(57)【要約】【課題】  表面プラズモン共鳴測定において、測定チップへの検体の固定化を促進し、かつ、非特異吸着を阻止することにより検出感度の向上を図る。【解決手段】  基板上に形成された金属薄膜と、該金属薄膜上にターゲット分子を固定化するために設けられた、金属及び第二の固定剤と結合する部位を有する化合物からなる第一固定剤と、ターゲットと結合可能な官能基と非特異吸着阻止のためのアルキレングリコール鎖を持つ第二固定剤の層を表面プラズモン共鳴センサー用測定チップに形成させた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴センサー用測定チップであって、
基板上に形成された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成されたターゲット分子を捕捉する固定化剤層を有し、
該固定化剤層は第一の固定化剤と第二の固定化剤を含み、第一固定化剤が金属と結合する部位および第二の固定化剤と結合する部位を有する化合物であり、第二固定化剤がターゲット分子と結合する部位、第一固定化剤と結合する部位（前記ターゲット分子と結合する部位と同じであってもよい）、および非選択的吸着阻止部位を有する化合物であることを特徴とする、表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項２】
前記第二固定化剤は高分子化合物であり、前記ターゲット分子と結合する部位が、アルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖の末端にターゲット分子と結合する官能基を備えるターゲット分子結合側鎖であり、前記第一固定化剤と結合する部位が、アルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖の末端に第一固定化剤と結合する官能基を備える第一固定化剤結合側鎖である、請求項１記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項３】
前記高分子化合物からなる第二固定化剤の非選択的吸着阻止部位は、アルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖の末端にオキシメチル基またはオキシエチル基を備える非特異的吸着阻止側鎖である、請求項２に記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項４】
前記ターゲット分子結合側鎖および第一固定化剤との結合側鎖の末端が、ｐ−ニトロフェニル基またはヒドロキシスクシンイミド基である、請求項２または３に記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項５】
前記第二固定化剤が、下式１で表される繰り返し単位と下式２で表される繰り返し単位を含む高分子化合物である、請求項１記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【化１】
2011196978.tif 000008
（式中、Ｄはアルキレングリコール基を示す。Ｇはオキシメチル基、またはオキシエチル基を示す。ｍは１〜２０の整数を示す。ｘは自然数である。）
【化２】
2011196978.tif 000009
（式中、Ｅはアルキレングリコール基を示す。ｎは１〜１０の整数を示す。Ａはｐ−ニトロフェニル基またはヒドロキシスクシンイミド基である。ｙは自然数である。式１の繰り返し単位と式２の繰り返し単位の結合順序は任意である。）
【請求項６】
前記第一固定化剤が、有機硫黄化合物である請求項１〜５いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項７】
前記有機硫黄化合物が、水素化された硫黄原子を末端に持つ請求項６記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項８】
前記有機硫黄化合物が、片方の末端がＳＨ基で、もう一端がアミノ基でありＳＨ基とアミノ基の間が有機基からなるスペーサー構造を備える請求項７記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項９】
前記有機硫黄化合物が、アミノアルカンチオール（ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ）（ｎは整数）、アミノベンゼンチオールから選ばれる化合物である請求項７または８に記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項１０】
基板が、透明基板である請求項１〜９いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項１１】
ターゲット分子が、生理活性物質である請求項１〜１０いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項１２】
前記生理活性物質が、抗体である請求項１１記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【請求項１３】
前記金属薄膜が、金、白金、または金を含む合金である請求項１記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴センサー用測定チップおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサーは、生体由来の分子認識機構（例えば、抗原−抗体反応、リガンド−レセプター反応）を利用した化学センサーのことである。通常は、分子認識の一方の側を酵素、蛍光物質、ラジオアイソトープなどで標識することで検出されるが、標識物質が酵素、蛍光物質の場合は、標識物質が分子認識に機能を果たす部位に導入された場合には、結合反応を阻害する可能性があり、標識物質の分子サイズによっては機能部位ではなくその近傍にあっても立体障害により分子認識を阻害する可能性がある。
一方、ラジオアイソトープ標識の場合は、前記のような心配はなく、正確に分子認識機構が微量から検知できるが、ラジオアイソトープの使用に対して、設備、購入、取り扱い、廃棄の規制が厳しく、いつでもどこでも実施できるものではない。
