(57)【要約】【課題】造腫瘍性がなく、かつすべての細胞系列に分化しうる多能性幹細胞の割合を増加させた細胞集団を製造する。【解決手段】哺乳動物の分娩後胎盤組織から羊膜組織を分離する工程と、前記羊膜組織を培養し、単一細胞浮遊物からなる羊膜由来細胞を調製する工程と、前記羊膜由来細胞を抗ＡＢＣＧ１抗体、抗ＳＬＣ２１Ａ１２抗体、抗ＣＬＤＮ３抗体、抗ＳＣＮＮ１Ａ抗体、抗ＴＭＰＲＳＳ４抗体、抗ＣＬＤＮ４抗体、抗ＣＬＤＮ７抗体、抗ＥＺＲ抗体、抗ＳＴ１４抗体及び抗ＭＵＣ１８抗体からなる群から選択されるいずれか１種以上の抗体と接触させる工程と、前記抗体と結合する細胞を選択する工程と、を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の分娩後胎盤組織から羊膜を分離する工程と、
前記羊膜を培養し、単一細胞浮遊物からなる羊膜由来細胞を調製する工程と、
前記羊膜由来細胞を抗ＡＢＣＧ１抗体、抗ＳＬＣ２１Ａ１２抗体、抗ＣＬＤＮ３抗体、抗ＳＣＮＮ１Ａ抗体、抗ＴＭＰＲＳＳ４抗体、抗ＣＬＤＮ４抗体、抗ＣＬＤＮ７抗体、抗ＥＺＲ抗体、抗ＳＴ１４抗体及び抗ＭＵＣ１８抗体からなる群から選択されるいずれか１種以上の抗体と接触させる工程と、
前記抗体と結合する細胞を選択する工程と、
を含むことを特徴とする多能性幹細胞の割合を増加させた細胞集団の製造方法。
【請求項２】
前記羊膜由来細胞は、前記分娩後胎盤組織に付着した凝血塊から母体由来血清を調製し、当該母体由来血清を含む培地中にて前記羊膜及びこれより遊走してなる細胞を培養して得られる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法で製造された細胞集団であって、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の遺伝子を発現し、かつ免疫不全動物に移植したときに造腫瘍性を有さない多能性幹細胞を含む細胞集団。
【請求項４】
請求項３に記載の細胞集団を含む、移植治療用の多能性幹細胞組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の細胞集団と医薬的に許容可能な担体とを含む、細胞治療に使用するための医薬組成物。
【請求項６】
ヒト分娩後胎盤組織及びその付着物から凝血塊と羊膜とをそれぞれ単離する工程と、
前記凝血塊から母体由来血清を調製する工程と、
前記羊膜を、前記母体由来血清を含むが異種動物由来の血清を含まない培地で培養し、単一細胞浮遊物からなる羊膜由来細胞を調製する工程と
を含むことを特徴とする羊膜由来多能性幹細胞の培養方法。
【請求項７】
ヒト分娩後胎盤組織から羊膜を分離する工程と、
前記羊膜を細切りし、コラゲナーゼ処理する工程と、  
前記羊膜細片及びこれより遊走してなる細胞に保護剤を添加して凍結する工程と、
を含むことを特徴とする羊膜由来多能性幹細胞の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物胎仔由来の羊膜から羊膜由来細胞を調製し、その細胞集団の中から多能性幹細胞を単離、培養及び保存する方法並びにその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の胚盤胞期受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）より樹立された胚性幹（ＥＳ）細胞は、多分化能を持ち、すべての細胞系列に分化しうる。ＥＳ細胞を用いてインビトロで特定の細胞系列に分化誘導させる技術が開発され、細胞移植や臓器移植といった形での再生医療への応用が期待されている。また、多分化能を有するＥＳ細胞を胚盤胞期受精卵の内腔へ注入すれば、産生個体はキメラマウスを形成し、この技術を用いて特定遺伝子を欠失したノックアウトマウス等を作製することができる。
【０００３】
山中らはＥＳ細胞において高発現している４種類の遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃを体細胞に導入して過剰発現させることにより、体細胞をＥＳ様の状態に初期化しうることを見出した（例えば、特許文献１参照）。この方法により作成された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、ＥＳ細胞と同様にすべての細胞に分化誘導することができる。ｉＰＳ細胞を作製するためにレトロウイルスベクターを用いて導入された遺伝子は染色体ＤＮＡへ組み込まれて異所性発現を引き起こすため、当該ｉＰＳ細胞を用いて作成されたキメラ動物の約２０％に腫瘍形成が認められた。その後、レトロウイルスベクターに代えてアデノウイルスベクターやプラスミドベクターを用いて染色体ＤＮＡへの組換えを起こさない改良法が開発されているが、いずれも体細胞の初期化効率が低いという問題点がある。しかし、ｉＰＳ細胞は、患者自身の細胞から調製することができるため、移植の際の免疫適合性の観点でＥＳ細胞よりも有利である。
【０００４】
