(57)【要約】      （修正有）【課題】環境に感受性のあるレポータータンパク質である修飾された甲虫ルシフェラーゼタンパク質が提供される。【解決手段】関心のある分子と相互作用するアミノ酸配列を含む挿入を含み、修飾に寛容性のある親甲虫ルシフェラーゼ配列の残基又は領域において環状置換された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド。前記ポリヌクレオチドによってコードされる修飾された甲虫ルシフェラーゼ。前記ポリヌクレオチドを細胞に形質導入し、細胞内の関心のある分子を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは、関心のある分子と相互作用するアミノ酸配列を含む挿入を含み、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは、修飾に寛容性のある親甲虫ルシフェラーゼ配列の残基又は領域において環状置換され、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼの活性は、前記関心のある分子と挿入配列が相互作用した後に活性に関して相互作用の前と比べて変化し、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼはホタル又はコメツキムシルシフェラーゼであり、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼの場合、ホタルルシフェラーゼの残基２から１２、残基１１６から１２６、残基２２８から２３８、残基２６２から２７２、残基２８９から３０８、残基３５６から３６６又は残基５３５から５４６と対応する領域において環状置換されており、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼがコメツキムシルシフェラーゼの場合、コメツキムシルシフェラーゼの残基１５から３０、残基１１２から１２２、残基３５２から３６２、残基３７１から３８４、残基３９３から４１４又は残基４８５から４９５に対応する領域において環状置換されている、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記修飾された甲虫ルシフェラーゼのＮ末端、Ｃ末端又はその両方における少なくとも１つのアミノ酸の標識をコードするポリヌクレオチドを更に含んでいる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは挿入に加えて甲虫ルシフェラーゼ残基Ｎ末端及び／又はＣ末端の欠失を更に含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記欠失は甲虫ルシフェラーゼ配列の１５残基以下である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは親甲虫ルシフェラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端と対応する甲虫ルシフェラーゼ残基の欠失を更に含む、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記欠失は甲虫ルシフェラーゼ配列の１５残基以下である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記挿入は親甲虫ルシフェラーゼのＮ末端及び／又はＣ末端におけるものである、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する親甲虫ルシフェラーゼの活性の少なくとも約５０％を有する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する親甲虫ルシフェラーゼの活性の少なくとも約１％を有する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記標識はＰＥＳＴ配列、ＧＳＴ配列、ポリヒスチジン配列又はレポータータンパク質である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記挿入は約４から約５０のアミノ酸残基である、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記甲虫ルシフェラーゼはコメツキムシルシフェラーゼである、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記甲虫ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼである、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる修飾された甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項１７】
請求項２に記載のポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質。
【請求項１８】
細胞内の関心のある分子を検出する方法であって、ａ）細胞を請求項１４に記載のベクターと接触させ、前記ベクターを前記細胞に形質移入し、前記挿入は前記分子によって認識されるステップと、ｂ）前記ベクターによってコードされる前記修飾された甲虫ルシフェラーゼの活性を検出又は決定し、それによって前記細胞内の前記分子の存在又は量を検出又は決定するステップとを含む方法。
【請求項１９】
前記甲虫ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記甲虫ルシフェラーゼはコメツキムシルシフェラーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
修飾された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する親甲虫ルシフェラーゼに対する少なくとも２つの修飾を含み、前記少なくとも２つの修飾のそれぞれは修飾に寛容性のある甲虫ルシフェラーゼ配列の残基又は領域にあり、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは環状置換されており、前記修飾に寛容性のある前記残基又は領域は、ホタルルシフェラーゼの残基２から１２、残基１１６から１２６、残基２２８から２３８、残基２６２から２７２、残基２８９から３０８、残基３５６から３６６又は残基５３５から５４６に対応し、又はコメツキムシルシフェラーゼの残基１５から３０、残基１１２から１２２、残基３５２から３６２、残基３７１から３８４、残基３９３から４１４又は残基４８５から４９５に対応するものである、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
プロテアーゼ切断部位を含んでいる環状置換された甲虫ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記ルシフェラーゼは対応する非置換の甲虫ルシフェラーゼにおいては修飾に寛容性のある部位で置換されており、前記修飾に寛容性のある部位は、ホタルルシフェラーゼの残基２から１２、残基１１６から１２６、残基２２８から２３８、残基２６２から２７２、残基２８９から３０８、残基３５６から３６６又は残基５３５から５４６に対応し、又はコメツキムシルシフェラーゼの残基１５から３０、残基１１２から１２２、残基３５２から３６２、残基３７１から３８４、残基３９３から４１４又は残基４８５から４９５に対応するものである、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記プロテアーゼ切断部位は対応する非置換ルシフェラーゼのＮ及びＣ末端と対応している残基の位置又はその近くで挿入される、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記プロテアーゼ切断部位での切断は発光の増加をもたらす、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記プロテアーゼ切断部位はカスパーゼ３切断部位、カスパーゼ８切断部位、エンテロキナーゼ切断部位、前立腺血清抗原切断部位、ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ切断部位、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＮＬＹＦＱＧ）、又はライノウイルスプロテアーゼ切断部位である、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチドによってコードされるルシフェラーゼ。
【請求項２７】
請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、参照により本明細書に組み込まれた２００３年１０月１０日に出願の米国特許出願第６０／５１０１８７号の出願日の権益を請求する。
【０００２】
本発明は、生化学アッセイ及び試薬の分野に関するものである。より具体的には、本発明は発光性レポータータンパク質などの修飾されたレポータータンパク質、及びそれらの使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ルシフェラーゼは、光量子の放出を伴う基質（例えばルシフェリン）の酸化を触媒する酵素である。ルシフェラーゼは、鞘翅類節足動物及び多くの海洋生物を含む多数の種から単離されている。検出が容易でありその活性は高精度で定量化することが可能なので、ルシフェラーゼ／基質対は遺伝子発現及びタンパク質の所在を研究するために広く使用されてきた。発色団の形成に最高３０分を要する他のレポータータンパク質である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と異なり、ルシフェラーゼ生成物はポリペプチド鎖の合成（基質及び酸素も存在する場合）終了後直ちに検出することが可能である。更に、酵素活性のために翻訳後修飾は必要ではなく、また、この酵素は補欠分子団、結合コファクター及びジスルフィド結合を含まない。ルシフェラーゼは、多数の種及び多種多様な細胞における有用なレポーターである。
【０００４】
ルシフェラーゼは、バイオセンシングのためのレポーター分子、すなわち、生物学的の性状を明らかにする分子としてそれらを特に有用なものにする追加機能を有する。バイオセンサー（生物学的構成要素を含むセンサー）におけるシグナル伝達は、通常二段階過程を含む。即ち、生物学的構成要素を通してのシグナル生成並びに電気的構成要素を通してのシグナル伝達及び増幅である。シグナル生成は、一般的に結合又は触媒作用を通して達成される。電気信号へのこれらの生化学事象の変換は一般的に電気化学的又は熱検出法に基づいているが、これらは生化学反応の自由エネルギーの変化によって制限される。大部分の反応については、これはＡＴＰ２分子の加水分解のエネルギー、すなわち約７０ｋＪ／モルより少ない。しかし、ルシフェラーゼによって導き出される発光は、非常に高いエネルギー含量を有する。例えば、ホタルルシフェラーゼによって触媒される反応（５６０ｎｍ）は、２１４ｋＪ／モルのエネルギーを発する。更に、ルシフェラーゼによって触媒される反応は知られている最も効率的な生物発光反応の１つであり、約０．９の量子収率を有する。ルシフェラーゼは、したがって極めて効率的な化学エネルギー変換器である。
【０００５】
ルシフェラーゼバイオセンサーが記載されている。例えば、Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂｙら（１９９１年）は、サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位を生成するためにＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼｃＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅したことを開示している。特に、部位ＲＲＦＳを生成するために２１７位置のバリンがアルギニンに変異され、ブタピルビン酸キナーゼのリン酸化部位であるヘプタペプチドケンプチドがルシフェラーゼのＮ又はＣ末端に加えられた。Ｓａｌａ−Ｎｅｗｂｙらは、リン酸化部位を運ぶタンパク質の比活性、ｐＩ、発光色に及ぼすｐＨの影響、及びＡＴＰ存在下でのタンパク質キナーゼＡの触媒サブユニットの影響について特徴を明らかにしたと述べている。組換えタンパク質（ＲＲＦＳ）の１つだけが野生型ルシフェラーゼとかなり異なり、そのＲＲＦＳ変異体は低い比活性、低い最適ｐＨを有し、低いｐＨでより濃い緑の光を発し、且つリン酸化されるとその活性が最高８０％減少することが発見された。後者の影響はホスファターゼによって逆転されたことが開示されている。
【０００６】
Ｗａｕｄら（１９９６年）は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼｃＤＮＡに、タンパク質キナーゼ認識配列及びプロテイナーゼ部位を導入した。ルシフェラーゼの２つの領域が、Ｗａｕｄらによって修飾された。１つはアミノ酸２０９と２２７との間で、他はＣ末端のアミノ酸５３７と５５０との間である。Ｗａｕｄらは、残基２０９及び２２７の間のアミノ酸の変異は生物発光活性を野生型組換え体の１％未満に低下させたが、Ｃ末端におけるペプチド配列の導入は野生型組換えルシフェラーゼの０．０６％〜１２０％の範囲の比活性をもたらしたことを開示している。Ｗａｕｄらは、サイクリックＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットの、キナーゼ認識配列ＬＲＲＡＳＬＧ（配列番号１０７）が組み込まれ、セリンがアミノ酸位置５４３にある変異型ルシフェラーゼへの添加は、３０％の活性低下をもたらしたことも開示している。アルカリホスファターゼ処理は活性を回復させた。Ｗａｕｄらは、トロンビン認識配列ＬＶＰＲＥＳ（配列番号１０８）を含み、切断部位がアミノ酸５４２及び５４３の間に位置する変異型ルシフェラーゼの生物発光活性は、トロンビン存在下でインキュベートされると５０％減少したことも開示している。
【０００７】
Ｏｚａｗａら（２００１年）は、ホタルルシフェラーゼの合理的に設計された断片のタンパク質スプライシング誘発性の相補に基づくバイオセンサーを記載している。タンパク質スプライシングは、それを通してインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）（内部タンパク質）が前駆体融合タンパク質から切除されて連なるエクステイン（ｅｘｔｅｉｎ）（外部タンパク質）が連結されて連続したポリペプチドになる、翻訳後タンパク質修飾である。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ属種ＰＣＣ６８０３からのＮ及びＣ末端のインテインＤｎａＥは、それぞれルシフェラーゼのＮ及びＣ末端の断片に融合されたことが開示されている。タンパク質対タンパク相互作用はＤｎａＥインテインの折畳みを引き起こしてタンパク質スプライシングをもたらし、それにより、連結されたルシフェラーゼのエクステインはその酵素活性を取り戻す。Ｏｚａｗａらは、公知の結合パートナーであるリン酸化インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）及びその標的であるＰＩ３−キナーゼのＮ末端ＳＨ２ドメインの間の相互作用が、インスリン存在下で分割されたルシフェラーゼを使用して観察されたことを開示している。
【０００８】
Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎら（２００２年）は分割されたホタルルシフェラーゼに基づくアッセイを使用し、相補性方策及びインテイン媒介再構成手法を使用して細胞培養及びマウスで２つのタンパク質、即ちＭｙｏＤ及びＩｄの相互作用を観察した。レポーター活性を保持するために、相補性手法では融合タンパク質はタンパク相互作用、即ち、タンパク質パートナーＭｙｏＤ及びＩｄの相互作用を必要とするが、再構成手法においてはインテイン媒介スプライシングを通して形成された新しい完全なレポータータンパク質がタンパク質パートナーの間の継続的な相互作用のない場合でさえその活性を維持する。
【０００９】
タンパク質断片相補性アッセイは、Ｍｉｃｈｎｉｃｋら（米国特許第６２７０９６４号、第６２９４３３０号及び第６４２８９５１号）で開示されている。具体的には、Ｍｉｃｈｎｉｃｋは、ＤＨＦＲのＮ末端断片及びＤＨＦＲのＣ末端断片がそれぞれＧＣＮ４ロイシンジッパー配列に融合している、分割されたマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に基づくアッセイを記載している。ＤＨＦＲ活性は、両方の融合タンパク質を発現していた細胞で検出された。Ｍｉｃｈｎｉｃｋらは、アミノグリコシドキナーゼ（ＡＫ）遺伝子内のＳ１ヌクレアーゼ生成欠失の入れ子セットがロイシンジッパー構築物に導入され、得られた構築物セットが細胞に導入されてＡＫ活性がスクリーニングされた他の相補性手法も記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
必要なものは、例えばタンパク質対タンパク質相互作用などの細胞現象を高い特異性及び高量子収率で検出する際にバイオセンサーとして使用するための、改良された組換えレポータータンパク質である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は改良された遺伝子産物、例えば他の分子（１つ又は複数の関心のある分子）の存在下で、又はある条件下で１つ又は複数の変更された活性を有する修飾されたレポータータンパク質、例えば修飾された甲虫ルシフェラーゼを提供する。一実施形態では、修飾されたレポータータンパク質のアミノ酸配列は、修飾に寛容性のある、例えば挿入、欠失、環状置換又はその任意の組み合わせに寛容性のある部位（残基）又はある領域における１つ又は複数の修飾の結果として、対応する修飾されていない（天然、野生型又は親の）レポータータンパク質のアミノ酸配列とは異なる。１つ又は複数の修飾は修飾されていないレポータータンパク質のＮ又はＣ末端に対して内部でもよく、且つ／又は修飾されていないレポータータンパク質のＮ及び／又はＣ末端におけるものでもよく、例えば１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失及び／又は挿入であり、それにより修飾されたレポータータンパク質が与えられる。修飾としては、直接又は間接的に関心のある分子と相互作用し、且つ／又はさもなければ条件の変化に感受性のある１つ又は複数の別々の（分離された）アミノ酸配列の導入があり、任意選択に、例えば修飾に寛容性のある部位又は領域、例えば修飾されていないレポータータンパク質のＮ及び／又はＣ末端における１つ又は複数のアミノ酸の欠失があるが、この場合、得られた修飾されたレポータータンパク質は外因性の剤などの関心のある分子との相互作用又は条件変化の前及び／又は後にレポーター活性を有するものとする。例えば、修飾されたレポータータンパク質は、対応する修飾されていないレポータータンパク質に対する、１から約１０又は１５の残基、或いはその中間の任意の整数のＮ又はＣ末端位置の欠失を含んでもよい。修飾は、修飾されたレポータータンパク質における、対応する修飾されていないレポータータンパク質においてペプチド結合を通して結合された２つのアミノ酸の間のペプチド結合の欠如であってもよく、並びに修飾されたレポータータンパク質における、対応する修飾されていないレポータータンパク質のＮ末端及びＣ末端の残基において又はその近くで見られる残基の間のペプチド結合の欠如でもよく、これらからは環状置換されたレポータータンパク質が与えられ、このレポータータンパク質は任意選択に直接又は間接的に関心のある分子と相互作用するかさもなければ条件変化に感受性であるアミノ酸配列を含む。修飾されたレポータータンパク質は、したがって可逆的相互作用、例えば２つ以上の分子の結合、ジスルフィド結合の形成又は他の高次構造変化又はｐＨ、温度若しくは溶媒疎水性などの条件の変化、或いは修飾されたレポータータンパク質の活性の変化、例えば光強度、色又は動態学的プロフィールの変化によるペプチド結合の切断などの不可逆的相互作用を検出するために使用することができる。
【００１２】
本明細書で以下に記載されているように、コメツキムシルシフェラーゼ核酸配列への１９のアミノ酸をコードするＤＮＡ挿入のライブラリーを調製するために、Ｔｎ５を使用した。挿入を有する４１６のクローンの分析により、クローンの約１０％（５２）は部分活性、例えば野生型の最高で２％の活性を有することが明らかになった。５２クローンの内２７クローンはルシフェラーゼ読取り枠内に挿入を有し、それらの挿入の内の１６は残基３９８から４０９の間（「ヒンジ」領域）にあった。特に、検出可能な活性を有する修飾されたコメツキムシルシフェラーゼをもたらすインフレーム挿入は、コメツキムシルシフェラーゼの残基２１、２５、１１７、３５８、３７６、３７９、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０５、４０６、４０７、４０９又は４９０の位置であり、即ち、それらの残基及び／又はそれらの残基の近くの領域は挿入を含む修飾に寛容性である。したがって、本発明は、コメツキムシルシフェラーゼの例えば残基２１、２５、１１７、３５８、３７６、３７９、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０５、４０６、４０７、４０９又は４９０などの残基、或いは、残基１５から３０、例えば残基２１若しくは２５、残基１１２から１２２、例えば残基１１７、残基３５２から３６２、例えば残基３５８、残基３７１から３８４、例えば残基３７９、残基３９３から４１４又は残基４８５から４９５に対応する領域における修飾を有する、修飾された甲虫ルシフェラーゼを含む。対応する位置は、ルシフェラーゼ配列を一列に並べることによって特定することができる。詳細には、本発明は甲虫ルシフェラーゼのヒンジ領域、例えばコメツキムシルシフェラーゼの残基３９０から４０９に対応する残基並びに修飾に寛容性のある他の領域における修飾を有する、修飾された甲虫ルシフェラーゼを含む。
【００１３】
また本明細書で記載されているように、ホタルルシフェラーゼ核酸配列への挿入のライブラリーを調製するために、Ｔｎ７を使用した。検出可能な活性を有する修飾されたホタルルシフェラーゼをもたらすインフレーム挿入は、ホタルルシフェラーゼの残基７、１２１、２３３、２６７、２９４、３０３、３６１、５４０又は５４１の位置であり、即ち、それらの残基及び／又はそれらの残基の近くの領域は挿入を含む修飾に寛容性である。したがって、本発明はホタルルシフェラーゼの残基２から１２、残基１１６から１２６、残基２２８から２３８、残基２６２から２７２、残基２８９から３０８、残基３５６から３６６又は残基５３５から５４６と対応する残基又は領域における修飾を有する、修飾された甲虫ルシフェラーゼを含む。対応する位置は、ルシフェラーゼ配列を一列に並べることによって特定することができる。
【００１４】
したがって、一実施形態ではレポータータンパク質は甲虫ルシフェラーゼであり、修飾された甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、修飾に寛容性のある部位又はある領域における１つ又は複数の修飾の結果として、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列とは異なる。例えば、一実施形態では、修飾された甲虫ルシフェラーゼは検出可能な活性を有し、また対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼに対する修飾に寛容性のある部位又は領域における１つ又は複数のアミノ酸の挿入を含み、この挿入は修飾された甲虫ルシフェラーゼのＮ及びＣ末端の内部にある。一実施形態では、修飾された甲虫ルシフェラーゼは、２つ以上、例えば３、４、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００以上で約５００未満の、又はその中間の任意の整数のアミノ酸残基の挿入を含む。一実施形態では、本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼは修飾に寛容性のある残基又は領域に少なくとも４つのアミノ酸の内部挿入を含み、この挿入は関心のある分子と直接的に相互作用するアミノ酸配列を含み、例としては関心のある分子の認識配列を含む挿入又は関心のある分子に間接的に、例えば他の分子を通して作用する挿入がある。一実施形態では、内部挿入を有する修飾された甲虫ルシフェラーゼは、甲虫ルシフェラーゼ配列の内部欠失、例えば１つ又は複数で約１００未満、例えば５０、４０、３０、２０、１０又は５未満又はその中間の任意の整数の残基の欠失を更に含む。
【００１５】
一実施形態では、修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼに対する、修飾に寛容性のある部位又は領域における欠失を含む。一実施形態では、本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼは、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼに対する少なくとも５０、例えば少なくとも１００の連続したアミノ酸残基の欠失を含み、即ち、前記修飾された甲虫ルシフェラーゼは完全長の修飾されていない甲虫ルシフェラーゼ配列の断片、例えば少なくとも５０、例えば少なくとも１００の連続したアミノ酸残基の断片であり、例えば対応する完全長の修飾されていない甲虫ルシフェラーゼよりも少なくとも５％、例えば１０％少ない残基、及び関心のある分子と直接又は間接的に相互作用するかさもなければ条件に感受性のあるアミノ酸配列の挿入を有する断片である。そのような修飾された甲虫ルシフェラーゼは、タンパク質相補性アッセイで、例えば関心のある分子に連結されたルシフェラーゼの他の断片の存在下でルシフェラーゼの検出可能な活性が増加する場合に、又はインテイン媒介組換えなどのタンパク質組換えアッセイで使用することができる。一実施形態では、甲虫ルシフェラーゼ断片（１つ又は複数の異種配列を有さず）は対応する完全長の修飾されていない甲虫ルシフェラーゼの活性の例えば約０．００１％、０．０１％、０．１％又は１％未満の検出可能な活性を有し、また相補断片（１つ又は複数の異種配列を有さず）と結合すると、いずれの断片と比較しても３倍を超える、例えば１０又は５０から１００倍又はそれ以上の活性増加を有する。例えば、一実施形態では、Ｎ末端甲虫ルシフェラーゼ断片は対応する完全長の修飾されていない甲虫ルシフェラーゼの少なくとも０．００１％で１％未満の、また、Ｃ末端甲虫ルシフェラーゼ断片は少なくとも０．０１％で５％未満の活性を有する。他の実施形態において、本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼは、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼに対する少なくとも５０、例えば少なくとも１００の連続したアミノ酸残基の欠失、関心のある分子と直接又は間接的に相互作用するかさもなければ条件に感受性のあるアミノ酸配列の挿入、及び異種、例えば非甲虫ルシフェラーゼ配列の挿入を有する断片であり、これらの挿入は好ましくは甲虫ルシフェラーゼ断片の活性を増加しないが個々に、又は一緒にそれを減少させてもよいが、一旦取り除かれると修飾された甲虫ルシフェラーゼに対して活性の増加したトランケーションされた甲虫ルシフェラーゼをもたらす。
【００１６】
本明細書で更に記載されているように、対応する非環状で置換されていない甲虫ルシフェラーゼ内の修飾に寛容性のある残基又は領域にＮ末端を有し、任意選択に、関心のある分子、例えばプロテアーゼ認識部位若しくはキナーゼ部位と直接又は間接的に相互作用するアミノ酸配列を含む、環状置換された蛍及びコメツキムシのルシフェラーゼが調製され、それらは検出可能な活性を有することが示されたが、この活性は関心のある分子、例えば環状置換ルシフェラーゼ内でプロテアーゼ認識部位又はキナーゼ部位をそれぞれコードしていた構築物内の適当なプロテアーゼ又はキナーゼの存在下で変化した。それ故に、一実施形態では、本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼは、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して環状置換されたアミノ酸配列を含み、その結果修飾された甲虫ルシフェラーゼ内に新しいＮ及びＣ末端を含み、少なくともその１つは修飾に寛容性のある部位又は領域にある。他の実施形態において、環状置換された甲虫ルシフェラーゼは他の修飾、例えばそれには限定されないが、環状置換された甲虫ルシフェラーゼのＮ又はＣ末端の内部の挿入及び／又は欠失、例えば対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼのＮ及びＣ末端又はその近くの挿入及び／又は欠失、例えば修飾されていない甲虫ルシフェラーゼのＮ末端の残基１から約１０若しくは１５又はその中間の任意の整数と対応する残基、及び／或いはＣ末端の最後の残基又は最後の約１５、又は１から１５の間の任意の整数の残基と対応する残基における挿入及び／又は欠失を含む。したがって、レポータータンパク質のＮ及びＣ末端は環状置換を通して変更することが可能であり、得られた置換された分子は置換されないレポータータンパク質の１つ又は複数の活性を有することができる。したがって、環状置換されたレポータータンパク質は、タンパク質相補性アッセイ又はタンパク質組換えアッセイで使用することができる。さらに、環状置換されたレポータータンパク質は、直接又は間接的に関心のある分子と相互作用するかさもなければ条件変化に感受性のあるアミノ酸配列を導入することによって、官能性を有するようにすることができる。一実施形態では、本発明の環状置換されたレポータータンパク質は、チモーゲンである。
【００１７】
