(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌、とりわけ微生物Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａによる感染に対して、魚類を予防および／または治療処理するワクチン組成物の提供。【解決手段】特定量の鉄を含む培地で細菌細胞を培養した、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの培養物物由来の生物材料を含むワクチン組成物。培養物を、該成分が生産された後に好ましくはホルマリンで処理することによって、使用前に該微生物を殺菌するために処理する。宿主細胞への侵入に関与し、かつ過剰の鉄を含む培地中で培養物を増殖させたときに多量に生成する該成分中の２成分は、魚類に注入したときに、魚類細胞内への微生物の侵入を防止する抗体の生成を誘発する。これらの抗体は、微生物による感染から魚類を保護する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
その細菌の通常の増殖に必要な量より過剰の鉄を含む培地で、その細菌細胞を培養したことを特徴とする、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの培養物から誘導した生物材料を含む組成物。
【請求項２】
生物材料が、宿主細胞への侵入に関与する外膜蛋白、またはｉｎｖａｓｉｎまたはａｄｈｅｓｉｎを含み、かつワクチンの調製に使用する通常の培地中より多量に発現する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｉｎｖａｓｉｎと血清学的に関連する細胞外蛋白が、通常の培養より多量に発現する請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
培地からの鉄の直線的取込みがもはや起こらなくなるまで細胞に鉄を担持させるように、十分な鉄を含んだ培地中でＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの細菌細胞を培養する段階を含むワクチンの生産方法。
【請求項５】
細胞が鉄で飽和される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
鉄が第二鉄塩の形態で培地に供給される請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
培養後、細菌が不活性化される請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
不活性化がホルムアルデヒド組成物を用いて行われる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
その方法の生産物が抗体の生産に使用される請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
細菌による感染に対して、魚類を予防または治療処理するワクチンの調製における、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法により生産される細胞、細胞膜または細胞外生成物の使用。
【請求項１１】
細菌による感染に対して、魚類を予防または治療処理するワクチンの調製における、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
ワクチンが生理的に許容し得る担体を含む請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
ワクチンが免疫反応を増強するのに適したアジュバントを含む請求項１０から１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
細菌、とりわけ微生物Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａによる感染に対して、魚類を予防および／または治療処理するワクチン組成物であって、英国、アバディーンのＮ．Ｃ．Ｉ．Ｍ．Ｂ．に２０００年８月４日に登録番号４１０６２で寄託された微生物の培養により生産される成分を含む組成物。
【請求項１５】
ワクチンの調製における、英国、アバディーンのＮ．Ｃ．Ｉ．Ｍ．Ｂ．に２０００年８月４日に登録番号４１０６２で寄託された細菌の使用。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法によって生産される抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌による感染に対して魚類を予防処理するため、とりわけＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａ等の細菌による感染から魚類を保護するための、ワクチンおよび医薬として使用する新規な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
