(57)【要約】【課題】エキソポリサッカライドの収量を増加させるための新規の培養技術を提供すること。【解決手段】エキソポリサッカライドを産生できる単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を開示する。ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１は、受託番号ＢＣＲＣ９１０４２０として食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）に、及び受託番号ＤＳＭ２２３４５としてＤＳＭＺに寄託されている。エキソポリサッカライドを生産する方法も開示する。この方法は、エキソポリサッカライドが形成される条件下で、適した培地中で単離ペディオコッカス・アシディラクティシを培養するステップを含む。上述のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む医薬組成物及び上述のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む食品も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソポリサッカライドを産生できる単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）０５Ｂ０１１１であって、受託番号ＤＳＭ２２３４５としてＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託されている上記単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）０５Ｂ０１１１。
【請求項２】
エキソポリサッカライドを生産する方法であって、エキソポリサッカライドが形成される条件下で、適した培地中で単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）を培養するステップを含む上記方法。
【請求項３】
単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）が、請求項１に記載の単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）０５Ｂ０１１１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
エキソポリサッカライドを精製するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
適した培地が、ラクトース、フルクトース、マルトース、グルコース、糖蜜、ガラクトース、キシロース、キシリトール、イヌリン、ソルビトール、トレハロース、スクロース、及びこれらの混合物からなる群から選択される炭素源を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
適した培地が食用材料である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
食用材料が、流体乳製品、粉乳、果汁、豆乳、野菜−果物汁、健康食品、動物飼料、農産物、畜産物、水産物、及び機能性成分からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
適した培地が、培養の前に、３〜７の範囲のｐＨ値を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
適した培地が、培養の前に、５のｐＨ値を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
培養ステップが、２５℃〜３７℃の範囲の温度で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）０５Ｂ０１１１を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項３に記載の方法から得られたエキソポリサッカライドをさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）０５Ｂ０１１１を含む食品。
【請求項１５】
請求項３に記載の方法から得たエキソポリサッカライドをさらに含む、請求項１４に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年１０月１５日出願の台湾特許出願第０９８１３４９１４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、高エキソポリサッカライド産生能を有する単離ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）０５Ｂ０１１１に関する。ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１は、受託番号ＢＣＲＣ９１０４２０として食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）（Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）に、及び受託番号ＤＳＭ２２３４５としてＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託されている。本発明はまた、エキソポリサッカライドの生産する方法であって、エキソポリサッカライドが形成される条件下で、適した培地中で単離ペディオコッカス・アシディラクティシを培養するステップを含む上記方法にも関する。また、本発明は、単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む医薬組成物及び単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む食品にも関する。
【背景技術】
【０００３】
エキソポリサッカライド（ＥＰＳ）又は細胞外ポリサッカライド（ＥＰＳ）は、微生物によって産生される巨大分子であり、微生物の細胞壁の外側に分泌される。ＥＰＳは、一般に、（１）細胞表面に緩く付着したスライム層を形成する被膜ＥＰＳと、（２）環境に分泌されうる非付着ＥＰＳに分類される。
【０００４】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、一般に安全と認められており（ＧＲＡＳ）、広く使用されているプロバイオティクスである。多種のＬＡＢがＥＰＳを産生できる。ほとんどのＥＰＳ産生ＬＡＢは、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、又はペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する（Ｐｅｔｒｏｎｅｌｌａ  Ｊ．Ｌｏｏｉｊｅｓｔｅｉｊｎら（１９９９）、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６５：５００３−５００８；Ｔ.Ｓｍｉｔｉｎｏｎｔら（１９９９）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５１：１０５−１１１；Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｒｕａｓ−Ｍａｄｉｅｄｏら（２００７）、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、７３：４３８５−４３８８）。加えて、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する一部の菌株も、ＥＰＳ産生能を有することが示されている（Ｐ．Ｒｕａｓ−Ｍａｄｉｅｄｏ及びＣ．Ｇ．ｄｅ  ｌｏｓ  Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎ（２００５）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．、８８：８４３−８５６）。
【０００５】
一般的に言えば、ＬＡＢによって産生されるＥＰＳは、ホモ多糖（ＨｏＰＳ）及びヘテロ多糖（ＨｅＰＳ）として分類することができる。ＨｏＰＳは、単一の型の単糖から構成されている。ＨｏＰＳの例として、α−グルカン（例えば、デキストラン）、β−グルカン、及びフルクタン（例えば、レバン型及びイヌリン型フルクタン）が挙げられる。ＨｅＰＳは、異なる単糖を含む反復単位から構成されている。ＨｅＰＳの反復単位は、通常は３〜８の単糖からなり、ほとんどがＤ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、及びＬ−ラムノースを含む。少数のケースでは、ＨｅＰＳは、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、グルクロン酸、及び非糖置換基（例えば、リン酸塩、アセチル基、及びグリセロール）を含む。
【０００６】
ＬＡＢによって産生されるＥＰＳは、食品に特殊な流体力学的特性及び構造を付与することができ、それによって、食品産業において頻繁に増粘剤、安定化剤、乳化剤、及びゲル化剤として役割を果たす。加えて、ＬＡＢによって産生されるＥＰＳの摂取者の健康に対する多くの優れた効果、例えば、コレステロール降下、免疫活性の調節、抗腫瘍性などが見出された。ＬＡＢによって産生されるＥＰＳは生物活性に有益であるため、このようなＥＰＳは広く使用されている。
【０００７】
しかし、細菌によって産生されるＥＰＳは、通常は不安定であり、このＥＰＳの収量は、通常は極めて低い。ＥＰＳの需要が大きいため、ＥＰＳの収量を増加させるための新規の培養技術を開発するためにＬＡＢのＥＰＳの生産性に影響を与える様々な因子を調べた。Ｐｅｔｒｏｎｅｌｌａ  Ｊ．Ｌｏｏｉｊｅｓｔｅｉｊｎらは、菌株、培養条件、及び培地の組成が、特定の種によって産生される微生物ＥＰＳの量に影響を与え、炭素源の種類が、ＥＰＳの生産性に大きく影響し、ＥＰＳの組成にも影響を与えうると述べている。Ｐｅｔｒｏｎｅｌｌａ  Ｊ．Ｌｏｏｉｊｅｓｔｅｉｊｎらは、さらに、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＮＣＦＢ２７７２が、炭素源としてグルコースを用いると、フルクトースを用いる場合よりも３倍多くＥＰＳを産生し、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）ＣＧ１１、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）Ｃ８３、及びストレプトコッカス・サリバリウス亜種サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）によって産生されるＥＰＳの収量が、明らかに炭素源による影響を受けていると述べている（Pｅｔｒｏｎｅｌｌａ  Ｊ．Ｌｏｏｉｊｅｓｔｅｉｊｎら（１９９９）、前出）。
