(57)【要約】【課題】カリン抽出物由来の生理活性物質及びそれを利用した脂質代謝改善剤、飲料、食品等を提供する。【解決手段】生カリン果実を、熱水、エタノール、又はそれらの混合溶媒により抽出した抽出物から得られる、カテキン重合度が２〜１８のポリフェノール、このポリフェノールを有効成分として含有する脂質代謝改善剤、及びこのポリフェノールを添加した飲食品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生カリン果実を、熱水、エタノール、又はそれらの混合溶媒により抽出した抽出物から得られる、カテキン重合度が２〜１８のポリフェノール。
【請求項２】
請求項１記載のポリフェノールを有効成分として含有する脂質代謝改善剤。
【請求項３】
請求項１記載のポリフェノールを添加した飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質代謝改善機能を有するカリン由来ポリフェノール、及びそれを含む脂質代謝改善剤及び飲食品等に関する。
【背景技術】
【０００２】
カリン（学名：Chaenomeles sinesis）の可食部等にはポリフェノールが含まれており、カリン由来抽出物が糖尿病の改善に対して有効であることについてはいくつかの報告がある。例えば、カリン可食部の凍結乾燥粉末の熱水抽出物は、抗酸化活性（ＤＰＰＨラジカル消去活性）、糖化タンパク質（ＡＧＥ）生成阻害活性を有し、糖尿病ラットに経口投与した場合、血漿中の糖濃度を減少させ、糖尿病に特徴的な体重の減少を抑制する作用を有することが公知である（非特許文献１：小浜ら、岩手県工業技術センター研究報告  第１３号、２００６）。特許文献１（特開２００９−１６７１５３号公報）には、カリンの果肉以外の部位（葉等）のメタノール抽出物が、血糖値上昇抑制作用を有することが記載されている。特許文献２（特開２００７−１３１５９９号公報）には、カリンの果実、種子等の熱水又はアルコール等の水性液体による抽出物が、グリケーション抑制作用を有することが記載されている。
しかし、カリンは、抗肥満効果を有することについては知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−１６７１５３号公報
【特許文献２】特開２００７−１３１５９９号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】小浜ら、「機能性に優れた県産食品素材の検索（III）」、岩手県工業技術センター研究報告  第１３号（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、カリン抽出物の更なる有効利用を企図してその作用を詳細に調べた。すなわち、本発明は、カリン抽出物由来の生理活性物質及びそれを利用した脂質代謝改善剤、飲料、食品等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、カリン抽出物に含まれるポリフェノールが肥満を改善する優れた作用を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明によれば、
〔１〕  生カリン果実を、熱水、エタノール、又はそれらの混合溶媒により抽出した抽出物から得られる、カテキン重合度が２〜１８のポリフェノール；
〔２〕  前記〔１〕記載のポリフェノールを有効成分として含有する脂質代謝改善剤；
〔３〕  前記〔１〕記載のポリフェノールを添加した飲食品
が提供される。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のポリフェノールは、カリン果実から容易に得ることができ、市販のブドウ種子ポリフェノールと比較して顕著に優れた脂質代謝改善作用を有する。また、カリンは、古くから食用に供せられており、毒性又は副作用については報告されておらず、非常に安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、カリン熱水抽出物（ＫＷ）及びエタノール抽出物（ＫＡ）のＳｅｐｈａｄｅｘ（セファデックス）ＬＨ−２０ゲルによるカリンポリフェノールの分画を表す図である。
【図２】図２は、カリン熱水抽出物（ＫＷ）とエタノール抽出物（ＫＡ）のＤＰＰＨラジカル消去能を表す図である。
