(57)【要約】【課題】著しい視力低下をきたす加齢黄斑変性症の発症及び進行を、高い精度及び確率で予測可能であり、加齢黄斑変性症の早期予防や、既に発症した患者に対する最適な薬剤治療法の選択に好適に利用可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカー、並びに、加齢黄斑変性症の罹患の難易を簡便に判定可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定方法及び加齢黄斑変性症易罹患性判定キットの提供。【解決手段】下記配列番号：１で表される塩基配列を有し、加齢黄斑変性症の罹患の難易を検出するマーカーとして用いられる加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーである。  ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣ  （配列番号：１）【選択図】図４
2011135838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記配列番号：１で表される塩基配列を有し、加齢黄斑変性症の罹患の難易を検出するマーカーとして用いられることを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカー。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣ  （配列番号：１）
【請求項２】
被験体由来のＤＮＡ含有試料中の下記配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子の一部及び全部のいずれかに相補的な蛍光標識を有するプローブを、下記配列番号：１で表される塩基配列にハイブリダイズさせ、前記蛍光標識により前記ＣＦＨ遺伝子の発現を測定する測定工程と、
前記測定工程で測定された蛍光強度から前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定するＤＮＡコピー数決定工程と、
前記ＤＮＡコピー数決定工程で決定されたＤＮＡコピー数から加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定する易罹患性判定工程と、
を少なくとも含むことを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣ  （配列番号：１）
【請求項３】
易罹患性判定工程が、決定されたＤＮＡコピー数を組み合わせて判定する工程であり、前記ＤＮＡコピー数の組合せが、（Ａ）０コピー及び１コピーと、（Ｂ）２コピー及び３コピーとの組合せ、並びに、（Ｃ）０コピー〜２コピーと、（Ｄ）３コピーとの組合せのいずれかであり、前記組合せにおいて、前記（Ｂ）及び前記（Ｄ）のいずれかである場合に加齢黄斑変性症に易罹患性であると判断する工程である請求項２に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
【請求項４】
測定工程が、配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子を鋳型とした定量ＰＣＲにより前記ＣＦＨ遺伝子の発現を測定する工程である請求項２から３のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
【請求項５】
下記配列番号：２及び下記配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う請求項４に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴ  （配列番号：２）
ＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴ  （配列番号：３）
【請求項６】
定量ＰＣＲがハウスキーピング遺伝子を内部標準として定量され、
ＤＮＡコピー数決定工程が、ＣＦＨ遺伝子に対応する蛍光強度と、前記ハウスキーピング遺伝子に対応する蛍光強度とを比較することにより前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定する工程である請求項４から５のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
【請求項７】
定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ法により行なわれる請求項４から６のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
【請求項８】
ＤＮＡコピー数決定工程が、測定工程で測定された蛍光強度が飽和に達するより前の時点におけるＣＦＨ遺伝子に対応する蛍光強度から前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定する工程である請求項２から７のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
【請求項９】
易罹患性判定工程において、一塩基多型を更に組み合わせて加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定する請求項２から８のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
【請求項１０】
一塩基多型が、ｒｓ８００２９２（Ｉ６２Ｖ）、ｒｓ１０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）、及びｒｓ１４１０９９６の少なくともいずれかである請求項９に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを少なくとも含み、加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定することを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定用キット。
【請求項１２】
下記配列番号：２及び下記配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーと、下記配列番号：４で表される塩基配列を有するプローブとを少なくとも含み、加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定することを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定用キット。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴ  （配列番号：２）
ＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴ  （配列番号：３）
ＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧ  （配列番号：４）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢黄斑変性症易罹患性判定マーカー並びに該加齢黄斑変性症易罹患性判定マーカーを用いた加齢黄斑変性症易罹患性判定方法及び加齢黄斑変性症易罹患性判定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢黄斑変性症（Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）は、高齢者の眼底において、網膜中心部の黄斑部に組織の変性や血管新生が起こり、視機能障害に至る加齢性眼科疾患であり、我が国を含む先進国において増加傾向にある疾患である。現在、５０歳以上の人口の約０．９％が罹患していると考えられ、数百万人単位の高齢者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）が著しく損なわれる疾患として注目されている。
しかし、加齢黄斑変性症に対する治療としては、視力低下発症後のものが主体であるため、病期進行してからの治療については効果が限られているのが現状である。
【０００３】
加齢黄斑変性症の発症リスク因子としては、近年、補体系の抑制因子である補体Ｈ因子（ＣＦＨ）（非特許文献１〜３参照）及びセリンプロテアーゼ遺伝子ＨＴＲＡ１近傍（非特許文献４〜５参照）の遺伝子多型が同定され、加齢黄斑変性症が遺伝的背景により強く影響を受ける可能性が示唆されている。
しかし、これらの遺伝子多型が加齢黄斑変性症発症に関与するメカニズムの詳細については不明な点が多く、加齢黄斑変性症の診断及び治療の分子標的として必要充分であるか否かについては明らかではない。
【０００４】
特許文献１には、ＣＦＨをコードする遺伝子の多型部位における変異の存在又は非存在を、一塩基多型（ＳＮＰ）を用いて測定する加齢黄斑変性症を発症する被験体の性向を決定するための診断方法が開示されている。
しかし、この方法を用いても加齢黄斑変性症疾患易罹患性の判定の確立及び精度が十分ではない点で問題であった。
【０００５】
加齢黄斑変性症の発症は、前記遺伝的な要因だけでなく、喫煙や食生活等の疾患関連性が指摘されていることから、多数の遺伝子が関連する遺伝的要因と、環境要因との両者が関与する多因子疾患であると考えられる。
一般的に、多因子疾患においては、一遺伝子の変異や異常からその罹患リスクを判断することは困難であるため、前記ＳＮＰによる判定では不十分であるが、複数の罹患リスクマーカーの組み合わせにより、罹患性の難易をより正確に予測できる可能性が高くなる。
【０００６】
近年、染色体ＤＮＡの重複や、欠失よりは短いゲノム領域（数１０キロ塩基対以上）におけるＤＮＡコピー数多型（ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＮＶ）が、ＳＮＰとは異なる新しいゲノム解析のマーカーとして注目を集めており、ＤＮＡコピー数多型の疾患関連性について解析が行われつつある。
【０００７】
従来の遺伝学的解析では、ＳＮＰに代表される個人間の遺伝子の“配列の違い”について、よく検討されてきた。これに対して、ＤＮＡコピー数多型は、リファレンスとなるゲノムＤＮＡと比較して、１キロ塩基対（ｋｂｐ）から長いものでは数メガ塩基対（Ｍｂｐ）に及ぶ長さの大きなゲノム領域において、ＤＮＡコピー数が変動する遺伝子の“数の違い”を意味する。
