(57)【要約】【課題】体液中の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を選択的に吸着除去する吸着体及び方法の提供、並びに該吸着体を含む体液浄化するための吸着装置の提供。【解決手段】プトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリンからなる群から選択されるポリアミンの少なくとも１つ、あるいはＬ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンからなる群から選択される脂肪族塩基性アミノ酸の少なくとも１つを有効成分として含む変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着剤及び吸着体。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリンからなる群から選択されるポリアミンの少なくとも１つを有効成分として含む変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着剤。
【請求項２】
Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンからなる群から選択される脂肪族塩基性アミノ酸の少なくとも１つを有効成分として含む変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着剤と水不溶性担体を含み、該吸着剤が該水不溶性担体に固定化された、変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着体。
【請求項４】
水不溶性担体が、親水性ビニルポリマーゲル又はセルロースゲルである、請求項３記載の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着体。
【請求項５】
変性低密度リポ蛋白質が関与する疾患を治療するための、請求項３又は４に記載の変性低密度リポ蛋白質除去用吸着体。
【請求項６】
終末糖化産物が関与する疾患病態を治療するための、請求項３又は４に記載の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着体。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の吸着体を含む、体液から変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を除去し、体液を浄化するための吸着装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内ポリアミン又は脂肪族塩基性アミノ酸を固定化した吸着体を、変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を除去するために使用することで、広く変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物が関与する疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動脈硬化病変では、泡沫細胞の集積が特徴的な形態として観察される。この泡沫細胞は、マクロファージがスカベンジャー受容体を介して変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）などを貪食した細胞である。スカベンジャー受容体のリガンドとしては、酸化ＬＤＬやアセチル化ＬＤＬなどの変性ＬＤＬの他、デキストラン硫酸などの陰性荷電を持つ高分子などが知られている。このように、動脈硬化の進展の過程では、マクロファージがこれらの変性ＬＤＬを取り込むことにより、泡沫細胞となり、動脈硬化病変を形成すると考えられている（非特許文献１を参照）。
【０００３】
代表的な変性ＬＤＬである酸化ＬＤＬは、血管内皮細胞からの単球走化性蛋白質―１の発現分泌を促し、単球の血管組織への浸潤を亢進させることにより、動脈硬化の増幅因子として働くと考えられている（非特許文献２を参照）。また、酸化ＬＤＬは、血管内皮細胞からの血管弛緩因子である一酸化窒素の放出を阻害し、血管の緊張性を弱めることも報告されている（非特許文献３を参照）。
【０００４】
近年、高脂血症モデルのマウスの肝臓に酸化ＬＤＬ受容体の遺伝子を導入すると、血中のコレステロール、ＬＤＬ及びＨＤＬコレステロール値を保ちながら、酸化ＬＤＬ値だけを３分の１程度に減少させることができ、無処置の高脂血症マウスと比較すると、動脈硬化の進行が完全に抑制されて通常のマウス程度になったという実験結果が示された（非特許文献４を参照）。
【０００５】
血液透析患者の死因の約４０％は、心不全や心筋梗塞などの冠動脈疾患であり（非特許文献５を参照）、また、冠動脈疾患患者では血中の酸化ＬＤＬ濃度が高く、血中酸化ＬＤＬ値は冠動脈疾患の進行度合いを示す良い指標となることが報告されている（非特許文献６を参照）。現在まで選択的に酸化ＬＤＬを低下させる方法は見出されていない。高脂血症あるいは動脈硬化症の患者では血中のＬＤＬ量が多いため、ＬＤＬを除去することにより治療することが有効であり、デキストラン硫酸を固定したセルロースゲルを充填したリポソーバー（株式会社カネカメディックス）が家族性高コレステロール血症患者に使用されている。しかしながら、透析患者では、血中のＬＤＬ濃度は健常者と同レベルであるため、ＬＤＬ除去カラムを使用することが出来ない。したがって、選択的に酸化ＬＤＬを低下させる方法の開発が待ち望まれている。
【０００６】
一方、現在の日本において、糖尿病患者及び糖尿病予備軍の総数は、２千万人にも達するといわれている。糖尿病で問題になるのは、高血糖が長く続いた場合に、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と体内の蛋白質のアミノ基との反応（メイラード反応）により生成される終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）という物質である。このＡＧＥｓが体内の様々な器官に蓄積して糖尿病性合併症を引き起こす。例えば、器官が腎臓であれば糖尿病性腎症、網膜であれば糖尿病性網膜症、神経であれば糖尿病性神経障害、血管であれば動脈硬化である。さらに、ＡＧＥｓは、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ及び老化などの原因となることも報告されている（非特許文献７を参照）。このような背景の下、アミノグアニジン、ピリドキサミン誘導体などのＡＧＥｓ生成抑制剤が提案されているが、予防という点では有効と考えられるが、既に蓄積されたＡＧＥｓを除去するという課題を解決するものではない。したがって、体内に蓄積されたＡＧＥｓを効果的に除去する方法の開発が待ち望まれている。
