(57)【要約】【課題】基板と該基板と接着されたカバー部材からなる分析チップにおいて、基板とカバーに囲まれた空隙に微粒子を封入するとき、静電気の発生により空隙内への微粒子封入が困難となり、また封入された微粒子同士の固着または空隙内への気泡の混入等により検体溶液との反応が不十分になることがあった。【解決手段】基板と該基板と接着されたカバー部材からなり、該基板と該カバー部材との間に空隙を有する分析チップであって、該空隙に微粒子が封入されており、該微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である分析チップを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と該基板と接着されたカバー部材からなり、該基板と該カバー部材との間に空隙を有する分析チップに用いる分析チップ用セラミックス微粒子であって、該空隙に微粒子が封入されており、該微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である分析チップ用セラミックス微粒子。
【請求項２】
前記微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である請求項１に記載の分析チップ用セラミックス微粒子。
【請求項３】
前記微粒子の最大径が１０μｍ以上５００μｍ以下である請求項１または２に記載の分析チップ用セラミックス微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質と選択結合性物質との反応による分析を行う際に用いうる分析チップあって、該被検物質の溶液を保持する空間に微粒子が封入された分析チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのように、各種の核酸／核酸間の相補性を利用した方法により、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。一方、蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡチップ法（ＤＮＡマイククロアレイ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。ＤＮＡチップは、数百〜数万という多数の遺伝子発現を同時に測定するための小型装置であり、ガラス、シリコンなどの基材の基板上にＤＮＡなどの分子を高密度に配置したものである。ＤＮＡチップを使用することによって、各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能、すなわち遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をＤＮＡチップによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になると思われる。
【０００４】
現在、ＤＮＡチップの作製は、主に２つの基本的な方法、すなわちＧｅｎｅＣｈｉｐ法及びｃＤＮＡマイクロアレイ法が採用されている。
【０００５】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ法はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって開発された方法で、フォトリソグラフ法によりガラス板上で２５マー（ｍｅｒ）程度のオリゴＤＮＡを合成し、１つの遺伝子あたり、塩基配列データから１６カ所から２０カ所の２５マーを設定し、２５マーの完全一致と１３塩基目を意図的に違えた１塩基ミスマッチのオリゴマーセットを組にしてプローブＤＮＡとする。この方法は、プローブＤＮＡの長さが一定であり、配列が既知なため、ハイブリダイゼーションの強さに影響をあたえるＧＣ含量を一定にすることができるので、発現量の定量的解析には理想的なアレイと考えられている。一方、ｃＤＮＡマイクロアレイ法は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学によって開発された方法で、キャピラリー状のペンによるスポッティング方式や、インクジェット方式などの手法により、ガラス板にＤＮＡを固定するものである。いずれの方法も、あらかじめ蛍光標識した測定する試料（遺伝子）を、ＤＮＡチップ上のプローブとハイブリダイゼーションにより結合させ、スキャナーを用いてその蛍光強度を測定することにより、遺伝子の発現を測定するものである。
【０００６】
ＤＮＡチップデータの解析の１つとして、階層的クラスタリングがある。これは、発現パターンの類似した遺伝子を集めて系統樹を作製することができる方法であり、多数の遺伝子の発現レベルが色で模式的に表示されうる。このようなクラスタリングによって、ある疾患に関連する遺伝子を識別することができる。
【０００７】
ＤＮＡだけでなく、タンパク質や糖類などを基板に配置した分析チップも検査、解析手段としても利用されるようになってきた。とりわけ、タンパク質を配置したプロテインチップでは、抗体、抗原、酵素基質などのタンパク質が基板上に固定される。
【０００８】
一般的なガラスやシリコンではなくポリマーを基材とした、凹凸構造を有する特殊な形状のＤＮＡチップを開発されている（特許文献１）。この方法により、基板の凸部上面にスポットされる物質量のばらつきが小さくなり、その結果、Ｓ／Ｎ比及び検出感度が大きく改善された。さらに、凹部内に微粒子を存在させることによって、反応液の攪拌効率を増大させることが可能となり、結果として反応促進効果も達成された（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２６４２８９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】滝澤聡子ら、バイオテクノロジージャーナル：２００５年７−８月号、４１８−４２０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のような、基板と該基板と接着されたカバー部材からなり、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が封入されている分析チップにおいては、この空隙に微粒子を封入する際、静電気の発生により、例えばカバーに設けられた貫通孔から空隙内への微粒子封入が困難となることがある。また、静電気の発生により十分量の微粒子を封入できない場合、溶液の攪拌効率が十分得られないことがある。さらに、封入された微粒子が固まって動かなくなることがあり、このような状態でカバーと基板に囲まれた空隙に検体溶液を注入した場合、微粒子が固まった箇所に検体溶液が染み渡らず、空隙内に気泡が混入する結果、反応ムラが生じることがある。
