(57)【要約】【課題】ＰＨＢ２が結合するタンパク質を新たに同定することによって、脂肪分化の調節機序を解明し、これに基づいて、脂肪分化調節剤の新規なスクリーニング方法、並びに新規な脂肪分化調節剤を提供すること。【解決手段】プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を促進又は阻害する被験物質を選択することを含む、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの複合体の形成の調節剤のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を調節する物質を含む、脂肪分化調節剤。
【請求項２】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体を含む、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）活性調節剤。
【請求項３】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体を含む、脂肪分化調節剤。
【請求項４】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体。
【請求項５】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を促進又は阻害する被験物質を選択することを含む、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの複合体の形成の調節剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）のコアクチベーター活性の抑制を調節する被験物質を選択することを含む、脂肪分化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の転写活性の抑制を調節する被験物質を選択することを含む、脂肪分化調節剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を調節する物質を含む、脂肪分化調節剤に関する。さらに本発明は、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）がパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）に結合することに基づいた薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロヒビチン（以下、ＰＨＢとも表記する）は、細胞増殖抑制因子として最初に哺乳動物で単離された。ＰＨＢは酵母から哺乳動物に至るまで高度に保存されたタンパク質である。ＰＨＢタンパク質には、アミノ酸の一次構造が類似した２種類のタンパク質ＰＨＢ１及びＰＨＢ２が存在し、互いに複合体を形成し、ミトコンドリアの内膜に局在することが知られている。酵母ＰＨＢタンパク質に関しては、細胞周期制御や新規に合成されたミトコンドリアタンパク質の安定化を担うシャペロン様の機能を果たすことが明らかにされている。また、線虫では、ＰＨＢ１の老化や初期発生への関与が報告されている。一方、哺乳動物では、ＰＨＢ１及びＰＨＢ２による転写制御等の多様な機能が示唆されている。
【０００３】
特許文献１では、エストロゲンレセプター（ER）の発現調節レプレッサーとして働く物質として、ＰＨＢ２の相同タンパク質であるrepressor of estrogen receptor activity (REA)が同定され、エストロゲンレセプター（ER）とREAとの相互作用による発現調節を操作する物質のスクリーニング方法が記載されている。
【０００４】
特許文献２では、ＰＨＢ２がエストロゲンレセプター（ER）存在下でエストラジオール（Ｅ２）依存的にミトコンドリアから核内に移動し、ＥＲαなどの核レセプターを発現している細胞においてＰＨＢ２遺伝子調節剤をスクリーニングする方法が記載されている。特許文献２の実施例１３ではＰＨＢ２タンパク質の転写抑制活性の検討が記載されている。具体的には、ＨｅＬａ細胞に、ＥＲＥ−Ｌｕｃ遺伝子、各々発現ベクターに挿入したＥＲα遺伝子、ＰＨＢ−２遺伝子、ＰＧＣ−１α遺伝子を導入し、さらにコントロールとしてＣＭＶプロモーターを持つウミシイタケルシフェラーゼを同時に導入し、これを内部コントロールとしてルシフェラーゼ活性を測定したことが記載されている。また、特許文献２の図１４には、各遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞における相対的ルシフェラーゼ活性した測定の結果が示されている。特許文献２の実施例１３には、ＥＲα遺伝子及びＥＲαのコアクチベーターであるＰＧＣ−１α遺伝子をＨｅＬａ細胞に導入すると、転写活性が増強し、特にＥ２存在下では転写活性がさらに増強したこと、これにＰＨＢ２タンパク質を共発現させると、転写活性の抑制効果が検出できたことから、ＰＨＢ２タンパク質はＥＲαのコアクチベーターであるＰＧＣ−１αタンパク質の転写調節に抑制的に働くことが記載されている。上記の通り、特許文献２には、ＰＨＢ２タンパク質はＰＧＣ−１αタンパク質の転写調節に抑制的に働くことが教示されているものの、ＰＨＢ２タンパク質がどのような作用機構によってＰＧＣ−１αタンパク質の転写調節に抑制的に働くことについては何ら教示がない。即ち、特許文献２には、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとが相互作用又は結合するとことについては何ら示唆されていない。なお、転写は、一般的には非常に複雑な機構により制御されているため、仮にあるタンパク質が別のタンパク質の転写調節に抑制的に働くことが明らかになったとしても、そのような転写調節の抑制がどのような作用機構によってなされるかについては更なる解析を行う必要がある。従って、転写調節を抑制するという事実が判明したとしても、当該タンパク質同士が直接相互作用したり、直接結合しているということを予測させるものではない。
【０００５】
非特許文献１では、REAノックアウトマウスでREAの発現量が半減し、有意な体重増加を示したことから、REAが肥満に関連していることが示されている。一方、非特許文献２では、ＰＰＡＲγノックアウトマウスで、ＰＰＡＲγによる転写される遺伝子の発現低下により、脂肪細胞の増加が抑制されることが記載されている。また、非特許文献３では、ＰＰＡＲγのアンタゴニストにより活性を抑制することで肥満を改善できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／２６２３２号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００７／０６１０２２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Molecular Cellular Biology, Vol.25, No.5, pp1989-1999(2005)
【非特許文献２】J Biol Chem, Vol.276, No.44, pp41245-41254 (2001)
【非特許文献３】J Clin Invest, Vol.108, No.7, pp1001-1013 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エストロゲンの生理作用は、性、メタボリックシンドローム、骨粗鬆症に関係することが報告されている。特に、エストロゲンの分泌が低下する閉経後女性の肥満は明らかである。また、エストロゲンを合成できない男性患者においても、脂肪肝などのメタボリックシンドロームが顕著である。しかし、それらの作用機序は明らかではない。また、ＰＨＢ２がエストロゲンレセプター存在下においてエストラジオール依存的にミトコンドリアと核をシャトルすること、核内においてエストロゲンレセプター活性を抑制することが知られているが、ＰＨＢ２の核における相互作用タンパク質は、エストロゲンレセプター以外にはあまり明らかにされていない。さらに、エストロゲンレセプターの転写調節作用のみでは、肥満抑制を説明することはできない。
【０００９】