近年、ＤＮＡコピー数多型は、ヒトゲノム全体の１２％以上（約３６０Ｍｂｐ）という、従来考えられていたよりもはるかに広い領域にＤＮＡコピー数多型が見られ、これまで知られていたＳＮＰに加えて新たな個人間のゲノムの多様性を生み出している可能性が示された（非特許文献６参照）。これらのＤＮＡコピー数多型には、様々な疾患、薬剤感受性に関連するものを含め約３，０００個の遺伝子が含まれており、いわゆる染色体異常をともなう先天性疾患だけではなく、生活習慣病、自己免疫疾患といったｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ（ありふれた病気）を含むヒト形質の個人差に広く寄与している可能性が示された。ＤＮＡコピー数多型のデータは、現在、インターネット上の公共データベース（ＤａｔａＢａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ，  ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｔｃａｇ．ｃａ／ｖａｒｉａｔｉｏｎ／）に公開されている。
【０００８】
ＳＮＰのジェノタイピングを検討する場合も、ＤＮＡコピー数多型を含むゲノム領域にそのＳＮＰが存在する場合には、以下の問題により、コピー数多型解析が必要になる。
一般的に、ＳＮＰのジェノタイピングをＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、あるいはインベーダ法などの方法で解析した場合、各反応がプラトーに達した後のエンドポイントにおいて、各アレルに対応する蛍光強度の比を求めると、各アレルについてのホモ接合体（アレル比  １：０若しくは０：１）及びヘテロ接合体（アレル比  １：１）の３つの群に対応する数値（グラフ上にプロットした場合は３つのクラスター）に集約される。これに対して、各反応がプラトーに達する前のある時点にてＳＮＰのジェノタイピングを行うと、ＤＮＡコピー数多型を含まない領域におけるＳＮＰのジェノタイピングにおいては、各アレルに対応する蛍光強度の比が３つのクラスターに分けられるが、ＤＮＡコピー数多型を含む領域におけるＳＮＰのジェノタイピングにおいては、３つのクラスターに分けられない場合が存在しうる（非特許文献７参照）。
即ち、遺伝子の重複が起こっている被験体、特に重複の結果、「アレル非対称性」が生じている被験体では、上記３つのいずれとも異なる蛍光強度比をとり、３つのクラスターのいずれとも異なる位置にプロットされるものが検出されうる。「アレル非対称性」が起こっている被験体では、両アレルのコピー数比が１：１以外（例えば、２：１、１：２など）のヘテロ接合体である可能性を推測することができる。しかし、ＳＮＰのジェノタイピング解析のみでは、総コピー数は不明であり、両アレルの詳細な数を求めることができないため、コピー数多型の定量的解析が必要となる。
【０００９】
したがって、ＳＮＰがコピー数多型のあるゲノム領域に含まれている場合には、従来、ヘテロ接合体と考えられていた被験体の中に、例えば、罹患リスクアレル：非リスクアレルが２：１のものと、罹患リスクアレル：非リスクアレルが１：２のものが存在しうることになり、罹患リスクのコピー数が実は異なっている可能性が推測される。また、ＳＮＰのジェノタイピング解析のみでは、「アレル対称性」の遺伝子重複（例えば、２コピー：２コピー）と、遺伝子重複のないヘテロ接合体（１コピー：１コピー）とを判別できず、遺伝子重複のあるホモ接合体（３コピー：０コピー）と遺伝子重複のないホモ接合体とホモ接合体と欠失（１コピー：０コピー）を判別できないなどの問題があり、コピー数多型の定量的解析から総コピー数を求めることが必要である。
【００１０】
前記ＣＦＨ遺伝子及びその関連遺伝子であるＣＦＨＲ１−ＣＦＨＲ５は、進化の過程で遺伝子が重複して染色体１番の１ｑ３１．３領域で３００ｋｂ程にわたるＲＣＡ（ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）ｌｏｃｕｓ（遺伝子群）を形成していることが知られている（非特許文献２参照）おり、ＣＦＨ遺伝子の３’領域にＤＮＡコピー数多型が存在することが知られているものの（非特許文献８及びＤａｔａＢａｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｔｓ参照）、これらのＤＮＡコピー数多型と、加齢黄斑変性症罹患性との相関性については、国内外ともに未だ解析が進んでいない。
【００１１】
したがって、著しい視力低下をきたす加齢黄斑変性症の発症及び進行を高い確率で予測可能であり、加齢黄斑変性症の早期予防や、既に発症した患者に対する最適な薬剤治療法の選択に好適に利用可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカー、並びに、加齢黄斑変性症の罹患の難易を簡便に判定可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定方法及び加齢黄斑変性症易罹患性判定キットの提供が強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２００８−５２９５３６号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｌｅｉｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００５，  ３０８（５７２０），  ３８５−３８９
【非特許文献２】Ｅｄｗａｒｄｓ  ＡＯ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００５，  ３０８（５７２０），  ４２１−４２４
【非特許文献３】Ｈａｉｎｅｓ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００５，  ３０８（５７２０），  ４１９−４２１
【非特許文献４】Ｙａｎｇ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６，  ３１４（５８０１），  ９９２−９９３
【非特許文献５】Ｄｅｗａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００６，  ３１４（５８０１），  ９８９−９２
【非特許文献６】Ｒｅｄｏｎ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，２００６，  ４４４（７１１８），  ４４４−４５４
【非特許文献７】Ｈｏｓｏｎｏ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ，  ２００８，  ２９（１），  １８２−１８９
【非特許文献８】Ａｌｋａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００９，  ４１（１０），  １０６１−１０６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、著しい視力低下をきたす加齢黄斑変性症の発症及び進行を、高い精度及び確率で予測可能であり、加齢黄斑変性症の早期予防や、既に発症した患者に対する最適な薬剤治療法の選択に好適に利用可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカー、並びに、加齢黄斑変性症の罹患性の難易を簡便に判定可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定方法及び加齢黄斑変性症易罹患性判定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子をマーカーとして、前記マーカーのＤＮＡコピー数多型を定量ＰＣＲを用いて決定することで、前記ＤＮＡコピー数多型から高い確率及び精度で加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定可能であること、また、前記ＤＮＡコピー数多型と併せてＣＦＨ遺伝子のアミノ酸変異を伴う一塩基多型との組合せにより更に高い精度及び確立で判定可能であることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１６】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記配列番号：１で表される塩基配列を有し、加齢黄斑変性症の罹患の難易を検出するマーカーとして用いられることを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーである。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣ  （配列番号：１）
＜２＞  被験体由来のＤＮＡ含有試料中の下記配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子の一部及び全部のいずれかに相補的な蛍光標識を有するプローブを、下記配列番号：１で表される塩基配列にハイブリダイズさせ、前記蛍光標識により前記ＣＦＨ遺伝子の発現を測定する測定工程と、前記測定工程で測定された蛍光強度から前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定するＤＮＡコピー数決定工程と、前記ＤＮＡコピー数決定工程で決定されたＤＮＡコピー数から加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定する易罹患性判定工程と、を少なくとも含むことを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣ  （配列番号：１）
＜３＞  易罹患性判定工程が、決定されたＤＮＡコピー数を組み合わせて判定する工程であり、前記ＤＮＡコピー数の組合せが、（Ａ）０コピー及び１コピーと、（Ｂ）２コピー及び３コピーとの組合せ、並びに、（Ｃ）０コピー〜２コピーと、（Ｄ）３コピーとの組合せのいずれかであり、前記組合せにおいて、前記（Ｂ）及び前記（Ｄ）のいずれかである場合に加齢黄斑変性症に易罹患性であると判断する工程である前記＜２＞に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
