(57)【要約】【課題】本発明は、そのプロトプラストが植物体に再生可能な、カッサバまたは近縁種のプロトプラストを生成する方法に関するものである。【解決手段】本発明の方法は、カッサバまたは近縁種の外植体から脆性胚形成性カルスを生成し、この脆性胚形成性カルスからプロトプラストを単離することを含む。本発明はまた、当該方法により得られるプロトプラストに関するものである。さらに本発明は、カッサバまたは近縁種のこのようなプロトプラストを形質転換させる方法、およびそれにより得られる形質転換したプロトプラストに関するものである。加えて、本発明は、これらのプロトプラストから植物体を再生させる方法、およびそれにより得られるカッサバ植物体または近縁種に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのプロトプラストが植物体に再生可能な、カッサバまたは近縁種のプロトプラストを生産する方法であって、カッサバまたは近縁種の外植体から脆性胚形成性カルスを生産し、この脆性胚形成性カルスからプロトプラストを単離することを含む方法。
【請求項２】
脆性胚形成性カルスを液体培地での培養に付す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞壁分解酵素の混合物を用いてプロトプラストを単離する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
外植体を取得する植物をオーキシンで前処置する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
脆性胚形成性カルスを魚雷型一次または成熟胚から生成させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
一次外植体上で胚が誘導される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法により得られるプロトプラスト。
【請求項８】
カッサバまたは近縁種のプロトプラストを形質転換させる方法であって、追加の遺伝情報を含む細菌による感染によって前記プロトプラストに前記追加の遺伝情報を提供することにより、または、前記追加の遺伝情報を含むベクターを提供する電気穿孔もしくは化学的穿孔により、または、前記追加の遺伝情報で被覆されている粒子の衝突により、請求項７に記載のプロトプラストを形質転換させる前記方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる形質転換したプロトプラスト。
【請求項１０】
追加の遺伝情報が、関心のある遺伝子を含む、請求項９に記載の形質転換したプロトプラスト。
【請求項１１】
追加の遺伝情報がアンチセンス構築体を含む、請求項９に記載の形質転換したプロトプラスト。
【請求項１２】
アンチセンス構築体がアミロース合成経路を阻害することのできる、請求項１１に記載の形質転換したプロトプラスト。
【請求項１３】
請求項７または９〜１２のいずれか１項に記載のプロトプラストが胚を生産するよう誘導され、この胚は結果的に植物体を生産するよう誘導される、プロトプラストから植物体を再生するための方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により得られるカッサバ植物体またはその近縁種。
【請求項１５】
塊茎が本質上アミロースを含有しない、請求項１２に記載のプロトプラストから得られる、請求項１４に記載の植物体。
【請求項１６】
−  塊茎を洗浄し、その後これをすりおろし粉砕し；
−  分離機内で繊維および汁から澱粉を分離し；
−  その澱粉を篩通しし；
−  その澱粉を洗浄し；そして、
−  その澱粉を乾燥する、
工程を含む、請求項１４または１５に記載の植物体の塊茎から澱粉を単離する方法。
【請求項１７】
澱粉を湿式サイクロン中で洗浄する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
澱粉を減圧濾過器で乾燥し、その後乾燥塔で乾燥する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法により得られる澱粉。
【請求項２０】
澱粉の（乾燥物質）質量を基準として少なくとも９５質量％のアミロペクチン含有量を有する、請求項１９に記載の澱粉。
【請求項２１】
澱粉の（乾燥物質）質量を基準として少なくとも９８質量％のアミロペクチン含有量を有する、請求項２０に記載の澱粉。
【請求項２２】
天然のアミロペクチンカッサバ澱粉。
【請求項２３】
澱粉が少なくとも約９０（質量）％のアミロペクチン含有量を有する、請求項２２に記載の澱粉。
【請求項２４】
澱粉が少なくとも約９５（質量）％のアミロペクチン含有量を有する、請求項２２に記載の澱粉。
【請求項２５】
澱粉が少なくとも約９８（質量）％のアミロペクチン含有量を有する、請求項２２に記載の澱粉。
【請求項２６】
澱粉の粘度が通常のカッサバ澱粉の粘度よりも少なくとも約３０％大きい、請求項２２に記載の澱粉。
【請求項２７】
澱粉の粘度が通常のカッサバ澱粉の粘度よりも少なくとも約５０％大きい、請求項２２に記載の澱粉。
【請求項２８】
澱粉の粘度が通常のカッサバ澱粉の粘度よりも少なくとも約８０％大きい、請求項２２に記載の澱粉。
【請求項２９】
物理的、化学的または酵素的に修飾された、請求項２２に記載の澱粉。
【請求項３０】
請求項２２に記載の澱粉を含む組成物。
【請求項３１】
当該組成物が、紙製品、食品、医薬品、栄養製品、身体ケア製品、洗浄剤、乳化剤、封入剤、および生物分解性発泡製品より成る群から選ばれる、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
常套的に使用される澱粉の代わりに請求項２２に記載の澱粉を使用することを含む、請求項３０に記載の組成物を製造する方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の澱粉を含む組成物。
【請求項３４】
当該組成物が、紙製品、食品、医薬品、栄養製品、身体ケア製品、洗浄剤、乳化剤、封入剤、および生物分解性発泡製品より成る群から選ばれる、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
常套的に使用される澱粉の代わりに請求項２９に記載の澱粉を使用することを含む、請求項３３に記載の組成物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
遺伝子修飾または形質転換とは、１または数個の遺伝子を商業上興味深い遺伝子型またはクローンに添加する技術である。原則として、成功する形質転換系は、特定の植物部分（茎、葉、節など）から新たな植物が形成される、または、特定の植物部分から誘導される特定組織（体細胞胚、胚形成性カルス、脆性胚形成性カルス）から新たな植物が形成される、または、これらの部分もしくは特定組織から誘導されるプロトプラスト（細胞壁を持たない単一の細胞）から新たな植物が形成される有効な系、その植物部分またはプロトプラストにＤＮＡ分子を移行させる系、および、導入された遺伝子を含み且つこれを発現する組織および植物を選択するための系を必要とする。原則としてプロトプラストがＤＮＡデリバリーのための最も理想的な系である。これらは単細胞として培養でき、そこから植物が発育する多細胞コロニーを生成する。プロトプラストから誘導される植物は一般にクローン性の起源である。これはいかなる形質転換系に対しても有用な手段となるが、それは、これがトランスジェニック植物においてキメラ現象を排除するためである。
【０００２】
カッサバはプロトプラストの植物再生にとって極めて扱いにくい。カッサバのプロトプラストからの芽の再生の報告はただ一つしかない（ＳｈａｈｉｎおよびＳｈｅｐｈａｒｄ、１９８０）。彼等はプロトプラストの単離用に、充分に拡大した葉を使用した。以来、少なからぬ努力にも拘わらずプロトプラスト（葉、茎、および根から単離）からの植物再生は再現されていない（著者不詳、１９８５；Ｎｚｏｇｈｅ、１９９１；Ａｎｔｈｏｎｙ  他、１９９５、Ｓｏｆｉａｒｉ、１９９６）。論理的アプローチは胚形成細胞を含む組織を使用することであった。このような細胞は、頂端分裂組織、若い葉、またはオーキシン添加培地で培養した体細胞胚で見出される（ＳｔａｍｐおよびＨｅｎｓｈａｗ、１９８７ａ；Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、１９９３ａ）。しかしながら、これらの組織から単離したプロトプラストはせいぜい緑色カルスおよび不定根を生成したに過ぎなかった（Ｓｏｆｉａｒｉ、１９９６）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
近年、新しい型の体細胞胚形成が開発された。このインビトロ系では、胚は（前）球状期を超えて発育することがなく、胚形成性カルスは極めて脆い（Ｔａｙｌｏｒ  他、１９９５）。この脆い胚形成性カルス（ＦＥＣ）を液体培地に移すと懸濁液様培養が生成した。リーキ（ＢｕｉｔｅｎｖｅｌｄおよびＣｒｅｅｍｅｒｓ、１９９４）、ペチュニア（Ｐｏｗｅｒ  他、１９７９）、米（Ｋｙｏｚｕｋａ  他、１９８８）、サトウキビ（Ｃｈｅｎ  他、１９８８）、および小麦（Ｃｈａｎｇ  他、１９９１）においては、このような培養はプロトプラスト再生の優れた供給源であった。ここに本発明者等は、カッサバにおいてＦＥＣが、これまでのところ植物に再生できるプロトプラストを単離できる唯一の組織であることを見出した。さらに本発明者等は、ＦＥＣを使用して、塊茎が実質上アミロースを含有しない澱粉を含有するカッサバ植物体を再生できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって本発明は、カッサバまたは近縁種のプロトプラスト（このプロトプラストは植物体へと再生できる）を製造する方法であって、カッサバまたは近縁種の外植体から脆性胚形成性カルスを製造し、この脆性胚形成性カルスからプロトプラストを単離することを含む方法を提供する。下に述べるように、適当なプロトプラストを取得するためには、溶液中でのＦＥＣの培養がかなり重要である。故に本発明はさらに、脆性胚形成性カルスを液体培地での培養に付す方法を提供する。
【０００５】
プロトプラストは、好ましくは植物細胞を酵素による細胞壁破壊に付すことによって製造する。したがって本発明は、細胞壁分解酵素、例えば、セルラーゼ、ペクトリアーゼおよび／またはマセロザイムの混合物を使用してプロトプラストを生成させる方法を提供する。
【０００６】
また、本発明に係る方法は、外植体を取得する植物を前処置する場合に最もうまく実施できるようである。よって本発明は、外植体を取得する植物を下記のようにオーキシンで前処置する方法を提供する。
【０００７】
この外植体上で好ましくは胚形成が誘導され、その結果、脆性胚形成性カルスが一次、二次または環状胚形成性組織から生成する本発明方法が導かれる。理由は詳細な説明において述べる。上に開示した方法により得られるプロトプラストもまた本発明の一部である。
【０００８】