【図３】図３は、ＯＲＡＣ法によるカリン熱水抽出物（ＫＷ）及びエタノール抽出物（ＫＡ）のＤＰＰＨラジカル消去能を表す図である。
【図４】図４は、カリン抽出物の膵リパーゼ阻害活性を表す図である。Ｇ＝市販ブドウ種子抽出物、ＫＡ＝カリンアルコール抽出物ポリフェノールである。
【図５】図５は、カリン抽出物ポリフェノールを摂取した高脂肪食負荷ＫＫ−Ａｙマウスの血糖値の経時変化及び最終日血糖値を表す図である。Ｃ＝２０％カゼイン食、Ｇ＝ブドウ種子抽出物添加２０％カゼイン食、Ｋ＝カリン抽出物添加２０％カゼイン食を、それぞれ与えた群。値は、平均値±標準偏差を示す（ｎ＝５〜６）。＊は、Ｃ群に対し、Ｐ＜０．０５を表す。
【図６】図６は、カリン抽出物ポリフェノールを摂取した高脂肪食負荷ＫＫ−Ａｙマウスの血中アディポネクチン、血中インスリン、血中トリグリセリド及び血中総コレステロール濃度を表す図である。Ｃ＝２０％カゼイン食、Ｇ＝市販ブドウ種子抽出物添加２０％カゼイン食、Ｋ＝カリン抽出物添加２０％カゼイン食。値は、平均値±標準偏差を示す（ｎ＝５〜６）。ａ、ｂは、それぞれ異なる符号の群に対し、Ｐ＜０．０５を表す。
【図７】図７は、カリン抽出物ポリフェノールを摂取した高脂肪食負荷ＫＫ−Ａｙマウスの肝臓トリグリセリド、肝臓コレステロール含量及び糞中胆汁酸排泄量を表す図である。Ｃ＝２０％カゼイン食、Ｇ＝ブドウ種子抽出物添加２０％カゼイン食、Ｋ＝カリン抽出物添加２０％カゼイン食。値は、平均値±標準偏差を示す（ｎ＝５〜６）。ａ、ｂは、それぞれ異なる符号の群に対し、Ｐ＜０．０５を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のカリン抽出物ポリフェノールは、生のカリン果実を、熱水又はエタノール、又はそれらの混合溶媒を用いて抽出することにより、得られる。この抽出物は、そのまま使用することができるが、必要に応じて凍結乾燥したものを用いることもできる。さらに、後述するようなカラムクロマトグラフィ等の技術を用いて精製することもできる。
【００１０】
抽出工程は、植物原料に熱水又はエタノール、あるいはこれらの混合溶媒を用いて行う。これらの液体を用いて抽出することにより、溶媒の残留による影響が懸念されないので、好都合である。
【００１１】
抽出温度は、熱水を用いる場合、好ましくは５０℃以上１２０℃以下である。抽出効率、操作性、経済性などのバランスから、最も好ましくは７０℃以上１００℃以下である。エタノールを用いる場合は、常温で行うことができ、混合溶媒を用いる場合はそれらの中間的な温度で抽出を行うことができる。
【００１２】
抽出は、通常は常圧下で行うが、加圧又は減圧条件下で実施してもよい。なお、抽出温度又は圧力条件によっては、抽出媒体は液体ではなく、蒸気又は気体の形態であってもよい。
【００１３】
このようにして得られた本発明のポリフェノールを含む液状の抽出物は、そのまま脂質代謝改善剤又は飲食品、医薬品、飼料などの素材として利用することができる。抽出物を、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の手法を用いて濃縮及び／又は精製してもよい。また、噴霧乾燥、凍結乾燥、膜ろ過等による乾燥、濃縮などによって、粉末状、ペースト状などの形態として利用してもよい。
【００１４】
本発明の抽出物ポリフェノールを飲食品とする場合は、単独で又は他の果実ジュースなどと混合して液状組成物としたり、パンやクッキーなどに混入して固体組成物としたり、又はヨーグルトやジャムなどに混入してクリーム状の組成物としたりすることができる。
また、抽出物ポリフェノールを原料として、発酵させて酒類や酢等とすることができる。
【００１５】
本発明の抽出物ポリフェノールは、医薬品や医薬部外品などに使用することもできる。たとえば、医薬組成物とする場合、抽出物をそのまま、あるいは常用される無機又は有機の担体又は医薬賦形剤を加えて、固形、半固形、又は液状で経口投与剤や、経腸剤、外用剤などの非経口投与剤とすることができる。
【００１６】
このような脂質代謝改善作用を有する本発明の医薬品組成物の有効な投与量は、投与対象の年齢、体重、一般的な身体状態などに応じて適宜変化させることができるが、たとえば成人１日当たり総ポリフェノール含量に換算して０．０１〜１０ｇ、一般的には０．０５〜５ｇ、さらに一般的には０．１〜０．５ｇを、経口投与することができる。
