(57)【要約】      （修正有）【課題】複数の反応を経由して検体液中の酵素活性の定量を行う際、所定時間の恒温処理を行うことなく、短時間で行うことが可能な小型なセンサシステムを提供する。【解決手段】検体液収納室７と第１流路８を通して接続され検体液中の被測定成分と反応する反応基質が収納された反応室４と、下端が反応室４と連通するように挿着された微小ポンプ１０と、第１流路より大きい断面積を持つ第２流路１４を通して接続される反応液流通空間１２と、逆止弁１７と、を備える検体液反応装置１において、反応液流通空間１２内に位置するように取り付けられ、少なくとも造膜成分および酸化還元性色素を含むセンシング膜を備える平面型光導波路センサ２１を具備し、反応室４およびセンシング膜のいずれか一方または両方に被測定成分と反応基質との反応生成物から酸化性物質または還元性物質を生成する反応試薬を含むことを特徴とする。【選択図】図１
2011196854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体液反応装置と、この反応装置に取り付けられた平面型光導波路センサとを具備し、
前記検体反応装置は、装置本体と、この本体に形成された検体液収納室と、前記本体に形成され、前記検体液収納室と第１流路を通して接続されると共に前記検体中の被測定成分と反応する反応基質が少なくとも収納された反応室と、前記本体に下端が前記反応室と連通するように挿着された吸引・吐出動作が可能な微小ポンプと、前記本体に前記反応室より上方に位置して形成され、一端が前記反応室と前記第１流路より大きい断面積を持つ第２流路を通して接続され、他端に外部への開口部を有する反応液流通空間と、前記本体に取り付けられ、前記開口部を開閉するための逆止弁と、を備え、
前記光導波路センサは、前記反応液流通空間内に位置し、少なくとも造膜成分および酸化還元性色素を含むセンシング膜を備え、かつ
前記反応室および前記センシング膜のいずれか一方または両方に前記被測定成分と前記反応基質との反応生成物から酸化性物質または還元性物質を生成する反応試薬を含むことを特徴とするセンサシステム。
【請求項２】
反応基質は、乾燥状態で前記反応室内に配置されることを特徴とする請求項１記載のセンサシステム。
【請求項３】
前記平面型センサは、平面光導波路型センサであり、前記平面光導波路型センサは透明基板と、この基板表面に形成される一対のグレーディングと、一対のグレーディングを含む前記基板表面形成される光導波路層と、グレーディング間の前記光導波路層に形成される前記センシング膜とを備えることを特徴とする請求項１または２記載のセンサシステム。
【請求項４】
前記センシング膜は、酸化還元性色素の発色触媒をさらに含む請求項１ないし３いずれか記載のセンサシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサシステムに関し、特に血液や血清等の検体液中の酵素活性を定量するセンサシステムに係わる。
【背景技術】
【０００２】
血液などの生物体液中の成分は医療診断に際して有用な情報を提供するものである。その分析方法は、溶液中で測定対象物質の反応に必要な試薬類と血液や血清等の検体液とを混合し、吸光度等の変化を計測することで定量する方法（湿式法）が一般的である。これに対し、操作の簡便性に優れる方法、すなわちシート上やセル内等の反応部に予め必要試薬類が乾燥状態で配置し、検体液を導入するだけで検出可能な方法（乾式法）が近年盛んに開発され一部実用化に至っている。いずれの方法においても、測定対象物質を起点として検出に至るまでに複数段階の反応を経る反応系を利用する方法が数多く知られている。具体的には、測定対象物質が酵素であり、その活性を定量するような反応系において、２段階以上の反応を経て最終的に生成した物質の定量により酵素活性を定量する方法が知られている。
【０００３】