【０００３】
前記のことを鑑み、バイオセンサーにおいて、表面プラズモン共鳴原理を用いて、リガンド−レセプター反応を、標識物質を必要とすることなく、高感度に検出することが考えられ、そのための測定装置が種々開発された。
表面プラズモン共鳴センサー用測定チップはガラス基板上に金属膜を形成し、その上の有機機能性膜上に生理活性物質が担持または固定された状態で使用される。
表面プラズモン共鳴による検知は、金属膜に接する機能性膜の表面の近傍で起こる吸着および脱着等で発生する質量変化を屈折率の変化として捕らえ、反射光波長のピークシフト、または、一定波長の反射量の変位として検知する方法である（非特許文献１）。
【０００４】
表面プラズモン共鳴センター用の測定チップは、前述のように金属膜近傍で分子認識反応が起こる必要があるが、金属膜に直接生体由来物質を効率的に固定化することは難しく、表面プラズモン共鳴センサー用に種々の特徴を持つ測定用チップが開発されている。
例えば、特許文献１は、金属膜上に有機硫黄層を構築しその有機硫黄層において生体分子を固着させることを特徴としている。該有機硫黄層には、水酸基、カルボニル基、アミノ基などの官能基が導入され生体由来物質との親和性を高めている。
【０００５】
また、特許文献２では、金属結合性官能基としてチオール基を用い炭素数８以下のアルキル基を持った化合物を金属表面に形成させ、それにより生体分子を固着させ、かつ、親水性基をもつ高分子部分を有し、その部分への非特異的な生体由来物質の吸着を抑制する工夫がなされている。
しかしながら、生体分子を固着する部分と非特異的な生体由来物質の吸着を抑制する部分が区分けされており、位置がずれると肝心の生体分子が非特異吸着抑制により固着できない、それにより反応面積が狭くなるので十分なシグナル値を得ることができないなどの問題が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２８２０３９号公報
【特許文献２】特開２００４−２７９２０４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｐｌａｓｍａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８４（２００８）１０−１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、表面プラズモン共鳴測定において、測定チップへの検体の捕捉性を改善し、かつ、非特異吸着を抑制することにより検出感度の向上を図ることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような目的は、下記（１）〜（１３）に記載の本発明により達成される。
（１）表面プラズモン共鳴センサー用測定チップであって、
基板上に形成された金属薄膜と、該金属薄膜上に形成されたターゲット分子を捕捉する固定化剤層を有し、
該固定化剤層は第一の固定化剤と第二の固定化剤を含み、第一固定化剤が金属と結合する部位および第二の固定化剤と結合する部位を有する化合物であり、第二固定化剤がターゲット分子と結合する部位、第一固定化剤と結合する部位（前記ターゲット分子と結合する部位と同じであってもよい）、および非選択的吸着阻止部位を有する化合物であることを特徴とする、表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（２）前記第二固定化剤は高分子化合物であり、前記ターゲット分子と結合する部位が、アルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖の末端にターゲット分子と結合する官能基を備えるターゲット分子結合側鎖であり、前記第一固定化剤と結合する部位が、アルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖の末端に第一固定化剤と結合する官能基を備える第一固定化剤結合側鎖である、上記（１）記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（３）前記高分子化合物からなる第二固定化剤の非選択的吸着阻止部位は、アルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖の末端にオキシメチル基またはオキシエチル基を備える非特異的吸着阻止側鎖である、上記（２）に記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（４）前記ターゲット分子結合側鎖および第一固定化剤との結合側鎖の末端が、ｐ−ニトロフェニル基またはヒドロキシスクシンイミド基である、上記（２）または（３）に記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（５）前記第二固定化剤が、下式１で表される繰り返し単位と下式２で表される繰り返し単位を含む高分子化合物である、上記（１）記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【化１】
2011196978.tif 000002
（式中、Ｄはアルキレングリコール基を示す。Ｇはオキシメチル基、またはオキシエチル基を示す。ｍは１〜２０の整数を示す。ｘは自然数である。）
【化２】
2011196978.tif 000003
（式中、Ｅはアルキレングリコール基を示す。ｎは１〜１０の整数を示す。Ａはｐ−ニトロフェニル基またはヒドロキシスクシンイミド基である。ｙは自然数である。式１の繰り返し単位と式２の繰り返し単位の結合順序は任意である。）