植物へと再生できるプロトプラストの取得が求められる重要な理由は無論、プロトプラストは、容易に形質転換または形質導入でき、または他の何らかの好適な方法による追加の遺伝情報の提供ができるということである。したがってこの場合、カッサバ植物体または近縁種に、興味の持たれる遺伝物質を提供することができる。したがって本発明はさらに、追加の遺伝情報を含む細菌、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による感染によって、または追加の遺伝情報を含むベクターを提供する電気穿孔または化学的穿孔によって、または粒子が追加の遺伝情報で被覆されている粒子の衝突によって、当該プロトプラストに前記の追加の遺伝情報を提供することにより、カッサバまたは近縁種を形質転換させる方法［ここで、脆性胚形成性カルスから得られるプロトプラストが形質転換される］を提供する（任意の適当な方法で提供すると定義する）ものである。本発明はさらに、このような方法により得られる形質転換したプロトプラストを包含する。
【０００９】
下に、植物、例えばカッサバを形質転換させることの有用性に関する短い序論を述べる。
植物遺伝子技術の適用は、有用遺伝子の単離、それらの特性決定および操作から、植物への修飾構築体の再導入に至る、数多くの異なる技術を包含している（Ｌｏｎｓｄａｌｅ、１９８７）。植物遺伝子技術は、米（Ｃｈｅｎ  他、１９８７；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  他、１９８９）、トウモロコシ（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  他、１９９０；Ｖａｉｎ  他、１９９３）、小麦（Ｍａｒｋｓ  他、１９８９）、および馬鈴薯（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ、１９８８；Ｖｉｓｓｅｒ  他、１９８９）といったトランスジェニック作物の少数の例により例示されるように、植物育種の進歩を誘導するであろう。遺伝子技術の急速な進歩は、植物病原体認識の複雑な分子機構と宿主植物の自然の防御戦略への洞察を可能にした。この技術は、古典的育種の可能性をはるかに凌駕した望ましい遺伝子型の、制御され且つ効率的な同定のために使用できる。
【００１０】
例えば、懸濁培養から誘導したプロトプラストの電気穿孔は、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓ  他、１９８８）、米（Ｔｏｒｉｙａｍａ  他、１９８８）およびカモガヤ（Ｈｏｒｎ  他、１９８８）の形質転換を導いた。
【００１１】
タバコのトバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）（Ｐｏｗｅｌ  Ａｂｅｌ  他、１９８６）、馬鈴薯（Ｈｏｅｋｅｍａ  他、１９８９）およびパパイヤ（Ｆｉｔｃｈ  他、１９９２）のポテックスウイルス（ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）といった病原性ウイルスに対する耐性を改善するための試みが成功を収めた。上記の例では、導入された特性は、外殻蛋白をコードしている単一遺伝子の発現に基づいていた。カッサバでは、アフリカカッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）およびカッサバコモンモザイクウイルス（ＣＣＭＶ）は、外殻蛋白の仲介する耐性技術によって制御できる（Ｆａｕｑｕｅｔ  他、１９９２）。シアン生成の重要酵素をコードしている遺伝子がクローニングされた（Ｈｕｇｈｅｓ  他、１９９４）が、これはアンチセンスアプローチを用いる遺伝的形質転換によるカッサバのシアン生成の操作を可能にするものである。本発明のもう一つの態様は、カッサバ塊茎中の澱粉の操作である。
【００１２】
したがって本発明は、追加の遺伝情報がアンチセンス構築体、特にそのアンチセンス構築体がアミロース合成経路を阻害することのできるアンチセンス構築体を含む、形質転換したプロトプラストを提供する。
【００１３】
プロトプラストは農地で生育させることも収穫することもできない。プロトプラストは形質転換にとって必要であるが、このプロトプラストを胚および／または植物体にまで再生できなければならない。これは本発明の非常に重要な態様であり、何故ならカッサバはプロトプラストから再生することが困難であることが示されてきたからである。詳細な説明は、これが如何にして達成できるかを説明している。追加の情報についてはＥ．Ｓｏｆｉａｒｉにより記載されたＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｓｓａｖａ（Ｍａｎｉｈｏｔ  Ｅｓｃｕｌｅｎｔａ  Ｃｒａｎｔｚ．）と題される論文を、本出願にそのコピーを同封し、引用によりこれを本明細書の一部とする。したがって本発明はプロトプラストから植物体を再生する方法を提供するものであり、この方法においては、本発明に係るプロトプラストを誘導して胚を生成させ、その胚を誘導して結果的に植物体を生成させる。
【００１４】
当該方法により得られる植物体、特に塊茎が本質的にアミロースを含有しない植物体もまた本発明の一部である。
さらに本発明は、当該カッサバ植物体の塊茎から澱粉を取得する方法を提供する。この方法は馬鈴薯塊茎から澱粉を単離する方法と本質上類似の方法で実施できる。本発明の一つの態様では、この方法は、塊茎を洗浄し、その後それらをすりおろし粉砕する工程を含む。続いてこの澱粉を分離器、例えば遠心分離器または湿式サイクロン中で繊維および汁から分離する。単離した澱粉はその後篩通し、洗浄および乾燥できる。洗浄は湿式サイクロン中で実施できる。乾燥は減圧濾過器および乾燥塔内で実施できる。
カッサバ塊茎から取得した、アミロペクチン含有量の高い澱粉もまた本発明の一部である。この澱粉は好ましくは本質上アミロースを含有しないが、それは、好ましくはこれが、当該澱粉の（乾燥物質）質量を基準として少なくとも約９０質量％、より好ましくは少なくとも約９５質量％、最も好ましくは少なくとも約９８質量％のアミロペクチン含有量を有することを意味する。本明細書で使用するアミロペクチン澱粉または低アミロース澱粉とは、このような高いアミロペクチン含有量を有する植物体から得られた澱粉を意味することを意図するものである。加えて、この澱粉は、分子量、固有粘度、粒径、および鎖長分布といった幾つかの明瞭な性質を持っており、それらは後に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】一次、二次体細胞胚形成、脆性胚形成性カルスの選択、成熟および乾燥、その後の発芽を含む、カッサバの体細胞胚形成の模式的表示。  ｇｄ２＝２０ｇ／ｌ  スクロースを加えたＧｒｅｓｓｈｏｆｆおよびＤｏｙの塩（１９７４）およびビタミンを添加した培地。  ｇｄ４＝４０ｇ／ｌ  スクロースを加えたＧｒｅｓｓｈｏｆｆおよびＤｏｙの塩（１９７４）およびビタミンを添加した培地。  ｍｓ２＝２０ｇ／ｌ  スクロースを加えたＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの塩およびビタミンを添加した培地。  ｐｉｃ＝１０ｍｇｌ／ｌ  ピクロラム、ＮＡＡ＝１０ｍｇ／ｌ  ナフタレン酢酸、２，４−Ｄ＝８ｍｇ／ｌ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸。  ｓｈ６＝６０ｇ／ｌスクロースを加えたＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）の塩およびビタミンを添加した培地。
【図２】通常のおよびアミロペクチンタピオカ澱粉の、ＧＰＣによる分子量分布。
【図３】通常のおよびアミロペクチンタピオカ澱粉に存在する脱分枝アミロペクチンの、ＧＰＣによる分子量分布。
【図４】通常のおよびアミロペクチンタピオカ澱粉の、ＧＰＣによる分子量分布。
【図５】通常のおよびアミロペクチンタピオカ澱粉のＢｒａｂｅｎｄｅｒ粘度。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＦＥＣの開始
ＦＥＣを取得する方法を図１に概説する。これは一次胚の誘導から始まる。一次胚は二工程の方法で作成する。第一工程では、塩およびビタミン（好ましくはＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２））、炭水化物源（例えば２０ｇ／ｌのスクロース）およびオーキシン（例えば１〜８ｍｇ／ｌのピクロラム（ｐｉｃｌｏｒａｍ）、またはジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）または２，４−Ｄ）を添加した培地上で胚の開始のために外植体を培養する。１０〜１５日後にこの最初の培地上で二極魚雷形態の胚が形成される。魚雷型の胚は明瞭な胚軸および子葉原基を有する。魚雷型胚を有するこの外植体を第二工程培地（オーキシンを加えず、最終的にサイトカイニンを添加する他は第一工程の培地と同一）に移した後、この魚雷型胚は成熟する。成熟胚は大きな緑色の子葉を有する。
【００１７】
接合子の胚（ＳｔａｍｐおよびＨｅｎｓｈａｗ  １９８２；Ｋｏｎａｎ  他、１９９４）、若葉外植体または頂端分裂組織（ＳｔａｍｐおよびＨｅｎｓｈａｗ、１９８７ａ；Ｓｚａｂａｄｏｓ  他、１９８７；ＭｒｏｇｉｎｓｋｙおよびＳｃｏｃｃｈｉ、１９９３；Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  １９９３ａ；Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ  他、１９９５）および花組織（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ、１９９５、ＷｏｏｄｗａｒｄおよびＰｕｏｎｔｉ−Ｋａｅｒｌａｓ、２００１）を使用して一次胚が得られる。このようにして、一次胚を形成する能力に関して多くの異なる遺伝子型を評価した。このプロトコルでは、一次体細胞胚は固体培地での培養後にのみ形成され、液体培地での培養では全く形成されなかった。さらに、体細胞胚（一次）は、ピクロラム、ジカンバまたは２，４−Ｄといったオーキシンを使用した場合にのみ観察され、ＩＡＡ、ＩＢＡまたはＮＡＡでは観察されなかった。
【００１８】
ここに使用するプロトコルでは、培養された外植体あたりの形成された成熟胚の数に遺伝子型の変異がある。遺伝子型Ｍ．Ｃｏｌ１５０５、Ｍ．Ｃｏｌ２２およびＧａｄｉｎｇは、培養された葉の外植体あたり最大数の成熟胚を与えた（ＭＥ／ＣＬＥ）。しかしながら形成された成熟胚の数は少なかった。Ｍ．Ｃｏｌ２２では、インビトロ生育させた植物体から単離し４ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加した第一工程培地で培養した葉の外植体の最大２２％がＭＥを形成し、そのＭＥ／ＣＬＥの最大数は０．８であった。８ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加した第一工程培地では、最大４９％の葉の外植体が形成され、ＭＥ／ＣＬＥの最大数は３．５であった。より高濃度の２，４−Ｄが外植体の胚形成能をさらに改善することはなかった。
