(57)【要約】【課題】一過性ではなく、かつ安全性が高く、コンプライアンスの良好な勃起障害治療用組成物を提供する。【解決手段】生体組織由来幹細胞を血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含む培地で培養することにより得られる細胞培養物を含有することを特徴とする勃起障害治療用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織由来幹細胞を血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含む培地で培養することにより得られる細胞培養物を含有することを特徴とする勃起障害治療用組成物。
【請求項２】
生体組織由来幹細胞が、脂肪組織由来幹細胞である請求項１記載の勃起障害治療用組成物。
【請求項３】
組織由来幹細胞が、皮下脂肪組織由来幹細胞である請求項１又は２記載の勃起障害治療用組成物。
【請求項４】
生体組織由来幹細胞が、自家生体組織由来幹細胞である請求項１〜３のいずれか１項記載の勃起障害治療用組成物。
【請求項５】
陰茎海綿体注入用組成物である請求項１〜４のいずれか１項記載の勃起障害治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効性が高く、安全性の高い勃起障害治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国には、勃起障害（ＥＤ）患者が、およそ１１００万人存在すると推定されている。ＥＤの危険因子としては、加齢以外に糖尿病、高血圧、高脂血症、肥満、喫煙などが知られている。中でも糖尿病はＥＤの主要な危険因子であり、６０歳以上の男性糖尿病患者の７５％はＥＤであるという報告もある。糖尿病患者の増加と人口の高齢化の進行に伴い、ＥＤ患者は今後ますます増加することが予想される。
【０００３】
従来のＥＤの治療法としては、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィルなどのホスホジエステラーゼタイプ５阻害薬の経口剤がある。これらは経口投与で有効であることから、広く使用されているが、効果が一過性であり、海綿体の構造自体を改善するものではないため有効でない場合も多い。
またプロスタグランジン製剤の海綿体注射も使用されるが、持続勃起症の危険がある。また、シリコーン等のプロステーシスの陰茎海綿体への移植手術は、侵襲が大きく、また感染の危険も高いという問題がある。
【０００４】
一方、脂肪組織由来幹細胞を肝臓や胸部に移植すれば、肝臓や胸部の乳房が再生することが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１５０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、一過性ではなく、かつ安全性が高く、コンプライアンスの良好な勃起障害治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、陰茎海綿体細胞に作用する成分について検討してきたところ、生体組織由来幹細胞に血管内皮細胞増殖・分化促進因子を加えて培養した細胞を陰茎海綿体に注入したところ、血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含まない培地で培養した細胞を注入した場合に比べて顕著に勃起障害が改善され、その作用は一過性ではなく、刺激により勃起が生じ継続することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、生体組織由来幹細胞を血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含む培地で培養することにより得られる細胞培養物を含有することを特徴とする勃起障害治療用組成物を提供するものである。
また、本発明は、生体組織由来幹細胞を血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含む培地で培養することにより得られる細胞培養物を、陰茎海綿体に自家注入することを特徴とする勃起障害治療方法を提供するものである。
さらに、本発明は、生体組織由来幹細胞を血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含む培地で培養して得られる細胞培養物の、勃起障害治療用組成物製造のための使用を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の勃起障害治療用組成物を用いれば、糖尿病等によりＥＤとなった患者の陰茎が中枢神経刺激に伴ない、勃起を生じるようになる。その作用は、ホスホジエステラーゼタイプ５阻害薬のような一過性ではなく、かつプロステーシスのような手術も必要がない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】勃起障害治療実験の概要を示す。
【図２】海綿体刺激と海綿体内圧（ＩＣＰ）との関係を示す図である。
【図３】細胞投与１週間後（ＳＴＺ投与１０週後）の海綿体内圧（ＩＣＰ）を示す図である。
【図４】細胞投与２週間後（ＳＴＺ投与１１週後）の海綿体内圧（ＩＣＰ）を示す図である。
【図５】細胞投与４週間後（ＳＴＺ投与１２週後）の海綿体内圧（ＩＣＰ）を示す図である。
