(57)【要約】【課題】  蛍光イメージングを用いずに、また、観察中の試料（実験用小動物の組織）の血管外組織の状況を容易に把握できる態様にて、コントラストの高い血管像の取得を可能にする生体試料の顕微観察を行う方法を提供すること【解決手段】  本発明の実験用小動物の組織を観察する方法は、可視光領域を含む照明光を観察領域に照射する過程と、光学顕微鏡を用いて得られる観察領域からの戻り光による像を撮像手段にて取得する過程とを含み、血管の像を取得する際には、撮像手段へ入射する戻り光の波長帯域を照明光の波長帯域内の緑色光又はヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む所定の帯域に狭められるよう制限することを特徴とする。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実験用小動物の組織を観察する方法であって、可視光領域を含む照明光を前記組織の観察領域に照射する過程と、光学顕微鏡を用いて得られる前記観察領域からの前記照明光の戻り光による前記観察領域の像を撮像手段にて取得する過程とを含み、前記組織の観察領域の血管の像を取得する際には、前記撮像手段へ入射する前記戻り光の波長帯域を緑色光の所定の波長帯域に狭められるよう制限することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記所定の波長帯域がヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む波長帯域であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、前記所定の波長帯域が実質的に５１０ｎｍから５５０ｎｍまでの帯域であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかの方法であって、前記戻り光の波長帯域の前記所定の帯域への制限が前記戻り光をバンドパスフィルターに通過させることにより達成されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、前記撮像手段がＲ成分、Ｇ成分及びＢ成分を合成してなるカラー画像の取得が可能な撮像手段であり、前記撮像手段により得られた前記組織の観察領域の血管の像が前記カラー画像の前記Ｇ成分の像であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１の方法であって、更に前記組織の観察領域の血管の像に基づいて前記血管の直径、分岐数又は面積を測定する過程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料（生体組織又は実験用小動物）を、光学顕微鏡等を用いて観察するための方法に係り、より詳細には、簡便に生体試料の表層の血管構造をイメージングする方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
医学的、薬学的又は生物学的研究の分野に於いて、種々の態様にて生体試料の血管をin  vivoにて可視化し顕微観察して、血管の構造及び機能を観測する試みが為されている。よく知られているように、血管は、発生段階の胚に於いて、或いは、（成体の）がんや炎症などの疾患部位に於いて新生され、栄養や酸素の供給経路となる。従って、血管を可視化し、その成長・消滅等の挙動を観測することにより、血管新生、動物の発生若しくはがんの増殖・転移のメカニズムの解明或いは診断に於いて有用な情報が得られることが期待される。また、新薬開発に於いて、がんに於ける血管新生を阻害する阻害剤は、抗がん剤として機能することが期待されることから、実験用小動物の血管をin  vivoにて可視化する動物モデル実験が実施され、これによる小動物体内の血管の構造及び機能の観測結果が、抗がん剤等の新薬の評価を行うために用いられている。
【０００３】
