(57)【要約】      （修正有）【課題】熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンドを提供する。【解決手段】Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合する能力を有するＤＮＡリガンド、並びにこうしたリガンドを得る方法。リガンドは、あらかじめ決定されたいかなる温度でも、ポリメラーゼを阻害することが可能である。ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドの温度依存性結合は、その望ましい特性が、いかなる数でもよい反応条件、例えばｐＨおよび塩濃度に基づき、スイッチオンまたはオフすることが可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定する方法であって：
ａ）核酸候補混合物を調製し；
ｂ）あらかじめ決定された温度で、前記ポリメラーゼと核酸候補混合物を接触させ、ここで、その温度で、候補混合物に比較し、前記ポリメラーゼに増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；
ｃ）増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配し；そして
ｄ）増加した親和性を有する核酸を増幅し、前記ポリメラーゼに対する結合に関し、相対的により高い親和性および特異性を持つ核酸配列が濃縮された核酸混合物を生じ、ここで前記にて同定された前記ポリメラーゼの核酸リガンドの塩基配列が以下からなる群から選択されるものである：
（ｉ）配列番号８９−９５、１１３−１１４、および１１６−１１８の内の一つ；および
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列番号の一つと８０％を超える一次配列相同性を有する配列
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、さらに：
ｅ）工程ｂ）、ｃ）、およびｄ）を反復する
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＴＺ０５ポリメラーゼである、前記方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、前記核酸候補混合物が一本鎖核酸で構成される、前記方法。
【請求項５】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定された高親和性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ核酸リガンドの有効量を、ＤＮＡ重合反応に添加することを含む、前記方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼがＴＺ０５ポリメラーゼである、前記方法。
【請求項７】
以下からなる群から選択される精製されそして単離された、非天然発生核酸：
（ｉ）配列番号８９−９５、１１３−１１４、および１１６−１１８の内の一つ；および
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列番号の一つと８０％を超える一次配列相同性を有する配列の核酸であって、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する核酸；および  
（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）の配列に相補的な核酸配列を有する配列。
【請求項８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法であって：
ａ）増幅しようとする核酸配列を含む試料を、増幅しようとする配列に隣接する配列と相補的なプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および該ポリメラーゼを５５℃で阻害することが可能であり、それにもかかわらず５５℃より高い温度でポリメラーゼが活性化されることを可能にする核酸リガンドと混合し；そして
ｂ）標的核酸を融解し、標的核酸にプライマーをアニーリングさせ、そして標的核酸を合成する標準的ＰＣＲ工程を、混合物の熱反復により行う、
ここで、前記核酸リガンドの塩基配列は以下からなる群から選択されるものである：
（ｉ）配列番号８９−９５、１１３−１１４、および１１６−１１８の内の一つ；および
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列番号の一つと８０％を超える一次配列相同性を有する配列
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
請求項８の方法であって、前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＴＺ０５ポリメラーゼである、前記方法。
【請求項１０】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定された、前記ＤＮＡポリメラーゼを阻害する核酸リガンドを、前記リガンドが重合を阻害する温度またはそれ以下の温度で維持されている、ＤＮＡ重合反応に添加することを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼがＴＺ０５ポリメラーゼである、前記方法。
【請求項１２】
核酸スイッチを同定する方法であって：
ａ）核酸候補混合物を調製し；
ｂ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと核酸候補混合物を接触させ、ここで、候補混合物に比較し、前記ポリメラーゼに増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；
ｃ）増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物状態から分配し、それにより増加した親和性を有する核酸を、環境パラメーターの変動に際し、前記ポリメラーゼへの親和性を欠くことに基づき、さらに分配し；そして
ｄ）増加した親和性を有する核酸を増幅し、ポリメラーゼに対する結合に関し、相対的により高い親和性および特異性を持つ核酸配列が濃縮された核酸混合物を生じ、ここで前記にて同定された核酸の塩基配列が以下からなる群から選択されるものである：
（ｉ）配列番号８９−９５、１１３−１１４、および１１６−１１８の内の一つ；および
（ｉｉ）前記（ｉ）の配列番号の一つと８０％を超える一次配列相同性を有する配列
ことを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼがＴＺ０５ポリメラーゼである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本明細書に記載されるのは、ＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対する高親和性核酸リガンドを同定し、そして調製する方法である。好ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカスから単離された熱安定性ポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼ；サーマス・サーモフィラスから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｔｈポリメラーゼ；または別のサーマス種から単離されたＴＺ０５ポリメラーゼである。しかし、本発明の方法は、いかなる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの同定および調製に拡張してもよい。これらの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのいくつかはまた、ＲＮＡをコピーＤＮＡに逆転写する能力も有する。逆転写能を持つＤＮＡポリメラーゼの例には、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼが含まれる。こうした核酸リガンドを同定するのに、本明細書において利用される方法はＳＥＬＥＸと称され、これは、指数的濃縮によるリガンドの計画的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の頭字語である。本明細書にやはり記載されるのは、本発明の核酸リガンドを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行う改善法である。本明細書に特に開示されるのは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、およびＴＺ０５ポリメラーゼに対する高親和性核酸リガンドである。本発明は、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、およびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、それによりあらかじめ決定された温度範囲でポリメラーゼ活性を阻害する、高親和性ＤＮＡリガンドを含む。本発明にさらに含まれるのは、核酸スイッチである。本発明のＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドの温度依存性結合は、その望ましい特性が、いかなる数でもよい反応条件、例えばｐＨおよび塩濃度に基づき、スイッチオンまたはオフすることが可能であるリガンドの例である。
【０００２】
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、近年開発された技術であり、科学の多くの領域に重大な影響を有してきた。ＰＣＲは、指数的方式で標的ＤＮＡ配列を特異的に増幅する、迅速でそして単純な方法である（Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０；  ＭｕｌｌｉｓおよびＦａｌｏｏｎａ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５５：３３５）。簡潔には、該方法は、標的配列に隣接するＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプライマーセットを合成することからなる。その後、プライマーを、標的ＤＮＡ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびすべての４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ）の溶液と混合する。その後、ＤＮＡの相補鎖を分離するのに十分な温度（およそ９５℃）に溶液を加熱し、そしてその後、プライマーが隣接配列に結合するのを可能にするのに十分な温度に冷却する。その後、反応混合物を再び（およそ７２℃に）加熱し、ＤＮＡ合成が進行するのを可能にする。短期間の後、反応混合物の温度を再び、新規に形成された二本鎖ＤＮＡを分離するのに十分な温度に上昇させ、こうしてＰＣＲの第一の周期を完了する。その後、反応混合物を冷却し、そして周期を反復する。このように、ＰＣＲはＤＮＡ融解、アニーリングおよび合成の反復周期からなる。２０の複製周期により、標的ＤＮＡ配列の百万倍までの増幅を達成することが可能である。単一のＤＮＡ分子をＰＣＲにより増幅する能力は、環境および食物微生物学（Ｗｅｒｎａｒｓら（１９９１）Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５７：１９１４−１９１９；  ＨｉｌｌおよびＫｅａｓｌｅｒ（１９９１）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １２：６７−７５）、臨床微生物学（Ｗａｇｅｓら（１９９１）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３３：５８−６３；  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏら（１９９１）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ５：２２９−２４０；  Ｌａｕｒｅら（１９８８）Ｌａｎｃｅｔ  ２：５３８）、腫瘍学（ＫｕｍａｒおよびＢａｒｂａｃｉｄ（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３：６４７−６５１；  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６−６１；  Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：４８６９）、遺伝的疾患予後（Ｈａｎｄｙｓｉｄｅら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：７６８−７７０）、血液バンキング（Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９０）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３０：５１−５７）および法医学（ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ）（Ｈｉｇｕｃｈｉら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）  ３３２：５４３）に適用を有する。
【０００３】
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの入手可能性は、ＰＣＲを単純化しそしてまた改善してきている。元来、ＰＣＲで使用するのに、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼなどの熱感受性ポリメラーゼのみが利用可能であった。しかし、熱感受性ポリメラーゼは二本鎖ＤＮＡを融解するのに必要な温度で破壊され、そして各ＰＣＲ周期後に、さらなるポリメラーゼを添加しなければならない。好熱性細菌、サーマス・アクアティカスから単離されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、９５℃まで安定であり、そしてＰＣＲで使用すると、各熱周期後、温度感受性ポリメラーゼを繰り返し添加する必要性が除かれた。さらに、Ｔａｑポリメラーゼはより高い温度で用いることが可能であるため、ＰＣＲの特異性および感受性が改善された。特異性が改善された理由は、より高い温度で、望ましいもの以外の部位に対するプライマーの結合（ミスプライミングと称される）が有意に減少するためである。
【０００４】
その発見以来、ポリメラーゼ連鎖反応は、多様な適用のため修飾されてきており、例えば、伝統的なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの検出限界を単一コピーレベルにまで押し上げたｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ（Ｈａａｓｅら（１９９０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：４９７１−４９７５）、およびＰＣＲにより増幅される前に、逆転写酵素（ＲＴ）によりＲＮＡ配列をコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、ＲＮＡをＰＣＲの基質とする、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９１）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ，  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓら監修，中，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州サンディエゴ，  ２１−２７）がある。しかし、中温性ウイルス逆転写酵素は、ＲＮＡ分子の安定な二次構造を「読みぬく（ｒｅａｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）」ことが不可能であるため、全長ｃＤＮＡ分子を合成することがしばしば不可能である。この限界は、最近、サーマス・サーモフィラスから単離されたポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）の使用により克服された。Ｔｔｈポリメラーゼは、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼの両方として機能することが可能な熱安定性ポリメラーゼである（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１−７６６６）。Ｔｔｈポリメラーゼを用い、上昇した温度で逆転写を行うと、テンプレートＲＮＡの二次構造が除かれ、全長ｃＤＮＡ合成が可能になる。
【０００５】
ＰＣＲ技術にはかなりの進歩があったが、副反応、例えばバックグラウンドＤＮＡのミスプライミングによる、非標的オリゴヌクレオチド増幅および／またはプライマーオリゴマー化は、やはり重大な問題を呈する。これは、バックグラウンドＤＮＡを含むが、標的ＤＮＡが単一コピーで存在する可能性がある環境で、ＰＣＲを行う、診断適用に特に当てはまる（Ｃｈｏｕら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２０：１７１７−１７２３）。非特異的増幅産物の生成は、非特異的にアニーリングしたプライマーを伸長する、周囲温度でのポリメラーゼ活性に起因すると考えられてきている（Ｃｈｏｕら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２０：１７１７−１７２３；  Ｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：４５８０）。したがって、周囲温度でのポリメラーゼ活性の阻害は、非特異的産物の生成を調節するのに重要である。
【０００６】
これらの副反応を最小限にする、２つの方法が報告されてきている。「手動ホットスタート（ｍａｎｕａｌ  ｈｏｔ  ｓｔａｒｔ）」ＰＣＲと称される、第一の方法では、混合物温度が、非特異的プライマーアニーリングを防ぐのに十分に高くなるまで、反応混合物にポリメラーゼ活性に必須の構成要素（例えば二価イオンおよび／またはポリメラーゼ自体）を添加しない（Ｃｈｏｕら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２０：１７１７−１７２３；  Ｄ’Ａｑｕｉｌａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：３７４９）。したがって、最後の試薬、通常はポリメラーゼを添加する前に、試薬すべてを７２℃に加熱する。ワックス仲介「ホットスタート」ＰＣＲでは、ポリメラーゼ活性に必須の構成要素を、第一の周期での加熱に際し融解するワックス層により、低温では残りの反応混合物から物理的に分離する（Ｃｈｏｕら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：１７１７；  Ｈｏｒｔｏｎら（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：４２）。「ホットスタート」ＰＣＲは特定の欠点を有する；熱反復を開始する前に、試験管を再度開く必要があり、これは交差混入を増加させ、そしてピペッティングの反復は、多くの試料を扱うのを冗長にする。すべての他の反応構成要素と共に直接反応混合物中に入れることが可能であり、そして周囲温度でポリメラーゼを阻害する試薬は、「ホットスタート」ＰＣＲに関連する限界を克服するのに有用であろう。本方法は特異性を増加させ、それにより副産物を減少させるが、該方法は、多くの試料を扱うのに不便であり、反応混合物はより容易に汚染され、そして該方法を誤りがちにする。
【０００７】
「ｉｎ  ｓｉｔｕホットスタート」と称される、第二の方法では、低温でポリメラーゼに結合しそして阻害するが高温ではしない試薬（例えば、Ｔａｑポリメラーゼの中和抗体（ＴａｑＳｔａｒｔ）またはオリゴヌクレオチドアプタマー）を完全反応混合物に添加する（Ｂｉｒｃｈら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：４４５；  ＤａｎｇおよびＪａｙａｓｅｎａ（１９９６）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６４：２６８；  Ｋｅｌｌｏｇｇら（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：１１３４−１１３７）。本抗体は、周囲温度でポリメラーゼ活性を阻害するが、反応が熱反復されると熱変性により不活性化され、ポリメラーゼを活性にする。副産物を減少させる本アプローチの欠点は、抗Ｔａｑ抗体を使用まで−２０℃で保管しなければならないことである。これは検出キットを調節された環境下でパッケージングし、そして輸送しなければならず、費用が加算されることを意味する。さらに、１回のＰＣＲに、売主が特定する緩衝液で希釈された、かなりの量の抗体（〜１μｇの抗体／５  ＵのＴａｑポリメラーゼ）を必要とする。
【０００８】
熱安定性ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを阻害することが可能な高親和性核酸リガンドの開発は、「ホットスタート」法の必要性を除き、そして第二の方法に関連する限界を克服するであろう。非常に特異的で、そして高親和性を有する核酸阻害剤を開発することが可能である。核酸は周囲温度でタンパク質より安定であるため、抗体を用いることに関連する輸送およびパッケージングの問題を克服することが可能である。さらに、核酸は、抗体同様、より高い温度でポリメラーゼに対する親和性を失い、望ましいときにポリメラーゼが活性化されることを可能にすると確認することが可能である。ＰＣＲにおいて、核酸に基づく阻害剤が、それ自体、（反応に用いられる特異的プライマーに加え）プライマーとして機能することにより仲介されるミスプライミングの可能性は、その３’末端をキャップ化することにより、除去することが可能である。
【０００９】
いくつかのＤＮＡポリメラーゼのＸ線結晶構造により、これらが類似の三次元構造にフォールディングしていることが示されてきている（概説には、ＪｏｙｃｅおよびＳｔｅｉｚ（１９９４）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６３：７７７を参照されたい）。重合に責任があるＣ末端ドメインは、解剖学的に右手と類似の「手のひら（ｐａｌｍ）」、「手指（ｆｉｎｇｅｒ）」および「親指（ｔｈｕｍｂ）」の３つのサブドメインに組織される。ＴｔｈポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼは、アミノ酸配列レベルで９３％類似であり、そして８８％同一である（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）中）。どちらも３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）中；  ＴｉｎｄａｌｌおよびＫｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：６００８）。したがって、核酸リガンド阻害剤は、これらの酵素両方と共に、他の熱安定性ポリメラーゼに類似の振る舞いをすると期待される。これにより、いくつかの熱安定性酵素に単一の阻害剤を用いることが可能になるであろう。
【００１０】
