(57)【要約】      （修正有）【課題】穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて被検大麦を選別することができ、かつ作業が容易で、多検体を短時間で処理することができ、大麦育種現場への応用に適した被検大麦の選別方法を提供すること。【解決手段】特定の塩基配列を多重整列して特定される多型マーカーＡ〜Ｃに基づき、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし配列番号３及び４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたＰＣＲによって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて、多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定するか、多型マーカーＢ及び多型マーカーＣに基づいて遺伝子型を決定し、（ｉ）決定した塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、又は（ｉｉ）決定した遺伝子型が特定の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列することによって特定される多型マーカーに基づく被検大麦の選別方法であって、
多重整列した際に、
配列番号７に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＡ、
配列番号６に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＢ、
配列番号５に記載の塩基配列と、対応する配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＣとし、
前記被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて、前記多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定するか、前記多型マーカーＢ及び前記多型マーカーＣに基づいて遺伝子型を決定し、
（ｉ）該決定した遺伝子型が配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、又は、
（ｉｉ）該決定した遺伝子型が配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、
を選別する被検大麦の選別方法。
【請求項２】
前記増幅ＤＮＡ断片を用いた遺伝子型の決定が、前記増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩにより消化して得られる切断断片の数又はサイズを検出することによるものである、請求項１に記載の選別方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の選別方法において選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の選別方法において、
（ｉ）として選別された大麦又は（ｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦から麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の選別方法において、
（ｉｉ）として選別された大麦又は（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦から麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の麦芽製造方法により得ることのできる麦芽。
【請求項７】
仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、
前記仕込工程で用いる大麦原料が、請求項１又は２に記載の選別方法において（ｉ）として選別された大麦、当該大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦、又はこれらから得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法。
【請求項８】
仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、
前記仕込工程で用いる大麦原料が、請求項１又は２に記載の選別方法において（ｉｉ）として選別された大麦、当該大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦、又はこれらから得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の製造方法により得ることのできる麦芽発酵飲料。
【請求項１０】
配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大麦の選別方法、麦芽及び麦芽発酵飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
大麦は収穫前の低温、降雨などの影響により、穂の状態で発芽することがあり、この現象は穂発芽と呼ばれている。穂発芽が起こると、種子貯蔵物質であるでんぷんやタンパク質が分解され、更に発芽率が低下する（非特許文献１）。このため穂発芽が起きた大麦は、製麦用として採用されないことがあり、穂発芽は農家にとって最も重要な問題の一つである。穂発芽性は種子休眠性と密接な関係がある。種子休眠性は、発芽に好適な条件下でも、種子が発芽しない性質であり、大麦品種間差が存在することが知られている。
【０００３】
これまでに種子休眠性に関しては様々な遺伝解析が行われており、北海道系譜系統の分析では、５Ｈ染色体長腕部末端のＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）マーカーＡＢＧ３１４と種子休眠性との関係が示唆されている（非特許文献２）。また、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／Ｍｏｒｅｘ、Ｃｈｅｖｒｏｎ／Ｓｔａｎｄｅｒ、Ｓｔｅｐｔｏｅ／Ｍｏｒｅｘ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／ＴＲ３０６、Ｔｒｉｕｍｐｈ／Ｍｏｒｅｘ、Ｃｈｅｖｅｃ／Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの各集団を用いた種子休眠性の量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｒａｉｔ  Ｌｏｃｕｓ；ＱＴＬ）解析により、解析に用いた集団により差はあるものの、いずれの集団の場合でも５Ｈ長腕末端付近に高い寄与率（１５−７１％）で統計的に有意なＱＴＬが検出されている（非特許文献３−７）。さらに、５Ｈ長腕末端付近以外にも集団によっては５Ｈセントロメア付近、４Ｈ、７Ｈ、１Ｈ、２ＨにもＱＴＬが検出されている（非特許文献３−７）。
