(57)【要約】【課題】歯肉溝液中の生体内物質をリアルタイム、かつ高精度に、そして非侵襲的に、測定可能な技術の提供。【解決手段】本発明では、歯肉溝液中に存在する生体内物質を検出するための用具であって、歯肉溝に挿入可能な歯肉溝挿入部を備え、該歯肉溝挿入部には、前記生体内物質を光学的に検出可能とする検出用物質を含有する感応部が設けられた生体内物質検出用プローブを提供する。本発明によれば、歯肉溝液中の生体内物質を歯肉溝中で測定することができるため、歯肉溝液中の生体内物質を、リアルタイムかつ高精度に、そして、非侵襲的に測定することが可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯肉溝液中に存在する生体内物質を検出するための用具であって、
歯肉溝に挿入可能な歯肉溝挿入部を備え、
該歯肉溝挿入部には、前記生体内物質を光学的に検出可能とする検出用物質を含有する感応部が設けられた生体内物質検出用プローブ。
【請求項２】
前記感応部への光照射および／または前記感応部からの光検出を行うための光導波路が備えられた請求項１記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項３】
前記光導波路は光ファイバーで形成された、請求項２記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項４】
前記歯肉溝挿入部はその短辺または短径が０．２ｍｍ以下である、請求項１から３のいずれか一項に記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項５】
前記歯肉溝挿入部には、歯肉溝液を毛細管現象により採取し得る毛細管部が設けられ、該毛細管部を介して前記歯肉溝液が前記感応部に導入される請求項１から４のいずれか一項に記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項６】
前記毛細管部の内壁面に前記感応部が設けられており、該感応部に前記検出用物質が固定化された構成である、請求項５記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項７】
前記光導波路は、前記毛細管部の側胴部に連結されている、請求項６記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項８】
前記固定化が光反応によって行われる、請求項６記載の生体内物質用プローブ。
【請求項９】
前記検出用物質は、前記生体内物質と特異的に結合することにより蛍光強度が変化する物質である、請求項１から８のいずれか一項に記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１０】
前記蛍光強度が変化する物質は、ボロン酸化合物である、請求項９に記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１１】
前記検出用物質は、
（１）１種または複数種の酵素、（２）光学的測定の対象となり得る物質、
から構成される、請求項１から８のいずれか一項に記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１２】
前記光学的測定の対象となり得る物質は、酵素反応の生成物である過酸化水素との反応により蛍光源に変換される物質である、請求項１１記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１３】
前記蛍光源は、レソルフィン（Resorufin）である、請求項１２に記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１４】
前記光学的測定の対象となり得る物質は、前記酵素反応の生成物である過酸化水素との反応により吸光度が変化する物質である、請求項１１記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１５】
前記吸光度が変化する物質は、オルトジアニシジン（ο-dianisidine）である、請求項１４記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１６】
前記酵素は、前記歯肉溝液中の前記生体内物質が関与する反応を触媒する第１の酵素と、
前記反応によって生成される生成物が関与する反応を触媒する第２の酵素と、から構成される、請求項１０記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１７】
前記第１の酵素が、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウリカーゼ（尿酸オキダーゼ）、乳酸オキシダーゼ、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、サルコシン酸化酵素、およびコレステロール酸化酵素のいずれか一つから選択される、請求項１６記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１８】
前記第２の酵素は、ペルオキシダーゼ（peroxidase）である、請求項１５記載の生体内物質検出用プローブ。
【請求項１９】
歯肉溝に挿入可能な歯肉溝挿入部を備え、
該歯肉溝挿入部には、生体内物質を光学的に検出可能とする検出用物質を含有する感応部が設けられた生体内物質検出用プローブと、
該生体内物質検出用プローブの前記感応部に対して光を照射する光照射手段と、
該光照射手段による光照射によって前記感応部中からの光学的情報を検出する光検出手段と、
が少なくとも備えられた歯肉溝液中の生体内物質検出装置。
【請求項２０】
前記光照射手段による光照射によって前記感応部中からの光学的情報を分離するダイクロイック素子を更に備える請求項１９に記載の生体内物質検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯肉溝液中の生体内物質を検出するための用具として用いる生体内物質検出用プローブに関する。より詳しくは、歯肉溝液中の生体内物質を光学的に検出可能とする生体内物質検出用プローブ、および該生体内物質検出用プローブを用いた生体内物質検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内物質の検出には、通常、血液を採取して、血液中の生体内物質を光学的または電気的に調べることが一般的に行われている。しかしながら、血液採取は、侵襲的な方法であり、採取者に医療的な資格なども必要であり、また、高コストである。更に、実際の検出・測定では、血液の精製が必要であり、検出・測定結果を得るのに、手間と時間を要するという問題もある。加えて、連続的な測定を行うためには、サンプリングの回数を増やす必要があり、被験者への負担も大きい。そのため、リアルタイムな測定が不可能であるという問題もある。
【０００３】
そこで、近年、生体への侵襲性を低減させるための様々な方法が開発されつつある。血糖値測定を例に挙げて、無侵襲性若しくは低侵襲性の測定方法を以下説明する。
【０００４】
無侵襲性測定方法としては、真皮や腕、指先などを対象として、近赤外光を用いて散乱透過スペクトルを測定することにより血中のブドウ糖値を測定する方法、口唇粘膜を対象として、赤外光を用いて散乱スペクトルを測定することにより血中のブドウ糖値を測定する方法、指先を対象として、ラマン散乱スペクトルを測定することにより血中のブドウ糖値を測定する方法、皮膚を対象として、光音響測定を行うことにより血中のブドウ糖値を測定する方法、などが挙げられる。
【０００５】
これらの無侵襲性測定方法は、リアルタイムに血中ブドウ糖値を測定することができる反面、採血による測定方法に比べ、その精度が劣ることが問題である。
【０００６】
低侵襲性測定方法としては、腕から体液（細胞間液）をイオンフォートレーシスで採取することにより体液中のブドウ糖値を測定する方法、皮膚から超音波を用いて体液を採取することにより体液中のブドウ糖値を測定する方法、腕からバッチやカニューレを用いて体液を採取することにより体液中のブドウ糖値を測定する方法、眼から涙液を採取し、蛍光測定を行うことにより涙液中のブドウ糖値を測定する方法、眼から涙液を採取し、ホログラム回析を行うことにより涙液中のブドウ糖値を測定する方法、口内から唾液を採取して唾液中のブドウ糖値を測定する方法、尿を採取して尿中のブドウ糖値を測定する方法、などを挙げることができる。
【０００７】
これらの低侵襲性測定方法では、体液中のブドウ糖値は血中のブドウ糖値に比べ３０分程度遅れるためにリアルタイムな測定が不可能であること、体液、涙液、唾液、尿中のブドウ糖濃度は、血中のブドウ糖濃度に比べ１／１０以下と低いことから正確な血中ブドウ糖濃度の測定が困難であること、口内から唾液を採取するには安定したサンプリングが難しいため、正確なブドウ糖値の測定が困難であること、などの問題がある。
【０００８】
ところで、非侵襲的な測定方法として、歯肉溝液中の生体内物質を検出する方法が開発されつつある。例えば、歯肉溝液中のブドウ糖値は血中のブドウ糖値と比べ、ほぼ同等に推移することが分かっている。そのため、歯肉溝液中のブドウ糖値を測定することで、糖尿病の診断、治療、管理を行うことができる。
【０００９】
また、肝機能のパラメータであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性は、歯肉溝液中の数値と血中の数値が、それぞれ相関することが分かっている。そのため、歯肉溝液中のＡＳＴ活性、ＡＬＴ活性を測定することで、肝機能低下の程度を調べることができる。
【００１０】
このように歯肉溝液中の生体内物質を測定する技術として、特許文献１には、歯肉溝液に含まれる化学物質濃度から血糖値などの生体情報を非侵襲的に推定するという着想に基づき、歯肉溝液を、毛細管現象を用いて吸引可能とするキャピラリー装置に関する技術が開示されている。
【００１１】
また、特許文献２には、横断面において、外郭部と前記外郭部から求心方向に突出した複数のリブ部とからなり、その各部間に長手方向に液体を吸い上げる複数の毛細管通路を一端から他端まで貫通形成することにより、採取部からピンポイントで数μL以下の微量体液を定量採取することが可能な採取具が開示されている。
【００１２】
これらの技術では、前記キャピラリー装置または前記採取具を用いて歯肉溝液などの体液を採取した後に、採取した体液中の生体内物質の値を測定する方法であるため、サンプルのハンドリングが煩雑であり、時間的にも労力的にも手間が多く、熟練を要する。また、連続測定のためには、サンプリング回数を頻繁に行う必要があり、事実上、リアルタイムに生体内物質の値を測定することも不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００１−２０１４３７号公報
【特許文献２】特開２００５−２８３３６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前述のように、近年、歯肉溝液中の生体内物質を測定することにより、あらゆる疾病の診断、治療、管理を行う技術が開発されている。しかしながら、現在までには、特許文献１に記載された技術のように、歯肉溝液中の生体内物質をリアルタイムに測定する技術までは、到達できていないのが現状である。また、歯肉溝という非常に狭い部位から検体を採取するため、採取可能な歯肉溝液は少量であり、測定精度の安定性を保つことができないという問題もあった。
【００１５】
そこで、本発明では、歯肉溝液中の生体内物質を、リアルタイムかつ高精度に、そして非侵襲的に、測定可能な技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本願発明者らは、前記の目的を解決するために鋭意研究を行った結果、歯肉溝液を採取するという発想を根本的に転換し、歯肉溝中で生体内物質を測定するという発想に立つことにより、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
まず、本発明では、歯肉溝液中に存在する生体内物質を検出するための用具であって、歯肉溝に挿入可能な歯肉溝挿入部を備え、該歯肉溝挿入部には、前記生体内物質を光学的に検出可能とする検出用物質を含有する感応部が設けられた生体内物質検出用プローブを提供する。前記感応部への光照射および／または前記感応部からの光検出を行うための光導波路が備えられた構成、例えば、光導波路を光ファイバーで形成できる。
前記歯肉溝挿入部はその短辺または短径が０．２ｍｍ以下とし、さらに、該歯肉溝挿入部には、歯肉溝液を毛細管現象により採取し得る毛細管部を設け、該毛細管部を介して前記歯肉溝液が前記感応部に導入する。さらに、毛細管部の内壁面に感応部を設け、該感応部に前記検出用物質を固定化する構成を採用できる。この場合、前記光導波路を、毛細管部の側胴部に連結する構成も採用できる。なお、前記固定化は光反応によって行ってもよい。
前記検出用物質については、前記生体内物質と特異的に結合することにより蛍光強度が変化する物質、例えば、ボロン酸化合物を採用してもよい。あるいは、検出用物質について、（１）１種または複数種の酵素、（２）光学的測定の対象となり得る物質、以上（１）、（２）から構成してもよい。
前記光学的測定の対象となり得る物質は、酵素反応の生成物である過酸化水素との反応により蛍光源に変換される物質、例えば、レソルフィン（Resorufin）を採用してもよく、あるいは、前記酵素反応の生成物である過酸化水素との反応により吸光度が変化する物質、例えば、オルトジアニシジン（ο-dianisidine）を採用してもよい。
前記酵素は、前記歯肉溝液中の前記生体内物質が関与する反応を触媒する第１の酵素と、前記反応によって生成される生成物が関与する反応を触媒する第２の酵素と、から構成してもよく、この場合、前記第１の酵素を、例えば、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウリカーゼ（尿酸オキダーゼ）、乳酸オキシダーゼ、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、サルコシン酸化酵素、およびコレステロール酸化酵素のオキシダーゼ類から少なくとも一つを選択できる。前記第２の酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ（peroxidase）を採用できる。
【００１８】
次に、本発明では、歯肉溝に挿入可能な歯肉溝挿入部を備え、該歯肉溝挿入部には、生体内物質を光学的に検出可能とする検出用物質を含有する感応部が設けられた生体内物質検出用プローブと、該生体内物質検出用プローブの前記感応部に対して光を照射する光照射手段と、該光照射手段による光照射によって前記感応部中からの光学的情報を検出する光検出手段と、が少なくとも備えられた歯肉溝液中の生体内物質検出装置を提供する。前記光照射手段による光照射によって前記感応部中からの光学的情報を分離するダイクロイック素子を更に備えるようにしてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、歯肉溝液中の生体内物質を歯肉溝中で測定することができるため、歯肉溝液中の生体内物質を、リアルタイムかつ高精度に、そして非侵襲的に、測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図２】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１の断面形状を模式的に例示す断面模式図である。
【図３】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第２実施形態と生体内物質を検出するための装置との接続方法を説明するための模式概念図である。
【図４】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第３実施形態の歯肉溝挿入部１１を側方から視た断面模式図である。
【図５】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第４実施形態の歯肉溝挿入部１１を側方から視た断面模式図である。
【図６】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第５実施形態の歯肉溝挿入部１１を側方から視た断面模式図である。
【図７】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第６実施形態の歯肉溝挿入部１１を側方から視た断面模式図である。
【図８】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第７実施形態の歯肉溝挿入部１１を側方から視た断面模式図である。
【図９】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第８実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図１０】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第９実施形態の毛細管部１４を模式的に示す拡大模式概念図である。