例えば、特許文献１には電極により酸化還元反応を検出する乾式法のセンサ（微小分析装置）が記載されている。検体液中の体内酵素であるγＧＴＰ、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）等を検出するには、次の２段階反応を経て検出する。すなわち、それぞれの酵素に対応する基質（例えばαーケトＧＡおよびＬ−アラニン）を測定対象酵素の触媒としてＬ−グルタミン酸を生成する第１反応を行う。生成したＬ−グルタミン酸をＬ−グルタミン酸オキシダーゼの作用により酸化して過酸化水素を生成する第２反応を行う。最終的に生成した過酸化水素濃度を電極で検出する。この発明では、第１反応基質が電極を取り付けた基材に対向する位置に乾燥状態で固定され、第２反応に関与するＬ−グルタミン酸オキシダーゼが電極近傍に担持されている。検体液が導入されると第１反応基質が溶解して第１反応がなされ、その後順次反応が進行する。
【０００４】
特許文献２には多層乾式分析素子の一形態が開示されている。多層乾式分析素子は透明シート上に発色層、反射層、反応層、展開層が順次積層した構造を有する。血液や血清等を展開層に点着するとその下の反応層中で第１反応が進行しつつ、生成物がさらに下の発色層に到達する。このとき、発色層で起こる吸光度変化が計測される。特に、第１反応基質として２つの基質が関わる反応系において、各基質を別の層、例えば第１反応層、第２反応層にそれぞれ含ませることによって基質間の副反応を抑制して保存性能を向上する。実施例には、ＡＬＴ活性を定量するための試薬類が詳細に開示されている。Ｌ−アラニンおよび２−ケトグルタル酸が第１反応基質として別々の反応層に含まれている。発色層にはピルビン酸オキシダーゼ（第１反応で生成するピルビン酸を酸化して過酸化水素を生成するための酵素）、過酸化水素と色素との発色反応を触媒するペルオキシダーゼおよび色素等が含まれる。この構成において、発色反応は前述の第２反応に相当する。
【０００５】
特許文献３は、サンプルが輸送される流路と反応室を有するマイクロチップを用い、回転駆動源を有する装置に関し、遠心力を加えることによって反応試薬との混合、検出部への導入を行う方式が開示されている。
【０００６】
一方、発色反応を高感度かつ短時間で検出可能なセンサとして、平面光導波路型センサの構成や製造方法についての一例が特許文献４に開示されている。この平面光導波路型センサは、透明基板上にグレーティングおよび膜厚３〜３００μｍの光導波路層を形成した構造を有する。光ダイオードのような小型で比較的安価な光源から放出される光をグレーティングで回折させて光導波路層内を伝播させ、導波路層表面に設けられたセンシング膜に作用させた測定対象物質の濃度に応じた吸光度変化をデカプラとして設けられたグレーティングから出射し、その光量を計測することにより測定対象物質の濃度を定量する。特許文献４の実施例には、グルコースを定量する例が開示されている。すなわち、センシング膜内に含まれる成分はグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色素である。光が光導波路層内を複数回にわたり全反射しつつ伝播し、各反射点において導波路層表面からセンシング膜内に染み出すエバネッセント波で発色度の変化を検出する。このため、通常の吸光度測定では検出下限となるような低濃度のグルコースであっても速やかに検出することが可能になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２５９７６２号公報
【特許文献２】特開平９−２６６７９５号公報
【特許文献３】特開２００８−８８７５号公報
【特許文献４】特開２００６−２０８３５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したような、検体液中の酵素活性を定量するための従来の乾式分析素子または装置はいずれも導入された検体液に元々含まれる水分が反応場となり各反応が進行する。しかしながら、溶媒の粘性などによって変化する反応物質の拡散速度の影響によって反応速度も変化する。また、複数の反応をトータルした反応速度は検体液の個体差による影響を少なからず受ける。
【０００９】
特許文献１の実施例では、ＧＯＴ検出用の構成において、検体液としてそれぞれＧＯＴ水溶液の場合とＧＯＴがヒト血清試料に含まれる場合とが比較開示され、検出電流値の経時変化の立ち上がりが後者においてより緩やかであることが記載されている。すなわち、検体液の個体差による影響で反応速度が変動し、結果として検出精度が低下する。
