(57)【要約】【課題】マイクロ電気泳動チップで分離したタンパク質を多孔質膜に転写し、検出されたタンパク質のチップ上での位置を正確かつ簡便に測定するチップを提供する。【解決手段】マイクロ電気泳動チップ１００は、基板１０７（ガラス基板）と基板１０７上に設けられている検体試料用の流路１０２（微細流路）とを備え、流路１０２の両端部の位置を示すマーカー用の凹部（第１のマーカー保持部１３０および第２のマーカー保持部１３２）が、流路１０２と離間して基板１０７に設けられている。【選択図】図２
2011039002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と前記基板上に設けられている検体試料用の流路とを備え、
前記流路の両端部の位置を示すマーカー物質保持用の凹部が、前記流路と離間して前記基板に設けられている、マイクロ電気泳動チップ。
【請求項２】
前記流路を挟んで対向するように、一対の前記凹部が設けられている、請求項１に記載のマイクロ電気泳動チップ。
【請求項３】
前記凹部が、前記流路の延在方向に設けられている、請求項１または２に記載のマイクロ電気泳動チップ。
【請求項４】
前記凹部の内部が、親水性である、請求項１から３のいずれかに記載のマイクロ電気泳動チップ。
【請求項５】
前記凹部近傍の前記基板表面が、疎水性である、請求項１から４のいずれかに記載のマイクロ電気泳動チップ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のマイクロ電気泳動チップを用い、
前記流路の両端間に電圧を印加して、前記流路中の前記検体試料を分離する工程と、
前記凹部にマーカー物質を導入する工程と、
前記基板表面に転写用部材を接触させて、前記流路中の前記検体試料および前記凹部中の前記マーカー物質を前記転写用部材に転写する工程と、
前記転写用部材に転写された前記検体試料を検出する工程と、を含み、
前記検体試料を検出する工程において、前記流路の両端部の位置を示す前記マーカー物質の位置を基準として、前記転写用部材上の前記検体試料の位置データと前記検体試料の検出データとを対応づけることにより、前記検体試料を分析する、分析方法。
【請求項７】
前記検体試料の前記位置データと複数種類の前記検出データとを統合して、前記検体試料を分析する、請求項６に記載の分析方法。
【請求項８】
前記検出する工程が、抗体を用いた免疫学的方法により、前記検体試料を検出する工程である、請求項６または７に記載の分析方法。
【請求項９】
前記検出する工程が、質量分析方法により、前記検体試料を検出する工程である、請求項６または７に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記検出する工程が、前記検体試料固有の活性を検出する、請求項６または７に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記検出する工程は、前記マーカー物質の位置を検出する工程と同時に行う、請求項６から１０のいずれかに記載の分析方法。
【請求項１２】
前記マーカー物質の位置を検出する工程において、検出された前記マーカー物質の位置に基づいて、前記転写用部材上で前記検体試料の前記流路中の位置を決定する、請求項１１に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記マーカー物質が、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、蛍光物質、燐光物質、クマシーブルー、およびアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、蛍光物質、燐光物質若しくはクマシーブルーで標識または染色されたタンパク質からなる群から選択される少なくとも一種以上を含む、請求項６から１２のいずれかに記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ電気泳動チップおよび分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、合成された後、リン酸化や糖鎖付加など様々な構造修飾を受ける。この翻訳後修飾は、タンパク質の活性、細胞内局在あるいは細胞外分泌などを制御しており、タンパク質の機能発現に大きく関わっている。従って、翻訳後修飾の簡便かつ迅速な検出は、基礎研究だけでなく、疾患診断マーカー検出や薬効評価等の実用面において有用な技術になると期待される。細胞内において、タンパク質は、修飾されることによって異なる等電点や分子量をもつ複数のアイソフォームとして存在する。アイソフォームは、等電点や分子量の差異をもとに二次元電気泳動などによって分離し、多孔質膜に転写した後、抗体を用いたウェスタンブロッティング法などによって検出されている。この際、二次元電気泳動および膜転写には、長い場合には２日程度の時間を要する。
【０００３】
近年、微細加工技術の発展により、基板上に形成したマイクロ流路を用いた電気泳動に関する研究開発が行われ、電気泳動に要する時間の短縮が図られてきている。また、このようなマイクロ電気泳動チップを用いた等電点電気泳動と質量分析器を組み合わせることによる「二次元」タンパク質解析技術が開発されてきている。
【０００４】
非特許文献１には、試料分離を行うマイクロ電気泳動チップとＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ−Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）型質量分析計とを組み合わせた解析技術の例が紹介されている。このマイクロ電気泳動チップでは、ガラス基板の表面に微細加工によりエッチングされた溝と、マイクロ流路を覆う除去可能なＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）の蓋によってマイクロ流路が形成されている。マイクロ流路に導入されたタンパク質を含む試料は、電気泳動によって分離された後、分離状態を保存するために凍結される。次いで、チップを凍結した状態でＰＤＭＳの蓋を剥離し、マイクロ流路中の試料を凍結乾燥した後、マトリックス溶液を塗布し、質量分析器によって分子量の測定が行われる。この電気泳動チップを用いて数分という短時間の内にタンパク質を等電点電気泳動分離し、その後に質量分析器によってタンパク質を検出することが可能になっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｕｊｉｔａ、Ｍ．、Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｗ．、Ｓａｎｏ、Ｔ．、Ｂａｂａ、Ｍ．、Ｓｏｍｅｙａ、Ｈ．、Ｍｉｙａｚａｋｉ、Ｋ．、Ｋａｍｉｊｏ、Ｋ．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ｋ．、Ｋａｗａｕｒａ、Ｈ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１１１１、ｐｐ２００−２０５（２００６）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１記載のマイクロ電気泳動チップによる等電点電気泳動と質量分析器とを組み合わせた解析では、タンパク質の等電点や分子量などの物理化学的性状を知ることはできるが、これらの情報だけでは複雑な混合物中に含まれる特定のタンパク質を同定することは極めて困難である。
【０００７】
一方、タンパク質の同定には、分離したタンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的手法（ウェスタンブロッティング法）や質量分析器を用いたペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ法）が一般的によく用いられる。
ここで、非特許文献１記載のマイクロ電気泳動チップではタンパク質を分離した後、流路上部のＰＤＭＳ蓋を剥離することによって、流路中のタンパク質に直接アクセスすることが可能である。しかし、蓋を剥離し、凍結乾燥を行った後、流路上において溶液中における反応操作を伴う免疫学的検出法あるいはＰＭＦ法に必須な前処理工程である酵素処理を実施すれば、分離されたタンパク質は拡散し、分離状態は崩れてしまう。
【０００８】
そこで、マイクロ電気泳動チップでタンパク質を分離し、流路上部のＰＤＭＳ蓋を剥離した上で流路中のタンパク質をニトロセルロース膜等の多孔質性膜に転写することによって分離状態を固定することが考えられる。流路の深さは１０〜数十マイクロメートルであり、実際、流路中のタンパク質はニトロセルロース膜等の多孔質性膜に極めて短時間で転写することができ、従来の方法と比較して、電気泳動と転写に要する時間の大幅な短縮を図ることが期待される。
【０００９】
しかしながら、非特許文献１に開示されたマイクロ電気泳動チップから多孔質膜に試料を転写し、免疫学的検出法やＰＭＦ法を適用する上で課題があった。これについて図１を用いて説明する。図１（Ａ）は、マイクロ電気泳動チップを用いた等電点電気泳動に引き続き、蓋を剥離し、凍結乾燥を行った後、基板１０１の流路１０２上において分離された検出対象のタンパク質バンド１０３を模式的に表している。また、図１（Ｂ）は、ニトロセルロース膜１０４上で検出された対象タンパク質のバンド１０５を表している。図１（Ｂ）から分かるように、ニトロセルロース膜１０４上には流路位置に関する情報がないため、タンパク質バンド１０５の流路１０２端からの距離が不明である。このため、タンパク質バンド１０５の位置を正確に把握することが難しい。
また、免疫学的検出法では、通常パーオキシダーゼ標識された抗体を用い、化学発光によってタンパク質を検出する。最終的な結果は、対象タンパク質から発せられる化学発光シグナルに感光したＸ線フィルム上の斑点として得られることが多い。Ｘ線フィルム上の斑点を流路内におけるバンドの位置と対応付けることは難しい。
さらに、免疫学的検出において、しばしば見られる多孔質膜あるいはチップ上の流路以外の汚れに由来する誤ったシグナルとの判別も容易ではない。また、多孔質膜上でタンパク質の酵素消化を行うには、流路に対応する位置に正確に酵素を添加する必要があり、膜上での流路位置の把握が必要となる。
このように、非特許文献１に開示されたマイクロ電気泳動チップから多孔質膜に試料を転写し、免疫学的検出法やＰＭＦ法を適用する上で上記のような課題があった。
【００１０】
本発明の目的は、上記事情に鑑みてなされたものであり、マイクロ電気泳動チップにより分離された試料を多孔質膜に転写し、免疫学的方法あるいは質量分析器による解析を行うに当たり、多孔質膜上あるいはＸ線フィルム上に検出される対象タンパク質等に由来するシグナルの位置をチップ流路上での位置と容易に対応付けることができるマイクロ電気泳動チップ、マイクロ電気泳動チップを用いたタンパク質等の分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、
基板と前記基板上に設けられている検体試料用の流路とを備え、
前記流路の両端部の位置を示すマーカー物質保持用の凹部が、前記流路と離間して前記基板に設けられている、マイクロ電気泳動チップが提供される。
【００１２】
また、本発明によれば、
上記マイクロ電気泳動チップを用い、
前記流路の両端間に電圧を印加して、前記流路中の前記検体試料を分離する工程と、
前記凹部にマーカー物質を導入する工程と、
前記基板表面に転写用部材を接触させて、前記流路中の前記検体試料および前記凹部中の前記マーカー物質を前記転写用部材に転写する工程と、
前記転写用部材に転写された前記検体試料を検出する工程と、を含み、
前記検体試料を検出する工程において、前記流路の両端部の位置を示す前記マーカー物質の位置を基準として、前記転写用部材上の前記検体試料の位置データと前記検体試料の検出データとを対応づけることにより、前記検体試料を分析する、分析方法が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、検体試料を正確に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】一般的なマイクロ電気泳動チップを用いた電気泳動を示す概念図および転写後のニトロセルロース膜を示す概念図である。
【図２】本実施の形態のマイクロチップを用いた電気泳動の概念図および転写後のニトロセルロース膜の概念図である。
【図３】マイクロ電気泳動チップの流路長手方向の断面図である。
【図４】マイクロ電気泳動チップから多孔質膜への転写の概念図である。
【図５】本発明のマイクロ電気泳動チップの流路に導入したウサギ血清を膜転写後、抗ウサギＩｇＧ抗体により検出した。
【図６】（Ａ）ＨＲＰの二次元電気泳動のイメージである。（Ｂ）本実施例のニトロセルロース膜上でのＨＲＰ活性検出を示す図である。
