(57)【要約】【課題】生体分子の直接標識用の非常に安定で対費用効果の高いシアニン色素ホスホアミダイト、保護基の導入及び除去のステップを必要としないホスホアミダイトを合成する便利な方法を提供すること。【解決手段】本発明は、色素ホスホアミダイト、特に、以下の一般式（Ｉ）の置換環状架橋シアニン及び関連する色素のホスホアミダイトを提供する。一般式（Ｉ）において、各破線は融合した置換又は未置換の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから独立に選択され、Ｒ１はアルキル基であり、（ＰＡＭ）はホスホアミダイト基であり、Ｘ−は陰イオンであり、ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、ＯＲ２は第２級アルキル基である。前記色素ホスホアミダイトの製造方法及び使用方法も提供される。2011116998.tif 000025【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的にはシアニン色素に関し、具体的には、安定化環状架橋シアニン色素ホスホアミダイトと、その合成方法及び生体分子標識におけるその使用方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物医学研究及び組換えＤＮＡ技術において採用される多くの手順は、プローブ、プライマー、リンカー、アダプター及び遺伝子断片としてのオリゴヌクレオチドの使用に大きく依存する。これらの使用のいくつかは非特許文献１及び２のような一般的な実験マニュアルに説明される。自動化ＤＮＡ配列決定及びマッピングと、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検出と、ＰＣＲ産物検出と、構造的な研究とのような多くの用途では標識オリゴヌクレオチドが必要である。これらの用途には伝統的に放射能標識が用いられたが、最近、ある種のシアニン色素が生体分子の標識に非常に有用であることが証明された。
【０００３】
シアニン色素は、取扱いの安全性と、長波長（ｌｏｎｇｅｒ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）での吸光度と、吸光係数の高さと、比較的高い量子効率と、分子サイズの小ささと、化学的操作の容易性と、試薬、ｐＨ及び温度に対する合理的な安定性とを含む、多くの望ましい特性を提供する。生体分子のバックグランド蛍光は低く、スペクトルの長波長部分でシアニン色素の吸光度が高いことのために、シアニン色素は優れた信号対雑音比を提供する。シアニン色素の発色団部分を修飾することによって、４００からほぼ１１００ｎｍまでの広いスペクトル範囲で吸光及び発光する異なる蛍光標識試薬を得ることができる。シアニン色素に取り込むことができる官能基の多機能性が、前記色素及び標識された産物の可溶性を制御することを可能にし、アッセイ混合液中の無関係な成分への標識された物質の非特異的結合を低減するのに役立つ（特許文献１及び２）。
【０００４】
従来、シアニン色素でのオリゴヌクレオチド標識は、手作業の２段階の手順で実行される。まず、オリゴヌクレオチドが合成され、その後、活性化シアニン色素が該合成オリゴヌクレオチドの５’末端に結合される。通常シアニン色素は、シアニン色素をオリゴヌクレオチドに共有結合で結合するのを補助する反応基の導入によって活性化される（例えば特許文献１及び２を参照せよ。）。この２段階法は遅く（４−５日）、手間がかかり、高価で、しばしば望ましくない有機副産物を生成する。代替的なより便利な１段階のアプローチでは、蛍光色素はホスホアミダイトに変換され、オリゴヌクレオチドの合成の際に該オリゴヌクレオチドの直接標識に使用される。しかし、現在利用可能なシアニン色素のホスホアミダイトは、その標準的で未修飾のものよりも実質的により高価で安定性がより低い。
【０００５】
特許文献３は、合成オリゴヌクレオチドを標識するためのカルボシアニンホスホアミダイトの使用を開示する。しかし特許文献３のシアニンホスホアミダイトは、トリチル基、４−Ｏ−モノメトキシトリチル基、４，４’−Ｏ−ジメトキシトリチル基又はアシル基のような保護基を含む。保護基は保存及び取扱いの際の不安定性を伴うのが通常であるので、これらのホスホアミダイトの市場価値を下げる。
【０００６】
特許文献４は、合成オリゴヌクレオチド標識へのシアニンホスホアミダイト色素の使用を開示する。特許文献４の色素は商業的に有用ではあるが、それでもやはりやや高価で、少し不安定であるという特徴を有する。
【０００７】
特許文献５は、複素環の窒素原子の１つを移動度を修飾する原子団で修飾されたシアニン色素のクラスを開示する。特許文献５は、シアニン色素の内在的な不安定性を認識し、塩基性条件下で分解しやすい（ｂａｓｅ−ｌａｂｉｌｅ）除去可能な保護基を用いて環外アミンその他の官能基を保護することを示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，５６９，５８７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６２７，０２７号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５５６，９５９号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３３１，６３２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７１６，９９４号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９
【非特許文献２】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
関連技術が複数の欠陥を有する点から見て、生体分子の直接標識用の非常に安定で対費用効果の高いシアニン色素ホスホアミダイトを提供することが本発明の目的である。保護基の導入及び除去のステップを必要としないホスホアミダイトを合成する便利な方法を提供することも本発明の目的である。オリゴヌクレオチドの合成の際に直接該オリゴヌクレオチドを標識する方法を提供することも本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以上及びその他の目的は、以下の一般式（Ｉ）を有する本発明の色素で達成される。
【００１２】
【化１】
2011116998.tif 000002
（Ｉ）
【００１３】
上記化学式（Ｉ）において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから独立に選択され、Ｒ１はアルキル基であり、（ＰＡＭ）はホスホアミダイト基であり、Ｘ▲横一文字の入った丸（上付き）▼（以下では、「（−）」と表記する。）は陰イオンであり、ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、ＯＲ２は第２級アルキル基である。
【００１４】
本発明の１つの実施態様によると、前記色素は、環状トリカルボシアニン色素（環状Ｃｙ７）、ベンゾインドール環状シアニン色素（環状ＢＣｙ７）及びジベンゾインドール環状シアニン色素（環状ＤＢＣｙ７）からなるグループから選択されるシアニン色素である。前記ホスホアミダイト基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロポル−Ｏ−β−シアノエチル・ホスホアミダイト基の場合がある。
【００１５】
本発明の別の局面は色素ホスホアミダイトの合成方法を提供する。該方法は、
（ａ）化学式（ＩＩ）を有する、色素の水酸基誘導体を形成するステップと、
（ｂ）化学式（ＩＩ）の水酸化誘導体の水酸基の水素をホスホアミダイト基で置換するステップとを含む。
【００１６】
【化２】
2011116998.tif 000003
（ＩＩ）
【００１７】
上記化学式（ＩＩ）において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺはＳ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、Ｒ１はアルキル基で、Ｘ（−）は陰イオンであり、ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、ＯＲ２は第２級アルキル基である。
【００１８】
本発明の１つの実施態様では、化学式（ＩＩ）を有する色素の水酸基誘導体を合成するステップは、一般式（ＸＩＶ）を有する色素の塩素化誘導体の形成を可能にする条件下で化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）を反応させるステップを含む。
【００１９】
【化３】
2011116998.tif 000004
（ＸＩＶ）
【００２０】
上記化学式（ＸＩＶ）において、ＱはＬ−Ｃｌで、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、Ｃｌは塩素である。
【００２１】
