(57)【要約】      （修正有）【課題】ブタを呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）から保護し、ＰＲＲＳＶに感染したブタを治療し、ブタにおいてＰＲＲＳＶを検出する方法の提供。【解決手段】ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のアイオワ株の１個以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるタンパク質、これらのタンパク質の抗原性領域であって、長さが少なくとも５アミノ酸でありかつ次のＰＲＲＳＶ単離体によるチャレンジに対してブタ宿主を効果的に保護する抗原性領域、およびそれらの組合せであって、抗原性に対して本質的でないアミノ酸を保存的に置換することができるものからなる群から選択される少なくとも１個のポリペプチド、及びこのようなタンパク質の有効量を含んでなるワクチン、このようなタンパク質に特異的に結合する抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号： （ＩＳＵ−１２）からなるブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
配列番号： のヌクレオチド１９１〜７３８７（ＯＲＦ１ａ）、
配列番号： のヌクレオチド７３７５〜１１７５７（ＯＲＦ１ｂ）、
配列番号： のヌクレオチド１１７６２〜１２５２９（ＯＲＦ２）、
配列番号： のヌクレオチド１２３８５〜１３１１６（ＯＲＦ３）、
配列番号： のヌクレオチド１２９３０〜１３４６３（ＯＲＦ４）、
配列番号： のヌクレオチド１３４７７〜１４０７６（ＯＲＦ５）、
配列番号： のヌクレオチド１４０６４〜１４５８５（ＯＲＦ６）、および
配列番号： のヌクレオチド１４５７８〜１４９４６（ＯＲＦ７）からなる群から選択される請求項１に記載のＰＲＲＳＶのオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ配列。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡ配列によってコードされる１個以上のポリペプチドを含んでなるＰＲＲＳＶに対する抗体を誘導するための組成物。
【請求項５】
配列番号： （ＩＳＵ−５５）からなるＰＲＲＳＶをコードするＤＮＡ配列。
【請求項６】
配列番号： のヌクレオチド１９１〜７６９９（ＯＲＦ１ａ）、
配列番号： のヌクレオチド７６８７〜１２０６９（ＯＲＦ１ｂ）、
配列番号： のヌクレオチド１２０７４〜１２８４１（ＯＲＦ２）、
配列番号： のヌクレオチド１２６９２〜１３４５８（ＯＲＦ３）、
配列番号： のヌクレオチド１３２１２〜１３７７５ＯＲＦ４）、
配列番号： のヌクレオチド１３７８９〜１４３８８（ＯＲＦ５）、
配列番号： のヌクレオチド１４３７６〜１４５９２（ＯＲＦ６）、および
配列番号： のヌクレオチド１４８９０〜１５２５８（ＯＲＦ７）からなる群から選択される請求項５に記載のＰＲＲＳＶのオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ配列。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド。
【請求項８】
ブタにおいて抗体を誘導するのに有効な配列番号： （ＩＳＵ−５５）によってコードされるＰＲＲＳＶの一定量および生理学的に許容可能なキャリヤーを含んでなる、ＰＲＲＳＶに対する抗体を誘導するための組成物。
【請求項９】
請求項６に記載のＤＮＡ配列によってコードされる１個以上のポリペプチドを含んでなる、ＰＲＲＳＶに対する抗体を誘発するための組成物。
【請求項１０】
上記の５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変を統計学的に有意な量だけ減少させ、この量が接種していない５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変と比較して有意であり、すなわちｐ値が０．０１未満である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
上記の５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変を統計学的に有意な量だけ減少させ、この量が接種していない５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変と比較して有意であり、すなわちｐ値が０．０１未満である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
更にアジュバントを含んでなる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
更にアジュバントを含んでなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
ブタ生殖器および呼吸器疾患からブタを保護する方法であって、請求項８に記載の組成物の有効量をこの疾患から保護する必要があるブタに投与することを含んでなる、方法。
【請求項１５】
上記ワクチンを経口または非経口投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記ワクチンを筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下または鼻内投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ブタ生殖器および呼吸器疾患からブタを保護する方法であって、請求項９に記載の組成物の有効量をこの疾患から保護する必要があるブタに投与することを含んでなる、方法。
【請求項１８】
上記ワクチンを経口または非経口投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
上記ワクチンを筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下または鼻内投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−５５株をＰＲＲＳＶの他の株から識別する方法であって、
（ａ）  下記の２種類のプライマー
５５Ｆ  ５′−ＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣ−３′、および
３ＲＦＬＰ  ５′−ＧＧＣＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧ−３′
を用いてＰＲＲＳＶのＤＮＡ配列を増幅し、
（ｂ）  段階（ａ）の増幅した配列をＤｒａＩで消化し、
（ｃ）  ６２６ｂｐ、１８７ｂｐおよび１３５ｂｐの３種類の制限断片をＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−５５株と相関させる
ことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）から単離されたポリ核酸、ポリ核酸によってコードされるタンパク質および／またはポリペプチド、このタンパク質またはポリ核酸を含んでなるＰＲＲＳＶからブタを保護するワクチン、このタンパク質、ポリペプチドおよびポリ核酸の作成法、ワクチンを用いてＰＲＲＳからブタを保護する方法、ワクチンの製造法、ＰＲＲＳＶに感染したまたは暴露したブタの治療法、およびＰＲＲＳＶの検出法に関する。
【０００２】
背景の説明
ブタの新規で重篤な疾病であるブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は１９８７年に米国で最初に報告され、多くの西欧諸国で急速に認められるに至った（Goyal, J. Vet. Diagn. Invest., 1993, 5:656-664;および米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書に概説されている）。この疾病は成熟した雌ブタや妊娠経験のない雌ブタでの生殖器障害、若い成長期のブタの肺炎および離乳前死亡率の増加を特徴としている（Wensvoort et al., Vet. Q., 13:121-130, 1991; Christianson et al., 1992, Am. J. Vet. Res., 53: 485-488; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。
【０００３】
ＰＲＲＳの原因物質であるブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、欧州で最初に同定され、次いで米国で同定された(Collins et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126)。レリスタッドウイルス（ＬＶ）と呼ばれるＰＲＲＳＶの欧州株は、クローニングされ、配列決定されている（Meulenberg et al., 1993, Virology, 192:62-72およびJ. Gen. Virol., 74:1697-1701; Conzelmann et al., 1993, Virology, 193:329-339）。
【０００４】
ＰＲＲＳＶはArteriviridaeの新規なウイルスの科における単一属アルテリウイルスに分類され、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ増強ウイルス（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が挙げられる（Plagemann & Moennig, 1992, Adv. Virus. Res., 41:99-192; Godeny et al., 1993, Virology, 194:585-596; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書、およびCavanaugh D., 1997, Arch. Virol., 142:629-633）。この群の一本（＋）鎖ＲＮＡウイルスは、ゲノム構成、複製法、形態学およびマクロファージ向性のような多くの特徴を共有している（Meulenberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。無症状感染、および抗体産生が併存する持続性ウイルス血症も、アルテリウイルスの独特な組織病理学的特性である。
【０００５】
抗原、遺伝子および病原変体は、ＰＲＲＳＶ単離体中に報告されている（Wensvoort et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:134-138; Mardassi et al., 1994, J. Gen. Virol., 75: 681-685; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。更に、米国および欧州のＰＲＲＳＶは、２種類の異なる遺伝子型を有する（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。抗原変異性も、同様に様々な北米単離体に存在している(Wensvoort et al., 1992)。顕著な病原性の差は、米国と欧州の単離体の間だけでなく、異なる米国単離体中でも見られている（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。
【０００６】
アルテリウイルスのゲノム構成は、複製がサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ）の３′−共末端ネステドセット(3'-coterminal nested set)の形成を伴う点においてコロナウイルスおよびトロウイルスに類似している（Chen et al., 1993, J. Gen. Virol., 74:643-660; Den Boon et al., 1990, J. Virol., 65:2910-2920; De Vries et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18:3241-3247; Kuo et al., 1991, J. Virol., 65:5118-5123; Kuo et al., 1992; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。幾つかの北米単離体の部分配列も決定されている（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書; Mardassi et al., 1994, J. Gen. Virol., 75:681-685）。
【０００７】
ＰＲＲＳＶのゲノムはポリアデニル化されており、長さが約１５ｋｂであり、８個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ; Meulenberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）を含む。ＯＲＦ１ａおよび１ｂは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼをコードするものと考えられる(Meulenberg et al., 1993)。ＯＲＦ５、６および７は、それぞれグリコシル化膜タンパク質（Ｅ）、未グリコシル化膜タンパク質（Ｍ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）をコードすることが見出された(Meulenberg et al., 1995)。ＯＲＦ２〜４は、膜関連タンパク質の特徴を有すると思われる（Meulenberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。ＬＶのＯＲＦ２〜４は、それぞれＧＰ２、ＧＰ３およびＧＰ４と呼ばれるビリオン関連タンパク質をコードする(Van Nieuwstadt et al., 1996, 70:4767-4772)。
【０００８】
ＯＲＦ５によってコードされたＥＡＶの主要なエンベロープ糖タンパク質はウイルス付着タンパク質であることがあり、中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）はこのタンパク質に向けられている(de Vries, J. Virol., 1992; 66:6294-6303; Faaberg, J. Virol., 1995; 69:613-617)。ＰＲＲＳＶの緊密に関連した要素であるＬＤＶの主要なエンベロープタンパク質もＯＲＦ５によってコードされ、数種類の異なる中和ＭＡｂがＯＲＦ５タンパク質を特異的に免疫沈降することが分かった(Cafruny et al., Vir. Res., 1986; 5:357-375)。従って、ＯＲＦ５によってコードされる主要なエンベロープタンパク質は、ＰＲＲＳＶに対する中和抗体を誘導することがあると思われる。
【０００９】
ＯＲＦ５中の数種類の超可変領域を同定し、抗原性であると予想した（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。ウイルスの抗原性変更は宿主免疫応答による変異体の直接的選択の結果であると提案されている（Domingo et al., J. Gen. Virol., 1993, 74:2039-2045による概説）。従って、これらの超可変領域は、宿主の免疫選択圧力によるものと思われ、ＰＲＲＳＶ単離体中で抗原多様性が観察されることを説明することができる。
【００１０】
ＩＳＵ３９２７などの米国のＰＲＲＳＶ単離体のＭおよびＮタンパク質は、硬度に保存される（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。ＭおよびＮタンパク質はＰＲＲＳＶビリオンの構造を保存する上で不可欠のものであり、Ｎタンパク質は機能的に厳しく制約を受けることがある。従って、（ａ）ＭおよびＮタンパク質は主要抗体選択圧力に暴露されたり、または（ｂ）ＭおよびＮタンパク質をコードすると思われるＯＲＦ６および７はウイルスビルレンスに関与しているかまたはこれと相関しているとは思われない。しかしながら、興味深いことには、ＬＤＶＭタンパク質の更に高度な配列変異が異なる神経ビルレンスを有するＬＤＶ単離体の間で見られた(Kuo et al., 1992, Vir. Res., 23:55-72)。
【００１１】
ＯＲＦ１ａおよび１ｂは、フレームシフトによって単一タンパク質（ウイルスポリメラーゼ）に翻訳されることが予想される。ＯＲＦ２〜６は、ウイルス膜関連タンパク質をコードすることができる。
【００１２】
ゲノムＲＮＡに加えて、多くの動物ウイルスは１種類以上のｓｇｍＲＮＡ種を産生し、制御された仕方でウイルス遺伝子を発現させる。ＰＲＲＳＶに感染した細胞では、３′共末端ネステドセット(3'-coterminal nested set)を表す７種類のウイルス特異性ｍＲＮＡが合成される（ｍＲＮＡ１〜７、この順に大きさが減少）。ｍＲＮＡ１はゲノムｍＲＮＡを表す。それぞれのｓｇｍＲＮＡは、ウイルスゲノムの５′末端由来のリーダー配列を含む。
【００１３】
ｓｇｍＲＮＡの数は、アルテリウイルスの間で異なり、同一ウイルスの異なる単離体の間でも異なる。ＥＡＶ感染細胞および欧州ＰＲＲＳＶ感染細胞では、６個のｓｇｍＲＮＡのネステドセット(nested set)が検出された。しかしながら、ＬＤＶ感染細胞では、ゲノムＲＮＡの他に、６個の（ＬＤＶ−Ｃ）または７個の（ＬＤＶ−Ｐ）ｓｇｍＲＮＡのネステドセット(nested set)が含まれている。ＬＤＶ−Ｐの追加のｓｇｍＲＮＡ１−１は、ＯＲＦ１ｂの３′末端を含み、ウイルスポリメラーゼのＣ−末端を表すタンパク質に潜在的に翻訳することができる。ＬＤＶおよびＥＡＶのｓｇｍＲＮＡの配列分析は、リーダー−ｍＲＮＡ結合モチーフが保存されることを示唆している。最近、欧州ＬＶのリーダー−ｍＲＮＡ結合配列も、共通モチーフＵＣＡＡＣＣまたは硬度に類似した配列を含むことが示された。
【００１４】
ｓｇｍＲＮＡは、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）および伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）のような幾つかのコロナウイルスのビリオン中にパッケージされていることが示されている。しかしながら、別種のコロナウイルスであるマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）の精製ビリオンには、微量のｓｇｍＲＮＡしか検出されなかった。ＰＲＲＳＶの関連性の高いウイルスであるＬＤＶのｓｇｍＲＮＡもビリオンにはパッケージされず、精製ＬＤＶビリオンにはゲノムＲＮＡしか検出されなかった。
【００１５】
ＬＤＶおよびＥＡＶのｓｇｍＲＮＡは、詳細に特性決定されている。しかしながら、ＰＲＲＳＶ株、特に米国ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡに関する情報は極めて限定されたものである。従って、米国ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡを更に完全に特性決定する必要があると思われる。
【００１６】
ＭＨＶのパッケージングシグナルはＯＲＦ１ｂの３′末端に位置しており、従ってＭＨＶのゲノムＲＮＡのみがパッケージされる。しかしながら、ＢＣＶおよびＴＧＥＶのｓｇｍＲＮＡは精製ビリオン中に見出されている。ＢＣＶおよびＴＧＥＶのパッケージングシグナルは、決定されていない。アウラアルファウイルスｓｇｍＲＮＡは、パッケージングシグナルがｓｇｍＲＮＡに存在すると思われるため、ビリオンに効率的にパッケージされる。シンドビスウイルス２６ＳのｓｇｍＲＮＡは、パッケージングシグナルが（ｓｇｍＲＮＡには存在せず）ゲノム部分にあるので、ビリオンにはパッケージされない。
【００１７】
ｓｇｍＲＮＡの発生には、数種類の機構が関与している。コロナウイルスは、ユニークなリーダーＲＮＡによって開始された転写機構であって、リーダーＲＮＡであって、リーダーＲＮＡをゲノムの大きさの（−）鎖鋳型ＲＮＡの３′末端から転写され、この鋳型から解離した後、下流の遺伝子間領域で鋳型ＲＮＡに再結合して、ｓｇｍＲＮＡの転写を開始する機構を利用している。このモデルから、５′リーダーがその３′末端に特異配列を含み、ＯＲＦ２〜７のそれぞれに先行してゲノム中で更に下流で反復していることが予想される。リーダーは、ｓｇｍＲＮＡのそれぞれの本体にリーダー−ｍＲＮＡ結合部分を介して結合している。
【００１８】
ＰＲＲＳＶの様々な株が、続いて特性決定されている（Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest., 8:11-20 (1996); Meng et al., J. Vet. Diagn. Invest., 8:374-381 (1996); Meng et al., J. Gen. Virol., 77: 1265-1270 (1996); Meng et al., J. Gen. Virol., 76:3181-3188 (1995); Meng et al., Arch. Virol., 140:745-755 (1995); Halbur et al., Vet. Pathol., 32:200-204 (1995); Morozov et al., Arch. Virol., 140: 1313-1319 (1995); Meng et al., J. Gen. Virol., 75:1795-1801 (1994); Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest., 6:254-257 (1994); 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）。
【００１９】
ＰＲＲＳＶは、養豚施設(nursery)および離乳したブタの肺炎の重要な原因である。ＰＲＲＳＶは、養豚施設のブタの肺炎によりかなりの経済的損失を引起す（その正確な程度は完全には知られていない）。ＰＲＲＳＶの比較的低ビルレンス株が初期に流行るため、過去数年間は生殖器疾患がＰＲＲＳＶ感染症の支配的な臨床的結果であった。ＰＲＲＳＶの比較的高ビルレンス株が流行ってきているため、呼吸器疾患がＰＲＲＳＶに関連した主要な問題となってきた。様々なＰＲＲＳＶ株によって引起される疾患から保護するためのワクチンが必要であると思われる。
【００２０】
意外なことには、米国および世界的にも動物ワクチンの市場は、ヒトワクチンの市場より大きい。従って、家畜を疾病から保護することによって誘導される実質的な講習衛生上の利点の他に、新規な獣医用ワクチンの開発が経済的に奨励されている。
【００２１】
発明の概要
従って、本発明の目的は、
配列番号： （ＩＳＵ−１２）または
配列番号： （ＩＳＵ−５５）を含むブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【００２２】
本発明のもう一つの目的は、
配列番号： のヌクレオチド１９１〜７３８７（ＯＲＦ１ａ）、
配列番号： のヌクレオチド７３７５〜１１７５７（ＯＲＦ１ｂ）、
配列番号： のヌクレオチド１１７６２〜１２５２９（ＯＲＦ２）、
配列番号： のヌクレオチド１２３８５〜１３１１６（ＯＲＦ３）、
配列番号： のヌクレオチド１２９３０〜１３４６３（ＯＲＦ４）、
配列番号： のヌクレオチド１３４７７〜１４０７６（ＯＲＦ５）、
配列番号： のヌクレオチド１４０６４〜１４５８５（ＯＲＦ６）、および
配列番号： のヌクレオチド１４５７８〜１４９４６（ＯＲＦ７）を包含する、または
【００２３】
配列番号： のヌクレオチド１９１〜７６９９（ＯＲＦ１ａ）、
配列番号： のヌクレオチド７６５７〜１２００９（ＯＲＦ１ｂ）、
配列番号： のヌクレオチド１２０７４〜１２８４１（ＯＲＦ２）、
配列番号： のヌクレオチド１２６９７〜１３４５８（ＯＲＦ３）、
配列番号： のヌクレオチド１３２４２〜１３７７５（ＯＲＦ４）、
配列番号： のヌクレオチド１３７８９〜１４３８８（ＯＲＦ５）、
配列番号： のヌクレオチド１４３７６〜１４８９７（ＯＲＦ６）、および
配列番号： のヌクレオチド１４８９０〜１５２５８（ＯＲＦ７）を包含する
ＩＳＵ−１２のＩＳＵ−５５のオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【００２４】
また、本発明の目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５をコードするＤＮＡ配列、またはそれらの１種類以上のＯＲＦによってコードされるポリペプチドを提供することである。
【００２５】
更にもう一つの本発明の目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５の１種類以上のＤＮＡ配列によってコードされる１種類以上のポリペプチドを含んでなるＰＲＲＳＶに対する抗体を誘導する組成物を提供することである。
【００２６】
本発明のもう一つの目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５の１種類以上のＯＲＦのＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの有効量をブタ生殖器または呼吸器疾患から保護する必要のあるブタに投与することによって、ブタを上記疾患から保護する方法を提供することである。
【００２７】
更にもう一つの本発明の目的は、ＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−５５株をＰＲＲＳＶの他の株から識別する方法であって、
（ａ）  下記の２種類のプライマー
５５Ｆ  ５′−ＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣ−３′、および
３ＲＦＬＰ  ５′−ＧＧＣＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧ−３′
を用いてＰＲＲＳＶのＤＮＡ配列を増幅し、
（ｂ）  段階（ａ）の増幅した配列をＤｒａＩで消化し、
（ｃ）  ６２６ｂｐ、１８７ｂｐおよび１３５ｂｐの３種類の制限断片をＰＲＲＳＶ  ＩＳＵ−５５株と相関させる
ことを特徴とする、方法を提供することである。
【００２８】
上記および他の目的は、下記の好ましい態様の説明によって明らかになるものであり、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のアイオワ株の１種類以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされたタンパク質、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ２によってコードされたタンパク質と少なくとも９４％であるが１００％未満の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ３によってコードされたタンパク質と少なくとも８８％であるが１００％未満の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ４と少なくとも９３％の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ５と少なくとも９０％の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ６およびＯＲＦ７の一方または両方によってコードされたタンパク質と少なくとも９７％であるが１００％未満の相同性を有するタンパク質、長さが少なくとも５アミノ酸でありかつブタ宿主中でＰＲＲＳＶ単離体による攻撃に対して防御を効果的に刺激する上記タンパク質の抗原性領域、およびそれらの組合せからなる群から選択される精製および／または単離されたポリペプチド、上記のポリペプチドまたはポリペプチド類をコードする単離されたポリ核酸、上記のポリヌクレオチドまたは（複数の）ポリペプチドの有効量を含んでなるワクチン、上記のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体、上記のものの産生法、および(i)ＰＲＲＳからブタを効果的に保護する、（ii）ＰＲＲＳＶに暴露されたまたはＰＲＲＳに罹っているブタを治療する、および（iii）上記のものを用いてＰＲＲＳＶを検出する方法によって提供されたものである。
【００２９】
好ましい態様の詳細な説明
本出願では、低ビルレンス単離体および「中」および高ビルレンスを有する４種類の他のオイオワ株ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列を決定した。様々なＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜７の比較に基づいて、既知の最小ビルレンスの米国単離体（ＩＳＵ３９２７）は、ＯＲＦ２〜４には他の米国単離体と比較して比較的高い配列変異がある。更に、ＯＲＦの配列の分析に基づけば、米国ＰＲＲＳＶの主要な遺伝子型には少なくとも３種類の副遺伝子型(minor genotype)が存在する。
【００３０】
様々なＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ５タンパク質の配列分析は、非保存アミノ酸置換を含む３種類の超可変領域を示している。これらの領域は、コンピューター分析によって予想されたように、親水性でありかつ抗原性でもある。
【００３１】
本発明において、「ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス」または「ＰＲＲＳＶ」は、ＰＲＲＳＶのアイオワ株、米国で発見された他のＰＲＲＳＶの株（例えば、ＶＲ２３３２）、カナダで発見されたＰＲＲＳＶの株（例えば、ＩＡＦ−ｅｘｐ９１）、欧州で発見されたＰＲＲＳＶの株（例えば、レリスタッドウイルス、ＰＲＲＳＶ−１０）、およびこれまでに出現しかつ将来に出現するこれらのウイルスの関連性の高い変異株などのＰＲＲＳ、ＰＥＡＲＳ、ＳＩＲＳ、ＭＳＤ、および／またはＰＩＰ（「ＰＩＰ」という用語は現在では用いられなくなっている）といった疾患を引起すウイルスを表す。
【００３２】
ＰＲＲＳＶの「アイオワ株」としては、（ａ）本発明者らによってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に寄託された、および／または本願明細書および／または先行米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書のいずれかに記載されているＰＲＲＳＶ単離体、（ｂ）ＣＲＬ１１１７１細胞中で培養またはこれを通過させるときに６種類を上回るｓｇｍＲＮＡを産生するＰＲＲＳウイルス、（ｃ）感染から１０日後に５週齢のカエサリアン(caesarean)由来の初乳を欠失した子ブタに少なくとも４０％の総肺病変または肺硬化を生じるＰＲＲＳＶ、（ｄ）下記の表２に記載のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦへの相同性が最小限であるタンパク質をコードするゲノムを有するＰＲＲＳＶ単離体、および／または（ｅ）このようなウイルスを識別する特徴を有する任意のＰＲＲＳＶが挙げられる。
【００３３】
本発明のワクチンがブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）による感染からブタを保護する場合には、このワクチンは有効である。ワクチンを感染していないブタに投与した後、生物学的に純粋なウイルス単離体（例えば、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６または下記の他のウイルス単離体）を接種したとき、保護されていない同様なブタで単離体によって典型的に引起される変化や症状と比較して（すなわち、適当な対照物に対して）、疾患のあらゆる総体的または組織病理学的変化（例えば、肺の病巣）および／または症状が軽くなる場合には、このワクチンはＰＲＲＳＶによる感染からブタを保護する。更に具体的には、本発明のワクチンは、ワクチン投与を必要としている１頭以上の適当なブタに投与した後、適当な時間（例えば、１〜４週）の後、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ単離体の大きな試料（１０３〜７ＴＣＩＤ５０）を接種することによって有効であることを示すことができる。次に、血液試料を接種したブタから約１週間後に採取し、血液試料からウイルスを単離する試みを行う（例えば、下記の実験VIIIに示したウイルス単離手続きを参照）。ウイルスが単離されれば、ワクチンが有効でない可能性があることを示唆しており、ウイルスを単離することができなければ、ワクチンが有効である可能性があることを示唆している。
【００３４】
従って、本発明のワクチンの有効性を定量的に（すなわち、適当な対照群と比較して硬化した肺組織の比率の減少）または定性的に（例えば、血液からのＰＲＲＳＶの単離、免疫ペルオキシダーゼ分析法（下記）による肺、扁桃またはリンパ組織試料でのＰＲＲＳＶ抗原の検出など）評価することができる。ブタ生殖器および呼吸器疾患の症状は、定量的（例えば、体温／熱）、半定量的（例えば、呼吸困難の程度（下記に詳細に説明）、または定性的（例えば、１以上の症状の存在または非存在、またはチアノーゼ、肺炎、心および／または脳の病変の様な１種類以上の症状の緩快など）に評価することができる。
【００３５】
未感染ブタは、ブタ生殖器および呼吸器疾患感染性物質に暴露されたことがない、またはブタ生殖器および呼吸器疾患感染性物質に暴露されたことがあるがこの疾患の症状を示さないブタである。感染ブタは、ＰＲＲＳの症状を示す、またはＰＲＲＳＶを単離することができるブタである。
【００３６】
ＰＲＲＳの臨床的兆候または症状としては、嗜眠、呼吸困難、「サンピング(thumping)」（強制呼気）、熱、ヘアコートの荒れ(roughened haircoats)、くしゃみ、咳、眼浮腫(eye edema)、および場合によっては結膜炎を挙げることができる。病変としては、総体的および／または微視的肺病変、心筋炎、リンパ節炎、脳炎および鼻炎を挙げることができる。更に、ＰＲＲＳＶおよびアイオワ株の余りビルレンスが高くないおよび非ビルレンス形態であって、上記症状のサブセットを引起すことができるかまたは症状を全く引起さないものも見出されている。ＰＲＲＳＶの余りビルレンスが高くないおよび非ビルレンス形態は、それでもなお本発明に従って用いてブタ生殖器および呼吸器疾患から保護することができる。
【００３７】
「ポリ核酸」という用語は、ウイルスまたは感染性物質から単離されたＲＮＡまたはＤＮＡに相当するまたは相補性のＲＮＡまたはＤＮＡ、並びにｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを表す。「ＯＲＦ」とは、ＰＲＲＳＶゲノムなどのウイルスゲノムから単離されたオープンリーディングフレームまたはポリペプチドコードセグメントを表す。本発明において、ＯＲＦは、部分（画分として）または全体が包含され、かつ隣接ＯＲＦの５′−または３′−配列（例えば、下記の図１および実験１を参照）と重複することができる。「ポリヌクレオチド」はポリ核酸と同等であるが、特有の分子または分子の群を定義することがある（例えば、ポリ核酸の群のサブセット）。
【００３８】
下記の実験において、（ａ）低ビルレンス米国ＰＲＲＳＶ単離体および（ｂ）様々なビルレンスの他の２種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５の単離、クローニングおよび配列決定を行った。これら３種類のヌクレオチドおよびアミノ酸の推定配列を、他の既知のＰＲＲＳＶ単離体の相当する配列と比較した（例えば、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書を参照）。これらの結果は、かなりの遺伝子変異が米国ＰＲＲＳＶと欧州ＰＲＲＳＶとの間だけでなく、米国単離体でも見られることを示している。
【００３９】
検討を行った７種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体間のアミノ酸配列アイデンティティーは、ＯＲＦ２では９１〜９９％であり、ＯＲＦ３では８６〜９８％であり、ＯＲＦ４では９２〜９９％であり、ＯＲＦ５では８８〜９７％であった。既知の最小ビルレンス米国単離体（ＩＳＵ３９２７）は、他の米国単離体と比較して、ＯＲＦ５〜７よりもＯＲＦ２〜４での配列変異が高い。抗原ポテンシャルを有する３種類の超可変領域は、ＯＲＦ５によってコードされる主エンベロープ糖タンパク質で同定されている。
