(57)【要約】【課題】本発明は、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞培養できる細胞培養基材を提供する。【解決手段】本発明に係る細胞培養基材は、動物由来の生体組織である血管、心臓弁、心膜、角膜、羊膜、硬膜を含む軟組織、骨、軟骨、歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳を含む臓器又はその一部を、界面活性剤又はそれを含み、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら流動するか、振動している処理液に接触させて細胞膜を破壊し、この処理液に接触させる時に、その処理液により動的負荷を与え、抽出された細胞材料を洗浄除去して残った間質構造からなるをことを特徴とし、界面活性剤又はそれを含む処理液に接触させる時に、その処理液により動的負荷を与えることで、血管内皮細胞や平滑筋細胞や各幹細胞などの生着率の向上を図ることができるとともに、将来異種グラフト移植手術の成功率を高め得るという優れた効果を奏する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物由来の生体組織である血管、心臓弁、心膜、角膜、羊膜、硬膜を含む軟組織、骨、軟骨、歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳を含む臓器又はその一部を、界面活性剤又はそれを含み、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら流動するか、振動している処理液に接触させて細胞膜を破壊し、抽出された細胞材料を洗浄除去して残った間質構造からなるをことを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
動物由来の生体組織である血管、心臓弁、心膜、角膜、羊膜、硬膜を含む軟組織、骨、軟骨、歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳を含む臓器又はその一部を、界面活性剤又はそれを含み、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら流動するか、振動している処理液に接触させて細胞膜を破壊し、抽出された細胞材料を洗浄除去して残った間質構造をリングクランプしてなることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項３】
前記処理液の流速又は振動が、前記臓器又はその一部との接触初期には高く又は強く、接触後期には低く又は弱くなるように調整してなることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物由来の生体組織から単離した臓器又はその一部を脱細胞化し、細胞材料を洗浄除去して得た間質構造からなり、生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞培養できる細胞培養基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来から細胞培養は、人工の高分子材料、特に、ポリスチレンを用いて行われてきたことが多い。このポリスチレンは、耐久性、透明性及びコストの点で優れているが、表面が疎水性であり、細胞との接着性で問題であったが、この疎水性の表面をコロナ放電処理して表面のみに陰イオン導入して親水性を付与して細胞との接着性を改善したものが知られている。また、特開平６−１５３９０５号公報の如く、疎水性の表面を親水化させ、その表面にさらにコラーゲンや親水性ポリマーなどを施した技術も開示されている。
【特許文献１】特開平６−１５３９０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、これら人工の高分子材料では、構造が複雑な生体組織を再現することが困難である上に、脱細胞化した臓器（脱細胞臓器スキャフォールド：細胞成分がなく間質構造が主体となる）、例えば芯膜を基材として、これに血管内皮細胞や平滑筋細胞を播種しても生着率や開存率が高まるもののその有効性に関するメカニズムは必ずしも明らかでなかった。
【０００４】
本発明は、上記の点に鑑みて創出したもので、その目的とするところは、動物由来の生体組織から単離した臓器又はその一部を脱細胞化し、洗浄除去して生体環境に近く、生体適合性の高い状態で細胞培養できる細胞培養基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するため、本発明に係る細胞培養基材は、動物由来の生体組織である血管、心臓弁、心膜、角膜、羊膜、硬膜を含む軟組織、骨、軟骨、歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳を含む臓器又はその一部を、界面活性剤又はそれを含み、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら流動するか、振動している処理液に接触させて細胞膜を破壊し、この処理液に接触させる時に、その処理液により動的負荷を与え、抽出された細胞材料を洗浄除去して残った間質構造からなるをことを特徴とし、血管内皮細胞や平滑筋細胞の生着率の向上が得られるように構成した。
【０００６】