旧名Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａのＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａは、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａから再区分され、小サブユニット１６ｓリボソームＲＮＡの相同性に基づいて、ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科に割当て直された（Ｇａｕｌｔｈｉｅｒ等（１９９５）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４５：１３９−１４４）。Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅは、仮性結核と普通呼ばれる重篤な致死性疾患を暖水海水魚に引き起こし、主要な器官や組織に感染して、筋肉組織中に特徴的な潰瘍または偽結核結節を生じる。
【０００３】
抗生物質耐性の出現、ならびに、感染したとき魚は摂食を止め、したがって抗生物質入り餌を消費しないことが、化学療法の失敗原因と示唆されてきた。その上、宿主内コロニー形成中に、細胞内に生存する時期が存在することを示唆する証拠が益々増えている（Ｂａｒｎｅｓ等（１９９９）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：４８３−４９４）。したがって、免疫による予防が、この疾患を抑制する最も望ましい手段と思われる。
【０００４】
ホルマリン殺菌細菌（バクテリン）に基づく様々なワクチン接種戦略が提案されてきたが、これらの多くは再現性のある保護効果を生じることができなかった（Ｒｏｍａｌｄｅ  ＆  Ｍａｇａｒｉｎｏｓ（１９９７）  Ｆｉｓｈ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｋａｒｇｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｐｐ１６７−１７７）。これは、感染剤に対する宿主の低い抗体反応性を反映するものと思われる（Ａｒｉｊｏ等、（１９９７）  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６３−７２）。その上、これらの製剤中に含まれる保護抗原については殆ど何もわかっていない。鉄制限外膜蛋白質（ＩＲＯＭＰ）に基づく製剤および細胞外生成物の豊富なバクテリン（ＥＣＰ）が記載されてきた（Ｍａｇａｒｉｎｏｓ等、（１９９４）Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓ．Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈｏｌ．１４：１２０−１２２）が、これらは商品として無効であった。
【０００５】
細菌が絶対的に鉄を必要とし、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅも例外でないことは、確立された事実である。培地中に十分な量を含めないか、またはその利用率を減少させるキレート剤を含めることにより、鉄が制限的である条件下で、様々な高親和性鉄取込み系が発現することが示された（Ｍａｇａｒｉｎｏｓ等、（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：２９９０−２９９８）。これらは、シデロフォア（ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ）および鉄制限外膜蛋白質（ＩＲＯＭＰ）を含む。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（Ｈｉｒｓｔ  ＆  Ｅｌｌｉｓ（１９９４）  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２９−４５）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ（英国特許明細書第８８０５２５３号  Ｗ  Ｄｏｎａｃｈｉｅ、英国）等の他の細菌種では、ワクチン中の保護抗原としてＩＲＯＭＰを開発して成功した。しかし、これらが、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅにおいて保護作用を示すとは認められない（Ｒｏｍａｌｄｅ  ＆  Ｍａｇａｒｉ−ｏｓ（１９９７）  Ｆｉｓｈ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｋａｒｇｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｐｐ１６７−１７７）。この保護作用の欠如が、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅによる感染の戦略を反映するものと思われる。鉄制限下で、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅは、プロテアーゼ活性の増加（Ｂａｋｏｐｏｌｏｕｓ（１９９７）  Ｊ．Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓ．２０：２９７−３０５）および莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の増加を起こす。莢膜多糖は、血清殺菌力に対する耐性を増加させ、宿主マクロファージによる食作用を防止する（Ａｒｉｊｏ等、（１９９８）  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６３−７２）。