一方、成体幹細胞は、自発的に分化しないが適切な成長条件を適用することによって分化するように誘導することができる。しかし、成体幹細胞は、不死でなく、それらのほとんどは培養において一定数の継代を経た後にその分化能を失うという欠点を有する。羊膜組織に存在する胎仔由来の細胞から、ある種の多能性幹細胞を単離しうることが報告されている。例えば、特許文献２には、ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、ＲＴ−ＰＣＲにおいてＯｃｔ４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、ＦＧＦ４遺伝子、Ｒｅｘ１遺伝子の発現が認められ、免疫細胞染色においてビメンチン陽性及びＣＫ１９陽性であるサイドポピュレーション細胞が少なくとも神経細胞に分化可能であることが開示されている。また、特許文献３では、羊膜組織から分離した細胞を、２０％牛胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養し、単一細胞培養物からなる羊膜由来幹細胞を調製している。このようにして単離された羊膜由来幹細胞は、細胞表面マーカーとしてＣＤ２９及びＣＤ９０陽性であり、かつＣＤ４５及びＣＤ１１ｂ陰性である。また、かかる羊膜由来幹細胞は、それぞれ適切な条件下で培養することにより、神経、骨、脂肪、肝臓および心臓細胞へ分化誘導しうることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６パンフレット
【特許文献２】特開２００４−２５４６８２
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００８／００３０４２パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は自発的に様々なタイプの組織に分化する傾向があり、免疫不全マウスに注射した場合、奇形腫（テラトーマ）となり多重組織型に分化することが知られている。また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を分化誘導して作製した細胞を患者に移植する場合にも、混入する未分化細胞の存在により、ある一定の割合で腫瘍が発生する危険性がある。
【０００７】
羊膜由来幹細胞は、成体幹細胞よりも高い増殖能を維持しており、培養においてその多能性をより長く保持できるが、必ずしもすべての細胞に分化誘導できるかどうか不明である。例えば、未だ造血系の細胞に分化しうるという報告は無い。本発明は、これら従来技術の課題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであって、哺乳動物の分娩後胎盤組織から調製した羊膜由来細胞について、特定の細胞表面マーカーを用いて多能性幹細胞の割合を増加させた細胞集団を選択的に取得しうることを見出した。得られた細胞集団に含まれる細胞は、核初期化因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の各遺伝子が発現していることが免疫染色法にて確認され、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と同様にすべての体細胞に分化しうる多能性幹細胞であることが分かった。
【０００９】
すなわち、本発明の第一の視点において、哺乳動物の分娩後胎盤組織から羊膜を分離する工程と、前記羊膜を培養し、単一細胞浮遊物からなる羊膜由来細胞を調製する工程と、前記羊膜由来細胞を抗ＡＢＣＧ１抗体、抗ＳＬＣ２１Ａ１２抗体、抗ＣＬＤＮ３抗体、抗ＳＣＮＮ１Ａ抗体、抗ＴＭＰＲＳＳ４抗体、抗ＣＬＤＮ４抗体、抗ＣＬＤＮ７抗体、抗ＥＺＲ抗体、抗ＳＴ１４抗体及び抗ＭＵＣ１８抗体からなる群から選択されるいずれか１種以上の抗体と接触させる工程と、前記抗体と結合する細胞を選択する工程と、を含む多能性幹細胞の割合を増加させた細胞集団の製造方法が提供される。
【００１０】
前記羊膜由来細胞は、前記分娩後胎盤組織に付着した凝血塊から母体由来血清を調製し、当該母体由来血清を含む培地中にて前記羊膜及びこれより遊走してなる細胞を培養して得ることが好ましい。
【００１１】
本発明の他の視点において、上記方法で製造された細胞集団であって、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の遺伝子を発現し、かつ免疫不全動物に移植したときに造腫瘍性を有さない多能性幹細胞を含む細胞集団が提供される。この細胞集団は、移植治療用の多能性幹細胞組成物や細胞治療に使用するための医薬組成物として使用することができる。
【００１２】
本発明のさらに異なる視点において、ヒト分娩後胎盤組織及びその付着物から凝血塊と羊膜とをそれぞれ単離する工程と、前記凝血塊から母体由来血清を調製する工程と、前記羊膜を、前記母体由来血清を含むが異種動物由来の血清を含まない培地で培養し、単一細胞浮遊物からなる羊膜由来細胞を調製する工程と、を含む羊膜由来多能性幹細胞の培養方法が提供される。
【００１３】
