(57)【要約】【課題】酸性条件においても安定して高い酵素活性を示す新規なマンナナーゼを提供すること。【解決手段】  アメフラシに由来し、下記の（a）〜（c）の理化学的性質を有するマンナナーゼ。(a) 作用：ガラクトマンナン及びグルコマンナンを分解して、還元糖を遊離する(b) 基質特異性：ロカストビーンガム、タラガム、グアガム及びグルコマンナンを分解する(c) 至適pH：pH2.0〜7.5（最適pH：pH3.0〜7.0）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アメフラシに由来し、下記の（a）〜（c）の理化学的性質を有するマンナナーゼ。
(a) 作用：ガラクトマンナン及びグルコマンナンを分解して、還元糖を遊離する
(b) 基質特異性：ロカストビーンガム、タラガム、グアガム及びグルコマンナンを分解する
(c) 至適pH：pH2.0〜7.5（最適pH：pH3.0〜7.0）
【請求項２】
以下の（d）〜（h）からなる群より選択される少なくとも1つの性質を更に有する、請求項1に記載のマンナナーゼ。
(d) 分子量：約39,000Daの単一バンド（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
(e) 至適温度：約55℃
(f) 熱安定性：pH 6.0において45℃で20分間の加熱後に75％以上のマンナナーゼ活性が残存する
(g) pH安定性：酸性領域において、マンナナーゼ活性が維持される
(h) 塩濃度変化に対する安定性：0〜0.5 MのNaCl存在下で、80％以上のマンナナーゼ活性が維持される
【請求項３】
アメフラシの消化器官組織又は消化液からマンナナーゼ粗酵素を抽出し、該粗酵素をクロマトグラフィー処理して、請求項1又は2に記載のマンナナーゼを採取することを特徴とする該マンナナーゼの製造方法。
【請求項４】
請求項1又は2に記載のマンナナーゼとガラクトマンナン又はグルコマンナンとを接触させる工程を含む、ガラクトマンナン又はグルコマンナンの分解方法。
【請求項５】
前記接触工程が、酸性条件下で行われる、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
以下の（i）、（ii）又は（iii）のタンパク質。
（i）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ii）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質
（iii）配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
請求項6に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の（iv）、（v）又は（vi）のポリヌクレオチド。
（iv）配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（v）配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（vi）配列番号1に示す塩基配列に対して、50％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項９】
請求項7又は8に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項9に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
請求項10に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からマンナナーゼを採取することを特徴とするマンナナーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アメフラシに由来する新規なマンナナーゼ、その製造方法及び利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マンナナーゼは、マンナンからマンノビオースやマンノトリオースなど、食品添加物や医薬品素材として付加価値の高いマンノオリゴ糖を生成する有用な酵素である。具体的には、マンナナーゼは、β-1,4-マンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナンなどのマンノース間のβ-1,4-結合をランダムに加水分解する。現在までに細菌類（非特許文献1及び2）、真菌類（非特許文献3及び4）、高等植物（非特許文献5及び6）及び軟体動物（特許文献1並びに非特許文献7、8及び9）からマンナナーゼが単離されている。
【０００３】
マンナンは、ヒトの消化酵素では消化されないため、このような性質を利用して、食物繊維として食品に添加することにより、整腸作用を促すことができる。また、マンナンの分解によって生じるオリゴ糖は、いわゆる善玉菌であるビフィズス菌は資化できるが、悪玉菌である大腸菌などはマンナンを資化できないため、マンナンの分解物は、善玉菌を選択的に増殖させて腸内環境を調整するのに非常に有用である（特許文献2）。
【０００４】
このような有用性に基づき、マンナンの分解物は広く食品等に利用されているが、マンナン分解物を大量に得るためには、マンナナーゼによる効率的なマンナン分解が不可欠である。工業スケールでのマンナン分解にマンナナーゼを利用する場合、マンナナーゼは、pH、温度、塩濃度等をパラメーターとする多様な条件下で安定性を示し、酵素活性を維持できることが望まれる。しかしながら、現在までに単離されたマンナナーゼは、その至適pHの範囲が中性付近に存在するため、中性外領域、即ち、酸性領域又は塩基性領域で使用することが困難であった（特許文献１）。このため多様な条件で利用することができるマンナナーゼが望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許4166808号
【特許文献２】特開58-212780号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Tamaru, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 4454-4458 (1995)
【非特許文献２】Akino, T. et al., Agr. Biol. Chem., 52, 773-779 (1988)
【非特許文献３】Reese, T. et al. Can. J. Microbiol., 11, 167-183 (1965)
【非特許文献４】Stalbrand, H., J. Biotechnol., 29, 229-242 (1993)
【非特許文献５】Shimahara, H. et al., Agr. Biol. Chem., 39, 301-312 (1975)
【非特許文献６】Marraccini, P. et al., Planta, 213, 296-308 (2001)
【非特許文献７】Yamaura, I. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 1316-1319 (1993)
【非特許文献８】Yamaura, I. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 674-676 (1996)
【非特許文献９】Xu, B. et al., J. Biotechnol., 92, 267-277 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の状況に鑑み、本発明は、酸性条件においても酵素活性が低下しない新規なマンナナーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、アメフラシのマンナナーゼを単離し、その性質を解明し、当該マンナナーゼを化学的に特定することに成功した。単離されたアメフラシ由来マンナナーゼは、驚くべきことに、pH6未満の酸性条件でも殆ど活性の低下がみられず、熱安定性の高いものであった。さらに、本発明者は、詳細に研究を進め、前記マンナナーゼの遺伝子配列及びタンパク質のアミノ酸配列を同定することに成功した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の通りである。
［1］  アメフラシに由来し、下記の（a）〜（c）の理化学的性質を有するマンナナーゼ。
(a) 作用：ガラクトマンナン及びグルコマンナンを分解して、還元糖を遊離する
(b) 基質特異性：ロカストビーンガム、タラガム、グアガム及びグルコマンナンを分解する
(c) 至適pH：pH2.0〜7.5（最適pH：pH3.0〜7.0）
［2］  以下の（d）〜（h）からなる群より選択される少なくとも1つの性質を更に有する、前記［1］に記載のマンナナーゼ。
(d) 分子量：約39,000Daの単一バンド（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