【図６】細胞投与６週間後（ＳＴＺ投与１５週後）の海綿体内圧（ＩＣＰ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の勃起障害治療用組成物は、生体組織由来幹細胞を、血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含む培地で培養することにより得られる細胞培養物である。原料として用いる生体組織由来幹細胞（ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、生体組織に由来する体性幹細胞であり、多分化能を有している限り、生体組織に含まれる体性幹細胞であっても、人工多能性幹細胞であってもよい。人工多能性幹細胞は例えば、特許第４１８３７４２号に記載の方法によって得られる。また生体組織に含まれる体性幹細胞の採取部位は、限定されないが、入手の容易性から、皮膚や脂肪組織が好ましい。脂肪組織としては、例えば皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪などが挙げられるが、侵襲が少ない点から皮下脂肪組織由来の幹細胞を用いるのが好ましい。皮下脂肪は、局所麻酔下で簡単に採取可能である。なお、生体組織は、自家、すなわち、患者自身のものを用いるのが望ましい。
【００１２】
生体組織から幹細胞の採取は、常法により行なえばよいが、脂肪細胞から単離する方法を以下に説明する。
採取した脂肪細胞は、まずコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素処理をする。酵素処理としてはコラゲナーゼ処理が特に好ましい。酵素処理は、３７℃、３０〜６０分が好ましい。
【００１３】
酵素処理した細胞は、メッシュ（例えば、１００μｍ）を通して大きな細胞塊を除去し、遠心分離して成熟脂肪細胞を除去する。遠心分離の条件は、５〜１０分間、６００×ｇ（１，５００〜２，０００ｒｐｍ）が好ましい。
【００１４】
得られた細胞画分を、通常の動物細胞培養用培地で培養する。ここで、培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（日水製薬株式会社等）、α−ＭＥＭ（大日本製薬株式会社等）、ＤＭＥＤ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２混合培地（１：１）（大日本製薬株式会社等）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ（大日本製薬株式会社等）等を使用することができる。血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、馬血清など）又は血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）を添加した培地を使用してもよい。血清又は血清代替物の添加量は例えば５％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）の範囲内で設定可能である。
【００１５】
次いで、生体組織由来幹細胞は、血管内皮細胞増殖・分化促進因子の存在下で培養する。血管内皮細胞増殖・分化促進因子には、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ハイドロコーチゾン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などが含まれる。このうち、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上を用いるのが好ましく、さらにＶＥＧＦを含有し、かつＩＧＦ、ＥＧＦ及びＦＧＦから選ばれる１種又は２種以上を含有するのが好ましい。ＶＥＧＦファミリーにはＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＩＧＦ−１、ＰＩＧＦ−２など存在するが、ＶＥＧＦ−Ａが特に好ましい。ＩＧＦにはＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２の二つのアイソフォームが存在するが、ＩＧＦ−１が特に好ましい。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などを含む約２０種類の成長因子ファミリーであるが、この中ではｂＦＧＦが好ましい。これらの血管内皮細胞増殖・分化促進因子の培地中の含有量は、各々１ｎｇ〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に５ｎｇ〜５０ｎｇ／ｍＬが好ましい。
培地には、血管内皮細胞増殖・分化促進因子以外の成分としては、動物細胞培養用成分が含まれる。従って、前記のＤＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＤ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２混合培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地等が用いられる。なお、このときの血清又は血清代替物の添加量は５％（ｖ／ｖ）〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましい。
【００１６】
前記２段階の培養条件は、それぞれ３７℃、７〜１４日間が好ましい。
【００１７】
