(57)【要約】      （修正有）【課題】炎症性細胞が産生する種々の炎症性メディエーターによる炎症反応や、炎症局所における前記炎症性細胞の浸潤を抑制することができ、副作用がなく、優れた抗炎症活性を有する抗炎症剤、前記抗炎症剤を含有し、局所炎症の予防乃至治療に有効な薬用組成物の提供。【解決手段】下記一般式（１）で表される化合物乃至その塩を含有し、炎症性細胞の活性化を抑制する抗炎症剤。2011116678.tif 000034前記一般式（１）において、Ｘは、ＮＨＣＯＣＦ３、ＮＨＣＯＣＣｌ３、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２などで表される置換基のいずれかを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物乃至その塩を含有し、炎症性細胞の活性化を抑制することを特徴とする抗炎症剤。
【化２２】
2011116678.tif 000025
前記一般式（１）において、Ｘは、ＮＨＣＯＣＦ３、ＮＨＣＯＣＣｌ３、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、及び下記一般式（２）で表される置換基のいずれかを示す。
【化２３】
2011116678.tif 000026
【請求項２】
一般式（１）で表される化合物乃至その塩が、弱酸性から中性条件下で下記構造式（１）から（６）の少なくともいずれかで表される化合物に構造変換される請求項１に記載の抗炎症剤。
【化２４】
2011116678.tif 000027
【化２５】
2011116678.tif 000028
【化２６】
2011116678.tif 000029
【化２７】
2011116678.tif 000030
【化２８】
2011116678.tif 000031
【化２９】
2011116678.tif 000032
【請求項３】
一般式（１）で表される化合物乃至その塩が、下記構造式（７）で表される化合物である請求項１から２のいずれかに記載の抗炎症剤。
【化３０】
2011116678.tif 000033
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の抗炎症剤を含有することを特徴とする薬用組成物。
【請求項５】
局所炎症の予防乃至治療に用いられる請求項４に記載の薬用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症剤及び該抗炎症剤を含有する薬用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は、細菌等の病原体の侵入、高温等の物理的障害、有機溶剤等の化学物質などによる有害な刺激により組織が障害されると、サイトカイン、ヒスタミン、ロイコトリエン等の炎症性メディエーターが放出され、発熱、疼痛、発赤、腫脹等を伴う炎症性疾患が引き起こされる。放出された炎症性メディエーターは、血管に作用し、血管拡張や局所の血管壁の基底膜の透過性を亢進させる。そのため炎症が起こると局所において炎症性細胞の血管外浸潤が促進される。
【０００３】
前記基底膜の構成成分としては、コラーゲン、ラミニン、へパラン硫酸プロテオグリカンなどが知られている。このうち、ヘパラン硫酸の分解に関与する酵素としてヘパラナーゼが知られており、前記炎症性細胞は、このヘパラナーゼを発現していることが開示されている（非特許文献１〜２参照）。
前記炎症性細胞とは、炎症局所へ遊走して作用する細胞であり、主として急性期の炎症反応にみられる好中球や、炎症反応の慢性期にみられるリンパ球や単球などが挙げられる。
【０００４】
炎症反応を抑制する手段としては、様々な方法が試みられている。例えば、前記炎症性メディエーターの酵素活性阻害物質や拮抗物質、前記炎症性メディエーターを産生する炎症性細胞に対する阻害物質等の適用などが挙げられる。
【０００５】
前記炎症性メディエーターの酵素活性阻害物質としては、アスピリンやインドメタシンなどをはじめとするＮＳＡＩＤＳ（非ステロイド系抗炎症薬）が知られている。前記ＮＳＡＩＤＳは、アラキドン酸からプロスタグランジン類を合成する酵素であるシクロオキシゲナーゼを阻害し、炎症性メディエーターであるプロスタグランジンＥ２の産生を抑制することにより炎症反応の諸症状を緩和する薬剤である。
しかし、炎症性疾患に対して充分な治療効果があるとはいえず、また長期にわたる連続投与により胃粘膜障害や腎障害等の消化管障害を起こすなどの副作用もあるため、その臨床利用が制限されることがある点で問題であった。
【０００６】
前記炎症性メディエーターの拮抗物質としては、ステロイドホルモン剤やメトトレキセート等の代謝拮抗薬が知られている。前記代謝拮抗薬は、前記ＮＳＡＩＤＳに比べて有効であることが知られている。
しかし、前記代謝拮抗薬は、非特異的に免疫系を抑制するため、細菌等による感染症を引き起こしやすくなる点で問題であった。また、前記ステロイドホルモン剤は、副腎皮質機能不全をはじめとする重篤な副作用を引き起こすことがあり、前記メトトレキセートは、造血系、消化器系、精神及び神経系などに重篤な副作用を示すことがある点で問題であった。
【０００７】
一方、前記基底膜を浸潤する細胞としては、炎症性細胞の他に癌細胞が知られており、（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−６−（トリフロロアセタミド）−４，５−ジヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸、（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−６−（トリクロロアセタミド）−４，５−ジヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸、及び（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−６−グアニジノ−４，５−ジヒドロキシピペリジン−３−カルボン酸が、癌細胞の転移を抑制することが開示されている（特許文献１〜２参照）。また、前記化合物は、へパラナーゼ阻害活性を有することが開示されている（非特許文献３〜５参照）。
【０００８】
しかし、炎症反応は、癌細胞の転移とは異なり、種々の炎症性メディエーターにより反応が活性化されるため、その機構は非常に複雑である。したがって、単に炎症性細胞の浸潤を抑制すれば炎症反応が抑制されるというものではなく、前記化合物の炎症反応における作用は未だ不明である。
【０００９】
そこで、前記炎症性細胞が産生する種々の炎症性メディエーターによる炎症反応や、炎症局所における前記炎症性細胞の浸潤を抑制することができ、副作用がなく、優れた抗炎症活性を有する抗炎症剤、前記抗炎症剤を含有し、局所炎症の予防乃至治療に有効な薬用組成物の提供が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３２４２４７２号
【特許文献２】特許第３８０６４５６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓａｓａｋｉ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００４，  １７２（６），  ３８３０−３８３５
【非特許文献２】Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００８，  ３３１（１−２），  ８２−９３
【非特許文献３】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ６５（１），  ２−１１
【非特許文献４】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ２００８，  １７８０（４），  ７０９−７１５