(e) 至適温度：約55℃
(f) 熱安定性：pH 6.0において45℃で20分間の加熱後に75％以上のマンナナーゼ活性が残存する
(g) pH安定性：酸性領域において、マンナナーゼ活性が維持される
(h) 塩濃度変化に対する安定性：0〜0.5 MのNaCl存在下で、80％以上のマンナナーゼ活性が維持される
［3］  アメフラシの消化器官組織又は消化液からマンナナーゼ粗酵素を抽出し、該粗酵素をクロマトグラフィー処理して、前記［1］又は［2］に記載のマンナナーゼを採取することを特徴とする該マンナナーゼの製造方法。
［4］  前記［1］又は［2］に記載のマンナナーゼとガラクトマンナン又はグルコマンナンとを接触させる工程を含む、ガラクトマンナン又はグルコマンナンの分解方法。
［5］  前記接触工程が、酸性条件下で行われる、前記［4］に記載の方法。
［6］  以下の（i）、（ii）又は（iii）のタンパク質。
（i）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ii）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質
（iii）配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質
［7］  前記［6］に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［8］  以下の（iv）、（v）又は（vi）のポリヌクレオチド。
（iv）配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（v）配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（vi）配列番号1に示す塩基配列に対して、50％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［9］  前記［7］又は［8］に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
［10］  前記［9］に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
［11］  前記［10］に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からマンナナーゼを採取することを特徴とするマンナナーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、酸性条件でも活性が低下せず、高い熱安定性を示す新規なマンナナーゼが提供される。また、本発明のポリヌクレオチドを用いることにより、このような特性を有するマンナナーゼを容易に作製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アメフラシ消化液からマンナナーゼを精製する方法の概略を示す図である。
【図２】アメフラシ消化液を硫安分画した後にPhenyl-Toyopearlカラムクロマトグラフィーで精製した結果を示す図である。
【図３】Phenyl-Toyopearlカラムクロマトグラフィーで得られた活性画分をCM-Toyopearlカラムクロマトグラフィーで精製した結果を示す図である。
【図４】CM-Toyopearlカラムクロマトグラフィーで得られた活性画分をMono-Sカラムクロマトグラフィーで精製した結果を示す図である。
【図５】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）の基質特異性を示す図である。
【図６】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）の各種マンナン分解によるマンノオリゴ糖の生成を示す図である。M1〜M6は、それぞれ、マンノース（M1）、マンノビオース（M2）、マンノトリオース（M3）、マンノテトラオース（M4）、マンノペンタオース（M5）及びマンノヘキサオース（M6）を表す。
【図７】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）の各種マンナン分解によるマンナン溶液の粘性低下を示す図である。
【図８】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）のpH依存性を示す図である。
【図９】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）の温度依存性を示す図である。
【図１０】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）の耐熱性の測定結果を示す図である。
【図１１】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）のNaCl濃度依存性の測定結果を示す図である。
【図１２】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）とアワビ由来マンナナーゼ（HdMan）のN末端40残基部分のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１３Ａ】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）遺伝子の塩基配列及びその推定アミノ酸を示す図である。
【図１３Ｂ】図13Aの続き
【図１４】アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）遺伝子の構造を示す図である。
【図１５Ａ】実施例で用いた各プライマーの配列とアメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）遺伝子の塩基配列との対応を示す図である。
【図１５Ｂ】図15Aの続き
【発明を実施するための形態】
【００１２】
1．本発明のマンナナーゼ
本発明のマンナナーゼは、アメフラシ由来のものであり、以下の（a）〜（c）の性質を有する。
(a) 作用：ガラクトマンナン及びグルコマンナンを分解して、還元糖を遊離する
(b) 基質特異性：ロカストビーンガム、タラガム、グアガム及びグルコマンナンを分解する
(c) 至適pH：pH2.0〜7.5（最適pH：pH3.0〜7.0）
【００１３】
由来
本発明のマンナナーゼは、アメフラシ由来のものである。本発明において、「アメフラシ」とは、腹足綱後鰓類の無楯類 (Anapsidea、Aplysiomorpha) に属する軟体動物の総称であり、具体例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：
クロヘリアメフラシ（Aplysia parvula）、クロスジアメフラシ（Stylocheilus striatus）、アマクサアメフラシ（Aplysia juliana）、ジャンボアメフラシ（Aplysia californica）、ジャノメアメフラシ（Aplysia dactylomela）、アプリシア・エクストラオルディナリア（Aplysia extraordinaria）、ミドリアメフラシ（Aplysia oculifera）、サガミアメフラシ（Aplysia sagamiana）、アプリシア・シドニーエンシス（Aplysia sydneyensis）及びアメフラシ（Aplysia kurodai）。これらの具体例のうち、アメフラシ（Aplysia kurodai）が好ましい。
【００１４】
本発明のアメフラシ由来マンナナーゼは、以下の（a）〜（c）の性質を有する。
【００１５】
(a) 作用
本発明のマンナナーゼは、ガラクトマンナン及びグルコマンナンを分解して、還元糖を遊離する。より具体的には、本発明のマンナナーゼは、ガラクトマンナン及びグルコマンナンのマンノース間のβ-1,4-結合をランダムに加水分解する。
【００１６】
(b) 基質特異性
本発明のマンナナーゼは、ロカストビーンガム（locust bean gum）、タラガム（tara gum）、グアガム（guar gum）及びグルコマンナン(glucomannan)を効率的に分解する（図5）。ロカストビーンガムとはカロブ樹（carob tree: Ceratonia siliqua）の種子の胚乳部分から得られる水溶性天然高分子多糖類で、主成分はガラクトマンナンである。グアガムとは、グアー豆の胚乳部から得られる水溶性の天然多糖類であり、主成分はガラクトマンナンである。タラガムとは、タラ（Caesalpinia spinosa Kuntze）の種子の胚乳部から得られる多糖類であり、ガラクトマンナンを主成分する。グルコマンナンは、β-1,4結合した六炭糖のグルコースとマンノースを含む水溶性中性多糖であり、針葉樹の細胞壁や蒟蒻芋に多く含まれる。グルコマンナンは、コンニャクの主成分であるため（乾燥重量で約40％）「コンニャクマンナン」と呼ばれる場合もある。