（６）前記第一固定化剤が、有機硫黄化合物である上記（１）〜（５）いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（７）前記有機硫黄化合物が、水素化された硫黄原子を末端に持つ上記（６）記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（８）前記有機硫黄化合物が、片方の末端がＳＨ基で、もう一端がアミノ基でありＳＨ基とアミノ基の間が有機基からなるスペーサー構造を備える上記（７）記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（９）前記有機硫黄化合物が、アミノアルカンチオール（ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ）（ｎは整数）、アミノベンゼンチオールから選ばれる化合物である上記（７）または（８）に記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（１０）基板が、透明基板である上記（１）〜（９）いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（１１）ターゲット分子が、生理活性物質である上記（１）〜（１０）いずれか１項記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（１２）前記生理活性物質が、抗体である上記（１１）記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
（１３）前記金属薄膜が、金、白金、または金を含む合金である上記（１）記載の表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、表面プラズモン共鳴測定において、測定チップへの検体の捕捉性を改善し、かつ、非特異吸着を抑制することにより検出感度の向上を図ることを目的としている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定用チップの詳細について説明する。
【００１２】
本発明における表面プラズモン共鳴センサー用測定チップは、基板上に配置される金属薄膜、金属薄膜上にターゲット分子を固定化するために設けられた、第一固定化剤と第二固定化剤を含む固定化剤層により形成される。
【００１３】
表面プラズモン共鳴センサー用測定チップ基板は、通常該目的に使用されるものであれば特に限定しない。材質としては、レーザー光に対して透明であるガラス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートが好適に使用でき、加工が可能なものがよく、厚さは、１〜２０ｍｍがよい。測定原理から透明基板を用いることが一般的で、特に透明ガラス基板が好適に使用される。
また、基板上に形成される金属薄膜は、通常、金属蒸着によって作製される。蒸着厚みとしては、５０〜２００ｎｍが一般的であり、本発明においてもこれに準じた基板を用いる。
【００１４】
第一固定化剤は、金属と結合する部位及び第二の固定剤と結合する部位を有する化合物からなり、第二固定化剤は、ターゲット分子と結合する部位、第一固定化剤と結合する部位（前記ターゲット分子と結合する部位と同じであってもよい）、および非選択的吸着阻止部位を有する化合物からなる。
ここで言うターゲット分子とは、表面プラズモン共鳴センサー用測定チップに捕捉させる化合物である。
【００１５】
実際の表面プラズモン共鳴センサーによる測定は、ターゲット分子を捕捉した状態で、該ターゲット分子とターゲット分子に結合しうる分子との結合を観察する。例えばターゲット分子が抗体であれば、ターゲット分子に結合し得る分子は抗原となり、ターゲット分子がリガンド物質であれば、ターゲット分子に結合し得る分子はレセプターとなる。
【００１６】
第二固定化剤とターゲット分子との結合は、第二固定化剤にターゲット分子が物理的吸着または化学的結合により結合していればよいが、好ましくはイオン結合、水素結合、配位結合、または共有結合の化学結合が好ましく、より好ましくは共有結合により結合していることが好ましい。
【００１７】
第一固定化剤は、金属と結合する部位及び第二固定化剤と結合する部位を併せ持つ必要がある。まず、金属と結合することのできる部位として代表的な原子は硫黄であり、硫黄を含む原子団であり、チオール基（ＳＨ基）が好ましい。一方、第二の固定化剤を結合する部位は、第二固定化剤とイオン結合、共有結合、配位結合等の化学反応により結合する官能基であれば良く、例えば、カルボキシル基、水酸基、アミノ基などがあげられる。
第一固定化剤は有機硫黄化合物で、低分子量のものが好ましい。有機硫黄化合物は金属原子との反応性に富んでおり金属薄膜上に反応点を構築するには最良の化合物である。低分子量のものが好ましい理由は、分子量の高い物質の場合、構造的に複雑になり、それにより非特異吸着を惹起する可能性が存在するからである。
【００１８】
従って、第一固定化剤は、まず、金属薄膜上に固相化される必要があり、それを満足するには、水素化された硫黄原子を末端に持つ有機硫黄化合物であることが望ましい。
水素化された硫黄原子として代表的なチオール基を有し、かつ反応性官能基を同時に有している分子であれば良い。
【００１９】
次に第二固定化剤との結合に用いられる官能基については、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基などがあげられる。この中で最も好ましい反応性官能基は、アミノ基である。ターゲット分子は、生理活性物質である場合が多く、その多くは分子中にアミノ基を含むものが多い。第一固定化剤の官能基をアミノ基にすることにより、第二固定化剤には、アミノ基と反応しうる官能基を導入することになり、この官能基はターゲット分子の固定化にも使用可能となる。従って、第一固定化剤としては、例えば、アミノアルカンチオール類、アミノベンゼンチオール類があげられる。それらの中でも、２−アミノエタンチオールが、入手のしやすさなどから最も好ましい。
【００２０】
第二固定化剤は、第一固定化剤と結合する官能基、及びターゲット分子を固定化する為の官能基を併せ持ち、さらに、ターゲット分子固定後の非特異的な物質吸着を抑制することが必要な条件となる。
【００２１】
第二固定化剤に含まれる、第一固定化剤と結合する官能基と、ターゲット分子を固定化する為の官能基の種類は、異なる二種類の官能基でもよく、または同じ種類の官能基をあっても良い。好ましくは、同じ種類の官能基を用いることであり、そうすることで第二固定化剤の構造が簡単になり、複数種の官能基を導入するより化合物の合成などに有利である。以下、特に断らない限り、第一固定化剤と結合する官能基と、ターゲット分子と結合する官能基を一括して「官能基」と称し、まとめて説明する。