＜４＞  測定工程が、配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子を鋳型とした定量ＰＣＲにより前記ＣＦＨ遺伝子の発現を測定する工程である前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
＜５＞  下記配列番号：２及び下記配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う前記＜４＞に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴ  （配列番号：２）
ＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴ  （配列番号：３）
＜６＞  定量ＰＣＲがハウスキーピング遺伝子を内部標準として定量され、ＤＮＡコピー数決定工程が、ＣＦＨ遺伝子に対応する蛍光強度と、前記ハウスキーピング遺伝子に対応する蛍光強度とを比較することにより前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定する工程である前記＜４＞から＜５＞のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
＜７＞  定量ＰＣＲが、ＴａｑＭａｎ法により行なわれる前記＜４＞から＜６＞のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
＜８＞  ＤＮＡコピー数決定工程が、測定工程で測定された蛍光強度が飽和に達するより前の時点におけるＣＦＨ遺伝子に対応する蛍光強度から前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定する工程である前記＜２＞から＜７＞のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
＜９＞  易罹患性判定工程において、一塩基多型を更に組み合わせて加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定する前記＜２＞から＜８＞のいずれかに記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
＜１０＞  一塩基多型が、ｒｓ８００２９２（Ｉ６２Ｖ）、ｒｓ１０６１１７０（Ｙ４０２Ｈ）、及びｒｓ１４１０９９６の少なくともいずれかである前記＜９＞に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法である。
＜１１＞  前記＜１＞に記載の加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを少なくとも含み、加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定することを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットである。
＜１２＞  下記配列番号：２及び下記配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーと、下記配列番号：４で表される塩基配列を有するプローブとを少なくとも含み、加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定することを特徴とする加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットである。
ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴ  （配列番号：２）
ＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴ  （配列番号：３）
ＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧ  （配列番号：４）
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、著しい視力低下をきたす加齢黄斑変性症の発症及び進行を、高い精度及び確率で予測可能であり、加齢黄斑変性症の早期予防や、既に発症した患者に対する最適な薬剤治療法の選択に好適に利用可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカー、並びに、加齢黄斑変性症の罹患の難易を簡便に判定可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定方法及び加齢黄斑変性症易罹患性判定キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、染色体１番、ｃｙｔｏｂａｎｄ  １ｑ３１．３のＣＦＨ遺伝子において、配列番号：２で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーとを用いたＰＣＲの増幅産物の位置を示す図である。矢印で示した箇所が、ＰＣＲ増幅産物の位置である。
【図２】図２は、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６（ｈｇ  １８）においてｃｈｒ１：１９４９３７３２６−１９４９３７３９９（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５では、ｃｈｒ１：１９３４０２３６０−１９３４０２４３３）に相当する配列において、配列番号：２で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーとを用いたＰＣＲの増幅産物とその周辺ゲノムの情報を示す図である。
【図３】図３は、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６（ｈｇ  １８）においてｃｈｒ１：１９４９３７３２６−１９４９３７３９９（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５では、ｃｈｒ１：１９３４０２３６０−１９３４０２４３３）に相当する配列において、配列番号：２で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーとを用いたＰＣＲの増幅産物とその周辺ゲノムの情報を示す図である。
【図４】図４は、配列番号：２で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーとを用いたＰＣＲの増幅産物を示す図である。
【図５】図５は、配列番号：２で表される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーとを用いたＰＣＲの増幅産物のＣＦＨ遺伝子における位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカー）
本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーは、加齢黄斑変性症の罹患の難易を検出するマーカーとして用いられるマーカーであり、下記配列番号：１で表される塩基配列を有する。
下記配列番号：１で表される塩基配列は、加齢黄斑変性症と関連性が知られているＣＦＨ遺伝子９番イントロン（短型ＣＦＨ遺伝子  ＮＭ＿００１０１４９７５では３’下流領域）が有する塩基配列である。
５’−ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣ  −３’  （配列番号：１）
【００２０】
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーは、１本鎖のＤＮＡであってもよく、２本鎖のＤＮＡであってもよく、前記ＤＮＡから転写されたＲＮＡであってもよい。また、前記ＤＮＡやＲＮＡからなる抗体であってもよい。
前記配列番号：１で表される塩基配列は、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入など変異しているものであってもよく、１若しくは数個の塩基が３’末端及び５’末端の少なくともいずれかに付加しているものであってもよいが、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーは、前記ＣＦＨ遺伝子又はそのＲＮＡと、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものが好ましく、前記配列番号：１で表される塩基配列そのものがより好ましい。
【００２１】
ここで、ストリンジェントな条件とは、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーが結合する被験体由来のＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる（Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ  １９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．  １５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ参照）。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ（ＮａＣｌ，ｔｒｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）、０．１質量％  ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、３７℃」程度の条件を挙げることができる。前記条件で洗浄しても、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーと、被験体由来のＤＮＡとがハイブリダイズ状態を維持するものをいう。
【００２２】
＜製造方法＞
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然の遺伝子から制限酵素などにより酵素的に直接切り出す方法、天然の遺伝子を鋳型としてＰＣＲで増幅させる方法、遺伝子クローニングによる方法、化学合成による方法などが挙げられる。
【００２３】
