(57)【要約】【課題】ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）、またはその２つの触媒ドメインの一方を発現させるための細胞株を提供する。【解決手段】非動物供給源の低タンパク質組織培養培地を用いつつ、高レベルの酵素発現が達成される。ロバストな２工程の下流精製により高い酵素純度がもたらされる。得られるＰＡＭまたはそのＰＨＭ触媒ドメインは、Ｘ−α−ヒドロキシ−ＧｌｙまたはＸ−ＮＨ２（Ｘは、グリシン基が共有結合し得るカルボニル基を有するペプチドまたは任意の化学的化合物である）へのＸ−Ｇｌｙの変換の酵素的変換を触媒するために使用される。また、好ましい細胞株の調製方法も示す。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）第１、第２および第３の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、前記第１のベクターが、第１の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第２のベクターが、第２の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第３のベクターが、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、前記第１のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１であり、前記第２のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞に選択圧をかけ、前記第１のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞に選択圧をかけ、前記第２のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を発現する細胞を選択する工程
を含む、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法。
【請求項２】
工程（Ｄ）で得られた細胞に増幅した選択圧をかけることにより、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを増幅する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の選択可能なマーカーが、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の選択可能なマーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記選択可能なマーカーの少なくとも一方がジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子であり、前記増幅がメトトレキサートの存在下で行なわれる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも１０：１であり、前記第２のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも１０：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第３のベクターが、リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のＳＶ４０エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第３のベクターが、リボソーム結合部位、ヒトメタロチオニンを含む制御領域、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のエンハンサーに操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記エンハンサーがＳＶ４０エンハンサーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記潜在的宿主細胞がＣＨＯ  Ｋ１細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法で得られる細胞株。
【請求項１２】
（Ａ）ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程
を含む、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法。
【請求項１３】
工程（Ｂ）においてカラム結合を助長するために、クエン酸ナトリウムが用いられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現させるための発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１細胞。
【請求項１５】
前記発現ベクターが、リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のＳＶ４０エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する、請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
前記発現ベクターが、リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンＩＩＡプロモーターを有する制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する、請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
前記ベクターが、前記プロモーターの上流にエンハンサーをさらに含む、請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
前記エンハンサーがＳＶ４０エンハンサーである、請求項１７に記載の形質転換細胞。
【請求項１９】
リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のＳＶ４０エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクター。
【請求項２０】
リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンＩＩＡプロモーターを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクター。
【請求項２１】
前記ベクターが前記プロモーターの上流にエンハンサーをさらに含む、請求項４０に記載のベクター。
【請求項２２】
前記エンハンサーがＳＶ４０エンハンサーである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
（Ａ）第１、第２および第３の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、前記第１のベクターが、第１の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第２のベクターが、第２の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、前記第３のベクターが、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、前記第１のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１であり、前記第２のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞に選択圧をかけ、前記第１のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞に選択圧をかけ、前記第２のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現する細胞を選択する工程
を含む、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法。
【請求項２４】
工程（Ｄ）で得られた細胞に増幅した選択圧をかけることにより、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを増幅する工程をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の選択可能なマーカーが、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子である、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の選択可能なマーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子である、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
前記選択可能なマーカーの少なくとも一方がジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子であり、前記増幅がメトトレキサートの存在下で行なわれる、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも１０：１であり、前記第２のベクターに対する前記第３のベクターの濃度比が少なくとも１０：１である、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
前記第３のベクターが、リボソーム結合部位、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のＳＶ４０エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
前記第３のベクターが、リボソーム結合部位、ヒトメタロチオニンを含む制御領域、プロモーターおよび前記プロモーターの上流のエンハンサーに操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
前記エンハンサーがＳＶ４０エンハンサーである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記潜在的宿主細胞がＣＨＯ  Ｋ１細胞を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の方法で得られる細胞株。
【請求項３４】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を含む細胞株。
【請求項３５】
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の細胞または細胞株によって発現されるペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ。
【請求項３６】
グリシン残基を有し、遊離酸の形態であり、カルボニル基に結合された前駆体を、請求項３５に記載のペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの存在下で反応させた後、ルイス塩基またはペプチジルα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼの存在下で、さらに反応させることを含む、アミド化生成物のインビトロ産生方法。
【請求項３７】
前記前駆体が、Ｃ末端グリシンを有するペプチドである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
請求項３６記載の方法で得られるアミド化生成物。
【請求項３９】
（Ａ）ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程
を含む、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法。
【請求項４０】
工程（Ｂ）においてカラム結合を助長するために、クエン酸ナトリウムが用いられる、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
（Ａ）グリシン残基を有し、遊離酸の形態であり、カルボニル基に結合された前駆体を、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの存在下で反応させることにより、ヒドロキシル化中間体を形成すること；および
（Ｂ）前記中間体を、ルイス塩基またはペプチジルα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼのいずれかと同時またはその後反応させること
を含む、アミド化生成物のインビトロ産生方法であって
前記ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼが、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の細胞または細胞株によって発現された、産生方法。
【請求項４２】
工程（Ｂ）でルイス塩基が用いられる、請求項４１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年６月２４日に出願された米国特許仮出願第６０／６９３，６１２号（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭもしくはα−ＡＥ）、またはその２つの触媒ドメインの一方の発現のための組換え発現ベクターおよび細胞株に関する。本発明はまた、Ｘ−α−ヒドロキシ−ＧｌｙまたはＸ−ＮＨ２（Ｘは、グリシン基が共有結合し得るカルボニル基を有するペプチドまたは任意の化学的化合物である）へのＸ−Ｇｌｙの酵素的変換を触媒するための、かかるＰＡＭ（またはその触媒ドメインの一方）の使用に関する。さらに、本発明は、好ましい細胞株の調製に関する。一部のある実施形態では、ＣＨＯ  Ｋ１宿主が用いられる。一部のある実施形態では、発現ベクターは、ヒトメタロチオニンＩＩＡプロモーターおよび／またはＳＶ４０エンハンサーを含む。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
数多くのヒトホルモン、増殖因子、サイトカイン、神経伝達物質、誘導体化脂肪酸および他の重要な生物学的化合物は、その分子構造の実質的な部分としてアミノ酸またはペプチドを有する。多くの疾患は、患者において、これらの生物学的化合物のレベルの上昇に対して陽性に応答する。治療有効量のかかる生物学的に関連性のある化合物は患者に、さまざまな様式で投与され得る。したがって、効率的で費用効果のあるかかる化合物の製造方法は非常に重要である。これは、生物学的化合物が、経口送達用の投薬形態（これは、他の投与様式と比べてバイオアベイラビリティが低いにもかかわらず、通常好ましい投与様式である）に調製される場合、特に言える。
【０００４】
哺乳動物細胞および他の真核生物では、ある種の翻訳後プロセシング手順が行なわれ得るが、原核生物では行なわれ得ない。ある種の原核生物、例えば、大腸菌は、バッチ発酵手順で容易に培養され得るため、および遺伝子工学的に充分特性化されているため、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）手法による哺乳動物タンパク質の産生のための宿主として広く使用されている。しかしながら、多くの哺乳動物タンパク質には、なんらかの型の翻訳後プロセシングが必要とされる。このようなタンパク質が、例えば大腸菌の遺伝子操作によって産生される場合、翻訳後プロセシングは、多くの場合、複雑なインビトロ化学的手順を用いて行なわれなければならないが、該手順は、大規模生産の適用のためには、たいへんな費用がかかる。ペプチドを、哺乳動物宿主を用いて、組換えにより産生させる場合であっても、多くの場合、前駆体を効率的に産生させ、これを、その後でのみさらに修飾させることが望ましい。
【０００５】
かかるさらなるプロセシング活性の一例は、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端アミノ酸の特異的アミド化を含む。多くの天然に存在するホルモンおよびペプチドはかかる修飾を含み、これは、多くの場合、該タンパク質が生物学的に活性であるべきならば不可欠である。一例はカルシトニンであり、この場合、天然形態のアミド化プロリンを非アミド化プロリン残基で置換すると、生物学的活性の非常に有意な低下がもたらされる。充分な活性に翻訳後アミド化を必要とする他の生物学的ペプチドとしては、限定されないが、成長ホルモン放出因子、他のカルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、セクレチン、ペプチドＹＹなどが挙げられる。
