(57)【要約】【課題】現在利用可能なローダミン色素よりも実質的に狭い蛍光スペクトルを有する、ローダミン色素のクラスを提供すること、および現存のローダミン色素と比較して、レッドシフトした吸収スペクトルを有する、ローダミン色素のクラスを提供すること。【解決手段】蛍光色素として有用な１セットの４，７−ジクロロローダミン化合物を開示する。別の局面において、本発明は、４，７−ジクロロローダミン色素化合物で標識された試薬を含む。これには、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、およびポリヌクレオチドが挙げられる。さらなる局面において、本発明は、このような色素化合物および試薬を利用する方法を含む。これには、ジデオキシポリヌクレオチド配列決定およびフラグメント分析法が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、分子プローブとして有用である、蛍光色素化合物に概して関する。より詳細には、本発明は、蛍光標識化試薬として有用である、４，７−ジクロロローダミン色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
（参考文献）
【０００３】
【表１】
2011016813.tif 000002
2011016813.tif 000003
（背景）
生物工学分析の非放射性検出は、現代の分析バイオテクノロジーにおいて重要な技術である。放射標識の必要性をなくすことで、安全性が高まり、そして試薬を処分する際の環境的な影響が、大きく低減し、分析のための費用が減少する。このような非放射性検出方法を使用する方法の例としては、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドプローブ方法、ポリメラーゼ連鎖反応産物の検出、イムノアッセイなどが挙げられる。
【０００４】
多くの適用において、混合物中における複数の空間的重なり分析の独立した検出は、例えば、単一チューブマルチプレックスＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮＡ配列決定法などを必要とする。多遺伝子座ＤＮＡプローブアッセイの場合において、多色検出を提供することによって、反応チューブの数は減少され得、これにより実験プロトコールを単純化し、そして適用特異的キットの製造を容易にする。自動化されたＤＮＡ配列決定の場合、多色標識化により単一レーンの４種の塩基全ての分析を可能にし、これによりスループットオーバー単一色法を増加させ、そしてレーン間の電気泳動移動度変化に関連する不確定性を排除する。
【０００５】
マルチプレックス検出は、色素標識の選択において、特に電気泳動による分離および酵素を用いる処理（例えば、ＤＮＡ配列決定）を必要とする分析に対して、多数の厳しい制限を与える。第１に、蛍光スペクトルが、スペクトル的に分解される色素の収集を見出すことは、困難である。なぜならば、有機蛍光色素の典型的な発光バンドの半値幅  は、約４０〜８０ナノメーター（ｎｍ）であり、そして利用可能なスペクトルの幅は、励起光源によって制限されるからである。第２に、重ならない蛍光スペクトルを有する色素が見出されたとしても、各蛍光効率が低すぎる場合、このセットは、まだ適切とはなり得ない。例えば、ＤＮＡ配列決定の場合、増加したサンプルの充填は、低い蛍光効率（Ｐｒｉｎｇｌｅ）を補償し得ない。第３に、いくつかの蛍光色素が同時に使用される場合、同時励起が困難となる。なぜならば、色素の吸収バンドが、幅広く分かれるからである。第４に、色素の電荷、分子サイズおよびコンホメーションは、フラグメントの電気泳動の移動度に悪影響を与えてはならない。最後に、蛍光色素は、フラグメント（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）を作製するか、または操作するために、使用される化学物質と適合性でなければならない。
【０００６】
これらの厳しい制限のために、多色適用（特に、４色のＤＮＡ配列決定の分野）において使用され得る、数セットのみの蛍光色素が見出された（Ｓｍｉｔｈ  １９９２，１９９５；Ｐｒｏｂｅｒ；Ｃｏｎｎｅｌｌ）。
【０００７】
多色適応において特に有用な蛍光色素の１つのクラスは、ローダミン色素である（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＸ（ＲＯＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン１１０（Ｒ１１０）など）（Ｂｅｒｇｏｔ）。ローダミン色素は、フルオレセイン色素に比べて特に魅力的である。なぜなら、（１）ローダミンは、フルオレセインよりも典型的により光安定性であり、（２）ローダミン標識化ジデオキシヌクレオチドは、熱安定性ポリメラーゼ酵素に対して良好な基質であり、そして（３）ローダミン色素の蛍光スペクトルは、フルオレセインより有意に赤色（高波長）側にある。
【０００８】
しかし、マルチプレックス検出法の状況において、現在利用可能なローダミンの１つの重要な欠点は、このような色素の比較的幅広い蛍光スペクトルである。この幅広い蛍光スペクトルは、空間的に隣接する色素のスペクトル間の乏しいスペクトル分解を生じ、これによって、このような色素の組み合わせの多成分分析を困難としている。図７に示した蛍光性蛍光スペクトルは、高い程度のスペクトルの重なりを示す。現在利用可能なローダミン色素の第２の欠点は、それらの吸収スペクトルが、現在利用可能な固相状態周波数２倍グリーンダイオードレーザー（例えば、約５３２ｎｍに輝線を有する、ネオジム固相状態ＹＡＧレーザー）の波長と一致しない。このようなレーザーを使用することは、そのコンパクトなサイズ、長い有効寿命、および電力の効率的使用のために非常に利点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（要旨）
本発明は、分子プローブとして有用である、４，７−ジクロロローダミン色素のクラスの発明に関する。
【００１０】
本発明の目的は、現在利用可能なローダミン色素よりも実質的に狭い蛍光スペクトルを有する、ローダミン色素のクラスを提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、現存のローダミン色素と比較して、レッドシフトした吸収スペクトルを有する、ローダミン色素のクラスを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の局面において、本発明の上記の目的および他の目的は、以下の式：
【００１３】
【化１７】
2011016813.tif 000004
を有する、化合物によって達成される。
【００１４】
第２の局面において、本発明は、以下の式：
【００１５】
【化１８】
2011016813.tif 000005
を有する、化合物を含む。
【００１６】
第３の局面において、本発明は、以下の式：
【００１７】
【化１９】
2011016813.tif 000006
を有する、標識化ヌクレオチドを含む。
【００１８】
第４の局面において、本発明は、以下の式：
【００１９】
【化２０】
2011016813.tif 000007
を有する、標識化ヌクレオチドを含む。
【００２０】
このＢとＤとを連結する結合部は、Ｒ1〜Ｒ6またはＸ1〜Ｘ3の位置の１つでＤに結合される。好ましくは、このＢとＤとを連結する結合部は、Ｘ2またはＸ3の位置１つでＤに結合される。特に好ましい実施形態において、この結合部は、以下：
【００２１】
【化２１】
2011016813.tif 000008
である。Ｂがプリンである場合、結合部は、このプリンの８−位置に結合される。Ｂが７−デアザプリンである場合、結合部は、この７−デアザプリンの７−位置に結合される。Ｂがピリミジンである場合、結合部は、このピリミジンの５−位置に結合される。
【００２２】
第５の局面において、本発明は、ヌクレオチド配列決定の方法を含み、このような方法は、例えば、以下の工程：ポリヌクレオチドの第１のクラス、第２のクラス、第３のクラス、および第４のクラスの混合物を形成する工程；ポリヌクレオチドを電気泳動で分離する工程であって、これにより、類似した大きさのポリヌクレオチドのバンドを形成する工程；色素を蛍光発光させ得る、照射ビームでバンドを照射する工程；色素の蛍光スペクトルによって、バンドでポリヌクレオチドのクラスを同定する工程を包含する。この第１クラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１色素で標識されており、第２クラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そして第２色素で標識されており、第３クラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含み、そして第３色素で標識されており、第４クラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含み、そして第４色素で標識されている。第１色素、第２色素、第３色素、または第４色素が、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素であり、他の色素は、４，７−ジクロロローダミン色素および互いからスペクトル的に分解可能であるように、色素が選択される。
本発明はさらに、以下を提供する。
（１） 以下の式：
【化１０１】
2011016813.tif 000009
を有する化合物であって、ここで：
Ｒ7〜Ｒ10、Ｒ12〜Ｒ16、およびＲ18は、水素、フッ素、塩素、メチル、エチル、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ1〜Ｃ8アルケン、Ｃ1〜Ｃ8アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、Ｃ1〜Ｃ8アルコキシ、連結基、もしくはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され、そして／またはＲ7、Ｒ8、Ｒ13およびＲ14は共に、酸素、硫黄、イミニウム、およびアルキルイミニウムからなる群から選択され；
