(57)【要約】【課題】  タンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化させるプロテアーゼ活性の測定方法を提供する。【解決手段】  この方法において、プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体を予め結合させた固相とインキュベートし、そして  固相を洗浄した後それに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬とインキュベートする。【効果】  血液凝固VII因子活性化プロテアーゼを簡便かつ特異的に測定して疾患の早期検出に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして
固相を洗った後、別個の活性化工程を経ずにそれに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする、
ことを特徴とするタンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性
を測定する方法であって、さらに、
梗塞または安定もしくは不安定狭心症の発見に利用できるように、タンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルを、梗塞または安定もしくは不安定狭心症患者由来のタンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルと比較する、方法。
【請求項２】
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして
固相を洗った後、別個の活性化工程を経ずにそれに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする、
ことを特徴とするタンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性
を測定する方法であって、さらに、
狭心症患者に対する予防処置の効果の評価に利用できるように、タンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルを、予防処置が行われていない狭心症患者由来のタンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルと比較する、方法。
【請求項３】
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして
固相を洗った後、別個の活性化工程を経ずにそれに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする、
ことを特徴とするタンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性
を測定する方法であって、さらに、
狭心症患者に対する治療処置の効果の評価に利用できるように、タンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルを、治療処置が行われていない狭心症患者由来のタンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルと比較する、方法。
【請求項４】
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして
固相を洗った後、別個の活性化工程を経ずにそれに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする、
ことを特徴とするタンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性
を測定する方法であって、さらに、
梗塞の重篤度の診断に利用できるように、タンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルを、梗塞患者由来のタンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルと比較する、方法。
【請求項５】
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして
固相を洗った後、別個の活性化工程を経ずにそれに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする、
ことを特徴とするタンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性
を測定する方法であって、さらに、
血栓塞栓性合併症の危険のモニタリングに利用できるように、妊娠女性由来のタンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルを測定する、方法。