【００１０】
特許文献２の実施例には、検体液を展開層に点着した後、素子全体を３７℃で４分間インキュベーションする方法による結果が開示されている。これは検体液の粘性に起因する反応速度低下やその個体差を補うことが目的と推察される。しかしながら、反応スキームの中への所定時間のインキュベーションの追加は、検査時間の短縮化または装置の小型化のような乾式法の利点を損なう。
【００１１】
特許文献３に記載のように分析要素に遠心力を加えることによって検体液と試薬との混合や検出部への混合液の移動を行う方式は、精密な回転駆動源を必要とすることから装置の小型化の障害になる。
【００１２】
特許文献４に記載の平面光導波路型センサにおいて、センシング膜は光導波路層表面近傍のみで検出する性質上、少なくとも色素については反応性を維持しつつ表面近傍に保持することが必要である。このため、通常のセンシング膜には水溶性を持ちつつ検出反応中は溶解しない程度の適切な水溶性を有するセルロース誘導体のような造膜成分を含む。前述のように二段階以上の反応を経由して検出する反応系に適用した場合、検体液がセンシング膜に接触した状態で第１反応から順次進行させるためには、反応速度低下や検体液の個体差を補うためのインキュベーションや攪拌操作などを加えることが必要になる。その結果、造膜成分の溶解が助長され、センサ性能の劣化につながる。
【００１３】
本発明は、複数の反応を経由して検体液中の被測定成分活性の定量（例えば酵素活性の定量）を行う際、所定時間の恒温処理を行うことなく、短時間で行うことが可能な小型なセンサシステムを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明の態様によると検体液反応装置と、この反応装置に取り付けられた平面型光導波路センサとを具備し、
前記検体液反応装置は、装置本体と、この本体に形成された検体液収納室と、前記本体に形成され、前記検体液収納室と第１流路を通して接続されると共に前記検体液中の被測定成分と反応する反応基質が少なくとも収納された反応室と、前記本体に下端が前記反応室と連通するように挿着された吸引・吐出動作が可能な微小ポンプと、前記本体に前記反応室より上方に位置して形成され、一端が前記反応室と前記第１流路より大きい断面積を持つ第２流路を通して接続され、他端に外部への開口部を有する反応液流通空間と、前記本体に取り付けられ、前記開口部を開閉するための逆止弁と、を備え、
前記光導波路センサは、前記反応液流通空間内に位置し、少なくとも造膜成分および酸化還元性色素を含むセンシング膜を備え、かつ
前記反応室および前記センシング膜のいずれか一方または両方に前記被測定成分と前記反応基質との反応生成物から酸化性物質または還元性物質を生成する反応試薬を含むことを特徴とするセンサシステムが提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、複数の反応を経由して検体液中の酵素活性の定量を行う際、所定時間の恒温処理を行うことなく、短時間で行うことが可能な小型なセンサシステムを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態に係るセンサシステムを示す平面図。
【図２】図１のII−II線に沿う断面図。
【図３】図１のセンサシステムに組み込まれる平面型光導波路センサを示す断面図。
【図４】リン酸バッファで希釈した標準血清を作用させて得られた吸光度変化を示す図。
【図５】６０秒間の吸光度変化の推定ピルビン酸濃度に対してプロットした図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、実施形態に係るセンサシステムを図面を参照して説明する。
【００１８】
図１に実施形態に係るセンサシステムを示す平面図、図２は図１のII−II線に沿う断面図、図３は図１に組み込まれる平面型光導波路センサを示す概略断面図である。
【００１９】
センサシステムは、検体液反応装置１と、この反応装置１に取り付けられた平面型光導波路センサ２１とを具備する。
【００２０】
