(57)【要約】【課題】  水系媒体中へのカーボンナノチューブの効果的な分散方法、および分散させたカーボンナノチューブをタンパク質から分離して精製する方法を提供すること。【解決手段】  本発明の水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法は、タンパク質とカオトロープの存在下でカーボンナノチューブを分散させることを特徴とするものである。本発明によれば、タンパク質を用いた水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法において、カーボンナノチューブの分散量を容易に高めることができる。さらにカオトロープを添加すると、カーボンナノチューブに吸着していたタンパク質が変性を起こすことによって両者が解離し、カーボンナノチューブは沈殿するので、水系溶液中のタンパク質と分離することができる。従って、この現象を利用すれば、カーボンナノチューブ分散水系溶液からカーボンナノチューブを精製することができる。【選択図】  図１
2011116624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法であって、タンパク質とカオトロープの存在下でカーボンナノチューブを分散させることを特徴とする方法。
【請求項２】
タンパク質の濃度を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬとすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
カオトロープがグアニジン（塩の形態であってもよい）であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
カオトロープが尿素（塩の形態であってもよい）であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
カーボンナノチューブ分散水系溶液の製造方法であって、水系媒体中においてタンパク質とカオトロープの存在下でカーボンナノチューブを分散させることを特徴とする方法。
【請求項６】
水系媒体中にカーボンナノチューブとともにタンパク質とカオトロープを含んでなることを特徴とするカーボンナノチューブ分散水系溶液。
【請求項７】
水系媒体中にカーボンナノチューブとともにタンパク質とカオトロープを含んでなるカーボンナノチューブ分散水系溶液からカーボンナノチューブを精製する方法であって、カーボンナノチューブ分散水系溶液にカオトロープをさらに添加することで、カーボンナノチューブを沈殿させてタンパク質と分離することによることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水系媒体中へのカーボンナノチューブの効果的な分散方法、および分散させたカーボンナノチューブの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カーボンナノチューブは１９９１年の発見以来、機械的特性、熱特性、電気的特性などの点において非常に注目されてきた。しかしながら、カーボンナノチューブは水系媒体中に分散させようとしても凝集することがその応用への障壁となっていた。カーボンナノチューブの凝集の主因は、カーボンナノチューブ間の非共有結合であり、具体的にはファンデルワールス力、π−πスタッキング、疎水性相互作用などが挙げられる。カーボンナノチューブの特性は凝集することで著しく低下する。そのため、カーボンナノチューブを水系溶媒中に分散させる方法がこれまでにも各種提案されてきた。そのひとつとして、共有結合を利用してカーボンナノチューブを化学修飾する方法がある。しかしながら、共有結合を利用したカーボンナノチューブの化学修飾は、その特性を劣化させる原因になる。従って、水系媒体中にカーボンナノチューブを分散させる際には、共有結合を利用しない方法で行うことが望ましい。このような方法の代表例として、界面活性剤の存在下でカーボンナノチューブを分散させる方法が知られている。
【０００３】
近年、バイオマテリアルやドラッグデリバリーシステムなどにおけるカーボンナノチューブの利用が注目されてきており、このような分野での利用に向けて、水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法として、生体分子を用いた方法が着目され、特許文献１では生体分子として卵白タンパク質を用いる方法が提案されている。このようなタンパク質を用いた方法は、バイオセンサーなどのバイオマテリアルにカーボンナノチューブを利用する際に有効であることが期待される。しかしながら、カーボンナノチューブ間の相互作用は強く、そのためタンパク質を用いただけでは、当該相互作用を十分に弱めることができず、その結果として、水系媒体中に分散させることができるカーボンナノチューブの量には限界がある。