【０００４】
一方、麦芽のＫｏｌｂａｃｈ  Ｉｎｄｅｘ（ＫＩ）は、麦芽全窒素含有量に占める可溶性窒素分の割合を示す値であり、麦芽中の窒素成分や糖がどの程度分解され、可溶化、低分子化されているかを評価する上で最も重要な指標の一つである。ＫＩの値が低すぎると麦汁の窒素分が不足し、発酵に大きく影響する。一方、ＫＩが高すぎるとビールを醸造したときの味のバランス等に影響する。このため麦芽のＫＩは適当な値の範囲内でなければならない。麦芽のＫＩは製麦時の浸麦度や発芽時間等の製麦条件で制御されるが、同一の条件で製麦しても、大麦品種間によってＫＩの値が異なることが知られている。
【０００５】
ミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統を用いた麦芽ＫＩのＱＴＬ解析により、前述のＲＦＬＰマーカーＡＢＧ３１４に統計的に有意なＱＴＬが検出されたことが報告されている（非特許文献８）。さらに、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／ＴＲ３０６、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ／Ｍｏｒｅｘの集団を用いた麦芽ＫＩのＱＴＬ解析により５Ｈ染色体にＱＴＬが検出されている（非特許文献９、１０）。
【０００６】
大麦に限らず様々な作物においてＤＮＡ多型やタンパク質含量を指標とした分子選抜技術が進歩している。分子選抜技術の中でもＤＮＡマーカーによる選抜は、育種初期世代での選抜が可能であること、操作性に優れること、育種後代に進める種子を使用せず葉で種子の形質の解析が可能なことなどの理由から盛んに研究開発が進められている。ＤＮＡマーカーを利用した選抜方法として、ＲＦＬＰ法、Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ法（ＣＡＰＳ法）など、様々な方法が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．，（１９９４）５２：７６−８３頁．
【非特許文献２】育種学研究（２００７）９（別冊１号）１８７頁．
【非特許文献３】Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．，（２００９）４９：８４１−８４９頁．
【非特許文献４】Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｔ．，（１９９６）９２：８７−９１頁．
【非特許文献５】Ｉｎ：Ｋ．Ｎｏｄａ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｍａｒｅｓ（ｅｄ．）Ｐｒｏｃ．Ｏｆ  ｔｈｅ  ７ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｏｎ  Ｐｒｅ−ｈａｒｖｅｓｔ  Ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｅｒｅａｌｓ．Ｃｅｎｔ．Ａｃａｄ．Ｓｏｃ．  Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ．，（１９９６）２０５−２１２頁．
【非特許文献６】Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｔ．，（２００４）１０９：６２−７０頁．
【非特許文献７】Ａｕｓｔ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｒｅｓ．，（２００３）５４：１３０３−１３１３頁．
【非特許文献８】Ｍａｔｅｒ  Ｂｒｅｗ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｔｅｃｈ．Ｑ．，（２００６）４３：９−１４頁．
【非特許文献９】Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｔ．，（２０００）１０１：１７３−１８４頁．
【非特許文献１０】Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．，（１９９７）３７：５４４−５５４頁．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
種子休眠性及び麦芽ＫＩに関して、これまでにＲＦＬＰ法で利用可能なＤＮＡマーカーとして、非特許文献２及び８に記載されたＡＢＧ３１４がＲＦＬＰマーカー化されている。しかしながら、このＲＦＬＰマーカーはゲノムＤＮＡの制限酵素切断とサザンハイブリダイゼーションをもとにした検出法であり、作業が煩雑で、遺伝子型を判別するのに多大な時間を要し、更に多検体を処理するには不向きな方法であった。このため、サンプル処理点数に制限があり、処理に多大な時間を要していたため、育種の現場で用いることは困難であった。
【０００９】
ゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅ＤＮＡ断片を得て、その増幅ＤＮＡ断片に含まれるＤＮＡマーカーを検出する方法は、同時に処理できる検体数を増やすことができ、かつ簡易な操作で短時間に検出が可能であるため、大麦育種の現場で用いるには有利である。特に、ＣＡＰＳ法は葉から抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲとそのＰＣＲ産物の制限酵素切断、及び電気泳動のみで遺伝子型を判定できる点で優れており、ＣＡＰＳマーカーの構築が望まれる。
【００１０】
上述のＲＦＬＰマーカーＡＢＧ３１４領域は、公知の塩基配列情報に基づいて構築したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した増幅ＤＮＡ断片をＤＮＡマーカーの検出に用いることが困難であった。これは、ＡＢＧ３１４と塩基配列が非常に類似したゲノムＤＮＡ領域が存在するため、標的領域とともに非標的領域もＰＣＲにより増幅されてしまうことが原因であった。また、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩについて大麦育種現場への応用に有効なＤＮＡマーカーはこれまでに報告されていない。
【００１１】
そこで本発明は、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて被検大麦を選別することができ、かつ作業が容易で、多検体を短時間で処理することができ、大麦育種現場への応用に適した被検大麦の選別方法の提供を目的とする。
【００１２】