【００１２】
本発明は、空隙に微粒子を封入する際に生じる静電気を抑制し、また微粒子の封入操作を容易にする分析チップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題に鑑みて、本発明者らは鋭意検討した結果、基板と該基板と接着されたカバー部材からなり、該基板と該カバー部材との間に空隙を有する分析チップにおいて、基板とカバーに囲まれた空隙に微粒子を封入するとき、微粒子の表面粗さを制御することで上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち本発明は、基板と該基板と接着されたカバー部材からなり、該基板と該カバー部材との間に空隙を有する分析チップであって、該空隙に微粒子が封入されており、該微粒子の表面の中心線平均粗さ、すなわちＲａ値が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である分析チップである。
【００１５】
本発明の好ましい形態は、微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である分析チップである。
【００１６】
本発明の好ましい形態は、微粒子の材質がセラミックまたはガラスである分析チップである。
【００１７】
本発明の好ましい形態は、微粒子の最大径が１０μｍ以上５００μｍ以下である分析チップである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＤＮＡチップにおいて、表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下の微粒子を用いると、基板とカバーに囲まれた空間に微粒子を封入する際に静電気の発生が抑えられて、微粒子封入時の作業効率が著しく向上する。さらに、基板とカバーに囲まれた空間に容易に十分量の微粒子を封入できることから、ハイブリダイゼーション時の溶液撹拌効率が著しく向上し、従来のＤＮＡチップと比較してＳ／Ｎ比および検出感度を大幅に改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図とＡ１に沿った面で切断した部分断面図である。
【図２】本発明の分析チップを構成する基板の概略図及び縦断面図である。
【図３】本発明の分析チップの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図４】本発明の分析チップを構成するカバーにおける貫通孔及び液面駐止チャンバーの一例を示す部分断面図である。
【図５】本願実施例及び比較例における、プローブＤＮＡの固定化を示す概略図である。
【図６】本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図とＡ２に沿った面で切断した部分断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
【００２１】
本発明の分析チップは、基板とその一部に接着されたカバー部材からなり、該基板と該カバー部材とで形成される空隙があって、該空隙に微粒子が封入されている分析チップである。
【００２２】
図１に、本発明の分析チップの１例を示す。図１の分析チップは、基板１とその一部に接着層３を介して接着されたカバー部材２とを含む分析チップであって、基板１とカバー２とで形成される空隙６に微粒子８が封入されている。
【００２３】
分析チップとは、被検物質を含む溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、基板表面に固定化された選択結合性物質と検体との反応により、検体の量や、検体の有無を調べるバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を基板表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を基板表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を基板表面に固定化した糖鎖チップ、及び基板表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。選択結合性物質及びその固定化の態様については後述する。
【００２４】
本発明の基板は、微細な凹凸構造を有することが好ましい。凹部及び凸部の形状は特に限定されないが、特に凸部は角柱、円柱、円錐台などの柱状構造が好ましい。また凸部の上面の形状は、円形又は三〜八角形などの角形が好ましい。凹部又は凸部は完全に又は実質的に同一の構造を有しており、また交互に規則的に配列していることが好ましい。このような規則的な配列の場合、凸部の形状に応じて凹部の形状が決まる。
【００２５】
基板の材質としては、例えば、ガラス、セラミックス、シリコンなどの無機材料、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコンゴムなどのポリマーを挙げることができる。好ましくは、成形が容易な合成ポリマー、例えばＰＭＭＡである。
基板の成形としては、ポリマーの場合、射出成形法、ホットエンボス法などの方法、ガラスやセラミックの場合、サンドブラスト法などの方法、シリコンの場合、公知の半導体プロセスで使用される方法が挙げられる。
【００２６】
基板は、その全体又は一部を黒色にすることができる。黒色とは、可視光範囲（波長４００〜８００ｎｍ）において、基板の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値、好ましくは７％以下であり、かつ、黒色部分の分光透過率も特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値、好ましくは２％以下であることを意味する。基板の少なくとも一部を黒色にすることによって、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。黒色にする手段として、基板材料又は絶縁材料に黒色物質、例えばカーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、金属（Ｒｕ，Ｍｎ，Ｎｉ，Ｃｒ，Ｆｅ，Ｃｏ，Ｃｕなど）の酸化物、Ｓｉ，Ｔｉ，Ｔａ，Ｚｒ，Ｃｒの炭化物を混入させることにより達成される。