生体試料の血管のイメージングに於いては、典型的には、被写体（生体試料）の表面に可視光又は白色光が照射され、その戻り光又は反射光による被写体の像が撮像手段（カメラなど）により撮影される。しかしながら、血管量の豊富な試料に於いては、その像に於いて血管と血管外組織との像のコントラストが低く、明瞭に血管構造を写し出した画像を得ることは困難である。そこで、従来の技術に於いては、血管をコントラストよく可視化するための方法として、例えば、蛍光試薬の光を用いた蛍光イメージング技術による方法（非特許文献１−３）や狭帯域光観察による方法（特許文献１）などが提案されている。蛍光イメージングによる血管の可視化の例としては、例えば、生体試料の血管中に蛍光試薬（トレーサー分子）が投与され、血管中に滞留する蛍光試薬を光らせることにより血管のみを可視化する方法（非特許文献１、２）、実験用小動物に於いてＧＦＰ遺伝子が導入された移植腫瘍内の血管の形成を観察する方法（非特許文献３：ＧＦＰ遺伝子導入腫瘍細胞が蛍光を発するのに対して血管が蛍光を発しないことにより、血管構造の像がコントラストよく得られる。）などが報告されている。また、狭帯域光観察による方法では、血液に吸収されやすく血管外組織で反射されやすい波長の光を照明光として用い、血管像のコントラストを高くするといった手法が用いられている（内視鏡に於いて採用されている。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３５８３７３１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ルーニグ（Leunig,  Michael）他６名  キャンサーリサーチ（Cancer  Research）  52,  6553-6560  1992年12月1日
【非特許文献２】ボルグストルム（Borgstrom,P）他  キャンサーリサーチ（Cancer  Research）  56,  4032-4039  1996年
【非特許文献３】ヤン（Yang,  Meng）他８名  PNAS  Vol.98  2616-2621  2001年
【非特許文献４】ジジルストラ（Zijlstra，W．G）他２名  クリニカル・ケミストリー（CLINICAL  CHEMISTRY）  37/9，1633-1638  1991年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の如き血管のイメージングに於いて、血管中に蛍光試薬を導入し血管のみを光らせてイメージングする方法の場合、観察を行う度に蛍光試薬が必要であり、ランニングコストがかかる上、血中に投与された蛍光試薬の多くが時間と伴に血管外に漏出してしまい、血管の周囲の輝度（バックグラウンド）が上がりＳ／Ｎ比（コントラスト）が低減してしまうという不具合がある。そして、一旦、Ｓ／Ｎ比が低減してしまった個体で再び高いＳ／Ｎ比で血管を観察するためには、その個体から血管外に拡散した蛍光試薬が排除された後（クリアランスされた後）に、再度蛍光試薬を血管中に導入するといった過程が必要となるところ、蛍光試薬のクリアランスには、一般に数日間を要するので、例えば、１日毎に血管の変化を継続して観察するといったことが困難となる。また、ＧＦＰ遺伝子導入細胞を用いる方法では、遺伝子導入技術を要するなど、やや特別な処理過程及び処理設備が必要となり、利用可能な実験用小動物、細胞種及び実施可能な環境が高度に制限される。一方、狭帯域光観察による方法は、単色光照明を行うための装備を要し、高価で複雑な装置が必要となる。また、観察装置に於いて、試料に白色光ではなく単色光が照射されるようになっている場合、単色光では血管外組織の状況を把握することが困難となり、手術等の処置を行うことが困難である。
【０００７】
かくして、本発明の一つの課題は、蛍光イメージングを用いずに、また、観察中の試料（実験用小動物の組織）の血管外組織の状況を容易に把握できる態様にて、コントラストの高い血管像の取得を可能にする生体試料の顕微観察を行う方法を提供することである。
【０００８】