本発明は更に、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて選別した大麦を用いた麦芽及びその製造方法並びに麦芽発酵飲料及びその製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列（マルチプルアラインメント）することによって特定される多型マーカーに基づく被検大麦の選別方法であって、
多重整列した際に、
配列番号７に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＡ、
配列番号６に記載の塩基配列と、対応する配列番号５及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＢ、
配列番号５に記載の塩基配列と、対応する配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＣとし、
上記被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて、少なくとも１つの上記多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定するか、又は少なくとも１つの上記多型マーカーＢ及び少なくとも１つの上記多型マーカーＣに基づいて遺伝子型を決定し、
（ｉ）決定した遺伝子型が、配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、又は、
（ｉｉ）決定した遺伝子型が、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別する被検大麦の選別方法を提供する。
【００１４】
上述の選別方法において、（ｉ）の被検大麦を選別することによって、穂発芽性が高く、種子休眠性が低く、かつ麦芽ＫＩ値がより高い被検大麦を得ることができる。一方、（ｉｉ）の被検大麦を選別することにより、穂発芽性が低く、種子休眠性が高く、かつ麦芽ＫＩがより低い被検大麦を得ることができる。上記選別方法は、ＰＣＲ法により増幅したゲノムＤＮＡを用いて多型を検出することに基づくため、選別にかかる労力が大幅に低減できる。また、作業が容易で、多検体を短時間で処理することができる。また、本発明の被検大麦の選別方法によれば、大麦育種の初期段階で穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて被検大麦を信頼性よく選別することができる。
【００１５】
ＡＢＧ３１４には、塩基配列が非常に類似したゲノムＤＮＡ領域が存在しているため、公知の塩基配列情報に基づいて構築したオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより増幅ＤＮＡ断片を得ることが困難であった。本発明は、その類似したゲノムＤＮＡ領域を実質的に増幅することなく、ＡＢＧ３１４のみを特異的にＰＣＲで増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー対を設計し、このオリゴヌクレオチドプライマー対を用いることで、ＡＢＧ３１４の内部配列における大麦品種間多型を明らかにし、その大麦品種間多型と穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩとの間に統計的に有意な関係があることを見出したことによるものである。
【００１６】
上記被検大麦の選別方法においては、上記増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩにより消化して得られる切断断片の数又はサイズを検出することにより遺伝子型を決定することが好ましい。
【００１７】
上記増幅ＤＮＡ断片中には、配列番号７に記載の塩基配列のみに制限酵素ＣｌａＩによる認識配列を形成する多型マーカーＡが存在するため、上記増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩによって消化することにより、切断断片の数又はサイズの違いによって、その多型マーカーＡの遺伝子型を決定することができる。これにより、ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の制限酵素消化、切断断片の数やサイズの検出といった本技術分野において汎用されている手法のみによって上記選別が可能となるため、選別にかかる労力が更に低減できる。また、作業がより容易で、より多検体をより短時間で処理することができる。
【００１８】
本発明はまた、上記被検大麦の選別方法において（ｉ）として選別された大麦同士を交配すること又は（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦を提供する。
【００１９】
上記被検大麦の選別方法において（ｉ）として選別された大麦同士を交配することにより、上記多型マーカーの遺伝子型が配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する交配後代系統の大麦を得ることができる。したがって、このようにして得られた交配後代系統の大麦は、穂発芽性が高く、種子休眠性が低く、かつ麦芽ＫＩ値が高いという特性を有する。同様に、上記被検大麦の選別方法において（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより、上記多型マーカーの遺伝子型が配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する交配後代系統の大麦を得ることができる。このようにして得られた交配後代系統の大麦は、穂発芽性が低く、種子休眠性が高く、かつ麦芽ＫＩが低いという特性を有する。また、収穫前の低温、降雨などの影響により、穂の状態で発芽しにくく、種子貯蔵物質であるでんぷんやタンパク質の分解が生じにくいため、製麦用大麦としての栽培効率を向上させることができる。
【００２０】
本発明は、上記選別方法において（ｉ）として選別された大麦又は（ｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦（以下、まとめて「（ｉ）型大麦」ともいう。）を用いて麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法を提供する。（ｉ）型大麦は、種子休眠性が低く、かつ麦芽ＫＩ値が高いため、浸麦時間や発芽日数を短縮しても一定の品質を維持できる。したがって、麦芽製造コストの低減及びＣＯ２排出量の削減が可能である。
【００２１】
本発明は、上記選別方法において（ｉｉ）として選別された大麦又は（ｉｉ）として選別された大麦同士を交配することにより得ることのできる交配後代系統の大麦（以下、まとめて「（ｉｉ）型大麦」ともいう。）を用いて麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、上記いずれかの麦芽製造方法により得ることのできる麦芽を提供する。（ｉ）型大麦は麦芽ＫＩが高い傾向にあり、一方、（ｉｉ）型大麦は麦芽ＫＩが低い傾向にある。麦芽ＫＩは、製麦工程中にタンパク質や糖などがどの程度可溶化、低分子化されたかを示す指標の一つであり、麦芽ＫＩの異なる麦芽を原料とする麦芽発酵飲料は、それぞれ異なる風味を呈する。したがって、上記麦芽を適切に用いることにより、麦芽発酵飲料の風味を制御することができる。