【０００６】
最大限の有効性のためにアミド化が必要とされる多くの重要な生物学的タンパク質のポリペプチド配列が、例えば、遺伝子操作手法によって製造され得る。しかしながら、重要であり、時には不可欠であるカルボキシ末端のアミド化は、多くの場合、インビトロで行なわなければならない。この点において、高価で煩雑な化学的アミド化手法は回避することが望ましく、したがって、特異的アミド化を行なうためにはアミド化酵素を用いることが望ましい。タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸の特異的アミド化は、高頻度で、α−アミド化酵素によって触媒される。
【０００７】
ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）は、アミド化ペプチド生成物へのペプチド基質の変換を触媒する。該変換は２工程反応である。ＰＡＭは２つの触媒ドメインを有する：ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）は、工程１（中間体への基質の変換）を触媒し、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼ（ＰＡＬ）は、工程２（生成物への中間体の変換）を触媒する。完全長ＰＡＭは２つの機能を有し、両方の工程を触媒する。工程２はまた、中間体をルイス塩基と接触させる場合、非酵素的に、効率的になされ得る。
【０００８】
自然界では、ほぼ５０％のペプチドホルモンおよび神経伝達物質が、ＰＡＭによって前述の様式でアミド化される。ＰＡＭ活性は、数多くの多様な種で認められており、ＰＡＭは、ラット、ウシおよびカエルなど多様な種間で有意な構造的相同性を有する傾向にある。また、ＰＡＭの機能、基質および補因子は、種間で類似する（高頻度で、同一である）ことが知られている。基質は化合物であり、多くの場合、遊離カルボキシル基を有するグリシン残基を有するペプチドである。ＰＡＭ触媒アミド化反応は当該技術分野でよく知られている。例えば、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを用い、グリシン伸長サケカルシトニン前駆体の、そのＣ末端がアミド化された（すなわち、前駆体のＣ末端グリシンの代わりにアミノ基を有する）真のサケカルシトニンへの変換を触媒するペプチドは、米国特許第６，１０３，４９５号に詳細に記載されている。
【０００９】
ＰＡＭおよびＰＡＭを発現する細胞株の供給源は、当該技術分野で知られている。アミド化ペプチドの大規模なＰＡＭ触媒産生では、最良のコスト有効性のため、ＰＡＭの安定な高収率供給源が必要とされる。さらに、ＰＡＭは、潜在的ヒト用医薬品の作製に高頻度に用いられるため、ＰＡＭ産生（ＰＡＭ発現細胞株およびこれを培養する培養培地の両方）のための系では、ＰＡＭ発現中、できるだけ不純物の産生を少なくすることが重要である。特に重要なことは、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のリスクを回避するために、哺乳動物タンパク質の使用を最小限に抑えることである。それにもかかわらず、培養培地中の哺乳動物タンパク質増殖因子（ＴＳＥの観点からは望ましくない）は、ＰＡＭ発現細胞株の生存および産物発現の補助において有用であり得る。したがって、当該技術分野において、本発明の場合以外では培地に必要とされ得る哺乳動物タンパク質の非存在下であっても強い発現をもたらし、良好な安定性および生存を示すＰＡＭ発現（またはＰＨＭ発現）細胞が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
したがって、本発明の目的は、酵素が後に製品の製造（例えば、アミド化医薬品の製造）に使用される場合に問題となり得る哺乳動物型のタンパク質および他の不純物が実質的にない培地中で良好な生存割合および良好な発現収率を有するのに充分強いＰＡＭ発現細胞またはＰＨＭ発現細胞を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、それ自体は有意な望ましくない不純物を共発現しないＰＡＭ発現細胞またはＰＨＭ発現細胞を提供することである。
【００１２】
さらなる目的は、良好な発現収率をもたらすＰＡＭ発現細胞またはＰＨＭ発現細胞を提供することである。
【００１３】
さらなる目的は、かかる細胞に有用な発現ベクターを提供することである。
さらなる目的は、かかる細胞をトランスフェクトおよび選択するための良好な手法を提供することである。
【００１４】
さらなる目的は、酵素反応用の高活性および高純度のＰＡＭまたはＰＨＭを提供し、それにより、良好な酵素反応および結果としてのアミド化生成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
これらおよび他の目的は、本明細書に開示する本発明によって提供される。
一実施形態において、本発明は、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを発現させるための発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１細胞を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位、プロモーターおよび該プロモーターの上流のＳＶ４０エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンＩＩＡプロモーターを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、
（Ａ）第１、第２および第３の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、該第１のベクターが、第１の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第２のベクターが、第２の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第３のベクターが、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、該第１のベクターに対する該第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１であり、該第２のベクターに対する該第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞に選択圧をかけ、該第１のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞に選択圧をかけ、該第２のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを発現する細胞を選択する工程
を含む、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は細胞株ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍを提供する。
別の実施形態において、本発明は、細胞株ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍによって発現されるペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、
（Ａ）ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程
を含む、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現させるための発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｋ１細胞を提供する。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位、プロモーターおよび該プロモーターの上流のＳＶ４０エンハンサーを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位およびヒトメタロチオニンＩＩＡプロモーターを含む制御領域に操作可能に連結されたペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードする核酸を有するコード領域を有する組換え発現ベクターを提供する。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、
（Ａ）第１、第２および第３の発現ベクターの存在下で、潜在的宿主細胞をトランスフェクトする工程であって、該第１のベクターが、第１の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第２のベクターが、第２の選択可能なマーカーをコードするコード領域を含み、該第３のベクターが、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼをコードするコード領域を含み、該第１のベクターに対する該第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１であり、該第２のベクターに対する該第３のベクターの濃度比が少なくとも３：１である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた細胞に選択圧をかけ、該第１のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞に選択圧をかけ、該第２のベクターでトランスフェクトされた細胞を選択する工程；
（Ｄ）工程（Ｃ）で得られた細胞を限界希釈し、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現する細胞を選択する工程
を含む、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの発現のための細胞株の調製方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、
（Ａ）ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの不純試料を陰イオン交換クロマトグラフィーにかける工程であって、溶出が均一濃度である工程；
（Ｂ）工程（Ａ）の溶離液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける工程であって、硫酸アンモニウムが使用されず、溶出が均一濃度である工程
を含む、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを発現および培養培地中への分泌後に精製する方法を提供する。
【００２６】
所望の酵素は、本発明の細胞および細胞株によって発現され、好ましい実施形態では、本発明の精製手法に従って精製される。次いで、該酵素の存在下で、グリシン残基を有し、遊離酸の形態であり、カルボニル基に結合された前駆体から始まる反応が行なわれる。反応条件および補因子は当該技術分野で知られている。本明細書に記載の実施例１および２に、アミド化生成物の典型的なアミド化反応および精製を示す。好ましいアミド化生成物が得られる。ペプチジルα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼを用いた場合、中間体が得られ、これは、アミド化生成物を形成するために、ルイス塩基またはペプチジルα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼのいずれかとのさらなる反応を必要とする。
【００２７】
酵素産生細胞株、例えば本明細書に記載のものが、酵素を発現して培養培地中に分泌する場合、特定のある実施形態では、続いて、該酵素を精製するための一連の工程が行なわれ得る。収集工程では、ならし培地が細胞から分離される。第１のタンジェンシャルフロー濾過（濃縮、ダイアフィルトレーション）により、低分子量成分が除去される。陰イオン交換クロマトグラフィー工程および疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、主に、タンパク質不純物および培地成分からの精製のために用いられる。ウイルス濾過前の最後のタンジェンシャルフロー濾過、濃縮およびバッファー交換は、望ましくは、保存前に実施される。改善された陰イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを、本明細書の特許請求の範囲に示す。
【発明の効果】
【００２８】
驚くべきことに、望ましくは安定なＣＨＯ  Ｋ１細胞が、内在ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の存在にもかかわらず、本発明の状況において使用され得ることがわかった。該内在遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する選択可能なマーカーに基づくメトトレキサート選択を有意に妨げなかった。
【００２９】
ＰＡＭ遺伝子と、独立したベクター上の２つの選択可能なマーカーとの共トランスフェクションは、本明細書に記載のように、ゲノムのより望ましい部分で起こる共増幅の機会を有意に増大させると考えられる。
【００３０】
ＳＶ４０エンハンサーが使用される場合、エンハンサーは、任意の転写プロモーター、例えば限定されないが、ＳＶ４０転写プロモーター、本明細書に記載の好ましいメタロチオニンＩＩＡプロモーターなどとともに使用され得ると理解されている。
【００３１】
本発明に従って発現および精製されるペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼは、望ましくないプロテアーゼ活性を実質的に含まず、本明細書に記載のような基質の効率的なα−アミド化に好適である。
【００３２】
本明細書に記載の好ましい細胞株であるＵＧＬ  ７３−２６／Ｍは、良好な長寿命プロフィールを示したため、安定性が非常に重要である規模の拡大に特に有用であると考えられる。
【００３３】
同様に、本明細書に記載の好ましい精製手法では、拡張可能な特性および有意な生成物純度が提供される。具体的には、画分収集が有意に単純化される均一濃度の溶出が使用される。先行技術のような疎水性相互作用クロマトグラフィーと共に硫酸アンモニウムを使用することは、硫酸アンモニウムが酵素の沈殿および不活化を引き起こし得るため、望ましくは回避する。
【００３４】
類推により、本明細書に記載の発明は、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼに関して有益であったため、ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼに関して有益であることが予測される。
【００３５】
本明細書に記載の好ましい態様の１つ以上を組み合わせて使用され得る。例えば、限定を意図しないが、好ましいプロモーターが、好ましいエンハンサーおよび／または好ましい宿主細胞と一緒に使用され得る。
【００３６】
（Ａ）ＰＨＭおよび（Ｂ）ＰＡＬまたはルイス塩基のいずれかがＰＡＭの代わりにアミド化に使用される場合、ＰＨＭおよびＰＡＬ（使用される場合）は、いくつかの様式で得られ得る。一部を以下に示す。
【００３７】
ＰＨＭ
発現されたときＰＨＭ活性のみを含むＰＡＭ遺伝子の天然に存在する形態の発現
カエルに由来する酵素の一例は、天然に存在するＰＨＭ酵素である。Ｍｉｚｕｎｏら（１９８６），「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａ−Ａｍｉｄａｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｔｏ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ  Ｆｒｏｍ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ｓｋｉｎ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１３７（３）９８４−９９１を参照のこと。これは、後に、完全長ＰＡＭではなくＰＨＭであることがわかった。Ｓｕｚｕｋｉら（１９９０），ＥＭＢＯ  ９（１３）４２５９−４２６５を参照のこと。
【００３８】
完全長ＰＡＭの発現および切断