【０００８】
Ｐ．Ｒｕａｓ−Ｍａｄｉｅｄｏ及びＣ．Ｇ．ｄｅ  ｌｏｓ  Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎは、ラクトバチルス・カゼイＣＲＬ８７によるＥＰＳの産生が、ガラクトースでグルコースの１．７倍高く、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｃｒｅｍｏｒｉｓ）Ｂ４０が、グルコースでフルクトースよりも多量のＥＰＳを産生すると述べている（Ｐ．Ｒｕａｓ−Ｍａｄｉｅｄｏ及びＣ．Ｇ．ｄｅ  ｌｏｓ  Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎ（２００５）、前出）。Ｔ．Ｓｍｉｔｉｎｏｎｔらは、伝統的なタイ国の食品から単離された２つのペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）菌株（ＡＰ−１及びＡＰ−３）が、ＥＰＳを高収量で産生することができ、炭素源としての２％スクロースを含む液体培地において、ＡＰ−１及びＡＰ−３菌株が、それぞれ６．０ｇ／Ｌ  ＥＰＳ及び２．５ｇ／Ｌ  ＥＰＳを産生できると報告している（Ｔ．Ｓｍｉｔｉｎｏｎｔら（１９９９）、前出）。
【０００９】
加えて、ペディオコッカス属に属する既知の種の中で、ペディオコッカス・ダムノサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｍｎｏｓｕｓ）、ペディオコッカス・パルブルス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒｖｕｌｕｓ）、及びペディオコッカス・ペントサセウスは、ＥＰＳを産生することができる（Ｍａｉｔｅ  Ｄｕｅｎａｓら（２００３）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、８７：１１３−１２０；Ｓ．Ｖｅｌａｓｃｏら（２００６）、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、１１１：２５２−２５８；Ｔ．Ｓｍｉｔｉｎｏｎｔら（１９９９）、前出）。しかし、本出願者らは、文献又は先行技術のいずれにも、ペディオコッカス・アシディラクティシのエキソポリサッカライド産生能及びその適用が開示されていないことを示す。
【００１０】
研究中に、本出願者らは、ペディオコッカス・アシディラクティシがエキソポリサッカライド産生能を有することを見出した。詳細には、本出願者らは、発酵食品から、スクリーニングによって１株のペディオコッカス・アシディラクティシ分離株を得た。この分離株は、公表されているペディオコッカス菌株とは系統学的に異なる。このペディオコッカス・アシディラクティシ分離株は、優れたエキソポリサッカライド産生能を有するため、多量のＥＰＳを産生すると期待されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、第１の態様によると、本発明は、エキソポリサッカライドを産生できる単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を提供する。ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１は、受託番号ＢＣＲＣ９１０４２０として食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）、及び受託番号ＤＳＭ２２３４５としてＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）に寄託されている。
【００１２】
第２の態様によると、本発明は、エキソポリサッカライドを生産する方法であって、エキソポリサッカライドが形成される条件の下、適した培地中で単離ペディオコッカス・アシディラクティシを培養するステップを含む上記方法を提供する。
【００１３】
第３の態様によると、本発明は、上述の単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
第４の態様によると、本発明は、上述の単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む食品を提供する。
【００１５】
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面を参照しながら、下記の好適な実施の形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明によるペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列を示す配列表である。
【図２】本発明によるペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のエキソポリサッカライド産生能に対する様々な炭水化物の影響を示す棒グラフである。
【図３】培養の異なる時点（８時間及び７２時間）における１０％スクロースを含むオレンジ果汁中のエキソポリサッカライド濃度を示す棒グラフである。１０％スクロースを含むオレンジ果汁に、本発明によるペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を接種し、次いで３０℃及び３７℃のそれぞれで培養した。
【図４】異なるエキソポリサッカライド濃度における、マウスＢＡＬＢ／ｃマクロファージＲＡＷ２６４．７によって分泌されるＴＮＦ−αの濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書でいずれの従来技術の刊行物を参照したとしても、このような参照は、台湾又は他の国において、このような刊行物が当技術分野の共通一般知識の一部を構成するということを認めるものではないことを理解されたい。
【００１８】
本明細書において、語「含む」とは、「含むがこれに限定されない」を意味すること、及び語「含む」は対応する意味を有することを明確に理解されたい。
【００１９】
特段の記載がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有する。
【００２０】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、一般に安全と認められており（ＧＲＡＳ）、広く使用されているプロバイオティクスである。摂取者の健康に対するＬＡＢの多くの有用な効果が確認されている。ＬＡＢによって産生されるエキソポリサッカライドは広く使用することができる。エキソポリサッカライドを大量に生産するために、本出願者らは、高いエキソポリサッカライド産生能を有するＬＡＢ分離株を、様々なＬＡＢから探し出そうと試みた。
【００２１】
このため、本出願者らは、市販されている発酵食品から、エキソポリサッカライドを産生できる２６のＬＡＢ分離株を予備的にスクリーニングした。これらの２６のＬＡＢ分離株を１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析で解析したところ、その結果は、２６のＬＡＢ分離株のうちの５つのＬＡＢ分離株が系統学的にペディオコッカス・アシディラクティシに属していることを示している。詳細には、エキソポリサッカライド産生能及び系統学的新規性の評価によって、本出願者らは、上述の５つのＬＡＢ分離株のうち、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が、最大のエキソポリサッカライド産生能を有し、新規のＬＡＢ分離株と考えられることを見出した。２００９年２月１０日、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を受託番号ＢＣＲＣ９１０４２０として食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）に寄託した。さらに、ブダペスト条約の要件を満たすために、２００９年３月５日、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を受託番号ＤＳＭ２２３４５としてＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）に寄託した。
【００２２】
したがって、本発明は、エキソポリサッカライドを生産する方法であって、エキソポリサッカライドが形成される条件の下、適した培地中で単離ペディオコッカス・アシディラクティシを培養するステップを含む上記方法を提供する。好ましくは、この方法で培養される単離ペディオコッカス・アシディラクティシは、単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１である。本発明の好適な実施形態では、得られるエキソポリサッカライドは精製されている。
【００２３】
本明細書で用いる用語「培養」、用語「培養する」、及び用語「発酵」は、同義的に用いることができる。
【００２４】
本発明によると、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を培養するのに適した培地は、合成培地又は食用材料でありうる。本発明に適した合成培地の例として、ＭＲＳ培地が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明に適した食用材料の例として、流体乳製品（例えば、乳や濃縮乳）、粉乳、果汁、豆乳、野菜−果物汁、健康食品、動物飼料、農産物、畜産物、水産物、及び機能性成分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の好適な実施形態では、培地として用いる食用材料は乳である。本発明の別の好適な実施形態では、培地として用いる食用材料はオレンジ果汁である。本発明のさらに別の好適な実施形態では、培地として用いる食用材料は豆乳である。
【００２５】
本発明によると、適した培地は、ラクトース、フルクトース、マルトース、グルコース、糖蜜、ガラクトース、キシロース、キシリトール、イヌリン、ソルビトール、トレハロース、スクロース、及びこれらの混合物からなる群から選択される炭素源を含む。好ましくは、炭素源は、マルトース、グルコース、糖蜜、キシロース、イヌリン、スクロース、及びこれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、炭素源は、イヌリン、スクロース、及びこれらの混合物からなる群から選択される。本発明の好適な実施形態では、炭素源はスクロースである。
【００２６】
好ましくは、適した培地が、培養の前に、３〜７の範囲のｐＨ値を有する。本発明の好適な実施形態では、適した培地が、培養の前に、５のｐＨ値を有する。
【００２７】