【００２３】
本発明は、仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、上記仕込工程で用いる大麦原料が、（ｉ）型大麦又は（ｉ）型大麦から得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。（ｉ）型大麦は麦芽ＫＩ値が高いため、仕込時間を短くしてもアルコール発酵に必要な成分を抽出できる。したがって、仕込時間を短縮することができ、麦芽発酵飲料の製造コストの低減及びＣＯ２排出量の削減が可能である。
【００２４】
本発明は、仕込工程と、発酵工程とを少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法であって、上記仕込工程で用いる大麦原料が、（ｉｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦から得ることのできる麦芽である、麦芽発酵飲料の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、上記いずれかの麦芽発酵飲料の製造方法で得ることのできる麦芽発酵飲料を提供する。（ｉ）型大麦は麦芽ＫＩが高く、一方、（ｉｉ）型大麦は麦芽ＫＩが低いため、（ｉ）型大麦を原料とした麦芽発酵飲料及び（ｉｉ）型大麦を原料とした麦芽発酵飲料はそれぞれ異なる風味の麦芽発酵飲料とすることができ、消費者のニーズに合わせた麦芽発酵飲料の提供が可能となる。
【００２６】
本発明は、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を提供する。上記オリゴヌクレオチドプライマー対は、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにおいて、標的領域を特異的に増幅することができる。これにより、増幅ＤＮＡ断片を用いた多型マーカーの遺伝子型の検出が可能となる。
【発明の効果】
【００２７】
従来の麦芽ＫＩに関するＤＮＡマーカーはＲＦＬＰ法によるものであり、遺伝子型を判定するのに煩雑な操作と多大な時間を要していたが、本発明の選別方法では簡易ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ、制限酵素処理、電気泳動といった基本的かつ比較的容易な操作のみで遺伝子型を判別することができ、多点数を短時間で処理することが可能である。
【００２８】
また、本発明の選別方法によれば、穂発芽性、種子休眠性及び麦芽ＫＩに基づいて被検大麦を選別することができ、かつ作業が容易で、多検体を短時間で処理することができ、大麦育種の初期段階で信頼性よく被検大麦種の選別ができる。したがって、大麦育種現場への応用に適している。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】大麦品種の休眠指数（％）、７２時間後発芽率（％）、穂発芽性スコアを示すグラフである。
【図２】制限酵素ＡｌｕＩによる多型検出例を示す写真である。
【図３】ＡＢＧ３１４領域の塩基配列（ＡＢＧ）とＡＢＧ３１４領域と類似した非標的ゲノムＤＮＡ塩基配列の多重整列結果を示す図である。
【図４】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ミカモゴールデン、ＧａｉｒｄｎｅｒのＡＢＧ３１４領域の塩基配列を多重整列した結果を示す図である。
【図５】制限酵素ＣｌａＩによる多型検出例を示す写真である。
【図６】本発明の選別方法により選別した大麦の（ａ）２００４年度産の麦芽ＫＩ、（ｂ）２００５年度産の麦芽ＫＩ、（ｃ）２００６年度産の麦芽ＫＩ、（ｄ）２００８年度産の麦芽ＫＩの平均値を比較した結果を示すグラフである。
【図７】本発明の選別方法により選別した大麦の（ａ）７２時間後発芽率、（ｂ）休眠指数、（ｃ）穂発芽性スコアの平均値を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、穂発芽特性、種子休眠特性及び麦芽ＫＩ特性により大麦を選別するための選別方法を提供する。上記選別方法では、配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列することによって多型マーカーを特定し、多型マーカーの遺伝子型に基づいて被検大麦を選別する。
【００３１】
配列番号５、配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列を多重整列した際に、配列番号７に記載の塩基配列と対応する配列番号５及び配列番号６に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＡ、配列番号６に記載の塩基配列と対応する配列番号５及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＢ、配列番号５に記載の塩基配列と対応する配列番号６及び配列番号７に記載の塩基配列とが異なる塩基配列部位を多型マーカーＣを得る。配列番号５、６及び７に記載の塩基配列は、それぞれ大麦ミカモゴールデン種、Ｇａｉｒｄｎｅｒ種及びＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ種に由来するゲノムＤＮＡ配列である。
【００３２】
本明細書において多重整列（マルチプルアラインメント）とは、複数の塩基配列を相互に比較可能なものにするため、対応する塩基配列部分が並ぶよう、適宜空白（ギャップ）を入れて塩基配列を整列したものをいう。塩基配列が２つの場合にも、多重整列という。多重整列にあたっては、公知の多重整列作成プログラムを利用することができる。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘなどを好適に利用可能である。
【００３３】
多重整列により、複数の塩基配列相互に塩基配列が一致しない塩基配列部位を特定することができる。特定された塩基配列部位を、多型マーカーとして利用することができる。なお、多重整列を最適化するために導入されるギャップ部分については、本発明においては塩基配列が一致しない塩基配列部位、すなわち多型マーカーとして特定する。なお、本明細書において、例えば、配列番号５の第５８８番目の塩基に対応する塩基とは、多重整列した際に、配列番号５の第５８８番目の塩基の列に整列される又は整列できることをいう。
【００３４】
被検大麦における上記多型マーカーの遺伝子型の決定は、被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたＰＣＲによって得られる増幅ＤＮＡ断片を用いて行う。
【００３５】