ＰＡＭ酵素をＰＨＭ活性とＰＡＬ活性の間の部位、例えば２塩基性切断部位で切断するため、特異的プロテアーゼが使用され得る。次いで、ＰＨＭ触媒ドメインが精製によって得られ得る。例えば、Ｏｕａｆｉｋら，（１９９２）「Ｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ａ−Ａｍｉｄａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ：Ｅｘｏｎ／Ｉｎｔｒｏｎ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｒｏｕｔｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）１５７１−１５８４には、ラット由来ＰＡＭ内の２つの触媒ドメインの位置が記載されており、「対の塩基部位での内部タンパク質分解性切断により、２つの触媒ドメインが分離され得る」と記載されている。また、Ｅｉｐｐｅｒら（１９９３），「Ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ａ−Ａｍｉｄａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｉｔｈ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｒｏｕｔｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２，４８９−４９７も参照のこと。
【００３９】
ＰＡＭ内への停止コドンまたはリーディングフレームを改変する点変異の導入
代替法として、翻訳停止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）が、任意の種由来の任意のＰＡＭ  ｃＤＮＡ内のＰＡＭの２つの機能ドメイン（ＰＨＭおよびＰＡＬ）間に導入され得るか、またはリーディングフレームを改変するために、かかる位置内に点変異が導入され得る。
【００４０】
ＰＨＭ  ｃＤＮＡのみを有する発現ベクターの再設計
ＰＣＲを用い、ＰＨＭドメインのみをコードする切断型ＰＡＭ遺伝子を合成し、プロモーターまたはエンハンサー／プロモーター配列の下流の発現ベクターに配置し得る。
【００４１】
以下に、異なる型のＰＡＭ酵素およびその触媒ドメインに関するさらなる参考文献を示す。
【００４２】
Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．ら，（１９８７）「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  α−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ」、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４８（２）５４６−５５２
Ｏｈｓｕｙｅ，Ｋ．ら，（１９８８）「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  α−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ」、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５０（３）１２７５−１２８１
Ｋｏｌｊｅｋａｒ，Ａ．Ｓ．ら，（１９９７）「Ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  α−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ，ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｗ−ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｏｒｅ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１３９０１−１３９０９
Ｋｏｌｊｅｋａｒ，Ａ．Ｓ．ら，（２００２）「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｃｏｒｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  α−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｙｃｉｎｅ  α−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｌｙａｓｅ」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：１２３８４−１２３９４
Ｂｅｒｔｅｌｓｅｎ，Ａ．Ｈ．ら，（１９９０）「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｒａｔ  α−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃＤＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７９（１）８７−９６
Ｊｉｍｅｎｅｚ  Ｎ．ら，（２００３）「Ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  α−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３５：１４−２４
ＰＡＬ
天然に存在する形態のＰＡＬの発現
ＰＡＭの２つの触媒ドメインは、ショウジョウバエと刺胞動物（イソギンチャク）の別々の遺伝子にコードされている。したがって、これらの種に由来するＰＡＬをコードする遺伝子は、プロモーターまたはエンハンサー（ｅｎｃｈａｎｃｅｒ）／プロモーター配列の下流の発現ベクターに配置すると、発現され得る。Ｋｏｌｈｅｋａｒ，Ａ．Ｓ．ら．（１９９７）「Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｍｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ：Ｓｅｐａｒａｔｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｅ  ｔｈｅ  Ｔｗｏ  Ｅｎｚｙｍｅｓ
Ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ  Ａｍｉｄａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １７（４）：１３６３−１３７６を参照のこと。
【００４３】
完全長ＰＡＭの発現および切断
完全長の２つの機能を有するＰＡＭを発現させ得、ＰＨＭを不活化させるために、ＰＨＭドメインとＰＡＬドメイン間および／またはＰＨＭドメイン内の特異的プロテアーゼ部位で切断を行ない得る。任意の適当に特異的なプロテアーゼを用い、例えば、２塩基性切断部位でＰＨＭ活性をＰＡＬ活性から分離し得る。ＰＡＬ活性／タンパク質は、さらに精製され得る。同様の手順および２塩基性切断部位の位置は、ＰＨＭの取得に関して上記に記載している。
【００４４】
ＰＡＬ  ｃＤＮＡのみを有する発現ベクターの再設計
ＰＣＲを用い、ＰＡＬドメインのみをコードする切断型ＰＡＭ遺伝子を合成し、プロモーターまたはエンハンサー／プロモーター配列の下流の発現ベクターに配置し得る。
【００４５】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面、グラフ、表などに言及する本発明の以下の記載から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ｐＨＳ１のプラスミドマップである。
【図２】図２は、ｐＵＣ８のプラスミドマップである。
【図３】図３は、ｐＳＶ４０２ＭＴのプラスミドマップである。
【図４】図４は、α−ＡＥ  ｃＤＮＡ遺伝子配列の誘導（ｄｅｒｉｖｔｉｏｎ）である。
【図５】図５は、ｐＡＥ７３のプラスミドマップである。
【図６】図６は、７３−２６浮遊適合スキームである。
【図７】図７は、スピナーフラスコにおける溶存酸素濃度およびα−ＡＥ産生性である。
【図８】図８は、ＤＯおよびα−ＡＥ産生性に対するスピナーフラスコの容積の効果である。
【図９】図９は、ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの攪拌培養ｐＨである。
【図１０】図１０は、ｐＨ制御なしでの攪拌槽バイオリアクターおよびスピナーフラスコのｐＨプロフィールである。
【図１１】図１１は、攪拌槽バイオリアクターにおけるＵＧＬ  ７３−２６／Ｍα−ＡＥ産生性に対するｐＨの効果。
【図１２】図１２は、精製ＰＡＭ酵素のＳＤＳ  ＰＡＧＥである。
【図１３】図１３は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリーのスキャンおよびピーク面積パーセントの計算である。
【図１４】図１４は、α−ＡＥの産生のプロセスフローダイアグラムである。
【図１５】図１５は、ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの種菌スキームである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の実施形態の詳細な説明
本発明によるＰＡＭ発現細胞株（内部的にはＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＷＣＢ  ００と示す）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ，２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．に、２００５年６月１０日あたりに、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約に従って寄託された。ＡＴＣＣ受託番号はＰＴＡ  ６７８４である。この寄託細胞株は、この条約の下に公布された規定に従い、試料は、その時点で、および該条約によって求められる条件下で、ならびに特許法および該条約の調印国の規定に準じて入手可能となる。例えば、本出願またはこれを優先権主張するか、もしくはこれを参照する任意の他の米国特許出願の米国特許が発行された場合、該寄託物質の入手可能性に関するあらゆる制限は、ブダペスト条約または３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２に求められる程度まで変更不可的に解除される。
【００４８】
本発明のＰＡＭ発現ベクターの構築を、以下に詳細に記載する。本明細書に示すプラスミドマップにおいて、「αアミド化酵素」（例えば、図５、ｐＡＥ７３のプラスミドマップを参照）と示す領域は、添付の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有し、添付の配列番号２に示される７１５アミノ酸の一次翻訳産物をコードする。該翻訳産物は、シグナルペプチドをアミノ酸１〜２５に、プロ領域を２６〜４１に、および成熟ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーを４２〜７１５に含む。本発明に従って発現および精製される酵素のほとんどは、該プロ領域を含み続け、非常に有効であることが示された。
【実施例】
【００４９】
以下、好ましいＰＡＭ発現細胞株、その発酵、方法の開発、精製および使用の例を詳述する。
【００５０】
以下により詳細に記載するように、ＰＡＭ遺伝子を、ｐＳＶ４０２ＭＴ発現ベクター内にクローニングし、ＰＡＭ発現プラスミドｐＡＥ７３を創製した。ＣＨＯ  Ｋ１細胞をｐＡＥ７３  ＤＮＡでトランスフェクトした。二重選択プロセスおよび限界希釈クローニング後、メトトレキサートの濃度を増加させ、ＣＨＯ細胞株をさらに増幅した。接着細胞株７３−２６を、選択なし血清無含有の浮遊培養物ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍに変換した。ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＣＢおよびＭＷＣＢは、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．において創製した。ＭＣＢおよびＭＷＣＢの両方を充分に特性化したところ、ＧＭＰ施設においてのＰＡＭの産生に対し、認可され得ると考えられる。ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ細胞株を適合させ、攪拌槽バイオリアクター内での培養した。発酵の開発により、スピナーフラスコで１４日間行なわれる種菌プロセスの定義付けがもたらされた。発酵／細胞培養相は１７日間のプロセスである。発酵プロセスの重要なパラメータは以下の通り：第５、１０および１４日にグルコース添加（２ｇ／Ｌ）、溶存酸素濃度≧７０％、発酵がその自然な設定点に達するｐＨ、およびタンパク質無含有、非動物由来組織培養培地、Ｓｉｇｍａ  Ｃ５４６７（グルタミンを終濃度２ｍＭまで補充）である。簡便でロバストな下流精製プロセスを、Ｃ５４６７  ＣＨＯならし培地からのＰＡＭのために開発した。精製後、定常的に純度の４倍増加および活性酵素の４０％の総回収が得られる。該プロセスでは、製造レベルに規模を拡大し易い慣用的な濾過系およびバイオプロセスクロマトグラフィー樹脂が用いられる。細胞培養発酵と下流精製のプロセス全体を、１０Ｌパイロットプラント／製造レベルの規模にした。記載のプロセスは、大量のＰＡＭの産生について確認可能な製造プロセスに従いやすいものであるのがよい。
【００５１】
大量のＰＡＭを発現するＣＨＯ細胞株ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍを開発した。ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ用に開発した細胞培養プロセスは、非動物タンパク質由来の培地中のものとした。単純なバッチ細胞培養プロセスが好ましかった。精製スキームの目的は、触媒的に活性な酵素の良好な収率を伴う、ロバストで拡張可能なプロセスを開発することであった。
【００５２】
ベクターの構築
該細胞株を作製するために使用される発現ベクターｐＡＥ７３の創製は、Ｆｒｉｅｄｍａｎら．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：３５９−３６２（１９８９）の研究結果を基にした。この論文に記載されたプロセスに従い、本発明者らは、試験用のｐＡＥ７３発現ベクターの創製を進めた。各ベクターの主要成分は、ヒトメタロチオネインＩＩＡ（ｈＭＴＩＩＡ）プロモーター（ｐＨＳ１内に位置する、Ｍ．Ｋａｒｉｎ氏より受領）、ＳＶ４０エンハンサー（ｐＳＶ４０由来、ＡＴＣＣ）および本明細書に記載のα−アミド化酵素遺伝子である。
【００５３】
ｐＡＥ７３の誘導化
ｐＨＳ１
ｐＡＥ７３の創製に使用する出発プラスミドは、１９９０年２月にＵＣＳＤのＭ．Ｋａｒｉｎから贈与プラスミドｐＨＳ１（図１）であった。ｐＨＳ１は、Ｄｒ．Ｋａｒｉｎの研究室において、ｐＵＣ８（図２）内にヒトメタロチオネインＩＩＡプロモーターをスプライシングすることにより誘導されたものである。８４６ｂｐのＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｂａｍ  Ｈ１断片を、ｐＵＣ８マルチクローニング部位（ＭＣＳ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂａｍ  Ｈ１部位内にクローニングした。得られたプラスミドｐＨＳ１は、該マルチクローニング部位内に挿入されたヒトメタロチオネインＨＡプロモーターを有する。
【００５４】
ｐＳＶ４０１ＭＴおよびｐＳＶ４０２ＭＴ
ＳＶ４０エンハンサーをヒトメタロチオネインプロモーターの上流に挿入することにより、ｐＨＳ１を発現ベクターｐＳＶ４０１ＭＴまたはｐＳＶ４０２ＭＴ（図３）に変換した。ＳＶ４０  ＤＮＡ断片は、ｐＳＶ４０プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化することにより調製した。１１６７ｂｐのＨｉｎｄ  ＩＩＩ断片を、ｐＨＳ１のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位内にクローニングした。ＳＶ４０エンハンサーは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ＤＮＡ断片内に非対称に存在し、したがって、該エンハンサーは、ｈＭＴＩＩＡプロモーターに近接して、または遠く離れてのいずれかで位置する。元のプラスミド内のｌａｃ  Ｚ遺伝子内のものに対するＳＶ４０エンハンサー内のＢｇｌ  Ｉ部位の配向により、該プラスミドの配置（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）が決まる。ｐＳＶ４０１ＭＴは、ｈＭＴＩＩＡプロモーターから遠く離れたＳＶ４０エンハンサーを有し、ｐＳＶ４０２ＭＴは、ｈＭＴＩＩＡプロモーターに近接したＳＶ４０エンハンサーを有する。ｐＳＶ４０２ＭＴを、さらなるベクター構築に選択した。