【００２７】
凸部のサイズは、例えば高さ約１０〜約２００μｍ、幅約５０〜約１５０μｍであるが、このような範囲に限定されない。凸部と凸部の間隔は、例えば約５０〜約６００μｍであるが、好ましくは複数の微粒子が入ることが可能なサイズである。また、特開２００４−２６４２８９（特許文献１）に示す理由から、凸部の高さについては、その周りの平坦部と同じ高さであることが好ましい。凸部と平坦部の関係については、図２および図３に示す。
【００２８】
凸部の上面には、図３に示すように、選択結合性物質を固定化することができる。この場合、凸部の上面とカバーとの間には、選択結合物質と被検物質とが結合しうるための空間を設ける必要がある。そのような空間のサイズは、例えば高さ方向で、１〜５００μｍである。これより小さい範囲であると、固定された選択結合性物質に被検物質が接触する機会が極端に少なくなり、ハイブリダイゼーション後のシグナルが著しく小さくなるため、一方空間サイズが５００μｍを超えると、多くの液量が必要となり、微量な検体を用いる場合、検体溶液の濃度が薄くなってハイブリダイゼーションの反応性が低下し、検出時のシグナルが弱くなるため、それぞれ好ましくない。
【００２９】
基板の凸部の上面に選択結合性物質を固定化するために、凸部の上面は、選択結合性物質と結合可能な官能基（例えばアミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基など）を含むことができる。このような官能基を導入するために、例えば該表面にプラズマ処理や放射線処理（例えばγ線、電子線など）を施し、この後さらにグラフト重合処理することによって極性基を導入したり、ポリカチオン（例えばポリ−Ｌ−リシン、シランカップリング剤など）をコートしたりすることができる。
【００３０】
ここで用いられるシランカップリング剤としては、例えば３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシランなどが挙げられる。
【００３１】
本発明で使用可能な好ましい基板及びその製法は、例えば本出願人による特開２００４−２６４２８９（特許文献１）、バイオテクノロジージャーナル：２００５年７−８月号、４１８−４２０頁（非特許文献１）、などに記載されたものである。
【００３２】
前記カバーの形状は、前記選択結合性物質固定化基板の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基板と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、基板は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記基板に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着される。
【００３３】
カバーは、空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。この孔は、微粒子、被検試料、反応用バッファなどの液体を注入するためのものであり、また同時に、チップ内部の圧力を大気圧に保持するためのものでもある。貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３〜６個とすることにより、検体溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバーが複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つを注入口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び検体溶液の密閉保持性の点から、注入口を検体溶液の注入に必要となる広い孔径とし、その他の貫通孔をより狭い孔径とすることが好ましい。具体的には、注入口の貫通孔サイズは直径０．０１〜２．０ｍｍの範囲とし、その他の貫通孔の直径を０．０１〜１．０ｍｍの範囲とすることが好ましい。
【００３４】
貫通孔は、その少なくとも１つが、その径を変化させて、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバーを備えるものとしても良い。（ここで駐止とは、必要部位にとどめることを意味する。）液面駐止用チャンバーを備えることにより、貫通孔からアプライされ空隙に充填された検体溶液の液面の上昇を抑え、貫通孔を封止部材で封止する際に容易かつ確実に行うことが可能となるとともに、検体溶液の中に多数の気泡が入ったり、検体溶液の流出を防ぐことができるので好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は特に限定されるものではなく、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形、又はこれに近似した形状とすることができる。これらのうち、製造の容易さ及び検体溶液の上昇を抑制する効果の高さ等の観点から、円柱形が特に好ましい。
【００３５】
貫通孔の孔径サイズについては特に限定されるわけではないが、図４に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔及び液面駐止用チャンバーとの組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔の孔径サイズ（直径）は、０．０１〜２．０ｍｍが好ましく、０．３〜１．０ｍｍがより好ましい。孔径を０．０１ｍｍ以上とすることにより、検体溶液のアプライを容易に行うことができる。一方、貫通孔の直径を１．５ｍｍ以下とすることにより、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制することができる。液面駐止用チャンバーの孔径サイズ（直径）については、１．０ｍｍ以上が好ましい。１．０ｍｍ以上とすることにより、貫通孔とのサイズの差を十分に得ることができ、その結果、十分な液面駐止効果が得られるため好ましい。液面駐止用チャンバーの直径の上限は、特に限定されないが、１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバーの深さは、特に限定されないが、０．１〜５ｍｍの範囲内とすることができる。
