(57)【要約】      （修正有）【課題】複数のウイルス、特に呼吸器感染症に関連する複数のウイルスを同時に検出可能な方法、そのためのプライマーセット、ならびにそのためのキットの提供。【解決手段】従来のマルチプレックスＰＣＲのプライマーを大幅に改善したことにより、特異性を改善し、プライマー同士の相互作用を軽減させることに成功した。また、マルチプレックスＰＣＲに組み込むプライマーセットの組み合わせを工夫したことにより、複数のウイルスを高感度に同時に検出することを可能にした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群から少なくとも２つ選択されるプライマーセット：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなる構成されるプライマーセット；
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
【請求項２】
以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択され、かつ以下の（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択されるプライマーセット：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなる構成されるプライマーセット；
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２３又は配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘ）配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９又は配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉ）配列番号３１又は配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｘｉｉｉ）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３８又は配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
【請求項３】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から少なくとも２つ選択されるプライマーセット：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなる構成されるプライマーセット；および
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
【請求項４】
以下の（ｖ）〜（ｖｉｉ）からなる群から少なくとも２つ選択されるプライマーセット：
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
【請求項５】
以下の（ｖ）〜（ｖｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択され、かつ以下の（ｖｉｉｉ）のプライマーセットを含むプライマーセット：
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２３又は配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
【請求項６】
以下の（ｉｘ）のプライマーセットを含み、かつ以下の（ｘ）および（ｘｉ）からなる群から少なくとも１つ選択されるプライマーセット：
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘ）配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９又は配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｘｉ）配列番号３１又は配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
【請求項７】
以下の（ｘｉｉ）および（ｘｉｉｉ）からなるプライマーセット：
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｘｉｉｉ）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３８又は配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットを用いて、被験対象から採取した試料からウイルス遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、ウイルスの検出方法。
【請求項９】
ウイルスが、呼吸器感染症に関連するウイルスである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のプライマーセットを含有する、ウイルス遺伝子又はその転写産物の検出用キット。
【請求項１１】
ウイルスが、呼吸器感染症に関連するウイルスである、請求項１０記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器感染症に関連する複数のウイルスの同時検出を可能にするプライマーセット、該プライマーセットを含有する複数のウイルスの同時検出用キット、および該プライマーセットを用いた、呼吸器感染症に関連する複数のウイルスの同時検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性呼吸器感染症（ＡＲＩ）は、世界的な小児の疾患および死因の主要原因である（非特許文献１〜３）。ウイルスは、幼児および低年齢小児の下気道感染において一般的にみられ、ウイルス性呼吸器病原体は、小児における大きな公衆衛生問題となっている（非特許文献４〜６）。多種多様なウイルス病原体が呼吸器感染症に関与しており、ウイルスの単離、検出のための利用可能な施設が限られているため、熱帯地域、特に発展途上国ではウイルス性呼吸器病原体の役割が、十分には研究されていない。
【０００３】
呼吸器感染症の一般的治療法としては、人工呼吸管理および気管支拡張薬の投与などの対処療法ならびに抗ウイルス剤・抗生物質の投与が挙げられる。しかし、不適当な抗ウイルス剤・抗生物質の選択またはそれらの多用などにより、肺炎などに重症化する場合もある。かかる場合、確定診断を行い、適切な抗生物質、抗ウイルス剤を選択して患者に投与することが求められる。しかし、疾患の原因となるウイルス・バクテリアを同定するためには、患者から喀痰を採取し、そこからウイルスまたはバクテリアを培養し、染色しなければならず、確定診断まで一週間弱の時間がかかるのが現状である。
【０００４】
かかる時間的問題を解決すべく、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣＲ法）によってウイルス等を迅速に検出する方法が提案されている。ＰＣＲ法は定量的かつ迅速であるため、病原体が一種類であれば確定診断に好ましく用いることができる。しかし、呼吸器感染症の原因として知られるウイルスは、小児に限定した場合であっても、１０種類以上が挙げられる。このような場合、ウイルスを一種類ずつ単離して、ＰＣＲ法により確定診断を行っていたのでは、コストが掛かり、現実的ではない。多種類のウイルスを一度にＰＣＲ法によって検出する方法（マルチプレックスＰＣＲ法）も考案され、いくつかの疾病病原菌の検出に用いられており、そのためのキットも販売されている。ただし、該方法は、一種類のウイルス等を検出するために用いられていたプライマーセットをそのまま流用した場合、プライマー同士の干渉により、検出感度が低下することが懸念される。
【０００５】
現時点では、呼吸器感染症の病原体ウイルス等を一度に検出するだけの特異性・定量性を備えたマルチプレックスＰＣＲ法は知られておらず、依然としてそのニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kusel, M. M., N. H. de Klerk, P. G. Holt, T. Kebadze, S. L. Johnston, and P. D. Sly. Pediatr Infect Dis J. 2006; 25:680-686.
【非特許文献２】Gasparini, R., P. Durando, F. Ansaldi, L. Sticchi, F. Banfi, D. Amicizia, D. Panatto, S. Esposito, N. Principi, G. Icardi, and P. Crovari. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007; 26:619-628.
【非特許文献３】Regamey, N., L. Kaiser, H. L. Roiha, C. Deffernez, C. E. Kuehni, P. Latzin, C. Aebi, and U. Frey. Pediatr Infect Dis J. 2008; 27:100-105.
【非特許文献４】Broor, S., S. Parveen, P. Bharaj, V. S. Prasad, K. N. Srinivasulu, K. M. Sumanth, S. K. Kapoor, K. Fowler, and W. M. Sullender. PLoS ONE. 2007; 2:e491.
【非特許文献５】Lambert, S. B., K. M. Allen, R. C. Carter, and T. M. Nolan. Respir Res. 2008; 9:11.
