(57)【要約】【課題】動物の組織や臓器を形成する細胞の培養操作及び培養された細胞の回収操作を半自動化又は自動化して、培養された細胞への汚染物混入を防止するとともに、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる半自動又は自動細胞培養システムを提供する。【解決手段】本発明の細胞培養システムは、細胞培養器Ａと、培養液容器Ｂ、洗浄液容器Ｃ、剥離剤容器Ｄ、培養細胞回収容器Ｆ及び廃液容器Ｇの５つの容器と剥離剤収容シリンジＥと、２つのポンプＰ１及びＰ２と、７つのバルブＰＶ１〜ＰＶ７と、細胞培養器と各容器とを接続するプラスチック製チューブからなる流路１〜１０と、上記７つのバルブの開閉と２つのポンプの駆動・停止の指令信号をプログラムに従って出力する制御手段Ｈで構成されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
全流路及び膜で内外２室に区画された細胞培養器に洗浄液を供給して洗浄する工程、細胞培養器の各室に培養液を充填する工程、細胞培養器の外室に細胞を注入する工程、細胞培養器の内室に培養液を供給して細胞培養する工程及び培養された細胞を回収する工程からなる細胞培養システムであって、
洗浄液容器と第１の分岐を第２のバルブを介して接続する洗浄液流路と、該第１の分岐の一方と剥離剤容器を第１のバルブを介して接続する剥離剤供給流路と、該第１の分岐の他方と第２の分岐を第２のポンプを介して接続する第２のポンプ流路と、該第２の分岐の一方と第３の分岐を第３のバルブを介して接続する第１の流路と、該第２の分岐の他方と細胞培養器の外室入口とを細胞注入用シリンジ針刺しこみ用の細胞充填ポート及び第４のバルブを介して接続する第２の流路と、該第３の分岐の一方と細培養液容器とを第１のポンプを介して接続する第１の培養液流路と、該第３の分岐の他方と細胞培養器の内室入口を接続する第２の培養液流路と、該細胞培養器の内室出口と第４の分岐を接続する第４の流路と、第４の分岐の一方に第６のバルブを介して廃液を廃液容器に送出する廃液流路と、該第４の分岐の他方にバルブ７を介して培養液回収容器と接続する培養液回収流路と、該細胞培養器の外室出口と第５のバルブを介して接続する培養細胞回収流路と、
上記各バルブ及び各ポンプにバルブ開閉及びポンプ駆動・停止の指令信号を出力する制御手段
を具備した細胞培養システム。
【請求項２】
該制御手段が、外部からのプライプミング洗浄スタート信号を受けて、第２、第３及び第６のバルブを開放し、第１、第４、第５及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する細胞培養器の内室洗浄手段と、
該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２、第３及び第５のバルブを開放し、第１、第４、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する細胞培養器の膜壁洗浄手段と、
該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２、第４及び第５のバルブを開放し、第１、第３、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する細胞培養器の外室洗浄手段と、
該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２、第３及び第７のバルブを開放し、第１、第４、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する洗浄液回収流路洗浄手段と、
該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２及び第３のバルブを開放し、第１、第４、第５、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第２のポンプを駆動し、第１のポンプを逆方向に駆動する培養液流路洗浄手段と、
該第１又は第２のポンプからの流量検知信号、あるいはタイマーからの信号を受けて、第３、第４、第５、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１及び第２のバルブを開放し、第１及び第２のポンプを停止する剥離剤供給流路洗浄手段
を具備した洗浄回路からなる請求項１記載の細胞培養システム。
【請求項３】
該制御手段が、外部からの培養液充填スタート信号を受けて、第７のバルブを開放し、第１、第２、第３、第４、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する細胞培養器内室への培養液充填手段と、
該第１のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第５のバルブを開放し、第１、第２、第３、第４、第６及び第７のバルブを閉止し、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する細胞培養器外室への培養液充填手段
を具備した培養液充填回路からなる請求項１記載の細胞培養システム。
【請求項４】
該制御手段が、外部からの細胞充填スタート信号を受けて、第１、第２、第３、第６及び第７のバルブを閉止し、第４及び第５のバルブを開放し、第２、第３、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１及び第２のポンプを停止し、その後、細胞注入用シリンジを作動させて培養器の外室に細胞を注入する細胞充填手段
