(57)【要約】【課題】感染細胞においてｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した、インビボで弱毒化された変異体ウイルスを提供すること。【解決手段】感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、変異体ラブドウイルスが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス分野に関し、特にウイルスベクターおよびワクチンとして有用な変異体ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
弱毒化ウイルスまたは複製能力を減少したウイルスが、例えばワクチンもしくはワクチンベクターとして、または遺伝子治療ベクターとして、多くの治療応用のために広く使用されている。弱毒化ウイルスの産生は、代表的には、不自然な宿主を通して野生型ウイルスを繰返し継代することによる偶然の変異の単離を含む。組換えＤＮＡ技術および遺伝子工学技術の進歩は、治療剤および予防剤としてウイルスをよりよく開発する道具を提供している。組換え技術は、特異的な変異をウイルスゲノムの選択された領域に導入することを可能にし、そして変異体ウイルスの野生型への復帰を最小化する。
【０００３】
多くのウイルスの体液性免疫および細胞媒介性免疫の両方を刺激する能力は、それらのウイルスを理想的なワクチンベクターにし、そして多くのウイルスが、その結果、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびガンを含む広い範囲の疾患についてのワクチンベクターとして開発された。ウイルスはまた、遺伝子治療ベクターとしての用途にも適している。遺伝子治療（即ち機能的な遺伝子の体細胞への一時的または永久的な転移による遺伝子発現の改変）は、疾患を予防および処置する新規なアプローチとして、集中的に開発されている。外因性核酸を真核細胞に導入するための種々の物理的方法および化学的方法が公知であるが、ウイルスは、この目的のためには、ずっと効率的であることが一般的に分かっている。パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルスおよびポックスウイルスのような数種のウイルスが、可能な遺伝子治療ベクターとして調査された（例えば、特許文献１；特許文献２および特許文献３を参照のこと）。
【０００４】
特定の性質を有する組換えウイルスを産生する多くのウイルスの工学技術が、記載されている。例えば、特許文献４は、パラミクソウイルスＳＶ５株のＦタンパク質を発現する組換えラブドウイルスを記載している。この組換えウイルスにおいて、上記Ｆタンパク質は、ラブドウイルスＧタンパク質の部分との融合タンパク質として発現される。特許文献５および特許文献６は、非コード配列またはウイルスの非構造（ＮＳ）遺伝子のコード配列の変異を含む、操作された弱毒化ウイルスを記載している。改変されたウイルスタンパク質またはキメラウイルスタンパク質を発現するキメラ弱毒化ウイルスもまた、記載されている。特許文献６は、感染細胞でインターフェロン産生を誘導し得る生弱毒化インフルエンザウイルスを、さらに記載している。
【０００５】
操作されたウイルスはまた、腫瘍崩壊剤として記載されており、それらは腫瘍性細胞における複製して腫瘍性細胞を崩壊させるが、非腫瘍性細胞において複製してそれを崩壊することはない、腫瘍細胞に特異的な遺伝子欠陥を利用する。例えば、特許文献７および特許文献８は、腫瘍細胞の増殖を阻害する変異体単純ヘルペスウイルス  （ＨＳＶ−１７１６）を開示し、特許文献９は、ｐ５３陰性腫瘍細胞において優先的に複製すると考えられている変異アデノウイルスを記載し、特許文献１０は、Ｒａｓ媒介性腫瘍の処置のためのレオウイルスの使用を教示し、そして特許文献１１は、薬物感受性遺伝子と補助的効果を産生することができる第２遺伝子（例えば、インターフェロン遺伝子または腫瘍抑制遺伝子）とを有する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを記載している。
【０００６】
ウイルスを遺伝子的に操作することの代替法として、非病原性ウイルスが使用され得、例えば、特許文献１２が、ラブドウイルスの使用、特に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を、ＰＫＲ（二本鎖ＲＮＡ依存性キナーゼ）活性の低いレベルかまたはＰＫＲ活性が無いことにより特徴づけられた腫瘍細胞に対する選択的な腫瘍崩壊剤として記載している。特許文献１２はまた、インターフェロンに対して感受性の４種の変異体ＶＳＶの同定および腫瘍崩壊剤としてそれらの変異体ＶＳＶの使用を記載している。
【０００７】
この背景情報は、出願人により本発明と関連する可能性があると考えられる情報を示す目的で提供される。必ずしも承認を意図するものでもなく、上記情報のいずれも、本発明に対する先行技術を構成するものと解釈されるべきでもない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，４４０，４２２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５３１，１２３号明細書
【特許文献３】米国特許第６，４５１，３２３号明細書
【特許文献４】米国特許第６，４９７，８７３号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０２２，７２６号明細書
【特許文献６】米国特許第６，４６８，５４４号明細書
【特許文献７】国際公開第９７／２６９０４号パンフレット
【特許文献８】国際公開第９６／０３９９７号パンフレット
【特許文献９】米国特許第６，２９６，８４５号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，１１０，４６１号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，５３１，４５６号明細書
【特許文献１２】国際公開第０１／１９３８０号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
（項目１）
感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、変異体ラブドウイルス。
（項目２）
前記一以上の変異が基質（Ｍ）タンパク質をコードする遺伝子に存在する、項目１に記載の変異体ラブドウイルス。
（項目３）
変異体水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である、項目２に記載の変異体ラブドウイルス。
（項目４）
前記一以上の変異が、Ｍ５１Ｒ、Ｍ５１Ａ、Ｍ５１〜５４Ａ、ΔＭ５１、ΔＭ５１〜５４、ΔＭ５１〜Ｍ５７、Ｖ２２１Ｆ、Ｓ２２６Ｒ、ΔＶ２２１〜Ｓ２２６，Ｍ５１Ｘ，Ｖ２２１Ｘ、Ｓ２２６Ｘ、またはそれらの組合せである、項目３に記載の変異体ＶＳＶ。
（項目５）
前記一以上の変異が、Ｍ５１Ｒ／Ｖ２２１Ｆ；Ｍ５１Ａ／Ｖ２２１Ｆ；Ｍ５１〜５４Ａ／Ｖ２２１Ｆ；ΔＭ５１／Ｖ２２１Ｆ；ΔＭ５１〜５４／Ｖ２２１Ｆ；ΔＭ５１〜５７／Ｖ２２１Ｆ；Ｍ５１Ｒ／Ｓ２２６Ｒ；Ｍ５１Ａ／Ｓ２２６Ｒ；Ｍ５１〜５４Ａ／Ｓ２２６Ｒ；ΔＭ５１／Ｓ２２６Ｒ；ΔＭ５１〜５４／Ｓ２２６Ｒ：およびΔＭ５１〜５７／Ｓ２２６Ｒの群から選択される二重の変異である、項目３に記載の変異体ＶＳＶ。
（項目６）
前記一以上の変異が、Ｍ５１Ｒ／Ｖ２２１Ｆ／Ｓ２２６Ｒ；Ｍ５１Ａ／Ｖ２２１Ｆ／Ｓ２２６Ｒ；Ｍ５１〜５４Ａ／Ｖ２２１Ｆ／Ｓ２２６Ｒ；ΔＭ５１／Ｖ２２１Ｆ／Ｓ２２６Ｒ；ΔＭ５１〜５４／Ｖ２２１Ｆ／Ｓ２２６Ｒ；およびΔＭ５１〜５７／Ｖ２２１Ｆ／Ｓ２２６Ｒの群から選択される三重の変異である、項目３に記載の変異体ＶＳＶ。
（項目７）
前記一以上の変異が、さらに宿主細胞のミトコンドリアとＭタンパク質の相互作用を調節する結果となる、項目１、２または３のいずれか１項に記載の変異体ラブドウイルス。
（項目８）
前記変異体ラブドウイルスが、感染細胞における一以上のサイトカインの産生を誘発することができる、項目１、２または３のいずれか１項に記載の変異体ラブドウイルス。
（項目９）
感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスを含有するウイルスベクターであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、ウイルスベクター。
（項目１０）
異種の核酸をさらに含む、項目５に記載のウイルスベクター。
（項目１１）
感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子および一以上の抗原をコードする異種の核酸に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスを含むワクチンベクターであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、ワクチンベクター。
（項目１２）
感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアを含有するワクチンアジュバンドであって、該変異体ラブドウイルスが、感染細胞で一以上のサイトカインの産生を誘発することができ、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、ワクチンアジュバンド。
（項目１３）
感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアを含有する選択的腫瘍崩壊剤であって該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、選択的腫瘍崩壊剤。
（項目１４）
感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物であって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、薬学的組成物。
（項目１５）
感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスおよび、薬学的に受容可能なキャリアを含有する免疫原性組成物であって、該変異体ラブドウイルスが、感染細胞で一以上のサイトカインの産生を誘発することができ、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、免疫原性組成物。
（項目１６）
該調製物から生じる有害の復帰変異体から保護するためのウイルスの薬学的調製物用の添加剤としての、項目８に記載の変異体ラブドウイルスの使用。
（項目１７）
サイトカインの放出により軽減され得る、疾患または障害の処置における、項目８に記載の変異体ラブドウイルスの使用。
（項目１８）
前記疾患または障害が、癌、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染である、項目１７に記載の使用。
（項目１９）
前記異種核酸が必要な被験体に、該異種核酸を送達するための項目１０に記載のウイルスベクターの使用。
（項目２０）
一以上の容器ならびに感染細胞においてｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスを備えるキットであって、該一以上の変異が、野生型ウイルスと比較して、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる、キット。
本発明の目的は、変異体ウイルスおよびそれらの使用を提供することである。本発明の局面に従って、感染細胞においてｍＲＮＡおよびタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する、変異体ラブドウイルスが提供される。ここで上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【００１０】
本発明の別の局面に従って、感染細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスを含有するウイルスベクターが提供される。ここで上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【００１１】
本発明の別の局面に従って、感染細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスと、一以上の抗原をコードする異種核酸とを含有する、ワクチンベクターが提供される。ここで上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【００１２】
本発明のさらなる局面に従って、感染細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスと、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、ワクチンアジュバンドが提供される。ここで上記変異体ラブドウイルスは、感染細胞において一以上のサイトカインの産生を誘発することができ、上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【００１３】
本発明の別の局面に従って、感染細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスと、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、選択的腫瘍崩壊剤が提供される。ここで上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【００１４】
本発明のさらなる局面に従って、感染細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、薬学的組成物が提供される。ここで上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【００１５】
本発明の別の局面に従って、感染細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスと、薬学的に受容可能なキャリアとを含有する、免疫原性組成物が提供される。ここで上記変異体ラブドウイルスは、感染細胞において一以上のサイトカインの産生を誘発することができ、上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【００１６】
本発明のさらなる局面に従って、調製物中に副生する有毒な復帰変異体に対して防御するウイルスの薬学的調製物のための添加剤としての、上述のような変異体ラブドウイルスの使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の局面に従って、サイトカイン放出により緩和され得る疾患および障害の処置における、上述のような上記変異体ラブドウイルスの使用が提供される。
【００１８】
本発明のさらに別の局面に従って、上記異種核酸を、それらが必要な被験体に送達するためのウイルスベクターとしての、上述のような変異体ラブドウイルスの使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の局面に従って、一以上の容器と、感染細胞においてｍＲＮＡおよびタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する変異体ラブドウイルスとを含有する、キットが提供される。ここで上記変異は、野生型と比較して、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する能力の低下した変異体ラブドウイルスを生じる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】図１は、変異体ＶＳＶウイルス  ＡＶ１および変異体ＶＳＶウイルス  ＡＶ２のインビボでの低下した毒性がインターフェロンにより媒介されることを示している。（Ａ）ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ３）およびヒト腎臓癌細胞（ＣＡＫＩ−１）が、モック感染されたか、または野生型（ＷＴ）、ＶＳＶ  ＡＶ１株  もしくはＶＳＶ  Ａ２株で感染されたかのいずれかであった。培養培地が、感染後１８時間で、ヒトＩＦＮ−α産生を検出するためにＥＬＩＳＡでアッセイされた。（Ｂ）経路およびマウス種によるＷＴ  対  変異体ＶＳＶ株のインビボ毒性。ＩＮ＝鼻腔内；ＩＶ＝静脈内；ｎｄ＝分析されず。（Ｃ）ＡＶ２は、致死的なＷＴ  ＶＳＶ感染に対してトランスでマウスを防御し得る。ＰＫＲ−／−マウスが、種々の用量でＷＴ、ＡＶ２または両株の組合せのいずれかで鼻腔内感染され、罹患率または死亡率についてモニターされた。数値は、感染の徴候を示す各群のマウスの数（罹患率）または感染で死んだ各群のマウスの数（死亡率）を示す。