ＲＮＡ配列は、ＰＣＲにより増幅される前に、逆転写によりｃＤＮＡに変換される。最初は、これは、２つの異なる酵素：逆転写酵素および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いた２つの工程で達成された。最近の研究により、特定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを逆転写する能力を有し、ＲＮＡ単位複製物を増幅するのに単一の酵素の使用が可能になることが示されてきている（ＭｙｅｒｓおよびＧｅｌｆａｎｄ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１−７６６６）。ＲＮＡは二価イオンの存在下で、高温で不安定であるため、逆転写はＤＮＡ合成より低い温度（５０−６０℃）で行う。したがって、ポリメラーゼの周囲活性を阻害するのに用いられる試薬が、より低い温度でポリメラーゼを再活性化するような試薬を有することが望ましいであろう。この必要性は、ＲＮＡに基づく増幅において、ｉｎ  ｓｉｔｕホットスタート条件を生成する、不活性化のために高温（７０−９０℃）を要求する、抗体の使用を排除する。
【００１１】
ＳＥＬＥＸTM
標的分子に対し非常に特異的な結合を持つ、核酸分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化のための方法が開発されてきている。本方法は、指数的濃縮によるリガンドの計画的進化、ＳＥＬＥＸTMと称され、現在放棄されている、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９１年６月１０日に提出された“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／７１４，１３１号、現米国特許第５，４７５，０９６号、および１９９２年８月１７日に提出された“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／９３１，４７３号、現米国特許第５，２７０，１６３号（１９９１年１２月２６日に刊行されたＷＯ  ９１／１９８１３も参照されたい）に記載され、これらの各々は、特に本明細書に援用される。これらの出願の各々は、本明細書において、集合的にＳＥＬＥＸ特許出願と称され、いかなる望ましい標的分子に対しても核酸リガンドを作成するための根本的に新規な方法を記載する。
【００１２】
ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、並びに同じ一般的選択計画を用いた、結合、分配および増幅の段階的反復を伴い、実質的にいかなる望ましい規準の結合親和性および選択性も達成する。ＳＥＬＥＸ法は、好ましくはランダム配列セグメントを含む核酸混合物から出発し、結合に好ましい条件下で標的と混合物を接触させ、標的分子に特異的に結合している核酸から非結合核酸を分配し、核酸−標的複合体を解離させ、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅し、核酸のリガンド濃縮混合物を生じ、その後、結合、分配、解離および増幅を、望ましいだけ再反復し、標的分子に対する非常に特異的な高親和性核酸リガンドを生じる工程を含む。
【００１３】
いくつかの特定の目的を達成するように、基本的なＳＥＬＥＸ法が修飾されてきている。例えば、１９９２年１０月１４日に提出され、現在放棄されている、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｄｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”と題される米国特許出願第０７／９６０，０９３号（１９９４年２月２２日に提出された“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｄｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”と題される米国特許出願第０８／１９８，６７０号、現米国特許第５，７０７，７９６号を参照されたい）は、特定の構造特性を持つ核酸分子、例えば折れ曲がりＤＮＡを選択するための、ゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ法の使用を記載する。１９９３年９月１７日に提出され、現在放棄されている、“Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０８／１２３，９３５号（１９９６年３月８日に提出された“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／６１２，８９５号、現米国特許第５，７３６，１７７号）は、標的分子に結合しおよび／または光架橋しおよび／または該分子を光不活性化することが可能な光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸに基づく方法を記載する。１９９５年５月１８日に提出された“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｆｆｅｉｎｅ”と題される、米国特許出願第０８／４４３，９５７号、現米国特許第５，５８０，７３７号を支持し、放棄された、１９９３年１０月７日に提出された“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｃａｆｆｅｉｎｅ”と題される、米国特許出願第０８／１３４，０２８号は、非常に近縁の分子の間を区別することが可能な非常に特異的な核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と称される方法を記載する。１９９５年６月５日に提出された“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ”と題される、米国特許出願第０８／４６１，０６９号、現米国特許第５，５６７，５８８号を支持し、放棄された、１９９３年１０月２５日に提出された“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ”と題される、米国特許出願第０８／１４３，５６４号は、標的分子に高い親和性を有するオリゴヌクレオチドおよび低い親和性を有するものの間の非常に効率的な分配を達成する、ＳＥＬＥＸに基づく方法を記���する。１９９２年１０月２１日に提出された、“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ＨＩＶ−ＲＴ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ”と題される、米国特許出願第０７／９６４，６２４号、現米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸが行われた後に、改善された核酸リガンドを得るための方法を記載する。１９９５年３月８日に提出された、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ”と題される、米国特許出願第０８／４００，４４０号、現米国特許第５，７０５，３３７号は、標的にリガンドを共有結合する方法を記載する。
【００１４】
ＳＥＬＥＸ法は、リガンドに改善された特性、例えば改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性または改善された搬送特性を与える修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を含む。こうした修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基位での化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含む、ＳＥＬＥＸ法で同定された核酸リガンドは、１９９５年４月２７日に提出された、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題される、米国特許出願第０８／４３０，７０９号、現米国特許第５，６６０，９８５号を支持し、放棄された、１９９３年９月８日に提出された“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題される、米国特許出願第０８／１１７，９９１号に記載され、該出願は、ピリミジンの５−および２’−位で化学的に修飾されているヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する。上記の米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾されている１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む、非常に特異的な核酸リガンドを記載する。１９９４年６月２２日に提出された、現在放棄されている、“Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｎｏｗｎ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０８／２６４，０２９号は、多様な２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。
【００１５】
１９９４年８月２日に提出された“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２８４，０６３号、現米国特許第５，６３７，４５９号および１９９４年４月２８日に提出された“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｂｌｅｎｄｅｄ  ＳＥＬＥＸ”と題される米国特許出願第０８／２３４，９９７号、現米国特許第５，６８３，８６７号にそれぞれ記載されるように、ＳＥＬＥＸ法は、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド官能単位と組み合わせることを含む。これらの出願により、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状および他の特性のアレイ、並びに効率的な増幅および複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。基本的ＳＥＬＥＸ法の修飾を記載する上述の特許出願の各々は、特に、完全に本明細書に援用される。
【００１６】
発明の簡単な概要
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定しそして産生する方法を含む。特に含まれるのは、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼを含む、ポリメラーゼ連鎖反応に有用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定する方法、並びにこうして同定されそして産生された核酸リガンドである。より詳細には、それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに特異的に結合することが可能であり、それにより、それらがＤＮＡ合成を触媒する能力を阻害するＤＮＡ配列が提供される。本発明の方法を用い、使用者により定義される条件下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸リガンドを選択し、そしてしたがって、あらかじめ選択された温度／またはそれに近い温度で、ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するリガンドを選択する機会が提供される。周囲温度で、ＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するＤＮＡ配列、並びに５５℃近傍で、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するＤＮＡ配列が提供される。本発明の方法は、あらかじめ決定されたいかなる温度までの、いかなる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドを同定しそして産生すること、およびこうして同定されそして産生されたリガンドにも拡張することが可能である。
【００１７】
本発明にさらに含まれるのは、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列を同定する方法であって、（ａ）核酸候補混合物を調製し、（ｂ）あらかじめ決定された温度で、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する親和性に基づき、前記候補混合物のメンバー間で分配し、そして（ｃ）選択された分子を増幅し、それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する結合に関し比較的高い親和性の核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る、工程を含む、前記方法である。
【００１８】
本発明にさらに含まれるのは、周囲温度で熱安定性ポリメラーゼを阻害するが、上昇した温度で該ポリメラーゼから解離する核酸リガンドを含む工程を含む、ポリメラーゼ連鎖反応を実行する改善法である。こうした核酸リガンドは、本発明の方法にしたがって同定される。
【００１９】
より具体的には、本発明は、上述の方法にしたがって同定された、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するｓｓＤＮＡリガンドを含み、表２−３、１０および１１（配列番号７−７４および７６−７７）並びに表４−６および図３３（配列番号７８−１１５）を含む。やはり含まれるのは、いかなるものでもよい既定のリガンドに実質的に相同であり、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼの活性を阻害する、実質的に同一の能力を有する、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドである。本発明にさらに含まれるのは、本明細書に提示されるリガンドと実質的に同一の構造型を有し、そしてＴａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼの活性を阻害する、実質的に同一の能力を有する、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドである。
【００２０】
本発明はまた、本明細書に同定されるＤＮＡリガンドに基づく修飾ヌクレオチド配列および該配列の混合物も含む。
本発明の核酸リガンドは、反応混合物の温度に応じ、ポリメラーゼ連鎖反応を「オン」または「オフ」にする「スイッチ」として機能することが可能である。したがって、本発明はまた、スイッチとして機能する核酸リガンド配列を同定しそして調製する方法であって、（ａ）核酸候補混合物を調製し、（ｂ）Ｔａｑ、ＴｔｈまたはＴＺ０５ポリメラーゼに対する親和性に基づき、前記候補混合物のメンバー間で分配し、そして（ｃ）標的分子を用い、選択された分子を増幅し、増幅温度以下の温度でのみ、それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する結合に関し比較的高い親和性の核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る、工程を含む、前記方法も含む。
【００２１】
本発明は、したがって、核酸スイッチを同定する方法を含む。核酸スイッチは、ＳＥＬＥＸ法により同定される核酸であり、ここで該核酸の望ましい特性は、いくつかの環境パラメーターの操作に応じ、「スイッチ」オンまたはオフすることが可能である。核酸スイッチは、ＳＥＬＥＸ分配工程を操作し、反応媒体パラメーター中の改変に基づき、反対の結果――しばしば標的に対する結合――を生じる核酸を選択することにより、同定することが可能である。この場合の例は、温度に基づき、オンおよびオフされる核酸スイッチを示すが、本発明の方法を拡張し、限定されるわけではないが、ｐＨ、特定のイオン、すなわちＭｇ++の濃度を含む、温度以外の条件に基づくスイッチとして機能する核酸リガンドを同定しそして調製してもよい。
【００２２】
発明の詳細な説明
本出願は、ＤＮＡポリメラーゼに対する核酸リガンドの単離を記載する。具体的には、本出願は、ポリメラーゼ連鎖反応に有用な熱安定性ポリメラーゼに対する核酸リガンドの単離を記載する。好ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ、ＴｔｈまたはＴＺ０５ポリメラーゼより選択されるが、本発明の方法は、いかなる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに対する高親和性核酸リガンドの同定および調製に拡張してもよい。核酸リガンドは、ＳＥＬＥＸとして知られる方法を通じ、同定される。ＳＥＬＥＸは、現在放棄されている、“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ”と題される米国特許出願第０７／５３６，４２８号、１９９１年６月１０日に提出された“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／７１４，１３１号、現米国特許第５，４７５，０９６号、および１９９２年８月１７日に提出された“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ”と題される米国特許出願第０７／９３１，４７３号、現米国特許第５，２７０，１６３号（１９９１年１２月２６日に刊行されたＷＯ  ９１／１９８１３も参照されたい）に記載される。これらの出願は各々、特に本明細書に援用され、集合的にＳＥＬＥＸ特許出願と称される。
【００２３】
最も基本的な形で、ＳＥＬＥＸ法は、以下の一連の工程により定義することが可能である：
１）異なる配列の核酸候補混合物を調製する。候補混合物は、一般的に、固定配列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一部位に同一配列を含む）およびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は：ａ）以下に記載される増幅工程を補助するよう、ｂ）標的に結合する既知の配列を模倣するよう、またはｃ）候補混合物中の既定の構造配置の核酸の濃度を亢進するよう、選択される。ランダム配列は、完全にランダム（すなわちいかなる位でも塩基が４つのうち１つであることを見出すことが可能）でも、または部分的にのみランダム（例えば、塩基を見出す可能性が、いかなる部位でも０および１００パーセントの間のいずれでもよいレベルで選択することが可能）でもよい。
２）候補混合物を、標的および候補混合物のメンバーの間の結合に好ましい条件下で、選択された標的と接触させる。これらの状況下では、標的および候補混合物核酸の間の相互作用は、標的および標的に対し最も強い親和性を有する核酸の間の核酸−標的対を形成するとみなすことが可能である。
３）標的に対し最も高い親和性を持つ核酸を、標的に対しより少ない親和性の核酸から分配する。最も高い親和性の核酸に相当する配列は、候補混合物中に非常に少数のみ（そしておそらくわずか１つの核酸分子が）存在するため、一般的に、候補混合物中の核酸のかなりの量（およそ５−５０％）が分配中に保持されるように、分配規準を設定することが望ましい。
４）その後、分配中、標的に対し相対的に高い親和性を有すると選択された核酸を増幅し、標的に対し相対的に高い親和性を有する核酸が濃縮された、新規候補混合物を生成する。
５）上記の分配および増幅工程を反復することにより、新たに形成される候補混合物は、より少ない特有配列を含み、そして標的に対する核酸親和性の平均的度合いは、一般的に増加するであろう。極端な場合、ＳＥＬＥＸ法は、標的分子に対し最も高い親和性を有する、元来の候補混合物由来の核酸に相当する、１つまたは少数のユニークな核酸を含む、候補混合物を生じるであろう。
【００２４】
ＳＥＬＥＸ特許出願は、本方法を非常に詳細に記載し、そして詳述する。含まれるのは、本方法に用いることが可能な標的；候補混合物中の核酸を分配する方法；および分配された核酸を増幅し、濃縮候補混合物を生成する方法である。ＳＥＬＥＸ特許出願はまた、タンパク質が核酸結合タンパク質であるまたはない、タンパク質標的を含む、いくつかの標的種に対して得られるリガンドも記載する。
【００２５】
ＳＥＬＥＸ法は、標的分子の高親和性リガンドを提供する。これは核酸研究の分野で前例のないまれにみる達成に相当する。本発明は、ＳＥＬＥＸ法をＤＮＡポリメラーゼ、特にＴａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼの核酸阻害剤という特定の標的に適用する。以下の実施例項では、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸阻害剤を単離しそして同定するのに用いた実験パラメーターが記載される。
【００２６】
１９９２年１０月２１日に提出された、同時係属であり、そして本発明の譲受人に譲渡された米国特許出願第０７／９６４，６２４号、現米国特許第５，４９６，９３８号（’９３８特許）では、ＳＥＬＥＸを行った後、改善された核酸リガンドを得る方法が記載される。“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ＨＩＶ−ＲＴ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ”と題される’９３８特許は、特に本明細書に援用される。
【００２７】
本明細書において、本発明を記載するのに用いられる特定の用語は、以下のように定義される：
本明細書において、「核酸リガンド」は、標的に対し望ましい作用を有する、非天然発生核酸である。望ましい作用には、限定されるわけではないが、標的の結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を修飾する／改変する方式での標的との反応、自殺阻害剤におけるような、標的への共有結合、標的および別の分子の間の反応の促進が含まれる。好ましい態様において、作用は、標的分子への特異的結合親和性を有し、こうした標的分子は、主にワトソン／クリック塩基対形成または三重らせん結合に依存する機構を通じ、核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここで核酸リガンドは、標的分子に結合される既知の生理学的機能を有する核酸ではない。既定の標的のリガンドである核酸リガンドには、核酸候補混合物より：ａ）候補混合物を標的と接触させ、ここで候補混合物に比較し、標的に増加した親和性を有する核酸を残りの候補混合物から分配することが可能である；ｂ）増加した親和性の核酸を残りの候補混合物から分配し；そしてｃ）増加した親和性の核酸を増幅し、リガンド濃縮核酸混合物を生じる、ことを含む方法により、同定される核酸が含まれる。
【００２８】
「候補混合物」は、そこから望ましいリガンドを選択しようとする、異なる配列の核酸の混合物である。候補混合物の供給源は、天然発生核酸またはその断片、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸または前述の技術の組み合わせにより作成された核酸由来であってもよい。好ましい態様において、各核酸は、増幅過程を促進する、ランダム領域を囲む固定配列を有する。
【００２９】
「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖または二本鎖、およびそのいかなる化学修飾物をも意味する。修飾には、限定されるわけではないが、核酸リガンド塩基または全体としての核酸リガンドに、さらなる電荷、極性、水素結合、静電相互作用、および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を取り込む他の化学基を提供するものが含まれる。こうした修飾には、限定されるわけではないが、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；骨格修飾、メチル化、異常塩基対の組み合わせ、例えばイソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジン、並びにそれらに匹敵するものが含まれる。修飾はまた、キャップ化などの３’および５’修飾も含んでもよい。
【００３０】