このことは、マクロファージの呼吸バースト中に生成する反応性酸素種による殺菌に対する適応性を欠いた結果として（Ｂａｒｎｅｓ等、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：４８３−４９５）、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅが食細胞による攻撃に耐性を示さないことから（Ｓｋａｒｍｅｔａ等、（１９９５）Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇ．２３：５１−５７）、明らかである。しかし、赤血球の溶解により増加した蛋白分解活性が、ヘム形態の鉄を遊離させることができる。ヘムは莢膜によって吸収され（Ａｎａ  Ｄｏ  Ｖａｌｅ，Ｐｅｒｓ．Ｃｏｍｍ．）、その鉄はＩＲＯＭＰによって膜を通過する。したがって、鉄取込みの第１段階として作用する莢膜多糖のために、罹病過程の間にＩＲＯＭＰが露出することはない。鉄濃度が増加するにつれ、莢膜生産は減少し、ＩＲＯＭＰは不活性化され、蛋白分解活性は検出不能となる（Ｂａｋｏｐｏｌｏｕｓ（１９９７）Ｊ．Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓ．２０：２９７−３０５）。この結果、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅは、抗体、マクロファージのいずれの攻撃も受け易くなると思われる。しかし、この時点でその細菌は、非食細胞性魚類細胞に接着し（Ｙｏｓｈｉｄａ等、（１９９７）  Ｊ．Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓ．２０：７７−８８）、侵入する（Ｍａｇａｒｉ−ｏｓ等、（１９９６）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．  １３８：２９−３４）ことができ、したがって抗体や食細胞による攻撃を回避する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】英国特許第８８０５２５３号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇａｕｌｔｈｉｅｒ等（１９９５）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４５：１３９−１４４
【非特許文献２】Ｒｏｍａｌｄｅ  ＆  Ｍａｇａｒｉｎｏｓ（１９９７）  Ｆｉｓｈ  Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｋａｒｇｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，ｐｐ１６７−１７７
【非特許文献３】Ａｒｉｊｏ等、（１９９７）  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６３−７２
【非特許文献４】Ｍａｇａｒｉｎｏｓ等、（１９９４）Ｂｕｌｌ．Ｅｕｒ．Ａｓｓ．Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈｏｌ．１４：１２０−１２２
【非特許文献５】Ｍａｇａｒｉｎｏｓ等、（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：２９９０−２９９８
【非特許文献６】Ｈｉｒｓｔ  ＆  Ｅｌｌｉｓ（１９９４）  Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２９−４５
【非特許文献７】Ｂａｋｏｐｏｌｏｕｓ（１９９７）  Ｊ．Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓ．２０：２９７−３０５
【非特許文献８】Ｂａｒｎｅｓ等、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：４８３−４９５
【非特許文献９】Ｓｋａｒｍｅｔａ等、（１９９５）Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇ．２３：５１−５７
【非特許文献１０】Ｙｏｓｈｉｄａ等、（１９９７）  Ｊ．Ｆｉｓｈ  Ｄｉｓ．２０：７７−８８
【非特許文献１１】Ｍａｇａｒｉ−ｏｓ等、（１９９６）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．  １３８：２９−３４
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一目的は、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ等の細菌による感染から、魚類を保護するワクチンを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、このようなワクチンを生産する方法を提供することである。
【００１０】
本発明によれば、その細菌の通常の増殖に必要な量より過剰の鉄を含む培地で、その細菌細胞を培養したことを特徴とするＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの培養物由来の生物材料を含む、ワクチンおよび／または治療組成物が提供される。
【００１１】
「過剰の鉄を含む」により、培地は、標準トリプトンダイズブロス（Ｏｘｏｉｄ）中の鉄量の少なくとも２倍を含むべきである。
