(57)【要約】【課題】反応制御を改善した動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法などを提供する。【解決手段】動物心筋含有蛋白を酵素分解するに当たり、動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法として、ホモジナイズ後、同一反応槽内で酵素の持つ特性に基づいて、段階的に酵素を作用させ処理する。このように処理した動物心筋含有ポリペプチド類のアミノ酸配列において、キモトリプシン酵素によって、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンのカルボキシル基の関与するペプチド結合を酵素分解する。【選択図】  図１
2011135843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物心筋含有蛋白を酵素分解するに当たり、同一反応槽内で酵素の持つ特性に基づいて、段階的に酵素を作用させ処理することを特徴とする動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法。
【請求項２】
請求項１の動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法による処理によって得られた動物心筋含有ポリペプチド類のアミノ酸配列において、キモトリプシン酵素によって、チロシン、フェニルアラニン、及びトリプトファンのカルボキシル基の関与するペプチド結合を酵素分解することを特徴とする動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法。
【請求項３】
請求項１、２記載の動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法による処理によって得られる動物心筋ペプチド混合物を含むことを特徴とする食品素材。
【請求項４】
請求項３記載の食品素材を含むことを特徴とする免疫賦活・強壮作用・新陳代謝促進用の健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物心筋を加水分解処理し低分子ペプチドを製造し、機能性健康・食品素材として供する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物エキス、動物内蔵乾燥末などが栄養食品、健康食品に使用されている。これらを摂取することによる効果は、これらに含有される蛋白質の有用性にあるといえるが、得てして蛋白質の分子量が大きく、人が摂取しても体内での吸収、機能面で質的、量的に問題があった。そこで、本発明者らは、動物心筋の強壮作用、免疫向上効果について研究した。その結果、動物心筋から得られる心筋ペプチド混合物を継続摂取することによって、免疫賦活、強壮改善作用が促進されることを明らかにした。
【０００３】
なお、本発明に関連した先行技術文献としては、特許文献１〜６があげられる。特許文献１には、哺乳動物の心臓などを磨細し、自己消化させたのちに処理するという「抗脂血作用を有する物質の製造法」が開示されている。特許文献２には、鶏ガラを常圧加熱水加熱しチキンエキスを得た後、抽出残渣に水を加え加圧熱水加熱してチキンエキスを得、ついで両エキスを混合するという「チキンエキスの製造方法」が開示されている。特許文献３には、エキス固形分濃度０．５〜１０％程度に熱水抽出した抽出液を過熱温度９０℃以下かつ蒸発温度６０℃以下の条件で濃縮するという「濃縮エキスの製造方法」が開示されている。特許文献４には、（i）鳥ガラまたは鳥ガラとその肉を熱水抽出する工程、（ii）抽出液からオイルを除去する工程、（iii）オイル除去された抽出液に含まれている鳥ガラをミンチする工程、（iv）オイル除去された抽出液と鳥ガラミンチよりなる組成物を酵素分解する工程、よりなる「鳥エキスの製法」が開示されている。特許文献に５は、動物心臓を酵素処理して得られる心臓ペプチド混合物からなる「肝臓脂質代謝改善剤」が開示されている。そして、特許文献６には、鳥獣畜肉に対して糖類の存在下に鰹節菌の作用により得られる「鳥獣畜肉発酵加工食品」が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公昭４８−６７６３号公報
【特許文献２】特開平２−４２９５５号公報
【特許文献３】特開平２−２７６５５２号公報
【特許文献４】特開平６−１６５６５４号公報
【特許文献５】特開２０００−２５６２００号公報