一実施形態では、関心のある分子が存在しない場合、修飾された甲虫ルシフェラーゼのような修飾されたレポータータンパク質の活性は対応する修飾されていないレポータータンパク質の活性よりも小さく、例えば修飾された甲虫ルシフェラーゼのレポーター活性は、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼのそれの約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、５０％、７０％又はそれ以上で１００％未満であり、その修飾されたレポータータンパク質の活性は任意選択に検出可能である。他の実施形態では、関心のある分子が存在しない場合、修飾された甲虫ルシフェラーゼのような修飾されたレポータータンパク質の活性は対応する修飾されていないレポータータンパク質の活性よりも大きく、例えば修飾された甲虫ルシフェラーゼのレポーター活性は、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼのそれの約１．５倍、例えば少なくとも２倍、３倍又は５倍又はそれ以上である。関心のある分子の存在下では、修飾されたレポータータンパク質の活性は検出可能に変更される。例えば、関心のある分子の存在下での修飾された甲虫ルシフェラーゼの活性における検出可能な変化は、関心のある分子がない場合の修飾された甲虫ルシフェラーゼの活性と比較して、少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％又は１００％、及び最高で２倍、４倍、１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、又はそれ以上の変化である。したがって、修飾されたレポータータンパク質に存在するが対応する修飾されていないレポータータンパク質には存在しない修飾と相互作用する関心のある分子の物理的近接性は、修飾されたレポータータンパク質の活性を変化、例えば減少、除去又は増加させる。例えば、修飾された甲虫ルシフェラーゼは対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼに対する内部挿入を含んでもよく、この挿入はプロテアーゼ認識部位、即ちプロテアーゼによって切断される部位を含む。プロテアーゼ存在下でのそのような修飾された甲虫ルシフェラーゼの発光シグナルは、プロテアーゼが存在しない場合の修飾された甲虫ルシフェラーゼの発光シグナルと比較して、又は関心のある分子の存在下又は非存在下における対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼの発光シグナルと比較して、減少させ、除去し又は増加させることができる。或いは、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼに対する欠失を含む修飾された甲虫ルシフェラーゼは、関心のある分子と相互作用するリガンドと融合することができる。甲虫ルシフェラーゼの相補性の第２の断片が関心のある分子と融合され、２つの融合の相互作用が可能になり、この相互作用は、例えばいずれかの融合単独の活性と比較して得られた複合体の活性を変化、例えば増加させる。一実施形態では、甲虫ルシフェラーゼの１つの断片は、ホタルルシフェラーゼの残基約１から約１２６、約１から約２３８、約１から約２７２、約１から約３０８、約１から約３６６、約１１６から約５５０、約２２８から約５５０、約２６２から約５５０、約２８９から約５５０、又は約３５６から約５５０、又はその中間の任意の整数の残基、或いはコメツキムシルシフェラーゼの約１から約１２２、約１から約３６２、約１から約３８４、約１から約４１４、約３５２から約５４２、約３７１から約５４２、又は約３９３から約５４２、又はその中間の任意の整数の残基と対応する残基を有する。
【００１８】
本発明は、レポータータンパク質のＮ末端及びＣ末端に異種配列を含む修飾されたレポータータンパク質も提供し、即ち、前記修飾されたタンパク質は融合タンパク質であり、また前記異種配列は非共有結合で相互作用し、つまり２つの異種配列は結合パートナーである。一実施形態では、修飾されたレポータータンパク質はＮ末端及びＣ末端に異種配列を含む、環状置換された甲虫ルシフェラーゼである。一実施形態では、１つ又は複数の外因性因子（少なくともその１つは関心のある分子でよく、例えば試料中で検出又は特定されるもの）がない場合、１つはＮ末端に他はＣ末端にある両方の異種配列を有する修飾されたレポータータンパク質は、対応する修飾されていないレポータータンパク質より小さいか、同じか又は大きな活性を有する。一実施形態では、修飾されたレポータータンパク質は、修飾されていないレポータータンパク質のＮ及び／又はＣ末端に存在する１つ又は複数のアミノ酸を欠いてもよく、その欠落は修飾されたレポータータンパク質のレポーター活性を実質的に変更せず、例えば修飾されたレポータータンパク質のレポーター部分の活性は、欠失のない対応するレポータータンパク質の活性の少なくとも０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、５０％、１００％、又はそれ以上である。一実施形態では、１つ又は複数の外因性因子の存在下で、又は特定条件下で、異種配列のない対応するレポータータンパク質（即ち対応する修飾されていないレポータータンパク質）ではなく両方の異種配列を有する修飾されたレポータータンパク質の活性は、例えば少なくとも２倍、５倍又は１０倍又はそれ以上検出可能に変更される。例えば、ラパマイシン存在下で、ラパマイシン結合タンパク質（ＦＲＢ）及びＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合されたルシフェラーゼは、ＦＲＢ及びＦＫＢＰを欠くルシフェラーゼと比較して活性は低下している。一実施形態では、外因性因子がない場合又は異なる条件下で、修飾されたレポータータンパク質は検出可能な活性を有さないが他の実施形態においては検出可能な活性を有し、その活性は少なくとも１つの外因性因子の存在下で又は特定条件下で強化することができる。例えば、外因性因子がない場合、修飾されたレポータータンパク質の活性はほとんど又は全くないが、２つの異種配列の非共有結合的相互作用を強化する選択された外因性因子を添加すると、修飾されたレポータータンパク質の活性は強化される。或いは、両方の異種配列を有する修飾されたレポータータンパク質の活性は、少なくとも１つの外因性因子の存在下又は特定条件下では抑制されてもよい。一実施形態では、１つの異種配列は、他の異種配列の領域と非共有結合的に相互作用する、任意選択にリン酸化などにより共有結合的に修飾されてもよい例えば３以上のアミノ酸残基などの領域を含む。甲虫ルシフェラーゼに融合する場合の結合パートナーとして有用な異種配列としては、それには限定されないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用し、また任意選択に例えばタンパク質モデリングに基づき、結合に加わらないが結合パートナーの相互作用を変化させる外因性因子の存在下又は非存在下で選択された距離離れており、甲虫ルシ��ェラーゼの末端へのそれらの融合は調整可能な甲虫ルシフェラーゼをもたらす結合配列を有するものがある。例示的な異種配列としては、それには限定されないが、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ内のそれらのもの、タンパク質キナーゼの調節サブユニット（ＰＫａ−Ｒ）及びタンパク質キナーゼの触媒サブユニット（ＰＫａ−Ｃ）、ｓｒｃ相同領域（ＳＨ２）及びリン酸化が可能な配列、例えばチロシン含有配列、１４−３−３のアイソフォーム、例えば１４−３−３ｔ（Ｍｉｌｓら、２０００年を参照）、及びリン酸化が可能な配列、ＷＷ領域（プロリンが豊富な分子と結合するタンパク質内の配列（Ｉｌｓｌｅｙら、２００２年；Ｅｉｎｂｏｎｄら、１９９６年を参照））を有するタンパク質、並びにリン酸化が可能な異種配列、例えばセリン及び／又はトレオニン含有配列、並びにジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びギラーゼＢ（ＧｙｒＢ）内の配列などがある。
【００１９】
他の実施形態において、１つの（第１の）外因性因子の存在下では、結合パートナーであるＮ末端及びＣ末端の異種配列を含む修飾されたレポータータンパク質は、前記外因性因子がない場合の活性に対して変化した活性を有し、また異なる（第２の）外因性因子の存在下では、前記修飾されたレポータータンパク質の活性は、前記第１の外因性因子の存在下で、例えば前記第２の外因性因子が前記第１の外因性因子と競合する条件下での活性に対して変化する。一実施形態では、第１の外因性因子がない場合、修飾されたレポータータンパク質は検出可能な活性を全く示さないか低い活性を示し、第１の外因性因子の添加は修飾されたレポータータンパク質の活性の増加をもたらし、この増加は第２の外因性因子の添加により戻すことが可能である。他の実施形態では、第１の外因性因子がない場合、修飾されたレポータータンパク質は検出可能な活性を有し、第１の外因性因子の添加は検出可能な活性の低下又は喪失をもたらすか、或いは検出可能な活性の増加をもたらし、これは第２の外因性因子の添加により戻すことが可能である。修飾されたレポータータンパク質は、任意選択に修飾されていないレポータータンパク質に対してＮ及び／又はＣ末端の１つ又は複数のアミノ酸を欠いてもよく、例としては対応する修飾されていないレポータータンパク質のＮ末端の残基１又は残基１から約１０若しくは１５、又はその中間の任意の整数、及び／或いはＣ末端の最後の残基又は最後の約１５、又は１から１５の間の任意の整数の残基と対応する残基の欠失がある。
【００２０】
他の実施形態では、修飾されたレポータータンパク質は、修飾されたレポータータンパク質の活性を抑制するなど変更する異種配列をＮ末端又はＣ末端に含み、前記活性は第１の外因性因子の添加によって例えば少なくとも部分的に取り戻されるなど変更される。任意選択に、第１の外因性因子の影響は、第２の外因性因子によって可逆的に変更される。一実施形態では、異種配列は基質の進入を抑制することができ、また、異種配列の高次構造は第１の外因性因子の存在下で実質的に変更されて、修飾されたレポータータンパク質はその基質と相互作用することが可能になる。修飾されたレポータータンパク質は、任意選択に修飾されていないレポータータンパク質のＮ及び／又はＣ末端の１つ又は複数のアミノ酸を欠いてもよく、例としては対応する修飾されていないレポータータンパク質のＮ末端の残基１から約１０若しくは１５、又はその中間の任意の整数の残基、及び／或いはＣ末端の最後の残基又は最後の約１５、又は１から１５の間の任意の整数の残基と対応するものがある。この実施形態で有用な異種配列は、カルモジュリン（ＣａＭ）である。
【００２１】
したがって、修飾されたレポータータンパク質は結合パートナーの可逆的相互作用又は異種配列の可逆的高次構造変化を検出するために使用することができ、これは１つ又は複数の因子又はイオン強度若しくは温度などの条件の変化によって強化又は抑制することができる。
【００２２】
したがって、本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼは、バイオセンサーとして使用することができる。
【００２３】
本発明は、本発明の修飾されたレポータータンパク質をコードしている核酸配列を含んでいる単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）も提供する。修飾されたレポータータンパク質及び修飾されたレポータータンパク質のＮ末端（Ｎ末端融合パートナー）及び／又はＣ末端（Ｃ末端融合パートナー）の１つ又は複数のアミノ酸残基を含んでいる融合タンパク質をコードする核酸配列を含んでいる、単離された核酸分子も更に提供されている。したがって、本明細書で使用されるように、「融合タンパク質」は本発明の修飾されたレポータータンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に１つ又は複数のアミノ酸を含む、ポリペプチドである。好ましくは、融合タンパク質内の１つ又は複数の融合パートナーの存在は、対応する修飾されたレポータータンパク質に対して、融合タンパク質の検出可能な活性を実質的に変更しない。一実施形態では、融合タンパク質は少なくとも２つの異なる融合パートナーを、１つは修飾されたレポータータンパク質のＮ末端に、他はＣ末端に含む。Ｎ又はＣ末端の融合パートナーは、精製のために使用される配列、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はｐｏｌｙＨｉｓ配列、修飾されたレポータータンパク質の特性を変えることを意図した配列、例えば修飾されたレポータータンパク質内のキナーゼ部位のための修飾に寛容性のある残基又は領域のタンパク質不安定化配列又はキナーゼ結合ドメイン、或いは融合タンパク質内のレポータータンパク質の１つ又は複数の特性と区別できる特性を有する配列でよい。一実施形態では、融合タンパク質は修飾された甲虫ルシフェラーゼ及び甲虫ルシフェラーゼとは異なるレポータータンパク質である融合パートナーを含み、このレポータータンパク質は分子内対照、例えば蛍光タンパク質として有用である。他の実施形態において、本発明は本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼを含んでいる融合タンパク質をコードする核酸配列及び前記修飾された甲虫ルシフェラーゼの甲虫ルシフェラーゼとは異なるレポータータンパク質をコードする核酸断片を含んでいるベクターを含む。任意選択に、少なくとも甲虫ルシフェラーゼをコードするヒトコドンの最適化された配列などの最適化された核酸配列、及び好ましくは修飾された甲虫ルシフェラーゼ又は修飾された甲虫ルシフェラーゼを含む融合タンパク質は、それらの最適化された配列は甲虫ルシフェラーゼのシグナル強度を高めることができるので、本発明の核酸分子で使用される。核酸配列の最適化は当技術分野で知られており、例えば国際公開０２／１６９４４を参照。
【００２４】
本発明は、本発明の甲虫ルシフェラーゼなどの修飾されたレポータータンパク質又は融合タンパク質を発現する安定した細胞系、並びに本発明の修飾されたレポータータンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでいる発現カセット、及び本発明の核酸分子を宿主細胞で発現することができるベクターも含む。好ましくは、前記発現カセットは、作動可能的に核酸配列に結合されたプロモーター、例えば構成的又は調節可能なプロモーターを含む。一実施形態では、発現カセットは、誘導的プロモーターを含む。本発明の発現カセット又はベクターを含む宿主細胞、例えば原核細胞又は植物若しくは脊椎動物の細胞、例えばそれには限定されないがヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、又は齧歯類（例えばウサギ、ラット、白イタチ若しくはマウス）の細胞を含む哺乳類細胞などの真核細胞、及び核酸分子、発現カセット、ベクター、宿主細胞又は本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼ若しくは融合タンパク質を含むキットも提供される。
【００２５】
本発明の修飾されたレポータータンパク質は、修飾されていないレポータータンパク質が例えば機能的レポーターとして関心のある分子の様々な状態及び／又は分子を測定及び検出することが不可能な用途で使用することができる。例えば、プロテアーゼ切断認識部位の挿入を含んでいる修飾された甲虫ルシフェラーゼをコードするベクター、又はこの修飾された甲虫ルシフェラーゼは、細胞、細胞溶解物、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物、又は上清に導入され、修飾された甲虫ルシフェラーゼの活性は、例えば１つ又は複数の時点で、対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼと比較されて検出又は測定される。細胞、細胞溶解物、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物又は上清における発光活性の経時的及び／又は対照、例えば対応する修飾されていない甲虫ルシフェラーゼを有する細胞に対する変化は、プロテアーゼの存在を示す。例えば、本発明は重症急性呼吸器症候群と関連するウイルスを検出するための方法を含む。この方法は、生物学的試料、例えば生理学的組織又は流体試料を、対応する修飾されていないレポータータンパク質に対する内部挿入を含む修飾されたレポータータンパク質、例えば修飾された甲虫ルシフェラーゼと接触させることを含み、前記修飾されたレポータータンパク質は検出可能な活性を有する。前記挿入は、レポータータンパク質配列内の、修飾に寛容性がありウイルスのプロテアーゼに対するアミノ酸認識配列を含む残基又は領域で起こる。修飾されたレポータータンパク質の活性が試料存在下で変更されるか否かが検出又は決定され、それによって試料がウイルスを含むかどうかが示される。
【００２６】
本発明は関心のある分子の存在を検出する方法も提供する。例えば、細胞を、調節可能なプロモーターなどのプロモーター、及び関心のある分子と相互作用する挿入を含んでいる本発明の修飾されたレポータータンパク質をコードする核酸配列を含んでいるベクターと接触させる。一実施形態では、形質移入細胞はプロモーターが修飾されたレポータータンパク質の一時的発現を誘発する条件下で培養され、修飾されたレポータータンパク質の検出可能な活性が測定される。
【００２７】
また、修飾されたレポータータンパク質をコードする選択された変異ポリヌクレオチドを調製する方法も提供される。この方法は、検出可能な活性を有する修飾されたレポータータンパク質をコードする親ポリヌクレオチドに変異を起こさせて、変異を起こした修飾されたレポータータンパク質をコードする１つ又は複数の変異ポリヌクレオチドを生成することを含む。親ポリヌクレオチドは、対応する修飾されていないレポータータンパク質に対して修飾に寛容性のある残基又は領域が修飾されている、修飾されたレポータータンパク質の読取り枠を含む。修飾されたレポータータンパク質は、直接又は間接的に関心のある分子と相互作用するか、さもなければ対応する修飾されていないレポータータンパク質と比較して条件に感受性を示すアミノ酸配列を含む。関心のある分子との相互作用又はある条件下での活性が、修飾されたレポータータンパク質の相互作用又は活性に対して変更された、変異修飾レポータータンパク質をコードする、１つ又は複数の変異ポリヌクレオチドが選択される。他の実施形態において、本発明は、本発明の修飾されたレポータータンパク質を分子のライブラリーと接触させて、１つ又は複数の分子が、修飾と又は前記修飾されたレポータータンパク質内の非レポータータンパク質配列と相互作用するかどうかを検出又は決定することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＥＺ：ＴＮインフレームリンカー挿入プロトコルの概要を示す図である。
【図２】ｃｂｇ６９遺伝子へのＴｎ５挿入突然変異誘発の結果を示す図である。ｃｂｇ６９によってコードされるタンパク質は、野生型コメツキムシルシフェラーゼと比較して位置４０９（Ｉ４０９Ｖ）に１つのアミノ酸置換を有する（図３を参照）。
【図３】コメツキムシルシフェラーゼ（配列番号８９）におけるＴｎ５挿入位置（太字）を示す図である。
【図４】Ｔｎ５挿入で修飾されたコメツキムシルシフェラーゼの活性を示す図である。
【図５Ａ】カスパーゼ−３認識部位挿入（ｃｂｇ６９ＤＥＶＤ）で修飾されたコメツキムシルシフェラーゼの活性を示す図である。ｃｂｇ６９ｓｓ又はｃｂｇ６９ＤＥＶＤによるカスパーゼアッセイにおける相対光単位（ＲＬＵ）。
【図５Ｂ】カスパーゼ−３認識部位挿入（ｃｂｇ６９ＤＥＶＤ）で修飾されたコメツキムシルシフェラーゼの活性を示す図である。コメツキムシルシフェラーゼ及びカスパーゼ阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）によるカスパーゼアッセイにおけるＲＬＵ。
【図５Ｃ】カスパーゼ−３認識部位挿入（ｃｂｇ６９ＤＥＶＤ）で修飾されたコメツキムシルシフェラーゼの活性を示す図である。様々な量のカスパーゼ−３及びｃｂｇ６９ＤＥＶＤによるアッセイにおける経時的ＲＬＵ。
【図６Ａ】プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位及び金属結合部位を含むヒンジ領域における修飾を有するコメツキムシルシフェラーゼの配列及び活性を示す図である。６Ｈｉｓ＝６×Ｈｉｓ−標識；ＦＬＡＧ＝ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４）；ＤＥＶＤ（配列番号１０６）＝カスパーゼ３／７認識部位、Ｐｋａ＝Ｐｋａキナーゼ部位（配列番号９０〜９６）。挿入は、ＳｎａＢＩ及びＳａｌＩを使用してＣｂｇＬｕｃ（Ｉ４０９Ｖ）のヒンジ領域に導入された。
【図６Ｂ】ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ認識部位を有する修飾されたコメツキムシルシフェラーゼの存在下におけるＳＡＲＳウイルス３ＣＬプロテアーゼ活性を示す図である。
【図６Ｃ】ヒンジ領域（配列番号９０〜９１及び９７〜１０２）にＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ認識部位を有するコメツキムシルシフェラーゼの配列及び活性を示す図である。挿入は、ＳｎａＢＩ及びＳａｌＩを使用してＣｂｇＬｕｃ（Ｉ４０９Ｖ）のヒンジ領域に導入された。
【図７Ａ】エンテロキナーゼ認識部位で修飾されたホタルルシフェラーゼの活性を示す図である。親（修飾されていない）ホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ＋）（配列番号１０３）のアミノ酸配列。
【図７Ｂ】エンテロキナーゼ認識部位で修飾されたホタルルシフェラーゼの活性を示す図である。残基２３３の後にＧｌｙ（３）Ａｓｐ（４）ＬｙｓＧｌｙ（３）挿入を有する修飾されたホタルルシフェラーゼ又は親のホタルルシフェラーゼ（ＷＴ）によるエンテロキナーゼアッセイにおけるＲＬＵ。
【図７Ｃ】エンテロキナーゼ認識部位で修飾されたホタルルシフェラーゼの活性を示す図である。残基２３３の後にＰｒｏＧｌｙＰｒｏＧＩｙ（３）Ａｓｐ（４）ＬｙｓＧｌｙ（３）ＰｒｏＧｌｙＰｒｏ挿入を有する修飾されたホタルルシフェラーゼ又は親のホタルルシフェラーゼ（ＷＴ）によるエンテロキナーゼアッセイにおけるＲＬＵ。
【図７Ｄ】エンテロキナーゼ認識部位で修飾されたホタルルシフェラーゼの活性を示す図である。残基５４１の後にＡｓｐ（４）Ｌｙｓ挿入を有する修飾されたホタルルシフェラーゼ又は親のホタルルシフェラーゼ（ＷＴ）によるエンテロキナーゼアッセイにおけるＲＬＵ。
【図８】エンテロキナーゼ部位を有する環状置換されたホタルルシフェラーゼのエンテロキナーゼ活性化を示す図である。
【図９】カスパーゼ−３部位を有する環状置換されたホタルルシフェラーゼによる経時的カスパーゼ−３活性化を示す図である。
【図１０Ａ】様々な量のカスパーゼ−３及びカスパーゼ−３認識部位を有する環状置換されたホタルルシフェラーゼによるカスパーゼアッセイにおけるＲＬＵを示す図である。
【図１０Ｂ】様々な量のカスパーゼ−３及びカスパーゼ−３認識部位を有する環状置換されたホタルルシフェラーゼによるカスパーゼアッセイにおけるＲＬＵを示す図である。
【図１１】エンテロキナーゼ部位又はカスパーゼ−３部位を有する環状置換されたホタルルシフェラーゼのデータの比較を示す図である。
【図１２】ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ認識部位を有する環状置換されたコメツキムシ（ＣＰ１：Ｒ＝Ａｓｎ４０１及びＣＰ２：Ｒ＝Ａｒｇ２２３）及びホタル（ＣＰ：Ｒ＝Ａｓｐ２３４）ルシフェラーゼによるＳＡＲＳウイルス３ＣＬプロテアーゼ活性を示すグラフである。
【図１３】カスパーゼ−３部位を有しＴＲＡＩＬで処理された環状置換されたルシフェラーゼのＲＬＵを示す図である。
【図１４】二重ルシフェラーゼカスパーゼアッセイのためのベクターの概略図である。
【図１５】ｐＢＩＮＤベクター及び対照ルシフェラーゼ構築物並びに自己集合のためのＮ又はＣ末端のルシフェラーゼ構築物の概略図である。
【図１６Ａ】完全長ホタルルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼのＮ末端部分、ホタルルシフェラーゼのＣ末端の部分又はＮ末端及びＣ末端部分の混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１６Ｂ】完全長ホタルルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼのＮ末端部分、ホタルルシフェラーゼのＣ末端の部分又はＮ末端及びＣ末端部分の混合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示す図である。
【図１７】ＣＨＯ又は２９３の哺乳類細胞抽出物内のルシフェラーゼタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す図である。
【図１８】ルシフェラーゼの結合パートナーＸ又はＹとの融合を発現する構築物を調製するためのクローニング方策を示す図である。
【図１９】修飾されていないルシフェラーゼタンパク質及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応を使用して生成した１つ又は複数の異種配列とのルシフェラーゼの融合のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析を示す図である。
【図２０Ａ】ラパマイシンの存在下又は非存在下における、修飾されていないルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）、ＦＲＢ（ラパマイシン結合タンパク質）と融合されたルシフェラーゼ、ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）と融合されたルシフェラーゼ並びにＦＲＢ及びＦＫＢＰと融合されたルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図２０Ｂ】上昇する濃度のＦＫ５０６の存在下におけるルシフェラーゼとＦＲＢとＦＫＢＰとの融合のルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図２１Ａ】ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）、コメツキムシルシフェラーゼ（Ｃｂｇ及びＣｂｒ）及びＲｅｎｉｌｌａ（ＲＬｕｃ）ルシフェラーゼのＦＲＢ及びＦＫＢＰとの融合のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図２１Ｂ】ラパマイシンの存在下又は非存在下におけるＦＲＢ及びＦＫＢＰのホタルルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼとの融合のルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図２２】Ｔｋプロモーターからルシフェラーゼを発現する構築物を示す図である。
【図２３】ＦＫ５０６によるラパマイシン媒介調整の抑制を示している、ＦＲＢ及びＦＫＢＰ（ＦＲＢ１−ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ）と融合されたルシフェラーゼで形質移入されたＤ２９３細胞におけるラパマイシン存在下でのＦＫ５０６の滴定を示す図である。
【図２４】ラパマイシンの存在下又は非存在下における、ＴＫプロモーター及びＦＲＢ−ルシフェラーゼ−ＦＫＢＰ融合のコード領域を有する構築物で形質移入されたＤ２９３細胞における経時的な相対発光を示す図である。
【図２５Ａ】ラパマイシンの存在下又は非存在下における、ＦＲＢ−ルシフェラーゼ−ＦＫＢＰ融合のコード領域と結合されたＣＭＶプロモーターを有する構築物で形質移入されたＤ２９３細胞における経時的な相対発光を示す図である。
【図２５Ｂ】ラパマイシンの存在下又は非存在下における、ＦＲＢ−ルシフェラーゼ融合のコード領域と結合されたＣＭＶプロモーターを有する構築物で形質移入されたＤ２９３細胞における経時的な相対発光を示す図である。
【図２５Ｃ】ラパマイシンの存在下又は非存在下における、ルシフェラーゼのコード領域と結合されたＣＭＶプロモーターを有する構築物で形質移入されたＤ２９３細胞における経時的な相対発光を示す図である。
【図２５Ｄ】ラパマイシンの存在下又は非存在下における、ルシフェラーゼ−ＦＫＢＰ融合のコード領域と結合されたＣＭＶプロモーターを有する構築物で形質移入されたＤ２９３細胞における経時的な相対発光を示す図である。
【図２６】ＥＧＴＡ又はＣａ２＋存在下におけるカルモジュリン−ルシフェラーゼ融合の相対発光を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
本明細書で使用される用語「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」は、ポリペプチド又はタンパク質前駆体の生産のために必要なコード配列を含む核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡを指す。コードされたポリペプチドは完全長ポリペプチド、その断片（完全長より短い）、又は完全長ポリペプチド若しくはその断片と他のポリペプチドとの融合から生じる融合ポリペプチドであってもよい。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「核酸」は、１つのヌクレオチドのペントースの３’位置がリン酸ジエステル基によって次のペントースの５’位置と連結され、またヌクレオチド残基（塩基）が特定の配列順序、即ち線状ヌクレオチドで連結されている、共有結合で結ばれたヌクレオチド配列である。本明細書で使用されるように、「ポリヌクレオチド」は長さが約１００ヌクレオチドを超える配列を含んでいる核酸である。本明細書で使用されるように、「オリゴヌクレオチド」又は「プライマー」は短いポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドの一部である。オリゴヌクレオチドは、一般的に約２から約１００の塩基の配列を含む。語「オリゴ」は語「オリゴヌクレオチド」の代わりに時々使用される。
【００３１】
核酸ホスホジエステル結合が置換基モノヌクレオチドのペントース環の５’炭素及び３’炭素で起こるので、核酸分子は「５’末端」（５’端）及び「３’末端」（３’端）を有すると言われる。新しい結合が５’炭素に対して起こるポリヌクレオチドの末端は、その５’末端ヌクレオチドである。新しい結合が３’炭素に対して起こるポリヌクレオチドの末端は、その３’末端ヌクレオチドである。本明細書で使用されるように、末端ヌクレオチドは３’又は５’末端の末端位置にあるヌクレオチドである。
【００３２】
モノヌクレオチドが反応して、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を通して１方向にその隣の３’酸素と結合するようにオリゴヌクレオチドを形成するので、ＤＮＡ分子は「５’端」及び「３’端」を有すると言われる。したがって、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と結合しない場合は「５’端」と呼ばれ、その３’酸素が以降のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結合しない場合は「３’端」と呼ばれる。
【００３３】
本明細書で使用されるように、たとえより大きなオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの内部にある場合でも、核酸配列は５’端及び３’端を有すると言うことができる。線状又は環状ＤＮＡ分子のいずれの場合も、独立した要素は「上流」又は「下流」の５’側又は３’要素と称される。この専門用語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’にかけて進行するという事実を反映する。一般的に、連結された遺伝子（例えば読取り枠又はコード領域）の転写を指示するプロモーター及びエンハンサー要素は、通常、コード領域の５’側又は上流に位置する。しかし、エンハンサー要素は、プロモーター要素及びコード領域の３’側に位置する場合でも、それらの影響を発揮することができる。転写終結及びポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’側又は下流に位置する。
【００３４】
本明細書で使用する用語「コドン」は、ポリペプチド鎖に取り込まれる特定のアミノ酸、又は開始若しくは終止シグナルを指定する３つのヌクレオチドの配列からなる基本的な遺伝暗号単位である。構造遺伝子に関連して使用される場合の用語「コード領域」は、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として発達中のポリペプチドで見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。一般的に、コード領域は５’側は開始因子メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」が結合し、３’側は終止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）が結合する。場合によっては、コード領域はヌクレオチドトリプレット「ＴＴＣ」から始まることも知られている。