さらになお異なる視点において、ヒト分娩後胎盤組織から羊膜を分離する工程と、前記羊膜を細切りし、コラゲナーゼ処理する工程と、前記羊膜細片及びこれより遊走してなる細胞に保護剤を添加して凍結する工程と、を含む羊膜由来多能性幹細胞の保存方法が提供される。なお、これらの発明の概要は、必要な特徴のすべてを列挙しているものではなく、よって、これらの特徴群の下位概念（サブコンビネーション）もまた発明になりうる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の製造方法によれば、分娩後胎盤より調製された羊膜由来細胞から簡便かつ効率よく多能性幹細胞を単離することができる。かかる方法で製造された幹細胞は、造腫瘍性を有さないため、そのままの状態で、あるいは所望の目的細胞に分化誘導した後、生体に移植することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例において、ヒト羊膜から分離、培養した細胞についてのＦＡＣＳの結果を示す図である。
【図２】ヒト羊膜初代培養細胞を抗ＡＢＣＧ１抗体で免疫染色した結果を示す図である。
【図３】ヒト羊膜初代培養細胞を抗ヒトＯｃｔ４抗体、抗ヒトＳｏｘ２抗体及び抗ヒトＫｌｆ４抗体の３種類の抗体で免疫染色した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（１）哺乳動物からの羊膜由来細胞の取得
本明細書において、「哺乳動物」とは、ヒトをはじめとする霊長類の他、ウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等を含む。
本発明にかかる羊膜由来細胞は、当該分野の技術者に公知な技術を使用することにより、上記哺乳動物の分娩後胎盤組織から容易に単離することができる。本明細書において、「分娩後胎盤組織」とは、哺乳動物の出産時に胎児とともに娩出される組織であって、羊膜、絨毛膜、胎盤葉等を含む。用語「羊膜」とは、絨毛膜とともに胎児を覆っている２つの膜のうち最も胎児に近い膜であり、その中には羊水を満たし胎児はその羊水中に浮遊している。本発明において、「羊膜」及び「羊膜組織」とは互換的に用いられる。
【００１７】
１つの実施形態として、哺乳動物の分娩後胎盤組織を、機械的処理、消化酵素を用いた処理、若しくはキレート剤を用いた処理又はそれらの組み合わせにより、羊膜から遊走する細胞を単離し、単一細胞浮遊物として取得することができる。前記キレート剤は、隣接した細胞間の結合を弱め、組織を分散させて、目に見えるほどの細胞破損なしに個々の細胞を分離させる。また、細胞同士の酵素的な分離は、組織を細かく切り刻み、みじん切りにされた組織を１つの消化酵素を単独で、又は幾つかの消化酵素を組み合わせて処理することにより達成することができる。当該消化酵素としては、例えばトリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ及び／又はヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ等が挙げられるが、これに限定されない。また、哺乳動物の胎盤組織の機械的破壊は、例えば、粉砕機、配合機、ふるい、ホモジナイザー、細胞圧縮機又は超音波処理機などを用いて行うことができる。
【００１８】
本発明において、哺乳動物の胎盤組織から羊膜由来細胞を単離する方法としては、上記消化酵素処理のうちコラゲナーゼを用いる方法がより好ましい。例えば、０．５〜５ｍｇ／ｍｌの濃度のコラゲナーゼを用いて３７℃にて３０分から数時間、好ましくは１時間程度インキュベートする。
【００１９】
このように細片化した羊膜組織及びこれを酵素処理した羊膜由来細胞については、そのまま保存剤、特に凍結保護剤を添加して凍結保存することで、長期間の安定保存が可能となる。細胞の凍結保護剤としては、細胞外凍結保護剤として知られるデキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルピロリドン等の水溶性高分子や、細胞内凍結保護剤として知られるジメチルスルホキシド、グリセロール等の低分子有機化合物等を例示することができるが、これらに限定されることなく適宜選択すればよい。また、本発明に係る凍結物の製造の際には、凍結保護剤の他に、細胞膜保護剤や栄養成分なども必要に応じて添加することができる。
【００２０】
かかる組成物の凍結保存に際しては、マイナス８０℃のディープフリーザーを用いる簡便法、あるいはプログラムフリーザーによって徐冷した後に液体窒素中に保存する方法などが挙げられる。このようにして得られた細胞凍結物は、羊膜組織をそのまま凍結した場合と比較して、長期間保存した後に融解して羊膜細胞を培養する際の細胞の生存能(viability)が、極めて高く、羊膜細胞バンクとしての保存に適している。この方法で保存された細胞凍結物は、胎児由来の多能性幹細胞を含むので、これにより、他人向けの公的細胞バンクのみならず、特に当該胎児自身やその母親向けの私的細胞バンク、又は家族向けの私的細胞バンクとして有用である。
【００２１】
（２）羊膜由来細胞の培養