【図１−２】図１は、変異体ＶＳＶウイルス  ＡＶ１および変異体ＶＳＶウイルス  ＡＶ２のインビボの低下した毒性がインターフェロンにより媒介されることを示している。（Ｄ）Ｂａｌｂ／ＣマウスおよびＢａｌｂ／Ｃ  ＩＦＮＲ−／−マウスが、ＷＴ  ＶＳＶ、ＡＶ１ウイルスまたはＡＶ２ウイルスで鼻腔内から感染され、罹患率についてモニターされた。
【図２−１】図２は、２次転写応答がＷＴ  ＶＳＶ  で阻害されるが、ＡＶ１またはＡＶ２では、阻害されないことを示している。（Ａ）ウイルス感染に対する１次応答は、ＩＲＦ−３、ｃＪＵＮ／ＡＴＦ−２およびＮＦκＢにより媒介される（ＩＦＮ−βプロモーターでのエンハンソソーム（ｅｎｈａｎｓｏｓｏｍｅ）複合体の形成部分がここに示されている）。マイクロアレイデータは、ＷＴウイルス感染細胞および変異体ウイルス感染細胞の両方において、強固にアップレギュレートされた１次転写応答遺伝子を示している（ａ：ＩＳＧ１５が、完全誘導のためにＩＳＧＦ３を必要とすることは公知である）。数値は、モック感染に対する誘導倍率を示す。（Ｂ）ＩＦＮ−βは、その後、翻訳され、そして上記核の中で、２次転写応答の遺伝子の誘導を媒介するＩＳＧＦ３複合体を形成するようにＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達をオートクリン式に刺激するために分泌される。ＡＶ１またはＡＶ２に感染された細胞が、これらの遺伝子の強固なアップレギュレーションを示す一方、ＷＴ感染細胞は、全く発現を示さない（Ａ＝無し）。（Ｃ）ＷＴ  ＶＳＶで感染された細胞において、ＩＲＦ−７が結果的に発現することが無い場合は、殆ど全てのＩＦＮ−α遺伝子を含む、第３次転写波は発生し得ない（ｂ：ＩＦＮ−α７は、ＷＴサンプルのアレイによって、僅かに検出される）。反対にＡＶ１およびＡＶ２に感染された細胞は、ＩＦＮ−α遺伝子の発現を効率的に誘導する。
【図２−２】図２は、２次転写応答がＷＴ  ＶＳＶ  で阻害されるが、ＡＶ１またはＡＶ２では、阻害されないことを示している。（Ｄ）Ａ５４９細胞の感染後４時間目のＲＴ−ＰＣＲデータは、ＷＴ  ＶＳＶおよび変異体ＶＳＶで感染された細胞において同様のレベルに誘導された１次応答遺伝子のＲＡＮＴＥＳならびにＩＦＮ−βを示したが、一方、ＭＸ１のアップレギュレーション（２次応答）は、ＷＴ感染細胞で減少した。（Ｅ）ウェスタンブロット分析は、ＷＴ  ＶＳＶと変異体ＶＳＶの間でＩＲＦ−３活性化の類似した動態を示したが、しかしながら、ＩＳＧ５６（１次応答）タンパク質発現は、ＷＴ感染細胞において著しく減少した。ＩＲＦ−７タンパク質は、ＡＶ１感染細胞およびＡＶ２感染細胞においてのみ検出される。ＩＲＦ−７Δは、内因性ＩＲＦ−７の発現を誘導することができると思われる。
【図３】図３は、ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡが、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定されるように、ＷＴ  ＶＳＶ感染細胞からの細胞質画分にて著しく欠失されていることを示している。（Ａ）ＷＴ  ＶＳＶ、ＡＶ１  ＶＳＶまたはＡＶ２  ＶＳＶで感染された細胞からの核（Ｎ）の全ＲＮＡ画分および細胞質（Ｃ）の全ＲＮＡ画分が、ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡについてアッセイされた；同じサンプルからのＨＰＲＴ  ｍＲＮＡに対して正規化した。＊は、ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡが検出されなかったことを示した。（Ｂ）ＷＴ  ＶＳＶ株または変異体ＶＳＶ株のいずれかで感染された細胞が、ＩＦＮ−β産生についてＥＬＩＳＡによりアッセイされた。ＡＶ１感染細胞およびＡＶ２感染細胞は、検出し得る分泌ＩＦＮ−βを示したが、ＷＴ  ＶＳＶ  感染細胞では、示さなかった。
【図４−１】図４は、上記変異体ＶＳＶが、種々の腫瘍モデルにおいて、インビボ効力を実証することを示している。（Ａ）変異体ＶＳＶは、異種移植ヒト卵巣腹水腫瘍を腹腔内処置により処置することにおいて効果的である。ヒトＥＳ−２卵巣癌細胞が、腹水腫瘍を樹立するためにＣＤ−１ヌードマウスの腹腔内窩に注入された。１×  １０６のＥＳ−２細胞の注入１２日間後、動物は、ＡＶ２  ＶＳＶ  または紫外線不活性化ＡＶ２  ＶＳＶいずれかで隔日（全３用量）に処置された。各用量（１×１０９ｐｆｕ）が腹腔内窩に投与された。動物は、罹患率および死亡率について評価され、中程度の腹水形成の出現後に安楽死させた。「ｎ」は、各群の動物の数を示している。（Ｂ）免疫能力のある動物における皮下腫瘍の全身系処置。皮下腫瘍は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて、後脇腹領域に１×１０６のＣＴ２６結腸癌細胞を注入して樹立された。腫瘍がおよそ１０ｍｍ３になった時に、マウスは隔日に、１０日間（全６用量）、５×１０８ｐｆｕの上記ウイルスの静脈内注入で処置された。「Ｔｒｏｊａｎ」とは、ＭＯＩ＝２０でＡＶ１  ＶＳＶで感染された３×１０５のＣＴ２６細胞の注入をいう。コントロールマウスは、６用量の５×１０８ｐｆｕ当量の紫外線不活性化ＡＶ２  ＶＳＶを受けた。腫瘍は、毎日腫瘍体積を計算するために測定された。動物は、それらの腫瘍負荷が過剰（およそ７５０ｍｍ３）と思われた時点で安楽死させた。（Ｃ）処置前３日間と処置後１１日目まで、各群について毎日測定されたマウスの体重変化を示す。誤差棒は、標準誤差を示す。
【図４−２】図４は、上記変異体ウイルスが、種々の腫瘍モデルにおいて、インビボ効力を実証することを示している。（Ｄ）免疫能力のあるマウスモデルにおける播種性肺腫瘍の処置。肺腫瘍は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの尾静脈に３×１０５のＣＴ２６細胞を注入して樹立される。１２日目にマウスは、以下のように処置された：ＵＶ  ＡＶ２ＩＶ＝１用量（５×１０８ｐｆｕ当量）を静脈内に、ＡＶ２ＩＶ＝１用量（５×１０８ｐｆｕ）の変異体３  ＶＳＶを静脈内に、ＡＶ２ＩＮ＝１用量（５×１０７ｐｆｕ）のＡＶ２  ＶＳＶを鼻腔内（ｉｎｔｒａｎｓａｌｌｙ）に、ＡＶ２  ＩＶおよびＩＮ＝１用量（５×１０８ｐｆｕ）のＡＶ２  ＶＳＶを静脈内におよび１用量の（５×１０７ｐｆｕ）のＡＶ２  ＶＳＶを鼻腔内に処置された。処置後４日目に、全ての動物を殺し、それらの肺が除去された（心臓は、見える大きさ）。矢印は、残存する腫瘍である。（Ｅ）肺腫瘍は、上述のように樹立された、１２日目に、マウスは、示されたように鼻腔内滴下により送達された５×１０７ｐｆｕで、隔日に２週間（全６用量）処置される。罹患率および死亡率について毎日モニターされ、呼吸窮迫の徴候を示すマウスが、安楽死させられ、腫瘍負荷について試験される。［ｎ］は、処置群のマウスの数を示す。
【図５】図５は、変異体ＶＳＶ株が、いかに混合集団からの有毒なＷＴ株の出現を防止することができ得るかを、描いているモデルを示している。（Ａ）ＷＴ  ＶＳＶは、感染細胞からのＩＦＮ分泌を遮断し得、隣接細胞を無防備にし、新生ウイルス粒子に対して感受性にし、それがウイルス拡散を生じる。（Ｂ）ＩＦＮの「サイトカイン雲」および、恐らく他のサイトカインは、核／細胞質輸送を遮断することができないＭタンパク質をコードするＶＳＶ株で感染された後に誘導される。上記隣接細胞は、変異体ＶＳＶおよび上記集団から出現しようとしている任意の推定上の復帰変異体株による感染から保護される。
【図６】図６は、ＶＳＶの上記Ｍタンパク質をコードする遺伝子において本発明に従って作られ得る変異の例を示している。
【図７】図７は、レスキューされた変異体ＸＮＤＧ  Ｍ４およびＸＮＤＧ  Ｍ５の上記ＶＳＶ  Ｍタンパク質の関連部分の配列を示している。
【図８】図８は、上記レスキューされた変異体ＶＳＶ  ＸＮＤＧ  Ｍ４およびＸＮＤＧ  Ｍ５が、上記Ｍｕｔ２変異体ＶＳＶと同様なプラークサイズを有することを示している。
【図９】図９Ａ、ＢおよびＣは、ＧＦＰ（ＷＴ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１、緑）およびＯＣＴ−ＤｓＲｅｄ２（ミトコンドリアマーカー、赤）と融合したＶＳＶのアミノ末端の７２アミノ酸でトランスフェクトされた細胞を示している。Ｍ−ＧＦＰおよびＯＣＴ−ＤｓＲｅｄ２の同時局在を示す併合画像。Ｄ、ＥおよびＦ。ＷＴ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１でトランスフェクトされＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄで染色された細胞。矢印は、一面に小斑点のある（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ）ミトコンドリアおよび減少したＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色を示す、代表的なトランスフェクトされた細胞を示している。アステリスクは、ＷＴ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１の同時局在および減少したＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色を示す網様（正常）ミトコンドリアを有するトランスフェクトされた細胞を示している（併合画像Ｆ）。ＧおよびＨ。ＷＴ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１でトランスフェクトされ、そしてＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄで染色された細胞。トランスフェクトされた細胞は、一面に小斑点のあるミトコンドリアおよび減少したＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染色（矢印）を有する。
【図１０】図１０Ａ、Ｂ、およびＣは、ＧＦＰ（ＷＴ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１、緑）およびＯＣＴ−ＤｓＲｅｄ２（ミトコンドリアマーカー、赤）と融合したＶＳＶ  Ｍのアミノ末端の７２アミノ酸で同時トランスフェクトされた、生きた細胞の画像を示す。併合画像は、同時局在およびこの細胞がこの毒性のタンパク質により死んでいくにつれ、この細胞における初期には網様のミトコンドリアの進行性の断片化を示している。Ｄ  上記の同時トランスフェクトされた生きた細胞。再び、これは、ＶＳＶ  Ｍ−ＧＦＰ融合タンパク質の相対的な濃度でのＷＴ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１およびＯＣＴ−ＤｓＲｅｄ２の上記同時局在ならびにミトコンドリア（緑）の隆起および接合部を示している。
【図１１−１】図１１は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ１のゲノムの核酸配列（配列番号１）を示している。
【図１１−２】図１１は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ１のゲノムの核酸配列（配列番号１）を示している。
【図１１−３】図１１は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ１のゲノムの核酸配列（配列番号１）を示している。
【図１１−４】図１１は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ１のゲノムの核酸配列（配列番号１）を示している。
【図１１−５】図１１は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ１のゲノムの核酸配列（配列番号１）を示している。
【図１２】図１２は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ１の変異体Ｍタンパク質遺伝子の核酸配列（配列番号２）を示している。
【図１３】図１３は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ１の変異体Ｍタンパク質遺伝子のアミノ酸配列（配列番号３）を示している。
【図１４−１】図１４は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ２のゲノムの核酸配列（配列番号４）を示している。
【図１４−２】図１４は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ２のゲノムの核酸配列（配列番号４）を示している。
【図１４−３】図１４は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ２のゲノムの核酸配列（配列番号４）を示している。
【図１４−４】図１４は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ２のゲノムの核酸配列（配列番号４）を示している。
【図１４−５】図１４は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ２のゲノムの核酸配列（配列番号４）を示している。
【図１５】図１５は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ２の変異体Ｍタンパク質遺伝子の核酸配列（配列番号５）を示している。
【図１６】図１６は、上記ＶＳＶ変異体ＡＶ２の変異体Ｍタンパク質遺伝子のアミノ酸配列（配列番号６）を示している。
【図１７】図１７ＡおよびＢは、本発明の一つの実施形態に従う変異体ＶＳＶの保護効果を図で示しており、図１７Ａは、ＶＳＶの致死的頭蓋内用量の投与後のマウスの生存％を示している；そして１７Ｂは、ＶＳＶの致死的頭蓋内用量の投与後の経時的なマウス体重変化を示している。
【図１８】図１８は、ＷＴ  ＶＳＶまたは変異体ＶＳＶ（ＡＶ１もしくはＡＶ２）に感染し、ＯＶＣＡＲ４細胞、ＣＡＫＩ−１細胞およびＨＯＰ６２細胞における、相対的β−ＩＦＮ産生を図に示している。
【図１９】図１９ＡおよびＢは、樹立されたＣＴ２６腫瘍を有するＷＴ  ＶＳＶ処置マウスおよびΔＭ５１  ＶＳＶ処置マウスから得られた脾臓細胞からの抗ＣＴ２６細胞傷害性Ｔリンパ球活性（図１９Ａ）を図で示し、ならびにＷＴ  ＶＳＶおよびΔＭ５１  ＶＳＶで処置された非担癌マウスから得られた脾臓細胞によるＮＫ依存性およびＮＫ非依存性のＣＴ２６細胞崩壊（図１９Ｂ）を、図で示している。
【図２０】図２０は、皮下ＣＴ２６腫瘍を持っている、Δ５１Ｍ  ＶＳＶ  ＧＦＰ処置マウスからのＣＴ２６腫瘍の免疫化学的染色切片を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、感染細胞においてｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することを担うタンパク質をコードする遺伝子に一以上の変異を有する、変異体ウイルスを提供する。従って、上記変異体ウイルスは、野生型ウイルスと比較して核への輸送を遮断する能力が低下しており、インビボで弱毒化される。上記変異体ウイルスは、正常な宿主細胞の抗ウイルス系を、これらの系の効果に対する感受性を残しながら、誘発することができ得る。上記変異体ウイルスは、限定されないが、ワクチンおよびアジュバントとして、ウイルスベクターとして、ならびに悪性細胞または感染細胞の選択的溶解のための細胞溶解剤および細胞傷害剤として、癌および慢性感染の処置のための治療剤を含む広範囲の応用に適切である。
【００２２】
（定義）
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語および化学的用語は、本発明が関する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。標準的なアミノ酸の３文字表記および１文字表記が、本明細書で交互に使用される。
【００２３】
本明細書で特定のウイルスに関連して使用される、用語「異種核酸配列」とは、上記特定のウイルス以外の源に起源する核酸配列をいう。
【００２４】