【００３５】
用語「遺伝子」は、コード配列及び任意選択にＤＮＡ配列からのポリペプチドの生産に必要な制御配列を含む、ＤＮＡ配列を指す。
【００３６】
本明細書で使用されるように、用語「異種」核酸配列又はタンパク質は、基準配列に対して由来の異なる配列、例えば外来種に起源を有するものを指し、又は同じ種からのものであっても原形からかなり変化したものでもよい。
【００３７】
核酸は、異なる種類の変異を含むことが知られている。「点」突然変異は、野生型配列に対するヌクレオチド配列内の１塩基位置の変化を指す。変異は、１つ又は複数の塩基の挿入又は欠失により核酸配列が野生型などの基準配列と異なるものも指す。
【００３８】
本明細書で使用されるように、用語「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーション」は、標的核酸への相補配列のアニーリング、即ち相補配列を含んでいる２つの核酸ポリマー（ポリヌクレオチド）の塩基対合を通してアニーリングする能力を指す。用語「アニールされた」及び「ハイブリダイズされた」は本明細書全体を通して互換的に使用され、部分相補性だけを有する領域の結合を含む、相補配列及び標的核酸の間の任意の特異的且つ再生可能な相互作用を包含するものとする。普通は天然核酸では見られないある種の塩基が本発明の核酸に含まれてもよく、例としてはイノシン及び７−デアザグアニンがある。核酸技術の当業者ならば、二重鎖の安定性は多くの変数、例えば相補配列の長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列順序、イオン強度並びにミスマッチ塩基対の発生率などを考慮して経験的に決めることができる。核酸二重鎖の安定性は、融点又は「Ｔｍ」で測定される。特定の条件下での特定の核酸二重鎖のＴｍは、平均して塩基の半分が分離する温度である。
【００３９】
用語「組換えＤＮＡ分子」は、自然界では通常一緒に見られない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでいるハイブリッドＤＮＡ配列を意味する。用語「ベクター」は、ＤＮＡの断片を挿入又はクローニングすることができる核酸分子に関して使用され、細胞にＤＮＡセグメントを移すために使用でき、また細胞内での複製が可能である。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミドなどから得ることができる。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「組換えベクター」及び「発現ベクター」は、所望のコード配列及び特定の宿主生物における作動可能的に結合されたコード配列の発現のために必要な、適当なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。原核生物の発現ベクターは、プロモーター、リボソーム結合部位、宿主細胞における自律複製のための複製起点、及び恐らく他の配列、例えば任意選択のオペレーター配列、任意選択の制限酵素部位を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡとの結合及びＲＮＡ合成の開始を指示するＤＮＡ配列と定義される。真核生物の発現ベクターは、プロモーター、任意選択にポリアデニル化シグナル及び任意選択にエンハンサー配列を含む。
【００４１】
タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、遺伝子のコード領域を含んでいる核酸配列を意味し、又は、核酸配列は遺伝子産物をコードすると換言することができる。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡのいずれの形態でも存在することができる。ＤＮＡ形態で存在するとき、オリゴヌクレオチドは一本鎖（即ちセンス鎖）又は二本鎖でよい。エンハンサー／プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルその他などの適当な調節要素は、適切な転写開始を可能にし且つ／又は一次ＲＮＡ転写産物のプロセシングを修正するために、必要ならば遺伝子のコード領域に近接して置くことができる。或いは、本発明の発現ベクターで利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルその他を含んでもよい。更なる実施形態において、コード領域は内因性及び外因性の調節要素の組み合わせを含んでもよい。
【００４２】
用語「転写調節要素」又は「転写調節配列」は、核酸配列の発現の一部の態様を調節する遺伝的要素又は配列を指す。例えば、プロモーターは作動可能的に結合されたコード領域の転写の開始を容易にする調節要素である。他の調節要素としては、それには限定されないが、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終止シグナル及びエンハンサー要素がある。
【００４３】
真核生物における転写調節シグナルは、「プロモーター」及び「エンハンサー」要素を含む。プロモーター及びエンハンサーは、転写に関係する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短い配列からなる。プロモーター及びエンハンサー要素は、酵母、昆虫及び哺乳類細胞の遺伝子を含む様々な真核生物の供与源から単離された。プロモーター及びエンハンサー要素はウイルスからも単離され、類似の調節要素、例えばプロモーターも原核生物で見られる。特定のプロモーター及びエンハンサーの選択は、関係するタンパク質を発現するために使用される細胞の種類によって決まる。真核生物のプロモーター及びエンハンサーは広い宿主域を有するものもあれば、限られたサブセットの細胞種で機能的なものもある。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類の種からの多種多様な細胞種で非常に活性であり、哺乳類細胞内でのタンパク質の発現のために広く使われてきた。広範な哺乳類細胞種で活性を示すプロモーター／エンハンサー要素の他の２つの例は、ヒト伸長因子Ｉ遺伝子及びＲｏｕｓ肉腫ウイルスの末端反復配列、並びにヒトサイトメガロウイルスからのものである。
【００４４】
用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター及びエンハンサー機能（即ち先に述べたようにプロモーター要素及びエンハンサー要素によって提供される機能）を提供することができる配列を含んでいる、ＤＮＡセグメントを意味する。例えば、レトロウイルスの末端反復配列は、プロモーター及びエンハンサーの両方の機能を含む。エンハンサー／プロモーターは「内因性」又は「外因性」又は「異種性」でよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の与えられた遺伝子と自然に連結しているものである。「外因性」又は「異種性」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子の転写が結合したエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作（即ち分子生物学的技術）によって遺伝子の近くに置かれたものである。
【００４５】
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、真核宿主細胞における組換え転写産物のより高い発現レベルをしばしばもたらす。スプライシングシグナルは一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライス供与部及び受容部位からなる。通常使用されるスプライス供与部及び受容体部位は、ＳＶ４０の１６Ｓ  ＲＮＡからのスプライス部位である。
【００４６】
真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的な発現のためには、得られた転写産物の効率的な終結及びポリアデニル化を指示するシグナルの発現を必要とする。転写終止シグナルは、通常、ポリアデニル化シグナルの下流に見られ、長さは２、３百ヌクレオチドである。本明細書で使用する用語「ポリ（Ａ）部位」又は「ポリ（Ａ）配列」は、発達中のＲＮＡ転写物の終結及びポリアデニル化を指示するＤＮＡ配列を意味する。ポリ（Ａ）テールがない転写産物は不安定であり速やかに分解するので、組換え転写産物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターで利用されるポリ（Ａ）シグナルは「異種性」又は「内因性」でよい。内因性のポリ（Ａ）シグナルは、ゲノム内の与えられた遺伝子のコード領域の３’末端で自然に見られるものである。異種ポリ（Ａ）シグナルは、１つの遺伝子から単離され、他の遺伝子に対して３’に位置するものである。通常使用される異種ポリ（Ａ）シグナルは、ＳＶ４０  ポリ（Ａ）シグナルである。ＳＶ４０  ポリ（Ａ）シグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨ  Ｉ／Ｂｃｌ  Ｉ制限断片に含まれ、終結及びポリアデニル化を指示する。
【００４７】
真核生物の発現ベクターは、また「ウイルスのレプリコン」又は「ウイルスの複製開始点」を含んでもよい。ウイルスのレプリコンは、適当な複製因子を発現している宿主細胞内でのベクターの染色体外複製を可能にする、ウイルスのＤＮＡ配列である。ＳＶ４０又はポリオーマウイルスの複製起点を含んでいるベクターは、適当なウイルスのＴ抗原を発現する細胞内で高いコピー数（最高１０４の複製／細胞）で複製する。対照的に、ウシの乳頭腫ウイルス又はＥＢウイルスからのレプリコンを含んでいるベクターは、染色体外で低コピー数（約１００の複製／細胞）を複製する。
【００４８】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人工環境及び人工環境内で起こる過程又は反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境としては、それには限定されないが、試験管及び細胞溶解物がある。用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は自然環境（例えば動物又は細胞）、及び自然環境内で起こる過程又は反応を指す。
【００４９】
用語「発現系」は、関心のある遺伝子の発現を決定する（例えば、検出する）ための任意のアッセイ又は系を指す。分子生物学の分野に熟練している者は、多種多様な発現系のいずれも使用されることを理解しよう。広範囲にわたる適当な哺乳類細胞が広範囲の供給源（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、メリーランド州）から入手可能である。形質転換又は形質移入の方法及び発現媒体の選択は、選択された宿主系によって決まる。形質転換及び形質移入の方法は、当技術分野で公知である。発現系は、関心のある遺伝子（例えばレポーター遺伝子）が調節配列に結合され、遺伝子の発現は遺伝子の発現を抑制又は誘発する剤による処理の後に観察される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子発現アッセイを含む。遺伝子発現の検出は任意の適当な手段、例えばそれには限定されないが、発現されたｍＲＮＡ又はタンパク質（例えばレポーター遺伝子の検出可能な生成物）の検出を通して、又は関心のある遺伝子を発現している細胞の表現型の検出可能な変化を通して可能である。発現系は、切断事象又は他の核酸若しくは細胞の変化が検出されるアッセイを含んでもよい。
【００５０】
本明細書で使用されるように用語「野生型」は、天然の供与源から単離されたその遺伝子又は遺伝子産物の特性を有する遺伝子又は遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団で最もしばしば観察され、したがって任意にその遺伝子の「野生型」形態と称されるものである。対照的に、用語「突然変異体」は、野生型の遺伝子又は遺伝子産物に対して、配列及び／又は機能的性状（即ち、特性変化）の変化を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然の突然変異体を単離することが可能であると指摘されている。これらは野生型の遺伝子又は遺伝子産物に対して変化した特性を有することで確認される。
【００５１】
「単離されたオリゴヌクレオチド」又は「単離されたポリヌクレオチド」のように核酸に関して使用される場合の用語「単離された」は、その供与源内で通常関連している少なくとも１つの混在物から識別及び分離される核酸配列を指す。したがって、単離された核酸は、自然界でそれが見られるものとは異なる形態又はセッティングで存在する。対照的に、単離されていない核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それらが自然界で存在する状態で見られる。例えば、与えられたＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は、宿主細胞染色体上で近隣の遺伝子に近接して見られる。ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、多くのタンパク質をコードする他の多数のｍＲＮＡとの混合物として細胞内で見られる。しかし、単離された核酸としては、例えばその核酸が自然の細胞のそれと異なる染色体上の位置にあるか、さもなければ自然で見られるものとは異なる核酸配列に連結している、通常その核酸を発現している細胞内の核酸がある。単離された核酸又はオリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の形態で存在することができる。単離された核酸又はオリゴヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合は、オリゴヌクレオチドは最低限センス又はコード鎖（即ち、オリゴヌクレオチドは一本鎖でよい）を含むが、センス及びアンチセンスの両方の鎖（即ち、オリゴヌクレオチドは二本鎖でよい）を含んでもよい。
【００５２】
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、長さ又は翻訳後修飾（例えばグリコシル化又はリン酸化）に関係なく任意のアミノ酸鎖を意味する。本発明の核酸分子は、天然のタンパク質の変異体又はそのポリペプチド断片をコードしてもよく、それは、それが由来する天然の（生来若しくは野生型）タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％同一であるアミノ酸配列を有する。用語「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、Ｎ及び／又はＣ末端が１つ又は複数の異種配列（例えば非ルシフェラーゼポリペプチド）に結合されている参照タンパク質（例えばルシフェラーゼ）を含んでいるキメラタンパク質を指す。一部の実施形態において、本発明の修飾されたポリペプチド、融合ポリペプチド又は完全長ポリペプチドの一部は、対応する完全長機能的（非キメラ）ポリペプチドの活性の少なくとも一部を保持してもよい。他の実施形態において、外因性因子又は関心のある分子がない場合、本発明の修飾されたポリペプチド、融合ポリペプチド又は完全長機能的ポリペプチドの一部は、対応する完全長機能的ポリペプチドに対して活性を失ってもよい。他の実施形態において、外因性因子の存在下で本発明の修飾されたポリペプチド、融合ポリペプチド又は完全長機能的ポリペプチドの一部は、対応する完全長機能的ポリペプチドに対して活性の少なくとも一部若しくは実質的に同じ活性を保持してもよく、或いは、活性を失ってもよい。
【００５３】
ポリペプチド分子は、ペプチド結合が第１のアミノ酸残基の骨格アミノ基及び第２のアミノ酸残基の骨格カルボキシル基の間で起こるので、「アミノ末端」（Ｎ末端）及び「カルボキシ末端」（Ｃ末端）を有すると言われる。ポリペプチド配列に関した用語「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」は、それぞれポリペプチドのＮ末端及びＣ末端領域の一部を含むポリペプチド領域を指す。ポリペプチドのＮ末端領域の一部を含む配列は、主にポリペプチド鎖のＮ末端半分からのアミノ酸を含むが、そのような配列に限定はされない。例えば、Ｎ末端配列は、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端の両半分からの塩基を含むポリペプチド配列の内側の部分を含んでもよい。同じことは、Ｃ末端領域にも当てはまる。Ｎ末端及びＣ末端の領域は、その必要はないが、ポリペプチドのそれぞれ最終Ｎ末端及びＣ末端を規定しているアミノ酸を含んでもよい。
【００５４】
本明細書で使用されるように用語「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ分子から発現されたタンパク質分子を指す。対照的に、用語「未変性タンパク質」は、本明細書では天然の（即ち遺伝的組換えではない）供与源から単離されたタンパク質の意味で使用される。タンパク質の未変性形態に対して同一の特性を有するタンパク質の組換え体を生成するために、分子生物学的技術を使用することができる。
【００５５】
本明細書で使用されるように用語「細胞」、「細胞系」及び「宿主細胞」は互換的に使用され、そのような呼称は全てこれらの呼称の後代又は潜在的後代を含む。「形質転換細胞」は、それに（又はその先祖に）本発明の核酸分子が導入された細胞を意味する。任意選択に、本発明の核酸分子は、遺伝子によってコードされたタンパク質又はポリペプチドを産生することができる安定的に形質移入された細胞系を作製するために、適当な細胞系に導入してもよい。ベクター、細胞及びそのような細胞系を構築する方法は、当技術分野で公知である。用語「形質転換体」又は「形質転換細胞」は、経代数に関係なく元の形質転換細胞に由来する一次形質転換細胞を含む。故意又は偶発的な突然変異のために、必ずしも全ての後代においてＤＮＡの内容が正確に同一ではないかもしれない。それにもかかわらず、形質転換体の定義には、当初の形質転換細胞でスクリーニングされたものと同じ機能を有する変異後代が含まれる。
【００５６】
用語「相同性」は、２つ以上の配列の間の相補性の程度を指す。部分相同性又は完全な相同性（即ち同一性）があってもよい。相同性は、しばしば配列解析ソフトウェア（例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、マジソン、ウィスコンシン州、５３７０５、のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、挿入、その他の修飾に割り当てることによって類似の配列を比較する。保存的な置換は、一般に下記群内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及び、フェニルアラニン、チロシン。
【００５７】
「単離されたタンパク質」又は「単離されたポリペプチド」のようにポリペプチドに関して使用される場合の用語「単離された」は、その供与源内で通常関連している少なくとも１つの混在物から識別及び分離されるポリペプチドを指す。したがって、単離されたポリペプチドは、自然界でそれが見られるものとは異なる形態又はセッティングで存在する。対照的に、単離されていないポリペプチド（例えばタンパク質及び酵素）は、それらが自然界で存在する状態で見られる。
【００５８】
用語「精製された」又は「精製する」は、関係する構成要素、例えばタンパク質又は核酸から混在物の一部を除去する任意の過程の結果を意味する。精製された構成要素の試料中のパーセントは、それによって増加される。
【００５９】
本明細書で使用されるように、「純粋」は対象種が存在する支配的な種（即ち、モルベースでは組成物中の他のいかなる個々の種よりも豊富）であることを意味し、また好ましくは実質的に精製された分画は、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モルベースで）を対象種が占める組成物である。通常、「実質的に純粋な」組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０パーセント、より好ましくは約８５％、約９０％、約９５％及び約９９％を超える割合を含む。最も好ましくは、対象種は、組成物が本質的に単一の高分子種からなる本質的に均質状態（従来の検出法によって混在種は組成物内に検出されない）になるまで精製される。
【００６０】
本明細書で使用されるように用語「作動可能的に結合された」は、与えられた遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指示することができる核酸分子が生成されるような核酸配列の結合を指す。この用語は、機能的（例えば、酵素的に活性、結合パートナーとの結合が可能、抑制することが可能、その他）タンパク質又はポリペプチドが生成されるような、アミノ酸をコードする配列の結合を指す。
【００６１】
本明細書で使用されるように、用語「ポリヒスチジントラクト」又は（Ｈｉｓタグ）は、２から１０のヒスチジン残基を含んでいる分子、例えば５から１０の残基のポリヒスチジントラクトを指す。ポリヒスチジントラクトは、固定化金属、例えばニッケル、亜鉛、コバルト又は銅、キレートカラムの上の共有結合した分子のアフィニティ精製、又は他の分子（例えばＨｉｓタグと反応する抗体）との相互作用を通した精製を可能にする。
【００６２】
「タンパク質不安定化配列」としては、それには限定されないが、ＰＥＳＴ配列、例えば有糸分裂サイクリンなどのサイクリン、ウラシル透過酵素又はＯＤＣからのＰＥＳＴ配列、ＯＤＣなど短寿命タンパク質のＣ末端領域、初期応答タンパク質、例えばサイトカイン、リンフォカイン、プロトオンコジーン、例えばｃ−ｍｙｃ若しくはｃ−ｆｏｓ、ＭｙｏＤ、ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ、又はＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ、ＣＬ配列、サイクリン破壊ボックス又はＮ−デグロン（ｄｅｇｒｏｎ）からの配列などがある。
【００６３】
本明細書で使用されるように、「マーカー遺伝子」又は「レポーター遺伝子」はその遺伝子を発現している細胞に異なった表現型を与える遺伝子であり、したがって、その遺伝子を有しない細胞からのその遺伝子を有する細胞の区別を可能にする。化学的手段、例えば選択剤（例えば除草剤、抗生物質、その他）の使用を通してそれについて「選択」することのできる形質をマーカーが付与するのか、或いはそれは単に観察又は検査を通して、即ち「スクリーニング」により特定することができる「レポーター」形質に過ぎないのかによって、そのような遺伝子は、選択可能な又はスクリーニングが可能なマーカーのいずれかをコードすることができる。本開示の要素は、特定のマーカー遺伝子の使用を通して詳細に例証される。当然ながら、適当なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子の多くの例は当分野で公知であり、本発明の実施において使用することが可能である。したがって、以下の説明は網羅的というよりは例示的であることは理解されよう。本明細書で開示されている技術及び当技術分野で公知の一般的組換え技術に照らして、本発明は任意の遺伝子の変更を可能にする。例示的な修飾されたレポータータンパク質は、修飾されたレポーター遺伝子、例えばそれには限定されないが、ネオ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｇｕｓ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、ｂｌｅ遺伝子、ｍｐｒｔ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子、ガラクトピラノシド遺伝子、キシロシダーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、アラビノシダーゼ遺伝子、突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）若しくはアセトアシッドシンターゼ遺伝子（ＡＡＳ）、メトトレキセート抵抗性ｄｈｆｒ遺伝子、ダラポンデハロゲナーゼ遺伝子、５−メチルトリプトファンに抵抗性を付与する突然変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子（国際公開９７／２６３６６）、Ｒ座位遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、ｘｙｌＥ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（例えばＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子若しくはコメツキムシルシフェラーゼ（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）遺伝子）、エクオリン遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子などの修飾を含んでいる核酸分子によってコードされる。
【００６４】
本明細書で特定される全てのアミノ酸残基は、天然のＬ−コンフィギュレーションである。標準ポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基の略記号は以下の対応表に示す通りである。
【表１】
2011135892.tif 000002
【００６５】
Ｉ．修飾に寛容性のあるレポータータンパク質の残基又は領域を特定する方法
破壊されるなど修飾されても転写及び翻訳されたときに所望の、例えば容易に検出可能な遺伝子産物を生成することができるレポータータンパク質遺伝子内の部位及び／又は領域を特定するために、多数の方法が利用できる。例えば、１つ又は複数のアミノ酸残基のヌクレオチドをレポータータンパク質遺伝子に対して削除及び／又は挿入するために、増幅反応を使用することができる。或いは、挿入変異のライブラリーを調製するためにトランスポゾンを使用することができる。トランスポゾンは、原核生物及び真核生物のゲノムで見られる移動性のＤＮＡ配列である。トランスポゾン標識は、プライマー結合部位をランダムに分散し、遺伝子「ノックアウト」を作製し、物理的標識又は遺伝標識を大きな標的ＤＮＡに導入するための強力な研究手段として、長く認められてきた。本発明の修飾されたレポータータンパク質を調製するために有用なレポーター遺伝子内の挿入は、レポータータンパク質のコード領域内部のインフレーム挿入である。以下の実施例は例示のために示したものにすぎないが、レポーター遺伝子内の挿入に寛容性のある領域を特定するための、Ｔｎ５ベースの系（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マジソン、ウィスコンシン州からのＥＺ：ＴＮ（商標））及びＴｎ７ベースの系（ＧＰＳ−Ｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．）の使用を記載する。
【００６６】
Ａ．Ｔｎ−５挿入突然変異
頻繁に使われる転位系の１つは、グラム陰性菌から単離されたＴｎ５系である。Ｔｎ５トランスポザーゼは、クローニングされ、高比活性に精製された小さな、単一のサブユニット酵素であり、宿主細胞因子を必要とせずに転位を実行する。さらに、標的ＤＮＡへのＴｎ５トランスポゾンの挿入は非常にランダムであり、また単純な過程で進行する。Ｔｎ５トランスポザーゼは、その短い１９の塩基対Ｍｏｓａｉｃ  Ｅｎｄ（ＭＥ）Ｔｎ５トランスポザーゼ認識配列の間に含まれるいかなるＤＮＡ配列も転位させる。ＥＺ：ＴＮインフレームリンカー挿入プロトコルの概要を図１に示す。
【００６７】
ｉ．トランスポゾン挿入反応
標的ＤＮＡの調製。標的レポーターＤＮＡは、トランスポゾン遺伝子、例えばカナマイシン抵抗性遺伝子によってコードされていないものを選択する。トランスポゾン挿入反応は標的ＤＮＡ調製物内の高レベルのＲＮＡ汚染によってかなり抑制されることはないが、標的ＤＮＡが標的転位の直接の競合者である染色体ＤＮＡによって高度に汚染されるならば、クローン数は減少する。プラスミド及びコスミドクローンは、標準の微小溶解手法によって精製することが可能であり、挿入反応で標的ＤＮＡとして使用することができる。ＢＡＣ又はコスミドクローンなどの低いコピー数のベクターは、より高いモル比率の大腸菌染色体ＤＮＡによってしばしば汚染され、したがってトランスポゾン挿入頻度が低下する。したがって、挿入反応の前に染色体ＤＮＡを除去するためにＢＡＣ及びコスミドＤＮＡを精製することが好ましい。
【００６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスポゾン挿入反応。複数の挿入事象を最小にしてトランスポゾン挿入の効率を最大にするために、反応条件が最適化される。例えば、等モル量のトランスポゾンがそのモル数の標的ＤＮＡに加えられる。
１．以下の順序で加えることによってトランスポゾン挿入反応混合物を調製する：
１μｌ  １０×反応緩衝液
０．２μｇ  標的ＤＮＡ＊
ｘμｌ  モル当量トランスポゾン
９μｌの反応体積にｘμｌの滅菌水
１μｌ  トランスポザーゼ
１０μｌ  総反応体積
２．反応混合物を３７℃で２時間インキュベートする。
３．μｌ停止液を加えて反応を止める。
混合して７０℃で１０分間加熱する。
反応混合物は−２０℃で保存することができる。
【００６９】
ｉｉ．トランスポゾン挿入クローンの選択
形質転換及び回収。１回の反応で得られるトランスポゾン挿入クローンの数は、とりわけ使用されるコンピテント細胞の形質転換効率によって決まる。コンピテント細胞の形質転換効率がより高いほど、より多くの挿入クローンが得られる。ベクターの多量体形態を生成する可能性をなくすために、大腸菌のｒｅｃＡ−系統が好まれる。また、宿主系統はトランスポゾンで存在するいかなる抗生物質耐性マーカー、例えばカナマイシン抵抗性マーカーを発現してはならない。
１．挿入反応混合物の１μｌを使用して、ｒｅｃＡ−大腸菌、例えばエレクトロコンピテント細胞を形質転換する。
２．エレクトロポレーションの直後にＳＯＣ培地を１ｍｌの最終体積までエレクトロポレーションセルに加えることによって、エレクトロポレーションされた細胞を回収する。培地／細胞をピペットで穏やかに混ぜる。管に移して３７℃の撹拌機で３０〜６０分間インキュベートして細胞成長を促進する。
【００７０】
形質転換体の平板培養及び選択。トランスポゾン挿入クローンは、抗生物質を含んでいるプレート上で選択される。Ｔｎ５については、カナマイシンを含んでいるプレートを使用してもよいが、トランスポゾンはネオマイシン及びＧ４１８抵抗性を大腸菌に付与することもできる。
１．細胞の一部を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んでいるＬＢプレート上で平板培養する。
２．トランスポゾン挿入効率を測定するために、形質転換反応の同一の希釈液及び希釈アリコートを、標的ＤＮＡを特異的に選択する抗生物質（例えば対照ＤＮＡでは１００μｇ／ｍｌのアンピシリン）を含んでいる第２のプレート上で平板培養する。転位頻度は、対照ＤＮＡのＫａｎＲ／ＡｍｐＲのクローン比率によって与えられる。
３．３７℃で一晩プレートを増殖させる。１％のトランスポゾン挿入効率及び高純度の標的ＤＮＡ（即ち染色体ＤＮＡの汚染がほとんど又は全くない）の使用を仮定すると、１プレートにつき約１００〜５００ＫａｎＲクローンが存在する。
【００７１】
ｉｉｉ．インフレーム１９コドン挿入の生成
トランスポゾン挿入のマッピング。Ｔｎ５は、ランダムに標的ＤＮＡに挿入される。したがって、各クローンにおけるトランスポゾン挿入部位は、３つの方法の１つによって制限酵素消化、例えばＮｏｔＩ消化の前に決定しなければならない：