また、本発明のもう一つの課題は、上記の如き生体試料の顕微観察方法であって、観察試料（実験用小動物）を選ばず、且つ、比較的簡便に血管の構造及び形成又は新生の経時的な観察を実施することのできる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、上記の課題を解決する新規な方法が提供される。本発明の実験用小動物の組織を観察する方法は、可視光領域を含む照明光を実験用小動物の組織の観察領域に照射する過程と、光学顕微鏡を用いて得られる観察領域からの照明光の戻り光による観察領域の像を撮像手段にて取得する過程とを含み、組織の観察領域の血管の像を取得する際には、撮像手段へ入射する戻り光の波長帯域を、緑色光の所定の波長帯域に制限することを特徴とする。かかる構成に於いて、「実験用小動物の組織」とは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験用小動物の個体、胚などの生きた生物試料の任意の部位又はそれらの生物試料から取り出した任意の組織であってよい。「可視光領域を含む照明光」は、この分野に於いて光学顕微鏡による明視野観察の際に利用される光源、例えば、ハロゲンランプなど、により得られる、所謂、白色光であってよい。また、「光学顕微鏡」は、この分野で通常使用される任意の生物顕微鏡、実体顕微鏡等であってよい。更に、「撮像手段」は、この分野に於いて光学顕微鏡による明視野観察の際に利用されるカメラ、例えば、ＣＣＤカメラなど、であってよい。戻り光の波長帯域の所定の波長帯域への制限は、撮像手段へ入射する戻り光をバンドパスフィルターに通過させることにより達成されるようになっていてよい。そして、「緑色光」は、定義にもよるが、略５００〜６００ｎｍの範囲に入る波長の光であり、「所定の波長帯域」は、かかる緑色光のうちの所定の波長帯域である。
【００１０】
上記の構成から理解される如く、本発明の方法の基本的な構成は、典型的な、実験用小動物の組織の明視野観察と同様である。実験用小動物の組織の観察領域自体は、所謂白色光にて照明されているので、観察領域全体の状況は、白色光の戻り光から把握することができ、従って、観察領域に対して手術等の処置が容易に行うことができるようになっている。しかしながら、本発明の方法に於いては、特に、組織の観察領域の血管の像を取得する際に、撮像手段へ入射する戻り光の波長帯域が、照明光の波長帯域内のうちの緑色光の波長帯域に制限される。かかる構成によれば、観察領域から撮像手段へ入射される光は、緑色光の波長帯域の成分のみとなるところ、ヘモグロビンの光吸収は、約５００〜６００ｎｍの波長、即ち、緑色光の波長帯域に於いて高くなることが分かっているので（非特許文献４のFig．1参照）、かかる光成分は、観察領域内の血管の位置では、血中のヘモグロビンに相当に吸収され、従って、血管の位置から撮像手段へ入射される光の成分の強度は大幅に低減されることとなる。その結果、血管自体の像は暗くなり、血管外の組織の像は（光成分が低減しないので）明るくなり、かくして、高いコントラストにて血管の像が写し出された画像が得られることとなる。
【００１１】
上記の本発明の構成に於いて、所定の波長帯域は、特に、ヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む所定の波長帯域であることが好ましい。ヘモグロビンの光吸収が極大となる波長の近傍の帯域の光成分は、血管内のヘモグロビンに相当に吸収され、従って、戻り光に於いて光吸収の極大波長の近傍の成分がその他の波長帯域に比して大幅に低減されることとなる。そうすると、血管の存在領域からの戻り光の光強度のみが大幅に低減されることとなり、戻り光が結像されたとき、血管の像のコントラストが相当に改善されることとなる。また、実施の形態に於いて示されている如く、戻り光の波長帯域の所定の波長帯域への制限は、実質的に５１０ｎｍから５５０ｎｍまでの光を透過するバンドパスフィルターを用いて為されてよく、従って、所定の波長帯域は、実質的に５１０ｎｍから５５０ｎｍまでの帯域であってよい。なお、バンドパスフィルターの透過波長帯域をヘモグロビンの光吸収が極大となる波長に適合するよう最適化することにより、血管の像のコントラストがより高くなることは理解されるべきである。
【００１２】
