(57)【要約】【課題】生体成分との相互作用を利用して電気泳動法により特定成分を分離分析する際に、泳動後の転写工程を必要とせずに、簡便に実施でき、しかも、転写による定量性の低下などの問題を生じることのない、電気泳動用支持体、および該支持体を用いた分離分析法を提供する。【解決手段】生体成分に親和性を有する物質を疎水性ポリマー膜へ固定化した後、疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマー層を形成したものを電気泳動支持体として提供することで、生体成分との相互作用を利用した特定成分の分離が可能となり、また転写工程を要しない簡便な特異的検出が可能となる。【選択図】図１
2011039043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる生体成分と親和性を持つ物質を固定化した疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマー層を有することを特徴とする電気泳動用支持体。
【請求項２】
前記生体成分、及び生体成分と親和性を持つ物質が、何れもタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用支持体。
【請求項３】
前記生体成分が糖タンパク質であり、前記生体成分と親和性を持つ物質がレクチンであることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用支持体。
【請求項４】
前記生体成分がリポタンパク質であり、前記生体成分と親和性を持つ物質がレクチンであることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用支持体。
【請求項５】
前記生体成分がレクチンであり、前記生体成分と親和性を持つ物質が糖タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用支持体。
【請求項６】
前記生体成分がレクチンであり、前記生体成分と親和性を持つ物質が糖脂質であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用支持体。
【請求項７】
前記生体成分及び前記生体成分と親和性を持つ物質のいずれか一方が抗体であり、他方が抗原であることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用支持体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気泳動用支持体を用い、固定化した物質の生体成分との親和性を利用して試料中に含まれる特定の生体成分を分離検出することを特徴とする分離分析方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の電気泳動用支持体を備えることを特徴とする、生体成分の分離分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来試料のような複雑な混合物を、支持体に固定化された物質との相互作用と電気泳動とにより泳動分離するための電気泳動用支持体、および該支持体を用いた生体成分の分離分析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に存在するタンパク質は、癌などの疾患時にその発現量が変化することが知られており、疾患により変化した分子群を捕えることで、新規診断マーカーとしての応用が期待できる。特に糖タンパク質は、疾患時の量的変化に加え、構造上の質的変化、特に翻訳後修飾によって付加される糖鎖構造の変化が知られており、疾患により変化した糖鎖構造やそれらを含む分子群を捕えることで、より優れた新規診断マーカーとして利用できる可能性がある。そのため、質的な違いに基づく糖タンパク質群の分離分析法や、ある特定の糖鎖を有する糖タンパク質の特異的検出法は、疾患の診断や治療にとって大切な臨床検査の１つとなる可能性が高い。
【０００３】
特定の糖鎖構造を持つ糖タンパク質群を分離する技術としては、分離状態を視覚的にとらえることができる電気泳動法が好ましく用いられており、具体的にはレクチン親和性電気泳動法が知られている（特許文献１、非特許文献１参照）。
これらの方法は、レクチンを含ませたセルロースアセテート膜もしくはアガロースゲル中で電気泳動を行い、レクチンに対する親和性の違いを利用して糖鎖構造が異なる糖タンパク質を分離する技術である。
糖鎖の違いに基づく疾患の診断に利用される糖タンパク質としては、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）やα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）などが知られている。ＡＦＰは、肝細胞癌およびヨークサック腫瘍に特異性の高い腫瘍マーカーとして診断に用いられているが、慢性肝炎、肝硬変等の良性肝疾患でも高値となるため、血清ＡＦＰ値のみを指標とした場合、良性疾患と肝細胞癌の鑑別は困難である。
【０００４】
そこで、ＡＦＰ分子上の糖鎖の癌性変化をレクチンとの親和性を利用して検出し、肝細胞癌由来ＡＦＰを分別測定する手法が開発された。
レンズマメレクチン(Lens  culimaris  agglutinin-A:ＬＣＡ)を用いた親和性電気泳動において分離されるバンドを、陽極側よりＬ１(ＬＣＡ非結合性)、Ｌ２(ＬＣＡ弱結合性)およびＬ３(ＬＣＡ結合性)分画とするとき、肝良性疾患患者ＡＦＰの大部分がＬ１分画に出現するのに対して、肝細胞癌患者ではＬ３分画の占める比率が増加する。これを利用して、肝細胞癌と良性肝疾患の鑑別等に用いる方法が臨床診断法として利用されている。
また、この方法は最近の生化学研究においてもＡＦＰの分離解析法として使用されている（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００３−５２７６００号公報
【特許文献２】特開２００９−２６５０７８号公報
【特許文献３】特願２０１０−０８８７６９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Taketa  K  et  al.  Antibody-affinity  blotting,  a  sensitive  technique  for  the  detection  of  α-fetoprotein  separated  by  lectin  affinity  electrophoresis  in  agarose  gels.  Electrophoresis  1985,  6,  492-497.