好ましくは、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の培養ステップが、２５℃〜３７℃の範囲の温度で行われる。本発明の好適な実施形態では、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１は３０℃で培養される。
【００２８】
エキソポリサッカライドの単離及び精製、並びにエキソポリサッカライド濃度の決定は、当業者に知られている技法によって行うことができる。例えば、エキソポリサッカライドは、トリクロロ酢酸又はエタノールを用いて単離及び精製することができる。エキソポリサッカライド濃度は、フェノール−硫酸法を用いて決定することができる（Ｐ．Ｒｕａｓ−Ｍａｄｉｅｄｏ及びＣ．Ｇ．ｄｅ  ｌｏｓ  Ｒｅｙｅｓ−Ｇａｖｉｌａｎ（２００５）、前出）。
【００２９】
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の培養物から単離及び精製されるエキソポリサッカライドは、マクロファージを培養するのに使用されており、それゆえ免疫調節活性を有することが示されている。さらに、エキソポリサッカライドの他の既知のプロバイオティクス特性に基づいて、エキソポリサッカライドを含むペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の培養物は、免疫調節、コレステロール降下、及び抗腫瘍のための薬物の製造に適用可能であることが期待されている。
【００３０】
したがって、本発明は、単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、この医薬組成物は、エキソポリサッカライドを生産する上述の方法から得られるエキソポリサッカライドをさらに含む。
【００３１】
この医薬組成物は、経口投与可能でありえ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、タブレット、ピル、シロップ、ロゼンジ、トローチ、チューインガム、カプセル及びスラリーなどの剤形に製剤することができる。好ましくは、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００３２】
本明細書で用いる用語「薬学的に許容される担体」は、対象に投与したときに対象にアレルギー反応や望ましくない効果を引き起こすことができない担体を指す。本発明によると、薬学的に許容される担体は、次の試薬、すなわち溶媒、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、潤滑剤、及びこれらの類似物のうちの１つ又は複数を含むことができる。
【００３３】
経口剤形の他に、単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む医薬組成物は、局所投与（例えば、経皮投与又は鼻腔内投与）に適した剤形に製剤することもできる。局所投与に適した剤形の例として、クリーム、ローション、軟膏、鼻腔スプレー用製剤、エアロゾル、及び乾燥粉末吸入剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
加えて、本発明は、食用材料及び単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を含む食品を提供する。好ましくは、この食品は、エキソポリサッカライドを生産する上述の方法から得られるエキソポリサッカライドをさらに含む。この食品に含まれる食用材料の例として、粉乳、飲料、菓子、キャンディー、発酵食品、動物飼料、健康食品、栄養補助食品、ゼリー、特殊調整粉乳、サラダ用ドレッシング、マヨネーズ、スプレッド、クリーム、ソース、プリン、アイスクリーム、ベーカリー製品、ケチャップ、及びマスタードが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
エキソポリサッカライドを含むペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の培養培地は、免疫調節、コレステロール降下、及び抗腫瘍のための健康食品及び非処方薬の生産に適用可能であることが期待されている。本発明の食品に関して、その食用材料は、単離ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の培養のための培地として用いることができる。
【００３６】
以下に示す例を用いて本発明をさらに説明する。しかし、以下に示す例は、単なる例示目的であり、実施における本発明の限定と解釈すべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【００３７】
実験材料：
Ａ．ＭＲＳ培地：
以下の例で用いるＭＲＳ培地は、炭素源として２％グルコースを含む市販のラクトバチルスＭＲＳ培地（ＤＩＦＣＯ、カタログ番号０８８１）である。
【００３８】
Ｂ．ＭＲＳ−炭水化物培地：
以下の例で用いるＭＲＳ−炭水化物培地は、グルコース以外の炭水化物を炭素源として用いることと、ＭＲＳ−炭水化物培地の炭水化物濃度が１０％であることを除き、主にＭＲＳ培地の調製方法にしたがって調製する。例えば、ＭＲＳ−スクロース培地は、２％グルコースの代わりに１０％スクロースを含む。
【００３９】
Ｃ．１０％（ｖ／ｖ）スクロースを含む飲料：
以下の例で用いる飲料は、オレンジ果汁（ｐＨ＝３．８９）（Ｃｈｉａ  Ｍｅｅｉ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｌ．Ｃｏｒｐ．から購入）、全乳（Ｋｕａｎｇ  Ｃｈｕａｎ  Ｄａｉｒｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、及び無糖豆乳（Ｉ−Ｍｅｉ  Ｆｏｏｄｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）である。
【００４０】
まず、濃度５０％（ｖ／ｖ）のスクロースストック溶液を作製するために適量のスクロースをｄｄＨ２Ｏに溶解し、次いで１２１℃で１５分間滅菌した。次いで、５０％スクロースストック溶液を、後で使用するために冷却した。オレンジ果汁を、滅菌のために９０℃の水槽に１分間入れた。さらに、全乳及び無糖豆乳のそれぞれを、滅菌のために１００℃の水槽に３０分間入れた。３つの飲料を室温まで冷却した。オレンジ果汁（ｐＨ＝３．８９）の一部を収集し、そのｐＨをＮａＯＨで５．０に調整した。
【００４１】
適量の５０％スクロースストック溶液を、滅菌オレンジ果汁（ｐＨ＝３．８９とｐＨ＝５）のそれぞれ、並びに滅菌全乳及び滅菌無糖豆乳のそれぞれに添加して、１０％スクロースを含むオレンジ果汁（ｐＨ＝３．８９とｐＨ＝５）、１０％スクロースを含む乳、及び１０％スクロースを含む豆乳を調製した。
【００４２】
一般的な実験手順：
Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製：
所定量の試験試料及びこの試験試料と等量の２０％トリクロロ酢酸を、懸濁ミキサーを用いて２００ｒｐｍで２時間均等に混合し、次いで３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。得られた上清を収集し、この上清の２倍量の９５％アルコール（４℃）と混合した。得られた混合物を、４℃で一晩放置してから、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、次いで上清を除去した。沈殿物を、この沈殿物と等量のｄｄＨ２Ｏに溶解し、次いで得られた溶液の２倍量の９５％アルコール（４℃）を添加し、４℃で一晩保管した。３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去した。後の使用のためにゲル状又は膜状のエキソポリサッカライド（ＥＰＳ）が得られるように沈殿物を凍結乾燥させた。
【００４３】
Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定：
「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」と題した上の項で説明した手順にしたがって得たＥＰＳを、「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」と題した上の項で述べた試験試料の所定量と等量のｄｄＨ２Ｏに溶解した。この結果、ＥＰＳ溶液が形成された。ＥＰＳ溶液１ｍＬを取り出し、次いで５％フェノール溶液０．５ｍＬ及び濃硫酸２．５ｍＬを順次に添加し、これらを均等に混合した。得られた混合物を室温で１０分間反応させ、次いで３０℃の水槽に１５分間入れた。最後に、ＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４９０ｎｍの波長で得られた混合物の吸光度（ＯＤ４９０）を測定した。得られた混合物のＯＤ４９０を、予め標準ＥＰＳの濃度（０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、及び１００ｍｇ／Ｌ）及びそれぞれのＯＤ４９０をプロットすることによって作成した相関曲線にしたがって濃度（ｍｇ／Ｌ）に変換した。
【００４４】
（例１）
ＥＰＳ産生能を有する乳酸菌分離株のスクリーニング
Ａ．試験菌株の源及び単離：
乳酸菌株を、従来の市場で購入したいくつかの発酵食品（例えば、チャイニーズピクルス、キムチ、チャイニーズチーズ、梅干、他の保存食など）から単離した。適量の選択した発酵食品をＭＲＳ培地に添加し、次いで３７℃で１〜３日間培養した。次いで、得られた細菌培養物を、１０１〜１０７倍希釈細菌培養液が形成されるように１０倍段階希釈した。１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、及び１０７倍希釈細菌培養液を各０．２ｍＬ得て、ＭＲＳ寒天プレートに均等に添加し、次いで３７℃で７２時間培養した。次いで、コロニーの形態及び顕微鏡検査の結果に基づいて、本出願者らは、１２１の乳酸菌分離株を選択し、これらを複数回精製した。精製乳酸菌分離株のそれぞれを、２０％グリセロールと混合した。得られた混合物を凍結バイアルに入れ、後で使用するために−８０℃で保管した。
【００４５】
Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製：
「Ａ．試験菌株の源及び単離」と題した上の項で得た乳酸菌分離株のそれぞれを、ＭＲＳ培地５ｍＬに接種してＭＲＳ培地を１％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にし、次いで３７℃で１８時間培養した。乳酸菌分離株を活性化させるために、上記の培養ステップを２回繰り返した。得られた培養物は、以下の例における乳酸菌分離株の接種材料として役立った。
【００４６】
Ｃ．ＥＰＳ産生能を有する乳酸菌分離株の事前スクリーニング：