得られた細胞培養物は、選択的に増殖した細胞を回収して使用するのが好ましい。回収操作は、例えば酵素処理（トリプシンやディスパーゼ処理）後の細胞をセルスクレイパーやピペットなどで剥離することによって行うことができる。また、市販の温度感受性培養皿などを用いてシート培養した培養は、酵素処理をせずにそのままシート状に細胞を回収することも可能である。
【００１８】
上記の如くして得られた細胞培養物は、後述の実施例に示すように、糖尿病等により勃起不全となった患者の陰茎海綿体に注入することにより、勃起障害を治療することができる。１回の治療で、神経の刺激に応じて、継続して勃起が生じる。すなわち、プロスタグランジン注入のような持続勃起症はなく、かつホスホジエステラーゼタイプ５阻害薬のような一過性の作用でもない。また、処置は、陰茎海綿体への注入だけであり、プロステーシスのような手術も必要なく、感染症の問題もない。
本発明の勃起障害治療用組成物の作用機序は、明らかではないが、１）注入した幹細胞が陰茎海綿体の血管内皮細胞、血管平滑筋細胞へ分化して海綿体の血管構造を改善する、２）陰茎海綿体内に留まる幹細胞が分泌する血管拡張因子の作用で海綿体内の血流が増加する等の機序が推察される。
【００１９】
本発明の勃起障害治療用組成物は、前記細胞培養物を陰茎海綿体に注入すればよい。その投与量は、患者の年齢、症状、体重などにより適宜定められるが、１回あたり細胞数として１０5〜１０7個が好ましい。また、１〜２回投与するのが好ましい。
【００２０】
また、本発明の勃起障害治療用組成物には、生理食塩水、緩衝剤、保存剤、ブドウ糖、アミノ酸、ビタミンを含有させてもよい。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されない。
【００２２】
実施例１（ＡＳＣの調整）
１）Ｗｉｓｔａｒ系ラットの皮下脂肪を採取し、氷上で細かく刻んだ。コラゲナーゼを２％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液に２ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、コラゲナーゼ溶液を得た。コラゲナーゼ溶液に脂肪組織を約１／１０量加え、３７℃で６０分インキュベートした。細胞培養液を追加してコラゲナーゼを不活化した。
【００２３】
２）細胞をメッシュ（１００μｍ）を通し、遠心分離用チューブに移した。遠沈チューブを４℃で６００×ｇ（１，７８０ｒｐｍ）で１０分遠心分離し、上清を除去した。
【００２４】
３）得られた細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＤ：Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２混合培地（１：１）を用いて特殊コーティングされていない細胞培養用のペトリ皿に、３０，０００個／ｃｍ2の密度でまいて、３７℃６時間培養した。
４）新しい培地に交換して培養皿に接着しない細胞を除いた後、さらに同じ培地で１週間培養した。
【００２５】
５）ＶＥＧＦ−Ａ、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ハイドロコーチゾン、ｂＦＧＦなどの血管内皮細胞増殖・分化促進因子及び５％牛胎児血清を含有するＥＧＭ培地（Lonza Walkersville社）１０ｍＬに、細胞数３×１０5個を添加し、フィブロネクチン（５μｇ／ｍＬ）でコーティングした培養皿を用いて３７℃、１週間培養した。
一方、陰性対照として５％牛胎児血清を含むがＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ハイドロコーチゾン、ｂＦＧＦなどの血管内皮細胞増殖・分化促進因子を含まないＥＢＭ培地（Lonza Walkersville社）で、同様に培養した細胞培養物を調製した。
【００２６】
実施例２
（ＥＤラット調整法）
６週齢Ｗｉｓｔａｒ系ラットにストレプトゾトシン（ＳＴＷ）６５ｍｇ／ｋｇ体重を尾静脈より注射し、糖尿病モデルを作成した。１０週間後（１６週齢）以降に、陰茎の勃起力を測定した。
ＳＴＺ注射４週間後に血糖値（ＢＳ）を測定し、糖尿病の発症を確認した。ＳＴＺ注射９週間後に細胞培養物（５×１０5個）を海綿体内に注入した。麻酔下に海綿体神経刺激（５．０Ｖ、２０Ｈｚ、２ｍｓｅｃの電気刺激）時の海綿体内圧（ＩＣＰ：勃起力）を圧トランスデューサー（ＡＤＩ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）を用いて測定した。実験の概要を図１に示す。図２に神経刺激と、海綿体内圧との関係を示す。
【００２７】
（結果）
図３〜図６に、細胞培養物投与１週間後、（ＳＴＺ投与１０週後）、２週間後（ＳＴＺ投与１１週後）、４週間後（ＳＴＺ投与１３週後）及び６週間後（ＳＴＺ投与１５週後）の正常ラット（Ｗｉｓｔａｒ）、コントロール（Ｃ；ＳＴＺ糖尿病ラット）、本発明細胞培養物投与群（ＡＳＣ−ＥＧＭ）、及びＥＢＭで培養した細胞（ＡＳＣ−ＥＢＭ）投与群の刺激時の海綿体内圧（ＩＣＰ）を示す。
これらの結果から、本発明細胞培養物を投与すると、刺激に応じた勃起能が有意に改善することがわかる。その効果は、極めて長期間持続した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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