【非特許文献６】Iwane, M. K., K. M. Edwards, P. G. Szilagyi, F. J. Walker, M. R. Griffin, G. A. Weinberg, C. Coulen, K. A. Poehling, L. P. Shone, S. Balter, C. B. Hall, D. D. Erdman, K. Wooten, and B. Schwartz. Pediatrics. 2004;113:1758-1764.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、多種類の呼吸器ウイルス病原体の同時検出可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、従来のマルチプレックスＰＣＲのプライマーを大幅に改善したことにより、特異性を改善し、プライマー同士の相互作用を軽減させることに成功した。また、マルチプレックスＰＣＲに組み込むプライマーセットの組み合わせを工夫したことにより、複数のウイルスを高感度に同時に検出することを可能にした。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
［１］以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群から少なくとも２つ選択されるプライマーセット：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなる構成されるプライマーセット；
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
［２］以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択され、かつ以下の（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択されるプライマーセット：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなる構成されるプライマーセット；
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２３又は配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘ）配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９又は配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉ）配列番号３１又は配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｘｉｉｉ）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３８又は配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
［３］以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から少なくとも２つ選択されるプライマーセット：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなる構成されるプライマーセット；および
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット。
［４］以下の（ｖ）〜（ｖｉｉ）からなる群から少なくとも２つ選択されるプライマーセット：
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
［５］以下の（ｖ）〜（ｖｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択され、かつ以下の（ｖｉｉｉ）のプライマーセットを含むプライマーセット：
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２３又は配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
［６］以下の（ｉｘ）のプライマーセットを含み、かつ以下の（ｘ）および（ｘｉ）からなる群から少なくとも１つ選択されるプライマーセット：
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘ）配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９又は配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｘｉ）配列番号３１又は配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
［７］以下の（ｘｉｉ）および（ｘｉｉｉ）からなるプライマーセット：
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｘｉｉｉ）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３８又は配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
［８］上記［１］〜［７］のいずれか１つに記載のプライマーセットを用いて、被験対象から採取した試料からウイルス遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、ウイルスの検出方法；
［９］ウイルスが、呼吸器感染症に関連するウイルスである、上記［８］記載の方法；
［１０］上記［１］〜［７］のいずれか１つに記載のプライマーセットを含有する、ウイルス遺伝子又はその転写産物の検出用キット；
［１１］ウイルスが、呼吸器感染症に関連するウイルスである、上記［１０］記載のキット；
などを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプライマーセットを複数組み合わせて用いることにより、複数のウイルスを同時に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】グループ１のウイルスを同時検出対象とした、１回目マルチプレックスＰＣＲの増幅産物を電気泳動した結果の写真像である。各レーン番号は下記の通り対応する。１：ヒトメタ肺炎ウイルス（３７１ｂｐ）が増幅された、２：呼吸器合胞体ウイルス（２７１ｂｐ）が増幅された、３：増幅なし、４：増幅なし、５：増幅なし、６：ヒトメタ肺炎ウイルス（３７１ｂｐ）および呼吸器合胞体ウイルス（２７１ｂｐ）が増幅された、７：Ａ型インフルエンザウイルス（２４１ｂｐ）およびＢ型インフルエンザウイルス（３５２ｂｐ）が増幅された、８：増幅なし、Ｍ：サイズマーカー。
【図２】単一のウイルス核酸を鋳型とした１回目ＰＣＲの増幅産物を電気泳動した結果の写真像である。各レーン番号は下記の通り対応する。１：Ａ型インフルエンザウイルス（２４１ｂｐ）、２：Ｂ型インフルエンザウイルス（３５２ｂｐ）、３：呼吸器合胞体ウイルス（２７１ｂｐ）、４：ヒトメタ肺炎ウイルス（３７１ｂｐ）、６：パラインフルエンザウイルス１型（３００ｂｐ）、７：パラインフルエンザウイルス２型（３８６ｂｐ）、８：パラインフルエンザウイルス３型（２３０ｂｐ）、１０：ライノウイルス（２５４ｂｐ）、１２：アデノウイルス（１９３ｂｐ）、１３：ボカウイルス（３５４ｂｐ）、Ｍ：サイズマーカー、５，９，１１，１４：ネガティブコントロール。
【図３】単一のウイルス核酸を鋳型としたhemi-nested PCRの増幅産物を電気泳動した結果の写真像である。各レーン番号は下記の通り対応する。１：Ａ型インフルエンザウイルス（１５１ｂｐ）、２：Ｂ型インフルエンザウイルス（１０６ｂｐ）、３：呼吸器合胞体ウイルス（２０１ｂｐ）、４：ヒトメタ肺炎ウイルス（２８７ｂｐ）、６：パラインフルエンザウイルス１型（２１０ｂｐ）、７：パラインフルエンザウイルス２型（３２９ｂｐ）、８：パラインフルエンザウイルス３型（１４８ｂｐ）、１０：ライノウイルス（１７５ｂｐ）、１２：アデノウイルス（１５２ｂｐ）、１３：ボカウイルス（３０３ｂｐ）、Ｍ：サイズマーカー、５，９，１１，１４：ネガティブコントロール。
【図４】ヒトメタ肺炎ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスの核酸混合物を鋳型とした、１回目マルチプレックスＰＣＲの増幅産物を電気泳動した結果の写真像である。各レーン番号は下記の通り対応する。１：ヒトメタ肺炎ウイルス：呼吸器合胞体ウイルス＝１００：１、２：ヒトメタ肺炎ウイルス：呼吸器合胞体ウイルス＝１００：１０、３：ヒトメタ肺炎ウイルス：呼吸器合胞体ウイルス＝１００：１００、４：ヒトメタ肺炎ウイルス：呼吸器合胞体ウイルス＝１０：１００、５：ヒトメタ肺炎ウイルス：呼吸器合胞体ウイルス＝１：１００、Ｍ：サイズマーカー。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、多種類の呼吸器ウイルス病原体を同時に検出し得るプライマーセットを提供する。本発明においてプライマーセットとは、各呼吸器ウイルス病原体の遺伝子を増幅する為のＰＣＲプライマーのセットである。遺伝子増幅の為にＰＣＲは、通常１回行えばよいが、精度を上げる為にnested-PCRあるいはhemi-nested PCRを行ってもよい。各ＰＣＲの手法自体は公知であるので、プライマー以外の材料は容易に入手可能であり、種々の反応条件も適宜設定することができる。具体的には、該プライマーセットは、
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１のプライマーともいう）と、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号２のプライマー、配列番号３のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号４のプライマーともいう）と、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号５のプライマー、配列番号６のプライマーともいう）とからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号７のプライマー、配列番号９のプライマーともいう）と、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号８のプライマーともいう）とからなる構成されるプライマーセット；