【００３６】
このようなカバーは、脱着可能な強度、態様で前述の選択結合性物質固定化基板に接着されていることが好ましい。本発明の分析用チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取る必要があるが、カバーが接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットできたとしてもスキャン操作を実施するとカバーとスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバーを介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバーを取り外せるように、カバーが脱離可能であることが好ましい。
【００３７】
本発明の分析チップは、基板とカバーに囲まれた空隙に微粒子を含む（図３）。微粒子が存在することによって、注入された検体溶液を効率よく攪拌することが可能となり、その結果、ハイブリダイゼーションの反応促進効果がもたらされる。
【００３８】
微粒子の材質は特に限定されないが、例えばガラス、セラミック、ステンレス等の金属類、ナイロン、ポリスチレン等のポリマーなどが挙げられる。中でも、物理的、化学的に安定であり、かつ比重が大きいことから、セラミックの微粒子が好ましく用いられる。セラミックには、アルミナ、ジルコニア、窒化アルミ、窒化珪素、炭化珪素、サイアロン、チタニア系、フェライト等のファインセラミックが含まれる。これらのなかでさらに好ましく用いられるのは、イットリア部分安定化ジルコニアである。
【００３９】
本発明の分析チップに用いる微粒子としては、既知または市販のものをそのまま使用することができる。イットリア部分安定化ジルコニアからなる微粒子は、次のようにして製造することができる。出発原料となる粉末は、例えば、加水分解法、中和共沈法、熱分解法、水熱合成法、アルコキシド法などの化学合成法や酸化物混合法など、公知の粉末合成方法により製造された粉末を使用することができる。かかる粉末を微粒子に成形する手段としては、例えば、公知の転動造粒成形法、プレス成形法、噴霧造粒成形法、撹拌造粒成形法、ＣＩＰ成形法、鋳込み成形法、押し出し成形法等を採用することができる。前記成形法で所望の大きさに成形した後、得られた成形体を酸化性雰囲気中または大気中で焼結する。焼結温度は１３５０〜１５００℃で、焼結時間は２時間〜３時間が好ましい。さらに、前記焼結後にＨＩＰ（Hot Isostatic Pressing）処理してもよい。必要により粒径を調整する場合は、振動篩い機等により所定の粒度に分級すればよい。焼結後において、微粒子の表面粗さＲａを調整する場合、例えば研磨や熱処理あるいは薬液処理等により本発明の範囲に調整すれば良く、焼結後の表面粗さが本発明の範囲であれば、そのまま使用することも可能である。
【００４０】
微粒子をハイブリダイゼーションの際に移動させることにより、液が効率よく撹拌される。微粒子を移動させる手段としては、好ましくはチップを回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、振とう機に微粒子を含んだチップをセットし基板を振とうさせる方法、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法が用いられるが、チップを振とう機にセットし、水平面内で旋回回転させる方法が、微粒子の移動範囲が大きく、偏り無く移動するため、その結果効率よく液を攪拌できるため好ましい。このとき、旋回回転の回転数は、好ましくは１０〜１０００回転／分、より好ましくは１００〜５００回転／分である。
【００４１】
本発明の分析チップに用いる微粒子は、その表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。この範囲の表面粗さを有する微粒子を封入することで、静電気が発生しにくくなり、効率よく微粒子の封入作業を行うことが可能となる。セラミックス製微粒子の場合、材質の強度を考慮すると、Ｒａ値が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ未満の微粒子を用いると、静電気が発生してしまい封入効率が非常に低下する。また、微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が３００ｎｍより大きい場合、ハイブリダイゼーション後に検体溶液に濁りが見られ、検出結果にムラが生じてしまう。
【００４２】
微粒子の表面粗さを表す中心線平均粗さ、すなわちＲａ値は、ＪＩＳ  Ｂ０６０１：２００１で規定された粗さ曲線の算術平均粗さである。Ｒａ値は、ＪＩＳ規格においては、以下のように触針法により測定される。測定には、ＪＩＳ  Ｂ０６５１  ２００１に従って作られた触針電気式表面粗さ測定機が使用される。本装置は、測定する対象面と触針先端との接触に関係する機械的各要素（位置決め装置、対象物の固定具、測定スタンド、送り装置、プローブ）から成る。測定は対象表面をプローブ先端の触針で曲線的になぞり、触針が対称面の粗さに従って曲線に対して上下方向に動くことを電気信号に変換し、「粗さ曲線」を描くことから始まる。このとき、測定距離（曲線の長さ）はＪＩＳ  Ｂ０６５１  ２００１によって規定されており、それを基準長さｌ（エル）と呼称する。粗さ曲線の算術平均粗さＲａ値は、基準長さｌ内の任意の位置ｘにおける粗さ曲線の高さＺ（ｘ）の絶対値の平均である。
【００４３】
また、微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）は、本発明の微粒子を測定対象とする場合は、走査型電子顕微鏡を使用し、微粒子の表面プロファイル像を観察し、その像からＲａ値を算出することによっても測定することができる。この方法は、より高精度なＲａ値を得ることができるので、好ましく用いられる。
【００４４】
微粒子の大きさ（直径）は特に限定されないが、１０μｍ〜５００μｍが好ましく、５０μｍ〜３００μｍがより好ましい。これより小さい範囲だと、撹拌の効果が十分得られない場合があるため、逆にこれより大きい範囲だと、微粒子を封入するためにカバーと基板との間の空隙を大きくする必要があり、結果的に必要な液量が多くなるため、それぞれ好ましくない。また、基板とカバーに囲まれた空間に検体等の溶液を入れて、封入された微粒子を移動させることで攪拌することを考えると、溶液や微粒子がカバーの貫通孔からこぼれてしまわないように、貫通孔を塞ぐことが好ましい。