【請求項６】
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして
固相を洗った後、別個の活性化工程を経ずにそれに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする、
ことを特徴とするタンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性
を測定する方法であって、さらに、
血栓症の危険の発見に利用できるように、タンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルを、血栓症患者由来のタンパク質溶液中のプロテアーゼ活性レベルと比較する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば血漿のような複雑なタンパク質溶液中でVII因子を活性化するプロテアーゼを定性および定量測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドイツ特許出願199 03 693.4には、すでに血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの定性的および定量的検出をするための試験システムおよび方法が開示されている。これらは、標識された低分子量ペプチド基質の開裂およびこの場合に生じる吸光の光度計による測定を基にする色素産生試験方法および開示されているプロテアーゼの生物学的特性を利用する試験方法を包含している。これらの方法では、プロテアーゼまたそのプロ酵素が、
ａ)  血液凝固VIII／VIIIａまたはＶ／Ｖａ因子を不活性化する作用または
ｂ)  全凝固試験で血液凝固時間を低減する作用または
ｃ)  プラスミノーゲン活性化因子（activator）を活性化する作用または
ｄ)  VII因子を活性化する作用
を有している点からみて、このものを検出することができる。
【０００３】
しかしながら、従前から使用されている測定方法では、もしもプロテアーゼが精製または濃縮された状態で存在している場合において、VII因子活性化因子の活性の測定に、信
頼し得る結果が得られ、また不純分の阻害効果が測定結果をゆがめることがない。しかしながら、殊に血漿または組織液のような極めて複雑なタンパク質混合物は、VII因子活性
化因子の特異的な測定を阻害するか、または少なくとも妨害し得る多数のタンパク質を含有している。さらには、現在の知識レベルによると、プロテアーゼは血漿中では特にプロ酵素として存在し、そのためにその後の活性測定のためには活性プロテアーゼを生じる活性化が必要となる。
【発明の概要】
【０００４】
VII因子活性化プロテアーゼは、殊に凝固および繊維素溶解プロセスでの協同作用により、うっ血の調整に関係する血漿タンパク質である。従って、プロテアーゼの機能および生物活性の研究は非常に関心の高いものである。例えば、遺伝子変異による抗原含量の低下および／または生物活性の崩壊は血栓症の危険性の増大を示唆するものである。従って、VII因子活性化プロテアーゼの生物活性の一種または二種以上をできるだけ簡便かつ特異的な方式での測定を可能とする方法を開発することが目的である。このプロテアーゼの生理学的役割は未だ明らかになっていないので、この方法は原則として多数の活性の測定をなし得るものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
これらの必要性が、タンパク質溶液中血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性を測定する方法によって満たされることが見い出された。この方法では、
・  プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液を、プロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして
・  固相を洗った後、それに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする。
【０００６】
意外にも、この測定方法はその活性化された形態のプロテアーゼに限らず使用し得るものである。以前の研究結果からプロテアーゼは主にプロ酵素として血漿中を循環していて
、それ故にその生物活性を発現し得るためには上述した固相に結合した後に初めて活性化されなければならないと予想されるが、意外なことには、このような活性化は必要がないことが見い出され、ただし血漿から固相に結合されたプロ酵素は活性酵素と同様に固定化された形態でその生物活性を示すことも見い出された。これにより、別個の活性化工程は不要であり、さらに迅速で、干渉のない測定が可能となる。
もっとも、結合されたプロ酵素が完全に活性化されたことを確実にするために、プロ酵素の特異的な活性化を、なお明らかに追加し得るであろう。
