(57)【要約】【課題】本発明は、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法（診断する方法）及びその為のキットを提供すること、発症メカニズムに基づいた、皮膚バリアの機能異常を改善する方法、その為の薬剤を提供することを目的とする。【解決手段】被検体における皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定する工程を含む、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定する工程を含む、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法。
【請求項２】
該被検体より血清を採取して血清中のＩｇＥ濃度を測定する工程を含み、且つ該被検体の皮膚バリアの機能異常にＩｇＥが介在するか否かを識別診断する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;及び
Protease, serine 27
からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
さらに、被検体におけるＪａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進の有無を測定する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進が、Ｊａｋ１活性の亢進、Ｓｔａｔ３活性の亢進、及び／又はＳｏｃｓ３活性の低下である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
被検体が皮膚炎症を発症しているか、発症し得るものである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
血清中のＩｇＥ濃度を測定する工程により、ＩｇＥが介在していないと識別診断された被検体に対し、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
当該被検体の皮膚組織試料を用いることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16からなる群より選択される少なくとも1種を特異的に検出し得る物質を含む、皮膚バリアの機能異常の診断用キット。
【請求項１１】
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;及び
Protease, serine 27
からなる群より選択される少なくとも１種を特異的に検出し得る物質を含む、請求項１０記載のキット。
【請求項１２】
皮膚組織試料を採取する一定の粘着力を有した材料をさらに含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質を含む、皮膚炎症性疾患の予防及び／又は治療用薬剤であって、該薬剤が皮膚に適用されることを特徴とする薬剤。
【請求項１４】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質が、Ｊａｋ１阻害剤、Ｓｏｃｓ３、及び／又はＳｔａｔ３阻害剤である、請求項１３記載の薬剤。
【請求項１５】
（ａ）被検体における皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定する工程、（ｂ）血清ＩｇＥ濃度を測定する工程、及び（ｃ）前記工程（ａ）で皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの構成バランスの変動が認められ、且つ前記工程（ｂ）で血清ＩｇＥ濃度の上昇が認められなかった被検体に対して、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質の有効量を投与する工程を含む、皮膚バリアの機能異常を改善する方法。
【請求項１６】
プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;及び
Protease, serine 27
からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
被検体が、皮膚炎症を発症しているか、発症し得るものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
皮膚炎症が、ＩｇＥ非介在型である、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）において当該被検体の皮膚組織試料を用いることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質が、Ｊａｋ１阻害剤、Ｓｏｃｓ３、及び／又はＳｔａｔ３阻害剤である、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法に関する。より具体的には皮膚バリアの機能異常の有無を評価することにより、より初期の段階で皮膚炎症を発症しているか、あるいは発症する可能性があるかを診断することが可能な診断方法、その為のキット等に関する。さらに本発明は、皮膚バリアの機能異常を改善する為の方法及びその為の薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎は先進国の小児の１５％から３０％に認められる掻痒性の皮膚疾患群であり、アレルギー体質に起因すると考えられているものとそれに関係しない外部要因に起因すると思われているものとにわかれるが、その発症のメカニズムについては解明されていないところが多い。前者では免疫学的にＴｈ２が亢進しやすい遺伝素因を持つものが多いとされていて、実際にアトピー性皮膚炎患者の７０％はアレルギーマーチと呼ばれる多彩なアレルギー疾患を呈したり、高い血清ＩｇＥの数値を示したりするものが多くみられる。一方、アトピー性皮膚炎患者の３０％ではＴｈ２亢進や血清ＩｇＥの亢進は認められず、免疫学的な遺伝素因が根本的な原因ではないと考えられている。先進国で発症することから衛生環境や大気汚染が環境要因として関連すること、さらに、家族性の影響も認められることから遺伝要因の重要性も示唆されている。これらが単独で、もしくは複合して影響することでこの疾患は発症すると考えられている。
一方でアトピー性皮膚炎の予防・治療剤としては、免疫抑制剤としてのステロイド剤、ＦＫ５０６（タクロリムス）、それらと保湿製剤の組み合わせ等、臨床症状を見ながらの対症療法として種々の治療法が報告されているが、発症のメカニズムが解明された上での対応ではないために、個人に適応した適切な治療方法であるかどうかはわからないままであり、さらに長期連用での副作用の問題、マスコミにあおられたステロイド治療に対する恐怖感の蔓延等、安全性や効果、心理的満足度の上で効果的な治療方法が存在しないのが現状である。
また、現時点では疾患発症メカニズムがわからないために、アトピー性皮膚炎の診断と治療は、疾患がある程度進んで初めて可能なものであり、その時点では合併する感染症やアレルギー性疾患の複合が病状の解析を複雑にし、このことが治療方法の開発を困難にしているし、発症を予防する理論的な治療法の開発も進んでいない。
つまり発症メカニズムに基づいた疾患発症予測方法（診断方法）及びそのメカニズムに基づいた作用機序を有するアトピー性皮膚炎の予防・治療剤の提供が求められていた。
【０００３】
アトピー性皮膚炎の研究用として複数のアトピー性皮膚炎のモデルマウスが報告されている。アトピー性皮膚炎モデルマウスとして報告されたものには自然発症のものが５系統〔ＮＣ/Ｎｇａ、ＮＯＡ、ＤＳ−Ｎｈ、ＭＡＤ（以上、非特許文献１参照）、ｎａｄ /ｎａｄ（特許文献１参照）〕、遺伝子操作されたもの７系統〔ＩＬ−４ Ｔｇ、ＣＡＳＰ１ Ｔｇ、ＩＬ−１８ Ｔｇ、ＩＬ−３１ Ｔｇ、Ｒｅ１Ｂ−ＫＯ（以上、非特許文献１参照）、ＣａｔＥ−ＫＯ（特許文献２、非特許文献１参照）、ＭＡＩＬ−ＫＯ（特許文献３、非特許文献２参照）〕、抗原塗布等による皮膚炎誘発モデルが４種類、さらにヒト化マウスにアトピー性皮膚炎患者の血液成分を移植して作成された例等が報告されている。さらに特許文献４にはエピレグリン遺伝子欠損動物が、特許文献５にはＧＡＴＡ−３遺伝子導入アトピー性皮膚炎モデル動物が開示されている。これらはそれぞれ一長一短があり、アトピー性皮膚炎モデルマウスとして使用する上でいくつかの制限を受けるものであった。
一方、本発明者らは、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）誘導ミュータントマウス（以下、単にＥＮＵミュータントマウスとも称する）をスクリーニングすることにより、アトピー性皮膚炎マウスを得て、その表現型を報告している（特許文献６）。
【０００４】
皮膚組織におけるＪａｋ１分子の変異あるいは活性化とアトピー性皮膚炎を含むアレルギー性疾患との関連性を示唆する文献は２００９年２月２８日までのＰｕｂＭｅｄ上での検索では、これまで報告されていない。Ｊａｋ阻害剤のアトピー性皮膚炎治療への応用の可能性が報告されているが（特許文献７）、Ｊａｋ分子の免疫応答への関与に基づいて考察されたものであり、免疫応答が関与しないアトピー性皮膚炎とＪａｋ１分子との関連性を証明したものではない。
Ｊａｋ１分子を含む信号伝達系が表皮の恒常性維持、あるいは病的状態の形成に関係するという報告がある。非特許文献３には、ＩＬ−６とその受容体ＩＬ−６Ｒαとｇｐ１３０による信号伝達が皮膚バリア形成に重要であることが記載されている。非特許文献４には、ＯｎｃｏｓｔａｔｉｎＭとその受容体であるＯＳＭＲとｇｐ１３０による信号伝達がケラチノサイトの移動や分化に重要であり、創傷治癒や炎症にかかわるということが記載されている。非特許文献５には、Ｊａｋ１分子下流の信号伝達因子であるＳｔａｔ３の活性化が皮膚の癌化に関与していることが記載されている。非特許文献６には、Ｊａｋ１分子の信号伝達阻害因子であるＳｏｃｓ３の皮膚での活性化や機能阻害が皮膚の創傷治癒あるいは癌化に関わることが記載されている。しかしながらいずれの文献もＪａｋ１分子とアトピー性皮膚炎発症との関連性を証明したものではない。
【０００５】
Ｊａｋ１分子と同じファミリーに属するＴｙｋ２あるいはこれらの下流で機能するＳｔａｔ３分子に関しては先天性ヒト疾患である「先天性高ＩｇＥ血症」患者で遺伝子変異があることが報告されている（非特許文献７、８）。これらの患者ではアトピー性皮膚炎様の症状を有する点において類似点があるが、これらの患者におけるＴｙｋ２あるいはＳｔａｔ３変異は免疫細胞の機能あるいは分化阻害により原発性免疫不全状態を引き起こすものであり、アトピー性皮膚炎発症のメカニズムを解明するものではない。
【０００６】
皮膚のバリア機能の破綻が原因でアトピー性皮膚炎を発症することはＦｉｌａｇｇｒｉｎ分子の変異で先天性魚麟癬あるいはアトピー性皮膚炎が発症すること（非特許文献９）、さらに皮膚の角質のターンオーバーのために必要なＳＣＣＥと呼ばれるプロテアーゼであるＫＬＫ７の活性化変異が皮膚バリアの破壊によりアトピー性皮膚炎を発症すること（非特許文献１０）、逆にそのＫＬＫ７の活性化を抑制する阻害因子であるＳＰＩＮＫ５と言う分子の欠損変異でＮｅｔｈｅｒｔｏｎ症候群という先天性疾患が発症し、その病態の一部がやはりアトピー性皮膚炎であることが明らかとなっている（非特許文献１１）。さらに、皮膚バリア機能改善剤（特許文献８）及び保湿用組成物（特許文献９）が報告されている。
【０００７】
Chitinase 3 like 1発現亢進と炎症性疾患発症の関連性に関しては喘息患者の気道上皮での発現亢進及び血清中での濃度上昇が報告されており（非特許文献１２）、一部の集団では喘息患者で同遺伝子の特定のＳＮＰの比率が高いことも報告されている（非特許文献１３）。これらの報告に先立って、chitinaseの発現が喘息等のアレルギー疾患に関連して治療のターゲットとなりうることに関して報告されている（特許文献１０）。また、潰瘍性大腸炎患者の腸管上皮での発現が亢進していること（非特許文献１４）、腸管上皮に強制発現させた場合病原性細菌の侵入を容易にすること（非特許文献１５）等からすでに喘息や潰瘍性大腸炎等のアレルギー性疾患や炎症性疾患の病態とChitinase 3 like 1との関連性が指摘されている（特許文献１１）。
【０００８】
アトピー性皮膚炎発生に関しては文献的な考察から2008年のNew England Journal of Medicine誌においてBieberにより疾患発症と進行の概念が提示されている（非特許文献１６）。
要約すると、アトピー性皮膚炎は、初期には皮膚の構成要素の問題でバリア障害がおこり、ここにアレルゲンやアジュバントによる刺激が加わり、やがてＩｇＥに影響を受けるＴｈ２タイプのアレルギー性炎症となり、掻破行動と感染等による炎症増悪を繰り返すことで慢性炎症に変化していくというタイムコースを有することが記載されている。
しかしながら、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎症性疾患が無症状状態から発症、進行する際に生じる皮膚での構成要素の変化の詳細は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１０５１１３号公報
【特許文献２】特開２００４−０４１１２３号公報
【特許文献３】特開２００４−３２１１１２号公報
【特許文献４】特開２００４−２９００３８号公報
【特許文献５】特開２００４−１６６６９６号公報
【特許文献６】特開２００７−０７５０３３号公報
【特許文献７】特表２００９−５０８９６８号公報
【特許文献８】特開２００８−００１５９９号公報
【特許文献９】特開２００８−００１６６６号公報
【特許文献１０】特表２００６−５０８０１４号公報
【特許文献１１】特表２００８−５４６７５２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gutermuth J. et al., Mouse models of atopic eczema critically evaluated. Int Arch Allergy Immunol. 2004, 135, 262-276
【非特許文献２】Shiina T. et al., Targeted disruption of MAIL, a nuclear IkappaB protein, leads to severe atopic dermatitis-like disease. J Biol Chem. 2004, 279, 55493-55498
【非特許文献３】Wang X. P. et al., The interleukin-6 cytokine system regulates epidermal permeability barrier homeostasis. J Invest Dermatol. 2004, 123(1), 124-31
【非特許文献４】Boniface K., et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. J Immunol. 2007, 178(7), 4615-22
【非特許文献５】Kim D. J. et al., Constitutive activation and targeted disruption of signal transducer and activator of transcription 3 (Stat3) in mouse epidermis reveal its critical role in UVB-induced skin carcinogenesis. Oncogene 2009, 28(7), 950-60
【非特許文献６】Zhu B. M., et al. Socs3 negatively regulates the gp130-Stat3 pathway in mouse skin wound healing. J Invest Dermatol. 2008, 128(7), 1821-9