【特許文献６】特開２００１−１３６９３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、蛋白質は分子量が大きく、人が摂取しても体内での吸収、機能面で質的、量的に問題があるという点に対しては、前記のとおり、心筋ペプチド混合物を継続摂取すること、即ち、動物心筋の弾性蛋白質コネクチン、ミオグロビン、チトクロームＣなどを含む蛋白質をペプチド化し、食品、健康食品として摂取するという解決策がある。しかし、蛋白質を分解してペプチド化すれば、免疫賦活、強壮、代謝促進作用が改善されることは明らかであるが、動物心筋を加水分解処理するに当り、処理に関わる反応制御に改善すべき点があり、このため生産物（ペプチド含有製品）の、均一性、風味、吸収性、機能性の点で問題があった。
【０００６】
従って、本発明は、反応制御を改善した動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法などを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、動物心筋のコネクチン、ミオグロビン、チトクロームＣなどを含む蛋白質を加水分解することによりペプチド混合物を得るため、アルカラーゼ、システインプロテアーゼ、ニュートラーゼ、セリンプロテアーゼ、ペプチターゼ、パンクレアチン、プロテアーゼ、リバーゼ、について、これら酵素を１種類添加又は２種類添加あるいは同時添加の研究を行ったが、条件面で問題があることを見出した。
【０００８】
そこで、本発明者らは種々検討した結果、２種類の分解酵素を、その酵素の特性に合わせ、第一段階、第二段階と個々に分解酵素を単独に至適分解温度、至適ｐＨ値（水素イオン濃度値）を設定し至適相対活性で作用させることで、安定した分解に至ることを見出した。更に、生産物の機能性を高めるためキモトリプシン分解酵素でチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンのカルボキシル基の関与するペプチド結合を分解することにより、よりペプチドの機能性が高まり、様々な食品に機能性を付与することができることを見出した。
【０００９】
本発明者らは、かかる知見に基づき、動物心筋蛋白質を加水分解する際に反応効率を向上させるべく、動物心筋蛋白質に対して、段階的加水分解処理を行うことにより反応制御性が改善されることに着目し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、動物心筋を加水分解処理するに当って心筋の性質と酵素の特性（例えば：反応制御のし易さ、連続性、生産物の均一化条件）を保持しつつ動物心筋の加水分解が効率よく行われるようにしたことを特徴とする。
【００１０】
更に、生成した心筋ペプチド混合物を含有する物を主成分としたもので免疫賦活、強壮作用、新陳代謝改善促進剤として機能性食品を製造できることに着目して本発明を完成させるに至った。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、反応制御を改善した動物心筋蛋白含有物の酵素処理方法などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】馬心筋粉末の水泳持続時間を示す図である。
【図２】馬心筋粉末のＮＫ活性を示す図である。１週間投与時のグラフ
【図３】馬心筋粉末のＮＫ活性を示す図である。２週間投与時のグラフ
【図４】馬心筋粉末のＮＫ活性を示す図である。４週間投与時のグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を実施するための形態（実施形態）を説明する。
本発明を実施するに当り、第一段階の反応では、セリンプロテアーゼ酵素の特性に分解反応条件を設定し酵素分解を行い酵素分解終了後、酵素を失活させた。更に、第二段階の反応では、システインプロテアーゼ酵素の特性に分解反応条件を設定して分解を行い終了後、第一段階と同様に酵素を失活させた。
【００１４】
更に、第二段階の後、第三段階の反応では、キモトリプシン酵素でチロシン、フェニルアラニン、トリプトファンのカボキシル基の関与するペプチド結合を分解させ、基質となる心筋蛋白質の機能向上あるいは新機能性を付加させた。
なお、ペプチド結合は、アミド結合（アミンと有機酸の脱水素結合）のうち、アミノ酸同士が脱水縮合して形成される結合である。多数のアミノ酸が縮合した高分子物質はタンパク質である。
【００１５】
分解酵素の段階的組み合わせはセリンプロテアーゼとシステインプロテアーゼ及びキモトリプシン又はセリンプロテアーゼとキモトリプシン、システインプロテアーゼとキモトリプシンの組み合わせで行ってもよい。本発明の対象となる食品は本組成を損なわない範囲で粉末単独あるいは適宜に配合できる。以下実施例を挙げ、本発明を説明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
ちなみに、後記する実施例１と実施例２では、下記の表１に示す酵素を選択使用した。実施例２では、第三段階の反応＝第二段階の反応である。
補足すると、第一段階の反応では、セリンプロテアーゼを好適に用いることができる。また、第二段階の反応では、システインプロテアーゼを好適に用いることができる。また、第三段階の反応では、キモトリプシンを好適に用いることができる。
