(57)【要約】      （修正有）【課題】より実用的な血糖測定センサ用酵素を開発し、より具体的には、センサ用途での広範な利用に耐えうるよう、基質親和性と比活性を向上させた改変型ＦＡＤＧＤＨの提供。【解決手段】基質親和性と比活性に優れ、溶存酸素の影響を受けることのないフラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）。具体的には、野生型アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来ＦＡＤＧＤＨの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより基質親和性および／または比活性を向上させた改変型ＦＡＤＧＤＨおよび該改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡ。【選択図】図１
2011139677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）のアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）〜（５）からなる群より選択される少なくともいずれか１のアミノ酸置換が追加されたアミノ酸配列からなる改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）。
（１）Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍ
（２）Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ
（３）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ
（４）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉ
（５）Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ
【請求項２】
配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）のアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）〜（４）からなる群より選択される少なくともいずれか１のアミノ酸置換が追加されたアミノ酸配列からなる改変型ＦＡＤＧＤＨであって、アミノ酸置換導入前の元のＦＡＤＧＤＨと比較して、Ｋｍ値が低下することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨ。
（１）Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍ
（２）Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ
（３）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉ
（４）Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ
【請求項３】
配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）のアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）〜（５）からなる群より選択される少なくともいずれか１のアミノ酸置換が追加されたアミノ酸配列からなる改変型ＦＡＤＧＤＨであって、アミノ酸置換導入前の元のＦＡＤＧＤＨと比較して、比活性値が上昇することを特徴とする改変型ＦＡＤＧＤＨ。
（１）Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍ
（２）Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ
（３）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ
（４）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉ
（５）Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および付加から選ばれる少なくとも１つの改変がなされたアミノ酸配列からなる改変型ＦＡＤＧＤＨであって、ＧＤＨ活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ＤＮＡの塩基配列において、コドンユーゼージを大腸菌に最適化した請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤＮＡを含む組換え発現プラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え発現プラスミドで形質転換された宿主を含む形質転換体。
【請求項９】
宿主が大腸菌である請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の形質転換体を培養することを含む改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキット。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサ。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース濃度の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）の特定のアミノ酸を他のアミノ酸に変更することにより基質親和性および／または比活性を向上させた改変型ＦＡＤＧＤＨの遺伝子ならびに該遺伝子にコードされるアミノ酸配列から成る改変型ＦＡＤＧＤＨに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いたバイオセンサの開発は、産業の分野を問わず盛んに行われてきた。その代表的なものとして、主に医療分野で使用されるグルコースセンサが挙げられる。
【０００３】
グルコースセンサは、酵素と電子伝達物質を含む反応系を構築するためのものであり、このグルコースセンサを利用する場合には、例えばアンペロメトリックな手法を用いてグルコースが定量される。酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）が利用されてきた。
【０００４】
ＧＯＤはグルコースに対する基質特異性が高く熱安定性に優れており、酵素の量産化が可能であるために生産コストが他の酵素と比べて安価であるといった利点があるが、その反面、ＧＯＤを使用した系は測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けるため、測定結果が不正確になる問題があった。
【０００５】
一方、ＧＤＨを使用した系は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けない。このため、ＧＤＨを使用した系は、酸素分圧が低い環境下で測定を行ったり、酸素量が多く要求される高濃度サンプルを測定する場合であっても、精度よくグルコース濃度を測定することができる。
【０００６】
しかしながら、ＧＤＨは溶存酸素の影響を受けない点においてＧＯＤに勝るが、例えば補酵素としてＮＡＤの添加が必須のＮＡＤＧＤＨは安定性に乏しく、ピロロピノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素としてもつＰＱＱＧＤＨは基質特異性が低くマルトース等への糖類にも作用するため、グルコースセンサとして利用した場合、測定値の正確性が損なわれるといった問題があった。
【０００７】
特に、マルトースに対する反応性に関しては、インスリン製剤とマルトース療法を併用する糖尿病患者に対し測定血糖値が偽高値となって、インスリン過剰投与の結果、低血糖症を引き起こす危険性が指摘されてきた。
【０００８】
したがって、グルコースセンサとして利用する酵素は溶存酸素の影響を受けず、かつグルコース以外の糖への反応性の低い酵素が望まれる。上記のスペックを満たす酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素としてもつＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）が挙げられる。
【０００９】
非特許文献１にはアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の培養外液および菌体内にＦＡＤＧＤＨが存在することが示され、さらに精製された酵素は基質特異性が高く、比活性も高いことが示されている。
【００１０】
しかしながら、アスペルギルス・オリゼの培養液当たりの活性は低く、工業的に生産するには不十分であった。さらに該酵素の遺伝子配列が不明であるため、遺伝子組換えによる工業的な大量生産も不可能であった。また、該酵素の遺伝子を特定して工業的に利用するには、酵素の単離精製、部分アミノ酸配列の解読、該酵素をコードする遺伝子配列の解読といった課題が山積していた。
【００１１】
一方、近年、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株の全ゲノム配列の解読が完了し、一般に公開されて利用することができるようになった。さらに、特許文献１にはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）由来ＦＡＤＧＤＨについて報告され、特許文献２では該ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列およびアミノ酸配列も報告されている。
【００１２】
さらに特許文献３には、アスペルギルス・オリゼＴ１株から抽出したｍＲＮＡより完全長ＦＡＤＧＤＨ遺伝子が報告されており、特許文献４ではＰＣＲを利用したランダム変異導入法と熱安定化酵素のスクリーニングを組み合わせた手法により、熱安定化したＦＡＤＧＤＨ等が得られたことが報告されている。
【００１３】
