(57)【要約】      （修正有）【課題】改変されたプロモーター、当該プロモーターを含有する発現ベクター及び形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いた目的遺伝子産物の製造方法の提供。【解決手段】バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、特定の塩基配列；当該塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列；ならびに前記特定の塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの１以上が改変されている塩基配列を含む、改変プロモーター。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号１で示される塩基配列；当該塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列；ならびに配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの１以上が改変されている塩基配列を含む、改変プロモーター。
【請求項２】
前記配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号２で示される塩基配列である、請求項１に記載の改変プロモーター。
【請求項３】
バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、請求項１又は２記載の改変プロモーター。
【請求項４】
バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス  エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つｃｒｅ様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、請求項３記載の改変プロモーター。
【請求項５】
塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、請求項１〜４のいずれか１項記載の改変プロモーター。
【請求項６】
バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号１で示される塩基配列；当該塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列；ならびに配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの１以上を改変する工程を含む、改変プロモーターの製造方法。
【請求項７】
前記配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号２で示される塩基配列である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、請求項６又は７記載の製造方法。
【請求項９】
バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス  エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つｃｒｅ様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、請求項６〜９のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変プロモーター又は請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法で製造された改変プロモーターにおいて、さらに１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された改変プロモーター。
【請求項１２】
請求項１〜５及び１１のいずれか１項記載の改変プロモーター、又は請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法で製造された改変プロモーターを含有する発現ベクター。
【請求項１３】
改変プロモーターが目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている、請求項１２記載の発現ベクター。
【請求項１４】
目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている請求項１〜５及び１１のいずれか１項記載の改変プロモーター又は請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法で製造された改変プロモーターを含む、形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４記載の形質転換体を用いることを特徴とする、目的遺伝子産物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたプロモーター、当該プロモーターを含有する発現ベクター及び形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いた目的遺伝子産物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。一方、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、特に最近では、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な有用物質生産が注目されている。
【０００４】
遺伝子の転写に必要なプロモーターに関する研究も数多く行なわれており、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においては異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を強力に転写するプロモーター領域として、例えば、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域（例えば、非特許文献１参照）や、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（例えば、特許文献１、非特許文献２参照）の上流部に存在するプロモーター領域等が利用されている。
【０００５】
しかしながら、工業的な生産における生産コストの低減化のためには、更なる高い生産性を実現するプロモーター及び微生物が求められている。
【０００６】
