(57)【要約】      （修正有）【課題】菌体内のタンパク質を抽出するための新たな試薬および方法、ならびに前記試薬または方法を用いた、ポリメラーゼの効率的なスクリーニング方法を提供する。【解決手段】少なくとも非イオン性界面活性剤および陰イオン界面活性剤を含んだ試薬により、グラム陰性細菌から菌体内タンパク質を効率的に抽出する。また、ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーを構築する工程、前記ライブラリーを宿主へ形質転換し培養後複数の形質転換体を選択する工程、前記ポリメラーゼを発現させる工程、発現したポリメラーゼを抽出する工程、先の工程で抽出したポリメラーゼを精製する工程、前記精製したポリメラーゼを用いて核酸合成を行ないポリメラーゼ活性を測定する工程、からなる、ポリメラーゼのスクリーニング方法において、前記ポリメラーゼを抽出する工程に前記試薬を用いることで、所望の機能を有したポリメラーゼを効率的にスクリーニングする。【選択図】図６
2011051943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン性界面活性剤および陰イオン界面活性剤を少なくとも含んだ、グラム陰性細菌から菌体内タンパク質を抽出する試薬。
【請求項２】
非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）であり、陰イオン活性剤がデオキシコール酸ナトリウムである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
タンパク質がポリメラーゼである、請求項１または２に記載の試薬。
【請求項４】
請求項１から３に記載の試薬を用いた、グラム陰性細菌からの菌体内タンパク質抽出方法。
【請求項５】
（１）ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーを構築する工程、
（２）前記ライブラリーを宿主へ形質転換し、培養後、複数の形質転換体を選択する工程、
（３）前記選択した複数の形質転換体を培養し、前記ポリメラーゼを発現させる工程、
（４）（３）で培養した培養液から発現したポリメラーゼを抽出する工程、
（５）前記抽出したポリメラーゼを精製する工程、
（６）前記精製したポリメラーゼを用いて核酸合成を行ない、ポリメラーゼ活性を測定する工程、
からなる、ポリメラーゼのスクリーニング方法であって、
前記（４）の工程で、請求項３に記載の試薬を使用する、前記スクリーニング方法。
【請求項６】
前記（２）の工程で、形質転換体が前記ポリメラーゼを発現しているかどうかを判別可能なスクリーニングベクターをさらに宿主へ形質転換する、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記スクリーニングベクターが、前記ポリメラーゼが認識するプロモーターおよび蛍光タンパク質遺伝子を機能的に連結したポリヌクレオチドを挿入したベクターである、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記（３）から（６）の工程を複数の形質転換体に対して同時に実施する、請求項５から７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項５から８に記載の方法で得られたポリメラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、菌体内のタンパク質を抽出するための試薬、および前記試薬を用いたポリメラーゼの効率的なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の伸長反応を行なう酵素であるポリメラーゼは、基質となる核酸よりＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼとに大別される。さらにＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製やＤＮＡ修復において中心的な役割を担うＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼと、逆転写やテロメア合成を行なうＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼの２つのタイプに分けられる。一方、ＲＮＡポリメラーゼも同様にｍＲＮＡやｒＲＮＡなどを合成するＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡウイルスで重要な機能を果たすＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ、特定の鋳型を必要としないＲＮＡポリメラーゼの３つのタイプに分けられる。
【０００３】
ポリメラーゼは生命現象を理解する上で重要な研究対象であるだけでなく、さまざま応用例により産業上も重要な酵素である。例えば、ＰＣＲ法に用いられるＴａｑポリメラーゼや、遺伝子増幅／検出技術であるＴＲＣ法（特許文献１および非特許文献１）に用いられるＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが知られている。
【０００４】
前述した産業上利用されているポリメラーゼには、機能を強化した変異型酵素が知られているものも多い。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでは、アミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変した酵素（特許文献２）、高温での比活性および熱安定性を高めた酵素（特許文献３）、アミノ酸の欠失と置換により３’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強した酵素（特許文献４）が知られている。そして、このような機能を強化した変異型酵素や新規のポリメラーゼの取得には、スクリーニングを効率的に行なう必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献２】米国特許第５３８５８３４号公報
【特許文献３】特表２００３−５２５６２７号公報
【特許文献４】特開２００３−０６１６８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
新規のポリメラーゼは以下に示す工程からなるスクリーニング方法を用いて取得することができる。
（１）ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーを構築する工程、
（２）前記ライブラリーを宿主へ形質転換し、培養後、複数の形質転換体を選択する工程、
（３）前記選択した複数の形質転換体を培養し、前記ポリメラーゼを発現させる工程、
（４）（３）で培養した培養液から発現したポリメラーゼを抽出する工程、
（５）前記抽出したポリメラーゼを精製する工程、
（６）前記精製したポリメラーゼを用いて核酸合成を行ない、ポリメラーゼ活性を測定する工程。
【０００８】
しかしながら、前記（３）の工程で発現したポリメラーゼのうち、形質転換体内に発現したポリメラーゼを抽出する際、最も一般的な抽出方法である、超音波破砕処理を用いた方法では、一度に多数の試料を処理するのが困難であり、また数百μＬといった少量の培養液に対して処理を行なうのも困難であることから、前記スクリーニング方法で用いる抽出方法としては不向きであった。超音波破砕処理以外の抽出方法として、超音波破砕処理が不要な市販の菌体内タンパク質抽出試薬を用いる方法がある。しかしながら、前記市販試薬の一つであるＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名）（ノバジェン製）を用いて菌体内に発現したポリメラーゼの抽出を試みたところ、菌体内に発現したポリメラーゼを含んだ抽出液は得られたものの、前記抽出液に前記（５）のポリメラーゼ精製工程で使用する緩衝液（例えば、５００ｍＭ  塩化ナトリウムおよび２０ｍＭ  イミダゾールを含んだＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））を添加するとポリメラーゼが沈殿する現象が見られ、その後の精製工程を行なうことが困難であった。