また、センサ用途の酵素全般に求められることではあるが、センサの性能を評価する際、測定値の正確さ以外に、測定時間の短さも重要な評価項目となる。上述したように、測定値の正確さはセンサに使用している酵素の基質特異性に依存するが、測定時間の短さは酵素の基質親和性と比活性の両方に依存する。したがって、センサ用途の酵素を開発する際には、基質親和性と比活性の両方にも注目する必要がある。
【００１４】
新たな血糖センサ用酵素としてＦＡＤＧＤＨが注目されており、特許文献３には、アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨの完全長遺伝子配列が示されている。また、特許文献４では、ＰＣＲを利用したランダム変異導入法と熱安定化酵素のスクリーニングを組み合わせた手法により、熱安定化した改変型ＦＡＤＧＤＨが得られたことが報告されている。さらに、特許文献４では、基質特異性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨについても報告されている。
【００１５】
センサ部材に酵素を安定して固定する方法、もしくは酵素を固定したセンサを酵素の失活なしに長期保存する方法として、特許文献４に示されているように酵素そのものの耐熱性を向上させる手法がある。
【００１６】
一方で、バイオセンサを作製する際の処方により酵素を安定化させる手法もある。例えば、特許文献５に示されているように、酵素の安定化剤としてラフィノース等を配合することにより酵素の失活を抑制することができる。さらに、特許文献６のように糖アルコールを使用することもできる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００４／０５８９５８号
【特許文献２】国際公開第２００６／１０１２３９号
【特許文献３】国際公開第２００７／１１６７１０号
【特許文献４】国際公開第２００８／０５９７７７号
【特許文献５】特開２００４−３１７３５９号公報
【特許文献６】特開２００５−１１４３５９号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｔｃｈａｎ−ｇｉ Ｂａｋ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３９，２７７−２９３，１９６７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、より実用的な血糖測定センサ用酵素を開発し、広く提供することである。より具体的には、センサ用途での広範な利用に耐えうるよう、基質親和性と比活性を向上させた改変型ＦＡＤＧＤＨを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、酵素の安定化はセンサ作製時の処方で対処できると想定し、酵素の比活性および基質親和性を向上させることがセンサの性能を向上させる為に重要であると考えて種々検討した結果、元のＦＡＤＧＤＨに比べ比活性および／または基質親和性を向上させうることを見出し、本発明に達した。
【００２１】
すなわち、本発明の第一の様態は、配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列において、（１）Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍのアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ、（３）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ、（４）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉおよび（５）Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍからなる群より選択される少なくともいずれか１のアミノ酸置換が追加されたアミノ酸配列からなる改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）を要旨とするものである。
【００２２】
また、本発明の第二の様態は、前記した改変型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換および付加から選ばれる少なくとも１つの改変がなされたアミノ酸配列からなる改変型ＦＡＤＧＤＨをとするものである。
【００２３】
また、本発明の第三の様態は、前記した改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡを要旨とするものであり、好ましくは該ＤＮＡの塩基配列におけるコドンユーゼージを大腸菌に最適化したＤＮＡを要旨とするものである。
【００２４】
また、本発明の第四の様態は、前記したＤＮＡを含む組換え発現プラスミドを要旨とするものである。
【００２５】
また、本発明の第五の様態は、前記した組換え発現プラスミドを宿主に形質転換した形質転換体を要旨とするものであり、好ましくは宿主が大腸菌である形質転換体である。
【００２６】
また、本発明の第六の様態は、前記した形質転換体を培養することを含む改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法を要旨とするものである。
【００２７】
また、本発明の第七の様態は、前記したいずれか１の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを要旨とするものである。
【００２８】
また、本発明の第八の様態は、前記したいずれか１の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースセンサを要旨とするものである。
【００２９】
また、本発明の第八の様態は、前記したいずれか１の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコース濃度の測定方法を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、酵素の基質親和性の指標であるＫｍ値が低下し、および／または比活性が上昇した改変型ＦＡＤＧＤＨを提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】左側がタンパク質のサイズマーカーで「Ｍ」と表記し、右側が精製したＦＡＤＧＤＨで「ＧＤＨ」と表記して位置を矢印で示した。サイズマーカーの右に示した数値の単位はｋＤａ。
【図２】コンセンサス法に基づく部位特異的変異導入および、推定祖先型アミノ酸配列に基づく部位特異的変異導入に使用したアライメント図を、サイズの問題から３分割した図のうち、Ｎ末端側の図である。
【図３】コンセンサス法に基づく部位特異的変異導入および、推定祖先型アミノ酸配列に基づく部位特異的変異導入に使用したアライメント図を、サイズの問題から３分割した図のうち、真ん中の図である。
【図４】コンセンサス法に基づく部位特異的変異導入および、推定祖先型アミノ酸配列に基づく部位特異的変異導入に使用したアライメント図を、サイズの問題から３分割した図のうち、Ｃ末端側の図である。
【図５】図２から図４のアライメント図のアミノ酸配列情報と最尤法に基づく系統樹作成プログラムにより作成した分子系統樹を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤＧＤＨ）はフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素として持ち、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性をもつ酵素である。
【００３４】
以下、本発明の改変型フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、改変型ＦＡＤＧＤＨともいう）について説明する。本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、配列表の配列番号４で示されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のアミノ酸配列において、（１）Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍのアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ、（３）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ、（４）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉおよび（５）Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍからなる群より選択される少なくともいずれか１のアミノ酸置換が追加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００３５】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨは、アミノ酸置換導入前（以下、「改変前」ともいう）の元のＦＡＤＧＤＨと比較して、基質親和性および／または比活性が向上したポリペプチドである。
【００３６】
本発明の基質親和性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨは、改変前の対応するＦＡＤＧＤＨと比較して、基質親和性の指標であるＫｍ値が低下したものが好ましく、Ｋｍ値が３０以下、１以上であるものが好ましい。
【００３７】
ここで、Ｋｍ値とはミカエリス定数ともいい、ミカエリス・メンテン型の酵素反応速度式において最大速度Ｖｍａｘとともに含まれる定数で、グルコースデヒドロゲナーゼの場合はグルコースに対する親和性を表す数値である。同じ基質に対してＫｍ値が異なる酵素の場合はＫｍが小さいほど作用が強い。本発明におけるＫｍ値は、後述の条件で測定し、計算した値を意味する。
【００３８】
さらに、本発明の基質親和性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨは、Ｋｍ値が改変前の対応するＦＡＤＧＤＨのＫｍ値と比較して９０％以下であることが好ましく、８０％以下がより好ましく、７０％以下が最も好ましい。
【００３９】
