(57)【要約】【課題】非病原性であるバチルス属細菌に、Ｃ４０カロテノイドより親水性が高いＣ３０カロテノイド類の生産を行わせる手段を提供すること。【解決手段】プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能に連結された、デヒドロスクアレンシンターゼをコードするｃｒｔＭ遺伝子と、デヒドロスクアレンデサチュラーゼをコードするｃｒｔＮ遺伝子とを含むＣ３０カロテノイド合成遺伝子を組み込んだベクターを枯草菌等のバチルス属細菌に導入し、前記Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子を発現させ、ジアポリコペン及び/又はジアポニューロスポレンを含むＣ３０カロテノイド組成物を製造する。Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子として、さらにジアポニューロスポレンオキシダーゼをコードするｃｒｔＰ遺伝子や、グリコシルトランスフェラーゼをコードするｃｒｔＱ遺伝子を用いることもできる。【選択図】図１
2011135856.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能に連結された、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを含むＣ３０カロテノイド合成遺伝子を組み込んだベクターをバチルス属細菌に導入し、前記Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子を発現させ、ジアポリコペン及び／又はジアポニューロスポレンを含むＣ３０カロテノイド組成物を製造する方法。
【請求項２】
ベクターとして、プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能にｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子の順序で組み込まれているベクターを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子が、さらにｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子とを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
Ｃ３０カロテノイド組成物が、さらにジアポニューロスポレン酸及び／又はグルコシルジアポニューロスポレンを含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ベクターとして、プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能にｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子、ＣｒｔＰ遺伝子、ＣｒｔＱ遺伝子の順序で組み込まれているベクターを用いることを特徴とする請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子として、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【請求項７】
Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子として、スタフィロコッカス・アウレウス由来のｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子とを用いることを特徴とする請求項３〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
バチルス属細菌が、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）、バチルス・パミルス（B.pumils）、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・ラテロスポルス（B.laterosporus）、バチルス・アルベイ（B.alvei）、バチルス・ポピリエ（B.popilliae）、及びバチルス・リチェニフォルミス（B.licheniformis）からなる群から選ばれるいずれか１種又は２種以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス属（Bacillus）細菌において、ｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子等を発現させることで、ジアポリコペン、ジアポニューロスポレン等を含むＣ３０カロテノイド組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイド類は、黄色から赤色又は紫色の天然に広く分布するポリエン色素化合物で、６００種以上が植物、微生物、動物から単離されている。中でも炭素数４０のベータカロテンは、ビタミンＡの前駆体として脊椎動物において重要な働きをすることが知られているが、脊椎動物はカロテノイドを体内で作り出すことができないため、果実や野菜等を通じて摂取されている（例えば非特許文献１等参照）。
【０００３】
すでにカロテノイド類は、食品着色剤や化粧品成分として使用されているほか、近年の研究により、がんや心臓疾患等の重篤な疾病に対する防御に関与することが報告されていることから、健康維持に重要な作用をする化合物として、医薬品産業や食品産業において需要が拡大することが予想され、化学合成法により工業的に生産されているが、近年は、安全面の不安等の理由から天然物由来のカロテノイド類が求められている。
【０００４】