本明細書で使用される、用語「変異」とは、欠失、異種核酸の挿入、逆位または置換をいう。
【００２５】
本明細書で使用される、用語「遺伝子」とは、コード配列の上流もしくは下流に位置し得、プロモーター、オペレーター、ターミネーターなどのような関連制御領域と一緒に個別のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸の断片（「コード配列」もしくは「コード領域」ともいう）をいう。
【００２６】
本明細書で使用される、用語「変異体ウイルス」とは、限定されないが、欠失、異種核酸の挿入、逆位、置換またはそれらの組合せを含む、ゲノムにおける一以上の変異を含むウイルスをいう。
【００２７】
本明細書でウイルスに関連して使用される、用語「天然に存在する」とは、上記ウイルスが自然状態で見出し得ること、即ち自然の源から単離され得、そして実験室でヒトにより意図的に改変されていないことを示す。
【００２８】
本明細書で使用される、用語「野生型ウイルス」とは、自然に見出される最も頻度の多い遺伝子型のウイルスをいい、このウイルスに対して変異体が定義されている。
【００２９】
本明細書で使用される、用語「抗ウイルス系」とは、ウイルス感染に対する細胞応答の成分をいい、例えばインターフェロンおよび他のサイトカイン、一酸化窒素合成酵素、２本鎖ＲＮＡ依存キナーゼ（ＰＫＲ）、オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ），Ｍｘ  Ａ  ＧＴＰアーゼおよびＭｘ  Ｂ  ＧＴＰアーゼなどを含む。
【００３０】
本明細書で使用される、用語「抗ウイルス応答」とは、ウイルス感染に対する細胞応答をいい、例えばインターフェロンの産生、サイトカイン放出、ケモカインの産生、リンホカインの産生またはそれらの組合せを含む。
【００３１】
本明細書で使用される、用語「正常宿主細胞」とは、完全な抗ウイルス応答を有する、非癌性の非感染細胞をいう。
【００３２】
本明細書で使用される、用語「ワクチン」とは、疾患を誘発しないで、動物において免疫応答を刺激することができる物質の調製物をいう。
【００３３】
本明細書で使用される、用語「腫瘍崩壊剤」とは、腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、かつ／または腫瘍細胞を殺すことができる薬剤をいう。
【００３４】
本明細書で使用される、用語「アジュバント」とは、ワクチンに添加された場合、被験体においてそのワクチンにより刺激される免疫応答を昂進することができる物質をいう。
【００３５】
（変異体ウイルス）
本発明は、感染された宿主細胞においてｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子の中に、一以上の変異を有する変異体ウイルスを提供する。結果として、上記変異体ウイルスは、核への輸送を遮断する能力が低下し、そしてインビボで弱毒化される。ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への搬出を遮断することは、上記感染細胞内の上記抗ウイルス系を無力にし、かつ、感染細胞が、周辺の細胞を感染から保護し得る機構（即ち、早期警告系）を無力にし、そして最終的には細胞溶解を生じる。本発明の一つの実施形態では、従って、上記変異体ウイルスは、その野生型と比較して低下した細胞溶解性の性質を有する。
【００３６】
上記変異体ウイルスは、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することができないので、上記変異体ウイルスによる正常宿主細胞の感染は、上記細胞の抗ウイルス系を誘発する結果となり得、それは、野生型ウイルスにより通常は遮断または迂回される。本発明の別の実施形態に従って、従って、上記変異ウイルスは、正常宿主細胞の上記抗ウイルス系を誘発することができ、その抗ウイルス系に対して感受性である。
【００３７】
複製サイクルの一部として、感染細胞においてｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する、種々のウイルスは、公知であり、従って、本発明に従って変異体ウイルスを産生するための変異に適切である。上記ウイルスとしては、ＤＮＡウイルス、（＋）鎖ＲＮＡウイルスまたは（−）鎖ＲＮＡであり得る。適切なＤＮＡウイルスの例としては、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パポーバウイルス、イリドウイルス、ヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｅｎａｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、または風疹ウイルスが挙げられる。適切な（＋）鎖ＲＮＡウイルスの例としては、トガウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス、またはコロナウイルスが挙げられる。適切な（−）鎖ＲＮＡウイルスの例としては、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科およびパラミクソウイルス科ファミリーからのウイルスが挙げられる。
【００３８】
本発明の一つの実施形態では、上記ウイルスは、ポックスウイルス科、ピコルナウイルス科、オルトミクソウイルス科またはラブドウイルス科のファミリーから選択され、例えば、上記ウイルスは、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルスまたはベシキュロウイルスであり得る。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、上記ウイルスは、ラブドウイルス科のメンバーである。ラブドウイルスは、それらが通常のヒト病原体ではないので、治療用途には、特に適している。治療薬剤として使用されるものに類似するウイルス株に対する既存の免疫応答は、治療薬剤としての上記変異体ウイルスの効果を、弱体化し得、従って、望ましくない。さらに、ラブドウイルスは、細胞質で全ライフサイクルを過ごすＲＮＡウイルスであり、従って、患者のゲノムへの望ましくない組込みの危険を最小化する。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、上記ラブドウイルスはベシキュロウイルスである。適切なベシキュロウイルスの例としては、限定されないが、ピリ−ウイルス、チャンディプラウイルスおよび水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）が挙げられる。
【００４１】
ＶＳＶは、治療的潜在力を実証してきたベシキュロウイルス科のメンバーである。ヒトにおけるＶＳＶ感染は、無症候または緩和な「フルー」として顕性のうちのいずれかである。ＶＳＶ感染したヒトの間で重篤な病気や死亡の報告症例は無かった。ＶＳＶの他の有用な特性は、それは複製が早く、容易に高力価に濃縮され得、それはたった５つの遺伝子からなる単純ウイルスで、従って、容易に遺伝子操作を受け入れやすく、そして広い宿主範囲を有し、ヒト細胞の殆どのタイプに感染することができるという事実を含む。本発明の１つの実施形態では、上記変異体ウイルスは、変異体ＶＳＶである。多くの異なるＶＳＶ株が当該分野で公知であり、本発明における使用に適している。例としては、限定されないがインディアナ株とニュージャージー株が挙げられる。当業者は、ＶＳＶの新株が、本発明の使用にもまた適切で、将来出現するおよび／または発見されるであろうことを理解する。そのような株はまた、本発明の範囲に入ると考えられる。
【００４２】
（１．変異体ウイルスの調製）
本発明に従って、上記変異体ウイルスは、天然に存在する変異体であり得、またはそれらは、遺伝子操作された変異体であり得る。上記変異体ウイルスは、従って、定義された増殖条件または淘汰圧を使用して選択で得られ得、またはそれらは、当該分野で公知の遺伝子工学技術を使用して、特異的に操作された組換えウイルスであり得る。
【００４３】
例えば、感染細胞において抗ウイルス系を誘発し、抗ウイルス系に感受性を残しているそれらの変異体ウイルスの選択のために、上記ウイルスの集団は、野生型ウイルスによる感染に正常に感受性がある細胞上で増殖し得、これらの細胞上で増殖を殆どしない（より小さいプラーク形成をする）ウイルスが単離される。これらの単離されたウイルスは候補変異体ウイルスである。ＶＳＶ（感染細胞においてインターフェロン応答を正常に遮断する）のようなウイルスのためのそのような選択技術の例として、上皮細胞株のようなインターフェロン応答性細胞上で、野生型と比較して、貧増殖の選択である。これらの候補変異体が、インターフェロン非応答性細胞（例えば腫瘍細胞）上で増殖する場合の大きなプラーク形成は、上記貧増殖がインターフェロン応答に起因することを確証した（例えば国際特許出願ＷＯ  ０１／１９３８０）。
【００４４】
一度、天然に存在する変異体ウイルスが同定され、単離されると、そのウイルスゲノムの変異の位置を標準的な技術、例えば配列決定技術、制限分析、ハイブリダイゼーション技術、マイクロアレイ分析またはこれらの技術の組合せを使用して決定され得る。組換え変異体ウイルスが、上記ゲノムの同じ領域で、同一変異のまたは類似の変異のいずれかを含有する標準的な技術（以下を参照のこと）を使用して、遺伝子的に操作され得る。欠失変異または挿入変異を含有するように遺伝子操作されたウイルス（即ち、組換えウイルス）は、代表的には、天然に存在する変異体より、より低い復帰率を有し、従って治療目的に、特に適している。
【００４５】
あるいは、候補遺伝子は、既にウイルスの中で同定されている場合は、組換え変異体ウイルスは、当該分野で周知の技術を使用して遺伝子的に操作され得る（例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。この点に関する候補遺伝子は、感染細胞においてｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードすることが推測される遺伝子である。本発明の一つの実施形態は、上記変異体ウイルスが組換え変異体ウイルスである。
【００４６】
例えば，ＤＮＡウイルス（例えば、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス）および（＋）鎖ＲＮＡウイルス（例えばポリオウイルス）は、米国特許第４，７６９，３３０号；同第４，２１５，０５１号およびＲａｃａｎｉｅｌｌｏら、（１９８１、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４：９１６〜９１９）に記載されているように、組換えＤＮＡ技術を使用して操作され得る。（−）鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルスおよびＶＳＶ）は、ＶＳＶのために確立された逆遺伝子系のような十分に確立された「逆遺伝子」技術を使用して遺伝子的に操作され得る（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ａ．およびＪ．Ｋ．Ｒｏｓｅ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８、２４７：１〜６）。
【００４７】
上述のような、遺伝子技術は、従って、候補遺伝子において一以上の変異を操作するのに使用され得る。当業者は、上記遺伝子が、使用される特定のウイルスに依存するが、構造タンパク質または非構造タンパク質をコードし得ることを理解する。上記変異は、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド逆位もしくは一以上のヌクレオチドの置換、または異種核酸の挿入またはそれらの組合せであり得る。当該分野で公知のように、変異体ウイルスは、導入された変異の修正により、時々、野生型への復帰が可能である。欠失および／またはヌクレオチド多重変異のような修正が難しい変異は、従って、復帰を最小限にするための変異体ウイルスを作製する時に使用され得る。本発明の一つの実施形態では、導入変異は欠失である。別の実施形態では、上記導入変異は、２，３またはそれ以上のヌクレオチドの関わる変異である。タンパク質発現が遺伝子のコード領域またはそれと関連する調節領域のいずれかでの変異により影響され得ることは、当該分野で周知のことである。候補遺伝子の非コード領域もしくはコード領域またはそれらの組合せにおける変異は、本発明に包含される。一つの実施形態では、一以上の変異は、遺伝子のコード領域に操作される。別の実施形態では、一以上の変異は、非構造タンパク質をコードする遺伝子のコード領域に操作される。
【００４８】
非構造タンパク質をコードする適切な遺伝子の例としては、ラブドウイルスのマトリックスタンパク質またはＭタンパク質をコードする遺伝子である。ＶＳＶ由来の上記Ｍタンパク質は、よく研究されており、以下を含むいくつかの主要なウイルス機能に必要な多機能タンパク質であることが示されている：出芽（Ｊａｙａｋａｒら、２０００、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４（２１）：９８１８〜２７）、ウイルス粒子集合（Ｎｅｗｃｏｍｂら、１９８２、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、４１（３）：１０５５〜６２）、細胞変性効果（Ｂｌｏｎｄｅｌら、１９９０、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６４（４）：１７１６〜２５）および宿主遺伝子発現の阻害（Ｌｙｌｅｓら、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２５（１）：１７２〜８０）。後者の性質は、本明細書で、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方の宿主の核の中へのおよび中からの核輸送の阻害に起因することが示されている。ＶＳＶ  Ｍタンパク質をコードする遺伝子において作製され得る適切な変異の例としては、限定されないが、異種核酸のコード領域への挿入、コード領域における一以上のヌクレオチド欠失またはＭタンパク質の３３、５１、５２、５３、５４、２２１、２２６位の一以上のアミノ酸残基の置換もしくは欠失を生じる変異またはこれらの組合せが挙げられる。
【００４９】
ＶＳＶ  Ｍタンパク質の上記アミノ末端は、上記タンパク質の標的をミトコンドリアとすることが示され、上記タンパク質の細胞傷害性に寄与し得る。上記タンパク質のこの領域へ導入された変異は、従って、ウイルスの毒性の増減を生じ得る。上記タンパク質のＮ末端をコードするＭタンパク質遺伝子の上記領域において作製される適切な変異の例としては、限定されないが上記タンパク質の最初の（Ｎ末端から）７２のアミノ酸における、一以上の欠失、挿入または置換を生じる変異が挙げられる。
【００５０】
上記アミノ酸の数は、ＶＳＶのインディアナ株のＭタンパク質の上述の位置をいう。他のＶＳＶ株およびラブドウイルス科由来のＭタンパク質のアミノ酸配列は、インディアナ株ＶＳＶ  Ｍタンパク質のアミノ酸配列とは、いくつかのアミノ酸の存在、不存在に起因して僅かに異なり得、対応するアミノ酸の僅かに異なる番号付けになることは、当業者には、容易に分かる。本明細書で記載されているそれらに対応する変異のための適切なアミノ酸を同定するために、上記関連タンパク質配列とインディアナ株ＶＳＶ  Ｍタンパク質配列とのアラインメントは、標準的な技術およびソフトウエアを使用して当業者に容易に実施できる（例えば、ウェブサイトのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで入手できるＢＬＡＳＴＸプログラム）。このように同定されるアミノ酸は、本発明に従う変異の候補である。
【００５１】