【００１９】
葉の外植体が一次体細胞胚を生成する能力を改善するための試みとして、ドナー植物体を異なる条件の下で生育させた。異なる光条件（８、１２、１６または２４時間）の下でのインビトロドナー植物体の生育は、胚形成反応に影響を及ぼさなかった。しかしながら、光強度の低下は正の効果があった。８μＥｍ-2ｓ-1で生育させ第一工程培地で培養したドナー植物体から単離された葉の外植体で最良の結果が得られた。
【００２０】
他の研究者は、或る種の遺伝子型において、ジカンバ（１〜６６ｍｇ／ｌ）およびピクロラム（１〜１２ｍｇ／ｌ）は、一次胚形成の誘発に関して２，４−Ｄに優っていることを示した（Ｎｇ  １９９２；ＳｕｄａｒｍｏｎｏｗａｔｉおよびＨｅｎｓｈａｗ、１９９３；ＴａｙｌｏｒおよびＨｅｎｓｈａｗ、１９９３）。Ｍａｔｈｅｗｓ  他（１９９３）は、１５日間の第一工程培地の後に、外植体を０．５％の木炭を添加した成長調整剤を含まない培地に移すことにより、遺伝子型Ｍ．Ｃｏｌ１５０５における一次胚形成効率を改善した。この培地では成熟が改善され、結果として成熟胚の数が対照の０．４から３．４のＭＥ／ＣＬＥに増大した。ドナー植物体を２，４−Ｄまたはピクロラムまたはジカンバのようなオーキシンで前処置した場合に最良の結果が得られた。この場合、植物体は液体ＭＳ２０培地で生育させ、生育１２日後にオーキシンを添加した（最終濃度８ｍｇ／ｌ）。２日後、このドナー植物体から葉の外植体を単離し、８ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、ピクロラムまたはジカンバを含有する第一工程培地で培養した。クローンＭ．Ｃｏｌ２２では、９．４のＭＥ／ＣＬＥを導く結果となった。これはＨ2Ｏ処置された対照植物体（ＭＥ／ＣＬＥ  ３．５であった）よりも有意に高かった（表３）。
【００２１】
オーキシン前処置の一般的応用可能性を幾つかの異なる遺伝子型について試験した。ドナー植物体の前処置無しでは、二つの遺伝子型がＭＥを形成し、低い頻度であった。ドナー植物体の前処置後には、殆ど全ての遺伝子型の葉の外植体がＭＥを形成した。
【００２２】
最終的に本発明者等は、試験した２８の遺伝子型のうち２４から成熟した一次体細胞胚を得ることができた（表１。ＴＭＳ３０２２１、ＴＭＳ３０００１、ＴＭＳ３０５７２およびＳａｏ  Ｐａｏｌｏを除く）。これらのデータは、カッサバの殆ど全ての遺伝子型が体細胞胚形成を受け得るということを示唆しており、現在までに６０以上の遺伝子型においてそれらが一次体細胞胚形成を受け得ることが示されている（Ｔｈｒｏ  他、１９９９）。
【００２３】
接合子胚および葉から誘導される一次体細胞胚を外植体として使用して二次胚を開始させた（ＳｔａｍｐおよびＨｅｎｓｈａｗ、１９８７ｂ；Ｓｚａｂａｄｏｓ  他、１９８７；Ｍａｔｈｅｗｓ  他、１９９３；Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、１９９３ｂｃ；Ｌｕｏｎｇ  他、１９９５）。オーキシン添加培地での体細胞胚の連続培養は体細胞胚形成の環状系を産んだ。二次胚形成のための体細胞胚の継代培養の方法は、胚形成組織の形態に影響を及ぼすように思われた。固体２，４Ｄ含有培地上で、暗所で毎月再培養した体細胞胚の集塊は、古い胚の上に形成された手指様胚始原細胞に発達した。この胚は魚雷形態の段階を経なかった。
【００２４】
胚を含む集塊を光線下の第二工程培地に移すと、追加の発達が起こった（Ｓｚａｂａｄｏｓ  １９８７）。通常、成熟体細胞胚は第一工程培地中、明所で培養し、２０日後、成熟のためにこの外植体を第二工程培地に移した。この系では、胚は成熟するまで発達し、大きな緑色の子葉を有する成熟した胚を用いて胚形成の新たなサイクルを開始したが、一方他の系では、魚雷形態の胚を用いて二次体細胞胚形成の新たなサイクルを開始した。
【００２５】
成熟胚のこの増殖系を、表１に述べた１４２０の遺伝子型で試験した。殆どの遺伝子型で成熟一次胚がわずかしか得られなかったという事実にも拘わらず、１つを除く全ての遺伝子型が、一次体細胞胚形成での観察よりもはるかに高い頻度で、２，４−Ｄ添加培地での培養後に新たな成熟胚を与えた（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他．  １９９３ｂ、ｃ、２０００、２００１、Ｓｏｆｉａｒｉ  他、１９９６）。胚形成は、成熟胚の通常の継代培養により、１年以上維持された（Ｓｚａｂａｄｏｓ  他、１９８７；Ｍａｔｈｅｗｓ  他、１９９３；Ｒａｅｍａｋｅｒｓ、１９９３）。
【００２６】
新たな体細胞胚は液体および固体培地の両方で形成された。全ての遺伝子型において、液体培地では固体培地より多くの胚が形成され、二次体細胞胚形成の新たなサイクルの開始前に胚を断片化すると、全形の胚に比して生産が高まるということが観察された。例えば、Ｍ．Ｃｏｌ２２では、固体培地で培養した全形の胚は、培養胚当たり８個の胚を生成したが、一方、液体培地で培養した断片化胚は、培養胚当たり３２の胚を生成した（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、１９９３ｃ）。２，４−Ｄ、ピクロラムおよびジカンバのみならずＮＡＡもまた二次胚形成を誘発する能力を持っていた。ＩＢＡおよびＩＡＡは二次胚形成を誘発しなかった。
【００２７】
ＮＡＡは、Ａｄｉｒａ  １、Ａｄｉｒａ  ４、Ｇａｄｉｎｇ、系統  １１、Ｍ．Ｃｏｌ２２、Ｍ．Ｃｏｌ１５０５、ＴＭＳ９０８５３およびＧａｄｉｎｇに使用して成功を収めた（Ｓｏｆｉａｒｉ、１９９６）。一般に、ＮＡＡ添加培地では、２，４−Ｄ、ピクロラムまたはジカンバ添加培地よりも多くの成熟胚が生成された。さらに、ＮＡＡにより誘導された胚の発達は、２，４−Ｄ、ジカンバまたはピクロラムによるものより迅速であった。培養期間の短縮は、特に大規模での稼働では有益な効果を持っている。
組織学的には、２，４−Ｄにより新たに誘導された二次胚は外植体に垂直に付着していたのに対して、ＮＡＡによるものは水平に付着していた。
【００２８】
幾人かの科学者は、或る種の遺伝子型のカッサバで胚形成性培養を取得することに、今なお課題を有している（ＭｒｏｇｉｎｓｋｉおよびＳｃｏｃｃｈｉ、１９９２；Ｔａｙｌｏｒ  他、１９９２；Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ  他、１９９５；ＳｕｄａｒｍｏｎｏｗａｔｉおよびＢａｃｈｔｉａｒ、１９９５）。主たる課題は、一次外植体から胚形成性組織を得ることではなく、二次胚形成によるこの組織の大規模増殖である。この目的のため、魚雷形態の胚または成熟胚のいずれかより成る組織を使用できる。
【００２９】
魚雷型胚の増殖は極めて遺伝子型依存性であるが、成熟胚の増殖はほぼ遺伝子型独立性である（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ、１９９３）。一次および二次体細胞胚形成はいずれも、二極性構造を有する胎芽の形成を特徴とする。この二極性の魚雷型胚は、オーキシン添加第一工程培地で既に形成している。故に、Ｔａｙｌｏｒ  他、（１９９５）は、組織構造化された胚形成という語を提唱した。組織構造化された細胞とは、組織および器官が特徴的な統一体を形成している、活発に分裂しつつある細胞の一群と定義する（Ｗａｌｋｅｒ、１９８９）。
【００３０】
より組織構造化されていない型の体細胞胚形成がＴａｙｌｏｒ  他（１９９５）によって作り出された。１０ｍｇ／ｌのピクロラムを添加したＧｒｅｓｓｈｏｆｆおよびＤｏｙ（１９７２）の培地の塩およびビタミン（ＧＤ２）上で培養した、組織構造化された胚形成組織は、連続的な選択を行うにつれ、徐々に、より組織構造化していない組織に転換した。この組織は（ｐｒｏ−）球状胚のカルス様塊で構成されており、極めて脆性であった。故に、この組織は脆性胚形成性カルス（ＦＥＣ）と呼ばれた。ＦＥＣの細胞は常に集団の制御から離脱する状態にあり、そのためこれらは統一構造へと組織構造化されない。ＦＥＣは、ＧｒｅｓｓｈｏｆｆおよびＤｏｙ（１９７２）のビタミンおよび塩、７ｇ／ｌのＤａｉｃｈｉｎ寒天、２０ｇ／ｌのスクロースおよび１０ｍｇ／ｌのピクロラム（固体ＧＤ２）より成る培地上に維持する。３週間毎に脆性胚を上記の培地上に継代した。
【００３１】
液体懸濁培養を開始するため、脆性胚０．５ｇを、ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）の塩およびビタミン、６０ｇ／ｌのスクロースおよび１０ｍｇ／ｌのピクロラム（液体ＳＨ６）を添加した液体培地５０ｍｌを入れた２００ｍｌフラスコに移した。培地は２〜７日毎に更新し、１４日後に各フラスコの内容物を５個の新しいフラスコに分配した。オートクレーブにかける前にｐＨを５．７に調節した。生育室の温度は３０℃、光周期は１２時間、そして４０μｍｏｌｍ-2ｓ-1の照射とした。ＦＥＣを６％（ｗ／ｖ）スクロースおよび１０ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加したＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）培地（ＳＨ６）で培養することにより、懸濁培養を開始した。２〜３日毎にこの培地を更新した。
【００３２】
培養を極めて脆性状態に保つため、このＦＥＣは２ヶ月に１回篩通しせねばならない。実際には、１ｍｍ2のメッシュを有する篩を通したＦＥＣの一部を継代培養に使用する。
【００３３】
ＦＥＣはＧＤ２またはＳＨ６培地上では魚雷型胚を殆ど形成しない。魚雷型およびその後の成熟胚は、ＦＥＣを成熟培地で培養すると形成される。成熟培地は、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２）の塩およびビタミン、ならびにピクロラム  １ｍｇ／ｌで構成される。この成熟培地は３週間毎に更新した。
【００３４】
成熟胚は、２，４−Ｄ、ピクロラム、ジカンバまたはＮＡＡを添加したＭＳ２０培地で培養することにより、二次体細胞胚形成へと誘導できる。一次および二次体細胞胚形成は、広範囲の遺伝子型において比較的容易に確立される（表１を参照されたい）が、一方ＦＥＣは現在のところ幾つかの遺伝子型に限定されている。この系をより多くの遺伝子型に応用可能とするためには、追加の研究が必要であるが、体細胞胚形成および遺伝的形質転換の新たな系にとってＦＥＣへの期待は有望である。高品質の組織構造化した組織の利用可能性およびこの組織をＦＥＣに変換できることが、この目的にとって必須である。Ｔａｙｌｏｒ  他（１９９５）は「組織構造化された胚形成性組織」を使用し、ＦＥＣを開始するためにこれを魚雷型状態で増幅した。この場合、ＦＥＣの開始の成功にとっては、二つの工程（組織構造化組織の開始および非組織構造化組織への変換）が決定力を持っている。
【００３５】
いずれの工程も遺伝子型依存性である。もしＲａｅｍａｋｅｒｓ（１９９３）の記載のように、組織構造化組織が成熟状態で増幅するならば、ＦＥＣへと変換するこの組織の能力のみがＦＥＣ開始の決定的工程である。組織構造化された組織を出発材料として使用できるか否かは、尚調査せねばならない。組織構造化された組織が使用できない場合、この組織は、ＦＥＣの開始に使用する前に未成熟状態でまず増幅させるべきである。これは、外植体を高密度で培養すること、または環状期間を縮小することにより、容易に達成できる。