【非特許文献７】Minegishi Y. et al., Human tyrosine kinase 2 deficiency reveals its requisite roles in multiple cytokine signals involved in innate and acquired immunity. Immunity 2006, 25, 745-55
【非特許文献８】Minegishi Y. et al., Dominant-negative mutations in the DNA-binding domain of Stat3 cause hyper-IgE syndrome. Nature 2007, 448, 1058-62
【非特許文献９】Palmer CN. et al., Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nat Genet. 2006, 38, 441-446
【非特許文献１０】Vasilopoulos Y. et al., Genetic association between an AACC insertion in the 3'UTR of the stratum corneum chymotryptic enzyme gene and atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 2004, Jul;123(1), 62-6
【非特許文献１１】Stoll C. et al., Severe hypernatremic dehydration in an infant with Netherton syndrome. Genet Couns. 2001, 12, 237-43
【非特許文献１２】Chupp GL. et al., A chitinase-like protein in the lung and circulation of patients with severe asthma. N Engl J Med. 2007 Nov 15;357(20):2016-27
【非特許文献１３】Ober C. et al., Effect of variation in CHI3L1 on serum YKL-40 level, risk of asthma, and lung function. N Engl J Med. 2008 Apr 17;358(16):1682-91. Epub 2008 Apr 9
【非特許文献１４】Vind I. et al., Serum YKL-40, a potential new marker of disease activity in patients with inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 2003 Jun;38(6):599-605
【非特許文献１５】Mizoguchi E., Chitinase 3-like-1 exacerbates intestinal inflammation by enhancing bacterial adhesion and invasion in colonic epithelial cells. Gastroenterology. 2006 Feb;130(2):398-411
【非特許文献１６】Bieber T., Atopic dermatitis. N. Engl. J. Med. 2008, 358, 1483-94
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法（診断する方法）及びその為のキットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、発症メカニズムに基づいた、皮膚バリアの機能異常を改善する方法、その為の薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、皮膚炎症性疾患（例、アトピー性皮膚炎）の発症原因を分子レベルで解明し、以下のことを明らかにした。
１．皮膚炎症性疾患の症状が免疫学的な異常により誘発されていない場合、すなわち皮膚バリアの破壊（皮膚バリアの機能異常）などの皮膚の問題によって皮膚炎症性疾患の症状が表れている場合、その症状は皮膚組織での特定のプロテアーゼやそのインヒビターの発現変動が原因である。
２．特定のプロテアーゼやそのインヒビターの発現変動として、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の（異常な）機能亢進が確認される。
従って、かかる知見をもとに、
i)皮膚組織での特定のプロテアーゼやそのインヒビターの発現変動を測定することで、皮膚バリアの機能異常の有無を評価することが可能であること、
ii)アトピー性皮膚炎等の皮膚炎症性疾患のタイムコース上において、その発症原因に応じて被験者（被検体）がどの段階であるかを診断することが可能であること、すなわち被験者に血清ＩｇＥ濃度の上昇が認められない状態の場合、皮膚バリアの機能異常の有無から皮膚炎症疾患の初期段階か否かを診断すること、または当該被験者が皮膚炎症疾患を罹患するか否かを予測することが可能であること、
を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、以下の発明等を提供する。
［１］被検体における皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定する工程を含む、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法。
［２］該被検体より血清を採取して血清中のＩｇＥ濃度を測定する工程を含み、且つ該被検体の皮膚バリアの機能異常にＩｇＥが介在するか否かを識別診断する工程を含む、上記［１］記載の方法。
［３］プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16からなる群より選択される少なくとも1種である、上記［２］記載の方法。
［４］プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;及び
Protease, serine 27
からなる群より選択される少なくとも１種である、上記［２］記載の方法。
［５］さらに、被検体におけるＪａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進の有無を測定する工程を含む、上記［２］記載の方法。
［６］Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進が、Ｊａｋ１活性の亢進、Ｓｔａｔ３活性の亢進、及び／又はＳｏｃｓ３活性の低下である、上記［５］記載の方法。
［７］被検体が皮膚炎症を発症しているか、発症し得るものである、上記［２］に記載の方法。
［８］血清中のＩｇＥ濃度を測定する工程により、ＩｇＥが介在していないと識別診断された被検体に対し、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する、上記［７］記載の方法。
［９］当該被検体の皮膚組織試料を用いることを特徴とする、上記［８］記載の方法。
［１０］Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16からなる群より選択される少なくとも1種を特異的に検出し得る物質を含む、皮膚バリアの機能異常の診断用キット。
【００１４】
［１１］Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;及び
Protease, serine 27
からなる群より選択される少なくとも１種を特異的に検出し得る物質を含む、上記［１０］記載のキット。
［１２］皮膚組織試料を採取する一定の粘着力を有した材料をさらに含む、上記［１１］記載のキット。
［１３］Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質を含む、皮膚炎症性疾患の予防及び／又は治療用薬剤であって、該薬剤が皮膚に適用されることを特徴とする薬剤。
［１４］Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質が、Ｊａｋ１阻害剤、Ｓｏｃｓ３、及び／又はＳｔａｔ３阻害剤である、上記［１３］記載の薬剤。
［１５］（ａ）被検体における皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定する工程、（ｂ）血清ＩｇＥ濃度を測定する工程、及び（ｃ）前記工程（ａ）で皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの構成バランスの変動が認められ、且つ前記工程（ｂ）で血清ＩｇＥ濃度の上昇が認められなかった被検体に対して、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質の有効量を投与する工程を含む、皮膚バリアの機能異常を改善する方法。
［１６］プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16からなる群より選択される少なくとも1種である、上記［１５］記載の方法。
［１７］プロテアーゼ及び／又はそのインヒビターが、
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;及び
Protease, serine 27
からなる群より選択される少なくとも１種である、上記［１５］記載の方法。
［１８］被検体が、皮膚炎症を発症しているか、発症し得るものである、上記［１５］記載の方法。
［１９］皮膚炎症が、ＩｇＥ非介在型である、上記［１５］記載の方法。
［２０］工程（ａ）において当該被検体の皮膚組織試料を用いることを特徴とする、上記［１５］記載の方法。
［２１］Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質が、Ｊａｋ１阻害剤、Ｓｏｃｓ３、及び／又はＳｔａｔ３阻害剤である、上記［１５］記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎症性疾患のタイムコース上において、その発症原因に応じて被験者がどの段階であるかを判定することが可能である。すなわち、ＩｇＥに影響を受けるＴｈ２タイプのアレルギー性炎症が起こる前段階から皮膚炎症性疾患を診断すること、又は被験者の皮膚炎症性疾患の発症を予測することが可能になる。発症原因が特定されることにより、投薬計画をはじめとした治療方針の決定が可能となる。さらに、本発明によれば、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎症性疾患を簡便、且つ迅速に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アトピー性皮膚炎マウスにおける原因遺伝子変異を同定した結果を示す図である。ａ：マウス第４番染色体上のＪａｋ１遺伝子の位置を示す。ｂ：変異表現型を有するマウスのゲノムシークエンシングにより、Ｊａｋ１のコード領域における２６３３番目のヌクレオチドの点突然変異（グアニンからアデニンへの変異；Ｇ２６３３Ａ）が認められ、この点突然変異によりＪａｋ１のアミノ酸配列において８７８番目のアルギニンがヒスチジンに変化した（Ｒ８７８Ｈ）。ｃ：上記Ｊａｋ１におけるアミノ酸置換はＪａｋ１蛋白質のチロシンキナーゼドメイン内に存在する。
【図２】Ｊａｋファミリーにおけるチロシンキナーゼドメインの一部を示した図である。囲われた領域はＡＴＰ結合コンセンサスである。
【図３】マウス胚線維芽細胞系（ＭＥＦ細胞）において検出されるＪａｋ１の機能亢進を示した図である。ａ：ミュータントマウス（ホモ接合体；Mutant）及び野生型マウス（WT）から樹立したＭＥＦ細胞におけるＪａｋ１及びＳｔａｔ３のリン酸化を、免疫沈降によって測定した結果を示す。ＩＬ−６刺激前後で測定した。ｂ：Ｇ−ＣＳＦＲ−ｇｐ１３０キメラ受容体を発現している２９３Ｔ細胞にＨＡでタグ標識された変異Ｊａｋ１及び野生型Ｊａｋ１をトランスフェクトし、当該細胞におけるＪａｋ１及びＳｔａｔ３のリン酸化を、免疫沈降によって測定した結果を示す。ｃ：種々のサイトカインで刺激した、ミュータントマウス（ホモ接合体：mutant）及びその同腹仔（ヘテロ接合体:hetero、野生型マウス:WT）の脾臓から得られたＣＤ４陽性リンパ球の増殖能を調べた結果を示す図である。ホモ接合体のリンパ球は、ヘテロ接合体や野生型のリンパ球に比べて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γに応答して、よりよく増殖した。イオノマイシン及びＰＭＡ刺激もまたホモ接合体のリンパ球をよりよく増殖させた。ｄ：いずれの表現型のマウスのリンパ球についても、ＩＬ−１２に応答した増殖亢進が認められないことを示した図である。ミュータントマウス（ホモ接合体）及び同腹仔（ヘテロ接合体、野生型マウス）の脾臓ＣＤ４陽性リンパ球をＩＬ−１２で刺激した。ＩＬ−１２は、Ｊａｋ１ではなくＪａｋ２を介して刺激を伝達する。同腹仔間では増殖に違いは見られなかった。ミュータントマウス由来のリンパ球はＰＭＡ刺激により、よりよく増殖した。ｅ：汎Ｊａｋ特異的阻害剤（Jak inhibitor I；ピリドン６）によるリンパ球増殖亢進の阻害効果を示した図である。ミュータントマウス由来のリンパ球及び他の遺伝子型のリンパ球の増殖亢進が投与量依存的に阻害された。このことは、増殖能がＪａｋを介するシグナル伝達系により誘導されていることを示している。ｆ：Ｊａｋ３特異的阻害剤（Jak 3 inhibitor I；ＷＨＩ−Ｐ１３１）によるリンパ球増殖亢進の阻害効果を示した図である。増殖阻害が認められないことから増殖はＪａｋ３の機能とは独立していることが示された。
【図４】Ｊａｋ１における点突然変異が、Ｊａｋ１及びＳｔａｔファミリー遺伝子ｍＲＮＡの転写レベルに及ぼす影響を調べた図である。Ｊａｋ１及びＳｔａｔファミリー蛋白質の転写レベルでの活性化の可能性を調べる為に、種々の組織（骨髄、脾臓、皮膚、胸腺、リンパ節及びＭＥＦ細胞）におけるｍＲＮＡ発現レベルを調べた。ホモ接合体、ヘテロ接合体及び野生型間で有意な違いは認められなかった。
【図５】Ｊａｋ阻害剤の皮膚炎発症に及ぼす効果を示した図である。Ｊａｋ阻害剤を皮膚に適用することによって皮膚炎発症が抑制される。ａ：リン酸化されたＪａｋ１蛋白質（ｐＹ−Ｊａｋ１）が皮膚炎を生じている皮膚表皮層に強く蓄積していることを示す図である。ｂ：ミュータントマウスの耳皮膚における、Ｊａｋ阻害剤の臨床症状に及ぼす影響を示した図である。未処置のミュータントマウス（−○−；No application）、Ｊａｋ阻害剤を含まず溶媒のみで処置したミュータントマウス（−●―；DMSO/AOO）、Ｊａｋ阻害剤を含む溶媒で処置したミュータントマウス（−■−；Inhibitor/AOO）。ｃ：分化マーカー分子（Ｋｉ６７、Ｋ６、Ｋ１４、Ｋ１０）の表皮層における発現状況を免疫組織学的染色により観察した結果を示す図である。野生型マウス（ＷＴ）及びミュータントマウス（Ｍｕｔａｎｔ）における各分化マーカー分子の発現、並びに生後４週間のミュータントマウスに対してＪａｋ阻害剤で２週間処置しＪａｋ１活性を阻害した場合の各分化マーカー分子の発現を調べた。対照としてはＪａｋ阻害剤を含有しない溶媒のみで処置したものを用いた。
【図６】皮膚炎マウスにおける皮膚バリア透過性の破壊について調べた結果を示す図である。ａ：ミュータントマウスホモ接合体、ヘテロ接合体、及び野生型マウスの耳皮膚の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した結果を示す図である。ｂ：ミュータントマウスの皮膚バリアの破壊を、ビオチン粒子含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて調べた結果を示す図である。ｃ：ミュータントマウスの耳皮膚における、ワセリンコーティングの臨床症状に及ぼす影響を示した図である。未処置のミュータントマウス（−○−；No application）、皮膚にワセリンコーティングを施したミュータントマウス（−●―；Petrolatum）。