「ＳＥＬＥＸ」方法論は、望ましい方式で標的と相互作用する、例えばタンパク質に結合する、核酸リガンドの選択と、選択された核酸の増幅との組み合わせを伴う。選択／増幅工程の反復周期により、非常に多数の核酸を含むプールから、標的と最も強く相互作用する１つまたは少数の核酸の選択が可能になる。選択／増幅法の周期は、選択された目的が達成されるまで続ける。本発明において、ＳＥＬＥＸ方法論を使用し、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンドを得る。
【００３１】
ＳＥＬＥＸ方法論は、ＳＥＬＥＸ特許出願に記載される。
「標的」は、リガンドが望ましい、目的のいかなる化合物または分子も意味する。標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、染色剤、栄養物、増殖因子などであってもよく、制限はない。本出願では、標的はＤＮＡポリメラーゼである。好ましい態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼである。
【００３２】
本明細書において、「不安定リガンド」は、環境パラメーターの調整に基づき、標的に対する親和性が非常に減少する、ＳＥＬＥＸ法で同定された核酸リガンドである。好ましい態様において、環境パラメーターは温度であり、標的に対するリガンドの親和性は、上昇した温度で減少する。
【００３３】
本明細書において、「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ（逆転写酵素）をテンプレートして用い、ＤＮＡ鎖に対するデオキシリボヌクレオチド単位の添加により、ＤＮＡ合成を触媒するいかなる酵素も指す。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、４０℃以上の温度で成長する微生物から単離される。
【００３４】
「スイッチ」は、いくつかの特定の反応条件に応じ、反応を「オン」または「オフ」にするよう機能する、いかなる化合物も指す。本発明において、核酸リガンドは、反応温度に応じ、ＰＣＲを「オン」または「オフ」にするよう機能する。スイッチは、ｐＨ、イオン強度、あるいは特定のイオンの存在または非存在を含む他の反応条件に基づき、作動してもよい。核酸スイッチは、分配技術の適切な選択により、ＳＥＬＥＸ法を介し、同定される。望ましいスイッチ特性を有する核酸を選択するため、分配パラメーターを決定する。
【００３５】
本発明において、３０ランダム位（３０Ｎ）を含む縮重ライブラリーからＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに特異的な高親和性を持つ核酸リガンドを同定するため、ＳＥＬＥＸ実験を行った（実施例１）。本目的のため、ＲＮＡまたはＤＮＡリガンドを同定することが可能であるが、以下の実施例は、ＤＮＡリガンドの同定を記載する。本ＳＥＬＥＸ実験は、低温（室温）で、ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するが、高温（＞４０℃）でしないオリゴヌクレオチドを同定するよう設計した。これは、上昇した温度でＰＣＲにおいて、親和性選択分子を増幅する標的ポリメラーゼを用いて達成した。こうした条件下では、高温でＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを阻害するＤＮＡ配列は、選択中、増幅し、そして増加するとは期待されなかった。本発明は、実施例１に記載される方法により同定された、表２に示されるＴｔｈポリメラーゼに対する特異的ｓｓＤＮＡリガンド（配列番号７−３５）および表３に示されるＴａｑポリメラーゼに対するリガンド（配列番号３６−６６、７６、７７）並びに、表１０および１１に示される核酸リガンド（配列番号６７−７４）を含む。本発明はさらに、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの機能を阻害するＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドを含む。
【００３６】
本発明において、３０ランダム位（３０Ｎ）を含む縮重ライブラリーからＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに特異的な高親和性を持つ核酸リガンドを同定するため、高温ＳＥＬＥＸ実験もまた行った（実施例１）。本ＳＥＬＥＸ実験は、およそ５５℃で、ポリメラーゼに結合し、そして該ポリメラーゼを阻害するオリゴヌクレオチドを同定するよう設計した。本発明は、実施例１に記載される方法により同定された、表４および５に示されるＴａｑポリメラーゼに対する特異的ｓｓＤＮＡリガンド（配列番号７８−８８）並びに表６（配列番号８９−１０６）および図３（配列番号１０７−１１５）に示されるＴＺ０５ポリメラーゼに対するリガンドを含む。本発明はさらに、ＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼの機能を阻害するＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドを含む。
【００３７】
本発明に含まれるリガンドの範囲は、低温および高温親和性選択両方を用いたＳＥＬＥＸ法にしたがって同定される、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼの修飾および非修飾核酸リガンドすべてに拡張される。より具体的には、本発明は、表２−６、１０および１１並びに図３３に示されるリガンドに実質的に相同な核酸配列を含む。実質的に相同により、一次配列相同性の度合いが７０％を上回る、最も好ましくは８０％を上回ることを意味する。表２−６、１０および１１並びに図３３に示されるＴａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５のリガンドの配列相同性の再吟味により、ほとんどまたはまったく一次相同性を持たない配列が、それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合する、実質的に同じ能力を有する可能性があることが示される。Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合する、実質的に同じ能力は、親和性が、本明細書に記載されるリガンドの親和性と、数桁の範囲にあることを意味する。既定の配列――本明細書に特に記載されるものと実質的に相同なもの――が、それぞれ、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに結合する、実質的に同じ能力を有するかどうか決定するのは、十分に、一般の当業者の技術の範囲内である。
【００３８】
本発明はまた、上述のようなリガンドであって、前記リガンドが、限定されるわけではないが、ストッフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）断片、Ｔｂｒポリメラーゼ（サーマス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）より単離）、Ｔｆｌポリメラーゼ（サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）より単離）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（モロニーネズミ白血病ウイルスより単離）を含む、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの機能を阻害するものも含む。
【００３９】
本発明はまた、上述のようなリガンドであって、リガンドのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を増加させ、あるいは、リガンドの結合もしくは他の望ましい特性またはリガンドの搬送を亢進しまたは仲介するために、特定の化学的修飾が行われるものも含む。こうした修飾の例には、既定の核酸配列の糖および／またはリン酸および／または塩基位での化学的置換が含まれる。例えば、本明細書に特に援用される、米国特許出願第０８／４３０，７０９号、現米国特許第５，６６０，９８５号を支持し、放棄された、１９９３年９月８日に提出され、“Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題される、米国特許出願第０８／１１７，９９１号を参照されたい。他の修飾が一般の当業者に知られる。こうした修飾は、ＳＥＬＥＸ後に行ってもよい（先に同定された非修飾リガンドの修飾）し、またはＳＥＬＥＸ法への取り込みにより、行ってもよい。
【００４０】
本明細書に記載される、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンドは、ポリメラーゼ連鎖反応の試薬として有用である。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を行う改善法を含み、ここで増幅しようとする核酸配列を含む試料を、１）増幅しようとする配列に隣接する配列と相補的なプライマー、２）熱安定性ポリメラーゼ、および３）周囲温度でポリメラーゼを阻害することが可能な核酸リガンドと混合する。核酸リガンド阻害剤は、固体支持体上に固定してもよい。その後、混合物の熱反復により、ＰＣＲの通常の工程――融解、アニーリングおよび合成――にしたがう。核酸リガンドの存在は、反復前または反復中のより低い温度でのいかなる合成も妨げることにより、混合物がバックグラウンドＤＮＡを増幅することを妨げる。本発明はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、および周囲温度で前記ポリメラーゼを阻害するが、それにもかかわらずＰＣＲ法の上昇温度周期中の合成が起こることを可能にする核酸リガンドを含む、ＰＣＲキットも含む。本発明はまた、当業者に理解されるように、熱安定性ポリメラーゼに、周囲温度で前記ポリメラーゼを阻害するが、それにもかかわらずＰＣＲ法の上昇温度周期中の合成が起こることを可能にする核酸リガンドを添加する工程を含む、改善ＰＣＲ法も含む。
【００４１】
Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンド
実施例１は、室温でのＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方、並びに上昇温度でのＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンドの選択に用いる実験法を記載する。室温で、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行った選択１０周期から得たｓｓＤＮＡ配列を表２に示す。Ｔｔｈポリメラーゼ選択由来の２９の個々のクローンを配列決定した（表２には、可変３０ヌクレオチド領域のみを示す）。一次配列相同性に基づき、リガンドをファミリーに分類した。
【００４２】
室温で、Ｔａｑポリメラーゼを用いて行った選択１２周期から得たｓｓＤＮＡ配列を表３に示す。Ｔａｑポリメラーゼ選択由来の解析した４２の配列のうち、３３がユニークであった。大文字は、３０ヌクレオチドランダム領域を示し、これに５’−ｔｔｃｔｃｇｇｔｔｇｇｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｃ−および−ｔｃｔｔｇｔｇｔａｔｇａｔｔｃｇｃｔｔｔｔｃｃｃ−３’固定配列領域が隣接し、全長配列を形成する。いくつかの配列中の小文字は、５’固定配列を示す。同一配列を含むクローンの数は、括弧内に示した。配列類似性に基づき、配列を３つのファミリーに分類した。ファミリーＩおよびＩＩの保存配列モチーフを囲む。両ファミリーは、異なるコンセンサス配列を含み：ファミリーＩでは５’−Ａ/GＡ/GＴＧＴＧ/AＣＡＧＴＡＴ/GＣ−３’、ファミリーＩＩでは、５’−Ａ/GＣＧＴＴＴＴＧ−３’であった。ファミリーＩでは、コンセンサス配列の５’および３’領域は、互いに塩基対形成する能力を示した（表３下線）。さらに、これらの領域に観察される、共変動（ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、ステムループ構造の存在の可能性を示唆する。リガンドの大部分で、潜在的な塩基対形成領域は、コンセンサス領域を越え伸長する。対照的に、ファミリーＩＩリガンドは、明らかな二次構造モチーフを持たない。
【００４３】
ファミリーＩのクローン３０（ＴＱ３０（配列番号５０））およびファミリーＩＩのクローン２１（ＴＱ２１（配列番号５９））に関する、室温でのニトロセルロースフィルター結合により得られた代表的結合曲線を、図３に示す。両方の場合で、リガンドは２つのポリメラーゼに緊密な結合を示し、Ｋd値は低いピコモル範囲である：ＴＱ３０のＫd値は、それぞれ、Ｔａｑポリメラーゼに関し、４０±１  ｐＭ、そしてＴｔｈポリメラーゼに関し、２８±４  ｐＭであり、一方、ＴＱ２１では、それぞれＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼに関し、３６±４  ｐＭおよび１０±２  ｐＭである。２つのファミリーのさらにいくつかのリガンドをスクリーニングした。Ｋd値は、Ｔａｑポリメラーゼに関し、０．０４ないし９  ｎＭ、そしてＴｔｈポリメラーゼに関し、０．０１ないし０．３  ｎＭの範囲であった。
【００４４】
Ｔａｑポリメラーゼとの個々の配列の結合相互作用を、５５℃で、ニトロセルロースフィルター結合により、測定した。いくつかの代表的な結合曲線を図４Ａ−Ｅに示す。図４Ａ−Ｄは、ファミリーＩに属する４つの配列（表４および５を参照されたい）の結合曲線を示す。クローン６（配列番号７８）、２２（配列番号８１）および２８（配列番号８７）は、すべて、そのＫd値が低いピコモル範囲であったことにより特徴付けられるように、５５℃で、Ｔａｑポリメラーゼに対する高親和性結合を示す。しかし、ファミリーの他のもののなかに同定されるコンセンサス配列を含む、クローン１８（配列番号８３）は、高親和性を示さない。クローン１８は、ランダム領域が４ヌクレオチド短く、欠失ヌクレオチドが、ポリメラーゼとの相互作用に重要な役割を果たしているようであることが示唆される。クローン１９（配列番号８４）は、ファミリーＩＩに属し、そしてファミリーＩ配列に同定されたコンセンサス配列を持たない。にもかかわらず、該クローンは、大部分のファミリーＩ配列と類似の高親和性結合を示し（図４Ｅ）、ファミリーＩ配列に見出されたもの以外の、高親和性結合の別の配列の解決があることが示される。
【００４５】
図４Ａ−Ｅに示される結合解析を、５５℃で、Ｔｒｉｓ緩衝液中で行った。４０℃および５５℃で、ＴｒｉｓおよびＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液中で、クローン６、２２および２８の親和性を比較した（表７）。両緩衝液中で、すべての３つのクローンの結合親和性は、４０℃で、５５℃での場合より高かった。４０℃で、両緩衝液中で、非常によく似たＫd値が観察されたが、５５℃で、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中では、いくぶん減少した親和性が見られた。
【００４６】
実施例２に記載されるように、５５℃で、ニトロセルロースフィルター結合により、ＴＺ０５ポリメラーゼを用いた個々の配列の結合相互作用を測定した。図５Ａ−Ｄは、４つの異なる配列、クローン１（ＴＺ１（配列番号９４））、１３（ＴＺ１３（配列番号８９））、３６（ＴＺ３６（配列番号９９））および２（ＴＺ２（配列番号９６））（表６）の代表的な結合曲線を示す。個々のクローンのＫd値およびＩＴ50値を表８に要約する。ＩＴ50値は、実施例２に記載されるような、ヘアピン伸長アッセイを用いて得た。大部分のリガンドは、Ｋd値が低いピコモル範囲であることで特徴付けられるように、５５℃でＴＺ０５ポリメラーゼに対する高親和性結合を示す。ランダム領域に２６ヌクレオチド（期待されるより４ヌクレオチド短い）を持つＴＺ２配列は、５５℃で該ポリメラーゼと効率的に相互作用せず（図５Ｄおよび表８）、欠失ヌクレオチドが高親和性結合に必要であることが示唆された。
【００４７】
ポリメラーゼ阻害アッセイ
実施例２（図７−１０）は、低温親和性選択を用いて同定された、本発明のリガンドが、４０℃未満の温度で、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方の相互作用を阻害することが可能であることを立証する、いくつかのポリメラーゼ阻害アッセイを記載する。実施例２（図１１−１５）はまた、高温親和性選択を用いて同定された、本発明のリガンドが、およそ５５℃の温度で、ＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼ両方の相互作用を阻害することが可能であることを立証する、いくつかのポリメラーゼ阻害アッセイも記載する。実施例２では、設計ヘアピンＤＮＡ（ＤＮＡ−ＨＰ；  ５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＴ−３’（配列番号６；図６））をテンプレートとして用い、ＤＮＡ濃縮プールと共に、本発明の方法にしたがって同定された特定のリガンドが、多様な条件下で、ポリメラーゼ活性を阻害する能力を測定した。本アッセイは、折り返しＤＮＡヘアピン上の１５ヌクレオチドのテンプレート指示埋め込み合成を検出する。
【００４８】
低温でＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを認識するよう選択されたリガンド
図７Ａは、ＤＮＡリガンド濃縮プールを用い、異なるインキュベーション時間で、異なる温度で行った阻害アッセイの結果を示す。ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方の活性は、レーン３（室温反応）をレーン６−９（それぞれ５０、６０および７０℃での反応）と比較することにより、わかるように、一般的に、低温では低く、そして温度が増加するにつれ、増加する。濃縮プールは、室温で各ポリメラーゼの活性を阻害する（レーン４）が、５０℃−７０℃ではしない。レーン１０は、参考として放射標識プールの移動度を示し、ポリメラーゼのテンプレートとして作用することが可能な、プール中のＤＮＡ分子のありうる伸長を検出する。レーン６−９に標識プールに近くまたはそれ以上に移動する放射標識バンドがないことにより、ｓｓＤＮＡプールの重合がないことが示される。
【００４９】
熱安定性ポリメラーゼの活性は、周囲温度で低いため、アッセイ中のインキュベーション期間を１６時間に増加させた。図７Ｂおよび７Ｃは、選択プールおよびランダムプールの存在下での２つのポリメラーゼとテンプレートの１６時間インキュベーションの結果を示す。さらに、選択プールに仲介される阻害を、抗Ｔａｑ抗体（Ｔａｑｓｔａｒｔ）のものと比較した。図７Ｂのデータは、Ｔａｑポリメラーゼを用いて得、そして図７Ｃのデータは、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて得た。研究した３つの温度、室温、３０℃および３７℃に渡り、ランダムプールは、２つのポリメラーゼの阻害を示さず（レーン１−３を４−６と比較されたい）、濃縮プールにより引き起こされる阻害は、配列特異的であることが示唆された。Ｔａｑポリメラーゼに関し選択されたプールは、室温（レーン７）でのみ、１６時間インキュベーションに渡り、ポリメラーゼ活性を完全に阻害したが、３０℃およびそれ以上（レーン８および９）では阻害しなかった。Ｔｔｈポリメラーゼに関して選択されたプールは、Ｔａｑポリメラーゼに結合を示したが、Ｔａｑポリメラーゼを阻害することはできなかった（レーン１０−１２）。期待されるように、Ｔａｑｓｔａｒｔ抗体は、調べた３つの温度すべてでポリメラーゼ活性を阻害した（レーン１２−１５）。しかし、Ｔｔｈポリメラーゼに関し選択されたｓｓＤＮＡプールは、１６時間インキュベーションに渡り、酵素活性を阻害しなかった（レーン１−３を４−６と比較されたい）。対照的に、同一プールは、短期間のインキュベーションに渡り、酵素活性を阻害することが可能であった。Ｔａｑポリメラーゼに関し選択されたプールは、室温での１６時間インキュベーションに渡り、Ｔｔｈ活性を部分的に（＞５０％）阻害することが可能であった（レーン１０）。Ｔａｑｓｔａｒｔ抗体は、Ｔｔｈの活性にはいかなる影響も持たなかった（レーン１３−１５）。
【００５０】
Ｔａｑｓｔａｒｔ抗体の使用は、ＰＣＲ反応中１回に限定される。高温で変性されると、天然型に再生することはできない。しかし、単純な二次構造を持つ核酸リガンドは、熱周期を経た後、天然型に再生する可能性を有する。Ｔａｑポリメラーゼに関し選択されたＤＮＡプールの阻害能が、加熱後、回復するかどうか調べるため、実験を行った（図７Ｄおよび７Ｅ）。図７Ｄは、熱反復にさらされていない選択ＤＮＡプールによる、２０℃−４０℃のＴａｑ活性の阻害を示す。４５分間のインキュベーションに渡り、プールは、２０℃および２５℃で、Ｔａｑ活性を完全に阻害する。この比較的短いインキュベーション期間内では、プールは、３０℃で＞７０％の阻害を示した。テンプレートＤＮＡの非存在下で、Ｔａｑポリメラーゼを用いた２つのＰＣＲ周期にさらされたＤＮＡプールで、非常に類似の阻害プロフィールを見ることが可能である。この結果は、ｓｓＤＮＡに仲介される阻害は、可逆的に温度感受性であり、そしてＰＣＲの後であっても回復することが可能であることを立証する。
【００５１】
図８は、配列、ＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）（表３）が、ＴａｑおよびＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼに対し阻害性である温度範囲を示す。本図に示されるヘアピン伸長アッセイは、２５０  ｎＭの各リガンドを用い、１時間、示される温度で行った（レーン１−１０）。予期されるように、ｓｓＤＮＡリガンドは、＞４０℃の温度でどちらのＤＮＡポリメラーゼも阻害しなかった（図８Ａおよび８Ｂ）。リガンドＴＱ３０に関し、１時間アッセイ中に産物の５０％が生成される温度（ＩＴ50値）は、ＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼで、それぞれ４１℃および２９℃である。リガンドＴＱ２１に関するそれぞれの値は３７℃および２９℃である（図８Ｃおよび８Ｄ）。これらのポリメラーゼに対する２つのリガンドの結合親和性は、これらが高温で減少した阻害活性を持つのと一致して、より高い温度で減少する（データ未提示）。ヘアピン伸長アッセイでは、投入ヘアピンテンプレートのおよそ２％は、おそらく正しくないフォールディングのため、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長されなかった。
【００５２】
図９は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）によるＴａｑポリメラーゼの阻害は熱的に可逆的であり、そしてＰＣＲ後でさえ回復することが可能であることを例示する。本図に示されるヘアピン伸長アッセイは、リガンドＴＱ３０の非存在下（レーン１−５）および存在下（５０  ｎＭ）（レーン６−１０）で、５  ＵのＴａｑポリメラーゼを用い、１００μｌ反応体積中で、１０分間、示される温度で行った。図９Ａでは、リガンドＴＱ３０は、熱反復にさらされていない。図９Ｂでは、ＴＱ３０は、Ｔａｑポリメラーゼと共に、２５周期の熱反復（９０℃３０秒；５０℃１分；７２℃３０秒）にさらされ、そして放射標識ヘアピンテンプレート（２５０  ｎＭ）を添加する前に、室温に冷却した。図９でわかるように、どちらの場合でも、リガンドＴＱ３０は４０℃未満の温度でポリメラーゼを阻害した。さらに、熱反復を経た試料は、熱反復にさらされなかった試料と同一のまたはそれより有効な阻害を示した。
【００５３】
図１０は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの阻害に対するリガンド濃度の影響を立証する。ＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）に関し、ヘアピンアッセイで産物の５０％を産生するのに必要な阻害剤の濃度（ＩＣ50値）は、１６時間インキュベーション期間に渡る室温（およそ２２℃）でのＴａｑポリメラーゼの阻害に関し、それぞれ、６．５  ｎＭおよび１０  ｎＭであった（図１０Ａ）。アッセイに用いたＴａｑポリメラーゼの濃度は、１２．５  ｎＭであるため、ＴＱ３０（配列番号５０）による酵素阻害は、化学量論的結合の結果である可能性がある。１時間に渡り３０℃でアッセイした場合、ＩＣ50値は、およそ３倍増加した（ＴＱ３０では２２  ｎＭ、そしてＴＱ２１では６７  ｎＭ；データ未提示）。Ｔｔｈポリメラーゼの阻害に関するＴＱ３０およびＴＱ２１のＩＣ50値は、室温で、それぞれ、６０および３６  ｎＭであった（図１０Ｂ）。総合すると、これらのオリゴヌクレオチドは、Ｔｔｈポリメラーゼに対するより、選択に用いた酵素、Ｔａｑポリメラーゼに対し、より有効な阻害剤である。