【図７】（Ａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の二次元電気泳動イメージである。（Ｂ）ＧＦＰのマイクロ電気泳動チップ上での泳動パターン（蛍光イメージ）を示す図である。（Ｃ）本実施例の抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫学的検出の結果を示す図である。
【図８】本実施の形態の分析方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１６】
図２（Ａ）は、本実施の形態のマイクロ電気泳動チップ１００の基板１０７を模式的に示す。図３は、本実施の形態のマイクロ電気泳動チップ１００を模式的に示す。
本実施の形態のマイクロ電気泳動チップ１００について、説明する。
マイクロ電気泳動チップ１００は、基板１０７（ガラス基板）と基板１０７上に設けられている検体試料用の流路１０２（微細流路）とを備え、流路１０２の両端部の位置を示すマーカー物質保持用の凹部（第１のマーカー保持部１３０および第２のマーカー保持部１３２）が、流路１０２と離間して基板１０７に設けられている。
検体試料としては、タンパク質（所定の処理、たとえばＳＤＳ処理等がなされていてもよい）、ＤＮＡ、糖等の高分子等を用いることができる。本実施の形態では、タンパク質を用いた例を説明する。
また、マーカー保持部１３０、１３２は、光学的に検出可能なマーカー分子を保持する。
タンパク質やマーカー分子が転写される転写用部材は、特に限定されないが、たとえば多孔質膜（タンパク質ブロッティング用メンブレン）を用いることができる。多孔質膜としては、たとえばニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）等を用いることができる。
【００１７】
ここで、本実施の形態の概要について説明する。
本実施の形態においては、マイクロ電気泳動チップ１００により分離されたタンパク質を多孔質膜に転写し、免疫学的方法あるいは質量分析器等による解析を行うに際し、多孔質膜上あるいはＸ線フィルム上に検出される対象タンパク質に由来するシグナルの位置と流路１０２上での位置データ（または等電点データ）とを、マーカー分子のシグナルにより容易に対応付けることができる。このように、流路１０２の両端部の位置を示すマーカーにより、多孔質膜上での流路１０２の位置が把握できるので、流路１０２に有るタンパク質を正確に検出できる。
また、（ｉ）対象タンパク質の等電点データとともに免疫学的方法による第１の検出データを得ることができる。また、（ｉｉ）タンパク質の位置データを利用して、質量分析器により第２の検出データを正確に得ることができる。（ｉ）（ｉｉ）の解析に加え、（ｉｉｉ）タンパク質の位置データと等電点データとが一致するので、当該タンパク質の第１の検出データと第２の検出データとをリンクさせて解析できる。このような解析により、タンパク質を同定することができる。
【００１８】
本実施の形態では、流路１０２の両端部（第１の端部、第２の端部）のそれぞれに、少なくとも１つの第１のマーカー保持部１３０および第２のマーカー保持部１３２が設けられている（図２（Ａ））。ここで、第１の端部を、流路１０２と第１のリザーバ１２４との間とし、第２の端部を、流路１０２と第２のリザーバ１２６との間とする。すなわち、マーカー保持部１３０、１３２は、それぞれ第１の端部、第２の端部の位置情報を示すように設けられていればよい。
このため、流路１０２中のタンパク質のバンド（第１のタンパク質バンド１４０および第２のタンパク質バンド１４２）を転写すると、ニトロセルロース膜１０４には、第１のタンパク質バンド１５０および第２のタンパク質バンド１５２とともに、第１のマーカーバンド１２０および第２のマーカーバンド１２２が転写されている。ニトロセルロース膜１０４上の各バンドの位置は、基板１０７上のバンドの位置と精度よく一致している。すなわち、基板１０７上での各バンドの相対位置関係が、ニトロセルロース膜１０４上でも保持されている。
そのため、第１のマーカーバンド１２０の位置は、流路１０２の第１の端部の位置を示し、第２のマーカーバンド１２２の位置は、流路１０２の第２の端部の位置を示すことになる（図２（Ｂ））。ここで、図２(Ｂ)では、チップ表面のイメージが反転することを明示するためにチップ左上を示す「＋」マークがニトロセルロース膜１０４に記入されている。
【００１９】
マーカー保持部１３０、１３２の形状としては、特に限定されないが、基板１０７平面視において、矩形または三角形とすることができる。マーカー保持部１３０、１３２が矩形の場合には、マーカーバンド１２０、１２２も矩形となり、その長手方向が、流路１０２の端部に相当する位置を示す（図２（Ｂ））。また、マーカー保持部１３０、１３２が三角形の場合には、マーカーバンド１２０、１２２もほぼ三角形となり、その三角形の頂点の延長線上が流路１０２の端部に相当する位置を示す。
【００２０】
また、マーカー保持部１３０、１３２は、流路１０２を挟んで対向する位置にさらに設けられてもよい。すなわち、第１の端部および第２の端部には、流路１０２を挟んで、それぞれ一対の第１のマーカー保持部１３０および一対の第２のマーカー保持部１３２が設けられていてもよい。これにより、対向に位置された一対のマーカー保持部１３０、１３２を結んだ直線上が、流路１０２の両端部の位置を示す（図２（Ａ））。これにより、図２（Ｂ）に示すように、対向に位置された一対のマーカーバンド１２０、１２２を結んだ直線上が、流路１０２の両端部の位置を示す。このため、ニトロセルロース膜１０４上では、流路１０２の端部に相当する位置をより正確に把握することができる。
【００２１】
さらに、図２（Ａ）に示すように、一対のマーカー保持部１０８（凹部）が、流路１０２の延在方向上、特に流路１０２中央線の延長方向上の基板１０７に設けられていてもよい。
図２（Ｂ）に示すように、マーカー保持部１０８に対応する一対のマーカーバンド１２１により、ニトロセルロース膜１０４上にて流路１０２の軌道を正確に把握することができる。
また、図２（Ｂ）に示すように、ニトロセルロース膜１０４上にて、一対の第１のマーカーバンド１２０の延長線、一対の第２のマーカーバンド１２２の延長線および一対のマーカーバンド１２１の延長線が直交するように配置させている。各延長線の交点が流路１０２の端部を示す。これにより、より正確にニトロセルロース膜１０４上の流路１０２の両端部の位置およびその軌道を決定することができる。