本発明の一つの実施形態では、上記変異体ウイルスは、上記Ｍタンパク質（表記法は：野生型アミノ酸／アミノ酸位置／変異アミノ酸；記号Δは、欠失を、そしてＸは任意のアミノ酸を示す）をコードする遺伝子に導入された一以上の以下の変異を有するＶＳＶである：Ｍ５１Ｒ、Ｍ５１Ａ、Ｍ５１〜５４Ａ、ΔＭ５１、ΔＭ５１〜５４、ΔＭ５１〜Ｍ５７、Ｖ２２１Ｆ、Ｓ２２６Ｒ、ΔＶ２２１〜Ｓ２２６，Ｍ５１Ｘ，Ｖ２２１Ｘ、Ｓ２２６Ｘ、またはそれらの組合せ。別の実施形態では、上記変異体ウイルスは、上記Ｍタンパク質をコードする遺伝子に導入された変異の以下の組み合わせの一つを有するＶＳＶである：二重変異−Ｍ５１ＲおよびＶ２２１Ｆ；Ｍ５１ＡおよびＶ２２１Ｆ；Ｍ５１〜５４ＡおよびＶ２２１Ｆ；ΔＭ５１およびＶ２２１Ｆ；ΔＭ５１〜５４およびＶ２２１Ｆ；ΔＭ５１〜５７およびＶ２２１Ｆ；Ｍ５１ＲおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ５１ＡおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ５１〜５４ＡおよびＳ２２６Ｒ；ΔＭ５１およびＳ２２６Ｒ；ΔＭ５１〜５４およびＳ２２６Ｒ：ならびにΔＭ５１〜５７およびＳ２２６Ｒ；三重変異−Ｍ５１Ｒ、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ５１Ａ、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ５１〜５４Ａ、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；ΔＭ５１、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；ΔＭ５１〜５４、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；ならびにΔＭ５１〜５７、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ。変異体Ｍタンパク質の例は図６に示されている。
【００５２】
本発明はまた、上記変異体ウイルスの配列、またはその断片およびそれに対して相補的な配列を有する単離された核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する。そのような配列は、組換え変異体ウイルスの産生に、またはプライマーもしくはプローブとして有用である。一つの実施形態では、変異体ＶＳＶの配列、その断片およびそれに対して相補的な配列を有する単離された核酸配列が提供される。別の実施形態では、上記Ｍタンパク質の一以上の変異を有するＶＳＶ配列、それらの断片およびそれに対する相補的な配列を有する単離された核酸分子が、提供される。
【００５３】
（２．変異体ウイルスの試験）
本発明に従って、上記変異体ウイルスは、野生型ウイルスと比較した場合、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断する低下した能力に特徴づけられる。この能力の損失は、低下した細胞溶解活性を示す上記変異体ウイルスおよび／または上記細胞の抗ウイルス系（野生型ウイルスにより通常遮断されている）を誘発する上記変異体ウイルスを生じ得る。
【００５４】
（２．１  インビトロ試験）
候補変異体ウイルスは、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の核輸送を遮断する能力の低下または損失についてインビトロでスクリーニングされ得る。例えば、適切な細胞株を候補変異体ウイルスに感染させ得、上記細胞を、収集し得、そして核画分および細胞質画分を、単離し得る。ｍＲＮＡは、当該分野で周知の技術、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットまたはマイクロアレイ分析を使用して、これらの画分のそれぞれから単離され、そしてアッセイされ得る。上記核画分および細胞質画分のｍＲＮＡ含量は、その後、野生型ウイルスおよび／またはモック感染された細胞に関し類似した画分のｍＲＮＡ含量のような、適切なコントロールと比較され得る。
【００５５】
あるいは、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、候補変異体ウイルスの試験に使用され得る。そのようなアッセイは、元来のまたは遺伝子操作され得るの、いずれかで短い半減期を有する一以上の標的ｍＲＮＡを使用して、セットアップされ得る。インサイチュハイブリダイゼーションは、その後、候補変異体ウイルスに予め感染された細胞のこれらの標的ｍＲＮＡを検出するために使用される。感染後の細胞質の上記標的ｍＲＮＡの検出は、未感染コントロールおよび／または野生型ウイルスに感染されたコントロールと比較する場合、核からのｍＲＮＡの搬出を遮断する候補ウイルスの減退した能力を示している。このタイプのアッセイは、当業者により、ハイスループットスクリーニングに、容易に適用され得る。
【００５６】
同様に、候補変異体を試験するアッセイは、短い半減期を有するｍＲＮＡによりコードされている蛍光タンパク質を発現するように、標準的技術により操作された細胞株を使用して、セットアップされ得る。次いで、この操作された細胞株からの細胞は、野生型ウイルスおよび候補変異体ウイルスに別々に感染され、確立した技術を使用して蛍光がモニターされる。野生型ウイルスに感染されたそれらの細胞において、蛍光タンパク質をコードする新生ｍＲＮＡの核細胞質輸送のウイルスによる遮断に起因して蛍光は消失する。ｍＲＮＡ輸送を遮断する能力の低下した変異体ウイルスは、一方、長期間蛍光を発する。このタイプのアッセイはまた、当業者によりハイスループットスクリーニングに、容易に適用され得る。
【００５７】
変異体ウイルスに感染された細胞において、特定の参考ｍＲＮＡは、野生型ウイルスで感染された細胞の細胞質で検出されるより、より多くその細胞質で検出され得る。本発明に従って、変異体ウイルスによる細胞の感染は、野生型ウイルスに感染された細胞の細胞質中の量と比較して、上記細胞の細胞質中の参考ｍＲＮＡの量が少なくとも２０倍の増加を生じた。
【００５８】
一つの実施形態では、変異体ウイルスによる細胞の感染は、上記細胞の細胞質中の参考ｍＲＮＡの量の少なくとも５０倍の増加を生じる。他の実施形態では、上記増加は、１００倍、２５０倍、５００倍または少なくとも１０００倍である。
【００５９】
上に示されるように、上記変異体ウイルスは、野生型ウイルスにより通常は遮断されているまたは回避されている感染細胞において抗ウイルス系を誘発し得る。候補変異体ウイルスはまた、従って、野生型ウイルスと比較する場合、インタクトな抗ウイルス系を有する細胞上での貧増殖を基礎にしてスクリーニングされ得る。上記変異体ウイルスは、野生型ウイルスと同様に、抗ウイルス応答の一以上の構成成分が欠乏している細胞上で増殖可能なはずである。例えば上記インターフェロン系を誘発する変異体ウイルスは、インターフェロン応答性細胞上では貧増殖であるが、腫瘍細胞のようにインターフェロン応答が損なわれている細胞では野生型ウイルスと同じように増殖する。細胞における抗ウイルス系を誘発する上記変異体ウイルスの能力はまた、感染細胞における抗ウイルス応答構成成分をコードするそれらの遺伝子の発現を、標準的な技術、例えばウェスタンブロットもしくはノーザン分析またはマイクロアレイ分析を使用して分析し、および適切なコントロールに対する発現のレベルを比較して決定され得る。
【００６０】
抗ウイルス応答を誘発する変異体ウイルスはまた、野生型ウイルスによる感染に対して隣接する細胞を保護することができ得る。この能力は、上記野生型ウイルスによる感染に正常に感受性のある細胞と上記変異体ウイルスおよび野生型ウイルスとを使用した共感染実験ならびに共感染細胞上での野生型ウイルスの増殖を決定して、試験され得る。共感染実験を行う方法は、当該分野で公知である。
【００６１】
（２．２  インビボ試験）
一度、適切な変異体ウイルスが同定されれば、適切な動物モデルは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して上記変異体ウイルスの効力および毒性を評価するために使用され得る。
【００６２】
例えば、毒性はＬＤ５０試験を実施して決定され得る。本発明の一つの実施形態では、上記変異体ウイルスは、上記野生型のＬＤ５０より、約１０倍と約１００００倍との間のより大きいＬＤ５０を有する。あるいは、適切な動物モデルは、異なる濃度の上記変異体ウイルスで処置され得、上記ウイルスの毒作用は、その後適切な期間、動物の身体全体の健康状態および体重をモニターして評価され得る。評価期間終了後、上記動物は屠殺され、関連器官の外観および重量が測定され得る。適切な動物モデルの例としては、限定されないがＢａｌｂ／ＣマウスおよびＣＤ−１マウスが挙げられる。他の適切な動物モデルとしては、上記抗ウイルス応答の構成成分に欠陥のあるモデルのような野生型ウイルスによる感染に特に感受性のあるモデルが挙げられる。例として、ＰＫＲ−／−マウスがあり、これはＶＳＶ感染に極めて感受性であることが示されている。
【００６３】
上記変異体ウイルスの抗ウイルス応答を誘発する能力は、標準的な技術を使用してインビボで試験され得る。例えば、動物は、上記変異体ウイルスで処置され得、引き続いて野生型ウイルスまたは第２ウイルスにチャレンジされ得る。これらの動物の生存率は、上記変異体ウイルスで前処置を受けていないコントロール群と比較され得る。
【００６４】
上に示すように、免疫応答を誘発する変異体ウイルスはまた、野生型ウイルスによる同時共感染に対して、被験体を保護することができ得る。上記変異体ウイルスのこの保護効果を評価するために、抗ウイルス応答および毒性プロフィールが、野生型ウイルスと変異体ウイルスに共感染した動物について決定され得、野生型単独で感染した動物と比較され得る。
【００６５】
（使用）
本発明の変異体ウイルスは、広い範囲の応用に有用であることは当業者に容易に分かり得る。限定するわけではない実施例が、以下に提供される。
【００６６】
（１．ウイルスベクター）
本発明は、本発明の変異体ウイルスのウイルスベクターとしての使用を提供する。ウイルスベクターとして使用される場合、上記変異体ウイルスは、治療的に活性な分子をコードする少なくとも一つの異種核酸配列を取り込むために操作される。上記ウイルスベクターは、細胞を感染するのに使用され得、次いで、異種核酸配列でコードされた治療的に活性な分子を発現する。ウイルスベクターは、治療的に活性な分子をインビボで発現するために、上記異種核酸を被験体の細胞に送達するために使用され得る。
【００６７】
上記ウイルスベクターに取り込まれた上記異種核酸配列は、例えば、標準的なクローニング技術および／または核酸増幅技術の使用により、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡから取り出され得、または当該分野で公知の方法により化学的に合成され得る。上記核酸配列は、上記ウイルスのゲノムの非必須領域もしくは遺伝子またはｍＲＮＡもしくはタンパク質の核輸送を遮断することに関連するタンパク質をコードする遺伝子に、当該分野で公知の方法および本明細書および他で記載されている方法を使用して、挿入され得る。
【００６８】
本発明の目的のために、異種核酸配列によりコードされる上記治療的に活性な分子は、例えば、細胞内で発現される場合、上記細胞内に欠乏している活性を補充または供給するタンパク質であり得、従って、上記細胞を病的状態と戦うことができるようにする。そのようなタンパク質としては、限定されないが、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン、成長因子、神経伝達物質、栄養因子、アポリポタンパク質、および腫瘍抑制遺伝子、ウイルス特異抗原もしくは腫瘍特異抗原、抗原性エピトープ、免疫調節因子、インターフェロン調節因子、サイトカインおよび自殺遺伝子が挙げられる。当業者は、上記挿入された異種ＤＮＡ／ＲＮＡとしては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニルシグナル、ＩＲＥＳおよび上記ＤＮＡまたはＲＮＡによりコードされる遺伝子の効率的な発現に必要な他の調節要素を、さらに挙げられ得ることを理解する。あるいは、上記異種核酸の発現は、全体にまたは一部分、上記ウイルスベクターの内因性調節配列に依存し得る。
【００６９】
本発明はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたはｓｉＲＮＡをコードする異種核酸配列も意図している。標的細胞におけるこれらの配列の発現は、細胞性遺伝子の発現および／または細胞性ｍＲＮＡの転写を調節されることを可能にする。
【００７０】
本発明の一つの実施形態では、ウイルスベクターとしての使用のための上記変異体ウイルスは、変異体ラブドウイルスである。別の実施形態では、上記変異体ウイルスは、上記Ｍタンパク質に１以上の変異を有するラブドウイルスである。別の実施形態では、上記変異体ウイルスは上記Ｍタンパク質に一以上の変異を含むＶＳＶである。
【００７１】
ウイルスベクターとして使用される場合、本発明の変異体ウイルスは、エキソビボでドナー細胞を操作するのに使用され得、その操作された細胞は、その後ドナーか、他の患者に戻され、または本発明の上記変異体ウイルスは、インビボで患者細胞を操作するのに使用され得る。そのような方法は、当該分野で周知である。
【００７２】
本発明の一つの実施形態では、上記ウイルスベクターはタンパク質をコードする異種核酸の被験体への送達のために「遺伝子治療ベクター」として使用され、上記タンパク質はその被験体の細胞で発現されると、そうでなければ、上記細胞に欠乏する活性を補充または供給する。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、上記ウイルスベクターは一以上の抗原をコードする異種核酸配列を保有するワクチンベクターとして使用され、そして疾患および／または感染に対して、個体を免疫するために使用される。上記抗原は、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原または細菌抗原であり得る。「多価の」ワクチンベクターとしての上記ウイルスベクターの使用はまた、上記ベクターが異なる生体に対する抗原を含み、従って、１より多い疾患に対する免疫および１より多い生体による感染に対する免疫を提供する。
【００７４】
種々のサイトカインの産生のように、宿主細胞の上記抗ウイルス系を誘発する変異体ウイルスは、特にワクチンベクターとして有用である。サイトカインの誘導は、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方の刺激を引き起こし、従って、ワクチンベクターの効力を改善し得る。
【００７５】
ワクチンベクターとして使用される場合に被験体に投与される、本発明の上記変異体ウイルスの有効量は、コードされている抗原、被験体の年齢、体重および性別ならびに投与の様態に依存して変化する。当業者は、特定の被験体の免疫に必要な投薬量を当該分野で周知の標準的技術を使用して決定し得る。
【００７６】
ワクチンベクターとしての本発明の上記変異体ウイルスの効力を評価するために、チャレンジ研究が実施され得る。そのようなチャレンジ研究は、代表的に実験動物を使用して実施され、種々の技術、例えば鼻腔内、筋肉内により変異体ウイルスを動物の群に接種することを含む。上記変異体ウイルスの効果が比較され得るコントロール群は、平行してセットアップされるべきである。コントロール群は、非接種動物および、例えば、市販の代替ワクチンを接種された動物を含み得る。接種後の適切な時間後に、動物は、病原性因子でチャレンジされる（すなわち微生物、ウイルスまたは腫瘍細胞）。
【００７７】
チャレンジ後と同様に、接種前後に動物から血サンプルが収集され、その後、病原性薬剤に対する抗体応答が分析される。抗体応答の適切な試験としては、限定されないが、ウェスタンブロット分析、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。あるいは、上記動物は腫瘍細胞でチャレンジされる場合、上記腫瘍細胞の増殖が、例えば、腫瘍のサイズまたは重量の増加をモニターすることによって、モニターされる。
【００７８】
細胞性免疫応答はまた、細胞性免疫（Ｔリンパ球）の誘導をモニターするリンパ球幼若化反応、サイトカイン誘導をモニターするインターフェロン放出などの技術により評価され得る。
【００７９】
（２．腫瘍崩壊剤）
当該分野で公知のように、特定のウイルスは、選択的腫瘍崩壊剤として作用する能力がある。例としては、ＶＳＶ、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルスＨ−１およびＯＮＹＸ−０１５ヒトアデノウイルス（例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ  ０１／１９３８０およびＷＯ  ００／６２７３５ならびにＢｅｌｌ、ＪＣ、Ｌｉｃｈｔｙ  ＢＤおよびＳｔｏｊｄｌ  Ｄ．２００３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：７〜１１を参照のこと）のような特定の操作されたウイルスが挙げられる。腫瘍細胞増殖を抑制する腫瘍崩壊性ウイルスの効力は、正常細胞と比較して、ウイルス感染に対する腫瘍細胞の特異な感受性に、ある程度、存在する。腫瘍細胞は、増殖阻害またはアポトーシス経路において変異を獲得することにより、正常な対応物より、生存の優位性を得ている。腫瘍の進化の過程で、しばしば選択される一つの欠陥は、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の喪失である。インターフェロンはまた、個体の細胞の抗ウイルス応答の主要な伝達物質であり、このようにインターフェロン媒介性増殖制御プログラムからの逸脱を可能にする変異を獲得した腫瘍細胞は、同時にそれらの生得的な抗ウイルス応答を損なう。