【００１６】
【表１】
2011135843.tif 000003
【００１７】
なお、後記する実施例５におけるＮＫ細胞活性（図２中の「ＮＫ活性（％）」）は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性を示すものである。ここで、ＮＫ細胞とは、先天免疫の主要因子として働く細胞傷害性リンパ球の一種であり、特に腫瘍細胞やウィルス感染細胞の拒絶に重要である。ＮＫ細胞は、これらの悪性の細胞を殺すのにＴ細胞とは異なり事前に感作させておく必要がないということから、つまり、抗原感作なしに腫瘍細胞やウィルス感染細胞などを殺す（傷害する）ことから、ＮＫ（natural killer cell）と名付けられている。
【００１８】
（酵素について）
第一段階の反応に使用される「セリンプロテアーゼ（serine protease）」は、触媒残基として求核攻撃を行うセリン残基をもつプロテアーゼ（蛋白質分解酵素）である。また、第二段階の反応に使用される「システインプロテアーゼ（cysteine protease）」は、触媒部位において、システインのチオール基を求核基として用いる蛋白質分解酵素である。また、第三段階の反応に使用される「キモトリプシン（chymotrypsin）」は、エンドペプチダーゼ、セリンプロテアーゼの一種、かつ、膵液に含まれる消化酵素の一種であり、芳香族アミノ酸のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解する。
【００１９】
（アミノ酸について）
また、「チロシン（tyrosine）」は、アミノ酸の一種であり、側鎖にフェノール部位を持つ。2-アミノ-3-ヒドロキシフェニルプロピオン酸あるいは p-ヒドロキシフェニルアラニンとも呼ばれる。この分子式は、「Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３」である。また、「フェニルアラニン（phenylalanine）」も、アミノ酸の一種であり、側鎖にベンジル基を持つ。この分子式は、「Ｃ９Ｈ１１ＮＯ２」である。また、「トリプトファン（tryptophan）も、アミノ酸の一種であり、2-アミノ-3-（インドリル）プロピオン酸のことである。分子式は、「Ｃ１１Ｈ１２Ｎ２Ｏ２」である。これらは、いずれも、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有する。
【００２０】
（蛋白質について）
「コネクチン（connectin）」はタイチンともいい、横紋筋のＺ線とＭ線を１分子でつなぐ弾性蛋白質であり、非常に大きな分子量の分子である。また、「ミオグロビン（myoglobin）」は、主に心筋や骨格筋に存在する分子量約１７５００のヘム蛋白であり、筋肉中にあって酸素分子を代謝に必要な時まで貯蔵する。また、「チトクロームＣ（cytochrome C）」は、筋肉中に存在する分子量約１２４００の分子であり、酸化還元機能を持つヘム鉄を含有するヘム蛋白質の一種である。
【００２１】
≪実施形態１≫
実施形態１では、後記するように、馬心筋を対象として、温度調節機能付きの容器により第一段階の反応と、それに続く第二段階の反応と、更にそれに続く第三段階の反応を行った。
第一段階の反応では、酵素としてセリンプロテアーゼを用いた。セリンプロテアーゼは、相対活性における至適ｐＨ−活性値はｐＨ７．０、温度−活性至適は５０〜５５℃という特性を有するので第一段階の反応に好適に用いることができる。
第二段階の反応では、酵素としてシステインプロテアーゼを用いた。システインプロテアーゼは、相対活性における至適ｐＨ−活性値はｐＨ６．５、温度−活性至適は８０℃という特性を有するので第二段階の反応に好適に用いることができる。
第三段階の反応では、酵素としてキモトリプシンを用いた。キモトリプシンは、相対活性における至適ｐＨ−活性値はｐＨ７．５、温度−活性至適は５０℃という特性を有するので第三段階の反応に好適に用いることができる。
４倍量の水を用いたのは、蛋白の拡散性、分散性、添加酵素の反応性を考慮したものである。水が多いと生産性が低下する。一方、水が少ないと酵素の反応性が低下する。
【００２２】
≪実施形態２≫
実施形態２では、後記するように、羊心筋を対象として、温度調節機能付きの容器により第一段階の反応と、それに続く第二段階（＝第三段階）の反応を行った。
第一段階の反応では、酵素としてセリンプロテアーゼを用いた。セリンプロテアーゼは、相対活性における至適ｐＨ−活性値はｐＨ７．０、温度−活性至適は５０〜５５℃という特性を有するので第一段階の反応に好適に用いることができる。
第二段階（第三段階）の反応では、酵素としてキモトリプシンを用いた。キモトリプシンは、相対活性における至適ｐＨ−活性はｐＨ７．５、温度−活性至適は５０℃という特性を有するので第二段階の反応に好適に用いることができる。
３倍量の水を用いたのは、前記と同様である。
