(57)【要約】      （修正有）【課題】ホスホジエステラーゼ（PDE）をコードする遺伝子に対する治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびこれらを組み合わせて使用する方法を提供する。【解決手段】分析用ツールとしておよび／または患者の細胞のcAMPの減少と関連した疾患（例えば、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸窮迫症候群、気管支炎、慢性気管支炎、珪粉症、肺線維症、肺同種移植片拒絶、アレルギー性鼻炎および慢性副鼻腔炎を含む呼吸気道の炎症性疾患）ならびにサイクリックAMPの増加またはPDEレベルの低下が好ましいその他の症状を治療するアンチセンスオリゴヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
PDEをコードする核酸配列の少なくとも部分に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
化合物であって、前記化合物が前記PDEの発現を阻害するために有効である、前記アンチ
センスオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２】
Seq. ID No. 3；Seq. ID No. 4；Seq. ID No. 7；Seq. ID No. 15；Seq. IDNo. 17；Seq. ID No. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25；Seq. ID No. 27；Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. IDNo. 37；Seq. ID No. 41；Seq. ID No. 42；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45；Seq. ID No. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58；Seq. ID No. 64；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. ID No. 74；Seq. ID No. 81；Seq. ID No. 86；Seq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140；Seq. ID No. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152；Seq. ID No. 153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；およびSeq. ID No. 156からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
cAMPの減少と関連する疾患を有する被検体を治療するための、請求項1に記載のオリゴ
ヌクレオチド化合物を薬学的に許容可能なキャリアと共に含む組成物。
【請求項４】
PDE-関連疾患を治療するための、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
炎症性疾患を治療するための、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
炎症性呼吸器疾患を治療するための、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
PDEアイソタイプ；サイトカイン；ケモカイン；炎症性メディエーター；インターロイ
キン；TNF-α；およびマトリクスメタロプロテイナーゼからなる群から選択される異なる炎症性タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子の阻害をさらに示す、請求項3に記載の組成物。
【請求項８】
治療的有効量の請求項3に記載の組成物をcAMPの減少と関連した疾患を有する被検体に
投与することを含む、前記被検体を治療する方法。
【請求項９】
疾患がPDE-関連疾患である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
薬学的に許容可能なキャリアおよびそれぞれが標的PDEの発現を阻害することができる
少なくとも2種類のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含む、cAMPレベルの減少と
関連した疾患を治療するための医薬組成物であって、各オリゴヌクレオチドは、異なる標的PDEをコードする核酸配列の少なくとも部分に対するものであり、その標的PDEの20％未満の阻害を示す濃度で存在し、そして組み合わせることにより20％以上の、そして少なくとも一方の標的PDE阻害の少なくとも2倍の阻害を示す、前記医薬組成物。
【請求項１１】
組み合わせにより、1以上の標的PDEの阻害が示される、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
組み合わせにより、その他のPDEアイソタイプ；サイトカイン；ケモカイン；炎症性メ
ディエーター；インターロイキン；TNF-α；およびマトリクスメタロプロテイナーゼからなる群から選択されるその他の炎症性遺伝子の阻害が示される、請求項10に記載の組成物。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチド化合物が、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4D、PDE7AおよびPDE7Bからなる群から選択されるPDEをコードする核酸に対するものである、請求項10に記載の
医薬組成物。
【請求項１４】
PDE7Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物およびPDE3Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
PDE7Aオリゴヌクレオチド化合物が、Seq. ID No. 3；Seq. ID No. 4；Seq. ID No. 7；Seq. ID No. 15；Seq. ID No. 17；Seq. ID No. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25；Seq. ID No. 27からなる群から選択され、そしてPDE3Aオリゴヌクレオチド化合物が、Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. ID No. 37；Seq. ID No. 41；Seq. ID No. 42；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45からなる群から選択される、請求項14に記載の医薬組成物
。
【請求項１６】
Seq. ID No. 3；Seq. ID No. 4；Seq. ID No. 7；Seq. ID No. 15；Seq. ID No. 17；Seq. IDNo. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25；Seq. ID No. 27からなる群から選択されるPDE7Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. IDNo. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58からなる群から選択されるPDE3Bをコードする核酸に対
するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
Seq. ID No. 3；Seq. ID No. 4；Seq. IDNo. 7；Seq. ID No. 15；Seq. ID No. 17；Seq. ID No. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25；Seq. ID No. 27からなる群から選択されるPDE7Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 64
；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. ID No. 74；Seq. IDNo. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152からなる群から選択されるPDE4Aをコードする核酸に対するオリゴヌ
クレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
Seq. ID No. 3；Seq. ID No. 4；Seq. ID No. 7；Seq. ID No. 15；Seq. ID No. 17；Seq. ID No. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25；Seq. ID No. 27からなる群から選択
されるPDE7Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 81；Seq. ID No. 86；Seq. ID No. 153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；およびSeq.
ID No. 156からなる群から選択されるPDE4Bをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
Seq. ID No. 3；Seq. ID No. 4；Seq. ID No. 7；Seq. ID No. 15；Seq. ID No. 17；Seq. IDNo. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25；Seq. ID No. 27からなる群から選択されるPDE7Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140からなる群から選択されるPDE4Dをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. ID No. 37；Seq. ID No. 41；Seq. ID No. 42；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45からなる群から選択されるPDE3Aをコードする核酸に
対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58からなる群から選択されるPDE3Bをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合
物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. ID No. 37；Seq. ID No. 41；Seq. IDNo. 42
；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45からなる群から選択されるPDE3Aをコードする核酸に
対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 64；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. ID No. 74；Seq. ID No. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152からなる
群から選択されるPDE4Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請
求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. ID No. 37；Seq. ID No. 41；Seq. ID No. 42；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45からなる群から選択されるPDE3Aをコードする核酸に
対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 81；Seq. IDNo. 86；Seq. ID No.
153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；およびSeq. ID No. 156からなる群から選択
されるPDE4Bをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記
載の医薬組成物。
【請求項２３】
Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. ID No. 37；Seq. ID No. 41；Seq. ID No. 42；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45からなる群から選択されるPDE3Aをコードする核酸に
対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140からなる群から選択されるPDE4Dをコードする核酸に対するオ
リゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
Seq. ID No. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58からなる群から選択されるPDE3Bを
コードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 64；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. ID No. 74；Seq. ID No. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152からなる群から選択されるPDE4Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
Seq. ID No. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58からなる群から選択されるPDE3Bを
コードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 81；Seq. ID No. 86；Seq. ID No. 153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；およびSeq. ID No.156か
らなる群から選択されるPDE4Bをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含
む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
Seq. ID No. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58からなる群から選択されるPDE3Bを
コードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140からなる群から選択されるPDE4Dをコードす
る核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
Seq. ID No. 64；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. ID No. 74；Seq. IDNo. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152からなる群から選択されるPDE4Aをコードする核酸
配列に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 81；Seq. ID No. 86；Seq.
ID No. 153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；およびSeq. ID No. 156からなる群から選択されるPDE4Bをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
Seq. ID No. 64；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. ID No. 74；Seq. ID No. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152からなる群から選択されるPDE4Aをコードする核酸に対するオリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140からなる群から選択されるPDE4Dをコードする核酸に対する
オリゴヌクレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
Seq. ID No. 81；Seq. ID No. 86；Seq. ID No. 153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；およびSeq. ID No. 156からなる群から選択されるPDE4Bをコードする核酸に対する
オリゴヌクレオチド化合物、およびSeq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140からなる群から選択されるPDE4Dをコードする核酸に対するオリゴヌ
クレオチド化合物を含む、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチド化合物それぞれがSeq. ID No. 3；Seq. ID No. 4；Seq. ID No. 7
；Seq. ID No. 15；Seq. IDNo. 17；Seq. ID No. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25
；Seq. ID No. 27；Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. ID No. 37；Seq. ID No. 41；Seq. ID No. 42；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45；Seq. ID No. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58；Seq. ID No. 64；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. IDNo. 74
；Seq. ID No. 81；Seq. ID No. 86；Seq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140；Seq. ID No. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152；Seq. ID
No. 153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；およびSeq. ID No. 156からなる群から
選択される配列を有する、請求項10に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
被検体に対して少なくとも2種のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を投与するこ
とを含む、cAMPの減少と関連する疾患を治療する方法であって、各オリゴヌクレオチドは、異なる標的PDEをコードする核酸配列の少なくとも部分に対するものであり、標的PDEの発現を阻害することができ、その標的PDEの20％未満の阻害を示す濃度で存在し、そして
組み合わせることにより20％以上の、そして少なくとも一方の標的PDE阻害の少なくとも2倍の阻害を示す、前記方法。
【請求項３２】
疾患がPDE-関連疾患である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
請求項10に記載の医薬組成物の、炎症性呼吸器疾患の治療および／または予防のための医薬の製造のための使用。
【請求項３４】
請求項10に記載の組成物を含む、全身用製剤および局所用製剤からなる群から選択される製剤。
【請求項３５】
経口製剤、口内製剤、肺内製剤、直腸製剤、子宮内製剤、腫瘍内製剤、頭蓋内製剤、鼻内製剤、筋肉内製剤、皮下製剤、血管内製剤、クモ膜下製剤、吸入可能用製剤、経皮製剤、皮内製剤、腔内製剤、植え込み用製剤、イオン泳動製剤、眼用製剤、膣製剤、関節内製剤、耳内製剤、静脈内製剤、筋肉内製剤、腺内製剤、器官内製剤、リンパ管内製剤、植え込み用製剤、徐放性製剤、および腸溶性コーティング製剤からなる群から選択される、請求項34に記載の製剤。
【請求項３６】
キャリアが固体キャリアおよび液体キャリアからなる群から選択され、経口製剤である、請求項35に記載の製剤。
【請求項３７】
一定量のキャリアおよび標的PDE核酸に対して組成物を到達させることができるオリゴ
ヌクレオチド化合物を含む請求項10に記載の組成物を被検体に投与することを含む、標的ポリヌクレオチドに対して医薬組成物を送達するためのin vivo方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチド化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAおよびリボザイムから選択される、請求項10に記載の組成物。
【請求項３９】
局所投与用である、請求項34に記載の製剤。
【請求項４０】
被検体におけるcAMPの減少と関連する疾患を治療するために有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物を内部に含有するパッケージ材料を含む製品であって、前記組成物は薬学的に許容可能なキャリアおよびPDE遺伝子を阻害するために有効なアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド化合物を含み、前記オリゴヌクレオチド化合物はその遺伝子に対して少なくとも50％相補的であり、前記パッケージ材料は組成物が前記疾患を治療するために有用
であることを示唆する標識を含む、前記製品。
【請求項４１】
被検体におけるcAMPの減少と関連する疾患を治療するために有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物を内部に含有するパッケージ材料を含む製品であって、前記組成物が薬学的に許容可能なキャリアおよび少なくとも2種のアンチセンスオリゴヌクレオチド化
合物の組み合わせを含み、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、異なるPDE標的
遺伝子を下方制御することができ、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物がその標的遺伝子の20％未満の阻害を示す濃度で存在し、そして組み合わせることにより少なくとも1
つの標的遺伝子の阻害の2倍有効であり、製品のパッケージ材料は組成物を使用して前記
疾患を治療することができることを示唆する標識を含む、前記製品。
【請求項４２】
前記標識が、組成物を使用してPDE-関連疾患を治療することを示唆する、請求項40に記載の製品。
【請求項４３】
前記標識が、組成物を使用してPDE-関連疾患を治療することを示唆する、請求項41に記載の製品。
【請求項４４】
前記化合物の少なくとも部分が、RNAとハイブリダイズして、オリゴヌクレオチド-RNA
二重鎖を形成する、請求項1に記載の化合物。
【請求項４５】
オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、RNAにハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二重鎖を形成す