【００２２】
前記官能基は、反応性の低い基では、固定化反応に時間がかかる、また充分量のターゲット分子を固定化することができない、といった問題点がある。従って第二固定化剤の官能基としては、反応性の高い官能基が必要となる。第一固定化剤およびターゲット分子中にアミノ基を持つものが好ましいので、この点において、第二固定化剤の官能基としては、アミノ基と反応性の高い官能基が好適であり、中でも特に反応のための触媒やカップリング剤を必要としないｐ−ニトロフェニル基またはヒドロキシスクシンイミド基で代表される活性エステル基は有用な官能基である。
【００２３】
第二固定化剤に非特異的吸着を抑制するための機能を付与するためには、第二固定化剤としてターゲットト分子との立体反発によってターゲット分子の吸着を阻止する高分子化合物を使用することが好ましい。高分子化合物を用いる理由は、分子設計の自由度が高く、求める機能を有する化合物を比較的簡便に構成することが可能であるからである。また、アルキレングリコール鎖と官能基を同時に１分子中に導入することも可能である。
【００２４】
前記高分子化合物にターゲット分子との立体反発による非特異的吸着阻止機能を付与するには、高分子主鎖や側鎖にアルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖を導入することによって達成される。好ましくは高分子物質の側鎖部分にアルキレングリコール鎖を導入することであり、それによりフレキシビリティーの高いアルキレングリコール鎖がターゲット分子との立体反発を生じ、このことにより非特異吸着を抑制する。
【００２５】
前記高分子化合物に官能基を導入するためには、側鎖末端に官能基を導入する方法が簡便である。官能基は、側鎖中に存在すればどの位置でもかまわないが、側鎖末端に存在する方が、高分子化合物の構造による立体障害等の影響を受けにくく反応性が良好になる。
【００２６】
上記高分子化合物を合成するには、アルキレングリコール側鎖を獲得するために、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合モノマーと官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを共重合して得られる高分子物質を使用する。
第二固定化剤の高分子物質に使用する、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、特に構造を限定しないが、一般式〔１〕で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｄの連鎖からなる化合物が好ましい。
【化１】
2011196978.tif 000004
式中のアルキレングリコール残基Ｄの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、さらに好ましくは２〜４である。アルキレングリコール残基Ｄの繰り返し数ｍは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、さらに好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｄの炭素数は同一であっても、異なっていても良い。Ｇはオキシメチル基、またはオキシエチル基を示す。
【００２７】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合モノマーとしては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２-ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２-メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性から、メトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
【００２８】
官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、特に構造を限定しないが、下記の一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と官能基Ａが炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖を介して結合した化合物であることが好ましい。
【００２９】
【化２】
2011196978.tif 000005
【００３０】
式〔２〕において、アルキレングリコール残基Ｅの炭素数は１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは２〜４であり、より更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｅの繰り返し数ｎは１〜２０の整数であり、より好ましくは２〜１８の整数であり、更に好ましくは３〜１６の整数であり、最も好ましくは４〜１４の整数である。繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
【００３１】
官能基Ａとしては、化学的に活性な官能基があげられるが、特に限定するものではない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、スルホネート基などがある。中でもモノマーの保存安定性の観点から活性エステル基が最も好ましい。特に、ｐ-ニトロフェニル基またはヒドロキシスクシンイミド基が好ましい。
【００３２】
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、メチルエチルケトン、アセトン、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００３３】
