(57)【要約】【課題】香りのよいキク属植物およびその作出方法を提供すること。【解決手段】種子親としてChrysanthemum fruticulosaまたはChrysanthemum lavandulifoliumと、花粉親としてChrysanthemum morifolium Ramat.とを交雑して得られた、香気が増強されたキク属植物。【選択図】図１４
2011083260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
種子親としてChrysanthemum fruticulosaまたはChrysanthemum lavandulifoliumと、花粉親としてChrysanthemum morifolium Ramat.とを交雑して得られた、香気が増強されたキク属植物。
【請求項２】
植物の香気成分をヘッドスペース法によるイオンクロマトグラフィーで分析したときに、香気成分の総量が花粉親の１０倍以上である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、リナロール、メチルベンゾエート、リモネン、２−エチルヘキサノール、ｃｉｓ−３−ヘキセニルアセテート、α−ピネン、１，８−シネオール、ミルセン、２−フェニルエチルアルコール、カンファー、エチルアセテート、β−フェランドレン、カンフェン、ｔｒａｎｓ−クリサンテノール、クリサンテノン、ｔｒａｎｓ−クリサンテニルアセテート、ｃｉｓ−クリサンテニルアセテートおよびｃｉｓ−クリサンテノールからなる群から選択される香気成分を含む、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物の後代。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに１項に記載の植物、または請求項４に記載の植物の後代から得られた抽出物。
【請求項６】
種子親としてChrysanthemum fruticulosaまたはChrysanthemum Lavandulifoliumと、花粉親としてChrysanthemum morifolium Ramat.とを交雑することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物を作出する方法。
【請求項７】
植物の香気成分をヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで分析したときに、香気成分の総量が花粉親の１０倍以上である植物を選択することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
栄養繁殖することをさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
電照栽培することをさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク属植物およびその作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キクは、花卉園芸上重要な植物であり、独特の香気を有している。従来、様々なキク品種が作出されてきたが、花序の形、頭花数、頭花の大きさ、頭花の型、花弁の大きさ、花弁の形、花色、葉の形、葉色、草高、草姿、分枝数などの改良を目的としており（特許文献１）、植物品種登録のキクの審査基準（非特許文献１）に香りに関する項目がないことから示唆されるように、香りの改良は行われていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−３２１０５７号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】http://www.hinsyu.maff.go.jp/annai/sinsakijun/kijun/1480.pdf
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、香りのよいキク属植物およびその作出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、キク属の野生種と栽培種とを交雑することにより、香りがよく、香りが強いキク属植物を作出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、要約すると以下の通りである。
〔１〕種子親としてChrysanthemum fruticulosaまたはChrysanthemum lavandulifoliumと、花粉親としてChrysanthemum morifolium Ramat.とを交雑して得られた、香気が増強されたキク属植物。
〔２〕植物の香気成分をヘッドスペース法によるイオンクロマトグラフィーで分析したときに、香気成分の総量が花粉親の１０倍以上である、〔１〕に記載の植物。
〔３〕ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、リナロール、メチルベンゾエート、リモネン、２−エチルヘキサノール、ｃｉｓ−３−ヘキセニルアセテート、α−ピネン、１，８−シネオール、ミルセン、２−フェニルエチルアルコール、カンファー、エチルアセテート、β−フェランドレン、カンフェン、ｔｒａｎｓ−クリサンテノール、クリサンテノン、ｔｒａｎｓ−クリサンテニルアセテート、ｃｉｓ−クリサンテニルアセテートおよびｃｉｓ−クリサンテノールからなる群から選択される香気成分を含む、〔１〕または〔２〕に記載の植物。