【０００９】
そこで本発明の課題は、形質転換体内のタンパク質を抽出するための新たな試薬および方法、ならびに前記試薬または方法を用いた、ポリメラーゼの効率的なスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
第一の発明は、非イオン性界面活性剤および陰イオン界面活性剤を少なくとも含んだ、グラム陰性細菌から菌体内タンパク質を抽出する試薬である。
【００１１】
第二の発明は、非イオン性界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）であり、陰イオン活性剤がデオキシコール酸ナトリウムである、第一の発明に記載の試薬である。
【００１２】
第三の発明は、タンパク質がポリメラーゼである、第一または第二の発明に記載の試薬である。
【００１３】
第四の発明は、第一から第三の発明に記載の試薬を用いた、グラム陰性細菌からの菌体内タンパク質抽出方法である。
【００１４】
第五の発明は、
（１）ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーを構築する工程、
（２）前記ライブラリーを宿主へ形質転換し、培養後、複数の形質転換体を選択する工程、
（３）前記選択した複数の形質転換体を培養し、前記ポリメラーゼを発現させる工程、
（４）（３）で培養した培養液から発現したポリメラーゼを抽出する工程、
（５）前記抽出したポリメラーゼを精製する工程、
（６）前記精製したポリメラーゼを用いて核酸合成を行ない、ポリメラーゼ活性を測定する工程、
からなる、ポリメラーゼのスクリーニング方法であって、
前記（４）の工程で、第三の発明に記載の試薬を使用する、前記スクリーニング方法である。
【００１５】
第六の発明は、前記（２）の工程で、形質転換体が前記ポリメラーゼを発現しているかどうかを判別可能なスクリーニングベクターをさらに宿主へ形質転換する、第五の発明に記載のスクリーニング方法である。
【００１６】
第七の発明は、前記スクリーニングベクターが、前記ポリメラーゼが認識するプロモーターおよび蛍光タンパク質遺伝子を機能的に連結したポリヌクレオチドを挿入したベクターである、第六の発明に記載のスクリーニング方法である。
【００１７】
第八の発明は、前記（３）から（６）の工程を複数の形質転換体に対して同時に実施する、第五から第七の発明に記載のスクリーニング方法である。
【００１８】
第九の発明は、第五から第八の発明に記載の方法で得られたポリメラーゼである。
【００１９】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２０】
本発明の試薬は、グラム陰性細菌の細胞壁を溶かすことで、グラム陰性細菌内のタンパク質を超音波破砕処理せずに抽出可能な試薬である。本発明の試薬は、グラム陰性細菌に該当するいかなる細菌に対して適用可能であり、一例として遺伝子組換え操作で用いる宿主として最も一般的な大腸菌があげられる。
【００２１】
本発明の試薬は、２種類の界面活性剤、具体的には非イオン性界面活性剤および陰イオン性界面活性剤を含んでいることを特徴としている。非イオン性界面活性剤としては膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（商品名）、Ｂｒｉｊ  ５８（商品名）、Ｂｒｉｊ  ３５（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（商品名）、１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミン−Ｎ−オキサイド、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトサイド、スクロースモノドデカン酸、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−トリデシル−β−Ｄ−マルトピラノシドなどがあげられる。特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）が本発明の試薬で用いる非イオン性界面活性剤として好ましい。陰イオン性界面活性剤としては膜タンパク質可溶化剤として通常用いられる中から適宜選択することができ、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウムなどがあげられる。特にデオキシコール酸ナトリウムが本発明の試薬で用いる陰イオン性界面活性剤として好ましい。本発明の試薬に含まれる界面活性剤の濃度については、抽出対象（グラム陰性細菌）の菌種、培養液中の夾雑物の影響、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度などを考慮し、適宜設定すればよい。一例として、抽出対象が大腸菌の場合、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）が０．２（ｖ／ｖ）％以上、デオキシコール酸ナトリウムが０．０２（ｗ／ｖ）％以上となるように調整した試薬であればよい。なお、本発明の試薬に、リゾチームがさらに含まれていると、グラム陰性細菌がより溶菌しやすくなるため好ましく、グラム陰性細菌が大腸菌の場合は０．０３（ｗ／ｖ）％程度含んでいればよい。
【００２２】
本発明のスクリーニング方法における対象ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ、非依存型ＲＮＡポリメラーゼ、いずれのポリメラーゼに対しても適用可能であるが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼといった、認識配列が既知の鋳型依存型ポリメラーゼに対して適用するのが好ましい。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法で使用する、ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーは、野生型ポリメラーゼをコードする遺伝子の任意の位置に変異を導入したポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することで得られる。野生株ポリメラーゼをコードする遺伝子の入手は、当業者のなし得る方法であればいかなる方法でもよく、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼの場合、Ｔ７ファージ（ＤＳＭ  Ｎｏ．４６２３，ＡＴＣＣ  １１３０３−Ｂ７，ＮＣＩＭＢ１０３８０など）から、前記ゲノム情報より作製した適切なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことで取得することができる。また、前記変異を導入したポリヌクレオチドは、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤、放射線への露出といった公知の技術を適宜使用することにより得られる。前記変異を導入したポリヌクレオチドを挿入するベクターの種類は特に限定はなく、自律複製型ベクターでもよいし、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであってもよいが、好ましくは発現ベクターである。発現ベクターにおいて前記変異を導入したポリヌクレオチドは、プロモーターといった転写に必要な要素が機能的に連結される。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、大腸菌を宿主とした場合、使用できるプロモーターにはｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターなどがあげられる。発現ベクターとしては、大腸菌を宿主とした場合、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ１３８７２）、ｐＣＤＦ−１ｂ（タカラバイオ製）といった発現用プラスミドが例示できるが、当業者が入手し得る一般的な大腸菌用ベクターの中から適宜選択して使用してもよい。さらに、ベクターへ挿入する前記変異を導入したポリヌクレオチドには酵素の精製のために有用な配列を付加してもよい。例えばシグナルペプチドを利用して細胞外分泌型酵素としたり、シグナルペプチドとして末端にヒスチジンヘキサマーを含むタグ配列が付加されたポリヌクレオチドを作製することができる。もっとも、シグナルペプチドの種類やシグナルペプチドと本酵素の結合方法は上記方法に限定されることはなく、当業者が利用可能な任意のシグナルペプチドを利用することができる。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法における、前記ライブラリーを形質転換させる際に用いる宿主としては、グラム陰性細菌の中から適宜使用できるが、取り扱いの簡便な大腸菌を宿主として用いるのが好ましい。なお、形質転換に用いる大腸菌はＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株が例示できるが前記株に限定されない。
【００２５】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様として、前記ライブラリーを宿主へ形質転換させる際に、スクリーニングベクターも同時に宿主へ形質転換させてスクリーニングを行なう方法がある。前記方法は形質転換体が前記ポリメラーゼ遺伝子を発現しているかどうかを容易に判別できるため、その後のスクリーニング操作を効率的に行なうことができる。前記スクリーニングベクターの一態様として、前記ポリメラーゼが認識するプロモーターおよび蛍光タンパク質遺伝子を機能的に連結したポリヌクレオチドを挿入したベクターを例示することができる。前記蛍光タンパク質遺伝子は、公知となっている遺伝子情報（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８３３９５（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））、Ｎｏ．ＡＹ６４６０７３（赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）））から作製した適切なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことで取得することができる。前記プロモーターおよび蛍光タンパク質遺伝子を機能的に連結したポリヌクレオチドを挿入したベクターをスクリーニングベクターとして使用した場合は、形質転換体よりポリメラーゼが発現すると、前記スクリーニングベクター中のポリメラーゼを認識するプロモーターによって前記蛍光タンパク質が発現するため、前記タンパク質に由来する蛍光をＦＡＣＡｒｉａセルソーサー（日本ＢＤ製）といったフローサイトメーターで検出することで前記ポリメラーゼの発現を確認することができる。
【００２６】
前記ライブラリー遺伝子を宿主へ形質転換することにより得られた形質転換体は、挿入されたポリメラーゼ遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することで、ポリメラーゼを発現させることができる。
【００２７】
本発明のスクリーニング方法は、形質転換体培養液から発現したポリメラーゼを抽出する際に、本発明の試薬を用いることを特徴としている。本発明の試薬を用いて形質転換体内から抽出したポリメラーゼは、通常のタンパク質で用いられる精製法を用いて精製を行なえばよい。精製法の一例としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）トヨパール（商品名）（東ソー製）といったレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルトヨパールおよびフェニルトヨパール（商品名）（東ソー製）といったレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動といった電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いた方法があげられ、前記精製法によりポリメラーゼ精製標品を得ることができる。なお、末端にシグナルペプチドを含んだポリメラーゼを精製する場合は、前記シグナルペプチドを利用して精製する方法が簡便である。例えば、末端にヒスチジンヘキサマー配列を含んだポリメラーゼの場合はニッケルカラムを用いて容易に精製することができる。
【００２８】
本発明のスクリーニング方法で用いる活性測定は、スクリーニング対象のポリメラーゼに則した核酸伸長反応であればよい。例えば、ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼの場合、基質としてリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を使用し、特定の配列を有するＤＮＡを鋳型に、ＲＮＡ合成を行なえばよい。また、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼの場合、基質としてデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を使用し、特定の配列を有するＲＮＡを鋳型に、ＤＮＡ合成を行なえばよい。活性測定の条件は選択したいポリメラーゼの機能に合わせて適宜選択すればよく、例えば高温条件下による耐熱性の評価、低ｐＨ条件下によるｐＨ依存性の評価が例示できる。合成量の定量については、伸長した核酸を検出できる方法であればよく、インターカレーターを用いた定量や、紫外分光光度計、リアルタイムＰＣＲなどを例示できる。
【００２９】
本発明のスクリーニング方法において、ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーを宿主へ形質転換させることで得られた複数の形質転換体を培養し前記ポリメラーゼを発現させる工程、前記工程の培養液から前記ポリメラーゼを抽出する工程、前記ポリメラーゼを精製する工程、前記精製したポリメラーゼを用いて核酸合成を行ないポリメラーゼ活性を測定する工程を、各形質転換体毎に個別に実施するのではなく、複数の形質転換体に対して同時に実施するのが好ましい。複数の形質転換体に対して同時に実施する方法として、個々の試験管に各形質転換体を含んだ培地を入れた後、シェーカーを用いて同時に培養後、各形質転換体の培養液に本発明の試薬を添加することでポリメラーゼを同時に抽出し、個々のタンパク質精製カラムなどを用いて同時にタンパク質を精製後、活性測定しスクリーニングする方法もあるが、培養／精製操作を小スケールで行なえる点、一度に多くの形質転換体を評価できる点でマイクロプレートを用いて前記工程を行なうのが特に好ましい。マイクロプレートには９６穴、３８４穴、１５３６穴と様々な穴の数のプレートが、コーニング社、日本ジェネティクス社、ナルジェヌンク社などから入手可能であり、スクリーニングを行なう形質転換体の数に応じて適切なものを選択すればよい。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法で得られたポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼと比較して耐熱性、安定性、ｐＨ依存性、酵素活性などの特性が優れたポリメラーゼを得ることができる。よって、本発明のスクリーニング方法で得られたポリメラーゼを例えば遺伝子増幅試薬用酵素として用いた場合、迅速・高感度な遺伝子増幅試薬を得ることができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の試薬は、グラム陰性細菌内のタンパク質を、超音波破砕処理を行なわずに抽出することができる。また、本発明の試薬で抽出した前記タンパク質を含んだ抽出液に、塩を含んだ緩衝液をそのまま添加しても、タンパク質の沈殿が発生しないため、前記タンパク質を精製する際に塩を含んだ緩衝液をそのまま用いることができる。