また、流路１０２を囲むように、マーカー保持部を配置してもよい（連続で囲んでも、非連続で囲んでもよい）。このとき、ニトロセルロース膜１０４上で、マーカーバンドに囲まれた領域が、流路１０２についての両端部や軌道等の形状を示す。
【００２２】
図２に示すように、流路１０２は、両端において、それぞれ第１のリザーバ１２４および第２のリザーバ１２６に連通している。流路１０２には、検体試料を含む液体が導入される。流路１０２中で検体試料中の成分（第１のタンパク質バンド１４０、第２のタンパク質バンド１４２）が等電点分離により分離される。このとき、流路１０２は、ｐＨ勾配の形成される等電点分離領域を含み、等電点分離領域に電界を印加する一対の電極（不図示）と、等電点分離領域に検体試料および電極液を含む液体を導入する試料導入部（リザーバ１２４、１２６）とをさらに備える。リザーバ１２４、１２６の間に電界を印加したとき、流路１０２全体を等電点分離領域とすることができる。
【００２３】
上述のとおり、本実施の形態では、第１の端部から第２の端部までの領域が、流路１０２の等電点分離領域を示す。そのため、ニトロセルロース膜１０４では、第１のマーカーバンド１２０の位置（第１の端部に相当する）から第２のマーカーバンド１２２（第２の端部に相当する）までの領域が、上記等電点分離領域に相当する。
このように、流路１０２中での等電点分離領域情報が、マーカーバンド１２０、１２２の位置情報によりニトロセルロース膜１０４にも、正確に現れている。
すなわち、本実施の形態によれば、ニトロセルロース膜１０４でも、第１のタンパク質バンド１５０および第２のタンパク質バンド１５２の等電点が把握できる。よって、本実施の形態によれば、ニトロセルロース膜１０４でも、流路１０２で得られる等電点データと同じ、各タンパク質バンドの等電点データ（位置データ）を取得することができる。
【００２４】
流路１０２の形状は、基板１０７方向から見て、たとえば、Ｉ字状、Ｙ字状、コの字状等としてもよい。流路１０２の延設方向に対して垂直方向の断面形状は、たとえば、矩形、正方形、台形、三角形等の形状でもよい。また、基板１０７上に、複数の流路１０２が形成されていてもよい。
また、流路１０２において、流路幅は、たとえば０．４〜２ｍｍとすることができ、流路長は、たとえば、３０〜５０ｍｍとすることができる。
【００２５】
基板１０７の材料として、特に限定されず、たとえば石英等のガラス、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン樹脂、およびシリコン等でもよい。本実施の形態では、基板１０７として、ガラス基板を用いる。
【００２６】
図３に示すように、本実施の形態のマイクロ電気泳動チップ１００は、基板１０７上に、ＰＤＭＳ蓋１１０およびガラス蓋１１１をさらに備える。
本実施の形態のマイクロ電気泳動チップ１００においては、蓋（ＰＤＭＳ蓋１１０、ガラス蓋１１１）は、板状部材からなってもよい。これにより、流路１０２の上部を確実に被覆することができる。また、マイクロ電気泳動チップ１００においては、使用中に、除去可能な蓋（ＰＤＭＳ蓋１１０、ガラス蓋１１１）で、流路１０２（微小空間）の上面を覆うことができる。このため、流路１０２の内容物（検体試料や電解液）の蒸発や乾燥、内容物の漏出、または外来物質の侵入を抑制しつつ、検体試料に対して電気泳動等の処理を行うことできる。また、使用後においては、基板１０７表面から蓋を除去する際に、基板１０７の表面に垂直方向に蓋を除去することができる。このため、流路１０２内の検体試料が基板１０７と蓋との間隙に毛細管現象により移動し、内容物の汚染が生じるのを確実に抑制することができる。そして、流路１０２の検体試料を安定的に保持しつつ、蓋を除去し、流路１０２の上部を開放することができるので、流路１０２の検体試料が混和することを抑制することができる。たとえば、本実施の形態のマイクロ電気泳動チップ１００によれば、電気泳動などにより一つの流路１０２内で空間的に分離されていた成分同士の混和等を抑制することができる。
また、使用後においては、流路１０２上を開放することができるため、流路１０２区間内の任意の領域に存在する内容物に直接操作を加えることが可能となる。よって、迅速で確実な操作が可能となる。
【００２７】
ここで、基板１０７の表面に蓋（ＰＤＭＳ蓋１１０およびガラス蓋１１１）を圧接する手段としては、たとえば、ねじ、油圧装置、水圧装置、または気圧装置を採用することができる。これによりマイクロ電気泳動チップ１００の使用目的に応じて、基板１０７と蓋とを着脱自在に密着固定できる。
【００２８】
マイクロ電気泳動チップ１００において、流路１０２及びマーカー保持部１０８、１３０、１３２の内部（底面及び側面）は親水性とすることができる。これにより、流路１０２及びマーカー保持部１０８、１３０、１３２が微細な場合にも、（ｉ）流路１０２に液体（検体試料）を、（ｉｉ）マーカー保持部１０８、１３０、１３２にマーカー分子を、さらに確実に導入することができる。たとえば、オゾンアッシングやコーティングにより、基板１０７の表面を親水性化処理することができる。
また、流路１０２及びマーカー保持部１０８、１３０、１３２以外の領域、つまり流路１０２及びマーカー保持部１０８、１３０、１３２（凹部）近傍の基板１０７表面は、疎水性とすることができる。これにより、（ｉ）液体（検体試料）が流路１０２から、（ｉｉ）マーカー分子がマーカー保持部１０８、１３０、１３２から、基板１０７上面にあふれ出ないようにすることができる。たとえば、テフロン（登録商標）等の撥水性物質をコーティングすることにより、基板１０７の表面を撥水処理することができる。
【００２９】
また、マーカー分子（マーカー物質）としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、蛍光物質、燐光物質、クマシーブルー、およびアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、蛍光物質、燐光物質若しくはクマシーブルーで標識または染色されたタンパク質等を用いることができる。
【００３０】
本実施の形態のマイクロ電気泳動チップの製造方法を説明する。たとえば、マイクロ電気泳動チップとしては特願２００５−５１３９３７に記載されたマイクロ流路チップや実験条件に応じて適宜改変したものを採用することができる。
