臓器から、またはそれに隣接する組織から採取することができる。例えば、消化管内またはその近傍の領域もしくは臓器が検査下にある場合（例えば、大腸、前立腺、胃、または胆嚢）、その領域もしくは臓器、またはその領域もしくは臓器に隣接する組織の上皮から間質液を採取することができる（例えば、前立腺のモニタリングのためには、前立腺に隣接する結腸領域から間質液を採取することができる）。別の態様では、皮膚またはいくつかの遠位領域または臓器が検査下にあるかどうかにかかわらず、間質液は皮膚から採取することができる。例えば、皮膚の間質液は、乳房または子宮頸または甲状腺の新生物を示す癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含み得る。皮膚の皮層はコラーゲン繊維と、その繊維と細胞の間の空間に間質液を含む。対象の皮層から、または身体の他の場所から採取される間質液は、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を調べるために使用することができる。
【０５９９】
間質液サンプルは、限定されるものではないが、皮膚穿刺吸引（例えば、米国特許第６，７０２，７９１号、同第５，８２３，９７３号および同第５，５８２，１８４号参照）を含む穿刺吸引、マイクロポレーション（例えば、米国特許第６，５０８，７８５号参照）、超音波抽出（例えば、米国特許第６，５８９，１７３号参照）、経皮抽出（例えば、米国特許第４，５９５，０１１号参照）、イオン泳動（例えば、米国特許第６，４９６，７２８号；同第５，９８９，４０９号；同第５，３６２，３０７号および同第５，２７９，５４３号参照）、微小水疱採取などの水疱採取（例えば、米国特許第６，３３４，８５１号参照）、マイクロブレードまたはマイクロニードルアレイ抽出（例えば、米国特許第６，５６２，０１４号参照）、細胞浸透増強採取（例えば、米国特許第６，５０３，１９８号参照）および当技術分野で公知の他の様々な方法といった、当技術分野で公知の様々な方法により採取することができる。
【０６００】
一態様では、間質液サンプルは、間質液サンプルが採取される領域または臓器の外層、一般に上皮に、間質液が流入可能な皮下針などの器具を穿通させることにより採取することができる。皮下針などの媒体は、上皮細胞などの領域または臓器の最外部中および／または最外部を経て、領域または臓器の、間質液が存在する部分へと穿痛させることができる。穿通の深さは、当業者に知られているように、検査する領域または臓器の組織種および場所によって異なる。目的の領域または臓器を穿通する媒体は、その媒体の物理的完全性を保持しつつ、比較的容易に組織または臓器に穿通するに十分小さい外径と間質液をその媒体に通すに十分大きい内径を有する。例えば、２８〜３２ゲージまたは約２８〜約３２ゲージ（外径３６０ミクロン〜外径２３０ミクロン）の針が使用でき、一般に、２９または３０ゲージの針が用いられる。場合よっては、媒体は、バキューム装置またはプランジャーが手動により、または機械的に引き抜けるシリンジなどの負圧デバイスに作動可能なように取り付けることができる。米国特許第６，７０２，７９１号、同第６，６２４，８８２号、同第５，８２３，９７３号および同第５，５８２，１８４号に例示されているように、目的の領域または臓器に穿通させることによって間質液を採取するための様々な装置および方法が当技術分野で公知である。
【０６０１】
媒体で間質液を採取する一例では、皮膚から間質液を採取することができる。針などの媒体は、表皮の外層（解質層として知られる）を通り抜けることができ、皮膚の皮層は通り抜けない。解質層を通り抜けた後、間質液が媒体内に流入するか、または媒体内に抜き取ることができる。針などの媒体が皮膚に挿入される深さは、解質層を穿通するに十分深く、一般に、皮層を通り抜ける、また、皮下層を穿通するほどの深さではない。解質層は一般に１０〜１５ミクロンまたは約１０〜１５ミクロンの厚さであり、残りの表皮は一般に８０ミクロンまたは約８０ミクロンの厚さである。真皮は約２，０００〜３，０００ミクロンの厚さである。当業者に認識されているように、このような寸法は個人間で、また、サンプルが採取される皮膚の身体部位によっていくらか異なる。針などの媒体は、一般に、５０〜２，５００ミクロンまたは約５０〜２，５００ミクロン、多くの場合には、７００〜１，５００ミクロンまたは約７００〜１，５００ミクロンの深さで皮膚に挿入される。皮膚に穿通する媒体は、その媒体の物理的完全性を保持しつつ、最小の痛みで比較的容易に解質層を通り抜けるに十分小さい外径と間質液をその媒体に通すに十分大きい内径を有する。
【０６０２】
別の態様では、間質液サンプルは、ブレードまたはニードルのマイクロアレイを用いて臓器の上皮または皮膚の解質層などの目的領域または臓器へ穿通させることによって採取することができる。このようなマイクロアレイは、組織または臓器内に間質液が通過できる流路を設けるため、または間質液が通過できる媒体を提供するために目的組織または臓器に適用することができる。例えば、ブレードマイクロアレイは、解質層に間質液が通過できる流路を設けるために皮膚に適用することができる。マイクロブレードまたはマイクロニードルアレイは、目的領域または臓器上に間質液採取のための複数の場所を設けることができる。マイクロブレードまたはマイクロニードル各々が挿入される深さは、目的領域または臓器の間質液を含む領域に穿通するに十分な深さである。例えば、間質液サンプルが皮膚から採取される場合、マイクロブレードまたはマイクロニードルの各々が皮膚に挿入される深さは、解質層を穿通するには十分な深さであるが、一般に、皮層を通り抜け、皮下層に穿通するほどの深さではない。構成の一例では、マイクロブレードまたはニードルは各々、外径１〜５０ミクロンまたは約１〜５０ミクロン、長さ５０〜５００ミクロンまたは約５０〜５００ミクロンであり、隣接するマイクロニードルまたはマイクロブレードと５０〜１０００ミクロンまたは約５０〜１０００ミクロン離れている。マイクロブレードまたはマイクロニードルは、所望により、穿通組織からの間質液流量を高めるための装置または化合物と作動可能なように組み合わせることができる。例えば、マイクロニードルまたはマイクロブレードアレイを、バキューム装置などの負圧デバイスと組み合わせることができる。別の例では、マイクロブレードアレイまたはマイクロニードルアレイを、対象から間質液を毛管作用および／または浸透圧により抜き取ることができる吸収パッドと組み合わせることができる。米国特許第６，６６３，６１２号、同第６，５６２，０１４号および同第６，３１２，６１２号に例示されているように、このような間質液採取用アレイを用いるための様々なマイクロブレードおよびマイクロニードルアレイおよび方法が当技術分野で公知である。
【０６０３】
別の態様では、間質液サンプルは、水疱を形成させ、その水疱中の間質液を採集することにより採取することができる。間質液は水疱の主成分であり得る。水疱は吸引法および加熱法を含む当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって形成させることができる。例えば、皮膚に２００ｍｍＨｇまたは約２００ｍｍＨｇの負圧を１時間または約１時間かけると水疱ができる。吸引水疱中の液体は、限定されるものではないが、皮下針による吸引などの様々な方法のいずれかを用いて採取することができる。別の例では、熱を用いて水疱を形成させることができる。例えば、レーザーエネルギー吸収物質を対象の皮膚に載せ、皮膚にレーザーエネルギーを当てると小胞が生じる。吸収物質の位置およびレーザーエネルギーの量は、微小水疱だけを生じさせるように制御することができる。熱水疱中の液体は、皮下針による吸引(aspiration)などの様々な方法のいずれかを用いて採取することができる。米国特許第６，４０９，６７９号、同第６，３８７，０５９号および同第６，３３４，８５１号に例示されているように、水疱形成とその水疱からの間質液採取のための様々な装置および方法が当技術分野で公知である。
【０６０４】
別の態様では、間質液サンプルは超音波抽出により採取することができる。皮膚などの組織を超音波で処理すると組織を透過性とすることができ、その処理領域は処理後３０分または約３０分から処理後１０時間または約１０時間まで透過性を維持し得る。処理されたこの透過性領域から、限定されるものではないが、負圧の適用、その領域に界面活性剤または有機溶媒を接触させること、その領域に浸透圧を発生する組成物を接触させること、その領域に超音波カップリング媒体を接触させること、および電流の適用を含む様々な化学的および／または物理的方法のいずれかにより間質液を採取することができる。間質液は、バッファー、膏薬、ゲル、または処理された透過性領域と接触する他の組成物中に採取することができる。超音波は、大腸など、検査下の領域または臓器に直接適用することもできるし、または前立腺を検査する場合には、前立腺に隣接する大腸領域など、検査下の領域または臓器に隣接する領域に適用することもできる。また、超音波は皮膚に適用することもできる。米国特許第６，６２０，１２３号、同第６，５０８，７８５号および同第６，１９０，３１５号に例示されているように、超音波を用いて間質液を採取するための様々な装置および方法が当技術分野で公知である。
【０６０５】
別の態様では、間質液サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、電気的採集により採取することができる。電気的採集では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子などの物質は、電場をかけると膜上に拡散する。電気的採集を用いて間質液(intersitial fluid)内の物質を採取することができる。電気的採集は、組織に電流を通じて１以上の採取媒体または採取組成物（例えば、間質液の成分を吸収することができるバッファー、ゲル、膏薬またはクリーム）中に物質を抽出することにより行うことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子サンプルは、対象の組織表面に、物質または代謝産物をその組織表面上の採取部位において組織表面直下から所定の採取部位へと、または採取媒体へと移動させるのに十分な強度および時間の電気エネルギーをかけることにより、採取することができる。これらの方法はイオン泳動として知られる方法を含むが、このイオン泳動とは、組織を介して生物体の外部から荷電を持っていない非イオン性物質および陽イオンまたは陰イオンを駆動する処理方法である。通常のイオン泳動では、２つの電極を組織と接触させて置く。これらの電極の一方または両方は、抽出された物質を採取するためにサンプリングチャンバー／採取リザーバー内にあり、この２つの電極間に電圧をかける。サンプリングチャンバー／採取リザーバーは送られてきた物質の採取器として働くように組織表面に設ける。例えば、電気泳動、電気浸透、またはエレクトロポレーションなどにより間質液の成分の採取をもたらすイオン泳動のような当技術分野で公知の方法はいずれも、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含むサンプルを採取するために使用することができる。電気的採集は一般に、検査下の領域もしくは臓器、またはそれに隣接する領域に電場をかけることにより行うことができる。例えば、皮膚に電場をかけることができる。サンプルが採集される組織にかける電場は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子などの分析物がそれに沿って移動し得るいずれの電場でもよい。電場の例としては、直流、パルス直流、およびＡＣ電流などの電極が交互する電流が挙げられる。米国特許第６，４９６，７２８号、同第６，０２３，６２９号および同第５，９８９，４０９号に例示されているように、電気的採集により間質液から癌胎児性フィブロネクチン指標分子を採取するための様々な装置および方法が当技術分野で公知である。
【０６０６】
別の態様では、間質液サンプルは透過性増強化合物を用いて採取することができる。透過性増強化合物は膜、細胞または組織の透過性を高め、間質液、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子などの選択されるその成分を、膜、細胞または組織から間質液または成分が採取可能な場所まで通過させる働きをし得る。透過性増強化合物は一般に、透過性が増強される表面と接触させ、間質液の１以上の成分にその接触面を通過させることにより働く。様々な透過性増強化合物が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、水性高張液；プロピレングリコール、ジメチルスルホキシドまたはイソプロピルアルコールなどの有機溶媒を含有する溶液；コール酸ナトリウムを含む胆汁酸塩などの有機塩；陽イオン洗剤、陰イオン洗剤、非イオン洗剤および両性イオン洗剤を含む洗剤などの界面活性剤；Ｎ−メチル−ピロリドンを含むピロリドンなどの有機化合物が挙げられる。透過性化合物は液体であっても固体であってもよいが、透過性化合物が固体である場合には、この固体は一般に溶媒に溶解させる。透過性増強化合物が目的の表面に直接塗布することもできるし、あるいは膏薬、クリーム、ゲルなどの組成物として、または吸収パッドとして適用することもできる。一例では、透過性化合物は、サンプルが採取される対象の皮膚に貼付することができる経皮パッチの成分とすることができる。米国特許第６，５０３，１９８号、同第６，４９２，１８０号、同第５，４３８，９８４号、同第５，１３９，０２３号、同第４，９６０，４６７号、同第４，７４６，５０８号および同第４，５９５，０１１号に例示されているように、透過性増強化合物を用いて間質液の成分を採取するための様々な装置および方法が当技術分野で公知である。
【０６０７】
別の態様では、間質液サンプルは、電磁線により媒介される透過法により採取することができる。膜、細胞または組織の電磁線照射により、照射領域にアブレーションまたは微小孔の形成が起こる。電磁線照射は、光化学的、光熱的および写真製版的アブレーションを含む様々な機構によりアブレーションまたは微小孔形成を引き起こす。光化学的アブレーションは、膜もしくは組織もしくは細胞外マトリックスの破壊をもたらす原子結合の解離および／または形成により生じる。光熱的アブレーションは、膜もしくは組織もしくは細胞外マトリックスの変性、または膜もしくは組織もしくは細胞外マトリックス内で水蒸気の形成（これにより、膜、組織または細胞外マトリックスの破壊を起こす圧力が形成される）をもたらし得る熱の吸収により生じる。写真製版的アブレーションは、例えば、熱が拡散してしまうより短い時間で電磁線パルスを送り、これにより処理表面の圧縮、伸展および／または反動による機械的応力を発生させることにより、吸収表面上に機械的応力をかけるような方式での電磁エネルギーの吸収により生じる。当業者ならば、波長、強度、パルス持続時間、パルス周波数およびビームサイズなど、電磁線の変数を制御することにより、送るエネルギーの量と種類および照射表面の位置および面積を制御することができる。またこのような制御により、当業者ならば、アブレーションまたはマイクロチャネル形成が光化学的、光熱的もしくは写真製版的機構、またはそれらの組合せにより達成される程度を選択することができる。またこのような制御により、当業者ならば、電磁線照射の結果としての微小孔またはアブレーションの大きさおよび深さを決定することができる。電磁線は例えば、強度および波長などの特定のレーザー特性、または軽便性または費用などの他の観点に従って選択可能な様々なレーザーの１つにより送達することができる。さらに、当技術分野で公知のように、色素などの１以上の電磁エネルギー吸収化合物を用いて、表面へのエネルギー移動を補助する、またはさらに制御することができる。電磁線による微小孔形成またはアブレーションにより、間質液は処理された領域、膜または組織を通過することができる。身体の様々ないずれの組織または臓器でも電磁線で処理して微小孔を形成する、またはアブレーション組織とすることができる。一例では、皮膚の解質層は、間質液が通過できる微小孔を内部に形成させることができ；同様に、解質層および表皮から真皮へ通る微小孔を形成させることもできる。一般に、微小孔形成またはアブレーションは、周囲組織に有意な損傷を与えずに、または処置を受ける対象に不快感を与えずに、間質液を通過させるに十分なチャネルを形成させるように行われる。微小孔またはアブレーション組織のアレイもこのような方法を用いて容易に形成されることができる。電磁線照射(electromagentic irradiation)による微小孔形成またはアブレーションは、例えば、バキュームなどの負圧デバイスとの組合せを含む、間質液採集のための様々な方法のいずれかと組み合わせることができる。米国特許第６，６８５，６９９号、同第６，５０８，７８５号および同第６，３８７，０５９号に例示されているように、電磁線を用いた間質液採取のため���様々な装置および方法が当技術分野で公知である。
【０６０８】
同様の態様において、間質液サンプルは、プラズマ形成または微粒子衝撃の結果としての微小孔形成によって採取することができる。この場合のプラズマは、様々な荷電分子、原子または電子などの原子より小さい粒子のいずれかを意味する。プラズマは、例えば強力なレーザーからのパルスにより、皮膚表面などの標的領域または臓器の表面に形成することができる。荷電粒子は反応性が高く、プラズマの表層部位でアブレーションまたは微小孔形成を生じさせることができる。米国特許第６，３８７，０５９号および同第５，５８６，９８１号に例示されているように、微小孔形成またはアブレーション用のプラズマを用いて間質液を採取するための様々な装置および方法が当技術分野で公知である。微小孔またはアブレーションはまた、微粒子衝撃により生じさせることもできる。微粒子は、直径０．１ミクロン〜直径１００ミクロン、または直径約０．１ミクロン〜直径約１００ミクロンの範囲であり得る固体粒子である。微粒子は、固体の水（氷）または固体二酸化炭素（ドライアイス）から、酸化アルミニウムまたは酸化チタンのような不溶性無機化合物などの不溶性化合物、糖類、デンプンもしくは塩類などの可溶性化合物、または金、白金もしくはタングステンなどの金属まで、当技術分野で公知の様々な固体化合物または組成物のいずれからねっていてもよい。微粒子は検査下の領域または臓器の表面に向かって加速させることで微小孔を形成することができる。微粒子は、限定されるものではないが、圧縮ガス、放電、液体から気体への膨張（室温で気体へと膨張する液体ヘリウムなど）、負圧加速、または運動固体面との接触による運動量移行を含む当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用い、表面に向けて加速することができる。生じる微小孔の深さおよび大きさは使用する微粒子の大きさと重量、および微粒子の加速量の関数であり得る。一般に、形成される微小孔は、周囲組織に有意な損傷を与えずに、または処置を受ける対象に不快感を与えずに、間質液を通過させるチャネルを形成するのに十分な大きさである。例えば、微粒子により生じる微小孔は、直径１０ミクロン〜１０００ミクロン、または直径約１０ミクロン〜約１０００ミクロンの範囲であり得る。この微小孔の深さは採取する組織によって異なり、例えば、皮膚における微小孔は深さ５０〜２０００ミクロン、または約５０〜約２０００ミクロンであり得る。米国特許第６，７０６，０３２号および同第６，４８２，６０４号に例示されているように、微粒子衝撃を用いて間質液を採取するための様々な装置および方法が当技術分野で公知である。また、微小孔アレイも、プラズマアブレーションまたは微粒子衝撃を用いて容易に形成させることができる。プラズマまたは微粒子衝撃による微小孔形成は、例えば、バキュームなどの負圧デバイスとの組合せを含む、間質液採集のための様々な方法のいずれかと組み合わせることができる。
【０６０９】
上記の態様は、間質液または癌胎児性フィブロネクチン指標分子などのその成分を採取する際に組み合わせることができる。例えば、微粒子媒介マイクロポレーションは、サンプル採取の際に透過性増強化合物と組み合わせることができる。別の例では、例えば、超音波およびイオン泳動などの種々のマイクロポレーション法を組み合わせることができる。各態様に関する特許および米国特許第６，６９２，４５６号に記載されているように、上記の方法の多様なさらなる組合せが当技術分野で公知である。特に、間質液またはその成分の、採取可能な領域への流路を増強するための方法は、バキュームなどの負圧の適用、液体、ゲル、クリーム、膏薬、固体支持体（パッチなど）、または当技術分野で公知の間質液採取媒体または化合物を含む、間質液またはその成分を採取するための様々な方法のいずれかと組み合わせることができる。
【０６１０】
間質液または癌胎児性フィブロネクチン指標分子などのその成分を採取するための方法および装置は、サンプル処理および／または癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出の１以上の付加的工程と組み合わせて行うことができる。一態様では、サンプル採取デバイスを、非特異的結合相手を含有する組成物と組み合わせることができる。例えば、サンプルは、マイクロニードルアレイへのバキュームを組み合わせることによって採取することができ、このマイクロニードルアレイは非特異的結合相手を含有する組成物と液体連絡させることができる。例えば、このマイクロニードルアレイは、ＢＳＡなどの非特異的結合相手を含有するバッファーと液体連絡させることができる。別の例では、このマイクロニードルアレイは、非特異的結合相手を含有する固体支持体またはゲルと組み合わせることができる。本明細書の他所で示されたように、非特異的結合相手の様々な形式はいずれも、本明細書で提供される様々ないずれの間質液採取法およびそれらの組合せとも併用可能である。
【０６１１】
別の態様では、サンプル採取デバイスを、フィブロネクチン結合相手または癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含有する組成物と組み合わせることができる。例えば、サンプルは、マイクロポレーションの後に、透過性増強化合物を含有する経皮パッチを貼付することにより採取することができるが、この経皮パッチは、フィブロネクチン結合相手または癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含有する組成物をさらに含み得る。例えば、この経皮パッチは、金コロイドフィブロネクチン結合相手コンジュゲートを含有するバッファーを含み得る。別の例では、この経皮パッチは、固体支持体、または固体支持体に結合されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む固体支持体を含み得る。本明細書の他所で示されたように、フィブロネクチン結合相手または癌胎児性フィブロネクチン結合相手の様々な形式はいずれも、本明細書で提供される様々ないずれの間質液採取法およびそれらの組合せとも併用可能である。
【０６１２】
Ｆ．癌胎児性フィブロネクチンの検出方法
本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法が提供される。一般に、これらの方法は、対象由来のサンプルなどのサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するために用いられる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子と特異的に結合する自己抗体、またはそのフラグメントであり得る。サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法は、そのサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を決定するために使用することができ、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量または濃度を決定するために使用することができ、陽性結果が偽陽性であるかないかを決定するために使用することができ、また、検出された癌胎児性フィブロネクチン指標分子中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の範囲または組成を決定するために使用することができる。
【０６１３】
例えば、対象から採取される特定のサンプル種が一般に、正常な対象から採取した際に検出可能な量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含まない場合、このようなサンプルにおいていずれの量であれ癌胎児性フィブロネクチン指標分子が検出されれば、その対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題が存在することを示し得る。別の例では、対象から採取される特定のサンプル種が一般に、正常な対象から採取した際に基準量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、その基準量を超える量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が検出されれば、その対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題が存在することを示し得る。
【０６１４】
本明細書で開示される系および方法での使用が意図されるアッセイとしては、限定されるものではないが、タンパク質検出（イムノアッセイまたはその他の抗原結合に基づく検出を含む）；核酸検出（増幅および非増幅プロトコールを用いる方法を含む）；蛍光検出および発光検出などの比色的または分光光度的検出を含むアッセイ；または癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の結合を含むアッセイが挙げられる。本明細書で提供される方法で用いるには、シグナルを出すか、またはシグナルを生じさせることができる、または光検出器、γカウンターもしくは質量分析計などの検出器により検出可能な試験が意図される。いずれの波長も含めるものとする。
【０６１５】
本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチンの検出方法はいずれも、本明細書で提供される、または当技術分野で公知のサンプル採取法のいずれと組み合わせて用いてもよく、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の癌胎児性フィブロネクチン検出の指標または他の用途に関する情報を得ることができる。
【０６１６】
本明細書で提供される方法で使用可能なものとして、競合結合アッセイおよびサンドイッチアッセイを含む結合アッセイが挙げられる。当業者には明らかなように、本明細書で提供される方法および系は、様々な異なる指標のための様々なサンプル種に広く適用可能である。様々なプロトコールおよび標識を用いた、いくつかの異なる種類の結合アッセイがよく知られている。結合アッセイは単一の溶液中で行うこともできるし、あるいは結合相手を、アッセイを行う固体支持体に固定することもできる。サンドイッチアッセイも実施可能である。競合的アッセイも実施可能である。当業者に知られているように、これらの反応工程は同時に行うこともできるし、逐次行うこともできる。特定のレベルまたは割合を超える分析物レベルである場合にのみ陽性結果が得られる場合には閾値アッセイを行うことができる。アッセイ形式としては、限定されるものではないが、例えば、試験管内、膜上、ウェル内、マルチウェルプレート内、マイクロアレイ上、クロマトグラフィー試験ストリップ上で行うアッセイ、ならびにディップスティッ、水平流動、垂直流動、または遊走形式アッセイが挙げられる。
【０６１７】
アッセイ法はまた質量測定を含んでもよく、ここで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子、そのフラグメント、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となる他の化合物の質量は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示し得る。質量測定の一例が質量分析である。
【０６１８】
本明細書で提供されるアッセイ法はまた核酸分子増幅方法も含み、ここで、プライマーが癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）とハイブリダイズし、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの核酸合成法の基質として働き得る。
【０６１９】
本明細書で提供される検出法はまた１以上のサンプル操作法を含み得る。一例では、例えば、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の相対量を高める方法において、サンプル１以上の成分を分離または除去することができる。別の例では、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子をフラグメント化することができるフラグメンテーション化合物とサンプルを接触させることができる。
【０６２０】
一態様では、２以上の異なる結合相手を用いた、または２以上の異なる検出方法を用いた検出を用いて、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を確認することができる。また、２以上の異なる結合相手を用いた、または２以上の異なる検出方法を用いた癌胎児性フィブロネクチンの検出を用いて、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する領域および／または存在しない領域を決定することができる。サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の領域または組成の決定は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が産生された細胞または組織種、および／または癌胎児性フィブロネクチン指標分子が産生された可能性がる、または可能性がない細胞または組織種を同定するため、また、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンの結合活性または生化学活性（例えば、癌胎児性フィブロネクチンにＥＤＡが存在する場合、その癌胎児性フィブロネクチンはα9β1インテグリンと結合することができ、高い細胞拡散および移動特性を持ち得る、例えば、Manabe et al., J. Cell. Biol. 139:295−307 (1997)およびLiao et al., J. Biol. Chem. 277:14467−14474 (2002)参照）を示す、または同定するため、また、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または量が偽陽性となり得る場合を除外するためなど、様々な目的で使用することができる。
【０６２１】
様々な細胞種、組織種および腫瘍種が、ＥＤＡ、ＥＤＢ、およびＩＩＩＣＳのスプライス変異体の１つのうち１以上を含む癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含むことが知られている。ある場合では、この癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＡと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＡコード部分と結合する自己抗体の部分として特徴付けすることができる。別の例では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＥＤＢと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＥＤＢコード部分と結合する自己抗体の部分として特徴付けすることができる。別の例では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ部分、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード部分、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳと結合する自己抗体の部分、および癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のＩＩＩＣＳコード部分と結合する自己抗体の部分として特徴付けすることができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、ＩＩＩＣＳスプライス変異体Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５または増幅として特徴付けすることができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化などの１以上の翻訳後修飾を含むとして特徴付けすることができる。様々な細胞種、組織種および腫瘍種が、ＥＤＡ、ＥＤＢ、およびＩＩＩＣＳのスプライス変異体の１つのうち１以上を含まない癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含むことが知られている。ある場合では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳを欠いているものとして特徴付けすることができる。別の例では、ＩＩＩＣＳは、ＩＩＩＣＳのアミノ酸１〜２５、またはＩＩＩＣＳの９０〜１２０、またはその双方を欠いているものとして同定される。癌胎児性フィブロネクチン変異体ならびにそれらの種々の細胞種、組織種および腫瘍種との関連は本明細書で例示され、また当技術分野で公知である。特定の臓器または組織から、または尿、リンパ、血液、血漿、血清、唾液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、母乳、滑液、精液、精漿、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、腹腔液、腹水、汗、リンパ液、肺痰および洗浄液などの体液から採取されたサンプルなど、癌胎児性フィブロネクチンの存在が決定可能な多くのサンプルは、その供給源が２以上の細胞種、２以上の組織種または２以上の臓器である成分を含んでいる可能性がある。その結果、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの細胞源、組織源または臓器源は不明瞭となることがある。本明細書で提供される方法を用いれば、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンの範囲または組成の特徴付けは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の可能性のある細胞源、組織源または臓器源を同定するために使用することができ、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の可能性のない細胞源、組織源または臓器源を同定するために使用することができる。このような方法は、例えば、対象に存在する可能性がある腫瘍または新生細胞の種類を同定するため、または対象に存在する可能性がない腫瘍または新生細胞の種類を同定するために使用することができる。
【０６２２】
例示すれば、サンプルは２種類以上の異なる癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含み得る。例えば、ＥＤＡとＶ１２０を含むが、ＥＤＢは含まない癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含み得るサンプルがあるが、同じサンプルがＥＤＡ、ＥＤＢおよびＶ１２０を含む癌胎児性フィブロネクチンを含み得る場合がある。このようなサンプルはさらに、癌胎児性フィブロネクチンの可能性のある細胞源、組織源または臓器源を同定するために使用することができ、または癌胎児性フィブロネクチンの可能性のない細胞源、組織源または臓器源を同定するために使用することができる。当技術分野で公知のように、種々の細胞種および組織種が２種類以上の異なる癌胎児性フィブロネクチンを産生することが知られている。サンプル中に存在するこの異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、１以上の細胞種または組織種により産生することが知られている癌胎児性フィブロネクチンと比較して、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の細胞源または組織源の可能性の有無を同定することができる。同様に、サンプル中に存在する異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子の相対的レベルも、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の可能性のある細胞源、組織源または臓器源を同定するために使用することができ、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の可能性のない細胞源、組織源または臓器源を同定するために使用することができる。異なる細胞種および組織種は、２種類以上の異なる癌胎児性フィブロネクチンを既知の比率で産生する。サンプル中に存在する異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子の相対量を、１以上の細胞種または組織種により産生されることが知られている癌胎児性フィブロネクチンの相対量と比較して、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の細胞源または組織源の可能性の有無を同定することができる。
【０６２３】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の同定またはサンプル中の２種類以上の異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定を、癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題の存在を示すために使用することができる。例えば、対象から採取されるサンプルが一般に、正常な対象から採取した際には検出可能な量の特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子種を含まない場合、このようなサンプルにおいていずれの量であれ特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子種が検出されれば、その対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題が存在することを示すことができ、サンプルが一般に基準量の癌胎児性フィブロネクチンを含んでいる場合であっても、その基準量が異なる癌胎児性フィブロネクチンのものであれば、同様のことが言える。別の例では、対象から採取される特定のサンプル種が一般に、正常な対象から採取した際に基準量の特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子種を含んでいる場合、その基準量を超える量のその癌胎児性フィブロネクチン指標分子種が検出されれば、その対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題が存在することを示し得る。別の例では、対象から採取されるサンプル種が一般に、正常な対象から採取した際にある比率の２種類以上の特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子種を含んでいる場合、正常な比率とは異なる比率のその癌胎児性フィブロネクチン指標分子種が検出されれば、対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する健康問題が存在することを示し得る。
【０６２４】
１．癌胎児性フィブロネクチンを検出する化合物および組成物
例えば、水平流動デバイスなど、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手との併用のために適合可能なもの含む、いずれの既知のアッセイ法も、本明細書で提供される系および方法で使用することができる。アッセイ法の例としては、タンパク質結合アッセイ（例えば、ドットブロット分析およびウエスタンブロット分析）および核酸分子ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析、サザンブロット分析およびＦＩＳＨ）が挙げられる。これらは、例えば、水平流動・ディップスティック形式といった免疫学的方法、質量分析形式およびその他を含む好適ないずれの形式で行ってもよい。
【０６２５】
対象サンプルにおける分析物の存在または量の決定のために使用可能なものとして、競合結合アッセイおよび非競合結合アッセイを含む結合アッセイが挙げられ、本明細書で例示される。結合アッセイは例として示されるものであり、本明細書で提供される方法および系は、様々な異なる指標に関して様々なサンプル種に広く適用可能であると理解される。
【０６２６】
様々なプロトコールおよび標識を用いた、いくつかの異なる種類の結合アッセイがよく知られている。結合アッセイは単一の溶液中で行うこともできるし、あるいは結合相手を、アッセイを行う固体支持体に固定することもできる。サンドイッチアッセイも実施可能である。競合的アッセイも実施可能である。当業者に知られているように、これらの反応工程は同時に行うこともできるし、逐次行うこともできる。特定のレベルまたは割合を超える分析物レベルである場合にのみ陽性結果が得られる場合には閾値アッセイを行うことができる。アッセイ形式としては、限定されるものではないが、例えば、試験管内、膜上、ウェル内、マルチウェルプレート内、マイクロアレイ上、クロマトグラフィー試験ストリップ上で行うアッセイ、ならびにディップスティッ、水平流動、垂直流動、または遊走形式アッセイが挙げられる。
【０６２７】
ａ．癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す分子
本明細書で提供される方法において検出される分子は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る。対象において癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る分子としては、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のフラグメント、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡ、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡのフラグメント、または癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡの全部もしくは一部に相補的な増幅核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ）が挙げられる。下記の検出方法では、癌胎児性フィブロネクチンも検出方法は、当業者に自明である限り、特定の検出方法がそのように明示されているかどうかによらず、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子のいずれにも適用することができる（例えば、癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す分子を増幅するためのＰＣＲ法の使用は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、タンパク質フラグメントまたは自己抗体の増幅のためには用いられない）。
【０６２８】
当業者ならば理解できるように、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸分子の検出に加え、またはその代わりに、癌胎児性フィブロネクチンの１以上の自己抗体または抗体フラグメントを、本明細書で提供される方法を用いて検出することができる。癌胎児性フィブロネクチンに対する自己抗体の存在は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在の証拠となり得る。よって、この自己抗体の検出は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在の指標として使用することができる。本明細書で癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の検出に関して記載されたタンパク質検出法のいずれかを用いて、癌胎児性フィブロネクチンに対する、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸に対する自己抗体を検出することができる。
【０６２９】
ｂ．癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチン部分
本明細書で提供される方法では、癌胎児性フィブロネクチン、またはそのフラグメントの指標となるフィブロネクチン領域の検出を用いることができる。癌胎児性フィブロネクチンの指標となる領域としては、限定されるものではないが、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ、ＩＩＩＣＳのスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０など）およびＩＩＩＣＳのフラグメント（ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５およびＣＳ６など）が挙げられる。ヒトフィブロネクチンＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ領域、ならびに癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸のヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり、公開データベースで入手することができる。配列例が配列番号１〜８および１４〜３５で示されている。ラット、マウス、ニワトリ、ウシおよびアフリカツメガエルを含む様々な他種についてのアミノ酸および核酸分子も公知であり、公開データベースで容易に入手することができる。対立遺伝子変異体およびその他の変異体も知られており、かつ／または同定することができる。
【０６３０】
癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチン領域の検出は、当技術分野で公知の、または本明細書で開示されている様々な方法により行うことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチン領域は、フィブロネクチンタンパク質の癌胎児性フィブロネクチン指標領域と結合するタンパク質を用いて検出することができる。例えば、様々な抗癌胎児性フィブロネクチン抗体が当技術分野で公知であり、ＩＳＴ−９、ＤＨ１、ＢＣ−１、Ｌ１９、ＭＥ４Ｃ、Ｈ１０、Ａ１３４、Ｃ６、ＦＤＣ−６、５Ｃ１０、Ｘ１８Ａ４、Ｘ２０Ｃ４およびＸ８Ｅ３が挙げられる。
【０６３１】
癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチン領域はまた、インテグリンと結合することができる。例えば、ＥＤＡはα４β１インテグリンおよびα９β１インテグリンと結合することができる。ＥＤＡのアミノ酸配列ＥＤＧＩＨＥＬ（ＥＤＡアミノ酸４０〜４６）は、α４β１インテグリンおよびα９β１インテグリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳは、α４β１インテグリン、α４β７インテグリンおよびヘパリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳのＶ９５スプライス変異体は、ヘパリンと結合することができる、ＣＳ１およびＣＳ５は、α４β１インテグリンおよびα４β７インテグリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳアミノ酸配列ＬＤＶ（ＩＩＩＣＳアミノ酸２０〜２２）は、α４β１インテグリンおよびα４β７インテグリンと結合することができる。ＩＩＩＣＳアミノ酸配列ＲＥＤＶ（ＩＩＩＣＳアミノ酸１００〜１０３）は、α４β１インテグリンおよびα４β７インテグリンと結合することができる。
【０６３２】
癌胎児性フィブロネクチン領域は、癌胎児性フィブロネクチンの指標となるグリコシル化を検出することにより同定することができる。例えば、ＥＤＢは、１以上のＮ−結合グリコシル化部位を含み得る。ＩＩＩＣＳは、１以上のＮ−結合グリコシル化部位と１〜６個または約６個のＯ−結合グリコシル化部位を含み、特に、ＩＩＩＣＳは、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化を含み得る。
【０６３３】
癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチン領域の検出は、１以上のタンパク質分解フラグメントを検出することにより行うことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンは、２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａおよび／または５５ｋＤａのトリプシンフラグメントを生じ得る。一般に、これらの６つのトリプシンフラグメントは抗体ＦＤＣ−６と結合することができる。癌胎児性フィブロネクチンの一例では、癌胎児性フィブロネクチンのトリプシンフラグメントは２００ｋＤａ、１２０ｋＤａまたは５５ｋＤａであり得、ここで、各小さなフラグメントは大きなフラグメントのさらなるトリプシン切断産物に相当する。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンのトリプシンフラグメントは２３５ｋＤａ、１６０ｋＤａまたは６５ｋＤａであり得、ここで、各小さなフラグメントは大きなフラグメントのさらなるトリプシン切断産物に相当する。
【０６３４】
癌胎児性フィブロネクチンは、１１０ｋＤａおよび／または８５ｋＤａのカテプシンＤフラグメントを生じ得る。一般に、これら２つのカテプシンＤフラグメントは、抗体ＦＤＣ−６と結合することができる。癌胎児性フィブロネクチンはまた、１２０ｋＤａ、８５ｋＤａおよび／または３５ｋＤａのサーモライシンフラグメントを生じるフィブロネクチンであり得る。一般に、１２０ｋＤａおよび８５ｋＤａフラグメントは抗体ＢＣ−１と結合することができ、８５ｋＤａフラグメントは、１２０ｋＤａフラグメントのさらなるサーモライシン切断産物に相当する。癌胎児性フィブロネクチンは、１４ｋＤａのアクロモバクタープロテアーゼＩフラグメントを生じるフィブロネクチンであり得、ここで、このフラグメントは、一般に、抗体ＦＤＣ−６と結合することができる。
【０６３５】
核酸分子は対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る。癌胎児性フィブロネクチンの存在の指標となる核酸分子またはその相補物もまた、本明細書で提供される、または当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。
【０６３６】
本明細書では、癌胎児性フィブロネクチンの存在の指標となる核酸分子またはその相補物、またはそのフラグメントが検出可能である。癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る核酸分子またはそのフラグメントもしくは相補物は、癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチンポリペプチド領域の存在を示す。例えば、核酸分子またはそのフラグメントの検出は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域（ＩＩＩＣＳ領域のＶ０、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０スプライス変異体を含む）の存在を示し得る。例えば、配列番号２８〜３５参照。癌胎児性フィブロネクチンの指標となるフィブロネクチンポリペプチド領域を検出するためには、核酸分子またはそのフラグメントを検出するための様々な方法のいずれを用いてもよい。例えば、核酸分子の存在が癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す方法が使用可能である（例えば、プライマーがＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域とハイブリダイズするようにデザインされている場合、増幅された核酸分子の存在は癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る）。別の例では、予測された大きさの核酸分子の存在が、癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る（例えば、プライマーがＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳコード領域付近にある場合、小さな増幅核酸分子はＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳコード領域を含まないフィブロネクチンを示し、大きな増幅核酸分子は癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る）。別の例では、予測されたヌクレオチド配列またはその相補的配列を有する核酸分子の存在は、癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳコード領域に相補的なサザンブロットプローブを用いる場合、サンプルバンドに対するプローブの結合が癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る）。
【０６３７】
ｃ．癌胎児性フィブロネクチンに対する、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に体する自己抗体
癌胎児性フィブロネクチンに対する、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸に対する自己抗体は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る。自己抗体は本明細書で提供される、または当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。自己抗体は、対象自信の抗原に応答して対象により産生される。本方法では、自己抗体は癌胎児性フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に応答して産生される。自己抗体は、癌胎児性フィブロネクチンと、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ、ＩＩＩＣＳのスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０など）およびＩＩＩＣＳのペプチドフラグメント（ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５およびＣＳ６など）を含む、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる１以上の領域において特異的に結合する内因性抗体を含む。自己抗体はまた、癌胎児性フィブロネクチンと、ＥＤＢにおける１以上のＮ−結合グリコシル化部位、またはＩＩＩＣＳにおける１以上のＮ−結合グリコシル化部位もしくは１以上のＯ−結合グリコシル化部位、特にＩＩＩＣＳのトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化部位など、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる１以上の翻訳後修飾部位において特異的に結合することができる。自己抗体はまた、ＥＤＡ、ＥＤＢ、またはＩＩＩＣＳのスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５またはＶ１２０など）をコードする核酸分子など、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子とも特異的に結合することができる。
【０６３８】
自己抗体は、尿、リンパ、血液、血漿、血清、唾液、子宮頸分泌液、頸膣分泌液、膣分泌液、乳房分泌液、母乳、滑液、精液、精漿、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、間質液、卵胞液、羊水、眼房水、硝子体液、腹腔液、腹水、汗、リンパ液、肺痰および洗浄液またはその精製画分を含む、組織サンプルまたは体液サンプルなどの様々なサンプルのいずれにおいても検出することができる。自己抗体は、例えば、本明細書に記載のものなど、自己抗体と結合相手との結合を含む方法を含む様々な方法のいずれかにより検出することができる。
【０６３９】
ｄ．結合相手
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出のためのアッセイでは、検出を補助するため、または検出を可能とするために結合相手を用いることができる。本明細書で提供される方法において、結合相手は様々な役割で使用することができる。例えば、結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を固体支持体に結合させるため、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の相対的純度を高めるため、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示す検出可能なシグナルを提供するため、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示すために検出可能な標識が結合し得る結合表面を提供するため、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物を増幅させるため、および／またはサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特異的ドメインの存在を示すために使用することができる。
【０６４０】
一態様では、結合相手はフィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができ、従って、この、結合相手は、サンプル中に存在する他の分子よりも高い特異性でフィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができる。別の態様では、結合相手は癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができ、従って、この結合相手は、サンプル中に存在する非癌胎児性フィブロネクチン指標分子および／または他の分子よりも高い特異性で癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができる。
【０６４１】
結合相手の例としては、限定されるものではないが、抗体、抗体フラグメント、酵素、金属イオン、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、核酸分子、核酸類似体、有機化合物、炭水化物、レクチン、色素、還元剤、エネルギー吸収分子、親和性捕捉部分、光感受性結合分子およびそれらの組合せが挙げられる。
【０６４２】
結合相手は、フィブロネクチンタンパク質と特異的に結合する様々な化合物のいずれであってもよい。フィブロネクチンタンパク質と結合する化合物の例としては、インテグリンα３β１、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７、インテグリンα５β１、インテグリンα８β１、インテグリンα９β１、インテグリンαＶβ１、インテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ５、インテグリンαＶβ６およびインテグリンαＩＩｂβ３などのインテグリン；ヘパリン；フィブリン；コラーゲン；ゼラチン；ならびにＩＳＴ−４および３Ｅ３などの抗体が挙げられる。
【０６４３】
結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と特異的に結合する化合物を含み得る。癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、非癌胎児性フィブロネクチンには存在しないか、または非癌胎児性フィブロネクチンでは接近できない癌胎児性フィブロネクチンの部分と結合することができる。非癌胎児性フィブロネクチンには存在しない癌胎児性フィブロネクチンの部分の例としては、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ならびにＩＩＩＣＳのＶ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０などのアミノ酸領域が挙げられる。非癌胎児性フィブロネクチンには存在しない癌胎児性フィブロネクチンの部分の他の例としては、Ｏ−グリコシル化領域などの翻訳後修飾領域が挙げられる。非癌胎児性フィブロネクチンでは接近できない癌胎児性フィブロネクチンの部分の例としては、癌胎児性および非癌胎児性フィブロネクチンに存在するが、例えば、非癌胎児性フィブロネクチンには存在しないアミノ酸の発現の結果として、または非癌胎児性フィブロネクチンには存在しない翻訳後修飾の結果としてコンフォメーション的に異なるアミノ酸領域が挙げられる。癌胎児性フィブロネクチンまたはそれに対する抗体と優先的に結合する化合物の例としては、限定されるものではないが、ＢＣ−１、ＦＤＣ−６、Ｌ１９、ＭＥ４Ｃ、Ｘ１８Ａ４、５Ｃ１０、ＩＳＴ−９およびＤＨ−１などの抗体が挙げられる。
【０６４４】
ｉ．抗体
抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む）、または限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合するＦａｂフラグメントもしくはｓｃＦｖを含む、その抗原結合フラグメントを使用することができる。例えば、可動性の標識マウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体を用いて、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合させることができ、また、試験ストリップ上に固定されているポリクローナルヤギ抗フィブロネクチン抗体を用いて癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合させ、癌胎児性フィブロネクチンの存在を示す検出可能なサンドイッチ複合体を形成させることができる。別の例では、試験ストリップ上に固定されているマウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体を用いて、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合させることができ、標識ヤギポリクローナル抗癌胎児性−フィブロネクチン抗体コンジュゲートを用いて、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合させ、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示す検出可能なサンドイッチ複合体を形成させることができる。別の例では、膜を用いて、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と非特異的に結合させてそれを固定することができ、この固定された癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を標識抗癌胎児性フィブロネクチン抗体コンジュゲートに曝し、これを検出してサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示すことができる。別の例では、固定されている癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を、例えば、マウス抗癌胎児性フィブロネクチン抗体に曝し、次いで、標識ポリクローナルヤギ抗マウス抗体複合体に曝し、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示すことができる。
【０６４５】
本明細書に記載の方法で用いるための特異的結合抗体フラグメントは、個々のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体から通常の酵素的または化学的フラグメンテーション法によって作製することもできるし、または、慣行の組換え法によって作製することもできる。種々の手順が知られている（例えば、Tijssen, P. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theories of Enzyme Immunoassays, Elsevier, New York (1985)参照）。当技術分野で公知のように、例えば、モノクローナル抗体ＦＤＣ−６（ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９０１８）をパパインまたはペプシンなどのプロテアーゼにそれぞれ曝し、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントを形成することができる。さらに、ＦＤＣ−６のＶＬおよびＶＨは、組換え法を用い、単一のタンパク質鎖として発現させることを可能とする合成リンカーを用いて連結させることができ、ここでは、ＶＬ領域とＶＨ領域は対合して一価分子を形成している（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、例えば、Bird et al., Science, 242:423−426 (1988);およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879−5883 (1988)参照）。二価の二重特異的抗体（すなわち、ダイアボディー）を形成させることができ、この場合、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短いリンカーを用い、それにより、それらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得なくし、２つの抗原結合部位を作り出することで、ＦＤＣ−６  ＶＨドメインとＶＬドメインを一本のポリペプチド鎖上に発現させる（例えば、Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444−6448 (1993); Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121−1123 (1994)参照）。
【０６４６】
抗体は当業者に公知の方法を用いて作製および精製することができるか、あるいは公的に入手可能な供給源から得ることができる。例えば、抗体を作製および精製するための方法は、モノクローナル抗体ＦＤＣ−６（the American Type Culture Collectionに受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９０１８として寄託；米国特許第４，８９４，３２６号参照；また、Matsuura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6517−6521 (1985)も参照：また、米国特許第４，９１９，８８９号；同第５，０９６，８３０号；同第５，１８５，２７０号；同第５，２２３，４４０号；同第５，２３６，８４６号；同第５，２８１，５２２号；同第５，４６８，６１９号および同第５，５１６，７０２号も参照）を作製および精製のに用いられる方法と同様であり得る。抗フィブロネクチン抗体および抗癌胎児性フィブロネクチン抗体は、本明細書で開示されている、または当技術分野で公知の方法を用い、コンジュゲートとして形成するか、または固体支持体上に固定することができる。
【０６４７】
ａ．癌胎児性フィブロネクチンに対する抗体
一態様では、本明細書で用いる抗体は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と特異的に結合することができる。本明細書で用いる抗体は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に存在するエピトープと特異的に結合することができる。ポリクローナル抗体は一般に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に存在する２以上のエピトープと結合する。モノクローナル抗体は一般に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に存在する単一のエピトープと結合する。
【０６４８】