また、請求項２に記載の細胞培養基材は、動物由来の生体組織である血管、心臓弁、心膜、角膜、羊膜、硬膜を含む軟組織、骨、軟骨、歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓及び脳を含む臓器又はその一部を、界面活性剤又はそれを含み、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら流動するか、振動している処理液に接触させて細胞膜を破壊し、抽出された細胞材料を洗浄除去して残った間質構造をリングクランプしてなることを特徴とし、血管内皮細胞や平滑筋細胞や各幹細胞などの生着率の向上のほか、多様な実験用途に転用でき、しかも張力計測やイメージングの基本デバイスにもなる、生理学・薬理学実験に有用なツールともなるように構成した。
【０００７】
さらに、請求項３に記載の細胞培養基材は、前記処理液の流速又は振動が、前記臓器又はその一部との接触初期には高く又は強く、接触後期には低く又は弱くなるように調整してなることを特徴とし、間質構造を破壊せずに細胞膜のみの破壊を効率的に行えるように構成した。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、動物由来の生体組織である各種の臓器又はその一部を界面活性剤又はそれを含む処理液に接触させる時に、その処理液により動的負荷を与えることで、血管内皮細胞や平滑筋細胞や各幹細胞などの生着率の向上を図ることができるとともに、将来異種グラフト移植手術の成功率を高め得るという優れた効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
次に、本発明の最良の形態を図面に基いて説明する。図１は本願基材を作製するための装置の一例を示す概略説明図、図２は本願基材を用いて血管平滑筋細胞を播種培養した状態を示す説明図、図３は本願基材をリングクランプした状態を示す斜視図で、（ａ）はクランプ前、（ｂ）はクランプ後である。
【００１０】
本願基材（細胞培養基材）１は、動物由来の生体組織である各種の臓器（例えば、ブタの頸静脈）２を脱細胞処理によって得たものである。脱細胞処理によって臓器２をグラフト化する手法は、臓器特有の組織骨格を利用した点で生体適合性において極めて優れている。この脱細胞処理は、図１の如く、温度調整機３にて０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら発振機４により振動させた液槽５内の処理液６に接触させることにより行う。この処理液６は、界面活性剤又はこれを含むものである。この動的負荷（力学的な負荷）を与えられた処理液６に接触させることにより細胞膜を破壊し、抽出された細胞材料を洗浄除去して残った間質構造からなるスキャフォールド７に血管内皮細胞や平滑筋細胞や各幹細胞などの細胞、例えば、血管平滑筋細胞を播種して培養すると、図２の如く、生体で見られる長紡錘形の平滑筋細胞に近似した形状の細胞８で増殖させることができ、移植・再生医療への応用が可能である。
【００１１】
前記細胞が、足場（スキャフォールド）と接着する際、接着の細胞の形態や増殖性あるいは生理機能に大きな影響を与える。すなわち、脱細胞処理しようとする臓器２への力学的負荷は、細胞と足場の相互作用に多大な影響を与え、かつ、細胞の生理機能発現に重要な作用をもたらす。特に、力学的な負荷のかかる血管ではそれが顕著であるといえる。
【００１２】
前記臓器２の間質構造からなるスキャフォールド７を、図３の如く、上下の２つのリング９、９′の間に挟み込んで固定し、そのリングクランプされたスキャフォールド７にレシピエント由来の細胞、例えば、血管平滑筋細胞を播種して培養すると、移植臓器の生着率向上のほか、シンプルにして多様な実験用途に応用可能であるとともに、動的負荷による細胞応答を解析するためのツールとしても有用なものとなる。
【００１３】
前記温度調整機３にて液槽５内の処理液６の温度を、０°Ｃ〜４０°Ｃに維持しながら振動を付与する。これは振動付与時において処理液の液温が、０°Ｃ未満や４０°Ｃ以上になることを、生体力学特性を変化させないため、及び構成マトリックスの変性を防ぐために避けねばならない。このためには、この温度は、常に、温度センサー（図示せず）により感知され、制御される。
【００１４】
前記液槽５は、これを例えば、図示しない環状に形成し、該液槽内の界面活性剤又はそれを含む処理液を循環流動させ、この処理液６の温度を、０°Ｃ〜４０°Ｃに維持しながら流動中に動物由来の生体組織である臓器２を接触させるようにすることもある。この流動は、例えば液槽５の側壁に設けた水流ポンプ（図示せず）により作られるが、その流速及び温度は常に感知センサーにより感知され制御されることは勿論である。
【００１５】
前記処理液の液槽５の振動は、その周波数２０〜１００ｋＨｚで、正味の振動時間として１時間乃至２４時間が適当である。細胞膜を破壊し、抽出された細胞材料を洗浄除去する洗浄液は、新鮮なものがよい。また、前記振動を均等に付与するために３次元アクチュエータ（図示せず）を液槽５の下に設置しておくこともできる。
【００１６】
前記処理液６中に浸漬した動物由来の生体組織である臓器２としては、血管、心臓弁、心膜、角膜、羊膜、硬膜を含む軟組織と、骨、軟骨、歯を含む硬組織と、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脳を含む。勿論、臓器の一部も含まれる。
【００１７】
