(57)【要約】【課題】  如何なる検体を当てた場合にもバックグラウンド信号レベルを正確に評価することが可能となる手段を提供する。【解決手段】  基体と、前記基体の第１の領域内に固定化され、異なる配列を有する複数の第１のプローブを備えるネガティブコントロールプローブ群と、前記基体の第２の領域内に固定化されたターゲット核酸の相補配列を含む第２のプローブとを具備する核酸検出用マイクロアレイであって、前記ネガティブコントロールプローブ群に含まれる複数の第１のプローブの種類は、ネガティブコントロール群とそこに含まれる第１のプローブの一部に対するフルマッチ核酸との反応で得られるハイブリダイズ信号が閾値以下となる数であることを特徴とするマイクロアレイ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と、前記基体の第１の領域内に固定化され、異なる配列を有する複数の第１のプローブを備えるネガティブコントロールプローブ群と、前記基体の第２の領域内に固定化されたターゲット核酸の相補配列を含む第２のプローブとを具備する核酸検出用マイクロアレイであって、前記ネガティブコントロールプローブ群に含まれる複数の第１のプローブの種類は、ネガティブコントロール群とそこに含まれる第１のプローブの一部に対するフルマッチ核酸との反応で得られるハイブリダイズ信号が閾値以下となる数であることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
前記第１のプローブの各々の塩基配列が前記第２のプローブの塩基配列とは異なる配列であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
前記マイクロアレイが、電気化学的検出型、蛍光検出型、化学発色検出型および放射能検出型からなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
前記マイクロアレイが、電気化学的検出型であり、前記第１の領域が第１の電極上に、第２の領域が第２の電極上にあることを特徴とする請求項３に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
請求項１に記載のマイクロアレイに含まれるネガティブコントロールプローブ群の設計方法であって、ネガティブコントロール群に適用する複数の第1のプローブを別々の領域に固定化したマイクロアレイに対し、同一検体を作用させて繰り返しハイブリダイズ信号を測定すること、前記測定されたハイブリダイズ信号の間のバラツキ値の最大値を求めること、および前記バラツキ値の最大値に安全係数を乗ずることにより閾値を求め、当該ネガティブコントロール群に含まれる第１のプローブの一部に対するフルマッチ核酸との反応により得られるハイブリダイズ信号が閾値以下となる第１のプローブの濃度を決定し、ネガティブコントロールプローブ群を設計することを具備する方法。
【請求項６】
基体と、前記基体の第１の領域内に固定化されたポリヌクレオチドを具備するネガティブコントロールプローブと、前記基体の第２の領域内に固定化された、ターゲット核酸の相補配列を含む第２のプローブを具備するマイクロアレイであって、前記ネガティブコントロールプローブは、塩基配列特異的なハイブリダイゼーションに寄与しない修飾塩基を有するポリヌクレオチドであることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項７】
前記ネガティブコントロールプローブは、５炭糖の１’位に修飾塩基が結合したヌクレオチドを有するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
前記修飾塩基が、２’−デオキシイノシン、および２’−デオキシネブラリンからなる群より選択される修飾塩基であることを特徴とする請求項６記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネガティブコントロールプローブを具備するマイクロアレイ、及びネガティブコントロールの設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイ検出では、バックグラウンド信号レベルを評価する為に用いるネガティブコントロールプローブ（一般的にはＮＣプローブとも称する）を設定する必要がある（非特許文献１）。通常、ＮＣプローブを設定する際には、検体と交差反応する可能性の少ない特定の塩基配列を選定し、基体上に固定化することによりバックグラウンド信号レベル評価に用いることが行われている。
【０００３】
一方、近年、広い範囲の生物界において種の壁を越えてダイナミックに遺伝子配列のやり取りが行われていることが明らかとなっている。例えば、微生物の遺伝子配列の一部が植物遺伝子に組み込まれているといったようなことが確実に起こり得る。このことから、従来のＮＣプローブ設定方法により得られる、検出対象と交差反応する可能性の低い特定の塩基配列を選定するというコンセプトの下で設定されたＮＣプローブでは、種の壁を越えた遺伝子配列のやり取りに起因する意図せざる交差反応を避けることは困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】バイオ実験超基本  Ｑ＆Ａ、p58-61、羊土社
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、マイクロアレイのバックグラウンド信号レベルをより正確に評価することが可能となる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための手段は、
（１）基体と、前記基体の第１の領域内に固定化され、異なる配列を有する複数の第１のプローブを備えるネガティブコントロールプローブ群と、前記基体の第２の領域内に固定化されたターゲット核酸の相補配列を含む第２のプローブとを具備する核酸検出用マイクロアレイであって、前記ネガティブコントロールプローブ群に含まれる複数の第１のプローブの種類は、ネガティブコントロール群とそこに含まれる第１のプローブの一部に対するフルマッチ核酸との反応で得られるハイブリダイズ信号が閾値以下となる数であることを特徴とするマイクロアレイ；および