別の例では、癌胎児性フィブロネクチンに存在するエピトープは、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳドメインを含むエピトープなど、癌胎児性フィブロネクチンに存在し得るエピトープを含み得る。癌胎児性フィブロネクチンに存在するエピトープと結合する抗体としては、ＦＤＣ−６（ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９０１８）、ＩＳＴ−９(Carnemolla et al., FEBS Lett. 215:269−273 1987; Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY)、ＤＨ１(Vartio et al., J. Cell Sci. 88:419−430 1987)、ＢＣ−１(Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108:1139−1148 1989)、Ｌ１９（米国特許出願第２００３０１７６６６３号）、ＭＥ４Ｃ(Giovannoni et al., Nucleic Acids Res. 29:e27 (2001)（このＭＥ４Ｃ  ｓｃＦｖ核酸およびアミノ酸配列は配列番号９および１０で示され、また、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２９７９６０として入手できる）、Ｈ１０（米国特許出願第２００３０１７６６６３号）、Ａ１３４(Islami et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 97:40−45 2001)、５Ｃ１０(Mandel et al., APMIS 100:817−826 1992)、ならびにＸ１８Ａ４、Ｘ２０Ｃ４およびＸ８Ｅ３（米国特許第５，５２３，２２９号；それぞれＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１１５８７、ＨＢ−１１５８９およびＨＢ−１１５８８）が挙げられる。
【０６４９】
ｂ．抗体と標識のコンジュゲーション
一態様では、目的の分析物と結合する抗体を検出可能な標識とコンジュゲートさせることができる。この抗体コンジュゲートで用いる検出可能な標識は、検出可能であり、かつ、このアッセイの他の化合物および物質から識別可能な物理的標識または化学的標識であり得る。例えば、抗体コンジュゲートは、反射率リーダーなどのリーダーを用いて固体支持体上で検出することができる。一例では、マウスモノクローナル抗ｏｎｆＦＮ抗体（例えば、米国特許第５，２８１，５２２号参照）を、青色色素または他の分光光度的に検出可能な標識を含むラテックス粒子とコンジュゲートさせることができる。別の例では、ヒトフィブロネクチンに対するヤギポリクローナル抗体を金コロイド標識とコンジュゲートさせることができる。
【０６５０】
種々の抗体標識が当業者に周知である。これらの標識としては、限定されるものではないが、反応に発色する酵素−基質の組合せ、ラテックス粒子などの有色粒子、量子ドット、金属コロイドまたは金属または炭素ゾル標識、蛍光標識、およびリポソームまたはポリマーサック（標識の凝集により検出される）が挙げられる。ある特定の態様では、標識は有色ラテックス粒子である。もう１つの態様では、標識抗体コンジュゲートにおいて金コロイドが用いられる。
【０６５１】
標識は、抗体との結合のために誘導体化することができ、例えば、カルボキシル基などの官能基を粒子表面に結合させて抗体の共有結合を可能とすることによる。抗体は周知のカップリング法を用いて標識とコンジュゲートさせることができる。グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドなどのカップリング剤を使用することができる。標識は化学的結合または物理的結合により抗体と結合またはカップリングさせることができる。一例としての態様では、粒子カルボジイミドカップリング試薬、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ-プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いて、抗体をラテックスと結合させる。
【０６５２】
ｉｉ．核酸分子
結合相手はまた、フィブロネクチンをコードする核酸分子と特異的に結合する分子、フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的な配列と特異的に結合する分子、その増幅物、またはそのフラグメントであり得る（本明細書ではこの群を癌胎児性フィブロネクチン核酸分子と呼ぶ）。一態様では、少なくとも１つの結合相手が、フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物と特異的に結合する。別の態様では、２以上の結合相手が、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物と特異的にまたは優先的に結合することができる。結合相手としては、一本鎖または二本鎖核酸分子、オリゴヌクレオチド、プライマー、デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、リボ核酸分子（ＲＮＡ）、ペプチド核酸などの核酸ホモログ、およびそれらのハイブリッドを含み得る。結合相手はまた、抗体、抗体フラグメント、酵素、金属イオン、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、炭水化物、レクチン、色素、還元剤、エネルギー吸収分子、親和性捕捉部分、光感受性結合分子、およびそれらの組合せを含み得る。
【０６５３】
フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物と結合する結合相手は、フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物と特異的に結合することができる。癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物と結合する結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物と特異的に結合することができる。一般に、このような結合相手は、フィブロネクチンをコードする核酸もしくは癌胎児性フィブロネクチン核酸分子またはその相補物に相補的であるが、他の（非フィブロネクチンコード）核酸分子には存在しない。
【０６５４】
癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、非癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物と結合するよりも、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物と優先的に結合することができる。一般に、このような結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物に相補的である。例えば、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸と優先的に結合する結合相手は、限定されるものではないが、Ｖ１２０、Ｖ９５、Ｖ８９またはＶ６４をコードする核酸分子を含む、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域をコードする核酸配列と結合することができる。
【０６５５】
癌胎児性フィブロネクチン核酸分子またはその相補物の存在を検出するために用いられる結合相手は、結合、単離または検出に有用な部分とコンジュゲートさせることができる。部分としては、ビオチン、ニッケル、磁性ビーズ、または結合もしくは単離に用いられる他の組成物または化合物など、結合可能な部分を含み得る。例えば、結合相手は、アビジンまたはストレプトアビジンを併用する場合には、結合または単離に使用可能なビオチン部分とコンジュゲートさせることができる。このような部分はまた、蛍光化合物、放射性核種を含有する化合物、量子ドット、金属コロイド、または限定されるものではないが、蛍光測定法、吸収、反射、視診およびシンチレーションを含む方法による検出に使用可能な他のいずれかの部分などの検出可能な部分も含み得る。結合相手はまた、固体支持体上に固定することもできる。核酸および核酸類似体などの結合相手をコンジュゲートする、または固定するための方法は当技術分野で公知であり、本明細書の方法で使用することができる。
【０６５６】
結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物の増幅のためのヌクレオチド合成プライマーとして働き得る。このような結合相手は一般に、ホスホジエステル結合の形成または他のヌクレオチド合成工程のために接近可能な３’ヒドロキシ部分を含む核酸分子または核酸類似体である。ヌクレオチド合成反応用のプライマーを作製するための方法は当技術分野で周知であり、本明細書の方法で使用することができる。
【０６５７】
核酸分子結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはそれに相補的な核酸分子と結合することができる。例えば、本明細書で提供される方法は、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的な核酸分子が形成される核酸分子合成方法を含む。よって、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子を検出するための方法はまた、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的な核酸分子を検出することも意図する。
【０６５８】
一態様では、結合相手は核酸分子であり得る。一般に、核酸分子結合相手は、他の非フィブロネクチンコード核酸分子とは特異的に結合することなく、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物と特異的に結合するに十分長いものである。一例では、核酸分子結合相手は、他の非癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物とは特異的に結合することなく、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物と優先的に結合する。例えば、核酸分子結合相手は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳをコードする核酸分子、またはその相補物、またはそのフラグメントと特異的に結合することができる。
【０６５９】
核酸分子結合相手は様々な長さであってよく、その核酸分子結合相手の癌胎児性フィブロネクチンコード（またはその相補物）部分の他、付加的なヌクレオチド（例えば、転写開始部分またはチップハイブリダイゼーション配列）を含み得る。核酸分子結合相手の癌胎児性フィブロネクチンコード部分（またはその相補物）の長さの例としては、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約６ヌクレオチド、少なくとも約７ヌクレオチド、少なくとも約８ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチドまたはそれを超えるものがある。
【０６６０】
同様に、この癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物は、その癌胎児性フィブロネクチンコード配列の全長に結合相手が結合する必要はない。いくつかの態様では、結合相手が結合する癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物は全長核酸分子であり、この場合、結合相手は、他の非フィブロネクチンコード核酸分子とは特異的に結合することなく、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物の部分と特異的に結合する。一例では、核酸分子結合相手は、他の非癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物とは特異的に結合することなく、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物の部分と優先的に結合する。例えば、核酸分子結合相手は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳをコードする癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物の部分と特異的に結合することができる。
【０６６１】
他の態様では、この結合相手が結合する癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物は全長核酸分子のフラグメントであり、この場合、結合相手は、他の非フィブロネクチンコード核酸分子とは特異的に結合することなく、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物のフラグメントと特異的に結合する。一例では、核酸分子結合相手は、他の非癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物とは特異的に結合することなく、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物のフラグメントと優先的にと結合する。例えば、核酸分子結合相手は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳの少なくとも一部をコードする癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物のフラグメントと特異的に結合することができる。癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物のフラグメントは、核酸分子の酵素的、化学的または物理的切断を含み、また、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲなどの核酸合成法（この場合、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物の一部だけが増幅される）も含む、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって作製することができる。ある場合には、フラグメントはＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳをコードするヌクレオチドまたはその相補物のみを含み、この場合、このフラグメントは、全スプライス領域または全スプライス領域よりも小さい領域またはその相補物を含み得る。ＩＩＩＣＳに関して、フラグメントは、Ｖ１２０、Ｖ９５、Ｖ８９もしくはＶ６４をコードするヌクレオチドまたはその相補物のみを含み得るか、あるいはアミノ酸１〜２５、アミノ酸２６〜８９、またはアミノ酸９０〜１０２をコードするスプライス領域またはその相補物のみを含み得る。フラグメントはまた、上述のスプライス領域またはその相補物のいずれかと隣接する領域も含み得る。例えば、フラグメントは、ＥＤＡスプライス領域またはその相補物の３’側の１０ヌクレオチドと５’側の１０ヌクレオチドを含み得る。このようなフラグメントは、例えば、癌胎児性フィブロネクチンスプライス領域を含んでいる核酸分子と癌胎児性フィブロネクチンスプライス領域を欠いている核酸分子を識別するための質量分析的検出法において使用することができる。例えば、フラグメントは、ＥＤＡスプライス領域またはその相補物の３’側の１０ヌクレオチドと５’側の１０ヌクレオチドを含むことができ、癌胎児性フィブロネクチンスプライス領域（１１０ヌクレオチド長）を含んでいる核酸分子を、癌胎児性フィブロネクチンスプライス領域（２０ヌクレオチド長）を欠いている核酸分子から識別することができる。
【０６６２】
フラグメントは、検出される癌胎児性フィブロネクチンの領域、検出法およびサンプルを含む、当業者に公知の様々な因子のいずれによっても長さが異なり得る。核酸合成反応によって形成されるフラグメントなどのフラグメントは、核酸分子の癌胎児性フィブロネクチンコード部分の他、付加的なヌクレオチド（例えば、転写開始部位または非癌胎児性フィブロネクチンコードハイブリダイゼーション配列）を含み得る。フラグメントの（またはその相補物）の癌胎児性フィブロネクチンコード部分またはその相補の長さの例としては、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、または少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約６ヌクレオチド、少なくとも約７ヌクレオチド、少なくとも約８ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１２ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、またはそれを超えるものがある。
【０６６３】
ｉｉｉ．自己抗体に対する結合相手
結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体と特異的に結合することができる。このような結合相手としては、抗体、抗体フラグメント、酵素、金属イオン、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、炭水化物、レクチン、色素、還元剤、エネルギー吸収分子、親和性捕捉部分、光感受性結合分子、およびそれらの組合せを含み得る。結合相手はまた、一本鎖または二本鎖核酸、オリゴヌクレオチド、プライマー、デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、リボ核酸分子（ＲＮＡ）、ペプチド核酸などの核酸ホモログ、およびそれらのハイブリッドを含み得る。
【０６６４】
自己抗体に対する結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくはそのフラグメント、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはそのフラグメントを含み得る。これらの自己抗体は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ、ＩＩＩＣＳのスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０など）ならびにＩＩＩＣＳのフラグメント（ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５およびＣＳ６など）を含む、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる１以上の領域において特異的に結合することができる。自己抗体はまた、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と、ＥＤＢにおける１以上のＮ−結合グリコシル化部位、またはＩＩＩＣＳにおける１以上のＮ−結合グリコシル化部位もしくは１以上のＯ−結合グリコシル化部位、特にＩＩＩＣＳのトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化部位など、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる１以上の翻訳後修飾部位において特異的に結合することができる。自己抗体はまた、ＥＤＡ、ＥＤＢ、またはＩＩＩＣＳのスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５またはＶ１２０など）をコードする核酸分子など、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子とも特異的に結合することができる。よって、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる領域、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる翻訳後修飾、または癌胎児性フィブロネクチンの指標となるポリペプチド領域をコードする核酸分子領域のいずれかを含むタンパク質または核酸分子が、本明細書で提供される方法に従って自己抗体の結合相手として使用することができる。癌胎児性フィブロネクチンの指標となる領域、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる翻訳後修飾、または癌胎児性フィブロネクチンの指標となるポリペプチド領域をコードする核酸分子領域のいずれかを含むポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドなどのタンパク質または核酸分子のフラグメントも、自己抗体の結合相手として使用することができる。一例では、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドなどのフラグメントは、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる領域のみを含み、所望により、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる翻訳後修飾、または癌胎児性フィブロネクチンの指標となるポリペプチド領域をコードする核酸分子領域も含み得る。例えば、ポリペプチドは、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ、ＩＩＩＣＳスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０など）、ＩＩＩＣＳのペプチドフラグメント（ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５およびＣＳ６など）、またはそれらのフラグメントのみを含むことができ、場合よって、ＥＤＢにおける１以上のＮ−結合グリコシル化部位、またはＩＩＩＣＳにおける１以上のＮ−結合グリコシル化部位もしくは１以上のＯ−結合グリコシル化部位、特にＩＩＩＣＳのトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化部位など、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる１以上の翻訳後修飾部位を含み得る。別の例では、オリゴヌクレオチドは、ＥＤＡ、ＥＤＢ、またはＩＩＩＣＳのスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５またはＶ１２０など）をコードするヌクレオチドのみを含み得る。ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドフラグメントの大きさの例は、５〜３０残基、７〜２０残基、または９〜１５残基、または約５〜約３０残基、約７〜約２０残基、または約９〜約１５残基の範囲であり得る。
【０６６５】
自己抗体を検出するための方法はまた、抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体に特異的でない抗体結合相手も使用することができる。例えば、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＥまたは抗ＩｇＭ抗体、またはそのフラグメントを含む抗ヒト抗体などの抗体結合相手は、抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体を検出するための方法で使用することができる。抗体結合相手またはそのフラグメントはポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。
【０６６６】
本明細書で提供される方法に従って用いられる自己抗体の結合相手は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の結合相手または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子の結合相手の使用に関して本明細書に記載されているものと同様にして使用することができる。例えば、このような結合相手はコンジュゲートとして形成させることもできるし、あるいは固体支持体に固定することもできる。自己抗体を検出するための一般法および結合相手は当技術分野で公知であり、本明細書で提供される化合物、組成物および方法と併用することができる。このような方法および結合相手は、米国特許公報第２００３０２３２３９９号および同第２００４００４８３２０号ならびにＷＯ０３／０２０１１５に例示されている。
【０６６７】
ｉｖ．その他の結合相手
様々なその他の化合物も、ペプチドおよび非ペプチド有機化合物などのフィブロネクチンタンパク質と結合する化合物を含む、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸のフィブロネクチン結合相手として使用することができる。フィブロネクチンタンパク質と結合する化合物は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、例えば、米国特許第５，４９１，１３０号に示されているように、ＧＧＷＳＨＷ（配列番号３６）などの小ペプチドおよび関連のペプチドおよびその変異体（例えば、環状ペプチド）が挙げられる。また、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＢドメインと結合することが知られている、２，２−ジフェニルエチルアミン、２，２−ジフェニルプロピルアミン、３，３−ジフェニルプロピルアミン、２−ナフチル，２−フェニルエチルアミン、２−ナフチル，２−（２，６−ジクロロフェニル）エチルアミン、２−フェニル，２−（４−トリフルオロメチルフェニル）エチルアミン、２−フェニル，２−（３，４−メチレンジオキシベンジル）エチルアミン、２−フェニル，２−チエニルエチルアミンなどのジアリールアルキルアミンおよびそれらの誘導体を含む、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と特異的に結合する化合物も含まれる。このようなジアリールアルキルアミンは、the Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, December 2002に提出されたJoerg Scheuermannの博士論文に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０６６８】
ｖ．癌胎児性フィブロネクチンの領域と結合する結合相手
本明細書に記載されるように、結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するために使用することができる。結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる領域の存在を検出するために使用することができる。例えば、結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子におけるＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳならびにＩＩＩＣＳのスプライス変異体（Ｖ０、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５およびＶ１２０など）の存在を検出するために使用することができる。結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる１以上の領域、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる２以上の領域、または癌胎児性フィブロネクチンの指標となる３以上領域を検出するために使用することができる。
【０６６９】
結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる翻訳後修飾を検出するために、本明細書の方法において使用することができる。翻訳後修飾としては、Ｏ−結合グリコシル化およびＮ−結合グリコシル化などのグリコシル化、ジスルフィド橋の形成、タンパク質分解、脂質化およびその他の既知の翻訳後修飾が挙げられる。結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる１以上の翻訳後修飾、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる２以上の翻訳後修飾、または癌胎児性フィブロネクチンの指標となる３以上翻訳後修飾を検出するために使用することができる。結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンの指標となる領域と癌胎児性フィブロネクチンの指標となる翻訳後修飾の組合せを検出するためにも使用することができる。
【０６７０】
ｅ．非特異的結合剤
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出を向上させるために、例えば、結合相手と非特異的に結合することができるバックグラウンド物質をサンプルから除去すること、抽出すること、またはその結合を低減することによりバックグラウンドシグナルを低減することができる。例えば、尿サンプルは、そのサンプルを分析物特異的抗体と接触させる前に、非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤と接触させることができる。例えば、水平流動デバイスを用い、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのリガンドを含有するゾーンを含めることができる。このゾーンは、サンプルが癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が検出されるゾーンに到達する前に、サンプル溶液からバックグラウンド物質を除去することができる。
【０６７１】
非特異的結合を低減するための化合物の例としては、カゼイン、アルブミン、置換アルブミン（例えば、メチル化アルブミン）、ＩｇＧ、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンと特異的には結合しない抗体、および非特異的タンパク質相互作用をブロックすることが知られている他のタンパク質が挙げられる。核酸分子の検出の場合、非特異的結合を低減する化合物としては、サケ精子ＤＮＡ、ニシン精子ＤＮＡ、ポリ（ｄＩ−ｄＣ）−ポリ（ｄＩ−ｄＣ）、および非特異的核酸ハイブリダイゼーションをブロックする核酸分子が挙げられる。
【０６７２】
２．結合相手と複合体を形成した癌胎児性フィブロネクチンを検出するためのアッセイ
癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体、またはそのフラグメントなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための様々な異なるアッセイ法。一般に、癌胎児性フィブロネクチンの存在を検出するためのアッセイ法としては、例えば、サンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させる工程を含む。アッセイ法の例としては、限定されるものではないが、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット分析、ドットブロット分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、サンドイッチアッセイ、蛍光偏光、試験ストリップ分析、質量分析およびＰＣＲに基づく方法が挙げられる。アッセイは、固体支持体上に固定された癌胎児性フィブロネクチン指標分子を用いるか、または固体支持体上に固定されたフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を用いるか、または固体支持体上に固定された分子を用いずに行うことができる。固体支持体を含む態様では、限定されるものではないが、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、試験ストリップ、質量分析基板、およびニトロセルロース膜を含む、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の固体支持体のいずれかを使用することができる。
【０６７３】
アッセイを行うに当たっては、対象サンプルを得る。使用可能なサンプルとしては、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知のいずれのサンプルも含まれる。これらのサンプルは、例えば、液体および微粒子固体を含んでもよく、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を測定する前に、例えば、アッセイ試験ストリップに適用する前に、濾過することができる。サンプルは、繊維チップを有するスワブ、吸引器(aspirator)、吸引(suction)または洗浄デバイス、シリンジ、または尿もしくは唾液を採取するための受動式方法を含む、身体サンプル採取の他の公知の方法を用いるなど、当技術分野で公知の、または本明細書で提供されるいずれかの方法を用い、対象から取り出すことができる。サンプル、特に、不溶性媒体中のサンプルまたは不溶性媒体に付着しているサンプルは、バッファー溶液に抽出することができ、所望により濾過してもよい。一態様では、癌胎児性フィブロネクチンがサンプル中で検出される場合、そのサンプルは、可能性のある頸膣病巣点の近傍、子宮頸管、子宮頸口、外頸部、子宮頸の扁平上皮細胞と円柱細胞の間の移行域（すなわち、扁平円柱上皮接合部）、膣、後膣円蓋、膣の下三分の一などの後膣円蓋より下部の膣部分、陰唇、またはそれらの組合せから採取され、この場合、このサンプルは例えば、先端がポリエステル、レーヨンまたは綿などのフィブリン材となっているスワブを用い、スワブサンプルとして採取することができる。サンプルを綿スワブで採取する場合、これらのアッセイ法はそのスワブに対して行い、スワブに試薬を添加する。
【０６７４】
本明細書で提供されるアッセイ方法は一般に、タンパク質である癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するため、または核酸分子である癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するために使用することができる。当業者ならば理解できるように、試薬および特定の方法論の選択は、検出する癌胎児性フィブロネクチン指標分子によって異なる。
【０６７５】
本明細書で提供されるアッセイ方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の結合を検出するために使用することができ、また、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、所定量のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手をめぐって既知量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体と競合する場合には、競合的阻害を検出するために使用することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のアッセイにおいて、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手をめぐって既知量の標識癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはその標識類似体と競合し得る。固体に付着した標識フィブロネクチンの量または溶液中に留まっている標識フィブロネクチンの量を測定することができ、この測定値を用いて、当技術分野で公知の方法を用い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を求めることができる。
【０６７６】
ａ．溶液検出
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は溶液中で検出することができる。サンプルは１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合相手の間で形成された複合体を検出することができる。この複合体の検出が、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。複合体形成の指標となるシグナルの検出、または複合体形成に相当する分子量を有する物質の検出など、溶液中で形成される複合体の検出は当技術分野で公知である。いくつかの態様では、競合の検出を行うことができ、この場合には、複合体の指標となるシグナルがないことが、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。当技術分野で理解されているように、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物を検出する際には溶液検出法を行うことができる。
【０６７７】
ｉ．複合体形成の指標となるシグナル
癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の複合体形成の結果、複合体形成の指標となるシグナルが生じ得る。例えば、複合体形成は、シグナルの変化、独特なシグナル、シグナルの増強、シグナルの低下、またはシグナルの結合をもたらし得る。複合体形成の指標となるシグナルは、蛍光偏光、蛍光測定法、吸収、シンチレーション検出および凝集を含むシグナルを検出するための様々な方法のいずれかによって検出することができ、また、蛍光計、フローサイトメーター、または共焦顕微鏡などの顕微鏡いくつかの実験系のいずれかで構成することができる。複合体形成の指標となるシグナルの例としては、反応成分の凝集、蛍光偏光の変化、蛍光の強度もしくは波長の変化、吸収の強度もしくは波長の変化、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）などのエネルギー移動から生じる独特なシグナル、または２以上のシグナルの空間的近接が挙げられる。このような複合体形成の指標となるシグナルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と複合体を形成している結合相手から生じる変化（例えば、検出可能な部分のシグナルを変化させる結合相手のコンフォメーション変化）から、または同じ癌胎児性フィブロネクチン指標分子に結合している２以上の結合相手（例えば、結合相手間のＦＲＥＴから生じるシグナル）から生じ得る。さらに、上記の方法は、例えば、標識癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体を用い、競合アッセイとして行うこともでき、この場合には、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の競合の結果としてのシグナルの消失が、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。
【０６７８】
溶液中で、溶液から分析物を分離する工程を行うことなく、分析物の存在および／または量を同定するための様々な方法が知られている。以下にこのような非分離アッセイを行うための特定の方法を例示するが、Hussa, “The clinical marker hCG,” Praeger Publishers (1987), pp 38−40に例示されているように、他の様々な方法が当技術分野で公知である。
【０６７９】
一態様では、１つの結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子の結合により、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／またはレベルを示す検出可能なシグナルを呈することができる。例えば、蛍光プローブで標識した結合相手により、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合した場合に、結合していない場合のシグナルとは異なる蛍光偏光シグナルを呈することができる。別の例では、蛍光プローブで標識した分子（ここで、この分子は、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体であり得る）が結合することができる結合相手は、サンプル由来の癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合した場合に、サンプルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子が結合していない場合のシグナルとは異なる蛍光偏光シグナルを呈することができる。蛍光偏光シグナルは色素を含有する複合体の分子量によって異なり、蛍光色素で標識した結合相手が癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合すると、そのシグナルは、非結合形態よりも偏光が大きくなる。同様に、蛍光色素で標識した癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体が結合相手と結合すると、そのシグナルは、非結合型よりも偏光が大きくなり、また、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が蛍光標識癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体に取って代わった場合には、そのシグナルは、結合型よりも偏光が小さくなる。これらの方法の実施においては、フルオレセイン色素、シアニン色素、ダンシル色素、およびポリアザインダセン色素、例えば、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（ＢＯＤＩＰＹ）色素（Molecular Probes, Eugene, OR；例えば、米国特許第６，３２３，１８６号および同第６，００５，１１３号参照）を含む、様々な既知の色素がいずれも使用可能である。蛍光偏光アッセイは当技術分野で公知であり、アッセイ計画に応じてアッセイ条件を決定することができる。
【０６８０】
いくつかの蛍光偏光アッセイでは、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、蛍光色素で標識された抗体または抗体フラグメント、例えば、ＦＤＣ−６またはＭＥ４Ｃであり得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子と抗体結合相手の間で大きな質量差が望まれる態様では、この抗体結合相手は、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳＩＰ、または本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の他の抗原結合フラグメントといった抗体フラグメントであってもよい。
【０６８１】
他の蛍光偏光アッセイでは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体を蛍光色素に結合させることができ、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手との結合をめぐっての競合により決定することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子の類似体の例としては、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣの全部または一部を含むオリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられ、このような領域の一部はいずれも、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合するその能力に従って選択される。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質類似体は、ＩＩＩＣＳ領域のヘキサペプチドであってもよく、ここで、このヘキサペプチドは配列Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（配列番号３９）を含み、かつ、そのトレオニン残基にＯ−グリコシル化を有し、また、所望によりリンカーを含んでもよく、この類似体は当技術分野で公知の方法を用い、蛍光色素と直接またはリンカーを介して結合させることができる。
【０６８２】
一態様では、２以上の結合相手が同じ癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合する場合、第一の結合相手は第二の結合相手にエネルギーを移してシグナルを生じることができるが、このシグナルは第一の結合相手と第二の結合相手が空間的に近接している場合にのみ見られる。例えば、第一の結合相手上の発色団は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により、近接する第二の結合相手の蛍光団にエネルギーの量子を移し、その結果、この第二の結合相手の蛍光団が蛍光を発し得る。このような試験は、第二の結合相手の蛍光団の蛍光が、ＦＲＥＴの結果としてのみ生じ得る（発色団と蛍光団が互いに空間的に近接している場合にのみ生じ得る）ように構成することができる。第二の結合相手の蛍光団からの蛍光の検出は、その２つの結合相手が空間的に近接していることを示し、このことは癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。ＦＲＥＴを用いる方法は当技術分野で周知であり、これら様々な方法はいずれも本明細書で使用可能である（例えば、Gaits et al., Science STKE 2003:PE3参照）。
【０６８３】
別の態様では、２つの異なるシグナルの空間的近接が、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。２種類の異なる標識をした結合相手が１つの癌胎児性フィブロネクチン指標分子に結合すると、２つの異なるシグナル、例えば、２つの異なる波長の蛍光を呈する複合体が生じ得る。フローサイトメトリーまたは共焦顕微鏡などの検出方法を用い、サンプルの特定の部分または少量のサンプルをいつでもすぐに調べることができる。試験条件は、２以上の異なるシグナルの同時検出が、２種類の異なる標識をした結合相手が空間的に近接していること（これは、２以上の結合相手が同じ分子、すなわち、１つの癌胎児性フィブロネクチン指標分子に結合した場合に見られる）を示し得るように適合させることができる。よって、２以上の異なるシグナルの同時検出は、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。
【０６８４】
別の態様では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示す凝集アッセイにおいて、二座結合相手などの多座結合相手を使用することができる。多座結合相手は２つの癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合することができ、その結果、複数の結合相手と複数の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が結合して大きな複合体となることができる。多座結合相手の例としては、２つの結合部位を含む、従って二座である抗体、および癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の同じ、または異なる領域と結合する２以上の領域を含む融合タンパク質（癌胎児性フィブロネクチンフィブロネクチン結合相手を含む第一の領域とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む第二の領域を含んだ二座結合相手を含む）が挙げられる。このような大きな複合体は、例えば、分光光度的検出および視診などの様々な方法のいずれかにより検出することができる。凝集アッセイの例としては、２以上の同じ結合相手または２以上の異なる結合相手でコーティングした金ゾル粒子の使用を含み、視覚的または分光光度的検出による色の変化が、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在および／または量を示し得る。
【０６８５】
ｉｉ．複合体に相当する分子量
癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が複合体を形成する場合、その複合体の質量は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子単独または結合相手単独の質量よりも大きくなる。このような複合体に相当する質量の検出は、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。結合相手が検出可能なシグナルを生じ得る部分を含む場合、癌胎児性フィブロネクチン指標分子−結合相手複合体に相当する分子量を有する化合物の存在に伴う、このような化合物からの検出可能なシグナルの存在は、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。
【０６８６】
ゲル電気泳動（複合体を破壊しない条件下)およびサイズ排除クロマトグラフィーなどの電気泳動的およびクロマトグラフィー的方法、ならびに質量分析を含む、複合体の質量を測定するための様々な方法が当技術分野で公知である。一態様では、サンプルを、蛍光色素とコンジュゲートしたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させ、その後、分析的ゲル濾過カラムにロードすることができる。容量と蛍光に関して溶出をモニタリングすることができ、溶出用量を分子量に換算する。癌胎児性フィブロネクチン指標分子−結合相手複合体の分子量に相当する容量における蛍光シグナルが、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。
【０６８７】
ｂ．固定サンプル
癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含むことが疑われるサンプルは、そのサンプルを固体支持体上に固定すること、および固定されたサンプルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を用いて探査することにより、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関して調べることができ、ここで、固体支持体に対する結合相手の結合の検出は、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンの指標となる指標分子の存在の指標となる。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子はいずれも、本明細書で提供される方法において固体支持体に固定することができる。結合相手は直接的または間接的に検出することができる。結合相手の直接検出は、検出可能な部分とコンジュゲートされた、または結合可能な部分とコンジュゲートされた結合相手を用いて行うことができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間接検出は、そのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合することができ、かつ、検出可能なシグナルを生じることができるか、または別の結合相手が結合することができる結合相手を用いて行うことができる。また、標識および非標識（または異なる標識の）結合相手を用いた競合アッセイも行うことができる。
【０６８８】
本方法で用いられる固体支持体は、サンプルとの接触時に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が固定され得るいずれの固体支持体であってもよい。固体支持体の例としては、マイクロプレート、マイクロアレイ、またはニトロセルロース膜、ポリビニリジンフルオリド（ＰＶＤＦ）もしくはナイロン膜などの膜が挙げられる。サンプルを固体支持体上に固定するための方法は当技術分野で公知であり、本明細書の方法で使用することができる。ドットブロット、マイクロプレートまたはマイクロアレイの場合など、サンプルが２箇所以上の異なる場所に固定される場合、全てのサンプルに異なる処理を施すことができる場合には、各サンプルは独立に処理することもできるし、あるいはいくつかのサンプルには同じ処理を施し、他のサンプルには異なる処理を施すこともできる。処理の例としては、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の異なる領域と結合する結合相手含む、異なる結合相手と接触させること、および異なるバッファー条件下で接触させること、および異なる濃度の結合相手と接触させることが挙げられる。このような方法は当業者に公知である。
【０６８９】
シグナルの検出はまた、様々な公知の方法を用い、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を定量するためにも使用することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に相当するシグナルの強度は、例えば、蛍光もしくは吸収分光光度測定法、またはホスフォイメージャー測定法を含む当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて測定することができる。一例では、既知濃度の標品も含めることができ、１以上のサンプルシグナルの強度を、公知の方法を用い、標品と質的または量的に比較し、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の概算または算出を行うことができる。別の例では、複数のサンプル希釈液を検出することができ、各希釈液において測定されたシグナルを用いて、公知の方法を用い、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を概算することができる。
【０６９０】
ｉ．ドットブロット分析
ドットブロット法は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するために使用することができる。ドットブロット法は、まず、固体支持体、一般に、ニトロセルロース膜またはＰＶＤＦ膜などの膜を調製することにより、例えば、メタノールまたは蒸留水などの溶媒中で膜を湿らせるなどにより、行うことができる。他の例では、膜の調製の必要はない。次に、この膜にサンプルを加えることができる。ドットブロット法では、サンプルの１以上のアリコートを膜上の別個の場所に加え、膜上に１以上の「ドット」を形成することができる。複数のサンプルアリコートを用いる場合、それらのアリコートは同一であっても異なっていてもよく、この場合、異なるアリコートはサンプルの希釈レベルが異なってもよいし、あるいは少なくとも１つの異なる試薬で処理されたアリコートであってもよい。例えば、異なるアリコートを異なる非特異的結合化合物または表面と接触させてもよいし、あるいは１以上の第一のアリコートは無処理とし、１以上の第二のアリコートを例えば、非特異的結合化合物を用いて処理してもよい。また、対照または参照サンプルを膜上の別個の位置に加えてもよい。一態様では、膜に適用したサンプルは吸引ポンプまたは他の類似のデバイスにより膜から抜き取ることができる。癌胎児性フィブロネクチンは、例えば、膜を乾燥させる、または膜に紫外線を当てることを含む、公知のいずれかの方法により、膜に固定することができる。また、このような膜を洗浄し、膜に固定されなかった物質を除去することもできる。洗浄溶液は当技術分野で公知であり、Ｔｗｅｅｎ−２０などの陰イオン洗剤といった洗剤を含み得る。
【０６９１】
サンプルが加えられた膜は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることができる。一態様では、サンプルを加えた後、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を加える前に、この膜を、膜に対する付加的な非特異的結合を抑制する溶液で洗浄することができる。例えば、タンパク質（自己抗体を含む）検出の場合、膜を例えば、ＢＳＡまたはカゼインを含有する溶液で洗浄することができ、このＢＳＡまたはカゼインは、タンパク質と非特異的に結合し得る膜の残っている表面の全てに結合することができる。核酸検出の場合、膜を例えば、サケ精子ＤＮＡを含有する溶液で洗浄することができ、このサケ精子ＤＮＡは、核酸と非特異的に結合し得る膜の残っている表面の全てに結合することができる。非特異的結合を抑制する溶液で洗浄した後、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を加えることができる。膜上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の存在は、直接的または間接的に検出することができる。一例では、結合相手は、直接検出可能なシグナルを生じ得る部分とコンジュゲートさせることができる。
【０６９２】
フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が検出可能な部分とコンジュゲートされない場合には、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する結合相手を用いて間接的に検出することができ、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合するこの結合相手は、検出可能なシグナルを生じ得る部分とコンジュゲートさせることができるか、またはそれ自体に結合相手が結合することができる。例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はマウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体であってよく、このマウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体と結合する結合相手はセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体であり得る。
【０６９３】
検出可能なシグナルを生じ得る部分としては、放射性核種、蛍光分子、量子ドット、金属コロイドおよびタンパク質（緑色蛍光タンパク質、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど）が挙げられる。これらの部分は、蛍光分子の蛍光を検出することによるなど、直接検出することができる。また、これらの部分は、セイヨウワサビペルオキシダーゼにより触媒される化学発光を検出することによるなど、間接的に検出することもできる。膜上の別個の場所における部分の検出は、その別個の場所に適用されたサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示し得る。一態様では、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を、例えば、サンプルの複数の希釈液を２以上のドット位置に用い、各位置に存在する結合相手を検出するなど、公知の方法を用いて定量することができる。
【０６９４】
ｉｉ．ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または自己抗体の存在を検出するために使用することができる。ウエスタンブロット法は、まず、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルなどのゲルにタンパク質サンプルをロードすること、および公知の方法を用いてそのサンプルを電気泳動させることにより行う。ゲルの各レーンに一サンプルをロードすることができ、ゲルは複数のレーンを含み得る。一態様では、ゲルは、複数のサンプルアリコートを含み得る。複数のサンプルアリコートを用いる場合、アリコートは同一であっても異なっていてもよく、この場合、異なるアリコートはサンプルの希釈レベルが異なってもよいし、あるいは少なくとも１つの異なる試薬で処理されたアリコートであってもよい。例えば、異なるアリコートを異なる非特異的結合化合物または表面と接触させてもよいし、あるいは１以上の第一のアリコートは無処理とし、１以上の第二のアリコートを例えば、非特異的結合化合物を用いて処理してもよい。また、対照または参照サンプルをそのゲルに加えてもよい。次に、このゲルを公知の方法に従って電気泳動させることができる。
【０６９５】
次に、この電気泳動ゲルを調製した膜（当技術分野で公知の、また、ドットブロット分析に関して記載した通り）上に置き、公知の方法を用い、ゲルのタンパク質をその膜上にエレクトロブロットすることができる。次に、この膜を洗浄し、ブロックし、ドットブロット分析に関して記載したように、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を加えることができる。ドットブロット分析の場合と同様に、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、例えば、検出可能なシグナルを生じ得る部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を用いて直接検出することもできるし、あるいは、例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する結合相手コンジュゲートを用いて間接的に検出することもできる。
【０６９６】
膜の一レーンにおける部分からのシグナルの検出は、そのレーンにロードされたサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または自己抗体の存在を示し得る。さらに、そのレーンにおけるシグナルの場所を用いて、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が結合したサンプル成分の分子量を求めることもできる。この情報を用い、例えば、検出されたシグナルが癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または自己抗体（またはそのフラグメント）の予測された分子量に相当しない場合には、偽陽性シグナルを排除することができる。また、この情報を用い、例えば、Ｖ０、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５またはＶ１２０スプライス変異体間を識別することなど、例えば、存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質変異体の種類を特徴付けすることもできる。一態様では、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または自己抗体の量を公知の方法を用いて定量することができる。
【０６９７】
ｉｉｉ．サザンおよびノーザンブロット分析
サザンおよびノーザンブロット分析は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸またはその相補物の存在を検出するために使用することができる。癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸としては、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡまたはその増幅物（例えば、ｃＤＮＡ）およびそのフラグメントを含み得る。サザンおよびノーザンブロット分析は、まず、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルなどのゲルにＤＮＡ（サザン）またはＲＮＡ（ノーザン）サンプルをロードすること、および公知の方法を用いてそのサンプルを変性条件下で電気泳動させることにより行う。ゲルの各レーンに一サンプルをロードすることができ、ゲルは複数のレーンを含み得る。一態様では、ゲルは、複数のサンプルアリコートを含み得る。複数のサンプルアリコートを用いる場合、アリコートは同一であっても異なっていてもよく、この場合、異なるアリコートはサンプルの希釈レベルが異なってもよいし、あるいは少なくとも１つの異なる試薬で処理されたアリコートであってもよい。例えば、異なるアリコートを異なる非特異的結合化合物または表面と接触させてもよいし、あるいは１以上の第一のアリコートは無処理とし、１以上の第二のアリコートを例えば、非特異的結合化合物を用いて処理してもよい。また、対照または参照サンプルをそのゲルに加えてもよい。次に、このゲルを公知の方法に従って電気泳動させることができる。
【０６９８】
次に、この電気泳動ゲルを、ナイロン膜などの調製した膜（当技術分野で公知の、また、本明細書に記載の通り）上に置き、エレクトロブロット法、バキューム・ブロット法、セミドライ・エレクトロブロット法、双方向移動、および加圧を含む公知の方法を用い、ゲルの核酸分子をその膜上にブロットすることができる。
【０６９９】
次に、この膜を洗浄し、ブロックし、上記のように、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を加えることができる。ドットブロット分析の場合と同様に、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、検出可能なシグナルを生じ得る部分とコンジュゲートさせてもよいし、あるいは、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する結合相手コンジュゲートを使用することもできる。
【０７００】
膜の一レーン中の部分からのシグナルの検出は、そのレーンにロードされたサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンコード核酸またはその相補物またはそのフラグメントの存在を示し得る。さらに、そのレーンにおけるシグナルの場所を用いて、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が結合したサンプル成分の分子量を求めることもできる。この情報を用い、例えば、検出されたシグナルが癌胎児性フィブロネクチンコード核酸またはその相補物（またはそのフラグメント）の予測された分子量に相当しない場合には、偽陽性シグナルを排除することができる。また、この情報を用い、例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢおよび／またはＩＩＩＣＳのスプライス変異体またはその相補物を含む、または含まないとして癌胎児性フィブロネクチンを特徴付けすることもできる。
【０７０１】
また、シグナルの検出を用いて、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物の量を定量することもできる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンに相当するバンドの強度は、例えば、ホスフォイメージャー測定法を含む、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて測定することができる。一例では、既知濃度の標品もそのブロットに含め、１以上のサンプルバンドの強度を、公知の方法を用いて標品と質的または量的に比較し、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンコード核酸またはその相補物の量の概算または計算を行うことができる。
【０７０２】
ｉｖ．in situ分析
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、in situで決定することもできる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、組織または臓器サンプルにおいて検出することもできるし、または対象において検出することもできる。例えば、蛍光団とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を組織サンプルに適用することができ、その組織サンプル上の蛍光の検出が、その組織に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。別の例では、造影剤とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与することができ、対象における局在した造影剤シグナルの検出が、その対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子に存在と場所を示し得る。別の例では、対象の処置において、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手（所望により治療薬とコンジュゲートとしてもよい）を対象に投与することができる。
【０７０３】