【非特許文献２】Nakagawa  T  et  al.  Glycomic  analysis  of  alpha-fetoprotein  L3  in  hepatoma  cell  lines  and  hepatocellular  carcinoma patients.  J.  Proteome  Res.  2008,  7,  2222-2233.
【非特許文献３】Matsuno  YK  et  al.  Supported  molecular  matrix  electrophoresis:  a  new  tool  for  characterization  of  glycoproteins.  Anal.  Chem.  2009,  81,  3816-3823.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の方法は、いずれも分離した成分を抗体などにより高感度に検出する場合、泳動後、分離されたタンパク質を、ポリフッ化ビニリデン（以下、「ＰＶＤＦ」という。）膜やニトロセルロース膜などの疎水性ポリマー膜に転写固定化する工程を経る。そのため、従来法は、簡便さの点において課題があり、臨床診断法としての普及の障害となっている。また、泳動分離されたタンパク質を疎水性ポリマー膜に転写する場合には、転写効率に起因する定量性の低下などが問題となる場合がある。
また、従来法では泳動層であるゲルまたはセルロースアセテート膜の孔内にレクチンを含ませて電気泳動を行うため、レクチンはこれらの支持体には固定化されていない。従って、種類の異なる複数のレクチンを一枚のゲルや膜に固定し配置することが難しく、そのため、臨床診断法としての普及において重要な要素である、スループットの向上やコストの削減などが難しい。
【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、生体成分との相互作用を利用して電気泳動法により特定成分を分離分析する際に、泳動後の転写工程を必要とせずに、簡便に実施でき、しかも、転写による定量性の低下などの問題を生じることのない、電気泳動用支持体、および該支持体を用いた分離分析法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、既に、疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマー層を有することを特徴とする電気泳動用支持体を用いるタンパク質の電気泳動分離法（分子マトリックス電気泳動法：supported  molecular  matrix  electrophoresis  以下、「ＳＭＭＥ」という。）を提案している。この方法は、泳動後に別の疎水性ポリマー膜へ転写することなく、色素や抗体などで染色し検出することができる泳動技術である（特許文献２、特許文献３、非特許文献３参照）。
しかし、これらの文献では、生体成分との相互作用を利用して、特定の成分を分離する技術に関しては開示していない。
【００１０】
そこで、本発明者らは、試料中の特定の成分を分離分析するために、上記のＳＭＭＥを適用することを検討した結果、疎水性ポリマー膜に、生体成分と親和性を持つ物質を固定化することにより、上記目的を達成できることを見いだした。
すなわち、上記ＳＭＭＥでは、ベースとなる支持体に疎水性ポリマー膜を使用するため、疎水結合により簡単に物質を膜に固定化することができる。従って、生体成分に親和性を有する物質を疎水性ポリマー膜へ固定化した後、該疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマー層を形成したものを電気泳動支持体とすることで、生体成分との相互作用を利用した特定成分の分離が可能となり、また転写工程を要しない簡便な特異的検出が可能となることを見いだした。
【００１１】
本発明はこれらの知見に基づいて完成に至ったものであり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］試料中に含まれる生体成分と親和性を持つ物質を固定化した疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマー層を有することを特徴とする電気泳動用支持体。
［２］前記生体成分、及び生体成分と親和性を持つ物質が、何れもタンパク質であることを特徴とする［１］に記載の電気泳動用支持体。
［３］前記生体成分が糖タンパク質であり、前記生体成分と親和性を持つ物質がレクチンであることを特徴とする［１］に記載の電気泳動用支持体。
［４］前記生体成分がリポタンパク質であり、前記生体成分と親和性を持つ物質がレクチンであることを特徴とする［１］に記載の電気泳動用支持体。
［５］前記生体成分がレクチンであり、前記生体成分と親和性を持つ物質が糖タンパク質であることを特徴とする［１］に記載の電気泳動用支持体。