【図１１】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第１０実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図１２】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第１１実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図１３】本発明に係る生体内物質検出用プローブ１を構成する毛細管部の側胴部に光導波路を接続した実施形態例の基本構成を示す図である。
【図１４】本発明に係る生体内物質検出装置１０の第１実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図１５】本発明に係る生体内物質検出装置１０の第２実施形態を模式的に示す模式概念図である。
【図１６】実施例１において作製したスライドガラス上の感応部の８倍拡大写真である。
【図１７】実施例３において、100 mg/dLのD-グルコース/PBS溶液10μLを感応部上に滴下して、蛍光強度を測定した図面代用グラフである。
【図１８】実施例３において、感応部上に、リン酸緩衝食塩水（PBS）10μLのみを滴下した場合と、100 mg/dLのD-グルコース溶液10μLを滴下した場合の蛍光強度の違いを示す図面代用グラフである。
【図１９】実施例５において、感応部を有さない生体内物質検出用プローブを用いて、レソルフィン水溶液中から発せられる蛍光を測定した結果を示す図面代用グラフである。
【図２０】実施例５において、感応部を有さない生体内物質検出用プローブを用いて、スライドガラス上の感応部中から発せられる蛍光を測定した結果を示す図面代用グラフである。
【図２１】実施例６において、本発明に係る生体内物質検出用プローブを用いて、D-グルコースの検出を行った結果を示す図面代用グラフである。
【図２２】実施例８において、本発明に係る生体内物質検出用プローブを、リン酸緩衝食塩水（PBS）1 mLのみに浸漬した場合と、D-グルコース溶液1 mLに浸漬した場合の蛍光強度の違いを示す図面代用グラフである。
【図２３】実施例９において、本発明に係る生体内物質検出用プローブを用いて、D-グルコースの定量結果を示す図面代用グラフである。
【図２４】実施例１０において、光反応性のジアジド化合物を含む光固定化用水溶液を用いることにより、光ファイバー端面に感応部を形成した構成の生体内物質検出用プローブの蛍光測定結果を示す図面代用グラフである。
【図２５】実施例１１に関する蛍光観察画像である。詳しくは、実施例１０と同様の光固定化用水溶液を用いて毛細管内壁に形成された感応部における蛍光観察画像である。
【図２６】実施例１２に関する蛍光測定結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、毛細管内壁に形成された感応部を有するプローブ及び該プローブに接続された蛍光測定器によるD-グルコース濃度違いの蛍光測定結果を示すグラフである。
【図２７】実施例１３に関する蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、毛細管内壁に形成された感応部を有するプローブ及び該プローブに接続された蛍光測定器によるエタノールの蛍光検出測定結果を示すグラフである。
【図２８】実施例１４に関する蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、実施例１３で採用した検出用プローブと同様のプローブを用いて、D-グルコース検出に係わる蛍光測定を行なった結果を示す図面代用グラフである。
【図２９】実施例１５に関する蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、毛細管内壁に形成された感応部を有するプローブ及び該プローブに接続された蛍光測定器による尿酸の蛍光検出測定結果を示すグラフである。
【図３０】実施例１６に関する蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、毛細管内壁に形成された感応部を有するプローブ及び該プローブに接続された蛍光測定器による乳酸の蛍光検出測定結果を示すグラフである。
【図３１】実施例１７に関する蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、毛細管内壁に形成された感応部を有するプローブ及び該プローブに接続された蛍光測定器による糖化アルブミン及びアルブミンの蛍光検出測定結果を示すグラフである。
【図３２】実施例１８に関する蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、毛細管内壁に形成された感応部を有するプローブ及び該プローブに接続された蛍光測定器によるクレアチニン及びクレアチンの蛍光検出測定結果を示すグラフである。尚、（a）はクレアチニアーゼ含有、（ｂ）はクレアチニアーゼ非含有である。
【図３３】実施例１９に関する蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。詳しくは、毛細管内壁に形成された感応部を有するプローブ及び該プローブに接続された蛍光測定器によるコレステロール及び混合サンプルの蛍光検出測定結果を示すグラフである。尚、（ａ）はコレステロール・エステラーゼ含有、（ｂ）はコレステロール・エステラーゼ非含有である。
【図３４】本発明に係わる生体内物質検出用プローブ１を構成する毛細管部に空気孔を設けない場合（ａ）と設けた場合（ｂ）のそれぞれの明視野像及び蛍光像を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は、以下の順序（インデックス）に従って行う。
【００２２】
１．生体内物質検出用プローブ１
（１）歯肉溝挿入部１１
（２）感応部１２
（２―１）生体内物質が糖類である場合
（２−１−１）生体内物質：糖類／検出用物質：ボロン酸化合物
（２−１−２）生体内物質：グルコース／検出用物質：グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）
（２−２）生体内物質がアルコールである場合
（２−２−１）アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）
（２−３）生体内物質がプリン誘導体の場合
（２−３−１）生体内物質：尿酸／検出用物質：ウリカーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）
（２−４）生体物質が解糖系生成物の場合
（２−４−１）生体内物質：乳酸／検出用物質：乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−５）生体物質が糖化タンパク質の場合
（２−５−１）生体内物質：糖化アルブミン又はアルブミン／検出用物質：プロテアーゼ、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−５−２）生体内物質：糖化アルブミン又はアルブミン／検出用物質：ａ成分  プロテアーゼ、およびｂ成分  フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−６）生体物質がアミノ酸の場合
（２−６−１）生体内物質：クレアチニン又はクレアチン／検出用物質：クレアチニアーゼ、クレアチナーゼ、サルコシン酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−６−２）生体内物質：クレアチニン又はクレアチン／検出用物質：クレアチナーゼ、サルコシン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、および10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−７）生体物質が脂質の場合
（２−７−１）生体内物質：コレステロール又はコレステロール・エステル／検出用物質：コレステロール・エステラーゼ、コレステロール酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−７−２）生体内物質：コレステロール又はコレステロール・エステル／検出用物質：コレステロール酸化酵素、ペルオキシダーゼ、および10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−８）生体内物質の他の候補例
（３）光導波路１３
（４）毛細管部１４
【００２３】
２．生体内物質検出装置１０
（１）光照射手段１５
（２）光検出手段１６
（３）ダイクロック素子１７
（４）集光レンズ１８
（５）光学フィルター１９
【００２４】
＜１．生体内物質検出用プローブ＞
図１は、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第１実施形態を模式的に示す模式概念図である。本発明に係る生体内物質検出用プローブ１は、歯肉溝液中に存在する生体内物質を検出するための用具であって、大別すると、歯肉溝挿入部１１、感応部１２、を少なくとも備える。また、必要に応じて、光導波路１３、毛細管部１４を備えることも可能である。以下、各々について、詳細に説明する。
ここで、本発明でいう「歯肉溝液」とは、歯肉溝に存在し、歯組織からの生体内物質を含む液である。具体的には、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ：歯肉から滲出した血漿成分や組織液成分を含む液）や歯肉から出血した血液（白血球成分、赤血球成分、血漿等を含む）などが挙げられる。なお、一般的に「歯肉溝」とは、歯組織において、歯と歯肉の境目になる溝をいう。
【００２５】
（１）歯肉溝挿入部１１
本発明に係る生体内物質検出用プローブ１は、まず、歯肉溝に挿入可能な歯肉溝挿入部１１を有する。この歯肉溝挿入部１１は、歯肉溝に挿入可能であれば、その形態やサイズは特に限定されず、目的に合うように自由に設計することができる。例えば、実施形態１に示す断面形状が円形の形態に限らず、図２（ｂ）から（ｆ）に示すように、断面形状が楕円形、正方形、長方形、三日月形などの形態に設計することも可能である。
【００２６】
また、特に図示しないが、歯肉溝挿入部１１の先端から本体へ向かって徐々に口径や断面積が大きくなるようなテーパー形状に設計することも可能である。このようなテーパー形状に設計することで、歯肉溝への挿入作業を容易に行うことができ、かつ、被験者の歯肉を傷つけてしまうのを防止することができる。
【００２７】
歯肉溝挿入部１１の大きさは、歯肉溝に挿入可能であれば、自由に設計することができるが、健常人の歯肉溝は、幅約０．２ｍｍ、深さ約２ｍｍであることから、その短辺または短径（図２中符号Ｌ参照）を０．２ｍｍ以下とすることが好ましい。０．２ｍｍ以下とすれば、歯肉溝へ挿入する際、歯肉に刺激や損傷が加わるのを防止することができるからである。
【００２８】
歯肉溝挿入部１１に用いる材料は、歯肉溝に挿入可能であれば特に限定されないが、可撓性を有する材料を用いることが好ましい。可撓性を有する材料を用いて歯肉溝挿入部１１を形成することにより、被験者の歯肉を傷つけるのを防止することが可能である。可撓性を有する材料の一例としては、樹脂、金属、セラミック、紙、フェルト材のような布などを挙げることができる。
【００２９】
本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１以外の部分は、生体内物質を検出するための装置に接続可能であれば、その形態、大きさなどは特に限定されず、目的に応じて自由に設計することができる。例えば、後述するように、光ファイバーを用いる場合などには、図３の第２実施形態に示すように、フェルール（光コネクタ部材）Ｆ１とスリーブＳを用いて本体を形成し、フェルールＦ１と装置側のフェルールＦ２とを、スリーブＳにて接続することで、光学的検出を可能にすることができる。
【００３０】
なお、第２実施形態では、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１側にスリーブＳを備えているが、この実施形態例に限定されず、装置側のフェルールＦ２にスリーブＳを備えるか、若しくは、接続する際にのみスリーブＳを用いるように設計することも自由である。
【００３１】
（２）感応部１２
歯肉溝挿入部１１には、感応部１２を設ける。この感応部１２には、生体内物質との相互作用により該生体内物質を光学的に検出可能とする１種または複数種の検出用物質を含有させる。
【００３２】
感応部１２の形成方法は、感応部１２に前記検出用物質を含有させることができれば特に限定されず、自由な方法を用いて形成することができる。例えば、前記検出用物質、あるいは検出用物質に加えてその他の物質をも含有する溶液を歯肉溝挿入部１１の任意の位置に塗布し、固定化反応、乾燥等を実施することで、歯肉溝挿入部１１に直接、前記検出用物質を固定化した状態の感応部１２を形成することができる。
【００３３】
また、生体に悪影響を及ぼさない材料を用いた膜体中に、前記検出用物質を固定化することで形成することも可能である。より具体的には、例えば、前記検出用物質を含有する溶液と前記膜体を形成し得る材料を含有する溶液とを混合し、歯肉溝挿入部１１の任意の位置に塗布し、乾燥、光照射などを行うことにより、歯肉溝挿入部１１に前記検出用物質が固定化された膜状の感応部（以下、感応膜）を形成することができる。
【００３４】
この場合、感応膜を形成する材料は、前記検出用物質を固定化することができ、生体に悪影響を及ぼさない素材であれば特に限定されず、公知の素材を自由に選択して用いることができる。例えば、紫外線硬化樹脂、熱硬化樹脂、アガロース・ゲル、ポリアクリルアミド・ゲル、グルタルアルデヒド、その他多孔質の固定材料や一般的に用いられている酵素固定化剤などを用いることができる。
【００３５】
感応膜を形成するこれらの素材は、固定化する前記検出用物質の種類、性質などに応じて、選択すればよい。例えば、後述するように、感応部１２に酵素を含有させる場合には、熱などにより酵素活性が損なわれないように、紫外線硬化樹脂などを選択することが好ましい。
【００３６】
本発明に係る生体内物質検出用プローブ１は、生体内物質の検出を光学的に実施できる装置を用いて、リアルタイムに生体内物質を検出することができる。
一方、電気化学センサなどを用いて、電極を直接、歯肉溝に挿入することにより、理論的には、電気化学的な測定をリアルタイムに行うことが可能である。しかしながら、このような電気化学センサなどを用いた場合、歯肉溝液中の塩成分が測定に用いるセンサの電極上に析出するため、測定値のバラつきが生じ、医療的診断に耐え得る精度を持つ検査値を得ることが困難である。また、歯肉溝液中の塩成分によってセンサが破損しやすく、高コストであり、連続測定を行うもの難しい。
しかし、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１には、その感応部１２中に、生体内物質を光学的に検出可能とする物質が含有されている。このため、目的の生体内物質を光学的な検出を行うことが可能となるので、高精度な測定値を得ることができる。
【００３７】
感応部１２に含有させる検出用物質は、生体内物質との相互作用、化学反応、酵素反応等により生体内物質を光学的に検出可能とするものであれば特に限定されず、検出の対象となる生体内物質に応じて、自由に選択して用いることができる。
【００３８】
この検出の対象となる生体内物質は、様々な分野の分析・解析に用いることができるものである。以下に示すような、糖類、プリン誘導体、解糖系生成物、アミノ酸および脂質などは、特に医療分野では、糖尿病、脂質異常症、高尿酸血症などの生活習慣病やその他の代謝障害症などの重要な指標となるものである。更に、これに関連する疾患、例えば動脈硬化、脳梗塞、くも膜下出血、心不全などの心疾患・脳血管系疾患など幅広い疾患の予防・改善・治療の指標ともなる。このような生体内物質は、健康管理上又は症状の変化を観る上で、一定間隔で、場合によっては時間毎に、長期間モニタリングすることが望ましい。しかし、血液採取などの侵襲的な測定方法では、対象者の負担などから困難である。これに対し、本発明によれば、非侵襲的に測定できるので、一定間隔で、必要に応じて時間毎に、長期間のモニタリングも行い易い。また、本発明は、非侵襲的に簡便に測定できるので、医療分野に限らず、鑑識などの幅広い分野で利用可能である。
以下、検出対象となる生体内物質を例示し、それに適する検出用物質の例を挙げて説明する。
【００３９】
（２−１）生体内物質が糖類である場合
糖類としては、リボース、グルコース、ガラクトース、およびフルクトースなどの単糖類、並びに乳糖およびショ糖などの二糖類などが挙げられる。
例えば、前述の通り、歯肉溝液中のブドウ糖値は血中のブドウ糖値とほぼ同等に推移することが分かっている。そのため、歯肉溝液中のブドウ糖値を測定することで、糖尿病や高血糖症の診断、治療、管理を行うことができる。
【００４０】
（２−１−１）ボロン酸化合物
ボロン酸化合物は、糖類と特異的に結合し、糖−ボロン酸結合体となる。このボロン酸化合物を感応部１２に含有させ、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１歯肉溝に挿入することにより、歯肉溝液中の糖（例、D-グルコース）と感応部１２に含有されているボロン酸化合物が結合する。