被検大麦からのＤＮＡの抽出方法は、ＣＴＡＢ法など、植物の組織からのＤＮＡ抽出に常用される方法であれば好適に利用可能である。また、市販されているＤＮＡ抽出用キット類も好適に使用可能である。一方、ＤＮＡは被検大麦の葉、茎、根、種子等の部位から抽出されてもよいが、育種段階での選別を考慮すれば、葉から抽出するのが好ましい。葉から抽出することにより、早い段階で望ましい形質を有する大麦を選別することができる。
【００３６】
配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いた被検大麦のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲには、大麦から上述のとおり抽出されたＤＮＡを鋳型として用いることができる。ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、市販の耐熱性ポリメラーゼを適宜選択して使用することができる。例えば、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＴＡＫＡＲＡバイオ）を好ましく用いることができる。また、アニーリング温度は６０．０〜６５．０℃とするのが好ましく、例えば、６２．５℃とすることができる。アニーリング範囲をこの範囲に設定することにより、非標的領域の増幅をより効率よく抑えることができる。
【００３７】
上記ＰＣＲにより増幅された増幅ＤＮＡ断片を用いて、少なくとも１つの多型マーカーＡに基づいて遺伝子型を決定する。あるいは、多型マーカーＢ及び多型マーカーＣのそれぞれ少なくとも１つに基づいて遺伝子型を決定してもよい。決定した遺伝子型により、被検大麦を穂発芽特性、種子休眠特性及び麦芽ＫＩ特性により選別することができる。
【００３８】
被検大麦における上記多型マーカーに基づく遺伝子型の決定は、例えば、多型マーカーとなる塩基配列部位の塩基配列を判別することにより行うことができる。例えば、シークエンス解析により塩基配列を解読して判別すること、制限酵素認識配列の有無によって塩基配列を判別すること、完全マッチプローブやミスマッチプローブを利用したハイブリダイゼーションにより塩基配列を判別することなどにより行うことができる。
【００３９】
上記遺伝子型の決定を、認識配列中に上記多型マーカーを含む１種又は２種以上の制限酵素で、上記増幅ＤＮＡ断片を消化し、得られる切断断片の数又はサイズを検出することによって行うこともできる。
【００４０】
制限酵素の認識配列中に上記多型マーカーが含まれる場合、制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かで遺伝子型を同定することができる。制限酵素によるポリヌクレオチドの切断が生じるか否かは、制限酵素で消化したポリヌクレオチドをサイズ分画することにより、断片の数又はサイズから判断することができる。
【００４１】
制限酵素による消化反応は、各制限酵素に至適な緩衝液を用い、至適な反応温度において実施することができる。また、制限酵素消化後の断片をサイズ分画して検出する方法としては、当業者に常用されるアガロースゲル電気泳動を好適に採用することができる。また、公知の適切なカラムを用いたＨＰＬＣ法により、断片をサイズ分画して検出することもできる。
【００４２】
配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いたＰＣＲにより増幅される増幅ＤＮＡ断片においては、認識配列中に上記多型マーカーが含まれる制限酵素の具体例として、ＣｌａＩ、ＡｖａＩ等が挙げられる。
【００４３】
決定した遺伝子型をもとに、（ｉ）決定した遺伝子型が、配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別することにより、穂発芽性が高く、種子休眠性が低く、かつ麦芽ＫＩ値がより高い被検大麦を得ることができる。一方、（ｉｉ）決定した遺伝子型が、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致する被検大麦、を選別することにより、穂発芽性が低く、種子休眠性が高く、かつ麦芽ＫＩがより低い被検大麦を得ることができる。なお、上記（ｉ）の選別と（ｉｉ）の選別は、いずれか一方のみを実施してもよいし、両方を実施してもよい。
【００４４】
本発明の一実施形態として、（ｉ）として選別した大麦同士を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦が挙げられる。このようにして得られる交配後代系統の大麦は、多型マーカーの遺伝子型が配列番号７に記載の塩基配列の遺伝子型と一致するため、更なる選別を必要としない。すなわち、このようにして得られる交配後代系統の大麦は、穂発芽性が高く、種子休眠性が低く、かつ麦芽ＫＩ値がより高い大麦種である。
【００４５】
同様に、（ｉｉ）として選別した大麦同士を交配して得ることのできる交配後代系統の大麦を提供する。このようにして得られる交配後代系統の大麦は、多型マーカーの遺伝子型が配列番号５又は６に記載の塩基配列の遺伝子型と一致するため、更なる選別を必要としない。すなわち、このようにして得られる交配後代系統の大麦は、穂発芽性が低く、種子休眠性が高く、かつ麦芽ＫＩ値がより低い大麦種である。
【００４６】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦を用いて麦芽を得る製麦工程を備える麦芽製造方法である。製麦工程は、（ｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦を用いることを特徴とした麦芽を得る工程であり、公知の製麦の方法を利用することができる。具体的には、例えば、浸麦度が４０％〜４５％に達するまで浸麦後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、焙燥して麦芽を得ることができる。
【００４７】
一方、（ｉ）型大麦は、種子休眠性が低く、麦芽ＫＩ値が高いため、浸麦時間、発芽日数を短縮することができ、麦芽製造コストの低減、ＣＯ２排出量の削減が図れる。
【００４８】
上述した（ｉ）型大麦又は（ｉｉ）型大麦を、仕込工程及び発酵工程を少なくとも備える麦芽発酵飲料の製造方法において、大麦原料として使用することができる。ここで使用する（ｉ）型大麦とは、大麦そのもの及び上述の麦芽製造方法により得られた麦芽のいずれをも含む。（ｉｉ）型大麦についても同様である。
【００４９】
上記仕込工程は、麦芽を糖化させて麦汁を得る工程である。具体的には、麦芽を含む原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽を糖化させ、糖化された麦芽から麦汁を採取する。
【００５０】