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１０のプライマーともいう）と、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号１１のプライマー、配列番号１２のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号１３のプライマー、配列番号１５のプライマーともいう）と、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１４のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１６のプライマーともいう）と、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号１７のプライマー、配列番号１８のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号１９のプライマーともいう）と、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号２０のプライマー、配列番号２１のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２２のプライマーともいう）と、配列番号２３又は配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号２３のプライマー、配列番号２４のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２５のプライマーともいう）と、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号２６のプライマー、配列番号２７のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｘ）配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号２８のプライマーともいう）と、配列番号２９又は配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号２９のプライマー、配列番号３０のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｘｉ）配列番号３１または配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号３１のプライマー、配列番号３３のプライマーともいう）と、配列番号３２に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号３２のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３４のプライマーともいう）と、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号３５のプライマー、配列番号３６のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセット；
（ｘｉｉｉ）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマー（以下、配列番号３７のプライマーともいう）と、配列番号３８又は配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマー（以下、それぞれ配列番号３８のプライマー、配列番号３９のプライマーともいう）とから構成されるプライマーセットである。
【００１２】
配列番号１、２に示される塩基配列はそれぞれ、Ａ型インフルエンザウイルス(InFluA)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＹ０３８６７２．１）の第６番目から第２７番目の塩基配列、第２２６番目から第２４８番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸であり、配列番号３に示される塩基配列はＡ型インフルエンザウイルス(InFluA)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＹ０３８５９２．１）の第１３５番目から第１５８番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。Ａ型インフルエンザウイルスを検出する為には、後述する実施例の如くhemi-nested PCRを実施することができる。1st PCRを配列番号１のプライマー（センス）と配列番号２のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号１のプライマー（センス）と配列番号３のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００１３】
配列番号４、５および６に示される塩基配列はそれぞれ、Ｂ型インフルエンザウイルス(InFluB)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＹ０３８３４４．１）の第１５番目から第３８番目の塩基配列、第３４６番目から第３６７番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第９７番目から第１２１番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。Ｂ型インフルエンザウイルスを検出する為には、1st PCRを配列番号４のプライマー（センス）と配列番号５のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号４のプライマー（センス）と配列番号６のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００１４】
配列番号７、８および９に示される塩基配列はそれぞれ、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＤＱ７８０５６５．１）の第４５１番目から第４７４番目の塩基配列、第７０１番目から第７２２番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第５１３番目から第５３５番目の塩基配列からなる核酸である。ＲＳウイルスを検出する為には、1st PCRを配列番号７のプライマー（センス）と配列番号８のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号９のプライマー（センス）と配列番号８のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００１５】
配列番号１０、１１および１２に示される塩基配列はそれぞれ、ヒトメタ肺炎ウイルス(hMPV)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＦＪ１６８７７９．１）の第２４４２番目から第２４６４番目の塩基配列、第２７９０番目から第２８１３番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第２７０５番目から第２７２９番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。ヒトメタ肺炎ウイルスを検出する為には、1st PCRを配列番号１０のプライマー（センス）と配列番号１１のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号１０のプライマー（センス）と配列番号１２のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００１６】
配列番号１３、１４および１５に示される塩基配列はそれぞれ、パラインフルエンザウイルス１型(PIV1)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ７０９３６．１）の第５２３番目から第５４７番目の塩基配列、第７９９番目から第８２３番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第６１３番目から第６３７番目の塩基配列からなる核酸である。パラインフルエンザウイルス１型を検出する為には、1st PCRを配列番号１３のプライマー（センス）と配列番号１４のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号１５のプライマー（センス）と配列番号１４のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００１７】
配列番号１６、１７および１８に示される塩基配列はそれぞれ、パラインフルエンザウイルス２型(PIV2)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ１８９９５３．１）の第９４９番目から第９７１番目の塩基配列、第１３１５番目から第１３３５番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第１２５４番目から第１２７８番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。パラインフルエンザウイルス２型を検出する為には、1st PCRを配列番号１６のプライマー（センス）と配列番号１７のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号１６のプライマー（センス）と配列番号１８のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００１８】
配列番号１９、２１に示される塩基配列はそれぞれ、パラインフルエンザウイルス３型(PIV3)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＵ８１４６２３．１）の第３４２番目から第３６６番目の塩基配列、第４６９番目から第４９０番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸であり、配列番号２０に示される塩基配列はパラインフルエンザウイルス３型(PIV3)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ２６５２３．１）の第５６８番目から第５９０番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。パラインフルエンザウイルス３型を検出する為には、1st PCRを配列番号１９のプライマー（センス）と配列番号２０のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号１９のプライマー（センス）と配列番号２１のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００１９】