ボロン酸化合物（一例、フェニルボロン酸系化合物）は、糖類と特異的に結合して糖−ボロン酸結合体となると（以下の化学反応式１（化１）参照）、その蛍光強度が変化する。従って、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２からの蛍光強度の変化を測定することにより、歯肉溝液中のグルコース値を測定することができる。
【００４１】
【化１】
2011232320.tif 000003
【００４２】
（２−１−２）生体内物質：グルコース／検出用物質：グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）
グルコースオキシダーゼ（glucose oxidase）は、D-グルコースからD-グルコノ−１,５−ラクトンと過酸化水素を生成させる反応を触媒する（以下の化学反応式２（化２）参照）。
【００４３】
【化２】
2011232320.tif 000004
【００４４】
過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在によって、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）をレソルフィン（Resorufin）に変換する。このADHPは蛍光を発しないが、レソルフィンに変換されることによって蛍光を発する（以下の化学反応式３（化３）を参照）。即ち、このレソルフィンは光検出のための蛍光源として機能する。
【００４５】
【化３】
2011232320.tif 000005
【００４６】
この反応原理を用いる場合、感応部１２に、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ADHPを含有させておけば、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を歯肉溝に挿入することにより、歯肉溝液中のグルコースによって前記の一連の反応が進行する。そして、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２から得られる蛍光の強度を測定することにより、歯肉溝液中のグルコース値を測定することができる。
【００４７】
このように、歯肉溝液中の生体内物質に関わる反応を触媒する１または２以上の第１の酵素（例えば、オキシダーゼ類等）、および、この第１の酵素による触媒反応によって生体内物質から生成される生成物（例えば、過酸化水素）が関わる反応を触媒する１または２以上の第２の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）、更に、この第２の酵素による触媒反応に伴い蛍光が発せられる１または２以上の物質（例えば、ADHP）を、感応部１２に含有させておくことにより、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１を用いて、歯肉溝液中の生体内物質を光学的に検出することができる。
オキシダーゼ類としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ウリカーゼ（尿酸オキダーゼ）、乳酸オキシダーゼ、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、サルコシン酸化酵素、およびコレステロール酸化酵素などが挙げられる。生体内物質に応じて、これを単独で又は組み合わせて使用することができる。
また、第１の酵素で生体内物質を処理する前に、第１の酵素が反応しやすいように前処理酵素で生体内物質を処理してもよい。前処理酵素としては、加水分解酵素等が挙げられる。加水分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、クレアチナーゼ、クレアチニアーゼ、およびコレステロール・エステラーゼ等が挙げられる。これを単独で又は組み合わせて使用することができる。
【００４８】
なお、ADHPの代わりに、オルトジアニシヂン（ο-dianisidine）を含有させることも可能である。ADHPの代わりに、オルトジアニシヂンを感応部１２に含有させておけば、過酸化水素でこのオルトジアニシヂンが酸化される（以下の化学反応式４（化４）参照）。それに伴って吸光度が変化する。この変化を可視光分光法により吸光スペクトルを測定することで、歯肉溝液中の生体内物質を検出することができる。
【００４９】
【化４】
2011232320.tif 000006
【００５０】
（２−２）生体内物質がアルコールである場合
歯肉溝液中のアルコール濃度を検出することができれば、医療現場のみならず、例えば、飲酒運転の取り締まりや職場のアルコール対策などの現場において、呼気から検出することが一般的であったアルコール濃度を、より正確に測定することができる。
【００５１】
（２−２−１）生体内物質：アルコール／検出用物質：アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）
アルコールオキシダーゼ（alcohol oxidase）は、アルコールがアルデヒドに変化する反応を触媒する酸化還元酵素である。この反応では、アルデヒドと共に過酸化水素も生成する（以下の化学反応式５（化５）参照）。
【００５２】
【化５】
2011232320.tif 000007
【００５３】
過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在によって、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）をレソルフィン（Resorufin）に変換する。このADHPは蛍光を発しないが、レソルフィンに変換されることによって蛍光を発する（上掲の「化学反応式３（化３）」を参照）。即ち、このレソルフィンは光検出のための蛍光源として機能する。
【００５４】
このような反応原理を用いる場合、感応部１２に、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ADHPを含有させておけば、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を歯肉溝に挿入することによって、歯肉溝液中のアルコールによって前記の一連の反応が進行する。そして、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２から発せられる蛍光強度を測定することにより、歯肉溝液中のアルコール値を測定することができる。
【００５５】
この反応系の場合においても、ADHPの代わりに、オルトジアニシヂン（ο-dianisidine）を含有させることも可能である。ADHPの代わりに、オルトジアニシヂンを感応部１２に含有させておけば、過酸化水素でこのオルトジアニシヂンが酸化される（上掲の化学式４参照）。それに伴って吸光度が変化する。この変化を可視光分光法により吸光スペクトルを測定することで、歯肉溝液中のアルコール値を測定することができる。
【００５６】
（２−３）生体内物質がプリン誘導体である場合
プリン誘導体としては、プリン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、およびイソグアニンなどが挙げられる。
例えば、歯肉溝液中の尿酸値をより正確に測定することができれば、高尿酸血症を呈する痛風、低尿酸血症、レッシュ−ナイハン症候などの診断等に役立てることができる。
【００５７】
（２−３−１）生体内物質：尿酸／検出用物質：ウリカーゼ(尿酸オキシダーゼ)、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）
ウリカーゼ（urate oxidase）は、以下の化学反応式６（化６）で示される反応を触媒
する酵素であり、該反応では過酸化水素も生成する。
【００５８】
【化６】
2011232320.tif 000008
【００５９】
過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在によって、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）をレソルフィン（Resorufin）に変換する。このADHPは蛍光を発しないが、レソルフィンに変換されることによって蛍光を発する（上掲の化学反応式３（化３）を参照）。即ち、このレソルフィンは光検出のための蛍光源として機能する。
【００６０】
この反応原理を用いて、感応部１２に、ウリカーゼ、ペルオキシダーゼ、ADHPを含有させておけば、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を歯肉溝に挿入することによって、歯肉溝液中の尿酸によって前記の一連の反応が進行する。そして、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２から発せられる蛍光強度を測定することにより、歯肉溝液中の尿酸値を測定することができる。
【００６１】
なお、ADHPの代わりに、オルトジアニシヂン（ο-dianisidine）を含有させることも可能である。ADHPの代わりに、オルトジアニシヂンを感応部１２に含有させておけば、過酸化水素でこのオルトジアニシヂンが酸化される（上掲の化学式４参照）。それに伴って吸光度が変化する。この変化を可視光分光法により吸光スペクトルを測定することで、歯肉溝液中の尿酸値を測定することができる。
【００６２】
（２−４）生体内物質が解糖系生成物の場合
解糖系生成物としては、ピルビン酸、および乳酸など有機酸が挙げられる。
例えば、歯肉溝液中の乳酸をより正確に測定することができれば、乳酸アシドーシス、ミトコンドリア異常症、肝機能障害、乳酸脱水素酵素欠損症、組織の酸素不足状態、糖尿病などの診断、予防等に役立てることができる。
【００６３】
（２−４−１）生体内物質：乳酸／検出用物質：乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
乳酸オキシダーゼ（lactate oxidase）は、以下の化学反応式７（化７）で示される反応を触媒する酵素であり、該反応では過酸化水素も生成する。
【００６４】
【化７】
2011232320.tif 000009
【００６５】
過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在によって、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）をレソルフィン（Resorufin）に変換する。このADHPは蛍光を発しないが、レソルフィンに変換されることによって蛍光を発する（上掲の「化学反応式３（化３）」を参照）。即ち、このレソルフィンは光検出のための蛍光源として機能する。
【００６６】
この反応原理を用いて、感応部１２に、乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ADHPを含有させておけば、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を歯肉溝に挿入することによって、歯肉溝液中の乳酸によって前記の一連の反応が進行する。そして、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２から発せられる蛍光強度を測定することにより、歯肉溝液中の乳酸値を測定することができる。
【００６７】
なお、ADHPの代わりに、オルトジアニシヂン（ο-dianisidine）を含有させることも可能である。ADHPの代わりに、オルトジアニシヂンを感応部１２に含有させておけば、過酸化水素でこのオルトジアニシヂンが酸化される（上掲の化学式４参照）。それに伴って吸光度が変化する。この変化を可視光分光法により吸光スペクトルを測定することで、歯肉溝液中の乳酸値を測定することができる。
【００６８】
（２−５）生体内物質が、糖化タンパク質の場合
糖化タンパク質としては、フルクトサミン、糖化ヘモグロビン、および糖化アルブミンなどが挙げられる。
例えば、歯肉溝液中のフルクトサミン、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンをより正確に測定することができれば、糖尿病や高血糖症などの診断、予防等に役立てることができる。
【００６９】
（２−５−１）生体内物質：糖化アルブミン又はアルブミン／検出用物質：プロテアーゼ、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−５−２）生体内物質：糖化アルブミン又はアルブミン／検出用物質：ａ成分：プロテアーゼ、およびｂ成分：フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
プロテアーゼは、以下の化学反応式８（化８）で示される反応を触媒するタンパク質分解酵素であり、タンパク質をアミノ酸に分解する際に、グルコース結合アミノ酸を遊離させる。
【００７０】
【化８】
2011232320.tif 000010
【００７１】
フルクトシル・アミノ酸酸化酵素（fructosyl-amino acid oxidase）は、以下の化学反応式９（化９）で示される反応を触媒する酵素であり、該反応では過酸化水素も生成する。
【００７２】
【化９】
2011232320.tif 000011
【００７３】
過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在によって、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）をレソルフィン（Resorufin）に変換する。このADHPは蛍光を発しないが、レソルフィンに変換されることによって蛍光を発する（上掲の「化学反応式３（化３）」を参照）。即ち、このレソルフィンは光検出のための蛍光源として機能する。
【００７４】
この反応原理を用いて、感応部１２に、プロテアーゼ、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、ペルオキシダーゼおよびADHPを含有させておけば、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を歯肉溝に挿入することによって、歯肉溝液中の糖化タンパク質によって前記の一連の反応が進行する。そして、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２から発せられる蛍光強度を測定することにより、歯肉溝液中の血糖値を測定することができる。なお、プロテアーゼはタンパク質分解酵素のため他の酵素に影響を与えやすいので、プロテアーゼは、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素、ペルオキシダーゼおよびADHPを含有する感応部１２と別の感応部１２に含有させるのが、好適である。
【００７５】
なお、ADHPの代わりに、オルトジアニシヂン（ο-dianisidine）を含有させることも可能である。ADHPの代わりに、オルトジアニシヂンを感応部１２に含有させておけば、過酸化水素でこのオルトジアニシヂンが酸化される（上掲の化学式４参照）。それに伴って吸光度が変化する。この変化を可視光分光法により吸光スペクトルを測定することで、歯肉溝液中の血糖値を測定することができる。
【００７６】
（２−６）生体内物質がアミノ酸の場合
アミノ酸としては、クレアチニン、クレアチン、およびグルタミン酸などが挙げられる。
例えば、歯肉溝液中のクレアチニンやクレアチンをより正確に測定することができれば、腎機能障害などの診断、予防等に役立てることができる。クレアチニン濃度は、腎機能が低下した場合にはクレアチニン濃度が上昇するので、腎機能の指標である。
【００７７】
（２−６−１）生体内物質：クレアチニン又はクレアチン／検出用物質：クレアチニアーゼ、クレアチナーゼ、サルコシン酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−６−２）生体内物質：クレアチニン又はクレアチン／検出用物質：クレアチナーゼ、サルコシン酸化酵素、ペルオキシダーゼ、および10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
クレアチニアーゼ（creatininase）は、以下の化学反応式１０（化１０）で示される反応を触媒するものである。
【００７８】
【化１０】
2011232320.tif 000012
【００７９】
クレアチナーゼ（creatinase）は、以下の化学反応式１１（化１１）で示される反応を触媒するものである。
【００８０】
【化１１】
2011232320.tif 000013
【００８１】
サルコシン酸化酵素（sarcosine oxidase）は、以下の化学反応式１２（化１２）で示される反応を触媒する酵素であり、該反応では過酸化水素も生成する。
【００８２】
【化１２】
2011232320.tif 000014
【００８３】
過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在によって、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）をレソルフィン（Resorufin）に変換する。このADHPは蛍光を発しないが、レソルフィンに変換されることによって蛍光を発する（上掲の「化学反応式３（化３）」を参照）。即ち、このレソルフィンは光検出のための蛍光源として機能する。