本発明の基質親和性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨとしては、配列表の配列番号４で示されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のアミノ酸配列において、（１）Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍのアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ、（３）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉおよび（４）Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍからなる群より選択される少なくともいずれか１のアミノ酸置換が追加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００４０】
また、本発明の比活性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨは、改変前の対応するＦＡＤＧＤＨと比較して、比活性値が向上したものが好ましく、比活性値が７００Ｕ／ｍｇ−タンパク質以上であるものがより好ましく、１０００Ｕ／ｍｇ−タンパク質以上であるものがさらに好ましい。
【００４１】
本発明の比活性値が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨは配列表の配列番号４で示されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のアミノ酸配列において、（１）Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍのアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ、（３）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ、（４）Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉおよび（５）Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍからなる群より選択される少なくともいずれか１のアミノ酸置換が追加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００４２】
ここで、比活性値とはタンパク質重量当たりの活性値を表す。本明細書における比活性値は、後述の条件で測定し、計算した値を意味する。
【００４３】
さらに、本発明の比活性が向上した改変型ＦＡＤＧＤＨの比活性値は、改変前の対応するＦＡＤＧＤＨの比活性値と比較して１２０％以上であることが好ましく、１５０％以上がより好ましく、１７０％以上が最も好ましい。
【００４４】
配列表を除いた本明細書におけるアミノ配列中の２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。すなわち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
【００４５】
本明細書における「Ｎ３４Ｄ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば「Ｎ３４Ｄ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から３４番目のアミノ酸Ｎを、アミノ酸Ｄに置換することを意味する。
【００４６】
また、例えば「Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ」とは、Ｇ２０Ａ、Ｌ２８９ＱおよびＩ２９０Ｌのアミノ酸置換を同時に導入することを意味する。
【００４７】
本発明には、上述した改変型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入および置換から選ばれる少なくとも１つの改変がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドも含有される。さらに、ＧＤＨ活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００４８】
また、前記改変型ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列において、１個乃至２０個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入および置換から選ばれる少なくとも１つの改変がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましく、１個乃至１０個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入および置換から選ばれる少なくとも１つの改変がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。
【００４９】
さらに、1個乃至６個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入および置換から選ばれる少なくとも1つの改変がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドがさらに好ましく、数個（１から２または３個）のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入および置換から選ばれる少なくとも1つの改変がなされたアミノ酸配列からなるポリペプチドが特に好ましい。
【００５０】
さらに好ましくは、１個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。さらに、ＧＤＨ活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００５１】
さらに、本発明は、上述した改変型ＦＡＤＧＤＨに相同性を有するポリペプチドを含む。当該ペプチドとしては、例えば、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するポリペプチドをあげることができる。さらに、ＧＤＨ活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００５２】
ここで、「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎal  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ［ＮＣＢＩ］］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖa，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ.１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターとしては、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１が例示される。
【００５３】
以下、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え発現プラスミド、該プラスミドを導入した形質転換体、およびそれらの製造方法、また、該形質転換体を用いた改変型ＦＡＤＧＤＨの製造方法について説明する。
【００５４】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡとしては、例えば後述の遺伝子の全合成法およびＤＮＡの変異導入法により得ることができるＤＮＡが挙げられる。
【００５５】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡは、該ＤＮＡまたはこれを有する細胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞から、例えば配列表の配列番号３で示される配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することによって得られるＤＮＡであって、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含む。
【００５６】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、相同性が高い核酸同士、例えば７０〜９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件等が挙げられる。
【００５７】
また、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは、前記のストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
【００５９】
また、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡには、該ＤＮＡに相同性を有するＤＮＡであって、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。相同性としては、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。
【００６０】
ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．  Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターとしては、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１が例示される。
【００６１】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡは、コドンユーゼージ（コドン出現頻度、ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を宿主に最適化したものが好ましく、コドンユーゼージが大腸菌に最適化したＤＮＡがより好ましい。