検体液反応装置１は、例えば黒色アクリル樹脂から作られる装置本体である矩形状のブロック２を備えている。矩形状のブロック２は矩形状の下部ブロック片２ａと矩形状の上部ブロック片２ｂをそれらの間に薄膜のスペーサ３を介して固定した構造を有する。例えば円柱状の反応室４は、ブロック２の中央の内部に形成されている。すなわち、反応室４はスペーサ３を貫通して下部ブロック片２ａを円柱状に穿設して加工することにより形成されている。検体液中の被測定成分（例えばＡＬＴの酵素等）と反応する反応基質、例えば乾燥状態の反応基質（α−ケトグルタル酸およびＬ−アラニン）５は、反応室４内に収納されている。なお、反応室４上方のブロック２（上部ブロック片２ｂ）には後述する微小ポンプの吸引・吐出の繰り返しによって反応室４内の反応液が揺動したときに反応液流通空間に反応液の一部が流出するのを防ぐバッファ空間６が形成されている。
【００２１】
円柱状穴の検体液収納室７は、例えば左側のブロック２部分に形成されている。すなわち、検体液収納室７は上部ブロック片２ｂおよびスペーサ３に亘って穿設して加工することにより形成されている。検体液収納室７は水平方向に延びる第１流路８を通して反応室４と流体接続されている。第１流路８は反応室４と検体液収納室７の間に位置するスペーサ３を部分的かつ線状に切欠することにより形成される。
【００２２】
例えば上部に拡口部を有する円柱状の貫通穴９は、ブロック２の中央部に下端がバッファ空間６に連通し、上端がブロック２（上部ブロック片２ｂ）上面に開口するように穿設されている。中空逆台錐形状をなす吸引・吐出動作が可能な微小ポンプ１０は、貫通穴９内にその貫通穴９内周面と密着して挿入されている。
【００２３】
前記平面型光導波路センサ２１と同形状の第１矩形穴１１は、ブロック２の右側部分に形成されている。第１矩形穴１１は、その右端がブロック２の右側面から僅かな距離を明けて形成されている。第１矩形穴１１より小さい面積を持つ第２矩形穴１２は、第１矩形穴１１の底面に第１矩形穴１１と略相似的に形成されている。第２矩形穴１２の形成により第１矩形穴１１の底面は前記平面型光導波路センサ２１が載置される矩形枠状面１３になる。第２矩形穴１２は、後述する第２流路および第３流路の形成により反応液流通空間として機能する。この第２矩形穴１２（反応液流通空間）と反応室４とは概ね同じ容量を有する。第２矩形穴１２の底面は反応室４の上面より上方のブロック２に位置される。第２矩形穴１２の底面はバッファ空間６上面より上方のブロック２に位置されることが好ましい。なお、第１、第２の矩形穴１１，１２はブロック２の上部ブロック片２ｂを穿設する加工を施すことにより形成される。
【００２４】
第２流路１４は、ブロック２に第２矩形穴１２底面の左端部分から反応室４上面の右端部分に向けて下方に傾斜するように形成されている。第２矩形穴（反応液流通空間）１２は第２流路１４を通して反応室４に流体接続される。第２流路１４は、その最も小さい断面部分が前記第１流路８の断面より例えば２倍以上の面積を有する。第１流路８と第２流路１４の関係は、例えば第１流路８の断面が１ｍｍ（幅）×０．１ｍｍ（高さ）とした場合、第２流路１４の断面が２ｍｍ（幅）×１ｍｍ（高さ）とすることによって、第１流路８と第２流路１４の間で充分なコンダクタンス差を生じさせることが可能になる。このため、微小ポンプ１０の吸引・吐出による反応室４内の液の混合・撹拌時にその液が検体液収納室７に逆流するのを防止することが可能になる。
【００２５】
第３流路１５は、ブロック２に第２矩形穴１２底面の右端部分からブロック２の右側面に向けて下方に傾斜するように形成されている。すなわち、第３流路１５はその他端がブロック２（上部ブロック片２ｂ）の右側面に開口されて開口部１６を形成している。第３流路１５は反応液が反応室から反応流通空間へ移送される際の圧抜きの役目を果たす他、必要に応じて第２矩形穴（反応液流通空間）１２を流通した反応液を排出する役目をなす。逆止弁１７は、ブロック２の右側面に第３流路１５の開口部１６を開閉するように取り付けられている。逆止弁１７は、内部から外部へ圧力が加わる時に第３流路１５の開口部１６を開き、逆に内部へ吸引圧力が加わる時に第３流路１５の開口部１６を閉じる（遮断する）ように機能する。
【００２６】