【００３２】
ポリメラーゼをスクリーニングする際に、選択した形質転換体より発現したポリメラーゼを抽出する工程で本発明の試薬を用いることで、選択した多数の形質転換体からの培養液から迅速、簡便にポリメラーゼを抽出することができる。また、本発明の試薬で抽出した抽出液は、塩の添加によるポリメラーゼの沈殿が発生しないため、ポリメラーゼ精製工程において沈殿の再溶解などの操作が不要であり、効率的にポリメラーゼのスクリーニングを行なうことができる。
【００３３】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様である、ポリメラーゼ遺伝子のライブラリーを宿主へ形質転換し、培養後、複数の形質転換体を選択する工程において、形質転換体が前記ポリメラーゼを発現しているかどうかを判別可能なスクリーニングベクターをさらに宿主へ形質転換するスクリーニング方法は、形質転換体が前記ポリメラーゼ遺伝子を発現しているかどうかを容易に判別できるため、その後のスクリーニング操作を効率的に行なうことができる。また、選択した複数の形質転換体よりポリメラーゼを発現させる工程、前記工程での培養液から本発明の試薬を用いてポリメラーゼを抽出する工程、前記抽出したポリメラーゼを精製する工程、前記精製したポリメラーゼを用いて核酸合成を行ない活性を比較する工程、を複数の形質転換体に対して同時に行なうことで、さらに効率的かつ再現性の高いポリメラーゼのスクリーニングを行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをクローニングしたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図。
【図２】ｐＣＤＦ２プラスミドの制限酵素地図。
【図３】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰの制限酵素地図。
【図４】Ｎ末端にヒスチジンヘキサマーを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓの制限酵素地図。
【図５】Ｔ７プロモーターによって発現が誘導されるＧＦＰ遺伝子を持つｐＳＴＶＧＦＰの制限酵素地図。
【図６】ポリメラーゼ抽出工程における、界面活性剤の影響を確認した図（電気泳動写真）。レーン１は分子量マーカーであり、レーン２はＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名）を、レーン３はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）（試薬１）を、レーン４はデオキシコール酸ナトリウム（試薬２）を、レーン５はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびデオキシコール酸ナトリウム（試薬３）をそれぞれ培養液に添加して抽出したときの結果を示す。
【図７】ポリメラーゼ抽出工程における、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度およびデオキシコール酸ナトリウム濃度の影響を確認した図（電気泳動写真）。レーン１は１．０（ｖ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）および０．１（ｗ／ｖ）％  デオキシコール酸ナトリウム（試薬３）を、レーン２は０．５（ｖ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）および０．１（ｗ／ｖ）  ％デオキシコール酸ナトリウム（試薬４）を、レーン３は０．２（ｖ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）および０．１（ｗ／ｖ）％  デオキシコール酸ナトリウム（試薬５）を、レーン４は０．２（ｖ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）および０．０２（ｗ／ｖ）％  デオキシコール酸ナトリウム（試薬６）をそれぞれ培養液に添加して抽出したときの結果を示す。
【図８】スクリーニングした変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとで４３から５０℃におけるＲＮＡ生産量を比較した結果。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングは以下の方法に従い実施した。
（１）Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡライブラリー（シグマ製）を鋳型プラスミドとして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、以下の試薬組成および反応条件にて、前半部分と後半部分に分けてＰＣＲ法を用い増幅した。なお、試薬組成のうち合成ＤＮＡプライマーは、前半部分の増幅にはプライマーＦＦ（配列番号１、３’末端側２０塩基は配列番号５の１から２０番目の塩基に相当）およびプライマーＦＲ（配列番号２、配列番号５の１８１３から１８３９番目の塩基の相補鎖に相当）を、後半部分の増幅にはプライマーＲＦ（配列番号３、配列番号５の１８２５から１８５３番目の塩基に相当）およびプライマーＲＲ（配列番号４、３’末端側２０塩基は配列番号５の２６３３から２６５２番目の塩基の相補鎖に相当）を、それぞれ用いた。
【００３７】
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  
Ｔａｑ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱
後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを２５回繰り返
した。
（２）ＰＣＲ反応後の液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物のうち、前半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ製）およびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆとした。
（５）常法に従いｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆを調製後、後半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＦにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（６）（５）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌとした。図１にｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例８に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。得られたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＦＪ８８１６９４の１から２６５２番目の塩基に相当）に、アミノ酸配列を配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０と同一の配列）に示す。
【００３８】
実施例２  発現ベクターの作製
