(57)【要約】【課題】カンプトテシンの副作用を軽減し、より高い薬効を発揮させることを課題とする。【解決手段】ポリエチレングリコール類とポリアスパラギン酸からなるブロック共重合体のカルボキシル基と、カンプトテシンの水酸基がエステル結合したカンプトテシン高分子誘導体。【選択図】図２
2011162569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸からなるブロック共重合体のポリアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基に、カンプトテシンの水酸基がエステル結合したカンプトテシン高分子誘導体。
【請求項２】
カンプトテシン高分子誘導体が、下記一般式（I）
【化１】
2011162569.tif 000005
(式中、Ｒ1は水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を示し、Ｌ1は連結基を示し、Ｒは水酸基又は以下の構造を表し、
【化２】
2011162569.tif 000006
ｎは４０〜４５０の整数を示し、ｍ＋ｘは２０〜８０の整数を示し、ｘは、ｍ＋ｘのうちの０％〜９０％を占め、ｘが存在する場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＣＨ2ＣＨＮＨ）のユニットはランダムに存在する）で表される請求項１に記載のカンプトテシン高分子誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のカンプトテシン高分子誘導体を含有する抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンプトテシンの高分子誘導体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンプトテシンは、中国原産の旱蓮木より抽出・単離されたアルカロイドで、高い抗腫瘍活性と広い抗腫瘍スペクトルを示す抗腫瘍活性物質である。化学療法剤として使用するため、１９７０年台の初頭に、米国において臨床試験が実施されたが、強い副作用により中止された。しかしながら、臨床試験が実施された当時はトポイソメラーゼＩが発見されていなかったため、カンプトテシンの作用機作も明らかとされておらず、更に、カンプトテシンの水溶性の低さの理由から、開環した状態である、カンプトテシンナトリウム（sodium camptothecine）が使用されていた。その後の研究によって、開環した状態のカンプトテシンはトポイソメラーゼＩに対して弱い阻害活性しか持たないことが解明されていることなどから、当時の臨床試験は恐らく不適切だったとされている（非特許文献１）。しかしながら、上記の臨床試験の結果から、種々のカンプトテシン誘導体が開発され、既に、塩酸イリノテカンとノギテカン塩酸塩が臨床で使用されている。
【０００３】
近年になって、水溶性の低い薬物を可溶化する方法が試みられている。たとえば、親水性セグメントと疎水性セグメントを有するブロック共重合体を用い、疎水性相互作用によってタキサン系抗がん剤を高分子ミセル内に封入し水溶性を改善する方法が開発されている（特許文献１及び２）。また、特許文献３には、ポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸からなるブロック共重合体に塩酸ドキソルビシンをアミド結合させることによって薬物の水溶性を向上させることができることが示されている。また、特許文献４には、ポリエチレングリコールとポリグルタミン酸からなるブロック共重合体にSN-38のフェノール性水酸基をエステル結合させた高分子誘導体が開示されている。特許文献５には、カンプトテシン類をポリグルタミン酸に結合させたカンプトテシン誘導体が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】ＥＰ１１２７５７０号公報
【特許文献２】ＷＯ２００４／０８２７１８号公報
【特許文献３】特開平０２−３００１３３号公報
【特許文献４】ＷＯ２００４／０３９８６９号公報
【特許文献５】ＷＯ０１／７０２７５号公報
【非特許文献１】Slichenmyer et al. The Current Status of Camptothecin Analogues as Antitumor Agent. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 85, No. 4 (1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、カンプトテシンの副作用を軽減し、より高い薬効を発揮させる為になされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはより有用な抗がん剤を開発すべく鋭意努力した結果、ポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸からなるブロック共重合体の、ポリアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基にカンプトテシンの水酸基をエステル結合させ、副作用が低く、より効果の高い新規カンプトテシン高分子誘導体を見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
従って、本発明は、以下の態様を含む。
（１）ポリエチレングリコール類とポリアスパラギン酸からなるブロック共重合体のカルボキシル基と、カンプトテシンの水酸基がエステル結合したカンプトテシン高分子誘導体；
（２）カンプトテシン高分子誘導体が、下記一般式（I）
【化１】
2011162569.tif 000003
(式中、Ｒ1は水素原子又はＣ1〜Ｃ6のアルキル基を示し、Ｌ1は連結基を示し、Ｒは水酸基又は以下の構造を表し、
【化２】