【００８４】
この反応原理を用いて、感応部１２に、クレアチナーゼ、サルコシン酸化酵素、ペルオキシダーゼおよびADHP、必要に応じてクレアチニアーゼを含有させておけば、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を歯肉溝に挿入することによって、歯肉溝液中のクレアチンやクレアチニンによって前記の一連の反応が進行する。そして、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２から発せられる蛍光強度を測定することにより、歯肉溝液中のクレアチン濃度やクレアチニン濃度を測定することができる。なお、クレアチンを検出する場合には、クレアチニアーゼは含有させなくともよい。一方で、クレアチニンを検出する場合には、感応部１２にクレアチニアーゼも含有させるのが、クレアチニンの検出精度を高めるため、望ましい。
【００８５】
なお、ADHPの代わりに、オルトジアニシヂン（ο-dianisidine）を含有させることも可能である。ADHPの代わりに、オルトジアニシヂンを感応部１２に含有させておけば、過酸化水素でこのオルトジアニシヂンが酸化される（上掲の化学式４参照）。それに伴って吸光度が変化する。この変化を可視光分光法により吸光スペクトルを測定することで、歯肉溝液中のクレアチン濃度やクレアチニン濃度を測定することができる。
【００８６】
また、Ｄ型又はＬ型のアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびADHPを感応部１２に含有させておけば、歯肉溝液中のＤ型又はＬ型のアミノ酸濃度を測定することができる。なお、アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ又はＬ型）は、Ｄ型又はＬ型のアミノ酸からアンモニアと共に過酸化水素を生じさせる。
【００８７】
（２−７）生体物質が脂質の場合
脂質としては、コレステロール、コレステロール・エステル、トリグリセライド（中性脂肪）、リン脂質、および遊離脂肪酸などが挙げられる。
例えば、歯肉溝液中のコレステロール、コレステロール・エステルをより正確に測定することができれば、脂質代謝異常などの診断、予防等に役立てることができる。総コレステロール値は、高コレステロール血症や高脂血症の指標である。
【００８８】
（２−７−１）生体内物質：コレステロール又はコレステロール・エステル／検出用物質：コレステロール・エステラーゼ、コレステロール酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
（２−７−２）生体内物質：コレステロール又はコレステロール・エステル／検出用物質：コレステロール酸化酵素、ペルオキシダーゼ、および10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）
【００８９】
コレステロール・エステラーゼ（cholesteryl esterase，cholesterol esterase，sterol ester）、以下の化学反応式１３（化１３）で示される反応を触媒するものである。
【００９０】
【化１３】
2011232320.tif 000015
【００９１】
コレステロール酸化酵素（cholesterol oxydase）は、以下の化学反応式１４（化１４）で示される反応を触媒する酵素であり、該反応では過酸化水素も生成する。
【００９２】
【化１４】
2011232320.tif 000016
【００９３】
過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在によって、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）をレソルフィン（Resorufin）に変換する。このADHPは蛍光を発しないが、レソルフィンに変換されることによって蛍光を発する（上掲の「化学反応式３（化３）」を参照）。即ち、このレソルフィンは光検出のための蛍光源として機能する。
【００９４】
この反応原理を用いて、感応部１２に、コレステロール酸化酵素、ペルオキシダーゼおよびADHP、必要に応じてコレステロール・エステラーゼを含有させておけば、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を歯肉溝に挿入することによって、歯肉溝液中のコレステロール、コレステロール・エステルによって前記の一連の反応が進行する。そして、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２から発せられる蛍光強度を測定することにより、歯肉溝液中のコレステロール値や総コレステロール値を測定することができる。なお、総コレステロール値を測定する場合には、感応部１２にコレステロール・エステラーゼも含有させるのが、総コレステロール値の検出精度を高めるため、望ましい。
【００９５】
なお、ADHPの代わりに、オルトジアニシヂン（ο-dianisidine）を含有させることも可能である。ADHPの代わりに、オルトジアニシヂンを感応部１２に含有させておけば、過酸化水素でこのオルトジアニシヂンが酸化される（上掲の化学式４参照）。それに伴って吸光度が変化する。この変化を可視光分光法により吸光スペクトルを測定することで、歯肉溝液中のコレステロール値や総コレステロール値を測定することができる。
【００９６】
（２−７）生体内物質の他の候補例
なお、本発明では、検出対象の生体内物質は上述のものに限定されず、感応部１２に含有させる酵素を変更することによって、様々な生体内物質を検出することが可能である。
例えば、歯肉溝液中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）活性、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性が挙げられ、これは肝機能の指標である。
【００９７】
以上説明した感応部１２は、歯肉溝挿入部１１に設けられていれば、その形態については特に限定されず、自由に設計することができる。以下、光ファイバーを用いる場合を例に挙げて、感応部１２の一実施形態例を説明する。
【００９８】
図４は、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１を側方から視た断面模式図である。図４に示すように、光ファイバーの切断端面に、コア（core）、クラッド(clad)、コーティング(coating)のすべてに跨るように、感応部１２を設けることができる。
【００９９】
また、図５に示すように、コアのみを周囲よりも突出させた状態、または、図６に示すようにコアとクラッドを周囲よりも突出させた状態で光ファイバーを切断しておいて、コア、クラッド、コーティングのすべてに跨るように、感応部１２を設けることもできる。あるいは、図７に示すように、コア、クラッド、コーティングを段階的に（階段状に）切断しておき、コア、クラッド、コーティングのすべてに跨るように、感応部１２を設けることもできる。このような方法で感応部１２を設けることにより、感応部１２を、より強固な状態で光ファイバーの切断面に設けることができる。
【０１００】
更に、例えば、図８に示すように、感応部１２の表面に被覆層Ｃを設けることも可能である。このような被覆層Ｃを設けることで、感応部１２を、より強固な状態で設けることができるとともに、歯肉へのダメージを軽減することができる。また、感応部１２へ含有させる物質を保護することができ、例えば、感応部１２に生体に影響のある物質を含有させる場合であって、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１を安全に用いることができる。
【０１０１】
被覆層Ｃに用いる材料としては、生体に悪影響のないものを使用することができ、当該材料については自由に選択して用いることができる。例えば、寒天ゲル（アガロース）など生体由来のものを用いることで、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１をより安全に用いることができる。
【０１０２】
なお、図８では、図４に示す実施形態において、感応部１２を被覆した例を示しているが、これに限定されず、図５〜図７に示す実施形態においても、感応部１２を被覆することも可能である。
【０１０３】
感応部１２の形状は、歯肉溝中に挿入することができれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、歯肉溝に挿入し易くするために、斜めカット形状やコーン形状に設計することもできる。
【０１０４】
（３）光導波路１３
本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の感応部１２には、生体内物質を光学的に検出可能とする検出用物質が固定化されている。このため、歯肉溝から取り出した生体内物質検出用プローブ１をすぐに光検出することによって、歯肉溝液中の生体内物質を、ほぼリアルタイムに検出することが可能である。
更に、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１において、感応部１２への光照射および／または前記感応部からの光検出を行うための光導波路１３を備えるように工夫するのが好適である。このことで、歯肉溝へ挿入したまま、歯肉溝液中の生体内物質を検出することが可能となる。また、歯肉溝へ挿入したまま、歯肉溝液中の生体内物質を検出することができるので、経時的な検出・測定を容易に行うこともできる。
【０１０５】
光導波路１３の形成方法は、感応部１２への光照射および／または前記感応部中から発せられる光学的情報を伝送することができれば特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、ロッドを用いて光導波路１３を形成したり、光ファイバーを用いて光導波路１３を形成したり、あるいは、導光板を用いて光導波路１３を形成したりすることができる。
【０１０６】
図３に示す第２実施形態のように、光ファイバーを用いた光導波路１３を、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の歯肉溝挿入部１１として用いれば、歯肉溝挿入部１１を光導波路１３としても兼用することが可能である。
【０１０７】
（４）毛細管部１４
図９は、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第８実施形態を模式的に示す模式概念図である。本実施形態では、歯肉溝挿入部１１の先端に、毛細管部１４を設けている。この毛細管部１４を設けることで、歯肉溝挿入部１１を歯肉溝内に挿入した際に、歯肉溝液を毛細管現象により採取できる。この採取した歯肉溝液を、毛細管部１４を介して感応部１２へ円滑に導入することができる。
【０１０８】
また、毛細管部１４を設けることで、毛細管部１４の内容量に相当する一定量の歯肉溝液を採取することができるため、測定精度を向上させることも可能である。
【０１０９】
なお、毛細管部１４の大きさは、歯肉溝に挿入可能で毛細管現象により歯肉溝液を採取することができれば、自由に設計することができるが、その外径を５００μｍ以下とすることが好ましい。５００μｍ以下とすれば、歯肉溝内から確実に歯肉溝液を採取することが可能であり、かつ、歯肉溝へ挿入する際、歯肉に刺激や損傷が加わるのを防止することができるからである。
【０１１０】
また、図１０に示す第９実施形態のように、毛細管部１４の先端から歯肉溝挿入部１へ向かって徐々に口径や断面積が大きくなるテーパー構造に設計することも可能である。このようなテーパー構造に設計することで、歯肉溝への挿入をより容易に行うことができ、かつ、被験者の歯肉を傷つけるのをより確実に防止することができる。この場合、テーパー構造の先端の外径を、１５０μｍ以下とすることが好ましい。歯肉溝へ挿入する際、歯肉に刺激や損傷が加わるのを防止することができるからである。
【０１１１】
毛細管部１４に用いる材料は、歯肉溝に挿入可能であれば特に限定されないが、可撓性を有する材料を用いることが好ましい。可撓性を有する材料を用いて歯肉溝挿入部１１を形成することにより、被験者の歯肉を傷つけるのを有効に防止することが可能だからである。可撓性を有する材料の一例としては、樹脂、紙、フェルト材のような布などを挙げることができる。
【０１１２】
歯肉溝挿入部１１の先端への毛細管部１４の設置方法は、毛細管部１４から採取した歯肉溝液を感応部１２へ導入可能であれば特に限定されない。例えば、歯肉溝挿入部１１と毛細管部１４とを単に接触させる方法、硬化樹脂などを用いて接着させる方法、などを挙げることができる。
【０１１３】
また、図９の第８実施形態に示すように、スリーブＳなどのカバーを用いて、歯肉溝挿入部１１および光導波路１３として機能する光ファイバーと、毛細管部１４とを結合することも可能である。このようなカバーを用いることで、生体内物質検出用プローブ１内部への防水効果や防塵効果を付加することもできる。この時、スリーブＳと光ファイバーとの接着およびスリーブＳと毛細管部１４との接着するためには、紫外線硬化樹脂、熱硬化樹脂、シリコーン樹脂、エポキシ系硬化樹脂のような充填剤を用いるとよい。
【０１１４】
このように、スリーブＳのようなカバーを用いて、光ファイバーと毛細管部１４とを結合する場合には、スリーブＳに通気口Ｈを設けることが好ましい。この通気口Ｈは、毛細管現象により歯肉溝液を採取する場合の空気逃げとして機能するからである。
【０１１５】
毛細管部１４を設ける場合、感応部１２の形成位置は特に限定されず、例えば、図９に示す第８実施形態のように、歯肉溝挿入部１１および光導波路１３として機能する光ファイバーと毛細管部１４との結合部分に感応部１２を設けてもよい。
【０１１６】
また、図１１に示す第１０実施形態のように、毛細管部１４の内壁面に感応部１２を設けることも可能である。
【０１１７】
毛細管部１４の内壁面に感応部１２を形成する方法は限定されず、自由な方法を用いて形成することができる。例えば、前記検出用物質を含有する溶液を、毛細管部１４内に毛細管現象により導入した後に乾燥させることで、毛細管部１４の内壁面に直接、前記検出用物質を固定化した状態の感応部１２を形成することができる。
【０１１８】
また、生体に悪影響を及ぼさない素材を用いた膜中に、前記検出用物質を固定化することで形成することも可能である。より具体的には、例えば、前記検出用物質を含有する溶液と前記固定化素材を含有する溶液とを混合し、毛細管部１４内に毛細管現象により導入し、乾燥、光照射などを行うことにより、毛細管部１４の内壁面に前記検出用物質が固定化された感応膜を形成することができる。
【０１１９】
例えば、種々の光反応性基を有する水溶性化合物、例えば、アジド基（−Ｎ３）、特に、該アジド基を２個有するジアジド化合物（一例、二個のフェニルアジド基を連結した構造の化合物）と水溶性の高分子鎖を含む水溶液（固定化剤水溶液）中に検出用物質を混合し、該混合水溶液を毛細管部１４の内壁面に毛細管現象を利用して導入し付着させた後に、水分を乾燥させてから光（紫外線）を照射し固定化することができる。この方法により、毛細管部１４の内壁面に対して、毛細管に目詰まりを起こすようなことがない上に、感応部１２の容量（容積）も制御しながら、確実に固定することができる。
【０１２０】
なお、アジド基は、光照射によって窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルを生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基などの官能基だけでなく、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機化合物との共有結合を形成し得るという性質を有している。
【０１２１】
このように、毛細管部１４の毛細管現象を用いれば、前記検出用物質を含有する溶液を一定量、毛細管部１４内に導入することができるため、毛細管部１４の内壁面に、一定量の検出用物質を含有する感応部１２を設けることが可能である。
【０１２２】
毛細管部１４の内壁面は、アルコール性水酸基などの親水性基を有する固相で形成することが好ましい。毛細管部１４の内壁面に感応部１２を設けやすくするためである。このような固相としては、例えば、ガラス、石英、ポリアルコール性樹脂、表面改質した樹脂、シランカップリング剤など親水性基を付与した固相、などを挙げることができる。  
【０１２３】
また、毛細管部１４の内壁面は、単孔質、多孔質としてもよく、特に表面積を増加させた形態に形成することが好ましい。表面積を大きくすることで、該表面に設ける感応部１２に、より多くの検出用物質を含有させることができる。
【０１２４】
図１２は、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の第１１実施形態を模式的に示す模式概念図である。本実施形態では、毛細管部１４の先端から所定の距離を置いた内壁面に、感応部１２を設けている。例えば、毛細管部１４は、その先端に感応部を有さない毛細管部１４２と、これに接続する感応部１２を設けた毛細管部１４１とを備える。