【非特許文献５】Ｋｏｎｄｏ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ，  ２００１，  ９，  １０９１−１０９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、炎症性細胞が産生する種々の炎症性メディエーターによる炎症反応や、炎症局所における前記炎症性細胞の浸潤を抑制することができ、副作用がなく、優れた抗炎症活性を有する抗炎症剤、前記抗炎症剤を含有し、局所炎症の予防乃至治療に有効な薬用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、後述する一般式（１）で表される化合物は、弱酸性から中性条件下及び血液内で後述する構造式（１）〜（６）で表される化合物に構造変換されること、一般式（１）で表される化合物を生体内の局所炎症部位に投与することにより炎症性細胞からの炎症性細胞由来酵素の放出を抑制できること、更に、局所炎症部位における細胞の浸潤を顕著に抑制でき、これらの中でも、炎症性細胞の浸潤を抑制できることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１４】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記一般式（１）で表される化合物乃至その塩を含有し、炎症性細胞の活性化を抑制することを特徴とする抗炎症剤である。
【化１】
2011116678.tif 000002
前記一般式（１）において、Ｘは、ＮＨＣＯＣＦ３、ＮＨＣＯＣＣｌ３、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、及び下記一般式（２）で表される置換基のいずれかを示す。
【化２】
2011116678.tif 000003
＜２＞  炎症性細胞の活性化の抑制が、炎症性細胞由来酵素の放出抑制である前記＜１＞に記載の抗炎症剤である。
＜３＞  炎症性細胞の活性化の抑制が、炎症性細胞の炎症部位への浸潤の抑制である前記＜１＞に記載の抗炎症剤である。
＜４＞  一般式（１）で表される化合物乃至その塩が、弱酸性から中性条件下で下記構造式（１）から（６）の少なくともいずれかで表される化合物に構造変換される前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
【化３】
2011116678.tif 000004
【化４】
2011116678.tif 000005
【化５】
2011116678.tif 000006
【化６】
2011116678.tif 000007
【化７】
2011116678.tif 000008
【化８】
2011116678.tif 000009
＜５＞  弱酸性から中性条件が、ｐＨ３〜ｐＨ８である前記＜４＞に記載の抗炎症剤である。
＜６＞  一般式（１）で表される化合物乃至その塩が、生体内で構造式（１）から（６）の少なくともいずれかで表される化合物に構造変換される前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
＜７＞  一般式（１）で表される化合物乃至その塩が、下記構造式（７）で表される化合物である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の抗炎症剤である。
【化９】
2011116678.tif 000010
＜８＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の抗炎症剤を含有することを特徴とする薬用組成物である。
＜９＞  局所炎症の予防乃至治療に用いられる前記＜８＞に記載の薬用組成物である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、炎症性細胞が産生する種々の炎症性メディエーターによる炎症反応や、炎症局所における前記炎症性細胞の浸潤を抑制することができ、副作用がなく、優れた抗炎症活性を有する抗炎症剤、前記抗炎症剤を含有し、局所炎症の予防乃至治療に有効な薬用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは、試験例２における、構造式（７）で表される化合物のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝２７３．０６９３）を示す図である。ＲＴは、保持時間を示し、ＡＡは、ピークエリア面積を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験例２における、構造式（７）で表される化合物のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝１７８．０７１０）を示す図である。ＲＴは、保持時間を示し、ＡＡは、ピークエリア面積を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、０．５時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝２７３．０６９３）を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、０．５時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝１７８．０７１０）を示す図である。ＲＴは、保持時間を示し、ＡＡは、ピークエリア面積を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、１時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝２７３．０６９３）を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、１時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝１７８．０７１０）を示す図である。ＲＴは、保持時間を示し、ＡＡは、ピークエリア面積を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、４時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝２７３．０６９３）を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、４時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝１７８．０７１０）を示す図である。ＲＴは、保持時間を示し、ＡＡは、ピークエリア面積を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、２４時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝２７３．０６９３）を示す図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例２において、構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合し、２４時間インキュベート後のＬＣ−ＭＳスペクトル（ｍ／ｅ＝１７８．０７１０）を示す図である。ＲＴは、保持時間を示し、ＡＡは、ピークエリア面積を示す。
【図６】図６は、試験例３における、好中球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤試験の結果を示す図である。
【図７】図７は、試験例４における、炎症モデルマウスにおけるエアパウチ内への炎症性細胞の浸潤を確認した全浸潤細胞数の結果を示す図である。
【図８】図８は、試験例４における、炎症モデルマウスにおけるエアパウチ内への炎症性細胞の浸潤を確認した好中球及び単球の細胞数の結果を示す図である。
【図９】図９は、試験例５における、炎症性細胞由来酵素の定量の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、試験例６における、構造式（７）で表される化合物、構造式（１）で表される化合物、及び構造式（６）で表される化合物の酵素反応中の残存比率の経時変化を示す図である。
【図１１】図１１は、試験例６における、ヘパラン硫酸の分解度の算出方法を説明する図である。