対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するためのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを対象に投与する方法はまた、対象の処置のために使用することもできる。例えば、検出可能な胎児フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲート（放射性核種含有コンジュゲートなど）は公知の方法により検出することができ、また、対象の処置のために使用することもできる。検出および治療法の双方のために使用可能なコンジュゲートは当技術分野で公知である。
【０７０４】
一態様では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の使用に応じ、抗フィブロネクチンまたは抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体を使用することができる。例えば、抗フィブロネクチンまたは抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体を対象から取り出し、それに検出可能試薬および／または治療薬をコンジュゲートし、その後、その自己抗体を対象に投与して戻すことができ、この場合、この自己抗体コンジュゲートは検出可能なもの、治療用のもの、またはその双方のものとなり得る。
【０７０５】
ａ．組織または臓器サンプル
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、組織または臓器サンプルにおいてin situで決定することもできる。組織または臓器サンプルとしては、対象から取り出された生体物を含み、一般に、この生体物は細胞を含むか、または固体である。組織または臓器サンプルの一例として、生検またはパラフィン包埋組織サンプルがある。一態様では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを組織サンプルに適用することができ、組織サンプルと結合したコンジュゲートの検出が、その組織に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。このような方法に有用な様々なコンジュゲートは本明細書で提供されているか、または当技術分野で公知であり、蛍光部分、放射性核種、発色団、ラテックスマイクロスフェア、量子ドット、金属コロイド、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼなどの検出可能なシグナルを生じ得る酵素を含むコンジュゲートが挙げられる。別の態様では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を組織サンプルに適用することができ、組織サンプルと結合したフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の検出が、その組織に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の存在は、組織または臓器サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合する検出可能な化合物（限定されるものではないが、抗体またはオリゴヌクレオチドなど）と接触させることを含む様々な方法のいずれかを用いて検出することができる。例えば、サンプルを抗癌胎児性フィブロネクチンマウスモノクローナル抗体と接触させた場合、次に、このサンプルを、例えば、ルシフェラーゼなどの酵素とコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と接触させることができ、発光シグナルの存在が、サンプルと結合した抗癌胎児性フィブロネクチンマウスモノクローナル抗体が存在することを示し、それにより、そのサンプルに癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。
【０７０６】
組織または臓器サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を決定するには、用いるサンプル、検出する癌胎児性フィブロネクチン指標分子、ならびに用いる結合相手および結合相手検出法に応じて、様々な公知の組織化学的方法のいずれかを使用することができる。一般に、このような技術は通常、サンプルの調製または固定の工程、そのサンプル調製および癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法に対して適当な任意の固定後および／または抗原賦活工程、非特異的結合のブロックおよびその他の偽陽性をブロックする抗体（内因性ペルオキシダーゼのブロックなど）、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とのハイブリダイゼーション、洗浄、および直接または別の化合物を介して間接的にサンプルと結合したフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の検出の工程を含む。限定されるものではないが、ホルムアルデヒドでのサンプル固定とそのサンプルのパラフィン包理、アセトン中でのサンプル固定とそのサンプルのパラフィン包理、およびパラホルムアルデヒド中でのサンプル固定と液体窒素中でのそのサンプルの急速冷凍を含む、組織または臓器サンプル調製のための当技術分野で公知の方法はいずれも使用可能である。癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法は、検出する癌胎児性フィブロネクチン指標分子に応じ、様々な周知の方法のいずれかに従って行うことができる。一例において、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそのフラグメントを検出する場合、ＦＤＣ−６またはＢＣ−１といった抗癌胎児性フィブロネクチン抗体などのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を用いた標準的な免疫組織化学的方法を行うことができる。別の例において、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはそのフラグメントを検出する場合、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的なオリゴヌクレオチドを用いた標準的なヌクレオチドin situハイブリダイゼーション法（例えば、ＦＩＳＨ）を行うことができる。サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するためには、種々の公知の造影方法が使用可能である。一例では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するために、共焦顕微鏡を使用することができる。
【０７０７】
フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手（例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドプローブ）は、決定する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特性に応じて選択することができる。例えば、ＩＩＩＣＳを含む癌胎児性フィブロネクチンの存在を決定する場合、ＦＤＣ−６またはＸ１８Ａ４などの抗体を用いてもよいし、またはＩＩＩＣＳ領域の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。同様の、癌胎児性フィブロネクチン結合相手の選択を、サンプル中のＥＤＡまたはＥＤＢ含有癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を決定するためにも、また、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子内の、ＩＩＩＣＳの種々のスプライス変異体の存在を決定するためにも使用することができる。癌胎児性フィブロネクチン結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または自己抗体とも結合することができ、その対象における癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の翻訳後修飾を示し得る。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の２以上の異なる領域の存在を検出することができる２以上の癌胎児性フィブロネクチン結合相手の組合せを使用することができる。一例では、複数のオリゴヌクレオチドを用いて、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子を検出することができる。例えば、５つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＥＤＡを含む癌胎児性フィブロネクチン、ＥＤＢを含む癌胎児性フィブロネクチン、ＩＩＩＣの１つ目の２５アミノ酸のスプライス領域を含む癌胎児性フィブロネクチン、ＩＩＩＣＳの２つ目の６４アミノ酸のスプライス領域を含む癌胎児性フィブロネクチン、およびＩＩＩＣＳの３つ目の３１アミノ酸のスプライス領域を含む癌胎児性フィブロネクチンの存在を決定することができ；あるいは、１０個の増幅プライマーを用いて、標準的な核酸増幅法を用い、これらの５領域の存在を決定することができる。本明細書で開示されている、または当技術分野で公知の癌胎児性フィブロネクチン結合相手は単独で用いてもよいし、または、例えば、２以上の癌胎児性フィブロネクチン結合相手、３以上の癌胎児性フィブロネクチン結合相手、４以上の癌胎児性フィブロネクチン結合相手、または５以上の癌胎児性フィブロネクチン結合相手と組み合わせて用いてもよい。一態様では、各々異なる癌胎児性フィブロネクチン結合相手は違った検出が可能であり、例えば、各々異なる癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、他の蛍光部分とは異なる極大波長で蛍光を発する蛍光部分を含み得る。
【０７０８】
組織サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための様々な方法が当技術分野で公知である。例えば、組織サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を検出するために、抗体を使用することができる。使用可能な抗体としてＦＤＣ−６があり、これは、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、甲状腺癌、下垂体癌、眼の癌、脳の癌、口腔癌、皮膚癌、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、肉腫および神経芽腫を含む、対象において様々な癌（新生物性疾患）を検出するために使用することができる。一例では、ＦＤＣ−６は、乳癌などの癌性組織サンプルにおいてグリコシル化ＩＩＩＣＳを含む癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を検出するために使用することができる(Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 59:11−16 (1994))。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合する他の抗体も使用可能である。例えば、ＢＣ−１は、脳の髄膜腫および肺癌などの癌性組織サンプルにおけるＥＤＢ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を検出するために使用することができ(Carnemolla et al., J. Cell. Biol. 108:1139−1148 (1989))、Ｌ１９は、マウスの腫瘍組織におけるＥＤＢ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を検出するために使用することができ(Borsi et al., Int. J. Cancer 102:75−85 (2002))、５Ｃ１０は、口腔扁平上皮癌などの癌性組織サンプルにおけるグリコシル化ＩＩＩＣＳ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を検出するために使用することができ(Lyons et al., Br. J. Oral Maxillofac. Surg. 39:471−477 (2001))、Ｘ１８Ａ４は、卵巣癌などの癌性組織サンプルにおけるＩＩＩＣＳ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を検出するために使用することができ(Menzin et al., Cancer 82:152−158 (1998))、また、ＩＳＴ−９は、甲状腺乳頭腺癌などの癌性組織サンプルにおけるＥＤＡ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を検出するために使用することができる(Scarpino et al., J. Pathol. 188:163−167 (1999))。別の例では、ＩＳＴ−９およびＢＣ−１は、肝細胞癌におけるそれぞれ癌胎児性フィブロネクチンタンパク質内のＥＤＡおよびＥＤＢの存在を検出するために使用することができる(Oyama et al., Cancer Res. 53:2005−2011 (1993))。特定の新生物性疾患と癌胎児性フィブロネクチンタンパク質結合相手とのその他の組合せは経験的に決定することができる。
【０７０９】
また、核酸プローブは、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸のin situ検出のために使用することもできる。例えば、核酸プローブを用い、甲状腺乳頭腺癌および未分化癌などの癌性組織サンプルにおけるＩＩＩＣＳ含有癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡの存在を検出することができる(Takano et al., Br. J. Cancer 78:221−224 (1998))。別の例では、核酸プローブを用い、口腔扁平上皮癌などの癌性組織におけるＥＤＢ含有癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡの存在を検出することができる(Kosmehl et al., Br. J. Cancer 81:1071−1079 (1999))。特定の新生物性疾患と癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子結合相手とのその他の組合せは経験的に決定することができる。
【０７１０】
ｂ．対象での検出
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象においてin vivoで決定することができる。子宮頸腫瘍組織（本明細書で示されている）などの様々な腫瘍組織が癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を発現する。さらに、本明細書で示されるように、癌胎児性フィブロネクチンを発現する、または正常な細胞または組織よりも高い量の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を発現する細胞または組織が新生細胞または組織へと進展することがあり、または新生細胞または組織へ進展する高い可能性を有することがある。よって、対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを投与することにより、腫瘍組織、または腫瘍組織へ進展する可能性が高い組織を特異的にターゲッティングすることができる。本実施例によれば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを対象に投与することができ、対象のある場所におけるコンジュゲートの検出は、その場所に癌胎児性フィブロネクチンの発現が存在することを示し得る。例えば、対象の腫瘍組織は、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、そのコンジュゲートを腫瘍組織、またはその近傍の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に局在させ、その後、対象内のコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象の腫瘍組織を造影することにより造影することができる。別の例では、腫瘍組織へと進展中の組織、または進展する可能性がある組織を、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、コンジュゲートを腫瘍組織へと進展中の組織、または進展する可能性がある組織、またはその近傍の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に局在させ、その後、対象内のコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象の、腫瘍組織へと進展中の組織、または進展する可能性がある組織を造影することにより造影することができる。このような場合、コンジュゲートは、腫瘍性組織または前腫瘍組織自体に局在させることもできるし、または腫瘍性組織または前腫瘍組織に隣接する細胞外マトリックスまたは血管系に局在させることもできる。さらに、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを対象に投与することができ、対象のある場所におけるコンジュゲートの検出は、その場所に癌性（腫瘍性または新生物性）細胞、または癌性細胞へ進展する可能性が高い細胞が存在することを示し得る。例えば、対象の癌性（腫瘍性または新生物性）細胞は、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、そのコンジュゲートを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む癌性（腫瘍性または新生物性）細胞に局在させ、その後、対象内のコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象の癌性（腫瘍性または新生物性）細胞を造影することにより造影することができる。別の例では、癌性（腫瘍性または新生物性）細胞へと進展中の細胞、または進展する可能性が高い細胞を、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌��児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、そのコンジュゲートを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む、癌性（腫瘍性または新生物性）細胞へと進展中の細胞、または進展する可能性が高い細胞に局在させることにより造影し、その後、対象内の、そのように造影された対象の癌性（腫瘍性または新生物性）細胞へと進展中の細胞、または進展する可能性が高い細胞への局在化を検出することができる。また、本明細書では、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を対象に投与し、それにより、そのコンジュゲートを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象の領域に局在させ、その後、対象内のコンジュゲートの局在を検出し、それにより、対象における癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することにより、対象において癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための方法も提供される。
【０７１１】
磁気共鳴画像法もしくは他の共鳴法、超音波画像法、蛍光画像法、シンチノグラフィー、またはコンピューター体軸断層撮影法、陽電子放射型断層撮影法、単光子放射型コンピューター断層撮影法、超音波断層撮影法もしくはＸ線断層撮影法などのコンピューター断層撮影法を含む様々な非侵襲的造影方法が当技術分野で公知である。例えば、テクネチウム（Ｔｃ）−９９ｍで標識されたＢＣ−１は、対象の脳腫瘍におけるＥＤＢ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示すために使用することができ(Calcagno et al., Cancer 80:2484−2489 (1997))、また、１２３Ｉ−標識−Ｌ１９は、対象の肺癌または結腸直腸癌におけるＥＤＢ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示すために使用することができる(Santimaria et al., Clin. Cancer Res. 9:571−579 (2003))。別の例では、蛍光団Ｃｙ５で標識されたＬ１９は、眼の脈管形成におけるＥＤＢ含有癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在のin vivo蛍光指標用に使用することができる（米国特許公開第２００３００４５６８１号）。
【０７１２】
本明細書で提供される、または当技術分野で公知の造影方法で使用可能な化合物としては、一般に、造影部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が挙げられる。例えば、ＦＤＣ−６は、陽電子放射型断層撮影法によって検出可能な１８Ｆとコンジュゲートさせることができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手タンパク質、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手核酸分子およびフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手有機分子を含む、本明細書で開示されている、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々なフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はいずれも本明細書で提供される処置方法で使用することができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチンのＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ領域、またはＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５もしくはＶ１２０など）、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の特定の翻訳後修飾（ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化など）、またはそれらの組合せと特異的に結合する結合相手であってもよい。一般に、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、対象内で癌胎児性フィブロネクチンが存在する１以上の部位（例えば、前立腺、肺、脳、乳房、卵巣、甲状腺、子宮頸または膀胱）に局在するために十分な時間、かつ、本明細書で提供される、または当技術分野で公知の１以上の造影法によって造影するために十分な時間、対象内に存在することができる結合相手である。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はまた一般に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と優先的に結合するので、造影方法により、対象内の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の場所を決定することができる。in vivo造影の使用可能な癌胎児性フィブロネクチン結合相手の一例が、ＦＤＣ−６、ＢＣ−１、ＭＥ４ＣまたはＬ１９などの抗体である。一態様では、この抗癌胎児性フィブロネクチン抗体は「ヒト化」、すなわち、ヒト定常ドメインおよび／または可変ドメインを有するキメラ抗体であってもよいし、またはそうでなければヒト抗体源もしくはヒト抗体配列（Ｌ１９など）から誘導された抗体であってもよい。ＷＯ９７／４５５４４およびＷＯ０２／４６４５５に例示されているように、例えば、ファージディスプレーまたは抗体発現細菌の濾過選抜を用い、ヒト抗体源またはヒト抗体配列から抗体を誘導する方法が当技術分野で公知である。米国特許第６，６３２，９７６号および同第６，７１３，６１０号に例示されているように、例えば、ヒト抗体配列を発現するトランスジェニック動物を用い、ヒト抗体配列から抗体を誘導する方法が当技術分野で公知である。
【０７１３】
in vivo検出方法に用いるためのコンジュゲートは一般に、造影を可能とする部分を含む。蛍光部分、放射性核種、磁気検出可能な同位元素または化合物、超音波造影剤、発色団、ラテックスマイクロスフェア、または量子ドットを含む様々な造影部分が当技術分野で公知である。この部分は用いる造影法に応じて選択することができる。例えば、限定されるものではないが、ペルフルオロ炭素を満たしたアルブミンマイクロスフェア（例えば、米国特許第６，１７４，２８７号）などのペルフルオロ炭素含有マイクロスフェアまたはペルフルオロ炭素ガスを満たしたリン脂質コート微小気泡（例えば、米国特許第６，１４６，６５７号）を含む、また、シメチコンコートセルロース（例えば、米国特許第６，０２４，９３９号参照）またはガラクトースおよびパルミチン酸微粒子（例えば、米国特許第５，３８０，４１１号参照）などの他の造影剤を含む、様々な超音波造影剤が当技術分野で公知である。別の例では、限定されるものではないが、１３１Ｉ、１８Ｆ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、１１１ＩｎおよびＴｃ−９９ｍを含有する化合物を含む様々なコンピューター断層撮影法造影剤が当技術分野で公知である。別の例では、限定されるものではないが、鉄、マンガンもしくはガドリニウム含有錯体などの金属錯体、または自然界では存在量が低く、核磁気モーメントを有する原子を含有する他の化合物、例えば、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１９Ｆ、２９Ｓｉ、または３１Ｐを含有する化合物を含む様々な磁気共鳴造影剤が当技術分野で公知である。別の例では、生物発光酵素（例えば、ルシフェラーゼ）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、蛍光団、色素、ラテックスマイクロスフェアおよび量子ドットを含む様々な発光化合物または蛍光化合物のいずれかが使用可能である。別の例では、限定されるものではないが、硫酸バリウムなどのバリウム化合物、およびヨーダミド、ヨージパミドおよびイオグルカム酸などのイオン化合物、ならびにメトリザミド、イオヘキソール、イオプロミド、イオビトリドール、イオメプロール、イオベルソール、イオキシラン、イオジキサノール、イオトロランなどの非イオンヨウ素化合物を含むヨウ素化合物を含む様々なＸ線造影剤のいずれもが使用可能である。
【０７１４】
検出可能な部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、限定されるものではないが、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手および検出可能な部分の性質、造影する対象の身体領域、選択された投与速度ならびに意図しないクリアランスの可能性を含む当業者に公知の様々な因子に従い、化合物を対象に送達するための当技術分野で公知の様々な方法のいずれかで対象に投与することができる。一態様では、このコンジュゲートを対象に静脈投与することができる。別の態様では、このコンジュゲートを、例えば、洗浄組成物の成分として、またはクリーム、膏薬もしくはゲルとして局所投与する。このコンジュゲートはまた、限定されるものではないが、皮膚表面、口腔表面、耳表面、鼻腔表面、肛門表面、尿道表面、眼表面、乳房表面、頸膣表面、消化管表面（食道表面、胃表面、腸表面、または結腸表面など）を含む様々なその他の表面に局所投与することもできる。局所適用の例としては、膣腔および子宮腔にコンジュゲートを接触させること、または１以上の乳管にコンジュゲートを接触させることが挙げられる。
【０７１５】
本明細書で提供される方法はまた、特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子変異体を含む細胞または組織を造影することを含み得る。例えば、造影は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ領域、またはＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５もしくはＶ１２０など）、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の特定の翻訳後修飾（ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化など）、またはそれらの組合せと特異的に結合する癌胎児性フィブロネクチン結合相手を用いて行うことができる。よって、細胞または組織は、その細胞または組織がＥＤＡ、ＥＤＢもしくはＩＩＩＣＳ、またはＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５もしくはＶ１２０など）、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の特定の翻訳後修飾（ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化など）、またはそれらの組合せを含む癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含むかどうかによって、特異的に造影することができる。
【０７１６】
ｃ．対象の処置
また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象のin vivo処置のために使用することもできる。様々な腫瘍組織が癌胎児性フィブロネクチンを発現、放出および／または分泌することが知られている。よって、対象にフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを投与することにより、癌性（腫瘍性）組織を特異的にターゲッティングすることができる。本明細書で示されるように、癌性組織へと進展中の、または癌性組織へと進展するリスクが高い組織は癌胎児性フィブロネクチンを発現する。よって、対象にフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを投与することにより、癌性組織へと進展中の組織、または癌性組織へと進展するリスクが高い組織を特異的にターゲッティングすることができる。本態様によれば、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを対象に投与することができ、この結合相手またはコンジュゲートは、腫瘍組織、または新生物性組織へと進展中の組織もしくは癌性組織へと進展するリスクが高い組織の場所またはその近傍など、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含む対象内の場所に蓄積することができる。例えば、このコンジュゲートは、腫瘍性組織自体、または腫瘍性組織に隣接する細胞外マトリックスもしくは血管系に局在させることができる。別の例では、このコンジュゲートは、癌性組織へと進展中の組織もしくは癌性組織へと進展するリスクが高い組織自体、または癌性組織へと進展中の組織もしくは癌性組織へと進展するリスクが高い組織に隣接する細胞外マトリックスもしくは血管系に局在させることができる。さらに、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを対象に投与することができ、その結合相手またはコンジュゲートは、癌性細胞を含む対象内の場所に蓄積することができる。よって、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを対象に投与することができ、この結合相手またはコンジュゲートは、癌性細胞へと進展中の細胞または癌性細胞へと進展するリスクが高い細胞を含む対象内の場所に蓄積することができる。この局在した結合相手またはコンジュゲートは、次に、直接的または間接的に、その場所で細胞増殖を阻害するか、またはその場所で細胞死を誘発するか、またはその場所で細胞の癌性細胞への進展を阻害することができる。
【０７１７】
細胞増殖は、限定されるものではないが、局部的な新血管新生量の低下、または細胞増殖を促進するプロセスのダウンレギュレーションを含む様々な方法のいずれかにより阻害することができる。細胞死は、対象の免疫応答の増強、アポトーシスシグナルの生成もしくはそれ以外の方法でのアポトーシスの開始、またはジフテリア毒もしくは放射性核種もしくは化学療法物質などの毒素もしくは有毒物質の適用を含む様々な方法のいずれかにより誘発することができる。
【０７１８】
フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は単独で、腫瘍阻害または細胞死応答を誘発することができ、あるいは、細胞増殖を阻害するか、または細胞死を促進する部分を含むフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートが腫瘍阻害または細胞死応答を誘発することができる。タンパク質であるフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、核酸分子であるフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、および有機分子であるフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む、本明細書で開示されている、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々なフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はいずれも、本明細書で提供される処置方法で使用可能である。この癌胎児性フィブロネクチン結合相手はまた、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ領域、またはＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５もしくはＶ１２０など）、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の特定の翻訳後修飾（ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化など）またはそれらの組合せと特異的に結合する結合相手であってもよい。一例では、この癌胎児性フィブロネクチン結合相手は抗癌胎児性フィブロネクチン抗体であってもよく、この抗癌胎児性フィブロネクチン抗体は、標的細胞または標的組織に、またはその近傍に局在した癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合し、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が局在した場所において少なくとも一部の細胞の細胞死をもたらし得る対象の免疫系による免疫応答を惹起することができる。別の例では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合し、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の１以上の活性を阻害し、その結果、細胞増殖の阻害をもたらすことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子と結合するフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンの発現を阻害し、その結果、細胞増殖の阻害をもたらすことができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質と結合するフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチンの結合特性を変更、阻害、または調節し、その結果、細胞増殖を阻害することができる。本目的で、細胞増殖を阻害しない、または細胞死を誘発しない部分とコンジュゲートされたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手単独の場合と同様の細胞増殖阻害作用または細胞死誘発作用を持ち得る。一般に、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、対象内で癌胎児性フィブロネクチンが存在する１以上の部位（例えば、前立腺、肺、脳、乳房、卵巣、甲状腺、結腸または直腸、子宮頸または膀胱）に局在するために十分な時間、かつ、例えば、対象において免疫応答を惹起することにより細胞増殖を阻害するか、または細胞死を誘発するために十分な時間、対象内に存在することができる結合相手である。in vivo処置に使用可能なフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の一例が、ＦＤＣ−６、ＢＣ−１、ＭＥ４ＣまたはＬ１９などの抗体である。一態様では、この抗体は「ヒト化」、すなわち、ヒト定常ドメインおよび／または可変ドメインを有するキメラ抗体であってもよいし、またはそれ以外の方法でヒト抗体源もしくはヒト抗体配列（Ｌ１９など）から誘導された抗体であってもよい。例えば、ファージディスプレーまたは抗体発現細菌の濾過選抜を用い、ヒト抗体配列から抗体を誘導する方法が当技術分野で公知である。例えば、ヒト抗体配列を発現するトランスジェニック動物を用い、ヒト抗体配列から抗体を誘導する方法が当技術分野で公知である。
【０７１９】
フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はまた、コンジュゲートとして投与することもできる。このコンジュゲートは一般に、細胞増殖を阻害するか、もしくは細胞死を促進する、または細胞増殖の阻害もしくは細胞死の促進を活性化させ得る、または細胞増殖を阻害するか、もしくは細胞死を促進する化合物を活性化させ得る治療部分を含む。所望により、この部分はまた、本明細書の他所で記載されているように、造影剤としての作用など、１以上の付加的特性を有していてもよい。限定されるものではないが、生物毒素、サイトカイン、光増感剤、毒素、抗癌抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、結合相手および生物発光化合物を含む様々な治療部分が当技術分野で公知である。例えば、治療部分は、限定されるものではないが、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒、リシン、コレラ毒、ゲロニン、赤痢菌毒、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、外毒素Ａ、アブリン毒またはサポリンなどの生物毒素であり得る（例えば、米国特許公報第２００４／０００９５５１号参照）。例えば、治療部分は、サイトカインなどのシグナル伝達化合物；またはインターロイキン（インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−６およびインターロイキン−１２など）などの増殖因子；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などの腫瘍壊死因子；インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）などのインターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；アンギオゲニン；または組織因子であり得る（例えば、米国特許公報第２００３０２３２０１０号参照）。例えば、治療部分は、限定されるものではないが、ポルフィロマイシン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、およびダウノルビシンなどの抗癌抗生物質であり得る（例えば、米国特許公報第２００４００５４０１４号参照）。例えば、治療部分は、限定されるものではないが、インドシアニングリーン、トルイジンブルー、アミノレブリン酸、タキサフィリン、ベンゾポルフィリン、フェノチアジン、フタロシアニン、ポルフィリン（ポルフィマーナトリウムなど）、クロリン（テトラ（ｍ−ヒドロキシフェニル）クロリンまたはスズ（ＩＶ）クロリンｅ６など）、プルプリン（スズエチルエチオプルプリンなど）、プルプリンイミド、バクテリオクロリン、フェオフォルビド、ピロフェオフォルビドおよび陽イオン色素などの光増感剤であり得る（例えば、米国特許公報第２００４００１９０３２号および同第２００３０１１４４３４号参照）。例えば、治療部分は、限定されるものではないが、３２リン酸塩、６０コバルト、９０イットリウム、９９テクネチウム(Technicium)、１０３パラジウム、１０６ルテニウム、１１１インジウム、１１７ルテチウム、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１３７セシウム、１５３サマリウム、１８６レニウム、１８８レニウム、１９２イリジウム、１９８金、２１１アスタチン、２１２ビスマスおよび２１３ビスマスを含有する化合物などの高エネルギー放射性核種であり得る。
【０７２０】
治療部分は、限定されるものではないが、５−フルオロウリジン、カリチェアミシンおよびマイタンシンなどの多数の化学療法化合物のいずれをも含む、様々な他の毒素も含み得る（例えば、米国特許公開番号２００２００３９５５７参照)。付加的化学療法化合物としては、限定されるものではないが、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド(trietylenephosphoramide)、トリエチレンチオホスホルアミド(triethylenethiophosphaoramide)およびトリメチルオロメラミンナイトロジェンマスタード（クロラムブシル(chiorambucil)、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなど）を含むエチレンイミンおよびメチルメラミン(methylamelamine)；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素(nitrosurea)；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチェアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナリン作用薬；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジ��；多糖−Ｋ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；シトシンアラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸塩；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記いずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン作用薬；およびフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン作用薬；ならびに上記いずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体といった腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害する働きをする抗ホルモン薬も含まれる。本明細書で使用可能なこのような化学療法化合物には、毒性によりその化合物が一般の全身化学療法に使用できない化合物も含まれる。
【０７２１】
治療部分はまた、抗体もしくはそのフラグメント、受容体もしくはそのフラグメント、または抗体もしくは受容体のリガンドなどの結合相手であってもよく、この場合、このような部分は、細胞増殖を阻害するか、または細胞死を誘発するための様々な物質または化合物のいずれとも結合することができる。結合相手は、例えば、毒素、化学療法化合物、または放射性核種含有化合物と結合することができる。結合相手はまた、例えば、白血球または免疫応答に関連する他の細胞上の細胞表面タンパク質などの細胞表面タンパク質と結合することもできる。例えば、結合相手は、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球と結合することができ、結合相手の一例としては、ＮＫ細胞のＦｃ受容体と結合することができるＩｇＧがある。治療部分はまた、細胞増殖を阻害するか、または細胞死を促進する化合物を活性化させることができる。例えば、治療部分は、ルシフェラーゼなどの生物発光体であってもよく、また、ルシフェリンや光増感剤などの適当な基質を対象に投与した際に、そのコンジュゲートの局在領域で光増感剤を活性化させ、その場所で細胞増殖を阻害するか、または細胞死を誘発することができる。
【０７２２】
治療部分は、コンジュゲートの結合相手部分から切断可能である。光切断可能な結合、化学切断可能な結合、熱切断可能な結合、酵素切断可能な結合を含む様々な切断可能な結合が当技術分野で公知である。例えば、結合は、光切断可能なビオチン誘導体またはプロテアーゼ感受性ペプチドによるジスルフィド結合を介したものであり得る（例えば、米国特許第６，４１６，７５８号参照）。一態様では、切断可能な結合を介して結合相手と結合した部分は、直接細胞増殖を阻害するか、または細胞死を誘導する部分である。
【０７２３】
フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートは、限定されるものではないが、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の性質およびフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートの治療部分の性質、処置する対象の身体領域、選択された投与速度ならびに意図しないクリアランスの可能性を含む当業者に公知の様々な因子に従い、化合物を対象に送達するための当技術分野で公知の様々な方法のいずれかで対象に投与することができる。一態様では、この結合相手またはコンジュゲートを対象に静脈投与することができる。別の態様では、この結合相手またはコンジュゲートを、例えば、洗浄組成物の成分として、またはクリーム、膏薬もしくはゲルとして局所投与する。この結合相手またはコンジュゲートはまた、限定されるものではないが、皮膚表面、口腔表面、耳表面、鼻腔表面、肛門表面、尿道表面、眼表面、乳房表面、頸膣表面、消化管表面（食道表面、胃表面、腸表面、または結腸表面など）を含む様々なその他の表面に局所投与することもできる。局所適用の例としては、膣腔および子宮腔に結合相手またはコンジュゲートを接触させること、または１以上の乳管に結合相手またはコンジュゲートを接触させることが挙げられる。
【０７２４】
本明細書で提供される方法はまた、特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子変異体を含む細胞または組織を処置することを含み得る。例えば、処置方法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ領域、またはＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５もしくはＶ１２０など）、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の特定の翻訳後修飾（ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化など）、またはそれらの組合せと特異的に結合する癌胎児性フィブロネクチン結合相手を用いて行うことができる。よって、細胞または組織は、ＥＤＡ、ＥＤＢもしくはＩＩＩＣＳ領域、またはＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体（Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５もしくはＶ１２０など）、または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の特定の翻訳後修飾（ＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化など）、またはそれらの組合せを含む癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含むことにより、特異的に処置することができる。
【０７２５】
本明細書で提供される方法はまた、対象における新生物性疾患の再発を抑制するための方法も含み得る。このような方法は、対象の新生物性疾患を処置すること、および対象にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与し、それにより、新生物性疾患の再発を抑制することを含み得る。対象の処置は、化学療法、放射線療法、細菌またはウイルスの投与、腫瘍特異的化合物の投与およびそれらの組合せ（フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の投与を含む）を含む当技術分野で公知の様々な方法のいずれかにより行うことができる。新生物性疾患の処置に加え、対象に、新生物性疾患の再発または転移を抑制する働きをし得るフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を投与することもできる。このような投与は新生物性疾患処置と同時であっても、逐次であっても、または間欠的であっても、またはその混合型であってもよい。
【０７２６】
ｃ．固定結合相手
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、サンプルを固体支持体と接触させて、そこにフィブロネクチン結合相手または癌胎児性フィブロネクチン結合相手を固定することにより検出することができる。そのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合、固定された結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子の複合体形成を検出することができる。固定された結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子の間の複合体の検出は、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。複合体の検出は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって達成することができる。一例では、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子の複合体形成は、「サンドイッチ」複合体を形成している複合体中の第二の結合相手（フィブロネクチンか、または癌胎児性フィブロネクチン結合相手かのいずれか）の存在を検出することにより検出することができる。結合相手は、直接的または間接的に検出することができる。結合相手の直接検出は、検出可能な部分とコンジュゲートされた、または結合可能な部分とコンジュゲートされた結合相手を用いて行うことができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間接検出は、そのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合することができ、かつ、検出可能なシグナルを生じることができるか、または別の結合相手が結合することができる結合相手を用いて行うことができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の複合体形成は競合アッセイにより検出することができる。例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を、標識された癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体と接触させた後にサンプルと接触させることができ、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する場合には、結合相手との複合体における標識癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体の存在量が少なくなる。従って、競合アッセイにおけるシグナルの消失により、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出することができる。
【０７２７】
フィブロネクチン結合相手または癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、本明細書で提供される方法で用いるための公知の方法により、固体支持体上に固定することができる。結合相手が固定可能な固体支持体は、結合相手が直接結合することができるか、またはリンカーもしくはコーティングを介して結合することができる様々な支持体のいずれであってもよい。固体支持体の例としては、マイクロプレート、マイクロアレイ、またはニトロセルロース膜、ポリビニリジンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜もしくはナイロン膜などの膜が挙げられる。例えば、結合相手は無処理マイクロプレート、または結合相手の結合のための化合物でコートしたマイクロプレートを含む処理済みマイクロプレート上に固定することができる。サンプルを固体支持体上に固定するための方法は当技術分野で公知であり、本明細書の方法で使用することができる。
【０７２８】
その上に固定されているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む固体支持体には、その固体支持体をサンプルと接触させる前に、１以上の処理工程を行うことができる。このような処理工程は、固体支持体の表面をサンプルの１以上の成分が非特異的に結合することを防ぐためのブロッキング工程を含む。固体支持体には、当技術分野で公知の様々なブロッキング工程のいずれかを、また、固体支持体を、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質アッセイでは非特異的結合タンパク質、また、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物のアッセイでは非特異的結合核酸分子などの非特異的結合化合物と接触させる工程も適用することができる。
【０７２９】
サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む固体支持体に接触させる前に、サンプルを、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の１以上の工程で処理することができる。処理工程の例としては、粒状物を除去するためのサンプルの濾過、固定された結合相手に対するバックグラウンド物質の結合を低減させるためのサンプルと非特異的結合化合物または表面との接触、サンプル溶液への可溶性または可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートの添加、およびｐＨまたはイオン強度などの周囲条件を改変するための１以上のバッファーまたは試薬の添加が挙げられる。
【０７３０】
処理サンプルまたは無処理サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができる条件下で固体支持体に接触させることができる。一態様では、この固体支持体を、バックグラウンド物質が、固体支持体と癌胎児性フィブロネクチンとの結合を有意には妨げない（すなわち、固体支持体上の１０％もしくは約１０％以下の結合相手しかバックグラウンド物質と結合しない、または固体支持体上の結合相手が、サンプル中の９０％もしくは約９０％以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に結合する）条件下でサンプルと接触させる。条件の例としては、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニン、および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が挙げられる。この固体支持体は、所望により、固体支持体と非特異的に結合し得るバックグラウンド物質を除去するために洗浄してもよい。
【０７３１】
ドットブロット、マイクロプレートまたはマイクロアレイの場合など、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が２以上の別個の場所に固定される場合には、別個の各場所は独立に処理することができるし（この場合、全ての場所に異なる処理を施すことができる）、あるいはいくつかの場所には同じ処理を施し、他の場所には異なる処理を施すこともできる。処理の例としては、サンプルの種々の希釈液と接触させること、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣなどの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の異なる領域と結合する結合相手を含む、異なる可溶性または可動性の結合相手と接触させること、および異なるバッファー条件下で接触させることが挙げられる。このような方法は当業者に公知である。
【０７３２】
結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子の複合体形成は、いくつかの方法で決定することができる。複合体形成は、可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の使用により決定することができる。可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、結合相手とコンジュゲートされた検出可能な部分を用いて直接検出することもできるし、あるいはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する結合相手を用いて間接的に検出することもできる。このアッセイは定量的であってもよく、例えば、少なくとも第一のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が固体支持体に固定され、少なくとも第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が可溶性または可動性である酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であってもよい。癌胎児性フィブロネクチンアッセイは競合阻害に基づくものであってもよく、この場合、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手をめぐって、既知量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその類似体（一般に、標識されている）と、競合する。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に関するアッセイでは、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質が、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手をめぐって、既知量の標識癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはその標識類似体と競合し得る。固体に付着しているか、または溶液中に留まっている標識癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を測定することができ、この測定値を用いて、当技術分野で公知の方法を用い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を求めることができる。
【０７３３】
また、シグナルの検出を用いて、公知の様々な方法のいずれかを用い、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を定量することもできる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に相当するシグナルの強度は、例えば、蛍光もしくは吸収分光光度法、またはホスフォイメージャー測定法を含む、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて測定することができる。一例では、既知濃度の標品も含め、１以上のサンプルシグナルの強度を、公知の方法を用いて標品と質的または量的に比較し、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の概算または算出を行うことができる。別の例では、複数のサンプル希釈液を検出することができ、各希釈液で測定されたシグナルを用いて、公知の方法を用い、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を概算することができる。
【０７３４】
ｉ．サンドイッチアッセイ
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、２以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合し、このような複合体が複合体形成の指標となるシグナルを生じ得る場合に検出することができる。例えば、固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合した癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子との複合体形成の結果として、固体支持体と結合した可溶性または可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートの存在を検出することにより検出することができる。検出は、固体支持体をサンプルと接触させた後すぐ、または洗浄工程などの１以上の次工程の後に行うことができる。無標識の可溶性または可動性フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを加えるアッセイでは、所望により、固体支持体を洗浄し、この固体支持体を、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する結合相手などの１以上の付加的試薬と接触させることもできる。
【０７３５】
ある場合には、可動性または可溶性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は直接的または間接的のいずれかで検出される。直接検出は、例えば、可動性または可溶性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とコンジュゲートされた検出可能な部分を検出することを含み得る。間接検出は、例えば、可動性または可溶性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する結合相手を検出することを含み得る。例えば、可溶性マウス抗癌胎児性フィブロネクチン抗体の間接検出は、固体支持体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と接触させること、および適当な基質を用いて光の生成を測定することにより行うことができる。上記アッセイのいずれにおいても、固体支持体上の検出可能なシグナルの存在は、可溶性結合相手が、固定された結合相手に結合している癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合していることを示し得る。従って、固体支持体上の検出可能なシグナルの存在は、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。
【０７３６】
当業者ならば理解できるように、この固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とサンプルと可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はいずれの順序で加えてもよい。例えば、サンプルを可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手で処理した後、そのサンプルを固体支持体（固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む）と接触させることができ、次工程は、この固体支持体を、可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含むサンプルと接触させることを含み得る。別の例では、サンプルを固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む固体支持体と接触させた後、そのサンプルを可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることができ、次工程は、その固体支持体を可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させることを含み得る。別の例では、固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む固体支持体を可溶性または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させた後、いずれかの結合相手をそのサンプルと接触させることができ、次工程は、その固体支持体をサンプルと接触させることを含み得る。
【０７３７】
ｉｉ．試験デバイス
試験デバイスは、固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含み得る。シグナルを生じさせるために使用可能な、またはそれからシグナルが生じ得る試験デバイスは、本明細書で提供される方法、組合せおよびキット（例えば、水平流動形式および垂直流動形式）の一部としての使用が意図される。試験デバイスは、試験ストリップと、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を決定するために用いる１以上の付加的成分とを含み得る。
【０７３８】
ａ．試験ストリップ
試験ストリップは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示すために試験デバイスにおいて使用することができる。検出可能なシグナルを生じ得る試験ストリップ、例えば、視診可能なまたはリーダーに適合した試験ストリップはいずれも、本明細書で提供される方法、組合せおよびキットで使用することができる。当業者に知られているように、このような試験ストリップデバイスおよび使用方法は、本明細書で記載される系で使用することができる（例えば、米国特許第６，３９４，９５２号、同第６，２６７，７２２号、同第５，６５８，８０１号、同第５，６５６，５０３号、同第５，６５６，５０２号、同第５，６５４，１６２号、同第５，６２２，８７１号、同第５，５９１，６４５号、同第５，５７８，５７７号、同第５，５００，３７５号、同第５，２７０，１６６号、同第５，２５２，４５９号、同第５，２０９，９０４号、同第５，１４９，６２２号、同第５，１３２，０９７号、同第５，１２０，６４３号、同第５，０７３，４８４号、同第４，９６０，６９１号および同第４，９５６，３０２号参照）。
【０７３９】
試験ストリップは一般に、液体サンプル流に適合し、そこに固定されている、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手および／またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを含む領域を含む。試験ストリップはまた、サンプルを適用するための領域、サンプルから粒状物または固形物または不溶物を除去するための領域、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と非特異的に結合し得るバックグラウンド物質を除去するための領域、非特異的結合化合物を含む領域、サンプルとの接触時に可動化され得るフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを含む領域、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートと特異的に結合することができる結合相手を含む領域、およびそれらの組合せなど、１以上の付加的領域も含み得る。
【０７４０】
