(57)【要約】【課題】従来よりも早く焦点を合わせることを目的とする。【解決手段】標本に対する視野を水平方向に移動しながら視野毎の画像を撮影する顕微鏡装置であって、視野毎の合焦点を予測し、当該予測結果に基づいて視野毎の合焦点を調整する合焦点調整手段を具備する。【選択図】図３
2011145645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に対する視野を水平方向に移動しながら視野毎の画像を撮影する顕微鏡装置であって、
視野毎の合焦点を予測し、当該予測結果に基づいて視野毎の合焦点を調整する合焦点調整手段を具備することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記合焦点調整手段は、標本の同一面上に設けられた３点以上の基準印の空間座標から最小二乗法に基づいて標本の面に近似する標本近似面を求め、当該標本近似面に基づいて標本の水平位置から当該標本の垂直位置を割り出し、当該垂直位置を前記水平位置における合焦点として予測することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記合焦点調整手段は、決められたタイミングになると、前記基準印のうち１点以上の空間座標を再取得し、当該空間座標に基づいて前記視野の合焦点を予測し直すことを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記合焦点調整手段は、前記画像の所定走査線における輝度の変化の傾きが所定のしきい値より小さい場合に焦点が合っていないと判断し、当該判断により前記決められたタイミングになったと判断することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記合焦点調整手段は、撮影する視野を隣接する視野と一部重ねさせることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
着脱可能な平行平面基板上に前記標本は載っていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
標本に対する視野を水平方向に移動しながら視野毎の画像を撮影する標本撮影方法であって、
視野毎の合焦点を予測し、当該予測結果に基づいて視野毎の合焦点を調整する合焦点調整工程を具備することを特徴とする標本撮影方法。
【請求項８】
前記合焦点調整工程において、標本の同一面上に設けられた３点以上の基準印の空間座標から標本の面に近似する標本近似面を求め、当該標本近似面に基づいて水平位置から標本の垂直位置を割り出し、当該垂直位置を前記水平位置における合焦点として予測することを特徴とする請求項７に記載の標本撮影方法。
【請求項９】
前記合焦点調整工程において決められたタイミングになると、前記基準印のうち１点以上の空間座標を再取得し、当該空間座標に基づいて前記視野の合焦点を予測し直すことを特徴とする請求項８に記載の標本撮影方法。
【請求項１０】
前記合焦点調整工程において、前記画像の所定走査線における輝度の変化の傾きが所定のしきい値より小さい場合に焦点が合っていないと判断し、当該判断により前記決められたタイミングになったと判断することを特徴とする請求項９に記載の標本撮影方法。
【請求項１１】
前記合焦点調整工程において、標本の同一面上の標本の外に３点以上の基準印を設けることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の標本撮影方法。
【請求項１２】
前記合焦点調整工程において、透過型顕微鏡で標本を撮影する場合には、基準印としてビーズを配置し、蛍光顕微鏡で標本を撮影する場合には、基準印として蛍光ビーズを配置することを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の標本撮影方法。
【請求項１３】
前記合焦点調整工程において、撮影する視野を隣接する視野と一部重ねさせることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載の標本撮影方法。
【請求項１４】