また、上記の本発明の構成に於いて、撮像手段はＲ成分（赤色成分）、Ｇ成分（緑色成分）及びＢ成分（青成分）を合成してなるカラー画像の取得が可能な撮像手段であってよく、これにより、観察領域全体の画像が白色光の戻り光にて得られ、撮像手段の画像上に於いて、観察領域全体の状況が把握し易くなる。その場合、血管と血管外組織の像のコントラストが顕著に表れるのは、Ｇ成分の画像になるので、カラー画像の前記Ｇ成分の像が、前記の撮像手段により得られた組織の観察領域の血管の像として採用されるようになっていてよい。
【００１３】
上記の本発明の方法によれば、実施例に示されている如く、非常にコントラストのよい血管像が得られる。そこで、更に、得られた組織の観察領域の血管の像に基づいて、血管の直径、分岐数又は面積を測定する過程が実行されるようになっていてよく、それらの結果は、種々の実験の評価に用いられてよい。
【発明の効果】
【００１４】
上記の本発明の方法は、観察領域を白色光にて照明して、観察者による領域の全体の状況の把握を容易にしながら、簡便な手法にてコントラストの高い血管像の取得を可能にするものであるということができる。本発明によれば、例えば、観察領域に於いて手術等の処置を施す際、観察者は、血管像で血管の構造を確認しながら、白色光で照らされた観察領域に於いて種々の操作が行いやすくなるという利点が得られる（狭帯域光観察による方法の如く照明光を単色光にすると、観察者にとって観察領域が見づらくなってしまう。）。従って、本発明の方法は、手術用顕微鏡による観察に於いて適用されてよい。また、バンドパスフィルターを用いて戻り光の波長帯域の所定の波長帯域への制限を行う態様によれば、撮像手段の光の入射口の手前に於いてバンドパスフィルターを出し入れするだけで、コントラストの高い血管像の取得が可能となり、観察者は、通常の明視野画像と血管の像が強調された画像とを容易に観察することが可能となり、有利である。かくして、本発明によれば、従前に比して、より簡便に、種々の態様にて、或いは、広範囲にて、血管の構造又は形成の観測を含む実験が実施できるようになることが期待される。
【００１５】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による方法により試料の血管像を撮影するための生体イメージング装置２０の概略構成を模式的に表したものであり、図１（Ｂ）は、図１中のハロゲンランプ（光源）の発光波長特性、試料とカメラとの間に挿入される緑色バイパスフィルター（ＧＦ）の透過光波長特性及びカラーカメラの受光波長特性をそれぞれ示したものである。カメラの受光波長特性に於いて、Ｂ、Ｇ、Ｒ、ＩＲ−ｃｕｔは、それぞれ、カラー画像のＢ成分、Ｇ成分、Ｒ成分及び赤外カットフィルターの波長特性を示している。
【図２】図２（Ａ）は、本発明の方法によりＧＦを用いて戻り光の帯域制限をして撮影された健常ラットの肝臓の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。図２（Ｂ）は、従前の方法により撮影された（Ａ）と同じ健常ラットの肝臓の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。［ＲＧＢ合成画像は、実際にはカラー画像である。］
【図３】図３（Ａ）は、本発明の方法によりＧＦを用いて戻り光の帯域制限をして撮影された摘出されたラットの心臓の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。図３（Ｂ）は、従前の方法により撮影された（Ａ）と同じラットの心臓の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。
【図４】図４（Ａ）は、本発明の方法によりＧＦを用いて戻り光の帯域制限をして撮影された生きたラットの甲状腺の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。図４（Ｂ）は、従前の方法により撮影された（Ａ）と同じラットの甲状腺の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。
【図５】図５（Ａ）は、本発明の方法によりＧＦを用いて戻り光の帯域制限をして撮影された甲状腺二段階発がんモデルラットの甲状腺の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。図５（Ｂ）は、従前の方法により撮影された（Ａ）と同じラットの甲状腺の明視野像（ＲＧＢ合成画像）、Ｇ成分のみの画像及びその二値化像をそれぞれ示す。