試験ストリップは、液体流路を規定する膜系を含み得る。試験ストリップおよび試験系の例としては、ラピッドｆＦＮカセットおよびｆＦＮ膜イムノアッセイが挙げられる。試験ストリップは視診することもできるし、または米国特許第６，２６７，７２２号および同第６，３９４，９５２号に記載のケアデバイスのポイントなど、試験ストリップリーダーを併用することもできる。
【０７４１】
リーダーを使用する場合、リーダーにより１以上の測定値を得、この１以上の測定値に対して、画像再構成またはそうでなければ画像分類など、さらなる解析を行うことができる。反射率データの処理法および画像分類法は、米国特許第６，２６７，７２２号に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０７４２】
試験ストリップ測定の結果および／または画像分類の結果は単独で使用することもできるし、あるいは対象のさらなる試験または処置の指針を得るべく様々なデータまたは情報を解析することができるニューラルネットワークなどの意志決定支援システムに入力された他の情報と併用することもできる。このようなニューラルネットは通常、患者のデータまたは情報、一般には患者の履歴または臨床データを解析するものである（例えば、米国特許第６，６７８，６６９号および同第６，２６７，７２２号参照）。
【０７４３】
本明細書の方法で使用可能なものとして、水平流動試験イムノアッセイデバイスがある。このようなデバイスでは、膜系が試験ストリップに単一の液体流路を形成する。この膜系は、免疫反応の固体支持体として働く成分を含む。例えば、多孔性または吸水性または吸収性部材を一部重複するようにストリップ上に配置することもできるし、またはストリップに沿って液体を伝達するために単一の部材を使用することもできる。これらの膜部材は、プラスチック基板などの基板で裏打ちすることができる。一例としての態様では、試験ストリップは、ガラス繊維パッド、ニトロセルロースストリップおよびプラスチック基板で裏打ちされた吸収性のセルロースペーパーが挙げられる。
【０７４４】
フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手および／またはそのコンジュゲートは、固体支持体上に固定することができる。これらの結合相手またはコンジュゲートは、吸着、イオン結合、ファンデルワールス吸着、静電気結合により、またはグルタルアルデヒドなどのカップリング剤を用いることで共有結合により、試験ストリップに結合させることができる。例えば、これらの結合相手またはコンジュゲートは、シリンジポンプ、エアブラシ、セラミックピストンポンプまたはドロップオンデマンド型ディスペンサーなどの標準的な分注法を用い、コンジュゲートパッドおよびニトロセルロースストリップに適用することができる。一態様では、計量式セラミックピストンポンプディスペンサーを用いて、ガラス繊維コンジュゲートパッドおよびニトロセルロースストリップに、標識結合相手コンジュゲートを含む目的分析物と結合する結合相手を縞状配置する。
【０７４５】
試験ストリップは、それ以外に、例えば、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを含む試薬に固定を補助するために糖で、あるいは試験ストリップ上の非特異的結合部位をブロックするために、アルブミン（ウシ（ＢＳＡ）を含む）、免疫タンパク質、他の動物タンパク質、水溶性ポリアミノ酸、またはカゼインなどのタンパク質で処理することができる。一態様では、標識フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートと結合することができる結合相手が試験ストリップ上に固定されるが、このような結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と複合体を形成しない標識フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートと結合することができ、これにより、対照として使用することができる。例えば、標識コンジュゲートがマウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体を含む場合、ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いてコンジュゲートと結合させることができる。
【０７４６】
所定の液体サンプル流路を用いる試験ストリップでは、試験ストリップは２以上の独立した領域を含むことができ、この場合、サンプルは第一の領域と接触した後に第二の領域と接触する。一般に、全ての領域が、液体サンプルの少なくとも一部がその領域を通過することができ、かつ、適用可能であれば、そこに固定されている結合相手と相互作用することができるように、液体サンプルを収容することができる。例えば、試験ストリップは、サンプルを適用するための領域と固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む領域を含むことができ、この場合、サンプルはサンプル適用領域と接触した後に結合相手領域と接触する。
【０７４７】
試験ストリップは、サンプルを適用するための領域を含み得る。この領域はサンプル適用領域と呼ぶことができる。この領域は、サンプルが最初に接触する領域である。この領域は、液体サンプルを収容することができる固体構造を形成させるための様々な物質のいずれかから形成することができる。この領域はまた、濾過領域、非特異的表面領域、または本明細書に記載の他の領域などの１以上の付加的領域のための部位であってもよい。
【０７４８】
試験ストリップは、試験ストリップ上に固定されている、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを含む領域を含み得る。この領域はフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域と呼ぶことができる。一般に、固定された結合相手またはコンジュゲートは、液体サンプルが固定された結合相手またはコンジュゲートと相互作用可能なように液体サンプルを適合させることができる領域内にある。固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はサンプルと反応して、それぞれフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができる。よって、試験ストリップのこの領域は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が１以上のフィブロネクチンおよび／または癌胎児性フィブロネクチン結合相手と複合体を形成する領域であり得る。結合相手の例としては、ポリクローナル抗フィブロネクチン抗体、モノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体、ヘパリン、コラーゲン、インテグリン、フィブリン、または癌胎児性フィブロネクチンヌクレオチド配列に相補的な核酸が挙げられる。結合相手の他の例としては、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸に対する自己抗体と結合することができる癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはそのフラグメントがある。
【０７４９】
試験ストリップはまた、濾過領域も含み得る。濾過領域は、サンプル中に存在する、カットオフサイズよりも大きい粒状物、固形物または不溶物が試験ストリップを進まないように物理的に遮断する領域であり得る。濾過可能な物体の例としては、細胞、粘液、残渣、および不溶物が挙げられる。カットオフサイズは、サンプルから除去する選択物質に応じて様々なサイズのいずれであってもよい。例えば、カットオフフィルターサイズは、１０ｍｍ、５ｍｍ、１ｍｍ、５００μｍ、２００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．２μｍもしくは０．１μｍ、または約１０ｍｍ、５ｍｍ、１ｍｍ、５００μｍ、２００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、２０μｍ、１０μｍ、５μｍ、２μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．２μｍもしくは０．１μｍであり得る。濾過領域は、ガラス（例えば、ガラスウール）、セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリ塩化ビニル、テフロンおよび選択されたカットオフサイズと特性を有する他のいずれかの物質を含む、粒状物の濾過に用いられる様々な物質のいずれから形成できる。一態様では、濾過物質は低タンパク質結合物質である。この濾過領域は試験ストリップのサンプル適用領域に配置してもよいし、またはサンプル適用領域の下流に配置してもよい。一般に、この濾過領域はフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域の上流に配置する。
【０７５０】
試験ストリップはまた、非特異的結合剤を含む領域も含み得る。この領域は非特異的結合領域と呼ぶことができる。非特異的結合剤は固体構造上に存在していてもよく、ここで、この非特異的結合剤はサンプル中の少なくとも一部のバックグラウンド物質と結合するが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子とは少量（例えば、１０％未満）を超えては結合しない。非特異的結合剤用として可能性のある固体支持体としては、紙およびセルロース誘導体（セルロースエステルおよびセルロースエーテルなど）、天然および合成高分子物質（ラテックス、ビニルポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレンおよび部分的に加水分解された誘導体、重縮合物、共重合体および無機物質が挙げられる。一態様では、非特異的結合剤は、試験ストリップに沿って液体サンプルを送ることができる多孔性または吸水性部材である。使用可能な非特異的結合剤は、アルブミン（ウシ血清アルブミンまたはＢＳＡを含む）、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に特異的でない抗体、および当技術分野で公知の、または本明細書で開示されている他の表面など、１以上の非特異的結合タンパク質がその上に固定されている固体支持体が挙げられる。非特異的結合剤として使用可能なタンパク質の例としては、ＢＳＡ、メチル化ＢＳＡ、またはＷ６３２もしくはマウスＩｇＧなどの抗体が挙げられる。一例では、非特異的結合剤は、その上にＢＳＡが固定されているニトロセルロース膜であり得る。非特異的結合剤はサンプル適用領域と同じ領域にあってもよいし、またはサンプル適用領域の下流にあってもよい。非特異的結合剤は、存在するとすれば、濾過領域と同じ領域にあってもよいし、または存在するとすれば、濾過領域の上流もしくは下流にあってもよい。非特異的結合剤は一般に、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域の上流にある。
【０７５１】
試験ストリップはまた、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合することができる結合相手がそこに固定されている領域も含み得る。この領域は対照領域と呼ぶことができる。このような領域は、試験ストリップのデザインに応じて、陽性対照または陰性対照として働き得る。一般に、液体サンプルがフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する、固定された結合相手と相互作用することができるように、液体サンプルを収容することができる領域において固定を行う。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の固定された結合相手は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と特異的に結合することができる。一例では、このフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の固定された結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が結合しないフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合することができる。結合相手の例としては、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合するタンパク質もしくは核酸もしくは他の化合物、またはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に相補的な核酸分子と特異的に結合するポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体または他の抗体が挙げられる。対照領域は一般に、サンプル適用領域の下流にある。対照領域は、存在するとすれば、濾過領域と同じ領域にあってもよいし、または存在するとすれば、濾過領域の下流にあってもよい。対照領域は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域の上流もしくは下流、またはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域の上流および下流（すなわち、２以上の対照領域が存在してもよい）にあってもよい。対照領域は、非特異的結合領域（存在するとすれば）と同じ領域、その上流もしくは下流、またはそれらの組合せの領域にあってもよい。
【０７５２】
試験ストリップはまた、可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートを含む領域も含み得る。このような領域は可動化領域と呼ぶことができる。可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の例としては、ポリクローナル抗フィブロネクチン抗体、モノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体、ヘパリン、コラーゲン、インテグリン、フィブリン、またはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンをコードするヌクレオチド配列に相補的な核酸分子が挙げられる。結合相手の他の例としては、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸に対する自己抗体と結合することができる、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはそのフラグメントがある。可動性の結合相手またはコンジュゲートは、液体サンプルとの接触時に、その可動性化合物が液体サンプルの溶質と相互作用し、液体サンプルが試験ストリップに沿って移動するとともに、その可動性化合物が試験ストリップに沿って移動可能なように可動化される化合物であり得る。例えば、可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートは、非水性形式（例えば、溶媒の不存在下または非水性溶媒中）で試験ストリップの表面に付着させる水溶性化合物であり得る。よって、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手である可動性化合物は、可動化の際に、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合または反応することができる。可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートは、サンプル適用領域に配置してもようし、またはサンプル適用領域の下流に配置してもよい。可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートは、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域に配置してもよいし、またはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域の上流に配置してもよい。可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートは、濾過領域（存在するとすれば）の上流、それと同じ領域、もしくは下流、またはその組合せの領域に配置してもよい。可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートは、非特異的結合領域（存在するとすれば）の上流、それと同じ領域、もしくは下流、またはその組合せの領域に配置してもよい。可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートは一般に、存在するとすれば、対照領域の上流に配置する。
【０７５３】
試験ストリップについての上記の記載は、存在する可能性にある種々の領域と可能性のある領域の配置の例示を意図するものであり、当業者には選択されるアッセイの構成に応じて様々な組合せが明らかであるので、上記の記載は、可能な試験ストリップの組合せを上記のものに限定するものではない。試験ストリップは、本明細書に記載の領域の種々の組合せを含むことができ、２以上の同じ種の領域をその試験ストリップの異なる場所に含む場合もある。試験ストリップはまた、同じ領域に２以上の異なる組成物を含むこともできる（例えば、濾過領域と同じ場所非特異的結合領域があってもよい）。
【０７５４】
ｂ．試験ストリップハウジング
試験ストリップは所望によりハウジング内に収容することができる。このようなハウジングは、試験ストリップの取扱いを容易にする、または反射率リーダーへの挿入のためなど、様々な目的のいずれかを果たし得る。米国特許第６，２６７，７２２号に例示されているように、様々な試験ストリップハウジングが当技術分野で公知である。
【０７５５】
一例としての態様では、この試験ストリップハウジングは、アッセイデバイスに関するデータ、対象データおよび／または試験実施と関連づけることができるバーコードなどの記号表示を含む。例えば、ロット番号、使用期限、分析物および強度値などのデバイスに関する情報、または日付、較正データ、反射率値もしくは他の情報などの試験実施に関する情報を、デバイス上に印刷されたバーコードを含むデータベースなどにおいてコード化および関連づけすることができる。適当なライン巾と空間を与えるものであれば、いずれのバーコードシステムも使用可能である。公知のバーコードシステムの中でも、コード３９およびコード１２８が挙げられる。
【０７５６】
特定の態様では、コード３９を用いる。このバーコードは、アルファベット２文字と数字９文字を含む１１の英数文字からなる。コード３９システムで標準とされているように、最初と最後の文字はアスタリスク（*）である。ロット番号はアルファベット１文字と数字４文字のコードで保存され、製品の苦情や質問については特定のロット番号をたどればよい。例示的な態様では、１番目の文字は製造月を表し、２番目の文字は製造年を表す数字であり、最後の３文字はロット番号を示す指数値である。よって、ロット番号「Ａ８００１」は、１９９８年１月に製造されたロットの１番目のデバイスを表す。次の２文字（「０１」）は、２つの数字（００〜９９）としての分析物の識別番号である。これにより、このシステムで１００種類までの異なる分析物の使用が可能となる。反射率強度値（００〜９９）は、その次の２文字の数字（「０１」）として保存される。この強度値は、対照サンプルと対象サンプルを比較することができる参照閾値を設定するものである。これにより、その日ごとに液体参照サンプルを実施する必要がなくなる。最後に、期限切れデバイスの使用を防ぐために、カセット使用期限がアルファベット１文字と数字１文字のコードで保存される。例としては、使用期限コード「Ａ９」は、使用期限が１９９９年１月であることを表す。
【０７５７】
ｃ．試験デバイスによる分析
サンプル移動のための公知のデバイスのいずれか、例えば、標準的なプラスチックピペットを用い、試験ストリップに一定量のサンプルを送り込むことができる。一態様では、例えば、サンプルが液体の場合、無処理（例えば、無希釈または試薬無添加）のサンプルを試験ストリップに適用することができ、これは試験ストリップへの直接適用（例えば、試験ストリップを尿流と接触させること）を含み得る。別の態様では、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、標識された可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲート（例えば、標識された抗癌胎児性フィブロネクチン抗体コンジュゲート）と結合させることができ、その結果生じた複合体は試験ストリップに沿って移動する。あるいは、サンプルを標識コンジュゲートと予め混合した後に、その混合物を試験ストリップに適用することができる。その標識複合体が試験ストリップのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域に来ると、その中の可動性フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手（例えば、抗フィブロネクチン抗体）が、複合体となっている癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合し、サンドイッチ複合体を形成することができ、それにより、この可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートの標識が蓄積する領域が生じ、検出が可能となる。
【０７５８】
一態様では、サンプルを、試験ストリップのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域と接触させる前に、非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤と接触させることができる。例えば、サンプルがフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域を流れる前に非特異的結合領域を流れるように構成された試験ストリップにサンプルを添加すればよい。最初に非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤と接触させることで、そうしなければフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートと非特異的に結合してしまうサンプル中のバックグラウンド物質が、代わりに非特異的結合化合物または表面と結合し、これにより、これらのバックグラウンド物質は少なくとも一部はフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートと結合しないようになる。
【０７５９】
別の態様では、サンプルを、非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤と接触させる前に、可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートと接触させることができる。例えば、サンプルが非特異的結合領域を流れる前にフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手コンジュゲートを含有する可動化領域を流れるように構成された試験ストリップにサンプルを添加すればよい。最初に可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはコンジュゲートと接触させることで、そうでなければ非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤に付着してしまう癌胎児性フィブロネクチン指標分子が、代わりに可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはコンジュゲートと結合し、これにより、より多量の癌胎児性フィブロネクチン指標分子が結合相手に結合させることができる。
【０７６０】
別の態様では、サンプルを、可動性のフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのコンジュゲートと接触させる前に、非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤と接触させることができる。例えば、サンプルがフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合結合相手コンジュゲートを含有する可動化領域を流れる前に非特異的結合領域を流れるように構成された試験ストリップにサンプルを添加すればよい。最初に非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤と接触させることで、そうしなければフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはコンジュゲートと非特異的に結合してしまうサンプル中のバックグラウンド物質が、代わりに非特異的結合化合物または表面と結合し、これにより、これらのバックグラウンド物質は少なくとも一部はフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはコンジュゲートと結合しないようになる。
【０７６１】
サンプルがフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域を通過すると、非結合結合相手が対照ゾーンへと移動を続け、そこで、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合することができる固定された結合相手により、これが捕捉され得る。例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を対照領域に配置することができ、マウス抗癌胎児性フィブロネクチン抗体コンジュゲートと結合させることができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合する固定された結合相手とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間で形成された複合体はこの領域で、ストリップの呈色などの検出可能なシグナルを生じることができ、これが標識されたコンジュゲートの凝集を表す。この領域における検出可能なシグナルの存在は、アッセイが完了したことを示すとともに、陽性対照としても働き得る。
【０７６２】
このアッセイの結果はリーダーと関連のソフトウエアを用いて評価することができる。米国特許第６，２６７，７２２号および同第６，３９４，９５２号に記載のケアデバイスのポイントを用いれば、少なくともｏｎｆＦＮ  ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着サンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡ）；例えば、米国特許第５，２８１，５２２号参照）と同等の臨床関連情報が、著しい短時間でそのケアポイントにおいて示される。この癌胎児性フィブロネクチンイムノアッセイにより、使用者は２０分または約２０分で頸膣スワブサンプルを試験することができる。この２０分の迅速ｏｎｆＦＮ試験をｏｎｆＦＮ  ＥＬＩＳＡから得られたデータと比較すると、κ係数０．８１９５％信頼区間［０．７５、０．８８］、全一致率少なくとも９４．９％で得られる。これらのデータは、当技術分野で公知のように、イムノアッセイ試験ストリップを反射率リーダーと、データ縮小および曲線当てはめアルゴリズムまたはニューラルネットワークを用いるデータ処理ソフトウエアとを組み合わせて含むシステムを用いて得られたものである。
【０７６３】
ｉｉｉ．定量
固定されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手はまた、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の定量に利用できる形式で使用することができる。例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、分光光度的測定に使用可能な固体支持体上に固定することができる。
【０７６４】
一例では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の量は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量することができる。ＥＬＩＳＡ法の一例は、マイクロタイタープレートまたはマイクロタイターストリップなどの反応容器の１以上のウェルをフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手でコーティングすること、およびこのようなウェル内でサンプルをインキュベートすることにより行うことができる。インキュベートしたウェルを洗浄した後、可動性または可溶性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と反応させ、その後、再び洗浄することができる。ウェルに結合した可動性または可溶性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の量は、間接的または直接的に分光光度的に測定することができる。ＥＬＩＳＡプレートの作製方法および試薬およびＥＬＩＳＡの実施は当技術分野で公知であり、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法に使用することができる。
【０７６５】
ｉｖ．癌胎児性フィブロネクチンの親和性に基づく単離
フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特異的に単離するために使用することができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度を高めるために使用することができる。フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、サンプルの１以上のバックグラウンド成分の濃度に対し、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度を高め、それにより、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の純度を高めるために使用することができる。本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の他の使用によれば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を固体支持体に付着させ、サンプルと接触させることができる。そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子はその結合相手と結合することができ、１以上の次工程（例えば、洗浄および溶出工程）を用いて、バックグラウンド物質から癌胎児性フィブロネクチン指標分子を分離し、かつ／または癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在する容積が減じることができる。
【０７６６】
フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、本明細書に記載されているか、または当技術分野で公知のいずれの固体支持体に固定することもできる。例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンは、液体クロマトグラフィーで用いるビーズ、磁性ビーズ、または物理的方法（例えば、遠心分離）により単離可能ないずれかのビーズといったビーズに付着させることができる。この固体支持体は、限定されるものではないが、液体クロマトグラフィーカラムまたはビーズスラリーを含む、いずれの形態であってもよい。
【０７６７】
この固体支持体は、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に結合することができる条件下でサンプルと接触させることができる。一態様では、この固体支持体は、バックグラウンド物質が、固体支持体上の結合相手と癌胎児性フィブロネクチン指標分子との結合を有意には妨げない（すなわち、固体支持体上の１０％もしくは約１０％以下の結合相手しかバックグラウンド物質と結合しない、または固体支持体上の結合相手が、サンプル中の９０％もしくは約９０％以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に結合する）条件下でサンプルと接触させる。条件の例としては、標準的なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）条件（例えば、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）がある。
【０７６８】
一態様では、固体支持体から癌胎児性フィブロネクチン指標分子を除去するよりも、固体支持体からバックグラウンド物質を除去する溶液でこの固体支持体を洗浄する。このような条件は一般に、固体支持体から５０％または約５０％以上のバックグラウンド物質を除去し、一方、１０％または約１０％以下の癌胎児性フィブロネクチン指標分子しか除去しない。これらの条件は、サンプルと固体支持体を接触させるための最初の条件と同じであっても異なっていてもよい。条件の例としては、サンプルと固体支持体を接触させるための最初の条件に比べ、塩濃度もしくは洗剤濃度が高い、またはｐＨが異なるものである。条件を決定するための方法は当技術分野で公知である。
【０７６９】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかにより固体支持体から遊離させることができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、周囲バッファーのｐＨ変化またはイオン強度により固体支持体から遊離させることができる。別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、変性条件、塩条件、ｐＨ条件、尿素条件、界面活性剤条件または温度条件を含む変性条件に曝すことにより固体支持体から遊離させることができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子を固体支持体から遊離させるための条件の例としては、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５〜３．０である。
【０７７０】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子を固体支持体から遊離させた後、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含有する溶液は、そのまま癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出に用いることもできるし、または検出法の前に処理することもできる。処理の例としては、最終希釈濃度１×ＡＰＢとなるように高濃度ＡＰＢ溶液を加えること、または０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニン、および０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００が挙げられる。
【０７７１】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、本明細書で提供される方法または当技術分野で公知の検出方法など、様々な方法のいずれかを用いて検出することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含むゲル電気泳動により検出することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に相当する分子量を有するバンドが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示し得る。癌胎児性フィブロネクチン指標分子はまた、限定されるものではないが、サンドイッチアッセイおよびブロット分析を含む、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するために結合相手コンジュゲートを用いる本明細書に記載のいずれかの方法を用いて検出することができる。
【０７７２】
ｄ．癌胎児性フィブロネクチン領域の検出
癌胎児性フィブロネクチン指標分子内の特定の領域の存在を検出するためには結合相手を使用することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子における特定の領域の検出は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の可能性のある細胞または組織または臓器源の同定、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の可能性のない細胞または組織または臓器源の同定、または癌胎児性フィブロネクチンの特定の形態に関連する健康問題の同定を含む様々な目的を果たし得る。一例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質内のＥＤＢの存在を検出するために、抗体Ｌ１９を使用することができる。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に対する自己抗体と結合する結合相手もまた、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質内の１以上の翻訳後修飾の存在を検出するために使用することができる。例えば、抗体ＦＤＣ−６は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ領域のトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化の存在を検出するために使用することができる。また、ＩＩＩＣＳスプライス変異体（例えば、ＩＩＩＣＳのスプライス変異体Ｖ０、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５もしくはＶ１２０）を検出するため、またはＩＩＩＣＳの１以上のスプライス領域（例えば、ＩＩＩＣＳのスプライス領域ａａ１〜２５、ａａ２６〜８９もしくはａａ９０〜１２０）の存在を検出するためにも結合相手を使用することができる。
【０７７３】
特定の癌胎児性フィブロネクチン領域、ＩＩＩＣＳスプライス領域および翻訳後修飾の検出は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の特徴付けに役立ち得る。例えば、結合相手は、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けするために使用することができる。結合相手は、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化などの１以上の特定の翻訳後修飾を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けするために使用することができる。結合相手は、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、Ｖ０、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５またはＶ１２０などのＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けするために使用することができる。
【０７７４】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために本明細書で開示されている結合法を用いる場合、あるサンプルに対して行われる同じアッセイまたは異なるアッセイにおいて２以上の結合相手を使用することができる。各結合相手から、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の組成に関する情報が得られる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質がＦＤＣ−６およびＩＳＴ−９と結合するが、Ｌ１９とは結合しない場合、その癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、ＥＤＡおよびＩＩＩＣＳを含み、かつ、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化を含んでいるが、ＥＤＢは含んでないものとして特徴付けすることができる。よって、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が結合する１以上の結合相手を同定することにより、また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に結合しない結合相手を同定することにより、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするための方法が提供される。結合型および非結合型の結合相手（例えば、結合プロファイル）は、癌胎児性フィブロネクチン領域の指標、または特定の癌胎児性フィブロネクチン変異体の指標となり得る。一態様では、このような方法は、サンプルアッセイにおける結合型および非結合型のしていない結合相手と参照アッセイにおける結合型および非結合型の結合相手（例えば、既知の癌胎児性フィブロネクチン指標分子と接触させた結合型および非結合型の結合相手）を比較することにより、または結合プロファイルを理論結合プロファイルと比較することにより行うことができる。
【０７７５】
３．質量分析による癌胎児性フィブロネクチンの検出
本明細書では、質量分析形式を用いて癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出する方法が開示される。質量分析を用いれば、原子、分子または分子フラグメント（癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸またはその相補物のフラグメントなど）を検出することができる。原子、分子または分子フラグメントの存在は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示し得る。本明細書に記載の質量分析法を用いて検出される癌胎児性フィブロネクチン指標分子としては、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸の自己抗体、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡ、上述のｍＲＮＡの増幅物、ならびにそのフラグメントが挙げられる。
【０７７６】
本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法を行うには、様々な質量分析技術を使用することができる。質量分析技術は一般に、脱離法と検出法を含む。本明細書では、例えば、紫外線（ＵＶ）および赤外線（ＩＲ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ；例えば公開国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／５７３１８号および米国特許第５，１１８，９３７号参照）およびエレクトロスプレー（ＥＳ）法を含む公知の脱離法のいずれかが使用可能である。当業者ならば、実施する質量測定の選択に応じて、使用する特定の脱離法を選択することができる。本明細書では、例えば、一連または三連四重極モードのタイム・オブ・フライト型（ＴＯＦ）、フーリエ変換型および磁気セクター／磁気偏向型装置を含む公知の検出法はいずれも使用可能である。当業者ならば、実施する質量測定の選択に応じて、使用する特定の検出法を選択することができる。
【０７７７】
いくつかの態様では、本明細書に開示されている方法による質量分析によって検出を行う前に、サンプルを１以上の工程で操作することができ、その工程としては、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の単離、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメンテーション、およびサンプルのコンディショニングを含み得る。例えば、第一に、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含有するサンプルを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を単離する工程で処理し、第二に、そのサンプルをフラグメンテーション化合物と接触させる工程で処理し、第三に、質量分析を用いてそのフラグメントの質量を測定する工程で処理することができる。
【０７７８】
一態様では、この質量分析を用いて、トリプシンまたはカテプシンＤなどのプロテアーゼで処理したサンプルの分子量を測定する。１以上のプロテアーゼフラグメントの測定値が所定の質量範囲内にあれば、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチンタンパク質が存在することを示し得る。
【０７７９】
本明細書で提供される質量分析法は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示すタンパク質および核酸分子の双方を検出するために使用することができる。当業者が理解しているように、質量分析によるタンパク質検出法（および検出前のサンプル処理法）は、核酸分子検出法とは異なり得る。本明細書で提供される方法は、適当な分析物を検出するための常法により改変することができる。
【０７８０】
ａ．サンプル操作
サンプルは、質量分析を用いた質量測定の前に、１以上の工程で操作および／または処理することができる。操作工程の例としては、限定されるものではないが、サンプルとイオン表面の接触、サンプルと疎水表面との接触、サンプルとフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手との接触、およびサンプルとフラグメンテーション化合物との接触が挙げられる。このような操作はまたコンディショニングを含んでもよく、コンディショニングは質量スペクトルの分解能を高めるいずれかの手順を含む。このような操作工程はまた、癌胎児性フィブロネクチンが少なくとも部分的にサンプル中のバックグラウンド物質から分離される１以上の洗浄工程を含み得る。
【０７８１】
これらのサンプル操作工程はいずれの反応容器で行ってもよく、質量測定の直前、または質量測定の１時間以上前もしくは１日以上前、または質量測定と同時に行うことができる。一態様では、少なくとも１つのサンプル操作工程を質量分析基板上で行う。別の態様では、２以上のサンプル操作工程を質量分析基板上で行う。
【０７８２】
このような操作工程としては、当技術分野で公知の様々な表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法のいずれかを含む。例えば、質量分析基板を、逆相物質、イオン交換物質、結合相手、金属親和性物質、または当技術分野で公知の他の物質もしくは化合物といった、サンプル操作のための物質または化合物でコーティングすることができる。基板はこのような物質または化合物を独立した別個の場所に含み得る。基板はまた、このような物質または化合物の組合せを同じ場所または独立した別個の場所に含む。基板が２以上の別個の場所を含む場合、サンプルを各別個の場所に適用することができ、各別個の場所には同じ溶液を加えても異なる溶液を加えてもよい。特定の物質または化合物または組合せが複数の別個の場所に存在する場合、各場所には異なる溶液を加えることができ、その結果、各別個の場所に付着した化合物にはバリエーションが生じる；例えば、別個の場所を異なる溶液で処理し、低い特異性から高い特異性まで勾配を形成することができる。米国特許第５，７１９，０６０号、同第５，８９４，０６３号、同第６，１２４，１３７号および６，２２５，０４７号に例示されているように、これらの、またその他のＳＥＬＤＩ方法は、当技術分野で公知である。
【０７８３】
ｉ．結合相手との接触
サンプルは、抗癌胎児性フィブロネクチン抗体などの結合相手、またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合する他の部分と、サンプル中の他の成分に対するよりも高い親和性で接触させることができる。結合相手は、本明細書で開示されているように、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と特異的に、かつ／または優先的に結合させるために使用することができる。例えば、サンプルを結合相手と接触させること、次に、結合相手と結合するサンプル成分の分子量を検出することにより、癌胎児性フィブロネクチン指標分子がそのサンプルの成分からより容易に検出することができる。このような接触工程は、測定される異なる質量の数を減じることができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に相当しないサンプル成分の質量よりも、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に相当する質量を分析および富化することができる。
【０７８４】
例えば、固体支持体上に固定された結合相手を、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子がその結合相手と結合可能な条件下でサンプルと接触させることができる。サンプルを固体支持体と接触させた後、固体支持体を所望により洗浄してもよい。固体支持体と結合したサンプル成分は、ＭＡＬＤＩまたはＥＳなどの質量分析脱離法を用いてサンプル成分を脱離することによる質量分析によって測定することができるか、あるいはサンプル成分は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子がフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とはもはや結合しない溶媒条件を用い、固体支持体から取り除くことができる。溶媒条件によって固体支持体から取り除かれたサンプル成分に対しては、所望により、１以上のフラグメンテーション工程を含むサンプル成分の質量測定の前に、１以上のサンプル操作の次工程を行ってもよい。
【０７８５】
サンプルが癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含んでいる場合、サンプルを、固体支持体と結合したフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と接触させる工程を用い、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の相対濃度を高めることができ、従って、本明細書で提供される質量測定法を用いた癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出が容易となる。
【０７８６】
ｉｉ．フラグメンテーション化合物との接触
サンプルはフラグメンテーション化合物と接触させることができる。フラグメンテーション化合物は、特定の部位で癌胎児性フィブロネクチン指標分子をフラグメント化する（すなわち、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特異的にフラグメント化する）ために使用することもできるし、あるいは無作為な部位で癌胎児性フィブロネクチン指標分子をフラグメント化する（すなわち、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を非特異的にフラグメント化する）ために使用することもでき、ランダムフラグメンテーションとは、特定の部位が他の部位よりも２倍高い頻度で存在することのないフラグメンテーションを指すが、ランダムフラグメンテーションは、フラグメンテーションの純粋な無作為性は必ずしも必要としない。
【０７８７】
フラグメンテーション化合物は、タンパク質または核酸分子をフラグメント化するために使用することができるタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、またはその他の化合物であり得る。一態様では、フラグメンテーション化合物は、プロテアーゼまたは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質をフラグメント化するために使用することができるその他の化合物であり得る。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質をフラグメント化する化合物の例としては、カテプシンＤ、トリプシン、サーモライシン、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（Ｓ−シアニル化のため）、アクロモバクタープロテアーゼ１、黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼおよびヒドロキシルアミンが挙げられる。別の例では、フラグメンテーション化合物は、ヌクレアーゼ、リボザイム、ＤＮＡザイム、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物をフラグメント化するために使用することができるその他の化合物であり得る。核酸分子をフラグメント化するための化合物の例としては、制限エンドヌクレアーゼ、ハンマーヘッドリボザイムおよびＲＮアーゼが挙げられる。
【０７８８】
フラグメンテーション法は、サンプルを、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手（例えば、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が固定されている固体支持体）と接触させる、または、サンプルをコンディショニングするなどの他のサンプル処理工程の前に行うことができる。フラグメンテーション法は、他のサンプル処理工程の後に行うこともできる。フラグメンテーション法は他のサンプルの処理工程と同時に行うこともでき、例えば、サンプル成分が固体支持体に結合している間に、フラグメンテーション法を行うこともできる。
【０７８９】
ａ．トリプシンタンパク質分解
一態様では、サンプルをトリプシンで処理することができる。トリプシンで消化すると、ヒト癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、質量２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａおよび／または５５ｋＤａのタンパク質加水分解フラグメントを生じ得る。一般に、これらの６つのトリプシンフラグメントの各々は抗体ＦＤＣ−６と特異的に結合する。従って、質量２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａまたは５５ｋＤａであり、かつ、ＦＤＣ−６と特異的に結合することができる１以上のトリプシンフラグメントの測定は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示し得る。
【０７９０】
一例としてのトリプシン消化では、ヒト癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のトリプシンフラグメントは２００ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび／または５５ｋＤａであり得、ここで、各小さなフラグメントは大きなフラグメントのさらなるトリプシン切断産物に相当する。別のトリプシン消化の例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のトリプシンフラグメントは２３５ｋＤａ、１６０ｋＤａおよび／または６５ｋＤａであり得、ここで、各小さなフラグメントは大きなフラグメントのさらなるトリプシン切断産物に相当する。
【０７９１】
癌胎児性フィブロネクチンタンパク質検出法の一例では、サンプルを、ＦＤＣ−６が固定されている固体表面と接触させ、洗浄し、その後、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質がＦＤＣ−６ともはや結合しないようにする解離溶液と接触させることができる。その後、この解離溶液溶出物にトリプシンを接触させることができ、このトリプシン処理溶出物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析することができる。このような処理サンプルからの質量スペクトルが２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａもしくは５５ｋＤａ、または約２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａもしくは５５ｋＤａの１以上の測定質量を有する場合に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するサンプルとして同定することができる。別の方法例では、サンプルをトリプシンと接触させることができ、その後、ＦＤＣ−６が固定されている固体表面と接触させることができる。次に、この固体表面を洗浄し、その後、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質がＦＤＣ−６ともはや結合しないようにする条件下で処理することができる。このような処理サンプルからの質量スペクトルが２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａもしくは５５ｋＤａ、または約２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａもしくは５５ｋＤａの１以上の測定質量を有する場合に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するサンプルとして同定することができる。別の方法例では、サンプルをＦＤＣ−６が固定されている固体表面と接触させることができ、その後、その固体表面をトリプシンと接触させることができる。次に、この固体表面を洗浄し、その後、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質がＦＤＣ−６ともはや結合しないようにする条件下で処理することができる。このような処理サンプルからの質量スペクトルが２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａもしくは５５ｋＤａ、または約２３５ｋＤａ、２００ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、６５ｋＤａもしくは５５ｋＤａの１以上の測定質量を有する場合に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するサンプルとして同定することができる。一例では、サンプルを、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するものと同定する質量スペクトルは、２００ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび５５ｋＤａの３つの質量を全て含む。別の例では、サンプルを、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するものと同定する質量スペクトルは、２３５ｋＤａ、１６０ｋＤａおよび６５ｋＤａの３つの質量を全て含む。
【０７９２】
ｂ．カテプシンＤタンパク質分解
別の態様では、サンプルをカテプシンＤで処理することができる。カテプシンＤで消化すると、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、質量１１０ｋＤａおよび／または８５ｋＤａのフラグメントを生じ得る。一般に、これらの２つのカテプシンＤフラグメントは抗体ＦＤＣ−６と特異的に結合する。従って、質量１１０ｋＤａまたは８５ｋＤａであり、かつ、ＦＤＣ−６と特異的に結合することができる１以上のカテプシンＤフラグメントの測定は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示し得る。
【０７９３】
癌胎児性フィブロネクチンタンパク質検出法の一例では、サンプルを、ＦＤＣ−６が固定されている固体表面と接触させ、洗浄し、その後、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質がＦＤＣ−６ともはや結合しないようにする解離溶液と接触させることができる。その後、この解離溶液溶出物にカテプシンＤを接触させることができ、このカテプシンＤ処理溶出物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析することができる。このような処理サンプルからの質量スペクトルが１１０ｋＤａもしくは８５ｋＤａ、または約１１０ｋＤａもしくは８５ｋＤａの１以上の測定質量を有する場合に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するサンプルとして同定することができる。他の例では、サンプルをまずカテプシンＤと接触させ、次に固体支持体と接触させることもできるし、あるいは、サンプルを固体支持体と接触させ、カテプシンＤと接触させた後に、その固体支持体からサンプルを溶出させることもできる。
【０７９４】
ｃ．サーモライシンタンパク質分解
別の態様では、サンプルをサーモライシンと接触させることができる。サーモライシンで消化すると、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は、質量１２０ｋＤａ、８５ｋＤａおよび／または３５ｋＤａのフラグメントを生じ得る。一般に、この１２０ｋＤａおよび８５ｋＤａは抗体ＢＣ−１と結合することができる。従って、質量１２０ｋＤａまたは８５ｋＤａであり、かつ、ＢＣ−１と特異的に結合することができる１以上のサーモライシンフラグメントの測定は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示し得る。一例としてのサーモライシン消化では、この３５ｋＤａおよび８５ｋＤａフラグメントは、大きなフラグメントのさらなるサーモライシン切断産物に相当する。
【０７９５】
癌胎児性フィブロネクチンタンパク質検出法の一例では、サンプルを、ＢＣ−１が固定されている固体表面と接触させ、洗浄し、その後、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質がＢＣ−１ともはや結合しないようにする解離溶液と接触させることができる。その後、解離溶液溶出物をサーモライシンと接触させることができ、このサーモライシン処理溶出物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析することができる。このような処理サンプルからの質量スペクトルが１２０ｋＤａ、８５ｋＤａもしくは３５ｋＤａ、または約１２０ｋＤａ、８５ｋＤａもしくは３５ｋＤａの１以上の測定質量を有する場合に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するサンプルとして同定することができる。他の例では、サンプルをまずサーモライシンと接触させ、次に固体支持体と接触させることもできるし、あるいは、サンプルを固体支持体と接触させ、サーモライシンと接触させた後に、その固体支持体からサンプルを溶出させることもできる。一例では、サンプルを、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するものと同定する質量スペクトルは、１２０ｋＤａ、８５ｋＤａおよび３５ｋＤａの３つの質量を全て含む。
【０７９６】
ｄ．アクロモバクタープロテアーゼＩタンパク質分解
別の態様では、サンプルをアクロモバクタープロテアーゼＩで処理することができる。アクロモバクタープロテアーゼＩで消化すると、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は質量１４ｋＤａのフラグメントを生じ得る。一般に、この１４ｋＤａフラグメントは抗体ＦＤＣ−６と結合することができる。従って、質量１４ｋＤａであり、かつ、ＦＤＣ−６と特異的に結合することができるアクロモバクタープロテアーゼＩフラグメントの測定は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の存在を示し得る。
【０７９７】
癌胎児性フィブロネクチンタンパク質検出法の一例では、サンプルを、ＦＤＣ−６が固定されている固体表面と接触させ、洗浄し、その後、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質がＦＤＣ−６ともはや結合しないようにする解離溶液と接触させることができる。その後、この解離溶液溶出物をアクロモバクタープロテアーゼＩと接触させることができ、このアクロモバクタープロテアーゼＩ処理溶出物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析することができる。このような処理サンプルからの質量スペクトルが質量１４ｋＤａまたは約１４ｋＤａを有する場合に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含有するサンプルとして同定することができる。他の例では、サンプルをまずアクロモバクタープロテアーゼＩと接触させ、次に固体支持体と接触させることもできるし、あるいは、サンプルを固体支持体と接触させ、アクロモバクタープロテアーゼＩと接触させた後に、その固体支持体からサンプルを溶出させることもできる。
【０７９８】
ｉｉｉ．固体支持体
フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、フラグメンテーション化合物、またはその双方は、本明細書で提供される方法で用いるための１以上の固体支持体上に固定することができる。結合相手またはフラグメンテーション化合物を固定可能な固体支持体は、結合相手またはフラグメンテーション化合物が直接結合することができるか、またはリンカーを用いて結合することができる様々な支持体のいずれであってもよい。例えば、結合相手またはフラグメンテーション化合物は、ニトロセルロース膜などの膜上に固定することができる。結合相手またはフラグメンテーション化合物はまた、結合相手の結合のための化合物でコーティングされたマイクロプレートなどのマイクロプレート上に固定することもできる。結合相手またはフラグメンテーション化合物はまた、プローブ、ピペットチップ、または円錐型、ニードル型もしくは類似の形状の構造体上に固定することもできる。
【０７９９】
ｉｖ．コンディショニング
癌胎児性フィブロネクチン指標分子もしくはそのフラグメント、またはフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合した癌胎児性フィブロネクチン指標分子もしくはそのフラグメントは、所望により「コンディショニング」することができる。コンディショニングは質量分析の前、一般には１以上の結合相手接触工程またはフラグメンテーション工程の後またはそれと同時に行う。コンディショニングは、例えば、揮発に必要なレーザーエネルギーを減じるため、かつ／または意図しないフラグメンテーションを最小限とするために行うことができる。コンディショニングは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子、またはそのフラグメントもしくは複合体を質量分析基板に加える前に行うことができる。コンディショニングは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子、またはそのフラグメントもしくは複合体を基質上に固定する、または結合させる際に行うことができる。コンディショニングは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子、またはそのフラグメントもしくは複合体が基板から解離したか、またはそうでなければ基板とは結合しなくなった後に行うことができる。コンディショニングのための方法は当技術分野で公知であり、陽イオン交換樹脂の使用およびアセトニトリル溶液の使用を含む。
【０８００】
ｖ．サンプル操作工程の組合せ
結合相手とフラグメンテーション化合物の異なる順列を含むサンプル操作工程を採用することができる。例えば、サンプルをまず固定された結合相手と接触させ、その後、その固体支持体から遊離させ、固定されたフラグメンテーション化合物と接触させるとができる。別の例では、サンプルをまず可動性または可溶性のフラグメンテーション化合物と接触させ、その後、そこに固定されている結合相手を含む固体支持体と接触させることができる。別の例では、サンプルをまず、そこに固定されている結合相手を含む固体支持体と接触させ、そのサンプルが固体支持体にまだ曝されている間に、そのサンプルに可動性または可溶性のフラグメンテーション化合物を加えることができる。別の例では、サンプルをまず、そこに固定されている結合相手を含む固体支持体と接触させ、その後、その固体支持体から遊離させ、可溶性または可動性のフラグメンテーション化合物と接触させることができる。別の例では、サンプルを、そこに固定されている結合相手とフラグメンテーション化合物を含む固体支持体と接触させることができる。別の例では、サンプルをまず固定されたフラグメンテーション化合物と接触させ、その後、その固体支持体から遊離させ、固定された結合相手と接触させることができる。当業者には明らかであるように、その他の組合せも行うことができる。