前記ＰＣＲ法の場合、前記配列番号：１で表される塩基配列を含む領域を挟むようにプライマーを設計し、公知の方法で調製することができる。
【００２４】
前記遺伝子クローニング法の場合、例えば、正常核酸を増幅したものをプラスミドベクター、ファージベクター、プラスミドとファージとのキメラベクター等から選択されるベクターに組み込み、大腸菌、枯草菌等の原核微生物、酵母等の真核微生物、動物細胞等から選択される増殖可能な任意の宿主に導入することにより前記配列番号：１で表される塩基配列を大量に調製することができる。
【００２５】
前記化学合成法としては、例えば、トリエステル法、亜リン酸法などのような、液相法又は不溶性の担体を使った固相合成法などが挙げられる。前記化学合成法の場合、公知の自動合成機等を用い、１本鎖の前記配列番号：１で表される塩基配列を大量に調製した後、アニーリングを行うことにより、２本鎖前記配列番号：１で表される塩基配列を調製することができる。
【００２６】
＜使用＞
本願発明において、加齢黄斑変性症の罹患性の難易は、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーにより、被験体における、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーが認識するＣＦＨ遺伝子のＤＮＡのコピー数多型により判定することができる。即ち、前記ＤＮＡコピー数多型が、加齢黄斑変性症の発症の危険度が低い者では０コピー〜１コピーであり、加齢黄斑変性症の危険度が高い者では２コピー〜３コピーである。このＤＮＡコピー数多型の違いにより、加齢黄斑変性症の罹患性の難易を判定することができる。
【００２７】
前記ＤＮＡコピー数多型の決定及び加齢黄斑変性症の罹患の難易の判定は、後述する本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法により行うことが好ましい。
なお、後述するとおり、前記ＤＮＡコピー数多型は、前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数多型が既知である被験体との相対比による解析値であるため、０コピー〜３コピーはその解析値を示すものである。
【００２８】
＜用途＞
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーは、著しい視力低下をきたす加齢黄斑変性症の発症及び進行を予測可能であるため、加齢黄斑変性症判定用に用いられる、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＰＣＲ法、インベーダーアッセイ等のＰＣＲ法によらない迅速ＤＮＡ増幅法、塩基配列解析法などに好適に利用可能である。
【００２９】
（加齢黄斑変性症易罹患性判定方法）
本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法は、測定工程と、ＤＮＡコピー数決定工程と、易罹患性判定工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００３０】
＜測定工程＞
前記測定工程は、被験体由来のＤＮＡ含有試料中の前記配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子の一部及び全部のいずれかに相補的な蛍光標識を有するプローブを、前記ＤＮＡ含有試料中の前記ＣＦＨ遺伝子にハイブリダイズさせ、前記蛍光標識により前記ＣＦＨ遺伝子の発現を測定する工程である。
【００３１】
−ＤＮＡ含有試料−
前記ＤＮＡ含有試料は、被験体由来の前記配列番号：１で表される塩基配列を有する領域を含むものである。
前記測定工程において、前記ＤＮＡ含有試料は、予めＤＮＡとして調製されたものであってもよく、被験体から採取してＤＮＡ調製から行ってもよい。
また、前記ＤＮＡ含有試料は、ＤＮＡの代わりにＤＮＡの転写産物であってもよく、これらの混合溶液であってもよい。
【００３２】
前記ＤＮＡ含有試料を前記被験体から採取する際に用いる被験体由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、組織、血液、血球成分、リンパ液、毛髪などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記被験体由来の試料は、血液及びその分画である血球成分が、採取が簡便であるため好ましい。
【００３３】
前記被験体由来の試料からＤＮＡを抽出する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記ＤＮＡ含有試料は、前記抽出したＤＮＡそのものであってもよく、前記配列番号：１で表される塩基配列を含む領域を予めＰＣＲで増幅して得られた増幅産物であってもよい。
【００３４】
−プローブ−
前記プローブの塩基配列としては、前記配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子の一部及び全部のいずれかに相補的な配列であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列番号：１で表される塩基配列の一部に相補的な配列が好ましく、下記配列番号：４で表される塩基配列がより好ましい。
５’−ＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧ−３’  （配列番号：４）
【００３５】
前記プローブの蛍光標識としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄなどが挙げられる。また、前記プローブは、蛍光標識の代わりに放射性標識を有するものであってもよいが、安全性の点で蛍光標識が好ましい。
【００３６】
前記プローブを入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、合成する方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
前記市販品を用いる場合、例えば、ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙｓ：アプライドバイオシステムズ社製）などを用いることができる。
【００３７】
−遺伝子発現の測定−
前記配列番号：１で表される塩基配列で特定されるＣＦＨ遺伝子の発現を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、インベーダーアッセイ、ＰＣＲ−ＲＥＴＩＮＡ法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ）（特開２００８−２６３９７４号公報参照）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、定量ＰＣＲ法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が簡便に測定できる点で好ましく、リアルタイムＰＣＲ法がより好ましい。
【００３８】
前記リアルタイムＰＣＲ法は、前記プローブの蛍光強度をモニターすることで前記ＣＦＨ遺伝子の発現を測定することができるが、該モニターする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、インターカレーター法、ＴａｑＭａｎ法、サイクリングプローブ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法）などが挙げられる。これらの中でも、ＴａｑＭａｎ法やサイクリングプローブ法が、目的遺伝子であるＣＦＨ遺伝子に特異的なプローブを使用することにより極めて高い検出特異性を得ることができる点、また複数のプローブを用いたマルチカラー解析を行うことができる点で好ましい。
【００３９】
前記ＴａｑＭａｎ法で用いられるプローブは、前記配列番号：１で表される塩基配列の両端を蛍光物質と消光物質とで修飾した標的核酸の増幅領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであり、アニーリング時に前記ＣＦＨ遺伝子にハイブリダイズするが消光物質の存在により蛍光を発せず、伸長反応時にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されて蛍光物質が遊離することにより蛍光を発する。したがって、蛍光強度を測定することにより増幅産物の生成量をモニタリングすることができ、それによって元の鋳型ＤＮＡ量を推定することができる。
【００４０】
前記定量ＰＣＲに用いるプライマー配列としては、前記配列番号：１で表される塩基配列を含むゲノム領域を増幅させることができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記プライマー配列の塩基数としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５塩基〜３０塩基が好ましく、１７塩基〜２５塩基がより好ましく、１８塩基〜２２塩基が更に好ましい。また、ある程度長いゲノム領域において、複数のプローブを用いたマルチＰＣＲを行う場合は、プライマー対は、同等の温度で鋳型ＤＮＡにアニーリング可能なように設計されることが好ましい。
【００４１】
前記プライマー配列を設計する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖｅｒ  ３．０ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社製）、遺伝子相同性探索プログラムＢＬＡＳＴなどを用いて設計する方法などが挙げられる。
【００４２】
これらの中でも、前記プライマー配列は、下記配列番号：２で表される塩基配列を有するプライマー配列をセンスプライマー配列として、また下記配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマー配列をアンチセンスプライマー配列として用いることが好ましい。
５’−ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴ−３’  （配列番号：２）
５’−ＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴ−３’  （配列番号：３）
【００４３】