【０００７】
適当な固相は当業者に既知のマトリックス、例えば活性化Sepharose（登録商標）またはFraktogel（登録商標）である。マイクロタイタープレートは、好ましくは、ポリクローナルまたはモノクローナル由来のプロテアーゼに対する抗体でコーティングされている。抗体断片例えばＦ(ａｂ)またはＦ(ａｂ)2も使用し得る。検出、次いで定量化のために標識第二抗体を使用する抗原試験とは異なって、本発明によれば、プロテアーゼの活性の測定を可能とする色素産生基質を添加する。特に好ましい色素産生基質はChromogenix ABからのＳ２２８８（Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐＮＡ×２ＨＣｌ）であり、このものは類似化合物と全く同様に基質のアミド分解に因り吸収に顕著な濃度−および時間−依存性増大を示す。意外なことには、プロテアーゼは抗体に結合された後でもその生物活性および特性、すなわち、ＦVIIおよびプラスミノーゲン活性化因子を活性化する能力を保持している。複雑なタンパク質溶液からプロテアーゼの官能性の特異的測定がこれにより可能である。
【０００８】
色素産生基質に加えて、ドイツ特許出願199 03 693.4に記述されているその他の基質も活性測定に供することができる。すなわち、血液凝固VIII／VIIIａまたはＶ／Ｖａの不活性化およびＦVIIおよびプラスミノーゲン活性化因子の活性化である。この測定では、例えば、このようにして活性化されるVII因子の比率がＦVIIに特異的である色素産生基質の直接アミド分解により、または結合反応例えば所謂ＦVIIa-rＴＦ試験により、測定することができる。単鎖プラスミノーゲン活性化因子（ｓｃｕＰＡ、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子、またはｓｃｔＰＡ、単鎖組織プラスミノーゲン活性化因子）の活性化は例えばＳ２４４４（pyroGlu-Gly-Arg-pNA×HCl）の基質反応により簡単にモニターできる。ドイツ特許出願199 03 693.4に記載の如く、プロテアーゼの活性を刺激する物質例えば可溶性カルシウム塩および／またはヘパリンまたはヘパリン関連物質例えば硫酸デキストランを検出のために加えることもできる。
【０００９】
記載の方法の助けによって溶液、体液および細胞または組織抽出液をさらに検査することにより、ＦVII活性化プロテアーゼの検出または定量化に対する適合性が示された。これらのものには、このプロテアーゼを含有する溶液例えばプロテアーゼの生産中間体および組み換え発現に適した細胞の醗酵でも得られる細胞培養上澄液があることを理解すべきである。これらのものの中には、プロテアーゼまたはプロ酵素の形質転換生産で得られる溶液例えば乳があることを理解すべきである。
さらに、この方法は、組織または細胞の抽出液中のＦVII活性化プロテアーゼの活性を測定するのにも適当であり、このタンパク質の過剰−または過少発現の場合、プロテアーゼ活性の存在または潜在的な病態に効果を生じる。
【００１０】
特に関心があるのは、体液例えば血液および血漿、精漿、尿、髄液、気管肺泡洗浄液、羊膜液、唾液または涙液でのプロテアーゼ活性の検出に対する適用である。ここでの活性試験に対する有用な補助手段はドイツ特許出願199 03 693.4に開示されている抗原測定システム（例えばＥＬＩＳＡ）であり、両方のパラメーターの助けで例えば障害の場合より総合的な状態を得ることができる。
【００１１】
健康な血液ドナーの検査において、検査した血漿の約５〜１０％は、実施例１にさらに
詳述するように、標準品（プール血漿）と比較して著しく低いプロテアーゼ活性（「平均値」の約３０〜５０％）を有していたことが目立っていた。この情報は、これらのドナー全員のうちの大部分の者が正常な範囲の抗原含量を有していた事実によって補足された。このことは、例えば、血漿試料の抗原含量ではなくて活性に相応して影響するヘテロ接合体変異を指示していた。結果として、これらのドナーはある種の疾患の危険グループであり、必要ならば、早期に予防措置をとることができる。このことは活性レベルが増大または低下した人にも適用される。本発明者らは健康なドナーグループと比較して心筋梗塞に罹っている患者（実施例２も参照）および安定および不安定な狭心症に罹っている患者の血漿中のこのプロテアーゼ活性が著しく増大（場合によっては正常または若干増大した抗原含量を有する）したことを見い出した。これまでのところ、プロテアーゼ活性の増大がこの状態の一因と評価できるかどうか、またはこれがさらには血栓崩壊の増大の意味で生体の逆反応に対応するかも知れないものかどうかはなお判然としていない。
【００１２】
プロテアーゼ活性の増大の生理学な関連性とは別に、このパラメーターは早期検出にむすびつくものであり、徴候の変化の判定基準として用いることができる。これにはそれ以上の心臓血管関連の合併症の診断が含まれる。