（２）（１）に記載のマイクロアレイに含まれるネガティブコントロールプローブ群の設計方法であって、ネガティブコントロール群に適用する複数の第1のプローブを別々の領域に固定化したマイクロアレイに対し、同一検体を作用させて繰り返しハイブリダイズ信号を測定すること、前記測定されたハイブリダイズ信号の間のバラツキ値の最大値を求めること、および前記バラツキ値の最大値に安全係数を乗ずることにより閾値を求め、当該ネガティブコントロール群に含まれる第１のプローブの一部に対するフルマッチ核酸との反応により得られるハイブリダイズ信号が閾値以下となる第１のプローブの濃度を決定し、ネガティブコントロールプローブ群を設計することを具備する方法；
である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、マイクロアレイのバックグラウンド信号レベルをより正確に評価することが可能となる手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の一態様についての概念を示す図。
【図２】本発明の原理を説明するための図。
【図３】本発明の一態様により得られるハイブリダイズ信号を示す図。
【図４】本発明の一態様を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に従うマイクロアレイは、基本的には、基体上の検出用プローブ固定化領域に固定化されたターゲット核酸検出用プローブによって目的とする核酸を検出するための装置である。当該装置は、ターゲット核酸と相補的な配列を有するターゲット核酸検出用プローブと、ターゲット核酸とのハイブリダイズ信号を検出することにより、検体核酸を含む試料中にターゲット核酸が存在するか否かを検出するための装置である。本発明に従うマイクロアレイは、当該ターゲット核酸検出用プローブのほかに、ネガティブコントロールプローブ群を具備する。ネガティブコントロールプローブ群は、バックグラウンド信号を検出するためのプローブであり、これは、当該ターゲット核酸検出用プローブが固定化されている基体の同一面に配置されたネガティブコントロールプローブ固定化領域に固定化される。
【００１０】
ここで使用される「マイクロアレイ」は、一般的に使用される「核酸チップ」、「ＤＮＡチップ」および「DNAアレイ」などの用語と同義であり、互いに交換可能に使用される。
【００１１】
本発明において使用される基体は、電流検出型を代表とする電気化学的検出型、蛍光検出型、化学発色型および放射能検出型など、従来公知の何れの種類のマイクロアレイ用の基体であってよい。
【００１２】
何れの種類のマイクロアレイも、それ自身公知の方法により製造することが可能である。例えば、電流検出型マイクロアレイの場合、ネガティブコントロールプローブ固定化領域および検出用プローブ固定化領域は、それぞれ異なる電極上に配置されればよい。
【００１３】
ここで使用される「ハイブリダイズ信号」とは、プローブとその相補配列とのハイブリダイズにより生じる信号であり、当該マイクロアレイの検出方式により、例えば、電流値、蛍光光度、発光光度などとして検出される検出信号を総称するものである。
【００１４】
当該ネガティブコントロールプローブの塩基配列は、人工的にランダムに合成および／または選択された塩基配列であってもよく、通常自然界に存在する何れの塩基配列であってもよい。
【００１５】
本発明に従うネガティブコントロールプローブは、それ自身公知の何れの方法により製造されてもよく、自然界に存在する核酸から調製されてもよい。また、目的とする基体に固定化するための必要なそれ自身公知の何れかの修飾を有してもよい。
【００１６】
なお、本発明においては、基体と、ネガティブコントロールプローブを独立して具備するアッセイキットが提供されてもよい。その場合、更に、検出用プローブおよび／または固定化用試薬などが組み合わされて提供されてもよい。
【００１７】
本発明によれば、変異や遺伝子組み換えなどが生じた検体核酸を試料として使用した場合に意図せざる交差反応が生じたとしても、バックグラウンド信号レベルをより正確に評価することが可能となる。
【００１８】
ここで使用される検出用プローブは、それ自身公知の何れの核酸からなってもよく、またそれ自身公知の何れの特徴を有してもよい。
【００１９】
（第１の発明の実施形態）
マイクロアレイ１は図１（ａ）に示すように、基体２と、前記基体２の第１の面に具備される第１の領域であるネガティブコントロールプローブ固定化領域３に固定化された異なる配列を有する複数の第１のプローブ４ａ〜４ｘ（ここで、ｘは２以上の整数である）を備えるネガティブコントロールプローブ群５と、第２の領域である検出用プローブ固定化領域６に固定化された検出用プローブからなる第２のプローブ７を具備する。
【００２０】
第２のプローブ７は、ターゲット核酸の相補配列であればよく、例えば、検体中に存在することが予測される検体核酸配列の相補配列を有すればよい。マイクロアレイ１に対して検体核酸を含む試料を反応させた際に、試料中の目的とする核酸が、第２のプローブ７とハイブリダイズした場合にはハイブリダイズ信号が生じる。このハイブリダイズ信号を検出することにより当該マイクロアレイ１による検出が達成される。図１には検出プローブ固定化領域６は１つしか記載されていないが、従来のマイクロアレイと同様、第３、第４、第５の領域などとして、更なる検出用プローブ固定化領域６が複数設けられてもよい。その場合、更なる検出用プローブ固定化領域には、領域毎に異なる配列のプローブが固定化されてもよく、同じ配列のプローブが固定化されてもよい。
【００２１】
一方、ネガティブコントロールプローブ群５は、当該マイクロアレイの装置毎の測定におけるバックグラウンド信号を測定するために利用される。ネガティブコントロールプローブ群５は、当該マイクロアレイのネガティブコントロール固定化領域３に固定化されて提供される。ネガティブコントロールプローブ群５が複数のネガティブコントロールプローブ固定化領域３に固定化されて提供されてもよい。