かかる天然物由来のカロテノイド類の生産に組換え微生物が利用されている。カロテノイド生合成遺伝子としては、例えば、Ｃ４０カロテノイド生合成細菌であるパントエア（Pantoea）属細菌（従前はエルウィニア(Erwinia)属細菌とも呼ばれていた）由来の遺伝子が用いられ、具体的には、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＺ、ｃｒｔＸ等がよく用いられている。これらの遺伝子は大腸菌（Escherichia coli）に導入された場合にもさまざまなＣ４０カロテノイド化合物が産生されることも確認されている（例えば非特許文献２等参照）。また、その乾燥細胞重量の少なくとも約２０％まで脂質を蓄積できる酵母や真菌を利用してカロテノイドを生産する方法も報告されている（例えば特許文献１等参照）。
【０００５】
上記Ｃ４０カロテノイド類は、イソプレノイド生合成経路のファルネシル二リン酸から、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を経由して産生されるが、他方、ファルネシル二リン酸からデヒドロスクアレンを経由するＣ３０カロテノイド合成経路が存在することも確認されている。Ｃ３０カロテノイド組成物を産生する微生物としてはスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）がよく知られている。スタフィロコッカス・アウレウスにおいては、ファルネシル二リン酸を基質としてｃｒｔＭ遺伝子がコードするデヒドロスクアレンシンターゼによりデヒドロスクアレンが産生され、このデヒドロスクアレンを基質としてｃｒｔＮ遺伝子がコードするデヒドロスクアレンデサチュラーゼによる３段階の反応を経て、ジアポニューロスポレンが産生される。ひきつづいて、ｃｒｔＰ遺伝子がコードするジアポニューロスポレンオキシダーゼによりジアポニューロスポレン酸、ｃｒｔＱ遺伝子がコードするグルコシルトランスフェラーゼによりグルコシルジアポニューロスポレン、ｃｒｔＯ遺伝子がコードするアシルトランスフェラーゼにより、Ｃ３０カロテノイド配糖体であるスタフィロキサンチンが産生されるものと推定されており、ｃｒｔＯＰＱＭＮが組み込まれたベクターで形質転換されたスタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）において、スタフィロキサンチンが過剰発現されることが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。さらに、スタフィロコッカス・アウレウス内で産生されるスタフィロキサンチンの抗オキシダント特性が、スタフィロコッカス・アウレウスに、食細胞等の宿主免疫系からの攻撃に対して耐性を付与していることも示唆されていることから（例えば、特許文献２参照）、カロテノイド合成阻害剤である高脂血漿治療薬が、スタフィロコッカス・アウレウス感染症の治療薬に転用可能であることが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
また、Ｃ３０カロテノイド類は、Ｃ４０カロテノイド類と比較すると、より親水性が高い等の異なる特性を有するため、Ｃ３０カロテノイド類についても大量生産をすることが望まれているが、スタフィロコッカス属菌は、多くは日和見感染菌であり、中でもスタフィロコッカス・アウレウスのように食中毒菌であるクラス２に分類される弱毒菌に相当する菌もあるため、より安全な菌でのＣ３０カロテノイド組成物の生産が試みられている。例えば、ｃｒｔＮ遺伝子の産物であるデヒドロスクアレンデサチュラーゼ等を含むカロテノイド遺伝子産物の１つ又は複数を異種発現するバチルスやバチルスからの抽出物の使用について提案されている（例えば、特許文献３参照）が、各種カロテノイド産生酵素の発現が期待される遺伝子についての記述があるものの、実際に実施例において得られたバチルスは、排便直後のヒト糞便中に存在する着色を維持した耐熱胞子を分離したもので、実際に産生が確認されたカロテノイドは、Ｃ４０カロテノイドであるデメチルスフェロイデンやフィトエン等であって、Ｃ３０カロテノイドの産生が確認されている訳ではない。また、これまでにバチルス属細菌においてＣ３０カロテノイドが産生されたとの報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００８−５３７８７８号公報
【特許文献２】特表２００８−５３６９３３号公報
【特許文献３】特開２００９−５２１２１２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nelis et al., Appl. Bacteriol., 1991 (70), pp181-191
【非特許文献２】Misawa, N et al., J. Bacteriol., 177, 6575-6584, 1995
【非特許文献３】Pelz et al., Journal of Biological Chemistry Vol. 280, No. 37, pp32493-32498, September 16, 2005
【非特許文献４】Science, March 7, 2008, vol. 319, p1391-1394
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、非病原性であるバチルス属細菌に、Ｃ４０カロテノイドより親水性が高いＣ３０カロテノイド類の生産を行わせる手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本来、カロテノイド合成を行わない出芽酵母等の安全な微生物であるとの認識が高い宿主に、カロテノイド合成に必要とされる３つの遺伝子、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩを導入するとこれらの宿主にカロテノイドを生産させることが可能であることが明らかとなっていることから、発明者らは出芽酵母同様に安全な宿主と考えられているバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）に注目し研究を開始した。かかる研究開発において、まず、大腸菌に土壌細菌パントエア・アナナティス（P. ananatis）（旧学名E. uredovora）のｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩを導入したところ、赤色カロテノイドであるリコペンが合成され菌体が赤色に変化することを確認した。