〔４〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の植物の後代。
〔５〕〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の植物、または〔４〕に記載の植物の後代から得られた抽出物。
〔６〕種子親としてChrysanthemum fruticulosaまたはChrysanthemum Lavandulifoliumと、花粉親としてChrysanthemum morifolium Ramat.とを交雑することを含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の植物を作出する方法。
〔７〕植物の香気成分をヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで分析したときに、香気成分の総量が花粉親の１０倍以上である植物を選択することをさらに含む、〔６〕に記載の方法。
〔８〕栄養繁殖することをさらに含む、〔６〕または〔７〕に記載の方法。
〔９〕電照栽培することをさらに含む、〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のキク属植物は、好意的に感じる、甘い香りおよび／またはハーブのような香りがし、従来のキク属植物が有するキク独特の香気とは明らかに異なる香りを有する。本発明のキク属植物は、従来のキク属植物と比べて、香気強度（放出している香気物質の量）が高い。地植えの状態であると、株から立ちのぼるように香る。切花の状態でも従来のキク植物よりも強く香る。また、種子親と比べて、花が大きく直立性であるなどの見た目がよく、鑑賞花として優れており、枯れていくときに見た目が汚くなく、ドライフラワーなどにも適している。本発明のキク属植物は、電照栽培が可能で、露地栽培よりも草高や花の大きさを大きくすることができる。また、農業分野における電力需要の造成や離脱防止、花卉産業の活性化などに寄与できる。本発明のキク属植物から抽出された抽出物は、香水、化粧品、アロマオイル、芳香剤などの製品に使用することができる。さらに、野生種のキクは、防臭、大気浄化、薬などの昔から利用されている機能性を有しているものが多く、本発明のキク属植物も同様の機能性を有している可能性があり、鑑賞花以外での用途が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】パネルＡは、Chrysanthemum fruticulosaの株、パネルＢは、Chrysanthemum fruticulosaの花、パネルＣは、Chrysanthemum lavandulifoliumの株、パネルＤは、Chrysanthemum lavandulifoliumの花を示す。
【図２】パネルＡは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の黄色品種の株、パネルＢは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の黄色品種の花、パネルＣは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の赤色品種の株、パネルＤは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の赤色品種の花、パネルＥは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の橙色品種の株、パネルＦは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の橙色品種の花、パネルＧは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の白色品種の株、パネルＨは、Chrysanthemum morifolium Ramat.の白色品種の花を示す。
【図３】パネルＡは、交雑種から得られた種子を示す。パネルＢは、試験管中の培地への播種の様子を示す。パネルＣは、発芽の様子を示す。パネルＤは、伸長の様子を示す。
【図４】従来のＣＴＡＢ法と簡易ＣＴＡＢ法を比較する電気泳動像を示す。
【図５】ＲＡＰＤによる雑種性検定（プライマーＯＰＡ７使用）の電気泳動像を示す。
【図６】ＲＡＰＤによる雑種性検定（プライマーＯＰＡ８使用）の電気泳動像を示す。
【図７】ＲＡＰＤによる雑種性検定（プライマーＯＰＡ７使用）の２反復目の電気泳動像を示す。
【図８】ＰＡＲＤによる雑種性検定（プライマーＯＰＡ８使用）の２反復目の電気泳動像を示す。
【図９】パネルＡは、培養苗の増殖、育成の様子を示す。パネルＢは、順化開始時の培養苗を示す。パネルＣは、順化開始後約４週間の植物を示す。パネルＤは、定植後約４週間の植物を示す。パネルＥは、定植後約１４週間の植物を示す。パネルＦは、増殖培養中の培養苗を示す。
【図１０】パネルＡは、採穂前の定植株を示す。パネルＢは、採穂前の定植株を示す。パネルＣは、採取した脇芽を示す。パネルＤは、低温処理時の挿し芽の状態を示す。パネルＥは、育成開始後１１日の挿し芽を示す。パネルＦは、育成開始後１１日の挿し芽を示す。
【図１１】平成１７年度交雑の第１回栽培試験での調査結果及び生育状況を示す。
【図１２】図１１の続きである。
【図１３】図１２の続きである。
【図１４】図１３の続きである。
【図１５】図１４の続きである。
【図１６】図１５の続きである。
【図１７】図１６の続きである。
【図１８】図１７の続きである。
【図１９】図１８の続きである。
【図２０】図１９の続きである。