本工程において用いられる麦芽は、大麦に水分と空気を与えて発芽させ、乾燥して幼根を取り除いたものであることが望ましい。麦芽は麦汁製造に必要な酵素源であると同時に糖化の原料として主要なデンプン源となる。また、麦芽発酵飲料特有の香味と色素を与えるため発芽させた麦芽を焙燥したものを麦汁製造に用いる。また、更に原料の一部として、麦芽以外に、大麦、コーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類等の副原料を添加しても良い。また、原料の一部として、（ｉ）型大麦、（ｉｉ）型大麦又は一般大麦より調製されたモルトエキスあるいは大麦分解物、大麦加工物を用いることもできる。
【００５１】
上記仕込用水は特に制限されず、製造する麦芽アルコール飲料に応じて好適な水を用いればよい。また、糖化条件は特に限られず、一般的な条件で行えばよい。こうして得られた麦芽糖化液をろ過した後、ホップあるいはハーブなど、香り、苦味などを付与できる原料を添加して煮沸を行い、それを冷却することにより冷麦汁が得られる。
【００５２】
上記発酵工程は、仕込工程で得られた冷麦汁に酵母を添加して発酵させ麦芽発酵飲料を得る工程である。ここで用いられる酵母は、例えば、サッカロミセス・パトリアヌス、サッカロミセス・セレビシェ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。
【００５３】
麦芽発酵飲料は、その製造に用いられる麦芽の使用比率の多少は特に制限されず、麦芽を原料の一部として発酵により製造される飲料であればよい。具体的には、例えば、ビールや発泡酒、いわゆるノンアルコールビールが挙げられる。
【００５４】
本発明の更なる実施形態として、配列番号３及び配列番号４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対、並びにこのオリゴヌクレオチドプライマー対を含むキットが挙げられる。上記キットは、更に制限酵素を含むものであってよい。また、大麦の組織からＤＮＡを抽出するためのキットを更に包含していてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例をもとに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１：種子休眠性、穂発芽性及び麦芽ＫＩ）
種子休眠性及び穂発芽性の評価には、サッポロビール社木崎圃場産の４２品種・系統の大麦種子を用いた（２００８年播種、２００９年収穫）。
【００５７】
種子休眠性は、以下の方法によって求められる休眠指数に基づいて評価した。各品種の成熟期の穂を圃場でサンプリングし、種子乾燥器を用い、３５℃で乾燥させた（休眠打破処理）。産年度の生育条件により休眠の程度が異なるため、休眠打破処理時間は２４時間、１２０時間の２水準とした。乾燥後、休眠を保持するために−８０℃で冷凍保存し、全てのサンプルが揃った段階で評価試験を実施した。まず、シャーレにＮｏ．２ろ紙を２枚敷き、各品種の種子１００粒（ｎ＝２）をシャーレに取り、水道水４ｍｌを与え、２０℃暗所で保持した。７日間にわたり、２４時間ごとに各品種の発芽粒数を計数し、以下の計算式に従い休眠指数を算出した。休眠指数の値が大きいほど、種子休眠性が強いことを示す。
（休眠指数）（％）＝｛（２４時間後の未発芽率）＋（４８時間後の未発芽率）＋（７２時間後の未発芽率）＋（９６時間後の未発芽率）＋（１２０時間後の未発芽率）＋（１４４時間後の未発芽率）＋（１６８時間後の未発芽率）｝／７（測定回数）
【００５８】
穂発芽性を、以下に記載する方法により評価した。種子休眠性と同様に成熟期の穂を圃場で５穂を一組としてサンプリングし、種子乾燥器を用い、３５℃で２４時間乾燥させた。乾燥させた穂を、その状態のまま、プラスチックコンテナ内に満たした流水中に浸漬し１４時間吸水させた後、人工気象庫内で１８℃、１００％加湿条件で３日間保持した。穂ごとに全粒数及び発芽粒数を計数して発芽率を求め、５穂の平均値を算出した。この発芽率平均値に基づいて、表１に示した基準にしたがってスコアリングした。穂発芽性スコア（０〜６）が大きいほど、穂発芽性が高いことを示す。
【表１】
2011139669.tif 000002
【００５９】
麦芽ＫＩは、サッポロビール社木崎圃場産（２００４年、２００５年、２００６年、２００８年）の製麦データから求めた。マイクロモルティングは、浸麦度４３．５％、発芽温度１５℃、発芽日数６日の条件の下、実施した。麦芽ＫＩは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＢＣ）の標準法に準拠した分析法により分析した（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ａｎａｌｙｔｉｃａ，  １９８７）。
【００６０】
図１に、種子休眠性評価において、発芽の速い品種・系統群と遅い品種・系統群との間で最も顕著な差が見られた７２時間後発芽率、休眠指数（休眠打破処理時間は２４時間）及び穂発芽性スコアを示した。
【００６１】
図１に示した結果から、北米の一部を除く品種・系統（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＡＣ  Ｍｅｔｃａｌｆｅ，ＣＤＣ  Ｋｅｎｄａｌｌ，ＣＤＣ  ＰｏｌａｒＳｔａｒ，ＣＤＣ  Ｃｏｐｅｌａｎｄ，ＴＲ０７９２１，ＣＤＣ  Ａｕｒｏｒａ  Ｎｉｊｏ，ＣＤＣ  Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，ＣＤＣ  Ｓｅｌｅｃｔ，Ｎｅｗｄａｌｅ）において、顕著に種子休眠性が弱いことが明らかとなった（図１及び表２参照）。同時に、穂発芽性スコアも、これらの品種・系統は、他の品種・系統と比較して高いことが分かった。上記以外の日本、北米の一部（Ｂｅｔｚｅｓ、ＣＤＣ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）、豪州、欧州の品種については、穂発芽性スコアにはややばらつきがあるものの、上記の品種群と明らかに異なり、種子休眠性が強いことが分かった。
【００６２】
また、２００４年から２００８年までの４ヵ年（２００７年を除く）の麦芽ＫＩを表２に示す。産年度によってばらつきはあるものの、上述した種子休眠性が弱い品種・系統は、比較的高いＫＩを示す傾向が見られた。
【表２】
2011139669.tif 000003
【００６３】
（実施例２：ＡＢＧ３１４配列のプライマー設計）
ＲＦＬＰマーカーＡＢＧ３１４の５’端及び３’端の塩基配列情報に基づいて設計したプライマーＡ１（配列番号１）及びプライマーＡ２（配列番号２）を用いてアニーリング温度を５０℃に設定し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の電気泳動を行ったところ、約４ｋｂｐに単一のバンドが見られた（図２、ＰＣＲ産物１〜５レーン）。このＰＣＲ産物を様々な制限酵素を用いて処理したところ、制限酵素ＡｌｕＩで処理した場合に、図２のＡｌｕ処理後１〜５レーンのバンドパターン中、レーン４及びレーン５のみ約４００ｂｐのバンド（図２中、四角で囲まれたバンド）が検出され、ミカモゴールデン、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ間で多型が見られた（図２）。このことから、プライマーＡ１、Ａ２を用いたＰＣＲと制限酵素ＡｌｕＩでのＰＣＲ産物の処理により、ＡＢＧ３１４の遺伝子型の判別が行えることが示唆された。