【０００７】
ポリアミンは、低分子の窒素を含む塩基性物質のことであり、ヒトの体内には４種類のポリアミン、即ち、プトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリン（本明細書の表２）が存在している。これらの生体内ポリアミンは、細胞内ではマグネシウムイオンやＡＴＰと共に１〜２０ｍＭと高濃度に含まれているが、特定の高分子物質とは強く結合せず、細胞中に存在する多くの酸性高分子物質、例えば、核酸、リン脂質、酸性蛋白質などと非常に弱く結合している（未来の生物化学シリーズ２８、神秘の生命物質−ポリアミン、五十嵐一衛、１９９３年、共立出版株式会社）。ポリアミンの主な機能としては、核酸と相互作用することにより蛋白質合成を促進して細胞増殖因子として機能すること、グルタミン酸受容体の１つであるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体のポリアミン結合部位に作用してその活性を調節していること、また、ヘパリンなどのグリコサミノグリカンとの相互作用を介して凝固線溶系などを調節していることなどが報告されている（非特許文献８を参照）。
【０００８】
脂肪族塩基性アミノ酸とは、芳香環を持たない塩基性の高いアミノ酸のことであり、ヒトの体内には、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンが存在している。Ｌ−アルギニン及びＬ−リジンは蛋白質の構成成分として数％程度含まれており、Ｌ−オルニチンは常に遊離アミノ酸として機能している。Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンは成長ホルモンの分泌を促進する作用があること（非特許文献９を参照）、また、Ｌ−アルギニン及びＬ−オルニチンは、免疫力を高める機能を持つことなどが報告されている（非特許文献１０を参照）。
【０００９】
人工的に作製された酸化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ又は糖化ＬＤＬなどの変性ＬＤＬ、及び、カルボキシメチルリジン化蛋白質又は糖化蛋白質などのＡＧＥｓは、正味の陰性荷電を有しているために、アガロースゲルを用いた電気泳動ではその相対移動度は上昇することが知られている（非特許文献１１を参照）。一方、生体内ポリアミンあるいは脂肪族塩基性アミノ酸は、生体内に高濃度存在する比較的安全性の高い陽性荷電を有する塩基性物質である。
【００１０】
ポリアミンを有する基材からなることを特徴とする吸着材料の技術としては、特開平１１−２６７１９９号公報（特許文献１）及び特開平１１−２６７４２１号公報（特許文献２）に、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリプロピレンイミンなどを含む血液浄化材料が開示されている。また、特開２００６−２７２０７５号公報（特許文献３）には、ＩＬ−６やＩＬ−８等の過剰のサイトカイン及び／又はスーパー抗原を除去あるいは不活性化することが出来る吸着材料が開示されている。しかしながら、これらの技術には、プトレシンなどの生体内ポリアミン、及び、変性ＬＤＬやＡＧＥｓに対する作用及び用途についての開示はない。
【００１１】
塩基性アミノ酸を含有する吸着剤の技術としては、国際公開第０１／０２３４１３号パンフレット（特許文献４）に、エンドトキシン及びサイトカイン誘導物質を除去することができる、アルギニン及びリジンなどを含む血液処理材料が開示されている。しかしながら、これらの技術にはオリゴペプチドからなる組成物が用いられており、単独の脂肪族塩基性アミノ酸の利用、及び、変性ＬＤＬやＡＧＥｓに対する作用及び用途についての開示はない。
【００１２】
近年、酸化ＬＤＬを吸着除去できる中空糸膜として、特開２００２−２８４６１号公報（特許文献５）には、カチオン性ポリマーが含有されていることを特徴とする過酸化脂質吸着用中空糸膜が、また、特開２００５−２３０４０７号公報（特許文献６）には、カチオン性基と親水性高分子が導入された、血液適合性が良好で、かつ、酸化ＬＤＬなどの酸性蛋白質を除去できる改質基材が開示されている。一方、特許第３４９７１９５号公報（特許文献７）には、ラクトフェリンを有効成分とする変性ＬＤＬ結合剤が開示されている。しかしながら、これらの技術には、生体内ポリアミン及び脂肪族塩基性アミノ酸についての開示はない。
【００１３】
ＡＧＥｓを吸着除去できる吸着剤として、国際公開第０７／０３７５５４号パンフレット（特許文献８）には、親水性メタクリレート含有共重合体樹脂からなるＡＧＥｓ吸着剤が開示されている。また、特開２００３−２３８４０４号公報（特許文献９）には、ＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥｓ）の全配列もしくは部分配列を含むペプチドを固定化した再生可能な糖尿病合併症因子吸着体が開示されている。しかしながら、これらの技術には、ポリアミン及び脂肪族塩基性アミノ酸についての開示はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開1999-267199号公報
【特許文献２】特開1999-267421号公報
【特許文献３】特開2006-272075号公報
【特許文献４】国際公開第01/023413号パンフレット
【特許文献５】特開2002-28461号公報
【特許文献６】特開2005-230407号公報
【特許文献７】特許第3497195号公報
【特許文献８】国際公開第07/037554号パンフレット
【特許文献９】特開2003-238404号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】プロシーディングス オブ ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  ユーエスエー(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)、1984年、第81巻、p.3883-3887
【非特許文献２】サーキュレーション（Circulation）、2000年、第101巻、p.2889-2895