本発明は、ＰＨＢ２が結合するタンパク質を新たに同定することによって、脂肪分化の調節機序を解明し、これに基づいて、新規な脂肪分化調節剤、並びに脂肪分化調節剤の新規なスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、ＰＨＢ２の核における相互作用タンパク質が、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）であることを同定した。そして、本発明者らは、脂肪分化を促進する作用を有する転写因子ＰＰＡＲγの活性が、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの結合を介して抑制されるかどうかを検討した結果、ＰＨＢ２はＰＧＣ１αと直接結合し、その結果、ＰＰＡＲγの転写活性が抑制されることを明らかにした。さらに、本発明者らは、脂肪前駆細胞においてミトコンドリアに内在するＰＨＢ２をエストラジオールが核へ移行させること、またエストラジオールが脂肪前駆細胞の脂肪分化を抑制することを明らかにした。さらに本発明者らは、エストラジオール非存在下においても核に局在するＰＨＢ２変異体が、脂肪前駆細胞の脂肪分化を抑制することを明らかにした。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を調節する物質を含む、脂肪分化調節剤。
（２）  プロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体を含む、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）活性調節剤。
（３）  プロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体を含む、脂肪分化調節剤。
（４）  プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体。
（５）  プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を促進又は阻害する被験物質を選択することを含む、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの複合体の形成の調節剤のスクリーニング方法。
（６）  プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）のコアクチベーター活性の抑制を調節する被験物質を選択することを含む、脂肪分化調節剤のスクリーニング方法。
（７）  プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の転写活性の抑制を調節する被験物質を選択することを含む、脂肪分化調節剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、脂肪分化調節剤のスクリーニング方法を提供することができる。さらに本発明によれば、脂肪分化調節剤、並びにパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）活性調節剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Aは、3T3-L1細胞を脂肪細胞に分化させるための培地を示す。図１Bは、分化誘導後０日目と7日目の細胞を示す。図１Cは、分化誘導後0、2、4、7、9日目の細胞における分化マーカーであるPPARγおよびaP2（FABP4）の遺伝子発現をRT-PCRで調べた結果を示す。図１Dは、3T3-L1細胞は内在性にエストロゲンレセプターα（ERα）およびPPARγコアクチベータ１α（PGC1α）を発現することを3T3-L1細胞から抽出したRNAを用いたRT-PCRで確認した結果を示す。図１E は、3T3-L1細胞の分化培地に17βエストラジオール(E2)およびE2阻害剤であるICI 182,780（ICI）を添加し、分化への影響をadipogenesis assayで測定した結果を示す。図１Fは、免疫染色可能な抗PHB2抗体を用いて細胞免疫染色を行った結果を示す。
【図２】図2Aは、PPAR反応性エレメント（PPRE）をチミジンキナーゼ（TK）プロモータの上流に有するルシフェラーゼ(luciferase)レポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)を用いて、PHB2によるPPARγの転写活性の抑制を調べた結果を示す。図2B は、GAL4-DBDとPGC1αの融合タンパク質（DBD-PGC1α）を作製し、GAL4の認識配列であるUAS (upstream activator sequence) 配列を上流に有するルシフェラーゼレポーター遺伝子（GAL4-Luc）を用いて、転写活性解析を行った結果を示す。図2C は、GST-PHB2とPGC1α-mycを試験管内で混和した後、グルタチオンビーズでGST-PHB2複合体を精製し、抗myc抗体を用いてウエスタンブロットを行うことにより、このGST-PHB2複合体中にPGC1α-mycが存在するか否かを検討した結果を示す。図２Dは、DBD-PGC1αとPHB2のカルボキシル末端にFLAGタグを付加した融合タンパク質（PHB2-FLAG）をHeLa細胞に共発現させた細胞抽出液を調整し、抗DBD抗体を用いて免疫沈降実験を行った結果を示す。図２Eは、DBD-PGC1α(1-600)とPHB2-FLAGをHeLa細胞に共発現させた細胞抽出液を、抗FLAG抗体で免疫沈降実験を行った結果を示す。
【図３】図３Aは、エストロゲンによる内在性PHB２のミトコンドリアから核への移行が、ERαに依存するか否かを調べた結果を示す。図３Bは、E2投与による内在性PHB2の核への移行が、PPARγやPGC1αの活性を調節するかを検討した結果を示す。図３Cは、DBD-PGC1αとGAL4-Lucに、ERαを共発現させた実験における、E2存在下でDBD-PGC1αの転写活性の抑制を調べた結果を示す。
【図４】図４A は、PHB2野生型とFLAGタグとの融合体（PHB2-FLAG）と、PHB2CとFLAGタグの融合体（PHB2C-FLAG）を3T3-L1細胞に導入し、抗FLAG抗体による細胞免疫染色を行った結果を示す。図４Bは、レンチウイルスで、GFP、PHB2、PHB2C、PGC1αを導入した3T3-L1細胞を用いて脂肪分化誘導を行い、adipogenesis assayを行った結果を示す。図４Cは、分化後7日目の細胞からRNAを抽出し、定量PCRにて、遺伝子発現量を測定した結果を示す。
【図５】図５Aは、生後10週の卵巣摘出したC57BL6J雌マウスをE2含有飼料またはE2不含飼料にて飼育し、体重の経時変化を比較した結果を示す。図５Bは、60日間飼育後のマウスを解剖後に子宮重量を計測した結果を示す。図５Cは、60日間飼育後のマウスをX線CTを用いて脛骨の海綿骨密度を計測した結果を示す。図５Dは、CTによる内臓脂肪（VAT）、皮下脂肪（SAT）量を計測した結果を示す。図５Ｅは、各群のマウスを解剖後、卵巣周囲脂肪の組織切片を作成し、脂肪細胞の直径を比較した結果を示す。図５Ｆは、脂肪組織において、内在性PHB2の細胞内局在を組織免疫染色法にて確認した結果を示す。
【図６】図６は、PHB2の肥満抑制における分子メカニズムのモデルを示す。
【図７】図７Aは、PPARαとPGC1αの存在下において、PHB2によるPPRE-TK-Lucをレポーター遺伝子としたPPARαの転写活性の抑制を測定した結果を示す。図７Bは、ERαとPGC1αの存在下において、PHB2によるエストロゲン応答性エレメント（ERE）を有するレポーター遺伝子ERE-LucにおけるERαの転写活性の抑制を測定した結果を示す。図７Cは、PHB2の複数の欠失変異体を作製し、GAL4-DBD-PGC1αとGAL4-Lucを用いた系で、それらの活性を検討した結果を示す。
【図８】図８は、脂肪分化を促進する転写因子であるPPARγの転写活性に対する各種コアクチベータによる転写活性の促進を検討した結果、並びにこれらのコアクチベータ存在下でのPPARγの転写活性をPHB2が抑制するかを検討した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
（１）脂肪分化調節剤のスクリーニング方法
本発明においては、ＰＨＢ２の核における相互作用タンパク質が、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）であることが同定された。そして、ＰＨＢ２はＰＧＣ１αと直接結合し、ＰＰＡＲγの転写活性を抑制することを明らかにされた。さらに、脂肪前駆細胞においてミトコンドリアに内在するＰＨＢ２はエストラジオールにより核へ移行されること、またエストラジオールが脂肪前駆細胞の脂肪分化を抑制することが明らかにされた。さらに、エストラジオール非存在下においても核に局在するＰＨＢ２変異体が、脂肪前駆細胞の脂肪分化を抑制することも明らかにされた。
【００１５】
