(57)【要約】【課題】  本発明は、非特異的な吸着・結合を抑制し、かつ生理活性物質を簡便に表面に固定化する為の固定化用基材、およびその使用方法【解決手段】  基材と、樹脂層と、ビオチン結合性タンパク質とがこの順に配置されてなる生理活性物質捕捉用基材であって、前記樹脂層の基材と反対側の面が、親水性を有していることを特徴とする生理活性物質捕捉用基材。生理活性物質固定化用固相担体を用いることで、ビオチン修飾生理活性物質を基材に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、樹脂層と、ビオチン結合性タンパク質とがこの順に配置されてなる生理活性物質捕捉用基材であって、
前記樹脂層の基材と反対側の面が、親水性を有していることを特徴とする生理活性物質捕捉用基材。
【請求項２】
樹脂層を構成する物質が、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和モノマー（ａ）、ビオチン結合性タンパク質を固定するための官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、および架橋可能な官能基（ｃ）を共重合して得られる高分子物質であることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質捕捉用基材。
【請求項３】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式で表されるモノマーであることを特徴とする請求項１、２記載の生理活性物質捕捉用基材。
〔式１〕
2011083256.tif 000008
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を閉めす。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
【請求項４】
ビオチン結合性タンパク質を固定化するための官能基が、ｐ−ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの活性エステルであることを特徴とする請求項１−３記載の生理活性物質捕捉用基材。
【請求項５】
架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの官能基がアルコキシリルであることを特徴とする請求項１−４記載の生理活性物質捕捉用基材
【請求項６】
ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンからなる少なくとも一種類であることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質捕捉用基材。
【請求項７】
捕捉する生理活性物質が、ビオチンまたはビオチン誘導体で修飾されたオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、であることを特徴とする請求項１記載の生理活性物質捕捉用基材。
【請求項８】
細くしたオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡハイブリダイゼーション反応、ＲＮＡハイブリダイゼーション反応、ＤＮＡ伸長反応、ＤＮＡ増幅反応をその場で行うことを特徴とした請求項１−７記載の生理活性物質捕捉用基材。
【請求項９】
生理活性物質を捕捉するための基材がチューブ、プレートまたはビーズからなることを特徴とする請求項１−８記載の生理活性物質。
【請求項１０】
前記基材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリカーボネートからなる少なくとも１種である請求項１−８記載の生理活性物質。
【請求項１１】
請求項１記載の生理活性物質捕捉用基材であって、
（ａ）基材表面に活性エステルを含む高分子化合物で樹脂層を形成させる工程
（ｂ）ビオチン結合性タンパク質を活性エステルと反応させて固定する工程
（ｃ）ビオチン修飾核酸をアビジン・ビオチン反応で固相化する工程
からなる、生理活性物質捕捉方法。
【請求項１２】
請求項１記載の生理活性物質捕捉用基材であって、
（ａ）基材表面に活性エステルを含む高分子化合物で樹脂層を形成させる工程
（ｂ）ビオチン結合性タンパク質を活性エステルと反応させて固定する工程
（ｃ）ビオチン修飾核酸をアビジン・ビオチン反応で固相化する工程
（ｄ）基材に固定した状態で、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応、ＲＮＡハイブリダイゼーション反応、ＤＮＡ伸長反応、ＤＮＡ増幅反応を行う工程
からなる、生理活性物質捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非特異的な吸着・結合を抑制し、かつ生理活性物質を簡便に表面に固定化する為の固定化用基材、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビオチンはビオチン結合性タンパク質と特異的に結合反応を生じることは古くから知られており、その結合力は抗原−抗体反応の１００万倍以上と強く、ほとんど非可逆反応に近い結合性を示す。この特性を活かし、ビオチン−ビオチン結合タンパク質反応は、生化学分野における検出反応によく用いられる。ビオチン結合タンパク質で最も古くから利用されている物質はアビジンであり、アビジンは生卵白由来のタンパク質である。また、微生物であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉからストレプトアビジンが精製されるようになってからは、入手もしやすくなり、汎用されるようになった。また、アビジンを脱グリコシル化することでレクチン等、糖鎖との相互作用により発生する非特異吸着を抑えたニュートラアビジンが開発され、元来のアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンと、ビオチン結合タンパク質群として機能タンパク質のグループを形成している。
