(57)【要約】【課題】安定化剤としてヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、及び尿素を含有しない、新たなエリスロポエチンを含有する水性液剤を提供すること。【解決手段】１万〜５万ＩＵ／ｍＬの濃度のエリスロポエチンと、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの非イオン性界面活性剤と、緩衝剤および塩とを含有するエリスロポエチン水性液剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００００〜５００００ＩＵ／ｍＬの濃度のエリスロポエチンと、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの非イオン性界面活性剤とを含有し、安定化剤として尿素およびアミノ酸を含有しないことを特徴とする、エリスロポエチンの水性液剤。
【請求項２】
エリスロポエチンの濃度が、１２０００〜４８０００ＩＵ／ｍＬである、請求項１に記載の水性液剤。
【請求項３】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマーである、請求項１又は２に記載の水性液剤。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびポロキサマー１８８よりなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の水性液剤。
【請求項５】
緩衝剤および等張化剤を更に含有し、ｐＨが５．５〜７．２である、請求項１〜４に記載の水性液剤。
【請求項６】
緩衝剤がリン酸緩衝剤であり、等張化剤が塩化ナトリウムである、請求項５に記載の水性液剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、溶液状態で貯蔵安定なエリスロポエチンの水性液剤に関し、詳しくは、安定化剤としてヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、および尿素を含有しない、エリスロポエチンを含有する水性液剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  エリスロポエチンは、赤芽球前駆細胞に働いて赤血球へと分化させることによって、赤血球の産生を促進する糖タンパク質である。このため、エリスロポエチンは、ヒトの腎性貧血治療剤として、また手術に備えた自己血による貯血のために用いられている。医薬品として市販されているエリスロポエチン製剤には、凍結乾燥製剤と水性液剤があるが、水性液剤は使用時における薬剤の溶解操作が不要であるので、凍結乾燥製剤に比べて利便性が高い。【０００３】  エリスロポエチンを水性液剤として供給することにより、その使用時における利便性は向上する。しかし、水溶液中ではエリスロポエチンの変性、凝集、凝集による沈殿、容器の壁への吸着が起こり易く、薬剤としての安定性が損なわれるので、水性液剤を市場に流通させるためには、水溶液中におけるエリスロポエチンの安定性を高める必要がある。そこで、水溶液中におけるエリスロポエチンの安定性を高めるために種々の試みがなされている。例えば、エリスロポエチン製剤に関して、貯蔵安定性を高めるために、尿素、種々のアミノ酸および非イオン性湿潤剤を含有するものが報告されている（特許文献１参照）。この文献に示されたデータによれば、エリスロポエチンの良好な安定性を得るには尿素が必要である。【０００４】  また、安定化剤としてアミノ酸を含むエリスロポエチンの水性液剤が報告されている（特許文献２参照）。この文献に記載された試験結果は、加速試験による安定性試験に付したアミノ酸のうち、Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩およびＬ−リジン塩酸塩で安定性の向上が得られる一方、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−システインでは、無添加に比し安定性が却って大幅に低下すること、および、Ｌ−セリンでは無添加と実質的な差が見られないことを示している。【０００５】  また、安定化剤としてアミノ酸、特にグリシンを含むエリスロポエチンの水性液剤が報告されている（特許文献３参照）他、安定化剤としてトリプトファン又はトリプトファン誘導体を含むエリスロポエチンの水性液剤（特許文献４参照）、安定化剤としてメチオニンを含むエリスロポエチンの水性液剤（特許文献５参照）、安定化剤として、グリシン、アラニン、ロイシン又はイソロイシン等の中性アミノ酸を含むエリスロポエチンの水性液剤（特許文献６参照）が報告されている。更に、安定化剤としてロイシン、イソロイシン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニンあるいはグリシンを含むエリスロポエチンの水性液剤が報告されている（特許文献７参照）。【０００６】  市販されているエリスロポエチンの水性液剤には、エリスロポエチンの安定化剤として、ヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、又は尿素が含有されている。すなわち、市場に流通させることが可能な程度に安定なエリスロポエチンの水性液剤を得るためには、エリスロポエチンの安定化剤として、ヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、又は尿素を添加する必要があることが知られていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】  特公平７−８０７８２号公報
【特許文献２】  特開平１０−１８２４８１号公報
【特許文献３】  特表２００２−５４１２０８公報
【特許文献４】  ＷＯ２００１／０６４２４１
【特許文献５】  特表２００２−５２７４７０公報
【特許文献６】  特表２００７−５２８８４２号公報