「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した上の項で得た１２１の乳酸菌分離株のそれぞれの接種材料を、ＥＰＳ選択培地（ＥＳＭ）に接種してＥＳＭを１％の最終接種濃度（ｖ／ｖ）とし、次いで３７℃で７２時間培養した。得られた培養物を適量取り出して、その粘度を粘度計（モデルＤＶ−Ｉ＋、ＢＲＯＯＫＦＩＥＬＤ、ＵＳＡ）で測定した。
【００４７】
加えて、「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した上の項で得た１２１の乳酸菌分離株の適量の各接種材料を、４象限ストリーク法（ｆｏｕｒ−ｑｕａｄｒａｎｔ  ｓｔｒｅａｋ  ｍｅｔｈｏｄ）によってＭＲＳ−スクロース寒天プレートに添加し、次いで３７℃で５日間培養した。コロニーの物理的出現を人間の目で観察し、コロニーがロープ状ストランドを形成できたか否かを判定するためにつま楊枝の先でコロニーを取った。
【００４８】
乳酸菌分離株が、以下の２つの要件の少なくとも１つを満たす場合は、その乳酸菌分離株を、ＥＰＳを産生可能な菌株と見なす：
（１）粘度が１５０ｃｐ超；及び
（２）コロニーの周りでスライムが観察されるか、又はつま楊枝の先でコロニーを取ったときにコロニーがロープ状ストランドを形成する。
【００４９】
上記の要件及び因子（菌株の取得源及び食品を開発するための菌株の適切性など）の考慮にしたがって、本出願者らは、１２１の乳酸菌分離株から２６の分離株を予めスクリーニングし、その種を決定するために２６の分離株に対して１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析を行った。
【００５０】
Ｄ．１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析：
「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した上の項で得た２６の乳酸菌分離株の各接種材料を、ＭＲＳ寒天プレートに添加し、Ｌ型グラスロッドを用いて均等に広げ、次いで３７℃で２４時間培養した。次いで、少量の新鮮な菌株をＭＲＳ寒天プレートから擦り取り、１．５ｍＬの微小遠心管に移した。細菌株のゲノムＤＮＡを、Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｏｇｅｎｅ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを、適量のｄｄＨ２Ｏに溶解した。したがって、それぞれが２６の乳酸菌分離株のそれぞれのゲノムＤＮＡを含む２６の試料が得られた。
【００５１】
このように得たゲノムＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）及びＭｉｃｒｏＳｅｑ（登録商標）Ｆｕｌｌ  Ｇｅｎｅ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いる１６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験で鋳型として用いた。ＰＣＲ実験が完了したら、約５００塩基対のＰＣＲ増幅産物を検出するために１％アガロースゲル電気泳動を行った。ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｏｇｅｎｅ）によって、検出したＰＣＲ増幅産物を、ゲルから回収し精製した。
【００５２】
精製ＰＣＲ増幅産物を、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００及びＭｉｃｒｏＳｅｑ（登録商標）Ｆｕｌｌ  Ｇｅｎｅ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてサイクル配列決定実験を行った。次いで、サイクル配列決定産物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ（商標）ＤＴＲ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製した。このように精製したサイクル配列決定産物を、３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定し、得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を、ＭｉｃｒｏＳｅｑ（登録商標）ＩＤ解析ソフトウエア（ｖ．１．４０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＮＣＢＩウェブサイトのデータベースと比較した。この比較結果を表１に示す。
【表１】
2011083277.tif 000002
＊：「種」の欄は、本発明の各分離株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に最も相同な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する標準株の種名（すなわち、学名）を示している。この欄に２つ以上の種名が記載されている場合は、本発明の分離株が、２つ以上の標準株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に最も相同な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有することを意味する。
【００５３】
表１を参照すると、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列間の比較の結果は、１３の分離株がラクトバチルス属に属し、９つの分離株がペディオコッカス属に属し、２つの分離株がワイセラ属に属し、１つの分離株がストレプトコッカス属に属し、１つの分離株がエンテロコッカス属に属することを示している。とりわけ、本出願者らは、ペディオコッカス属に属する９つの分離株のうち、５つの分離株（それぞれの番号は、０５Ｂ０１１１、０５Ｂ０１６４、０５Ｂ０１６７、０５Ｂ０１６８、及び０５Ｂ０３４−２）がペディオコッカス・アシディラクティシであることに気付いた。これまでの文献及び従来技術のいずれにも、ペディオコッカス・アシディラクティシがＥＰＳ産生能を有するということが開示されていない。
【００５４】
ＥＰＳを大量に生産するために、本出願者らは、優れたＥＰＳ産生能を有する菌株をさらにスクリーニングすることにした。したがって、２６の乳酸菌分離株に対して以下に示す実験を行った。
【００５５】
Ｅ．優れたＥＰＳ産生能を有する乳酸菌分離株のスクリーニング：
「Ｃ．ＥＰＳ産生能を有する乳酸菌分離株の事前スクリーニング」と題した上の項で得た２６の乳酸菌分離株の各接種材料を、ＭＲＳ−スクロース培地１５ｍＬに接種してＭＲＳ−スクロース培地を１％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にし、次いで３７℃で７２時間培養した。得られた培養物中のＥＰＳの単離及び精製、並びに得られた培養物のＥＰＳ濃度の決定を、一般的な実験手順の「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」及び「Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定」と題した項で説明した手順にしたがって行った。
【００５６】
この結果は、「Ｄ．１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析」と題した上の項で予め同定した５つのペディオコッカス・アシディラクティシ分離株（番号は、０５Ｂ０１１１、０５Ｂ０１６４、０５Ｂ０１６７、０５Ｂ０１６８、及び０５Ｂ０３４−２）の培養物は、それぞれ８４５ｍｇ／Ｌ、１１．３４ｍｇ／Ｌ、２９．５１ｍｇ／Ｌ、１７．９９ｍｇ／Ｌ、及び１７．７４ｍｇ／ＬのＥＰＳ濃度を有することを示している。さらに、残りの２１の乳酸菌分離株のうち、４つの分離株の培養物は、６０ｍｇ／Ｌ〜１１０ｍｇ／Ｌの範囲のＥＰＳ濃度を有し、残りの乳酸菌分離株の培養物は、５０ｍｇ／Ｌ〜２．８９ｍｇ／Ｌの範囲のＥＰＳ濃度を有する。この実験結果に基づいて、本出願者らは、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が、ＥＰＳの生産に最も有望であると考えている。ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を、その系統学的新規性についてさらに評価した。
【００５７】
（例２）
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の系統学的新規性の評価：
上の例１でスクリーニングしたペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が、ペディオコッカス属に属する公表されている菌株の系統とは異なる系統を有することを確認するために、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１に対して、次の予備試験、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析、生理学的及び生化学的試験、及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション解析を行った。
【００５８】
実験材料及び手順：
Ａ．予備試験：
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の予備試験は、グラム染色、形態学的観察、運動性、カタラーゼ及びオキシダーゼの活性、好気性及び嫌気性環境下での増殖条件、及び内生胞子産生能を含む。
【００５９】
この結果は、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が、グラム陽性であり、運動性を有しておらず、カタラーゼ及びオキシダーゼの活性を持たず、好気性及び嫌気性環境下での増殖可能であり、内生胞子を産生できないことを示している。
【００６０】
Ｂ．１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析：