ヒトＰＨＢ２遺伝子は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿００７２７３としてＮＣＢＩに登録されている。ヒトＰＨＢ２タンパク質は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００９２０４としてＮＣＢＩに登録されている。ヒトＰＨＢ２遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示し、ヒトＰＨＢ２タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。ヒト以外の生物由来のＰＨＢ２遺伝子又はＰＨＢ２タンパク質としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来（ＰＨＢ２＿ＹＥＡＳＴ（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ５００８５））、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）由来（ＰＨＢ２＿ＣＡＥＥＬ（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｐ５００９３））、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来（ＡＴＰＨＢ２（ＰＲＯＨＩＢＩＴＩＮ ２）［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ］（ＮＣＢＩ登録番号 ＮＰ＿９７３７５５））、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来（ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ ２［Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ］（ＮＣＢＩ登録番号 ＮＰ＿００１０１６５５１））、マウス由来（ＰＨＢ２＿ＭＯＵＳＥ（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ０３５１２９））及びラット由来（ＰＨＢ２＿ＲＡＴ（ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｑ５ＸＩＨ７））のものが挙げられる。本発明では、ＰＨＢ２遺伝子には、上述した登録番号に記載の塩基配列から成るＤＮＡに限らず、これらＤＮＡにおいて、１又は複数（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列から成り、且つＰＨＢ２タンパク質機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。また、ＰＨＢ２遺伝子には、上述した登録番号に記載の塩基配列から成るＤＮＡに９０％以上、好ましくは９５％以上、９７％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つＰＨＢ２タンパク質機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。あるいは、上述した登録番号に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに限らず、これらアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つＰＨＢ２タンパク質機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもＰＨＢ２遺伝子に含まれる。
【００１６】
ヒトパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）遺伝子は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿０１３２６１としてＮＣＢＩに登録されている。ヒトＰＧＣ１αタンパク質は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０３７３９３ としてＮＣＢＩに登録されている。
パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）遺伝子は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿０１５８６９  としてＮＣＢＩに登録されている。ヒトＰＰＡＲγタンパク質は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０５６９５３としてＮＣＢＩに登録されている。
【００１７】
上記したＰＨＢ２に関して新たに見出された機能に基づいて、本発明を説明する。
【００１８】
本発明においては、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）がパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）と結合することが初めて同定された。即ち、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体は本発明により初めて同定されたものであり、本発明の範囲内に含まれる。
【００１９】
本発明では、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を促進又は阻害する被験物質を選択することによって、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの複合体の形成の調節剤をスクリーニングすることができる。即ち、本発明においては、被験物質の存在下においてプロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を分析し、上記複合体の形成を促進又は阻害する被験物質を、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの複合体の形成の調節剤として選択することができる。
【００２０】
さらに本発明によれば、被験物質の存在下において、（ａ）プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との結合、（ｂ）プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）のコアクチベーター活性の抑制、（ｃ）プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の転写活性の抑制、又は（ｄ）エストラジオールによるプロヒビチン２（ＰＨＢ２）の核への移行の何れかを測定し、上記（ａ）〜（ｄ）の何れかを変化させる被験物質を選択することによって脂肪分化調節剤をスクリーニング方法することができる。
【００２１】
本発明の一例では、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）のコアクチベーター活性の抑制を調節する被験物質を選択することによって脂肪分化調節剤をスクリーニングしてもよいし、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の転写活性の抑制を調節する被験物質を選択することによって脂肪分化調節剤をスクリーニングしてもよい。
【００２２】
本発明においては、（ａ）ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの結合、（ｂ）ＰＨＢ２によるＰＧＣ１αのコアクチベーター活性の抑制、（ｃ）ＰＨＢ２によるＰＰＡＲγの転写活性の抑制、又は（ｄ）エストラジオールによるＰＨＢ２の核への移行の何れか１以上を促進する物質は、脂肪分化抑制剤の候補物質として選択することができる。
【００２３】
反対に、（ａ）ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの結合、（ｂ）ＰＨＢ２によるＰＧＣ１αのコアクチベーター活性の抑制、（ｃ）ＰＨＢ２によるＰＰＡＲγの転写活性の抑制、又は（ｄ）エストラジオールによるＰＨＢ２の核への移行の何れか１以上を抑制する物質は、脂肪分化促進剤の候補物質として選択することができる。
【００２４】