【００８０】
そのような細胞において、上記生得的な抗ウイルス応答が弱体化される場合、ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への搬出を遮断する上記変異体ウイルスの無能力は、上記細胞の中での複製能力には影響しない。本発明の変異体ウイルスは、それらの抗ウイルス系に対して感受性であるままで、感染細胞において抗ウイルス系を誘発する能力があり、このように腫瘍細胞において選択的に複製し、腫瘍細胞の増殖を阻害し、または腫瘍細胞を殺す能力があるが、正常細胞では複製する能力が無い。従って、本発明は、変異体ウイルスの改善された腫瘍崩壊剤としての使用を提供する。ｍＲＮＡまたはタンパク質の核への輸送を遮断することに関連するウイルスタンパク質がまた、感染細胞に対して他の効果を有し得ることが理解される。例えば、上記ＶＳＶ  Ｍタンパク質は、感染細胞のミトコンドリアに上記タンパク質を標的化して、細胞傷害効果を導くために重要であることが示されてきている。上記Ｍタンパク質はまた、宿主タンパク質ＴＳＧ１０１と相互作用して、感染細胞からの子孫ビリオンの効率的な発芽を促進することが示されている。
【００８１】
本発明は、従って、変異体ウイルスの核への輸送を遮断する能力を低下させるだけでなく、Ｍタンパク質の宿主細胞のミトコンドリアとの相互作用をも変化させる上記Ｍタンパク質の一以上の変異を有する、組換え変異体ラブドウイルスを提供する。ＶＳＶ  Ｍタンパク質のＮ末端は、感染細胞のミトコンドリアにこのタンパク質を標的化するために重要であることが示されている。この局在化を昂進または抑制する上記タンパク質のこの領域の変異は、ウイルスベクターの細胞傷害性を、このように調節する。導入される変異に依存して、上記変異体ウイルスの細胞傷害性は増加または減少し得る。増加した細胞傷害性が生じるようにＭタンパク質に一以上の変異を有するように操作された、変異体ウイルスは、特に有効な腫瘍崩壊剤である。
【００８２】
本発明は、ウイルスの宿主タンパク質ＴＳＧ１０１との相互作用を改変する、Ｍタンパク質の一以上の変異を有する組換えラブドウイルスの使用を、さらに意図している。ＴＳＧ１０１は、腫瘍抑制タンパク質で、その発現および機能は悪性細胞において、しばしば変化されている。この相互作用に干渉する上記Ｍタンパク質への変異の導入は、腫瘍細胞でより効率的に複製し、より効果的な腫瘍崩壊剤になる組換えウイルスを生じ得る。
【００８３】
本発明の変異体ウイルスの腫瘍崩壊活性は、ヒト腫瘍が免疫構成動物に移植される、標準的な異種移植腫瘍モデルを使用して決定され得る。ヒト癌の異種移植モデルの例としては、限定されないが、皮下注入により移植され、そして腫瘍増殖アッセイに使用される、マウスにおけるヒト固形腫瘍異種移植；脂肪パッド注入により移植され、腫瘍増殖アッセイに使用される、マウスにおけるヒト固形腫瘍同系移植；マウスにおける生存率アッセイに使用される、マウスにおけるリンパ腫および白血病の実験モデルならびに肺転移の実験モデルが挙げられる。
【００８４】
変異体ウイルスの腫瘍崩壊活性は、変異体ウイルスで処置された異種移植動物および未処置コントロールにおける、腫瘍増殖を比較して決定され得る。上記野生型腫瘍崩壊ウイルスで感染されたコントロール動物もまた、使用され得る。上記変異体ウイルスは、直接腫瘍にもしくは全身系に投与され得、またはそれらは、エキソビボで細胞を感染し、引き続き、その細胞を使用して上記動物に投与されることに使用され得る。腫瘍が皮下に、または静脈内注入（肺腫瘍を形成する）で樹立された同系マウスモデル系もまた、上記変異体ウイルスの腫瘍崩壊活性を試験するのに使用され得る。
【００８５】
（３．ワクチンアジュバント）
宿主細胞における抗ウイルス系を誘発することができる本発明の変異体ウイルスは、ワクチンアジュバントの理想的な候補である。当該分野で公知のように、多くの抗原が、強くない免疫原性であり、ワクチンとして使用される場合、被験体における強い免疫応答を刺激するためにアジュバントの添加が要求される。本発明は、宿主の抗ウイルス応答を誘発することにより、上記ワクチンの免疫原性を高めるワクチンアジュバントとしての変異体ウイルスの使用を意図している。本発明の一つの実施形態において、上記変異体ウイルスがインターフェロンあるいは他のサイトカインの産生を刺激することにより、ワクチンアジュバントとして作用する。
【００８６】
（４．薬学的調製物中の保護剤）
上記に示されるように、感染した細胞の抗ウイルス系を誘発する本発明の変異体ウイルスは、野生型のウイルスおよび隣接する細胞に感染しようとする他のウイルスの複製を抑制し得る。これらの変異体ウイルスによる細胞の感染は、従って、自己制限的であるだけではなく、復帰変異体の出現に対しても保護する。上記変異体ウイルスは、このように、生産の間または被験体への投与後のいずれかで、調製物中に生じる有毒な復帰変異体に対して防御するウイルスの薬学的調製物の添加剤として使用され得る。
【００８７】
（５．他の治療応用）
上述のように、本発明の変異体ウイルスによる上記宿主細胞の抗ウイルス系の誘発は、種々のサイトカインの産生を生じる。これらの変異体ウイルスは、従って、サイトカイン放出により緩和され得る疾患または障害、例えば癌、自己免疫疾患ならびに細菌、ウイルスおよび真菌感染の処置に使用され得る。
【００８８】
（６．他の細胞溶解性応用）
当該分野で公知のように、ＨＩＶおよびＨＣＶのような多くのウイルスは、感染細胞の抗ウイルス系をダウンレギュレートする。ポックスウイルス、ＢＶＤＶ、ブニヤウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルスおよびＨＰＶのような他のウイルスは、それらの複製サイクルの部分として、宿主細胞の上記抗ウイルス系応答を遮断する。結果として、これらのウイルスのうちの一つで感染された細胞は、本発明の変異体ウイルスによる感染に対して増加した感受性を有し得る。上に示すように、抗ウイルス応答を弱体化された細胞において、上記変異体ウイルスはまだ複製可能である。従って、本発明の上記変異体ウイルスは、そのような感染細胞において選択的に複製し、そしてその感染細胞を殺し得る細胞溶解剤として、使用され得る。
【００８９】
（薬学的組成物）
本発明は、本発明のウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を、さらに提供する。
【００９０】
上記薬学的組成物は、上記変異体ウイルスと、適切な賦形剤（限定されないが、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムのような懸濁剤；例えばレシチンのような天然に存在するホスファチドのような分散剤または湿潤剤が挙げられる）との混和物を含有する、水性懸濁剤の形態であり得る。上記水性懸濁剤はまた、例えば、安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピルのような保存剤を、１種以上含有し得る。上記薬学的組成物は、滅菌注射用懸濁剤の形態であり得る。この懸濁剤は、上述のような適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用しる当該分野で公知の技術に従って処方され得る。上記滅菌注射用調製物はまた、滅菌注射用溶液または非毒性で非経口投与に受容可能な希釈剤もしくは溶剤に入った懸濁剤であり得る。使用することができる受容可能なビークルおよび溶剤としては、限定されないが、水、リンガー溶液、乳酸加リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。
【００９１】
他の薬学的組成物および薬学的組成物を調製する方法は、当該分野で公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（以前は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌｉｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ（２０００）に記載されている。
【００９２】
（キット）
本発明は、免疫処置における使用のための本発明の変異体ウイルスを含有するキット、および被験体への異種の遺伝子の送達のためのベクターとしての使用のための一以上の異種遺伝子を保有する、本発明の変異体ウイルスを含有するキットを提供する。上記変異体ウイルスは、薬学的組成物の形態でキットの中に提供され得る。上記キットの個別の構成成分は、分離した容器または共通の容器に包装され、製薬もしくは生物学的産物の製造、使用もしくは販売を、規制している行政機関により処方される形態での注意書きが、そのような容器と関連し得、その注意書きは、動物もしくはヒトへの投与のための製造、使用もしくは販売の上記機関による認可を反映しうる。
【００９３】
上記キットの構成成分はまた、乾燥形態または凍結乾燥形態で供給され得、そのキットは、凍結乾燥された構成成分の再構築のための適切な溶媒を、さらに含み得る。容器の数もしくはタイプに関係なく、本発明のキットはまた、被験体への組成物の投与を補助する用具も含み得る。そのような用具としては、吸入器、シリンジ、ピペット、目薬の容器または同様な医療に認可された送達媒体であり得る。
【実施例】
【００９４】
（実施例）
実施例１：ＩＦＮ−βシグナル伝達停止における欠陥を有する腫瘍崩壊性ＶＳＶ株
（材料および方法）
（ウイルス）
ＶＳＶの上記インディアナ血清型を、この研究のいたるところで使用し、Ｌ９２９細胞で増殖した。本明細書でＡＶ１（またはＭｕｔ２）およびＡＶ２（またはＭｕｔ３）とそれぞれいうＴ１０２６Ｒ（Ｄｅｓｆｏｒｇｅｓら、２００１、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７６（１）：８７〜１０２）、およびＴＰ３（Ｄｅｓｆｏｒｇｅｓら、２００１、同書）は、この研究で、そして他でも野生型ＶＳＶのインディアナのＨＲ株（Ｆｒａｎｃｏｅｕｒら、１９８７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０（１）：２３６〜４５）のＩＦＮ誘導変異体であることが示されている。
【００９５】
（ＩＦＮ産生ＥＬＩＳＡ）
インターフェロン−αレベルを、Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、製造業者の指示に従って細胞培養培地中で測定した。簡単にいうと、１００μｌの培養培地を感染後４８時間で収集し、９６ウェルマイクロタイタープレートに、製造業者から供給されたブランクおよび標準と一緒にインキュベートした。サンプルを、製造業者の使用説明書に従って処理をし、次いでＤＹＮＥＸＴＭプレートリーダー上、４５０ｎｍで読取った。
【００９６】
（ＶＳＶ変異体ウイルスのインビボ毒性の決定）
８〜１０週齢の雌性マウス（示されている種）を、５群にわけ、１×１０１０ｐｆｕ〜１×１０２ｐｆｕまで（ウイルスとマウスの種に依存する）の１対数または１／２対数希釈のウイルスで、示された経路で感染させた。体重減少、脱水症状、立毛、群居行動、呼吸窮迫および後肢麻痺について、動物をモニターした。中程度から重篤な罹患を示すマウスをＣＣＡＳに記載されている医薬品安全性試験実施基準に従って安楽死させた。ＬＤ５０値をＫａｒｂｅｒ−Ｓｐｅａｒｍａｎ法により計算した。
【００９７】
４週齢のＢａｌｂ／ＣマウスまたはＢａｌｂ／Ｃインターフェロンαレセプターノックアウトマウス（ＩＦＮＡＲ−／−）（Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆら、１９９５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９：２１５３〜２１５８）を、鼻腔内から、１０４ｐｆｕのＷＴ  ＶＳＶ、ＡＶ１またはＡＶ２のいずれかで感染させた。マウスを罹患の徴候についてモニターし、重篤な呼吸窮迫の徴候時に安楽死させた。
【００９８】
（野生型ＶＳＶ株および変異体ＶＳＶ株の混合サンプルのインビボ毒性の決定）  Ｂａｌｂ／Ｃ  ＰＫＲ−／−マウスは、およそ１０ｐｆｕのＬＤ１００であるＷＴ  ＶＳＶによる鼻腔内感染に、非常に感受性が高いことが、以前に決定されている（Ｓｔｏｊｄｌら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：９５８０〜９５８５）。３群のマウスを、ＷＴ，ＡＶ２またはそれらの株の混合物で、鼻腔内点滴により感染させた。マウスを罹患の徴候についてモニターし、重篤な呼吸窮迫または後肢麻痺の徴候時に安楽死させた。
【００９９】
（無胸腺症マウスにおける卵巣異系移植癌モデル）
およそ１×１０６ＥＳ−２ヒト卵巣癌細胞をＣＤ−１無胸腺マウスの腹腔窩に注入した。腹水の進展が、細胞注入後１５日までに一般に観察される。１２日、１４日、１６日にマウスを、１×１０９ＡＶ２ウイルスまたは１×１０９ｐｆｕ当量のＵＶ不活化ＡＶ２  ＶＳＶを腹腔内注入により処置した。マウスを病的状態についてモニターし、腹水の進展時に安楽死させた。
【０１００】
（皮下腫瘍モデル）
皮下腫瘍を樹立するために、８〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスの右側腹部を剃毛し、Ｂａｌｂ／ｃマウスと同系の１×１０６ＣＴ２６結腸癌細胞（Ｋａｓｈｔａｎら、１９９２、Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １（３）：２５１〜６）を注入した。これらの腫瘍をそれらがおよそ１０ｍｍ３に到達する（その時にウイルス処置が開始された）まで進展させた。群の動物に、１、６および１２用量の示されたウイルスを隔日に投与した。５×１０８ｐｆｕの各用量を尾静脈注入により投与した。腫瘍を毎日測定し、体積を式１／２（Ｌ×Ｗ×Ｈ）を使用して計算した。マウスの体重を毎日測定し、体重減少、脱水症状、立毛、群居行動、呼吸窮迫、後肢麻痺についてモニターした。動物を、それらの腫瘍負荷が最終点（７５０ｍｍ３）に到達すると安楽死させた。
【０１０１】
（肺モデル）
８〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性マウスに、３×１０５ＣＴ２６細胞（Ｓｐｅｃｈｔら、１９９７、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６（８）：１２１３〜２１）を尾静脈注入し、肺腫瘍を樹立した。１０日目、１２日目、１４日目、１７日目、１９日目、および２１日目に、他で記載（Ｓｔｏｊｄｌら、２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４（２０）：９５８０〜５）されているように、マウスの群に鼻腔内点滴により５×１０７ｐｆｕの示されたウイルスを投与した。マウスの体重を毎日測定し、体重減少、脱水症状、立毛、群居行動、呼吸窮迫および後肢麻痺についてモニターした。動物を呼吸窮迫の発症の際に安楽死させ、そしてそれらの肺を、腫瘍進展を確認するために試験した。
【０１０２】
（ＭＴＳアッセイ）
各実験において、上記試験細胞株を、９６ウェルプレートに、増殖培地（１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ−Ｆ１２−ＨＡＭ）中で、３×１０４細胞／ウェルで播種した。一晩インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した後、培地を吸引して除去し、各ウェルに２０μｌのウイルス含有培地（α−ＭＥＭ、無血清）を、１０倍の増分で、３×１０６ｐｆｕ／ウェル〜３ｐｆｕ／ウェルまでの範囲で、またはウイルスを含有しない陰性コントロール培地を添加した。試験された各ウイルス用量は、６連で行った。ウイルスを付着させるために６０分インキュベートした後に、８０μｌの増殖培地を各ウェルに添加し、そのプレートをさらに４８時間インキュベートした。細胞生存率をＣｅｌｌＴｉｔｒｅ９６ＴＭ  ＡＱｕｅｏｕｓ  ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）（テトラゾリウム化合物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ）および電子カプリング試薬（フェナジンメトスルファート；ＰＭＳ）の溶液を利用している）を使用して測定した。ＭＴＳは、細胞により、組織培養培地に溶解性のホルマザン生成物に生物還元される。ホルマザン生成物の４９０ｎｍでの吸光度は、９６ウェルアッセイプレートから直接測定され得る。ホルマザン生成物の量は、４９０ｎｍでの吸光度から決定されるように、培養液中の生存細胞の数と直接的に比例する。