上述のように単離された羊膜由来細胞は、当該技術分野で知られている公知の方法で培養することができる。具体的には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、低グルコース、Ｓｉｇｍａ）＋１０％ＦＢＳに懸濁し、培養を行うことが好ましい。また、ヒトの羊膜由来細胞を培養する場合には、ヒト分娩後胎盤組織に付着した凝血塊から母体由来血清を調製し、当該母体由来血清を含むが実質的に異種動物由来の血清を含まない培地中にて培養することが好ましい。異種動物由来の血清を含まないことにより、これらに由来するウイルス等の感染性物質の混入が防止されるとともに、遺伝的に最も近縁な個体からの血清を用いることで幹細胞組成物を本人に移植する際の免疫原性物質の混入も減少するからである。
【００２２】
（３）特定の細胞表面マーカーに対する抗体を用いる多能性幹細胞の単離、濃縮
羊膜由来細胞から幹細胞を単離する方法としては、すでにいくつかの方法が開示されている。例えば、ヘキスト３３３４２(Hoechst33342)は、ＤＮＡのＡＴ配列に取り込まれる蛍光色素で、膜透過性が高く細胞を生きたまま染色する。この色素を用いて染色した細胞集団中、相対的に染色の程度が低いものはＳＰ（サイドポピュレーション(side population）)細胞と呼ばれ、最初に血液中の造血系幹細胞が高頻度に含まれることが明らかにされた。その後、羊膜由来細胞からも同様に幹細胞が得られることが報告されている（特許文献２）。ＳＰ細胞の出現するメカニズムは、それらが発現する多剤耐性遺伝子であるＭＤＲ(multi drug resistance gene)などのある種のポンプにより色素が排出されることによる。興味深いことに、この様な性質は肝臓、腎臓、筋肉などの臓器幹細胞でも共通しており、抗体を用いないで臓器幹細胞を同定する方法に応用できる。上記方法により培養された羊膜由来細胞は、１％以下の低い頻度のＳＰ細胞しか含んでいなかった。
【００２３】
これら羊膜由来ＳＰ細胞の表面マーカーを解析すると、後述する実施例に示すように、ＡＢＣＧ１、ＳＬＣ２１Ａ１２、ＣＬＤＮ３、ＳＣＮＮ１Ａ、ＴＭＰＲＳＳ４、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ７、ＥＺＲ、ＳＴ１４、及びＭＵＣ１８遺伝子の発現が亢進しており、細胞表面及び細胞内においてこれらの遺伝子が発現している細胞が検出された。これらの遺伝子産物の中で、ＡＢＣＧ１はショウジョウバエ白色遺伝子(Drosophila White Gene)の哺乳動物相同物である。ＡＢＣＧ１のｃＤＮＡは、マウスやヒトのマクロファージ細胞株からクローニングされ、約７０ｋＤａの推定タンパク質をコードする。ヒトマクロファージでは、見かけの分子量が約６０ｋＤａと約１１０ｋＤａの２種類が報告されている。ＡＢＣＧ１はマクロファージにおいて過剰のコレステロールをＨＤＬへ輸送するための重要な役割を果たしている。そして、コリン含有リン脂質（ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン）の輸送にも関与している。細胞膜中のＡＢＣＧ１は、Ｎ末端の細胞質側ＡＴＰ結合領域ならびにＣ末端側に６回膜貫通へリックス構造を有する。ＡＢＣＧ１タンパク質は、ホモ二量体を形成して細胞膜に発現し機能する点で、１２回膜貫通構造を有し、広範囲な基質特異性を示すＭＤＲ（ＡＢＣＢ１）トランスポーターとは異なる。
【００２４】
ＳＬＣ２１Ａ１２は、イオン濃度勾配を利用して基質を輸送するトランスポーター（溶質トランスポーター）ファミリーの一員であり、ＳＬＣＯ４Ａ１(Solute carrier organic anion transporter
family member 4A1)とも呼ばれる。ヒト胎盤で発現するＳＬＣ２１Ａ１２タンパク質は、硫酸ステロイドの膜輸送に関与することが報告されている。クラウディンファミリー（ＣＬＤ３、４、７）タンパク質は、細胞接着及び密着結合の形成に直接関与する膜貫通タンパク質である。ＳＣＮＮ１Ａは、ナトリウムチャネル・非電位依存性１αと呼ばれるチャネル形成タンパク質のサブユニットである。この遺伝子の変異は、Ｉ型偽性低アルドステロ症と関連するとの報告がある。ＴＭＰＲＳＳ４は、膜結合型のセリンプロテアーゼである。ＥＺＲ（エズリン）は、細胞質側の膜表面に結合するタンパク質であって、微絨毛におけるチロシンキナーゼの基質として機能する。細胞膜とアクチン細胞骨格の中間に位置し、細胞表面構造の接着、遊走及び組織化の役割を果たす。ＳＴ１４は、上皮由来、膜内在性タンパクセリンプロテアーゼであり、他のプロテアーゼ前駆体、潜在型増殖因子を活性化する。ＭＵＣ１８は、ＭＣＡＭ(melanoma cell adhesion molecule)又はＣＤ１４６とも呼ばれる細胞表面タンパク質である。
【００２５】