【００５４】
テンプレート伸長の観察された阻害が、ポリメラーゼに対する選択リガンドの優先的な結合およびそれに続く基質としての利用のためであるという可能性を除外するため、５’末端放射標識ＴＱ２１およびＴＱ３０リガンドを、２つのＤＮＡポリメラーゼと１６時間インキュベーションした（実施例２、データ未提示）。リガンドＴＱ３０は、どちらの酵素とのインキュベーションに際しても、伸長産物を示さず、ポリメラーゼ活性の基質でないことが示された。しかし、ＴＱ２１は、より高い分子量のバンドを生じ、どちらのポリメラーゼとのインキュベーションに際しても、配列伸長が示された。ＴＱ２１の観察された部分的伸長は、標準的条件を用い、エチレングリコールリンカーで、３’末端をキャップ化することにより、３’ＯＨ基の利用可能性をブロッキングすることにより、有効に除去された。３’キャップ化オリゴヌクレオチド構築物は、未キャップ化分子と同等の有効な阻害剤である（データ未提示）。これらの結果は、ｓｓＤＮＡリガンドがポリメラーゼ活性の劣った基質であり、そして２種類のリガンドは、ＤＮＡポリメラーゼ上に異なって配置される可能性があることを示す：ＴＱ２１は、３’末端が伸長される（劣ってではあるが）ことが可能であるようにポリメラーゼに結合し、一方ＴＱ３０は、結合に際し、伸長不可能である。
【００５５】
高温でＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼを認識するよう選択されたリガンド
図１１は、高温での親和性選択後に得られた４つのリガンド：クローン６（配列番号７８）、１５（配列番号８６）、１０（配列番号８５）および１８（配列番号８３）の存在下で、温度範囲に渡り、Ｔａｑポリメラーゼに触媒される、末端標識ヘアピン基質の伸長を示す。４つのリガンドのすべてが、Ｔａｑポリメラーゼを同じ度合いで阻害するのではなかった。Ｔａｑポリメラーゼに高親和性結合を示さなかったクローン１８は、４０℃でさえも、有意な酵素阻害を示さなかった。これらのリガンドによるポリメラーゼ阻害の強度は、その親和性の順にしたがう；クローン６＞１５＞１０＞＞＞＞１８。図１２ＡおよびＢは、温度の関数として、これらのリガンドの存在下で形成された産物のパーセントを示す。これらのリガンドのＩＴ50値は、４０℃−５６℃の間であったが、リガンド１８は＜４０℃の値を示した。この結果は、減少した親和性と一致する。高親和性結合にしたがい、ファミリーＩＩ配列、クローン１９（配列番号８４）もまた、高いＩＴ50値を示した。表９は、クローン６（ＴＱＨ６）および２８（ＴＱＨ２８）のＫd値を要約する。表９中のデータは、明らかに、高温での親和性選択後に得られたリガンドは、期待される特性、すなわち高温での結合および阻害を持つことを立証する。この結果は、望ましい特性を持つリガンドを得るのに、適切な選択条件を定義する重要性をさらに裏付ける。
【００５６】
図１３Ａ−Ｆは、温度範囲にわたる高温での親和性選択後に得られた多様なリガンドの存在下で、ＴＺ０５ポリメラーゼに触媒される末端標識基質の伸長を示す。ＴＺ０５ポリメラーゼとリガンドの観察された高親和性相互作用は、これらが酵素のポリメラーゼ活性を阻害する能力を反映する。高親和性でポリメラーゼに結合しなかったクローン２（ＴＺ２（配列番号９６））を除き、他のリガンドは、４０−５９℃の間のＩＴ50値を示した（表８を参照されたい）。より短いランダム領域を持つＴＺ２（期待されるより４ヌクレオチド短い）は、３５℃でさえ、ポリメラーゼを有効に阻害しなかった。ファミリーＩに属するリガンドＴＺ１３（配列番号８９）およびＴＺ２６（配列番号９３）は、２つの極端なＩＴ50値（５８．５℃対４１℃）を示した。配列レベルでは、これらの２つの配列は非常に類似であるが、特により高い温度では、その阻害強度はかなり異なる。ＴＺ１３およびＴＺ２６の間には、高い度合いの配列類似性があるが、２つの配列の重大でない相違が、ポリメラーゼ阻害能の相違の原因となっている可能性がある。
【００５７】
図１４は、Ｔａｑポリメラーゼの阻害に関し、高温親和性選択を用いて得られた３つのリガンドの濃度の影響を示す。３つのリガンドのＩＣ50値は、およそ２０  ｎＭである。
【００５８】
図１５は、Ｔｒｉｓ緩衝液（図１５Ａ）およびＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液（図１５Ｂ）中のリガンド６（配列番号７８）、２２（配列番号８１）および２８（配列番号８７）に関し、温度の関数としてのＩＣ50値の変化を例示する。Ｔｒｉｓ緩衝液中では、３つのリガンドすべてのＩＣ50値は、４０℃ないし５０℃の温度範囲内では、非常に弾力的である（図１５Ａ）。しかし、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中では、ＩＣ50値は、４５°を超える温度で感受性である（図１５Ｂ）。これらのアッセイでは、Ｔａｑポリメラーゼの濃度は２．５  ｎＭであり、そしてＩＣ50値は、３０℃ないし４５°で２０−４０  ｎＭのままである。したがって、この温度範囲内では、完全に酵素を阻害するのに、酵素濃度に対し、およそ２０倍過剰のリガンド濃度で十分である。
【００５９】
親和性捕捉実験
ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼと核酸リガンドの相互作用の熱可逆性により、１つの増幅後、続く増幅に再使用するためにポリメラーゼを捕捉する、こうしたリガンドで生成された親和性マトリックスの使用の可能性が生じる。親和性捕捉の可能性を調べるため、実施例１に記載されるように、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）を含むアフィニティービーズを調製した。ヘパリンを含むＰＣＲ緩衝液中で、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを用い、ヘアピンテンプレートを伸長した後、実施例２に記載されるように、反応物を、アフィニティービーズまたはコントロールビーズと混合し、ビーズを完全に洗浄し、そしてポリメラーゼ以外、すべての試薬を含む反応混合物の新鮮なアリコットに曝露した。７０℃でさらに５分間インキュベーションし、新たに添加されたテンプレート上の伸長を可能にした後、変性条件下で、８％ポリアクリルアミドゲル上で、反応混合物を解析した。コントロールビーズを含んだ反応混合物では、増幅の第二の周期中、テンプレートの伸長はない。対照的に、アフィニティービーズを含んだ反応混合物では、増幅の第一および第二の周期両方で、伸長産物に相違はなく、両リガンド、ＴＱ３０およびＴＱ２１を含むアフィニティービーズがＰＣＲの最初の周期後、２つのポリメラーゼの捕捉に成功したことが示された。
【００６０】
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対する核酸リガンドの影響
ポリヌクレオチド合成を触媒する能力に加え、Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＴＺ０５ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も持つ（ＪｏｙｃｅおよびＳｔｅｉｔｚ（１９８７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  １２：２８８；  Ｌｏｎｇｌｅｙら（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：７３１７）。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の好ましい基質は、置換ｓｓＤＮＡ（またはフォーク様構造）であり、切断は二重鎖／ｓｓＤＮＡ結合部の近傍で起こる。ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対するオリゴヌクレオチド阻害剤の影響を研究するため、ヘアピン中に置換ｓｓＤＮＡを含むＤＮＡ基質（Ｅｘｏ−Ｓｕｂ）を設計した（実施例３、図１６）。５’および３’末端両方でＥｘｏ−Ｓｕｂ基質を放射標識し、エキソヌクレアーゼ活性により生じる２つのＤＮＡ断片の検出を可能にする。
【００６１】
ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対するリガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）の影響
エキソヌクレアーゼ活性から生じる２つの標識ＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチド阻害剤の存在下および非存在下両方で見られた（データ未提示）が、オリゴヌクレオチド阻害剤の存在下で生成される切断産物の量は、阻害剤の非存在下で生じるものより、いくぶん少なく、オリゴヌクレオチド阻害剤が、酵素のエキソヌクレアーゼ活性に対し、いくらか阻害効果を発揮することが示された。これらのオリゴヌクレオチドは、２５０  ｎＭで、２つの酵素のポリメラーゼ活性を完全に阻害したため、エキソヌクレアーゼ活性に対する影響は、不十分であるとみなされる。
【００６２】
ＴＺ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対するリガンドＴＺ１３（配列番号８９）、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＴＺ１３（５１ヌクレオチド）およびＴＺ３６（配列番号９９）の影響
図１７は、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する３つのリガンド：全長ＴＺ１３、一部切除ＴＺ１３（５１ヌクレオチド）（以下を参照されたい）および全長ＴＺ３６を用いて行ったアッセイの結果を示す。レーンＣは、リガンドの非存在下でＴＺ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ切断により生じる切断産物（７８ヌクレオチドおよび２４ヌクレオチド）を示す。レーン１−４、５−８および９−１２は、それぞれ、増加する濃度のＴＺ１３、ＴＺ１３−ＴｒｎｃおよびＴＺ３６リガンドの存在下でのＥｘｏ−Ｓｕｂ切断を示す。酵素のエキソヌクレアーゼ活性による基質の切断は、３つのリガンドすべてで阻害された。エキソヌクレアーゼ活性の阻害は、２μＭのリガンド濃度でさえ、１００％ではなかった。２５０  ｎＭのリガンド濃度で、ポリメラーゼ活性が完全に阻害されたことは注目に値する。したがって、ポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の完全な阻害に必要なリガンド濃度に基づき、これらのリガンドは、ポリメラーゼ活性に関してそうであるようには、エキソヌクレアーゼ活性の阻害剤として有効でない。
【００６３】
リガンドに対するＴａｑポリメラーゼおよびＴＺ０５ポリメラーゼの影響
理想的には、核酸リガンドは、酵素のポリメラーゼ活性の阻害剤としてのみ機能し、それによりＰＣＲにおける、望ましくない非特異的増幅を調節するのに適した試薬となるであろう。しかし、そのフォールディングした構造の性質に応じ、リガンドはそれ自体、ポリメラーゼ活性または５’→３’エキソヌクレアーゼ活性どちらか、あるいは両方の基質となる可能性がある。リガンドに対するＴａｑポリメラーゼの影響を研究するため、５’末端標識リガンド６（ＴＱＨ６（配列番号７８））、２２（ＴＱＨ２２（配列番号８１））および２８（ＴＱＨ２８（配列番号８７））を、ｄＮＴＰの存在下および非存在下でＴａｑポリメラーゼとインキュベーションし、そして変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により、反応産物を解析した。図１８は、これらのリガンドの各々に対するＴａｑポリメラーゼの影響を例示する。各リガンドに関し、レーン１および４は、インキュベーションが緩衝液中でのみ行われたコントロールである。レーン２および５は、Ｔａｑポリメラーゼとのインキュベーション後の結果を示し、そしてレーン３および６は、Ｔａｑポリメラーゼおよび４つのｄＮＴＰすべてとのインキュベーション後の結果を示す。図１８に見られるように、Ｔａｑポリメラーゼとインキュベーションした際、レーン２、３、５および６では、３つのリガンドすべてが、速く動く小さいＤＮＡ断片の出現により示されるように、エキソヌクレアーゼ活性の基質として作用した。実際観察されるのは、Ｈｏｌｌａｎｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０に記載されている、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の構造特異的エンドヌクレアーゼ活性である。エキソヌクレアーゼ活性の基質であるのに加え、各リガンドはまた、ｄＮＴＰの存在下でインキュベーションした際、ポリメラーゼにより伸長された（レーン３）。これは、リガンド６で明らかに顕著であり、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰとのインキュベーションに際し、遅く動くバンドが生成された。レーン４−６で見られるように、ポリメラーゼ伸長は、各リガンドの３’ＯＨ基の利用可能性をブロッキングすることにより、完全に停止した。本研究では、リガンドの化学合成中、３’末端をリン酸基でキャップ化した。リン酸基に加え、他の分子実体、例えば、エチレングリコールリンカーおよび３’−３’ｄＴ結合もまた、リガンドの３’末端を有効にキャップ化するのに用いることが可能である。リガンドの３’末端のキャップ化は、リガンドがＰＣＲにおいて非特異的プライマーとして作用する、潜在的な問題を除去する。リガンドの３’末端のキャップ化は、リガンドの機能に影響を与えなかった（ＤａｎｇおよびＪａｙａｓｅｎａ（１９９６）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６４：２６８）。
【００６４】
リガンドに対するＴＺ０５ポリメラーゼの影響を研究するため、ＴＺ０５に対する５’末端標識リガンドを、ｄＮＴＰの存在下でＴＺ０５ポリメラーゼとインキュベーションした。大部分のリガンドは、ｄＮＴＰおよびＴＺ０５ポリメラーゼとインキュベーションした際、伸長産物を示し、リガンドがポリメラーゼ活性の基質として利用されることが示された。さらに、試験したすべてのリガンド配列は、ＴＺ０５ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、２つの断片に切断された（データ未提示）。切断の正確な部位はマッピングされなかったが、５’固定領域のどこかであるようであった。上に論じられるように、リガンドに対するポリメラーゼ伸長は、リガンドの３’ヒドロキシル基をブロッキングすることにより、有効に調節することが可能である。しかし、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によるリガンドの切断は、ｉｎ  ｓｉｔｕで、新規３’末端を生成し、２つの結果を導く可能性があるであろう。第一に、切断は、リガンドの機能を潜在的に不活性化する可能性があり、そして第二に、新規未キャップ化３’末端がＰＣＲにおいて非特異的プライマーとして作用する可能性がある。これらの観察は、以下に記載される一部切除リガンドの同定を導いた。
【００６５】
ＴＱ２１（配列番号５９）およびＴＱ３０（配列番号５０）による多様なＤＮＡポリメラーゼの阻害
いくつかの他の商業的に入手可能なＤＮＡポリメラーゼ並びに阻害剤としてリガンドＴＱ２１（配列番号５９）およびＴＱ３０（配列番号５０）を用いた阻害アッセイが、実施例４に記載される。４つの熱安定性酵素（サーマス・ブロキアヌス由来のＴｂｒポリメラーゼ、サーマス・フラバス由来のＴｆｌポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＴｍａポリメラーゼ、およびサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＴｌｉポリメラーゼ）；３つの中温性酵素（大腸菌ＤＮＡＰ１のクレノウ断片（ＫＦ）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ）；並びに４つの逆転写酵素（ＲＴ）（ＨＩＶ−Ｉ  ＲＴ、ＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）ＲＴおよびＭ−ＭＬＶ（モロニーネズミ白血病ウイルス）ＲＴおよびＲＮアーゼＨ活性を欠くその突然変異体（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ））を調べた。
【００６６】
調べた６つの熱安定性ポリメラーゼ（ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを含む）のうち、サーマス種由来の４つのポリメラーゼ（Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＴｂｒおよびＴｌｆ）は、選択されたオリゴヌクレオチドの両方で阻害され、これらの酵素が高い度合いの類似性を共有することが示唆された。上述のように、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼは、アミノ酸配列レベルで、９３％類似であり、そして８８％同一であると報告されている（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）中）。Ｔｆｌポリメラーゼは、アミノ酸レベルで、９３％類似であり、そして８６％同一であると報告されている（Ｄ．  Ｇｅｌｆａｎｄ、個人的通信）。一方、サーモトガ・マリティマ由来のＴｍａポリメラーゼおよびサーモコッカス・リトラリス由来のＴｌｉポリメラーゼは、どちらのリガンドによっても阻害されなかった。Ｔｌｉポリメラーゼは、真正細菌酵素と、ほとんど配列相同性を共有しない（ＩｔｏおよびＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅ（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９：４０４５）。Ｔｍａポリメラーゼは、アミノ酸レベルで、Ｔａｑポリメラーゼに、６１％類似であり、そして４４％同一であると報告されている（Ａｂｒａｍｓｏｎ（１９９５）ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク）中）が、オリゴヌクレオチドリガンドは、Ｔｍａポリメラーゼを阻害しない。
【００６７】
試験した４つの逆転写酵素のうち、ＨＩＶ−ＩおよびＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）由来のＲＴは阻害されなかった。一方、Ｍ−ＭＬＶ（モロニーネズミ白血病ウイルス）およびＲＮアーゼＨ活性を欠くその突然変異体（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ）は、２つのオリゴヌクレオチドリガンドにより、阻害された。
【００６８】
中温性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌ＤＮＡＰ１のクレノウ断片（ＫＦ）、Ｔ４  ＤＮＡＰおよびＴ７  ＤＮＡＰは、ＴａｑポリメラーゼのポリメラーゼドメインおよびＫＦの類似性にもかかわらず、０．５μＭ濃度で、どちらのリガンドにも阻害されなかった（Ｋｉｍら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３７６：６１２；  Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：６４２７）。したがって、オリゴヌクレオチド阻害剤は、一般的にかなり特異的であるようである。これらの結果は、他の逆転写酵素に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択により同定される核酸リガンドの振る舞いに似ている（ＴｕｅｒｋおよびＭａｃＤｏｕｇａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８９：６９８８；  ＣｈｅｎおよびＧｏｌｄ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：８７４６；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：９５９９）。
【００６９】
ＴＱＨ６（配列番号７８）およびＴＱＨ２２（配列番号８１）による多様なＤＮＡポリメラーゼの阻害
ＴＱＨ６およびＴＱＨ２２の全長および一部切除型両方を研究し、Ｔａｑポリメラーゼのストッフェル断片、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＴＺ０５ポリメラーゼを阻害する能力を測定した。両リガンドは、４８℃のＩＴ50値で、ストッフェル断片を阻害した（図１９ＡおよびＢ）。どちらの場合でも、全長および一部切除リガンドは、同一のＩＴ50値を示した。この結果は、一部切除リガンドが、全長分子より低いＩＴ50値を示した、これらの２つのリガンドによるＴａｑポリメラーゼの阻害とはまったく異なる。
【００７０】
Ｔｔｈポリメラーゼに対する２つのリガンドの全長および一部切除型の阻害特性は、Ｔａｑポリメラーゼに対するものと非常に類似である。どちらの場合でも、一部切除リガンドは、より低いＩＴ50値（６℃または１０℃）を示した（図２０ＡおよびＢ）。
【００７１】
Ｍｇ2+またはＭｎ2+イオンどちらかの存在下で、２つのリガンドによるＴＺ０５ポリメラーゼの阻害を調べた。どちらかの金属イオンの存在下で、非常に類似の結果が観察された。図２１ＡおよびＢは、Ｍｇ2+イオンの存在下でのＴＺ０５ポリメラーゼの阻害を示す。
【００７２】
ＴＺ１（配列番号９４）、ＴＺ８（配列番号１００）、ＴＺ１３（配列番号８９）およびＴＺ５４（配列番号１０３）による、多様なＤＮＡポリメラーゼの阻害
ＴＺ０５ポリメラーゼの親和性選択から得たいくつかのリガンドを用い、これらのリガンドによる、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼおよびストッフェル断片の阻害を調べた。異なるファミリー由来の試験したいくつかの全長リガンドのうち、４つの連続するチミンを含むコンセンサスを持つリガンド、すなわちファミリーＩＩＩに分類される配列（ＴＺ８（配列番号１００）およびＴＺ５４（配列番号１０３））は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを両方、有効に阻害した（データ未提示）。この結果は、Ｔａｑポリメラーゼに対する親和性選択により同定されたファミリーＩＩリガンド（表４）もまた、Ｔｔｈポリメラーゼと共にサーマス・ブロキアヌスおよびサーマス・フラバス由来のポリメラーゼを阻害したという事実に基づくと、それほど驚くべきことではない。４つのチミンを含むコンセンサスモチーフを含むリガンド、ＴＺ５４により観察されるが、７つの隣接するグアニンを含むリガンド、ＴＺ１３（配列番号８９）により観察されない阻害は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに対する結合親和性を反映する（図２２ＡおよびＢ）。図２２に示されるように、ＴＺ１３は、どちらのポリメラーゼにも高い親和性では結合しないが、ＴＺ５４は結合する。一方、７つの隣接するグアニンを含む、ＴＺ１およびＴＺ１３は、３０℃以上で、これらの２つのポリメラーゼの有効な阻害を示さない（図２３ＡおよびＢ）。リガンドＴＺ３６（配列番号９９）は、７つの隣接するグアノシンまたは隣接する４つのチミンのいずれも持たず、そしてＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方を阻害する点でユニークである。したがって、７つの隣接するグアノシンを含むリガンドは、親和性選択に用いられたポリメラーゼである、ＴＺ０５ポリメラーゼに特異的である可能性がある。
【００７３】