次に、バチルス・ズブチリスに上記三つの遺伝子を導入した結果、カロテノイドの蓄積は認められなかった。かかるバチルス・ズブチリスにおける結果は、組換えバチルス・ズブチリスにカロテノイドを生産させようという試みがこれまで成し遂げられていないという、他の研究グループによる結果と同じものであった。これらの原因について考察したところ、遺伝子導入したバチルス・ズブチリスにおいて、導入遺伝子が発現していない可能性、伝令ＲＮＡからタンパク質への翻訳が行われない可能性、バチルス・ズブチリスにおいてはカロテノイド基本骨格でありＣｒｔＥ酵素の基質となるゲラニルゲラニルピロリン酸の供給が不十分である可能性等が考えられた。そして、研究を進めるにあたりこれらの可能性の中から、バチルス・ズブチリスでは導入遺伝子の機能不全でカロテノイド合成が行われないという仮説を立てた。
【００１１】
そこで、本発明者らは、バチルス・ズブチリスを宿主とした場合に、宿主細胞中でカロテノイド合成遺伝子が好適に発現しうるベクターシステムの構築について鋭意検討し、種々のカロテノイド合成遺伝子の組合せからなるベクターシステムを構築し、実際にバチルス・ズブチリスにおいてカロテノイドが産生されるかどうか調べる実験を数多く行ったところ、意外にもＣ４０カロテノイド類ではなく、Ｃ３０カロテノイド類の産生に関与するスタフィロコッカス・アウレウス由来のカロテノイド合成遺伝子であるｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを組み合わせたベクターシステムを構築し、バチルス・ズブチリスに導入したところ、世界で始めてバチルス属細菌にＣ３０カロテノイド類を産生させることに成功し、産生されたカロテノイドが抗酸化活性を有することを見いだした。スタフィロコッカス・アウレウスにおけるＣ３０カロテノイドの生合成経路の研究においては、ジアポリコペンが生成することは報告されていないのに対し、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを導入した形質転換バチルス菌においては、ジアポニューロスポレンとジアポリコペンとの混合物を産生することを確認した。さらに、ｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子とを組み込んだベクターを導入した、形質転換バチルス菌においては、グルコシルジアポニューロスポレンが産生することをも確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能に連結された、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを含むＣ３０カロテノイド合成遺伝子を組み込んだベクターをバチルス属細菌に導入し、前記Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子を発現させ、ジアポリコペン及び/又はジアポニューロスポレンを含むＣ３０カロテノイド組成物を製造する方法や、（２）ベクターとして、プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能にｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子の順序で組み込まれているベクターを用いることを特徴とする上記（１）記載の方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、（３）Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子が、さらにｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子とを含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法や、（４）Ｃ３０カロテノイド組成物が、さらにジアポニューロスポレン酸及び/又はグルコシルジアポニューロスポレンを含むことを特徴とする上記（３）記載の方法や、（５）ベクターとして、プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能にｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子、ＣｒｔＰ遺伝子、ＣｒｔＱ遺伝子の順序で組み込まれているベクターを用いることを特徴とする上記（３）又は（４）記載の方法や、（６）Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子として、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを用いることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載の方法や、（７）Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子として、スタフィロコッカス・アウレウス由来のｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子とを用いることを特徴とする上記（３）〜（６）のいずれか記載の方法や、（８）バチルス属細菌が、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）、バチルス・パミルス（B.pumils）、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・ラテロスポルス（B.laterosporus）、バチルス・アルベイ（B.alvei）、バチルス・ポピリエ（B.popilliae）、及びバチルス・リチェニフォルミス（B.licheniformis）からなる群から選ばれるいずれか１種又は２種以上であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、バチルス・ズブチリスにジアポリコペンとジアポニューロスポレン等のＣ３０カロテノイドを合成させることが可能となった。また、得られたジアポリコペンとジアポニューロスポレン等のＣ３０カロテノイドは抗酸化活性を有することが示された。本発明は、将来的に有用性が見込まれるＣ３０カロテノイドを安全な微生物宿主を用いて生産することを可能にした点で価値のあるものである。Ｃ４０カロテノイド類に比べると、Ｃ３０カロテノイド組成物の抗酸化活性や生理的役割については未解明の部分が多く残っているが、バチルス属細菌を用いてＣ３０カロテノイド組成物を安全に生産し供給する技術を開発したことの意義は大きいと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮの構造を示す。