【非特許文献３】ジャーナル オブ バイオロジカル  ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)、2001年、第276巻、p.13750-13755
【非特許文献４】サーキュレーション(Circulation)、2008年、第118巻、p.75-83
【非特許文献５】ネフロロジー ダイアライシス  トランスプランテーション(Nephrology Dialysis Transplantation)、2008年、第23巻、p.2629-2633
【非特許文献６】サーキュレーション(Circulation)、1998年、第98巻、p.1487-1494
【非特許文献７】グリコバイオロジー(Glycobiology)、2005年、第15巻、p.16R-28R
【非特許文献８】薬学雑誌、2006年、第126巻、p.455-471
【非特許文献９】ニュートリション(Nutrition)、2002年、第18巻、p.657-661
【非特許文献１０】ザ ジャーナル オブ ニュートリション(The Journal of Nutrition）、2001年、第131巻、p.2556S-2561S
【非特許文献１１】ダイアビーティス(Diabetes)、2000年、第49巻、p.1714-1723
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
かかる状況下において、安全性が高く、選択的に変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）及び／又は終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）を除去するための吸着体が求められている。より具体的には、(１)体液中の変性ＬＤＬを選択的に除去できる、(２)体液中のＡＧＥｓを選択的に除去できる、（３）血中の電解質量及び金属イオン量に影響を及ぼさない、（４）他のカチオン性ポリマーの問題点である血液中の血小板や凝固活性の活性化などが実質的に無い、あるいは、(５)リポソーバーの副作用であるブラジキニン産生による血圧低下やショック症状を起こさないなど、上記問題点の１つ以上を克服した吸着体が切望されている。本発明は、体液中の変性ＬＤＬ及び／又はＡＧＥｓを効率よく選択的に吸着する吸着体、並びに、体液中の変性ＬＤＬ及び／又はＡＧＥｓを除去する方法及び吸着装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、陽性荷電を持つこれらの生体内塩基性物質を固定化した不溶性担体を用いることにより、血液中の陰性荷電を帯びた病因物質である変性ＬＤＬ及び／又はＡＧＥｓを捕捉し除去することができると考え、安全性が高く有効性に優れた変性ＬＤＬ吸着体及び／又はＡＧＥｓ吸着体を得るべく、鋭意研究を重ねた。その結果、生体内ポリアミンであるプトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリンを固定化した吸着体、又は、脂肪族塩基性アミノ酸であるＬ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンを固定化した吸着体が、（１）変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）に高い結合活性を有すること、（２）終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）に高い結合活性を有すること、（３）選択性に優れていること、（４）血中の電解質量及び金属イオン量に影響を及ぼさないこと、（５）安全性が高いこと等の予期し得ない特徴を１つ以上有することを見出した。
【００１８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  生体内ポリアミンであるプトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリンからなる群から選択されるポリアミンの少なくとも１つを有効成分として含む変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着剤。
[２]  脂肪族塩基性アミノ酸であるＬ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンからなる群から選択される脂肪族塩基性アミノ酸の少なくとも１つを有効成分として含む変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着剤。
[３]  [１]又は[２]の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着剤と水不溶性担体を含み、該吸着剤が該水不溶性担体に固定化された、変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着体。
[４]  水不溶性担体が、親水性ビニルポリマーゲル又はセルロースゲルである、[３]の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着体。
[５]  変性低密度リポ蛋白質が関与する疾患を治療するための、[３]又は[４]の変性低密度リポ蛋白質除去用吸着体。
[６]  終末糖化産物が関与する疾患病態を治療するための、[３]又は[４]の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去用吸着体。
[７]  [３]〜[６]のいずれかの吸着体を含む、体液から変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を除去し、体液を浄化するのための吸着装置。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の吸着体は、（１）変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）に高い結合活性を有すること、（２）終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）に高い結合活性を有すること、（３）選択性に優れていること、（４）血中の電解質量及び金属イオン量に影響を及ぼさないこと、（５）安全性が高いこと等の予期し得ない特徴を１つ以上有することがことが示されたことから、これらの吸着体は、被験体の体液中の変性ＬＤＬ及び／又はＡＧＥｓを効率的に吸着除去することが可能であり、変性ＬＤＬが関与する疾患及び／又はＡＧＥｓが関与する疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の体液浄化装置の一実施例を模式的に示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の吸着剤は、生体内に存在する塩基性物質からなり、該生体内に存在する塩基性物質として、ポリアミン及び脂肪族塩基性アミノ酸が挙げられる。