【００４０】
ＯＲＦ２〜７の配列の対方式の比較および系統樹分析は、米国ＰＲＲＳＶの主遺伝子型内では少なくとも３群のＰＲＲＳＶ変異体（または副遺伝子型(minor genotype)）が存在することを示していた。既知の最小ビルレンス米国単離体は、異なるビルレンスを有する他の米国単離体とは異なる枝を形成する。この研究の結果は、ＰＲＲＳＶおよびワクチン開発の分類学に関連を有する。
【００４１】
もう一つのの実験では、ＰＲＲＳＶに感染した細胞のｓｇｍＲＮＡを特性決定した。データーは、６または７個のｓｇｍＲＮＡの３′共末端ネステドセット(3'-coterminal nested set)がＰＲＲＳＶの様々な単離体を感染させた細胞に形成されることを示していた。しかしながら、幾つかのコロナウイルスおよびアルファウイルスとは異なり、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡはビリオン中にはパッケージされず、ＰＲＲＳＶのゲノムＲＮＡのみが精製ビリオンに検出された。様々なビルレンスを有する様々なＰＲＲＳＶ単離体では、ｓｇｍＲＮＡの数の変異も観察された。２種類の米国単離体のＯＲＦ２〜７を更に配列分析し、それらを欧州ＬＶと比較すると、ＰＲＲＳＶのリーダー−ｍＲＮＡの不均一性が明らかになる。
【００４２】
下記の実験２に示すように、６個以上のｓｇｍＲＮＡの３′共末端ネステドセット(3'-coterminal nested set)がＰＲＲＳＶの様々な単離体を感染させた細胞に形成される。ｓｇｍＲＮＡのネステドセット(nested set)の存在は、欧州単離体であるレリスタッドウイルス（ＬＶ）と同様に米国ＰＲＲＳＶはＬＤＶ、ＥＡＶおよびＳＨＦＶなどの新規に提案されたArteriviridae科に属することを示している。ＯＲＦ特異性プローブを用いるノーザンブロット分析は、ＰＲＲＳＶｓｇｍＲＮＡの構造はポリシストロン性であり、ｓｇｍＲＮＡ７を除くｓｇｍＲＮＡのそれぞれが多重ＯＲＦを含むことを示している。従って、それぞれのｓｇｍＲＮＡの配列は隣接するより大きなｓｇｍＲＮＡの３′部分内に含まれ、ｓｇｍＲＮＡの総ての５′末端がより小さなｓｇｍＲＮＡの配列とは重なり合わない。
【００４３】
しかしながら、ｓｇｍＲＮＡの数とウイルス肺炎ビルレンスとの間には明確な相関はない。追加種のｓｇｍＲＮＡ３−１は、その５′末端に４５アミノ酸のコード容量を有する小さなＯＲＦ（ＯＲＦ３−１）を含むことが見出された。
【００４４】
下記の実験２では、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡはビリオン中にパッケージされないことが示されている。ｓｇｍＲＮＡがビリオンにパッケージされるかどうかは、ｓｇｍＲＮＡがパッケージングシグナルを有するかどうかによって変化することがある。ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡはビリオン中にパッケージされないので、ＰＲＲＳＶのキャプシド化シグナルはウイルスゲノムにとってユニークであるが、ｓｇｍＲＮＡには存在しないＯＲＦ１領域に局在していると思われる。
【００４５】
下記の実験２では、ＰＲＲＳＶの２種類の米国単離体ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４の接合部分（リーダー−ｍＲＮＡ接合配列）を決定する。リーダー−ｍＲＮＡ接合配列アイデンティティーの情報により、（ａ）感染性クローンおよび／またはワクチンとして用いられるキメラウイルス、および（ｂ）１個以上の遺伝子を適当な感染可能な宿主に挿入または「往復」させるためのベクターを効果的に産生するための手段が提供される。このようなキメラウイルス、感染性クローンおよびベクターを設計し、産生する方法は、既知である（例えば、Sambrook et al., 「分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨークを参照）。
【００４６】
２個の単離体のｓｇｍＲＮＡ３および４のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は異なっている（ＩＳＵ７９のｍＲＮＡ３−１についてはＴＴＧＡＣＣ、ｍＲＮＡ３についてはＧＴＡＡＣＣ、およびｍＲＮＡ４についてはＴＴＣＡＣＣ）。接合部におけるヌクレオチドの差のほとんどは、最初の３個のヌクレオチドに存在する。最後の３個のヌクレオチドは不変であり、リーダー配列のｓｇｍＲＮＡの本体への結合はリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の５′末端内で起こることを示唆している。同様な観察は、ＬＶ、ＥＡＶおよびＬＤＶについても報告されている。
【００４７】
単離体ＩＳＵ７９における追加のｓｇｍＲＮＡ３−１の獲得は、新規なリーダーｍＲＮＡ接合配列を生成する単一ヌクレオチド置換によるものである。この置換は接合部分の最後のヌクレオチドで起こり、リーダー−ｍＲＮＡ接合モチーフの最後のヌクレオチドはリーダーの結合および転写の開始にとって重要であることを示唆している。
【００４８】
リーダーとコロナウイルスの遺伝子間領域との配列の相同性から、塩基対形成がリーダーによって開始される転写に必須であるという仮説が導かれたが、ｓｇｍＲＮＡの転写において塩基対形成が必要であるということの実験的証明は報告されていない。例えば、融合工程に関与するコロナウイルスおよびアルテリウイルスのいずれにおいてもリーダーの３′末端の配列は知られていないのである。
【００４９】
数種類の証明法がコロナウイルスについてのリーダー開始転写機構を支持しているが、コロナウイルスに感染した細胞にマイナス鎖ｓｇｍＲＮＡおよびｓｇ複製中間体（ｓｇＲＩ）が存在することは、ｓｇｍＲＮＡ合成に関与する機構がリーダー配列の接合配列との単なる塩基対形成より複雑であることを示唆している。しかしながら、マイナス鎖ｓｇｍＲＮＡはＬＤＶを除きアルテリウイルスには検出されておらず、ｓｇＲＩはＥＡＶに感染した細胞だけに検出されている。従って、アルテリウイルス、特にＰＲＲＳＶにおけるｓｇｍＲＮＡ合成は、コロナウイルスより複雑でなくなる可能性がある。
【００５０】
２種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜７の配列合成およびこれらの配列とＬＶとの比較により、リーダー−ｍＲＮＡ接合配列の不均一性が明らかになっている。ｓｇｍＲＮＡに相当しない位置にリーダー−ｍＲＮＡ接合モチーフが存在すると、ＰＲＲＳＶおよび他のアルテリウイルスのゲノムのリーダーおよび接合配列に保存されている６ヌクレオチドのみの短い伸張が、リーダーがＯＲＦの上流のこれらの特異的接合部位へ効率的に結合するのに十分であるかどうかについて疑問が生じる。しかしながら、この明確な矛盾は、下記の２つの可能性によって説明することができる。
【００５１】
第一に、二次構造またはリーダー−ｍＲＮＡ接合部分の周りの配列のような追加的構造要素は、リーダーの特異的部位への融合（結合）に関与していることが予想される。ＭＨＶでは、ＵＣＵＡＡＡＣのコンセンサス配列（リーダー−ｍＲＮＡ接合配列）に隣接する配列がｓｇＤＩＲＮＡ転写の効率に影響を与え、かつコンセンサス配列がＤＩｍＲＮＡの合成に必要であるが、単独では十分でないことが示されている。
【００５２】
第二に、２つのリーダー−ｍＲＮＡ接合領域の距離がｓｇｍＲＮＡの転写に影響することがある。下流のリーダー−ｍＲＮＡ接合領域は上流のリーダー−ｍＲＮＡ接合領域からのＭＨＶのｓｇＤＩＲＮＡ合成を抑制していることが明らかにされている。２個のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の分離が３５ヌクレオチド未満であるときには、抑制は有意であった。しかしながら、２個のリーダー−ｍＲＮＡ接合領域が１００を上回るヌクレオチドによって分離されているときには、（上流のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列からの）より大きなｓｇＤＩＲＮＡ合成の有意な阻害は見られなかった。
【００５３】
以前に報告されている実験結果は、下記の実験２に記載の観察結果と一致しており、ｓｇｍＲＮＡ４の他にｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種がＰＲＲＳＶ単離体の幾つかに見られる。ＰＲＲＳＶのアイオワ株におけるｓｇｍＲＮＡ４および３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は、約２２６ヌクレオチドだけ離れている。従って、上流のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列からのより大きなｓｇｍＲＮＡ３−１の合成は、下流のリーダー−ｍＲＮＡ４接合配列の存在によって抑制されない。  
【００５４】
対照的に、マルチ・ポテンシャル・リーダー−ｍＲＮＡ接合配列(multiple potential leader-mRNA junction sequences)はＯＲＦ３、５、６および７の上流の様々な位置に見出されているが、ノーザンブロット分析ではこれらのリーダー−ｍＲＮＡ接合モチーフに相当するｓｇｍＲＮＡはなかった。これらのリーダー−ｍＲＮＡ接合配列のほとんどは、ＯＲＦ７（ポテンシャル・リーダー−ｍＲＮＡ接合配列(potential leader-mRNA junction sequences)は１１４ヌクレオチドだけ離れている）を除き、下流のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列から５０ヌクレオチド未満だけ離れている。しかしながら、ノーザンブロット分析でのｓｇｍＲＮＡ７は、広汎な広がりのバンドを示した。従って、上流のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列からのより大きなｓｇｍＲＮＡ７の転写は、下流の接合配列によって余り抑制されないことがあるが、これはノーザンブロット分析により多量に存在するｓｇｍＲＮＡ７からは容易には識別されない。
【００５５】
プラーク精製したＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−１２（１９９２年１０月３０日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド２０８５２、米国に登録番号ＶＲ２３８５［プラーク精製３回］およびＶＲ２３８６［プラーク精製なし］で寄託）のＯＲＦ２〜７、およびＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−２２、ＩＳＵ−５５、ＩＳＵ−３９２７（１９９３年９月２９日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)にそれぞれＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０およびＶＲ２４３１の登録番号で寄託）のＯＲＦ６〜７、ＩＳＵ−７９およびＩＳＵ−１８９４（１９９４年８月３１日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)にそれぞれＶＲ２４７４およびＶＲ２４７５の登録番号で寄託）は、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書に詳細に記載されている。しかしながら、これらの遺伝子の単離、クローニングおよび配列決定に用いられる手法は、あらゆるＰＲＲＳＶのゲノムポリ核酸の単離、クローニングおよび配列決定にも応用することができる。従って、本発明は、下記の実験に開示されている特定の配列に限定されない。
【００５６】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡを比較的多量に製造するための（および、所望ならば、転写によりＲＮＡをおよび／または既知のイン・ビボまたはイン・ビトロ法に準じて翻訳によりタンパク質を製造するプライマーは、ＰＲＲＳＶゲノムから得られた２以上の配列が決定されている配列情報（例えば、ＶＲ２３８５、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７４、ＩＳＵ−１８９４、ＶＲ２３３２およびレリスタッドウイルスのＯＲＦ２〜７）に基づいて設計することができる。少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のアイデンティティーを有する長さが約１５〜５０ヌクレオチドの領域を、決定された配列から選択する。欠失が（例えば、少なくとも５ヌクレオチドの）配列の１つに起こる領域を、ＰＲＲＳＶの１つの株または型のポリ核酸をもう一つのものと比較して選択的に増幅するための（例えば、北米および欧州株のＰＲＲＳＶの差別的診断のための）選択的プライマーの製造の基礎として用いることができる。
【００５７】
ゲノムポリ核酸が、既知の方法によって一旦増幅されて、適当な宿主にクローニングされると、クローンは本明細書に開示した配列情報に基づいて設計したプローブでスクリーニングすることができる。例えば、長さが約５０〜５００ヌクレオチドの領域を２個以上の配列（例えば、下記の実験IIIに開示されているＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ６〜７）の高度のアイデンティティー（例えば、少なくとも９０％）に基づいて選択し、適当な長さおよび配列アイデンティティーのポリヌクレオチドを既知の方法（例えば、選択された領域を含むポリ核酸からの適当な断片の自動合成、または制限、ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプライマーを用いるＰＣＲぞうふく、および電気泳動による単離）によって製造することができる。ポリヌクレオチドは、例えば３２Ｐ（放射測定）またはビオチン（蛍光測定法による検出）で標識することができる。このプローブを、次にクローンのポリ核酸とハイブリダイズさせ、既知の方法によって検出する。
【００５８】
本発明者らは、ＯＲＦ２〜４の１個以上をＰＲＲＳＶのビルレンスに関連づけることができることを見出した。例えば、ビルレンスが比較的低いＰＲＲＳＶの少なくとも１個の単離体は、ＯＲＦ４に欠失を有するとも考えられる（例えば、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験VIII〜XI参照）。更に、ビルレンスが最低の既知の単離体（ＶＲ２４３１）は、他の米国ＰＲＲＳＶ単離体と比較してＯＲＦ２〜４におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報において比較的高度の分散を示す。従って、１態様では、本発明はＶＲ２４３１のＯＲＦ２〜４に関連したポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【００５９】
もう一つの態様では、本発明は、次にＰＲＲＳＶによるチャレンジに対して直接または間接的に免疫原的に保護するＰＲＲＳＶ単離体から得たポリ核酸であって、ポリ核酸を含むＰＲＲＳＶを低ビルレント（すなわち、「低ビルレンス」（ｌｖ）表現型、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書における相当する説明を参照）または非ビルレント（いわゆる「欠失変異体」）とする程度まで欠失または変異したポリ核酸に関する。好ましくは、ＯＲＦ２〜４の１種類以上は、ＰＲＲＳウイルスを非ビルレントにする程度まで欠失または変異している。しかしながら、本発明のポリ核酸のＯＲＦ２〜４の１個以上の領域であって、(i)抗原および／または免疫保護ペプチド断片をコードし、（ii）ポリ核酸を含むＰＲＲＳウイルスにはビルレンスを付与しない領域を保持するのが望ましい。
【００６０】
本発明は、ＰＲＲＳＶ自体であって、ＯＲＦ２〜４の１個以上が低ビルレントまたは非ビルレントとする程度まで欠失または変異しているもの（例えば、ＶＲ２４３１）も包含する。このようなウイルスは、ワクチンとしてまたは適当な宿主（例えば、ＭＡ−１０４、ＰＳＰ３６、ＣＲＬ１１１７１、ＭＡＲＣ−１４５、またはブタ肺胞マクロファージ細胞）を外来遺伝子で形質転換するベクターとして用いられる。本発明の欠失変異体を用いて発現することができる好ましい異種遺伝子としては、タンパク質またはブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス抗原以外の抗原（例えば、仮性狂犬病および／またはブタインフルエンザウイルスタンパク質および／またはポリペプチド含有抗原、ブタ成長ホルモンなど）、またはポリペプチドを基剤とするアジュバント（例えば、ワクチン組成物について米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書に記載されているもの）をコードするものが挙げられる。
【００６１】
本発明のポリ核酸のある種の態様では、ＰＲＲＳＶＯＲＦの３′末端領域（例えば、長さが２００〜７００ヌクレオチド）であって、その少なくとも一部が直ぐ下流のＯＲＦの５′領域と重複することがあるものを含むことも望ましい。同様に、ＯＲＦの３′末端領域が直ぐ下流のＯＲＦの５′末端領域と重複する場合には、直ぐ下流のＯＲＦと重複するＯＲＦの５′領域を保持することが望ましいことがある。
【００６２】
本発明者らは、ＰＲＲＳＶゲノムにおけるＯＲＦ５が、ＰＲＲＳＶに感染したまま培養物を支持することができる哺乳類宿主細胞でのウイルスの複製に関係していると思われることも見出した。従って、本発明は、ＰＲＲＳＶゲノムから得たポリ核酸であって、ＯＲＦ５が多重コピー（いわゆる「過剰生産変異体」）に存在することがあるものに関する。例えば、本発明のポリ核酸は、高複製（ｈｒ）表現型ＰＲＲＳＶ単離体からの少なくとも２個の、更に好ましくは２〜１０個のＯＲＦ５のコピーを含むことができる。
【００６３】
興味深いことには、ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−１２はＯＲＦ５の５′末端付近に意外なほど多数のポテンシャル開始コドン（ＡＴＧ／ＡＵＧ配列）を有しており、この遺伝子の交互開始部位を示していると思われる。従って、ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の交互形態が、特に交互ＯＲＦが実験的に決定されたものと同様な分子量を有するタンパク質（例えば、長さが約１５０〜約２５０アミノ酸の）をコードする場合に、存在することができる。ＩＳＵ−１２のＯＲＦ５に対する最も可能性のあるコード領域を、図１に示す。
【００６４】
既知の方法に従って、欠失および過剰生産変異体を製造することができる。例えば、ポリ核酸変異体であって、ポリペプチドをコードする領域の配列に「サイレント」または縮重変化を含むものを製造することができる。適当な縮重突然変異を選択し、作成することによって、既知の制限酵素によって認識されるポリ核酸配列を置換することができる（例えば、下記の実験２参照）。従って、ＯＲＦの３′末端および下流のＯＲＦの５′末端の１または２つでサイレント縮重突然変異を行うと、ｈｒＯＲＦ５タンパク質生成物、ＰＲＲＳＶまたは他のウイルスエンベロープタンパク質および／またはＰＲＲＳＶタンパク質の抗原性断片の１または多数のコピーをコードするポリ核酸を含むことがある合成ポリ核酸（いわゆる「カセット」）を挿入することができる。この「カセット」には適当な開始コドン（ＡＴＧ）が先行することがあり、３′末端における終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で適当に終結することができる。ポリペプチドをコードしないオリゴヌクレオチド配列を挿入することができ、あるいはカセットを挿入することができないのは勿論である。これにより、いわゆる欠失変異体を提供することができる。
【００６５】
本発明は、ＶＲ２４３１のＯＲＦによってコードされるポリペプチドの領域および位置であって、この単離体の低ビルレンスに関与することがあるものにも関する。従って、本発明の単離しおよび／または精製したポリペプチドは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２、３および４の１個以上の「低ビルレンス突然変異によってコードされたもの（またはその低ビルレンス断片であって、長さが少なくとも５アミノ酸であるもの）であって、ＯＲＦ２によってコードされるポリペプチドの１２〜１４位の１個以上がＲＧＶ（但し、「Ｒ」、「Ｇ」および「Ｖ」は相当するアミノ酸に対する１文字略号である）であり、４４〜４６位がＬＰＡであり、８８位がＡであり、９２位がＲであり、１４１位がＧであり、１８３位がＨであり、２１８位がＳであり、２４０位がＳであり、２５２〜２５６位がＰＳＳＳＷであるもの、またはそれらの組合せであることができる。上記のアミノ酸位置アイデンティティーの１個以上と更に組合わせることができる他のアミノ酸残基アイデンティティーとしては、１７４位（Ｉ）および２３５位（Ｍ）のものが挙げられる。
【００６６】
本発明の単離しおよび／または精製したポリペプチドは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ３によってコードされたものであって、上記アミノ酸アイデンティティーの１以上を１１（Ｌ）、２３（Ｖ）、２６〜２８（ＴＤＡ）、６５〜６６（ＱＩ）、７０（Ｎ）、７９（Ｎ）、９３（Ｔ）、１００〜１０２（ＫＥＶ）、１３４（Ｋ）、１４０（Ｎ）、２２３〜２２７（ＲＱＲＩＳ）、２３４（Ａ）および２３５（Ｍ）位のものまたはそれらの任意の組合せから選択することができ、これは更に３２（Ｆ）、３８（Ｍ）、９６（Ｐ）、１４３（Ｌ）、２１３〜２１７（ＦＱＴＳ）、２３１（Ｒ）および２５２（Ａ）位の１以上と組合わせることもできる。
【００６７】
本発明の単離しおよび／または精製したポリペプチドは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ４によってコードされたものであって、上記アミノ酸アイデンティティーの１以上を１３（Ｅ）、４３（Ｎ）、５６（Ｇ）、５８〜５９（ＴＴ）、１３４（Ｔ），１３９（Ｉ）位のものまたはそれらの任意の組合せから選択することができ、これは更に２〜３（ＡＡ）、５１（Ｇ）および６３（Ｐ）位の１以上と組合わせることもできる。
【００６８】
本発明は、ＶＲ２４３１のＯＲＦ２〜４の任意の１個によってコードされるポリペプチドの５個以上のアミノ酸、好ましくは１０個以上のアミノ酸であって全長までのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、上記３節で詳細に説明したアミノ酸位置に相当する（複数の）コドンにおけるポリヌクレオチドをＶＲ２４３１の相当するＯＲＦによってコードされるタンパク質の相当するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドで置換したものにも関する。
【００６９】
本発明のもう一つの態様では、ポリ核酸は、ＰＲＲＳＶの１個以上のタンパク質、またはその抗原領域をコードする。好ましくは、本発明の核酸は、ＰＲＲＳＶ膜（エンベロープ）タンパク質の少なくとも１個の抗原領域をコードする。更に好ましくは、本発明のポリ核酸は、ＯＲＦ５ＰＲＲＳＶタンパク質生成物（下記の説明を参照）からの超可変領域をコードし、または（ｂ）ＰＲＲＳＶの高ビルレンス（ｈｖ）表現型の単離体からのＯＲＦ−５遺伝子の少なくとも１コピー（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書における「ｈｖ表現型」の説明を参照）、およびＰＲＲＳＶ単離体のゲノムからのＯＲＦ−２、ＯＲＦ−３、ＯＲＦ−４、０ＲＦ−５および／またはＯＲＦ−６の少なくとも１個の十分に長い断片、領域または配列を含み、（複数の）相当するタンパク質の抗原領域をコードしかつｈｖ表現型ＰＲＲＳＶ単離体などによる次のチャレンジに対する防御を効果的に刺激する。
【００７０】
更に好ましくは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ−２、ＯＲＦ−３、ＯＲＦ−５および／またはＯＲＦ−６によってコードされる少なくとも１個の全エンベロープタンパク質が本発明のポリ核酸に含まれ、本発明のポリ核酸はＰＲＲＳＶからのＯＲＦ２〜４の１個の十分に長い部分を除外しまたは修飾して、これを含むＰＲＲＳＶを低ビルレントまたは非ビルレントとする。最も好ましくは、ポリ核酸はＰＲＲＳＶのアイオワ株の単離体（例えば、ＶＲ２３８５（３回プラーク精製したＩＳＵ−１２）、（非プラーク精製ＩＳＵ−１２）、ＶＲ２４２８（ＩＳＵ−５１）、ＶＲ２４２９（ＩＳＵ−２２）、ＶＲ２４３０（ＩＳＵ−５５）、ＶＲ２４３１（ＩＳＵ−３９２７）、ＶＲ２４７４（ＩＳＵ−７９）および／またはＩＳＵ−１８９４）のゲノムから単離される。
【００７１】
本発明の更に好ましい態様としては、ＰＲＲＳＶ、好ましくはＰＲＲＳＶのアイオワ株の超可変領域からのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。従って、このようなポリヌクレオチドは、下記のアミノ酸配列の１個（以上）をコードする。
【表１】
2011103883.tif 000002
【００７２】
この態様では、３２〜３８、５７〜６６および／または１２０〜１２８位の超可変領域の１以上が包含されている限り、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５の他のアミノ酸配列（図３または米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号または第０８／３０１，４３５号明細書に開示）をコードすることができる（本発明は、特にＬＶおよびＶＲ２３３２のＯＲＦ５のタンパク質およびポリヌクレオチドを除外する）。
【００７３】
本発明の更に好ましい態様は、式（Ｉ）または（II）
５′−α−β−３′                      （Ｉ）
５′−α−β−γ−３′                   （II）
（式中、αは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ２、３および４、およびこのような抗原性および／または低ビルレンス断片をコードするその領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１個のポリペプチドまたはその抗原性または低ビルレンス断片をコードし、βは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株由来のＯＲＦ５の少なくとも１コピーまたはその抗原性断片（例えば、１以上の超可変領域）、好ましくは高複製（ｈｒ）表現型由来の完全長コピーであり、γは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ６およびＯＲＦ７および抗原性断片をコードするその領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１個のポリペプチドまたはその抗原性断片をコードする）の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関する。
【００７４】
あるいは、本発明は、式（III）
５′−β−δ−γ−３′                  （III）
（上記式中、
βおよびγは上記に定義されたとおりであり、δは共有結合またはポリ核酸の転写および／または翻訳に実質的に影響を及ぼさない結合性ポリ核酸である）の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関することができる。好ましくは、βは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ５によってコードされたタンパク質の少なくとも１個の超可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ５によってコードされる全長タンパク質をコードする。
【００７５】
本発明は、式（IV）
５′−α−β−δ−γ−３′              （IV）
（上記式中、α、β、γおよびδは、上記式（Ｉ）〜（III）で定義したとおりである）の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関することができる。
【００７６】
本発明は、式（Ｖ）
５′−ε−ζ−ι−κ−ξ−３′          （Ｖ）
（上記式中、
εは、場合によっては含まれており、ポリヌクレオチドα、β、γおよびδを操作上発現する手段を提供する５′末端ポリヌクレオチド配列であり、ζは式ＫＴＶＡＣＣ（式中、ＫはＴ、ＧまたはＵであり、ＶはＡ、ＧまたはＣである）のポリヌクレオチドであり、ιは長さがせいぜい約１３０（好ましくは、せいぜい１００）のポリヌクレオチドであり、κは通常のマーカーまたはレポーター遺伝子α、β、γおよびそれらの操作結合した組合せからなる群から選択される１個以上の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドであり、但し、α、βおよびγは上記の式（Ｉ）〜（IV）において定義した通りであり、ξは、場合によっては含まれており、ポリヌクレオチドα、β、γおよびδの操作発現を抑制せずかつ（例えば、プラスミド中の）εに操作結合することができる３′末端ポリヌクレオチド配列である）の配列を有するポリ核酸発現ベクターまたはプラスミドを含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関することもできる。
【００７７】
適当なマーカーまたはレポーター遺伝子としては、例えば、ネオマイシン、エリスロマイシンまたはクロラムフェニコールのような抗生物質に対する耐性を提供するもの、β−ラクタマーゼ、ＤＨＦＲ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、および米国特許第４，１９０，４９６号明細書第３２欄３３行目〜第３８欄４４行目（上記明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）に開示されている酵素のような既知の検出可能な酵素をコードするもの、および既知の抗体（例えば、マウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ラットＩｇＧなど）またはプロテインＡ、プロテインＧ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシγ−グロブリン（ＢＧＧ）、ラクトアルブミン、ポリセリン、ポリグルタメート、レシチンなどのような既知の抗原性タンパク質をコードするものが挙げられる。
【００７８】
ポリヌクレオチドιは、好ましくはリーダー−ｍＲＮＡ接合配列と直ぐ下流のＯＲＦの開始コドンとの間に位置したＰＲＲＳＶゲノムからのポリヌクレオチド配列に少なくとも８０％相同なポリヌクレオチド配列である。長さが「約１３０」ヌクレオチドとは、κの操作発現に悪影響を与えないポリヌクレオチドιの長さを表す。例えば、ＩＳＵ７９では、ＯＲＦ７の発現を抑制しないリーダー−ｍＲＮＡ接合配列をＯＲＦ７の開始コドンから１２９塩基上流に見出すことができる（下記の実験２参照）。ポリヌクレオチドιに適する典型的な配列を、図１および９に示される配列から推定することができる。
【００７９】
本発明のポリ核酸は、ポリヌクレオチドの混合物としてまたは頭−尾（センス−アンチセンス）または頭−頭方式で共有結合した上記配列の組合せを含んでなる、から本質的になる、またはからなることもできる。上記配列に相補性のポリ核酸およびその組合せ（アンチセンスポリ核酸）も、本発明に包含される。従って、ＯＲＦ５の多重または変異体コピーを有することに加えて、本発明のポリ核酸は、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ５の抗原または超可変領域などのＯＲＦ１〜７の１個以上の多重または変異体コピーを含むこともできる。
【００８０】
上記および下記の実験および米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書に記載の方法と同様に、ＰＲＲＳＶゲノム（例えば、宿主で発現可能な適当なプラスミドに挿入したもの）の適当に調整した制限断片を含む組換えクローンのライブラリーを（例えば、E. coliを宿主として用いて）調製することができる。次に、クローンを適当なプローブ（例えば、ＯＲＦ２〜３の保存配列に基づく；例えば、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の図２２を参照）でスクリーニングする。次いで、正のクローンを選択して、適当な濃度まで成長させることができる。次に、ポリ核酸を、既知の方法に準じて正のクローンから単離することができる。次いで、ＰＣＲに適するプライマーを上記のようにして設計して調製し、ポリ核酸の所望な領域を増幅することができる。増幅したポリ核酸を、次に既知の方法によって単離および分離することができる。
【００８１】
本発明の精製製剤は、ＶＲ２３８５、ＶＲ２４３０および／またはＶＲ２４３１のＯＲＦ５〜７の少なくとも１個と少なくとも９７％の配列アイデンティティー（または相同性）を有する配列、および下記のようにＶＲ２３８５、ＶＲ２４２８、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７４およびＩＳＵ−１８９４のＯＲＦ２〜５の少なくとも１個と少なくとも最小配列アイデンティティー（または相同性）を有するポリペプチドをコードする配列からなる群から選択されるポリ核酸を含むこともできる。
【表２】
2011103883.tif 000003
【００８２】
好ましくは、ポリ核酸は、ｈｖＰＲＲＳＶたんりたいＶＲ２３８５、ＶＲ２４２９、ＩＳＵ−２８、ＩＳＵ−７９および／またはＩＳＵ−９８４のＯＲＦ２〜４の１個以上の十分に長い領域または部分を除外または修飾して、単離体を低ビルレントまたは非ビルレントにする。
【００８３】
本出願に関して、「相同性」とは、通常の相同性決定法に準じて整列された（例えば、MACVECTORまたはGENEWORKSコンピュータープログラム、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験IIIに記載の手続きに従って整列された）１種類以上のウイルスの配列における同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を表す。
【００８４】
好ましくは、本の単離したポリ核酸は、タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの抗原性断片であって、長さが少なくとも１０アミノ酸でありかつ抗原性に本質的ではない非相同性アミノ酸を保存的に置換することができるものをコードする。タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの抗原性断片は、下記のような極性基の一員で置換されるときには、保存的に置換される。
【００８５】
塩基性アミノ酸：
リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）
【００８６】
酸性アミノ酸：
アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）
【００８７】
親水性の非イオン性アミノ酸：
セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）
【００８８】
含硫アミノ酸：
システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）
疎水性の芳香族アミノ酸：
フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）
【００８９】
疎水性の非芳香族アミノ酸：
グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）
【００９０】
更に詳細には、本のポリ核酸は、ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、ＶＲ２４２８、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７４および／またはＩＳＵ−１８９４の第二、第三、第四、第五、第六および／または第七番目のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２〜７）によってコードされる（複数の）タンパク質の１個以上をコードする（例えば、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の図３および／または配列番号：１５、１７、１９、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３および６５に示されている配列の１個以上）。