前記合焦点調整工程において、前記標本は平行平面基板上に載っていることを特徴とする請求項７〜１３のいずれか１項に記載の標本撮影方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置及び標本撮影方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の検出や細胞構造の観察では、頻繁に顕微鏡が用いられる。そして、この顕微鏡を用いて標本全体の微生物を計数する場合には、微生物を洗い出すために多数の視野を観察しなければならない。また、組織（細胞群）の切片などの顕微鏡の１視野よりも大きなものを観察する場合にも、組織の全体像を得るために多数の視野を観察する必要がある。そして、この多数の視野の観察を簡単に実行できるものとして、ステージの平面移動と焦点合わせとが自動化された顕微鏡が存在する。この顕微鏡は、各視野の画像を自動で撮影する機能も持ち、オートフォーカス機能を用いて各視野の焦点を合わせる。そして、オートフォーカス機能には、静止画を多数撮影して焦点の合い具合を判断するタイプと、観察対象を動かしながら最もフォーカスが合う位置を探すタイプがある。しかし、前者のタイプは、オートフォーカスの際に多くの静止画を撮影する必要があるため撮影に余計な時間がかかってしまう。また、後者のタイプも、撮影が完了するまでの時間の中でオートフォーカスにかかる時間が非常に長くなることが多い。そのため、蛍光染色法を用いて微生物を観察する場合などでは、オートフォーカスで焦点を合わせている間に、微生物の蛍光が退色してしまって当該微生物をうまく撮影できないことがある。
【０００３】
そのため、上記問題を解消する発明として、下記特許文献１には、スライドガラス上に設置した平坦な粘着シートに微生物を捕集し、スライドガラスの別の部分に設けたフォーカス目印を基準に標本の厚み位置に焦点を合わせ、標本を平行移動させることで焦点を保ちながら複数の画像を撮影する技術が提案されている。
また、下記特許文献２には、蛍光色素に対する励起光と異なる波長の光を照射した上でオートフォーカスを実行し、焦点の合ったタイミングで励起光を照射して画像を撮影する技術が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２２７７４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００３／０６７２３０号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、上記特許文献１では、スライドガラス上に設置した平坦な粘着シートに微生物を捕集し、スライドガラスの別の部分に設けたフォーカス目印を基準に標本の厚み位置に焦点を合わせ、標本を平行移動させることで焦点を保ちながら複数の画像を撮影している。しかし、粘着シート厚さの不均一性や標本の傾きなどの要因により、高倍率撮影や、蛍光撮影など焦点深度の浅い条件では合焦が難しい。
また、上記特許文献２では、蛍光色素に対する励起光と異なる波長の光を照射した上でオートフォーカスを実行し、焦点の合ったタイミングで励起光を照射して画像を撮影することで、蛍光色素の退色を防いでいる。しかし、合焦にかかる時間は改善されていなので、多数視野の撮影には長時間を要する。
【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、従来よりも早く焦点を合わせることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明では、顕微鏡装置に係る第１の解決手段として、標本に対する視野を水平方向に移動しながら視野毎の画像を撮影する顕微鏡装置であって、視野毎の合焦点を予測し、当該予測結果に基づいて視野毎の合焦点を調整する合焦点調整手段を具備するという手段を採用する。       
【０００８】
本発明では、顕微鏡装置に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記合焦点調整手段は、標本の同一面上に設けられた３点以上の基準印の空間座標から最小二乗法に基づいて標本の面に近似する標本近似面を求め、当該標本近似面に基づいて標本の水平位置から当該標本の垂直位置を割り出し、当該垂直位置を前記水平位置における合焦点として予測するという手段を採用する。
【０００９】