ることができる前記RNAオリゴヌクレオチドの少なくとも部分を有するRNAオリゴヌクレオチド、またはキメラオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療のために使用する方法、試薬および組成物に関する。具体的には、本発明は、例えば炎症性症状などのPDE-関連疾患を含む、患者におけるcAMPの減少と関連する疾患を治療する際に、アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療をを使用することに関する。本発明はまた、サイクリックAMPホス
ホジエステラーゼが関与する、遺伝子治療方法および新規なアンチセンスに基づくストラテジーを同定するための方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
肺胞上皮および気道上皮は、酸化ストレス、敗血症、内毒素血症、および肺におけるその他の重症疾患に対する炎症性反応および代謝性反応を制御するために重要な役割を果たす動的バリアとして認識される。呼吸器上皮は特に、上皮-血液インターフェースでの炎
症性症状／感染性症状の最初の標的であり、そして炎症性細胞を導入しそして炎症性メディエーターを産生することにより、それ自体が炎症性シグナルを増幅させることができる。
【０００３】
慢性的閉塞性肺疾患（COPD）は、炎症の持続的な亢進制御が原因であると考えられている、炎症性の気道疾患および肺胞疾患の一例である。COPDにおける炎症は、好中球、CD8
陽性リンパ球、およびマクロファージの気道中への浸潤が増加することを特徴とする。好中球およびマクロファージは、組織炎症および組織損傷を促進するエステラーゼ、メタロプロテアーゼ、および酸素ラジカルを含む多数のメディエーターを放出する能力を有するため、COPDにおける気道炎症の病因において重要な役割を果たしている。COPDを有する患者の気道中での炎症性細胞の蓄積が、炎症性細胞を気道中に誘因し、それらを活性化し、そしてそれらの存在を維持する、前炎症性サイトカインの放出およびケモカインの放出が増加することにより駆動されることが示唆された。存在する細胞はまた、組織に対して悪影響を及ぼし、そして疾患を永続化する、酵素（メタロプロテアーゼのようなもの）および酸素ラジカルを放出する。多数の前炎症性サイトカインおよびケモカインが、COPDを有する患者の肺において増加することが示された。中でも、COPDを有する患者の気道において増加する腫瘍壊死因子α（TNF-α）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、およびインターロイキン8（IL-8）が、重要な役割を果たす。
【０００４】
炎症が役割を果たしていると思われる呼吸器疾患のその他の事例には：喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性拒絶および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および副鼻腔炎が含まれる。喘息は、気道炎症、可逆性閉塞および気道過敏反応により規定される。この疾患において、関与する炎症性細胞は、好中球およびマクロファージも重要ではあるが、主として好酸球、Tリンパ球およびマスト細胞である。多数のサイト
カインおよびケモカインが、気道において増加しそして炎症、閉塞、および過敏反応を促進することにより、この疾患の病態生理学において役割を果たしていることが示された。
【０００５】
好酸球性咳は、気道閉塞または過敏反応の非存在下での、慢性の咳および患者の気道内での炎症性細胞（そのほとんどは好酸球である）の存在を特徴とする。いくつかのサイトカインおよびケモカインは主として好酸球指向性であるが、それらがこの疾患において増加する。好酸球は、気道中に導入されそして活性化され、そして炎症および咳を永続化させる際に役割を果たしている酵素および酸素ラジカルを放出する可能性がある。
【０００６】
急性気管支炎は、感染または花粉、ダスト、ガスおよび化学物質による下部気道の刺激性現象の際に生じる、急性疾患である。慢性気管支炎は、年間少なくとも3ヶ月間のほと
んどの日に、2年間にわたり、咳および粘液の生成が存在することにより規定される。急
性または慢性気管支炎のあいだ、気道内部において、広範囲のケモカインおよびサイトカインを伴う炎症性細胞（ほとんどが好中球）を見いだすこともできる。これらのメディエーターは、これらの疾患のあいだに生じる炎症、症候、および粘液産生において役割を果たしていると考えられている。
【０００７】
肺移植は、末期の肺疾患を有する患者において行われている。急性のそしてより重要には慢性の同種移植片拒絶は、われわれの体内の炎症性細胞、リンパ球、がドナー器官を“自己”として認識しない場合に生じる。炎症性細胞は、ケモカインおよびサイトカインにより導入され、そして組織破壊を引き起こす多数の酵素を放出し、そして慢性拒絶の場合には、疾患は閉塞性細気管支炎と呼ばれる。
【０００８】
サルコイドーシスは、慢性の非-乾酪性肉芽腫が組織内で生じる原因不明の疾患である
。肺は、最も一般的に影響を受ける器官である。肺気管支肺胞洗浄により、大部分はリンパ球、マクロファージが、そして時々好中球および好酸球が増加することが示される。これらの細胞は、サイトカインおよびケモカインにより導入されそして活性化され、そして疾患の病因に関与していると考えられる。
【０００９】
肺線維症は、慢性の呼吸器不全を引き起こしうる進行性かつ慢性の線維症（瘢痕形成）を特徴とする肺組織の疾患である。肺線維症の別のタイプおよび別の原因が存在するが、すべては炎症性細胞の流入および残存、肺組織中にコラーゲン沈着を伴う線維芽細胞の活性化および増殖により特徴づけられる。これらの現象は、肺組織内でのサイトカインおよびケモカインの放出と関連している様である。
【００１０】
急性鼻炎は、例えば花粉、ダスト、ガスまたは化学物質による、鼻または上部気道の感染または刺激性現象のあいだに生じる急性疾患である。慢性鼻炎は、定常的な慢性鼻水、鼻詰まり、くしゃみおよび心因性掻痒の存在により規定される。急性または慢性鼻炎のあいだ、上部気道中に、広範囲のケモカインおよびサイトカインを伴う炎症性細胞を見いだすこともできる。これらのメディエーターは、これらの疾患のあいだに生じる炎症、症候、および粘液生成において役割を果たしていると考えられる。
【００１１】
急性副鼻腔炎は、急性で、通常は感染性の洞の疾患であり、発熱を伴うかまたは伴わない、鼻詰まり、鼻水、化膿した粘液、頭痛または洞の痛みを特徴とする。慢性副鼻腔炎は、急性副鼻腔炎の症候が6ヶ月以上持続することにより規定される。急性または慢性の副
鼻腔炎のあいだ、上部気道内および洞内で、広範囲のケモカインおよびサイトカインを伴う炎症性細胞を見いだすこともできる。これらのメディエーターは、これらの疾患のあいだに生じる、炎症、症候、および粘液の生成において役割を果たしていると考えられる。
【００１２】
上述したように、これらの炎症性呼吸器疾患は、すべてが症候を引き起こす酵素または酸素ラジカルを放出する別の炎症性細胞を導入しそして活性化するメディエーターの存在、炎症の持続性、そして慢性の場合には正常組織の破壊または分解を特徴とする。
【００１３】
論理的な治療アプローチは、サイトカインおよびケモカインの生成および炎症性細胞反応を下方制御することであろう。このことは、局所性または全身性コルチコステロイドのいずれかを利用することにより、上述した疾患のすべてにおいて行われ、様々なレベルの成功を得た。コルチコステロイドは、免疫抑制性であり、そして炎症性細胞に対してだけでなく、持続的に投与される時に毒性を誘導する生体のその他の細胞に対しても、作用を有する。
【００１４】
COPD、喘息、およびその他の炎症性呼吸器疾患に関する投薬が利用可能であるにも関わらず、これらの疾患の罹患率および死亡率は、依然として安定な状態のままであるか増加している。炎症性呼吸器疾患の治療のための満たされていない医薬的な必要性が存在し、そして革新的な治療薬が必要とされることは明らかである。アンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療は、伝統的な治療ストラテジーの望まれない毒性作用を伴わない、特定の遺伝子の発現を選択的に減少させるための、新規な代替アプローチを提案する。アンチセンス治療は、いくつかの疾患の治療に関して現在検討されている。炎症性メディエーターの受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを肺に投与し、そしてそれらの標的を下方制御したことが以前に示された（W099/66037）。
【００１５】
抗-炎症性メディエーターまたは酵素の放出に対する作用を減少させた多数の細胞によ
り、前-炎症性サイトカインおよびケモカインの放出を減少させる治療アプローチは、炎
症性呼吸器疾患またはいずれかその他の全身性炎症性疾患に関して、現在の治療を超える利点を有する可能性がある。
【００１６】
サイクリックヌクレオチドcAMPおよびcGMPは、シグナル伝達経路および機構に関与する、ユビキタスな二次メッセンジャーである。哺乳動物細胞は、複数の複雑なフィードフォワード機構およびフィードバック機構を介してサイクリックヌクレオチドの生成および不活性化を制御する、複雑で高度に保存された酵素の補足物を進化させた。cAMPおよびcGMPは両方とも、それらのそれぞれの三リン酸（ATPおよびGTP）から、アデニリル（アデニレート）シクラーゼまたはグアニリル（グアニレート）シクラーゼの触媒活性により、形成される（Essayan D. M. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) inhibitors and immunomodulation. Biochem. Pharmacol., 1999, 57, 965-973中に記載される）。cAMP/cGMPの不活性化は、サイクリック-ヌクレオチド-依存性ホスホジエステラーゼ（PDE）によ
り触媒された、3'-ホスホジエステル結合の加水分解性切断により達成され、その結果、
対応する不活性の5'-モノホスフェートが形成される（Essayan, 1999 and Perry M. J. and Higgs G. A. Chemotherapeutic potential of phosphodiesterase inhibitors. 1998,
Curr Opin Chem Biol. 4: 472-81に記載される）。
【００１７】
炎症性反応およびその進行が、サイクリックヌクレオチドの定常状態レベルの修飾に非常に感受性であることが示された。この場合、それらの作用についての標的細胞が、免疫細胞を超えて気道平滑筋細胞、上皮細胞、および内皮細胞などのアクセサリー細胞、およびニューロンを含む様に拡大される（Perry and Higgs, 1998；Essayan, 1999）。この点に関して、細胞内のサイクリックヌクレオチドの修飾が炎症性環境を制御する際に主要な役割を果たすという新たな概念が、炎症性／自己免疫性応答の標的化することおよび改良することにおいて、近年進化してきた。サイクリックヌクレオチドPDEは、数が増えつつ
ある複数遺伝子を含む大きなファミリーであり、少なくとも11種のファミリーのPDE酵素
が含まれる。従って、選択的そして非選択的PDE阻害剤のin vitroおよびin vivoプロファイルから、抗うつ薬、抗増殖性物質、免疫修飾物質、子宮収縮抑制薬、変力物質／変周期性物質、そして細胞防御薬などの潜在的な治療用途が示唆される。
【００１８】
細胞内のcAMPは、平滑筋弛緩、活性化、そして増殖においてだけでなく、炎症性細胞によるメディエーターの放出の修飾においても、基本的な役割を有している様である。cAMPレベルの減少により、気道上皮細胞において、TNF-α、GM-CSF、およびIL-8などの炎症性メディエーターの生成増加が引き起こされる可能性がある。
【００１９】
炎症性／自己免疫性／感染性疾患だけでなく、細胞の恒常性におけるサイトカインの制御機能の分子的機構についての洞察により、薬理学的治療のための治療ストラテジーを設計するための新たなアプローチを提供されはじめた。そのような新たなアプローチの一つ
は、PDE酵素阻害の化学療法剤としての潜在性であり、それは広範囲の疾患状態にわたる
有望な治療薬についての現象の多様性および複雑性スキームを示す。PDE阻害の機構的理
解の一つは、サイクリックヌクレオチド（cAMP/cGMP）の免疫修飾特性に集中しており、
それにより抗炎症性の治療用途を明瞭に示すことができる道筋を開く。
【００２０】
炎症性反応およびその進行は、サイクリックヌクレオチドの定常状態レベルにおいて、修飾に対して極めて感受性であり、その場合、それらの作用に対する標的細胞は、免疫細胞だけでなく、上皮細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞などの構造的細胞、およびニューロンを含むように拡張される（Perry and Higgs, 1998；Essayan, 1999）。細胞内のサイクリックヌクレオチドの修飾は、炎症性反応を制御する際に主要な役割を果たしている。サイクリックヌクレオチドPDEは、数が増加しつつある複数遺伝子の大型のファミリーで
あり、少なくとも11種のファミリーのPDEイソ酵素を含む。PDEは、それらの組織分布および細胞分布、ならびにヌクレオチド配列およびタンパク質配列を含む分子的特徴および物理化学的特徴、基質特異性、阻害剤感受性、そして共因子必要性において、異なる。異なるファミリーにおいて、組織特異的アイソフォームが、選択的mRNAスプライシングおよび異なるプロモータ利用により、同一の遺伝子から生成される。
【００２１】
cAMP-特異的PDE4酵素ファミリーは、最も広範囲に研究されたPDEの一つである。このファミリー中の酵素は、ほとんどの前-炎症性細胞および免疫細胞中に見いだされ、その場
合、それらはcAMP代謝の制御において中心的な役割を果たす。PDE4酵素は、マクロファージ、好中球、細胞傷害性CD8+ T細胞、気管上皮細胞、および気道平滑筋細胞において発現される。さらに、PDE4阻害剤は、呼吸器疾患の動物モデルにおいて、炎症を修飾するが、このことから、PDE4が、低分子阻害剤を用いて治療するための治療ベースのストラテジーにおいて、適切な標的であることをを示す可能性があることが示唆される。抗-PDE4薬は
、細胞内cAMPの加水分解を阻害し、それに引き続いて気管支拡張および炎症性反応の抑制が提供される。シロミラスト（cilomilast）およびロフルミラスト（roflumilast）など
の選択的PDE4阻害剤は、好中球炎症の動物モデルにおいて活性である（Bundschuch DS et
al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, 297: 280-290）。
【００２２】
気道炎症の治療のためのPDE4阻害剤の使用が、集中的に臨床で研究されている最中であるが、いくつかの阻害剤は、吐き気および嘔吐が、最も一般的な生理学的徴候である、毒性、用量限定的副作用のために脱落した。結果的には、PDE4阻害剤の治療可能比を改善することにより、今でも研究の重要な分野である主要なチャレンジを提起する。
【００２３】
気道平滑筋および炎症性細胞におけるPDE3およびPDE4の高い活性を伴う、標的組織中の酵素の分布を考慮して、これらの酵素の選択的阻害剤が、慢性気道閉塞の治療に対して追加されうる。一般的に、低分子阻害剤は、PDEのイソ酵素すべてを阻害する弊害作用の可
能性を評価することなく、1またはいくつかのPDEに対して焦点を当ててきた。例えば、PDE4アンタゴニストの原因である毒性のほとんどが、PDE4アイソタイプDの阻害を介して生
じうることが示唆された。さらに、本明細書中で示されるように、PDEの特定のイソ酵素
の阻害が、すべての前-炎症性メディエーターを減少させる。しかし、アイソタイプ特異
的オリゴヌクレオチドの組み合わせにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正しい組み合わせを使用する場合に、ずっと幅広い作用を引き起こすことができる。
【００２４】
PDE3ファミリーは、2種の異なる遺伝子、PDE3AとPDE3Bとを含有し、それらはcGMP-阻害され、そしてcAMPに対して高い親和性を示す。各PDE3遺伝子は、少なくとも2種のスプラ
イスアイソフォームをコードする。PDE3Aは、平滑筋、血小板、および心臓組織において
同定された。PDE3Bは、脂肪細胞および肝臓細胞において最も豊富である。しかしながら
、選択的PDE3阻害剤またはPDE4阻害剤との組み合わせを用いた臨床試験から得られた初期のデータは、いくらかがっかりするものであり、予想をかなり下回るものであった。これ
は、これらの薬物は限定的な効力を有しており、そしてそれらの使用が副作用により臨床的に限定されたためである。
【００２５】
PDE7は、最初ヒト神経膠芽細胞腫から単離された。PDE7Aは、cGMPとPDE3およびPDE4の
阻害剤とに非感受性であり、その他のcAMP PDEとは異なるアミノ酸配列を有する、cAMP-
特異的PDEをコードする。ヒトにおいては、2種の遺伝子（PDE7AおよびPDE7B）が特定された。PDE7A遺伝子は、選択的mRNAスプライシングにより同一の遺伝子に由来する3種のイソ酵素（PDE7A1、PDE7A2、およびPDE7A3）をコードする。ヒトにおいて、PDE7A2 mRNAは、
骨格筋、心臓、および腎臓において豊富に発現されているが、一方精巣、肺、および免疫系（胸腺、脾臓、リンパ節、血液白血球）は、PDE7A1の豊富な供給源である。さらに、活性化された（天然のものではない）ヒトTリンパ球が、スプライシング変異体PDE7A3を発
現する。対照的に、PDE7Bは、ヒトにおける単一のイソ酵素として存在し、それはPDE7Aと約70％の配列同一性を共有するが、別個の力学的特性を有する。PDE7Bは、脳において、
そして肝臓、心臓、甲状腺、および骨格筋を含む多数のその他の組織において、主として発現される。ヒトナイーブT細胞を抗-CD3および抗-CD28抗体で刺激すると、IL-2産生とクローン性増殖が促進されることが示された。これらの作用は、PDE7Aの原因となり、そし
てこの酵素の下方制御により、リンパ球増殖が阻害される（Li L et al.,Science, 1999,
283, 848-851）。
【００２６】
PDE4ファミリーは、4つの異なる遺伝子（PDE4 A〜D）を含有する。この遺伝子の選択的スプライシングにより、複数のスプライシング変異体が報告され、そして2つの主要なグ
ループ、長いものと短いもの、に分類される。PDE4A、BおよびD遺伝子産物はほとんどの
免疫細胞および炎症性細胞において見いだされる。これらは、Burnouf C.およびPruniaux
M. P.（Current Pharmaceutical Design 2002; 8: 1255-1296）に記載されるように、構成的に存在するか、または活性化後に存在する。PDE4のすべてのアイソタイプまたは特定のアイソタイプの阻害は、いくつかの炎症性メディエーターの下方制御と関連している；しかしながら、特定の前-炎症性サイトカイン（例えば、IL-6）の増加が記載されている
（Giembycz M. A. Expert Opin Invest Drugs 2001, 10: 1361-1379）。
【００２７】
従って、3つのPDE酵素のすべてを阻害することが好ましい；しかしながら、このアプローチは、これらのそれぞれの酵素の阻害剤を投与することにより記述されてきた毒性により、悩まされるだろう。アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所適用は、酵素阻害の全身毒性を回避する可能性があるが、しかしこのアプローチが実務的であるためには、これらのPDEのイソ酵素は多すぎるようである。PDE酵素の1またはいくつかのアイソタイプの阻
害は、完全なPDE阻害と同じくらい有効というわけではない可能性がある。というのも、
その他のアイソタイプが、前-炎症性作用を有するために存在するためである。
【００２８】
従って、炎症性呼吸器疾患の治療のためには、より少ない抗-炎症性メディエーターま
たは阻害性酵素に影響を与えるあいだ、前-炎症性メディエーターおよびそれらの細胞を
下方制御する方法を追求することが好ましい様である。従って、PDE酵素の選択されたア
イソタイプに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせを治療的に適用することが、炎症性呼吸器疾患またはサイクリックAMPの増加が役割を果たしているいずれかの
疾患についての治療として、本明細書中において提案される。
【００２９】
発明の概要
本発明は、オリゴヌクレオチド化合物が指向するPDEアイソタイプ遺伝子を下方制御す
る際に有効であるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、ならびにオリゴヌクレオチド化合物が指向するPDEアイソタイプ遺伝子だけでなくその他のPDEアイソタイプ遺伝子および炎症性遺伝子を含むその他の関連遺伝子も下方制御する際に有効である選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を提供する。本発明はまた、それぞれが異なるPDE標
的遺伝子に対し、それぞれがPDE標的遺伝子を下方制御しまたは阻害するために有効な、
少なくとも2種のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせを含む組成物を提
供する。ここで、各オリゴヌクレオチド化合物は、その標的遺伝子の20％未満の阻害を示す濃度で組合わさって存在し、オリゴヌクレオチド化合物を組み合わせることにより、20％以上の阻害であって少なくとも一方の標的遺伝子の阻害の少なくとも2倍の阻害を示す
。本発明はさらに、薬学的に許容可能なキャリアおよび上述した少なくとも2つのアンチ
センスオリゴヌクレオチドの組み合わせを含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
本発明の組み合わせは、複数遺伝子ノックダウンと呼ばれるアプローチにより、阻害活性を発揮するようである。複数遺伝子ノックダウンは：
1）アンチセンスオリゴヌクレオチドがそのオリゴヌクレオチドが指向する遺伝子を下
方制御するだけでなく、その他の関連遺伝子を下方制御すること；そして
2）それぞれがアンチセンスオリゴヌクレオチドが実際上、その標的とする遺伝子を下
方制御するためには有効ではない濃度で存在する、少なくとも2つのアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの組み合わせであって、その組み合わせによりアンチセンスオリゴヌクレオチドが指向する両遺伝子および場合によりその他の関連遺伝子の顕著な下方制御が引き起こされる前記組み合わせ；
を包含する。
【００３１】
本発明は、上述したアプローチを使用して、患者におけるcAMPの減少と関連する疾患（呼吸器疾患、そしてより具体的にはCOPDおよび喘息を含む、PDE-関連疾患および炎症性疾患を含む）を治療しおよび／または予防するための方法、組成物、およびキットを提供する。
【００３２】
本発明は、少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含む組成物を提
供する。各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、異なる遺伝子を下方制御することができ、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物がその標的とする遺伝子を下方制御するためにそれ自体は実際上有効ではない濃度で存在し、そして少なくとも2つのアンチセン
スオリゴヌクレオチド化合物を組み合わせることにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が標的とするそれぞれの遺伝子および場合によりその他の関連遺伝子を顕著に下方制御する。本発明はまた、炎症性呼吸器疾患の治療および／または予防において組成物を使用することを提供する。
【００３３】
本発明は、異なるPDEイソ酵素遺伝子を下方制御することができる少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。それぞれのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的とするPDE遺伝子を下方制御するためにそれ自体は実際上有