化合物（ＸＩ）は以下の一般式を有するいずれの化合物であってもよい。
【００２２】
【化４】
2011116998.tif 000005
（ＸＩ）
【００２３】
化合物（ＸＩＩ）は以下の化学式を有する
【００２４】
【化５】
2011116998.tif 000006
（ＸＩＩ）
【００２５】
上記化学式（ＸＩＩ）において、Ｐｈはフェニル基である。
【００２６】
化合物（ＸＩＩＩ）は以下の一般式を有するいずれの化合物であってもよい。
【００２７】
【化６】
2011116998.tif 000007
（ＸＩＩＩ）
【００２８】
上記化学式（ＸＩＩＩ）において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺはＳ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、Ｒ１はアルキル基で、Ｘ（−）は陰イオンである。
【００２９】
本発明の１つの実施態様では、前記色素の水酸基誘導体を合成するステップは、シアニン色素の水酸基誘導体（ＩＩ）の形成を可能にする条件下で、シアニン色素の塩素化誘導体を還流することを含む。
【００３０】
本発明のさらなる局面は、一般式（Ｉ）を有する本発明の発光色素ホスホアミダイトがオリゴヌクレオチドを直接標識するのに使用される方法を提供する。
【００３１】
本発明は、ポリヌクレオチド、タンパク質及びペプチドのような生体分子の標識における他の色素の使用と比較した、経済及び技術の両方の面での利点を提供する。以下に詳細に説明するとおり、本発明の色素ホスホアミダイトは、オリゴヌクレオチド合成の際に、該オリゴヌクレオチドに前記色素を自動的に添加するために、例えばオリゴヌクレオチドＡＢＩ３９４（ベックマン・コールター社、カリフォルニア州）のようないずれかのＤＮＡ合成機上で直接使用される場合がある。保護基なしで色素ホスホアミダイトを使用することにより、保護基を除去するステップが除去されるために、標識オリゴヌクレオチド調製に要する全時間が非常に短縮される。さらに、Ｃｙ７及びＤＢＣｙ７ホスホアミダイトのコンジュゲートされた二重結合鎖内にＯＲ２基で置換された環状原子団を取り込むことは、Ｃｙ５様分子種への部分的変換を防止し、安定な色素の形成につながる。
【００３２】
本発明のホスホアミダイトの安定性は、ＯＲ２基で置換された環状架橋を有するので、本発明の発明者の以前の成果を反映する特許文献４に記載のホスホアミダイトのような、未置換環状架橋色素のホスホアミダイトの安定性をはるかに上回る。本発明の置換環状架橋色素のホスホアミダイトは、特許文献４のホスホアミダイトよりも実質的に長期間にわたって純度を維持する。これらはオリゴヌクレオチド結合効率も高い。オリゴヌクレオチド標識に用いるとき、これらは従来技術の色素ホスホアミダイトの半減期よりもはるかに長い半減期を示す。これは、本発明の色素ホスホアミダイトをオリゴヌクレオチドその他の生体分子の標識に利用することのよって提供される費用及び時間に加えて、現在利用可能なホスホアミダイトで標識された生体分子と比較して、より高い標識産物の全体的な収率が達成される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
化学式（Ｉ）を有する色素ホスホアミダイトであって、
【化１】
2011116998.tif 000008
（Ｉ）
上記化学式（Ｉ）において、
各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の１個又は複数個の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、
ｍは１から１８までの整数であり、
Ｙ及びＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから独立に選択され、
Ｒ１は第１アルキル基であり、
（ＰＡＭ）はホスホアミダイト基であり、
Ｘ−は陰イオンであり、
ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、Ｒ２は第２アルキル基である、色素ホスホアミダイト。
（項目２）
前記芳香族の環は、フェニル基、ナフチル基又は複素環基である、項目１に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目３）
前記芳香族の環は、ベンゾインドーリネン、置換インドーリネン及び置換ベンゾインドーリネンからなるグループから選択される、項目２に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目４）
前記第１及び第２アルキル基は、骨格に１ないし１８個の炭素原子を有するアルキル基又は置換アルキル基からなるグループから独立に選択される、項目１に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目５）
前記第１アルキル基はエチル基である、項目４に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目６）
前記第２アルキル基はメチル基である、項目４に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目７）
前記コンジュゲートされた環状原子団は、シクロヘキセン、シクロペンテン及びシクロヘプテンからなるグループから選択される、項目１に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目８）
前記色素はシアニン色素である、項目１に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目９）
前記シアニン色素は、環状トリカルボシアニン色素（環状Ｃｙ７）、ベンゾインゾール環状シアニン色素（環状ＢＣｙ７）及びジベンゾインドール環状シアニン色素（環状ＤＢＣｙ７）からなるグループから選択される、項目８に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目１０）
前記陰イオンは、Ｉ−又はＢｒ−である、項目１に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目１１）
前記ホスホアミダイト基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチル・ホスホアミダイト基である、項目１に記載の色素ホスホアミダイト。
（項目１２）
（ａ）化学式（ＩＩ）を有する色素の水酸化誘導体を形成するステップと、
（ｂ）前記水酸化誘導体（ＩＩ）の水酸基の水素をホスホアミダイト基で置換するステップとを含み、
【化２】
2011116998.tif 000009
（ＩＩ）
上記化学式（ＩＩ）において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の１個又は複数個の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、
ｍは１から１８までの整数であり、
Ｙ及びＺはＳ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、
Ｒ１は第１アルキル基で、
（ＰＡＭ）はホスホアミダイト基で、
Ｘ−は陰イオンであり、
ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、Ｒ２は第２アルキル基である、色素ホスホアミダイト基の合成方法。
（項目１３）
前記芳香族の環は、フェニル基、ナフチル基又は複素環基である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第１及び第２アルキル基は、骨格に１ないし１８個の炭素原子を有するアルキル基又は置換アルキル基からなるグループから独立に選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記コンジュゲートされた環状原子団は、シクロヘキセン、シクロペンテン及びシクロヘプテンからなるグループから選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記色素はシアニン色素である、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記シアニン色素は、環状トリカルボシアニン色素（環状Ｃｙ７）、ベンゾインゾール環状シアニン色素（環状ＢＣｙ７）及びジベンゾインドール環状シアニン色素（環状ＤＢＣｙ７）からなるグループから選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ホスホアミダイト基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチル・ホスホアミダイト基である、項目１２に記載の方法。
（項目１９）
前記色素の水酸化誘導体を形成するステップは、一般式（ＸＩＶ）を有する色素の塩素化誘導体の形成を可能にする条件下で、化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）を反応させるステップを含み、