【図７】ミュータントマウス皮膚における定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す図である。ＩＬ−４発現がミュータントマウスで増加した。
【図８】Ｊａｋ１ミュータントノックインマウスの構築の手順を示す図である。
【図９】ミュータントマウス及び野生型マウスの皮膚表面におけるＭａｒａｐｓｉｎ及びＣｈｉｔｉｎａｓｅ３−ｌｉｋｅ１の発現を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
（皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法）
本発明は、被検体における皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定する工程を含む、皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法を提供する。該方法は、さらに血清ＩｇＥ濃度を測定する工程を含む。
【００１９】
測定対象となる皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターは、皮膚バリアの機能異常の際にその発現様式が変動するものであれば特に限定されないが、具体的には以下の分子が挙げられる。
【００２０】
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16。
（以下、分子群Ａとも称する）
【００２１】
上記した一連の分子は、皮膚炎症性疾患、特にアトピー性皮膚炎のモデルマウスにおいてアトピー性皮膚炎発症に際して発現レベルが大きく変動したものである。
発現が上昇する（アップレギュレーション）分子としては、
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16が挙げられる。
また、アトピー性皮膚炎のモデルマウス（例、Ｓｐａｄｅマウス）では、その皮膚において、上記プロテアーゼやそのインヒビター分子群の発現は皮膚炎発症前の段階から次第に上昇している。
【００２２】
発現が減弱する（ダウンレギュレーション）分子としては、
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;及び
Betacellulin, epidermal growth factor family member
が挙げられる。
また、T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3分子は、生後４週目の時点では発現が減弱しているが、生後６週目の時点では発現が上昇するというプロファイルを有する。
【００２３】
上記分子群Ａの中でも特に、表皮角質部分のターンオーバーに関与していることが予測されるKallikrein related-peptidase 6、Predicted gene, OTTMUSG00000000971、WAP four-disulfide core domain 12、Extracellular proteinase inhibitor、Chitinase 3-like 1、及びProtease, serine 27から選択される少なくとも１種の分子の発現状況を解析（測定）することによって、より効果的に皮膚バリアの機能異常の有無を評価することができる。
【００２４】
上記一連のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定するためには、被検体の皮膚組織試料が用いられる。皮膚組織試料は当分野で通常実施されている手法により採取することができる。簡便な方法としては、一定の粘着力を有するテープ等を皮膚表面に貼付し、一定期間皮膚と接触させた後、テープを剥離することにより皮膚組織試料を採取する方法が挙げられる。粘着力や皮膚表面との接触時間等の諸条件は、所望する量の皮膚組織が得られる範囲内で適宜設定することができる。
【００２５】
上記分子の発現状況を解析（測定）する方法としては、当分野で通常実施されている方法、若しくは該方法を適宜修飾して採用することができる。具体的には上記分子に特異的親和性を有する物質を用いて発現状況を解析することによって行うことができる。ここで、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されない。例えば、該分子が遺伝子の態様の場合、該遺伝子に特異的親和性を有する物質を用いるハイブリダイゼーション反応を利用する方法が挙げられる。該遺伝子に特異的親和性を有する物質としては、該遺伝子に特異的親和性を有するオリゴ又はポリヌクレオチドプローブ（以下、便宜上単にプローブともいう）、ならびにオリゴ又はポリヌクレオチドプライマー対（以下、便宜上単にプライマー対ともいう）が挙げられ、その特異的親和性とは、目的の遺伝子にのみハイブリダイズする性質を意味し、従って当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいても良い。該プローブ、プライマー対は、当該遺伝子に特異的親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴ又はポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。当該オリゴ又はポリヌクレオチドは当該遺伝子に対する特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらのオリゴ又はポリヌクレオチドは、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
【００２６】
対象となる遺伝子が１種類の場合は、単独でハイブリダイゼーション反応を行っても良いが、複数種（好ましくは複数種の解析）の発現状況を同時に解析する場合にはマイクロアレイ解析を実施することが好ましい。マイクロアレイ解析は、当分野で通常実施されている方法、若しくは該方法を適宜修飾して採用することができ、簡便には、適宜、対象遺伝子に特異的親和性を有する物質を準備した上で、キット化された商品を利用することができる。
【００２７】
例えば、該分子がタンパク質の態様の場合、該タンパク質に特異的親和性を有する物質を用いる方法が挙げられる。
該タンパク質と特異的な親和性を有する物質としては例えば当該タンパク質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該タンパク質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該タンパク質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該タンパク質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該タンパク質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等、標識可能な物質で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００２８】
さらに、本発明の方法においては、さらに、被検体の血清ＩｇＥ濃度を測定する工程を含むことが好ましい。かかる工程の実施により、血清ＩｇＥ濃度の上昇が認められない時点、即ち、皮膚バリアの機能異常は起こっているが、まだ皮膚炎症を発症していない皮膚の状態や、あるいは皮膚炎症疾患を発症しているがＩｇＥが介在していない初期段階であるかの有効な手がかりを得ることができる。かくしてより発症メカニズムに即した治療を、より早い段階から開始することができる。
免疫学的な異常に起因する皮膚炎症性疾患又はＩｇＥ介在型の皮膚炎症性疾患ではあるものの、投薬等の処置により一時的に血清ＩｇＥ濃度が減少している場合も想定し得る。従って、既に何らかの治療を開始している患者に対しては、血清ＩｇＥ濃度の測定を治療開始前後で数回、好ましくは４〜６週間の間をあけて繰返すことが好ましい。
血清を採取し血清中のＩｇＥ濃度を測定する工程は、通常当分野で実施されている方法又はそれに準じた方法で行なうことができる。
【００２９】
本発明の方法は、被検体におけるＪａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進の有無を測定する工程をさらに含んでいてもよい。かかる工程の実施は、ＩｇＥ非介在型の皮膚炎症や皮膚バリアの機能異常と、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進との関連性に基づいている。
【００３０】
Ｊａｋ（ヤヌスキナーゼ；Janus kinase）ファミリーは増殖及び免疫応答に関与する細胞の機能のサイトカイン−依存的制御において役割を果たしている。現在、４つの既知の哺乳類Ｊａｋファミリーメンバーが存在する（Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、Ｊａｋ３、及びＴｙｋ２）。Ｊａｋ蛋白質は１２０〜１４０ｋＤａの範囲であり、幾つかの保存されたＪａｋホモロジー（ＪＨ）ドメインを含む。ＪＨドメインとしてチロシンキナーゼドメインが存在することが知られている。
【００３１】
本発明において、「Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系」とは、Ｊａｋ１が直接的及び間接的に関与する信号伝達経路であって、ＩＬ−６ファミリーのサイトカインあるいはＥＧＦ等の成長因子がそれらの受容体に結合することによりＪａｋが活性化され、活性化されたＪａｋがＳｔａｔ３のチロシン７０５をリン酸化することによりＳｔａｔ３が活性化されるという工程を含む、一連のカスケードを意図する。従って、Ｊａｋ１分子以外に、本経路に関与する分子、すなわちＪａｋ１分子の上流又は下流に位置する信号伝達分子や信号伝達阻害分子（以下、総称してＪａｋ１関連分子とも称する）も「Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系」に含まれる。Ｊａｋ１関連分子としては、例えば、
ＩＬ−６、ＩＬ−１１、オンコスタチンＭ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１等のｇｐ１３０共有グループのサイトカイン；
ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、Ｍ−ＣＳＦ等のチロシンキナーゼ受容体を持つ増殖因子；
ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α／β／ω、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９等のＩＩ型サイトカイン受容体ファミリーのサイトカイン；
ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１等のγｃ受容体を共有するサイトカイン；
ＩＬ６Ｒα、ｇｐ１３０、ＷＳＸ１、ＯＳＭＲ、ＩＬ３１Ｒα等のｇｐ１３０ファミリーに関連する受容体；
ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲαやＰＤＧＦＲβ、ｃ−ｆｍｓ等のチロシンキナーゼ受容体；
ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ−２８Ｒα、ＩＬ−１０Ｒβ、ＩＬ−２０Ｒα、ＩＬ−２２Ｒ等のＩＩ型サイトカイン受容体ファミリー；
γｃ受容体とそれとヘテロダイマーを形成する受容体で構成される上流の信号伝達分子；
Ｊａｋ１分子の下流の信号伝達分子であるＳｔａｔ１、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ５等；および
Ｊａｋ１信号伝達阻害分子としてのＳｏｃｓ３等；
等が挙げられる。
【００３２】
すなわち、「Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進の有無を測定する工程」とは、上記Ｊａｋ１関連分子の変異等によって引き起こされる信号伝達系の（異常な）発現亢進や機能亢進の有無を測定する工程であって、例えばＪａｋ１活性の亢進、Ｓｔａｔ３活性の亢進あるいはＳｏｃｓ３活性の低下が認められるか否かを測定することによって実施され得る。Ｊａｋ１活性の亢進は、Ｊａｋ１分子の発現量やＪａｋ１分子の自己リン酸化能によりリン酸化されたＪａｋ１分子の量、あるいはＪａｋ１分子のＳｔａｔ３をリン酸化する能力を測定することによって評価することができる。Ｓｔａｔ３活性の亢進は、Ｓｔａｔ３分子の発現量やリン酸化されたＳｔａｔ３分子の量を測定することによって評価することができる。Ｓｏｃｓ３活性の低下は、Ｓｏｃｓ３分子の発現量を測定することによって評価することができる。
リン酸化されたものも含め、各分子の量又は発現量の測定は、当分野で通常実施されている方法、若しくは該方法を適宜修飾して採用することができ、例えば各分子に対する特異抗体を用いたウェスタンブロッティング法等が用いられる。
【００３３】
また、実施例で詳述するが、本発明者らは、intrinsicな皮膚炎症性疾患の発症原因となる、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進が、Ｊａｋ１関連分子、特にＪａｋ１分子の変異により生じ得ることを見出した。例えば、マウスでは、Ｊａｋ１遺伝子のコード領域の２６３３番目のグアニンからアデニンへ点突然変異すること（かかる点突然変異により、Ｊａｋ１蛋白質において、８７８番目のアミノ酸がアルギニンからヒスチジンへと変化する（図１参照））によって、Ｊａｋ１のリン酸化能が亢進し、すなわちＪａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進が生じる。上記したＪａｋ１における変異は、チロシンキナーゼドメイン内の変異であって、Ｊａｋ１蛋白質において８６５番目のアミノ酸（アスパラギン酸）から始まる９０６番目までの３２アミノ酸で構成されるＪａｋファミリーに共通するコンセンサスであるアミノ酸配列内の変異である（図２）。さらに、ヒト及びマウスでこの３２個からなるアミノ酸配列は、Ｔｙｋ２及びＪａｋ１において、それぞれ全く同一であり、種を超えて保存された配列である。さらにこの配列の１６番目からはＡＴＰ結合ドメインの配列である。
【００３４】
本発明の診断方法の対象となる被検体は、皮膚バリアの機能異常の有無を評価すること、あるいは皮膚炎症の発症及び発症の可能性を診断することが所望されるものであれば特に限定されないが、例えば、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、その他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ又は霊長類が挙げられ、最も好ましくはヒトである。特に、本発明は、皮膚炎症性疾患の発症原因に基づいた識別診断を可能にし、免疫学的な異常に起因しない皮膚炎症性疾患（ＩｇＥ非介在型）をも診断し得ることから、血清ＩｇＥ濃度の上昇が認められない場合にも、必要に応じて治療を開始することが可能となる。従って、本発明の診断方法の対象となる好適な被検体は、血清ＩｇＥ濃度の上昇が認められない被検体である。
【００３５】
上記被検体から採取された試料を用いて、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進の有無を測定する工程を具体的に述べる。