本発明では、顕微鏡装置に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、決められたタイミングになると、前記基準印のうち１点以上の空間座標を再取得し、当該空間座標に基づいて前記視野の合焦点を予測し直すという手段を採用する。
【００１０】
本発明では、顕微鏡装置に係る第４の解決手段として、上記第３の解決手段において、前記合焦点調整手段は、前記画像の所定走査線における輝度の変化の傾きが所定のしきい値より小さい場合に焦点が合っていないと判断し、当該判断により前記決められたタイミングになったと判断するという手段を採用する。
【００１１】
本発明では、顕微鏡装置に係る第５の解決手段として、上記第１〜第４のいずれか１つの解決手段において、前記合焦点調整手段は、撮影する視野を隣接する視野と一部重ねさせるという手段を採用する。
【００１２】
本発明では、顕微鏡装置に係る第６の解決手段として、上記第１〜第５のいずれか１つの解決手段において、着脱可能な平行平面基板上に前記標本は載っているという手段を採用する。
【００１３】
本発明では、標本撮影方法に係る第１の解決手段として、標本に対する視野を水平方向に移動しながら視野毎の画像を撮影する標本撮影方法であって、視野毎の合焦点を予測し、当該予測結果に基づいて視野毎の合焦点を調整する合焦点調整工程を具備するという手段を採用する。
【００１４】
本発明では、標本撮影方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記合焦点調整工程において、標本の同一面上に設けられた３点以上の基準印の空間座標から標本の面に近似する標本近似面を求め、当該標本近似面に基づいて水平位置から標本の垂直位置を割り出し、当該垂直位置を前記水平位置における合焦点として予測するという手段を採用する。
【００１５】
本発明では、標本撮影方法に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記合焦点調整工程において決められたタイミングになると、前記基準印のうち１点以上の空間座標を再取得し、当該空間座標に基づいて前記視野の合焦点を予測し直すという手段を採用する。
【００１６】
本発明では、標本撮影方法に係る第４の解決手段として、上記第３の解決手段において、前記合焦点調整工程において、前記画像の所定走査線における輝度の変化の傾きが所定のしきい値より小さい場合に焦点が合っていないと判断し、当該判断により前記決められたタイミングになったと判断するという手段を採用する。
【００１７】
本発明では、標本撮影方法に係る第５の解決手段として、上記第２〜第４のいずれか１つの解決手段において、前記合焦点調整工程において、標本の同一面上の標本の外に３点以上の基準印を設けるという手段を採用する。
【００１８】
本発明では、標本撮影方法に係る第６の解決手段として、上記第２〜第５のいずれか１つの解決手段において、前記合焦点調整工程において、透過型顕微鏡で標本を撮影する場合には、基準印としてビーズを配置し、蛍光顕微鏡で標本を撮影する場合には、基準印として蛍光ビーズを配置するという手段を採用する。
【００１９】
本発明では、標本撮影方法に係る第７の解決手段として、上記第１〜第６のいずれか１つの解決手段において、撮影する視野を隣接する視野と一部重ねさせるという手段を採用する。
【００２０】
本発明では、標本撮影方法に係る第８の解決手段として、上記第１〜第７のいずれか１つの解決手段において、前記合焦点調整工程において、前記標本は平行平面基板上に載っている手段を採用する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、視野毎の合焦点を予測し、当該予測結果に基づいて視野毎の合焦点を調整する。このように顕微鏡装置Ｓは、予め合焦点を予測するので、従来よりも早く焦点を合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置Ｓの概略構成図である。
【図２】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置Ｓの演算装置Ｂの機能ブロック図である。
【図３】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置Ｓの演算装置Ｂの動作を示すフローチャートである。