前記プライマーは、前記配列番号：２で表される塩基配列及び前記配列番号：３で表される塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入された塩基配列からなるものであってもよい。
前記プライマーの入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、合成する方法、市販品を用いる方法などが挙げられる。
【００４４】
前記定量ＰＣＲにおいて内部標準として用いる遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ハウスキーピング遺伝子が好ましい。
前記ハウスキーピング遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リボヌクレアーゼＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ：ＲＮａｓａ  Ｐ）遺伝子、テロメラーゼ触媒サブユニット（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｒｉｐｔａｓｅ：ＴＥＲＴ）遺伝子、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子、β−アクチン遺伝子、シクロフィリン遺伝子などが挙げられる。
【００４５】
前記定量ＰＣＲにおいて、前記配列番号：１で表される塩基配列に対するプローブの蛍光標識と、前記ハウスキーピング遺伝子に対するプローブの蛍光標識とで異なる蛍光標識を用いることで、これらのＰＣＲ増幅量を区別して検出することができる。
【００４６】
＜ＤＮＡコピー数決定工程＞
前記ＤＮＡコピー数決定工程は、前記測定工程で測定された蛍光強度から前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定する工程である。
前記測定工程が、定量ＰＣＲで行われる測定される場合、前記蛍光強度は、該蛍光強度が飽和に達するより前の時点における前記ＣＦＨ遺伝子に対応する蛍光強度から前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定することが好ましい。
具体的には、前記測定工程において測定した前記配列番号：１で表される塩基配列に対するプローブにより測定された蛍光強度（以下、「ＣＦＨ遺伝子蛍光強度」と称することがある。）と、前記ハウスキーピング遺伝子に対するプローブにおける蛍光強度（以下、「内部標準蛍光強度」と称することがある。）とを比較して、前記ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数を決定することができる。
【００４７】
前記蛍光強度を比較する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、一方の蛍光強度を縦軸に、他方の蛍光強度を横軸にしてグラフ上にプロットする方法、ＣＦＨ遺伝子蛍光強度及び内部標準蛍光強度を数値化してこれらの計算値により比較する方法などが挙げられる。
【００４８】
前記グラフ上にプロットする方法である場合、ＣＦＨ遺伝子蛍光強度と、内部標準蛍光強度とのＤＮＡコピー数の比が同じ被験体についてはグラフ上のある領域にプロットが集中（クラスター化）し、前記ＤＮＡコピー数の比が異なる被験体についてはグラフ上の異なる位置にプロットされる。
【００４９】
前記蛍光強度を数値化する方法である場合、ＣＦＨ遺伝子蛍光強度と、内部標準蛍光強度とのＤＮＡコピー数が同じ被験体については近似した数値が与えられ、前記ＤＮＡコピー数が異なる被験体については異なる数値が与えられる。
【００５０】
ここで、前記配列番号：１で表される塩基配列のＤＮＡコピー数多型が既知である被験体（以下、「リファレンス」と称することがある。）における蛍光強度と、未知である被験体（以下、「被験者」と称することがある。）における蛍光強度とを比較することにより、ＤＮＡコピー数の比を定量化することができる。
前記リファレンスとして用いるＤＮＡとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、国際ＨａｐＭａｐプロジェクトにおける日本人男性のＤＮＡ  ＩＤ番号：ＮＡ１９０００などが挙げられる。
リファレンスのＤＮＡコピー数をＴａｑＭａｎ法以外のマイクロアレイ法などで特定しておくことにより、ＴａｑＭａｎ法で得られるＤＮＡコピー数の相対値を絶対値に変換することができる。
【００５１】
前記定量化方法としては、特に制限はなく、公知の統計学的手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、相対解析法、検量線法、Ｌｉｖａｋらによるｄｅｌｔａ−ｄｅｌｔａ  Ｃｔ（ΔΔＣｔ）法（Ｌｅｇｒａｎｄ−Ａｎｄｒｅｏｌｅｔｔｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １９９８，  ８（１），  ７−１４参照）などが挙げられる。これらの中でも、前記定量化方法は、ΔΔＣｔが簡便である点で好ましい。
【００５２】
前記ΔΔＣｔ法の概略を以下に示す。定量ＰＣＲ法において、遺伝子が指数関数的に増幅している段階では、遺伝子分子数Ｎは、下記式１により表される。
Ｎ＝Ｎ０×（１＋Ｅ）ｎ  ・・・式１
前記式１において、「Ｎ０」は初期分子数を表し、「Ｅ」は遺伝子増幅効率、「ｎ」はＰＣＲサイクル数を表す。
【００５３】
ここで、前記遺伝子増幅効率Ｅが、被験者のＣＦＨ遺伝子とリファレンスのＣＦＨ遺伝子との間で同様と仮定した場合、遺伝子増幅が飽和に達するより前の指数関数的増幅ステージにおける、ある遺伝子分子数Ｎを閾値とし、指数関数的な増幅曲線と、前記閾値との交わった点をＣｔ値とすると、標的遺伝子の初期濃度は、２−ΔΔＣｔ値として表される。このΔΔＣｔは、下記式２で表される。
ΔΔＣｔ＝（Ｘ−Ｙ）−（Ｘ’−Ｙ’）  ・・・式２
前記式２において、「Ｘ」は、リファレンスの内部標準の蛍光強度のＣｔ値を表し、「Ｙ」はＣｔリファレンスのＣＦＨ遺伝子の蛍光強度のＣｔ値を表し、「Ｘ’」は、被験者の内部標準の蛍光強度のＣｔ値を表し、「Ｙ’」は被験者のＣＦＨ遺伝子の蛍光強度のＣｔ値を表す。
【００５４】
前記被験者の２−ΔΔＣｔ値を算出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、加齢黄斑変性症に罹患しているか否かの質的因子と、ＤＮＡコピー数多型という量的因子との相関を、最尤度法に基づき解析するＲ環境のパッケージなどで算出する方法などが挙げられる。
具体的には、統計ソフトウェアＲ（ベル研究所で開発されたＳ言語に基づいたデータ解析用の環境）において動作可能なＤＮＡコピー数多型解析用のＣＮＶ  ｔｏｏｌｓ（Ｂａｒｎｅｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，  ２００８，  ４０（１０），  １２４５−１２５２参照）を用いた統計解析方法で算出することができる。前記ＣＮＶ  ｔｏｏｌｓは、オープンソースで入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｃｎｖ−ｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ＣＮＶｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ）。
これにより、被験者のＤＮＡコピー数多型を決定することができる。
【００５５】
＜易罹患性判定工程＞
前記易罹患性判定工程は、前記ＤＮＡコピー数決定工程で決定されたＤＮＡコピー数から加齢黄斑変性症の易罹患性を判定する工程である。
前記易罹患性の判定は、前記ＤＮＡコピー数を、１コピー単独で使用して判定してもよく、２コピー以上を組み合わせて判定してもよいが、２コピー以上を組み合わせて判定する方法が、判定の確立及び精度が向上する点で好ましい。
前記ＤＮＡコピー数の組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、（Ａ）０コピー及び１コピーと、（Ｂ）２コピー及び３コピーとの組合せ、並びに、（Ｃ）０コピー〜２コピーと、（Ｄ）３コピーとの組合せのいずれかが好ましい。
前記組合せにおいて、前記（Ｂ）及び前記（Ｄ）のいずれかである場合に加齢黄斑変性症に易罹患性であると判断することができる。
【００５６】
前記ＤＮＡコピー数の組合せが易罹患性の判定に有効か否かを検定する方法としては、特に制限はなく、公知の統計学的手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カイ二乗検定法、Ｆｉｓｈｅｒ正確検定法、オッズ比を算出する方法、ｐ値を算出する方法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよいが、２種以上を併用することが、確立及び精度が高くなる点で好ましい。
【００５７】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＣＦＨ遺伝子の一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」と称することがある。）を解析するＳＮＰ解析工程を含むことが好ましい。
前記易罹患性判定工程において、前記ＤＮＡコピー数の組合せで判定する方法に加え、更にＣＦＨ遺伝子のＳＮＰを組み合わせて判定を行うことにより、更に判定の確立及び精度を向上させることができる点で好ましい。
【００５８】
前記ＣＦＨ遺伝子のＳＮＰとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の（１）〜（３）に示すＳＮＰなどが挙げられる。
（１）エクソン２の蛋白質６２番目のイソロイシンがバリンへ変異したアミノ酸変異（Ｉ６２Ｖ）を伴うＳＮＰ：ｒｓ８００２９２（以下、「ＳＮＰ１」と称することがある。）。
（２）エクソン９の蛋白質４０２番目のチロシンがヒスチジンに変異したアミノ酸変異（Ｙ４０２Ｈ）を伴うＳＮＰ：ｒｓ１０６１１７０（以下、「ＳＮＰ２」と称することがある。）。
（３）イントロン１４のＳＮＰ：ｒｓ１４１０９９６（以下、「ＳＮＰ３」と称することがある。）。
【００５９】
前記ＳＮＰを解析する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｍｏｒｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，  ２００７，  ４８（１１），  ５３１５−５３１９に記載の方法や、特表２００８−５２９５３６号公報に記載の方法などが挙げられる。