【００２２】
バックグラウンド信号レベルをより正確に求める必要がある場合には、ネガティブコントロール固定化領域３に固定化されるネガティブコントロールプローブ群５の合計量は、検出用プローブ固定化領域６に固定化される第２のプローブと同量が固定化されることが望ましい。ここでいう同量とは、例えば第２のプローブの量の1/10以上10倍以下の範囲にあればよい。
【００２３】
また、ネガティブコントロール固定化領域３に固定化されるネガティブコントロールプローブ群５の合計量は検出用プローブ固定化領域６に固定化される第２のプローブと同量でなくとも、両者の間で所定の量比をもって固定化されていてもよい。その場合には、各プローブ固定化領域から得られた信号に適切な任意の値（例えば前記所定比率の逆数）を乗ずることによりバックグラウンド、或いはハイブリダイゼーション信号が算出されることとなる。
【００２４】
例えば、ネガティブコントロール固定化領域３に固定化されるネガティブコントロールプローブ群５の合計量が検出用プローブ固定化領域６に固定化される第２のプローブの１／２量であった場合、（１）検出用プローブ固定化領域６から得られるハイブリダイゼーション信号と比較するバックグラウンド信号を、ネガティブコントロール固定化領域３から得られる信号を２倍することにより算出する。あるいは（２）検出用プローブ固定化領域６から得られるハイブリダイゼーション信号を１／２倍し、ネガティブコントロール固定化領域３から得られるバックグラウンド信号と比較する。
【００２５】
当該ネガティブコントロールプローブ群５は、複数種類のプローブからなり、それらは互いに異なる塩基配列を有する。即ち、第一のプローブは、プローブ４ａ〜プローブ４ｘ（ここで、ｘは、２以上の任意の整数である）からなるプローブの集合体であってよく、更に、同じ種類の配列も複数で具備されてもよい。第１のプローブに含まれるプローブの塩基配列は基本的には、検出しようとするターゲット核酸の相補配列とは異なる配列を有することが望ましい。しかしながら、本発明に従うと、ネガティブコントロールプローブ群に含まれる配列に相補的な配列を有する核酸が、意図せざる交差反応により生じ、それがネガティブコントロールプローブ群に適用された場合であっても、閾値以下のハイブリダイズ信号強度しか生じないように設計される。従って、必ずしもネガティブコントロールプローブ群に含まれるプローブの配列が検体核酸の相補鎖と異なる必要はない。
【００２６】
当該ネガティブコントロールプローブ群５を構成する各々のプローブは、これとフルマッチの塩基配列を有する核酸とハイブリダイズした場合であっても、ネガティブコントロールプローブ群５全体としてはハイブリダイズ信号が検出されない。即ち、当該ネガティブコントロール群５は、ネガティブコントロールプローブ群５に含まれる複数種類のプローブのうちの１つの種類のプローブと、それと完全にマッチする配列とが反応した場合でも、有効な信号強度とそれ以下の信号強度とを分けるための閾値よりも小さな値を示すように設計されればよい。
【００２７】
このような設計は、ネガティブコントロール群５に含まれるプローブの種類を増やすことにより得ることができる。ネガティブコントロール固定化領域３に固定化されているネガティブコントロールプローブ群５からのハイブリダイズ信号、例えば、電気化学的信号、蛍光信号、化学発色信号などの信号は、ネガティブコントロールプローブ固定化領域３に存在する塩基配列の種類をある程度多くすることにより、意図せざる交差反応により生じたネガティブコントロールプローブ群内のハイブリダイズ信号を低く抑えることできる。例えば、プローブコントロール群に含まれるプローブの種類が増えれば増えるほど、意図せざるハイブリダイズ信号は低くなる。これは、１つのネガティブコントロールプローブ固定化領域３に含まれる１つの種類の塩基配列の濃度、即ち、分子数を低く抑えることによる。それにより、ある一定したバックグラウンドとして機能することが可能になる。即ち、図１（ｂ）に示すように、ネガティブコントロールプローブ群５に含まれる同一種類のポリヌクレオチドプローブの量が特定の濃度、即ち、臨界濃度または臨界分子量よりも低い場合（図１（ｂ）においては、破線矢印よりも左側の濃度において）、フルマッチの検体核酸をハイブリダイゼーションさせた場合であってもハイブリダイズによる信号は低く一定した値を取る。従って、このような濃度に同一種類のポリヌクレオチドプローブを抑えることが重要である。このように設計することにより、仮に試料中に含まれる一部の核酸にフルマッチの塩基配列が第１のプローブとして適用されたとしてもハイブリダイズ信号としては検出されない。そのため、ネガティブコントロールプローブ群５全体としては、ネガティブコントロールプローブとしての役割を果たすことが可能となる。
【００２８】
当該ネガティブコントロールプローブ群に含まれるプローブの種類は、多ければ多いほど好ましい。含まれるプローブの種類が多いほど、擬陽性シグナルが生じる確率を減らすことが可能であるので有利である。
【００２９】
ネガティブコントロールプローブ群に含まれるプローブの種類が多いほうがよいことは以下のことから理解することが可能である。
【００３０】
図２ａを参照されたい。図２ａには、１種類、２種類、３種類、４種類および５種類のプローブからなるネガティブコントロールプローブ群を具備するマイクロアレイに対して、各ネガティブコントロールプローブ群に含まれる１つのプローブと１００％相補性を有する核酸を反応させたときのマイクロアレイからのハイブリダイズ信号を検出した結果を示すグラフである。なお、これらプローブ群を構成するプローブ配列の種類数に関わらず、プローブ全体の量及び分子数は均一である。当該グラフの横軸は、固定化したプローブの種類であり、縦軸は検出されたハイブリダイズ信号を示す。当該グラフから分かるように、ネガティブコントロールプローブ群に含まれるプローブの種類が多いほどハイブリダイズ信号は小さくなる。