【００５５】
ｐＡＥ７３
ｐＡＥ７３は、α−アミド化酵素遺伝子（配列番号１）を、ｐＳＶ４０２ＭＴのＢａｍ  Ｈ１部位内にクローニングすることにより調製された。２８７０ｂｐのα−ＡＥ遺伝子断片を、Ｂｇｌ  １およびＢａｍ  Ｈ１  ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼでのｐＡＥ６４の消化後に単離した。ｐＡＥ６４プラスミドは、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーの下流に、可溶性７５ｋＤａのＰＡＭタンパク質を発現するように修飾されたＰＡＭ遺伝子を含有する。このＰＡＭ  ＤＮＡ配列を別のＣＨＯ発現細胞株ＵＧＬ  Ｂ３／Ａ１−７に使用し、７５ｋＤａのＰＡＭタンパク質を発現させた。ＰＡＭ遺伝子配列の誘導を図４に示す。
【００５６】
２８７０ｂｐのＤＮＡ断片を精製し、該断片のＢｇｌ  １末端を、２つの相補ＤＮＡオリゴヌクレオチド断片（ＡＥ９６／ＡＥ９７）で修飾し、これにより、該断片のＢｇｌ  １末端が新たなＢａｍ  Ｈ１末端に変換された。
【００５７】
ＡＥ９６（＋）２３  ５’ＧＡＴＣＣＡＴＣＧＡＴＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧＣＣ  ３’
ＡＥ９７（−）１６  ５’ＡＣＴＡＧＴＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧ          ３’
該修飾ＰＡＭ  ＤＮＡ断片を、発現ベクターｐＳＶ４０２ＭＴのＢａｍ  Ｈ１部位内にクローニングした。２つのＢａｍ  Ｈ１末端を有するＰＡＭ  ＤＮＡ断片は、発現ベクター内にセンスまたはアンチセンスのいずれかの配向に連結され得るため、ＰＡＭ遺伝子の配向を、該プラスミドのＥｃｏ  Ｒ１による制限消化マッピングによって調べた。Ｅｃｏ  Ｒ１部位と該発現ベクター両方におけるＰＡＭ遺伝子により、プラスミドＤＮＡの単純な解析が可能になる。正しい配向のＰＡＭを有するプラスミドをｐＡＥ７３と表示し、そのプラスミドマップを図５に示す。
【００５８】
α−アミド化酵素発現細胞株の創製
トランスフェクションおよびクローニング
３種類のプラスミド：ｐＡＥ７３、ｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐＳＹ２ｄｈｆｒをＣＨＯ  Ｋ１細胞の形質転換に使用した。トランスフェクト細胞によるプラスミドの組込みにより形質転換細胞株の容易な選択が可能となるため、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏおよびｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ともにＡＴＣＣから入手）を使用した。また、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒは、特に、ＣＨＯゲノム内へのＳＶ４０プロモーター／ｄｈｆｒ  ＤＮＡの組込みにより該遺伝子および他の近位遺伝子の選択的増幅が可能となるため選択された。共増幅される遺伝子は、プラスミドｐＡＥ７３内に担持されたα−アミド化酵素遺伝子であった。ＣＨＯ  Ｋ１細胞は、プラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム沈殿により形質転換した。プラスミドは、該細胞内にｐＡＥ７３：ｐＳＶ２ｎｅｏ：ｐＳＶ２ｄｈｆｒが１０：１：１の比でトランスフェクトした。１００ｍｍｄｉｓｈ１つあたり２０μｇのｐＡＥ７３を添加した。トランスフェクションの２日後、形質転換細胞のみが生存可能となるように、細胞を、選択圧下、２５０ｍｇ／ＬのＧ４１８を含有する培地中で培養した。この培地中でのＣＨＯ細胞の培養では、ｐＳＶ２ｎｅｏプラスミドの安定な組込みが必要とされ得る。トランスフェクションの２７日後、Ｇ４１８選択培地中でいったん安定な培養が確立されたら、メトトレキサートを該培養培地に添加した。形質転換細胞のＧ４１８プールを、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭまたは５μＭのメトトレキサートおよび２５０ｍｇ／ＬのＧ４１８を含有する培地中で培養した。２週間後（トランスフェクションの６週間後）、単離した細胞フォーカスは、クローニングシリンダーにより５μＭメトトレキサート＋Ｇ４１８培地中で培養した細胞から確立され得る。この方法によって、２５のフォーカスから細胞株を確立する試みを行なったが、移した後、２つのフォーカスからしか細胞が培養されず、この手法を却下した。限界希釈クローニングを０．５細胞／ウェルで、１μＭメトトレキサート＋Ｇ４１８を含有する培地中で培養した細胞から同時に開始した。低濃度のメトトレキサートで培養した形質転換細胞は除外した。限界希釈クローニング開始から３週間後、単離物を２４ウェルプレートに移し、次いで、２〜３日間以内に増殖のため１００ｍｍｄｉｓｈに移した。ＣＨＯ  Ｋ１細胞のトランスフェクション開始から１０週間後、７３−２６と表示する単離物のうちの１つを確立した。該細胞株を低温保存し、α−アミド化酵素発現を評価した。７３−２６は、この時点の６９５３Ｕ／１０６細胞／日を産生する最良の産生細胞株の１つであった。
【００５９】
細胞株７３−２６の増幅
７３−２６の初期クローンを継代し、１μＭメトトレキサート＋Ｇ４１８を含有する培地中で維持される確立された細胞株を得た。ｐＳＶ２ｄｈｆｒプラスミドをトランスフェクションのために選択する目的は、形質転換細胞株を同定するための第２の選択方法が提供されるためだけでなく、細胞を高濃度のメトトレキサートで培養すると、ｄｈｆｒミニ遺伝子が増幅されることが広く確立されているためであった。Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、以前に、このプラスミドで形質転換された細胞株を用い、α−アミド化酵素の最大の産生をもたらすのに２０〜５０μＭの濃度のメトトレキサートが必要とされ得ることが示されたことを経験している。α−アミド化酵素細胞株７３−２６を直接、１μＭ、２０μＭまたは５０μＭのメトトレキサートを含有する培地に分割した。また、すべての培地に、第２の選択方法としてＧ４１８も含めた。この細胞株のα−アミド化酵素発現の進行を、種々の時間間隔で表１に示す。
【００６０】
【表１】
2011139714.tif 000003
【００６１】
表１のデータは、以前に開発されたＢ３／Ａ１−７細胞株のものと比べ、この細胞株におけるα−アミド化酵素の発現レベルの増大を示す。α−アミド化酵素遺伝子とｄｈｆｒ遺伝子の共増幅は、メトトレキサートの濃度を増大させて継代培養を継続するより多くの酵素を発現する該細胞株能力により明白になる。２０μＭまたは５０μＭメトトレキサートの存在下で培養した細胞は、選択的増幅の３〜４ヶ月後、最良の発現レベルを有した。継続的に数ヶ月間、継代培養すると、α−アミド化酵素の発現レベルは低下した。したがって、以前に凍結させたこの細胞株のストックを、浮遊適合細胞株の調製に使用した。
【００６２】
浮遊適合α−アミド化酵素発現細胞株７３−２６の特性化
この細胞株の開発の最終目的は、メトトレキサートおよびＧ４１８の選択圧なしで安定な方法を開発することである。該細胞株の所望される別の属性は、これが、浮遊培養において比較的高い細胞密度で培養されることであった。該目的を達成するために用いた方法を以下に記載する。
【００６３】
浮遊適合無選択細胞株の調製
無選択浮遊適合細胞の調製では、ＵＧＬ  ７３−２６接着細胞を、血清、メトトレキサートおよびＧ４１８から離すことが必要とされた。この課題を達成するため、ｍｕｌｔｉ  ｐｒｏｎｇ  ａｔｔａｃｋ（図５）を開発した。除去のマトリックス（ｍａｔｒｉｘ  ｏｆ  ｒｅｍｏｖａｌ）は、可能な最終の細胞株に対して最後の数の細胞倍加を付加するという最終目的で確立された。将来的な研究開発のため、以前に凍結させた（１９９１年１２月１６日）７３−２６の２０μＭメトトレキサート細胞株を解凍し、浮遊適合血清無含有無選択細胞株を確立した。５０μＭメトトレキサートでのＰＡＭ活性はいくぶん高かったが、７３−２６  ５０μＭ細胞株の活性培養物を再確立する試みは成功裏でなかった。該細胞株のα−アミド化酵素産生性を、浮遊適合プロトコルを開始する前に評価した（表２）。
【００６４】
【表２】
2011139714.tif 000004
【００６５】
浮遊培養に適合させる前のこの細胞株のＰＡＭ活性は、細胞１つあたりの基準で、Ｂ３／Ａ１−７対照よりも２０倍大きい活性を有した。対照細胞株および７３−２６両方での酵素活性は、該細胞株を凍結する（１９９１年１２月１６日）直前の最初の試験で観察されたものの５〜１０倍であった（表１）。
【００６６】
４種類の新たな浮遊適合血清無含有細胞株を、図６に示すように作製した。７３−２６／Ｋ−Ｎと表示する該細胞株を、３７日間のプロセス後、低温保存した。
【００６７】
浮遊適合７３−２６のα−アミド化酵素産生
新たな７３−２６細胞株（７３−２６／Ｋ、７３−２６／Ｌ、７３−２６／Ｍ、７３−２６／Ｎ）のバンク登録細胞を解凍し、スピナーフラスコ内で培養した。該細胞株を、週に３回Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０１培地中で継代することにより維持した。定期的に培地を完全に交換し、酵素産生性の２４時間評価をα−ＡＥアッセイによって評価した。細胞株は、８０日間まで培養状態で維持した。以前の細胞株Ｂ３／Ａ１−７の半連続的バッチプロセスは４０日間プロセスであり、該細胞株の産生安定性を評価するため、この手順の長さの２倍を選択した。この研究のデータを表３に示す。この研究過程において、細胞株７３−２６／Ｌは第２２日〜第４０日の間で終わったが、他のすべての細胞株は、８０日の期間の最後まで活発に培養された。
【００６８】
【表３】
2011139714.tif 000005
【００６９】
すべての細胞株が、初期の期間ではＢ３／Ａ１−７よりも有意に多くのα−アミド化酵素を発現したが（＜４０日間）、７３−２６／Ｍおよび７３−２６／Ｎのみ、７０日後もなお、大量の酵素を産生していた。８０日の期間にわたって一貫してより多くのα−アミド化酵素を産生したことから、さらなる開発のためにＵＧＬ  ７３−２６／Ｍを選択した。その他の３種類の細胞株は、８０日の試験期間の終了前に培養が終了したか、またはその産生性／細胞／日が最後の２０日間で減衰したかのいずれかであった。
【００７０】
ＣＨＯ  Ｋ１、ＵＧＬ  ７３−２６、ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＣＢおよびＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＷＣＢ００のバンク登録前での細胞バンク登録の特性化研究
特性化研究を、前駆細胞株（７３−２６）である宿主細胞株（ＣＨＯ  Ｋ１）およびＵＧＬ  ７３−２６／Ｍシードバンクにおいて行なった。４０個のバイアルのＵＧＬ  ７３−２６／Ｍシードバンクを１９９８年２月４日に調製した。シードバンクの各バイアルには、９０％Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ３０１／１０％ＤＭＳＯ中４×１０６細胞／ｍＬが含まれる。実施した研究はすべて、ＣＨＯ細胞株がＭＣＢおよびＭＷＣＢになる必要があるという結果と整合すると評価された（表４参照）。
【００７１】
マスター細胞バンクＵＧＬ７３−２６／Ｍ細胞株は、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．において作製された。１１８ＭＣＢのバイアルのいくつかを用い、該細胞株を充分に特性化した。ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＣＢのすべての研究の結果は、ＣＨＯ起源の細胞株と整合し、感染性因子について陰性である。ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＣＢのバイアルを用い、製造業者の研究用の２３８個のバイアルの細胞バンクＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＷＣＢ００が、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．において創製された。ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＷＣＢ００の研究のすべての結果は、ＣＨＯ起源の細胞株と整合し、感染性因子について陰性である。
【００７２】
【表４−１】
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【００７３】
【表４−２】
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【００７４】
【表４−３】
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【００７５】
スピナーフラスコおよび攪拌槽バイオリアクターにおけるＵＧＬ  ７３−２６／Ｍのプロセスの開発研究
予備実験では、該細胞株の産生性が多数の生成では一貫して維持され得ないことが示されたため、バッチ発酵プロトコルを検討した。また、バッチプロトコルは、計画の容易さ、易拡張可能性および劇的なバッチ不成功の結果が少ないという利点を提供する。ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの発酵プロセスの開発には、該細胞株の細胞内産生性に影響し得るいくつかのパラメータを検討する必要がある。以下に詳述する発酵開発は、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨおよび培地補充を検討する主要な研究を示す。研究されなかった発酵パラメータは、インペラーのＲＰＭおよび発酵温度であった。
【００７６】
α−アミド化酵素発現に対する溶存酸素の効果
スピナーフラスコ内のＣＨＯ培養培地の溶存酸素濃度の効果を調べるための実験を行なった。スピナーフラスコには０．１×１０６細胞／ｍＬを播種した。２つのスピナーフラスコは、２５０ｍＬＴｅｃｈｎｅスピナーフラスコ内に１５０ｍＬの培地を入れ、一方、第３のスピナーフラスコには２５０ｍＬの培地を入れた。すべてのスピナーフラスコにおいて溶存酸素を毎日測定した。α−ＡＥアッセイによるα−ＡＥ産生性の評価のため、清澄ならし培地のアリコートを毎日採取した。この研究では、低タンパク質ＣＨＯ培地（Ｃ１７０７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびタンパク質無含有ＣＨＯ培地（Ｃ５４６７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の２種類の培養培地を使用した。この２種類の培地中で培養したＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの直接比較を図７に示す。２つの培養物中の溶存酸素レベルは著しく異なった。１５０ｍＬのＣ１７０７中で培養した細胞は、等容量のＣ５４６７培養培地中で培養した細胞よりも、産生された全酵素／ｍＬが少なかった。両培地の初期の溶存酸素濃度は約８０％ＤＯで同じであったが、Ｃ５４６７培地の培養物の溶存酸素濃度は、絶対に５０％未満にならなかった。Ｃ１７０７培養物のＤＯ含量は、第９日までに５０％未満となり、該培養物のピーク活性は２日後であった。これらのデータは、ＤＯ含量／細胞バイアビリティ／α−ＡＥ産生性間に相関性が存在し得ることを示す。
【００７７】
また、スピナーフラスコの容積も潜在的臨界パラメータとして検討した。スピナーフラスコは一定溶存酸素濃度に維持されないため、培養物が溶存酸素を維持する能力は、培養物の表面：容量比に対し相対的である。スピナーフラスコの培養容積を増大させると、明らかに表面：容積比は変化する。一方のスピナーフラスコの培養容積を１５０ｍＬ（５４６７ｓ）とし、他方を２５０ｍＬ（５４６７ｓａ）とした以外は、同一の培養物で開始した。％ＤＯおよびα−ＡＥ産生性に対する表面：容積比の変化の効果を図８に示す。
【００７８】