【図２１】平成１７年度交雑の第２回栽培試験での調査結果及び生育状況を示す。
【図２２】図２１の続きである。
【図２３】図２２の続きである。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】図２４の続きである。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２６の続きである。
【図２８】平成１７年度交雑の調査結果を示す。
【図２９】図２８の続きである。
【図３０】図２９の続きである。
【図３１】図３０の続きである。
【図３２】図３１の続きである。
【図３３】図３２の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．本発明のキク属植物
本発明のキク属植物は、種子親として、野生種のChrysanthemum fruticulosaまたはChrysanthemum lavandulifoliumと、花粉親として、栽培種のChrysanthemum morifolium Ramat.とを交雑して得られる。その香気は、種子親および花粉親よりも増強され、香気成分の種類や量の違いがあるが、好ましくは、香気成分の総量が花粉親の１０倍以上である。
【００１１】
本発明のキク属植物には、その後代も含まれ、枝代わりなどの突然変異体も含まれる。また、本発明のキク属植物には、植物体（根、茎、葉、花、挿し芽、茎頂などを含む）、種子、花粉、胚珠、細胞、およびカルスなどの培養物も含まれる。さらに、本発明のキク属植物には、生のもの（鉢植え、切花など）だけでなく、加工したもの（ドライフラワーなど）も含まれる。本発明のキク属植物は、種子親よりも直立性であり、草高が高く、約１５ｃｍ〜約１５０ｃｍであり、ほとんどの交雑種で花が大きく、頭花の直径で約０．５ｃｍ〜約５ｃｍ、花数が多い。花色は、例えば、黄色であるが、特に限定されない。また、上記組み合わせの交雑で得られる種々のキク属植物は、本発明において、香気が増強された一連の植物群（植物集団）と捉えてもよい。
【００１２】
（１）種子親
種子親のChrysanthemum fruticulosa（図１のパネルＡおよびＢ）は、北緯３０〜５０度、標高１５００〜３０００ｍに分布し、Chrysanthemum lavandulifolium（図１のパネルＣおよびＤ）は、北緯３０度以下、標高１５００ｍ以下に分布する野生種であり、濃い蜜のような香りを有する。叢生で、葉や茎は細く、花は小さく（約０．３ｃｍ〜約１．５ｃｍ）、日本の気候条件では花を付けにくく、種子を得るのが難しいので、通常、交雑親として選択される種ではない。これらの種子親は、広島大学大学院理学研究科附属植物遺伝子保管実験施設（郵便番号７３９−８５２６  広島県東広島市鏡山１−４−３）から入手可能である。
【００１３】
（２）花粉親
花粉親のChrysanthemum morifolium Ramat.の黄色品種（以下、Ｙ−４ということがある。図２のパネルＡおよびＢ）、Chrysanthemum morifolium Ramat.の赤色品種（以下、Ｒ−８ということがある。図２のパネルＣおよびＤ）、Chrysanthemum morifolium Ramat.の橙色品種（以下、Ｏｒ−３ということがある。図２のパネルＥおよびＦ）ならびにChrysanthemum morifolium Ramat.の白色品種（登録品種名‘セイユース’（有限会社精興園）、以下、Ｗ−４ということがある。図２のパネルＧおよびＨ）は、花色が鮮やかで濃く、葉が大きすぎないという基準で選択された栽培種である。本発明に用いるChrysanthemum morifolium Ramat.は、品種を問わない。Chrysanthemum morifolium Ramat.（Ｙ−４、Ｒ−８、Ｏｒ−３およびＷ−４）は、中部電力株式会社（郵便番号４５９−８５２２  愛知県名古屋市緑区大高町字北関山２０番地の１  中部電力株式会社エネルギー応用研究所）から入手可能である。
【００１４】
（３）交雑
種子親は花を付けにくいので、種子親の開花に合わせて花粉親の花粉を受粉することができるように、花粉親を電照栽培などで開花調節することが好ましい。受粉には、結実をよくするため、栽培種の花粉の採取後、冷凍または冷蔵保存した花粉ではなく、新鮮な花粉を用いることが好ましい。例えば、種子親が開花する時間に合わせ、同じ日に開花した花粉親の花粉を薬包紙に集めておき、種子親の雌蕊が伸長したことを確認した後、薬包紙上の花粉を毛筆または指等を使って柱頭に受粉し、他の花粉による受粉を防ぐため袋がけする。これを開花期間中反復する。約４週間後種子を回収する。回収した種子のうち未熟なものはとりまきし、成熟したものは室温で保存することができる。
【００１５】
（４）交雑種の育成
発芽率を向上させるため、例えば、試験管などに分注した培地に回収した種子を播種することが好ましい。培地として、例えば、ＭＳ培地を用いることができる。好ましくは１／２ＭＳ培地に、１％〜２％ショ糖、および０．１％〜０．５％ゲルライトまたは寒天など添加し、ｐＨを約５．５〜６．０にする。発芽条件、育成条件は、約３０００ｌｕｘ〜６０００ｌｕｘ、１０時間〜１６時間日長、約２０℃〜約２５℃が好ましい。試験管内で育成した交雑種をさらに培養繁殖し、個体数を増やす。培養増殖は、キク属植物では通常挿し芽で行うが、茎頂培養などの他の方法でもよい。十分に発根したら、根に付いている培地を洗い流し、バーミキュライトなどの園芸用土を入れたポットに植えて、順化を行い、その後定植する。育成されたキクをさらに挿し芽等で栄養繁殖させ、後代を育成することができる。
【００１６】