を具備した細胞充填回路からなる請求項１記載の細胞培養システム。
【請求項５】
該制御手段が、外部からの培養スタート信号を受けて、第７のバルブを開放し、第１、第２、第３、第４、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する細胞培養手段
を具備した細胞培養回路からなる請求項１記載の細胞培養システム。
【請求項６】
該制御手段が、外部からの回収スタート信号を受けて、第１、第4、第５及び第７のバルブを開放し、第２、第３及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する剥離剤供給手段と、
該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第１及び第７のバルブを開放し、第２、第３、第4、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１及び第２のポンプを停止する待機手段と、
タイマーからの信号を受けて、第３及び第４のバルブを開放し、第１、第２、第６及び第７のバルブを閉止し、第５のバルブを開放するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する第一回収手段と、
第１のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第５のバルブを開放し、第１、第２、第３、第４、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する第二回収手段
を具備した回収回路からなる請求項１記載の細胞培養システム。
【請求項７】
該洗浄液流路に圧力センサーを設け、該圧力センサーからの信号を受けて、細胞培養器の内室の圧力が設定圧力を超えると第５のバルブを開放し、設定圧力以下で第５のバルブを閉止するパルス発生手段を設けた請求項１記載の細胞培養システム。
【請求項８】
該洗浄液流路の洗浄液容器の下流に、容器内の洗浄水が切れたことを検知する洗浄液切れセンサーを設けるとともに、該センサーからの検知信号を受けて第２のバルブを閉止する液切れ検出手段を設けた請求項１記載の細胞培養システム。
【請求項９】
該第２の培養液流路に、ガス交換膜でガス室と培養液室に区画され、かつ各室に培養液の入口、出口及びガスの入口、出口を有するガス交換ユニットを設け、該ガス入口にガス供給流路、ガス出口に炭酸ガスセンサーを設けたガス排出流路を接続し、ガス入口流路に設けられた分岐に空気流路と、流量調整バルブを設けた炭酸ガス流路を接続するとともに、該炭酸ガスセンサーからの信号を受けて該流量調整バルブを調整して炭酸ガスの濃度を調整する炭酸ガス濃度調整手段を設けた請求項１記載の細胞培養システム
【請求項１０】
該細胞培養器を収容する恒温容器を設け、該恒温容器に空気循環流路を接続し、該循環流路にファンとヒーターからなる加温ユニットを設けるとともに、該容器内の温度を検知する温度センサーからの信号を受けて、ヒーターへ流れる電流を調整するか、又はヒーターの遮断、接続により恒温容器内を恒温条件に維持する温度調節手段を設けた請求項１記載の細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の組織や臓器を形成する細胞の培養操作及び培養された細胞の回収操作を半自動化又は自動化して、培養された細胞への汚染物混入を防止した閉鎖系の細胞培養システム、特に再生医療に用いる細胞、動植物細胞の大量培養に適した細胞培養システムに関するものである。以下再生医療に用いられる細胞培養システムについて説明するが、本発明のシステムは動植物細胞の培養にも適用が可能である。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト組織をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ)で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。細胞には、浮遊系細胞と付着系細胞の２種類が存在し、付着系細胞の培養においては、洗浄液、例えばＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔｓ）を用いて細胞培養器、各流路を洗浄する作業、細胞培養器の各室に培養液を充填する作業、細胞培養器の外室に細胞を注入する作業、細胞培養器の内室に培養液を供給する作業、次に、剥離剤、例えばトリプシンを用いて培養容器及び不織布等の担体付着した細胞を剥離する作業(浮遊系細胞では細胞の剥離作業は不要である)、剥離された細胞を回収する作業等多数の作業が行われる。
なお、細胞培養器へ培養液を循環させることが可能な培養装置(特許文献１及び２)や、細胞培養器内の培養液を自動的に交換することが可能な培養装置(特許文献３及び４)が提案されている。
【特許文献１】特開平５−２６０９５８号公報
【特許文献２】特開平５−２７６９２２号公報
【特許文献３】特開平８−１７２９５６号公報
【特許文献４】特開２００２−２６２８５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、細胞培養においては、細胞及び培養液が収容された細胞培養器をインキュベータから取り出して上述の作業を行っていたため、細胞培養器内に雑菌が混入することがあった。