平面型光導波路センサ２１は第２矩形穴１２周囲の矩形枠状面１３にそのセンシング膜が第２矩形穴（反応液流通空間）１２内に位置するように載置されている。センサ２１は遮光性を有する両面テープ（図示せず）でブロック２に密着され、反応液流通空間として機能する第２矩形穴１２から液漏れがないように密封している。
【００２７】
平面型光導波路センサ２１は図３に示すようにガラス基板２２を備える。ガラス基板２２主面の両端部付近には、光学要素である一対のグレーティング２３ａ，２３ｂがその基板２２に光を入射、放出させるためにそれぞれ形成されている。これらのグレーティング２３ａ，２３ｂは、前記基板２２より高い屈折率を有する例えば酸化チタンから作られている。膜厚３〜３００μｍの光導波路層２４は、グレーティング２３ａ，２３ｂを含むガラス基板２２の主面に形成されている。光導波路層２４は、ガラス基板２２より高屈折率の熱硬化性または光硬化性の樹脂から形成されている。光導波路層２４の主面は、ガラス基板２２の主面に平行になるように形成されている。センシング膜２５は、グレーティング２３ａ，２３ｂ間に位置する光導波路層２４上面部分に形成されている。センシング膜２５は、少なくとも色素および造膜成分を含む。例えば、センシング膜２５は反応室４で生成する反応液（反応物質）がピルビン酸の場合、反応試薬であるピルビン酸オキシダーゼと、発色触媒であるペルオキシダーゼと、酸化還元性色素である１，１，４，４−テトラメチルベンジジンをセルロース誘導体のような造膜成分で固定化した構成を有する。
【００２８】
ガラス基板２２の裏面側（上方側）には、レーザ光を図示しない偏光フィルタを通して入射する光源（例えばレーザダイオード）２６および光導波路層２４を伝播し、ガラス基板２２から放出された光を受ける受光素子（例えばフォトダイオード）２７がそれぞれ配置されている。
【００２９】
次に、図１〜図３に示すセンサシステムの動作を説明する。
【００３０】
（ａ）検体液収納室７内に検体液（例えば酵素：ＡＬＴを含む血液）を収容する。
【００３１】
（ｂ）微小ポンプ１０を駆動してその下端から貫通穴９およびこれと連通するバッファ空間６および反応室４内へ検体液を吸引する。このとき、反応室４と第２流路１４、第２矩形穴１２である反応液流通空間および第３流路１５を通して連通する開口部１６が逆止弁１７で遮断される。このため、反応室４、第２流路１４、反応液流通空間１２および第３流路１５の内部が減圧（負圧）になり、検体液収納室７内の検体液の一部が第１流路８を通して反応室４内に導入される。
【００３２】
（ｃ）微小ポンプ１０による吸引・吐出動作を繰り返し、検体液収納室７内の検体液をその吸引・吐出動作サイクル毎に一定量を反応室４に導入し、最終的に検体液収納室７内の全ての検体液を反応室４内に導入する。このような検体液の反応室４への導入により、反応室４内には予め収納された乾燥した反応基質（α−ケトグルタル酸およびＬ−アラニン）５と検体液内の酵素（ＡＬＴ）が検体液で混合、撹拌されてそれらの反応が進行する。すなわち、反応基質（α−ケトグルタル酸およびＬ−アラニン）と血液中のＡＬＴが反応してピルビン酸を生成する。なお、第２流路１４は、その最も小さい断面部分が前記第１流路８の断面より２倍以上の面積を有する。このため、第１流路８と第２流路１４の間で充分なコンダクタンス差を生じさせることが可能になる。その結果、微小ポンプ１０による吐出時に反応室４の液が検体液収納室７に逆流するのを防止することが可能になる。
【００３３】
（ｄ）ピルビン酸の生成後、微小ポンプ１０の吐出動作を行なう。このとき、微小ポンプ１０による吐出力を高めることによって、ピルビン酸が生成された反応液が反応室４から第２流路１４を通して反応液流通空間１２へ移送される。検出に要する時間を経た後、反応液は必要に応じて第３流路１５を経由してその開口部１６から外部に排出される。反応液が反応液流通空間１２に流通すると、平面型光導波路センサ２１のセンシング膜２５に反応液が接する。このとき、センシング膜２５中の反応試薬であるピルビン酸オキシターゼと反応液２０中のピルビン酸が反応して酸化性物質である過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）が生成される。過酸化水素はセンシング膜２５中の発色触媒の働きで１，１，４，４−テトラメチルベンジジン（酸化還元性色素）を酸化して発色させる。この発色度合は、生成した過酸化水素の量に比例する。
