(57)【要約】      （修正有）【課題】イマチニブの処置に耐性であるＫＩＴ(受容体タンパク質チロシンキナーゼ)依存性疾患に対しても有効な、変異ＫＩＴ阻害剤の提供。【解決手段】患者におけるＫＩＴ依存性疾患を処置する医薬を製造するためのミドスタウリン、バタラニブおよび下記式（Ａ）の化合物から成る群から選択される変異ＫＩＴの適切な阻害剤の使用。2011121973.tif 000006【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＫＩＴ(受容体タンパク質チロシンキナーゼ)依存性疾患を処置する医薬を製造するためのミドスタウリンの使用であって：
(ａ)該ＫＩＴ依存性疾患と関連するＫＩＴの変異体を同定し；そして
(ｂ)該患者に有効な変異ＫＩＴ阻害量のミドスタウリンから成る群から選択される阻害剤を投与する
ことを含む、使用であって、
該ＫＩＴの変異体がＤ８１６Ｆ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｎ、Ｋ６４２Ｅ、Ｙ８２３Ｄ、Ｄｅｌ５５０−５５８、Ｄｅｌ５５７−５６１、Ｎ８２２Ｋ、Ｖ６５４Ａ、Ｎ８２２Ｈ、Ｄｅｌ５５０−５５８＋Ｖ６５４Ａ、Ｄｅｌ５５７−５６１＋Ｖ６５４Ａ、Ｉｎｓ５０３ＡＹ、Ｖ５６０Ｇ、５５８ＮＰ、Ｄｅｌ５５７−５５８、ＤｅｌＶＶ５５９−５６０、Ｆ５２２Ｃ、Ｄｅｌ５７９、Ｒ６３４Ｗ、Ｋ６４２Ｅ、Ｔ８０１Ｉ、Ｃ８０９Ｇ、Ｄ８２０Ｙ、Ｎ８２２Ｋ、Ｎ８２２Ｈ、Ｙ８２３Ｄ、Ｙ８２３ＣおよびＴ６７０Ｉから選択される、使用。
【請求項２】
ＫＩＴの変異体がＤ８１６Ｆ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｎ、Ｋ６４２Ｅ、Ｙ８２３Ｄ、Ｄｅｌ５５０−５５８、Ｄｅｌ５５７−５６１、Ｎ８２２Ｋ、Ｖ６５４Ａ、Ｎ８２２Ｈ、Ｄｅｌ５５０−５５８＋Ｖ６５４Ａ、Ｄｅｌ５５７−５６１＋Ｖ６５４Ａから選択される、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＫＩＴの変異体がＫ６４２Ｅ、Ｙ８２３Ｄ、Ｄｅｌ５５０−５５８、Ｄｅｌ５５７−５６１、Ｎ８２２Ｋ、Ｖ６５４Ａ、Ｎ８２２Ｈ、Ｄｅｌ５５０−５５８＋Ｖ６５４ＡおよびＤｅｌ５５７−５６１＋Ｖ６５４Ａから選択される、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
ＫＩＴ依存性疾患がイマチニブの処置に耐性である、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ＫＩＴ依存性疾患が肥満細胞疾患、急性骨髄性白血病、消化器間質腫瘍、精上皮腫および未分化胚細胞腫から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＫＩＴの変異体により特徴付けられ、それにより該変異ＫＩＴを同定し、変異ＫＩＴの適切な阻害剤を投与するＫＩＴ依存性疾患の処置に関する。
【０００２】
ｃ−ｋｉｔ遺伝子は受容体タンパク質チロシンキナーゼ(本明細書ではＫＩＴと呼ぶ)をコードするが、肥満／幹細胞増殖因子受容体としても知られている。ＫＩＴのアミノ酸配列およびｃ−ｋｉｔ遺伝子のヌクレオチド配列は既知である。Swiss Prot.: P10721参照。そのリガンドである、幹細胞因子と結合すると、ＫＩＴは二量体を形成し、それは自己リン酸化し、シグナル伝達カスケードを活性化させて細胞増殖に至る。ＫＩＴの活性化型、とりわけそのリガンドと無関係に活性化する型に至る変異が既知であり、そしてある種の増殖性疾患、例えば肥満細胞症のような肥満細胞疾患、特に全身性肥満細胞症、急性骨髄性白血病、消化器間質腫瘍、副鼻腔ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、精上皮腫および未分化胚細胞腫において役割を有すると考えられている。
【０００３】
イマチニブ(商品名GLIVECまたはGLEEVECの下、そのメシル酸塩として市販)は、野生型ＫＩＴおよびあるＫＩＴ変異体、例えば消化器間質腫瘍(ＧＩＳＴ)において一般的に見られるエクソンにおけるものを阻害することが既知である。しかしながら、ＫＩＴのある他の変異体、例えば全身性肥満細胞症において一般的に見られるＤ８１６Ｖ変異に対しては不活性であるか、または著しく活性が低い。本発明は、ＫＩＴの変異体により特徴付けられる疾患の処置と、変異ＫＩＴを阻害する代替物の能力に基づいた適切な代替医薬療法を相関させた研究に基づく。
【０００４】
故に、本発明は、患者におけるＫＩＴ依存性疾患を処置する方法であって