実施例１で作製したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ（図１）を鋳型にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含んだＤＮＡ断片をＰＣＲ法にて増幅し、ｐＣＤＦ２プラスミド（図２）と連結した。
（１）ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ（図１）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成および反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。
【００３９】
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＦ（配列番号７）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＲ（配列番号８）
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  
Ｔａｑ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱
後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・２分４０秒の温度サイクルを２５回
繰り返した。
（２）１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ（タカラバイオ製）およびＢｌｎＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ製）およびＢｌｎＩで消化したｐＣＤＦ２プラスミド（図２）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰとした。図３にｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例８に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。
（５）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）を基に以下に示す方法でヒスチジンヘキサマーの導入を行なった。
（５−１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成および反応条件にて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＨｉｓＦ（配列番号９、３’末端側１８塩基は配列番号５の１から１８番目の塩基に相当）とプライマーｐＣＤＦＲ（配列番号１０、配列番号５の１０８０から１１０４番目の塩基の相補鎖に相当）の組み合わせ、またはプライマーＨｉｓＲ（配列番号１１）とプライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）の組み合わせを用いた。
【００４０】
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  
ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９８℃で３０秒加
熱後、９８℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・３分の温度サイクルを３０回繰
り返した後、７２℃で７分間反応した。
（５−２）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（５−３）得られた２種類のＰＣＲ産物を鋳型に、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＣＤＦＲ（配列番号１０）とプライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）の組み合わせを用いて２回目のＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応における試薬組成、および反応条件は合成ＤＮＡプライマーと鋳型以外は（５−１）と同じ条件で行ない、増幅した産物を（５−２）と同様にアガロースゲルにて電気泳動後、抽出、精製した。
（５−４）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰプラスミド（図３）と、（５−３）で精製した２回目のＰＣＲ産物に０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼおよび酵素に付属するバッファーを加え、総反応液量を１００μＬとした。この反応液をサーマルサイクラーを用いて９５℃で３０秒加熱後、９５℃・３０秒、５５℃・１分、６８℃・８分の温度サイクルを１８回繰り返した後、６８℃で７分間反応させることで、ＰＣＲ反応を行なった。
（５−５）ＰＣＲ反応終了後、制限酵素ＤｐｎＩを１０ｕｎｉｔｓ加え、３７℃で１時間消化し、常法に従い大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
（５−６）形質転換した溶液はＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））に塗布し、３７℃で一晩保温した。生成したコロニーから常法によりプラスミドを抽出し、ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミドとした。図４にｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓの制限酵素地図を示す。さらに実施例８に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないこと、およびヒスチジンヘキサマーが導入されていることを確認した。また培養した菌体から酵素を抽出し、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティー精製が可能であることを確認した。得られたヒスチジンヘキサマーを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号１３（配列番号５の５’側にａｔｇｇｇｇおよびヒスチジンヘキサマーをコードするオリゴヌクレオチド（ｃａｔを６回繰り返した配列）を付加した配列）に、アミノ酸配列を配列番号１４（配列番号６の５’側にメチオニン、グリシンおよびヒスチジンヘキサマーを付加した配列）に示す。
【００４１】
実施例３  ポリメラーゼ遺伝子ライブラリーの作製
実施例２で作製したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に以下の手順で変異を導入し、遺伝子ライブラリーを構築した。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成および反応条件にて、エラープローンＰＣＲ反応を行なった。
【００４２】
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
０．１から０．３ｍＭ（必要に応じて）  ＭｎＣｌ２
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ
０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ
１ｍＭ  ｄＣＴＰ
１ｍＭ  ｄＴＴＰ
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．０１ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＧｏＴａｑ（商品名）、
Ｐｒｏｍｅｇａ製）
酵素に付属するＭｇフリーのバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱
後、９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・８分の温度サイクルを２５回繰り返
した。
（２）ＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２プラスミド（図２）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。
（４）作製したライブラリーの一部を定法に従い大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換しプラスミドを精製し、実施例８に示す方法で塩基配列を決定することでエラープローンＰＣＲの効果を確かめた。
【００４３】
実施例４  スクリーニングベクターの作製
実施例３で作製した遺伝子ライブラリーの活性を評価するためのスクリーニングベクターを作製した。
（１）塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１８３３９５）に基づき、ＧＦＰ遺伝子を合成した。合成したＧＦＰ遺伝子には、Ｔ７プロモーターおよびクローニング操作を行なうための制限酵素（ＳｐｈＩ）認識配列を持つように設計した。
（２）合成したＧＦＰ遺伝子は制限酵素ＳｐｈＩ（タカラバイオ製）で３７℃で３時間消化し、１．０％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。これを同様に消化、精製したｐＳＴＶ２８ベクター（タカラバイオ製）とＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（３）（２）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｍ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを取得した。
（４）取得したコロニーは、ＬＢＧ／Ｃｍ液体培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）を用いて、３７℃で一晩培養後、プラスミドを回収し、このプラスミドをＴ７プロモーターによって発現が誘導されるＧＦＰ遺伝子を持つｐＳＴＶＧＦＰとした。図５にｐＳＴＶＧＦＰの制限酵素地図を示す。
（５）取得したｐＳＴＶＧＦＰ（図５）を、実施例３で作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーと共に大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換を行ない、前記形質転換液を３７℃のＳＯＣ培地で１．５時間培養後、ＦＡＣＡｒｉａセルソーター（日本ＢＤ製）で蛍光が観察される株を１クローンずつ分取し、３７℃の２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））で増殖してきた株を、変異体候補株とした。
【００４４】
実施例５  抽出条件の検討（その１）
形質転換体より発現したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを効率的に抽出するための、抽出条件の検討を行なった。
（１）１ｍＬ容量の９６ディープウェルプレート（ナルジェヌンク製）に２００μＬのＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））を加え、ＪＭ１０９／ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（野生型）形質転換体を植菌し、３７℃にて一晩６００回転／分で培養した。
（２）２ｍＬ容量の９６ディープウェルプレート（ナルジェヌンク製）に１．０ｍＬの２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））を添加し、（１）の一晩培養液１０μＬ植菌後、３７℃にて７５０回転／分で振とう培養を開始した。
（３）（２）での培養約４時間後、５０ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）溶液１０μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。培養終了後、４℃にて３０００回転／分で１５分間遠心分離して菌体を回収し、得られた菌体を−３０℃にて一晩凍結保存した。
（４）凍結保存した菌体に表１の組成からなる２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬを各ウェルに添加し、３０℃にて７００回転／分で３０分間撹拌することで抽出を行なった。なお、比較対照として市販の抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名）、ノバジェン製）を用いた抽出も同時に行なった。
【００４５】
【表１】
2011051943.tif 000003
（５）抽出液を４℃にて３０００回転／分で１５分間遠心分離して上清を回収し、その一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図６）。
【００４６】
図６から１．０（ｖ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１（ｗ／ｖ）％  デオキシコール酸ナトリウムを加えた試薬（表１の試薬３）が、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名）と同等の抽出効率であることがわかる。
【００４７】
実施例６  抽出条件の検討（その２）
実施例５より非イオン界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および陰イオン界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウムを含んだ試薬を添加することで、形質転換体内に発現したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを効率的に抽出できることが判明した。そこで、次に、試薬中に含まれる各界面活性剤の濃度が抽出効率に影響を及ぼすか確認した。
【００４８】
実施例５のうち、（４）で添加する試薬を表２に示す組成からなる２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００μＬに変更したほかは、実施例５と同様な方法で行なった。
【００４９】
【表２】
2011051943.tif 000004
結果を図７に示す。図７の結果より、少なくとも、試薬中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が０．２（ｖ／ｖ）％以上であり、デオキシコール酸ナトリウムが０．０２（ｗ／ｖ）％以上であれば、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名）と同等の抽出効率が得られることが分かる。以降の実施例では、表２の試薬６に示す組成からなる２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ抽出試薬として用いた。
【００５０】
実施例７  高温型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのスクリーニング
変異株のスクリーニングは効率的に変異体が評価できるよう９６ウェルプレートを用いて行なった。
（１）１ｍＬ容量の９６ディープウェルプレート（ナルジェヌンク製）に２００μＬのＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））を加え、実施例４で得たＧＦＰ陽性のコロニーを植菌し、３７℃にて一晩６００回転／分で培養した。