配列番号２２、２３および２４に示される塩基配列はそれぞれ、パラインフルエンザウイルス４型(PIV4)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ５５９７６．１）の第２３番目から第４２番目の塩基配列、第４４５番目から第４６４番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第３９４番目から第４１２番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。パラインフルエンザウイルス４型を検出する為には、1st PCRを配列番号２２のプライマー（センス）と配列番号２３のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号２２のプライマー（センス）と配列番号２４のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００２０】
配列番号２５に示される塩基配列はライノウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＵ８７０４８０．１）の第２４７番目から第２６８番目の塩基配列からなる核酸であり、配列番号２６に示される塩基配列はライノウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＵ０９６０６１．１）の第４５２番目から第４７３番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸であり、配列番号２７に示される塩基配列はライノウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＵ０９６０８３．１）の第３８４番目から第４０６番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。ライノウイルスを検出する為には、1st PCRを配列番号２５のプライマー（センス）と配列番号２６のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号２５のプライマー（センス）と配列番号２７のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００２１】
配列番号２８、２９および３０に示される塩基配列はそれぞれ、コロナウイルス229E(hCoV 229E)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０４４１９．１）の第７２６番目から第７５１番目の塩基配列、第１０４１番目から第１０６７番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第９７５番目から第９９４番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。コロナウイルス229Eを検出する為には、1st PCRを配列番号２８のプライマー（センス）と配列番号２９のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号２８のプライマー（センス）と配列番号３０のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００２２】
配列番号３１、３２および３３に示される塩基配列はそれぞれ、コロナウイルスOC43(hCoV OC43)ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ４６１５２２．１）の第７０１番目から第７２７番目の塩基配列、第１０３９番目から第１０５９番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第７４４番目から第７６９番目の塩基配列からなる核酸である。コロナウイルスOC43を検出する為には、1st PCRを配列番号３１のプライマー（センス）と配列番号３２のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号３２のプライマー（アンチセンス）と配列番号３３のプライマー（センス）で行う。
【００２３】
配列番号３４に示される塩基配列はアデノウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＥＵ８６７４９２．１）の第１７５７番目から第１７７９番目の塩基配列からなる核酸であり、配列番号３５および３６に示される塩基配列はそれぞれ、アデノウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＦＪ１６７５９９．１）の第５６番目から第７７番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第１３番目から第３６番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。アデノウイルスを検出する為には、1st PCRを配列番号３４のプライマー（センス）と配列番号３５のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号３４のプライマー（センス）と配列番号３６のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００２４】
配列番号３７、３８および３９に示される塩基配列はそれぞれ、ボカウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＦＪ１５４８９２４．１）の第１番目から第２１番目の塩基配列、第３３４番目から第３５４番目の塩基配列に相補的な塩基配列および第２８１番目から第３０３番目の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸である。ボカウイルスを検出する為には、1st PCRを配列番号３７のプライマー（センス）と配列番号３８のプライマー（アンチセンス）で行い、2nd PCR(hemi-nested PCR)を配列番号３７のプライマー（センス）と配列番号３９のプライマー（アンチセンス）で行う。
【００２５】
本発明のプライマーセットを構成するプライマーとしては、前記の各配列番号に示される塩基配列からなる核酸以外にも、各配列番号で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体もまた含まれる。
【００２６】
「各配列番号で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、上記した各配列番号で示される塩基配列にそれぞれ相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。例えば、「配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、配列番号１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによってＡ型インフルエンザ遺伝子の特定の領域をＰＣＲ増幅させることのできる機能を有する。同様に「配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによってＡ型インフルエンザ遺伝子の特定の領域をＰＣＲ増幅させることのできる機能を有する。同様に「配列番号３で示される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し同様にプライマーとしての機能を有するその変異体」とは、配列番号３で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであって、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと同様のプライマーとしての機能、すなわち配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと組み合わせることによってＡ型インフルエンザ遺伝子の特定の領域をＰＣＲ増幅させることのできる機能を有する。
かかる変異体は、プライマーとしての機能が維持される範囲で、もととなるオリゴヌクレオチドから１個又は複数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されている。
ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーのヌクレオチド配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring HarborLaboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。
【００２７】
上記の１３種のウイルスには、これまで多くのバリアントが報告されており、今後も新たな変異ウイルス株が続々と見出されるだろう。そのような変異ウイルス株であっても、ウイルスゲノム上の対応する塩基配列が本発明のプライマーセットの有する塩基配列と相補的である限り、後述する方法でウイルスの存否を検出することが可能である。
【００２８】