【００４５】
カバーを選択結合性物質が固定化された基板に脱着可能な状態で接着する態様は、特に限定されないが、前述したように、カバーと基板が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましく、例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着層を介して接着することができる。
【００４６】
接着層として両面テープを用いる場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましく、具体的には、両面テープの接着力の弱い面を基板側に接着し、接着力の強い面をカバー側に接着することが好ましい。このような態様とすることにより、カバーを剥離する際に、両面テープがカバーに接着した状態で同時に基板より脱離し易く、それにより、基板上への接着層の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号Ｎｏ．５３５Ａ、住友スリーエム株式会社製の製品番号９４１５ＰＣ及び４５９１ＨＬ、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号Ｎｏ．７６９１等が挙げられる。
【００４７】
接着層として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。これらの樹脂組成物を利用することにより、両面テープに比べて密閉性を高めることが可能となるとともに、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。特に、接着層としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、ダウコーニング社のシルガード（登録商標）や、信越化学工業社製の型取り用二液型ＲＴＶゴムを挙げることができる。  
【００４８】
選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合しうる物質をいう。その例として、核酸、タンパク質、糖類、又は他の抗原性化合物が挙げられる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）などを含む。タンパク質は、抗体およびその断片、抗原、酵素基質を含む。糖類は、オリゴ糖、多糖類を含む。他の抗原性化合物は、ペプチド、小分子を含む。好ましい選択性化合物は、核酸及びタンパク質（特に抗体、抗原など）である。この点で、本発明の好ましい分析チップの例は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイともいう）又はプロテインチップである。また、このような選択結合性物質は、市販のものでもよいし、あるいは、合成するか、生体組織又は細胞などの天然源から調製したものでもよい。
【００４９】
特性及び一次構造（塩基配列）が明らかな遺伝子などのＤＮＡについては、その配列に基づいてプローブ又はプライマーを作製し、例えば生物組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを選抜することができる。あるいは、生物組織から全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴカラムを使用してｐｏｌｙＡ  ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）を精製し、ｃＤＮＡクローニングによってｃＤＮＡ、さらにはｃＲＮＡを作製することができる。得られた核酸の検出は、サザン又はノザンブロット法、サザン又はノザンハイブリダイゼーション法などの公知の方法、制限酵素による切断及びマップ化、配列決定などの方法で行うことができる。また、得られた核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子組換え技術（例えばベクターの使用）などによって行うことができる。あるいは、１００マー以下のＤＮＡを、ＤＮＡ合成装置を用いて合成することも可能である。上記の一連の技術は、例えばＡｕｓｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＵＳ  （１９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８９）などを参照することができる。
【００５０】
タンパク質は、天然から文献記載の方法に従って精製するか、あるいは、遺伝子組換え技術（ベクター／宿主系）によって合成することができる。タンパク質を抗原として、ウサギ、マウス、ヤギなどの非ヒト哺乳動物を免疫することによって、該タンパク質に対する抗体を作製することができる。また、マウスなどのネズミにおいては、目的の抗原による免疫刺激を受けた脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合を含む方法によりモノクローナル抗体を作製することができる。抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗ペプチド抗体などが含まれる。これらの抗体の作製は周知の方法を利用して行うことができる。
【００５１】
モノクローナル抗体については、例えばＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＵＳ  （１９８０）；岩崎辰夫ら,  単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ,  講談社サイエンティフィク（１９８７）など、また、ポリクローナル抗体については、例えば松橋直ら,  免疫学実験入門（生物化学実験法１５）,  学会出版センター（１９８２）を参照することができる。
【００５２】
抗ペプチド抗体については、例えばタカラバイオ（株）などが合成委託をしているのでそれを利用して入手することも可能である。簡単に説明すると、タンパク質の一次配列について可動予測、親水・疎水性予測、二次構造予測、極性予測などを行い、タンパク質表面に位置する部位を予測するとともに、免疫動物が本来もたない配列であることをホモロジー検索（ＤＮＡＳＩＳソフト）によって予測し、ペプチド配列を決定する；次いで、その配列に基づいて、ペプチド合成によりペプチドを合成し；ウサギなどの動物に免疫し；血液から抗ペプチド抗体を分離し、親和性カラムなどを用いて精製する。