［６］前記生体成分がレクチンであり、前記生体成分と親和性を持つ物質が糖脂質であることを特徴とする［１］に記載の電気泳動用支持体。
［７］前記生体成分及び前記生体成分と親和性を持つ物質のいずれか一方が抗体であり、他方が抗原であることを特徴とする［１］に記載の電気泳動用支持体。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の電気泳動用支持体を用い、固定化した物質の生体成分との親和性を利用して試料中に含まれる特定の生体成分を分離検出することを特徴とする分離分析方法。
［９］［１］〜［７］のいずれかに記載の電気泳動用支持体を備えることを特徴とする、生体成分の分離分析用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、生体成分との相互作用を利用して特定成分を分離した後に、別の疎水性ポリマー膜へ転写することなく色素や抗体などで検出することができる電気泳動支持体を提供することができる。
また、本発明の電気泳動支持体においては、生体成分と親和性を有する物質は、従来のように泳動層に「含ませる」ものとは異なり、疎水性ポリマー層に「固定」され、その上に泳動層である親水性ポリマー層を有しているため、例えば、特定の泳動レーンや所定の箇所のみにレクチン溶液を塗布し固定化することで、固定するレクチンの量を節約しコストを下げることができるばかりでなく、種類の異なるレクチンを一枚の支持体膜上に複数配置することも可能となる。
したがって、本発明によれば、疾患診断マーカーの迅速・簡便・高感度検出が可能となり、臨床現場で普及させやすい診断キットへの応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ハプトグロビンおよびアシアロハプトグロビンを、それぞれレクチンを固定化していない支持体およびシアル酸認識レクチンを固定化した疎水性ポリマー膜を用いて、電気泳動した結果を示す図。
【図２】ハプトグロビンと抗ハプトグロビン抗体による抗原抗体反応を、疎水性ポリマー膜を用いた電気泳動上で検出した結果を示す図。
【図３】レクチンを固定化した疎水性ポリマー膜を乾燥させた後に使用した結果を示す図。
【図４】リポタンパク質のレクチン親和性電気泳動を本発明により実施した結果を示す図。
【図５】ハプトグロビンを固定化していない疎水性ポリマー膜、および固定化した疎水性ポリマー膜を用いて、レクチンを泳動した結果を示す図。
【図６】糖脂質を固定化していない疎水性ポリマー膜、および固定化した疎水性ポリマー膜を用いて、レクチンを泳動した結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の電気泳動法を用いた分離分析法は、生体成分と親和性を持つ物質を固定化した疎水性ポリマー膜上に親水性ポリマー層を有する電気泳動用支持体を用いることを特徴とする。
本発明に用いる疎水性のポリマー膜とは、タンパク質を疎水性相互作用によって強く結合保持する性質を有するポリマー膜であって、本来、この膜に、精製したタンパク質溶液を添加するか、又はゲル電気泳動によって分離したタンパク質を転写し、膜上で糖タンパク質や抗原タンパクなどの同定をおこなうために、もっぱら、タンパク質固定化用に用いられているものである。
本発明においても、従来、電気泳動法により分離されたタンパク質を転写する膜として用いられているものをそのまま使用できるが、具体的には、ＰＶＤＦ膜、ポリテトラフルオロエチレン膜（ＰＴＦＥ）、ナイロン膜（Nylon）、ニトロセルロース膜を挙げることができるが、タンパク質吸着能および泳動分離の分解能の点からＰＶＤＦ膜が最も好ましい。
【００１５】
本発明においては、前記の疎水性のポリマー膜に、試料中の生体成分と親和性を持つ物質を固定した後、更にその上に親水性ポリマー層を形成した電気泳動用支持体を用いることにより、試料中に含まれる特定の生体成分を、転写工程を必要としない、簡便な方法で、分離分析することが可能となるものである。
【００１６】
本発明において使用される試料中の生体成分と親和性を持つ物質は、従来、親和性電気泳動法において通常用いられている物質であり、例えば、タンパク質間の相互作用により試料中の生体成分と結合する性質を有するものであり、具体的には、糖鎖とレクチン間、や、抗原と抗体間、等の相互作用により結合するものである。
より具体的には、分析対象となる生体成分が、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）やα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）などの、疾患の診断に利用される糖タンパク質である場合は、生体成分と親和性を持つ物質は、小麦胚芽レクチンやレンズマメレクチン等のレクチンであり、また、分析対象となる生体成分が抗原であるときは、生体成分と親和性を持つ物質は抗体であり、分析対象となる生体成分が抗体であるときは、生体成分と親和性を持つ物質は抗原である。