【００２２】
本発明の吸着剤は、例えばヒトの生体内に天然で存在するポリアミンからなる。ここで、ポリアミンとは、アミノ酸鎖又は炭化水素鎖を基本骨格とし、少なくともその両端にアミノ基を有する、２つ以上のアミノ基を有する化合物をいう。ヒトの生体内に天然で存在するポリアミンとして、プトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリンが挙げられる。プトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリンの構造式を以下に示す。
プトレシンの構造式
【００２３】
【化１】
2011139805.tif 000003
スペルミジンの構造式
【００２４】
【化２】
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スペルミンの構造式
【００２５】
【化３】
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カダベリンの構造式
【００２６】
【化４】
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【００２７】
これらのポリアミンはヒトの生体内に天然で存在しており、ヒトの体液から精製して用いることができる。ここで、「体液」とは、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液及びこれらから得られた分画成分及びその他の生体由来の液体成分をいう。また、上記の構造式に基づいて合成することもできる。さらに、シグマ・アルドリッチ社や和光純薬等の試薬メーカーから、市販品を購入して使用してもよい。
【００２８】
さらに、本発明の吸着剤は、脂肪族塩基性アミノ酸からなる。脂肪族塩基性アミノ酸としては、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンが挙げられる。これらは、モノマーとして用いることができるし、２つ以上を結合させたポリマーとして用いることもできる。この場合、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンが混在したポリマーを用いることもできる。これらの脂肪族塩基性アミノ酸は、合成して用いることもできるし、市販品を用いることもできる。
【００２９】
本発明において「変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）」とは、種々の化学的、物理的な要因、あるいは熱などの種々の要因により変性を受けた低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）のことである。例えば、酸化ＬＤＬが挙げられる。また、人工的には、硫酸銅、マロンジアルデヒド、又は次亜塩素酸で酸化させたＬＤＬなども含まれる。該変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）が生体内に存在すると種々の障害や疾患を引き起こす。
【００３０】
本発明における「終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）」とは、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と蛋白質のアミノ基との非酵素的な反応（メイラード反応）によって生じる不可逆的な高分子架橋物質である。例えば、糖尿病の臨床検査項目の１つであるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）や構造が明らかになったカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）などがその代表である。終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）が生体内に存在すると種々の障害や疾患を引き起こす。
【００３１】
本発明の吸着剤は、生体内の上記の変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）や終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）を吸着させ、動物体内の変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）や終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）を除去するのに用いることができる。
【００３２】
本発明の吸着剤は、好ましくは、水不溶性担体に固定化して用いる。水不溶性担体とは、常温常圧の水溶液中で固体である担体をいう。形状は、限定されないが、球状、粒状、繊維状、平膜状、スポンジ状、チップ状などである。繊維状のものとしては、織布状、不織布状、中空糸状のものが挙げられる。
【００３３】
該水不溶性担体は、本発明の吸着剤を固定化し、生体内の変性低密度リポ蛋白質（変性ＬＤＬ）や終末糖化産物（Advanced Glycation End-products;AGEs）を吸着除去するのに用いることができる。本発明において、上記の吸着剤と水不溶性担体を含み、水不溶性担体に吸着剤が固定化されたものを吸着体と呼ぶ。このため、水不溶性担体の大きさは、細胞を含む体液が十分に水不溶性担体の間を通過できる間隔が得られるような大きさである必要がある。例えば、水不溶性担体が球状又は粒状である場合、球状又は粒状の平均粒径が５μｍ以下だと細胞を含む体液の場合に充分に通過し得る間隔を得られない傾向があり、粒径が２５００μｍ以上だと体積あたりの吸着能が充分得られない傾向がある。従って、粒径は、好ましくは２５μｍから１０００μｍ、より好ましくは５０μｍから８００μｍである。また、織布状及び不織布状の場合、同様の理由により、好ましい繊維径は１μｍから５００μｍであり、より好ましくは５μｍから２００μｍである。
【００３４】