【００６２】
コドンユーゼージを表す指標として、各コドンの宿主最適コドン使用頻度の総計を採択する。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち出現頻度が最も高いコドンと定義する。コドンユーゼージは、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌のコドンユーゼージの一例として以下のものが挙げられる。
【００６３】
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
【００６４】
本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨをコードするＤＮＡを、発現ベクターに連結させることにより、組換え発現プラスミド（以下、組換えベクターともいう）が得られる。
【００６５】
ここで発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えば後述する大腸菌（エシェリヒア・コリ）を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１１などが例示される。
【００６６】
一方、プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびコスミドであるＳｕｐｅｒ  Ｃｏｓ  Ｉなどが例示される。シュードモナスを用いる場合には、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２およびｐＣＮ５１などが例示される。
【００６７】
作製された改変型ＦＡＤＧＤＨのＤＮＡは、発現ベクターと結合した組換えベクターの状態で宿主中に安定に保存される。
【００６８】
宿主としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されない。宿主としては、真核生物でも原核生物でもよいが、微生物が好ましく、より好ましくは大腸菌、さらに好ましくは大腸菌ＤＨ５αおよび大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲを用いることができる。
【００６９】
宿主に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主が大腸菌の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法およびエレクトロポーレーション法などを用いることができる。
【００７０】
組換え発現プラスミドＤＮＡの分離・精製は、微生物を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼおよび他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤が併用される。
【００７１】
さらに、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００７２】
ＤＮＡの切断は、常法にしたがい、例えば制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素を用いる。ポリヌクレオチドと発現ベクターとの結合は、例えばＤＮＡリガーゼを用いて行う。
【００７３】
次いで、組換えベクターにマーカーを施して、該組換えベクターを宿主に移入して形質転換体を形成する。該形質転換体から、組換えベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する遺伝子供与微生物を得る。
【００７４】
ＦＡＤＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列は、従来公知の方法、例えばジデオキシ法により解読できる。ＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列は、当該方法により決定された塩基配列より推定できる。
【００７５】
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、好ましくは液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００７６】
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜およびピルビン酸などを使用する。
【００７７】
窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物および大豆粕アルカリ抽出物などを使用する。
【００７８】
その他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用する。
【００７９】
培養温度は、宿主が生育し、宿主がＦＡＤＧＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは２０〜３７℃程度である。培養は、ＦＡＤＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。
【００８０】
培地のｐＨは、宿主が発育し、宿主がＦＡＤＧＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。
【００８１】
形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法またはリゾチームなどの溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼおよび他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤を併用することにより可溶化し、ＦＡＤＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現したＦＡＤＧＤＨを培養液中に分泌させることができる。
【００８２】
上記のようにして得られたＦＡＤＧＤＨを含む水溶性画分から該酵素を精製する方法としては、該水溶性画分から直ちに行うこともできるが、該水溶性画分中のＦＡＤＧＤＨを濃縮した後に行うこともできる。
【００８３】
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理および親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法により行うことができる。」ＦＡＤＧＤＨの濃縮には、加熱処理および等電点処理も有効な精製手段である。
【００８４】
濃縮液の精製は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせることによって行うことができる。これらの方法はすでに公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして得られた精製酵素は、例えば、凍結乾燥、真空乾燥およびスプレードライにより粉末化して市場に流通させることができる。
【００８５】
本発明はまた、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを含む。本発明のグルコースアッセイキットは、本発明に従う改変型ＦＡＤＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。
【００８６】
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエータ、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、および使用にあたってのプロトコルを含んでもよい。本出願における改変型ＦＡＤＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００８７】
本発明はまた、本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを用いるグルコースセンサを含む。電極としては、例えば、カーボン電極、金電極および白金電極などを用いることができ、該電極上に本発明の酵素を固定化する。
【００８８】
固定化方法としては、例えば、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマーおよび酸化還元ポリマーなどが挙げられる。また、フェロセンまたはその誘導体に代表される電子メディエータとともにポリマー中に固定または電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。
【００８９】
例えば、グルタルアルデヒドを用いて本出願における改変型ＦＡＤＧＤＨをカーボン電極上に固定化し、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。
【００９０】
グルコース濃度の測定は、次のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエータとしては、例えば、フェリシアン化カリウムおよびフェナジンメトサルフェート等を使用できる。
【００９１】
作用電極として本出願における改変型ＦＡＤＧＤＨを固定化した電極を用い、対極および参照電極を用いることができる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００９２】
本発明において、ＧＤＨ活性の測定は以下の条件で行う。
（試薬）
１００ｍＭ  リン酸バッファーｐＨ６．５
４ｍＭ  ２,６−ジクロロフェノールインドフェノール(ＤＣＩＰ)
４ｍＭ  ＰＭＳ
１Ｍ  Ｄ−グルコース
１０％  ＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００
上記リン酸バッファーを１２．３ｍＬ、ＤＣＩＰ溶液を０．５ｍＬ、ＰＭＳ溶液を１．０ｍＬ、グルコース溶液を６ｍＬ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液０．２ｍＬを混合して酵素反応測定試薬とする。
【００９３】
（測定条件）