上記スクリーニング方法は、無細胞系又は細胞系の何れでも行うことができる。無細胞系で行う場合には、例えば、被験物質の存在下及び非存在下において、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとを相互作用させて複合体を形成させ、被験物質の非存在下の場合と比較して、被験物質の存在下において、上記複合体の形成量に差が生じるような被験物質を、上記複合体の形成を促進又は阻害する物質として選択することができる。また、細胞系で行う場合には、例えば、ＰＨＢ２遺伝子発現細胞を用いることができる。ＰＨＢ２遺伝子を発現する細胞であればいずれのものでもよいが、例えばＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌由来）、Ｕ−２ＯＳ細胞（ヒト骨肉腫由来）及びヒト線維芽細胞等のヒト由来の細胞系、並びにＢ６．１細胞（マウスミエローマ由来）、マウス胚性幹細胞及びＳＷＩＳＳ ３Ｔ３細胞（マウス線維芽細胞由来）が挙げられる。あるいは、ＰＨＢ２遺伝子を導入した（又は過剰発現させた）細胞もＰＨＢ２遺伝子発現細胞に含まれる。例えば、ＰＣＲ産物やベクターに含まれるＰＨＢ２遺伝子を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等により細胞へ導入することができる。本発明においては、上記したＰＨＢ２遺伝子発現細胞に、さらにＰＧＣ１αを発現させた細胞を用いることができる。例えば、ＰＣＲ産物やベクターに含まれるＰＧＣ１α遺伝子を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いた方法等により細胞へ導入することができる。上記細胞において、ＰＨＢ２遺伝子及びＰＧＣ１α遺伝子が発現していることの確認方法としては、ｍＲＮＡレベルでは、例えばＰＨＢ２遺伝子及びＰＧＣ１α遺伝子に特異的なプライマーやプローブを用いたＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲやノーザンブロッティングによって確認する方法が挙げられる。また、タンパク質レベルでは、例えばＰＨＢ２タンパク質及びＰＧＣ１αタンパク質に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッテイング等の免疫学的方法を用いて、ＰＨＢ２遺伝子及びＰＧＣ１α遺伝子の発現を確認することができる。
【００２５】
本発明において用いることができる被験物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、合成化合物、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、植物抽出物、動物組織抽出物等が挙げられる。また、被験物質は、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーなどでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーを用いることもできる。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、（ａ）プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との結合、（ｂ）プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）のコアクチベーター活性の抑制、（ｃ）プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の転写活性の抑制、又は（ｄ）エストラジオールによるプロヒビチン２（ＰＨＢ２）の核への移行の何れかを指標として、被験物質のスクリーニングを行うことができる。
【００２７】
（ａ）：
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との結合を指標とする場合には、上記した通り、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を分析し、上記複合体の形成を促進又は阻害する被験物質が選択すればよい。
【００２８】
（ｂ）：
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）のコアクチベーター活性の抑制を指標とする場合には、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）を接触させるが、さらにこの系に、ＰＧＣ１αのコアクチベーター活性を測定できる測定系を含めておく。ＰＧＣ１αのコアクチベーター活性を測定できる測定系としては、PPAR反応性エレメント（PPRE）をチミジンキナーゼ（TK）プロモータの上流に有するルシフェラーゼ(luciferase)レポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)、PPARγ遺伝子、PHB2遺伝子及びPGC1αを共発現させた系、あるいはGAL4-DBDとPGC1αの融合タンパク質（DBD-PGC1α）と、GAL4の認識配列であるUAS (upstream activator sequence) 配列を上流に有するルシフェラーゼレポーター遺伝子（GAL4-Luc）と、PHB2遺伝子とを共発現させた系などを挙げることができる。上記した系において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現量を指標として、ＰＧＣ１αのコアクチベーター活性の抑制を測定することができる。
【００２９】
（ｃ）：
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）によるパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の転写活性の抑制を指標とする場合には、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）を接触させるが、さらにこの系に、ＰＰＡＲγの転写活性の抑制を測定できる測定系を含めておく。ＰＰＡＲγの転写活性の抑制を測定できる測定系としては、PPAR反応性エレメント（PPRE）をチミジンキナーゼ（TK）プロモータの上流に有するルシフェラーゼ(luciferase)レポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)、PPARγ遺伝子、PHB2遺伝子及びPGC1αを共発現させた系などを挙げることができる。上記した系において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現量を指標として、ＰＰＡＲγの転写活性の抑制を測定することができる。
【００３０】
（ｄ）：
エストラジオールによるプロヒビチン２（ＰＨＢ２）の核への移行を指標とする場合には、細胞内において、被験物質の存在下及び非存在下において、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）を接触させる。その後、細胞内におけるプロヒビチン２（ＰＨＢ２）の局在を、例えば、細胞免疫染色などにより分析することによりスクリーニングを行うことができる。
【００３１】
被験物質の非存在下の場合と比べて、被験物質の存在下において、上記指標が有意に変化した場合には、当該被験物質を、ＰＨＢ２活性調節剤、又は脂肪分化調節剤であると判定することができる。
【００３２】
なお、上記した本発明のスクリーニング方法により選択されるＰＨＢ２活性調節剤、又は脂肪分化調節剤も本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００３３】
（２）脂肪分化調節剤、及びＰＧＣ１α活性調節剤
本発明によれば、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を調節する物質を含む、脂肪分化調節剤が提供される。例えば、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの複合体の形成を促進する物質は、脂肪分化抑制剤として有用であり、ＰＨＢ２とＰＧＣ１αとの複合体の形成を抑制する物質は、脂肪分化促進剤として有用である。本発明で用いるプロヒビチン２（ＰＨＢ２）とパーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）との複合体の形成を調節する物質としては、上記した本発明のスクリーニング方法により選択される物質を用いることもできる。
【００３４】
さらに、本発明によれば、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体を含む、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）活性調節剤、並びにプロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体を含む、脂肪分化調節剤が提供される。
【００３５】
プロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体としては、プロヒビチン２（ＰＨＢ２）のアミノ酸配列のうちの一部のアミノ酸配列からなり、ＰＧＣ１α活性調節作用又は脂肪分化調節作用を有するタンパク質、「ＰＨＢ２」又は「ＰＨＢ２の部分断片」のアミノ酸配列において、１又は複数（例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、かつＰＧＣ１α活性調節作用又は脂肪分化調節作用を有するタンパク質を挙げることができる。本発明で用いるプロヒビチン２（ＰＨＢ２）の部分断片又は変異体は、好ましくは、エストラジオール非存在下においても核に局在化するタンパク質である。なお、所定のアミノ酸配列に所望のアミノ酸変異を導入する方法は当業者に公知であり、例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法など通常の遺伝子組み換え技術により、所望の変異を有するタンパク質は調製することができる。
【００３６】
パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）活性抑制剤及び脂肪分化阻害剤としては、ＰＨＢ２のアミノ酸配列からミコトンドリア局在化配列を除外したアミノ酸配列からなるＰＨＢ２の部分断片を用いることができる。一例としては、パーオキシゾーム増殖因子活性化受容体γ・コアクチベーター（ＰＧＣ１α）活性抑制剤及び脂肪分化阻害剤としては、ＰＨＢ２のアミノ酸番号５１−２９９、アミノ酸番号５１−１５０、又はアミノ酸番号２０１−２９９からなるＰＨＢ２の部分断片を用いることができる。また、ＰＧＣ１α活性促進剤及び脂肪分化促進剤としては、ＰＨＢ２のアミノ酸番号５１−２５０、アミノ酸番号５１−２００、又はアミノ酸番号１０１−２５０からなるＰＨＢ２の部分断片を用いることができる。
【００３７】
本発明のＰＧＣ１α活性調節剤及び脂肪分化調節剤は、ヒトを含む任意の哺乳動物に投与することができるが、好ましくはヒトに投与される。  本発明のＰＧＣ１α活性調節剤及び脂肪分化調節剤は、例えば、メタボリックシンドロームの改善又は治療、肥満の改善又は治療のために使用することができ、さらにＰＧＣ１α活性を調節することにより老化抑制のために使用したり、あるいは脂肪肝の改善又は治療のために使用することができる。
【００３８】
本発明のＰＧＣ１α活性調節剤及び脂肪分化調節剤の製剤形態は特に限定されず、経口投与又は非経口投与用の製剤形態の中から治療や予防の目的に最も適した適宜の形態のものを選択することが可能である。経口投与に適した製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤、チュアブル剤などを挙げることができ、非経口投与に適する製剤形態としては、例えば、注射剤（皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射など）、点滴剤、吸入剤、噴霧剤、坐剤、ゲル剤若しくは軟膏剤などの形態の経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤若しくはテープ剤などの形態の経皮吸収剤などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００３９】
経口投与に適当な液体製剤、例えば、溶液剤、乳剤、又はシロップ剤などは、水、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを用いて製造することができる。また、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などの固体製剤の製造には、乳糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いることができる。
【００４０】
非経口投与に適当な注射用又は点滴用の製剤は、好ましくは、受容者の血液と等張な滅菌水性媒体に有効成分である上記の物質を溶解又は懸濁状態で含んでいる。例えば、注射剤の場合、塩溶液、又は塩水と他の溶液との混合物からなる水性媒体などを用いて溶液を調製することができる。非経口投与用製剤には、グリコール類、油類、フレーバー類、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種又は２種以上の補助成分を添加することもできる。
【００４１】
本発明のＰＧＣ１α活性調節剤及び脂肪分化調節剤の投与量及び投与回数は、症状の種類や重篤度、投与形態、患者の年齢や体重などの条件、合併症の有無などの種々の要因により適宜設定することができるが、一般的には、有効成分の投与量として一日当たり１０μg／kgから１０mg／kg程度である。
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１
脂肪前駆細胞(3T3-L1細胞）は、脂肪細胞の分化研究に適した細胞系である。デキサメタゾン、IBMXやインスリンなどの薬剤を添加した分化培地を用いることにより、3T3-L1細胞は脂肪細胞に分化する(図１A)。誘導後7日ではoil red Oで赤く染色される中性脂肪を含んだ脂肪滴が細胞質に多く出現する(図１B)。
【００４４】
分化誘導後、0、2、4、7、９日に細胞を回収しRNAを抽出後、RT-PCRに供した。RT-PCRの実験条件は以下の通りである。
RT-PCRは、先ず１μｇのtotal RNAからSuperscriptIIを用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。次に、このcDNAを鋳型としてrTaq polymerase (TAKARA)を用いてPCRを行った。PCRのプライマーと条件は以下に示す通りである。
【００４５】
マウスPPARγ遺伝子に対しては、5'-AAG AGC TGA CCC AAT GGT TG-3' （配列番号３）および5'-TCC ATA GTG GAA GCC TGA TGC-3'（配列番号４）のプライマーを用い、94℃、30 sec、55℃、30 sec、74℃、1 min  の反応を30回行った。
【００４６】
adipocyte-specific fatty acid binding protein (aP2) 遺伝子に対しては、5'-ATG TGT GAT GCC TTT GTG GGA-3'（配列番号５）および  5'-TGC CCT TTC ATA AAC TCT TGT-3' （配列番号６）のプライマーを用い、94℃、30 sec、55℃、30 sec、74℃、1 min  の反応を20回行った。
【００４７】
マウスGAPDH 遺伝子の増幅には、5'-GCC CAT CAC CAT CTT CCA G-3' （配列番号７）および5'-TGA GCC CTT CCA CAA TGC C-3' （配列番号８）のプライマーを用い、94℃、30 sec、55℃、30 sec、74℃、1 min  の反応を25回行った。
【００４８】
また、マウスERα遺伝子の増幅には、5'-ACC GTG TCC TGG ACA AGA TC-3' （配列番号９）および5'-GTC ATA GAG GGG CAC AAC GT-3' （配列番号１０）のプライマーを用い、94℃、30 sec、55℃、30 sec、74℃、1 min  の反応を40回行った。
【００４９】
さらに、マウスPGC1α遺伝子の増幅には、5'- gaa agg gcc aaa cag aga ga -3' （配列番号１１）および5'- gta aat cac acg gcg ctc tt -3' （配列番号１２）のプライマーを用い、94℃、30 sec、55℃、30 sec、74℃、1 min  の反応を40回行った。
【００５０】
これらの反応産物を３％アガロースゲルにて電気泳動を行い、産物を解析した。分化が進むに伴い、分化マーカーであるPPARγおよびaP2（FABP4）の遺伝子発現は増加した(図１C)。GAPDHはコントロールである。3T3-L1細胞は、内在性にエストロゲンレセプターα（ERα）およびPPARγコアクチベータ１α（PGC1α）を発現することを、3T3-L1細胞から抽出したRNAを用いたRT-PCRで確認した(図１D)。
【００５１】
脂肪細胞に分化した3T3-L1細胞は、oil red O染色後、これを抽出し定量することで、脂肪分化の程度を測定することが可能である（adipogenesis assay）。3T3-L1細胞の分化培地に17βエストラジオール(E2)およびE2阻害剤であるICI 182,780（ICI）を添加し、分化への影響を検討した。
【００５２】
Adipogenesis assayは、Adipogenesis Assay Kit（Chemicon）のプロトコールに従い実施した。3T3-L1細胞を２４穴プレートに播き、脂肪分化培地にて7日間培養後、ＰＢＳで洗浄後、0.36% oil red O染色液にて15分染色し、洗浄液で３回洗浄後、抽出液で中性脂肪を染色したoil red Oを抽出した。これを520 nmで吸光度を測定し、細胞に蓄積した中性脂肪の量を定量した（ｎ＝４）。