【００３１】
ここで使用したプローブは、５種類であり、それぞれのプローブは、配列番号１〜５に示されるポリヌクレオチドの何れかを含むプローブである。即ち、１種類で使用したプローブは、配列番号１のポリヌクレオチドを含むプローブである。２種類で使用したプローブは、配列番号１のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号２のポリヌクレオチドを含むプローブである。３種類で使用したプローブは、配列番号１のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号２のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号３のポリヌクレオチドを含むプローブである。４種類で使用したプローブは、配列番号１のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号２のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号３のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号４のポリヌクレオチドを含むプローブである。５種類で使用したプローブは、配列番号１のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号２のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号３のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号４のポリヌクレオチドを含むプローブと配列番号５のポリヌクレオチドを含むプローブである。
【００３２】
配列番号１から５のポリヌクレオチドは、ヒトパピローマウイルス（図中「ＨＰＶ」と記す。また、以下「ＨＰＶ」とも記す）に由来するポリヌクレオチドである。図２ａのグラフはこれらを電流検出型のマイクロアレイに固定化し、検体として配列番号１に相補的なポリヌクレオチドを適用し、生じたハイブリダイズ信号を電流値として検出した結果である。また、図中の黒菱形は、検体の濃度が１０１２コピー／ｍＬのときの電流値であり、黒四角は５倍希釈したときの電流値であり、黒三角は１０倍希釈したときの電流値である。
【００３３】
また、同じデータをプローブの種類ではなく、ネガティブコントロールプローブ群に含まれる１つの種類の核酸の濃度により示した図が図２ｂである。図２ｂに示すグラフは、横軸に着目した１種類の核酸の濃度を示し、縦軸にはハイブリダイズ信号を示す。
【００３４】
図２ｂから分かるように濃度が低いほどハイブリダイズ信号は小さくなる。即ち、ネガティブコントロールプローブ群に含まれるプローブの種類を多くすることにより、そこに存在する同じ種類のプローブの濃度は下がり、それにより検出されるハイブリダイズ信号を低下することが可能になる。本発明に従うネガティブコントロールプローブ群は、このような原理を利用し、検出されるハイブリダイズ信号が有効な信号強度よりも小さい値となるように、即ち、予め設定した閾値以下となるように、ネガティブコントロールプローブ群に異なる種類の配列を有するプローブを含ませればよい。
【００３５】
例えば、同一のネガティブコントロール固定化領域３内に固定化されるプローブの種類は、例えば、３種類以上、４種類以上、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上、１０種類以上、５０種類以上、１００種類以上であればよく、好ましくは５０種類以上または６０種類以上、より好ましくは１００種類以上、４ｎ種類以下（ここで、ｎはプローブの塩基数を示す）を同一基体の同一領域内に固定化すればよい。
【００３６】
また、１つのネガティブコントロール群に含まれるプローブは、その長さが同じであってもよく、異なっていてもよい。しかしながら、検出用プローブと同じ長さを有することが好ましい。また、種類の異なるプローブ間でその濃度が同じであっても、異なっていてもよい。
【００３７】
図３を参照されたい。図３には、ＨＰＶ１８（配列番号１）、ＨＰＶ３３（配列番号２）、ＨＰＶ５８（配列番号３）およびＨＰＶ６８（配列番号４）をネガティブコントロールプローブとして基体に固定化して得た電流検出型マイクロアレイに対して、１００％相補的なターゲット核酸を２つの濃度で反応させて得たハイブリダイズ信号を電流値として検出した結果を示す。それぞれのプローブを、精製水に０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭおよび３μＭとなるように溶解して、得られたプローブ溶液を１００ｎＬずつ電極に固定化した。何れの核酸を固定化した場合においても、濃度が低いほどハイブリダイズ信号は小さくなった。
【００３８】
従って、当該ネガティブコントロール群に含まれるプローブは、検体核酸に対してフルマッチの配列を有しても、同一領域内に固定化するための同一種類のプローブとして、得られる信号強度が有効な信号強度より小さい、即ち特定の閾値以下となるよう、例えば、１μＭ以下、０．５μＭ以下、好ましくは０．１μＭ以下または０．０５μＭ以下で固定化されればよい。そのようなネガティブコントロール群の固定化は、例えば、同一種類のプローブの濃度が上記のような濃度になり、且つ固定化されるネガティブコントロールプローブ群合計量の濃度が、第２のプローブと同量となるように異なる種類のプローブを混合して、ネガティブコントロールプローブ群溶液を調製し、それを用いて基体のネガティブコントロール固定化領域にプローブを固定化すればよい。このようなネガティブコントロールプローブ群溶液も本発明の範囲に含まれ、例えば、当該溶液を具備するキットとして提供されてもよい。
【００３９】