本発明のキク属植物は、電照栽培が可能である。加温する場合は、好ましくは約１０℃〜約２５℃、より好ましくは約１２℃〜約１８℃にすることが好ましい。また、電照加温栽培では、露地栽培と比べて、草高が高くなり、花が大きくなる。
【００１７】
（５）交雑種の確認
交雑種子から育成した植物体が、野生種と栽培種との交雑種であることを確認する方法として、両親との染色体数の比較やGenomic in situ hybridization（ＧＩＳＨ）法などを用いることが多かったが、染色体の観察には高度な技術習得が必要であり、時間もかかることから、大量の植物体を対象にするには効率的でない。そこで、遺伝子断片の相違をもとに、簡易な方法で雑種確認ができないかを検討し、Random amplified polymorphic DNA（ＲＡＰＤ）により可能であることを確認した。雑種個体や親となった野生種を識別できる特徴的な遺伝子断片が明らかになり、これと植物体の表現形質が一致すれば、野生種の有望な形質を持つ個体を、長期間の栽培を行うことなく育成初期にスクリーニングでき、新品種開発にかかる労力の大幅な削減が期待できる。また、ＲＡＰＤ法の試料となるＤＮＡは、抽出法としてCetyl trimethyl ammonium bromide（ＣＴＡＢ）法が多く用いられるが、時間がかかりすぎる。そこで、簡易なＤＮＡ抽出法（簡易ＣＴＡＢ法）の検討を行った。簡易ＣＴＡＢ法で抽出されたＤＮＡで、通常のＣＴＡＢ法で得たＤＮＡとほぼ同等のＲＡＰＤデータが得られ、また、ＤＮＡ抽出するのにかかる時間が大幅に短縮できる。
【００１８】
簡易ＣＴＡＢ法は、以下の手順で行うことができる。
（ａ）凍結保存した葉のサンプル（１００〜２００ｍｇ程度）を２．０ｍｌチューブに入れマイクロ乳棒で破砕する。これに５００μｌの２％ＣＴＡＢ溶液（２％ＣＴＡＢ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を加えて混和する。
（ｂ）５００μｌのＣＩＡ溶液（Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｈｏｌ＝２４：１）を加え、１分間やや強めに混和し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、室温）する。
（ｃ）上清を新しい１．５ｍｌチューブに移し、５００μｌの１％ＣＴＡＢ溶液（１％ＣＴＡＢ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）を加えて混和後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、室温）する。
（ｄ）上清除去後、ペレットに１ｍｌの７０％エタノールを加え、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１分、室温）する。再び上清除去後、５分間真空乾燥する。その後１００μｌのＴＥを加えて、−２０℃で保存する。
【００１９】
上記簡易ＣＴＡＢ法で得られたＤＮＡを試料として、ＲＡＰＤ法を行う。ＲＡＰＤ法のＰＣＲ増幅に用いるプライマーは、オペロン社のランダムプライマーシリーズＯＰＡ−７、ＯＰＡ−８が好ましい。
【００２０】
ＯＰＡ−７の塩基配列（配列番号１）：ＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧ
ＯＰＡ−８の塩基配列（配列番号２）：ＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧ
【００２１】
ＰＣＲ条件は、例えば、初期変性９４℃、３分、変性９４℃、１分、アニーリング４０℃、２分、伸長７２℃、２分を１サイクルとして４５サイクルである。
【００２２】
得られたＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、核酸染色溶液（臭化エチジウム終濃度０．５μｇ／ｍｌ）で染色後、紫外線照射でバンドを検出する。花粉親に特異的なバンドあるいは両親のバンドを持つものは自殖由来でないと考えられることから交雑種と判定できる。
さらに、ＳＴＳ化マーカーを作製して、交雑種の確認をしてもよい。
【００２３】
２．本発明のキク属植物の香気成分
本発明のキク属植物は、好ましくは、ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、リナロール、メチルベンゾエート、リモネン、２−エチルヘキサノール、ｃｉｓ−３−ヘキセニルアセテート、α−ピネン、１，８−シネオール、ミルセン、２−フェニルエチルアルコール、カンファー、エチルアセテート、β−フェランドレン、カンフェン、ｔｒａｎｓ−クリサンテノール、クリサンテノン、ｔｒａｎｓ−クリサンテニルアセテート、ｃｉｓ−クリサンテニルアセテートおよびｃｉｓ−クリサンテノールからなる群から選択される香気成分を含む。これらの香りの特徴を、下記の実施例の表８に示す。本発明のキク属植物は、他の成分、例えば、スクアレン、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸などをさらに含んでもよい。
【００２４】
本発明のキク属植物は、好ましくは、香気成分を、地植えの状態で、好ましくは開花時に、ヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで分析し、該香気成分の総量を１００％としたとき（クロマトグラフのデータでピークの全面積（エリア）を１００％としたとき）に、ベンズアルデヒドおよび／またはフェニルアセトアルデヒドを１〜３０％、５〜２５％、１０〜２０％の量で含みうるが、特に限定されない。また、ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒドを、それぞれ１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、または１５％以上の量で含むことが好ましい。