このように、感応部１２の位置を、毛細管部１４の先端から所定の距離を置いて設ければ、吸い込まれてきた歯肉溝液が一定量に達したところで、感応部１２中の検出用物質と各種反応を起こさせることができるため、歯肉溝液中に含まれている生体内物質と検出用物質との反応を安定化させることができる。その結果、より精度の高い検出、測定を行うことが可能となる。
【０１２５】
図１２に示す第１１実施形態のような毛細管部１４の形成方法については、特に限定されない。例えば、前述した図１１に示す第１０実施形態のように、毛細管部１４の内壁面全体に感応部１２を設けた毛細管部１４１を作成し、感応部を有さない毛細管部１４２と接続させることで、容易に形成することができる。
【０１２６】
また、上述した実施形態の変形例として、毛細管部１４の内壁面に、異なる検出用物質を固定化した複数の感応部１２を形成する。
例えば、毛細管部１４の毛細管現象を用いて、毛細管１４の先端の片側から前記検出用物質を含有する溶液を内壁面の片側に導入する。この反対側から別の検出用物質（例えば、異なる酵素）を含有する溶液を内壁面の反対側に導入する。これら検出用物質を毛細管部１４の内壁面に固定化することにより、長手方向に沿った感応部（感応膜）１２を複数形成することができる。
また、毛細管部１４の先端から前記検出用物質を含有する溶液を導入する。一方、毛細管部１４の上端から別の検出用物質（例えば、異なる酵素）を含有する溶液を内壁面の反対側に導入する。これら検出用物質を毛細管部１４の内壁面に固定化することにより、円筒状に感応部（感応膜）１２を複数形成することができる。
これにより、生体内物質を検出するための検出用物質を複数用意し、それぞれを別々の内壁面に適宜固定化できるので、検出用物質同士での阻害や競合などを抑制できる。このことから、より精度の高い検出等を行うことが可能となる。
【０１２７】
図１３は、本発明に係る生体内物質検出用プローブ１の変形実施形態の一例を示す図である。具体的には、毛細管部の側胴部に光導波路を接続した実施形態の基本構成を示す図である。
この図１３に示す実施形態例のように、毛細管部１４に対する光導波路１３（例、光ファイバー１３１）の配置構成に関して、該毛細管部１４の上端面１４１に対して前記光導波路１３を直列状に配置する構成ではなく、毛細管部１４の側胴部１４２に対して光導波路１３を接続させるように工夫してもよい。この側胴部１４２の内壁面、好ましくは接続部分付近の内壁面には、蛍光や可視光を発する検出用物質を含む感応部（感応膜）１２が形成されていることが好適である。これにより、感応部１２から発せられる光学的情報を取得しやすくなる。
具体的には、PFAチューブ（フッ素樹脂チューブ）Ｔの一端部付近に孔Ｔ１を開けておき、この孔Ｔ１に毛細管部１４の上部を挿着し、接着剤等で固定する。例えば、PFAチューブＴの内口径は0.5ｍｍ、外口径は1.0ｍｍに設計する。PFAチューブＴの内部には、光導波路１３、例えば光ファイバー１３１（例、口径0.25ｍｍ）を設けておく。この光ファイバー１３１の一端部は毛細管部１４の側胴部１４３に当接された状態で配置しておき（図１３参照）、この光ファイバー１３１を介して、光の伝送を行うようにする。
詳しくは、毛細管部１４の内壁面１４３に膜状に形成された感応部（感応膜）１２に対して測定用の光Ｐ１（例えば、蛍光励起光）を入射したり、該感応部１２に存在する蛍光源などから発生した蛍光や発光などの光Ｐ２を、図示しない光学測定部に対して伝送したりする。
図１３に示された符号Ｆは、光コネクタ部材であるフェルールであり、符号１８はフェルールＦを固定するためのホルダーであり、PFAチューブＴとホルダーＨは接着剤等によって固定する。
なお、符号１４４は毛細管部１４の先端部に形成されたテーパー部（上端面１４１方向に口径が徐々に大きくなっているテーパー部）を示している。
【０１２８】
図１３に示されている、毛細管部１４と光導波路１３の配置関係に工夫すれば、毛細管部１４に対して連結された光導波路１３が毛細管部１４を塞いで、歯肉溝液を吸い上げる毛細管現象の障害となってしまうようなことがなく、また、吸い上げられてきた歯肉溝液によって光導波路１３の端面が汚れてしまうこともない（直列状の配置構成との比較）。また、図１３に示す配置関係であれば、毛細管部１４と光導波路１３との距離関係を一定とすることができるし、また、後述する「歯ブラシ型」の実施形態（図１５参照）も形成しやすくなるという利点もある。
【０１２９】
図１３に示す変形実施形態のような、毛細管部１４の内壁面への感応部１２の形成方法は、特に限定されないが、例えば、上記第１１実施形態のような形成方法により毛細管部１４の内壁面に感応部１２を設けることができる。
更に、図１３に示すように、毛細管部１４の先端から所定の距離を置いた位置に、単数又は複数の毛細管孔１４Ｂを毛細管部１４に設けるのが好適である。後記実施例２０に示すように、孔を設けていない毛細管部１４では、検出用物質を含有する溶液が毛細管の先端から上端まで導入される。一方、毛細管１４に孔を設けると、検出用物質を含有する溶液を毛細管１４の先端から導入した場合、孔付近でこの溶液の導入が止まる。
このことより、毛細管部１４の内壁面に、単数又は複数の感応部（感応膜）１２を任意の位置で容易に形成することができる。さらに、感応部１２ごとに、生体内物質を検出するための検出用物質を適宜変更することができる。すなわち、複数の前記検出用物質を別々に任意の位置の内壁面に適宜固定化できるので、同じ領域の感応部１２に混在するために生じる検出用物質同士での阻害や競合などを低減できる。
また、毛細管孔１４Ｂは、毛細管現象により歯肉溝液を採取する場合の空気逃げとしても機能する。
【０１３０】
ここで、毛細管孔１４Ｂを１つ設ける場合には、毛細管先端１４Ａから毛細管上端１４Ｃとの間で、先端Ａから半分〜４分の３程度の位置に設けるのが好ましい。
また、毛細管孔１４Ｂを複数設ける場合には、その位置は特に限定されず、毛細管部１４の長手方向に間隔をあけて設けてもよいし、毛細管部１４の外周に設けてもよい。これにより、感応膜を効率よく確実に固定化することができる。
この毛細管孔１４Ｂを複数設けることによって、複数の感応部１２を毛細管１４の内壁面に形成でき、また任意の位置に形成することも可能である。例えば、毛細管孔１４Ｂを毛細管部１４の長手方向に２つ設けた場合には、毛細管先端１４Ａから毛細管孔１４Ｂまでの間の内壁面を感応部（感応膜）１２とし、毛細管孔１４Ｂから毛細管上端１４Ｃ方向にある毛細管孔（図示せず）の間の内壁面に異なる検出用物質を含有する感応部（感応膜）１２を形成することが可能である。そして、複数の感応部１２を設けることにより、一連の多段階酵素反応や複数の酵素を用いる場合、また他の酵素反応を阻害する可能性がある酵素を用いる場合（例えば、プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素等）でも、好適に目的とする生体内物質を検出、測定できる。
【０１３１】
毛細管孔１４Ｂは、公知の孔形成の技術にて、毛細管部１４に形成できる。この際、毛細管孔１４Ｃの孔径（直径）は、上記毛細管部１４の大きさ、特に先端の外径と同等よりも小さくするのが望ましい。毛細管孔１４Ｂの孔径は、０．０１〜０．２ｍｍが好ましく、０．０５〜０．１ｍｍがより好ましい。
毛細管孔１４Ｂを有する毛細管部１４の内壁面に感応部１２を形成する方法としては、上記第１０実施形態及び第１１実施形態のように行えばよい。そして、この毛細管孔１４Ｂを利用すれば、複数の感応部１２を簡単に形成することができる。
例えば、毛細管孔が１つの場合、具体的には、毛細管先端１４Ａを封止し、その反対側の封止していない毛細管上端１４Ｃから前記検出用物質を含有する溶液を、毛細管現象により、毛細管部１４内の、毛細管上端１４Ｃから毛細管孔１４Ｂ付近まで導入する。その後、乾燥させて、毛細管上端１４Ｃから毛細管孔１４Ｂまでの間の毛細管部１４の内壁面に直接、前記検出用物質を固定化した状態の感応部１２を形成することができる。
また、毛細管孔が２つの場合、上述のように前記検出用物質を含有する溶液を、毛細管部１４内の、毛細管上端１４Ｃから毛細管孔１４Ｂ付近まで導入し、その後、乾燥し、検出用物質を固定化した状態の感応部１２を形成する。そして、毛細管部１４を逆にして、この導入した検出用物質とは異なる検出用物質（例えば、酵素）を含有する溶液を、毛細管先端１４Ａから毛細管孔１４Ｂまでの間の毛細管部１４の内壁面に導入する。その後、乾燥して、異なる検出用物質を固定化した状態の感応部１２を形成する。これにより、異なる感応部１２を２つ形成することができる。なお、感応部への固定化のタイミングは適宜変更してもよい。例えば、毛細管部１４内にそれぞれの前記検出用物質を含有する溶液を毛細管の先端及び上端から導入した後、同時に固定化してもよい。
なお、前記検出用物質を含有する溶液に、上記第１０実施形態のように、光（紫外線）を照射し固定化できるジアジド化合物と固定化剤水溶液を含有させるのが好適である。
このように、毛細管孔１４Ｂは、公知の技術によって簡単に形成することができる一方で、この毛細管孔１４Ｂを利用することによって、単数又は複数の機能性の高い感応部１２を容易に任意の位置に形成することができる。
【０１３２】
＜２．生体内物質検出装置１０＞
図１４は、本発明に係る生体内物質検出装置１０の第１実施形態を模式的に示す模式概念図である。  本発明に係る生体内物質検出装置１０は、歯肉溝液中の生体内物質を検出するための装置であって、大別すると、生体内物質検出用プローブ１、光照射手段１５、光検出手段１６を少なくとも備える。また、必要に応じて、ダイクロイック素子１７、集光レンズ１８、光学フィルター１９を備えることも可能である。以下、各々について、詳細に説明する。なお、生体内物質検出用プローブ１は、前述した生体内物質検出用プローブ１と同様であるため、ここでは説明を割愛する。
【０１３３】
（１）光照射手段１５
光照射手段１５は、生体内物質検出用プローブ１に設けられた感応部１２に対して光（一例、蛍光励起光）を照射するための手段である。
【０１３４】
光照射手段１５から照射される光の種類は特に限定されないが、感応部１２中から蛍光や散乱光を確実に発生させるためには、光方向、波長、光強度が一定の光が望ましい。一例としては、レーザー、ＬＥＤ、水銀灯などを挙げることができる。レーザーを用いる場合、その種類も特に限定されないが、アルゴンイオン（Ar）レーザー、ヘリウム−ネオン（He-Ne）レーザー、ダイ（dye）レーザー、クリプトン（Cr）レーザー等を、１種又は２種以上、自由に組み合わせて用いることができる。
【０１３５】
（２）光検出手段１６
光検出手段１６は、光照射手段１５による光照射によって感応部１２中から発せられた光学的情報を検出するための手段である。
【０１３６】
本発明に係る生体内物質検出装置１０に用いることができる光検出手段１６は、光学的情報の検出ができれば、その種類は特に限定されず、公知の光検出器を自由に選択して採用することができる。例えば、蛍光測定器、散乱光測定器、透過光測定器、反射光測定器、回折光測定器、紫外分光測定器、赤外分光測定器、ラマン分光測定器、ＦＲＥＴ測定器、ＦＩＳＨ測定器その他各種スペクトラム測定器、複数の光検出器をアレイ状に並べた、いわゆるマルチチャンネル光検出器、などを１種又は２種以上自由に組み合わせて採用することができる。
【０１３７】
（３）ダイクロイック素子１７
本発明に係る生体内物質検出装置１０には、ダイクロイック素子１７を備えることも可能である（図１５参照）。このダイクロイック素子１７を備えることにより、必要な光学的情報のみを選択して検出することができる。
【０１３８】
本発明に係る生体内物質検出装置１０に用いることができるダイクロイック素子１７としては特に限定されず、公知のダイクロイック素子１７を目的に応じて自由に選択して用いることができる。例えば、ダイクロイックミラー、分波器などを用いることができる。
【０１３９】
（４）集光レンズ
本発明に係る生体内物質検出装置１０には、図示しないが、光照射手段１５からの励起光を感応部１２へ集光する目的で、光照射手段１５と感応部１２との間に、励起用の集光レンズを配置することができる。本発明に係る生体内物質検出装置１０では、この集光レンズは必須のものではないが、励起光用の集光レンズを設ければ、感応部１２に対して、より正確に励起光の照射を行うことが可能である。
【０１４０】
また、本発明に係る生体内物質検出装置１０には、図示しないが、感応部１２中から発せられた光学的情報を光検出手段１６に集光する目的で、感応部１２と光検出手段１６との間に、受光用の集光レンズを配置することができる。本発明に係る生体内物質検出装置１０では、この受光用の集光レンズも必須のものではないが、受光用の集光レンズ１８を設ければ、蛍光などの光学的情報のシグナルをより高めることができる。その結果、ＳＮ比の向上を図ることも可能である。
【０１４１】
（５）光学フィルター
本発明に係る生体内物質検出装置１０には、図示しないが、光照射手段１５と感応部１２との間に、励起用の光学フィルターを配置することができる。本発明に係る生体内物質検出装置１０では、この励起用の光学フィルターは必須のものではないが、励起用の光学フィルターを設ければ、感応部１２に、所望の波長の励起光を選択的に照射することができる。
【０１４２】
本発明に係る生体内物質検出装置１０には、図示しないが、感応部１２と光検出手段１６との間に、受光用の光学フィルターを配置することができる。本発明に係る生体内物質検出装置１０では、この受光用の光学フィルターは必須のものではないが、受光用の光学フィルターを設ければ、感応部１２中から発せられる蛍光などの光学的情報から、所望の波長の光を選択的に受光することができる。
【０１４３】
以上説明した本発明に係る生体内物質検出装置１０は、例えば、図１５の第２実施形態に示すように、「歯ブラシ型」に形成することができる。より具体的には、手持ち部の内部に、励起光用LEDのような光検出手段１５、受光用フォトダイオードのような光検出手段１６、蛍光などの光学的情報を分離する分波器のようなダイクロイック素子１７を配設することによって、装置全体の小型化を実現することができる。このように、手持ち可能な形態とすることにより、歯肉溝液中の生体内物質を、場所を問わず、リアルタイムかつ経時的に検出・測定することができる。
【実施例】
【０１４４】
〔実施例１〕
本実施例１では、本発明に係る生体内物質検出用プローブに用いることが可能な感応部の作成を実際に行った。なお、感応部に含有させる物質の一例として、本実施例では、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）を用いた。また、本実施例の感応部は、検出用物質を感応膜内に固定化した形態を採用した。本実施例１における感応部の作製手順は以下の通りである。
【０１４５】
１．ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10 mM ADHPを調製した。
２．純水に溶解した10 U/mL ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）を調製した。
３．１で調整した10 mM ADHPを100 μL、２で調整した10 U/mL HRPを200 μLそれぞれ分取し、混合後、4.7 mLの純水で希釈した。
４．純水に溶解した10 U/mL グルコース・オキシダーゼ（GOD）を調製した。
５．３で調整したADHP・HRP溶液、４で調整した10 U/mL GODと紫外線硬化樹脂（BIOSURFINE AWP、東洋合成工業株式会社製）を各50 μL分取し、混合した。
６．５で調整した混合物を20 μL、スライドガラス上に滴下した。
７．６のスライドガラスを恒温槽に移し，60℃で10分間乾燥させた。
８．７で乾燥させたスライドガラスに、UV光を5分間照射して硬化させ、スライドガラス上に感応部を作製した。
【０１４６】
作製した感応部の８倍拡大写真を、図１５に示す。
この図１５に示す通り、感応部は、多孔質であるので、物質透過性が良いことを確認できた。
【０１４７】
〔実施例２〕
実施例２では、実施例１で作製した「感応部」の物理的強度を調べた。実験の手順は以下の通りである。
【０１４８】
１．実施例１で作製した感応部を形成したスライドガラスを用意した。
２．実体顕微鏡で、スライドガラス表面を観察した。
３．歯肉溝用センサプローブ（PDT Sensor Probe Type U. S., Williame）を用意した。
４．スライドガラス上の感応部表面を、実体顕微鏡で観察しながら、20 gの荷重になるように、こすった。
５．裸眼並びに実体顕微鏡で目視し、剥がれの有無を観察した。
【０１４９】
その観察の結果、スライドガラス上の感応部表面にはがれなどはなく、生体内物質検出用プローブに用いても、十分な強度を示すことが証明された。
【０１５０】
〔実施例３〕
実施例３では、実施例１で作製したスライドガラス上の感応部において、光学的測定が可能であることを確認した。
【０１５１】
感応部の光学的測定は、以下の蛍光測定システムを用いた。具体的には、ADHPから生成するレソルフィンの蛍光測定用に次の２種類のシステムを用いた。
一つは、励起光用の光ファイバー光源（LE-1xxx，WT&T）、分光器（MCPD-7700，大塚電子）、励起光用フィルター内蔵ボックス、蛍光用フィルター内蔵ボックス、及び、励起光用と蛍光用の光ファイバーをバンドルし、先端に集光用のレンズを設けた光ファイバー・プローブの組み合わせを用いた。光源、励起光用フィルター内蔵ボックス並びに分光器と蛍光用フィルター内蔵ボックスは光ファイバーで結合され、起光用フィルター内蔵ボックスは光ファイバー・プローブの励起光用光ファイバー、蛍光用フィルター内蔵ボックスは光ファイバー・プローブの蛍光用光ファイバーと結合した。もう一つは、FLE-1000（日本板硝子）を用いた。これは、内部に励起光用LED、受光用フォトダイオード、蛍光を分離