【００１７】
また、本発明において、これらの生体成分と親和性を持つ物質を、疎水性ポリマー膜に固定する方法としては、これらの物質を溶解した溶液中に、疎水性のポリマー膜を浸漬する方法、これらの物質を溶解した溶液を、疎水性のポリマー膜上に塗布する方法などが挙げられる。
さらに、これらの物質は、疎水性ポリマーの全面に固定されてもよく、或いは、所定の箇所のみに固定されてもよい。
例えば、レクチンに対する親和性の違いを利用して糖鎖構造が異なる糖タンパク質を分離する場合には、疎水性ポリマーの全面にレクチンを固定し、また、抗原抗体反応を利用した分離検出においては、泳動原点から離れた所定の箇所に、抗原又は抗体を固定する。
【００１８】
生体成分と親和性を持つ物質が固定された疎水性のポリマー膜上に、親水性のポリマー層を形成する方法としては、具体的には、該疎水性のポリマー膜を、親水性ポリマー溶液中に浸漬する方法、疎水性のポリマー膜上に親水性ポリマーを塗布する方法、親水性ポリマーフィルムを積層する等の方法が挙げられる。ポリマー層を形成した後、そのまま泳動用緩衝液に膜を浸漬して電気泳動に用いることもできるし、またポリマー層を形成した後、一旦、乾燥させたものを泳動用緩衝液に浸漬して電気泳動に用いることもできる。
【００１９】
本発明において、親水性の層を形成するポリマーとしては、ポリマーの構成ユニットに酸素や窒素のようなヘテロ原子を少なくとも一つ含むポリマーであって水接触角が６０°以下の水との親和性を有するポリマーである。例としてポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドなどが挙げられるが、特に、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールが、分離能の点から好ましく、最も好ましいのは、ポリビニルアルコールである。
また、本発明において用いられる親水性ポリマーの分子量としては、１，０００〜４，０００，０００が好ましい。
【００２０】
本発明に用いる装置としては、従来のセルロースアセテート膜電気泳動装置をそのまま用いることができ、具体的には、EPC105AA型セルロースアセテート膜電気泳動装置（アドバンテック社製）などが使用できる。
本発明の前記電気泳動用支持体を用いた電気泳動は、「蛋白質・酵素の基礎実験法」（南江堂）、「新生化学実験講座３・糖質II」（東京化学同人）等に記載された手法に従っておこなう。
すなわち、電気泳動用緩衝液としては、ベロナール緩衝液、トリス緩衝液、ピリジン−ギ酸緩衝液等を使用する。タンパク質および糖タンパク質の分離にはベロナール緩衝液やトリス緩衝液を中性付近のｐＨで使用するのが好ましい。ムチン様糖タンパク質およびプロテオグリカン型糖タンパク質に対してより明確な分離を行うにはピリジン−ギ酸緩衝液（ｐＨ３．０〜ｐＨ５．０）が好ましい。また、検体の塗布量は、一般的には、１スポットあたり、あるいは幅１ｃｍあたり、０．８〜２．４μＬとされており、通電条件としては、幅１ｃｍあたり０．５〜１．５ｍＡ程度の電流を流すことが好ましい。また、電気泳動中の支持体の温度は、一般的に１０〜２０℃の範囲において、一定とする。
【００２１】
前述のとおり、本発明の前記電気泳動用支持体は、さらに別の膜に転写することなく、そのまま、抗体染色により特定のタンパク質を検出することができるものである。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
〈実施例１〉
本実施例では、ハプトグロビン（ヒト血漿由来）とシアル酸結合レクチンを例に用いて、ＳＭＭＥ膜上でのレクチン親和性電気泳動を検討した。
（アシアロハプトグロビンの調製）
ハプトグロビン（２５μｇ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、１２．５μｌ）に溶解し、シアリダーゼ（１ｍＵ/１μｌ）を加え、３７℃で一晩反応させた。反応後、試料溶液の一部を電気泳動に供した。ハプトグロビンおよびアシアロハプトグロビンは１００ｎｇを膜にアプライした。
【００２３】
（支持体の作成）
市販のＰＶＤＦ膜（Immobilon-P,ミリポア社製）を適した大きさに切り取り、メタノールに数分間浸した。ついで、該ＰＶＤＦ膜をメタノールから取りだし、０．０６Ｍバルビタールナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）に３０分間浸した。その後、膜を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度でシアル酸結合レクチンを含む前記緩衝液に３０分間浸し、ついで０．２５％のポリビニルアルコールを含む前記緩衝液に３０分間浸した。試料をスポットする直前に、前記緩衝液から膜を取りだし、膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、使用した。