また、細胞培養においては、多数の作業を行うため、初心者にとって難しい作業であった。
したがって、本発明の第一の目的は、細胞培養器内に雑菌が混入することのない細胞培養システムを提供することである。
本発明の第二の目的は、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる半自動又は自動細胞培養システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
すなわち、第一の発明は、全流路及び膜で内外２室に区画された細胞培養器に洗浄液を供給して洗浄する工程、細胞培養器の各室に培養液を充填する工程、細胞培養器の外室に細胞を注入する工程、細胞培養器の内室に培養液を供給して細胞培養する工程及び培養された細胞を回収する工程からなる細胞培養システムであって、洗浄液容器と第１の分岐を第２のバルブを介して接続する洗浄液流路と、該第１の分岐の一方と剥離剤容器を第１のバルブを介して接続する剥離剤供給流路と、該第１の分岐の他方と第２の分岐を第２のポンプを介して接続する第２のポンプ流路と、該第２の分岐の一方と第３の分岐を第３のバルブを介して接続する第１の流路と、該第２の分岐の他方と細胞培養器の外室入口とを細胞注入用シリンジ針刺しこみ用の細胞充填ポート及び第４のバルブを介して接続する第２の流路と、該第３の分岐の一方と細培養液容器とを第１のポンプを介して接続する第１の培養液流路と、該第３の分岐の他方と細胞培養器の内室入口を接続する第２の培養液流路と、該細胞培養器の内室出口と第４の分岐を接続する第４の流路と、第４の分岐の一方に第６のバルブを介して廃液を廃液容器に送出する廃液流路と、該第４の分岐の他方にバルブ７を介して培養液回収容器と接続する培養液回収流路と、該細胞培養器の外室出口と第５のバルブを介して接続する培養細胞回収流路と、
上記各バルブ及び各ポンプにバルブ開閉及びポンプ駆動・停止の指令信号を出力する制御手段を具備した細胞培養システムである。
【０００５】
第二から第六の発明は、上記各バルブ及び各ポンプにバルブ開閉及びポンプ駆動・停止の指令信号を出力する制御手段に関する発明であり、制御手段は洗浄回路、培養液充填回路、細胞充填回路、細胞培養回路及び回収回路から構成されている。
【０００６】
すなわち第二の発明は、制御手段を構成する洗浄回路に関する発明であり、
該洗浄回路は、外部からのプライプミング洗浄スタート信号を受けて、第２、第３及び第６のバルブを開放し、第１、第４、第５及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する細胞培養器の内室洗浄手段と、該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２、第３及び第５のバルブを開放し、第１、第４、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する細胞培養器の膜壁洗浄手段と、該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２、第４及び第５のバルブを開放し、第１、第３、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する細胞培養器の外室洗浄手段と、該第２のポンプからの流量+検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２、第３及び第７のバルブを開放し、第１、第４、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する洗浄液回収流路洗浄手段と、該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第２及び第３のバルブを開放し、第１、第４、第５、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第２のポンプを駆動し、第１のポンプを逆方向に駆動する培養液流路洗浄手段と、該第１又は第２のポンプからの流量検知信号、あるいはタイマーからの信号を受けて、第３、第４、第５、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１及び第２のバルブを開放し、第１及び第２のポンプを停止する剥離剤供給流路洗浄手段を具備している。
【０００７】
第三の発明は、培養液充填回路に関する発明であり、該培養液充填回路は、外部からの培養液充填スタート信号を受けて、第７のバルブを開放し、第１、第２、第３、第４、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する細胞培養器内室への培養液充填手段と、該第１のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第１、第２、第３、第４、第５、第６及び第７のバルブを閉止し、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する細胞培養器外室への培養液充填手段
を具備している。
【０００８】