試験した３つのリガンド（ＴＺ１、ＴＺ１３およびＴＺ３６）のいずれも、ストッフェル断片を阻害しなかった（図２３Ｃ）。この結果は、Ｔａｑポリメラーゼを有効に阻害するＴＺ３６に関しては、驚くべきことである。これは、Ｔａｑポリメラーゼ上のＴＺ３６の結合部位が、ストッフェル断片では欠失しているかまたは再構成されていることを示唆する。
【００７４】
低コピー数標的の増幅
実施例５は、標準的ＰＣＲ技術、「ホットスタート」ＰＣＲ、および「ホットスタート」条件の非存在下で、ＰＣＲにより低コピー数標的の検出を促進する、本発明の方法により同定されるリガンドを用いたＰＣＲを比較する、いくつかのＰＣＲ増幅を記載する。Ｒｅｓｐｅｓｓら（１９９４）により、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ９４：１１０に記載されるように、ＨＩＶ−２  ＬＴＲ（末端反復配列）由来の２０３塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片を検出するよう設計されたプライマー−テンプレート系を利用した。
【００７５】
図２４は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）を用いた結果を例示する。ＰＣＲ増幅は、０、１０および５０コピーのＨＩＶ−２  ＬＴＲ標的を用いて行った。通常ＰＣＲ条件下で、正しい標的バンドの同定は、いくつかの非特異的バンドの存在により、危うくされた（図２４Ａ、レーン１−３）。「ホットスタート」条件下で行った増幅は、非特異的バンドを除去した（図２４Ａ、レーン４−６）。ＴＱ２１およびＴＱ３０と同一の５’および３’固定配列を含む、非特異的７８ヌクレオチドｓｓＤＮＡ配列の存在下で行った増幅の結果は、「ホットスタート」条件を用いないＰＣＲにより得られたものと同様であった。しかし、標準的条件下（「ホットスタート」なし）で行い、ＴＱ２１（図２４Ｂ、レーン４−６）またはＴＱ３０（図２４Ｂ、レーン７−９）いずれかを添加したものは、標的特異的バンドの収率に影響を与えず、非特異的バンドを除去した。特に重要なのは、標的コピー数が低い場合、シグナル検出が非常に効果的であったという観察であった（図２４Ｂ、レーン２をレーン５および８と比較されたい）。オリゴヌクレオチド阻害剤の効果は、低コピー数のＨＩＶ−２  ＬＴＲを検出する際、Ｔａｑポリメラーゼの代わりにＴｔｈポリメラーゼを用いた場合、同様であった（データ未提示）。ＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチド阻害剤を用いて得られた標的特異的バンドの収率の亢進は、反応の感受性を増加させ、およそ３コピーしか存在しない標的の検出を促進した（図２４Ｃ）。
【００７６】
図２４に記載される実験に用いたオリゴヌクレオチド阻害剤は、３’末端がキャップ化されておらず、非特異的に増幅を開始することを可能にし、そしてさらにＰＣＲの結果を複雑にする可能性がある。しかし、偶発性の（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ）バンドは検出されず、本系では、オリゴヌクレオチド阻害剤の３’キャップ化は、非特異的バンドの生成を除去するのに必要でないことが示唆された。
【００７７】
図２５は、３’キャップ化一部切除リガンド：ＴＱＨ６、ＴＱＨ２２およびＴＱＨ２８を用いた結果を例示する。増幅は、１μｇのヒト胎盤ＤＮＡと混合した１０コピーのＨＩＶ−２  ＬＴＲ標的を含みまたは含まず行った。図２５に示されるすべての増幅は、ホットスタート条件の非存在下で行った。レーン１−４は、リガンドを含まないコントロール条件の結果を示す。これらの反応において、非特異的増幅のため、多数のＤＮＡバンドが生成された。これらの非特異的増幅産物は、テンプレートＤＮＡを含む反応および含まない反応に存在する。リガンドを反応混合物に添加した場合、結果は明らかに異なる（レーン５−１０）。すべての３つのリガンドの場合で、標的を含まない反応では、増幅産物は１つも存在しなかった（レーン５、７および９）。標的を含むＰＣＲ反応では、反応混合物にリガンドＴＱＨ６を添加した場合（レーン６）、特異的単位増幅物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）のみが増幅され、そしてリガンドＴＱＨ２２およびＴＱＨ２８を添加した場合、おそらく標的へのプライマーの非特異的アニーリングのため、さらなる低分子量バンドが存在した（レーン８および１０）。これらの結果は、これらの一部切除リガンドが、ｉｎ  ｓｉｔｕホットスタート条件を生成することにより、非特異的増幅を調節するのに有効であることを示す。
【００７８】
ＴＺ０５ポリメラーゼに対するリガンドが、低コピー数標的配列を増幅するＰＣＲの結果を改善する能力を試験するため、ヒトゲノムＤＮＡからＫ−ｒａｓ遺伝子を増幅するよう設計されたＰＣＲ系を用いた（Ｎｉｌｓｓｏｎら（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：７４４−７５１）。ＴＺ１（ＴＺ１−Ｔｒ（配列番号１０７））、ＴＺ１３（ＴＺ１３−Ｔｒ（配列番号１０８））およびＴＺ３６（配列番号１０９）の５１ヌクレオチド一部切除リガンド（図３３）を試験した。これらのリガンドの３’ＯＨ基を３’−３’ｄＴ残基でキャップ化し、リガンドのポリメラーゼ伸長を妨げた。さらに、これらのリガンドは、ＴＺ０５ポリメラーゼによるエキソヌクレアーゼ切断を遮断するため、５’末端に８つのホスホロチオエート結合を含んだ。増幅反応において、テンプレートヒトゲノムＤＮＡの添加前に、ポリメラーゼおよびプライマーを含む、完全反応緩衝液中にリガンドが存在した。ＰＣＲ後、３％アガロースゲル上で、増幅産物を解析した。濃度範囲にわたる、一部切除ＴＺ１リガンドの存在下で行ったＰＣＲの結果を図２６に示す。リガンドの非存在下または低濃度のリガンドの存在下では、Ｋ−ｒａｓ遺伝子は増幅されなかった（レーン２−６）。リガンド濃度が増加するにつれ、バックグラウンドの減少を伴い、特異的単位増幅物の生成が見られる（レーン７−８）。リガンド濃度のさらなる増加に際し、ＰＣＲは完全に阻害された（レーン９）。結果は、２０−４０  ｎＭの間である、リガンドの最適濃度が、望ましい増幅に必要であることを示す。他の２つのリガンドを用いた結果は、図２６に示される結果に非常に似ていた。
【００７９】
ＴＺ１およびＴＺ１３の３０ヌクレオチド一部切除体を用い、同様の結果が得られた（図２７ＡおよびＢ）。これらの一部切除体は、５’末端にホスホロチオエート結合を持たないが、３’末端でキャップ化された。３０ヌクレオチド一部切除体では、望ましい結果を達成するために必要な濃度は、５１ヌクレオチド一部切除体で必要とされたもののおよそ２倍であった。３０ヌクレオチド一部切除体よりさらに高い濃度（６６０  ｎＭ）のＴＺ１３の２６ヌクレオチド一部切除体で同様の結果が観察された。標的特異的単位複製物を産生するのに必要とされる一部切除リガンドの有効濃度は、リガンドの長さが減少するにつれ、減少する。この結果は、そのＩＴ50値と相関し、ＩＴ50値もまた、リガンドの長さの減少と共に減少する。
【００８０】
図２６および２７に見られる増幅は、ＴＺ０５ポリメラーゼを用いて行った。ＴＺ０５ポリメラーゼを認識するよう選択されたいくつかのリガンドはまた、Ｔｔｈポリメラーゼも阻害した。Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行う、同一のＰＣＲ系で、リガンドＴＺ３６（５１ヌクレオチド一部切除体）を試験した。図２８に示されるように、該リガンドはまた、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて特異的単位増幅物を生成するのにも、非常に有効である。
【００８１】
阻害活性を持つ一部切除リガンドの同定
典型的には、全長配列中のすべてのヌクレオチドが、その機能に必要であるのではない。したがって、全配列の機能を保持する一部切除ＤＮＡ配列の同定が望ましい。さらに、上に論じられるように、全長配列は、ポリメラーゼに関連する構造特異的エンドヌクレアーゼ活性による、部位特異的切断を経る。これは、伸長可能３’末端の生成または切断の際のリガンド機能のありうる不活性化のどちらか、あるいは両方による、ＰＣＲ適用における潜在的な問題を引き起こす。結果として、エキソヌクレアーゼ活性の基質でないリガンドが望ましい。切断部位は、配列の５’末端近傍であるため、一部切除はこの部位を除去することが可能である。一部切除はまた、リガンドを製造するのに経済的であるため、望ましい。
【００８２】
ＴＱ３０およびＴＱ２１の一部切除リガンドの同定
一部切除実験のため、ファミリーＩ由来のリガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびファミリーＩＩ由来のＴＱ２１（配列番号５９）（表１０を参照されたい）を選択した。実施例２に記載されるように、両リガンドの全長配列から生成した末端標識入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）断片に対する親和性選択後、配列決定ゲル解析を行ったが、同定可能な境界は得られなかった。しがたって、２つのリガンドを欠失解析に供した。ヘアピン伸長アッセイにおいて、ポリメラーゼを阻害する能力に関し、連続欠失型を試験し、機能する一部切除体を同定した。
【００８３】
リガンドＴＱ３０（配列番号５０）の一部切除体
予測されるステム−ループ構造を持つ保存配列モチーフを含むＴＱ３０の可変３０ヌクレオチド領域（Ｔｒｎｃ．Ａ−３０（配列番号７４）；表１１）は、全長配列と同じ度合いで、２５℃でＴａｑポリメラーゼを阻害する（データ未提示）。しかし、より高い温度では、阻害効率は、全長配列より低い。例えば３０℃では、Ｔｒｎｃ．Ａ−３０（２５０  ｎＭ）によるＴａｑポリメラーゼの阻害はおよそ８２％であり、一方、全長配列は、この温度および濃度で、酵素を完全に阻害した。Ｔｒｎｃ．Ａ−３０の熱感受性の増加は、Ａ−Ｔ塩基対で中断されたらせん、低温で融解する傾向があるらせんの存在による可能性がある。
【００８４】
したがって、高Ｇ−Ｃ塩基対を持つ非中断ステムを含む、Ｔｒｎｃ．Ａ−３０の３つのステム−ループ変異体を設計した。これらの変異体では、ファミリーＩに同定される保存配列モチーフは改変されなかった（表１１）が、ステムは多様な長さを有した。２５０  ｎＭ阻害剤濃度で、Ｔｒｎｃ．１−３０（配列番号６７）およびＴｒｎｃ．２−３０（配列番号６８）は、Ｔａｑポリメラーゼ活性をおよそ９５％阻害し、一方、Ｔｒｎｃ．３−３０（配列番号６９）は、ポリメラーゼ活性の約６０％しか阻害しなかった（以下を参照されたい）。これらの変異体のうち最短ステム（７塩基対）を含むＴｒｎｃ．３−３０は、Ｔａｑポリメラーゼの劣った阻害剤であり、生産的な相互作用には、ステム内でさらに接触することが必要であることが示された。Ｔｒｎｃ．３−３０で観察された阻害の減少が、ポリメラーゼに対する結合親和性の減少のためであるか決定するため、Ｔａｑポリメラーゼに対する結合に関し、３つの変異体すべての親和性を計算した。Ｋd値は、２−３  ｎＭの間であり、３つの変異体はすべて、同様の結合親和性を有することが示された。したがって、Ｔｒｎｃ．３−３０により引き起こされた阻害の欠失は、結合の欠失のためではなく、おそらく、活性部位をブロッキングすることができないためであった。Ｔａｑポリメラーゼに対する結合に関する３つの変異体の親和性は、全長分子より約７５倍低く（全長配列のＫdは、４０  ｐＭである）、そしてＴｒｎｃ．Ａ−３０より約３−５倍低い。３つの構築物のＩＣ50値は、ステムの長さの減少と共に減少した：Ｔｒｎｃ．１−３０、Ｔｒｎｃ．２−３０およびＴｒｎｃ．３−３０で、それぞれ２５、５０および１８６  ｎＭであった（図２９）。この結果は、より長いステムを持つリガンドがより有効な阻害剤であるという見解と一致する。全長配列のＩＣ50値は２２  ｎＭである。３０℃で１時間、ヘアピン伸長アッセイを行った。Ｔｔｈポリメラーゼが全長リガンドに完全に阻害されるという事実にもかかわらず、Ｔｒｎｃ．１−３０もＴｒｎｃ．２−３０もどちらもＴｔｈポリメラーゼを阻害しなかった。
【００８５】
ストッフェル断片（６１  ｋＤ）は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの一部切除型であり、そしてＫｌｅｎ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（６７  ｋＤ）と類似である。ストッフェル断片のポリメラーゼ活性は、全長と共にＴＱ３０の３つの一部切除型で完全に阻害された。３つの一部切除体のＩＣ50値は、Ｔｒｎｃ．１−３０＝２．７  ｎＭ、Ｔｒｎｃ．２−３０＝５．９  ｎＭおよびＴｒｎｃ．３−３０＝１０．３  ｎＭである（図３０）。総合すると、ＴＱ３０の３つの一部切除型は、Ｔａｑポリメラーゼよりストッフェル断片を阻害するのにより有効である（図２９を図３０と比較されたい）。ストッフェル断片の阻害に関するこれらの一部切除体のＩＣ50値は、Ｔａｑポリメラーゼに関するものより一桁優れていた。Ｔｒｎｃ．２−３０によるストッフェル断片の阻害に関するＩＴ50値は、３８℃であった（データ未提示）。驚くべきことに、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを両方阻害するＴＱ２１配列は、ストッフェル断片を阻害しない。これは、ストッフェル断片上のＴＱ２１結合部位が、部分的にまたは完全に欠失しているか、あるいはタンパク質の一部切除に際し、再構成されているかを示唆する。
【００８６】
リガンドＴＱ２１（配列番号５９）の一部切除体
ＴＱ３０のようなファミリーＩリガンドと異なり、ファミリーＩＩリガンド、ＴＱ２１の３０ヌクレオチド可変領域は、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼをどちらも阻害せず（データ未提示）、固定領域由来のさらなるヌクレオチドが阻害に必要であることが示される。全長ＴＱ２１配列の欠失解析により、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを両方阻害する能力を保持する、５１量体配列（Ｔｒｎｃ．２１（配列番号７０）（表１０））が同定された。３０ヌクレオチドランダム領域の全てに加え、Ｔｒｎｃ．２１配列は、５’および３’固定領域由来の、それぞれ、９および１２ヌクレオチドを含んだ（表１０）。Ｔａｑポリメラーゼに減少した親和性を示した、ＴＱ３０一部切除体と対照的に、Ｔｒｎｃ．２１は、増加した親和性を示し；Ｔａｑポリメラーゼへの結合に関するＴｒｎｃ．２１のＫdは、９  ｐＭであり（図３１Ａ）、全長配列より約4倍高い親和性である。Ｔａｑポリメラーゼの阻害に関するＴｒｎｃ．２１のＩＣ50値は、２１  ｎＭであり（図３１Ｂ）、全長配列の値より、約３倍低い。ＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼに関する計算ＩＴ50値は、それぞれ、３４℃および３５．６℃である（図３１Ｃ）。２５０  ｍＭ  Ｔｒｎｃ．２１を用い、３５および５０℃の温度の間で、1時間、ヘアピン伸長アッセイを行った。このように、親和性およびＩＣ50およびＩＴ50の値に基づくと、ＴＱ２１の一部切除型は、全長配列より優れた阻害剤である。全長配列同様、Ｔｒｎｃ．２１は、ストッフェル断片の活性を阻害しなかった。
【００８７】
リガンド６（ＴＱＨ６（配列番号７８））、２２（ＴＱＨ２２（配列番号８１））および２８（ＴＱＨ２８（配列番号８７））の一部切除体
全長配列の体系的欠失解析により、機能する一部切除体を同定した。一部切除体は、可変領域に結合する、それぞれ５’および３’固定領域由来の９および１２ヌクレオチドを含み、結果として５０または５１ヌクレオチド配列であった。したがって、各一部切除体では、可変領域に、５’−ＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−および−ＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡ−３’が隣接する。一部切除リガンドは、Ｔａｑポリメラーゼとインキュベーションした際、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されず（図３２）、一部切除に際し、切断部位が除去されたか、またはリガンドがエキソヌクレアーゼ活性に認識されない構造に作りかえられたかいずれかが示唆される。
【００８８】
一部切除リガンド、ＴＱＨ６−ＴｒおよびＴＱＨ２８−ＴｒのＴａｑポリメラーゼに対する親和性を、ＴｒｉｓおよびＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液中で測定した。５５℃で、２つの緩衝液における全長および一部切除リガンドのＫd値は、表９に示される。リガンド６（ＴＱＨ６）の親和性は、一部切除に際し、どちらの緩衝液でも３−４倍減少し、そしてリガンド２８（ＴＱＨ２８）の親和性は、Ｔｒｉｓ緩衝液中で３−４倍減少した。総合すると、一部切除に際し、親和性は中程度に減少し、これは欠失ヌクレオチドが、おそらく、非特異的相互作用を通じ、全長配列における結合エネルギーのある程度のレベルに寄与することを示す。
【００８９】
表１２に示されるように、一部切除リガンドＴＱＨ６−Ｔｒ、ＴＱＨ２２−ＴｒおよびＴＱＨ２８−ＴｒのＩＴ50値は、一部切除に際し、５−９℃減少した。一部切除および全長リガンドに関し、４５℃で、Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中で測定したＴＣ50値を比較すると、一部切除に際し、ＴＣ50値（投入ヘアピン基質の５０％が、既定の温度で完全伸長産物に変換される濃度）が２−３倍増加したことが明らかになる（表１２）。
【００９０】
総合すると、本解析の結果は、一部切除リガンドが、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断されないことを示す。さらに、これらはＴａｑポリメラーゼに高親和性結合を示し、そしてより高い温度でポリメラーゼ活性を阻害する。一部切除リガンドのこれらの特性は、非特異的増幅を調節するため、ＰＣＲ適用に望ましい。
【００９１】
ＴＺ０５ポリメラーゼに対する核酸リガンドの一部切除体
全長配列の体系的欠失解析により、ＴＺ０５ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害する一部切除リガンドを同定した。これらのリガンドは、２つの固定領域の大部分を欠き、そして５１ヌクレオチド長である（図３３）。一部切除体は、ポリメラーゼ活性の有効な阻害のため、５’および３’固定領域由来の、それぞれ、９および１２ヌクレオチドを必要とする。
【００９２】
表１３は、ＴＺ１、ＴＺ１３およびＴＺ３６に対する一部切除リガンドのＫd値を、各全長リガンドのものに比較する。これらのリガンドの親和性が、５１ヌクレオチドまでの一部切除に際し、劇的に変化しなかったことがわかる。５５℃で、ＴＺ０５緩衝液中で、表１３に示される結合反応を行った。この結果は、２つの固定領域中の欠失ヌクレオチドがポリメラーゼに対するリガンド結合に必須でないことを示す。５１ヌクレオチド一部切除体に加え、全長リガンドの可変領域のみを含む３０ヌクレオチド一部切除体もまた、ポリメラーゼを阻害する能力に関し、試験した（図３３）。
【００９３】
リガンドＴＺ１、ＴＺ１３およびＴＺ３６の５１および３０ヌクレオチド一部切除体のＩＴ50値を表１４に示す。ＩＴ50値を計算するため、実施例２に記載されるように、ヘアピン伸長アッセイを行った。表１４でわかるように、３つの５１ヌクレオチド一部切除体はすべて、４０℃以上でポリメラーゼ活性を阻害した。ＴＺ１３およびＴＺ３６のＩＴ50値は、一部切除に際し、７．５℃および４℃減少し、一方、ＴＺ１のＩＴ50値は、一部切除に際し、変化しなかった。総合すると、５１ヌクレオチドのＩＴ50値および親和性は、これらをＰＣＲ適用に関する魅力的な候補とする。
【００９４】
リガンドＴＺ１３の場合、３０ヌクレオチドまでのさらなる一部切除は、親和性をおよそ５倍減少させた（Ｋd＝１４５  ｐＭ）。本一部切除体の親和性は、低いＩＴ50値（４２℃）と一致する。ＴＺ１３の３０ヌクレオチド一部切除体の３’末端からさらに４ヌクレオチド欠失させると、ＩＴ50値は１７℃減少した（図３４ＡおよびＢ）。興味深いことに、ＴＺ１およびＴＺ１３の３０ヌクレオチド一部切除体は、４０℃以上のＩＴ50値を示し、一方、ＴＺ３６の３０ヌクレオチド一部切除体は示さなかった。したがって、ＩＴ50値が＞４０℃であるＴＺ１およびＴＺ１３の３０ヌクレオチド一部切除体もまた、ＰＣＲ適用に有用である可能性がある。
【００９５】
これらのリガンドの５１ヌクレオチド一部切除体は、親和性（Ｋd）およびポリメラーゼ阻害（ＩＴ50）に関し、望ましい値を保持する。図３５に示されるように、５１ヌクレオチド一部切除体は、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により切断された。しかし、３０ヌクレオチド一部切除体とＴＺ０５ポリメラーゼのインキュベーションの結果、切断は起こらず、５１ヌクレオチド一部切除体上の切断部位は、５’固定領域の９ヌクレオチドの範囲にある可能性があることが示唆された。３０ヌクレオチド一部切除体は、酵素により切断されなかったが、そのＫd値（１４５  ｐＭ）およびＩＴ50値（４２℃）は、５０℃に近い温度でのポリメラーゼ活性化が望ましい、特定のＰＣＲ適用には魅力的でない可能性がある。５１ヌクレオチド一部切除体の切断を遮断する試みの中で、ホスホロチオエート結合が導入された。５’末端の最初の８ヌクレオチドにホスホロチオエート結合を含む一部切除体（図３３）は、エキソヌクレアーゼ切断に耐性であることが見出された。ホスホロチオエート結合を持つ一部切除体のＩＴ50値は、ホスホロチオエートを欠くものに匹敵し、これらの一部切除体への８つのホスホロチオエート結合の導入は、ＴＺ０５ポリメラーゼを阻害する能力に影響を与えないことが示唆された。
【００９６】
一部切除体の二量体型
リガンドの多量体化は、有効な局所濃度を増加させ、標的とのより長い在留時間（アビディティー）を生じる。Ｔａｑポリメラーゼに関する中程度の親和性に基づき、ホモ二量体の合成のため、Ｔｒｎｃ．２−３０を選択した（表１０）。Ｔｒｎｃ．２−３０（配列番号６８）のホモ二量体（Ｄ．３０−Ｄ．３０）（配列番号７１）は、標準法を用い、固相化学合成において、支持体として対称的二量体ＣＰＧを用い、テールからテールへの方向（３’末端で結合）に合成した。
【００９７】
Ｔａｐポリメラーゼに対する結合に関するＤ．３０−Ｄ．３０二量体の親和性は４０  ｐＭ（図３６Ａ）であり、単量体型より約７５倍高かった。ホモ二量体のＩＣ50値は１４  ｎＭであり、単量体型より約３．５倍低かった（図３６Ｂ）。したがって、一部切除ＴＱ３０の二量体化は、Ｔａｑポリメラーゼのより有効な阻害剤を産生した。
【００９８】
２つの単量体一部切除体、Ｔｒｎｃ．２−３０およびＴｒｎｃ−２１（表１０）が、３つのチミンを含むリンカーにより連結された、２つのヘテロ二量体配列もまた、調製した。Ｄ．２１−Ｄ．３０（配列番号７２）において、Ｔｒｎｃ−２１配列を分子の５’末端に置く。全長ＴＱ３０と異なり、一部切除型は、Ｔｔｈポリメラーゼを阻害しなかった。一方、Ｔｒｎｃ−２は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼ両方を阻害したが、ストッフェル断片を阻害しなかった。単量体単位が独立に機能することが可能であると仮定すると、単一の配列につなぎとめられた後、２つの一部切除リガンドの組合せは、３つのポリメラーゼすべてを阻害することが可能な単一の配列を提供するであろう。最低の阻害剤濃度（６２．５  ｎＭ）で、Ｔａｑポリメラーゼに対する２つのヘテロ二量体の阻害効果は、２つの単量体より高い。Ｔｔｈポリメラーゼに対するヘテロ二量体の効果は、Ｔｒｎｃ−２１単量体のものと同等である。ストッフェル断片は、２つのヘテロ二量体の存在下で、ヘアピンテンプレートを完全に伸長することは不可能であった。対照的に、単量体Ｔｒｎｃ．２−３０配列の存在下で、部分的伸長産物は、より少なかった。ヘアピンテンプレートが完全には伸長しないことにより、ヘテロ二量体が、ストッフェル断片の活性を抑制することが示唆される。
【００９９】
ヘテロ二量体Ｄ．２１−Ｄ．３０は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの阻害に関し、およそ３０  ｎＭのＩＣ50値を有する（図３７Ａ）。ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの阻害に関するＩＣ50値は、それぞれ、４１および３４．５℃である（図３７Ｂ）。Ｄ．２１−Ｄ．３０は、１５．５  ｎＭのＩＣ50値および３８℃のＩＴ50値で、ストッフェル断片を阻害する（データ未提示）。Ｔａｑポリメラーゼに対する結合に関する、リガンドＤ．２１−Ｄ．３０ヘテロ二量体のＫdは、Ｔｒｎｃ−２１のもの（１０  ｐＭ）と同様であり、該タンパク質が、高親和性結合で配列モチーフに優先的に結合することを示唆する。