効ではない濃度で存在し、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを組み合わせることによ
り、オリゴヌクレオチドが標的とする両遺伝子および場合によりその他の関連する遺伝子を顕著に下方制御する。本発明はまた、炎症性呼吸器疾患の治療および／または予防において組成物を使用することを提供する。
【００３４】
本発明はまた、発現を減少させ、その結果として細胞サイクリックAMPホスホジエステ
ラーゼの活性を減少させ、そしてそれにより細胞内cAMPとサイトカイン／ケモカイン産生との正しいバランスを維持するための方法、試薬、および組成物を提供する。
【００３５】
本発明はさらに、PDE発現を阻害することができ、そして細胞内のcAMPレベルを上昇さ
せることができる、新規アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、薬物およびワクチンの組み合わせを、in vitro、in vivoおよびex vivoで同定し／スクリーニングするための方法およびツールを提供する。
【００３６】
本発明はまた、遺伝子に基づく治療を提供し、そして1またはそれ以上のアンチセンス
オリゴヌクレオチド化合物を、細胞トランスフェクションのために使用するか、またはPDEアイソタイプ遺伝子発現を阻害するためにヒトおよび動物に対して送達するトランスフ
ェクション法を提供する。
【００３７】
本発明はさらに、PDEの中でも、PDE3アイソタイプ（例えば、PDE3AおよびPDE3B）、PDE4アイソタイプ（PDE4A、PDE4BおよびPDE4D）およびPDE7アイソタイプ（PDE7A）に対して
有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３８】
本発明はさらに、；Seq. ID No. 3；Seq. IDNo. 4；Seq. ID No. 7；Seq. ID No. 15；Seq. ID No. 17；Seq. ID No. 19；Seq. ID No. 20；Seq. ID No. 25；Seq. ID No. 27；Seq. ID No. 35；Seq. ID No. 36；Seq. ID No. 37；Seq. ID No. 41；Seq. ID No. 42；Seq. ID No. 43；Seq. ID No. 45；Seq. ID No. 51；Seq. ID No. 55；Seq. ID No. 58；Seq. ID No. 64；Seq. ID No. 72；Seq. ID No. 73；Seq. ID No. 74；Seq. ID No. 81；Seq. ID No. 86；Seq. ID No. 131；Seq. ID No. 132；Seq. ID No. 139；Seq. ID No. 140；Seq. ID No. 145；Seq. ID No. 150；Seq. ID No. 152；Seq. ID No. 153；Seq. ID No. 154；Seq. ID No. 155；Seq. ID No. 156からなる群から選択される配列を有する、
本発明の組成物および方法において有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。（表1a〜f）。
【００３９】
本発明のその他の目的および利点は、添付の図面を参考にして作製される、いくつかの好ましい態様の以下の非限定的な記載を読む際に、あきらかであろう。
【００４０】
表の簡単な説明
表1aは、本発明によるヒトPDE7Aオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である；
表1bは、本発明によるヒトPDE3Aオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である；
表1cは、本発明によるヒトPDE3Bオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である；
表1dは、本発明によるヒトPDE4Aオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である；
表1eは、本発明によるヒトPDE4Bオリゴヌクレオチドアンチセンスを示す；
表1fは、本発明によるヒトPDE4Dオリゴヌクレオチドアンチセンスを示す；
表2aおよび2bは、標準的PCRにおいて使用するヒトオリゴヌクレオチドプライマーを示
す；
表2cは、リアルタイムPCRにおいて使用するヒトオリゴヌクレオチドプライマーを示す
；
表2dは、リアルタイムPCRにおいて使用するマウスオリゴヌクレオチドプライマーを示
す；
表3aおよび3bは、細胞株、初代細胞および組織におけるヒトPDE発現パターンを示す；
表4aは、ヒトPDEオリゴヌクレオチドアンチセンスの、A549細胞株中およびヒトPBMC中
での初回スクリーニングの概要を示す；
表4bは、複数遺伝子ノックダウン効果によるヒトPDE単一アンチセンスを示す；そして
表5は、マウスPDEオリゴヌクレオチドアンチセンスのin vivoでの初回スクリーニング
を示す。
【００４１】
発明の詳細な説明
本明細書中の発明は、細胞のcAMPの減少と関連する疾患および／または少なくとも1種
類のPDEレベルの亢進と関連する疾患を治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド-ベースの化合物、治療用組成物、および方法に関する。本発明は、細胞中のcAMPレベルを上昇させることを目的とし、一方で炎症性細胞により放出される前炎症性メディエーターならびに酵素のレベルを減少させることを目的とする。
【００４２】
これらの作用を得るため、本発明は、その一側面において、本明細書中で“複数遺伝子ノックダウン”と呼ばれるものを利用する。複数遺伝子ノックダウンは、単一のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が標的とするイソ酵素遺伝子だけでなく、関連する（1ま
たは複数の）遺伝子を下方制御する本発明の単一のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物によるか、または異なるイソ酵素遺伝子をそれぞれが下方制御する少なくとも2種類の
アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせによるか、のいずれかにより、複数遺伝子を阻害するかまたは下方制御することをいう。
【００４３】
細胞のcAMPレベルの減少と関連する疾患には、少なくとも1種のcAMP-特異的PDEのレベ
ルを増加させる疾患（すなわち、PDE-関連疾患）が含まれる。
用語“下方制御”は、本明細書中で、遺伝子の発現の少なくとも部分的な阻害のことをいうために使用される。本発明に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、そのオリゴヌクレオチド化合物が標的とする遺伝子、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が阻害を引き起こすに十分な配列相補性を示す遺伝子、を下方制御しまたは阻害する。
【００４４】
用語“関連遺伝子”は、細胞のcAMPの減少および／または少なくとも1種のPDEレベルの増加に関連する疾患の病態生理学においては役割を果たす可能性があるが、オリゴヌクレオチドアンチセンス化合物が全体としてはまたは部分的には相補的ではない、その他の遺伝子のことをいう。そのような遺伝子には、PDE酵素またはアイソタイプ、メディエータ
ー（例えば、サイトカインおよびケモカイン）をコードする遺伝子、および酵素をコードする遺伝子が含まれるが、これらには限定されない。メディエーターの例としては、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、およびTNF-αが含まれる。適切な酵素の例としては、マトリクス
メタロプロテイナーゼ（MMP）（例えば、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、およびMMP-12）
が含まれるが、これらには限定されない。
【００４５】
本発明に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、天然に存在するかまたは修飾されたオリゴヌクレオチド、好ましくはヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチドであって、mRNAの転写または翻訳を妨害することができるように特定の標的タンパク質をコードするDNAまたはmRNAに対して相補性を示すもの、および／またはRNaseまたはRNase-様活性を誘導しそれにより標的タンパク質の発現を減少させる様に機能するもの、として本明細書中において定義される。標的タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチド化合物が標的DNAまたはmRNAに対してハイブリダイズし、それによりその転写／翻訳が妨害され／阻害
される場合に減少する。従って、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、核酸に対してハイブリダイゼーションするために指向されるように、その核酸に対して十分に相補的でなければならない。従って、最も好ましい態様において、オリゴヌクレオチド化合物は、指向する核酸に対して100％の相補性であるが、当業者が認識する様に、オリゴヌクレオチ
ド化合物と指向する核酸とのあいだで生じるハイブリダイゼーションのためには、100％
の相補性は必要とされない。
【００４６】
本発明は、標的タンパク質の発現を減少させまたは阻害させるその活性に顕著な悪影響を及ぼさず、しかしこの活性を亢進する可能性がある、（1または複数の）アンチセンス
オリゴヌクレオチドに対する修飾にも関する。用語“核酸”および“核酸分子”は、本明細書中では互換的に使用されるが、ヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその両方からなる分子のことを指す。用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、ポリマーの場合には、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドが5'から3'結合で共に連結されている。しかしながら、結合には、例えば、5'-2'結合を含む核酸を含む、核酸合
成技術において既知のどのような結合が含まれていてもよい。核酸分子において使用されるヌクレオチドは、天然に存在するものであってもよく、または天然に存在する塩基対と
塩基対合の関連を形成することができる合成的に生成した類似体であってもよい。塩基対合の関連を形成することができる天然には存在しない塩基の例としては、アザおよびデアザピリミジン類似体、アザおよびデアザプリン類似体、およびプリン環およびピリミジン環の1またはそれ以上の炭素原子および窒素原子がヘテロ原子（例えば、酸素、イオウ、
セレン、リンなど）により置換されたその他のヘテロ環式塩基類似体が含まれるが、これらには限定されない。
【００４７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、それらの活性に顕著な悪影響を及ぼさない1またはそれ以上の塩基の挿入または欠失により修飾されていてもよい。特に、
指向する遺伝子に対して100％の相補性を示すオリゴヌクレオチドの末端での塩基の挿入
または欠失は、一般に阻害活性を顕著に失うことなく作製することができる。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を上昇させるかまたは安定性を向上させるために作製することができる。加えて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物における1
またはそれ以上の塩基の置換は、例えば、プリンをプリンに置換すること（アデニン、グアニン）およびピリミジンをピリミジンに置換すること（シトシン、チミン、ウラシル）は、活性に悪影響を及ぼすことなく作製することができる。
【００４８】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、RNAi（RNA干渉）アプローチ
をもたらす、siRNA（低分子干渉RNA）およびRISC（RNA-誘導サイレンシング複合体）もまた含む。RNA干渉（RNAi）アプローチは、最近記述されたものであるが、標的遺伝子の発
現を阻害するための新たなツールと考えられている。数年前に既に知られているように、RNAiは、下等真核生物において古くからある抗-ウィルス防御機構に基づくものである。
それは、二重鎖RNAにより引き起こされ、RISC複合体の補助のもとで一本鎖様式で標的mRNAにハイブリダイズした後、相同的な内在性mRNAの分解を引き起こす、21〜23 ntの低分子干渉RNA（siRNA）へプロセシングされることにより引き起こされる。RNAiが機能する方法は、完全には解明されていないが、幅広い真核生物種（例えば線虫類、ハエ類、植物類、真菌類、および哺乳動物類）のあいだで、機能欠損表現型を作製するための最初に選択するアプローチとして既に機能している。
【００４９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物には、in vitroおよび／またはin vivoで遺伝子の転写および／または翻訳を阻害することができる、上述した化学的修飾を取
り込んでいてもよい、リボザイムおよび低分子ヌクレオチド配列、一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNAもまた含まれる。
【００５０】
特定の作用機序に縛られる訳ではないが、本発明の組成物および方法は、一側面において、“複数遺伝子ノックダウン”と呼ばれているメカニズムにより作用する様である。本発明の文脈における複数遺伝子ノックダウンは：
1）指向する遺伝子を下方制御するだけでなく、その他の関連する遺伝子も下方制御す
るアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物；および
2）それぞれがある遺伝子を下方制御することができるが、それぞれのアンチセンスオ
リゴヌクレオチド化合物は指向する遺伝子を下方制御するためにそれ自体は実際には有効ではない濃度で存在し、しかし組み合わせることによりアンチセンスオリゴヌクレオチドが指向しそしてその他の関連する遺伝子を下方制御することもできる両遺伝子を顕著に下方制御するような、少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わ
せ；
のことをいう。
【００５１】
一側面において、本発明は、細胞のcAMPの減少および／または少なくとも1つのPDEレベルの上昇と関連した疾患を治療しおよび／または予防するための医薬組成物を提供する。前記組成物は、薬学的に許容可能なキャリアおよび少なくとも2つのアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド化合物を含み、各オリゴヌクレオチド化合物は異なる標的PDEをコードする
遺伝子の少なくとも部分を指向し、各オリゴヌクレオチド化合物は指向する標的遺伝子を下方制御することができ、各オリゴヌクレオチド化合物はその標的PDE遺伝子の20％未満
の阻害を示す濃度で存在し、組み合わせることにより20％以上の阻害かつ少なくとも一方の標的遺伝子および場合によりその他の関連する遺伝子の阻害の少なくとも2倍の阻害を
示す。
【００５２】
当業者は理解するであろうが、非常に低濃度の、例えば標的PDE遺伝子の1％未満の阻害を示す濃度の、本発明のオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせは、少なくとも20％の阻害を示すように組み合わせなくてもよい。本発明に従って各オリゴヌクレオチド化合物を使用して組み合わせを形成する最低の濃度は、変化してもよく、そしてこの濃度は、0.5
％の阻害が達成される濃度であってもよく、または1％〜5％の阻害が達成される濃度であってもよい。
【００５３】
本発明は、細胞のcAMPの減少および／または少なくとも1つのPDEレベルの上昇と関連した疾患を、治療しおよび／または予防するための医薬組成物を提供する。前記組成物は、薬学的に許容可能なキャリアおよび少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを
含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、異なる標的遺伝子を下方制御することができ、オリゴヌクレオチドの少なくとも一方はそれ自体では実際には有効ではない濃度、例えば標的遺伝子の20％未満の阻害を示す濃度、で存在し、オリゴヌクレオチドを組み合わせることにより、20％以上の阻害かつ少なくとも一方の標的遺伝子およびその他の関連する遺伝子の阻害の少なくとも2倍の阻害を示す。
【００５４】
本発明はさらに、細胞のcAMPの減少と関連した疾患（例えば、呼吸器の炎症性疾患）を治療しおよび／または予防するために、少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド化合物の組み合わせを使用することを提供する。ここで、各オリゴヌクレオチド化合物は、異なるPDEアイソタイプをコードする遺伝子に対するものであり、各オリゴヌクレオ
チド化合物は指向する遺伝子を下方制御することができ、オリゴヌクレオチド化合物は、各オリゴヌクレオチドが指向する遺伝子を下方制御するためにはそれ自体では実際には有効ではない濃度で存在し、その少なくとも2つのオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせ
は、オリゴヌクレオチド化合物が指向する遺伝子の少なくとも一方および場合により他の関連する遺伝子を下方制御するために有効である。
【００５５】
本発明はさらに、被検体に対して少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチド化
合物を投与することを含む、細胞のcAMPの減少に関連する疾患（例えば、炎症性呼吸器疾患）を治療しおよび／または予防するための方法を提供する。ここで、各オリゴヌクレオチドは、異なる標的PDE遺伝子を下方制御することができ、オリゴヌクレオチド化合物は
、オリゴヌクレオチド化合物がその標的遺伝子を下方制御するためにはそれ自体では実際には有効ではない濃度、例えば標的遺伝子の20％未満の阻害を示す濃度、で投与され、オリゴヌクレオチド化合物の組み合わせが、オリゴヌクレオチド化合物が指向する遺伝子の少なくとも一方および場合により他の関連する遺伝子を下方制御するために有効である。
【００５６】
本発明はさらに、細胞のcAMPの減少またはcAMP-特異的PDEレベルの上昇と関連した疾患（PDE-関連疾患）（例えば、炎症性疾患）の治療および／または予防のための医薬を製造するための、上述した医薬組成物の使用を提供する。本発明の方法および組成物が指向する炎症性疾患は、炎症性細胞および／またはメディエーターが関与する疾患として一般的には定義される。炎症性疾患の例としては、多発性硬化症、接触性皮膚炎、アレルギー性および非アレルギー性眼疾患、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、骨粗鬆症および認識障害が含まれるが、これらには限定されない。本発明の方法および組成物が指向する炎症性呼吸器疾患は、炎症性細胞およびメディエーターが存在する呼吸路および肺の疾患と
して一般に定義される。炎症性呼吸器疾患の例としては、COPD、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性拒絶および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎が含まれるが、これらには限定されない。
【００５７】
本発明はさらに、サイクリックAMPの減少が病態生理学的に関与する疾患を治療および
／または予防するための医薬を製造するために、上述した医薬組成物を使用することを提供する。
【００５８】
本発明はさらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾して、オリゴヌクレオチドが標的ヌクレオチドに到達することができおよび／または炎症性呼吸器疾患を治療および／または予防するために標的遺伝子に対してより有効となることができるようにするための方法を提供することに関する。
【００５９】
本発明はまた、全身性および／または局所性である上述した組成物を含む組成物を提供する。
本発明はさらに、医薬組成物を、その組成物が（1またはそれ以上の）標的遺伝子に対
して到達することができるようにするサーファクタントとを組み合わせて、被検体に対して投与することを含む、標的ポリヌクレオチドに対して医薬組成物を送達するためのin vivo方法を提供する。
【００６０】
好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を用いて治療することができる被検体または患者には、無脊椎動物、脊椎動物、鳥類、哺乳動物、例えばブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、および特にヒト、が含まれるが、これらには限定されない。本発明によるオリゴヌクレオチド化合物は、治療される特定の動物に対して適切となる様に設計される。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の配列は、治療される被検体は種内でゲノムの相違を有することにより変化するだろう。
【００６１】
本発明はさらに、例えば、PDEファミリーの酵素（PDE3、PDE4およびPDE7を含むがこれ
らには限定されない）の発現を阻害することができる、酵素に対して有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。当業者には理解されるように、各PDEサブタイプには、
アイソタイプが含まれていてもよい。例えば、PDE3サブタイプには、PDE3AおよびPDE3Bアイソタイプが含まれる；PDE4サブタイプには、アイソタイプPDE4A、PDE4B、PDE4C、およ
びPDE4Dが含まれる；そしてPDE7サブタイプには、アイソタイプPDE7A1、PDE7A2、PDE7A3
、およびPDE7Bが含まれる。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、“アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が実際には有効ではない濃度”という用語は、単独で与えられた場合に、オリゴヌクレオチド化合物が指向される遺伝子に関して実際には何も下方制御が観察されない濃度（標的遺伝子の20％未満の阻害が示される濃度）で、各オリゴヌクレオチド化合物を使用することを指す。このことは、本発明による少なくとも2つのオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせの作用
とは対照的であり、それぞれは、それぞれが指向する遺伝子を下方制御するためには単独では有効ではない濃度（20％未満の阻害が示される濃度）で存在し、この組み合わせは、20％以上の阻害かつオリゴヌクレオチド化合物が指向する遺伝子の少なくとも一方の少なくとも2倍の阻害を示すために有効である。
【００６３】
単一のオリゴヌクレオチドの有効性の比較は、図13および図14、および表4bおよび表5
に示されるが、これらには限定されない。例えば、図13Aにおいて、マウスPDE4Bを指向するTop 2430は、in vivoでPDE4A、PDE4B、PDE4DおよびPDE7Aを阻害するが、PDE3Bに対しては何ら作用を有さない。
【００６４】
少なくとも2つのオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせの有効性の比較は、図9、図10、図11および図12に示されるが、これらには限定されない。例えば、図9において、Top-1703（Seq. ID No. 4）とTop-1301（Seq. ID No. 35）の組み合わせまたはTop-1706（Seq.