（２）２ｍＬ容量の９６ディープウェルプレート（ナルジェヌンク製）に１．０ｍＬの２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））を加え、（１）の一晩培養液１０μＬ植菌後、３７℃にて７５０回転／分で振とう培養を開始した。
（３）（２）での培養約４時間後、５０ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）溶液１０μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。培養終了後、４℃にて３０００回転／分で１５分間遠心分離して菌体を回収し、得られた菌体は−３０℃にて一晩凍結保存した。
（４）凍結保存した菌体に溶菌液１００μＬ（組成：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２（ｖ／ｖ）％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、０．０２（ｗ／ｖ）％  デオキシコール酸ナトリウム、０．０３（ｗ／ｖ）％  リゾチーム（太陽化学製）、０．２５ｕｎｉｔのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ノバジェン製））を加え、３０℃にて５００回転／分で１時間振とうし、４℃にて３０００回転／分で３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（５）（４）で得られた上清の全量をニッケルキレート樹脂（ヒスバインド（商品名）、ノバジェン製）を充填した９６ウェルフィルタープレートにアプライし、緩衝液Ａ（２０ｍＭのイミダゾールおよび５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））２００μＬで４回洗浄後、５０μＬの緩衝液Ｂ（１５０ｍＭのイミダゾールおよび５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で溶出させた。
（６）溶出画分を、脱塩カラム（ＰＤ−１０（商品名）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）により、５ｍＭ  ジチオスレイトールおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、等量のグリセロールを加えた。精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは牛血清アルブミンをコントロールタンパク質としたプロテインアッセイキット（バイオラッド製）によりタンパク質濃度を求めた。また７．５％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより酵素の純度を分析した。
（７）活性測定は、インヴィトロ転写反応にて生成したＲＮＡ量を測定する方法で行なった。なお、鋳型ＤＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識するＴ７プロモーター配列を有するＤＮＡを用いるが、ここではＴ７プロモーター配列を含むプラスミドを鋳型にＰＣＲで増幅した約１．５ｋｂｐＤＮＡ断片を用いた。また、Ｔ７プロモーター配列の下流のＤＮＡの長さは１．０ｋｂｐであり、転写されるＲＮＡは約１．０ｋｂになる。
（７−１）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを除いた反応液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ジチオスレイトール、２０ｎｇ  鋳型ＤＮＡ、０．４Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤、各０．４ｍＭ  ＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ））を０．２ｍＬのＰＣＲチューブにいれ、精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ０．５μＬを０℃に冷却した状態で加え、合計１０μＬとした。
（７−２）予め４６℃に保温しておいたヒートブロック（マスターサイクラーｅｐグラジエント（商品名）、エッペンドルフ製）に先ほど調製したＰＣＲチューブをセットし、６０分間転写反応を行なった。反応停止は８０℃で２分間加熱することで行なった。
（７−３）生成したＲＮＡ量は１％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイドにて染色する方法、および市販のＲＮＡ定量キットのＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いて蛍光染色し、添付の標準ＲＮＡで作製した検量線より濃度換算する方法にて分析した。
【００５１】
スクリーニング結果の一部（スクリーニングしたウェルプレートのうちの一枚）を表３から５に示す。表３はインヴィトロ転写活性測定の結果（単位はｍｇ／ｍＬ）であり、表４はタンパク質濃度測定の結果（単位はｍｇ／ｍＬ）であり、表５はインヴィトロ転写生成量をタンパク質量で除した比活性の結果である（０．１ｍｇ／ｍＬ以上のタンパク質濃度の検体のみ算出している）。なお、Ｈ行９列およびＨ行１０列は野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの結果を、Ｈ行１１列およびＨ行１２列はブランクの結果を、それぞれ示す。本スクリーニングより、約４０００の変異株から野生型の比活性よりも約２倍高い菌株６０種類を選択した。
【００５２】
【表３】
2011051943.tif 000005
【００５３】
【表４】
2011051943.tif 000006
【００５４】
【表５】
2011051943.tif 000007
実施例８  シークエンス方法
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドの形質転換株を、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））で一晩培養後、定法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列決定は以下の方法で行なった。
（１）Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、添付のバッファー２．０μＬ、プレミックス４．０μＬ、合成ＤＮＡプライマー３．２ｐｍｏｌ、鋳型プラスミド５００ｎｇを滅菌水にて２０μＬに調製し、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で１分加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）（１）で調製した塩基配列決定用サンプルをＣｅｎｔｒｉ―Ｓｅｐスピンカラム（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、以下に示す方法で精製した。
（２−１）Ｃｅｎｔｒｉ―Ｓｅｐスピンカラムに滅菌水を８００μＬ加え、ボルテックスにより乾燥したゲルを十分に水和させた。
（２−２）カラムに気泡がないことを確認後、室温にて２時間以上放置した。
（２−３）上のキャップ、下のストッパーを順に外しカラム内の滅菌水をゲル表面まで自然落下させた後、７３０×ｇで２分間遠心分離を行なった。
（２−４）（２−１）から（２−３）により作製したスピンカラムの中央に塩基配列決定用サンプルをアプライし、７３０×ｇで２分間遠心分離によりサンプルをチューブに回収した。
（２−５）回収したサンプルについて減圧乾燥を行なった後、ホルムアミドに溶解した。