従って、タンパク質を用いた水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法において、カーボンナノチューブの分散量を高める方法が求められているが、未だ有効な方法が提案されるには至っていない。加えて、カーボンナノチューブの利用態様を考えると、水系媒体中に分散させたカーボンナノチューブをタンパク質から分離して精製する必要がある場合も想定されるが、こうしたカーボンナノチューブを精製する方法もまた、未だ提案されるには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１６１５７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、タンパク質を用いた水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法において、カーボンナノチューブの分散量を高める方法、および分散させたカーボンナノチューブをタンパク質から分離して精製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、タンパク質を用いて水系媒体中にカーボンナノチューブを分散させる際、系中にカオトロープを存在させることで、カーボンナノチューブの分散量を容易に高めることができること、さらにカオトロープを添加すると、カーボンナノチューブに吸着していたタンパク質が変性を起こすことによって両者が解離し、カーボンナノチューブは沈殿するので、水系溶液中のタンパク質と分離することができることを知見した。
【０００７】
上記の知見に基づいてなされた本発明の水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法は、請求項１記載の通り、タンパク質とカオトロープの存在下でカーボンナノチューブを分散させることを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、タンパク質の濃度を０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬとすることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、カオトロープがグアニジン（塩の形態であってもよい）であることを特徴とする。
また、請求項４記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、カオトロープが尿素（塩の形態であってもよい）であることを特徴とする。
また、本発明のカーボンナノチューブ分散水系溶液の製造方法は、請求項５記載の通り、水系媒体中においてタンパク質とカオトロープの存在下でカーボンナノチューブを分散させることを特徴とする。
また、本発明のカーボンナノチューブ分散水系溶液は、請求項６記載の通り、水系媒体中にカーボンナノチューブとともにタンパク質とカオトロープを含んでなることを特徴とする。
また、本発明の水系媒体中にカーボンナノチューブとともにタンパク質とカオトロープを含んでなるカーボンナノチューブ分散水系溶液からカーボンナノチューブを精製する方法は、請求項７記載の通り、カーボンナノチューブ分散水系溶液にカオトロープをさらに添加することで、カーボンナノチューブを沈殿させてタンパク質と分離することによることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、水系媒体中へのカーボンナノチューブの効果的な分散方法、および分散させたカーボンナノチューブの精製方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例の実験１における（Ａ）は各種濃度のグアニジンと卵白リゾチーム存在下でのカーボンナノチューブ分散液（上澄み液）の吸収スペクトルチャート、（Ｂ）は別途の実験による各種濃度のグアニジン存在下での卵白リゾチーム水溶液（濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルチャート、（Ｃ）はカーボンナノチューブの分散量の指標となる上澄み液の６００ｎｍの吸光度と卵白リゾチームの変性の程度を反映する２３０ｎｍのＣＤ値を示すグラフ（卵白リゾチームを用いて分散させたカーボンナノチューブに対するグアニジンの分散向上効果を示す）である。
【図２】同、６．３Ｍのグアニジンによるカーボンナノチューブからの卵白リゾチームの分離効果を示す蛍光スペクトルチャートである。
【図３】同、Ａ，Ｂはグアニジンを終濃度が６Ｍとなるように添加することによって得たカーボンナノチューブの沈殿物の電子顕微鏡写真、Ｃ，ＤはＮａＣｌを終濃度が０．５Ｍとなるように添加することによって得たカーボンナノチューブの沈殿物の電子顕微鏡写真、Ｅ，Ｆはカーボンナノチューブを沈殿させるためのグアニジンまたはＮａＣｌを添加する前のカーボンナノチューブを分散させた上澄み液の電子顕微鏡写真である。