図８に示すデータは、培養物の産生性が溶存Ｏ２によって大きく影響されることを示す。溶存Ｏ２濃度の減少が、培養物による利用のためであれ、表面：容積比の差による効果のためであれ、ＤＯ濃度が５０％未満の場合、培養物は４８〜７２時間以内に、より多くのα−アミド化酵素を発現するのを停止する。細胞が最も良好に産生性である培養期に溶存酸素濃度を反映させるためには、バイオリアクター内の溶存Ｏ２を７０％に維持するのがよい。
【００７９】
α−アミド化酵素発現に対する培地の効果
ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの培養培地の最も適切な選択肢の選択を容易にするために設計された研究、またはバイオリアクターの培養条件を規定する際の研究のいずれかの一部として、２種類のＣＨＯ培養培地Ｃ１７０７およびＣ５４６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて数多くの攪拌培養を開始した。両培養培地は規定されたものであり、Ｃ１７０７は、トランスフェリンが添加された低タンパク質培地であり、Ｃ５４６７は非動物タンパク質培地である。培地はともに、購入時に、終濃度２ｍＭまでＬ−グルタミンを添加する必要があった。以下の表５に、２つの培地のいずれかを用いたスピナーフラスコの多数のサンプリングのデータを示す。
【００８０】
【表５】
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【００８１】
表５のデータでは、いずれかの培地におけるＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ細胞株の酵素産生性の実質的な差は示されていない。Ｓｉｇｍａ  ＣＨＯ培養培地であるＣ５４６７は、動物由来の培地成分を含有しないため、米国および欧州連合の両方において、将来的な規制的ガイドラインに関して、より規制に準拠する培地の選択肢であり得る。Ｓｉｇｍａ  ＣＨＯ培養培地であるＣ５４６７は、将来的な研究のための培地の選択肢である。
【００８２】
α−アミド化酵素発現に対するグルコースの効果
ＵＧＬ７３−２６／Ｍのバッチ培養物の栄養状態を検討する研究により、培養開始の４〜５日後、培地中のグルコース濃度は、未使用培地のほぼ５０％（２ｇ／Ｌ）であることが明らかになった。酵素産生性に対するグルコース補充の効果の徹底的な研究を、さらなるグルコースを培養物に添加する一連のスピナーフラスコ実験として行なった。スピナーフラスコには、２ｇ／Ｌのグルコースを１〜３回、特定の時間間隔で補充した。α−ＡＥ産生性に対するグルコース添加の効果を表６に示す。
【００８３】
【表６】
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【００８４】
【表７】
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【００８５】
ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍのバッチ培養物へのグルコースの添加により、培養物の最大産生性は、グルコース添加計画に応じて５０〜１００％増大した。第５、１０および１５日目にグルコースを補充したスピナーフラスコでは、非補充対照と比べ、最も多くの酵素が発現されるようである。これらの培養物の平均相対産生性は対照の１９５％であった。他の補充培養物では、３回補充のものよりほんのわずか産生性が低かった（１４３〜１６４％）。さらなるグルコースを補充した培養物はすべて、培地中でのピーク酵素濃度の遅延を示した。ピーク酵素濃度は、グルコース補充培養物では第１７／１８日目に観察されたのに対し、対照の非補充培養物では第１３日目であった（表７）。
【００８６】
α−アミド化酵素発現に対するｐＨの効果
ならし培地のｐＨは攪拌槽バイオリアクターでは制御され得るが、スピナーフラスコにおいては対処され得ないプロセス変量の１つである。スピナーフラスコでは、培地成分が消費されるにつれて、および細胞の副生成物が産生されるにつれて、培養物のｐＨは低下する。１５０ｍＬ（５４６７ｓ）または２５０ｍＬ（５４６７ｓａ）のいずれかの容積のＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの２つの２５０ｍＬスピナーフラスコのｐＨプロフィールを、以下に図９に示す。培養物のｐＨは、バッチの前半では低下し、次いで培養の後半では上昇した。ｐＨの低下は、おそらく、培養前半での培養物中の乳酸濃度の増大によるものである。培養の最後でのｐＨの上昇は、細胞が該乳酸を炭素供給源として異化することによるものである。培養物の産生性はｐＨの低下に影響されない（図８）。
【００８７】
いくつかの（ｎ＝５）６〜１０Ｌ攪拌槽バイオリアクターは、スピナーフラスコ内の条件を模倣し、ｐＨ制御なしで実行した。攪拌槽バイオリアクター内のＣＨＯ細胞をＣ５４６７培地中で、７０％ＤＯおよび３７℃にて培養した。バイオリアクター内のならし培地の平均ｐＨプロフィールは、２つのスピナーフラスコで観察されたものと同様である（図１０）。バイオリアクター内で溶存酸素濃度は７０％に、温度は３７℃に維持した。
【００８８】
バイオリアクターを上記のようにｐＨ制御なしで実行させたことに加え、一連のバイオリアクターは、該バイオリアクターのｐＨが設定ｐＨ点（７．０〜７．４）に自由になるように実行した。所望のｐＨに達した時点で、これをそのｐＨに発酵の持続期間、維持した。攪拌槽バイオリアクター内のＣＨＯ細胞をＣ５４６７培地中で、７０％ＤＯおよび３７℃にて培養した。攪拌槽バイオリアクター内でのα−ＡＥ産生性に対するｐＨ制御の維持の効果を図１１に示す。
【００８９】
図１１は、ｐＨ設定点を開始しなかった場合、それらの実行に対する実行の間、各日のバイオリアクターにおける平均α−ＡＥ活性を示す。ｐＨが設定点の０．５ｐＨ単位以内になった後でのみｐＨ設定点を設定した場合の個々の実行のデータもまた図１１に示す。培養ｐＨと酵素活性と間に明白な相関性がある。ｐＨ設定点なしで実行させたバイオリアクターの活性プロフィールは、培養の最初の１６日間のすべての実行について優れている。唯一の例外は、ｐＨ設定点が７．１である場合の実行に対するプロフィールであった。この差は、おそらく、培養を、その他の実行よりも長く持続させたためであった。平均ｐＨ設定点なしの研究でのピークα−ＡＥ活性は、第１６日目で２８０，７０７単位／ｍＬであった。
【００９０】
生細胞密度に対するｐＨの効果はなかった（データ示さず）。培養物は、１．０〜１．５×１０６細胞／ｍＬのピーク生細胞密度まで培養させた。最大細胞密度は、バイオリアクターにイノキュレートしてから８〜１０日後に達成された。ｐＨ７．１で実行させた１つの培養物以外は、細胞バイアビリティに対するｐＨの影響はなかった（データ示さず）。細胞培養物のバイアビリティは、１５日以上培養した場合で５０％生細胞より大きかった。７．１のｐＨ設定点で実行させた１つのバイオリアクターでは、２０日間の培養で＞５０％生細胞が維持された。
【００９１】
研究開発したＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの発酵パラメータの概要
α−ＡＥ発現細胞株ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍの確立後、α−アミド化酵素の至適発現のための臨界パラメータを規定するために一連の実験を行なった。動物タンパク質無含有培地（Ｓｉｇｍａ，Ｃ５４６７）では、該酵素の高レベルの発現が支持されることが測定された。ＣＨＯ細胞は、Ｌ−グルタミンを終濃度２ｍＭで補充したＣ５４６７培地中で、バッチ培養物として培養され得る。しかしながら、該培養物は、その産生性をさらに促進するためには、Ｄ−グルコース補充を必要とする。至適グルコース補充は、第５、１０および１５日目で２ｇ／Ｌであった。バイオリアクターのＤＯ濃度は７０％に維持するのがよく、バイオリアクターのｐＨは、培地の緩衝能とＣＨＯ細胞による培地成分の代謝の関数となるｐＨに調整されるようにするのがよい。
【００９２】
下流精製の開発ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ
以下の節に、本発明者らが開発した、ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍクローンを用いて産生されたＰＡＭの下流精製についてまとめる。代表的な実験のみ（該プロセスの開発作業の論理的な進行を示す）をこの概要に含める。各工程の簡単な説明を示すが、これは、精製プロセスにおけるその工程の機能の記載である。精製実行は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（一定タンパク質および一定単位）、ＰＡＭ活性アッセイならびにＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いて解析した。実験はすべて、Ｂｏｏｎｔｏｎ，ＮＪ試験施設に技術移転する前または直後に完了した。本明細書に記載の方法を用い、ＰＡＭバッチ１３３０−Ｄ−１００３、１３３０−Ｄ−１００４、１３３０−Ｄ−１００５、１３３０−Ｄ−１００６、１３３０−１００９および１３３０−１０１０を製造した。
【００９３】
第１のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ１）
工程の説明：ＴＦＦ１工程を用い、クロマトグラフィーの前にＣＨＯ細胞ならし培地の濃縮およびダイアフィルトレーションを行なう。ならし培地を濃縮し、ダイアフィルトレーションによって導電率を低下させ、陰イオン交換カラムへの結合を助長する。ＴＦＦ１工程では、再生セルロースＰＬＣＴＫ  ３０ｋＤａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を取り付けたＰｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｍｏｄｕｌｅを使用する。
【００９４】
研究開発：この工程の最初の検討では、ＴＦＦがクロマトグラフィーの前に必要とされ得るか否かに着目した。水での希釈によるＣＨＯならし培地の導電率の低下を、ＴＦＦの代替法として検討した。クロマトグラフィーの前にならし培地を希釈しないと、充填後、ＰＡＭ活性の大部分が通過画分中に存在した。ならし培地の導電率をほぼ５ｍＳまで低下させると、通過画分中に検出されるＰＡＭ活性の量は最小限になった。しかしながら、ならし培地を陰イオン交換カラムに直接充填すると、２つの問題が確認された。一部の培地成分が不可逆的にカラムに結合し、樹脂がひどく変色した。勾配溶出後、大きなＵＶ吸光度特性を示す別の培地成分が、ＰＡＭ活性とともに共溶出された。
【００９５】
ＣＨＯ細胞ならし培地（Ｃ５４６７）を水で希釈し、導電率をほぼ５ｍＳまで低下させ、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に直接充填した。カラムを、１００％Ａ（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０））から６８％Ｂ（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、４７５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０））までの６０分かけた直線勾配にかけた。充填直後、大きな暗色のバンドがカラム上部に出現し、クロマトグラフィー実行中、残存した。カラムを２Ｍ  ＮａＣｌで清浄にし、１．０Ｍ  ＮａＯＨで殺菌した。清浄手順および殺菌手順を行なっても、暗色バンドはカラムから除去されなかった。続いて、カラムは、より厳しい清浄手順を行なった。カラムを、以下の一連の清浄試薬：０．５Ｍ  ＮａＯＨ  １Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ酢酸、０．１Ｍ酢酸  １Ｍ  ＮａＣｌおよび７０％エタノールにさらした。試験したいずれの条件でも暗色バンドはカラム（ＮＥＧ：００１：２２５−２４５）から除去されなかった。着色バンドは、未使用Ｃ５４６７培地中に存在する一成分のアウリントリカルボン酸であると同定された。ＴＲＩＳでｐＨ８．０まで緩衝化したアウリントリカルボン酸の６ｍｇ／Ｌの溶液（培地濃度）を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースＦＦカラムに直接充填した。充填直後、着色バンドがカラム上部に出現した。このカラムは、上記と同じ勾配溶出および清浄手順を行なった。アウリントリカルボン酸は、実行中、陰イオン交換カラムに結合したまま残存した（ＮＥＧ：００１：２７６−２９０）。アウリントリカルボン酸は、ｐＨ８．０において、水溶液中で容易に重合し、高電荷密度で巨大分子をもたらす。負の電荷を有する巨大分子は、明らかに、ＤＮＡとそっくりに陰イオン交換カラムに不可逆的に結合する。この物質をカラムに反復的に適用すると、おそらく充填容量が減少し、したがって、カラム全体の寿命に負の影響を及ぼす。
【００９６】
第２の培地成分は、ＰＡＭとともに共溶出することがわかった。非ならし培地または未使用培地を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースＦＦカラムに直接充填した。このカラムを再度、上記と同じ勾配溶出条件に供した。該酵素が典型的に溶出される領域に大きなＵＶピークが観察された（ＮＥＧ：００１：２４８−２５７）。ならし培地から精製したピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、該物質は、低分子量タンパク質または非タンパク質性培地成分のいずれかであることが明らかとなった（ＮＥＧ：００１：２２５−２４５）。Ｃ５４６７培地はタンパク質水解生成物を含有し、これは、該酵素のピークと一致する最大ＵＶピークの説明となり得る。両方の培地成分であるアウリントリカルボン酸および非同定ＵＶピークは、クロマトグラフィーの前にＴＦＦによって有効に除去される。該酵素は３０ｋＤａ膜によって保持され（貯留物）、低分子量培地成分はフィルターを通過する（透過物）。
【００９７】
再生セルロースＰＬＣＴＫ  ３０ｋＤａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を取り付けたＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ装置を用い、ならし培地を１０倍に濃縮してダイアフィルトレーションを行なった。該物質は、４〜５容量の２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．０００５％ＴＸ−１００（ｐＨ７．０）を用いて、最終導電率ほぼ３ｍＳまでダイアフィルトレーションを行なった。該物質を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースＦＦカラムに充填した。このカラムは上記のような勾配溶出が行なわれた。樹脂の変色は観察されず、該酵素と共溶出される最大ＵＶピークは存在しなかった。得られた酵素ピークの回収％および比活性を、それぞれ４７％および２．１×１０６Ｕ／ｍｇとなるまで測定した（ＮＥＧ：００４：２６３−２８３）。
【００９８】
ＴＦＦ工程の種々の段階における酵素安定性を検討した。ならし培地は、最初に、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ７．０）でダイアフィルトレーションを行なった後、５倍濃縮した。ダイアフィルトレーションおよび濃縮で得られた試料を、活性の低下および分解について解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは分解は観察されず、酵素活性のほぼ９５％が回収された（ＮＥＧ：００８：２４５−２５１）。
【００９９】
陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ）
工程の説明：陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー工程により、ＣＨＯ細胞ならし培地からのＰＡＭの全体精製が提供される。該工程では、主に、高分子量タンパク質が除去される。しかしながら、例えば、該酵素の切断型形態などの一部の低分子量タンパク質もまた除去される。該クロマトグラフィー工程では、定常的に、該酵素２〜３倍の精製がもたらされる。活性酵素の回収％は、典型的には５０〜７５％である。ＣＨＯ細胞の発酵後、供給原料流中に存在し得るＤＮＡは、該プロセスのこの段階で有効に除去される。
【０１００】
