(57)【要約】【課題】シクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞膜上の結合部位を明らかにし、該結合部位に作用する物質の活性を測定する方法、及び該方法に用いるためのキットを提供すること。【解決手段】工程Ａ：被検物質存在下の、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)を含む１８種類の特定のタンパク質からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド、に対するシクロペンテノン型プロスタグランジンの結合活性を測定する工程、ならびに工程Ｂ：工程Ａで得られた結合活性を、被検物質非存在下における結合活性と対比する工程(ここで、結合活性の増減が被検物質の細胞変性の調節活性を示す)を含む、被検物質の細胞変性の調節活性を検出するための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程Ａ：被検物質存在下の、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド、に対するシクロペンテノン型プロスタグランジンの結合活性を測定する工程、ならびに
工程Ｂ：工程Ａで得られた結合活性を、被検物質非存在下における結合活性と対比する工程(ここで、結合活性の増減が被検物質の細胞変性の調節活性を示す)
を含む、被検物質の細胞変性の調節活性を検出するための方法。
【請求項２】
前記タンパク質もしくはその部分ペプチドを発現してなる細胞を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標識したシクロペンテノン型プロスタグランジンを用いる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
工程Ａが、
被検物質と前記タンパク質又はその部分ペプチドとを接触させる工程、及び、
シクロペンテノン型プロスタグランジンと前記タンパク質又はその部分ペプチドとを接触させる工程
を含む、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
結合活性の測定が、シクロペンテノン型プロスタグランジンと前記タンパク質又はその部分ペプチドとの結合量の測定である、請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
工程Ａ’：熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチドを発現する細胞に、被検物質存在下、シクロペンテノン型プロスタグランジンを接触させて細胞変性度を測定する工程、ならびに
工程Ｂ’：工程Ａで得られた細胞変性度を、被検物質非存在下における細胞変性度と対比する工程(ここで、細胞変性度の増減が被検物質の細胞変性の調節活性を示す)
を含む、被検物質の細胞変性の調節活性を検出するための方法。
【請求項７】
標識したシクロペンテノン型プロスタグランジンを用いる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程Ａ’が、
被検物質と前記細胞とを接触させる工程、及び、
シクロペンテノン型プロスタグランジンと該細胞とを接触させる工程
を含む、請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
細胞変性度の測定が、細胞の形態学的変化、細胞におけるミトコンドリア機能、細胞質成分漏出量、細胞における核酸取込量、蛍光物質の核蓄積量、クロマチン凝集、及び細胞におけるＤＮＡ断片量からなる群より選らばれる少なくとも１つの測定である、請求項６〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
シクロペンテノン型プロスタグランジンが、プロスタグランジンＡ1、８−イソプロスタグランジンＡ１、プロスタグランジンＡ2、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ2、１５(Ｒ)−１５−メチルプロスタグランジンＡ2、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ2、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ2、プロスタグランジンＪ2、Δ12−プロスタグランジンＪ2、及び１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質、ならびに、シクロペンテノン型プロスタグランジンを含有してなる、被検物質の細胞変性の調節活性を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞における細胞変性調節活性の測定方法に関する。さらに詳細には、シクロペンテノン型プロスタグランジンによる細胞の変性に対する被検物質の亢進活性又は阻害活性を測定する方法、及び該方法に用いるための試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エイコサノイドは、アルツハイマー病(非特許文献１参照)あるいは脳卒中(非特許文献２参照)等の炎症性疾患において増加する生理活性物質である。エイコサノイドの一つであるプロスタグランジンＤ2は、プロスタグランジンＪ2、Δ12−プロスタグランジンＪ2、１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の順に代謝される(非特許文献３参照)。
【０００３】
特許文献１には、エイコサノイドの一つであるプロスタグランジンＤ2が、神経細胞保護作用を有することが開示されている。また、プロスタグランジンＤ2の代謝産物である１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、癌細胞等の増殖性細胞に対してアポトーシスを誘発することが報告されている(非特許文献４参照)。さらに、１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、増殖性細胞において、その受容体であるパーオキシソーム増殖因子活性化受容体γを介してアポトーシスを誘発していることが明らかにされている(非特許文献５参照)。一方、非増殖性細胞である神経細胞に対しては、１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、突起伸展作用を有することが見出されている(非特許文献６参照)。また、プロスタグランジンＤ2及び１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2を含むプロスタグランジンＤ2代謝産物は、神経細胞に対し神経細胞変性を誘発することが報告されている(非特許文献３参照)。
【０００４】
また、プロスタグランジンＤ2とは別のエイコサノイドであるトロンボキサンＡ2をマウスの片側線条体に投与すると、線条体機能の均衡が崩れ、回転行動を誘発することも知られている(特許文献２参照)。
【０００５】
神経芽細胞SH-SY5Yにおいて、１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の標的タンパク質としては、guanine monophosphate synthase, transketolase, actin beta, actine, Enolase 1 variant, pyrophosphatase, lactate dehydrogenase, biliverdin reductase A, guanine nucleotide binding protein, 14-3-3 γ protein が報告されている(非特許文献７参照)。メサンギウム細胞において、１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の標的タンパク質としては、Hsp90, Pyruvate kinase M2, Vimentin, Tublin, Actin, Methylthioadenosine phosphorylase, Tropomyosin, IgE-dependent histamine releaseing factor, Nucleoside diphosphate kinase が報告されている(非特許文献８参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２―１９８６１６号公報
【特許文献２】ＷＯ００／３０６８３号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Iwamotoら、J. Neurol., (1989) 236, 80-84
【非特許文献２】Hsuら、Ann. NY Acad. Sci., (1989) 559, 282295
【非特許文献３】Yagamiら、Exp Cell Res., (2003) 291, 212-227
【非特許文献４】Chattopadhyayら、J. Neurosci. Res., (2000) 61， 67-74
【非特許文献５】Butlerら、Cell Growth Differ., (2000) 11， 49-61
【非特許文献６】Satoら、Biochem. Biopys Res Commun., (1999) 258，50-53
【非特許文献７】Aldiniら、Biochemistry., 2007 Mar 13; 46(10): 2707-18.