第四の発明は、細胞充填回路に関する発明であり、該細胞充填回路は、外部からの細胞充填スタート信号を受けて、第１、第２、第３、第６及び第７のバルブを閉止し、第４及び第５のバルブを開放し、第２、第３、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１及び第２のポンプを停止し、その後、細胞注入用シリンジを作動させて培養器の外室に細胞を注入する細胞充填手段を具備している。
【０００９】
第五の発明は、細胞培養回路に関する発明であり、該細胞培養回路は、外部からの培養スタート信号を受けて、第７のバルブを開放し、第１、第２、第３、第４、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する細胞培養手段を具備している。
【００１０】
第六の発明は、回収回路に関する発明であり、該回収回路は、外部からの回収スタート信号を受けて、第１、第4、第５及び第７のバルブを開放し、第２、第３及び第６のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを停止し、第２のポンプを駆動する剥離剤供給手段と、該第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第１及び第７のバルブを開放し、第２、第３、第4、第５及び第６のバルブを閉止するとともに、第１及び第２のポンプを停止する待機手段と、タイマーからの信号を受けて、第３及び第４のバルブを開放し、第１、第２、第６及び第７のバルブを閉止し、第５のバルブを開放するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する第一回収手段と、第１のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第５のバルブを開放し、第１、第２、第３、第４、第６及び第７のバルブを閉止するとともに、第１のポンプを駆動し、第２のポンプを停止する第二の回収手段を具備している。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る細胞培養システムによれば、各容器に洗浄液、細胞培養液、剥離剤を収容する作業及び細胞注入作業を行えば、その後は自動的に細胞培養に必要な工程に従って一連の処理が実行されるので、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる。
また、全ての処理が完全密閉系で行われるので、細胞培養器内に雑菌が混入することはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
次に、付着性細胞の培養システムの一実施例について図面にて説明する。
本発明の細胞培養システムは図１に示す系統図から明らかなように、細胞培養器Ａと、培養液容器Ｂ、洗浄液容器Ｃ、剥離剤容器Ｄ、培養細胞回収容器Ｆ及び廃液容器Ｇの５つの容器と剥離剤収容シリンジＥと、２つのポンプＰ１及びＰ２と、７つのバルブＰＶ１〜ＰＶ７と、細胞培養器と各容器とを接続するプラスチック製チューブからなる流路１〜１０と、上記７つのバルブの開閉と２つのポンプの駆動・停止の指令信号をプログラムに従っ
て出力する制御手段Ｈで構成されている。
【００１３】
細胞培養器Ａは、図２に平膜モジュール、図３に中空糸モジュールの例を示すように、培養液と剥離剤を透過させ、細胞の透過を阻止する多孔膜２０でモジュール内部が内外２室に区画され、内室Ｘに培養液の入口２１と出口２２、外室Ｙに細胞入口２４と培養された細胞の出口２５が設けられている。
外室Ｙには細胞を培養するための担体として多孔性担体２３が設置されている。多孔性担体２３として通常不織布が使用される。細胞培養器Ａは、公知のモジュールを使用できる。中空糸モジュールでは、多数の中空糸と不織布を重ね合わせて海苔巻き状に巻いて、両端を接着剤で接着してモジュールを製作する。中空糸モジュールでは培養細胞回収時に細胞が不織布に引っかかって回収率の低下が避けられない。細胞の不織布への引っかかりを防ぐため、例えば、中空糸と該中空糸より短い不織布を重ね合わせ、海苔巻き状に巻いて円筒状ハウジング内に収容し、培養液の入口２１側に中空糸と不織布、培養液の出口２２側に中空糸のみが埋め込まれるように両端を接着剤で接着すると、培養液出口２２側に不織布のない空間が形成される。細胞回収時に培養液出口２２側の空間に細胞が集められて培養細胞出口２４から排出されるため不織布へ引っかかることはない。
【００１４】
本システム作動中に細胞培養器Ａの周囲温度の低下による細胞の活性低下を防ぐため、細胞培養器Ａを恒温容器Ｊに収容するのが好ましい。恒温容器Ｊに空気循環流路２９を接続し、該循環流路にファン３０とヒーター３１からなる加温ユニット３２と恒温容器Ｊ内の温度を検知する温度センサー(図示せず)を設ける。ヒーター３１は温度センサーからの信号を受けて、温度を調整し恒温容器Ｊ内の温度を一定温度に維持する。
培養液容器Ｂ、洗浄液容器Ｃ、剥離剤容器Ｄ、培養細胞回収容器Ｆ及び廃液容器Ｇは外部からの雑菌の侵入を防止するため、通常プラスチック製のバッグが使用される。
【００１５】
洗浄液容器Ｃに入れる洗浄液としては、カルシゥムを含まず、かつ培養細胞に悪影響を与えないものが用いられており、例えば、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔｓ）、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン−塩酸緩衝液(Ｔｒｉｓ)等の等張緩衝液や培養細胞と浸透圧が同一となる濃度のショ糖溶液、食塩水、塩化カリウム等の等張液が用いられる。通常ＰＢＳが用いられる。