【図４】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置Ｓに取り付けられるメンブレンフィルタＦｌの基準印Ｓｍを示す模式図である。
【図５】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡装置Ｓが算出する標本近似面を示す模式図である。
【図６】本発明の第２実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図７】本発明の第２実施形態の動作の変形例を示すフローチャートである。
【図８】本発明の第２実施形態に係る顕微鏡装置ＳＡが画像の焦点が合っていないか否か判断する基準を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
〔第１実施形態〕                
第１実施形態に係る顕微鏡装置Ｓは、図１に示すように、蛍光顕微鏡Ａ、演算装置Ｂ及びインタフェースケーブルＣから構成されている。この顕微鏡装置Ｓは、ＦＩＳＨ法によって蛍光染色されたレジオネラ菌を標本から検出するものである。なお、演算装置Ｂは、本実施形態における合焦点調整手段である。また、上記ＦＩＳＨ法とは、標的微生物（レジオネラ菌）の核酸（多くの場合においてリボソームＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid））に対して相補的なポリヌクレオチドを蛍光染色したプローブを標的微生物に結合させることで、標的微生物を選択的に染色して検出する方法である。
【００２４】
蛍光顕微鏡Ａは、落射型の蛍光顕微鏡であり、ステージ１上に取り付けられた平行平面基板Ｆｂに対向して対物レンズが配置されている。そして、ステージ１は、水平方向、すなわち前後（Ｘ軸方向）及び左右（Ｙ軸方向）と、垂直方向（Ｚ軸方向）とに移動する。そして、蛍光顕微鏡Ａには、このステージ１の垂直動を調整する調整器２が設けられている。この調整器が、演算装置Ｂの制御の下でステージ１を垂直動させることでステージ１上に載せられる標本に対する焦点を調整する。すなわち、調整器が、演算装置Ｂの制御の下でオートフォーカスを実行する。この際、蛍光顕微鏡Ａは、焦点の合ったステージ１上の標本の水平位置（Ｘ，Ｙ座標）及び垂直位置（Ｚ座標）を演算装置Ｂに出力する。
【００２５】
また、蛍光顕微鏡Ａには、対物レンズを介した観察光軸上には、三眼鏡筒ユニットを介して接眼レンズユニットが配置されるとともに、結像レンズユニットを介して電子カメラが配置されている。この電子カメラは、撮影した画像をインタフェースケーブルＣを介して演算装置Ｂに出力する。さらに、蛍光顕微鏡Ａは、落射照明光学系が設けられており、当該落射照明光学系によって平行平面基板Ｆｂ上の標本に励起光を照射する。
【００２６】
演算装置Ｂは、所定の顕微鏡制御プログラム及び画像解析プログラムを搭載したデスクトップ型またはノート型のパーソナルコンピュータであり、インタフェースケーブルＣを介して蛍光顕微鏡Ａに接続されている。この演算装置Ｂは、蛍光顕微鏡Ａの動作を制御し、また、レジオネラ菌を蛍光顕微鏡Ａから入力された画像に所定の画像処理を施すことにより検出する。このような演算装置Ｂは、図２に示すように、表示部１１、操作部１２、顕微鏡接続Ｉ／Ｆ部１３、記憶部１４及び演算部１５から構成されている。
【００２７】
表示部１１は、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）ディスプレイまたは液晶ディスプレイであり、演算部１５による制御の下で各種画面を表示する。
操作部１２は、マウス等のポインティングデバイス及びキーボードから構成され、ユーザから受け付けた操作指示を演算部１５に出力する。
【００２８】
顕微鏡接続Ｉ／Ｆ部１３は、インタフェースケーブルＣを介して蛍光顕微鏡Ａに接続され、蛍光顕微鏡Ａとの間で画像信号及び制御信号等の各種信号の送受信を行う。
記憶部１４は、ＲＯＭ（Read Only Memory）及びＲＡＭ（Random Access Memory）から構成されており、演算装置Ｂの動作を制御するために演算部１５によって実行される顕微鏡制御プログラム及び画像解析プログラムを記憶している。