2011162569.tif 000004
ｎは４０〜４５０の整数を示し、ｍ＋ｘは２０〜８０の整数を示し、ｘは、ｍ＋ｘのうちの０％〜９０％を占め、ｘが存在する場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＣＨ2ＣＨＮＨ）のユニットはランダムに存在する）で表される（１）に記載のカンプトテシン高分子誘導体；
（３）（１）又は（２）に記載のカンプトテシン高分子誘導体を含有する抗がん剤；
に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のカンプトテシン高分子誘導体は、ポリエチレングリコール類とポリアスパラギン酸からなるブロック共重合体の、ポリアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と、カンプトテシンの水酸基がエステル結合した構造であることを特徴とする。
【０００９】
本発明の一般式（Ｉ）において、ｎは４０〜４５０の整数であるが、６０〜４１０の整数が好ましく、特に１１０〜３４０の整数が好ましい。また、ｍ＋ｘは２０〜８０の整数であるが、特に２５〜５０の整数であることが好ましい。これらｎ、ｍ及びｘの数値は平均値である事はいうまでも無い。
【００１０】
また、本発明の一般式におけるＬ1連結基は、ポリエチレングリコールとポリアスパラギン酸を連結しうる限り特に限定されないが、好ましくは、Ｒ5（ＣＨ2）pＲ6であり、Ｒ5はＯであり、Ｒ6はＮＨであり、そしてｐは１〜６の整数である。
【００１１】
本発明のカンプトテシン高分子誘導体は水中でポリエチレングリコールを外殻とした高分子ミセルを形成しても良い。高分子ミセルを形成した場合の粒子径は、人体に投与される事を考慮すれば、１０μｍ以下であることが好ましく、５μｍ以下であることがより好ましい。特に、静脈内投与で用いる場合は、２００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以下であることがより好ましい。
【００１２】
カンプトテシンを結合させるための基本となるブロック共重合体の合成方法は所望のブロック共重合体が得られる限り特に限定されないが、特許文献３に記載の方法、即ち、例えば、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＮＨ2を開始剤として、脱水の有機溶媒中で、Ｎ−カルボキシ−β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を所望の重合度（アミノ酸ユニット数、即ち、式のｍ＋ｘ）となるように添加して反応させ、アルカリ加水分解によりベンジル基を除去することにより得ることができる。
【００１３】
本発明のカンプトテシン高分子誘導体の製剤としては、液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、特に凍結乾燥製剤が好ましい。いずれの場合も、製剤化のために一般に用いられる希釈剤、賦形剤、等張剤、pH調整剤などを用いることができる。
【００１４】
本発明のカンプトテシン高分子誘導体の投与ルートとしては、特に限定されないが、皮下、静脈、動脈、局所などの非経口投与が好ましく、特に静脈内注射が好ましい。
【００１５】
本発明のカンプトテシン高分子誘導体の投与量は、用法、患者の年齢、性別、患者の程度およびその他の条件により適宜選択される。限定されるものではないが、通常、カンプトテシン換算で、１日当たり、０．１〜１０００ｍｇ／ｍ2、好ましくは、１〜５００ｍｇ／ｍ2、より好ましくは、５〜１００ｍｇ／ｍ2を投与する。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。尚、以下カンプトテシンをＣＰＴ、カンプトテシン高分子誘導体をＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴと記載することがある。
【００１７】
実施例１
ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴの合成
特許文献３に記載の方法に従い合成した、メトキシポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（但し、ポリアスパラギン酸の片末端をアセチル化したもの）、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−Ａｃ（ＰＥＧの平均分子量：１２ｋＤａ、アスパラギン酸平均残基数：４０、アスパラギン酸はカルボン酸型）１ｇを無水ＤＭＦ ８０ｍＬに溶解後、カンプトテシン（和光純薬）を３８７ｍｇ添加した。続いて、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（国産化学）８２３ｍｇ、ジメチルアミノピリジン（和光純薬）１３６ｍｇを順に添加した。４℃で３日間攪拌し、室温に昇温してさらに一晩攪拌した。反応液を透析チューブ（Spectrum Laboratories、Spectra/Por（登録商標）分子量カットオフ３５００）に移し、精製水３Ｌに対し、４℃にて一晩透析した。沈殿を除いた後、得られた黄色溶液を０．８μｍフィルター（ミリポア、MILLEX（登録商標）-AA）でろ過した。ろ液を凍結乾燥し、淡黄色粉末を９２０ｍｇ得た。その中から５ｍｇを秤量し、精製水１ｍＬに溶解した。その溶液の３７０ｎｍにおける吸光度からカンプトテシン含量は５．４％（カンプトテシン高分子誘導体に対するカンプトテシンの重量比）と計算された。
【００１８】
血漿中濃度推移
実施例２
ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴを用いたラット血中動態試験
１）高分子ミセルの調製