基質特異性の確認試験は、基質候補（例えば、各種マンナン等の各種多糖類）とアメフラシ由来マンナナーゼを適切な比率（例えば、1：1）で混合し、時系的に基質の分解度をモニターすることにより行うことができる。
【００１７】
本発明のマンナナーゼは、ロカストビーンガム、タラガム、グアガム及びグルコマンナンを分解して、種々のオリゴ糖を生成させる。本発明のマンナナーゼを用いてこれらの基質を分解した場合、例えば、ロカストビーンガムからは3糖を主体とする2〜5糖程度のオリゴ糖が生じ、タラガムからは4糖を主体とする2〜5糖のオリゴ糖が生じる。一方、グアガムからは5糖以下のオリゴ糖は生じないが、6糖以上のオリゴ糖が生じていると推定される（図6）。さらに、本発明のマンナナーゼでグルコマンナンを分解すると、標準的なマンノオリゴ糖とは異なる移動度を示す複数種類のオリゴ糖が生じる（図6）。
本発明のマンナナーゼによるマンナン分解で生じるオリゴ糖の種類は、例えば、本発明のマンナナーゼを各種マンナンと混合して酵素反応を起こさせ、その反応系に含まれるオリゴ糖を薄層クロマトグラフィー等の分析方法によって分析することにより、同定することができる。
【００１８】
また、本発明のマンナナーゼの基質であるマンナンは、粘性を示すが、マンナンが分解されると反応溶液の粘性が減少するため、本発明のマンナナーゼによるマンナンの分解度は、反応溶液の粘度の低下を測定して間接的にモニターすることもできる（図7参照）。粘度は、キャノン-フェンスケ型、不透明液用（逆流型）型、ウベローデ型、希釈形ウベローデ型、キャノン-マニング型及びオストワルド型粘度計等の各種粘度計を用いて測定できる。
【００１９】
(c) 至適pH
本発明のマンナナーゼの至適pHは、pH2.0〜7.5であり、より好ましくは、pH3.0〜7.0であり、更に好ましくは、pH4.0〜7.0であり、より更に好ましくは、pH4.0〜6.5であり、最も好ましくは、pH4.0〜6.0である。したがって、本発明のマンナナーゼは、酸性条件での使用に非常に適している。このように酸性領域で失活しないマンナナーゼは本発明によって初めて提供されるものである。本発明のマンナナーゼは、多様な条件で利用することができる。本発明のマンナナーゼは、例えば、食品等の製造において、乳酸菌発酵工程等の酸性条件下であってもマンナンを効率よく分解することができる。
【００２０】
本発明のマンナナーゼは、任意の実施態様において、上記（a）〜（c）の性質に加えて、以下の（d）〜（i）からなる群より選択される少なくとも1つの性質を更に有していてもよい。
【００２１】
(d) 分子量
本発明のマンナナーゼは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した場合、分子量約39,000Daの単一バンドとして確認できる。即ち、本発明のマンナナーゼは、約39,000Daの分子量を有する。ここで、「約39,000Da」とは、37,000〜41,000 Da、好ましくは、38,000〜40,000 Da、更に好ましくは、38,500〜40,000 Da、最も好ましくは、38,750〜39,750 Daである。本発明のマンナナーゼは、その遺伝子配列（配列番号1）から推定されるアミノ酸配列（配列番号2）の情報から、39,962 Daの分子量を有するものと予測される。
分子量は、例えば、質量分析やSDS-PAGEなどの一般的なタンパク質分子量の測定方法によって測定可能であるが、SDS-PAGEによる測定が好ましい。また、SDS-PAGEを行う場合、本発明のマンナナーゼは、サンプルローディングに先立って2-メルカプトエタノール等の還元剤の存在下での加熱処理等によって変性されることが好ましい。
【００２２】
(e) 至適温度
即ち、本発明のマンナナーゼの至適温度は、約55℃である。「約55℃」とは、50〜60℃、好ましくは、52〜58℃、更に好ましくは、53〜57℃、より好ましくは、54〜56℃、最も好ましくは、55℃である。
至適温度は、一定濃度の基質（例えば、0.2重量％）と一定量のマンナナーゼを混合し、この混合物を所定の温度で加熱して、一定時間内に分解された基質の量を測定及び比較することによって求めることができる。各温度での基質分解量を比較し、最も多くの基質が分解された温度を至適温度と定めることができる。また、上述したように、マンナナーゼとマンナン基質を含む反応溶液の粘度の低下を測定して間接的に基質の分解度をモニターすることもできる（図7参照）。あるいは、マンナナーゼの活性は、マンナン分解により遊離した還元糖をPark-Johnson法で定量することにより、測定することができる。
【００２３】
(f) 熱安定性
本発明のアメフラシ由来マンナナーゼは、pH 6.0において種々の温度で加熱した場合、40℃までの加熱では殆ど活性が低下せず、45℃での過熱後でも75％の残存活性を示し、そして、52℃での過熱後でも50％の残存活性を示すことから、熱に対して非常に安定であるといえる（図10）。熱安定性は、マンナナーゼを様々な温度（例えば、15〜65℃）で一定時間（例えば、20分間）加熱処理した後に、加熱前の活性を100％と定義した上で相対活性を測定することにより、評価することができる。マンナナーゼ活性の測定は、前述と同様に、分解した基質量の測定、反応溶液の粘性の測定又はPark-Johnson法による還元糖の測定のいずれかで行うことができる。
【００２４】
(g) pH安定性
本発明のマンナナーゼは、酸性領域において、マンナナーゼ活性が維持される。即ち、図8に示されるように、本発明のマンナナーゼは、酸性領域において殆ど全く活性が低下することがなく、75％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、最も好ましくは90％以上のマンナナーゼ活性を維持する。ここで、「酸性領域」とは、下限がpH2.0、3.0又は4.0のいずれか一つから選択され、上限が、pH6.0、6.5又は7.0のいずれか一つから選択される、当該下限と上限との任意の組合せによって規定される領域を指し、好ましくは、pH3.0〜7.0、より好ましくは、pH4.0〜6.5、更に好ましくは、pH4.0〜6.0の領域を指す。この酸性領域での安定性は、従来のマンナナーゼには見出されない特徴である。例えば、特許文献1に記載のアワビ由来マンナナーゼは、pH6以下の酸性領域ではマンナナーゼ活性が至適pHでの活性の半分以下にまで低下しているため、酸性条件での使用に適さない。
pH安定性は、マンナナーゼを様々なpH（例えば、pH1.0〜13.0）の条件下で基質と反応させ、至適pH（例えば、pH6.0〜7.0）での活性を100％と定義した上で試験したpHでの相対活性を測定することにより、評価することができる。マンナナーゼ活性の測定は、前述と同様に、分解した基質量の測定、反応溶液の粘性の測定又はPark-Johnson法による還元糖の測定のいずれかで行うことができる。
【００２５】
(h) 塩濃度変化に対する安定性
本発明のアメフラシ由来マンナナーゼは、0〜0.5 Mの範囲でNaCl濃度を変化させた場合でも、80％以上のマンナナーゼ活性を維持する（図11）。このような塩濃度変化に対する安定性のため、本発明のマンナナーゼは、広範囲な塩濃度条件下で好適に使用できる。一般的に、真菌や細菌由来のマンナナーゼは、溶液のNaCl濃度が高くなると活性が著しく低下するため、緑藻や紅藻等の海藻の細胞壁に含まれるβ-1,4-マンナンの分解を目的としてこれらのマンナナーゼを用いた場合、酵素反応は、海水から混入するNaClによってネガティヴな影響を受けることが予測される。一方で、本発明のアメフラシ由来マンナナーゼはNaClの影響を殆ど受けないため、海藻のプロトプラスト作出、海藻のマンナンの分解又は海藻由来のマンノオリゴ糖の製造といった海水の混入する条件化で使用に非常に適している。
塩濃度の変化に対する安定性は、マンナナーゼを様々な塩濃度（例えば、0〜0.5 MのNaCl）の条件下で基質と反応させ、至適濃度（例えば0.25 M）での活性を100％と定義した上で試験した塩濃度での相対活性を測定することにより、評価することができる。マンナナーゼ活性の測定は、前述と同様に、分解した基質量の測定、反応溶液の粘度の測定又はPark-Johnson法による還元糖の測定のいずれかで行うことができる。
【００２６】
(i) N末端アミノ酸配列
本発明のアメフラシ由来マンナナーゼは、そのN末端部分において配列番号5に示すアミノ酸配列を有していてもよい。配列番号5に示すアミノ酸配列は、アワビ（Haliotis discus hannai）由来のマンナナーゼと、N末端の40アミノ酸残基からなる領域で55％の同一性を示す（図12参照）。アミノ酸配列の同一性は、European Bioinfomatics Instituteから入手可能なClustal WやGenetyx社から市販される配列解析ソフトウェアを用いて容易に算出することができる。
【００２７】
以下、本発明のアメフラシ由来マンナナーゼの製造方法を説明する。
【００２８】
2．アメフラシ由来マンナナーゼの製造方法