【非特許文献８】Stamatakis ら、J Am Soc Nephrol., 2006 Jan; 17(1): 89-98.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、神経細胞を含む細胞の細胞膜における１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の標的タンパク質は不明であり、プロスタグランジンＤ2の他の代謝産物の標的タンパク質についての報告も示唆もされていない。
【０００９】
本発明の課題は、シクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞膜上の結合部位を明らかにし、該結合部位に作用する物質の活性を測定する方法、及び該方法に用いるためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、シクロペンテノン型プロスタグランジンの生理機能の解明を目指して鋭意研鑚を重ねた結果、１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の神経細胞膜上の結合部位を特定し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、
〔１〕  工程Ａ：被検物質存在下の、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチド、に対するシクロペンテノン型プロスタグランジンの結合活性を測定する工程、ならびに
工程Ｂ：工程Ａで得られた結合活性を、被検物質非存在下における結合活性と対比する工程(ここで、結合活性の増減が被検物質の細胞変性の調節活性を示す)
を含む、被検物質の細胞変性の調節活性を検出するための方法、
〔２〕  工程Ａ’：熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチドを発現する細胞に、被検物質存在下、シクロペンテノン型プロスタグランジンを接触させて細胞変性度を測定する工程、ならびに
工程Ｂ’：工程Ａで得られた細胞変性度を、被検物質非存在下における細胞変性度と対比する工程(ここで、細胞変性度の増減が被検物質の細胞変性の調節活性を示す)
を含む、被検物質の細胞変性の調節活性を検出するための方法、
ならびに
〔３〕  熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質、ならびに、シクロペンテノン型プロスタグランジンを含有してなる、被検物質の細胞変性の調節活性を検出するためのキット
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、シクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞膜への結合活性を測定することにより、被検物質が該結合活性を亢進又は抑制する作用を有するかを判断することができる。また、該結合活性を抑制する被検物質は、シクロペンテノン型プロスタグランジンによる細胞の変性を抑制することができるため、細胞変性の調節活性に基づく中枢神経系疾患治療剤あるいは抗がん剤として有用であると判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2全結合サンプルをウェスタンブロッティングすることによって得られた電気泳動図を示す図である。
【図２】図２は、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2非特異的結合サンプルをウェスタンブロッティングすることによって得られた電気泳動図を示す図である。
【図３】図３は、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2全結合サンプルをSYPRO Ruby染色することによって得られた電気泳動図を示す図である。
【図４】図４は、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2膜標的タンパク質の阻害剤を神経細胞に適用したときの細胞保護活性あるいは細胞変性活性を示す図である。
【図５】図５は、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2をヒト由来の各種細胞に適用したときの細胞変性活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、被検物質が、シクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞膜への結合活性を亢進又は抑制するかを調べる方法であって、細胞膜の特定の標的タンパク質にシクロペンテノン型プロスタグランジンが結合する活性を測定することに大きな特徴を有する。
【００１５】
シクロペンテノン型プロスタグランジンは低濃度では細胞保護作用を、高濃度では細胞変性作用を有することが知られているが、シクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞膜上の標的タンパク質については、これまで不明であり示唆もされていなかった。そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、シクロペンテノン型プロスタグランジンの一つである１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の標的タンパク質が、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)であることを見出した。これらの標的タンパク質は、神経細胞の細胞膜画分にシクロペンテノン型プロスタグランジンを反応させて、得られた反応物を二次元電気泳動によって解析することにより見出されたものである。
【００１６】
二次元電気泳動法(DIGE法)とは、例えば、等電点と分子量というタンパク質の有する２つの物性面から分離を行う方法であり、一般的には、まずキャピラリーゲルや市販のストリップゲルなどを分離媒体として等電点電気泳動を行い、泳動を終了したゲルを第２の平面状のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによって、等電点電気泳動の展開方向に対して直角の方向に電気泳動を行う方法である。かかる方法により分離されたタンパク質は、公知の方法、例えば、ウェスタンブロット法、質量分析法等を組み合わせて、同定することができる。このようにして見出された標的タンパク質は、従来、細胞質等に局在する可溶性タンパク質として知られていたが、予想に反して細胞膜にも局在していることを新たに見出した。本発明では、この見出された標的タンパク質へのシクロペンテノン型プロスタグランジン結合活性を測定することにより、細胞の変性予測が可能となり、被検物質の神経細胞変性の調節活性を評価することができる。
【００１７】