【図４】実施例の実験２における、（Ａ）はタンパク質としてペプシンを用いて実験１と同様の実験を行って得たカーボンナノチューブを分散させた上澄み液の６００ｎｍの吸光度と２３０ｎｍのＣＤ値を示すグラフ、（Ｂ）はタンパク質としてヘモグロビンを用いて実験１と同様の実験を行って得たカーボンナノチューブを分散させた上澄み液の６００ｎｍの吸光度と２３０ｎｍのＣＤ値を示すグラフである。
【図５】実施例の実験３における、カーボンナノチューブを分散させた上澄み液の６００ｎｍの吸光度を示すグラフである（卵白リゾチームを用いて分散させたカーボンナノチューブに対する尿素の分散向上効果を示す）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散方法は、タンパク質とカオトロープの存在下でカーボンナノチューブを分散させることを特徴とするものである。
【００１１】
本発明の適用対象となるカーボンナノチューブは、主に炭素原子で構成される中空部材として当業者に認識されているものであればどのようなものであってもよく、具体的には単層カーボンナノチューブ（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ：ＳＷＮＴｓ）や多層カーボンナノチューブ（Ｍｕｌｔｉ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｕｂｅｓ：ＭＷＮＴｓ）などが挙げられる。
【００１２】
本発明において用いることができるタンパク質としては、特許文献１に記載の卵白タンパク質（卵白リゾチーム）の他、例えばNepal et al. Small 2007 3: 1259-1265に記載のヒストン、ヘモグロビン、ミオグロビン、オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、トリプシン、グルコースオキシダーゼや、ペプシンなどが挙げられる。タンパク質は単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。系中におけるタンパク質の濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬが望ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬがより望ましい。濃度が低すぎるとカーボンナノチューブの分散量が少なくなってしまうといった恐れがある一方、濃度が高すぎると共存するカオトロープによってその一部または全部が変性したり沈殿したりしてしまうといった恐れがある。
【００１３】
本発明において用いることができるカオトロープは、分子間の疎水性相互作用を弱める働きを有する物質として当業者に公知の物質であれば特段制限されるものではなく、例えば、グアニジンや尿素などが挙げられる。これらは塩酸塩、チオシアン酸塩、ヨウ化物塩、過塩素酸塩などの塩の形態であってもよい。カオトロープは単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散量を効果的に高めるためには、系中におけるカオトロープの濃度は、概ね１Ｍ〜８Ｍが望ましく、２Ｍ〜５Ｍがより望ましい。タンパク質を用いた水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散は、カーボンナノチューブに吸着されるタンパク質の表面電荷による静電反発作用を利用したものであるので、カオトロープを添加するとその静電遮蔽効果によってカーボンナノチューブの分散性は低下すると予測されるにもかかわらず、逆に上昇することは意外な現象といえる。
【００１４】
本発明における水系媒体中へのカーボンナノチューブの分散は、例えば水系媒体中にタンパク質とカオトロープを存在せしめた後、過剰量のカーボンナノチューブを添加し、５℃〜３５℃で１分間〜１時間超音波処理することで行うことができる。この際、必要に応じて、水系媒体のｐＨを、系中に存在せしめるタンパク質の等電点（ｐＩ）から少なくとも３以上離れるように酸またはアルカリを用いて調整することが望ましい。タンパク質の等電点付近のｐＨでは、タンパク質の表面電荷が小さいため、カーボンナノチューブの分散作用が低いからである。超音波処理を行った後、遠心分離を行えば、カーボンナノチューブ分散水系溶液をその上澄み液として得ることができる。こうして得られたカーボンナノチューブ分散水系溶液は、タンパク質と高度に分散したカーボンナノチューブを多量に含む複合材料として、バイオマテリアルやドラッグデリバリーシステムなどの分野において利用することができる。
【００１５】