従って、本発明は上記細胞表面マーカーに対して特異的親和性を有する抗体を用いて、当該マーカータンパク質が細胞膜表面に発現する細胞を分離／回収するものであり、具体的には、羊膜由来細胞を抗ＡＢＣＧ１抗体、抗ＳＬＣ２１Ａ１２抗体、抗ＣＬＤＮ３抗体、抗ＳＣＮＮ１Ａ抗体、抗ＴＭＰＲＳＳ４抗体、抗ＣＬＤＮ４抗体、抗ＣＬＤＮ７抗体、抗ＥＺＲ抗体、抗ＳＴ１４抗体、及び抗ＭＵＣ１８抗体からなる群から選択されるいずれか１種以上の抗体と接触させる工程と、前記抗体と結合する細胞を選択する工程とを含む。例えば、抗体結合ビーズを用いる方法や、親和性クロマトグラフィー、プレートのような固体マトリクスに付着させた抗体を用いるパニング法、あるいはセルソーター等を利用することができる。例えば、抗体を適当な色素や蛍光物質で標識して蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いることにより目的とする細胞を自動で分離、回収する。抗体の標識には蛍光標識二次抗体を用いてもよい。死細胞は、死細胞に関連する色素（ヨウ化プロピジウム：ＰＩ）を用いた選択によって除去することが可能である。
【００２６】
好ましい実施形態において、抗体はＡＢＣＧ１タンパク質もしくはその断片に特異的ないずれかの抗体である。本発明で用いられる抗体は、ＡＢＣＧ１タンパク質もしくはその断片に特異的に結合するのに十分な特異性を保持し、天然または組換え体のどちらか、合成または天然由来のどちらか、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらかの、いずれの抗体またはその断片も包含する。
【００２７】
その抗体を、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、クロマトグラフィー樹脂、固体支持体または薬物をはじめとする他の適切な分子および化合物とコンジュゲート（conjugate）することができる。抗体にコンジュゲートすることができる酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。抗体にコンジュゲートすることができる蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッド（Texas Red）が挙げられる。抗体にコンジュゲートすることができる金属化合物としては、フェリチン、コロイド金、そして特にコロイド状超常磁性ビーズが挙げられる。抗体にコンジュゲートすることができるハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン（oxazalone）及びニトロフェノールが挙げられる。抗体にコンジュゲートする、または組み込むことができる放射性化合物は、当該技術分野で知られており、テクネチウム９９ｍ、１２５Ｉ、ならびに限定するものではないが１４Ｃ、３Ｈ及び３５Ｓをはじめとするいずれかの放射性核種を含むアミノ酸が挙げられる。
【００２８】
ＡＢＣＧ１タンパク質をはじめとする上記細胞表面マーカー又はその断片は、哺乳動物由来であれば特に限定されないが、ヒトをはじめとする霊長類の他、ウシ、ウマ、イヌ、モルモット、マウス及びラット由来のタンパク質が好ましい。適切な抗原タンパク質を用いて、抗体又はその機能的部分を当該技術分野で知られた方法によって取得しうる。そのような方法としては、限定するものではないが、所望の特異性の細胞表面抗体を有するＢ細胞を分離すること、軽鎖および重鎖の可変領域を発現するＤＮＡをクローニングすること、ならびに適切な宿主細胞内で組換え遺伝子を発現させることが挙げられる。標準的モノクローナル抗体生成技術は、抗体が不死化された抗体産生ハイブリドーマ細胞から得られる場合に用いられることができる。これらのハイブリドーマは、上記ＡＢＣＧ１タンパク質をはじめとする細胞表面マーカー又はその断片によって動物を免疫化し、好ましくは免疫化宿主脾臓から単離されたＢリンパ球を、適合性のある不死化細胞、好ましくはＢ細胞ミエローマと融合させることによって産生することができる。
【００２９】
（４）多能性幹細胞の性質
本発明の方法により得られた細胞における遺伝子発現（例えば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」又は「定量」は、例えば、分子生物学的測定方法及び免疫学的測定方法などにより行うことができる。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイなど）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイ解析については、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ツーハイブリッドシステム、インビトロ翻訳法、ＣＡＧＥ法などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３０】
本発明の方法により製造された羊膜由来幹細胞は、ＤＮＡマイクロアレイ及び免疫染色法による遺伝子発現解析の結果、核初期化因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の少なくとも３つの遺伝子が発現していることが明らかとなった。これらの遺伝子は、細胞の分化の状態を初期化しうる転写因子をコードし、すべての細胞系列に分化しうる多能性幹細胞において特徴的に発現する遺伝子である。従って、本発明の方法により製造される羊膜由来幹細胞は、天然の多能性幹細胞であり、ｉＰＳ様の細胞であることが示唆される。