【特許文献７】  特表２００７−５３６２１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  上記背景の下で、本発明の目的は、安定化剤としてヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、および尿素を含有させることなく、市場に流通させることが可能な程度に安定なエリスロポエチンの水性液剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  上記目的に向けた研究において、本発明者らは、水性液剤中にエリスロポエチンを比較的高濃度で含有させることによって、安定化剤としてヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、又は尿素を添加させることなく、エリスロポエチンの水性液剤中の安定性を高めることができることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）１００００〜５００００ＩＵ／ｍＬの濃度のエリスロポエチンと、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの非イオン性界面活性剤とを含有し、安定化剤として尿素およびアミノ酸を含有しないことを特徴とする、エリスロポエチンの水性液剤。
（２）エリスロポエチンの濃度が、１２０００〜４８０００ＩＵ／ｍＬである、上記（１）に記載の水性液剤。
（３）非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート又はポロキサマーである、上記（１）又は（２）に記載の水性液剤。
（４）非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０およびポロキサマー１８８よりなる群から選ばれる、上記（１）又は（２）に記載の水性液剤。
（５）緩衝剤および等張化剤を更に含有し、ｐＨが５．５〜７．２である、上記（１）〜（４）に記載の水性液剤。
（６）緩衝剤がリン酸緩衝剤であり、等張化剤が塩化ナトリウムである、上記（５）に記載の水性液剤。
【発明の効果】
【００１０】  本発明によれば、安定化剤としてヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、又は尿素を含有させることなく、水性液剤中のエリスロポエチンを安定化させることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】  本発明において、「エリスロポエチン」というときは、特にヒトエリスロポエチンのことをいうが、これに限らず、牛、馬等の家畜およびイヌ、ネコ等の愛玩動物を含む哺乳動物のエリスロポエチンをも含む。また、「エリスロポエチン」には、野生型のエリスロポエチンのみならず、エリスロポエチンを構成する１つ又は２以上のアミノ酸残基を、置換、欠失、挿入させたエリスロポエチンの類似物をも含む。
【００１２】  本発明において、エリスロポエチンは、遺伝子組換え技術を用いて組換え体エリスロポエチンとして生産することができる。例えば、エリスロポエチン遺伝子を発現ベクターに組込み、これを用いて細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞）を形質転換し、得られた形質転換細胞を培養することにより、生物学的に活性な組換え体エリスロポエチンを製造する方法は、当業者に周知である（ＷＯ２００８／０６８８７９）。
【００１３】  本発明において、水性液剤に含有されるエリスロポエチンの濃度は、１万〜５万ＩＵ／ｍＬであることが好ましく、１．２万〜４．８万ＩＵ／ｍＬであることがより好ましい。好適には、エリスロポエチンの濃度を１．２万又は４．８万ＩＵ／ｍＬとすることができる。
【００１４】  本発明において、水性液剤に含有される非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートやポロキサマー等を単独で又はこれらを組合せて使用することができる。ポリソルベートとしてはポリソルベート２０、ポリソルベート８０が、ポロキサマーとしてはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール）が特に好適である。また、水性液剤に含有される非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．０２〜０．１ｍｇ／ｍＬであることが更に好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬであることが特に好ましい。
【００１５】  本発明において、水性液剤に含有される緩衝剤は、薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが、リン酸塩緩衝剤が好ましく、特にリン酸ナトリウム緩衝剤が好ましい。リン酸ナトリウムの濃度は、好ましくは０．０１〜０．０４Ｍである。また、緩衝剤によって調整される水性液剤のｐＨは、好ましくは５．５〜７．２、より好ましくは５．８〜７．０、更に好ましくは５．８〜６．２、特に好ましくは６．０である。
【００１６】  本発明において、水性液剤に含有される等張化剤は、薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが、塩化ナトリウム、マンニトールが好適に使用できる。
【実施例】
【００１７】  以下、実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００１８】〔エリスロポエチン水性液剤の安定性の検討〕