【００２９】
演算部１５は、上記記憶部１４に記憶されたプログラム及び操作部１２から入力される操作指示に基づいて、蛍光顕微鏡Ａの動作の制御指示を蛍光顕微鏡Ａに出力し、また蛍光顕微鏡Ａから入力された画像からレジオネラ菌を検出する。なお、この演算部１５の制御処理の詳細については、以下に演算装置Ｂの動作として説明する。
【００３０】
次に、演算装置Ｂの動作ついて、図３を参照して説明する。
まず、液体試料からレジオネラ菌を検出しようとするユーザは、ろ過によりメンブレンフィルタ上に液体試料からレジオネラ菌を捕集する。上記メンブレンフィルタは、直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。このメンブレンフィルタの中央部の直径１６ｍｍの円形領域（ろ過面）が、ろ過に使用される。
【００３１】
そして、ろ過が終了すると、次に、ＦＩＳＨ法によってメンブレンフィルタ上の標本の中のレジオネラ菌を蛍光染色する。そして、ユーザは、上記メンブレンフィルタのろ過面、すなわち標本と同一面上の標本の外に外周に沿って等間隔で４点の基準印を設ける。具体的には、図４に示すように、標本Ｓｐの載ったメンブレンフィルタＦｌ上のろ過面Ｆｓの外に４点の基準印Ｓｍを設ける。この基準印は、励起光が照射されると、波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発する蛍光インクまたは蛍光ビーズなどの蛍光物質からなる。
【００３２】
その後、ユーザは、上記メンブレンフィルタを平行平面基板Ｆｂに載せ、その上にカバーガラスを載せると当該平行平面基板Ｆｂを蛍光顕微鏡Ａに取り付ける。そして、ユーザは、演算装置Ｂの操作部１２を操作することで、４点の基準印それぞれの焦点の合った画像をオートフォーカス機能を使って撮影させることで４点の基準印の空間座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ座標）を顕微鏡装置Ｓに取得させる。
【００３３】
演算装置Ｂの演算部１５は、４点の基準印の空間座標（Ｘ，Ｙ，Ｚ座標）を取得したか否か判定する（ステップＳ１）。演算部１５は、ステップＳ１において『ＮＯ』と判定した場合には、すなわち４点の基準印の空間座標を取得していない場合には、４点の基準印の空間座標を取得するまで待機する。演算部１５は、ステップＳ１において『ＹＥＳ』と判定した場合には、すなわち４点の基準印の空間座標を取得した場合には、４点の基準印の空間座標から最小二乗法に基づいて標本の面に近似する標本近似面を求める（ステップＳ２）。
【００３４】
ここで、上記ステップＳ２について、具体的に説明する。
ステップＳ２は、以下に説明する《１》〜《３》の処理を有する。
例えば、図５に示すように４点の基準印の空間座標が（ｘ1，ｙ1，ｚ1）、（ｘ２，ｙ２，ｚ２）、（ｘ３，ｙ３，ｚ３）（ｘ４，ｙ４，ｚ４）であるとする。
〔《１》４点の基準印の合計値及び平均値の算出〕
まず、４点の基準印のＸ，Ｙ，Ｚ軸座標それぞれの合計値（Ｔｘ，Ｔｙ，Ｔｚ）を以下(１)、(２)及び(３)式に従って算出する。(ｎ＝４)
Ｔｘ（Ｘ座標の合計値）＝ｘ１＋ｘ２＋…＋ｘｎ …(１)
Ｔｙ（Ｙ座標の合計値）＝ｙ１＋ｙ２＋…＋ｙｎ …(２)
Ｔｚ（Ｚ座標の合計値）＝ｚ１＋ｚ２＋…＋ｚｎ …(３)  
そして、上記Ｔｘ，Ｔｙ，ＴｚからＸ，Ｙ，Ｚ軸座標それぞれの平均値（Ａｘ，Ａｙ，Ａｚ）を以下(４)、(５)及び(６)式に従って算出する。
Ａｘ（Ｘ座標の平均値）＝Ｔｘ／ｎ …(４)
Ａｙ（Ｙ座標の平均値）＝Ｔｙ／ｎ …(５)
Ａｚ（Ｙ座標の平均値）＝Ｔｚ／ｎ …(６)
【００３５】
〔《２》各座標偏差平方和の算出〕
上記《１》が終了すると、次に４点の基準印の空間座標、Ｘ，Ｙ，Ｚ軸座標の合計値（Ｔｘ，Ｔｙ，Ｔｚ）及び平均値（Ａｘ，Ａｙ，Ａｚ）から座標偏差平方和（Ｓｘｘ，Ｓｙｙ，Ｓｘｙ，Ｓｙｚ，Ｓｘｚ）を式(７)〜(１１)に従って算出する。（Σにおけるｉは、１，２…ｎである。そして、ｎ＝４）
Ｓｘｘ＝Σ(ｘｉ−Ａｘ)２＝ Σｘｉ２−Ｔｘｉ２／ｎ …(７)
Ｓｙｙ＝Σ(ｙｉ−Ａｙ)２＝ Σｙｉ２−Ｔｙｉ２／ｎ …(８)
Ｓｘｙ＝Σ{(ｘｉ−Ａｘ)×(ｙｉ−Ａｙ)}＝ Σ(ｘｉ×ｙｉ)−(Ｔｘ×Ｔｙ)／ｎ …(９)