１．挿入クローンは、順方向及び逆方向のトランスポゾン特異プライマーを使用して二方向に配列決定をすることが可能である。各クローンの挿入部位も、配列決定の前にマッピングすることが可能である。
２．挿入部位は、コロニー微小溶解ＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲ産物のサイズ分析によってマッピングすることが可能である。挿入部位をマッピングするために、順方向又は逆方向のトランスポゾン特異プライマー及びベクター特異フランキングプライマーを使用してもよい。
３．或いは、挿入部位は制限酵素消化物によってマッピングすることが可能である。
【００７２】
所望のクローンのトランスポゾン挿入部位が一旦決定されると、それらのクローンは制限酵素、例えばＮｏｔＩで個々に消化してＤＮＡを線状にする。線状にされたＤＮＡは次に精製される（例えば、アガロースゲル電気泳動、カラム精製、などによって）。
【００７３】
再連結及び形質転換。線状にされたクローンは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して再連結される。再連結が成功すると、単一の制限部位、例えばＮｏｔＩが再生され、３つ全ての読取り枠への５７ヌクレオチド（１９コドン）の挿入が作製される。再連結されたＤＮＡは選択された細胞に形質転換され、元のクローニングベクター上に存在する抗生物質マーカー（例えば対照ＤＮＡではアンピシリン）を使用して組換え体が選択される。
【００７４】
１９コドン挿入クローンの分析。５７のヌクレオチドのうちの９は、トランスポゾン挿入部位に直接連なっている９ｂｐ配列の複製の結果である。標的ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、１９コドン挿入の両側で保存される。
【００７５】
ｉｖ．トランスポゾン挿入クローンのＤＮＡ配列決定
プライマーの考慮。プライマーは、通常使用されるクローニングベクターとの相同性を最小にするように構築されなければならず、また、各プライマーの配列は、ベクターとの配列相同性が極小になるように使用者の特定のクローニングベクターのそれと比較しなければならない。
【００７６】
標的部位複製。Ｔｎ５の触媒によるトランスポゾン挿入は、１コピーが挿入されたトランスポゾンの各側に直接連なる、９ｂｐ標的部位配列の複製をもたらす。
【００７７】
挿入配列のためのトランスポゾン配列の識別。プライマーがトランスポゾン末端近くの領域にアニールするならば、各シークエンシング反応から得られる第１の配列データはトランスポゾンＤＮＡのそれである。
【００７８】
Ｂ．Ｔｎ７ベースの挿入突然変異
ＧＰＳ−Ｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍは、Ｔｎ７ベースのトランスポゾンをＤＮＡ標的にランダムに挿入するために、ＴｎｓＡＢＣ＊トランスポザーゼを使用する。標的ＤＮＡは、プラスミド、コスミド、ＢＡＣ又は精製された染色体ＤＮＡであってもよい。挿入部位が翻訳される遺伝子セグメント内にあるならば、これは通常無効な（機能の損失）変異をもたらす。挿入に対しては最小限の部位による好みがあるので、任意の読取り枠の破壊は可能である。標的の免疫性のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでは約１９０ｋｂの範囲でＤＮＡ分子１つにつき挿入は１つだけ起こる。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応は、それぞれ異なる位置に転位因子を含む標的ＤＮＡ分子の集団を生じる。
【００７９】
トランスポゾン供与体は、カナマイシンなどの抗生物質抵抗性マーカーを増やすか又は取り替えることによって修飾することが可能である。供与体プラスミドは標準の大腸菌実験系統で増殖させることができ、ベクター骨格はＡｍｐｒなどのトランスポゾンと異なる抗生物質マーカー及び複製起点を有す。反応しない供与体分子を破壊して望ましくない反応生成物を避けるために、供与体はレアカッティング酵素、例えばＰＩ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）による消化で破壊することができる。突然変異を起こすＤＮＡが元来コンピテントな生物（一本鎖ＤＮＡを取り込む）へ形質転換される適用については、ギャップが埋められて連結される。
【００８０】
ｉ．反応プロトコル
１．以下の試薬を混合する（２０μｌ反応液あたり）：
２μｌ  １０×緩衝液
１μｌ  スーパーコイルカスタム供与体（０．０２μｇ）
０．０８μｇ  標的ＤＮＡ
ｄＨ２Ｏ
１８μｌ  総体積
ピペット操作を２、３回行ってよく混ぜる。
２．１μｌトランスポザーゼを各管に加える。再び混合する。
３．３７℃で１０分間インキュベートする。これは、集合反応である。
４．１μｌ開始溶液を各管に加える。ピペット操作を２、３回行ってよく混ぜる。
５．３７℃で１時間インキュベートする。これは、鎖転移反応である。
６．７５℃で１０分間加熱不活化する。注：６５℃は十分でない。
７．任意選択のギャップ修復。
８．５μｌ  １０×Ｐｌ−ＳｃｅＩ緩衝液を加える
０．５μｌ  ＢＳＡ
１８．５μｌ  ｄＨ２Ｏ
６μｌ  Ｐｌ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）（６単位）
９．３７℃で１〜２時間インキュベートする。
１０．７５℃で１０分間インキュベートする。
１１．形質転換する。サブクローニング効率細胞（ｐＵＣ１マイクログラムにつき１０７）による化学的形質転換のためには、非希釈反応液の１μｌ及び１０μｌを形質転換する。エレクトロポレーション（ｐＵＣ１マイクログラムにつき＞１０９）のためには、ｄＨ２Ｏで１０倍に希釈して１μｌ及び１０μｌを形質転換する。増殖のためには、１ｍｌのＬＢに又は製造業者の指示通りに形質転換混合物を希釈し、３７℃で１時間通気下でインキュベートする。選択のないこの期間は、薬剤特にカナマイシンに対する耐性の発現のために必要である。
【００８１】
ｉｉ．一般的考慮
標的の量。標的ＤＮＡの推奨質量（１反応につき０．０８μｇ）は、プラスミド標的に対して有効である。コスミド及びＢＡＣについては、２：１（供与体対標的）のモル比が有効である。比率を４：１に増やすと、僅かに効率が低下する。
【００８２】
供与体対標的比率。推奨されている供与体：標的質量比（１：４、２０μｌ反応液につき０．０８μｇ標的）が最適である。逸脱が小さければ、回収された生成物の数の小さな変化がもたらされるだけである。しかし、供与体の飽和量は反応を抑制し、二重挿入の蓄積をもたらす可能性がある。
【００８３】
添加順序。水、標的ＤＮＡ、緩衝液及び供与体プラスミドを先ず加え、次にトランスポザーゼを加える。開始溶液は、集合反応の後に加えなければならない。
【００８４】
集合反応。この工程を省略すると、複合生成物の比率が増加する。
【００８５】
インキュベーション時間。反応物は３７℃で少なくとも１時間で線状になる。極めて長いインキュベーション時間は、二重挿入の蓄積をもたらす可能性がある。
【００８６】
インキュベーション温度。室温及び３０℃では、反応はより遅い速度であるが進行する。ＢＡＣとの反応では、３０℃が推奨される。
【００８７】
熱殺傷。７５℃で１０分間の加熱処理は反応複合体を有効に破壊する。６５℃で２０分間の熱処理は十分でない。フェノール／クロロホルム抽出後のアルコール沈殿も有効である。
【００８８】
手順の拡大縮小。最終体積及び全ての構成要素の体積を同じパーセンテージによって増加又は減少させる；２つのＤＮＡ種及びタンパク質の相対濃度は、緩衝液条件と同様に非常に重要である。
【００８９】
酵素名。Ｐｌ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）はｌ−ＳｃｅＩと同じでない。供与体の消化のためにはＰｌ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）を使用し、得られた挿入のマッピングのためにはＳｃｅｌを使用する。
【００９０】
ギャップ修復。この工程は大腸菌への形質転換には必要でなく、所望の適用が元来コンピテントな細菌への形質転換を含むときだけ必要である。元来コンピテントな細菌としては、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の種がある。これらの生物へのＤＮＡ取込みは、他の鎖の内部移行に伴う１本の鎖の分解を含む。ギャップ修復なしの場合、トランスポゾン挿入部位の５塩基ギャップは、トランスポゾン挿入を一方又は他の側のフランキングＤＮＡから解き放す。コンピテンスが化学的に又はエレクトロポレーションによって誘発される生物（例えば大腸菌及び他の腸内細菌の組織培養細胞、その他）は、両方のＤＮＡ鎖を取り込む。挿入部位のギャップは、細胞内の機構により有効に修復される。
【００９１】
ｉｉｉ．ギャップ修復プロトコル
７．フェノール／クロロホルム抽出（５０μｌ）。
８．エタノール沈殿：
６μｌ  ３Ｍ  ＮａＡｃｅｔａｔｅ
１００μｌ  ＥｔＯＨ
−２０℃で２０分間インキュベートする
微量遠心管で１０分間遠心分離する
９．１５μｌ  ＴＥで再懸濁する。
１０．１μｌ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）（１０単位）
３μｌ  １０×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液
９μｌ  ｄＮＴＰ（各ヌクレオチド１００μＭ；最終濃度それぞれ３３μＭ）
１１．室温で１５分間インキュベートする。
１２．１μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（４００単位）及びＡＴＰを１ｍＭの最終濃度まで加える。
１３．１６℃で４時間インキュベートする。
１４．フェノール／クロロホルム抽出。
１５．アルコール沈殿。
１６．２０μｌ  ＴＥで再懸濁する。
１７．５μｌ  ＯＸ  Ｐｌ−ＳｃｅＩ緩衝液を加える
０．５μｌ  ＢＳＡ
１８．５μｌ  ｄＨ２Ｏ
６μｌ  Ｐｌ−ＳｃｅＩ（ＶＤＥ）（６単位）
１８．３７℃で１〜２時間インキュベートする。
１９．７５℃で１０分間インキュベートする。
２０．適当な方法によって形質転換する。
【００９２】
ｉｖ．供与体操作
１．トランスポゾン供与体はスーパーコイルでなければならない。弛緩した又は線状の供与体を使用した反応の効率は、約１００倍低下する。供与体の調製物は良質でなければならないが、ＣｓＣｌ精製は必要でない。
２．トランスポザーゼに必須の認識要素は必須である。終止コドンはトランスポゾンに読み込まれる全ての枠に存在してもよい。転写は外側から非必須領域へ容易に進行することが可能である。
３．転位効率は、トランスポゾンが長くなるに従い若干減少する可能性がある。
４．最良の結果のために、トランスポゾン供与体プラスミドは単量体であることを確認する。
５．供与体調製物が単量体且つスーパーコイルであり、また、供与体分子が宿主生物内で複製しないならば、Ｐｌ−ＳｃｅＩ消化工程は省略してもよい。
【００９３】
ｖ．標的ＤＮＡの要件
配列決定をするためのプラスミド標的は、回収を容易にするために環状でなければならない。線状の（例えば、染色体の）ＤＮＡは、効率的な基質である。本来形質転換が可能な生物を使用するときは、修復及びライゲーション工程が形質転換の前に必要である。大きなプラスミド、例えばコスミド及びＢＡＣは使用可能な標的である。標的ＤＮＡは、１×ＴＥのような無塩緩衝液では少なくとも５μｇ／ｍｌでなければならない。濃度は、公知の濃度のＤＮＡとのアガロースゲル帯強度の比較によって、又は、２６０における吸光度によって推定することが可能である。
【００９４】
ＩＩ．修飾の例
一旦レポータータンパク質における修飾に寛容性のある部位又は領域が特定されるならば、その部位又は領域は１つ又は複数の残基の欠失、１つ又は複数の残基の挿入及び／又は環状置換又はその任意の組み合わせによって修飾することができる。一実施形態では、修飾は加水分解酵素、例えばそれには限定されないがプロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ（例えばコレステロールエステラーゼ）、ホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ）などの認識部位の導入であってよい。例えば、加水分解酵素としてはそれには限定されないが、ペプチド結合に作用する酵素（ペプチドヒドロラーゼ）、例えばアミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ及びトリペプチジルペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、ωペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、トレオニンエンドペプチダーゼ及び未知の触媒メカニズムのエンドペプチダーゼがある。例えば、本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼは、エンテロキナーゼ切断部位、カスパーゼ切断部位、コロナウイルスプロテアーゼ部位（ＳＴＬＱ−ＳＧＬＲＫＭＡ；配列番号１０）、キナーゼ部位、ＨＩＶ−１プロテアーゼ部位（ＳＱＮＹ−ＰＩＶＱ又はＫＡＶＲＬ−ＡＥＡＭＳ；それぞれ配列番号１１及び配列番号１２）、ＨＣＶプロテアーゼ部位（ＡＥＤＶＶＣＣ−ＳＭＳＹＳ；配列番号１３）（例えばＬｅｅら、２００３年を参照）、ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位（例えばＱＴＳＩＴＳＡＶＬＱＳＧＦＲＫＭＡＦＰＳ；配列番号１６又はＶＲＱＣＳＧＶＴＦＱＧＫＦＫＫＩＶＫＧＴ；配列番号１７）、ライノウイルスプロテアーゼ部位、例えば、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ部位、プロホルモンコンベルターゼ部位、インターロイキン１６変換酵素部位、ＣＭＶ集合部位、リーシュマンジシン（ｌｅｉｓｈｍａｎｄｙｓｉｎ）部位、Ｂ．アントラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）致死因子、ボツリヌス神経毒素軽鎖プロテアーゼ部位、アミロイド前駆体タンパク質のためのβ−セクレターゼ部位（ＶＫＭ−ＤＡＥＦ；配列番号１４）、前立腺特異性抗原配列、トロンビン部位、レニン及びアンジオテンシン変換酵素部位、カテプシンＤ部位、マトリックスメタロプロテイナーゼ部位、ｕＰＡ部位、プラスミン部位、カチオンのための結合部位、例えばカルシウム結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、キチン質結合ドメイン、マルトース結合タンパク質ドメイン又はビオチン結合ドメインを含むことができる。他の実施形態では、本発明の修飾されたレポータータンパク質は、リガンドによって認識される配列、例えば抗体、又はカルシウムのような金属を含んでもよい。
【００９５】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド及びタンパク質の例
本発明は検出可能な活性、例えば発光活性を有するポリペプチドを提供する任意のアミノ酸配列を含んでいる修飾されたレポータータンパク質、並びに組換えにより又は合成的に合成されたそのタンパク質断片を含む。修飾されたレポータータンパク質のレポータータンパク質配列は、対応する修飾されていないレポータータンパク質のアミノ酸配列と同じか又は実質的に同じである。実質的に同じ配列を有するポリペプチド又はペプチドは、アミノ酸配列が完全にではないがほとんど同じであり、それと関連する配列の機能的活性を保持することを意味する。一般に、２つのアミノ酸配列は、それらが少なくとも７０％同一であるならば、例えば少なくとも８０％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有する場合は実質的に同じ又は実質的に相同である。
【００９６】
相同性又は同一性は、しばしば配列解析ソフトウェア（例えばＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、マジソン、ウィスコンシン州  ５３７０５、のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な欠失、置換及びその他の修飾に割り当てることによって類似の配列を比較する。２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連で用語「相同性」及び「同一性」は、任意の数の配列比較アルゴリズムを用いることにより又は手動アラインメント及び目視検査により測定されるような、比較ウィンドウ又は指定領域上で最大の対応関係について比較及び整列したときに、同じであるか又は特定割合の同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。
【００９７】
配列比較のために、一般的に１つの配列は試験配列が比較される基準配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用するときは、試験配列及び基準配列がコンピュータに入力され、必要に応じて部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータが使用でき、又は代替パラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムはプログラムパラメータに基づいて、基準配列と比較した試験配列の配列同一割合を計算する。
【００９８】
比較のための配列アラインメントの方法は、当技術分野で公知である。比較のために最適な配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈら（１９８１年）のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０年）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅｒｓｏｎら（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ上での実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、マジソン、ウィスコンシン州、内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は手動アラインメント及び目視検査によって行うことができる。
【００９９】
これらの数値計算用アルゴリズムのコンピュータによる実行は、配列同一性の決定のために配列の比較のために利用することが可能である。そのような実行例としては、それには限定されないが、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、マウンテンビュー、カリフォルニアから入手可能）のＣＬＵＳＴＡＬ、並びにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡから入手可能）のＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）及びＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡがある。これらのプログラムを使用したアラインメントは、デフォルトパラメータを使用して実施することが可能である。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８年）、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９年）、Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８年）、Ｈｕａｎｇら（１９９２年）及びＰｅａｒｓｏｎら（１９９４年）が適切に記載している。ＡＬＩＧＮプログラムは、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（１９８８年）のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）のＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）のアルゴリズムに基づく。
【０１００】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手することができる。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列内の同じ長さのワードと並べたときに正の値の閾値スコアＴにマッチするかそれを満たす、クエリー配列内の長さＷのショートワードを特定することによって、高いスコアの配列の対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰの検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、次に累積アラインメントスコアが増加するまで、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列のためにはパラメータＭ（一対のマッチング残基のリワードスコア；常に＞０）及びパラメータＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアの計算のためにはスコアリングマトリックスが用いられる。各方向へのワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘ分低下する場合、累積スコアが１つ又は複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積によってゼロ以下になる場合、或いはいずれかの配列の末端に到達した場合に停止される。
【０１０１】
配列同一割合を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列間の類似性の統計解析も実行する（例えばＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性測定手段の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、試験核酸と基準核酸との比較において最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満のとき、試験核酸配列は基準配列と類似しているとみなされる。
【０１０２】
比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）が記載しているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０に含まれる）を利用することが可能である。或いは、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施するために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０に含まれる）を使用することが可能である。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記、を参照。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用するときは、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することが可能である（例えばヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮ、タンパク質のためのＢＬＡＳＴＸ）。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ値、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９年、を参照）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。
【０１０３】
詳細には、ポリペプチドは保存的な変異を除けばかなり相関している。保存的な変異は、他の生物学上類似した残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的な変異の例としては、１つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンによる他の残基の置換、１つの極性残基による他の残基の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換、その他がある。保存的な置換の他の実例としては、下記変更が含まれる：アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミン又はヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミン；イソロイシンからロイシン又はバリン；ロイシンからバリン又はイソロイシン；リジンからアルギニン、グルタミン又はグルタミン酸；メチオニンからロイシン又はイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン又はメチオニン；セリンからトレオニン；トレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニン；バリンからイソロイシン、ロイシン。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、特定の宿主での発現のために最適化される。本明細書で使用されるように、最適化はコドン最適化、並びに真核細胞においてはコザック配列及び／又は１つ又は複数のイントロンの導入を含む。したがって、核酸分子は、修飾されていない甲虫ルシフェラーゼをコードする野生型核酸配列とは、コドンの３０％、３５％、４０％又は４５％以上、例えば５０％、５５％、６０％若しくはそれ以上を超える割合で異なるコドン組成物を有してもよい。本発明に用いられる好ましいコドンは、特定の生物において同じアミノ酸の少なくとも１つの他のコドンよりも高頻度で使用され、またより好ましくはその生物において低利用コドンではなく、また核酸分子の発現のためにクローニング又はスクリーニングするために使用する生物においても低利用コドンではないものである。更に、あるアミノ酸（即ち、３つ以上のコドンを有するアミノ酸）の好ましいコドンは、他の（好ましくない）コドンよりも高頻度で使用される２つ以上のコドンを含んでもよい。１つの生物において他の生物におけるよりも高頻度で使用される核酸分子内のコドンの存在は、それらのコドンをより高頻度で使用する生物の細胞に導入されたとき、それらの細胞における野生型又は親の核酸配列の発現よりも高いレベルでそれらの細胞において発現される核酸分子をもたらす。
【０１０５】
本発明の一実施形態では、異なるコドンとは、哺乳類においてより高頻度で使用されるものであり、一方、他の実施形態においては、異なるコドンとは植物においてより高頻度で使用されるものである。特定の種類の哺乳類、例えばヒトは、他の種類の哺乳類とは異なる好ましいコドンセットを有している可能性がある。同様に、特定の種類の植物は、他の種類の植物とは異なる好ましいコドンセットを有しているかもしれない。本発明の一実施形態では、異なるコドンのほとんどは、所望の宿主細胞における好ましいコドンである。哺乳類（例えばヒト）及び植物の好ましいコドンは、当技術分野で公知である（例えばＷａｄａら、１９９０年）。例えば、ヒトの好ましいコドンとして、それには限定されないが以下がある。
【化１】
2011135892.tif 000003
（Ｗａｄａら、１９９０年）。
したがって、本発明の好ましい「ヒト化」合成の核酸分子は、増加した数の好ましいヒトコドンを有することによって野生型核酸配列と異なるコドン組成を有する。例えば、
【化２】
2011135892.tif 000004
又はそのいかなる組み合わせがある。例えば、本発明の核酸分子は、野生型核酸配列と比較して増加した数のＣＴＧ又はＴＴＧのロイシンエンコーディングコドン、ＧＴＧ又はＧＴＣのバリンエンコーディングコドン、ＧＧＣ又はＧＧＴのグリシンエンコーディングコドン、ＡＴＣ又はＡＴＴのイソロイシンエンコーディングコドン、ＣＣＡ又はＣＣＴのプロリンエンコーディングコドン、ＣＧＣ又はＣＧＴのアルギニンエンコーディングコドン、ＡＧＣ又はＴＣＴのセリンエンコーディングコドン、ＡＣＣ又はＡＣＴのトレオニンエンコーディングコドン、ＧＣＣ又はＧＣＴのアラニンエンコーディングコドン、或いはその任意の組み合わせを有することができる。同様に、植物においてより高頻度に使用されるコドンをより多く有す核酸分子は、増加した数の植物コドンを有することによって野生型核酸配列と異なるコドン組成を有し、このようなコドンとしては、それには限定されないが、
【化３】
2011135892.tif 000005
又はその任意の組み合わせがある（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９年）。好ましいコドンは、植物の種類が異なれば異なってもよい（Ｗａｄａら、１９９０年）。
【０１０６】
本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼタンパク質又は融合タンパク質は、組換え方法又は固相化学ペプチド合成法によって調製することができる。そのような方法は１９６０年代初期から当技術分野で公知であり（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３年）（Ｓｔｅｗａｒｔら、固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ロックフォード、Ｉｌｌ．、１１〜１２頁も参照）、また、市販のラボラトリペプチドデザイン及び合成キット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でも最近採用された。そのような市販のラボラトリキットは、通常、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４年）の教示を利用しており、全て単一のプレートに接続されている多数の「ロッド」又は「ピン」の先端でペプチドを合成することを可能にする。そのような系が利用されるときは、ロッド又はピンのプレートは逆にされて、適当なアミノ酸をピン又はロッドの先端に結合又は固定するための溶液を含んでいる、対応するウェル又は貯蔵器の第２のプレート内に挿入される。そのような工程を繰り返すことにより、例えばロッド及びピンの先端を逆にして適当な溶液に挿入することにより、アミノ酸は所望のペプチドに構築される。更に、いくつかのＦＭＯＣペプチド合成系が利用できる。例えば、ポリペプチド又は断片の集合は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ  ４３１Ａ自動ペプチド合成機を使用して固体支持体上で実行することが可能である。そのような設備は、直接合成又は他の公知の技術を使用して結合することができる一連の断片の合成による、本発明のペプチドへの到達を容易にする。
【０１０７】
ＩＶ．本発明の修飾されたレポータータンパク質との有用な融合パートナー
修飾されたレポータータンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドは、他の核酸配列、例えばｃＤＮＡなどの未変性の配列、又はＮ末端、Ｃ末端又はＮ及びＣ末端の融合タンパク質、例えば選択可能なマーカーを含む異なるレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質との融合を調製するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作されたものと一緒に使用することができる。適当な融合パートナーの多くの例は当技術分野で公知であり、本発明の実施で使用することが可能である。