【００６０】
＜用途＞
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定方法は、後述する本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットに好適に利用可能である。
本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法によれば、加齢黄斑変性症の発症及び進行を予測可能であり、これにより発症の危険度が高い人に関しては、より頻回に眼科検査を受けることにより加齢黄斑変性症の早期予防が可能となり、加齢黄斑変性症を既に発症した患者に対しては、最適な薬剤治療法の選択が可能となる。
【００６１】
（加齢黄斑変性症易罹患性判定用キット）
本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットの第１の態様としては、本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを少なくとも含み、必要に応じて、更に基板、蛍光標識、放射性標識、結合剤、内部標準マーカー、リファレンスゲノムＤＮＡ、プレート、ハイブリダイゼーション溶液、容器、使用説明書などのその他の要素を含む。
本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットの第２の態様としては、前記配列番号：２で表される塩基配列を有するプライマー及び前記配列番号：３で表される塩基配列を有するプライマーと、前記配列番号：４で表される塩基配列を有するプローブとを少なくとも含み、必要に応じて、更に蛍光標識、放射性標識、内部標準マーカー、リファレンスゲノムＤＮＡ、酵素、ＰＣＲ用バッファー、容器、使用説明書などのその他の要素を含む。
これらのキットは、被験体由来のＤＮＡ含有試料を用い、簡便に加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定することができるものである。
【００６２】
＜第１の態様＞
前記第１の態様の加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡマイクロアレイ、インベーダーアッセイなどが挙げられる。
前記ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカー及び内部標準マーカーが整列してなり、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーが、前記ＤＮＡ含有試料中のＣＦＨ遺伝子又はその転写産物（以下、「標的試料」と称することがある。）と結合し、前記ＣＦＨ遺伝子の発現と、内部標準マーカーの遺伝子発現とをモニタリングすることを特徴とする。
【００６３】
前記基板としては、特に制限はなく、公知の材料の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、樹脂などが挙げられる。
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーは、前記基板上に整列固定されてなり、この固定された加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーと、標的試料とのハイブリダイゼーションを行い、高感度で標的ＤＮＡ断片を検出する。
【００６４】
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーと、標的試料とで形成されたハイブリッドの検出手段としては、特に制限はなく、公知の手段の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標的試料に予め結合させた蛍光標識若しくは放射性標識を利用する方法、前記ハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基若しくは導電性基を有するインターカレーターを利用する方法などが挙げられる。
【００６５】
前記ＤＮＡマイクロアレイの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記基材表面において直接前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを合成する方法（オン・チップ法）、予め別に調製した加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを前記基材表面に固定する方法などが挙げられる。
【００６６】
前記オン・チップ法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術とを組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域での前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーの選択的合成を行う方法などが挙げられる。
【００６７】
予め調製した前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを前記基材表面に固定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スポッターを用いる方法などが挙げられる。
具体的には、まず、マイクロプレートに前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを調製する。また、前記基板表面にｐｏｌｙ−ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ等の前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーと前記基板との結合剤をコ−ティングする。この後、前記マイクロプレート中の前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーをピンに付着させ、表面に結合剤をコーティングした基板上に、スポッター等を用いてピンに付着させた前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを接触させてスポットする。マイクロプレート中の全ての前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、ＤＮＡマイクロアレイを製造する。
【００６８】
前記ＤＮＡマイクロアレイと、標的試料とをハイブリダイゼーションする方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを基板上に固定させたＤＮＡマイクロアレイと、蛍光物質で標識した被験体由来のＤＮＡ断片とを、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる方法などが挙げられる。
前記ハイブリダイゼーション溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ、ＳＤＳ、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｄｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、蒸留水、及びこれらの混合溶液などが挙げられる。
前記ハイブリダイゼーション溶液の混合比率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６９】
前記ハイブリダイゼーションにより、標的試料と、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーとが相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合することができる。
一方、両者が相補鎖でなければ結合することはなく、蛍光物質で標識したＤＮＡ含有試料は、そのままハイブリダイゼーション溶液に残留するか、その一部は基板上にコーティングされている結合剤と結合し残る場合もある。
【００７０】
ハイブリダイズせず前記基板上に残った蛍光物質で標識したＤＮＡ含有試料は、洗浄することが好ましい。前記洗浄の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記基板をそのまま水槽等の中に入れて洗浄する方法などが挙げられる。これにより、前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーと結合していないＤＮＡ含有試料は排除される。
【００７１】
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーと結合している標的試料を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、標的試料に標識した蛍光物質を、所定の光源からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサーで検出する方法などが挙げられる。
【００７２】
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーと、標的試料とのハイブリダイズによる蛍光強度と、内部標準マーカーと被験体由来のＤＮＡ断片との蛍光強度とを比較することにより、被験体におけるＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数多型を決定し、加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定することができる。
【００７３】
＜第２の態様＞
前記第２の態様の加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットは、ＰＣＲ法、インベーダーアッセイなどで加齢黄斑変性症の罹患の難易を判定することができる。
【００７４】