Ｓｙｚ＝Σ{(ｙｉ−Ａｙ)×(ｚｉ−Ａｚ)}＝ Σ(ｙｉ×ｚｉ)−(Ｔｙ×Ｔｚ)／ｎ …(１０)
Ｓｘｚ＝Σ{(ｘｉ−Ａｘ)×(ｚｉ−Ａｚ)}＝ Σ(ｘｉ×ｚｉ)−(Ｔｘ×Ｔｚ)／ｎ …(１１)
【００３６】
〔《３》平面パラメータの算出〕
上記《２》が終了すると、次に座標偏差平方和（Ｓｘｘ，Ｓｙｙ，Ｓｘｙ，Ｓｙｚ，Ｓｘｚ）及び平均値（Ａｘ，Ａｙ，Ａｚ）から平面パラメータ（ａ、ｂ、ｃ）を以下式(１２)〜(１４)に従って算出する。
ａ＝{(Ｓｘｚ×Ｓｙｙ)−(Ｓｙｚ×Ｓｘｙ)}／{(Ｓｘｘ×Ｓｙｙ)−Ｓｘｙ} …(１２)
ｂ＝{(Ｓｙｚ×Ｓｘｘ)−(Ｓｘｚ×Ｓｘｙ)}／{(Ｓｘｘ×Ｓｙｙ)−Ｓｙｙ} …(１３)
ｃ＝Ａｚ−(ａ×Ａｘ)−(ｂ×Ａｙ) …(１４)
そして、上記平面パラメータ（ａ、ｂ、ｃ）に基づいて標本近似面を示す（１４）式は、以下のようになる。
ｚ＝（ａ×ｘ）＋（ｂ×ｙ）＋ …(１４)
このようにすることで、４点の基準印Ｓｍの空間座標（ｘ1，ｙ1，ｚ1）、（ｘ２，ｙ２，ｚ２）、（ｘ３，ｙ３，ｚ３）（ｘ４，ｙ４，ｚ４）から標本近似面Ｓｐａｓが求まる（図５参照）。なお、図５に示す符号Ｚｏは、Ｚ軸原点を示している。
【００３７】
図３に戻り、演算部１５は、ステップＳ２の後に、蛍光顕微鏡Ａにステージを水平方向に移動させることで目的の視野まで水平方向に移動させる（ステップＳ３）。演算部１５は、ステップＳ３において目的の視野まで水平方向に移動すると、標本近似面に基づいて当該視野における標本の水平位置から標本の垂直位置を割り出し、垂直位置を標本の水平位置における合焦点として予測する（ステップＳ４）。すなわち、標本のＸ座標及びＹ座標を、上記（１４）式に代入することで標本のＺ座標を割り出し、当該Ｚ座標を合焦点Ｆｐ（図５参照）として予測する。
【００３８】
演算部１５は、ステップＳ４の後に、当該予測結果に基づいて蛍光顕微鏡Ａの調整器２に合焦点を調整させる（ステップＳ５）。演算部１５は、ステップＳ５の後に、蛍光顕微鏡Ａに励起光を照射させて画像を撮影させる（ステップＳ６）。なお、蛍光顕微鏡Ａは波長４９５ｎｍの青色の励起光を照射する。すると、レジオネラ菌に結合したプローブが波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光する。演算部１５は、ステップＳ６の後に、蛍光顕微鏡Ａが撮影した画像を記憶部１４に保存させ（ステップＳ７）、全ての視野の撮影をしたか否か判定する（ステップＳ８）。
【００３９】
演算部１５は、ステップＳ８において『ＮＯ』と判定した場合には、すなわち全ての視野の撮影を完了していない場合には、ステップＳ３に移行し、次の視野に移動する。演算部１５は、ステップＳ８において『ＹＥＳ』と判定した場合には、すなわち全ての視野を撮影した場合には、画像からレジオネラ菌を検出し、その数を割り出す（ステップＳ９）。
【００４０】
このように、レジオネラ菌に焦点が合うように調整されているので、蛍光顕微鏡の視野が移動しても、オートフォーカスによる焦点の再調整がほとんど行われることがない。そして、蛍光顕微鏡によって画像を撮影したところ、通常の方法では画像全体にフォーカスの合う画像は１０枚に１枚程度であったが、本実施形態に係る顕微鏡装置Ｓを使うことで多数の画像において良好なフォーカスの画像が得られた。
【００４１】
以上のように、本実施形態に係る顕微鏡装置Ｓは、標本と同一面上に設けられた基準印から標本近似面を求め、当該標本近似面に基づいて標本の水平位置から当該標本の垂直位置を割り出し、当該垂直位置を前記水平位置における合焦点として予測する。そして、顕微鏡装置Ｓでは、当該予測結果に基づいて蛍光顕微鏡Ａの調整器２により合焦点を調整する。このように顕微鏡装置Ｓは、予め合焦点を予測するので、従来よりも早く焦点を合わせることができる。また、標本を平行平面基板上に載せて標本を平坦化することで、予測結果に基づいて合焦点を調整したとしても、焦点がずれることが少ない。
【００４２】
〔第２実施形態〕                        
次に、第２実施形態について説明する。なお、第２実施形態の構成は、第１実施形態と同様であるため、その説明を省略し、第２実施形態の動作のみを図６を参照して説明する。また、図６におけるステップＳ２１〜２８の動作は、図３におけるステップＳ１〜８と同様であるので、説明を省略する。