Ｒ11およびＲ17は、水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、連結基、またはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され；そして
Ｘ1〜Ｘ3は、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、アミン、アミド、カルボキシレート、スルホネート、ヒドロキシメチル、および連結基からなる群から独立して選択される、化合物。
（２） Ｘ1がカルボキシレートである、項目１に記載の化合物。
（３） Ｘ1がスルホネートである、項目１に記載の化合物。
（４） Ｘ2およびＸ3の１つが連結基である、項目１に記載の化合物。
（５） Ｒ7〜Ｒ9、Ｒ12〜Ｒ15、およびＲ18が水素である、項目１に記載の化合物。
（６） Ｒ7、Ｒ8、Ｒ13、およびＲ14がメチルである、項目１に記載の化合物。
（７） Ｒ7、Ｒ8、Ｒ13、およびＲ14が共に、酸素、硫黄、イミニウム、およびアルキルイミニウムからなる群から選択される、項目１に記載の化合物。
（８） Ｒ11およびＲ17がメチルである、項目１に記載の化合物。
（９） Ｒ11およびＲ17がフェニルである、項目１に記載の化合物。
（１０） 以下の式：
【化１０２】
2011016813.tif 000010
を有する化合物であって、ここで：
Ｒ7〜Ｒ10、Ｒ12は、水素、フッ素、塩素、メチル、エチル、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され；そして
Ｒ11は、水素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、連結基、またはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される、化合物。
（１１） Ｒ7〜Ｒ9、およびＲ12が水素である、項目１０に記載の化合物。
（１２） Ｒ7およびＲ8がメチルである、項目１０に記載の化合物。
（１３） Ｒ11がメチルである、項目１０に記載の化合物。
（１４） Ｒ11がフェニルである、項目１０に記載の化合物。
（１５） 以下の式：
【化１０３】
2011016813.tif 000011
を有する標識化ヌクレオチドであって、ここで：
Ｄは、項目１に記載の色素化合物であり；
Ｂは、７−デアザプリンヌクレオチド塩基、プリンヌクレオチド塩基、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｗ1およびＷ2は、ＨおよびＯＨからなる群から独立して選択され；
Ｗ3は、ＯＨ、ＯＰＯ3、ＯＰ2Ｏ6、ＯＰ3Ｏ9、およびそれらのアナログからなる群から選択され；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部位は、プリンまたはデアザプリンのＮ9−位置で結合され、そしてＢがピリミジンである場合、上記糖部位は、ピリミジンのＮ1−位置で結合され；
ＢとＤとを連結する結合部が、Ｒ1〜Ｒ18またはＸ1〜Ｘ3の位置の１つでＤに結合され；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、上記結合部は、上記プリンの８−位置に結合され、Ｂが７−デアザプリンである場合、上記結合部は、上記７−デアザプリンの７−位置に結合され、そしてＢがピリミジンである場合、上記結合部は、上記ピリミジンの５−位置に結合される、
標識化ヌクレオチド。
（１６） Ｂがウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択される、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（１７） 上記結合部が、以下：
【化１０４】
2011016813.tif 000012
である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（１８） 上記結合部が、以下：
【化１０５】
2011016813.tif 000013
である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（１９） 上記結合部が、以下：
【化１０６】
2011016813.tif 000014
である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（２０） 上記結合部が、以下：
【化１０７】
2011016813.tif 000015
である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（２１） 上記結合部が、以下：
【化１０８】
2011016813.tif 000016
である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（２２） 上記結合部が、以下：
【化１０９】
2011016813.tif 000017
である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（２３） Ｗ1およびＷ2の両方がＨであり；そしてＷ3がＯＰ3Ｏ9である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（２４） Ｗ1がＨであり；Ｗ2がＯＨであり；そしてＷ3がＯＰ3Ｏ9である、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（２５） ＢとＤとを連結する結合部が、Ｘ2またはＸ3の位置の１つでＤに結合される、項目１５に記載の標識化ヌクレオチド。
（２６） 以下の式：
【化１１０】
2011016813.tif 000018
を有するヌクレオチドを含む、標識化ポリヌクレオチドであって、ここで：
Ｄは、項目１に記載の色素化合物であり；
Ｂは、７−デアザプリンヌクレオチド塩基、プリンヌクレオチド塩基、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｚ1は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｚ2は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰＯ3およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり；そしてＮｕｃおよびＤに結合した上記ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結され、上記結合は、上記Ｎｕｃの５’−位置に結合し；
Ｚ3は、Ｈ、ＰＯ3、ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、ＮｕｃおよびＤに結合した上記ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結され、上記結合は、上記Ｎｕｃの３’−位置に結合され；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部位は、上記プリンまたはデアザプリンのＮ9−位置で結合され、そしてＢがピリミジンである場合、上記糖部位は、上記ピリミジンのＮ1−位置で結合され；
ＢとＤとを連結する結合部が、Ｒ1〜Ｒ18またはＸ1〜Ｘ3の位置の１つでＤに結合され；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、上記結合部は、上記プリンの８−位置に結合され、Ｂが７−デアザプリンである場合、上記結合部は、上記７−デアザプリンの７−位置に結合され、そしてＢがピリミジンである場合、上記結合部は、上記ピリミジンの５−位置に結合される、
標識化ヌクレオチド。
（２７） Ｂがウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択される、項目２６に記載の標識化ヌクレオチド。
（２８） 上記結合部が、以下：
【化１１１】
2011016813.tif 000019
である、項目２６に記載の標識化ヌクレオチド。
（２９） 上記結合部が、以下：
【化１１２】
2011016813.tif 000020
である、項目２６に記載の標識化ヌクレオチド。
（３０） 上記結合部が、以下：
【化１１３】
2011016813.tif 000021
である、項目２６に記載の標識化ヌクレオチド。
（３１） 上記結合部が、以下：
【化１１４】
2011016813.tif 000022
である、項目２６に記載の標識化ヌクレオチド。
（３２） 上記結合部が、以下：
【化１１５】
2011016813.tif 000023
である、項目２６に記載の標識化ヌクレオチド。
（３３） 上記結合部が、以下：
【化１１６】
2011016813.tif 000024
である、項目２６に記載の標識化ヌクレオチド。
（３４） 以下の工程を包含する、ポリヌクレオチド配列決定の方法であって、上記方法は：
以下のようなポリヌクレオチドの第１クラス、第２クラス、第３クラス、および第４クラスの混合物を形成する工程であって：
上記第１クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシアデノシンを含み、そして第１色素で標識されており；
上記第２クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシシチジンを含み、そして第２色素で標識されており；
上記第３クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシグアノシンを含み、そして第３色素で標識されており；そして
上記第４クラスの各ポリヌクレオチドが３’−末端ジデオキシチミジンを含み、そして第４色素で標識されており；
ここで、上記第１色素、第２色素、第３色素、第４色素の１つが、項目１に記載の４，７−ジクロロローダミン色素であり；