【実施例】
【００２３】
以下、前記実施形態を具体化した実施例を説明する。なお、本発明がこの実施例のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００２４】
実施形態１に対応する実施例１を説明する。実施例１では、馬心筋５０ｋｇをホモジナイズし、これを温度調節機能付きのステンレス製の適量の容器（反応槽）に入れ、これに４倍量の水を加水して、（第一段階）温度を５０〜５５℃に設定し、温度安定の後ｐＨ７．０に調製する。３〜５時間後再度ｐＨを確認、調製しセリンプロテアーゼ１ｋｇを加え、１０時間酵素分解を行う。分解後８０℃以上で４０分間保持させ酵素を失活させ、（第二段階）次いで冷却し８０℃に設定し、温度安定後にｐＨ６．５に調製し、２〜５時間後再度ｐＨを確認、調製し、システインプロテアーゼ１ｋｇを加え１０時間酵素分解後、８０℃以上で４０分間保持し酵素を失活させる。（第三段階）次いで冷却し、５０℃に設定し、温度安定後ｐＨ７．５に調製しキモトリプシン４００ｇを加え３〜５時間酵素分解を行った後、８０℃以上で４０分間保持し酵素を失活させ、不溶物を除去後、凍結乾燥して約４３ｋｇの粉末を得た。
なお、第一段階〜第三段階までの反応は、同一の反応槽で行った。
【実施例２】
【００２５】
実施形態２に対応する実施例２を説明する。実施例２では、羊心筋２ｋｇをホモジナイズし、温度調節機能付きのガラス製の５リットル容器（反応槽）に入れ、これに３倍量の水を加水し、（第一段階）温度を５０〜５５℃に設定し、温度安定後ｐＨ７．０に調製し、２〜４時間後再度ｐＨを調製してセリンプロテアーゼ４０ｇを加え６〜８時間酵素分解を行った後、８０℃以上で４０分間保持させ酵素を失活させる。（第三段階（＝第二段階））次いで温度を下げ５０℃に設定して、温度安定後ｐＨ７．５に調製しキモトリプシン１０ｇを加え３〜６時間酵素分解を行った後、８０℃以上で３０分間保持し酵素を失活させ、不溶物を除去後、凍結乾燥して約１．６ｋｇの粉末を得た。
なお、この実施例２でも、各段階の反応は、同一の反応槽で行った。
ちなみに、実施例２では、システインプロテアーゼによる第二段階が存在しないが、これは、対象とした動物（馬と羊）の違いによるコネクチンを含む総蛋白質の分子量の違いに起因するものである。
【実施例３】
【００２６】
凍結乾燥；
実施例２で得られた凍結乾燥前の液に松谷化学工業株式会社製のパインデックス（登録商標）＃１００を２５０ｇ加え凍結乾燥して約１．８ｋｇを得た。なお、パインデックスは澱粉を加水分解し、精製した高純度の澱粉分解物である。澱粉分解物を加えることにより、これが賦形剤となり、素材製品の保存性、溶解性、風味がより向上し他素材との配合により高い機能性食品とすることができる。
【実施例４】
【００２７】
抗疲労試験；
馬心筋粉末の肉体的抗疲労作用の評価としてマウスによる実験を行った。３０匹のマウス（ｄｄｙ、雄、６週齢）を、コントロール群（Cont）、朝鮮人参エキス末（市販品）群（１００ｍｇ）、馬心筋粉末５０、１００、２００ｍｇ／ｋｇ群の５群に分け飼育して、各粉末を水に分散し各投与量で、１日１回、２週間マウスに経口投与した。２週間目にマウス体重の１０％の重りを負荷して、強制水泳実験（頭部が５秒間完全に水中に水没するまでの時間を測定した）を行った。結果投与２週間目の測定時で、馬心筋粉末投与群はコントロール群と比較して水泳持続時間の上昇が濃度依存的に認められた（図１）。また、滋養強壮素材として、朝鮮人参エキス末と比較した結果、馬心筋粉末は持続時間の延長が認められ、肉体疲労に対しての効果が示唆された。
なお、いずれの群も、同じ食餌を与えてある。また、ｍｇ／ｋｇとは、マウスの体重あたりに換算した投与量である。
【実施例５】
【００２８】
免疫力向上作用；
２４匹のマウス（雌雄、４週齢）を、対照群、５０ｍｇ／ｋｇ群、１００ｍｇ／ｋｇ群、２００ｍｇ／ｋｇ群の４群に分け、１週間、２週間、４週間後のマウス脾臓のＮＫ細胞活性を測定した。ＮＫ細胞は投与１週間から馬心筋粉末の投与量が多くなるにつれて、高くなる傾向を示し、２週間、４週間投与２００ｍｇ／ｋｇ群においては対照群に対して有意に高い値を示した（図２〜図４）。測定結果からマウス１匹あたり２００ｍｇ／ｋｇ、２週間以上投与することによりＮＫ活性が上昇することが示された。また、馬心筋粉末を継続的に摂取することで、免疫力を高める可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明においては、ペプチド化された動物心筋の本組成は高い分散性が有り、固形、錠剤、飲料、粉末、顆粒など、形態を問わず機能性、健康食品の素材として利用でき、また、他食品と配合することにより高い機能食品としての広範囲な利用ができる。
【図１】
2011135843.tif 000004
【図２】
2011135843.tif 000005
【図３】
2011135843.tif 000006
【図４】
2011135843.tif 000007