IDNo. 7）とTop-1303（Seq. ID No. 37）の組み合わせは、PDE3AおよびPDE7Aの両方の発現の減少に対して、オリゴヌクレオチドのいずれかがPDE3AまたはPDE7Aの発現のいずれかに対して単独で使用された場合に有する作用よりも、より大きな作用を示す。図11においては、Top-1360（seq. ID No. 58）とTop-1437（Seq. ID No. 86）の組み合わせ、またはTop-1360（Seq. ID No. 58）とTop-1498（seq. IDNo. 140）の組み合わせ、またはTop-1413（Seq. ID No. 74）とTop-1498（seq. IDNo. 140）の組み合わせ、またはTop-1437（Seq. IDNo. 86）とTop-1498（seq. ID No. 140）の組み合わせが、ヒトPBMCにおけるTNF-αの発現および放出の減少に対して、オリゴヌクレオチドのいずれかがTNF-αに対して単独で使用された場合に有する作用よりも、大きな作用を示す。図12において、Top-2437（PDE4B）とTop-2713（PDE7A）の組み合わせをマウスのin vivo鼻点滴注入すると、マウスPDE4BおよびPDE7Aの両方の発現の減少に対して、オリゴヌクレオチドのいずれかが、PDE4BまたはPDE7A発現のいずれかに対して、単独で低濃度で使用された場合に有する作用よりも
大きな作用を示す。
【００６５】
上述した複数遺伝子ノックダウンを引き起こすアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の多数の組み合わせを、本発明に従って使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせの例としては、PDE3を指向する少なくとも1つのオリゴヌクレオチ
ド化合物とPDE7を指向する少なくとも1つのオリゴヌクレオチド化合物との組み合わせが
含まれるが、これには限定されない。組み合わせの別の例には、PDE4を指向する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドとPDE7を指向する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドとの組み合わせが含まれていてもよい。組み合わせの別の例には、PDE3を指向する少なくとも1
つのオリゴヌクレオチド、PDE4を指向する少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、およびPDE7を指向する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドの組み合わせが含まれていてもよい。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は、表1a〜fに提示するオリゴヌクレ
オチドから選択することができるが、これらには限定されない。
【００６６】
本明細書中で使用する場合の用語“オリゴヌクレオチド”は、約1〜約100個のヌクレオチドを含む核酸分子、より好ましくは1〜80個のヌクレオチドを含む核酸分子、およびさ
らにより好ましくは約4〜約35個のヌクレオチドを含むを含む核酸分子のことを指す。用
語“オリゴヌクレオチド”には、上述したように、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド化合物も含まれる。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、用語“修飾オリゴヌクレオチド”および“修飾核酸分子”は、核酸塩基、糖成分、ヌクレオシド間リン酸結合のすべてまたはいずれかの天然の分子構造の分子レベルで1またはそれ以上の化学的修飾、ならびにジアミン、コレステリルま
たはその他の脂肪親和性基などの置換基が追加された分子、またはこれらの部位での修飾の組み合わせ、を有するオリゴヌクレオチドを含む核酸のことを指す。ヌクレオシド間リン酸結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホールアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートおよび／またはスルホンヌクレオチド間結合、または3'-3'結合、2'-5'結合または5'-5'結合、およびその
ような類似する結合の組み合わせ（混合バックボーン修飾オリゴヌクレオチドを生成するため）であってよい。修飾は、オリゴヌクレオチド分子の内部（1回または繰り返し）ま
たは末端（片側または両側）であってもよく、そしてヌクレオシド間リン酸結合の分子に対して、アミノ基と末端リボース、デオキシリボースおよび反対鎖または関連する酵素またはその他のタンパク質を切断しまたは架橋するリン酸修飾とのあいだでの可変数の炭素
残基を有するコレステリル、ジアミン化合物などの付加を含んでいてもよい。リボース-
ジアルデヒドなどの求電子性基は、そのようなタンパク質のリシル-残基のイプシロンア
ミノ基と共有結合していてもよい。オリゴマーに繋がれているn-エチルマレイミドなどの求核性基は、mRNAの5'末端に対してまたはその他の求電子性部位に対して、共有的に結合することができた。用語修飾オリゴヌクレオチドにはまた、2'-置換リボヌクレオチドな
どの糖成分、または5'-3'結合を介して一緒にいずれかが結合されているデオキシリボヌ
クレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾オリゴヌクレオチドはまた、配列の標的特異性が維持されているPNAまたはモルホリノ修飾バックボーンからなる
ものであってもよい。
【００６８】
場合により、現在記述されているオリゴヌクレオチドは、様々な生理学的キャリア分子と共に製剤化することができる。現在記述されているオリゴヌクレオチドはまた、標的細胞中に進入するオリゴヌクレオチドの能力を向上させる分子と複合化されていてもよい。そのような分子の例としては、糖質（carbohydrates）、ポリアミン、アミノ酸、ペプチ
ド、脂質、そして細胞増殖に必須な分子が含まれるが、これらには限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質と組み合わせてもよく、得られたオリゴヌクレオチド／脂質エマルジョンまたはリポソーム懸濁物は、オリゴヌクレオチドのin vivoでの半減期を
とりわけ効果的に向上させることができる。
【００６９】
あるいは、PDE標的に対するオリゴヌクレオチドは、プロトン化／酸性化されて、ホス
ホジエステラーゼ阻害剤かつ抗菌剤として二機能性で機能することもできる。従って、本明細書中で記載する発明の別の態様は、さらにプロトン化／酸性化されて、細胞の取り込みが上昇し、リポソーム中へのカプセル化が向上し、それによりそれが抗菌剤としても機能することができる、治療用オリゴヌクレオチドを修飾するPDEの用途である。さらに、
オリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドのin vivo安定性をさらに向上させ
るか、またはそうでなければその薬理学的特性を向上させる（例えば、in vivoでの半減
期を向上させる、毒性を低下させる、など）、様々な既知の化合物または構造と複合化されていてもよい。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、用語“核酸バックボーン”は、分子中のヌクレオチドを結合する化学的成分の構造のことをいう。これには、ヌクレオチドを化学的に結合するいずれかおよびすべての手段から形成される構造が含まれていてもよい。本明細書中で使用する場合、修飾バックボーンには、ヌクレオチド間の化学的結合、ならびに例えば糖構造の修飾など、安定性および親和性を向上させるために使用することができるその他の修飾が含まれる。例えば、天然の［β］-アノマーに関して塩基が逆向きであるデオキシリボー
スの［α］-アノマーを使用することができる。好ましい態様において、糖基の2'-OHは、親和性を含むことなく、分解に対する耐性を提供する、2'-O-アルキルまたは2'-O-アルキル-n（O-アルキル）へと変化させてもよい。
【００７１】
用語“酸性化”および“プロトン化／酸性化”は、本明細書中で互換的に使用される場合があるが、プロトン（または正の水素イオン）が核酸のプロトンアクセプター部位に付加されるプロセスのことを指す。プロトンアクセプター部位には、核酸の塩基構造のアミン基およびホスホジエステル結合のリン酸基が含まれる。pHが低下するにつれ、プロトン化されるこれらのアクセプター部位の数は増加し、結果として非常に高度にプロトン化／酸性化された核酸が得られる。
【００７２】
用語“プロトン化／酸性化された核酸”は、ml当たり約16のA260の濃度で水に溶解した場合、生理学的pHよりも低いpH、すなわち約pH 7よりも低いpHを有する核酸のことをいう。修飾核酸、ヌクレアーゼ耐性核酸、およびアンチセンス核酸は、この定義に包含されることが意味される。一般的に、核酸は、核酸のpHを減少させうるその他の修飾もまた使用
することができ、そしてこの用語に含まれるものとして意図されるものではあるが、プロトンを核酸上の反応部位に付加することにより、プロトン化／酸性化される。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、用語“末端ブロック化”は、選択したヌクレオチドの例えばヌクレアーゼ作用による分解を妨害する分子レベルでの化学的修飾を伴う核酸のことをいう。この化学的修飾は、核酸の不可欠な部分、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコード領域、を保護する様に位置する。末端ブロックは、3'末端ブロックであっても5'末端ブロックであってもよい。例えば、3'末端ブロックは、分子の最も3'-末端の位置
であってもよく、またはそれが核酸の不可欠な配列の3'であることを前提として、3'末端の内側であってもよい。
【００７４】
用語“実質的にヌクレアーゼ耐性”は、天然に存在する核酸または非修飾核酸と比較して、ヌクレアーゼ分解に対して耐性である核酸のことを指す。本発明の修飾核酸は、その非修飾対照物よりもヌクレアーゼ分解に対して少なくとも1.25倍耐性であり、より好ましくは少なくとも2倍耐性であり、さらにより好ましくは少なくとも5倍耐性であり、そして最も好ましくはその非修飾対照物よりも少なくとも10倍耐性である。そのような実質的にヌクレアーゼ耐性の核酸には、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、エチルホスホトリエステル、2'-O-メチルホスホロチオエート、2'-O-メチル-p-エトキシリボヌクレオ
チド、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-n（O-アルキル）、3'-O-アルキル、3'-O-アルキル-n（O-アルキル）、2'-フルオロ、2'-デオキシ-エリスロペントフラノシル、2'-O-メチルリボヌクレオシド、メチルカルバメート、メチルカーボネート、逆向き塩基（例えば、逆向きT）、またはこれらのバックボーンのキメラ版などの修飾バックボーンを有する核酸
が含まれるが、これらには限定されない。
【００７５】
本明細書中で使用する場合、用語“実質的に酸耐性”は、非修飾核酸と比較して、酸分解に対して耐性である核酸のことをいう。典型的には、核酸の相対的酸耐性は、耐性核酸の分解率（％）とその非修飾対照物（すなわち、“正常な”バックボーン、塩基、およびホスホジエステル結合を有する対応する核酸）の分解率（％）とを比較することにより測定することができる。酸耐性な核酸は、それらの非修飾対照物よりも、好ましくは酸分解に対して少なくとも1.5倍耐性であり、少なくとも2倍耐性であり、さらにより好ましくは少なくとも5倍耐性であり、そして最も好ましくは少なくとも10倍耐性である。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、用語“PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7Bオリゴヌクレオチド”のそれぞれは、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7Bの発現または活性に影響する配列をそれぞれ標的とするオリゴヌクレオチドのことをいう。これらには、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B DNAコーディング配列、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B
DNAプロモータ配列、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B DNAエンハンサ配列、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BなどをコードするmRNAが含まれるが、これらには限定されない。
【００７７】
上述したように、本発明の一態様は、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4D、PDE7Aの発現または活性に影響を与える配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、表1a〜fにおいて特定された
配列の一つを有してもよい。別の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者により理解される様に、オリゴヌクレオチド構造および／または長さを変化させる可能性があるが、遺伝子発現を下方制御するオリゴヌクレオチドの能力を維持するかまたは向上させる、これらの配列の断片または変異体を含んでいてもよい。別の態様において、本発明は、表1a〜fにおいて特定された配列を有する少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせを提供する。
【００７８】
用語“治療”、“治療する”、“治療法”などは、一般的に、所望の薬理学的作用および／または生理学的作用を得ることを意味する様に、本明細書中では使用される。
この作用は、疾患またはその症候を完全にまたは部分的に予防するという観点で予防的であってもよく、および／または疾患について部分的または完全に治癒するかおよび／または疾患に起因する悪影響を改善するという観点で治療的であってもよい。本明細書中で使用する場合、“治療”は、以前に定義した被検体、特にヒト、における疾患のいずれかの治療を包含し、そして以下のもの：
（a）疾患の素因を有している可能性はあるが、疾患を有しているとは未だ診断されて
いない被検体において、疾患が発生することを防止すること；
（b）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること；または
（c）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の軽減を引き起こすこと；
が含まれる。
【００７９】
キャリア、サーファクタント、および組成物に関して本明細書中で使用される場合、用語“医薬的に許容可能な”は、被検体の患者の治療において使用するために許容可能な、毒性ではなくまたは本明細書中で記載されるいずれかの投与経路により投与するためにも許容できないものではない、物質のことをいう。
【００８０】
本発明は、一般的には、本発明に従って、siRNA、リボザイム、標的核酸に対して相補
的である可能性があるかまたはまたは場合により上述したように修飾したものであってもよいRNAおよび／またはDNAを含む一本鎖または二本鎖の低分子ヌクレオチド配列、RNAに
ハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド-RNA二重鎖を形成することができるRNAオリゴヌ
クレオチドの少なくとも部分を有する前記RNAオリゴヌクレオチド、または内在性遺伝子
の発現をin vivoで下方制御しまたは阻害する可能性があるキメラオリゴヌクレオチド、
を含む、治療的有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を投与することにより、被検体を治療することに関する。
【００８１】
“治療的有効”量により、所望の治療効果を提供するための、非毒性だが十分な量のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を意味する。本事例において、治療される症状または疾患（例えば、細胞のcAMPの減少が関連する疾患、PDE-関連疾患、炎症性呼吸器疾患などの炎症性疾患）の症候を、軽減し、改善し、または防止するために有効なそのような用量のアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物のことをいう。
【００８２】
本明細書中で提供される医薬組成物は、上述したアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物および1またはそれ以上の医薬的に許容可能なサーファクタントを含む。本発明のアン
チセンスオリゴヌクレオチドの取り込みを向上させるための適したサーファクタントまたはサーファクタント構成要素は、U.S.出願公開No. 2003/0087845に以前に記載されたものであり、その内容は、サーファクタントに関して本明細書中に援用する。その出願は、適したサーファクタントには、“・・・合成のものおよび天然のもの、ならびに完全な型および短縮型の、サーファクタント・タンパク質A、サーファクタント・タンパク質B、サーファクタント・タンパク質C、サーファクタント・タンパク質Dおよびサーファクタント・タンパク質E、飽和（di-saturated）ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外のもの
）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジル酸、ユビキノン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルコリン、パルミトイル-リソホスファチジルコリン、デヒドロエピアン
ドロステロン、ドリコール、スルファチジン酸（sulfatidic acid）、グリセロール-3-リン酸、リン酸ジヒドロキシアセトン、グリセロール、グリセロ-3-ホスホコリン、ジヒド
ロキシアセトン、パルミテート（palmitat）、シチジン2リン酸（CDP）ジアシルグリセロ
ール、CDPコリン、コリン、コリンリン酸；ならびにサーファクタント、オメガ-3脂肪酸
、ポリエン酸（polyenic acid）、ポリエン酸（polyenoic acid）、レシチン、パルミチ
ン酸、エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドの非-イオン性ブロックコポリマー、
ポリオキシプロピレン、モノマー性およびポリマー性、ポリオキシエチレン、モノマー性およびポリマー性、デキストランおよび／またはアルカノール側鎖を有するポリ（ビニルアミン）、Brij 35、Triton X-100および合成サーファクタントALEC、Exosurf、SurvanおよびAtovaquone、の構成要素である天然のキャリアビヒクルの天然および人工のラメラ物質、が含まれる。これらのサーファクタントは、複数構成要素サーファクタントの一つまたは部分として製剤中で使用するか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）の5'末端および／または3'末端に対する共有結合した付加物として使用することができる”と述べられている。
【００８３】
本発明の組成物のアンチセンス構成要素は、少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌク
レオチド化合物の組み合わせを含むが、脂質粒子または小胞（例えば、リポソームまたは微結晶）中にて医薬製剤に含まれていてもよい。U.S.特許No. 6,025,339に記載される様