【図２】カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株とコントロール株の菌体懸濁液の色調を（ａ）に示し、カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株とコントロール株のアセトン抽出溶液の色調を（ｂ）を示す。
【図３】カロテノバチルスｃｒｔＭＮ菌体からの色素抽出物のクロマトグラム（ａ）と、ジアポリコペン（ｂ）とジアポニューロスポレン（ｃ）の吸収スペクトルを示す。
【図４】カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株とコントロール株のアセトン抽出物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトラムを示す。
【図５】カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株とコントロール株の過酸化水素ストレスに対する抵抗性の結果を示す。
【図６】カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮＰＱの構造を示す。
【図７】カロテノバチルス−ｃｒｔＭＮＰＱ菌体からの色素抽出物のクロマトグラム（ａ）と、グルコシルジアポニューロスポレン（ｂ）とジアポニューロスポレン（ｃ）の吸収スペクトルを示す。
【図８】Ｃ３０カロテノイドの生合成経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のＣ３０カロテノイド組成物を製造する方法としては、プロモーターと該プロモーターの下流に作動可能に連結された、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを含むＣ３０カロテノイド合成遺伝子を組み込んだベクターをバチルス属細菌に導入し、前記Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子を発現させ、ジアポリコペン及び/又はジアポニューロスポレンを含むＣ３０カロテノイド組成物の製造方法であれば特に制限されず、上記Ｃ３０カロテノイドとしては、イソプレノイド単位の配置が分子の中央で逆転するような様式で結合する６個のイソプレノイド単位からなる化合物又はその誘導体を挙げることができ、具体的には、ジアポニューロスポレン、ジアポリコペン、ジアポニューロスポレン酸、グルコシルジアポニューロスポレン、ジアポニューロスポレノールを好適に例示することができる。
【００１７】
上記Ｃ３０カロテノイド遺伝子としては、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを含むＣ３０カロテノイド合成酵素をコードする遺伝子であれば特に制限されず、上記ｃｒｔＭ遺伝子やｃｒｔＮ遺伝子の他に、ｃｒｔＰ遺伝子やｃｒｔＱ遺伝子を具体的に例示することができる。かかるｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを含むＣ３０カロテノイド遺伝子はプロモーターの下流に作動可能に連結され、ベクターに組み込んで用いられる。
【００１８】
上記ｃｒｔＭ遺伝子は、デヒドロスクアレンシンターゼをコードする遺伝子であり、デヒドロスクアレンシンターゼは、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）をデヒドロスクアレンに変換する酵素活性を有するタンパク質である（図８参照）。ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）とは、カロテノイド生合成経路において、Ｃ３０カロテノイド生合成経路とＣ４０カロテノイド生合成経路との分岐点に位置する化合物であり、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）にデヒドロスクアレンシンターゼが作用することにより、Ｃ３０カロテノイドの生合成経路へと進むことができる。
【００１９】
上記ｃｒｔＮ遺伝子は、デヒドロスクアレンデサチュラーゼをコードする遺伝子であり、デヒドロスクアレンデサチュラーゼは、上記デヒドロスクアレンを、３段階の反応を経ることによりジアポニューロスポレンに変換し、４段階の反応を経ることによりジアポリコペンに変換する酵素活性を有するタンパク質である（図８参照）が、ジアポニューロスポレンとジアポリコペンの産生量の割合は、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子の発現の順序や、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子の上流に位置するプロモーターの位置や強度等により調整することができ、例えば、テトラサイクリン（ＴｃＲ）プロモーターの下流に作動可能にｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子の順序で組み込まれているベクターを用いた場合は、ジアポニューロスポレンとジアポリコペンをほぼ同量得ることができる。
【００２０】