【００２５】
また、好ましくは、リナロール、メチルベンゾエート、リモネン、２−エチルヘキサノール、ｃｉｓ−３−ヘキセニルアセテート、α−ピネン、１，８−シネオール、ミルセン、２−フェニルエチルアルコール、カンファー、エチルアセテート、β−フェランドレン、カンフェン、ｔｒａｎｓ−クリサンテノール、クリサンテノン、ｔｒａｎｓ−クリサンテニルアセテート、ｃｉｓ−クリサンテニルアセテートおよびｃｉｓ−クリサンテノールを、それぞれ０．０５％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．５％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、または１０％以上の量で含む。但し、総量としては１００％を超えない。
【００２６】
本発明のキク属植物は、花粉親と比較して、甘く、ハーブのような香りを有し、非常に強く香る。葉のみ、花のみでも香りが強い。例えば、切花などの植物の香気成分をヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで分析したときに、香気成分の総量が花粉親の好ましくは１０倍以上、２５倍以上、３０倍以上、３５倍以上、４０倍以上、４５倍以上、または５０倍以上である。地植えであれば、さらに香りが強く、開花時は特に強い。
【００２７】
さらに、本発明のキク属植物の群（集団）の中から、植物の香気成分をヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで分析したときに、香気成分の総量が花粉親の１０倍以上であり、かつ、好意的な香り（甘い香り、ハーブのような香り）を有する株をスクリーニングしてもよい。
【００２８】
ヘッドスペース法は、本発明のキク属植物を地植えのまま花の部分のみをガラスフードで覆い、フードにテフロンチューブとポンプを接続して、流量０．５Ｌ／ｍｉｎで４時間空気を循環させ、チューブの途中のガラス管に充填した捕集剤：Ｔｅｎａｘ  ＴＡ  ５０ｍｇで香気を捕集し、捕集した香気を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）にかけ、分析条件として、キャピラリーカラムＴＣ−ＷＡＸ０．２５ｍｍφ×６０ｍ、初期温度４０℃→最終温度２３０℃、キャリアガス：ヘリウム、注入口温度：２５０℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、香気成分脱着温度：２３０℃で分析することにより行うことができる。
【００２９】
３．本発明のキク属植物の抽出物
抽出方法は、常法でよく、例えば、溶剤抽出法が挙げられる。抽出に用いられる本発明のキク属植物は、生のもの、半乾燥したもの、乾燥したもの、凍結乾燥したもの等のいずれでもよいが、生のものが好ましい。また、植物は、適宜粉砕または裁断されたもの、植物そのものの形態であってもよいが、粉砕されたものが好ましい。抽出の原料に用いられる植物の部分は、根、茎、葉、花等、あるいは全草のいずれでもよいが、花および／または葉を含むことが好ましい。
【００３０】
溶媒として、水、親水性有機溶媒、またはそれらの混合物を用いることができる。親水性有機溶媒は、より粘度の高い抽出物を得ることができ、好ましい。溶媒の具体例としては、純水、精製水、メタノール、エタノール、ブタノール、プロピレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール等のアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、１，４−ジオキサン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、酢酸等が挙げられ、特に限定されないが、メタノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールが好ましい。親水性有機溶媒のみを抽出に用いてもよいが、親水性有機溶媒と水の混合物を用いることが好ましい。この場合、親水性有機溶媒の濃度は、好ましくは１０〜９０ｖｏｌ％、より好ましくは２０〜６０ｖｏｌ％、さらに好ましくは２５〜３５ｖｏｌ％である。また、親水性有機溶媒を複数混合して用いてもよい。例えば、エタノール、１，３−ブチレングリコール及び水を混合してもよい。植物への溶媒の添加量は特に限定されないが、植物１００ｇに対し好ましくは１００〜１０００ｍＬ、より好ましくは２００〜６００ｍＬである。
【００３１】
溶媒を植物に添加して、抽出を、好ましくは温度０〜６０℃、より好ましくは２０〜３０℃で、好ましくは１時間〜７日間、より好ましくは８〜１６時間（一晩）行う。抽出終了後、必要に応じて濾過、遠心分離などで残渣を除いてもよいし、濃縮工程や精製工程を行ってもよい。これらの工程は減圧濃縮、凍結乾燥、エタノール等の溶媒による沈殿、クロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルパミエーションクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等、限外濾過等の各種公知の方法を用いて行うことができる。
【００３２】