ここで、本発明における標的タンパク質の同定方法について説明する。形質膜に局在する難溶性タンパク質は脂質成分を含むため、可溶化及びタンパク質抽出の至適条件を見出すのが極めて困難であり、一般的には詳細な条件に開示されず個々の研究者の経験を要する。従来の方法に従い、可溶化剤としてTritonX-100、Nonidet、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、Chaps等を用い、0.1〜10(v/v)％と濃度を振り、温度を4℃又は37℃に設定し、1時間〜24時間攪拌後、アセトン処理でタンパク質回収を試みたが、同定には至らなかった。鋭意研究を行った結果、意外にも、細胞膜タンパク質を1(v/v)％ TritonX-100で可溶化した遠心後の上清(可溶性分画)ではなく、沈殿(超難溶性画分)を、二次元電気泳動することにより初めて１５-デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2膜標的タンパク質の同定に成功した。このようにして、これまで細胞質に局在すると考えられた、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)を標的タンパク質として見出した。
【００１８】
なお、以下に本明細書で使用される用語を説明する。「エイコサノイド」とは、アラキドン酸由来の生理活性物質を意味する。例えば、トロンボキサン(例えば、トロンボキサンＡ2など)、プロスタグランジン(例えば、プロスタグランジンＤ2、プロスタグランジンＪ2、Δ12−プロスタグランジンＪ2、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2、プロスタグランジンＥ2、プロスタグランジンＩ2、プロスタグランジンＦ2α、プロスタグランジンＡ2など)、ロイコトリエン(例えば、ロイコトリエンＡ4、ロイコトリエンＢ4、ロイコトリエンＣ4、ロイコトリエンＤ4、ロイコトリエンＥ4)、ヒドロキシエイコサテトラエン酸などが挙げられる。また、「プロスタグランジン」とは、アラキドン酸よりシクロオキシゲナーゼによって産生される生理活性物質を意味する。例えば、プロスタグランジンＤ2、プロスタグランジンＪ2、Δ12−プロスタグランジンＪ2、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2、プロスタグランジンＥ2、プロスタグランジンＩ2、プロスタグランジンＦ2α、プロスタグランジンＡ2などが挙げられる。ここで、「プロスタグランジンＤ2」は、プロスタグランジンＤ2シンターゼによりプロスタグランジンH2から産生されるプロスタグランジンを意味する。シクロペンテノン型プロスタグランジンは、プロスタグランジンＤ2の非酵素的脱水反応によっても生成しうる。「シクロペンテノン型プロスタグランジン」としては、プロスタグランジンＡ2、プロスタグランジンＡ1、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＡ2、１５(Ｒ)−１５−メチルプロスタグランジンＡ2、１６−フェノキシテトラノルプロスタグランジンＡ2、１７−フェニルトリノルプロスタグランジンＡ2、プロスタグランジンＪ2、Δ12−プロスタグランジンＪ2、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2、及び８−イソプロスタグランジンＡ１が挙げられ、なかでも、プロスタグランジンＪ2、Δ12−プロスタグランジンＪ2、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2が好ましい。「調節活性」とは、亢進活性又は阻害活性を意味する。
【００１９】
また、本発明の方法は、細胞変性の結果生じる以下の現象を指標として用いる方法も包含する。「形態学的変化」とは、光学顕微鏡又は電子顕微鏡で細胞を観察した時の形態学上の変化、例えば、神経突起の縮退、細胞体の萎縮、細胞膜の泡沫化、細胞内小器官の異常、核の断片化等を意味する。「ミトコンドリア機能」とは、ミトコンドリアの酸化還元能を意味する。「細胞質成分漏出」とは、何らかの細胞膜障害による乳酸デヒドロゲナーゼを含む細胞質成分の細胞外への漏出を意味する。「核酸取込」とは、チミジン等の核酸の細胞内への取込を意味する。「蛍光物質の核蓄積」とは、何らかの細胞膜障害によるプロピヂウムアイオダイド等の蛍光物質の細胞核への蓄積を意味する。「クロマチン凝集」とは、固定された細胞をDNAに特異的に結合する蛍光色素で染色した時に蛍光顕微鏡で観察される核内の大小多数の球状構造を意味する。「ＤＮＡ断片」とは、細胞核で観察される切断されたＤＮＡを意味する。
【００２０】
＜被検物質の細胞変性の調節活性を検出するための方法＞
次に、本発明の被検物質の細胞変性の調節活性を検出するための方法について説明する。前記方法は、測定対象によって、
工程Ａ：被検物質存在下の、標的タンパク質又はその部分ペプチドに対するシクロペンテノン型プロスタグランジンの結合活性を測定する工程、及び
工程Ｂ：工程Ａで得られた結合活性を、被検物質非存在下における結合活性と対比する工程(ここで、結合活性の増減が被検物質の細胞変性の調節活性を示す)
を含む方法(態様１)、ならびに
工程Ａ’：標的タンパク質又はその部分ペプチドを発現する細胞に、被検物質存在下、シクロペンテノン型プロスタグランジンを接触させて細胞変性度を測定する工程、及び
工程Ｂ’：工程Ａで得られた細胞変性度を、被検物質非存在下における細胞変性度と対比する工程(ここで、細胞変性度の増減が被検物質の細胞変性の調節活性を示す)
を含む方法(態様２)
が挙げられる。なお、本明細書において、「標的タンパク質又はその部分ペプチド」を、単に「標的タンパク質」と記載することもある。
【００２１】
態様１及び２における標的タンパク質としては、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)が挙げられる。これらのタンパク質は、細胞膜上に発現しているものであり、シクロペンテノン型プロスタグランジンと結合することが見出されたものである。本発明においては、前記標的タンパク質は、シクロペンテノン型プロスタグランジンとの結合が確認されるのであれば、少なくとも１つ又は２種以上を組み合わせて用いることができる。前記タンパク質の種は特に限定されないが、好ましくは、ヒト、ラット、マウスである。なお、前記標的タンパク質は、NCBI及びSWISS  Protのような公知のデータベースを参照することにより、該タンパク質の分子量、等電点、構成アミノ酸等の情報を得ることができる。
【００２２】
膜標的タンパク質の部分ペプチドとは、前記標的タンパク質のアミノ酸配列において、シクロペンテノン型プロスタグランジンとの結合サイトを有するものであれば、前記アミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチドが例示される。
【００２３】
態様１における膜標的タンパク質は、シクロペンテノン型プロスタグランジンと結合できるのであれば、反応液中に遊離していても固定化されていてもよいが、シクロペンテノン型プロスタグランジンとの結合効率の観点から、態様２と同様に、細胞膜上に発現していることが好ましい。
【００２４】
細胞としては、前記タンパク質又はその部分ペプチドを発現してなる細胞であれば特に限定されず、生体組織より調製した初代培養細胞あるいは継代可能な株化細胞等を用いることができる。初代培養細胞としては、神経細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞等を用いることができる。株化細胞としては、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫、白血病等の癌細胞等の等を用いることができる。
【００２５】
神経細胞としては、例えば、大脳皮質又は海馬を、等張溶液中でプロテアーゼやＤＮＡ分解酵素を添加して、好ましくは20〜40℃、より好ましくは25〜38℃で、好ましくは5〜20分間、より好ましくは10〜15分間培養することにより調製することができる。得られた神経細胞は、培地に懸濁して、吸着防止用にコーティングした培養用プレートに撒くことにより使用することができる。