【０００３】
一方、ビオチンは分子量２４４の分子で分子末端にカルボシキル基を有することからヒドロキシスクシンイミドなどで活性エステル化することで簡便にアミノ残基を有する物質と結合でき、ビオチン標識することが可能となり、これらのことによりアビジン−ビオチン結合を用いた分子認識反応が広く用いられるようになった。
【０００４】
前記のようにビオチン−ビオチン結合タンパク質群の反応をより簡便に用いるために、種々のシステムが開発されている。たとえば、特開平０２−０２４５５９号公報においては、アビジンを固相化した免疫分析用プレートが記載されている。
【０００５】
前記特許文献１においては、アビジンもしくはストレプトアビジンが分子量５００，０００を超える可溶性タンパク質に結合させ、更に前記タンパク質を疎水性の固相に吸着させる技術が記載されている。アビジンもしくはストレプトアビジンを直接固相化するのではなく高分子量の可溶性タンパク質アビジン、ストレプトアビジンを固定化した後、可溶性タンパク質をもって基材に固相化させる方法であり、前記特許文献１）に記載されるように、イムノアッセイによるパラメーターの測定への使用を意図している。通常イムノアッセイは常温、水溶系で実施されるため可溶性タンパク質の使用は問題ないが、８０度Ｃを超える高温での使用においては、アビジン類が耐性を持つのに比べバインダーとなる可溶性タンパク質に耐熱性が乏しくアビジン類の機能を阻害することとなる。また、保存時の安定性においてタンパク質の利用は極めて不利であり、前記特許では対応しきれない系が存在する。
【０００６】
また、特開２００７−２６３６３４号公報においては、「プラスチックからなる固相担体の固相表面に、ホスホリルコリン基を有する高分子物質及び生理活性物質を固定化する為の分子を有し、該分子がビオチン又はビオチン誘導体と反応しうる分子であることを特徴とする生理活性物質固定化用固相担体」が記載されている。非特異吸着をホスホリルコリン基の持つ親水性により非特異吸着を抑制することが可能でブロッキング処理の手順を省くことができるだけでなく、安定したシグナル／ノイズ比率（Ｓ／Ｎ比）を低減する工夫がなされている。
【０００７】
特許文献２においては、ビオチン又はビオチン誘導体と反応しうる分子であるアビジン等の固定化が示されている。その際に、Ｓ／Ｎ比を改善するために、ホスホリルコリン基の持つ親水性により非特異吸着を抑制する方法が示されている。アビジン等の固定化に化学合成物を用いていることから保存安定性においては有利な発明である。しかしながら、本発明者らの検討により、前述の基材は耐熱性に乏しい傾向があり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏ：ＰＣＲ）における１００度Ｃでの使用等には適さない。また、好ましい形態として記載されている形態は、基材上にビオチンを固定化し、ホスホリルコリン基を有する高分子物質を塗布、更にアビジン類を固定しており、効果は高いものの作製に手間を要する。
【０００８】
また、特許３１５２６５６号広報には、プライマー分子をビオチン修飾し、アビジン−ビオチン反応により磁性粒子表面に結合させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特公平２−０２４５５９号公報
【特許文献２】特開２００７−２６３６３４号公報
【特許文献３】特許３１５２６５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ビオチン結合性タンパク質を表面に安定して保持し、ビオチン化合物と容易に結合反応でき、かつ、目的物以外の物理化学吸着を抑え効率よくビオチン化合物を回収する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このような目的は、下記（１）〜（１５）に記載の本発明により達成される。
（１）基材と、樹脂層と、ビオチン結合性タンパク質とがこの順に配置されてなる生理活性物質捕捉用基材であって、  前記樹脂層の基材と反対側の面が、親水性を有していることを特徴とする生理活性物質捕捉用基材。
（２）樹脂層を構成する物質が、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和モノマー（ａ）、ビオチン結合性タンパク質を固定するための官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）、および架橋可能な官能基（ｃ）を共重合して得られる高分子物質であることを特徴とする（１）の生理活性物質捕捉用基材。
（３）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式で表されるモノマーであることを特徴とする（１）、（２）記載の生理活性物質捕捉用基材。
〔式１〕
2011083256.tif 000002