【００３６】
ＦＥＣ系統はＲ６０、Ｒ９０、Ｍ７、ＴＭＳ６０４４４およびＡｄｉｒａ  ４において取得した（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、２０００、２００１）。ＦＥＣからの植物体再生は、Ｒ６０、Ｒ９０、Ｍ７、ＴＭＳ６０４４４およびＡｄｉｒａ  ４で達成した（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、２０００、２００１）。Ｔａｙｌｏｒ  他（２０００）は遺伝子型系統  ２、Ｍ．ｃｏｌ１５０５、ＴＭＳ９０８５３、ＫａｔａｏｌｉおよびＢｏｎｏｕａ  ＲｏｕｇｅにおいてＦＥＣ系統を取得した。
【００３７】
プロトプラストからの植物体の再生
プロトプラストの単離
プロトプラストの単離のため、固体ＧＤ２または液体ＳＨ６上で培養した両方のＦＥＣを使用できる。しかしながら、最も高収量のプロトプラストは、液体ＳＨ６で１〜３週間培養したＦＥＣから得られた。
【００３８】
細胞壁消化溶液１０ｍｌを入れたペトリ皿（直径９ｃｍ）にＦＥＣ  ２グラムを入れた。細胞壁消化溶液は、細胞壁分解酵素の混合物；１０ｍｇ／ｌのペクトリアーゼ、１０ｇ／ｌのセルロース、２００ｍｇ／ｌのマセロ（ｍａｃｅｒｏ）酵素成長調節剤（ＮＡＡ  １ｍｇ／ｌ、２，４−Ｄ  １ｍｇ／ｌ、ゼアチン  １ｍｇ／ｌ）；主要塩類（３６８ｍｇ／ｌ  ＣａＣｌ2；３４ｍｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4；７４０ｍｇ／ＫＮＯ3；４９２ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）；微量塩類（１９．２ｍｇ／ｌ  ＮＡ−ＥＤＴＡ；１４ｍｇ／ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）およびｏｓｍｏｔｉｃｕｍ（９１ｇ／ｌ  Ｄ−マンニトール）および０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳで構成されていた。セルラーゼ（１〜１０ｇ／ｌ）にマセロ酵素（２００ｍｇ／ｌ）を加えた細胞壁分解酵素はうまくプロトプラストを単離した。
【００３９】
ペクトリアーゼ（０．００１〜０．０１ｇ／ｌ）および／またはドリセラーゼ（０．０２ｇ／ｌ）の追加の添加はプロトプラストの収量を増加させた。１８時間のインキュベーションの後、洗浄培地１０ｍｌをこの溶液に加えた。浸透圧モル濃度０．５３０ｍＯｓｍ／ｋｇの洗浄培地は、主要塩類（細胞壁消化溶液を参照されたい）、４５．５ｇ／ｌマンニトールおよび７．３ｇ／ｌ  ＮａＣｌで構成されていた。消化された組織を７３μＭ孔径フィルター（ＰＡ  ５５／３４  Ｎｙｂｏｌｔ−スイス）で２５０ｍｌガラスビーカー中に濾過した。濾液を１２ｍｌのねじ蓋付き遠心管２本に均等に分け、６００ｒｐｍで３分間遠心分離した（Ｍｉｓｔｒａｌ  ２０００）。上清を除去後に１回洗浄操作を反復した。主要および微量塩類（細胞壁消化溶液を参照されたい）ならびに１０５ｇ／ｌのスクロースを含有する溶液９．５ｍｌ上に浮遊させることによってプロトプラスト溶液を再懸濁した。ｐＨは５．８、浸透圧モル濃度は０．６５０ｍＯｓｍであった。プロトプラストを含む溶液を５分間平衡化させた後、その上に洗浄培地０．５ｍｌを静かに加えた。７００ｒｐｍで１５分間遠心分離（Ｍｉｓｔｒａｌ  ２０００）した後、このプロトプラストをスクロースと洗浄培地間のバンドで濃縮した。プロトプラスト層をパスツールピペットで集め、標準血球計数計のチェンバーで収量を係数した。
【００４０】
プロトプラスト培養
同じ液体培地１０ｍｌを入れたペトリ皿中で、アガロース０．２％ｗ／ｖにより固化した培地中でプロトプラストを培養した（Ｄｏｎｓ  ｅｎ  Ｂｏｕｗｅｒ、１９８６）。以下の培地はミクロカルスの形成を導いた：
−  オーキシンのみ（０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ＮＡＡまたは０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ピクロラム、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ＩＡＡ、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ジカンバ）またはサイトカイニン（０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ゼアチン、０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ２−ｉＰ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ＢＡ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ＴＤＺ、０．０１〜１ｍｇ／ｇ  カイネチン）を加えたオーキシンを添加したＴＭ２Ｇ培地（Ｗｏｌｔｅｒｓ  他、１９９１）、
【００４１】
−  オーキシンのみ（０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ＮＡＡまたは０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ピクロラム、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ＩＡＡ、または０．１１０ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄ、または０．１〜１０ｍｇ／ｌ  ジカンバ）＋サイトカイニン（０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ゼアチン、０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ２−ｉＰ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ＢＡ、０．０１〜１ｍｇ／ｌ  ＴＤＺ、０．０１〜１ｍｇ／ｇ  カイネチン）を添加した培地Ａ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２）の塩およびビタミン、４．５ｇ／ｌ  ミオイノシトール、４．５５ｇ／ｌ  マンニトール、３．８ｇ／ｌ  キシリトール、４．５５ｇ／ｌ  ソルビトール、０．０９８ｇ／ｌ  ＭＥＳ、４０ｍｇ／ｌ  硫酸アデニンおよび１５０ｍｇ／ｌ  カゼイン加水分解物、０．５ｍｇ／ｌ  ｄ−カルシウム−パントテン酸塩、０．１ｍｇ／ｌ  塩化コリン、０．５ｍｇ／ｌ  アスコルビン酸、２．５ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、１ｍｇ／ｌ  ピリドキシン−ＨＣｌ、１０ｍｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｌ  葉酸、０．０５ｍｇ／ｌ  ビオチン、０．５ｍｇ／ｌ  グリシン、０．１ｍｇ／ｌ  Ｌ−システインおよび０．２５ｍｇ／ｌ  リボフラビンおよび５９．４０ｇ／ｌ  グルコース）。
【００４２】
この培地は９ｍｌを新しい培地に交換することにより１０日毎に更新した。最初の培地での２ヶ月間の培養の後、高品質のＦＥＣを選択し、追加の増殖用または成熟用いずれかの培地。増殖のため、４０ｇ／ｌ  スクロース、７ｇ／ｌ  Ｄａｉｃｈｉｎ寒天および２ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加したＧｒｅｓｓｈｏｆｆおよびＤｏｙ（１９９４）培地（ＧＤ４）にＦＥＣを移した。３週間後、２０ｇ／ｌ  スクロース、７ｇ／ｌ  寒天および１０ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加したＧｒｅｓｓｈｏｆｆおよびＤｏｙ培地（ＧＤ２）にＦＥＣを移した。１０ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加した液体ＳＨ６％培地にＦＥＣ  １．０ｇを移すことにより、懸濁培養を開始した。２週間後、この懸濁液を、１．０ｍｌの始発充填細胞量で新たなフラスコに分配した。
【００４３】
２ヶ月の培養の後、０．５ｍｇ／ｌ  ＮＡＡおよび１ｍｇ／ｌ  ゼアチンを添加したＴＭ２Ｇ中１０5／ｍｌの密度で培養した１０4のプロトプラストは１０５８のミクロカルスを生成し、一方１０6／ｍｌの密度で培養した１０4のプロトプラストは６４のミクロカルスを生成したに過ぎなかった。
【００４４】
ＴＭ２Ｇ培地を培地Ａに交換すると、両方の密度においてミクロカルスの数が有意に減少した。この段階では少なくとも３つの型のカルスが識別できた。１つの型は球形の胚より成り、これは主として１０6の密度で培養したプロトプラストで観察された。これらのうち幾らかは子葉のような構造を発達させ、淡緑色であった。しかしながら、これらの胚は正常に発芽できなかった。別の型は速やかに生育し、大きくて密なカルスから成り、両方の密度のプロトプラスト培養で観察された。このカルスは胚に発育しなかった。第三の型は極めて脆性のカルスであり、両方の密度で観察された。２〜５ｘ１０5の密度（培地ＴＭ２Ｇ）では、カルスの約６０％が脆性であり且つ胚形成性であった。ＦＥＣは追加の増殖または成熟のため、継代培養した。
【００４５】
プロトプラストから誘導したＦＥＣの増殖
ＦＥＣの選択の後、その０．１ｇを、２ｍｇ／ｌ  ピクロラムを加えたＧＤ４で３週間培養すると、０．７ｇの組織に増加した。この組織の９５％以上は高品質のＦＥＣで構成されていた。続いてこの組織を、１０ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加したＧＤ２培地で３週間継代培養することにより維持した。懸濁培養を開始するため、ＦＥＣを液体培地に移した。この材料の充填細胞量（ＰＶＣ）の増加は、元の材料のそれより僅かに高かった（データは示していない）。
【００４６】
プロトプラストから誘導したＦＥＣの成熟
胚の成熟を誘導する試みにおいて、ＴＭ２Ｇ中２ヶ月の培養後に単離したＦＥＣを成熟培地上で培養した。成熟培地は、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２）の塩およびビタミン、１０ｇ／ｌ  Ｄａｉｃｈｉｎ寒天、０．１ｇ／ｌ  ミオイノシトール、２０ｇ／ｌ  スクロース、１８．２ｇ／ｌ  マンニトール、０．４８ｇ／ｌ  ＭＥＳ、０．１ｇ／ｌ  カゼイン加水分解物、０．０８ｇ／ｌ  硫酸アデニン、０．５ｍｇ／ｌ  ｄ−カルシウム−パントテン酸塩、０．１ｍｇ／ｌ  塩化コリン、０．５ｍｇ／ｌ  アスコルビン酸、２．ｍｇ／ｌ  ニコチン酸、１ｍｇ／ｌ  ピリドキシン−ＨＣｌ、１０ｍｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、０．５ｍｇ／ｌ  葉酸、０．０５ｍｇ／ｌ  ビオチン、０．５ｍｇ／ｌ  グリシン、０．１ｍｇ／ｌ  Ｌ−システイン、０．２５ｍｇ／ｌ  リボフラビンおよび１ｍｇ／ｌ  ピクロラムで構成されていた。この成熟培地は３週間毎に更新した。