【図１２】図１２は、試験例６における、構造式（７）で表される化合物による好中球由来酵素の阻害活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（抗炎症剤）
本発明の抗炎症剤は、下記一般式（１）で表される化合物乃至その塩を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００１８】
＜一般式（１）で表される化合物＞
【化１０】
2011116678.tif 000011
前記一般式（１）において、Ｘは、ＮＨＣＯＣＦ３、ＮＨＣＯＣＣｌ３、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、及び下記一般式（２）で表される置換基のいずれかを示す。前記置換基を有する化合物は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、前記一般式（１）で表される化合物は、中性条件下又は生体内で、後述する構造式（１）〜（６）で表される化合物に構造変換しやすい化合物が好ましく、ＸがＮＨＣＯＣＦ３である下記構造式（７）で表される化合物がより好ましい。
【化１１】
2011116678.tif 000012
【化１２】
2011116678.tif 000013
【００１９】
−製造方法−
本発明者らは以前に、放線菌、ストレプトミセス・バーチシラス・バリエタス・クインツム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓ  ｖａｒ．  ｑｕｉｎｔｕｍ）（微工研菌寄第５０７号）を培養し、その培養液からシアスタチンＢを採取できることを知見した（特公昭５５−４６７１４号公報参照）。
また、リボースを原料として用い、前記リボースから一連の化学変換の過程でシアスタチンＢに達することから成るリボースを原料とするシアスタチンＢの合成的製造法を発明した（特開平１−２９４６８７号公報及びＮｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １９８８，  １１０，  ７２４９−７２５０参照）。前記シアスタチンＢの合成法を利用し新規なシアスタチンＢ類似物質の製造方法を確立することにも成功した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，  １９９２，  ４５（６），  ９５４−９６２及び９６３−９７０参照）。
前記一般式（１）で表される化合物は、前記シアスタチンＢから合成された化合物であり、特許第３２４２４７２号及び特許第３８０６４５６号に記載の合成方法により合成することができるが、これらの方法に限られるものではない。
【００２０】
前記一般式（１）で表される化合物は、薬理学上許容される塩の状態であってもよい。前記塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩等の酸付加塩；ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、アンモニウム塩等のアルカリ土類金属塩；メチルアミン、エチルアミン、ジエタノールアミン等の有機アミン塩などが挙げられる。
【００２１】
−構造変換−
前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩は、弱酸性から中性条件下で、下記構造式（１）から（６）の少なくともいずれかで表される化合物に構造変換される。前記中性条件は、生体内におけるｐＨ条件と一致するため、前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩が生体内に投与されると、前記下記構造式（１）から（６）の少なくともいずれかで表される化合物に構造変換され、これらの構造で抗炎症活性の活性成分として機能することができる。これらの中でも、下記構造式（１）で表される化合物が、抗炎症活性が高い点で好ましい。
【化１３】
2011116678.tif 000014
【化１４】
2011116678.tif 000015
【化１５】
2011116678.tif 000016
【化１６】
2011116678.tif 000017
【化１７】
2011116678.tif 000018
【化１８】
2011116678.tif 000019
【００２２】
前記中性条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨが、３〜８が好ましく、５〜７がより好ましく、抗炎症活性が高くなる観点から、６〜７が更に好ましい。前記ｐＨが８を超えると、前記構造式（１）〜（６）で表される化合物に構造変換されないことがある。
【００２３】
前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩が、前記構造式（７）で表される化合物である場合を例に挙げ、前記弱酸性から中性条件下において、前記構造式（７）で表される化合物が、前記構造式（１）〜（６）で表される化合物に構造変換するスキームを以下に示す。
なお、前記一般式（１）において、Ｘが、ＮＨＣＯＣＣｌ３、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、及び前記一般式（２）で表される置換基のいずれの場合であっても、前記弱酸性から中性条件下において、前記構造式（１）で表される化合物に構造変換するため、前記構造式（１）で表される化合物以降のスキームは同様である。
【化１９】
2011116678.tif 000020
【００２４】
前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩が、前記構造式（１）〜（６）で表される化合物に構造変換したことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロトン核磁気共鳴スペクトル、炭素１３核磁気共鳴スペクトル、液体クロマトグラフィー、質量分析等により分析する方法などが挙げられる。
【００２５】
−含有量−
前記抗炎症剤に含まれる、前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩の含有量としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲で、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗炎症剤は、前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩そのものであってもよい。
【００２６】
＜その他の成分＞
前記抗炎症剤におけるその他の成分としては、特に制限はなく、薬理学上許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プロテアーゼ阻害剤、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。これらの中でも、プロテアーゼ阻害剤を含むことが好ましい。
前記プロテアーゼ阻害剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が、抗炎症活性が向上する点で好ましい。
前記抗炎症剤中に含まれる、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
＜使用＞
前記抗炎症剤は、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記抗炎症剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００２８】
＜剤型＞
前記抗炎症剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散在などが挙げられる。これらの中でも、注射剤が、局所炎症に使用しやすい点で好ましい。
【００２９】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩に、賦形剤、及び必要に応じて、前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。
ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。
また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
【００３０】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００３１】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩に、必要に応じて、前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。
ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
【００３２】
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００３３】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩に、必要に応じて、前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。
ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などが挙げられる。
【００３４】
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００３５】
＜投与＞
前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。これらの中でも、注射による方法が、局所炎症部位に投与しやすい点で好ましい。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００３６】
＜抗炎症活性＞
前記抗炎症剤の抗炎症活性としては、炎症性細胞の活性化を抑制するものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炎症性細胞の炎症部位への浸潤の抑制、炎症性メディエーターの放出抑制などが挙げられる。
前記炎症性細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、好中球、単球、マクロファージ、リンパ球、好酸球、好塩基球などが挙げられる。
前記炎症性メディエーターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルクロニダーゼ、へパラナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ等の炎症性細胞由来酵素；プロスタグランジン類；活性酸素などが挙げられる。
前記抗炎症剤における抗炎症活性を定量する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炎症部位における前記炎症性細胞の浸潤細胞数を顕微鏡下で数えて定量する方法、炎症部位の浸潤液中の炎症性メディエーター量を測定する方法、腫脹部位の厚みや発赤部位の面積を測定する方法などが挙げられる。
前記抗炎症剤の抗炎症活性としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、炎症部位における浸潤細胞の数、若しくは、炎症性メディエーターの放出量が、前記抗炎症剤を炎症部位に投与する前と比較して、８０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましく、２０％以下が更に好ましい。
【００３７】
＜用途＞
前記抗炎症剤は、前記一般式（１）で表される化合物乃至その塩を含有することから、炎症性細胞が産生する種々の炎症性メディエーターによる炎症反応や、炎症局所における前記炎症性細胞の浸潤を抑制することができ、副作用がなく、優れた抗炎症活性を有するため、後述する薬用組成物などに好適に利用可能である。
【００３８】
（薬用組成物）
本発明の薬用組成物は、前記抗炎症剤を含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
＜抗炎症剤＞
前記薬用組成物における前記抗炎症剤の含有量としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲で、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記薬用組成物は、前記抗炎症剤そのものであってもよい。
【００３９】
＜その他の成分＞
前記薬用組成物におけるその他の成分としては、特に制限はなく、薬理学上許容される担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプンなどが挙げられる。
前記薬用組成物中に含まれる、その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
＜使用＞
前記薬用組成物は、１種単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記薬用組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用されてもよい。
【００４１】
＜剤型＞
前記抗炎症剤の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、吸入散在などが挙げられる。これらの中でも、注射剤が、局所炎症に使用しやすい点で好ましい。
【００４２】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記抗炎症剤に、賦形剤、及び必要に応じて、前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。
ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。
また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
【００４３】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００４４】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記抗炎症剤に、必要に応じて、前記その他の成分、添加剤を加えることにより、製造することができる。
ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
【００４５】
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００４６】
−注射剤−
前記注射剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記抗炎症剤に、必要に応じて、前記その他の成分、各種添加剤を加えることにより、製造することができる。
ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などが挙げられる。
【００４７】
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。
前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。
前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００４８】
＜投与＞
前記抗炎症剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、注射による方法、吸入による方法などが挙げられる。これらの中でも、注射による方法が、局所炎症部位に投与しやすい点で好ましい。
前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。
【００４９】
＜用途＞