本発明のキク属植物の抽出物（精油）は、好ましくは、１，８−シネオール、α−ピネン、ｐ−ムーロレンおよびｃｉｓ−サビノールからなる群から選択される成分を含む。含有量は、ガスクロマトグラフで分析したときに、それぞれ１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、１５％以上、または１６％以上が好ましい。なお、通常、精油には、サビノールはあまり含まれないと言われている。また、本発明のキク属植物の抽出物は、さらに、ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、β−ピネン、ｐ−シメン、カンフェン、ミルセン、リモネン、リナロール、メチルベンゾエート、２−エチルヘキサノール、ｃｉｓ−３−ヘキセニルアセテート、２−フェニルエチルアルコール、γ−テルピネン、γ−ムーロレン、カンファー、エチルアセテート、β−フェランドレン、ｔｒａｎｓ−クリサンテノール、クリサンテノン、ｔｒａｎｓ−クリサンテニルアセテート、ｃｉｓ−クリサンテニルアセテート、ｃｉｓ−クリサンテノールなどを含んでもよい。
【００３３】
４．本発明のキク植物の抽出物を用いた製品
上記抽出物は、例えば、香水、化粧品、アロマオイル、芳香剤などの製品に用いることができる。上記製品には、抽出物のほかに、各種成分、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール類、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのムコ多糖類及びその誘導体、コラーゲン、エラスチン、ケラチンなどのタンパク質及びその誘導体、グリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンなどのアミノ酸及びその誘導体、ソルビトール、トレハロース、グルコース、ショ糖などの糖類、尿素、セラミド、アロエ抽出物などの植物抽出物、ビタミンＡ、Ｃ、Ｅ類及びその誘導体、グルチルリチン酸類及びその誘導体、ナイアシンアミド、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、リノール酸、トラネキサム酸、胎盤抽出液、スーパーオキシドジムスターゼ、マンニトール、ケルセチン、カテキン、アスタキサンチン、コエンザイムＱ１０、カラギーナン、ペクチン、寒天、アラビアガム、グアガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、クインスシード、ゼラチン、デンプンなどの天然物系高分子、メチルセルロースヒドロキシセルロースなどのセルロース系高分子、カルボキシビニルポリマーなどのアクリル酸系高分子、アルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸系高分子、スクワラン、ホホバオイル、ヒマシ油、紅花油、オリーブ油などの植物油、パラオキシ安息香酸エステル類、さらに、界面活性剤、キレート剤、色素、ｐＨ調整剤などを含めてもよい。
【実施例】
【００３４】
１．キク属野生種と栽培種の交雑
以下の表１に示すように、種子親として野生種Chrysanthemum fruticulosaと、花粉親として栽培種９種とを交雑した。また、以下の表２に示すように、種子親として野生種Chrysanthemum lavandulifoliumと、花粉親として栽培種４種とを交雑した。
【００３５】
（１）交雑方法
上記野生種２種ともに、開花時期が不明であったため、これら野生種の開花期に栽培種の花粉を受粉させることができるよう、栽培種を開花調節可能な温室で栽培した。種子親が開花する時間に合わせ、同じ日に開花した花粉親の花粉を薬包紙に集め、種子親の雌蕊が伸長したことを確認した後、薬包紙上の花粉を毛筆または指等を使って柱頭に受粉し、他の花粉による受粉を防ぐため袋がけした。以下の表１および表２に、受粉花数、結実花数、得られた種子数、種子の状態を示す。
【００３６】
（２）播種
得られた種子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験管中の培地に播種した。
培地組成：１／２ＭＳ、１．５％ショ糖、０．２％ゲルライト、ホルモンフリー、ｐＨ５．７
環境条件：約４０００ｌｕｘ、１２時間日長、２２℃
【００３７】
以下の表１および表２に発芽数を示す。また、図３のパネルＡ〜Ｄに、それぞれ、種子、試験管への播種、発芽、伸長した植物体を示す。
【００３８】
【表１】
2011083260.tif 000003
【００３９】
【表２】
2011083260.tif 000004
【００４０】
２．交雑種の確認
交雑種子から育成した植物体が、野生種と栽培種との交雑種であることを確認する方法として、ＲＡＰＤ法を用いた。
【００４１】
（１）交雑種からの簡易ＤＮＡ抽出法
簡易ＣＴＡＢ法を上述の通りに行い、交雑種のＤＮＡを抽出した。通常のＣＴＡＢ法と簡易ＣＴＡＢ法を比較したＲＡＰＤ分析データを図４に示す。簡易ＣＴＡＢ方法は、通常のＣＴＡＢ法とほぼ同等のＲＡＰＤ分析結果が得られ、かつ、２４サンプルについてＤＮＡ抽出するのにかかる時間が、約６時間から約２時間に短縮できた。
【００４２】
（２）親個体を用いたプライマーの選定
種子親の野生種と花粉親の栽培種を用いて、オペロン社のランダムプライマーシリーズＯＰＡ１〜２０とＯＰＢ１〜２０を用いたＲＡＰＤ分析を行った。その結果、１１のプライマーでバンドが得られた。これらのバンドを解析した結果、ＯＰＡ７（配列番号１）、ＯＰＡ８（配列番号２）、ＯＰＡ９（配列番号３）、ＯＰＡ１８（配列番号４）のプライマーで良好な結果が得られることが確認できた。