【図６】図６は、図５（Ａ）、（Ｂ）の二値化画像から画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いて算出した血管面積の大きさを表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００１８】
観察方法の概要
本発明による実験用小動物の組織の観察方法は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験用小動物の個体、胚などの生きた生物試料又はそのような生物試料から摘出された臓器などの組織の、血管の構造及び形成過程の観察を含む任意の観察又は計測の一部として実行されてよい。例えば、本発明の方法は、胚に於ける血管新生、成体に於ける腫瘍の成長・増殖・転移・死滅に於ける血管新生又は消滅のメカニズムを解明するため、或いは、任意の薬剤の検査又は評価の情報を得るための、実験用小動物に検査されるべき薬剤を与えて動物内に形成した腫瘍細胞の成長、増殖、転移又は死滅の過程を観測することにより薬剤の作用を評価するといったモデル実験に於いて、腫瘍近傍の血管の新生若しくはその阻害又は消滅の過程の観察又は計測をする場合に採用されてよい。これらの場合、本発明の方法により得られた血管の像から更に、血管の直径、分岐数、面積が経時的に計測され、血管の新生若しくはその阻害又は消滅が判定され或いは考察されることとなる。また、本発明の方法では、以下に述べられる如く、観察される試料が白色光にて照明されるので、観察対象に対して手術等の処置を行う際に観察対象の状態の把握が容易であり、有利である。
【００１９】
観察の手順
（ｉ）試料について
実験用小動物は、既に触れた如く、この分野で通常使用されているマウス、ラット、モルモット、ウサギ等の生きた成体又は胚などの生物試料や、そのような生物試料から摘出された臓器を含む任意の組織であってよい。また、任意の腫瘍細胞が任意の部位に公知の態様にて移植された生物試料が用いられてもよい。
【００２０】
（ii）観察装置について
観察を行うための装置の基本的な構成は、図１（Ａ）に例示されている如き、生物試料の明視野による顕微鏡観察が可能な任意のイメージング装置の構成であってよい。例えば、本実施形態に於いて、イメージング装置２０は、顕微鏡で得られる像をＣＣＤカメラ２６により撮影するよう構成された公知の任意の形式のイメージング装置（例えば、オリンパス社ＯＶ１００／１１０、ＩＶ１００など）であってよい。かかるイメージング装置２０に於いて、顕微鏡は、通常の形式の生物顕微鏡又は実体顕微鏡であってよく、そこに於いて、まず、ハロゲンランプ等の白色光を発する光源２４からの照明光Ｌが光ファイバ２４ｂを通して試料１０の観察領域上に照射される（照明光Ｌの光路に於いて赤外線又は紫外線をカットするためのフィルター２４ａが設けられていてよい。）。そして、観察領域からの戻り光又は反射光が対物レンズ系２２により集光され、観察者が直接に（肉眼で）領域の観察が可能となるようにハーフミラー２５により戻り光の一部が反射されて接眼レンズへ向けられ、また、ＣＣＤカメラ２６により領域の像の撮影が可能となるように戻り光の一部がハーフミラー２５を透過し、ＣＣＤカメラ２６の受光面（図示せず）に於いて試料の像が形成される。光源２４とＣＣＤカメラ２６の作動は、コントローラ３０により制御され、ＣＣＤカメラ２６で取得された画像は、通常の態様にてコントローラにより処理されて画像記録装置（図示せず）に記録され、画像は、モニター３０ａにて表示されるようになっていてよい。更に、コントローラは、取得された画像に於ける輝度値を取得し、輝度値が任意の画像処理等の演算処理に利用できるよう構成されたものであってよい。
【００２１】