【０１０８】
融合パートナーとしては、それには限定されないが、親和性ドメイン又は他の機能性タンパク質配列、例えば酵素活性を有するものがある。例えば、機能性タンパク質配列はキナーゼ触媒ドメインをコードして（Ｈａｎｋｓ及びＨｕｎｔｅｒ、１９９５年）、リン酸部分を酵素的に特定のアミノ酸に加えることができる融合タンパク質を生成することができ、又は、Ｓｒｃ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ２（ＳＨ２）ドメインをコードして（Ｓａｄｏｗｓｋｉら、１９８６年；Ｍａｙｅｒ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９３年）、リン酸化されたチロシンと特異的に結合する融合タンパク質を生成することができる。
【０１０９】
親和性ドメインは、通常、固体支持体上で固定されるものなどの結合パートナーと相互作用することが可能なペプチド配列である。複数の連続的な単一アミノ酸、例えばヒスチジンをコードするＤＮＡ配列は、発現タンパク質に融合される場合、ニッケルセファロースなどの樹脂カラムとの高親和性結合による組換えタンパク質の一段精製のために使用してもよい。キチン結合ドメイン（キチンと結合する）、グルタチオン−Ｓ転移酵素（グルタチオンと結合する）、ビオチン（アビジン及びストレプトアビジンと結合する）、その他などのペプチドをコードする配列も、関係するタンパク質の精製を容易にするために使用することができる。親和性ドメインは、インテイン（タンパク質セルフスプライシング要素（Ｃｈｏｎｇら、１９９７年）の使用など、当業者に公知の方法によって関係するタンパク質から分離することが可能である。例示的な親和性ドメインとしては、ＨｉｓＶ５（ＨＨＨＨＨ）（配列番号１）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号２）、Ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号３）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号４）、ＳｔｅｐｔＴａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）（配列番号５）、血液凝集素、例えばＨＡ  Ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号６）、ＧＳＴ、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（配列番号１０４）、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号１０５）、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ末端ＲＮＡ標識、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号８）、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメイン又はカルシウム結合ドメイン、例えばカルモジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、リカバリン、Ｓ−モジュリン、ビシニン（ｖｉｓｉｎｉｎ）、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン（ｎｅｕｒｏｃａｌｃｉｎ）、ヒポカルシン（ｈｉｐｐｏｃａｌｃｉｎ）、フリケニン（ｆｒｅｑｕｅｎｉｎ）、カルトラシン（ｃａｌｔｒａｃｔｉｎ）、カルパイン大サブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルブアルブミン、カルビンジンＤ９Ｋ、カルビンジンＤ２８Ｋ及びカルレチニンなどのカルシウム結合タンパク質からのもの、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、Ｉｄ、ロイシンジッパー配列並びにマルトース結合タンパク質がある。一実施形態では、融合パートナーはＨｉｓ又はＧＳＴ標識など融合タンパク質を精製するために有用な配列であり、一実施形態では、精製標識は環状置換されたレポータータンパク質のＮ又はＣ末端に融合される。
【０１１０】
他のクラスの融合パートナーとしては、レポーター遺伝子、例えばそれには限定されないがネオ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｇｕｓ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、ｂｌｅ遺伝子、ｍｐｒｔ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子、ガラクトピラノシド遺伝子、キシロシダーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、アラビノシダーゼ遺伝子、突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）若しくはアセトアシッドシンターゼ遺伝子（ＡＡＳ）、メトトレキセート抵抗性ｄｈｆｒ遺伝子、ダラポンデハロゲナーゼ遺伝子、５−メチルトリプトファン抵抗性を付与する突然変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子（国際公開９７／２６３６６）、Ｒ座位遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、ｘｙｌＥ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、花虫類ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（例えばＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子などによってコードされるたんぱく質がある。選択可能な又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子という用語には、その分泌が形質転換細胞の特定又は選択の手段として検出することが可能な「分泌可能なマーカー」をコードする遺伝子も含まれる。例には、抗体相互作用によって特定することが可能な分泌可能な抗原をコードするマーカー、又はそれらの触媒活性によって検出することができる分泌可能な酵素をコードするマーカーさえ含まれる。分泌可能なタンパク質はいくつかのクラスに分けられ、例としては例えばＥＬＩＳＡによって検出可能な小さな、分散性タンパク質、及び細胞膜に挿入されるか捕捉されるタンパク質がある。
【０１１１】
Ｖ．修飾されたレポータータンパク質又はその融合物をコードするベクター及び宿主細胞
修飾されたレポータータンパク質又はその融合物をコードする望ましい核酸分子が一旦調製されると、その修飾されたレポータータンパク質又はその修飾されたレポータータンパク質を含んでいる融合タンパク質をコードする発現カセットが調製される。例えば、修飾された甲虫ルシフェラーゼをコードする核酸配列を含んでいる核酸分子は、発現カセットを形成するために任意選択に転写調節配列、例えば１つ又は複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列又はその組み合わせと作動可能的に結合される。核酸分子又は発現カセットは、プラスミド又はウイルスベクターなどの任意選択に選択可能なマーカー遺伝子を含んでいるベクターに導入し、このベクターを関係する細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセス属、バシラス属、スタフィロコッカス属などの原核細胞、並びに植物（双子葉植物又は単子葉植物）、真菌、酵母、例えばピチア、サッカロミセス又はシゾサッカロミセス属、或いは哺乳類細胞などの真核細胞に導入することができる。好ましい哺乳類細胞としては、ウシ、ヤギ、羊、イヌ、ネコ、サルなどヒト以外の霊長類、及びヒトの細胞がある。好ましい哺乳動物細胞系には、それには限定されないが、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、Ｈｅｌａ、ＣＶ−１、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＨＥＫ２９３及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が含まれる。
【０１１２】
コードされる修飾されたレポータータンパク質の発現は、原核細胞又は真核細胞で発現可能な任意のプロモーターによって調節することができる。好ましい原核プロモーターとしては、それには限定されないが、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ又はマルトースプロモーターが含まれる。好ましい真核生物のプロモーターとしては、それには限定されないが、構成プロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０及びＲＳＶプロモーターなどのウイルスのプロモーター、並びに調節可能なプロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター及びＣＲＥによって調節される合成プロモーターなどの誘導又は抑制が可能なプロモーターが含まれる。本発明の核酸分子、発現カセット及び／又はベクターは、任意の方法、例えばそれには限定されないが、カルシウム媒介性形質転換、エレクトロポレーション、顕微注射、リポフェクションなどによって細胞に導入することができる。
【０１１３】
ＶＩ．使用例
修飾されたレポータータンパク質又はその融合物は任意の目的、例えばそれには限定されないが、特定分子の量及び存在の検出（バイオセンサー）、特定分子の単離、特定分子の高次構造の例えば結合、リン酸化又はイオン化による変化の検出、ｐＨ又は温度などの条件の検出、高スループット又は低スループットのスクリーニングの促進、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ又は他のタンパク質ベースの相互作用の検出、或いはバイオセンサーの選択又は開発などのために有用である。例えば、修飾されたレポータータンパク質又はその融合物は以下のために有用である。例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は細胞ベースのアッセイにおける特定のキナーゼ（例えば、キナーゼ部位をレポータータンパク質に挿入することによる）、ＲＮＡｉ（例えば、ＲＮＡｉによって認識されることが疑われる配列をレポータータンパク質のコード配列に挿入し、次にＲＮＡｉを添加した後にレポーター活性を監視することによる）、又はプロテアーゼの量、存在又は活性の検出であり、例えば特定のウイルスプロテアーゼの存在を検出するためのものがあり、これは今度はウイルス又は抗体の存在の指標となる；阻害剤、例えばプロテアーゼインヒビターのスクリーニング；認識部位の特定、又は例えば選択された認識配列を有する修飾されたルシフェラーゼ又は単一の関心のある分子を有する異なる複数の配列若しくは複数の（例えばライブラリー）分子を有する修飾されたルシフェラーゼのライブラリーを使用した基質特異性の検出；バイオセンサー又は関心のある分子、例えばプロテアーゼの選択又は開発；或いは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は細胞ベースの方法による相補性又は結合を通したタンパク質−タンパク質相互作用の検出。一実施形態では、挿入を含む修飾された甲虫ルシフェラーゼが分子のランダムなライブラリー又は変異ライブラリーと接触させられ、その挿入と相互作用する分子が特定される。他の実施形態において、複数の挿入を有する修飾されたルシフェラーゼのライブラリーが分子と接触させられ、その分子と相互作用する修飾されたルシフェラーゼが特定される。
【０１１４】
本発明は、細胞内の分子の発現、場所及び／又はトラフィッキングを監視するための、並びに細胞内の微小環境の変化を監視するための、修飾された甲虫ルシフェラーゼ又はその融合タンパク質を使用した方法も提供する。例えば、一実施形態では、修飾された甲虫ルシフェラーゼは、ある条件下で互いと相互作用する２つのドメインを含んでいる内部挿入を含む。一実施形態では、挿入内の１ドメインはリン酸化が可能なアミノ酸を含み、他のドメインはホスホアミノ酸の結合ドメインである。適当なキナーゼ又はホスファターゼの存在下で、挿入内の２つのドメインは相互作用して修飾された甲虫ルシフェラーゼの高次構造を変え、その結果修飾された甲虫ルシフェラーゼの検出可能な活性の変化が起こる。他の実施形態において、修飾された甲虫ルシフェラーゼは分子の認識部位を含み、その分子がその認識部位と相互作用すると活性が増加するので、他の分子の存在又は量を検出又は決定するために使用することができる。
【０１１５】
２−ハイブリッド系は、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質：タンパク質相互作用を検出するための、並びにタンパク質：タンパク質相互作用に関係する残基／ドメインを特定するための極めて強力な方法である。２−ハイブリッド系の基礎は、一部の転写因子で見られるモジュラードメインである。即ち、特定のＤＮＡ配列と結合するＤＮＡ結合ドメイン、及び基礎の転写機構と相互作用する転写活性化ドメインである（Ｓａｄｏｗｓｋｉ、１９８８年）。ＤＮＡ結合ドメインと共同した転写活性化ドメインは、ＴＡＴＡボックスでのＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の集合を進めて転写を増やすことができる。ＣｈｅｃｋＭａｔｅ（商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、マジソン、ウィスコンシン州）において、別々のプラスミドによって生じたＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに融合された１つのタンパク質（「Ｘ」）が転写活性化ドメインに融合された第２のタンパク質（「Ｙ」）と相互作用するときは、緊密に関連する。この系において、タンパク質Ｘ及びＹの間の相互作用は、レポーター遺伝子又は選択可能なマーカー遺伝子の転写をもたらす。特に、ｐＢＩＮＤベクターは複数のクローニング領域の上流に酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含み、ｐＡＣＴベクターは複数のクローニング領域の上流に単純疱疹ウイルスＶＰ１６の活性化ドメインを含む。更に、ｐＢＩＮＤベクターは、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼを発現する。関係する相互作用する可能性のある２つのタンパク質をコードする２つの遺伝子は、ｐＢＩＮＤ及びｐＡＣＴベクターにクローニングされ、それぞれＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン及びＶＰ１６の活性化ドメインと融合タンパク質を生成する。ｐＧ５ｌｕｃベクターは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ＋）の上流にある最小ＴＡＴＡボックスの更に上流に、５つのＧＡＬ４結合部位を含む。ｐＧＡＬ４及びｐＶＰ１６融合構築物は、ｐＧ５ｌｕｃベクターと共に哺乳類細胞に形質移入される。形質移入の２〜３日後に細胞は溶解され、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びホタルルシフェラーゼの量はＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．＃Ｅ１９１０）を使用して定量することが可能である。ＧＡＬ４及びＶＰ１６融合構築物のような２つの試験タンパク質の間の相互作用は、陰性対照を上回るホタルルシフェラーゼ発現の増加をもたらす。本発明の修飾された甲虫ルシフェラーゼ、例えば、修飾に寛容性のある１部位又は領域（Ｎ末端断片）で欠失が起きているものはＤＮＡ結合ドメインと融合され、甲虫ルシフェラーゼの残り（Ｃ末端の断片）は転写活性ドメインと融合される。
【０１１６】
本発明は、関心のある分子の活性を調整することができる剤（「試験」剤）についてスクリーニングする方法も提供する。「調整」は、生物的活性又は過程（例えば酵素活性）の機能的特性を強めるか抑制する能力を指し、そのような強化又は抑制は特定の事象、例えばシグナル伝達経路の活性化の発生に付随するものでもよく、且つ／又は特定の細胞種だけで現れるものでもよい。「モジュレーター」は作用剤（天然又は非天然の）を指し、例えば生体高分子（例えば核酸、タンパク質、非ペプチド又は有機分子）、小分子、或いは細菌、植物、真菌類又は動物（特に哺乳動物）の細胞又は組織などの生体物質からの抽出物を指す。モジュレーターは、本明細書で記載されているスクリーニングアッセイに含めることにより、生物学的過程の（直接的又は間接的）阻害剤又は活性剤（例えばアゴニスト、部分アンタゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、抗腫瘍薬、細胞傷害剤、腫瘍性転化又は細胞増殖の阻害剤、細胞増殖促進剤、など）としての潜在的な活性について評価される。モジュレーターの活性は、知られていても、未知であっても、又は部分的に知られていてもよい。そのようなモジュレーターは、本発明の方法を使用してスクリーニングすることができる。用語「試験剤」は、推定されるモジュレーターとして本発明の１つ又は複数のスクリーニング法によって試験される剤を指す。通常、０．０１μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ及び１０．０μＭなどの様々な所定濃度がスクリーニングで使用される。対照は、試験剤がない場合のシグナル測定、標的を調整することが公知の剤との比較、又は試験剤との接触の前、その間、及び／又は後の試料（例えば細胞、組織又は生物体）との比較を含むことができる。
【０１１７】
一実施形態では、この方法はプロテアーゼ活性を調整する剤についてスクリーニングすることを含む。例えば、一実施形態では、アポトーシスを調整することができる剤を特定する方法が提供される。カスパーゼファミリープロテアーゼは、アポトーシスと関連付けられている。したがって、この方法はカスパーゼファミリープロテアーゼを含むことが疑われる試料を、カスパーゼ活性を調整することが疑われる剤、及びカスパーゼによる切断が可能な切断部位を有する修飾されたレポータータンパク質と接触させることを含む。試料中の修飾されたレポータータンパク質の活性は、試験剤との接触の前後に検出される。剤との接触後の活性増加は、アポトーシスを抑制する剤の指標であり、活性減少はアポトーシスを活性化する剤の指標である。
【０１１８】
したがって、本発明は本発明の修飾されたレポータータンパク質内に存在する認識配列の切断を調整する剤を特定してその活性を検出するための、有用なスクリーニング系を提供する。この系は、プロテアーゼ活性モジュレーターの迅速なスクリーニングを可能にする。本明細書で記載されているスクリーニング系を利用すると、プロテアーゼ、例えばカスパーゼファミリープロテアーゼを調整（例えば抑制又は活性化）する剤を特定するための感度が高く迅速な手段が提供される。
【０１１９】
したがって本発明の修飾されたレポータータンパク質は、修飾されたレポータータンパク質内の挿入及び関心のある分子との間の相互作用を調整する剤又は条件を研究するための基質として有用である。詳細には、本発明は、挿入が関係する酵素の切断部位であるアミノ酸配列を含んでいる、修飾されたルシフェラーゼタンパク質を企図する。したがって関心のある分子がプロテアーゼであるとき、挿入はそのプロテアーゼの切断認識配列を含んでいるペプチドを含む。プロテアーゼの切断認識配列は、タンパク分解性切断の間にそのプロテアーゼによって認識される特異的アミノ酸配列である。したがって、本発明は、試料を本発明の修飾されたルシフェラーゼポリペプチドと接触させてルシフェラーゼ活性の変化を測定することにより、試料中のプロテアーゼの量を測定する方法を提供する。本発明の修飾されたルシフェラーゼタンパク質は、とりわけ修飾されたルシフェラーゼを発現する細胞内のプロテアーゼ活性を監視するために使用することができる。
【０１２０】
本発明のアッセイは、修飾されたレポータータンパク質を切断するプロテアーゼ活性を変える化合物を特定するための薬剤をスクリーニングするために使用することができる。一実施形態では、アッセイはプロテアーゼを含んで試料に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。既知量のプロテアーゼを含んでいる試料は、本発明の修飾されたレポータータンパク質、及び試験剤と混合される。次に、試料中のプロテアーゼ活性量が先に述べたように測定される。その後、試験剤の存在下におけるプロテアーゼ１モルあたりの活性量が、試験剤がない場合のプロテアーゼ１モルあたりの活性と比較される。相違は、試験剤がプロテアーゼ活性を変化させることを示す。したがって、変化は修飾されたレポータータンパク質活性の減少をもたらすプロテアーゼ活性の増加或いは修飾されたレポータータンパク質活性の増加又は維持と対応するプロテアーゼ活性の低下である。
【０１２１】
一実施形態では、プロテアーゼ活性を変化させる剤の能力が決定される。このアッセイにおいて、細胞はプロテアーゼ活性を調整することが疑われる剤で条件づけられるか又は接触させられる。培養内の細胞は溶解されて、プロテアーゼ活性が測定される。例えば、既知又は未知の量のプロテアーゼを含んでいる溶解細胞試料は、本発明の修飾されたレポータータンパク質と混合される。次に、上記したように対照又は未処理の試料及び処理された溶解細胞試料の中の修飾されたレポータータンパク質活性の程度を測定することにより、試料中のプロテアーゼ活性量が測定される。活性又は抑制は、試料中のタンパク質１マイクログラム又は１ミリグラムをベースにして計算することができる。したがって、プロテアーゼ活性の調整は、修飾されたレポータータンパク質活性の減少をもたらすプロテアーゼ活性の増加或いは修飾されたレポータータンパク質活性の増加又は維持と対応するプロテアーゼ活性の低下を含む。一般的に、プロテアーゼ活性の絶対量を与えるために、相違は標準の測定値に対して較正される。プロテアーゼの活性又は発現を抑制又はブロックする試験剤は、非処理の対照と比較した処理された細胞内の修飾されたレポータータンパク質活性の増加によって検出することができる。
【０１２２】
他の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏでプロテアーゼ活性を変化させる剤の能力が決定される。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、本発明の修飾されたレポータータンパク質をコードする発現ベクターで形質移入された細胞は異なる量の試験剤に曝され、細胞内のレポータータンパク質活性への影響を決定することができる。一般的に、プロテアーゼ活性の絶対量を与えるために、相違は標準の測定値に対して較正される。プロテアーゼの活性又は発現を抑制又はブロックする試験剤は、非処理の対照と比較した処理された細胞内の修飾されたレポータータンパク質活性の増加によって検出することができる。
【０１２３】
本発明のアッセイに用いられる物質及び組成物は、キットの調製に適していることが理想である。そのようなキットは、１つ又は複数の容器手段、例えばバイアル、管、その他を含んでいる担体手段を含んでもよく、各容器手段はその方法で使用される別々の要素の１つを含んでいる。容器の１つは、本発明の修飾されたレポータータンパク質又はポリヌクレオチドを（例えば、ベクターの形で）含む。第２の容器は、修飾されたレポータータンパク質の基質を含んでもよい。
【０１２４】
本発明は、以下のそれには限定されない実施例で更に説明される。
【実施例１】
【０１２５】
コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子のＴｎ５挿入突然変異
Ａ．トランスポゾン挿入反応
標的ＤＮＡの調製。コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子（ｃｂｇ６９）を大腸菌Ｔ７発現ベクターにクローニングし、得られたプラスミド（ｐＪＬＣ１）をトランスポゾン突然変異反応のために標的ＤＮＡとして使用した。
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏトランスポゾン挿入反応。複数の挿入事象を最小にしてトランスポゾン挿入の効率を最大にするために、反応条件を最適化した。例えば、等モル量のトランスポゾンをそのモル数の標的ＤＮＡに加えた。
【０１２６】
１．以下の順序で加えることによってトランスポゾン挿入反応混合物を調製する：
１μｌ  １０×反応緩衝液
０．３５μｇ  標的ＤＮＡ（ｐＪＬＣ１）（７μｌ）
１μｌ  モル当量トランスポゾン
１μｌ  トランスポザーゼ
１０μｌ  総反応体積
２．反応混合物を３７℃で２時間インキュベートする。
３．１μｌ停止液を加えて反応を止める。
混合して６５℃で１５分間加熱する。
反応混合物は−２０℃で保存した。
【０１２７】
Ｂ．トランスポゾン挿入クローンの選択
形質転換及び回収。１回の反応で得られるトランスポゾン挿入クローンの数は、とりわけ使用されるコンピテント細胞の形質転換効率によって決まる。コンピテント細胞の形質転換効率がより高いほど、より多くの挿入クローンが得られる。大腸菌のｒｅｃＡ−系統（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅからのＥＣ１００コンピテント細胞）を形質転換のために使用した。
３．挿入反応混合物の１μｌを使用して、ＥＣ１００エレクトロコンピテント細胞へ形質転換する。
４．エレクトロポレーションの直後にＳＯＣ培地を１ｍｌの最終体積までエレクトロポレーションセルに加えることによって、エレクトロポレーションされた細胞を回収する。培地／細胞をピペットで穏やかに混ぜる。管に移して３７℃の撹拌機で３０〜６０分間インキュベートして細胞成長を促進する。
５．細胞の一部を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んでいるＬＢプレート上で平板培養する。
６．３７℃で一晩プレートを増殖させる。
【０１２８】
Ｃ．トランスポゾン挿入マッピング。数千の挿入コロニーが得られた。２７の挿入クローンを選択し、ｃｂｇ６９遺伝子の２つの末端のプライマーセットを使用してＴｎ５トランスポゾンを含んでいるコメツキムシｌｕｃ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、同じプライマーセットを使用して配列決定した。Ｔｎ５挿入の位置はランダムであることが明らかになった（図２〜３）。
【０１２９】
Ｄ．トランスポゾン挿入を有するｌｕｃ遺伝子のプラスミドライブラリーの作製。
ｌｕｃ遺伝子内に挿入を有するクローンは、プラスミド骨格に挿入を有するものから分離する必要がある。このため、全ての形質転換体をプールして、プラスミドＤＮＡを精製した。トランスポゾン挿入を有するｃｂｇ６９遺伝子を含んでいるＤＮＡフラグメントを放出するために、得られたプラスミドＤＮＡを一対の制限酵素（例えばＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ）で消化した。このＤＮＡフラグメントはトランスポゾン挿入を含まない大腸菌Ｔ７発現ベクターのそれぞれの制限酵素部位に再クローニングし、Ｔｎ５挿入を有するｌｕｃ遺伝子を含んでいるプラスミドライブラリーを得た。
【０１３０】
Ｅ．インフレーム１９コドン挿入ライブラリーの作製
Ｔｎ５トランスポゾンの除去。一旦トランスポゾン挿入を有するｌｕｃ遺伝子のプラスミドライブラリーが作製されたならば、制限酵素、例えばＮｏｔＩによる消化によってＴｎ５トランスポゾンを除去した。線状にされたＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動によってＴｎ５を含んでいるＤＮＡ断片から分離し、次に精製した。
【０１３１】
再連結及び形質転換。線状にされたＤＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して再連結した。再連結が成功すると、単一の制限部位、例えばＮｏｔＩが再生され、３つの読取り枠の１つへの５７ヌクレオチド（１９コドン）の挿入が作製された。再連結されたＤＮＡはＥＣ１００細胞に形質転換し、元のクローニングベクター上に存在する抗生物質マーカー（例えば対照ＤＮＡではアンピシリン）を使用して組換え体を選択した。
【０１３２】
Ｆ．活性リンカー挿入クローンの選択。個々のリンカー挿入クローンを使用して１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含んでいる１ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩増殖させた。ルシフェラーゼ活性は、一晩培養したもの１００μｌとＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（マジソン、ウィスコンシン州）からのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬１００μｌとを混ぜることによって測定した。発光は、５分後に照度計で記録した。
【０１３３】
Ｇ．活性リンカー挿入クローンのＤＮＡ配列決定。４００以上のクローンがスクリーニングされた。バックグラウンドより２０倍よりも強いルシフェラーゼ活性を有していたリンカー挿入クローンを選択した。リンカー挿入位置は、リンカー挿入を含んでいるｌｕｃ遺伝子のＰＣＲ産物の配列決定により決定した。各活性リンカー挿入クローンの位置及び相対活性は、図３〜４に示す。
【実施例２】
【０１３４】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子のＴｎ−７挿入突然変異
市販のキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）からのＧＰＳ（商標）−Ｍ  ＧＰＳ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、Ｔｎ７ベースのトランスポゾンをホタルルシフェラーゼＤＮＡにランダムに挿入した。この挿入断片の大部分を次に制限酵素消化により切り取り、再連結によって５アミノ酸の挿入を得た。最初に、コロニーを増殖させて切り取りの前にルシフェラーゼ活性の消失についてスクリーニングした。ルシフェラーゼ活性を有していた培養物内のプラスミドを次に切り取り、細胞へ形質転換で戻し、ルシフェラーゼ活性の復活がないかコロニーを調べた。その後、ランダム位置に大きな挿入を含んでいるゲル精製ルシフェラーゼ断片がベクターにクローニングされ、ベクター集団の大量切り取りが実施されたより効率的な方法が使用された。ここで、切り取られたベクターによる形質転換の後にルシフェラーゼ活性を発現したコロニーを選択した。トランスポゾンはカナマイシン耐性を有していたので、挿入を含まないベクター分子を除去することが可能であった。
【０１３５】
第１の方法では、反応は次のように組み立てられた：
【化４】
2011135892.tif 000006