上記ｃｒｔＰ遺伝子は、ジアポニューロスポレンオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ジアポニューロスポレンオキシダーゼは、ジアポニューロスポレンをジアポニューロスポレン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質である（図８参照）。また、上記ｃｒｔＱ遺伝子は、グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であり、グルコシルトランスフェラーゼは、ジアポニューロスポレン酸をグルコシルジアポニューロスポレンに変換する酵素活性を有するタンパク質である（図８参照）。これらｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子は、例えば、プロモーターの下流に作動可能にｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子、ｃｒｔＰ遺伝子、ｃｒｔＱ遺伝子の順序で発現ベクターに組み込んで用いることができる。
【００２１】
また、上記ｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子、ｃｒｔＰ遺伝子、ｃｒｔＱ（Ｐ→Ｑ）遺伝子を得ることができる細菌としては、これら遺伝子を有するスタフィロコッカス・アウレウス、ラクトバチルス・プランタルム、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、アカリオクロリス・マリナ(Acaryochloris marina)、シネココッカス属細菌（Synechococcus sp.）などを例示することができ、中でも、ＧＣ含量がバチルス属細菌と同様に５０％未満の細菌、例えばスタフィロコッカス・アウレウスが好ましい。
【００２２】
本発明に用いられるプロモーターとしては、該プロモーターの下流に作動可能に連結されたｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とを発現させることができるプロモーターであれば特に制限されないが、ｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子とをさらに発現させることができるプロモーターであることが好ましく、また、Ｃ３０カロテノイド遺伝子が導入された細胞を選別できる点で、その下流に薬剤耐性マーカー遺伝子が作動可能に連結されているプロモーター、具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、トリメトプリム、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、多剤耐性遺伝子等のプロモーターを好適に挙げることができる。
【００２３】
本発明に用いられるベクターとしては、バチルス属細菌内に導入された場合に上記Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子の発現に適した発現ベクターであれば特に制限されず、かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましい。また、上記Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子が発現できる位置に該プロモーターの他、エンハンサー、ターミネーター、ＳＤ配列等の制御配列を含有しているものも好適に使用することができる。例えば、ｐＢＴｒＰ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２(いずれもべーリンガーマンハイム社製)、ｐＳＥ２８０(Invitrogen社製)、ｐＧＥＭＥＸ−１(Promega社製)、ｐＱＥ−８(Qiagen社製)、ｐＱＥ−３０(Qiagen社製)、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ株式会社製）、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等を例示することができるが、ｐＨＹ３００ＰＬＫが好ましい。
【００２４】
上記のＣ３０カロテノイド合成遺伝子を、自立複製可能である発現ベクター、例えば発現コスミドベクター又は発現プラスミドベクター、好ましくは発現プラスミドベクターに適切にインテグレイトすることにより、バチルス属細菌にＣ３０カロテノイドを産生させることができる組換えベクターを構築することができる。また、上記Ｃ３０カロテノイド合成遺伝子をベクターに導入する際には、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)により行うことができる。
【００２５】
上記のＣ３０カロテノイド合成遺伝子を組み込んだ組換えベクターはバチルス属細菌内に導入される。組換えベクターをバチルス属細菌へ導入する方法としては、Molecular Cloning: A laboratory Manual,3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 2001.（モレキュラークローニング第３版）等に記載されている方法などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、接合伝達（コンジュゲーション）法等により行うことができるが、エレクトロポレーション法が好ましい。
【００２６】
本発明に用いられるバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）、バチルス・パミルス（B.pumils）、バチルス・レンタス（B.lentus）、バチルス・ラテロスポルス（B.laterosporus）、バチルス・アルベイ（B.alvei）、バチルス・ポピリエ（B.popilliae）、バチルス・リチェニフォルミス（B.licheniformis）等を挙げることができるが、中でもバチルス・ズブチリスが特に好ましい。
