(57)【要約】【課題】高分解能な多光子励起顕微鏡を提供する。【解決手段】周期的な光サイクルを有する分子に対して、光サイクルを回すための第１の励起光（λｐ）と第２の励起光（λｒ）および信号光（ＦＬ）を発生させるための第３の励起光（λｐ）を照射し、信号光を検出する。ここで、第１または第２の励起光の少なくともいずれかを周波数ωで強度変調し、検出される信号光から周波数ｎω成分を抽出する。周波数ｎω成分は光サイクルをｎ回回った後に信号光が発生する遷移である。このように、励起光の波長を長くすることなく多光子励起の信号光を識別できるので、空間分解能を向上できる。本発明は、蛍光顕微鏡にもラマン散乱顕微鏡にも好適に適用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
周期的な光サイクルを有する分子に対して光を照射する光照射手段と、
前記分子から発生した信号光を検出する検出手段と、
検出された信号光から、所定回数の光サイクルを経た後に発生される信号光を抽出する信号処理手段と、
を有する多光子励起顕微鏡であって、
前記光照射手段は、
観察対象の分子を第１のエネルギー状態から第２のエネルギー状態へ変化させる第１の励起光と、
前記分子を第２のエネルギー状態から第１のエネルギー状態へ変化させる第２の励起光と、
第１のエネルギー状態にある前記分子から信号光を発生させるための第３の励起光と、
を照射し、
少なくとも前記第１の励起光または前記第２の励起光のいずれかを振幅変調するものであり、
前記信号処理手段は、検出した光信号からサイクル数に対応した周波数の成分を抽出することで、所定回数の光サイクルを経た後に発生される信号光を抽出する
ことを特徴とする多光子励起顕微鏡。
【請求項２】
前記検出手段は、第３の励起光の照射によって発生する蛍光を信号光として測定することを特徴とする請求項１に記載の多光子励起顕微鏡。
【請求項３】
前記第１の励起光と前記第３の励起光は同一波長の光であることを特徴とする請求項１または２に記載の多光子励起顕微鏡。
【請求項４】
前記第１の励起光は、振動数の差が第１のラマン振動数に一致する１対のポンプ光およびストークス光からなり、
前記第２の励起光は、振動数の差が前記第１のラマン振動数に一致する１対のポンプ光および反ストークス光からなり、
前記第３の励起光は、振動数の差が第２のラマン振動数に一致する１対のポンプ光およびストークス光からなり、
誘導ラマン散乱過程によって分子のエネルギー状態を変化させるものであり、
前記検出手段は、第３の励起光に含まれるポンプ光またはストークス光の強度の変化を検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の多光子励起顕微鏡。
【請求項５】
周期的な光サイクルを有する分子に対して光を照射する光照射工程と、
前記分子から発生した信号光を検出する検出工程と、
検出された信号光から、所定回数の光サイクルを経た後に発生される信号光を抽出する信号処理工程と、
を含む多光子励起顕微鏡法であって、
前記光照射工程では、
観察対象の分子を第１のエネルギー状態から第２のエネルギー状態へ変化させる第１の励起光と、
前記分子を第２のエネルギー状態から第１のエネルギー状態へ変化させる第２の励起光と、
第１のエネルギー状態にある前記分子から信号光を発生させるための第３の励起光と、
を照射し、
少なくとも前記第１の励起光または前記第２の励起光のいずれかを振幅変調し、
前記信号処理工程では、検出した光信号からサイクル数に対応した周波数の成分を抽出することで、所定回数の光サイクルを経た後に発生される信号光を抽出する
ことを特徴とする多光子励起顕微鏡法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多光子励起顕微鏡に関し、特に、励起光の波長を長くすることなく多光子励起を行う多光子励起顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
多光子励起顕微鏡は、物質励起に多光子過程を利用した顕微鏡である。n光子蛍光顕微