【０８０１】
質量測定前のサンプル操作工程はいずれの順序であってもよい。例えば、サンプルをまずフラグメンテーション化合物と接触させ、その後、結合相手と接触させることができる。別の例では、サンプルをまず結合相手と接触させ、その後、フラグメンテーション化合物と接触させることができる。別の例では、サンプルをフラグメンテーション化合物と接触させると同時に、そのサンプルを結合相手と接触させることができる。結合相手、フラグメンテーション化合物、またはその双方は、支持体上に固定することができる。フラグメンテーション化合物および結合相手が固定される場合、それらは同じ固体支持体上に固定することもできるし、異なる固体支持体上に固定することもできる。固定された結合相手または固定されたフラグメンテーション化合物、またはその双方を含む固体支持体は質量分析用基板として役立ち得る。
【０８０２】
一例では、サンプルをまず、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手（ＦＤＣ−６など）が固定されている第一の固体支持体と、癌胎児性フィブロネクチン指標分子がそのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合することができる条件下で接触させる。バッファー条件の例としては、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；一般に、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３ｍＭ  ＫＣｌ）中１％のウシ血清アルブミンが挙げられる。サンプルと第一の固体支持体との接触は、１以上の測定可能なフラグメントが質量分析により測定可能なように次工程を行うために十分な癌胎児性フィブロネクチン指標分子の結合が得られるならば、いずれの時間でもよい。例えば、第一の固体支持体はサンプルと、１０分間、３０分間、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間、または約１０分間、３０分間、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間またはそれを超える時間接触させることができる。次に、この第一の固体支持体はサンプルから分離することができ、いくつかの態様では、１以上の洗浄工程を行う。例えば、その基板をＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄することにより、余分なサンプルを除去することができる。次に、この第一の固体支持体を、結合したサンプル化合物（存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含有する）を第一の固体支持体上の結合相手から遊離させる分析物遊離溶液に曝すことができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子を結合相手から遊離させるためのバッファー条件は一般に、低ｐＨ溶液、高イオン強度溶液、または癌胎児性フィブロネクチンを癌胎児性フィブロネクチン結合相手から解離させる化合物を含有する溶液を含む。バッファー条件の例としては、ｐＨ３．０または約３．０以下のバッファー、１Ｍまたは約１Ｍ以上の濃度のＮａＣｌを含有するバッファー、または４Ｍ  ＮａＳＣＮまたは６Ｍ尿素などのカオトロピック剤を含有するバッファーが挙げられる。遊離したサンプル化合物（存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチンを含有する）は、トリプシンなどのフラグメンテーション化合物が固定された第二の固体支持体に直接（例えば、固体支持体から遊離させて即）または間接的（例えば、容器保存、バッファー交換、冷凍、遠心分離、濾過などの後）に加えることができる。一態様では、この第二の固体支持体は、質量分析により測定される分析物の脱離にために用いる基板として役立ち得る。次に、遊離したサンプル化合物（存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含有する）を、フラグメンテーション化合物が癌胎児性フィブロネクチン指標分子を少なくとも１箇所で切断することができる条件下で、フラグメンテーション化合物に曝すことができる。遊離したサンプル化合物（存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチンを含有する）と第二の固体支持体のインキュベーションは、１以上の測定可能なフラグメントが質量分析により測定可能なように次工程を行うために十分なフラグメンテーションが得られるならば、いずれの時間でもよい。例えば、第二の固体支持体は遊離化合物と、１０秒間、２０秒間、３０秒間、４５秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間、または約１０秒間、２０秒間、３０秒間、４５秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、５時間、１０時間、２４時間、またはそれを超える時間接触させることができる。
【０８０３】
フラグメンテーション後、第二の固体支持体上のサンプル化合物（存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチンフラグメントを含有する）を質量分析における脱離用の基板に移すこともできるし、または第二の固体支持体から直接脱離させることもできる。次に、質量分析法を用い、サンプル化合物および／またはフラグメント（存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチンフラグメントを含有する）の電荷／質量比を測定し、そのサンプル化合物（存在するとすれば、癌胎児性フィブロネクチンフラグメントを含有する）の分子量を検出することができる。次に、このサンプル化合物およびフラグメントの質量を、本明細書の他所で記載されているように、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの存在に関するさらなる決定のために使用することができる。
【０８０４】
結合相手、フラグメンテーション化合物、結合相手またはフラグメンテーション化合物が固定される固体支持体、質量分析用基板、ならびにフラグメンテーション、分析物の特異的結合およびフラグメントの質量分析測定を含む方法、およびこのような１以上の工程を行うためのシステムの例は本明細書で開示されており、また、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，４９８，０３９号、同第６，３１６，２６６号、同第６，０９３，５４１号、同第６，００４，７７０号、同第５，９５５，７２９号および同第５，７１９，０６０号；ならびに米国特許出願第２００３００２７２１６号、同第２００２０１６４８１８号、同第２００２０１１０９０４号、同第２００２００９４５６６号、同第２００２００４２０７５号、同第２００１００２１５３５号および同第２００１００１９８２９号参照）。当技術分野で公知の、または本明細書に記載されている質量分析および質量分析結果の解析の様々な方法はいずれも、上記のサンプル操作法と併用可能である。
【０８０５】
ｂ．質量分析用基板
質量分析用基板は様々ないずれの物質であってもよい。特に、この基板は、特定の質量分析形式で使用可能、実質的に不溶物質または固形物質からなるものであってよい。
【０８０６】
本明細書で提供される方法で使用可能なＭＡＬＤＩ基板としては、市販のものが挙げられる。例えば、基板は、金、ケイ素、銀、銅、アルミニウム、またはスチールなどの金属；ガラスまたは石英などの非金属；ならびに炭化水素ポリマー、ポリシラン、ＰＴＦＥ、ＰＴＥ、ＰＥ、ＰＦＡ、ペルフルオロアルキレートおよびメタクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリビニルジフルオリド、ポリビニリデンフルオリド、所望によりフルオロアルキル基で置換されていてもよいポリシロキサン、ペルフルオロデシルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシラン、フルオロポリマー、シリコーン、グラファイト、グラファイト充填ポリマー、またはポリシランなどのポリマーであり得る。ＭＡＬＤＩ基板は、ビーズ、キャピラリー、平面（ピットアレイなどのピットを含む平面を含む）、マイクロアレイ、またはピン（ピンアレイなど）を含む様々ないずれの形状であってもよい。基板は多孔性であっても非孔質であってもよく、ピットまたはウェルを含み、アレイを構成する特徴（例えば、ピット、ウェル、ピンなど）を有していてもよい。ＭＡＬＤ基板はまた、当技術分野で公知の方法を用い、単層、薄層、または厚層でコーティングすることもできる。様々な組成、形状およびコーティングの基板が市販されており、米国特許出願第２００３０１３８８２３号、米国特許第５，８０８，３００号、同第６，２６５，７１５号、同第６，２８７，８７２号および同第６，４６５，７７８号に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０８０７】
基板は結合相手が固定されている固体支持体、フラグメンテーション化合物が固定されている固体支持体、または結合相手とフラグメンテーション化合物が固定されている固体支持体であってもよい。また、基板は、結合相手やフラグメンテーション化合物固定されていなくともよい。
【０８０８】
いくつかの態様では、基質は、そこに固定されている１以上のエネルギー吸収化合物（分析物の脱離やイオン化を促進し得るマトリックス化合物など）を含む、または有し得る。例えば、エネルギー吸収化合物は、当技術分野で公知のように、また、米国特許第５，８９４，０６３号に例示されているように、共有結合または物理的吸着(physiadsorption)により基板に結合させることができる。別の例では、基板には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が結合する物質または化合物（例えば、疎水性物質、イオン物質、または結合相手を含む）を結合させることができ、ここで、この物質または化合物は、光感受性結合を介して癌胎児性フィブロネクチン指標分子と結合するか、またはこの物質または化合物はエネルギーを吸収して、分析物の脱離およびイオン化を促進することができる。このような基板は、米国特許第６，１２４，１３７号に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０８０９】
ｃ．質量分析
質量分析は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するために使用することができる。質量スペクトル検出は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、癌胎児性フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体またはそのフラグメントの直接検出であってもよいし、あるいは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、それらに対する自己抗体、またはそのフラグメントの存在を示す質量マーカーまたはその他の原子または分子の検出であってもよい。質量分析は、結合相手と、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物、それらに対する自己抗体、またはそのフラグメントとの間の複合体形成後に使用することができる。
【０８１０】
様々な質量分析検出形式が当業者に公知である。これらには、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、エレクトロスプレーイオン化質量分析、誘導結合型プラズマ質量分析、高速原子衝突質量分析、フーリエ変換型質量分析、電子衝撃質量分析、化学的イオン化質量分析、イオンサイクロトロン共鳴質量分析およびそれらの組合せが含まれ、このようなイオン化および検出法は、米国特許第６，６５７，１９１号に例示されているように、当技術分野で公知である。公知の形式はいずれも、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出に適合させることができる。
【０８１１】
ｉ．気相におけるイオン形成
質量分析の一工程では、サンプル物質から気相イオンを形成させる。サンプルの気相イオンの形成は、様々な技術のいずれかを用いて達成することができる。例えば、紫外線マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法、赤外線マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法、エレクトロスプレー法、イオンサイクロトロン共鳴法および／または誘導結合型プラズマ法を用いて、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のフラグメントを脱離およびイオン化することができる。一例として、サンプル物質に十分な揮発性がある場合には、気相サンプル分子の電子衝撃（ＥＩ）または化学的イオン化（ＣＩ）によりイオンを生じさせることができる。固体サンプルについては、高エネルギー光子または粒子を用いた衝撃によるサンプル分子の脱離およびイオン化によりイオンを生じさせることができる。二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）は、例えば、サンプル物質を脱離およびイオン化させるためにｋｅＶイオンを用いる。このＳＩＭＳ法では、多量のエネルギーが分析物分子に付与される。その結果、脆弱な分子がフラグメント化する。このフラグメンテーションは、元のサンプル組成に関する情報（例えば、サンプル分子の分子量）が失われる場合には一般に使用されない。
【０８１２】
別の例において、より不安定または脆弱な分子については、今や他のイオン化法が存在する。プラズマ脱離法（ＰＤ）によれば、より大きい、より不安定な種、例えば、インスリンおよび他のタンパク質分子の脱離が生じる。Van Breeman et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys. 49:35−50 (1983); Tabet et al., Anal. Chem. 56:1662 (1984); Olthoff et al., Anal. Instrument. 16:93 (1987)に例示されているように、生体分子または他の不安定な分子の脱離を誘発する場合と同様にレーザーを使用することができる。不安定な分子のプラズマまたはレーザー脱離およびイオン化は、目的の分析物分子にエネルギー付与がほとんど、または全くないことに頼るものである。不安定な無傷の分子を脱離およびイオン化するためのレーザー使用の１つは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）と呼ばれる（例えば、Tanaka et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2:151 (1988)およびKaras et al., Anal. Chem. 60:2299 (1988)参照）。ＭＡＬＤＩ法の一例では、分析物を固体有機マトリックス中で融解させる。この固体マトリックスには吸収されるが、分析物には吸収されない波長のレーザー光を用いてサンプルを励起させる。このマトリックスをレーザーにより直接励起させ、励起したマトリックスを、それとともに分析物分子を運ぶ気相へと昇華させる。次に、この分析物分子を、マトリックス分子から分析物分子への陽子、電子、または陽イオン移動によりイオン化する。このＭＡＬＤＩ法は一般に、タイム・オブ・フライト型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）と併用し、これを用いて１００，０００ダルトンを超えるタンパク質の分子量を測定することができる。
【０８１３】
別の例では、大気圧イオン化法（ＡＰＩ）も使用することができる。一般に、分析物のイオンは大気圧下で液体溶液から生じさせる。このような方法の１つが、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）として知られている（例えば、Dole et al., J. Chem. Phys. 49:2240 (1968)参照）。このエレクトロスプレー技術では、分析物を液体溶液に溶解させ、ニードルからスプレーする。このスプレーは、ニードルと対電極の間の電位差を利用して誘導する。このスプレーにより、帯電した微細な分析物分子含有液滴が形成される。この気相では、溶媒が蒸発し、あとに帯電した気相分析物イオンが残る。この方法により極めて大きなイオンを形成させることができる。質量分析と組み合わせたＥＳＩ（ＥＳＭＳ）により、１ＭＤａという大きなイオンが検出された。ナノエレクトロスプレーＭＳと呼ばれる方法において小径ニードルの使用を教示したWilm et al., Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 136:167 (1994)に例示されているように、様々なエレクトロスプレー法が当技術分野で公知である。
【０８１４】
一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを、基板上に固定されているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と複合体形成させる場合、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを基板から脱離させる。この脱離法により、結合相手を基板から脱離させることなく、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを基板から脱離させることができる。他の態様では、脱離法は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントとその結合相手を基板から脱離させることができる。
【０８１５】
ＭＡＬＤＩなどの脱離法では、サンプルを、そのＭＡＬＤＩ法で用いる、マトリックスおよびサンプルを基板から脱離させるのに十分なレーザー光を吸収するマトリックス物質と混合するか、またはそのマトリックス物質とともに提供する。例えば、ニコチン酸、３’−ヒドロキシピコリン酸、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、コハク酸、グリセロール、尿素およびＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３または約７．３を含む、多種のマトリックス物質が当技術分野で公知である。マトリックス物質は、例えば、マトリックス物質をサンプルと混合するなどにより、サンプルと同時に適用することができる。あるいは、マトリックス物質はサンプルの適用前に誘導体化基板上に存在してもよいし、またはサンプルの適用後に導入してもよい。
【０８１６】
次に、この癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、核酸、フラグメントまたは複合体の気相イオンを、質量分析を用いて検出する。
【０８１７】
ｉｉ．検出
気相イオンは、タイム・オブ・フライト型（ＴＯＦ）質量分析器などの様々な質量分析器のいずれかにより検出することができる。気相イオンの質量分析は、例えば、磁気もしくは静電気分析器、またはその双方を用いて行うことができる。磁場または静電場を通るイオンは屈曲した経路を描く。磁場において、この経路の曲率は、イオン運動量／電荷比の指標となる。静電場では、この経路の曲率は、イオンのエネルギー／電荷比の指標となる。磁気分析器と静電気分析器を連続的に用いれば、そのイオンの運動量／電荷比とエネルギー／電荷比が検出でき、これによりそのイオンの質量を求めることができる。
【０８１８】
質量分析器の別の例として、タイム・オブ・フライト型（ＴＯＦ）質量分析器がある。典型的なＴＯＦ装置は、ＭＡＬＤＩを含むレーザー脱離法などの方法で生じるようなパルスイオン化を利用する。ＴＯＦ方法では、電位１０〜３０ｋＶまたは約１０〜３０ｋＶによりイオンを加速した後、１〜２ｍまたは約１〜２ｍ長の無電場領域をドリフトダウンさせる。質量の違いから生じる速度の違いにより、これらのイオンは異なる時間で検出器に到達し、これにより質量を求めることができる。反射型ＴＯＦ質量分析器も質量決定に使用可能である。
【０８１９】
別の例では、四重極質量分析器を使用することができる。これらの質量分析器では、イオンを電気的に加速し（５〜１５Ｖ）、対称に配置された４本のロッド長い中心軸を通過させる。ＤＣ電位と振動ＲＦ電位の組合せを適用すれば、イオンはロッド軸に沿った不規則な飛行経路をドリフトする。このＤＣ／ＲＦ比は一定を保ち、ＤＣとＲＦの絶対値は異なる。特定のｍ／ｚ値を有するイオンだけが所定のＤＣおよびＲＦ値の安定軌道を有する。ＤＣを０に設定すれば、全てのイオンが安定軌道を有する。四重極質量分析器はイオントラップとも併用可能である。
【０８２０】
イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析器も使用可能である。ＩＣＲ質量分析器では、一定範囲のｒｆ成分を用いてサンプルを励起させることができる。超伝導磁石内にこのイオントラップを置くことにより、捕捉されたイオンはサイクロトロン旋回を受け、容易に閉じこめられる。サイクロトロン線の振動数はイオンのｍ／ｚ比に反比例し、磁場に正比例する。イオンがその固有サイクロトロン振動数で励起されると、高エネルギーレベルへと移動する。このイオン雲は次に、２以上の検出電極でイメージ電流を誘導する。フーリエ変換分析を行った際に得られるシグナルは、イオンサイクロトロン振動数の極めて正確な測定、ゆえに、ｍ／ｚ値および分子量が得られる。
【０８２１】
ｉｉｉ．サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンを検出するための質量分析の使用
質量分析法は、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となる分子、分子フラグメントまたは原子の分子量を検出することにより、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するために使用することができる。一態様では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となるこの分子、分子フラグメントまたは原子としては、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質フラグメント、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物のフラグメントを含む。以下でさらに記載されるように、質量分析は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子における特定領域の存在を検出するために使用することができる。例えば、特定の検出分子量を有するタンパク質または核酸フラグメントは、本明細書に記載されているような癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸におけるＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳの存在を示し得る。また、質量分析は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質における１以上の翻訳後修飾の存在を検出するために使用することもできる。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸フラグメントの測定は、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸分子の存在を検出するため、また、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸分子に存在する構造エレメントを特徴付けするために使用することができる。さらに本態様によれば、その方法は、２以上の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質フラグメント、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物のフラグメント；３以上の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質フラグメント、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物フラグメント；４以上の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質フラグメント、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物のフラグメント；あるいはそれ以上のものの分子量を検出することを含み得る。
【０８２２】
質量分析は、それらの分子量に従って化合物を検出するために使用することができる。検出されたシグナルは、化合物の分子量を測定する際に使用することができ、測定された分子量を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントなどの１以上の予測分子量と比較することができる。また、検出された質量分析シグナルを、参照質量スペクトルまたは１以上の質量スペクトルの参照シグナルなどの１以上の参照と比較することもできる。参照質量スペクトルまたはシグナルなどの参照は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子もしくはそのフラグメントに相当するか、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子もしくはそのフラグメントを含んだ参照サンプルに相当する質量スペクトルまたはシグナルであり得る。検出された質量分析シグナルを１以上の参照と比較する際、特定ピークの分子量の算出は随意である。例えば、サンプルからの質量スペクトルを１以上の参照と比較することができ、ここで、検出されたシグナルが参照シグナルと一致する場合には、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントの存在の指標となる検出シグナルとして同定することができる。
【０８２３】
別の態様では、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在の指標となる分子、分子フラグメントまたは原子は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の結合事象の後に質量分析により検出される。癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の結合事象をシグナル伝達する分子、分子フラグメントまたは原子は様々な形態のいずれをとってもよい。例えば、シグナル伝達分子、分子フラグメントまたは原子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、核酸、自己抗体、またはそのフラグメントであり得る。別の例では、シグナル伝達分子、分子フラグメントまたは原子は、フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのフラグメントであり得る。別の例では、シグナル伝達分子、分子フラグメントまたは原子は、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、核酸、自己抗体、結合相手、またはそのフラグメントと結合した検出可能な部分であり得る。このような検出可能な部分は、質量分析法により測定可能ないずれかの部分、一般に、他の検出質量から分解可能な質量分析計の質量もしくは質量／電荷比、または質量スペクトルの質量／電荷比を有する部分であり得る。部分の例としては、例えば、当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載されている質量標識が挙げられる。
【０８２４】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の結合事象を検出する一例では、第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手を固体支持体に結合させることができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子含有サンプルをこの固体支持体に適用して、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と第一の癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の複合体を形成させることができる。複合体形成の後、第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手をその固体支持体に適用して、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と第一および第二の癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間の複合体（すなわち、サンドイッチ複合体）を形成させることができる。この第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手は、光切断可能な質量標識などの検出可能な部分を含み得る。この検出可能な部分は質量分析を用いて直接測定することもできるし、またはこの検出可能な部分のシグナルを、癌胎児性フィブロネクチン指標分子−癌胎児性フィブロネクチン結合相手複合体が形成される際に存在する検出可能な部分の数を増やすことにより、測定前に増強することもできる。
【０８２５】
ａ．直接測定
癌胎児性フィブロネクチンタンパク質、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸もしくはその相補物、または癌胎児性フィブロネクチン自己抗体などの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子、またはそのフラグメントを直接検出することにより測定することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、固体支持体に結合されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と選択的に結合させた後、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントがフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手ともはや結合しない条件に曝し、その後、質量分析を用いて癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントを検出することにより、質量分析を用いて検出することができる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントが結合相手ともはや結合しない条件としては、例えば、低結合バッファー条件（バッファーが高塩、低ｐＨ、界面活性剤および変性剤などの物質を含む場合）；タンパク質分解；質量識別可能な類似体との競合的置換；またはイオン化もしくは脱離（所望により、フラグメンテーションと組み合わせてもよい）が挙げられる。
【０８２６】
また、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対応する結合相手との複合体中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を直接検出することにより決定することもできる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子／結合相手複合体は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、固体支持体に結合されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と選択的に結合させた後、その複合体を、そのフィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのフラグメントが固体支持体にもはや結合しない条件に曝し、その後、質量分析を用いて癌胎児性フィブロネクチン指標分子／結合相手またはそのフラグメントの複合体を検出することにより、質量分析を用いて検出することができる。フィブロネクチンもしくは癌胎児性フィブロネクチン結合相手またはそのフラグメントが固体支持体ともはやと結合しない条件は当技術分野で公知であり、例えば、イオン化、脱離、タンパク質分解、または結合相手を支持体に連結しているリンカーの切断が挙げられる。
【０８２７】
さらに別の態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントの存在は、切断可能である質量標識などの切断可能な指標原子または分子を用いて検出することができる。様々な切断可能な質量標識が選択でき、適当な切断可能な架橋化学法によりフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手と結合させることができる。本方法によれば、結合相手が癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはそのフラグメントと結合する際、または結合した後に、質量標識が放出され、それを検出し、それにより、癌胎児性フィブロネクチン指標分子またはその特定のフラグメントの存在を示すことができる。
【０８２８】
米国特許出願第２００３０１９４７１７１号、ＷＯ９８／３１８３０、ＷＯ９８／２６０９５、ＷＯ９７／２７３２７および米国特許第５，７７０，３６７号、同第６，５５８，９０２号に例示されているように、様々な質量標識および切断可能な架橋化学法が当技術分野で公知である。このような質量標識は、質量分析により検出することができる。質量標識としては、生体高分子および合成高分子を含む種々の化合物種の膨大なアレイを含み得る。質量標識の一例では、アミノ酸、非天然アミノ酸、核酸、糖類、炭水化物、ペプチドミミックおよび核酸ミミックを含む、生体モノマー単位を単独または重合形態で使用することができる。アミノ酸としては、単純な脂肪族側鎖を有するもの（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびヒスチジン）、酸素および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、メチオニンおよびシステイン）、カルボン酸基またはアミド基を含有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン）ならびに強塩基基を含有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）およびプロリンが挙げられる。上記アミノ酸の誘導体もモノマー単位である。アミノ酸誘導体としては、その構造内にアミノ置換カルボン酸の塩基性アミノ酸核を含むいずれの化合物も含み、代表例としては、限定されるものではないが、アザセリン、フルオロアラニン、ＧＡＢＡ、オルニチン、ノルロイシンおよびサイクロセリンが挙げられる。上記アミノ酸から誘導されたポリペプチドもまた、モノマー単位として使用することができる。代表例としては、分子量が５００ダルトンまたは約５００ダルトンを超える天然ポリペプチドおよび合成ポリペプチドが挙げられる。
【０８２９】
糖類の代表例としては、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトースおよび２〜７個の炭素の鎖からなる糖誘導体が挙げられる。代表的な多糖としては、上記に挙げた糖単位の、グリコシド結合を介した組合せが挙げられる。質量標識はまた、その構造内にプリン、ピリミジン、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらのいずれかの誘導体、例えば保護核酸塩基、プリン類似体、ピリミジン類似体、フォリン酸類似体、リン酸メチル誘導体、ホスホトリエステル誘導体、ボラノリン酸誘導体またはホスホロチオエート誘導体を有するいずれかの部分を含む核酸塩基化合物からなってもよい。
【０８３０】
質量標識としてはまた、所定の質量値を有し、バイオアッセイの間水溶性を保持し、質量分析により検出可能である、有機または無機高分子のいずれかを含み得る。高分子形態の質量単位として使用可能な代表的合成モノマー単位としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルフェノール、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレングリコール、ポリピロールおよびその誘導体が挙げられる。これらのポリマーは単一種のモノマー単位からなってもよいし、またはモノマー単位の組合せで混合型ポリマーを形成していてもよい。いずれか１つの質量標識内のポリマー単位の配列は重要でなく、全質量がその標識の重要な特徴となる。質量が５００Ｄａまたは約５００Ｄａ未満の不揮発性質量標識には、通常、相当なイオン性が必要であり、代表例としては、第四級アンモニウム塩ポリエチレングリコールオリゴマー（例えば、Ｒ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）３＋／Ｃｌ−）ならびにカルボン酸および塩のポリエチレングリコールオリゴマー（例えば、Ｒ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２−Ｎｏ＋）が挙げられる。不揮発性質量標識の例としては一般に、分子量が約５００Ｄａまたは約５００Ｄａ未満のポリエチレングリコールの小オリゴマーおよび小ペプチド（天然または修飾）が挙げられる。これらの例では、本明細書で検討する全てのケースで、質量の分析は電子結合によるものではない。質量標識の例としては、非ポリマー性の様々な不揮発性および揮発性の有機化合物が挙げられる。不揮発性有機化合物の代表例としては、ヘム基、色素、有機金属化合物、ステロイド、フラーレン、レチノイド、カロテノイドおよびポリ芳香族炭化水素が挙げられる。
【０８３１】
フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手に質量標識を連結させるには、当技術分野で公知の様々な切断可能なリンカーを使用することができる。種々のリンカー化学法が、特定の物理条件または化学条件下で切断性を付与する。様々なデザインのリンカーを切断するために働く条件の例としては、酸、塩基、酸化、還元、フルオリド、チオール交換、光分解、イオン化および酵素条件が挙げられる。上記に挙げた一般基準を満たす切断可能なリンカーの例は当業者に周知であり、例えば、Pierce (Rockford, IL)から入手可能なカタログに見られるものが挙げられる。例として、エチレングリコビススクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ヒドロキシルアミンにより切断可能なアミン反応性架橋試薬（１Ｍ、３７℃にて３〜６時間）；０．０１５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムにより切断可能なアミン反応性架橋試薬である、ジスクシンイミジルタータレート（ＤＳＴ）およびスルホ−ＤＳＴ；塩基（ｐＨ１１．６）により切断可能なアミン反応性架橋試薬である、ビス［２−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）およびスルホ−ＢＳＯＣＯＥ；チオール交換または還元により切断可能な１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ（プロピオンアミド））ブタン（ＤＰＤＰＢ）；フッ化物により、または酸性条件下で切断可能な（光分解）ピリジルジチオール架橋剤；および光子源により切断可能な３−、４−、５−もしくは６−置換−２−ニトロベンジルオキシ、または２−、３−、５−または６−置換−４−ニトロベンジルオキシ架橋基が挙げられる。
【０８３２】
ｂ．シグナル増強を行う場合
癌胎児性フィブロネクチン指標分子およびフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の間で複合体を形成する際に、それに結合された増幅可能なシグナル伝達核酸または増幅可能なシグナル伝達核酸結合部位を有する第二のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を導入することができる。増幅可能なシグナル伝達核酸結合部位としては、増幅可能なシグナル伝達核酸か、または増幅可能なシグナル伝達核酸と結合した化合物と特異的に結合することができる中間結合相手（ビオチンとコンジュゲートされた増幅可能なシグナル伝達核酸が結合するアビジンなど）と結合した化合物に特異的に結合することができる、ビオチンまたはポリ−ヒスチジンなどの部分が挙げられる。
【０８３３】
この増幅可能なシグナル伝達核酸が複合体と結合した際、そのシグナル伝達核酸は、当技術分野で公知の方法を用いて増幅することができる。例えば、シグナル伝達核酸は、転写、ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、ローリングサークル型増幅増幅、または当技術分野で公知のその他の増幅反応により増幅することができる。一例では、このシグナル伝達核酸はＰＣＲを用いて増幅される。
【０８３４】
一態様では、標識された抗癌胎児性フィブロネクチン抗体（例えば、ビオチン化抗癌胎児性フィブロネクチン抗体）を癌胎児性フィブロネクチンタンパク質とフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手の複合体に結合させてサンドイッチ複合体を形成させる。次に、ストレプトアビジンまたはアビジンをこの複合体に加え、標識抗体と特異的に結合させることができる。その後、ビオチン化直鎖ＤＮＡなどのビオチン化シグナル伝達核酸をこの複合体に加え、ストレプトアビジンまたはアビジンと特異的に結合させることができる。そして、この結合したシグナル伝達核酸を、複数回の（例えば、３０サイクルまたは約３０サイクル）ポリメラーゼ連鎖反応法で増幅させることができる。一般に、例えば、各サイクルは、９４℃で１分の変性工程、５８℃で１分のアニーリング工程および７２℃で１分のプライマー伸張工程、または約９４℃で約１分の変性工程、約５８℃で約１分のアニーリング工程および約７２℃で約１分のプライマー伸張工程を含む。約１０６の増幅倍率が得られる。
【０８３５】
シグナル伝達核酸の増幅後、そのシグナル伝達核酸を質量分析を用いて検出し、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を示すことができる。
【０８３６】
ｉｖ．癌胎児性フィブロネクチン領域の検出
質量分析を用い、フィブロネクチン内の特定領域の存在を検出し、それにより、癌胎児性フィブロネクチンおよびその種を同定かつ／または特徴付けすることができる。フィブロネクチン内の特定領域の存在の検出は、可能性のある癌胎児性フィブロネクチンの細胞源または組織源または臓器源の同定、可能性のない癌胎児性フィブロネクチンの細胞源または組織源または臓器源の同定、または癌胎児性フィブロネクチンの特定の形態に関連する健康問題の同定を含む様々な目的を果たし得る。一例では、特定の検出分子量を有するフラグメントは、限定されるものではないが、本明細書に記載されているような癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはその相補物内にＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳなど、癌胎児性フィブロネクチン指標分子が存在することを示し得る。また、質量分析を用い、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の１以上の翻訳後修飾の存在を検出することもできる。例えば、特定の検出分子量を有するフラグメントは、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ領域のトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化の存在を示し得る。また、質量分析を用い、ＩＩＩＣＳの１以上のスプライス領域の存在を検出することもできる。例えば、特定の検出分子量を有するフラグメントは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子のアミノ酸（ａａ）９０〜１２０スプライス領域の存在を示し得る。
【０８３７】
特定の癌胎児性フィブロネクチン領域、ＩＩＩＣＳスプライス領域および翻訳後修飾の検出は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするのに役立ち得る。例えば、質量分析を用いて、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域の全部または一部を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けすることができる。質量分析を用い、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を、ＩＩＩＣＳのトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化などの１以上の特定の翻訳後修飾を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けすることができる。質量分析を用い、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、Ｖ０、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５またはＶ１２０などのＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けすることができる。
【０８３８】
癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために本明細書で開示されている質量分析法を用いるに当たり、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために必ずしも全ての検出分子量を用いる必要はない。また、癌胎児性フィブロネクチンを特徴付けするためにその質量が測定されるフラグメントの組成を同定する必要もない。例えば、ある質量を測定し、その質量を１以上の参照質量と比較することで、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質における、Ｏ−グリコシル化トレオニン３３を含むＩＩＩＣＳのＶ１２０の存在を示すことができる。別の例では、２つ以上の質量を測定し、それらの質量を２以上の参照質量と比較することで、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質における、Ｏ−グリコシル化トレオニン３３を含むＩＩＩＣＳのＶ１２０の存在を示すことができる。別の例では、２つ以上の質量を測定し、それらの質量を２以上の参照質量と比較することで、癌胎児性フィブロネクチン指標分子におけるＩＩＩＣＳのＶ１２０とＥＤＢの存在を示すことができる。よって、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチンの領域の指標となる１以上の質量を同定することにより、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けする方法が提供される。一態様では、このような方法は、質量スペクトルの１以上の質量を参照質量スペクトル（例えば、既知の癌胎児性フィブロネクチン指標分子から採取された質量スペクトル）の質量と比較することにより、または質量スペクトルの１以上の質量を１以上の参照質量（計算されたか、または実験的に決定されたもの）と比較することにより、行うことができる。
【０８３９】
別の態様では、１以上の検出分子量を用いて、異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を識別または特徴付けすることができる。例えば、組成の異なる２つの癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、同じサンプル処理および質量分析法を施しても異なる質量パターンを生じる。よって、異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子の質量パターンは１以上の検出分子量が異なり、このような異なる質量を用いて、異なる癌胎児性フィブロネクチン指標分子を識別または特徴付けすることができる。質量パターンは、特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子構造（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ（およびＩＩＩＣＳのスプライス変異体）の存在または不存在、ならびに１以上の翻訳後修飾の存在または不存在が既知である癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ（およびそのスプライス変異体）を含むフィブロネクチンタンパク質をコードしている、またはコードしていないことが既知である癌胎児性フィブロネクチン核酸またはその相補物）またはその相補物の指標となり得る。従って、本明細書では、特定の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の指標となる１以上の質量を同定することにより、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするための方法が提供される。一態様では、このような方法は、質量スペクトルの１以上の質量を参照質量スペクトル（例えば、既知の癌胎児性フィブロネクチン指標分子から採取された質量スペクトル）の質量と比較することにより、または質量スペクトルの１以上の質量を１以上の参照質量（計算されたか、または実験的に決定されたもの）と比較することにより、行うことができる。
【０８４０】
ｖ．癌胎児性フィブロネクチンの定量
質量分析を用い、サンプルの成分の相対濃度を決定することができる。このような方法に基づき、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量またはサンプル中の異なる種類の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を定量することができる。一例では、質量分析の前に、対象由来のサンプルに既知量の参照分子を加えることができる。参照分子のピーク強度と癌胎児性フィブロネクチン指標分子の主要なピークの強度を比較することで、参照分子に対する、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の比が得られ、そして、このサンプル中に存在する参照分子の量に関する知見から、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度が得られる。一態様では、サンプル中の分析物の濃度に対して異なる濃度の参照分子を含有する複数のサンプルを用いて標準曲線を作製し、それと癌胎児性フィブロネクチン指標分子関連ピークを比較して、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定することができる。質量分析を用いたサンプル中の分析物の定量法は、米国特許公報２００３００２７２１６に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０８４１】
４．核酸分子の検出
対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在は、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチンコード核酸を検出することにより示すことができる。癌胎児性フィブロネクチンコード核酸としては、転写ｍＲＮＡをコードする癌胎児性フィブロネクチンなどの、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子が上げられる。癌胎児性フィブロネクチンコード核酸の範囲内には、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸の末端切断型、スプライス変異体およびフラグメントが含まれる。癌胎児性フィブロネクチンコードする核酸の全長型、末端切断型、変異体およびフラグメントは、本明細書で提供される方法を用いて検出することができる。一般に、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸の検出は、癌胎児性フィブロネクチンまたはその相補物に独特なヌクレオチド配列を含む核酸部分の検出を含む。
【０８４２】
ａ．検出方法
ＲＴ−ＰＣＲから増幅された核酸分子は、本明細書で提供されるものおよび当技術分野で公知のものを含む、サンプル中の核酸分子の検出のための様々な方法により測定することができる。例えば、核酸分子は、ゲル電気泳動、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、質量分析、ドットブロット分析、マイクロアレイまたはチップハイブリダイゼーション法、および本明細書で提供される、または当技術分野で公知の他の方法を用いて検出することができる。
【０８４３】
癌胎児性フィブロネクチンコード核酸またはその相補物は直接検出することもできるし、または間接的に検出することもでき、例えば、癌胎児性フィブロネクチンに関連する核酸またはその相補物は、核酸増幅の後に核酸分子を検出することにより、間接的に検出することができる。様々な増幅方法が当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ＰＣＲ、ローリングサークル型増幅、転写、逆転写および逆転写ＰＣＲが挙げられる。
【０８４４】
本明細書で提供される方法によれば、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物に相当する増幅核酸分子の検出は、サンプル中に癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子が存在することを示し得る。このような増幅核酸分子は、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子のヌクレオチド配列またはその相補物の全部または一部を含み得る。例えば、増幅核酸分子は、フィブロネクチンのＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域をコードするヌクレオチド配列またはその相補物の全部または一部を含み得る。一態様では、増幅核酸分子は、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳなど、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質には存在しないアミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列、またはその相補物を含む。このような例では、ヌクレオチド合成反応用のプライマーは、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質には存在しないアミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列またはその相補物に相補的となるように設計することができる。また、プライマーは、存在する場合には、鋳型核酸分子において、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳコード領域またはその相補物の全部または一部を含む増幅核酸分子を形成するように設計することもできる。このプライマーの設計に応じ、増幅核酸の存在の検出、または予測された大きさを持つ増幅核酸の検出、または予測されたヌクレオチド配列を含む増幅核酸の検出は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る。例えば、これらのプライマーが、癌胎児性フィブロネクチンおよび非癌胎児性フィブロネクチン中に見られるフィブロネクチンをコードする領域またはその相補物に相補的であるが、癌胎児性フィブロネクチンだけに見られるフィブロネクチン部分をコードする領域またはその相補物にフランキングしない場合には、そのフラグメントの大きさが、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの存在または不存在を示し得る（この場合、小さいフラグメントが非癌胎児性フィブロネクチンをコードするヌクレオチドを含み、従って、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの指標とはならず、大きいフラグメントは癌胎児性フィブロネクチンをコードするヌクレオチドを含み、従って、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの指標となる）。別の例では、１以上のプライマーが、癌胎児性フィブロネクチンだけに見られるフィブロネクチン部分をコードする領域またはその相補物に相補的である場合、増幅物の存在が、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る。
【０８４５】
ｂ．ＲＮＡの検出
一態様では、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸を逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて増幅する。一般に、逆転写ＰＣＲは２種類の反応を含み、それらの反応は一段階で行うこともできるし、多段階で行うこともできる。１つ目のタイプの反応では、サンプルからのＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写する。２つ目のタイプの反応では、そのｃＤＮＡを、従来のＰＣＲ法を用いて増幅する。
【０８４６】
ｉ．逆転写
逆転写は、ＲＮＡ含有サンプルを逆転写酵素およびプライマーと接触させることにより行うことができ、この場合、プライマーは癌胎児性フィブロネクチンをコードするＲＮＡに相補的なものであり得る。サンプルを逆転写酵素と接触させる前に、サンプルからＤＮＡを除去するために、例えば、当技術分野で公知の物理的、化学的または酵素的方法を用いてサンプルを処理することができる。癌胎児性フィブロネクチンをコードするＲＮＡに相補的なプライマーを用いた逆転写法では、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｃＤＮＡを選択的に得ることができる。
【０８４７】
ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換プロセスでは一般に、逆転写酵素と呼ばれる種類の酵素、または逆転写酵素活性を有する関連の酵素を用いる。逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼである。既知の逆転写酵素は全て、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ転写物を合成するためにプライマーを必要とする。これらの逆転写酵素は、レトロウイルスに感染した真核細胞から、またはレトロウイルスゲノムの一部または全部を含むいくつかのプラスミドから得ることができる。さらに、ＲＴ遺伝子を含むメッセンジャーＲＮＡ様ＲＮＡもレトロウイルスから得ることができる。ＲＴの供給源の例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）；Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）；ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；サッカロミセスを含む酵母、アカパンカビ属、ショウジョウバエ；霊長類；および齧歯類が挙げられる。例えば、Weiss et al., 米国特許第４，６６３，２９０号 (1987); Gerard, G. R., DNA 5(4):271−279 (1986); Kotewicz, M. L., et al., Gene 35:249−258 (1985); Tanese, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(15):4944−4948 (1985); Roth, M. J., et al., J. Biol. Chem. 260:9326−9335 (1985); Michel, F., et al., Nature 316:641−643 (1985); Akins, R. A., et al., Cell 47:505−516 (1986), EMBO J. 4:1267−1275 (1985);およびFawcett, D. F., Cell 47:1007−1015 (1986)参照。ＲＮアーゼＨ活性を実質的に欠くＭ−ＭＬＶ逆転写酵素もまた記載されている。例えば、米国特許第５，２４４，７９７号参照。
【０８４８】
ｉｉ．ｃＤＮＡの増幅
これらの方法ではまた、逆転写ＤＮＡを増幅するため、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む１以上のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。ＤＮＡポリメラーゼは、当技術分野で周知の技術（ＷＯ９２／０６２００、米国特許第５，４５５，１７０号および同第５，４６６，５９１号参照）により、天然または組換え供給源から、あるいは、市販されている（例えば、American Type Culture Collection, Rockville, Md.から）様々な好熱性細菌から単離することができる。組換え系で発現させるための熱安定性ポリメラーゼまたはその遺伝子においては、好熱性細菌Thermus aquaticus、Thermus thermophilus、Thermococcus litoralis、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus woosiiおよびPyrococcus属の他の種、Bacillus sterothermophilus、Sulfolobus acidocaldarius、Thermoplasma acidophilum、Thermus flavus、Thermus ruber、Thermus brockianus、Thermotoga neapolitana、Thermotoga maritimaおよびThermotoga属の他の種、ならびにMethanobacterium thermoautotrophicum、ならびにそれらの突然変異体、変異体または誘導体を含む様々な供給源が利用可能である。単離する代わりに、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.)、New England BioLabs (Beverly, Mass.)、Finnzymes Oy (Espoo, Finland)、Stratagene (La Jolla, Calif.)、Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, Ind.)およびPerkin Elmer Cetus (Norwalk, Conn.)から商業的に入手することもできる。本明細書で提供されるよび組成物および方法で用いるための熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの例としては、限定されるものではないが、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｌｉ／ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、ＴｆｉまたはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはその突然変異体もしくは誘導体が挙げられる。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.)から商業的に入手することもできるし、または従前に記載されているように（米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、その天然源である好熱性細菌Thermus aquaticuから単離することもできる。Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼは、その天然源である好熱性細菌Thermotoga neapolitanaから単離することができ（米国特許第５，９３９，３０１号参照）、また、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼは、その天然源である好熱性細菌Thermotoga maritimaから単離することができる（米国特許第５，３７４，５５３号参照）。好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、特にＴｎｅおよびＴｍａポリメラーゼの突然変異体および誘導体を作出する方法は、米国特許第５，９４８，６１４号および同第６，０１５，６６８号に記載されている。Ｔｆｉ、Ｔｌｉ／ＶＥＮＴ（商標）およびＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）は商業的に入手することもできるし（例えば、New England BioLabs; Beverly, Mass.から）、または従前に記載されているように作出することもできる(Tli/VENTTMについてはBej, A. K. and Mahbubani, M. H., in: PCR Technology: Current Innovations, Griffin, H. G. and Griffin, A. M., eds., CRC Press, pp. 219−237 (1994);DEEPVENTTMについてはFlaman, J. M., et al., Nucl. Acids Res. 22 (15):3259−3260 (1994))。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、溶液中、０．１〜２００単位／ｍｌ、０．１〜５０単位／ｍｌ、０．１〜４０単位／ｍｌ、０．１〜３６単位／ｍｌ、０．１〜３４単位／ｍｌ、０．１〜３２単位／ｍｌ、０．１〜３０単位／ｍｌ、もしくは０．１〜２０単位／ｍｌの最終濃度で、最も一般には、２０単位／ｍｌ、または約０．１〜２００単位／ｍｌ、約０．１〜５０単位／ｍｌ、約０．１〜４０単位／ｍｌ、約０．１〜３６単位／ｍｌ、約０．１〜３４単位／ｍｌ、約０．１〜３２単位／ｍｌ、約０．１〜３０単位／ｍｌ、もしくは約０．１〜２０単位／ｍｌの濃度で、最も一般には約２０単位／ｍｌの濃度で本組成物に加えることができる。
【０８４９】
一段階反応の態様では、ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、逆転写酵素活性を有する酵素の濃度比として決定することができる。従って、組成物は、０．２：２〜５００：２、０．５：２〜２５０：２、もしくは３：２を超える、または約０．２：２〜約５００：２、約０．５：２〜約２５０：２、もしくは約３：２を超える範囲の逆転写酵素酵素／ＤＮＡポリメラーゼ酵素の単位比を持ち得る。
【０８５０】
ｉｉｉ．その他の成分