【００４７】
この培地上では増殖から成熟への緩徐な移行がある。その結果、２週間の液体成熟培地での培養の後、充填細胞量は係数４で増加していた。固体成熟培地への移行後にも増殖はある。固体培地上で２週間の後、胚の殆どは球形に到達し、これらの球形胚のうち少数のみがさらに発達した。最初の魚雷型胚は、固体成熟培地上で１ヶ月培養後に見えるようになった。成熟胚および魚雷型胚の数は、平板培養効率ではなく、最初に培養したプロトプラストの密度に相関していた。成長調節剤無しのＴＭ２Ｇでプロトプラストを培養した場合、このような胚は得られなかった。最大数の成熟および魚雷型胚は、０．５ｍｇ／ｌ  ＮＡＡおよび１ｍｇ／ｌ  ゼアチンを添加したＴＭ２Ｇで培養したプロトプラストから形成された。ＮＡＡをピクロラムに交換すると、魚雷型および成熟胚の数は著しく低下した（表２）。試験したピクロラム濃度では２ｍｇ／ｌが最良の結果を与えた。３ヶ月の培養の後、アガロース１滴あたり６０〜２００の魚雷型および成熟胚が単離された。魚雷型胚は、これを新鮮な成熟培地またはＭＳ２プラス０．１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰで培養すると高頻度で成熟した。
【００４８】
二次体細胞胚形成およびプロトプラストから誘導した成熟胚の発芽
１０ｍｇ／ｌ  ＮＡＡまたは８ｍｇ／ｌ  ２，４−Ｄを添加した液体または固体ＭＳ２培地で培養した場合、少数の魚雷型胚が二次胚を形成したに過ぎなかった（データは示していない）。成熟胚は二次胚形成のためのよりよい外植体であった。液体および固体培地の両者において、２，４−Ｄは二次胚形成の誘導に関してＮＡＡよりも優っていた。成熟胚を最初に２，４−Ｄで、そして次に液体ＮＡＡで培養した場合、その反応は２，４−Ｄ単独での培養に匹敵するものであった。さらに、最初に２，４−Ｄを含む培地で二次体細胞胚形成を１サイクル受けた胚は、１０ｍｇ／ｌ  ＮＡＡを添加したＭＳ２０において高い効率で二次胚を生成した。
【００４９】
オーキシン２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）またはナフタレン酢酸（ＮＡＡ）により液体培地中で誘導した環状または二次体細胞胚の発芽を比較した。全ての遺伝子型において、乾燥が、ＮＡＡにより誘導された胚の正常な発芽を刺激した。しかしながら乾燥した胚は、高率の発芽のためにベンジタミノプリン（ＢＡＰ）のようなサイトカイニンを添加した培地を必要とした。得られた苗の形態はＢＡＰの濃度に依存していた。１ｍｇ／ｌのＢＡＰでは、太く短い主根と、節間の短い分岐した芽を持つ植物体が形成された。０．１ｍｇ／ｌのＢＡＰでは、主根は細く貧弱であり、芽は１または２個の頂端分裂組織しか持っていなかった。胚を最適となるまで乾燥させなかった場合、発芽を刺激するためには、最適に乾燥させた場合よりも高濃度のＢＡＰを要した。また、暗所で培養した乾燥胚はより低濃度のＢＡＰしか必要とせず、さらに、これらの胚は明所で培養した胚よりも早く発芽した。完全な植物体は、体細胞胚の誘導開始の４週間後に得られた。２，４−Ｄにより誘導した胚は異なる反応を示した。ただ一つの遺伝子型において、乾燥が２，４−Ｄ誘導胚の発芽を向上させ、他の三つの遺伝子型はそうでなかった。全ての遺伝子型において乾燥は根の形成を刺激した。暗所で培養した胚は専ら不定根を形成し、明所で培養した胚は専ら主根を形成した。
【００５０】
遺伝子転移系
過去数年にわたり、ＤＮＡを植物プロトプラストに転移させる幾つかの技術、例えばシリコン繊維（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  他、１９９０）、マイクロ注入（Ｄｅ  ＬａａｔおよびＢｌａａｓ、１９８７）および電気泳動（ＧｒｉｅｓｂａｃｈおよびＨａｍｍｏｎｄ、１９９３）が開発されてきた。最も一般的に使用されそして最も応用可能性の高い技術は、アグロバクテリウム仲介遺伝子デリバリー、ミクロ発射体／粒子衝突およびプロトプラスト電気穿孔である。
【００５１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス  ＤＮＡデリバリー系は最も一般的に使用されている技術である。それは恐らくこの方法による植物におけるＤＮＡデリバリーの最初の発明に関連している。当初これはカランコエ（Ｋａｌａｎｃｈｏｅ）およびソラナシエ（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、特にタバコに限られていた。近年このアグロバクテリウム仲介形質転換の用途は劇的に変化し、トウモロコシおよび米といった殆どの重要な単子葉植物を包含する広範囲の植物を、単子葉植物に限って形質転換させることが可能である（ＷｏｒｄｒａｇｅｎおよびＤｏｎｓ、１９９２により総説されている）。
【００５２】
カッサバはアグロバクテリウムのための宿主であるが、これに極めてよく反応する訳ではないことが分かっている。
【００５３】
カッサバ由来のＦＥＣはまた、アグロバクテリウム・ツメファシエンスにより効率的に形質転換された（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、２０００、Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ  他、２００１）。Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、２０００およびＳｃｈｒｅｕｄｅｒ  他、２００１により記載された方法を使用して、ＣａＭＶプロモーターの調節下に、アンチセンスｇｂｓｓ遺伝子を持つ遺伝子型Ａｂｉｒａ  ４およびＴＭＳ６０４４４４から遺伝子改変された植物体がうまく生成された。
【００５４】
原則としてプロトプラストがＤＮＡデリバリーのための最も理想的な外植体である。これらは、そこから植物体が発達する多細胞コロニーを生成する単一細胞として培養できる。プロトプラストから誘導される植物体は一般にその起源がクローン性である。これはいかなる形質転換系に対しても有用な手段を提供するが、それは、トランスジェニック植物においてキメラ現象を排除するためである。しかしながらプロトプラストの使用は、高度に種依存性である再生系によって妨げられる。形質転換のために、プロトプラストをＰＥＧと組み合わせて使用して原形質膜を変化させることができ、それにより、例えば、ロリウム・マルチフォーム（Ｌｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍ）（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  他、１９８５）およびトリチクム・モノコックム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）（Ｌｏｒｚ  他、１９８５）で証明されたように、ＤＮＡが細胞質に入ることを可能にする可逆的透過性が導かれる。ＤＮＡに対する原形質膜および細胞壁の透過性さえをも増大させるもう一つの技術は電気穿孔によるものである（総説としてＪｏｎｅｓ  他、１９８７を参照されたい）。この方法では、電気的パルスが、ＤＮＡが細胞に入るのを可能にする。米は、受精能力のあるトランスジェニック植物がプロトプラスト電気穿孔から得られた最初の作物であった（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  他、１９８９）。
【００５５】
外来ＤＮＡを運搬するための粒子衝突またはｂｉｏｌｉｓｔｉｃの使用はカッサバの形質転換に代替方法を提供する。粒子衝突は、殆ど全ての組織においてＤＮＡを細胞内に運搬できる唯一の方法である。この方法を用いて得られた最初のトランスジェニック植物はタバコであった（Ｋｌｅｉｎ  他、１９８９）。この形質転換法の成功に続いて、粒子衝突はアグロバクテリウム感染の影響をより受けにくい植物、とりわけ単子葉植物に広く使用されている。粒子（マイクロ発射体）を加速するための幾つかのＤＮＡデリバリー機器の改善は、最も最近のモデルＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）ＰＤＳ−１０００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リッチモンド、Ｃａ）を産んだ。これらの機器は市販品が入手可能であるが、現在のところ価格が比較的高い。ＤＮＡで被覆したタングステンまたは金粒子が、標的組織中にＤＮＡを運搬するミクロ発射体として一般に使用されている（Ｓｏｎｇｓｔａｄ  他、１９９５に総説がある）。
【００５６】
遺伝子改変に使用する選択およびリポーター遺伝子
形質転換した細胞を同定可能とするために、興味の持たれる遺伝子を選択マーカー遺伝子とカップリングする。このマーカー遺伝子は形質転換した細胞の選択に必要である。選択は、形質転換した細胞／組織の視覚的特徴に基づくことができる。一つの例は蛍から単離したルシフェラーゼ遺伝子である。この遺伝子を発現し且つ基質（ルシフェリン）が供給された植物細胞は、特別な装置で検出できる光を発する（Ｏｗ  他、１９８６）。形質転換した組織を選択するもう一つの方法は、抗生物質または除草剤に対する耐性をコードしている遺伝子の導入である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  他、１９８７；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ  他、１９９０）。
【００５７】
幾つかの抗生物質および除草剤が植物の形質転換における選択剤として使用されてきた。穀物においては、除草剤フォスフィノトリシン（ＰＰＴ）に対する耐性がトランスジェニック植物の選択に選ばれた（Ｃａｏ  他、１９９０）。カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ）（Ｆｉｔｃｈ  他、１９９４）、ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（Ｎａｋａｎｏ  他、１９９４；Ｓｃｏｒｚａ  他、１９９５）、トウモロコシ（Ｒｈｏｄｅｓ  他、１９８８）および米（Ｃｈｅｎ  他、１９８７）では、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子（Ｆｒａｌｅｙ  他、１９８６）が選択マーカーとして使用された。
【００５８】
カッサバでは上記の選択系が全て使用できるが、ＰＰＴに基づく選択は、成熟胚を形成するＦＥＣの能力を改善し、このようにして植物の再生を増強するという利点を持っている。
【００５９】
以下の部分は、塊根中のアミロペクチン含有量の高いカッサバ植物体を作り出すという目的でいかにしてカッサバ植物体を遺伝的に改変するかを記載するものである。
【００６０】