（式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を閉めす。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）
（４）ビオチン結合性タンパク質を固定化するための官能基が、ｐ−ニトロフェニルエステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの活性エステルであることを特徴とする（１）−（３）記載の生理活性物質捕捉用基材。
（５）架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの官能基がアルコキシリルであることを特徴とする（１）−（４）記載の生理活性物質捕捉用基材
（６）ビオチン結合性タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンからなる少なくとも一種類であることを特徴とする（１）記載の生理活性物質捕捉用基材。
（７）捕捉する生理活性物質が、ビオチンまたはビオチン誘導体で修飾されたオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、であることを特徴とする（１）記載の生理活性物質捕捉用基材。
（８）細くしたオリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡハイブリダイゼーション反応、ＲＮＡハイブリダイゼーション反応、ＤＮＡ伸長反応、ＤＮＡ増幅反応をその場で行うことを特徴とした（１）−（７）記載の生理活性物質捕捉用基材。
（９）生理活性物質を捕捉するための基材がチューブ、プレートまたはビーズからなることを特徴とする（１）−（８）記載の生理活性物質。
（１０）前記基材がポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリカーボネートからなる少なくとも１種である（１）−（８）記載の生理活性物質。
（１１）（１）記載の生理活性物質捕捉用基材であって、
（ａ）基材表面に活性エステルを含む高分子化合物で樹脂層を形成させる工程
（ｂ）ビオチン結合性タンパク質を活性エステルと反応させて固定する工程
（ｃ）ビオチン修飾核酸をアビジン・ビオチン反応で固相化する工程
からなる、生理活性物質捕捉方法。
（１２）（１）記載の生理活性物質捕捉用基材であって、
（ａ）基材表面に活性エステルを含む高分子化合物で樹脂層を形成させる工程
（ｂ）ビオチン結合性タンパク質を活性エステルと反応させて固定する工程
（ｃ）ビオチン修飾核酸をアビジン・ビオチン反応で固相化する工程
（ｄ）基材に固定した状態で、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応、ＲＮＡハイブリダイゼーション反応、ＤＮＡ伸長反応、ＤＮＡ増幅反応を行う工程
からなる、生理活性物質捕捉方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ビオチン結合生理活性物質を効率よく簡単に固相担体に結合する事が可能となり、また、該生理活性物質と反応する別の物質の非特異吸着を効果的に抑制する事から、簡便かつハイスループットなＰＣＲ容器やバイオチップの作製と評価が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の生理活性物質固定化用基材について説明する。
【００１４】
本発明に使用する生理活性物質を固定化する為の分子としては、生理活性物質に結合したビオチン又はビオチン誘導体と特異的に反応する分子が好ましく、特にアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンが好ましい。前述のようにビオチンとアビジンとの相互作用は非常に強く、特異性も高い。また、低分子であるビオチンを生理活性物質へ導入する事も容易な為、物質固定化の為の強力なツールとなる。
【００１５】
本発明に使用する高分子物質はアルキレングリコール残基、ビオチン結合性タンパク質を固定化するための官能基、かつ架橋可能な官能基を有する高分子物質が好適である。
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、下記の一般式で表されるモノマーを用いた共重合体であることが好ましい。
式１
2011083256.tif 000003
【００１６】
式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｐは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＸは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。
【００１７】
また、ビオチン結合性タンパク質を固定化するための官能基は、反応性のしやすさを考慮すると、ｐ-ニトロフェニルエステル又はＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステルの活性エステルであることが好ましい。
【００１８】
架橋可能な官能基としては架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの官能基としてアルコキシリル基が好ましい。
【００１９】
本発明の生理活性物質固定化用固相基材の製造工程の一例を下記に示す。
（ａ）プラスチック固相基材を準備する。