に、脂質粒子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがその内部に含まれる限りにおいて、いずれかの適した構造（例えば、単層または多層）の物であってもよい。N-［1-（2,3-ジオレオイルオキシ）プロピル］-N,N,N-トリメチル-アンモニウムエチルスルフェートまたは“DOTAP”などの正に荷電した脂質は、そのような粒子および小胞として特に好ましい
。そのような脂質粒子の調製は、周知である。例えば、JanoffらのU.S.特許No. 4,880,635；KuronoらのU.S.特許No. 4,906,477；WallachのU.S.特許No. 4,911,928；WallachのU.S.特許No. 4,917,951；AllenらのU.S.特許No. 4,920,016；WheatleyらのU.S.特許No. 4,921,757；などを参照。
【００８４】
本発明の組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を所望の部位（例えば肺）に輸送するいずれかの手段により投与することができる。本明細書中で開示されるアンチセンス化合物は、いずれかの適した手段により患者の肺に対して投与することができるが、しかし好ましくは、アンチセンス化合物を含む吸引可能な粒子からなるエアロゾルの吸入により、投与される。
【００８５】
本発明の組成物は、例えば、吸入に際しては鼻、口および喉頭を通過するために十分に小さいサイズの粒子および気管および肺胞を通過するために十分に小さいサイズ、などの吸引可能なサイズの粒子を含む、製剤として呼吸器系に投与することができる。一般的には、吸引可能な粒子は、約0.5〜10ミクロンのサイズ範囲である。エアロゾル中に含まれ
る吸引可能ではないサイズの粒子は、咽頭に沈着し、そして飲み込まれる傾向にある。そして従って、エアロゾル中の吸引可能ではない粒子の量は、最小にすることが好ましい。鼻投与のため、10〜500μmの範囲の粒子サイズが、鼻腔中に保持されることを保証するために好ましい。
【００８６】
エアロゾルを作製するための活性化合物（（1またはそれ以上の）アンチセンスオリゴ
ヌクレオチド化合物）の液体医薬組成物は、アンチセンス化合物と適切なビヒクル（例えば、発熱性物質なしの滅菌水またはリン酸緩衝塩類溶液）とを組み合わせることにより調製することができる。
【００８７】
アンチセンス化合物を含む固体粒子状組成物は、場合により、エアロゾルの形成ならびに他の治療用化合物の形成を容易にするために機能する、分散剤を含んでいてもよい。適した分散剤は、例えば、重量比1：1などの、いずれかの適した比率でアンチセンス化合物とブレンドされていてもよいラクトースである。
【００８８】
アンチセンス組成物は、有効量の抗-気管支収縮薬、抗-アレルギー薬および／または抗
-炎症性薬中で投与することができる。その量は、治療される疾患の程度、被検患者の状
態、特定の製剤、投与経路、被検体への投与のタイミング、などに依存する。一般的に、0.05〜50μM、またはより具体的には、0.2〜5μMのオリゴヌクレオチド細胞内濃度が好ましい。例えばヒトなどの哺乳動物患者に対して投与するため、約0.001、0.01、0.1、または1 mg/Kgから約50、または100 mg/Kgまたはそれ以上までの用量が、一般的に利用される。しかしながら、その他の用量もまた企図される。活性化合物のいずれかの特定の製剤中での可溶性に依存して、日用量は、1またはいくつかの単位用量投与のあいだで分割して
もよい。
【００８９】
アンチセンス化合物を含む液体粒子のエアロゾルは、いずれかの適した手段により、例えばネブライザーを用いて、作製することができる。ネブライザーは、活性成分の溶液または懸濁液を、圧縮ガス、典型的には空気または酸素の圧縮ガスを狭いベンチュリ管を通して加速することにより、または超音波振動することにより、治療用エアロゾルミストにする、商業的に入手可能な装置である。ネブライザーに使用するために適した製剤は、活性アンチセンスオリゴヌクレオチド成分を、液体キャリア中に製剤の40％w/wまでの量で
、好ましくは製剤の20％w/w未満の量で含む。キャリアは、典型的には、水または希釈水
性アルコール溶液であり、好ましくは例えば、塩化ナトリウムを添加することにより体液と等張にしたものである。オプションの添加物には、製剤が無菌の状態で調製されない場合には、例えば、メチルヒドロキシベンゾエート、抗-酸化剤、抗菌剤、着香料、揮発性
油、バッファー剤、および乳化剤、およびその他の製剤サーファクタントなどの、保存剤が含まれる。
【００９０】
（1またはそれ以上の）活性オリゴヌクレオチド化合物および医薬的に許容可能なサー
ファクタントを含む固体粒子のエアロゾルは、いずれかの固体粒子医薬エアロゾル発生装置を用いて、同様に産生することができる。固体粒子医薬を被検体に対して投与するためのエアロゾル発生装置は、上述したように吸引可能な粒子を作製し、そして規定の秤量された用量の医薬をヒトに投与するために適した比率で含有するある量のエアロゾルを作製する。活性オリゴヌクレオチド成分は、典型的には、0.1〜100 w/wの製剤を含む。2番目
のタイプの例示的なエアロゾル発生装置は、秤量された用量の吸入器を含む。秤量された用量の吸入器は、加圧エアロゾルディスペンサーであり、典型的には液化推進剤（liquified propellant）中に活性成分の懸濁液製剤または溶液製剤を含有する。使用するあいだ、これらの装置は、秤量用量、典型的には10〜150μlを送達し、活性成分を含有する微細粒子のスプレーを生成するために適合させたバルブを介して、製剤を放出する。適した推進剤には、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたはヒドロフルオロアルカン、およびこれらの混合物が含まれる。製剤には、1またはそれ以上の共溶媒、例えばエ
タノール、乳化剤、およびその他の製剤サーファクタント、例えばオレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン、抗酸化剤、および適した着香剤がさらに含まれていてもよい。
【００９１】
エアロゾルは、固体粒子から形成されているか液体粒子から形成されているかにかかわらず、約1〜150リットル／分の速度でエアロゾル発生装置により産生することができる。
本発明の製剤は、経口製剤、口内製剤、肺内製剤、直腸製剤、子宮内製剤、腫瘍内製剤、頭蓋内製剤、鼻内製剤、筋肉内製剤、皮下製剤、血管内製剤、クモ膜下製剤、吸入可能用製剤、経皮製剤、皮内製剤、腔内製剤、植え込み用製剤、イオン泳動製剤、眼用製剤、膣製剤、関節内製剤、耳内製剤、静脈内製剤、筋肉内製剤、腺内製剤、器官内製剤、リンパ管内製剤、植え込み用製剤、徐放性製剤、または腸溶性コーティング製剤であってもよい。製剤中で使用されるキャリアは、例えば固体キャリアおよび／または液体キャリアであってもよい。
【００９２】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物と組み合わせて組成物／製剤を投与に適したものと
して呼吸器疾患を治療することに適しているその他のキャリアについては、“Remington's Pharmaceutical Sciences”（17th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985）を参照するとよい。
【００９３】
本発明のさらなる側面において、細胞のcAMPが減少すること、またはPDEレベルが上昇
することと関連した炎症性疾患を含む症状を治療するために治療的に有効な、医薬的に許容可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物が内部に含有されるパッケージ材料を含む製品が提供される。一態様において、組成物は、PDE遺伝子を阻害するために有効な、
その遺伝子に対して少なくとも50％相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を含む。別の側面において、組成物は、少なくとも2つのアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド化合物を含み、それぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物は異なるPDE遺伝子
を下方制御することができ、各アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物はアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が指向する遺伝子を下方制御するためにはそれ自体は実際には有効ではない濃度で存在し、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の組み合わせは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが指向する少なくとも一方の遺伝子を下方制御するために有効である。
【００９４】
一態様において、品物のパッケージ材料は、組成物を使用して炎症性疾患を治療することができることを示すラベルを含み、そして疾患が、多発性硬化症、接触皮膚炎、アレルギー性および非アレルギー性眼疾患、リウマチ性関節炎、敗血症ショック、骨粗鬆症、および認識障害の一つであるとの表示をさらに含んでいてもよい。
【００９５】
別の態様において、品物のパッケージ材料は、組成物を使用して炎症性呼吸器疾患を治療することができることを示すラベルを含み、そして疾患が、COPD、喘息、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性拒絶および慢性拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎または副鼻腔炎の一つであるとの表示をさらに含んでいてもよい。
【００９６】
本発明の目的のため、パッケージ材料は、ボトルまたはその他の容器（プラスチックまたはガラスのいずれか）、カートン、チューブ、またはその他の保護性ラッピングを含む、本発明のヌクレオチド含有組成物を包装するために適したいずれかの材料であってもよい。分かるように、包装は、オリゴヌクレオチド組成物の性質により変化しうるものであり、例えば液体製剤はエアロゾル製剤とは異なる様に包装される可能性がある。
【００９７】
本発明は、以下の限定的ではない実施例により、さらに詳細に説明される。
【００９８】
材料および試薬
RPMI 1640（Wisent, cat# 10040 CV）；FBS（ウシ胎児血清、Wisent, cat# 80150）；
ペニシリン、ストレプトマイシン（GIBCO, cat# 15140-122）；HEPES（Wisent, cat# 26060CI）およびL-グルタミン（Gibco, cat# 25030-081）；DMEM/F12（Wisent, cat# 10090CV）；ピルビン酸ナトリウム（Wisent, cat# 25000-Ci）；滅菌PBS（GIBCO, cat# 25030-081）；トリプシン0.25％およびEDTA 0.01％（Wisent, cat# 25-052-Ci）；Hanks平衡塩類溶液（HBSS）cellgro、cat# 20021-cv；PHA（フィトヘムアグルチニン、Sigma, cat# L-9132, lot#: 073K8925）hEGF（ヒト組換え表皮成長因子、cat-4230；BPE: clonetics cat#4009；ヒドロコルチゾン: clonetics cat#4031；エピネフリン: clonetics cat#4221；変更後: clonetics cat#4205；インスリン: clonetics cat#4021；レチノイン酸: clonetics cat#4085；トリヨードチロニン: clonetics cat#4211；ゲンタマイシン／アンホテリシンB: clonetics cat#4081；ヒト上皮成長因子（hEGF）: clonetics cat#4230；インスリ
ン、cat# cc-4021；hFGF（ヒト線維芽細胞成長因子）cat# cc-4068；SmBm Bulletキット
（Cat# CC 3182, Clonetics）。BEBM Bulletキット（Cat# CC 4175, Clonetics）；Trizol: Invitrogen, cat#15596-018；Dnase I: Fermentas, cat#EN0521；RT-PCR用スーパース
クリプトファーストストランド合成システムキット（Invitrogen, cat#11904-018）；dNTPs: Invitrogen, cat# 10297-018；オリゴ（dT）12-18: Invitrogen,cat# 11904-018；Qiagen RNAeasy Miniキット（Qiagen, Cat#74106）；β-メルカプトエタノール（Sigma, Cat#M-6250）；99％エタノール（Commercial alcohols Inc., Brampton, Ontario, Canada
）；QiaVac 24 Manifold（Qiagen, Cat#;19403）；Disposable Vacconnectors（Qiagen, Cat# 19407）；DNAse Iキット（Fermentas, Cat. # EN0521）；RiboGreen定量試薬（Invitrogen-Molecular probes, Cat # R-11490）；Taq PCRコアキット（Qiagen, cat# 201223）、Light-Cycler装置バージョン1.5（Roche, Cat# 3531414）；20 ml反応用LCキャピラ
リー（Roche, cat# 1909339）；LC FastStart DNA Master SYBR Green 1 PLUS（100 ml）（Roche, Cat# 03752186001）；K3EDTAチューブ（Greiner Bio-one, cat#: 455036B110306）；Ficoll（Amersham Biosciences；cat# 17-1440-03）；ヒトTNF-αELISAキット（BioSource Cat#CHC-1754, lot# 041703）；マウスTNF-αELISAキット（BioSource, cat# cmc3013）；ELISAプレートリーダー（フィルター450 nm、参照フィルター650 nm、Biorad, 
モデル680）；Escort IIトランスフェクション試薬（Sigma, cat# L6037）、リポポリサ
ッカライド（SIGMA-Aldrich；cat. #L-4391, lot# 083K4048, E. Coli 0111:B4）；キシ
ラジン（Anased）（Novopharm；cat. #02239093；lot no. KA09802D）；ケタミン（Vetalar）（Bioniche；cat. #01989529；lot. #K033A）；Hema-3染色セット（Fisher scientific Co. Cat#122-911, lot#999901）；Poltron PT 1200（Brinkmann Instruments）；Alamar Blue（Biosource cat#DAL1100）、ヒト肺全RNA（BD Bioscience, cat#64092-1, lot# 4030253）；ヒト平滑筋全RNA（BD Bioscience, cat#cr2628, lot# 3110321）；ヒト脳全RNA（BD Bioscience, cat#64098-1, lot#4010842）。
【００９９】
細胞
ヒト気管平滑筋細胞（BSMC）（cat# CC 2576）；正常ヒト気管上皮細胞（NHBE）（cat#
CC 2540）を、Cloneticsから購入した。EOL-1（ヒト急性骨髄性“好酸球性”白血病細胞株；ATCC）、U937（ヒト組織球性細胞株；ATCC）、HL-60（ヒト急性前骨髄球白血病細胞
株；ATCC）；A549（ヒト肺癌細胞株；ATCC）；Jurkat（ヒト急性T細胞白血病；ATCC）お
よびHut-78（ヒト皮膚Tリンパ球白血病細胞株；ATCC）。NCI-H292（ヒト粘膜表皮肺癌細
胞株、ATCC）；PBMC（ヒト末梢血単核細胞）。
【０１００】
細胞培養
EOL-1、U937、HL-60、JurkatおよびNCI-H292は、2 mM L-グルタミン；1.5 g/L重炭酸ナトリウム；4.5 g/Lグルコース；10 mM Hepes；1 mMピルビン酸ナトリウム；10％FBS、ペ
ニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを添加したRPMI 1640中で培養した。
【０１０１】
Hut78は、4 mM L-グルタミン；1.5 g/L重炭酸ナトリウム；10％FBS、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを添加したIscoveの改変培地中で培養した。
A549は、2 mM L-グルタミン；1.5 g/L重炭酸ナトリウム；10％FBS、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを添加したHam's F12K中で培養した。
【０１０２】
気管平滑筋細胞を、25 cm2フラスコ中、0.5μg/mL hEGF；25 mg/mlゲンタマイシン；25μg/mLアンホテリシンB；2.5 mg/mLインスリン；hFGF 10 ng/mL、およびFBS 5％を含むSmBm培地を用いて培養した。細胞培養は、各実験につき十分な細胞を得るため、10日間行った。
【０１０３】
正常ヒト気管上皮細胞（NHBE）は、25 cm2フラスコ中、基本培地（500 mL）および以下の増殖添加物：BPE：2 mL；ヒドロコルチゾン：0.5 mL；hEGF：0.5 mL；エピネフリン：0.5 mL；トランスフェリン：0.5 mL；インスリン：0.5 mL；レチノイン酸：0.5 mL；トリ
ヨードチロシン：0.5 mL；GA-1000：0.5 mLを含むBEBM培地を用いて培養した。細胞培養
は、各実験につき十分な細胞を得るため、10日間行った。
【０１０４】
細胞生存率
細胞生存率は、Alamar Blue試験を製造者が示唆するように使用して、体系的にアッセ
イを行った。
【０１０５】
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）
PBMCは、正常ドナー由来のEDTA K3血液をFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離により単離
した。PBMCは、10％加熱非働化FBS、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを添加したRPMI 1640細胞培養培地中、12ウェルプレートに2×106細胞/mL/ウェルで播種
した。
【０１０６】
アンチセンス処置  U937、EOL-1、Jurkat、Hut-78細胞株：
細胞を遠心処理（5分間、1500 RPM、室温）により回収し、1×HBSSで洗浄し、そして血清を含まないRPMI培地中に1×106細胞/mlで再懸濁した。1×106細胞を滅菌チューブ中で5分間、正確なアンチセンス濃度（0〜20μMのあいだ）で、インキュベートした。次に、各反応物を、12ウェルプレート中に移し、そして37℃にて5時間、インキュベートした。RPMI/FBS 20％を、最終濃度10％FBSとなるように添加し、そして細胞を37℃で一晩インキュ
ベートした。細胞を遠心処理（5分間、1500 RPM、室温）により回収し、そして1×Hanks
平衡塩類溶液（HBSS）で洗浄した。
【０１０７】
A549細胞株（直接トランスフェクション）：
細胞をトリプシン処理し、DMEM-F12培地中に再懸濁し（106細胞/ウェル）、そして37℃で一晩、血清枯渇条件下でインキュベートした。翌日、接着細胞を37℃で5時間、様々な
濃度（0、5、10、15または20μM）のアンチセンスと共に、直接的にウェル内でインキュ
ベートした。DMEM-F12/FBS 20％を、最終濃度10％FBSとなるように添加し、そして細胞を37℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心処理（5分間、1500 RPM、室温）により回収
し、そして1×HBSSで洗浄した。
【０１０８】
Escort II試薬媒介性A549細胞株トランスフェクション
A549細胞を、37℃、5％CO2条件下にて、12ウェルプレート中3×105細胞/mLで一晩播種
