(57)【要約】 【課題】ヤマイモまたはヤマノイモのウイルスフリー培養苗から大量の芽を発芽させ、この多芽体からウイルスフリー種芋を生産する。【解決手段】ヤマイモまたはヤマノイモの茎頂から再生したウイルスフリー培養苗を切り出し、この切り出された切片を植物ホルモン６−ベンジルアデニン１.０ｍｇ〜５.０ｍｇ／リットルの添加されたＭＳ培地で培養することにより大量の芽を発芽させ、得られた多芽体を馴化し、ガラス温室中で栽培してムカゴを獲得し、このムカゴを種芋として温室栽培してウイルスフリー種芋を生産する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマイモまたはヤマノイモの茎頂から再生したウイルスフリー培養苗を切り出し、この切り出された切片を植物ホルモン６−ベンジルアデニン１.０ｍｇ〜５.０ｍｇ／リットルの添加されたＭＳ培地で培養することにより大量の芽を発芽させることを特徴とする培養苗から多芽体の形成方法。
【請求項２】
請求項１において、切り出された切片は腋芽を含む請求項１の形成方法。
【請求項３】
請求項１において、植物ホルモン６−ベンジルアデニンは１.０ｍｇ〜３.０ｍｇ／リットル添加される請求項１の形成方法。
【請求項４】
請求項１において、植物ホルモン６−ベンジルアデニンは２.０ｍｇ／リットル添加される請求項１の形成方法。
【請求項５】
請求項１において、さらに光量１５００ｌｕｘ以上、８〜１６時間日長、２０℃〜３０℃の温度で培養する請求項１の形成方法。
【請求項６】
請求項１において、光量３０００ｌｕｘ、日長１６時間、培養温度２５℃で培養する請求項１の形成方法。
【請求項７】
請求項１で得られた多芽体を馴化し、ガラス温室中で栽培してムカゴを獲得し、このムカゴを種芋として温室栽培して、ウイルスフリー種芋を生産することを特徴とするウイルスフリー種芋の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヤマイモまたはヤマノイモのウイルスフリー培養苗から大量の芽を発芽させて多芽体を形成する方法およびこの多芽体からウイルスフリー種芋を生産する方法に関する。          
【背景技術】
【０００２】
ヤマイモDioscore  oppsita  THUNB. は、ナガイモDioscore  batatas  DECNE.、ヤマトイモ、ツクネイモの総称であり、ヤマノイモはジネンジョDioscore  japonica THUNB.をさし、いずれも日本各地で栽培されている根菜である。
【０００３】
ヤマイモまたはヤマノイモの栽培は、春先に親芋を１００ｇ程度に切り、暖かな場所で芽を出させた後、畑に植え付け、秋に収穫する。このような栽培を栄養繁殖といい、短期間で同じ遺伝子型の作物を増やすことが容易に出来る方法である。しかし、親芋がウイルスに感染している場合や奇形等の変異を起こしている場合には、小芋にも影響があり商品価値を失ってしまう。そのため、農業生産者は病原性ウイルスに感染していない親芋（ウイルスフリー種芋）を定期的に種苗会社等から購入し、更新する必要がある。
【０００４】
ヤマイモまたはヤマノイモは、茎頂培養でウイルスフリーの培養苗を作出し、その培養苗を株分け培養することで増やし、ウイルスフリー種芋の生産を行っている。ヤマイモまたはヤマノイモの培養苗では頂芽があると側芽は伸長しないため、一定期間内での１株からの増殖数に限りがあり、生産効率はよいとはいえない。そのため培養苗を大量に確保するには時間も経費もかかり、ウイルスフリー種芋の単価は高く、安定した供給は困難であった。
【０００５】
ヤマイモまたはヤマノイモはウイルス病による収量の低下、品質の劣化が著しい。そのためウイルスフリーの種芋を得るために、茎頂培養を経て、３ヶ月に一度腋芽を切片にして新しい培地に置床し、その芽を成長させて新たな株を作出する組織培養による増殖を行っている（表１）。しかし、ヤマイモまたはヤマノイモの培養苗では頂芽があると側芽は伸長しにくい特性（頂芽優勢）を有するため、１株から獲得できる芽の数に限りがあり、この手法では生産効率が悪い。これらのことから、ウイルスフリー種芋は高価な上に、生産農家の要望にこたえうる数量の種芋供給も困難であった。たとえ、優良な系統のヤマイモ類を育種できたとしても、斉一なウイルスフリー種芋を得るためには、系統を作出してから最短でもウイルスフリー培養苗の獲得に１年、その培養苗の増殖と種芋を作るためのハウス栽培で３年間以上かかる。