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡを、上の例１の「Ｄ．１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析」と題した項で説明した手順にしたがって配列決定した。ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡの完全長配列を、図１に示し、ＭｉｃｒｏＳｅｑ（登録商標）ＩＤ解析ソフトウエアを用いてＮＣＢＩウェブサイトのデータベースと比較した。この比較は、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡの完全長配列（配列番号１）とペディオコッカス・アシディラクティシの１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ、受託番号ＡＪ２４９５３５）との間の配列類似性、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡの完全長配列とペディオコッカス・スティレシイ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｉｌｅｓｉｉ）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ、受託番号ＡＪ９７３１５７）との間の配列類似性、及びペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の１６Ｓ  ｒＤＮＡの完全長配列とペディオコッカス・クラウセニ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列（Ｇｅｎｂａｎｋ、受託番号ＡＦ４０４７１６）との間の配列類似性のすべてが９７％を超えていることを示している。
【００６１】
Ｃ．生理学的及び生化学的試験：
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の温度耐性、ｐＨ耐性、ＮａＣｌ耐性、及び炭水化物発酵プロフィールを試験した。
【００６２】
温度耐性、ｐＨ耐性、及びＮａＣｌ耐性の試験手順は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ａ．Ｐ．Ｆｒａｎｚら（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ａ．Ｐ．Ｆｒａｎｚら（２００６）、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、５６：３２９−３３３）に記載されている手順を基に僅かに変更した。簡潔には、上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で調製した適量のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料を、ＭＲＳ寒天プレートに添加し、Ｌ型グラスロッドで均等に広げ、次いで３７℃で５日間培養した。次いで、ＭＲＳ寒天プレート上のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の増殖条件を観察した。
【００６３】
炭水化物発酵プロフィールを、ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ同定システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）及びそのマニュアルガイドを用いて試験した。次の炭水化物：アラビノース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、リボース、キシロース、グリセロール、グルコン酸カリウム、２−ケトグルコン酸カリウム、及びトレハロースを試験した。
【００６４】
加えて、例２の「Ｂ．１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析」と題した項の結果により、本出願者らは、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１と比較して同等の菌株としてＦＩＲＤＩのＢＣＲＣから購入した３つのペディオコッカス標準株を用いた。３つのペディオコッカス標準株は次の通りである。
（１）オオムギから単離したペディオコッカス・アシディラクティシＢＣＲＣ１７５９９（商標）（ＤＳＭ２０２８４（商標）に一致）、
（２）腐敗ビールから単離したペディオコッカス・クラウセニＢＣＲＣ１７６００（商標）（ＤＳＭ１４８００（商標）、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３４４（商標）、及びＫＣＴＣ３８１１（商標）に一致）、及び
（３）トウモロコシ白粒から単離したペディオコッカス・スティレシイＢＣＲＣ１７６０１（商標）（ＤＳＭ１８００１（商標）、ＣＣＵＧ５１２９０（商標）、及びＬＭＧ２３０８２（商標）に一致）。
【００６５】
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１及び３つのペディオコッカス標準株についての温度耐性、ｐＨ耐性、ＮａＣｌ耐性、及び炭水化物発酵プロフィールを表２に示す。
【表２】
2011083277.tif 000003
＊：ｐＨ耐性、温度耐性、及びＮａＣｌ耐性の試験の結果において、「＋」は、試験株が各条件でＭＲＳ寒天プレート上で増殖できることを意味し、「−」は、試験株が各条件でＭＲＳ寒天プレート上で増殖できないことを意味する。
＊＊：炭水化物発酵プロフィールの試験の結果において、「＋」は、試験株が、発酵させて酸を生成するために各炭水化物を用いることができることを意味し、「−」は、試験株が、発酵させるために各炭水化物を用いることができないことを意味する。
【００６６】
表２に示す結果に基づいて、本出願者らは、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の生理学的及び生化学的特性が、ペディオコッカス属に属する菌株の結果に全体的に一致しており、ペディオコッカス・アシディラクティシＢＣＲＣ１７５９９（商標）、ペディオコッカス・クラウセニＢＣＲＣ１７６００（商標）、及びペディオコッカス・スティレシイＢＣＲＣ１７６０１（商標）の結果に類似していると考えている。
【００６７】
Ｄ．ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション解析：
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の種をさらに確認するために、本出願者らは、上の例１の「Ｄ．１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列解析」と題した項で説明した手順にしたがってペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１、ペディオコッカス・アシディラクティシＢＣＲＣ１７５９９（商標）、ペディオコッカス・クラウセニＢＣＲＣ１７６００（商標）、及びペディオコッカス・スティレシイＢＣＲＣ１７６０１（商標）のゲノムＤＮＡ試料を調製した。本出願者らは、Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ｅｚａｋｉら（Ｔａｋａｙｕｋｉ  Ｅｚａｋｉら（１９８９）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、３９：２２４−２２９）が記載した手順にしたがってＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。まず、各ゲノムＤＮＡ試料を熱変性させ、次いで濃度２０μｇ／ｍＬのＤＮＡ溶液を作製するために０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と混合した。ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＤＮＡ溶液を、０５Ｂ０１１１群と呼び、ペディオコッカス・アシディラクティシＢＣＲＣ１７５９９（商標）、ペディオコッカス・クラウセニＢＣＲＣ１７６００（商標）、及びペディオコッカス・スティレシイＢＣＲＣ１７６０１（商標）のＤＮＡ溶液を標準株群と呼ぶことにした。さらに、子ウシ胸腺のＤＮＡ溶液（Ｍｅｒｃｋ、カタログ番号２６１８）は、陰性コントロール群として役割を果たした。各群のＤＮＡ溶液１００μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで３７℃で１時間培養した。各ＤＮＡ溶液を、各ウェルから除去した。ウェルを、０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳで洗い流した。９６ウェルプレートを６０℃で一晩乾燥させた。
【００６８】
加えて、フォトビオチン５μＬ及びペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の熱変性ゲノムＤＮＡ試料５μＬ（１μｇ／μＬ、蒸留水中）を微小遠心管に添加し、均等に混合し、次いで紫外線灯（５００Ｗ）を１５分間照射した。遊離フォトビオチンを、２−ブタノール抽出物によって除去した。結果として、ビオチン標識ＤＮＡが形成され、これを後で使用するために保管した。
【００６９】
一晩乾燥させた９６ウェルプレートを用意した。プレハイブリダイゼーション溶液（２×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、変性サケ精子ＤＮＡ（２００μｇ／ｍＬ）、及び５０％ホルムアミドを含む）２００μＬを、各ＤＮＡ溶液でコーティングした各ウェルに添加し、次いで３７℃で１時間培養した。各ウェルの液体を除去した。次いで、ハイブリダイゼーション溶液（２×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、３％デキストラン硫酸、５０％ホルムアミド、変性サケＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、及びビオチン標識ＤＮＡ  ５０ｎｇを含む）１００μＬを各ウェルに添加し、次いで４２℃で１時間ハイブリダイゼーション反応させた。各ウェルの液体を除去した。各ウェルを、２×ＳＳＣ緩衝液３００μＬで４回洗浄し、次いでストレプトアビジン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（１０ｎｇ／ｍＬ、０．５％ウシ血清アルブミン及び０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ中）１００μＬを添加した。得られた混合物を、３７℃で３０分間反応させた。
【００７０】
次いで、各ウェルの液体を除去し、各ウェルを、０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳで２回洗い流した。４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（３×１０−４Ｍ、ＰＢＳ中）１００μＬを各ウェルに添加した。得られた混合物を、３７℃で１０分間反応させた。各ウェルの得られた混合物の蛍光強度を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ＩＩマイクロプレート蛍光光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて３６０ｎｍ（励起波長）及び４５０ｎｍ（発光波長）で測定した。
【００７１】