本発明のプライマーセットは、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群（それぞれＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、ライノウイルスおよびアデノウイルスを検出する為のプライマーセット）から少なくとも２つ選択されるプライマーセット（又は、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択され、かつ上記（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉｉ）からなる群（それぞれパラインフルエンザウイルス４型、コロナウイルス229E、コロナウイルスOC43およびボカウイルスを検出する為のプライマーセット）から少なくとも１つ選択されるプライマーセット）であるが、多種類のプライマー同士の相互作用を減じ、ウイルスの検出感度を向上させるため、特定のプライマーセットを組み合わせることが好ましい場合もある。そのような組み合わせとしては、上記(i)〜(ix)の各プライマーセット（即ち、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびヒトメタ肺炎ウイルスを検出する為のプライマーセットの組み合わせ）の少なくとも２つを含むもの（好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは４つ全てを含むもの）、上記(v)〜(vii)の各プライマーセット（即ち、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、およびパラインフルエンザウイルス３型を検出する為のプライマーセットの組み合わせ）の少なくとも２つを含むもの（好ましくは３つ全てを含むもの）（または、上記(v)〜(vii)の各プライマーセットの少なくとも１つを含み、かつ上記(viii)のプライマーセット（即ち、パラインフルエンザウイルス４型を検出する為のプライマーセット）を含むもの）、上記(iｘ)のプライマーセット（即ち、ライノウイルスを検出する為のプライマーセット）（または、上記(iｘ)のプライマーセット、かつ上記（ｘ）または（ｘｉ）のプライマーセット（コロナウイルス229EまたはコロナウイルスOC43を検出する為のプライマーセット）の少なくとも１つを含むもの）、または上記(ｘｉｉ)および（ｘｉｉｉ）のプライマーセット（即ち、アデノウイルス、ボカウイルスを検出する為のプライマーセット）含むものである。
【００２９】
本発明はまた、本発明のプライマーセットを用いて、被験対象から採取した試料からウイルス遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする、ウイルスの検出方法を提供する。
【００３０】
本発明の検出方法が適用できる対象は特に制限されないが、例えば、呼吸器感染症を発症するおそれがあるか、もしくは発症していることが疑われる哺乳動物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。好ましくはヒトである。
【００３１】
本発明の検出方法に用いられる試料としては、被験対象である上記哺乳動物から採取されるものであって、検出対象であるウイルス遺伝子またはその産物（例、ＤＮＡ、RNA、それらの分解産物など）を含有するものであれば特に制限されない。例えば、全血、血球成分、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、汗、唾液、関節液等の体液もしくはそのフラクション、粘膜（例えば、鼻咽頭など）、生検により得られる細胞もしくは組織標本などが挙げられる。迅速且つ簡便に採取することができ、動物への侵襲が少ないなどの点から、鼻咽頭液が好ましいが、それらに限定されない。
【００３２】
本発明の検出方法は、上記した哺乳動物から採取した試料における、ウイルス遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴とする。本発明の検出方法で検出されるウイルスとしては、呼吸器感染症に関連するウイルスが挙げられる。そのようなウイルスとしては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス１〜４型、ライノウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ボカウイルス等が挙げられるが、それらの変異株も検出することができる。
【００３３】
被験対象から採取した試料におけるウイルス遺伝子の検出は、該試料からＤＮＡ（例：ウイルスゲノムＤＮＡ）画分またはRNA（例：ウイルスゲノムRNA、mRNA）画分を調製し、該画分中に含まれるウイルス遺伝子またはその転写産物を検出することにより調べることができる。ＤＮＡ画分の調製は、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法など、RNA画分の調製は、グアニジン-CsCl超遠心法、AGPC法など公知の手法を用いて行うことができるが、市販のウイルスＤＮＡ／RNA抽出用キット（例：QIAamp Viral DNA Mini Kit, QIAamp Viral RNA Mini Kit; QIAGEN製等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度のＤＮＡまたはRNAを調製することができる。ＤＮＡまたはRNA画分中のウイルス遺伝子またはその転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、DNAチップ解析等）を用いる方法、あるいはPCR（RT-PCR、競合PCR、リアルタイムPCR、マルチプレックスＰＣＲ等）を用いる方法などが挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よくウイルス遺伝子またはその転写産物を検出できる点で競合PCRやリアルタイムPCRなどの定量的PCR法が、また、複数のマーカー遺伝子の発現変動を一括検出することができ、検出方法の選択によって定量性も向上させ得るなどの点でDNAチップ解析が好ましいが、迅速性・定量性・複数遺伝子を同時に検出可能であるという点で、マルチプレックスＰＣＲが特に好ましい。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。
【００３５】
ＤＮＡチップ解析による場合、例えば、上記のようにして調製したＲＮＡ画分から、逆転写反応によりＴ７プロモーター等の適当なプロモーターを導入したｃＤＮＡを合成し、さらにＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを合成する（この時ビオチンなどで標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたｃＲＮＡが得られる）。この標識ｃＲＮＡを、プローブを固相化したチップと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、ウイルス遺伝子を検出することができる。
【００３６】
別の好ましい実施態様によれば、ウイルス遺伝子またはその転写産物を検出する方法として定量的ＰＣＲ法が用いられる。定量的ＰＣＲとしては、例えば、競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどがある。本発明の検出方法においては、特に同時に多種類ウイルスを検出可能であることから、マルチプレックスＰＣＲが好適に用いられる。
【００３７】
マルチプレックスＰＣＲとは、一または複数の標的核酸の複数の標的配列を一の反応容器内で同時に増幅する方法である。各標的配列を増幅し得るプライマーセットを一反応容器に入れて単一のＰＣＲ操作により、標的配列を増幅させる。通常、ＰＣＲ反応は一の標的配列を増幅することを目的として一回のＰＣＲ操作につき、一種類プライマーセットを用いるが、マルチプレックスＰＣＲでは複数の標的配列を増幅し得るプライマーセットを利用することにより、単一ＰＣＲに比べて標的ＤＮＡの増幅に要する時間、労働力及び試薬コストを大きく低減させることが可能となる。また、微量試料をも対象とすることができる。また、マルチプレックスＰＣＲでは、２回以上のＰＣＲを反復して行ってもよい。その際、２回目以降のＰＣＲはnested PCRまたはhemi-nested PCRであることが好ましい。Nested ＰＣＲは、直前のＰＣＲで用いたプライマーセットより内側に設計したプライマーセットを用いて、２段階のＰＣＲを行う方法であり、目的とする領域からの直前のＰＣＲ産物を鋳型にして、直前に使用したプライマー位置より、５’および３’側ともに内側に新たにプライマーを設計して行う方法をnested PCR、５’または３’側のいずれかのみの内側に新たにプライマーを設計して行う方法をhemi-nested PCRという。ＰＣＲは、二つのプライマーセットの標的配列に対する特異性に基づいて特定の断片を増幅する手法であるが、プライマーの類似配列によってミススプライシングがときどき起こり、標的配列の増幅とともに非特異的な増幅が生じうる。この非特異的断片を含むＰＣＲ生成物を鋳型にしてnested PCRまたはhemi-nested PCRを行うことにより、非特異的な断片のなかにnested PCRプライマーに類似した配列が存在する確率が極めて低くなるため、特異的配列のみを増幅することができる。
【００３８】
ＰＣＲにおいてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、例えば、検出対象のウイルス遺伝子またはその転写産物を特異的に検出し得る核酸プライマーを挙げることができる。１つの好ましい態様においては、本発明の検出方法に用いられる核酸プライマーとしては、例えば、本発明の上記したプライマーセットが挙げられる。
【００３９】
被験対象の呼吸器感染症の確定診断が必要な状況下においては、多くの場合、該対象は一般的な対症療法または抗ウイルス剤・抗生物質の投与履歴を有している。かかる場合、被験対象のウイルス等が検出に耐え得る程度に保存されていないために、ウイルス・バクテリアの培養・染色、一のウイルス等のみを増幅対象としたＰＣＲでは、複数感染していた場合に、いずれのウイルス等が疾病の主要原因であるか判定が困難な場合がある。また、マルチプレックスＰＣＲによって、複数の病原体を増幅対象として、同時に検出を試みた場合であっても、プライマーセット同士の相互作用、ウイルスゲノムの変異による特異性の欠如等の要因により、検出されない場合もある。そこで、上記の不都合が生じないようにプライマーセットを設計し、適当な組み合わせを採用することが要される。具体的には、本発明のマルチプレックスＰＣＲに適用されるプライマーセットとしては、(i)〜(iv)のプライマーセット、(v)〜(viii)のプライマーセット、(ix)〜(xi)のプライマーセット、または(xii)および(xiii)のプライマーセットからなる組み合わせが好ましく用いられる。
【００４０】
本発明はまた、上記本発明の検出方法において好ましく使用され得る、ウイルス遺伝子またはその転写産物の検出用キットを提供する。該キットは、
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉ）配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号５又は配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット；
（ｉｉｉ）配列番号７又は配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーとからなる構成されるプライマーセット；