する分波器を持ち、取り付けた光ファイバー・プローブを用いて、測定対象に励起光を照射し、発生する蛍光を検出することができるものである。
【０１５２】
１．D-グルコース溶液を以下の手順で調整した。
（１）リン酸緩衝食塩水（PBS）を純水で調製した。
（２）4 g/L D-グルコース溶液を調製した。
（３）（１）調整したリン酸緩衝食塩水と、（２）で調整した4 g/L D-グルコース溶液を用いて、任意の濃度のD-グルコース溶液を調整した。
２．次に、実施例１で作製したスライドガラス上の感応部上に、前記蛍光システムの光ファイバー・プローブを設置した。
３．感応部に、１で調整した反応液を滴下し、または、滴下せずに前記蛍光システムで蛍光強度を測定した。
【０１５３】
測定結果を図１７と図１８に示す。図１７は、100 mg/dLのD-グルコース/PBS溶液10μLを感応部上に滴下して、蛍光強度を測定した図面代用グラフである。なお、図１７中のグラフは下から、滴下から0秒後、60秒後、120秒後、180秒後、240秒後、300秒後、360秒後、420秒後、480秒後、540秒後の蛍光強度を示す。
この図１７に示す通り、感応部にD-グルコース溶液を滴下することにより、感応部中から蛍光が測定されることを確認できた。
【０１５４】
図１８は、感応部上に、リン酸緩衝食塩水（PBS）10μLのみを滴下した場合と、100 mg/dLのD-グルコース溶液10μLを滴下した場合の蛍光強度の違いを示す図面代用グラフである。なお、図１８中の実線（D-グルコース溶液）と破線（PBSのみの場合）の各グラフは、下から、滴下時、２分後、５分後の蛍光強度を示す。
この図１８に示す通り、PBSのみを滴下した対照区に比べ、D-グルコース溶液を滴下した場合の蛍光強度が明らかに高いことが分かった。
【０１５５】
〔実施例４〕
実施例４では、本発明に係る生体内物質検出用プローブを実際に作製した。なお、本発明に係る生体内物質検出用プローブの感応部に含有させる物質の一例として、本実施例４では、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）を用いた。
【０１５６】
１．ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10 mM ADHPを調製した。
２．純水に溶解した10 U/mL ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）を調製した。
３．１で調整した10 mM ADHPを100 μL、２で調整した10 U/mL HRPを200 μLそれぞれ分
取し、混合後、4.7 mLの純水で希釈した。
４．純水に溶解した10 U/mL グルコース・オキシダーゼ（GOD）を調製した。
５．３で調整したADHP・HRP溶液、４で調整した10 U/mL GODと紫外線硬化樹脂（BIOSURFINE AWP、東洋合成工業株式会社製）を各50 μL分取し、混合した。
６．プラスチック製またはガラス製の光ファイバー（外径0.25 mm）を用意した。
７．６で用意した光ファイバーを3 cm程度にカットし、FCコネクタ用フェルールに挿入した。
８．フェルールとは反対側の光ファイバーの先端に、５で調整した混合液を滴下した。
９．混合液を滴下した光ファイバーを恒温槽に移し、60℃で10分間乾燥させた。
１０．その後、UV光を5分間照射して硬化させて、本発明に係る生体内物質検出用プローブを実際に作製した。
【０１５７】
〔実施例５〕
実施例５では、感応部を有さない生体内物質検出用プローブを用いて、レソルフィン水溶液中および感応部中から発せられる蛍光測定を行った。本実施例５は、光ファイバーが本発明に係る生体内物質検出用プローブの光導波路として機能するか否かを調べる実験である。
【０１５８】
１．蛍光測定システムの作製
（１）FLE-1000にFCコネクタ付光ファイバーを結合した。
（２）FCコネクタ同士を結合するアダプタを、（１）のFCコネクタに取り付けた。
（３）感応部を有さない生体内物質検出用プローブを、（２）ののアダプタに取り付けた。
２．レソルフィン水溶液の調製
（１）10 mLの純水を用意した。
（２）（１）の純水に、0.004 gのレソルフィンを混合し、飽和水溶液を調製した。この際、溶解しないレソルフィンは沈殿した。
（３）希釈する場合は、（２）の飽和水溶液の上清を分取し、純水を加えることで行った。
３．レソルフィン水溶液中での蛍光測定
（１）２で調製したレソルフィン水溶液（飽和濃度）および1/3に希釈した水溶液中に、１で作製した蛍光測定システムの感応部を有さない生体内物質検出用プローブの先端を浸漬し、レソルフィンの測定を行った。
４．感応部中の蛍光測定
（１）実施例１で作製した感応部（スライドガラス上）に、実施例３で調整したD-グルコース溶液を滴下した。
（２）（１）のスライドガラス上の感応部に、１で作製した蛍光測定システムの感応部を有さない生体内物質検出用プローブの先端を当て、蛍光測定を行った。
【０１５９】
その測定結果を図１９および図２０に示す。図１９は、感応部を有さない生体内物質検出用プローブを用いて、レソルフィン水溶液中から発せられる蛍光を測定した結果を示す図面代用グラフである。図２０は、感応部を有さない生体内物質検出用プローブを用いて、スライドガラス上の感応部中から発せられる蛍光を測定した結果を示す図面代用グラフである。
【０１６０】
図１９および図２０に示す通り、感応部を有さない生体内物質検出用プローブを用いて、レソルフィン水溶液中および感応部中から発せられる蛍光が測定できることが確認できた。この結果から、光ファイバーが、本発明に係る生体内物質検出用プローブの光導波路として機能することを確認できた。
【０１６１】
〔実施例６〕
本実施例６では、実施例４で作製した本発明に係る生体内物質検出用プローブを用いて
、D-グルコースが実際に検出可能であることを確認する実験を行った。
【０１６２】
１．蛍光測定システムの作製
（１）FLE-1000にFCコネクタ付光ファイバーを結合した。
（２）FCコネクタ同士を結合するアダプタを、（１）のFCコネクタに取り付けた。
（３）実施例４で作製した生体内物質検出用プローブを、（２）ののアダプタに取り付けた。
２．D-グルコースの検出
（１）プラスチック製1 cm角分光セルを用意した。
（２）実施例３で調整したD-グルコース溶液2 mL（100mg/dL（健常者の血糖値））を、（１）のセルに注入した。
（３）１で作製した蛍光測定システムの生体内物質検出用プローブを、セル中のD-グルコース溶液に浸漬し、蛍光測定を行った。
【０１６３】
前記蛍光測定結果を図２１に示す。
この図２１は、本発明に係る生体内物質検出用プローブを用いて、D-グルコースの検出を行った結果を示す図面代用グラフである。図２１に示す通り、本発明に係る生体内物質検出用プローブを用いれば、生体内物質検出用プローブの感応部に固定化された各酵素および色素が一連の反応を起こすことにより、レソルフィンが生成され、このレソルフィンの蛍光強度を測定することで、D-グルコースの検出が可能であることが分かった。
【０１６４】
〔実施例７〕
本実施例７では、「毛細管部を有する生体内物質検出用プローブ」を実際に作製した。
なお、本発明に係る生体内物質検出用プローブの感応部に含有させる物質の一例として、本実施例７では、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）を用いた。
【０１６５】
１．＜例１＞
毛細管部と光ファイバーの間に感応膜からなる感応部を形成した例
（１）ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10 mM ADHPを調製した。
（２）純水に溶解した10 U/mL ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）を調製した。
（３）（１）で調整した10 mM ADHPを100 μL、（２）で調整した10 U/mL HRPを200 μLそれぞれ分取し、混合後、4.7 mLの純水で希釈した。
（４）純水に溶解した10 U/mL グルコース・オキシダーゼ（GOD）を調製した。
（５）（３）で調整したADHP・HRP溶液、（４）で調整した10 U/mL GODと紫外線硬化樹脂（BIOSURFINE AWP、東洋合成工業株式会社製）を各50 μL分取し、混合した。
（６）プラスチック製またはガラス製の光ファイバー（外径0.25 mm）を用意した。
（７）（６）で用意した光ファイバーを3 cm程度にカットし、FCコネクタ用フェルールに挿入した。
（８）フェルールとは反対側の光ファイバーの先端に、（５）で調整した混合液を塗布
し、さらに毛細管を取り付けた。
（９）毛細管を取り付けた光ファイバーを恒温槽に移し、60℃で10分間乾燥させた。
（１０）その後、UV光を5分間照射して硬化させることにより、毛細管を光ファイバーに接着するとともに、両者の間に感応膜からなる感応部を形成した。
【０１６６】
２．＜例２＞
毛細管部の内壁面に、感応膜からなる感応部を形成した例
（１）ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10 mM ADHPを調製した。
（２）純水に溶解した10 U/mL ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）を調製した。
（３）（１）で調整した10 mM ADHPを100 μL、（２）で調整した10 U/mL HRPを200 μLそれぞれ分取し、混合後、4.7 mLの純水で希釈した。
（４）純水に溶解した10 U/mL グルコース・オキシダーゼ（GOD）を調製した。
（５）（３）で調整したADHP・HRP溶液、（４）で調整した10 U/mL GODと紫外線硬化樹脂（BIOSURFINE AWP、東洋合成工業株式会社製）を各50 μL分取し、混合した。
（６）プラスチック製またはガラス製の光ファイバー（外径0.25 mm）を用意した。
（７）（６）で用意した光ファイバーを3 cm程度にカットし、FCコネクタ用フェルールに挿入した。
（８）フェルールとは反対側の光ファイバーの先端に、毛細管を取り付けた。
（９）（５）で調整した混合液を、毛細管内に吸い上げ、恒温槽に移し、60℃で10分間乾燥させた。
（１０）その後、UV光を5分間照射して硬化させることにより、毛細管内に感応膜からなる感応部を形成した。
【０１６７】
３．＜例３＞
毛細管部の内壁面に、直接、検出用物質を固定化することにより感応部を形成した例
（１）ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10 mM ADHPを調製した。
（２）純水に溶解した10 U/mL ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）を調製した。
（３）（１）で調整した10 mM ADHPを100 μL、（２）で調整した10 U/mL HRPを200 μLそれぞれ分取し、混合後、4.7 mLの純水で希釈した。
（４）純水に溶解した10 U/mL グルコース・オキシダーゼ（GOD）を調製した。
（５）（３）で調整したADHP・HRP溶液と、（４）で調整した10 U/mL GODとを各50 μL分取し、混合した。
（６）プラスチック製またはガラス製の光ファイバー（外径0.25 mm）を用意した。
（７）（６）で用意した光ファイバーを3 cm程度にカットし、FCコネクタ用フェルールに挿入した。
（８）フェルールとは反対側の光ファイバーの先端に、毛細管を取り付けた。
（９）（５）で調整した混合液を、毛細管内に吸い上げ、恒温槽に移し、60℃で10分間乾燥させることにより、毛細管部の内壁面に、直接、検出用物質を固定化することにより感応部を形成した。
【０１６８】
〔実施例８〕
実施例８では、実施例７で作製した＜例１＞と＜例３＞の生体内物質検出用プローブを用いて、D-グルコースが検出可能であることを確認した。
【０１６９】
１．蛍光測定システムの作製
（１）FLE-1000にFCコネクタ付光ファイバーを結合した。
（２）FCコネクタ同士を結合するアダプタを、（１）のFCコネクタに取り付けた。
（３）実施例８で作製した＜例１＞および＜例３＞の生体内物質検出用プローブを、（２）のアダプタに取り付けた。
２．D-グルコースの検出
（１）プラスチック製1 cm角分光セルを用意した。
（２）実施例３で調整したD-グルコース溶液1 mLを、（１）のセルに注入した。また、コントロールとして、リン酸緩衝食塩水を別のセルに注入した。
（３）１で作製した蛍光測定システムの生体内物質検出用プローブを、セル中のD-グルコース溶液またはリン酸緩衝食塩水に浸漬し、蛍光測定を行った。なお、感応部を有さない生体内物質検出用プローブを別に用意し、リン酸緩衝食塩水への応答も同時に調べた（図２２中「bare」参照）。
【０１７０】
前記蛍光測定の結果を図２２に示す。この図２２は、本発明に係る生体内物質検出用プローブを、リン酸緩衝食塩水（PBS）1 mLのみに浸漬した場合と、D-グルコース溶液1 mLに浸漬した場合の蛍光強度の違いを示す図面代用グラフである。この図２２に示す通り、PBSのみに浸漬したコントロール（破線グラフ）に比べ、D-グルコース溶液に浸漬した場合の蛍光強度（実線グラフ）が明らかに高いことが分かった。
【０１７１】
〔実施例９〕
実施例９では、実施例７で作製した＜例３＞の生体内物質検出用プローブを用いて、D-
グルコースの定量が可能であることを確認した。
【０１７２】
１．蛍光測定システムの作製
（１）FLE-1000にFCコネクタ付光ファイバーを結合した。
（２）FCコネクタ同士を結合するアダプタを、（１）のFCコネクタに取り付けた。
（３）実施例８で作製した＜例３＞の生体内物質検出用プローブを、（２）のアダプタに取り付けた。
２．D-グルコースの検出
（１）プラスチック製1 cm角分光セルを用意した。
（２）実施例３と同様の方法で、0 g/L、0.5 g/L、1g/Lに調整したD-グルコース溶液1 mLを、（１）のセルにそれぞれ注入した。
（３）１で作製した蛍光測定システムの生体内物質検出用プローブを、セル中のD-グルコース溶液に浸漬し、蛍光測定を行った。
【０１７３】
この蛍光測定の結果を図２３に示す。  この図２３に示す通り、D-グルコース溶液の濃度に比例して、蛍光強度が高くなることが分かった。この結果から、本発明に係る生体内物質検出用プローブを用いれば、生体内物質の検出のみならず、該生体内物質の定量までもが可能であることが証明された。
【０１７４】
〔実施例１０〕
光反応性の化合物の一例であるジアジド化合物を用いた感応部作製に関する実験を行った。検出用物質としては、グルコースオキシダーゼ（GOD）、ペルオキシダーゼ（POD）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）を使用した。GOD（シグマ社製），POD（シグマ社製）、 ADHP（AnaSpec社）、ジアジド化合物と水溶性の高分子鎖を含む光固定化剤溶液（ヒラソルハ゛イオ社製）を準備し、水溶液（以下、「光固定化用水溶液Ａ」を調製した。光導波路としては、プラスチック・光ファイバー（直径0.25 mm，長さ2 cm）を準備した。この片側をFCコネクタ用フェルールにはめ込み、反対側の光ファイバーの先端を感応部作製用の「光固定化用水溶液A」に10秒程度浸漬し、離液した。30分間以上室温にて乾燥後、紫外線を照射することにより、FCコネクタの反対側の端面にGOD，POD，ADHPを含有する感応部を形成した。続いて、励起光源内蔵の光ファイバー型蛍光測定器（日本板硝子社製）を用意した。感応部を設けた光ファイバーのFCコネクタ用フェルールを、コネクタ・アダプタを介して、その測定器の光ファイバー部分に光結線した。1 g/Lの濃度のD-グルコースのリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液を調製してサンプル液とした。このサンプル液に感応部を設けた光ファイバーの端面を浸漬し、生じる蛍光を測定した。
その測定結果を図２４に示す。この図２４に示されたグラフの通り、サンプル液に前記光ファイバーの感応部をサンプル液に浸漬した直後から蛍光を測定することができ、結果は良好であった。
【０１７５】
〔実施例１１〕
次に、実施例１０で使用した「光固定化用水溶液A」を用いて、生体内物質検出用プローブを構成する毛細管の内壁への検出用物質の固定化を行う実験を実施した。まず、外径0.4 mm、長さ2 cmのプラスチック製の毛細管を用意した。実施例１０と同じ「光固定化用水溶液A」を0.2 μL分取し、前記毛細管に吸液させた。この毛細管は、光固定化用水溶液Aを吸い上げており、その吸液の様子を目視で確認できた。そして、30分間以上室温での乾燥後、紫外線を毛細管に照射し、感応部を毛細管内壁に形成した。従来一般に使用されている水溶性紫外線硬化樹脂とは異なり、毛細管力で毛細管内部に吸液が円滑に行われることをまず確認した。続いて、実施例１０と同じサンプル液を準備し、前記毛細管をスライドガラス上に両面テープで固定し、蛍光顕微鏡で観察した。毛細管の先端に、サンプル液を5 μL滴下して、毛細管にサンプル液を吸収させた。毛細管を緑光で励起し、蛍光像を目視観察した。サンプル液は毛細管内部に吸引されて、毛細管内部からの蛍光を観察できた。毛細管内壁に感応部を形成したにもかかわらず、毛細管力は全く失われず、目詰まりも生じず、サンプル液を円滑に通液することを確認できた。