【０１０３】
ＩＦＮ欠損をアッセイするために、細胞株を５単位／ｍｌのＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βで、１２時間前処置し、その後上述のＷＴ  ＶＳＶの範囲の用量でチャレンジした。標準ＭＴＳアッセイを実施し、その結果を、前処置なしの細胞からの結果と比較した。
【０１０４】
（マイクロアレイ）
野生型（ＷＴ）ＶＳＶ株および変異体ＶＳＶ株でモック処置または感染のいずれかをされたＯＶＣＡＲ４細胞をＰＢＳ中に収集し、ペレット化し、そして２５０μｌの再懸濁緩衝液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５  ｍＭ  ＮａＣｌ，１２．５ｍｇ  ＭｇＣｌ２）に再懸濁した。６００μｌの溶解緩衝液（２５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．５ｍｇ  ＭｇＣｌ２  ５％  ショ糖および１％  ＮＰ−４０）を添加し、溶解物を４℃１０分間、時折ボルテックスしながらインキュベートした。核を、１０００×ｇで３分間の遠心分離により収集した。その上清（細胞質画分）を収集し、−８０℃で凍結させ、一方上記ペレット（核画分）を、一度、２５０μｌの溶解緩衝液で洗浄し、そして凍結乾燥した。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙＴＭキット（製造業者の使用説明書に従って；Ｑｉａｇｅｎ、  Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、核画分および細胞質画分の両方から単離し、引き続きＬｉＣｌ沈降により各サンプルを濃縮した。２０μｇの各ＲＮＡサンプルを製造業者の標準プロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ、ＵＳＡ）に従って処理をし、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａ  Ａｒｒａｙ（ＨＧ  Ｕ１３３Ａ  チップ）とハイブリダイズした。各チップは、１５００まで目盛をつけられ、各ＨＧ  Ｕ１３３Ａチップ上に存在する１００正規化コントロール遺伝子に対して正規化し、それから全ての核サンプルを、各遺伝子基準でモック核サンプルに対して正規化し、そして上記細胞質画分を、対応するモック細胞質サンプルに対して正規化した。データをＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇＴＭソフトウエア（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
【０１０５】
（ウェスタンブロッティング）
ＯＶＣＡＲ４細胞を１０％胎児ウシ血清（Ｗｉｓｅｎｔ）を補充したＲＰＭＩ（Ｗｉｓｅｎｔ）で増殖した。１．０×１０７細胞を感染の前日に１０ｃｍディッシュにプレートした。感染時に、上記培地を除去し、ＶＳＶウイルス株あたり５×１０７ｐｆｕの添加の前に、ＲＰＭＩ単独に置き換えた。ウイルス添加後１時間で、培地を除去し、そして実験の残りの期間、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地に置き換えた。細胞を標準ＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解し、７５μｇの全細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリロアミドゲル上で泳動し、示されるように以下の抗体：ＩＲＦ−７（ｓｃ−９０８３）、ＩＲＦ−３（ｓｃ−９０８２）、ＩＳＧ５６（Ｇｅｎｅｓ  Ｓｅｎからの贈り物）、ＶＳＶ−Ｎ（全長インディアナＮタンパク質に対するポリクローナル）およびアクチン（ｓｃ−８４３２）でブロッティングをした。
【０１０６】
（構築物およびウイルスレスキュー）
本質的に活性なＩＲＦ−７Δ（ＩＲＦ−７Δ２４７〜４６７）の作製は、以前に他で記載されている（Ｌｉｎら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：３４３２０〜３４３２７）。ＩＲＦ−７Δ２４７〜４６７を付加的５’ＶＳＶキャップシグナルおよびＸｈｏ１リンカーを有するＦｌａｇエピトープに対する順方向プライマー：５’−ＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧＡＣＡＡＧ−３’（配列番号７）およびＶＳＶポリＡシグナルおよびＮｈｅ１リンカーを有する特異的ＩＲＦ−７逆方向プライマー−：５’−ＡＴＣＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣＴＡＧＧＴＧＧＧＣＴＧＣ−３’（配列番号８）とを一緒に使用して、ＰＣＲで増幅した。
【０１０７】
上記ＰＣＲフラグメントを、それからｒＶＳＶレプリコンベクターｐＶＳＶ−ＸＮ２（Ｊｏｈｎ  Ｒｏｓｅ提供）の上記Ｘｈｏ１部位およびＮｈｅ１部位にクロ−にングした。ｒＶＳＶの回収は、以前に記載されている（Ｌａｗｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：４４７７〜４４８１）。
【０１０８】
（インターフェロンβｍＲＮＡの定量的ＰＣＲ）
感染ＯＶＣＡＲ４細胞またはモック感染ＯＶＣＡＲ４細胞からの核全ＲＮＡおよび細胞質全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書（ＲＮｅａｓｙ；Ｑｉａｇｅｎ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａ）に従って単離した。４μｇの全ＲＮＡをＤＮＡａｓｅで処理し、そして逆方向転写した。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒＴＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌａｖａｌ、Ｃａｎａｄａ）技術を使用して、定量的ＰＣＲを、各々からＩＦＮ−βおよびヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）標的を増幅するために３連で実施した。各標的アンプリコンに対して作成された標準曲線を基礎にして、交差点を絶対量に変換した。ＨＰＲＴレベルが、これらの感染の経過期間中変わらないので、ＩＦＮ−βシグナルを、引き続いてＨＰＲＴに対して正規化した。データは示されていない。ＩＦＮ−βを増幅するために使用したプライマーは以下の通りであった：センス５’−ＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＡＧＣ−３’（配列番号９）；アンチセンス５’−ＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＴＴＡＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１０）およびＨＰＲＴプライマー：  センス５’−ＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号１１）；アンチセンス５’−ＧＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１２）。
【０１０９】
（インターフェロンαおよびインターフェロン刺激遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ）
１０％ＦＢＳを補充したＦ１２Ｋ培地中で培養したＡ５４９細胞を、ＷＴ  ＶＳＶ株または変異体ＶＳＶ株（ＭＯＩ  １０、ここでＭＯＩとは感染多重度をいい、感染性ウイルス粒子の細胞に対する比である）で感染した。製造業者の使用説明書に従って、感染後４時間でトリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。１μｇのＲＮＡをオリゴｄＴプライマーで逆方向転写し、そして５％のＲＴをＴａｑ  ＰＣＲで、テンプレートとして使用した。用いたプライマーは以下の通りであった：Ｍｘ順方向プライマー５’−ＡＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１３）；Ｍｘ逆方向プライマー５’−ＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧ−３’（配列番号１４）；ＶＳＶ  Ｎ  順方向プライマー５’−ＡＴＧＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣ−３’（配列番号１５）；ＶＳＶ  Ｎ逆方向プライマー５’−ＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡＴＴＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＡＴＡ−３’（配列番号１６）；ＲＡＮＴＥＳ順方向プライマー５’−ＴＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号１７）；ＲＡＮＴＥＳ逆方向プライマー５’−ＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１８）；βアクチン順方向プライマー５’−ＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴ−３’（配列番号１９）およびβアクチン逆方向プライマー５’−ＧＡＴＧＧＧＣＡＣＡＧＴＧＴＧＧＧＴＧＡ−３’（配列番号２０）。
【０１１０】
（結果）
インビボでのＶＳＶの弱毒化は、インタクトなインターフェロン経路に依存する。
【０１１１】
インターフェロン応答性細胞に、小さいプラークを産生する（本明細書でＡＶ１およびＡＶ２という）二種のＶＳＶの改変体は、上皮細胞株の感染後、野生型（ＷＴ）のＶＳＶの２０〜５０倍のインターフェロンα（ＩＦＮ−α）を誘発することがわかった（図１Ａ）。上記変異体の完全なゲノム配列決定は、Ｍタンパク質においてＡＶ１（Ｍ５１Ｒ）の場合は、一つのみのアミノ酸置換、そしてＡＶ２では、二つのアミノ酸置換（Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ）で、野生型株と異なることを明らかにした。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに鼻腔内に送達された場合のＡＶ１およびＡＶ２のＬＤ５０は、同じ経路で送達されたＷＴ  ＶＳＶより１０，０００倍大きいことが決定された（図１Ｂ）。同様な結果が、ＣＤ−１マウスで見られた（ＷＴ＝１×１０６；ＡＶ１＝２×１０８  ｐｆｕ）。重要なことに，ＡＶ１とＡＶ２は、インビボでのＡＶ１およびＡＶ２の増殖の減弱がインタクトなインターフェロン系に依存することを示すインターフェロンレセプターをノックアウトした動物を感染するために使用される場合、野生型ウイルスと同じ程、有毒である（図１Ｃ）。さらに、ＷＴ  ＶＳＶとの組合せで使用された場合、上記変異体株ＡＶ２は、ＷＴ  ＶＳＶから高感受性マウス（ＰＫＲ−／−）を保護することがわかった（図１Ｄ）。事実、マウスが，ＡＶ２およびＷＴ  ＶＳＶを同時に投与された場合、ＷＴ  ＶＳＶのＬＤ１００より１００倍多い用量でさえ、罹患の徴候（脱水、立毛、倦怠、低下した活動度、呼吸窮迫、後肢麻痺）を示さなかった。これらの変異体が、感染後にＩＦＮが産生されることを可能にした知見と合わせて、このデータは、ＶＳＶの変異体株ＡＶ１または変異体株ＡＶ２による感染が、その宿主にインターフェロン産生を誘発し、病的感染から上記宿主を保護する抗ウイルス状態を樹立するモデルと一致する。
【０１１２】
（野生型および弱毒化ＶＳＶ変異体の両方が、生得性の抗ウイルス応答を誘発する）
感染の間のどの時点で、野生型ウイルスおよび弱毒化されたウイルスが、宿主細胞の抗ウイルス応答を誘導または不活化する能力を分出するかを決定するために、宿主細胞のＶＳＶ感染の間に起こる、早期シグナル伝達事象が、最初に樹立される必要があった。ウイルス感染過程の時間にわたるマイクロアレイ分析の使用は、抗ウイルス遺伝子の上記転写活性化に対して直接的に、または間接的につながる、ＶＳＶ感染により誘発された早期のシグナル伝達事象の検出を可能にするはずである。上記マイクロアレイデータから、ＶＳＶ感染は、特定の、連続した順で多くの遺伝子のアップレギュレーションを導く。遺伝子は、従って、以下を基礎にして群分けされる：（１）時間経過のアップレギュレーションのそれらの動態および（２）ＷＴ感染  対  変異体ＶＳＶ感染に応答するそれらの誘導パターン。遺伝子のこれらのコホートは、３種の分離した転写波（表１、ならびに図２Ａ，図２Ｂおよび図２Ｃ）に対応するようである。これと一致して、ＩＦＮ−βサブタイプ，ＩＲＦ−７サブタイプおよびＩＦＮ−αサブタイプは、コホートを分けるために、各々を分離した。他のグループは、刺激の数に応じて、潜在的転写因子ＩＲＦ−３、ＮＦκＢおよびｃ−ＪＵＮ／ＡＴＦ−２は、活性化され、発現を誘導するＩＦＮ−βプロモーター上でＣＢＰ／ｐ３００と一緒に会合することを確立した（Ｗａｔｈｅｌｅｔら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １：５０７〜５１８）。また、ＩＦＮ−βは、ＩＲＦ−７およびそれらのプロモーターのＩＳＲＥ要素を含有する他の遺伝子の誘導（Ｌｕら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：３１８０５〜３１８１２；ＺｈａｎｇおよびＰａｇａｎｏ、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１７：５７４８〜５７５７；ＺｈａｎｇおよびＰａｇａｎｏ、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７５：３４１〜３５０）を引き起こすＩＳＧＦ３転写複合体の活性化を誘導するよう、オートクリン様式で作用することが公知である。さらに、ＩＲＦ−７の異所性発現は、ＩＳＧＦ３複合体を形成することができない細胞において、ＩＦＮ−αの発現に臨界的であることが示された（Ｓａｔｏら、１９９８、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４４１：１０６〜１１０）。ＩＦＮ−α誘導の帰せられたＩＲＦ−７依存性およびＩＲＦ−７発現の帰せられたＩＦＮ−β依存性は、上述のアレイの遺伝子の動態プロフィールを暗示させるものである。これらの知見に照らしてみて、一般モデルにおいて、ＩＦＮ−β、ＩＲＦ−７およびＩＦＮ−α１を原型遺伝子と仮定して、これらの遺伝子のコホートは、３種の分離した転写波に対応し得；各々は、その前の転写波に依存し、そして誘発されると思われる（表１、ならびに図２Ａ，図２Ｂおよび図２Ｃ）。
【０１１３】
【表１】
2011103897.tif 000002
（ＷＴ  ＶＳＶ  Ｍタンパク質は、インターフェロンβシグナル伝達を遮断する一方、ＡＶ１およびＡＶ２からのＭタンパク質は遮断できない。）