【００１２】
培地が０．５μＭから１ｍＭの鉄を含むのが好ましい。
培地が１０μＭから５００μＭの鉄を含むのがより好ましい。
培地が２５μＭから５００μＭの鉄を含むのが最も好ましい。
【００１３】
普通、宿主細胞への侵入に関与する外膜蛋白質またはｉｎｖａｓｉｎまたはａｄｈｅｓｉｎは、通常培地での量より多量に発現する。
【００１４】
「通常培地での量より多量に発現する」により、該蛋白またはｉｎｖａｓｉｎまたはａｄｈｅｓｉｎは、通常の発現量の少なくとも２倍で発現する。通常の発現量は、標準トリプトンダイズブロス（Ｏｘｏｉｄ）中での発現量である。
【００１５】
普通、ｉｎｖａｓｉｎと血清学的に関連する細胞外蛋白質は、通常培地中より多量に発現する。
【００１６】
普通、５５Ｋｄａ細胞外蛋白複合体および／または９７Ｋｄａ外膜蛋白質は、通常培地中より多量に発現する。
【００１７】
本発明は、ワクチンとして、またはワクチン製剤中に使用する、記載のような精製蛋白質も提供する。
【００１８】
本発明は、該精製蛋白質に対する抗体も提供する。
【００１９】
更に、本発明は、培地からの鉄の直線的取込みがもはや起こらなくなるまで細胞に鉄を担持させるように、十分な鉄を含んだ培地中で細胞を培養する生産方法を提供する。
【００２０】
細胞が鉄で飽和されるのが好ましい。
鉄を第二鉄塩の形態で培地に供給するのが好ましい。
培養後、細菌を不活性化してしまうのが好ましい。
ホルムアルデヒド組成物を使用して、不活性化を行うのが好ましい。
【００２１】
更に、本発明は、培養細菌の細胞または細胞膜または細胞外生成物を提供する。
その生物材料は、生理学的に許容し得る担体中で提供されるのが好ましい。
【００２２】
本発明の組成物は、免疫反応を増強するのに適したアジュバントを含むのが好ましい。
【００２３】
したがって、ワクチン組成物を、細菌、とりわけ微生物Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａによる感染に対して、魚類を予防および／または治療処理するために提供する。
【００２４】
該組成物は、該微生物の培養によって生成する成分を含む。成分が生成した後、好ましくはホルマリンで処理することによって、使用前に微生物を殺すために、培養物を処理する。
【００２５】
宿主細胞への侵入に関与し、かつ過剰の鉄を含む培地中で培養物を増殖させたときに多量に生成する成分中の２成分は、魚類に注入したときに、魚類細胞内への微生物の侵入を防止する抗体の生成を誘発する。
これらの抗体は、微生物による感染から魚類を保護する。
したがって、本発明は抗体も提供する。
【００２６】
特定の一実施形態では、その生物材料は、英国、アバディーンのＮ．Ｃ．Ｉ．Ｍ．Ｂ．に２０００年８月４日に登録番号４１０６２で寄託されたＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ  ＭＴ１４１５株の培養物から誘導される。
【００２７】
本発明者は、鉄の豊富な条件下で外膜中に発現する蛋白質（ｉｎｖａｓｉｎまたはａｄｈｅｓｉｎ）が、シーバスの繊維芽細胞によるＰ．ｄａｍｓｅｌａｅのインターナリゼーションに関係していると決定した。この蛋白質を特異的に結合するレクチンは、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅの侵入能力を阻害するが、一方、その蛋白質を結合しないレクチンは、シーバスの幼若繊維芽細胞系（ＳＢＬ）への侵入を顕著には阻害しない。その上、シーバス中でこの蛋白質に対して生じた抗体は、魚類上皮細胞（ＥＰＣ）による該細菌のインターナリゼーションを防止する。塩化第二鉄の形態で第二鉄を増殖培地に添加することにより、この蛋白質の発現量を増加させることができる。例えば、１００μＭの塩化第二鉄を添加すると、その蛋白質の発現が少なくとも２．６倍増加する。このような鉄の補充下でＰ．ｄａｍｓｅｌａｅを増殖させることにより生産したバクテリンは、ニジマスおよび幼若なタイの臨床的パスツレラ症に対して保護作用を示す。
【００２８】
ｉｎｖａｓｉｎが増加するように、細菌細胞による鉄の取込みを起こす任意の形態で、鉄を培地に供給してよい。他の培養条件もこの蛋白の発現を増加させ得る。例えば、十分な鉄の存在下で嫌気的条件におかれると、より多くの該蛋白が発現し得る。しかし、より高い細胞密度は、酸素含量を維持するために連続的振盪または他の通気法で、細菌を２２℃から３５℃で増殖させることにより実現される。
【００２９】
本発明のワクチン細胞は、任意の標準的方法によって不活性化されるが、ホルムアルデヒドを使用して不活性化するのが都合良い。アジュバントの添加、細胞濃度、許容し得る担体中への再懸濁等のワクチンの更なる調製によって、追加の保護が得られよう。
【００３０】
本発明のワクチンおよびその生産方法を、単に実例として以下の非制限的な実施例と図を参考にして、これから説明する。本請求項の範囲に入る更なる実施形態は、これらの実例に鑑みて、当分野の技術者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物で免疫試験をするニジマスのワクチン処理に対する生存率パーセント（ＲＰＳ）のヒストグラムを示す図である。
【図２】Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物で免疫試験をするヨーロッパヘダイ（Ｓｐａｒｕｓ  ａｕｒａｔａ）のワクチン処理に対する生存率パーセント（ＲＰＳ）のヒストグラムを示す図である。