(ａ)該ＫＩＴ依存性疾患と関連するＫＩＴの変異体を同定し；そして
(ｂ)該患者に有効な変異ＫＩＴ阻害量のミドスタウリン、バタラニブおよび化合物Ａから成る群から選択される阻害剤を投与する
ことを含む、方法に関する。
【０００５】
ＫＩＴ依存性疾患は、一般にＫＩＴの活性化変異のための過剰なＫＩＴキナーゼ活性により特徴付けられる増殖性疾患である。このような活性化変異体は既知であり、かつ当分野で既知の技術により同定される。
【０００６】
ＫＩＴ依存性疾患は、下記の既知ＫＩＴ変異により特徴付けられる疾患を含む：Ｄ８１６Ｆ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｎ、Ｄ８１６Ｙ、Ｄ８１６Ｖ、Ｋ６４２Ｅ、Ｙ８２３Ｄ、Ｄｅｌ５５０−５５８、Ｄｅｌ５５７−５６１、Ｎ８２２Ｋ、Ｖ６５４Ａ、Ｎ８２２Ｈ、Ｄｅｌ５５０−５５８＋Ｖ６５４Ａ、Ｄｅｌ５５７−５６１＋Ｖ６５４Ａ、Ｉｎｓ５０３ＡＹ、Ｖ５６０Ｇ、５５８ＮＰ、Ｄｅｌ５５７−５５８、ＤｅｌＶＶ５５９−５６０、Ｆ５２２Ｃ、Ｄｅｌ５７９、Ｒ６３４Ｗ、Ｋ６４２Ｅ、Ｔ８０１Ｉ、Ｃ８０９Ｇ、Ｄ８２０Ｙ、Ｎ８２２Ｋ、Ｎ８２２Ｈ、Ｙ８２３Ｄ、Ｙ８２３ＣおよびＴ６７０Ｉ。
【０００７】
本発明の重要な態様において、ＫＩＴ依存性疾患はイマチニブの処置に耐性である。イマチニブに耐性のＫＩＴ依存性疾患は、一般に４００−１０００mg／日の用量で投与するイマチニブが、明白な治療効果をもたらすための変異ＫＩＴの阻害を十分に提供しない、上記のＫＩＴ依存性疾患である。一般に、イマチニブに耐性の変異ＫＩＴは、約３マイクロモルよりも高い変異ＫＩＴのインビトロＩＣ５０を有する。イマチニブ耐性ＫＩＴ変異体は、Ｄ８１６Ｆ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｎ、Ｄ８１６Ｙ、Ｄ８１６Ｖ、Ｔ６７０Ｉを含み、かつＶ６５４Ａを含む変異体を含む。
【０００８】
ＫＩＴの変異体を阻害する化合物の選択は、１個の化合物または多数の化合物の変異ＫＩＴを阻害するそれらの能力に関する試験に基づく。このような試験は、当分野で既知であるか、または当業者の技術の範囲内である標準阻害アッセイにより行う。
【０００９】
本発明の方法に従い使用するＫＩＴ阻害剤は、ミドスタウリン、バタラニブおよび化合物Ａを含む。ミドスタウリン(ＵＳ５；０９３,３３０)およびバタラニブ(ＷＯ９８／３５９５８)は当分野で既知である。化合物Ａは、式
【化１】
2011121973.tif 000002
の化合物である。
そして、ＷＯ０４／００５２８１に従い製造できる。
【００１０】
ミドスタウリン、バタラニブおよび化合物Ａの適切な投与量は、慣用法により決定する。
【００１１】
ミドスタウリンの適切な投与量は、例えば、１日あたり２５−３００mg、好ましくは５０−３００m、より好ましくは５０−１００mg、最も好ましくは１００−３００mgの総量を、１日１回、２回または３回、例えば、１日あたり１５０−２５０mg、好ましくは２２５mgの総量を、１日２回または３回投与する。
【００１２】
バタラニブ(vatanalib)の適切な投与量は、３００−４０００mgの範囲、例えば、３００−２０００mg／日または３００−１５００mg／日の範囲、特に、３００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００または２０００mg／日、特に１２５０mg／日である。
【００１３】
７０kg／ヒトへの化合物Ａの１日量は、約０.０５−５ｇ、好ましくは約０.２５−１.５ｇである。
【００１４】
実施例
ａａ５４４−９７６をコードするヒトＫＩＴ遺伝子を、バキュロウイルスドナープラスミドｐＦＢ−ＧＳＴ−０１にクローン化した。このコーディング配列を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ  Ｈ１およびＥｃｏＲ１を使用して取り出し、適合性の末端を有するＢａｃ−ＢａｃドナーベクターｐＦＢ−ＧＥＸ−Ｐ１にライゲートした。続いて、所望の変異体を、当業者に既知の方法によりＫＩＴ遺伝子に組み込んだ。変異コーディング配列を産生するために使用したオリジナルプラスミド内のフレームシフトのために、変異したプラスミド挿入断片を取り出し、Ｂａｃ−ＢａｃドナーベクターｐＦＢ−ＧＳＴ−０１に、図１に示す各変異について制限酵素ＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１を使用して挿入した。自動配列決定は、各変異プラスミドについて正しい配列が存在することを確認した。