研究開発：Ｑ−セファロースＦＦ工程の開発前に、本発明者らは、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーを用いてＰＡＭの精製を簡単に検討した。ＣＥＸクロマトグラフィーの使用は、最初にＴＦＦ工程を伴って、またはなしで検討した。精製は、ＳＰ５５０Ｃ（ＴｏｓｏＨａａｓ）カラムにおいて行ない、ｐＨ５．０〜６．０の移動相を使用した。各場合において、分離および回収の結果は不充分であり、充填後、酵素活性の大部分は通過画分中に確認された（ＮＥＧ：００４：００６−０２９およびＮＥＧ：００４：１０２−１１９）。結合を助長するための移動相のｐＨの低下は、低ｐＨでの該酵素の安定性の欠如の可能性のため、考慮しなかった。この点で、ＣＥＸクロマトグラフィーは却下した。
【０１０１】
勾配溶出を用いた一連のＡＥＸクロマトグラフィー実行をＱ−セファロースＦＦカラムにおいて検討した。Ｑ−セファロースＦＦ精製はすべて、（１．１×１３．７ｃｍ）カラムにおいて行ない、１８０ｃｍ／時で実行した。精製開発の初期において、新鮮ならし培地の入手可能性は限定的であり、したがって、これらの実験の多くは、凍結／解凍材料で行なった。ならし培地をＴＦＦによって濃縮／ダイアフィルトレーションし、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたカラムに充填した。このカラムを、１００％Ａ（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０））から６８％Ｂ（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、４７５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０））までの６０分かけた塩直線勾配にかけた。ｐＨ７．０またはｐＨ８．５のいずれかのＨＥＰＥＳバッファーを用いた同様の勾配実行もまた検討した。概して、この勾配実行では、ほとんど精製はもたらされず、酵素比活性は不充分な結果となった（ＮＥＧ：００４−１３９−１５６、ＮＥＧ：００５：１１９−１３２、ＮＥＧ：００９：００９−０２２およびＮＥＧ：００９：０２４−０３８）。多くの場合で、酵素活性は、おそらく差示的なグリコシル化の結果として、この勾配全体において散在的であった。
【０１０２】
開発を継続している際、逐次塩工程を用いた段階的溶出方法を、Ｑ−セファロースＦＦカラムにおいて検討した。濃縮／ダイアフィルトレーションを行なったならし培地を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースカラムに充填した。このカラムは、１７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２２５ｍＭ  ＮａＣｌおよび２７５ｍＭ  ＮａＣｌでの逐次段階的溶出が行なわれた。酵素活性は、１７５ｍＭと２２５ｍＭの間の塩工程で等しく分布し、全体回収％ｏはほぼ４１％であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析により、１７５ｍＭおよび２２５ｍＭ両方のＮａＣｌ画分において７５ｋＤａの酵素の存在が明らかとなった（ＮＥＧ：００５：１９８−２１１）。両方の塩工程での酵素活性は、グリコシル化の差またはおそらく活性を保持している該酵素の切断型形態によるものであり得る。
【０１０３】
スピナーフラスコ実行または１０Ｌバイオリアクター実行のいずれかの新鮮なならし培地を、残りの陰イオン交換実験に使用した。スピナーフラスコからのＣＨＯならし培地０００２０Ｓ３をＴＦＦにさらし、次いで、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースＦＦ上に充填した。酵素をカラムから、１回の塩工程、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で溶出させた。回収されたピークの回収％および比活性の値は、それぞれ３４％および１．９×１０６Ｕ／ｍｇであった（ＮＥＧ：００８：０２１−０３３）。同様に、１０ＬバイオリアクターからのＣＨＯならし培地（０００２１ＢＲ、第１４日）をＴＦＦにさらし、１回の２２５ｍＭ  ＮａＣｌ工程を用いてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で精製した。この実行での回収％および比活性の値は、それぞれ３７％および２．３×１０６Ｕ／ｍｇであった（ＮＥＧ：００８：０６５−０７５）。
【０１０４】
また、ＨＥＰＥＳ移動相を用いた段階的溶出を、活性酵素の回収を改善する取り組みにおいて検討した。２連の精製実行を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）を溶出バッファーとして用いて行なった。１０Ｌバイオリアクター実行（Ｂｏｏｎｔｏｎパイロット施設、実行番号１、第１５日）からのＣＨＯならし培地を、これらの精製実行のための投入物質として使用した。両方の精製実行での回収％および比活性は、それぞれ、ほぼ６０％および３．０×１０６Ｕ／ｍｇであった（ＮＥＧ：００８：２６３−２８８）。ＨＥＰＥＳ移動相の使用により、酵素の回収％および純度が明らかに改善された。
【０１０５】
Ｑ−セファロースＦＦ精製に対する細胞バイアビリティの効果を検討した。１０Ｌバイオリアクター実行から、第１４日および第２１日に収集したＣＨＯならし培地（ＢＯＯｌＯｌ）の精製を比較した。第１４日および第２１日における細胞バイアビリティを測定し、それぞれ９５％および４８％であると決定された。第１４日および第２１日のＣＨＯならし培地は、ＴＦＦ、および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）を段階的溶出バッファーとして用いたＱ−セファロースＦＦ精製が行なわれた。第１４日の物質の精製では、４９％の回収および２．１５×１０６Ｕ／ｍｇの比活性がもたらされたが、第２１日での実行では、４０％の回収および２．１×１０６Ｕ／ｍｇがもたらされた（ＮＥＧ：００９：１１４−１２５およびＮＥＧ：００９：１４９−１６６）。また、１０Ｌバイオリアクター実行からの第１２日および第１５日のＣＨＯならし培地（００１０７ＢＲ）を用いた精製も行なった。第１２日および第１５日での細胞バイアビリティを測定し、それぞれ８６％および８０％であると決定された。各場合において、酵素はＱ−セファロースＦＦカラムから、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）を用いて溶出した。第１２日の物質では、６２％の回収および１．９×１０６Ｕ／ｍｇの比活性がもたらされたが、第１５日の物質では、５４％の回収および４．３×１０６Ｕ／ｍｇの比活性が得られた（ＮＥＧ：００９：１９５−２０３およびＮＥＧ：００９：２２７−２３６）。細胞バイアビリティは、ＡＥＸクロマトグラフィー後の全体的な回収％または酵素比活性に対して有意な影響を及ぼさないようであった。
【０１０６】
実用範囲を確立するため、Ｑ−セファロースＦＦクロマトグラフィーの臨界パラメータを特定し、検討した。該精製手順に取り組むために設計した計画を規定し、酵素の回収および純度に対する影響を調べるために検討した。２通りのＱ−セファロースＦＦ精製実行を、異なる段階的溶出バッファー、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ７．８）または５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．２）（低ｐＨ／高塩濃度および高ｐＨ／低塩濃度）のいずれかを用いて比較した。これらの実験の論理的説明は、実用範囲を規定するためにクロマトグラフィーを極端な溶出条件に供することであった。１０Ｌバイオリアクター実行からのＴＦＦ処理したＣＨＯならし培地（２１３２−Ｄ−１００４）を、精製のための投入物質として使用した。低ｐＨ／高塩濃度の計画では、ならし培地を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ７．８）で平衡化させたカラムに充填した。酵素をカラムから、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ７．８）で溶出した。酵素の回収％および比活性の値は、それぞれ６６％および２．０×１０６Ｕ／ｍｇであった（ＮＥＧ：０１０：１５１−１６１）。高ｐＨ／低塩濃度の計画でのならし培地は、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．２）で平衡化させたカラムに充填し、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．２）で溶出した。この場合の回収％および酵素比活性は、それぞれ６６％および２．４×１０６Ｕ／ｍｇであった（ＮＥＧ：０１０：１４０−１５０）。これらのデータに基づき、Ｑ−セファロースＦＦカラムは［７．８〜８．２］のｐＨ範囲で実行され得、溶出バッファー中の塩化ナトリウム濃度は［２００ｍＭ〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ］の間で種々であり得る。
【０１０７】
３０Ｌバイオリアクター実行に精製規模拡大するのを補助するため、Ｑ−セファロースＦＦカラムの実用容量を確立した。カラムの実用容量は、２つの様式：［酵素単位／ｍＬ樹脂］および［ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂］で規定した。この実験の大きな進歩は、通過画分および洗浄工程で確認される酵素活性が合計で≧１０％である規定された。ＴＦＦにさらされたＣＨＯならし培地（１００ｍＬ）（２１３２−Ｄ−１００２）を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースＦＦカラムに充填した。ならし培地の酵素活性およびタンパク質濃度は、それぞれ１．９７×１０６Ｕ／ｍＬおよび２．４１ｍｇ／ｍＬであると決定された。ＡＥＸカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖａｎｔａｇｅ−Ｌ、１．１×１３．７ｃｍ）を、線速度１８０ｃｍ／時で実行した。５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で、段階的溶出を行なった。１％未満の総酵素活性が、カラム通過画分および洗浄工程において確認された。ほぼ５１％の酵素単位がメインピークで回収された。１３．０ｍＬのカラム容積に対し、実用容量は、［１．５１×１０７Ｕ／ｍＬ樹脂］または［１８．５ｍｇのタンパク質／ｍＬ樹脂］のいずれかであると算出された（ＮＥＧ：０１０：０８１−０９２）。Ｑ−セファロースＦＦ工程の真の充填容量を決定するため、さらなる実験を計画している。
【０１０８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（フェニル−セファロースＦＦ、低置換）
工程の説明：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程により、ＡＥＸ工程後に残留するタンパク質不純物の大部分が除去され、さらに２倍の精製がもたらされる。ＨＩＣ後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、少量の低分子量不純物を伴うのメジャーバンドが明らかになった。典型的には、ＨＩＣ後の活性酵素の回収％は５０〜７５％である。
【０１０９】
研究開発：Ｂ３／Ａ１−７クローンから産生されるＰＡＭのために開発した精製プロセスでもＨＩＣを用いた。リガンド−タンパク質相互作用促進するため、硫酸アンモニウムを含有する移動相を使用した。硫酸アンモニウムを含有するバッファーへの酵素の長期間の曝露により、予測不可能な沈殿および酵素変性がもたらされた。これらの問題を最小限に抑える試みにおいて、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズで他の塩、例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを検討した。
【０１１０】
塩化ナトリウムを含有する移動相を用いた逆直線勾配を、最初に検討した。これらのクロマトグラフィー研究の投入物質は、ＴＦＦ１で得られたものまたはＱ−セファロースＦＦで得られたもののいずれかとした。最初のＴＦＦ工程後の直接ＨＩＣを、ＡＥＸ工程を排除する試みにおいて検討した。典型的には、酵素を等容量の水で、その後、等容量の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、４Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で希釈した。塩添加前の水での希釈により、タンパク質濃度が減少し、「塩析」によって引き起こされる沈殿の可能性が最小限になる。希釈した物質を、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化させたフェニル−セファロースＦＦカラムに充填した。酵素をカラムから、１００％Ａ（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２．０Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））から１００％Ｂ（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０））までの逆直線勾配で、６８分間にわたって溶出した。概して、活性酵素の回収％はほぼ５０％であった（ＮＥＧ：００５：１７０−１８５およびＮＥＧ：００５：２１２−２２６）。
【０１１１】
また、塩化ナトリウム移動相を用いた段階的溶出方法も検討した。ＴＦＦ１またはＱ−セファロースＦＦクロマトグラフィーのいずれかにかけられた酵素を、等容量の水で、その後、等容量の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ５４Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で希釈した。希釈した物質を、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化させたＨＩＣカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄した後、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１．０Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄した。酵素をカラムから、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で溶出した。活性酵素の収率は相当であったが、なされた精製はほんのわずかであった（ＮＥＧ：００８：０３４−０４６およびＮＥＧ：００８：１３５−１４８）。塩化ナトリウムの使用は、硫酸アンモニウムの場合のように「塩析」を引き起こさないようであったが、高濃度の塩化ナトリウムにおいて、酵素が経時的に変性した。
【０１１２】
クエン酸ナトリウムは、比較的低濃度でＨＩＣカラムへの酵素の結合を促進することがわかった。ＴＦＦにさらされたＣＨＯならし培地を等容量の水で、その後、等容量の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１．０Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈し、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．５Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化させたフェニル−セファロースＦＦカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、１０ｍＭ
ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）でストリッピングした。酵素活性は、カラム通過画分または洗浄画分のいずれにおいても確認されなかった。ほぼ５０％の酵素活性が１０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）画分において確認された（ＮＥＧ：００５：０６４−０７６）。この実験を、より低い終濃度のクエン酸ナトリウムを用いて繰り返した。この低塩濃度では、酵素を等容量の水で、その後、等容量の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈した後、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化させた  ＨＩＣカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）でストリッピングした。結果は、本質的に先の実行と同一であり、活性は、通過画分または洗浄画分のいずれにおいても確認されなかった（ＮＥＧ：００８：２０３−２１３）。