【図３】Ａｕｒｏｄｙｅ（レーン１〜５の蛋白に対して）およびシーバス抗鉄補充Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅ血清（レーン６〜９）で染色したＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ外膜蛋白質（ＯＭＰ、レーン２、４、６、８）および細胞外生成物（ＥＣＰ、レーン３、５、７、９）のウエスタンブロットを示し、９７Ｋｄａ蛋白（レーン８）および５５Ｋｄａ蛋白複合体（レーン７、９）を明確に示す図である。
【図４】２）正常シーバス血清、または３）シーバス抗Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅｉｎｖａｓｉｎ抗血清で予備インキュベートした、少なくとも１つの細胞内Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅを有するＥＰＣ細胞のパーセンテージを、１）対照と共に示す図である。
【図５】様々なレクチンとインキュベートしたＰ．ｄａｍｓｅｌａｅによるＥＰＣ／ＳＢＬ細胞の侵入を、レクチンと予備インキュベートしていない対照に対して示す図である。
【図６】レクチン、シーバス抗Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅ抗血清およびウサギ抗５５ＫＤａ複合体血清をプローブとした、鉄補充条件下で生産したＰ．ｄａｍｓｅｌａｅＯＭＰのウエスタンブロットを示す図である。各レーンは、１）ウサギ抗５５ＫＤａ複合体抗体、２）バス抗ＭＴ１４１５抗体、３）ビオチニル化ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、４）ビオチニル化コンカナバリンＡレクチン、５）Ｓｉｇｍａビオチニル化分子量マーカー。
【図７】鉄補充培養物（ワクチンＡ）と比較して、鉄枯渇培養物（ワクチンＢ）中に５５ＫＤａ複合体がないことを示すワクチン製剤から得た外膜蛋白質の、シーバス抗Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ抗体で染色したウエスタンブロットを示す図である。
【図８】Ａ）５５ＫＤａ複合体および９７ＫＤａ  ＯＭＰを発現するワクチン、またはＢ）５５ＫＤａ複合体、９７ＫＤａ  ＯＭＰのいずれも発現しないワクチンで接種した後、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａで免疫試験をしたシーバスＤｉｃｅｎｔｒａｒｃｌｕｓ  Ｌａｂｒａｘの生存率パーセント（ＲＰＳ）を示す図である（図７も参照されたい）。
【実施例】
【００３２】
実施例１：ｉｎｖａｓｉｎ発現Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅワクチンの製造
トリプトン大豆ブロス（オキソイド）を３０ｇ／ｌで蒸留水中で調製し、塩化ナトリウムを三角フラスコ中で２０ｇ／ｌで添加したが、その際、フラスコの容量は十分なエアレーションが可能であるように媒体容量の５倍であった。１２１℃で１５分間のオートクレーブ処理による滅菌の後に、塩化第二鉄を、蒸留水中１００ミリモルの無菌ストックからの１００マイクロモルの最終濃度に添加した。ブロスを２５℃に予備加温し、これに、フォトバクテリウム  ｄａｍｓｅｌａｅ（ＭＴ１４１５株、アバディーン（英国）のＮ．Ｃ．Ｉ．Ｍ．Ｂに２０００年８月４日に受入番号４１０６２番で寄託されているようなカプセルポジティブビルレント分離菌）の、塩２％を含有する一晩トリプトン大豆ブロス培養１／１００００容量を播種した。インキュベーションを１４０ｒｐｍでの振盪下に２５℃で４０時間継続した。インキュベーションの後に、ホルマリン０．５ｖ／ｖ％（遊離ホルムアルデヒド０．２％）の添加により培養を不活化し、ブロスを２５℃で２４時間放置して、完全に不活化した。最終ワクチン製剤の光学濃度を求め、ワクチンを必要になるまで４℃で貯蔵した。
【００３３】
投与のために、この細胞懸濁液をいくつの方法のうちの１つで投与した。
【００３４】
２５℃の真水に入れたニジマス（１０〜１５ｇ）にＭＳ２２２（ｓｉｇｍａ）で麻酔をかけた。麻酔をかけられた魚に適切なワクチン製剤（１００μｌ）または対照製剤または対照としての無菌リン酸緩衝生理食塩水を腹腔内注射により播種した。免疫化後少なくとも５００度日後に魚にビルレントＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ１０８ｃｆｕの腹腔内注射でチャレンジした。死亡率を毎日記録し、対照魚に比較してのＲＰＳ（相対生存百分率）を求めた。結果を下記の図１に示したが、この際、本発明で使用したＲＰＳをいくつかの対照ワクチンと比較している；１  対照ワクチン、２  対照ワクチン、３  鉄制限ワクチン、４  鉄補足ワクチン（本発明のワクチン）、５  標準トリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）ワクチン、６〜１２  対照ワクチン。
【００３５】
もしくは、アメリカチヌ（０．３ｇ）を本発明または対照ワクチンの１０倍希釈液中で一回６０秒浸漬することにより免疫化した。ワクチン接種後５００日の後の魚をビルレントＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ約１０５ｃｆｕ／ｍｌを含有する懸濁液に２５℃で１時間浸漬することによりチャレンジした。死亡率を上記と同様に記録した。結果を図２に示した；１  鉄制限ワクチン、２  ＴＳＢワクチン、３  鉄補足ワクチン（本発明）。