該試料は、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進の有無を測定することができるものであれば特に限定されないが、細胞内信号伝達系の機能亢進を測定対象とすることから、被検体のゲノム試料であることが好ましい。該ゲノム試料は、被検体から採取した生体試料であってもよく、生体試料等から抽出・精製したゲノム溶液でもよい。特に臨床検査等に用いられるヒト由来の生体試料や、ヒト由来の生体試料から抽出・精製したゲノム溶液であることが好ましい。ヒト由来の生体試料として、例えば、血液、骨髄液、リンパ液、尿、喀痰、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、膀胱洗浄液、膵液、唾液、精液、胆汁、又は大便等がある。また、該生体試料は、生物から採取された状態の試料（例えば、生検試料）であってもよく、調製した試料であってもよい。該調製の方法は、該生体試料中に含有されているゲノムを損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、通常、生体試料に対してなされている調製方法を行うことができる。その他、生体試料から抽出・精製したゲノム溶液をＰＣＲ等により増幅処理したものでもよい。また、生体試料として皮膚組織試料も好ましく用いられる。皮膚組織試料を用いた場合には、上記した一連のプロテアーゼ及びそのインヒビターの発現状況を同時に測定することができ好都合である。当該生体試料は、炎症部位を含むものであっても、炎症部位を含まないものであってもよい。さらに、臍帯血や胎盤付加物等を生体試料として使用することによって出生時という極めて初期の段階で皮膚炎症性疾患の発症を予測することが可能になる。
【００３６】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進の有無は、通常、被検体の試料における測定結果と、対照の試料における測定結果との比較によって実施される。
ここで「対照の試料」としては、１．皮膚バリアの機能異常も認められず、また皮膚炎症性疾患を発症していない健常体から採取した試料が用いられる場合、２．皮膚バリアの機能異常を呈しているか、皮膚炎症性疾患を有している個体の非炎症部位から採取した試料が用いられる場合、３．皮膚バリアの機能異常を呈しているか、皮膚炎症疾患を有している個体の炎症が沈静している状態で炎症があった部位から採取した試料が用いられる場合、の３通りが考えられる。
ある個体が将来的に皮膚炎症性疾患を発症するか否かを予測する場合、あるいは皮膚炎症性疾患を発症している場合の発症原因を診断する場合の対照は１．の健常個体より採取した試料である。また、皮膚炎症性疾患を発症している個体で、炎症部位と非炎症部位に明瞭な症状の差がある場合には２．を用いることで部位特異的に活性化して機能あるいは発現が亢進している遺伝子群を判定できる。また、さまざまな治療方法により皮膚炎症が沈静している個体において再発が疑われた場合には３．の炎症沈静期の試料を対照として用いることにより、炎症再燃の機序の診断が可能である。
【００３７】
本発明の方法により診断又は発症予測が可能となる皮膚炎症性疾患としては、皮膚の炎症を伴う疾患であれば特に限定されないが、具体的には、乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、急性熱性好中球性皮膚症、湿疹、乾皮性湿疹、発汗異常性湿疹、小水疱性掌蹠湿疹、尋常性座瘡、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚筋炎、剥脱性皮膚炎、手湿疹、汗疱、酒さ、サルコイドーシスに起因する酒さ、強皮症に起因する酒さ、スイート症候群に起因する酒さ、全身性エリテマトーデスに起因する酒さ、蕁麻疹に起因する酒さ、帯状疱疹痛に起因する酒さ、スイート病、好中球性汗腺炎、無菌性膿疱症、薬疹、脂漏性皮膚炎、バラ色粃糠疹、皮膚の菊池病、妊娠性掻痒性蕁麻疹性丘疹及びプラーク(pruritic urticarial papules and plaques of pregnancy)、スティーブンス・ジョンソン症候群及び中毒性表皮剥離症、タトゥー反応(tatoo reaction)、ウェルズ症候群(好酸球性蜂巣炎)、反応性関節炎(ライター症候群)、腸関連皮膚病-関節炎症候群(bowel-associated dermatosis-arthritis syndrome)、リウマチ性好中球性皮膚疾患(rheumatoidneutrophilic dermatosis)、好中球性エクリン汗腺炎(neutrophilic eccrine hidradenitis)、手背の好中球性皮膚疾患、形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、ベーチェット病、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、手の皮膚炎、光沢苔癬、扁平苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、貨幣状皮膚炎、壊疽性膿皮症、サルコイドーシス、角層下膿疱症、蕁麻疹、一過性棘融解性皮膚症等が挙げられ、好ましくはアトピー性皮膚炎である。
【００３８】
好ましくは、皮膚バリア破壊を伴う炎症性疾患である。皮膚のバリア機能は主に角質層（セラミドに代表される角層間脂質や天然保湿因子）やその表面を覆う皮脂膜により担われ、それらが正常に機能することで体内からの水分の喪失を防ぎ、外界からのさまざまな刺激や物質の侵入を防いでいる。皮膚バリア破壊を定量的に判断する方法としては、当分野で通常実施されている方法、若しくは該方法を適宜修飾して採用することができる。例えば、リボフラビン法やＴＥＷＬ（Trans epidermalwater loss：経皮水分蒸散量）を測定する方法等が挙げられる。リボフラビン法は経皮的に低分子の蛍光物質であるリボフラビンを染み込ませ、角質層に浸透した量をその蛍光強度を測ることで皮膚のバリア破壊を評価する方法である。ＴＥＷＬは専用の機器を用いて一定の条件下で簡便に測定することができる。
【００３９】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能が亢進している場合、例えば、Ｊａｋ１活性の亢進、Ｓｔａｔ３活性の亢進あるいはＳｏｃｓ３活性の低下が認められる場合には、当該被検体は、皮膚バリアの機能異常に起因する皮膚炎症性疾患に罹患しているか、または罹患する可能性があると診断され、あるいはＩｇＥ非介在型の皮膚炎症性疾患に罹患しているか、または罹患する可能性があると診断される。一方、皮膚炎症を発症しているものの、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能が亢進していない場合、例えば、Ｊａｋ１活性の亢進、Ｓｔａｔ３活性の亢進あるいはＳｏｃｓ３活性の低下が認められない場合には、当該皮膚炎症性疾患は、免疫学的な異常に起因するものであるか、あるいはＩｇＥ介在型のものであると診断される。すなわち、本発明の診断方法は、皮膚炎症性疾患を発症原因に応じて識別診断する方法を提供することができる。
【００４０】
（皮膚炎症性疾患の予防・治療用薬剤）
本発明は、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質（以下、単に本発明の有効成分とも称する）を含む、皮膚炎症性疾患の予防・治療用薬剤を提供する。当該薬剤は、皮膚への適用を特徴とする。
【００４１】
上記本発明の方法の記載及び後述する実施例からも明らかなように、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能が亢進している場合、皮膚バリアの機能異常に起因する皮膚炎症性疾患に罹患している／罹患する可能性がある、あるいはＩｇＥ非介在型の皮膚炎症性疾患に罹患している／罹患する可能性がある、と診断されることから、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質は、皮膚炎症性疾患、特に皮膚バリアの機能異常に起因する皮膚炎症性疾患、あるいはＩｇＥ非介在型の皮膚炎症性疾患の予防・治療用薬剤に有効成分として含めることができる。
【００４２】
「Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質」とは、Ｊａｋ１及び／又はＪａｋ１関連分子（例、Ｓｏｃｓ３、Ｓｔａｔ３）に作用してＪａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害することができる物質であり、Ｊａｋ１阻害剤、Ｊａｋ１信号伝達分子（例、Ｓｔａｔ３）の阻害剤、Ｊａｋ１信号伝達阻害分子（例、Ｓｏｃｓ３）等が例示される。当該機能亢進は、Ｊａｋ１やＪａｋ１関連分子における変異によってもたらされるものであってもよい。その場合には、当該機能亢進を阻害する物質は、変異Ｊａｋ１及び／又は変異Ｊａｋ１関連分子に作用してＪａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害し得る。
【００４３】
Ｊａｋ１阻害剤、Ｊａｋ１信号伝達分子の阻害剤及びＪａｋ１信号伝達阻害分子は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、蛋白質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００４４】
「Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質」として本発明の皮膚炎症性疾患の予防及び／又は治療用薬剤に含め得る物質について説明する。
【００４５】
Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸（以下、「アンチセンス核酸」ともいう）は、クローン化された、あるいは決定されたＪａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードするヌクレオチド配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸はＪａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子遺伝子の複製又は発現を阻害することができる。即ち、アンチセンス核酸は、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）又は機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
【００４６】
アンチセンス核酸の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてＪａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡ又は初期転写産物の全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡ又は初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ又は初期転写産物）の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端ヘアピンループが標的領域として選択されうるが、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。
さらに、アンチセンス核酸は、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズしてポリペプチドへの翻訳を阻害するだけでなく、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードする二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００４７】
アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、アンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用する等の剤形の工夫によっても克服できる。
【００４８】
Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンス核酸に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位のヌクレオチド配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)]。
【００４９】
Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、アンチセンス核酸に包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来[Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザイムの代替技術として広く利用されている。ｓｉＲＮＡの大きさは、ＲＮＡｉを誘導し得る限り特に限定されないが、例えば、１５ｂｐ以上、好ましくは２０ｂｐ以上であり得る。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。
【００５０】
上述のＪａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸を発現し得る発現ベクターも、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質として好ましい。該発現ベクターは、適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内で機能可能な発現ベクターであることが好ましく、該ベクター中の適切なプロモーター（例えば適用対象である哺乳動物の細胞（Ｔ細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーター）の下流に、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸が機能的に連結された態様で提供され得る。
【００５１】
Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子を特異的に認識する抗体は、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子に結合することにより、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子の機能（例えば、他の分子との相互作用、蛋白質キナーゼ活性等）を抑制し得る。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体の結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例えば、単鎖抗体）であってもよい。
【００５２】
例えば、ポリクローナル抗体は、Ｊａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ(Keyhole Limpet Hemocyanin)等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全又は不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスター等の哺乳動物が挙げられる。
【００５３】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん−基礎と臨床−」、第２−１４頁、サイエンスフォーラム出版、１９８５年）により作成することができる。例えば、マウスにＪａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子あるいはそのフラグメントを市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１，Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８等）を細胞融合してＪａｋ１やＪａｋ１信号伝達分子を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法[J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)]でも電圧パルス法[Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)]であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡ又はＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、又はマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清又は動物の腹水から取得できる。