該高分子化合物の組成比は、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合モノマーと官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの仕込み比換算で制御することが可能である。アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合モノマーは、上述したように、高分子化合物に非特異的吸着阻止機能を付与するモノマーであり、例えば、前記式〔１〕で表されるアルキレングリコールまたはアルキレングリコール鎖を導入した化合物である。通常の場合、ターゲット分子結合側鎖および第一固定化剤との結合にかかわる官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの割合が多いほどターゲット分子の固定化量は向上するが、同時に非特異吸着も高くなる傾向にある。固定化量と非特異吸着のバランスが好適であるのは、ターゲット分子結合側鎖および第一固定化剤との結合にかかわる官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの割合が、３〜４０ｍｏｌ％であり、更に好適には５〜３０ｍｏｌ％である。また、非特異的吸着阻止モノマーと官能基モノマーが、高分子化合物全体の９０ｍｏｌ％以上であることが好適である。
【００３４】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００３５】
第二固定化剤の化学構造は、少なくともアルキレングリコール残基、ターゲット分子を固定化する官能基を有する各エチレン系不飽和重合性モノマーが共重合されたものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
第二固定化剤の分子量は、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００３６】
金属薄膜を構成する金属は表面プラズモン共鳴が生じるものであれば特に限定されず、具体的には、金、銀、銅、アルミニウム、白金等が挙げられ、それらを単独、又は組み合わせて使用することができる。
【００３７】
得られた第二固定化剤を表面プラズモン共鳴センサー用基体に塗布する場合、その溶媒は第二固定化剤を溶解し、かつ、第一固定化剤が付着した基板を損傷しなければ、特に限定されるものではなく、エタノール、メタノール、アセトン、メチルエチルケトン、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなど種々の有機溶媒を好適に用いることができる。
【００３８】
本発明の第二固定化剤を第一固定化剤に結合させることにより、ターゲット分子以外の分子の非特異的吸着を抑制する性質を容易に付与することが可能である。その際に、第一固定化剤と第二固定化剤を同時に金属薄膜上に結合させてもよいし、まず、第一固定化剤を結合させ、その後、第二固定化剤を結合しても良い。非特異吸着を抑制するためには、基板上にアルキレングリコール鎖が豊富に存在することが好ましいので、後者の第一固定化剤を結合した後、第二固定化剤を結合する方法がより好ましい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
（高分子化合物の合成例）
ポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート）（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量＝約４７５  Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）、をそれぞれ順に０．３２ｍｏｌ／Ｌ、０．０８ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．００８ｍｏｌ／Ｌの２、２−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、和光純薬製）を添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で６時間反応させた後、反応溶液をヘキサン／アセトン＝７／３（体積比）中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、３．２ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６および８．３ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００４１】
【表１】
2011196978.tif 000006
【００４２】
（第一固定化剤の配位）
２-アミノエタンチオール（和光純薬工業製、３２６−２２１９２）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−）、日水製薬製、０５９１３）に溶解し、０．１Ｍのアミノエタンチオール／ＰＢＳ溶液を得た。
前記アミノエタンチオール溶液中に、金蒸着ガラス基板を浸漬して、室温で１時間静置。１時間後、金蒸着基板を超純水に５回浸漬して洗浄、風乾して第一固定化剤を金蒸着基板上に配位させた。
【００４３】
（第二固定化剤の配位）
合成例において作製した第二固定化剤の高分子物質を、メチルエチルケトン（ＭＥＫ、和光純薬、１５５５４８）に溶解し、０．３ｗｔ％高分子物質溶液を調整した。
前記高分子物質溶液中に第一固定化剤を配位した金蒸着基板を浸漬、室温、１時間静置。１時間後、ＭＥＫで５回洗浄し、第二固定化剤を配位した金蒸着基板を得た。
【００４４】
＜実施例１＞  抗体の固定化
ぺルオキシダーゼ標識された抗体をターゲット分子に用いて第二固定化剤への固定化実験を行った。
Ｐｅｒｏｘｉｄａｚｅ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｒａｂｂｉｔ  抗Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ抗体（ＤＡＫＡ社製、Ｐ０２６０）を５０μｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ、日水製薬製、０５９１３）で希釈した。
第二固定化剤を配位した金蒸着基板の金蒸着面に前記抗体希釈液を滴下し、基板全面が溶液で覆われるように液滴を拡げ、室温にて４時間静置して固定化反応を行った。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＧＥヘルスケアサイエンス製、１７−１３１６−０１）含有ＰＢＳで５回、さらに超純水で２回洗浄し、金蒸着基板上に抗体の固定化反応を行った基板を準備した。