【００３６】
防御抗原の同定
腹腔内注射によりスズキ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）を免疫化するために、上記と同様に調製されたワクチンを使用した。フロインド不完全アジュバントを１：１の比率で同時に投与した。魚を２５℃の海水に２０日間保持し、その後、これらに２回目の同じ用量を与えた。さらに２０日の後に魚から採血し、血液を血餅にし、赤血球を遠心分離により除去して、血清を集めた。血清をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析し、−８０℃で凍結貯蔵した。
【００３７】
外膜タンパク質（ＯＭＰ）および細胞外生成物（ＥＣＰ）を鉄制限下に、標準ＴＳＭ中で、または鉄補足下に培養したＰ．ｄａｍｓｅｌａｅから調製した。鉄制限のために２，２−ジピリジル（１００マイクロモル）をトリプトン大豆ブロスに添加して、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅの接種前に鉄をキレート化した。次いでインキュベーションを前記と同様に実施した。沈殿、続いて内膜のサルコシル可溶化により、ＯＭＰを調製した（Ｈａｎｃｏｃｋ  ＆  Ｐｏｘｔｏｎ（１９８８）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ（英国））。細胞外生成物をブロス培養上澄み液から回収した。
【００３８】
非還元条件下にＥＣＰおよびＯＭＰ（同じタンパク質濃度）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に泳動させ、ＰＶＤＦ膜上にブロッティングした。膜を抗鉄補足Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅバス血清で、続いて、抗バス免疫グロブリンマウスモノクローナル抗体で（Ｓａｎｔｏｓ  他（１９９７）Ｆｉｓｈ．Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１７５−１９１）、続いて抗マウスヤギ血清アルカリフォスファターゼ複合体で調べた。バンドを視覚化するために膜を、ニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェートからなる基質中でインキュベートした。結果を図３および図７に示している。鉄含有培養からのＯＭＰ調製物では澄明なバンドが９７Ｋｄａマーカー付近で視認されたが、これは鉄制限下では存在しない（図３および７）。デンシトメトリーを走査することにより、標準ＴＳＭ培養に対して鉄補足培養からのＯＭＰでは少なくともその２．６倍以上濃縮されていて、鉄制限培養では検出されなかったことがこのバンドで決定された。鉄含有媒体中で培養した細胞からのＥＣＰでは、２つのバンドが明らかであり、それらのうち、移動度がおよそ９７Ｋｄａ付近のバンドは、ＯＭＰ調製物で認められたバンドと同一であると確認された。もう一方のバンドはより低分子量で、５５ＫＤａマーカー付近ではあるが、それよりも下に存在した。これらのバンドのどちらも鉄不足培地中で培養された細胞からのＯＭＰＳまたはＥＣＰ中では検出されなかった。
【００３９】
鉄補足Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅに対する抗血清による魚類上皮細胞の浸潤の抑制
Ｂａｎｄｉｎ  他（１９９５）（Ｄｉｓ  Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇ．２３：２２１〜２２７）によって記載された蛍光標識直接カウント法によって、魚類上皮細胞（ＥＰＣ）に浸潤するＰ．ｄａｍｓｅｌａｅの能力を決定した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（０．１ｍｇ／ｍｌ）を使用してＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ細胞を１時間標識した。次いでＰ．ｄａｍｓｅｌａｅをＰＢＳ中で十分に洗い、１０９細胞／ｍｌの密度に再懸濁した。細胞懸濁液を分け、１つのアリコットを前記の抗鉄補足Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅスズキ抗血清を加熱することにより調製された熱不活化免疫血清と共に４５℃で１５分間、インキュベーションし、第２のアリコットは熱不活化正常スズキ血清と共にインキュベーションした。血清処理されたＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ細胞のアリコット（１０μｌ）をＧ−ＭＥＭ１ｍｌ中の６×１０５ＥＰＣ細胞に添加し、２５℃で２時間、接触および浸潤させた。ＰＢＳ中で洗うことにより外部細菌を除去し、ＥＰＣを臭化エチジウムで対比染色した。アリコット（１０μｌ）をガラススライドに置き、ガラスカバーで覆い、その後、蛍光顕微鏡検査法により分析した。少なくとも１００場での直接カウントにより、内在化したバクテリアの割合を決定した。実験を４回、反復した。結果を図４に示す：１  対照（血清を伴わないＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ）、２  熱不活化正常スズキ血清と共にインキュベートしたＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ、３  熱不活化抗血清と共にインキュベートしたＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ（スズキｖｓＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ）。