プロモーター領域には通常、転写制御に関わる様々な部位が存在する。これらの部位は、周囲の環境からのシグナルを受けて遺伝子の発現を促進又は抑制する役割を担っている。例えば、微生物の培地中にグルコース等の異化代謝物が多く存在すると、微生物がそれらの異化代謝物を炭素源として主に利用するように、より高分子の糖の分解酵素の発現は抑制される。このような現象は異化代謝物抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれ、大腸菌、バチルス属菌等で観察されている。枯草菌のｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎは転写レベルで生じることが知られており、それに関与する領域はｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ｃｒｅ）と称される。
【０００７】
非特許文献３には、枯草菌α−アミラーゼ遺伝子のｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｐｅｒａｔｏｒ領域の点変異によって、ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎが増加する場合と減少する場合とがあったことが報告されている。一方、枯草菌のエンドグルカナーゼのプロモーターにおいても、α−アミラーゼのｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ領域と似た配列が存在することが発見され、ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｐｅｒａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれた（非特許文献２）。しかし、その実際の役割は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−２１００８１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｕｍｉｔｏｍｏら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９：２１７２−２１７５，１９９５
【非特許文献２】Ｈａｋａｍａｄａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２２８１−２２８９，２０００
【非特許文献３】ＷｅｉｃｋｅｒｔおよびＣｈａｍｂｌｉｓｓ，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔl．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６２３８−６２４２，１９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、遺伝子の転写量を向上させ得る改変されたプロモーター、当該プロモーターを含有する発現ベクター及び形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いた目的遺伝子産物の製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、バチルス属細菌セルラーゼ遺伝子のプロモーター領域に、ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ配列と似た配列が複数存在することを見出した。さらに、当該配列を変異させることにより、プロモーターに制御される遺伝子の発現が大きく増加し、当該遺伝子にコードされる遺伝子産物の生産性が向上することを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号１で示される塩基配列；当該塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列；ならびに配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの１以上が改変されている塩基配列を含む、改変プロモーター。
（２）上記配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号２で示される塩基配列である、（１）記載の改変プロモーター。
（３）バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、（１）又は（２）記載の改変プロモーター。
（４）バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス  エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つｃｒｅ様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、（３）記載の改変プロモーター。
（５）塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、（１）〜（４）のいずれか１に記載の改変プロモーター。
（６）バチルス属細菌由来のプロモーターにおいて、配列番号１で示される塩基配列；当該塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列；ならびに配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される塩基配列のうちの１以上を改変する工程を含む、改変プロモーターの製造方法。
（７）上記配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列が、配列番号２で示される塩基配列である、（６）記載の製造方法。
（８）バチルス属細菌由来のプロモーターが、枯草菌又は枯草菌変異株由来のプロモーターである、（６）又は（７）記載の製造方法。
（９）バチルス属細菌由来のプロモーターが、バチルス  エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター、又はこれらのプロモーターの塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つｃｒｅ様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターである、（８）記載の製造方法。
（１０）塩基配列の改変が、塩基配列の塩基の欠失、置換又は付加である、（６）〜（９）のいずれか１に記載の製造方法。
（１１）（１）〜（５）のいずれか１に記載の改変プロモーター又は（６）〜（１０）のいずれか１に記載の方法で製造された改変プロモーターにおいて、さらに１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された改変プロモーター。