他の色素は、４，７−ジクロロローダミン色素および互いからスペクトル分析可能である、工程；
上記ポリヌクレオチドを電気泳動で分離する工程であって、これにより、類似した大きさのポリヌクレオチドのバンドを形成する、工程；
上記色素を蛍光発光させ得る、照射ビームでバンドを照射する、工程；および
上記色素の蛍光スペクトルによって、上記バンドで上記ポリヌクレオチドのクラスを同定する、工程、
を包含する、方法。
【００２３】
これらの局面および他の局面、本発明の目的、特徴、および利点は、以下の発明の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲を参照することで、より理解され得る。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ここで、本発明の好ましい実施形態、添付の図面に例示される例を詳細に、言及する。本発明は、好ましい実施形態と共に記載するが、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。一方、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されるように、本発明の範囲内に含まれ得る、代替物、改良物および均等物を包含することが意図される。
【００２５】
一般に、本発明は、蛍光色素として有用な４，７−ジクロロローダミン化合物の新規なクラス、分子標識としてこのような色素を使用する試薬、および分析バイオテクノロジーの分野において、このような色素および試薬を利用する方法を含む。本発明の化合物は、多色蛍光ＤＮＡ配列決定およびフラグメント分析の分野において、特定の適用を見出す。
【００２６】
本発明は、４，７−ジクロロローダミンおよび関連の色素の蛍光特性が、分子プローブとして利用するために、非常に好ましいという発見に一部基づいている。これらの発光バンド幅は、４，７−ジクロロ誘導体を欠くアナログよりも、一般に２０〜３０％狭く、そしてこれらの発光および吸収極大は、４，７−ジクロロ誘導体を欠くアナログよりも、一般に約１０〜３０ｎｍ高波長側である。
【００２７】
（Ｉ．定義）
他に示されない限り、本明細書中で使用される場合、以下の用語および語句は、以下の意味を有すると意図される：
「連結基」（Ｌ）とは、試薬に結合した「相補的官能基」と反応し得る官能基であり、このような反応が、色素をこの試薬に接続する「結合部」を形成する。使用される特定の連結基は、相補的官能基の性質および所望の結合部の型に依存する。いくつかの場合において、連結基は相補的な官能基との反応の前に活性化されなければならず、例えば、カルボキシレート連結基の、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いる活性化により、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを形成する。好ましくは、相補的官能基がアミンである場合には必ず、本発明の連結基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、スルホニルクロリド、アルデヒドもしくはグリオキサール、エポキシド、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、酸無水物、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、または他の活性カルボキシレートである。好ましくは、相補的官能基がスルフヒドリルである場合には必ず、連結基は、ハロアセチル、アルキルハライド、マレイミド、ハロアセチル、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤（例えば、フルオロベンゼン）などである。相補的官能基がカルボキシレートである場合、連結基は、好ましくは、ジアゾアルカン（ｄｉａｚｏａｌａｎｅ）、ジアゾアセチル、カルボニルジイミダゾール、およびカルボジイミド（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）である。特に好ましい実施形態において、連結基は、アミンに相補的な官能基と反応する活性化ＮＨＳエステルであり。この場合、活性化ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート連結基を含む本発明の色素は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応し、ＮＨＳエステルを形成する（Ｋｈａｎｎａ；Ｋａｓａｉ）。以下の表１は、代表的な連結基の見本を、適合性の相補的官能基および生じる結合部とともに示す。
【００２８】
【表２】
2011016813.tif 000025
用語「低級アルキル」は、１〜８個の炭素原子を含む、直鎖炭化水素部分および分枝炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなど）を意味する。
【００２９】
用語「プロパノ」とは、特に、部分−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−をいう。
【００３０】
「シクロアルキル」とは、環を形成する炭化水素部分（例えば、シクロヘキシルおよびシクロペンチル）をいう。シクロアルキル置換基と一緒になった窒素原子は、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、より大きい環、およびそれらの置換された形態を形成し得る。
【００３１】
「低級置換アルキル」は、電子吸引置換基（例えば、ハロ、シアノ、ニトロ、スルホなど）を含む低級アルキルを意味する。
【００３２】
「低級ハロアルキル」は、１以上のハロゲン原子置換基（通常、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）を有する低級置換アルキルを意味する。
【００３３】
「低級アルケン」は、炭素−炭素結合のうち１つ以上が二重結合である、低級アルキルまたは低級置換アルキルを意味する。
【００３４】
「低級アルキン」は、炭素−炭素結合のうち１つ以上が三重結合である、低級アルキルまたは低級置換アルキルを意味する。
【００３５】
「低級アルコキシ」とは、酸素原子に単結合で結合された低級アルキルを含む部分をいう。
【００３６】
「アリール」とは、単一または複数のフェニルまたは置換フェニル（例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル、など）をいう。
【００３７】
用語「ヌクレオシド」とは、ペントースに１’位で連結されたプリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物をいい、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシ形態を含む（Ｓｔｒｙｅｒ）。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいい、ここでエステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合されるヒドロキシル基である。本開示においてしばしば、用語ヌクレオシドは、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を含むことを意図される。
【００３８】
ヌクレオシドを参照した「アナログ」は、改変された塩基部分、改変された糖部分、および／または改変されたリン酸エステル部分を有する合成的アナログ（例えば他で記載されるような）を含む（Ｓｃｈｅｉｔ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）。用語「標識化ヌクレオシド」とは、式Ｉの色素化合物に共有結合で結合されたヌクレオシドをいう。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチドモノマーまたはそのアナログの線状ポリマーをいい、一本鎖および二本鎖の、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのα−アノマー形態などを含む。通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合部で連結され、ここで本明細書中で使用される場合、用語「ホスホジエステル結合部」とは、ホスホジエステル結合またはそのアナログ（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホラミデートなどを含む）をいい、対イオンが存在する場合、付随する対イオン（例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、Ｎａ+など）を含む。ポリヌクレオチドは、代表的には、サイズにおいて少数のモノマー単位（例えば、８〜４０個）から、数千のモノマー単位までの範囲である。他に示されない限り、ポリヌクレオチドが、文字の配列（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）により表される場合には必ず、ヌクレオチドは、５’→３’の順に、左から右であること、および「Ａ」がデオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」がデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを意味し、そして「Ｔ」がチミジンを意味するということが理解される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、一連の色素を参照した用語「スペクトル分解」は、これらの色素の蛍光発光スペクトルが十分に明確（すなわち、十分に重複していない）であり、その結果、それぞれの色素が結合される試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、他に記載される（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ；Ｗｈｅｅｌｅｓｓ）システムにより例示されるような、標準的な光検出システムを使用して（例えば、バンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステム、分光器と連結した電荷結合素子などのシステムを利用して）、それぞれの色素により生成される蛍光シグナルに基づいて識別され得る（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ；Ｗｈｅｅｌｅｓｓ）。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「置換（された）」とは、１つ以上の水素原子が、１つ以上の非水素原子、官能基、または部分で置き換えられる分子をいう。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ2であるが、置換窒素は、−ＮＨＣＨ3である。例示的な置換基としては、ハロ（例えば、フッ素および塩素）、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、複素環式、および連結基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
（ＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素化合物）
第１の局面において、本発明は、以下の式Ｉのような一般構造を有する４，７−ジクロロローダミン色素化合物の新規なクラスを含む（本開示の全体を通して提供される全ての分子構造は、示される厳密な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴構造、エナンチオマー、ジアステレオマー、およびプロトン化状態も含むことが意図される）。
【００４３】
【化２２】
2011016813.tif 000026
式Ｉにおいて、可変性の置換基は、以下のように規定される。Ｒ1〜Ｒ6は、独立して、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組み合わせであるか、あるいは、一緒に考慮される場合、Ｒ1およびＲ6は、ベンゾであり、あるいは、一緒に考慮される場合、Ｒ4およびＲ5は、ベンゾである。好ましくは、Ｒ1〜Ｒ6は、水素、メチル、またはエチルである。Ｙ1〜Ｙ4は、独立して、水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、またはシクロアルキルである。あるいは、一緒に考慮される場合、Ｙ1およびＲ2、Ｙ2およびＲ1、Ｙ3およびＲ3、ならびに／またはＹ4およびＲ4は、プロパノ、エタノ、またはそれらの置換形態であり、縮合環を形成する。Ｘ1〜Ｘ3は、独立して、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボキシレート、スルホン酸（スルホネート）、ヒドロキシメチル（−ＣＨ2ＯＨ）、および連結基である。好ましくは、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3は、独立して水素および連結基である。
【００４４】
一連の本発明の特に好ましい化合物において、Ｒは、水素（ｄＪＯＮ）またはメチル（ＤＭＤＪ）であり、以下に式ＩＩとして示される。
【００４５】
【化２３】
2011016813.tif 000027
本発明の別の特に好ましい化合物を、ｄＲ６５０といい、以下に式ＩＩＩとして示される。
【００４６】
【化２４】
2011016813.tif 000028
第３の特に好ましい一連の化合物は、以下の式ＩＶに示されるような、Ｒが６−ヘキサン酸（ｄＪＯＤＡ）またはメチル−ｐ−安息香酸（ｄＲ１３４）である化合物である。
【００４７】
【化２５】
2011016813.tif 000029
本発明の第４の特に好ましい化合物は、本明細書中でｄＲ１３９といい、ここでＹ1およびＹ2、ならびにＹ3およびＹ4は、窒素置換基としてピロリジニル環を形成し、Ｒ1〜6は水素であり、Ｘ1はカルボキシルであり、そしてＸ2およびＸ3は、カルボキシルおよび水素である。ｄＲ１３９の構造を、以下に式Ｖとして示す。
【００４８】
【化２６】
2011016813.tif 000030
第２の局面において、本発明は、以下に式ＶＩとして示される一般構造を有する、新規なクラスの４，７−ジクロロローダミン色素化合物を含む。
【００４９】
【化２７】
2011016813.tif 000031
式ＶＩにおいて、Ｒ7〜Ｒ10、Ｒ12〜Ｒ16、およびＲ18は、水素、フッ素、塩素、メチル、エチル、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、スルホネート、スルホン、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組合せであり得る。好ましくは、Ｒ7〜Ｒ10およびＲ13〜Ｒ16は、水素、メチル、またはエチルである。Ｒ7およびＲ8、またはＲ13およびＲ14は共に、酸素（＝Ｏ）、イオウ（＝Ｓ）、イミニウム（＝ＮＨ）、アルキルイミニウム（＝ＮＲ）であり得る。Ｒ11およびＲ17は、水素、低級アルキル、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、低級アルケン、低級アルキン、シクロアルキル、フェニル、アリール、連結基、またはそれらの組合せであり得る。好ましくは、Ｒ11およびＲ17は、メチルまたはフェニルである。Ｘ1〜Ｘ3は、独立して、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、アミン、アミド、カルボキシレート、スルホン酸（スルホネート）、ヒドロキシメチル（−ＣＨ2ＯＨ）、および連結基である。好ましくは、Ｘ1は、カルボキシレートであり、そしてＸ2およびＸ3は、独立して水素または連結基である。特に好ましい実施形態は、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ13、Ｒ14およびＲ17が、水素またはメチルであり、Ｒ9およびＲ15が、水素であり、Ｒ11およびＲ15がメチルまたはフェニルであり、そしてＲ12およびＲ18が、水素である実施形態である。
【００５０】
（ＩＩＩ．４，７−ジクロロローダミン色素化合物を利用する試薬）
別の局面において、本発明は、式Ｉ〜ＶＩの４，７−ジクロロローダミン色素化合物で標識された試薬を含む。本発明の試薬は、本発明の色素が結合され得る実質的に任意の試薬である。好ましくは、これらの色素は、試薬に直接にか、または結合部を介して共有結合で結合される。例示的な試薬としては、タンパク質、ポリぺプチド、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機ポリマーおよび無機ポリマー、ならびにそれらの組合せおよび集合（例えば、染色体、核、生存細胞（例えば、細菌）、他の微生物、哺乳動物細胞、組織、糖タンパク質など）が挙げられる。
【００５１】
（Ａ．ヌクレオチド試薬）
本発明の好ましいクラスの試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン色素を組み込むヌクレオチドおよびヌクレオシドを含む。このようなヌクレオチド／ヌクレオシド試薬は、酵素的合成により形成されるポリヌクレオチドの標識に関連して（例えば、ＰＣＲ増幅、Ｓａｎｇｅｒ型ポリヌクレオチド配列決定、およびニックトランスレーション反応に関連して使用されるヌクレオチドトリホスフェート）特に有用である。
【００５２】
本発明の好ましいヌクレオチド／ヌクレオシド試薬は、以下の式ＶＩＩに示され、
【００５３】
【化２８】
2011016813.tif 000032
この式において、Ｂは、ヌクレオシド塩基；７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基、それらのアナログであり、そして好ましくは、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、またはデアザグアノシンである。Ｄは、本発明の式Ｉ〜ＶＩの４，７−ジクロロローダミン色素化合物である。Ｗ1およびＷ2は、独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｗ3は、ＯＨ、ＯＰＯ3、ＯＰ2Ｏ6、ＯＰ3Ｏ9であり、それらのアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラミデートおよび他のホスフェートアナログなど）を含み、存在する場合、付随する対イオン（例えば、Ｈ+、Ｎａ+、ＮＨ4+など）を含む。１つの好ましい実施形態において、Ｗ1は、Ｈであり、Ｗ2は、ＯＨであり、そしてＷ3は、ＯＰ3Ｏ9である。第２の好ましい実施形態において、Ｗ1およびＷ2は、Ｈであり、そしてＷ3は、ＯＰ3Ｏ9である。Ｂが、プリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのＮ9−位に結合され、そしてＢが、ピリミジンである場合、糖部分は、ピリミジンのＮ1−位に結合される。ＢとＤとを連結する結合部は、Ｒ1〜Ｒ18またはＸ1〜Ｘ3の位置のうちの１つにて、Ｄに結合される。
【００５４】
Ｂが、プリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分はプリンまたはデアザプリンのＮ9−位に結合され、そしてＢが、ピリミジンである場合、糖部分は、ピリミジンのＮ1−位に結合される。
【００５５】
ＢとＤとを連結する結合部は、Ｒ1〜Ｒ18またはＸ1〜Ｘ3の位置のうちいずれか１つにてＤに結合され得る。好ましくは、この結合部は、Ｘ2またはＸ3のうちの１つにて結合される。好ましくは、Ｂが、プリンである場合、ＢとＤとを連結する結合部は、プリンの８位に結合され、Ｂが、７−デアザプリンである場合、この結合部は、７−デアザプリンの７位に結合され、そしてＢが、ピリミジンである場合、この結合部は、ピリミジンの５位に結合される。
【００５６】