ＶＳＶ感染に対する早期転写応答のよりよい理解のために、上記ＷＴと「ＩＦＮ誘導株」間のこれらの応答における差異の理解が必要であった。ウェスタンブロットにより、ＷＴウイルス、ＡＶ１ウイルスおよびＡＶ２ウイルスは、同様な動態で、ＩＲＦ−３リン酸化を誘発する（図２Ｅ）。さらに、転写因子ＩＲＦ−３、ＮＦκＢおよびｃ−ＪＵＮ／ＡＴＦ−２により直接、調節された遺伝子のいくつかは、ＷＴウイルス、ＡＶ１ウイルスおよびＡＶ２ウイルスに感染した細胞において、同程度にアップレギュレートされていることがわかった（図２Ａ）。例えば、１次応答遺伝子は、３種の全てのウイルスによる感染後、３〜６時間で、しっかりと誘導された（図２Ａ、ＤおよびＥ）。一方、ＩＦＮ−βの産生およびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のオートクリン活性化（図２Ｂ）を必要とする２次応答遺伝子は、野生型ウイルスおよび弱毒化ウイルスにより、差動的に誘導された（図２Ｂおよび２ＥのＩＲＦ−７を参照のこと）。ＷＴ  ＶＳＶ感染細胞における損なわれたＩＲＦ−７産生の結果として、ＩＮＦ−α転写物のように３次応答遺伝子産物は、ＡＶ１およびＡＶ２感染細胞では強く発現されたが、野生型ＶＳＶ感染細胞では誘導されなかった（図２Ｃ）。合わせて考えると、これらの結果は、野生型ＶＳＶが、そのＭタンパク質により図２に示されるように、１次と２次の抗ウイルス転写応答の間の遮断に影響することを示唆している。以前のトランスフェクション実験では、ＶＳＶ  Ｍタンパク質が、ＩＦＮ−βの転写を遮断するか（Ｆｅｒｒａｎ  およびＬｕｃａｓ−Ｌｅｎａｒｄ、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：３７１〜３７７）、ｍＲＮＡの核からの搬出を阻害するか（Ｈｅｒら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：１８４５〜１８４８；ｖｏｎ  Ｋｏｂｂｅら、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、６：１２４３〜１２５２）、またはＪａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝達に干渉する（Ｔｅｒｓｔｅｇｅｎら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６７：５２０９〜５２１６）かのいずれかが示唆されている。本明細書で記載されている転写物のプロフィール化研究は、後２者のメカニズムのいずれかに一致するが、しかしながら、感染細胞の外因性のインターフェロンによる上記Ｊａｋ／Ｓｔａｔ経路の誘導における障害は、観察されなかった（データは示されていない）。一方、マイクロアレイ分析またはＲＴ−ＰＣＲ分析は、核画分および細胞質画分における転写物を比較および対比するために使用された場合、野生型ウイルス感染細胞と弱毒化されたウイルス感染細胞との間に明確な差が見られた（図３）。重要なことに、ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡは、３つの全てのウイルスにより核画分に誘導されたが、野生型ウイルス感染細胞においてｍＲＮＡの細胞質プールには、著しい程度には見られなかった。
【０１１４】
全体として、これらの結果は、感染時に野生型ＶＳＶが１次抗ウイルス応答を誘発するが、ウイルス遺伝子産物の対等な発現を通して、臨界的抗ウイルスｍＲＮＡの核からの搬出を遮断することにより２次応答および３次応答を、弱めるという考え方に一致する。このモデルを支持して、構成的に活性型のＩＲＦ−７を発現する野生型ＶＳＶが、構築された。予想されたように、このウイルスは、弱毒化表現型であり、野生型ＶＳＶ  Ｍタンパク質の存在下でさえも、感染後４時間以内にＩＦＮ−α遺伝子の発現を誘導することができる（図２Ｄ；ＩＦＮ−αは、ＡＶ１感染およびＡＶ２感染の場合に、感染後１２時間まで発現されない：表１）。
【０１１５】
（弱毒化ウイルスＡＶ１およびＡＶ２は、腫瘍細胞を殺す能力を保持する）
上記弱毒化ＶＳＶ株の腫瘍崩壊的性質を評価するために、ＮＣＩヒト腫瘍細胞パネル（悪性度のスペクトルからの６０細胞株）をＷＴウイルス、ＡＶ１ウイルスまたはＡＶ２ウイルスのいずれかでチャレンジし、材料および方法に記載されているように４８時間後の代謝的細胞死をアッセイした。ＷＴ  ＶＳＶが、広い範囲の異なる癌細胞型に感染し、そして殺すことができることは、表２Ａから、明らかである。さらに、本発明者らの以前の研究（Ｓｔｏｊｄｌ  ＤＦ、Ｌｉｃｈｔｙ  Ｂ、Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓ、Ｍａｒｉｕｓ  Ｒ、Ａｔｋｉｎｓ  Ｈ、Ｓｏｎｅｂｅｒｇ  Ｎ、Ｂｅｌｌ  ＪＣ  ２０００  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：８２１〜５）が示すように、試験された癌細胞株の大多数（およそ８０％）は、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βのいずれかに対する、損なわれた応答を実証している（表２Ｂ）。従って、驚くべきことでは無いが、ＡＶ１およびＡＶ２は、ＷＴ  ＶＳＶと同じように、おそらく、これらの細胞におけるＩＦＮシグナル伝達の欠陥に起因して、これらの腫瘍細胞株を殺すことに有効であった（表２ＡおよびＢ）。
【０１１６】
【表２Ａ】
2011103897.tif 000003
【０１１７】
【表２Ｂ】
2011103897.tif 000004
（ＡＶ１およびＡＶ２のインビボ腫瘍崩壊性活性）
以前に、ヌードマウスにおける異系皮下移植腫瘍のＷＴ  ＶＳＶによる成功的な処置が報告された（Ｓｔｏｊｄｌら  ２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（７）：８２１〜５）、しかしながら、これらの実験では、外因性のインターフェロンが、上記ウイルス処置から、免疫不全の動物を保護するのに必要であった。上に記載されている結果は、ＡＶ１およびＡＶ２が、外因性に投与されたインターフェロンがない場合でさえ、ヌードマウスモデルにおいて、ほとんど毒性なしで、効率的に腫瘍細胞を殺すはずであることを示唆する。ヒト卵巣癌細胞をＣＤ−１マウスの腹腔窩に注入し、１２日間増殖をさせた。ＵＶ不活化ウイルスを受けた殆どのマウス（１４／１５）は、処置後１５日で、腹水が貯留した（このコホートの残りのマウスは、３９日の終点まで到達した）。反対に、腹腔窩に送達した３用量ＡＶ２は、マウスの７０％の持続性の治癒を提供した（図４Ａ）。注目すべきことに、単回のＷＴ  ＶＳＶの腹腔内用量が、一様にヌードマウスに致死的であるが、３用量のＡＶ２で処置された動物の一匹も、ウイルス感染の徴候（倦怠、体重減、脱水症状）さえも示さなかった。
【０１１８】
（ＡＶ１およびＡＶ２による皮下腫瘍の全身系処置）
上記ＡＶ１株およびＡＶ２株を、腫瘍を播種した最初の部位に注入した場合には有効であるが、全身系に送達された弱毒化株の治療効力を決定する必要がある。この目標に向かって、皮下腫瘍を、ＣＴ２６結腸癌細胞を同系Ｂａｌｂ／Ｃマウスの側腹後方に注入することにより樹立した。腫瘍が触知可能（およそ１０ｍｍ３）になった後、ウイルスを尾静脈注入により投与した。処置後１２日でＵＶ不活化ＶＳＶを受けたマウスは、平均腫瘍サイズが７５０ｍｍ３で終点に到達した。反対に、ＡＶ２による単回処置は顕著な効力を示し、終点までの時間を殆ど３倍（３４日）遅延させた。この処置群の８動物のうちの７匹が、部分応答者であると考えられ、一匹のマウスのみが処置に応答しなかった（表３）。多用量のＡＶ１またはＡＶ２を静脈内に投与した場合、処置の効力は顕著に増加した（図４Ｂおよび表３）。１動物の例外を除いては、全ての腫瘍は、ＡＶ１処置に応答し、３／６のマウスは腫瘍の完全な後退を示した。これらのマウスのうち２匹は、感染後それぞれ８日目および９日目と早期に、完全後退を示した。残りの動物のうちの２匹は、部分応答を示し、コントロールと比較して、腫瘍の進展の殆ど２倍の遅延を示した。全８匹のＡＶ２感染マウスが、処置によく応答し、８匹のうち５匹は、持続的な腫瘍後退であった。事実、処置後７ヶ月でさえも、腫瘍の再増殖の徴候は無かったことは明らかであった。さらに、これらのマウスは処置後７ヶ月に、ＣＴ２６細胞で再チャレンジした場合、微量のウイルスも検出できず（データは示されていない）、腫瘍が発生せず、これはおそらく腫瘍に対する宿主媒介性の免疫が進展したことを示している。
【０１１９】
担癌（ｔｕｍｏｕｒ  ｂｅａｒｉｎｇ）動物に投与するウイルス用量の数を倍にしても、持続的な後退の数は増加せず（表３）これは、処置の過程の間に生じる抗ウイルス免疫が、結果に影響し得ることを示唆している。腫瘍崩壊性ＨＳＶ（Ｌａｍｂｒｉｇｈｔら、１９９９、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、６８：１７５６〜１７６０および１７６１〜１７７２）に関して以前に記載されたアプローチにおいてもまた、ウイルス単独の代わりに、ウイルス感染細胞の注入の有用性を、治療様式として試験した。感染細胞が、ウイルスが血管系にいる間ウイルスを隠す「トロイの木馬」として、そして腫瘍新生血管にいるときにはウイルスの送達を容易にするよう機能をし得ることと判断した。この目的のために、ＡＶ２で２時間、インビトロで感染されたＣＴ２６細胞を、担癌マウスの尾静脈内に注入した。これらの実験で、感染されたＣＴ２６細胞は、精製ウイルスを使用するときと同じく、効果的なウイルスを腫瘍部位に送達する方法であるように考えられる（３匹の完全後退および１匹の部分応答；図４Ｂ）。
【０１２０】
静脈内処置の全ての形態は、マウスにより耐えられ、死亡は無くかつ罹患の徴候も最小であった。感染マウスは、初期の処置後、軽度から中程度の立毛、軽度の脱水症状およびいくらかの一時的体重減少があった（図４Ｃ）。これらの徴候は、上記初期の感染後にのみ観察され、全ての後の用量は、感染の徴候が現れなかった。
【０１２１】
【表３】
2011103897.tif 000005
（播種性疾患に対するＡＶ１およびＡＶ２の全身系投与は有効である）
ＣＴ２６細胞は、尾静脈に注入した時に、肺の内側が優勢であったが、マウスのいたるところで腫瘍が散在し、３〜４週間で死に到る。４匹のマウスの肺を、腫瘍細胞注入後１６日およびＵＶ不活化ウイルスで、処置後４日で試験した（図４）。これらの肺は、腫瘍負荷により通常の大きさの３倍、肺表面の結節として明らかであった。反対に、屠殺時の４日前にＡＶ２の単回の静脈内用量を受けた担癌同腹子は、通常の肺の大きさを有し、明らかな腫瘍結節が殆どなかった。鼻腔内滴注によるＡＶ２投与はまた、静脈内投与および鼻腔内投与の組合せが、最適のように見えるが、顕著な効力を示した（図４Ｄ）。
【０１２２】
図４Ｅは、肺腫瘍を播種し、その後ＵＶ不活化ウイルス，ＡＶ１またはＡＶ２いずれかで鼻腔内処置したマウスの生存率の図を示す。ＵＶ不活化ウイルスで処置された動物の死に到るまでの平均時間（ＭＴＤ）は、約２０日であった。しかしながら、ＡＶ１またはＡＶ２で処置されたマウスは完全に保護された。この実験は，競合的で、播種性の、免疫能のある腫瘍モデルにおけるＡＶ１およびＡＶ２の持続的治癒を産生する顕著な能力を実証した。
【０１２３】
（議論）
これらの弱毒化ウイルスと以前に報告されたＶＳＶの腫瘍崩壊性バージョンとの主な差異は、感染細胞における変異Ｍタンパク質のインターフェロン産生を遮断する能力のなさである。ＶＳＶ  Ｍは、以下を含むいくつかの主要なウイルス機能に必要な多機能タンパク質であることが示されている：出芽（Ｊａｙａｋａｒら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７４：９８１８〜９８２７）、ウイルス粒子集合（Ｎｅｗｃｏｍｂら、１９８２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、４１：１０５５〜１０６２）、細胞変性効果（Ｂｌｏｎｄｅｌら、１９９０、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、６４：１７１６〜１７２５）および宿主遺伝子発現の阻害（Ｌｙｌｅｓら、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２５：１７２〜１８０）。後者の性質は、Ｍが宿主ＲＮＡポリメラーゼ活性を遮断（Ｙｕａｎら、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７５：４４５３〜４４５８）またはタンパク質およびｍＲＮＡの両方の宿主の核の中へおよび中からの核輸送を阻害（Ｈｅｒら、１９９７、同上；ｖｏｎ  Ｋｏｂｂｅら、２０００、同上）する能力に起因するとされている。ウイルス感染を使用して本明細書で示されている結果は、核輸送の遮断が主要な機序であり、この機序により野生型ＶＳＶ株が、宿主の抗ウイルス応答を軽減してしまうということと一致する。感染細胞の転写物の本分析は、宿主細胞転写の阻害におけるＭタンパク質の役割を支持する証拠は殆ど提供せず、しかしＶＳＶ感染は、むしろ抗ウイルス遺伝子のＩＲＦ−３媒介性の刺激、引き続き感染細胞の核からの１次応答転写物輸送のＭタンパク質媒介性の遮断を誘発することを示す。この研究と特に関係するのは、Ｄａｈｌｂｅｒｇのグループの研究（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０：８５９０〜８６０１）およびトランスフェクション研究で、Ｍタンパク質が核孔タンパク質と関連し得、ｍＲＮＡ搬出を遮断させ得ることを示した他の研究（ｖｏｎ  Ｋｏｂｂｅら、２０００、同書）である。
【０１２４】
理論に拘束される意図は無いが、宿主細胞の抗ウイルスプログラムが、潜在的転写因子ＮＦκＢ、ｃ−ＪＵＮ／ＡＴＦ−２およびＩＲＦ−３の活性化により開始されることが明らかになった。上記宿主細胞にウイルスが侵入するときに、上記転写因子ｃ−ＪＵＮおよびＩＲＦ−３は、それぞれ、ＪＮＫによりリン酸化され、そして最近同定されたウイルスにより活性化されるキナーゼ（Ｊｏｈｎ  Ｈｉｓｃｏｔｔ、私信）である一方、ＮＦκＢは、上流ＩＫＫの作用を通してインヒビターＩｋＢから放出される（ＤｉＤｏｎａｔｏら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ、３８８：５４８〜５５４）。上記活性化転写因子は、上記核に転座し、ＩＦＮ−βのプロモーターのところで、エンハンソソーム複合体を協調的に形成し；ＩＦＮ−β誘導に導く（Ｗａｔｈｅｌｅｔら、１９９８、同書）。これは、本明細書でウイルス感染に対する１次転写応答としていわれる。２次転写波は、ＩＦＮ−β依存性の種々のインターフェロン刺激遺伝子の誘導により誘発されると推定されている。野生型Ｍタンパク質に関して本明細書で示されるデータは、これらの１次転写事象と２次転写事象の間の区別を描写し、いくつかの新規なウイルス応答遺伝子（ＧＡＤＤ３４，ＰＵＭＡ）を同定する支援をする。変異体Ｍタンパク質を有するウイルスによる感染後、ＩＦＮ−βによるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路のオートクリン刺激は、順々に、ＩＦＮ−αの３次誘導に臨界的なＩＲＦ−７のような２次応答遺伝子の産生を引き起こすことが明らかとなった（Ｍｏｒｉｎら、２００２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３１６：１００９〜１０２２）。実際は、Ｍタンパク質の２次および３次転写物の遮断は、野生型Ｍタンパク質が存在する場合でさえも、構成的に活性なバージョンのＩＲＦ−７（ウイルスプロモーターから）を発現することにより、克服され得る。
【０１２５】
腫瘍崩壊性治療の限界の一つは、ヒトの集団に存在する既存の抗体によるウイルスの中和であり得る（Ｉｋｅｄａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５：８８１〜８８７）。ヒト集団に固有ではない、ＶＳＶのような腫瘍崩壊性ウイルスを使用することは、重要な治療的有利点を提供するはずである。ある時点での腫瘍崩壊活性に対する用量依存性（６回の処置は１回の処置より優れる）が、本研究でわかったが、おそらく中和抗体が発生するので、さらなる用量は、治療的利益を提供しないであろう。これらの結果は、奏効するウイルス治療に対する臨界的な決定因子の一つは、抗ウイルス免疫応答が進展する前に、効率的な腫瘍部位への送達であることを示唆する。臨床的には、宿主媒介性抗ウイルス応答の進展の前に、できるだけ頻度多く最大耐性ウイルス用量を送達することが重要そうである。個別の患者に必要な正確な用量の決定は、当該分野で働く臨床医の能力の十分な範囲内で、従って、特定の投薬量を本明細書で議論する必要はない。
【０１２６】
ウイルス治療に先立つ患者の免疫抑制に関わる戦略は、原則的には有用であるが、しかしながら、ウイルスの腫瘍崩壊治療の重要な構成成分は、腫瘍細胞表面上でのウイルスタンパク質の発現により開始される抗腫瘍応答であることが分かっている（データは示されていないおよびＴｏｄｏら、１９９９、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１０：２７４１〜２７５５）。
【０１２７】