【００９１】
ＯＲＦ６および７は、これらの遺伝子のヌクレオチド配列が高ビルレンス（ｈｖ）および低ビルレンス（ｌｖ）単離体中に高度に保存されるので、ＰＲＲＳＶのビルレンスおよび複製表現型を調節するものとは思われない（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験III参照）。しかしながら、ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ５は、高複製（ｈｒ）および低複製（ｌｒ）単離体には余り保存されないと思われる。従って、ｈｒＰＲＲＳＶ単離体由来のＯＲＦ５が本のポリ核酸に含まれていれば、ポリ核酸から産生される組換えワクチンの産生および発現が増強される。
【００９２】
更に、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５は、典型的にはポリペプチドの抗原性と関連した３種類の親水性の超可変領域を含む。従って、本発明はＰＲＲＳＶＯＲＦ５の１種類以上の超可変領域を含んでなるポリペプチド、好ましくは式ａ−ｂ−ｃ−ｄ−ｅ−ｆ−ｇのポリペプチドであって、
【００９３】
ａは、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の１〜３１位に相当するポリ（アミノ酸）、またはポリペプチドの抗原性に悪影響を及ぼさないポリ（アミノ酸）の断片であり、
【００９４】
ｂは、上記の表１の超可変領域１に示されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、
【００９５】
ｃは、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の３９〜５６位に相当するアミノ酸配列（好ましくは、１個以上（好ましくは１〜１０個）のアミノ酸が保存的に置換される式ＬＱＬＩＹＮＬＴＬＣＥＬＮＧＴＤＷＬの配列）であり、
【００９６】
ｄは、上記の表１の超可変領域２に示されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、
【００９７】
ｅは、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の６７〜１１９位に相当するアミノ酸配列であって、１個以上（好ましくは、１〜２０、更に好ましくは１〜１０個）のアミノ酸残基が保存的に置換されかつポリペプチドの抗原性に悪影響を及ぼさないものであり、
【００９８】
ｆは、上記の表１の超可変領域３に示されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、
【００９９】
ｇは、カルボキシル基（式−ＣＯＯＨの基）、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の１２９〜２００位に相当するアミノ酸配列またはその断片であって、ポリペプチドの抗原性に悪影響を及ぼさないものである
ものをコードするポリヌクレオチドも包含する。
【０１００】
従って、本発明のポリ核酸は、免疫防御用に用いるときには（例えば、ワクチンの製造では）、高複製単離体（すなわち、ＣＲＬ１１１７１細胞などで１０６〜１０７ＴＣＩＤ５０の力価にまで成長する単離体、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験VIII〜XIの説明も参照）由来のＯＲＦ５の少なくとも１コピーを含むのが好ましい。
【０１０１】
一方、ｌｖ単離体ＶＲ２４３１は、ｈｖ単離体と比較して欠失変異体であると考えられる（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験IIIおよびVIII〜XI参照）。欠失は、ノーザンブロット分析によれば、ＯＲＦ４にあると思われる。従って、本発明のポリ核酸は、本発明液防御用に用いるときには、好ましくは高ビルレンスに関与するｈｖ単離体由来のＯＲＦ４の領域を含まず、更に好ましくは隣接のＯＲＦ３および５と重複しないＯＲＦ４の領域を除外する。
【０１０２】
（少なくともＰＲＲＳＶについては）ヌクレオキャプシドタンパク質もそれに対する抗体もブタをＰＲＲＳＶから免疫学的に保護しないことも知られている。従って、本発明のポリ核酸は、免疫防御用に用いるときには、ウイルスエンベロープタンパク質の抗原性領域をコードするＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２、３、４、５および６由来の１個以上の領域の１個以上のコピーを含むが、ブタに投与したときには、ＰＲＲＳに関連した症状または組織病理学的変化を生じない。好ましくは、この領域は、他のＰＲＲＳＶ単離体のエンベロープタンパク質に対する抗体と免疫学的に交差反応性である。
【０１０３】
同様に、本発明のポリ核酸によってコードされるタンパク質は、このタンパク質を含んでなる組成物を投与したブタをＰＲＲＳから保護し、このタンパク質に対する抗体は他のＰＲＲＳＶ単離体のエンベロープタンパク質と免疫学的に交差反応性である。更に好ましくは、本発明のポリ核酸は、ＰＲＲＳＶ単離体の全エンベロープタンパク質またはこれに少なくとも８０％相同性でありかつ非相同性残基が保存的に置換されるタンパク質、あるいはこれに少なくとも９８％相同性であるタンパク質をコードする。最も好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、図１に示された配列の１つであり、そこに引用されているオープンリーディングフレームの少なくとも１個を包含する。
【０１０４】
ウイルスのゲノムにおける比較的短い部分を用いて、感染動物からの組織および／または生物学的流体試料をスクリーニングまたは同定し、および／または本明細書に記載されておりかつ家畜およびウイルス診断学および獣医学の分野で通常の技術を有する者に知られている方法によって関連ウイルスを同定することができる。従って、本発明のもう一つの態様は、ＰＲＲＳＶゲノム（好ましくは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株）のＯＲＦ２〜７由来の長さが１５〜２０００ｂｐ、好ましくは１８〜１０００ｂｐ、更に好ましくは２１〜１００ｂｐの断片から本質的になる単離した（かつ所望ならば、精製した）ポリ核酸を包含する。特に好ましくは、本発明の単離したポリ核酸断片は、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のゲノムのＯＲＦ２〜７の１個以上の末端から得られ、最も好ましくは下記の実験１および２、および米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の配列番号：１〜１２および２８〜３４に記載のプライマーからなる群から選択される。
【０１０５】
本発明は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスを分析するための診断キットであって、（ａ）長さが１０〜５０ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチドであって、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスのアイオワ株由来のゲノムポリ核酸にハイブリダイズするものを含んでなる第一のプライマー、（ｂ）長さが１０〜５０ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる第二のプライマーであって、この第二のプライマーの上記配列がブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスの上記アイオワ株由来の上記ゲノムポリ核酸に見出されかつ第一のプライマーがハイブリダイズする配列の下流にあるもの、および（ｃ）増幅したポリ核酸を検出することができる試薬を含んでなる診断キットにも関する。好ましくは、この試薬はインターカレート染料であり、その蛍光特性は二本鎖ＤＮＡへのインターカレーション時に変化する。
【０１０６】
本発明の単離したポリ核酸断片は、（ｉ）ウイルスポリ核酸に相当する（相補性の）ｃＤＮＡの１種類以上の適当な制限酵素による消化、（ii）（（複数の）所望なＯＲＦの５′および３′末端領域または５′末端の上流または３′末端の下流の領域に相補性の適当なプライマーを用いる）ＰＣＲによる増幅およびクローン、または（iii）市販の自動ポリヌクレオチド合成装置を用いる合成によって得ることができる。
【０１０７】
本発明のもう一つの態様は、ＰＲＲＳウイルス、好ましくはＰＲＲＳＶのアイオワ株由来の１種類以上のタンパク質またはその抗原性断片に関する。上記のように、ＰＲＲＳウイルス（好ましくは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株）由来のタンパク質の抗原性断片は長さが少なくとも５アミノ酸であり、特に好ましくは、長さが少なくとも１０アミノ酸であり、抗原性断片を含む組成物を投与したブタでの免疫学的防御応答を提供しまたは刺激する。
【０１０８】
タンパク質の抗原性部分の測定法は、当業者には知られている（上記の説明を参照）。更に、完全長のタンパク質が宿主動物（例えば、ブタ）で抗原性であることを最初に示すことによってタンパク質の本質的な抗原性断片を測定することもできる。タンパク質の特定領域または配列に特異的に結合する抗体の存在下でもタンパク質が抗原性である場合には、この領域または配列は免疫防御にとって本質的でない可能性がある。一方、タンパク質が、タンパク質の特定領域または配列に特異的に結合する抗体の存在下では最早抗原性でなくなる場合には、この領域または配列は、抗原性にとって本質的であると考えられる。
【０１０９】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５における３種類の超可変領域は、総ての入手可能なＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ５生成物のアミノ酸配列を比較することによって同定した（例えば、図２Ｄ参照）。これらの３種類の領域でのアミノ酸変動は著しく、構造的には保存されない（図２Ｄ）。３種類総ての超可変領域は親水性でありかつ抗原性である。従って、これらの領域は、ウイルス膜に暴露されており、従って宿主の免疫選択圧力下にあると考えられる。
【０１１０】
本発明は、上記のポリ核酸の１種類以上、好ましくはＰＲＲＳＶ、更に好ましくはＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦの１種類以上によってコードされるタンパク質またはその抗原性断片にも関する。本発明のタンパク質および抗原性断片は、ＰＲＲＳＶに対するブタの免疫、ＰＲＲＳＶ（特に、ＰＲＲＳＶのアイオワ株）への暴露または感染似ついてブタをスクリーニングするための血清学的試験などに用いられる。
【０１１１】
例えば、本発明のタンパク質は、ＶＲ２３８５、ＩＳＵ−２２（ＶＲ２４２９）、ＩＳＵ−５５（ＶＲ２４３０）、ＩＳＵ−１８９４、ＩＳＵ−７９（ＶＲ２４７４）およびＩＳＵ−３９２７（ＶＲ２４３１）（例えば、図２および／または米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の配列番号：１５、１７、１９、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６７、６９および７１に示されている配列の１個以上）のＯＲＦ２〜７によってコードされるタンパク質、長さが５アミノ酸〜タンパク質の全長未満であるこれらのタンパク質少なくとも１個の抗原性領域、上記表２に示されているＰＲＳＳＶＯＲＦによってコードされるタンパク質との相同性が最小であるポリペプチド、およびＶＲ２３８５、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＩＳＵ−１８９４、ＩＳＵ−７９およびＶＲ２４３１のＯＲＦ６〜７の１つによってコードされるタンパク質と少なくとも９７％の相同性を有するポリペプチド（例えば、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の配列番号：１７、１９、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９および６１）からなる群から選択されることができる。好ましくは、本発明のタンパク質は、ＶＲ２３８５、ＶＲ２４２８、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７１およびＩＳＵ−１８９４のＯＲＦ２〜５（例えば、図２Ａ〜Ｄ参照）からなる群から選択されるＯＲＦによってコードされる配列、その変異体であって、これを投与したブタに効果的な免疫学的防御を提供しかつアミノ酸配列中に１〜１００（好ましくは、１〜５０、更に好ましくは１〜２５）の欠失または保存的置換が存在するもの、および長さが少なくとも５、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸のその抗原性断片であって、これを投与したブタに効果的な免疫学的防御を提供するものを有する。
【０１１２】
更に好ましくは、本発明のタンパク質変異体またはタンパク質断片は、完全長の天然に存在するタンパク質（すなわち、ＰＲＲＳＶＯＲＦによってコードされるタンパク質）に特異的に結合するモノクローナル抗体に対して、相当する完全長の天然に存在するタンパク質の結合アフィニティーの少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％の結合アフィニティーを有する。
【０１１３】
本発明は、ポリペプチドの産生法であって、本発明のポリ核酸を操作発現系で発現させ、発現したポリペプチドを発現系から精製することを特徴とする、方法にも関する。適当な発現系としては、タンパク質およびポリペプチドのイン・ビトロまたはイン・ビボでの発現に通常用いられるもの、例えばイン・ビトロ発現およびイン・ビボ発現のためのウサギ網状赤血球系、修飾またはキメラＰＲＲＳＶ（ＭＡ−１０４、ＣＲＬ１１１７１、ＰＳＰ−３６、ＰＳＰ−３６−ＳＡＨ、ＭＡＲＣ−１４５およびブタ肺胞マクロファージのような感染可能な宿主細胞に感染するのに用いられる）、または通常の発現系（例えば、細菌プラスミドおよび相当する宿主細菌、酵素発現系および相当する宿主酵素など）で用いるための既知プロモーター（例えば、チミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０など）の操作制御下で本発明のポリ核酸を含む通常の発現ベクターが挙げられる。次に、発現したポリペプチドまたはタンパク質を、通常の精製および／または単離法によって発現系から精製または単離する。
【０１１４】
本発明の他の特徴は、下記の代表的態様の説明の経過中に明らかにされるが、これらの態様は発明の例示の目的で示されるものであり、発明を制限しようとするものではない。
【０１１５】
例１
概要
１個の低ビルレンス、１個の「中」ビルレンスおよび１個の高ビルレンス米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５の配列を決定して、分析した。他のＰＲＲＳＶ単離体の既知配列と比較すると、異なるビルレンスを有する７個の米国単離体のＯＲＦ２〜５には、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルのいずれでもかなりの配列変動があることが示されている。しかしながら、これら７種の米国単離体のＯＲＦ６および７は、高度に保存されている（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。欧州ＬＶおよび米国単離体のＯＲＦ２〜７にも、広汎な配列変動が見られた。既知の最小ビルレンス米国ＰＲＲＳＶ単離体（ＩＳＵ−３９２７）は、他の米国単離体と比較して最大の配列変動を示した。
【０１１６】
米国単離体の系統的関連性も分析した。米国単離体のＯＲＦ２〜７の系統分析では、主要な米国ＰＲＲＳＶ遺伝子型中に少なくとも３つの群のＰＲＲＳＶ変異体があることが示唆された。従って、異なる地理学上の領域から更に多くのウイルス単離体が検討されているので、多数の追加の主または副遺伝子型が同定されると思われる。
【０１１７】
興味深いことには、既知の最小ビルレンス米国ＰＲＲＳＶ単離体（ＩＳＵ−３９２７）は、他の米国単離体とは異なる分科を形成する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の分析でも、単離体ＩＳＵ３９２７は他の米国単離体と比較してＯＲＦ２〜４で最大の変動を示すことが明らかになった。単離体ＩＳＵ３９２７におけるこれらの変動の多くは、非保存アミノ酸置換を生じる。しかしながら、単離体ＩＳＵ３９２７におけるこれらの非保存変化は、他の米国単離体と比較して、特定の領域に限定されるとは考えられず、それらはＯＲＦ２〜４中に存在する。従って、配列変動とウイルスビルレンスとの間の特異的相関は、（ＯＲＦ３におけるある位置はビルレンスに関係している（図２Ｂ参照；３０、４８、５４〜５６、１３４、１４０、１４３、１４７、１５３、２０６および２１５位）と思われ、これらの位置の１個以上におけるアミノ酸はＰＲＲＳＶＯＲＦ３によってコードされる他の既知のタンパク質を突然変異するための基礎として働くことができるが）完全には解明されていない。
【０１１８】
結果
７個の米国ＰＲＲＳＶたんりたい間のアミノ酸配列アイデンティティーは、ＯＲＦ２では９１〜９９％であり、ＯＲＦ４では９２〜９９％であり、ＯＲＦ５では８８〜９７％であった。既知の最小ビルレント米国単離体は、他の米国単離体と比較して、ＯＲＦ５〜７よりＯＲＦ２〜４での配列変動が高い。抗原性を有する３個の超可変領域をＯＲＦ５によってコードされる主エンベロープ糖タンパク質で同定した。
【０１１９】
ＯＲＦ２〜７の対毎の比較および系統樹分析により、米国ＰＲＲＳＶの主遺伝子型内に少なくとも３群のＰＲＲＳＶ変異体（または副遺伝子型）が存在することが示唆された。既知の最小ビルレント米国単離体は、異なるビルレンスを有する他の米国単離体とは異なる分科を形成する。この研究の結果は、ＰＲＲＳＶおよびワクチン開発の分類学について示唆が与えられる。
【０１２０】
図１は、米国単離体であるＩＳＵ３９２７、ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのヌクレオチド配列の比較を示している。ＶＲ２３８５のヌクレオチド配列を最上部に示し、異なる部分だけを示している。それぞれのＯＲＦの開始コドンは＋＞で示し、それぞれのＯＲＦの終止コドンは星印（＊）で示す。サブゲノムｍＲＮＡ３、４および３−１についてのリーダー−ｍＲＮＡ接合配列に下線を施し、それぞれのＯＲＦの開始コドンに対する接合配列の位置を、それぞれのＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示す。この整列に用いたＶＲ２３８５（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）は、以前に報告したものである。
【０１２１】
材料および方法
細胞およびウイルス
ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞系を用いて、ＰＲＲＳＶを増殖させた。細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×抗生物質（ペニシリンＧ１０，０００単位／ml、ストレプトマイシン１０，０００mg／mlおよびアンホテリシンＢ２５mg／ml）を補足したDulbeccoの最小必須培地（ＤＭＥＭ）で成長させた。
【０１２２】
この研究で用いたＰＲＲＳＶの３種類のＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と呼ばれる米国単離体を、ＰＲＲＳの発生中のアイオワ州の様々な農場から得たブタ肺から単離した。３種類総ての単離体は、ＣＲＬ１１１７１細胞上で３回プラーク精製した後、更に実験に供した。比較病理学的研究では、単離体ＩＳＵ３９２７は１０種類の異なる米国ＰＲＲＳＶ単離体の中で最小ビルレンスの単離体であることを示した。単離体ＩＳＵ２２は高ビルレンス単離体であり、単離体ＩＳＵ５５は「中程度」の病原性である。この実験に用いた３種類のウイルス単離体総ては、７代目のものであった。
【０１２３】
ＰＲＲＳＶ細胞内ＲＮＡの単離
ＣＲＬ１１１７１細胞の集密的単層をそれぞれＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７であるＰＲＲＳＶの３種類の米国単離体を０．１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させた。感染から２４時間後、感染細胞を冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。次に、総細胞内ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネートおよびフェノール−クロロホルム抽出(Stratagene)によって単離した。ＲＮＡ製剤中におけるウイルス特異的ＲＮＡ種の存在は、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって確かめた（データーは示さなかった）。総細胞内ＲＮＡは、分光光度法によって定量した。
【０１２４】
逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
第一の鎖の相補性（ｃ）ＤＮＡは、以前に報告したようにランダムプライマーを用いる逆転写によって総細胞内ＲＮＡから合成した(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。ＰＲＲＳＶの３種類の単離体のＯＲＦ２〜５の総タンパク質コード領域を増幅するため、２組のプライマーをＶＲ２３８５およびＬＶの配列に基づいて設計した。プライマーＪＭ２５９（５′−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＣＧＴ−３′）およびＪＭ２６０（５′−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＡＴＡＧＧＧＡＡＴＧＴＧ−３′）はＯＲＦ４および５の配列を増幅し、プライマーＸＭ９９２（５′−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧ−ＴＡＡＴＡＧ（Ａ）ＧＴＣＴＧ−３１およびＸＭ９９３（５′−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣ−３′）はＯＲＦ２および３の配列を増幅した。これらのプライマーの５′末端にユニーク制限部位（ＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ）を導入して、クローニングを促進した。縮重塩基Ｇ（Ａ）を、ＶＲ２３８５およびＬＶの配列に基づいてプライマーＸＭ９９２において合成した(Meulenberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。ＰＣＲは、以前に報告した方法で行った(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。
【０１２５】
クローニングおよびヌクレオチド配列決定
ＲＴ−ＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースゲル電気泳動によって分析した。それぞれＯＲＦ２および３並びにＯＲＦ４および５を表す２種類のＰＣＲ断片を、グラスミルク法(glassmilk procedure; GENECLEAN, BIO 101, Inc.)によって精製した。精製断片をそれぞれＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、以前に報告した方法でベクターｐＳＫ＋にクローニングした(Meng et al., 1993)。E. coli DH 5α細胞を、組換えプラスミドの形質転換に用いた。白色コロニーを選択し、１００mg／mlアンピシリンを含むＬＢブロスで成長させた。組換えプラスミドを含むE. coli細胞をリゾチームで溶解し、次にプラスミドをQiagenカラム(QIAGEN Inc.)を用いて単離した。
【０１２６】
ウイルスインサートを含むプラスミドを、自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystem, Inc.)を用いて配列決定した。３種類のＰＲＲＳＶ単離体のそれぞれからのＯＲＦ２〜５の全配列を表す３種類以上の独立したＣＤＮＡクローンを、ユニバーサルおよび復帰プライマーを用いて配列決定した。数種類のウイルス特異的プライマーであるＸＭ９６９（５′−ＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧ−３′）、ＸＭ９７０（５′−ＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣ−３′）、ＸＭ１００６（５′−ＧＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡ−３′）、ＸＭ０７７（５′−ＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＣＡＣＴ−３′）およびＸＭ０７８（５′−ＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧ−３′）も用いて、ＯＲＦ２〜５の配列を決定した。
【０１２７】
配列分析
配列データーを組合わせて、Mac Vector (International Biotechnologies, Inc.)およびGene Workds (IntelliGenetics, Inc.)コンピューターソフトウェアプログラムを用いて分析した。系統発生分析は、PAUPソフトウェアパッケージ第３．１．１版(David L. Swofford, Illinois Natural HIstory Survey, シャンペン, イリノイ）を用いて行った。PAUPは、最大倹約アルゴリズムを用いて、系統樹を構築する。
【０１２８】
結果
ＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列分析
５種類のＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ７９、ＩＳＵ１８９４、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７のＯＲＦ２〜５の配列を決定し、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３３２およびＬＶなどの他の既知のＰＲＲＳＶ単離体と比較した(Meulenberg et al., 1993)。単離体ＶＲ２３８５、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９、ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ３９２７のＯＲＦ６および７の配列は、以前に報告されていた（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。この実験に用いた単離体は、実験的に感染したブタにおける肺ビルレンスが異なることが示されている（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。ＩＳＵ３９２７は、１０種類の異なる米国ＰＲＲＳＶ単離体の中で最小ビルレンスの単離体である（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書および米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。
【０１２９】
他の米国ＰＲＲＳＶ単離体と同様に、これらの単離体のＯＲＦ２〜４は互いに重複した（図１）。しかしながら、ＬＶとは異なり、米国単離体のＯＲＦ４および５は１０ヌクレオチドだけ離れている（図１）。ＬＶのＯＲＦ４および５は、１ヌクレオチドだけ重複した。ＬＶにおけるＯＲＦ５の開始コドンＡから米国単離体におけるＴへの単一ヌクレオチドの置換は、ＯＲＦ４停止コドンの１０ヌクレオチド下流に米国単離体のＯＲＦ５の開始コドンを設置する。従って１０ヌクレオチドの非コード配列は、既知の米国単離体のＯＲＦ４および５の間に現われる（図１）。
【０１３０】
ＩＳＵ７９のＯＲＦ２は、他の米国単離体より３ヌクレオチドだけ短い。ＯＲＦ２の停止コドンの直前のＴＧＧからＴＡＧへの単一ヌクレオチドの置換により、ＩＳＵ７９に新たな停止コドンが生じる（図１）。他の米国単離体と比較してＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５には、３ヌクレオチド欠失も見られた（図１）。総ての米国単離体のＯＲＦ２〜５の大きさは、他のＯＲＦより３ヌクレオチド短いＩＳＵ７９のＯＲＦ２およびＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５を除き同一である（図１）。
【０１３１】
図１に示される７個の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５の配列の比較は、米国単離体のＯＲＦ２〜５にはかなりのヌクレオチド配列の変動があることを示している（図１）。ヌクレオチド配列アイデンティティーは、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４間において、ＯＲＦ２では９６〜９８％であり、ＯＲＦ３では９２〜９８％であり、ＯＲＦ４では９２〜９９％であり、ＯＲＦ５では９０〜９８％であった（表３）。
【０１３２】
最小ビルレンス単離体ＩＳＵ３９２７は、７種類の米国単離体の中で最大の変動を有する（図１および表３）。ＩＳＵ３９２７と他の米国単離体との間のヌクレオチド配列アイデンティティーは、ＯＲＦ２では９３〜９４％であり、ＯＲＦ３では８９〜９０％であり、ＯＲＦ４では９１〜９３％であった（表３）。ＯＲＦ６および７（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）と同様に、ＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５は３ヌクレオチドの欠失を除き有意な変化はない（図１）。ＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５は、他の米国単離体のＯＲＦ５と９１〜９３％のヌクレオチド配列アイデンティティーを共有している（表３）。
【０１３３】
しかしながら、ＬＶおよび米国単離体の間のＯＲＦ２〜５には、広汎な配列変動が見られた（図１および表３）。ＬＶおよび米国単離体の間のヌクレオチド配列アイデンティティーは、ＯＲＦ２では６５〜６７％であり、ＯＲＦ３では６１〜６４％であり、ＯＲＦ４では６３〜６６％であり、ＯＲＦ５では６１〜６３％であった（表３）。ＬＶおよび米国ＰＲＲＳＶの間のＯＲＦ６および７には、広汎な遺伝子変動も存在する（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。これらの結果は、最小ビルレント単離体ＩＳＵ３９２７は米国単離体と最も関係が少なく、遺伝子変動はほとんどがＯＲＦ２〜４にあることを示している。
【０１３４】
ＩＳＵ７９で観察されたＯＲＦ２における停止コドンの前のＴＧＧからＴＡＧへの単一ヌクレオチド置換は、７個のｓｇｍＲＮＡを産生する単離体ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７にも存在するが、それぞれ６個のｓｇｍＲＮＡしか合成しない単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ１８９４またはＶＲ２３８５には存在しない（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。これらの結果は、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７のリーダー−ｍＲＮＡ３−１接合配列はＩＳＵ７９と同じであると思われることを示唆している（図１）。
【０１３５】
ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４についてのリーダー−ｍＲＮＡ結合配列は、ｓｇｍＲＮＡ３についてはＯＲＦ３の８９ヌクレオチド上流のＧＵＡＡＣＣ、およびｓｇｍＲＮＡ４についてはＯＲＦ４の１０ヌクレオチド上流のＵＵＣＡＣＣであると決定された（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書；下記の実験２を参照）。単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と単離体ＶＲ２３８５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４との配列を比較すると、ｓｇｍＲＮＡ３および４についてのリーダー−ｍＲＮＡ結合配列は米国単離体中で保存されていることを示唆している（図１）。
【０１３６】
ＯＲＦ２〜５によってコードされる推定アミノ酸配列の分析
図２は、米国単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２（Ａ）、ＯＲＦ３（Ｂ）、ＯＲＦ４（Ｃ）およびＯＲＦ５（Ｄ）の推定アミノ酸配列の整列を示す。ＶＲ２３８５の配列を最上部に示し、差だけを示す。欠失は（−）によって示す。ＬＶ（Ｄ）のＯＲＦ５における提案シグナルペプチド配列には、下線を施す(Meulenberg et al., 1995)。ＯＲＦ５（Ｄ）における抗原性を有する３種類の超可変領域は、星印（＊）によって示した。この整列に用いた公表配列は、ＬＶ(Meulenberg et al., 1993)、ＶＲ２３８５（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）であった。
【０１３７】
塩基性アミノ酸が高含量でありかつそれが親水性であることに基づいて、ＯＲＦ７の転写生成物はヌクレオキャプシドタンパク質（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書; Meulenberg et al., 1993; Conzelmann et al., 1993; Mardassi et al., 1994）。ＯＲＦ６生成物は潜在的なアミノ末端シグナル配列を欠きかつ潜在的な膜貫通断片を表すことができる数個の疎水性領域を含む。従って、ＯＲＦ６生成物は、Ｍタンパク質であると予想された（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書; Meulenberg et al., 1993; Conzelmann et al., 1993）。
【０１３８】
コンピューター分析は、米国単離体のＯＲＦ２〜５によってコードされる生成物は総て膜関連タンパク質を連想させるヒドロパシー特性を有する。ＯＲＦ２〜５の翻訳生成物は、それぞれ疎水性アミノ末端を含む。Ｎ−末端の疎水性配列はこれらのＯＲＦのそれぞれについてのシグナル配列として機能し、ＯＲＦ２〜５の感染細胞の小胞体への輸送に関与することがある。ＯＲＦ２〜５のそれぞれにおける少なくとも１個の追加の疎水性ドメインが、カルボキシ末端に見られた。これらの追加の疎水性ドメインは、膜アンカーとして機能することができる。
【０１３９】
検討を行った７種類の米国単離体のＯＲＦ２〜５の推定アミノ酸配列もかなり変動し、図１で観察されたヌクレオチドの差のほとんどはサイレント突然変異ではないことを示していた。ＶＲ２３８５、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４の間のアミノ酸配列のアイデンティティーは、ＯＲＦ２では９５〜９９％であり、ＯＲＦ３では９０〜９８％であり、ＯＲＦ４では９４〜９８％であり、ＯＲＦ５では８８〜９７％であった（表３）。
【０１４０】
また、最小ビルレント単離体ＩＳＵ３９２７は、他の米国単離体と比較して、ＯＲＦ５〜７（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書および表３）よりもＯＲＦ２〜４（図２および表３）で、より大きな変動を示した。ＬＶのＯＲＦ２〜５は、米国単離体のＯＲＦとそれぞれ５７〜６１％、５５〜５６％、６５〜６７％および５１〜５５％だけのアミノ酸配列アイデンティティーを共有している（表３）。欧州ＬＶと米国単離体との比較では、ＯＲＦ２〜５中に欠失または挿入が見られた（図２）。