本発明は、アメフラシの消化器官組織又は消化液からマンナナーゼ粗酵素を抽出し、該粗酵素をクロマトグラフィー処理して、下記の（a）〜（c）の理化学的性質を有するマンナナーゼを採取することを特徴とする該マンナナーゼの製造方法を提供する。
(a) 作用：ガラクトマンナン及びグルコマンナンを分解して、還元糖を遊離する
(b) 基質特異性：ロカストビーンガム、タラガム、グアガム及びグルコマンナンを分解する
(c) 至適pH：pH2.0〜7.5（最適pH：pH3.0〜7.0）
【００２９】
本発明において、「粗酵素」とは、マンナナーゼとマンナナーゼ以外の不純物成分とを含有する混合物を意味するものであり、液体であっても固体であってもよい。
【００３０】
本発明において、「抽出」とは、消化器官組織又は消化液に含まれるマンナナーゼを適切な溶媒中に溶出させて回収する操作を意味する。例えば、マンナナーゼ粗酵素の抽出方法の具体例として、硫安分画、限外濾過又は凍結乾燥等の一般的なタンパク質濃縮方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明において、「クロマトグラフィー処理」とは、クロマトグラフィー操作によってマンナナーゼの純度を高める精製処理を広く意味するものである。ここで、「精製」とは、粗酵素中に含まれるマンナナーゼ以外の不純物成分を取り除くことにより、マンナナーゼの純度を高める操作を意味する。クロマトグラフィー精製の具体例としては、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー等の精製方法が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
【００３２】
以下において、アメフラシからのマンナナーゼの製造方法の具体例を説明するが、本発明のアメフラシ由来マンナナーゼの製造方法は、以下に限定されるものではない。
【００３３】
アメフラシ由来のマンナナーゼは、アメフラシの内臓や内臓滲出液、特に消化器官の組織や消化液に多く含まれることから、これらの組織や体液から当該酵素を含有する粗酵素を抽出した後、当該粗酵素を更に精製することで高純度のマンナナーゼを得ることができる。本発明のマンナナーゼの場合、例えば、アメフラシの消化液を硫安分画することにより粗酵素を得ることができる。また、回収したマンナナーゼ粗酵素を精製する方法としては、マンナナーゼ粗酵素を緩衝液等に混合し、得られたマンナナーゼ混合物を吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー処理で精製することにより高純度のマンナナーゼを得ることができる。下記の実施例で行ったアメフラシ消化液からのマンナナーゼの抽出及び精製の概略を図1に示す。
【００３４】
最初に、マンナナーゼが含まれる組織及び体液、好ましくは、消化器官組織の溶解物や消化液を遠心して固形物を沈殿させた上で上澄を回収し、この上澄を硫安分画、限外濾過又は凍結乾燥等の一般的なタンパク質濃縮方法によって濃縮することにより粗酵素を得ることができる。下記の実施例では、消化液を遠心して、その上澄を硫安分画（40〜60％硫酸アンモニウム）することによって、粗酵素を得ている（図1参照）。
【００３５】
マンナナーゼ粗酵素は、更に精製することが好ましく、このような精製は、公知のタンパク質精製方法、例えば、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー処理により行うことができる。
【００３６】
吸着クロマトグラフィーを行う場合、マンナナーゼの疎水性を利用して精製を行うことが可能であるため、疎水性樹脂カラムを用いることが好ましい。疎水性樹脂カラムの例としては、TOYOPEARL Phenyl 650カラム（東ソー社製）等が挙げられる。例えば、吸着クロマトグラフィーの前の工程でマンナナーゼを硫安分析及び透析によって粗抽出した場合、疎水性樹脂カラムを透析に用いた緩衝液で事前に平衡化することが好ましい。下記の実施例では、硫安分画後にTOYOPEARL Phenyl 650カラムを用いた疎水クロマトグラフィーを行っている（図2を参照）。
【００３７】
イオン交換クロマトグラフィーを行う場合、イオン交換樹脂としては、陽イオン交換タイプのイオン交換樹脂を用いることができる。このような、陽イオン交換樹脂を利用したカラムは市販されており、例えば、TOYOPEARL CM-650Mカラム（東ソー社製）等が挙げられる。下記の実施例では、疎水クロマトグラフィー後にTOYOPEARL CM-650Mカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーを行っている（図3を参照）。
【００３８】
サイズ排除クロマトグラフィーを行う場合、マンナナーゼの分子量約39,000Da前後のタンパク質を分離できる樹脂を用いることが好ましい。このような樹脂を用いたカラムの例としては、市販のTOYOPEARL HW50 Fカラム（東ソー社製）が挙げられる。
【００３９】
上記の各種クロマトグラフィーを行う場合、マンナナーゼを吸着剤に吸着させた後、適切な溶離液をカラムに加えて、マンナナーゼを吸着剤から溶出させる。吸着剤からの溶出は、溶離液の直線濃度勾配を利用すると、より高純度のマンナナーゼを得ることができる。クロマトグラフィー処理は繰り返し行ってもよい。溶出されたマンナナーゼ含有分画は、一つにまとめて濃縮してもよい。濃縮は、硫安分画、限外濾過又は凍結乾燥等の一般的なタンパク質濃縮方法によって行うことができる。
【００４０】
各種クロマトグラフィーによって精製されたマンナナーゼ含有分画は、強陽イオン交換カラム（例えば、Mono-Sカラム（GEヘルスケア・ジャパン株式会社））を用いて最終精製することが好ましい。下記の実施例では、Mono-Sカラムを用いて最終精製を行っている（図4を参照）。
【００４１】
上記の各種精製方法を組み合わせることにより、純粋なアメフラシ由来マンナナーゼを得ることができる。精製度は、例えばSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）等により確認することができる。実施例では、上記の各種精製方法を組み合わせることにより、純粋なアメフラシ由来マンナナーゼを得ることができた。活性収量は約6.4％であり、精製度は約28倍であった（下記表１を参照）。また、下記の実施例において、精製したアメフラシ由来マンナナーゼは、SDS-PAGE分析により分子量約39,000Daの単一のバンドとして確認されている（図1及び4を参照）。
【００４２】
本発明の製造方法によって得られるアメフラシ由来マンナナーゼは、前述の通り、（a）〜（c）の性質を有する。また、本発明の製造方法によって得られるアメフラシ由来マンナナーゼは、更に以下の（d）〜（h）からなる群より選択される少なくとも1つの性質を有していてもよい。
(d) 分子量：約39,000Daの単一バンド（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
(e) 至適温度：約55℃
(f) 熱安定性：pH 6.0において45℃で20分間の加熱後に75％以上のマンナナーゼ活性が残存する
(g) pH安定性：酸性領域において、マンナナーゼ活性が維持される
(h) 塩濃度変化に対する安定性：0〜0.5 MのNaCl存在下で、80％以上のマンナナーゼ活性が維持される
（a）〜（h）の性質については、上述のとおりである。
【００４３】
本発明のアメフラシ由来マンナナーゼ及び本発明の製造方法によって得られるアメフラシ由来マンナナーゼは、以下の用途に利用できる。
【００４４】
3．アメフラシ由来マンナナーゼの用途
本発明は、アメフラシ由来マンナナーゼとガラクトマンナン又はグルコマンナンとを接触させる工程を含む、ガラクトマンナン又はグルコマンナンの分解方法を提供する。
ここで、前記接触工程は、好ましくは、酸性条件下で行われる。「酸性条件」とは、下限がpH2.0、3.0又は4.0のいずれか一つから選択され、上限が、pH6.0、6.5又は7.0のいずれか一つから選択される、当該下限と上限との任意の組合せによって規定されるpH条件を指し、好ましくは、pH3.0〜7.0、より好ましくは、pH4.0〜6.5、更に好ましくは、pH4.0〜6.0の条件を指す。
本発明のアメフラシ由来マンナナーゼは、酸性〜中性領域において安定して活性を維持し、耐熱性に優れ、かつNaClの影響を殆ど受けないため、種々の条件下でのマンナンの分解に使用することが可能であり、海洋植物の細胞工学又は育種工学用の試薬酵素としての使用されることが期待される。本発明のマンナナーゼは、例えば、海藻のプロトプラスト作出、海藻のマンナンの分解又は海藻由来のマンノオリゴ糖の製造といった海水の混入する条件下での使用に非常に適している。
【００４５】
4．本発明のタンパク質
本発明者らは、本発明のマンナナーゼの全長cDNAを単離することに成功し、該cDNAの配列から本発明のマンナナーゼの遺伝子配列を同定した。また、本発明者らは、前記遺伝子の塩基配列から、本発明のマンナナーゼの推定アミノ酸配列を同定した。