【００３４】
前述した一連の操作において、検体液収納室７内の全ての検体液を反応室４内に導入した後、レーザダイオード２６を発振する。レーザ光は基板２２を通してその主面と右側のグレーティング２３ａの界面で屈折させて光導波路層２４に入射する。レーザ光は、光導波路層２４とセンシング膜２５の界面で屈折されてその光導波路層２４を伝播する。このとき、光導波路層２４を伝播する光のエバネッセント波はセンシング膜２５で生成される過酸化水素量に相関する発色度合に応じて吸収される。光導波路層２４を伝播した光は、左側のグレーティング２３ｂから放出され、受光素子（例えばフォトダイオード）２７で受光される。前述したように平面型光導波路センサ２１のセンシング膜２５への反応液２０の接触、過酸化水素の生成、１，１，４，４−テトラメチルベンジジンの発色が起こると、受光したレーザ光強度はセンシング膜２５が発色しない時（反応腋がセンシング膜２５に接触した直後）に受光したレーザ光の強度に比べて低下する。その結果、この低下率からセンシング膜２５で生成した過酸化水素量を検出することが可能になる。過酸化水素量はその前の反応基質５との反応がなされる検体液１８中のＡＬＴの酵素活性と相関するため、受光したレーザ光の強度測定によって、ＡＬＴの酵素活性を検出できる。
【００３５】
このような実施形態によれば、微小ポンプ１０の吸引・吐出による検体液収納室７内の検体液の反応室４内への導入によって、検体液で反応室４内の反応基質との混合・撹拌がなされ、それらの反応を迅速に進行させることができる。すなわち、インキュベーションのような所定時間の恒温処理を行うことなく、検体液の粘性等の個体差による酵素と反応基質の反応速度のばらつきを抑制して、検体液中の酵素と反応基質とを迅速に反応できる。
【００３６】
また、反応室４と同一空間である反応液流通空間１２において、導入された反応液と平面型光導波路センサ２１のセンシング膜２５中の反応試薬との反応を連続して行い、センシング膜２５中の酸化還元性色素の発色、センサ２１で発色度合の検出を行うことができる。すなわち、酵素と反応基質の反応後に反応試薬によりその生成物から発色作用をなす酸化性物質、例えば過酸化水素を同一空間内で生成でき、過酸化水素の量に相関する発色度合をセンサ２１で検出できるため、この検出に基づいて検体液中の酵素活性の定量を短時間で行うことが可能になる。
【００３７】
さらに、平面光導波路センサ２１の使用により、検体液中の微量の測定対象物を高感度に検出することができる。
【００３８】
したがって、実施形態によれば微小ポンプ１０の吸引・吐出により検体液中の酵素と反応基質の迅速な反応を行ない、かつ反応室４と同一空間の反応液流通空間１２に位置する平面型光導波路センサ２１のセンシング膜２５で前記反応による生成物から酸化性物質を生成し、酸化性物質で酸化還元性色素の発色、平面型光導波路センサ２１による発色度合の検出を行うことができる。その結果、この発色度合に基づいて発色度合に関与する酸化性物質量、酸化性物質量に相関する検体液中の酵素活性を短時間で測定をすることができる。
【００３９】
なお、実施形態において検体液の被測定成分と反応基質の反応、この反応生成物から酸化性物質（過酸化水素）を生成する反応は、前述したＡＬＴ（酵素）とα−ケトグルタル酸およびＬ−アラニン（反応基質）の反応によるピルビン酸の生成、ピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼ（反応試薬）の反応による過酸化水素（酸化性物質）の生成を伴う酵素活性反応系を説明したが、これに限定されず、例えば以下の反応系でもよい。
【００４０】
１）酸化性物質（過酸化水素）の生成のための酵素活性反応系
ＡＳＴ（酵素）とα−ケトＧＡおよびＬ−アスパラギン酸（反応基質）の反応によるオキサロ酢酸の生成、オキサロ酢酸とオキサロ酢酸テルオキシターゼ（反応試薬）の反応によるピルビン酸の生成、ピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼ（反応試薬）の反応による過酸化水素（酸化性物質）の生成を伴う酵素活性反応系。