前記動物由来の生体組織である臓器２から細胞成分を除去し、間質構造を作成する処理に適用する処理液としては、界面活性剤又はその溶液（水、高張液、低張液、酸素液等）が使用される。また、少割合の有機溶媒、グルタルアルデヒドのような化学的固定剤の溶液を使用することも可能である。
【００１８】
前記臓器２の移植の領域において、臓器グラフトにレシピエント由来の内皮細胞を播種・生育して移植することで、グラフトの長期開存率を高くする。その臓器２に力学的負荷を加えて生理機能を移植前に最適化させることが有利である。すなわち、移植後のグラフト生着率・開存率が高めるためには、冠動脈への自己血管の移植に際して、力学的に弱い静脈グラフト（大伏在静脈など）の長期開存率は、動脈グラフトに比して低い。このために、血管グラフトに播種された細胞の生理機能の力学付加による適正化は、移植において考慮すべきである。
【００１９】
血管移植の臨床において有機材料による人工血管が用いられる頻度が高い現況の中で、移植用血管グラフトの新しい戦略を明確に設定し、臨床応用を目指した課題は極めて萌芽的でチャレンジ性の高い研究テーマである。脱細胞化した血管という生体適合性にすぐれたグラフト基材に、レシピエントの血管平滑筋細胞を播種したのち力学的付加に加えてから移植することで、移植成功率を向上させる。
【００２０】
グラフトの物性及び力学的環境を生体における状況とできるだけ同じにすることで、グラフトに播種された細胞の生理機能発現の最適化を図り得る。機能的に優れた血管グラフトが家畜動物から大量に生産できるようになり、糖尿病等で自己血管の移植使用が困難な患者への福音となる。一方で、クランプリングと脱細胞スキャフォールドの組合せは、仕組みが簡単なうえ、形状がシンプルであるために多様な実験用途に転用でき、張力計測やイメージングの基本デバイスにもなり、生理学・薬理学実験に有用なツールともなる。
【実施例１】
【００２１】
まず、摘出したブタ頸静脈を切開、約１０ｍｍ角に伸展させ、これを４°Ｃに維持しながら振動させた液槽内の界面活性剤である１％デオキシコール酸または１％トリトンＸ−１００などを含む緩衝液に９０分間、接触させて脱細胞処理を行い、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄して得た間質構造を取り出した。次いで、組織断面をＨＥ染色により光学顕微鏡観察することで組織学的に評価した。その結果、間質構造は振動させた液槽内での処理の場合には、振動させない液槽内での処理の場合と比較してより組織深部まで細胞を除去することができた。
【実施例２】
【００２２】
摘出したブタ頸静脈を切開、約１０ｍｍ角に伸展させ、これを４°Ｃに維持しながら環状に形成した液槽内において、界面活性剤である１％デオキシコール酸または１％トリトンＸ−１００などを含む緩衝液を循環流動させ、この流動中に９０分間接触させて脱細胞処理を行い、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄して得た間質構造を取り出した。処理後、組織断面をＨＥ染色により光学顕微鏡観察することで組織学的に評価した。その結果、ブタ頸静脈からなる間質構造は流動させた液槽内での処理の場合には、流動も振動させない液槽内での処理の場合と比較してより組織深部まで細胞を除去することが確認できた。換言すれば、脱細胞化前と脱細胞化後の細胞の残存率の差を見ることにより判った。
【実施例３】
【００２３】
実施例１と同様のサンプルを振動させた液槽内の界面活性剤である１％デオキシコール酸または１％トリトンＸ−１００などを含む緩衝液に接触させて得た間質構造を、２つのリングの間に挟み込んで固定する。そのリングクランプされたスキャフォールドに、血管平滑筋細胞を播種して培養すると、シンプルにして多様な実験用途に応用可能であるし、動的負荷による細胞応答を解析するためのツールとしても有用であることが判った。
【実施例４】
【００２４】
実施例１と同様のサンプルを振動させた液槽内の界面活性剤である１％デオキシコール酸または１％トリトンＸ−１００などを含む緩衝液に接触させ、接触初期には振動を強くし、接触後期には振動を弱くなるように調整したところ、処理時間を短縮して細胞除去効果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本願処理方法は、正常に機能しない患者自身の器官や組織に代わって移植し、正常な機能を回復させる再生医療技術および多様な細胞の成長分化を観察するための三次元的足場としての研究材料技術の分野において有効であり、所定の生体組織に存在する原細胞の除去を効率的に行うことができ、医療の現場での利用性、すなわち、産業上の利用可能性は極めて高いものである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本願基材を作製するための装置の一例を示す概略説明図である。
【図２】本願基材を用いて血管平滑筋細胞を播種培養した状態を示す説明図である。
【図３】本願基材をリングクランプした状態を示す斜視図で、（ａ）はクランプ前、（ｂ）はクランプ後である。
【符号の説明】
【００２７】
１  本願基材（細胞培養基材）
２  臓器
３  温度調整機
４  発振機
５  液槽
６  処理液
７  スキャフォールド
８  長紡錘形の細胞
９、９′  リング
【図１】
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【図２】
2011135836.tif 000004
【図３】
2011135836.tif 000005