【００４３】
（３）交雑種個体を用いたＲＡＰＤ法による雑種性検定
実施例の上記１．で得られた順調に成長している交雑種８５個体の葉を培養試験管から採取し、実施例の上記２．に記載の簡易ＣＴＡＢ法を用いてＤＮＡを抽出し、プライマーＯＰＡ７（配列番号１）とＯＰＡ８（配列番号２）を用いて３反復のＲＡＰＤ分析を行った。
【００４４】
反応液の調製は、最終濃度０．５μＭプライマー、最終濃度０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、反応液２０μｌあたり０．５ＵのＰＣＲ用酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）、２０μｌあたり１μｌの鋳型ＤＮＡを混ぜ、全量２０μｌになるように滅菌蒸留水を加えた。
【００４５】
ＲＡＰＤ法では、上記プライマー２種を用いて、ＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動した。
【００４６】
図５に、交雑番号２２番（C.fruticulosa×Ｙ−４）の交雑種由来の鋳型ＤＮＡをプライマーＯＰＡ７で増幅した増幅産物の電気泳動像を例として示す。図中、＊印は花粉親（Ｙ−４）特異的バンド、△印は種子親（C.fruticulosa）特異的バンドを示す。花粉親特異的バンドと種子親特異的バンドの両方を持つ個体は、番号２２−１０１（レーン２）、２２−１３（レーン６）、２２−１７（レーン９）であった。
【００４７】
図６に、交雑番号２２番の交雑種から抽出された鋳型ＤＮＡをプライマーＯＰＡ８で増幅した増幅産物の電気泳動像を例として示す。花粉親特異的バンドと種子親特異的バンドの両方を持つ個体は、番号２２−１０１（レーン２）、２２−１０３（レーン３）、２２−１２（レーン５）、２２−１３（レーン６）、２２−１５（レーン７）、２２−１６（レーン８）、２２−１７（レーン９）、２２−１８（レーン１０）、２２−１９（レーン１１）、２２−２（レーン１２）、２２−２０（レーン１３）であった。
【００４８】
上記プライマーＯＰＡ７とＯＰＡ８を用いたＲＡＰＤ分析をさらに２回反復し、再現性が確認されたものを交雑種と判定した。図７にＯＰＡ７を用いた２回目の分析の電気泳動像、図８にＯＰＡ８を用いた２回目の分析の電気泳動像を例として示す。その結果、花粉親特異的バンドと種子親特異的バンドの両方を持つ交雑種が多数確認された。また、明らかに種子親とは違うバンドパターンが確認された系統もあった（例えば、図８のレーン３および４）。これらの系統は、プライマーＯＰＡ７またはＯＰＡ８では確認出来ない交雑種、または自然雑種であると考えられた。
【００４９】
以下の表３および表４に、種子親のC.fruticulosa、C.lavanduliforiumに各花粉親を交雑して得られた交雑種のデータを示す。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
【表４】
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【００５２】
なお、ＳＴＳ化マーカーを作製して、ＲＡＰＤの雑種性検定の確認も行った（データは示さず）。
３．交雑種の育成
（１）順化、親株定植
交雑個体であることが遺伝的に確認された個体は、１個体を１系統とし、培養増殖により個体数を確保した。十分な個体数が確保できた系統から、順化を行い、屋外圃場で親株の定植を行った。系統により発芽時期、雑種確認時期、成長速度が異なるため、順化および屋外圃場での栽培は成長に合わせ３年にわたり実施した。
【００５３】
培養増殖は、培地（１／２ＭＳ、１．５％ショ糖、０．２％ゲルライト、ホルモンフリー、ｐＨ５．７）に、十分発根した個体からの挿し芽を植え、約４０００ｌｕｘ、１２時間日長、２２℃の条件下で行った。
【００５４】
十分に発根した培養苗から培地を洗い流して、培養苗をバーミキュライトに植えて、順化を行った（図９のパネルＡ〜Ｆ）。
【００５５】
（２）挿し芽
露地に定植・育成した親株の脇芽を５ｃｍ程度で折り、葉を３〜４枚残して切除し、濡らした新聞紙に包んでビーカーに立て、冷蔵庫へ入れて一晩おいた後、新聞紙を取り、ポリエチレン袋に入れてビーカーに立て、引き続き冷蔵庫で保管した。約２週間後、セルトレイに入れたバーミキュライトに挿し、温室内で約４週間育成した（図１０のパネルＡ〜Ｆ）。
【００５６】
（３）露地栽培および電照加温栽培
交雑種の特性を確認するため、露地栽培と電照加温栽培を行った。露地栽培と電照加温栽培のスケジュールは表５の通りである。電照は、１００Ｗの白熱電球を約１０平方メートルに１．５球の割合で、高さ約２．０ｍのところに配置して行った。
【００５７】
【表５】
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【００５８】
４．交雑種の特性
（１）露地栽培および電照加温栽培における生育特性
現在までに５５系統の交雑種を育成した。平成２０年度に、３１系統の交雑種（交雑は平成１７年度に行った。）の栽培試験を行い、生育特性を調査した。露地栽培と電照加温栽培を比較すると、露地では外花弁の無かった交雑種系統でも外花弁が形成伸長し、電照加温栽培では全体的に植物体が大きくなった。表６に、生育特性調査を示す。表中、露地での到花日数は、夏至をスタートとしてカウントしており、短日の感応時間が明らかでないため、参考値である。電照加温栽培において、消灯からの到花日数は、５４〜６０日が最も多く、平均８．２週となった。また、生育障害は、電照加温における定植後の枯死が４系統で顕著となったが、種子親に用いた野生種の生育地が冷涼乾燥な地域であったため、定植時に高温多湿条件が不適である可能性が高いと思われた。
