(57)【要約】【課題】強力な抗酸化作用を有する天然由来の物質を提供する。【解決手段】本発明は、以下のアミノ酸配列を有する抗酸化ペプチド：Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trpを提供するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列からなる抗酸化ペプチド：
Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
【請求項２】
請求項１に記載の抗酸化ペプチドを有効成分とする抗酸化剤。
【請求項３】
請求項１に記載の抗酸化ペプチドを含む食品。
【請求項４】
ローヤルゼリー由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解することを特徴とする、以下のアミノ酸配列を有する抗酸化ペプチドの製造方法：
Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
【請求項５】
請求項１に記載の抗酸化ペプチドを含む化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化作用を有するペプチドに関し、詳しくはローヤルゼリーに含まれる蛋白質を加水分解して得られる抗酸化ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在ローヤルゼリーは健康食品、医薬品、化粧品など世界中で広く利用されており、血管拡張、血圧降下、抗菌作用など種々の薬理作用および栄養生理的作用が報告されている。ローヤルゼリーは蜜蜂の唾液腺で合成され、頭部にあるマンデブラー腺から分泌されるミルク状の物質で、女王蜂幼虫用の巣房に入れられた幼虫蜂に対して働き蜂が女王蜂を作るために与えるものである。ローヤルゼリーはタンパク質やビタミン、ミネラルをバランスよく含んでおり、これを一生食べ続ける女王蜂は、働き蜂の４０倍の寿命と、１日２０００個の産卵能力を持つ。このローヤルゼリーの有効成分の研究は、10-ヒドロキシ-2-デセン酸を代表とする脂肪酸、アミノ酸、ビタミンなどの低分子化合物を中心になされてきた。
【０００３】
一方、ローヤルゼリーには通常１０％以上のタンパク質が含まれているが、このタンパク質の分子構造や生理作用に関する研究は遅れている。また、ローヤルゼリー配合の化粧品、ドリンク剤などの製造時には、アルコール抽出が行われ、タンパク質は沈殿物として分離されるが、このタンパク質の有効利用は図られていないのが現状である。
【０００４】
ローヤルゼリータンパク質のプロテアーゼ処理物については、カルシウム吸収促進作用（非特許文献１）、血糖値低下作用（非特許文献２）が知られ、抗酸化作用についても報告されているが（非特許文献３）、その効果はビタミンＥよりも弱いものであった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】仲佐輝子、食品と開発、３４，５（１９９９）
【非特許文献２】上田修一郎、Ｆｏｏｄ Ｓｔｙｌｅ ２１，６，５（２００２）
【非特許文献３】（社）全国ローヤルゼリー公正取引協議会「ローヤルゼリー(Royal Jelly)に関する研究」平成１３年度研究報告書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、強力な抗酸化作用を有する天然由来の物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題に鑑み検討を重ねた結果、ローヤルゼリーをトリプシン・キモトリプシンで酵素処理することにより、ビタミンＥと同等程度の抗酸化力を有する強力な抗酸化ペプチドが得られることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は以下の発明に関する。
１． 以下の(1)〜(3)のいずれかのアミノ酸配列を有する抗酸化ペプチド：
(1) Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；
(2) Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；
(3) Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
２． 上記１．に記載の抗酸化ペプチドを有効成分とする抗酸化剤。
３． 上記１．に記載の抗酸化ペプチドを含む食品。
４． ローヤルゼリー由来の蛋白質をプロテアーゼで加水分解することを特徴とする、以下の(1)〜(3)のいずれかのアミノ酸配列を有する抗酸化ペプチドの製造方法：
(1) Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；
(2) Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；
(3) Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
５． 上記１．に記載の抗酸化ペプチドを含む化粧料。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、天然物に由来する極めて安全性の高い抗酸化ペプチドを得ることができ、食品、化粧料などに広く応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ロダン鉄法による抗酸化作用の測定結果を示す。図１中、”none”はタンパク質のないコントロール、“Chymo”はペプシン、トリプシン及びキモトリプシンで処理して得られた分解物（Ｃｈｙｍｏ画分）“S.I”はペプシン、トリプシン、キモトリプシン及び小腸酵素で処理して得られた分解物（Ｓ.Ｉ 画分）、”V.E”はビタミンEを各々示す。