実施例１で得た複合体５０ｍｇをサンプルバイアルに精秤し、精製水を１ｍＬ添加して、ポリマーを懸濁した。一昼夜４℃で撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所High Power Unit）を用いて、氷冷下で１０分間超音波処理し、０．２２μｍのフィルター（ミリポア、MILLEX（登録商標）GP PES）でろ過し、ろ液を回収した。そのろ液をゲルろ過［GEヘルスケアバイオサイエンス、PD-10、溶離液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／５％グルコース］し、回収したミセル画分（平均粒子径８０ｎｍ）を以下の実験に用いた。
【００１９】
２）動物実験
雄性Wistarラット（日本チャールス・リバー（株）、６週齢）に上記の高分子ミセルを以下の条件でエーテル麻酔下、尾静脈内投与した（ｎ＝１）。ヘパリンコートしたシリンジを用いて採取した血液を４℃で遠心分離後、血漿を回収し測定まで−３０℃で保存した。
【００２０】
投与量：ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ（ＣＰＴ換算として）１ｍｇ／ｋｇ
採血時間：投与後５分，１，３時間
採血量：０．２〜０．２５ｍＬ／回（頸静脈から）
なお、比較としてカンプトテシン（和光純薬）のＤＭＳＯ溶液も上記に倣い、投与、採血した。
【００２１】
３）血漿中ＣＰＴ濃度の測定
ａ）総ＣＰＴ濃度の測定
回収したラット血漿５０μＬに対し、６Ｎ ＨＣｌを２倍容（１００μＬ）添加し、クライオチューブ（家田化学）にて１００℃で１時間加熱した。反応液を７５μＬ回収し、６Ｎ ＮａＯＨを５０μＬ添加して中和後、０．２２μｍフィルター（ミリポア、MILLEX（登録商標）-GV）でろ過した。ろ液を２５ｍＭギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）で１０倍希釈し、この処理サンプル液をＨＰＬＣサンプルバイアルに充填し、ＨＰＬＣ分析により、血漿中総ＣＰＴ濃度を決定した。
【００２２】
b)遊離ＣＰＴ濃度の測定
回収したラット血漿３０μＬに対し、アセトニトリル１００μＬ、１０ｍＭ ＨＣｌ ２０μＬを順に加えて攪拌した。続いて、４℃にて遠心分離（フナコシ、チビタン、１０，０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上清を５０μＬ回収した。この上清５０μＬに対し、２５ｍＭ ギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）を１００μＬ加えた後、０．２２μｍフィルター（ミリポア、MILLEX（登録商標）-GV）でろ過した。ろ液をＨＰＬＣサンプルバイアルに充填し、ＨＰＬＣ分析により、血漿中遊離ＣＰＴ濃度を決定した。
【００２３】
ｃ）分析条件
ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。特に記載がない場合、ＣＰＴに関するＨＰＬＣ分析は、すべて同条件で行った。
システム：Waters Alliance System
カラム：Tosoh TSK-gel ODS-80TM（４．６Ф×１５０ｍｍ）（４０℃）
移動相：２５ｍＭ ギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）／アセトニトリル＝７０／３０
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：蛍光（Ｅｘ：３７０ｎｍ、Ｅｍ：４２０ｎｍ）
インジェクション体積：２０μＬ
【００２４】
４）血漿中濃度時間推移の測定結果
溶液投与の場合、血漿中濃度は速やかに減衰した。ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴの場合、総ＣＰＴに関しては、高濃度で血漿中に滞留することが明らかとなった。遊離ＣＰＴは、総ＣＰＴ濃度より低い濃度で推移するものの、溶液投与時の数倍から１０倍であった。結果を図１に示す。
【００２５】
薬効評価
実施例３
ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を用いた薬効試験−１
ＰＣ−３細胞（住商ファーマインターナショナル株式会社を介し、ＡＴＣＣから購入。以下同様）をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地を用い、５％ＣＯ2下、３７℃にて培養し、移植に必要とする細胞数になるまで増殖させた。細胞を生理食塩水に懸濁し、雄性ヌードマウス［Balb nu/nu、８週齢、日本チャールス・リバー（株）］１匹当たり３×１０6個／１００μＬになるよう背部皮下に接種した。その後７日間ヌードマウスを飼育し、腫瘍体積が８３．３±６．２ｍｍ3（平均±ＳＥ。但しＳＥは標準誤差を表わす。以下も同様とする。）になったところで薬剤の投与を開始した。投与スケジュールは４日おきに計３回の尾静脈内投与とし、(1)コントロール（無処理）、(2)ＣＰＴ ＤＭＳＯ溶液 ７ｍｇ／ｋｇ、(3)ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ ３ｍｇ／ｋｇ（但し、投与量はカンプトテシン換算量ｍｇ／ｋｇ／注射）の３群（ｎ＝７）で腫瘍体積および体重の経時変化を測定した。腫瘍体積は電子ノギス［（株）ミツトヨ］で腫瘍の長径（ａ ｍｍ）と短径（ｂ ｍｍ）を測定し、下式に基づき、計算した。
【００２６】
腫瘍体積（ｍｍ3）＝ａ×ｂ2／２
検体投与開始後の腫瘍体積の時間推移を図２に、体重変化を図３にそれぞれ示す。ＣＰＴ溶液投与時はコントロール群と比較して、ほとんど腫瘍増殖抑制効果が認められなかったが、体重は最大で１０％以上減少した。一方、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴは溶液の半分以下の投与量にも拘わらず、腫瘍の増殖を抑制し、体重の減少は認められなかった。以上の結果から、溶液に比べ、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴは優れた治療効果を有することが明らかとなった。