本実施の形態では、まず、流路１０２の形状に対応する光学マスクを準備する。そして、基板１０７上に光学レジストをスピンコート法により塗布する。続いて、予め準備しておいたマスクを用いて、光学レジストに流路パターンを光学露光し、現像することにより、レジストパターンを作製する。そして、得られたパターンをマスクとして、基板１０７のドライエッチングやウエットエッチングにより、流路１０２およびこれに連通する各液溜（第１のリザーバ１２４、第２のリザーバ１２６）を形成する。
具体的な上記製造方法の一例としては、まず、厚さ０．５ｍｍ程度のガラス基板に電子線描画用レジストを塗布し、電子線描画装置を用いて電子線照射を行う。現像の後、例えば、流路幅０．４〜２ｍｍ、流路長３０〜５０ｍｍ、また位置決めマーカー保持部として長辺１〜２ｍｍ、短辺０．５〜１ｍｍのレジストパターンを得る。マーカー保持部の長手方向の中央線は、保持部１０８においては流路中央線の延長線上、また保持部１０９においては流路端にそれぞれ合致させる。流路の深さは数μｍから数１０μｍとし、流路底面には円柱の直径を５０〜１０００ｎｍ、最近接の円柱間距離を５０〜１０００ｎｍ程度とする柱状の分離構造を設置する。柱間の距離としては、数μｍ〜数１０μｍが適当である。次に、レジストをマスクとして、ＣＦ４ガス等による反応性イオンエッチングによりガラス基板表面に溝を形成し、アッシング処理によりレジストを剥離する。
【００３１】
次いで、本実施の形態の分析方法について説明する。本実施の形態の分析方法は、タンパク質の解析、とくにタンパク質の同定に関する。
図８は、本実施の形態の分析方法のフローチャートを示す。
本実施の形態の分析方法は、本実施の形態のマイクロ電気泳動チップ１００を用い、流路１０２の両端間に電圧を印加して、流路１０２中の検体試料（タンパク質）を分離する工程と（Ｓ１００）、凹部（マーカー保持部１０８、１３０、１３２）にマーカー分子を導入する工程と、基板１０７表面に転写用部材（ニトロセルロース膜１０４）を接触させて、流路１０２中の検体試料および凹部中のマーカー分子を転写用部材に転写する工程と（Ｓ１０２）、転写用部材に転写された検体試料を検出する工程と(Ｓ１０４)、を含む。
本実施の形態の分析方法では、流路１０２の両端部の位置を示すマーカー分子の位置を基準として、転写用部材上の検体試料の位置データと検体試料の検出データと対応づけることにより、検体試料を分析する。
【００３２】
本実施の形態の分析方法においては、流路１０２中に、分析対象となる検体試料（タンパク質の混合物）の成分を分離する（Ｓ１００）。具体的には、流路１０２において、適当な物理的または化学的性質、たとえばサイズや等電点で電気泳動分離を行う。このとき、電気泳動用試料溶液を用意し、流路１０２に導入した後、第１のリザーバ１２４および第２のリザーバ１２６のそれぞれに電極（たとえば白金等）を挿入し、電極間に電圧を印加して、分離動作を行う。また、電圧を印加して分離する方法に代えて、圧力を印加する分離方法を用いてもよい。
【００３３】
ここで、電気泳動用の溶液は、用途に応じて適宜選択されるが、等電点電気泳動のための溶液であってもよい。等電点電気泳動とは、試料中の成分であるタンパク質等両性担体に固有の等電点（ｐＩ）に応じて、両性担体を分離する電気泳動の手法のひとつである。ｐＩとは、試料中の成分が持つ正電荷と負電荷がちょうど等しくなるｐＨのことを指す。試料中の成分は、自身が溶解している溶液のｐＨに応じた電荷をもっており、各々のｐＩ領域まで電気泳動する。各々のｐＩに達すると、試料中の成分の電気泳動移動度がゼロになり、電気泳動を終了する。この現象により、試料中の成分をそれぞれのｐＩごとに濃縮、分離することができる。等電点電気泳動のための溶液には、分離する試料中の成分以外に、ｐＨ勾配を形成するための両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）が含まれている。流路１０２中にｐＨ勾配をつくるためには、たとえば等電点電気泳動のための溶液を流路１０２に導入し、次に第１のリザーバ１２４に酸溶液、第２のリザーバ１２６にアルカリ溶液を入れ、リザーバ内に配置した電極間に、電圧を印加すればよい。
等電点電気泳動により、検体試料をタンパク質のバンド（ｐＩごと）に精度良く分離することができる。また、等電点電気泳動により、タンパク質のバンドが現れる位置は再現性がよい。
【００３４】
続いて、マーカー分子をマーカー保持部１０８、１３０、１３２に導入する。導入方法としては、特に限定されないが、たとえばスポイト等を用いて導入することができる。導入時期としては、特に限定されず、検体試料の分離前でもよい。
【００３５】
続いて、分離後、分離済みの試料を凍結乾燥等の方法により乾燥させて、流路１０２内の分離された位置に固定する。これらの手順により、マイクロ電気泳動チップ１００上に、タンパク質などの分析用試料が乾燥固定される。
【００３６】
続いて、流路１０２中の検体試料（第１のタンパク質バンド１４０、第２のタンパク質バンド１４２）および、マーカー保持部１０８、１３０、１３２中のマーカー分子を、ニトロセルロース膜１０４に転写する（Ｓ１０２）。
転写するには、基板１０７とニトロセルロース膜１０４とを接触させればよい。たとえば、基板１０７とニトロセルロース膜１０４との間に、圧力を掛けて転写させることができる。具体的には、図４に示すように、所定の処理を施したニトロセルロース膜１０４を基板１０７上面に密着させ、その上部に濾紙１１２を介してアクリル板１１３と５００ｇ程度の重量物（重り１１４）を載せることにより、タンパク質（第１のタンパク質バンド１４０、第２のタンパク質バンド１４２）をニトロセルロース膜１０４に転写させることができる。その他の転写手段としては、電圧や空気圧（吸引力）を用いることもできる。
以上により、タンパク質バンドおよびマーカーバンドが転写されたニトロセルロース膜１０４を得ることができる。
【００３７】
続いて、上記工程で得られたニトロセルロース膜１０４中のバンドが示すタンパク質の解析を行う（Ｓ１０４）。
その後、目的のタンパク質とマーカー分子に適合した方法によって、タンパク質（第１のタンパク質バンド１５０、第２のタンパク質バンド１５２）とマーカー分子（第１のマーカーバンド１２０、第２のマーカーバンド１２２、マーカーバンド１２１）とを、それぞれを検出する（図２（Ｂ））。このとき、タンパク質とマーカー分子を同時に検出することができる。
【００３８】
以下、各検出方法について詳述する。
本実施の形態に係る免疫学的方法（ウェスタンブロッティング法）では、目的タンパク質に対して抗体を反応させて検出を行う。電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせることで、複数のタンパク質バンド（第１のタンパク質バンド１５０、第２のタンパク質バンド１５２）から目的タンパク質を検出することができる。