カッサバｇｂｓｓ遺伝子の単離および植物形質転換ベクターの組み立て  過去の研究では、ｇｂｓｓ遺伝子は馬鈴薯ｇｂｓｓ遺伝子（Ｖｉｓｓｅｒ  他、１９８９）をプローブに使用してカッサバから単離された（Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎ  他、１９９３）。このｇｂｓｓ遺伝子をｐＵＣ１９の馬鈴薯ｇｂｓｓプロモーター（Ｖｉｓｓｅｒ  他、１９９１）およびノパリンシンターゼターミネーターの間にアンチセンス方向にサブクローニングし、ベクターｐＡＧ６１を得た（Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎ  他、１９９３）。その他の好ましくは塊根特異的なプロモーター、例えばカッサバ由来の蛋白合成伸長因子１−アルファ（Ｓｕｈａｎｄｏｎｏ  他、２００１）、カッサバｇｂｓｓまたはＣａＭＶのようなより一般的なプロモーターもまた、ｇｂｓｓのような遺伝子の発現を指令するために使用できる。
【００６１】
完全なルシフェラーゼ遺伝子（ＢｇｌＩＩフラグメント）をｐＪＩＴ１００（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  他、１９９３）から単離し、ｐＡＧ６１のＢａｍＨＩ部位に挿入した。これにより二つの異なるベクター：ｐＧＢＳＳａｓ２およびｐＧＢＳＳａｓ７（この二つのベクターの相違はルシフェラーゼとアンチセンスｇｂｓｓ遺伝子の相互の向きであった）が生成した。いずれの構築体も、高アミロペクチン含有量を有するカッサバ植物体の生成に成功裏に使用された。
【００６２】
使用した植物材料および組織培養培地
遺伝子型ＴＭＳ６０４４４の植物を、  ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２）の塩およびビタミンならびに４０ｇ／ｌ  スクロースを添加した培地（ＭＳ４）上で、一節の挿し木を毎月継代培養することにより維持した。脆性胚形成性カルス（ＦＥＣ）系統を以下のように開始した：
−  ドナー植物体からの分裂組織または未熟な葉の単離
−  分裂組織／葉を、６ｍｇ／ｌ  ＮＡＡおよび６ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加したＭＳ４０で培養
−  密な胚形成性組織を単離し、ＧｒｅｓｓｈｏｆｆおよびＤｏｙ（１９７４）の塩およびビタミン、６０ｇ／ｌ  スクロースおよび１０ｍｇ／ｌ  ピクロラム（ＧＤ６）を添加した培地で培養
−  ＧＤ６培地で培養したＦＥＣ（凝集した球形ユニットの小さな集塊）の単離。ＦＥＣはＧＤ６培地上での３週間の継代培養により維持した。ＦＥＣ  ０．５ｇを、ＳｃｈｅｎｋおよびＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）の塩およびビタミン、６０ｇ／ｌ  スクロースおよび１０ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加した液体培地（ＳＨ６）５０ｍｌを入れた２００ｍｌのフラスコに移すことにより、液体培養を開始した。この培地は週に２回更新し、２週間後、各フラスコの内容物を５個の新しいフラスコに分配した。このフラスコを１２０ｒｐｍの回転振盪機（ＬＡＢ−ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．  Ｍｏｄｅｌ  ３５１９）上で培養した。
【００６３】
粒子上のＤＮＡの被覆
Ｃａｄｅ  他（１９８８）を調整した方法を用いて粒子上のＤＮＡを被覆した。８０μｇのＤＮＡ（ベクターｐＧＢＳＳａｓ２およびｐＧＢＳＳａｓ７から、ＰｒｏｍｅｇａのＷｉｚａｒｄＴＭ  Ｍａｘｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ精製系を用いて単離）を、１０ｍｇの金粒子（１．６μｍ、ＢｉｏＲａｄ）、３０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、５μｌの２Ｍ  トリス  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、９６５μｌの  Ｈ2 Ｏ、１００μｌの  ２５％  ＰＥＧ  １５５０、１００μｌの０．１Ｍ  スペルミジンおよび５０μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ2 と混合した。遠心分離した後、ペレットを無水アルコール１０ｍｌに再懸濁し、短時間超音波処理した。１６０μｌの懸濁液をマクロキャリアー上に逆さまに置いたマクロキャリアーホルダーの孔にピペットで入れた。５分後、マクロキャリアーホルダーを取り去った。金ビーズの薄層で覆われたマクロキャリアーを乾燥機で乾燥し（１０分間、４０℃）、衝突に使用した。
【００６４】
ＦＥＣの衝突およびトランスジェニック植物の選択
液体ＳＨ６培地で少なくとも５週間培養したＦＥＣを篩通し（１ｍｍメッシュ）集めた。ＦＥＣ  １００ｍｇをＧＤ６培地上に広げ、ＢｉｏＲａｄ  ＰＤＳ−１０００Ｈｅ  ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ装置を用いて衝突させた（ヘリウム圧１１００ｐｓｉ、破壊ディスクとマクロキャリアーとの間およびマクロキャリアーとストッパー板との間の距離は０．５ｃｍ、ストッパー板とＦＥＣとの間の距離は５．０ｃｍ、２７インチＨｇ減圧）。
【００６５】
ＴＭＳ６０４４４由来のＦＥＣを入れた計２１２および１８４個のペトリ皿を、それぞれ構築体ＧＢＳＳａｓ２またはＧＢＳＳａｓ７と衝突させた。衝突後、衝突させたＦＥＣを液体ＳＨ６培地を満たしたプラスチックポットで培養した。２週間後、ＦＥＣを固体ＧＤ６培地上に集め、ルシフェラーゼ活性について検定した。各々のルシフェラーゼ（ＬＵＣ）スポットを個別系統として継代培養した。構築体ＧＢＳＳａｓ２を用いて合計１８６のｌｕｃスポットが、そしてＧＢＳＳ７を用いて２２２のｌｕｃスポットが生成した。どのＦＥＣユニットがＬＵＣ活性を持っているのかを正確に位置決定してトランスジェニック組織の損失を回避することは不可能であったため、ＬＵＣスポットの周囲の半径０．５〜１ｃｍの組織を液体ＳＨ６培地に移した。２週間後、このＦＥＣをルシフェラーゼ活性について検定した。ルシフェラーゼ活性を持たない系統は廃棄し、４またはそれ以上のスポットを有する系統を小集塊分割に使用した。１〜３のスポットを有する系統を再度液体ＳＨ６培地に移し、２週間後、スポットの数が４以上に増加していた系統を小集塊分割に使用し、他のものは廃棄した。
【００６６】
ｐＧＢＳＳａｓ２を用いた衝突から４４の系統が、そしてｐＧＢＳＳａｓ７を用いた衝突から４０の系統が得られた。トランスジェニック組織を単離し小集塊分割（Ｒａｅｍａｋｅｒｓ  他、２０００）と呼ばれる方法によって精製した。小集塊分割は、ルシフェラーゼ陽性スポットの周囲（直径０．５〜１ｃｍ）の組織を継代培養することで開始した。この組織をＧＤ６培地上でできる限り細かく分割した。２週間後、ペトリ皿はＦＥＣ組織の小さな集塊で覆われた。ＬＵＣ陽性塊のみを継代培養した。このために、集塊を小集塊に分割し、ＧＤ６培地で培養した。
【００６７】
この選択操作をさらに１〜２回反復した後、組織を植物体再生のために培養した。このために、８４のＦＥＣ系統を成熟培地（１ｍｇ／ｌ  ピクロラムを添加したＭＳ４）上で２〜３週間毎に継代しながら１０〜１２週間培養した。魚雷型体細胞胚をＦＥＣから単離し、０．１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰを添加したＭＳ４で培養し、これにより追加の成熟が起こった。成熟体細胞胚はまず液体培地で２週間、その後固体発芽培地（ＭＳ４  ＋  １ｍｇ／ｌ  ＢＡＰ）で培養した。植物はＭＳ４培地上で根付いた。４４のＧＢＳＳａｓ７培養系統のうち３１から、そして４０のＧＢＳＳａｓ７培養系統のうち２７から植物体が得られた。
【００６８】
これらの植物体は最初に８％スクロースを添加したＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地で生育させ、カッサバ植物体の茎に澱粉を貯留させた（Ｓａｌｅｈｕｚｚａｍａｎ  他、１９９４）。アミロース／アミロペクチン比は、インビトロの肥厚した茎の断面をルゴール液（Ｉ２：ＫＩ）で沃素染色することによって視覚化した。染色した茎の切片を顕微鏡で視覚化した。合計９個の系統（ＧＢＳＳａｓ２から３個、ＧＢＳＳａｓ７から６個）が、染色パターンの異なる植物体を生成したが、これは、当該植物体の茎が異なる澱粉組成を持つことを意味している。これらの植物体を温室に移して塊根を形成させた。３ヶ月後、根を剥皮し、貯蔵根の中央円筒部を、少量のＮａ2Ｓ2Ｏ5を加えた水中で実験用ブレンダー中で粉砕した。このスラリーを澱粉単離のためにＳａｎａｍａｔに移した。この水−澱粉顆粒懸濁液を遠心管に移して遠心分離した。澱粉を摂氏２０度で３日間乾燥した。
【００６９】
Ｈｏｖｅｎｋａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ  他（１９８８）により記載のプロトコルを用いてアミロペクチン／アミロース含有量を決定した。
【００７０】
合計２個の系統（１個はＧＢＳＳａｓ２から、そして１個はＧＢＳＳａｓ７から）が植物体を生成し、これらは両方の試験で高いアミロペクチン含有量を持っていた。１年後、同じ植物体を再度温室に移した。二つの系統の合計３０の植物体の澱粉を沃素染色および分光測光法によって分析した。全ての植物体が高いアミロペクチン含有量の澱粉を持っていた。同時に３０００以上の植物体から澱粉を単離した。この澱粉を三つの異なる実験室で分析したが、やはりこの澱粉は高いパーセンテージのアミロペクチンを含有することが示された。
【００７１】
材料および方法
試料
タピオカ澱粉                対照試料
アミロペクチンタピオカ澱粉  Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ由来のＡＦＣ３ＫＤ
馬鈴薯澱粉                  Ｏｏｓｔｅｒｍｏｅｒ  １９９８
アミロペクチン馬鈴薯澱粉    Ｏｏｓｔｅｒｍｏｅｒ  １９９６
コーンスターチ              Ｍｅｒｉｔｅｎａ  Ａ
ワキシーコーンスターチ      Ｍｅｒｉｔｅｎａ  ３００
【００７２】
方法
窒素含有量（Ｎtotal）
ＩＳＯ  ５３７８（１９７８）、澱粉および誘導製品  −  ケルダール法による窒素の測定  −  分光測光法。
粒子径分布
粒子径は、Ｃｏｕｌｔｅｒ校正標準Ｐ．Ｄ．Ｖ．Ｂ．で校正し、Ｌａｔｅｘ  ｌｏｔ  Ｆ．３４、直径測定管１４０μｍ、測定クラスの数２５６、測定範囲３.１−１０７.７μｍ（馬鈴薯澱粉）および２.８−８２.０μｍ（他の澱粉）のＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩで測定する。試料を等張塩溶液（ＤｉｌｕｉｄＴＭアジド無し、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）に懸濁し、超音波浴（Ｂｒａｎｓｏｎ  ５５１０）でホモジナイズする。