【００２４】
（電気泳動）
泳動槽には、セルロースアセテート膜電気泳動装置（ＥＰＣ１０５ＡＡ型、アドバンテック社製）を使用した。通電条件は、膜の幅１ｃｍあたり１．０ｍＡとし、泳動時間は３０分間とした。泳動緩衝液には０．０６Ｍバルビタールナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）を使用した。
【００２５】
（染色方法）
ハプトグロビン抗体による免疫染色は、泳動後の膜をアセトン中で１５分間振とうし、ハプトグロビンを膜へ固定化した後、従来公知の方法に従い実施した。すなわち、固定化後の膜を５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝性食塩水（ＰＢＳ）中で１時間振とうしてブロッキングした。膜をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ tween）で５分間洗浄し、この洗浄操作を合計３回繰り返した。
振とう洗浄後、ウサギ抗ヒトハプトグロビン抗体(IgG、１ｍｇ／ｍｌ)をＰＢＳ−Ｔで２０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。その後、膜をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  tween）で５分間洗浄し、この洗浄操作を合計３回繰り返した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体をＰＢＳ−Ｔで２０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。その後、膜をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  tween）で５分間洗浄し、この洗浄操作を合計3回繰り返した後、ＰＢＳで洗浄しコニカイムノステインキット（イムノステインHRP-1000、コニカミノルタ社製）により検出した。
【００２６】
（泳動結果）
シアル酸結合レクチンによるハプトグロビンのレクチン親和性電気泳動の結果を図１に示す。レクチンを固定化しない場合、ハプトグロビンは図の位置に泳動される（左図、左レーン）。α２−６結合したシアル酸を認識するニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）を固定化した場合、ハプトグロビンはレクチンとの相互作用によりスメアーなスポットとして泳動された（左図、中央レーン）。α２−３結合したシアル酸を認識するイヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）を固定化した場合、ハプトグロビン中にマイナー成分として含まれるα２−３シアル酸を多く含む分子群がレクチンとの相互作用により分離された（左図、右レーン、矢印）。これらの結果は、ハプトグロビンに含まれるシアル酸の８０％がα２−６結合であるという既報と一致した。
一方、シアリダーゼ処理によりシアル酸を除去したアシアロハプトグロビンを用いた場合では（右図）、いずれのレクチンを固定化した場合においても、相互作用による泳動パターンの変化はほとんど観察されず、単一のスポットとして観察された。
以上の結果から、本発明により、疎水性ポリマー膜上でレクチンとの相互作用を利用した特定の糖タンパク質の電気泳動分離が可能であり、かつ転写を必要としない簡便な検出が可能であることが分かった。
【００２７】
〈実施例２〉
本実施例では、ハプトグロビンと抗ハプトグロビン抗体の結合を例として用い、ＳＭＭＥ膜上での抗原抗体反応を利用した分離検出の可能性を検討した。
（支持体の作成）
市販のＰＶＤＦ膜（Immobilon-P,ミリポア社製）を適した大きさに切り取り、メタノールに数分間浸した。ついで、該ＰＶＤＦ膜をメタノールから取りだし、０．０６Ｍバルビタールナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）に３０分間浸した。その後、原点から０．５ｃｍの位置に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１μｇ）、ハプトグロビン（１μｇ）、及びヒト血漿タンパク（約３μｇ）をそれぞれスポットし固定化した。膜を乾燥した後、再度メタノールに数分間浸し、０．２５％のポリビニルアルコールを含む前記緩衝液に３０分間浸した。試料をスポットする直前に、前記緩衝液から膜を取りだし、膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、使用した。サンプルはウサギ抗ヒトハプトグロビン抗体（１００ｎｇ）をアプライし泳動した。