（ｉｖ）配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１１又は配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖ）配列番号１３又は配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉ）配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号１７又は配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉ）配列番号１９に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２０又は配列番号２１に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２３又は配列番号２４に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｉｘ）配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２６又は配列番号２７に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘ）配列番号２８に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２９又は配列番号３０に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉ）配列番号３１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３２又は配列番号３３に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；
（ｘｉｉ）配列番号３４に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３５又は配列番号３６に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット；および
（ｘｉｉｉ）配列番号３７に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号３８又は配列番号３９に示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセットを含有する各試薬のうち、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群（それぞれＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、ライノウイルスおよびアデノウイルスを検出する為のプライマーセットを含有する試薬）から少なくとも２つ選択されるプライマーセットを含有する試薬（又は、上記（ｉ）〜（ｖｉｉ）、（ｉｘ）および（ｘｉｉ）からなる群から少なくとも１つ選択され、かつ上記（ｖｉｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉ）および（ｘｉｉｉ）からなる群（それぞれパラインフルエンザウイルス４型、コロナウイルス229E、コロナウイルスOC43およびボカウイルスを検出する為のプライマーセットを含有する試薬）から少なくとも１つ選択されるプライマーセットを含有する試薬）を含有するものであるが、多種類のプライマーの非特異性を減じ、ウイルスの検出感度を向上させるため、特定のプライマーセットを含有する試薬を組み合わせることが好ましい場合もある。そのような組み合わせとしては、上記(i)〜(ix)の各プライマーセットを含有する試薬（即ち、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、およびヒトメタ肺炎ウイルスを検出する為のプライマーセットを含有する試薬の組み合わせ）の少なくとも２つを含むもの（好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは４つ全てを含むもの）、上記(v)〜(vii)の各プライマーセットを含有する試薬（即ち、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、およびパラインフルエンザウイルス３型を検出する為のプライマーセットを含有する試薬の組み合わせ）の少なくとも２つを含むもの（好ましくは３つ全てを含むもの）（または、上記(v)〜(vii)の各プライマーセットを含有する試薬の少なくとも１つを含み、かつ上記(viii)のプライマーセットを含有する試薬（即ち、パラインフルエンザウイルス４型を検出する為のプライマーセットを含有する試薬）を含むもの）、上記(iｘ)のプライマーセットを含有する試薬（即ち、ライノウイルスを検出する為のプライマーセットを含有する試薬）（または、上記(iｘ)のプライマーセットを含有する試薬、かつ上記（ｘ）または（ｘｉ）のプライマーセットを含有する試薬（即ち、コロナウイルス229EまたはコロナウイルスOC43を検出する為のプライマーセットを含有する試薬）の少なくとも１つを含むもの）、または上記(ｘｉｉ)および（ｘｉｉｉ）のプライマーセットを含有する試薬（即ち、アデノウイルス、ボカウイルスを検出する為のプライマーセットを含有する試薬）含むものである。
【００４１】
上記プライマーは、配列番号１〜３９に示される各塩基配列情報に基づいて、該塩基配列を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによって得ることができる。
【００４２】
本発明のキットによって検出されうるウイルスは、上記に記載した検出方法で検出されるウイルスと同様である。
【００４３】
ウイルス遺伝子またはその転写産物を検出し得る核酸は、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。
【００４４】
キットを構成する各試薬中に含有される核酸は、同一の方法（例：サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロット、DNAアレイ技術、定量RT-PCR、マルチプレックスＰＣＲ等）によりウイルス遺伝子またはその転写産物を検出し得るように構築されていることが特に好ましい。
本発明のキットの構成として、上記の試薬がそれぞれ別個に提供されるもの［例：核酸が標識プローブ（特にドットブロット解析の場合）やPCR（特にリアルタイム定量PCR）用プライマーとして機能する場合等］、異なるウイルス遺伝子またはその転写産物を検出し得る核酸が同一の試薬中に含有されて提供されるもの［例：核酸がPCR（特に、マルチプレックスＰＣＲ）や標識プローブ（特に、ノーザンブロット解析で転写産物のサイズにより各マーカー遺伝子を区別し得る場合）として機能する場合等］、あるいは、異なるウイルス遺伝子またはその転写産物を検出し得る核酸が、同一の固相の別個の領域にそれぞれ固定化されて提供されるもの［例：標識cRNA等とのハイブリダイゼーション用プローブとして機能する場合等］などが例示されるが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明のキットを構成する試薬は、ウイルス遺伝子またはその転写産物を検出し得る核酸に加えて、該遺伝子の発現を検出するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、ウイルス遺伝子またはその転写産物を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。例えば、ウイルス遺伝子またはその転写産物を検出するための反応がPCRの場合、当該他の物質としては、例えば、反応緩衝液、dNTPs、耐熱性DNAポリメラーゼ等が挙げられる。競合PCRやリアルタイムPCRを用いる場合は、competitor核酸や蛍光試薬（上記インターカレーターや蛍光プローブ等）などをさらに含むことができる。
【００４６】
以下の実施例おいて、本発明を詳細に述べるが、本発明はそれらになんら限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
（１）試料調製
試料として鼻咽頭スワブ試料および咽頭スワブ試料を選択した。しかし、鼻咽頭洗浄試料、気管支肺胞洗浄試料、胸膜液試料および耳スワブ試料のような他の試料も用いることができる。さらに、脳脊髄液試料、血清または血漿試料並びに血液試料もまたウイルス血症が疑われる場合に用いることができる。
（a）鼻咽頭スワブ試料について
１．５ｍＬチューブに滅菌済みの生理食塩水８００μＬを準備した。鼻咽頭後壁に達するまで鼻腔底に沿って、鼻腔内にスワブを挿入した。途中障害物に接触した場合は、もう一方の鼻腔に挿入した。スワブをゆっくりと回転させ、１０秒間静置した後、スワブを取り出し、直ぐに８００μＬの滅菌済み生理食塩水入りのチューブ内にスワブを置いた。滅菌済みの鋏でスワブのシャフト部を切断し、チューブを密閉し、シャフト部をバイオハザードバッグに廃棄した。試料をラベルし、断熱包装に包んで冷凍パックで三時間以内に研究室に輸送した。
（b）咽頭スワブ試料について
１．５ｍＬチューブに滅菌済みの生理食塩水８００μＬを準備した。舌の後部までデプレッサーを挿入し、舌を押さえて空間を確保した。被験対象に発声させ、舌を避けて中咽頭および扁桃腺の後部を拭った。スワブを取りだし、直ぐに８００μＬの滅菌済み生理食塩水入りのチューブ内にスワブを置いた。滅菌済みの鋏でスワブのシャフト部を切断し、チューブを密閉し、シャフト部をバイオハザードバッグに廃棄した。試料をラベルし、断熱包装に包んで冷凍パックで三時間以内に研究室に輸送した。
（c）研究室での試料調製
スワブ入りのチューブを１０秒間ボルテックスした後、３０秒間６０００ｒｐｍでスピンダウンした。滅菌済み鉗子を用いて、スワブをチューブ壁に押し付けながら、試料を溶出させてスワブを除去した。ウイルス移行培地１ｍＬ入りのチューブに試料を１２５μＬ移した。キャップを密閉し、−８０℃で試料を保存した。試料の一部はすぐにＲＮＡまたはＤＮＡ抽出に用いることもできる。
（d）核酸抽出
ウイルス移行培地中の上記試料１４０μＬから、ＱＩＡ  ｖｉｒａｌ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を用いて添付のガイドラインに従い、ウイルス核酸を抽出した。最終溶出工程は、溶出バッファー８０μＬで行った。
【００４８】
（２）ＰＣＲ解析方法
（a）１回目マルチプレックスＰＣＲ