（１２）（１）〜（５）及び（１１）のいずれか１に記載の改変プロモーター、又は（６）〜（１０）のいずれか１に記載の方法で製造された改変プロモーターを含有する発現ベクター。
（１３）改変プロモーターが目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている、（１２）記載の発現ベクター。
（１４）目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている請求項（１）〜（５）及び（１１）のいずれか１に記載の改変プロモーター又は（６）〜（１０）のいずれか１に記載の方法で製造された改変プロモーターを含む、形質転換体。
（１５）（１４）記載の形質転換体を用いることを特徴とする、目的遺伝子産物の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の改変プロモーターは、その下流に連結される遺伝子の転写量を顕著に向上させることができる。従って、本発明によれば、目的の遺伝子産物をより効率的に生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた欠失変異プロモーターの作製手順。
【図２】ｐＤＬ２−Ｓ２３７プラスミドの調製手順。
【図３】本発明の形質転換体と野生株におけるβ−ガラクトシダーゼ活性。Ａ：グルコース含有培地での活性、Ｂ：マルトース含有培地での活性、Ｃ：ソルビトール含有培地での活性、Ｄ：モデル糖化液含有培地での活性。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法  （Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
本明細書に記載される枯草菌ＤＮＡの塩基配列及び塩基番号は、特に示されない限り、枯草菌転写因子検索サイト（ｈｔｔｐ：／／ｄｂｔｂｓ．ｈｇｃ．ｊｐ／）に基づく。
【００１７】
本発明の改変プロモーターは、ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔの塩基配列と類似する塩基配列（以下、ｃｒｅ様配列と称する）を有するバチルス属細菌遺伝子由来のプロモーターをコードするポリヌクレオチドにおいて、当該ｃｒｅ様配列の塩基配列を改変することによって作製されるものである。ｃｒｅ様配列としては、配列番号１で示される塩基配列、及び当該配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列が挙げられる。あるいは、ｃｒｅ様配列としては、配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ここで、複数個とは、１〜６個、好ましくは１〜３個を意味する。
【００１８】
塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の方法は、例えば、Dieffenbachら（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995）に記載されている。この手法を用いることによって１個又は複数個の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入が可能である。ｃｒｅ様配列であることは、例えば後述の実施例と同様に改変した場合に、グルコース等の異化代謝物の存在下における目的遺伝子の発現の増強効果により確認可能である。配列番号１で示される塩基配列に対して７０％以上の配列同一性を有する塩基配列の例としては、配列番号２で示される塩基配列が挙げられる。これは配列番号１の塩基配列に対して３個の塩基が置換された配列であり、従って、配列番号１の塩基配列と７６．９％の配列同一性を有する。
【００１９】
本発明の改変プロモーターが由来するバチルス属細菌由来のプロモーター、すなわち本発明のプロモーターの親プロモーターとしては、ｃｒｅ様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターであれば特に制限されないが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び枯草菌変異株由来のプロモーターが好ましい。また好ましくは、バチルス  エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子（配列番号３）由来のプロモーター（配列番号３の塩基番号１〜６０９）及びバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（配列番号４）のプロモーター（配列番号４の塩基番号１〜５７２）が挙げられる。配列番号１及び２の塩基配列は、それぞれ配列番号３の塩基番号１〜６０９で示されるＫＳＭ−６４株アルカリセルラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列の塩基番号３９９〜４１２及び塩基番号２６４〜２７６、ならびに配列番号４の塩基番号１〜５７２で示されるＫＳＭ−Ｓ２３７株アルカリセルラーゼ遺伝子プロモーターの塩基配列の塩基番号３５９〜３７２及び塩基番号２２３〜２３５に該当する。
【００２０】
あるいは、本発明のプロモーターの親プロモーターとしては、上記配列番号３又は４で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーターの塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列を有するか、あるいは当該プロモーターの塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、且つｃｒｅ様配列を有するバチルス属細菌由来のプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターがｃｒｅ様配列を有するか否かは、シークエンシングにより塩基配列の中にｃｒｅ様配列が含まれるかどうかを調べることによって、あるいは、配列番号３又は４で示されるプロモーターとの配列比較を行い、ｃｒｅ様配列に相当する領域を決定することによって確認することができる。塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の方法は、例えば、Dieffenbachら（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995）に記載されている。この手法を用いることによって１個又は複数個の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入が可能である。プロモーター配列であることは、例えば後述の実施例と同様にＬａｃＺ遺伝子を導入し、β−ガラクトシダーゼの発現により確認することができる。
【００２１】