【００３１】
（５）移植治療用の多能性幹細胞組成物
本発明の方法により製造される羊膜由来多能性幹細胞集団は、移植治療用の組成物として用いることができる。移植治療とは、組織破壊を伴う疾患を予防又は治療することであり、例えば、神経疾患、呼吸器系疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化器系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患及び肺疾患等に適用できる。すなわち、本発明の羊膜由来多能性幹細胞集団は、細胞の濃縮、洗浄、回収処理が可能な機器を用いて生理食塩水で洗浄し、培養及び分離に用いた抗体やサイトカインなどを限りなく除去することが好ましい。このようにして洗浄、濃縮された幹細胞集団は、通常の点滴法で静脈中に注入するか、疾患部位に直接注入することで組織破壊を伴う疾患の予防又は治療に用いることができる。幹細胞集団の投与量としては、疾患又は組織破壊の状況によって異なるが、１回あたり１０〜１０６個の細胞を投与することが好ましい。
【００３２】
本発明は、上述の羊膜由来多能性幹細胞集団から分化誘導された細胞も提供する。分化細胞としては、特に限定されないが、例えば、骨芽細胞、神経系細胞、軟骨芽細胞、肝細胞、膵細胞、血液細胞または脳細胞などが挙げられる。神経系細胞としては、神経系前駆細胞、前記神経系前駆細胞から分化する神経幹細胞、ニューロン（例えば、運動性ニューロンもしくはドーパミン作動性ニューロン）、神経膠星状細胞、希突起神経膠細胞またはシュワン細胞などが挙げられる。さらに骨芽細胞などに分化する骨前駆細胞も挙げられる。
【００３３】
上述の羊膜由来多能性幹細胞集団から、前記のような所望の細胞に分化誘導する方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いてよい。例えば、公知の細胞分化誘導因子を用いて処理するという方法が挙げられる。前記細胞分化誘導因子としては、骨形成因子；神経栄養因子；腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）−βもしくはアクチビンなどのＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する因子；塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）または酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）などのＦＧＦスーパーファミリーに属する因子；白血病抑制因子（ＬＩＦ）などの因子が挙げられ、好ましくは骨形成因子または神経栄養因子が挙げられる。骨形成因子としては、骨形成および軟骨形成を促進させる蛋白質であるＢＭＰ−２，−４，−５，−６，−７，−８，−９，−１０，−１１，−１２などのＢＭＰファミリー、とりわけＢＭＰ−２，−４，−６，−７が挙げられる。神経栄養因子としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およびニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＮＴ−４／５などが挙げられ、好ましくはＮＧＦファミリーが挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明にかかるヒト羊膜由来多能性幹細胞集団は医薬として応用することができる。具体的には、前記羊膜由来多能性幹細胞集団を細胞または臓器再生剤として用いることが好ましい。この場合の「細胞」としては特に限定されないが、骨芽細胞、各種生理活性物質産生細胞、神経系細胞などが挙げられる。生理活性物質産生細胞としてはドーパミン産生細胞等が挙げられ、神経系細胞としては運動ニューロン等が挙げられるが、これらに限定されない。また、神経系細胞としては神経系前駆細胞；神経幹細胞；ニューロン、特にドーパミン作動性ニューロン；神経膠星状細胞；希突起神経膠細胞；またはシュワン細胞も挙げられる。
【００３５】
また、本発明にかかる羊膜由来多能性幹細胞集団から分化誘導された細胞も医薬として応用することができる。例えば、本発明にかかる羊膜由来多能性幹細胞集団を所望の組織や臓器に適合する細胞に分化誘導した場合、かかる分化誘導された細胞は、前記組織や臓器の障害を治癒もしくは緩和、または更なる悪化の予防のための医薬として用いることができる。より具体的には、本発明にかかる羊膜由来多能性幹細胞集団または前記羊膜由来多能性幹細胞集団から分化誘導された所望の組織や臓器に適合する細胞を、障害のある組織または臓器に移植することにより、前記組織または臓器を再生することができる。このように再生され得る組織または臓器としては、特に限定されないが、例えば、血管、角膜、半月板、脳組織、皮膚、皮下組織、上皮組織、骨組織もしくは筋組織等の組織；または、眼、肺、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、脾臓、小腸を含む消化管、膀胱、卵巣または精巣などの臓器が挙げられる。