【化３】
2011116998.tif 000010
（ＸＩＶ）
【化４】
2011116998.tif 000011
（ＸＩ）
【化５】
2011116998.tif 000012
（ＸＩＩ）
【化６】
2011116998.tif 000013
（ＸＩＩＩ）
上記化学式において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺはＳ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、Ｒ１はアルキル基で、Ｘ−は陰イオンであり、
ＱはＬ−Ｃｌであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、Ｃｌは塩素で、
Ｐｈはフェニル基である、項目１２に記載の方法。
（項目２０）
前記芳香族の環は、フェニル基、ナフチル基又は複素環基である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記陰イオンは、Ｉ−又はＢｒ−である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記アルキル基は、１ないし１８個の炭素原子を有する、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記アルキル基はエチル基である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記化合物（ＸＩＩＩ）は、化合物（ＸＩＩＩ）の形成を可能にする条件下で、化合物（ＸＶ）を
【化７】
2011116998.tif 000014
（ＸＶ）
Ｂｒ（ＣＨ２）ｍ−ＯＨと反応させることによって形成され、
上記化学式において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ＹはＳ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、ｍは１から１８までの整数である、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記色素は環状Ｃｙ７で、化合物（ＸＩ）はヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチルインドーリニウムで、化合物（ＸＩＩＩ）は、臭化１−（１’−ヒドロキシヘキシル）−２，３，３−トリメチルインドーリニウムである、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
前記色素は環状ＤＢＣｙ７で、化合物（ＸＩ）はヨウ化１−エチル−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンズインドーリニウムで、化合物（ＸＩＩＩ）は臭化１−（６−ヒドロキシヘキシル）−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンズインドーリニウムである、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
前記色素の水酸化誘導体を形成するステップは、化合物（ＸＩＶ）の塩素を−ＯＲ２基で置換するステップを含み、Ｒ２は第２アルキル基である、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記塩素を置換するステップは、化合物（ＸＩＶ）と、ＮａＯＭｅ粉末と、無水メタノールとの混合液を加熱還流するステップを含み、項目２８に記載の方法。
（項目２９）
前記置換するステップ（ｂ）は、化学式（Ｉ）の色素ホスホアミダイト基
【化８】
2011116998.tif 000015
（Ｉ）
の形成を可能にする条件下で、前記水酸化誘導体（ＩＩ）を塩化メチレンと、テトラゾール又はエチルチオテトラゾールと反応させることによって実行され、
上記化学式において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の１個又は複数個の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、
ｍは１から１８までの整数であり、
Ｙ及びＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから独立に選択され、
Ｒ１は第１アルキル基であり、
（ＰＡＭ）はホスホアミダイト基であり、
Ｘ−は陰イオンであり、
ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、Ｒ２は第２アルキル基である、項目１２に記載の方法。
（項目３０）
前記置換するステップ（ｂ）は、化学式（Ｉ）の色素ホスホアミダイト基
【化９】
2011116998.tif 000016
（Ｉ）
の形成を可能にする条件下で、前記水酸化誘導体（ＩＩ）を塩化メチレンと、２−シアノエチル・テトライソプロピルホスホアミダイト（ＴＩＰＡ）と、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（ＤＩＩＰＴ）と反応させることによって実行され、
上記化学式において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の１個又は複数個の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、
ｍは１から１８までの整数であり、
Ｙ及びＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから独立に選択され、
Ｒ１は第１アルキル基であり、
（ＰＡＭ）はホスホアミダイト基であり、
Ｘ−は陰イオンであり、
ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、Ｒ２は第２アルキル基である、項目１２に記載の方法。
（項目３１）
項目１に記載の一般式（Ｉ）を有する色素ホスホアミダイト基と生体分子との結合を可能にする条件下で、該色素を該生体分子と反応させるステップを含む、生体分子の標識方法。
（項目３２）
前記生体分子はオリゴヌクレオチドである、項目１に記載の方法。
（項目３３）
前記生体分子はタンパク質又はペプチドである、項目１に記載の方法。
（項目３４）
項目１に記載の一般式（Ｉ）を有する色素ホスホアミダイト基で標識されたオリゴヌクレオチドを含む、標識オリゴヌクレオチド。
（項目３５）
項目１に記載の一般式（Ｉ）を有する色素ホスホアミダイト基で標識されたタンパク質又はペプチドを含む、標識タンパク質又は標識ペプチド。
（項目３６）
項目１に記載の一般式（Ｉ）を有する色素ホスホアミダイトを含む、オリゴヌクレオチドを標識するためのキット。
（項目３７）
項目１に記載の一般式（Ｉ）を有する色素ホスホアミダイトを含む、タンパク質およびポリペプチドを標識するためのキット。
【００３３】
本発明は、添付した特許請求の範囲に完全な範囲が定義され、その好ましい実施態様に以下のとおり説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本発明の上記の特徴及びその他の特徴と、その入手方法とは、添付する図面とともに、以下の説明を参照することによって最も良く理解されるであろう。
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、本発明の色素ホスホアミダイトの合成方法の模式図である。
【図２】図２は、実施例１、２及び３に記載の本発明のある実施態様の環状（ＯＣＨ３）−Ｃｙ７ホスホアミダイトの合成反応経路図である。
【図３】図３は、実施例１、２及び３に記載の補はの別の実施態様の環状（ＯＣＨ３）−Ｃｙ７ホスホアミダイトの合成反応経路図である。
【図４】図４は、本発明のさらなる実施態様の環状（ＯＣＨ３）−ＤＢＣｙ７ホスホアミダイトの合成反応経路図である。
【図５】図５は、環状（Ｃｌ）−Ｃｙ７の水酸化誘導体の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】図６は、環状（ＯＣＨ３）−Ｃｙ７の水酸化誘導体の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図７】図７は、環状（ＯＣＨ３）−Ｃｙ７ホスホアミダイトの３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】図８は、環状（ＯＣＨ３）−Ｃｙ７ホスホアミダイトで標識された２４量体のＣＥＱ分析を示す。ＣＥＱは完全自動化遺伝子解析システムである。このシステムは、線状ポリアクリルアミドゲルを毛管アレイに自動的に充填し、試料を変性させて装荷し、電圧プログラムを適用して、データを解析する。ＣＥＱはサイズに基づいてＤＮＡ断片を分析するのが典型的である。
【図９】図９は、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）ホスホアミダイトと、環状Ｃｙ７（Ｈ）との室温での安定性データを含む表１を示す。