した。翌日、細胞を1×HBSSで2回洗浄し、そして500μL血清および抗生物質不含DMEM-F12で覆った。トランスフェクション複合体は、1μgのアンチセンスおよび2.5μLのEscort II試薬からなる。DNA-Escort II複合体を調製し、製造者の推奨に従って細胞に添加した。
【０１０９】
BSMCおよびNHBE初代細胞：
細胞を37℃で3〜5分間トリプシン処理し（トリプシン0.025％、EDTA 0.01％）、反応を培養液により停止し、計数した細胞を12ウェルプレート中5×105細胞/mLで再懸濁し、そ
して37℃にてインキュベートした（一晩）。翌日、細胞を洗浄し、培養液を交換し、そして血清不含培養液に交換した。アンチセンスを様々な濃度（0〜20μMのあいだ）でウェル中に直接的に添加した。混合物を37℃で5時間、インキュベートした。血清を添加して、
最終濃度5％とし、そして培養物をさらに48時間インキュベートした。細胞をHBSSで3回洗浄し、回収し、そしてRNAを抽出した。
【０１１０】
PBMC
2×106細胞/mL/ウェルを、0〜5μMの範囲のアンチセンス濃度で、5％加熱非働化FBS、
ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μg/mLおよび10μg/mL PHAを添加したRPMI 1640細胞培養液中で、16〜20時間インキュベートした。その後、細胞を回収しそして洗浄して、その後RNAを調製した。
【０１１１】
RNA抽出
RNAは、Qiagenから入手したQiaVac 24マニホルドを使用してRNAeasyミニキットプロト
コルに従って細胞ペレットから抽出し、そしてFermentasの手順に従ってDNase-Iで処置した。RNAを、製造者（Invitrogen-Molecular probes）のプロトコルに従ってRiboGreen試
薬を使用して定量した。
【０１１２】
逆転写（RT）
ファーストストランドcDNAの調製は、RT-PCR用スーパースクリプトファーストストランド合成システムキットを用いて、全反応用量20μLで行った。1μgのRNAを、最初に0.5 mMの各dNTP、0.5μgのオリゴ（dT）12-18、とともに65℃、5分間で変性させ、および少なくとも1分間氷上で冷却した。混合物を、42℃で2分間インキュベートし、そして1×ファー
ストストランドバッファー、10 mM DTT、40ユニットのRNaseOUTおよび40ユニットのスー
パースクリプトII RTを含有する2番目のプレミックスを添加した。反応物を42℃で10分間インキュベートし、50℃で1時間インキュベートし、そして70℃で15分間加熱することに
よりインキュベートした。
【０１１３】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
PCRを、50μLの全反応用量中1×PCRバッファー（10×：Tris-HCl、KCl、（NH4）2SO4、15 mM MgCl2；pH 8.7）、0.2 mMの各dNTP、8.5 pmolの各PCRプライマーおよび2.5 unitのTaq DNAポリメラーゼ中で、最適化した量のcDNA（遺伝子標的に依存して10〜200 ng）を
用いて行った。混合物を94℃にて5分間加熱し、その後94℃にて1分間、60℃にて45秒間、および72℃にて45秒間のインキュベーションからなるサイクルを30〜35サイクル（標的に依存する）行った。追加的な伸長を、72℃にて10分間行った。PCR産物を、エチジウムブ
ロマイドの存在下にて、1.5％アガロースゲル電気泳動により解析した。各遺伝子につい
て使用したPCRプライマー配列および予想されるPCR増幅産物のサイズは、表2a〜bに記載
される。PCR産物の定量は、Total Labソフトウェア（Background subtraction with Rolling Ball；Ultra Lum Inc.,Model UC4800）を使用して行った。
【０１１４】
リアルタイムPCR
PCR反応混合物を、0.5 mMの各PCRプライマーおよび4μLのLC FastStart DNA Master SYBR Green 1 PLUSの存在下、全量20μL中3μLのcDNA反応物を用いて調製する。
【０１１５】
工程1（変性）：95℃、10分（勾配20℃／秒）
工程2（サイクル×40回）：95℃、（勾配20℃／秒）；57℃、5秒（勾配20℃／秒）（PDE4Dに関して例外的にTm＝59℃）；72℃、10秒（勾配20℃／秒）
工程3（溶融曲線）：95℃、（勾配20℃／秒）；70℃、30秒（勾配20℃／秒）；95℃、0秒（勾配0.1℃／秒）
工程4（冷却）：40℃、30秒（勾配20℃／秒）。
【０１１６】
各遺伝子について使用したPCRプライマー配列は、表2c〜dに記載される。PCR産物の定
量は、RelQuantプログラム（Roche）を使用して行った。
【０１１７】
ヒトTNF-αELISA
PBMCを、PHA刺激をすることなく、以前に記載したように、16〜18時間、（1または複数の）アンチセンス（それぞれ0.05μM）を用いてトランスフェクトする。その後、細胞をPHA（10μg/mL）にて6時間刺激する。その後、上清を回収し、2000 rpmにて5分間遠心分離に供し、製造者により記載された様にELISAのために使用するまで、-80℃で保存した。
【０１１８】
動物
すべての動物プロトコルは、Mispro Biotech Services Inc. Animal Care Committeeにより承認され、そして動物実験に関するCanadian Council of Animal Careガイドライン
に適合した。C57BL/6マウスおよびAKR/Jマウス（20〜25 g）（Charles River Canada, Lasalle QC, Canada）を、Mispro Biotech Services Inc.動物施設（Montreal QC, Canada
）にて飼育した。
【０１１９】
In vivoアンチセンス標的評価および複数遺伝子クロスノックダウンC57BL/6マウスを、ケタミン／キシラジンをi.p.注射することにより軽く麻酔した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を受けた群については、肺採取の16〜20時間前にマウスをアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（50 mg/マウス/アンチセンス）の点鼻により事前処理した。対照
マウスは、滅菌PBS中同一量の対照アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を受けた。
【０１２０】
リポポリサッカライド（LPS）-誘導性肺炎モデル
C57BL/6マウスを、ケタミン／キシラジンをi.p.注射することにより軽く麻酔し、そし
て10 mgのE. coli血清型0111:B4由来LPS（Sigma-Aldrich, Oakville ON, Canada）を点鼻することにより、急性肺炎を誘導した。対照マウスは、同様の量の滅菌PBSの投与を受け
た。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を受けた群については、LPS曝露の12時間前
にマウスをアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（200 mg/マウス）の点鼻により事前処
理した。対照マウスは、滅菌PBS中同一量の対照アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与
を受けた。気管支肺胞洗浄および肺採取を、LPS点鼻後6時間後に行った。
【０１２１】
タバコの煙-誘導性肺炎モデル
AKR/Jマウスを、喫煙装置（SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc., Montreal Canada）を使用して、8種類の1R3F研究用タバコ（University of Kentucky）からの全
煙に曝露した。対照マウスは、疑似喫煙（sham smoked）させた。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドの投与を受けた群については、マウスを軽く麻酔し、そしてタバコの煙-曝露
の3時間前および24時間後にアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（200 mg/マウス）を点鼻することにより事前処理した。対照マウスは、滅菌PBS中同一量の対照アンチセンスオ
リゴヌクレオチドの投与を受けた。気管支肺胞洗浄および肺採取を、タバコの煙への曝露後48時間後に行った。
【０１２２】
気管支肺胞洗浄（BAL）および細胞カウントの差異
マウスを、ケタミン／キシラジンをi.p.注射することにより軽く麻酔した。気管切開術を行い、そして肺を0.5 mlの氷冷PBSを用いて4回洗浄した。全細胞をカウントし、次にサイトスピンスライド上に遠心分離した。細胞カウントの差異は、サイトスピンスライドをWright-Giemsaにより染色した後に評価した。少なくとも200個の細胞を油浸顕微鏡下でカウントした。BAL液を、次のTNF-α測定のために-80℃で保存した。
【０１２３】
マウスTNF-αELISA
BAL液中のTNF-αレベルを、製造者の推奨に従って、マウスTNF-αELISAキットを使用して測定した。
【０１２４】
逆転写（RT）およびリアルタイムPCR
マウス肺をポリトロンPT 1200（Brinkmann Instruments）を使用してホモジナイズし、そして全RNAをQiagen RNAeasyミニキット（Qiagen, Mississauga ON, Canada）を使用し
、その後DNase I消化を行うことにより抽出した。全RNAは、Ribogreen蛍光アッセイ（Invitrogen Corporation, Burlington ON, Canada）を使用して定量した。cDNAを、SuperScript（商標）II RTキットを用いたファーストストランドcDNA合成（Invitrogen Corporation, Burlington ON, Canada）を使用して、1μgのRNAから調製した。リアルタイムPCR反
応物を、LC FastStart DNA Master SYBR Green 1 PLUS（Roche Diagnostics, Laval QC, Canada）を使用して50 ngのcDNAを用いて調製し、そしてLightCycler（Roche Diagnostics, Laval QC, Canada）中で実行した。プライマーセットをTibMolbiol（Adelphia, NJ）
により設計し、GSP精製した（表2dを参照）。PBGDまたはHPRTを参照遺伝子として使用し
た。各リアルタイムPCR実行には、キャリブレータcDNA（マウス肺組織由来の保存されたRNAから調製したもの）が含まれ、そして遺伝子／PBGD比または遺伝子／HPRT比を、キャリブレータのCp値を使用して正規化した。さらに、各遺伝子について、PBGDについておよびHPRTについての標準曲線を、キャリブレータcDNAを使用して行い、そして係数ファイルを標的遺伝子および参照遺伝子のあいだの増幅効率の差異に関する補正を含むように作成した。
【実施例】
【０１２５】
実施例1
本実施例は、PDEアイソタイプの細胞分布および組織分布に関する。炎症性呼吸器疾患
は、炎症性細胞（マクロファージ、リンパ球、好中球および好酸球）および組織細胞（ほとんどが上皮細胞および平滑筋細胞）のあいだでの相互作用を特徴としている。PDE3のアイソタイプ（PDE3AおよびB）、PDE7のアイソタイプ（PDE7AおよびB）およびPDE4のアイソタイプ（PDE4A、B、C、およびD）の異なる細胞および組織でのmRNA発現を評価した。すべてのPDEアイソタイプ用に使用したプライマーの概要は、表2aに見出すことができる。選
択された細胞は、A549（肺のアデノカルシノーマ由来の上皮細胞）、およびNCI-H292（粘膜表皮肺ガン）であった。初代ヒト細胞における発現は、BSMC（ヒト気管支平滑筋細胞）およびPBMC（末梢血単核細胞）において評価された。正常ヒト肺を、PDEの発現を特徴付
けるためにも使用した。最終的に、正常ヒト脳は対照として含まれた。というのもほとんどのPDEがこの組織内で発現されるからである。図1においても示されるように、異なる細胞および組織は、上述した条件下で評価したすべての細胞および組織において発現されたPDE 7AおよびPDE4B以外のPDEの異なるアイソタイプを発現する。PDE4C mRNAは、これらの実験において使用された細胞および組織においては、あまり豊富ではないことが見出された。PDE4Aは、肺および脳において見出されたが、一方PDE4Dは、肺細胞および気道細胞（A549およびNCI-H292）で確認された。PDE7Aは、試験したすべての細胞において存在して
おり、そしてリンパ球により媒介される疾患において重要であることが最近示唆されたため、われわれは、PDE7Aのサブアイソタイプも評価した。図2においても示されるように、PDE7A1は、試験したすべての細胞においてもっとも発現されているアイソタイプであるようである。
【０１２６】
PCRは、数回繰り返し、そして各細胞株、初代細胞または組織におけるPDE酵素のアイソタイプの発現の有無を表3aおよびbに示す。PDE3Aが、PBMCおよびA549以外のいくつかの細胞株においては見出されなかったことに注目すべきである。さらに、PDE7BおよびPDE4Cに対応するメッセンジャーが、ここで使用される細胞および組織においてはまれに検出された。
【０１２７】
実施例2
本実施例は、PDE7Aに対する効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関するもので
ある。PDE7A mRNAに対するいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そしてPDE7Aを発現する細胞におけるそれらの効率について評価した。表1aには、使用された配
列のリストが含まれる。すべての実験は、オリゴヌクレオチド濃度を徐々に増加させて行い、そして効率を処置細胞におけるGAPDH密度に対するPDE7A mRNA密度の比を、非処置細
胞におけるものと比較することにより、評価した。
【０１２８】
Top-1702（Seq. ID No. 3）、Top-1706（Seq. ID No. 7）、Top-1703（Seq. ID No. 4
）、Top-1701（Seq. IDNo. 2）、およびTop-1707（Seq. ID No. 8）が、Eol-1細胞におけるPDE7A mRNAの発現を阻害する際に有効であることが見出されたことは、図3において注
目されるべきである。。さらに、Top-1702（Seq. ID No. 3）、Top-1703（Seq. ID No. 4）、Top-1706（Seq. ID No. 7）、およびTop-1707（Seq. ID No. 8）は、U937細胞におい
てPDE7A mRNAを阻害した。図4において、いくつかのPDE7Aアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Jurkat細胞において、10〜20μモルの濃度でPDE7A mRNAを60％以上阻害することを示した（Top-1702（Seq. ID No. 3）、Top-1703（Seq. ID No. 4）、およびTop- 1706（Seq. ID No. 7））。オリゴヌクレオチドTop-1707（Seq. ID No. 8）およびTop-1726（Seq. ID No. 23）は、研究した条件下では、実際には有効ではなかった。Hut-78細胞におい
ては、オリゴヌクレオチドTop-1703（Seq. IDNo. 4）は、10μモルの濃度でその有効性を維持していたが、一方Top-1706（Seq. IDNo. 7）はそれほど有効ではなく、そしてTop-1702（Seq. ID No. 3）は有効なものではなかった。BSMCおよびA549細胞においては、Top-1702（Seq. ID No. 3）、Top-1703（Seq. ID No. 4）、およびTop-1706（BSMCのみが示さ
れる、Seq. ID No. 7）は、図5に示されるようにPDE7AのmRNA発現を下方制御する際に、
すべて有効である。さらに、これらのPDE7Aアンチセンスを、ヒトPBMCにおいて評価した
。結果から、アンチセンスのなかでも、Top-1706（Seq. ID No. 7）は、その特異的なメ
ッセンジャーを40％阻害する際に有効であることが示された（表4a）。報告された結果は、標的とアンチセンスオリゴヌクレオチドの一次配列特異的であり、そして間接的または非特異的作用のためにはそうではなかった。
【０１２９】
全体的な結果から、本発明のPDE7Aに対するアンチセンスストラテジーが、標的化mRNA
の顕著な阻害をもたらすことに成功することが示された。設計されたオリゴの中でも、Top-1703（Seq. ID No. 4）、Top-1706（Seq. ID No. 7）、およびTop-1702（Seq. ID No. 3）は、研究されたすべての細胞株および初代細胞において、PDE7Aに関するmRNA発現を阻害するためにもっとも有効であるようである。これらの結果から、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを本発明の治療ベースの戦略において使用することができることが示唆される。
【０１３０】
実施例3
本実施例は、PDE3AおよびPDE3Bに対する効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。1セットのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そしていくつかの細胞型に
おいてmRNAを減少させる能力について試験した。表1b〜cには、使用された配列のリスト
が含まれる。
【０１３１】
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、A549細胞においておよび／またはU937細胞において、PDE3A mRNAレベルを減少させる際に有効なものであることが見いだされた。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドには、図6、表4a（上）および4b（下）にお
いて示される様に、Top-1301（Seq. ID No. 35）、Top-1302（Seq. ID No. 36）、Top-1303（Seq. ID No. 37）、Top-1307（Seq. ID No. 41）、Top-1308（Seq. ID No. 42）、TOP-1309（Seq. ID No. 43）、Top-1311（Seq. ID No. 45）、およびTop-1312（Seq. ID No. 46、あまり効果的ではないが）が含まれる。初代気管支平滑筋細胞において、同一のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、図7において示される様に、PDE3A mRNA発現を減
少させる際に有効であった。
【０１３２】
PBMCを用いてPDE3Bを使用して行われた実験で、いくつかのアンチセンスが、PDE3B mRNAを特異的にブロックする際に有効であることが示された。表4aに示される様に、これら
のアンチセンス中でも、Top-1357（Seq. ID No. 55）は、75％の阻害を示したが、一方Top-1351（Seq. ID No. 49）は4％しか示さなかった。あわせると、これらの結果から、PDE3A阻害および／またはPDE3B阻害に対する本発明のアンチセンスストラテジーは有効であ
ることが示唆される。いくつかのその他のアンチセンスオリゴヌクレオチド、Top-1304（Seq. ID No. 38）、Top-1305（Seq. ID No. 39）、Top-1313（Seq. ID No. 47）、Top-1351（Seq. ID No. 49）は、顕著なmRNA阻害を示さなかった。このことから、ここで報告されたアンチセンスブロック効率は、標的およいｂアンチセンスオリゴヌクレオチド一次配列特異的なものであるが、間接的アンチセンス作用のためではないことが示唆される。
【０１３３】
実施例4