【００５３】
糖類は、化学的に合成するか、あるいは、糖タンパク質からグリコシダーゼにより切り出すことによって得ることができる。
【００５４】
選択結合性物質を基板に固定化するには、例えばキャピラリー状のペンでスポッティングする方式、インクジェット方式などの公知の手法を利用することができる。スポッティング方式は、スポッターまたはアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いて選択結合性物質をスポットする方法である。具体的には、例えば多数のウエルをもつプレートの各ウエルに異なる溶液を入れておき、この溶液をピン（針）で取り上げて基板上に順番にスポットする。インクジェット方式は、ノズルから微少な液滴を圧電素子などにより噴射し、選択結合性物質を基板に吹き付ける方法である。具体的には、ノズルより遺伝子を噴射し、基板上に高速度で選択結合性物質を整列配置する。あるいは、選択結合性物質が核酸の場合、フォトリソグラフ法により基板上で順次ヌクレオチド合成を行うことができる。
【００５５】
本発明はさらに、上で説明した本発明の分析チップの、それに固定化された選択結合性物質と直接的又は間接的に結合しうる被検試料中の物質の存在又は量の測定への使用方法を提供する。ここでいう選択結合性物質とは、上記の核酸、タンパク質、糖類又は他の抗原性化合物である。
【００５６】
ここでいう被検試料とは、生物学的試料である。生物学的試料は、例えば植物や動物由来の生物学的試料、ヒトを含む哺乳動物由来の組織、細胞、体液などの生物学的試料などを含む。具体的には、例えばヒト疾患関連遺伝子、その発現産物（タンパク質）などである。さらに、生物学的試料には、細菌などの原核生物、酵母、担子菌、藻類、昆虫などの上記以外の真核生物由来の生物学的試料、ウイルス由来の試料などが含まれる。
【００５７】
測定は、基板上に固定化された選択結合性物質と、被検試料中の物質との結合を検出することを含む。選択結合性物質が核酸の場合、測定はＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション又はＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションに基づく。また、選択結合性物質がタンパク質の場合、測定は抗原-抗体反応、すなわち免疫学的反応に基づく。反応温度、時間、バッファなどの条件は、ハイブリダイズさせる核酸の種類や鎖長、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類などに応じて適宜選択される。
【００５８】
ハイブリダイゼーションは、一般にはストリンジェントな条件下で行われる。そのような条件は特に限定されないが、例えば３０〜５０℃で、３〜４×ＳＳＣ、０．１〜０．５％ＳＤＳ中で１〜２４時間のハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液による洗浄を含むことができる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む溶液（ｐＨ７．２）である。
【００５９】
ＤＮＡチップでは、生物の細胞又は組織から抽出されたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡをＣｙ染料で標識したのち、これを試料として基板上のＤＮＡとハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００６０】
免疫学的反応は、例えば基板上に固定化された抗体と、被検試料中の抗原との反応である。検出は、抗体と抗原との免疫複合体を、例えば分光学的方法を用いて測定することによって行われる。測定としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法、蛍光抗体法などの酵素、放射性同位元素又は発蛍光剤を標識とする方法が望ましいだろう。例えば、基板上の抗体と試料中の抗原とを結合させたのち、形成された免疫複合体の抗原と結合可能な標識抗体（すなわち二次抗体）を作用させることによって、標識の強度に基づいて、目的抗原の量又は存在を測定することができる。基板には、抗体ではなく抗原を予め固定化することも可能である。
【００６１】
上記のハイブリダイゼーションや免疫反応を行った後、ＤＮＡチップ上をスキャナーを用いてスキャンし、標識が発する蛍光などのシグナルの強度又は存在を測定する。必要に応じて、測定したデータをコンピュータで解析する。
【００６２】
本発明の分析チップは、カバー表面又はその近傍での気泡の発生が実質的にないため、凹凸構造をもつ基板を特徴とする分析チップが本来的にもつ良好なＳ／Ｎ比、高検出感度などの特性を維持し、測定値のばらつきを改善し、正確で信頼性の高い測定を可能にする。
【実施例】
【００６３】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６４】
実施例１
（ＤＮＡ固定化基板の作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製の基板を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、基板は黒色である。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００６５】
基板の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部分を除き表面は平坦であった。基板の中央に、縦・横２２ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．１５ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部を１２９６（３６×３６）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（１２９６箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、１２９６個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．５ｍｍであった。