【００２７】
実施例４
ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を用いた薬効試験−２
ＰＣ−３細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地を用い、５％ＣＯ2下、３７℃にて培養し、移植に必要とする細胞数になるまで増殖させた。細胞を生理食塩水に懸濁し、雄性ヌードマウス［Balb nu/nu、５週齢、日本チャールス・リバー（株）］１匹当たり３×１０6個／１００μＬになるよう背部皮下に接種した。その後１５日間ヌードマウスを飼育し、腫瘍体積が８１．６±５．０ｍｍ3（平均±ＳＥ）になったところで薬剤の投与を開始した。投与スケジュールは４日おきに計３回の尾静脈内投与とし、以下の３群（ｎ＝８）で腫瘍体積および体重の経時変化を測定した。(1)コントロール（無処理）、(2)ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ ７ｍｇ／ｋｇ、(3)ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ １０ｍｇ／ｋｇ（(1)及び(2)の投与量はＣＰＴ換算量ｍｇ／ｋｇ／注射）。
【００２８】
検体投与開始後の腫瘍体積の時間推移を図４に、体重変化を図５にそれぞれ示す。ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴの７ｍｇ／ｋｇの投与群では、効果的に腫瘍の増殖を抑制した。加えて、体重の減少は最大で約１０％であり、投与開始から１５日後にはコントロール群と同等にまで回復し、死亡例は認められなかった。投与量が１０ｍｇ／ｋｇの時、さらに腫瘍を縮小するものの、体重が減少し、８例中５例が死亡した。以上の結果から、ＣＰＴ高分子誘導体、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴは副作用が低く、大変に優れた治療効果を有することが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＣＰＴ高分子誘導体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ）及びＣＰＴ溶液をラットの静脈内へ投与した後の薬物の血漿中濃度の推移を示すグラフである。黒丸は、ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴを投与したラットにおける、ＣＰＴの総濃度、白丸はＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴから遊離されたＣＰＴ濃度、黒三角は、溶液のＣＰＴを投与したラットにおける薬物の血漿中濃度をそれぞれ示す。
【図２】ヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３担がん動物に対するＣＰＴ高分子誘導体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ）の抗がん活性を示すグラフである。矢印は投与したタイミングを示し、縦軸は投与開始時からの相対的な腫瘍体積を示し、横軸は時間（日）を示す。黒丸は対照群（無処理）、黒四角はＣＰＴ溶液の投与群、白丸はＣＰＴ高分子誘導体投与群をそれぞれ示す。
【図３】ヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３担がん動物に対するＣＰＴ高分子誘導体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ）投与後の体重の変化を示すグラフである。矢印は投与したタイミングを示し、縦軸は投与開始時からの体重の変化率を示し、横軸は時間（日）を示す。黒丸は対照群（無処理）、黒四角はＣＰＴ溶液の投与群、白丸はＣＰＴ高分子誘導体投与群をそれぞれ示す。
【図４】ヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３担がん動物に対するＣＰＴ高分子誘導体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ）の抗がん活性を示すグラフである。矢印は投与したタイミングを示し、縦軸は投与開始時からの相対的な腫瘍体積を示し、横軸は時間（日）を示す。黒丸は対照群（無処理）、黒四角は１０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ高分子誘導体（ＣＰＴ換算）投与群、黒三角は７ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ高分子誘導体（ＣＰＴ換算）投与群をそれぞれ示す。
【図５】ヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３担がん動物に対するＣＰＴ高分子誘導体（ＰＥＧ−ｐＡｓｐ−ＣＰＴ）投与後の体重の変化率を示すグラフである。矢印は投与したタイミングを示し、縦軸は投与開始時からの体重の変化を示し、横軸は時間（日）を示す。黒丸は対照群（無処理）、黒四角は１０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ高分子誘導体（ＣＰＴ換算）投与群、黒三角は７ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ高分子誘導体（ＣＰＴ換算）投与群をそれぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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