【００７３】
示差熱量測定法
示差熱量測定実験はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＤＳＣ−７を用いて実施する。少なくとも１０ｍｇの澱粉および４０ｍｇの脱イオン水をステンレススチールＤＳＣ−皿に入れて８０％の水分とし、それにより澱粉の水分を考慮する。ＤＳＣ−皿を溶接密閉し、平衡化するため室温で一夜保存する。翌日、試料を１０℃／分の速度で５から１３０℃まで加熱する。
【００７４】
乾燥物質含有量
ＩＳＯ  １６６６（１９９７）、澱粉および澱粉由来製品  −  含水量の測定
−  乾燥機乾燥法。
灰分含有量
ＩＳＯ  ５９８４（１９７８）、動物飼料  −  粗灰分含有量の測定。
【００７５】
固有粘度（ＩＶ）
固有粘度は、１Ｍ水酸化ナトリウムを溶媒としＵｂｂｅｌｏｈｄｅ粘度計を用いて既知の方法で測定し、ｇ／ｄｌで表す。Ｈ．Ｗ．Ｌｅａｃｈ、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０巻５９５頁（１９６３）に記載の通りである。
【００７６】
燐含有量（Ｐ）
ＩＳＯ  ３９４６（１９８２）、澱粉および澱粉由来製品  −  総燐含有量の測定  −  分光測光法。
粘度の挙動
Ｎｅｗｐｏｒｔ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＲａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＲＶＡ）で測定した。測定は、脱イオン水中６％濃度、４００ｒｐｍで実施する。温度サイクル：４５℃２分間、１分あたり１４゜で９０゜まで加熱、９０゜５分間、そして１分あたり１４゜で３０゜まで冷却。
【００７７】
鎖長分布
アミロペクチン澱粉をイソアミラーゼで脱分枝し、得られた直線状のアルファ−１，４マルト−オリゴ糖をＰｕｌｓｅｄ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いる高性能アニオン交換クロマトグラフィーによって測定する。
【００７８】
結果
結果を以下の表に示す。
【００７９】
【表１】
2011135894.tif 000003
【００８０】
【表２】
2011135894.tif 000004
【００８１】
【表３】
2011135894.tif 000005
【００８２】
【表４】
2011135894.tif 000006
【００８３】
【表５】
2011135894.tif 000007
【００８４】
ワキシートウモロコシ澱粉と比較して異なっているアミロペクチンカッサバ澱粉の特性：
・低Ｔｇ
・速やかに溶解する澱粉（糊化Ｔと最高Ｔの差）
・約２０％高い粘度
・より少ない蛋白、低不純物レベル
アミロペクチン馬鈴薯澱粉と比較したアミロペクチンカッサバ澱粉の特性：
・  幾分低いＴｇ（＜１Ｃ）
・  速やかに溶解する澱粉、しかしながらＡＰＳの粘度はより高い（デルタＣ＝６  Ｃ−ＢＵ＝１４００）
・  約３０％低い粘度レベル
・  小さな顆粒
・  結晶性
【００８５】
【表６】
2011135894.tif 000008
【００８６】
【表７】
2011135894.tif 000009
a,b  同一文字を有する平均値は、それぞれカイ二乗法（ｐ＜０．１）およびＬＳＤ法（ｐ＜０．１）で有意に相違していない。
【００８７】
【表８】
2011135894.tif 000010
a)  ３回の実験の平均（合計４８〜７４の葉の外植体）、b)  ２回の実験の平均（合計２４〜４８のＭＥ外植体）。
【００８８】
したがって本発明はさらに、天然および誘導体化されたアミロペクチンカッサバ（タピオカ）澱粉、ならびにかかる澱粉を含有する組成物を含むことを意図するものである。この澱粉は、化学的修飾を施してまたは施さずに、多岐にわたる食品、医薬品、および工業上の適用に有用である。
【００８９】
本明細書中使用するアミロペクチン澱粉とは、通常のカッサバ澱粉より実質上高い、特に少なくとも約９０％、より特別には少なくとも約９５％、最も特別には少なくとも約９８％（質量）のアミロペクチン含有量を有する澱粉または粉末を意味することを意図している。
【００９０】
アミロペクチンカッサバ澱粉は、上記のＦＥＣ法によって得られる。やはり本発明に包含されるのは、天然に見出し得るアミロペクチンカッサバ植物体、標準的育種および雑種形成技術により得られるアミロペクチンカッサバ植物体、または、転座、逆位、形質転換またはその他の遺伝子もしくは染色体組換えの方法（それらの変形を包含する）であって、それにより本発明に係る澱粉の性質が得られる方法によって得られるアミロペクチンカッサバ植物体に由来するアミロペクチンカッサバ澱粉である。加えて、突然変異育種に関する既知の標準法により生成できる上の包括的組成物の人為的突然変異および変異から生育させた植物体から抽出した澱粉もまた本発明に適用可能である。
【００９１】
実質上純粋な澱粉が、アミロペクチンカッサバ植物体の根から抽出できる。抽出は当分野で知られる任意の方法によることができ、その根を微粉砕し、水抽出により残りの成分から澱粉を分離することを包含するが、これに限定される訳ではない。
【００９２】
アミロペクチンカッサバ澱粉は低レベルのアミロースおよび高レベルのアミロペクチンを有している。アミロペクチンカッサバ澱粉は特に、通常のカッサバ澱粉より高い粘度、特に、通常のカッサバ澱粉より少なくとも約３０％、より特別には少なくとも５０％、そして最も特別には少なくとも約８０％高い粘度を持っている。特に好適なアミロペクチンカッサバ澱粉は、下記実施例３ａの方法を用いてＲａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒで測定した場合、少なくとも約１２００、より特別には少なくとも約１３００のピーク粘度を有する澱粉である。
【００９３】
得られる天然澱粉は、多くの適用において特異な且つ望ましい性質および機能性を有する。このような天然澱粉は、化学的修飾をすることなく所望の機能性を達成できるという追加の利点を持っている。しかしながら、本発明に係る澱粉はまた、それらの性質および機能性をさらに高めるために修飾することもできる。化学的、物理的、または酵素的修飾を包含する、当分野で既知の任意の修飾を用いることができる。
【００９４】
化学的誘導体形成は、エーテル、エステルまたは半エステル、例えば、ヒドロキシアルキルエーテル、酢酸エステル、燐酸エステル、琥珀酸エステル、即ち琥珀酸オクテニル、第三および第四アミンエーテル等を形成するもの、または、当分野で既知のその他任意の修飾技術によるものを包含する。
【００９５】
本発明に係る澱粉の化学的修飾は架橋を包含する。当分野で既知の任意の架橋剤をこの目的のために使用でき、エピクロロヒドリン、直線状二カルボン酸無水物、クエン酸アクロレイン、オキシ塩化燐、アジピン酸／酢酸混合酸無水物、トリメタ燐酸塩、ホルムアルデヒド、塩化シアヌル、ジイソシアネート、およびジビニルスルホンを包含するが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明に係る澱粉は、例えばＷＯ９５／０４０８２号（１９９５年２月９日公開）に記載の熱阻害または剪断によって物理的に修飾できる。
【００９７】
本発明に係る澱粉はまた、アルファアミラーゼ、ベータアミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトゲナーゼ、イソアミラーゼおよびプルラナーゼを包含するがこれらに限定されない当分野で既知の１以上の酵素によって酵素的に修飾できる。
【００９８】
この澱粉はアルファ化できる。アルファ化澱粉の製造方法の例は、米国特許第４２８０８５１号（Ｐｉｔｃｈｏｎ  他．）、米国特許第４４６５７０２号（Ｅａｓｔｍａｎ  他．）、米国特許第５０３７９２９号（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ）、米国特許第５１３１９５３号（Ｋａｓｉｃａ  他．）および米国特許第５１４９７９９号（Ｒｕｂｅｎｓ）に開示されている。澱粉をアルファ化する常法は当業者に周知であり、第ＸＸＩＩ章「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ  Ｓｔａｒｃｈ」、Ｓｔａｒｃｈ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第ＩＩＩ巻、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｒ．Ｌ．ＷｈｉｓｔｌｅｒおよびＥ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９６７のような論文に記載されている。
【００９９】
この澱粉は、酸化、酵素的変換、とりわけα−アミラーゼによる酵素的変換、酸加水分解、または熱およびまたは酸デキストリン化によって製造される、特に流動性または低粘性変性澱粉を生成させるために変換することができる。
【０１００】
本発明に係る澱粉は当分野で知られる任意の方法により精製して、当該澱粉の本来持つ、または澱粉化工過程で作り出される臭気および色を除去することができる。
【０１０１】
当業者は、所望の澱粉の性質および機能性を得るため、任意の単一または組み合わせた修飾を使用することができる。これらの方法は当分野で周知であり、得られる澱粉の性質および機能性は、とりわけ、使用する修飾の型、修飾の程度、および反応条件に応じて変化するであろう。
【０１０２】
本発明に係るアミロペクチンカッサバ澱粉を用いて得られる機能性は、封入および乳化、濃厚化および高粘度化、ゲル化および薄膜形成を包含するがこれらに限定されない。
【０１０３】
本発明に係るアミロペクチンカッサバ澱粉は様々な工業的応用に使用でき、それらは紙製品、食品、医薬品および栄養製品、身体ケア製品およびその他の工業製品を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１０４】
紙製品は、紙、板紙、ライナーボード、波付け、ボール紙、袋、および封筒の包含を意図するがこれらに限定されない。
【０１０５】
食品は、任意の食用製品を意味することを意図し、シリアル、パンおよびパン製品、チーズおよび模造チーズ製品、薬味、菓子、注ぐことのできるドレッシングおよびスプーンでかけることのできるドレッシングを包含するドレッシング、果物およびクリームフィリングを包含するパイフィリング、ホワイトソースおよび乳製品を基礎とするソース（例えばチーズソース）を包含するソース類、グレービー、模造およびライトシロップ、プディング、カスタード、ヨーグルト、サワークリーム、パスタ、乳製品を基礎とする飲み物を包含する飲み物類、グレーズ、スープおよびベビーフードを包含するがこれらに限定されない。
【０１０６】
医薬品および栄養製品は、薬用賦形剤、発泡性錠剤を包含する錠剤、散布用澱粉および粉末、ならびに前生物的製品の包含を意図している。
【０１０７】
身体ケア製品は、消臭剤および制汗剤、毛髪固定剤（スプレー、ゲル、ムース、ローションおよびポマードを包含する）、石鹸およびクレンザー、メークアップ（アイシャドウ、パウダー、ファウンデーションおよび頬紅を包含する）、シャンプーおよびコンディショナー、ならびに口内洗浄剤、口臭清涼剤および練り歯磨きの包含を意図している。