本明細書で示されているウイルス感染細胞の注入またはポリマーでのウイルス調製物の被覆（Ｆｉｓｃｈｅｒら、２００１、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８：３４１〜３４８）のような、他の戦略は、おそらく、価値ある宿主の免疫応答を損なわずに、治療剤を腫瘍部位に送達する機会を提供する。本明細書で示されているデータは、ＮＣＩパネルの細胞株の大多数が傷害された応答を伴う、インターフェロンシグナル伝達の欠陥が、腫瘍の進展の間、頻繁に発生することを示している。増え続けるデータは、インターフェロンが、細胞増殖、アポトーシスおよび抗ウイルス経路を協調的に調節し得る多機能サイトカインであることを示している。おそらく腫瘍の進展の間に、容赦のない増殖およびアポトーシスの損失の選択が、抗ウイルス活性の時折の必要性を凌駕する。
【０１２８】
理想的には、腫瘍崩壊性ウイルスは、悪性細胞において優先的に複製し、原発性腫瘍から転移部位への伝播する能力を有し、最終的には宿主により一掃される。上記弱毒化ウイルスＡＶ１およびＡＶ２が、これらの特質の全てを具体化し、正常細胞において抗ウイルス応答を誘発するそれらの能力の故に、インビボで例外的に安全であり得る証拠が、本明細書で示されている。実際に、インターフェロンの抗ウイルス効果に耐性のＶＳＶ変異体（Ｎｏｖｅｌｌａら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：６４１４〜６４１７）を選択することは、今まで不可能であると証明されており、そしてＷＴ  ＶＳＶによる感染に対して宿主をトランスで保護する変異体を誘導するこれらのＩＦＮの能力が示されている（図１Ｄ）。従って、粒子の大多数が、強力なインターフェロン誘発因子であるウイルスの集団において、優勢に発生する野生型変種の可能性は、殆どないという可能性がある。ＩＦＮ誘発ウイルスによる感染で生じる「サイトカイン雲」は、宿主をより有毒なＷＴ株から保護する（図５を参照のこと）。これらの細胞は、そのような「サイトカイン雲」に、応答するのに欠陥があることが示されているので、腫瘍を殺すことには、影響されない。
それ故、上記治療指標は増加し、腫瘍崩壊性ウイルスの癌治療剤としての潜在力をさらに改善する。
【０１２９】
（実施例２：レスキューされた変異体ＶＳＶ）
一連の組換えウイルスを、インターフェロン誘発変異体の産生に有用な変異体の範囲を試験するために、構築した。この目的のために、プラスミドｐＸＮ−１（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ＭＪ、Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅ  Ｌ、Ｗｈｉｔｔ  ＭＡおよびＲｏｓｅ  ＪＫ（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４、２３１８〜２３２３）からＮ遺伝子，Ｇ遺伝子およびＬ遺伝子ならびにＡＶ１からのＰ遺伝子およびＭ遺伝子を含有するキメラウイルス骨格を作った。それらのＭ遺伝子のみが異なる一連のウイルスを作製した後、添付図（図６および図７）に示すように、Ｍ遺伝子改変体を順に置換して産生した。例えば、ＸＮＤＧ  Ｍ４は、ｐＸＮ−１からの上記Ｎ遺伝子，Ｇ遺伝子およびＬ遺伝子、ＡＶ１からのＰ遺伝子ならびにメチオニン５１が欠失しているＭ遺伝子を含有している。ＸＮＤＧ  Ｍ５は、メチオニン５１、アスパラギン酸５２、スレオニン５３およびヒスチジン５４と４つのアミノ酸の欠失を有するＭ遺伝子（図７）を有する。表４（以下）に本発明者らが示すように、これらの２種の変異体は、メチオニン５１がアルギニンに変換された（すなわちＭ５１Ｒ）天然に存在する変異体（Ｍｕｔ２もしくはＡＶ１）として、３種の腫瘍形成性のヒト細胞株を殺すことに等しく有効である。ＸＮＤＧ  Ｍ４およびＸＮＤＧ  Ｍ５は、欠失変異体であるので、これらの組換えウイルスが、本来のメチオニン５１の遺伝子型に復帰するのは、ずっと難しい。さらに、操作された上記ウイルスは、依然、効果的に腫瘍細胞を殺すことができるが、それらはインターフェロン応答性細胞上で小さいプラークを形成し、これらのウイルスがインターフェロンに応答し得る細胞での増殖のために弱毒化されていることを示している（図８）。
【０１３０】
プラークアッセイを実施するために、Ｖｅｒｏ細胞を、直径６０ｍｍの組織培養ディッシュで、１０％ウシ血清を補充したａＭＥＭ培地に集密的に播種し、通常の組織培養条件下で、少なくとも３時間、付着するよう放置した。上記サンプルウイルス懸濁液を、無血清αＭＥＭで、１／２対数ごとに（例えば、１０−４、１０−４  １／２、１０−５、１０−５１／２、・・・等）連続希釈した。培地を６０ｍｍディッシュから吸い取り、各ディッシュに、１００μｌのウイルス懸濁液を加え、通常の組織培養条件下で４５分間インキュベートした。４５分のインキュベーションに続き、上記ディッシュを４２℃で、１％アガロースと（２０％胎児ウシ血清を補充した２×ＭＥＭ）の３ｍｌの１：１の混合物を重層した。上記ディッシュを、その後一晩インキュベートし、翌朝プラークを計数した。
【０１３１】
ＯＶＣＡＲ（ヒト卵巣癌細胞株）、２９３Ｔ（ＳＶ−４０からのラージＴ抗原により形質転換されたヒト腎臓細胞株）およびＵ２ＯＳ（ヒト骨肉腫細胞株）細胞株を、ＡＶ１（Ｍｕｔ２）、ＸＮＤＧ  Ｍ４ウイルスおよびＸＮＤＧ  Ｍ５ウイルスに感染させ、時間経過後、上述の如くＭＴＳアッセイを使用して、細胞生存率を決定した。表４に提供されるデータは、レスキューされた変異体ＶＳＶが、ＡＶ１と比較して類似の殺傷特性を有することを実証する。
【０１３２】
【表４】
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（実施例３：ＧＦＰ−Ｍタンパク質融合タンパク質  緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のアミノ末端と融合する場合、ＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質のアミノ末端（アミノＭ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１）は、この融合タンパク質をミトコンドリアに標的化する（図９および図１０）。ＶＳＶインディアナ株のＭの最初の７２のアミノ酸は、ＧＦＰを標的化することができる。メチオニン３３（Ｍ３３）で開始する融合タンパク質はまた、ＧＦＰをミトコンドリアに標的化することができるが、最初の５０アミノ酸のみではできない。メチオニン５１（Ｍ５１）は、必要ではない。ＧＦＰのＣ末端で融合する場合、これらの配列は、上記融合タンパク質をミトコンドリアに標的化せず、従って、これらの配列は、この標的化を達成するために組換えタンパク質のアミノ末端でなければならない。
【０１３３】
図９および図１０に示されるように、アミノ末端７２アミノ酸とＧＦＰ（アミノＭ＋７２−ＧＦＰ−Ｎ１）との間の融合タンパク質が、培養細胞で一時的に発現する場合：１）上記融合タンパク質は、ミトコンドリアに標的化される、２）上記ミトコンドリアは、通常の網様管状組織を失い、小斑点のある核周囲構造に崩壊し、３）上記膜電位を失う。これらは、死細胞の証明である。
【０１３４】
ＶＳＶマトリックスタンパク質は、上記ウイルスの細胞傷害性において役割を担っている毒性タンパク質として、認識されている。Ｍタンパク質の転写は、３者（Ｍ１、Ｍ３３、およびＭ５１）択一のＡＴＧコドンで開始し、より短いアイソフォームを産生し得ないＭ３３およびＭ５１で変異したウイルスは、著しく細胞傷害性が、減少していた。もはやミトコンドリアに標的化されない変異体ＶＳＶ  Ｍタンパク質を有するウイルスは、より細胞傷害性が低い。
【０１３５】
（実施例４．ＶＳＶで誘発される罹患に対する保護）
本研究は、全身投与された変異体ＶＳＶ（ΔＭ５１）が、ＶＳＶの致死的頭蓋内投与に対して保護し得ることを実証する。
【０１３６】
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群にＰＢＳ、ＷＴ  ＧＦＰ  ＶＳＶ（１ｅ８  ｐｆｕ）またはΔＭ５１  ＧＦＰ  ＶＳＶ（１ｅ８  ｐｆｕ）のいずれかを静脈内に注入した（感作した）。２４時間後、全てのマウスに２ｅ７  ｐｆｕのΔＭ５１  ＶＳＶ（５μｌのＰＢＳで）頭蓋内に接種し、罹患の徴候および麻痺をモニターした。
【０１３７】
結果を図１７Ａおよび１７Ｂに示す。図１７Ａは、ΔＭ５１で感作したマウスの１００％が生存し、一方ＷＴで感作したマウスおよびＰＢＳコントロールで感作したマウスの全てが、後肢麻痺を進展させ、安楽死させたことを実証するＫａｐｌａｎ  Ｍｅｙｅｒ生存率プロットを提供する。図１７Ｂは、静脈内処置後の経時的なマウスの体重のプロットである。ΔＭ５１で感作したマウスは、体重減少はなかったが、一方ＷＴで感作したマウスおよびＰＢＳコントロールで感作したマウスは、安楽死の前に、極端な体重減少を示した。
【０１３８】
（実施例５：ＶＳＶ感染後のインターフェロン産生）
本研究で示されたデータは、変異体ＶＳＶに感染された細胞が、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを分泌し、ＷＴ  ＶＳＶに感染されたそれらの細胞は、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを分泌しないか、または産生しても非常に僅かな量であったことを実証する。
【０１３９】
（βインターフェロン）
ＯＶＣＡＲ４細胞、ＣＡＫＩ−１細胞およびＨＯＰ６２細胞をＷＴ  ＶＳＶ株または変異体ＶＳＶ株のいずれかに感染（ＭＯＩ  １０  ｐｆｕ）させた。感染後１０時間で、その感染細胞についてＥＬＩＳＡでＩＦＮ−βの産生をアッセイした。ＡＶ１感染細胞およびＡＶ２感染細胞は、分泌ＩＦＮ−βを産生するが、ＷＴ  ＶＳＶ感染細胞は産生しなかった。上記ＥＬＩＳＡを、市販のヒトＩＦＮ−β検出キット（ＴＦＢ  ＩＮＣ；東京  日本）を使用して実施した。本研究の結果を、図１８に図示する。
【０１４０】
本研究で使用された細胞株は、市販で、例えばＮＣＩの新薬開発プログラムから入手可能である。上記３種の細胞株は、それらが、いくらかインターフェロン応答性である癌の２０％の中に入っているので、本研究のために選択した、全てヒト癌である。ＯＶＣＡＲは、卵巣癌細胞であり、ＨＯＰ６２は、肺癌細胞であり、そしてＣＡＫＩ−１は、腎臓癌である。各症例において上記細胞を、ＭＴＳアッセイで記載したように感染させた（実施例１を参照のこと）。
【０１４１】
（αインターフェロン）
マウスＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、マウス血清のＩＦＮ−βレベルをアッセイした。雌性Ｂａｌｂ／Ｃ（１０週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をＰＢＳまたはＰＢＳで希釈した１×１０８  ｐｆｕのＷＴ  ＧＦＰもしくは１×１０８  ｐｆｕのＡＶ３  ＧＦＰ（ここで、ＡＶ３は、メチオニン５１が完全に欠失している、ＶＳＶの操作されたバージョンである）を静脈内に、注入した。感染後示された時間に、血液を各マウスの伏在静脈からヘパリン化した試験管に収集し、遠心分離をして、血清を得た。各サンプルについて、５μｌの血清を９５μｌのＰＢＳに希釈して製造業者の使用説明書に従ってアッセイした。下の表５に提供した上記結果は、ΔＭ５１変異体に感染させたマウスは、ＷＴ  ＶＳＶに感染させたマウスよりも早く、かつ多くの量のＩＦＮ−αを産生したことを実証する。上記未処置のマウスは検出できる量のＩＦＮ−αを産生しなかった。
【０１４２】
【表５】
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（実施例６）
ΔＭ５１−ＶＳＶによるマウスのインビボ処置は、担癌ＶＳＶ未処置マウスからの脾臓細胞による溶解と比較して、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性のＣＴ２６腫瘍細胞標的の溶解を、劇的に増強することが分かった。
【０１４３】
樹立したＣＴ２６皮下腫瘍を持つＢａｌｂ／ｃマウスを５×１０８  ｐｆｕ  ΔＭ５１  ＶＳＶでまたは無しで静脈内に処置した。７日後、脾臓細胞を収集し、そして照射されたＣＴ２６腫瘍細胞と５：１の比で培養した。インビトロ刺激の７日後、脾臓細胞の抗ＣＴ２６ＣＴＬ活性についてアッセイした。本研究の結果を、図１９Ａに図示する。そこにはエフェクター脾臓細胞の非存在下でＣＴ２６標的腫瘍細胞の自然発症的な溶解のバックグラウンドより上の腫瘍特異的溶解％を、エフェクター：標的比（標的細胞は、腫瘍細胞で，脾臓細胞はエフェクター細胞またはキラー細胞である）に対してプロットした。
【０１４４】
ＷＴウイルスまたはΔＭ５１ウイルスにより誘発される免疫応答にもまた、定性的な差異を観察した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを５×１０８  ｐｆｕの野生型ＶＳＶまたはΔ５１−ＶＳＶで、静脈内より処置し、７日後に脾臓細胞を収集して、照射されたＣＴ２６腫瘍細胞と共培養した。培養７日後、抗体結合磁性ビーズによるＮＫ細胞の事前の除去をする場合としない場合の脾臓細胞について、ＣＴ２６細胞に対する溶解アッセイをした。野生型ＶＳＶおよびΔＭ５１−ＶＳＶでのマウスの処置により、ウイルス感染の間にそれらの腫瘍抗原に、以前のインビボ曝露なしで、インビトロでのＣＴ２６腫瘍抗原に対する強力な１次免疫応答発生のために脾臓細胞を感作した。これは、ＶＳＶ治療が、新規抗原に対してインビトロで引き続き１次応答発生のため、インビボで脾臓細胞を感作していることを示している。野生型ＶＳＶ治療後のＣＴ２６細胞に対する上記溶解活性は、ＮＫ依存性であった。ΔＭ５１−ＶＳＶ治療後のＣＴ２６細胞に対する上記溶解活性は、ＣＴＬ媒介性であった。これは、ＷＴ  ＶＳＶによる治療後に対してΔＭ５１  ＶＳＶ治療後の定性的に異なる免疫学的感作事象を示している。これらの結果を、図１９Ｂに示す。このデータはまた、ＣＴ２６細胞に対して、主に生得的なＮＫ細胞が媒介するエフェクターメカニズムを発生させる野生型感染とは対照的に、保護的な免疫学的記憶の進展の潜在力を有し、効力のある適応免疫（ＣＤ８＋Ｔ細胞が媒介する溶解）を誘発する、ΔＭ５１  ＶＳＶの優れた能力を示唆している。
【０１４５】
本研究は、上記変異体ウイルスが、野生型ウイルスとは定性的に異なる応答を誘導することを示している。このアッセイにおいてＣＴＬ細胞の誘導は、上記変異体ウイルスの場合にのみ見られる。ＮＫ応答は記憶を有しないが、上記ＣＴＬ応答は、長期保護応答である。この異なる応答の誘導は、上記変異体ウイルスのサイトカイン誘導に起因するようである。
【０１４６】
（実施例７：変異体ＶＳＶ処置された腫瘍の免疫組織化学染色）
変異体ＶＳＶの腫瘍に対する効果を研究するために、皮下ＣＴ２６腫瘍を持つＢａｌｂ／ｃマウスを、静脈内にΔＭ５１  ＶＳＶ  ＧＦＰで処置した。２、５または８日後、上記マウスを安楽死させ、腫瘍を素早く凍結し、後で切片（５μｍ）を作製し、ＶＳＶ、活性カスパーゼ３および全白血球マーカーであるＣＤ４５のための免疫組織化学染色を行った。標準的技術を、本研究で使用した。上記染色切片の写真を図２０に示す。陽性染色は褐色で、一方、全ての核をヘマトキシリンで青に対比染色した。Ｈ＆Ｅ染色は、腫瘍の形態を示している（Ｈ＆Ｅ染色は、その腫瘍の全体的な構造を示す非特異的染色である）。
【０１４７】
上記変異体ＶＳＶ処置腫瘍の免疫組織化学染色は、大量のアポトーシスおよび白血球蓄積を明らかにした。本研究は、変異体ＶＳＶが優れた腫瘍崩壊剤であることを実証する。なぜなら、感染していない腫瘍細胞の死を誘導するからである（即ち、アポトーシスを耐えたカスパーゼ３＋細胞）。理論に拘束される意図はないが、再び上記ウイルスが、感染ウイルスに先んじて腫瘍細胞を殺す細胞傷害性のサイトカインの産生を誘導するので、このことはもっともらしい。さらに、上記変異体ウイルスは、上記腫瘍を浸潤し得、そして攻撃し得る白血球（ＣＤ４５＋細胞）を漸増させる。上記ＣＤ４５＋細胞は、上記変異体ウイルスが細胞を感染させた後、腫瘍細胞のウイルス感染により誘導されるサイトカインに応答する。
【０１４８】
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示し、そして本明細書に、個別の刊行物、特許または特許出願が参考として援用されているように具体的におよび個別に示されたのと同じ程度に、参考として援用されている。
【０１４９】
本発明の実施形態がこのように記載されると、それらの実施形態が、様々に変化され得ることは明白である。そのようなバリエーションは、本発明の精神と範囲から逸脱するものとは見なされるべきではなく、全てのそのような改変は、当業者には特許請求の範囲内に包含されるよう意図していることは明らかである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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