【００６６】
上記のＰＭＭＡ基板を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成した。
【００６７】
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ（６０塩基、５’末端アミノ化）を合成した。なお、このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
【００６８】
このＤＮＡを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ＬにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、基板表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。そして、これらの混合溶液をアレイヤー（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ―ＩＩ）で基板凸部上面の全てにスポットした。次いで、基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。この反応スキームを図５に示す。
【００６９】
（カバーの接着）
射出成形法により図６に示す貫通孔を４つ有するカバー（外周部にオーバーハング構造有り）を作製した。
【００７０】
カバーを洗浄剤（クリーンエース（アズワンカタログ、品番：４−０７８−０１）２５倍希釈溶液）に浸漬して５分間超音波洗浄した後、逆浸透水（ＲＯ水）で十分にすすぎ、エアブローにより乾燥させた後、上記で得られたプローブＤＮＡを固定した基板に、洗浄済カバーをＰＤＭＳポリマー（東レダウコーニングシリコーン）により接着した。接着条件は、４２℃２時間である。
【００７１】
（微粒子の調製と封入）
表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が２０（ｎｍ）、平均粒径が１９７μｍの市販ジルコニア製微粒子（東レ株式会社製）を、炭化珪素質研磨材（粒度＃２０）を用い遠心式バレル研磨機で１時間、水中にて研磨を行い、水洗して乾燥した。この研磨後の微粒子の表面粗さは、Ｒａ＝１６５ｎｍであった。かかる微粒子の表面の中心線平均粗さの測定は、その表面をＡｕで真空蒸着した後、走査型電子顕微鏡（株式会社エリオニクス製、型式ＥＳＡ−２０００）で表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）（ｎｍ）を測定した。前記中心線平均粗さは、観察倍率を１０，０００倍、カットオフ値を０とし、任意の１０個について測定し、その平均値を求めた。かかる微粒子の粒径は、実体顕微鏡で任意の１００個以上の微粒子の画像を５０〜１５０倍で撮影した後、画像処理解析ソフト（三谷商事社株式会社製、Ｗｉｎ  Ｒｏｏｆ）により円相当径を求めて平均値を算出し、それを平均粒径とした。その後エタノール溶液に浸漬し、超音波洗浄を５分間行った。さらに同様の洗浄を２回繰り返した。この微粒子をカバーの貫通孔から、基板とカバーの空隙内に１２０ｍｇ封入した。
【００７２】
（検体ＤＮＡの調製）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な配列番号４で表される塩基配列を持つＤＮＡ（９６８塩基、以下、配列番号４のＤＮＡともいう）を用いた。調製方法を以下に示す。
【００７３】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号２のＤＮＡともいう）と配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号３のＤＮＡともいう）を合成した。これを純水に溶解して濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株））（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。
【００７４】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μｌ（タカラバイオ（株）製）、配列番号２のＤＮＡの溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡの溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
【００７５】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので、検体ＤＮＡの長さにはばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００７６】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈した液を指す。同様に、２０×ＳＳＣを純水で２倍に希釈した液を１０×ＳＳＣ、１００倍に希釈した液を０．２×ＳＳＣと表記する）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。
【００７７】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーション用の検体ＤＮＡ溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡ濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった。
【００７８】
（ハイブリダイゼーション）
マイクロピペットを用いて、基板とカバーの空隙（反応槽）にハイブリダイゼーション検体溶液１６５μＬを貫通孔より注入した。このとき、容易に溶液を注入でき、気泡が混入することはなかった。封止材としてシリコンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株））をシート振盪台（東京理化器械（株）製  ＭＭＳ  ＦＩＴ−Ｓ）に密着させて固定し、基板をハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、基板をセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバーのふたを閉めて６本の固定ネジを締めて固定後、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製  ＦＭＳ−１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製  ＭＭＳ−３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから基板を取り出し、基板に接着したカバーとＰＤＭＳポリマーを脱離した後、洗浄、乾燥した。