【００４０】
レクチンを使用しての、スズキ細胞中へのＰ．ｄａｍｓｅｌａｅ内在化に随伴するタンパク質の同定
以前の研究により、魚類細胞中へのＰ．ｄａｍｓｅｌａｅの内在化に伴う実体は糖蛋白質でありうるということが提示されている（Ｍａｇａｒｉ−ｏｓ  他（１９９６）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１３８：２９〜３４）。糖蛋白質の炭水化物側鎖は特異的に特定のレクチンに結合しうる。レクチンは特定の糖の配置に対して高い特異的な親和性を有する植物抽出物である。異なる種類のレクチンと共にＰ．ｄａｍｓｅｌａｅをインキュベーションし、次いでスズキ幼生線維芽細胞（ＳＢＬ）に浸潤するその能力を決定し、浸潤を抑制しうるレクチンおよび抑制しえないレクチンを同定した。次いで、浸潤に伴う糖蛋白質をビオチン化レクチンを用いてのウエスタンブロットでプローブすることにより同定することができた。
【００４１】
ＦＩＴＣで標識し、洗浄し、前記と同様に１０９ｃｆｕ／ｍｌの密度に再懸濁したＰ．ｄａｍｓｅｌａｅを１００μｇ／ｍｌの濃度の様々なレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１時間インキュベーションした。インキュベーションの後に、細胞を十分に洗い、浸潤アッセイを前記と同様に実施した。結果を図５に示す：Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅを次と共にインキュベーションした；１  Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａグルチニン、２  コンカナバリンＡアグルチニン、３  Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓアグルチニン、４  Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａアグルチニン、５  スクシニル化小麦胚芽アグルチニン、６  ドリコスアグルチニン、７  ピーナッツアグルチニン、８  大豆アグルチニン、９  Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓアグルチニン、１０  小麦胚芽アグルチニン。
【００４２】
Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅによる浸潤を強力に抑制しうる２種のレクチン、Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａグルチニン（ＳＪＡ）およびＣｏｎＡアグルチニン（ＣｏｎＡ）を選択した。浸潤を抑制しなかった１種のレクチン、ドリコスアグルチニン（ＤＢＡ）も選択した。これらのレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のビオチン化製剤をＰ．ｄａｍｓｅｌａｅからのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ＯＭＰのウエスタンブロットを染色するために使用した。結果を図６に示した。
【００４３】
全てのレクチンがいくつかの炭水化物／糖蛋白質を染色した。しかしながら、１つの領域のみがＣｏｎＡによって染色され、ＤＢＡによっては染色されなかった。この領域は２つの蛋白質バンドのコンプレックスからなり、非限定的条件下に近似的分子量５５Ｋｄａを有し、鉄飽和条件下に培養されたＰ．ｄａｍｓｅｌａｅからのＯＭＰ製剤中でのみ検出され、鉄制限条件下に培養されたＰ．ｄａｍｓｅｌａｅからの製剤では検出されなかった。さらに、Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅからのＯＭＰのウエスタンブロットを切り出し、ＣｏｎＡレクチンおよび抗鉄補足Ｐ．ｄａｍｓｅｌａｅスズキ抗血清で染色すると、通常のバンド、５５Ｋｄａコンプレックスが両方の方法で染色された。レーン１は抗５５ＫＤａコンプレックスウサギでプローブされたＯＭＰを示し、レーン２は浸潤抑制研究で使用された抗フォトバクテリウムｄａｍｓｅａｌｅＭＴ１４１５スズキ抗血清でプローブされたＯＭＰを示す。レーン３はドリコアグルチニンでプローブされたＯＭＰを示し、レーン４はコンカナバリンＡレクチンでプローブされたＯＭＰを示し、レーン５はＳｉｇｍａビオチン化分子量マーカー（ＳＤＳ−６Ｂ）を示す。
【００４４】
９７ＫＤａＯＭＰと５５ＫＤａＥＣＰとの間の血清学的関連性
９７ＫＤａＯＭＰおよび５５ＫＤａＥＣＰを慎重にポリアクリルアミドゲルから切除し、ホモジナイズし、スズキに注入した。３０日後、血清を集め、ＯＭＰおよびＥＣＰのウエスタンブロットをプローブするために使用した。９７ＫＤａＯＭＰに対してスズキで生じた抗血清を５５ＫＤａと交叉反応させた。同様に、５５ＫＤａＥＣＰに対してスズキで生じた抗体も、ＫＤａＯＭＰと交叉反応させた。本発明者は５５ＫＤａＥＣＰは９７ＫＤａＯＭＰの分泌バージョンの１つであると提案する。
【００４５】
精製およびＮ末端配列