【００２６】
等張溶液としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等の塩類、及びグルコース、スクロース等の糖類を混合して使用すれば良い。プロテアーゼとしては、例えば、トリプシンン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、パパイン(0.44mg/mL)等が挙げられ、好ましくはトリプシンを用いる。ＤＮＡ分解酵素としては、例えば、デオキシリボヌクレアーゼＩ及びＩＩ等が挙げられ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼＩを用いる。培地としては、例えば、Leivbovitz's L−15培地、Eagle's Basic培地、Eagle's MEM培地、F10培地、Dulbecco's MEM培地、RPM−1640培地、F12培地、Is cove'sMDM培地、McCoy's5a等を用いることができる。プレ−トのコ−ティング剤としては、poly−L−lysin、コラーゲン、ポリエチレンイミン、ポリオルニチン等を用いることができる。
【００２７】
このようにして得られた神経細胞は、標的タンパク質を既に発現したものであることから、そのまま用いることができる。また、前記得られた神経細胞に、標的タンパク質の遺伝子を公知の方法に従って導入することによりさらに発現したものを用いてもよい。
【００２８】
また、標的タンパク質又はその部分ペプチドを発現してなる細胞としては、市販品を用いてもよく、例えば、気管支平滑筋細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞等のヒト正常細胞等を好適に用いることができる。また、NIH3T3等の神経芽細胞、神経成長因子あるいは脳由来神経栄養因子等の神経栄養因子により神経細胞へと分化されたPC12細胞等を好適に用いることができる。さらに、標的タンパク質の遺伝子を公知の方法に従ってHEK293、COS7等に導入することにより強制発現させた細胞を用いてもよい。Caki-1、Caki-2、ACHN、786-O等の癌細胞を用いることができる。
【００２９】
態様１及び態様２で用いられる被検物質としては、細胞変性に対する調節活性が未知の化合物のみならず、細胞変性に対する調節活性が他の実験系で確認されている化合物であってもよい。
【００３０】
態様１の工程Ａ及び態様２の工程Ａ’では、シクロペンテノン型プロスタグランジンと標的タンパク質との結合が被検物質の存在下で行われるのであれば、特に限定はないが、被検物質の薬効を十分に検出する観点から、被検物質と標的タンパク質との接触を先に行うことが好ましい。よって、工程Ａは、被検物質と標的タンパク質とを接触させる工程、及び、シクロペンテノン型プロスタグランジンと標的タンパク質とを接触させる工程を含むことが好ましい。また、工程Ａ’は、被検物質と標的タンパク質を発現する細胞とを接触させる工程、及び、シクロペンテノン型プロスタグランジンと標的タンパク質を発現する細胞とを接触させる工程を含むことが好ましい。
【００３１】
標的タンパク質とシクロペンテノン型プロスタグランジンとの接触は、被検物質の存在有無に関わらず、結合反応を十分に行う観点から、好ましくは4〜37℃、より好ましくは4〜25℃で、好ましくは12〜72時間、より好ましくは24〜60時間反応させることが望ましい。なお、被検物質と標的タンパク質との接触を先に行う場合は、被検物質の種類や添加量に応じて被検物質の接触を先に行ってから、前記条件で、標的タンパク質とシクロペンテノン型プロスタグランジンとの接触を行うことができる。
【００３２】
態様１における、シクロペンテノン型プロスタグランジンと標的タンパク質との結合活性を測定する方法としては、結合したタンパク質を測定できるのであれば特に限定はないが、これらタンパク質の結合量を測定する方法が好ましい。例えば、[3H]、[14C]等の放射性同位体で標識した放射性同位体標識シクロペンテノン型プロスタグランジンを用いて、液体シンチレーションカウンターにより従来の方法で測定することができる。また、非標識シクロペンテノン型プロスタグランジンのカルボキシル基をアミノカラムにカップリングさせることにより、表面プラズモン共鳴(Biacore)を指標に結合量を測定することができる。
【００３３】
また、標識したシクロペンテノン型プロスタグランジンを用いる方法として、酵素免疫測定法(EIA)、酵素イムノメトリックアッセイ法(ELISA)、蛍光免疫測定法(FIA)、放射線免疫測定法(RIA)、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法等も挙げられる。また、高感度に多くのタンパク質を検出できることから、二次元電気泳動法(DIGE法)を用いることもできる。
【００３４】
シクロペンテノン型プロスタグランジンの標識化は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、[3H]、[14C]等の放射性同位体で標識する放射性標識あるいはビオチン標識等の非放射性標識いずれも当該分野で公知の方法に従って行うことができる。また、ビオチン標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2〔Cayman(米国)〕等の市販品を用いてもよい。
【００３５】
また、質量分析方法を用いる方法も例示される。具体的には、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)型質量分析装置、ESI(エレクトロスプレイイオン化法)型質量分析装置等を用いる質量分析方法が挙げられる。
【００３６】
態様２における、シクロペンテノン型プロスタグランジンと標的タンパク質との結合による細胞変性度を測定する方法としては、細胞が変性することにより生じる現象が確認できるのであれば特に限定はない。ここで、細胞変性度とは、細胞の変性程度を意味する。前記方法の具体例としては、例えば、細胞の形態学的変化を測定する方法、ミトコンドリア機能を測定する方法、細胞質成分漏出量を測定する方法、細胞における核酸取込量を測定する方法、蛍光物質の核蓄積量を測定する方法、クロマチン凝集を測定する方法、ＤＮＡ断片量を測定する方法が例示される。なお、本発明において、１つの測定方法の結果のみでも、２つ以上の測定方法の結果を組み合わせて、細胞の細胞変性度としてもよい。
【００３７】
具体的には、例えば、ミトコンドリア機能を測定する方法について説明する。先ず、神経細胞培養液に、ＭＴＴ(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)を添加し、好ましくは20〜40℃、より好ましくは25〜38℃で、好ましくは30〜180分間、より好ましくは60〜120分間培養し、産生したホルマザン結晶をプロパノールに溶解させて、自動マイクロプレートリーダーの特定波長で測定して、細胞のミトコンドリアの呼吸能を評価することができる。
【００３８】
かくして、被検物質存在下及び非存在下の両条件における、シクロペンテノン型プロスタグランジンと標的タンパク質との結合活性、及びシクロペンテノン型プロスタグランジンと標的タンパク質との結合による細胞の細胞変性度が測定される。なお、被検物質非存在下の結合活性や細胞変性度は、工程Ａ又はＡ’における被検物質存在下での測定の際に併せて測定しても、別途測定してもよい。また、被検物質非存在下の測定を複数回行って、その統計から被検物質非存在下の結合活性や細胞変性度を設定して、被検物質存在下のデータと比較することが好ましい。