【０１１３】
段階的溶出方法の開発を補助するため、クエン酸ナトリウムバッファー系を用いた勾配溶出を検討した。ＴＦＦで得られたものを等容量の水で、その後、等容量の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈した後、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で平衡化させたカラムに充填した。このカラムを１００％Ａ（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））から１００％Ｂ（１０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０））までの７０分間かけて逆直線勾配にかけた。酵素活性のピークは該勾配の最後付近で確認された。他のタンパク質不純物がこの勾配領域で溶出されたとともに、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）カラムストリップ中にまで拡張された（ＮＥＧ：００８：２５２−２６２）。１０ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）ストリップ中に溶出される酵素とタンパク質のより良好な分離を達成するため、段階的溶出を検討した。
【０１１４】
Ｑ−セファロースＦＦ精製（１０Ｌバイオリアクター実行、００１０７ＢＲ、第１２日）からのピーク画分（２２５ｍＭ  ＮａＣｌ）を、等容量の水で、その後、等容量の５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、６００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈した。希釈した物質を、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化させたフェニル−セファロースカラムに充填した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄した後、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）での第２の洗浄を行ない、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）でストリッピングした。酵素活性はすべて、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム画分において確認された。回収％および比活性は、それぞれ４２％および２．０×１０６Ｕ／ｍｇであると算出された（ＮＥＧ：００９：２０４−２１８）。酵素と他のタンパク質不純物との良好な分離は、この方法を用いて達成された。
【０１１５】
ＴＦＦ直後のＨＩＣ（ＡＥＸ工程なし）は、この工程では粗製供給物質流からＤＮＡを排除する効果がないため、却下した。４回のＨＩＣ精製を、上記に詳述した塩化ナトリウム段階的溶出方法を用いて行なった。これらの実行の投入物質は、クロマトグラフィーの前にＴＦＦにさらされたＢ３／Ａ１−７  ＣＨＯならし培地とした。このときの本発明者らのＤＮＡ内部基準は＜１０ｎｇ／ｍｇタンパク質であった。各場合において、ＨＩＣ後のメイン酵素ピーク中に存在する残留ＤＮＡレベルは該基準より６〜１０倍高く、それにより１回の工程でのＨＩＣ精製が許容され得ないことがわかった（ＮＥＧ：００６：１３７−１５９、ＮＥＧ：００６：１７６−１８７およびＮＥＧ：００６：１９２−２００）。
【０１１６】
３０Ｌ容規模拡大の取り組みを補助するため、ＨＩＣ精製工程の実用容量を検討した。大きな進歩は、カラム通過画分または洗浄画分のいずれかにおいて≧１０％の酵素活性の存在と規定された。産生実行のＱ−セファロースで得られたもの（１２５ｍＬ、０．３６８ｍｇ／ｍＬ、７１０，５６３Ｕ／ｍＬ）１３３０−Ｄ−１００３を等容量の水で、その後、等容量の５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈した。希釈した物質を、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、３００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化させたフェニル−セファロースＦＦカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖａｎｔａｇｅ−Ｌ、１．１×１５．８ｃｍ）上に充填した。このカラムを１８０ｃｍ／時で実行した。このカラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、酵素を２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で溶出した。酵素活性は、通過画分または洗浄画分のいずれにおいても確認されなかった。メインピークはほぼ７５％の酵素活性単位を含んでおり、比活性は２．６×１０６Ｕ／ｍｇであると算出された。１５．０ｍＬのカラム容積に対し、実用容量は５．９２×１０６Ｕ／ｍＬ樹脂であると算出された（ＮＥＧ：０１０：１１１−１２４）。実用容量は、ＡＥＸ後にカラムに充填されたタンパク質が極めて少なかったため、［ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂］では報告されなかった。ＨＩＣ工程の真の充填容量を決定するため、さらなる実験を計画している。
【０１１７】
ＨＩＣ単位実行のための全体の時間は水希釈を排除し、実行流速を１８０ｃｍ／時から２４０ｃｍ／時に上げることにより劇的に短縮された。クエン酸ナトリウムへの曝露時間および樹脂上で費やされる時間量を最小限に抑えることにより、最終的に、活性酵素の減少の低減が補助され得る。１３３Ｏ−Ｄ−１００３  からＱ−セファロースＦＦで得られたものを等容量の５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．６Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈し、先のバラグラフで記載したＨＩＣ段階的溶出方法を用いて精製した。メインピーク（２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））の回収％および比活性は、それぞれ７７％および２．４×１０６Ｕ／ｍｇであると算出された（ＮＥＧ：０１０：１２５−１３９）。クエン酸塩を用いた希釈中またはその後でタンパク質沈殿は観察されなかったが、「塩析」現象を回避するため、該物質はゆっくりと希釈しなければならない。
【０１１８】
ＨＩＣ方法は、実用範囲を確立するために移動相の塩濃度を変更することにより取り組んだ。回収％および酵素比活性に対する効果を、２通りの異なる精製手順を行なうことにより検討した。第１の実行では、充填および溶出中のクエン酸塩濃度を減少させ、一方、第２の実行では、充填中のクエン酸塩濃度は減少させたが、溶出バッファーのクエン酸塩濃度は増大させた。１０Ｌバイオリアクター実行からＱ−セファロースＦＦで得られたもの（１３３Ｏ−Ｄ−１００５）を、等容量の５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．５Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈し、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化させたＨＩＣカラムに充填した。このカラムを２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で洗浄した。ほぼ５１％の酵素活性が５０ｍＭのクエン酸ナトリウム画分において確認され、１％未満が通過画分および洗浄画分中に確認された。メインピークにおける酵素比活性は１．３５×１０６Ｕ／ｍｇであると算出された（ＮＥＧ：０１０：１７５−１８６）。第２のＨＩＣ実行では、Ｑ−セファロースＦＦで得られたものを、上記のようにして希釈および充填したが、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を溶出バッファーとして使用した。この場合、５０％の酵素活性が１００ｍＭクエン酸塩画分において確認され、２％未満が通過画分および洗浄画分中に確認された。１００ｍＭクエン酸塩画分における酵素比活性は２．５×１０６Ｕ／ｍｇであった（ＮＥＧ：０１０：１６３−１７４）。第１のＨＩＣ実行で観察された比活性のほうが低く、これは、溶出バッファー中のクエン酸塩濃度の減少により、通常該酵素と共溶出するストリップ中に見られるさらなるタンパク質がもたらされ、したがって最終純度が低下することを示した。対照的に、溶出バッファー中のクエン酸塩濃度の増大は純度を低下させないようであった。これらのデータに基づき、溶出バッファー中のクエン酸ナトリウムの濃度は、最終純度を損なうことなく７５〜１００ｍＭの間で変更され得る。
【０１１９】
第２のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ２）
工程の説明：ＴＦＦ２を用いて、ウイルス濾過の前に、フェニル−セファロースＦＦで得られたものの濃縮およびダイアフィルトレーションを行なう。ＨＩＣで得られたものを直接ＴＦＦにさらし、溶出バッファー（２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））中での長期保存による酵素の不活化を最小限に抑える。フェニル−セファロースＦＦで得られたものをほぼ３倍に濃縮し、ダイアフィルトレーションを行ない、ウイルス濾過に適したバッファー中に酵素を入れ、その後保存する。ＴＦＦ２工程では、再生セルロースＰＬＣＴＫ  ３０ｋＤａ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を取り付けた  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｍｏｄｕｌｅを使用する。
【０１２０】
研究開発：ＴＦＦ２手順は、最初は、Ｂ３／Ａ１−７クローンを用いて産生されるＰＡＭのために開発された。該酵素は、種々の条件下の５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０００５％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）中で安定であることが示され、この理由のため、さらなる研究開発は試みなかった。
【０１２１】
Ｃ５４６７  ＣＨＯならし培地由来のＰＡＭの代表的な小規模精製
１０Ｌバイオリアクター実行からのＣＨＯ細胞ならし培地（５００ｍＬ）の試料（００１０７ＢＲ、第１５日）を８倍に濃縮し、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）に対してダイアフィルトレーションを行なった。ＴＦＦ１で得られたもののほぼ３分の１を、上記の精製プロセスの規模縮小形態を用いて精製した（ＮＥＧ：００９：２１９−２４９）。精製データを表８にまとめる。この精製実行のこの工程収率は、比較的不充分であり、実際、ＨＩＣ工程後の酵素比活性は低下した。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、おおむねα−アミド化酵素は、ほぼ７５ｋＤａの単一のメジャーバンドに精製されることが示された（図１２、レーン１０）。ゲルおよびデンシトメトリースキャン（図１３）により、酵素の純度は高く（ほぼ純度６７％）、低分子量不純物はごく微量しか存在しないことが明白に示された。該酵素は多くの精製バッファー中で経時的に不活化され、したがって、該プロセスの実施は各工程間で遅滞なく進行させなければならない。精製プロセスにおけるばらつきは、全体収率および比活性を低下させる不活性酵素の存在に起因した。より重要なことには、精製および発酵の開発はともに同時進行させ、これにより、観察されたばらつきがある程度説明され得る。該産生規模における工程収率および比活性は、その後、おそらく該プロセスにおいて該物質をより高速で移動させ、画分を速やかにアッセイした結果、ずっと良好になることがわかった。
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
ＰＡＭ下流精製プロセスの概要
技術移転のパイロット施設に渡す情報を反映する各プロセス工程の精製手順を以下に詳述する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリースキャンを含む代表的な小規模精製実行のデータを、表８および図１１および１２に含める。
【０１２４】
ＴＦＦ１手順：清澄ＣＨＯ細胞ならし培地を５倍に濃縮し、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で、最終導電率４〜６ｍＳが達成されるまでダイアフィルトレーションを行なう。濾過中、膜貫通圧力を≦１０ｐｓｉに維持する。
【０１２５】
ＡＥＸ手順：ＴＦＦによって濃縮／ダイアフィルトレーションした清澄ＣＨＯ細胞ならし培地を、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）で平衡化させたＱ−セファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに充填する。このカラムを１８０ｃｍ／時で実行し、ＵＶ吸光度を２８０ｎｍにおいてモニターする。カラムをさらなる平衡バッファーで洗浄し、ＰＡＭをカラムから、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で溶出する。カラムを２．０Ｍ  ＮａＣｌで清浄にし、１．０Ｍ  ＮａＯＨで殺菌する。カラムは、各実行間では１０ｍＭ  ＮａＯＨ中に保存する。
【０１２６】
ＨＩＣ手順：Ｑ−セファロースで得られたものを、等容量の５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、６００ｍＭクエン酸塩（ｐＨ７．０）で希釈し、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、３００ｍＭクエン酸塩（ｐＨ７．０）で平衡化させたフェニル−セファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に充填する。カラムを２４０ｃｍ／時で実行し、ＵＶ吸光度を２８０ｎｍにおいてモニターする。カラムを２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、３００ｍＭクエン酸塩（ｐＨ７．０）で洗浄し、ＰＡＭをカラムから、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ、７５ｍＭクエン酸塩（ｐＨ７．０）で溶出する。カラムを、それぞれ２５ｍＭ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．０）および１．０Ｍ  ＮａＯＨで清浄し、殺菌する。カラムは、各実行間では１０ｍＭ  ＮａＯＨ中に保存する。
【０１２７】
ＴＦＦ２手順：フェニル−セファロースＦＦで得られたものを最初にほぼ３倍に濃縮し、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０００５％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）を用いてダイアフィルトレーションを行ない、ウイルス濾過に適した容量までさらに濃縮し、保存する。
【０１２８】
１０Ｌ攪拌槽バイオリアクタープロセス実行
α−アミド化酵素の１０Ｌ発酵および精製プロセスの概要
いくつかの１０Ｌ攪拌槽バイオリアクター実行に従って精製α−ＡＥを調製した。α−アミド化酵素を誘導するためのプロセス工程は、上記および図１４に示すように、１４日間の種菌相、１７日間の発酵相および２日間の精製スキームであった。これらの実験で使用した培養培地は、タンパク質無含有ＣＨＯ培地Ｃ５４６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。これらの実行のプロセスの詳細はすべて、適切なバッチの記録を見るとよい。
【０１２９】
プロセスフローダイアグラムである図１４は、ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍクローンを用いて産生されるα−ＡＥ／ＰＡＭのために開発した最終プロセス工程を示す。
【０１３０】
第１相−種菌