【０００６】
（表１）
各系統の株分け培養法での培養３ヶ月後の１株からの増殖株数
株分け培養法での３ヶ月後
系  統  名              に得られる苗数                
ツクネイモ                  ３.０±１.２株
ヤマトイモ                  ３.１±０.５株
ナガイモ                    １.８±０.２株
ジネンジョ                  ２.８±０.４株             
使用培地：ホルモンフリーＭＳ培地
培養容器：直径２.５ｃｍ×高さ１２.０ｃｍ  ガラス試験管
培地量：試験管１本当たり１０ミリリットル
試験管あたりの植え付け数：２個／試験管
培養条件：２５℃  ３０００ｌｕｘ  １６時間日長          
【０００７】
ムカゴから得られる出荷用ウイルスフリー種芋は培養苗から得られるものよりも大きく、露地栽培時にも旺盛な生育となるため、出荷先での評価も高い。既存の技術については、ヤマノイモのシュートまたはその幼葉を組織培養して葉にムカゴ様体を形成させ、得られたムカゴ様体を発芽させてヤマノイモの苗を獲得する増殖法が検討されている（特許文献１）。しかしながら、苗を得るまでに、培養した後に培養ムカゴを馴化、発芽させる工程が必要となっている。従来方法に比べ大量増殖は可能となっているが、ウイルスフリー種芋を得るまでの時間の短縮化は図られていない。
【０００８】
また、サトイモ科においては６−ベンジルアデニン１.０ｍｇ／リットル以下の量を添加したシュークロースを１〜２％含むＭＳ培地で多芽体を作成する方法が検討されている（特許文献２、３）。この手法では暗黒下で培養し、培地は液体を用いることで良好な多芽体を作出している。暗黒下での培養はヤマイモまたはヤマノイモで実施した場合、カルスが形成されるのみで、芽への再分化は認められず、多芽体を得ることはできない。液体の培地を用いた場合、ヤマイモまたはヤマノイモでは切片からポリフェノールを分泌し、自己の生育を阻害する。
【０００９】
また、多くの芽を茎頂組織から誘導する手法として、α−ナフタリン酢酸０.４２ｍｇ／リットルと６−ベンジルアデニン０.４５ｍｇ／リットルを添加したＭＳ培地で茎頂組織を培養する方法が検討されている（非特許文献１）。この手法を実施した場合、培養期間３ヶ月で形成される芽は５〜１０個程度であり、この方法で大量増殖の問題点を解決できるとはいえない。
【００１０】
また、多芽体から種芋を得る方法においてもサトイモ科において、多芽体を馴化した後、ハウス内のセルトレイで育苗する方法が検討されている（特許文献４）。しかし育苗のたびにウイルスフリー培養苗を作成しなくてはならず、培養、育苗期間を省力、短縮化できる画期的な方法とはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許公開平０１−１５７３１３号公報
【特許文献２】特開２０００−９３０２９号公報
【特許文献３】特開２０００−９３０３１号公報
【特許文献４】特開２０００−３５０３２５号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】西貞夫等,野菜の組織・細胞培養と増殖11ヤマノイモ, 最新バイオテクノロジー全書２  １８０−１８６，１９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
そこで、本発明の課題において、従来の株分け培養法では大量生産が困難であったウイルスフリー培養苗の大量増殖法の確立と、その培養苗から得たウイルスフリームカゴを使用する温室栽培方法の確立を実施し、それを種芋生産工程に組み込み、低コストで安定したウイルスフリー種芋の大量生産を行うことにある。
【００１４】
本発明の課題は培養時間、植え替え回数を既存方法の半分以下にまで短縮したヤマイモまたはヤマノイモの多芽体を作出し、かつ温室で栽培した培養苗にウイルスフリームカゴを形成し、翌年以降の温室用種芋として利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上述の課題を解決するため、本発明の培養苗から多芽体の形成方法によれば、ヤマイモまたはヤマノイモの茎頂から再生したウイルスフリー培養苗を切り出し、この切り出された切片を植物ホルモン６−ベンジルアデニン１.０ｍｇ〜５.０ｍｇ／リットルの添加されたＭＳ培地で培養することにより大量の芽を発芽させることを特徴とする。