【００２８】
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により行った。
（染色方法）
スポットの検出は従来公知の方法に従い実施した。すなわち、泳動後の膜をアセトン中で振とうすることなく、ＰＢＳ−Ｔで５分間洗浄し、この洗浄操作を合計３回繰り返した。振とう洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体をＰＢＳ−Ｔで１０００倍希釈した溶液に浸し、１時間振とうした。その後、膜をＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  tween）で５分間洗浄し、この洗浄操作を合計３回繰り返した後、ＰＢＳで洗浄しコニカイムノステインキット（イムノステインHRP-1000、コニカミノルタ社製）により検出した。
【００２９】
（泳動結果）
ＢＳＡ、ハプトグロビン、ヒト血漿タンパクをそれぞれ固定化した支持体を用いるＳＭＭＥ法により、抗ハプトグロビン抗体を泳動し、２次抗体により染色した結果を図２に示す。
図のように、タンパク質を固定化しない場合（左端レーン）とＢＳＡを固定化した場合（左から２番目のレーン）では、抗原抗体反応は起きないため、固定化した位置にスポットは観察されない。一方、ハプトグロビン（右から２番目のレーン）とハプトグロビンを含むヒト血漿タンパク質（右端レーン）を固定化した場合では、結合した抗ハプトグロビン抗体がスポットとして検出された。
以上の結果から、本発明により、疎水性ポリマー膜上で抗原抗体反応を利用したタンパク質の電気泳動分離が可能であり、かつ転写を必要としない簡便な検出が可能であることが分かった。
【００３０】
〈実施例３〉
本実施例では、レクチンを疎水性ポリマー膜に固定化し、次いで親水性ポリマー層を形成させた後、一度乾燥させた支持体膜が、本発明において使用可能であることを確認した。
（試料）
サンプルにはハプトグロビン（１００ｎｇ）を使用し、固定化するレクチンにはＳＳＡを使用した。
（支持体の作成）
実施例１と同様の手順により作成した支持体を一度乾燥させた後、２０％メタノールで再湿潤させ、０．０６Ｍバルビタールナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）に３０分間浸した。試料をスポットする直前に、前記緩衝液から膜を取りだし、膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、使用した。
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により実施した。
（染色方法）
実施例１と同様の手順により実施した。
【００３１】
（泳動結果）
ＳＳＡをＰＶＤＦ膜に固定化した後、ポリビニルアルコールでコーティングした支持体でハプトグロビンを泳動した結果を図３に示す。左のレーンは支持体膜を作成してすぐに使用した場合、右のレーンは作成後に一度乾燥させ、使用直前に再湿潤させたものを使用した場合の結果をそれぞれ示している。
図３に示すように、本発明の支持体は、一度乾燥させた後においても使用でき、その性能は作成後すぐに使用した場合とほぼ同様であることが分かった。従って、乾燥した状態で膜支持体を提供することが可能となり、安定で扱いやすいキットとしての提供が期待できる。
【００３２】
〈実施例４〉
本実施例では、レクチンとリポタンパク質を例に用いて、ＳＭＭＥ膜上でのレクチン親和性電気泳動を検討した。
（試料）
リポタンパク質にはＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬを使用し、１〜２μｇ相当をアプライした。固定化するレクチンにはＳＳＡを用いた。
（支持体の作成）
実施例１と同様の手順により作成した。
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により実施した。
（染色方法）
染色にはＦａｔ  Ｒｅｄ  ７Ｂを使用し、６０％メタノールにより脱色した。
【００３３】
（泳動結果）
ＳＳＡを固定化した支持体によるリポタンパク質のレクチン親和性電気泳動の結果を図４に示す。左の図はレクチンを固定化しない場合、右の図はＳＳＡを固定化した場合の結果をそれぞれ示している。ＨＤＬ（左レーン）にはシアル酸がほとんど存在しないため、ＳＳＡとの相互作用が観察されず、ＳＳＡを固定化していない場合とほぼ同様の位置に泳動される。一方、ＬＤＬ（中央レーン）とＶＬＤＬ（右レーン）は分子内にシアル酸を多く含むため、ＳＳＡとの相互作用によりスメアーなスポットとして観察される。
以上の結果から、本発明は、リポタンパク質にも応用可能であり、リポタンパク質中の糖鎖を指標とする疾患の診断などに有効となることが期待できる。
【００３４】
〈実施例５〉