本実施例は、PDE4に対する有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。PDE4 mRNAに対するいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そしてPDE4を発現する
細胞内でのそれらの有効性について評価した。表1d〜fには、利用された配列のリストが
含まれる。全ての実験を、オリゴヌクレオチドの濃度を徐々に増加させて行い、そして効率を処置細胞におけるHPRT（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、内部対照としての）密度に対するPDE4A、PDE4B、PDE4DのmRNA密度の比を、非処置細胞のものと
比較するリアルタイムPCRによりにより評価した（表2cおよびd）。
【０１３４】
いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、PBMC中でPDE4 mRNAレベルを減少させ
る際に有効であることが見いだされた。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドには、Top-1411（PDE4A、Seq. ID No. 72）、Top-1437（PDE4B、Seq. ID No. 86）、およびTop-1498（PDE4D、Seq. ID No. 140）が含まれ、それぞれ43％、53％、および56％であった（表4a）。
【０１３５】
あわせると、これらの結果から、PDE4阻害に対する本発明のアンチセンスストラテジーは有効であることが示唆される。いくつかのその他のアンチセンスオリゴヌクレオチド、Top-1406（PDE4A、Seq. ID No. 67）、Top-1430（PDE4B、Seq. ID No. 79）、Top-1495（PDE4D、Seq. ID No. 137）は、顕著なmRNA阻害を示さなかった。このことから、本明細書中で報告されたアンチセンスブロック効率が標的およびアンチセンスオリゴヌクレオチド一次配列特異的なものであり、間接なアンチセンス作用のためではないことが示唆される。
【０１３６】
実施例5
本実施例は、単一のPDEアイソタイプの阻害の、異なるPDEのmRNA産生に対する作用に関する。この実験は、A549細胞においてそしてPBMCにおいて行われた。表4bに示される様に、いくつかのアンチセンスが、それらの特異的標的を阻害することが見いだされただけでなく、その他のPDEに対応するmRNAを下方制御することができた。PDE3AアンチセンスTop-1308（Seq. ID No. 42）は、A549細胞株中でその特異的mRNAの阻害（60％）を示しただけでなく、PDE3B（53％）、PDE4Aの発現（63％）、PDE4Dの発現（26％）、およびPDE7Aの発現（44％）を下方制御した。同一の実験をPBMCにおいて行い、そしてその結果から、PDE3BアンチセンスTop-1357（Seq. ID No. 55）が、その標的を特異的に阻害する能力を有し
（62％）、PDE4A、PDE4B、PDE4Dおよび、PDE7Aに対応するメッセンジャーを、それぞれ76％、43％、65％、および38％下方制御することができたことが示された（表4b）。この複数遺伝子ノックダウンプロセスは、PBMC中で使用されたPDE4Aに対するアンチセンスTop-1413（Seq. ID No. 74）、PDE4Bに対するアンチセンスTop-1437（Seq. ID No. 86）、PDE4Dに対するアンチセンスTop-1490（Seq. ID No. 132）、PDE7Aに対するアンチセンスTop-1706（Seq. IDNo. 7）により見いだされた（表4b）。観察された阻害は、以下の理由によ
り特異的であった：本研究において使用された全てのTop-アンチセンスオリゴヌクレオチドは、研究された他のPDEヌクレオチド配列と、何もホモロジーを有さなかった。さらに
、本明細書中で使用した効果的なアンチセンスは、研究された全てのPDEに影響を与えた
訳ではなかった。例えば、PDE3B、PDE4AおよびPDE7Aに対して強力であるTop-1308（Seq. ID No. 42）は、PDE4Dに対してほとんど有効ではなく、PDE4Bに対しては何も作用を有さ
なかった。さらに、本研究において使用されたいくつかのその他のアンチセンスは、それらの特異的標的に対して活性であることが見いだされたわけでも、その他のPDEに対して
活性であることが見いだされたわけでもない（（Top-1312、Seq. ID No. 46）、Top-1404、Seq. ID No. 65））（表4b）。これらの結果から、PDEアイソタイプmRNA をアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて阻害することは、その他のPDEの産生に影響を与え、本明
細書中で記載される単一オリゴヌクレオチド誘導性複数遺伝子ノックダウンプロセスの原
因となることが示される。
【０１３７】
実施例6
本実施例は、単一のPDEのアイソタイプの阻害の、サイトカインおよび酵素mRNAの産生
に対する作用に関する。サイトカインおよびケモカインは、細胞活性および導入において重要なメディエーターである。炎症性呼吸器疾患の病態生理において増加しおよび／または役割を果たしていることが示されたメディエーターの中では、インターロイキン（IL）-6、IL-7、IL-8、IL-15およびTNF-αである。いくつかの酵素は、組織破壊および／また
は修復に直接的または間接的に関与している。中でも、これらの酵素は、マトリクスメタロプロテイナーゼ、MMP類（MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-12）、MMPの組織特異的阻害剤1（TIMP-1）およびシクロオキシゲナーゼcox-1である。いくつかの炎症性呼吸器疾患におい
て、MMPのそれらの阻害剤またはTIMPに対する比が増加することが示された。PDE3AまたはPDE7A mRNAの阻害の、ヒト初代平滑筋気管支細胞によるメディエータおよび酵素mRNA産生に対する作用を、評価した。
【０１３８】
図8に示される様に、PDE3A mRNA産生を減少させる際に有効であったアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド（Top-1301（Seq. ID No. 35）、Top-1303（Seq. ID No. 37）、Top-1308（Seq. ID No. 42）、Top-1311（Seq. ID No. 45））またはPDE7A mRNA産生を減少させる際に有効であったアンチセンスオリゴヌクレオチド（Top-1702（Seq. ID No. 3）、Top-1703（Seq. ID No. 4）、Top-1706（Seq. ID No. 7））はまた、IL-6、IL-7、IL-15、TNF-αについてのmRNAを減少させ、そしてIL-8についてのmRNAを低い程度で減少させた。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、MMP12についてのmRNAに対して阻害作用を有したが
、同じ濃度では、MMP-1、MMP-2、MMP-3、TIMP-1、およびcox-1 mRNAに対する作用を何も
有さなかった。
【０１３９】
単一のPDE特異的アンチセンスの、その他のPDEに対する作用は、表4b中に示される。いくつかの特異的PDEアンチセンス（（Top-1308（Seq. ID No. 42）；Top-1357（Seq. ID No. 55）；Top-1413（Seq. ID No. 74）；Top-1437（Seq. ID No. 86）；Top-1490（Seq. ID No. 132）；Top-1706（Seq. ID No. 7））は、それらの特異的標的を下方制御する際
に有効性を有していただけでなく、その他のホスホジエステラーゼに対しても阻害性作用を有している。
【０１４０】
繰り返すと、観察された阻害は、本研究において使用された全てのTop-アンチセンスオリゴヌクレオチドが、研究されたサイトカインまたは酵素のヌクレオチド配列と何ら類似性を有していなかったため、特異的であった。さらに、mRNA産生におけるTop-アンチセンスレベルの減少は、配列特異的でありそしてサイトカイン特異的であった。これらの結果から、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたPDEアイソタイプmRNAの阻害は、メディ
エータおよび酵素の産生に影響を与えることが示される。
【０１４１】
実施例7
本実施例は、アイソタイプ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせの、PDE3A遺伝子発現およびPDE7A遺伝子発現に対する作用に関する。オリゴヌクレオチドを組み合わせることの、両アイソタイプのPDEともを発現するU937細胞におけるPDE3A mRNA発現
およびPDE7A mRNA発現に対する作用を、評価した。これに関して、研究した条件下で、この細胞株において実質的に有効ではなかった濃度で、各オリゴヌクレオチドは別個に使用された（10μモル、図9において示される）。PDE3AおよびPDE7Aのアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの特定の組み合わせは、いずれか一方のアンチセンスオリゴヌクレオチドのみと比較して、PDE3A mRNA発現およびPDE7A mRNA発現の両方を減少させる際に、顕著に非常に効果的であった。Top-1703（Seq. ID No. 4）とTop-1301（Seq. ID No. 35）との組み
合わせ、またはTop-1706（Seq. ID No. 7）とTop-1303（Seq. ID No. 37）との組み合わ
せは、PDE3A mRNAおよびPDE7A mRNAの両方の強力な相乗的阻害を示す。さらに、ここで報告された作用は、標的およびアンチセンス一次配列特異的である。というのも、いくつかのその他のTOP-1700およびTOP-1300オリゴヌクレオチドの組み合わせは、顕著なmRNA阻害作用を有さなかったからである。
【０１４２】
本発明の組み合わせにおいて使用するための効果的なPDEオリゴヌクレオチドアンチセ
ンス化合物は、標的PDE遺伝子の発現を阻害する能力を有するものとして本明細書中に記
載されており、これは、別のオリゴヌクレオチド化合物と両方ともがそれらの標的PDE遺
伝子の20％未満の阻害を示す濃度で組み合わせた場合、少なくとも一つの標的PDE遺伝子
についての20％以上の阻害を引き起こし、そして一つのオリゴヌクレオチド化合物のみにより示される阻害の程度の少なくとも二倍の阻害を引き起こす。この組み合わせは、PDE
核酸標的並びにその他のPDEおよび炎症性メディエーターをコードする核酸の両方の阻害
を示すことができる。
【０１４３】
これらの結果から、2種類の異なる標的遺伝子、例えばPDE7AとPDE3A、のヌクレオチド
配列に由来する、2種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせる特異的複数遺
伝子ノックダウン作用が示される。
【０１４４】
オリゴヌクレオチドは、単独で使用された場合にはそれらの標的遺伝子に対して何ら作用を有さない濃度で投与されたが、この組み合わせは、標的遺伝子に対する顕著な阻害を誘導した。
【０１４５】
実施例8
本実施例は、PDE3AアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびPDE7Aアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせの、メディエータおよび酵素のmRNA発現に対する作用に関する。複数遺伝子ノックダウンの、サイトカイン、ケモカインおよび酵素遺伝子についてのmRNAの発現に対する作用の例は、図10に示される。結果は、U937単球細胞株において観察された。研究された濃度では、各アンチセンスオリゴヌクレオチドのみでは、IL-10 mRNA発現およびMMP-8 mRNA発現に対して、わずかな阻害作用しか有さないことは注目すべきである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独で使用される場合、PDE4B、MMP-1、MMP-2、
およびTIMP-1のmRNA発現に対しては何ら阻害作用を有さない。2種類のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせ（Top-1311（Seq. ID No. 45）＋Top-1703（Seq. ID No. 4
）またはTop-1307（Seq. ID No. 41）＋Top-1703（Seq. ID No. 4））は、単独で利用さ
れた各アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合と同様の作用を有する（IL-10 mRNAおよびMMP-8 mRNAに対して穏やかな阻害作用を有し、PDE4B、MMP-1、MMP-2、およびTIMP-1のmRNA発現に対しては何ら作用を有さない）。しかしながら、2種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせ（Top-1301（Seq. ID No. 35）＋Top-1703（Seq. ID No. 4）また
はTop-1303（Seq. ID No. 37）＋Top-1706（Seq. ID No. 7））は、TIMP-1 mRNA発現には影響を与えることなく、IL-10およびMMP-8 mRNA発現だけでなく、PDE4B、MMP-1およびMMP-2 mRNA発現も顕著に減少させることにより示される、相乗的な阻害作用を有した。アン
チセンスオリゴヌクレオチドの最後の2種類の組み合わせを使用することにより見いださ
れた複数遺伝子ノックダウンは、いくつかのMMPの酵素活性を阻害する遺伝子であるTIMP-1が、影響を受けなかったために選択的であり、そしてハウスキーピング遺伝子GAPDHがこの組み合わせにより影響を受けなかったために特異的である。これらの結果は、実施例5
に示される結果と一致しており、そして複数遺伝子ノックダウンがより幅広い抗-炎症性
作用を有するために強力であることを示す。
【０１４６】
実施例9
本実施例は、機能的アッセイ（すなわち、TNF-α産生の阻害）を利用し、ヒトPBMCにおけるPDEアイソタイプに対する2種類の選択したオリゴヌクレオチドを組み合わせることの
複数遺伝子ノックダウン作用を示す。
【０１４７】
サイトカインは、喘息およびCOPDを含む全ての疾患における慢性炎症の組織化において重要な役割を果たしている。TNF-αは、いくつかの炎症性疾患において発現される最も重要な前炎症性サイトカインの一つである。TNF-αレベルは、COPDを有する患者の誘発唾液中で顕著に増加する（Keatings et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996; 153; 530-534）。さらに、体重減少を伴うCOPD患者は、循環性細胞からのTNF-αの放出の増加を示し、そしてTNF-αは、骨格筋細胞のアポトーシスを誘導する可能性があり、その結果として、重症COPDを有する何例かの患者において見られる、特徴的な筋肉疲労（消耗）および悪液質を引き起こす（De Godoy et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996, 153,
633-637）。
【０１４８】
PDE4阻害剤は、細胞内のサイクリックAMPの上昇を介して、炎症性細胞からのサイトカ
インおよびケモカインの放出の減少を引き起こした（Torphy, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 157, 351-370）。コルチコステロイドとは対照的に、PDE4阻害剤は、好中
球に対して強力な阻害作用を有する（Au et al.,Br. J. Pharmacol. 1998, 123, 1260-1266）。このことは、それらがCOPDのための有用な抗-炎症性処置である可能性があること
を示唆している。PDE4阻害剤Cilomilastが、肺機能を向上させ、そしてCOPDを有する患者における症候を改善するという、予備的な証拠が存在し、そしてこのことは、サイトカイン阻害によるものである可能性がある（Compton et al., Lancet. 2001, 358, 265-270）。ここで、いくつかの選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせは、それらの特異的PDE標的を阻害するだけではなく、前-炎症性サイトカインTNF-αの産生の減少を含む、複数遺伝子ノックダウンを引き起したことが、示された。図11は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Top-1360（PDE3B、Seq. ID No. 58）；Top-1413（PDE4A、Seq. ID No. 74）；Top-1437（PDE4B、Seq. ID No. 86）；Top-1498（PDE4D、Seq. ID No. 140）
）を個別に使用した場合、それらは試験した濃度では、PHA-活性化PBMCからのTNF-α放出に対して、わずかな最小の作用しか有さないことを示す。しかしながら、組み合わせを調べると、それらはPBMCからのTNF-α放出に対して、付加的以上の作用を示す。ミスマッチアンチセンスを個別に使用するか、またはその他のアンチセンスと組み合わせて使用しても、刺激PBMCからのTNF-α放出に対して何ら作用を有さなかったため、TNF-α放出に対する観察された作用は、特異的であった。
【０１４９】
TNF-αは炎症性疾患および慢性呼吸器疾患における共通の特徴と考えられているため、本発明は、いくつかの炎症性疾患を治療するための幅広い治療用途を提供する。
【０１５０】
実施例10
本実施例は、PDEアイソタイプに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをin vivoで投与することにより、PDE4A、PDE4B、およびPDE7AについてのmRNAの発現を減少させること
ができることを示す。本実験において、各アンチセンスオリゴヌクレオチド（表5）は、
点鼻（50 mg）により投与され、そして肺は16時間後に回収された。標的mRNAの発現は、
肺全体から調整されたcDNAに対するリアルタイムPCRにより、調べられた。表5は、各マウス標的mRNAに対して特異的ないくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドを列挙し、それについての測定された阻害活性は、25％よりも大きかった。各実験に含まれる対照アンチセンスオリゴヌクレオチドは、異なるmRNA標的の阻害活性を何も示さなかった。このことから、観察されたアンチセンス活性が、標的およびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列特異的であることが示唆された。従って、いくつかのPDE mRNAの発現の阻害は、活性なアンチセンスオリゴヌクレオチドの単純な点鼻により、マウスの肺において達成することができた。
【０１５１】
実施例11
本実施例は、2種類のアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせを、複数遺伝子ノ
ックダウンをin vivoで誘導するために利用することができることを示す。図12Aは、TOP 2437を測定する時点で、PDE4Bに対するマウスアンチセンスオリゴヌクレオチドが、低濃
度（50 mg/マウス）で使用された場合、PDE4B mRNA発現それ自体に対しては何ら顕著な阻害作用を有さないことを示す。しかしながら、Top 2437（PDE4Bに対するアンチセンスオ
リゴヌクレオチド）をTop 2713（PDE7Aに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）と組
み合わせることにより、マウス肺において、40％以上のPDE4Bの阻害が引き起こされる。
図12Bは、TOP2437およびTOP2713単独は、低濃度で使用される場合に、PDE7A mRNA発現に