本発明で用いる水不溶性担体は、適当な大きさの細孔を多数有する構造を有していることが好ましい。即ち、本発明の水不溶性担体は、多孔構造を有する担体であることが好ましい。また、単位体積当たりの吸着能から考えて、表面多孔性よりも全多孔性が好ましい。ここで、全多孔性とは表面ばかりでなく、内部にも多孔構造を有することをいう。水不溶性担体の孔のサイズは、変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物の吸着能力を確保するために排除限界分子量で表した場合に、２００万以上であることが好ましい。また、吸着能力は表面積により大きく影響される。即ち、表面積が大きいと吸着能力は上がり、小さいと下がる。したがって、吸着体の表面積が０．５ｍ２／ｍＬ以上であることが好ましく、１．０ｍ２／ｍＬ以上であることがより好ましい。
【００３５】
水不溶性担体の材質は、上記のポリアミンや脂肪族塩基性アミノ酸を表面に固定化して保持できるものであれば、限定されず、無機化合物でも有機化合物でもよい。ただし、体液との接触時に溶出物が少ないこと、水不溶性担体の細孔の制御がより精巧にできることが好ましく、この点から、有機高分子化合物が好ましい。
【００３６】
無機化合物として、シリカゲル、ガラスビーズ等が挙げられ、有機化合物としては、ポリビニルアルコール等のビニル系化合物の重合体若しくは共重合体、セルロース等の植物由来の多糖類、ポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリメタクリレートエステル、ポリアクリレートエステル系化合物等が例示される。この中でも、重合の容易さ、強度的安定性及び導入の容易さ等の面から、ビニル系化合物の重合体、共重合体やセルロース等が好適に用いられ、例えば、親水性ビニルポリマーゲル、セルロースゲルが挙げられる。市販の担体としては、トヨパールＡＦ−エポキシ−６５０、トヨパールＡＦ−トレシル−６５０、トヨパールＡＦ−ホルミル−６５０、トヨパールＡＦ−カルボキシ−６５０（以上、東ソー株式会社）、セルファインホルミル、セルファインアミノ（以上、チッソ株式会社）、Ｎ−ヒドロキシスクシミド活性化セファロース、臭化シアン活性化セファロース、エポキシ活性化セファロース（以上、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）等が挙げられる。
【００３７】
水不溶性担体表面に上記のポリアミンや脂肪族塩基性アミノ酸を固定化し、保持させる方法としては、化学的方法により水不溶性担体表面の官能基を介して共有結合させる方法、放射線や電子線を用いたグラフト法によって共有結合させる方法、物理的吸着により結合させる方法などが挙げられる。このうち、官能基を介して共有結合させる方法が、使用時に塩基性物質が溶出する可能性が低いので好ましい。官能基の例としては、エポキシ基、ホルミル基、Ｎ−スクシミド基、ハロゲン化シアノ基、イソシアン酸基、トシル基、酸無水物基、アミノ基、カルボキシル基などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの官能基は公知の方法で前記の水不溶性担体に結合させることができる。また、これらの官能基をあらかじめ結合させた市販の水不溶性担体を用いることもできる。ポリアミンや脂肪族塩基性アミノ酸の担体への固定化量は、用いる担体により様々であるが、例えば、担体がトヨパールＡＦ−エポキシ−６５０の場合、その固定化量は乾燥重量１ｇ当たり１０〜６００ｍｇ、好ましくは３０〜３００ｍｇである。
【００３８】
本発明の吸着剤及び吸着体は、特定の障害や疾患の原因となる生体の体液中に存在する変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物の吸着除去に用いることができる。
【００３９】
例えば、本発明の吸着剤や吸着体を血液等の体液中に投与し、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を吸着させ、その後これらの物質を吸着させた吸着剤や吸着体を回収すればよい。
【００４０】
また、体液を生体から採取し、生体外で本発明の吸着剤又は吸着体と接触させ、変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を体液から吸着除去することができる。その後、体液を生体に戻せばよい。
【００４１】
上記の生体の体液中に存在する変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物の吸着除去には、好適には、吸着剤が水不溶性担体に固定化された吸着体が用いられ、好適には、生体から体液を採取し、生体外で変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物の吸着除去が行われる。この場合、本発明の吸着体を含む、吸着装置が用いられる。
【００４２】
該吸着装置は、吸着体が内部に配置され、体液の流入口と流出口を有する体液が通過する流路を有し、流入口から装置内部に入った体液が装置内部の吸着体と接触し、体液中の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物が吸着除去される。その後、残った体液が流出口から排出され、生体内に戻される。したがって、装置の流入口及び流出口は、生体と連結される。この際、シリンジ等を用いて生体と連結し、生体内の体液と装置をつなげればよい。吸着体は、好ましくはカラム等の容器に充填保持した状態で装置に配置される。すなわち、生体内と連結した体液が通過する流路がカラム等の容器に連結されている。さらに、また、該カラム等の容器は、好ましくは、吸着体が体液の流れにより流出するのを防ぐための流出防止手段を備えている。流出防止手段としては、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターが例示され、これらを例えば、カラム等の容器の流入口と流出口又は流出口に配置すればよい。体液の循環は例えばポンプにより行われる。
【００４３】
本発明においては、流入口と流出口を含み、吸着体を内部に充填したものを吸着装置という場合もあり、またさらに、前記流入口、流出口に連結され、生体と連結するための流路を含むものを吸着装置ということがある。本発明の吸着装置は、変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を吸着除去するという点で、変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物除去装置ということができ、さらに、これらを除去して体液を浄化するので、体液浄化装置ということもできる。
【００４４】