１つの特に好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチドは、以下に式ＶＩＩＩで示される構造を有するジデオキシヌクレオチドトリホスフェートであり、存在する場合、付随する対イオンを含む。
【００５７】
【化２９】
2011016813.tif 000033
標識化ジデオキシヌクレオチド（例えば、式ＶＩＩＩに示される）は、Ｓａｎｇｅｒ型ＤＮＡ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ）において、鎖終結試薬または「ターミネーター」としての特定の適用を提供する。
【００５８】
第２の特に好ましい実施形態において、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＸで示される構造を有するデオキシヌクレオチドトリホスフェートであり、存在する場合、付随する対イオンを含む。
【００５９】
【化３０】
2011016813.tif 000034
式ＩＸに示されるような標識化デオキシヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ）において、ポリメラーゼ伸長産物を標識するための手段として特定の適用を提供する。
【００６０】
ヌクレオチド／ヌクレオシド標識は、公知の連結基、および結合部を形成するための付随する相補的官能基を使用する、多数の公知のヌクレオシド／ヌクレオチド標識技術のいずれかを使用して達成され得る。好ましい連結基の考察に関しては，上記を参照のこと。色素とヌクレオシドとを連結する結合部は、（ｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションと干渉しないべきであり、（ｉｉ）関連する酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなど）と適合性であるべきであり、そして（ｉｉｉ）色素の蛍光を消光しないべきである。
【００６１】
１つの好ましい実施形態において、本発明の色素は、ピリミジン塩基の５−炭素、または７−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合で結合される。いくつかの適切な塩基標識手順は、本発明と共に使用される得るということが報告されている。（Ｇｉｂｓｏｎ；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ；Ｎｅｌｓｏｎ１９９２；Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ；Ｆｕｎｇ１９８８；Ｗａｒｄ；Ｗｏｏ）。
【００６２】
好ましくは、結合部はアセチレンアミド結合部、またはアルケンアミド結合部であり、色素とヌクレオチド塩基との間の結合部は、色素の活性化ＮＨＳエステルの、ヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導体化塩基またはアルケニルアミノ誘導体化塩基との反応により形成される。より好ましくは、生じた結合部は、３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミノー１−プロピン−１−イルである（式Ｘ．１）。本発明の色素をヌクレオシド塩基に連結するためのいくつかの好ましい結合部は、以下に式Ｘ．１〜６として示される（Ｋｈａｎ）。
【００６３】
【化３１】
2011016813.tif 000035
アルキルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、（Ｈｏｐｂｂｓ  １９８９，１９９２）により記載される。簡単には、アルキルアミノ誘導体化ヌクレオチドは、適切なハロジデオキシヌクレオシド（通常５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコ中に配置し、空気を除くためにアルゴンでフラッシュし、乾燥ＤＭＦを添加し、次いでアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ0を添加することにより形成される。この反応混合物を数時間か、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消失を示すまで攪拌する。保護されていないアルキニルアミンを使用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、反応混合物を濃縮し、そしてカップリング反応において生成したハロゲン化水素を中和するための水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用してシリカゲル上でクロマトグラフィーすることにより単離し得る。保護されたアルキニルアミンが使用される場合、メタノール／塩化メチレン、次いで強塩基性アニオン交換樹脂の炭酸水素塩形態を反応混合物に添加し得る。次いでこのスラリーを約４５分間攪拌し、濾過し、そしてこの樹脂をさらなるメタノール／塩化メチレンでリンスし得る。合わせた濾液を濃縮し、そしてメタノール−塩化メチレン勾配を使用するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し得る。５’トリホスフェートを、標準の技術により得る。
【００６４】
（Ｂ．ポリヌクレオチド試薬）
本発明のなお別の好ましいクラスの試薬は、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素で標識されるポリヌクレオチドを含む。このような標識化ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブなどを含む多数の重要な状況において有用である。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドは、式：
【００６６】
【化３２】
2011016813.tif 000036
を有するヌクレオチドを含み、ここで可変性の置換基および結合部は、以下に規定される。Ｄは、本発明の４，７−ジクロロローダミン色素化合物である。Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基、好ましくは、ウラシル、シトシン、デアザアデノシン、またはデアザグアノシンである。Ｚ1は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ3である。Ｚ2は、Ｈ、ＯＨ、ＯＰＯ3、ＯＰ2Ｏ6、ＯＰ3Ｏ9、またはＮｕｃ（隣接するヌクレオチド）であり、ここでＮｕｃおよびヌクレオシドは、ホスホジエステル結合部またはそれらのアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉａｔｅ）、および他のホスフェートアナログなど）により連結され、存在する場合付随する対イオン（例えば、Ｈ+、Ｎａ+、ＮＨ4+）を含み、この結合部は、Ｎｕｃの５’位に結合される。Ｚ3は、Ｈ、ＯＰＯ2であり、ホスフェートアナログまたはＮｕｃを含み、ここでＮｕｃおよびヌクレオシドは、ホスホジエステル結合部またはそのアナログにより連結され、この結合部は、Ｎｕｃの３’位に結合され、ここでＮｕｃとは、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドをいう。Ｂが、プリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分は、プリンまたはデアザプリンのＮ9位に結合され、そしてＢが、ピリミジンである場合は、糖部分はピリミジンのＮ1位に結合される。Ｂは、上記の本発明のヌクレオチド試薬のように、糖部分および色素化合物に結合される。規定されるように、式ＸＩの標識化ヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの任意の内部ヌクレオチドであり得る。
【００６７】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドとしては、多重色素が挙げられ、これらのうち少なくとも１つは本発明の色素化合物であり、蛍光エネルギー移動がドナー色素とアクセプター色素との間で起こるように配置される。このような多色素ポリヌクレオチドは、スペクトル的に調整可能なプローブまたはＤＮＡ配列決定プライマーとしての適用を提供する（Ｊｕ；Ｌｅｅ）。
【００６８】
標識化ポリヌクレオチドは、酵素的に（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼ（Ｓｔｒｙｅｒ）を使用して）か、または化学合成（例えば、ホスホラミダイト法、ホスファイト−トリエステル法など（Ｇａｉｔ）により）のいずれかにより合成され得る。標識は、上記の標識化ヌクレオチドトリホスフェートモノマーを利用する酵素合成の間に導入され得るか、または合成の後に導入され得る。
【００６９】
一般的に、標識化ポリヌクレオチドが、酵素合成により作製される場合、以下の手順が使用され得る。テンプレートＤＮＡを、変性させ、そしてオリゴヌクレオチドプライマーを、このテンプレートＤＮＡにアニールする。デオキシヌクレオチドトリホスフェートおよび／またはジデオキシヌクレオチドトリホスフェートの混合物を、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰを含む反応系に添加し、ここで少なくとも１つのデオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの１つの少なくとも１つのフラクションを上記のような本発明の色素化合物で標識する。次に、ポリメラーゼ酵素を、ポリメラーゼ活性が有効である条件下で添加する。標識化ポリヌクレオチドを、ポリメラーゼ鎖合成の間に標識化デオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの組込みにより形成する。代替の酵素合成法において、２つのプライマーを、１つのプライマーの代わりに使用し、一方のプライマーは、標的の＋（プラス）鎖に相補的であり、他方のプライマーは、標的の−（マイナス）鎖に相補的であり、ポリメラーゼは、熱的に安定なポリメラーゼであり、そして反応温度は、変性温度と伸長温度との間を循環され、それによりＰＣＲにより標的配列に対する標識化相補体を指数関数的に合成する（Ｍｕｌｌｉｓ；Ｉｎｎｉｓ）。