なお、本発明において、水系媒体とは、５０重量％〜１００重量％の水と０重量％〜５０重量％の水溶性有機溶媒とからなる媒体を意味する。水溶性有機溶媒としては、メタノールやエタノールなどのアルコールの他、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなどが挙げられる。必要に応じて、水系媒体には緩衝剤や防腐剤などの添加剤が含まれていてもよい。
【００１６】
以上のようにしてカーボンナノチューブを分散させた水系溶液にカオトロープをさらに添加すると、カーボンナノチューブに吸着していたタンパク質が変性を起こすことによって両者が解離し、カーボンナノチューブは沈殿するので、水系溶液中のタンパク質と分離することができる（例えば分離手段として遠心分離を用いることで効率的に分離することができる）。従って、この現象を利用すれば、カーボンナノチューブをタンパク質の非存在下で利用したい場合などのために、カーボンナノチューブ分散水系溶液からカーボンナノチューブを精製することができる。また、この現象は、バイオマテリアルやドラッグデリバリーシステムなどの分野におけるカーボンナノチューブの回収や再利用の場面などにおいても利用することができる。なお、カオトロープはタンパク質と異なってカーボンナノチューブに吸着されないため、タンパク質から分離したカーボンナノチューブと共存するカオトロープは、カーボンナノチューブを例えば水洗することで容易に除去することができる。水系溶液中のカーボンナノチューブをタンパク質と分離するために必要なカオトロープの添加量は、カオトロープの種類によっても異なるが、水系溶液中のその濃度が、カーボンナノチューブを分散させるために用いたタンパク質を変性させる濃度以上となる量とすることが望ましい。例えば、カオトロープとしてグアニジンを用いた場合、水系溶液中のその濃度を６Ｍ以上とすることが望ましい。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１８】
実験１：カオトロープとしてグアニジンを用いた場合の効果（その１）
（実験方法）
５０ｍＭのクエン酸・リン酸緩衝液、０Ｍ〜６．３Ｍのグアニジン（塩酸塩）、１．０ｍｇ／ｍＬの卵白リゾチーム（ニワトリ由来、ｐＩは約１１）を含有する１０ｍＬの溶液（ｐＨ３．４）に、十分量の単層カーボンナノチューブ（Unidym社製）を添加し、ボルテックスミキサー（Vortex Genie 2, Scientific incustries社製）で攪拌した後、２０℃で１５分間超音波処理を行った（装置：UT-250S, Sharp社製）。その後、再び溶液をボルテックスミキサーで攪拌した後、再度、２０℃で１５分間超音波処理を行った。こうして得たカーボンナノチューブ含有溶液を室温で１時間放置した後、２５℃で３０分間遠心分離（４０，０００ｇ）を行い（装置：SRX-201, TOMY社製）、その上澄み液のＶｉｓ−ＮＩＲ吸収スペクトルを測定することで（装置：UV-3150, SHIMADZU社製）、上澄み液中のカーボンナノチューブの分散量を評価した。
（実験結果）
各種濃度のグアニジンと卵白リゾチーム存在下でのカーボンナノチューブ分散液（上澄み液）の吸収スペクトルを図１（Ａ）に示す。また、別途の実験による各種濃度のグアニジン存在下での卵白リゾチーム水溶液（濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを図１（Ｂ）に示す。さらに、カーボンナノチューブの分散量の指標となる上澄み液の６００ｎｍの吸光度と卵白リゾチームの変性の程度を反映する２３０ｎｍのＣＤ値を図１（Ｃ）に示す（●で結ばれる実線が吸光度を示し○で結ばれる実線がＣＤ値を示す）。図１（Ａ）〜（Ｃ）から明らかなように、グアニジンの濃度が２Ｍ〜５Ｍの場合、卵白リゾチームによるカーボンナノチューブの分散量を大いに高めることができた。とりわけグアニジンの濃度が３Ｍ程度の場合にその分散向上効果が顕著であり、グアニジンを添加しない場合に比較してカーボンナノチューブの分散性が１０倍程度にまで上昇した。その後、カーボンナノチューブの分散量は、グアニジンの濃度が高くなることによって卵白リゾチームの変性の程度が大きくなる（ＣＤ値が上昇する）につれて低下し、グアニジンの濃度が６Ｍを超えるとカーボンナノチューブの沈殿が認められた。なお、グアニジンの濃度がいずれの場合においても、卵白リゾチームの沈殿は認められなかった。また、グアニジン自体にはカーボンナノチューブに対する分散効果は認められなかった（卵白リゾチームの非存在下で行った別途の実験による）。
【００１９】