上記で抽出されたウイルス核酸のうち、ウイルスＲＮＡについては逆転写反応（以下、ＲＴ反応）および１回目のマルチプレックスＰＣＲは、ウイルスＲＮＡを鋳型として、ＱＩＡ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を用いて行う。反応操作は、ＱＩＡ  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔに添付のガイドラインに従う。また、ウイルスＤＮＡについては、Ｇｏｌｄ  Ｔａｑ  Ｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて、１回目のマルチプレックスＰＣＲを行う。マルチプレックスＰＣＲによる同時検出対象としたウイルスグループは、（グループ１）Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルスおよびヒトメタ肺炎ウイルス、（グループ２）パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型およびパラインフルエンザウイルス４型、（グループ３）ライノウイルス、コロナウイルス229EおよびコロナウイルスOC43、（グループ４）アデノウイルスおよびボカウイルスの４グループである。各グループについての１回目のマルチプレックスＰＣＲに用いたプライマー群を表１〜表４にそれぞれ示す。
【００４９】
【表１】
2011103861.tif 000002
【００５０】
【表２】
2011103861.tif 000003
【００５１】
【表３】
2011103861.tif 000004
【００５２】
【表４】
2011103861.tif 000005
【００５３】
各グループの一回目マルチプレックスＰＣＲ（グループ１〜３についてはＲＴ反応含む）について、反応液の組成を以下に示す。
【００５４】
［グループ１］
RNaseフリー水                                    ７μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
５×Ｑ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ                         ５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                               １μＬ
配列番号１のプライマー(100pmol/μL)      ０．１２５μＬ
配列番号２のプライマー(100pmol/μL)      ０．１２５μＬ
配列番号４のプライマー(100pmol/μL)      ０．１２５μＬ
配列番号５のプライマー(100pmol/μL)      ０．１２５μＬ
配列番号７のプライマー(100pmol/μL)      ０．１２５μＬ
配列番号８のプライマー(100pmol/μL)      ０．１２５μＬ
配列番号１０のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号１１のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ                             １μＬ
鋳型ＲＮＡ                                       ５μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００５５】
［グループ２］
RNaseフリー水                                    ７μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
５×Ｑ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ                         ５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                               １μＬ
配列番号１３のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号１４のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号１６のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号１７のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号１９のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号２０のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号２２のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号２３のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ                             １μＬ
鋳型ＲＮＡ                                       ５μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００５６】
［グループ３］
RNaseフリー水                              ７．２５μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
５×Ｑ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎ                         ５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                               １μＬ
配列番号２５のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号２６のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号２８のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号２９のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号３１のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号３２のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ                             １μＬ
鋳型ＲＮＡ                                       ５μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００５７】
［グループ４］
蒸留水                                     １１．５μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                         ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                           ０．５μＬ
配列番号３４のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号３５のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号３７のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
配列番号３８のプライマー(100pmol/μL)    ０．１２５μＬ
Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                 ０．１μＬ
鋳型ＤＮＡ                                       ５μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００５８】
各グループのマルチプレックスＰＣＲの反応温度、伸長時間、反応サイクル数等は以下の通りに設定する。また、反応にはＡＢＩ９７００サーマルサイクラーを用いる。
［グループ１］
５０℃（３０分）、９５℃（１５分）、［９４℃（３０秒）、５７℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×４０サイクル、７２℃（５分）、４℃
［グループ２］
５０℃（３０分）、９５℃（１５分）、［９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×４０サイクル、７２℃（５分）、４℃
［グループ３］
５０℃（３０分）、９５℃（１５分）、［９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×４０サイクル、７２℃（５分）、４℃
［グループ４］
９４℃（５分）、［９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×４０サイクル、７２℃（５分）、４℃
【００５９】
上記の１回目マルチプレックスＰＣＲ産物の各グループ９μＬと１０×ローディングバッファー１μＬの混合物を２％アガロースゲル上で電気泳動する。電気泳動条件は電圧１００Ｖで３５〜４０分で行う。電気泳動後のアガロースゲルにＵＶ（３０２ｎｍ）を照射し、増幅産物を可視化する。
【００６０】
（b）２回目マルチプレックスＰＣＲ(hemi-nested PCR)
上記した１回目マルチプレックスＰＣＲで増幅された核酸を鋳型として、Ｇｏｌｄ  Ｔａｑ  Ｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて２回目マルチプレックスＰＣＲ(hemi-nested PCR)を行う。反応操作は、Ｇｏｌｄ  Ｔａｑ  Ｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付のガイドラインに従う。hemi-nested PCRでは、１回目マルチプレックスＰＣＲで検出対象としたウイルスグループを同時検出対象とする。各グループについてのhemi-nested PCRに用いたプライマー群を表１〜表４にそれぞれ示す。
【００６１】
各グループのhemi-nested PCRについて、反応液の組成を以下に示す。
【００６２】
［グループ１］