また、前記濃度とするためには、例えば、異なる塩基配列の種類を、３種類以上、４種類以上、５種類以上、６種類以上、７種類以上、８種類以上、９種類以上、１０種類以上、５０種類以上、１００種類以上であればよく、好ましくは５０種類以上または６０種類以上、より好ましくは１００種類以上、４ｎ種類以下（ここで、ｎはプローブの塩基数を示す）を同一基体の同一領域内に固定化すればよい。
【００４０】
何れの検出型のマイクロアレイであっても、前記閾値は、次のように求めることが可能である。即ち、複数種のプローブを別々の領域に固定化したマイクロアレイに対し、各々のプローブに相補的な同一検体を作用させ繰り返しハイブリダイズ信号量を測定する。次に繰り返し測定した各プローブ毎のハイブリダイズ信号量の測定値間のバラツキの範囲を求め、そのバラツキの最大値に、安全係数を乗じたものを閾値とすればよい。それにより何れの検出型のマイクロアレイについても閾値を求めることが可能である。
【００４１】
このようにして求めた閾値よりも低いハイブリダイズ信号が得られるように各プローブの濃度を決定する。そして各濃度のプローブを混合して、または当該各濃度になるようにプローブを混合して、ネガティブコントロールプローブ群を形成すればよい。
【００４２】
また、電流検出型以外の検出様式のマイクロアレイの場合では、その様式により感度が異なる場合がある。その場合であっても、上述した方法により閾値を求め、その閾値以下となるのに必要な種類のプローブを混合してネガティブコントロール群を作製すればよい。またはそのような閾値以下となるのに必要なプローブの濃度を求めて臨界濃度とし、臨界濃度以下となるように複数種類のポリヌクレオチドを含むプローブを混合し、基体にネガティブコントロールプローブ群を作製してもよい。
【００４３】
本発明はまた、ネガティブコントロールプローブ群を設計する方法も提供する。そのような方法の例は次の通りである。まず、複数種のプローブを別々の領域に固定化したマイクロアレイに対し、同一検体を繰り返し測定し、測定間のハイブリダイズ信号量のバラツキの範囲を求める。次に得られたバラツキの値の最大値に、測定手段に応じた安全係数を乗ずることにより閾値を求める。次に、１００％の相補鎖を適用したときに得られるハイブリダイズ信号量が当該閾値以下となるようなプローブ濃度条件を求める。当該条件を満たすように複数の種類のプローブの濃度を選択することにより、ネガティブコントロールプローブ群を設計することが可能である。このような設計方法は、それ自身公知の何れの検出型のマイクロアレイのネガティブコントロール群に対しても適用することが可能である。なお、安全係数は、使用条件の数値の、理論値や実験によって求められる使用上限の数値に対する倍率である。
【００４４】
当該マイクロアレイにより検出した結果は、検出用プローブ固定化領域から得られたハイブリダイズ信号からネガティブコントロール固定化領域から得られたハイブリダイズ信号を引くことにより算出すればよい。
【００４５】
（第２の発明の実施形態）
更なる実施形態において、マイクロアレイ１１は、図１（ｃ）に示すように、基体１２と、第１の領域としてのネガティブコントロールプローブ固定化領域１３に固定化されたネガティブコントロールプローブである第１のプローブ１４と、第２の領域としての検出用プローブ固定化領域１６に固定化された検出用プローブである第２のプローブ１７を具備する。
【００４６】
第２のプローブ１７は、第１の実施形態と同様に、ターゲット核酸の相補配列、例えば、検体中に存在することが予測される検体核酸配列の相補配列を有する。マイクロアレイ１１に対して核酸を含む検体を反応させた際に、検体中の目的とする核酸が、第２のプローブ１７とハイブリダイズした場合にはハイブリダイズ信号が生じる。このハイブリダイズ信号を検出することにより当該マイクロアレイ１１による検出が達成される。データについては、得られたデータからネガティブコントロールプローブより得られたハイブリダイズ信号をバックグラウンドとして差し引く処理を行う。図１（ｄ）には検出プローブ固定化領域１６は１つしか記載されていないが、従来のマイクロアレイと同様、検出プローブ固定化領域１６が複数設けられてもよく、各々の領域毎に異なる若しくは同じ配列の検出用プローブが固定化されてもよい。
【００４７】
上述したようにネガティブコントロールプローブである第１のプローブ１４は、当該マイクロアレイの装置毎の測定におけるバックグラウンドを測定するために利用される。ネガティブコントロールプローブ１４は、当該マイクロアレイのネガティブコントロールプローブ固定化領域１３に固定化されて提供される。
【００４８】
当該ネガティブコントロールプローブ１４は、修飾塩基を有するヌクレオチド１５を有するポリヌクレオチドである。
【００４９】
ここで使用する「修飾塩基」とは、ヌクレオチドを構成する塩基の部分に塩基配列特異的なハイブリダイズを起こさないような修飾を有する塩基をいう。そのような修飾は、これに限定するものではないが、例えば、２’−デオキシイノシン（2'-deoxyinosine）、および２’−デオキシネブラリン(2'-deoxynebularine)などが含まれる。修飾塩基を使用することにより、仮に、交差反応によりフルマッチの塩基配列が含まれていてもハイブリダイズ信号としては検出されず、ネガティブコントロールプローブとしてのその役割を果たすことが可能である。
【００５０】
同一のネガティブコントロール固定化領域１３に固定化されるネガティブコントロールプローブは、複数種類のヌクレオチドからなる修飾塩基を有するポリヌクレオチドであっても、同一種類のヌクレオチドからなる修飾塩基を有するポリヌクレオチドであってよい。
【００５１】
本実施形態のネガティブコントロールプローブとして提供される修飾塩基を有するポリヌクレオチドは、それ自身公知の方法により合成されてよい。また、目的とする基体に固定化するために必要なそれ自身公知の何れかの修飾を有して提供されてもよい。また、１つのネガティブコントロールに含まれるプローブは、その長さが同じであってもよく、異なっていてもよい。しかしながら、検出用プローブと同じ長さを有することが好ましい。また、種類の異なるプローブ間でその濃度が同じであっても、異なっていてもよい。