タンパク質の検出には、抗体を用いてもよいし、蛍光試料を用いてもよい。抗体を用いる場合には、目的タンパク質に一次抗体を反応させ、この一次抗体に、たとえばＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）やＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）などで標識した二次抗体を反応させて、酵素活性による発色や化学発光を検出する。蛍光試料を用いる場合には、Ｘ線フィルムへの露光検出を行ったり、あるいは蛍光試料を検出可能なスキャナーを用いたりする。これらの検出方法により、微量タンパク質の検出が容易となる。また、蛍光試料を用いる手法は、感度が良く、定量性に優れている。
【００３９】
このように、特異性が高い抗原抗体反応等を利用することで、検体試料のタンパク質溶液中に微量に含まれる、目的タンパク質を明瞭に検出することができる。これにより、ニトロセルロース膜１０４上のバンド（スポット）に存在するタンパク質が、目的のタンパク質か否か判断し、バンドごとにタンパク質を同定することができる。
【００４０】
本実施の形態の作用効果について説明する。
本実施の形態では、抗体特異性が高いタンパク質をスポットの有無で検出できる。また、上述のとおり、多孔質膜上あるいはＸ線フィルム上に検出される対象タンパク質に由来するシグナルの位置と流路１０２上での等電点データとを、マーカー分子のシグナルにより容易に対応付けることができる。そのため、マーカーバンド１２０、１２２の位置情報により、タンパク質のスポット（バンド）の等電点が分かる。このように、本実施の形態では、ニトロセルロース膜１０４上で、免疫学的方法による第１の検出データ（スポットの有無）と、対象タンパク質が示すスポットの等電点データと、を両方取得することができる。このため、一度の工程で、２つ観点から検出できるので、タンパク質（検出対象）を正確に検出できる。また、２つのデータにより、このタンパク質を同定することができる。
【００４１】
なお、本実施の形態では、マーカーバンド１２０、１２２の位置情報により、ニトロセルロース膜１０４上で、流路１０２上に相当する位置データを正確に把握できる。そのため、Ｘ線フィルム上の斑点がこの位置データの範囲外にあれば、当該斑点は流路１０２内における対象タンパク質のバンドではないと容易に判断できる。このように、当該斑点が目的タンパク質のバンドか否か簡単に分かる。そのため、対象タンパク質のバンド（シグナル）の誤認を防ぐことにより、タンパク質を正確に検出することができる。
【００４２】
また、本実施の形態に係る質量分析では、タンパク質の酵素消化物の質量分析データであるペプチドマスフィンガープリントを、タンパク質データベースに照合させることで、タンパク質を同定することができる。ニトロセルロース膜１０４上のタンパク質のバンド（スポット）に、酵素処理を行い、得られた断片ペプチド混合物をＭＡＬＤＩ法による質量分析により質量ピークデータ、すなわちペプチドマスフィンガープリントが得られる。このとき、ペプチド断片化を行った後、イオン化促進剤であるマトリックスを添加し質量分析を行う。また、スプレー法や滴下法等の所定の方法を用いて、ニトロセルロース膜１０４上のタンパク質のバンドに好適なマトリックスを添加できる。
また、上記酵素処理においては、タンパク質分解酵素（トリプシン等）を用い、タンパク質をアミノ酸配列の特定部位で切断する。このため、本実施の形態で得られる質量ピークデータ（第２の検出データ）は、タンパク質固有のデータとなる。
【００４３】
本実施の形態では、マーカーバンド１２０、１２２の位置情報により、ニトロセルロース膜１０４上で、流路１０２上に相当する位置データを正確に把握できる。そのため、ニトロセルロース膜１０４上の流路１０２に対応する位置に正確に酵素を添加することができる。これにより、操作ミスが低減するとともに、再現性も高まるので、正確にタンパク質を検出することができる。
また、ニトロセルロース膜１０４上にて、質量分析を行う位置（流路１０２に対応する位置）が分かるので、正確にタンパク質を検出することができる。
【００４４】
また、本実施の形態では、質量分析器による第２の検出データ（ペプチドマスフィンガープリント）と、タンパク質の流路１０２の両端部からの位置データが分かる。この位置データは、上記等電点データに相当する。そのため、マーカーバンド１２０、１２２の位置情報により得られるタンパク質の位置データに基づいて、第１の検出データ（タンパク質が特異的に反応する抗体の種類）と第２の検出データ（質量データ）とを結びつけることができる。
このように、本実施の形態では、タンパク質の基本データ（位置データ、特に等電点データ）と、複数種類の検出データを対応づけられるので、各検出データを統合して、タンパク質をより正確に同定することができる。
【００４５】
また、本実施の形態に係るタンパク質固有の活性の検出においては、生理活性物質（抗体、蛍光物質、染色物質等）をニトロセルロース膜１０４上のタンパク質のバンドに添加して、吸光度測定、発光測定等を行う。これにより、所望のタンパク質固有の活性、特に酵素活性を検出することができる。
【００４６】
本実施の形態では、免疫学的方法の場合に得られる効果と同様の効果が得られる。また、タンパク質の固有の活性の検出により第３の検出データ（酵素活性）を、さらにタンパク質の基本データ（位置データ、特に等電点データ）と統合できる。これにより、タンパク質をより正確に同定することができる。
【００４７】
以上のように、本実施の形態においては、位置決めマーカー保持部の凹部に添加された位置決めマーカー分子はマイクロ流路および流路上に分離されたタンパク質との相対的位置関係を保ったまま多孔質膜上に転写されるため、多孔質膜あるいはＸ線フィルム上に検出されたタンパク質のシグナルの流路内における位置を容易にかつ正確に測定することが可能になる。
また、本実施の形態では、ガラス基板上に形成された微細流路において電気泳動により分離されたタンパク質をニトロセルロース膜等の多孔質膜に転写し、後工程の免疫学的方法等により検出する方法に関し、特に多孔質膜上に転写されたタンパク質の検出において、タンパク質に由来するシグナルを特定し、チップ上での位置を迅速、正確かつ簡便に測定することを可能にするチップを提供することができる。