親プロモーター中に複数のｃｒｅ様配列が存在する場合、ｃｒｅ様配列の塩基配列の改変には、親プロモーター中に存在するｃｒｅ様配列の塩基配列のうちの１以上を改変すればよい。すなわち、親プロモーター中に存在するｃｒｅ様配列の塩基配列のうちのいずれか１、いずれか２若しくはそれ以上、又は全てを改変することができる。例えば、親プロモーターに配列番号１及び２でそれぞれ示される２つのｃｒｅ様配列が存在する場合、配列番号１で示される塩基配列のみを改変してもよく、配列番号２で示される塩基配列のみを改変してもよく、又は配列番号１及び２で示される２つの塩基配列の両方を改変してもよい。好ましくは、配列番号１及び２で示される２つの塩基配列の両方を改変する。
【００２２】
すなわち一態様において、本発明の改変プロモーターは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又は枯草菌変異株のプロモーターにおいて、当該プロモーター中に存在するｃｒｅ様配列のうちの１以上を改変することによって作製されるものである。
【００２３】
別の態様において、本発明の改変プロモーターは、配列番号３の塩基番号１〜６０９で示されるＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーターにおいて、塩基番号２６４〜２７６で示されるｃｒｅ様配列及び塩基番号３９９〜４１２で示されるｃｒｅ様配列のうちの１以上を改変することによって作製されるものである。好ましくは、塩基番号２６４〜２７６で示されるｃｒｅ様配列及び塩基番号３９９〜４１２で示されるｃｒｅ様配列の両方が改変されている。
【００２４】
別の態様において、本発明の改変プロモーターは、配列番号４の塩基番号１〜５７２で示されるバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）のアルカリセルラーゼ遺伝子由来のプロモーターにおいて、塩基番号２２３〜２３５で示されるｃｒｅ様配列及び塩基番号３５９〜３７２で示されるｃｒｅ様配列のうちの１以上を改変することによって作製されるものである。好ましくは、塩基番号２２３〜２３５で示されるｃｒｅ様配列及び塩基番号３５９〜３７２で示されるｃｒｅ様配列の両方が改変されている。
【００２５】
ｃｒｅ様配列の塩基配列の改変としては、ｃｒｅ様配列の塩基配列における、一部又は全部の塩基の欠失、一部又は全部の塩基の置換、及び任意の位置における塩基の付加が挙げられる。ここで、一部の塩基とは、１個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは６個以上、さらに好ましくは１０個以上の塩基を意味する。塩基の欠失、置換、及び付加は、部位特異的当然変異導入等の当該分野で通常使用される方法によって行われ得る。部位特異的当然変異導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８２，４８８，１９８５）、ＰＣＲ法等によって行うことができる。
【００２６】
あるいは、本発明の改変プロモーターは、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，５１，１９８９）により、上記プロモーターの塩基配列中に存在するｃｒｅ様配列の塩基配列の塩基を欠失、置換、及び付加させることで、構築することができる。
【００２７】
ＳＯＥ−ＰＣＲ法では、１回目のＰＣＲにより、塩基配列の改変を施した部位を下流末端とする上流側ＤＮＡ断片と、塩基配列の改変を施した部位を上流末端とする下流側ＤＮＡ断片を調製する。例えば、ｃｒｅ様配列が欠失した断片を調製する場合、上流側ＤＮＡ断片の下流側および下流側ＤＮＡ断片の上流側が、相互にアニールし、且つｃｒｅ様配列が欠失した塩基配列を有するようにプライマーを設計する（図１）。
【００２８】
次いで、１回目のＰＣＲにて調製した２種類のＤＮＡ断片を鋳型とし、上流側ＤＮＡ断片の上流側プライマーと下流側ＤＮＡ断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流側ＤＮＡ断片の下流末端と下流側ＤＮＡ断片の上流末端の間でアニールが生じて、２つのＤＮＡ断片が連結し、ｃｒｅ様配列が欠失したプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を得ることができる（図１）。このとき、使用するプライマーが制限酵素切断配列を含むように設計しておくことで、制限酵素切断配列を端部に含む断片が構築されるため、後述する制限酵素法を用いてプロモーターＤＮＡをベクターへ導入することができる。
【００２９】
同様に、上流側ＤＮＡ断片の下流側および下流側ＤＮＡ断片の上流側が、相互にアニールし、且つｃｒｅ様配列の塩基の置換又は付加を含む塩基配列を有するようにプライマーを設計することにより、ｃｒｅ様配列の塩基が置換又は付加されたプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を調製することができる。
【００３０】
改変されたプロモーター配列は、そのプロモーターとしての機能及び目的遺伝子の発現の増強効果を保持する限りにおいて、さらに１個又は複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入されたものであっても良い。塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入の方法は、例えば、Dieffenbachら（Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995）に記載されている。この手法を用いることによって１個又は複数個の塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入が可能である。さらなる改変後のプロモーターがプロモーターとしての機能及び目的遺伝子の発現の増強効果を有するかどうかは、例えば後述の実施例と同様に、グルコース等の異化代謝物の存在下における目的遺伝子の発現の増強効果を調べることにより確認可能である。
【００３１】
斯くして調製された本発明の改変プロモーターを適切なベクターに導入することによって、本発明の発現ベクターが構築される。導入のためのベクターとしては、特に限定されないが、ｐＤＬ２、ｐＭＵＴＩＮ等が好ましい。改変プロモーターのベクターへの導入は、当該分野で通常使用される任意の方法に従って行うことができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、上記で構築した制限酵素切断配列を端部に有するプロモーターを添加することによって、プロモーターをベクターに導入することができる（制限酵素法）。
【００３２】