【００５２】
当該マイクロアレイにより検出した結果は、検出用プローブ固定化領域から得られたハイブリダイズ信号量からネガティブコントロール固定化領域から得られたハイブリダイズ信号量を引くことにより求めればよい。
【００５３】
［例］
以下に、本発明の例を説明する。
【００５４】
例１
マイクロアレイとして電流検出型核酸チップを用いて、３０ｍｅｒのプローブをネガティブコントロールプローブとして用いる例を説明する。このシステムでは、１５ｎＡ未満の微弱な信号増幅については、測定誤差の範囲内であると捉え、有効な信号と判定するための閾値を１５ｎＡ以上と設定した。
【００５５】
まず、有効なハイブリダイズ信号が与えられないレベルの核酸量および／または分子数の条件を検討するために、異なる配列を有する３０ｍｅｒの合成オリゴ核酸を２００種類混合して、ネガティブコントロールプローブ群とした。これらの塩基配列は、配列表の配列番号１から２００に示す。これらのプローブは、金電極を具備したマイクロアレイの基体に固定化するために３’末端にチオール基を導入した。
【００５６】
基体として、複数の金電極を具備するガラス基板を準備した。
【００５７】
何れのプローブも全体の核酸濃度が終濃度３μＭになるように調製した。１種類の塩基配列を有するポリヌクレオチドを３μＭの濃度になるように滅菌蒸留水中に溶解した。同様に、２種類のポリヌクレオチド（配列番号１および２）を各々終濃度１．５μＭずつ、総核酸濃度で終濃度が３μＭになるように調製した。更に、３種類（配列番号１〜３）から２００種類（配列番号１〜２００）のポリヌクレオチドを含む溶液を、それぞれ総核酸濃度で終濃度が３μＭになるように調製した。即ち、１から複数種類のポリヌクレオチドについて、段階的に種類が増えるように一連のプローブ混合溶液を調製した。これらのプローブの混合種類数の異なる核酸溶液を、同一基板上の異なる金電極上に滴下した。これを常温にて１時間放置し、水洗し、乾燥することにより、金電極上にプローブを固定化した。
【００５８】
一方で、２００種類の前記プローブのうち、各混合溶液に共通して含まれる１種類に対して１００％相補的な配列を含む２００ｍｅｒ程度の核酸断片を準備し、これをターゲット核酸として用いた。
【００５９】
各プローブ溶液を用いてプローブを基体に固定化してマイクロアレイを作製した後、当該マイクロアレイに対して１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液を添加したターゲット核酸を滴下し、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００６０】
ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。
【００６１】
なお、対照区として、基板上に搭載さているプローブ配列のいずれとも全く相補性の無い核酸配列を対照核酸として適用した場合の各電極からの電流値についても同様に反応させてデータを取得した。これをバックグラウンドとし、ターゲットのハイブリッダイゼーションによる電流増加量を算出する際の参考として用いた。その結果、評価を実施した何れのターゲット核酸とプローブとの組み合わせにおいても、ターゲット核酸と１００％相補的な対象プローブの濃度が当該プローブ核酸混合溶液中で０．０５μＭ程度以下の場合、即ち、６０種類程度以上の核酸種を混合した場合に、閾値以下の信号強度となり、有効なハイブリダイズ信号が生じないことを確認した。
【００６２】
以上の評価結果を踏まえ、ウイルス核酸検出用プローブを、プローブ核酸混合溶液中の各配列の濃度が０．０５μＭ程度以下になるように混合し、プローブ固定化電極を試験区として作製した。
【００６３】
他方、プローブと相補的な配列を含むターゲット核酸を１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液を添加して終濃度１０１２コピー／ｍＬに調製し、当該プローブ固定化電極に対して滴下した。これを３５℃で１時間ハイブリダイゼーションし、０．２ｘＳＳＣで１５分間の洗浄をした。その後、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。なお、対照区として３μＭの濃度で単独種類のプローブを固定化した電極も同一基板上に準備した。その結果、対照区では顕著な電流値増加が見られた。他方、試験区では電流値増加、ハイブリダイゼーションに起因する信号が全く観察されなかった。
【００６４】
なお、本実施例では電流検出型核酸チップを使用した例を挙げたが、発明の用途はこれに限定されるものではなく、他の検出方式による核酸チップ、具体的には蛍光検出方式や化学発色方式、ビーズアレイなどにも適用可能である。
【００６５】
また、実施例対象としてウイルス由来配列を使用した例を示したが発明の用途は当然のことながらこれに限定されるものではない。またここでは、３０ｍｅｒの合成オリゴ核酸をプローブとして用いた場合を例示したが、プローブの長さや配列、固定化方法については検出目的や用途などに応じて適切なものを選べばよく、本例記載の条件に限定されるものではない。また、必要に応じて長さの異なるプローブを混合してもよい。
【００６６】
以上のことから、本発明の方法により、例え、プローブと１００％相補的な配列を有するターゲット核酸を検体として用いた場合でも、ネガティブコントロールプローブ群における有効なハイブリダイズ信号の発生を避けることができたので、バックグラウンド信号レベルを正確に評価できるネガティブコントロールプローブ群が提供されることが示された。
【００６７】
なお、本実施例においては、複数のプローブ配列を混合することにより有効なハイブリダイズ信号が与えられないレベルの核酸量および／または分子数の条件を導き出す方法を示したが、実際に多くの種類数を混ぜることは労力を要する。作業を簡便化するため、2種類程度の比較的少ない種類数を用いて、1種類のプローブ配列のみを対象として着目し、プローブ混合液中の対象プローブ濃度、あるいは分子数を変えていくことで、混合するプローブの種類数を変えて使用した場合と同様な結果が得られることを確認している。