【００３９】
被検物質存在下の結合活性や細胞変性度と非存在下のそれとを対比して解析する方法としては、特に限定はなく、公知の方法(Steel法、t検定、Dunnett's test法等)を用いることができる。
【００４０】
前記解析により、例えば、結合活性が被検物質非存在下よりも被検物質存在下の方が有意に減少あるいは増加していることが示された場合、被検物質はシクロペンテノン型プロスタグランジンの結合活性を調節する物質として判断される。即ち、この試験により結合活性を調節する物質として判断された物質は、細胞変性を亢進あるいは抑制する細胞変性調節物質の候補物質となる可能性が高いと判断される。また、結合活性が被検物質非存在下と存在下でほぼ同じであることが示された場合は、被検物質がシクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞変性を抑制も亢進もしない可能性が高いと判断される。
【００４１】
また、細胞変性度が被検物質非存在下よりも被検物質存在下の方が有意に減少していることが示された場合は、被検物質がシクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞変性を抑制する可能性が高いと判断される。細胞変性度が被検物質非存在下よりも被検物質存在下の方が増加していることが示された場合は、被検物質がシクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞変性を亢進する可能性が高いと判断される。また、細胞変性程度が被検物質非存在下と存在下でほぼ同じであることが示された場合は、被検物質がシクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞変性を抑制も亢進もしない可能性が高いと判断される。なお、「細胞変性程度の増加」とは、細胞変性程度の増加又は増大を意味し、「細胞変性程度の減少」とは、細胞変性程度の減少又は縮小を意味する。
【００４２】
このようにして細胞変性を抑制する可能性が高いと判断された被検物質は、細胞保護剤(例えば、神経細胞変性抑制剤、神経細胞死抑制剤)として有用であり、さらには中枢神経系疾患治療剤(なかでも、脳卒中又はアルツハイマー病の治療剤)として有用である。すなわち、中枢神経系疾患により生じうる神経細胞変性に対し、神経細胞変性阻害活性を発揮し、中枢神経系疾患の治療又は予防を行うことができる。中枢神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー型痴呆症、パーキンソン氏病、精神分裂病、小脳変性症剤、ウィルソン氏病、ダウン症候群、網膜色素変性症、レビー小体病、脳虚血、筋萎縮性側索硬化症、プリオン関連疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、クル病、多発性硬化症、遺伝性運動失調症、シャイードレガー症候群、進行性核上性症候群、ハンチントン舞踏病、脊髄筋萎縮症、ライ症候群、てんかん重積持続状態、進行性多病巣性白質脳、ウイルス性脳炎、正常圧水頭症、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄損傷後変性、前頭葉痴呆、灰白髄炎、緑内障、自律神経症、ギランーバール症、糖尿病性神経症、ポルフィン症、自己免疫疾患、脈管炎などが挙げられる。
【００４３】
このようにして細胞変性を亢進する可能性が高いと判断された被検物質は、細胞変性誘導剤(例えば、抗がん剤)として有用である。癌としては、例えば、道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫、白血病等を挙げることができる。また、抗喘息剤、抗動脈硬化剤、抗糸球体腎炎剤等に用いることができる。
【００４４】
また、本発明の方法により選択された化合物は中枢神経系に作用するものであるため、中枢への移行性を高める観点から、周知の方法に従ってプロドラック化してもよく、このような化合物も本発明の範囲内に含まれる。
【００４５】
＜被検物質の神経細胞変性の調節活性を判定するためのキット＞
本発明の別の態様では、被検物質の細胞変性の調節活性を判定するためのキットが提供される。
【００４６】
本発明のキットには、シクロペンテノン型プロスタグランジンとその標的タンパク質との結合を検出することができるものであれば全て含まれる。具体的には、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質、ならびに、シクロペンテノン型プロスタグランジンを含有するキットが挙げられ、結合したタンパク質を検出する方法であれば(例えば、ウェスタンブロット法、ELISA法等)、前記キットを用いることができる。なお、前記標的タンパク質とシクロペンテノン型プロスタグランジンとの結合が検出されるのであれば、それ以外のタンパク質との結合が同時に検出されることがあってもよい。
【００４７】
本発明のキットを用いて、被検物質の存在下と非存在下の、標的タンパク質とシクロペンテノン型プロスタグランジンとの結合を測定して、被検物質存在下の結合量が非存在下の結合量に比べて有意に減少した場合には、被検物質が神経細胞変性を制する可能性が高いと判断することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００４９】
調製例１  細胞膜調製
ホモジナイズしたラットの大脳皮質をPercall密度勾配遠心法により分画し、細胞膜を調製した。具体的には、下記の要領で行った。
【００５０】
5匹のラットより大脳皮質を摘出し、22.5mL STE緩衝液(10 mM Tris (pH7.5), 0.25M sucrose, 0.1 mM EGTA, Aprotinin (0.185％ v/v))を用いてホモジナイズした。
【００５１】
次に、得られた試料を700×gで10分間遠心した後、上清を取り除き、沈殿物約7.5mLに、STE緩衝液16.5mLを加えて、サンプル(24mL)をホモジナイズした。その後、Percoll液を216mL加えて、終濃度、10 mM Tris (pH7.5), 0.25M sucrose, 0.1 mM EGTA, Aprotinin (0.185％ v/v), 14％ Percoll)とした。35000×gで45分間遠心し、神経細胞を細胞膜、脂質、核酸に分画した。
【００５２】
得られた細胞膜画分約88mLを採取し、72mL HEA緩衝液(50 mM Hepes (pH7.5), 1 mM EGTA, Aprotinin (0.185％ v/v))を加えたサンプル(160mL)を12000×gで30分間遠心した。
【００５３】
遠心後、上清を取り除き、沈殿物約5mLにHEA緩衝液5mLを加え、膜タンパク質サンプル(10mL)をホモジナイズした。これを500μLずつ分注して、液体窒素で凍結後、-80℃下で保存した。これを適宜解凍し、以降の結合実験を行った。
【００５４】
実施例１  結合実験
調製例１より得たサンプルに、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2を加え、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2結合タンパク質を作成した。なお、ビオチン標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2はCayman(米国)より購入した。