【００４６】
そこで、本発明は、以下の（i）、（ii）又は（iii）のタンパク質（以下において、「本発明のタンパク質」）を提供する。
（i）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ii）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質
（iii）配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質
【００４７】
上記（ii）又は（iii）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の天然に存在する変異体であるが、例えば、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487（1982）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409（1982）"、"Gene, 34, 315 （1985）"、"Nuc.  Acids.  Res., 13, 4431（1985）"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488（1985）"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質に人為的に変異を導入して取得することができるものも含まれる。また、変異は、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（Invitrogen）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：Takara Bio）等を用いて容易に導入することができる。
【００４８】
本明細書中、「配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質」としては、配列番号2のアミノ酸配列において、例えば、1〜100個、1〜90個、1〜80個、1〜70個、1〜60個、1〜50個、1〜40個、1〜39個、1〜38個、1〜37個、1〜36個、1〜35個、1〜34個、1〜33個、1〜32個、1〜31個、1〜30個、1〜29個、1〜28個、1〜27個、1〜26個、1〜25個、1〜24個、1〜23個、1〜22個、1〜21個、1〜20個、1〜19個、1〜18個、1〜17個、1〜16個、1〜15個、1〜14個、1〜13個、1〜12個、1〜11個、1〜10個、1〜9個（1〜数個）、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマンナナーゼ活性かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００４９】
また、このようなタンパク質としては、配列番号2のアミノ酸配列と60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００５０】
本発明において、1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された形態としては、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加が生じていてもよく、欠失、置換及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。また、アミノ酸残基の付加が生じている場合、該アミノ酸残基は、アミノ酸配列中に挿入される態様で付加されていてもよく、あるいはアミノ酸配列のN末端又はC末端に付加されていてもよい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸；C群：アスパラギン、グルタミン；D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2，4−ジアミノブタン酸、2，3−ジアミノプロピオン酸；E群：プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン；F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；G群：フェニルアラニン、チロシン。
【００５１】
本発明のタンパク質は、本発明のマンナナーゼと同様の理化学的性質を有していると考えられる。従って、本発明のタンパク質は、下記の（a）〜（h）からなる群より選択される少なくとも1つの性質を有していてもよい。
(a) 作用：ガラクトマンナン及びグルコマンナンを分解して、還元糖を遊離する
(b) 基質特異性：ロカストビーンガム、タラガム、グアガム及びグルコマンナンを分解する
(c) 至適pH：pH2.0〜7.5（最適pH：pH3.0〜7.0）
(d) 分子量：約39,000Daの単一バンド（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
(e) 至適温度：約55℃
(f) 熱安定性：pH 6.0において45℃で20分間の加熱後に75％以上のマンナナーゼ活性が残存する
(g) pH安定性：酸性領域において、マンナナーゼ活性が維持される
(h) 塩濃度変化に対する安定性：0〜0.5 MのNaCl存在下で、80％以上のマンナナーゼ活性が維持される
これら（a）〜（h）の各性質については、上述のとおりである。
【００５２】
5．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、以下の（i）、（ii）又は（iii）のポリヌクレオチドを提供する。
（i）配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ii）配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（iii）配列番号2に示すアミノ酸配列に対して、60％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００５３】
また、本発明は、以下の（iv）、（v）又は（vi）のポリヌクレオチド。
（iv）配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
（v）配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（vi）配列番号1に示す塩基配列に対して、50％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００５４】
以下において、（i）〜（vi）のいずれかのポリヌクレオチドを「本発明の遺伝子」又は「マンナナーゼ遺伝子」と呼ぶこともある。
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、DNA又はRNAを意味する。
本明細書中、配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook ＆ Russell，  Molecular Cloning： A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"及び"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
【００５５】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃又は5 x SSC、1％ SDS、50 mM Tris−HCl（pH7.5）、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0．5％SDS、50％ホルムアミド、50℃又は0.2 x SSC、0.1％ SDS、65℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５６】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System（GE Healthcare）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1％（w/v）SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。あるいは、配列番号1に示す塩基配列又は配列番号2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、PCRラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（DIG）ラベルした場合には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５７】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド又は配列番号2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと50％以上、51％以上、52％以上、53％以上、54％以上、55％以上、56％以上、57％以上、58％以上、59％以上、60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、又は99.9％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５８】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたblastn、blastx、blastp、tblastnやtblastxと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990）。塩基配列の同一性を測定する場合は、一般的にblastnが用いられ、一方、アミノ酸配列の同一性を測定する場合は、blastpが用いられる。いずれのプログラムを使用する場合であっても、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることで配列間の同一性を求めることができる。