本実施例では、固定化する物質を糖タンパク質、泳動する生体成分をレクチンとして、ＳＭＭＥ膜上での親和性電気泳動を検討した。
（試料）
固定化する糖タンパク質にはハプトグロビンを用い、泳動するレクチンにはＦＩＴＣにより蛍光標識したニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）とイヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）を用いた。
（支持体の作成）
実施例１と同様の手順により作成し、ハプトグロビンは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で固定化した。
（電気泳動）
実施例１と同様の手順により実施した。
（検出）
蛍光スキャナーにより検出した。
【００３５】
（泳動結果）
ハプトグロビンを固定化した支持体によりレクチンを泳動した結果を図５に示す。左の図はハプトグロビンを固定化しない場合、右の図は固定化した場合の結果をそれぞれ示している。ハプトグロビンを固定化しない場合は、相互作用しないため各レクチンは図の位置に泳動される。一方、ハプトグロビンを固定化した場合、α２−６結合したシアル酸を認識するニホンニワトコレクチン（ＳＳＡ）は、α２−６結合したシアル酸がほとんどであるハプトグロビン中の糖鎖との相互作用により泳動が図のように遅れた（右図、左レーン）。α２−３結合したシアル酸を認識するイヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）を泳動した場合は、顕著な泳動の遅れは観察されない（右図、右レーン）。
以上の結果から、本発明は、糖タンパク質を固定化し、それらに親和性を持つタンパク質を検出する場合においても応用可能であることが分かった。
【００３６】
〈実施例６〉
本実施例では、固定化する物質を糖脂質、泳動する生体成分をレクチンとして、ＳＭＭＥ膜上での親和性電気泳動を検討した。
（試料）
固定化する糖脂質にはアシアロガングリオシドＧＭ１とモノシアロガングリオシドＧＭ２を用い、泳動するレクチンにはＦＩＴＣにより蛍光標識したイヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）とピーナッツレクチン（ＰＮＡ）を用いた。
（支持体の作成）
各糖脂質のクロロホルム/メタノール（１：１）溶液を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、３００μｌをＰＶＤＦ膜に染み込ませた後、一度ＰＶＤＦ膜を乾燥させることで糖脂質を固定化した。該膜を少量の５０％メタノールに浸し、その後すぐに０．２５％のポリビニルアルコールを含む０．０６Ｍバルビタールナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）に３０分間浸し、親水化した。試料をスポットする直前に、前記緩衝液から膜を取りだし、膜に付着した過剰の溶液をろ紙でかるく拭き取った後、使用した。
（電気泳動）
実施例１と同様の泳動槽を使用した。通電条件は、膜の幅１ｃｍあたり０．５ｍＡとし、泳動時間は１時間とした。
（検出）
蛍光スキャナーにより検出した。
【００３７】
（泳動結果）
糖脂質を固定化した支持体を用いてレクチンを泳動した結果を図６に示す。左の図は糖脂質を固定化しない場合、中央の図はアシアロガングリオシドＧＭ１を固定化した場合、右の図はモノシアロガングリオシドＧＭ２を固定化した場合の結果をそれぞれ示している。糖脂質を固定化しない場合では、相互作用は生じないため、各レクチンは図の位置に泳動される。一方、アシアロガングリオシドＧＭ１を固定化した場合では、糖鎖中のＮ-アセチルガラクトサミンにβ１−３結合したガラクトース（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）構造を認識するＰＮＡは相互作用により泳動が遅れる（中央図、右レーン）。ＭＡＭはアシアロガングリオシドＧＭ１中の糖鎖には結合しないため、泳動位置は変化しない（中央図、左レーン）。モノシアロガングリオシドＧＭ２を固定化した場合、糖鎖中にＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ構造がないため、ＰＮＡの顕著な泳動の遅れは観察されない（右図、右レーン）。ＭＡＭはモノシアロガングリオシドＧＭ２中のシアル酸には結合しないことが報告されている。従って、図のようにＭＡＭの泳動位置は変化しない（右図、左レーン）。
以上の結果から、本発明は、糖脂質を支持体に固定化し、それらに親和性を持つタンパク質を検出する場合においても応用可能であることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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