【００６８】
例２
図４に示すように例１で得られたネガティブコントロールプローブ群６５を電流検出型マイクロアレイ６１の基体６２のネガティブコントロール固定化領域６３に固定化した。更に、検出用プローブ６６を検出用プローブ固定化領域６４に固定化した。これにより本発明に従うマイクロアレイが提供された。
【００６９】
例３
固定化のために３’末端にチオール基を導入した３０ｍｅｒの２’−デオキシイノシンおよび２’−デオキシネブラリンを塩基として有する合成オリゴ核酸をネガティブコントロールプローブとして準備した。この修飾核酸を構成核酸として有するネガティブコントロールプローブを、３μＭの濃度で滅菌蒸留水中に溶解した。
【００７０】
一方、複数の金電極を具備するガラス基板をマイクロアレイの基体として準備した。
【００７１】
当該金電極上に、３μＭのネガティブコントロールプローブ溶液を滴下し、常温にて１時間放置し、水洗し、乾燥した。これによりネガティブコントロールプローブを具備するマイクロアレイを得た。
【００７２】
様々な配列からなるターゲット核酸を１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液を添加して終濃度１０１２コピー／ｍＬに調製した。これを、上記のように作成したネガティブコントロールプローブを具備したマイクロアレイに対して滴下し、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。その結果、どのようなターゲットを当てた場合においても電流値増加がみられなかった。即ち、当該ネガティブコントロールプローブとターゲット間でのハイブリダイゼーションに起因する信号は全く観察されなかった。
【００７３】
なお、本実施例では電流検出型核酸チップを使用する例を挙げたが、本発明に従うと、他の検出方式による核酸チップ、例えば、蛍光検出型チップ、化学発色型チップ、ビーズアレイなども顕著な効果を有する本発明に従うマイクロアレイとして提供される。
【００７４】
ここでは、３０ｍｅｒの合成オリゴ核酸をプローブとして用いた場合を例示したが、プローブの長さや修飾核酸種については検出目的や用途などに応じて適切なものを選べばよく、本例記載の条件に限定されるものではない。また、必要に応じて長さや核酸種の異なるプローブを混合してもよい。
【００７５】
以上のことから、本発明の方法により、例え、プローブと１００％相補的な配列を有するターゲット核酸を含む検体を試料として用いた場合でも、ネガティブコントロールプローブにおける交差反応による有効なハイブリダイズ信号が生じるのを避けることが可能でことが示された。これにより、バックグラウンド信号レベルを正確に評価可能なネガティブコントロールプローブが提供された。
【００７６】
例４
図１（ｃ）に示すように例３で得られたネガティブコントロールプローブ１４を電流検出型マイクロアレイ１１の基体１２のネガティブコントロール領域１３に固定化した。更に、検出用プローブ１７を検出用プローブ領域１６に固定化した。これにより本発明に従うマイクロアレイが提供された。
【００７７】
例５
マイクロアレイとして電流検出型核酸チップを用いて閾値求めた。
【００７８】
まず、プローブとして、３’末端にチオール基を導入した異なる配列を有する３０ｍｅｒの合成オリゴ核酸を１５種類準備した。基体として、複数の金電極を具備するガラス基板を準備した。
【００７９】
何れの配列を持つプローブも全体の核酸濃度が終濃度３μＭになるように調製し、これらを同一基板上の異なる金電極上に滴下した。これを常温にて１時間放置し、水洗し、乾燥することにより、金電極上にプローブとして固定化し電流検出型核酸マイクロアレイとして供試した。
【００８０】
次に、ＤＮＡチップ上に固定化されたプローブ配列のそれぞれに対して１００％相補的な標的核酸を１０段階の濃度（１０２、１０４，１０６，１０８，１０１０，１０１２，１０１４，１０１６，１０１８，１０２０コピー／ｍｌ）で１／９量の２０ｘＳＳＣ緩衝液に溶解して得た溶液を当該マイクロアレイに対して滴下し、３５℃で１時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００８１】
ハイブリダイゼーション後、０．２ｘＳＳＣで１５分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト３３２５８の電流応答を測定した。それぞれの実験区について少なくとも５０回以上の反復試験を行い、測定結果の再現性及びデバイス自身の特性に起因する測定間のバラツキの程度を評価した。
【００８２】
なお、対照区として、基板上に搭載さているプローブ配列の何れとも全く相補性の無い核酸配列を対照核酸として適用した。これらの各電極からの電流値についても同様に反応を行いデータを取得した。これをバックグラウンドとし、ターゲットのハイブリッダイゼーションによる電流増加量を算出する際の参考として用いた。
【００８３】
その結果、評価を実施した何れのターゲットとプローブとの組み合わせについても、各プローブから得られる電流信号のバラツキの範囲は１０ｎＡ以下であった。
【００８４】
前記のプローブおよびターゲット以外の配列を用いた場合（即ち、２００種類以上の配列）についても、同様な評価を実施した。測定結果の再現性及びデバイス自身の特性に起因する測定間のバラツキの程度を評価した結果、本デバイスを用いた場合には最大で１０ｎＡの信号のバラツキが生じることを確認した。
【００８５】
実際の使用環境は、多分に不確実性を含んだものであるため、ある程度の余裕のある設計を行う必要がある。従って、ここで得られた１０ｎＡのバラツキ実測値に対し、安全係数として１．５を掛け合わせ、１５ｎＡという値をハイブリダイズ信号の閾値として設定した。
【００８６】
以上の結果を踏まえ、本例で使用したシステムでは、１５ｎＡ未満の微弱な信号増加については、測定誤差の範囲内であると捉えた。即ち、有効なハイブリダイズ信号と判定するための閾値を１５ｎＡと設定した。