【００７０】
合成に続いて、ポリヌクレオチドは、多数の位置で標識化され得、この位置としては、以下が挙げられる：５’末端（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ；Ｏｒｇｅｌ；Ｓｍｉｔｈ）；ホスホジエステル骨格（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）；または３’末端（Ｎｅｌｓｏｎ１９９２ａ；Ｎｅｌｓｏｎ１９９２ｂ；Ｎｅｌｓｏｎ１９９５）。オリゴヌクレオチド標識化手順の完全な概説については、（Ｓｔｅｉｎｅｒ）を参照のこと。
【００７１】
１つの好ましい合成後化学的標識化法において、オリゴヌクレオチドは、以下のように標識される。カルボキシレート連結基を含む色素を、約１当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび約３当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと、乾燥酢酸エチル中で３時間室温にて反応させることによりＮＨＳエステルに変換する。反応混合物を、５％ＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして固体になるまで濃縮して、ＤＭＳＯに再懸濁する。次いで、このＤＭＳＯ色素ストックを、過剰（１０〜２０×）に、０．２５Ｍ炭酸水素塩／炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに添加し、そして６時間反応させる（Ｆｕｎｇ１９８８）。この色素標識化オリゴヌクレオチドを、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを通して、緩衝液（例えば、０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ））で溶出することにより、未反応の色素から分離する。粗標識化オリゴヌクレオチドを含むフラクションを、勾配溶出を利用する逆相ＨＰＬＣによりさらに精製する。
【００７２】
（ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用する方法）
本発明の色素および試薬は、蛍光検出を利用する方法、特に、複数の空間的に重なる被分析物の同時検出を必要とする方法に、良く適している。本発明の色素および試薬は、特に、電気泳動（ここで、例えば、サイズ、コンフォメーション、電荷、疎水性などの同様の物理化学的特性を有する標的物質の一連のバンドまたはスポットが直線配置または平面配置で存在する）のような生化学的分離手順に供されたポリヌクレオチドのクラスの同定に良く適している。本明細書中で使用されるように、用語「バンド」は、同様または同一の物理化学的特性に基づく、被分析物の任意の空間的集団または凝集を含む。通常、バンドは、電気泳動による色素−ポリヌクレオチド結合体の分離の際に生じる。
【００７３】
ポリヌクレオチドのクラスは、種々の状況において生じ得る。本明細書中で「フラグメント分析」法または「遺伝分析」法と呼ばれる方法の好ましいカテゴリーにおいて、標識化ポリヌクレオチドフラグメントは、標識化プライマーまたはヌクレオチドを使用するテンプレート指向酵素的合成を通して、例えば、ライゲーションまたはポリメラーゼ指向プライマー伸長によって生成され；このフラグメントは、サイズ依存分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）に供され；そしてこの分離されたフラグメントは、その分離に続いて、例えば、レーザー誘発蛍光によって検出される。特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドの複数のクラスは、同時に分離され、この異なるクラスはスペクトル的に分解可能な標識によって区別される。
【００７４】
増幅フラグメント長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として公知の１つのこのようなフラグメント分析法は、増幅フラグメント長多型（すなわち、ＰＣＲ（Ｖｏｓ）によって増幅される制限フラグメント長多型）に基づく。種々のサイズのこれらの増幅されたフラグメントは、家系を通した変異体遺伝子に続く連結されたマーカーとして作用する。増幅されたフラグメントが染色体の変異体遺伝子に接近するほど、結合部相関がより高くなる。多くの遺伝障害についての遺伝子が同定されていないため、これらの結合部マーカーは、疾患危険性または父系（ｐａｔｅｒｎｉｔｙ）の評価を補助するのに役立つ。ＡｍｐＦＬＰ技術において、ポリヌクレオチドは標識化ポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用することによって、またはＰＣＲの標識化ヌクレオチド三リン酸エステルを使用することによって標識され得る。
【００７５】
別の例示的なフラグメント分析方法は、可変数の縦列繰り返し、またはＶＮＴＲ（Ｗｅｂｂｅｒ；Ｃａｓｋｅｙ）に基づいている。ＶＮＴＲは、特定の配列の隣接する複数のコピーを含み、繰り返し単位の数が可変である、二本鎖ＤＮＡの領域である。ＶＮＴＲ座の例は、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１８、およびＡｐｏＢである。ＶＮＴＲ方法のサブセットは、マイクロサテライト繰り返し、すなわち、短い縦列繰り返し（ＳＴＲ）（すなわち、短く（２〜４塩基）繰り返された配列によって特徴付けられるＤＮＡの縦列繰り返し）の検出に基づく方法である。ヒトの最も豊富にある散在した繰り返しＤＮＡファミリーの１つは、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド反復ファミリー（（ＣＡ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）である。ヒトゲノム内に５０，０００〜１００，０００（ＣＡ）ｎもの繰り返し領域が存在すると考えられ、代表的には、１ブロックあたり１５〜３０の繰り返しを有する。これらの繰り返し領域の多くは、長さが多型であり、それ故に有用な遺伝マーカーとして作用し得る。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法において、色素標識は、色素標識されたＰＣＲプライマーを使用することによってポリヌクレチドフラグメント内に導入される。
【００７６】
特に好ましいフラグメント分析方法において、本発明に従って同定されたクラスは、末端ヌクレオチドに関して、４つの可能な末端塩基と一組のスペクトル的に分解可能な色素（Ｆｕｎｇ  １９８９）のメンバーとの間に一致が確立されるように規定される。このような組は、市販の分光光度計を用いて発光帯域および吸収帯域を測定することによって、本発明の色素から容易に組み立てられる。より好ましくは、これらクラスはＤＮＡ配列決定の化学的方法または鎖終結方法の状況において生じ、そして最も好ましくは、これらクラスは鎖終結方法（すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定、またはＳａｎｇｅｒ配列決定）の状況において生じる。この方法は、配列が決定される一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは二本鎖ＤＮＡテンプレートを使用する、インビトロでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合成を含む。合成は、オリゴヌクレオチドプライマーがテンプレートをアニールする１つの部位のみにおいて開始される。この合成反応は、連続したＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチドアナログの組み込みによって終結される。この鎖終結ヌクレオチドアナログは、代表的には、３’→５’ＤＮＡ鎖伸長に必要な３’−ＯＨ基を欠く２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸エステル（ｄｄＮＴＰ）である。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸エステル）および４つのｄｄＮＴＰの１つが使用される場合、ｄｄＮＴＰが組み込まれ得る各部位において、酵素触媒重合が鎖の集団の画分で終結される。標識化プライマーまたは標識化ｄｄＮＴＰが各反応に使用される場合、配列情報は、高分解電気泳動による分離後、蛍光によって検出され得る。鎖終結方法において、本発明の色素は配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに取りつけられ得る。
【００７７】
上記フラグメント分析方法の各々において、標識化ポリヌクレオチドは好ましくは、電気泳動手順（ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ；Ｏｓｔｅｒｍａｎ）によって分離される。好ましくは、この型の電気泳動マトリクスは、約２〜２０重量％の間の濃度（体積に対する重量）を有する架橋したポリアクリルアミドまたは架橋していないポリアクリルアミドである。より好ましくは、ポリアクリルアミド濃度は、約４〜８％の間である。好ましくは、ＤＮＡ配列決定の状況において、特に電気泳動マトリクスは、鎖分離剤または変性剤（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を含む。このようなマトリクスを構成するための詳細な手順は、（Ｍａｎｉａｔｉｓ  １９８０；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ３７７ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ）によって与えられる。特定の分離において採用される最適ポリマー濃度、最適ｐＨ、最適温度、最適変性剤濃度などは、多くの因子に依存する。この因子としては、分離される核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、それらが一本鎖かまたは二本鎖であるか、および情報が電気泳動によって探求されるクラスの性質が挙げられる。従って、本発明の適用は、特定の分離のための条件を最適化するために標準の予備試験を必要とし得る。