プラスチック固相基材表面は、プラズマ処理等によりカルボキシル基、水酸基、アミノ基等の官能基が表面に導入されていることが好ましい。
（ｂ）親水基及び官能基を有する高分子物質を塗布する。
（ｃ）生理活性物質を固定化するための分子を導入する。
前記分子は、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンであることが好ましい。
【００２０】
（固相化基材）
本発明の基材には、プラスチック、ガラス、金属などを用いることが可能であるが、形状加工性や価格などを考慮するとプラスチックを用いることが好適である。用いるプラスチックとしては、熱可塑性、熱硬化性樹脂を用いることができるが、熱可塑性樹脂の方が製造効率の観点から好ましい。熱可塑性樹脂としては、例えばポリエチレンやポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。耐熱性、耐薬品性、成形性に特に優れるポリエチレン、ポリプロピレン、環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。
【００２１】
（基材の形状）
固相担体の形状としては、チューブ、マイクロウェルプレート、マイクロビーズ、平板状基板、微細流路形状を有した基板等が挙げられる。
【００２２】
（生理活性物質の固定化）
本発明において生理活性物質を固相上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。生理活性物質を溶解又は分散した液体のｐＨは６．０〜８．０であることが好ましく、ｐＨ６．５〜７．５がより好ましい。この範囲外だと、生理活性物質や生理活性物質を固定化する分子が変性・分解する恐れがある。
生理活性物質付着後は、固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、生理活性物質と反応しうる別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。しかし、生理活性物質と反応しうる別の物質に固相表面の分子と反応しうるビオチン又はビオチン誘導体が含まれる場合、生理活性物質を固定化した以外の固相表面に残存する分子の不活性化処理を、ビオチン又はビオチン誘導体を有する他の化合物で行うことが好ましい。
【００２３】
（固定化する生理活性物質の構造）
固定化する生理活性物質にビオチン又はビオチン誘導体を、一般的な方法で導入する事で、基材表面に固定化されたビオチン結合タンパク質によって、効果的に目的の生理活性物質を固定化する事が可能となる。より反応性を高める為に、ビオチン又はビオチン誘導体の導入位置は生理活性物質の末端や外側であることが望ましい。生理活性物質の合成法が進歩してきた事で、任意の位置にビオチン又はビオチン誘導体を導入できるようになってきており、生理活性を発現する為に重要な部位に影響を及ぼさないような位置で生理活性物質を担体表面に固定化することが可能である。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
＜実施例１＞
（高分子化合物の合成例１）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量＝約４７５  Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン（ＭＰＤＥＳ  ＧＥＬＥＳＴ、INC.製）をそれぞれ順に０．９０ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、になるように脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００２ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、和光純薬製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で１．５時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、０．１５ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチル基に帰属されるピーク、３．３５ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
表１  ビオチンｄＴ２０ｍｅｒプライマー配列
2011083256.tif 000004
（アビジンチューブの作製）
ＰＣＲ用チューブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｓｔｒｉｐ  Ｔｕｂｅｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内を合成例１で合成したポリマーでコートした。５μｇ／ｍＬに調整したＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社製、品番３１０００）ＰＢＳ溶液を分注し２時間静置し、その後超純水で洗浄し、遠心乾燥により乾燥することで、本発明の実施形態であるアビジンチューブを作製した。
（比較例１）
ＰＣＲ用チューブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｓｔｒｉｐ  Ｔｕｂｅｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に５μｇ／ｍＬに調整したＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎＰＢＳ溶液を分注し２時間静置し、その後超純水で洗浄し、遠心乾燥により乾燥することで、アビジンチューブを作製した。