対してほとんど阻害作用を有さなかったが、両アンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせは、PDE7A mRNA発現を83％阻害したことが示される。結果から、2種類の異なるPDEアイソザイムを標的とする2種類のアンチセンスを組み合わせると、単一のアンチセンス処
置の場合と比較して、結果として各標的遺伝子についてより高い阻害、例えば、付加的レベル以上の阻害、が得られることが示される。図12Cは、PDE4BおよびPDE7Aに対するアン
チセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせもまた、マウス肺において、PDE4A mRNA発現を減少させることを示す。結果から、各アンチセンスオリゴヌクレオチドがそれ自体何も作用を有さないとしても、組み合わせ処置の後、PDE4A mRNA発現の高い相乗的レベルの阻害が得られたことが示された。
【０１５２】
これらの結果は、標的PDEアイソタイプの付加的以上の阻害を、これらのアイソタイプ
に対する2種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを組み合わせることにより得ることがで
きるだけでなく、その他のPDEアイソタイプの付加的な阻害もまた、所定のアイソタイプ
には対していない2種のアンチセンスの組み合わせを用いて処置することにより得ること
ができることを示す。
【０１５３】
実施例12
本実施例は、特異的PDEアイソタイプに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、マ
ウスにおいてLPSにより引き起こされた急性肺炎を部分的に阻害することができることを
示す（図13）。本実施例において、PDE4Bが標的とされた。というのも、以前に、LPS誘導性炎症においてそれが重要であることが示されたためである（Ma et al.,Mol. Pharmacol., 1999, 55, 50-57；Wang et al., Molec. Pharmacol., 1999, 56, 170-174）。さらに
、我々の以前の結果により、PDE4B発現がマウスにおけるLPS処置により亢進制御されることが確認された（データは示さず）。
【０１５４】
標的mRNAの発現が、LPS-曝露マウスにおいて阻害されうるかを調べるため、マウスを200 mgのTOP2430（PDE4Bに特異的）または対照アンチセンスオリゴヌクレオチドの点鼻により事前処理し、12時間後にLPS曝露した。図13Aにおいて示される様に、PDE4B発現は、TOP2430の事前処理の後、86％減少された。図13Aはまた、肺PDE4A、PDE4DおよびPDE7A mRNA
発現もまた、PDE4Bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用することにより、部
分的に阻害されたことを示す。対照的に、PDE3B発現は、PDE4Bの阻害の後、117％まで活
性化された。本実施例は、別の方法で、in vivoでの複数遺伝子ノックダウンの概念をし
めす。
【０１５５】
図13Bは、PDE4B阻害のLPS-誘導性急性肺炎に対する作用を示す。結果から、対照マウスと比較した場合、TOP-2430によるPDE4Bの阻害により、LPSに曝露されたマウスの肺への細胞の流入が顕著に減少した（40％の減少、p<0.013）ことが示される。処置マウスにおい
ては、全細胞の減少が、肺洗浄中に存在する好中球の顕著な減少（40％の減少、p<0.016
）およびマクロファージの顕著な減少（50％の減少、p<0.002）と関連した。さらに、TOP-2430での前処理により、肺洗浄液中のLPS-誘導TNF-α濃度の顕著な減少（26％）が引き
起こされた（図13C）。
【０１５６】
結果から、標的PDE mRNAの特異的な阻害は、マウスにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所的送達により達成することができることが示される。さらに、LPS-曝露マウスにおけるPDE4Bの発現の阻害は、細胞の流入の減少を伴う炎症性反応、肺への好中球
およびマクロファージの遊走およびTNF-α放出の減少に対して、顕著な作用を有している。この作用のメカニズムは、PDE4Bに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、結果と
していくつかのその他のPDEの下方制御をももたらす場合に生じる複数遺伝子ノックダウ
ンと関連している可能性がある。
【０１５７】
実施例13
本実施例は、タバコの煙に曝露することにより誘導される急性肺炎を阻害するために、特異的PDEB4 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率に関するものである（図14）。
【０１５８】
図14は、AKR/Jマウスをタバコの煙の中で呼吸させることの作用を示す。喫煙は、曝露
後24時間後まで気管支肺胞洗浄細胞（好中球およびマクロファージ）の顕著な増加を生じ、それは少なくとも48時間持続した（図14A）。炎症性細胞の流入と同時に、煙への曝露
は、肺組織内でのTNF-αの発現の増加を誘導した（3.5倍の増加、図14B）。マクロファージ、好中球およびTNF-αが、喫煙誘導性肺炎およびそれに引き続いて起こる肺気腫の進行において、重要な役割を果たしていることが示された（Churg et al.,Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 2002, 166, 849-854；Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2002, 27, 368-374）。
【０１５９】
図14Cは、PDE4B阻害のTNF-αmRNA発現の喫煙誘導性増加に対する作用を示す。結果から、対照アンチセンスオリゴヌクレオチドにより事前処置したマウスと比較して、TOP-2430による20％のPDE4Bの阻害により、TNF-αの発現が肺組織において21％減少することが示
された。
【０１６０】
全体から見て、これらの結果は、PDE4B mRNA発現の特異的阻害を、煙に曝露されたマウスにおいて得ることができ、そしてそれが全肺組織におけるTNF-αmRNA発現に対する匹敵する作用を有することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
本発明は、以下の記載および図面を参照して、よりよく理解することができる。
【図１】図1は、構造細胞（A549、気管支平滑筋細胞（BSMC）、NCI-H292）；免疫細胞（末梢血単核細胞、PBMC）および組織（肺、脳）において、異なるホスホジエステラーゼ（PDE）の発現プロファイルを示す、半-定量的PCRの6枚のゲルを示す。3A＝PDE3A；3B＝PDE3B；7A＝PDE7A；7B＝PDE7B；4A＝PDE4A；4B＝PDE4B；4C＝PDE4C；4D＝PDE4D；P＝PBGD（ポルフォビリノーゲン・デアミナーゼ）；G＝GAPDH（グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ）；（-）＝逆転写なしのRNAの増幅；MW＝100 bp DNAラダー。
【図２】図2は、肺炎反応において潜在的に重要な細胞に関連する、構造細胞（A549、NHBE、BSMC）および非-構造細胞（Eol-1、Hut-78、Jurkat、およびU937）において、PDE7Aアイソタイプの発現プロファイルを示す、半-定量的PCRの7枚のゲルを示す。7A1＝PDE7A1；7A2＝PDE7A2；7A3＝PDE7A3；G＝GAPDH、（-）＝逆転写なしのRNAの増幅、そしてMW＝100 bp DNAラダー。
【図３】図3は、Eol-1細胞およびU937細胞においてPDE7A mRNA発現を減少させる際の、1700番台のアンチセンスシリーズのいくつかの効率を示す、半-定量的PCRの8枚のゲルを示す。C＝アンチセンスなし；Top-1701、Top-1702、Top-1703、Top-1706、Top-1707およびTop-1726＝PDE7A-指向性アンチセンス；100bp＝DNAラダー；（0）、（10）および（20）＝アンチセンス濃度（μM）。
【図４】図4は、Jurkat細胞およびHut-78細胞においてPDE7A mRNA発現を減少させる際の、1700番台のアンチセンスシリーズのいくつかの効率を示す、半-定量的PCRの6枚のゲルを示す。C＝アンチセンスなし；Top-1702、Top-1703、Top-1706、Top-1707およびTop-1726＝PDE7A-指向性アンチセンス；100 bp＝DNAラダー；（0）、（10）および（20）＝アンチセンス濃度（μM）。
【図５】図5は、BSMC細胞およびA549細胞においてPDE7A mRNA発現を減少させる際の、1700番台のアンチセンスシリーズのいくつかの効率を示す、半-定量的PCRの6枚のゲルを示す。C1およびC2＝アンチセンスなし；Top-1702、Top-1703、およびTop-1706＝PDE7A-指向性アンチセンス；MW＝100 bp DNAラダー；（0）、および（20）＝アンチセンス濃度（μM）。
【図６】図6は、A549細胞およびU937細胞においてPDE3A mRNA発現を減少させる際の、1300番台のアンチセンスシリーズのいくつかの効率を示す、半-定量的PCRの6枚のゲルを示す。C＝アンチセンスなし；Top-1301、Top-1302、Top-1303、Top-1307、Top-1308、Top-1309およびTop-1311＝PDE3A-指向性アンチセンス；100 bp＝DNAラダー；（0）、（10）および（20）＝アンチセンス濃度（μM）。
【図７】図7は、BSMC細胞においてPDE3A mRNA発現を減少させる際の、1300番台のアンチセンスシリーズのいくつかの効率を示す、半-定量的PCRのゲルを示す。C1およびC2＝アンチセンスなし；Top-1301、Top-1302、Top-1303、Top-1307、Top-1308、Top-1309およびTop-1311＝PDE3A-指向性アンチセンス；100 bp＝DNAラダー；（0）、および（20）＝アンチセンス濃度（μM）。
【図８】図8は、BSMC細胞においてMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-12、TIMP-1、COX-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、TNF-αを減少させる際の、1300番台および1700番台のアンチセンスシリーズのアンチセンスオリゴヌクレオチドの相対的な効率を示す、半-定量的PCRのゲルを示す。C＝アンチセンスなし；Top-1301、Top-1303、Top-1308、およびTop-1311＝PDE3A-指向性アンチセンス；Top-1702、Top-1703、およびTop-1706＝PDE7A-指向性アンチセンス；MW＝100 bp DNAラダー。
【図９】図9は、U937細胞において、1700番台のシリーズおよび1300番台のシリーズ由来のオリゴの組み合わせによる、PDE3A mRNA発現およびPDE7A mRNA発現の複数遺伝子ノックダウンの効率および概念を示す、半-定量的PCRのゲルを示す。C＝アンチセンスなし；1＝Top-1301；2＝Top-1303；3＝Top-1307；4＝Top-1311；5＝Top-1702；6＝Top-1703；7＝Top-1706；8＝Top-1702およびTop-1301；9＝Top-1703およびTop-1301；10＝Top-1706およびTop-1301；11＝Top-1702およびTop-1303；12＝Top-1703およびTop-1303；13＝1706および1303；14＝Top-1702およびTop-1307；15＝Top-1703およびTop-1307；16＝Top-1706およびTop-1307；17＝Top-1703およびTop-1311；18＝Top-1706およびTop-1311；MW＝100 bp DNAラダー。9および13の組み合わせは、複数遺伝子ノックダウンで効果的なものである。
【図１０】図10は、U937細胞においてPDE4B、IL-10、IL-15、MMP-1、MMP-2、MMP-8、TIMP-1の発現レベルを修飾する際の、1300番台のアンチセンスシリーズおよび1700番台のアンチセンスシリーズの複数遺伝子ノックダウンの効率および概念を示す、半-定量的PCRを示す。C＝アンチセンスなし；Top- 1301、Top-1303、Top-1307およびTop-1311＝PDE3A-指向性アンチセンス；Top-1703、およびTop-1706＝PDE7A-指向性アンチセンス；MW＝100 bp DNAラダー。1＝Top-1301；2＝Top-1303；3＝Top-1703；4＝Top-1706；5＝Top- 1301およびTop-1703；6＝Top-1303およびTop-1706；7＝Top-1311およびTop-1703；8＝Top-1307およびTop-1703。
【図１１】図11は、ヒトPDEアンチセンス（AS）についての機能的アッセイの結果およびTNF-αタンパク質レベルでの複数遺伝子ノックダウンの相対的効率のの結果を示す。試験は、PDEの異なるアイソタイプに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの、PHAで刺激されたヒトPBMCにおけるTNF-α産生に対する作用を評価した。PBMCを、1つのASでトランスフェクトした：PDE3B AS Top-1360（Seq. ID No. 58）＝3B；PDE4B AS Top- 1437（Seq. ID No. 86）＝4B；PDE4D AS Top-1498（seq. ID No. 140）＝4D；PDE4A AS Top-1413（Seq. ID No. 74）＝4A。PBMCを、2つのASの組み合わせでもトランスフェクトした：3B/4B＝Top-1360（Seq. ID No. 58）+ Top- 1437（Seq. ID No. 86）；3B/4D＝Top-1360（Seq. ID No. 58）+ Top-1498（seq. ID No. 140）；4A/4D＝Top-1413（Seq. ID No. 74）+ Top-1498（Seq. ID No. 140）；4B/4D＝Top-1437（Seq. ID No. 86）+ Top-1498（seq. ID No. 140）。ミスマッチAS（3Bmi、4Ami、4Bmiおよび4Dmi）もまた、本研究に含まれた。PHAで刺激されたが、トランスフェクトされていないPBMCは、対照として考えられた。
【図１２】図12は、PDE4BおよびPDE7Aの両方を標的とする組み合わせアンチセンス処置の複数標的阻害および相乗的作用を示す。マウス（グループごとに8匹）に対して、50 mgのTop-2437（PDE4Bを標的とする）、50 mgのTop-2713（PDE7Aを標的とする）、または両アンチセンスの組み合わせ（各50 mg）を鼻から吹き込んだ。対照マウスは、同量の対照アンチセンスオリゴヌクレオチドを吹き込んだ。リアルタイムPCR解析を、HPRT（参照遺伝子）について標準化して、吹き込み後16時間後に、（A）PDE4Bの発現、（B）PDE7Aの発現、そして（C）PDE4Aの発現について行った。データは、各マウスにつきPDE4B発現、PDE7A発現およびPDE4A発現の阻害％で示す（対照アンチセンス処置マウスと比較して）。バーは、阻害の平均％を示す。
【図１３】図13は、PDE4B mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる特異的阻害の、LPS-誘導性肺炎に対する作用、およびPDE mRNA発現に対する作用を示す。A）PDE4Bの阻害の、その他のPDE mRNAの発現に対する作用。TOP2430処置マウスにおける別のPDE mRNAの発現レベルを、LPS曝露の6時間後にリアルタイムPCRにより評価した。阻害％は、得られた発現レベルを対照アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与したマウスにおいて測定された発現レベルと比較することにより決定した。示される値は、平均±SD（n＝8〜9）を示す。B）TOP2430で事前処理したLPS-曝露マウスの肺内への細胞の流入の阻害。BAL細胞の特異的な細胞カウントを、LPS曝露後6時間後に行った。示される値は、平均±SD（n＝8〜9）を示す。C）BALにおけるTNF-α放出に対する作用。TOP2430処置マウスにおけるTNF-α放出は、ELISAにより測定し、そして阻害％は、TOP 2430後に得られたTNF-α値を対照アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置したマウスにおいて得られた値と比較することにより決定した。
【図１４】図14は、マウスPDE4B mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる特異的阻害の、タバコの煙により誘導された肺炎に対する作用を示す。A）タバコの煙への曝露後24時間後および48時間後の気管支肺胞洗浄細胞カウント。値は、平均±SDである。PMN＝好中球；AM＝マクロファージ。B）タバコの煙に曝露されたマウスの肺組織におけるTNF-αmRNA発現。TNF-αmRNAの発現レベルは、タバコの煙への曝露（3匹のマウス）後48時間後の全肺から単離したRNAから調製されたcDNAについてのリアルタイムPCRにより評価した。対照マウスは、疑似喫煙させた（5匹のマウス）。値は、HPRTに対するTNF-α発現の平均±SDである。C）TOP2430で事前処置した3時間後にタバコの煙に曝露したマウス（4匹のマウス）または対照アンチセンスで事前処置した3時間後にタバコの煙に曝露したマウス（5匹のマウス）における、TNF-αおよびPDE4B mRNA発現。TNF-αmRNAおよびPDE4B mRNAの発現レベルは、タバコの煙に曝露した後48時間後の全肺から単離したRNAから調製したcDNAについてのリアルタイムPCRにより評価した。値は、HPRTに対する、TNF-α発現またはPDE4B発現の平均±SDである。
【図１５−１】表1aは、本発明によるヒトPDE7Aオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である；表1bは、本発明によるヒトPDE3Aオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である；表1cは、本発明によるヒトPDE3Bオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である。
【図１５−２】表1dは、本発明によるヒトPDE4Aオリゴヌクレオチドアンチセンスの特定である；表1eは、本発明によるヒトPDE4Bオリゴヌクレオチドアンチセンスを示す；表1fは、本発明によるヒトPDE4Dオリゴヌクレオチドアンチセンスを示す。
【図１６−１】表2aおよび2bは、標準的PCRにおいて使用するヒトオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図１６−２】表2cは、リアルタイムPCRにおいて使用するヒトオリゴヌクレオチドプライマーを示す；表2dは、リアルタイムPCRにおいて使用するマウスオリゴヌクレオチドプライマーを示す。
【図１７】表3aおよび3bは、細胞株、初代細胞および組織におけるヒトPDE発現パターンを示す。
【図１８】表4aは、ヒトPDEオリゴヌクレオチドアンチセンスの、A549細胞株中およびヒトPBMC中での初回スクリーニングの概要を示す；表4bは、複数遺伝子ノックダウン効果によるヒトPDE単一アンチセンスを示す。
【図１９】表5は、マウスPDEオリゴヌクレオチドアンチセンスのin vivoでの初回スクリーニングを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月23日(2011.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
PDEをコードする核酸配列の少なくとも部分に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であって、前記化合物が前記PDEの発現を阻害するために有効である、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物。