【００１６】
さらに、上述の課題を解決するため本発明のウイルスフリー種芋の生産方法によれば、得られた多芽体を馴化し、ガラス温室中で栽培してムカゴを獲得し、このムカゴを種芋として露地栽培して、ウイルスフリー種芋を生産することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明はヤマイモまたはヤマノイモの茎頂から再生したウイルスフリー培養苗を切り出し、特殊なＭＳ培地で培養することにより、大量の芽を発芽させ、かつこの多芽体から生産農家の要望の高いウイルスフリー種芋を安価に、大量に提供するという効果を奏するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
従来方法の株分け培養法では、１株の元株を１０００株まで増やすのに４年間を要していたウイルスフリー培養苗生産を２年以内に短縮できる高倍率増殖法の確立とその利用、その培養苗から得たウイルスフリームカゴを使用する温室栽培方法の確立を検討し、種芋生産工程を改良し、ウイルスフリー種芋の低コスト大量作出を安定的に実施できるようにした。
【００１９】
本発明において、従来方法と大きく異なるのは次の２点である。１点目は、ヤマイモまたはヤマノイモの茎頂から再生したウイルスフリー培養苗の葉柄の内側に生じた芽を切り出し、植物ホルモンを含むＭＳ培地を用いて組織培養を実施し、多芽体（腋芽切片から伸長した蔓に新たに形成されたそれぞれから発芽し、枝分かれした状態）を作出することでウイルスフリー培養苗を短期間に大量に獲得できる点。２点目は、ウイルスフリー培養苗を利用するのは新規導入時のみの１回だけで、作出したウイルスフリー培養苗は完全防虫のガラス温室で馴化栽培し、その際に蔓にできるウイルスフリームカゴを翌年以降の温室用種芋として使用する点である。
【００２０】
ヤマイモまたはヤマノイモが感染するウイルス病は表２のとおりであり、アブラムシによって媒介される。そのため、温室栽培用の親芋となるムカゴのウイルスフリーを確実に維持し続けるために、ガラス温室等の完全防虫施設を用いることが必須条件となる。
【００２１】
（表２）
ヤマイモまたはヤマノイモが感染するウイルス病  一覧
種      類                    特        徴                                
ヤマノイモモザイクウイルス        ナガイモを除く日本産ヤマイモ、ヤマノイモに                                      感染
ＪＹＭＶ                          強毒で萎縮症状、収量激減
ヤマイモ、ヤマノイモ以外の感染植物は未確認   
ヤマノイモえそモザイクウイルス    ナガイモにのみ感染    
ＣｈＹＮＭＶ                      ＢＢＷＶ２に重複感染していることが多い      

ヤマノイモマイルドモザイクウイルス    ナガイモを除く日本産ヤマイモ、ヤマノイ                                          モに感染
ＹＭＭＶ                              海外ではヤムで問題となっている
近年海外より進入してきたため日本での影                                          響は不明
ササゲに実験的に感染                    
ソラマメウイルトウイルス２            日本産ヤマイモ、ヤマノイモに感染
感染すると萎縮症状、収量激減
ヤマイモ、ヤマノイモ以外の植物に広く感染

【実施例１】
【００２２】
以下、本発明を実施例によって詳述する。
【００２３】
ウイルスフリー苗の生産方法
ヤマイモまたはヤマノイモの茎頂から再生したウイルスフリー培養苗の腋芽を切り出し、植物ホルモン６−ベンジルアデニンを２.０ｍｇ／リットルを含むＭＳ培地（表３）を用いて組織培養を行った。
また、組織培養で得られた多芽体（腋芽切片から伸長した蔓に新たに形成された腋芽それぞれから発芽し、枝分かれした状態）をガラス温室で栽培した。