【００５５】
具体的には、4mL 全結合サンプル(0.1mg/mL 膜タンパク質、50 mM Tris (pH8.0)、100 mM NaCl、10μMビオチン標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2)及び4mL 非特異的結合サンプル (0.1mg/mL 膜タンパク質、50 mM Tris (pH8.0)、100 mM NaCl、10μM１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2、1μM１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2)を4℃の環境下で終夜反応させた。
【００５６】
得られた反応物は、反応後、3500×gで10分間遠心した。その後、上清を取り除き、前記反応の際に使用した緩衝液(50 mM Tris (pH8.0)／100 mM NaCl)と同量のPBS緩衝液を沈殿物に加え、3500×gで10分間遠心した。この作業を3回繰り返した。3回目の遠心後の沈殿物に1％のTriton-Xを含むPBS緩衝液4〜12mLを加え、30分間室温で反応させた。反応後、3500×gで15分間遠心し、上清と沈殿物を分けた。得られた沈殿物を、後述の実施例２に使用した。
【００５７】
実施例２  二次元電気泳動解析
実施例１より得られた１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2結合タンパク質400μgを下記に示す二次元電気泳動にて解析した。
【００５８】
一次元目電気泳動(等電点電気泳動)
乾燥ストリップゲル〔17cm、pH勾配(pH3〜10)〕を5mLの膨潤液(1.8g尿素, 0.76g チオ尿素, 2％(v/v)TritonX-100, 10 mg dithiothreitol (DTT), 1％ (v/v) Pharmalyte, 2.5 mM 酢酸, 0.0025 ％(w/v)BPB)で終夜、室温膨潤した。
【００５９】
１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2膜結合タンパク質を、1.00 mL 抽出液(0.30g 尿素, 0.15g チオ尿素, 0.10mL 20％(w/v)CHAPS, 0.10mL 20％(w/v)SB3-10, 0.01g dithiothreitol (DTT), 0.02mL Pharmalyte)に溶解させた。
【００６０】
濾紙に上記サンプルを染み込ませ、ストリップゲルの陰極側へ密着させ、プログラム(500V 2 h, 700V 0.5 h, 1000V 0.5 h, 1500V 0.5 h, 2000V 0.5 h, 2500V 0.5 h, 3000V 0.5 h, 3500V 19 h)に従い24時間泳動した。
【００６１】
一次元電気泳動後にストリップゲルを5mL SDS処理液(1.815g 尿素, 25 mg dithiothreitol(DTT), 25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2％(w/v)SDS, 0.0025％(w/v)BPB, 30％(v/v)グリセロール)に浸し、5mL還元アルキル化処理液(25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2％(w/v)SDS, 0.0025％(w/v)BPB, 30％(v/v)グリセロール, 225 mg iodoacetamide)に浸した。
【００６２】
二次元目電気泳動(分子量電気泳動)
3％Cポリアクリルアミドゲルプレート(35％(w/v) acrylamide 42.85mL、2％(w/v) BIS-acrylamide 23.2mL、2M Tris-HCl、pH 8.8 23.44mL、60％(v/v) グリセロール 13.5mL、Milli-Q 21.06mL、10％(w/v) SDS 1.25mL、10％ APS 1.0〜1.5mL TEMED 0.075mL)２枚を泳動槽にセットし、ゲルストリップをゲルプレートに装着した。
【００６３】
Tris‐Glycine系SDS-泳動バッファー(Tris 30.3g, Glycine 144g, SDS 10g/ Milli-Q水10 L)を泳動槽に注いだ。15分間 定電流25mA/1枚で泳動を開始し、約5時間 定電流30mA/1枚で通電後、BPBのバンドがほぼ先端に来た時に終了した。
【００６４】
泳動後、下記の条件でゲルをウェスタンブロッティング解析し、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2標的タンパク質の泳動位置を確認し、SYPRO Rubyでタンパク質を検出した。
【００６５】
実施例３  ウェスタンブロッティング解析
実施例２で得られたゲルを用いてPVDF膜への転写を行った。転写されたサンプルに対して、下記に示す一次抗体をロードし、常温(25℃)で2時間インキュベーションした。反応後、PVDF膜をPBS(Phosphate Buffered Saline)バッファーにより洗浄後、下記の二次抗体の溶液を添加し、1時間反応させた。抗体と反応した後、ECL発色溶液を添加することによって各バンドを検出させた。結果を図１及び図２に示す。
一次抗体：マウス抗ヒトZYXポリクローナル抗体 (抗体希釈率 1/500) 
二次抗体：西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート-ヒツジ抗マウスIgG抗体 (抗体希釈率 1/400)
【００６６】
図１より、全結合試料は、ビオチン標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2特異的結合タンパク質と、非特異的結合タンパク質の両者を示している。図２より、非特異的結合試料は、ビオチン標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2非特異的結合タンパク質を示している。二つの試料の比較を行い、非特異的結合試料で検出量が減少しているタンパク質がビオチン標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2特異的結合タンパク質であると判断された。図１の全結合試料中の丸で囲んでいるタンパク質は、特異的結合タンパク質の中で同定に成功したタンパク質である。
【００６７】
実施例４  SYPRO Ruby染色
SYPRO Ruby染色は、下記の要領で行った。
１．ゲルを50％メタノール／10％酢酸(約200mL)中で30分間以上振とう後、10％メタノール／7％酢酸中で、さらに30分間振とうして固定した。
２．固定液を捨てて、SYPRO Ruby染色液(約200mL)を注ぎ、遮光して室温(25℃)で、1.5〜2時間振とうした。
３．10％メタノール／8％酢酸中で30分間洗浄して過剰の色素を除き、FluoroPhoreStar 3000を用いて蛍光画像を取り込んだ。
４．実施例３で得られたビオチン標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2特異的結合タンパク質と、二次元電気泳動上で位置が一致しているタンパク質を１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2標的タンパク質とした。図３の丸で囲んでいるタンパク質は、同定に成功したタンパク質である。
【００６８】
実施例５  インゲル消化・スポッティング