前記薬用組成物は、前記抗炎症剤を含有することから、炎症性細胞が産生する種々の炎症性メディエーターによる炎症反応や、炎症局所における前記炎症性細胞の浸潤を抑制することができ、副作用がなく、優れた抗炎症活性を有するため、発熱、疼痛、発赤、腫脹等を伴う種々の炎症性疾患や、血管炎症候群、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性腎炎等の慢性炎症性疾患の予防乃至治療に好適に利用可能である。
【実施例】
【００５０】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５１】
（製造例１：構造式（７）で表される化合物の合成）
下記構造式（７）で表される化合物は、特許第３２４２４７２号に記載の方法に従って合成した。下記構造式（７）で表される化合物の理化学的性状は、特許第３２４２４７２号に記載の通りである。
【化２０】
2011116678.tif 000021
【００５２】
（試験例１：中性条件における構造式（７）で表される化合物の構造変換の確認）
製造例１で得られた前記構造式（７）で表される化合物のｐＨを、５〜６又は７〜８の溶液に懸濁し、各条件下における構造を以下に示す方法で分析したところ、下記スキームを経て構造変換していることがわかった。
なお、下記スキームにおいて、下記構造式（２）〜（５）で表される化合物は、前記ｐＨ条件下における存在時間が短く、分析による確認はできなかった。
【化２１】
2011116678.tif 000022
【００５３】
＜構造式（１）で表される化合物＞
前記構造式（７）で表される化合物の塩酸塩の水溶液を弱塩基性樹脂Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＷＧＲイオン交換樹脂（シグマアルドリッチ社製）を加えて、ｐＨを５〜６に調整した後、数時間撹拌し、樹脂をろ過し、溶媒を除去して前記構造式（１）で表される化合物を得た。
【００５４】
−プロトン核磁気共鳴スペクトル−
前記ｐＨ５〜ｐＨ６の条件で得られた化合物について、Ｄ２Ｏ（重水）中のＨＯＤ（４．７７ｐｐｍ）の値を内部標準として用い、０．００４質量％  Ｄ２Ｏ中で２５℃にて測定した４００ＭＨｚにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは以下の通りであった。なお、プロトン核磁気共鳴スペクトルは、ＪＥＯＬ  ＧＸ−４００（日本電子社製）により測定した。
化学シフト値  δｐｐｍ：
３．１０５（１Ｈ，ｄｑ，Ｈ−３），３．４２（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２ａｘ），３．４９（１Ｈ，ｑ，Ｈ−２ｅｑ），３．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−５），４．５５（１Ｈ，ｔ，Ｈ−４），４．８６（１Ｈ，ｄ，  Ｈ−６）
大きなカップリング（Ｊ２ａｘ，３＝９．２及びＪ５，６＝９．８Ｈｚ）と、小さなカップリング（Ｊ３，４＝Ｊ４，５＝２．７Ｈｚ）とが得られた。即ち、得られた化合物は、前記構造式（７）で表される化合物と同様の４Ｃ１立体構造（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ，  １９９４，  ４７，  １０１参照）を有することがわかった。
【００５５】
−炭素１３核磁気共鳴スペクトル−
前記ｐＨ５〜ｐＨ６の条件で得られた化合物について、Ｄ２Ｏ（重水）中のＨＤＯ（４．６５ｐｐｍ）の値を内部標準として用い、０．００４質量％  Ｄ２Ｏ中で２３℃にて測定した１２５ＭＨｚにおける炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りであった。なお、炭素１３核磁気共鳴スペクトルは、α５００スペクトロメーター（日本電子社製）により測定した。
化学シフト値  δｐｐｍ：
３８．７４（Ｃ−６），４３．５０（Ｃ−５），６８．９９（Ｃ−４），７１．５０（Ｃ−３），δ７９．１４（Ｃ−２），１７３．４１（ＣＯＯＨ）
前記構造式（７）表される化合物では、メタンジアンに特徴的なδ６０．７１（Ｃ−２）が観察されるが、これに代えて、へミアミナールに特徴的なδ７９．１４（Ｃ−２）（Ｂｏｃｋ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；  Ｔｒｉｐｓｏｎ，Ｒ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３，  ４１，  ｐｐ２７−６６参照）が観察された。
また、トリフルオロアセトアミド基に認められるδ１１５．８５及びδ１６０．５２における炭素は認められなかった。
【００５６】
−マススペクトル−
前記ｐＨ５〜ｐＨ６の条件で得られた化合物のマススペクトルの結果は、以下の通りであった。なお、ＦＡＢは、ＪＭＳ−ＳＸ１０２（日本電子社製）により、またＥＳＩは、ＪＭＳ−Ｔ１００Ｌ（日本電子社製）により測定した。
分子量：１７７
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｅ）正イオンモードの
計算値（Ｍ＋Ｈ）＋：１７８（Ｃ６Ｈ１２Ｎ１Ｏ５として）
実験値：１７８
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）正イオンモードの
計算値（Ｍ＋Ｈ）＋：１７８（Ｃ６Ｈ１２Ｎ１Ｏ５として）
実験値：１７８
ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）陰イオンモードの
計算値（Ｍ−Ｈ）−：１７６（Ｃ６Ｈ１０Ｎ１Ｏ５として）
実験値：１７６
【００５７】
これらの分析結果より、前記構造式（７）で表される化合物は、ｐＨ５〜ｐＨ６の条件下では、前記構造式（１）で表される化合物に構造変換したことが確認された。
【００５８】
＜構造式（６）で表される化合物＞
前記構造式（７）で表される化合物の塩酸塩の水溶液を弱塩基性樹脂Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＷＧＲイオン交換樹脂（シグマアルドリッチ社製）を加えて、ｐＨを７〜８に調整した後、数時間撹拌し、樹脂をろ過し、溶媒を除去して前記構造式（６）で表される化合物を得た。前記構造式（６）で表される化合物は、酸性溶液（ｐＨ３）中でも安定であった。
【００５９】
−プロトン核磁気共鳴スペクトル−
前記ｐＨ７〜ｐＨ８の条件で得られた化合物について、前記同様の方法で測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りであった。
化学シフト値  δｐｐｍ：
２．８８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｈ−３），２．９８及び３．０５（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｈ−６），３．０６（１Ｈ，ｔ，Ｈ−２ａｘ），３．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−２ｅｑ），３．９８（１Ｈ，ｄ，Ｈ−４）
Ｃ−６（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，δ＝２．９８及び３．０５）及びＣ−２（１Ｈ，ｔ，Ｊ２，２’＝Ｊ２，３＝１２．２Ｈｚ，δ３．０６，Ｈ−２；１Ｈ，ｄｄ，Ｊ２，２’＝１２．２及びＪ２’，３＝４．４Ｈｚ，δ３．２１，Ｈ−２’）の２つのアミノメチル基のメチレンプロトンが確認された。
また、Ｃ−３のプロトンは、（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ３，２＝１２．２Ｈｚ，Ｊ３，２’＝４．４Ｈｚ  及び  Ｊ３，４＝１．２Ｈｚ，δ２．８８）であり、Ｃ−４のプロトンは、（１Ｈ，ｄ，Ｊ４，３＝１．２Ｈｚ，δ３．９８）であり、Ｃ−５にプロトンは検出されなかった。
これより、ボート型のラクタールであることがわかった。
【００６０】
−炭素１３核磁気共鳴スペクトル−
前記ｐＨ７〜ｐＨ８の条件で得られた化合物について、前記同様の方法で測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルのピークは、以下の通りであった。
化学シフト値  δｐｐｍ：