前記第２の態様の加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットにおいて、前記プライマー及び前記プローブは、乾燥した状態であってもよく、溶液の状態であってもよい。前記プライマー及び前記プローブが溶液の状態である場合、該溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノールなどが挙げられる。
前記プライマー及びプローブは、使用時に適宜前記溶液により所望の濃度に調製して用いることができる。
前記プライマー及びプローブの濃度としては、特に制限はなく、反応条件などに応じて適宜選択することができる。
前記プローブは、蛍光標識若しくは放射性標識を有するものが好ましく、蛍光標識を有するものが安全性が高い点で好ましい。
【００７５】
前記ＰＣＲ法及びインベーダーアッセイは、標的試料に前記プローブを結合させ、該標的試料を増幅させ、前記標識の強度により前記ＣＦＨ遺伝子の発現をモニタリングすることを特徴とする。このとき、同時に内部標準マーカーの遺伝子発現をモニタリングすることが好ましい。
【００７６】
前記第２の態様の加齢黄斑変性症易罹患性判定用キットの使用方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、本発明の前記加齢黄斑変性症易罹患性判定方法を用いることが好ましい。
【００７７】
＜用途＞
前記加齢黄斑変性症易罹患性判定キットは、加齢黄斑変性症の発症及び進行を予測するための診断キットとして好適に利用可能である。
これにより、発症の危険度が高い人に関してはより頻回に眼科検査を受けることにより加齢黄斑変性症の早期予防が可能となり、また、加齢黄斑変性症を既に発症した患者に対しては、最適な薬剤治療法の選択が可能となる。
【実施例】
【００７８】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７９】
（実施例１）
＜ＤＮＡコピー数多型解析方法＞
＜＜ＤＮＡ採取工程＞＞
埼玉医科大学倫理委員会の承認の下、埼玉医科大学病院眼科に受診した加齢黄斑変性症罹患者（以下、「ＡＭＤ罹患者群」と称することがある。）男女１９５名と、眼底疾患を有さない非罹患者（以下、「対照群」と称することがある。）男女１３０名より、血液を採取し、ＤＮＡサンプルをＷｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ社製）を用いて精製した。
【００８０】
＜＜測定工程＞＞
ＤＮＡコピー数多型（以下、「ＣＮＶ」と称することがある。）の解析には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を販売元のインターネットホームページに記載の方法に従いＣｕｓｔｏｍ−ｍａｄｅで作製したものを用いた。
染色体１番、ｃｙｔｏｂａｎｄ  １ｑ３１．３のＣＦＨ遺伝子（ＲｅｆＳｅｑデータベースＩＤ：ＮＭ＿００１８６）に対するＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙｓ：アプライドバイオシステムズ社製）は、５’末端がＦＡＭにて蛍光標識されており、内部標準として用いたＲＮａｓｅ  Ｐ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｈ１（Ｈ１ＲＮＡ）  ｇｅｎｅ  （ＲＰＰＨ１）  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １４，  ｃｙｔｏｂａｎｄ  １４ｑ１１．２）遺伝子に対するＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙｓ：アプライドバイオシステムズ社製）は、５’がＶＩＣにて蛍光標識されているため、ＰＣＲ増幅量を区別して検出することが可能である。
【００８１】
前記ＣＦＨ遺伝子に対して特異的なＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ及びＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖｅｒ  ３．０ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社製）及び遺伝子相同性探索プログラムＢＬＡＳＴを用いて、定量的ＰＣＲ用に最適化したものを、ＣＦＨ遺伝子９番イントロン上（短型ＣＦＨ遺伝子  ＮＭ＿００１０１４９７５では３’下流領域）に設計した。前記ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブは、下記配列番号：４で表される塩基配列であり、前記ＰＣＲプライマーは、下記配列番号：２及び下記配列番号：３で表される塩基配列である。
［センスプライマー］
５’−ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴ−３’  （配列番号：２）
［アンチセンスプライマー］
５’−ＧＣＴＴＧＣＣＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＡＧＡＴＴ−３’  （配列番号：３）
［プローブ］
５’−ＧＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧ−３’  （配列番号：４）
【００８２】
前記ＰＣＲプライマーにより増幅されるＣＦＨ遺伝子の塩基配列は、下記配列番号：１で表される塩基配列であり、ＰＣＲの増幅産物の長さは、７４塩基対（ｂｐ）である。
また、前記ＰＣＲプライマーと、それに挟まれる領域のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ位置は、ゲノムデータのバージョンとしてＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３６（ｈｇ  １８）において、ｃｈｒ１：１９４９３７３２６−１９４９３７３９９（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３５では、ｃｈｒ１：１９３４０２３６０−１９３４０２４３３）に相当し、下記に示すとおりである。
［増幅産物］
５’−ＴＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴｇｔｇｃａｇｃａｇｇｃａｔａｃａａａｔｃｔｇａｃＡＡＴＣＴＣＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＧＣＡＡＧＣ−３’  （配列番号：１）
前記配列番号：１で表される塩基配列において、大文字は、ＰＣＲプライマー部位を示し、下線部は、解析用ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ相当部位を示す。
【００８３】
ＰＣＲは、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）により、３８４ウエルプレートを用いて行った。１反応における反応系は、表１に示すとおりであり、１サンプルにつき、３回実験を反復した。また、ＰＣＲ温度プロトコールとしては、表２に示すとおりである。
【００８４】
【表１】
2011135838.tif 000003
【００８５】
【表２】
2011135838.tif 000004
【００８６】
＜＜ＤＮＡコピー数決定工程＞＞
ＣＦＨ遺伝子発現量は、内部標準として同じ反応系において共増幅したＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子発現量との相対値から、ΔΔＣｔ法を用いて決定した。
また、ＣＦＨ遺伝子のＤＮＡコピー数が既知のリファレンスＤＮＡとしては、国際ＨａｐＭａｐプロジェクトにおける日本人男性のＤＮＡ  ＩＤ番号：ＮＡ１９０００を用いた。
遺伝子が指数関数的に増幅しているステージにおいて、遺伝子分子数Ｎは、下記式１により表される。
Ｎ＝Ｎ０×（１＋Ｅ）ｎ  ・・・式１
前記式１において、「Ｎ０」は初期分子数を表し、「Ｅ」は遺伝子増幅効率、「ｎ」はＰＣＲサイクル数を表す。
【００８７】
遺伝子増幅効率Ｅが、ＣＦＨ遺伝子と、ＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子とで同様と仮定すると、ＣＦＨ遺伝子の初期濃度は、指数関数的増幅ステージにおけるある閾値と、増幅曲線との交わった点であるＣｔ値を用いて、２−ΔΔＣｔ値として表され、ΔΔＣｔは、下記式２で表される。
ΔΔＣｔ＝（Ｘ−Ｙ）−（Ｘ’−Ｙ’）  ・・・式２
前記式２において、「Ｘ」は、リファレンスＤＮＡにおけるＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子の蛍光強度のＣｔ値を表し、「Ｙ」は、リファレンスＤＮＡにおけるＣＦＨ遺伝子の蛍光強度のＣｔ値を表し、「Ｘ’」は、対照群又はＡＭＤ罹患者群におけるＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子の蛍光強度のＣｔ値を表し、「Ｙ’」は対照群又はＡＭＤ罹患者群におけるＣＦＨ遺伝子の蛍光強度のＣｔ値を表す。
【００８８】
サンプルの２−ΔΔＣｔ値は、統計ソフトウェアＲに含まれるＤＮＡコピー数多型解析用のＣＮＶ  ｔｏｏｌｓ（Ｂａｒｎｅｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，  ２００８，  ４０（１０），  １２４５−１２５２参照）を用いて統計解析を行い、ＤＮＡコピー数を、０コピー、１コピー、２コピー、及び３コピーのいずれかに決定した。
【００８９】
＜＜易罹患性判定工程＞＞
ＡＭＤ罹患者群及び対照群において、ＤＮＡコピー数多型の違いによるグループ分けを行い、カイ二乗検定による加齢黄斑変性の罹患の難易との相関解析を行った。また、オッズ比（以下、「ＯＲ」と称することがある）及びｐ値による有意差検定を行った。
【００９０】
＜結果＞
ＡＭＤ罹患者群及び対照群の全人数における各ＤＮＡコピー数（以下、「ＣＮ」と称することがある。）の人数分布を表３に、ＡＭＤ罹患者群及び対照群別の各ＤＮＡコピー数の人数分布を表４に示す。また、ＤＮＡコピー数によりグループ分けを行った場合のＡＭＤ罹患者群と、対照群との間の有意差検定の結果を表５及び表６に示す。
なお、ＤＮＡコピー数が０コピー及び１コピーの場合を、以下「グループＡ」と、ＤＮＡコピー数が２コピー及び３コピーの場合を、以下「グループＢ」と、ＤＮＡコピー数が０コピー〜２コピーの場合を、以下「グループＣ」と、ＤＮＡコピー数が３コピーの場合を、以下「グループＣ」と称することがある。