なお、従来の水溶性紫外線硬化樹脂で行った同様の比較実験では目詰まりする場合が殆どであり、通液しにくかった。詳しく、蛍光観察するために、2 mm程度の長さに毛細管を切り出し、同様に、サンプル液に対する応答を蛍光観察した。
その蛍光観察の画像を図２５に示す。横からの画像（図２５の上側の画像参照）により、毛細管全体から蛍光が発してことが確認できた。即ち、毛細管内壁に形成した感応部全体で反応が起こっていることが確認できた。横断面の画像（図２５の下側の画像）では、毛細管の内側より蛍光が発せられていることが確認できた。
このような観察結果により、感応部を備える毛細管の内壁側へサンプル液が円滑に吸い上げられ、該内壁に固定化された感応部で目的の酵素反応等が進み、蛍光が発せられていることを確認できた。
【０１７６】
〔実施例１２〕
次に、FCコネクタ用フェルールにはめ込んだプラスチック製光ファイバー（直径0.25 mm，長さ2 cm）を、PFAチューブ（内径0.5 mm）に挿入し、該PFAチューブとフェルールを接着した。PFAチューブに実施例１１の毛細管をはめ込み、毛細管の端面が光ファイバーの端面に接するようにしてPFAチューブと毛細管を接着してプローブを作製した。
実施例１０で用いた蛍光測定器と前記プローブを同様に光結線した。0、0.5、1、2、4 g/LのD-グルコースのPBS溶液をそれぞれ調製して、サンプル液とした。前記プローブの毛細管先端を前記サンプル液に2秒間浸漬し、蛍光測定を行った。D-グルコースの濃度に対する20秒後の蛍光強度の結果を図２６に示す。この図２６のグラフに示されているように、毛細管が吸い込んだサンプル液で蛍光を測定することができることを確認できた。
【０１７７】
〔実施例１３〕
本実施例１３では、アルコール（エタノール）検出系に関する実験を行った。なお、検出用物質としては、アルコールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP）を用いた。まず、感応部を以下の手法で作製した。アルコールオキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）、ペルオキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP，AnaSpec社製）を用意し、9 U/mLのアルコールオキシダーゼ水溶液、1.5 U/mLのペルオキシダーゼ水溶液，50 μg/mLのADHPのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を調製した。以上で調製したアルコールオキシダーゼ水溶液1.3 μL、ペルオキシダーゼ水溶液1.5 μL、 ADHP溶液2.5 μLを混合した後、純水310 μLを加えて希釈した。そこに、0.0625%となるようにジアジド化合物を含む光固定化剤（ヒラソルバイオ社製）を加えて混合して、「光固定化用水溶液B」を調製した。次に、外径0.4 mm、長さ2 cmの毛細管を用意し、上記の光固定化用水溶液Bを0.2μLを毛細管に吸引させた。乾燥後、紫外線を照射して固定化した。これにより、毛細管内壁に酵素と基質を含有する感応部を形成（固定）した。
次に、エタノールのリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液をサンプル溶液として準備した。そ
のエタノール濃度は0.03%とした。これは血中で検出されれば、ヒトの酩酊濃度とされる
濃度である。蛍光顕微鏡のステージに、前記感応部を有する毛細管を固定した。該毛細管
の先端に前記サンプル液を5 μL垂らし、該毛細管に吸引させた。
その結果、該毛細管中のサンプル液の流れに対応して蛍光が観察され、毛細管内壁に形成した感応部が目的どおりに機能作していることを確認した。
続いて、図１３の実施形態例に準ずる生体内物質検出用プローブの作製を以下の手順で行った。直系0.25 mm，2 cm長のプラスチック製光ファイバーを用意し、FCタイプのフェルールに装着した。2 cm長，内径0.5 mmのPFAチューブを用意し、中央部付近に横穴を開け、毛細管の側胴部にPFAチューブを直交するようにはめ込んだ。前記光ファイバーにPFAチューブをはめ込み、光ファイバーが毛細管の側胴部に接するようにし、フェルールとPFAチューブ、PFAチューブと毛細管を接着した。これにより、フェルール部の光ファイバーを介して励起光を伝送すれば、該励起光は毛細管の側胴部へ入射することとなり、光透過性の毛細管の内壁面に形成された感応部におけるレゾルフィンを励起する。そして、該レソルフィンから発せられる蛍光を前記光ファイバーで受光して、蛍光測定を行うことができる構成を実現できる。
続いて、光ファイバー方式の蛍光測定装置（日本板硝子社製）を用意した。FCタイプのアダプタを介して、本実施例１３で準備した上記検出用プローブを装着した。また、本実施例１３で準備したアルコール含有サンプル液を37℃に保温し、5 μLを秤量皿上に準備した。前記検出用プローブを5秒間、前記サンプル液に浸漬した後、プローブを離液させて、蛍光測定を行った。対照区として、PBS溶液を用意しておき、同様に蛍光測定を行った。
前記蛍光測定の結果、エタノール含有サンプル液では蛍光の増加が顕著であったが，PBSでは見られなかった。図２７は、本実施例１３の蛍光測定の結果を示す図面代用グラフである。このグラフに示されている結果から、毛細管内壁に感応部を備えており、該毛細管の側胴部に光導波路として機能する光ファイバーが接続された構成の検出用プローブで、エタノールの検出が可能であることを確認できた。
なお、基質の濃度の増加に対して酵素反応は増加するため、基質の濃度を最終生成物の濃度より推定することができるので、蛍光強度に基づいてエタノールの濃度を知ることもできる。
また、歯肉溝滲出液は血液の血漿成分と同様であることが知られているから、歯肉溝滲出液を測定することにより、血中のエタノール濃度を定量することができるから、観血的ではなく、非侵襲的に血中のアルコール濃度を測定可能な技術となる。
【０１７８】
〔実施例１４〕
実施例１３で採用した前記構成の検出用プローブにおいて、感応部の検出用物質をグルコースオキシダーゼ（GOD）、ペルオキシダーゼ（POD）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoazine（ADHP）とすることにより、D-グルコースの検出も可能である。
図２８は、本実施例１３で採用した前記構成の検出用プローブを用いたD-グルコース検出に係わる蛍光測定結果を示す図面代用グラフである。このグラフからわかるように、100 mg/dl濃度のD-グルコースのPBSは、対照区のPBSに比べて、蛍光が測定されていることが明らかである。
【０１７９】
〔実施例１５〕
本実施例１５では、尿酸検出系に関する実験を行った。
まず、尿酸検出のための感応部を作製した。ウリカーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）、ペルオキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ社製）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP，AnaSpec社製）を用意し、9 U/mLのウリカーゼ水溶液，1.5 U/mLのペルオキシダーゼ水溶液，50 μg/mLのADHPのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を調製した。調製したウリカーゼ水溶液1.3 μL，ペルオキシダーゼ水溶液1.5 μL，ADHP溶液2.5 μLを混合した後、純水310 μLを加えて希釈した。この希釈溶液に0.0625%となるように、ジアジド化合物を含有する光固定化剤（ヒラソルハ゛イオ社製）を加えて混合し、感応部形成用の「光固定化用水溶液Ｃ」を調製した。
次に、外径0.4 mm，長さ2 cmの毛細管を用意した。上記の光固定化用水溶液Ｃを0.2 μL毛細管に毛細管現象により吸引させた。乾燥後、毛細管に紫外線を照射して感応部を形成（固定）した。
続いて、サンプル液として、尿酸ナトリウム塩のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液を用意した。濃度は0.01%とした。これは、7 mg/dL（0.007%）が高尿酸値の基準値に相当し、血中で0.01%は高尿酸値が疑われる濃度である。蛍光顕微鏡のステージに、検出用プローブとして機能する前記毛細管を固定した。該毛細管の先端に前記サンプル液を5 μL垂らして、この毛細管に吸引させた。毛細管中のサンプル液の流れに対応して、蛍光が観察された。この結果、毛細管内壁に形成した感応部が尿酸検出系として機能していることを確認することができた。
続いて、図１３の実施形態例に準ずる生体内物質検出用プローブを、実施例１３や実施例１４と同様の手法で作製し、該プローブを、光ファイバー方式の蛍光測定装置（日本板硝子社製）に、FCタイプのアダプタを介して、装着した。
次に、本実施例１５で準備した上記サンプル液を37℃に保温し、該サンプル液5 μLを秤量皿上に準備した。そして、前記プローブを5秒間，そのサンプル液に浸漬した後、プローブを離液させて、蛍光測定を行った。対照区としては、PBSを用意し、これを同様に測定した。
測定の結果、尿酸を含有するサンプル液では蛍光の増加が顕著であったが、対照区のPBSでは増加が小さかった。図２９に示されたグラフは、尿酸を含有するサンプル溶液（尿酸溶液）が、対照区である「尿酸を含有しないPBS」に比べて蛍光強度が高く測定されていることを示している。
【０１８０】
以上の結果から、感応部を毛細管内壁に備え、該毛細管の側胴部に対して光導波路が接続されている構成の検出用プローブにより、尿酸の検出が実際に可能であることが分かった。基質の濃度の増加に対して酵素反応は増加するため、基質の濃度を最終生成物の濃度より推定することができる。このため，蛍光強度よって尿酸の濃度を知ることができる。
また、歯肉溝滲出液は血液の血漿成分と同様であることが知られているから、歯肉溝滲出液を測定することにより、血中の尿酸濃度を定量することができる。従って、観血的ではなく、非侵襲的に血中の尿酸濃度を測定可能な技術として有効である。
なお、上記実施例群で採用された感応部において、検出用物質としてボロン酸化合物を含有させておけば、上掲した化学反応式１（化１）に示されている反応原理に基づいて、歯肉溝液中に含まれる糖の蛍光検出を実施できる。
【０１８１】
〔実施例１６〕
本実施例１６では、乳酸検出系に関する実験を行った。
まず、乳酸検出のための感応部を作製した。乳酸オキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ）、ペルオキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP、AnaSpec）を用意した。1 U/μLの乳酸オキシダーゼ水溶液、1.5 U/mLのペルオキシダーゼ水溶液、50 μg/mLのADHPのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を調製した。調製した乳酸オキシダーゼ水溶液10 μL、ペルオキシダーゼ水溶液15 μL、 ADHP溶液9 μLを混合後、純水を280 μL加えて希釈した。そこに0.0625%となるように光固定化剤（ヒラソルバイオ）を加え、混合し、感応部形成用の「光固定化用水溶液Ｄ」を調製した。
次に、外径0.4 mm、長さ3 cmの毛細管を用意した。上記光固定化用水溶液Ｄを5 μL分取し、毛細管の末端を浸漬し、毛細管現象により吸引させた。乾燥後、紫外線を照射して感応部を形成（固定化）した。これにより、毛細管内壁に酵素と基質の感応膜を固定した。
続いて、上記乳酸検出のための感応部を用いた以外は、上記実施例１５の生体内物質検出用プローブの作製方法と同様にして、本実施例１６の生体内物質検出用プロープを作製し、該プローブを、励起光源と光センサを内蔵した蛍光分光器（FLE-1000、日本板硝子社製）に取り付けた光ファイバーと光結線した。これにより、毛細管の側面から励起光を照射し、毛細管内で酵素反応によって生じたレゾルフィンの発する蛍光を計測することができる。
ここで、サンプル液として、乳酸（L-(+)-lactic acid、シグマ・アルドリッチ）のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液を用意した。濃度は2.0 mMとした。この2.0 mMが血中乳酸の正常値であり、これより高いと、乳酸アシドーシスが疑われる。37℃に保温した秤量皿上の乳酸含有サンプル液5 μLに、前記検出用プロープの先端を5秒間浸漬後、離液し、蛍光測定を行った。対照区として、PBSを用意し、同様に蛍光測定を行った。
【０１８２】
前記蛍光測定の結果、乳酸含有サンプル液では蛍光の増加が顕著であったが、PBSでは増加が小さかった（図３０参照）。この結果から、毛細管内壁に感応膜を設けたプローブを用いれば、乳酸の検出が可能であることが確認できた。
なお、基質の濃度の増加に対して酵素反応は増加するため、基質の濃度を最終生成物の濃度より推定することができる。このため、正常値である2.0 mMで測定できたことにより、この値よりも高濃度の異常値でも測定が可能である。そして、蛍光強度より、乳酸の濃度を知ることができる。また、歯肉溝滲出液は血液の血漿成分と同様であることが知られており、歯肉溝滲出液を測定することにより、血中の乳酸濃度を定量することができる。この生体内物質検出用プローブは、観血的ではなく、非侵襲的に血中の乳酸濃度を測定可能な技術であることが確認できた。
【０１８３】
〔実施例１７〕
本実施例１７では、糖化タンパク質検出系に関する実験を行った。
まず、糖化タンパク質検出のための感応部を作製した。プロテアーゼ（シグマ・アルドリッチ）、フルクトシル・アミノ酸酸化酵素（シグマ・アルドリッチ）、ペルオキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP、AnaSpec）を用意した。0.7 U/μLのプロテアーゼ水溶液、 0.7 U/μLのフルクトシル・アミノ酸酸化酵素水溶液、 1.5 U/mLのペルオキシダーゼ水溶液、 50 μg/mLのADHPのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液をそれぞれ調製した。
調製したフルクトシル・アミノ酸酸化酵素水溶液10 μL、ペルオキシダーゼ水溶液15 μL、 ADHP溶液9 μLを混合後、純水を280 μL加えて希釈し、プロテアーゼを含まない溶液を調製した。この溶液に、更にプロテアーゼ水溶液も添加し、これらの全ての混合溶液を調製したが、白濁を示し、プロテアーゼによる酵素の分解が生じていると推察できた。
そこで、プロテアーゼを含まない溶液と、プロテアーゼのみの溶液とを別々に調製することとした。
上記のプロテアーゼを含まない溶液に0.0625%となるように光固定化剤（ヒラソルバイオ）を加え、混合し、プロテアーゼを含まない感応部形成用の「光硬化用水溶液Ｅ１溶液」を調製した。
プロテアーゼのみの溶液は、プロテアーゼ水溶液10 μLに純水を305 μLを加えて希釈して調製し、そこに0.0625%となるように上記光固定化剤（ヒラソルバイオ）を加え、混合し、プロテアーゼを含む感応部形成用の「光硬化用水溶液Ｅ２溶液」とした。
次に、外径0.4 mm、長さ3 cmの毛細管を用意した。毛細管の左半分の片側より、プロテアーゼを含む光硬化用水溶液Ｅ２溶液0.2 μLを毛細管現象により吸収させた。この毛細管の反対側の右半分より、プロテアーゼを含まない光硬化用水溶液Ｅ１溶液0.2 μLを毛細管現象により吸収させた。乾燥後、紫外線を照射し、毛細管の内壁に、プロテアーゼの感応膜を毛細管の左半分で、酵素群（フルクトシル・アミノ酸酸化酵素とペルオキシダーゼ）及び基質（ADHP）の感応膜を毛細管の右半分で、各々感応部を形成（固定化）した。
続いて、上記乳酸検出のための感応部を用いた以外は、上記実施例１５の生体内物質検出用プローブの作製方法と同様にして、本実施例１６の生体内物質検出用プロープを作製した。該プローブを、励起光源と光センサを内蔵した蛍光分光器（FLE-1000、日本板硝子社製）に取り付けた光ファイバーと光結線する際、この光ファイバーを、酵素群（フルクトシル・アミノ酸酸化酵素とペルオキシダーゼ）と基質（ADHP）の感応膜側から中に差し込んだ。この差し込んだ側を内側とし、その反対側であるプロテアーゼの感応膜側を外側とした。これにより、フェルールに内挿された光ファイバーは、酵素群（フルクトシル・アミノ酸酸化酵素とペルオキシダーゼ）と基質（ADHP）の感応膜が内側に固定された毛細管の部分の側面に接することになる。
ここで、糖化アルブミン（albumin glycated、シグマ・アルドリッチ）とアルブミン（albumin、シグマ・アルドリッチ）のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液を用意した。濃度は5 g/dlとした。上記の通り、5 g/dLは血清中のアルブミンの正常値である。両者を混合し、糖化アルブミンが総アルブミン量（糖化アルブミンとアルブミンの和）の20%となるように調製し、サンプル液とした。上記の通り、この20%という値は正常値を越えたぐらいの値であり、これが測定できれば、血糖値の診断に用いることができる。