δ４０．８８（Ｃ−２），４４．７６（Ｃ−３），４７．２６（Ｃ−６），７１．２８（Ｃ−４），７１．５０（Ｃ−５），１７７．５７（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）
高フィールドにδ４７．２６（Ｃ−６）及び低フィールドにδ７１．５０（Ｃ−５）の２つの特徴的な炭素を有し、ラクタールで特徴付けられる構造で、前記構造式（１）で表される化合物とは異なる構造であることがわかった。
【００６１】
−マススペクトル−
前記ｐＨ７〜ｐＨ８の条件で得られた化合物のマススペクトルの結果は、以下の通りであった。なお、ＡＰＣＩは、日立  Ｍ−１２００Ｈ  ＡＰＣＩ（株式会社日立製作所製）により測定した。
分子量：１５９
ＡＰＣＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）正イオンモードの
計算値（Ｍ＋Ｈ）＋：１６０（Ｃ６Ｈ１０Ｎ１Ｏ４として）
実験値：１６０
ＡＰＣＩ−ＭＳ（ｍ／ｅ）陰イオンモードの
計算値（Ｍ−Ｈ）−：１５８（Ｃ７Ｈ８Ｎ１Ｏ４として）
実験値：１５８
【００６２】
これらの分析結果より、前記構造式（７）で表される化合物は、ｐＨ７〜ｐＨ８の条件下では、前記構造式（６）で表される化合物に構造変換したことが確認された。
【００６３】
更に、前記構造式（７）で表される化合物の塩酸塩は、Ｄ２Ｏ中でｐＨを７〜８に調整すると、Ｃ−２のメチレンプロトンが重水素化された。また、前記構造式（６）のＤ２Ｏ溶液を濃縮すると、Ｃ−２のメチレンプロトンが重水素化された。
【００６４】
これらの結果より、前記構造式（６）で表される化合物は、環状ラクタールの構造を有し、前記構造式（１）で表される化合物から脱水され、続いてエノール化され、更に水和されて前記構造式（５）に変換され、前記構造式（５）で表される化合物が脱水されて、スキーム１で表される前記構造式（６）で表される化合物が導かれることが示唆された。
【００６５】
（試験例２：構造式（７）で表される化合物の生体内における構造変換）
−方法−
マウス血清（シグマアルドリッチ社製）に、前記構造式（７）で表される化合物を、１００μｇ／ｍＬの濃度になるように溶解し、３７℃にて、０．５時間、１時間、４時間、及び２４時間インキュベートした。各時間経過後に、等量のアセトニトリルを添加した。これを遠心分離し、上澄み液を得た。
前記上澄み液を５０質量％アセトニトリル水溶液で希釈し、１０μｇ／ｍＬの濃度の溶液を調製し、各時間における生成物を、それぞれ下記条件でＬＣ−ＭＳを用いて分析した。
なお、標準サンプルとしては、前記構造式（７）で表される化合物を５０質量％アセトニトリル水溶液に溶解したものを用いた。
［ＬＣ−ＭＳ分析条件］
カラム：  カプセルパックＣ１８  ＭＧＩＩＩ  ２．０×１５０ｍｍ，３μｍ（株式会社資生堂製）
カラム温度：  ２５℃
溶媒系：  Ａ：メタノール
Ｂ：５ｍＭ  ウンデカフルオロヘキサン酸水溶液
（０分間−１５分間，Ａ：Ｂ（Ｖ／Ｖ）＝１０：９０からＡ：Ｂ（Ｖ／Ｖ）＝９０：１０の直線濃度勾配）
流速：  ０．２ｍＬ／分間
検出器：  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ（サーモサイエンティフィック社製）
スキャンタイプ：  フルスキャン、ｍ／ｅ  １２０−１，０００
イオン化：  ＥＳＩ  正イオンモード
分解能：  ３０，０００
【００６６】
−結果−
図１Ａ〜５ＢにＬＣ−ＭＳスペクトルの結果を示す。図１Ａ及び１Ｂは、標準サンプル、図２Ａ〜５Ｂは、前記構造式（７）で表される化合物と、マウス血清とを混合後、０．５時間後（図２Ａ及び２Ｂ）、１時間後（図３Ａ及び３Ｂ）、４時間後（図４Ａ及び４Ｂ）、及び２４時間後（図５Ａ及び５Ｂ）の結果である。
なお、前記構造式（７）で表される化合物の計算値は、ｍ／ｅ  ２７３．０６９３（Ｃ８Ｆ３Ｈ１２Ｎ２Ｏ５として）であり、実験値は、ｍ／ｅ  ２７３．０６９３（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
また、前記構造式（７）で表される化合物と、血清との反応後に検出されたスペクトルは、試験例１で確認した前記構造式（１）で表される化合物と一致し、その計算値は、ｍ／ｅ  １７８．０７１０（Ｃ６Ｈ１２Ｎ１Ｏ５として）であり、実験値は、ｍ／ｅ  １７８．０７１０（Ｍ＋Ｈ）＋であった。
図１Ａ及び１Ｂに示す通り、標準サンプルは、保持時間９分間に前記構造式（７）で表される化合物のみが検出された（図１Ａ）。一方、図２Ａ〜５Ｂでは、前記構造式（７）で表される化合物は検出されず（図２Ａ、３Ａ、４Ａ、及び５Ａ）、保持時間６．４分間に前記構造式（１）で表される化合物のみが検出された（図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、及び５Ｂ）。
これより、血清中においても、前記合成例で示したｐＨの変化による構造変換と同様に、前記構造式（７）で表される化合物は、前記構造式（１）で表される化合物に構造変換し、前記構造式（１）で表される化合物が安定に存在することがわかった。
【００６７】
（試験例３：好中球のｆＭＬＰ依存的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤の確認）
−方法−
「がんの浸潤・転移研究マニュアル」（金芳堂）の方法に従い、以下のように行った。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢〜１５週齢、オス、ｎ＝３、日本クレア社）の骨髄細胞から、磁気ビーズを結合した抗Ｇｒ−１抗体（バイオレジェンド社製）を用いａｕｔｏＭＡＣＳ（自動磁気細胞分離装置：ミルテニーバイオテク株式会社製）により好中球を分画した。ケモタキセル（ポアサイズ３μｍ：倉敷紡績株式会社製）の膜上にマトリゲル（１０μｇ）を添加し乾燥したものを事前に作製した。
２４ウエルプレートで、前記ケモタキセルの下部に、１０μＭ及び１００μＭのいずれかの濃度の前記構造式（７）で表される化合物を１μＭのｆＭＬＰ（ｆ−ＭＥＴ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅからなる合成ペプチド：シグマアルドリッチ社製）を含む培地（０．５質量％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ハイクローン社製）含有ＲＰＭＩ１６４０（日水製薬株式会社製））で調製した。また、１００μＭの前記構造式（７）で表される化合物と、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤であるＭＭＩ−２７０（ノバルティス  ファーマ株式会社  筑波研究所より提供された非臨床使用品）１０μＭとを、前記ｆＭＬＰを含む培地で調製した。対照として、前記ケモタキセルの下部に、前記ｆＭＬＰを含む培地のみを添加したウエルをおいた。
前記ケモタキセルの上部には、単離した好中球を１×１０５細胞／ウエルの細胞密度で０．５質量％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に懸濁したものを添加し、３７℃で２４時間培養した。
培養後、前記ケモタキセルの上部の細胞を綿棒で除き、下部に浸潤した細胞をＤｉｆｆＱｕｉｋ液（シスメックス社製）で染色し、膜を切り取り封入した後、浸潤細胞数をカウントした。浸潤細胞数は、ｆＭＬＰのみを添加した対照ウエルにおける浸潤数を１００％として標準化した（ｎ＝３）。有意差はＡＮＯＶＡ  ａｎｄ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−ｔｙｐｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔ−ｔｅｓｔで検定した。結果を図６に示す。
【００６８】
−結果−
図６の結果より、ｆＭＬＰのみを添加した対照ウエルでは有意に多数の浸潤細胞が回収された。これに対し、ｆＭＬＰと共に前記構造式（７）で表される化合物を添加したウエルでは、前記対照ウエルに比べ浸潤細胞数が少なく、浸潤細胞数は、前記構造式（７）で表される化合物の濃度依存的に減少した。また、ｆＭＬＰと共に前記構造式（７）で表される化合物と、ＭＭＩ−２７０とを添加したウエルでは、更に浸潤細胞数が減少しており、前記構造式（７）で表される化合物による細胞の浸潤抑制効果は、ＭＭＩ−２７０と相加的であることがわかった。