【図１０】図１０は、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）ホスホアミダイトの３７°Ｃでの安定性データを含む表２と、環状Ｃｙ７（Ｈ）ホスホアミダイトの３７°Ｃでの安定性データを含む表３とを示す。３１Ｐ  ＮＭＲスケールはｐｐｍ（百万分の１）である。百分率は、１４４．６４ｐｐｍでの主ピークの積分値を指す。結合効率は、前記ホスホアミダイトのオリゴヌクレオチドへの結合によって測定される。前記オリゴヌクレオチドは合成された後前記ホスホアミダイトに結合され、穏和な脱保護試薬で切断及び脱保護され、逆相ＨＰＬＣで分析された。百分率は、ＨＰＬＣ上の標識オリゴヌクレオチドの面積百分率である。
【図１１】図１１は、時間に対する関数としての標識オリゴの色素比を示すチャートである。オリゴヌクレオチド１−３は、置換環状基（環状Ｃｙ７（ＯＭｅ））か、未置換環状基（環状Ｃｙ７（Ｈ））かのいずれかを有する、環状架橋Ｃｙ７色素のホスホアミダイトで標識された。前記色素比は、２６０ｎｍでの吸光度を、最大色素での吸光度（環状Ｃｙ７（Ｈ）については７５０ｎｍ、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）については７６３ｎｍ）で除算し、前記オリゴヌクレオチドの長さで除算した商として計算される。
【図１２】図１２は、サイズ標準と比較された百分率信号としてＣＥＱによって測定された時間に対する関数としてのプライマー１−３の安定性を示し、該サイズ標準と比較された百分率信号は、平均対立遺伝子座ピーク高の平均サイズ標準ピーク高に対する比として計算される。オリゴヌクレオチド１−３は環状架橋Ｃｙ７色素のホスホアミダイトで標識され、該環状架橋Ｃｙ７色素のホスホアミダイトは置換環状基又は未置換環状基のいずれかを有する。
【図１３】図１３は、置換環状基又は未置換環状基のいずれかを有する環状架橋Ｃｙ７色素のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチド１−３の半減期の推定値を含む表４を示す。
【図１４】図１４は、置換環状基（Ｃｙ７（ＯＭｅ））又は未置換環状基（Ｃｙ７（Ｈ））のいずれかを有する環状架橋Ｃｙ７色素のホスホアミダイトで標識されたＤ１６Ｓ５３９（オリゴ１）、アメロジェニン（Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ、オリゴ２）及びＤ１９Ｓ５９１（オリゴ３）について、−２０°Ｃで等価な時間の関数として相対色素比を示すチャートを示す。
【図１５】図１５は、置換環状基（Ｃｙ７（ＯＭｅ））又は未置換環状基（Ｃｙ７（Ｈ））のいずれかを有する環状架橋Ｃｙ７色素のホスホアミダイトで標識されたＤ１６Ｓ５３９（オリゴ１）、アメロジェニン（オリゴ２）及びＤ１９Ｓ５９１（オリゴ３）について、−２０°Ｃで等価な時間の関数としてＰＣＲ増幅の相対収率を示すチャート（図１５（１））を示す。図１５は、置換環状基（Ｃｙ７（ＯＭｅ））又は未置換環状基（Ｃｙ７（Ｈ））のいずれかを有する環状架橋Ｃｙ７色素のホスホアミダイトで標識されたＤ１６Ｓ５３９（オリゴ１）、アメロジェニン（オリゴ２）及びＤ１９Ｓ５９１（オリゴ３）についての時間の関数として、ＰＣＲ増幅産物の百分率として非特異的なノイズのピークを示すチャート（図１５（２））も示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
ホスホアミダイトの安定性を増大させるために、本発明はＯＲ２基で置換された環状架橋基を用いる。したがって、本発明は以下の化学式（Ｉ）を有する色素ホスホアミダイトを提供する。
【００３６】
【化７】
2011116998.tif 000017
（Ｉ）
【００３７】
上記化学式（Ｉ）において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺは、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから独立に選択され、Ｒ１はアルキル基であり、（ＰＡＭ）はホスホアミダイト基であり、Ｘ（−）は陰イオンであり、ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、ＯＲ２は第２級アルキル基である。
【００３８】
活性化色素は、複素環か、フェニル環のような単環芳香族構造か、ナフチル環のような融合環構造かを含む場合がある。芳香族環は、ベンゾインドーリネン、置換インドーリネン及び置換ベンゾインドーリネンからなるグループから選択される場合がある。第１アルキル基は一般に１ないし１８個の炭素原子を有する。本発明の１つの実施態様では、第１アルキル基はエチル基で、２個の炭素原子を含む。第２アルキル基は一般的には１ないし１８個の炭素原子を有し、好ましくは１ないし６個の炭素を有する。本発明の１つの実施態様では、第２アルキル基はメチル基で、１個の炭素原子を含む。ホスホアミダイト基は通常はアルキル鎖で前記色素と結合する。該アルキル鎖の長さは炭素原子１ないし１２個である。１つの実施態様では、アルキル鎖の長さは炭素原子約６個である。
【００３９】
環状原子団Ｌは周囲の炭素構造にコンジュゲートされる場合がある。本発明の１つの実施態様では、前記環状原子団は、シクロヘキセン、シクロペンテン及びシクロヘプテンからなるグループから選択される。本発明の化合物（Ｉ）は陰イオンＸ（−）を含む。このイオンはハロゲンであることが好ましいが、他の陰イオンが用いられる場合もある。例えば前記陰イオンは、合成戦略に応じて、Ｉ（−）又はＢｒ（−）の場合がある。ホスホアミダイト基はＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−β−シアノエチル・ホスホアミダイト基でかまわないが、当業者に知られた他のホスホアミダイトが使用される場合がある。
【００４０】
一般的には本発明の色素は、ホスホアミダイト基及びアルキル基を取り込み、かつ、ＯＲ２基で置換された環状架橋を有するかぎり、標識の目的に慣用されるいかなる蛍光色素であってもかまわない。ホスホアミダイト基及び第１アルキル基が本色素のインドール又はベンゾインドール部分の窒素と結合することが必要である。本色素の吸光及び発光波長はスペクトルの特定領域に限定されず、近紫外から近赤外又はそれらの間を超えたどこであってもかまわない。
【００４１】
本発明の実施態様によると、本色素はシアニン及びこれに関連する色素の場合がある。シアニン色素は、長波長での吸収（安価な検出システムが使えること、及び、これらの波長での生物学的試料からのバックグランドが低いことにつながる。）と、高い吸光係数と、比較的高い量子効率と、小さな分子サイズと、蛍光特性を低下させることなく化学的操作が容易であること、試薬、ｐＨ及び温度に合理的な安定性があることを含む、敏感な検出標識として機能するうえで望ましい複数の特性を有する。
【００４２】
本発明の１つの実施態様では、ホスホアミダイト色素は、環状トリカルボシアニン色素（環状Ｃｙ７）、ベンゾインドール環状シアニン色素（環状ＢＣｙ７）及びジベンゾインドール環状シアニン色素（環状ＤＢＣｙ７）からなるグループから選択される。ベンゾインドール環状シアニンＣＢｙ７は１個のベンゼン基置換を有し、ジベンゾインドール環状ＤＢＣｙ７は対応するインドールシアニンである、環状Ｃｙ７に対して、２個の余分なベンゼン基置換を有する。このように、ベンゾインドール環状シアニンは、インドールの対応化合物よりも最大吸光及び発光波長が長い。
【００４３】
ＯＲ２基を色素ホスホアミダイトのコンジュゲートされた環状原子団に導入することが未置換の環状原子団を有する色素ホスホアミダイトよりも安定性をさらに増大させることが本発明の発見である。前記コンジュゲートされた環状基は、シクロヘキセン、シクロペンテン及びシクロヘプテンからなるグループから選択される場合がある。１つの実施態様では、前記環状原子団は、以下の構造（ＸＶａ）を有する。
【００４４】
【化８】
2011116998.tif 000018
（ＸＶａ）
【００４５】
この実施態様では、得られたホスホアミダイト色素の合成コストは、未置換環状原子団を用いる対応する色素の合成コストの６０％にすぎない。
【００４６】