カナマイシン耐性遺伝子を有するｐＧＰＳ５（ＮＥＢ）は供与体プラスミドであり、アンピシリン耐性遺伝子を有するｐＳＰ−Ｌｕｃ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）は受容体であった。転位が成功すると、受容体プラスミドにカナマイシン耐性カセットが挿入された。反応体をピペット操作で混合し、次にＴｎｓＡＢＣ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅの１μｌを加えて反応体を更に混合した。反応体は、３７℃で１時間インキュベートし、７５℃で１０分間加熱してから氷上に置いた。次に５μｌを１００μｌの高効率コンピテント大腸菌ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）に形質転換した。氷上での１０分間のインキュベーションの後、細胞を４２℃で４５秒間の温熱ショックで処理し、次に氷上で２分間インキュベーションした。１ｍｌのＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）を次に加え、細胞を３７℃で１時間振盪した。次に、４０μｌずつを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んでいるＬＢ寒天プレート上で平板培養した。
【０１３６】
その翌日、コロニーをそれらのプレートから拾い、３ｍｌのＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ＋０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ内で個々に生育させた。一晩増殖の後、培養物の１０μｌをｐＨ５．５の１００ｍＭクエン酸ナトリウム中の１ｍＭルシフェリンの１００μｌに加えることによってこれらの培養物をルシフェラーゼ活性について分析し、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０照度計で数値を読み取った。
【０１３７】
プラスミドは低活性培養物（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓキット）から調製し、制限酵素ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）で消化して大多数の挿入断片を切り取り、次に再連結した。一般的に、これらの反応は次の通りであった。
【化５】
2011135892.tif 000007
インキュベーションは３７℃で１時間であった。次に反応体を６５℃で２０分間加熱して制限酵素を不活性化し、ライゲーション反応を下記のように組み立てた。
１μｌ  上の反応液
３μｌ  １０×リガーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１μｌ  ３  Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
２５μｌ  Ｈ２Ｏ
３０μｌ
ライゲーションは１６℃で少なくとも２時間インキュベートし、次に先に述べたように３μｌをＪＭ１０９に形質転換した。各形質転換の５０μｌをＬＢ／ａｍｐプレート又はこれらのプレートの上に重層されたニトロセルロースフィルター上に平板培養した。３７℃で一晩増殖させた後に、フィルターを取り出して４０℃にセットしたスライドウォーマー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のｐＨ５．５の１００ｍＭクエン酸ナトリウム中の１ｍＭルシフェリン溶液の１ｍｌの上に置いた。部屋を暗くし、フィルターの発光を観察した。輝くのが観察されたピックからのコロニーはＬＢ／ａｍｐプレートから成長させ、プラスミドを単離し、次に制限酵素切断及びシークエンシングによって分析した。大きなカナマイシン挿入断片の切り出しの後、単一のＰｍｅＩ部位が挿入部位に残る。したがって、ＰｍｅＩ及び他の制限酵素による切断は、挿入部位のマッピングを可能にする。
【０１３８】
第２の方法において、挿入ライブラリーをゲル精製ルシフェラーゼ断片内で単離し、タンパク質の切り出し及び発現のためにベクターにクローニングした。具体的には、ｐＳＰＬｕｃ＋への転位を先に述べたように達成し、次に、先に述べたように３×５μｌを３×１００μｌ高効率ＪＭ１０９に形質転換した。各管からの４０μｌをＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ上に平板培養し、この管の残り並びに他の管からの細胞を５０ｍｌのＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎに加えて３７℃で一晩生育させた。プレートは約７，０００の異なるプラスミドのライブラリーに相当する９３のコロニーを生成したが、その約１，４００の挿入はルシフェラーゼコード配列内にあると予想された。プラスミドは、液体培養の８ｍｌから単離された。ルシフェラーゼ遺伝子と連結するＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩによるプラスミドの消化は、ベクター骨格及びルシフェラーゼコード配列と対応する４つの断片をもたらし、それぞれはカナマイシン挿入断片を有すか有さなかった。関係するバンドは長さ３，４３８ｂｐであり、転位されたルシフェラーゼ遺伝子断片と一致した。ライブラリーからの約２μｇのプラスミドをＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含んでいる１％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。３，４３８ｂｐバンドはＵＶ照明による可視化の後にゲルから切り取り、Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用してアガロース切片から精製した。次に標準手順に従ってこのＤＮＡをＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）にクローニングした。これによりルシフェラーゼ遺伝子はベクター内のＬａｃプロモーターの支配下に置かれる。大多数のカナマイシン挿入断片は、ＰｍｅＩで切断してライブラリーから切り取った。
２μｌ  ０．２５μｇ／μｌ  ｐＧＥＭ−３Ｚ−ｌｕｃ−ｋａｎライブラリー
２μｌ  １０×緩衝液Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１．５μｌ  １０  Ｕ／μｌ  ＰｍｅＩ（ＮＥＢ）
１４．５μｌ  Ｈ２Ｏ
２０μｌ
この反応体を３７℃で１時間インキュベートし、次に６５℃で２０分間加熱して下記のように連結した。
２μｌ  上記消化液
３μｌ  １０×リガーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１μｌ  ３  Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
２４μｌ  Ｈ２Ｏ
３０μｌ
ライゲーション反応体を１６℃で一晩インキュベートし、次に個々のコロニーを得るためにコンピテントなＪＭ  １０９に形質転換した。アンピシリンのみ又はアンピシリンとカナマイシンの両方を含んでいるプレート上に平板培養することによって、アンピシリンプレート上の形質転換体の約９０％はカナマイシンに感受性であり、したがって挿入断片の切り取りに成功したと推測することができた。個々のコロニーを３ｍｌのＬＢ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンで培養し、培養物のルシフェラーゼ活性を分析した。
【０１３９】
結果
第１の方法については、培養物の約２０％はルシフェラーゼ活性が大きく低下しており、このことはトランスポゾンがｐＳＰ−Ｌｕｃ＋プラスミド内のルシフェラーゼコード領域に挿入されていることと一致している。第２の方法については、個々のコロニーからの培養物の約１５％でかなりの活性が観察された。プラスミドは活性のある培養物から調製され、ＰｍｅＩ部位挿入断片のおおよその位置を特定するために制限マッピングを実施した。次にこれらの試料に対して、アイオワ大学ＤＮＡシーケンシング施設で標準のジデオキシ配列決定法を実施した。活性クローンの約半分は、ルシフェラーゼコード領域の直ぐ外側に挿入断片を含んでいた。残りは、コード領域内の様々な場所に挿入断片を有していた。上で議論した２つの異なる方法からの結果を合わせたものを下で提示するが、挿入の位置及び残存している活性のおおよその割合が示されている。
【表２】
2011135892.tif 000008
【実施例３】
【０１４０】
ヒンジ領域に修飾を有する修飾されたコメツキムシルシフェラーゼ
トランスポゾン突然変異研究によって特定された位置に関係する様々な部位を都合よく挿入するために、コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子（ｃｂｇ６９）を修飾して、ヒンジ領域をコードする配列に連続している２つの独特の制限酵素部位、ＳｎａＢＩ（ＴＡＣＧＴＡ）及びＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）を生成した。具体的には、２つのオリゴヌクレオチド：
【化６】
2011135892.tif 000009
を使用してＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるｃｂｇ６９遺伝子の修飾を実施した。得られたコメツキムシルシフェラーゼＣｂｇ６９ｓｓはＩｌｅ４０９のＶａｌへの１アミノ酸置換を有し、野生型Ｃｂｇ６９の２倍の活性を示すことが明らかになった。Ｃｂｇ６９ｓｓを有すプラスミド（ｐＪＬＣ１ｓｓ）は、ヒンジ領域に修飾を有する他のルシフェラーゼを生成するためのテンプレートとして使用した。
そのために、以下のオリゴヌクレオチド対を合成した：
【化７】
2011135892.tif 000010
各オリゴヌクレオチドは、以下の反応条件を使用してリン酸化した。
オリゴヌクレオチド  ３０ｐｍｏｌ
１０×  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液  ２．５μｌ
１０ｍＭ  ＡＴＰ  ２．５μｌ
Ｔ４オリゴヌクレオチドキナーゼ（１μ／μｌ）  ０．５μｌ
水  ２５μｌまで
３７℃で３０分間インキュベートし、７０℃で１０分間不活性化する。
【０１４１】
各リンカーにつき、一対のリン酸化オリゴヌクレオチド（上記反応体からの１０μｌ）を９５℃で５分間加熱して１時間で３７℃に冷却してアニールした。次に各リンカーをｐＪＬＣ１ｓｓのＳｎａＢＩ及びＳａｌＩ部位にクローニングした。
【０１４２】
結果
Ａ．コメツキムシルシフェラーゼを残基４００の後で修飾してカスパーゼ−３認識部位（ＤＥＶＤ）を含むようにし、Ｃｂｇ６９ＤＥＶＤが得られた。Ｃｂｇ６９ｓｓ及びＣｂｇ６９ＤＥＶＤは細菌宿主で発現された。細菌溶解物をカスパーゼ−３の様々な量（０、６．２５、１２．５、２５、５０、１００又は２００ｎｇ）或いは２００ｎｇのカスパーゼ−３及び０．１ｍＭカスパーゼ阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯと混合し、ルシフェラーゼ活性を監視した。図５Ａは、カスパーゼ−３濃度の上昇に従って、Ｃｂｇ６９ｓｓのそれではなくＣｂｇ６９ＤＥＶＤの活性が減少したことを示す。さらに、カスパーゼ阻害剤の存在下では活性低下は観察されなかった（図５Ｂ）。さらに、ルシフェラーゼ活性は時間と共に低下した（図５Ｃ）。
【０１４３】
Ｂ．ＳＡＲＳウイルス３ＣＬプロテアーゼはＳＡＲＳコロナウイルスのシステインプロテアーゼであり、抗ＳＡＲＳウイルス薬剤の潜在的な標的である。２つのコメツキムシルシフェラーゼを残基４００の後で修飾して、２つのＳＡＲＳプロテアーゼ認識部位（Ｃｂｇ６９ＳＡＲＳ３及びＣｂｇ６９ＳＡＲＳ６）の１つを含むようにした。Ｃｂｇ６９ｓｓ、Ｃｂｇ６９ＳＡＲＳ３及びＣｂｇ６９ＳＡＲＳ６は、ウサギ網状赤血球溶解物及び／又はコムギ胚抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して生成した。ＳＡＲＳプロテアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからのｐＭＡＬ精製系を使用して部分的に精製した。コメツキムシルシフェラーゼを含んでいる溶解物をＳＡＲＳプロテアーゼと混合して、ルシフェラーゼ活性を監視した。図６Ｃは、室温で１時間のインキュベーションの後、Ｃｂｇ６９ｓｓではなくＣｂｇ６９ＳＡＲＳは、ＳＡＲＳプロテアーゼ（約０．３μｇ）で処理したとき非処理の試料と比較して活性が低下したことを示す。
【０１４４】
Ｃ．図６Ａ〜Ｃで示すように、Ａｓｎ４００の後に様々な挿入部位を有する修飾されたコメツキムシルシフェラーゼは全て活性であった。これらの修飾されたルシフェラーゼは、Ｃｂｇ６９ｓｓと比較して１２〜６４％の活性を有していた。したがって、コメツキムシルシフェラーゼのヒンジ領域における修飾は、活性を保持している修飾されたルシフェラーゼを与えることができる。
【実施例４】
【０１４５】
内部エンテロキナーゼ部位を有する修飾されたホタルルシフェラーゼ
ホタルルシフェラーゼのアミノ酸２３３及び５４１の後の５アミノ酸挿入は酵素活性の最大分画を保持していた（実施例２）ので、それらの部位を詳細解析のために選択した。プロテアーゼによる切断の後のルシフェラーゼ活性に対する影響を検討するために、ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ（商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を行い、これらの部位にプロテアーゼ切断部位を挿入した。先ず、標準の手法を使用してルシフェラーゼ遺伝子を発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした。ｌｕｃ＋遺伝子（図７Ａで示すタンパク質配列をコードする）をＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＶ断片上でｐＳＰＬｕｃ＋から切り取り、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を埋めて平滑末端にした後にｐＲＳＥＴ−Ｂ内のＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの間にクローニングした。この構築物は、ルシフェラーゼアミノ酸配列をアミノ末端６Ｘヒスチジンタグと融合させる。
【０１４６】
ｌｕｃ＋のＰｒｏ２３３の後のｐＲＳＥＴ−Ｂ−ｌｕｃ＋にエンテロキナーゼプロテアーゼ切断部位（Ａｓｐ（４）Ｌｙｓ）を挿入するために、配列
【化８】
2011135892.tif 000011
のオリゴヌクレオチドを使用した。プラスミドテンプレートを先ず下記のように変性した。
【化９】
2011135892.tif 000012
この混合物を室温で５分間インキュベートし、次に２μｌの２Ｍ酢酸アンモニウム及び７５μｌの９５％エタノールを加え、得られた混合物を−２０℃で３０分間インキュベートした。次に混合物を最高速度の微量遠心機により４℃で５分間遠心分離した。ペレットを次に−２０℃の７０％エタノール１５０μｌを用いて洗浄し、２分間遠心分離にかけ、減圧下乾燥し、１００μｌのＴＥに溶かした。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを、変性させたテンプレートに以下の反応でアニールさせた：
１０μｌ  変性テンプレート（上記）
１μｌ  ２．９ｎｇ／μｌ上部鎖選択オリゴヌクレオチド（０．２５ｐｍｏｌｅ）
１μｌ  ２８ｎｇ／μｌ上記突然変異誘発性オリゴヌクレオチド（１．２５ｐｍｏｌｅ）
２μｌ  アニーリング  １０×緩衝液
６μｌ  Ｈ２Ｏ
２０μｌ
このアニーリング反応体を７５℃の水２００ｍｌを含んでいるビーカーに置き、次にその水の中で３７℃に冷却させた。次に以下の成分を添加した。
５μｌ  Ｈ２Ｏ
３μｌ  １０×合成緩衝液
１μｌ  ７．７  Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ
１μｌ  ３  Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ
３０μｌ
この反応体を３７℃で９０分間インキュベートし、その後ＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒ（商標）技術マニュアルで記載されているように反応体の５μｌをコンピテントなＢＭＨ  ７１−１８  ｍｕｔＳに形質転換した。その翌日、得られた培養物からプラスミドを調製してＪＭ１０９に再度形質転換した。得られた個々のコロニーを拾い、増殖させ、プラスミドを調製した。突然変異体のスクリーニングは、ＢａｎＩＩ及びＳｐｈＩでプラスミドを消化し、エチジウムブロミドで染色した６％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で生成物を電気泳動にかけることによって実施した。消化物は野生型遺伝子（ＷＴ）の場合は３６１ｂｐの断片を生じ、エンテロキナーゼ部位を含んでいる挿入突然変異体では３７６ｂｐの断片を生じる。このようにして特定された突然変異体は、次に配列決定をすることによって確認された。この実験では、７／８のクローンが所望の挿入を含んでいた。
【０１４７】
ＷＴ  ｌｕｃ＋遺伝子又はエンテロキナーゼ部位挿入をコードするプラスミドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。形質転換された培養物を３７℃で約０．５のＡ６００まで増殖させ、次に、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３７℃で更に３〜４時間増殖を継続させた。細胞を次にペレットにし、ＭａｇｎｅＨｉｓ樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用して酵素精製した。一般的には、２ｍｌの細胞を微量遠心機で２分間遠心分離にかけてペレットにした。ペレットは１００μｌのＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｗａｓｈ／Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液中で再懸濁し、次に、１０μｌの１０×ＭＬＲ（製品番号Ｖ５８３Ａ）を加えて細胞を溶解した。５μｌの１Ｕ／μｌ  ＲＱＩ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）及び３μｌの７Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｏｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を溶解細胞に加え、時々混合しながら氷上で１０分間インキュベーションした後、溶解物を４℃で５分間微量遠心機で回転させた。４０μｌのＭａｇｎｅＨｉｓ樹脂を上清に加え、次に、得られた混合物を時折混合しながら５分間室温でインキュベートした。樹脂は、次に磁場を加えることによって管壁の上で濃縮し、ＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｗａｓｈ／Ｂｉｎｄｉｎｇ緩衝液中で再懸濁及び磁化のサイクルを３回繰り返して洗浄した。タンパク質は、最後に、ｐＨ７．５の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の５００ｍＭイミダゾールの１００μｌで溶出した。この手順により、ＷＴ又は修飾されたタンパク質の約５μｇが得られた。
【０１４８】
修飾されたタンパク質はエンテロキナーゼ部位を取り込んだけれども、対応するプロテアーゼは酵素活性に影響を及ぼさず、またＰｒｏ２３３の後で変異タンパク質を切断することもなかった。ＷＴ及び変異タンパク質は、タンパク質からの６Ｘヒスチジンタグの除去を認めるアミノ末端の他のエンテロキナーゼ部位も含んでいた。ゲル分析は、両方のタンパク質でこの部位がエンテロキナーゼによって利用されることを示した。
【０１４９】
潜在的にエンテロキナーゼ部位の利用をより容易にするＧｌｙ（３）Ａｓｐ（４）ＬｙｓＧｌｙ（３）部位がＰｒｏ２３３の後に挿入されている、他の修飾されたタンパク質を調製した。突然変異誘発は、配列
【化１０】
2011135892.tif 000013
を有する突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを利用して上のように実施した。
【０１５０】
消化反応は次の通りに組み立てた。
【表３】
2011135892.tif 000014
エンテロキナーゼ（ＥＫＭａｘ）及びその１０×緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。反応体は室温でインキュベートし、１５分時及び３０分時に反応体の１μｌを１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）に加えた。各試料は、次にＴｕｒｎｅｒ２０／２０照度計で読み取った。
これからは、以下のデータが得られた：
【表４】
2011135892.tif 000015
Ｇｌｙ（３）Ａｓｐ（４）ＬｙｓＧｌｙ（３）部位を有する修飾されたタンパク質をエンテロキナーゼで処理すると、ルシフェラーゼ活性は５０〜１００％増加することがわかった（図７Ｂ）。対照的に、エンテロキナーゼはＷＴ酵素の活性に対して影響を及ぼさなかった。したがって、修飾されたルシフェラーゼ骨格のニッキングは、酵素活性を破壊しなかった。さらに、挿入断片のアミノ酸配列は修飾されたタンパク質に対してプロテアーゼによるニッキングにより軽減されるストレスを起こすこともあり、その結果酵素活性が増加する。
【０１５１】
エンテロキナーゼ部位、即ちＰｒｏＧｌｙＰｒｏＧｌｙ（３）Ａｓｐ（４）ＬｙｓＧｌｙ（３）ＰｒｏＧｌｙＰｒｏを含んでいるより大きな挿入断片を、Ｌｕｃ＋のＰｒｏ２３３の後に挿入した。タンパク質に対する捻り応力を更に高めるためにＰｒｏＧｌｙＰｒｏが含まれた。この挿入を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、  
【化１１】
2011135892.tif 000016
であった。ｐＲＳＥＴ−Ｂ−Ｌｕｃ＋を開始プラスミドとして使用することより、上のように突然変異誘発を実施した。この場合、得られた突然変異体プラスミドは、ウサギ網状赤血球（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで、以下のような反応で翻訳した；
【表５】
2011135892.tif 000017
反応体は、３０℃で１時間インキュベートしてから、下の通りエンテロキナーゼ（ＥＫＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した：
【表６】
2011135892.tif 000018
エンテロキナーゼを加える前に、次にプロテアーゼ添加後の様々な時間に室温で、１００μｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＡＲ）で１μｌを分析した。得られたデータは、図７Ｃで示す。ＷＴ酵素の活性はプロテアーゼの影響を受けなかったが、修飾された酵素はプロテアーゼ処理で不活性化された。
【０１５２】
ＬＵＣ＋のＬｙｓ５４１の後へのエンテロキナーゼ部位の挿入の影響も、測定した。この場合、前記したようにオリゴヌクレオチド
【化１２】
2011135892.tif 000019
をｐＲＳＥＴ−Ｂ−ｌｕｃ＋プラスミド及びＧｅｎｅＥｄｉｔｏｒキットと使用して、カルボキシル末端から９番目のアミノ酸であるＬｙｓ５４１の後にエンテロキナーゼ部位を導入した。突然変異体プラスミドは、上述のそれらと類似の反応で対照のＷＴと共に転写及び翻訳し、その後エンテロキナーゼで消化した（図７Ｄ）。エンテロキナーゼによる修飾された酵素の処理はその活性を約７５％減らしたが、ＷＴ酵素の活性は変化しなかった。
【実施例５】
【０１５３】
欠失及び異種挿入を有する修飾されたホタルルシフェラーゼ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏプロテアーゼアッセイで有用なルシフェラーゼチモーゲンを調製するために、また、特定のタンパク質分解、例えばアポトーシスによって引き起こされるかそれに依存する細胞事象を監視する際に、Ｌｙｓ５４１（５５０のアミノ酸のうち）の後に挿入された９のアミノ酸を有するホタルルシフェラーゼ突然変異体を構築した。この９つのアミノ酸は５残基のエンテロキナーゼプロテアーゼ部位をコードし、その後に２つのグリシン、次に（ＤＤＤＤＫＧＧＤＩ；配列番号５８）をクローニングするためのＥｃｏＲＶ部位をコードする２つのアミノ酸が続いた。ベクターは、遺伝子の３’末端の外側に、クローニング部位として使用されたＥｃｏＲＩ部位も有していた。この塩基構築物によって特定されたタンパク質がエンテロキナーゼで切断されると、カルボキシ末端の９アミノ酸が除去され、約１０％のＷＴ酵素活性を有する酵素が生成された。大腸菌ＤＮＡのＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩ断片のライブラリーを、基礎ベクター内のこれらの部位の間にクローニングした。１００コロニーを選んでルシフェラーゼ活性を分析した。７コロニーは、ＷＴと比較して活性が１００〜１０００倍低下していることがわかった。これらの７コロニーを培養してプラスミドを調製した。プラスミドは、それぞれ大きさが約０．２から３ｋｂの大腸菌ＤＮＡの挿入断片を含むことがわかった。これらのプラスミドをＴＮＴウサギ網状赤血球溶解物内で翻訳すると、分子量のより高いルシフェラーゼをコードすることがわかった。タンパク質の１つのエンテロキナーゼ切断により、ルシフェラーゼ活性が最大で４０倍増加することがわかった。最大の活性化を示す修飾されたタンパク質は分子量が約６８ｋＤであり、約６０の残基がルシフェラーゼに追加されてチモーゲンを形成していることを示している。
【実施例６】
【０１５４】
環状置換されている修飾されたホタルルシフェラーゼ
Ｐｌａｉｎｋｕｍら（２００３年）は、新しいＮ及びＣ末端及び元のＮ及びＣ末端を連結するプロテアーゼ認識部位を含んでいるペプチドリンカーを有するリボヌクレアーゼＡの環状置換形態は、活性部位の位置的閉塞のためにリボヌクレアーゼ活性が低下したことを報告した。Ｐｌａｉｎｋｕｍらは、プロテアーゼによる環状置換リボヌクレアーゼＡの切断は、恐らく活性部位の障害を除去することによってタンパク質の活性を増加させることを明らかにした。
【０１５５】
ルシフェラーゼの場合、Ｎ及びＣ末端は約４０オングストローム離れており、その距離は５〜６のアミノ酸に相当する。ペプチド鎖でルシフェラーゼのＮ及びＣ末端を連結することは、タンパク質のカルボキシル末端ドメインによって形成された「リッド」ドメインの閉鎖を阻止することによって、その活性を崩壊させる可能性がある。したがって、ホタルルシフェラーゼｌｕｃ＋遺伝子の頭−尾結合二量体を構築した。ＰＣＲプライマーは、増幅された上流側プライマーがＡｓｐ（２３４）から始まり、増幅された下流側プライマーがＰｒｏ（２３３）から始まるように設計された。上流側プライマーはＡｓｐ（２３４）の直前にメチオニンのＡＴＧコドンを含み、下流側プライマーは終止コドンを含んでいた。元のＣ及びＮ末端の間の終止コドンを除去してこれらの末端をプロテアーゼ認識部位をコードする配列で連結するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を使用した。得られたＰＣＲ産物をクローニングするために、上流側及び下流側の両方のプライマーは制限酵素部位もコードしていた。
【０１５６】
方法
頭−尾結合（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）ｌｕｃ＋二量体は、次のように構築した。ベクターｐＳＰＬｕｃ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）をＮｃｏＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して末端を埋め、平滑末端線状化ベクターはＥｃｏＲＩで消化した。受容媒体の役目を果たすために、ｐＳＰＬｕｃ＋はＸｂａＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して末端を埋め、次にＥｃｏＲＩで消化した。第１の消化物からのルシフェラーゼ断片をこのベクターにクローニングし、同じベクター内の２つのｌｕｃ＋遺伝子の頭−尾結合配列を得た。具体的には、ｐＳＰＬｕｃ＋は次のような反応で消化した。
【化１３】
2011135892.tif 000020
反応体は、３７℃で１時間インキュベートし、６５℃で１５分間加熱してから氷上で短時間冷却した。次に、５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ及び１μｌの９Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を加えて、反応体を３７℃で２０分間インキュベートした。Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用して反応体を精製した。Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ樹脂からの５０μｌにおける６５℃での溶出の後、混合物を冷却し、ＤＮＡは５μｌの１０×緩衝液Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）及び１μｌの１２Ｕ／μｌ  ＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を加えることによって消化した。反応体は、３７℃で１時間インキュベートし、次に６５℃で１５分間加熱した。受容ベクターは、次に以下のように調製した。
【化１４】
2011135892.tif 000021
上の反応体を３７℃で１時間インキュベートし、次にＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを使用して精製し、溶出は６５℃の５０μｌ中で行った。以下を精製したＤＮＡに加えた。
【化１５】
2011135892.tif 000022
反応体は、３７℃で２０分間インキュベートし、次に上で述べたように精製した。５μｌの１０×緩衝液Ｈ及び１μｌの１２Ｕ／μｌ  ＥｃｏＲＩを、Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ樹脂からの溶出液に加えた。反応体は、３７℃で１時間インキュベートし、次に６５℃で１５分間加熱して制限酵素を不活性化した。このＤＮＡを次に下の通り上記の消化したＤＮＡと混合した：
１５μｌ  ＸｂａＩ切断、埋める、ＥｃｏＲＩ切断、ｐＳＰＬｕｃ＋加熱
２５μｌ  ＮｃｏＩ切断、埋める、ＥｃｏＲＩ切断、ｐＳＰＬｕｃ＋加熱
５μｌ  １０×リガーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）
２μｌ  ３Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ
１６℃で一晩のライゲーションの後、１μｌを高効率コンピテント大腸菌ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）に形質転換し、細胞をＬＢ／ａｍｐプレートに平板培養した。正しい大きさのプラスミドを含んでいる形質転換体を特定した。それらの形質転換体を展開し、そこからプラスミドを単離し、制限酵素消化によってプラスミドの同一性を確認した。
【０１５７】
新しいＮ末端がＡｓｐ（２３４）に、新しいＣ末端がＰｒｏ（２３３）にある置換されたルシフェラーゼのＰＣＲ増幅のために、上で構築された頭−尾結合二量体Ｌｕｃ＋ＤＮＡをテンプレートとして使用した。この増幅で使用されたプライマーは、下記配列を有した。