【００６９】
（試験例４：炎症モデルマウスにおけるエアパウチ内への炎症性細胞の浸潤の確認）
−方法−
Ｒａｍａｌｌｏ  Ｇ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００２，  １６９：  ６４６７−６４７３の方法に従い、以下のように行った。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５週齢、オス、ｎ＝６：日本クレア社）の背部皮膚に６ｍＬの滅菌空気を皮下投与し、エアパウチを作製した。３日後に同じ場所（背部皮膚）に更に３ｍＬの滅菌空気を注入した。
最初の滅菌空気の皮下投与から６日後に、１μＭ  ｆＭＬＰを含むＰＢＳ溶液１ｍＬ又は１質量％カラギナン（シグマアルドリッチ社製）を含むＰＢＳ溶液１ｍＬを前記エアパウチに投与し、局所炎症を誘発した。以下、ｆＭＬＰを投与したマウスを「ｆＭＬＰ処理群」、カラギナンを投与したマウスを「Ｃａｒ処理群」と称することがある。
また、１μＭ  ｆＭＬＰを含むＰＢＳ溶液１ｍＬに前記構造式（７）で表される化合物（１００μＭ）を含むもの又は前記１質量％カラギナンを含むＰＢＳ溶液１ｍＬに前記構造式（７）で表される化合物（１００μＭ）を含むものを同様にして前記エアパウチに投与した。以下、ｆＭＬＰ及び前記構造式（７）で表される化合物を投与したマウスを「ｆＭＬＰ−構造式（７）処理群」、カラギナン及び前記構造式（７）で表される化合物を投与したマウスを「Ｃａｒ−構造式（７）処理群」と称することがある。
対照としては、ＰＢＳ  １ｍＬのみを前記エアパウチに投与した。以下、「対照群」と称することがある。
前記５種類のサンプルの投与から４時間後に前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスを犠牲死させ、３ｍＬのＰＢＳで洗浄することによりエアパウチ内の浸潤液をそれぞれ回収した。
回収された浸潤液中の全浸潤細胞数、及び炎症性細胞の一種である好中球又は単球の細胞数を顕微鏡で観察しながらカウントすることにより、炎症の程度を評価した。有意差はＡＮＯＶＡ  ａｎｄ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−ｔｙｐｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔ−ｔｅｓｔで検定した。全浸潤細胞数の結果を図７に、好中球及び単球の細胞数の結果を図８に示す。
【００７０】
−結果−
図７の結果より、ｆＭＬＰ処理群及びＣａｒ処理群では、ＰＢＳのみを投与した対照群に比べ有意に多数の浸潤細胞が回収された。これに対し、ｆＭＬＰ−構造式（７）処理群では、ｆＭＬＰ処理群に比べ、回収された全浸潤細胞数が有意に少なかった。また、Ｃａｒ−構造式（７）処理群では、Ｃａｒ処理群に比べ、回収された全浸潤細胞数が有意に少なかった。これより、前記構造式（７）で表される化合物により、局所炎症部位における細胞の浸潤が抑制されることがわかった。
【００７１】
図８の結果より、エアパウチ内の浸潤細胞の大部分が炎症性細胞である好中球及び単球であり、前記全浸潤細胞数の結果と同様に、前記構造式（７）で表される化合物により、好中球及び単球の浸潤が抑制されることがわかった。
【００７２】
（試験例５：エアパウチ内に放出される炎症性細胞由来酵素の定量）
−方法−
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５週齢、オス、ｎ＝６：日本クレア社）を用い、試験例４と同様の方法でエアパウチを作製し、試験例４と同様の方法で、対象群、ｆＭＬＰ処理群、及びｆＭＬＰ−構造式（７）処理群を作製し、エアパウチ内の浸潤液をそれぞれ回収した。
【００７３】
炎症性細胞由来酵素に対する抗体として、Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００８，  ３３１（１−２），  ８２−９３で確立したモノクローナル抗体の中から、エピトープの異なる、抗ヘパラナーゼモノクローナル抗体（ＲＩＯ−１）及び抗ヘパラナーゼモノクローナル抗体（ＲＩＯ−７）の２つの抗体を選択し、サンドイッチＥＬＩＳＡの検出系を構築した。即ち、ＲＩＯ−１溶液を９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩固相化した後、室温（２５℃）で２時間イムノブロック（ＤＳファーマバイオメディカル社製）によりブロッキングを行った。このプレートに、前記対照群、前記ｆＭＬＰ処理群、及び前記ｆＭＬＰ−構造式（７）処理群の各個体から回収した浸潤液をそれぞれプレートにアプライし、４℃で一晩反応させた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化された生理食塩水（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有する）で洗浄後、ビオチン標識抗ヘパラナーゼモノクローナル抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＲＩＯ−７）を室温で４５分間反応させ、更にＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ザイメッド社製）を室温で３０分間反応させた。ＡＢＴＳ（２，２’−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ［３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）を用いて発色し、４０５ｎｍ及び４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
浸潤液中のヘパラナーゼ濃度は、標準溶液として組換え型マウスヘパラナーゼ（成熟体）を用いて検量線を作製し、算出した。有意差は、ＡＮＯＶＡ  ａｎｄ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−ｔｙｐｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔ−ｔｅｓｔで検定した。ヘパラナーゼ濃度の結果を図９に示す。
なお、前記組換え型マウスヘパラナーゼ（成熟体）は、Ｌｅｖｙ−Ａｄａｍ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２００３，  ３０８（４），  ８８５−８９１の方法に従い、組換え型マウスヘパラナーゼ（成熟体）を昆虫細胞で発現させた。培養上清中に放出されたヘパラナーゼをヘパリンアガロース（シグマアルドリッチ社製）に吸着させ、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）によって溶出された分画を用いた。
【００７４】
−結果−
図９の結果より、ｆＭＬＰ処理群では、対照群に比べ、高濃度の炎症性細胞由来酵素が検出された。浸潤液中への炎症性細胞由来酵素放出は、炎症反応の活性化状態を反映する現象であり、ｆＭＬＰの投与により炎症が惹起され、炎症性細胞由来酵素の放出量が増加したと考えられる。これに対し、ｆＭＬＰ−構造式（７）処理群では、ｆＭＬＰ処理群に比べ、炎症性細胞由来酵素の濃度が有意に低かった。
これらの結果より、前記構造式（７）で表される化合物は、炎症性細胞の炎症部位への浸潤を抑制できるだけでなく、炎症性細胞からの炎症性メディエーターの放出を抑制することもでき、炎症性細胞の活性化状態を抑制することが示唆された。
【００７５】
（試験例６：炎症性細胞由来酵素阻害活性）
＜マクロファージ由来酵素阻害活性＞
−方法−