【００２４】
（表３）
ＭＳ培地の組成（鈴木隆雄等、バイオテクノロジーへの基礎実験、
三共出版株式会社、２８、２９、１９９２ )
成    分                  ｍｇ／リットル         
ＮＨ４ＮＯ                     １６５０.０                          
ＫＮＯ３                       １９００.０                       
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ              ４４０.０      
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              ３７０.０                
ＫＨ２ＰＯ４                      １７０.０
ＫI                                  ０.８                                   
Ｈ３ＢＯ３                            ６.２                              
ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ                ２２.３                 
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ８.６
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ               ０.３                
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                  ０.０
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                  ０.０                       
Ｎａ２ＥＤＴＡ                     ３７.３    
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                ２７.８
myo-inositol                     １００.０                      
nicotinic acid                       ０.５                        
Pyridoxine Hydrochloride             ０.５
Thiamine Hydrocholoride          ０.１〜１
Glycine                              ２.０            
ｇ／リットル          
Sucrouse                            ３０
寒  天                                ８              
【００２５】
高倍率増殖方法の植物ホルモンの種類、濃度
従来の株分け培養法では、一定期間で増える芽の数に限界があり、培養期間３ヶ月では増えにくい系統であるナガイモでは１.８個、一番増えやすい系統であるヤマトイモ、ツクネイモ、ジネンジョでも１株から得られる芽は２.８〜３.１個程度にしかならない。これでは畑１アールに植えつけるのに必要なウイルスフリー種芋  約５００個を得るための、元となる培養苗を増やすだけで最短でも３年間もかかってしまう。これを短縮し、効率のよいウイルスフリー苗の培養生産を実施する目的で、芽の誘導をよりしやすくする植物ホルモンの組み合わせをした。
【００２６】