本明細書の実施例５により詳細に説明するとおり、本発明のホスホアミダイトは当業者に知られたホスホアミダイトより安定性において勝っている。例えば１つの実施態様では、置換環状シアニン色素（環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ））及び未置換環状シアニン色素（環状Ｃｙ−７（Ｈ））のホスホアミダイトがテストされた。環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトは、加速された安定性試験が実施されたとき、本発明の環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトよりも安定性が悪かった。ＨＰＬＣにより測定（図９、表１に表す）したところでは、環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトの純度は、６７．６０％で始まって、室温、４週間で５２．１１％まで低下したが、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトの純度は、もっと高い８１．９４％ではじまって、室温、４週間で６８．９２％と高い値にとどまった。さらに、環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトのオリゴヌクレオチド結合効率は、室温、４週間で４４．８３％から１５％まで落ち込んだが、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトのオリゴヌクレオチド結合効率は、室温、４週間で４６．００％から３５．４９％までしか下がらなかった（図９、表１）。室温で４週間は、４°Ｃで１３ヶ月に等しい。したがって、このデータは、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトが環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトよりはるかに安定であることを示す。本発明の色素の純度の増加と、製造から長期間経過後のオリゴヌクレオチド結合能力の増大とによって、本発明の色素はオリゴヌクレオチドを標識する能力について従来技術より勝れている。
【００４７】
環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）ホスホアミダイトは、環状Ｃｙ−７（Ｈ）ホスホアミダイトで標識されたものと比較して３７°Ｃでの安定性の増大という同じ傾向を示した（図１０、表２及び３）。環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトの純度は、４９．９３％で始まって、３７°Ｃ、７日間で２０．９２％まで低下したが、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトの純度はもっと高い６１．６５％で始まって、３７°Ｃ、７日間で５９．９５％という高い値にとどまった。さらに、環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトのオリゴヌクレオチド結合効率は、３７°Ｃ、７日間で３０％から０％まで低下したが、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトのオリゴヌクレオチド結合効率は、３７°Ｃ、７日間で４３％から１７％までしか低下しなかった。環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトの結合効率は第５日目で３７．４２％であったが、環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトの結合効率は第５日目では既に２％まで低下していた。これは、本発明のホスホアミダイトが３７°Ｃで環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトよりもはるかに安定なため、オリゴヌクレオチド標識により有用であることを示す。
【００４８】
発光／吸光比及び３１Ｐ  ＮＭＲのデータも、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトは環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトよりも安定であることを証明する。発光／吸光比の変化は、色素自体の変化を反映する。前記比が大きく変化するほど、色素の安定性は低い。表２でわかるように、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトが７日間で１２１０から１０８８に色素比が変化するのに対し、環状Ｃｙ−７（Ｈ）は同じ期間で１８８２から１２９５まで色素比が変化した（表３）。３１Ｐ  ＮＭＲデータはホスホアミダイトの純度を反映する。環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトは７日間で１５％ポイントだけしか低下しなかったのに対し、環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトは４０％ポイントも低下したという事実は、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトが純度を保持する傾向が高いことを示す。このデータは、本発明のホスホアミダイトが環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトより３７°Ｃではるかに安定性が高いことを再確認する。
【００４９】
本発明の色素ホスホアミダイトは、該色素をオリゴヌクレオチドに自動的に添加するためにいずれかのＤＮＡ合成機に直接用いる場合がある。本発明の色素ホスホアミダイトはいかなる保護基も含まない。保護基なしでの色素ホスホアミダイトの使用によって、保護基を除去するステップが削除されるので、標識オリゴヌクレオチド調製に要する全時間は非常に短縮される。オリゴヌクレオチドその他の生体分子を標識するために本発明の色素ホスホアミダイトを使用することによって提供されるコスト及び時間に加えて、従来の２段階法より高い標識産物の全収率も達成される。
【００５０】
本発明の別の局面は、色素ホスホアミダイトの合成方法を提供する。該方法は、
（ａ）以下の化学式（ＩＩ）を有する色素の水酸化誘導体を形成するステップと、
（ｂ）その水酸基の水素をホスホアミダイト基で置換するステップとを含む。
【００５１】
【化９】
2011116998.tif 000019
（ＩＩ）
【００５２】
上記化学式（ＩＩ）において、各破線は融合した置換又は未置換の芳香族の環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺはＳ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、Ｒ１はアルキル基で、Ｘ（−）は陰イオンであり、ＱはＬ−Ｗであり、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団で、ＷはＯＲ２で、ＯＲ２は第２級アルキル基である。
【００５３】
水酸基誘導体（ＩＩ）は、複素環か、フェニル環のような単環芳香族構造か、ナフチル環のような融合環構造かを含む場合がある。１つの実施態様では、第１及び第２アルキル基は、主鎖の１個ないし１８個の炭素を有する、アルキル基及び置換アルキル基からなるグループから独立に選択される。具体的には、ある実施態様では、第１アルキル基は２個の炭素を含み、第２アルキル基は１個の炭素を含む。特に関心があるのは、環状Ｃｙ７、環状ＢＣｙ７及び環状ＤＢＣｙ７を含む、上記のとおり説明されたシアニン色素である。
【００５４】
本発明の１つの実施態様によると、前記シアニン色素の水酸化誘導体を形成するステップ（ａ）は、一般式（ＸＩＶ）を有するシアニン色素の塩素化誘導体の形成を可能にする条件下で、化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）を反応させるステップを含む。
【００５５】
【化１０】
2011116998.tif 000020
（ＸＩＶ）
【００５６】
化合物（ＸＩ）は以下の一般式を有するいかなる化合物でもかまわない。
【００５７】
【化１１】
2011116998.tif 000021
（ＸＩ）
【００５８】
化合物（ＸＩＩ）は以下の化学式を有する。
【００５９】
【化１２】
2011116998.tif 000022
（ＸＩＩ）
【００６０】
上記化学式（ＸＩＩ）において、Ｐｈはフェニル基である。
【００６１】
化合物（ＸＩＩＩ）は以下の化学式を有する。
【００６２】
【化１３】
2011116998.tif 000023
（ＸＩＩＩ）
【００６３】
上記化学式において、各破線は融合した置換又は未置換芳香族環を形成するのに必要な炭素原子を表し、ｍは１から１８までの整数であり、Ｙ及びＺはＳ、Ｏ、Ｎ、ＣＨ２及びＣ（ＣＨ３）２からなるグループから選択され、Ｒ１はアルキル基で、Ｘ（−）は陰イオンである。
【００６４】
特定の化合物（ＸＩ）及び（ＸＩＩＩ）の選択は、合成されるべき色素ホスホアミダイトのタイプに依存する。環状Ｃｙ７ホスホアミダイトの合成のためには、化合物（ＸＩＩ）と、未置換の化合物（ＸＩ）及び（ＸＩＩＩ）とを使って、その後、所望のＯＲ２基を置換する場合がある。環状ＤＢＣｙ７ホスホアミダイトは、ベンズ置換された化合物（ＸＩ）及び（ＸＩＩＩ）と、化合物（ＸＩＩ）とを使い、その後所望のＯＲ２基に置換することによって合成される場合がある。
【００６５】