【０１４１】
ＯＲＦ５生成物の配列比較では、ＯＲＦ５のＮ末端領域は、（ａ）米国単離体とＬＶとの間でも、（ｂ）様々な米国単離体同士でも極めて可変である（図２Ｄ）。ＬＶでは、ＯＲＦ５の最初の３２〜３３アミノ酸残基がシグナル配列を表すことができる（Meulenberg et al., 1995; 図２Ｄ）。従って、総てのＰＲＲＳＶ単離体におけるＯＲＦ５の潜在的シグナル配列は極めて不均一である。この不均一性は、シグナルペプチドは開裂して、成熟ビリオンには存在しないので、任意の宿主免疫選択圧力によるものではない。
【０１４２】
３個の追加の超可変領域も、入手可能な総てのＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ５のアミノ酸配列を比較することによって同定した（図２Ｄ）。これらの３つの領域におけるアミノ酸変動は著しく、構造的には保存されない（図２Ｄ）。コンピューター分析は、３つの超可変領域総てが親水性でありかつ抗原性であることを示唆している。従って、これらの領域はウイルス膜に暴露されており、宿主免疫選択圧力下にあると思われる。しかしながら、ＯＲＦ５エンベロープタンパク質におけるこれらの超可変領域の抗原決定基としての特異的機能を確かめるには更に実験が必要なことがある。
【０１４３】
ＰＲＲＳＶの米国単離体中の系統発生的関係
米国ＰＲＲＳＶと欧州ＰＲＲＳＶはＭおよびＮ遺伝子の分析に基づいて２種類の異なる遺伝子型を表すことは以前に示されている（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。米国ＰＲＲＳＶ単離体の系統発生的関連性を決定するため、図１および２に示した７種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜７を最初にGeneWorks プログラム(Intelligenetics, Inc.)を用いて整列した。次に、PAUPプログラム(David L. Swofford, Illinois Natural History Survey, シャンペン, イリノイ）を用いて、ＰＲＲＳＶの米国単離体中の関連性を示す系統樹を構築した。
【０１４４】
図３の系統樹は、PAUPソフトウェアパッケージ第３．１．１版を用いる最大倹約法によって構築した。最短の長さの（最も倹約した）分科は、徹底的な検索法を行うことによって見出された。分科の長さ（アミノ酸置換の数）は、それぞれの分科の上に示す。分析に用いる配列は、ＬＶ、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４である。
【０１４５】
この系統樹は、主要な米国ＰＲＲＳＶ遺伝子型には少なくとも３群の変異体（または副遺伝子型）があることを示唆している。最小ビルレンスの米国ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ３９２７は、他の米国単離体とは異なる分科を形成している（図３）。単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ７９、ＩＳＵ１８９４およびＶＲ２３３２は、第二の副遺伝子型を表すもう一つの分科を形成する。第三の副遺伝子型は、単離体ＩＳＵ７９およびＶＲ２３８５によって表される（図３）。極めて類似した樹は、図１に示された７個の米国単離体のＯＲＦ１ｂの最後の６０ヌクレオチドを分析することによっても得られた（データーは示されていない）。同一の系統樹トポロジーは、GeneWorks プログラムを用いて算術的手段による未秤量対群法(unweighted pair-group method with arithmetic mean; UPGMA)によっても生成した（データーは示されていない）。
【０１４６】
要約すると、ＰＲＲＳＶの様々な遺伝子型を確認し、更に解明した。米国ＰＲＲＳＶの主遺伝子型中の少なくとも３種類の副遺伝子型を、ＯＲＦ２〜７の配列の分析に基づいて同定した。欧州ＰＲＲＳＶおよび米国ＰＲＲＳＶ間のみでなく、米国ＰＲＲＳＶ単離体同士の遺伝子変動も、同様に確認し、ＰＲＲＳＶの不均一性を示した。最小ビルレンスの米国ＰＲＲＳＶ単離体であるＩＳＵ３９２７は、他の米国単離体と比較して、ＯＲＦ２〜４において予想外に高い配列変動を有する。
【表３】
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【０１４７】
例２
ＰＲＲＳＶの複製中に、ゲノムＲＮＡの他に６個のサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ）を合成する。これらのｓｇｍＲＮＡを、この実験で特性決定した。
【０１４８】
ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡは、ＰＲＲＳＶに感染した細胞中で３′−共末端ネステドセットを形成する。これらのｓｇｍＲＮＡのそれぞれはポリシストロン性であり、（ＯＲＦ特異プローブを用いるノーザンブロット分析によって示されるように）ｓｇｍＲＮＡを除き多重オープンリーディングフレームを含む。ｓｇｍＲＮＡはビリオンにはパッケージされず、ゲノムＲＮＡのみが精製ビリオンで検出され、ＰＲＲＳＶのキャプシド化シグナルはＯＲＦ１領域に位置しているらしいことを示唆した。
【０１４９】
ＰＲＲＳＶ感染細胞中のｓｇｍＲＮＡの数は、異なるビルレンスを有するＰＲＲＳＶ単離体中で変化する。幾つかのＰＲＲＳＶ単離体におけるｓｇｍＲＮＡの追加種は、ＯＲＦ４の上流の配列に由来することが上記の実験１で示され、ｓｇｍＲＮＡ３−１と命名した。
【０１５０】
単離体ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４、並びに単離体ＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は、共通の６ヌクレオチド配列モチーフＴ（Ｇ）ＴＡ（Ｇ／Ｃ）ＡＣＣを含む。これらの２個の米国単離体のゲノムＲＮＡの配列分析を行い、レリスタッドウイルス（ＬＶ）と比較したところ、ＰＲＲＳＶ単離体中でリーダー−ｍＲＮＡ接合配列が不均一であることが明らかになった。リーダー−ｍＲＮＡ接合領域の数、位置および配列は、米国単離体およびＬＶ間並びに米国単離体中で変化した。リーダー−ｍＲＮＡ接合配列の最後の３ヌクレオチドＡＣＣは不変である。最初の３ヌクレオチドに、変動が見られた。
【０１５１】
ｓｇｍＲＮＡ３−１の５′末端配列をＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のゲノム配列と比較することによって、ＩＳＵ１８９４におけるＴからＩＳＵ７９におけるＣへの単一ヌクレオチド置換によりＩＳＵ７９に新たなリーダー−ｍＲＮＡ接合配列、従って、ｓｇｍＲＮＡの追加種（ｓｇｍＲＮＡ３−１）が生じることが分かった。ＯＲＦ３−１と命名され、４５アミノ酸のコード容量を有する小さなＯＲＦが、ｓｇｍＲＮＡ３−１の５′末端で同定された。
【０１５２】
材料および方法
ウイルスおよび細胞
用いたＰＲＲＳＶ単離体（ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９、ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ３９２７）は、アイオワ州の様々な農場から得たブタ肺から単離した。連続的細胞系ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１を用いて、ウイルスを単離し、成長させた。これらのＰＲＲＳＶ単離体を３回のプラーク精製によって生物学的にクローニングし、ＣＲＬ１１１７１細胞上で成長させた。この研究に用いたウイルス単離体の総ては、第７代であった。
【０１５３】
ＩＳＵ２２およびＩＳＵ７９は病原性が高く、接種後１０日目に剖検した実験的に感染させた５週齢のカエサリアン(caesarean)由来の初乳を欠失した子ブタの肺組織の５０〜８０％の硬化を生じる。対照的に、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ３９２７は病原性が低く、同じ実験では肺組織の１０〜２５％しか硬化しなかった（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。
【０１５４】
ウイルス特異的総細胞内ＲＮＡ、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡおよびビリオンＲＮＡの調製
ＣＲＬ１１１７１細胞の集密的単層を、第７代目のＰＲＲＳＶの様々な単離体を０．１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させた。ＰＲＲＳＶ特異的総細胞内ＲＮＡを、通常のグアニジニウムイソチオシアネート法(Stratagene)によってＰＲＲＳＶ感染細胞から単離した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムクロマトグラフィー(Invitrogen)によって総細胞内ＲＮＡから濃縮した。
【０１５５】
ＰＲＲＳＶビリオンＲＮＡを単離するため、集密的ＣＲＬ１１１７１細胞をＰＲＲＳＶの単離体ＩＳＵ３９２７で０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。感染細胞の７０％を上回る量が細胞変性硬化を示したとき、培養物を凍結融解を３回行い、培地を４℃にて１２００×ｇで２０分間清澄化した。次に、ウイルスをポリエチレングリコールで沈澱させた後、米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書に記載の通りの塩化セシウムグラディエント遠心分離によって精製した。精製したウイルスを、２０μ／mlの最終濃度のＲＮアーゼＡを用いて３７℃で９０分間処理した。次に、ウイルスをペレット化し、ビリオンＲＮＡを通常のグアニジニウムイソチオシアネート法を用いて単離した。
【０１５６】
ｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ連鎖反応
ｃＤＮＡは、以前に報告したようにランダムプライマーを用いる逆転写によって総細胞内ＲＮＡから合成し、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。
【０１５７】
ノーザンブロット分析
ウイルス感染細胞および擬似感染細胞由来の総細胞内ＲＮＡ１０μｇを、ホルムアルデヒド−アガロースゲル中でレーン当たりに用いた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡおよびビリオンＲＮＡを分離するため、ビリオンＲＮＡ１５ngおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡ０．２μｇを、レーン当たりに加えた。ＲＮＡは、通常の方法に従ってホルムアルデヒドで変性した（Sambrook et al., 「分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版, Cold Spring Harbor Laboratory, コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク）。ＲＮＡの電気泳動分離、ＲＮＡブロッティングおよびハイブリダイゼーションは、米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書に記載の方法で行った。幾つかの実験では、グリオキサール−ＤＭＳＯアガロースゲルも米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書に記載の方法で行った。
【０１５８】
プローブを調製するため、ＯＲＦ１ｂ〜７のそれぞれからの特異的ｃＤＮＡ断片を、ＯＲＦ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって生成させた。プライマーは、それぞれのプライマーが所定のＯＲＦの特異的断片のみを増幅し、重複している隣接ＯＲＦどうしがあらゆる所定のｃＤＮＡプローブには含まれないような方法で設計した。ＯＲＦ１ｂ−７を表すｃＤＮＡプローブを生成するためのプライマー対は、ＯＲＦ１ｂについてはＩＭ７２９／ＩＭ７８２であり、ＯＲＦ２についてはＩＭ３１２／ＩＭ３１３であり、ＯＲＦ３についてはＸＭ１０２２／ＩＭ２５８であり、ＯＲＦ４についてはＸＭ１０２４／ＸＭＩ０２３であり、ＯＲＦ５についてはＰＰ２８７／ＰＰ２８６であり、ＯＲＦ６についてはＰＰ２８９／ＸＭ７８０であり、ＯＲＦ７についてはＰＰ２８５／ＰＰ２８４である（表４）。
【０１５９】
クローニング、配列決定およびヌクレオチド配列分析
ＲＴ−ＰＣＲのプライマーは、ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のＯＲＦ２〜５の全タンパク質コード領域を増幅するＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５の配列に基づいて設計した。プライマーＪＭ２５９およびＪＭ２６０は０ＲＦ４および５の増幅に用い、ＸＭ９９２およびＸＭ９９３はＯＲＦ２および３の増幅に用いた（表４）。ＰＣＲ生成物の末端にユニーク制限部位（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ）を導入することによって、これらのＯＲＦの置換に対するカセット法が可能となった。
【０１６０】
ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１９８４のＯＲＦ２〜３およびＯＲＦ４〜５のＰＣＲ生成物をそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、精製して、以前に報告した通りにベクターｐＳＫ＋にクローニングした(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。ウイルスインサートを含むプラスミドを、通常の自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystem, Inc.)で配列決定した。それぞれのウイルス単離体からのＯＲＦ２〜５の全配列を表す少なくとも３個のｃＤＮＡクローンを、普遍および復帰プライマー並びに他のウイルス特異的配列決定プライマーで配列決定した（ＸＭ９６９、ＸＭ９７０、ＸＭ１００６、ＸＭ０７８およびＸＭ０７７；表４を参照）。
【０１６１】
ｓｇｍＲＮＡ３、４および３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を決定するため、プライマー対ＩＭ７５５およびＤＰ５８６（表４）をＲＴ−ＰＣＲに用いて、相当する５′末端配列を増幅した。生成するＰＣＲ生成物を、ウイルス特異的プライマーＸＭＤ７７およびＸＭ１４１を用いる直接ＰＣＲ配列決定によって精製して、配列決定した（表４）。これらの配列を組合わせて、Mac Vector (International Biotechnologies, Inc.)およびGeneWorks (IntelliGenetics, Inc.)コンピューターソフトウェアプログラムによって分析した。
【０１６２】
オリゴヌクレオチド
この研究に用いた合成オリゴヌクレオチドを、表４にまとめた。これらのオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置(Applied Biosystem)を用いて一本鎖ＤＮＡとして合成し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。
【０１６３】
結果
ｓｇｍＲＮＡはＰＲＲＳＶビリオンにパッケージされない。
ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡがパッケージされるかどうかを決定するため、ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ３９２７のビリオンをＣｓＣｌグラディエントによって精製した。精製ビリオンをＲＮアーゼで処理した後、ビリオンをペレット化して、ＲＮＡを抽出し、ビリオン表面に付着した総てのＲＮＡ種を除去した。ＰＲＲＳＶ感染細胞の単離体ＩＳＵ３９２７からの総細胞内ＲＮＡと共にＲＮアーゼＡで処理したビリオンからのＲＮＡをホルムアルデヒドゲル中で分離し、プライマーＰＰ２８４およびＰＰ２８５を用いるＰＣＲによってウイルスゲノムの３′末端配列から生成したプローブを用いてハイブリダイゼーションした（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書；表４）。
【０１６４】
ゲノムＲＮＡのみがＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ３９２７の精製ビリオン中に検出され（図４）、ｓｇｍＲＮＡの検出可能な量は３週間の暴露の後でも精製ビリオンには見られなかった。対照的に、ゲノムＲＮＡの他に、７種のｓｇｍＲＮＡがＩＳＵ３９２７で感染した細胞で検出された（図４）。同様な結果は、２つの他の米国単離体ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９で観察された。
【０１６５】
異なるビルレンスを有する米国ＰＲＲＳＶ単離体中のｓｇｍＲＮＡの数の変動
米国ＰＲＲＳＶおよび欧州ＰＲＲＳＶなどの本発明前に既知の総てのアルテリウイルスは、７つのｓｇｍＲＮＡを合成する３種類のＬＤＶ変異体（ＬＤＶ−Ｐ、ＬＤＶ−ａおよびＬＤＶ−ｖ）を除き６個のｓｇｍＲＮＡを産生することが示された。しかしながら、６個のｓｇｍＲＮＡのネステドセットがＬＤＶ−Ｃ株で産生される。
【０１６６】
米国ＰＲＲＳＶ単離体中のｓｇｍＲＮＡには変動があるかどうかを比較するため、ＣＲＬ１１１７１細胞の集密的単層に異なるビルレンスを有する米国ＰＲＲＳＶの５種類の異なる単離体を０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。総細胞内ＲＮＡを、感染から２４時間後にウイルス感染細胞から単離した。ｃＤＮＡ断片を、プライマーＰＰ２８４およびＰＰ２８５を用いるＰＣＲによってウイルスゲノムの究極３′末端から生成させた（表４）。ｃＤＮＡ断片をランダムプライマー伸張法によって３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、（ホルムアルデヒドゲル条で分離した）総細胞内ＲＮＡとハイブリダイゼーションした。
【０１６７】
ＲＮＡの分析では、ゲノムＲＮＡの他に６個以上のｓｇｍＲＮＡのネステドセットが、異なるビルレンスを有する米国ＰＲＲＳＶの５個の単離体の１つで感染させた細胞中に存在することが示された（図５）。同様な結果は、総細胞内ＲＮＡをグリオキサール−ＤＭＳＯアガロースゲル上で分離したときに得られた。ＰＲＲＳＶ単離体のＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ３９２７は、７種類の容易に識別可能なｓｇｍＲＮＡを産生し、単離体ＩＳＵ２２およびＩＳＵ１８９４は６種類のｓｇｍＲＮＡを産生した（図５）。米国ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５は、６種類のｓｇｍＲＮＡも産生する（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書）。ｓｇｍＲＮＡの追加種は、ｓｇｍＲＮＡ３および４の間に位置し、ｓｇｍＲＮＡ３−１と命名した。ｓｇｍＲＮＡは、５個のＰＲＲＳＶの単離体中で大きさがほとんど異ならず、異なっていても僅かであった（図５）。しかしながら、肺ビルレンスとこれら５種類の単離体で観察されるｓｇｍＲＮＡの数との間には相関はないと思われる。
【０１６８】
ｓｇｍＲＮＡ３−１は欠陥のある干渉性ＲＮＡではなく、プローブのリボソームＲＮＡへの非特異的結合の結果ではない。
コロナウイルスでは、ＭＨＶを高ｍ．ｏ．ｉ．で組織培養で連続的に継代するときに、様々な大きさの様々な欠陥のある干渉性ＲＮＡ（ＤＩＲＮＡ）が生成した。ＤＩＲＮＡは、未希釈継代の際のトロウイルスに感染した細胞でも観察された。従って、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡ３−１がＤＩＲＮＡとなる可能性を検討した。
【０１６９】
この可能性を除外するため、ｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種を産生するＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ７９の元のウイルス保存株を、それぞれ０．１、０．０１および０．００１の異なるｍ．ｏ．ｉ．でＣＲＬ１１１７１細胞中で４回継代した。コントロール実験では、ＩＳＵ７９の元のウイルス保存株の４回の未希釈継代を行った。４回の継代の後、総細胞内ＲＮＡをウイルス感染細胞から単離し、ノーザンブロット分析をウイルスゲノムの究極３′末端から生成した同じプローブを用いて繰返した。
【０１７０】
ｓｇｍＲＮＡの分析では、ｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種が様々なｍ．ｏ．ｉ．を有する総てのＲＮＡ製剤並びに未希釈継代からのＲＮＡ製剤に存在することが示された（図６Ａ）。更に、ＤＩＲＮＡを用いる場合に通常に見られるように、ｓｇｍＲＮＡ３−１の存在下では他のｓｇｍＲＮＡの合成には干渉や減少はなかった。
【０１７１】
２回の高希釈継代の後には、ＭＨＶのＤＩＲＮＡは消失することが示された。従って、ＩＳＵ７９の元のウイルス保存株がＤＩＲＮＡを含むときには、ＤＩＲＮＡは４回の高希釈継代の後に消失することが示された。上記の実験データーは、ＤＩＲＮＡとは異なり、ｓｇｍＲＮＡ３−１の複製は標記位の量から独立していることを示している。従って、ｓｇｍＲＮＡ３−１は、ＤＩＲＮＡではない。
【０１７２】
総細胞内ＲＮＡのノーザンブロット分析では、プローブは総細胞質ＲＮＡ製剤中に豊富に含まれる１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡに非特異的に結合することができる。あるいは、多量に存在するリボソームＲＮＡは、ゲル中のリボソームＲＮＡと共に波形で同時移動することができるウイルス特異的ｓｇｍＲＮＡの遅延を引起すことがある。
【０１７３】
リボソームＲＮＡへのプローブの非特異的結合による２つの追加バンドは、ＬＶ感染細胞およびＬＤＶ感染細胞で観察された。従って、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡ３−１は、プローブのリボソームＲＮＡへの非特異的結合による可能性がある。
【０１７４】
この可能性を除外するため、ポリアデニル化ＲＮＡを、２個のＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９のいずれかで感染したＣＲＬ１１１７１細胞の総細胞内ＲＮＡから単離した。ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９はいずれも、ｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種を産生する（図５）。ポリアデニル化ＲＮＡのノーザンブロット分析は、これら２種類の単離体のいずれかで感染した細胞中にｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種が存在することを示し、ｓｇｍＲＮＡ３−１は、プローブのリボソームＲＮＡへの非特異的結合によらないことを示唆していた。
【０１７５】
ｓｇｍＲＮＡは３′共末端ネステドセットを表し、ｓｇｍＲＮＡ３−１はＯＲＦ４の上流の配列から誘導される。ゲノムＲＮＡの他に、６個のｓｇｍＲＮＡはウイルスゲノムの究極３′末端からのｃＤＮＡプローブを用いてＶＲ２３８５で感染した細胞で検出される（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書）。従って、ベルンウイルス（ＢＥＶ）、ＬＤＶ、ＥＡＶ、コロナウイルスおよびＬＶと同様にして、米国ＰＲＲＳＶの複製にはｓｇｍＲＮＡの３′共末端ネステドセットの合成も必要である（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。
【０１７６】
これらのｓｇｍＲＮＡを更に詳細に分析するため、ＯＲＦ１ｂ〜７のそれぞれについて特異的な７種類のｃＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲのためのプライマーの設計は、ＶＲ２３８５の配列に基づいていた。プライマー、すなわちＯＲＦ１ｂについてＩＭ７２９およびＩＭ７８２、ＯＲＦ２についてＩＭ３１２およびＩＭ３１３、ＯＲＦ３についてＸＭ１０２２およびＩＭ２５８、ＯＲＦ４についてＸＭ１０２４およびＸＭ１０２３、ＯＲＦ５についてＰＰ２８６およびＰＰ２８７、ＯＲＦ６についてＰＰ２８９およびＸＭ７８０、およびＯＲＦ７についてＰＰ２８４およびＰＰ２８５、および３′非コード領域（ＮＣＲ）の配列および位置を、表４に示す。プライマーは、プライマーのそれぞれの組が特定のＯＲＦからの断片を増幅するだけであり、隣接ＯＲＦ間の重複配列はいずれの所定の断片にも含まれないような方法で設計した。従って、これらの７個のＤＮＡ断片のそれぞれは、ＯＲＦ７および３′−ＮＣＲの両方を表す断片７を除き１個の特定のＯＲＦのみを表す。
【０１７７】
これらの７個のＤＮＡ断片に３２Ｐ−ｄＣＴＰを標識して、ＰＲＲＳＶの２種類の米国単離体ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のいずれかに感染した細胞から抽出される総細胞内ＲＮＡのノーザンブロットにハイブリダイズした。擬似感染したＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総細胞内ＲＮＡは、コントロールとして包含された。
【０１７８】
ノーザンブロット分析は、ＯＲＦ１ｂから生成したプローブ１はゲノムＲＮＡとのみハイブリダイズすることを示した。プローブ２〜７はそれぞれゲノムＲＮＡの他に１以上の追加ＲＮＡ種とハイブリダイズする（図７）。これらの結果は、６個（ＩＳＵ１８９４）またはそれ以上（ＩＳＵ７９）の３′共末端ネステドセットが、ＯＲＦ７をコードする最小の３′末端ＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ７）を有するＰＲＲＳＶ感染細胞で形成されることを示している（図７Ａおよび７Ｂ）。米国ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡは総て、ゲノムＲＮＡの３′末端を含むが、所定のｓｇｍＲＮＡの大きさによってゲノムの５′末端に向かって様々な距離で伸張する。
【０１７９】
ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３−１は、プローブ４〜７とハイブリダイズするが、プローブ１、２および３とはハイブリダイズせず、ｓｇｍＲＮＡ３−１がＯＲＦ４〜７並びに３′−ＮＣＲを含むことを示している。従って、ｓｇｍＲＮＡ３−１は、ＯＲＦ４の上流の配列から生成される。
【０１８０】
単一ヌクレオチド置換により、ｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種が得られる。ノーザンブロットハイブリダイゼーションデーターは、ｓｇｍＲＮＡ３−１がＯＲＦ４の上流の配列から誘導されることを示した（図７Ｂ）。ｓｇｍＲＮＡ３−１の正確な位置およびリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を決定するため、プライマーの組ＩＭ７５５およびＤＰ５８６を設計した（表４）。
【０１８１】
プライマーＩＭ７５５およびＤＰ５８６を用いるＲＴ−ＰＣＲを、ＩＳＵ１８９４またはＩＳＵ７９のいずれかで感染した細胞から単離した総細胞内ＲＮＡを用いて行った。ＩＳＵ７９はｓｇｍＲＮＡ３−１を生成するが、ＩＳＵ１８９４は生成しない（図５）。３０秒間のＰＣＲ伸張を行い、ｓｇｍＲＮＡ３、４および３−１の５′末端配列を表す短い断片を優先的に増幅した。
【０１８２】
ＲＴ−ＰＣＲ生成物の分析では、大きさが約１．１ｋｂおよび０．４５ｋｂの２個の断片を、ＩＳＵ１８９４ウイルスに感染した細胞の総ＲＮＡから増幅した（図８Ａ）。これらの２個の断片は、それぞれｓｇｍＲＮＡ３および４の５′部分を表す。ＩＳＵ１８９４の単離体で観察された２個の断片に加えて、ｓｇｍＲＮＡ３−１の５′部分を表す約０．６ｋｂの第三の断片もＩＳＵ７９で感染した細胞の総ＲＮＡから増幅した（図８Ａ）。
【０１８３】
ｓｇｍＲＮＡ３、４および３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を決定するため、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のＲＴ−ＰＣＲ生成物をGENECLEANキット(Bio 101, Inc.)を用いてアガロースゲルから精製し、自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystem)を用いて直接配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の５′末端を配列決定するのに用いたプライマー（ＸＭ１４１およびＸＭ０７７、表４）を、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のゲノム配列に基づいて設計した（図９）。２個の米国ＰＲＲＳＶ単離体のｓｇｍＲＮＡ３、４および３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列（リーダーはｓｇｍＲＮＡの合成中にｍＲＮＡ本体に結合する）を、２個の単離体のｓｇｍＲＮＡおよびゲノムＲＮＡの５′末端の配列を比較することによって決定した（図８Ｂ）。
【０１８４】
ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３および４のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は、同一であった。ｓｇｍＲＮＡ３については、リーダー−接合配列（ＧＵＡＡＣＣ）はＯＲＦ３の８９ヌクレオチド上流に位置している。ｓｇｍＲＮＡ４については、ＵＵＣＡＣＣはＯＲＦ４の１０ヌクレオチド上流に位置している（図８Ｂおよび図９）。ＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列はＵＵＧＡＣＣであって、ＯＲＦ４の２３６ヌクレオチド上流に位置している（図８Ｂおよび９）。
【０１８５】
ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のゲノム配列の配列整列は、ＩＳＵ１８９４におけるＴからＩＳＵ７９におけるＣへの単一ヌクレオチド置換により、ＩＳＵ７９における追加のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列ＵＵＧＡＣＣが得られることを示している（図８Ｂおよび９）。従って、ｓｇｍＲＮＡ（３−１）の追加種が形成される（図５）。ｓｇｍＲＮＡ４に含まれるＯＲＦ４〜７の他に、ｓｇｍＲＮＡ３−１は５′末端に４５アミノ酸のコード容量を有する追加の小さなＯＲＦ（ＯＲＦ３−１）を含む（図９）。この小さなＯＲＦは、ＯＲＦ４の開始コドンのちょうど１ヌクレオチド前で停止する。
【０１８６】
２個の米国単離体のＯＲＦ２〜７の配列分析により、リーダーｍＲＮＡ接合配列の不均一性が明らかになる。
ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のＯＲＦ２〜５をクローニングし、配列決定した（上記の実験１参照）。ＩＳＵ７９は７個の容易に識別可能なｓｇｍＲＮＡを生成するが、ＩＳＵ１８９４は６個の識別可能なｓｇｍＲＮＡを生成する（図５および７）。ＯＲＦ２〜５の任意の所定の領域における少なくとも３個のｃＤＮＡクローンを、普遍および逆プライマー並びにウイルス特異的プライマーＸＭ９６９、ＸＭ９７０、ＸＭ１００６、ＸＭ０７８およびＸＭ０７７を用いてそれぞれのウイルス単離体について配列決定した（表４）。ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ６および７の配列は、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書に開示されている。
【０１８７】
配列分析は、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のＯＲＦ２〜７が、ＯＲＦ４およびＯＲＦ５の間の１０ヌクレオチドの非コード領域を除き、互いに重複していることを示した。同じ知見は、ＶＲ２３８５について以前に得られていた（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。これはＬＶなどの提案したArteriviridae科の総ての成員が重複している０ＲＦを含むので、極めて異例である。しかしながら、コロナウイルスのＯＲＦは、遺伝子間非コード配列によって隔てられている。従って、米国ＰＲＲＳＶは、ＯＲＦ４および５の接合領域におけるゲノム構成に関してコロナウイルスに幾分類似していると思われる。
【０１８８】
ＩＳＵ１８９４のＯＲＦ２は、ＩＳＵ７９より１アミノ酸だけ長い（図９）。ＯＲＦ２の停止コドンＴＡＧは、ＩＳＵ１８９４ではＴＧＧに変化し、直ぐ後にＩＳＵ１８９４での新たな停止コドン（ＴＧＡ）が続いていた（図９）。ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４の他のＯＲＦの大きさは同一であった（図９）。しかしながら、ＩＳＵ７９とＩＳＵ１８９４との間のＯＲＦ２〜７の全配列中には多数の置換が存在する（図９）。
【０１８９】
測定したまたは予想したリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の数および位置は、ＩＳＵ１８９４とＩＳＵ７９との間で変化した（図９）。ＯＲＦ４の１０ヌクレオチド上流の正規のリーダー−ｍＲＮＡ４接合配列ＴＴＣＡＣＣの他に、ＩＳＵ７９におけるＯＲＦ４の２３６ヌクレオチド上流に位置した追加のリーダー−ｍＲＮＡ３−１接合配列（ＴＴＧＡＣＣ）があった（図９）。ｓｇｍＲＮＡ４および３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は２２６ヌクレオチドだけ離れており、ノーザンブロット分析（図５）およびＲＴ−ＰＣＲ増幅（図８Ａ）で観察されたｓｇｍＲＮＡ４および３−１の推定の大きさと相関した。
【０１９０】
リーダー−ｍＲＮＡ３接合配列は、ＩＳＵ１８９４とＩＳＵ７９との間で同一のＧＴＡＡＣＣであり、ＯＲＦ３の８９ヌクレオチド上流に位置した。ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ２および６の予想リーダー−ｍＲＮＡ接合配列も同一であった（図９）。
【０１９１】
しかしながら、ＩＳＵ１８９４とＩＳＵ７９の予想したリーダー−ｍＲＮＡ５接合配列は異なっている（図９）。ＩＳＵ７９については３個の潜在的リーダー−ｍＲＮＡ５接合配列がある（ＧＣＡＡＣＣ、ＧＡＧＡＣＣおよびＴＣＧＡＣＣ、それぞれＯＲＦ５の５５、７０および１０５ヌクレオチド上流に位置している）。２個の潜在的リーダー−ｍＲＮＡ５接合配列も、ＩＳＵ１８９４に見られた（ＧＡＡＡＣＣおよびＴＣＧＡＣＣ、それぞれＯＲＦ５の７０および１０５ヌクレオチド上流に位置した）（図９）。これらの差は、これらの単離体の予想したリーダー−ｍＲＮＡ５接合配列における２ヌクレオチド置換によるものであった（図９）。
【０１９２】
ＯＲＦ７の１５ヌクレオチド上流のリーダー−ｍＲＮＡ７接合配列の他に、これら２個の単離体のそれぞれにおけるＯＲＦ７の１２９ヌクレオチド上流に位置する追加のリーダー−ｍＲＮＡ７接合配列（ＡＴＡＡＣＣ）が見出された（図９）。しかしながら、この追加のリーダー−ｍＲＮＡ７接合配列に相当するｓｇｍＲＮＡは、ノーザンブロット分析で広範に拡散したバンドを生じた多量に存在するｓｇｍＲＮＡ７と明確に識別されなかった（図５、６および７）。
【０１９３】
この実験で分析したＬＶと２個の米国単離体とのリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の数および位置の変動は、ＬＶのリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を２個の米国単離体であるＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のそれと比較することによっても見出した。総合すれば、これらのデーターは、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡが多形であり、ｓｇｍＲＮＡの数および正確な大きさは分析を行った特定のＰＲＲＳＶ単離体によって変化することを示している。しかしながら、６個のｓｇｍＲＮＡのネステドセットが標準的なアルテリウイルスゲノム構成および転写を最もよく反映していると思われる。