【００５９】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、当業者であれば、配列番号1の配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。例えば、配列番号1の5’末端から10〜30番目の塩基の配列と同一の配列を有するフォワードプライマー及び3’末端から10〜30番目の塩基の配列と相補的な配列を有するリバースプライマーを作製し、これらのプライマーを用いて、アメフラシの組織、好ましくは消化器官組織から調製したcDNAを鋳型としてPCR反応を行うことにより、本発明のポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６０】
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号1の塩基配列に変異が導入されたものであってもよい。変異は、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（Invitrogen）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：Takara Bio）等を用いて配列番号1の塩基配列に導入することができる。
【００６１】
作製したポリヌクレオチド、特にDNAの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００６２】
塩基配列の決定は、プラスミドベクターを用いて作製された形質転換体の場合、宿主が大腸菌（Escherichia coli）であれば試験管等で培養を行い、常法に従ってプラスミドを調製する。得られたプラスミドをそのまま鋳型とするか、あるいは挿入断片を取り出してM13ファージベクター等にサブクローニングした後に、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。ファージベクターで作製された形質転換体の場合も基本的に同様な操作により塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基配列決定までの基本的な実験法については、例えば、T.Maniatisらの”Molecular Cloning, A Laboratory Manual”等に記載されている。
【００６３】
6．組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。
【００６４】
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325,pUC118, pUC119, pUC18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110,pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００６５】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００６６】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００６７】
7．形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはS121等の昆虫細胞が挙げられる。
【００６８】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００６９】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００７１】
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法“Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)”、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００７２】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を用いることができる。
【００７３】
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法“Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)”、スフェロプラスト法“Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)”、酢酸リチウム法“Itoh, H.：J.Bacteriol., 153：163(1983)”等が挙げられる。
【００７４】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００７５】
昆虫細胞を宿主とする場合は、S121細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００７６】
8．本発明のタンパク質の生産
本発明のタンパク質は、本発明のマンナナーゼ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸に前記変異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつマンナナーゼ活性を有するものである。なお、本発明のタンパク質をマンナナーゼタンパク質ともいう。
【００７７】
本発明のマンナナーゼタンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００７８】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。
【００７９】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００８０】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で行う。なお、培地のpHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８１】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、あるいはtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸(IAA)等を培地に添加してもよい。
【００８２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地として、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で1〜30日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００８３】
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりマンナナーゼタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００８４】
あるいは、本発明のタンパク質は、培養細胞を用いずに、無細胞タンパク質合成系によっても作製することができる。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
【００８５】
ここで、上記細胞抽出液は、上記で述べた各種細胞の抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されていないものであってもよい。