【００７９】
（測定）
ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）に上記処理後の基板をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態で測定を行った。ここで、蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値であり、バックグラウンドノイズとは、プローブＤＮＡを固定化していない凸部の蛍光強度である。結果を表１に示す。十分な蛍光強度が得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。また、同様の実験を基板１０枚を用いて行ったが、全てのチップにおいて、容易に微粒子を封入することができ、溶液アプライ時も気泡の混入等なく、簡便に行うことができた。
【００８０】
ここで、表１において、操作性（微粒子封入時）の「○」は、空隙内に容易に１２０ｍｇの微粒子を封入可能であったことを示し、「×」はそれが困難であったことを示す。また、操作性（溶液アプライ時）の「○」は、容易に空隙内に気泡を残さずに中に注入可能であったことを示し、「×」は、それが困難であったことを示す。
【００８１】
実施例２
アルミナ質研磨材（粒度＃２２０）で２時間研磨したジルコニア製微粒子を封入した以外は実施例１と同様の実験を行った。この微粒子の表面の中心線平均粗さは、Ｒａ＝４３ｎｍであった。結果を表１に示す。十分な蛍光強度が得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。また、同様の実験を基板１０枚を用いて行ったが、全てのチップにおいて、容易に微粒子を封入することができ、溶液アプライ時も気泡の混入等なく、簡便に行うことができた。
【００８２】
実施例３
実施例１に記載の市販ジルコニア製微粒子を、２０℃の５５％フッ化水素酸（ステラケミファ株式会社製）に２時間浸漬後、水洗して乾燥した以外は実施例１と同様の実験を行った。この微粒子の表面の中心線平均粗さは、Ｒａ＝１１０ｎｍであった。結果を表１に示す。十分な蛍光強度が得られ、バックグラウンドノイズも低く抑えられた。また、同様の実験を基板１０枚を用いて行ったが、全てのチップにおいて、容易に微粒子を封入することができ、溶液アプライ時も気泡の混入等なく、簡便に行うことができた。
【００８３】
比較例１
研磨を行わずに表面の中心線平均粗さＲａ＝２０ｎｍのジルコニア製微粒子をそのまま封入した以外は実施例１と同様の実験を行った。結果を表１に示す。基板１０枚を用いて行ったが、全ての基板で微粒子を封入する際に静電気が発生してしまい、３０ｍｇ程度しか封入することができなかった。また、溶液アプライにおいても静電気により動かなくなった微粒子の間に抜けきらない気泡が残ってしまいハイブリダイゼーションの反応ムラが生じてしまった。封入された微粒子が少なかったため、溶液の攪拌効果も不十分であり、蛍光強度は実施例１、２と比較して低かった。
【００８４】
比較例２
アルミナ質研磨材（粒度＃２２０）で１時間研磨したジルコニア製微粒子を封入した以外は実施例１と同様の実験を行った。この微粒子の表面の中心線平均粗さは、Ｒａ＝３２ｎｍであった。結果を表１に示す。基板１０枚を用いて実験を行ったが、全ての基板で微粒子を封入する際に静電気が発生してしまい、４０〜６０ｍｇ程度しか封入することができなかった。また、溶液アプライにおいても静電気により動かなくなった微粒子の間に抜けきらない気泡が残ってしまいハイブリダイゼーションの反応ムラが生じてしまった。封入された微粒子が少なかったため、溶液の攪拌効果も不十分であり、蛍光強度は実施例１と比較して低かった。
【００８５】
実施例４
実施例３のフッ化水素酸処理したジルコニア製微粒子を、炭化珪素質研磨材（粒度＃２０）を用い遠心式バレル研磨機で３０分、水中にて研磨を行い、水洗して乾燥した以外は実施例１と同様の実験を行った。この微粒子の表面の中心線平均粗さは、Ｒａ＝２５４ｎｍであった。結果を表１に示す。基板１０枚を用いて行ったが、微粒子の封入、溶液のアプライ操作は、実施例１と同様に容易に行うことができ、バックグラウンドノイズが実施例１より大きくなったものの、蛍光強度は実施例１と同等であった。
【００８６】
【表１】
2011164112.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の分析チップは、基板とカバーの空隙に微粒子を封入する作業を容易に行うことができるため、ハイブリダイゼーション反応に必要となる量の微粒子を容易に封入することが可能である。また、本発明の分析チップは、微粒子を空隙内を移動させて分散させてから検体溶液を注入できるため、カバー表面又はその近傍での気泡の発生が実質的にない。したがって、凹凸構造をもつ基板を特徴とする分析チップが本来的にもつ良好なＳ／Ｎ比、高検出感度などの特性を維持し、測定値のばらつきを改善し、正確で信頼性の高い測定を可能にする。このため、生物学、医学、微生物学などの分野で多用されている分析チップの精度向上が可能となり、産業上、非常に有用である。
【符号の説明】
【００８８】
１  基板
２  カバー部材
３  接着層
４  液面駐止チャンバー
５  貫通孔
６  空隙
７  基板に固定化された選択結合性物質
８  微粒子（ビーズ）
９  封止材
１０  検体溶液
１１  プローブＤＮＡ
【図１】
2011164112.tif 000004
【図２】
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【図３】
2011164112.tif 000006
【図４】
2011164112.tif 000007
【図５】
2011164112.tif 000008
【図６】
2011164112.tif 000009
【配列表】
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