鏡では、１光子蛍光顕微鏡の励起波長λexの約n倍の励起波長λn ≒ n・λexを用いて蛍
光分子を励起する。n光子励起による蛍光強度（n光子過程が生じる確率）は励起光強度のn乗に比例する。そのため、励起光を対物レンズ（開口数：NA）により集光した場合、励
起光強度の高い集光点近傍のみで信号が発生する。その結果、同じ波長で１光子励起を行った場合の空間分解能0.61λn/NAに比べて、空間分解能がn1/2倍[(0.61 λn)/(n1/2 NA)]に向上する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１３７７２号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Stefan W. Hell and Jan Wichmann, "Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy Opt. Lett. 19, 780-782 (1994)
【非特許文献２】Christian W. Freudiger, et al., “Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy”, Science 322, 1857 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多光子励起蛍光顕微鏡では、同じ波長を用いて１光子励起を行う場合よりも空間分解能は向上しているが、n光子励起の励起波長λnは１光子励起の波長のn倍(λn ≒ n・λex)
である。したがって、実際には空間分解能が1/n1/2倍[(0.61 n1/2 λex)/(NA)]に低下し
てしまう。
【０００６】
このような課題を考慮し、本発明は、高分解能の多光子励起顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る多光子励起顕微鏡は、周期的な光サイクルを有する分子を利用し、光サイクルを回すための励起光の少なくとも１つを時間的に振幅変調し、得られる信号光から光サイクル数に応じた周波数成分を抽出することで所定回数の光サイクルを経た後に発生される信号光を抽出する。
【０００８】
より詳細には、本発明は、
周期的な光サイクルを有する分子に対して光を照射する光照射手段と、
前記分子から発生した信号光を検出する検出手段と、
検出された信号光から、所定回数の光サイクルを経た後に発生される信号光を抽出する信号処理手段と、
を有する多光子励起顕微鏡であって、
前記光照射手段は、
観察対象の分子を第１のエネルギー状態から第２のエネルギー状態へ変化させる第１の励起光と、
前記分子を第２のエネルギー状態から第１のエネルギー状態へ変化させる第２の励起光と、
第１のエネルギー状態にある前記分子から信号光を発生させるための第３の励起光と、
を照射し、
少なくとも前記第１の励起光または前記第２の励起光のいずれかを振幅変調するものであり、
前記信号処理手段は、検出した光信号からサイクル数に対応した周波数の成分を抽出することで、所定回数の光サイクルを経た後に発生される信号光を抽出する
ことを特徴とする多光子励起顕微鏡である。
【０００９】
このように励起光を振幅変調することで、所定回数の光サイクルを経た後の信号光を取り出すことができる。励起光の波長を長くすることなく多光子過程（２光子過程や３光子過程などを複数回経由することも含む）の信号光を得ることができるので、空間分解能が高くなる。
【００１０】
本発明における多光子励起顕微鏡は、蛍光発光を観察する蛍光顕微鏡として構成することができる。または、誘導ラマン散乱を利用したラマン顕微鏡として構成することもできる。誘導ラマン散乱を利用する場合は、励起光のそれぞれは、ポンプ光とストークス光（または反ストークス光）からなる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る多光子励起顕微鏡によれば、励起波長を長くすることなく、多光子過程の信号光を取り出せるので空間分解能が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】蛍光タンパク分子Dronpa-3の光サイクルを説明する図である。