本発明の発現ベクターにおいては、本発明の改変プロモーターは、目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている。目的遺伝子産物としては、タンパク質又はポリペプチド、及びノンコーディングＲＮＡが挙げられる。タンパク質又はポリペプチドとしては、特に限定されず、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ／Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、例えば、バチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号３及び配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる、それぞれバチルス  エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）又はバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３３】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、バチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、例えば、バチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３４】
好ましくは、上記タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、本発明の改変プロモーター領域に加えて、分泌用シグナルペプチド領域と作動可能に連結されている。例えば、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）やＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のセルラーゼ遺伝子の分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号３で示される塩基配列の塩基番号６１０〜６９６の塩基配列や配列番号４で示される塩基配列の塩基番号５７３〜６５９の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが好ましい。
【００３５】
ノンコーディングＲＮＡは、ＤＮＡから転写された後タンパク質に翻訳されないＲＮＡである。ノンコーディングＲＮＡとしては、制御配列を含む非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｌｉｋｅ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等が挙げられる。これらのノンコーディングＲＮＡは、細胞の発現制御、発生、分化、その他生命活動に関わる多種多様なメカニズムを担っており、研究、医療、診断、創薬、品種改良や農薬生産等の農業、水産及び畜産分野、化学品製造等において利用可能である。
【００３６】
本発明の改変プロモーターと目的遺伝子産物をコードする遺伝子、又は分泌シグナルペプチド領域との連結は、ベクター導入前に行われてもよく、又は予め目的遺伝子産物をコードする遺伝子、又はさらに分泌シグナルペプチド領域を含むベクターに、本発明の改変プロモーターを導入してもよい。
【００３７】
本明細書において、プロモーターと遺伝子、又はプロモーターと遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」とは、プロモーターが遺伝子の転写を誘導し得るように、又は遺伝子にコードされたタンパク質が分泌シグナルにより分泌されるように、連結されていることをいう。プロモーターと遺伝子、又はプロモーターと遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００３８】
構築した本発明の発現ベクターを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物に取り込ませることによって、本発明の形質転換体を得ることができる。あるいは、本発明の改変プロモーターと目的遺伝子産物をコードする遺伝子、又はさらに分泌シグナルペプチド領域とを連結させて構築したＤＮＡ断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合させたＤＮＡ断片を作製し、これを相同組み換えによって宿主微生物のゲノムに直接組み込むことによっても本発明の形質転換体を得ることができる。構築した本発明の発現ベクターを、一般的な形質転換法によって宿主微生物に取り込ませることでも、本発明の形質転換体を作製することができる。
【００３９】
本発明の形質転換体を用いた目的遺伝子産物の生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、目的遺伝子産物を採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、本発明の形質転換体においては、ｃｒｅ様配列が改変されていない微生物と比較して、目的遺伝子産物の生産性が向上している。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
【００４１】
実施例１  アルカリセルラーゼ遺伝子由来変異プロモーターの作製
ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ[Ｈａｋａｍａｄａ ら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４，２２８１−２２８９，２０００］由来のプロモーター領域ＤＮＡの取得のため、大腸菌−枯草菌のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子ＤＮＡのプロモーター領域（配列番号４の塩基番号１〜５７２）を鋳型とし、表１に示したプライマーＥｃｏＲＩ＿ＰＳ２３７  ＦＷ（配列番号６）、及びＢａｍＨＩ＿ＰＳ２３７  ＲＶ（配列番号７）を用いたＰＣＲにより、上流にＥｃｏＲＩ、下流にＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を付加したプロモーター領域ＤＮＡ断片を調製した。次に、プロモーター領域中の標的配列が欠失した変異体プロモーターＤＮＡ断片の取得のため、上記ＰＣＲで調製した断片を鋳型とし、表１に示したプライマーセットΔｃｒｅ１  ＦＷ（配列番号８）及びＢａｍＨＩ＿ＰＳ２３７  ＲＶ、ならびにＥｃｏＲＩ＿ＰＳ２３７  ＦＷ及びΔｃｒｅ１  ＲＶ（配列番号９）を用いたＰＣＲにより、標的配列が欠失した領域を上流、及び下流に持つ断片をそれぞれ調製した。得られた２断片を混合して鋳型とし、ＥｃｏＲＩ＿ＰＳ２３７  ＦＷ及びＢａｍＨＩ＿ＰＳ２３７  ＲＶを用いたＰＣＲを行うことで、配列番号４で示される塩基配列の２２３〜２３５残基が欠失したプロモーター領域配列ＤＮＡ断片（Δｃｒｅ１）を取得した（図１）。同様に、Δｃｒｅ１  ＦＷの代わりにΔｃｒｅ２  ＦＷ（配列番号１０）、Δｃｒｅ１  ＲＶの代わりにΔｃｒｅ２  ＲＶ（配列番号１１）を用いることで、配列番号４で示される塩基配列の３５９〜３７２残基が欠失したプロモーター領域配列ＤＮＡ断片（Δｃｒｅ２）を取得した。さらに、Δｃｒｅ１を鋳型としてプライマーΔｃｒｅ２  ＦＷ及びＢａｍＨＩ＿ＰＳ２３７  ＲＶ、ならびにＥｃｏＲＩ＿ＰＳ２３７  ＦＷ及びΔｃｒｅ２  ＲＶを用いたＰＣＲをそれぞれ行い、得られた２断片を鋳型としてプライマーＥｃｏＲＩ＿ＰＳ２３７  ＦＷ及びＢａｍＨＩ＿ＰＳ２３７  ＲＶを用いたＰＣＲを行うことで、配列番号４で示される塩基配列の２２３〜２３５残基及び３５９〜３７２残基が欠失したプロモーター領域配列ＤＮＡ断片（Δｃｒｅ１．２）を取得した。