また前記組織としては、神経系前駆細胞；神経幹細胞；ニューロン、特に、運動性ニューロンもしくはドーパミン作動性ニューロン；神経膠星状細胞；希突起神経膠細胞またはシュワン細胞などの神経系細胞も挙げられる。特に、本発明にかかる羊膜由来多能性幹細胞集団または該羊膜由来多能性幹細胞集団から分化誘導された骨芽細胞は、骨粗鬆症の予防治療薬または骨形成薬として用いることが好ましい。また、本発明にかかる羊膜由来多能性幹細胞集団、該羊膜由来多能性幹細胞集団から分化誘導された神経系前駆細胞または該神経系前駆細胞からさらに分化誘導されたドーパミン作動性ニューロンは、パーキンソン病の予防治療薬として用いることが好ましい。
【００３６】
上記のような本発明にかかる医薬は、含有されている本発明にかかる羊膜由来多能性幹細胞集団の主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）が明示されていることが好ましい。このようにＭＨＣが明示されていれば、羊膜提供者と同一型のＭＨＣを有するレシピエントに細胞移植する際の拒絶反応を低減することができる。すなわち、本発明は、レシピエントのＭＨＣと同一型のＭＨＣを有する、哺乳動物の羊膜由来多能性幹細胞集団又は該幹細胞から分化誘導された細胞を移植することを特徴とする細胞移植時の拒絶反応が低減された治療方法を提供する。
【００３７】
上述の本発明に係る医薬は、活性成分である上記本発明に係る羊膜由来多能性幹細胞集団又は該羊膜由来多能性幹細胞集団から分化誘導された細胞そのものであってもよいが、通常、該活性成分と薬理学的に許容される担体とを自体公知の方法［製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方（例えば第１３改正）に記載の方法等］にしたがって混合することによって製造される。薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。また必要に応じて、界面活性剤、発泡剤、色素、酸味剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、矯味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００３８】
本発明に係る医薬の剤形としては、例えば注射剤（例、皮下注射剤，静脈内注射剤，筋肉内注射剤，腹腔内注射剤等）、外用剤（例、経鼻投与製剤，経皮製剤，軟膏剤等）、坐剤（例、直腸坐剤，膣坐剤等）、ペレット、点滴剤、徐放性製剤（例、徐放性マイクロカプセル等）等の非経口剤が挙げられる。本発明にかかる医薬の投与量は、医薬の剤型、治療すべき病態の種類、症状および疾患の重篤度、患者の年齢、性別もしくは体重、投与方法などにより異なるので、一概には言えないが、医師が上記の状況を総合的に判断して決定することができる。本発明にかかる医薬の投与経路は、特に限定されず、例えば、本発明にかかる医薬が注射剤の場合、例えば、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。
【００３９】
以下に、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
（１）羊膜細胞の培養方法
自然分娩のヒト羊膜を採取し、羊膜上皮と絨毛膜をはさみで細切した。この羊膜細片を２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼで３７℃、１時間処理した。コラゲナーゼ処理した羊膜細片及びこれより遊走してきた細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後フラスコに播き、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清（ＢＳＡ）を添加した培地にて１か月培養、継代した。
【００４１】
（２）ＳＰ分画および非ＳＰ分画の方法
フラスコの接着面ほぼいっぱいに広がった細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Invitrogen）で３７℃、１０分間処理し細胞を回収した。得られた細胞をＰＢＳに懸濁しよく混合した後、最終濃度が２．５μｇ／ｍｌとなるようにヘキスト３３３４２を加え、３７℃で３０分間染色した。蛍光活性化セルソーター（ベクトン・ディキンソン株式会社）を用いて３５０ｎｍのＵＶレーザーで励起し、Hoechst Blue(350nm)とHoechst Red(675nm)を検出した。その結果を図１に示す。グラフの左下の部分、すなわち、両波長の蛍光強度がともに弱い領域に０．４２％の割合で存在するＳＰ細胞を回収した。また、このＳＰ細胞分画はＭＤＲ分子の機能阻害剤であるベラパミル(verapamil)を添加しても完全には消失しなかった。一つの羊膜から２．０×１０８個以上の初代培養細胞が得られたことから少なくとも０．８×１０６個のＳＰ細胞の分離が可能と考えられた。