【０１００】
二量体中の２つの単量体単位の配置は、３つのポリメラーゼのいずれに対する阻害にも、全体的な影響を持たないようである。２つの異なる単量体単位は、二量体に組み合わされた際、不都合な影響を示さなかった。期待されるように、ヘテロ二量体は、かなり有効に３つのポリメラーゼすべてを阻害する能力を示し、概して、ヘテロ二量体における単量体単位の機能は、互いに排他的であることを示す。
【０１０１】
核酸リガンドＴＺ１３（配列番号８９）の３０ヌクレオチド一部切除体は、３つの異なる型の二量体として合成した（図３８）。ＴＺ１３−タンデム（配列番号１１６）は、３０ヌクレオチド一部切除体の２つの単位を、３つのチミン単位により結合した、タンデム様式に置くことにより、得た。ＴＺ１３−対称的二量体−１（配列番号１１７）は、グリセロール部分により、２つのリガンドの３’末端を結合することにより、合成した。第三の二量体、ＴＺ１３−対称的二量体−２（配列番号１１８）では、３’末端で、グリセロール部分を通じて２つの単量体単位を結合したが、３’末端およびグリセロール部分の間に、６つのエチレングリコール単位からなるリンカーを置いた。図３９Ａおよび表１５に示されるように、３つの二量体はすべて、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する結合に関し、Ｋd値が１４５  ｐＭであった単量体リガンドより、高い親和性を示す（Ｋd値は１８−８０  ｐＭの間）。ポリメラーゼと二量体の相互作用には、アビディティーが役割を果たし、そしてそれにより親和性を増加させると期待される。同一単量体の３つの二量体構築物は、異なる親和性を示す。リンカーを含まない対称的二量体−１は、３つの二量体で最高の親和性を示し、一方、エチレングリコールリンカーを含む対称的二量体−２は、最低の親和性を有する。３つの二量体の観察される親和性は、ＩＴ50値により測定されるような、その阻害強度とよく相関する（図３９Ｂおよび表１５）。
【０１０２】
以下の実施例は、本発明を説明し、そして例示するため提供され、そして本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１．実験法
Ａ．材料および方法
１００  ｍＭ  ＫＣｌ、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％グリセロール（ｖ／ｖ）および０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０からなる緩衝液中に懸濁された組換えＴａｑポリメラーゼ（ｒＴａｑ；Ｍｒ  ９４  ｋＤａ）；５０  ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ  ８．３）、９０  ｍＭ  ＫＣｌおよび５０％グリセロール（ｖ／ｖ）からなる緩衝液に懸濁された組換えＴｔｈポリメラーゼ（ｒＴｔｈ；Ｍｒ  ９４  ｋＤａ）；およびサーマス種Ｚ０５（ＴＺ０５  ｐｏｌ）はＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州アラメダ）より購入した。Ｔａｑ、ＴｔｈおよびＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから得た。Ｕｌｔｍａポリメラーゼは、Ｔｍａポリメラーゼの欠失型であり、野生型５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。ＴｌｉおよびＴｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａより購入した。Ｔｂｒポリメラーゼ（サーマラーゼ（Ｔｈｅｒｍａｌａｓｅ）Ｔｂｒ）は、Ａｍｒｅｓｃｏ  Ｉｎｃ．より得た。対称的分岐３’−３’結合ＣＰＧおよびＣ−６チオール修飾剤ホスホロアミダイトは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）より得た。ＵＬＴＲＡＬＩＮＫTMヨードアセチルビーズは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（イリノイ州ロックフォード）より購入した。ＤＮＡの放射標識に用いた酵素は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（インディアナ州インディアナポリス）より得た。すべての他の試薬および化学薬品は、解析等級であり、そして標準的な商業的供給源より購入した。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドの調製  オリゴヌクレオチドは、標準的固相シアノエチルホスホロアミダイト化学反応により合成し、そして均一な大きさにする、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動または逆相高圧液体クロマトグラフィーにより、精製した。対称的ホモ二量体は、対称的分岐３’−３’結合ＣＰＧを用いて合成した。ＤＮＡ濃度は、３３μｇ／ｍｌ＝１  Ａ260単位に基づいた。
【０１０５】
アフィニティービーズの調製  ５’末端にチオール基を含む、リガンドＴＱ２１（配列番号５９）またはＴＱ３０（配列番号５０）（表３）いずれか２５ナノモルを、製造者の指示にしたがい、ＡｇＮＯ3およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）で脱保護した。過剰なＤＴＴは、等体積の酢酸エチルを用いた、４回の連続抽出により、除去した。その後、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）および５  ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液で２回洗浄しておいた５００μｌのＵＬＴＲＡＬＩＮＫTMヨードアセチルビーズと、脱保護リガンドを混合した。反応混合物を、回転プラットホーム上で、室温で２時間、インキュベーションした。ヨードアセチルビーズの未反応部位は、同緩衝液中の０．５  Ｍ  システイン溶液５０μｌと混合物を１５分間反応させることにより、キャップ化した。コントロールビーズは、０．５  Ｍ  システイン５００μｌとヨードアセチルビーズ５００μｌを反応させることにより、調製した。反応後、７５μＭ  ヘパリン、１２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０  ｍＭ  ＫＣｌおよび１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）からなるＰＣＲ緩衝液５００μｌで、ビーズを５回洗浄した。
【０１０６】
Ｂ．ＳＥＬＥＸ
ＳＥＬＥＸ法は、本明細書に完全に援用される、米国特許第５，２７０，１６３号に、詳細に記載されている。表１に示されるテンプレートおよびプライマーを用い、室温および上昇した温度で、ＳＥＬＥＸ実験を行った。
【０１０７】
室温  Ｔａｑポリメラーゼに対する選択は、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３：２２℃）、５０  ｍＭ  ＫＣｌおよび２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2からなる緩衝液（Ｔａｑ結合緩衝液）中で、室温で行った。Ｔｔｈポリメラーゼに対する選択は、５０  ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ  ８．３：２５℃）、９０  ｍＭ  ＫＣｌおよび３．５  ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）2からなる緩衝液（Ｔｔｈ結合緩衝液）中で行った。
【０１０８】
各ＳＥＬＥＸ実験は、固定構造の５’および３’領域が隣接する、３０ヌクレオチドランダム領域からなる、合成のゲル精製ランダム配列プール一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（表１）５  ｎｍｏｌで開始した。典型的な選択周期では、適切な結合緩衝液に懸濁したｓｓＤＮＡを９０℃で３分間加熱し、氷上で冷却し、そしてその後、室温にした。室温に平衡化すると、競合剤としての２  ｎｍｏｌのｔＲＮＡおよび０．０１％ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）の存在下で、適切な標的ポリメラーゼとＤＮＡを、１５分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じ、吸引下で、ニトロセルロースろ過することにより、未結合ＤＮＡからポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を分離した。フィルターを直ちに、結合緩衝液２０  ｍｌ、結合緩衝液中の０．５  Ｍ  尿素、および水中の０．５  Ｍ  尿素で洗浄した。フィルターに保持されたＤＮＡを溶出し、そしてキャリアーｔＲＮＡ（５μｇ）の存在下で、エタノール沈殿により、単離した。
【０１０９】
単離ＤＮＡを、プライマーセットＩ（表１）を用いたＰＣＲにより、増幅した。プライマー鎖の１つは、５’末端に３つの連続するビオチンを含んだ。生じた二重鎖ＤＮＡの非ビオチン化鎖を、変性条件下でゲル電気泳動により単離し（Ｐａｇｒａｔｉｓ（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２４：３６４５−３６４６）、そして次の選択周期に用いた。続く周期で、標的ポリメラーゼとのインキュベーション前に、ＤＮＡプールをニトロセルロースフィルターに通過させ（逆選択）、ニトロセルロースフィルターに結合するＤＮＡ配列を除去した。標的ポリメラーゼのピコモル数は、ＳＥＬＥＸの経過中、次第に減少させ、高親和性結合の配列に関する選択圧を増加させた。各選択中のＤＮＡ量は、タンパク質量の少なくとも５倍に維持され、高親和性結合ＤＮＡ配列に関する競合を確実にした。
【０１１０】
ＳＥＬＥＸの進行は、濃縮プールのニトロセルロースフィルター結合解析によりモニターした。最高の親和性の結合を示した濃縮プールは、プライマーセットＩＩを用いてＰＣＲ増幅し、生じた二重鎖ＤＮＡの末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を取り込んだ。このＤＮＡをゲル精製し、そしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして標準的技術を用い、同一酵素であらかじめ消化されたプラスミドｐＵＣ１８ベクターにクローニングした（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，中，  第３部，  ｐＣ．１．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。クローンを単離し、そして標準的ジデオキシ配列決定技術により、配列決定した（Ｕ．Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、オハイオ州クリーブランドのＳｅｑｕｅｎａｓｅキット）。
【０１１１】
高温ＳＥＬＥＸ  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ  ８．０）、５０  ｍＭ  ＫＯＡｃ（ｐＨ  ７．５）、２．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2および１０％グリセロールからなる結合緩衝液（Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液）中で、５５℃で、Ｔａｑポリメラーゼに対する高温での親和性選択を行った。本選択の出発ライブラリーは、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５０  ｍＭ  ＫＣｌおよび２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2からなる結合緩衝液中で、室温で行った親和性選択由来の１２回目の周期のｓｓＤＮＡであった（表３（ＤａｎｇおよびＪａｙａｓｅｎａ（１９９６）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６４：２６８））。大文字は、５’−ＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−および−ＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’固定配列が隣接する、３０ヌクレオチド（ｎｔ）ランダム領域を示す。ファミリーＩ配列の下線領域は、塩基対形成に関し相補的である。後者のライブラリーは、配列５’−ＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−［Ｎ］30−ＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１；表１）を用い、合成ランダム配列ｓｓＤＮＡライブラリーから濃縮した。
【０１１２】
Ｔｒｉｃｉｎｅ結合緩衝液に懸濁した１２回目の周期のｓｓＤＮＡライブラリー５  ｎｍｏｌを用い、高温親和性選択を開始した。本懸濁物を９５℃で３分間加熱し、氷上で５分間冷却し、そして５５℃にした。２  ｎｍｏｌのｔＲＮＡ（競合剤として使用）、０．０１％（ｗ／ｖ；最終濃度）のｈＳＡ（ヒト血清アルブミン）およびＴａｑポリメラーゼ（１２５  ｎＭ）をＤＮＡ懸濁物に添加し、そして５５℃で１５分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μＭ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じ、吸引下で、迅速にろ過することにより、ポリメラーゼ結合ＤＮＡを回収した。フィルターを直ちに、２０  ｍｌ体積の結合緩衝液、続いて同体積の結合緩衝液中の０．５  Ｍ  尿素で洗浄した。どちらの洗浄緩衝液も、使用前に、あらかじめ６０℃に温めた。フィルターに保持されたＤＮＡを溶出し、そしてキャリアーとして用いる５μｇのｔＲＮＡの存在下で、エタノール沈殿により、単離した。単離ＤＮＡは、上述のようにプライマーセットＩ（表１）を用いたＰＣＲにより増幅した。
【０１１３】
Ｔａｑ  ｐｏｌに対する高親和性結合ＤＮＡ配列の濃縮を確実にするため、選択経過中、選択圧を次第に増加させた。これは、Ｔａｑポリメラーゼおよび各周期で用いられるＤＮＡ両方の量を次第に減少させると共に、フィルター保持ＤＮＡのストリンジェントな洗浄により、達成した。濃縮ライブラリーの親和性は、ニトロセルロースフィルター結合によりモニターした（以下に記載される）。８周期の選択後、有意な親和性の改善は見られなかった。８回目の周期のライブラリーを、上述のようにプライマーセットＩＩ（表１）を用いてＰＣＲ増幅した。ジデオキシ配列決定技術（ＵＳＢのＳｅｑｕｅｎａｓｅキット）により、形質転換体のＤＮＡ挿入物を配列決定することにより、濃縮ライブラリーの複雑さを解析した。
【０１１４】
５０  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、１２５  ｍＭ  ＫＯＡｃ、２．５  ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）2および８％グリセロールからなる結合緩衝液（ＴＺ０５  ｐｏｌ緩衝液）中で、５５℃で、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する親和性選択を行った。結合緩衝液は、１  Ｍ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ  ８．０）、３  Ｍ  ＫＯＡｃ（ｐＨ  ７．５）、２５  ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）2および８０％グリセロールのストック溶液を混合することにより、調製した。同一条件下で、異なるｓｓＤＮＡライブラリーから出発し、２つの親和性選択を行った。１つの選択は、５  ｎｍｏｌの合成ランダム配列ｓｓＤＮＡライブラリー；５’−ＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ−［Ｎ］30−ＴＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号１；表１）で開始した。他の選択の出発ライブラリーは、室温で、Ｔａｑポリメラーゼに対して行った親和性選択由来の１２回目の周期のｓｓＤＮＡライブラリーであった（表３）。
【０１１５】
結合緩衝液に懸濁したｓｓＤＮＡライブラリーを９５℃で３分間加熱し、氷上で５分間冷却し、そしてその後、５５℃にした。２  ｎｍｏｌのｔＲＮＡ（競合剤として使用）、０．０１％（ｗ／ｖ；最終濃度）のｈＳＡ（ヒト血清アルブミン）およびＴＺ０５ポリメラーゼ（１２５  ｎＭ）をＤＮＡ懸濁物に添加し、そして５５℃で１５分間インキュベーションした。あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μＭ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通じ、吸引下で、迅速にろ過することにより、ポリメラーゼ結合ＤＮＡを回収した。フィルターを直ちに、２０  ｍｌの結合緩衝液、および結合緩衝液中の０．５  Ｍ  尿素で洗浄した。どちらの洗浄緩衝液も、使用前に、あらかじめ６０℃に温めた。フィルターに保持されたＤＮＡを溶出し、そしてキャリアーとして用いた５μｇのｔＲＮＡの存在下で、エタノール沈殿により、単離した。
【０１１６】
単離ＤＮＡは、上述のようにプライマーセットＩ（表１）を用いたＰＣＲにより増幅した。完全ランダムライブラリーで開始した選択には、標準的ＰＣＲ増幅を用い、一方、Ｔａｑ  ｐｏｌに対するあらかじめ選択されたライブラリーで開始した選択には、突然変異性ＰＣＲ条件を用いた。突然変異性ＰＣＲは、生じたＰＣＲ産物のヌクレオチド多様性を増加させるよう意図され、以下のように行った。回収ＤＮＡは、まず、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、１．１  ｍＭ  ＭｎＣｌ2、７  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１  ｍＭ  ｄＣＴＰ、１  ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２  ｍＭ  ｄＧＴＰ、０．２  ｍＭ  ＡＴＰおよび１  ＵのＴａｑポリメラーゼを含む１００μｌ体積中で、９４℃５０秒、４５℃４５秒および７２℃４５秒を５周期の反復パラメーターで、ＰＣＲにより増幅した。上述のＰＣＲから１３μｌを、上述のものと同じ条件下で、５周期行う、新規の１００μｌ  ＰＣＲのテンプレートとして用いた。後者の工程をさらに３回繰り返した。４回目の突然変異性ＰＣＲ由来の１３μｌを、５００μｌ  ＰＣＲのテンプレートとして用い、次の選択に用いるｓｓＤＮＡプールを生成した。変性ポリアクリルアミドゲル上で分離された、生じた二重鎖ＰＣＲ産物の非ビオチン化鎖を単離し、そして次の周期の選択に用いた。
【０１１７】
ＴＺ０５  ｐｏｌに対する高親和性結合ＤＮＡ配列の濃縮を確実にするため、選択経過中、選択圧を次第に増加させた。これは、ＴＺ０５ポリメラーゼおよび各周期で用いられるＤＮＡ両方の量を次第に減少させると共に、フィルターのストリンジェントな洗浄により、達成した。親和性濃縮は、濃縮ライブラリーの平衡解離定数を測定することにより、モニターした。
【０１１８】
その後、濃縮ライブラリーを、上述のようにプライマーセットＩＩ（表１）を用いてＰＣＲ増幅した。ジデオキシ配列決定技術（ＵＳＢのＳｅｑｕｅｎａｓｅキット）により、形質転換体のＤＮＡ挿入物を配列決定することにより、濃縮ライブラリーの複雑さを解析した。
【０１１９】
Ｃ．ニトロセルロースフィルター結合アッセイ
室温  オリゴヌクレオチドライブラリーおよび個々のリガンドの親和性を評価するため、ニトロセルロースフィルター結合技術を用いた。簡潔には、５’末端で標識したゲル精製32Ｐ  ｓｓＤＮＡプールを結合緩衝液に懸濁し、８０℃に加熱し、氷上で冷却し、そしてその後、室温にした。その後、ＤＮＡ（５−１０  ｐＭ）を、０．１μｇのｔＲＮＡおよび０．０１％  ｈＳＡを含む、適切な結合緩衝液５０μｌ中で、多様な量の標的ポリメラーゼと、室温で１５分間インキュベーションした。ＤＮＡ濃度は１００  ｐＭより低く維持し、過剰なタンパク質濃度の存在下で平衡を確実にした。１５分後、結合反応混合物を、あらかじめ湿らせたニトロセルロース／セルロースアセテート混合マトリックスフィルター（０．４５μｍ孔サイズ、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）に通過させ、そしてフィルターを直ちに５  ｍｌの結合緩衝液で洗浄した。フィルターに結合したＤＮＡの量は、液体シンチレーション計測により、フィルターの放射能を測定することにより、定量化した。タンパク質の非存在下でフィルターに結合したＤＮＡの量を、バックグラウンド訂正に用いた。各フィルターに保持された投入ＤＮＡのパーセントを、対応するポリメラーゼ濃度の対数に対しプロットした（図１および２）。非線形最小二乗法を用い、それぞれ、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに対するＤＮＡリガンドの解離定数（Ｋd）を得た（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：９５９９；  Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：１１２２７−１１２３１）。
【０１２０】
非選択ランダム配列プールは、およそ７０  ｎＭの概算Ｋdで、Ｔｔｈポリメラーゼに結合し（図１Ｂ（黒丸））、一方、Ｔａｑポリメラーゼに対する本プールの結合のＫdはおよそ５０−１００  ｎＭである（図１Ａ（白丸））。１２周期の選択後、Ｔａｑポリメラーゼに対する結合のＫdは、３．５  ｎＭであった（図１Ａ（白丸））。選択周期をさらに多くしても、親和性のさらなる改善は生じなかった。このように、Ｔａｑポリメラーゼに対する濃縮プールの結果的な親和性は、非選択ランダムプールに比較し、有意に改善された。Ｔｔｈポリメラーゼで、同様の結果が得られ、１０回目の周期からのプールは、５  ｎＭのＫdを示した（図１Ｂ（白丸））。
【０１２１】
Ｔａｑポリメラーゼに関して選択されたｓｓＤＮＡプールは、０．２  ｎＭのＫdで、Ｔｔｈポリメラーゼに非常に緊密な結合を示した（図２Ａ（白丸））。２つのポリメラーゼの間のアミノ酸配列同一性はおよそ８７％である（Ａｓａｋｕｒａら（１９９３）Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ７６：２６５−２６９）ため、この結果は驚くべきことではない。Ｔｔｈポリメラーゼに関し選択されたプールは異なる方式でＴａｑポリメラーゼに結合し、結合は５０％レベル付近で飽和し（図２Ｂ（白丸））、プール中の約半分の配列は、Ｔａｑポリメラーゼと相互作用しないことが示唆された。５０％飽和に基づき、概算Ｋdは０．３  ｎＭである。
【０１２２】
Ｔｔｈポリメラーゼを用いて行った１０周期の選択から得たｓｓＤＮＡ配列を、表２に示す。Ｔｔｈポリメラーゼ選択由来の２９の個々のクローンを配列決定した（可変３０ｎｔ領域のみを表２に示す）。配列類似性に基づき、配列を２つのファミリーに分類した。Ｔａｑポリメラーゼを用いて行った１２周期の選択から得たｓｓＤＮＡ配列を、表３に示す。３３のユニーク配列を単離した。いくつかの配列中の小文字は、５’固定配列を示し、そして大文字は、３０ヌクレオチドランダム領域を示す。配列類似性に基づき、配列を３つのファミリーに分類した。
【０１２３】