【表４】
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【０１９４】
例３
細胞系ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１を用いて、ＰＲＲＳＶ単離体を増殖させた。細胞系の保持およびウイルスの単離は、以前に記載したのと同じであった(Meng et al., J. Gen. Virol., 75:1795-1801 (1994); Meng et al., J. of Veterinary Diagnostic Investigation, 8:374-381 (1996))。形質細胞腫細胞系ＳＰ２／Ｏを用いて、ＭＡｂ調製における細胞融合を行った。ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ２３８５を、ＰＲＲＳＶに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングの抗原として用いた。
【０１９５】
間接免疫蛍光分析法（ＩＡＦ）
ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞の単層に、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５を０．１の感染多重度で接種し、４８時間インキュベーションし、メタノールで固定した。ハイブリドーマ上清を、固定した細胞単層上で３７℃にて３０分間インキュベーションした。フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）接合体を用いて、特異反応を検出した。１個のＰＲＲＳＶＮ（ＯＲＦ７生成物）特異的モノクローナル抗体ＰＰ７ｅＦ１１を正のコントロールとして用い、非ＰＲＲＳＶ特異的ＭＡｂからの細胞培養上清ＰＰＡｃ８を負のコントロールとして用いた。
【０１９６】
ＭＡｂ製剤
ＰＲＲＳＶＯＲＦ４および５の組換えバキュロウイルスを感染した昆虫細胞からの全細胞溶解生成物を免疫源として用いて、マウスを免役した。ＰＲＲＳＶＯＲＦ４および５を含む組換えバキュロウイルスの構築は、以前に報告したとおりの方法で行った(Bream et al., J. Virol., 67:2665-2663 (1993))。簡単に説明すれば、ＰＲＲＳＶＯＲＦ４および５遺伝子を、個別にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を含むプライマーを用いて、ｐＰＳＰ・ＰＲＲＳＶ２〜７の鋳型からＰＣＲ増幅した(Morozov et al., Archives of Virology, 140:1313-1319 (1995))。増幅した断片を上記の制限酵素で切断し、ベクターＰＶＬ１３９３(Invitrogen)に連結した。挿入した遺伝子はポリヒドリン遺伝子プロモーターの制御下にあり（O'Reilly et al., バキュロウイルス発現ウイルス: 実験室便覧(Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual), １０７〜２３４頁，第２版，ニューヨーク：W.H. Freeman and Company (1992))、制限酵素消化およびＰＣＲ増幅によって確かめた。次に、組換えベクターＤＮＡおよび線形化したAutographa Califomia multinuclear polyhedrosis virus DNA (Invitrogen)を説明書に記載の方法でＳｆ９細胞に同時トランスフェクションした。組換えバキュロウイルス中の挿入遺伝子は、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。組換えウイルスを用いて、昆虫細胞に接種し、細胞溶解生成物をマウスの免疫に用いた。免疫は、２週間間隔で３〜５回の腹腔内注射によって行った。脾臓細胞を以前に報告されている方法でＳＰ２／Ｏ 骨髄腫細胞とハイブリダイゼーションした(Brown & Ling, 「ネズミモノクローナル抗体(Murine Monoclonal Antibodies)」／抗体：実際的方法(Antibodies: a practical approach), ８１〜１０４頁，Catty D. Zoxford監修，Washing,
D.C., IRL Press (1988))。ハイブリドーマを、ＩＦＡを用いてＰＲＲＳＶ特異抗体の分泌についてスクリーニングし、ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ２３８５との反応を検出した。正のハイブリドーマを選択して、３回クローニングした。４個のＭＡｂをＧＰ４に対して展開し、６個のＭａｂをタンパク質に対して展開した。Ｍａｂを、MonoAb IDキット(Zymed Laboratories Inc.)でイソタイプとした。
【０１９７】
酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡは、詳細に記載されている（Harlow & Lane, 抗体：実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual)，４７１〜６１２頁，Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988); Ausubel et al., 分子生物学の簡単な方法(Short protocols in molecular biology)，１１．５〜１１．７頁，第２版，ニューヨーク，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)）。コーティング抗原を、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５感染細胞から１％Triton X-100で抽出した。ＭＡｂを、プレートに結合する抗原を用いてＥＬＩＳＡでの結合活性について試験した。正常細胞からの抽出物および非ＰＲＲＳＶ特異的ＭＡｂからの細胞培養液ＰＰＡｃ８を、それぞれ負の抗原および負のコントロールとして用いた。ＰＲＲＳＶＮ特異的ＭＡｂであるＰＰ７ｅＦ１１を、正のコントロールとして用いた。特異的反応を、ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ接合体を用いて検出し、基質２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用いて確かめた。次に、光学密度を４０５nm（Ａ４０５）で測定した。
【０１９８】
固定細胞ＥＬＩＳＡは、以前に報告されている方法で行い(van Nieuwstadt et al., J. Virol., 70:4767-4772 (1991))、ＭＡｂとＰＲＲＳＶの農場単離体との反応性を試験した。簡単に説明すれば、ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞の単層にＰＲＲＳＶの農場単離体を０．００１の感染多重度で接種し、４８時間インキュベーションし、メタノールで固定した。次に、細胞を１％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックした。ＭＡｂの細胞培養上清を２倍シリーズで希釈し、固定細胞プレートに加えた。ＰＰ７ｅＦ１１およびＰＰＡｃ８を、それぞれ正および負のコントロールとして用いた。特異的反応を、上記の方法で検出した。
【０１９９】
イムノブロット法
ウェスタンイムノブロット分析は、以前に報告されている通りに行った（Harlow & Lane, 抗体：実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual)，４７１〜６１２頁，Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988)）。タンパク質試料を様々な条件下で処理した後、ゲルで分離した。変性条件については、試料を２％SDＳおよび５％２−メルカプトエタノールを含むLaemmli試料中１００℃で３分間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。非変性条件下では、試料を１％Triton X-100を含む試料緩衝液中で４０℃にて２０分間処理し、ＰＡＧＥにかけた。次に、分離したタンパク質を、電気泳動によってニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、３％ＢＳＡでブロックした。ＭＡｂを、マルチスクリーニング装置を用いて膜上での抗原との反応性についてスクリーニングした。ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を正のコントロールとして用いて、ＰＰＡｃ８由来の細胞培養物上清を負のコントロールとして用いた。結合した抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭペルオキシダーゼ接合体またはヤギ抗ブタＩｇＧペルオキシダーゼ接合体とインキュベーションした後、４−クロロ−１−ナフトール基質で発色することによって検出した。
【０２００】
ウイルス中和（ＶＮ）試験
ＭＡｂのウイルス中和活性は、以前に報告された方法を幾つか改良を行って試験した(Mecham et al., Viral Immunol., 3:161-170 (1990); White et al., J. Gen. Virol., 71:4767-4772 (1990))。ハイブリドーマ上清を、３０〜７０プラーク形成単位を含む同容積のＰＲＲＳＶと混合し、これを１０％モルモット補体を含むＤＭＥＭで希釈した。ウイルス−抗体混合物を３７℃で１時間インキュベーションした後、６ウェルプレートでＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞の単層に移し、３７℃で更に１時間インキュベーションした。次に、アガロース培地混合物で、単層を被覆した。３７℃で３日間インキュベーションした後、単層を０．０５％ニュートラルレッド／アガロースで染色した。ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を正のコントロールとして用い、非ＰＲＲＳＶ特異的ＭＡｂ由来のハイブリドーマ細胞培地を負のコントロールとして用いた。
【０２０１】
ＩＦＡで同定したＰＲＲＳＶ特異的Ｍａｂ
ハイブリドーマを、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５に感染したＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞上でＩＦＡでスクリーニングした。ＩＦＡ陽性のハイブリドーマを選択して、増幅し、クローニングした。６個のＭＡｂをＰＲＲＳＶＥタンパク質に対して展開し、４個をＧＰ４に対して展開した。それらの総ては、強度には若干差があるが強い核周囲蛍光を示し、これはＰＲＲＳＶＮタンパク質特異的ＭＡｂの細胞質染色とは異なっていた（図１０）。この結果は、オリゴ糖の糖タンパク質への移行は一般に小胞体およびゴルジ体のような特定の区画で行われるので、ＧＰ４およびＥ糖タンパク質はＰＲＲＳＶ感染細胞の非細胞区画で合成され、蓄積されることを示していた(Pfeffer et al., Ann. Rev. Biochem., 56:829-852 (1987))。ＧＰ４およびＥは、膜関連糖タンパク質と予想された(Meng et al., 1994, & Morozov et al., Archives of Virology, 140:1313-1319 (1995))。対照的に、ＰＲＲＳＶＮタンパク質は塩基性および親水性が高く、ＰＲＲＳＶ感染細胞の細胞質で合成され、これはＮ−特異的ＭＡｂ染色によりＩＦＡでの蛍光の細胞質ゾル分布の観察によって示された。総てのＭＡｂは、サブタイプＩｇＭとして同定した。
【０２０２】
ＥＬＩＳＡにおけるＰＲＲＳＶ抗原との反応性
洗剤処理に対するエピトープの感受性を測定するため、ＥＬＩＳＡを行い、ＭＡｂの１％Triton X-100で抽出したＰＲＲＳＶ抗原との反応性を試験した。Ｅタンパク質に対するＭＡｂの中では、ＰＰ5bＨ４のみがＰＲＲＳＶ抗原に対して強い反応性を示した（図１１）。Ｅ特異的ＭＡｂの残部とＰＲＲＳＶ抗原との間には、明瞭な反応は見られなかった。ＧＰ４に対するＭＡｂの中では、ＰＰ4bＢ３のみがＰＲＲＳＶ抗原と穏和な反応性を示した。ＧＰ４に対するＭＡｂの他の３個は、反応性は全く示されなかった。負のコントロールは、ＥＬＩＳＡでは反応を示さなかった。
【０２０３】
１０個のＭＡｂの中、ＰＰ５ｂＨ４およびＰＰ４ｂＢ３のみが洗剤抽出したＰＲＲＳＶ抗原とＥＬＩＳＡにおける反応性を示した。この結果は、ＰＰ５ｂＨ４によって認識されるエピトープは耐Triton X-100処理性であり、ＰＰ４ｂＢ３のエピトープは部分的に耐洗剤性であることを示唆していた。他の８個のＭＡｂによって認識されたエピトープは処理に対して感受性であり、配座依存性であることがある。Triton X-100は、一般に細胞膜の非変性特性に対して細胞膜を破壊するように選択されるが(Deutscher, 「タンパク質精製入門(Guide to protein purification)」，酵素学の方法(Methodsin Enzymology)，第１８２巻，サンディエゴ，カリフォルニア，Academic Press, Inc. (1990))、この試験ではＰＲＲＳＶタンパク質のエピトープは、ＭＡｂ結合によって観察したところ、抽出工程の際に幾分変化した。
【０２０４】
イムノブロット分析
ウェスタンブロッティングを行い、ＭＡｂとＰＲＲＳＶ抗原との反応性を測定して、ＭＡｂが配座依存性エピトープに対するものであるという推論を確かめた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの変性条件下では、ＰＰ５ｂＨ４のみが、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いて検出した推定物Ｅと一致する２６ｋＤａの位置における精製ＰＲＲＳＶビリオンのバンドを認識した（図１２）。次に、イムノブロッティングを非変性ＰＡＧＥで行い、エピトープが非変性条件下で保存されるかどうかを試験した。６個のＭＡｂ〜Ｅの中で、ＰＰ５ｂＨ４のみがＰＲＲＳＶ抗原と反応を示した。ＭＡｂ〜ＧＰ４の中、いずれもこの試験における条件下では精製ビリオンまたは感染細胞中のＰＲＲＳＶ抗原を認識しなかった（結果は示されていない）。
【０２０５】
ＰＰ５ｂＨ４を除き、ＭＡｂはイムノブロットでＰＲＲＳＶ抗原を認識することはできず、これらのＭＡｂによって認識されたエピトープは連続的構造から誘導されないことを示唆していた。ＭＡｂＰＰ５ｂＨ４は２６ｋＤａの位置においてＰＲＲＳＶと反応し、Ｅの分子質量についての報告が確認された(Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1995))。この結果は、他の９個のＭＡｂによってにクローン指揮されたエピトープは洗剤処理に対して感受性であり、ＥＬＩＳＡのものに相当することを示した。また、この結果は、エピトープが配座依存性であることを示唆していた。ＰＰ４ｂＢ３は、ウェスタンブロットにおいてＰＲＲＳＶ抗原と全く反応性を示さず、これはＰＡＧＥおよび移行の際にエピトープが喪失しまたは変更されることによる可能性がある。
【０２０６】
ウイルス中和活性
プラーク減少分析を行って、ＥおよびＧＰ４タンパク質に対するＭＡｂの中には、ウイルス中和活性があるかどうかを試験した。１個のみのＥ特異的ＭＡｂ、すなわちＰＰ５ｄＢ４が、ＶＲ２３８５単離体に対し相同的中和の能力を示した。正のコントロールであるブタ抗ＰＲＲＳＶ血清も、ウイルス中和活性を示した。
【０２０７】
ＧＰ４およびＥに対する１０個のＭＡｂの中で、少なくともＰＰ５ｄＢ４はＰＲＲＳＶＶＲ２３８５に対して相同的ウイルス中和活性を示した。ＰＰ５ｄＢ４はＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット水溶性においてＰＲＲＳＶ抗原を認識することができないので、中和エピトープは配座依存性であった。また、ＰＰ５ｄＢ４の中和活性は、エピトープの少なくとも一部はビリオン表面上に位置しており、ＭＡｂにより接近可能であることを示唆している。ＰＰ５ｄＢ４の中和活性の機構は明らかでない。これは、ウイルス結合または細胞中への侵入がブロックされることによるものと考えることができる。
【０２０８】
他のＰＲＲＳＶ単離体との反応性
ＰＲＲＳＶの農場での単離体を増殖させ、固定細胞ＥＬＩＳＡでのＭＡｂの交差反応性を試験し、他のＰＲＲＳＶ単離体でのエピトープの存在を測定した（表５）。固定細胞ＥＬＩＳＡを用いたが、これらのＭＡｂのほとんどが配座依存性エピトープを認識しかつこれらのエピトープを固定細胞に保存することができるからである。総てのＭＡｂは総ての単離体と反応するが、異なる力価で反応する。この結果は、ＭＡｂによって認識されたエピトープが、試験した単離体中に保存されることを示唆している。しかしながら、試験を行った単離体には抗原性の差がある。力価が２５６以上である場合には、反応性強度は高として任意に定義され、力価が６４〜１２８である場合には中として、また力価が３２以下である場合には低として定義された。試験を行った２３個の単離体の中、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のみが１０個のＭＡｂの中７個と高い反応性を有した。５個の単離体は、１０個のＭＡｂの中少なくとも６個と低い反応性を有し、１２個の単離体は１０個のＭＡｂの中少なくとも６個と中程度の反応性を有し、他の５個の単離体は半数のＭＡｂと低反応性を有した。ＭＡｂ  ＰＰ４ｄＧ６およびＰＰ５ｂＨ４は、ほとんどの単離体と他のＭＡｂより低い反応性を示した。ＰＰ４ｂＢ３は、総てのＭＡｂの中で、ＧＰ４およびＥタンパク質に対して最も強い反応性を示した。力価の差は、１個のＭＡｂと異なる単離体との反応については６４倍程度であり、例えばＰＲＲＳＶＲＰ１０およびＲＰ１２と反応するＭＡｂＰＰ４ｃＢｌ１の力価は、それぞれ１６および１０２４であった。一方、１個の単離体とのＭＡｂの力価の差は１２８倍程度であり、例えばＰＲＲＳＶＲＰ１１と反応するＭＡｂＰＰ４ｂＢ３およびＰＰ４ｂＣ５の力価はそれぞれ１０２４および８であった。この結果は、異なるＭＡｂによって認識されるエピトープは異なっていることを示唆した。正のＭＡｂコントロールは、ＩＳＵ−５１を除き総ての単離体と強い反応性を示す。ＭＡｂとＰＲＲＳＶ単離体との反応性の差は、ＶＲ２３８５、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＲＰ４５のアミノ酸配列アイデンティティーがＯＲＦ４では９４〜９８％であり、ＯＲＦ５では８８〜９７％であるという報告と一致した(Meng et al., J. Gen. Virol., 140:745-755 (1995))。
【０２０９】
要約すれば、６個のＭＡｂがＰＲＲＳＶＥタンパク質に対して開発され、４個がＧＰ４に対して開発された。ＰＰ５ｂＨ４を除き、それらの総ては、ＥＬＩＳＡおよびイムノブロッティングによって測定したところ、配座依存性エピトープに対するものであった。ＭＡｂＰＰ５ｄＢ４は、ＶＲ２３８５に対してウイルス中和活性を示した。ＭＡｂとＰＲＲＳＶの農場での単離体との反応性のパターンは、ＰＲＲＳＶＧＰ４およびＥには抗原性の差があることを示唆し、これによりＭＡｂのＰＲＲＳＶＮおよびＯＲＦ３生成物に対するＭＡｂについての以前の報告が確かめられた(Nelson et al., J. Clinical Microbiology, 31:3184-3189 (1993); Drew et al., J. General Virol., 76:1361-1369 (1995); Wieczorek-Krohmer et al., Veterinary Microbiology, 51:257-266 (1996))。
【０２１０】
例４
細胞およびウイルス
ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞を用いてＰＲＲＳＶを増殖させ、ＰＲＲＳＶ精製は以前に報告された方法で行った(Meng et al., J. Gen.Virol., 75:1795-1801 (1994); Meng et al., J. Vet. Diag. Invest., 8:374-381 (1996); Halbur et al., Vet. Pathol, 32:648-660 (1995))。ＰＲＲＳＶ単離体ＡＴＣＣＶＲ２３８５(Meng et al., 1994 & Morozov et al., 1995)は、ＯＲＦ２〜４遺伝子のＰＣＲ増幅に用いた。
【０２１１】
Spodoptera frugiperdaクローン９（Ｓｆ９）およびHigh FiveTM (Invitrogen)昆虫細胞を培養して、バキュロウイルスを増殖させた。バキュロウイルス株Autographa California multinuclear polyhedrosis virus（ＡｃＭＮＰＶ）を、組換えバキュロウイルス構築のための親ウイルスとして用いた。
【０２１２】
ＡｃＭＮＰＶ組換え体伝達ベクターの構築
ＰＲＲＳＶＯＲＦ２、３および４を別個に含むバキュロウイルス伝達ベクターの構築を、以前に報告された方法で行った(Bream et al., J. Virol., 67:2655-2663 (1993))。簡単に説明すれば、ＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜４遺伝子は、ＯＲＦ２および３の遺伝子についてはＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ、ＯＲＦ４についてはＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を含むプライマーで、ｐＰＳＰ・ＰＲＲＳＶ２〜７プラスミドの鋳型から別個にＰＣＲ増幅した。
【０２１３】
ＯＲＦ２についての前進プライマーは５′ＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＧＴ３′であり、復帰プライマーは５′ＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＧＡＡＡＧ３′であった。ＯＲＦ３についての前進プライマーは５′ＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＴＡＡＴＡＧＣＴ３′であり、復帰プライマーは５′ＣＧＣＧＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＣＣＴＡＴＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣ３′であった。ＯＲＦ４についての前進プライマーは５′ＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＡＴＡＡ３′であり、復帰プライマーは５′ＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＣＧＧＣＡＣＧＡＴＡＣＡＣ３′であった。増幅断片を上記の制限酵素で切断し、ＯＲＦ２および３断片についてはベクターｐＦａｓｔＢＡＣ１(GIBCO BRL)に、ＯＲＦ４断片についてはベクターＰＶＬ１３９３(Invitrogen)に連結した。挿入した遺伝子は、ポリヘドリン遺伝子プロモーターによって制御され(O'Reilly et al., バキュロウイルス発現ベクター：実験室便覧(Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual), W.H. Freeman & Co., ニューヨーク（１９９２年））、制限酵素消化およびＰＣＲ増幅によって確かめた。次に、ＯＲＦ２〜４遺伝子を別々に含む組換えベクターを単離して、ＯＲＦ２伝達ベクターについてはｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ２、ＯＲＦ３伝達ベクターについてはｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ３、およびＯＲＦ４伝達ベクターについてはｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ４と命名した。ｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ２およびｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ３については、それらのＤＮＡを単離し、Ｂａｃｍｉｄと呼ばれるバキュロウイルスの全ゲノムを含むコンピテントなＤＨ１０ＢＡＣE. coli 細胞(GIBCO BRL)にトランスフェクションした。
【０２１４】
組換えウイルスのトランスフェクションおよび選択
ＯＲＦ２および３について、組換えウイルスをＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣＴＭ発現系(GIBCO BRL)を用いて生成した。単離した組換えＢａｃｍｉｄＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクションした後、細胞培地をウイルス保存物として回収した。ＯＲＦ４組換えウイルス構築のため、ｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ４ＤＮＡおよび線形化ＡｃＭＮＰＶＤＮＡ(Invitrogen)を説明書に記載されているようにＳｆ９細胞に同時トランスフェクションした。推定的組換えバキュロウイルスを、３回の閉塞体が負のプラーク精製(occlusion body-negative plaque purification)の後に選択した。組換えウイルスに挿入された遺伝子は、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。４個の組換え体を組み換えバキュロウイルスの３株のそれぞれについて選択した。ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いる間接免疫蛍光法は、それぞれの株についての４個の組換え体が同様なタンパク質発現レベルを有することを示した。更に検討を行うため、それぞれの株から１個をＯＲＦ２の組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｐ２、ＯＲＦ３の組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｐ３、およびＯＲＦ４の組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｐ４と命名した。
【０２１５】
間接免疫蛍光分析（ＩＦＡ）
ＩＦＡは、至る所で詳細に記載されていた(O'Reilly et al., 1992)。簡単に説明すれば、High FiveTM細胞の単層に、野生型（ｗｔ）のＡｃＭＮＰＶまたはそれぞれｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４の組換えウイルスを０．１の感染多重度で感染させ、７２時間インキュベーションした。ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いて、昆虫細胞で発現される特異タンパク質を検出した。総タンパク質発現を、固定した感染細胞で検出し、染色して、蛍光顕微鏡下で観察した。細胞表面発現を、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清で４℃にて１時間インキュベーションした未固定および未透過性化細胞上で検出し、フルオレセインで標識したヤギ抗ブタＩｇＧ接合体で４℃にて１時間染色した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０２１６】
イムノブロッティング
ウェスタンイムノブロッティングを、以前に報告された方法で行った（Harlow & Lane, 抗体：実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual)，Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988)）。組換えウイルスまたはｗｔＡｃＭＮＰＶで感染させた昆虫細胞からの細胞抽出物を、この分析に用いた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気泳動によってニトロセルロース膜に移した。膜を、ブタノール抗ＰＲＲＳＶ血清と共に室温にて１時間インキュベーションした。特異反応をヤギ抗ブタＩｇＧペルオキシダーゼ接合体で検出した後、４−クロロ−１−ナフトール基質中で発色した。
【０２１７】
ツニカマイシン処理
High FiveTM細胞に、ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４またはｗｔＡｃＭＮＰＶを感染させ、細胞−培地中５μｇ／mlツニカマイシンと共に感染後０〜７２時間インキュベーションした。未処理の昆虫細胞を、同時にコントロールとして感染させた。細胞溶解生成物を回収して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングを行った(O'Reilly et al., 1992)。
【０２１８】
組換えタンパク質の免疫原性
ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４に感染した昆虫細胞の細胞溶解生成物を用いて、ウサギでの組換えタンパク質の免疫原性を試験した。２匹の１２週齢のウサギに、これらの組換えタンパク質をそれぞれ筋肉内および皮下注射した。２回の追加免疫注射の１０日後に、血液を採取した。抗体を間接ＥＬＩＳＡで試験した(Ausubel et al., 分子生物学の簡単な方法(Short protocols in molecular biology)，１１．５〜１１．７頁，第２版，ニューヨーク，Green Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)）。精製したＰＲＲＳＶビリオンを超音波処理し、９６ウェルのプレートのコーティングに用い、ヤギ抗ウサギＩｇＧへペルオキシダーゼ接合体を用いて、ウサギ血清試料中の抗ＰＲＲＳＶ抗体を検出した。免疫前ウサギ血清を、負のコントロールとして用いた。基質２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用いて、特異反応を確かめた。
【０２１９】
結果
組換えウイルスの構築および確認
構築法の詳細を、方法において説明する。ＯＲＦ２および３については、組換えバキュロウイルスを組み換えＢａｃｍｉｄを含むE. coliから選択した後、Ｓｆ９昆虫細胞のトランスフェクションから集めた。組換えウイルスを、更にＤＮＡハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅によって確かめた。感染細胞由来のＤＮＡとＯＲＦ２〜４のＰＲＲＳＶ遺伝子由来の特異的プローブとのハイブリダイゼーション、およびＰＣＲ増幅のいずれも、組換えバキュロウイルスはクローニングした正しい遺伝子を有することを示していた（データーは示されていない）。
【０２２０】
組換えウイルスｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４の表面免疫蛍光
High FiveTM細胞にｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４またはｗｔＡｃＭＮＰＶを感染させ、７２時間インキュベーションし、メタノールで固定して、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いるＩＦＡによって総タンパク質発現を検討した。未固定および未透過性化昆虫細胞を４℃で染色し、ＩＦＡによって細胞表面の免疫蛍光を検出した。ｖＡｃ−Ｐ２に感染した細胞では、弱い細胞質蛍光があり、ｖＡｃ−Ｐ３またはｖＡｃ−Ｐ４に感染した昆虫細胞では強い細胞質蛍光があり、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した細胞では特異蛍光は見られなかった（図１７）。ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４に感染し、４℃で染色し、固定および透過性化を行わなかった昆虫細胞には、明瞭な細胞表面免疫蛍光が見られた（図１５）。細胞表面染色は、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞では見られなかった。また、抗体の非存在下において組換えウイルスに感染した昆虫細胞は、蛍光を全く示さなかった（データーは示さない）。
【０２２１】
発現した組換えタンパク質の分析
High FiveTM細胞の単層にｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４またはｗｔＡｃＭＮＰＶを０．１の感染多重度で感染させ、７２時間インキュベーションした。昆虫細胞における組換えタンパク質の発現を、全細胞抽出物を用いて分析した。総タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜に移し、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清で検出した（図１９Ａ）。精製したＰＲＲＳビリオンを加え、同じゲルで分析した。昆虫細胞で発現したＯＲＦ２生成物は、Ｍｒにおいて２７および２９ｋＤａの種として検出された。ＯＲＦ３生成物は、２２、２５、２７〜３１および３５〜４３ｋＤａの多バンド種として検出された。２７〜３１および３５〜４３ｋＤａのＭｒにおけるシグナルは、識別して単一バンドとすることは困難であり、特異なグリコシル化または部分タンパク質分解による可能性がある。ＯＲＦ４生成物は、１５、１８、２２、２４、２８および３０ｋＤａの多バンド種として見出された。これらの特異的バンドは、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞では見られなかった。精製したＰＲＲＳＶ試料では、Ｍｒで少なくとも４つのバンド：１５、１９、２７〜３１および４５ｋＤａがあった。精製したＰＲＲＳビリオンで検出された特異的バンドは、正常細胞コントロールでは見られなかった（図１９Ａ）。
【０２２２】
組換えタンパク質をグリコシル化した。
組換えバキュロウイルスまたはｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞のツニカマイシン処理を行い、ツニカマイシンがＮ−結合グリコシル化を阻害するので組換えタンパク質がＮ−グリコシル化されるかどうかを試験した。処理の後、ＯＲＦ２組換えタンパク質の２９ｋＤａのバンドが消失し、２５ｋＤａが出現し、２７ｋＤａの種には変化がなかった（図２０Ａ）。ＯＲＦ３の組換えタンパク質については、２７〜３１および３５〜４３ｋＤａの種が消失し、２２〜２７ｋＤａのバンドには変化がなかった。ＯＲＦ３の組換えタンパク質の２７ｋＤａの種は、ツニカマイシン処理の後には更に多くなった。Ｎ−グリコシル化阻害の後、ＯＲＦ４の組換えタンパク質は、１５および１８ｋＤａの種のみとして示され、２２〜３０ｋＤａのバンドは消失した。１５および１８ｋＤａのバンドは、ツニカマイシン処理の後には更に鮮明かつ濃くなった。ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞からの抽出物では、シグナルは全く検出されなかった。
【０２２３】
組換えタンパク質の免疫原性
ＯＲＦ２〜４生成物の組換えタンパク質の免疫原性について、ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４に感染した昆虫細胞の溶解生成物でウサギを免役することによって試験した。ウサギ血清試料中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在は、ＥＬＩＳＡによって検出した。免役したウサギの平均力価は、ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４細胞溶解生成物の群についてそれぞれ１９２、１２８および３８２であった（表６）。