【００１５】
バクミドＤＮＡを、材料および方法で記載した通りのｐＦＢ−Ｇ０１−ＫＩＴ−変異プラスミドクローンで形質転換したＤＨ１０Ｂａｃ細胞の各々の１０コロニーから産生し、これらをＳｆ９細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を播種し、上清に存在する得られた組み換えバキュロウイルスを増幅した。ウェスタン・ブロットを溶解細胞ペレットに適用し、免疫検出のために抗−ＫＩＴおよび抗−ＧＳＴ抗体を使用して、ウイルスクローンによりＧＳＴ−ｃ−ＫＩＴ融合タンパク質の発現を確認した。
【００１６】
【化２】
2011121973.tif 000003
【００１７】
【表１】
2011121973.tif 000004
【表２】
2011121973.tif 000005
【００１８】
アッセイ条件：１μＭ  ＡＴＰ、５μg／ml  Ｐｏｌｙ−ＥＹ、１０分環境温度でインキュベーション
ウイルス含有培地をトランスフェクトした細胞培養物から回収し、その力価を上昇させるための感染に使用した。２回の感染の後に得たウイルス含有培地を、大規模タンパク質発現に使用した。大規模タンパク質発現のために、１００cm２丸型組織培養プレートに５×１０７細胞／プレートを播種し、１mLのウイルス含有培地で感染させた(約５ＭＯＩ)。３日後、該細胞をプレートから掻き取り、５００rpmで５分遠心分離した。１０−２０個の、１００cm２プレートからの細胞ペレットを５０mLの氷冷溶解緩衝液(２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２mM  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１mM  ＤＴＴ、１mM  ＰＭＳＦ)に再懸濁した。該細胞を氷上で１５分撹拌し、次いで、５０００rpmで２０分遠心分離した。
【００１９】
遠心分離した細胞溶解物を２mLグルタチオン−セファロースカラム(Pharmacia)に充填し、３回１０mLの２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、２mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＤＴＴ、２００mM  ＮａＣｌで洗浄した。ＧＳＴ−標識タンパク質を、次いで２５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０mM  還元−グルタチオン、１００mM  ＮａＣｌ、１mM  ＤＴＴ、１０％グリセロールの１０回の適用(各１mL)により溶出させ、−７０℃で貯蔵した。
【００２０】
様々なＫｉｔ変異体２００−５００ngのタンパク質キナーゼ活性を阻害剤の存在下または非存在下、２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、３mM  ＭｎＣｌ２、３mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＤＴＴ、１０μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、３μg／mL  ポリ(Ｇｌｕ,Ｔｙｒ)４：１、１％ＤＭＳＯ、１.５μＭ  ＡＴＰ(γ−[３３Ｐ]−ＡＴＰ  ０.１μＣｉ)中で行った。該アッセイ(３０μL)を９６ウェルプレート中、環境温度で３０分行い、反応を２０μLの１２５mM  ＥＤＴＡの添加により停止させた。続いて、３０μlの反応混合物を、予め５分メタノールに浸したImmobilon-PVDF膜(Millipore, Bedford, MA, USA)に移し、水で濯ぎ、次いで５分、０.５％Ｈ３ＰＯ４に浸して、繋がっていない真空源を備えた真空マニホルド上にマウントさせた。全サンプルをスポットした後、真空に繋ぎ、各ウェルを２００μL  ０.５％Ｈ３ＰＯ４で濯いだ。膜を除き、４回シェーカー上で１.０％Ｈ３ＰＯ４で洗浄し、１回エタノールで洗浄した。膜を環境温度で乾燥させ、Packard TopCount  ９６ウェルフレームにマウントし、１０μL／ウェルのMicroscint(Packard)を添加した後に計数した。ＩＣ５０値を、デュプリケートで４濃度(通常０.０１、０.１、１および１０μＭ)での各化合物の阻害パーセントの直線回帰分析により計算した。タンパク質キナーゼ活性の１単位を、ＲＴで[γ３３Ｐ]ＡＴＰから基質タンパク質／分／タンパク質mgに移動する１nmoleの３３Ｐと定義した。