高温  ＴａｑおよびＴＺ０５ポリメラーゼに対するアプタマーの結合親和性を、ニトロセルロースフィルター結合技術により、５５℃で測定した。簡潔には、末端標識アプタマーを、それぞれ、多様な濃度のＴａｑまたはＴＺ０５ポリメラーゼと、５０μｌの結合緩衝液中で、５５℃で１５分間、インキュベーションした。アプタマー−ポリメラーゼ混合物を、あらかじめ５５℃に温めた結合緩衝液を用い、あらかじめ湿らせたニトロセルロースフィルター（０．４５μｍ）に通過させた。５５℃に加熱した同緩衝液５  ｍｌを用い、フィルターを直ちに洗浄した。各ポリメラーゼには２つの緩衝液を用いた：５０  ｍＭ  ＫＣｌ、２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２２℃でｐＨ  ８．３）、２  ｎｇ／μｌのｔＲＮＡおよび０．０１％  ｈＳＡからなるＴｒｉｓ緩衝液；並びに、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ  ８．３）、５０  ｍＭ  ＫＯＡｃ（ｐＨ  ７．５）、２．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１０％グリセロール、２  ｎｇ／μｌのｔＲＮＡおよび０．０１％  ｈＳＡからなるＴａｑ緩衝液または５０  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、１２５  ｍＭ  ＫＯＡｃ、２．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、８％グリセロール、２  ｎｇ／μｌのｔＲＮＡおよび０．０１％  ｈＳＡからなるＴＺ０５緩衝液。平衡解離定数（Ｋd値）は、非線形最小二乗法を用いることにより、計算した。
【０１２４】
５５℃で、Ｔａｑポリメラーゼを用いて行った選択８周期後のｓｓＤＮＡ配列およびその発生頻度を表４に示す。個々の配列は表５に示す。各配列に関し、３０ｎｔランダム領域のみを示す。全長アプタマー中、ランダム領域は、表１に示される固定配列（配列番号１）に隣接する。表４でわかるように、出発ライブラリーの複雑さは有意に減少し；そして驚くべきことに、わずか６配列しか見られなかった。表４のデータは、６３の読み取り可能な個々の配列の解析から得た。配列類似性に基づき、アプタマーを２つのファミリーに分類した。ファミリーＩアプタマーは、出発ライブラリーのファミリーＩＩ配列に緊密に関連し（表３および４を比較されたい）；これらの２つのファミリーは、各表の囲み内に示される類似のコンセンサス配列モチーフを持つ。出発ライブラリーに存在するファミリーＩ配列のすべて（表３）は、高温での選択後、完全に消失し、これらのＴａｑポリメラーゼとの相互作用は、非常に温度感受性であったことを示した。最終ライブラリーでファミリーＩＩと分類された単一配列は、解析した配列のおよそ１０％に相当する。本配列は、ファミリーＩ配列とまったく異なり、そしてコンセンサスモチーフを欠く。出発および最終ライブラリーの配列複雑性の比較により、出発ライブラリー中の特定の配列は、新規選択条件に耐えず、そして順応してヌクレオチドが変化した他の配列が新規条件に耐えたことが示される。
【０１２５】
ＴＺ０５ポリメラーゼを用いて行った２つの選択の経過中、ＴＺ０５ポリメラーゼに結合し、そしてまた該ポリメラーゼを阻害する能力に関し、濃縮ライブラリーを試験した。ランダム配列ライブラリーで開始した選択は、選択１４周期後、親和性およびＴＺ０５ポリメラーゼ阻害能の有意な改善を示した。本選択に比較し、突然変異性ＰＣＲを通じて得た選択の濃縮ライブラリーは、わずか４周期の選択後、ＴＺ０５ポリメラーゼ阻害能において、さらにより大きい改善を示した。４周期の選択後、５５℃で、突然変異性条件下でのＰＣＲを行って得たｓｓＤＮＡ配列を表５に示す。表に示される３０ｎｔランダム領域は、表１に示される固定配列（配列番号１）に隣接する。括弧内の数字は、その配列が同定された回数を示す。配列類似性に基づき、配列を３つのファミリーに分類した。精査すると、これらの配列が２つの広いカテゴリーに分類されることが明らかになる；グアニンがリッチな配列（ファミリーＩ−ＩＩ）およびグアニンが少ない配列（ファミリーＩＩＩ）である。グアニンリッチ配列中のグアニンの分布は、分子内Ｇ−四分子構造にフォールディングすることが可能であるようなものである。興味深いことに、これらのグアニンリッチ配列は、表３に複雑性を示す出発ライブラリーには存在しない（存在量が少ないため、クローニングにより検出されなかった可能性が最も高い）。ファミリーＩＩＩ中の配列は、グアニンリッチではないが、ランダム配列の３’末端付近にＣＧＴＴＴＴＧコンセンサスモチーフを持つ。出発ライブラリー中、ファミリーＩＩ配列に同様のコンセンサスモチーフが同定され（表３）、これらの２つのファミリーが関連しており、そして他方から一方が派生したことが示唆される。出発ライブラリーに存在するファミリーＩ配列は、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する高温選択に際し、消失した。同一ライブラリーを、Ｔａｑポリメラーゼに対する高温親和性選択に供すると、同様の結果が観察され、出発ライブラリーに見られるファミリーＩアプタマーと２つのポリメラーゼの相互作用が温度感受性であり、そして高温での選択に耐えなかったことを示唆する。それらの間でまたは表５に示されるものに配列相同性を持たない１３の他の配列もまた同定され、そしてオーファン配列と分類された（データ未提示）。
【０１２６】
実施例２．ポリメラーゼ阻害活性
ポリメラーゼ阻害アッセイは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび32Ｐ−γ−ＡＴＰを用い、５’末端で末端標識し、そして変性条件下でゲル電気泳動により精製したテンプレートＤＮＡ（ＤＮＡ−ＨＰ；  ５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＴ−３’（配列番号６；図６））を用いて行った（図６）。それぞれの実験法において、０．２５  ｐｍｏｌのＴａｑポリメラーゼ（５  Ｕ）または０．１２５  ｐｍｏｌのＴｔｈポリメラーゼ（２．５  Ｕ）いずれかを、標準的ＰＣＲ緩衝液（２０μｌ）中の５  ｐｍｏｌ（２５０μＭ）の濃縮プール、ランダムプールまたは特異的ＤＮＡリガンドと混合した。５  ｐｍｏｌ（２５０  ｎＭ）の標識テンプレートＤＮＡ−ＨＰを添加し、そして異なる温度で既定の時間、混合物をインキュベーションした。最終濃度１２５  ｍＭにＥＤＴＡを添加する（５μｌの０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ）ことにより、反応を停止した。変性条件下でポリアクリルアミドゲル上でＤＮＡを分離した。オートラジオグラフィーによりゲルを視覚化し、そしてホスホイメージャーにより結合ＤＮＡパーセントを定量化した。特定の反応に関する一般的な方法の変動は、明細に示される。
【０１２７】
オリゴヌクレオチド阻害剤が反応混合物に添加される順序は、テンプレートが最後に添加される限り、問題でない。オリゴヌクレオチドは、機能するのに、ＰＣＲの必須の構成要素であるＭｇ++イオンを必要とし、そして多くの緩衝液系に耐えるようである。
【０１２８】
図７は、ＤＮＡ濃縮プールを用いたポリメラーゼ活性アッセイの結果を例示する。図８−１０は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）を用いたポリメラーゼ活性アッセイの結果を例示する。
【０１２９】
ＩＣ50値の測定
ＩＣ50値（アッセイにおいて、産物の５０％を生じるのに必要な阻害剤濃度）は、ヘアピン伸長アッセイを用いて得た。典型的な阻害アッセイにおいて、２０μｌ反応は、ＴｒｉｓまたはＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液（ＴａｑおよびＴｔｈ  ｐｏｌ）あるいはＴＺ０５緩衝液（ＴＺ０５  ｐｏｌ）中に、０．２５（０．０４）ｐｍｏｌのＴａｑポリメラーゼ（５  Ｕ）（１  Ｕ）、０．１２５  ｐｍｏｌのＴｔｈポリメラーゼ（２．５  Ｕ）、または０．０５  ｐｍｏｌのＴＺ０５ポリメラーゼ（１  Ｕ）いずれか、オリゴヌクレオチド阻害剤（多様な濃度）、０．２  Ｍ  ｄＮＴＰを含んだ。その後、ゲル精製５’末端標識ヘアピンＤＮＡ基質（ＤＮＡ−ＨＰ；  ５’−ＡＴＧＣＣＴＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＴ−３’（配列番号６；図６））を、最終濃度２５０  ｎＭまで添加し、そして図レジェンドに示されるように、既定の時間、望ましい温度で、反応をインキュベーションした（ＴＺ０５  ｐｏｌでは３０分間）。反応は、５μｌの０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）の後、ホルムアミドゲル装填緩衝液を添加することにより、停止した。変性条件下で、１０％ポリアクリルアミドゲル上で、伸長産物を分離し、そしてホスホイメージャーにより定量化した。阻害剤の存在下で形成された産物の量を、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物パーセントを得た。
【０１３０】
ＩＴ50値の測定
ヘアピン伸長反応は、阻害剤濃度が２５０  ｎＭであり、そしてＴＺ０５ポリメラーゼ反応が３７℃で行われたことを除き、上述のものと同じであった。各温度でのインキュベーション時間は、ＴａｑおよびＴｔｈ  ｐｏｌで１時間、そしてＴＺ０５  ｐｏｌで３０分間であった。産物量はホスホイメージャーにより定量化し、そして同一温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物パーセントを得た。
【０１３１】
リガンドＴＱ３０およびリガンドＴＱ２１基質活性の測定
各実験法において、５’末端標識リガンドＴＱ３０（配列番号５０）、ＴＱ２１（配列番号５９）またはＴＱ２１（エチレングリコールリンカーを用い３’キャップ化されたもの）（およそ３  ｐｍｏｌ）を、５  ＵのＴａｑポリメラーゼまたは２．５  ＵのＴｔｈポリメラーゼいずれかの存在下または非存在下で、２０μｌの結合緩衝液中、１  ｍＭの各ｄＮＴＰと、室温で１６時間、インキュベーションした。ＴＱ２１の３’末端のキャップ化は、当業に知られる標準的条件を用い、エチレングリコールリンカー（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの３’−スペーサーＣ３支持体）を用いて達成した。
【０１３２】
親和性捕捉アッセイ
親和性捕捉反応は：７５μＭ  ヘパリン、１２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１  ｍＭ  各ｄＮＴＰ、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５  ＵのＴａｑポリメラーゼまたは２．５  ＵのＴｔｈポリメラーゼおよび２５０  ｎＭ  ５’末端標識ヘアピンアッセイテンプレート（ＤＮＡ−ＨＰ）を含む、１００μｌ反応体積中で、７０℃で５分間行った。５分後、反応混合物を３倍希釈し、そして４℃に冷却した。第１周期合成後、１５μｌのビーズ（上述のように調製された、アフィニティービーズまたはコントロールビーズいずれか）を４℃で反応混合物に添加し、そして１０分間、穏やかに混合した。標識テンプレートを含む上清を遠心分離後回収し、そしてゲル解析のため取り置いた。その後、７５μＭ  ヘパリン、１２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０  ｍＭ  ＫＣｌおよび１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）からなる緩衝液１００μｌでビーズを５回洗浄した。第２周期合成後、洗浄ビーズを、ポリメラーゼ以外全ての試薬を含む反応混合物の新鮮なアリコットと混合した。７０℃で５分間インキュベーションした後、反応混合物を回収し、そしてゲル電気泳動により解析した。
【０１３３】
実施例３．エキソヌクレアーゼ阻害アッセイ
エキソヌクレアーゼ阻害アッセイは、（［γ32Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い）５’末端で、そして（［α32Ｐ］−ｄｄＡＴＰおよびデオキシターミナルトランスフェラーゼを用い）３’末端で、放射標識された、設計テンプレート、５’−ＴＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣ−３’ （Ｅｘｏ−ｓｕｂ）（配列番号７５）を用いて行った。ＴａｑおよびＴｔｈ  ｐｏｌのための代表的な実験法において、それぞれ、５  ＵのＴａｑポリメラーゼまたは２．５  ＵのＴｔｈポリメラーゼを、標準的ＰＣＲ緩衝液（２０μｌ）中で、２５０  ｎＭのリガンドＴＱ３０またはリガンドＴＱ２１と混合し、その後、二重標識Ｅｘｏ−Ｓｕｂ（２５０  ｎＭ、最後に添加）を添加した。室温で１６時間インキュベーションした後、最終濃度０．１  ｍＭまでＥＤＴＡを添加することにより、反応を停止した。変性条件下で、８％ポリアクリルアミドゲル上で、切断産物を分離した。
【０１３４】
ＴＺ０５のための代表的な実験法において、１  ＵのＴＺ０５ポリメラーゼを、ＴＺ０５緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、５０  ｍＭ  ＫＯＡｃ、２．５  ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）2、８％グリセロール；２０μｌ）中で、リガンドと混合し、その後、二重標識Ｅｘｏ−Ｓｕｂ（２５０  ｎＭ、最後に添加）を添加した。４５℃で２０分間インキュベーションした後、最終濃度０．１  ｍＭまでＥＤＴＡを添加することにより、反応を停止した。変性条件下で８％ポリアクリルアミドゲル上で、切断産物を分離した。
【０１３５】
実施例４．ポリメラーゼ阻害アッセイ
ＴＱ２１（配列番号５９）およびＴＱ３０（配列番号５０）による阻害を、（Ａ）好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、（Ｂ）中温性ＤＮＡＰ（コントロールとしてＴａｑポリメラーゼ）、および（Ｃ）逆転写酵素（ＲＴ）に対し、試験した。すべての反応は、２５０または５００  ｎＭのリガンドＴＱ２１またはＴＱ３０いずれかを用い、１  ｍＭ  各ｄＮＴＰの存在下で、ＨＰヘアピンテンプレート（実施例２）を含む２０μｌ体積中で行った。各ポリメラーゼに関する特定の反応条件は、以下の通りであった：
【０１３６】
熱安定性ポリメラーゼ：  Ｔｍａポリメラーゼ：ＵｌＴｍａポリメラーゼ（６  Ｕ）、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．８、１０  ｍＭ  ＫＣｌ、２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０，００２％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｖ／ｖ）；  Ｔｂｒポリメラーゼ（２  Ｕ）、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．８、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；  Ｔｌｉポリメラーゼ（３  Ｕ）およびＴｆｌポリメラーゼ（５  Ｕ）、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ９．０、５０  ｍＭ  ＫＣｌおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。
【０１３７】
中温性ポリメラーゼ：  Ｔａｑポリメラーゼ（５  Ｕ）（緩衝液の内部コントロール）を含むすべてのインキュベーションは、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、４０  ｍＭ  ＫＣｌ、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2および７．５  ｍＭ  ＤＴＴからなる緩衝液中で行った（クレノウ断片（５  Ｕ）；  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（４  Ｕ）；  Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（７  Ｕ））。
【０１３８】
逆転写酵素：  すべてのインキュベーションは、５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．３、６０  ｍＭ  ＮａＣｌ、６  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2および１０  ｍＭ  ＤＴＴからなる緩衝液中で行った（ＨＩＶ−１  ＲＴ（０．５６  ｐｍｏｌ）；  ＡＭＶ  ＲＴ（１  Ｕ）；  Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（１０  Ｕ）；  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｓｒｉｐｔ  ＩＩ）（１０  Ｕ））。
【０１３９】
実施例５．低コピー数標的の検出
「ホットスタート」条件なしで、Ｒｅｓｐｅｓｓら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ９４：１１０に記載されるように、ＨＩＶ−２  ＬＴＲから２０３  ｂｐの標的特異的産物を増幅する系を用い、ＰＣＲ増幅を行った。すべてのＰＣＲ増幅は、１００μｌ反応体積中で、１．３μｇのヒト胎盤ＤＮＡ、０．４  ｍＭ  各ｄＮＴＰ、２５  ｐｍｏｌの各プライマー、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０％グリセロール、０．２  ｐｍｏｌ（５  Ｕ）のＴａｑポリメラーゼおよびテンプレート（図１０Ａ−１０Ｃに示されるような、およそのコピー数）の存在下で行った。熱反復は、５０℃２分の後、９４℃３０秒；６０℃３０秒；７２℃３０秒およびその後、１℃増加の自己伸長（ａｕｔｏｅｘｔｅｎｄｅｄ）６０℃アニーリングを５周期、ＴＣ９６００熱反復装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。これに、９０℃３０秒；６５℃３０秒；７２℃３０秒での３５周期増幅が続いた。
【０１４０】
あるいは、ＨＩＶ−２の末端反復配列（ＬＴＲ）を検出するよう設計したＰＣＲ増幅を、「ホットスタート」条件なしで、１μｇのヒト胎盤ＤＮＡの存在下で行った（Ｒｅｓｐｅｓｓら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ９４：１１０）。ＰＣＲは、１００μｌ体積中に、１５  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ  ８．０）、４８  ｍＭ  ＫＯＡｃ（ｐＨ  ７．５）、３．５  ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１０％グリセロール、０．４  ｍＭ  ｄＮＴＰおよび０．２  ｐｍｏｌ（５  Ｕ）のＴａｑポリメラーゼを含んだ。リガンドは５０  ｎＭ濃度で用い、そしてテンプレートを添加する前に反応混合物中に存在した。テンプレートは、５０μｌ体積中に１μｇのヒト胎盤ＤＮＡと混合したゼロまたはおよそ１０コピーのＨＩＶ−２テンプレートＤＮＡを含んだ。熱反復は、５０℃２分、９４℃３０秒、６０℃３０秒（１℃／周期の自己伸長で）、７２℃３０秒の後、９０℃３０秒、６５℃３０秒および７２℃３０秒での３５周期をＴＣ９６００熱反復装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。最後に、反応を７２℃で１０分間インキュベーションした。ＰＣＲ由来の２０μｌを、非変性条件下で、８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、解析した。ゲルは、エチジウムブロミド染色により視覚化した。
【０１４１】
ＴＺ０５  ｐｏｌに対し選択されたアプタマーの成果は、「ホットスタート」条件なしに、ヒトゲノムＤＮＡからヒトＫ−ｒａｓ遺伝子を増幅するよう設計されたＰＣＲ系で評価した（Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９７）。ＰＣＲ増幅は、プライマー、５’−ＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ−３’および５’−ＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡ−３’を用いて行った。すべてのＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ系９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）上で、３０μｌ反応体積で行った。ＰＣＲは、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１μＭ各プライマー、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、または５０  ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ、１２５  ｍＭ  ＫＯＡｃ、２．５  ｍＭ  Ｍｎ（ＯＡｃ）2、８％グリセロール、１μＭ  各プライマーおよび２００μＭ  各ｄＮＴＰいずれかを含んだ。アプタマーは、ヒト胎盤ＤＮＡ２５  ｎｇをテンプレートとして添加する前に、緩衝液および２．５  ＵのＴＺ０５ポリメラーゼを含む反応に存在した。９４℃２分間の変性後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７５℃４５秒で、３４周期の増幅を行った。これに、７２℃５分間の単回インキュベーションが続いた。ＴＢＥ緩衝液中の３％アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧ；  ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）上で、ＰＣＲの５μｌを泳動することにより、増幅産物を解析した。ゲルは、エチジウムブロミドで染色した後、ＵＶ光下で視覚化した。
【０１４２】
「ホットスタート」ＰＣＲは、製造者の指示にしたがい、「ＡｍｐｌｉＷａｘ」ビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いることにより、行った。全ての他のＰＣＲ増幅は、「ホットスタート」条件なしで行った。
【０１４３】
「ＮｅＸｓｔａｒｔ」ＰＣＲは、阻害剤として（５０  ｎＭ最終濃度の）リガンドＴＱ３０およびＴＱ２１を用いて行った。１つの増幅は、比較目的のため、非特異的オリゴヌクレオチド（５０  ｎＭ  最終濃度）の存在下で行った。
【０１４４】
【表１】
2011103890.tif 000002
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
【表５】
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【０１４９】
【表６】
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【０１５０】
【表７】
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【０１５１】
【表８】
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【０１５２】
【表９】
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【０１５３】
【表１０】
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【０１５４】
【表１１】
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【０１５５】
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【０１５６】
【表１２】
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【０１５７】
【表１３】