本明細書で用いる組成物は、１以上のヌクレオチド（例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ））を含む。本組成物のヌクレオチド成分は、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼの作用によって組み込まれる、新たに合成される核酸の「構成ブロック」として働く。本組成物で用いるためのヌクレオチドの例としては、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰまたはその誘導体が挙げられ、これらは全て、Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.)、New England BioLabs (Beverly, Mass.)およびSigma Chemical Company (Saint Louis, Mo.)を含む供給源から市販されている。ｄＮＴＰは標識されていなくとも、または例えば、質量分析により検出可能な質量標識、分光光度的に検出可能な標識、磁性ビーズ、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐまたは３５Ｓ）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドまたはフィコエリトリン）、化学発光標識およびジオキシゲニンなど、当技術分野で公知の方法によりそれらに結合させることにより、検出可能に標識することもできる。標識ｄＮＴＰも、例えば、Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.)またはSigma Chemical Company (Saint Louis, Mo.)から商業的に入手可能である。ｄＮＴＰは、例えば、各ｄＮＴＰの実施濃度が１０〜１０００マイクロモル、１０〜５００マイクロモル、１０〜２５０マイクロモル、１０〜１００マイクロモル、もしくは１００マイクロモル、または約１０〜１０００マイクロモル、約１０〜５００マイクロモル、約１０〜２５０マイクロモル、約１０〜１００マイクロモル、もしくは約１００マイクロモルとなるように加えることができる。
【０８５１】
ヌクレオチドの他、本組成物は、ＲＮＡ鋳型の全部または一部に相補的な第一のＤＮＡ分子（例えば、一本鎖ｃＤＮＡ分子）の合成を促進する１以上のプライマーを含む。プライマーはまた、第一のＤＮＡ分子の全部または一部に相補的なＤＮＡ分子を合成し、それにより二本鎖ｃＤＮＡ分子を形成するためにも使用することができる。さらに、これらのプライマーは、当技術分野で公知の、または本明細書で提供される方法に従い核酸分子を増幅する際に使用することができる。このようなプライマーとしては、限定されるものではないが、標的特異的プライマー（一般に、癌胎児性フィブロネクチン特異的プライマーなどの遺伝子特異的プライマーである）、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマーまたは任意のプライマーが挙げられる。サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡの特異的検出に向けられる方法では、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡと特異的に結合するプライマーと、それにより癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡを選択的に逆転写して癌胎児性フィブロネクチンをコードするｃＤＮＡを形成するための逆転写酵素を使用することができる。
【０８５２】
ＲＴ−ＰＣＲを実施するための組成物はまた、１以上のＲＮアーゼ阻害剤も含み得る。ＲＮＡは逆転写反応の基質であることから、サンプル中のＲＮＡの忠実度は、癌胎児性フィブロネクチンをコードするＲＮＡを検出する上で重要であり得る。例えば、ヒト胎盤ＲＮアーゼ阻害剤を含む、様々な公知のいずれのＲＮアーゼ阻害剤を、本明細書で提供されるＲＴ−ＰＣＲ法に用いてもよい。
【０８５３】
ｉｖ．核酸合成工程
逆転写反応は、適当な反応条件下でＲＮＡサンプルに逆転写酵素、プライマーおよび４種類全てのデオキシヌクレオシド三リン酸を加えることにより行う。一般に、逆転写反応は、不完全なｃＤＮＡ合成をもたらすことがあるｍＲＮＡの分解を防ぐ、または低減する条件下で行う。逆転写反応条件の例としては、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．５ｍＭ［３Ｈ］ｄＣＴＰ（２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、５０μｇ／ｍｌ（ｄＴ）１２−１８、２０μｇ／ｍｌ  ２．３ｋｂ  ＲＮＡおよび４，０００単位／ｍｌ  ＲＴを含む、３７℃でインキュベートする。
【０８５４】
一態様では、逆転写反応の前にサンプルからＤＮＡを除去する。ＤＮＡは、物理的、化学的および酵素的方法を含む様々な方法のいずれかにより、サンプルから除去することができる。例えば、ＤＮＡは、ＤＮアーゼＩなどのＤＮアーゼを用い、サンプルから除去することができる。ＤＮＡはまた、酸フェノール：クロロホルムを用いた抽出とその後の、例えば、０．５Ｍ酢酸アンモニウムおよびエタノールを用いたＲＮＡの沈殿により、除去することができる。ＤＮＡはまた、例えば、７．５Ｍ  ＬｉＣｌを用い、サンプルからＲＮＡを沈殿させ、上清中にＤＮＡが残留するのでこれを廃棄するなど、沈殿法によりから分離することができる。
【０８５５】
別の態様では、逆転写の前にＤＮＡが除去されない。この態様は、ＰＣＲまたは他の増幅法の前に、逆転写されたＤＮＡをサンプル中の他のＤＮＡから分離する工程を含み得る。例えば、逆転写されたＤＮＡは、癌胎児性フィブロネクチンコード配列に特異的な配列、またはポリＡ配列などのＲＮＡ特異的配列を含む配列組成に基づいて分離することができる。他の態様では、ＤＮＡはまた、増幅の前には除去されず、逆転写されたＤＮＡを選択的に増幅するようにＰＣＲプライマーを設計する。選択的プライマーの例としては、癌胎児性フィブロネクチンコード配列に特異的な配列と結合するプライマー、およびポリ（ｄＴ）配列を含有するＤＮＡを含む、逆転写のＤＮＡ産物に特異的な配列と結合するプライマーが挙げられる。
【０８５６】
逆転写から生じるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを、次に、例えば、アルカリまたはＲＮアーゼＨで処理してＲＮＡを選択的に加水分解するとｃＤＮＡが残り、このｃＤＮＡは、逆転写酵素または他のＤＮＡポリメラーゼにより触媒される第二のＤＮＡ増幅反応において二本鎖型へと変換され得る。Old, R. W., et al., Principals of Gene Manipulation, second edition, Studies in Microbiology, Vol. 2, University of California Press, p. 26 (1981)参照。
【０８５７】
「非組合せ」ＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、二段階ＲＴ−ＰＣＲ）では、逆転写は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ、３７℃などの逆転写酵素活性に最適なバッファー条件を用い、独立した工程として行う。ｃＤＮＡ合成の後、反応液を希釈し、ＭｇＣｌ２およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の濃度を、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性に許容される条件まで引き下げ、標準的な条件（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号参照）に従ってＰＣＲを行うことができる。
【０８５８】
「組合せ」ＲＴ−ＰＣＲ法では、逆転写酵素活性およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ活性のために共通の、または中間的(compromised)なバッファーを用いる。１つの形式では、酵素を加える前にリバースプライマーのアニーリングを独立した工程として行い、その後これを単一の反応容器に加える。別の形式では、逆転写酵素活性は熱安定性Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの一成分である。Ｍｎ＋＋の存在下でアニーリングとｃＤＮＡの合成を行うことができ、次に、キレート剤によりＭｎ＋＋を除去した後にＭｇ＋＋の存在下でＰＣＲを行うことができる。
【０８５９】
アニーリング、逆転写およびＰＣＲ工程を１つの連続する反応として組み込み、成分や酵素の添加のために反応管を開放しなくてもよい「連続」法（例えば、一段階ＲＴ−ＰＣＲ）も使用することができる。連続ＲＴ−ＰＣＲは、熱安定性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼの逆転写酵素活性を用いた単一の酵素系として、またはＡＭＶ−ＲＴおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた二酵素系として（この場合、初期温度は６５℃である）行うことができる。
【０８６０】
米国特許公報第２００３０１１３７１２号には、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴ、またはそのＲＮアーゼＨ依存的誘導体を１以上のＤＮＡポリメラーゼと組合せて用いる、一段階／一管ＲＴ−ＰＣＲに有用な組成物および方法が記載されている。これらの方法は、逆転写酵素活性を有する２種類以上の酵素を含む組成物を用いた場合に、ＰＣＲの阻害を軽減するために、硫黄含有分子または酢酸基含有分子（または硫黄含有分子と酢酸基含有分子の組合せ）の存在下で行うことができる。
【０８６１】
ＲＴ−ＰＣＲ反応では、反応混合物を、ＲＮＡ鋳型の全部または一部に相補的なＤＮＡ分子を合成するのに十分な温度でインキュベートすればよい。このような条件は用いる酵素によって異なり、２０℃〜７５℃、３５℃〜６０℃、もしくは４５℃〜５５℃、または約２０℃〜約７５℃、約３５℃〜約６０℃、もしくは約４５℃〜約５５℃の範囲であり得る。この逆転写反応の後、反応液を合成されたＤＮＡ分子が増幅されるのに十分な温度でインキュベートすればよい。一態様では、この増幅は、１回以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により達成される。増幅条件は、ＤＮＡ分子の増幅に十分な混合物の加熱と冷却を交互に繰り返すといったサーモサイクリングを含むことができ、９０℃〜１００℃の範囲の第一の温度と、４５℃〜７５℃、５０℃〜７５℃、５５℃〜７５℃、もしくは６５℃〜７５℃の範囲の第二の温度を交互に繰り返す、または約９０℃〜約１００℃の範囲の第一の温度と、約４５℃〜約７５℃、約５０℃〜約７５℃、約５５℃〜約７５℃、もしくは約６５℃〜約７５℃の第二の温度を交互に繰り返すことを含む。サーモサイクリングは何回でもよいが、一般に５〜８０回または約５〜約８０回、１０回もしくは約１０回より多い回数、または２０回もしくは約２０回より多い回数行うことができる。
【０８６２】
米国特許公報第２００３０１５７５５０号は、オリゴヌクレオチドが固定され、ＰＣＲの温度サイクルを受け得るオリゴヌクレオチド固定マイクロプレート（ＰＣＲマイクロプレート）を用いるための方法を提供しており、ｍＲＮＡの捕捉と逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が同じプレートで行える。ポリプロピレン、ポリオレフィン、またはポリカーボネート製といったＰＣＲマイクロプレートを用いれば、それらの蛍光特性のため、固定されたオリゴヌクレオチド、ハイブリダイズしたｍＲＮＡおよび合成されたｃＤＮＡが、核酸染色を用いることにより、または蛍光または化学発光の生成によるタンパク質の助けで蛍光測定により定量することができる。これらのＰＣＲマイクロプレートはまた、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを精製することなく、粗細胞溶解液からｍＲＮＡを捕捉することもできる。
【０８６３】
また、本明細書では、本明細書に記載の逆転写ＰＣＲ法を実施するためのキットも提供される。このようなキットは、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製するために用いられる方法の個々の要素の１つが各々入った、バイアルやチューブなどの１以上の容器が、その中にきっちり収まって受け渡されるように区画化されたキャリヤーを含み得る。例えば、溶液中にＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつ、ＲＮアーゼＨ活性を実質的に含まない逆転写酵素の入った容器を提供することができる。さらなる容器としては、バッファー、デオキシヌクレオシド三リン酸などのＤＮＡ合成のための基質、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよび標品として用いる対照ＲＮＡを含み得る。
【０８６４】
ｖ．検出
ＲＴ−ＰＣＲから増幅された核酸分子は、質量分析またはチップハイブリダイゼーションなど、サンプル中の核酸分子を検出するための様々な方法により測定することができ、様々な検出結果はいずれも、増幅核酸分子の存在または不存在などのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子の存在または不存在、または検出される核酸分子の大きさを示し得る。癌胎児性フィブロネクチンをコードするＲＮＡの存在はまた、相対的ＲＴ−ＰＣＲ、競合的ＲＴ−ＰＣＲ、比較ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲなどの様々な方法を用いて定量することができる。
【０８６５】
ａ．ＤＮＡ検出法
ＲＴ−ＰＣＲから増幅された核酸分子は、本明細書で提供されるもの、または当技術分野で公知のものを含む、サンプル中の核酸を検出するための様々な方法により測定することができる。例えば、ＤＮＡは、ゲル電気泳動、サザンブロット分析、質量分析、ドットブロット分析およびチップハイブリダイゼーション法を用いて検出することができる。
【０８６６】
本明細書で提供される方法によれば、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物に相当する増幅デオキシリボ核酸分子などの核酸分子の検出は、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子の存在を示し得る。このような増幅核酸分子は、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子をコードする核酸分子（またはその相補物）の全部または一部を含み得る。例えば、本明細書で提供される方法を用いて検出される増幅核酸分子は、フィブロネクチンのＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域をコードする核酸分子またはその相補物の全部または一部を含み得る。増幅核酸分子はまた、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質には存在しないアミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列またはその相補物を含み得る。ヌクレオチド合成反応に関して逆転写用または増幅用に用いるプライマーは、非癌胎児性フィブロネクチンタンパク質には存在しないアミノ酸領域をコードする核酸分子またはその相補物に相補的となるように設計することができる。また、プライマーは、存在する場合には、鋳型核酸分子において、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳコード領域またはその相補物の全部または一部を含む増幅核酸分子を形成するように設計することもできる。このプライマーの設計に応じ、増幅核酸の存在の検出、または特定の大きさを持つ増幅核酸の検出、または特定のヌクレオチド配列を含む増幅核酸の検出は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る。
【０８６７】
ｂ．定量
癌胎児性フィブロネクチンをコードするＲＮＡの存在は、相対的ＲＴ−ＰＣＲ、競合的ＲＴ−ＰＣＲ、比較ＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを含む、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて定量することができる。相対的ＲＴ−ＰＣＲでは、標的核酸分子（すなわち、癌胎児性フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡ）の増幅を、β−アクチンｍＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ、または１８Ｓ  ｒＲＮＡといったハウスキーピング遺伝子の配列などの対照配列の増幅と比較する。この方法は、サンプル間のシグナルをノーマライズするために２以上のサンプルについて行い、これにより、癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子またはその相補物などの標的核酸分子の量の定量的算出が可能となる。
【０８６８】
競合的ＲＴ−ＰＣＲは、標的核酸分子の逆転写と、その後の、標的核酸分子と標的核酸分子の競合鋳型との同時ＰＣＲ増幅を用いることができ、ここで、この競合鋳型は標的核酸分子の、デザインされた突然変異体である。突然変異体の例としては、点突然変異、挿入または欠失から生じたものがある。これらの突然変異体は野生型配列とは異なるものとして検出することができ、例えば、この突然変異体は欠失を有する場合があり、従って、野生型標的核酸分子よりも短い核酸分子となる。標的核酸分子の存在量を定量するために用いる標準曲線を作製するため、いくつかのサンプルにおいて種々の量の競合突然変異体鋳型を使用することができる。競合法の一例として、試験間の比較を可能とする標準化競合鋳型を用いる標準化ＲＴ−ＰＣＲがある。例えば、米国特許第５，８７６，９７８号では、少なくとも標的核酸分子とハウスキーピング遺伝子の逆転写と、その後の、標的核酸分子、ハウスキーピング遺伝子およびこれらの核酸各々の競合鋳型の同時ＰＣＲ増幅を含む標準化競合的ＲＴ−ＰＣＲ法が提供されている。この方法では、標的核酸分子のプライマー、ハウスキーピング遺伝子のプライマー、および標的核酸分子とハウスキーピング遺伝子の設計された突然変異体を含む２つの内部標準競合鋳型を同時に用いる。このような方法はまた、ＷＯ０３／０８３０５１に記載のような複合形式で行うこともできる。
【０８６９】
ＲＴ−ＰＣＲ結果を定量するための別法として、比較ＲＴ−ＰＣＲがある。この方法では、２以上の標的核酸分子サンプルで、各サンプルに独特なプローブを用いて逆転写を行うが、この独特さはそのプローブのＲＮＡ認識部分におけるものではなく、サンプルごとに独特なｃＤＮＡが生じるというものである。逆転写後、種々の標的核酸分子配列を合わせ、ＰＣＲ増幅を行うと、種々のｃＤＮＡが互いに競合する（本明細書に記載される、または当技術分野で公知の競合的ＲＴ−ＰＣＲの場合と同様）。次に、増幅された独特な各ｃＤＮＡの相対量を決定することにより、各サンプル中の標的核酸分子の相対量が比較できる。
【０８７０】
また、ＲＴ−ＰＣＲは、「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲを用い、各増幅サイクルが終わるたびに定量することもできる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡの形成を検出する能力に基づくものである。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量のための方法の一例としては、標的核酸分子に少なくとも部分的に相補的であり、かつ、蛍光色素と消光色素を有するプローブヌクレオチドの使用を含む。このプローブヌクレオチドは、そのプローブヌクレオチドが標的核酸分子と相互作用（例えば、ハイブリダイズ）しない場合には蛍光色素が消光されて蛍光シグナルがほとんど、または全く生じず、そのプローブヌクレオチドが標的核酸分子と相互作用する場合には蛍光色素は消光されずに蛍光シグナルを生じるように設計される。この標的核酸分子が増幅されると、プローブヌクレオチドがその標的核酸分子と相互作用（例えば、ハイブリダイズ）して、標的核酸分子の存在量に比例して増加する蛍光シグナルを生じる。例えば、Bustin, J. Mol. Endocrinology 29:23−39 (2002)およびThelwell et al., Nucleic Acids Res. 28:3752−61 (2000)に記載されているようなＴａｑＭａｎプローブ、スコーピオンを含む様々なプローブヌクレオチドが利用可能である。リアルタイム定量はまた、ＳＹＢＲグリーン（例えば、Qiagen, Inc. (Valencia, CA)製のキット；例えば、Mouillesseaux et al., J. Virol. Methods 111(2):121−127 (2003)参照）など、二本鎖ＤＮＡと結合した際にだけ発光する色素を用いて行うこともできる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）または副溝結合色素などのさらなる試薬も使用可能である（Bustin, J. Mol. Endocrinology 29:23−39 (2002)参照）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ測定から得られた結果は、核酸濃度の関数としてシグナル強度を表す標準曲線と比較することができるか、または１以上の参照核酸のシグナル強度と比較することができる。蛍光色素／蛍光クエンチャープローブヌクレオチドを用いるものなど、これらの方法は、複合反応にも用いることができる。
【０８７１】
ｃ．癌胎児性フィブロネクチン領域の検出
核酸検出方法を用い、癌胎児性フィブロネクチンの特定領域の存在を検出することができる。癌胎児性フィブロネクチンの特定領域の検出は、可能性のある癌胎児性フィブロネクチンの細胞源または組織源または臓器源の同定、可能性のない癌胎児性フィブロネクチンの細胞源または組織源または臓器源の同定、または癌胎児性フィブロネクチンの特定の形態に関連する健康問題の同定を含む様々な目的を果たし得る。一例では、特定の核酸分子の検出、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質にＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ（またはその特定のスプライス変異体）が存在することを示し得る。また、核酸検出法を用い、ＩＩＩＣＳの１以上のスプライス領域の存在を検出することもできる。例えば、特定の検出分子量を有するフラグメントは、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質のＩＩＩＣＳ領域のトレオニン３３におけるＯ−グリコシル化の存在を示し得る。また、質量分析を用い、ＩＩＩＣＳの１以上のスプライス領域の存在を検出することもできる。例えば、特定の核酸分子の検出は、癌胎児性フィブロネクチンのアミノ酸（ａａ）９０〜１２０スプライス領域の存在を示し得る。
【０８７２】
特定の癌胎児性フィブロネクチン領域およびＩＩＩＣＳスプライス領域の検出は、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの特徴付けに役立ち得る。例えば、核酸検出法を用い、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンを、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ領域を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けすることができる。核酸検出法を用い、サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンを、Ｖ０、Ｖ６４、Ｖ８９、Ｖ９５またはＶ１２０などのＩＩＩＣＳの特定のスプライス変異体を含んでいる、または欠いているものとして特徴付けすることもできる。
【０８７３】
サンプル中に存在する１以上の癌胎児性フィブロネクチン核酸分子またはその相補物を特徴付けするためには、限定されるものではないが、ゲル電気泳動、質量分析、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ドットブロット分析、質量分析およびチップアレイハイブリダイゼーションを含む、本明細書で開示されている、または当技術分野で公知の様々な方法を使用することができる。一態様では、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物は、癌胎児性フィブロネクチン核酸分子またはそのフラグメントの分子量に従って特徴付けすることができる。例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０を含む癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物は、ＥＤＢとＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０のみをコードする癌胎児性フィブロネクチンまたはその相補物よりも大きな質量を有し、従って、核酸分子の質量の測定を用い、サンプルを、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０をコードする癌胎児性フィブロネクチン核酸分子またはその相補物、あるいはＥＤＢとＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０をコードする癌胎児性フィブロネクチン核酸分子またはその相補物を含有するものとして特徴付けすることができる。
【０８７４】
別の態様では、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物は、サンプルの核酸分子をプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより、特徴付けすることができる。例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０を含む癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子は、ＥＤＡ、ＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０スプライス領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができ、一方、ＥＤＢとＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０を含む癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子はＥＤＢおよびＩＩＩＣＳ  Ｖ１２０スプライス領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることができるが、ＥＤＡスプライス領域に相補的なオリゴヌクレオチドプローブとはハイブリダイズすることができない。
【０８７５】
癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子を特徴付けするための、本明細書で開示されている核酸検出法の使用においては、プローブまたはプライマーなどの１以上の核酸分子を用いて、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子を特徴付けすることができる。例えば、異なる癌胎児性フィブロネクチン領域に相補的な２以上の核酸分子またはその相補物を用い、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物を識別または特徴付けすることができる。従って、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチンのある領域の指標となる、または特定の癌胎児性フィブロネクチン変異体の指標となる１以上の核酸を同定することにより、サンプル中の癌胎児性コードフィブロネクチンまたはその相補物を特徴付けするための方法が提供される。そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物に応じて、プローブまたはプライマー核酸分子は全てではないにしてもいくつかが、癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物の特徴付けにおいて検出かつ／または増幅可能である。例えば、サンプルが、ＥＤＡはコードするがＥＤＢはコードしないヌクレオチド配列を含む癌胎児性フィブロネクチンコード核酸分子を含む場合、ＥＤＡをコードする核酸分子とＥＤＢをコードする核酸分子の双方およびそれぞれに相補的なプローブまたはプライマーをサンプルに加えることができるが、ＥＤＡをコードする核酸分子に相補的なプローブまたはプライマーだけが増幅かつ／または検出される。必ずしも必要ではないが、サンプルの癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物の核酸分子組成物またはヌクレオチド組成物を同定し、その癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子またはその相補物を特徴付けすることもできる。例えば、ヌクレオチド組成の異なる（例えば、一方はＥＤＡおよびＥＤＢをコードし、他方はＥＤＢをコードするがＥＤＡをコードしない）２つの癌胎児性フィブロネクチンコード分子またはその相補物は、同じサンプル処理および核酸検出法を施したとしてもゲルまたはブロット上で異なった結合を示し、これにより、その分子のヌクレオチド配列またはヌクレオチド組成を調べることなく、一方または双方の癌胎児性フィブロネクチンコード分子またはその相補物を特徴付けすることができる。一態様では、このような方法は、サンプルの１以上の核酸分子の測定値を参照の核酸分子（例えば、既知の癌胎児性フィブロネクチン分子）の測定値と比較することにより、または１以上の核酸分子を１以上の参照核酸分子（計算されたか、または実験的に決定されたもの）と比較することにより行うことができる。
【０８７６】
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの領域を検出するためにオリゴヌクレオチドを用いる様々な方法は、腫瘍組織サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンまたはその相補物の領域を検出するためにオリゴヌクレオチドを用いる方法を含む、当技術分野で公知である。例えば、オリゴヌクレオチドを用い、甲状腺乳頭腺癌においてＥＤＡ、ＥＤＢ、ならびにＩＩＩＣＳのＶ０、Ｖ６４およびＶ８９をコードするｍＲＮＡの存在を検出することができる(Takano et al., J. Endocrinol. Invest. 22:18−22 (1999))。別の例では、オリゴヌクレオチドを用い、肝細胞癌においてＥＤＡおよびＥＤＢの存在を検出することができる(Oyama et al., Cancer Res. 53:2005−2011 (1993))。
【０８７７】
５．癌胎児性フィブロネクチンに対する自己抗体の検出
癌胎児性フィブロネクチン、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはそのフラグメントに対して反応性のある自己抗体の検出は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在を示し得る。癌胎児性フィブロネクチン、または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはそのフラグメントに対して反応性のある自己抗体の検出はまた、全般的な健康、癌、または妊娠関連の状態を含む様々な健康状態および／または健康問題を示し得る。さらに、自己抗体レベルのモニタリングを用いれば、疾病進行の段階を決定すること、疾病または障害の結果を決定すること、疾病または障害の特定の処置の成功の可能性を決定すること、および／または処置計画を決定することができる。対象由来の血清サンプルなどのサンプルにおける自己抗体の検出は、いくつかの方法のうちいずれによって行ってもよい。癌胎児性フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子に対する自己抗体を検出するためには、本明細書で提供されるものを含む、抗体検出のための、公知の様々な方法のいずれを用いてもよい。このような方法としては、限定されるものではないが、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、ディップスティックイムノアッセイ、水平流動イムノアッセイ、垂直流動イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、およびラテックスビーズ凝集アッセイなどの凝集アッセイといった技術を用いるアッセイ系を含むイムノアッセイが挙げられる。サンプル中の自己抗体を検出するための方法および組成物は、米国特許第６，７８８，１２８号、米国特許公報第２００３０２３２３９９号および同第２００４００４８３２０号ならびにＷＯ０３／０２０１１５に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０８７８】
イムノアッセイの一例としては、対象の血清サンプルなどのサンプルを癌胎児性フィブロネクチンタンパク質またはそのフラグメントと、特異的抗原抗体結合複合体が形成可能な条件下で接触させること、および複合体を検出する、またはその量を測定することにより行うことができる。抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の存在は、対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在、または対象における癌胎児性フィブロネクチン関連の疾病または障害の存在を示し得る。別の例では、サンプル中の自己抗体のレベルを、その疾病または障害を持たない対象由来の類似のサンプル中に存在するレベルと、あるいはその疾病または障害を持たない対象集団中に存在するレベルと比較することができる。その疾病または障害を持たない対象におけるレベルよりも高い抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体レベルが存在する場合に癌胎児性フィブロネクチン陽性結果を示し、その対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する疾病または障害が存在することを示し得る。
【０８７９】
イムノアッセイの別の例では、サンプルを、抗ヒトＩｇＧ抗体などの抗（ヒト抗体）抗体、またはそのフラグメントと、特異的抗原抗体結合複合体が形成可能な条件下で接触させ、複合体を検出する、またはその量を測定する。抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の存在は、癌胎児性フィブロネクチンの存在、またはその対象における癌胎児性フィブロネクチン関連の疾病または障害の存在を示し得る。別の例では、サンプル中の自己抗体のレベルを、その疾病または障害を持たない対象由来の類似のサンプル中に存在するレベルと、あるいはその疾病または障害を持たない対象集団中に存在するレベルと比較することができる。その疾病または障害を持たない対象におけるレベルよりも高い抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体レベルが存在する場合に癌胎児性フィブロネクチン陽性結果を示し、その対象に癌胎児性フィブロネクチンに関連する疾病または障害が存在することを示し得る。
【０８８０】
イムノアッセイは様々な方式で行うことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子もしくはそのフラグメントを固体支持体上に固定し、それに特異的に結合した抗癌胎児性フィブロネクチン抗体を検出することができる。本明細書で提供されるアッセイで用いる癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または癌胎児性フィブロネクチンをコードする核酸分子は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンまたはその抗原性フラグメントをコードするＤＮＡ分子を、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸の大規模生産に適当な発現ベクター中へ遺伝子操作することができる。癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の標識、固定または検出を補助する融合タンパク質を発現させることができる。例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている技術を参照。あるいは、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸は天然源から精製することもでき、例えば、当技術分野で公知の精製および分離技術を用いて細胞から精製することができる。このような精製技術としては、限定されるものではないが、分子ふるいクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。一態様では、マイクロタイタープレートを、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸の固体支持体として用いることができる。これらの表面は予め調製し、保存しておくことができる。この固体支持体に結合した抗癌胎児性フィブロネクチン抗体は、例えば、固体支持体を、抗（ヒト抗体）抗体（抗ヒトＩｇＥ抗体など）などの検出可能な抗体と接触させることにより検出することができ、この場合、この検出可能な抗体は検出可能な部分または結合可能な部分と結合させることもできるし、あるいは抗ヒトＩｇＥ−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートなど、検出可能な部分または結合可能な部分を含み、特異的に結合する相手により検出することもできる。
【０８８１】
別の例では、抗ヒトＩｇＥ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体などの抗（ヒト抗体）抗体、またはそのフラグメントを固体支持体上に固定し、そこに特異的に結合した抗癌胎児性フィブロネクチン抗体を検出することができる。本明細書で提供されるアッセイで用いる抗（ヒト抗体）抗体は、本明細書で提供される、またはそうでなければ当技術分野で公知の様々な方法のよって作製することができる。一例では、マイクロタイタープレートを、抗（ヒト抗体）抗体の固体支持体として用いることができる。これらの表面は予め調製し、保存しておくことができる。この固体支持体に結合した抗癌胎児性フィブロネクチン抗体は、例えば、固体支持体を、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントなどの結合相手と接触させることにより検出することができ、この場合、この結合相手は検出可能な部分または結合可能な部分と結合させることもできるし、あるいは抗ヒトフィブロネクチン−セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートなど、検出可能な部分または結合可能な部分を含む化合物が特異的に結合することもできる。
【０８８２】
別の例では、抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体は、サンプルを癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントと接触させること、および癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントと結合したサンプル成分を、残りのサンプル成分から分離することにより検出することができる。このような分離法は、限定されるものではないが、サンプルを、固体支持体に固定されている癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントと接触させた後、その固体支持体をサンプルから分離すること（例えば、洗浄バッファーを使用）によるか、あるいはサンプルを、磁性ビーズまたはビオチンなどの結合可能な部分とコンジュゲートされた癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントと接触させ、そのコンジュゲートをサンプルから分離すること（例えば、そのコンジュゲートをサンプルから取り出すための磁石またはストレプトアビジンを含有する固体支持体を使用）によるなど、当技術分野で公知の様々な方式のいずれかで行うことができる。結合したサンプル成分を残りのサンプルから分離した後、サンプル成分またはそのフラグメントを癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントから解離させ、結合していたサンプル成分またはそのフラグメントの分子量を検出することができる。抗体の指標となる１以上の質量は、そのサンプル中に抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体が存在することを示し得る。所望により、サンプル成分の質量を測定する前に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントと結合したサンプル成分を癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントから遊離させ、抗（ヒト抗体）抗体と、ヒト抗体がその抗（ヒト抗体）抗体と特異的に結合する条件下で接触させることができる。抗（ヒト抗体）抗体と結合したサンプル成分またはそのフラグメントは、残りのサンプル成分から分離し、このような分離の後に、結合していたサンプル成分またはそのフラグメントの質量を測定することができる。当業者が認識しているように、結合および分離の２つの事象を質量測定の前に行う場合には、自己抗体結合相手の順序は容易に相互交換可能である（例えば、まず、サンプルを抗（ヒト抗体）抗体と結合させ、次に、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸と接触させることもできるし、またはその逆も可能である）。
【０８８３】
サンプル成分またはそのフラグメントの質量測定は、例えば、質量分析により行うことができる。サンプル成分またはそのフラグメントの分子量を検出するために質量分析を用いる場合、抗体またはそのフラグメントは検出される分子量によって同定することができる。抗体のタンパク質分解は、質量が既知の抗体フラグメントを生じ得る。従って、自己抗体結合相手との結合の際、または自己抗体結合相手から遊離した後のサンプル成分のタンパク質分解から、抗体フラグメントの指標となる質量を有するフラグメントが生じ得る。質量分析は質量を正確に測定し、抗体フラグメントの指標となる質量を有するフラグメントが存在するかどうかを決定することができる。抗体フラグメントの指標となる質量を有するタンパク質分解フラグメントの検出により、このサンプルを、抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体を含有するものと同定することができ、これにより、その対象に癌胎児性フィブロネクチンが存在することを示すことができる。
【０８８４】
また、本明細書では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸と結合する１以上の自己抗体のアミノ酸配列を決定するための方法も提供される。質量分析により測定された抗体および抗体フラグメントを、その抗体または抗体フラグメントのアミノ酸配列の全部または一部を決定するためにさらに検討することができる。例えば、タンデム質量分析測定法およびＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標）(Thermo Electron Corp., Woburn MA)などのコンピューター法を含む、タンパク質またはタンパク質フラグメントのアミノ酸配列を決定するために質量分析を用いる様々な方法は当技術分野で公知である。様々な公知の質量分析配列決定法の例が、米国特許第５，５３８，８９７号、同第６，０１７，６９３号、同第６，４８９，１２１号、同第６，６７０，１９４号および同第６，７１６，６３６号および米国特許公報第２００３０１０４４８３号に示されている。方法の一例では、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸と結合する１以上の自己抗体のアミノ酸配列は、サンプルを抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体結合相手と接触させること、その結合相手と結合してないサンプル成分を分離すること、所望により、結合した細分を遊離させること、および遊離した成分を第二の抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体結合相手と接触させること、所望により、結合した成分をフラグメント化すること、結合した成分またはそのフラグメントの分子量を質量分析により検出し、それにより、その成分またはそのフラグメントのアミノ酸配列が決定されることにより、決定することができる。
【０８８５】
また、本明細書では、１以上の付加的抗腫瘍マーカー自己抗体の検出とともに、抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体を検出するための方法が提供される。このような検出法は、抗癌胎児性フィブロネクチン自己抗体の検出に関して本明細書に記載されているものと同じ原理に従って行うことができ、この場合、この付加的腫瘍マーカーまたはそのフラグメントを自己抗体結合相手として使用することができる。例えば、サンプルを、固体支持体に固定されている抗（ヒト抗体）抗体と接触させ、その固体支持体をまた、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントと１以上の付加的腫瘍マーカーまたはそのフラグメントと接触させることができ、この場合、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸および各腫瘍マーカーは識別して検出可能な部分または結合可能な部分（例えば、発光波長の異なる蛍光団、または一方がビオチンとコンジュゲートされ、他方が磁性ビーズとコンジュゲートされたもの）とコンジュゲートさせることができ、それにより、識別可能なシグナルまたは独立した結合事象により、独立的に、そのサンプル中の、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸に対する自己抗体および／または１以上の付加的腫瘍マーカーの存在を同定することができる。別の例では、サンプルを、固体支持体に固定されている癌胎児性フィブロネクチンタンパク質もしくは核酸またはそのフラグメントと１以上の付加的腫瘍マーカーと接触させることができ、この場合、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸および各腫瘍マーカーを固体支持体の異なる領域に固定することができ、この固体支持体をまた、所望により検出可能な部分または結合可能な部分とコンジュゲートされていてもよい抗（ヒト抗体）抗体と接触させることができ、ここで、１以上の領域における自己抗体の存在により、独立的に、そのサンプル中の、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質または核酸に対する自己抗体および／または１以上の付加的腫瘍マーカーの存在を同定することができる。このような手順を行うための方法および装置は、例えばマイクロアレイチップを用いて行うことができ、その一般的な使用は当技術分野で公知である。
【０８８６】
それに対する自己抗体を検出することができる様々な付加的腫瘍マーカーは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ｐ５３、ｃ−ｅｒｂＢ２、ｃ−ｍｙｃ、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｂｃｌ−２、ｂａｘ、ＰＳＡ、ＣＹＦＲＡ  ２１−１、ＰＴＨ−ＲＰ、ＣＡ１２５、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー、プロガストリン、ガストリンＧ１７、ガストリンＧ３４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７−２９、ＣＡ  ７２−４、ＡＰＣ、ＳＣＣ、ＨＰＶサブタイプ、ＴＫ、αＦＰ、ｐ６２、カリクレイン、ｒａｓ、バソプレシン、ガストリン放出ペプチド、アネキシンＩ、アネキシンＩＩ、ＨｕおよびＫＯＣが挙げられる（例えば、米国特許公開番号２０００３０２３２３９９参照）。
【０８８７】
６．その他の分析物の測定
分析物としては、癌胎児性フィブロネクチンの他、限定されるものではないが、エストリオールを含むステロイドホルモンなどのホルモン；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、サルモネラ菌、大腸菌、酵母または寄生虫感染など、感染性生物の指標となる抗原、アポリポタンパク質（ａ）およびリポタンパク質（ａ）、環境抗原、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、Ｅ−３−Ｇ、インターロイキンおよび他のサイトカイン類、および免疫調節タンパク質（ＩＬ−６およびインターフェロンなど）、小核リボ核酸粒子（ｓｎＲＮＰ）抗原、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）、３−クロロチロシンなどの次亜塩素酸マーカー、腫瘍マーカー、または癌または妊娠関連の状態の他の指標といったタンパク質またはペプチド；上記タンパク質またはペプチドの１つをコードする核酸またはその相補物、メチル化核酸、または癌または妊娠関連状態に関連する他の核酸；クレアチニン、サンプルの比重または癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値をノーマライズするために使用可能な他の分析物が挙げられる。
【０８８８】
ａ．ノーマライゼーション
無処理サンプルは、広範な溶質濃度を含む可能性があり、また、これに希釈バッファーを含む１以上の試薬を添加することもできる。サンプル中の溶質濃度には変動がある可能性があるため、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量がある閾値レベルを超える量を示すかどうは不明瞭である場合がある。必要に応じて、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が閾値レベル以上であるかどうかを決定するため、サンプル中の溶質の濃度をノーマライズすることができる。例えば、尿サンプル中の成分の濃度、排尿間の時間、対象による食物および水分の摂取、ならびに対象の腎機能を含む様々な因子によって異なる。このような場合には、例えば、分析物濃度を一定して産生される尿成分の濃度と比較し、溶質濃度を変動させる因子の影響の少ない、または因子には依存しないノーマライズ分析物濃度を得ることにより、分析物濃度をノーマライズすることができる。
【０８８９】
一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量をそのサンプルに対してノーマライズするために、１以上の成分またはサンプルの他の特徴を測定すればよい。測定される特性および／または成分としては、ｐＨ、比重、イオン強度、一定の割合で産生される化合物の濃度、および一定の割合でそのサンプル中に流入する投与化合物の濃度が挙げられる。尿の場合、対象が一定の割合で産生する尿の成分としては、クレアチニン、ＩｇＡ、ＩｇＧ、アルブミン、尿素、シスタチン−Ｃ、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ヨウ化芳香族、金属錯体および有機色素が挙げられる（Achilefu et al., Topics in Current Chemistry, 222:31−72 (2002)参照）。これら、また他の化合物を用いて尿成分をノーマライズする方法は当技術分野で公知であり、クレアチニンまたはイヌリンを用いたノーマライズに関しては米国特許第６，４３６，７２１号に例示されており、また、ＩｇＡ、アルブミンまたはＩｇＧを用いたノーマライズに関しては米国特許第６，３６８，８７３号に例示されている。ノーマライゼーション用の化合物ならびに分析物を測定するためのデバイスは、米国特許第５，８０４，４５２号、同第６，３６８，８７３号および同第６，４３６，７２１号に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０８９０】
一例では、尿サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度は、その尿サンプルにおいて測定された癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度を、その尿サンプルにおいて測定されたクレアチニン濃度と比較することにより、ノーマライズすることができる。サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度を測定する際には、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子とクレアチニンの濃度を測定することができる。この癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度は、尿サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度とクレアチニン濃度の比を求めることによりノーマライズすることができる。このようにノーマライズされた癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度を用い、サンプルが採取された対象の尿中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の典型的な濃度をより正確に求めることができ、かつ／または対象を癌胎児性フィブロネクチン陽性または陰性として同定するのに使用可能な参照比と比較することができる。また、このノーマライズされた癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度を用い、それを超えると対象の疾病または分娩の可能性が高くなる閾値をより正確に決定することができる。また、このノーマライズされた癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度は、試験結果を変化させることなく、尿サンプルの操作（例えば、濃縮および／または希釈）の容易性も高める。
【０８９１】
ｂ．その他のマーカーとの組合せ
一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出を、妊婦が分娩に至る可能性の高低、妊婦の分娩日、誘発処置の有効性、新生物性疾患の存在または不存在、新生物性疾患の処置の有効性、または新生物性疾患に対する対象の傾向を決定するための１以上の付加的マーカーの検出と組み合わせることができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、唾液エストリオールと組み合わせて検出することができ、癌胎児性フィブロネクチン指標分子と唾液エストリオールの検出は、妊婦が分娩に至る可能性が高いこと、妊婦の分娩日、または誘発処置の有効性を示し得る。
【０８９２】
別の例では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出は、新生細胞の存在を決定するための１以上の付加的腫瘍マーカーの検出と組み合わせることができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）および／またはＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ−Ｔ３（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３）と組み合わせて検出することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子をＩＬ−６と組み合わせて検出する場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子とＩＬ−６の検出は、新生乳房細胞、新生膀胱細胞、新生子宮頸細胞または新生卵巣細胞などの新生細胞の存在を示し得る。別の例では、特定の発現遺伝子、抗原もしくはタンパク質、またはその変異体など、腫瘍または新生物性症状の指標となる腫瘍マーカーを、本明細書で提供される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法と組み合わせて検出し、対象における腫瘍性細胞または新生細胞の存在または不存在を示すことができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出を、乳癌診断法のＨｅｒ／Ｎｅｕ検出法と組み合わせることができる。
【０８９３】
ｉ．破水の指標
一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定は、破水の指標の測定により行うことができる。一般に、癌胎児性フィブロネクチンアッセイが陽性の場合、その対象由来のサンプルに対して、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）または３−クロロチロシンなどの次亜塩素酸のマーカーといった破水指標のアッセイを行い、羊膜が完全であるかどうかを決定することができる。この頸膣サンプルは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子に関してアッセイするために用いたサンプルと同じであっても異なっていてもよい。ＩＧＦＢＰ−１アッセイを行うための方法は、国際公開第ＷＯ９４／１７４０５号に例示されているように、当技術分野で公知であり；例えば、当技術分野で公知の様々な方法の１つを用いて３−クロロチロシンを検出することにより、次亜塩素酸の存在を検出する方法も当技術分野で公知であり、ＷＯ０４／００３５５５に例示されている。破水指標アッセイが陰性であれば、破水はなく、その対象には本明細書に記載のように子宮収縮抑制剤を投与することができる。しかし、破水指標アッセイが陽性であれば、破水していることを示し、その試験は、分娩は遅延させることができず、一般に子宮収縮抑制剤は投与されないことを示す。
【０８９４】
ａ．インスリン様増殖因子結合タンパク質
ＩＧＦＢＰ−１は、サンプル中のＩＧＦＢＰ−１の量を測定することができるか、またはＩＧＦＢＰ−１の量が閾値レベル以上である場合に破水を示す、いずれかの定量的または半定量的手順によってアッセイされる。
【０８９５】
抗ＩＧＦＢＰ−１抗体は、いくつかの方法により作製することができる。ポリクローナル抗体は、ヒトＩＧＦＢＰ−１を含有する免疫組成物を宿主動物に投与することにより誘導することができる。あるいは、羊水または高レベルＩＧＦＢＰ−１の別の供給源を免疫原として用いてもよく、選択された特異性を有する抗体を同定することができる。
【０８９６】
ＩＧＦＢＰ−１の免疫組成物の作製は宿主動物によって異なり、周知のものである。例えば、ＩＧＦＢＰ−１またはその抗原部分は、ＫＬＨまたはＢＳＡなどの免疫物質とコンジュゲートさせることもできるし、またはアジュバント中に提供することもできる。誘導された抗体は、その組成物がＩＧＦＢＰ−１特異的であるかどうか決定するため試験することができる。ポリクローナル抗体組成物が十分な特異性を示さない場合には、様々な常法により特異性を高めるために抗体を精製することができる。例えば、この組成物は、この組成物を、固体支持体に付着させたＩＧＦＢＰ−１と接触させることにより精製し、他の物質との結合を低減することができる。支持体と結合する抗体が保持される。セファデックス、セファロースを含むアフィニティークロマトグラフィー物質などの様々な固体支持体に付着させた抗原を用いた精製技術が周知である。
【０８９７】
また、モノクローナルＩＧＦＢＰ−１特異的抗体も常法により作製することができる。マウスにＩＧＦＢＰ−１を含有する免疫組成物を注射し、脾細胞を得ることができる。これらの脾細胞を融合相手と融合させ、ハイブリドーマを作出することができる。これらのハイブリドーマにより分泌された抗体を、それらの抗体がＩＧＦＢＰ−１と反応し、かつ、サンプル中に存在し得る他のタンパク質とは実質的に反応を示さないハイブリドーマを選択すべくスクリーニングすることができる。選択された特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマは、標準的な技術により培養することができる。ハイブリドーマの作出技術および培養法は当技術分野で公知である。
【０８９８】
これらのアッセイ条件および試薬は、当技術分野で公知の、または本明細書で開示されている様々な方法および条件のいずれであってもよい。このアッセイはヘテロジニアスアッセイであってもホモジニアスアッセイであってもよく、サンドイッチアッセイが便利である。このアッセイは通常、固相付着抗ＩＧＦＢＰ−１抗体を用いる。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルまたは抗体フラグメントまたは他の結合部分であってもよい。これらの固相付着抗体をサンプルと合わせる。抗体とサンプルの間の結合はいくつかの方式で決定することができる。ＩＧＦＢＰ−１に特異的な可溶性抗体を用いることで、複合体の形成を決定することができる。これらの抗体は直接標識することもできるし、またはその可溶性抗体種に特異的な標識二次抗体を用いて検出することもできる。種々の標識として、放射性核種、酵素、蛍光化合物、金属コロイドなどが挙げられる。便宜には、このアッセイは定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、ここでは、ＩＧＦＢＰ−１特異的抗体を、固相に付着させ、酵素標識した可溶性抗体として用いる。あるいは、アッセイは競合阻害に基づくものであってもよく、ここでは、サンプル中のＩＧＦＢＰ−１は、所定量の抗ＩＧＦＢＰ−１抗体をめぐって既知量のＩＧＦＢＰ−１と競合する。例えば、そのサンプル中に存在するＩＧＦＢＰ−１は、抗体結合部位をめぐって既知量の標識ＩＧＦＢＰ−１またはＩＧＦＢＰ−１類似体と競合し得る。固相に付着した標識ＩＧＦＢＰ−１の量か、または溶液中に残っている標識ＩＧＦＢＰ−１の量を測定することができる。
【０８９９】
このコンジュゲートを適宜希釈し、そのアッセイのバックグラウンド値を超えるＩＧＦＢＰ−１の選択された閾値レベルを陽性サンプルとして検出することができる。
【０９００】
これらのアッセイ結果は次のように解釈することができる。ＩＧＦＢＰ−１レベルが２０〜５０ｎｇ／ｍＬ未満である場合には、バックグラウンドとみなすことができ、陰性とされる。バックグラウンドレベルとして選択されるカットオフは、高感度試験を選択するか高特異性試験を選択するかによって異なる。例えば、急迫出産に関して陽性の癌胎児性フィブロネクチン決定結果を示し（バッファー処理スワブサンプルについて＞５０ｎｇ／ｍＬ）、かつ、破水に関して陰性のシダ状結晶形成性、プーリング、ニトラジン決定結果を示した２４の頸膣分泌液検体をＩＧＦＢＰ−１に関して試験した。これらの検体のうち１つは４２ｎｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−１を示し、残りのものは２０ｎｇ／ｍＬ未満のＩＧＦＢＰ−１を示した。２０ｎｇ／ｍＬのカットオフを用いたとしたら、破水を除外すべく示されるこの試験の特異性は９７％となる。一方、５０ｎｇ／ｍＬを用いたとしたら、この試験の除外特異性は１００％となる。ほとんどの場合において、破水した対象が破水していない対象よりも感染の危険性が大きいために、高い除外特異性を用いればよく、従って、カットオフは２０〜５０ｎｇ／ｍｌまたは約２０〜５０ｎｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【０９０１】
異なる試薬を用いる他のアッセイでは、カットオフ値が異なる。例えば、抗原結合特性が異なるＩＧＦＢＰ−１抗体は最適なカットオフ値が異なるアッセイ結果を生じ得る。当業者ならば、異なる試薬を用いればバックグラウンドが異なることが分かるであろうし、また、選択されたアッセイに関して選択された特異性と感度に相応のバックグラウンドレベルをどのように決定すればよいかが分かるであろう。さらに、異なる適用には異なる最適カットオフを用いることができる。例えば、分娩日の予測因子として癌胎児性フィブロネクチンを用いる場合には、バッファー処理スワブサンプルのカットオフとして癌胎児性フィブロネクチンタンパク質５０ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍＬを使用することができる。
【０９０２】
高い分娩リスクを示すマーカーに関して陽性である対象由来の頸膣分泌液サンプルにおけるＩＧＦＢＰ−１の存在は、破水していることを示す。ＩＧＦＢＰ−１が２０〜５０ｎｇ／ｍＬ未満であるか、または検出できない（そのアッセイバックグラウンド）場合、羊膜は完全なままである。ＩＧＦＢＰ−１が陽性であり（＞２０〜５０ｎｇ／ｍＬ）、かつ、分娩マーカー（例えば、癌胎児性フィブロネクチン）が陰性であれば、羊膜は破れている可能性があるが、破水しているほとんどの対象はＩＧＦＢＰ−１と分娩マーカーが同時に陽性を示す。ＩＧＦＢＰ−１が陰性であれば、一般に、そのサンプルがＩＧＦＢＰ−１陽性となるまで毎日、ＩＧＦＢＰ−１試験を繰り返せばよい。
【０９０３】
ｂ．次亜塩素酸
次亜塩素酸の存在は、当技術分野で公知のように、Winterbourn et al., Free Radic. Biol. Med. 29:403−409 (2000) and Chapman et al., Arch. Biochem. Biophys. 377:95−100 (2000)に例示されているように、様々な既知の方法のいずれかによりアッセイすることができる。次亜塩素酸の存在を決定するための典型的な方法は、サンプル中の３−クロロチロシンおよび／または他のクロロチロシンを検出することにより行うことができる。３−クロロチロシン、およびジクロロチロシンを含む他のクロロチロシンを検出するための方法は、WO 04/003555, Woods et al., Kettle, AJ, Methods Enzymol. 300:111−120 (1999)およびHazen et al., J. Clin. Invest. 99:2075−2081 (1997)に例示されているように、当技術分野で公知である。３−クロロチロシンなどのクロロチロシンを検出するための典型的な方法は、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（例えば、Hazen et al., J. Clin. Invest. 99:2075−2081 (1997) 参照）およびＥＬＩＳＡを含むイムノアッセイなどの結合相手に基づく方法（例えば、WoodsらのＷＯ０４／００３５５５参照）を含む。
【０９０４】
一態様では、次亜塩素酸指標の存在が破水を示し得る。他の態様では、閾値レベル以上の量の次亜塩素酸指標の存在が破水を示し得る。一般に、破水を示し得る次亜塩素酸指標の量は、破水していない妊婦に存在する平均量（平均または中間量など）よりも多い量である。サンプルが破水を表し得る程度は、診断目的に応じ、破水していない妊婦に存在する平均量を標準偏差いくつ分超えているかに従って決定することができる。例えば、さらなる評価のために選択し得る偽陽性を含んでもよいアッセイや、正常以下のエストリオール値を有し、サンプル間の変動が比較的小さいことが分かっている対象や、高リスク個体では、１つ分の標準偏差を用いることができる。一般には、平均値を２つ分超える標準偏差か、平均値を３つ分超える標準偏差が用いられる。
【０９０５】
抗クロロチロシン抗体は当技術分野で公知のいくつかの方法によって作製することができる。このような抗体を生成するための方法および抗原の例は、ＷＯ０４／００３５５５に示されている。例えば、ポリクローナル抗体は、宿主動物に、例えば、担体タンパク質に結合された３−（３−クロロ−４−ヒドロキシ−ベンジル）−６−メルカプトメチルピペラジン−２，５−ジオン、担体タンパク質に結合されたＮ−アセチル−３−クロロチロシン、または担体タンパク質に結合されたＮ−アセチル−３，５−クロロチロシンを含有する免疫組成物を投与することにより誘導することができる。
【０９０６】
免疫組成物の調製は宿主動物によって異なり、周知のものである。例えば、クロロチロシンを含有する化合物は、ＫＬＨまたはＢＳＡなどの免疫物質とコンジュゲートさせることもできるし、またはアジュバント中に提供することもできる。誘導された抗体は、その組成物がクロロチロシン特異的であるかどうか決定するため試験することができる。ポリクローナル抗体組成物が十分な特異性を示さない場合には、様々な常法により特異性を高めるために抗体を精製することができる。例えば、この組成物は、この組成物を、固体支持体に付着させたクロロチロシンと接触させることにより精製し、他の物質との結合を低減することができる。支持体と結合する抗体が保持される。セファデックス、セファロースを含むアフィニティークロマトグラフィー物質などの様々な固体支持体に付着させた抗原を用いた精製技術が周知である。
【０９０７】