本発明は、該体液浄化装置を用いて体液中の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物を吸着除去する方法も包含する。例えば、該方法においては、前記装置が脱血ライン等の脱体液ライン及び返血ライン等の返体液ラインにより、血液等の体液を浄化しようとする被験体とつながっており、脱体液ラインを介して被験体の体液が前記体液浄化装置に導入され、装置内で体液が前記吸着体と接触し、体液中の変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物が吸着体に吸着される。変性低密度リポ蛋白質及び／又は終末糖化産物が除去された体液は返体液ラインを介して被験体に戻される。該方法において、体液は血液ポンプ等のポンプにより循環される。また、脱体液ライン及び返体液ラインは、体液が血液の場合、被験体の静脈に連結すればよい。
【００４５】
カラム等の容器の形状、材質、大きさには特に限定はないが、形状は筒状容器が好ましい。材質として好ましいのは、耐滅菌性を有する素材であり、具体的にはポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリサルフォン、塩化ビニルなどが挙げられる。吸着装置のカラム等の容器の容量は１０ｍＬから１０００ｍＬ程度が適当である。容量が１０ｍＬ以下では吸着量が充分でなく、１０００ｍＬ以上では体液の体外循環量が多くなり過ぎるので好ましくない。また、カラム等の容器の直径は２ｃｍ以上２０ｃｍ以下が好ましい。直径が２ｃｍ以下では線速が大きくなり圧力損失が大きくなり、２０ｃｍ以上では線速が小さくなり血液成分が凝固する危険性が増すので、好ましくない。また、前記容器を含む装置は、使用前にオートクレーブ、ガンマ線などの放射線、紫外線、エチレンオキサイドガスなどの方法により滅菌処理を行うことができる。
【００４６】
本発明の吸着装置を、体液を体外で循環させて用いる場合、主に２つの方法がある。１つは、体内から取り出した血液を血漿分離器により血球成分と血漿成分とに分離した後、血漿成分を吸着装置中の吸着体を通過させて浄化した後、血球成分と合わせて体内に戻す方法である。もう１つは、体内から取り出した血液を直接本発明の装置の吸着体を通過させて浄化する方法である。本発明の吸着体は、いずれの方法にも有効に使用できる。
【００４７】
また、本発明の吸着装置は、本発明の吸着体のみを含んでいてもよいが、他の吸着体を混合して含んでいてもよい。他の吸着体として、例えば、リポソーバー（株式会社カネカメディックス）、プラソーバ（旭化成クラレメディカル）等に用いられている吸着体が挙げられる。
本発明の体液浄化装置の一例の断面図を図１に示す。
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４９】
実施例１  吸着体の製造
以下の方法により、本発明の吸着体を製造した。
吸着体１
プトレシン−レジン１
＜工程１＞
エポキシ基を保持した親水性ビニルポリマーゲル（トヨパールＡＦ−エポキシ−６５０（レジン1）；東ソー株式会社）1ｇを水中で膨潤させ水洗した。プトレシン（和光純薬）３００ｍｇを含む２ｍoｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液を２ｍＬ調製した。プトレシン１５０ｍｇ／ｍＬ溶液２ｍＬをゲルに添加し撹拌した後、４５℃で１晩インキュベートした。その後、未反応のプトレシンを除くために２ｍoｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液で２回洗浄した。次に、残存活性基をブロックするため、２ｍｏｌ／Ｌグリシン溶液を４ｍＬ添加し、４５℃で１晩インキュベートした。その後、ｐＨが８以下になるまでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。
【００５０】
さらに、以下の吸着体２〜４を、吸着体１と同様の工程で製造した。なお、スペルミジン、スペルミン及びカダベリンは和光純薬より購入した。
吸着体２
スペルミジン−レジン１
吸着体３
スペルミン−レジン１
吸着体４
カダベリン−レジン１
吸着体５
Ｌ−アルギニン−レジン２
【００５１】
＜工程２＞
アミノ基を保持したセルロースゲル（セルファイン−アミノ（レジン２）；チッソ株式会社）1ｍＬを水中で膨潤させ水洗した。Ｌ−アルギニン（シグマ・アルドリッチ社）２０ｍｇを含む水溶液を１ｍＬ調製し、塩酸を添加することによりｐＨを約４．５に調整した。アルギニン２０ｍｇ／ｍＬ水溶液１ｍＬをゲルに添加した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（和光純薬）を１２ｍｇ添加して、３７℃で１晩インキュベートした。その後、ｐＨが７以上になるまでリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。
【００５２】
以下の吸着体６及び７を、吸着体５と同様の工程で合成した。なお、Ｌ−リジン及びＬ−オルニチンは和光純薬より購入した。
吸着体６
Ｌ−リジン−レジン２
吸着体７
Ｌ−オルニチン−レジン２
【００５３】
各々の塩基性物質の結合量は、分光光度計ナノドロップ（登録商標）（ＮＤ−１０００；エル・エム・エス社）を用いて、吸収極大における吸光度を測定することにより定量した。吸着体１から７の塩基性物質の結合量を次式より求め、結果を表１に示した。また、本発明における生体内塩基性物質の化学構造式を表２に示した。
Ｂａｓｅbind  ＝  Ｂａｓｅbefore  −  Ｂａｓｅafter
Ｂａｓｅbind        ：塩基性物質の結合量
Ｂａｓｅbefore      ：反応前の塩基性物質量
Ｂａｓｅafter  ：反応後の塩基性物質量
【００５４】
【表１】
2011139805.tif 000007
【００５５】
【表２】
2011139805.tif 000008
【００５６】
実施例２  吸着体による変性ＬＤＬ及びＡＧＥｓの吸着
１．  [変性ＬＤＬの調製]
硫酸銅を用いて酸化されたＬＤＬ（Ｃｕ−ＯｘＬＤＬ）及びアセチル化されたＬＤＬ（Ａｃｅｔｙｌ−ＬＤＬ）は、カレン社から購入した。
【００５７】