【０２２４】
検討
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２〜４の遺伝子をＢＥＶＳにクローニングし、組換えタンパク質を昆虫細胞で発現させた。Ｓｆ９細胞で閉塞体が負のプラーク(occlusion body-negative plaque)を選択する代わりにE. coliで組換えバキュロウイルスの選択工程を行ったので、ＯＲＦ２および３のクローニング法はＯＲＦ４よりもずっと速やかであった。High FiveTM細胞でのタンパク質収率はＳｆ９細胞より高いと考えられているので、Ｓｆ９細胞をバキュロウイルスの増殖に用い、High FiveTM細胞をタンパク質発現に用いた(Wickham et al., Biotechnology Progress, 8:391-396 (1992) & Davis et al., In Vitro Cell and Developmental Biology, 29A:388-390 (1993))。High FiveTM細胞は無血清培地に適合させ、将来のタンパク質精製に役立つようにしてあり、また大規模な工業的生産に適する懸濁培養に適合させることもできる。
【０２２５】
組換えタンパク質は、ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４組換えウイルスに感染した昆虫細胞で発現することをＩＦＡによって示された。ｖＡｃ−Ｐ２に感染した細胞では弱い細胞質蛍光があり、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４に感染した細胞では強い細胞質蛍光があった。ｖＡｃ−Ｐ２に感染した細胞の蛍光が弱い理由は知られておらず、メタノールで固定した後のエピトープの変化による可能性がある。未固定および未透過性化昆虫細胞は４℃で染色して、ブタ抗ＰＲＲＳＶ抗体が細胞表面タンパク質のみと反応し細胞質には入らないようにした。ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４組換えウイルスに感染した昆虫細胞には、明瞭な細胞表面免疫蛍光が見られたが、これは組換えタンパク質が効率的に加工されて、細胞表面に転移されたことを示している。この結果は、ＯＲＦ２〜４生成物が膜関連タンパク質であることを示唆しており、これは配列研究からの予測と一致している(Morozov et al., Archives of Virology, 140:1313-1319 (1995))。しかしながら、これらの生成物がＰＲＲＳＶに感染した哺乳類細胞の細胞表面にも転移されまたは組立てて表面タンパク質としてのビリオンとなるかどうにかについては明らかではない。最近の報告は、ＯＲＦ３および４生成物がウイルス性構造タンパク質であることを示していた(VAN Nieuwstadt et al., J. Virol., 70:4767-4772 (1996))。これらのタンパク質の運命を検討するには、更に実験を行う必要がある。
【０２２６】
免疫ブロット法の結果は、組換えタンパク質が昆虫細胞で効率的に発現したことを示していた。ＯＲＦ２生成物は、Ｍｒが２７および２９ｋＤａの種として検出された。ツニカマイシン処理により２９ｋＤａバンドがなくなり、２５ｋＤａの種が導入され、２７ｋＤａには変化が見られず、２９ｋＤａがＮ−グリコシル化されたことを示唆していた。ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５ＯＲＦ２の予想Ｍｒは２９．５ｋＤａであり、２個の可能なグリコシル化部位を有する(Morozov et al., 1995)。２５ｋＤａの種は、３７〜３８シグナル配列(Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1995))が成熟タンパク質で除去されるならば、ＯＲＦ２のコアタンパク質である可能性がある。２９と２５ｋＤａのバンドの４ｋＤａの差は、１個のグリコシル残基のＭｒが約２〜３ｋＤａであるので、炭水化物構造によるものと思われる(Trimble et al., J. Biol. Chem., 250:2562-2567 (1983))。２７ｋＤａの種は、ツニカマイシン処理に感受性ではなく、Ｏ−結合グリコシル化または他の翻訳後修飾によって修飾される可能性がある。
【０２２７】
昆虫細胞におけるＯＲＦ３生成物は、免疫ブロット法によって検出された２２〜４３ｋＤａの多バンド種として示された。２８〜４３ｋＤａの種は、ｖＡｃ−Ｐ３に感染した昆虫細胞のツニカマイシン処理によって除去され、これらはＮ−結合糖タンパク質でありかつ多バンドはディファレンシャルグリコシル化(differential glycosylation)によるものであることを示唆していた。ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５ＯＲＦ３生成物の予想Ｍｒは、２８．７ｋＤａ（ＬＶのものより約２ｋＤａ小さい）であり、７個の可能なＮ−結合グリコシル化部位を有する(Morozov et al., 1995)。ＯＲＦ３の組換えタンパク質の２７ｋＤａの種はコアタンパク質である可能性があるが、これはツニカマイシン処理の後に量が増加し（図２０Ａ）かつエンドグリコシダーゼＦによる精製ＰＲＲＳＶビリオンの処理の後には２７ｋＤａのバンドが出現しかつ４５ｋＤａのバンドが消失したからである（データーは示さない）。２７ｋＤａより小さな種は、切詰めタンパク質(truncated protein)またはタンパク質分解生成物である可能性がある。無処理試料の２７〜４３ｋＤａのバンドは個々のバンドに識別することは困難であり、これらは過剰負荷または部分タンパク質分解による可能性がある。４３ｋＤａの種は、７個のＮ−結合グリコシル化部位を有しかつ約２〜３ｋＤａが各グリコシル残基と見なされているので、完全にグリコシル化された生成物である可能性がある(Trimble et al., 1983)。最近の報告は、ＬＶのＯＲＦ３が４５〜５０ｋＤａの構造タンパク質をコードし、昆虫細胞中のＯＲＦ３の組換えタンパク質が放射性免疫沈澱によってＭｒが２８〜４４ｋＤａとして検出されたことを示していた。２８ｋＤａの種は、ＬＶＯＲＦ３生成物のコア生成物として見出された。米国特許出願連続番号第ＰＲＲＳＶとＬＶのＯＲＦ３からの組換えタンパク質のＭｒには差があると考えられており、これは用いられる発現系が異なっているかまたはこれら２種類の単離体でこの遺伝子が異なっていることによる可能性がある。もう一つの報告には、バキュロウイルスで発現したＬＶＯＲＦ３のカルボキシ末端の１９９アミノ酸の組換え融合タンパク質はＮ−グリコシル化されず(Katz et al., Vet. Microbio
l., 44:65-76 (1995))、これは同一遺伝子からの発現生成物の多様性が説明されることを示していた。
【０２２８】
昆虫細胞におけるＯＲＦ４は、１５〜３０ｋＤａの多バンド種として検出された。ツニカマイシン処理の後には、２２〜３０ｋＤａのバンドはなくなり、１５，１８ｋＤａのバンドには変化がなく、これは２２〜３０ｋＤａの種が様々な程度にＮ−グリコシル化されていることを示唆していた。ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のＯＲＦ４は、４個の可能なＮ−グリコシル化部位を有する１９．５ｋＤａのタンパク質をコードすると予想された(Morozov et al., 1995)。ＯＲＦ４生成物の１５ｋＤａの種はコアタンパク質であり、１８ｋＤａのバンドはコアタンパク質とＯ−結合グリコシル残基または他の修飾物である可能性がある。ＬＶＯＲＦ４が３１〜３５ｋＤａの構造タンパク質をコードし、昆虫細胞で発現したＯＲＦ４の組換えタンパク質が１７ｋＤａのコアタンパク質を有する２０〜２９ｋＤａの種として検出されたことが報告された(VAN Nieuwstadt et al., 1996)。また、Ｍｒに差があることの理由は、クローニングされる遺伝子の差および発現系が異なることによると思われる。もう一つの報告は、ＯＲＦ４が十分に保存される領域ではないことを示すことによって差を説明していた(Kwang et al., J. Vet. Diag. Invest., 6:293-296 (1994))。
【０２２９】
組換えタンパク質によるウサギの免疫では、これらが抗ＰＲＲＳＶ抗体を誘導したことを示していた。この結果は、これらの組換えタンパク質が、ＰＲＲＳＶに感染した哺乳類細胞におけるそれらの天然の相手と同様な免疫原性を有することを示唆している。
【０２３０】
この研究は、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のＯＲＦ２〜４がＢＥＶＳで発現し、昆虫細胞の細胞質および細胞表面のいずれでも検出されることを示していた。ＯＲＦ２〜４の組換えタンパク質は、Ｎ−結合糖タンパク質であり、グリコシル化の程度によって識別される。精製ＰＲＲＳＶビリオンを同時に分析し、免疫ブロット法で４個のバンドを示した。しかしながら、オリゴクローナルまたはモノクローナル抗体を欠いているため、ＯＲＦ２〜４生成物のいずれかが精製ビリオンで検出されるかどうかを予測することは困難である。ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清の組換えタンパク質との反応は、これらのタンパク質の天然の結合相手が天然の宿主に免疫応答を誘導したことを示唆した。ウサギでの抗ＰＲＲＳＶ抗体の誘導は、これらの組換えタンパク質が、ＰＲＲＳＶに感染した天然宿主に天然のＯＲＦ２〜４生成物と同様な免疫原性を有することを示唆していた。
【表５】
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【０２３１】
例５
細胞およびウイルス
ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１１７１細胞を用いて、ＰＲＲＳＶを増殖させた(Meng et al., 1994 and 1996; Halbur et al., 1995)。Spodoptera frugiperda clone 9 （Ｓｆ９）およびHigh FiveTM (Invitrogen)昆虫細胞を用いて、バキュロウイルスを増殖させた。ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５(Meng et al., 1994 and 1996)を用いて、遺伝子増幅を行い、ＢＥＶＳにクローニングした。ＰＲＲＳＶビリオンは、以前に報告されている方法で精製した(Meng et al., 1994)。バキュロウイルスのAutographa california multinuclear polyhedrosis virus（ＡＣＭＮＰＶ）株を親ウイルスとして用いて、組換えウイルスを構築した。
【０２３２】
ＡｃＭＮＰＶ組換え転移ベクターの構築
ＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３８５のＯＲＦ５〜７の核酸配列は、以前に報告されていた(Meng et al., 1994)。ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ５〜７を個別に含むバキュロウイルス転移ベクターの構築は、以前に報告されている方法を用いて行った(Bream et al., 1993)。簡単に説明すれば、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ５〜７遺伝子を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を含むプライマーで鋳型ｐＰＳＰ・ＰＲＲＳＶ２−７プラスミド個別にＰＣＲ増幅した。ＯＲＦ５の前進プライマーは５′ＴＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＧＧＧ３′であり、復帰プライマーは５′ＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣ３′であった。ＯＲＦ６についての前進プライマーは５′ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＴＣＡＧＣＧＧ３′であり、復帰プライマーは５′ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣ３′であった。ＯＲＦ７についての前進プライマーは５′ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣ３′であり、復帰プライマーは５′ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＡＴＴＣ３′であった。増幅した断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、単離して、ベクターＰＶＬ１３９３(Invitrogen)に連結し、これをまたＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断して正確な配向を確保した。挿入遺伝子はポリヘドリン遺伝子プロモーターの制御下にあり(O'Reilly et al., 1992)、制限酵素消化およびＰＣＲ増幅で確認した。ＯＲＦ５〜７遺伝子を個別に含んでいる組換えベクターを単離した：ＯＲＦ５にはｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｅ、ＯＲＦ６５にはｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｍ、およびＯＲＦ７にはｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｎ転移ベクター。
【０２３３】
組換えウイルスのトランスフェクションおよび選択
Ｓｆ９昆虫細胞を、線形化ＡｃＭＮＰＶＤＮＡ(Invitrogen)およびそれぞれｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｅ、ｐＰＳＰ．Ａｃ−ＭおよびｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｎの組換えプラスミドＤＮＡを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクションした。推定的組換えウイルスを、３回の閉塞体が負のプラーク(occlusion-negative plaque)の精製後に選択した。組換えウイルスに挿入された遺伝子は、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。４個の組換え体を組み換えウイルスの３株のそれぞれについて選択し、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いる免疫蛍光分析法と同様であることを見出した。それぞれの株から１個の組換えウイルスを任意に選択し、ＯＲＦ５を含む組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｅ１、ＯＲＦ６を含む組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｍ１、およびＯＲＦ７を含む組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｎ１と命名した。
【０２３４】
免疫ブロット法
ウェスタン免疫ブロット分析は、以前に報告されている方法に従って行った(Harlow and Lane, 1988)。感染した昆虫細胞、精製ＰＲＲＳＶまたは正常細胞からの全タンパク質を、試料として用いた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を３％ＢＳＡでブロックし、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清と室温にて１時間反応させた。結合抗体は、ヤギ抗ブタＩｇＧペルオキシダーゼ接合体とインキュベーションした後、４−クロロ−１−ナフトール基質と発色させることによって検出した。
【０２３５】
ツニカマイシン処理
感染したHigh FiveTM細胞を５μｇ／mlツニカマイシンと共に細胞−培地中で感染後０〜７２時間インキュベーションし、回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った(O'Reilly et al., 1992)。
【０２３６】
グリコシダーゼによる開裂
組換えタンパク質または精製ＰＲＲＳＶの場合には、エンドグリコシダーゼＦ／Ｎ−グリコシダーゼＦ混合物（ＰＮＧアーゼＦ）およびエンドグリコシダーゼＨ(Boehringer-Mannheim Biochemicals)を用いて、製造業者の指示通りに感染High FiveTM細胞（０．１ＰＦＵ／細胞；感染後７２時間）からの溶解生成物を処理した。簡単に説明すれば、１０５個の細胞を、３０μｇのリーシス緩衝液で溶解した。次に、細胞溶解生成物１０μｇをＰＮＧアーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨで消化し、または未処理のマーカー保持し、未処理コントロールとして用いた。試料を３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
【０２３７】
放射性免疫沈澱（ＲＩＰ）
組換えバキュロウイルスまたは野生型（ｗｔ）ＡｃＭＮＰＶに感染したHigh FiveTM細胞および未感染High FiveTM細胞をメチオニン不含培地で１回洗浄し、感染から４８時間後に１時間飢餓状態にした。次に、５０ｃｉ／mlのTrans35S標識（メチオニンおよびシスチン）(Amersham Life Science Inc.)／メチオニン不含培地を、感染細胞に加えた。３時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡリーシス緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％ＮＰ４０；１％デオキシコール酸ナトリウム；０．１％SDＳ）に加えた。免疫沈澱およびゲル電気泳動は、以前に記載されている方法で行った(Hutchinson et al., J. Virol., 66:2240-2250 (1992))。
【０２３８】
間接免疫蛍光分析（ＩＦＡ）
ＩＦＡは、以前に報告されている方法で行った(O'Reilly et al., 1992)。High FiveTM細胞の単層にｗｔＡｃＭＮＰＶまたは組換えバキュロウイルスを接種し、７２時間インキュベーションし、固定して、総ての組換えタンパク質発現をブタ抗ＰＲＲＳＶ血清で検出した。接種を行った昆虫細胞は、細胞表面タンパク質の存在についても検討した。未固定で未透過性化細胞をブタ抗血清と４℃で１時間反応させ、フルオレセインを標識したヤギ抗ブタＩｇＧ接合体と共に４℃で更に１時間インキュベーションした後、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０２３９】
組換えタンパク質の免疫原性
ｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−Ｍ１、およびｖＡｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞の溶解生成物を、１２週齢のウサギに筋肉内および皮下注射した。２匹のウサギを、Ｅ、ＭおよびＮ組換えタンパク質のそれぞれについて免役した。３週間の間隔を置いて、２回の追加接種を行った。注射投与量は、２×１０６個の昆虫細胞由来の細胞溶解生成物であった。２回目の追加接種の１０日後に、血液を採取した。抗体は、間接ＥＬＩＳＡで試験した。精製ＰＲＲＳＶビリオンを超音波処理し、９６ウェルのプレートのコーティングに用い、ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ接合体を用いて、ウサギ血清試料中の抗ＰＲＲＳＶ抗体を検出した。免疫前ウサギ血清を、負のコントロールとして用いた。基質２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用いて、特異的反応を明らかにした。
【０２４０】
結果
組換えバキュロウイルスにおけるＰＲＲＳＶの存在の確認
ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅を行い、組換えバキュロウイルスにクローニングされた遺伝子が含まれていることを確認した。ＰＲＲＳＶ遺伝子からのプローブと組換えバキュロウイルスのハイブリダイゼーションにより、ＰＲＲＳＶ遺伝子が組み換えバキュロウイルスに含まれていることが示された。ＰＲＲＳＶ遺伝子からの特異的プライマーによるＰＣＲ増幅では、組換えウイルスからでありかつｗｔＡｃＭＮＰＶにはない単一バンドが示された（結果は示されていない）。これらの試験により、組換えバキュロウイルスがＰＲＲＳＶ遺伝子ＯＲＦ５〜７を含むことを確かめた。
【０２４１】
組換えウイルスｖＡｃ−Ｎ１ではなく、ｖＡｃ−Ｅ１およびｖＡｃ−Ｍ１における表面免疫蛍光
ｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−Ｍ１、ｖＡｃ−Ｎ１およびｗｔＡｃＭＮＰＶに感染したHigh FiveTM細胞を、総発現タンパク質および細胞表面発現の存在について検討した。ｖＡｃ−Ｅ１およびｖＡｃ−Ｍ１に感染した細胞には、弱い細胞質傾向が見られた。対照的に、ｖＡｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞には、強い細胞質蛍光が見られ、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した細胞には、蛍光は見られなかった（図１８）。ｖＡｃ−Ｅ１およびｖＡｃ−Ｍ１に感染した細胞には、明瞭な細胞表面免疫蛍光が見られた（図１６）。しかしながら、ｖＡｃ−Ｎ１およびｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞には、表面免疫蛍光は見られなかった。また、組換えウイルスに感染した抗体昆虫細胞の非存在下では、蛍光は全く見られなかった（データーは示されない）。
【０２４２】
昆虫細胞で発現したＯＲＦ５〜７生成物の分析
昆虫細胞での予想タンパク質の発現を分析するため、High FiveTM細胞の集密単層に、０．１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で、それぞれｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−Ｍ１およびｖＡｃ−Ｎ１を感染させ、７２時間インキュベーションした。総タンパク質試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理を行い、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いてウェスタンブロット法によって分析した（図１９Ａ）。昆虫細胞で発現した組換えタンパク質Ｅは、１６、１８、２０、２４および２６ｋＤａの多バンド種として検出された。昆虫細胞で発現したＥは、精製ＰＲＲＳＶにおける２６ｋＤａの種である天然のＥと比較して多様性が大きくかつＭｒが低かった。昆虫細胞で発現したＭは、１９ｋＤａのバンドとして検出され、精製ＰＲＲＳＶでの天然Ｍに相当した。昆虫細胞で発現したＮは、１５ｋＤａのバンドとして検出され、これも精製ＰＲＲＳＶでの天然Ｎに相当した。これらの特異的バンドは、正常な昆虫細胞（結果は示されていない）およびｗｔＡｃＭＮＰＶに感染したものでは検出されなかった。精製ＰＲＲＳビリオンは、同じゲルで分析した。少なくとも５個のバンド１５、１９、２４，２６〜３０および４５ｋＤａが見られた。精製ＰＲＲＳビリオンで検出された特異的バンドは、正常な哺乳類細胞コントロールでは見られなかった。
【０２４３】
バキュロウイルス発現Ｅ、ＭおよびＮのグリコシル化分析
昆虫細胞で発現したＥ、ＭおよびＮがＮ−グリコシル化を行うかどうかを決定するため、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞をツニカマイシンで処理し、Ｎ−結合グリコシル化を阻害した。ツニカマイシン処理の後には、２０〜２６ｋＤａの種はｖＡｃ−Ｅ１に感染した昆虫細胞では検出されなかったが、１６および１８ｋＤａのバンドが更に多くなった。ｖＡｃ−Ｍ１およびｖＡｃ−Ｎ１に感染した細胞では、ＭおよびＮタンパク質のＭｒにはツニカマイシン処理の後には変化が見られなかった（図２０Ｂ）。
【０２４４】
組換えタンパク質の免疫原性
組換えタンパク質Ｅ、ＭおよびＮを、ｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−Ｍ１およびｖＡｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞の溶解生成物でウサギを免役することによって、免疫原性について試験した。次に、ＥＬＩＳＡを行い、ウサギ血清試料における抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在について試験した。Ｅ、ＭおよびＮで免役したウサギの平均力価は、それぞれ３８４、３２０および２，０５６であった（表７）。
【０２４５】
検討
ＰＲＲＳＶの遺伝子Ｅ、ＭおよびＮを含む組換えバキュロウイルスを構築し、昆虫細胞でＥ、ＭおよびＮを発現させた。High FiveTM細胞のタンパク質収率はＳｆ９細胞より高いと考えられるので、Ｓｆ９細胞をバキュロウイルスの増殖に用い、High FiveTM細胞をタンパク質発現に用いた(Wickman et al., 1992 and Davis et al., 1993)。
【０２４６】
免疫蛍光分析では、遺伝子Ｅ、ＭおよびＮを含む組換えウイルスに感染した昆虫細胞でこれらの遺伝子を発現させ、ＥおよびＭは昆虫細胞の細胞表面に輸送された。この結果は、昆虫細胞で発現したＥおよびＭは膜関連タンパク質であり、翻訳後修飾において効率的に加工されることを示唆していた。ＥおよびＭの細胞質免疫蛍光強度が昆虫細胞で低いことの理由は、不明である。感染した昆虫細胞の固定後にエピトープが喪失しまたは修飾されることによるのかもしれない。ｖＡｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞では、強い細胞質免疫蛍光だけが観察され、表面蛍光は検出されなかった。この結果は、バキュロウイルス発現Ｎが細胞表面に輸送されず、細胞質ゾルにあることを示唆していた。この特徴は、配列研究から予測された極めて親水性のヌクレオキャプシドタンパク質としてのその性質と一致している(Meng et al., 1994)。
【０２４７】
組換えＥタンパク質は免疫ブロット法で多バンドを示し、Ｍｒが２６ｋＤａより小さいバンドは精製ＰＲＲＳＶでは見られなかった。昆虫細胞で発現したＥは、精製ＰＲＲＳＶでは２６ｋＤａの種である天然Ｅと比較して、多様性が一層大きくかつＭｒが低かった（図１９）。多バンドは、翻訳後修飾の際の昆虫細胞での差別的グリコシル化によるものであるかもしれない。ツニカマイシン処理により、２０〜２６ｋＤａのバンドがなくなり、１６ｋＤａのバンドの強度が増加した。処理後に１８ｋＤａのバンドが存在することは、Ｏ−結合グリコシル化、ホスホリル化または他の翻訳後修飾による可能性があった。２０〜２６のバンドは、昆虫細胞におけるＥの差別的Ｎ−グリコシル化種のバンドを表す。１６ｋＤａのバンドは、グリコシル化されていないリーダー不含コアタンパク質である可能性がある。組換えタンパク質ＥのＰＮＧアーゼＦおよびエンドグリコシダーゼＨ処理の予備研究では、複雑なグリコシル化が行われることを示していた。ツニカマイシンおよびＰＮＧアーゼＦおよびエンドグリコシダーゼＨ処理のいずれでも、１９および１５ｋＤａのバンドの移動度は変化しなかったので、組換え体ＭおよびＮはＮ−結合グリコシル化を行わなかった。これらの結果は、２０〜２６ｋＤａの組換えタンパク質ＥはＮ−グリコシル化され、昆虫細胞で発現した組換えＭおよびＮタンパク質はＮ−グリコシル化されないことを示唆している。ツニカマイシン処理後の移動度の変化は、配列研究から決定したＥポリペプチドにおける２個のＮ−結合グリコシル化部位の存在と一致していた(Meng et al., 1994)。しかしながら、配列研究は、ＭおよびＮポリペプチドには、それぞれ２および１個の潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位があることを示唆していた。バキュロウイルス発現ＭおよびＮでは、Ｎ−結合グリコシル化は検出されなかった。天然のものと比較して、昆虫細胞での組換えタンパク質は、免疫ブロット法から分かるように、ずっと豊富である（組換えタンパク質の装填量は、図１９ではＰＲＲＳＶレーンの約１％であった）。しかしながら、オリゴクローナルまたはモノクローナル抗体なしでは、差を測定することは困難である。
【０２４８】
精製ＰＲＲＳＶについては、少なくとも５個のバンド、１５、１９、２４、２６〜３０および４５ｋＤａがある。この結果は、ＰＲＲＳＶビリオンには少なくとも３種類の構造タンパク質があるという以前の報告と一致している(Conzelmann et al., Virology, 193:329-339 (1993); Nelson et al., J. Clin. Microbiol., 31:3184-3189 (1994)and Mardassi et al., Arch. Virol., 140:1405-1418 (1994))。精製ＰＲＲＳＶでの４５ｋＤａのバンドは、報告されているようにＯＲＦ３生成物である可能性がある(Kapur et al., J. Gen. Virol., 77:1271-1276 (1996))。２４、２７〜３０ｋＤａの種は数字で表すことはできない。ＰＮＧアーゼＦおよびエンドグリコシダーゼＨで処理した後、バンドパターンはＰＲＲＳＶ試料については変化した。ＰＮＧアーゼＦで処理したＰＲＲＳＶでは、１６−ｋＤａのバンドはＥのグリコシル化されていないリーダーが除去されたコアタンパク質を表し、２７−ｋＤａのバンドはＥ、ＭおよびＮの他のＰＲＲＳＶのもう一つの構造タンパク質を示している可能性がある。しかしながら、これらのバンドの性質は、オリゴクローナルまたはモノクローナル抗体によって決定する必要がある。
【０２４９】
ウサギ免疫試験の結果は、組換えタンパク質でウサギを免役して得た抗体が天然のＰＲＲＳＶウイルス抗原を認識することができることを示唆していた。組換えタンパク質は、ＰＲＲＳＶに感染した哺乳類細胞ではその天然のものと同じ抗原性を示し、特に組換え体Ｎは、ウサギでＥおよびＮより高い抗体力価を誘導した。
【表６】
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【０２５０】
例６
ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の改質生ウイルスワクチンを凍結乾燥ウイルスケーキとして調製し、滅菌水で再構成し、皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）経路で投与した。この研究の目的は、３週齢のブタでのＰＲＲＳＶワクチンの免疫原性を１回の２ml用量をＩＭまたはＳＣでワクチン接種することによって確認することであった。また、ＰＲＲＳＶワクチンが、ビルレントＰＲＲＳＶかぶＩＳＵ−１２によるチャレンジからブタの保護において、２ml用量をＩＭまたはＳＣで１回ワクチン接種した３週齢のブタで安全でありかつ有効であるかどうかも決定した。
【０２５１】
動物の選択
７０頭の雑種ＰＲＲＳＶ血清反応陰性のブタ（陽性比＜０．４に対するＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡ試料）をEvergreen Partners（ モーリス，ミネソタ）から購入し、この研究に用いた。総てのブタは、ワクチン接種の時点で３週齢であった。
【０２５２】
ワクチンの組成
ウイルス株ＩＳＵ−５５を含んでなるＰＲＲＳＶワクチンを、ウイルス継代レベルＸ＋５で生産した。ワクチンは、使用前に２°〜７℃で保存した。ワクチンは、５個を力価測定した。
【０２５３】
ワクチン接種−効力試験
保存ワクチンを、凍結乾燥ウイルスの一部を滅菌水で再構成することによって調製した。保存ワクチンを、培地で最小保護用量レベル（用量当たり約１０４ＴＣＩＤ５０）にまで希釈した。調製したワクチンの典型的な分量を、ウイルス抗原の定量の目的で−７０℃に保持した。この研究に用いた７０頭のＰＲＲＳＶ血清反応陰性の感受性の強いブタを、無作為に４つの処理群に分け、下記のようにしてわく接種した。
【表７】
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【０２５４】
注射部位は、右首（ＩＭ）または側腹部ひだ（ＳＣ）に行った。コントロールブタ（ＣおよびＤ群）には、ワクチンやプラシーボワクチンを接種しなかった。
【０２５５】
ワクチン接種の前に、総てのブタから採血してワクチン接種前血清検査を行った。コントロール動物は、チャレンジの前に採血して、ＰＲＲＳＶに対して血清反応陰性（ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比＜０．４）のままであることを確かめた。
【０２５６】
チャレンジおよび観察手続き
ワクチン接種から３６日後、群Ａ、ＢおよびＣの２０頭のブタのそれぞれを共通隔離室(common isolation room)で混合し(commingled)、ビルレントＰＲＲＳＶでチャレンジした。群Ｄの動物は、非チャレンジコントロールとして残した。ビルレントＩＳＵ−１２ＰＲＲＳＶチャレンジウイルスは、アイオワ州立大学（エイムス、アイオワ）から入手した。ビルレントＩＳＵ−１２ＰＲＲＳＶチャレンジウイルスを、ＰＳＰ３６細胞で膨張させた後、凍結（−７０℃）保存物として保持した。それぞれのブタノールに、チャレンジウイルス２mlを鼻内投与した。ＰＲＲＳＶチャレンジ保存物を融解し、１０４ＴＣＩＤ５０／２mlに希釈した後、投与した。チャレンジウイルスは、チャレンジの際には氷に固定した。チャレンジウイルス製剤の分量を−７０℃に保持して固定した後、ＰＳＰ３６細胞上で力価測定した。動物を、−１および０のチャレンジ後日数（ＤＰＣ）に観察して、各種臨床症状にについてベースラインおよび１〜１０ＤＰＣを確立した。
【０２５７】
臨床的観察
ブタを、食欲不振、嗜眠、下痢、神経学的症状、呼吸困難、チアノーゼおよび死亡のようなチャレンジ後の臨床症状について毎日評価を行った。
【０２５８】
肺病変の評価
個々のブタの肺を、チャレンジから１０日後の剖検時に全体的病巣について検討した。全体的肺病巣の採点者は、それぞれのブタがどの処理群に属しているのか知らされていなかった。簡単に説明すれば、それぞれの肺葉での肺病巣についての得点は、ＰＲＲＳＶ様病巣（色および組織に基づく）を示す肺葉の比率を計算して記録し、その肺葉について可能な点数を掛けた。各肺葉についての最大得点は、肺葉によって占められる全肺容積の相対比によって決定された。次に、総ての肺葉の背側および腹側の外観からの得点を加えて、各ブタについての総得点を得た。各動物についての可能な最大総得点は、１００であった。
【０２５９】
統計分析
ワクチン接種体(vaccinates)およびコントロールについての臨床的症状および全体的病巣の得点を、変動分析を用いて比較した（一般的線形モデル）。非階層化全体的病巣得点を用いる分散モデルの分析の使用は、正規確率分布内の得点を当てはめることによって正当化された。パラメーター分析の誤差の比較は、それらが正規分布していることを示唆し、分散分析についての主要な仮定を実証していた。従って、階層化した全体的肺病巣得点を用いるデーター分析は、必要なかった。総ての統計分析は、ＳＡＳソフトウェアを用いてＩＢＭコンピューターで行った。
【０２６０】
結果及び検討
ＶＳコードワクチンでのＰＲＲＳＶ抗原力価
ＰＲＲＳＶワクチン抗原力価測定の結果を、表８に示す。５回の力価測定からのワクチンの用量当たりの平均ＰＲＲＳＶ力価は、１０３．９２ＴＣＩＤ５０であった。
【０２６１】
臨床的観察
ワクチン接種の後、ワクチン接種したブタのいずれにも、臨床的症状は見られなかった。ビルレントＰＲＲＳＶＩＳＵ−１２ｐ６を投与した後、ワクチン接種体およびコントロールブタは、チャレンジ後の１０日間の観察期間中に呼吸器または神経学的疾患の有意な臨床的徴候は見られなかった。
【０２６２】
全体的肺病巣の病理学