下記の試験方法で、ヤマイモまたはヤマノイモの茎頂組織からの植物体の分化を促すために使用する植物ホルモンのα-ナフタリン酢酸と６−ベンジルアデニンの濃度を様々に組み合わせたＭＳ培地で、ツクネイモ培養苗の腋芽を含んだ切片を試験培養し、新たに形成される芽の数を調査した。結果は表４および表５の通りであり、腋芽からの芽の分化を促す最適な培地は、６−ベンジルアデニンを１.０〜３.０ｍｇ／リットル添加したもので、もっとも数多くの芽を獲得できた。また、使用する植物ホルモンを他のものに変えて同様に試験したが、表５にあるように芽の形成はみられるものの、６−ベンジルアデニンを使用したときよりも数は少ない。
【００２７】
以上のことから、ヤマイモまたはヤマノイモの高倍率増殖方法に使用する培地は表３の組成に６−ベンジルアデニンを１.０〜３.０ｍｇ／リットル添加する。
【００２８】
試験方法
使用系統：ツクネイモ
使用培地：必要に応じて植物ホルモンを添加したＭＳ培地
培養容器：直径９ｃｍ  ガラスシャーレ
培地量：シャーレ1枚あたり２０ミリリットル
シャーレ1枚あたりの切片数：１０個／シャーレ
培養温度および光条件：２５℃  ３０００ｌｕｘ  １６時間日長
培養期間：３ヶ月
調査方法：切片1つから新たに形成された芽をカウント
【００２９】
【表４】
2011083235.tif 000002
【００３０】
【表５】
2011083235.tif 000003
【００３１】
高倍率増殖方法の光条件と培地の状態
科の異なる作物ではあるが、サトイモ科では６−ベンジルアデニンを使用したＭＳ培地で暗黒下、液体培地で多芽体が誘導されるとの報告があるため、本実験でも芽の誘導を促す目的で培養期間中の光条件、培地の状態を下記の方法で試験した。６−ベンジルアデニンを２.０ｍｇ／リットル添加したＭＳ培地から寒天を除いた液体培地にツクネイモの腋芽を含む切片を植えたところ、液体培地で培養したものは培養液中にポリフェノールや粘り物質（水溶性食物繊維  ムコ多糖類）を分泌し、それにより生育が阻害され、カルスの形成や枯死にいたる切片が確認された（表６）。また、暗黒条件下では軟白状の蔓が伸長し、株元に透明なカルスを形成し、芽の数は光源ありのいずれの条件下よりも減少した（表７）。得られた芽も柔らかく、水分を多く含んでおり、そのままではガラス温室での栽培環境に適応できず、そのままの馴化ではすべて枯死した。暗黒化で得られた培養苗は馴化後の環境に適応させるために、光源下での培養を２週間程度行い、緑化した硬い蔓を新たに伸長させてからとなるため、かえって手間がかかり、培養苗の質からみても、良いものとはいえなかった。
【００３２】
以上のことから、ヤマイモまたはヤマノイモでは既に知られているサトイモ科で多芽体を誘導する場合とは異なり、光源のある培養条件でとくに２５℃  ３０００ｌｕｘ  １６時間日長で６−ベンジルアデニンを２ｍｇ／リットル添加したＭＳ固形培地が適するといえる。
【００３３】
培地組成比較試験方法
使用系統：ツクネイモ
使用培地：６−ベンジルアデニン２.０ｍｇ／リットルを添加したＭＳ培地
固形の場合は寒天０.８％を加える
培養容器：直径９ｃｍ  ＰＰ製バイオポット
培地量：バイオポット１個あたり１００ミリリットル
バイオポット1個あたりの切片数：１０個／バイオポット
培養条件：２５℃  ３０００ｌｕｘ  １６時間日長
培養期間：３ヶ月
調査方法：切片1つから新たに形成された芽をカウント
【００３４】
光の有無比較試験方法
使用系統：ツクネイモ
使用培地：６−ベンジルアデニン２.０ｍｇ／リットルを添加したＭＳ固形培地
培養容器：直径９ｃｍ  ガラスシャーレ
培地量：シャーレ1枚あたり２０ミリリットル
シャーレ1枚あたりの切片数：１０個／シャーレ
培養期間：３ヶ月
調査方法：切片1つから新たに形成された芽をカウント
【００３５】
（表６）
ツクネイモでの多芽体培養法に用いる液体培地と固形培地での生育の比較
多芽体培養法での３ヶ月
後に得られる苗数          カルスの形成      切片の枯死    
固形培地      ４３.８±１７.４株            ＋              ―  
液体培地      ３２.０±  ０.４株           ＋＋             ＋         
表の見方  カルスおよび切片の枯死の発生
−：発生無し、  ＋：発生３０％以下、 ＋＋：発生３０％以上
【００３６】
【表７】
2011083235.tif 000004
【００３７】
高倍率増殖方法（多芽体培養法）の検討