酵素反応測定試薬０．９ｍＬを分光光度計用セルに入れ、３７℃で３分間以上プレインキュベートする。ＧＤＨ溶液０．００５ｍＬを添加してよく混合し、３７℃で予めインキュベートされた分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を９０秒間記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ）を測定する。ブランクは、ＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨの溶媒を酵素反応測定試薬に混合して上記のように１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ）を測定する。これらの値から、下記の計算式にしたがって活性値を求める。
【００９４】
ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度３００ｍＭのグルコース存在下において、１分間に１マイクロモルのＤＣＩＰを還元する酵素量として定義される。
【００９５】
活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛−（ΔＯＤ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×９０５×希釈倍率｝／（１８．５×５×１．０）
なお、上記計算式の９０５は酵素反応測定試薬と酵素溶液の液量、１８．５は本測定条件におけるＤＣＩＰの分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、５は酵素溶液の液量、１．０は酵素活性測定に使用するセルの光路長（ｃｍ）を示す。
【００９６】
本発明において、ＦＡＤＧＤＨの比活性の測定は以下の条件で行う。
（試薬）
酵素希釈液：２０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー  ｐＨ５．２、０．１％  ＢＳＡ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
酵素反応測定試薬：上記のＧＤＨ活性の測定に使用した試薬と同じ組成のもの
ブラッドフォード試薬：例えば市販品（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用する。
【００９７】
（測定条件）
必要であれば酵素原液を酵素希釈液で希釈し、上記活性測定法により活性を求める。酵素原液のタンパク質濃度を、ブラッドフォード試薬により定法に従って測定する。検量線はＢＳＡでとり、ブランクは酵素希釈液でとる。
【００９８】
上記計算式により、酵素原液の活性（Ｕ／ｍＬ）を求め、同時にＢＳＡを対照として求めた酵素原液のタンパク質濃度を求める。これらの値から、以下の計算式にしたがって、比活性を求める。
【００９９】
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝（活性）／（タンパク質濃度）
【０１００】
本発明において、ＦＡＤＧＤＨのＫｍの測定は以下の条件で行う。
（試薬）
１００ｍＭ  リン酸バッファーｐＨ６．５
４ｍＭ  ２,６−ジクロロフェノールインドフェノール(ＤＣＩＰ)
４ｍＭ  ＰＭＳ
Ｄ−グルコース
１０％  ＴｒｉｔｉｏｎＸ−１００
Ｄ−グルコースは、１Ｍ、０．５Ｍ、０．２５Ｍ、０．１２５Ｍ、０．０９４Ｍ、０．０６３Ｍ、０．０３１Ｍの計７種類の溶液を準備する。
【０１０１】
上記リン酸バッファーを１２．３ｍＬ、ＤＣＩＰ溶液を０．５ｍＬ、ＰＭＳ溶液を１．０ｍＬ、グルコース溶液を６ｍＬ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を０．２ｍＬを混合して計７種類のグルコース濃度の異なるＫｍ測定用試薬を調製する。Ｋｍ測定用試薬のグルコース終濃度は、３００ｍＭ、１５０ｍＭ、７５ｍＭ、３７．５ｍＭ、２８ｍＭ、１８．８ｍＭ、９．４ｍＭとなる。
【０１０２】
（測定条件）
必要であれば酵素原液を酵素希釈液で希釈する。酵素反応測定試薬０．９ｍＬを３７℃で３分間以上プレインキュベートする。ＧＤＨ溶液０．００５ｍＬを添加してよく混合し、３７℃で予めインキュベートされた分光光度計で、６００ｎｍの吸光度変化を９０秒間記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ）を測定する。ブランクは、ＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨの溶媒を酵素反応測定試薬に混合して上記のように１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ）を測定する。これらの値から、下記の計算式にしたがって反応速度を求める。
【０１０３】
ここで反応速度とは、計７通りのグルコース濃度において、１分間の吸光度変化として定義される。
【０１０４】
反応速度(ΔＡ)＝−（ΔＯＤ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）
横軸にグルコース濃度、縦軸にΔＡをプロットすると、ミカエリス・メンテンプロットが描ける。Ｋｍ値は、公知のコンピュータープログラムを利用してラインフィッティング法により引いた曲線から算出させる。
【０１０５】
以下、本発明の一態様を詳細に説明する。
【０１０６】
国際公開２００７／１１６７１０号には、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）Ｔ１株から抽出したｍＲＮＡより完全長ＦＡＤＧＤＨ遺伝子が報告されており、コードされているＦＡＤＧＤＨの全長アミノ酸配列も推定されている。本発明に関しては該アミノ酸配列を利用した。
【０１０７】
上記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを有していない場合は、遺伝子の全合成法により該ＤＮＡを増幅することが可能である。ここでの遺伝子の全合成法としては、簡便に利用できる以下のような方法が挙げられるが限定はされない。
【０１０８】
ＰＣＲを使用した遺伝子の全合成法には、材料として好ましくは１００ｍｅｒ程度の合成オリゴヌクレオチドを使用する。合成オリゴヌクレオチドは、所望の遺伝子配列に基づいて設計することもできるし、所望の遺伝子を異種発現させる際には宿主のコドンユーゼージを使用して設計することもできる。
【０１０９】
例えば、真菌の遺伝子を大腸菌で発現させる際は、合成する遺伝子配列のコドンユーゼージを大腸菌に最適化するようにオリゴヌクレオチドを合成する。所望の遺伝子が２００ｂｐを超える長鎖である場合には、数本から数十本に分割した合成オリゴヌクレオチドを互いにアニーリング部位をもつように設計する。これらの合成オリゴヌクレオチドを鋳型にＰＣＲを行うことにより、所望の遺伝子を増幅させ、利用することができる。
【０１１０】
得られたＤＮＡを発現ベクターに結合させて大腸菌を形質転換し、培養してＦＡＤＧＤＨを発現させ、後述する各種の精製方法によって精製し、Ｋｍおよび比活性を測定したものの、グルコースセンサとしての利用するうえで十分な性能を有しているとは言い難かった。
【０１１１】
本発明者らは鋭意研究の結果、（１）コンセンサス法および（２）系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法、並びに（３）進化工学的な手法といった確率論的な手法を駆使することにより、Ｋｍ値が低下および／または比活性値が上昇した改変型ＦＡＤＧＤＨの取得に至った。
【０１１２】
（１）コンセンサス法
マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法とは、本来は抗体の機能改変を目的として利用され始め、酵素の熱安定性の向上を目的として利用された実績もあるＤＮＡ配列あるいはアミノ酸配列における部位特異的変異導入法（配列上のどの位置にどの変異を導入するか部位特異的に決定する方法）であり、本発明のように酵素の活性がない原因となっている部位の改変に利用された実績もある（詳細については、Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４０，１８８−１９２，１９９４を参照）。しかし、必ずしも成功するとは限らない。
【０１１３】
マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法の材料としては、既知のアミノ酸配列を公知のデータベースに対して相同性検索することで得られる複数のアミノ酸配列を、公知のアライメントプログラムなどを利用してマルチプルアライメントさせた図を使用する。マルチプルアライメント図のすべての座位は、コンピュータープログラムにより挿入、欠失および置換等が最小となるように並べられる。したがって、アミノ酸配列の欠失等により候補タンパク質に活性がない場合には、候補タンパク質のアミノ酸配列の特定の座位が欠失し、候補遺伝子以外のアミノ酸配列には何らかのアミノ酸が配置されている状況が観察されることがある。その座位において候補タンパク質以外のアミノ酸残基に例えばメチオニン（Ｍ）が多く配列していれば、該欠失部位にＭを挿入する。同様にセリン（Ｓ）が多く配置していれば、該欠失部位にＳを挿入する。このような多数決的な決定による変異導入法をコンセンサス法と呼ぶ。
【０１１４】
（２）系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法
系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法は、ある特定の酵素についての複数の生物種における共通祖先のアミノ酸配列を推定し、該アミノ酸配列をもとの酵素に変異として導入することにより共通祖先の酵素の機能を推察する目的で開発された手法である。一般的に共通祖先型の酵素はもとの酵素に対して耐熱化することが示されており、全生物の共通祖先が超好熱菌であるとの仮説を支持するものであるが、本発明における利用のように酵素活性が発現しない原因となっている部位の改変にも使用した実績もある（詳細については、「Ｈｉｓａｋｏ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４３，３９３−３９８，２００５」、「Ｋｅｉｋｏ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８０，３８６７−３８７１，２００６」、「ＪＰＡ２００２−２４７９９１」を参照）。しかし、必ずしも成功するとは限らない。