上流側プライマー
【化１６】
2011135892.tif 000023
下流側プライマー
【化１７】
2011135892.tif 000024
増幅反応は、次の通りであった。
５μｌ  １０×ＰｆｕＵｌｔｒａ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
１μｌ  ５ｎｇ／μｌ  上のＬｕｃ＋二量体構築物ＤＮＡ
１μｌ  １００ｎｇ／μｌ  上流側プライマー
１μｌ  １００ｎｇ／μｌ  下流側プライマー
４０μｌ  Ｈ２Ｏ
４９μｌ
反応体を混合し、鉱油を重層し、９５℃のＰＥ４８０サーマルサイクラーに入れた。この温度で２分後に、１μｌの２．５Ｕ／μｌ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加え、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２０回繰り返し、その後ブロックを４℃にした。完了した反応体は次にＰｒｏｍｅｇａのＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓキットを使用して精製し、Ｗｉｚａｒｄ樹脂から５０μｌのＨ２Ｏで溶出した。生成物に取り込まれたＰＣＲプライマーは、ＮｄｅＩ（上流側プライマー）又はＢａｍＨＩ（下流側プライマー）のための部位を有する。ＰＣＲ産物をこれらの酵素で消化し、下の通りＴ７発現ベクターｐＥＴ−３ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。
【表７】
2011135892.tif 000025
【０１５８】
上の反応体を３７℃で１時間インキュベートし、次にそれぞれＰｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐキットを使用して精製し、ＤＮＡの溶出は５０μｌのＴＥ中で６５℃で行った。２つの精製されたＤＮＡを混合し、下の通り連結した。
５μｌ  １０×リガーゼ緩衝液
２０μｌ  溶出１
１０μｌ  溶出２
２μｌ  ３Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ
１３μｌ  Ｈ２Ｏ
５０μｌ
ライゲーション反応体を１６℃で２時間インキュベートし、次に５μｌをコンピテントなＪＭ１０９に形質転換し、細胞をＬＢ／ａｍｐに平板培養した。適当な大きさのプラスミドを含んでいるコロニーを展開し、プラスミドを調製し、正しく挿入されているかについて各調製物を制限消化により確認した。プラスミドはＰＣＲ産物の挿入を含んでいるのがわかったので、これは、終止コドンが除かれ２つのルシフェラーゼ遺伝子部分を分けている接合部でＣ及びＮ末端を連結している、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発のための基礎ベクターとして使用した。
【０１５９】
最初の突然変異誘発は、Ａｓｐ（４）Ｌｙｓのカルボキシル末端側を切断するプロテアーゼエンテロキナーゼの認識部位を含んでいる突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを利用し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．からのＧｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒキットを使用して実施した。このオリゴヌクレオチドは、下記配列を有していた。
【化１８】
2011135892.tif 000026
突然変異誘発手順の第２回目の形質転換からの６コロニーを個々に増殖させて、それらからプラスミドを調製した。これらのプラスミドは、ＴｎＴウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）内での共役転写／翻訳による突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの取り込みについてスクリーニングした。正しい突然変異体は、ルシフェラーゼドメインのＣ及びＮ末端が融合し、完全長ルシフェラーゼタンパク質を生成した。翻訳反応は、次のように実施した。
２５μｌ  ＴｎＴウサギ網状赤血球溶解物
２μｌ  ＴｎＴ反応緩衝液
１μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
１μｌ  完全アミノ酸配合
１μｌ  Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｔ  Ｌｙｓ  ｔＲＮＡ
１μｌ  ４０Ｕ／μｌ  ｒＲＮａｓｉｎ
５μｌ  ミニプレップＤＮＡ
１４μｌ
５０μｌ
翻訳反応体は、３０℃で６０分間インキュベートしてから、下の通りエンテロキナーゼ（ＥＫ）（ＥＫＭａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した（又は処理しなかった）。
２μｌ  １０×ＥＫＭａｘ緩衝液
５μｌ  上の翻訳反応体
＋／−１μｌ  １Ｕ／μｌ  ＥＫＭａｘ
１２μｌ  Ｈ２Ｏ
２０μｌ
これらの消化は室温で３０分間行われ、その後１μｌを１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）に加えて検定した。データ収集は、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０照度計で行った。５μｌの４×ＳＤＳ試料緩衝液を各反応体の残りに加え、試料を６５℃で２分間加熱した。次に試料を４〜２０％Ｎｏｖｅｘトリス−グリシンゲルで電気泳動にかけ、ゲルは高感度のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒでスキャンした。結果は、融合した完全長タンパク質は６クローンの内の２つで形成されたことを示し、突然変異誘発が成功したことを示した。さらに、融合した変異タンパク質の活性は、エンテロキナーゼによる処理で約１５０倍増加した。さらに、ゲルは、プロテアーゼが完全長タンパク質を消化して断片化したことを示した。
【０１６０】
蛍光リジン誘導体の取り込みによって標識されていない突然変異体ルシフェラーゼの活性に及ぼすＥＫ処理の影響を検討するために、翻訳反応を上記のように実施したが、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｔ  Ｌｙｓ  ｔＲＮＡは反応から省略された。この場合、ＥＫで酵素を処理するとルシフェラーゼ活性の約９０倍の活性化が観察された（図７）。活性化の後、変異酵素はＷＴ活性の約０．５％を回復した。
【０１６１】
２つのルシフェラーゼドメインの間にカスパーゼ−３  ＤＥＶＤ切断部位を挿入するために、他の突然変異誘発を実施した。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒキットは、以下の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと使用された。
【化１９】
2011135892.tif 000027
【０１６２】
この場合、所望の突然変異体は５／８クローンで見られ、これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によってスクリーニングした。カスパーゼ−３による活性化倍率は、エンテロキナーゼで以前に観察された活性化倍率より高いことが明らかになった。また、切断によって回復された活性の割合も高くなっていた。
【０１６３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳は、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＴｎＴウサギ網状赤血球溶解物を使用して、カスパーゼ−３  ＤＥＶＤ切断部位を含んでいる置換されたルシフェラーゼをコードするプラスミド又はＷＴルシフェラーゼを含んでいる反応で実施した。これらの反応体の一部を次にカスパーゼ−３（１００単位、ＢｉｏＭｏｌ）で消化し、図９〜１１で示すデータが生成された。ＷＴ酵素の活性はプロテアーゼの影響を受けなかった。対照的に、変異酵素の活性はカスパーゼ−３による処理で大きく増加した。活性化倍率はこの場合約５００倍であり、活性化された酵素の活性はＷＴの活性の約１７％であった。
【０１６４】
置換された酵素のカスパーゼ−３活性を検出する能力も、発光プロテアーゼアッセイで検討した。カスパーゼ反応は以下のように実施した。
１０μｌ  ２×カスパーゼ緩衝液
５μｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳タンパク質
１μｌ  希釈カスパーゼ−３
４μｌ  Ｈ２Ｏ
２０μｌ
反応体は９．６から２３３３ｐｇのカスパーゼ−３を含み、これらは室温で９０分間インキュベートし、その後１μｌを取り出して１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬に加え、Ｔｕｒｎｅｒ  ２０／２０照度計で読み取った。図９Ａは、得られたデータを示す。プロテアーゼの低量点を再プロットすると（図９Ｂ）、このアッセイで低ピコグラムのカスパーゼ−３を検出することができることが示される。さらに、インキュベーション時間を９０分から一晩に長くすると、アッセイの感度は更に４倍高まった（データは示さず）。
【０１６５】
置換されたルシフェラーゼの合成及び活性化も、ＴｎＴ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）で検討した。反応には以下が含まれた。
２５μｌ  ＴｎＴ  Ｔ７  ＷＧ抽出物
２μｌ  ＴｎＴ反応緩衝液
１μｌ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
１μｌ  アミノ酸配合
１μｌ  ４０Ｕ／μｌ  ｒＲＮａｓｉｎ
５μｌ  ５０ｎｇ／μｌルシフェラーゼプラスミド
１５μｌ  Ｈ２Ｏ
５０μｌ
反応体は３０℃で９０分間インキュベートした後、以下の通りプロテアーゼで消化した。
１０μｌ  ２×緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセリン、２０ｍＭ  ＤＴＴ）
１０μｌ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応体
１μｌ  １Ｕ／μｌ  ＥＫＭａｘ又は１μｌ  １００Ｕ／μｌ  カスパーゼ−３
【０１６６】
プロテアーゼ消化物は室温でインキュベートし、その後様々な時間で１μｌを１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬に加え、Ｔｕｒｎｅｒ  ２０／２０照度計で読み取った。この実験で、カスパーゼ−３は置換カスパーゼ−ルシフェラーゼの活性をＷＴのそれの約４分の１まで約３０００倍高め、ＥＫはＥＫ−ルシフェラーゼの活性をＷＴの約１．１％まで約３００倍高めた（図８及び１１）。一例ではＤＥＶＤＧ、他ではＤＤＤＤＧで、両方の挿入断片は同じ大きさである点に注意する。したがって、ルシフェラーゼの３つのＮ末端アミノ酸及び６つのＣ末端アミノ酸を元のタンパク質の末端からそれぞれ置換することによって、より長い配列が取り込まれる可能性がある。このことは、少なくとも１４〜１５のアミノ酸部位が２つのルシフェラーゼドメインの間に取り込まれるのを可能にするはずである。上で言及した９つの残基は対応する結晶構造に現れず、したがって非常に柔軟であり、酵素活性に悪影響を及ぼさずに置換することが可能な点に注意する。
【実施例７】
【０１６７】
追加の環状置換構築物
Ａ．ＰＳＡは、配列Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ（配列番号２１）内のＧｌｎ及びＳｅｒの間でＳｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ  Ｉを切断するプロテアーゼである。ＰＳＡの切断基質を有する修飾されたルシフェラーゼを生成するために、関連する１２量体ペプチドＡｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ（配列番号２２）のオリゴヌクレオチドを、実施例６で記載したプラスミド構築物内のＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ部位の間にクローニングした。以下の配列
【化２０】
2011135892.tif 000028
を有するオリゴヌクレオチドを、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。
【化２１】
2011135892.tif 000029
ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドはＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ適合末端を有する二本鎖断片を生成するが、ＮｃｏＩ部位は改造されているのに対してＸｈｏＩ部位は破壊されている。ベクターをＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化してアニールしたオリゴヌクレオチドに連結し、次に大腸菌に形質転換した。ミニプレップＤＮＡを個々のコロニーから調製し、プロテアーゼ部位を含んでいるオリゴヌクレオチドの取り込みを示す、ＸｈｏＩではなくＮｃｏＩによる消化についてプラスミドをスクリーニングした。所望の構築物はコムギ胚（ＷＧ）翻訳抽出物又はウサギ網状赤血球溶解物内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳し、得られたタンパク質は精製ＰＳＡ（シグマ）で処理した。翻訳を実施した。開裂反応は以下の通り実施した。
【表８】
2011135892.tif 000030
反応体は室温で２０分又は４０分間インキュベートした。各反応の１μｌを１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬（ＬＡＲ）に加え、光出力をＴｕｒｎｅｒ２０／０照度計で記録した。下記データを得た。
【表９】
2011135892.tif 000031
ＰＳＡの添加は、光出力の実質的な増加をもたらした。２０分時には、修飾されたルシフェラーゼの活性化倍率はウサギ網状赤血球溶解物内で合成された修飾されたルシフェラーゼの場合は６５８倍であり、コムギ胚抽出物で合成された修飾されたルシフェラーゼの場合は１，１１０倍であった。
【０１６８】
Ｂ．ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼは、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）及びライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で構成される融合タンパク質である。このプロテアーゼは、配列Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号２５）内のＧｌｎ及びＧｌｙ残基の間で切断することができる。この配列を規定しているオリゴヌクレオチドが設計され、下記配列（トップストランド）
【化２２】
2011135892.tif 000032
を有していた。これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングはＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ適合末端を有する二本鎖断片を生成し、ＸｈｏＩ部位は保持されているのに対してＮｃｏＩ部位は破壊されている。上記の例の場合のように、アニールされたオリゴヌクレオチドは、ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで切断されたベクターにクローニングされた。所望のクローンの濃縮のために、形質転換の前にライゲーション混合体をＮｃｏＩで再切断した。所望のプラスミドを選択して、前記したようにウサギ網状赤血球溶解物内でｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行った。消化反応体は、以下の通り調製した。
【表１０】
2011135892.tif 000033
反応体は室温でインキュベートし、その後様々な時間で１μｌを１００μｌのＬＡＲに加え、試料をＴｕｒｎｅｒ  ２０／２０照度計で読み取った。以下のデータが生成された。
【表１１】
2011135892.tif 000034
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによるルシフェラーゼの活性化は速やかに起こり、プロテアーゼの存在下で４，０００倍を超える発光の増加をもたらした。
【０１６９】
Ｃ．真核細胞が含まれない溶解物内で合成された置換されたルシフェラーゼのタンパク分解性処理によって高度な活性化が観察されたが、非融合タンパク質が大腸菌で合成されたときの活性化の程度は非常に小さかった。面白いことに、大腸菌調製物の部分精製は、プロテアーゼによって活性化される能力の高くなったタンパク質をもたらした。細菌細胞から環状置換されたルシフェラーゼを有効に精製するために、ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）内でカスパーゼ−３部位を有する環状置換されたルシフェラーゼがＧＳＴに融合されているベクターを調製した。ＰＣＲ反応体は以下を含んでいた。
５μｌ  １０×ＰｆｕＵｌｔｒａ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
１μｌ  ５ｎｇ／μｌカスパーゼ−３部位プラスミド
１μｌ  １００ｎｇ／μｌ  上流側オリゴヌクレオチド
１μｌ  １００ｎｇ／μｌ  下流側オリゴヌクレオチド
４０μｌ  Ｈ２Ｏ
５０μｌ
１μｌの２．５μ／μｌ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加えてＰＣＲを開始し、９５℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２０回繰り返し、その後４℃にした。
【０１７０】
上流側オリゴヌクレオチドはＢａｍＨ１を含み、下記配列を有し
【化２３】
2011135892.tif 000035
下流側オリゴヌクレオチドはＥｃｏＲＩ部位を含み、下記配列を有す
【化２４】
2011135892.tif 000036
得られたＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ１で消化し、ベクター内のこれらの部位の間にクローニングすると、ＧＳＴとルシフェラーゼとのインフレーム融合がもたらされる。所望のプラスミドを特定し、大腸菌系統Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。細胞をＬＢ培地で増殖させ、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加することによって誘導した。最良の増殖条件は２５〜２６℃で一晩の誘導であることが明らかになった。細胞を収集して超音波処理で溶解した。遠心分離による清浄の後、上清を固定化グルタチオンを含んでいるカラムに加え、遊離のグルタチオンを含んでいる緩衝液で溶出した。融合タンパク質の収率は、初期の培養物１リットルにつき約１ミリグラムであった。カスパーゼ−３による活性化は、活性化反応の条件に従い約１，２００倍以上で、最高５０，０００倍（氷上で一晩の活性化）であった。
【０１７１】
Ｄ．ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位ＴＳＡＶＬＱＳＧＦＲ（配列番号１９）を含んでいる３つの環状置換されたルシフェラーゼを生成した。２つはコメツキムシのルシフェラーゼ（ＣＰ１：Ｒ＝Ａｓｎ４０１及びＣＰ２：Ｒ＝Ａｒｇ２２３）で１つはホタルルシフェラーゼ（ＣＰ：Ｒ＝Ａｓｐ２３４）のものである。ＣＰ２は、ホタルルシフェラーゼの位置２３４と対応するコメツキムシルシフェラーゼの位置に挿入を有する。
【０１７２】
ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位を有する環状置換されたコメツキムシルシフェラーゼは、次のように構築された。先に述べたようにＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位の間に挿入突然変異体ｃｂｇ６９ＳＡＲＳ３遺伝子を、及びＳｎａＢＩ及びＳａｌＩの間にＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位をコードする配列を含んでいるプラスミドｐＪＬＣ３３を開始ベクターとして使用した。以下のプライマーセットを使用して、野生型ｃｂｇ６９を含んでいるｐＪＬＣ１からＰＣＲ断片を増幅した。
【化２５】
2011135892.tif 000037
【０１７３】
ＣＰ１−ａ（又はＣＰ２−ａ）のＰＣＲ産物をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＪＬＣ３３のそれぞれの部位にクローニングし、ｐＪＬＣ−ｃｐ１ａ（又はｐＪＬＣ−ｃｐ２ａ）を得た。ＣＰ１−ｂ（又はＣＰ２−ｂ）のＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＳｎａＢＩで消化し、ｐＪＬＣ−ｃｐ１ａ（又はｐＪＬＣ−ｃｐ２ａ）のそれぞれの部位にクローニングした。得られたプラスミドｐＪＬＣ４７（又はｐＪＬＣ４８）は、ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位を有するコメツキムシルシフェラーゼの環状置換された突然変異体１（又は２）を含む。
【０１７４】
置換されたホタルルシフェラーゼについては、置換されたベクターは、元のＮ及びＣ末端のためにＤＮＡを分離しているＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ部位を有するリンカーを取り込むように修飾した。このリンカーは、
【化２６】
2011135892.tif 000038
であり、これは第１のドメインのＣ末端から６アミノ酸を除去し、第２のドメインのＮ末端から３アミノ酸を除去する。ＳＡＲＳウイルスＮ末端の自己切断部位は、ＳＩＴＳＡＶＬＱＳＧＦＲＫＭＡ（配列番号５３）である。この配列を規定しているオリゴヌクレオチドは、次のように設計された。
【化２７】
2011135892.tif 000039
アニールされたオリゴヌクレオチドはＮｃｏＩ部位を保持し、ＸｈｏＩ部位を欠く。アニールされ消化されたオリゴヌクレオチドは、上記したように基礎ベクターにクローニングした。
【０１７５】
ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼ部位を有する３つの環状置換されたルシフェラーゼＣｂｇ６９ＣＰ１、Ｃｂｇ６９ＣＰ２及びＦｆＣＰの全ては、ウサギ網状赤血球溶解物及び／又はコムギ胚抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して生成した。ＳＡＲＳウイルスプロテアーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓからのｐＭＡＬ精製系を使用して部分的に精製した。変異ルシフェラーゼを含んでいる溶解物をＳＡＲＳウイルスプロテアーゼと混合して、ルシフェラーゼ活性を監視した。約０．３μｇのＳＡＲＳウイルスプロテアーゼとの室温で１時間のインキュベーションの後、Ｃｂｇ６９ＣＰ２及びＦｆＣＰはそれぞれ２０〜３０倍及び６０〜２００倍に活性化された（図１２）が、Ｃｂｇ６９ＣＰ１は活性化されなかった（データは示さず）。
【０１７６】
Ｅ．活性カスパーゼ−３を生成するためのプロカスパーゼ−３の活性化は、生細胞におけるアポトーシス誘導の代理である。修飾されたルシフェラーゼが細胞内のアポトーシスを監視するために使用することができるかどうか確認するために、カスパーゼ−３切断部位を含んでいる環状置換されたルシフェラーゼをＣＭＶプロモーターの制御下の哺乳類発現ベクターにクローニングし、一過性形質移入を通してＨｅｌａ細胞に導入した。細胞を次にタンパク質ＴＲＡＩＬで処理し、死受容体の活性化を通してアポトーシスを誘発して活性カスパーゼ−８を形成し、これは次にプロカスパーゼ−３を活性化してカスパーゼ−３にする。したがって、活性カスパーゼ−３の出現は、ルシフェラーゼ基質が切断されて酵素によって活性化されるに従い、発光の増加を伴うはずである。
【０１７７】
カスパーゼ−３切断部位を含んでいる置換されたルシフェラーゼのＰＣＲ断片は、ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩのための部位を含んでいるプライマーを使用して作製され、ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のこれらの部位の間にクローニングした。増幅は、上記したように下記上流側プライマーを用いて実施した。
【化２８】
2011135892.tif 000040
得られた構築物は、一般式ＡＮＮＡＴＧＧの最適コザック配列を有していた。ＤＮＡは、ＴｒａｎｓＦａｓｔ形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＨｅｌａ細胞に形質移入し、ＤＭＥＭ＋１０％Ｃｏｓｍｉｃ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ中の１μｇ／μｌのＴＲＡＩＬタンパク質（Ｂｉｏｍｏｌ）を加えることによりアポトーシスを開始した。一部のウェルを、初期ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーの制御下の天然のホタルルシフェラーゼ遺伝子（非置換）を運ぶプラスミドｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌで形質移入した。示された時間に１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬をウェルに加え、Ｏｒｉｏｎ照度計（０．５秒の読取り）で発光を記録した。
【表１２】
2011135892.tif 000041
【０１７８】
図１３のデータは、置換されたルシフェラーゼ−カスパーゼ−３プラスミドを受け取る細胞では、発光がなくなってから１〜２時間の間にＴＲＡＩＬタンパク質が発光活性を誘導することを示す。この影響は、培地だけを含んでいるウェルでは見られない。ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを含んでいるウェルは、培地単独と培地＋ＴＲＡＩＬとの間で相違を示さなかった。培地を変えたときに見られるＬＵの全般的増加の原因はタンパク合成の誘導である可能性があり、ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌではルシフェラーゼは活性型であるが、ｐＣＩ−ｎｅｏ−カスパーゼプラスミドではルシフェラーゼは不活性型である。形質移入のストレスによる死細胞バックグラウンドが観察されているので、この培地単独の場合に見られる小さな増加の原因は、アッセイの全過程にわたる死細胞の蓄積にあるかもしれない。
【実施例８】
【０１７９】
修飾されたルシフェラーゼによる細胞ベースのアッセイ
分子内制御をコードし、カスパーゼ−３活性を検出するベクターを提供するために、本発明の融合タンパク質をコードするベクターを調製した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（対照）を、残基４００の後にＤＥＶＤを含んでいる修飾されたコメツキムシルシフェラーゼ（Ｃｂｇ６９ＤＥＶＤ）のＮ末端又はＣ末端に融合した。リンカー配列（Ｇｌｙ（２）ＳｅｒＧｌｙ（４）ＳｅｒＧｌｙ（４）ＳｅｒＧｌｙ（２））を２つのタンパク質の間に置いた。
【０１８０】
ｒＬｕｃ−リンカー−Ｃｂｇ６９ＤＥＶＤ融合を作製するために、一対のオリゴヌクレオチド
【化２９】
2011135892.tif 000042
を使用してプラスミドｐＪＬＣ６から完全長Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子（ｒＬｕｃ）を増幅した。得られたＰＣＲ断片をＮｄｅＩ及びＡｓｅＩで消化して、Ｃｂｇ６９ＤＥＶＤをコードするｐＪＬＣ２３のＮｄｅＩ部位にクローニングした。
【０１８１】
Ｃｂｇ６９ＤＥＶＤ−リンカー−ｒＬｕｃ融合を作製するために、一対のオリゴヌクレオチド
【化３０】
2011135892.tif 000043
を使用してプラスミドｐＪＬＣ２３から完全長Ｃｂｇ６９ＤＥＶＤ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ断片をＮｄｅＩ及びＡｓｅＩで消化して、ｒＬｕｃを含んでいるｐＪＬＣ６のＮｄｅＩ部位にクローニングした。
【０１８２】
図１４は、各融合タンパク質がＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ並びにコメツキムシルシフェラーゼの活性を有していたことを示す。
【実施例９】
【０１８３】
結合して機能性ルシフェラーゼを形成するルシフェラーゼ断片の能力の評価
一実施形態では、本発明は、ルシフェラーゼの２つの独立した断片が互いに相補して機能性タンパク質を生成することのできる系を提供する。
【０１８４】
材料及び方法
ルシフェラーゼのＮ及びＣ末端の断片の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで結合して機能性ルシフェラーゼタンパク質を形成する能力を評価するために、３つの構築物が設計された（図１５）。ホタルルシフェラーゼ遺伝子のＮ末端の６９９ヌクレオチド（アミノ酸１〜２３３）を、順方向プライマー
【化３１】
2011135892.tif 000044
及び逆方向プライマー
【化３２】
2011135892.tif 000045
を使用して以下の条件でｐＳＰ−ｌｕｃ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）から増幅した。パーキンエルマー２４００サーマルサイクラーを使用して、９５℃で２分間、１サイクルが９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で２分間を２５サイクル、その後７２℃で１０分間。ＮｈｅＩ制限部位は順方向プライマーの５’末端へ導入し、ＢａｍＨＩ制限部位は逆方向プライマーの５’末端へ導入した。得られたＮ末端ルシフェラーゼ断片は次に確立された技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）を使用してｐＢＩＮＤベクターのＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位にクローニングし、発現ベクターｐＪＬＣ６２（ｎ  ｌｕｃ）を得た。
【０１８５】
同様に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子のＣ末端の９５１ヌクレオチド（アミノ酸２３４〜５５０）を、順方向プライマー
【化３３】
2011135892.tif 000046
及び逆方向プライマー５’ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＴＴＧ３’（配列番号６３）を使用して、Ｎ末端のクローニングについて前記したのと同じＰＣＲ条件下でｐＳＰ−ｌｕｃ＋から増幅した。ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位はＮ末端プライマーについて前記したようにプライマーに導入し、Ｃ末端のルシフェラーゼ断片はｐＢＩＮＤベクターのＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩにクローニングして発現ベクターｐＪＬＣ６３（ｃ  ｌｕｃ）を得た。