【００４３】
演算部１５は、ステップＳ２８において『ＮＯ』と判定した場合には、すなわち全ての視野の撮影を完了していない場合には、Ｚ軸補正を実行するための決められたタイミングになったか否か判定する（ステップＳ２９）。ここで、ステップＳ２９について詳細に説明する。上述の決められたタイミングとは、例えば、顕微鏡Ａに対する所定操作が所定回数行われたタイミングや、撮影の視野がメンブレンフィルタＦｌの端まで移動したタイミングである。例えば、ステップＳ２３において、撮影の視野が、メンブレンフィルタＦｌ上を左右方向に移動し、メンブレンフィルタＦｌの左右方向の端まで移動すると、前後のいずれかの方向に移動した上で再び左右方向に移動する場合には、視野がメンブレンフィルタＦｌの左右方向の端まで移動したタイミングが、上述の決められたタイミングである。
【００４４】
図６に戻り、演算部１５は、ステップＳ２９において『ＹＥＳ』と判定した場合には、すなわち決められたタイミングになった場合には、現在の視野に最も近い基準印を蛍光顕微鏡Ａにオートフォーカス機能を使って撮影させることで当該基準印のＺ軸座標を再取得し、当該Ｚ軸座標に基づいて視野の合焦点を予測し直す（ステップＳ３０）。例えば、基準印のＺ軸座標の値が上方向に『５』ずれていた場合には、合焦点の予測結果も上方向に『５』ずらす。このように、合焦点を予測し直すのは、ステージを水平方向に移動させる際の上下方向へのずれなどが原因で、標本近似面に基づいて予測した合焦点と正しい合焦点とにずれが生じるからである。演算部１５は、ステップＳ３０が終了すると、ステップＳ２３において蛍光顕微鏡Ａにステージを移動させることで次の視野まで移動させ、再取得した基準印のＺ軸座標の値に基づく合焦点の予測を開始する。
【００４５】
演算部１５は、ステップＳ２９において『ＮＯ』と判定した場合には、すなわち決められたタイミングになっていない場合には、ステップＳ２３に移行する。演算部１５は、ステップＳ２８において『ＹＥＳ』と判定した場合には、すなわち全ての視野を撮影した場合には、画像からレジオネラ菌を検出し、その数を割り出す（ステップＳ３１）。
【００４６】
以上のように、第２の実施形態は、第１実施形態にはない合焦点の予測し直し機能を有し、決められたタイミングになった場合に合焦点を予測し直し、予測結果に基づいて画像を撮影し直すので、第１実施形態よりも焦点の合った良好な画像を得ることができる。
【００４７】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法を用いてレジオネラ菌を検出する目的で作製された標本の合焦点を割り出したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法などのＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法、また蛍光染色法以外の微生物検出方法を用いて微生物を検出するための標本、さらには微生物以外のものを検出するための標本の合焦点を割り出すようにしてもよい。すなわち、本実施形態に係る顕微鏡装置Ｓが合焦点を割り出す標本はどのような標本であってもよい。
【００４８】
（２）上記実施形態では、標本に対する蛍光顕微鏡Ａの合焦点を割り出したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、透過顕微鏡の合焦点を割り出してもよい。すなわち、本発明は、あらゆる顕微鏡装置に適用することができる。
【００４９】
（３）上記実施形態では、４点の基準印から標本近似面を求めたが、本発明これに限定されない。
本発明は、少なくとも基準印は３点あれば標本近似面求めることができる。そのため、基準印は３点以上であればいくつでもよい。
【００５０】
（４）上記実施形態では、平面板として平行平面基板を用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、平行平面基板の代わりに、スライドガラスを用いてもよい。しかし、より平面度を増すためには平行平面基板など平面度の高い物を用いた方がよい。また、ＦＩＳＨ法などの蛍光染色法では、標本を載せる平面板が透明である必要がないので、シリコンウェハーを用いてもよい。
【００５１】