グアニジンの濃度を６Ｍにした場合のカーボンナノチューブに対する分散向上効果の喪失現象の検討を以下の方法によって行った。グアニジンの濃度を２Ｍにして上記の方法と同様の方法でカーボンナノチューブ含有溶液を得た。次に、溶液中に含まれるカーボンナノチューブに吸着されていない遊離の卵白リゾチーム、グアニジン、緩衝成分（クエン酸、リン酸）を透析膜（MWCO 10,000, Spectra/Por, Spectrum Labs社製）を用いて除去した後、２５℃で２０分間遠心分離（１６，８００ｇ）を行い（装置：himac CF 15RX, Hitachi Koki社製、以下同じ）、カーボンナノチューブを分散させた上澄み液を得た。この上澄み液を攪拌しながらグアニジンを終濃度が６Ｍとなるように添加すると、直ちにカーボンナノチューブが沈殿した。再度、２５℃で２０分間遠心分離（１６，８００ｇ）を行った後、上澄み液中の卵白リゾチーム含量をフルオレスカミンによる蛍光強度から見積もった。その結果を、グアニジンのかわりにＮａＣｌを終濃度が０．５Ｍとなるように添加してカーボンナノチューブを沈殿させた場合の結果とあわせて図２に示す（図２において実線１はカーボンナノチューブを沈殿させるためのグアニジンまたはＮａＣｌを添加する前のカーボンナノチューブを分散させた上澄み液の蛍光スペクトルを示し、破線２はグアニジンを添加した後の上澄み液の蛍光スペクトルを示し、点線３はＮａＣｌを添加した後の上澄み液の蛍光スペクトルを示す）。図２から明らかなように、ＮａＣｌを添加した後の上澄み液中の卵白リゾチーム含量は、添加前に比較して大幅に減少しており、卵白リゾチームがカーボンナノチューブとともに沈殿したことがわかった。これに対し、グアニジンを添加した後の上澄み液中の卵白リゾチーム含量は、添加前と差異はなく、卵白リゾチームはカーボンナノチューブとともに沈殿せずに上澄み液中に留まり、カーボンナノチューブから分離されたことがわかった。グアニジンを終濃度が６Ｍとなるように添加することによって得たカーボンナノチューブの沈殿物の電子顕微鏡写真を図３のＡ，Ｂに、ＮａＣｌを終濃度が０．５Ｍとなるように添加することによって得たカーボンナノチューブの沈殿物の電子顕微鏡写真を図３のＣ，Ｄに、カーボンナノチューブを沈殿させるためのグアニジンまたはＮａＣｌを添加する前のカーボンナノチューブを分散させた上澄み液の電子顕微鏡写真を図３のＥ，Ｆにそれぞれ示す（スケールバーはＡ，Ｃ，Ｅが１００ｎｍでＢ，Ｄ，Ｆが１０ｎｍ）。図３から明らかなように、グアニジンを終濃度が６Ｍとなるように添加することによって得たカーボンナノチューブの沈殿物は、カーボンナノチューブが卵白リゾチームから分離され、カーボンナノチューブの束状の凝集体が観察された（Ａ，Ｂ）。これに対し、ＮａＣｌを終濃度が０．５Ｍとなるように添加することによって得たカーボンナノチューブの沈殿物は、カーボンナノチューブを沈殿させるためのグアニジンまたはＮａＣｌを添加する前のカーボンナノチューブを分散させた上澄み液と同様に、カーボンナノチューブに卵白リゾチームが吸着している様子が観察された（Ｃ，Ｄ対Ｅ，Ｆ：Ｄ，Ｆにおいて黒線でなぞったものが主要なカーボンナノチューブであってその周辺に張り付いているものが卵白リゾチーム）。
【００２０】
実験２：カオトロープとしてグアニジンを用いた場合の効果（その２）
卵白リゾチームのかわりにペプシンを用いて実験１と同様の実験を行って得たカーボンナノチューブを分散させた上澄み液の６００ｎｍの吸光度と２３０ｎｍのＣＤ値を図４（Ａ）に、卵白リゾチームのかわりにヘモグロビンを用いて実験１と同様の実験を行って得たカーボンナノチューブを分散させた上澄み液の６００ｎｍの吸光度と２３０ｎｍのＣＤ値を図４（Ｂ）にそれぞれ示す。図４（Ａ）（Ｂ）から明らかなように、タンパク質としてペプシンやヘモグロビンを用いた場合でも、グアニジンを添加することでカーボンナノチューブの分散向上効果が認められ、さらに添加することでカーボンナノチューブとペプシンまたはヘモグロビンが解離し、カーボンナノチューブが沈殿することがわかった。
【００２１】
実験３：カオトロープとして尿素を用いた場合の効果
グアニジンのかわりに尿素を用いて実験１と同様の実験を行い、上澄み液中のカーボンナノチューブの分散量を評価した。上澄み液の６００ｎｍの吸光度を図５に示す。図５から明らかなように、尿素を用いた場合もグアニジンを用いた場合と同様に卵白リゾチームによるカーボンナノチューブの分散量を大いに高めることができた。しかしながら、尿素を用いた場合、グアニジンを用いた場合と異なり、その濃度が５Ｍを超えてもなおカーボンナノチューブに対する分散向上効果を発揮した。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明は、水系媒体中へのカーボンナノチューブの効果的な分散方法、および分散させたカーボンナノチューブをタンパク質から分離して精製する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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