かかるイメージング装置２０に於いて、特に、本発明の方法により、観察領域の血管の像を撮影する際には、観察領域（又はハーフミラー２５）とＣＣＤカメラ２６との間に、照明光の波長帯域内のうちの緑色光の所定の波長帯域、好ましくは、ヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む所定の波長帯域のみを実質的に透過するバイパスフィルター２８が取り外し可能に配置され、戻り光の波長帯域が制限される。既に触れた通り、実験用動物の組織に於いて特に血管量の豊富な領域の場合、白色光照明では、血管と血管外組織との像のコントラストが低く、血管構造を明瞭に写し出した画像を得ることは困難である。そこで、血管と血管外組織との像のコントラストを増大するために、照明光の波長帯域を緑色光の波長帯域に制限すれば、血管では緑色光が相対的に強く吸収されるため、血管と血管外組織との像のコントラストが高い画像を得ることが可能となるが、その場合、観察者の直接の領域の観察のために接眼レンズへ向けられる光も緑色光の波長帯域となってしまい、領域の全体的な状況を把握することが困難となり、手術等の処置が行い難くなってしまう。かくして、本発明では、上記の如く、照明光の波長制限をするのではなく、観察領域は、白色光で照明して、観察者の直接の領域の観察を容易にする状態を確保するとともに、ＣＣＤカメラ２６に向かう光のみ、血管と血管外組織との像のコントラストが増大するよう波長制限が為される。（なお、バイパスフィルター２８は、図中、破線２８’にて示されている如く、対物レンズ２２とハーフミラー２５との間に配置されてもよい。その場合でも、試料を目視する際には、観察領域は、白色光で照明されているので、状態が把握しやすくなっている。）
【００２２】
図１（Ｂ）上段、中段は、イメージング装置２０に於ける光源（ハロゲンランプ）２４の発光波長特性、バイパスフィルター２８の透過光波長特性をそれぞれ示したものである。図から理解される如く、本実施形態では、照明光の波長が略可視光領域全般に亙るようにすることにより、観察領域の状態は、観察者の直接の観察に適したものとなり、カメラ２６へ向かう光は、バイパスフィルター２８により緑色光のみ（図示の例では、実質的に５１０〜５５０ｎｍの領域のみ）に制限され、これにより、カメラで形成される像は、血管と血管外組織との像のコントラストが高いものとなる。
【００２３】
なお、ＣＣＤカメラ２６は、好適には、カラーＣＣＤカメラ、即ち、像のＲＧＢ成分を別々に取得し、これらを合成してカラー画像を形成する形式のカメラであってよい。その場合、例えば、図１（Ｂ）の下段に示されている如き波長帯域を有するＲ成分、Ｇ成分、Ｂ成分の像がカメラにより別々に形成される。ここに於いて、バイパスフィルター２８を透過してくる光成分は、主として、Ｇ成分に含まれるので、血管の画像としては、Ｇ成分の像が採用されてよく、かかるＧ成分の像を用いて、血管の直径、分岐数、面積などが計測されてよい。
【００２４】
（iii）血管像の観察について
上記の装置を用いて生物試料を観察する際には、所望の領域が対物レンズの視野に入るように、試料１０がイメージング装置の試料台１０ａに配置され、照明光が照射され、接眼レンズによって領域の状態が観察される一方で、ＣＣＤカメラ２６により血管像が撮影される。かかる血管像に於いては、既に触れた通り、実質的に緑色光のみにより像形成が為されているところ、血管の存在領域では、ヘモグロビンの光吸収の作用により緑色光が減衰しているので、血管の輝度のみが周囲に比して低くなり、これにより、血管の像が把握されることとなる。かくして、撮影された像は、画像処理装置に於いて画像データとして取り込まれ、バックグラウンド補正、シェーディング補正等の公知の画像補正処理が施される。そして、得られた画像から、任意の手法により、血管の直径、分岐数、面積が計測されてよい。［より厳密には、ここで、撮影される血管像は、試料の表層の血管の像となる。本実施形態では、カメラに入射される光が緑色光（５１０〜５５０ｎｍ）に制限されているところ、緑色光は、生体試料の深部まで到達せず、表層で反射される。従って、緑色光で形成される像は、生体試料の表層の像であるので、ここで得られる血管像は、表層の血管の像である。なお、戻り光を、ヘモグロビンの、より短波長側の吸収波長（４００〜４５０ｎｍ）、より詳細には、吸収極大波長に制限しても或る程度の高いコントラストでの観察が可能である。その場合、写し出される像は、より表層の血管の像となろう。］