（５）上記実施形態では、蛍光顕微鏡Ａにおいて蛍光インクまたは蛍光ビーズなどの蛍光物質から構成される基準印から標本近似面を求めたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、本実施形態が蛍光顕微鏡Ａの代わりに透過顕微鏡を備える場合に、蛍光物質ではなく通常インクまたは蛍光ビーズではない通常の微細ビーズから基準印を構成するようにしてもよい。
【００５２】
（６）上記第２実施形態では、決められたタイミングになった場合に、現在の視野に最も近い基準印のＺ軸座標を再取得し、当該Ｚ軸座標に基づいて視野の合焦点を予測し直したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、演算部１５は、決められたタイミングになった場合に、４つの基準印を蛍光顕微鏡Ａにオートフォーカス機能を使って再撮影させることでその空間座標を再取得し、当該空間座標から最小二乗法に基づいて標本近似面を再計算し、以後、当該標本近似面に基づいて合焦点を予測するようにする。このように正しい標本近似面を求め直すことで、焦点の合った良好な画像を得ることができる。
【００５３】
（７）上記第２実施形態では、決められたタイミングが、蛍光顕微鏡Ａに対する所定操作が所定回数行われたタイミングや撮影の視野がメンブレンフィルタＦｌの端まで移動したタイミングであったが、本発明はこれに限定されない。
第２実施形態の変形例、すなわち決めれらたタイミングの変形例を図７及び図８を参照して説明する。なお、図７のステップＳ４１〜４８の動作は、図６のステップＳ２１〜２８の動作と同じであり、図７のステップＳ５０，５１も図６のステップＳ３０，３１と同じであるため、その説明を省略する。
【００５４】
図７に示すように、演算部１５は、ステップＳ４８において『ＮＯ』と判定した場合には、すなわち全ての視野の撮影を完了していない場合には、先ほど撮影された画像の焦点が合っていないかどうか判定する（ステップＳ４９）。ステップＳ４９について詳細に説明する。演算部１５は、ステップＳ４９において、所定視野を撮影後に画像の所定主走査線の輝度を取得し、当該輝度から焦点が合っていないかどうか判定する。例えば、図８の（ａ）に示す画像Ｇｐを撮影した場合に、演算部１５は、当該画像Ｇｐの主走査線Ｍｓの輝度を取得する。この主走査線Ｍｓにおける輝度は、図８の（ｂ）に示される。焦点が合っている場合には、図８の（ｂ）の実線ｓｌで示すようにレジオネラ菌ｌｇと背景ｂｋとの輝度の変化の傾きは急峻である。しかし、焦点が合っていない場合には、図８の（ｂ）の一点鎖線ｃｌで示すようにレジオネラ菌ｌｇと背景ｂｋとの輝度の変化の傾きは緩やかである。
【００５５】
演算部１５は、図８の（ｂ）の輝度の変化の傾きを利用して焦点が合っていないかどうか判定する。つまり、演算部１５は、所定主走査線の輝度の変化の傾きが所定のしきい値より小さい場合に焦点が合っていないと判断し、所定のしきい値より大きい場合に焦点が合っていると判断する。なお、ステップＳ４９において、主走査線、すなわち横方向の走査線に限らず、縦方向の走査線または斜め方向の走査線における輝度の変化の傾きから焦点が合っていないかどうか判断してもよい。
【００５６】
（８）上記第２実施形態では、ステップＳ３０において、現在の視野に最も近い基準印のＺ軸座標を再取得し、当該Ｚ軸座標に基づいて視野の合焦点を予測し直したが、本発明これに限定されない。
最も近い基準印に限定されずに、いずれかの基準印のＺ軸座標を再取得し、当該Ｚ軸座標に基づいて前記視野の合焦点を予測し直すようにすればよい。
【符号の説明】
【００５７】
Ｓ…顕微鏡装置、Ａ…蛍光顕微鏡、Ｂ…演算装置、Ｃ…インタフェースケーブル、１…ステージ、１１…表示部、１２…操作部、１３…顕微鏡接続Ｉ／Ｆ部、１４…記憶部、１５…演算部
【図１】
2011145645.tif 000003
【図２】
2011145645.tif 000004
【図３】
2011145645.tif 000005
【図４】
2011145645.tif 000006
【図５】
2011145645.tif 000007
【図６】
2011145645.tif 000008
【図７】
2011145645.tif 000009
【図８】
2011145645.tif 000010