【００５３】
その結果、E2の添加により濃度依存的に脂肪分化が阻害された。一方、ICIの添加では分化を阻害せず、さらにICIの添加はE2による分化阻害を抑制した（図１E）。以上から、エストロゲンは脂肪細胞の分化抑制作用を有することが示された。なお、統計学的有意差をT-testにて検討した。
【００５４】
免疫染色可能な抗PHB2抗体を用いて細胞免疫染色を行った。この免疫染色可能な抗PHB2抗体は、大腸菌で作成したGST-PHB2タンパク質を抗原としてウサギに免疫して作成した。細胞免疫染色は以下の通り行った。3T3-L1脂肪前駆細胞を35-mm poly-L-lysine-coated glass-bottomed dishes (Matsunami Glass Ind.)に播き、10-8 M ICIまたは10-7 M E2を添加した細胞培養液に2時間培養後、固定液（4% PFA and 0.4% Triton X-100 in PBS）で室温20分処理した。PBSで洗浄後、抗ＧＳＴ−ＰＨＢ２抗体（５００倍希釈）を一次抗体に、Alexa 488-conjugated anti-rabbit IgG (Molecular Probes)（1000倍希釈）を二次抗体に使用して細胞染色を行った。蛍光像は、TCS SP5（Leica）共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮影し解析した。
【００５５】
その結果、3T3-L1細胞の内在性のPHB2は、ICIを添加した際には主にミトコンドリアに局在するが、E2を添加すると内在性PHB2の一部は核に移行した像が観察された(図１F)。
以上から、3T3-L1細胞は、内在性にERαやPGC1α遺伝子の発現を有すること、エストロゲンで3T3-L1細胞の脂肪分化が抑制されること、3T3-L1細胞では、エストロゲン刺激により内在性のPHB2の一部がミトコンドリアから核に移行することを示した。
【００５６】
実施例２
ウミシイタケ(Renilla reniformis)由来luciferase (RLuc)を内部標準にしたDual luciferase assayを用いて、PHB2の核内作用を検討した。
【００５７】
Dual luciferase assayは、Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega)を使用し、プロトコールに従い実施した。具体的には、HeLa細胞に、チミジンキナーゼ（TK）プロモータの上流に有するウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子(TK-RLuc)およびPPAR反応性エレメント（PPRE）をTKプロモータの上流に有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)に、PPARγ遺伝子、PGC1α遺伝子、PHB2遺伝子などを表示の組み合わせで混合し、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、DNAを細胞に導入した。５時間後、培地交換を行い、合計22時間後に細胞を細胞融解液で回収後、これをルミノメーターにて測定した。ウミシイタケルシフェラーゼの活性を内部標準として用い、ホタルルシフェラーゼにて、転写活性を比較した（ｎ＝3−4）。なお培地交換時の培地には、PPARγのアゴニストを各々15d-PGJ2を10μM、Pioglitazone （Pio）を10μM、Troglitazone （Tro）を10μMの終濃度で添加した。
【００５８】
また、GAL4 assayには、内部標準としてTK-RLucおよびレポーター遺伝子としてGAL4の認識配列であるUAS (upstream activator sequence) 配列を上流に有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子（GAL4-Luc）を用い、さらにGAL4のDNA結合ドメイン（GAL4-DBD）、GAL4-DBDとPGC1αの融合タンパク質（DBD-PGC1α）遺伝子、PHB2（PHB2-wt）遺伝子、PHB2のN末欠失変異体（PHB2(51-299)）遺伝子を表示に示す組み合わせで遺伝子導入した。ルシフェラーゼ活性の測定は、前述のDual luciferase assayに従い測定した。
【００５９】
先ず、PPAR反応性エレメント（PPRE）をチミジンキナーゼ（TK）プロモータの上流に有するルシフェラーゼ(luciferase)レポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)を用いて、PPARγ遺伝子とPHB2遺伝子を共発現させたところ、PHB2のPPARγの転写活性の抑制は顕著でなかった。しかし、PPARγのコアクチベータであるPGC1αを共発現させた場合には、PHB2は顕著な転写抑制活性を示した(図2A)。次に、PHB2がPGC1αへ直接作用する可能性を検討するために、GAL4-DBDとPGC1αの融合タンパク質（DBD-PGC1α）を作製し、GAL4の認識配列であるUAS (upstream activator sequence) 配列を上流に有するルシフェラーゼレポーター遺伝子（GAL4-Luc）を用いて、転写活性解析を行ったところ、PHB2はDBD-PGC1αの転写活性を顕著に抑制した(図2B)。
【００６０】
PHB2がPGC1αタンパク質に直接結合するか否かを、大腸菌で発現させ精製したグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）とPHB2の融合タンパク質（GST-PHB2）と、HeLa細胞で発現させたPGC1αのカルボキシル末端にmycタグを融合したタンパク質（PGC1α-myc）を用いたGST-pulldownアッセイにて検討した。
【００６１】
GST-pulldownアッセイは、以下の通り実施した。先ず、HeLa細胞にPGC1α-Mycをリポフェクタミン2000で遺伝子導入した。18時間培養後、この細胞を回収し、0.1 % NP-40を添加したTNE buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2mM EDTA)で細胞抽出液を調整した。大腸菌で発現させたGSTまたはGST-PHB2タンパク質を各々2μgと上記抽出液をGSTビーズと共にTNE (0.1% NP-40)中で一晩混合した。TNE（1% NP-40)で3回洗浄した後、これらの沈殿物を用いてSDS-PAGEを行い、ECL-ニトロセルロース膜（Amersham）に転写後、マウスモノクローナル抗Myc抗体（BD Biosciences）を1000倍希釈で一次抗体に用い、二次抗体はHRP-conjugated抗マウスIg抗体（GE Healthcare）を2000倍希釈にて用いた。検出はECL検出キット（GE Healthcare）を用い、検出した。なお、HeLa(PGC1α-myc)inputは1/40量の細胞抽出液を用いた。GST-PHB2タンパク質は、全長のGST-PHB2(1-299)、C末端欠失変異体であるGST-PHB2(1-179)およびGST-PHB2(1-100)を用いた。
【００６２】
上記の通り、GST-PHB2とPGC1α-mycを試験管内で混和した後、グルタチオンビーズでGST-PHB2複合体を精製し、抗myc抗体を用いてウエスタンブロットを行うことにより、このGST-PHB2複合体中にPGC1α-mycが存在するか否かを検討したところ、PHB2がPGC1αと結合することが示された(図2C)。またPHB2の欠失変異体を解析したところ、PGC1αとの結合部位は、PHB2タンパク質の179-299アミノ酸部位に存在することが示された(図2C)。
【００６３】
次に、免疫沈降実験を行った。先ず、DBD-PGC1αまたはDBD融合PGC1αのC末欠失変異体とPHB2のカルボキシル末端にFLAGタグを付加した融合タンパク質（PHB2-FLAG）をHeLa細胞に共発現させ、各々の細胞を回収し、RIPA buffer (10 mM Tris HCl (pH 8.0)、1% DOC、1% Triton X-100、0.1% SDS、150 mM NaCl)に懸濁し、ヌクレアーゼ分解酵素を添加してDNAを分解後、遠心にて上清を抽出した。この抽出液を先ずProtein G Sepharoseを加えた後遠心した上清を回収し非特異的結合を除いた後、この上清にウサギポリクローナル抗DBD抗体(Santa Cruz)を１μｇおよびProtein G Sepharoseを添加した後、４℃にて結合させた後、遠心及び洗浄にて、DBD融合タンパク質に結合する複合体を精製した。これを用いてSDS-PAGEを行い、ニトロセルロース膜に転写後、抗FLAG抗体（M2，Sigma）30,000倍希釈にてウエスタンブロットを行い、DBD融合タンパク質と共にFLAG融合タンパク質が沈降するかを検出した。逆の実験として、上と同様に、抗FLAG抗体にて、免疫沈降を実施した後、抗DBD抗体にてウエスタンブロットを行うことにより、FLAG融合タンパク質と共にDBD融合タンパク質が沈降するかを検出した。