【０１０８】
その他の工業製品は、洗浄剤および生物分解性泡入り製品（ルースフィル、シートおよび形材を包含する）の包含を意図するがこれらに限定されない。
【０１０９】
アミロペクチンタピオカ澱粉は一般に任意の所望レベルで使用でき、その量は、得ようとする機能性に依存する。一般に、アミロペクチンカッサバ澱粉は、製品の約１％〜約９５％、特に約５％〜約６０％、より特別には約１０％〜約４０％（質量）の量で使用する。
【０１１０】
実施例
以下の実施例は本発明をさらに例示し説明するために供するものであるが、いかなる点においても本発明を限定するものと解してはならない。使用するパーセントは全て質量／質量ベースである。
【０１１１】
下記の実施例において、使用したタピオカ試料は以下の通りである：
カッサバ１＝Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ、米国）より市販品が入手可能な、タイで生育した通常のカッサバ澱粉。
【０１１２】
カッサバ２＝Ａｖｅｂｅ  Ｂ．Ａ．（Ｆｏｘｈｏｌ、オランダ）より市販品が入手可能な、インドネシアで生育した通常のカッサバ澱粉。
【０１１３】
ＡＣＳ  １−３＝ＧＢＳＳ遺伝子をアンチセンス方式で導入しＦＥＣ（ここからカッサバ植物体を再生させる）を使用することにより、遺伝学的に生成させたアミロペクチンカッサバ澱粉。
【０１１４】
馬鈴薯＝Ａｖｅｂｅ  Ｂ．Ａ．（Ｆｏｘｈｏｌ、オランダ）より市販品が入手可能な通常の馬鈴薯澱粉。
【０１１５】
ＡＭＦ馬鈴薯＝Ａｖｅｂｅ  Ｂ．Ａ．（Ｆｏｘｈｏｌ、オランダ）より市販品が入手可能な、低アミロース馬鈴薯澱粉。
【０１１６】
トウモロコシ＝Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ、米国）より市販品が入手可能な通常のコーンスターチ。
【０１１７】
ワキシー＝  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ、米国）より市販品が入手可能なワキシー（低アミロース）コーンスターチ。
【０１１８】
実施例１  −  アミロース含有量
ａ．  アミロース含有量を電位差滴定により測定した。澱粉試料およそ０．５ｇを濃塩化カルシウム（約３０質量％）１０ｍｌ中で３０分間９５℃に加熱した。試料を室温まで冷却し、２．５％酢酸ウラニル溶液５ｍｌで希釈し、よく混合し、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで試料を濾過して透明な溶液を得た。
【０１１９】
澱粉濃度を１ｃｍの偏光セルを用いる偏光分析によって測定した。次に試料の全アリコート（通常５ｍｌ）を、ＫＣｌ基準電極を用いる白金電極を使用して電位を記録しながら、標準化した０．０１Ｎ沃素溶液で直接滴定した。変曲点に到達するまでに要した沃素の量を、結合した沃素として直接測定した。アミロース１．０グラムが沃素２００ミリグラムと結合すると考えることによりアミロースの量を算出した。
この電位差滴定の結果を表９に示す。
【０１２０】
表９
基準の澱粉    アミロース含有量（％）
カッサバ１          ２０％
カッサバ２          １７．４％
ＡＣＳ１              ２．０％
ＡＣＳ２              ２．８％
ＡＣＳ３              ２．７％          
表９から確定できるように、アミロペクチンカッサバ澱粉は通常のカッサバ澱粉よりも著しく少ないアミロースを含有している。
【０１２１】
ｂ．  アミロース含有量をゲル透過クロマトグラフ（ＧＰＣ）によって調べた。硝酸ナトリウム５ｍＭを含有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）４ｇ中で澱粉４〜８ｍｇをスラリーとし、１００℃で２時間加熱することにより分析用試料を調製した。必要ならばこの試料を濾過し、ＧＰＣ  １５０Ｃクロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＭＡ）中に注入した（３００ｍｌ）。このゲル透過クロマトグラフは４本のカラムを使用した（保護カラム、１０5、１０3、１０2ミクロン（公称）孔径カラム、全てＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＭＡより）。移動相は５ｍＭ硝酸ナトリウムを含有するジメチルスルホキシドであった。機器は温度８０℃で操作し、流速０．７ｍｌ／分を使用した。カラムは分子量５８００〜８５０，０００の範囲のプルラン標準（Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ｋ．Ｋ、日本）で検定した。図２は通常のおよびアミロペクチンカッサバ澱粉のＧＰＣによる相対分子量分布を示す。この図から判断できるように、３種のアミロペクチンカッサバ澱粉は、約６．８３の相対ｌｏｇ（分子量）におけるピークによって分かるような、著しく多量のアミロペクチンを有している。さらに、これは唯一の主たるピークである。対照的に通常の澱粉は、約６の相対ｌｏｇ（分子量）に、追加のアミロースピークをそれぞれ示している。
【０１２２】
実施例２  −  構造
この実施例では、以下の方法によって脱分枝を達成した。９０％ＤＭＳＯ（１０％水）２ｍＬに澱粉２０ｍｇを加え、溶解するまで攪拌した（９５℃で）。ｍＭ酢酸緩衝液７．９８０ｍｌ（ｐＨ４．８）をこのバイアルに加え、攪拌した。幾らかのアミロースが溶液から沈殿するようならば、溶液が透明となるまで短時間煮沸した。試料が完全に溶解したならば、純粋なイソアミラーゼ２０μｌを加えた。このバイアルを３８℃の恒温槽で１６時間インキュベートした。完了したならば、鎖長分布評価のため試料１ｍｌを２ｍｌバイアルにピペットで移した。残りの試料をアセトン５０ｍｌ中で沈殿させた。沈殿した物質を０．２ミクロンナイロンフィルターを用いて濾過することにより集め、ＧＰＣ用に準備した。
【０１２３】
理想的には、ｂ部分はａ部分の前にすべきである。脱分枝したアミロペクチン（ａ）の構造は、全体の脱分枝澱粉クロマトグラム（ｂ）を取得し、次いでアミロペクチンピークのみをまとめることによって得る。
【０１２４】
ａ．  高アミロースおよび通常のタピオカ澱粉の脱分枝アミロペクチンの分子量分布を実施例１ｂのようにＧＰＣを用いて決定した。図３は、得られたカッサバ澱粉の脱分枝アミロペクチンの分子量分布を示す。わかるように、アミロペクチン構造は異なるカッサバ澱粉に関して実質上同一である。
【０１２５】
ｂ．  脱分枝アミロペクチンおよび通常のカッサバ澱粉の分子量分布を上記ａのようにして決定した。図４は、得られたカッサバ澱粉の分子量分布を示す。この図から、アミロペクチンの構造は似通っているが、約３．０および４．０の実質上同じ（相対）ｌｏｇ（分子量）ピークに多量が存在することが確認できる。さらにこの図は、約５．８１に（相対）ｌｏｇ（分子量）ピークが無いことによって証明できるように、アミロペクチンカッサバ澱粉には実質量のアミロースが無いことを示している。
【０１２６】
実施例３  −  粘度
ａ．  ＲＶＡ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４  Ｒａｐｉｄ  Ｖｉｓｃｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、オーストラリア）を用いて粘度を測定した。乾燥質量ベースで５％の澱粉を含有するスラリーを調製し、１分間あたり３．０℃の速度で５０℃から９５℃に加熱した。次にこの試料を５分間９５℃に維持した。最後に試料を１分間あたり６．０℃の割合で３５℃まで冷却した。１６０ｒｐｍで粘度測定を行い、結果（ピーク粘度）を下の表１０に示す。
【０１２７】
表１０
基準の澱粉      粘度（ＲＶＡ単位）
カッサバ１        ６００
カッサバ２        １０１５
ＡＣＳ１            １２３０
ＡＣＳ２            １３６０
ＡＣＳ３            １３３０        
表１０から分かるように、アミロペクチンカッサバ澱粉は著しく高いピーク粘度を有し、それはインドネシアの通常のカッサバ澱粉よりも約３０％高く、タイの通常のカッサバ澱粉の約２倍である。
【０１２８】
ｂ．  さらにＶｉｓｃｏ／ａｍｙｌｏ／ｇｒａｐｈ、Ｍｏｄｅｌ  ＶＡ−１Ａ（Ｃ．Ｗ．Ｂｒａｂｅｎｄｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ、ＮＪ、米国０７６０６）を使用して粘度を測定した。乾燥質量ベースで５％澱粉のスラリーを調製し、クエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝溶液を用いてｐＨ３に調節した。合計賦課質量４６０グラムを１分間あたり１．５℃の速度で５０℃から９２℃に加熱した。次にこのスラリーを３０分間９２℃に維持した。Ｖｉｓｃｏ／ａｍｙｌｏ／ｇｒａｐｈでペーストを加熱しながら熱粘度を測定し、得られた粘度プロフィールを図５に示す。この図によって、アミロペクチンカッサバ澱粉が通常のカッサバ澱粉よりも高いピーク粘度を有することが確認できる。
【０１２９】
実施例４  −  糊化温度
ａ．  示差熱量測定法を用いて糊化温度を測定した。澱粉試料を、水：澱粉比２：１、加熱速度１０℃／分で５℃から１４０℃まで走査する。２回の測定を行い平均値を報告する。結果を第１１表に示す。
【０１３０】
【表９】
2011135894.tif 000011
【０１３１】
表１１に示すように、３種のアミロペクチンカッサバ澱粉は全て、タイの通常のカッサバ澱粉より僅かに高くインドネシアの通常のカッサバ澱粉より僅かに低い糊化開始温度を持っている。３種のアミロペクチンカッサバ澱粉は全て通常のカッサバ澱粉より高い糊化エンタルピーを持っている。
【０１３２】
ｂ．糊化開始温度を実施例３ｂの方法を用いてＢｒａｂｅｎｄｅｒによりさらに調べた。図５から分かるように、アミロペクチンカッサバ澱粉の糊化開始温度は通常のタイ産カッサバよりも低い。
【０１３３】
【表１０】
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【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
【表１３】
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【０１３７】
【表１４】
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【０１３８】
【表１５】
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【０１３９】
【表１６】
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【０１４０】
【表１７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【外国語明細書】
2011135894000001.pdf