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１とペディオコッカス・アシディラクティシＢＣＲＣ１７５９９（商標）との間のＤＮＡ関連性、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１とペディオコッカス・クラウセニＢＣＲＣ１７６００（商標）との間のＤＮＡ関連性、及びペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１とペディオコッカス・スティレシイＢＣＲＣ１７６０１（商標）との間のＤＮＡ関連性は、この項で測定した蛍光強度を以下に示す式に代入して算出した。
ＤＮＡ関連性（％）＝［（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）］×１００
式中、
Ａ＝標準株群の蛍光強度
Ｂ＝０５Ｂ０１１１群の蛍光強度
Ｃ＝陰性コントロール群の蛍光強度
【００７２】
この結果は、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のゲノムＤＮＡとペディオコッカス・アシディラクティシＢＣＲＣ１７５９９（商標）のゲノムＤＮＡとの間のＤＮＡ関連性、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のゲノムＤＮＡとペディオコッカス・クラウセニＢＣＲＣ１７６００（商標）のゲノムＤＮＡとの間のＤＮＡ関連性、及びペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のゲノムＤＮＡとペディオコッカス・スティレシイＢＣＲＣ１７６０１（商標）のゲノムＤＮＡとの間のＤＮＡ関連性が、それぞれ７５．５％、２１．１％、及び４．９％であることを示している。この結果に基づいて、本出願者らは、単離０５Ｂ０１１１がペディオコッカス・アシディラクティシであることを確認した。
【００７３】
上記の試験及び解析の結果、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｈｏｌｔら（１９９４）、「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、第９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、及び細菌学の文献（例えば、Ｆｒａｎｚら（２００６）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６：３２９−３３３）に基づいて、本出願者らは、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が新規のペディオコッカス・アシディラクティシ分離株であると考えている。
【００７４】
本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１は、２００９年２月１０日に受託番号ＢＣＲＣ９１０４２０としてＦＩＲＤＩ（３３１  Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ  Ｒｏａｄ、Ｈｓｉｎｃｈｕ  ３００、Ｔａｉｗａｎ）のＢＣＲＣに寄託した。ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１は、ブダペスト条約の要件を満たすために、２００９年３月５日に受託番号ＤＳＭ２２３４５としてＤＳＭＺにも寄託した。
【００７５】
（例３）
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の酸耐性試験及び胆汁酸耐性試験
本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が、摂取された後に消化管の厳しい条件下で生存できるか否かを調べるために、このペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１に対して以下の実験を行った。
【００７６】
実験手順：
Ａ．酸耐性試験：
上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で得た適量のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料をＭＲＳ培地１０ｍＬに接種し、次いで３７℃で２４時間培養し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、菌株を十分に懸濁するためにＰＢＳ  １ｍＬを添加した。このようにして懸濁液を作製した。懸濁液０．５ｍＬを、２つの各ＰＢＳ溶液（ｐＨ＝２とｐＨ＝７．２）１０ｍＬに接種し、これらを十分に混合した。得られた混合物を３７℃で２時間培養した。得られた培養物を１ｍＬ取り出し、ＰＢＳで１０倍段階希釈し、次いでスプレッドプレート法で生菌をカウントした。
【００７７】
Ｂ．胆汁酸耐性試験：
上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で得たペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料を、ＭＲＳ培地１０ｍＬ及び０．３％（ｖ／ｖ）雄ウシ胆汁（ＤＩＦＣＯ）を含むＭＲＳ培地１０ｍＬのそれぞれに接種して、雄ウシ胆汁を含まないＭＲＳ培地及び０．３％雄ウシ胆汁を含むＭＲＳ培地を２％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にし、次いで十分に混合した。得られた混合物を３７℃で２４時間培養した。得られた培養物１ｍＬを、ＰＢＳで１０倍段階希釈し、次いでスプレッドプレート法で生菌をカウントした。
【００７８】
結果：
ｐＨ２及びｐＨ７．２のＰＢＳ溶液を用いて本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を２時間培養した場合は、生菌数は、それぞれ９．０５  ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬ及び９．４０  ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬである。加えて、雄ウシ胆汁を含まないＭＲＳ培地及び０．３％（ｖ／ｖ）雄ウシ胆汁を含むＭＲＳ培地を用いて本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１を２４時間培養した場合は、生菌数は、それぞれ９．０７  ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬ及び８．４０  ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬである。この結果は、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１は、酸及び胆汁酸に対して耐性であり、したがって摂取された後にヒト消化管の環境でも耐性であることを証明している。
【００７９】
（例４）
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能に対する様々な培養条件の影響
Ａ．ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能に対する糖の影響：
１２種類の炭水化物（例えば、ラクトース、フルクトース、マルトース、グルコース、糖蜜、ガラクトース、キシロース、キシリトール、イヌリン、ソルビトール、トレハロース、及びスクロース）を炭素源として用いて、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能に対するこれらの影響を調べた。
【００８０】
上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で得たペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料を、１２種類のＭＲＳ−糖培地（各１５ｍＬ）のそれぞれに摂取して、これら１２種類の各ＭＲＳ−糖培地を１％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にし、次いで３７℃で７２時間培養した。得られた培養物中のＥＰＳの単離及び精製、並びに得られた培養物のＥＰＳ濃度の決定を、上の一般的な実験手順の「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」及び「Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定」と題した項で説明した手順にしたがって行った。この結果を図２に示す。
【００８１】
図２を参照すると、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能は、異なる炭素源によって変化する。特に、他の炭水化物と比較して、スクロースが炭素源として役割を果たす場合にＥＰＳ濃度が最も高い（約８５０ｍｇ／Ｌ）。この結果は、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が、増殖のため及びエネルギー源としてスクロースを用いる場合、それが多量のＥＰＳを産生できることを示している。
【００８２】
Ｂ．ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能に対する温度の影響：
スクロースが炭素源として役割を果たしたときのペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能に対する様々な培養温度の影響を調べた。
【００８３】
上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で得たペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料を、１０％スクロースを含むオレンジ果汁の２つの部分（各５Ｌ）のそれぞれに接種して、オレンジ果汁の２つの各部分を４％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にし、次いでオレンジ果汁の２つの各部分を、それぞれ３０℃及び３７℃で培養した。８時間後及び７２時間後に、得られた培養物の一部を取り出し、得られた培養物中のＥＰＳの単離及び精製、並びに得られた培養物のＥＰＳ濃度の決定を、上の一般的な実験手順の「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」及び「Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定」と題した項で説明した手順にしたがって行った。この結果を図３に示す。
【００８４】