全体的肺病巣の採点の結果を、表９に示す。ＰＲＲＳＶ投与の後、全体的肺表層の得点は、ＩＭワクチン接種したブタ（群Ａ）では０〜２９であり、平均得点は１４．１５であり、ＳＣワクチン接種したブタ（群Ｂ）では１〜２７であり、平均得点は１１．２０であり、ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタ（群Ｃ）では７〜５７であり、平均得点は２５．８０であり、ワクチン接種していない非チャレンジコントロールブタ（群Ｄ）では１〜２８であり、平均得点は１０．９０であった。ＩＭおよびＳＣワクチン接種したブタのいずれも、ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタより肺病巣は有意に少ない（ｐ＜０．０５）。ワクチン接種したブタは、ワクチン接種していない非チャレンジブタの全体的肺病巣の得点と比較して、全体的肺病巣得点に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタは、ワクチン接種していない非チャレンジコントロールブタより有意に高い全体的肺病巣を有していた（Ｐ＜０．０５）。
【０２６３】
結論
この研究の結果は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスの改質生ウイルスワクチンが、ビルレントＰＲＲＳＶチャレンジによって引起される呼吸器疾患の予防における補助として３週齢以上の健康なブタに使用するのに有効であることを示している。改質生ワクチンを接種した３週齢ブタの１００％は、ワクチン接種の後に局部的または全身的臨床上の悪影響を受けなかった。これらのブタは、ワクチン接種後の３６日の全観察期間中健康かつ活動的であった。ワクチンを１０３．９２ＴＣＩＤ５０の用量で筋肉内または皮下投与したブタは、外来性のビルレントＰＲＲＳＶチャレンジ株ＩＳＵ−１２を投与した後は、ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタと比較して全体的肺病巣の発現が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。ワクチン接種したブタのチャレンジ後の全体的肺病巣得点は、ワクチン接種していない非チャレンジコントロールと統計学的に識別できなかった（ｐ＞０．０５）。分散のパラメーター分析の誤差の分析では、それらが正規分布していることを示唆し、分散分析についての主要な仮定を実証していた。ワクチン接種したブタは、いずれもチャレンジ後の期間中に臨床的徴候を示さなかった。
【表８】
2011103883.tif 000009
【表９】
2011103883.tif 000010
【０２６４】
例７
ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５の完全配列
材料および方法
ウイルスおよび細胞
ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３５５、継代７を、この研究に用いた。連続細胞系ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１を、ウイルスの成長およびウイルス感染細胞培養からのウイルスＲＮＡおよび総ＲＮＡの単離に用いた。
【０２６５】
ｃＤＮＡのクローニングおよびＰＣＲ増幅
ＶＲ２３８５のゲノムのＯＲＦ１領域を特性決定するため、ランダムｃＤＮＡλライブラリーをUni-Zap cDNAクローニングキット(Stratagene, ラヨラ, カリフォルニア）を用いて構築した。簡単に説明すれば、ＣＲＬ１１１７１細胞にＶＲ２３８５ウイルスを０．１のＭ．Ｏ．Ｉ．で感染させ、感染細胞からの総ＲＮＡを感染から２４時間後にグアニジニウムチオシアネート法を用いて単離した。最初に、ＯＲＦ２の５′末端に特異的なプローブを用いて、ランダムｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。このプローブとハイブリダイズしたプラークを単離して、精製した。ウイルスｃＤＮＡインサートを含むファージミド(phagemids)を、ExAssistヘルパーファージおよびE. coli SOLR細胞(Stratagene, ラヨラ, カリフォルニア）を用いるイン・ビトロ切除によって回収した。ＯＲＦ１に特異的な重複断片とハイブリダイゼーションした後に、大きさが２〜６ｋｂの範囲のウイルス特異的ｃＤＮＡインサートを有する数個の組換えファージミドを選択した。次に、ウイルスｃＤＮＡインサートを含むプラスミドを精製し、自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems, フォスターシティー, カリフォルニア）を用いてサンガーのジデオキシヌクレオチド連鎖停止法によって配列決定した。普遍、逆およびＰＲＲＳＶ特異的内部プライマーを用いて、配列を決定した。ＯＲＦ１ａおよび１ｂの配列を表す少なくとも２個の独立したｃＤＮＡクローンを配列決定した。ライブラリーで表されない１つの領域（ｎｔ１９５０〜２０５０）を、プルーフリーディングTag Extender (Stratagene)のＴａｇＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマーＩＭ６８７（５−ＣＣＣＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＧＴＣＣ−３′）およびＩＭ２５００（５′−ＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣ−３′）でＰＣＲ増幅した。配列決定データーを集めて、Mac Vector (Ingternational Biotechnologies, Inc., コネチカット）およびGene Works (IntelliGenetics, カリフォルニア）コンピュータープログラムを用いて分析した。
【０２６６】
プライマー伸張実験およびＲＮＡ配列決定法
プライマー伸張実験は、SureScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Gibco BRL)を用いて行った。３２ＰひょうしきしたオリゴヌクレオチドＲＮＳ（５′−ＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣ−３′）を、総容積が１２μlのＶＲ２３８５のウイルスＲＮＡ０．５μｇと混合し、ＲＮＡを９０℃で１０分間変性した。試料を、第一鎖ｃＤＮＡ緩衝液(first strand cDNA buffer)で１９μlの総量に調整し、４２℃で５分間インキュベーションし、プライマーのアニーリングを行った。次に、Super Script II逆転写酵素を反応に加えて、反応混合物を４２℃または５０℃で    分間インキュベーションした。試料を４０％ポリアクリルアミドゲル中で分析した。リーダーの部分配列を含むプライマー伸張生成物をｐＰＲ５９クローンの配列決定反応に続いて泳動した。オリゴヌクレオチドＲＮＳは、配列決定反応のプライマーとして作用した。
【０２６７】
精製ウイルスＲＮＡの直接配列決定は、γ３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドＲＮＳ（５′−ＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣ−３′）および１５１Ｅｘｔ（５′−ＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＧＧＧＧ−３′）と共にRT RNA Sequencing Kit (USB, クリープランド, オハイオ）を用いて行った。配列決定は、配列決定反応当たり精製ウイルスＲＮＡ０．５μｇを用いて、製造業者の使用説明書に準じて行った。
【０２６８】
結果
ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のリーダー配列
以前は、λＺａｐベクターにおけるＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のオリゴｄＴおよびランダムｃＤＮＡライブラリーを、そして今回はＯＲＦ１ｂの部分の配列を構築し、完全ＯＲＦ２〜７を決定した。ＯＲＦ１のＡＴＧ開始コドンの１６１ヌクレオチド上流のＶＲ２３８５の部分リーダー配列は、クローンｐＰＲ５９から得た。ＬＤＶのリーダー配列は１５６ヌクレオチドであり、ＬＶ（ＰＲＲＳＶの欧州単離体）のリーダー配列は２２１ヌクレオチドであることは、以前に示されている。米国ＰＲＲＳＶの完全リーダー配列を決定するため、プライマー伸張実験を行った。１つの実験では、SuperScript II逆転写酵素を用いて４２節し及び５０℃で、ｃＤＮＡを合成した。もう一つの実験では、Ｍｎの存在下でｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを６０℃でのｃＤＮＡ合成に用い、ｃＤＮＡ合成中のリーダーＲＮＡにおける二次構造のポテンシャルを最小限にした。総ての実験において、生成したｃＤＮＡ断片の長さは同一であり、約１９０ヌクレオチド出会った。ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５の完全リーダー配列を検出するため、ウイルスＲＮＡの直接配列決定を行った。スクロースグラディエントによって精製したウイルスから単離したビリオンＲＮＡを、直接ＲＮＡ配列決定反応に用いた。直接ＲＮＡ配列決定は、ＯＲＦ１ａのＡＵＧ開始コドンの１０〜６７ｎｔ上流の位置におけるリーダー配列に相補性のプライマーを用いて行った。リーダー特異的プローブを用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって以前に検出された１６１ｎｔのリーダー配列の他に、追加の２７ヌクレオチドのリーダー配列を同定した。リーダーの究極５′末端における２個のヌクレオチドは、配列決定ゲル中の４個のレーン総てで強いバンドが観察されたため、同定することができなかった。直接ＲＮＡ配列決定によって決定されたリーダーの大きさは、プライマー伸張実験の結果と相関した。直接ＲＮＡ配列決定によって得られたデーターを更に確かめるため、ＲＴ−ＰＣＲを、リーダーの究極５′末端に相当する１6b．ｐ．のプライマーおよびリーダーの３′末端の１０ｎｔ上流に位置したアンチセンスプライマーを用いて行った。直接ＲＮＡ配列決定によって得られた結果と一致する予想された１８０ｂ．ｐ．のＰＣＲ断片を増幅した。従って、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のリーダーの推定的大きさは１９０ｎｔであり、ＬＶ（２２１ｎｔ）、ＥＡＶ（２１２ｎｔ）およびＳＨＦＶ（２０８ｎｔ）について報告されたものより小さいが、ＬＤＶ（１５６ｎｔ）について報告されたリーダー配列より大きかった。リーダーの３′末端の接合領域の配列は、ＴＴＴＡＡＣＣであった。ＯＲＦ１ａのＡＴＧ開始コドンは、この配列の直ぐ下流に位置している。同様な結果は、ＬＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶについても報告されており、ＯＲＦ１ａの開始コドンは接合配列の後にも位置している。しかしながら、ＥＡＶリーダー接合配列のゲノムは、ＯＲＦ１ａの開始コドンの１３ｎｔ上流に報告されていた。ＶＲ２３８５のリーダー配列とＬＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶのリーダー配列の間のヌクレオチド配列アイデンティティーの割合は、それぞれ５５％、４７％および３８％であった。意外なことには、ＶＲ２３８５のリーダーの３′末端の最後の４４ヌク���オチドのみが、ＬＶのリーダー配列と有意な相同性を有している（この領域では８６％アイデンティティー）。ＶＲ２３８５とＬＤＶ（６４％）およびＳＨＦＶ（６３％）との間では、この４４ｎｔ領域では、比較的高い相同性も見られた。ＶＲ２３８５とＥＡＶのリーダー配列の間には、有意な相同性は見られなかった。
【０２６９】
ＰＲＲＳＶゲノムのクローニングおよび配列決定
ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のＯＲＦ１を分析するため、λＺａｐベクターにおけるランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーを、ウイルス感染細胞の総ＲＮＡから構築した。ｃＤＮＡライブラリーからの２０を超過する重複ｃＤＮＡクローンを選択して、配列決定した（図２３）。ほとんどの領域について、配列は、少なくとも２個の独立したクローンから決定した。ヌクレオチド１９００〜２０５０に相当する領域はｃＤＮＡライブラリーでは表されず、このゲノム領域をＰＣＲ増幅し、配列決定した。配列分析は、ポリＡ配列を除くＰＲＲＳＶ（米国単離体ＶＲ２３８５）のゲノムＲＮＡは長さが１５１００ヌクレオチドであった。
【０２７０】
ＯＲＦ１ａ／１ｂにおける機能的ドメインおよび関連ウイルスとの相同性
ＯＲＦ１ａの大きさの予想は、７１７９ヌクレオチドである。これは、ヌクレオチド１９１から７３８７までに及んでおり（停止コドンＴＡＧを除外）、２３９９アミノ酸のポリタンパク質をコードする。リーダーゲノム接合領域はＬＶのそれに類似しており、ＡＴＧ開始コドンは、リーダーのＴＴＴＡＡＣＣは胃列の直後に位置している。ＬＶおよびＶＲ２３８５のＯＲＦ１配列を比較したとき、差を同定した。ＬＶにおけるＯＲＦ１ａは、長さが７１８８ヌクレオチドであり、ＶＲ２３８５より３アミノ酸だけ短い２３９６アミノ酸をコードする。ＶＲ２３８５およびＬＶのヌクレオチド配列を対にして比較したところ、ＯＲＦ１ａの５′末端は３′末端より発散性であることを示唆していた。ＶＲ２３８５およびＬＶの間のヌクレオチド配列５５％アイデンティティーは、ＯＲＦ１ａの３′末端では６１％であり、（ヌクレオチド３０５０〜７３８７）、ＯＲＦ１ａの最初の１５００ヌクレオチドでは５５％、ヌクレオチド１５００〜２５００の涼気では４６％である。ＯＲＦ１ａ中の最可変領域は、ヌクレオチド２５００〜３０００の間に位置し、ＶＲ２３８５とＬＶとの間には有意な相同性はなかった。アミノ酸アイデンティティーは１〜５３０アミノ酸の領域については４９％であり、１１００〜２３９９アミノ酸の領域については５５％であり、アミノ酸５３０〜１１００に及ぶ領域では有意な相同性は見られなかった。ＶＲ２３８５とＬＤＶのＯＲＦ１ａの配列を比較したところ、最初の２０００ヌクレオチドには５２％の相同性があり、ＯＲＦ１ａの最後の３８００ヌクレオチドでは５５％の相同性があった（ＶＲ２３８５における３４００〜７１９７ｎｔおよびＬＤＶにおける２８５０〜６６７８ｎｔに相当）。ＶＲ２３８５の２０００〜３４００ｎｔおよびＬＤＶの２５００〜２８５０ｎｔの領域は高可変性であり、ＬＤＶゲノムには５００ｎｔを上回る欠失がある。予想アミノ酸配列の比較では、アミノ酸１〜５００の領域についての相同性は３６％であり、予想タンパク質の最後の１３００アミノ酸を含む領域（ＶＲ２３８５では１１２０〜２３５３ａａについては３９％であり、ＬＤＶでは９４０−２２２６ａａ）については３９％であった。
【０２７１】
ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａによってコードされた予想タンパク質の分析では、他のアルテリウイルスおよびコロナウイルスについて報告されたものと同様に、２つのパパイン様システインプロテアーゼドメイン（ａａ６３〜１６５およびａａ２６１〜３４７）および１つの３Ｃ様セリンプロテアーゼドメイン（ａａ１５４２〜１６４４）があることが明らかになった。ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａの親水性プロフィールは、ＬＶおよびＬＤＶと同様であった。タンパク質の５′ハーフ（ＶＲ２３８５における最初の１１００ａａ）はほとんどが親水性であり、究極３′末端（ＶＲ２３８５におけるａａ２２３０〜２３９９）は親水性であり、タンパク質の３′ハーフは４つの疎水性領域（ＶＲ２３８５の１１２９〜１２０７ａａ、１２４０〜１２８６ａａ、１４７８〜１６４３ａａおよび１８５６〜２０７６の領域）を有する。
【０２７２】
ＶＲ２３８５ＯＲＦ１ｂは長さが４３８９ヌクレオチドであり、ヌクレオチド７３６９から１１７５７（停止コドンＴＧＡを除く）に及び、１４６３ａａのタンパク質をコードした。ＶＲ２３８５ＯＲＦ１ｂとＬＶ、ＬＤＶおよびＥＡＶのヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列を比較したところ、ＯＲＦ１ｂはＯＲＦ１ａより保存されていることが確かめられた。ＶＲ２３８５とＬＶとの間のヌクレオチドおよびアミノ酸の相同性は、ＯＲＦ１ｂではそれぞれ６４および６７％であり、ＯＲＦ１ａでは５８および５３％であった。ＶＲ２３８５とＥＡＶの予想タンパク質を比較したところ、３６％の相同性をし召した。ＶＲ２３８５の予想ＯＲＦ１ｂタンパク質は、ＬＶ、ＬＤＶ、ＥＡＶおよびコロナウイルスについて記載したのと同様に、推定的ポリメラーゼドメイン（アミノ酸３７３〜５７６）、推定的ジンクフィンガードメイン（アミノ酸６４７〜６８９）、およびＲＮＡヘリカーゼドメイン（アミノ酸７９３〜１０１５）を含む。
【０２７３】
コロナウイルスおよびアルテリウイルスのＯＲＦ１領域の分子特性決定は、ＯＲＦ１ポリタンパク質が２個の重複ＯＲＦであるＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂによって発現されることを示していた。ＯＲＦ１ａと−１フレームで重複しているＯＲＦ１ｂの発現は、いわゆるリボソームフレームシフト機構によって起こり、リボソームがＯＲＦ１ａ停止コドンを迂回し、ＯＲＦ１ｂによってコードされたタンパク質を翻訳する。フレームシフト領域は、「滑りやすい配列」に続いて擬似結節構造から綯っている。ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａ／ＯＲＦ１ｂ接合領域の分析は、潜在的な滑りやすい配列（５′−ＵＵＵＡＡＡＣ−３′）が、ＯＲＦ１ａの停止コドンおよび提案された擬似結節構造の３ヌクレオチド上流に位置していることを示唆した。この領域は、コロナおよびアルテリウイルスで極めて保存されており、ＶＲ２３８５およびＬＶの間のヌクレオチド配列の相同性は８６％であった。
【０２７４】
ＶＲ２３８５とＬＶのリーダー配列の比較は、これらの２種類のウイルスが点突然変異および場合によっては組換えによって互いに異なっていることを示唆した。これらの２種類のウイルスのリーダー配列における広汎な配列の差は、ＰＲＲＳＶにおけるリーダー配列が保存されず、広汎な突然変異による変化を受けやすいことを示唆していた。リーダーにおけるほとんどの保存領域は３′末端における最後の４４ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列酸アイデンティティー(nucleotide sequence acid identity)はＶＲ２３８５とＬＶとの間では８６％であり、ＶＲ２３８５とＬＤＶとの間では６８％であった。ＶＲ２３８５の推定的リーダー配列は１９０ｎｔであり、ＬＶのリーダー配列より３１ｎｔ短く、またＬＤＶのそれより３５ｎｔ長い。図２４に示されるように、ＬＶのリーダー配列と比較してＶＲ２３８５リーダー（ヌクレオチド１４５の後に位置する）には２０ｎｔの欠失がある。ＶＲ２３８５およびＬＤＶのリーダー配列を比較すると、ＬＤＶのリーダー配列の相当する領域に２０ｎｔのギャップが導入されたときに、最大の相同性の得点が得られることが示唆された（図２４）。同様に、ＬＶおよびＬＤＶリーダー配列の整列中に５０ｎｔのギャップがＬＤＶリーダーに導入されるときに最高相同性の得点が得られた。この結果は、リーダーのこの領域がウイルス複製にとって重要ではなく、ウイルス発生の際にリーダーのこの領域に欠失顔こり得ることを示唆している。この観察により、ＶＲ２３８５、ＬＶおよびＬＤＶの中のリーダー配列の長さに差が見られることも説明することができた。
【０２７５】
例８
ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のサブゲノムｍＲＮＡにおけるリーダー配列およびリーダー−本体接合部位の特性決定
ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５の完全なリーダー配列を決定するため、リーダー特異的３２Ｐ標識ＰＣＲプローブを用いるオリゴｄＴｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いるウイルスＲＮＡのＲＮＡ連結（ＲＮＡ円形化）の後、ＯＲＦ７およびリーダー特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ、およびウイルスＲＮＡの５′末端の直接配列決定（例７）などの幾つかの方法を用いた。第一に、リーダー配列の１００ｂ．ｐ．断片をプローブとして用いて、オリゴｄＴλライブラリーからリーダー配列を含むｃＤＮＡクローンを検出した。８個のｃＤＮＡクローンを分析して配列決定し、これらのクローンがｍＲＮＡ７（５クローン）、６（２クローン）、および２（１クローン）のリーダー配列を表すことを見出した。リーダー配列の大きさは、７クローンの６つで１６０から１６３ヌクレオチドまで変化した。ｍＲＮＡ６を表すクローンの１つでは、リーダー特異的配列は１７２ヌクレオチドであった。ウイルスのリーダー内の強力な二次構造がλＺａｐライブラリーの構築の際にリーダーＲＮＡの完全ｃＤＮＡ合成を妨げた可能性がある。第二の実験では、ウイルスＲＮＡの３′および５′末端をＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて頭−尾方式で連結した。フェノールクロロホルム抽出および沈澱の後、連結ＲＮＡにプライマーＩＭ１００３（アンチオリゴヌクレオチド、リーダー配列の３′末端相補性）およびＩＭ１００４（オリゴヌクレオチド、ゲノム３′非コード領域のセグメントに相当、ポリ（Ａ）尾の１００ヌクレオチド上流）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。大きさが２５０〜３５０ヌクレオチドのＰＣＲ生成物の拡散バンドをアガロースゲルから精製し、ｐＳＫ＋ベクターにクローニングした。７個の独立したクローンを配列決定した。配列分析では、ゲノム３′末端におけるポリＡ配列およびゲノムの５′末端におけるリーダー配列を全７クローンで互いに連結したが、リーダー配列の３′末端からの９５〜９６ヌクレオチドのみがウイルスゲノムの３′末端と連結した。ポリＡで配列決定したクローンの大きさは、各クローンで９から４２ヌクレオチドまで変化し、配列決定されたクローンは独立していることを示唆していた。ＶＲ２３８５の推定的な完全長のリーダー配列は、スクロースグラディエント精製したウイルスから単離したビリオンＲＮＡの５′末端の直接ＲＮＡ配列決定によって決定した。
【０２７６】
ＶＲ２３８５のゲノム内のリーダーｍＲＮＡ接合配列および遺伝子間領域
ＶＲ２３８５株のｓｇＲＮＡのリーダー本体接合領域を特性決定するため、リーダー特異的プライマー、およびそれぞれのｓｇｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。２０感染後時間（ｈ．ｐ．ｉ．）に単離した総ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。主要なバンドをアガロースゲルから単離して、クローニングし、配列決定した。ＰＣＲ生成物の直接配列決定も行った。ＰＲＲＳＶのゲノムにおけるリーダー本体接合領域を同定するため、リーダー特異的３２Ｐ標識プローブを用いて、ウイルスＲＮＡから生成したランダムｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、リーダー−ＯＲＦ１ａ接合領域を含む幾つかのクローンを単離して、配列決定した。ｓｇｍＲＮＡ２〜７のリーダー本体接合領域を特性決定した。
【０２７７】
表１０に、総てのｓｇｍＲＮＡのリーダー−本体接合領域、およびウイルスゲノムにおけるそれらの相当する領域をまとめた。ｓｇｍＲＮＡ２、３および６に対して単一の接合部位のみが検出され、ｓｇｍＲＮＡ４、５および７については２個の部位が検出され、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂおよび７ａ、７ｂと命名された。ＶＲ２３８５におけるリーダーゲノム接合領域は、配列ＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴＡＡＣＣによって表され、配列と類似している。
【表１０】
2011103883.tif 000011
【０２７８】
リーダー本体ｍＲＮＡ接合領域は、ｓｇｍＲＮＡ３、４、５ｂ、６および７ａで変化した。表１１で、ＶＲ２３８５、ＬＶ、ＬＤＶおよびＥＡＶのゲノム中の遺伝子間領域を比較する。ＶＲ２３８５、ＬＶおよびＬＤＶの遺伝子間領域は、非常に類似している。ほとんどの変動は、これらの領域の最初の３ヌクレオチドで見られ、最後の４ヌクレオチドは保存されており、ほとんどの領域では、配列ＡＡＣＣによって表される。変動は、この接合配列の最初の２ヌクレオチドでも見られた（ＶＲ２３８５のＯＲＦ４の遺伝子間領域におけるＧＡＣＣおよびＣＡＣＣ、ＶＲ２３８５のＯＲＦ５ｂの遺伝子間領域におけるＡＧＣＣ、ＬＶにおけるＯＲＦ３の遺伝子間領域におけるＧＡＣＣ、およびＬＤＶのＯＲＦ２の遺伝子間領域におけるＡＣＣ）。ＶＲ２３８５のｓｇｍＲＮＡ５ａについての遺伝子間領域はＧＵＣＡＡＣＵであり、ＥＡＶのものと類似している。
【表１１】
2011103883.tif 000012
【０２７９】
相当するＯＲＦの開始コドンの上流の遺伝子間部位の位置は、４から２３１ヌクレオチドまで変化する。表１２は、ＶＲ２３８５とＬＶのゲノムにおける遺伝子間部位の位置を比較する（数字は、相当するＯＲＦの遺伝子間部位とＡＵＧ開始コドンの間のヌクレオチドでの距離を表す）。ＶＲ２３８５とＬＶのゲノムにおけるこれらの部位の位置は、ｓｇｍＲＮＡ３、４、５および６で異なっている。ＶＲ２３８５ゲノムのｓｇｍＲＮＡ４、５および７の合成のための３個の代替遺伝子間部位も同定した。以前は、ｓｇｍＲＮＡの６個のバンドだけが、ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析によるＶＲ２３８５に感染した細胞で検出された。追加のｓｇｍＲＮＡがＶＲ２３８５の複製の際に実際に合成されることを確認するため、リーダーおよびＯＲＦ特異的プライマーを用いてネステドＲＴ−ＰＣＲを行った。増幅したＰＣＲ生成物は、大きさが同様であり、追加のｍＲＮＡ４ａ、５ａおよび７ａに相当した（図２６）。これらの結果は、相当するＯＲＦの開始コドンにより接近しているｓｇｍＲＮＡ４および５の遺伝子間部位４ｂおよび５ｂがｓｇｍＲＮＡ合成に頻繁に用いられることを示唆していた。ｓｇｍＲＮＡ４および５は、種として遺伝子間部位４ｂおよび５ｂから生成したが、代替４ａおよび５ａを用いることによっては極少数しか生成しなかった。ｓｇｍＲＮＡ７の場合には、ＯＲＦ７の開始コドンの１２３ｎｔ上流に位置した遺伝子間部位７ａが頻繁に用いられたが、ＯＲＦ７の開始コドンの９ｎｔ上流に位置した部位７ｂはｓｇｍＲＮＡ７の合成には余り関与しなかった。
【表１２】
2011103883.tif 000013
【０２８０】
リーダーゲノム接合配列と、ｓｇｍＲＮＡにおける遺伝子間領域の配列およびリーダー本体接合領域の配列との比較は、リーダーの最後の７ヌクレオチドのみ（ＴＴＴＡＡＣＣ）がＶＲ２３８５のゲノムにおける遺伝子間領域の配列と相同性を有することを示していた。総体的相同性は５から７ｎｔまで変化し、唯一の例外は、遺伝子間領域の１２ｎｔの１１がリーダー配列の３末端に類似しているｓｇｍＲＮＡ６であった。ｓｇｍＲＮＡのリーダー本体接合領域において、ＣＣＡＣＣＣＣ配列は保存され、リーダーから生成する。しかしながら、様々なｓｇｍＲＮＡについて変化したＣＣＡＣＣＣＣの後の配列は、リーダーの３′末端におけるＴＴＴＡＡＣＣ配列と高水準の相同性を有する。様々なｓｇｍＲＮＡについて検出されたリーダー本体接合配列の変動は、リーダー本体結合が不正確であることを示している。リーダーの３′末端、ｓｇｍＲＮＡのリーダー本体接合領域、およびＶＲ２３８５のゲノム内の遺伝子間領域の間のヌクレオチド配列の比較により、リーダーとｓｇｍＲＮＡの本体との実際の接合の領域が検出された（表II，下線）。
【０２８１】
結論
ＰＲＲＳＶの米国単離体のサブゲノムｍＲＮＡの合成の機構は、ＬＶ、ＬＤＶおよびＥＡＶの機構と類似している。ＶＲ２３８５で検出された遺伝子間領域は一層可変であり、ＬＶと比較すると、様々な部位に位置した。リーダー本体接合配列の変動は、リーダー本体接合が不正確であることを示している。ｓｇｍＲＮＡにおける実際のリーダー本体接合部位の位置は、リーダープライミング以外の（複数の）機構がｓｇｍＲＮＡの合成に関与している可能性があることを暗示している。ＰＲＲＳＶの米国単離体のゲノムにおける代替リーダー−本体接合部位は、ＰＲＲＳＶの様々な株の中のｓｇｍＲＮＡの数の変動を生じることができる。
【０２８２】
例９
ＰＲＲＳＶの農場単離体からのＰＲＲＳＶの高継代ＩＳＵ５５株の同定および識別についての信頼性のある試験を、下記に示す。以前の研究では、低継代ＩＳＵ５５株（継代７）の配列を決定し、この配列を用いてＩＳＵ５５ｈｐ株の識別のためのＲＦＬＰ試験を開発した。第一段階として、ＩＳＵ５５ｐ−７の配列を分析して、ユニーク制限部位を含む可変領域を同定した。コンピューターによる配列分析および異なるＰＲＲＳＶ株の配列との比較の後、２つのユニーク制限部位を含む特異的領域をＯＲＦ４の３′末端で同定した。これらの２つの制限部位は、ＩＳＵ５５（ｐ−７）配列におけるＯＲＦ２のＡＴＧ開始コドンの上流位置に対して、１５１０位のＤｒａＩ（ＴＴＴ／ＡＡＡ）および１６９７位のＢａｌＩ（ＭｓｃＩ）（ＴＧＧ／ＣＣＡ）であった。これらの２つの制限部位は、ＩＳＵ５５株の相当する領域にのみ存在したが、他のＰＲＲＳＶ株には存在しなかった。
【０２８３】
コンピューター解析の結果を確かめるため、高継代ＩＳＵ５５株の配列を決定した。ＯＲＦ３〜７などのゲノム領域（２６９６ｂ．ｐ．）をＰＣＲによって増幅し、配列決定した。高継代ＩＳＵ５５の配列を、ＩＳＵ５５継代７の配列と比較した。この比較の結果を、図２７（ｃＤＮＡ整列）、図２８（ＯＲＦマップ）および図２９（制限酵素ＤｒａＩおよびＢａｌＩを用いる制限パターン）に示す。ＰＲＲＳＶＩＳＵ５５の低継代および高継代の配列は、極めて保存された。高継代ＩＳＵ５５株には、１５ヌクレオチドの置換しか見られなかった。ＯＲＦ３〜７の大きさおよび相対的位置は、同一のままである。高継代ウイルスにおける単一ヌクレオチドの変化は、低継代ＩＳＵ５５と比較して高継代ウイルスの配列には追加のＤｒａＩ部位を生じた（図２９）。この知見により、低継代ＩＳＵ５５ウイルスから高継代ウイルスを識別する機会が提供される。芽球(BLAST)探索を行い、ＩＳＵ５５の高継代株の特異的領域をGenBankデーターベースで利用可能な他のＰＲＲＳＶ配列と比較した。ＩＳＵ５５高継代株のユニーク制限部位（ＩＳＵ５５ｈｐの制限マップの９６６および１１５９位における２個のＤｒａｌ部位および１１５７位におけるＢａｌＩ部位）を含む２３７ｂｐの断片を比較のための鋳型として用いた。芽球探索の結果は、これらの部位がＩＳＵ５５高継代株についてユニークであり、データーベースで利用可能な２４の他のＰＲＲＳＶ単離体には存在しないことを示唆していた。
【０２８４】
ＩＳＵ５５高継代株のＯＲＦ５（６０３ｂｐ）を他のＰＲＲＳＶ株のＯＲＦ５とも比較した。予想されたように、ＩＳＵ５５の７継代株は最高の相同性得点を有し、ヌクレオチド置換は３に過ぎない。第二の高相同性得点を有する株はＮＡＤＣ８であり、ＩＳＵ５５ｈｐ株のＯＲＦ５と比較してＯＲＦ５におけるヌクレオチド置換は３３であった。芽球探索で比較したＰＲＲＳＶ株の残りは、ＯＲＦ５において更に変動を示した（６３ｎｔまでの変化）。これらのデーターは、ＩＳＵ５５ＰＲＲＳＶ株がこれまでに特性決定した他の総てのＰＲＲＳＶ株と異なることを明らかに示している。
【０２８５】
ＰＣＲ−ＲＦＬを開発して、ＩＳＵ５５高継代株をＰＲＲＳＶのＩＳＵ５５ｌｐウイルスおよび他の株から識別した。ＲＦＬＰしけんのため、２つのプライマーを合成した。前進プライマー５５Ｆ  ５′−ＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧ−３′（８２３位）および復帰プライマー３ＲＦＬＰ  ５′−ＧＧＣＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧ−３′（１８３８位）（ＩＳＵ５５高継代株の２６９6bｐの配列決定した断片の５′末端からの位置）。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験の復帰プライマーは、このプライマーが多数のＰＲＲＳＶ単離体と共にＰＣＲ−ＲＦＬＰにおいて用いられ、特異的であることが示されているのでＭＬＶＲｅｓＰＲＲＳＶワクチン株を識別するためにＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験に用いられたものと同一であった（Wesley et al., J. Vet. Diagn. Invest., 10:140-144 (1998); Wesley et al., Amer. Assoc. Of Swine Practitioners, pp. 141-143 (1996); Andreyev et al., Arch. Virol., 142:993-1001 (1997); Mengeling et al., 1997; 上記の文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）。制限酵素ＤｒａＩを用いる消化の後、３個の断片（６２６ｂｐ、１８７ｂｐおよび１３５ｂｐ）が生成する。ＢａｌＩで消化した後、大きさが６２６および３２２ｂｐの２つの断片を形成した。他のＰＲＲＳＶ株のＰＣＲおよび制限酵素消化の後、１０２６ｂｐの断片がコンピューターデーターの解析に準じて形成される。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験をバリデートするため、総ＲＮＡをＩＳＵ５５ｈｐ、ＩＳＵ１２ｌｐ、ＩＳＵ１２ｈｐ株から単離し、プライマー５５Ｆおよび３ＲＦＬＰを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。１０２６ｂｐの断片を、総ての単離体から増幅した。これらの断片を精製し、制限酵素ＤｒａＩおよびＢａｌＩで消化した。生成物を１．５％アガロースゲルで分析した。図３０に試験の結果を示す。ライン１は、ＩＳＵ５５ｈｐ株の未処理の１０２6bｐＰＣＲ断片を示す。ライン２および５は、ＤｒａＩ（ライン２）およびＢａｌＩ（ライン５）で消化したＩＳＵ５５ｈｐのＰＣＲ生成物を示す。断片６２６ｂｐ、１８７ｂｐおよび１３５ｂｐがＤｒａＩでの消化の後に形成され、６２６および３２２ｂｐの断片がＢａｌＩで消化した後に形成した。ライン３、４、６および７は、ＩＳＵ１２ｌｐ（ライン３および６）およびＩＳＵ１２ｈｐ（ライン４および７）のＰＣＲ生成物のＤｒａＩ消化（ライン３および４）およびＢａｌＩ消化（ライン６および７）の結果を示す。ＩＳＵ１２ｌｐおよびｈｐ株との総ての反応において、１０２６ｂｐのＰＣＲ断片を検出した。これらのデーターは、ＩＳＵ５５ｈｐ株のＰＣＲ−ＲＦＬＰ識別についての予測と相関している。
【０２８６】
明らかに、本発明の多数の改質および変更は、上記の教示の観点で可能である。従って、特許請求の範囲内において、本発明は本明細書に具体的に記載されたもの以外に実施することができることを理解すべきである。
【０２８７】
例１０
弱毒化ＰＲＲＳＶワクチン株（ＩＳＵ５５ｐ４９）のゲノムの配列決定
ＶＲ２３８５株の配列を決定した後、得られた配列決定情報を用いて、弱毒化ＰＲＲＳＶ株（ワクチン株）の配列を決定した。ワクチン株の全ゲノムを、２１の重複断片で増幅し、配列決定した。配列決定データーを組合わせると、ゲノムの全体の大きさは１５，４１２ヌクレオチドであり、ＶＲ２３８５株のゲノムの長さと比較して３０９ｎｔ長かった。ＯＲＦマップおよびそれらの位置を、図３１に示す。ワクチン株とＶＲ２３８５株のゲノムを比較したところ、ＯＲＦ１ｂ−ＯＲＦ７の大きさと相対的位置は同じであった。ＯＲＦ１ａは最も可変であり、１個の３０９ヌクレオチド欠失が、ワクチン株の配列と比較してＶＲ２３８５のゲノムに見出された。この欠失はフレームにあり、ＶＲ２３８５ＰＲＲＳＶのゲノムの５′末端から３２４２ヌクレオチドの位置のＯＲＦ１ａの領域に配置された。もう一つの３ヌクレオチドは、ワクチン株のゲノムに比較して１ａａ欠失を引起すゲノムの領域２５０４〜２５１５ｎｔで欠失した。ワクチン株およびＶＲ２３８５株の異なるＯＲＦのゲノムの比較の結果を、表１３にまとめる。これらの株の間の全般的ＤＮＡの相同性は約９１％であり、両株で１４０９４ヌクレオチドが同一であった。３０９ｎｔの欠失を除けば、ＤＮＡ相同性は９３％であった。リーダー配列は、ＶＲ２３８５株についてだけ、ウイルスＲＮＡの直接配列決定によって決定し、ＶＲ２３８５のリーダーの５′末端に特異的な１７ｂｐプライマーを用いて、ワクチン株のリーダーの１７０ｎｔ部分を増幅した。これらの配列を比較すると、総体的相同性は９４％であり、両株には単一のヌクレオチド欠失があり、ＶＲ２３８５リーダーのヌクレオチドＡ（７５位）およびＧ（１１９位）は、ワクチン株のリーダーではなくなっており、ワクチン株リーダーのヌクレオチドＡ（８７位）およびＧ（１２４位）はＶＲ２３８５株のリーダーではなくなっている。