【００５９】
【表６】
2011083260.tif 000008
【００６０】
また、図１１〜２６に、上記３１系統の交雑種の苗、蕾、株および花と調査結果を示す。
【００６１】
（２）形態的な特徴
平成１９年度に電照加温栽培した２１系統の交雑種について、株の直立性、枝の広がり、花、葉の形態を比較した。図２７に、種子親の野生種（C.fruticulosa）と交雑種（番号２２−７）の比較を示す。また、図２８〜図３２に、上記２１系統（平成１７年度交雑）の交雑種の全体、花、葉の調査結果を示す。
【００６２】
（３）香気的な特徴
平成１９年度の電照加温栽培、平成２０年度の露地栽培および電照加温栽培で、香気調査を実施した。
（ｉ）官能調査
花は、開花直後から花が枯れるまで香りが続き、系統により、香り、強さに違いがあったが、いずれの交雑種も、花粉親よりも強く香った。花の香りの種類としては、従来のキクに近い「青臭い」、「苦い」と感じる香りを含む系統もあったが、ほとんどの系統が、「甘い」、「ハーブ」のような好意的に感じる香りを強く有していた（図１１〜図２６）。C.fruticuloseの系統では、濃いハチミツのような甘さ、C.lavandulifoliumの系統では、やや柑橘系のさわやかな甘さが感じられた。
【００６３】
葉の香りは開花時期に特に強く、系統により、香り、強さに違いがあったが、いずれの交雑種も、花粉親よりも強く香った。葉の香りの種類としては、「ハーブ」のような好意的に感じる香りがほとんどで、葉が擦れるなどの刺激によって周囲に広がる傾向が強かった。
【００６４】
（ｉｉ）香気分析
（ａ）切花の香気分析
平成１９年度に電照加温栽培した交雑種２系統（１−８、２２−１０１）と栽培種Ｙ−４の香気をヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで分析した。
【００６５】
香気成分は２０〜５０種検出された。主成分は、交雑種、栽培種ともにα−ピネンで、交雑種では香気成分総量の約５３％〜約６７％、栽培種では７５％を占めた（表７）。以下、β−ピネン、ｐ−シメン、カンフェン、ミルセンが両種に共通して含まれていた。栽培種の特徴は、ｐ−シメン、γ−テルピネンを多く含むことであり、この成分は交雑種にも見られた。一方、交雑種は、栽培種でみられない１，８−シネオールを約１０％〜約２７％主要成分として含んでいた。また、すべての香気成分の総量を比較すると、交雑種の葉は、栽培種の約３０倍の量を放出しており、交雑種の花は、栽培種の約５０倍の量を放出していた。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
交雑種２２−４（C.fruticulose x Chrysanthemum morifolium Ramat.）の花部の主な香気成分を表８に示す。
【００６８】
【表８】
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【００６９】
（ｂ）抽出物の香気分析
交雑種２系統（番号１−８、２２−１０１）から常法で抽出物（精油）を調製し、その香気成分をヘッドスペース法によるイオンクロマトグラフィーで分析した。
【００７０】
分析結果を表９に示す。抽出物の収量は、２種の交雑種とも約０．０４ｗｔ％であり、抽出物の構成成分は、セスキテルペン炭化水素であるγ−ムーロレンとサビノールを多く含有していた。
【００７１】
【表９】
2011083260.tif 000011
【００７２】
（ｃ）地植えでの香気分析
平成２０年度に電照加温栽培した開花期の交雑種２系統（１−１５、２２−４）の香気を、地植えの状態で、ヘッドスペース法によるガスクロマトグラフィーで分析した。
【００７３】
香気の採取は、本発明のキク属植物を地植えのまま花の部分のみをガラスフードで覆い、フードにテフロンチューブとポンプを接続して、流量０．５Ｌ／ｍｉｎで４時間空気を循環させ、チューブの途中のガラス管に充填した捕集剤：Ｔｅｎａｘ  ＴＡ  ５０ｍｇで香気を捕集した。捕集した香気は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＭＳ）にかけ、分析条件としてキャピラリーカラムＴＣ−ＷＡＸ０．２５ｍｍφ×６０ｍ、初期温度４０℃→最終温度２３０℃、キャリアガス：ヘリウム、注入口温度：２５０℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、香気成分脱着温度：２３０℃で分析した。
【００７４】
上記（ａ）の切花での分析で主要成分であった、α−ピネン、１，８−シネオール、ミルセンは１％以下であるが含まれており、ベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒトがそれぞれ香気成分総量の約１０〜約２０％を占めた。また、他の成分として、リナロール、メチルベンゾエート、リモネン、２−エチルヘキサノール、ｃｉｓ−３−ヘキセニルアセテート、２−フェニルエチルアルコール、カンファー、エチルアセテート、β−フェランドレン、カンフェン、ｔｒａｎｓ−クリサンテノール、クリサンテノン、ｔｒａｎｓ−クリサンテニルアセテート、ｃｉｓ−クリサンテニルアセテートおよびｃｉｓ−クリサンテノールなどを含み、甘い香りの要因となっていることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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