【００１７】
以下に本発明を実施例によってさらに説明するが、本発明は何らこれらに限定されることはない。
【実施例】
【００１８】
カリン抽出物ポリフェノールの製造
１cm角程度に刻んだ生のカリン果実（岩手県産）に１０倍量の水を加え、オートクレーブを用いて１００℃で１時間加熱してカリン熱水抽出物を得た。ろ紙で不溶物を除去し、可溶性部分を凍結乾燥し、これをカリン熱水抽出物ポリフェノール（「ＫＷ」と表記することがある）とした。１kgのカリンから約３０gの試料が得られた。
【００１９】
同様に、生のカリン果実に１０倍量のエタノールを加えて室温で一晩抽出して抽出物を得、ろ紙で不溶物を除去し、可溶性部分をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。この抽出物をカリンアルコール抽出物ポリフェノール（「ＫＡ」と表記することがある）とした。１kgのカリンから約１５ｇの試料が得られた。
【００２０】
これらの各試料を、ポリフェノール量として２.５mg/mlになるように水に溶解して、「セファデックスＬＨ−２０」（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、東京）を充填したカラム（３．２×１９cm）に４ml添加し、次いで６００mlの水、５０％メタノール、８０％メタノール、７０％アセトンの順に試料溶液中の成分を流速１．５ml/分で溶出させた。
【００２１】
この分画により、低分子のポリフェノールはほとんどゲルに吸着されずに水で溶出され、分子量（重合度）が大きくなるに従いメタノール、アセトンで溶出される。ＫＷ及びＫＡは、いずれも８０％メタノール画分と７０％アセトン画分がＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法で測定した全ポリフェノール含量の３０〜４０％程度を占めていた（図１）。
【００２２】
また、上記で製造したＫＷ及びＫＡのそれぞれを、「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  ＰＥＦ」（商品名、４．６×２５０mm, Sigma-Aldorich, USA）カラムに添加し、移動相として６０％メタノール−０．１％ギ酸を用いて０．６ml/minで溶出させ、２８０nmの吸光度で検出した。このカラムに充填されているゲルは、ポリフェノールの水酸基と相互作用するため、カテキンが重合したプロシアニジンの場合、モノマー、ダイマー、トリマーと重合度にしたがって溶出される。
【００２３】
その結果、ＫＷ及びＫＡのいずれについても、重合度２（ダイマー）から重合度１８のピークが検出された。したがって、ＫＷ及びＫＡには、重合度２〜１８のポリフェノールが含有されていることが示された。
【００２４】
試験例１
インビトロ抗酸化活性の測定
ＫＷ及びＫＡのそれぞれについて上記で得たセファデックスＬＨ−２０各分画の抗酸化性を測定した。各分画のポリフェノール含量をＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法で測定した。水で１０倍、５０倍、１００倍、２００倍等に適宜希釈した試料溶液１mlに、１Ｎ  フェノール試薬（和光純薬）を０.５ml加え、さらに１０％（W/V）炭酸ナトリウム水溶液を１.５ml加えて室温で３０分放置後、７５０nmの吸収を分光光度計（ＵＶ−１２００、島津製作所）で測定した。標準試料としては０．１mg/mlの没食子酸（gallic acid）を用いた。
【００２５】
抗酸化活性をＤＰＰＨラジカル消去活性及び酸素ラジカル吸収活性（ＯＲＡＣ）法で測定した。標準物質としては没食子酸を用いた。ＤＰＰＨラジカル消去活性は、適宜水で１０倍、５０倍、１００倍、２００倍等に希釈した抽出物試料を９６ウェルマイクロプレートに２０μlずつ分注し、０．１M  トリス塩酸、５００μM  ＤＰＰＨエタノール溶液（４：５）を１８０μl加えて撹拌し、室温で２０分間の５１７nmにおける吸光度の変化をプレートリーダー（商品名「Ｐｏｗｅｒｓｃａｎ  ＨＴ」、大日本住友製薬）を用いて測定した。
【００２６】