【００２７】
次いで、組換えベクターが導入され、形質転換されたバチルス属細菌を培養し、該形質転換細胞又はその培養液を回収し、Ｃ３０カロテノイド組成物を公知の方法により精製することによりＣ３０カロテノイド組成物を単離することができ、例えば、溶媒抽出した後、遠心分離、ろ過等を行うことにより抽出することができ、必要に応じてカラムクロマトグラフィー等の通常の精製手段を用いて精製することができる。
【００２８】
本発明により製造されたＣ３０カロテノイド組成物は抗酸化活性を有する。抗酸化活性の強度は、Ｈ２Ｏ２生存試験法、ベータカロテン法、ＤＰＰＨ法、ロダン鉄法等の周知の方法により測定することができる。例えば、Ｈ２Ｏ２生存試験法は、本発明に用いられるバチルス属細菌等の被検微生物を加えた液にＨ２Ｏ２を添加することで、被検微生物の抗酸化能を測定する方法であり、より具体的には、被検バチルス属細菌を遠心分離にて集菌し、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、５００μＬずつ３つのチューブに分配し、３つのチューブそれぞれに、０ｍＭ、５０ｍＭ、又は１００ｍＭのＨ２Ｏ２を添加して暗室で氷上に静置し、６０分後に菌体細胞を集菌して１ｍＬのＰＢＳで洗浄後、適当な培地上で培養した後、コロニー数をカウントすることで、コロニー数が多くカウントされた被検バチルス属細菌ほど抗酸化活性が高いことが示される。
【００２９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
［カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮの作製］
枯草菌−大腸菌シャトルベクターであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ株式会社製）のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩサイトに、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子を挿入し、カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮを以下のように作製した。
ＤＮｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅ キット（Qiagen社製）を用いて、スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＴＣ５０５８１株細胞の全ＤＮＡを抽出した。以下のプライマー；
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＣ−３’
（配列番号１）（フォワード）（ＢａｍＨＩサイトが導入された部分は下線で示す）
５’−ＣＧＣＣＧＴＣＧＡＣＣＧＴＴＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧ−３’
（配列番号２）（リバース）（ＳａｌＩサイトが導入された部分は下線で示す）
を用いて、人工的なShine-Dalgano（ＳＤ）配列を上流に付加したｃｒｔＭ遺伝子のＯＲＦと、ｃｒｔＮ遺伝子のＳＤ配列及びＯＲＦを増幅し、ｐＧＥＭＴベクター（Promega社製）にクローニングした。得られたプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩとで消化し、ｃｒｔＭＮ断片を作製した。ｐＨＹ３００ＰＬＫをＢａｍＨＩとＳａｌＩとで消化し、上記ｃｒｔＭＮ断片を挿入して、カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮを構築した。
【００３１】
上記カロテノイド産生プラスミドであるｐＨＹｃｒｔＭＮの構造を図１に表す。図１中、矢印は転写又は複製の方向を示し、Ｏｒｉ−１７７は、ｐＡＣＹＣ１７７由来の複製起点を示し、Ｏｒｉ−ｐＡＭα１は、プラスミドｐＡＭα１由来の複製起点を示し、ＡｐＲは、アンピシリン耐性遺伝子を示し、ＴｃＲは、テトラサイクリン耐性遺伝子を示す。
【００３２】
［カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株の作製］
バチルス・ズブチリスＪＨ６４２株は、法政大学大学院工学研究科佐藤博士より供与された。スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＴＣ５０５８１株は、National Collection of Type Culture（イギリス）にて保管されており、一定条件下で分譲可能である。
【００３３】
一晩Tryptic soy broth（TSB；関東化学社製）で培養したバチルス・ズブチリスＪＨ６４２株の培養液２ｍＬを、０．５Ｍソルビトールを含有するＬＢ培地３２ｍＬに植菌して培養を継続し、ＯＤ６００が０．８５〜０．９５になったところで氷上に静置した。１０分間後遠心分離し、得られた菌体を氷冷した溶液Ａ（０．５Ｍソルビトール及び０．５Ｍマニトールを含有する１０％ｖ／ｖグリセロール）１０ｍＬ中に懸濁した。遠心分離と再懸濁の工程を合計４回繰り返し、得られた菌体を０．８ｍＬの溶液Ａに再懸濁してバチルス・ズブチリス細胞懸濁液とした。該バチルス・ズブチリス細胞懸濁液７０μＬに前記のカロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮ２００ｎｇを添加した後、エレクトロポレーション用キュベットに移した。２５μＦ、２ｋＶ／ｍｍ及び２５０Ωの条件で、ジーンパルサー（Biorad社製）を用いてエレクトロポレーションを行った後、バチルス・ズブチリス細胞は、直ちに０．５Ｍソルビトールと０．３８Ｍマンニトールとを含有するＬＢ培地１ｍＬに移され、３時間培養後、形質転換株の選抜のためテトラサイクリン２０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地で培養された。ｐＨＹｃｒｔＭＮプラスミドが導入されている形質転換バチルス・ズブチリスであるか否かは、数対のプライマーを用いてＰＣＲで確認した。