これらの指摘以外に、記載した試験システム（抗原測定とも組み合わせて）悪性疾患、炎症、自己免疫疾患、脈管炎、呼吸障害の症例での診断および治療モニターリング、またはうっ血（凝固および繊維素溶解）の診断、また敗血症および関連反応例えば播種性血管内凝固症候群の症例での診断および治療モニターリングにも使用することができる。さらにこれ以上の適用領域には、臓器障害、例えば脳、呼吸器および腎臓の疾患の診断が包含される。肝硬変に罹っている患者では、本発明者らは、プロテアーゼの活性が著しく低減していることを見い出し、これはほとんどの場合抗原レベルの低減を伴っていた。
【００１３】
それ以上の検査で、健康な妊婦の血漿中で抗原レベルが適度に増大することに加えて、妊娠の過程でプロテアーゼ活性の著しい増大が認められ、また第三のトリメスターで最高値を有することがわかった。このようなプロテアーゼの増加がないことは、妊娠中の母体および胎児にとって例えば早産および流産または胎児の奇形に至るまで、またこれらを包含する血栓塞栓性合併症の危険に関連するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】検査した健康な男性(Ａ)および女性(Ｂ)のプロテアーゼ活性を示す。
【図２】急性心筋梗塞患者(Ａ)および健康なドナー(Ｂ)のプロテアーゼ活性を示す。
【００１５】
本発明を以下の実施例によって例示する。
実施例１
マイクロタイタープレート（９６ウエル）をＦVII活性化因子に対するモノクローナル抗体で各孔に１０μg／mlからなる溶液１５０μlをピペットで注入することによってコーティングした。室温で１６時間インキュベートした後、プレートを数回洗った。増加濃度の精製プロテアーゼ１００μlまたは種々の希釈度の標準ヒト血漿（ＳＨＰＬ）を各々の場合孔にピペットで注入した。３７℃でインキュベートした後、溶液を数回洗って除き、活性を測定した。
プロウロキナーゼ溶液（１０μg／ml、American Diagnostica, US）５０μlを各孔にピペットで注入し、その時に３０mM ＣａＣｌ2および１００IU／mlのヘパリンを含む緩衝剤５０μlを入れた。２分後に、緩衝剤をさらに１００μlおよび基質Ｓ２４４４（３mM）２５μlを加えた。４０５nmでの毎分の吸収増大を測定した。
【００１６】
【表１】
2011103902.tif 000002
【００１７】
実施例２
試料溶液を用いたマイクロタイタープレートのコーティングおよびインキュベーションを実施例１に記載の如く行った。プロウロキナーゼの活性化に代わって、VII因子の活性化を測定した。このために、各々の例では、３０mM ＣａＣl2および１００IU／mlヘパリンを含む緩衝剤５０μlを室温で２分間プレートの孔に加えた。緩衝剤をさらに１００μlおよびSpectrozym（登録商標）VIIａ（３mM，American Diagnostica／US）を加えた後、△ｍＯＤ／分を測定した。
【００１８】
【表２】
2011103902.tif 000003
【００１９】
これらの希釈系の助けにより、個々の血漿の比較およびプロテアーゼの官能度を測定することが可能となる。いくつもの個々の血漿のプールを表している標準ヒト血漿との比較により、標準からの有意の偏差を検知することができる。このようにしてわかった活性は理想的には例えばＥＬＩＳＡによって測定し得る抗原含量に対する比で設定すべきものである。
プロテアーゼ量が既知であると、プロテアーゼの比活性およびタンパク質溶液中に含まれるそのプロ酵素を測定することができる。
【００２０】
実施例３
１９０人の健康ドナーの血漿のプロテアーゼ測定
１４０人が男性で、５０人が女性である１９０人の健康人のクエン酸塩加血漿について、ここに記載の活性度試験の助けで検査した。活性がプロテアーゼ抗原レベルの相当する変化を伴っている全ての検査血漿の平均値とは潜在的に相異しているか否かを測定するために、ドイツ特許出願199 03 693.4に記載の如くＥＬＩＳＡを用いた。抗原としてのプロテアーゼの検出のためのこのＥＬＩＳＡはこのプロテアーゼに対するモノクローナルまたはポリクローナル特異抗体の助けによって実施し得る。
図(１)は検査健康男性(Ａ)および女性(Ｂ)のプロテアーゼ活性を示す。男女共に、５〜１０％が平均値に比べて顕著に低下した活性を示していることが明らかである。
【００２１】
プロテアーゼ活性（ｙ軸）およびこれに属している対応する人の抗原レベル（ｘ軸）を図示する。抗原および活性レベルの任意の「正常域」は各例でパラメーターの上部および下部限界として水平および垂直の線で示している。従って、これから生じる長方形は健康なドナーの「正常域」を表している。活性が低下した試料の大多数が抗原レベルの対応する低減を伴っていないことも特にここでは明瞭である。このことはヘテロ接合性変異（または数種の）を示し、すなわち、プロテアーゼ分子の例えば約５０％が一種または二種以上の変異によって修飾され、その結果生物学的基質との反応がそれ以上保証されなくなる。プロテアーゼの繊維素溶解性の重要さでは、これは現在のところなお「健康な」集団の血栓症（またはその他の疾患等）の危険性と関連しているが、検査した試料の少数例では、抗原含量の低減と極めてよく同調している低減プロテアーゼ活性の数値をまさしく興味あるものとして評価すべきであり、これはプロテアーゼの血漿利用性の不調が存在していることが明白であることにより、そして記載した如く相当な危険性と関連し得るものである。