１０Ｌ攪拌槽バイオリアクター用の種菌を調製するため、ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍ  ＭＷＣＢ００のバイアルの１つを解凍した。このクリオバイアルの細胞を取り出し、新鮮培地中に入れた。細胞ペレットを新たな培地中に再懸濁し、Ｃ５４６７  ＣＨＯ培地を入れたスピナーフラスコに添加した。次の１４日間、培養物を、４００ｍＬの培地＋細胞を入れた４つのフラスコ内に増殖した（種菌スキーム図１５を参照）。
【０１３１】
培養物を、種菌相ｌ２の最後でのα−ＡＥ発現について試験した。第１２日目、平均酵素活性濃度は＞１３，０００Ｕ／ｍＬであった（表９パネルＣ参照）、培養物および細胞バイアビリティの生細胞計数を各時点で行ない、種菌培養物を修正した。培養物のバイアビリティは、概ね、この相の間で９５％よりも大きかった（表９パネルＡ参照）。種菌培養物の平均総生細胞計数は、第１４日目で２．０３×１０９であった（表９パネルＢ参照）。
【０１３２】
【表９−１】
2011139714.tif 000013
【０１３３】
【表９−２】
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【０１３４】
第２相−発酵
１０Ｌのバイオリアクターは、各種菌相の終了時に開始した。バイオリアクターに、未使用タンパク質無含有培地中１×１０５細胞／ｍＬでＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｃ５４６７）を播種した。バイオリアクターパラメータを、下記の設定点；温度＝３７℃、ＲＰＭ＝６０、ｐＨ＝維持するｐＨ設定点なしに設定し、ｐＨは流動的にし（開始時、ｐＨはｐＨ７．５より大きくならなりようにする）、ＤＯ設定点は７０％ＤＯにする。未使用培地の溶存酸素濃度は、７０％より大きくし、バイオリアクターの溶存酸素濃度は７０％まで流動的にさせ、次いで、該設定点に維持した。バイオリアクターには、第５、１０および１４日目に２ｇ／Ｌのグルコースを補充した。第１７日目にならし培地を収集した。収集物質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｃａｐ  Ｆｉｌｔｅｒに通して清澄にした。後述する最初の２つの発酵では、第１７日目ではなく第１８日目に２１３１−Ｄ−１００３および２１３１−Ｄ−１００４を収集した。培養物の最大細胞密度は第１０〜１７／１８日目の間で達成され、維持された。これらの発酵の平均最大細胞密度は１．５−１．６×１０６細胞／ｍＬであった（表１０パネルＢ）。培養物のバイアビリティは、培養の最初の１４日間で＞８０％であり、収集した日の平均バイアビリティは７６．０％であった（表１０パネルＡ）。培養物の産生性を、収集時、第１７／１８日目に評価した。平均清澄収集物は３７８，５６７単位のα−ＡＥ／ｍＬを含んでいた（表１０パネルＣ）。
【０１３５】
【表１０】
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【０１３６】
第３相−精製
該精製プロセスは、上記のような５つの異なる工程を有する。清澄収集物を濃縮し、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．００１％ＴＸ−１００（ｐＨ８．０）に対してダイアフィルトレーションした。酵素物質を平均してほぼ４倍に濃縮した（データ示さず。バッチの記録参照）。このプロセス物質をＱ−セファロースカラムに適用し、２２５ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、０．００１％Ｔｒｉｔｏｎバッファー中でのＮａＣｌ段階的勾配に従って溶出した。酵素溶液を５０ｍＭ  ＴＲＩＳ、６００ｍＭクエン酸（ｐＨ７．０）で希釈し、フェニルセファロースカラムに適用した。α−アミド化酵素をカラムから、クエン酸塩の工程勾配に従って溶出した。酵素物質を最終容量ほぼ１Ｌまで濃縮した。６つの酵素バッチのうち４つをウイルス除去フィルターに通して処理した。２つのバッチはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＮＦＰフィルターに通して処理し（１３３０−Ｄ−１００５および１３３０−Ｄ−１００６）、２つのバッチは、Ｐａｌｌ  Ｔｒｉｎｃｏｒ  ＤＶ５０フィルターに通した（１３３０−１００９および１３３０−１０１０）。各々のプロセス工程のデータを以下の表１１に示す。
【０１３７】
最初の工程ＴＦＦ１は、α−アミド化酵素活性単位の保持に関してほぼ定量的な工程であった。１０Ｌバイオリアクター実行からのＴＦＦ濃縮物は、１．６０×１０６単位／ｍｇタンパク質の平均比活性を有する（表１１）。Ｑ−セファロースクロマトグラフィーカラムに適用したＴＦＦ１濃縮物は、カラムからほぼ３Ｌで溶出された。酵素比活性は、このプロセス工程で、３．３３×１０６単位／ｍｇまでほぼ２倍に増大した。Ｑ−セファロース溶出液のタンパク質濃度および酵素活性濃度は非常に一貫していた（表１１参照）。フェニル−セファロースクロマトグラフィー後、平均酵素比活性は、３．３３×１０６から４．９６×１０６単位／ｍｇタンパク質まで増大した。フェニル−セファロース溶出液を、第２のＴＦＦ工程を用いて１Ｌまで濃縮した。この濃度工程後、比活性に変化はなかった（表１１）。一部の酵素バッチからのＴＦＦ２濃縮物を、ウイルス除去フィルターに適用した。４つのうち３つの酵素バッチの比活性が低下した（表１１）。最終精製酵素の平均比活性は、３５０，０００単位／ｍｇから４．６１×１０６単位／ｍｇタンパク質低下した。この比活性の低下は、おそらく一部の該酵素の不活化によるものであった。
【０１３８】
【表１１−１】
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【０１３９】
【表１１−２】
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【０１４０】
精製プロセスの各工程の一貫性を示すこのデータは重要である。しかしながら、本当に重要なのは、該プロセスの各工程での所望の生成物の回収パーセントである。表１２は、α−アミド化酵素精製プロセスの各工程での回収パーセント、および４回または５回のプロセス工程後のプロセス全体収率を示す。表１２は、酵素が両方のＴＦＦ工程から定量的に回収されたことを示す。クロマトグラフィー工程、Ｑ−セファロースおよびフェニルセファロースでの平均回収パーセントは、それぞれ６５．３％および７２．０％である。試験した両方のウイルス除去フィルターで約８０％のα−ＡＥ活性が回収された。ＴＦＦ２またはウイルス濾過を通した清澄回収物質の酵素精製プロセスの全体収率は、それぞれ４０．８％または３８．８％であった。
【０１４１】
【表１２】
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【０１４２】
結論
高レベルのα−ＡＥ活性を発現する安定な充分特性化されたＣＨＯ細胞株ＵＧＬ  ７３−２６／Ｍが開発された。高レベルの酵素発現は、非動物供給源の低タンパク質含有組織培養培地Ｃ５４６７（Ｓｉｇｍａ）を用いる１７日間のバッチ発酵プロセスにおいて達成される。臨界発酵パラメータ（例えば、ｐＨ、ＤＯおよびグルコース濃度など）を検討し、最適化した。また、酵素がほぼ均一に精製され得るロバストな２工程の下流精製プロセスも開発した。この発酵および精製プロセスの一貫性は、製造レベルへの規模拡大に充分適している。
【０１４３】
以下に、本発明の細胞によって発現されるＰＡＭを用いたアミド化生成物の産生を示す実施例を示す。
【０１４４】
実施例１：ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを用いたグリシン増殖副甲状腺ホルモン断片のアミド化対応物への変換
ピルビン酸塩を用いたｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨのアミド化
ｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨのアミド化に用いた成分および終濃度を表１２に示す。アミド化の簡単な説明は以下の通りである。
【０１４５】
【表１３】
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【０１４６】
・ほぼ１２．４ｇのｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨを含む１，９００ｍＬの２５ｍＭ  ＭＥＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．０）を、攪拌器およびガススパージャーを取り付けたガラス槽内に供給した。
【０１４７】
・この溶液に、以下の成分：３０２５ｍＬの水、７４１ｍＬの２５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ  ６．３、１．０３ｍＬの３ｍＭ  硫酸銅、１２４ｍＬのヨウ化カリウム、６２ｍＬの１９０プルーフエタノール、１２４ｍＬの４００ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１２４ｍＬの１００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを記載順に添加した。
【０１４８】
・反応槽を水浴中に入れ、反応混合物を２５〜２７℃まで攪拌しながら昇温させた。
・反応混合物のｐＨを２１ｍＬの２Ｍ  ＨＣｌによって５．８に調整した。酸素のスパージングを開始したが、スパージング速度は、反応混合物の過剰な起泡が回避されるように調整した。
【０１４９】
・４７ｍＬのＰＡＭを添加し、反応混合物を２５〜２７℃で４時間３５分間インキュベートした（インキュベーション期間中、酸素スパージングを行なった）。
【０１５０】
・反応混合物を７４ｍＬの２ＭのＨＣｌでｐＨ２．４に酸性化した。
この実施例で用いたＰＡＭ酵素は、上記のようにして構築し、本明細書においてＵＧＬ  ７３−２６／Ｍと表示する本発明の好ましいＣＨＯ  Ｋ１細胞から発現された。また、この細胞株を用いて上記のＡＴＣＣ寄託物を提供した。
【０１５１】
グリシン増殖前駆体は、既知の供給源から得られるものであってもよく、既知の様式で生成されたものであってもよい。例えば、これは、米国特許第６，１０３，４９５号（その実施例１〜２）に記載のものと同様の様式で発酵によって生成され、アミド化の前に米国特許第６，１０３，４９５号（その実施例３）に記載のようにして精製され得る。上記の本発明のアミド化に用いた具体的な前駆体は、係属中の米国特許出願第１１／０７６，２６０号（２００５年３月９日出願および２００５年１０月６日に公開番号ＵＳ  ２００５／０２２１４４２で公開）の細胞株によって発現させた。
【０１５２】
アミド化に使用する酵素がペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）である場合、ＰＨＭをＰＡＭに変えて、上記のものと同じ反応混合物が使用され得る。また、４〜６時間のインキュベーション期間の最後に、反応混合物のｐＨを塩基の添加によって８〜９に上昇させる。反応混合物は、反応終了前にさらに４〜８時間攪拌する。ＰＨＭは、ＰＡＭを本明細書に教示したとおりに発現させた後、ＰＨＭ触媒ドメインをＰＡＭ分子の残部から分離することにより得られ得る。あるいはまた、本明細書において使用されるベクターは、ＰＨＭの後でＰＡＬの前の触媒ドメインで翻訳が停止されるように修飾されていてもよい。あるいはまた、該ベクターは、第１の例では、上記のＰＡＭコード領域の代わりにＰＨＭコード領域を用いて構築され得る。ＰＨＭは、ＰＡＭ  のＮ末端部分のみ（最初の約４０ｋＤａ）を発現させることにより得られ得る。ＰＡＭおよびその触媒ドメインの位置は文献に報告されている。かかる任意のＰＡＭまたはＰＨＭは、本発明に従って有用であると考えられる。例えば、Ｍｉｚｕｎｏら，ＢＢＲＣ  Ｖｏｌ．１４８，Ｎｏ．２，ｐｐ．５４６−５２（１９８７）（その開示は引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。特にＭｉｚｕｎｏの「ＡＥ１」を参照のこと。カエルの皮膚は、天然状態でＰＨＭを発現することが知られている。
【０１５３】
実施例２：アミド化後精製
陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー
残留ｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨからのｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）−ＮＨ２の精製を、ＣＥＸクロマトグラフィーを用いて行なった。ＣＥＸクロマトグラフィー方法の簡単な説明は以下の通りである。アミド化で得られたものを酸性化して２５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）で平衡化させたＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ）カラム（９ｃｍ×１９ｃｍ）上に充填した。カラムを１８０ｃｍ／時で実行し、カラム流出液のＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターした。このカラムを２５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）で、カラム流出液ｐＨのｐＨが６．５に戻るまで洗浄した。このカラムを２５ｍＭ  ＭＥＳ，８０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．５）で、洗浄ピークが完全に溶出され、安定なＵＶベースラインが得られるまで洗浄した。生成物ｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）−ＮＨ２をカラムから、２５ｍＭ  ＭＥＳ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．５）で溶出した。ＵＶピークをすべて回収したが、プール基準を決定するため、画分をＲＰ−ＨＰＬＣによってスクリーニングした。
【０１５４】
逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー
ＲＰクロマトグラフィーを用い、塩形態のペプチドを塩化物から酢酸塩に交換した；ＲＰクロマトグラフィーでは、ほんのわずかのペプチド精製しかもたらされない。ＣＥＸクロマトグラフィーで得られたものを３容量の３３３ｍＭ酢酸ナトリウムで希釈し、充分混合した。混合物は、充填前に室温で７５分間放置した。酢酸塩希釈試料を、２５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化させた  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００  Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ）カラム（６ｃｍ×１７ｃｍ）上に充填した。カラムを１８０ｃｍ／時で実行し、カラム流出液のＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターした。カラムを２５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で６０分間洗浄した。カラムを０．１％酢酸中で平衡化させた。生成物ｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）−ＮＨ２をカラムから、０．１％酢酸、４０％エタノールで溶出した。ＵＶピークをすべて回収した。
【０１５５】
ｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）−ＮＨ２の特性化
ＲＰクロマトグラフィーで得られたものを濃縮し、凍結乾燥によって白色の綿毛様粉末にし、１１．８ｇ（アミド化から９５％の全体収率）のｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）−ＮＨ２を得た。ｒｈＰＴＨ（ｌ−３４）−ＮＨ２の分子質量は、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって４，１１６．９Ｄａであると決定され、これは、平均分子質量の計算値４，１１６．８Ｄａと整合した。
【０１５６】
本発明は、特別の実施形態に関して説明されており、多くの他の変形および修飾、ならびに他の使用は、当業者に明らかである。したがって、本発明は、本明細書における特異的開示、または付け加えられた特許請求の範囲に限定されない。
【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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