実施例４で得られた１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2標的タンパク質のスポットを切り抜き、ゲル中のタンパク質を一晩トリプシン(Promega社)で処理してペプチド断片にした後、C18Tip(Eppendorf社)を用いて脱塩をおこなった。MALDIサンプルプレートに、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2標的タンパク質のペプチド1μLとマトリックス溶液〔10mg/mL α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)、50％アセトニトリル、0.1％ TFA)1μLを添加し、共結晶化させた。MALDI-TOF型質量分析装置により、全ペプチドの質量を測定し、解析を行った。具体的には、MALDIサンプルプレートを質量分析機(AXIMA-TOF2、島津製作所)にセットしてレーザーを照射し、リフレクトロンモードで質量を自動測定した。上記ペプチドの質量パターンを得て、それをタンパク質同定ソフトMascotにて解析した。結果を表１に示す。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
表１より、これまで細胞質に局在すると考えられた、熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)を予想に反して細胞膜にも局在していることを見出した。
【００７１】
実施例６
Developmental Brain Research,30(1986)47−56頁記載の方法に従って、Sprague−Dawley rat(胎生１９日)より大脳皮質を取りだし、等張溶液(137 mM 塩化ナトリウム, 5.4 mM 塩化カリウム, 0.17 mM リン酸二ナトリウム, 0.22 mM リン酸カリウム, 5.5 mM グルコ−ス, 59 mM スクロ−ス；各25mL)に懸濁した。トリプシン及びデオキシリボヌクレア−ゼを、それぞれ 4mg/mL及び 0.4mg/mLとなるように添加し、37℃で12分間、培養して神経細胞を分散させた。Leivbovitz's L−15培地(5％子牛血清＋5％馬血清を含有)に、神経細胞を1 x 106 cells/ mLになるように懸濁した。poly−L−lysinでコ−ティングした培養用プレ−トに2.5 x 10５ cells/cmの密度で神経細胞を撒いた。神経細胞は、37℃の5％ CO2インキュベ−タ−で培養し、２日目に実験に用いた。
【００７２】
前記のようにして調製した培養神経細胞を用いて、表１記載の１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2膜標的タンパク質について、該タンパク質の阻害剤による細胞生存への効果を調べた(血清不含培地中)。結果を図４に示す。棒グラフのカラムは、それぞれ(１)コントロール群、(２)電位依存性陰イオンチャンネル阻害剤(20 μM 4,4'-Diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid disodium salt hydrate)、(３)ATP合成酵素阻害剤(0.1 μM oligomycin A)、(４)エノラーゼ２阻害剤(2 μM sodium fluoride)、(５)ベシクルフュージングATPアーゼ阻害剤(0.2 μM N-Ethylmaleimide)、(６)5μM １５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2、(７)5μM １５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2＋イソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤(0.5μM oxalomalic acid)、(８)5μM １５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2＋ダイナミン１阻害剤(8μM Dynasore monohydrate)、を培地(血清不含)1mLに対して添加した。添加12時間後に、MTTアッセイ(ミトコンドリア活性)を行った。一群の例数は３で、Dunnett's testを用い、有意差検定を行った。＊はP<0.05、＊＊はP<0.01で有意差のあることを示す。
【００７３】
熱ショックタンパク質８は分子シャペロンで翻訳されたタンパク質のフォールディングの関与している。従って、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、熱ショックタンパク質８を介して高次構造の破壊されたタンパク質の修復及びタンパク質変性の抑制機能を制御していると考えられる。
【００７４】
ベシクルフュージングATPアーゼは、N-エチルマレイミド感受性因子であり細胞内小胞と膜との融合の接着過程を仲介するタンパク質である。従って、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、ベシクルフュージングATPアーゼを介して細胞内で合成された物質(蛋白質など)を分泌顆粒内に貯留し、開口分泌によって分泌する機構を制御していると考えられる。図４の条件において、N-エチルマレイミド感受性因子阻害剤には細胞変性亢進作用が検出された。
【００７５】
エノラーゼ２は解糖系、イソクエン酸デヒドロゲナーゼはクエン酸回路、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼは解糖系における酵素である。従って、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、エノラーゼ２・イソクエン酸デヒドロゲナーゼ・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ及びATP合成酵素を介して嫌気的及び好気的ＡＴＰ産生を制御していると考えられる。図４の条件において、エノラーゼ２阻害剤及びATP合成酵素阻害剤には細胞変性亢進作用が検出された。一方、イソクエン酸デヒドロゲナーゼには、細胞変性抑制作用が検出された。
【００７６】
14-3-3タンパク質ζ/δは、ヒスタミンの分泌やタンパク質のミトコンドリアへの輸送に関与しているタンパク質である。従って、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、14-3-3タンパク質ζ/δを介してヒスタミンの分泌やタンパク質のミトコンドリアへの輸送を制御していると考えられる。
【００７７】
電位依存性陰イオンチャンネルは、膜電位に依存して陰イオンを運ぶイオンチャンネルである。従って、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2は、電位依存性陰イオンチャンネルを介して陰イオンの輸送を制御していると考えられる。図４の条件において、電位依存性陰イオンチャンネル阻害剤には、細胞変性抑制作用が検出された。
【００７８】
実施例７