【図２】陽イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラム、および各フラクションの抗酸化試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の抗酸化ペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。
・Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu（以下、「ペプチド１」と略すことがある）
・Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln（以下、「ペプチド２」と略すことがある）
・Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp（以下、「ペプチド３」と略すことがある）
ペプチド１〜ペプチド３は新規なペプチドであり、その抗酸化作用が本発明により初めて明らかにされた。
【００１２】
本発明の抗酸化ペプチドは、遺伝子組換えや化学合成により得ることもでき、また、ローヤルゼリー自体（生ローヤルゼリー、乾燥ローヤルゼリーなど）またはローヤルゼリー由来のタンパク質画分をペプシン、トリプシン、キモトリプシン、豚由来小腸酵素を、作用させて得ることもできる。また、ペプチド１〜ペプチド３を得られる限りにおいて、ローヤルゼリー以外のタンパク質原料をペプシン、トリプシン、キモトリプシン、豚由来小腸酵素などの加水分解酵素で加水分解したものを使用することもできる。
【００１３】
タンパク質の酵素分解により本発明の抗酸化ペプチドを製造するための酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、小腸酵素、などが挙げられ、これらは、微生物、哺乳動物を含む動物、植物、酵母、真菌などの任意の生物由来のペプチド結合を加水分解し得る酵素が例示され、好ましくはペプシン、トリプシン、キモトリプシン、豚由来小腸酵素を作用させる。例えばローヤルゼリー由来のタンパク質を３７℃程度の温度下に各種生物由来のペプシン、トリプシン、キモトリプシン、小腸酵素とともに、１〜４８時間程度処理することにより、本発明のいずれかの抗酸化ペプチドを得ることができる。
【００１４】
本発明のペプチドは、ローヤルゼリーに由来するタンパク質の酵素分解物から分離・精製して使用してもよく、本発明の抗酸化ペプチドとともに多数の他のペプチドを含む蛋白分解物組成物（必要に応じて塩類、糖類あるいは高分子タンパク質などを除去処理したもの）を抗酸化ペプチドとして食品、化粧品などの各種用途に使用してもよい。
【００１５】
例えば、ローヤルゼリーを配合したドリンク剤は、ローヤルゼリーに７０〜９５％ｖ／ｖ程度のアルコール、好ましくはエタノールを添加して沈殿するタンパク質を除去して製造されているが、この含水アルコールに不溶性のローヤルゼリー由来のタンパク質を酵素処理の原料タンパク質として用いることができる。化学合成法としては、ペプチドシンセサイザーにより合成することもでき、固相合成または液相合成により段階的にアミノ酸をペプチド結合を介して伸長して製造することもできる。
【００１６】
本発明の抗酸化ペプチドは、抗酸化作用に基づき、活性酸素に起因する各種疾患の予防ないし治療用食品に好適に配合することができる。本発明の抗酸化ペプチドは、ビタミンEと同等程度の抗酸化力を有し、食品として１日に１μｇ〜１０００ｍｇ程度摂取することにより、活性酸素に起因する各種疾患の予防ないし治療作用を有し得る。食品としては、飲料、ドリンク剤などの液状食品、ゼリー状食品（栄養補助食品、燕下困難者用の食品を含む）中に配合してもよいし、サプリメント、機能性食品などとしてタブレット、顆粒などの固形食品形態で摂取してもよい。また、医薬部外品（口中清涼剤、デンタルケア、スキンケア、毛髪用剤、浴用剤、てんか粉類、ドリンク剤、健胃清涼剤など）、動物用食品（ペットフードなど）、動物用飼料、植物用肥料などにも使用できる。
【００１７】
本発明の抗酸化ペプチドは、酸化に不安定な食品に配合することにより、安定化剤として使用することもできる。
【００１８】
また、本発明の抗酸化ペプチドは化粧料に配合することができる。化粧料としては、例えばローション、化粧水、乳液、口紅、クリーム、ゼリー、パック、ファンデーション等の主として皮膚や粘膜などに適用されるものに用いるのが好適である。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する
【００２０】
実施例１
（１）抗酸化ペプチド画分の調製
アルコール変性ローヤルゼリータンパク質を凍結乾燥した後、５倍量の蒸留水に溶解した。透析を行うことで低分子の糖、不純物を取り除き、より純度の高いアルコール変性ローヤルゼリータンパク質を得た。そのタンパク質溶液を１ＮＨＣｌでｐＨ２．８に調整し、最初に、1/500重量比のペプシンを作用させた。その分解物をトリプシン、キモトリプシン（シグマ社製）、豚由来小腸酵素で順次処理した。ペプシン、トリプシン、キモトリプシンについては添加後３７℃で２４時間、小腸酵素については添加後３７℃で１時間インキュベートした。反応停止には、ペプシンの場合、１ＮＮａＯＨでｐＨ８．０に調整することで酵素を失活させ、トリプシン、キモトリプシン、小腸酵素の場合は４倍量の９９．７％エタノールを添加し、３，０００×ｇで２０分遠心分離して未反応のタンパク質および酵素を除去した。小腸酵素処理で得られた上清をエバボレーターで濃縮乾固後、蒸留水に溶解し、アルコール変性ローヤルゼリータンパク質のプロテアーゼ分解物とした。このようにして得られたペプシン／トリプシン／キモトリプシン分解物（Ｃｈｙｍｏ画分）、ペプシン／トリプシン／キモトリプシン／小腸酵素分解物（Ｓ.I 画分）をサンプルとして用いた。ベプチドの濃度測定はＬｏｗｒｙ法により行われた。標準タンパク質として牛血清アルブミンを用いた。