【００７８】
電気泳動分離の後に、色素−ポリヌクレオチド結合体が、色素標識化ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することによって検出される。このような検出を実施するために、標識化ポリヌクレオチドは標準的手段（例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなど）によって照射される。好ましくは、この照射手段は、４８８ｎｍと５５０ｎｍとの間の波長の照射ビームを有するレーザーである。より好ましくは、色素−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー、特にアルゴンイオンレーザーの４８８ｎｍ輝線および５１４ｎｍ輝線によって、またはネオジミウム固相状態ＹＡＧレーザーの５３２ｎｍ輝線によって生成されるレーザー光によって照射される。これらの線で同時にレーザー光を発する幾つかのアルゴンイオンレーザーが、市販されている（例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ，Ｌｔｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ）からのＭｏｄｅｌ  ２００１）。次いで、蛍光は、光感知検出器（例えば、光増幅増倍管、電荷結合デバイスなど）によって検出される。
【実施例】
【００７９】
（Ｖ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することによってさらに明らかにされ、これらの実施例は、本発明を純粋に例示すること、および本発明の範囲をいかなる方法においても限定しないことが意図される。全ての試薬は、他に指示されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。無水３，６−ジクロロトリメリト酸を（Ｋｈａｎｎａ）によって記載されるように調製した。
【００８０】
（実施例１）
（ｄＲ１３９の調製）
【００８１】
【化３３】
2011016813.tif 000037
ｍ−アミノフェノール（１２．６ｇｍ、０．１１５モル）および１，４−ジブロモブタン（５０ｇｍ、０．２３モル）の溶液を、１３０℃まで１２時間加熱した。この混合物を室温まで冷却し、ジエチルエーテル、次いで酢酸エチルで粉砕した。この残渣を酢酸エチルに溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨ、水、および飽和ＮａＣｌで抽出した。ＭｇＳＯ4で有機層を乾燥し、濾過し、そして真空下で溶媒を除去した後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、薄黄色の固体を得た。この固体を５００ｍｌトルエンおよび１７ｍｌのトリエチルアミン（０．１２モル）と共に１時間還流し、室温まで冷却し、水および飽和ＮａＣｌで洗浄した。この溶液を再びＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして真空下でエバポレートし、３−ピロリジニルフェノールを白色固体として得た（６．０ｇｍ、０．０３７モル、３２％）。
【００８２】
３−ピロリジニルフェノール（１．６３ｇｍ、１０ｍｍｏｌ）、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（１．３ｇ、５ｍｍｏｌ）およびポリリン酸（５ｍＬ）の混合物を１６０℃まで２時間加熱した。室温まで冷却した後、水（２０ｍｌ）を加え、沈殿した生成物を濾過によって回収した。逆相ＨＰＬＣによる精製によって、ｄＲ１３９（極大吸収波長５６８ｎｍ（メタノール）、（式Ｖ））の５カルボキシル異性体および６カルボキシル異性体を分離し、異性体１（０．３ｇｍ、５％）および異性体２（０．６ｇｍ、１０％）を得た。
【００８３】
（実施例２）
（ｄＲ６５０の合成）
【００８４】
【化３４】
2011016813.tif 000038
４−ヒドロキシインドールを、シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよび酢酸を用いて還元し、４−ヒドロキシジヒドロインドールを得た。ヨウ化エチル（４０ｍｌ）、炭酸カリウム（１．０９ｇｍ、７．８ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシジヒドロインドール（１．０６ｇｍ、７．８ｍｍｏｌ）の混合物を２時間還流した。過剰のヨウ化エチルを真空下でエバポレートし、水を加え（１０ｍｌ）、そして生成物をジクロロメタンで抽出した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、Ｎ−エチル−４−ヒドロキシ−ジヒドロインドール（０．３０ｇｍ、収率２３％）を薄黄色固体として得た。
【００８５】
Ｎ−エチル−４−ヒドロキシ−ジヒドロインドール（０．３０ｇｍ、１．８ｍｍｏｌ）、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（２３０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）およびポリリン酸無水物（ＰＰＡ）（５ｇ）の混合物を１８０℃まで２．５時間加熱した。室温まで冷却後、この固体をＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、７．５ｍｌ）に溶解した。この生成物をＨＣｌ水溶液（２Ｍ、７．５ｍｌ）で沈殿させた。この固体を、濾過によって回収し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、ｄＲ６５０（極大発光波長６３３ｎｍ（８Ｍ尿素）、極大吸収波長６１４ｎｍ（８Ｍ尿素）、（式ＩＩＩ））を得た。これらの異性体の５カルボキシル基および６カルボキシル基の位置化学について帰属しなかった。異性体１（５３ｍｇ、５％）および異性体２（１０５ｍｇ、１０％）は逆相ＨＰＬＣにより分離可能であった。
【００８６】
（実施例３）
（ｄＪＯＮの合成）
【００８７】
【化３５】
2011016813.tif 000039
６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン（１．４９ｇｍ、１０ｍｍｏｌ）、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（１．３ｇ、５ｍｍｏｌ）およびメタンスルホン酸（２ｍｌ）の混合物を１６０℃まで６時間加熱した。室温まで冷却した後、水（２０ｍｌ）を加え、この沈殿生成物を濾過によって回収した。逆相ＨＰＬＣによる精製によって、ｄＪＯＮ（極大吸収波長５５７ｎｍ（メタノール）、（式ＩＩ））の５カルボキシル異性体および６カルボキシル異性体を分離し、異性体１（２７０ｍｇ、５％）および異性体２（５５０ｍｇ、１０％）を得た。
【００８８】
（実施例４）
（式ＶＩの合成）
【００８９】
【化３６】
2011016813.tif 000040
２ｍｌのジクロロメタン中の塩化Ｏ−フルオロ−ベンゾイル（１．５９ｇｍ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を、氷浴中で冷却した５ｍｌのジクロロメタンおよびトリエチルアミン（１．０１ｇｍ、１ｍｍｏｌ）中のｍ−Ｎ−メチルアミノフェノール（１．２３ｇｍ、１０ｍｍｏｌ）に滴下した。この反応溶液を室温まで１時間にわたって昇温させた。この混合物をジクロロメタンで希釈し、水および飽和ＮａＣｌで抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして真空下でエバポレートした。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、Ｎ−メチル，Ｎ−（ｍ−ヒドロキシフェニル）−Ｏ−フルオロ−ベンズアミドを白色泡状物（１．２ｇｍ、５ｍｍｏｌ、５０％）として得た。
【００９０】
水素化ナトリウム（２００ｍｇ、油中６０％分散、５０ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのジメチルホルムアミド中のアミド（１．２ｇｍ、５ｍｍｏｌ）に周囲の温度で加えた。次いで、この混合物を２時間加熱還流し、室温まで冷却した。溶媒を真空下でエバポレートし、５ｍｌの塩酸（２Ｍ）を加えた。この混合物を酢酸エチルで２回抽出した。この合わせた酢酸エチル抽出物を水および飽和ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、そして減圧下でエバポレートした。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、環化した三環式アミドを白色固体として得た（０．５６ｇｍ、２．５ｍｍｏｌ、５０％）。
【００９１】
ジメチルスルフィド／ボラン錯体（３．７５ｍｌ、７．５ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中２Ｍ）を、氷浴中で冷却した１０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中の三環式アミド（０．５６ｇｍ、２．５ｍｍｏｌ）に滴下した。この混合物を１時間還流し、氷浴中で冷却し、１０ｍｌのメタノールをゆっくり滴下した。溶媒を真空下でエバポレートし、より多くのメタノールを加え、そして真空下で徹底してエバポレーションを繰り返した。この粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、白色固体として三環式アミンを得た（４００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ、７６％）。