【００６４】
DBD-PGC1αとPHB2のカルボキシル末端にFLAGタグを付加した融合タンパク質（PHB2-FLAG）をHeLa細胞に共発現させた細胞抽出液を調整し、抗DBD抗体を用いて免疫沈降実験を行うと、PHB2がPGC1αと結合すること、さらにPGC1α欠失変異体を用いた実験から、PHB2の結合部位はPGC1αタンパク質の401-600アミノ酸の部位に存在することが示された(図２D)。一方、DBD-PGC1α(1-600)とPHB2-FLAGをHeLa細胞に共発現させた細胞抽出液を、抗FLAG抗体で免疫沈降実験を行うと、確かに、PGC1αはPHB2と共沈した(図２E)。また、詳細なPHB2の欠失変異体の解析から、PGC1αの結合部位はPHB2タンパク質の151-200アミノ酸の部位に存在することが示された(図２F)。図２Cの結果を考慮すると、PHB2タンパク質におけるPGC1α結合部位は、171-200アミノ酸の領域に存在すると考えられた。以上から、PHB2はPPARγのコアクチベータであるPGC1αに直接結合すること、PHB2はPGC1αの活性を抑制すること、その結果PHB2はPGC1αの活性調節を介してPPARγの転写活性を抑制することが示された。
【００６５】
実施例３
HeLa細胞をガラスボトムディッシュに培養し、リポフェクトアミン2000を用いて野生型ERαおよび核移行シグナルを含む256−303アミノ酸の部位を欠失させた変異型ERα（ERα241G）を一過的に遺伝子導入した。翌日、10-8 M ICIまたは10-7 M E2を添加した細胞培養液に置換し2時間培養後、前述の方法で、抗ＧＳＴ−ＰＨＢ２抗体を用いて細胞免疫染色を実施した。蛍光像は、TCS SP5（Leica）共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した。
【００６６】
エストロゲンによる内在性PHB２のミトコンドリアから核への移行が、ERαに依存するか否かを、先ず検討した。HeLa細胞では、内在性PHB2は野生型ERαを発現させたときにのみ、E2存在下でミトコンドリアから核に移行することが示された。一方、ERαを導入しなかった場合、また、核移行シグナルを含む256−303アミノ酸の部位を欠失させた変異型ERα（ERα241G）を導入した場合では、E2存在下においても核への移行は観察できなかった（図３A）。また、野生型ERαを導入した場合でも、E2非存在下では核への移行は観察できなかった（図３A）。即ち、内在性のPHB2をミトコンドリアから核への移行には、E2およびERαの両者が必要であることが明らかになった。
【００６７】
次に、E2投与による内在性PHB2の核への移行が、PPARγやPGC1αの活性を調節するかを検討した。
【００６８】
前述の記載に従いDual luciferase assayを実施した（ｎ＝3−4）。但し、共発現させる遺伝子にＥＲαを加えた。また、遺伝子導入した５時間後の培地交換の際に10-7 M E2を添加した実験系を加えた。また、GAL4 assayにおいても、前述の記載に従い実施し、共発現させる遺伝子にＥＲαを加えた場合、また、遺伝子導入した５時間後の培地交換の際に10-7 M E2を添加した実験系を加えた。
【００６９】
図３Bに示すように、PPRE-TK-LucにPPARγおよびPGC1αを共発現させた場合は、PPARγ−PGC1αの転写活性が最大となり、ERαを共発現させても、E2非存在下であれば転写活性は比較的高く保たれる(図３B、E2(-))。しかしながら、ERαを共発現させたとき、E2が存在する条件下では、その転写活性は著明に抑制されることが明らかとなった(図３B、E2(+))。同様に、DBD-PGC1αとGAL4-Lucに、ERαを共発現させた実験では、E2存在下でDBD-PGC1αの転写活性が抑制された(図３C)。以上から、E2-ERαの存在下では、内在性のPHB2がミトコンドリアから核へ移行すること、その結果、核に移行したPHB2は、PGC1αの活性を抑制し、この抑制を介してPPARγの転写活性を抑制することが強く示唆された。
【００７０】
実施例４
PHB2の核移行が、直接的に脂肪分化抑制作用を有するか否かを検討する目的で、E2非存在下においても核に移行する、アミノ末端に局在するミトコンドリア移行シグナルを欠失したPHB2変異体（PHB2C：51−299AA）をレンチウイルスで作製し、これを3T3-L1細胞に導入することにより、E2が関与しないPHB2の脂肪分化抑制作用の有無を検討した。
【００７１】
レンチウイルスで遺伝子導入させた3T3-L1脂肪前駆細胞を35-mm poly-L-lysine-coated glass-bottomed dishes (Matsunami Glass Ind.)に播き、これを前述の記載どおりに細胞免疫染色を行った。用いた抗体は一次抗体はウサギポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Sigma）を1,000倍希釈で、二次抗体としてAlexa 488-conjugated anti-rabbit IgG (Molecular Probes)を1000倍希釈で使用した。蛍光像は、TCS SP5（Leica）共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮影し解析した。
【００７２】
PHB2野生型とFLAGタグとの融合体（PHB2-FLAG）と、PHB2CとFLAGタグの融合体（PHB2C-FLAG）を3T3-L1細胞に導入したところ、PHB2C-FLAGはミトコンドリアではなく、細胞質および核に局在することが、抗FLAG抗体による細胞免疫染色で示された(図４A)。
【００７３】
Adipogenesis assayは、レンチウイルスを導入した3T3-L1細胞を用いて前述の通り実施し、培養時間を誘導開始後、5日後および7日後に測定した（ｎ＝４）。
【００７４】
レンチウイルスで、GFP、PHB2、PHB2C、PGC1αを導入した3T3-L1細胞を用いて、脂肪分化誘導を行ったところ、adipogenesis assayでは、PHB2Cを導入した3T3-L1細胞で著明に脂肪分化が抑制した（図４B）。
【００７５】
レンチウイルスを導入した3T3-L1細胞からtotal RNA を抽出し、このうち１μｇを用い逆転写酵素にてcDNAを合成した。定量ＰＣＲは、定法に従いLightCyclerTM FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green Iキット(Roche Applied Science)を用い、LightCycler 1.5 (Roche Applied Science)を用いて実施した。PCRのプライマーは以下に示す通りである。
【００７６】
マウスPPARγ遺伝子に対しては、5'-AAG AGC TGA CCC AAT GGT TG-3'（配列番号１３）および5'-TCC ATA GTG GAA GCC TGA TGC-3' （配列番号１４）のプライマーを用い、aP2遺伝子に対しては、5'-ATG TGT GAT GCC TTT GTG GGA-3' （配列番号１５）および5'-TGC CCT TTC ATA AAC TCT TGT-3' （配列番号１６）のプライマーを用い、Adiponectin遺伝子に対しては、5'-GCA CTG GCA AGT TCT ACT GCA A-3' （配列番号１７）および5'-GTA GGT GAA GAG AAC GGC CTT GT-3'（配列番号１８）のプライマーを用い、コントロールとしてGAPDH 遺伝子の増幅には、5'-GCC CAT CAC CAT CTT CCA G-3' （配列番号１９）および5'-TGA GCC CTT CCA CAA TGC C-3' （配列番号２０）のプライマーを用いた。GAPDH の遺伝子量を内部標準として、その他の遺伝子発現量の比を検討した（ｎ＝３）。
【００７７】
分化後7日目のそれぞれの細胞からRNAを抽出し、定量PCRにて、遺伝子発現量を検討したところ、脂肪分化のマーカー遺伝子であるPPARγ、aP2 (FABP4)、adiponectinの遺伝子発現量は、PHB2Cを導入した3T3-L1細胞で著明に減少した(図４C)。以上から、PHB2の核内移行が、E2を介さず脂肪分化を直接抑制することが示された。
【００７８】
実施例５