【００５４】
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、上記抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）， Vol.6, No.10, 1988」、特公平３−７３２８０号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平４−５０６４５８号公報、特開昭６２−２９６８９０号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平４−５０４３６５号公報、国際公開第９４／２５５８５号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平６−５００２３３号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
【００５５】
また、Ｊａｋ１信号伝達阻害分子や当該分子の発現や活性を増強させるような物質も、好適に本願発明の皮膚炎症性疾患の予防及び／又は治療用薬剤に含めることができる。かかる物質として、Ｓｏｃｓ３等のＪａｋ１信号伝達阻害分子自体や、それをコードする核酸、それを含む発現ベクター等が挙げられる。
Ｓｏｃｓ３等のＪａｋ１信号伝達阻害分子をコードする核酸としては、Ｊａｋ１信号伝達阻害分子をコードするｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、染色体ＤＮＡ等が挙げられる。Ｊａｋ１信号伝達阻害分子をコードする核酸は、哺乳動物の種類等によってその配列が異なる場合があり、本発明においてはそのような核酸もまた用いることができる。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。Ｊａｋ１信号伝達阻害分子をコードする核酸は、該核酸の一部分を有する合成プライマーと、該核酸を有する染色体ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等を含む鋳型を用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）又はReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）により増幅することにより得ることが出来る。
【００５６】
Ｊａｋ１信号伝達阻害分子をコードする核酸を含有する発現ベクターは、クローン化された該核酸を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、用いる宿主に応じて適切なベクター（プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等）を選択することが出来る。また、プロモーターも、用いる宿主に対応して、適切なものを選択することが出来る。
【００５７】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)等）、酵母（サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（サル細胞（ＣＯＳ−７等）、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ細胞等）等）等が用いられる。
【００５８】
また、「Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質」としてのＪａｋ１阻害剤の一例として、ミリセチン（Myricetin；3,3',4',5,5',7-hexahydroxyflavone）が挙げられる。ミリセチンは、種々の果物や野菜に含まれるフラボノイドの一種であり、Ｊａｋ１のリン酸化を阻害し、また、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の自己リン酸化を増加させることが知られている（Kumamoto T. et al., Cancer Lett. 2009, Mar 8; 275(1): 17-26, Epub 2008 Nov 7.）。該物質は商業的にも入手可能である（ナカライ等）。
【００５９】
本発明の皮膚炎症性疾患の予防・治療用薬剤における本発明の有効成分の配合量は、所期の効果が得られる限り特に制限されず、使用する有効成分の種類に応じて広い範囲から適宜選択することができる。
【００６０】
本発明の皮膚炎症性疾患の予防・治療用薬剤の剤型は、皮膚への適用が可能な範囲で特に限定されず、例えば、基剤中に、上記した本発明の有効成分を溶解又は混合分散させてクリーム状、ペースト状、ゼリー状、ゲル状、乳液状、液状等の形状になされたもの（軟膏剤、リニメント剤、ローション剤等）；基剤中に、上記した本発明の有効成分を溶解又は混合分散させたものを支持体上に展延したもの（パップ剤等）；粘着剤中に、上記した本発明の有効成分を溶解又は混合分散させたものを支持体上に展延したもの（プラスター剤、テープ剤等）等が挙げられる。
【００６１】
上記基剤としては、薬学的に許容しうるものであれば特に限定されず、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤等の基剤として従来公知のものを用いることができ、例えば、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン等のポリマー；ミツロウ、オリーブ油、カカオ油、ゴマ油、ダイズ油、ツバキ油、ラッカセイ油、牛油、豚油、ラノリン等の油脂類；白色ワセリン、黄色ワセリン；パラフィン；ハイドロカーボンゲル軟膏（例えば、ブリストルマイヤーズスクイヴ社製、プラスチベース等）；ステアリン酸等の高級脂肪酸；セチルアルコール、ステアリルアルコール等の高級アルコール；ポリエチレングリコール；水等が挙げられる。
【００６２】
本発明の皮膚炎症性疾患の予防・治療用薬剤には、更に必要に応じて、その形態に応じて通常使用される担体を添加してもよく、例えば、結合剤、界面活性剤、保湿剤、充填剤、増量剤、湿潤剤等の希釈剤又は賦形剤が挙げられる。
【００６３】
本発明の皮膚炎症性疾患の予防・治療用薬剤は、その形態における常法に従って調製することができる。
【００６４】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質が核酸である場合、該核酸の細胞内への導入を促進するために、本発明の剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該核酸がウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該核酸がプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム；ジオクトアデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオールエオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオールエオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクトアデシルアンモニウム臭化物）、ＤＨＤＥＡＢ（Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ＨＤＥＡＢ（Ｎ−ｎ−ヘキサアデシル−Ｎ，Ｎ−ジヒドロキシエチルアンモニウム臭化物）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
【００６５】
また、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質が蛋白質である場合、該蛋白質の細胞内への導入効率を高めるために、本発明の組成物は更にポリペプチド導入用試薬を含むことができる。該試薬としては、プロフェクト（ナカライテスク社製）、プロベクチン（ＩＭＧＥＮＥＸ社製）等を用いることが出来る。
【００６６】
本発明の皮膚炎症性疾患の予防及び／又は治療用薬剤の適用量及び適用期間は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等によって適宜設定される。通常、皮膚への適用が可能な剤型（例、軟膏、液剤）で有効量が１日１回〜数回に分けて患部に適用される。
【００６７】
（皮膚バリアの機能異常を改善する方法）
本発明は、皮膚バリアの機能異常を改善する方法を提供する。かかる方法は、好ましくは、上記した、本発明の皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法によって得られた評価結果に基づいて実施される。
すなわち、本発明の皮膚バリアの機能異常を改善する方法は、
（ａ）被検体における皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの発現を測定する工程、（ｂ）血清ＩｇＥ濃度を測定する工程、及び（ｃ）前記工程（ａ）で皮膚表面のプロテアーゼ及び／又はそのインヒビターの構成バランスの変動が認められ、且つ前記工程（ｂ）で血清ＩｇＥ濃度の上昇が認められなった被検体に対して、Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質の有効量を投与する工程を含む、方法である。
工程（ａ）及び工程（ｂ）は、上記した本発明の「皮膚バリアの機能異常の有無を評価する方法」で実施した工程と同様である。
工程（ｃ）において用いられる、「Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質」としては、上記した本発明の皮膚炎症性疾患の予防及び／又は治療用薬剤に含められるものとして例示されたものと同様なものが例示される。
投与経路は、後述のように、本願発明の対象が免疫学的な異常に起因しない皮膚炎症性疾患、特に皮膚バリアの機能異常に起因する疾患であることから、また、該物質が有する、所望する作用以外の作用の影響を抑制し得ることから経皮投与が選択される。特に皮膚表皮上に塗布することが好ましい。剤型や投与量については上記した本発明の皮膚炎症性疾患の予防及び／又は治療用薬剤について記載したものと同様なものが例示される。
【００６８】
Ｊａｋ１が関与する細胞内信号伝達系の機能亢進を阻害する物質の「有効量」とは、初期の効果が得られる範囲内で、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、適用対象となる動物種、適用対象の薬物受容性、体重、年齢等に基づいて適宜設定され得る。
さらに、本発明の評価方法において、皮膚バリアの機能異常が確認された被検体に対し、ワセリン等の皮膚保護剤を皮膚局所に適用することにより、皮膚バリアの機能異常に起因する皮膚炎症性疾患やＩｇＥ非介在型の皮膚炎症性疾患を予防及び／又は治療することができる。
【００６９】
（皮膚炎症性疾患の診断用キット）
上述の通り、皮膚バリアの機能異常及び／又は皮膚炎症性疾患の際には、その皮膚において、一連のプロテアーゼやそのインヒビター分子群の発現亢進が観察される。従って、本発明はこれらの分子群の少なくとも１種の分子を特異的に検出し得る物質を含む、皮膚炎症性疾患の診断用キットを提供する。
かかる分子群は、上記、皮膚炎症性疾患、特にアトピー性皮膚炎のモデルマウスにおいてアトピー性皮膚炎発症に際してその発現レベルが大きく変動したものである。具体的には、
Keratin 77;
Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase;
T-cell leukemia/lymphoma 1B, 3;
Betacellulin, epidermal growth factor family member;
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16。
が挙げられる。
【００７０】
好ましくは、特に発現が上昇した分子から構成される。具体的には、
Ubiquitin specific peptidase 18;
Colony stimulating factor 2 receptor, beta 2, low-affinity (granulocyte-macrophage);
Interferon regulatory factor 7;
Ets homologous factor;
Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1;
SAM domain and HD domain, 1;
Lipocalin 2;
Alcohol dehydrogenase 6A (class V);
Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6D;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Late cornified envelope 1F;
RIKEN cDNA 6330442E10 gene;
S100 calcium binding protein A8 (calgranulin A);
Solute carrier family 5 (sodium/glucose cotransporter), member 1;
Predicted gene, OTTMUSG00000000971;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Protease, serine 27 (marapsin);
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16が挙げられ、より好ましくは
Kallikrein related-peptidase 6、
Predicted gene, OTTMUSG00000000971、
WAP four-disulfide core domain 12、
Extracellular proteinase inhibitor、
Chitinase 3-like 1、及び
Protease, serine 27 (marapsin)が挙げられる。
【００７１】
本発明の皮膚炎症性疾患の診断用キットに含められる、上記分子群の少なくとも１種の分子を特異的に検出し得る物質としては、当該分子を遺伝子レベルで、あるいはタンパク質レベルで検出し得る物質であって、具体的には該分子の遺伝子に特異的親和性を有する物質、及び／又は該分子のタンパク質に特異的親和性を有する物質が挙げられる。
該遺伝子に特異的親和性を有する物質としては、該遺伝子に特異的親和性を有するプローブやプライマー対が挙げられ、その特異的親和性とは、目的の遺伝子にのみハイブリダイズする性質を意味し、従って当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいても良い。該プローブ、プライマー対は、当該遺伝子に特異的親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴ又はポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。当該オリゴ又はポリヌクレオチドは当該遺伝子に対する特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらのオリゴ又はポリヌクレオチドは、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