【００１６】
剥離剤容器Ｄに入れる剥離剤としては、不織布に接着した培養細胞に、０．５ｍＭ〜１０ｍＭのＥＤＴＡの他、ＥＧＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＴＡ、ＴＴＨＡ等の２価金属のキレート剤、又はトリプシンやコラーゲン等のタンパク質分解酵素、又はインテグリンやカドヘリン等のタンパク質の接着を競合的に阻害するペプチドが使用される。かかる剥離剤を細胞培養器に供給し、細胞培養器内壁や不織布に細胞を付着させているインテグリン等の接着因子の切断と、上記細胞同士を接着させているカドヘリン等の接着因子を切断する。接着因子が切断されると付着性細胞が浮遊するため回収が容易となる。
【００１７】
流路を開閉するバルブ(PV1)〜(PV7)は、外部からの雑菌の侵入のない方式、通常ピンチバルブが使用される。ポンプ(P1)〜(P2)は同様な理由でローラーポンプが使用される。
制御手段Ｈは、周知のようにＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、タイマ等で構成されている。この制御手段はポンプでの流量の測定、又はタイマで計時するとともに，各バルブやポンプに指令信号を発信する。
【００１８】
次に上記細胞培養システムの一連の動作について、図４〜図１０に基づき具体的に説明する。図４は本発明の細胞培養システムにおける一連の動作を表わす工程図である。
【００１９】
まず、本システムに図３に示す中空糸型の細胞培養器Ａ、培養液容器Ｂ、洗浄液容器Ｃ、剥離剤容器Ｄ、培養細胞回収容器Ｆ及び廃液容器Ｇ及び各流路の装着と、細胞注入用シリンジＥの準備を確認した後、スタートスイッチを押すと、全バルブが開となる。その状態を図５に示す。全バルブが開となったことを確認した後、洗浄スタートスイッチを押す。
【００２０】
洗浄工程は６つの工程からなっており、洗浄工程(１)は中空糸の内側(内室Ｘ)を洗浄する工程で、図４及び図６(１)に示すように、第２(PV2)、第３(PV3)及び第６のバルブ(PV6)を開放し、第１(PV1)、第４(PV4)、第５(PV5)及び第７のバルブ(PV7)を閉止して、第１のポンプ(P1)を停止し、第２のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、洗浄液容器Ｃ内の洗浄液は洗浄液流路２、第１の流路３、第２の培養液流路６から細胞培養器Ａの中空糸の内室Ｘを通過して洗浄し、第４の流路７、廃液流路９から廃液容器Ｇに排出される。
【００２１】
次に洗浄工程(２)は中空糸膜壁を洗浄する工程で、図６(２)に示すように、第２(PV2)、第３(PV3)及び第５(PV5)のバルブを開放し、第１(PV1)、第４(PV4)、第６(PV6)及び第７(PV7)のバルブを閉止して、第１のポンプ(P1)を停止し、第２のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、細胞培養器Ａの出口側の第６のバルブ(PV6)及び第７のバルブ(PV7)が閉止しているため、中空糸の内側に供給された洗浄液は加圧されて中空糸膜壁を透過して洗浄し、細胞回収流路１０から廃液容器Ｇに排出される。
【００２２】
洗浄工程(３) は中空糸の外室Ｙを洗浄する工程で、図６(３)に示すように、第２(PV2)、第４(PV4)及び第５のバルブ(PV5)を開放し、第１(PV1)、第３(PV3)、第６(PV6)及び第７(PV7)のバルブを閉止し、第１のポンプ(P1)を停止し、第２のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、洗浄液容器Ｃ内の洗浄液は洗浄液流路２、第１の流路３、第２の流路４から細胞培養器Ａの中空糸の外室Ｙを通過して洗浄し、細胞回収流路１０から廃液容器Ｇに排出される。その際、外室Ｙに配置された不織布(図示せず)も同時に洗浄される。
【００２３】
洗浄工程(４) は培養液回収流路８を洗浄する工程で、図６(４)に示すように、第２(PV2)、第３(PV3) 及び第７のバルブ(PV7) を開放し、第１(PV1)、第４(PV4)、第５(PV5)及び第６のバルブ(PV6)を閉止して、第１のポンプ(P1)を停止し、第２のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、洗浄液容器Ｃ内の洗浄液は洗浄液流路２、第１の流路３、第２の培養液流路６から細胞培養器Ａの中空糸の内室（Ｘ）を経て、培養液回収流路８から培養液容器Ｂの代わりに取り付けられた廃液容器(図示せず)に排出される。
【００２４】
洗浄工程(５) は培養液流路５を洗浄する工程で、図６(５)に示すように、第２(PV2)及び
第３のバルブ(PV3)を開放し、第１(PV1)、第１(PV1)、第４(PV4)、第５(PV5)、
第６(PV6)及び第７(PV7)のバルブを閉止して、第２のポンプ(P2)を駆動し、第１のポンプ(P1)を逆方向に駆動する。この工程では、洗浄液容器Ｃ内の洗浄液は洗浄液流路２、第１の流路３、第２の流路４から培養液流路５を経て、洗浄液容器Ｂの代わりに取り付けられた廃液容器(図示せず)に排出される。
【００２５】
洗浄工程(６) は剥離剤供給流路１を洗浄する工程で、図６(６)に示すように、第１(PV1) 及び第２のバルブ(PV2)を開放し、第３(PV3)、第４(PV4)、第５(PV5)、第６(PV6)及び第７(PV7)のバルブを閉止し、第１のポンプ(P1)及び第２のポンプ(P2) を停止する。洗浄液容器Ｃ内の洗浄液は洗浄液流路２から剥離剤供給流路１を経て剥離剤容器Ｄの代わりに取り付けられた廃液容器(図示せず)に排出される。
浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、洗浄工程(６)は不要である。
【００２６】
なお、上記洗浄工程中に洗浄容器Ｃ内の洗浄液が途切れることを防止するため図１２に示すように、洗浄液流路２の第２のバルブ(PV2)の上流に液切れセンサー２７を取り付け、該液切れセンサー２７からの検知信号を受けて第２のバルブ(PV2)を閉止する液切れ検出手段と，液切れを知らせるブザー又はランプなどの警報手段及びこれらを制御する液切れ制御部２８が設けられている。液切れ警報が出ると操作員はストップキーを押してポンプ(P1)、(P2))を停止し、洗浄液を補充した後、再スタートスイッチを押すとポンプが駆動して洗浄工程が再開する。
上記洗浄工程(１)〜(６)により、本システムの接液部の全てが洗浄されると、次の培養液充填工程に移行する。
【００２７】
洗浄工程が終了したことを確認した後、次の培養液充填工程のスタートスイッチを押す。培養液充填工程は２つの工程からなっており、培養液充填工程（１）は細胞培養器Ａの内室(Ｘ)に培養液を充填する工程で、図７(１)に示すように、第７のバルブ(PV7)を開放し、第１(PV1)、第２(PV2)、第３(PV3)、第４(PV4)、第５(PV5)及び第６のバルブ(PV6)を閉止し、第１のポンプ(P1)を駆動し、第２のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液容器Ａ内の培養液は、第１培養液流路５、第２培養液流路６から細胞倍容器Ａの内室Ｘを経て、培養液回収流路８から培養液容器Ｂへ循環して、細胞倍容器Ａの内室Ｘに培養液を充填する。
【００２８】
培養液充填工程(２)は細胞培養器Ａの外室(Ｙ)に培養液を充填する工程で、図７(１)に示すように、第５のバルブ(PV5)を開放し、第１(PV1)、第２(PV2)、第３(PV3)、第４(PV4)、第６(PV6)及び第７のバルブ(PV7)を閉止し、第１のポンプ(P1)を駆動し、第２のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液容器Ａ内の培養液は、第１培養液流路５、第２培養液流路６から細胞培養器Ａの内室Ｘへ加圧供給されるため、培養液が膜壁を透過して外室Ｙに移行して外室Ｙに培養液を充填し、一部が細胞回収流路１０から廃液容器Ｇに排出される。
上記培養液充填工程(１)及び(２)で、細胞培養器Ａに培養液が充填されると、次の細胞充填工程に移行する。
【００２９】
培養液充填工程が終了したことを確認した後、次の細胞充填工程のスタートスイッチを押す。細胞充填工程は細胞培養器Ａの外室(Ｙ)に細胞を充填する工程で、図８に示すように、第１(PV1)、第２(PV2)、第３(PV3)、第６(PV6)及び第７のバルブ(PV7)を閉止し、第４(PV4)及び第５のバルブ(PV5)を開放し、第１のポンプ(P1)及び第２のポンプ(P2)を停止し、細胞充填準備完了信号を発信する。細胞充填準備完了信号を確認すると、作業員が第２の流路に取り付けられた細胞充填ポート(混注ボタン)１５に細胞注入用シリンジＥを刺し込んでシリンジ内の細胞を培養器の外室に注入する。シリンジＥの細胞注入作業は、エアシリンダ(図示せず)を使用して自動化することが可能である。
例えばエアシリンダの先端をシリンジの押出部に等接し、細胞充填準備完了信号を受けてエアシリンダを駆動させ、タイマー又はリミットスイッチの作動でエアシリンダを停止させる。
上記細胞充填工程で、細胞培養器Ａの外室(Ｙ)に細胞が充填されると、次の培養工程に移行する。
【００３０】
細胞充填工程が終了したことを確認した後、次の培養工程のスタートスイッチを押す。培養工程は培養液容器Ｂから細胞培養器Ａの内室Ｘに培養液を循環供給し、細胞培養器Ａを区画する中空糸膜壁を透過させて内室Ｘから細胞が注入された外室Ｙに、細胞の栄養分である培養液を供給する工程で、図９に示すように、第７のバルブ(PV7)を開放し、第１(PV1)、第２(PV2)、第３(PV3)、第４(PV4)、第５
(PV5) 及び第６のバルブ(PV6)を閉止し、第１のポンプ(P1)を駆動し、第２のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液が培養液容器Ｂから第１培養液流路５、第２培養液流路６から細胞培養器Ａの内室Ｘに供給され、第４の流路７及び培養液回収流路８を経て、培養液容器Ｂに循環する。培養液が細胞培養器Ａの内室Ｘへ加圧供給されるため、培養液が膜壁を透過して外室Ｙに移行し、外室に注入された細胞と接触して、外室Ｙに注入された細胞と接触し細胞を培養する。第１のポンプ(P1)の回転数を変更すると、培養液循環量を増減して最適な培養状態を維持することができる。培養時間は細胞及び培養液の種類によって決定されるが、通常１〜３週間であ
る。
【００３１】