サンプル液を37度Cに保温し、37℃に加熱した秤量皿上に5 μL分取した。サンプル液に前記検出用プローブの外側末端を5秒間浸漬後、離液し、蛍光を測定した。対照区として、5 g/dLのアルブミンのPBS溶液、PBSを用意し、同様に蛍光測定を行った。
【０１８４】
前記蛍光測定の結果、糖化アルブミンを含むサンプル液、アルブミンのみのサンプル液、PBSでの結果を図３１に示した。アルブミンとPBSでの比較では、アルブミンでの蛍光強度の増加が大きく、アルブミン存在による蛍光が観察された。糖化アルブミンを含むサンプルはアルブミンのサンプルに較べ、蛍光強度の増加が大きく、アルブミン自身の影響は無視でき、糖化アルブミンの検出が可能であることが確認できた。
このように、基質である糖化アルブミンの濃度の増加に対して酵素反応は増加するため、基質の濃度を最終生成物の濃度より推定することができる。このため、正常値を越えたぐらいの濃度で測定できたことにより、この値よりも高濃度の異常値でも測定が可能である。そして、蛍光強度より、糖化アルブミンの濃度を知ることができる。また、歯肉溝滲出液は血液の血漿成分と同様であることが知られており、歯肉溝滲出液を測定することにより、血中の糖化アルブミン濃度を定量することができる。観血的ではなく、非侵襲的に血中の糖化アルブミン濃度を測定可能な技術であることが分かる。
タンパク質分解酵素の種類によって、基質特異性が異なる。今回のように基質特異性が低いプロテアーゼを用いれば、血清中の糖化タンパク質全般を分解するので、フルクトサミンの測定に用いることができる。糖化アルブミンに特異性の高いタンパク質分解酵素を用いれば、糖化アルブミンのみの測定が可能である。糖化アルブミンに特異性の高いタンパク質分解酵素が知られており、市販の検査薬であるルシカGA（旭化成ファーマ）で使用されている。こうした基質特異性の異なるタンパク質分解酵素を用いることにより、フルクトサミンだけでなく、糖化アルブミン、糖化ヘモグロビン等、特定の糖化タンパク質を測定できる。
【０１８５】
〔実施例１８〕
本実施例１８では、クレアチン及びクレアチン検出系に関する実験を行った。
まず、クレアチニン及びクレアチン検出のための感応部を作製した。なお、クレアチニンは、クレアチニアーゼの作用によりクレアチンとなる。
クレアチニナーゼ（シグマ・アルドリッチ）、クレアチナーゼ（シグマ・アルドリッチ）、サルコシン酸化酵素（シグマ・アルドリッチ）、ペルオキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP、AnaSpec）を用意した。1 U/μLのクレアチニナーゼ水溶液、1 U/μLのクレアチナーゼ水溶液、0.5 U/μLのサルコシン酸化酵素水溶液、1.5 U/mLのペルオキシダーゼ水溶液、50 ug/mLのADHPのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を調製した。
以上の溶液を基に、クレアチニナーゼを含む水溶液及びこれを含まない水溶液を調製した。
クレアチニナーゼを含む水溶液は、クレアチニナーゼ水溶液10 μL、クレアチナーゼ水溶液10 μL、サルコシン酸化酵素水溶液10 μL、ペルオキシダーゼ水溶液15 μL、 ADHP溶液9 μLを混合後、純水を260 μL加えて希釈した。また、クレアチニナーゼを含まない水溶液は、クレアチニナーゼ水溶液の代わりに純水を10 μLを加えた以外は、各酵素と基質の濃度は同様とした。両者の水溶液には、それぞれ0.0625%となるように光固定化剤（ヒラソルバイオ）を加え、混合し、クレアチニナーゼを含む感応部形成用の「光固定化用水溶液Ｆ」およびクレアチニナーゼを含まない感応部形成用の「光固定化用水溶液ＦＮ」を調製した。
次いで、外径0.4 mm、長さ3 cmの毛細管を２つ用意した。上記光固定化用水溶液Ｆおよび光固定化用水溶液ＦＮの各固定液を、それぞれの毛細管に0.2μL吸収させた。それぞれの毛細管を、乾燥後、紫外線を照射し、それぞれの毛細管の内壁に酵素群と基質の感応膜を固定化し、感応部を形成した。このようにして、クレアチニナーゼを含む感応膜を有する検出用プロープおよびクレアチニナーゼを含まない感応膜を有する検出用プロープを作製した。
続いて、上記クレアチン等検出のための感応部を用いた以外は、上記実施例１５の生体内物質検出用プローブの作製方法と同様にして、本実施例１８の生体内物質検出用プロープを２つ作製し、該各プローブを、励起光源と光センサを内蔵した蛍光分光器（FLE-1000、日本板硝子社製）に取り付けた光ファイバーと光結線した。これにより、毛細管の側面から励起光を照射し、毛細管内で酵素反応によって生じたレゾルフィンの発する蛍光を計測することができる。
ここで、サンプル液として、クレアチニン（シグマ・アルドリッチ）のリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液およびクレアチン（シグマ・アルドリッチ）のリン酸緩衝食塩水溶液を２種用意した。濃度はそれぞれ1.5 mg/dLと1.0 mg/dLとした。この濃度は、正常値を越えたぐらいの値であり、これが測定できれば、クレアチニンおよびクレアチンの検査に用いることができる。37℃に保温した秤量皿上の乳酸含有サンプル液5 μLに、前記クレアチニナーゼを含む感応膜を有する検出用プロープの先端を5秒間浸漬後、離液し、蛍光測定を行った。対照区として、PBSを用意し、同様に蛍光測定を行った。また、クレアチニナーゼを含まない感応膜を有する検出用プロープも同様にして蛍光測定を行った。
【０１８６】
クレアチニナーゼを含む感応膜を有する検出用プローブを用いた場合での結果を図３２（a）に、クレアチニナーゼを含まない感応膜を有する検出用プローブを用いた場合での結果を図３２（ｂ）に示した。
感応膜にクレアチニナーゼを含まない場合には、クレアチニンに較べ、クレアチンでの蛍光強度が強いことが期待される。図３２（ｂ）の結果はより、クレアチンでの蛍光強度が強いことが確認できた。
感応膜にクレアチニナーゼを含む場合には、クレアチニンに作用するため、蛍光強度が上昇することが期待できる。図３２（a）の結果より、クレアチニンに対して蛍光強度が上昇し、応答した。クレアチニンの検出ができることが確認できた。
このように、基質であるクレアチニンとクレアチンの濃度の増加に対して酵素反応は増加するため、基質の濃度を最終生成物の濃度より推定することができる。このため、正常値を越えたぐらいの濃度で測定できたことにより、この値よりも高濃度の異常値でも測定が可能である。そして、蛍光強度より、クレアチニンとクレアチンの濃度を知ることができる。また、歯肉溝滲出液は血液の血漿成分と同様であることが知られており、歯肉溝滲出液を測定することにより、血中での濃度を定量することができる。この生体な物質検出用プローブは、観血的ではなく、非侵襲的に血中のクレアチニンとクレアチンの濃度を測定可能な技術であることが確認できた。
【０１８７】
〔実施例１９〕
本実施例１９では、コレステロール及びコレステロール・エステル検出系に関する実験を行った。
まず、コレステロール及びコレステロール・エステル検出のための感応部を作製した。なお、血中コレステロールの３／４は、エステルの状態で存在している。コレステロール・エステラーゼ（シグマ・アルドリッチ）、コレステロール酸化酵素（シグマ・アルドリッチ）、ペルオキシダーゼ（シグマ・アルドリッチ）、10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine（ADHP、AnaSpec）を用意した。1 U/μLのコレステロール・エステラーゼ水溶液、0.5 U/μLのコレステロール酸化酵素水溶液、1.5 U/mLのペルオキシダーゼ水溶液、50 μg/mLのADHPのジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を調製した。
前記の液を用いて、コレステロール・エステラーゼを含む水溶液は、コレステロール・エステラーゼ水溶液10 μL、コレステロール酸化酵素水溶液10 μL、ペルオキシダーゼ水溶液15 μL、 ADHP溶液9 μLを混合後、純水を270 μL加えて希釈し、調製した。また、コレステロール・エステラーゼを含まない水溶液は、コレステロール・エステラーゼ水溶液の代わりに、純水を10 μL加えて、調製した。
各水溶液に、それぞれ0.0625%となるように光固定化剤（ヒラソルバイオ）を加え、混合し、コレステロール・エステラーゼを含む感応部形成用の「光固定化用水溶液Ｇ」およびコレステロール・エステラーゼを含まない感応部形成用の「光固定化用水溶液ＧＮ」を調製した。
次いで、外径0.4 mm、長さ3 cmの毛細管を２つ用意した。上記光固定化用水溶液Ｇおよび光固定化用水溶液ＧＮの各固定液を、それぞれの毛細管に0.2μL吸収させた。それぞれの毛細管を、乾燥後、紫外線を照射し、それぞれの毛細管の内壁に酵素群と基質の感応膜を固定化し、感応部を形成した。このようにして、コレステロール・エステラーゼを含む感応膜を有する検出用プロープおよびコレステロール・エステラーゼを含まない感応膜を有する検出用プロープを作製した。
続いて、上記コレステロール及びコレステロール・エステル検出のための感応部を用いた以外は、上記実施例１５の生体内物質検出用プローブの作製方法と同様にして、本実施例１９の生体内物質検出用プロープを２つ作製し、該各プローブを、励起光源と光センサを内蔵した蛍光分光器（FLE-1000、日本板硝子社製）に取り付けた光ファイバーと光結線した。これにより、毛細管の側面から励起光を照射し、毛細管内で酵素反応によって生じたレゾルフィンの発する蛍光を計測することができる。
ここで、コレステロール・ステアリン酸エステル（cholesteryl stearate、シグマ・アルドリッチ）とコレステロール（シグマ・アルドリッチ）をエタノールに懸濁した。血中同様に存在比が1:4となるように両者を混合し、リン酸緩衝食塩水（PBS）溶液で希釈してコレステロール量で220 mg/dLの混合サンプル液を調製した。また、コレステロールのみで220 mg/dLとなるコレステロール・サンプル液も用意した。220 mg/dL未満が正常値である。この濃度で検出できれば、総コレステロールの測定に用いることができる。37℃に保温した秤量皿上の混合サンプル液に5 μLに、前記コレステロール・エステラーゼを含む感応膜を有する検出用プローブの先端を10秒間浸漬後、離液し、蛍光測定を行った。また、コレステロール・サンプル液も同様に測定を行った。対照区として、PBSを用意し、同様に測定を行った。検出用プローブを、コレステロール・エステラーゼを含まない感応膜を有する検出用プロープに代えた以外は上述と同様にして、混合サンプル液、コレステロール・サンプル液及びPBSのそれぞれ測定を行った。
【０１８８】
このように、コレステロール・エステラーゼを含む感応膜を有する検出用プローブを用いた場合の結果を図３３（ａ）に示した。コレステロール・エステラーゼを含まない感応膜を有する検出用プローブを用いた場合の結果を図３３（ｂ）に示した。
コレステロール・エステラーゼ含む感応膜を有する検出用プローブを用いた場合、コレステリル・ステアリン酸エステルとコレステロールの混合サンプル液では蛍光強度が大きく、コレステロールのサンプル液に較べ、反応が大きいことが確認できた（図３３（ａ）参照）。コレステロール・エステラーゼによるコレステリル・ステアリン酸エステルの分解によって産生したコレステロールの増加によるものと考えられる。
感応膜にはコレステロール酸化酵素が含まれるので、コレステロールに対して応答するが、混合サンプル液よりも低い。感応膜中でコレステロール・エステラーゼにより、コレステロール酸化酵素の近傍で高濃度にコレステロールが産生していると推測できる。
また、コレステロール・エステラーゼを含まない感応膜を有する検出用プローブを用いた場合、混合サンプル液ではコレステロールの濃度が低いため、コレステロールのみを含むサンプル液に較べ、蛍光強度が低いと考えられる。図３３（ｂ）は想定通りの結果を示した。コレステロールのみのサンプルに較べ、混合サンプル液の応答は低かった。しかしながら、PBSよりは高く、反応は生じていると考えることができた。
なお、基質の濃度の増加に対して酵素反応は増加するため、基質の濃度を最終生成物の濃度より推定することができる。このため、正常値である220 mg/dLで測定できたことにより、この値よりも高濃度の異常値でも測定が可能である。そして、蛍光強度より、コレステロール・エステル並びにコレステロールの総量の濃度を知ることができるため、コレステロールの総量も分かる。また、歯肉溝滲出液は血液の血漿成分と同様であることが知られており、歯肉溝滲出液を測定することにより、血中のコレステロールの総量の濃度を定量することができる。この生体内物質検出用プローブは、観血的ではなく、非侵襲的に血中のコレステロールの総量の濃度を測定可能な技術であることが確認できた。
【０１８９】
〔実施例２０〕
本実施例２０では、図１３に示すような、本発明に係わる生体内物質検出用プローブ１の毛細管部１４の側胴部１４２に対して光導波路１３を接続させたもの（毛細管孔１４Ｂなし）および、この毛細管部１４に毛細管孔１４Ｂを設けたもの（毛細管孔１４Ｂあり）を用いた。
1. 毛細管の用意
外径0.4 mm、長さ20 mmの毛細管を用意した。毛細管の中央（先端より10 mm位置）に、0.05または0.1 mmで深さ0.2 mmの穴を設けた。これにより、毛細管の導管と外側がつながる空気孔を作製した。
2. 酵素固定化液の調製
グルコース・オキシダーゼ（アルドリッチ・シグマ）、ペルオキシダーゼ（アルドリッチ・シグマ）、 ADHP（AnaSpec）、光固定化剤溶液（ヒラソルバイオ）を準備し、水溶液を調製した。
3. 感応膜の作製
空気孔（毛細管孔１４Ｂ）を設けた毛細管の先端（毛細管先端１４Ａ）を、シール材で封止した。上記調製した酵素固定化液を秤量皿に5 μL分取した。封止していない側の先端（毛細管上端Ｃ）を酵素固定化液に浸漬し、吸収させた。乾燥後、紫外線を照射し、毛細管内壁に酵素を固定化し、感応膜を作製した。
空気孔（毛細管孔１４Ｂ）を設けていない毛細管も用意し、封止なしで酵素固定液を毛細管の先端から吸収させ、毛細管内壁に感応膜を作製した。
4. サンプル液の調製
1 g/dLのD-グルコースのPBS溶液を用意した。
5. 感応膜の応答の観察
秤量皿に5 μLの上記調製したサンプル液（D-グルコース溶液）を分取した。上記感応膜を設けた毛細管で酵素固定液を吸収させなかった側を5秒間浸漬し、蛍光観察を行った。蛍光観察用に蛍光実体顕微鏡を用意した。作製した感応膜が上記D-グルコース溶液に応答すれば、ADHPがレゾルフィンに変化し、緑光の励起により、橙光の蛍光を示す。そこで、蛍光実体顕微鏡の励起光を緑色、蛍光受光を橙色とした。
【０１９０】
結果から、空気孔を設けなかった毛細管では毛細管内壁全域から蛍光が観察された（図３４（ａ）参照）。空気孔を設けた毛細管では孔径0.05 mm、0.1 mmの両方で、酵素固定液を吸収させた側から空気孔付近までで蛍光が観察された。0.05 mmの空気穴を設けた場合の結果を示す（図３４（ｂ）参照）。蛍光が観察された内壁に感応膜が存在すると想定される。感応膜は空気孔を設けた場合、酵素固定液を吸収させた先端から空気孔までに分布することが確認できた。他方、空気孔を設けていない場合は毛細管全域に広がった。片側を封止しした毛細管に空気孔を設けることにより、導管内の空気が抜けることができる空気孔付近までは酵素固定液が吸収されるが、それ以上は吸収されにくいことが確認できた。
【０１９１】
斯様なことから、空気孔を複数設けることにより、毛細管内壁への感応膜の固定場所を選択できる。その際に、空気孔も酵素固定液の吸収に利用すれば、先端と空気孔、空気孔と他の空気孔のように、任意の場所に感応膜を固定できることは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
本発明によれば、歯肉溝液中の生体内物質を歯肉溝中で測定することができるため、歯肉溝液中の生体内物質を、リアルタイムかつ高精度に、そして、非侵襲的に測定することが可能である。この技術を用いることで、医療分野（病理学、腫瘍免疫学、移植学、遺伝学、再生医学、化学療法など）、創薬分野、臨床検査分野、食品分野、農業分野、工学分野、法医学分野、犯罪鑑識分野、など様々な分野における分析・解析技術の向上に貢献することができる。
【符号の説明】
【０１９３】
１  生体内物質検出用プローブ
１１  歯肉溝挿入部
１２  感応部
Ｆ，Ｆ１,Ｆ２  フェルール
Ｓ  スリーブ
１３  光導波路
１４  毛細管部
Ｈ  通気口
１０  生体内物質検出装置
１５  光照射手段
１６  光検出手段
１７  ダイクロック素子
１４３  毛細管部の内壁面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２８】
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【図１６】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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