【００４２】
ＤＮＡ断片増幅のためのＰＣＲには、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々１０ｐｍｏｌ及び、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．５Ｕ添加して、反応溶液を５０μＬとした。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０回繰り返した後、７２℃で５分間反応させることにより行った。
【００４３】
【表１】
2011103875.tif 000002
【００４４】
実施例２  発現ベクターの作製
実施例１で得られた各プロモーター領域配列ＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断後、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断したｐＤＬ２プラスミド［Ｆｕｋｕｃｈｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４６，１５７３−１５８３，２０００］とライゲーションした。得られたプラスミドを用いて定法に従って大腸菌の形質転換処理を行い、出現した形質転換体からプラスミドを抽出した（図２参照）。取得したプラスミド中に挿入されたプロモーターの塩基配列の確認は、３１００ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行なった。実施例１で得られたプロモーター領域配列ＤＮＡ断片を含むプラスミドを、発現ベクターとして所得した。
【００４５】
実施例３  形質転換体の作製
実施例２で得られた発現ベクターを、制限酵素ＳｃａＩで切断し断片化した後、コンピテント法により枯草菌１６８株に組み込んで形質転換処理を行い、処理した菌をアンピシリン（１μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で培養した。生育したコロニーをａｍｙＥ  遺伝子中にプロモーター領域とＬａｃＺ遺伝子が組み込まれた形質転換体として分離した。
【００４６】
実施例４  β−ガラクトシダーゼ活性測定
実施例３で得られた形質転換体を各種糖源含有培地で培養した際の各プロモーターの転写強度を、β−ガラクトシダーゼ活性を指標として評価した。糖源としては、グルコース、マルトース、ソルビトール、及びモデル糖化液（バイオマス由来の炭素源を模した液：４％グルコース、０．５％キシロース、０．５％セロビオースを含む糖液）を用いた。菌体の培養は、終濃度０．５％の糖源を含むＬＢ培地１ｍｌに、ＬＢ培地１ｍｌ、３０℃で１２時間培養した培養液を終濃度１％となるように植菌した。３７℃で８時間培養した後ＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００＝１．０の培養液を遠心分離して集菌した。その後、菌体を０．５ｍＬの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁することで培養液を完全に除去し、遠心分離で再集菌した。集菌した菌体は、０．６４ｍＬのＺ ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、４０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ4／７Ｈ2Ｏ、２ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し、さらにＺ ｂｕｆｆｅｒに溶かした２．５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液を０．１６ｍＬ加え、３７℃、５分間インキュベートすることで細胞壁を除去し、プロトプラスト細胞を作製した。ここに１０％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を８μＬ加えて混和することで、菌体溶菌液とした。対照として、ｌａｃＺを組み込んだ野生株から同様の手順で菌体溶菌液を得た。
得られた溶菌液のβ−ガラクトシダーゼ活性はＯＮＰＧ測定法を用いて測定した。方法は以下のとおりである。溶菌液を３０℃で３分プレインキュベーションし、ＯＮＰＧのＺ ｂｕｆｆｅｒ溶液（４ｍｇ／ｍＬ）を０．２ｍＬ加えた。ＯＮＰＧ溶液を加えた時間を０秒とし、β−ガラクトシダーゼ活性によって溶液が黄変したところで１Ｍ Ｎａ2ＣＯ3を０．４ｍＬ加えて反応を停止させた。遠心分離により不溶性画分を取り除いた後、各反応液のＯＤ４２０を測定し、以下の式を用いた計算によってβ−ガラクトシダーゼ活性を算出した。
β−ガラクトシダーゼ活性（Ｕｎｉｔ）＝１０００×ＯＤ４２０／反応時間（分）
結果を表２及び図３Ａ〜Ｄに示す。グルコースを含む培地で培養した場合、Δｃｒｅ１プロモーターを含む形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ活性は野生型の約１．９倍に向上していた。Δｃｒｅ２プロモーターを含む形質転換体は、野生型の約６．２倍のβ−ガラクトシダーゼ活性を示した。また、Δｃｒｅ１とΔｃｒｅ２の欠失を組み合わせたΔｃｒｅ１．２プロモーターを含む形質転換体は、野生型の約７．８倍の活性を示し、最も高い転写強度を有していた。
糖源をマルトース、ソルビトールに置き換えて同様の実験を行った場合でも、形質転換体におけるプロモーターの転写強度は野生型と比較して顕著に向上していた。さらに植物体等のバイオマスの糖化液をモデル化した糖源（モデル糖化液）においても顕著な転写強度の向上が認められた。
【００４７】
【表２】
2011103875.tif 000003
【図３】
2011103875.tif 000004
【図１】
2011103875.tif 000005
【図２】
2011103875.tif 000006
【配列表】
2011103875000001.app