従って、抗原測定とも関連してプロテアーゼの活性の検出で早期の認識および予防／治療コントロールのためのパラメーターを知ることができる。
【００２２】
実施例４
妊娠女性の血漿中のプロテアーゼ活性の測定
妊娠女性のクエン酸塩加血漿を実施例３に記載の如く試験した。
試料は妊娠期間中の様々な時点で入手し、次いで検査した。
二通りの問題のない妊娠経過を表１に示す。妊娠期間と共にプロテアーゼ活性が明らかに増大したことが検知され、これと比較して、プロテアーゼの抗原含量は全く増大しない乃至中程度の増大を示す。この増大した活性が存在していないことは、母体および胎児にとっての問題と関連させることができる。
一方、健康な（妊娠していない）女性は相当する観察期間中（示していない）の連続したプロテアーゼ活性の過程（試験の変動に関して増大も低減もしていない）を示している。
【００２３】
【表３】
2011103902.tif 000004
【００２４】
実施例５
心筋梗塞血漿中のプロテアーゼ活性の測定
急性心筋梗塞に罹った５４人の患者の血漿を救急病棟への許可を得て（集中治療前）入手し、そして通常の分析に使用した。その後、血漿残渣（未解凍アリコート）をプロテアーゼ活性（および抗原含量）の定量に使用した。
図(２)に検査の結果を要約する。健康なドナー(Ｂ)のグループと比較して、急性心筋梗塞に罹っている患者(Ａ)の血漿では、有意により高いプロテアーゼ活性（そしてまた抗原含量）を測定することができる。
【００２５】
従って、これらのパラメーターを梗塞の早期検知に、すなわち安定および不安定狭心症の場合でも、使用することができる。これらの冠状心疾患に罹っている患者では、本発明者らは平均して有意に増大した活性を見い出した。測定値の高さにより、疾患の重篤度の評価が可能となり、または梗塞および狭心症予防および治療の過程で患者の症状についての貴重な指示を得ることができる。さらには、これらのパラメーターは心臓血管系に関連するその他の合併症の評価に使用することもできる。
【００２６】
本願発明は、例えば、以下の実施態様に具現化される。
（１）プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素を含むタンパク質溶液をプロテアーゼに対する抗体が予め結合されている固相と共にインキュベートし、そして固相を洗った後、それに固定されたプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素をそれらの活性の測定を可能とする試薬と共にインキュベートする、ことを特徴とするタンパク質溶液から血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼの活性を測定する方法。
（２）プロテアーゼの活性を、色素産生基質に対する作用中に生じる吸光を光度計による測定によって測定する上記（１）の方法。
（３）プロテアーゼの活性を、ａ) 血液凝固VIII／VIIIａまたはＶ／Ｖａ因子を不活性化するその作用またはｂ) 全凝固試験で血液凝固時間を短縮するその作用またはｃ) プラスミノーゲン活性化因子を活性化するその作用またはｄ) VII因子を活性化するその作用に
よって測定する上記（１）の方法。
（４）プロテアーゼに対する抗体がポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはＦ(ａｂ）もしくはＦ(ａｂ)2抗体断片である上記（１）〜（３）の方法。
（５）血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼを測定するためのキット。
（６）測定するパラメーターが血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼである梗塞、
または安定もしくは不安定狭心症の早期発見のための方法。
（７）測定するパラメーターが血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼである梗塞の
過程または重篤度または狭心症の場合の予防および／または治療の結果を診断する方法。（８）測定するパラメーターが血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼである妊娠を
モニターする方法。
（９）測定するパラメーターが血液凝固VII因子を活性化するプロテアーゼである血栓症
の危険を早期に発見する方法。
【図１】
2011103902.tif 000005
【図２】
2011103902.tif 000006