【００８７】
なお、本例では電流検出型核酸チップを使用した例を挙げたが、発明の用途はこれに限定されるものではなく、他の検出方式による核酸チップ、具体的には蛍光検出方式や化学発色方式、ビーズアレイなどにも適用可能である。また、デバイス構成やその測定系の原理、測定目的などの条件によって前記バラツキの範囲や、安全係数の値などは異なってくる。
【００８８】
また、上述の例では、対象としてウイルス由来配列を使用した例を示したが、閾値設定に用いることの出来る配列はこれに限定されるものではない。ここでは３０ｍｅｒの合成オリゴ核酸をプローブとして用いた例を示したが、プローブの長さや配列については検出目的や用途などに応じて適切なものを選べばよく、本例記載の条件に限定されるものではない。また、必要に応じて長さの異なるプローブを混合してもよい。
【符号の説明】
【００８９】
１    マイクロアレイ
２    基体
３    ネガティブコントロール固定化領域
４    プローブ
５    ネガティブコントロールプローブ群
６    検出用プローブ固定化領域
７    検出用プローブ
１１  マイクロアレイ
１２  基体
１３  ネガティブコントロール固定化領域
１４  ネガティブコントロールプローブ
１５  修飾塩基
１６  検出用プローブ固定化領域
１７  検出用プローブ
６１  マイクロアレイ
６２  基体
６３  ネガティブコントロールプローブ固定化領域
６４  検出用プローブ固定化領域
６５  ネガティブコントロールプローブ群
６６  検出用プローブ群
【図１】
2011027750.tif 000002
【図２】
2011027750.tif 000003
【図３】
2011027750.tif 000004
【図４】
2011027750.tif 000005
【配列表】
2011027750000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月27日(2010.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体と、
前記基体の１検出点としての第１の領域内に固定化され、互いに異なる配列を有する４種類以上のプローブからなるネガティブコントロールプローブ群である第１のプローブ群と、
前記基体の１検出点としての第２の領域内に固定化されたターゲット核酸の相補配列を含むプローブからなる第２のプローブ群と
を具備する核酸検出用マイクロアレイであって、
前記４種類以上のプローブは、各種類のプローブが同濃度で含まれる溶液と前記第１の領域との接触により固定化されたプローブであり、
前記４種類以上のプローブが存在することにより、前記第１のプローブ群に含まれる同種類のプローブからなる群が、それに対するフルマッチ核酸と反応した場合であっても前記第１の領域から検出される信号がバックグラウンド信号として機能することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
基体と、
前記基体の１検出点としての第１の領域内に固定化され、互いに異なる配列を有する４種類以上のプローブからなるネガティブコントロールプローブ群である第１のプローブ群と、
前記基体の１検出点としての第２の領域内に固定化されたターゲット核酸の相補配列を含むプローブからなる第２のプローブ群と
を具備する核酸検出用マイクロアレイであって、
前記４種類以上のプローブは、各種類のプローブが同じ割合であり、
前記４種類以上のプローブが存在することにより、前記第１のプローブ群に含まれる同種類のプローブからなる群が、それに対するフルマッチ核酸と反応した場合であっても前記第１の領域から検出される信号がバックグラウンド信号として機能することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項３】
基体と、
前記基体の１検出点としての第１の領域内に固定化され、互いに異なる配列を有する１０種類以上のプローブからなるネガティブコントロールプローブ群である第１のプローブ群と、
前記基体の１検出点としての第２の領域内に固定化されたターゲット核酸の相補配列を含むプローブからなる第２のプローブ群と
を具備する核酸検出用マイクロアレイであって、
前記１０種類以上のプローブは、各々の種類毎に複数本のプローブを備え、
前記１０種類以上のプローブが存在することにより、前記第１のプローブ群に含まれる同種類のプローブからなる群が、それに対するフルマッチ核酸と反応した場合であっても前記第１の領域から検出される信号がバックグラウンド信号として機能することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項４】
基体と、
前記基体の１検出点としての第１の領域内に固定化され、互いに異なる配列を有する６０種類以上のプローブからなるネガティブコントロールプローブ群である第１のプローブ群と、
前記基体の１検出点としての第２の領域内に固定化されたターゲット核酸の相補配列を含むプローブからなる第２のプローブ群と
を具備する核酸検出用マイクロアレイであって、
前記６０種類以上のプローブは、各々の種類毎に複数本のプローブを備え、
前記６０種類以上のプローブが存在することにより、前記第１のプローブ群に含まれる同種類のプローブからなる群が、それに対するフルマッチ核酸と反応した場合であっても前記第１の領域から検出される信号がバックグラウンド信号として機能することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項５】
前記ネガティブコントロールプローブ群に存在する各種類のプローブが、同濃度で含まれる溶液と前記第１の領域との接触により固定化されたプローブである請求項３または４に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
前記ネガティブコントロールプローブ群に存在する各種類のプローブが、同じ割合である請求項３または４に記載のマイクロアレイ。