【０１８６】
ルシフェラーゼ遺伝子全体（１６５０ヌクレオチド、５５０アミノ酸）を、順方向プライマー
【化３４】
2011135892.tif 000047
及び、逆方向プライマー
【化３５】
2011135892.tif 000048
を使用し、また上記同じＰＣＲ条件を使用してＮ及びＣ末端クローンで使用されたのと同じ方法でｐＢＩＮＤベクターにクローニングした。得られた発現ベクターｐＪＬＣ６４（完全長ＦＦ）をタンパク質相補性実験のための対照として使用した。
【０１８７】
全ての構築物は、メーカーのプロトコルに従ってＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＳｙｓｔｅｍをＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と一緒に使用して、正しいタンパク質の大きさについて検証した。
【０１８８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質相補性試験は、メーカーのプロトコルに従ってＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＳｙｓｔｅｍをＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と一緒に使用して実施した。翻訳の後、各試料の２μｌを１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬に加え、Ｖｅｒｉｔａｓ照度計を使用して発光を測定した。
【０１８９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ相補性試験は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及び２９３のヒト胎生期腎臓組織培養細胞で実施した。ＣＨＯ又は２９３の細胞のいずれかの組織培養細胞を６穴の組織培養プレートに播種し、３７℃で一晩、５％ＣＯ２で増殖させ、翌日８０％のコンフルエンシーで形質移入した。形質移入は、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してメーカーの推奨に従って実施した。つまり、対照反応では、各形質移入の最終濃度が２μｇの全ＤＮＡとなるように、ｐＪＬＣ６２、ｐＪＬＣ６３又はｐＪＬＣ６４のいずれかの１μｇを１μｇのｐＢＩＮＤ対照プラスミド（ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含まない元のベクター）で形質移入した（３μｌ  ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）試薬／μｇ  ＤＮＡ）。タンパク質相補性試験については、１μｇのｐＪＬＣ６２及び１μｇのｐＪＬＣ６３を同じプロトコルに従って形質移入した。形質移入後２４時間時に、細胞をトリプシン処理して各形質移入条件のために２群に分けた。２５０μｌの１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＬＢ）を１つの群に加え、２５０μｌの１リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を他の群に加えた。ＰＬＢ群は組織培養細胞の溶解を確実にするために−８０℃の凍結融解で１回処理し、ＰＢＳ群は凍結融解をしなかったので非溶解細胞が維持された。全ての群からの発光は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  （登録商標）レポーターアッセイシステムを使用し、メーカーの推奨に従って測定した。基本的には、各群からの２０μｌを３反復の白の９６穴プレートに加え、Ｖｅｒｉｔａｓ照度計でアッセイを実施した。全てのホタルルシフェラーゼデータは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼシグナルに正規化した。
【０１９０】
結果
図１５で示す３つの構築物の全ては、正しい大きさのタンパク質を与えた（図１６Ａ）。本明細書で先に記載したプロテアーゼ切断後の環状置換ホタルルシフェラーゼの活性化は、ルシフェラーゼの断片が酵素活性を相補し且つ再構成することができることを示唆した。図１６Ｂ（同じＴｎＴ反応におけるルシフェラーゼのＮ及びＣ断片）で見られるように、Ｎ及びＣ末端のルシフェラーゼ断片のｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質相補性は、完全長ルシフェラーゼタンパク質と比較して機能性タンパク質を与えた。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質相補性は、ＣＨＯ及び２９３組織培養細胞の両方で起こった（図１７）。たとえ組織培養細胞が溶解しなかった場合でも類似の傾向が見られた（ＰＢＳ；データは示さず）。
【実施例１０】
【０１９１】
モジュレーター系におけるルシフェラーゼ融合タンパク質の非共有結合的結合の検出
一実施形態では、本発明は、２つの部分の結合を誘発又は強化、或いは抑制する外因性因子（エフェクターＡ）、及び任意選択に前記２つの部分の結合をそれぞれ解離又は強化する他の外因性因子（エフェクターＢ）を有するモジュレーター系を提供する。例えば、そのような系は、ルシフェラーゼに融合されたＦＫＢＰ及びＦＲＢの結合の誘導物質としてラパマイシンを、また結合の解離物質としてＦＫ５０６を使用することができる。
【０１９２】
Ａ．ルシフェラーゼモジュレーター系を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
材料及び方法
ヒトコドン最適化ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ２．０）を、順方向プライマー
【化３６】
2011135892.tif 000049
及び逆方向プライマー
【化３７】
2011135892.tif 000050
を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により以下の条件でｐＧＬ４．１０（ｌｕｃ２）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（配列番号６６）から増幅した：９５℃で２分間、次に１サイクルが９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で２分間のものを２５サイクル、７２℃で１０分間の最終展開。ルシフェラーゼタンパク質とのＮ末端融合の生成を容易にするために、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶ制限酵素部位を順方向プライマーの５’末端に導入した。ルシフェラーゼタンパク質とのＣ末端融合の生成を容易にするために、ＳｎａＢＩ、ＮｏｔＩ及びＳａｃＩ制限酵素部位を逆方向プライマーの５’に導入した。５’及び３’末端上の更なるクローニング部位を有する増幅されたルシフェラーゼ遺伝子をルシフェラーゼＴ７対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｔ  Ｎｏ＃Ｌ４８２１）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ部位にクローニングし、対照ベクターに通常存在するルシフェラーゼ遺伝子を置換した。得られたベクターは、ｐＪＬＣ６５と呼ばれた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現ルシフェラーゼＴ７対照ベクターへのクローニングの一般的スキームは、図１８で見ることができる。
【０１９３】
いくつかの発現構築物がｐＪＬＣ６５ベクターを使用して作製された；ホタルルシフェラーゼへのＦＲＢのＮ末端融合（ｐＪＬＣ６６）、ホタルルシフェラーゼへのＦＫＢＰのＣ末端融合（ｐＪＬＣ６７）及びホタルルシフェラーゼへのＦＲＢ（Ｎ末端）及びＦＫＢＰ（Ｃ末端）の二重融合（ｐＪＬＣ６８）。ＦＲＢは、
【化３８】
2011135892.tif 000051
の合成遺伝子を含んでいるＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎからのプラスミドから得られた。ＦＲＢは、５’末端のＮｃｏＩ制限酵素部位及び３’末端のＥｃｏＲＶ制限部位を使用してＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎベクターから切断され、公知の分子生物学的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）を使用してルシフェラーゼ遺伝子のＮ末端にクローニングした。
【０１９４】
ＦＫＢＰは、
【化３９】
2011135892.tif 000052
の合成遺伝子を含んでいるＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎからのプラスミドから得られた。ＦＫＢＰ断片がルシフェラーゼ遺伝子のＣ末端にクローニングされるように、ＦＫＢＰを遺伝子の５’末端のＳｎａＢＩ制限酵素部位及び３’末端のＮｏｔＩ制限酵素部位を使用してＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎベクターから切断した。二重融合は、ＦＲＢ及びＦＫＢＰをそれぞれＮ末端及びＣ末端に含んでいた。
【０１９５】
４つのルシフェラーゼ構築物は、メーカーのプロトコルに従ってＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＳｙｓｔｅｍをＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と一緒に使用して、発現されたタンパク質の正しい大きさについて評価した。簡潔には、４つの各反応において、１μｇの適当なＤＮＡをＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬｙｓ  ｔＲＮＡを含む５０μｌの反応体に加えた。各反応体（５μｌ）からの試料を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）技術ガイド（バージョンＥ、ＩＭ−１００１）で記載されているように、１×ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液を使用して１０％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔ  Ｂｉｓ−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に流した。ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ  ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用してゲルを画像化した。
【０１９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイについては、上述の各ＴｎＴ（登録商標）反応からの５μｌを、０．２μＭラパマイシン（ＢｉｏＭｏｌ）を含んでいるか含まない９５μｌの１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に別々に加えた。ラパマイシンの添加の後、各試料からの１０μｌを１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬（ＴｎＴ（登録商標）システムを設置）に加え、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０照度計（Ｔｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して発光を測定した。
【０１９７】
ＦＲＢ及びＦＫＢＰの間の相互作用が調整することができるかどうか研究するために、ラパマイシンと競合して融合パートナー間の相互作用を抑制することが公知であるＦＫ５０６をｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で使用した。二重融合ＦＲＢ−ｌｕｃ２−ＦＫＢＰを先に述べたように転写及び翻訳した。翻訳の後、試料の４μｌを５μｌの２×ＦＬＩＣＥ緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ＣＨＡＰＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセリン、２０ｍＭ  ＤＴＴ）及び１μｌのラパマイシン（１０ｎＭ）、及び０、１、２、５、１０、２０及び４０ｎＭ（０、０．８２、１．６４、４．１、８．２、１６．４及び３２．８ｎｇ／ｍｌのタクロリムスに相当）の様々な濃度のＦＫ５０６（タクロリムス、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｐｌｕｓ．ｃｏｍ）と混合した。試料は室温で１５分間インキュベートし、その後試料の５μｌを１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬で希釈してＴｕｒｎｅｒ２０／２０照度計で発光を測定した。
【０１９８】
結果
下記４つの構築物を調製した：ｌｕｃ２（ホタルルシフェラーゼをコードする；５５０アミノ酸）、ＦＲＢ−ｌｕｃ２（ＦＲＢ及びホタルルシフェラーゼの融合をコードする；６４４アミノ酸）、ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ（ホタルルシフェラーゼ及びＦＫＢＰの融合をコードする；６５７アミノ酸）及びＦＲＢ−ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ（二重融合をコードする；７７１アミノ酸）。４つの構築物（３つは対照、１つは二重融合）は、ＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＳｙｓｔｅｍをＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍと一緒に使用して、発現されたタンパク質の正しい大きさについて評価した。４つの構築物の全ては、正しい大きさのタンパク質を与えた（図１９）。
【０１９９】
次に２つの融合パートナーＦＲＢ及びＦＫＢＰの間の相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で検出するために、これらの構築物を実験で使用した。誘導物質ラパマイシンの存在下で、２つの融合パートナーが結合して発光は減少するはずである。対照反応と比較して、ラパマイシンの添加により二重融合ＦＲＢ−ｌｕｃ２−ＦＫＢＰでは相対発光は２０倍減少した（図２０Ａ）。したがって、ラパマイシンの存在下では、ルシフェラーゼとの二重融合における２つの結合パートナーは結合し、それによってルシフェラーゼ酵素を制限し、その結果酵素はルシフェリン基質と有効に相互作用することができなくなった。逆に、ＦＫ５０６の添加量が増加すると、二重融合反応の発光はＦＫ５０６の増加の量に応じて増加した（図２０Ｂ）。
【０２００】
Ｂ．他のルシフェラーゼモジュレーター系
材料及び方法
クローニングは、以下の例外を除いて先に述べたように実施した。赤色コメツキムシ遺伝子（ｃｂｒ）は、順方向プライマー
【化４０】
2011135892.tif 000053
及び、逆方向プライマー
【化４１】
2011135892.tif 000054
を使用してｐＣＢＲ−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から増幅した。ＥｃｏＲＶ部位を順方向プライマーの５’末端に、ＢｇｌＩＩを逆方向プライマーの５’末端に導入し、その後、対応する増幅された断片をｐＪＬＣ６８の対応する部位にクローニングした。緑色コメツキムシ遺伝子（ｃｂｇ）は、順方向プライマー
【化４２】
2011135892.tif 000055
及び、逆方向プライマー
【化４３】
2011135892.tif 000056
を使用してｐＣＢＧ６８−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から増幅した。赤色コメツキムシでｐＪＬＣ６８ベクターにクローニングしたのと同じ制限部位をこれらのプライマーに導入した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子（Ｒｌｕｃ）は、順方向プライマー
【化４４】
2011135892.tif 000057
及び、逆方向プライマー
【化４５】
2011135892.tif 000058
を使用してｐｈＲＬ−ｎｕｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から増幅した。ｐＪＬＣ６８ベクターのＥｃｏＲＶ（ＳｎａＢＩとの平滑末端ライゲーション）及びＢｇｌＩＩ上でクローニングするために、ＳｎａＢＩ部位を順方向プライマーの５’末端に、ＢｇｌＩＩ部位を逆方向プライマーの５’末端に導入した。ｐＪＬＣ６８へのｃｂｇ、ｃｂｒ及びＲｌｕｃのクローニングは、ＦＲＢ−ルシフェラーゼ−ＦＫＢＰ型の二重融合をもたらした。正しいタンパク質の大きさについてクローンを検証した（図２１Ａ）。先に述べたように二重融合を転写及び翻訳し、発光を測定したが、例外として、ラパマイシンの実験では０．２μＭのラパマイシンだけが使用された。
【０２０１】
結果
ホタルルシフェラーゼタンパク質で見られたＦＲＢ及びＦＫＢＰ系の類似した調整が他の種類のルシフェラーゼでも見られるかどうかを決定するために、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈａｌａｍからの赤及び緑の２つの修飾されたコメツキムシ遺伝子、並びにＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのルシフェラーゼ遺伝子で置換した。ｐＪＬＣ６８へのｃｂｇ、ｃｂｒ及びＲｌｕｃのクローニングは、ＦＲＢ−ルシフェラーゼ−ＦＫＢＰの二重融合をもたらした。正しいタンパク質の大きさについてクローンを検証した（図２１Ａ）。先に述べたように二重融合を転写及び翻訳し、発光を測定した。
【０２０２】
図２１Ｂで見られるように、緑及び赤のコメツキムシ二重融合は、ラパマイシンが存在したときは対照（Ｌｕｃ２）と比較して同じ相対効果を示した。発光はラパマイシンに応じて減少したが、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼはラパマイシンに反応しなかった。
【０２０３】
Ｃ．ルシフェラーゼモジュレーター系のｉｎ  ｖｉｖｏ証明
実施例Ｘ．ＡからのｐＪＬＣ６８をテンプレートとして使用して、ＦＲＢのルシフェラーゼとのＮ末端融合（ＦＲＢ−Ｌｕｃ２）の断片、ルシフェラーゼのＦＫＢＰとのＣ末端融合（Ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ）、又は二重融合（ＦＲＢ−Ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ）を、９５℃で２分間、続いて１サイクルが９５℃で３０秒、５０℃で３０秒間及び７２℃で２分間のものを２５サイクル、また７２℃で１０分間の最終展開からなるＰＣＲプログラムに従って増幅した。増幅のための全ての順方向プライマーはプライマーの５’末端にＮｈｅＩ制限酵素を含むように設計され、全ての逆方向プライマーはプライマーの５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を含むように設計され、それによりｐＢＩＮＤベクターへのクローニングのための５’末端がＮｈｅＩ部位及び３’末端のＢａｍＨＩ部位と連なる増幅断片が形成された。増幅のためのプライマーは、次の通りである：
Ｌｕｃ２：
順方向プライマー：
【化４６】
2011135892.tif 000059
逆方向プライマー：
【化４７】
2011135892.tif 000060
ＦＲＢ−Ｌｕｃ２：
順方向プライマー：
【化４８】
2011135892.tif 000061
逆方向プライマー：
【化４９】
2011135892.tif 000062
Ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ：
順方向プライマー；
【化５０】
2011135892.tif 000063
逆方向プライマー；
【化５１】
2011135892.tif 000064
ＦＲＰ−Ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ：
順方向プライマー：
【化５２】
2011135892.tif 000065
逆方向プライマー：
【化５３】
2011135892.tif 000066
【０２０４】
ｐｈＲＬ−ＴＫベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＴＫプロモーター及びベクター骨格の供与源として使用して（図２２Ａ）、ベクターで見られるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを除去してｐＢＩＮＤ−ＦＲＢ−Ｌｕｃ２−ＦＫＢＰから増幅したＦＲＢ−Ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ配列で置換し、断片の５’末端にＮｈｅＩ制限酵素を、断片の３’末端にＸｂａＩ部位を生成した。確立された分子生物学的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）を使用して、以下のプライマーで以降のｐｈＲＬ−ＴＫベクターへの挿入のための生成物を生成した。ＴＫ  ＦＲＰ−Ｌｕｃ２−ＦＫＢＰ；
順方向プライマー：
【化５４】
2011135892.tif 000067
逆方向プライマー
【化５５】
2011135892.tif 000068
【０２０５】
ラパマイシンへのＦＲＢ−ＦＫＢＰ相互作用のｉｎ  ｖｉｖｏ反応を、Ｄ２９３細胞（ｃＡＭＰ刺激に対する反応の増加のために以前に選択された親ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３  ＨＥＫ２９３細胞の下位集団）を使用して研究した。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ実験について、形質移入の前にＤ２９３細胞を９６穴組織培養プレート上に５，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃及び１０％のＣＯ２で少なくとも８時間インキュベートした。プロトコルで記載されているように、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）ＬＴ１形質移入試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用し、９６穴プレートの１ウェルにつき０．１μｇＤＮＡ／０．３μｌ形質移入試薬の濃度を使用して、ｐＢＩＮＤ構築物及びＴＫ二重融合構築物をＤ２９３細胞に形質移入した。形質移入の約２４時間後に（図２４〜２５）、１０μｌの５０ｍＭルシフェリンＥＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、無エンドトキシン）を各ウェルに加え、少なくとも１５分間細胞を平衡化させた。初期の発光読取値を各試料（時間は０分）から測定し、次に、ＯｐｔｉＭＥＭ組織培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈した０．２μＭラパマイシン原液の１０μｌをラパマイシン試験ウェルに加え、対照ウェルにはラパマイシンを加えなかった。ラパマイシンの添加後、またラパマイシンの添加の後最高で１時間までの約１５分ごとにプレートを読み取った。図２４で示すデータについては、反応体に０〜５０μＭの範囲でＦＫ５０６を滴定すると、ラパマイシン濃度は１μＭであった。Ｖｅｒｉｔａｓ照度計を使用して発光を直接測定した。
【０２０６】
結果
ＦＲＢ−ルシフェラーゼ−ＦＫＢＰのラパマイシンを介した調整は、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された（図２３〜２５）。ＴＫ又はＣＭＶプロモーター系を使用して、発光シグナルのそれぞれ最高５倍及び２倍の減少が観察された。対照構築物はラパマイシンに反応を示さなかった（図２５Ｂ〜Ｄ）。さらに、ＦＫＢＰとの結合においてラパマイシンと競合するＦＫ５０６は、滴定可能な方法でラパマイシンの影響を打ち消す（図２４）。
【実施例１１】
【０２０７】
Ｃ末端調整ルシフェラーゼ融合系によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
一実施形態では、ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼのＮ又はＣ末端の融合によって調整することができる。例えば、カルモジュリンとのルシフェラーゼＣ末端の融合は、カルモジュリンを調整する剤によって調整される。
【０２０８】
材料及び方法
ヒトカルモジュリン遺伝子（ＣａＭ）は、順方向プライマー
【化５６】
2011135892.tif 000069
及び、逆方向プライマー
【化５７】
2011135892.tif 000070
を使用して、下記プログラムに従ってベクターｐＯＴＢ７（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｇｌｏｂａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＭＧＣ−１４４７）から増幅した：９５℃で５分間、次に１サイクルが９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で１分間１０秒を２０サイクル。ＳｎａＢＩ部位は順方向プライマーの５’末端へ導入し、ＸｈｏＩ部位は逆方向プライマーの５’末端へ導入した。ＣａＭ遺伝子はＬｕｃ２遺伝子（先に述べたように）をＳｎａＢＩ／ＸｈｏＩ部位に有するルシフェラーゼＴ７対照ベクターのＣ末端へクローニングして、Ｌｕｃ２−ＣａＭ融合構築物を作製した。融合タンパク質は、ＴｎＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を使用してメーカーのプロトコルに従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた。発光は、Ｔｕｒｎｅｒ２０／２０照度計で測定した。
【０２０９】
結合したＣａＭタンパク質によるルシフェラーゼタンパク質の調整を検定するために、ＥＧＴＡ及びＣａＣｌ２を順番にｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｌｕｃ２−ＣａＭ融合タンパク質溶解物に加えた。最初に、ＴｎＴ（登録商標）反応からのＬｕｃ２−ＣａＭ溶解物の１μｌを１００μｌのルシフェラーゼ検定用試薬（ＬＡＲ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）に加え、混合物の２５μｌを使用してＥＧＴＡ及びＣａＣｌ２の添加前のベースライン発光を確定した。最初の発光を測定した後、１μｌの７５ｍＭ  ＥＧＴＡ溶液（最終濃度３ｍＭ）を溶解物／ＬＡＲに加えて発光を測定した。一旦ＥＧＴＡの添加に応じた発光を測定した後、１μｌの１００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液を溶解物／ＬＡＲに加えて発光を測定した。したがって、Ｌｕｃ２−ＣａＭ融合構築物の発光測定が３つある；１）ＥＧＴＡ又はＣａ＋２を添加しないベースライン、２）ＥＧＴＡの添加の後、及び３）Ｃａ＋２の添加の後。
【０２１０】
結果
カルモジュリンタンパク質はカルシウムに応じて構造が大きく変化し、それによりＣ末端の融合を通してルシフェラーゼ活性を調整する他の可能性を提供する。ＥＧＴＡ又はＣａ＋２が存在しない場合、ＣａＭはルシフェラーゼ及びその基質の間の相互作用を制限する（図２７、「試料」）。しかし、ＥＧＴＡの添加後、この制限は解放され（図２７、「ＥＧＴＡ」）、発光は約９倍増加する。この発光増加は、Ｃａ＋２の添加によって逆転される（図２７、「ＣａＣｌ２」）。したがって、ＣａＭの高次構造は、Ｌｕｃ２−ＣａＭ融合におけるルシフェラーゼ活性に影響を及ぼすようであった。
【０２１１】
（参考文献）
2011135892.tif 000071
【０２１２】
全ての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書で組み込まれている。以上の明細書において、本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載され、多くの詳細が例示目的のために述べられているが、本発明に更なる実施形態を加えることが可能なこと、また本明細書の詳細の一部は本発明の基本原理から逸脱することなくかなりの程度変更することが可能なことは、当業者にとって明らかであろう。
【図１】
2011135892.tif 000072
【図２】
2011135892.tif 000073
【図３】
2011135892.tif 000074
【図４】
2011135892.tif 000075
【図５Ａ】
2011135892.tif 000076
【図５Ｂ】
2011135892.tif 000077
【図５Ｃ】
2011135892.tif 000078
【図６Ａ】
2011135892.tif 000079
【図６Ｂ】
2011135892.tif 000080
【図６Ｃ】
2011135892.tif 000081
【図７Ａ】
2011135892.tif 000082
【図７Ｂ】
2011135892.tif 000083
【図７Ｃ】
2011135892.tif 000084
【図７Ｄ】
2011135892.tif 000085
【図８】
2011135892.tif 000086
【図９】
2011135892.tif 000087
【図１０Ａ】
2011135892.tif 000088
【図１０Ｂ】
2011135892.tif 000089
【図１１】
2011135892.tif 000090
【図１２】
2011135892.tif 000091
【図１３】
2011135892.tif 000092
【図１４】
2011135892.tif 000093
【図１５】
2011135892.tif 000094
【図１６Ａ】
2011135892.tif 000095
【図１６Ｂ】
2011135892.tif 000096
【図１７】
2011135892.tif 000097
【図１８】
2011135892.tif 000098
【図１９】
2011135892.tif 000099
【図２０Ａ】
2011135892.tif 000100
【図２０Ｂ】
2011135892.tif 000101
【図２１Ａ】
2011135892.tif 000102
【図２１Ｂ】
2011135892.tif 000103
【図２２】
2011135892.tif 000104
【図２３】
2011135892.tif 000105
【図２４】
2011135892.tif 000106
【図２５Ａ】
2011135892.tif 000107
【図２５Ｂ】
2011135892.tif 000108
【図２５Ｃ】
2011135892.tif 000109
【図２５Ｄ】
2011135892.tif 000110
【図２６】
2011135892.tif 000111
【配列表】
2011135892000001.app