また、本実施の形態においては、マイクロ電気泳動チップを用いて生物試料中の特定のタンパク質を迅速かつ特異的に分離・検出することが可能となり、タンパク質発現解析、疾患や薬効判定のマーカータンパク質検出あるいは農産物・食品中の特定タンパク質の検出などへ応用することができる。
【実施例】
【００４８】
（実施例１）
本実施例で用いるマイクロ電気泳動チップ１００について説明する。マイクロ電気泳動チップ１００としては特願２００５−５１３９３７（ＷＯ２００５／０２６７４２号パンフレット）に記載されたマイクロ流路チップや実験条件に応じて適宜改変したものを採用することができる。上記の製法に沿って、マイクロチップを作製した。流路１０２は直線状とし、流路長は３５ｍｍ、幅及び深さは、それぞれ２ｍｍ、１０μｍである。流路１０２内には楕円柱型の分離構造のアレイ配列からなっており、ピラーの長径は３０μｍ、短径は１０μｍ、またピラーの間隔は１０μｍであった。また、流路１０２と位置決め用のマーカー保持部１０８、１３０、１３２の深さは１０μｍであった。ＰＤＭＳ蓋１１０を基板１０７に密着させ、流路１０２を形成し、ＰＤＭＳ蓋１１０を強化するために上部にさらにガラス蓋１１１を載せた。
【００４９】
ニトロセルロース膜１０４への転写を行った後、ウサギ血清ＩｇＧを抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検出することによって、タンパク質サンプルの転写の可否を検証した。ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、１リットルの純水中に８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を含む、ｐＨ７．４）で１／１００に希釈したウサギ血清を第１のリザーバ１２４に１μｌ注入し、反対側第２のリザーバ１２６から吸引し、流路１０２に導入した。チップを凍結後、蓋を剥離し、マーカー保持部１０８、１３０、１３２に１／１００にＰＢＳで希釈したウサギ血清を０．２μｌ添加後、さらに凍結乾燥を行った。予めニトロセルロース膜１０４を３０％メタノール、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭ  グリシンを含む溶液中で１０分間洗浄し、さらに純水で５分間洗浄した後、キムワイプ(登録商標)などで過剰の水分を除去し、膜表面に水分が残らない状態にした。上記のように前処理し湿った状態のニトロセルロース膜１０４をチップ上面に密着させ、上部に乾燥した２〜３枚の濾紙１１２を載せ、その上にアクリル板１１３と５００ｇ程度の重量物（重り１１４）を載せることにより、タンパク質（第１のタンパク質バンド１４０、第２のタンパク質バンド１４２）をニトロセルロース膜１０４に転写した（図４）。転写はローラーのような器具を用いて適当な圧力をかけることによって行うこともできる。ニトロセルロース膜１０４をブロックエース（登録商標、大日本製薬）中、室温で３０分間、インキュベートしブロッキングを行った。ニトロセルロース膜１０４の全体を覆うように、３％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで３０００倍希釈したパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をかけて（０．２〜０．４ｍｌ／１ｃｍ２ニトロセルロース膜）、湿度を保ったチャンバー内において乾燥を防ぎながら室温で２時間インキュべートした。ニトロセルロース膜１０４をＴＢＳ−Ｔ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、９ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で１５分間、振とうしながら余分な抗体を洗浄した。洗浄をさらに２回行った後、ニトロセルロース膜１０４に化学発光基質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ検出試薬、ＧＥヘルスケア）を１分間、反応させた。ニトロセルロース膜１０４をラップし、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒ  Ｆｉｌｍ  ＥＣＬ、  ＧＥヘルスケア）に密着させ化学発光反応によって生じた光を検出した。
【００５０】
図５に示したように、ウサギＩｇＧは流路１０２の形状に沿って全体にわたり一様に検出された（図５中、実線は、ニトロセルロース膜上での流路の位置決めマーカーの位置を示す）。また、流路端は位置決めマーカー（第１のマーカーバンド１２０、第２のマーカーバンド１２２）と一致していた。このように、本実施の形態では、マーカーバンドの位置により、ニトロセルロース膜１０４上で流路１０２の両端部の位置を正確に把握することができることが分かった。
【００５１】
（実施例２）
（タンパク質の等電点の検出）
溶液の調製は以下のように行った。ｃＩＥＦゲル（８．２５μｌ）、キャリアアンフォライト（ｐＨ４．０〜６．０、０．２５μｌ）、蛍光マーカー（ｐＩ４．０、４．５および５．５の混合液０．７５μｌ、  Ｆｌｕｋａ）、ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、５．６μｇ／ｍｌ）１μｌに水を添加し、全量を１２．５μｌとした。陽極の電極液は１Ｍリン酸溶液５μｌとｃＩＥＦゲル５０μｌとの混合液１０μｌと９０μｌのｃＩＥＦゲルを混合して作製する。陰極の電極液には３０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を用いた。
【００５２】
マイクロピペットを用いて１μｌのサンプル溶液を陽極リザーバに注入し、毛細管現象および陰極側からの真空ポンプによる吸引によって流路に導入した。陰極および陽極リザーバに８μｌの各電極液を注入後、全量を回収することによって、過剰のサンプル溶液を除去するとともにリザーバ内の洗浄を行った。７μｌの電極液を各リザーバに注入した。両極に１５００Ｖを１分間印加後、３０００Ｖで１２分間印可することにより、等電点電気泳動を行った。泳動中のチップの温度はペルチエ素子により１０℃に設定した。泳動終了後、チップ温度を迅速に−３０℃に下げ、流路内の溶液を凍結させた。凍結後、蓋を剥離し、位置決めマーカー保持部にＨＲＰ（５．６μｇ／ｍｌ）を０．２μｌ添加し、さらに凍結乾燥を行った。ＰＤＭＳの蓋を取り外し、−２０℃において凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、蛍光顕微鏡を用いて蛍光マーカーの位置を検出した。サンプルを実施例１記載の方法でニトロセルロース膜に転写した。転写されたＨＲＰを実施例１と同様にＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ検出試薬により検出した。