【００８６】
細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
【００８７】
無細胞タンパク質合成系において合成された本発明のタンパク質は、細胞培養系で合成された場合と同様の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等で単離精製することができる。
【００８８】
また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００８９】
以下、実施例により本発明の実施方法を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００９０】
アメフラシ個体からのマンナナーゼの抽出及び精製
アメフラシ由来マンナナーゼの精製の概略は図1に示す。アメフラシ（Aplysia kurodai）は函館沿岸にて7〜8月に採取した（平均体長：15cm）。採取したアメフラシを生きたまま実験室に搬入した後に解体し、胃部から駒込ピペットを用いて消化液を吸引回収した。その結果、1個体当り約10 mlの消化液が得られた。マンナナーゼ粗酵素は、10個体分の消化液（合計107 ml）から精製した。最初に、この消化液を硫安分画し、40〜60％飽和で沈殿する画分を遠心分離（10,000 x g, 10 min）で回収した。この沈殿物を約30 mlの30％飽和硫安で溶解した後、10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）を含む40％飽和硫安で平衡化したPhenyl-Toyopearl 650Mカラム（2.5 x 20 cm）を用いて疎水クロマトグラフィー精製した（図2）。非吸着成分を40％飽和硫安で洗浄除去した後、吸着した成分を30％、10％及び0％の飽和硫安によりステップワイズ溶出した。この溶出液を10 mlずつ分取した。ロカストビーンガムを基質として溶出画分のマンナナーゼ活性を測定したところ、フラクション番号78〜81で酵素活性が検出された。そこで、これら4つの画分を一つにまとめ、60％飽和硫安により沈殿させ、遠心分離で回収した。得られた沈殿物を10 mlの10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）に溶解し、同溶液に対して透析した。この透析物を10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）で平衡化したCM-Toyopearl 650Mカラム（2.2 x 20 cm）を用いてイオン交換クロマトグラフィー精製した（図3）。非吸着成分を10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）で洗浄した後、吸着した成分を0〜0.3 M NaClの直線濃度勾配により溶出した。溶出液は5 mlずつ分取した。各画分についてマンナナーゼ活性を測定した結果、活性はフラクション番号74〜78付近で検出された。そこで、これら5つの画分を一つにまとめて限外濾過で 5 mlに濃縮した後、10 mM リン酸ナトリウム（pH 7.0）に対して透析した。この透析物をSDS-PAGEで分析したところ、主成分は分子量約39,000Daのタンパク質であったが、80,000Da又はそれ以上の分子量を有する混入物が微小量認められた。そこで、それらの混入物を除去するために、Mono-Sカラムクロマトグラフィー精製を行った（図4）。吸着したタンパク質を0〜0.5 M NaClの直線濃度勾配により溶出した結果、マンナナーゼはフラクション番号19〜20に溶出していた。これらの画分をSDS-PAGEで分析したところ、分子量39,000Daの単一のバンドが確認された。以上の精製操作により、約5 mgの精製マンナナーゼ酵素が得られ、活性収量は約6.4％、精製度は約28倍であることが分かった（表1）。本実施例で精製したマンナナーゼは、アメフラシの学名と酵素作用（マンナン分解）に基づき、AkMan（Aplysia kurodai, Mannanase）と名付けた。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
基質特異性試験
精製したアメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）の基質特異性について、ガラクトマンナン（ロカストビーンガム、タラガム、グアガム）、グルコマンナン（コンニャクマンナン）、アガー、キシラン、デキストラン、カルボキシメチルセルロースを基質として検討した（図5）。活性は、10 mM リン酸ナトリウム（pH 6.0）と0.2％の基質存在下で、30℃にて測定した。その結果、AkManはガラクトマンナンとグルコマンナンに対して顕著な活性を示したが、その他の基質には活性を示さないことが明らかとなった。また、マンナンの間での活性の高さは以下の順であった：ロカストビーンガム＞タラガム＞グルコマンナン＞グアガム（図5）。
【００９３】
マンナン分解物の分析
ロカストビーンガム、タラガム、グアガム、及びグルコマンナンをAkManによって分解し、生じたマンノオリゴ糖を薄層クロマトグラフィーにより分析した。分解反応は30℃で行い、薄層クロマトグラフィーはTLC60プレートを用いて行った。展開溶媒は、酢酸エチル：酢酸：水（2:2:1(v:v:v)）を用い、プレート上の糖質はエタノール-硫酸を噴霧後、120℃で加熱することにより検出した。その結果、ロカストビーンガムからは3糖を主体とする2〜5糖程度のオリゴ糖が生じた（図6）。また、タラガムからは4糖を主体とする2〜5糖のオリゴ糖が生じた（図6）。一方、グアガムからは5糖以下のオリゴ糖が殆ど検出されなかったため、6糖以上のオリゴ糖が生じていることが推定される（図6）。一方、グルコマンナンからは多種類のオリゴ糖が生じたが、これらのオリゴ糖は、標準マンノオリゴ糖とは異なる移動度を示した。グルコマンナンから生じたオリゴ糖は、グルコースとマンノースが様々な量比で結合したオリゴ糖であると考えられる。これらの結果より、AkManは基質の種類及び構造の違いに応じて、サイズ及び構造の異なる種々のオリゴ糖を生成させることが分かる。
【００９４】
粘性試験
精製したアメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）による各種マンナンの分解に伴うマンナン溶液の粘性低下について検討した。マンナンの濃度は0.5％とし、粘度測定にはオストワルド型粘度計（溶媒の流下時間32秒）を用いた。反応は30℃で行った。図7に示すように、マンナン溶液の粘性はいずれのマンナンにおいても反応初期に急激に低下し、その後は穏やかに低下した。これらの結果は、AkManがエンド型の作用様式でマンナンを切断したことを示している。なお、粘度低下の速度はロカストビーンガム＞タラガム＞グルコマンナン＞グアガムの順であり、これはAkManの基質好適性の序列（図5参照）と一致する。
【００９５】
pH依存性試験
ロカストビーンガムを基質として用いてAkManのpH依存性を30℃で測定した。その結果、AkManはpH 6〜7付近に最大活性を示しpH4〜7においても最大活性の90％程度の活性を示した（図8）。この結果は、AkManが酸性域で高活性を示す酵素であることを示している。このように広い酸性pH域で高活性を示すことは、アメフラシ由来マンナナーゼの大きな特徴の一つである。
【００９６】
温度依存性試験
ロカストビーンガムを基質として用いてAkManの温度依存性をpH 6.0で測定した。その結果、AkMan は、55℃付近で最大活性を示すことが明らかになった（図9）。アワビ由来マンナナーゼの至適温度が45℃であるのに対し（特許文献1）、アメフラシ由来マンナナーゼの至適温度は、これを10℃近く上回ることが判明した。
【００９７】
耐熱性試験
AkManの耐熱性を検討した。すなわち、AkManをpH 7.0において種々の温度で20分間加熱した後に0℃に冷却した。冷却後、この酵素試料の残存活性を10 mM リン酸ナトリウム（pH 6.0）緩衝液中で30℃にて測定した。結果を図10に示す。アメフラシ由来マンナナーゼは、40℃までの加熱では殆ど活性が低下せず、45℃での過熱後でも約75％の残存活性を示し、52℃での過熱後でも約50％の残存活性を示した。アワビ由来マンナナーゼが50％の残存活性を示す温度は40℃であるのに対し（特許文献1）、アメフラシ由来マンナナーゼが50％の残存活性を示した温度は52℃であり、アワビ由来マンナナーゼより12℃も高い。従って、本実験結果から、アメフラシ由来マンナナーゼが非常に耐熱性に優れることが判明した。
【００９８】
塩濃度依存性試験
AkManの活性に及ぼすNaCl濃度の影響を検討した。その結果、AkMan は、0〜0.5 MのNaCl濃度の範囲で最大活性（NaCl：0.25 M）の80％以上の活性値を示した（図11）。従って、AkManは広範囲なNaCl濃度で安定に高活性を示すことが明らかになった。