【図２】第１の実施形態に係る多光子励起蛍光顕微鏡の構成を示す図である。
【図３】第１の実施形態における蛍光信号のフーリエ成分を示すグラフである。
【図４】第１の実施形態における蛍光強度の励起光強度依存性を示すグラフである。
【図５】第１の実施形態における（Ａ）水平方向分解能および（Ｂ）垂直方向分解能を示すグラフである。
【図６】表面にDronpa-3をコートしたビーズを、（Ａ）第１の実施形態に係る多光子励起蛍光顕微鏡で撮影した蛍光像と、（Ｂ）従来の共焦点蛍光顕微鏡で撮影した蛍光像を示す図である。
【図７】第２の実施形態のおけるラマン散乱蛍光顕微鏡での光サイクルを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜原理＞
初めに本発明の多光子励起顕微鏡の測定原理を説明する。
【００１４】
本発明では、プローブ分子として周期的な光サイクルを有する分子を利用する。周期的な光サイクルを有する分子とは、第１の励起光によって初期状態Aから励起状態Bに遷移し、第２の励起光によって励起状態Bから初期状態Aに戻せる分子であり、この遷移を繰り返し行える分子である。また、このプローブ分子からは第３の励起光によって信号光が得られるものとする。以下、第１〜３の励起光をそれぞれ、ポンプ光、リバース光、プローブ
光と称する。
【００１５】
このプローブ分子にポンプ光、リバース光、プローブ光を同時に照射して信号光を得た場合、プローブ分子は光サイクルを回らずに信号光を発光する場合と、光サイクルをn回
（nは自然数）回った後に信号光を発光する場合がある。ポンプ光、リバース光、プロー
ブ光の強度をそれぞれI1, I2, I3とした場合に、光サイクルをn回繰り返した場合の信号
光強度は、I1nI2nI3に比例し、多光子励起（2n+1光子励起）と同様の応答を示し、励起光強度の高い集光点近傍でのみ信号が発生する。このようにして、励起光の波長を変えることなく多光子励起が得られるので、多光子励起の信号光のみを取り出せれば分解能が向上する。
【００１６】
信号光の性質は１光子励起であっても多光子励起であっても同一であるので、多光子励起起源の信号光のみを取り出すために以下の方法を採用する。すなわち、ポンプ光またはリバース光の少なくともいずれかを時間に応じて振幅変調する。例えば、ポンプ光をI1{1+cos(ωt)}のように変調する。そうすると、光サイクルをn回繰り返した2n+1光子励起の
信号光の強度Ifは、以下のように表せる。
2011145487.tif 000003
【００１７】
このように、2n+1光子過程の信号光には、周波数ω, 2ω, …, nωの成分が含まれる。なお、この測定の際には、m (m≠n)回光サイクルを回った後に信号光を発生する過程（2m+1光子過程）も同時に生じている。m<nのとき、周波数nωの成分にはm回繰り返した後に
発生する信号光は含まれない。一方、m>nのときは、信号光に周波数nωの成分が含まれる（下記式参照）が、次数の高い信号（繰り返し回数が多い）ほど信号の大きさは小さくなる（an>>bn）。
2011145487.tif 000004
そのため、周波数nωの信号成分の主な信号は、n回光サイクルを繰り返した後に発生する信号光である。よって、周波数nω成分を検出することにより、2n+1光子励起により発
生した信号を検出することが可能である。
【００１８】
以上のように、本発明によれば、励起光の波長を変えることなく多光子励起が可能となり、また、多光子励起起源の信号光を抽出可能である。よって、空間分解能を向上させることが可能であり、その空間分解能に理論的な上限はない。
【００１９】
（第１の実施形態）
本実施形態は、信号光として試料から発生する蛍光発光を測定する多光子励起蛍光顕微鏡である。
＜構成＞
［プローブ分子］