下記の表１〜表３に記載した組成からなるエリスロポエチン水性液剤を調製し、０．７ｍＬずつガラスバイアルに充填し、密封して暗所で、５０℃で７日間又は４０℃で３０日間保存した。水性液剤中におけるエリスロポエチンの濃度は、１５００ＩＵ／ｍＬ（表１）、１２０００ＩＵ／ｍＬ（表２）および４８０００ＩＵ／ｍＬ（表３）に設定した。エリスロポエチンの濃度を１５００ＩＵ／ｍＬに設定した液剤については、ｐＨを６．５とし、安定化剤として１、０．５および０．２５ｍｇ／ｍＬのグリシンを添加した液剤（液剤Ａ〜Ｃ）と、グリシン無添加の液剤（液剤Ｄ）を調製した。エリスロポエチンの濃度を１２０００ＩＵ／ｍＬと４８０００ＩＵ／ｍＬに設定した液剤については、各々について、安定化剤として１ｍｇ／ｍＬのグリシンを添加した液剤と、グリシンを添加しない液剤を調製した。また、液剤のｐＨは、６．０、６．５および７．０に調整した。また、エリスロポエチンとして、ＣＨＯ細胞を用いて製造した組換え体ヒトエリスロポエチンを使用した。【００１９】
【表１】
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【００２０】
【表２】
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【００２１】
【表３】
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【００２２】〔分析方法〕
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．５ｍＬに水８３３ｍＬを加えて０．０６％ＴＦＡ水溶液（Ａ液）とした。また、ＴＦＡ０．５ｍＬにアセトニトリル６６６ｍＬおよび水１６７ｍＬを加えて、０．０６％トリフルオロ酢酸／８０％アセトニトリル水溶液（Ｂ液）とした。ＨＰＬＣシステムＬＣ−１０Ａ（島津製作所製）に固定相としてブチルシリル化シリカゲルカラム（Ｖｙｄａｃ  ２１４ＡＴＰ５４、  Ｖｙｄａｃ社）（粒形５μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）を取り付け、エリスロポエチン資料を注入して、２５℃にて流速１．０ｍＬ／分で、Ａ液とＢ液の混合物を移動相としてＨＰＬＣを行った。移動相の組成は、最初の１０分間はＡ液とＢ液の混合比を５０／５０とし、次いでＡ液とＢ液の混合比を１０分間かけて２５／７５へと直線的に移行させ、その比率で２０分間維持し、次いで５０／５０に戻して１０分間維持した。検出は紫外吸光光度計（測定波長２１５ｎｍ）にて行った。この条件でＨＰＬＣ開始後約２０分の位置に検出されるピークがエリスロポエチンであることを確認し、保存前後のピーク面積の比から、その残存率（％）を求めた。【００２３】〔分析結果〕
１５００ＩＵ／ｍＬの濃度のエリスロポエチン含有水性液剤を５０℃で７日間保存した後のエリスロポエチンの残存率を表４に示す。グリシンが無添加の液剤Ｄでは、残存率が、グリシンを０．５ｍｇ／ｍＬ以上含む液剤（液剤ＡおよびＢ）と比較して、エリスロポエチンの残存率が著しく低下しており、エリスロポエチンを水性液剤中で安定に保持するために、安定化剤としてグリシンが必要であることがわかった。この結果は、先行技術文献中における、安定なエリスロポエチンの水性液剤を得るために、グリシン等のアミノ酸を安定化剤として添加することが効果的であるとの記載を裏付けるものである。【００２４】
【表４】
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【００２５】  １２０００ＩＵ／ｍＬおよび４８０００ＩＵ／ｍＬの濃度のエリスロポエチン含有水性液剤を、５０℃で７日間保存した後のエリスロポエチンの残存率を表５および表６に示す。エリスロポエチンの濃度が１２０００ＩＵ／ｍＬの場合、ｐＨ７．０に調整した液剤で、エリスロポエチンの残存率が、グリシンを含有する液剤に比較して、グリシンを含有しない液剤で若干低下したが、ｐＨ６．０と６．５に調整した液剤では、グリシンの有無によってエリスロポエチンの残存率が大きく異なることはなかった（表５）。エリスロポエチンの濃度が４８０００ＩＵ／ｍＬの場合も同様の結果が得られた（表６）。特に、ｐＨを６．０に調整した液剤では、いずれの濃度においても、グリシンを含有しない液剤が、グリシンを含有する液剤に比較して、高い残存率を示した（液剤１と２、液剤７と８）。これらの結果は、水性液剤中におけるエリスロポエチンの濃度を、比較的高濃度の１２０００ＩＵ／ｍＬ以上とすることにより、グリシン等の安定化剤を添加することなく、水性液剤中におけるエリスロポエチンを安定に保持できることを示し、特に、ｐＨ６．０では、グリシンを含有しない液剤が、エリスロポエチンの安定性をより高めることを示す。これらの事実は、表４の結果および先行技術文献中の記載から、水性液剤中におけるエリスロポエチンを安定に保持するためには、グリシン等の安定化剤が必要であると考えられたことからして、驚くべきものである。【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
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【００２８】  次に、エリスロポエチン含有水性液剤を４０℃で３０日間保存した後のエリスロポエチンの残存率を表７および８に示す。エリスロポエチンの濃度が１２０００ＩＵ／ｍＬの場合、グリシンの有無によってエリスロポエチンの残存率が大きく異なることはなかった（表７）。エリスロポエチンの濃度が４８０００ＩＵ／ｍＬの場合も同様の結果が得られた（表８）。但し、ｐＨ６．５および７．０の場合、エリスロポエチンの残存率が、グリシンを添加した液剤と比較して、グリシンを含有しない液剤で、若干の低下が認められた。しかし、ｐＨ６．０では、グリシンの有無は、エリスロポエチンの残存率にほとんど影響を与えなかった。【００２９】
【表７】
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【００３０】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００３１】  本発明によれば、安定化剤としてヒスチジン、アルギニン、グリシン等のアミノ酸、又は尿素を含有しないエリスロポエチン含有水性製剤を提供することができる。