本発明の１つの実施態様は、環状Ｃｙ７ホスホアミダイトの合成を伴う（図２）。この実施態様では、化合物（ＸＩ）がヨウ化１−エチル−２，３，３−トリメチルインドーリニウム、化合物（ＸＩＩＩ）が臭化１−（６−ヒドロキシヘキシル）−１，１，２−トリメチルインドーリニウムの場合がある。別の実施態様では、環状ＤＢＣｙ７（図４）が合成される。この実施態様では、化合物（ＸＩ）がヨウ化１−エチル−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンズインドーリニウムで、化合物（ＸＩＩＩ）が臭化１−（６−ヒドロキシヘキシル）−１，１，２−トリメチル−Ｈ−ベンズインドーリニウムの場合がある。当業者は、適当な化合物（ＸＩ）、（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）を選択することによって他のホスホアミダイトが合成できることを了解するであろう。
【００６６】
塩素化誘導体（ＩＶ）の形成を可能にするかぎりいかなる反応条件でも使用してかまわないが、１つの実施態様では、化合物（ＸＩ）、化合物（ＸＩＩＩ）及び無水エタノールが、全ての固形物が溶解するまで室温で撹拌される。その後化合物（ＸＩＩ）が溶液に添加され、該溶液は全ての固形物が溶解するまで再度撹拌された。その後、無水酢酸ナトリウムが前記溶液に添加され、１時間加熱還流される。その後、溶媒が除去され、混合物は真空乾燥される。その後、前記混合物はＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、エーテル中で沈殿され、再度真空乾燥される。再度前記混合物はＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、得られた溶液はシリカゲルカラム上に装荷される。該カラムは、ＣＨ２Ｃｌ２、メタノール、アセトン及び酢酸エチルを含む溶媒の勾配で溶出され、産物が分画として回収される。その後、前記産物は室温で終夜乾燥される。
【００６７】
本発明の水酸化誘導体（ＩＩ）を形成するステップは、さらに、背水酸化誘導体（ＩＩ）の形成を可能にする条件下で、前記色素の塩素化誘導体（ＸＩＶ）を試薬と反応させるステップを含む場合がある。誘導体（ＩＩ）の形成を可能にするかぎりいかなる反応条件を使用してもかまわないが、本発明の１つの実施態様では使用される試薬はＮａＯＲ２である。Ｒ２はいかなるアルキル基でもかまわないが、１つの実施態様では、メチル基（Ｍｅ）が用いられる。この実施態様では、ＯＭｅ環状シアニン色素の水酸化誘導体は一般式（ＩＩａ）を用いて製造される。
【００６８】
【化１４】
2011116998.tif 000024
（ＩＩａ）
【００６９】
上記化学式（ＩＩａ）において、ＱはＬ−ＯＭｅで、Ｌはコンジュゲートされた環状原子団である。
【００７０】
１つの実施態様では、ＮａＯＭｅがアルゴン存在下で保護されたコンデンサ内で無水メタノールと混合され、ＮａＯＭｅが完全に溶解するまで撹拌される。その後、前記色素の水酸化及び塩素化誘導体がフラスコ内に混合され、混合物が１時間加熱還流される。この溶液が冷却され、溶媒は真空蒸散される。その後、残渣はＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、シリカゲルカラム上に装荷される。前記カラムは溶出され、産物が回収される。溶媒は真空蒸散され、前記産物は室温で終夜乾燥される。この実施態様では、このようにして、実施例２で説明されるとおり前記色素の水酸化誘導体が得られる。
【００７１】
本発明の目的のためには、前記色素の水酸化誘導体（ＩＩ）は、色素ホスホアミダイト（Ｉ）を形成するのに十分な条件下で適当な試薬と反応させられる場合がある。本発明の実施態様によると、適当な試薬は、テトラゾール、エチルチオテトラゾール、２−シアノエチル・テトラ・イソプロピル・ホスホアミダイト（ＴＩＰＡ）及びジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（ＤＩＩＰＴ）からなるグループから選択される場合がある。
【００７２】
１つの実施態様では、水酸化誘導体（ＩＩ）は、前記ホスホアミダイト色素の形成を可能にする条件下で、塩化メチレンと、テトラゾール（図２に示す）か、エチルチオテトラゾールかのいずれかと反応させられる。このステップで製造されるホスホアミダイト色素の一般的な構造は上記のとおり化学式（Ｉ）に示される。
【００７３】
本発明のホスホアミダイト色素（Ｉ）の形成を可能にする異なる反応条件を使ってもかまわないが、実施例３で詳細に説明される１つの実施態様では、水酸化誘導体（ＩＩ）と、無水塩化メチレンとがアルゴン存在下で保護されたフラスコ内に入れられて、０°Ｃで１５分間撹拌される。その後ＴＩＰＡがシリンジを使って前記フラスコに添加され、その後、テトラゾール溶液かエチルチオテトラゾールかのいずれかが添加される（図３）。反応液は０°Ｃ１時間撹拌される。その後、混合液は室温まで温められ、反応が室温で２０時間継続される。その後前記混合液は１０％重炭酸ナトリウム溶液で２回洗浄され、有機層はさらに２回蒸留水で洗浄される。有機層は回収され、無水硫酸ナトリウムで約１時間乾燥される。前記硫酸ナトリウムは濾過して除去され、溶媒は真空下で除去され、混合物は真空下で乾燥される。残渣は無水塩化メチレンに溶解され、無水エーテルに添加されて、その後約３０分間静置される。その後溶媒は除去され、生成物は終夜真空下で乾燥される。実施例３は適当な反応条件についてのさらなる詳細を提供する。
【００７４】
別の実施態様では、水酸化誘導体（ＩＩ）が、図３のステップ３に示すとおり、ホスホアミダイト色素の形成を可能にする条件下で、塩化メチレンと、２−シアノエチル・テトライソプロピルホスホアミダイト（ＴＩＰＡ）と、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（ＤＩＩＰＴ）とともに反応される。
【００７５】
ホスホアミダイト色素の形成を可能にするかぎりいかなる反応条件を使ってもかまわないが、１つの実施態様では、水酸化誘導体（ＩＩ）と無水塩化メチレンとがアルゴン存在下で保護されたフラスコ内に入れられ、室温で１５分間撹拌される。ＴＩＰＡ及びＤＩＩＰＴが添加され、混合液が室温で２時間アルゴン又は窒素雰囲気下で撹拌される。その後、前記混合液は３時間２５−３０°Ｃに加熱される。前記混合液は冷却され反応が終夜継続される。前記混合液は重炭酸ナトリウムで２回洗浄され、水で２回洗浄される。有機層は回収され、無水硫酸ナトリウムで乾燥される。硫酸ナトリウムはアルゴン保護下の加圧漏斗で除去され、残渣は真空中で乾燥される。前記残渣は無水塩化メチレンに溶解され、無水エーテルに添加される。懸濁液は１５分間静置され、溶媒はアルゴンによって保護された加圧漏斗を用いて除去される。この工程は繰り返され、３０分間の静置時間が許される。エーテルは濾過して除去され、混合物は真空下で乾燥される。生成物はビンに回収され、室温、高真空下で終夜乾燥される。実施例４は適当な反応条件についてさらなる詳細を提供する。
【００７６】
本発明の別の局面は生体分子の標識方法を提供する。該方法は、上記のとおりの一般式（Ｉ）を有する本発明の色素ホスホアミダイトが前記生体分子に結合することを可能にする条件下で、該色素ホスホアミダイトを該生体分子と反応させるステップを含む。前記生体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸からなるグループから選択される場合がある。当業者は、本発明の開示を参照して、過度の実験を要することなく標識条件を調べることができる。
【００７７】
本発明のホスホアミダイトは適当な条件下で広範囲の生体分子を標識するのに利用できるが、実施例６でより詳細に説明される１つの実施態様では、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトがオリゴヌクレオチドを標識するのに用いられた。前記色素ホスホアミダイトは無水アセトニトリル中に溶解され、５’末端との結合を可能にするために前記オリゴヌクレオチドと１０分間結合された。
【００７８】
実施例６により詳細に説明されるとおり、標識されたプライマーの安定性の研究が実施され、本発明の１つの実施態様の環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドは、環状Ｃｙ７（Ｈ）のホスホアミダイトで標識されたプライマーよりも機能的な安定性が向上することを示す。図１３、表４に示すとおり、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドの平均半減期は３．７週間であるが、環状Ｃｙ７（Ｈ）のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドの平均半減期は１．３週間である。同様の傾向はＰＣＲ産物収率（図１５）及び色素比（図１４）のデータによって証明される。これらの結果は、本発明のホスホアミダイトは従来技術よりも効率的にオリゴヌクレオチドを標識する能力において優れていることを示す。
【００７９】
当業者は、本発明の色素のホスホアミダイトがオリゴヌクレオチド配列のどこにでも導入できることを了解するであろう。しかし、付加の好ましい場所は、色素標識による雑種形成との干渉が最小となる、オリゴヌクレオチドの５’末端である。多色標識オリゴヌクレオチドを提供するために第２の色素を付加することは、商業的に入手可能なリンカーを利用することによって可能である。したがって本発明は、生体分子の蛍光検出用の安定で便利な標識を提供する。該標識は、いずれかのＤＮＡ合成機上で単一の自動化されたステップでオリゴヌクレオチドに付加でき、従来用いられてきた保護−脱保護のステップを必要としない。