【００９９】
N末端アミノ酸配列同定
AkManのN末端40残基のアミノ酸配列を、アワビ由来マンナナーゼ（HdMan）の対応するN末端アミノ酸配列と比較した（図12）。その結果、AkManとHdManのN末端部分のアミノ酸配列は、当該領域において55％の同一性を有することが判明した。この結果はアメフラシ由来マンナナーゼとアワビ由来マンナナーゼが、類縁ではあるが明らかに異なる一次構造を有する酵素であることを示している。
【実施例２】
【０１００】
アメフラシ由来マンナナーゼcDNAのクローニングと全アミノ酸配列の解析
本実施例では、実施例1で完全精製した分子量サイズ39 kDaのアメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）をコードするcDNAを、PCR法及びRACE法により取得し、そのcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。
【０１０１】
（1）アメフラシ肝膵臓cDNAライブラリーの作成
アメフラシ肝膵臓1 gからグアニジンチオシアン酸-フェノール法により、全RNAを抽出した。このRNA約300 μgからOligo-Tex dT (30)（TaKaRa社製）を用いたバッチ法により、約2 μgのmRNAを得た。このmRNA約0．5 μgを用いて、TaKaRa cDNA Synthesis Kit （TaKaRa社製）によりアメフラシ肝膵臓cDNAライブラリーを作製し、PCRのテンプレートとした。一方、残りのmRNAは、5´-及び3´-RACE反応に用いた。
【０１０２】
（2）cDNAの取得、及び、塩基配列並びにアミノ酸配列の解析
第1回目のPCR
AkManのN末端アミノ酸配列（配列番号5）に基づき、PCR用の縮重フォワードプライマAkManFw-2（配列番号6）を作製した。一方、リヴァースプライマー合成のために、リジルエンドペプチダーゼによる消化断片の内部ペプチドのアミノ酸配列を決定した。アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）をリジルエンドペプチダーゼにより消化すると、識別可能な4断片が得られた。得られた各断片のN末端アミノ酸配列を決定したところ配列番号7から10に示される配列を得た。そのうちの一つのアミノ酸配列（配列番号9）から縮重リバースプライマーAkManRV（配列番号11）を作製した。AkManFw-2とAkManRVとをプライマーとして、（1）にて作成したアメフラシ肝膵臓cDNAライブラリーをテンプレートとしてPCRを行い、約620 bpのcDNA（cDNA-1）を得た。このcDNA（cDNA-1）をPCR-TOPO2．1システム（Invitrogen社製）でクローン化し、DNAシーケンサー（ABI 310、パーキンエルマー-ABI社製）で塩基配列を分析した。その結果、cDNA-1は、配列番号12に示される配列を有する620 bpの塩基配列ことが明らかとなった。
【０１０３】
（3）3´-RACE-PCR
cDNA-1の塩基配列より、アメフラシ由来マンナナーゼの部分配列が明らかとなったが、C末端領域の配列及びN末端近傍やシグナルペプチドなどの配列は不明であった。そこで、まず、C末端領域のアミノ酸配列をコードするcDNAを得るために、TaKaRa 3´-Full RACE Core Set（TaKaRa社製）により、3´-RACE-PCRを行った。その際、フォワードプライマーとしてcDNA-1の3´末端領域と同一の配列を持つ特異プライマーAkMan(3)Fw（配列番号13）を用い、リヴァースプライマーとしてはキット付属の3 ´sites Adapto primer （配列番号14）を用いた。このPCRにより増幅されたcDNA（cDNA-3RACE）を第1回目のPCRと同様の条件でクローン化し、塩基配列を分析した結果、cDNA-3RACEは、配列番号15に示される配列を有する677bpのポリヌクレオチドであることが明らかとなった。
【０１０４】
（4）5´-RACE-PCR
さらに、cDNA-1にコードされるアメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）のN末端近傍やシグナルペプチドなどの配列情報を得るために、5´-RACE-PCRにより、cDNAの5´末端領域の塩基配列を解析した。なお、5´-RACEは、TaKaRa 5´-Full RACE Core Set（TaKaRa社製）を用いて行い、5‘リン酸化されたAkMan(5)RT-Rv（配列番号16）をプライマーとして逆転写反応を行い、アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）のN末端近傍やシグナルペプチドなどの上流領域を含む1stストランドcDNAを調製した。さらにキットのプロトコルに従い、RNaseH処理、RNAリガーゼによる一本鎖コンテカマー化を行った。得られたコンテカマーをテンプレートとして、AkMan(5)Fw-2（配列番号17）及びAkMan(5)Rv-2（配列番号18）をプライマーとしてPCRを行った。さらに得られたPCR産物をテンプレートとして、AkMan(5)Fw-1（配列番号19）及びAkMan(5)Rv-1（配列番号20）をプライマーとしてPCRを行い、アメフラシ由来マンナナーゼ（AkMan）のN末端近傍やシグナルペプチドなどの上流領域を含む未知配列333 bp（cDNA-5RACE）（配列番号21）を得た。
【０１０５】
以上、PCR法とRACE法によりアメフラシ由来マンナナーゼをコードするcDNAを取得し、合計1,368 bpの塩基配列を決定した。本実施例で同定されたアメフラシ由来マンナナーゼのCDSの塩基配列、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列、完全長cDNAの塩基配列及び成熟マンナナーゼのアミノ酸配列、は、それぞれ配列表の配列番号1、2、3及び4に示す通りである。アメフラシ由来マンナナーゼの完全長cDNAは、下記のプライマーを用いて増幅することができる。
AkManFull5F  : 5’-ACTACGACGCGGTCCTACTC-3’ （配列番号22）
AkManFull3R  : 5’-CGGGACTCTATATGTCTTGCC-3’ （配列番号23）
【０１０６】
アメフラシ由来マンナナーゼをコードするcDNAの構造模式図を図13に示す。図13に示すように、アメフラシ由来マンナナーゼをコードするcDNAのうち、Open Reading Frame(ORF)領域は1,110 bpであった。このORF領域には、開始コドンに相当するメチオニン（Met）、18残基からなるシグナルペプチド、成熟型酵素部分の350残基部分及び停止コドンからなるアミノ酸配列が含まれていた。なお、アミノ酸配列から計算される分子量は39,962であり、SDS-PAGEによって見積もられた分子量約39,000とほぼ一致する。
【０１０７】
これらの塩基配列及びその推定アミノ酸配列は、DDBJをはじめとするDNAデータベースには登録されておらず、新規配列であることが確認された。なお、アメフラシ由来マンナナーゼcDNAの塩基配列及び翻訳アミノ酸配列、即ち、アメフラシ由来マンナナーゼの一次構造は、ヨーロッパイガイ （Mytilus edulis）、エゾアワビ （Haliotis discus hannai）のものと、それぞれ47％、53％の相同性を示すことから、本酵素はglycosil hydrolase family 5 に分類されることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明により、酸性〜中性条件で安定であり、熱耐性に優れ、塩濃度の変化に対して安定なアメフラシ由来マンナナーゼが提供される。また、本発明のマンナナーゼを用いることにより、酸性〜中性領域におけるpH変化や塩濃度の変化等を伴う多様な条件下で効果的にマンナンを分解し、マンナン分解物を得ることが可能である。また、本発明により、酸性〜中性条件で安定であり、熱耐性に優れ、塩濃度の変化に対して安定なアメフラシ由来マンナナーゼの製造方法が提供される。さらに、本発明により、アメフラシ由来マンナナーゼ活性を用いたマンナンの分解方法が提供される。また、本発明の遺伝子を用いることにより、容易に本発明のマンナナーゼを作製することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０９】
配列番号6: 合成DNA
配列番号11: 合成DNA
配列番号13: 合成DNA
配列番号14: 合成DNA
配列番号16: 合成DNA
配列番号17: 合成DNA
配列番号18: 合成DNA
配列番号19: 合成DNA
配列番号20: 合成DNA
配列番号22: 合成DNA
配列番号23: 合成DNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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