【００３４】
形質転換体であることが確認された形質転換バチルス・ズブチリスの培養液と菌体からの色素抽出液の色調を、ｐＨＹ３００ＰＬＫで形質転換したバチルス・ズブチリスＪＨ６４２株（以下、「コントロール株」ともいう）をコントロールとして評価したところ、コントロール株の培養液は乳白色であったのに対し、形質転換バチルス・ズブチリスの培養液はオレンジ色を呈した（図２（ａ）右側参照）。この結果から、かかるｐＨＹｃｒｔＭＮで形質転換されたバチルス・ズブチリスは菌体内で黄色色素を合成することが推察されたため、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とが黄色の色素の産生に関与することが確認された。そこで、この形質転換バチルス・ズブチリスをカロテノバチルス（CarotenoBacillus）ｃｒｔＭＮと命名した。
【００３５】
［アセトンによる色素抽出］
上記カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株のコロニーの一つを、Tryptic soy broth（TSB、関東化学社製）５０ｍＬに植菌し２４時間培養した。その後遠心分離により集菌された細胞は、ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１ｍＬで洗浄され、ＴＥバッファー２００μＬに再懸濁し、２０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム５０μＬで処理後、３７℃にて１５分間静置し、カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株の細胞溶解物を得た。かかる細胞溶解物をグラスチューブに移し、アセトン５００μＬを添加後、２分間ボルテックスし、５５℃の水槽で１分間昇温後、再び１分間ボルテックスした。以上のアセトンによる抽出は４回繰り返され、得られたカロテノバチルスｃｒｔＭＮ株のアセトン色素抽出物は、ＨＰＬＣ又はＴＬＣに供されるまで−２０℃にて保存された。コントロール株の菌体からのアセトン色素抽出物は無色であったのに対し、カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株の菌体からの色素抽出液は黄色を呈した（図２（ｂ）右側参照）。
【００３６】
［色素分析］
上記カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株の菌体からの色素抽出物について、逆相高速液体クロマトグラフ法により分析を行った。分析用カラムはμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８カラム（３．９×３００ｍｍ、１２５Å細孔径、Ｗaters社製）、検出器はフォトダイオードアレイ検出器 ｔｙｐｅ ２９９６（ウォーターズ社製）を用い、２３０ｎｍから８００ｎｍのスペクトルによりモニターされた。色素は、アセトニトリルと水を８５：１５（ｖ／ｖ）の比率で混合した移動相により２ｍＬ／分にて分離・溶出を行った。結果を図３に示す。保持時間２６．８分と２８．９分に二つの主要ピークが認められ、そして保持時間１３．８分のピークなどいくつかの小さなピークも認められた（図３ａ参照）。
【００３７】
［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析］
上記逆相高速液体クロマトグラフ法で検出されたカロテノイド色素を同定するために、カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株菌体、及び、コントロール株菌体からのアセトン抽出物は、カロテノイドの有効な分析法の一つであるマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて分析された。試料として、シリカゲル６０Ｆ２５４プレート（Merck社製）上で軽質石油（light petroleum）／アセトン（７：３、ｖ／ｖ）に溶解してＴＬＣで展開し、色の付いたスポットをＴＬＣからスクラッチし、５０μＬアセトンに溶出した色素抽出物を用いた。得られた色素溶出物はＭａｓｓ分析に供されるまで−２０℃にて保存された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析はＡｕｔｏｆｌｅｘＴＯＦ／ＴＯＦ（Brucker Daltonics社製、Germany）を用いて行われた。ジトラノール（Ditranol；1,8-dihydorxy-9(10H)-anthracenone）がマトリックスとして使用され、アセトンに溶解された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳスペクトルは、ポジティブリフレクションモードで得ることができた。イオンは、３３７ｎｍのＮ２レーザーの放射によって産生された。結果を図４に示す。
【００３８】
上記逆相高速液体クロマトグラフ法における保持時間２６．８分のピークの吸収スペクトルは４４３ｎｍ、４７２ｎｍ及び５０１ｎｍに吸収極大を有していた（図３ｂ）。この吸収スペクトルはジアポリコペンのものと一致したことから、保持時間２６．８分のピークはジアポリコペンであることが示された。一方、保持時間２８．９分のピークの吸収スペクトルは４１５ｎｍ、４３９ｎｍ及び４６９ｎｍに吸収極大を有していた（図３ｃ）。この吸収スペクトルはジアポニューロスポレンのものと一致したことから、保持時間２８．９分のピークはジアポニューロスポレンであることが示された。
【００３９】
カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株色素抽出物においてはコントロール株では認められない四つの主要ピークが、ｍ／ｚが４００と４０１、４０２、４０３に検出された（図４参照）。ｍ／ｚが４００と４０２のピークはジアポリコペン（４００）とジアポニューロスポレン（４０２）の分子量にそれぞれ一致する。ｍ／ｚが４０１と４０３はそれぞれジアポリコペンとジアポニューロスポレンの同位体置換体の分子量に一致する。これらの結果より、カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株が生合成するカロテノイド色素は、Ｃ３０カロテノイドに分類されるジアポリコペンとジアポニューロスポレンであることが確認された。
【００４０】
これらの結果は、カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株の呈する黄色は主としてジアポリコペンとジアポニューロスポレンの蓄積によるものであることを示す。このことから、導入されたｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子はバチルス・ズブチリスの細胞内で機能することが確認された。
【００４１】
［Ｈ２Ｏ２生存試験］
ＯＤ６００で１．９〜２．０を示すカロテノバチルスｃｒｔＭＮ株１．５ｍＬを遠心分離にて集菌して１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１．５ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、５００μＬずつ３つのチューブに分配した。３つのチューブそれぞれに０ｍＭ、５０ｍＭ、又は１００ｍＭのＨ２Ｏ２を添加して暗室で氷上に静置した。６０分後、カロテノバチルスｃｒｔＭＮ細胞は集菌され１ｍＬのＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳで希釈され、テトラサイクリンが添加されたTryptic soy broth寒天培地に播種された。コロニー数が２４時間後にカウントされた。
【００４２】
図５に示すようにカロテノバチルスｃｒｔＭＮ株は、コントロール株と比較した場合、５０ｍＭと１００ｍＭの過酸化水素の酸化的ストレスに対する耐性が顕著に増加することが明らかとなった。このことから、生合成されたジアポリコペンとジアポニューロスポレンは抗酸化ストレスに対する抵抗性を宿主細胞に付与したことが示された。
【００４３】
［カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮＰＱの作製］
ｐＨＹ３００ＰＬＫに、ｃｒｔＭ遺伝子とｃｒｔＮ遺伝子とｃｒｔＰ遺伝子とｃｒｔＱ遺伝子を挿入した、カロテノイド産生プラスミドＨＹｃｒｔＭＮＰＱを以下のように作製した。
ＤＮｅａｓｙ ｔｉｓｓｕｅキット（Qiagen社製）を用いて、スタフィロコッカス・アウレウスＮＣＴＣ５０５８１株細胞の全ＤＮＡが抽出された。人工的なShine-Dalgano（ＳＤ）配列を上流に付加したｃｒｔＰのＯＲＦと、ｃｒｔＱのＳＤ配列及びＯＲＦが、全ＤＮＡから以下のプライマー；
５’−ＣＡＧＴＣＧＡＣＧＴＡＡＧＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＧ−３’
（配列番号３）（フォワード）（ＳａｌＩサイトが導入された部分は下線で示す）
５’−ＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴ−３’
（配列番号４）（リバース）（ＸｂａＩサイトが導入された部分は下線で示す）
を用いて増幅され、ｐＧＥＭＴベクター（Promega社製）にクローニングされた。得られたプラスミドは、ＳａｌＩとＸｂａＩとで消化し、ｃｒｔＰＱ断片を作製した。上記カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮをＳａｌＩとＸｂａＩとで消化し、上記ｃｒｔＰＱ断片を挿入して、カロテノイド産生プラスミドｐＨＹｃｒｔＭＮＰＱを作製した。上記カロテノイド産生プラスミドであるｐＨＹｃｒｔＭＮの構造を図６に表す。図６中、矢印は転写又は複製の方向を示し、Ｏｒｉ−１７７は、ｐＡＣＹＣ１７７由来の複製起点を示し、Ｏｒｉ−ｐＡＭα１は、プラスミドｐＡＭα１由来の複製起点を示し、ＡｐＲは、アンピシリン耐性遺伝子を示し、ＴｃＲは、テトラサイクリン耐性遺伝子を示す。
【００４４】
［色素分析］
上記カロテノバチルスｃｒｔＭＮＰＱ株の菌体からの色素抽出物について、逆相高速液体クロマトグラフ法により上記カロテノバチルスｃｒｔＭＮ株の菌体からの色素抽出物の色素分析に準じて分析を行った。色素は、メタノールとアセトニトリルと水を４７．５：４７．５：５（ｖ／ｖ／ｖ）の比率で混合した移動相により１ｍＬ／分にて分離・溶出を行った。
【００４５】
その結果、保持時間１０．０分と１４．４分に二つの主要ピークが認められ、そしていくつかの小さなピークが認められた（図７ａ）。上記同様のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析により、保持時間１０．０分のピークの吸収スペクトルは２８２ｎｍ及び４６９ｎｍに吸収極大を有していた（図７ｂ）。この吸収スペクトルはグルコシルジアポニューロスポレンのものと一致したことから、保持時間１０．０分のピークはグルコシルジアポニューロスポレンであることが示された。保持時間１４．４分のピークの吸収スペクトルは４１４ｎｍ、４４１ｎｍ及び４６９ｎｍに吸収極大を有していた（図７ｃ）。この吸収スペクトルはほぼジアポニューロスポレンのものと一致したことから、保持時間１４．４分のピークはジアポニューロスポレンであることが示された。ジアポリコペンとジアポニューロスポレン酸についても微量ではあったが、検出された。
【図１】
2011135856.tif 000003
【図３】
2011135856.tif 000004
【図４】
2011135856.tif 000005
【図５】
2011135856.tif 000006
【図６】
2011135856.tif 000007
【図７】
2011135856.tif 000008
【図８】
2011135856.tif 000009
【図２】
2011135856.tif 000010
【配列表】
2011135856000001.app