【００２１】
なお、「アルコール変性ローヤルゼリータンパク質」として、ローヤルゼリーをアルコール（本実施例では70％ｖ／ｖ含水エタノール）沈殿処理し、得られたローヤルゼリータンパク質を凍結乾燥したものを使用した。
【００２２】
（２）抗酸化作用の測定
（２−１）酸化モデル系
酸化モデル系は、Ｃｈｅｎらの方法（14）に改良を加えて行った。バイアル瓶に ５ｍｇリノレン酸、および１ｍｌの0.2M K-phosphate buffer(ｐＨ７．０；１％TritonX-100)を加え、酸化促進剤として０．０５ｍＭ塩化鉄（II）と蒸留水を添加し、４０℃で４分間超音波処理を行い、エマルションを作成した。最終容量が１ｍｌとなるようにサンプル（0.2％） と蒸留水を加え、４０℃の恒温槽で６０分間加熱、振とうした。加熱前および加熱後の反応液の過酸化脂質量を、直ちにロダン鉄法で測定した。抗酸化作用の評価は、加熱前後における過酸化脂質の増加量を比較することにより行った。
【００２３】
（２−２）ロダン鉄法
大澤らの方法（２３）に準じて行った。０．０５ｍｌの反応液に２．２５ｍ1の99.5％エタノール、０．０５ｍ１の３０％チオシアン酸アンモニウム水溶液、0.1ｍｌのｌＮ ＨＣｌおよび０．１ｍ1の0.02ＭＦｅＣｌ２／3.5％ＨＣｌを加え、よく攪拌後、500nｍでの吸光度を測定した。測定には、Jasco、V-530UVsectrophotometerを用いた。S.I画分、Chymo画分、ビタミンE（VE）及びタンパク質のないコントロール（none）を比較した結果を図１に示す。なお、各ペプチドは０．２％の濃度で添加した。これは通常、食品添加物が使用される濃度が０．１％程度なので、その濃度に近い値を用いたものである。Ｓ.Ｉサンプルはα‐トコフェロールと同等の抗酸化作用を示すことが明らかとなった。
【００２４】
（３）抗酸化ペプチドの単離・同定
（３−１）陽イオン交換クロマトグラフィー
Ｓ．Ｉ画分は、０．０５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ、同緩衝液で平衡化したＡＧ５０ＷＸ２(Ｈ+form，50-100mesh，ＢｉｏＲａｄ)カラムに吸着させた。非吸着物質を同じ緩衝液で洗浄した後、吸着画分を0.2Ｍ の ＮＨ４ＯＨで溶出させた。溶出した吸着画分を凍結乾燥し、塩基性ベプチド画分を得た。陽イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラム、および各フラクションの抗酸化試験の結果を、図２に示した。図２で最も高い抗酸化活性を示した画分ＶをさらにＨＰＬＣで精製した。
【００２５】
（３−２）ＨＰＬＣ
画分Ｖに存在する抗酸化ペプチドを単難するため、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。カラムとしてＯＤＳカラム（Pegasil-3000DS，Senshu Scientific Co.）を用い、溶離には0.1％ ＴＦＡ水溶液から0.085％ＴＦＡを含む６０％アセトニトリル溶液への６０分間での濃度勾配法（１％／ｍｉｎ）を用いた。ベプチドの溶出位置は220nｍでの吸光度で確認した。また、再ＨＰＬＣを行った場合は、０．１％TFAを含む２０％アセトニトリル溶液から0.085％ＴＦＡを含む４０％アセトニトリル溶液への４０分間での濃度勾配法(０．５％／ｍｉｎ)を用いた。逆相カラムを用いたＨＰＬＣで単離した抗酸化ベプチドのアミノ酸配列を、プロテインシークエンサーG-1005A（ヒューレット・パッカード社）を用いて分析した。その結果、ペプチド１（配列番号１）、ペプチド２（配列番号２）、ペプチド３（配列番号３）が得られた。これらペプチドのマススペクトルの結果を以下の表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１のマススペクトルの結果は、プロテインシークエンサーの結果と一致しており、本発明のペプチドの配列が同定された。
【００２８】
製剤例１：化粧水
以下の各成分を配合し、常法に従い化粧水を調製した。
エタノール ５重量％
グリセリン ４重量％
ＢＧ（１，３−ブチレングリコール） ４重量％
実施例１で得られたローヤルゼリータンパク質酵素分解物 ０．５重量％
クエン酸 適量
クエン酸ナトリウム 適量
精製水 残余
【００２９】
製剤例２：ドリンク剤
以下の各成分を配合し、常法に従いドリンク剤を調製した。
水 ８８重量％
ブドウ糖 １０重量％
アスコルビン酸ナトリウム ４重量％
実施例１で得られたローヤルゼリータンパク質酵素分解物 １重量％
ＥＤＴＡ２Ｎａ ０．５重量％
【００３０】
製剤例３：健康食品（錠剤）
以下の各成分を配合し、常法に従い錠剤を調製した。
デンプン １５重量％
乳糖 ２５重量％
ヒドロキシプロピルセルロース ４重量％
ステアリン酸マグネシウム １重量％
シェラック ５重量％
グラニュー糖 ４５重量％
実施例１で得られたローヤルゼリータンパク質酵素分解物 ５重量％
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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