ヒト気管支平滑筋細胞(Clontics より購入)を Molecular, Developmental, and Cellular Biology培地(5％子牛血清, 50μg/mL gentamicin, 50ng/mL amphotericin, 0.5ng/mL human epidermal growth factor, 5mg/mL insulin, and 2ng/mL human fibroblast growth factor)に、3.5 x 103cells/cmの密度で培養用プレ−ト(48穴)に撒いた。ヒト大動脈内皮細胞(Clontics より購入)を Czapek Dox Broth改変培地(２％子牛血清, 50μg/mL gentamicin, 50ng/mL amphotericin, 10ng/mL human epidermal growth factor, 12mg/mL ウシ脳抽出物, and 1ng/mL hydrocortisone)に、5 x 104cells/cmの密度で培養用プレ−ト(48穴)に撒いた。ヒトメサンギウム細胞(Clontics より購入)を CCMD 180培地(5％子牛血清, 50μg/mL gentamicin, 50ng/mL amphotericin)に、3.5 x 103cells/cmの密度で培養用プレ−ト(48穴)に撒いた。ヒト肝細胞(Applied Cell Biology Research Instituteより購入)を CS-C培地(10％子牛血清)に、5 x 104cells/cmの密度で培養用プレ−ト(48穴)に撒いた。ヒト皮膚繊維芽細胞(Clontics より購入)を ＤＭＥＭ培地(１０％子牛血清, 50U/mL penicilin, 50μg/mL streptomycin)に、5 x 104cells/cmの密度で培養用プレ−ト(48穴)に撒いた。細胞は、37℃の5％ CO2インキュベ−タ−で培養した。
【００７９】
前記のようにして培養した細胞を用いて、10μM １５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の細胞生存への効果を調べた(図５)。棒グラフのカラムは、上から順にヒト気管支平滑筋細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒトメサンギウム細胞、ラット大脳皮質神経細胞、ヒト肝細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞である。１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2添加１２時間後に、MTTアッセイ(ミトコンドリア活性)を行った。一群の例数は４で、Dunnett's testを用い、有意差検定を行った。＊はP<0.05、＊＊はP<0.01で有意差のあることを示す。
【００８０】
結果、ヒト肝細胞及びヒト皮膚繊維芽細胞において、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の細胞変性調節活性は検出されなかった。一方、ヒト気管支平滑筋細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒトメサンギウム細胞、ラット大脳皮質神経細胞において、１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2の細胞変性亢進作用が検出された。
【００８１】
実施例８  中枢神経系疾患治療剤候補化合物のスクリーニング
１次スクリーニング
(１−１) 熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチドを発現している組織あるいは強制発現させた細胞から細胞膜を調製する。
【００８２】
(１−２)トリチウム標識１５−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンＪ2をリガンドとして結合実験を行い、膜標的タンパク質に結合する公知の化合物あるいは抗体を用いて特異的結合に影響を与える物質をスクリーニングする。
【００８３】
２次スクリーニング
(２−１) 熱ショックタンパク質８(Heat shock protein 8)、Protein prune ホモローグ(Protein prune homolog)、ジヒドロピリミヂナーゼ関連タンパク質２(Dihydropyrimidinase-related protein 2)、ダイナミン１(Dynamin-1)、エノイル-CoA ヒドラターゼ(Enoyl-CoA hydratase)、ベシクルフュージングATPアーゼ(Vesicle-fusing ATPase)、インターネキシンα(Internexin  α)、ATP合成酵素(ATP synthase)、グリア線維酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, testis-specific)、エノラーゼ２(Enolase2)、F-アクチン-キャッピング タンパク質(F-actin-capping protein)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Isocitrate dehydrogenase)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、レギュカルシン(Regucalcin)、オートファジー関連タンパク質３(Autophagy-related protein 3)、電位依存性陰イオンチャンネル(Voltage-dependent anion channel)、及び14-3-3タンパク質ζ/δ(14-3-3 proteinζ/δ)からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質又はその部分ペプチドを発現している組織から初代培養を行い、あるいは強制発現させた細胞を培養する。
【００８４】
(２−２)１次スクリーニングの結果得られた化合物あるいは抗体を上記初代培養細胞あるいは強制発現細胞に適用し、細胞保護作用あるいは細胞毒性を評価する。
【００８５】
(２−３)細胞保護作用を有する化合物は、アルツハイマー病等の中枢神経系疾患モデル動物に適用し薬効を評価する。
【００８６】
(２−４)細胞毒性を有する化合物は、腎癌等の癌モデル動物に適用し薬効を評価する。
【００８７】
(２−５)上記(２−１)〜(２−４)において得られた化合物をシード化合物として構造類縁体を合成し、構造-活性相関を調べ、(２−３)もしくは(２−４)を再試行する。
【００８８】
従って、本発明では、この見出された標的タンパク質へのシクロペンテノン型プロスタグランジン結合活性を測定することにより、神経細胞の変性予測が可能となり、被検物質の神経細胞変性の調節活性を評価することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明の方法により、被検物質の細胞変性の調節活性を検出することができる。細胞変性亢進作用を有する物質は、抗がん剤、例えば、道癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、胆道癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、悪性リンパ腫、白血病等の治療剤として有用な候補化合物を効率よくスクリーニングすることができる。細胞変性抑制作用を有する物質は、中枢神経系疾患治療剤、例えば、脳卒中、アルツハイマー病、クロイツフェルト‐ヤコブ病等の治療剤として有用な候補化合物を効率よくスクリーニングすることができる。
【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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