【００６４】
しかしながら、上記条件において、アニーリング温度を５０℃以上にすると多型が見られず、アニーリング温度５０℃の条件では電気泳動のバンドの有無が判別しづらいという問題があった（図２）。さらに、高アニーリング温度の条件ではミカモゴールデン−Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎの倍化半数体系統のＡＢＧ３１４分離パターンと異なる分離パターンを示すバンドが見られた。これらのことから、プライマーＡ１、Ａ２のセットを用いたＰＣＲでは、ＤＮＡの大きさはＡＢＧ３１４と同じであるが、ＡＢＧ３１４以外の別の類似したＤＮＡ断片が増幅されており、しかもバンドの濃さから目的でないＤＮＡ断片の方が優先的に増幅されていることが示唆された。このことから再度ＡＢＧ３１４のみが増幅する適当なプライマーを設計する必要が生じた。そこで、プライマーＡ１、Ａ２を用いた高アニーリング温度でのＰＣＲで増幅される目的でないＤＮＡ断片の塩基配列とＡＢＧ３１４クローンの塩基配列を比較し、この２つの塩基配列間で多型が見られる箇所をプライマーとして設計することとした。有用なプライマーを設計することのみを目的としたため、５’側、３’側の一部配列のみを解析した（図３）。図３中波線で示した部分は塩基配列の解析を行っていない。また、プライマーＡ１及びＡ２の配列は、図示していない。「ＡＢＧ」はＡＢＧ３１４の塩基配列、「４ｋｂ」はＡＢＧ３１４以外の別の類似したＤＮＡ断片の塩基配列であることを示す。四角で囲った塩基配列は、プライマーＢ１及びＢ２がアニーリングする塩基配列に相当する。多型が見られた箇所を中心に複数のプライマーセットを調整し、ＰＣＲを行った結果、プライマーＢ１とＢ２の組み合わせのときに、６２．５℃までアニーリング温度を上昇させてもＡｌｕＩ処理後に多型が見られ、かつ判別もしやすかったことから、このプライマーセットを以降の解析に用いることにした。しかし本条件による解析では、ＰＣＲ産物のＡｌｕＩ処理後に見られた多型はヘテロ型（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型とミカモゴールデン型の両方の遺伝子を一つずつ持っている状態）が判別できない。育種上、ヘテロ型を判定できることは非常に重要である。このためＡＢＧ３１４内部塩基配列を解析し、ヘテロ型を判別可能なマーカーを構築することを目指した。
【００６５】
なお、塩基配列の解析は、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を行い、出現したバンドを切り出しＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、ｃａｔ．Ｎｏ．２８７０６）でＤＮＡ断片を精製した後、このＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。塩基配列解析はＳｉｇｍａ社への委託解析により行った。
【００６６】
ＡＢＧ３１４の５’端と３’端のそれぞれ約２０ｂｐの塩基配列はＧｒａｉｎ  Ｇｅｎｅｓのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｈｅａｔ．ｐｗ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ＧＧ２／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）に公開されている。この塩基配列情報をもとにプライマーＡ１、Ａ２を設計した。また本発明において初めて明らかにしたＡＢＧ３１４内部塩基配列情報に基づいてプライマーＢ１（配列番号３）、Ｂ２（配列番号４）を設計した。これらのプライマー配列は次に示すとおりである。
【００６７】
プライマーＡ１：
５’−ＴＧＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣＴＴＧＴＧＡＴＴ−３’（配列番号１）
プライマーＡ２：
５’−ＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＴＴＡＴ−３’（配列番号２）
プライマーＢ１：
５’−ＧＧＡＧＣＡＴＡＡＧＧＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＡ−３’（配列番号３）
プライマーＢ２：
５’−ＣＡＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＣＣ−３’（配列番号４）
【００６８】
なお、プライマーＢ１、Ｂ２を用いたＰＣＲ反応は、９４℃で１分間の変性ステップ、６２．５℃で１分間のアニーリングステップ、７２℃で５分間の伸長ステップを１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返した後、７０℃で５分間伸長ステップを行うという条件下で行った。
【００６９】
（実施例３：ＡＢＧ３１４内部配列の品種間多型解析とＣＡＰＳマーカー構築）
図１、表２の結果から種子休眠性が弱く、麦芽ＫＩが高い品種・系統（グループ１）からＨａｒｒｉｎｇｔｏｎを、種子休眠性が強く、麦芽ＫＩがグループ１と比較し低い品種・系統（グループ２）からミカモゴールデン、Ｇａｉｒｄｎｅｒを選定し、プライマーＢ１、Ｂ２でＡＢＧ３１４のＤＮＡを増幅後、それぞれの塩基配列を解析した（図４）。決定した塩基配列を、ミカモゴールデンについては配列番号５、Ｇａｉｒｄｎｅｒについては配列番号６、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎについては配列番号７に示した。これらの塩基配列をマルチプルアラインメントにより解析した結果、解析した２５２０ｂｐの配列内に３つの品種間で塩基配列多型が７２箇所で確認された（図４）。
【００７０】
７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列とミカモゴールデン、Ｇａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列とが異なる塩基多型（多型マーカーＡ）として、配列番号５の第１１０番目、９６２番目、１０２７番目、１３７４番目、１４１５番目、１９７１番目、２３４８−２３４９番目、２４８３−２４８５番目の塩基に対応するものが確認された。
【００７１】
また、７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列、Ｇａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列、ミカモゴールデン（グループ２）の塩基配列がいずれも異なる塩基多型（多型マーカーＡ）として、配列番号５の第８７７番目の塩基に対応するものが確認された。