また、モノクローナルクロロチロシン特異的抗体も常法により作製することができる。マウスにクロロチロシンを含有する免疫組成物を注射し、脾細胞を得ることができる。これらの脾細胞を融合相手と融合させ、ハイブリドーマを作出することができる。これらのハイブリドーマにより分泌された抗体を、それらの抗体がクロロチロシンと反応し、かつ、サンプル中に存在し得る他のタンパク質とは実質的に反応を示さないハイブリドーマを選択すべくスクリーニングすることができる。選択された特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマは、標準的な技術により培養することができる。ハイブリドーマの作出技術および培養法は当技術分野で公知である。
【０９０８】
これらのアッセイ条件および試薬は、当技術分野で公知の、または本明細書で開示されている様々な方法および条件のいずれであってもよい。このアッセイはヘテロジニアスアッセイであってもホモジニアスアッセイであってもよく、サンドイッチアッセイが便利である。このアッセイは、固相付着抗クロロチロシン抗体を用いることができる。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルまたは抗体フラグメントまたは他の結合部分であってもよい。これらの固相付着抗体をサンプルと合わせる。抗体とサンプルの間の結合はいくつかの方式で決定することができる。クロロチロシンに特異的な可溶性抗体を用いることで、複合体の形成を決定することができる。これらの抗体は直接標識することもできるし、またはその可溶性抗体種に特異的な標識二次抗体を用いて検出することもできる。種々の標識として、放射性核種、酵素、蛍光化合物、金属コロイドなどが挙げられる。便宜には、このアッセイは定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、ここでは、Ｉクロロチロシン特異的抗体を、固相に付着させ、酵素標識した可溶性抗体として用いる。あるいは、アッセイは競合阻害に基づくものであってもよく、ここでは、サンプル中のクロロチロシンは、所定量の抗クロロチロシン抗体をめぐって既知量のクロロチロシンまたはクロロチロシン含有化合物と競合し、競合を当技術分野で公知の方法により測定することができる。
【０９０９】
クロロチロシンを検出するためのガスクロマトグラフィー／質量分析法は当技術分野で公知のようにして行うことができ、Hazen et al., J. Clin. Invest. 99:2075−2081 (1997)に例示されている。要するに、サンプルを、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー工程を含む１以上の分離工程で処理すればよい。次に、クロマトグラフィー済みのサンプルを、例えば、化学的イオン化によりイオン化し、そのイオンの質量および／または質量／電荷比を質量分析により測定することができる。
【０９１０】
ｉｉ．エストリオール
ＩＧＦＢＰ−１アッセイに加え、またはその代わりに、対象から得たサンプル中のエストリオール濃度を測定することもできる。エストリオールの測定に用いるアッセイのタイプに特に制限はない。いずれのエストリオールアッセイを用いてもよい。
【０９１１】
１９９６年１月２日に発行された米国特許第５，４８０，７７６号に例示されているように、エストリオールアッセイの様々な例が当技術分野で公知である。要するに、血液（または血液画分、特に、血清または血漿）、尿、子宮頸または膣分泌液、汗、唾液またはその他の体液などの体液サンプルのいずれかに対してアッセイを行えばよい。エストリオールは、体中の液体に分布するに十分な水溶性を有している。サンプル採取が簡単で、また、尿とは違ってエストロゲンコンジュゲートの存在によって検出が煩雑になることがないので、唾液を使用することができる。
【０９１２】
アッセイは一般に遊離型エストリオールの検出に向けられるが、これはコンジュゲート型のエストリオールの生物活性が低いためである。唾液では、約９２％のエストリオールが遊離型であるが、尿ではほとんどのエストリオールがコンジュゲートとして存在する。ステロイド代謝を熟知している者にとっては明らかなことであるが、エストリオールコンジュゲートは、非ステロイド系化合物とエストリオールの共有結合の形成により形成される化合物である。この結合は一般にステロイド環構造のヒドロキシル基を介したものである。非ステロイド系成分は無機（例えば、硫酸基）であっても有機（例えば、グルクロニド基）であってもよい。
【０９１３】
一貫性が維持される限り、サンプルの採取および取扱いには特に制限はない。唾液および血漿などのいくつかの体液を用いる場合には、エストリオールレベルの日中変動は小さい。他の体液、特に尿では、変動がある。一態様では、例えば、１日の同じ時間にサンプルを採取することにより、変動を可能な限り小さくする。臨床学的液体中の分析物の測定値の一貫性を確保するため、他の技術を用いることもできる。例えば、尿中のエストリオールと同時にクレアチニンを測定し、エストリオール濃度をノーマライズすることができる。当技術分野で公知のように、クレアチニンは、腎臓において一定の割合で産生されるので、クレアチニン濃度を測定すれば、尿サンプルにおける量的誤差を補正することができる。
【０９１４】
所望によりおよび試験する体液源に依存して、エストリオールコンジュゲートから遊離エストリオールを分離することができる。このような分離技術は当技術分野で公知である。例えば、このような分離とともに血漿エストリオールを測定するために有用な２つのラジオイムノアッセイを記載しているEvan, N.Z. Med. Lab. Tech. 33:86 (1979)を参照。これらの分離は一般に難しく、遊離型エストリオールとコンジュゲート型エストリオールとを区別する特異的抗体または他の結合相手を使用するため、またはサンプルが唾液など、ほとんど遊離型のエストリオールを含有する供給源から得られているために分離を必要としないアッセイを使用することができる。
【０９１５】
アッセイする液体中のエストリオール濃度は、いつ陣痛が切迫するか決定するための標準値と相関している。この標準は通常、（１）一般集団における正常妊婦の、相当する妊娠期の、または通常の妊娠終了に対する特定の妊娠期における同じ体液のエストリオール濃度の所定範囲、あるいは（２）同じ妊婦の同じ体液の過去に測定されたエストリオール濃度である。この標準値よりも高いエストリオール濃度測定値は、早期陣痛が始まる可能性の指標となる。本明細書の方法は、体液中のプロゲステロン濃度など、他のいずれの物質の測定も必要としないし、また、一定の時間の総エストリオール産生の測定も必要しない。所望により、尿を用いて、２４時間などある期間内の総エストリオールの測定を行ってもよい。
【０９１６】
上記に示した１つ目の一般的標準、すなわち、一般に、正常妊婦の同じ体液のエストリオール濃度の所定範囲は、通常、最大の相関を確保するために、被験個体に対するその方法の適用に用いるものと同じアッセイ技術により得られるものとする。比較を行う統計学的に有意な範囲の正常値を得るのに十分な測定を正常な妊婦集団で行う（一般に、正常な妊娠期の予め選択された期間に行う）。通常分娩の直前の時期（３８〜４０週）と比較する場合が多いが、他の時期を用いてもよい。例えば、与えられた個々の妊娠週数でのエストリオールレベル（すなわち、対象のもの）を、同じ時期（例えば、２０週）の通常の濃度範囲と比較することができる。一般に、陣痛開始の可能性の指標となる最小濃度は、与えられた体液に関して正常妊婦の陣痛開始直前に測定された平均エストリオール濃度を標準偏差少なくとも１つ分、一般に少なくとも２つ分、一般に少なくとも３つ分、または少なくとも４つ分超えているものと考えられる。
【０９１７】
統計学を熟知する者ならば、妊娠合併症の指標として標準偏差いくつ分を用いるかは適当な診断目標を念頭に置いて選択されることが分かるであろう。例えば、１つ分の標準偏差が６８％または約６８％の正常サンプルを含み、すなわち、３２％の正常サンプルがその平均値が１つ分の標準偏差により設定された下限および上限の外側にくることが予想される（従って、１６％が選択限界の上にくると予想される）。よって、通常の平均値を超える１つ分の標準偏差は、含む偽陽性が多すぎるので、通常の分析には用いられない。１つ分の標準偏差は、さらなる評価のために、早期陣痛の素因を持ち得る、可能性のある全ての候補を洗い出すために選択されるアッセイで適当であるか、あるいは正常以下のエストリオール値を有し、サンプル間の変動が比較的小さいことが分かっている対象ではこの限界を選択することができる。また、早期陣痛の問題を持つことが分かっている対象で、時期を決定するために、管理条件下で対象をより密接に監視する（常時監視のために対象を入院させる場合など）ために１つ分の標準偏差を選択することができる。平均値からの２つ分の標準偏差は９５％または約９５％の正常サンプルを含み、３つ分の標準偏差は９９％または約９９％の正常サンプルを含み、４つ分の標準偏差は９９％を超える正常サンプルを含む。これらのレベルは一般に、特にエストリオールのレベルが正常であるか、正常よりも若干高いだけであることが分かっているか、またはサンプルごとに変動することが分かっている対象の場合、ならびに高い変動係数を持つアッセイの場合には妥当正が高い。
【０９１８】
標準偏差において陣痛指標の下限（正常な範囲の上限）を表す必要はない。陣痛開始の可能性の、統計学的に有意な指標を得るために使用可能な他のいずれの系も使用可能である。例えば、この限界は正常な妊娠の同じ体液で、正常な対象の少なくとも９５パーセンタイル濃度といった高い濃度に設定することができる。いずれの場合でも、正常妊娠での３８〜４２週、一般に４０週または約４０週から正常限界を選択することができる。濃度のモニタリングは２０週、２１週、２２週、２３週、２４週、２５週、２６週、２７週、２８週、２９週または３０週以内などの選択された時期に開始し、分娩まで継続すればよい。
【０９１９】
多くの異なる臨床目的があり得るので、早期陣痛の開始の可能性の指標となる実際のエストリオールレベルは、妊娠初期のいくつかのサンプルからデータを採取した後担当医により、測定を行う時期を考慮して最良に選択される。例えば、正常な妊娠の３０週において、陣痛開始前の、予測されるエストリオール濃度の変化は、３０週の平均エストリオール濃度から標準偏差２つ分小さい。従って、妊娠前期（３０週以前）におけるアッセイでは陣痛開始の指標として標準偏差３つ分または４つ分を使用することができるが、妊娠後期（例えば、３０週以降）では、対象の状態、担当医が認識している母体の他の臨床指標、および胎児の健康に応じて、標準偏差２つ分、１．５個分、またはさらに１つ分を用いるのがより妥当である。早期陣痛を避けるためにより大きな注意が必要なのはより初期の妊娠期であり、これはこれらの段階に胎児の発達不全や産後の嬰児死亡の高いリスクがあるからである。早期陣痛は一般に、通常妊娠４０週が終わるまでの陣痛と考えられる。
【０９２０】
本明細書の方法は、たとえ短い期間であっても妊娠の延長が早産の結果を軽減する上で最も効果的である、妊娠２０週〜３６週に使用可能である。このアッセイは、特に増加率の検出に用いる場合には、４０週を過ぎた後の陣痛および分娩で終了する妊娠に使用することができ、この期間、測定を行うことができる。３８週以降に用いる場合、本明細書で提供される方法は一般に、本明細書の他所で述べられている「自己比較」法を用い、すなわち、同じ対象で、ある時期の測定値と過去に得た測定値を比較することにより行われる。
【０９２１】
同様にして、上述のものと同じ制約条件下で、異常妊娠の指標として、従って、陣痛開始の可能性の指標として、ここでも、同じ妊娠期の平均正常濃度を標準偏差少なくとも１つ分、一般に少なくとも２つ分、通常には少なくとも３つ分、または少なくとも４つ分高いアッセイ濃度を用いることができるが、測定された量が３８〜４２週で正常と考えられるレベルに達していない場合には、その確率は低くなる。
【０９２２】
標準値は、濃度が測定される特定の体液によって、また、用いる特定のアッセイによって（程度は低いが）異なる。非コンジュゲートエストリオールを測定するアッセイにおいて典型的な陣痛開始の最小指標レベルは、次に各体液に関して示した通りである（濃度は全てｎＭ）：唾液、少なくとも３、一般に少なくとも５または少なくとも６または少なくとも７；血清、３０、少なくとも３５または少なくとも４５。
【０９２３】
エストリオール濃度を正常集団中に存在するものと比較する代わりに、同じ妊婦の同じ体液で過去に測定されたエストリオール濃度を比較標準として使用することもできる。この場合、決定されるのは通常、供試体液中のエストリオール濃度の増加率である。測定された濃度が同じ妊婦の同じ体液で過去に測定されたエストリオール濃度を１週間以内に５０％、一般に７５％、通常には１００％超えることが示された場合に陽性アッセイ（すなわち、陣痛開始が近い指標）とみなされる。ここでも、陣痛開始の下限としてのレベルに対する特定の増加率は、担当医が、選択される特定の理由により選択することができる。例えば、潜在的に問題のある対象をさらなる観察と診断のために病院へ収容することを意図したスクリーニング試験は、偽陰性結果を避け、比較的多数の偽陽性を含むことから起こる問題を許容して、その限界として増加率５０％を選択することができる。正常集団の平均値からの標準偏差に関して上記で示したものと同様に、最小陽性指標として高い増加率％とするほど、ホームアッセイおよびポイント・オブ・ケアアッセイに対する許容性が高まる。本段落の標準を満たし、さらに正常な対象集団において陣痛開始の指標となることが従前に示されているレベルに達したエストリオール濃度の増加率は特に陣痛開始が近いことを示す可能性が高い。
【０９２４】
多くのアッセイが使用可能である。例えば、米国特許第５，４８０，７７６号では、酵素標識成分（ここでは、標識エストリオール分子またはその誘導体）がエストリオールの競合結合アッセイで用いられている。このアッセイは、予め選択されたカットオフ値において有／無または「閾値」（±）アッセイ結果が得られる非機器的酵素イムノアッセイであり、よって、本明細書で使用可能である。
【０９２５】
この技術を用いた典型的なアッセイでは、酵素標識競合結合成分は、アッセイの抗体を作製するために用いた免疫原と結合したエストリオール（またはアッセイで用いる抗体を作製するために用いたその一部）を含む。酵素標識は、アビジン−ビオチン複合体などの嵩のあるリンカーを介してこの部分と結合させる。このような競合結合相手を用いることで、抗体と競合物の結合の親和性を操作することを試みなくとも、±分析に必要な傾きの大きな競合結合曲線を確保しながら、抗体を使用することができる。
【０９２６】
このような典型的アッセイでは、抗体をマイクロタイタープレートのウェル、試験管または多孔性試薬ストリップ（セルロースまたはガラス繊維など）などの固体表面と結合させる。この抗体をコーティングした固体表面を、次に、サンプルおよび競合結合相手と同時に接触させる。分析物および競合結合相手の相和中に存在するよりも抗体結合部位を少なくすることで、溶液中の分子の一部だけが固体表面に結合する。分析物分子が存在しない場合には、全ての結合部位が競合結合相手に占められるので、最大量の酵素が固体表面に結合する。このサンプルを洗い流した後に、この酵素の基質を固体表面に接触させると、酵素と基質が反応し、検出可能なシグナル（通常は呈色）が生じ、これがサンプル中の分析物の不存在（陰性結果）を使用者に示す。サンプル中に分析物が存在する場合には、分析物が結合部位をめぐって競合するので、結合し得る酵素標識競合物が少なくなる。分析物よりも抗体に顕著に結合しなくなる嵩のある結合組成物を用いることで、また、サンプルの添加量に対して結合部分の数を適宜選択することで（当業者にとっては標準的な技術である）、予め選択された最小レベルを超える濃度で存在する分析物が競合結合組成物の結合を排除するので、酵素と固体支持体が結合する。種々の閾値レベルを提供するためのこのような選択方法の一例は米国特許第５，４８０，７７６号に見られる。従って、そのサンプル中に十分な分析物が存在していれば、反応の後、変色をもたらす酵素は存在せず、この反応混合物は同じ状態を呈する（本反応スキームを用いた場合の陽性反応）。
【０９２７】
呈色が分析物の存在の指標となる他の反応スキームも使用することができる。前例は、単にエストリオールが測定可能な多種の競合結合アッセイの一例である。
【０９２８】
エストリオールアッセイで用いるための抗体生産は常法であり、ここでは詳しく述べない。ステロイドに特異的な抗体の生産のための一般的な技術を以下に簡単に説明する。
【０９２９】
上記のように調製した、免疫原、通常はタンパク質と共有結合したエストリオールを含有する組成物を動物に注射する。何回か注射するか、アジュバントを使用して免疫系の最大刺激と抗体生産を確保する。ポリクローナル抗体が選択される場合には、免疫動物から単に採血し、標準的な技術により他の血液成分から抗体を分離することにより調製することができる。モノクローナル抗体を得るためには、免疫動物から脾臓またはリンパ球を取り出し、不死化させるか、またはそれを用い、当業者に公知の細胞融合法によりハイブリドーマを作製する。不死化細胞により分泌された抗体は、選択された特異性を有する抗体を分泌するクローンを決定するためにスクリーニングする。モノクローナル抗エストリオール抗体に関しては、抗体はエストリオールと結合しなければならない。選択された特異性を有する抗体を産生する細胞を選択し、クローニングし、選択された特異性を有するモノクローナル抗体を生産するために増殖させる。
【０９３０】
抗体は、タンパク質物質を固体支持体物質に結合させる公知の技術を用い、アッセイに用いるための固体表面に結合させるこができる。固体支持体としては、試験管またはマイクロタイタープレートのプラスチック表面、ポリマービーズ、ディップスティック、またはフィルター物質が挙げられる。結合法としては、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、および固体支持体上の化学反応基（活性化されたカルボキシル基、ヒドロキシル基またはアルデヒド基）への、一般にはアミノ基を介してのタンパク質の共有結合が挙げられる。
【０９３１】
ｉｉｉ．その他の腫瘍指標
本明細書ではまた、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、１以上の付加的腫瘍マーカーの検出と組み合わせて検出するための方法が提供される。このような検出法は、限定されるものではないが、質量分析法、サンドイッチアッセイ、試験ストリップに基づくアッセイおよびin situアッセイなどのタンパク質検出法、核酸分子検出法および自己抗体検出を含む、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出に関して本明細書で記載したものと同じ原理に従って行うことができる。
【０９３２】
例えば、サンプルを、そこに固定されている抗癌胎児性フィブロネクチンポリクローナル抗体と抗（腫瘍マーカー）ポリクローナル抗体を有する固体支持体と接触させ、その固体支持体をまた、モノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体またはそのフラグメントとモノクローナル抗（腫瘍マーカー）抗体またはそのフラグメントと接触させることができ、この場合、これらのモノクローナル抗体は識別して検出可能な部分または結合可能な部分（例えば、発光波長の異なる蛍光団、一方がビオチンとコンジュゲートされ、他方が磁性ビーズとコンジュゲートされたもの）とコンジュゲートされており、それにより、識別可能なシグナルまたは独立した結合事象により、独立的に、そのサンプル中の、癌胎児性フィブロネクチン指標分子および／または１以上の付加的腫瘍マーカーの存在を同定することができる。本明細書で提供される様々な方法に関して述べたものなど、様々な異なる組合せもまた、癌胎児性フィブロネクチン指標分子および１以上の付加的腫瘍マーカーの検出に使用することができる。様々な付加的検出可能腫瘍マーカーが当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ＡＥ１／ＡＥ３、ＢＣＡ−２２５、カテプシンＤ、Ｅ−カドヘリン、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、Gross Cystic Disease Fluid Protein 15（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＯＸ−Ｂ３、Ｋｉ−６７、ｐ６５、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）およびトランスグルタミナーゼＫ（ＴＧＫ）、ｐ２１、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＲＣＡ−３、ｐ１６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩａ、ＭＥＮ−ＩＩｂ、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｐ５３、ｃ−ｅｒｂＢ２、ｃ−ｍｙｃ、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｂｃｌ−２、ｂａｘ、ＰＳＡ、ＣＹＦＲＡ  ２１−１、ＰＴＨ−ＲＰ、ＣＡ１２５、ＣＥＡ遺伝子ファミリーメンバー、プロガストリン、ガストリンＧ１７、ガストリンＧ３４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７−２９、ＣＡ  ７２−４、ＡＰＣ、ＳＣＣ、ＨＰＶサブタイプ、ＴＫ、αＦＰ、ｐ６２、カリクレイン、ｒａｓ、バソプレシン、ガストリン放出ペプチド、アネキシンＩ、アネキシンＩＩ、ＨｕおよびＫＯＣが挙げられる。このような腫瘍マーカーの結合相手、このような腫瘍マーカーの検出方法、およびこのような腫瘍マーカーと相関のある腫瘍は、米国特許公報第２００３０１９０６０２号および同第２００４００５９５１９号に例示されているように、当技術分野で公知である。
【０９３３】
Ｇ．検出測定値の解析
癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定値は、本明細書で提供される、または当技術分野で公知の方法のいずれかにより得ることができ、これらを分析して、対象の全身の健康状態、対象の出産傾向、または対象の腫瘍または新生物性疾患に関する情報を含む、そのサンプルが採取された対象に関する情報を得ることができる。
【０９３４】
１．定量
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は定量可能である。本明細書で提供される、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定のための方法は定量的測定が可能である。例えば、質量分析を用い、内部標準の使用または測定する化合物の標識を含む様々な方法により、サンプル中の分析物に関する定量的結果を得ることができる。（例えば、Bucknall et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 13:1015−1027 (2002); Ross et al., Biotechniques 2000:620−629; Amexis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:12097−12102 (2001); Griffin et al., Anal. Chem. 73:978−986 (2001)参照）。ＲＴ−ＰＣＲおよび関連の方法は、本明細書に記載されている、または当技術分野で公知のように、競合的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびその他などの手順を用いて定量的結果を得ることができる。競合結合アッセイを含む定量的結合アッセイも当技術分野で公知であり、癌胎児性フィブロネクチンの定量のために使用することができる。様々な分光光度測定または反射率測定を用いて、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を表すシグナルの強度に従い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度を決定することができる。例えば、そこに固定されているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む領域を有する試験ストリップを使用することができ、試験ストリップのその領域から反射される光の量が、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を示すことができ、その光の量を反射率リーダーにより測定することができる。定量的方法の例としては、頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルを定量するためのＥＬＩＳＡ法、ならびに尿サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルを定量するための水平流動試験ストリップデバイスと試験ストリップリーダーの使用が挙げられる。
【０９３５】
２．閾値
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在は、対象の全般的な健康状態、妊娠もしくは分娩関連状態、前癌または癌（例えば、新生物性疾患）の状態を含む様々な生物学的状態または健康状態のいずれかの指標となり得る。ある場合には、癌胎児性フィブロネクチン指標分子がサンプル中に検出される場合に、測定値が癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなされる。また、他の場合では、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在が１以上の閾値レベル以上である場合に、測定値が癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなされる。一例では、試験ストリップを用いてアッセイされるバッファー処理頸膣サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値レベルは５０ｎｇ／ｍＬであり得る。別の例では、試験ストリップを用いてアッセイされるバッファー処理頸膣サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の閾値レベルは１５０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【０９３６】
サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンのレベルを閾値レベルと比較する態様では、閾値レベルは、非改変サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量であってもよく、または閾値レベルは、改変サンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量（例えば、バッファー溶液と混合した後の頸膣スワブサンプルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の濃度）であってもよい。本明細書においてサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベル、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベルという場合には、一般に、改変サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子のレベルを意味する。例えば、頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定など、いくつかの癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定は、サンプル改変型に従い、当技術分野で公知であり、従って、頸膣スワブサンプルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子レベルおよび閾値レベルとは一般に、改変されたサンプルのレベルを意味する。
【０９３７】
いくつかの態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量を１以上の閾値と比較することができる。本明細書で提供される１以上の閾値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える閾値である。一般に、閾値レベル以上のサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度は、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示す。一態様では、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が５０ｎｇ／ｍｌ以上（もしくは無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ以上）、または約５０ｎｇ／ｍｌ以上（もしくは無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ以上）である場合、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示す。一般に、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が閾値レベル未満である場合、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陰性であることを示す。一態様では、バッファー処理頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子濃度が５０ｎｇ／ｍｌ未満（もしくは無処理スワブサンプルでは５００ｎｇ／ｍｌ未満）、または約５０ｎｇ／ｍｌ（もしくは無処理スワブサンプルでは約５００ｎｇ／ｍｌ未満）である場合、そのサンプルが癌胎児性フィブロネクチン陰性であることを示す。
【０９３８】
異なるサンプル種の閾値レベルは異なり得る。本明細書で提供される、異なるサンプル種はまた、関連する閾値レベルを有する場合もある。例えば、膣の下三分の一などの、後膣円蓋より下部の膣部分から採取された頸膣スワブサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、同じ対象から採取した後膣円蓋の頸膣スワブ中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の三分の一または約三分の一であり得る。別の例では、尿サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量は、同じ対象から採取した後膣円蓋の頸膣スワブ中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の十分の一または約十分の一であり得る。
【０９３９】
切迫出産または早産の種々の可能性を示し得るバッファー処理サンプルの閾値例としては、５０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌおよび約１０００ｎｇ／ｍｌが挙げられる。切迫出産または早産の種々の可能性を示し得る無処理サンプルの閾値例としては、５００ｎｇ／ｍｌ、１５００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、３０００ｎｇ／ｍｌ、５０００ｎｇ／ｍｌ、７５００ｎｇ／ｍｌおよび１００００ｎｇ／ｍｌ、または約５００ｎｇ／ｍｌ、約１５００ｎｇ／ｍｌ、約２０００ｎｇ／ｍｌ、約３０００ｎｇ／ｍｌ、約５０００ｎｇ／ｍｌ、約７５００ｎｇ／ｍｌおよび約１００００ｎｇ／ｍｌが挙げられる。いくつかの態様では、この癌胎児性フィブロネクチン指標分子は癌胎児性フィブロネクチンタンパク質である。
【０９４０】
血清または血漿がサンプルである一態様では、閾値レベルは、ＦＤＣ−６陽性癌胎児性フィブロネクチンタンパク質３μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬ、または約３μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬであり得る。閾値より高いレベルを含む血清または血漿サンプルが、その対象における腫瘍性疾患もしくは新生物性疾患の指標となるか、または早産もしくは切迫出産の指標となるか、またはその個体の健康状態に伴う他の何らかの問題の指標となり得る。一例では、ＦＤＣ−６と、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質結合相手としてのヤギポリクローナル抗ヒトフィブロネクチンとを用いたＥＬＩＳＡ試験により測定したところ、子癇前症を有する対象は１１．５μｇ／ｍＬ〜３８μｇ／ｍＬの範囲の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質血漿レベルを示したのに対し、正常な対象は４μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬの範囲の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質レベルを示した(Kupferminc et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 172:649−652 (1995)）。従って、血清サンプルにおいて１２μｇ／ｍＬまたは約１２μｇ／ｍＬより高いレベルのＦＤＣ−６反応性癌胎児性フィブロネクチンタンパク質が検出された場合は、その対象が閾値より高い癌胎児性フィブロネクチンタンパク質レベルを示し、従って、癌胎児性フィブロネクチン陽性であることを示し、また、血清において８μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬの間または約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬの間のＦＤＣ−６反応性癌胎児性フィブロネクチンタンパク質レベルが検出された場合は、その対象が癌胎児性フィブロネクチン陽性であるかもしれないし、陽性でないかもしれないことを示し、さらに、血清において８μｇ／ｍＬまたは約８μｇ／ｍＬ未満のＦＤＣ−６反応性癌胎児性フィブロネクチンタンパク質レベルが検出された場合は、その対象が癌胎児性フィブロネクチン陰性であることを示し得る。
【０９４１】
他の場合には、癌胎児性フィブロネクチンの測定に多層閾値を適用することができ、この場合、多層閾値は２以上の閾値レベルを含み、それぞれより高い閾値レベルが個々の健康状態の分類を示し、例えば、それぞれより高い閾値レベルは、より重篤な健康問題、切迫出産の可能性が高いこと、分娩日の確実性が高いこと、または癌の攻撃性が高いことを示し得る。多層閾値の一例として、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質に関する二層閾値があり、この場合、バッファー処理サンプルについて、下方閾値が５０ｎｇ／ｍＬであって、上方閾値が１５０ｎｇ／ｍＬである。サンプルは、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の測定量未満である閾値に従って分類することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が第一の閾値よりも高いが第二の閾値よりは高くない妊娠２４週の妊婦は、早産の高い可能性を有するものと分類することができ、一方、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が第一の閾値レベルよりも第二の閾値レベルよりも高い妊娠２４週の妊婦は、切迫出産のより高いリスクを有するものとして分類することができる。
【０９４２】
ある場合には、対象サンプルの測定量に適用される１以上の閾値レベルまたは１以上の閾値曲線は、様々な対象特異的因子のいずれに従って決定してもよい。一例では、対象特異的因子は、対象由来の１以上のサンプルの測定量であり得る。
【０９４３】
別の態様では、閾値レベルは、１以上の付加的因子によって異なる。このような因子としては、限定されるものではないが、妊娠期間、１以上の他のマーカーの存在、解剖学的因子、過去の健康歴と遺伝因子、疾病の進行、または対象の年齢など、対象の生物学的状態が挙げられる。因子はまた、経時的な癌胎児性フィブロネクチン指標分子測定値の増加率を含む、経時的な対象の生物学的状態も含み得る。閾値レベルの変化は、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の閾値レベルが時間（例えば、妊娠週数）の関数として変化する閾値曲線として表すことができる。閾値レベルは経時的に低下する場合もあるし、閾値レベルは経時的に増加する場合もある。
【０９４４】
ある場合には、対象由来の特定のサンプル種（例えば、頸膣スワブ）における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変化率を用い、サンプルを癌胎児性フィブロネクチン陽性または陰性として同定することもできるし、またはサンプルを２以上の集団に分類することもできる。あるサンプル種における癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の変化率は、そのサンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の安定、増加または減少を示し得る。
【０９４５】
３．組織起源の同定
癌胎児性フィブロネクチン指標分子は様々な異なるスプライス領域（例えば、ＥＤＡ、ＥＤＢまたはＩＩＩＣＳ）のいずれかを含むことがあり、また、癌胎児性フィブロネクチンタンパク質は翻訳後修飾（例えば、Ｏ−グリコシル化）を含むことがある。従って、同一でない様々なタンパク質が癌胎児性フィブロネクチンと呼ばれ、同一でない様々な核酸分子が癌胎児性フィブロネクチンをコードし得る。サンプルに関する研究では、これらのスプライス領域および翻訳後修飾の異なる組合せを含む様々な異なるフィブロネクチンタンパク質が見られている。本明細書で提供される、または当技術分野で公知の方法を用い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を同定することができ、また、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子に存在する１以上のスプライス領域および／または翻訳後修飾を同定することもできる。癌胎児性フィブロネクチン指標分子に存在する１以上のスプライス領域および／または翻訳後修飾の存在または不存在の同定は、本明細書では癌胎児性フィブロネクチンの特徴付けという。
【０９４６】
一態様では、癌胎児性フィブロネクチンの特徴付けを用い、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の生体源を決定することができる。例えば、癌胎児性フィブロネクチンの特徴付けを用い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の組織源を同定することができる。例えば、ＥＤＢとトレオニン３３がＯ−グリコシル化されたＩＩＩＣＳとを含む癌胎児性フィブロネクチンタンパク質（本明細書では、ＥＤＢ＋、ＦＤＣ−６＋ｏｎｆＦＮと呼ぶ）は、肝硬変、肝臓転移、拡張型心筋症、繊維腫症、関節リウマチ、結節性手掌繊維腫症、下垂体腺腫、乳癌、浸潤性乳管癌、口腔扁平上皮癌、結腸癌および腎臓癌で見られており、ＥＤＢを含む癌胎児性フィブロネクチン指標分子（ＥＤＢ＋ｏｎｆＦＮ）は、新しく形成された血管を含む細胞外マトリックス、脳腫瘍、前立腺癌、良性前立腺肥大、胃腺癌、腎臓明細胞癌、膀胱癌、皮膚癌、皮膚および眼の黒色腫、肺癌および結腸癌で見られており；ＥＤＢとＥＤＡを含む癌胎児性フィブロネクチン指標分子（ＥＤＢ＋、ＥＤＡ＋ｏｎｆＦＮ）は、創傷治癒中の繊維芽細胞およびマクロファージ、糸球体腎炎、結節性手掌繊維腫症および甲状腺腫瘍で見られており、ＥＤＡを含む癌胎児性フィブロネクチン指標分子（ＥＤＡ＋ｏｎｆＦＮ）は、乾癬および肝腫瘍で見られており、ＣＳ１を含む癌胎児性フィブロネクチン指標分子（ＩＩＩＣＳ／ＣＳ１＋ｏｎｆＦＮ）は肝腫瘍で見られている。
【０９４７】
本明細書で提供されたおよび当技術分野で公知の方法を用い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、１以上のドメインおよび／または翻訳後修飾の存在に従って特徴付けすることができる。このような決定の後、特徴付けされたそのサンプルの癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、癌胎児性フィブロネクチンを含むことが分かっている組織、腫瘍および他の生体源と比較することができる。サンプル由来の、特徴付けされた癌胎児性フィブロネクチン指標分子と同じ癌胎児性フィブロネクチン変異体を含むことが分かっている組織、腫瘍または他の供給源を、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子の可能性のある組織、腫瘍または他の生体源として同定することができる。例えば、サンプルがＥＤＢ＋、ＦＤＣ−６＋ｏｎｆＦＮタンパク質を含む場合、そのサンプル中のその癌胎児性フィブロネクチンタンパク質の供給源は、肝臓、血管組織、下垂体組織、乳房組織、口腔扁平上皮細胞、結腸または腎臓であり得る。
【０９４８】
また、本明細書では、サンプルを、そのサンプルの組織以外の生体源を含むものとして同定するための方法も提供される。上記のように、本明細書で提供される方法を用い、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の組織、腫瘍または他の供給源を同定することができる。このような方法を用い、その癌胎児性フィブロネクチン指標分子をサンプルの組織以外の生体源から生じたものと同定することができる。例えば、膵臓癌は一般にＥＤＢ＋癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含まないので、膵臓組織サンプルでＥＤＢ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子が同定された場合には、そのサンプルは膵臓組織以外の生体物質を含有するものとして同定することができる。このような場合、そのサンプルのその組織以外の生体物質としては、例えば、転移腫瘍細胞が挙げられる。例えば、転移肝臓細胞を含有する膵臓組織サンプルは、ＥＤＢ＋癌胎児性フィブロネクチン指標分子を含有する膵臓組織サンプルである可能性があり、従って、本明細書で提供される方法を用い、転移腫瘍細胞と非腫瘍性膵臓細胞または組織を含有するサンプルとして同定することができる。よって、本明細書で提供される、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けすることを含む方法は、サンプル中の転移腫瘍細胞の存在を決定するための方法、および転移腫瘍細胞を含有するサンプルと非転移腫瘍細胞を含有するサンプルとを識別するための方法で使用することができる。
【０９４９】
また、本明細書で提供される方法を用い、特定の組織、腫瘍または生体源の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の組成を特徴付けするために使用することができる。例えば、新しく形成された、または形成中の血管を含む細胞外マトリックスは癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を含み得る。本明細書で提供される方法を用い、その細胞外マトリックス中の癌胎児性フィブロネクチンタンパク質を、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ（およびそのスプライス変異体）ならびにＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化などの１以上の翻訳後修飾を含む、または含まないものと特徴付けすることができる。本明細書で提供される方法を用い、対象のいずれかの組織に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けすることができる。同様に、良性、過形成、新生物性、胎児、男性、女性またはそれらの組合せ（例えば、新生物性の男性の肝臓組織、新生物性の女性の肝臓組織）である組織を、本明細書で提供される方法においてサンプルとして使用することができ、そのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＩＩＩＣＳ（およびそのスプライス変異体）ならびにＩＩＩＣＳのトレオニン３３のＯ−グリコシル化などの１以上の翻訳後修飾を含む、または含まないものと特徴付けすることもできる。
【０９５０】
Ｈ．組合せ、プローブ、コンジュゲートおよびキット
組合せおよびそれらの組合せを含むキットも提供される。この組合せは、１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手；および所望により、少なくとも１つのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を検出するための試薬を含む。この組合せは、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、膜または試験ストリップなどの固体支持体に固定されている１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含み得る。これらの組合せはまた、サンプルを混合することができる１以上の溶液（例えば、バッファー溶液）も含み得る。これらの組合せはまた、液体サンプルから微粒子または固体または不溶物を除去するための１以上のフィルターも含み得る。これらの組合せはまた、乾燥状態または溶液中の非特異的結合化合物、および／または非特異的結合剤を含む固体支持体も含み得る。これらの組合せはまた、サンプル操作のための電気泳動ゲル、またはサンプル成分を固定するためのマイクロタイタープレート、マイクロアレイもしくは膜など、サンプル成分を固定または操作するための構造体も含み得る。早産に関して用いる場合、この組合せはまた、所望により子宮収縮抑制剤および所望によりその子宮収縮抑制剤を投与するためのデバイスも含み得る。分娩誘発に関して用いる場合、この組合せは所望により誘発剤および所望によりその誘発剤を投与するためのデバイスを含み得る。これらの組合せおよびキットは所望により、サンプルの採取および／またはアッセイの実施に関する説明書を含み得る。米国特許第５，２８１，５２２号、同第６，３９４，９５２号、および同第６，２６７，７２２号に例示されているように、当業者に公知の技術を用いて本明細書で提供される方法で用いるために適合可能な、当技術分野で公知の様々な組合せおよびキットはいずれも、本明細書で意図される。これらの組合せおよびキットは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチンの検出ため、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量の決定のため、および／またはサンプル中の１以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために使用することができる。
【０９５１】
これらの組合せはまた、限定されるものではないが、ポリエステルスワブ、検尿カップ、洗浄液、ディップスティック、受動式サンプル採取デバイス、または経皮パッチなど、サンプルを採取するため、またはサンプルと接触させるためのデバイスまたは溶液も含み得る。本組合せのスワブの例としては、膣に挿入するには十分な長さであるが、子宮頸に接触するほどの長さではないスワブが挙げられ、例えば、そのスワブの長さは、１５ｃｍ以下、１３ｃｍ以下、１２ｃｍ以下、１１ｃｍ以下、１０ｃｍ以下、９ｃｍ以下、８ｃｍ以下、７ｃｍ以下、６ｃｍ以下、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、または２ｃｍ以下であり得る。スワブはまた、膣前庭および／または陰唇を拭き取るために使用可能な、かつ／または膣の下三分の一の部分を拭き取るために使用可能なティッシュまたはパッド（例えば、ガーゼパッド）であってもよい。受動式サンプル採取デバイスの例としては、膣の下三分の一を含む後膣円蓋より下部の膣部分などの膣中に挿入可能なデバイス、陰唇および／または膣口に接触するデバイス、陰唇および／または膣口と対象の下着との間に置くことができるデバイスが挙げられる。サンプル採取デバイスはまた、そこに固定されている１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含んでもよい。
【０９５２】
スワブ、受動式採取デバイス、およびサンプル採取時に膣に挿入される他のサンプル採取デバイスは、所望により、過挿入防止デバイスが取り付けられていてもよい。過挿入防止デバイスにより、そのサンプル採取デバイスが挿入可能な膣内の距離を制限することができ、それにより、サンプル採取デバイスが確実に容易に抜き取ることができ、かつ／またはサンプル採取デバイスとの意図しない接触により損傷を受けることがある子宮頸または頸膣腔の他の部分にサンプルが接触しないようにすることができる。過挿入防止デバイスはまた、膣内の特定の距離を超えてサンプルが採取されないようにすることにより、また所望により、一部または大部分のサンプルが採取される膣の場所を限定することにより、サンプルが採取される膣の場所を標準化するためにも役立ち得る。例えば、スワブのポリエステルチップから５ｃｍの過挿入防止デバイスを用いれば、このポリエステルチップは膣内５ｃｍ以内の液体を採取すること、および所望により、そのポリエステルチップにより吸収される頸膣分泌液の大部分が膣前庭または膣口から約５ｃｍの場所にある頸膣分泌液であることを保証することができる。過挿入防止装置(overinsertion device)の一例では、一端に固いシャフトとポリエステルチップを備えたスワブなどの細長いスワブに、スワブがそれ以上膣に挿入されないよう、膣に入らない大きさの幅の広いシールドを取り付けることができる。様々な過挿入防止デバイスのいずれを用いてもよいが、一般に、サンプル採取デバイスの過挿入防止デバイス部分は、膣に挿入されるサンプル採取デバイス部分よりも大きい。過挿入防止デバイスの例としては、限定されるものではないが、シールド、ハンドルまたは三次元構造（例えば、球体または立方体）が挙げられる。いくつかの態様では、サンプルが採取される膣内の場所を標準化する過挿入防止デバイスにより、サンプル採取の再現性を高めることができる。
【０９５３】
サンプル採取デバイスはまた、使用のしやすさに関して選択することもできる。いくつかの態様では、サンプル採取デバイスは、サンプルが採取される対象または対象の家族などの非医療従事者により操作可能なデバイスであり得る。このようなサンプル採取デバイスにはまた、熟練していない者にサンプル採取方法を説明する使用説明書を添付することができる。
【０９５４】
これらの組合せは１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含む試験ストリップまたは他のデバイスを含むことができ、この場合、このようなデバイスを用いて、サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出すること、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を示すことができる。いくつかの態様では、このようなデバイスは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が定義された閾値レベルを超える場合に陽性結果を示すように構成することができる。閾値レベルの例としては、無処理サンプル、処理前サンプルまたは無希釈サンプルで、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌおよび約５０ｎｇ／ｍｌが挙げられる。閾値レベルの他の例としては、バッファー処理サンプルで、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約７ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌおよび約２０ｎｇ／ｍｌが挙げられる。試験ストリップなど、閾値レベルのサンプル成分が存在する際に陽性結果が得られるデバイスを構成する方法は当技術分野で公知である。この試験ストリップは試験ストリップリーダーなどの機器で読み取り可能であるか、または機器によってではなく個体が読み取るように構成することもできる。
【０９５５】
これらの組合せは、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定するために使用可能な試験ストリップリーダー、または吸光度デバイス、蛍光デバイスなどの他のデバイスを含み得る。いくつかの態様では、このようなデバイスは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量が定義された閾値レベルを超える場合に陽性結果を示すように構成することができる。閾値レベルの例としては、無処理サンプルまたは処理前サンプルで、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌおよび約５０ｎｇ／ｍｌが挙げられる。閾値レベルの他の例としては、バッファー処理サンプルで、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌ、または約１ｎｇ／ｍｌ、約２ｎｇ／ｍｌ、約３ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、約７ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌおよび約２０ｎｇ／ｍｌが挙げられる。
【０９５６】
キットは、所望により他の試薬またはデバイスを含む組合せでパッケージングされる。例えば、キットは所望により、対象由来のサンプルを採取および操作するための１以上のデバイスを含み得る（例えば、膣アクセス手段または管アクセス手段）。キットはまた所望により、スポイトまたはピペットなど、サンプルを移動または混合するための１以上のデバイスも含み得る。一態様では、キットは、１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手が配置されている試験ストリップを含む。試験ストリップは、その試験ストリップ上に固定されている、またはサンプルとの接触時に可動化するフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含み得るか、あるいは固定されている癌胎児性フィブロネクチン結合相手と可動性の癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含み得る。所望により、試験ストリップを含むキットは、サンプルを試験ストリップに適用する前にサンプルを混合することができる溶液中または可動性のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含み得る。１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を、コンジュゲートの検出のための部分とコンジュゲートさせることもできる。試験ストリップを含むキットはまた、非特異的結合化合物または非特異的結合表面などの非特異的結合剤を、試験ストリップの一成分として、または別の構造体、組成物または溶液として含むこともできる。一例では、キットは、例えば、サンプル採取デバイスまたは媒体、試験ストリップ、サンプル採取、試験ストリップの使用および試験ストリップ結果の解釈に関する説明書、および所望により、サンプルと混合するため、または癌胎児性フィブロネクチン指標分子の検出とともに用いるための１以上の化合物、組成物、バッファーまたは溶液など、サンプルにおける癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在に関してホームテストを実施するために必要な全ての成分を含む。一般に、ホームテストに使用可能なキットは、個体が手に持った際に子宮頸に接触するほど長いスワブは含まない。
【０９５７】
本明細書で提供される組合せはまた、既にサンプルが接触した組合せも含む。これらの組合せは既にサンプルが接触した１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手、および所望により、既に試験デバイスと接触したフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を検出するための試薬を含む、少なくとも１つのフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を検出するための試薬、および／またはフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含み得る。この組合せは、例えば、１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手がそこに固定されている固体支持体を含む、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、膜または試験ストリップなどの固体支持体を含み得る（この場合、この固体支持体は既にサンプルと接触している）。これらの組合せはまた、１以上の溶液（例えば、バッファー溶液）と既に混合されているサンプルを含み得る。これらの組合せはまた、液体サンプルと既に接触した１以上のフィルターも含み得る。これらの組合せはまた、乾燥状態または液体中の非特異的結合化合物および／またはサンプルが既に接触した非特異的結合剤を含む固体支持体も含み得る。これらの組合せはまた、サンプル成分を含有する電気泳動ゲル、サンプル成分がそこに固定されているマイクロタイタープレート、マイクロアレイ、または膜など、１以上のサンプル成分がそこに固定されている、または１以上のサンプル成分を含有する構造体も含み得る。組合せの例としては、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在、またはサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量、またはサンプル中の、閾値レベル以上の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を示す組合せであり得る。別の組合せ例としては、サンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の不存在、またはサンプル中の、閾値レベル未満の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を示す組合せであり得る。
【０９５８】
本明細書ではまた、本明細書で提供される組合せとサーマルサイクラーなどの１以上のデバイス、当技術分野で公知の、または本明細書で提供される、組織ホモジナイザーなどのサンプル調製のための装置を含むキットも提供される。キットはまた、本明細書に記載される癌胎児性フィブロネクチン指標分子検出法を実施するために適当なバッファーおよび溶液を含み得る。
【０９５９】
本明細書ではまた、１以上のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するための１以上のデバイスを含む系が提供される。これらの結合相手は溶液中では移動でき、固体支持体上では可動性であり、または試験ストリップ、質量分析基板もしくはＤＮＡアレイチップなどの固体支持体に固定することもできる。サンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するためのデバイスは、質量分析計、吸光度分光計、蛍光分光計、反射率リーダー、フローサイトメーター、または電気泳動ゲルスキャナーを含む様々な検出デバイスのいずれであってもよい。一態様では、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を検出するためのデバイスは、サンプルまたはサンプル成分を含有し、かつ、所望により、フィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手も含有してもよい固体支持体を受容するように設計される。
【０９６０】
このキットにおいて用いられるパッケージング物質は、キットの内容物を収容するために用いる１以上の物理的構造体であってよく、一般に、無菌で汚染のない環境を提供するための周知の方法により構築することができる。このパッケージング物質は、キットの成分を示したラベルを含み得る。さらに、このパッケージングは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在を決定するため、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の量を決定するため、またはそのサンプル中に存在する癌胎児性フィブロネクチン指標分子を特徴付けするために、そのキット内の物質をどのように利用すればよいかを示した説明書を含む。説明書は一般に、試薬濃度、または混合する試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合に関する維持時間、温度、バッファー条件および他のパラメーターなどの少なくとも１つのアッセイ法のパラメーターを記載した解説書を含む。このキットは、癌胎児性フィブロネクチン指標分子決定法に用いるプライマー、酵素または他の反応体またはバッファー溶液を定められた限界内に保持することができる１以上の容器を含み得る。例えば、キットは、ミリグラム量のフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を収容するために用いられるガラスバイアルを含み得る。キットはまた、バイアルもしくはチューブ、または質量分析基板を含む、癌胎児性フィブロネクチン指標分子決定法を実施するための基板、支持体または容器を含み得る。
【０９６１】
また、本明細書のキットにおいては、１以上の閾値レベルに従ってサンプルを分類するための系が提供される。１以上の閾値以上の癌胎児性フィブロネクチン量を含むサンプルは、癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなされる。例えば、２５ｎｇ／ｍｌ以上を含むサンプルは癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなされる。一方、１以上の閾値未満の癌胎児性フィブロネクチン量を有するサンプルは癌胎児性フィブロネクチン陰性とみなされる。例えば、２５ｎｇ／ｍｌ未満を含むサンプルは癌胎児性フィブロネクチン陽性とみなされる。
【０９６２】
本明細書ではまた、癌胎児性フィブロネクチンおよび指標分子の検出および／または定量用のプローブも提供される。これらのプローブとしては、例えば、癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出するための、質量分析基板とその質量分析基板上に固定されているフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手とを含む。質量分析基板は、限定されるものではないが、ガラス、金属、セラミック、テフロンコート磁気、有機高分子、生体高分子および無機高分子などの物質である。本明細書で示されるようなプローブを用いて、質量分析により特定の質量のフラグメントを検出することにより癌胎児性フィブロネクチン指標分子を検出することができる。
【０９６３】
本明細書ではまた、コンジュゲートも提供される。コンジュゲートとしては、例えば、治療薬または造影剤または検出剤と直接結合された、またはリンカーを介して間接的に結合されたフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合相手を含み得る。治療薬としては、限定されるものではないが、サイトカイン、光増感剤、毒素、抗癌抗生物質、化学療法化合物、放射性核種、および生物発光化合物、あるいは、例えば、蛍光部分、放射性核種、磁気検出可能な同位元素または化合物、超音波造影剤、発色団、ラテックスマイクロスフェア、または量子ドットなどの検出可能な部分が挙げられる。ある場合には、この治療薬は脈管形成阻害剤である。特定の場合では、治療薬はシュードモナス外毒素、ジフテリア毒、リシン、コレラ毒、ゲロニン、赤痢菌毒、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、外毒素Ａ、アブリン毒、サポリン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、アンギオゲニン、組織因子、ポルフィロマイシン、ドキソルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、インドシアニングリーン、トルイジンブルー、アミノレブリン酸、テキサフィリン、ベンゾポルフィリン、フェノチアジン、フタロシアニン、ポルフィリン、クロリン、プルプリン、プルプリンイミド、バクテリオクロリン、フェオフォルビド、ピロフェオフォルビド、陽イオン色素、３２リン酸塩、６０コバルト、９０イットリウム、９９テクネチウム(Technicium)、１０３パラジウム、１０６ルテニウム、１１１インジウム、１１７ルテチウム、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、１３７セシウム、１５３サマリウム、１８６レニウム、１８８レニウム、１９２イリジウム、１９８金、２１１アスタチン、２１２ビスマス、２１３ビスマス、５−フルオロウリジン、カリチェアミシンまたはマイタンシンであり得る。治療薬はまた、例えば、ＭＩＦ（マクロファージ阻害因子）阻害剤、トール様受容体アゴニスト、またはｓｔａｔ３阻害剤などのシグナル伝達調節剤であってもよい。これらコンジュゲートの結合相手は、例えば、ＦＤＣ−６、ＢＣ−１、ＭＥ４ＣまたはＬ１９などの抗体であり得る。
【０９６４】
本明細書では、限定されるものではないが、癌胎児性フィブロネクチン指標分子の存在または高いレベルを特徴とする健康障害の診断、造影および／または処置を含む、本明細書で提供されるいずれかの方法のための薬剤の製造を目的とした本明細書で提供される生成物のいずれかの使用が提供される。
【０９６５】
以下の実施例は単に例示のために示されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０９６６】
実施例１
ポリクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体
癌胎児性フィブロネクチンは、Engvall and Ruoslahti, Int. J. Cance r, 20:1−5 (1977)により記載されているように、羊水から精製することができる。
【０９６７】
文献、例えば、Stollar, Meth. Enzymol., 70(A):70−85 (1980)に記載されている、癌胎児性フィブロネクチン抗原でウサギを免疫する免疫技術および計画を用い、ウサギに抗（癌胎児性フィブロネクチン）抗体を惹起させる。抗血清は、Lange et al., Clin. Exp. Immunol. 25(2):191−198 (1976)およびPisetsky et al., J. Immun. Meth. 41(2):187−200 (1981)により記載されているものなど、モノクローナル抗体に関して使用されるものと同様の固相アッセイでスクリーニングする。
【０９６８】
抗血清のＩｇＧ画分を、癌胎児性フィブロネクチンを結合させたＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ(Pharmacia Fine Chemicals)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製する。結合に使用する方法は、ゲル製造業者推奨の方法である、AFFINITY CHROMATOGRAPHY, Pharmacia Fine Chemicals, pp. 15−18。
【０９６９】
要するに、カラムを２〜３容量のバッファー（０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で平衡化した後に、抗（癌胎児性フィブロネクチン）抗体を含有する溶液をカラムに適用する。溶出液の吸光度を、カラムからタンパク質が流れ出なくなるまで２８０ｎｍでモニタリングする。次に、カラムを０．１Ｍグリシンバッファー、ｐＨ２．５で洗浄して、免疫親和性結合した抗（癌胎児性フィブロネクチン）抗体を脱離させる。ピークタンパク質画分を回収し、プールし、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２で４℃にて２４〜３６時間、何回かバッファー交換しながら透析する。
【０９７０】
優先的に結合する抗体を純粋なものにしたいならば、アフィニティー精製したＩｇＧを、上記の手順により成体血漿フィブロネクチンが結合したアフィニティーカラムに通して、非癌胎児性フィブロネクチンと交差反応する抗体を除去してもよい。
【０９７１】
実施例２
モノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体