（３）（２）で調製した塩基配列決定用サンプルを９５℃で２分間処理し、氷上で急冷後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０−ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で解析することで、塩基配列を決定した。塩基配列決定に使用した合成ＤＮＡプライマーは、プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）、プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）、プライマーＴ７Ｆ０（配列番号１７）、プライマーＴ７Ｆ１（配列番号１８、配列番号５の２５８から２８７番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ２（配列番号１９、配列番号５の７１１から７４０番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ３（配列番号２０、配列番号５の１１６３から１１９２番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ４（配列番号２１、配列番号５の１６１５から１６４４番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ５（配列番号２２、配列番号５の２０６６から２０９５番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ６（配列番号２３、配列番号５の２５２０から２５４９番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｒ０（配列番号２４）、プライマーＴ７Ｒ１（配列番号２５、配列番号５の２３９０から２４１９番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ２（配列番号２６、配列番号５の１９３２から１９６１番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ３（配列番号２７、配列番号５の１４７６から１５０４番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ４（配列番号２８、配列番号５の１０２５から１０５４番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ５（配列番号２９、配列番号５の５６１から５９０番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ６（配列番号３０、配列番号５の１１１から１４０番目の塩基の相補鎖に相当）を必要に応じて選択し使用した。
（４）決定した塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ  ｖｅｒ．８．０（商品名）（ゼネティクス製）を使用して解析を行なった。
【００５５】
実施例９  スクリーニング株の活性評価
実施例７でスクリーニングしたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの性能を詳細に評価した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製は以下に示す手順で行なった。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））３ｍＬに実施例７で得た形質転換体のグリセロールストックを植菌し、１８ｍＬ試験管にて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））１００ｍＬに（１）の前培養液１．０ｍＬを植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて、３７℃、１５０回転／分（タイテック製、ロータリー式）で培養した。（３）（２）の培養約３から４時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ１．０程度）に５００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）１００μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。
（４）培養終了後、４℃にて４０００回転／分で１５分間遠心分離し、菌体を回収した。直ちに菌体破砕を行わない場合は−３０℃に保存した。
（５）回収した菌体は２０ｍＬの２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により１回洗浄し、同じ組成の緩衝液２０ｍＬに再懸濁し、菌体破砕した。菌体破砕は超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、５℃にて約１５０Ｗの出力で約５分間処理した。
（６）得られた菌体破砕液を４℃にて１２０００回転／分で１０分間遠心分離し、回収した上清を酵素抽出液として、塩化ナトリウムおよびイミダゾールをそれぞれ５００ｍＭ，２０ｍＭになるように添加し、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティ精製に供した。
（７）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに付加させたヒスチジンヘキサマータグを利用したアフィニティ精製により、以下の方法で酵素精製を行なった。
（７−１）２ｍＬのニッケルキレート樹脂（ヒスバインド（商品名）、ノバジェン製）のスラリーを付属の空カラムに充填し、３ｍＬの滅菌水で洗浄した。
（７−２）洗浄したニッケルキレート樹脂に５ｍＬの５０ｍＭの硫酸ニッケル水溶液でキレート樹脂にニッケルを結合させ、更に３ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  イミダゾール）で洗浄した。そこに上記の酵素抽出液を加え、６ｍＬの緩衝液Ａで洗浄後、１ｍＬの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、１５０ｍＭ  イミダゾール）で溶出し、活性画分を回収した。
（７−３）回収した画分を脱塩カラム（ＰＤ−１０（商品名）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）により、５ｍＭ  ジチオスレイトールおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、等量のグリセロールを加えた。精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは牛血清アルブミンをコントロールタンパク質としたプロテインアッセイキット（バイオラッド製）により濃度を求めた。また７．５％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより酵素の純度を分析し、ほぼ単一であることを確認した。
（８）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を実施例７に示した手順に従い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を２０μｇ／ｍＬ、反応温度を４３から５０℃の範囲で１０分間反応させて測定した。
（９）生成したＲＮＡ量をＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いて求めた。
【００５６】
測定したＲＮＡ濃度を図８に示した。スクリーニングにより得られた株は４３℃から５０℃の範囲で野生型よりも比活性が高いことがわかり、本発明のスクリーニング方法により、目的とするポリメラーゼを効率的に得られることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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