【００７２】
一方、７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列とミカモゴールデン（グループ２）の塩基配列とが一致し、かつＧａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列とは異なる塩基多型（多型マーカーＢ）として、配列番号５の第５８８番目、６３９番目、６７５番目、８２６番目、９２７番目、１０２５番目、１２６５番目、１２６９番目、１６１１番目、１９４３番目、２１５０番目の塩基に対応するものが確認された。
【００７３】
さらに、７２箇所の塩基多型のうち、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ（グループ１）の塩基配列とＧａｉｒｄｎｅｒ（グループ２）の塩基配列とが一致し、かつミカモゴールデン（グループ２）の塩基配列とは異なる塩基多型（多型マーカーＣ）として、配列番号５の第５４番目、１０６−１０９番目、１９７番目、２０５番目、２５３番目、２５６−２６３番目、３０９番目、３８３番目、５５９番目、６１１番目、７１５番目、８００番目、８１５番目、８６５番目、８９７番目、９０５番目、９２９番目、９３５番目、９７６番目、９８２番目、９８８番目、９９０番目、９９５番目、１０２３番目、１０３２番目、１０４１番目、１０６５番目、１０６７−１０６８番目、１２８５番目、１４０９番目、１４３０番目、１４５２番目、１５０３番目、１５３８番目、１５５２番目、１５７３番目、１６３１番目、１６３７番目、１７００番目、１７２９番目、１７４２番目、１８４２番目、１９１１番目、１９５９番目、１９９２番目、２０１１番目、２０２０番目、２０５０番目、２０６８番目、２０８０番目、２１４３番目、２２２７番目の塩基に対応するものが確認された。
【００７４】
上記多型マーカーＡは９箇所存在しており、このうち少なくとも１つを利用することにより、１ステップでグループ１と２に分類することができる。また、上記多型マーカーＢ、多型マーカーＣはそれぞれ１１箇所、５２箇所存在しており、多型マーカーＢのうち少なくとも１つを利用し、かつ多型マーカーＣのうち少なくとも１つを利用することにより、グループ１と２に分類することができる。
【００７５】
上記多型マーカーＡのうち、配列番号５の第１０２７番目の塩基に対応するものに制限酵素ＣｌａＩの認識配列が含まれていた。ＣｌａＩの認識配列（ＡＴＣＧＡＴ）は図４の塩基配列内に合計３箇所存在した（ＣｌａＩ（１）、ＣｌａＩ（２）、ＣｌａＩ（３））。このうち、ＣｌａＩ（２）には塩基多型が存在する（配列番号５の第１０２７番目、第１０３２番目）。この塩基多型により、Ｇａｉｒｄｎｅｒの塩基配列はＧＴＣＧＡＴ、ミカモゴールデンの塩基配列はＧＴＣＧＡＣとなり、いずれもＣｌａＩの認識配列を欠損していた（表３）。一方、２箇所（ＣｌａＩ（１）、ＣｌａＩ（３））には上記塩基多型は存在していなかった。そのため、ＣｌａＩ処理後のＤＮＡ断片はグループ１では約１３００、９００ｂｐにバンドが検出され、一方グループ２では約２２００ｂｐに一本のバンドが検出されると予想され、ＣＡＰＳマーカーとして利用できる可能性があった。そこで、大麦７品種について、プライマーＢ１及びＢ２によるＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物をＣｌａＩで処理し、電気泳動を行った結果、予想どおりのバンドパターンが得られ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型の電気泳動パターンを示す大麦品種と、ミカモゴールデン（Ｇａｉｒｄｎｅｒ）型を示す大麦品種とにＡＢＧ３１４の遺伝子型を分類することが可能であった（図５）。
【表３】
2011139669.tif 000004
【００７６】
（実施例４：ＡＢＧ３１４の遺伝子型と種子休眠性、穂発芽性及び麦芽ＫＩの関係）
図１の４２品種・系統のＡＢＧ３１４の遺伝子型を上記ＣＡＰＳマーカーを用いて判別し、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型、ミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）に分類した。その遺伝子型ごとの種子休眠性（７２時間後発芽率、休眠指数）、穂発芽性（穂発芽性スコア）及び麦芽ＫＩの平均値を比較した。２００４、２００５、２００６、２００８年度産大麦の麦芽ＫＩの平均値を比較した結果を、図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）にそれぞれ示した。また、７２時間後発芽率を比較した結果を図７（ａ）に、休眠指数を比較した結果を図７（ｂ）に、穂発芽性スコアを比較した結果を図７（ｃ）に示した。
【００７７】
その結果、種子休眠性（７２時間後発芽率、休眠指数）、穂発芽性（穂発芽性スコア）について、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型とミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）は、危険率０．１％で有意差が認められ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ型を示す品種・系統はミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）を示す品種・系統と比較し、種子休眠性が弱く、穂発芽抵抗性が低いことが分かった。また、ＫＩについては、各年度においてＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ型がミカモゴールデン型（Ｇａｉｒｄｎｅｒ型）と比較し、危険率０．１％〜１％で有意に高かった。
【００７８】
以上の結果より、本ＣＡＰＳマーカーは種子休眠性の程度、つまり一定の穂発芽抵抗性を有するかどうか、及び麦芽ＫＩの程度を推定する上で非常に重要であることが示唆された。北米や豪州では近年、収穫期の降雨による穂発芽が問題になってきている。このため穂発芽抵抗性遺伝子を新品種に導入し、品種の付加価値を向上させることは重要である。穂発芽の検定は手間がかかり、大量にある育種材料を細かくチェックするのは現実的ではない。本マーカーを大麦育種の選別過程で利用することにより、コスト削減、ＤＮＡレベルで検定するため確実性の向上、開発品種の高付加価値化などが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
配列番号１〜４；合成プライマー
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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