実施例１の手順によって得られた精製癌胎児性フィブロネクチンを用い、癌胎児性フィブロネクチンをマウスを免疫する抗原として用いるGalfre and Milstein, Meth. Enzymol., 73(Pt.B):3−46 (1981); およびMatsuura, H. and Hakomori, S. et. al.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6517−6521 (1985)の標準的な手順により、癌胎児性フィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体を得る。このモノクローナル抗体を、文献、例えば、Lange et al., Clin. Exp. Immunol., 25(2):191−198 (1976);およびPisetsky et al., J. Immun. Meth., 41(2):187−200 (1981)に記載されている技術の改変法を用いてスクリーニングする。
【０９７２】
マウスモノクローナル抗体は、Tijsson, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Science Publishers, pp. 105−107 (1985)の手順に従い、プロテインＡ結合セファロース−４Ｂ(Pharmacia Fine Chemicals)を用いて腹水またはハイブリドーマ培養上清から精製する。
【０９７３】
実施例３
ポリクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体コーティングマイクロタイタープレート
実施例１に記載のように、調製し、非癌胎児性フィブロネクチン交差反応を除くためにさらに精製したウサギ抗（癌胎児性フィブロネクチン）を０．０５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６で１０μｇ／ｍＬに希釈する。IMMULON II マイクロタイタープレート(Dynatech)の各ウェルに１００μＬずつ入れる。プレートに蓋をし、室温で４時間または４℃で一晩インキュベートする。このプレートを洗浄バッファー（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）で４回洗浄する（使用ごとにウェルを完全に空にして満たす）。次に、各ウェルにブロッキング溶液（０．０１Ｍ  ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７．４）２００μｌを入れ、室温で１時間インキュベートすることによりプレートをブロックする。その後、ウェルを上記のように洗浄バッファーで４回洗浄する。このプレートをサンプルのイムノアッセイに使用することができる。
【０９７４】
実施例４
ポリクローナル抗ヒトフィブロネクチン抗体
Engvall and Ruoslahti, Int. J. Cancer, 20:1−5 (1977)により記載されているように、ヒト血漿からヒト血漿フィブロネクチンを精製した。
【０９７５】
文献、例えば、Stollar, Meth. Enzymol., 70(A):70−85 (1980)に記載されているヒト血漿フィブロネクチン抗原でヤギを免疫する免疫技術および計画を用いて、ヤギに抗ヒト血漿フィブロネクチン抗体を惹起させた。抗血清は、Lange et al., Clin. Exp. Immunol., 25(2):191−198 (1976)およびPisetsky et al., J. Immun. Meth., 41(2):187−200 (1981)により記載されているものなど、モノクローナル抗体に関して使用されるものと同様の固相アッセイによりスクリーニングした。
【０９７６】
抗血清のＩｇＧ画分を、製造業者(AFFINITY CHROMATOGRAPHY, Pharmacia Fine Chemicals Catalogue, 1990, pp. 15−18)推奨の方法に従ってヒト血漿フィブロネクチンと結合させたＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ(Pharmacia Fine Chemicals)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０９７７】
要するに、カラムを２〜３容量のバッファー（０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で平衡化した後に、抗ヒトフィブロネクチン抗体を含有する溶液をカラムに適用した。溶出物の吸光度を、カラムからタンパク質が流れ出なくなるまで２８０ｎｍでモニタリングした。次に、２８０ｎｍにおけるベースライン吸光度が得られるまでカラムを平衡バッファーで洗浄した。
【０９７８】
免疫親和性結合した抗ヒト血漿フィブロネクチン抗体を０．１Ｍグリシンバッファー、ｐＨ２．５で溶出させた。ピークタンパク質画分を回収し、プールし、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２で４℃にて２４〜３６時間、何回かバッファー交換しながら透析した。上記の手順を繰り返し、ヒト血漿フィブロネクチンでウサギを免疫し、得られたポリクローナル抗ヒトフィブロネクチン抗体を精製した。
【０９７９】
実施例５
ポリクローナル抗フィブロネクチン抗体コーティングマイクロタイタープレート
実施例４に記載のように調製したヤギ抗ヒト血漿フィブロネクチンを０．０５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６で１０μｇ／ｍＬに希釈する。Costar、NuncまたはDynatechによって供給されているようなポリスチレンマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μＬずつ入れる。プレートに蓋をし、室温で２〜４時間または４℃で一晩インキュベートする。このプレートを洗浄バッファー（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）で３〜４回洗浄する（使用ごとにウェルを完全に空にして満たす）。次に、各ウェルにブロックキング／安定化溶液（４％スクロース、１％マンニトール、０．０１Ｍ  ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７．４）２００μＬを入れ、室温で３０分間〜２時間インキュベートすることによりプレートをブロックする。その後、ウェルを吸引して乾燥させ、プレートを乾燥剤の袋の入った気密容器に封入し、必要になるまで４℃にて保存する
【０９８０】
実施例６
ハイブリドーマＨＢ  ９０１８由来のモノクローナル抗体
ハイブリドーマ（the American Type Culture Collectionに受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ  ９０１８として寄託）の調製については、１９９０年１月１６日発行のMatsuura et al.の米国特許第４，８９４，３２６号に記載されている。ハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ  １６４０組織培養培地で増殖させることにより培養した。加えて、Mishell and Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman ＆ Co, San Francisco, page 368, (1980)の手順に従い、ハイブリッド細胞を注射することによりハイブリドーマをマウス内で培養した。
【０９８１】
ハイブリドーマによりＦＤＣ−６と呼ばれるモノクローナル抗体を産生させ、イムノアッセイに用いるために次の手順により調製した。培養上清または腹水のＩｇＧ画分を硫酸アンモニウム分画により沈殿させた。製造業者の説明書に従い、Protein−G Fast Flow (Pharmacia Fine Chemicals)でアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行うため、抗体を再び溶解し、適当なバッファーで透析した。
【０９８２】
実施例７
モノクローナル抗体コーティングマイクロタイタープレート
下記の手順に従い、マイクロタイタープレートをＦＤＣ−６モノクローナル抗体でコーティングした。
【０９８３】
実施例６に記載のように調製したモノクローナル抗体ＦＤＣ−６をリン酸バッファー、ｐＨ７．２で１０μｇ／ｍＬに希釈し、ポリスチレンマイクロタイタープレート(Costar)に１００μｌ／ウェルを入れた。プレートを室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。ウェルの内容物を吸引し、そのウェルを、実施例５に記載のように洗浄バッファー（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）で３〜４回洗浄した。次に、ウェルに２００μｌ／ウェルのブロッキング／安定化溶液（４％スクロース、１％マンニトール、０．５％カゼインおよび０．０１Ｍ  ＰＢＳ）を加え、室温で３０分間〜４時間インキュベートした。その後、ウェルを吸引して乾燥させ、プレートを乾燥剤の袋の入った気密容器に封入し、必要になるまで４℃にて保存した。
【０９８４】
上記の手順をNuncおよびDynatech製マイクロタイタープレートを使用して繰り返したところ、同等の結果が得られた。
【０９８５】
実施例８
酵素標識抗フィブロネクチン抗体
実施例４に従って調製した抗ヒト血漿フィブロネクチン抗体を、Avramea, Immunochem. 6:43 (1969)の一段階グルタルアルデヒド法により、子ウシ腸アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた。
【０９８６】
実施例９
癌胎児性フィブロネクチンアッセイキットおよび方法
癌胎児性フィブロネクチンアッセイキットには、次の試薬が含まれる。
１．アフィニティー精製マウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体でコーティングしたマイクロタイタープレート、
２．子ウシ腸アルカリホスファターゼコンジュゲートのアフィニティー精製ポリクローナルヤギ抗フィブロネクチン抗体、
３．酵素基質、
４．陰性対照、
５．陽性対照、
６．リンスバッファー濃縮液（５０×）、および
７．停止液
【０９８７】
マウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体でコーティングしたマイクロタイタープレートとアルカリホスファターゼコンジュゲートのアフィニティー精製ポリクローナルヤギ抗フィブロネクチン抗体は、それぞれ、実施例７および実施例８に記載のように調製した。マイクロタイタープレートを各８個のウェルを持つ１２ストリップとして乾燥剤の入った密閉プラスチック袋に封入し、２℃〜８℃にて保存した。
【０９８８】
このストック抗体コンジュゲートをコンジュゲート希釈液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ７．２、２％Ｄ−ソルビトール、２％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ塩化マグネシウムおよび０．１％塩化亜鉛）で適宜希釈し、１０ｍＬをポリエチレンスポイトボトル容器に入れた。
【０９８９】
酵素基質（ポリエチレンスポイトボトル容器中１０ｍＬ）は、０．１ｍＭ塩化マグネシウムおよび０．２％アジ化ナトリウムを含有する０．４Ｍアミノメチルプロパンジオールバッファー、ｐＨ１０に溶かしたフェノールフタレイン一リン酸（１ｍｇ／ｍＬ）とした。
【０９９０】
陽性対照（ポリエチレンスポイトボトル容器中３．４ｍＬ）は、サンプル希釈液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー  ｐＨ７．４、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍＬのアプロチニンおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で癌胎児性フィブロネクチン濃度５０ｎｇ／ｍＬに希釈した癌胎児性フィブロネクチンを含有する羊水とした。このサンプル希釈液については、１９９０年４月２４日発行のJones et al.の米国特許第４，９１９，８８９号に記載されている。
【０９９１】
陰性対照（ポリエチレンスポイトボトル容器中２．５ｍＬ）は、癌胎児性フィブロネクチンを含んでいない陽性対照に使用したサンプル希釈液とした。
【０９９２】
リンスバッファー（ポリエチレンスポイトボトル容器中２０ｍＬ）は、１．０ＭＴｒｉｓバッファー  ｐＨ７．４、４．０Ｍ塩化ナトリウム、２．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％アジ化ナトリウムを含有する５０×濃縮液とした。アッセイに用いるため、このリンスバッファーを蒸留水または脱イオン水で終濃度０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．０８Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０２％アジ化ナトリウムに希釈した。停止液（ポリエチレンスポイトボトル容器中１０ｍＬ）は、５０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５０ｍＭリン酸ナトリウムを含有するものであった。
【０９９３】
加えて、孔径５μｍポリエチレンサンプルフィルター(Porex Technologie, Fairburn, Ga.)、マイクロタイターストリップホルダー、マイクロタイタープレートカバー、保存チューブおよび指示書。キット中のスポイトボトルは全て、試薬をおよそ５０μｌ滴下するように設計されたポリエチレンボトルであった。サンプル採取の後に行った全てのアッセイ段階で、このキット中の試薬と物質を使用した。全サンプル、陽性および陰性対照は、同じキットのキット試薬を用いて同時に試験した。
【０９９４】
アッセイは、以下のように実施した。全サンプルを、ポリエステルスワブを用いて後膣円蓋または子宮頸口の近傍で採取した。スワブサンプルを採取バイアルに入ったサンプル希釈液１．０ｍＬに浸漬した。このサンプル希釈液は上記のものである。採取チューブ内にできるだけ多くの量の液体が残るようにして、溶液からスワブを取り出した。アッセイ前の、濾過前か濾過後に、全サンプルおよび対照試薬をインキュベーター内で３７℃に２０分間または３７℃水浴中で１０分予温した。サンプルフィルターを各サンプルチューブ上の適当な位置で留め(snapped)、サンプル全てが濾過されるまでフィルターを底に押し付けた。濾過が効果的でなかったサンプルでは、サンプルを室温にて５５０×ｇで５分間遠心分離し、試験上清をアッセイに用いた。８−ウェルストリップをストリップホルダー内の適当な位置に留めた。ホルダーは、１２×８列の標準的なマイクロタイタープレートが英数字表示されたものであった。各サンプルと予温した陽性および陰性対照の１００μＬアリコート２組をマイクロタイターストリップのそれぞれのウェルに入れ、室温で１時間インキュベートし、蓋をした。
【０９９５】
インキュベーション後、サンプルおよび対照をウェルから吸引した。ウェルを希釈した洗浄バッファー（１×）で３回洗浄し、毎回必ずウェルを完全に満たした。洗浄後、各ウェルに酵素−抗体コンジュゲート１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートし、蓋をした。ウェルを吸引し、上記のように洗浄した。洗浄後、各ウェルに酵素基質１００μＬを加え、室温で３０分間インキュベートし、蓋をした。３０分インキュベートした後、各ウェルに停止液５０μＬを加えた。
【０９９６】
プレートを手でまたはオービタルシェーカーを用いて緩やかに振盪し、ウェル内容物を混合した。このストリップフレームをＥＬＩＳＡプレートリーダーに入れた。各ウェルの５５０ｎｍでの吸光度を測定した。各サンプルおよび対照に対し、ウェル２組の平均吸光度を算出した。対象サンプルの吸光度が陽性対照の吸光度より低い場合には、そのサンプルは陰性であり、そのサンプル中の癌胎児性フィブロネクチンが検出できないレベルであることを示す。サンプル吸光度が陽性対照の吸光度以上である場合には、そのサンプルは陽性であり、そのサンプル中に癌胎児性フィブロネクチンが存在することを示す。いずれのアッセイにおいても、陽性対照の平均吸光度が陰性対照の平均吸光度よりも少なくとも０．０２吸光度単位大きいものでなかった場合には、その結果を破棄し、アッセイ手順を繰り返した。
【０９９７】
実施例１０
早期陣痛サンドイッチイムノアッセイ
妊娠２０週〜３６週の間に得られた試験サンプルで実施例９の手順を繰り返した。研究は、米国内の３つの周産期紹介病院で行った。早期破水の疑いまたは羊膜が無傷の状態での早期陣痛の疑いに関し、女性を入院させるかどうか判断した。
【０９９８】
破水の確認は、羊水漏出に関する膣の視診、乾燥膣分泌液のシダ状結晶形成についての顕微鏡検査、ニトラジン紙を用いたアルカリ性膣分泌液の存在および羊水過少の超音波診断によって行った。これらの４つの診断基準のうちのいずれか２つが存在することによって破水と診断した。判明している最終月経と妊娠初期の骨盤内診察および妊娠２８週までの超音波検査によって確定される出産予定日に基づいて、妊娠２３週〜３６週、妊娠６日目の、羊膜が無傷の状態の女性１１７名について以下に記載する。これらの女性らは、病歴と子宮収縮の記録や子宮頸の検査を含む診察に基づいて、担当医により早期陣痛とその後に続く分娩のリスクがあると診断されていた。早期陣痛について臨床的定義を設けることは難しい場合があるため、早産を結果変数として用い、癌胎児性フィブロネクチンの臨床的有用性を確立するデータを解析した。
【０９９９】
母体の血漿フィブロネクチンによる頸膣汚染の可能性を決定するため、母体の血液検体を見掛け上健全な妊娠状態にある妊娠第２期または第３期の女性５２名から採取した。羊水検体は、妊娠第２期の初期に遺伝子診断のために羊水穿刺を受けた対象９２名と、妊娠第３期に選択的反復帝王切開前の胎児肺成熟度の評価のために羊水穿刺を受けた対象８名から採取した。
【１０００】
アッセイの結果は、羊水の癌胎児性フィブロネクチン濃度は、妊娠第２期では８７．１±４．８μｇ／ｍＬ（ｎ＝９２）であり、妊娠第３期では２７．１±１７．３μｇ／ｍＬ（ｎ＝８）であるということを示した。母体血漿の癌胎児性フィブロネクチン濃度は、妊娠第２期では１．４８±０．１１μｇ／ｍＬ（ｎ＝２０）であり、妊娠第３期では３．１９±０．３０μｇ／ｍＬ（ｎ＝３２）であった。
【１００１】
早期陣痛の疑いがあり、羊膜が無傷の状態の対象１１７名では、満期分娩（ＴＤ）の女性５８名のうち１１名（特異性＝８１．０％）に対し、早産（ＰＴＤ）の女性５９名のうち４９名（感受性＝８３．１％）の頸膣分泌液に癌胎児性フィブロネクチンが含まれていた（ｐ＜０．０１）。同様に、頸膣分泌液に癌胎児性フィブロネクチンが含まれている対象は、頸膣癌胎児性フィブロネクチンを発現していない女性（陰性適中率＝８２．５％）よりも早産する可能性がはるかに高かった（陽性適中率＝８１．７％）。
【１００２】
早期陣痛の疑いのあるこれらの女性において、頸膣癌胎児性フィブロネクチンの存在は、早産リスクの高感度かつ特異的な予測因子であった。これらの対象における癌胎児性フィブロネクチンの存在は、早産リスクに強く関連し、ロジスティック回帰オッズ比は３．７９であった（９５％ＣＩ：２．３３、６．１５；ｐ＜０．０１）。
【１００３】
母体由来の癌胎児性フィブロネクチンと混同する可能性を評価するため、血液が混入した３１サンプルを除いた後、データを解析した。以下に示すように、同様の割合の対象の頸膣分泌液に癌胎児性フィブロネクチンが含まれており、その対象は早産した。さらに、段階的ロジスティック回帰モデルに、おしるし(vaginal bloody show)の存在または不存在を含めると、オッズ比１．７０（９５％ＣＩ：０．９１、３．１８；ｐ＝０．１）が得られ、癌胎児性フィブロネクチンをモデルに導入した後では、おしるしが早産の独立した予測因子とはならないということが示される。しかし、単変量解析より、おしるしでの癌胎児性フィブロネクチンの検出が切迫出産の指標となるということが明らかとなった。
【１００４】
ＰＴＤのリスクがある女性を同定するための癌胎児性フィブロネクチンの有用性は、子宮口の開大が２ｃｍ超え、羊膜が無傷の状態で早期収縮を起こしている女性を解析から排除した場合でさえも維持された。ロジスティック回帰オッズ比３．１８（９５％ＣＩ：１．８、５．６、ｐ＜０．０１）は、この臨床的に別個の集団における癌胎児性フィブロネクチンの診断価値を裏付けた。
【１００５】
実施例１１
癌胎児性フィブロネクチンアッセイキットおよび方法
癌胎児性フィブロネクチンアッセイキットには、次の成分が含まれる。このキットは、ベッドサイドで迅速アッセイを行うために使用されるように設計されたものである。
【１００６】
１．プラスチックハウジングを有し、
（ａ）モノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチン抗体が結合されている多孔性ナイロン膜；
（ｂ）流量制御膜系；および
（ｃ）吸収材層
を含むアッセイデバイス
２．タンパク質マトリックス中の金コロイド標識ヤギ抗フィブロネクチン抗体コンジュゲート
３．コンジュゲート再構成バッファー
４．洗浄液
５．滅菌済ポリエステルサンプル採取スワブ
【１００７】
この膜デバイスは、次の手順によりを調製した。実施例６に記載のように調製したマウスモノクローナル抗体ＦＤＣ−６およそ２μＬを、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するｐＨ６、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．１Ｍクエン酸バッファー中の膜（１．２μｍナイロン, Biodyne−A, Pall）表面に適用する。同じバッファー中の、実施例４に記載のように精製したヒト血漿フィブロネクチンを含有する、処置対照も膜の別の領域に適用する。膜を風乾した後、膜にＰＢＳ緩衝０．５％脱脂粉乳のブロッキング試薬を加える。少なくとも約２０分後には過剰なブロッキング試薬を除去する。
【１００８】
アッセイ膜から吸収材層へのサンプル溶液の流量を制御するために、膜ホールディングデバイス（Target Device, V−Tech, Pomona, Calif.）を、抗体含有膜の（サンプル適用方向に）真下の第二の多孔性層（０．４５μｍ低タンパク質結合ナイロン, LoProdyne, Pall）とともに構築する。次に、この多孔性膜２枚を、１．５ｍＬを超える容量を有する多孔性ポリエチレン吸収材層(Chromex, Brooklyn, N.Y.)の上に載せ、デバイス内に入れる。このデバイスを、乾燥剤の入った密閉プラスチック袋に個別に封入する。
【１００９】
金コロイドは、０．０１％テトラクロロ金酸を０．１６％クエン酸ナトリウムで還元することにより調製し、この方法で、およそ３０ｎｍの粒子が生じる。要するに、この２つの溶液を別々に９０℃に加熱する。この還元溶液を、激しく攪拌しながら、金溶液に加える。合わせた溶液を少なくとも１０分間沸騰させる（１００℃）。
【１０１０】
アフィニティー精製ヤギ抗フィブロネクチン抗体（実施例４に記載のように調製）を吸着により金コロイドに結合させた。要するに、上記で調製した金コロイド溶液を水中、抗体（５〜１０μｇ／ｍＬ）と合わせた。コンジュゲート後、５％ＢＳＡおよび５％ポリビニルピロリジン（終濃度）を加えて、コンジュゲート溶液を安定化させた。
【１０１１】
このストックコンジュゲートを、中空繊維フィルターを使用した限外濾過によりおよそ１０〜１２倍濃縮した。濃縮したコンジュゲートを１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．２％ポリエチレングリコール、８％ポリビニルピロリジンおよび０．０４％チメロサールで適当なレベルに希釈した。下記のようなサンプルアッセイ法において一定の範囲の希釈液を用い、最良の結果が得られる希釈率を決めることにより、適当な濃度を決定した。
【１０１２】
選択したコンジュゲート希釈液をポリエチレン製サンプル採取チューブに入れ、凍結乾燥した。凍結乾燥工程中は、チューブに孔径２μｍポリエチレンサンプルフィルター(Porex Technologie, Fairburn, Ga.)を取り付ける。凍結乾燥したコンジュゲートは、乾燥剤の入ったホイル袋に個別に封入する。
【１０１３】
コンジュゲート再構成バッファーは１００ｍＭ酢酸ナトリウムである。このバッファーは、単位用量として１ｍＬ使い捨てチューブに封入する。
【１０１４】
洗浄液は水であり、単位用量として使い捨てチューブに封入する。
【１０１５】
キットには、個別に封入された滅菌ポリエステルスワブおよび手順一覧表がさらに含まれる。
【１０１６】
アッセイは、次のように実施した。
１．サンプル採取前に、ホイル袋から金コンジュゲートの入ったプラスチックチューブを取り出し、スポイトチップを取り外し、コンジュゲート再構成バッファーの入ったチューブの全内容物を加える。
２．提供されているスワブでサンプルを採取する。無菌膣鏡診中に、スワブを後膣円蓋に挿入し、およそ１０秒間回転させて体液を吸収させる。直ちに試験の実施を進める。スワブを金コンジュゲート溶液に入れ、１０〜１５秒間上下に動かし、手早く混合する。
３．チューブの内側でチップを回転させて、スワブからできる限り多くの液体を取り出す。スワブは、感染している恐れのある物質の取扱いに合致する方法で廃棄する。
４．プラスチックチューブにスポイトチップを戻し、直ちに、希釈濾過したサンプルの全容量を膜デバイスの表面に注ぐ。
５．サンプル液を膜表面に吸収させた後、洗浄液を数滴加え、結果を観察する。
６．膜の処置対照のみが赤を呈していれば、陰性結果を示す。膜の試験ゾーンならびに対照ゾーンにピンクまたは赤いスポットがあれば、陽性結果を示す。
【１０１７】
実施例１２
頸膣サンプルにおける、子宮頸癌マーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンの検出
子宮頸癌と診断された対象１５名の子宮頸口のスワブサンプルを採取した。具体的には、ポリエステルスワブ(Adeza Specimen Collection Kit, Adeza Biomedial, Inc., Sunnyvale, CA)を使用して、子宮頸口の子宮頸病変部または子宮頸口の移行域のいずれかをスワブ採取し、いくつかの移行域スワブには外頸部のスワブも含めた。各スワブからバッファーに物質を抽出するため、各スワブを、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニンおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する抗プロテアーゼバッファー（ＡＰＢ）１ｍｌの入った別個の容器に入れた。
【１０１８】
各サンプルに対し、各スワブから遊離したＡＰＢサンプル２００μｌを、試験ストリップに液体サンプルを吸い出す吸収パッドを含む試験ストリップに加えることにより水平流動を実施した。サンプルを、まず、ブルーマイクロスフェア(Adeza Biomedical, Inc.)とコンジュゲートされたＦＤＣ−６コンジュゲートを含む可動化領域に流した。このコンジュゲートはサンプル流によって移動した。次に、このサンプルとコンジュゲートを、試験ストリップと拡散しないように結合された、実施例４に記載されているもののようなヤギポリクローナル抗フィブロネクチン抗体（本明細書ではＡ１２０抗体とも呼ばれる）を含むフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域に流した。最後に、サンプルを、試験ストリップと拡散しないように結合された、ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（ＦＤＣ−６ブルーラテックスマイクロスフェアコンジュゲートと選択的に結合する）を含む対照領域に流した。その後、試験ストリップをリーダーデバイスに入れ、このリーダーデバイスで検出および対照領域における光の反射率を測定した。
【１０１９】
この試験では子宮頸癌を有する対象のサンプルの１００％で、検出可能なレベルの癌胎児性フィブロネクチンを含んでいた（１５サンプル中１５サンプル）。これらのサンプルのＥＬＩＳＡアッセイ（実施例９参照）からも同様の結果が得られた。
【１０２０】
実施例１３
尿サンプルにおける、膀胱癌マーカーとしての癌胎児性フィブロネクチンの検出
膀胱癌対象４４名から尿サンプルを採取した。これらの対象うち、対象２３名はＴ１期膀胱癌と診断され、対象７名はＴ２期膀胱癌と診断され、対象６名はＴ３期膀胱癌と診断され、対象２名はＴ４期膀胱癌と診断され、対象６名は病期不明の膀胱癌を有していた。膀胱癌ではない対象４１名から対照サンプルも採取した。サンプルを冷凍し、−８０℃で保存した。試験の前に、サンプルを解凍した。サンプルは、無処理で（すなわち、バッファーまたは試薬を加えないで）試験するか、または以下に示すように希釈した。
【１０２１】
試験は、異なる３つの方法：ドットブロット分析、ディップスティック／水平流動および垂直流動により実施した。
【１０２２】
Ａ．ドットブロット法
この分析では、尿サンプル４９種を試験した：膀胱癌を有する対象の尿サンプル２９種と対照（陽性および陰性）対象の尿サンプル２０種。ブロットアッセイは、マウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチンＦＤＣ−６抗体とセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体を、解凍した冷凍尿サンプルを適用したニトロセルロース膜とともにインキュベートすることにより実施した。要するに、冷凍尿サンプルを解凍し、各サンプル５μｌをニトロセルロース膜の別個の位置に適用することによりニトロセルロース膜に添加した。ニトロセルロース膜に適用した液体サンプルを風乾した。ニトロセルロース膜を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０および５％ＢＳＡを含有する溶液（ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ）中で１時間インキュベートすることにより、非特異的タンパク質結合をブロックし、その後、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液を除去した。次に、６μｇ／ｍｌ  ＦＤＣ−６を含有する一次抗体のＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液をニトロセルロース膜とともに３０分間インキュベートした。次いで、そのニトロセルロース膜を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５および０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する溶液（ＴＢＳ−Ｔ）で３回すすいだ。次に、セイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ(Jackson Immunological, West Grove, PA)を含有する二次抗体のＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液を３０分間インキュベートし、続いて、ＴＢＳ−Ｔで３回すすぎ、その後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含有する溶液（ＴＢＳ）を含む溶液で２回すすいだ。次に、このニトロセルロース膜を同量の酵素化学発光溶液１および２（Amersham ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬、カタログ番号ＲＰＮ２１０９； Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ）とともに短時間インキュベートし、余分な液体を除去し、ニトロセルロース膜をラップで包み、フィルムカセットに入れ、フィルムを１分間露光させた。フィルムを現像し、化学発光暴露をスキャンした。シグナルが癌胎児性フィブロネクチンの指標となるということの確認は、ウエスタンブロット分析により行った。
【１０２３】
この試験では膀胱癌を有する対象のサンプルの７９％が癌胎児性フィブロネクチン陽性であった（２９サンプル中２３サンプル）。この試験では膀胱癌でない対象のサンプルの９０％が癌胎児性フィブロネクチン陰性であった（２０サンプル中１８サンプル）。よって、癌胎児性フィブロネクチンが存在する場合の膀胱癌の存在に関する陽性適中率は９２％であり、癌胎児性フィブロネクチンが存在しない場合の膀胱癌の不存在に関する陰性適中率は７５％であった。癌胎児性フィブロネクチン陽性としての決定は、バックグラウンドを上回るシグナルの存在により行った。
【１０２４】
Ｂ．ディップスティック／水平流動
この分析では、尿サンプル５９種を試験した：膀胱癌を有する対象の尿サンプル３５種と対照（陽性および陰性）対象の尿サンプル２４種。尿サンプル１００μｌを、ＡＰＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニンおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）３００μｌに加えた後、この希釈尿サンプル混合物２００μｌを、試験ストリップにサンプルを吸い出す吸収パッドを含む試験ストリップに適用することにより水平流動を実施した。サンプルを、まず、試験ストリップと拡散可能なように結合された、ブルーマイクロスフェア(Adeza Biomedical, Inc.)とコンジュゲートされたＦＤＣ−６コンジュゲートを含む可動化領域に流した。このコンジュゲートはサンプル流によって移動した。次に、このサンプルおよびコンジュゲートを、試験ストリップと結合されたメチル化ＢＳＡを含む非特異的結合捕捉領域に流した。次いで、サンプルおよびコンジュゲートを、試験ストリップと拡散しないように結合された、実施例４に記載されているもののようなヤギポリクローナル抗フィブロネクチン抗体（本明細書ではＡ１２０抗体とも呼ばれる）を含む領域に流した。最後に、サンプルおよびコンジュゲートを、試験ストリップと拡散しないように結合された、ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（ＦＤＣ−６コンジュゲートと選択的に結合する）を含む対照領域に流した。その後、試験ストリップに対して、検出および対照領域における青色の存在または不存在について視診を行った。
【１０２５】
この試験では膀胱癌を有する対象のサンプルの６６％が癌胎児性フィブロネクチン陽性であった（３５サンプル中２３サンプル）。この試験では膀胱癌でない対象のサンプルの８８％が癌胎児性フィブロネクチン陰性であった（２４サンプル中２１サンプル）。よって、癌胎児性フィブロネクチンが存在する場合の膀胱癌の存在に関する陽性適中率は８９％であり、癌胎児性フィブロネクチンが存在しない場合の膀胱癌の不存在に関する陰性適中率は６４％であった。癌胎児性フィブロネクチン陽性としての決定は、バックグラウンドを上回るシグナルの存在により行った。
【１０２６】
Ｃ．垂直流動
垂直流動解析を用い、膀胱癌を有する対象の尿サンプル４３種と対照対象の尿サンプル４２種を調べた。凍結乾燥ポリクローナルヤギ抗ヒトフィブロネクチン抗体／金コロイドコンジュゲートを、１００ｍＭ  ＮａＯＡＣおよび３ｍＭ  ＮａＮ３を含有する再構成バッファーに溶かすことにより垂直流動を実施した。再構成したコンジュゲート溶液１ｍｌに尿サンプルを６滴（約１５０〜３００μｌ）加えた。このサンプル混合物を、膜（この膜の真下に膜を通じて液体サンプルを吸い出す吸収パッドを含む）の表面に添加した。試験ストリップの中央には、試験ストリップと拡散しないように結合された、ＦＤＣ−６（ＡＴＣＣ  ＨＢ−９０１８）を含むフィブロネクチンまたは癌胎児性フィブロネクチン結合領域がある。ポリクローナルヤギ抗ヒトフィブロネクチン抗体／金コロイドコンジュゲートと特異的に結合することができるフィブロネクチンを含む環状対照領域は、ＦＤＣ−６領域とは分離され、ＦＤＣ−６領域を取り囲んでいる。サンプルが膜を通過し後、視診により辺縁に沿った環の存在が検出されることで、試験が完了したこと、そして抗フィブロネクチン／金コロイドコンジュゲートが試験ストリップに沿って移動したことが示された。視診により検出された環の内部にピンクまたは紫色のスポットが存在することで、この試験が癌胎児性フィブロネクチン陽性であることが示された。
【１０２７】
この試験では膀胱癌を有する対象のサンプルの５４％が癌胎児性フィブロネクチン陽性であった（４３サンプル中２３サンプル）。この試験では膀胱癌でない対象のサンプルの６７％が癌胎児性フィブロネクチン陽性であった（４２サンプル中２８サンプル）。よって、癌胎児性フィブロネクチンが存在する場合の膀胱癌の存在に関する陽性適中率は６２％であり、癌胎児性フィブロネクチンが存在しない場合の膀胱癌の不存在に関する陰性適中率は５８％であった。癌胎児性フィブロネクチン陽性としての決定は、バックグラウンドを上回るシグナルの存在により行った。
【１０２８】
Ｄ．ＢＴＡ  Ｓｔａｔ
この分析では、尿サンプル６８種を試験した：膀胱癌を有する対象の尿サンプル２６種と対照（陽性および陰性）対象の尿サンプル４２種。ブロットアッセイは、ＢＴＡ−ｓｔａｔ試験ストリップ(Polymedco, Inc., Cortlandt Manor, NY)に尿を５滴加えることにより実施した。ＢＴＡ−ｓｔａｔ試験ストリップには、検出可能な部分とコンジュゲートされた可動性抗ＢＴＡ抗体が含まれ、その混合物はＢＴＡと結合する抗体を含む領域に移動し、この領域は、十分なＢＴＡが存在する場合には、目に見えるラインを生じ、これにより、サンプルがＢＴＡ陽性であることを示す。
【１０２９】
この試験では膀胱癌を有する対象のサンプルの６５％がＢＴＡ陽性であった（２６サンプル中１７サンプル）。この試験では膀胱癌でない対象のサンプルの２１％がＢＴＡ陽性であった（４２サンプル中９サンプル）であり、７９％がＢＴＡ陰性であった（４２サンプル中３３サンプル）。よって、ＢＴＡが存在する場合の膀胱癌の存在に関する陽性適中率は６５％であり、ＢＴＡが存在しない場合の膀胱癌の不存在に関する陰性適中率は７９％であった。
【１０３０】
Ｅ．ＯｎｆＦＮとＢＴＡ−Ｓｔａｔの組合せ
ＢＴＡ解析とｏｎｆＦＮ測定を行ったサンプルを対象の癌の状態に関して比較した；尿サンプル４８種を試験した：膀胱癌を有する対象の尿サンプル２３種および対照（陽性および陰性）対象の尿サンプル２５種。
【１０３１】
ＢＴＡ、ｏｎｆＦＮともに陽性のサンプルを提供した１５名全ての対象が膀胱癌を有していた。ＢＴＡ、ｏｎｆＦＮともに陰性のサンプルを提供した対象では、９１％が膀胱癌ではなかった（２２名中２０名）。ＢＴＡ陰性、ｏｎｆＦＮ陽性のサンプルを提供した対象では、７１％が膀胱癌を有していた（７名中５名）。ＢＴＡ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性のサンプルを提供した対象では、２５％が膀胱癌を有していた（４名中１名）。
【１０３２】
Ｆ．免疫沈降およびウエスタンブロット法
この分析では、尿サンプルを試験した。免疫沈降は、ＡＰＢバッファーで１：１０希釈したマウスモノクローナル抗癌胎児性フィブロネクチンＡ１２０抗体（０．５〜１．０ｎｇ／ウェル）または抗体Ａ１３７（２．５〜５．０ｎｇ／ウェル）をインキュベートすることにより実施した。サンプル８００μｌにＡ１３７コーティングビーズ３０μｌを加えた。ＰＢＳで洗浄することにより、沈降サンプルの酸を中和した。内部標準を設定した：（ＡＰＢ中２５μｇ／ｍｌ＝２ｎｇ／ウェル）：ＡＰＢ中２５ｎｇ／ｍｌの５０％未満を陰性（−）；ＡＰＢ中２５ｎｇ／ｍｌの５０〜６０％を陽性（＋）；ＡＰＢ中２５ｎｇ／ｍｌの６０〜７０％を陽性（＋＋）；ＡＰＢ中２５ｎｇ／ｍｌの７０〜８０％を陽性（＋＋＋）；およびＡＰＢ中２５ｎｇ／ｍｌの８０〜１００％を陽性（＋＋＋＋）とした。ウエスタンブロットは、上記のように実施した。
【１０３３】
Ｇ．総合結果
略語は以下の通りである：ＢＣ＝膀胱癌、ＰＣ＝前立腺癌；ＢＰＨ＝前立腺肥大症、ＫＣ＝腎臓癌、水腎症（ＨＮ）、精管切除（ＶＳ）および失禁（ＩＮ）＝症候性の泌尿器状態の対照。病期および攻撃性は上記の通りである。ｐｏｓ＝陽性、ｎｅｇ＝陰性。
【表２】
2011039068.tif 000004
【表３】
2011039068.tif 000005
【表４】
2011039068.tif 000006
【１０３４】
ｏｎｆＦＮ測定を行ったサンプルを対象の癌に状態に関して比較した；尿サンプル８５種を試験した：膀胱癌を有する対象の尿サンプル４４種、前立腺癌を有する対象の尿サンプル５種、前立腺肥大症を有する対象の尿サンプル１１種、腎臓癌を有する対象の尿サンプル２種、有症対照の尿サンプル２種および対照対象の尿サンプル２０種。
【１０３５】
この試験では水平流動により試験した膀胱癌を有する対象のサンプルの７１％がｏｎｆＦＮ陽性であった（３１サンプル中２２サンプル）。この試験では水平流動により試験した膀胱癌でない対象の陰性対照サンプルの９４％がｏｎｆＦＮ陰性であった（１６サンプル中１５サンプル）。
【１０３６】
この試験では免疫沈降およびウエスタンブロット法により確認した膀胱癌を有する対象のサンプルの６５％がｏｎｆＦＮ陽性であった（３１サンプル中２０サンプル）。この試験では免疫沈降およびウエスタンブロット法により決定した膀胱癌でない対象の陰性対照サンプルの１００％がｏｎｆＦＮ陰性であった（１６サンプル中１６サンプル）。陽性結果に関して、ｏｎｆＦＮの閾値を２５ｎｇ／ｍｌの５０％を超えるように設定した場合、この試験ではＴ１期膀胱癌対象の５９％がｏｎｆＦＮ陽性であり（１７サンプル中１０サンプル）、この試験ではＴ２期膀胱癌対象の８３％がｏｎｆＦＮ陽性であり（６サンプル中５サンプル）、この試験ではＴ３期膀胱癌対象の７５％がｏｎｆＦＮ陽性であり（４サンプル中３サンプル）、この試験ではＴ４期膀胱癌対象の１００％がｏｎｆＦＮ陽性であり（１サンプル中１サンプル）、この試験では前立腺肥大症対象の３０％がｏｎｆＦＮ陽性であり（１０サンプル中３サンプル）、この試験では前立腺肥大症(prostate)対象の５０％がｏｎｆＦＮ陽性であり（４サンプル中２サンプル）、この試験では症状のある状態にある対象（すなわち、陰性対照）の１００％がｏｎｆＦＮ陰性であり（１０サンプル中１０サンプル）、この試験では陰性対照対象の１００％がｏｎｆＦＮ陰性であった（３サンプル中３サンプル）。
【１０３７】
尿サンプルの免疫沈降およびウエスタンブロット分析を用い、浸潤性膀胱癌と非浸潤性膀胱癌を識別することができた。サンプルをｏｎｆＦＮについて、上記のように試験し、陽性結果に関してはｏｎｆＦＮの閾値を２５ｎｇ／ｍｌの５０％を超えるように設定した。非浸潤性膀胱癌を有する患者の５４％が閾値以上を示し、浸潤性膀胱癌を有すると確認された患者の８０％が陽性を示した。これに対し、陰性対照の１００％がｏｎｆＦＮレベル２５ｎｇ／ｍｌ未満であった（１６サンプル中１６サンプル）。
【１０３８】
実施例１４
膀胱癌の存在を示す癌胎児性フィブロネクチンを検出するための尿サンプルの処置
尿サンプルを、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する抗プロテアーゼバッファー（ＡＰＢ）で４倍希釈した。
【１０３９】
尿サンプル１００μｌを、ＡＰＢ（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、５００カリクレイン単位／ｍｌのアプロチニンおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）３００μｌに加えた後、この希釈尿サンプル混合物２００μｌを、試験ストリップにサンプルを吸い出す吸収パッドを含む試験ストリップに適用することにより水平流動を実施した。サンプルを、まず、試験ストリップと拡散可能なように結合された、ブルーマイクロスフェア(Adeza Biomedical, Inc.)とコンジュゲートされたＦＤＣ−６コンジュゲートを含む可動化領域に流した。このコンジュゲートはサンプル流によって移動した。次に、このサンプルおよびコンジュゲートを、試験ストリップと結合されたメチル化ＢＳＡを含む非特異的結合捕捉領域に流した。次いで、サンプルおよびコンジュゲートを、試験ストリップと拡散しないように結合された、実施例４に記載されているもののようなヤギポリクローナル抗フィブロネクチン抗体（本明細書ではＡ１２０抗体とも呼ばれる）を含む領域に流した。最後に、サンプルおよびコンジュゲートを、試験ストリップと拡散しないように結合された、ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（ＦＤＣ−６コンジュゲートと選択的に結合する）を含む対照領域に流した。その後、試験ストリップに対して、検出および対照領域における青色の存在または不存在についての視診を行った。水平流動法の改変法は、可動化領域上流の非特異的結合捕捉領域においてＢＳＡ、Ｗ６３２（抗ＭＨＣクラスＩ）およびマウスＩｇＧを用いて実施した
【１０４０】
実施例１５
イムノアッセイ試験ストリップ
図２および３の試験ストリップ１００は、３つの部品：多孔性または吸水性部材１０２；コンジュゲートパッド１０８；および吸収パッド１１０を含む膜系を含む。この膜系は、基質または基板１１２に取り付けることができ、コンジュゲートパッド１０８と吸収パッド１１０は、それらの間に挿入される多孔性または吸水性部材１０２と少し重なるようになっている。分かるように、コンジュゲートパッド１０８は、コンジュゲートパッド１０８上に置かれる液体サンプルがコンジュゲートパッド１０８から多孔性または吸水性部材１０２まで伝わるように、多孔性または吸水性部材１０２と重なっている。同様に、吸収パッド１１０は、コンジュゲートパッド１０８から多孔性または吸水性部材１０２へと導入される液体サンプルが、その後、吸収パッド１１０に送られるように、多孔性または吸水性部材１０２と重なっている。そのため、コンジュゲートパッド１０８、吸収パッド１１０および多孔性または吸水性部材１０２は全て、互いに液体連絡しており、コンジュゲートパッド１０８上に置かれたいずれの液体サンプルもコンジュゲートパッド１０８を通じて多孔性または吸水性部材１１０まで、続いて吸収パッド１１０まで伝わる。
【１０４１】
この膜系はコンジュゲートパッド１０８を含み、このコンジュゲートパッドはサンプル適用部品として働き、分析物に対する、検出可能な標識とコンジュゲートさせた抗体を含んでいる。このコンジュゲートパッドは多孔性または吸水性部材１０２と液体が流通する。標識抗体コンジュゲートはコンジュゲートパッドと拡散可能なように結合し、液体サンプルを適用すると可動性となり、試験ストリップに沿って移動する。コンジュゲートパッドはガラス繊維などの多孔性物質でできている。このコンジュゲートパッドはサンプルのプレフィルターとしての働きもすることができる。コンジュゲートパッドはまた、非特異的結合表面またはそこに固定されている非特異的結合化合物などの非特異的結合剤も含み得る。
【１０４２】
多孔性または吸水性部材１０２は、試験ストリップに沿って液体サンプルを送ることができ、免疫反応が生じた際に固体支持体として働く。標的分析物および／または標識と反応する抗体は固体支持体上に固定されている。考えられる固体支持体としては、紙およびセルロース誘導体（セルロースエステルおよびセルロースエーテルなど）、天然および合成高分子物質（ビニルポリマーおよび部分加水分解誘導体、重縮合物、共重合体および無機物質など）が挙げられる。固体支持体の例としては、ニトロセルロース膜が挙げられる。
【１０４３】
多孔性または吸水性部材１０２は、異なる抗体が固定されている少なくとも２つの異なるゾーン、すなわち、分析物結合ゾーン１０４と対照ゾーン１０６を含む。分析物ゾーンは、固定された分析物結合相手（目的の分析物と結合する抗体など）を含むが、一方、対照ゾーンは、分析物とは結合せずに標識抗体コンジュゲートと結合する、固定された抗体または他の成分（抗原など）を含む。
【１０４４】
さらに、この多孔性部材は非特異的結合剤を含み得る。非特異的結合剤は、コンジュゲートパッド１０８のいずれの部分、または分析物結合ゾーン１０４とコンジュゲートパッド１０８との間に存在する多孔性または吸水性部材１０２のいずれの部分に配置してもよい。
【１０４５】
膜系はまた吸収パッド１１２も含み、この吸収パッドは多孔性または吸水性部材とも液体連絡しており、このデバイスから連続的に液体を吸い出す働きをする。この吸水性ストリップは、セルロースペーパーまたは当業者に公知の他の物質などの物質からなっていてよい。
【１０４６】
試験ストリップおよびハウジングアッセンブリー３００を備えたイムノアッセイデバイスの例を示す図４に関して、ハウジング３０２は、一般に、試験ストリップ１００（図２および３）を収容し、試験サンプルを適用する開口部３０４、ならびに検出ゾーンと対照ゾーンの上部に窓３０６を含み、この窓により、リーダーによる標識量の測定が可能となり、この標識量が試験サンプル中の分析物の量と相関している。ハウジング３０２は、その上面３０８に、ハウジング３０２をつかむために用いる厚みのある端部３１０とハウジング３０２内部のイムノアッセイ試験ストリップのコンジュゲートパッド１０８にサンプルを適用するための適用窓３０４（またはサンプル窓）とを含む。ハウジング３０２は、イムノアッセイの試験結果が表示されるテスト窓３１４も含む。示された態様によれば、テスト窓３１４（またはサンプル窓３１２）内には窓材は使われない。よって、ハウジング３０２の外部からテスト窓３１４を通ってイムノアッセイ試験ストリップまでの光路は、物質に遮られることはない。他のもう１つの態様は、光学的に透明な物質（本明細書に記載のデバイスから放出された光が発する波長において透明）も含み得る。
【１０４７】
実施例１６
陣痛誘発結果の指標としての癌胎児性フィブロネクチン
Ａ．試験計画
Ａ．１  目的
妊娠３６  ０／７週以降４２  ０／７週までの妊婦の陣痛誘発に関連するｏｎｆＦＮ試験の有用性および誘発結果を予め評価するために、多施設共同臨床試験を行った。この研究目的では、陣痛誘発の有利な結果としては、帝王切開率の低下、２４および４８時間以内の経膣分娩率の上昇、子宮頸管熟化剤投与から分娩までの時間の短縮、子宮頸管熟化剤の投与回数の減少およびオキシトシン開始から分娩までの時間の短縮が含まれる。
【１０４８】
この研究では以下の比較を行った。
１．ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における誘発（子宮頸管熟化剤投与を含む）開始２４時間および４８時間以内の経膣分娩率
２．ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における子宮頸管熟化剤の初回投与から分娩までの時間
３．ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における子宮頸管熟化剤の投与回数
４．ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と範囲された女性におけるオキシトシン開始から分娩までの時間
５．ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された、子宮頸の状態が望ましくなく、羊膜が無傷の状態の未産婦における帝王切開率
【１０４９】
Ａ．２  研究計画
この研究は前向きに行い、臨床医が管理する患者にはｏｎｆＦＮ試験の結果をブラインドした。患者の管理は、臨床医のｏｎｆＦＮ試験の結果に関する知識には基づかずに行った。登録した女性は、インフォームド・コンセントを得た時点から分娩まで追跡調査を行った。用いたサンプルサイズでは、上に挙げた５つの臨床結果それぞれで検出力８０〜９０％を得ることができると概算された。それぞれの結果を両側５％有意水準で検定した。女性９０１名を登録した。これらの登録女性９０１名のうち、２６名のｏｎｆＦＮ試験結果が、検体の不適切な取扱いのため利用できなかった。よって、８７５名の登録とし、それらの女性は安全性および有効性データ解析に関して評価可能であると判断された。
【１０５０】
Ａ．３  対象
陣痛誘発が予定されている女性は、試験に含めるかどうか事前にスクリーニングを行った。最初の医療記録で、女性が１８歳以上であること、未経産であること、妊娠齢３６  ０／７週〜４２  ０／７週で単胎妊娠および頭位あることを確認した。ｏｎｆＦＮ試験検体を採取するとともに、羊水漏出が起こっていないことを確認した。Adeza Biomedical Specimen Collection Kit (Sunnyvale, CA)を使用して、後膣円蓋からｏｎｆＦＮ試験用の検体を採取した後、臨床医がそれ以外の骨盤内診察を行った。試験は、Rapid onfFN for the TLiIQ（商標）System (Adeza Biomedical, Sunnyvale, CA)により実施した。
【１０５１】
Ａ．４  データ採取および解析
３群以上の比較のためにＡＮＯＶＡを用いて統計解析を行った。２検体ｔ検定を用い、連続型変数の平均値を比較した。必要に応じて、フィッシャーの直接確率検定、カイ二乗検定または２検体ウィルコクソン順位検定により離散変数の群を比較した。必要に応じて、ロジスティックまたは一般線形回帰モデリング法を用い、目的とする臨床結果因子に対し、二値または多値変数の単変量相関と多変量相関を評価した。検定は全て両側検定とし、統計的に有意であるにはｐ値が０．０５未満である必要があった。統計的評価は、統計的解析システム(SAS Institute, Cary, North Carolina)を使用して行った。
【１０５２】
Ｂ．  結果
試験女性８７５名のうち、３７１名（４２．４％）がｏｎｆＦＮ陽性と決定され、５０４名（５７．６％）がｏｎｆＦＮ陰性と決定された。この集団の誘発結果を以下に示す。
【１０５３】
Ｂ．１  ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における帝王切開率
ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性とｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性との間には帝王切開率に差があった。ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性では、１８７名は帝王切開で分娩し、３１７名は帝王切開で分娩せず、結果として、実際の帝王切開率は０．３７１であった。ＯｎｆＦＮ陽性と決定された女性では、１０７名は帝王切開で分娩し、２６４名は帝王切開で分娩せず、結果として、実際の帝王切開率は０．２８８であった。割合差０．０８３（標準誤差＝０．０３２）は、ｐ値０．０１１の場合には統計的に有意であった（フィッシャーの直接確率検定）。よって、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性の帝王切開率は、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性の帝王切開率よりも高かった。
【１０５４】
ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性とｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性との間の帝王切開率における差を数値化するもう１つの方法がそれらの割合比である。割合比（０．３７１／０．２８８）１．２９は、陣痛誘発前ではｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性は、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性よりも帝王切開で分娩する可能性が２９％［９５％  ＣＩ  ６％、５７％］高いことを示す。
【１０５５】
Ｂ．２  ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における誘発開始２４および４８時間以内の経膣分娩率
ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性とｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性との間には子宮頸管熟化剤またはオキシトシン開始２４時間以内の経膣分娩率に差があった。ＯｎｆＦＮ陽性と決定された女性において、２２９名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始２４時間以内に経膣分娩に至り、１３８名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始２４時間以内に経膣分娩に至らず、結果として、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性における実際の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から２４時間以内の経膣分娩率は０．６２４であった。ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性において、２２５名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始２４時間以内に経膣分娩に至り、２７４名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始２４時間以内に経膣分娩に至らず、結果として、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における実際の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から２４時間以内の経膣分娩率は０．４５１であった。９名については、子宮頸熟化剤またはオキシトシンを受けなかったか、またはそれらのデータがないために除外した。割合差０．１７３（標準誤差＝０．０３４）は、ｐ値＜０．０００１の場合には統計的に有意であった（フィッシャーの直接確率検定）。よって、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から２４時間以内の経膣分娩率は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から２４時間以内の経膣分娩率よりも高かった。
【１０５６】
ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性とｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から２４時間以内の経膣分娩率の比（０．６２４／０．４５１）は１．３８であった。よって、結果を割合比として表すと、陣痛誘発前ではｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性よりも子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から２４時間以内に経膣分娩する可能性が３８％［９５％  ＣＩ  ２２％、５７％］高かった。
【１０５７】
ＯｎｆＦＮ陽性と決定された女性において、２５３名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始４８時間以内に経膣分娩に至り、１１４名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始４８時間以内に経膣分娩に至らず、結果として、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性における実際の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から４８時間以内の経膣分娩率は０．６８９であった。ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性において、２９９名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始４８時間以内に経膣分娩に至り、２００名は子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始４８時間以内に経膣分娩に至らず、結果として、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における実際の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から４８時間以内の経膣分娩率は０．５９９であった。９名については、子宮頸熟化剤またはオキシトシンを受けなかったか、またはそれらのデータがないために除外した。割合差０．０９０（標準誤差＝０．０３３）は、ｐ値＝０．００７の場合には統計的に有意であった（フィッシャーの直接確率検定）。よって、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から４８時間以内の経膣分娩率は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性の子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から４８時間以内の経膣分娩率よりも高かった。
【１０５８】
ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性とｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から４８時間以内の経膣分娩率の比（０．６８９／０．５９９）は１．１５であった。よって、結果を割合比として表すと、陣痛誘発前ではｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性よりも子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から４８時間以内に経膣分娩する可能性が１５％［９５％  ＣＩ  ４％、２７％］高かった。
【１０５９】
Ｂ．３  ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における子宮頸管熟化剤またはオキシトシンの初回投与から分娩までの時間
ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性において観察された、子宮頸管熟化剤またはオキシトシンの初回投与から分娩までの平均時間（２８．７時間）は、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性の場合の平均時間（１９．１時間）よりも９．６時間長かった。この差の標準誤差は１．９２であり、２検体ｔ検定のｐ値は＜０．０００１であった。よって、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性における子宮頸熟化剤またはオキシトシン開始から分娩までの平均時間は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における平均時間よりも短かった。
【１０６０】
Ｂ．４  ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における子宮頸管熟化剤の投与回数
ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性において観察された、子宮頸管熟化剤の平均投与回数（１．４３）は、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性の場合の平均投与回数（０．８３）よりも０．６０多かった。この差の標準誤差は０．０８であり、２検体ｔ検定のｐ値は＜０．０００１であった。よって、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性における子宮頸管熟化剤の平均投与回数は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における平均投与回数よりも少なかった。
【１０６１】
Ｂ．５  ｏｎｆＦＮ陽性、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性におけるオキシトシン開始から分娩までの時間
ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性において観察された、オキシトシン投与から分娩までの平均時間（１６．８時間）は、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性の場合の平均時間（１２．４時間）よりも４．４時間長かった。この差の標準誤差は１．０７であり、２検体ｔ検定のｐ値は＜０．０００１であった。よって、ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性におけるオキシトシン開始から分娩までの平均時間は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性における平均時間よりも短かった。
【１０６２】
Ｃ．  ｏｎｆＦＮ試験結果と誘発結果との関連性の概要
ｏｎｆＦＮ試験と陣痛誘発結果との関連性を、割合（帝王切開率および２４および４８時間以内の経膣分娩率）における差および平均値（子宮頸管熟化剤の初回投与からの時間、子宮頸管熟化剤の投与回数およびオキシトシン開始から分娩までの時間）における差に関して、それぞれ、表３および４に示す。ｏｎｆＦＮ陽性と決定された女性は、ｏｎｆＦＮ陰性と決定された女性と比べて、帝王切開で分娩する可能性が低く、２４時間以内の経膣分娩、分娩までの時間の短縮、子宮頸管熟化剤の投与回数の減少およびオキシトシン開始から分娩までの時間の短縮を受ける可能性はより小さい。
【表５】
2011039068.tif 000007
【表６】
2011039068.tif 000008
【１０６３】
実施例１７
種々のレベルの癌胎児性フィブロネクチンのにおける誘発結果の違い
妊娠２４週目の女性から採取した頸膣スワブサンプルにおいて癌胎児性フィブロネクチンの濃度を測定した。その後、妊婦の追跡調査を行い、分娩日を記録した。妊婦を、（ａ）癌胎児性フィブロネクチン測定値が６０ｎｇ／ｍｌ未満の女性、（ｂ）癌胎児性フィブロネクチン測定値が６０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌの女性および（ｃ）癌胎児性フィブロネクチン測定値が１５０ｎｇ／ｍｌ以上の女性、の３つの集団に分けた。そして、各集団の未分娩の女性の割合を分娩日に対してプロットした（２４週目以降）。
【１０６４】
３集団それぞれ、異なる分娩誘発結果を示した。癌胎児性フィブロネクチン最低群は、残りの妊娠期間を通して最も高い未分娩率を示し、癌胎児性フィブロネクチン最高群は、残りの妊娠期間を通して最も低い未分娩率を示した。中間群は、３０週頃まで癌胎児性フィブロネクチン最低群と同様の結果であったが、それ以降の６週間（３０週目〜３６週目）に分娩率１週間あたり約５％を示した。３６週目の時点で、この集団の約６５％が未分娩のままであった。癌胎児性フィブロネクチン最高群は、最初の４週間（２４週目〜２８週目）に分娩率１週間あたり約５％を示し、それ以降の８週間（２８週目〜３６週目）に２週間あたり約５％を示した。この集団では３６週目の時点で未分娩者は６０％未満であった。
【１０６５】
実施例１８
膣の下三分の一から採取したスワブサンプルの癌胎児性フィブロネクチン測定
妊娠対象２５９名から頸膣スワブサンプルを２形式で採取した。第一の頸膣スワブサンプル形式は後膣円蓋のスワブであった。第二の頸膣スワブサンプル形式は膣の下三分の一のスワブであった。
【１０６６】
実施例１２に記載の水平流動法を用い、全てのサンプルを試験ストリップに適用し、ＴＬｉＩＱ（商標）反射率リーダーを用いて測定した反射率強度によりサンプル中の癌胎児性フィブロネクチン濃度を決定した。後膣円蓋の頸膣スワブサンプルは、その反射率シグナルが癌胎児性フィブロネクチン濃度５０ｎｇ／ｍｌ以上を示した場合に癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類した（使用した試験ストリップのロットでは、５０ｎｇ／ｍｌを示す対応する反射率シグナルは０．３１５であった）。膣の下三分の一の頸膣スワブサンプルは、その反射率シグナルが０．１以上である場合に癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類した。この試験ストリップの反射率シグナルは、これらの条件において癌胎児性フィブロネクチンの線形関数であることから、膣の下三分の一の頸膣スワブサンプルで、癌胎児性フィブロネクチンの量が１６ｎｇ／ｍｌ以上であることが測定された場合に癌胎児性フィブロネクチン陽性として分類した。
【１０６７】
２５９サンプル２セットのうち、２３９のサンプルセットが一致していた。とりわけ、２３９のサンプルセットのうち、２０５セットでは双方とも陰性であり、３４セットでは双方とも陽性であった。違っていた２０のサンプルセットのうち、３サンプルだけが膣の下三分の一で陰性であり、後膣円蓋では陽性であった。残りの１７サンプルは後膣円蓋で陰性であり、下三分の一で陽性であった。よって、後膣円蓋の陽性測定値には、その測定値の９１．９％に膣の下三分の一での陽性測定値が伴い、また、後膣円蓋の陰性測定値には、その測定値の９２．３％に膣の下三分の一での陰性測定値が伴う。膣の下三分の一の陽性測定値には、その測定値の６６．７％に後膣円蓋での陽性測定値が伴い、また、膣の下三分の一の陰性測定値には、その測定値の９８．６％に後膣円蓋での陰性測定値が伴う。
【１０６８】
当業者には改変は自明であるため、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【図１】
2011039068.tif 000009
【図１Ａ】
2011039068.tif 000010
【図１Ｂ】
2011039068.tif 000011
【図１Ｃ】
2011039068.tif 000012
【図２】
2011039068.tif 000013
【図３】
2011039068.tif 000014
【図４】
2011039068.tif 000015
【配列表】
2011039068000001.app