【０１１５】
材料としては、候補遺伝子のアミノ酸配列をデータベースに対して相同性検索することで得られた複数の相同アミノ酸配列、それらを基に作成した分子系統樹（以下、系統樹とも表記する）および系統樹作成のためのアルゴリズム、並びにマルチプルアライメント図を利用する。
【０１１６】
系統樹作成のための様々なアルゴリズム、例えば、最大節約原理に基づくアルゴリズム等が知られており、それを実現するコンピュータープログラムも利用または入手することができる。例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、ＰＵＺＺＬＥ、ＭＯＬＰＨＹおよびＰＨＹＬＩＰ等の種々の系統樹推定プログラムが利用できる。
【０１１７】
また、最尤原理に基づくアルゴリズム等も知られており、それを実現するコンピュータープログラムも利用または入手することができる。例えば、ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ、ＰＨＹＭＬおよびＰＨＹＬＩＰ、ＴｒｅｅＦｉｎｄｅｒ等の種々の系統樹推定プログラムが利用できる。それらを用いて系統樹を作製することができるが、より簡便には、既に公表されている系統樹を利用することもできる。
【０１１８】
このような系統樹においては、分子進化的に近い位置の生物種は、系統樹中で近い位置に現れる。また、系統樹中で根元に近い位置にある生物種はより祖先に近いと考えられる。
【０１１９】
候補遺伝子のアミノ酸配列をデータベースに対して相同性検索することで得られた複数の相同アミノ酸配列のデータを基に適当なプログラムを使用してマルチプルアラインメントの結果が得られたならば、特定の系統樹における祖先型タンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。
【０１２０】
本発明においては、特に最大節約法または最尤法（「Ｙｏｕｎｇ，Ｚ．,Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｎｅｉ．Ｍ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４１，１６４１−１６５１０，１９９５」、「Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．−Ｂ．Ａｃｔｉｖｅ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４,１２−１３，１９９５」、「根井正利『分子進化遺伝学』培風館、「根井正利、S. クマー『分子進化と分子系統学』培風館」）を用いた。
【０１２１】
本発明に使用し得る最大節約法とは、祖先型を仮定したときにその後生じると予想される変異の事象の数が最も少ない祖先型の過程を真の祖先型と推定する方法である。また、最大節約法に基づいてアミノ酸配列から直接に祖先型推定を行なうためのプログラムＰＲＯＴＰＡＲＳも利用可能である。この方法では原理的には系統樹の推定と祖先型アミノ酸の推定が同時に行われるため、必ずしも系統樹を作成することは必要ではないが、特に手動計算で祖先型アミノ酸を推定する場合には系統樹を作成することが好ましい。
【０１２２】
本発明に使用し得る最尤法とは、予め決定した系統樹の樹形とアミノ酸置換モデルに基づいて、樹形の特定の位置に（主に系統樹の根にあたる部分）おけるあらゆる祖先型アミノ酸配列を推定し、最も尤度の高い配列を最も有望な祖先型アミノ配列として選択する方法である。また、最尤法に基づいて、系統樹およびアミノ酸配列のマルチプルアライメントから祖先型推定を行うためのプログラムＰＡＭＬ等も利用可能である。
【０１２３】
いずれかの方法で得られた系統樹を利用してマルチプルアラインメントしたアミノ酸残基のそれぞれの部位に関して祖先型アミノ酸を決定することができる。このようにして、マルチプルアラインメントした配列の各々の残基に関して祖先型アミノ酸残基を推定し、その結果、対応する領域の祖先型アミノ酸配列を推定することができる。
【０１２４】
この場合、祖先型アミノ酸配列を推定するために用いる生物種を変えると、系統樹の樹形が変化し、それと関連して異なる祖先型アミノ残基が得られる場合もあり、その位置と種類は比較に用いるタンパク質にも依存する。
【０１２５】
従って、そのような変動が比較的少ない位置のアミノ酸残基を改変の対象とすることが考えられる。そのようなアミノ酸残基は、系統樹の作成に用いる生物種を変える、または、生物種は変えずに系統樹作成に使用するアミノ酸配列情報の一部のみを用いるなど、系統樹の作成に使用するアミノ酸配列情報を変化させた場合の樹形変化の程度を見積り、樹形への影響の少ない残基を選択することによって決定することが考えられる。
【０１２６】
上述のようにして祖先型アミノ酸残基が決定されたならば、解析対象としたタンパク質について非祖先型であるアミノ酸残基の少なくとも１つを祖先型アミノ酸残基に置換してそのタンパク質を改変することができる。
【０１２７】
（３）進化工学的手法
例えば進化工学的手法を利用した酵素の機能改変は、まず目的のタンパク質の遺伝子配列にランダム変異を導入するところから始める。ランダム変異導入とは、主としてＰＣＲを利用した手法であり、ＰＣＲの正確性をわざと低く設定することで遺伝子上の様々な部位に様々な変異を導入する手法であり、例えばＤｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＩＩ  ＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）等のキットを使用して簡便に実施することができる。そのようにして変異を導入した遺伝子の変異体を後述するような方法により適当な発現プラスミドに連結して適当な宿主に形質転換し、プレート培地上に撒いてコロニーを形成させることにより、変異体ライブラリを作成することができる。
【０１２８】
上記の変異体ライブラリは単コロニーずつ、９６ウェルプレート等において液体培養し、変異体酵素を発現させることが可能である。発現させた変異体酵素は９６ウェルフォーマット等で後の実験に使用することができる。酵素の機能改変ターゲットが基質親和性であれば、上記９６ウェルフォーマットの変異体酵素のライブラリを、同じく９６ウェルフォーマットで調製した通常よりも基質濃度の低い活性測定試薬へ入れて酵素反応をモニターし、他の変異体に比べ酵素反応の反応速度が速い変異体をピックアップすることにより、基質親和性の高い変異体酵素をスクリーニングすることが可能である。変異体遺伝子のどの部位にどのような変異が導入されたかは、後述するようにシーケンスによりＤＮＡ配列を読むことにより確認できる。
【０１２９】
本発明者らは、上述の方法を用いて鋭意検討した結果、基質親和性および／または比活性を向上させた改変型ＦＡＤＧＤＨの取得に至り、本発明に至った。
【実施例】
【０１３０】
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【０１３１】
＜実施例１＞
アスペルギルス・オリゼ由来フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤＧＤＨとも表記する）遺伝子の最適化設計と合成
本発明の研究を開始した当初、アスペルギルス属におけるＦＡＤＧＤＨ遺伝子は国際公開第２００６／１０１２３９号および国際公開第２００７／１１６７１０号において公開されていた。特に国際公開第２００７／１１６７１０号において、アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列が明らかにされていた。
【０１３２】
本発明者らは、これらの遺伝子配列情報をもとに、ＦＡＤＧＤＨの機能改変を試み、もとのＦＡＤＧＤＨに比べて性能が向上した変異体酵素の取得を目指した。アスペルギルス・オリゼ由来ＦＡＤＧＤＨの遺伝子配列は国際公開第２００７／１１６７１０号において、配列表の配列番号１の配列が公開された。この遺伝子の全配列を大腸菌に最適化すべく、コドンを変更した。また、後述するように、大腸菌での発現に最適化すべくＮ末端シグナル配列を除去するような遺伝子を設計した。
【０１３３】
変更後のコドンは以下のように設定した。一文字目のアルファベットから、アミノ酸の一文字表記、アミノ酸の名称（設計に使用したコドン）の順に表記する。
【０１３４】
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
【０１３５】
配列表の配列番号１のＤＮＡ配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードすることが、国際公開第２００７／１１６７１０号において公開されている。このアミノ酸配列のＮ末端側には真菌のシグナル配列が含まれており、大腸菌で該遺伝子を発現させるには、このＮ末端側シグナル配列を除去する必要がある。そこで、公知の推定プログラムを用いて該アミノ酸配列中のＮ末端シグナル配列を推定したところ、配列番号２のアミノ酸配列の１６番目のＡと１７番目のＳの間で切断されることが推定された。
【０１３６】
そこで、配列表の配列番号１に示したＤＮＡ配列の１番目のコドン「ａｔｇ」から順に、上記コドンに変更し、さらに上述したように、推定されたＮ末端配列を除去して開始コドンのメチオニンを付加するようにし、配列表の配列番号３に示したＤＮＡ配列を設計した。
【０１３７】
上記の配列表の配列番号３のＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列は配列表の配列番号４に記載したとおりであり、配列表の配列番号２のＮ末端側シグナル配列の１６番目までを除去してメチオニン（Ｍ）を付加した配列である。
【０１３８】
上記の配列表の配列番号３の全長ＤＮＡ配列を人工合成するために、配列表の配列番号５から配列番号２６に記載のロングプライマーを合成し、以下の実験に供した。
【０１３９】
ＰＣＲ反応液１（１×ＫＯＤ〜ｐｌｕｓ〜緩衝液（東洋紡製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２μＭ  ロングプライマー、１Ｕ  ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製））を５０μＬ調製し、以下のサイクル様式でＰＣＲを行った。
初期変性           ９４℃、１分間