細胞は、生存に必要な酸素を培養液から取り込み、かつ培養液のｐＨを維持して細胞の活性低下を防ぐため、培養液の炭酸ガス濃度を維持することが好ましい。そのため第２培養液流路６にガス交換器Ｉを設け、ガス交換膜を介して炭酸ガスを培養液側に透過させる。ガス交換器Ｉは、図１１に示すように、ガス交換膜１６、例えばシリコンチューブでガス室と培養液室に区画したハウジング１７と、ガス交換膜１６で区画された培養液室と連通する培養液入口１８、出口１９、ガス室に連通するガスの入口２６、出口２７を有している。該ガス入口２６にガス供給流路２８を接続し、ガス出口２７に炭酸ガスセンサー３２を設けたガス排出流路３０を接続している。ガス供給流路２８の端部には分岐２９が設けられ、その一方に空気流路３１、他方に炭酸ガス流路３３が設けられている。炭酸ガス流路３３には炭酸ガスセンサー３２からの信号を受けて、炭酸ガスの供給量を調整する流量調整バル３４が設けられている。炭酸ガスと混合した空気はガス供給流路２８からガス交換器Ｉに供給されて培養液中の炭酸ガス濃度を調整している。
【００３２】
また、培養液の循環中に培養液中の酸素濃度が低下すると細胞の活性が低下するため、培養液容器の培養液を新鮮な培養液と交換することが好ましい。
培養液交換時には、ストップキーを押して第１のポンプ(P1)を停止する。培養液の交換が完了すると再び培養工程のスタートスイッチを押すと第１のポンプ(P1)が駆動して培養工程が再開する。培養が終了すると次の回収工程に移行する。
【００３３】
培養工程が終了したことを確認した後、次の回収工程のスタートスイッチを押す。回収工程は４つの工程からなっている。回収工程(1)は、外室Ｙに剥離剤を供給する剥離剤供給工程で、図１０(1)に示すように、第１(PV1)、第4(PV4)、第５(PV5)及び第７(PV7)のバルブを開放し、第２(PV2)、第３(PV3)及び第６のバルブ(PV6)を閉止し、第１のポンプ(P1)を停止し、第２のポンプ(P2)を駆動する。この工程では、剥離剤が剥離剤容器Ｄから、剥離剤供給流路１、第２の流路４を経て、細胞培養器Ａの外室Ｙに供給されてＹに充満する。外室Ｙをオーバーフローした剥離剤は細胞回収流路１０から回収容器Ｆに回収される。回収工程(1)で剥離剤の供給が完了すると、次の回収工程(2)に移行する。
浮遊性細胞を培養する場合には、細胞が不織布等の坦体に付着しないため、回収工程(1)は不要である。
【００３４】
第２のポンプからの流量検知信号又はタイマーからの信号を受けて、第１(PV1)及び第７のバルブ(PV7)を開放し、第２(PV2)、第３(PV3)、第4(PV4)、第５(PV5)及び第６のバルブ(PV6)を閉止し、第１(P1)及び第２のポンプ(P2)を停止して、外室Ｙに剥離剤を充満させた状態を維持し、剥離剤が内壁と不織布等に細胞を付着させるタンパク質を分解して、細胞を剥離させるまで待機する。待機時間は、細胞及び剥離剤の種類によって決定されるが、通常３〜８分間である。回収工程(2)で細胞が剥離されると、次の回収工程(3)に移行する。
【００３５】
回収工程(3)は、培養液で培養細胞を外室Ｙから追い出して、回収容器Ｆに回収する工程で、タイマーからの信号を受けて、第３(PV3)、第4(PV4)及び第５バルブ(PV5)を開放し、第１(PV1)、第２(PV2)、第６
(PV6) 及び第７のバルブ(PV7)を閉止し、第１のポンプ(P1)を駆動し、第２ポンプ (P2)を停止する。
この工程では、培養液容器Ｂから第１の培養液流路５、第２の培養液流路４を経て、培養液を培養器Ａの内室Ｘへ供給するとともに第１の流路、第２の流路４を経て培養液を培養器Ａの外室Ｙへ供給して培養細胞を外室Ｙから追い出して回収容器Ｆに回収する。培養液を培養器Ａの内室Ｘへ供給すると内室Ｘと外室Ｙ内の圧力が等しいため、培養細胞は細胞回収流路１０から回収容器Ｆに確実に回収できる。
【００３６】
培養細胞の回収時に，培養細胞が外室Ｙに配置された不織布に引っかかり細胞回収率が低下する。培養細胞を不織布から取り外す方法として、細胞培養器Ａを揺動させたり、細胞培養器Ａの内室Ｘに供給される培養液を間歇的に加圧することが行われている。例えば第2培養液流路４に圧力センサー２８を設け、該圧力センサー２８からの信号を受けて、第2培養液流路４の圧力が設定圧力を超えると第５のバルブ(PV5)を開放し、設定圧力以下になると第５のバルブ(PV5)を閉止して、細胞培養器Ａの内室Ｘに供給される培養液の圧力を間歇的に加圧することで不織布に引っかかった培養細胞を取り外す。
回収工程(３)で培養細胞の回収が完了すると、次の回収工程(４)に移行する。
【００３７】
回収工程(４)では、膜表面に浮遊する培養細胞を外室Ｙから追い出して、回収容器Ｆに回収する工程で、タイマーからの信号を受けて、第５のバルブ(PV5)を開放し、第１(PV1)、第２(PV2)、第３(PV3)、第4(PV4)、第６(PV6)及び第７のバルブ(PV7)を閉止し、第１のポンプ(P1)を駆動し、第２のポンプ(P2)を停止する。この工程では、培養液容器Ｂから第１の培養液流路５、第２の培養液流路４を経て、培養液を培養器Ａの内室Ｘへ供給する。細胞培養器Ａの内室Ｘへ加圧供給された培養液は膜壁を透過して外室Ｙに移行し、膜表面に浮遊する培養細胞を外室Ｙから追い出して、回収容器Ｆに回収する。
【００３８】
回収工程(４)が終了し、最後に廃棄スタートスイッチを押すと全バルブが開放される。全バルブが開放されたことを確認した後、細胞培養器Ａ、ガス交換器Ｊ、全流路をシステムから取り外して廃棄すると本発明の細胞培養システムでの細胞培養操作が完了する。
【００３９】