【００８０】
本発明の色素のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む試料中の特異的な相補的ヌクレオチド配列の有無及び量を同定するための蛍光雑種形成プローブとして利用される場合がある。これら及び多くの他の可能なシアニン色素標識の用途の詳細な説明は、係属中の「効率的な活性化シアニン色素」という名称の米国特許第６，１１０，６３０号明細書と、「発光法による生物学的その他の材料の検出用標識試薬としてのシアニン色素」という名称の米国特許第５，６２７，０２７号明細書と、「発光アリルスルホン酸シアニン色素を用いる材料の標識及び検出方法」という名称の米国特許第５，５６９，５８７号明細書に提供され、これらの関連する内容は引用によって本明細書に取り込まれる。
【００８１】
上記に説明されたオリゴヌクレオチド以外の生物学的材料を標識するために異なる反応条件が使われる場合があるが、１つの実施態様では、ペプチド及びタンパク質は無水条件下で標識される。かかる標識ペプチド及びタンパク質も、従来技術のホスホアミダイトで標識されたペプチド及びタンパク質と比較うｓると安定性が向上すると予測される。
【００８２】
以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図するものであって、限定する意図はない。かかる実施例は使用されるかもしれない実施態様の典型的なものではあるが、代替的に、当業者に知られた他の手順が利用されてもかまわない。実際、当業者は、本明細書の開示内容に基づいて、過度の実験を伴うことなく、さらなる実施態様を容易に想到し作成することができる。
【００８３】
これらの実施例に用いられる一般的な分析方法及び特徴付けの技術は、以下に示される。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚで（ブルカー社）分光装置により記録された。化学的シフトはＴＭＳに対して百万分の１部（ｐｐｍ、δ）で記録された。３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルは３００ＭＨｚで（ブルカー社）分光装置により記録された。化学シフトはリン酸に対して百万分の１部（ｐｐｍ、δ）で記録された。分析用逆相ＨＰＬＣによる分析は、４６ＭＭ  Ｘ  ２５ＣＭ（ベックマン  カタログ番号＃２３５３２９）Ｃ１８ウルトラスフェアカラム（５μ  粒子）を取り付けたベックマン高圧液体クロマトグラフィ装置で実施された。
【実施例１】
【００８４】
環状Ｃｙ７（Ｃｌ）−ＯＨの合成
磁気スターラー・バー及びコンデンサ付きのオーブン乾燥済み５００ｍＬ丸底フラスコ中に、１０．２８ｇの臭化１−（１’−ヒドロキシヘキシル）−２，３，３−トリメチルインドーリウム（３０．２ミリモル）と、９．５２ｇのヨウ化エチル−２，３，３−トリメチルインドーリウム（３０．２ミリモル）と、１６０ｍＬの無水エタノールとが添加された。全ての固形物は室温で混合液を撹拌することによって溶解された。その後、１０．８６ｇのＮ−［（３−アニリノメチレン）−２−クロロ−１−シクロヘキセネル・メチレン」アニリン・モノヒロドクロリド（リンカー）（３０．２ミリモル）が前記フラスコ中に添加された。前記混合液は室温で撹拌され、溶液中の全ての固形物が溶解された。その後６ｇの無水酢酸ナトリウムが前記フラスコ中に添加された。前記溶液は１１０−１２０°Ｃの油浴中で１時間加熱還流され、その後室温まで冷却された。反応が完了したかどうかを知るために、前記混合液は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ、溶媒システム  ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール：アセトン：酢酸エチル＝８５：５：５：５）によってチェックされた。溶媒は真空下で除去され、混合液は真空下で２時間乾燥された。その後、得られた混合物は３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解され、３００ｍＬのエーテル中で沈殿された。溶媒は濾過によって除去され、全ての固形物が回収され、真空下で１時間乾燥された。その後、残った固形物は４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解され、シリカゲルカラム内に装荷された。該カラムは勾配溶媒システム（塩化メチレン：アセトニトリル：アセトン、体積比は１００：０：０から６０：２０：２０まで変化させた）で、１００％塩化メチレン（約２Ｌ）で開始して、徐々に溶媒システムを変化させて溶出した。分画が緑色になったとき、分画あたり約２５０ｍＬのセグメントに分取され、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ、溶媒システム  ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール：アセトン：酢酸エチル＝８５：５：５：５）によって監視された。生成物を含む分画は丸底フラスコにプールされ、溶媒が蒸散された。その後、生成物は室温で高真空下で終夜乾燥された。結果は、９．０ｇの生成物で、環状Ｃｙ（Ｃｌ）−ＯＨの４７％の収率であった。以下の物理的特性が観察された。
【００８５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ１．４６  （ｔ，  ３Ｈ−ＣＨ２ＣＨ３），  δ１．６  （ｍ，  ４Ｈ，  ２ＣＨ２）  δ１．８  （ｓ，  １２Ｈ，  （ＣＨ３）４），  δ１．８５  （ｍ，  ４Ｈ，  ２ＣＨ２），  δ２．０  （ｍ，  ２Ｈ，  環のＣＨ２），  δ２．８  （ｔ，  ４Ｈ，  環の（ＣＨ２）２），  δ３．７５  （ｔ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  δ４．２  （ｍ，  ４Ｈ，  （ＣＨ２−Ｎ）２），  δ６．２  （ｔ，  ２Ｈ），  δ７．２−７．５５  （ｍ，  ８Ｈ，  芳香族）及びδ８．４  （ｄ，  ２Ｈ）．  （図５）．
ＶＩＳ−ＮＩＲ  λｍａｚ  ７７８ｎｍ．
【実施例２】
【００８６】
環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）−ＯＨの合成
アルゴン存在下でパージされ保護された磁気スターラー・バー及びコンデンサ付きのオーブン乾燥済み２５０ｍＬ丸底フラスコ中に、５ｇのＮａＯＭｅ粉末と、２００ｍＬの無水メタノールとが添加された。溶液は、ＮａＯＭｅが完全に溶解することを担保するために撹拌された。これに、１０ｇの環状Ｃｙ（Ｃｌ）−ＯＨ（１５．０８ミリモル）が添加された。得られた混合液は８０−１００°Ｃの油浴中で１時間加熱還流され、その後、室温まで冷却された。溶媒は真空下で蒸散され、残渣は真空下で乾燥された。その後乾燥固形物が２０−３０ｍＬの塩化メチレンに溶解された。試料はシリカゲルカラム内に装荷された。該カラムは、１００％塩化メチレンから開始して、１％メタノールから５％メタノールまでの勾配に沿って徐々に変化させながら溶出された。分画は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ、溶媒システム  ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール：アセトン：酢酸エチル＝８５：５：５：５）を用いてチェックされ、予想された分画が２５０ｍＬフラスコ内に回収された。その後前記予想された分画はプールされ、全ての溶媒が真空下で蒸散された。生成物を室温で終夜真空下で乾燥させる。結果は、生成物８．１ｇで、環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）−ＯＨの８１％の収率であった。
【００８７】
以下の物理的特性が観察された。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ１．４５  （ｔ，  ３Ｈ，  ＣＨ２−ＣＨ３），  δ１．５５  （ｍ，  ２ＣＨ２），  δ１．６３  （ｓ，  １２Ｈ，  （ＣＨ３）４），  δ１．８−１．９  （ｍ，  ６Ｈ，  ３−ＣＨ２），  δ２．５  （ｔ，  ４Ｈ，  環の２ＣＨ２），  δ３．７５  （ｔ，  ２Ｈ，  ＣＨ２），  δ３．９２  （ｓ，  ３Ｈ，  Ｏ−ＣＨ３），  δ４．２  （ｍ，  ４Ｈ，  （ＣＨ２−Ｎ）２），  δ６．１  （ｄｄ，  ２Ｈ），  δ７．２−７．５５  （ｍ，  ８Ｈ，  芳香族）及びδ８．０（ｄ，  ２Ｈ）．  （図５）
ＶＩＳ−ＮＩＲ  λｍａｘ  ７５０  ｎｍ．
【実施例３】
【００８８】
環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）−ホスホアミダイトの合成（方法１）