【００９１】
【表３】
2011135838.tif 000005
【００９２】
【表４】
2011135838.tif 000006
カイ二乗検定により、ＡＭＤ罹患者群と、対照群との間のＣＮ値分布には有意差が認められた。
カイ二乗値＝１９．７４１
自由度＝３
ｐ値＝１．９２１×１０−４
【００９３】
【表５】
2011135838.tif 000007
ｐ値＝８．８４７×１０−４
ＯＲ＝３．２１９９０９（９５％信頼区間  １．５４１７９４〜６．９８７２３８）
【００９４】
【表６】
2011135838.tif 000008
ｐ値＝６．２１３×１０−５
ＯＲ＝２．６１６７４６（９５％信頼区間  １．６０６６７１〜４．２８８０９８）
【００９５】
表５より、ＤＮＡコピー数が０コピー及び１コピーの場合（グループＡ）と、ＤＮＡコピー数が２コピー及び３コピーの場合（グループＢ）とのグループ分けにおける加齢黄斑変性症の罹患と、ＤＮＡコピー数との相関性は有意であり、ＡＭＤ罹患者群において、グループＢにおけるオッズ比（ＯＲ）は、約３．２倍（９５％信頼区間  １．５〜７．０）に期待された。
表６より、ＤＮＡコピー数が０コピー〜２コピーの場合（グループＣ）と、ＤＮＡコピー数が３コピーの場合（グループＤ）とのグループ分けにおける加齢黄斑変性症の罹患と、ＤＮＡコピー数との相関性も有意であり、ＡＭＤ罹患者群において、ＤＮＡコピー数が３のオッズ比（ＯＲ）は、約２．６倍（９５％信頼区間  １．６〜４．３）に期待された。
これらの結果より、オッズ比の点では、グループＡ及びＢの組合せが好ましく、ｐ値の点では、グループＣ及びＤの組合せが好ましいことがわかった。
【００９６】
（実施例２）
実施例２では、実施例１におけるグループＡ及びＢと、ＣＦＨ遺伝子のＳＮＰを用いた解析とを組み合わせてＡＭＤの罹患の難易の相関解析を行った。
【００９７】
＜ＳＮＰ解析方法＞
Ｍｏｒｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，  ２００７，  ４８（１１），  ５３１５−５３１９に記載の方法により、ＡＭＤ罹患性との相関が明らかになっているＣＦＨ遺伝子の３種類のＳＮＰについて、ＴａｑＭａｎ  ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて遺伝子型を決定した。前記ＣＦＨ遺伝子の３種類のＳＮＰは、以下の（１）〜（３）に示すとおりである。
（１）エクソン２の蛋白質６２番目のイソロイシンがバリンへ変異したアミノ酸変異（Ｉ６２Ｖ）を伴うＳＮＰ：ｒｓ８００２９２（以下、「ＳＮＰ１」と称することがある。）。
（２）エクソン９の蛋白質４０２番目のチロシンがヒスチジンに変異したアミノ酸変異（Ｙ４０２Ｈ）を伴うＳＮＰ：ｒｓ１０６１１７０（以下、「ＳＮＰ２」と称することがある。）。
（３）イントロン１４のＳＮＰ：ｒｓ１４１０９９６（以下、「ＳＮＰ３」と称することがある。）。
【００９８】
＜結果＞
ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３のリスクアレルは、表７に示すとおりである。また、ＡＭＤ罹患者群及び対照群の全人数におけるＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３の遺伝子型の人数分布、及びこの結果から劣性遺伝モデルによる分割表にて解析（ＳＮＰ  Ａｌｙｚｅ（登録商標）：ダイナコム株式会社製）を行った結果を併せて表７に示す。
【００９９】
【表７】
2011135838.tif 000009
【０１００】
−ＳＮＰ１の劣性遺伝と、ＣＮＶ（グループＡ及びＢ）との組合せによるＡＭＤ易罹患性判定−
ＡＭＤ罹患者群及び対照者群と、ＳＮＰ１の劣性遺伝１及び２、並びに実施例１におけるグループＡ及びＢとを用いた８グループ間でカイ二乗検定による加齢黄斑変性症の罹患の難易の相関解析を行った。また、オッズ比及びｐ値による有意差検定を行った。結果を表８に示す。なお、オッズ比は、最もリスクが低い群（表８において劣性遺伝子１かつＣＮ値０、１の群）を１とする。
【０１０１】
【表８】
2011135838.tif 000010
カイ二乗値＝３３．０１
自由度＝３
ｐ値＝３．２０６×１０−７
【０１０２】
−ＳＮＰ２の劣性遺伝と、ＣＮＶ（グループＡ及びＢ）との組合せによるＡＭＤ易罹患性判定−
ＡＭＤ罹患者群及び対照者群と、ＳＮＰ２の劣性遺伝１及び２、並びに実施例１におけるグループＡ及びＢとを用いた８グループ間でカイ二乗検定による加齢黄斑変性症の罹患の難易の相関解析を行った。また、オッズ比及びｐ値による有意差検定を行った。結果を表９に示す。なお、オッズ比は、最もリスクが低い群（表９において劣性遺伝子２かつＣＮ値０、１の群）を１とする。
【０１０３】
【表９】
2011135838.tif 000011
カイ二乗値＝１３．９５６
自由度＝３
ｐ値＝２．９６６×１０−３
【０１０４】
−ＳＮＰ３の劣性遺伝と、ＣＮＶ（グループＡ及びＢ）との組合せによるＡＭＤ易罹患性判定−
ＡＭＤ罹患者群及び対照者群と、ＳＮＰ３の劣性遺伝１及び２、並びに実施例１におけるグループＡ及びＢとを用いた８グループ間でカイ二乗検定による加齢黄斑変性症の罹患の難易の相関解析を行った。また、オッズ比及びｐ値による有意差検定を行った。結果を表１０に示す。なお、オッズ比は、最もリスクが低い群（表１０において劣性遺伝子１かつＣＮ値０、１の群）を１とする。
【０１０５】
【表１０】
2011135838.tif 000012
カイ二乗値＝２７．８６８
自由度＝３
ｐ値＝３．８７１×１０−６
【０１０６】
（実施例３）
実施例３では、実施例１におけるグループＣ及びＤと、ＣＦＨ遺伝子のＳＮＰを用いた解析とを組み合わせてＡＭＤの罹患の難易の相関解析を行った。ＳＮＰ解析方法は、実施例２と同様の方法で行った。
【０１０７】
−ＳＮＰ１の劣性遺伝と、ＣＮＶ（グループＣ及びＤ）との組合せによるＡＭＤ易罹患性判定−
ＡＭＤ罹患者群及び対照者群と、ＳＮＰ１の劣性遺伝１及び２、並びに実施例１におけるグループＣ及びＤとを用いた８グループ間でカイ二乗検定による加齢黄斑変性症の罹患の難易の相関解析を行った。また、オッズ比及びｐ値による有意差検定を行った。結果を表１１に示す。なお、オッズ比は、最もリスクが低い群（表１１において劣性遺伝子１かつＣＮ値０、１、２の群）を１とする。
【０１０８】
【表１１】
2011135838.tif 000013
カイ二乗値＝３８．４６
自由度＝３
ｐ値＝２．２６１×１０−８
【０１０９】
−ＳＮＰ２の劣性遺伝と、ＣＮＶ（グループＣ及びＤ）との組合せによるＡＭＤ易罹患性判定−
ＡＭＤ罹患者群及び対照者群と、ＳＮＰ２の劣性遺伝１及び２、並びに実施例１におけるグループＣ及びＤとを用いた８グループ間でカイ二乗検定による加齢黄斑変性症の罹患の難易の相関解析を行った。また、オッズ比及びｐ値による有意差検定を行った。結果を表１２に示す。なお、オッズ比は、最もリスクが低い群（表１２において劣性遺伝子２かつＣＮ値０、１、２の群）を１とする。
【０１１０】
【表１２】
2011135838.tif 000014
カイ二乗値＝１９．１３９
自由度＝３
ｐ値＝２．５５９×１０−４
【０１１１】
−ＳＮＰ３の劣性遺伝と、ＣＮＶ（グループＣ及びＤ）との組合せによるＡＭＤ易罹患性判定−
ＡＭＤ罹患者群及び対照者群と、ＳＮＰ３の劣性遺伝１及び２、並びに実施例１におけるグループＣ及びＤとを用いた８グループ間でカイ二乗検定による加齢黄斑変性症の罹患の難易の相関解析を行った。また、オッズ比及びｐ値による有意差検定を行った。結果を表１３に示す。なお、オッズ比は、最もリスクが低い群（表１３において劣性遺伝子１かつＣＮ値０、１、２の群）を１とする。
【０１１２】
【表１３】
2011135838.tif 000015
カイ二乗値＝３４．６７
自由度＝３
ｐ値＝１．４３３×１０−７
【０１１３】
ＣＮＶの組合せのみで判定した場合と比較した実施例１と比較して、ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３の遺伝子型と、ＣＮＶとの組合せにより判定した実施例２及び３では、ＡＭＤ罹患性の難易を更に高い確率で判定することが可能であった。また、ＳＮＰとＣＮＶとの組合せは、ＳＮＰの劣性遺伝と、ＣＮＶのグループＣ及びＤとを組み合わせることが好ましいことがわかった。
【０１１４】
（比較例１）
実施例２におけるＳＮＰ１、ＳＮＰ２、及びＳＮＰ３について、各ＳＮＰ単独でＦｉｓｈｅｒ正確検定による加齢黄斑変性症の罹患の難易の相関解析を行った。また、オッズ比及びｐ値による有意差検定を行った。結果を表１４に示す。表１４において、ＳＮＰ１及びＳＮＰ３については、各群における劣性遺伝２（リスクアレルがホモ接合型）のパーセントを示す。ＳＮＰ２については、各群における劣性遺伝１（リスクアレルがホモ接合型およびヘテロ接合型）のパーセントを示す。
【０１１５】
【表１４】
2011135838.tif 000016
【０１１６】
表１４より、ＳＮＰ単独では、ＡＭＤ罹患性の難易の判定確率は、実施例１及び２と比較して低いものであった。
【０１１７】
これらの結果より、従来の一遺伝子の変異や、連鎖不平衡に基づくＳＮＰマーカーに着目した技術と比較して本願発明のＤＮＡコピー数多型による加齢黄斑変性症易罹患性の判定は、精度及び確立が高く、疾患の診断に優れていると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーは、著しい視力低下をきたす加齢黄斑変性症の発症及び進行を予測可能であるため、加齢黄斑変性症判定用に用いられる、ＤＮＡアレイ、塩基配列解析、ＰＣＲ法又はＰＣＲ法によらない迅速ＤＮＡ増幅法（インベーダーアッセイ）などに好適に利用可能である。
また、本発明の加齢黄斑変性症易罹患性判定方法及び加齢黄斑変性症易罹患性判定キットは、加齢黄斑変性症の発症及び進行を予測可能であり、これにより発症の危険度が高い人に関しては、より頻回に眼科検査を受けることにより加齢黄斑変性症の早期予防が可能となり、加齢黄斑変性症を既に発症した患者に対しては、最適な薬剤治療法の選択に好適に利用可能である。これにより、高齢者の視機能の維持とＱＯＬ向上、ひいては高齢者の医療費の削減も期待され、社会全体にも利益還元が期待される。
【図１】
2011135838.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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