ＯＲＡＣは、ポリフェノール量として適宜水で１０倍、５０倍、１００倍、２００倍等に希釈した抽出物試料を９６ウェルマイクロプレートに１０μlずつ分注し、０．２nM  Ｒ−フィコエリトリン（R-phycoerythrin）溶液を１７０μl加え、さらに０．３M  ＡＡＰＨ溶液を加えて、８０分間の蛍光強度の変化（励起波長５３２nm、蛍光波長５６５nm）をプレートリーダー（商品名「Ｐｏｗｅｒｓｃａｎ  ＨＴ」、大日本住友製薬）を用いて測定した。対照としてはトロロックス（Calbiochem, Germany）を用いた。
【００２７】
抽出物全体（ＫＷ、ＫＡ）についても同様に測定し、これらとの比較のため、市販のブドウ種子抽出物ポリフェノール（商品名「グラヴィノール」、キッコーマン）も測定した。
【００２８】
ＤＰＰＨラジカル消去活性は、ＫＷの水画分の抗酸化活性が他の半分程度と弱く、それ以外の画分は、多少のばらつきはあるものの同程度の活性を示した。ＫＡも同様に、水画分の抗酸化活性が弱く、それ以外の画分はほぼ同じ値を示した（図２）。
【００２９】
ＯＲＡＣ法では、ＫＷ、ＫＡともに水画分で抗酸化活性が強く、５０％メタノール画分、８０％メタノール画分となるに従い、活性が減少した。７０％アセトン画分ではほとんど活性を示さなかった（図３）。
【００３０】
以上の結果より、カリン抽出物の低分子画分に抗酸化性の強いポリフェノールが多く存在し、８０％メタノール、アセトン画分には、分子量が大きいプロシアニジンが多いため、ポリフェノール存在量としては比較的多いものの、抗酸化性としては弱いことが考えられた。
【００３１】
また、ＫＡと市販のブドウ種子ポリフェノールとを比較すると、市販のブドウ種子ポリフェノールのＯＲＡＣは０．４７mg没食子酸当量であったのに対し、ＫＡでは０.７２mg没食子酸当量であった。
【００３２】
試験例２
カリン抽出物ポリフェノールの膵リパーゼ阻害活性
食事中性脂肪は、膵臓から分泌されるリパーゼによって小腸で脂肪酸とモノアシルグリセロールとに加水分解され、小腸から吸収される。したがって膵リパーゼの阻害により、中性脂肪の吸収が阻害される可能性がある。
【００３３】
本試験例では、カリンエタノール抽出物ポリフェノール（ＫＡ）の膵リパーゼ阻害活性を、蛍光性のリパーゼ基質である４−メチルウンベリフェリルオレエート（4-methylumbelliferyl oleate；４−ＭＵオレエート）の加水分解活性の阻害から評価した。４−ＭＵオレエート及び膵リパーゼ（Type VI-S, from porcine pancreas）はSigma Chemical Co. USAから購入した。９６ウェルマイクロプレートに、５〜１００μg/mlに水で希釈した試料を２５μlずつ分注し、０．１mM  ４−ＭＵオレエート／トリス塩酸緩衝液（pH８．０）を５０μl及び５０U/ml  膵リパーゼ／トリス塩酸緩衝液（pH８．０）を２５μl加え、２５℃で３０分間インキュベーションした。蛍光プレートリーダーで励起波長３５５nm、蛍光波長４６０nmにおける蛍光強度を測定した。
【００３４】
膵リパーゼ阻害活性は次の式で求めた。
膵リパーゼ阻害活性（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×１００
（式中、Ａ：試料溶液の蛍光強度、Ｂ：ブランクの蛍光強度）
【００３５】
ポリフェノール濃度が１００μg/mlのとき、代表的なプロシアニジン含有物であるブドウ種子抽出物（前記と同じ市販品；Ｇ）は３１．３±４．０％の阻害を示したのに対し、ＫＡは６３．４±１．０％の阻害を示した。各試料のリパーゼ阻害活性のＩＣ５０値は、Ｇでは１５４．５μg/mL、ＫＡでは６６．５μg/mLとなった。したがって、カリン抽出物ポリフェノールは、極めて強力な膵リパーゼ阻害活性を有することが示された（図４）。
【００３６】
試験例３
高脂肪食肥満モデルマウスにおけるカリン抽出物ポリフェノールの効果