＜固定化された抗体量の測定＞
基板上の第二固定剤によって先のＰｅｒｏｘｉｄａｚｅ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  抗Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎが固定されているかを、ペルオキダーゼの活性を測定して求めた。
先に作成した抗体を固定化した基板をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（住友ベークライト製、ＭＳ−８４９６Ｆ）のウェルの中に入れ、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製、ＭＬ−１１２０Ｔ）の発色液を１２０μＬ加え、遮光下、室温で１５分間静置した。１５分後、反応停止液を１２０μＬ加えて酵素反応を停止させた。
基板を除去した後、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製、ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００）で波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４５】
＜比較例１＞
実施例と同様に第二固定化剤を配位した基板の金蒸着面にブロッキング剤として０．１Ｍエタノールアミン（和光純薬製、１５１０７８）／０．０５ＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（和光純薬製、３０９８Ｔ−Ｂ１０１）（ｐＨ９．５に調製）を含むＰＢＳを滴下し、基板全面が溶液で覆われるように液滴を拡げ、室温にて４時間静置してブロッキング反応を行った。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で５回、さらに超純水で２回洗浄した。
さらに、前記の標識抗体希釈液を用いて基板全面が溶液で覆われるように液滴を拡げ室温にて４時間静置して固定化反応を行った。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回、さらに超純水で２回洗浄した。
前記「固定化された抗体量の測定」に従って、標識抗体処理、発色工程を経て吸光度を測定した。
【００４６】
＜比較例２＞
第一固定化剤のみを配位した金蒸着基板の金蒸着面にブロッキング剤として０．１Ｍエタノールアミン（和光純薬製、１５１０７８）／０．０５ＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（和光純薬製、３０９８Ｔ−Ｂ１０１）（ｐＨ９．５に調製）を含むＰＢＳを滴下し、基板全面が溶液で覆われるように液滴を拡げ、室温にて４時間静置して固定化反応を行った。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で５回、さらに超純水で２回洗浄した。
さらに、実施例１で用いた抗体希釈液を滴下し、基板全面が溶液で覆われるように液滴を拡げ、室温にて４時間静置して固定化反応を行った。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で５回、さらに超純水で２回洗浄した。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回、さらに超純水で２回洗浄した。
前記「固定化された抗体量の測定」に従って、標識抗体処理、発色工程を経て吸光度を測定した。
【００４７】
＜比較例３＞
実施例と同様に第二固定化剤まで配位した金蒸着基板を準備した。
続いて、該第二固定化剤を配位した金蒸着基板にシリコンオイルを直径５０μｍで２５箇所スポットしてマスキングした後、ブロッキング処理を行った。ブロッキング剤として０．１Ｍエタノールアミン（和光純薬製、１５１０７８）／０．０５ＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（和光純薬製、３０９８Ｔ−Ｂ１０１）（ｐＨ９．５に調製）を含むＰＢＳを滴下し、基板全面が溶液で覆われるように液滴を拡げ、室温にて４時間静置してブロッキング反応を行った。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で５回、メタノールで５回（シリコンオイル除去のため）さらに超純水で２回洗浄した。この操作で、シリコンオイル点着箇所のみに官能基を有する基板を得た。
次に、抗体固定化反応を行った。前記の標識抗体希釈液を用いてシリコンオイルでマスキングされた同じ位置になるように位置合せして点着し、室温にて４時間静置して固定化反応を行った。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５回、さらに超純水で２回洗浄した。
前記「固定化された抗体量の測定」に従って、標識抗体処理、発色工程を経て吸光度を測定した。
【００４８】
結果を表に示す。
【表２】
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【００４９】
実施例において、抗体が固相化されていることが確認された。
比較例１において、エタノールアミンが第二固定化剤の官能基を失活させ非特異吸着が阻止されていることが確認された。また、エタノールアミンによるブロッキングによって非特異吸着が惹起されていないことも確認された。
比較例２において、第一固定化剤のみでは十分なターゲット分子の固定化量が得られていないことが確認された。
比較例３において、第二固定化剤の点着では十分な固定化量が確保できないことが確認された。また、点着部以外のブロッキング、位置合せの操作は、実施例に比べ工程を増やす要因となった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の測定チップを用いることによって、表面プラズモン共鳴測定において、非特異吸着を抑制し、検出感度の向上を達成できる。