図３を参照すると、８時間後及び７２時間後において、３０℃で培養した培養物のＥＰＳ濃度が、３７℃で培養した培養物のＥＰＳ濃度よりも高い。この結果は、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能が炭素源としてスクロースを用いて３０℃で培養すると、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が優れたＥＰＳ産生能を有することを示している。
【００８５】
Ｃ．ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能に対する初期ｐＨ値の影響：
スクロースを炭素源として用いて３０℃で培養したときのペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能に対する様々な初期ｐＨ値の影響を調べた。
【００８６】
上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で得たペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料を、オレンジ果汁の２つの各部分（共に１０％スクロースを含み、それぞれに３．８９及び５．０の初期ｐＨ値を有する）８０ｍＬに接種して、オレンジ果汁の２つの各部分を４％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にし、次いで３０℃で７２時間培養した。得られた培養物中のＥＰＳの単離及び精製、並びに得られた培養物のＥＰＳ濃度の決定を、上の一般的な実験手順の「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」及び「Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定」と題した項で説明した手順にしたがって行った。
【００８７】
結果として、初期ｐＨ値３．８９の培地を用いて培養した培養物のＥＰＳ濃度は６７７．３３ｍｇ／Ｌであり、初期ｐＨ値５．０の培地を用いて培養した培養物のＥＰＳ濃度は１１５４ｍｇ／Ｌである。この結果は、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が炭素源としてスクロースを使用し、初期ｐＨ値５．０の培地を用いて３０℃で培養すると、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が優れたＥＰＳ産生能を有することを証明している。
【００８８】
（例５）
様々な飲料におけるペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１のＥＰＳ産生能の評価
１０％（ｖ／ｖ）スクロースを含む飲料のＥＰＳ濃度が、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の添加によってどのように影響されるかを調べるために、まず、ＥＰＳの単離及び精製、並びにＥＰＳ濃度の決定を、１０％（ｖ／ｖ）スクロースを含む次の適量の飲料：オレンジ果汁、乳、及び豆乳のそれぞれに対して、上の一般的な実験手順の「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」及び「Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定」と題した項で説明した手順にしたがって行った。
【００８９】
次いで、上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で得たペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料を、１０％スクロースを含むオレンジ果汁（５Ｌ）、１０％スクロースを含む乳（３０ｍＬ）、及び１０％スクロースを含む豆乳（５０ｍＬ）のそれぞれに接種し、オレンジ果汁、乳、及び豆乳をそれぞれ４％、２％、及び２％の最終接種濃度（ｖ／ｖ）にした。接種したオレンジ果汁は、３０℃で７２時間培養し、接種した乳及び接種した豆乳を３７℃で７２時間培養した。得られた培養物中のＥＰＳの単離及び精製、並びに得られた培養物のＥＰＳ濃度の決定を、上の一般的な実験手順の「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」及び「Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定」と題した項で説明した手順にしたがって行った。
【００９０】
本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１での接種前は、１０％スクロースを含むオレンジ果汁、１０％スクロースを含む乳、及び１０％スクロースを含む豆乳のＥＰＳ濃度は、それぞれ４５２ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、及び１５７ｍｇ／Ｌである。本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１で接種して７２時間培養すると、オレンジ果汁、乳、及び豆乳を用いて培養した培養物のＥＰＳ濃度は、それぞれ６７７ｍｇ／Ｌ、６５５ｍｇ／Ｌ、及び１１２８ｍｇ／Ｌである。この結果は、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が、様々な飲料においてＥＰＳ産生能を有し、食品産業で広く使用できることを示している。
【００９１】
（例６）
ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳの、マウスマクロファージの炎症誘発性サイトカイン分泌及び酸化窒素分泌を刺激する能力についての評価
マウスマクロファージを、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳと共に培養した。この例では、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、及びインターロイキン−１２ｐ７０（ＩＬ−１２ｐ７０）を、炎症誘発性サイトカインの発現レベルの指標として見なし、窒化物を、酸化窒素（ＮＯ）のレベルの指標として利用した。
【００９２】
実験の材料及び手順：
Ａ．マクロファージの源及び培養：
ダルベッコ変更イーグル培地（ＤＭＥＭ）粉末（ＨｙＣｌｏｎｅ）１３．４ｇ及び重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）１．５ｇを、それぞれｄｄＨ２Ｏ  ６００ｍＬ及びｄｄＨ２Ｏ  ３００ｍＬに添加した。十分に溶解してから、得られた２つの混合物を一緒に均等に混合し、次いで１Ｎ  ＨＣｌによってｐＨ７．２〜７．４に調整した。このようにして、ＤＭＥＭ培地を用意した。１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２％グルタミンをＤＭＥＭに添加し、次いで０．２２μｍの細孔径の膜フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてろ過し、４℃で保管した。
【００９３】
この例では、マウスＢＡＬＢ／ｃマクロファージＲＡＷ２６４．７（ＦＩＲＤＩのＢＣＲＣから購入、受託番号ＢＣＲＣ６０００１）を使用した。マクロファージＲＡＷ２６４．７を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、４ｍＭグルタミン、及び１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを含み、ｐＨ＝７．２〜７．４）が入った１０ｃｍペトリ皿に入れ、培養条件を３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベータで培養した。
【００９４】
ペトリ皿の底部の８０〜９０％をマクロファージＲＡＷ２６４．７で覆い、顕微鏡で観察された細胞増殖パターンが正常な場合、ＤＭＥＭをペトリ皿から除去した。新鮮なＤＭＥＭ  ３ｍＬをペトリ皿に添加した。ペトリ皿の新鮮なＤＭＥＭを吸引し、ピペットで除去して、ペトリ皿の底部の細胞を繰返し洗い流した。したがって、細胞がペトリ皿の底部から分離し、懸濁液が得られた。適量の懸濁液を、ＤＭＥＭ  １０ｍＬを含む新しいペトリ皿に添加し、次いで培養条件を３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベータで培養した。
【００９５】
Ｂ．ＥＰＳ試験溶液の調製：
上の例１の「Ｅ．優れたＥＰＳ産生能を有する乳酸菌分離株のスクリーニング」と題した項で得たペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳ溶液（８４５ｍｇ／Ｌ）を滅菌水で希釈して、ＥＰＳ試験溶液を４２２．５ｍｇ／Ｌ、１６９ｍｇ／Ｌ、及び８４．５ｍｇ／Ｌの最終濃度にした。初めのＥＰＳ溶液（８４５ｍｇ／Ｌ）の一部も、ＥＰＳ試験溶液として使用した。ＥＰＳ試験溶液のすべてを、後で使用するために、０．２２μｍの細孔径の膜フィルタを用いてろ過した。
【００９６】
Ｃ．ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳの、マクロファージＲＡＷ２６４．７の炎症誘発性サイトカイン分泌を刺激する能力についての評価：
この実験を行う前に、「Ａ．マクロファージの源及び培養」と題した前の項で説明した手順にしたがって継代培養したマクロファージＲＡＷ２６４．７を用意し、細胞濃度をＤＭＥＭで調整した。次いで、細胞濃度が８×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を作製した。マクロファージＲＡＷ２６４．７の上述の細胞懸濁液１００μＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、９６ウェルプレートをインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）に入れ、１〜２時間培養した。したがって、マクロファージＲＡＷ２６４．７が各ウェルの底に付着した。マクロファージＲＡＷ２６４．７を、４つの実験群、２つのコントロール群（陽性群と陰性群）、及び１つのブランク群を含む７つの群に分けた。７つの群に次の物質を添加した：（１）各実験群１、２、３、４に、８４．５ｍｇ／Ｌ、１６９ｍｇ／Ｌ、４２２．５ｍｇ／Ｌ、及び８４５ｍｇ／Ｌの濃度のＥＰＳ試験溶液２０μＬをそれぞれ添加し；（２）陽性コントロール群に、リポ多糖（ＬＰＳ）（１０μｇ／ｍＬ）２０μＬを添加し；（３）陰性コントロール群にＤＭＥＭ  ２０μＬを添加し；及び（４）ブランク群に滅菌水２０μＬを添加した。
【００９７】
インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養した後、各ウェルの液体を取り出して、マウスＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ４１０）を用いて酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。４つの実験群の吸光度（ＯＤ４５０）を、４５０ｎｍの波長で測定し、標準ＴＮＦ−αの濃度及びそれぞれの吸光度（ＯＤ４５０）をプロットすることによって予め作成した相関曲線にしたがって濃度（ｐｇ／ｍＬ）に変換した。加えて、実験群４の細胞培養物の一部及びブランク群の細胞培養物の一部を、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＢＤ、カタログ番号５５２３６４）を用いてＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙによって解析した。
【００９８】
Ｄ．ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳの、マクロファージＲＡＷ２６４．７の酸化窒素泌を刺激する能力についての評価：
「Ａ．マクロファージの源及び培養」と題した前の項で説明した手順にしたがって継代培養したマクロファージＲＡＷ２６４．７を、９６ウェルプレートの各ウェル（１×１０５細胞／ウェル）にプレーティングし、次いで３７℃で一晩培養した。マクロファージＲＡＷ２６４．７を、３つの実験群及び１つの陽性コントロール群を含む４つの群に分けた。３つの各実験群（１％、５％、及び１０％ＥＰＳ群と呼ぶ）に、すべてが１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖及び１ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γを含み、且つそれぞれ１％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）、及び１０％（ｖ／ｖ）ＥＰＳ試験溶液を含む３つの溶液それぞれの１つを１００μＬ添加した。陽性コントロール群に、１００ｎｇ／ｍＬリポ多糖及び１ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γのみを含む溶液１００μＬを添加した。３７℃で２４時間培養した。
【００９９】
各ウェルから液体５０μＬを取り出して、後の酸化窒素アッセイ（ＮＯアッセイ）のために新しい９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。スルファニルアミド（６０ｍＭ）５０μＬ及びＮ−１−ナフチルエチレンジアミン（４ｍＭ）５０μＬを、上述の新しい９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、次いで５分間振盪させた。各ウェルの混合物の吸光度（ＯＤ５４０）を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５４０ｎｍの波長で測定した。混合物のＯＤ５４０を、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）の様々な既知の濃度及びそれぞれの吸光度（ＯＤ５４０）をプロットすることによって予め作成した相関曲線にしたがって亜硝酸濃度に変換した。陽性コントロール群の亜硝酸濃度を１００％と見なし、３つのＥＰＳ群の亜硝酸濃度の相対率を、陽性コントロール群の亜硝酸濃度に基づいて算出した。
【０１００】
結果：
「Ｃ．ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳの、マクロファージＲＡＷ２６４．７の炎症誘発性サイトカイン分泌を刺激する能力についての評価」と題した前の項のＥＬＩＳＡの結果を図４に示す。図４を参照すると、マクロファージＲＡＷ２６４．７によって分泌されたＴＮＦ−αの濃度は、ＥＰＳ濃度の上昇と共に上昇している。この結果は、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳは、マクロファージＲＡＷ２６４．７を刺激してＴＮＦ−αを分泌させることができることを示している。すなわち、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳは、マクロファージの活性化を助けることができる。
【０１０１】
Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙを用いた解析の結果は次の通りである。ブランク群については、マクロファージＲＡＷ２６４．７を滅菌水で２４時間培養すると、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、及びＩＬ−１２ｐ７０の濃度は、それぞれ０ｐｇ／ｍＬ、０ｐｇ／ｍＬ、１１３ｐｇ／ｍＬ、０ｐｇ／ｍＬ、１３６２ｐｇ／ｍＬ、及び０ｐｇ／ｍＬであった。実験群４については、マクロファージＲＡＷ２６４．７を８４５ｍｇ／Ｌの濃度のＥＰＳ試験溶液で２４時間培養すると、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、及びＩＬ−１２ｐ７０の濃度は、それぞれ７ｐｇ／ｍＬ、６８ｐｇ／ｍＬ、２１５ｐｇ／ｍＬ、２６ｐｇ／ｍＬ、２４７３ｐｇ／ｍＬ、及び４．９２ｐｇ／ｍＬであった。この結果は、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳは、マクロファージＲＡＷ２６４．７を刺激してＴＮＦを分泌させることができるが、効果的にマクロファージＲＡＷ２６４．７を刺激してＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１２ｐ７０を分泌させることができないことを示している。
【０１０２】
ＮＯアッセイの結果は次の通りである。それぞれ１％、５％、及び１０％の各ＥＰＳ試験溶液でマクロファージＲＡＷ２６４．７を２４時間培養すると、各ＥＰＳ群の亜硝酸濃度の相対率が低下する。亜硝酸濃度の相対率の低下の程度は、ＥＰＳ濃度が上昇するとより明らかになる傾向がある。特に、１０％ＥＰＳ群の亜硝酸濃度は、陽性コントロール群の亜硝酸濃度の約６９％まで低下する。この結果は、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳは、マクロファージＲＡＷ２６４．７のＮＯ分泌を抑制することができ、したがって炎症反応を緩和できることを証明している。
【０１０３】
ＴＮＦ−αは、マクロファージの活性化の指標として用いることができ、炎症誘発性サイトカイン及びＮＯを炎症反応の指標として用いることができる。したがって、上述の結果に基づいて、本出願者らは、本発明のペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳはマクロファージを活性化させることができるが、マクロファージを刺激して炎症反応を誘発し、これにより免疫活性を調節できるものではないと考えている。
【０１０４】
（例７）
炭素源として異なる糖を用いて培養されたペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳの、マウスマクロファージのＴＮＦ−αの分泌を刺激する能力についての評価
実験材料及び手順：
上の例１の「Ｂ．乳酸菌分離株の接種材料の調製」と題した項で得たペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１の接種材料を、ＭＲＳ培地（１０％グルコースを含む）１５ｍＬ、ＭＲＳ−スクロース培地１５ｍＬ、及びＭＲＳ−マルトース培地１５ｍＬのそれぞれに接種して、ＭＲＳ培地（グルコース群と呼ぶ）、ＭＲＳ−スクロース培地（スクロース群と呼ぶ）、及びＭＲＳ−マルトース培地（マルトース培地と呼ぶ）のそれぞれを１％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にした。次いで、３７℃で７２時間培養した。得られた培養物中にあるＥＰＳの単離及び精製、並びに得られた培養物のＥＰＳ濃度の決定を、「一般的な実験手順」の「Ａ．エキソポリサッカライドの単離及び精製」及び「Ｂ．ＥＰＳ濃度の決定」と題した項で説明した手順にしたがって行った。精製ＥＰＳをｄｄＨ２Ｏに溶解し、次いで滅菌水で２倍、５倍、及び１０倍に希釈した。このようにして、濃度が異なるＥＰＳ試験溶液を用意した。上の例６の「Ｃ．ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳの、マクロファージＲＡＷ２６４．７の炎症誘発性サイトカイン分泌を刺激する能力についての評価」と題した項で説明した手順にしたがって、濃度が異なるＥＰＳ試験溶液を用いて、マクロファージＲＡＷ２６４．７を刺激してＴＮＦ−αを分泌させ、マクロファージＲＡＷ２６４．７によって分泌されたＴＮＦ−αの濃度を測定した。滅菌水で培養したマクロファージＲＡＷ２６４．７は、ブランク群として用いた。
【０１０５】
結果：
この結果を表３に示す。
【表３】
2011083277.tif 000004
【０１０６】
表３を参照すると、炭素源としてグルコース、スクロース、及びマルトースを用いてペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳは、すべてマクロファージＲＡＷ２６４．７を刺激してＴＮＦ−αを分泌させることができ、マクロファージＲＡＷ２６４．７によって分泌されたＴＮＦ−αの濃度が、ＥＰＳ濃度の上昇と共に上昇する。加えて、ブランク群と比較すると、グルコース群、スクロース群、及びマルトース群のＥＰＳは、異なるＥＰＳ濃度下でマクロファージＲＡＷ２６４．７のＴＮＦ−α分泌を刺激する異なる能力を有する。本出願者らは、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１によって産生されたＥＰＳにおける分子量、構造、及び分岐の程度は、ペディオコッカス・アシディラクティシ０５Ｂ０１１１が用いた炭素源で異なるため、マクロファージのＴＮＦ−α分泌を刺激するＥＰＳの能力が影響を受ける可能性があると推測している。
【０１０７】
本明細書で言及したすべての特許及び参考文献並びにそれらの中の参考文献は、参照によりその全容が本明細書に組み入れられるものとする。矛盾が生じた場合は、定義を含め、本明細書の記載が優先するものとする。
【０１０８】
上の特定の実施形態に関連付けて本発明を説明してきたが、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、様々な改良形態及び変更形態が可能であることは明白である。したがって、本発明は、添付のクレームによってのみ限定されるものとする。
【図１】
2011083277.tif 000005
【図２】
2011083277.tif 000006
【図３】
2011083277.tif 000007
【図４】
2011083277.tif 000008
【配列表】
2011083277000001.app
【外国語明細書】
2011083277000001.pdf