本発明の細胞培養システムで培養された細胞には、タンパク質分解酵素等の剥離剤が含まれ、接着因子以外の細胞表面マーカー、チャネルやレセプターまでも分解、破壊し、培養細胞に悪影響を与えてしまうため、別途培養細胞とともに回収されたタンパク質分解酵素等の剥離剤をＰＢＳ等の洗浄液で置換するのが好ましい。図１３は回収された培養細胞に含まれる剥離剤を洗浄液で置換するシステムの一例であり、回収容器Ｆの下部に接続された排水流路３３に培養液、剥離剤を透過させ、細胞の透過を阻止する多孔膜を収容したフィルタ３４が接続され、その端部は排水容器Ｋが接続されている。回収容器Ｆからとり溶液中の培養細胞はフィルタ３４に阻止されて、フィルタ３４の表面に堆積する。
【００４０】
排水流路３３のフィルタ３４の上部には細胞取り出し流路３５が第９のバルブ(PV9)を介して接続されている。排水流路３３のフィルタ３４の下部には、第８のバルブ(PV8)と排水ポンプＰ３が設けられている。また排水流路３３のフィルタ３４と第８のバルブ(PV8)の間に培養液供給流路３６が接続されている。培養液供給流路３６には回収容器Ｆから培養液容器Ｌへ培養細胞を含むよう溶液の流入を防ぐ逆止弁３７と培養液供給ボンプＰ４が設けられている。  
【００４１】
本発明の細胞培養システムにおいては、各容器に培養液、剥離剤、洗浄剤、及びシリンジに細胞を収容する作業を行ない、洗浄工程、培養液充填工程、細胞充填工程、培養工程及び回収工程のスタートスイッチを押すだけで、自動的に各工程が実施されるので、初心者であっても容易に細胞培養を行うことができる。また全ての工程が密閉系で実施されるため、細胞培養器内に雑菌が侵入することはない。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の細胞培養システムの系統図である。
【図２】平膜モジュールの説明図である。
【図３】中空糸モジュールの説明図である。
【図４】本発明システムの一連の動作を表わす工程図である。
【図５】本発明システムのスタート開始時の状態を示す系統図である。
【図６（１）】洗浄工程(1)を示す系統図である。
【図６（２）】洗浄工程(2)を示す系統図である。
【図６（３）】洗浄工程(3)を示す系統図である。
【図６（４）】洗浄工程(4)を示す系統図である。
【図６（５）】洗浄工程(5)を示す系統図である。
【図６（６）】洗浄工程(6)を示す系統図である。
【図７（１）】培養液充填工程(1)を示す系統図である。
【図７（２）】培養液充填工程(2)を示す系統図である。
【図８】細胞充填工程を示す系統図である。
【図９】培養工程を示す系統図である。
【図１０（１）】回収工程(1)を示す系統図である。
【図１０（２）】回収工程(2)を示す系統図である。
【図１０（３）】回収工程(3)を示す系統図である。
【図１０（４）】回収工程(4)を示す系統図である。
【図１１】ガス交換器の説明図である。
【図１２】洗浄液の流出を示す系統図である。
【符号の説明】
【００４３】
Ａ    細胞培養器
Ｂ    培養液容器              
Ｃ    洗浄液容器
Ｄ    剥離剤容器              
Ｅ    シリンジ              
Ｆ    回収容器
Ｇ    廃液容器              
Ｈ    制御部              
Ｉ    ガス交換器
Ｊ    恒温容器              
Ｋ    廃液容器              
Ｌ    洗浄液容器
Ｘ    内室
Ｙ    外室
PV1〜PV7   第１のバルブ〜第７のバルブ  
Ｐ１  第１のポンプ
Ｐ２  第２のポンプ
１    剥離剤供給流路
２    洗浄液流路
３    第１の流路
４    第２の流路
５    第１の培養液流路
６    第２の培養液流路
７    第４の流路
８    培養液回収流路
９    廃液流路
１０  細胞回収流路
１１  第１の分岐
１２  第２の分岐
１３  第３の分岐
１４  第４の分岐
１５  細胞充填ポート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６（１）】
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【図６（２）】
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【図６（３）】
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【図６（４）】
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【図６（５）】
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【図６（６）】
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【図７（１）】
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【図７（２）】
2011103832.tif 000015
【図８】
2011103832.tif 000016
【図９】
2011103832.tif 000017
【図１０（１）】
2011103832.tif 000018
【図１０（２）】
2011103832.tif 000019
【図１０（３）】
2011103832.tif 000020
【図１０（４）】
2011103832.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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