蒸留水                                     １５．１μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                         ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                           ０．５μＬ
配列番号１のプライマー(100pmol/μL)          ０．１μＬ
配列番号３のプライマー(100pmol/μL)          ０．１μＬ
配列番号４のプライマー(100pmol/μL)          ０．１μＬ
配列番号６のプライマー(100pmol/μL)          ０．１μＬ
配列番号８のプライマー(100pmol/μL)          ０．１μＬ
配列番号９のプライマー(100pmol/μL)          ０．１μＬ
配列番号１０のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号１２のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                 ０．１μＬ
１回目マルチプレックスＰＣＲ増幅産物             １μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００６３】
［グループ２］
蒸留水                                     １５．１μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                         ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                           ０．５μＬ
配列番号１４のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号１５のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号１６のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号１８のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号１９のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号２１のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号２２のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号２４のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                 ０．１μＬ
１回目マルチプレックスＰＣＲ増幅産物             １μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００６４】
［グループ３］
蒸留水                                     １５．３μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                         ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                           ０．５μＬ
配列番号２５のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号２７のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号２８のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号３０のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号３２のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号３３のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                 ０．１μＬ
１回目マルチプレックスＰＣＲ増幅産物             １μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００６５】
［グループ４］
蒸留水                                     １５．５μＬ
５×バッファー                                   ５μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２                         ２．５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ                           ０．５μＬ
配列番号３４のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号３６のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号３７のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
配列番号３９のプライマー(100pmol/μL)        ０．１μＬ
Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ                 ０．１μＬ
１回目マルチプレックスＰＣＲ増幅産物             １μＬ
全量                                           ２５μＬ
【００６６】
各グループのhemi-nested PCRの反応温度、伸長時間、反応サイクル数等は以下の通りに設定する。また、反応にはＡＢＩ９７００サーマルサイクラーを用いる。
［グループ１］
９４℃（５分）、［９４℃（３０秒）、５７℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×３５サイクル、７２℃（５分）、４℃
［グループ２］
９４℃（５分）、［９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×３５サイクル、７２℃（５分）、４℃
［グループ３］
９４℃（５分）、［９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×３５サイクル、７２℃（５分）、４℃
［グループ４］
９４℃（５分）、［９４℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（４５秒）］×３５サイクル、７２℃（５分）、４℃
【００６７】
上記のhemi-nested PCR産物の各グループ９μＬと１０×ローディングバッファー１μＬの混合物を２％アガロースゲル上で電気泳動する。電気泳動条件は電圧１００Ｖで３５〜４０分で行う。電気泳動後のアガロースゲルにＵＶ（３０２ｎｍ）を照射し、増幅産物を可視化する。
【００６８】
上記試料から調製したウイルス核酸を鋳型として、グループ１に属するウイルス群、即ちＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルスおよびヒトメタ肺炎ウイルスの同時検出を目的とした、１回目マルチプレックスＰＣＲを行った。各ＰＣＲの反応液組成、ＰＣＲ反応温度、伸長時間、反応サイクル数などはグループ１に該当する上記の条件に従った。増幅産物の電気泳動結果を図１に示す。各レーンのうち、レーン１、２、６、７には増幅産物が確認でき、その断片サイズから、レーン１の試料に含まれたウイルスは、ヒトメタ肺炎ウイルス、レーン２の試料に含まれたウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス、レーン６の試料に含まれたウイルスは、ヒトメタ肺炎ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス、レーン７の試料に含まれたウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスおよびＢ型インフルエンザウイルスであることが確認できた。また、それ以外のレーンには増幅産物が見当たらないことから、検出対象となったウイルスは含まれていないことが分かった。
【００６９】
また、上記試料から調製した複数の標的遺伝子が混在したウイルス核酸ではなく、別途調製した単一のウイルス核酸（Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、ライノウイルス、アデノウイルスおよびボカウイルス）をそれぞれ鋳型として、各ウイルスを対象としたプライマー（例えば、Ａ型インフルエンザウイルスを対象とする場合、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットのみ）を用いて、１回目ＰＣＲおよび２回目ＰＣＲを行った。増幅結果の電気泳動像を図２および図３に示す。各プライマーは増幅対象遺伝子を特異的に増幅できており、各標的遺伝子は増幅されるサイズが異なるため、増幅産物が混在しているマルチプレックスＰＣＲであっても、電気泳動像からウイルスを同定することができることが分かった。
【００７０】
また、本発明のマルチプレックスＰＣＲの増幅感度についても検討を行った。ヒトメタ肺炎ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスについて、鋳型核酸の混合比を変えて１回目ＰＣＲを行った。結果を図４に示す。レーン２およびレーン４は鋳型核酸としてのヒトメタ肺炎ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスのモル比が１００：１０および１０：１００であるが、両ウイルスを検出することができた。従って、最も少ない鋳型核酸であっても、そのモル数が全体の１０％までならば、検出可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、本発明のプライマーセットを複数組み合わせて用いることにより、迅速・簡便に複数のウイルスを同時に検出することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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