実験動物として、５週齢ＫＫ−Ａｙ／ＴａＪｃ１雄マウス（２３〜２６g、日本クレア株式会社、東京）を用いた。５日間の予備飼育後、高脂肪飼料（「２０％カゼイン食」；Ｃ）を与えるコントロール群（Ｃ群）、高脂肪飼料にＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法で測定したポリフェノールとして０．３９％（W/W）の市販ブドウ種子抽出物を添加した飼料（「ブドウ種子抽出物添加２０％カゼイン食」；Ｇ）を与える群（Ｇ群）、及び高脂肪飼料にＦｏｌｉｎ−Ｄｅｎｉｓ法で測定したポリフェノールとして０．５％（W/W）のカリンエタノール抽出物（ＫＡ）を添加した飼料（「カリン抽出物添加２０％カゼイン食」；Ｋ）を与える群（Ｋ群）に群分けし（ｎ＝５〜６）、２８日間飼育した。水は水道水を自由に飲ませた。実験に用いた飼料の組成を表１に示した。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
実験食を与えてから２５日目に代謝ケージを使用して３日間糞を採取し、２８日目から１２時間絶食させ、２９日目にマウスをジエチルエーテル麻酔下で開腹し、下大静脈からヘパリン処理した注射器で採血後、屠殺した。
【００３９】
血糖値、血中インスリン濃度及び血中アディポネクチン濃度を、それぞれ市販の測定キット（商品名「グルコース  ＣII−テストワコー」（和光純薬株式会社、大阪）、「モリナガ超高感度マウスインスリン測定キット」（株式会社森永生科学研究所、横浜）及び「マウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬株式会社、東京））を用いて測定した。血中トリグリセリド濃度、総コレステロール濃度、ＨＤＬ−コレステロール濃度は、和光純薬製の測定キット（商品名「トリグリセリド  Ｅ−テストワコー」、「コレステロール  Ｅ−テストワコー」、「ＨＤＬ−コレステロール  Ｅ−テストワコー」）を用いて測定した。血糖値の測定は飼育２週後及び４週後に行い、それ以外の各成分の測定は４週後に行った。
【００４０】
肝臓のトリグリセリド及びコレステロールは、肝臓を２０倍量のクロロホルム−メタノール（２：１  （v/v））でホモジナイザーを用いてホモジナイズし、２５，０００ｇで遠心分離した上清のクロロホルム層を用いて上記キットで測定した。
【００４１】
最終日体重は、Ｃ群の４１．０±１．４gに対して、Ｇ群、Ｋ群はそれぞれ４４．４±０．９ｇ、４３．６±１．９ｇと有意に重かったが、摂食量は各群に有意差が見られなかった。血糖値の変化を見ると、飼育２週後では各群の差は認められなかったが、４週後ではＣ群に比べＫ群で顕著な低下が認められた。一方、Ｇ群は、Ｃ群との間で有意な差が認められなかった（図５）。
【００４２】
血中アディポネクチン濃度は、Ｃ群に対してＧ群、Ｋ群で有意に増加した（図６）。アディポネクチン濃度の増加は、脂質代謝改善効果の存在を示すことが知られている。したがって、本実験結果により、本発明のカリン抽出物ポリフェノールは、優れた脂質代謝改善作用を有することが示された。
【００４３】
血中インスリン濃度は、有意差はなかったがＣ群に対してＧ群、Ｋ群ともに増加抑制傾向を示した（図６）。血中トリグリセリド濃度は、Ｃ群に比べＫ群で５０％程度まで低下した（図６）。一方、Ｇ群ではＣ群と有意な差を示さなかった。血中総コレステロール濃度は、各群の間で有意差はなかったが、Ｋ群でＧ群に比べわずかに低下傾向が認められた（図６）。したがって、カリン抽出物ポリフェノールは、肥満モデルマウスにおいて顕著な血中のトリグリセリド濃度の抑制作用を示すことが明らかになった。
【００４４】
肝臓のトリグリセリド濃度は、各群間に有意差は認められなかった（図７）。コレステロール濃度では、Ｋ群でＣ群に比べ減少する傾向が認められた（図７）。糞中に排泄された胆汁酸はＫ群でＣ群に比べ有意に減少した（図７）。高脂肪食負荷による肥満モデルにおいては、トリグリセリドの代謝に異常が見られるが、肝臓のトリグリセリドに変化がなかったことから、トリグリセリドの吸収あるいは脂肪組織における代謝に本発明のカリン抽出物ポリフェノールが好ましい影響を与えたものと考えられる。
【００４５】
また、肝臓コレステロール濃度の減少、胆汁酸排泄量の減少から、本発明のカリン抽出物ポリフェノールは、肝臓におけるコレステロールの合成にも影響を与えている可能性が考えられる。
【００４６】
これらのカリン抽出物ポリフェノールの効果は、市販ブドウ種子抽出物よりも顕著であり、優位性の高いものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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