（比較例２）
ＰＣＲ用チューブ（ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｓｔｒｉｐ  Ｔｕｂｅｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）に特許文献（２）に記載のポリマーをコートした。５μｇ／ｍＬに調整したＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎＰＢＳ溶液を分注し２時間静置し、その後超純水で洗浄し、遠心乾燥により乾燥することで、アビジンチューブを作製した。
【００２６】
加熱処理
実施例１及び比較例１−２で作製したチューブに超純水を分注し９５℃で３０分静置した。超純水を廃棄して冷却した。
【００２７】
それぞれの加熱処理したチューブと未処理チューブに
ビオチン標識ＨＲＰ（ＺＹＭＥＤ社製、品番４３−２０４０）を８ｎｇ／ｍＬになるように調整し、１００μＬ分注し、室温で1時間静置した。
その後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ水溶液３００μＬで３回洗浄した。
住友ベークライト社製ＳＵＭＩＬＯＮペルオキシダーゼ発色キット（ＭＬ−１１２０Ｔ）を用いて発色した。
マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製Ｉｎｆｉｎｉｔ２００）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２８】
表２  吸光度測定結果
2011083256.tif 000005
【００２９】
ＲＴ−ＰＣＲでの評価
（ＨｅＬａ細胞のトータルＲＮＡからｃＤＮＡの作製）
培養したＨｅＬａ細胞より抽出したトータルＲＮＡ１μｇを含むＤＥＰＣ処理水溶液１００μＬとビオチンｄＴ２０ｍｅｒのプライマー（表１）を混合させて３７℃で５分間ハイブリダイゼーションを行った。
ストレプトアビジン処理チューブに５０μＬ分注して３７℃で３分間静置した。
１Ｍトリス塩酸ｐＨ７．５、５Ｍ塩化リチウム、０．５ＭＥＤＴＡ水溶液を用いて３回洗浄した。
反応液として、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｍ−ＭＬＶ（ＲＮＡｓｅ  Ｈ−）（タカラバイオ社製、品番２６４０Ａ）、５×Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｍ−ＭＬＶ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｕｐｅｒ）、２０ｍＭ  ｄＴＴＰ、２０ｍＭ  ｄＡＴＰ、２０ｍＭ  ｄＧＴＰ、２０ｍＭ  ｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ）を加えて調製しものを、上記の反応済みチューブに加えた。４２℃で１時間インキュベートすることにより、相補鎖ｃＤＮＡを合成した。
１Ｍトリス塩酸ｐＨ７．５、５Ｍ塩化リチウム、０．５ＭＥＤＴＡ水溶液を用いて３回洗浄した。
【００３０】
反応液として、ＥｘＴａｑ  ＨＳ、１０ＸＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、１００μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマー、１００μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー、２０ｍＭ  ｄＴＴＰ、２０ｍＭ  ｄＡＴＰ、２０ｍＭ  ｄＧＴＰ、２０ｍＭ  ｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ）を加えて調製したものを、各チューブに２０μＬを分注し、ＰＣＲ反応を行った。なお、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー、１００μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは人由来β Ａｃｔｉｎ配列内から選択した。プライマーの配列について表２に示す。
反応後、各チューブのＰＣＲ反応液を電気泳動によってＰＣＲ産物を確認した。
【００３１】
表３  各プライマー配列
2011083256.tif 000006
actggaacggtgaaggtgac
cagtgtacaggtaagccctg
【００３２】
電気泳動を行ったゲル中のＰＣＲ産物をエチジウムブロマイドで染色し、そのバンドの濃淡を蛍光スキャナーを用いて数値化を行った。比較例１おけるバンドの濃さを１００として、下記表３に示す。この数値を比較することによりＰＣＲ反応よって得られた産物の量を知ることができる。数値が高いほどより多くの産物を得ることできており、効率よくＰＣＲ反応が起きていることになる。
【００３３】
表４  電気泳動バンドの濃淡数値化
2011083256.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の生理活性物質固定化用固相担体を用いることで、生理活性物質を基材に固定化し、それ以外の部分への不要な生理活性物質や蛍光物質の吸着および結合を抑制することできる。