【００５３】
図６（Ａ）は、ＨＲＰの二次元電気泳動のイメージを示す（図６中、実線は、ニトロセルロース膜上での流路の位置決めマーカーの位置を示す）。
Ｓｉｇｍａ社によると、実施例２で用いたＨＲＰ標品にはｐＩが異なる少なくとも５個のアイソフォームが含まれるとされている。通常の二次元電気泳動により本ＨＲＰ標品を解析した。すなわち、ＨＲＰ（２μｇ）を一次元目にｐＨ３−１０の等電点電気泳動、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ポリアクリルアミド）を行い分離した後、銀染色により可視化した。ｐＨ５．３〜６．７の範囲に少なくとも５個のＨＲＰのスポットが見られた（図６（Ａ））。
【００５４】
このＨＲＰ標品を、本実施の形態のマイクロ電気泳動チップで等電点電気泳動し、ニトロセルロースに転写した後、膜上で活性を見ることにより検出を試みた。その結果、図６（Ｂ）に示すように、４本のバンドを見出した。これらのバンドは流路上の蛍光マーカーの位置と位置決めマーカーの位置をもとにｐＩ５．４〜５．９の領域にあることが分かった。
【００５５】
(実施例３)
（緑色蛍光タンパク質の等電点電気泳動と免疫学的検出）
サンプル溶液の調製は以下のように行った。ｃＩＥＦゲル（８．２５μｌ、ベックマン）、キャリアアンフォライト（ｐＨ４．０〜６．０、０．２５μｌ、ベックマン）、蛍光マーカー（ｐＩ４．０、４．５および５．５の混合液０．７５μｌ、  Ｆｌｕｋａ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ベクトンディッキンソン社、０．２５μｇ／μｌ）０．５μｌに水を添加し全量を１２．５μｌとした。陽極および陰極の電極液は実施例２と同様に調製した。
【００５６】
サンプル溶液の流路への注入、電極液の注入および等電点電気泳動は実施例２と同様に行った。泳動終了後、チップを迅速に−３０℃に下げ、流路内の溶液を凍結させた。凍結後、ＰＤＭＳの蓋を剥離し、位置決めマーカー保持部にＧＦＰ（０．２５μｇ／μｌ）を０．２μｌ滴下し、−２０℃において凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、蛍光顕微鏡を用いて蛍光マーカーの位置を検出した。
【００５７】
図７（Ａ）は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の二次元電気泳動イメージを示す（図７中、実線は、ニトロセルロース膜上での流路の位置決めマーカーの位置を示す）。
実施例３で用いたベクトンディッキンソン社のＧＦＰはｐＩが異なる少なくとも２個のアイソフォームを含むと報告されている。図７（Ａ）に示すように、ＧＦＰ（１．５μｇ）を一次元目にｐＨ４−７の等電点電気泳動、二次元目はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ポリアクリルアミド）を行い分離した後、銀染色により可視化した。ｐＨ４．９〜５．２の範囲に３個のスポットが見られた。
【００５８】
図７（Ｂ）は、ＧＦＰのマイクロ電気泳動チップ上での泳動パターン（蛍光イメージ）を示す。
マイクロ電気泳動チップを用いて等電点電気泳動し、凍結乾燥後、チップ上におけるＧＦＰの蛍光イメージをイメージスキャナー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００、ＧＥヘルスケア）により取得した。  すなわち、ＧＦＰ（０．１２５μｇ）をｐＨ４〜６のキャリアアンフォライトを用いて等電点分離し、凍結乾燥後、チップ上で蛍光スキャナーを用いてＧＦＰの分離パターンを見た。  図７（Ｂ）に示すように、ｐＩの値が４．１〜４．２と少し低いものの、通常の二次元電気泳動の結果と同じく１本のメジャーバンドに加えて２本のマイナーバンドが認められた。よって、等電点が少し異なるものの、通常の二次元電気泳動と同様に３本のＧＦＰのバンドが確認された。
【００５９】
図７（Ｃ）は、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫学的検出の結果を示す。
実施例１記載の方法でニトロセルロース膜に転写し、ブロッキングを行った。抗ＧＦＰ抗体（Ｚｙｍｅｄ社、３％牛血清アルブミンを含むＰＢＳで７５０倍希釈）を実施例１と同様にニトロセルロース膜にかけ、チャンバー内で乾燥を防ぎながら室温で２時間インキュべートした。実施例１と同様に洗浄した後、３％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで３０００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をかけ、先と同様にインキュベート、洗浄を行った。さらに、先と同様に化学発光基質を反応後、Ｘ線フィルムによりシグナルを検出した（図７（Ｃ））。これらのバンドのｐＩは位置決めマーカーおよび蛍光マーカーとの比較から蛍光スキャナーから得られるものと同じｐＩ値であった。
【００６０】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【符号の説明】
【００６１】
１００  マイクロ電気泳動チップ
１０１  基板
１０２  流路
１０３  タンパク質バンド
１０４  ニトロセルロース膜
１０５  タンパク質バンド
１０６  リザーバ
１０７  基板
１０８  マーカー保持部
１１０  ＰＤＭＳ蓋
１１１  ガラス蓋
１１２  濾紙
１１３  アクリル板
１１４  重り
１２０  第１のマーカーバンド
１２１  マーカーバンド
１２２  第２のマーカーバンド
１２４  第１のリザーバ
１２６  第２のリザーバ
１３０  第１のマーカー保持部
１３２  第２のマーカー保持部
１４０  第１のタンパク質バンド
１４２  第２のタンパク質バンド
１５０  第１のタンパク質バンド
１５２  第２のタンパク質バンド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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