本実施形態で利用するプローブ分子は、光スイッチング機能を有する蛍光タンパク分子Dronpa-3である（特許文献１参照）。図１に示すように、基底状態Ａの蛍光タンパク分子Dronpa-3は、波長λp(488nm)の励起光が照射されると、通常は励起状態A*を経て蛍光を発して、基底状態Aへと戻る。この波長λpによる励起は、一定の確率で基底状態Aから励起
状態A*を経て蛍光を発しない基底状態Bへと遷移することもある。基底状態Bの状態において波長λr(405nm)により励起すると、励起状態B*を経て状態Aへと遷移させることが可能
である。Dronpa-3を利用する場合は、ポンプ光とプローブ光が同一の光となる。
【００２０】
このように蛍光タンパク分子Dronpa3は、光サイクルを有する分子であるため、波長λpとλrの励起光を同時に照射すると、状態Aと状態Bの間のサイクルをn回(n = 0, 1, 2, …)回った後の蛍光発光が観察できる。
【００２１】
［装置構成］
図２に本実施形態に係る多光子励起顕微鏡の構成を示す。本実施形態では、488nmと405nmの励起光の一方を振幅変調して共焦点蛍光顕微鏡に導入して、蛍光信号の所定周波数成分を抽出する。以下、実験で採用した装置構成をより詳細に説明する。
【００２２】
レーザ発振器１ａは波長488nmのレーザを出射するレーザダイオード（Neoark, TC20-4820-4.5）であり、レーザ発振器１ｂは波長405nmのレーザを出射するレーザダイオード（Neoark, TC20-4030-4.5）である。レーザ発振器１ａ，１ｂを駆動するための電流量はＰＣ１７によって制御される。本実施形態では、ＰＣ１７からの変調信号によって、レーザ発振器１ｂの出力（405nm, リバース光）を周波数ω=400Hzで強度変調し、レーザ発振器１
ａの出力（488nm, ポンプ光）は一定とする。レーザ発振器１ａから出射された波長488nmのレーザ光は、反射ミラー２ａで反射し、ダイクロイックミラー２ｂ（Semrock, Di01-R405）で、レーザ発振器１ｂから出射された波長405nmのレーザ光と合成される。合成され
たレーザ光は、カップリングレンズ３、シングルモードファイバー４(Nufern, S405)、コリメートレンズ５を介して、共焦点顕微鏡に導入される。
【００２３】
入射されたレーザ光は、ダイクロイックミラー６によって反射され、開口数1.4の油浸
対物レンズ７(Olympus, UPLASPO100×O)によって試料１０中の集光点に集光される。なお、スライドガラス９（Matsunami Glass, MAS-GP)上に固定された試料１０は、３軸のピエゾステージ８(Piezosystem Jena, TRITOR 101 CAP)によって移動可能であり、３次元的に走査可能である。
【００２４】
試料１０から発生された蛍光信号は、ダイクロイックミラー６(Semrock, FF01-520/35)，反射ミラー１１、バンドパスフィルター１２，コンフォーカルレンズ１３，直径40μm
のピンホール１４を介して、光電子増倍管１５（PMT; Photomultiplier Tube)（Hamamatsu Photonics, R4220）に入射される。ＰＭＴ１５において検出された蛍光信号から周波数成分を抽出するためのディジタル信号処理を省略するために、本実施形態ではロックインアンプ１６（Stanford Research Systems, SR830）を採用する。ロックインアンプ１６では、励起光の振幅変調の周波数に応じた周波数成分を抽出する。ロックインアンプ１６において抽出された信号光の各周波数成分は、ＰＣ１７に送られて、表示、記憶等の処理がなされる。
【００２５】
＜測定結果＞
上述の測定によって得られる蛍光信号のフーリエ成分を図３に示す。なお、この測定では、ロックインアンプに替えて、ＰＭＴ１５での検出信号をアンプユニット（Hamamatsu Photonics, C7319）にて増幅しＰＣ１７にてフーリエ変換等のディジタル処理を施してフーリエ成分（全周波数成分）を得ている。図を参照すると、１サイクル成分（周波数ω）にピークが見られ、また励起光強度を上げると２サイクル成分（周波数2ω）も得ること
ができる。２サイクルおよびそれ以上のサイクルの成分はノイズに埋もれてしまっているが、ＳＮＲを上げることによって多サイクル成分も検出できる。