複数種の発現状況を同時に解析する場合には、マイクロアレイ用として試薬を調製することもできる。
【００７２】
例えば、該タンパク質に特異的親和性を有する物質としては例えば当該タンパク質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該タンパク質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該タンパク質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該タンパク質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該タンパク質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
【００７３】
本発明のキットには、皮膚炎症発症に際してその発現レベルが大きく変動する分子、特に発現が上昇した分子を特異的に検出し得る物質に加えて、当該検出に必要な各種試薬を一緒に梱包することができる。例えば、緩衝液や標識用試薬、反応容器等が挙げられる。
【００７４】
本発明の好ましい診断用キットは、例えば以下の(i)被検体の皮膚組織試料を回収するための粘着性シート、及び(ii)皮膚組織試料中に含まれる分子を検出・同定する為の試薬を含む。該粘着性シートは、皮膚に重大な影響を与えることなく、好ましくは皮膚炎症発症時に発現亢進される分子を含む層のみを回収することが可能な粘着力を有するシートである。かかる粘着力は使用するシートの材質や適用する適用部位、適用時間等に応じて適宜設定することができる。シート上に回収された皮膚組織試料に対して、(ii)皮膚組織試料中に含まれる分子を検出・同定する為の試薬を用いて、該分子の有無を調べることにより、皮膚炎症性疾患に罹患しているか否かを診断することができる。また、その発現の程度を知ることにより、重篤度や進行の程度を予測することもできる。該試薬には、上記した該分子に特異的な親和性を有する物質（例、抗体）が含まれる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。
【００７６】
（方法・材料）
１．マウス
詳細なプロトコルは既報に従い（Masuyaら, Hum Mol Genet 16, 2366-2375 (2007)；http://www.brc.riken.jp/lab/gsc/mouse/）アトピー性皮膚炎のモデルマウスを作製した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス及びＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスは日本クレアから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６−ｋｉｔＷ−ｓｈ／Ｗ−ｓｈマウスは理研バイオリソースセンターから入手した。Ｃ５７ＢＬ／６−ＲＡＧ１−／−マウスは自家繁殖させた。重症度スコアは、既報(Matsudaら、Int Immunol. 9, 461-466 (1997))を改良したものを用いた。マウスはＳＰＦ（specific pathogen-free）環境下で飼育し、理化学研究所の動物実験委員会の許可を得てガイドラインに従って実験を行った。
この皮膚炎モデルではＳＰＦ環境下でも生後８週間で皮膚炎が発症し、それから２週間遅れて血清ＩｇＥ値が上昇するという経過をたどる。具体的な時間的経過は以下の通りである。
１．生後８週齢前後で皮膚バリア異常による非ＩｇＥ依存性の皮膚炎の発症
２．上記発症から２週間遅れてＩｇＥ値およびＩｇＧ１値の増加と肥満細胞等の活性化等のＴｈ２系統に免疫シフトした皮膚炎へと変化
３．皮膚炎発症後８週間前後でのＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃ値の上昇で示されるＴｈ１系統も含めた免疫系全体が活性化した慢性皮膚炎への変化
【００７７】
２．マッピング及びシークエンシング
皮膚に異常を示したPhenodeviantを野生型Ｃ３Ｈ/ＨｅＪマウスと交配し表現型の伝達と原因遺伝子の遺伝子マッピングを調べた。マッピングされた一塩基多型（Single nucleotide polymorphism；SNP）が報告されている（Masuyaら、上述、2007)。ＰｏｓＭｅｄ(http://omicspace.riken.jp)でサーチ検索しリストアップされた候補遺伝子の中からＪａｋ１遺伝子を原因遺伝子として選択した。Ｊａｋ１遺伝子相補的なプライマー（要求により入手可能）を用いてＰＣＲ増幅し配列決定した。
【００７８】
３．ウェスタンブロッティング
免疫沈降及びイムノブロッティングは以下のようにして行った。
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）を血清欠乏条件下で１２時間培養し、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。次いで、細胞を溶解バッファー（20mM Tris-HCl[pH7.4],150mM NaCl,1% Nonidet P-40；プロテアーゼインヒビターを補充）で溶解した。ライセートを遠心分離（10,000×g、30分間）して清澄にした。清澄にしたライセートを抗Ｊａｋ１抗体（BD Transduction Lab）又は抗Ｓｔａｔ３抗体（Cell signaling）で、protein A-Sepharose（GE Healthcare）と一緒に４時間インキュベートした。インキュベーション後、免疫沈降物を、プロテアーゼインヒビターを含まない溶解バッファーで洗浄し、勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、PVDF Immobilon P membrane（Millipore）に転写した。膜を抗ｐＴｙｒ抗体（4G10, Upstate）、抗Ｊａｋ１抗体、抗ｐＹ−Ｓｔａｔ３抗体（Cell signaling）又は抗Ｓｔａｔ３抗体（Cell signaling）のいずれかとインキュベートした。ＴＢＳＴ（20mM Tris-HCl[pH 7.4], 150mM NaCl, 0.1% Tween 20）で洗浄した後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Zymed）に浸した。免疫複合体をケミルミネッセンスシステム（PerkinElmer Life Sciences. Inc.）で可視化した。
【００７９】
４．インビトロキナーゼアッセイ
Ｊａｋ１キナーゼ活性は実際には、既報（Fukadaら、Immunity 5, 449-60 (1996)；Takahashi-Tezuka M.ら、Mol Cell Biol. 18, 4109-4117 (1998)）に従って測定した。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体の細胞外ドメイン及びｇｐ１３０の短縮化された細胞内ドメインから構成されるキメラ受容体を安定して発現している２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ−Ｇ１３３細胞）を変異Ｊａｋ１（Ｒ８７８Ｈ）又は野生型Ｊａｋ１の発現プラスミドで形質転換し、次いでＧ−ＣＳＦ（100ng/ml）で刺激した。
刺激して１０分後、ＨＡタグ標識されたＪａｋキナーゼを抗ＨＡ抗体で免疫沈降し、プロテアーゼインヒビターを含有しない溶解バッファーで洗浄し、キナーゼバッファー（60mM HEPES[pH7.3], 3mM MgCl2, 3mM MnCl2, 1.2mM DTT, 1mM ATP)に浸した。キナーゼ反応は、ＡＴＰ（1mM)及び基質としてのリコンビナントＳｔａｔ３蛋白質（Active Motif）を含有するキナーゼバッファーでインキュベーションすることによって実施した。Ｓｔａｔ３及びＪａｋ１蛋白質のリン酸化を、それぞれ、抗ｐＹ−Ｓｔａｔ３抗体（Cell Signaling）及び抗ｐＹ−Ｊａｋ１抗体（Cell Signaling）を用いてイムノブロッティングすることにより解析した。
【００８０】
５．バリア機能の測定
経表皮水分蒸散量（Trans epidermal water loss;TEWL）は、水分蒸散量測定装置Tewameter TM 300（Courage and Khazaka）を用いて、耳皮膚の腹部及び背部について測定した。透過性の測定には、ＰＢＳ中にNHS-LC-Biotin（Pierce）を含有する等張液を耳皮膚に塗布した。６０分間のインキュベーションの後、耳皮膚を解剖し凍結した。凍結切片を作製し、Ａｌｅｘａ５４６結合ストレプトアビジン（Invitrogen）で染色しＤＡＰＩ（Vector laboratories）でカウンター染色した。
【００８１】
６．骨髄キメラマウスの作製
レシピエントマウス（ホストとなるマウス）には、１３７Ｃｓ線源で致死的な放射線を照射し（9.5Gy）、放射線照射後８〜１０時間後に、異なるドナーマウスから得た骨髄細胞（1×107細胞）を静脈内注射した。レシピエントマウスには0.5mg/ml硫酸ネオマイシン及び0.3mg/ml塩酸テトラサイクリン（Calbiochem）を含有する飲料水を与えた。
【００８２】
７．Ｊａｋ阻害剤の局所適用
アセトン／オリーブ油（４：１）に懸濁したＪａｋ阻害剤Ｉ（150μM, ピリドン６；Calbiochem)を、生後４週間から、１週間に３回、１０μｌずつミュータントマウスの耳皮膚の腹部と背部に局所的に塗布した。
【００８３】
８．ＥＬＩＳＡ
顎下静脈から血液を回収し、ＥＤＴＡ−２Ｋを抗凝固剤として加えた。希釈した血漿中の免疫グロブリン及びヒスタミンのレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Bethyl and MBL）を用い、使用説明書に従って測定した。
【００８４】
９．増殖活性
サイトカイン依存性の細胞増殖活性の測定には、胸腺の単一細胞懸濁液を5 x 105 cells/wellの濃度で培養し、ＰＭＡ(10 ng/ml)［ＩＬ−２(25 ng/ml)、ＩＬ−４(25 ng/ml)、ＩＬ−６(100 ng/ml)、ＩＬ−７(25 ng/ml)、ＩＬ−１２(1 -100 ng/ml)又はIFN-γ(100 ng/ml)(Peprotech and R&D)を添加する］で刺激した。幾つかの実験では、汎Ｊａｋ阻害剤であるＪａｋ阻害剤Ｉ(3 - 100 nM, ピリドン６；Calbiochem)又はＪａｋ３阻害剤Ｉ(125 - 500 μM, ＷＨＩ−Ｐ１３１；Calbiochem)を用いた。細胞を４８時間培養し、ＷＳＴ−８(Nacalai tesque)及び可溶性テトラゾリウム／ホルマザンを用いるアッセイにより細胞増殖を測定した。
【００８５】
１０．組織学及び免疫組織学的解析
耳の組織試料をマウスから調製し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定しポリエステルワックス(VWR International)に包埋した。５μｍの厚さの切片を作製しヘマトキシリンとエオシン又はトルイジンブルーで染色した。
免疫組織学的解析には、凍結した耳組織の標本を１０秒間マイクロ波照射して固定した。全スライド標本をまず、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１０％の標準ヤギ血清、５％標準マウス血清中でインキュベートした。次いで、ＣＤ４を検出する場合には、スライド標本をビオチンがコンジュゲートした抗ＣＤ４ｍＡｂ(e-bio)、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて染色した。反応を３，３’−ジアミノベンジジン(DAB)発色剤（Ｄｏｊｉｎ）を用いて可視化した。marapsin及びchitinase3-like 1を検出する場合には、スライド標本を、抗marapsin抗体（ヤギ；Ｒ＆Ｄ）又は抗chitinase3-like 1抗体（ヒツジ；Ｒ＆Ｄ）、次いで、ＨＲＰがコンジュゲートした２次抗体（抗ヤギＩｇＧ又は抗ヒツジＩｇＧ；Ｚｙｍｅｄ）をそれぞれ用いて染色した。反応をＤＡＢ発色剤（Ｄｏｊｉｎ）を用いて可視化した。
免疫蛍光による解析には、凍結した耳組織の標本を固定し、ｐＹ−Ｊａｋ１に対する抗体(Cell signaling)、Ｋｉ６７に対する抗体(Abcam)、Ｋ６、Ｋ１４又はＫ１０に対する抗体(Covance)を用いて染色した。次いで、試料をＦＩＴＣ又はＣｙ３がコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体(Zymed)でインキュベートした。スライドをさらにヘマトキシリン又はＤＡＰＩ(Vector laboratories)でカウンター染色した。
【００８６】
１１．ミュータントＪａｋ１マウスの作製
Ｊａｋ１ミュータントノックインマウスの構築図を図８に示す。
マウスＪａｋ１遺伝子を含むゲノムクローンであるＲＰ２３−２５Ａ２０は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス起源のＢＡＣクローンコレクション(Invitrogen)から入手した。Ｊａｋ１遺伝子のｅｘｏｎ１６−１７とｅｘｏｎ１８−２２をそれぞれ含む２．４ｋｂｐのBxtXI-Aor51HI  ＤＮＡ断片及び４．３ｋｂｐのAor51HI-EcoRV  ＤＮＡ断片を、pGEM-T Easy Vector(Promega)にサブクローニングして、ターゲッティングベクターを作製した。次いで、ミスセンス変異（Ｒ８７８Ｈ，ＣＧＴからＣＡＴへの変異）をＪａｋ１遺伝子のエクソン１９に組換えＰＣＲ技術によって導入した。pMC1neoPolyA(Stratagene)プラスミドをバックボーンベクターとして用いてターゲッティングベクターを構築した。相同組換えしたものを選別するために、ｌｏｘｐ−ＮｅｏのカセットをＪａｋ１遺伝子のイントロン１７のＡｏｒ５１ＨＩ部位にクローニングした。ランダム挿入されたものを選別するために５’アームの上流にチミジンキナーゼ遺伝子を挿入した。線状化したターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法にてＭ１  ＥＳ細胞にトランスフェクトしてミュータントＪａｋ１マウスを作製した。相同組換えについてターゲッティングベクターの外側に位置する２つの３２Ｐ−ＣＴＰで標識されたＤＮＡプローブを用いてＰＣＲ法及びサザンブロット解析を行ってＧ−４１８及びガンシクロビルに抵抗性のクローンをスクリーニングした。詳細には、以下のプライマーセットをＥＳ細胞のＰＣＲスクリーニングに用いた。
５’側のＰＣＲ増幅；
5'-GAG TGG AGA AAG CTG ACC TGT G-3'（配列番号１）、及び
5'-CGC CTT CTA TCG CCT TCT TGA C-3'（配列番号２）;
３’側のＰＣＲ増幅；
5'-CAG TCA TAG CCG AAT AGC CTC-3'（配列番号３）、及び
5'-AGC AGT CCA GAG GCT CAC AGC AAC-3'（配列番号４）。
ＥＳ細胞のサザンブロット解析は以下のプローブを用いて行った。各プローブはＪａｋ１遺伝子を含むゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅により作製した。
５’プローブ（８１０ｂｐ）；
5'-CTA GCA TGA TGA GAC AGG TT-3'（配列番号５）、及び
5'-TCC GGT GCA TGA AGA GAT CC-3'（配列番号６）;
３’プローブ(４９０ｂｐ);
5'-CAG CAT GAA TGG CCA GAG TCC -3'（配列番号７）、及び
5'-ATT GGT CCA TAA CAG CAC ATC -3'（配列番号８）。