アルゴン存在下でパージされ保護された、磁気スターラーバー付きのオーブン乾燥済み２５０ｍＬ丸底フラスコに、５ｇの環状Ｃｙ−７（ＯＭｅ）−ＯＨ（７．５８ミリモル）と、２００ｍＬの無水塩化メチレンとが添加された。溶液は０°Ｃで（温度は氷浴で制御された）１５分間撹拌された。その後４．５７ｇのＴＩＰＡ（０．０１５ミリモル）がシリンジを使って前記フラスコ内に添加され、その後、１５．２ｍＬの０．５Ｍテトラゾール溶液か、２４．６ｇｍの４％エチルチオテトラゾールかが添加された。反応混合液は０°Ｃで１時間撹拌された。その後前記混合液は、反応を約２０時間（終夜）室温で継続させるために、室温まで温められた。前記反応混合液は、生成物が開始材料よりも高いＲＦを有することを確かめるために、ＴＬＣ（溶媒システム  ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール：アセトン：酢酸エチル＝８５：５：５：５）によってチェックされた。その後前記反応混合液は、分離漏斗に移され、２００ｍＬの１０百分率重炭酸ナトリウム溶液で２回洗浄された。その後有機層は３００ｍＬの蒸留水で２回洗浄され、有機相が回収された。その後有機溶液は約１時間２０ｇの無水硫酸ナトリウムで乾燥され、その後、該硫酸ナトリウムは濾過して除去された。その後残存する溶媒はＲｏｔｏ−ｖａｐ（回転式エバポレータ）によって真空下で除去され、残渣は真空下で１時間乾燥された。前記残渣は最少量の無水塩化メチレン（約１０−２０ｍＬ）に溶解され、この溶液が５００ｍＬの無水エーテルに添加された。混合液は約３０分間静置され、前記エーテルがアルゴンによって保護された加圧漏斗によって除去された。残った固形物は３０分間真空下で乾燥され、上述の沈殿の手順が１回繰り返された。その後最終生成物が室温で終夜真空下で乾燥された。３．６ｇの生成物環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）−ホスホアミダイトが５５％の収率で回収された。
【実施例４】
【００８９】
ＯＭｅ−環状−Ｃｙ７−ホスホアミダイトの合成（方法２）
アルゴン存在下でパージ及び保護された、磁気スターラーバー付きのオーブン乾燥済み２５０ｍＬ丸底フラスコに５ｇの環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）−ＯＨ（７．５８ミリモル）と、２００ｍＬの無水塩化メチレンとが添加された。溶液は室温で１５分間撹拌された。シリンジを用いて、６±０．４ｇのＴＩＰＡ（６．０±０．２ｍＬ、又は、０．０１５モル）が前記フラスコに添加され、その後、１．５ｇのジイソプロピルアンモニウムテトラリド（ＤＩＩＰＴ、活性化剤）が添加された。その後、反応混合液はアルゴン又は窒素雰囲気下で２時間室温で撹拌され、その後、２５−３０°Ｃまで３時間加熱された。その後、混合液は室温まで冷却され、反応は室温で約１６時間（終夜）継続された。前記反応混合液は、生成物が開始材料よりも高いＲＦを有することを確認するために、薄層クロマトグラフィ（溶媒システム  ＣＨ２Ｃｌ２：メタノール：アセトン：酢酸エチル＝８５：５：５：５）によってチェックされた。前記反応混合液は分離漏斗に移され、２００ｍＬの１０％重炭酸ナトリウム溶液で２回洗浄された。有機層は２回３００ｍＬの蒸留水で洗浄された。有機相は回収され、４０ｇの無水硫酸ナトリウムで約１時間乾燥された。前記硫酸ナトリウムはアルゴンによって保護された加圧漏斗を用いて濾過して除去さｒえ、溶媒は濾液から回転式エバポレータによって除去された。残渣は高真空下で１時間乾燥され、その後、該残渣は最少量の無水塩化メチレン（約２０−３０ｍＬ）に溶解された。その後この溶液は５００ｍＬの無水エーテルに１滴ずつ添加され、懸濁液は１５分間静置された。溶媒はアルゴンによって保護された加圧漏斗を用いて除去され、残った混合物は真空下で１時間乾燥された。その後上述の沈殿の手順が１回繰り返され、混合液は約３０分間静置された。その後無水エーテルはアルゴンで保護された加圧漏斗を用いて濾過して除去された。その後残存固形物は真空下で１時間乾燥された。生成物はビンに回収され、該生成物は室温で終夜高真空下で乾燥された。この工程は、４．６ｇの生成物を、ＯＭｅ−環状−Ｃｙ７−ホスホアミダイトの７０％の収率で提供した。以下の物理的特性が観察された。Ｐ３１  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ１４４．２４  （純度９５％）．  （図６）．
【実施例５】
【００９０】
環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）対環状Ｃｙ−７（Ｈ）の加速安定性試験
環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）対環状Ｃｙ−７（Ｈ）ホスホアミダイトの加速安定性試験は３７°Ｃ及び室温で行われた。試料は３７°Ｃ又は室温で保存され、異なる時間ポイントでリンＮＭＲと、Ｃ１カラム上の高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）と、オリゴヌクレオチドへの結合とが実施された。前記オリゴヌクレオチドは、穏和な切断及び脱保護試薬である、０．０５Ｍ  Ｋ２ＣＯ３／ＭｅＯＨを用いて切断及び脱保護され、蒸散され、Ｃ−１８  ＨＰＬＣのＵＶ−ＶＩＳスペクトル及び％面積によって解析された。データは図９及び１０の表１―３に要約される。
【００９１】
表２及び３の発光／吸光比は、保存温度での色素の吸光及び発光特性を示す。前記比は、環状Ｃｙ−７（Ｈ）については経時的に環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）ホスホアミダイトと比べてより実質的に変化するが、これは、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）の安定性がより高いことを示す。同様に、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）ホスホアミダイトの場合に色素の分解と関連する３１Ｐ  ＮＭＲ測定値の百分率の低下が少ないことは、環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）よりも安定性が高いことを示す。
【実施例６】
【００９２】
色素ホスホアミダイトのＮ末端への結合
標識プライマーの加速安定性試験は、３７°Ｃ及び室温で実行された。ポリヌクレオチドは、Ａｐａｃ、Ｇｉｐｒ−ｐａｃ、Ｃａｃ及びＴホスホアミダイトを使ってＡＢＩ３９４で合成された。１００ｍｇの環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）又は環状Ｃｙ−７（Ｈ）ホスホアミダイトは１ｍＬの無水アセトニトリル（ＡｃＣＮ）に溶解され、配列の５’末端に１０分間結合された。前記オリゴヌクレオチドは０．０５Ｍ  Ｋ２ＣＯ３／ＭｅＯＨを用いて終夜室温で切断及び脱保護され、蒸散され、逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で精製された。精製されたオリゴヌクレオチドは安定性試験のために３７°Ｃ及び室温で保存された。異なる時点で試料が取り出され、色素比及び機能性試験が実施された。色素比は２６０ｎｍの吸光度／７６３ｎｍの吸光度／オリゴヌクレオチドの長さによって測定された。プライマーの配列は以下のとおりである。
オリゴヌクレオチド１：５’  ＧＡＴＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴ  ３’（配列番号１）
オリゴヌクレオチド２：５’  ＣＣＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＧ  ３’（配列番号２）
オリゴヌクレオチド３：５’  ＴＴＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＡＧＣＡＧＴＧ  ３’（配列番号３）
【００９３】
本試験に関するデータは図１１−１５に要約される。
【００９４】
環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドは、環状Ｃｙ−７（Ｈ）のホスホアミダイトで標識されたプライマーよりも高い安定性を示す。例えば、本発明のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドの勝れた安定性は、機能的安定性試験（図１５）及び色素比に基づく安定性試験（図１４）によって証明される。本発明のホスホアミダイトで標識されたオリゴヌクレオチドは、３７°Ｃで５日間（−２０°Ｃで７．１８年間に等しい）インキュベーションされたとき、約２．５倍安定性が高い。ノイズのレベルは環状Ｃｙ７（ＯＭｅ）又は環状Ｃｙ−７（Ｈ）のいずれの合成とも相関しないようであった（図１５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2011116998000001.pdf