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【０１５８】
【表１４】
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【０１５９】
【表１５】
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【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１Ａは、１２周期のＳＥＬＥＸ後のＤＮＡ濃縮プール（白丸）およびＤＮＡ非選択ランダムプール（黒丸）の、Ｔａｑポリメラーゼに対する結合親和性を示す。図１Ｂは、１０周期のＳＥＬＥＸ後のＤＮＡ濃縮プール（白丸）およびＤＮＡ非選択ランダムプール（黒丸）の、Ｔｔｈポリメラーゼに対する結合親和性を示す。
【図２】図２Ａは、Ｔａｑポリメラーゼに関する濃縮ＤＮＡプール（白丸）およびＴｔｈポリメラーゼに関する濃縮ＤＮＡプール（黒丸）の、Ｔｔｈポリメラーゼに対する交差結合解析を示す。図２Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼに関する濃縮ＤＮＡプール（白丸）およびＴｔｈポリメラーゼに関する濃縮ＤＮＡプール（黒丸）の、Ｔａｑポリメラーゼに対する交差結合解析を示す。
【図３】図３Ａは、リガンド３０（ＴＱ３０（配列番号５０））（黒丸）およびリガンド２１（ＴＱ２１（配列番号５９））（白丸）の、Ｔａｑポリメラーゼに対する結合曲線を示す。図３Ｂは、リガンド３０（黒丸）およびリガンド２１（白丸）の、Ｔｔｈポリメラーゼに対する結合曲線を示す。
【図４】図４Ａ−Ｅは、５５℃で測定したＴａｑポリメラーゼに対するいくつかの全長リガンドの結合曲線を示す。図４Ａ−Ｄは、ファミリーＩに属するリガンドの相互作用を示し、一方図４Ｅは、ファミリーＩＩの代表的なリガンドの結合を示す。
【図５】図５Ａ−Ｄは、ＴＺ０５ポリメラーゼに対するいくつかの全長リガンドの結合相互作用を示す。
【図６】図６は、ポリメラーゼ活性をアッセイするのに用いた、ヘアピンＤＮＡ基質およびその産物を例示する。
【図７Ａ】図７Ａは、異なる温度で、異なるインキュベーション時間を用いて行った、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに関するポリメラーゼ活性アッセイを例示する。図６に示される末端標識ＤＮＡ基質を、変性条件下で、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。パネル１のデータは、ＴａｑポリメラーゼおよびＴａｑポリメラーゼに関し選択された濃縮プールを用いて得、一方、パネル２に示されるデータは、ＴｔｈポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼに関し選択された濃縮プールを用いて得た。未処理の５’末端標識ＤＮＡヘアピンテンプレート（レーン１）；ポリメラーゼを欠く反応混合物中の標識テンプレート（レーン２）；濃縮プールの非存在下（レーン３）および存在下（レーン４）での、室温で２５分間の、完全反応混合物のインキュベーション。レーン５、６、および７は、それぞれ、３７℃、５０℃および６０℃で５分間の、濃縮プールの存在下での完全反応混合物のインキュベーションを示す。レーン８および９は、濃縮プールの存在下（レーン８）および非存在下（レーン９）での、７０℃で５分間の、完全反応混合物のインキュベーションを示す。レーン１０は、末端標識プールＤＮＡのゲル移動度を示す。ゲルの右側の図式は、出発時の末端標識された短いＤＮＡおよびポリメラーゼ伸長産物の位置を示す。
【図７ＢＣ】図７Ｂおよび７Ｃは、異なる温度で行った、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼに関する第二のアッセイを例示する。ＤＮＡは、変性条件下で、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。図７Ｂのデータは、Ｔａｑポリメラーゼを用いて得、そして図７Ｃのデータは、Ｔｔｈポリメラーゼを用いて得た。レーン１−３は、それぞれ、室温、３０℃および３７℃で５分間のインキュベーションに際し、いかなる阻害剤も非存在下で得た産物を示す。レーン４−６は、非選択ランダム配列プールを用いて得たデータを示し；レーン７−９は、Ｔａｑポリメラーゼに関する濃縮プールを用いて得たデータを示し；レーン１０−１２は、Ｔｔｈポリメラーゼに関する濃縮プールを用いて得たデータを示し；レーン１３−１５は、示される３つの温度での５分間のインキュベーションでの、Ｔａｑｓｔａｒｔ抗体で得たデータを示す。右側の図式は、出発時の末端標識された短いＤＮＡおよびポリメラーゼ伸長産物を示す。
【図７ＤＥ】図７Ｄおよび７Ｅは、濃縮プールによるＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの可逆的阻害を例示する。図７Ｄは、熱周期にさらされていない、濃縮プールの存在下でのＴａｑポリメラーゼの活性を示し、一方、図７Ｅは、反応に添加される前に熱周期にさらされた、濃縮プールの存在下でのＴａｑポリメラーゼの活性を示す。レーン１−５は、それぞれ、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃および４０℃での５分間のインキュベーションに渡り、形成された産物の量を示す。レーン６−１０は、それぞれ、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃および４０℃での５分間のインキュベーションに渡る、濃縮プールの存在下での、Ｔａｑポリメラーゼ活性を示す。右側の図式は、出発時の末端標識された短いＤＮＡおよびポリメラーゼ伸長産物を示す。
【図８】図８は、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）による、Ｔａｑポリメラーゼ（図８Ａ）およびＴｔｈポリメラーゼ（図８Ｂ）の阻害に対する温度の影響を示す（レーン１−１０）。ＤＮＡは、変性条件下で、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。レーン１１−１５は、阻害剤の非存在下での産物の形成を示す。オートラジオグラムの右側は、ポリメラーゼ伸長前および後の５’標識テンプレートを図式的に示す。図８Ｃおよび８Ｄは、それぞれ、Ｔａｑポリメラーゼ（図８Ｃ）およびＴｔｈポリメラーゼ（図８Ｄ）を用い、リガンドＴＱ２１（白丸）およびリガンドＴＱ３０（黒丸）の存在下で形成された産物のパーセントを示す。産物量は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た（図８ＣおよびＤ（横座標））。
【図９】図９ＡおよびＢは、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）によるＴａｑポリメラーゼの可逆的阻害を例示する。ＤＮＡは、変性条件下で、１０％ポリアクリルアミド上で分離する。レーン１−５は、２０℃−４０℃の間でのインキュベーションに際し、いかなる阻害剤も非存在下で得た産物を示す。レーン６−１０は、熱反復されていないリガンドＴＱ３０（図９Ａ）および２５周期の熱反復にさらされたリガンドＴＱ３０（図９Ｂ）の存在下で、２０℃−４０℃の間でのインキュベーションに際し、形成された産物を示す。
【図１０】図１０ＡおよびＢは、リガンドＴＱ３０（配列番号５０）（黒丸）およびＴＱ２１（配列番号５９）（白丸）による、Ｔａｑポリメラーゼ（図１０Ａ）およびＴｔｈポリメラーゼ（図１０Ｂ）の阻害に対するリガンド濃度の影響を示す。テンプレート伸長アッセイにおける、多様な濃度の阻害剤の存在下で形成された産物の量は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た（横座標）。
【図１１】図１１は、リガンド６（配列番号７８）、１５（配列番号８６）、１０（配列番号８５）および１８（配列番号８３）によるＴａｑポリメラーゼの阻害に対する温度の影響を示す。伸長産物は、変性条件下で、１０％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した後、オートラジオグラフィーにより、解析した。
【図１２】図１２ＡおよびＢは、Ｔａｑポリメラーゼを用い、リガンド６（黒丸）、リガンド１０（黒三角）、およびリガンド１５（黒四角）（図１２Ａ）並びにリガンド１８（黒丸）、リガンド１９（黒三角）、およびリガンド２０（黒四角）（図１２Ｂ）の存在下で形成された産物のパーセントを示す。産物量は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。
【図１３】図１３Ａ−Ｆは、リガンドＴＺ１（配列番号９４）、ＴＺ２（配列番号９６）、ＴＺ３（配列番号１０６）、ＴＺ８（配列番号１００）、ＴＺ９（配列番号１０１）およびＴＺ１３（配列番号８９）によるＴＺ０５ポリメラーゼの阻害に対する温度の影響を示す。伸長産物は、変性条件下でのゲル電気泳動後、オートラジオグラフィーにより、解析した。
【図１４】図１４は、高温での親和性選択後に得られた多様なリガンドを用い、Ｔａｑポリメラーゼの阻害に対するリガンド濃度の影響を示す（リガンド６（配列番号７８）（黒丸）、リガンド２２（配列番号８１）（黒三角）およびリガンド２８（配列番号８７）（黒四角））。ヘアピン伸長アッセイは、実施例２に記載されるように行った。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。
【図１５】図１５ＡおよびＢは、Ｔｒｉｓ緩衝液（図１５Ａ）およびＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液（図１５Ｂ）中のリガンド６（配列番号７８）（黒丸）、リガンド２２（配列番号８１）（黒三角）およびリガンド２８（配列番号８７）（黒四角）のＩＣ50値に対する温度の影響を示す。
【図１６】図１６は、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により触媒される、置換鎖と予測される２つのステム−ループを持つ、９７ヌクレオチドＤＮＡ配列（Ｅｘｏ−Ｓｕｂ）（５’−ＴＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣ−３’（配列番号７５））の切断を図式的に例示する。フォールディングした配列の極性は、小さい矢印により示される。ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により仲介される切断は、置換鎖およびらせんの結合部近傍で起こり、２０ヌクレオチドおよび７７ヌクレオチドの２つのＤＮＡ断片を生じると期待される。分子の両端の黒丸は、放射標識を示す。
【図１７】図１７は、ＴＺ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に対する、リガンドＴＺ１３（配列番号８９）、ＴＺ１３一部切除体（５１ヌクレオチド）およびＴＺ３６（配列番号９９）の影響の解析を示す。レーンＵは、両端での未処理Ｅｘｏ−Ｓｕｂ標識の移動度を示す。レーンＣは、リガンドの非存在下でのＴＺ０５ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ切断から生じる切断産物（７８ヌクレオチドおよび２４ヌクレオチド）を示す。レーン１−４、５−８、および９−１２は、それぞれ、増加する濃度のＴＺ１３、ＴＺ１３−ＴｒｎｃおよびＴＺ３６リガンドの存在下でのＥｘｏ−Ｓｕｂ切断を示す。アプタマー濃度は、２５０  ｎＭから２０００  ｎＭの範囲であった。レーンＣから１２までのすべての反応は、同一条件下で行った。
【図１８】図１８は、５’標識リガンド６（配列番号７８）、２２（配列番号８１）および２８（配列番号８７）に対するＴａｑポリメラーゼの影響を例示する。各リガンドに関し、レーン１および４は、インキュベーションが緩衝液のみで行われたコントロールである。レーン２および５は、Ｔａｑポリメラーゼとのインキュベーション後の結果を示し、そしてレーン３および６は、Ｔａｑポリメラーゼおよび４つのｄＮＴＰすべてとのインキュベーション後の結果を示す。下部の矢印は、エキソヌクレアーゼ切断から生じる切断産物を示し、一方、上部の矢印は、リガンドの伸長産物を示す。
【図１９】図１９ＡおよびＢは、ＴＱＨ６（配列番号７８）（図１９Ａ）およびＴＱＨ２２（配列番号８１）（図１９Ｂ）の全長（黒丸）および一部切除（黒四角）リガンドによるストッフェル断片の阻害を示す。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。産物の５０％が形成された温度は、リガンドのＩＴ50値である。
【図２０】図２０ＡおよびＢは、ＴＱＨ６（図２０Ａ）およびＴＱＨ２２（図２０Ｂ）の全長（黒丸）および一部切除（黒四角）リガンドによるＴｔｈポリメラーゼの阻害を示す。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。産物の５０％が形成された温度は、リガンドのＩＴ50値である。
【図２１】図２１ＡおよびＢは、ＴＱＨ６（図２１Ａ）およびＴＱＨ２２（図２１Ｂ）の全長（黒丸）および一部切除（黒四角）リガンドによるＴＺ０５ポリメラーゼの阻害を示す。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。産物の５０％が形成された温度は、リガンドのＩＴ50値である。
【図２２】図２２ＡおよびＢは、Ｔａｑポリメラーゼ（図２２Ａ）およびＴｔｈポリメラーゼ（図２２Ｂ）に対する、ＴＺ１３（配列番号８９）（黒四角）およびＴＺ５４一部切除体（５１ヌクレオチド）（黒丸）の結合解析を示す。
【図２３】図２３Ａ−Ｃは、ＴＺ０５ポリメラーゼに高温で結合するよう選択された、リガンドＴＺ１（配列番号９４）（黒丸）、ＴＺ１３（配列番号８９）（黒四角）およびＴＺ３６（配列番号９９）（黒三角）による、多様な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの阻害の解析を示す。図２３Ａは、Ｔｔｈポリメラーゼの活性に対するリガンドの影響を示し；図２３Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼの活性に対するリガンドの影響を示し；図２３Ｃは、ストッフェル断片の活性に対するリガンドの影響を示す。
【図２４】図２４Ａ−Ｃは、標準的ＰＣＲ増幅、「ホットスタート」ＰＣＲ、並びにオリゴヌクレオチド阻害剤ＴＱ３０（配列番号５０）およびＴＱ２１（配列番号５９）の存在下でのＰＣＲ増幅（「ＮｅＸスタートＰＣＲ」）を用いた、低コピー数標的の検出を例示する。図２４Ａは、〜１０および５０コピーで標的を検出する際の、標準的条件（レーン１−３）下で行った増幅と、「ホットスタート」ＰＣＲ（レーン４−６）の比較を例示する。図２４Ｂは、〜１０および５０コピーで標的を検出する際の、非特異的（ＮＳ）オリゴヌクレオチド（レーン１−３）の存在下で行ったＰＣＲ増幅と、ＴＱ２１（レーン４−６）およびＴＱ３０（レーン７−９）のものの比較を例示する。図２４Ｃは、オリゴヌクレオチド阻害剤ＴＱ２１およびＴＱ３０の存在下での、（示されるような）非常に低い数の標的コピーの検出を例示する。（Ｂ）および（Ｃ）とも、オリゴヌクレオチド阻害剤は、５０  ｎＭの濃度で用いた。Ｍは分子量標準を示す。各パネルの矢印は、ゲルにおける標的特異的２０３  ｂｐ  ＤＮＡの位置を示す。
【図２５】図２５は、リガンドの一部切除オリゴヌクレオチド阻害剤、ＴＱＨ６（配列番号７８）、ＴＱＨ２２（配列番号８１）およびＴＱＨ２８（配列番号８７）の存在下でのＰＣＲ増幅（「ＮｅＸスタートＰＣＲ」）を用いた、低コピー数標的の検出を例示する。すべてのＰＣＲ増幅は、非手動「ホットスタート」を用い、１μｇのヒト胎盤ＤＮＡの存在下で行った。レーン１−４は、リガンドの非存在下で行ったＰＣＲ増幅の結果を示す。奇数のレーンに示される反応は、ＨＩＶ−２テンプレートＤＮＡを含まず、一方、偶数で示されるものは、１０コピーのＨＩＶ−２ゲノムＤＮＡを含んだ。矢印は特異的単位複製物を示す。
【図２６】図２６は、ヒトＫ−ｒａｓ遺伝子から１０４  ｂｐの単位増幅物を増幅するＰＣＲ系を用いた、低コピー数標的の検出を例示する。ＴＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼを含むすべての増幅反応は、手動ホットスタート条件なしで行った。レーン１では、テンプレートＤＮＡを添加せず；レーン２では、アプタマーを添加せず；レーン３−９では、増加する濃度の５１ヌクレオチド一部切除ＴＺ１リガンドを用い、完全なＰＣＲを行った。リガンド濃度は、１．３  ｎＭの濃度から開始し、１つの反応から次には二倍とした。レーンＭはＤＮＡサイズ標準を示す。
【図２７】図２７ＡおよびＢは、ＴＺ１（図２７Ａ）およびＴＺ１３（図２７Ｂ）の３０ヌクレオチド一部切除体の存在下で、ＴＺ０５ポリメラーゼによるヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の増幅を示す。ＴＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼを含むすべての増幅反応は、手動ホットスタート条件なしで行った。レーン１では、テンプレートＤＮＡを添加しなかった。レーン２では、リガンドを添加しなかった。レーン３−９では、増加する濃度の各リガンドを用い、完全なＰＣＲを行った。リガンド濃度は、１．３  ｎＭの濃度から開始し、各連続反応で二倍とした。
【図２８】図２８は、ＴＺ３６の５１ヌクレオチド一部切除体の存在下で、ＴｔｈポリメラーゼによるヒトＫ−ｒａｓ遺伝子の増幅を示す。すべての増幅反応は、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを含み、そして手動ホットスタート条件なしで行った。レーン１では、テンプレートＤＮＡを添加しなかった。レーン２では、リガンドを添加しなかった。レーン３−９では、増加する濃度のリガンドを用い、完全なＰＣＲを行った。リガンド濃度は、１．３  ｎＭの濃度から開始し、各連続反応で二倍とした。
【図２９】図２９は、Ｔａｑポリメラーゼの活性に対する、Ｔｒｕｎｃ．１−３０（配列番号７５）（黒丸）、Ｔｒｎｃ．２−３０（配列番号７６）（黒四角）およびＴｒｎｃ．３−３０（配列番号７７）（黒三角）の濃度の影響を示す。多様な濃度の阻害剤の存在下で形成された産物の量は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た（横座標）。
【図３０】図３０は、ストッフェル断片の活性に対する、一部切除リガンドＴｒｕｎｃ．１−３０（黒丸）、Ｔｒｎｃ．２−３０（黒四角）およびＴｒｎｃ．３−３０（黒三角）の阻害剤濃度の影響を示す。多様な濃度の阻害剤の存在下で形成された産物の量は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た（横座標）。
【図３１】図３１Ａ−Ｃは、一部切除リガンドＴｒｎｃ．２１（配列番号７０）の親和性および阻害特性を例示する。図３１Ａは、Ｔａｑポリメラーゼに対するリガンドＴｒｎｃ．２１の結合曲線を示す。図３１Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼ（黒丸）およびＴｔｈポリメラーゼ（白丸）の活性に対するＴｒｎｃ．２１濃度の影響を例示する。ＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼのＩＣ50値は、それぞれ、２１および３６．５  ｎＭである。図３１Ｃは、Ｔｒｎｃ．２１によるＴａｑポリメラーゼ（黒丸）およびＴｔｈポリメラーゼ（白丸）の阻害に対する温度の影響を示す。既定の温度で、阻害剤の存在下で形成された産物の量を、同一温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。ＴａｑポリメラーゼおよびＴｔｈポリメラーゼの計算ＩＴ50値は、それぞれ、３４℃および３５．６℃である。
【図３２】図３２は、リガンド６（配列番号７８）、２２（配列番号８１）および２８（配列番号８７）の一部切除型に対するＴａｑポリメラーゼの影響を例示する。本実験では５’末端標識リガンドを用いた。各リガンドに関し、レーン１および４は、インキュベーションが緩衝液のみで行われたコントロールである。レーン２および５は、Ｔａｑポリメラーゼとのインキュベーション後の結果を示し、そしてレーン３および６は、Ｔａｑポリメラーゼおよび４つのｄＮＴＰすべてとのインキュベーション後の結果を示す。矢印は、リガンドの伸長産物を示す。
【図３３】図３３は、ＴＺ０５ポリメラーゼに対するリガンドの一部切除体の配列を示す。下線のヌクレオチド塩基は、５’および３’固定領域由来である。アステリスクは、ホスホロチオエート結合を示す。
【図３４】図３４ＡおよびＢは、リガンドＴＺ１３（配列番号８９）の異なる一部切除体によるＴＺ０５ポリメラーゼの阻害に対する温度の影響を例示する。ヘアピン基質の伸長産物は、ホスホイメージャーにより定量化し、そして同一の温度で、阻害剤の非存在下で形成された産物に対し規準化し、産物のパーセントを得た。産物の５０％が形成された温度は、アプタマーのＩＴ50値である。
【図３５】図３５は、ＴＺ１およびＴＺ１３の５’末端標識一部切除リガンドに対するＴＺ０５ポリメラーゼの影響を例示する。レーン１−３およびレーン４−６は、各リガンドの５１ヌクレオチドおよび３０ヌクレオチド一部切除体で得た結果を示す。レーン１および４の反応は、ｄＮＴＰを含まず、一方、レーン２、３、５および６ではｄＮＴＰを含んだ。矢印は、エキソヌクレアーゼ切断から生じる切断産物を示す。
【図３６】図３６は、ホモ二量体（Ｄ．３０−Ｄ．３０）（配列番号７１）の親和性および阻害特性を示す。図３６Ａは、Ｔａｑポリメラーゼに対するホモ二量体（Ｄ．３０−Ｄ．３０）の結合曲線を示す（Ｋd＝４７．５±５  ｐＭ）。図３６Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼ活性に対する二量体（黒丸）および単量体（白丸）リガンド濃度の影響を例示する。Ｔｒｎｃ．２−３０（単量体）のＩＣ50値は４８  ｎＭであり、一方、Ｄ．３０−Ｄ．３０（二量体）は１４  ｎＭである。
【図３７】図３７ＡおよびＢは、ヘテロ二量体Ｄ．２１−Ｄ．３０（配列番号７２）の阻害特性を示す。図３７Ａは、Ｔａｑポリメラーゼ（黒丸）およびＴｔｈポリメラーゼ（白丸）活性に対するＤ２１−Ｄ３０濃度の影響を例示する。これら２つのポリメラーゼの阻害に関するＩＣ50値はおよそ３０  ｎＭである。図３７Ｂは、ヘテロ二量体Ｄ．２１−Ｄ．３０によるＴａｑポリメラーゼ（黒丸）およびＴｔｈポリメラーゼ（白丸）の阻害に対する温度の影響を例示する。Ｔａｑポリメラーゼに対するＩＴ50値は、４１℃であり、一方、Ｔｔｈポリメラーゼに対する値は、３４．５℃である。
【図３８】図３８は、ＴＺ１３（配列番号８９）核酸リガンドの３つの二量体の配列およびリンカー構造を示す。
【図３９】図３９ＡおよびＢは、ＴＺ１３（配列番号８９）単量体および図３８に示される３つの二量体の結合および阻害解析を示す。図３９Ａは、ＴＺ０５ポリメラーゼに対する３つの二量体および単量体のニトロセルロースフィルター結合解析を示し、そして図３９Ｂは、反応温度の関数としての３つの二量体および単量体によるＴＺ０５ポリメラーゼ活性の阻害解析を示す。
【図４０】図４０ＡおよびＢは、Ｔａｑポリメラーゼに対するＴｒｎｃ．２１の結合親和性に対する、ｄＮＴＰおよびヘアピンテンプレートＤＮＡの影響を例示する。図４０Ａは、１  ｍＭ  ｄＮＴＰの存在下でのＴｒｎｃ．２１のニトロセルロースフィルター結合解析を示す。黒丸は、ヘアピンＤＮＡテンプレートの非存在下での結合を示し、一方、白丸は、２５０  ｎＭのヘアピンＤＮＡテンプレートの存在下での結合を示す。これらの条件下での計算Ｋd値は、およそ２．５  ｎＭである。図４０Ｂは、Ｔａｑポリメラーゼに対するＴｒｎｃ．２１の結合に対するｄＮＴＰ濃度の影響を例示する。本実験では、１  ｎＭ  Ｔａｑポリメラーゼに対する放射標識Ｔｒｎｃ．２１の結合を、多様な濃度のｄＮＴＰの存在下でモニターした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７ＢＣ】
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【図７ＤＥ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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