マロンジアルデヒドにより酸化されたＬＤＬ（ＭＤＡ−ＯｘＬＤＬ）は、ハバーランド（Ｈａｂｅｒｌａｎｄ）らの方法（「プロシーディングス オブ ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ）」、１９８２年、第７９巻、ｐ．１７１２−１７１６）に従って調製した。即ち、マロンジアルデヒドビスジメチルアセタール１６５μＬに１０ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００μＬを添加し、室温で１．５分間インキュベートした後、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）を４．８ｍＬ添加してｐＨを６．４に調整した。この溶液を０．２ｍｏｌ／Ｌマロンジアルデヒド貯蔵液とした。その後、ＬＤＬ５ｍｇ／ｍＬ溶液（カレン社）０．３ｍＬに０．２ｍｏｌ／Ｌマロンジアルデヒド貯蔵液０．３ｍＬを添加して、３７℃で３時間インキュベートした後、１５４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，０．３４ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）溶液中で透析して、ＭＤＡ−ＯｘＬＤＬ溶液を得た。
【００５８】
次亜塩素酸により酸化されたＬＤＬ（ＨＯＣｌ−ＯｘＬＤＬ）は、マルシェ（Ｍａｒｓｃｈｅ）らの方法（「ジャーナル オブ バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第２７８巻、ｐ．４７５６２−４７５７０）に従って調製した。即ち、ＬＤＬ（カレン社）１ｍｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝生理食塩水１．５ｍＬに、４％次亜塩素酸ナトリウム（シグマ・アルドリッチ社）４．５μＬを添加し、４℃で１時間インキュベートした後、１５４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム，０．３４ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）溶液中で透析して、ＨＯＣｌ−ＯｘＬＤＬ溶液を得た。
【００５９】
２．  [アガロースゲル電気泳動]
変性ＬＤＬのアガロースゲル電気泳動における移動度は、そのＬＤＬ粒子の陰性荷電度によって決定されることが知られている。そこで、アガロースゲル電気泳動法を行い、ＬＤＬ相対移動度を測定することにより、変性ＬＤＬの陰性荷電度、即ち、酸化変性度を確認した。ＬＤＬ相対移動度は、次式により算出し、各々の変性ＬＤＬの相対移動度を表３に示した。
ＬＤＬ相対移動度  ＝    ＥＭtest  ／  ＥＭLDL  × １００
ＥＭtest  ：変性ＬＤＬの移動度
ＥＭLDL       ：ＬＤＬの移動度
【００６０】
【表３】
2011139805.tif 000009
【００６１】
調製された変性ＬＤＬは、アガロースゲル電気泳動において、いずれも陰極から陽極への移動度は、未処置のＬＤＬよりも上昇していた。即ち、変性ＬＤＬは、未処置ＬＤＬよりも陰性荷電を増していることがわかった。また、人工的に作製されたＡＧＥｓも、正味の陰性荷電を増していることが報告されている（「ダイアビーティス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、２０００年、第４９巻、ｐ．１７１４−１７２３）。一方、ポリアミン及び塩基性アミノ酸は、陽性荷電を持った低分子化合物であり、ヒトの体内に高濃度存在している比較的安全性の高い塩基性物質である（「フード アンド  ケミカル  トキシコロジー（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）」、１９９７年、第３５巻、ｐ．３３７−３４８；  四国医学雑誌、２００２年、第５８巻、ｐ．１８９−１９３）。したがって、陰性荷電を持つ変性ＬＤＬやＡＧＥｓと陽性荷電を有するポリアミンや塩基性アミノ酸とは、相互に影響し合う可能性が高いと考えて、それらの吸着体を製造して吸着除去実験を行った。
【００６２】
３．  [酸化ＬＤＬ吸着除去能]
実施例１で製造した吸着体１〜７を１００μＬ分取し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。牛血清アルブミン溶液５００μｇ／ｍＬを１ｍＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングした。そして、蛍光プローブである３，３’−ジオクタデシルインドカルボシアニン（ＤｉＩ）でラベルしたＣｕ−ＯｘＬＤＬ（ＤｉＩ−Ｃｕ−ＯｘＬＤＬ）、又は、ＭＤＡ−ＯｘＬＤＬ（ＤｉＩ−ＭＤＡ−ＯｘＬＤＬ）５μｇ／ｍＬを添加したヒト血漿（コージンバイオ社）３００μＬを添加した後、３７℃で３時間インキュベートした。さらに、３０００×ｇで５分間遠心した後、その上清中の蛍光強度を、スペクトラマックスＭ５ｅ（モレキュラーデバイス社）を用いて、励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５７５ｎｍで測定した。そして、Ｃｕ−ＯｘＬＤＬ又はＭＤＡ−ＯｘＬＤＬの吸着除去率を次式により求め、結果を表４又は表５に示した。
吸着除去率（％） ＝ （１  −  Ｆｌｕafter／Ｆｌｕbefore）× １００
Ｆｌｕafter     ：吸着実験後の蛍光強度
Ｆｌｕbefore     ：吸着実験前の蛍光強度
レジン１：  トヨパールＡＦ−エポキシ−６５０（東ソー株式会社）
【００６３】
【表４】
2011139805.tif 000010
【００６４】
【表５】
2011139805.tif 000011
【００６５】
本発明の吸着体は、上記の酸化ＬＤＬ吸着除去アッセイにおいて、除去率が５０％以上、好ましくは７０％以上を示す。従って、生体内ポリアミン又は脂肪族塩基性アミノ酸を結合させた吸着体は、血漿などの体液中の酸化ＬＤＬを吸着除去するのに有用であることが示された。なお、トヨパール樹脂自体の酸化ＬＤＬ除去能力は弱かった。
【００６６】
４．  [ＡＧＥｓ吸着除去能]
実施例１で製造した吸着体１〜７を１００μＬ分取し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。そして、０．５％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングした。その後、カルボキシメチルリジン化牛血清アルブミン（ＣＭＬ−ＢＳＡ）１００ｎｇ／ｍＬを含む０．５％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水を２５０μＬ添加した後、３７℃で３時間インキュベートした。その後、３０００×ｇで５分間遠心して、その上清中のＣＭＬ濃度を、ＣＭＬエライザキット（サーキュレックス社）を用いて測定した。そして、ＣＭＬ−ＢＳＡの吸着除去率を次式により求め、結果を表６に示した。
吸着除去率（％） ＝ （１  −  ＣＭＬafter／ＣＭＬbefore）× １００