E2による肥満抑制が、PHB2の細胞内局在変化を伴うものか否かを、in vivoで検証した。
先ず、卵巣摘出施術（ovarectomy; OVX）を施行したマウスを作製し、閉経後肥満のモデルマウスとなるかを検証した。生後10週のC57BL6J雌マウスを、OVX処置後、一週間後から0.1 mg/kgのE2含有飼料またはE2不含飼料にて飼育し、体重の経時変化を比較したところ、E2不含飼料にて飼育したマウス（E2非投与群）の体重は増加したものの、E2含有群では、体重増加が認められなかった(図５A)。マウスへのE2の効果を確認するために、60日間飼育後のマウスを、解剖後に子宮重量を計測したところ、E2非投与群では子宮重量が減少していた(図５B)。しかし、E2投与群では、子宮重量は増加していた(図５B)。一方、60日間飼育後のマウスを、X線CTを用いて脛骨の海綿骨密度を計測したところ、E2非投与群で骨密度が減少していたが、E2投与群では骨密度は増加していた(図５C)。また、同様にCTによる内臓脂肪（VAT）、皮下脂肪（SAT）量を計測したところ、E2非投与群では脂肪量が増加していたが、E2投与群では脂肪量は減少していた (図５D)。以上から、OVXマウスは、閉経後肥満のモデルとなること、またE2投与によるホルモン補充療法がマウスに対して効果があり、肥満を抑制することが示された。
【００７９】
これら各群のマウスを解剖後、卵巣周囲脂肪の組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色にて染色後、それらの脂肪細胞の直径を比較すると、明らかにE2非投与群では脂肪直径が増大していたが、E2を投与すると直径が減少した(図５E)。
【００８０】
各群のマウスを、４％パラホルムアルデヒドを用いて還流固定した。その後、卵巣周囲白色脂肪組織から凍結切片を作製した。組織免疫染色は、ウサギポリクローナル抗ＧＳＴ−ＰＨＢ２抗体（５００倍希釈）を一次抗体に、Cy5-conjugated anti-rabbit IgG (GE Healthcare)（500倍希釈）を二次抗体に使用して組織免疫染色を行った。蛍光像は、TCS SP5（Leica）共焦点レーザー顕微鏡を用いて撮影し解析した。
【００８１】
上記の脂肪組織において、内在性PHB2の細胞内局在を組織免疫染色法にて確認したところ、E2非投与群に比較して、E2投与群では、PHB2が核に局在していることが示された(図５F)。以上から、マウス生体内においてもE2でPHB2がミトコンドリアから核に移行すること、また、E2投与が、白色脂肪細胞の体積の増大を抑制することが明らかになった。
【００８２】
実施例６
以上から、(1)ミトコンドリアに局在するPHB2が、ERαおよびE2の存在下にて核に移行すること、(2)PHB2は核において、脂肪分化を促進する転写因子PPARγのコアクチベータであるPGC1αに直接結合することにより、その活性を抑制し、この抑制を介してPPARγの転写活性を抑制すること、(3)E2非存在下においても、PHB2の核局在が脂肪分化を抑制することから、PHB2の直接作用として脂肪分化抑制活性があることが示された。さらに、(4)閉経後肥満のモデルであるOVXマウスの脂肪組織においても、E2が内在性PHB2の核局在を誘導し、更に脂肪細胞の肥満を抑制することを明らかにした。図６において、PHB2の肥満抑制における分子メカニズムのモデルを示す。
【００８３】
実施例７
前述の記載に従いDual luciferase assayを実施した（ｎ＝3）。内部標準としてTK-RLuc、レポーター遺伝子としてエストロゲン反応性エレメントをTKプロモータの上流に有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子(ERE-Luc)、共発現させる遺伝子にＥＲα、マウスPGC1α遺伝子、PHB2遺伝子などを表示の組み合わせで導入した。遺伝子導入後５時間後の培地交換の際にリガンドとして10-7 M E2を添加した実験を加えた。
【００８４】
一方、PPARαの転写活性調節に関しては、TK-RLuc、PPRE-Luc、PPARα、ヒトPGC1α遺伝子、PHB2遺伝子などを表示の組み合わせで導入した。遺伝子導入後５時間後の培地交換の際にリガンドとして10-5 M Fenofibrate (FFB-10)または10-4 M WY14643 (WY)を添加した実験を加えた。
【００８５】
また、GAL4 assayにおいても、前述の記載に従い実施し、GAL4-DBDとPGC1αの融合タンパク質（DBD-PGC1α）遺伝子、PHB2遺伝子、PHB2の各種欠失変異体遺伝子を表示に示す組み合わせで遺伝子導入した。
【００８６】
PHB2がPGC1αのコアクチベータ活性を抑制することが示されたが、PPARγ以外のPGC1αが結合する転写因子についての効果を、dual luciferase assayにて検討した。まず、PPARαとPGC1αの存在下において、PHB2はPPRE-TK-Lucをレポーター遺伝子としたPPARαの転写活性を抑制した(図７A)。同様にERαとPGC1αの存在下において、PHB2はエストロゲン応答性エレメント（ERE）を有するレポーター遺伝子ERE-LucにおけるERαの転写活性を抑制した(図７B)。以上から、PPARγ以外のPGC1αに結合する転写因子においても、PHB2はそれらの転写活性を、PGC1αのコアクチベータ活性を調節することにより、調節する可能性が示された。
【００８７】
一方、PHB2のPGC1αの活性調節に寄与するドメインを決定するために、複数の欠失変異体を作製し、GAL4-DBD-PGC1αとGAL4-Lucを用いた系で、それらの活性を検討したところ、PGC1αの活性を調節する複数の部位が見出された(図７C)。これらの欠失変異体は、PGC1αの活性調節剤のプロトタイプを提案するものである。
【００８８】
以上より、PHB2はPGC1αの活性調節を介して、PGC1αが調節する各種の転写因子の活性を調節することを示した(図７D)。PHB2類似体や変異体に由来するペプチドやそれらの活性を代替する物質が、これらの機能を調節する薬剤となることが考えられる。
【００８９】
実施例８
脂肪分化を促進する転写因子であるPPARγの転写活性に対し、各種コアクチベータを加えることにより、どのコアクチベータが転写活性を促進する検討し、さらにこれらのコアクチベータ存在下でのPPARγの転写活性を、PHB2が抑制するかを検討した。
【００９０】
Dual luciferase assayは、Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega)を使用し、プロトコールに従い実施した。具体的には、HeLa細胞に、チミジンキナーゼ（TK）プロモータの上流に有するウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子(TK-RLuc)およびPPAR反応性エレメント（PPRE）をTKプロモータの上流に有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)に、PPARγ遺伝子、PGC-1α遺伝子、PGC-1β遺伝子（NCBI登録番号 NM_133249）、SRC-1遺伝子（NCBI登録番号 NP_003734）、SRC-2遺伝子（NCBI登録番号 NP_006531）、SRC-3遺伝子（NCBI登録番号 NP_858045）、PHB2遺伝子などを表示の組み合わせで混合し、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を用いて、DNAを細胞に導入した。５時間後、培地交換を行い、合計22時間後に細胞を細胞融解液で回収後、これをルミノメーターにて測定した。ウミシイタケルシフェラーゼの活性を内部標準として用い、ホタルルシフェラーゼにて、転写活性を比較した（ｎ＝3）。
【００９１】
Dual luciferase assayを用いて、先ず、PPAR反応性エレメント（PPRE）をチミジンキナーゼ（TK）プロモータの上流に有するルシフェラーゼ(luciferase)レポーター遺伝子(PPRE-TK-Luc)を用いて、PPARγ遺伝子とPGC-1αを始めとする各種コアクチベータ遺伝子（PGC-1β、SRC-1、SRC-2、SRC-3）を各々共発現させたところ、PPARγ遺伝子とPGC-1αの組み合わせが、他のコアクチベータに較べPPARγの転写活性を著明に増加させた。これらの組み合わせに対しPHB2遺伝子を加えたところ、PHB2はPPARγ遺伝子とPGC-1αの組み合わせの転写活性を顕著に抑制した （図８)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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