【００９２】
【化３７】
2011016813.tif 000041
この三環式アミン（４００ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（２４８ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびポリリン酸（１ｇ）の混合物を１８０℃まで２時間加熱した。室温まで冷却後、この固体をＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、７．５ｍｌ）に溶解した。この生成物をＨＣｌ水溶液（２Ｍ、７．５ｍｌ）で沈殿させた。この固体を濾過によって回収し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、色素（極大吸収波長６３８ｎｍ）を得た。これらの異性体の５カルボキシル基および６カルボキシル基の位置化学について、帰属しなかった。異性体１（３２ｍｇ、５％）および異性体２（６５ｍｇ、１０％）を逆相ＨＰＬＣによって分離可能であった。
【００９３】
（実施例５）
（ｄＲ１３９標識化ジデオキシアデノシン三リン酸エステル、式ＶＩＩＩの調製）
ｄｄＡＴＰ−ＮＨ2（５μＬ、２０ｍＭ、０．１μｍｏｌ）（Ｈｏｂｂｓ１９８９、１９９２）、ｄＲ１３９−ＮＨＳ（０．１５μｍｏｌ）および２５０ｍＭ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９（５μＬ）の溶液を混合した。室温で１０分放置した後、この溶液をアニオン交換カラムを有するＨＰＬＣに供し、４０％アセトニトリル／６０％０．１Ｍトリエチルアンモニウム炭酸水素塩から４０％アセトニトリル／６０％１．５Ｍトリエチルアンモニウム炭酸水素塩の勾配で溶出して、遊離色素を除去した。色素標識化ヌクレオチドおよび標識していないヌクレオチドを含む画分を真空遠心で濃縮し、逆相カラムを使用する第２のＨＰＬＣに供した。標識されていないヌクレオチドおよび色素標識化ヌクレオチドの各色素異性体を、１５％アセトニトリル／８５％０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩から３５％アセトニトリル／６５％０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩の溶出勾配を使用して分離した。色素標識化ヌクレオチドを含有する溶液を真空遠心で濃縮し、１０ｍＭの炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９に再溶解し、ＵＶ／可視分光光度計中の溶液の吸光度を測定することによって定量した。収率はおよそ１％であった。
【００９４】
（実施例６）
（色素標識化オリゴヌクレオチドの調製、式ＸＩ）
５’−アミノヘキシル官能基化オリゴヌクレオチド（１０μＬ、１ｍＭ）およびｄＲ１３９−ＮＨＳ（１０μＬ、メチルスルホキシド中１２ｍＭ）の溶液および炭酸塩／炭酸水素塩（２μＬ、１Ｍ）緩衝液を合わせた。このアミノヘキシル誘導体化プライマーを自動化固相ＤＮＡ合成によって、その合成の最後のサイクルにおいてＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２を使用して調製した（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。室温で１０分放置した後、この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５によるゲル濾過に供し、遊離の色素を分離した。色素標識化オリゴヌクレオチドおよび標識していないオリゴヌクレオチドを含有する画分を回収し、逆相カラムによるＨＰＬＣ精製に供した。標識されていないオリゴヌクレオチドおよび色素標識化オリゴヌクレオチドの各色素異性体を、１０％アセトニトリル／８５％０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩から３０％アセトニトリル／６５％０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸塩の溶出勾配を使用して分離した。色素標識化オリゴヌクレオチドを含有する溶液を真空遠心で濃縮し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０（ＴＥ）を含有する緩衝液に再溶解した。
【００９５】
（実施例７）
（本発明の４，７−ジクロロローダミンジデオキシヌクレオチドターミネーターを利用する配列決定反応）
色素ターミネーター反応をＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＦＳを用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTMＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ  Ｍａｎｕａｌ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の基本プロトコルに従って、実施した。（このＦＳ酵素は、２点変異、すなわちＧ４６ＤおよびＦ６６７Ｙを有する組換えサームス属水生ＤＮＡポリメラーゼである）。ｄＮＴＰ混合物および色素ターミネーターを除く全ての試薬は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTMＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から得た。反応成分の予備混合物を以下のように調製し、ここで容量は１反応に基づいている：
【００９６】
【化３８】
2011016813.tif 000042
反応物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ４８０  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の０．５ｍｌチューブに調整した。全反応物容量は、２０μｌであり、これは、１５μｌの上記反応予備混合物、適切な量の色素標識化ターミネーター、および水を含む。色素ターミネーター反応物を、ＡおよびＧターミネーターについての１ｐｍｏｌの色素ターミネーター、またはＣおよびＴターミネーターについての１５ｐｍｏｌの色素ターミネーターのいずれかを用いて、本発明の色素を用いて、調整した。幾つかの場合において、ＣまたはＴについての色素ターミネーターは、５μＬが１５ｐｍｏｌ未満の色素ターミネーターを生じるように、非常に低い濃度であった。これらの場合において、５μｌの色素ターミネーターが使用され、水をこの反応物に加えなかった。３０μＬの鉱油を各反応容量の上部に加え、サーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）の間の蒸発を軽減した。反応物を以下の２５サイクルをサーモサイクルした：３０秒間９６℃、１５秒間５０℃、４分間６０℃；次いで４℃で保持するサイクル。
【００９７】
全ての反応物をＣｅｎｔｉ−Ｓｅｐスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ）によるスピン−カラム精製によって精製した。カラム内のゲル材料を０．８ｍＬの脱イオン水を用いて、室温で少なくとも３０分間水和した。このカラムを水和した後、ゲル材料内に気泡が捕捉されていないことが明らかであり、上端キャップ、次いで下端キャップを取り外した。このカラムを重力によって排水した。次いで、カラムをＣｅｎｔｉ−Ｓｅｐキット内に設けられた洗浄チューブ内に挿入し、可変速度ミクロ遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｏｄｅｌ  ５４１５）中で１３００×ｇで２分間遠心分離した。カラムを洗浄チューブから取り外し、サンプル回収チューブ内に挿入した。この反応混合物をガラスピペットを使用して油下から慎重に除き、Ｃｅｎｔｉ−Ｓｅｐカラムの上部に充填した。カラムを２分間遠心分離した。サンプルを真空遠心下で乾燥した。
【００９８】
この乾燥させたサンプルを２５μｌのＴｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に再懸濁し、撹拌し、９５℃まで２分間加熱し、氷上で冷却し、再び撹拌し、そして遠心分離（１３，０００×ｇ）した。１０μｌの精製したサンプルを、ＰＥ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM３１０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる使用に適応したサンプルバイアル内に等分した。Ｍｏｄｅｌ  ３１０による電気泳動は、６１ｃｍ長で、５０ｃｍの検出器に対する長さを有する５０μｍ内径の非コート溶融シリカキャピラリーを使用する。このキャピラリーを線形ジメチルポリアクリルアミド（ＤＭＡ）ふるい分けポリマー（Ｍａｄａｂｈｕｓｈｉ）、緩衝液、および核酸変性剤（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する溶液で充填した。サンプルを、３０秒間、２．５ｋＶにおいて、動電学的に注入した。電気泳動を、４２℃に維持したキャピラリー温度で、２時間１２．２ｋＶにおいて実施した。
【００９９】
全ての刊行物および特許出願は、本明細書中において、各々の個々の刊行物または特許出願が特別にかつ個々に参考として援用されるように指示されるのと同程度に、参考として援用される。
【０１００】
幾つかの実施形態のみが上記において詳細に記載されたが、有機化学分野の当業者は、多くの改変が、それらの教示から逸脱することなく好ましい実施形態において可能であることを明らかに理解する。全てのこのような改変は、前述の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。