【００４１】
２）酸化性物質（過酸化水素）の生成のための酵素活性反応系
γ−ＧＴＰ（酵素）とＬ−グルタルグルタミン酸およびグリシジルグリシン（反応基質）の反応によるＬ−グルタミン酸の生成、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸オキシターゼ（反応試薬）の反応による過酸化水素（酸化性物質）の生成を伴う酵素活性反応系。
【００４２】
３）酸化性物質（過酸化水素）の生成のための濃度検出反応系
リポプロテインの界面活性剤によるコレステロール、コレステロールエステル、タンパク質への遊離、コレステロールエステルとコレステロールエステラーゼの反応によるコレステロールの生成、コレステロールとコレステロールオキシダーゼの反応による過酸化水素の生成を伴う酵素活性反応系。
【００４３】
４）ＮＡＤＨ（還元性物質）の生成のための酵素活性反応系
ＬＤＨ（酵素）とＬ−乳酸およびＮＡＤ+（反応基質）の反応によるＮＡＤＨの生成、ＮＡＤＨとジアホラーゼ（反応試薬）の反応によるテトラゾリウム塩のホルマザン色素への変換（発色反応）
前記酵素活性反応系において、反応試薬は反応室側に入れても、センシング膜中に含有させても、または両者に入れてもよい。ただし、センシング膜の安定性を考慮すると、反応試薬は反応室に入れた方が好ましい。
【００４４】
以下、本発明のセンサシステムによる酵素活性の定量を前述した図１〜図３を参照して説明する。
【実施例】
【００４５】
検体液反応装置１の反応室４は容量を約４０μＬとした。反応基質であるＬ−アラニンおよび２−ケトグルタル酸を４０μＬの溶媒に溶解させた際にそれぞれ２００ｍｍおよび１０ｍＭになる量を乾燥状態で配置した。
【００４６】
平面型光導波路センサ２１は、光導波路層２４を熱硬化性アクリル樹脂で形成し、その膜厚を約３０μｍとした。センシング膜２５は反応試薬であるピルビン酸オキシダーゼ、発色触媒であるペルオキシダーゼ、酸化還元性色素であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルベンジジンを含み、カルボキシメチルセルロースを造膜成分として成膜した。
【００４７】
検体液として、ヒト血清由来の標準血清（リキッドノーマル、デンカ生研）を０．２Ｍリン酸バッファ（ｐＨ＝６．２）で５倍，１０倍，２０倍，５０倍，１００倍，２００倍に希釈した溶液、および血清を含まない０．２Ｍリン酸バッファ４００μＬをそれぞれ検体溶液収納室７に供給した後、微小ポンプ１０で４０μＬ分の吸引動作を行って検体液の一部を反応室４に導入した。その直後、室温で２分間にわたり、微小ポンプ９の吸引および吐出動作を容量１μＬ相当で１０ミリ秒間隔で繰返した後、反応室４内の４５μＬ分の血清の吐出動作を行うことによって全ての血清を反応液流通空間１２に送液した。
【００４８】
この時点より平面型光導波路センサ２１へのレーザダイオード２６からのレーザ光の入射、センサ２１からの出射光量のフォトダイオード２７によるモニタを行い、６０秒後までの吸光度変化を計測した。その結果を図４に示す。図４から明らかなように希釈倍率が低い（血清分率が高い）程、吸光度が高く推移した。
【００４９】
６０秒後の吸光度を、標準血清中のＡＬＴの活性値から算出したピルビン酸濃度に対してプロットした結果を図５に示す。この図５から明らかなように活性値を示す生成ピルビン酸濃度に応じた検量線が得られた。
【００５０】
本実施例のセンタシステムでは、血清で反応基質を充分に混合、攪拌することにより血清の成分濃度の影響を抑えつつ、３分以内という短時間で血清中の酵素活性を定量可能であることを確認した。
【符号の説明】
【００５１】
１…検体液反応装置、２…ブロック、４…反応室、５…反応基質、７…検体液収納室、８…第１流路、１０…微小ポンプ、１２…第２矩形穴（反応液流通空間）、１４…第２流路、１５…第３流路、１７…逆止弁、２１…平面型光導波路センサ、２４…光導波路層、２５…センシング膜。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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