５５ＫＤａ蛋白質の後続精製および配列決定はこの領域の３個の蛋白質を明らかにした。主要な抗原蛋白質はＮ−末端ブロックされていて、転写後のグリコシレーションと矛盾せず、したがって配列を求めることはできないが、このフラクションは強い赤血球凝集活性を有し、内在化での概然的波及を示す。第２のたんぱく質はβ−１，４Ｎ−アセチルムラミダーゼ、他のバクテリアに対する防御に対して１００％相同性を有するＮ−末端アミノ酸配列を与えた：ＡＭＫＲＨＧＬＤＮＹＲＧＹＳＬＧＮＷＶＣ。
【００４６】
第３のたんぱく質はデアミナーゼまたは異化作用性デヒドラターゼのフラグメントでありうる：ＮＶＶＬＨＧＤＮＦＤＳＴＸＶＸＶＫＡＶ。
【００４７】
スズキ（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）での攻撃研究での、５５ＫＤａコンプレックスを発現するワクチンと発現しないワクチンとの防護効力の比較
次の研究を独立して、ＣＥＦＡＳ  Ｗｅｙｍｏｕｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで研究プロトコルＰ００７５、参照９９００８で行った。
【００４８】
５５ＫＤａたんぱく質コンプレックスを発現するワクチンを次のように調製した：２．５ｌエルレンマイヤーフラスコ中塩化第二鉄２００マイクロモルを含有するトリプトン大豆ブロス５００ｍｌ＋ＮａＣｌ２％（ＴＳＢ２）にフォトバクテリウムｄａｍｓｅａｌｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａ  ＭＴ１４１５の１８時間ＴＳＢ２培養の接種物０．０１ｖ／ｖ％を接種した。この培養を後期指数成長段階まで（約４０時間）１４０ｒｐｍの振盪下に２４℃で成長させた。生じた培養をホルマリン（最終濃度０．２％）で不活化し、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加して、イソプロパノール中の１００ミリモル原液から１００マイクロモルの最終濃度にして、プロテアーゼを不活化した。
【００４９】
５５ＫＤａコンプレックスの発現が完全に抑制されるワクチンを製造するために、フォトバクテリウムｄａｍｓｅｌａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｉｓｃｉｃｉｄａ分離菌ＭＴ１４１５を、２，２ジピリジル、鉄キレート化剤１００マイクロモルを含有するＴＳＢ２中で２回、１８時間継代培養した。生じた完全に鉄を消尽した培養をワクチン培養のための接種材料（０．５ｖ／ｖ％）として使用したが、これを、２．５ｌエルレンマイヤーフラスコ中の２，２ジピリジル１００マイクロモルを含有するＴＳＢ２  ５００ｍｌ中、１４０ｒｐｍでの振盪下に、遅い指数成長段階まで（約４８時間）、２４℃で成長させた。この製剤からの５５Ｄａコンプレックスの不在が、重複培養から調製された外膜たんぱく質のウエスタンブロットにより確認された（図７参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年6月8日(2011.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの培養物由来の生物材料を含むワクチン組成物であって、０．５μＭから１ｍＭの鉄を含む培地で、その細菌細胞を培養したことを特徴とし、浸漬による魚類への投与に適した形態に調製される前記組成物。
【請求項２】
培地が２５μＭから５００μＭの鉄を含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
浸漬により魚類の細菌感染を予防または治療する薬剤の調製における、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの培養物由来の生物材料を含むワクチン組成物の使用。
【請求項４】
請求項１から２のいずれか一項に記載のワクチン組成物の請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記魚類がタイまたはスズキ（シーバス）である請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記魚類がＳｐａｒｕｓ  ａｕｒａｔａまたはＤｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘから選択される請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記細菌がＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅである請求項３から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの培養物由来の生物材料を含むワクチン組成物を魚類に投与する方法であって、ワクチンを水中に浸漬することを含む方法。
【請求項９】
前記ワクチンが１０倍希釈で浸漬される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅの培養物由来の生物材料を含む組成物であって、０．５μＭから１ｍＭの鉄を含む培地で、その細菌細胞を培養したことを特徴とし、その生物材料が、宿主細胞への侵入に関与する外膜蛋白質、またはｉｎｖａｓｉｎもしくはａｄｈｅｓｉｎである外膜蛋白質を含み、かつ該膜外蛋白質がワクチンの調製に使用する通常の培地中より多量に発現する組成物。
【外国語明細書】
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