ウイルスフリー培養苗の腋芽を含む節間を１ｃｍ程度に切り出し、６−ベンジルアデニンを２.０ｍｇ／リットルを含むＭＳ培地に置床する。培養開始から２週間ほどで新葉を展開し、その後４ヶ月で腋芽の部分に多くのムカゴもしくは多芽体を形成する。これを繰り返し、目標数量まで生産をする。ヤマイモまたはヤマノイモ系統ごとの増殖株数（1株の培養苗が、３ヶ月後に何株の培養苗にまで増えるのか）は表８の通りである。
【００３８】
多芽体培養法では、同じ培養期間内で一番増えにくいジネンジョで株分け法に比べ２.６倍、もっとも増えたツクネイモでは１４.６倍の数量の苗を得ることが出来た。
【００３９】
調査方法
使用培地：６−ベンジルアデニンを２.０ｍｇ／リットルを添加したＭＳ培地
培養容器：直径９ｃｍ  ガラスシャーレ
培地量：シャーレ1枚あたり２０ミリリットル
シャーレ1枚あたりの切片数：１０個／シャーレ
培養条件：２５℃  ３０００ｌｕｘ  １６時間日長
培養期間：３ヶ月  
【００４０】
（表８）
従来法（株分け法）と多芽体培養法の増殖株数の比較
株分け法での３ヶ月          多芽体培養法での３ヶ月
系統名      後に得られる苗数            後に得られる苗数        
ツクネイモ      ３.０±１.２株              ４３.８±１７.４株
ヤマトイモ      ３.１±０.５株              ２４.０±１０.３株
ナガイモ        １.８±０.２株              ２５.３±１３.８株
ジネンジョ      ２.８±０.４株                ７.３±  ３.６株      
【００４１】
ムカゴを用いたウイルスフリー種芋生産
ムカゴとは、ヤマイモまたはヤマノイモの蔓にできる塊茎で、芋と同じ性状を有している。葉で作られたデンプンが転流する際に腋芽部分に滞留すると、それを貯蔵するために作られると考えられている。土に植えつけると通常の種芋を植え付けたときと同様の生育をし、地下部には芋を形成する。
【００４２】
このムカゴの性質を利用し、ウイルスフリー種芋生産の中で大きなコストを占める培養苗の必要数を抑えるために、培養苗を温室で栽培して得ることが出来るムカゴをその翌年以降の温室栽培用ウイルスフリー種芋（親芋）として用いる手法を発明した。
【００４３】
ムカゴ栽培技術
培養苗を温室に馴化、栽培した際、地上部の蔓（葉柄の基部  腋芽部分）にムカゴの着生が認められた。ムカゴを種芋とした株にも同様にムカゴが着生する。さらに地下部には、ウイルスフリー種芋として出荷可能なサイズの新芋を形成する。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
ムカゴを使う優位性としては、次の３点が挙げられる。一つ目は培養苗を温室栽培した場合に問題となる、馴化時の環境変化による株の枯死が、ムカゴを種芋として温室栽培した際には全く発生しないこと。発芽率はほぼ１００％であり、発芽時から第一葉が形成されるまでのおおよそ1ヶ月間はムカゴに貯蔵された栄養分を使って生育するため、環境変化に強い上に、生育も旺盛である。そのため、特別な管理も必要としない。
【００４５】
二つ目は、初期成育が良くその後の生育も旺盛なため、形成される新芋のサイズが培養苗由来のものに比べ大きくなる（表９）。
【００４６】
三つ目は、ウイルスフリー培養苗から得られたムカゴは、１００％ウイルスフリーであるということ。つまり、完全防虫のガラス温室で栽培し続ける限り、必ず毎年、地下部には種芋として出荷する新芋、地上部には翌年のガラス温室用種芋に使うムカゴをウイルスフリーで獲得できるため、ウイルスフリー培養苗を作成するのは、増殖を開始する1回のみでよいということ。一回ウイルスフリー培養苗を作出し、防虫対策をしたガラス温室で栽培し続ければ、ウイルスフリーの種芋の出荷が可能となるため、大掛かりな培養施設も必要なく、培養にかかわる人件費も抑えることが出来る。
【００４７】
（表９）
培養苗馴化栽培とムカゴ栽培収穫時の生育状況の比較
培養苗栽培              ムカゴ栽培          
収穫時の草丈      ７.３±０.７ｃｍ        ９０±１５.２ｃｍ    
収穫時の蔓の長さ    ２.３±６.４ｃｍ      １５３±１８.５ｃｍ    
収穫時の葉の枚数    １.５±０.５枚        １１３±３４枚         
新芋重量          ６.４±２.６ｇ        １８.０±５.４ｇ