選別されたＥＳ細胞中のゲノムＤＮＡにおけるミスセンス変異（Ｒ８７８Ｈ）をＤＮＡ配列決定によって確認した。
生殖系列のキメラマウスを細胞凝集法によって作製した。ミュータントＪａｋ１マウスのヘテロ接合体を作製するために、高いＥＳ細胞の寄与を有するキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとを交配させた。
【００８７】
１２．リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析
RNeasy Gene Expression Kit(Qiagen)を用い、使用説明書に従って全細胞ｍＲＮＡを耳組織から単離した。ＲＮＡをHigh-capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)を用いて逆転写した。遺伝子発現の定量解析の為に、TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems)を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
IL-4, Mm00445259_m1; IFN-γ, Mm00801778_m1; Jak1, Mm00600614_m1; Stat1, Mm00439518_m1; Stat3, Mm00456961_m1; Stat5a, Mm00839861_m1; Stat5b, Mm00839889_m1;及びStat6, Mm01160477_m1。
ABI 7300 real-time PCR system上で、TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems)を用い、９５℃１０分間→９５℃１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルのサイクルプロトコルで増幅反応を行った。続いて、Ｃｔ（threshold cycle）値を測定した。Ｃｔ値は、一定のＰＣＲの増幅量に達した際のサイクル数を示す。マウス  リボソーム  ハウスキーピング遺伝子であるＲＰＬ１９(Mm02601633_g1)で標準化して２-ΔΔＣｔ法に従って算出した（ここで、ΔＣｔはターゲット遺伝子のＣｔ値から、ＲＰＬ１９のＣｔ値を差し引いた値を、ΔΔＣｔは試料のΔＣｔの値から対照のΔＣｔの値を差し引いた値を示している。
【００８８】
実施例１  Ｊａｋ１チロシンキナーゼにおける原因遺伝子の変異の同定
上記（方法と材料）の項で作製したアトピー性皮膚炎のモデルマウスをＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスと交配させることによって遺伝子マップを作製し、原因遺伝子の同定を試みた。ＳＰＦ条件下で、Ｃ３Ｂ６Ｆ１ヘテロ接合体の異種交配により１／４の確率で皮膚炎の表現型を発現した。次いで、これら２つの系列を用いて、ＳＮＰマーカーを用いて表現型の伝達と原因遺伝子マッピングを行った。結果、疾患の原因となる領域は第４染色体に存在することが示された（図１ａ）。第４染色体を分割し、ＰｏｓＭｅｄを用いたサーチ検索により候補遺伝子を幾つかピックアップし（Kobayashi Nら、Bioinformatics. 24:1002-10 (2008)）、候補遺伝子であるＪａｋ１コード領域中の点突然変異を同定した（図１ｂ）。この点突然変異によりＪａｋ１のチロシンキナーゼドメイン中に位置する８７８番目のアルギニン（Ｒ）がヒスチジン（Ｈ）に変化した（図１ｃ）。以下当該変異をＲ８７８Ｈとも称する。皮膚炎の表現型を有する全マウス、及びそれらの同腹仔マウスについてゲノム配列決定を行ったところ、変異表現型と１００％合致し、このＪａｋ１点突然変異はホモ接合性であることが示された（ＪＡＤ／ＪＡＤマウス、又はＳｐａｄｅ／Ｓｐａｄｅマウスとも称する；Ｓｐａｄｅ＝Stepwise Progressive Atopic Dermatitis）。該変異は、ヘテロマウスでヘテロの形で見つかった。野生型表現型にはそのような変異は存在しなかった。
図２で示されるように、Ｊａｋファミリーにおけるコンセンサス配列は下線部分で示される「チロシンキナーゼドメインの先端部分」を含み、さらに「ＡＴＰ結合コンセンサス」を含む（囲い部分）。Ｊａｋ１のＲ８７８Ｈなる変異はそのＡＴＰ結合コンセンサスの２アミノ酸上流のアルギニンがヒスチジンに変わったものであり、ＡＴＰ結合活性に影響を及ぼしている可能性がある。Ｔｙｋ２においては、Ｊａｋ１Ｒ８７８Ｈの変異点に対応する部分はＪａｋ１遺伝子とほぼ同一の配列であり、Ｔｙｋ２のＲ８９８Ｈの変異を作ることにより機能亢進型Ｔｙｋ２分子を作製できる可能性がある。Ｊａｋ２及びＪａｋ３分子ではＪａｋ１の８７８番目のアミノ酸に対応する部分及びその前後は異なるアミノ酸配列であるが、Ｊａｋ２における８５１番目から８５４番目のＦＬＱＱあるいはＪａｋ３における８２０番目から８２３番目のＹＩＳＬをＲＩＲＤに入れ替えることにより野生型のＪａｋ１分子の配列をもつキメラ分子を作製することでＪａｋ１あるいはＴｙｋ２の配列とほぼ相同のアミノ酸配列に入れ替えることができる。したがって、このＲＩＲＤの代わりにＲＩＨＤを導入することで機能亢進型のＪａｋ２分子、あるいはＪａｋ３分子を作製できる可能性がある。
このＪａｋ１における点突然変異の近傍に未同定の変異が共存しているという可能性を排除するために、遺伝子操作により同じ点突然変異を有するノックインマウスを作製した。ノックインマウスは図８に示されるコンストラクトで構成される遺伝子配列を相同組み換えでＣ５７ＢＬ／６マウスＥＳ細胞のゲノムに組み入れたものである。相同組み換えに成功したＥＳ細胞をブラストシストに注入し、アグリゲーションキメラからヘテロ個体を得た。ヘテロ個体同士を交配してノックイン遺伝子のホモ、ヘテロ、野生型遺伝子を持つマウスを作製した。ミュータントマウスホモ接合体をＪａｄ／Ｊａｄマウスとも称する。
作製されたノックインマウスは８週齢前後での激しいかゆみを伴う皮膚炎の発症、それに２週間遅れての血清ＩｇＥとＩｇＧ１上昇というＴｈ２傾向へのシフト等、先に報告されているＥＮＵミュータントマウスと全く同じ疾患発症経過を辿った。以上のことからＥＮＵミュータントマウスにおける皮膚炎発症は全てこのＪａｋ１遺伝子の点突然変異に起因するものであることが確認された。
【００８９】
実施例２  点突然変異によるＪａｋ１の機能亢進
Ｊａｋ１遺伝子の変異マウスは報告されているが、ノックアウトマウスでは周産期致死であり、皮膚炎のような症状は報告されていない（Rodigら、Cell. 93:373-83. (1998)）。従って、Ｊａｋ１遺伝子におけるこの点突然変異は機能を失うものではなく、皮膚炎を誘導させるようなある特有の機能を与えるものであることが予測された。ヌクレオチドの点突然変異は、Ｒ８７８Ｈという１アミノ酸の置換を誘導し、これはＪａｋ１分子のチロシンキナーゼドメイン内の８８０番目のアミノ酸から始まるＡＴＰ結合コンセンサスドメインの近傍に認められた(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?seqinput=NP_666257.2)。チロシンキナーゼのＡＴＰ結合ドメインは、チロシンリン酸化活性の発現に極めて重要な配列であり、このコンセンサスドメインはマウス及びヒトのＪａｋファミリー蛋白質で保存されている(Levine及びGilliland, Curr Opin Hematol. 14:43-7. (2007))。この点突然変異がこのチロシンキナーゼ分子のチロシンリン酸化能に影響を与えるか否かを調べた。
まず、ミュータントマウス（ホモ接合体）及び野生型マウスから胚線維芽細胞系（ＭＥＦ細胞）を樹立し、Ｊａｋ１蛋白質の自己リン酸化について比較した。サイトカインＩＬ−６の刺激前、刺激後ともに、野生型マウスのＭＥＦ細胞に比べてミュータントマウスのＭＥＦ細胞においてＪａｋ１蛋白質はリン酸化が亢進されていた（図３ａ、上段２つ）。Ｊａｋ１蛋白質の構成的なリン酸化の亢進に加えて、Ｓｔａｔ３蛋白質（Ｊａｋ１の下流に直接存在するシグナル伝達経路に関与する分子）についてもまた、リン酸化の亢進が認められた（図３ａ、下段２つ）。これらの結果は、変異Ｊａｋ１分子におけるチロシンキナーゼ機能の過剰な活性化を示している。
次に、ミュータントマウス由来のＭＥＦ細胞におけるＪａｋ１（変異Ｊａｋ１）の過剰なリン酸化が変異Ｊａｋ１のチロシンキナーゼ活性の過剰な活性化によって誘導されるものであるのかを調べるために、ＨＡでタグ標識された変異Ｊａｋ１及び野生型Ｊａｋ１をＧ−ＣＳＦＲ−ｇｐ１３０キメラ受容体を発現している２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。Ｇ−ＣＳＦで細胞を刺激した後、ＨＡでタグ標識された変異Ｊａｋ１あるいは野生型Ｊａｋ１蛋白質を免疫沈降し、インビトロで組換えＳｔａｔ３リン酸化を誘導させた。変異Ｊａｋ１蛋白質の過剰な活性化が組換えＳｔａｔ３の強いチロシンリン酸化によって確認された（図３ｂ）。これらの結果から、この点突然変異がＪａｋ１分子のチロシンリン酸化能の過剰な活性化をもたらすことが明らかとなった。
【００９０】
実施例３  免疫細胞における過剰な増殖におけるＪａｋ１変異の影響
皮膚炎が進行したマウスでは、末梢リンパ節及び脾臓の殆どが肥大し、リンパ球の数が増加する。免疫細胞増殖におけるＪａｋ１変異の影響を調べるために、脾臓ＣＤ４陽性Ｔ細胞のインビトロでの増殖能について、ミュータントマウス（ホモ接合体）と野生型の同腹仔とを比較した。Ｊａｋ１を介して、それらのシグナルを送っている種々のサイトカイン（例、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γ）は、ミュータントマウス由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞における過剰な増殖を誘導し（図３ｃ）、そして、この過剰な増殖はＪａｋ阻害剤であるピリドン６の添加により、投与量依存的に阻害された（図３ｅ）が、Ｊａｋ３特異的阻害剤であるＷＨＩ−Ｐ１３１の添加では阻害されなかった（図３ｆ）。これらのサイトカインとは対照的に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＩＬ−１２（Ｊａｋ１ではなくＪａｋ２を介してシグナル伝達する）で刺激した場合には、変異型マウスと野生型マウスの間で細胞増殖に差は認められなかった（図３ｄ）。これらの結果より、Ｊａｋ１のＲ８７８Ｈという変異が、免疫細胞においてＪａｋ１依存的シグナル伝達の活性化を誘導していることが示された。しかしながら、サイトカインによる刺激後の、Ｊａｋ１及び種々のＳｔａｔのｍＲＮＡの転写レベルは、ミュータント、ヘテロ接合体及び野生型の間で同程度であった（図４）。このことは、Ｊａｋ１の過剰な活性化はこれらのシグナル伝達物質の転写活性を誘導しているわけではないことを示唆している。
【００９１】
実施例４  皮膚環境による皮膚炎の誘導
Ｊａｋ１は、免疫細胞のみならず、皮膚上皮細胞あるいは神経細胞といった種々の細胞系列において、シグナル伝達経路に関与していることが報告されている（Crokeraら、Seminars in Cell & Developmental Biology 19: 414-422 (2008))。アトピー性皮膚炎の発症の原因となる細胞又は組織を検出する為に、野生型マウスとミュータントマウスとの骨髄キメラマウスを作製し、皮膚炎の発症／進行を観察した（表１）。実施例１で作製したミュータントマウスホモ接合体であるＪａｄ／Ｊａｄマウス由来の骨髄を野生型マウスホストに移植して得られたキメラマウスは移植後半年たっても皮膚炎を発症しなかった。野生型マウス由来の骨髄をＪａｄ／Ｊａｄマウスホストに移植して得られたキメラマウスは骨髄移植後１０週間で皮膚炎を発症したが、興味深いことに、Ｊａｄ／Ｊａｄマウスホスト及びＪａｄ／Ｊａｄマウス由来骨髄との組合せにより得られたキメラマウスに比べて、その骨髄移植後の皮膚炎発症時期は約４週間遅れたものであり、臨床症状も軽いものであった。野生型マウス由来の骨髄と野生型マウスホストとの組合せでは皮膚炎は発症しなかった。以上の結果より、骨髄細胞は皮膚炎の悪化に関与するかもしれないが、皮膚炎の発症に寄与する細胞（組織）は骨髄細胞ではなく皮膚組織であることが推察された。種々の免疫細胞に関与する骨髄細胞が皮膚炎の発症に寄与していないことを確認するために、Ｊａｄ／ＪａｄマウスをＲＡＧ１ノックアウトマウス（Chenら、Curr Opin Immunol. 6:313-9, (1994)）又はＫｉｔＷｓｈホモ接合体(Grimbaldestonら、Am J Pathol. 167:835-48, (2005))と交配させた。ＲＡＧ１ノックアウトマウス（ＲＡＧ１−ＮＯマウス）は、成熟リンパ球が形成されないミュータントマウスであり、ＫｉｔＷｓｈホモ接合体は肥満細胞が形成されないミュータントマウスである。ＲＡＧ１−ＮＯ：Ｊａｋ１二重ミュータントマウス、及びＫｉｔＷｓｈ：Ｊａｋ１二重ミュータントマウスのいずれにおいてもＳＰＦ条件下で皮膚炎を発症した（表２）。
【００９２】
【表１】
2011083279.tif 000002
【００９３】
【表２】
2011083279.tif 000003
【００９４】
ＲＡＧ１欠損条件で、発症時期が遅れ臨床スコアが減少したことは、リンパ球の機能が皮膚炎の発症や進行の後に影響を与えているかもしれないことを示しているが、これらの遺伝的試験は皮膚炎の発症に皮膚組織が寄与していることを確認するものであった。
【００９５】
実施例５  ミュータントマウスにおける皮膚バリア透過性の破壊
ミュータントマウスの皮膚における皮膚炎の発症／進行のメカニズムを知る為に、まず、ミュータントマウスの皮膚におけるリン酸化されたＪａｋ１蛋白質（ｐＹ−Ｊａｋ１）を解析した。ｐＹ−Ｊａｋ１が皮膚炎を生じている皮膚表皮層に強く蓄積していることが確認され、野生型同腹仔の皮膚表皮では稀であった（図５ａ）。ｐＹ−Ｊａｋ１は表皮にのみ検出され、真皮には検出されなかった。ｐＹ−Ｊａｋ１の蓄積は、皮膚炎が発症する前であってもミュータント皮膚表皮で認められ（図５ｃ）、さらに幾つかの分化マーカー分子が表皮層で異常に発現していた（図５ｃ）。
ミュータントマウスの耳皮膚中での強いＫｉ６７の発現は、表皮層細胞の過剰な増殖を示している。野生型の同腹仔の皮膚中ではなく、ミュータントマウスの皮膚中でサイトケラチン６が発現していることは、ミュータントマウスの皮膚の表皮角化細胞の分化が混乱状態にあることを示している。野生型マウスでは表皮の基底膜においてのみ見られるサイトケラチン１４の発現が、ミュータントマウスの皮膚ではいずれの層においても観察され、このことは、正常な分化からの混乱を示している。ミュータントマウスの皮膚におけるサイトケラチン１０の大量発現は、ミュータントマウス表皮における表皮角化細胞の増殖を示している。以上の結果より、ミュータントにおける皮膚炎の発症には表皮ケラチノサイトが寄与していると想定された。
表皮層の機能的欠損が皮膚炎を生じさせているということを確認するために、ミュータントマウスの皮膚透過性バリア機能を調べた。皮膚バリア透過性の破壊はアトピー性皮膚炎の患者でよく知られている現象である(Corkら、J Allergy Clin Immunol. 118:3-21, (2006); Bieberら、N Engl J Med. 358:1483-94, (2008))。経皮水分蒸散量（trans-epidermal water loss；TEWL）の算出は、皮膚バリア機能を評価する方法として良く知られている(Rosadoら、Int J Cosmet Sci. 27:237-41, (2005))。ミュータントマウスホモ接合体、ヘテロ接合体及び野生型の同腹仔の耳皮膚のＴＥＷＬをそれぞれ調べたところ、ＴＥＷＬは、皮膚炎を発症する前、４週齢からホモ接合体マウスで高値を示し、次第に増加した。皮膚炎が発症した後では、発症時期である８〜１０週目、及び皮膚の苔蘚化が見られる２０週目のいずれにおいても、ＴＥＷＬはホモ接合体の皮膚で極めて高値を示した（図６ａ）。