ＣＭＬafter   ：吸着実験後のＣＭＬ量
ＣＭＬbefore     ：吸着実験前のＣＭＬ量
レジン１：  トヨパールＡＦ−エポキシ−６５０（東ソー株式会社）
【００６７】
【表６】
2011139805.tif 000012
【００６８】
本発明の吸着体は、上記のＡＧＥｓ吸着除去アッセイにおいて、除去率が５０％以上、好ましくは７０％以上を示す。さらに、本発明吸着体は、ヒト血漿中においてもほぼ同等のＡＧＥｓ吸着除去能を有していたので、生体内ポリアミンあるいは脂肪族塩基性アミノ酸を結合させた吸着体は、血漿などの体液中のＡＧＥｓを吸着除去するのに有用であることが示された。なお、トヨパール樹脂自体のＡＧＥｓ除去能力は弱かった。
【００６９】
５．  [吸着の選択性]
上記の吸着実験前と後の血漿を用いて、以下の定量を行った。血漿中の総蛋白質量の測定は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）蛋白質アッセイキット（サーモサイエンティフィック社）を用いて行った。また、コレステロール量はコレステロール定量キット（バイオビジョン社）、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール量はＨＤＬ、ＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール定量キット（ＭＢＬ社）を用いて、添付のプロトコールに従って測定した。そして、吸着除去率を次式により求め、結果を表７に示した。
吸着除去率（％） ＝ （１ − Ｃｏｍｐafter／Ｃｏｍｐbefore）× １００
Ｃｏｍｐafter  ：吸着実験後の各成分量
Ｃｏｍｐbefore     ：吸着実験前の各成分量
【００７０】
【表７】
2011139805.tif 000013
【００７１】
本発明の吸着体は、血中の総蛋白質量、総コレステロール量、ＨＤＬコレステロール量及びＬＤＬ／ＶＬＤＬコレステロール量に対して、ほとんど影響を及ぼさなかった。したがって、本発明吸着体は、選択的に、体液から有害物質である酸化ＬＤＬ及び／又はＡＧＥｓを吸着除去できることが示された。
【００７２】
６．［電解質に対する影響］
被検吸着体を４００μＬ分取し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。そして、牛血清アルブミン溶液５００μｇ／ｍＬを４ｍＬ添加した後、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングした。その後、ヒト血漿（コージンバイオ社）１．２ｍＬを添加し、３７℃で３時間インキュベートした。さらに、３０００×ｇで５分間遠心した後、血漿上清１ｍＬを採取した。そして、吸着実験前と後の血漿中におけるナトリウム、カリウム及びクロール量を電極法、カルシウム量をアルセナゾIII法、また、マグネシウム量をキシリジルブルー法によって測定し、その結果を表８に示した。
【００７３】
【表８】
2011139805.tif 000014
【００７４】
本発明の吸着体は、血漿中の電解質量及び金属イオン量に対して、ほとんど影響を与えなかった。したがって、本発明吸着体は、血漿中の電解質量及び金属イオン量に影響を与えることなく、酸化ＬＤＬやＡＧＥｓを選択的に吸着除去できることから、心臓に対する致死的な副作用（不整脈、ＱＴ延長やそれに続く心室頻拍や突然死など）、鉄欠乏性貧血及び筋肉の攣縮などの有害反応を誘発する可能性が低いことが示された。
【００７５】
７．［細胞毒性試験］
ヒト肺大細胞癌由来細胞株であるＬｕ９９Ｂ細胞に、生体内ポリアミンであるプトレシン、スペルミジン、スペルミン及びカダベリン（共に和光純薬）を添加し、２４及び４８時間インキュベートして細胞毒性試験を行った結果、３００μｍｏｌ／Ｌという高濃度まで、明らかな影響は認められなかった。
【００７６】
本実施例より、本発明の吸着体は、変性ＬＤＬに高い結合活性と優れた選択性を有することから、体液から変性ＬＤＬを選択的に吸着除去できることが示された。したがって、本発明吸着体は、変性ＬＤＬが関与する疾患及び／又は病態すべてに有用であることが示された。変性ＬＤＬが関与する疾患とは、心筋梗塞や狭心症などの冠動脈疾患、高脂血症や動脈硬化症などの生活習慣病、糖尿病とその合併症、脳梗塞、血液透析や腹膜透析を行っている透析患者、虚血再灌流障害（心臓、腎、脳など）、高血圧症、肥満症及び老化などを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
同様に、本発明の吸着体は、ＡＧＥｓに高い結合活性と優れた選択性を有することから、体液からＡＧＥｓを選択的に吸着除去できることが示された。したがって、本発明吸着体は、ＡＧＥｓが関与する疾患及び／又は病態すべてに有用であることが示された。ＡＧＥｓが関与する疾患とは、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害などの糖尿病性合併症、アルツハイマー病、慢性関節リウマチ、非アルコール性脂肪性肝炎、骨粗鬆症及び腫瘍の転移などを含むが、これらに限定されない。
【００７８】
さらに、本発明の吸着体は、血漿中のその他の蛋白質量、コレステロール量、電解質量及び金属イオン量に影響を及ぼさないことから、心臓（不整脈、ＱＴ延長とそれに続く心室頻拍や突然死など）、血液系、又は神経系に対して、重大な副作用を誘発する可能性が低いことが示された。また、細胞毒性試験において、ポリアミンは、３００μｍｏｌ／Ｌという高濃度を添加しても明らかな影響が認められなかったこと、また、脂肪族塩基性アミノ酸は、サプリメントとしても市販されており、ヒトにおける安全性も確認されていることから（四国医学雑誌、２００２年、第５８巻、ｐ．１８９−１９３）、本発明の吸着体の極めて低い毒性が示された。
【００７９】
したがって、本発明の吸着体が、（１）変性ＬＤＬに高い結合活性を有すること、（２）ＡＧＥｓに高い結合活性を有すること、（３）選択性に優れていること、（４）血中の電解質量及び金属イオン量に影響を及ぼさないこと、（５）安全性が高いこと等の予期し得ない特徴を１つ以上有することがことが示されたことから、これらの吸着体は、変性ＬＤＬが関与する疾患及び／又はＡＧＥｓが関与する疾患の治療に有用である。
【符号の説明】
【００８０】
１：  体液浄化装置
２：  体液の流入口
３：  体液の流出口
４：  カラム容器
５：  吸着体
６：  流出防止手段
【図１】
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