前記構造式（７）で表される化合物、前記構造式（１）で表される化合物、及び前記構造式（６）で表される化合物のβ−グルクロニダーゼ（ウシ肝臓由来β−グルクロニダーゼ）の阻害活性について検討した。前記β−グルクロニダーゼは、様々な組織に存在するが、肝臓においては主にクッパー細胞（マクロファージ）及び内皮細胞に発現する炎症反応に関与する酵素である（Ｒｏｄｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ，  １９８９，  １４３：６０−７６，  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７６−８６，  ２８１−５．及びＶｉｒｋ  Ｋ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｌｉｖｅｒ，  １９８９，  Ｄｅｃ；９（６），  ３３８−４５．参照）。
基質としては、フェノールフタレインモノ−β−グルクロン酸（シグマアルドリッチ社製）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５）で希釈し、３．３×１０−４Ｍに調製したものを用いた。前記化合物は、それぞれ水で希釈し、０．００５μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．０２５μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、１．０μｇ／ｍＬ、２．０μｇ／ｍＬ、４．０μｇ／ｍＬ、及び８．０μｇ／ｍＬに調製した。
前記基質０．０１ｍＬと、前記化合物を含む被験試料０．０５ｍＬと、バッファー溶液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５））０．０７５ｍＬとを懸濁した後、この反応溶液に炎症性細胞由来酵素（ウシ肝臓由来グルクロニダーゼ：シグマアルドリッチ社製）３００Ｕ／ｍＬを０．０１５ｍＬ添加し、全量０．１５ｍＬの反応溶液を調製した。この反応溶液を３７℃で６０分間反応させた。次いで、０．６Ｍのグリシン水酸化ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ１０．５）０．１５ｍＬを添加し、遊離したフェノールフタレインの５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールとしては、被験試料に代えて水を添加し、同様の酵素反応を行ったものを用いた。
炎症性細胞由来酵素阻害率、以下の式により算出し、ＩＣ５０（酵素活性の５０％が阻害されたときの前記被験試料の濃度）を算出した結果を表１に示す。
炎症性細胞由来酵素阻害率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×１００
ここで、Ａは、コントロールの吸光度を示し、Ｂは、被験試料を添加した場合の吸光度を示す。
【００７６】
また、酵素反応開始から、２０分間後、４０分間後、及び６０分間後の炎症性細胞由来酵素阻害活性を確認した。このとき、同時に基質のフェノールフタレインモノ−β−グルクロン酸及び炎症性細胞由来酵素（ウシ腎臓由来グルクロニダーゼ）を除いたバッファー溶液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５））中の上記反応条件下における、前記構造式（７）で表される化合物、前記構造式（１）で表される化合物、及び前記構造式（６）で表される化合物の混合比率も、試験例１と同様の方法でプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定することにより確認した。
結果を表２に示す。また、酵素反応中の前記各化合物の残存比率の経時変化（プロトンＮＭＲで観測されるピーク面積の積分比）を図１０に示す。
【００７７】
【表１】
2011116678.tif 000023
【００７８】
【表２】
2011116678.tif 000024
【００７９】
−結果−
表１の結果より、前記構造式（７）で表される化合物及び前記構造式（１）で表される化合物における炎症性細胞由来酵素阻害活性は同程度であった。
また、表２及び図１０の結果より、前記構造式（１）で表される化合物は、ｐＨ５において安定に存在し、前記構造式（７）で表される化合物及び前記構造式（１）で表される化合物の反応液中の含有量が増加するほど、炎症性細胞由来酵素阻害活性が強くなることがわかった。
【００８０】
＜好中球由来酵素阻害活性＞
−方法−
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６週齢〜１５週齢、オス、ｎ＝３、日本クレア社）の骨髄細胞から、試験例３と同様の方法で好中球を分画した。これを可溶化緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０））中で超音波処理し、遠心分離後の上清を取得することにより、好中球の可溶化物を得た。
前記好中球の可溶化物と、基質であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｍｉｎｅ標識ヘパラン硫酸（生化学工業株式会社製）と、前記構造式（７）で表される化合物を水で希釈したものを１００μＬ中で混合し、３７℃、２０時間保温した。このとき、反応液中の可溶化物として４×１０６個の細胞に由来するものを加えた。基質の最終濃度は、１０μｇ／ｍＬとした。また、前記構造式（７）で表される化合物の最終濃度は、１０μＭ、１００μＭ、及び１，０００μＭのいずれかとした。
この反応液に、ヘパリン（シグマアルドリッチ社製）を最終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加した後、１００℃にて５分間煮沸することにより、反応を停止させた。これをＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（径０．２２μｍ、ミリポア社製）でろ過した後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＨＰＬＣ装置に接続し、移動相としてＰＢＳを０．５ｍＬ／分間の流速で流すことにより、ヘパラン硫酸分解産物を溶出した。この蛍光標識ヘパラン硫酸の分解活性の測定方法は、Ｓａｓａｋｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００４，  １７２（６），３８３０−３８３５に記載された内容に従っている。
【００８１】
ヘパラン硫酸の分解度は、下記式で示すとおり、未分解のヘパラン硫酸及び分解されたヘパラン硫酸について、それぞれＨＰＬＣで２４分間以降に溶出されたピーク面積の、ピーク全体の面積に対する面積比をとり、前記分解されたヘパラン硫酸の面積比をから、前記未分解のヘパラン硫酸の面積比を引く（減ずる）ことにより定量化した。
分解度（％）＝Ｘ／Ｚ１×１００−Ｙ／Ｚ２×１００
ここで、Ｘは、分解されたヘパラン硫酸の２４分間以降に溶出されたピーク面積を示し、Ｙは、未分解のヘパラン硫酸の２４分間以降に溶出されたピーク面積を示し、Ｚ１及びＺ２は、それぞれ、分解されたヘパラン硫酸及び未分解のヘパラン硫酸のピーク全体の面積を示す。通常、Ｚ１とＺ２とは同一の値になる。
定量方法の例を図１１に示す。図１１において、Ｘ／Ｚ１×１００（未分解のヘパラン硫酸の面積比）は、８８％であり、Ｙ／Ｚ２×１００（分解されたヘパラン硫酸の面積比）は、１０％である。このときの分解度は、７８％となる。
【００８２】
−結果−
好中球の可溶化物の結果を図１２に示す。前記構造式（７）で表される化合物は、好中球由来ヘパラナーゼに対する優れた阻害活性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の抗炎症剤及び前記抗炎症剤を含有する薬用組成物は、炎症性細胞が産生する種々の炎症性メディエーターによる炎症反応や、炎症局所における前記炎症性細胞の浸潤を抑制することができ、副作用がなく、優れた抗炎症活性を有するため、発熱、疼痛、発赤、腫脹等を伴う種々の炎症性疾患や、血管炎症候群、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性腎炎等の慢性炎症性疾患の予防乃至治療に好適に利用可能である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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