皮膚からの水分蒸発を保護するという皮膚バリア機能を示すＴＥＷＬ試験に加えて、外部から皮膚への小分子の浸潤を保護するという皮膚バリア機能を調べた（図６ｂ）。ビオチン粒子を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をマウスの耳皮膚に適用した。ビオチン粒子はミュータントマウスホモ接合体の耳皮膚には容易に浸潤するのに対し、野生型マウスの耳皮膚には浸潤しなかった。図中の矢印は、ビオチン粒子が表皮棘層で、ホモ接合体ミュータントマウスの皮膚に深く浸潤している箇所を示したものである。一方、野生型の皮膚表皮中にはビオチン粒子は浸潤しなかった。界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を生理食塩水中に含めた場合、野生型マウス表皮中でも、同様のビオチンの浸潤が観察された。
以上の結果より、変異Ｊａｋ１の過剰な活性化が表皮ケラチノサイトの異常な発生とそれに伴う皮膚バリア機能の欠損を引き起こすことが示唆される。
【００９６】
実施例６  Ｊａｋ１阻害剤の皮膚炎発症に及ぼす影響
上記実施例から、ミュータントマウスにおける皮膚炎は、Ｊａｋ１の過剰な活性化及びそれに伴う皮膚バリアの欠損によって引き起こされることが示された。この仮説を確かめる為に、生後４週間のミュータントマウス及びその同腹仔の耳皮膚にＪａｋ阻害剤を塗布した。阻害剤が表皮層に深く浸透するように、阻害剤の溶媒として、アセトンとオリーブオイルの組み合わせを用いた。実際、この溶媒自体は、表皮バリア形成に有害でありミュータントマウスの皮膚炎発症はこの溶媒を投与することによって促進された。しかしながら、Ｊａｋ阻害剤を含有させることによって、溶媒単独で処理した場合に比べて、皮膚炎の発症を１週間遅らせ、その臨床症状も軽いものであった（図５ｂ）。Ｊａｋ阻害剤コーティングは、発症を予防する能力に加えて、皮膚炎が発症した後でも疾患の進行を抑えることができた。これらの知見から、Ｊａｋ阻害剤の局所適用は、疾患発症の予防のみならず、疾患の進行をも予防し得る薬剤として有望であることがわかる。
幾つかの分化マーカー分子が表皮層で異常に発現していたので、ミュータントマウスにおいて、Ｊａｋ阻害剤でＪａｋ１活性を阻害した場合に、それらの分化マーカー分子の発現がどのように変化するか免疫組織学的染色により調べた（図５ｃ）。Ｊａｋ１活性を阻害することにより、ミュータントマウス耳皮膚におけるｐＹ−Ｊａｋ１発現及びＫｉ６７発現を減少させることができた。対象的に、溶媒のみを適用したマウスではＪａｋ１及びＫｉ６７は過剰に活性化された。このことは、Ｊａｋ阻害剤の局所適用がＪａｋ１の過剰な活性化を防ぐのに役に立つということを示している。アセトン−オリーブオイル単独で処置したマウスの耳皮膚では全てのマーカーが、未処置のマウスの皮膚に比べて高く発現していた。そして表皮細胞の核の形状をＤＡＰＩで染色すると、全ての上皮細胞が活性化されていることがわかった。
【００９７】
実施例７  ワセリンコーティングの皮膚炎発症に及ぼす影響
皮膚透過性バリアの破壊が、このミュータントマウスにおける皮膚炎発症の原因となっているのかを調べる為に、マウスの耳皮膚に、１週間に３回、４〜１６週間、ワセリンコーティングを単独で施した。驚くべきことに、ミュータントマウスの耳皮膚にワセリンを塗付することによって、未処置のミュータントマウスに比べて発症が平均４週間遅延した。臨床スコア曲線では、平均の値では、Ｊａｋ阻害剤を適用した群よりも、未処置群の方が疾患の進行が緩やかであったが、これらの系には、１６週目まで全く発症しなかった動物も含まれている。いったん発症したら、臨床スコアの上昇傾斜は、対照マウスのそれとほとんど一致していた（図６ｃ）。
興味深いことに、耳をいったん掻き始めた動物では、ワセリンコーティングは疾患の進行に何の影響も与えなかった。発症を完全に抑えることができることを期待して、Ｊａｋ阻害剤をワセリンに加えてみたが、何の相加的な効果も観察されなかった。ワセリン処理によって小粒子の浸潤もまた阻害された。ワセリンコーティングにより皮膚炎発症を完全に予防し得ることは、ワセリンによって水の蒸発から皮膚が保護されることが皮膚バリアを維持するのに都合がよいことを示している。この知見は、ＳＰＦ条件下でも、初期の疾患の発症には、破壊された皮膚バリアを介して何らかの外因性の刺激が必要であるという可能性を提起した。
この可能性に関連して、動物飼育室の衛生状態の影響について観察した。ＳＰＦ条件下で飼育した雌性Ｊａｄヘテロ接合体は、全て生後１年間は皮膚炎を発症しなかったが、雄性マウスでは喧嘩によって皮膚が傷つくと皮膚炎を発症したものがいた（データ示さず）。このことは、創傷リモデリングあるいはある種の菌の感染による未知の刺激がヘテロ接合体雄性マウスにおけるアトピー性皮膚炎の発症に重要な役割を担っていることを示唆している。衛生状態の影響を調べる為に、ヘテロ接合体マウスのケージをＳＰＦクリーンルームからコンベンショナルな飼育室に移した。移してから５か月で全てのヘテロ接合体マウスがアトピー性皮膚炎を発症した。上記知見により、実際には、表皮を介した外因性の刺激が皮膚炎の発症の進行に寄与していることが示唆される。
【００９８】
実施例８  Ｊａｋ１を介する信号伝達
皮膚炎発症前にミュータントマウスにおいて活性化される分子を同定するために、発症前の生後２週間及び４週間でマウスの耳皮膚からｍＲＮＡを採取し、マイクロアレイ解析、あるいは定量的ＰＣＲ解析によりｍＲＮＡの発現を調べた。
ミュータントマウスホモ接合体、ヘテロ接合体及び野生型のマウスの耳皮膚をそれぞれサンプルとし、種々のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１７、ＩＬ−３１及びＴＳＬＰ）のｍＲＮＡ発現を調べた。Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１３の発現レベルが発症前では皮膚組織中で上昇するのに対し、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの発現レベルは上昇しなかった（図７）。
【００９９】
実施例９  皮膚炎症性疾患発症時の遺伝子発現のマイクロアレイによる解析
生後２週齢、４週齢、６週齢においてアトピー性皮膚炎マウス及びその同腹野生型マウスの耳組織でのｍＲＮＡ発現をマイクロアレイ比較で比較した。その発現比率が２倍を超えるもので、４週齢と６週齢で共通するものを下記表に示す。
【０１００】
【表３】
2011083279.tif 000004
【０１０１】
【表４】
2011083279.tif 000005
【０１０２】
表中右側３列の数値は２週齢、４週齢ならびに６週齢において、アトピー性皮膚炎を発症しているミュータントマウスホモ接合体の皮膚におけるｍＲＮＡ発現量を分母に、野生型ｍＲＮＡ発現量を分子において計算したものである、すなわち、数値が２を超えるものはミュータントマウスにおいて発現量が低下しているもので、数値が０．５を下回るものがミュータントマウスにおいて発現量が亢進しているものである。２週齢における数値は発現比率が２倍を超えたもののみについて記載した。
【０１０３】
さらに、Proteinase, serine 27 (marapsin)は、タンパク質レベルでも皮膚表面
での発現量の増加が観察された（図９）。
【０１０４】
２週齢から４週齢、さらに６週齢と、少なくとも発症前一ヶ月にわたって発現が亢進しているものとして、以下の１１の遺伝子が挙げられる。
Ubiquitin specific peptidase 18;
Psoriasis susceptibility 1 candidate 2 (human);
ATPase, H+/K+ transporting, nongastric, alpha polypeptide;
Receptor transporter protein 4;
Phosphodiesterase 1B, Ca2+-calmodulin dependent;
WAP four-disulfide core domain 12;
Kallikrein related-peptidase 6;
Extracellular proteinase inhibitor;
Aldehyde oxidase 4;
Chitinase 3-like 1;及び
Keratin 16。
【０１０５】
Kallikrein related-peptidase 6（ＫＬＫ６）は、古い皮膚を分解して落屑させることで角質層のターンオーバーにかかわることが知られているＫＬＫ７（別名ＳＣＣＥ）と同じファミリーに属しており、皮膚での発現も確認されていることから同様に角質層のターンオーバーにかかわる可能性がある。また、それらに機能的に関連した分子として、Predicted gene, OTTMUSG00000000971、WAP four-disulfide core domain 12、Extracellular proteinase inhibitor、及びProtease, serine 27が挙げられる。
ミュータントマウスの皮膚において２週齢から６週齢に通じてchitinase 3-like 1分子の発現量が亢進していた（図９）。これは細菌、菌糸や昆虫外皮等の外来異物であるキチン質を捕捉して分解することのできる酵素キチナーゼと類似の構造を持つ物質であり、キチナーゼ同様にキチン質と結合することができるが、分解能は持たない分子である。この分子がミュータントマウスの皮膚で高発現していることは免疫組織化学でも確認しており、この分子の疾患発症における重要性を示唆している。この分子の重要性を示唆する現象が、ヘテロマウスの発症率の飼育環境による変化である。ヘテロマウスを清浄度の低い環境で飼育することでアトピー性皮膚炎発症を誘導できるが、これは皮膚バリアの破壊に加えて、何らかの環境因子（例、細菌感染）による影響を受けるものと考えられる。Chitinase 3-like 1分子は喘息患者における気道上皮で発現亢進していること、同遺伝子のＳＮＰがアレルギー患者において連鎖不平衡を指摘されていること、及び潰瘍性大腸炎患者腸管上皮において発現が亢進することが確認されている。さらに、in vitroの実験からこの分子を腸管上皮細胞に発現させた場合には、感染性細菌の上皮内への取り込みを亢進することが示されている。
以上のことからchitinase 3-like 1のミュータントマウスにおける発現亢進はアレルギー疾患発症の際のハウスダスト等のアレルゲンの取り込み及び細菌感染による皮膚炎の誘発を誘導する効果があると推測できる。
【０１０６】
アトピー性皮膚炎マウスでは皮膚炎発症後掻破行動を繰り返し、そのような機械的刺激により皮膚バリアが破壊されると、組織再生のためにプロテアーゼやそのインヒビターの発現が亢進する。アトピー性皮膚炎マウスの表皮における複数のプロテアーゼやそのインヒビターの発現のバランスにおける乱れが、Protease-Activated Receptor（ＰＡＲ２）を活性化し、かかる活性化がＴＳＬＰ（Thymic stromal lymphopoietin)等のサイトカインの産生を亢進しＴｈ２免疫系の活性化に作用している可能性が示唆される。
【０１０７】
実施例１０  Ｓｏｃｓ３の表皮細胞特異的欠失による乾癬用皮膚炎の発症誘導
生体にはＪａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝達系による活性化経路を抑制的に制御するシステムが存在しており、Suppressor of Cytokine Signaling（ＳＯＣＳ）はその代表的なシステムである。Ｓｏｃｓ分子はファミリーを構成しており、そのファミリー分子の中のＳｏｃｓ３はＪａｋ１からの信号伝達を抑制的に制御することが知られていることから、同遺伝子を角化細胞特異的に欠失させたＫ５ｃｒｅＴｇＸＳｏｃｓ３  ｆ／ｆマウス（Ｓｏｃｓ３欠損マウス）を作製した。
すなわち、ＳＯＣＳ３遺伝子の皮膚での発現を欠損させるために、ｌｏｘｐ配列でＳＯＣＳ３遺伝子を挟み込んだゲノム配列を相同組み換えにより作成したノックインマウスを作成し、これを皮膚特異的にＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスＫ５ＣｒｅＴＧと交配させることで皮膚特異的にｌｏｘｐ配列で挟んだ領域を欠失させることができる。このようにして皮膚特異的Ｓｏｃｓ３欠損マウスを作製した。
Ｓｏｃｓ３欠損マウスは、生後３ヶ月齢より引っ掻き行動を伴う皮膚炎を発症し始め、生後５ヶ月齢には９０％以上の個体で重度の皮膚炎を発症した。これら皮膚炎を発症したマウスにはいずれもＩｇＥ抗体価の上昇が認められたが、アトピー性皮膚炎に特徴的に見られる皮膚炎部位での肥満細胞の増加あるいは脱顆粒はみとめられなかったため、アトピー性皮膚炎とは異なる皮膚炎であると考えられた。Ｓｏｃｓ３欠損マウスの病変部位には好中球の浸潤と重度の血管拡張が認められ、その皮膚炎の病態は乾癬様を示していた。
これまで確立された疥癬モデルにはＴｈ１７細胞を介するIL-23-Stat3-Th17-IL-22-Defensine／抗菌蛋白Ｓ１００Ａ７経路とＴ細胞非依存的なIL-23-Stat3-IL-19/IL-20/IL-24-Defensine／抗菌蛋白Ｓ１００Ａ８／Ａ９経路の２つのモデルが提唱されている。ところが、Ｓｏｃｓ３欠損マウスにおける疥癬様皮膚炎は、ＩＬ−６を起点とするIL-6-Stat3-IL-19/IL-24-DefensineとＳ１００Ａ８／Ａ９の経路によって制御されており、従来のモデルとは異なる経路を介して乾癬様病態を形成していた。
このことから、Ｓｏｃｓ３は角質細胞の増殖に関与するＩＬ−６によるＳｔａｔ３の活性化を抑制的に制御して、皮膚の異常増殖を抑制し、恒常性を保つ重要な働きを持つことが分かってきた。そして、この抑制機構の破綻は、角質細胞の異常増殖を誘発し、乾癬様の皮膚炎を発症させる事に繋がって行く。この事から、Ｓｏｃｓ３の皮膚の恒常性維持における新しい側面が明らかとなった。
Ｓｏｃｓ３欠損マウスでは、毛剃りクリームによる皮膚バリアの破壊は、角質層の肥厚を誘導するとともに、皮膚炎誘導に繋がるＩＬ−１９、ＩＬ−２４、Ｄｅｆｅｎｓｉｎｅ、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の発現を亢進した。また、この皮膚バリア破壊によって誘導されるこれら変化は、抗ヒスタミン剤耐性、ＦＫ５０６感受性、Ｊａｋ阻害剤感受性であった。
Ｓｏｃｓ３欠損マウス（乾癬モデルマウス）は、高いＩｇＥ抗体価が認められること、転写レベルの解析から皮膚炎部位でのＩＬ−４とＩＬ−１３産生が認められる等、アトピー性皮膚炎モデルと非常に似通った側面も持ち合わせていた。また、このＩｇＥ抗体の上昇は、Ｊａｋ１ミュータントマウスホモ接合体で認められたのと同様、常に皮膚炎発症後に観察された。このことから、Ｊａｋ１変異を有するミュータントマウスホモ接合体と同様、皮膚バリアの破壊がＩｇＥ抗体の上昇に繋がる経緯が予想された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本願発明は、分子レベル、細胞レベルで皮膚炎症性疾患の発症機序の解明に基づいて為されたものであり、アトピー性皮膚炎等の炎症性疾患発症の遺伝子診断、発症予測方法、発症予防方法及び発症後の治療方法の開発等が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
配列番号１：５’ＰＣＲプライマー
配列番号２：５’ＰＣＲプライマー
配列番号３：３’ＰＣＲプライマー
配列番号４：３’ＰＣＲプライマー
配列番号５：５’プローブ
配列番号６：５’プローブ
配列番号７：３’プローブ
配列番号８：３’プローブ
【図２】
2011083279.tif 000006
【図１】
2011083279.tif 000007
【図３】
2011083279.tif 000008
【図４】
2011083279.tif 000009
【図５】
2011083279.tif 000010
【図６】
2011083279.tif 000011
【図７】
2011083279.tif 000012
【図８】
2011083279.tif 000013
【図９】
2011083279.tif 000014
【配列表】
2011083279000001.app