【００２６】
この周波数ω成分が多光子過程によって生じていることを確認するために、周波数ωの信号成分の励起光強度に対する依存性を測定した。この測定もディジタル処理によって行っている。測定結果を図４に示す。周波数ω成分、すなわち、３光子励起は励起光強度が低い領域では、励起光強度の2.5乗に比例していることが確認できる。このように、多光
子過程によって生じる信号光の非線形性が確認できた。なお、周波数ω成分は３光子過程
であるので、本来は励起光強度の３乗に比例すべきであるが、現象の飽和によって非線形性が低下したと考えられる。
【００２７】
次に、分解能の向上が得られることを確認するために、スライドガラス９へDronpa-3を数層コートした試料を用いて、コートされた領域とコートされていない領域をイメージングすることにより分解能を測定した。分解能測定ではロックインアンプを使用して周波数ω成分を抽出している。境界を光軸に垂直な方向へイメージングしたときの強度プロファイルを図５Ａに示す。周波数ω成分（３光子励起）の測定結果を三角で示し、定数成分を丸印で示す。定数成分は１光子過程の蛍光発光を測定しており、従来の共焦点顕微鏡における分解能を示す。これらの結果を微分することにより、本実施形態における分解能は310nmであり、従来の共焦点顕微鏡では570nmであることが分かった。また、境界を光軸方向にイメージングしたときの強度プロファイルを同様に図５Ｂに示す。本実施形態における分解能は450nmであり、共焦点顕微鏡では1.48μmであることが分かった。このように、本実施形態による多光子励起蛍光顕微鏡では、従来の共焦点顕微鏡と比較して、光軸に垂直な方向では約２倍、光軸方向では約３倍の分解能の向上を確認できた。
【００２８】
また、表面にDronpa-3をコートした直径3μmのガラスビーズのイメージングした蛍光像を図６に示す。本測定もロックインアンプを使用している。蛍光はビーズの表面からのみ発生するはずであるが、従来の共焦点顕微鏡（図６Ｂ）では表面だけでなく中央からも強い信号が観測された。本実施形態による多光子励起顕微鏡（図６Ａ）では、中央の信号は十分小さくなっている。この違いは、光軸方向の空間分解能が共焦点顕微鏡では1.48μm
でビーズの半径程度であり、本実施形態ではビーズの450nmとビーズの半径よりも十分に
小さいために生じている。
【００２９】
＜変形例＞
上記の説明では、プローブ分子として蛍光タンパク分子Dronpa-3を採用したが、周期的な光サイクルを有する分子であれば、任意の分子を利用することができる。また、基底状態A（蛍光を発する状態）のDronpa-3に波長488nmのレーザ光を照射すると、蛍光発光と、基底状態B（蛍光を発しない状態）への遷移とが確率的に生じるので、ポンプ光とプロー
ブ光は同一のレーザ光であった。しかしながら、採用するプローブ分子に応じてこれらの励起光は異なる波長の光であっても良い。
【００３０】
また、上記の説明ではリバース光の強度を変調しているが、ポンプ光またはリバース光のいずれかが強度変調されていればよい。
【００３１】
Dronpa-3を採用する場合のようにポンプ光とプローブ光が同一の場合に、ポンプ光（＝プローブ光）のみを周波数ωで強度変調した場合、得られる信号光の強度Ifは、
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であるので、周波数(n+1)ω成分を測定することで、2n+1光子励起の信号光を測定するこ
とができる。一方、ポンプ光（＝プローブ光）を周波数ω1で強度変調し、リバース光を
周波数ω2で強度変調した場合は、周波数n(ω1+ω2)+ω1成分を測定すれば、2n+1光子励
起の信号光を測定することができる。
【００３２】
また、ポンプ光とプローブ光が異なる場合に、ポンプ光またはリバース光のいずれか一方のみを周波数ωで強度変調する場合は、周波数nω成分を検出することで、2n+1光子励
起の信号光を測定することができる。ポンプ光とリバース光のそれぞれを周波数ω1, ω2で強度変調する場合は、周波数n(ω1+ω2)成分を検出することで、2n+1光子励起の信号光を測定することができる。さらに、プローブ光を強度変調しても良く、その場合も適宜対応した周波数成分を抽出すればよい。