【００４２】
（３）ＤＮＡチップ解析：
ＳＰ分画および非ＳＰ分画の各細胞からトリゾール（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出した。各細胞につき、２０ｎｇの全ＲＮＡを用いて、２段階(two cycle)ｃ−ＲＮＡ合成キット（Affymetrix）によってｃ−ＲＮＡを合成した。続いて、各細胞のｃ−ＲＮＡを用いてＨＧ−Ｕ１３３Ａチップ（Affymetrix）によって遺伝子発現解析を行った。チップはGeneArray Scanner (Affymetrix)を用いて読み取り、遺伝子の発現量はAffymetrix softwareであるMicroarray Suite 5.0を用いてtarget
intensity を1000としたglobal
scaling method（全遺伝子の発現量の平均を1000とした場合の相対発現量）で解析した。その結果、非ＳＰ分画の細胞に比べてＳＰ分画の細胞において発現が約３倍以上亢進している細胞表面局在蛋白質の遺伝子として下記ＡＴＰトランスポーターＡＢＣＧ１遺伝子を含む１０遺伝子を見出した。これら遺伝子のチップ解析による発現量は次のとおりである。
【００４３】
【表１】
2011139691.tif 000002
【００４４】
（４）細胞染色解析：
初代培養した羊膜細胞をカバーガラス上にまき、２４時間培養後、２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにより氷上で３０分間インキュベートし固定した。続いて０．１％TritonＸ−１００(ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル)を含むＰＢＳで１０分間、室温においてインキュベートし、膜透過処理を行い、続いてブロッキングBuffer(2% Normal Swine Serum/0.05%
TritonX-100 in PBS)に溶液を変え、室温において３０分間インキュベートしブロッキング反応を行った。その後、抗ヒトＡＢＣＧ１ウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, #sc-11150）を用いて４℃において一晩インキュベートした。一次抗体を除いた後、二次抗体としてＡｌｅｘａ５５５を結合させた抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体(Invitrogen, #A-31572)で室温において１時間インキュベートした。続いて、ＤＡＰＩ（２μｇ／ｍｌ）を加え室温で１５分間処理して核酸を標識した。免疫染色した細胞は、共焦点レーザー顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社）を用いて解析した。その結果を図２に示す。赤色で示されたＡＢＣＧ１蛋白質が細胞表面及び細胞質に局在する細胞を見出した。上記ＤＮＡチップ解析の結果を考慮すると、ＳＰ細胞中にはより多くの頻度でＡＢＣＧ１を細胞表面に発現する細胞が存在すると考えられる。
【００４５】
次に、一次抗体として抗ヒトＯｃｔ４ウサギポリクローナル抗体（abcam, #ab19857）、抗ヒトＳｏｘ２ヤギポリクローナル抗体（R&D systems, #AF2018）及び抗ヒトＫｌｆ４マウスモノクローナル抗体（abcam, #ab75486）の３種類の抗体を用いて初代培養羊膜細胞を染色した。２次抗体としては、Ａｌｅｘａ５５５を結合させた抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体(Invitrogen, #A21432)、Ａｌｅｘａ６４７を結合させた抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体(Invitrogen, #A-21245)及びＡｌｅｘａ４８８を結合させた抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体(Invitrogen, #A21202)を用いた。共焦点レーザー顕微鏡で撮影した結果を図３に示す。これらの細胞中には、紫色で示されたＯｃｔ４、赤色で示されたＳｏｘ２及び緑色で示されたＫｌｆ４が同時に発現している細胞が存在することから、羊膜由来ＳＰ細胞及び／又はＡＢＣＧ１を細胞表面マーカーとして分離してきた細胞画分には、細胞の核初期化に必要な３つの転写因子が発現しており、ｉＰＳ様の多能性幹細胞が含まれることが示唆された。
【００４６】
以上説明したように、本発明は羊膜由来幹細胞表面に発現するマーカータンパク質に対する抗体を用いて多能性幹細胞の割合を増加させた細胞画分の製造方法を提供するものであり、再生医療の実現に向けて有用な技術であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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