【０２８８】
ワクチン株のＯＲＦ１ａは１９１から７６９９ｎｔまでに及び、２５０３アミノ酸（ａａ）タンパク質を個々ととし、これはＶＲ２３８５株のＯＲＦ１ａタンパク質と比較して１０３ａａ長い。ワクチン株およびＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａで予想されたタンパク質の総体的なａａ同一性は、８８％（ＶＲ２３８５における欠失を含まなければ９２％）であった。ＬＶのＯＲＦ１ａタンパク質と比較すると、総体的ａａ同一性は約４７％であったが、異なるタンパク質類似性を有する幾つかの領域を同定することができる。５′末端（ワクチン株におけるａａ１〜５２９およびＬＶにおけるａａ１〜５２１、５０％ａａ同一性）は比較的保存性であり、３′末端（ワクチン株でのａａ１２３２〜２５０３およびＬＶでのａａ１１１５〜２３９６、５８％ａａ同一性）は比較的保存性であり、その間（ワクチン株でのａａ５３０〜１２３１およびＬＶでのａａ５２２〜１１１４）は超可変領域（ＨＶＲ）であった。ＨＶＲにおける相同性を更に詳細に検討したところ、１つの短い領域（９４ａａ）であって、ワクチン株とＬＶとの間でａａ相同性が５０％であるものを検出することができた。この領域は、ワクチン株ではａａ１０１５〜１１０８、およびＬＶではａａ９２９〜１０２１に及ぶ。興味深いことには、ＯＲＦ１ａで予想されたタンパク質における相同性は、下記のようにして提供することができる。すなわち、保存的領域１（ワクチン株／ＶＲ２３８５株でのａａ１〜５２９、ＬＶでのａａ１〜５２１、ワクチン株とＶＲ２３８５との間のａａ同一性９０％、ワクチン／ＶＲ２３８５株とＬＶとの間のａａ同一性５０％）超可変領域（ＨＶＲ）（ワクチン株でのａａ５３０〜１２３１、ＶＲ２３８５株でのａａ５２０〜１１２７、ＬＶでのａａ５２２〜１２３２、ワクチン株とＶＲ２３８５の間のａａ同一性８４％、ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａタンパク質での１０３ａａ欠失、ワクチン／ＶＲ２３８５株とＬＶとの間のａａ同一性４０％未満）、および保存適量域２（ワクチン株でのａａ１２３２〜２５０３、ＶＲ２３８５株でのａａ１１２８〜２３９９、ＬＶでのａａ１１２８〜２３９６、ワクチン株間のａａ同一性９６％、およびワクチン／ＶＲ２３８５株およびＬＶ間のａａ同一性５７％）。ワクチン株のＨＶＲにおける９４アミノ酸断片（ａａ９２９〜１０２１）は、ＬＶと５０％ａａ相同性を有し、この領域はＶＲ２３８５株では欠失している。
【０２８９】
ワクチン株でのＯＲＦ１ｂはｎｔ７６８７〜１２０６９に及び、１４６１ａａタンパク質をコードし、これは大きさがＶＲ２３８５と同様である。ヌクレオチドおよびアミノ酸を比較したところ、ＯＲＦ１ｂはＯＲＦ１ａと比較して遙かに保存的である。ワクチン株とＶＲ２３８８とのヌクレオチド相同性は９３％であり、それらの予想されるタンパク質の相同性は９７％であった。ＬＶのＯＲＦ１ｂ（１４６２ａａ）と比較すると、ａａ同一性は６７％であった。１つの可変領域が、ＬＶと比較してＯＲＦ1b（ａａ１３６７〜１４６１）の３′末端で検出された。
【０２９０】
ワクチン株のＯＲＦ２〜ＯＲＦ７領域は、ＶＲ２３８５と同様なゲノム構成を示し、ＯＲＦの大きさおよび相対位置は同様であった。ワクチン株とＶＲ２３８５との間の相同性のデーターを表１３に示す。ワクチン株とＬＶとのヌクレオチド（アミノ酸）同一性はＯＲＦ２については６６％（６１％）であり、ＯＲＦ３については６１％（５５％）であり、ＯＲＦ４については６６％（６７％）であり、ＯＲＦ５については６３％（５１％）であり、ＯＲＦ６については６８％（７９％）であり、ＯＲＦ７については６０％（５８％）であった。
【表１３】
2011103883.tif 000014
【０２９１】
例１１
ＶＲ２３８５単離体における欠失の分析
ＶＲ２３８５ＰＲＲＳＶから増幅したＰＣＲ生成物は、ＯＲＦ１ａに４４5bｐの欠失が存在することを示していた。上記の４４５ｂｐの欠失並びに３０９ｂｐの欠失はフレームにあり、重複しており、独立した起源のものであると思われた。プラーク精製の後、これらの欠失変異体はＶＲ２３８５の固体に現われ、４４５ｎｔの欠失を有する変異体はウイルス保存物で主成分となった。この変異体は、低継代ウイルス、高継代ウイルスおよびブタで２回継代したウイルスから単離したＲＮＡのＰＣＲ検討に基づけば安定であると考えられる。３０９ｂｐ欠失変異体は少量であると思われ、ネステドＰＣＲによってのみ特異的プライマーを用いて幾つかのウイルス保存物から増幅することができた。
【０２９２】
例１２
連続継代ＰＲＲＳＶの特性決定
細胞培養の継代によって弱毒化が起こるかどうかを決定するため、ＶＲ２３８５継代７（ｐ７）およびＶＲ２３８５継代８５（ｐ８５）を用いて３週齢のブタに感染させた。感染から１０日後に、推定の全体的肺病巣および臨床的呼吸器得点は、低継代ウイルスに感染したブタでは有意に高かった。ゲノムのＯＲＦ２〜７領域を配列決定し、比較した。ＶＲ２３８５の２つの継代の遺伝子分析では、ＯＲＦ６は最も保存され、アミノ酸レベルで１００％相同であることを示している。残りのＯＲＦは、アミノ酸相同性が９５〜９８％であり、未熟な停止コドンを含むＶＲ２３８５ｐ８５のＯＲＦ２では、推定１０個のアミノ酸の切捨てを生じた。
【図面の簡単な説明】
【０２９３】
【図１Ａ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列の比較。
【図１Ｂ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列の比較。
【図１Ｃ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列の比較。
【図１Ｄ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列の比較。
【図１Ｅ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列の比較。
【図１Ｆ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列の比較。
【図１Ｇ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列の比較。
【図２Ａ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４およびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図２Ｂ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４およびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図２Ｃ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４およびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図２Ｄ】米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４およびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図３】様々なビルレンスを有する７種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜７のヌクレオチド配列に基づいた系統樹。
【図４】ＩＳＵ３９２７に感染したＣＲＬ１１１７１細胞（レーン１）およびＩＳＵ３９２７の精製ビリオン（レーン２）から単離したＲＮＡのノーザンブロット分析。
【図５】それぞれＩＳＵ２２（レーン１）、ＩＳＵ５５（レーン２）、ＩＳＵ７９（レーン３）、ＩＳＵ１８９４（レーン４）およびＩＳＵ３９２７（レーン５）に感染したＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総細胞内ＲＮＡのノーザンブロット分析。
【図６Ａ】様々な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）のＩＳＵ７９を感染させたＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総ＲＮＡ（Ａ）およびＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９を感染させた細胞から単離したポリアデニル化ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション。
【図６Ｂ】様々な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）のＩＳＵ７９を感染させたＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総ＲＮＡ（Ａ）およびＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９を感染させた細胞から単離したポリアデニル化ＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション。
【図７Ａ】ＩＳＵ１８９４（Ａ）およびＩＳＵ７９（Ｂ）を感染させたＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総細胞内ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。
【図７Ｂ】ＩＳＵ１８９４（Ａ）およびＩＳＵ７９（Ｂ）を感染させたＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総細胞内ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。
【図８】ＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４（レーン１）およびＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３、４および４−１（レーン２）の５′末端配列のＲＴ−ＰＣＲ増幅（但し、レーンＬは１−ｋｂマーカー）（Ａ）、およびＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４およびＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡのリーダー−ｍＲＮＡ接合配列（但し、それぞれのＯＲＦの開始コドンに対するゲノム中のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は、ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）（Ｂ）。
【図９Ａ】ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦの開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によって示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図９Ｂ】ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦの開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によって示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図９Ｃ】ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦの開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によって示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図９Ｄ】ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦの開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によって示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図１０】ＰＲＲＳＶを感染させた細胞を用いるＭＡｂの免疫蛍光分析法。ハイブリドーマ上清を、感染したＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞上でＩＦＡで試験した。タンパク質特異的ＭＡｂとの反応による典型的な免疫蛍光を、ここに示す。Ａ．ＧＰ４特異的ＭＡｂ、ＰＰ４ｂＢ３；Ｂ．Ｅ特異的ＭＡｂ、ＰＰ５ｄＢ４；Ｃ．Ｎ特異的ＭＡｂ、ＰＰｅＦ１１；およびＤ．負のコントロール、ＰＰＡｃ８。
【図１１】ＥＬＩＳＡにおけるＭＡｂおよび洗剤抽出したＰＲＲＳＶ抗原の反応性。ＰＲＲＳＶ感染細胞から洗剤１％Triton X-100で抽出し、１％ＢＳＡでブロックした抗原でプレートをコーティングした。ハイブリドーマ上清を、それぞれ正および負のコントロールＰＰｅＦ１１およびＰＰＡｃ８で試験した。特異的反応が、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ接合体で検出された。ＡＢＴＳ基質をプレート中で２０分間インキュベーションした後、Ａ４０５を測定した。ＰＰ４ｂＢ３から出発した最初の４個のＭＡｂはＧＰ４特異抗体であり、ＰＰ５ｂＨ４から出発した次の６個のＭＡｂはＥ特異抗体である。
【図１２】免疫ブロッティングにおけるＥ特異的ＭＡｂおよびＰＲＲＳＶビリオンの抽出物の反応性。分子量標準（ｋＤａ）を、図の左側に示す。レーン：１，ＰＰ５ｄＢ４；２，ＰＰ５ｂＨ４；３，負のコントロール：ＰＰＡｃ８；４，正のコントロール：ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清；５，負のコントロール：正常なブタ血清。
【図１３】モノクローナル抗体の力価。
【図１４】ＰＲＲＳＶ単離体とＰＲＲＳＶに対するＭＡｂとの反応性パターン。ＭＡｂの力価は、図１３に示した。反応性パターンは、少なくとも６個のＭＡｂと任意の１個の単離体との力価に準じて決定した：＜＝３２−低反応性；６４〜１２８−中反応性；＞＝２５６−高反応性。上記の群に属さない単離体をその他とした。試験した単離体の総数は２３であった。
【図１５】昆虫細胞での組換えタンパク質発現の免疫蛍光検出。High FiveTM細胞をｖＡｃ−Ｐ２（Ａ）、ｖＡｃ−Ｐ３（Ｂ）、ｖＡｃ−Ｐ４（Ｃ）およびｗｔＡｃＭＮＰＶ（Ｄ）に感染させ、メタノールで固定し、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清と反応させた。特異的反応は、フルオレセイン標識したヤギ抗−ブタＩｇＧ接合体によって検出され、蛍光顕微鏡下で観察された。
【図１６】High FiveTM細胞での組換えタンパク質の細胞表面発現。昆虫細胞をｖＡｃ−Ｐ５（Ａ）、ｖＡｃ−Ｍ（Ｂ）、ｖＡｃ−Ｎ（Ｃ）およびｗｔＡｃＭＮＰＶ（Ｄ）に感染させ、７２時間インキュベーションし、固定および透過性化(permeabilization)を行わずに４℃で染色した。ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清を用いて細胞表面組換えタンパク質と反応させ、フルオレセイン標識したヤギ抗−ブタＩｇＧ接合体を用いて蛍光顕微鏡下で観察される任意の特異反応を検出した。
【図１７】昆虫細胞で発現した組換えＧＰ２、ＧＰ３およびＧＰ４タンパク質の免疫蛍光検出。High FiveTM細胞を、ＯＲＦ２を含む組換えバキュロウイルスｖＡｃ−Ｐ２（Ａ）、ＯＲＦ３を含むｖＡｃ−Ｐ３（Ｂ）、ＯＲＦ４を含むｖＡｃ−Ｐ４（Ｃ）またはｗｔＡｃＭＮＰＶ（Ｄ）で感染させ、メタノールで固定し、ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清と反応させた。特異的反応は、フルオレセイン標識したヤギ抗−ブタＩｇＧ接合体によって検出され、蛍光顕微鏡下で観察された。
【図１８】昆虫細胞で発現した組換えタンパク質ＧＰ５、ＭおよびＮの免疫蛍光検出。High FiveTM細胞を、ＯＲＦ５を含む組換えバキュロウイルスｖＡｃ−Ｐ５（Ａ）、Ｍ遺伝子を含むｖＡｃ−Ｍ（Ｂ）、Ｎ遺伝子を含むｖＡｃ−Ｎ（Ｃ）またはｗｔＡｃＭＮＰＶ（Ｄ）で感染させ、メタノールで固定し、ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清と反応させた。免疫蛍光は、Ｅ、ＭおよびＮタンパク質を発現する細胞の細胞質に見られる。
【図１９】昆虫細胞における組換えタンパク質発現の免疫ブロット法による検出。全タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１５％ゲル中で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清を用いて、膜をインキュベーションし、特異的反応をヤギ抗−ブタＩｇＧペルオキシダーゼ接合体によって検出した。分子量標準（ｋＤａ）を、図の左側に示す。レーン：１，ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染したHigh FiveTM細胞；２，ｖＡｃ−Ｐ２に感染したHigh FiveTM細胞；３，ｖＡｃ−Ｐ３に感染したHigh FiveTM細胞；４，ｖＡｃ−Ｐ４に感染したHigh FiveTM細胞；５，精製ＰＲＲＳＶビリオン；６，正常なＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞。（Ｂ）．レーン：１，ｖＡｃ−Ｐ５に感染したHigh FiveTM細胞；２，ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染したHigh FiveTM細胞；３，ｖＡｃ−Ｍに感染したHigh FiveTM細胞；４，ｖＡｃ−Ｎに感染したHigh FiveTM細胞；５，精製ＰＲＲＳＶウイルス；６，正常なＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞。矢印は、組換えタンパク質のＭｒにおける位置または範囲を示す。イメージを、Hewlett Packard ScanJet 3c/TスキャナーおよびAdobe Photoshop 3.0 (Adobe System Inc.)のプログラムで走査した。
【図２０】昆虫細胞で発現した組換えタンパク質Ｅ、ＭおよびＮのグリコシル化分析。（Ａ）ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４またはｗｔＡｃＭＮＰＶに感染させた昆虫細胞のツニカマイシン処理。（Ｂ）ｖＡｃ−Ｐ５、ｖＡｃ−Ｍ、ｖＡｃ−ＮまたはｗｔＡｃＭＮＰＶに感染させた昆虫細胞のツニカマイシン処理。
【図２１】ＰＣＲによるＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜７遺伝子の増幅に用いたプライマー。各プライマー内の下線を施した配列は、次のクローニング段階を促進する目的で導入された特異的制限酵素部位を表す。
【図２２】昆虫細胞で発現したＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜５の組換えタンパク質。ａ＝ＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜５の生成物の予想ＭｒおよびＮ−グリコシル化部位は、ヌクレオチド配列の研究に基づいている(Meng et al., 1994 & Morozov et al., 1995)。ｂ＝昆虫細胞での発現生成物。ｃ＝ツニカマイシン処理後のバンドは、免疫ブロット分析によって決定した。ｄ＝リーダーを含まないコアタンパク質は、ツニカマイシン処理分析に基づいて決定する。ツニカマイシン処理後の組換え生成物中の他のバンドの存在は、Ｏ−結合グリコシル化、ホスホリル化または他の転写後修飾による可能性がある。
【図２３】ＶＲ２３８５ｃＤＮＡライブラリーから配列決定した２０個の重複ｃＤＮＡクローン。
【図２４】ＶＲ２３８５およびＬＶのリーダー配列のＤＮＡ整列。
【図２５Ａ１】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ２】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ３】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ４】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ５】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ６】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ｂ１】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ２】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ３】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ４】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ５】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｃ１】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ２】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ３】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ４】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ５】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ６】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ７】ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２６】ｍＲＮＡ４ａ、５ａおよび７ａに相当するＰＣＲ生成物を増幅するためのリーダーおよびＯＲＦ特異的プライマーを用いるネステドＲＴＰＣＲの結果。
【図２７】低継代および高継代ＩＳＵ−５５のＤＮＡ配列整列。
【図２８】ＩＳＵ−５５の高継代および低継代株のＯＲＦマップ。
【図２９】高継代ＩＳＵ−５５株の配列における追加ＤｒａＩ部位を示す制限マップ。
【図３０】ＩＳＵ−５５ｈｐ、ＩＳＵ−１２ｌｐおよびＩＳＵ−１２ｈｐ株から単離され、プライマー５５Ｆおよび３ＲＦＬＰを用いるＲＴＰＣＲに用いられる総ＲＮＡについてのＲＦＬＰ試験の結果。
【図３１】ＩＳＵ−５５ｈｐのＯＲＦのゲノムマップおよびリスト。
【図３２】ＩＳＵ−５５のヌクレオチド配列。
【図３３】ＩＳＵ−１２（ＶＲ２３８５）のヌクレオチド配列。
【図３４】ＩＳＵ−５５およびＩＳＵ−１２（ＶＲ２３８５）のヌクレオチド配列の整列。
【図１Ａ】
2011103883.tif 000015
【図１Ｂ】
2011103883.tif 000016
【図１Ｃ】
2011103883.tif 000017
【図１Ｄ】
2011103883.tif 000018
【図１Ｅ】
2011103883.tif 000019
【図１Ｆ】
2011103883.tif 000020
【図１Ｇ】
2011103883.tif 000021
【図２Ａ】
2011103883.tif 000022
【図２Ｂ】
2011103883.tif 000023
【図２Ｃ】
2011103883.tif 000024
【図２Ｄ】
2011103883.tif 000025
【図３】
2011103883.tif 000026
【図４】
2011103883.tif 000027
【図５】
2011103883.tif 000028
【図６Ａ】
2011103883.tif 000029
【図６Ｂ】
2011103883.tif 000030
【図７Ａ】
2011103883.tif 000031
【図７Ｂ】
2011103883.tif 000032
【図８Ａ】
2011103883.tif 000033
【図８Ｂ】
2011103883.tif 000034
【図９Ａ】
2011103883.tif 000035
【図９Ｂ】
2011103883.tif 000036
【図９Ｃ】
2011103883.tif 000037
【図９Ｄ】
2011103883.tif 000038
【図１０】
2011103883.tif 000039
【図１１】
2011103883.tif 000040
【図１２】
2011103883.tif 000041
【図１３】
2011103883.tif 000042
【図１４】
2011103883.tif 000043
【図１５】
2011103883.tif 000044
【図１６】
2011103883.tif 000045
【図１７】
2011103883.tif 000046
【図１８】
2011103883.tif 000047
【図１９】
2011103883.tif 000048
【図２０】
2011103883.tif 000049
【図２１】
2011103883.tif 000050
【図２２】
2011103883.tif 000051
【図２３】
2011103883.tif 000052
【図２４】
2011103883.tif 000053
【図２５Ａ１】
2011103883.tif 000054
【図２５Ａ２】
2011103883.tif 000055
【図２５Ａ３】
2011103883.tif 000056
【図２５Ａ４】
2011103883.tif 000057
【図２５Ａ５】
2011103883.tif 000058
【図２５Ａ６】
2011103883.tif 000059
【図２５Ｂ１】
2011103883.tif 000060
【図２５Ｂ２】
2011103883.tif 000061
【図２５Ｂ３】
2011103883.tif 000062
【図２５Ｂ４】
2011103883.tif 000063
【図２５Ｂ５】
2011103883.tif 000064
【図２５Ｃ１】
2011103883.tif 000065
【図２５Ｃ２】
2011103883.tif 000066
【図２５Ｃ３】
2011103883.tif 000067
【図２５Ｃ４】
2011103883.tif 000068
【図２５Ｃ５】
2011103883.tif 000069
【図２５Ｃ６】
2011103883.tif 000070
【図２５Ｃ７】
2011103883.tif 000071
【図２６】
2011103883.tif 000072
【図２７Ａ】
2011103883.tif 000073
【図２７Ｂ】
2011103883.tif 000074
【図２７Ｃ】
2011103883.tif 000075
【図２７Ｄ】
2011103883.tif 000076
【図２７Ｅ】
2011103883.tif 000077
【図２７Ｆ】
2011103883.tif 000078
【図２７Ｇ】
2011103883.tif 000079
【図２７Ｈ】
2011103883.tif 000080
【図２８Ａ】
2011103883.tif 000081
【図２８Ｂ】
2011103883.tif 000082
【図２９】
2011103883.tif 000083
【図３０】
2011103883.tif 000084
【図３１】
2011103883.tif 000085
【図３２Ａ】
2011103883.tif 000086
【図３２Ｂ】
2011103883.tif 000087
【図３２Ｃ】
2011103883.tif 000088
【図３２Ｄ】
2011103883.tif 000089
【図３２Ｅ】
2011103883.tif 000090
【図３２Ｆ】
2011103883.tif 000091
【図３３Ａ】
2011103883.tif 000092
【図３３Ｂ】
2011103883.tif 000093
【図３３Ｃ】
2011103883.tif 000094
【図３３Ｄ】
2011103883.tif 000095
【図３３Ｅ】
2011103883.tif 000096
【図３３Ｆ】
2011103883.tif 000097
【図３４Ａ】
2011103883.tif 000098
【図３４Ｂ】
2011103883.tif 000099
【図３４Ｃ】
2011103883.tif 000100
【図３４Ｄ】
2011103883.tif 000101
【図３４Ｅ】
2011103883.tif 000102
【図３４Ｆ】
2011103883.tif 000103
【図３４Ｇ】
2011103883.tif 000104
【図３４Ｈ】
2011103883.tif 000105
【図３４Ｉ】
2011103883.tif 000106
【図３４Ｊ】
2011103883.tif 000107
【図３４Ｋ】
2011103883.tif 000108
【図３４Ｌ】
2011103883.tif 000109
【図３４Ｍ】
2011103883.tif 000110
【図３４Ｎ】
2011103883.tif 000111
【図３４Ｏ】
2011103883.tif 000112
【図３４Ｐ】
2011103883.tif 000113
【図３４Ｑ】
2011103883.tif 000114
【図３４Ｒ】
2011103883.tif 000115
【図３４Ｓ】
2011103883.tif 000116
【図３４Ｔ】
2011103883.tif 000117
【図３４Ｕ】
2011103883.tif 000118
【図３４Ｖ】
2011103883.tif 000119
【図３４Ｗ】
2011103883.tif 000120
【図３４Ｘ】
2011103883.tif 000121
【図３４Ｙ】
2011103883.tif 000122
【図３４Ｚ】
2011103883.tif 000123
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月16日(2010.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：５５（ＩＳＵ−１２）のＤＮＡ配列または配列番号：５４（ＩＳＵ−５５）のＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ配列をコードする単離されたポリ核酸。
【請求項２】
ポリ核酸と生理学的に許容可能なキャリヤーとを含んでなる、ＰＲＲＳＶに対する抗体を誘導するための組成物であって、ポリ核酸が、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）:
５′−α−β−３′                        （Ｉ）
５′−α−β−γ−３′                    （ＩＩ）
５′−β−δ−γ−３′                    （ＩＩＩ）
５′−α−β−δ−γ−３′                （ＩＶ）
［式中、
αは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ２、３および４からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１個のポリペプチド、その低ビルレンス変異体、またはその抗原性もしくは低ビルレンス断片をコードし；
βは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株由来のＯＲＦ５の少なくとも１コピーまたはその１以上の超可変領域であり；
γは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ６およびＯＲＦ７からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１個のポリペプチドをコードし；かつ
δは、共有結合またはポリ核酸の転写および／または翻訳に実質的に影響を及ぼさない結合性ポリ核酸である。］
からなる群から選択される配列を有する、組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の単離されたＤＮＡ配列によってコードされる１個以上のポリペプチドを含んでなるＰＲＲＳＶに対する抗体を誘導するための組成物。
【請求項４】
上記の５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変を統計学的に有意な量だけ減少させ、この量が接種していない５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変と比較して有意であり、すなわちｐ値が０．０１未満である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
更にアジュバントを含んでなる、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項６】
ブタ生殖器および呼吸器疾患からブタを保護する方法であって、請求項２または３に記載の組成物の有効量をこの疾患から保護する必要があるブタに投与することを含んでなる、方法。
【請求項７】
上記組成物の有効量を経口または非経口投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記組成物の有効量を筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下または鼻内投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項８に記載の形質転換された宿主細胞を培養することを含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドに結合する抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
発明の概要
従って、本発明の目的は、
配列番号：５５（ＩＳＵ−１２）または
配列番号：５４（ＩＳＵ−５５）を含むブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のもう一つの目的は、
配列番号：５５のヌクレオチド１９１〜７３８７に対応する配列番号：６８（ＯＲＦ１ａ）、
配列番号：５５のヌクレオチド７３７５〜１１７５７に対応する配列番号：６９（ＯＲＦ１ｂ）、
配列番号：５５のヌクレオチド１１７５６〜１２５２３に対応する配列番号：７０（ＯＲＦ２）、
配列番号：５５のヌクレオチド１２３７９〜１３１１０に対応する配列番号：７１（ＯＲＦ３）、
配列番号：５５のヌクレオチド１２９２４〜１３４５７に対応する配列番号：７２（ＯＲＦ４）、
配列番号：５５のヌクレオチド１３４７１〜１４０７０に対応する配列番号：７３（ＯＲＦ５）、
配列番号：５５のヌクレオチド１４０６４〜１４５８５に対応する配列番号：７４（ＯＲＦ６）、および
配列番号：５５のヌクレオチド１４５７８〜１４９４６に対応する配列番号：７５（ＯＲＦ７）を包含する、または
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
配列番号：５４のヌクレオチド１９１〜７６９９に対応する配列番号：７６（ＯＲＦ１ａ）、
配列番号：５４のヌクレオチド７６５７〜１２００９に対応する配列番号：７７（ＯＲＦ１ｂ）、
配列番号：５４のヌクレオチド１２０７０〜１２８３７に対応する配列番号：７８（ＯＲＦ２）、
配列番号：５４のヌクレオチド１２６９３〜１３４５７に対応する配列番号：７９（ＯＲＦ３）、
配列番号：５４のヌクレオチド１３２３８〜１３７７２に対応する配列番号：８０（ＯＲＦ４）、
配列番号：５４のヌクレオチド１３７８５〜１４３８４に対応する配列番号：８１（ＯＲＦ５）、
配列番号：５４のヌクレオチド１４３７６〜１４８９７に対応する配列番号：８２（ＯＲＦ６）、および
配列番号：５４のヌクレオチド１４８９０〜１５２５８に対応する配列番号：８３（ＯＲＦ７）を包含する
ＩＳＵ−１２のＩＳＵ−５５のオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011103883000001.app
【外国語明細書】
2011103883000001.pdf