【００３３】
（第２の実施形態）
第１の実施形態は蛍光顕微鏡に本発明を適用した例であるが、本発明は誘導ラマン散乱顕微鏡にも適用することができる。
【００３４】
まず、誘導ラマン散乱顕微鏡（非特許文献２）について簡単に説明する。状態Aと状態Bのエネルギー差が(h/2π)Ω（Ω：ラマン振動数， h：プランク定数）となる分子に対し
て、異なる２つの波長（ポンプ光λpumpと、ストークス光λstokesまたは反ストークス光λanti-stokes：差がラマン振動数Ωに一致）の光を入射すると、分子は状態Aから中間状態Mを経て状態Bへと遷移する。このとき、１個のポンプ光の光子が１個のストークス光に変換され、ポンプ光は減衰して、ストークス光・反ストークス光は増幅される。ここで、ポンプ光または（反）ストークス光の一方を強度変調し、変調しない方の励起光を信号光として変調した周波数により変化量を検出する。このような手法により高感度な観察が可能となる。
【００３５】
本実施形態では、図７に示すような３つのエネルギー状態A, B, Sを有する分子に対し
て、３対のポンプ光とストークス光を用いる。
【００３６】
波長λpump1のポンプ光と波長λstokes1のストークス光（波長の差がラマン振動数Ω1
に一致する）の１対の励起光（第１の励起光）により、振動基底状態Aにある分子は、誘
導ラマン散乱過程により、中間状態M1を経て振動励起状態Bへ遷移する。
【００３７】
また、波長λpump2のポンプ光と波長λanti-stokes2の反ストークス光（波長の差がラ
マン振動数Ω1に一致する）の１対の励起光（第２の励起光）により、振動励起状態Bにある分子は、誘導ラマン散乱過程により、中間状態M2を経て振動基底状態Aへ遷移する。
【００３８】
また、波長λpump3のポンプ光と波長λstokes3のストークス光（波長の差がラマン振動数Ω2に一致する）の１対の励起光（第３の励起光）により、誘導ラマン散乱過程により
、振動基底状態Aから中間状態M3を経て振動励起状態Sに遷移する。
【００３９】
このような３対の励起光を同時に測定対象の分子に照射すると、状態Aと状態Bを２対の励起光（第１の励起光および第２の励起光）により繰り返し遷移した後に、第３の励起光による誘導ラマン散乱過程によって信号光が発生する。このとき、状態Aと状態Bの間の遷移をn回繰り返した後に第３の励起光による誘導ラマン散乱過程が生じる確率は、第１の
励起光強度および第２の励起光強度のn乗に比例する。
【００４０】
このとき、第１の励起光に含まれるポンプ光λpump1とストークス光λstokes1の少なくとも一方と、第２の励起光に含まれるポンプ光λpump2と反ストークス光λanti-stokes2
の少なくとも一方の強度を時間的に変調する。また、信号光を検出するために、第３の励起光に含まれるポンプ光λpump3とストークス光λstokes3の少なくとも一方を強度変調する。第１〜３の励起光のうちの強度変調されたレーザ光の強度をそれぞれI1, I2, I3は、変調周波数をω1, ω2, ω3として、以下のように表せる。
2011145487.tif 000006
【００４１】
状態Aと状態Bの間の遷移をn回繰り返した後に発生する信号光（第３の励起光のうち変
調していない光の変化量）の強度は、
2011145487.tif 000007
となる。したがって、第１の実施形態と同様に、信号光のうち周波数n(ω1+ω2)+ω3成分を抽出することで、光サイクルをn回繰り返した後の信号光を測定することができる。
【符号の説明】
【００４２】
１ａ、１ｂ  レーザ発振器（レーザダイオード）
７  油浸対物レンズ
１０  試料
１５  光電子増倍管
１６  ロックインアンプ
１７  コンピュータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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