１２サイクル       ９４℃、３０秒間
５５℃、１分間
６８℃、２分間
最終伸長           ６８℃、５分間
【０１４０】
ＰＣＲ完了後、ＰＣＲ反応溶液２（１×ＫＯＤ〜ｐｌｕｓ〜緩衝液（東洋紡製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．３μＭ  特異的プライマー、１μＬ  ＰＣＲ１反応溶液、１Ｕ  ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製））を５０μＬ調製し、以下のサイクル様式でＰＣＲを行った。特異的プライマーは配列表の配列番号２７と配列番号２８のように合成されたものを使用した。
初期変性           ９４℃、１分間
１２サイクル       ９４℃、３０秒間
５５℃、３０分間
６８℃、２分間
最終伸長           ６８℃、５分間
【０１４１】
ＰＣＲ反応溶液の一部をとって定法によりアガロースゲル電気泳動したところ、約１７００ｂｐの単一なバンドが観察された。
【０１４２】
＜実施例２＞
ＦＡＤＧＤＨ遺伝子の大腸菌における発現
上記遺伝子を発現させるプラスミドにはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを使用した。該プラスミドはｌａｃプロモーターによりＬａｃＺ遺伝子を発現するが、ｌａｃＺ開始コドン近傍配列「ｃｔａｔｇ」をＰＣＲによる部位特異的変異導入法により「ｃａｔａｔｇ」とすることにより、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列とすることができ、制限酵素ＮｄｅＩで切断した遺伝子をクローニングし、ｌａｃプロモーターにより遺伝子を比較的ゆるやかに発現させることができる。以下、ＮｄｅＩ認識配列をｌａｃＺ開始コドンに挿入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをｐＢＳＮと表記する。
【０１４３】
ＦＡＤＧＤＨ候補遺伝子を大腸菌で発現させるために、実施例１に記載の全長遺伝子とｐＢＳＮを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断してそれぞれを精製し、リガーゼで両遺伝子断片どうしを結合して発現プラスミドを作製した。
【０１４４】
作製した発現プラスミドにより大腸菌ＤＨ５を形質転換し、寒天プレート培地上で培養してコロニーを形成させ、各発現プラスミドで形質転換した形質転換体を得た。
【０１４５】
得られた形質転換体を２ｍＬのＬＢ培地で培養し、定法に従いプラスミドを精製した。合成した遺伝子に特異的なプライマーを使用してシーケンスを行い、所望する配列表の配列番号３で示される塩基配列のＤＮＡが組み込まれた発現プラスミドであることを確認した。以下、配列表の配列番号３で示される塩基配列で表されるＦＡＤＧＤＨ遺伝子が組み込まれたｐＢＳＮを、ｐＢＳＮＧＤＨと表記する。
【０１４６】
ｐＢＳＮＧＤＨで形質転換された形質転換体の単コロニーを２ｍＬのＬＢ培地に植菌して３７℃で１６時間培養し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液２０ｍＬに植菌して２７℃で４８時間培養した。培養終了後、菌体を破砕して活性の有無を確認したところ、ＧＤＨ活性が観察された。
【０１４７】
＜実施例３＞
ＦＡＤＧＤＨの大量発現、精製、性能評価
実施例２で得られたｐＢＳＮＧＤＨを形質転換した大腸菌を使用して、ＦＡＤＧＤＨの発現と精製を具体的には以下のように実施した。
【０１４８】
（３−１）大量発現
ｐＢＳＮＧＤＨを大腸菌ＤＨ５に形質転換し、寒天プレート培地上で培養してコロニーを形成させた。単一のコロニーをLB液体培地２ｍＬに植菌し、３７℃で１８時間、振とう培養した。ＬＢ液体培地を２０ｍＬ調整して５００ｍＬフラスコに入れ、１２０℃で２０分オートクレーブ滅菌して上記培養液を植菌し、３７℃、６時間、振とう培養した。オートクレーブした１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液１Ｌに上記培養液２０ｍＬを植菌し、５Ｌフラスコにおいて、２７℃で４８時間、振とう培養した。培養完了後、培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）して菌体を回収し、精製に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１４９】
（３−２）精製
−８０℃保存した菌体ペレットに３０ｍＬの２０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．２）に懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、４０分、４℃）して上清を回収した。得られた上清を、２０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．２）で平衡化した２０ｍＬのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに素通りさせた。続けて、同じく２０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．２）で平衡化した２０ｍＬのＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させて、０Ｍから０．５ＭのＮａＣｌグラジエントで溶出し、ＧＤＨ活性を有する画分を得た。得られたＧＤＨ画分に、氷冷下で３０％飽和硫安となるように硫酸アンモニウムを添加して硫安沈殿し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分、４℃）によりＧＤＨ画分を有する上清を得た。
【０１５０】
ＦＰＬＣ装置（ＧＥヘルスケア製）に６ｍＬのＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥカラム（ＧＥヘルスケア製）をセットし、３０％  飽和硫安＋２０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．２）で装置全体を平衡化した。硫安沈殿の上清をアプライしてＧＤＨ画分をカラムに吸着させ、３０％から０％の硫酸アンモニウムのグラジエントで溶出し、ＧＤＨ画分を得た。得られたＧＤＨ画分を０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋２０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．２）で透析した。
【０１５１】
上記ＧＤＨ溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動して精製度を確認したところ、単一バンドになるまで精製されていた（図１）。観察された分子量は約６０ｋＤａであり、アミノ酸配列から計算された分子量６２．１ｋＤａに比べてほとんど違いがなかった。
【０１５２】
（３−３）ＦＡＤＧＤＨのＫｍと比活性の測定
精製されたＦＡＤＧＤＨのＫｍならびに比活性を測定したところ、Ｋｍ値が３５ｍＭ、比活性が６３２Ｕ／ｍｇであった。
【０１５３】
上記のように、大腸菌で発現させたＦＡＤＧＤＨは、本出願に記載の測定方法において比較的低いＫｍ値、および比較的高い比活性を示していることが明らかになったが、グルコースセンサ用途としてはまだ満足のいくものではなく、この酵素をもとに、Ｋｍ値の低下、比活性値の上昇を目標に、実施例４以下に示す一連の変異導入実験を行った。
【０１５４】
＜実施例４＞
ＦＡＤＧＤＨアミノ酸配列への変異導入部位の決定
実施例３より、大腸菌により発現させたＦＡＤＧＤＨのスペックはセンサ用途としてはまだ不十分であることが示された。この酵素のＫｍの減少と比活性の上昇を目的として、以下に示す推定祖先型アミノ酸配列に基づく変異導入およびコンセンサス概念に基づく変異導入実験を行った。
【０１５５】
（４−１）ＦＡＤＧＤＨ相同タンパク質情報の取得
配列表の配列番号４で示されるＦＡＤＧＤＨのアミノ酸配列とアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来ＦＡＤＧＤＨ（以下にＡＴＧＤＨとも示す）のアミノ酸配列を使用して、Ｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により相同性検索を行い、ＦＡＤＧＤＨと相同な様々な生物種由来のアミノ酸配列情報をランダムに得た。
【０１５６】
具体的には、ＡＴＧＤＨ（Ｓｅｑ０１）、Ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ(Ｓｅｑ０２、ＣＡＣ１２８０２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ)、ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ０３、ＹＰ＿３６３８８０、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ０４、ＣＡＫ１２００１、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、ＧＭＣ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ｓｅｑ０５、ＺＰ＿００６２９２９３、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、Ｃｈｏｌｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓｅｑ０６、ＺＰ＿００１０５７４６、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、ｇｌｕｃｏｓｅ−ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｃｈｏｌｉｎｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ｓｅｑ０７、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、Ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓｅｑ０８、ＺＰ＿００１１０５３８、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ０９、ＺＰ＿０１１６２８３６、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ）、ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ１０、ＮＰ＿４１４８４５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ１１、ＺＰ＿０１１０９７８４、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｌｅｏｄｉｉ）、ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ１２、ＹＰ＿６９４４３０、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）、Ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｓｅｑ１３、ＺＰ＿００８９１６９２、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、ＦＡＤ−ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｅｑ１４、ＹＰ＿４７１８３９、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）のアミノ酸配列情報を得た。
【０１５７】
さらにこれらの配列情報に、配列表の配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｓｅｑ１５）も付け加えた。ここで、Ｓｅｑ〜とは図２〜図４に示した配列番号を指し、間の数値はデータベースに登録されているそれぞれのアミノ酸配列のアクセッションナンバーを指す。さらにその後に生物種の名称を示した。
【０１５８】
（４−２）ＦＡＤＧＤＨを含むマルチプルアライメント図の作成
上記のデータベースに登録されたアミノ酸配列データを、定法にしたがって公知のマルチプルアライメントソフトによりアライメントし、アライメント図を得た（図２〜図４）。得られたアライメント図は、以降の祖先型アミノ酸配列の推定と、コンセンサス法による部位特異的変異導入に使用した。
【０１５９】
（４−３）分子系統樹の作成と祖先型アミノ酸配列の推定
上記アミノ酸配列のアライメント図に基づき、公知のコンピュータープログラムを使用して最尤法による系統樹を作成した（図５）。得られた系統樹に基づいて、１５種の生物由来の共通祖先（系統樹の根の位置）のアミノ酸配列を、公知のコンピュータープログラムを使用して最尤法により推定した。配列表の配列番号２９で示される共通祖先のアミノ酸配列（祖先型アミノ酸配列）を、該アミノ酸配列のすべての座位がＦＡＤＧＤＨの座位と対応するように、図２〜図４のアライメント図と同時に並べた。
【０１６０】
（４−４）ＦＡＤＧＤＨに対するアミノ酸置換
ＦＡＤＧＤＨに対し、どの部位に祖先型アミノ酸を導入するか決定した。同時に、該アライメント図においてコンセンサス法により、どの部位にどのアミノ酸配列を導入するか決定した。
【０１６１】
すなわち、配列表の配列番号４で示されるＦＡＤＧＤＨアミノ酸配列において、以下の変異１〜５のアミノ酸置換が各々なされたアミノ酸配列からなる変異体１〜５を作成することを決定した。
変異１．Ｎ３４Ｄ＋Ａ６７Ｋ＋Ｈ２７３Ｙ＋Ｉ２８０Ｌ＋Ｎ５３０Ｐ＋Ｓ５６８Ａ＋Ｌ５７０Ｍ
変異２．変異１＋Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ
変異３．変異１＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ
変異４．変異１＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ＋Ｖ２９６Ｉ
変異５．変異１＋Ｇ２０Ａ＋Ｖ５４７Ｉ＋Ｌ５４８Ｍ
【０１６２】
ここで、「Ｎ３４Ｄ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば「Ｎ３４Ｄ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から３４番目のアミノ酸Ｎを、アミノ酸Dに置換することを意味する。さらに、例えば「Ｇ２０Ａ＋Ｌ２８９Ｑ＋Ｉ２９０Ｌ」とは、Ｇ２０ＡとＬ２８９ＱとＩ２９０Ｌのアミノ酸置換を同時に導入することを意味する。
【０１６３】
＜実施例５＞
ＦＡＤＧＤＨへの部位特異的変異導入と発現解析、精製、および性能評価
ＦＡＤＧＤＨに対する上記部位特異的へに導入は以下のように行った。上記変異１から変異５の変異導入を実施するため、ＰＣＲによる部位特異的変異導入に使用するオリゴヌクレオチドを設計した。
【０１６４】
変異１については、配列表の配列番号３０および配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９、並びに配列番号４０および配列番号４１で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
【０１６５】
変異２については、配列表の配列番号３０および配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、並びに配列番号４４および配列番号４５で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
【０１６６】
変異３については、配列表の配列番号３０および配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１、配列番号４４および配列番号４５、並びに配列番号４６および配列番号４７で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
【０１６７】
変異４については、配列表の配列番号３０および配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１、配列番号４４および配列番号４５、並びに配列番号４８と配列番号４９で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
【０１６８】
変異５については、配列表の配列番号３０および配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、配列番号３４および配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、配列番号３８および配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４３、配列番号４６および配列番号４７で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
【０１６９】
上記の相補的なオリゴヌクレオチドを利用して、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を使用し、ｐＢＳＮＧＤＨを鋳型としてＰＣＲによる部位特異的変異導入を行った。変異導入したそれぞれのプラスミドＤＮＡにより、大腸菌ＤＨ５αを形質転換してクローニングし、所望の変異が導入できたかどうか、シーケンスにより確認した。
【０１７０】
得られた変異導入プラスミドＤＮＡを、変異１から変異５の順にそれぞれｐＢＳＮＧＤＨ１、ｐＢＳＮＧＤＨ２、ｐＢＳＮＧＤＨ３、ｐＢＳＮＧＤＨ４、ｐＢＳＮＧＤＨ５と命名し、以下の発現解析に使用した。
【０１７１】
ｐＢＳＮＧＤＨ１〜ｐＢＳＮＧＤＨ５で形質転換した大腸菌ＤＨ５αを使用して、実施例３で示した方法により変異体酵素を発現、精製した。得られた精製酵素を用いて、実施例３と同様に、変異体１から変異体５の変異体酵素のＫｍと比活性を測定した。測定結果を表１に示す。
【０１７２】
【表１】
2011139677.tif 000003
【０１７３】
表１に示すように、Ｋｍ値に関しては、変異を導入していないＦＡＤＧＤＨに比べて数値上Ｋｍ値が低下したのは変異体２、変異体４、および変異体５であった。また、比活性値に関しては、変異を導入していないＦＡＤＧＤＨに比べて数値上比活性値が向上したのは変異体２、変異体３、変異体４、および変異体５であった。
【０１７４】
＜実施例６＞
グルコースセンサ
実施例５で使用した変異体３の改変型ＦＡＤＧＤＨを使用した酵素固定化グルコースセンサを試作し、公知の方法（Ｓ．Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，６５４−６５９，２００６）を参考にＤ−グルコースの測定を行った。
【０１７５】
変異体３の改変型ＦＡＤＧＤＨを３Ｕ固定化させたグラッシーカーボン電極を使用し、Ｄ−グルコースに対する応答電流を測定した。電解セル中に０．１Ｍのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）と、１Ｍのフェリシアンカリウム溶液を充填し、空気飽和条件化で既知の濃度のＤ−グルコースの測定を行った。
【０１７６】
既知のグルコース濃度に対して電流値をプロットすることにより、グルコース濃度の上限が１０００ｍｇ／ｄＬまでの検量線を描くことができた。これにより本発明の改変型ＦＡＤＧＤＨを使用した酵素固定化グルコースセンサによりグルコースの定量が可能であることが示された。
【０１７７】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更および修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明のアミノ酸置換導入前の元のＦＡＤＧＤＨと比較して基質親和性および/または比活性の向上した改変型ＦＡＤＧＤＨをグルコースセンサ等に利用することにより、測定時間のさらなる短縮および測定データの正確さの向上といったスペック上のメリットが得られ、医療関連分野等の産業に幅広く貢献することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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