【００２５】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００２６】
本実施例に於いては、生きたラットの肝臓の血管をｉｎ  ｖｉｖｏ観察した。操作処理過程は、以下の通りとした。
【００２７】
１．試料の準備として、健常Ｆ３４４雄ラットに気化麻酔（イソフランを使用）により麻酔をかけた後、開腹して肝臓を露出させた。
２．イメージング装置ＯＶ１００（オリンパス社）に於いて、露出された肝臓を明視野観察した。照明光光源として、１００ＷハロゲンランプＬＧ−ＰＳ２を用い（発光波長特性は、図１（Ｂ）上段）、対物レンズを１．６７倍に設定した。検出装置として、カラーＣＣＤカメラ（ＤＰ７１、オリンパス社）を用い（ＲＧＢ各成分の応答波長特性は、図１（Ｂ）下段）、血管像の撮影に於いては、適宜、カメラの入射光路に緑色バンドパスフィルター（ＢＡ５１０−５５０、透過光波長特性は、図１（Ｃ）中段）を配置した。
【００２８】
図２は、ラットの肝臓の明視野像を示している。同図に於いて、上段（Ａ）は、本発明の方法に従って、緑色バンドパスフィルター（ＧＦ）を用いて、撮影した像であり、下段（Ｂ）は、ＧＦを用いずに撮影した像である。図から理解される如く、全体像（ＲＧＢ合成）について、（Ａ）、（Ｂ）のものを比較すると、（Ｂ）の像に比して、（Ａ）の像に於いて、血管の構造が明瞭に観察された。更に、それぞれ、全体像中の枠内の部分について、Ｇ成分の像を比較すると、（Ａ）の像に於いて、血管の像のコントラストは、更に高くなった。かかるＧ成分の像を二値化すると（画像処理は、画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを用いてバックグラウンド減算処理を施した後、適当な閾値にて二値化した。）、（Ａ）の像に於いて、（Ｂ）の像に比して、血管の構造が明瞭に検出された。
【実施例２】
【００２９】
本実施例に於いては、ラットから摘出された心臓の血管を観察した。操作処理過程は、以下の通りとした。
【００３０】
１．試料の準備として、健常Ｆ３４４雄ラットを安楽死させた直後に心臓を摘出した。
２．イメージング装置ＯＶ１００に於いて、摘出された心臓を明視野観察した。照明光光源として、１００ＷハロゲンランプＬＧ−ＰＳ２を用い、対物レンズを２倍に設定した。検出装置として、カラーＣＣＤカメラ（ＤＰ７１）を用い、血管像の撮影に於いては、適宜、カメラの入射光路に緑色バンドパスフィルターを配置した。
【００３１】
図３は、ラットの心臓の明視野像を示している。同図に於いて、上段（Ａ）は、本発明の方法に従って、緑色バンドパスフィルター（ＧＦ）を用いて、撮影した像であり、下段（Ｂ）は、ＧＦを用いずに撮影した像である。図から理解される如く、（Ａ）、（Ｂ）のそれぞれに於いて、ＲＧＢ合成像とＧ成分像とを比較して、Ｇ成分像に於いて、血管の像が明瞭であることが観察され、（Ａ）の像と（Ｂ）の像とを比較して、（Ａ）の像に於いて、より明瞭に血管の像が高いコントラストにて写し出されている様子が観察できる。かかるＧ成分の像を実施例１と同様に二値化すると（Ａ）の像に於いて、（Ｂ）の像に比して、血管の構造が細部に亙って検出された。
【実施例３】
【００３２】
本実施例に於いては、生きたラットの甲状腺の血管をｉｎ  ｖｉｖｏ観察した。実験に於いては、健常ラットの甲状腺と、甲状腺二段階発がんモデルラットの甲状腺をそれぞれ観察した。操作処理過程は、以下の通りとした。
【００３３】
１．試料の準備として、発がんモデルラットは、６週齢のＦ３４４雄ラットにイニシエーターとしてＤＨＰＮを皮下投与し、１週間後にプロモーターとしてＳＤＭを２４週間飲水投与して作成した。かくして、作成した発がんモデルラットと健常Ｆ３４４雄ラットのそれぞれに気化麻酔（イソフランを使用）により麻酔をかけた後、切開して甲状腺を露出させた。
２．イメージング装置ＯＶ１００に於いて、露出された甲状腺を明視野観察した。照明光光源として、１００ＷハロゲンランプＬＧ−ＰＳ２を用い、対物レンズを０．５６倍に設定した。検出装置として、カラーＣＣＤカメラ（ＤＰ７１）を用い、血管像の撮影に於いては、適宜、カメラの入射光路に緑色バンドパスフィルターを配置した。
【００３４】
図４は、健常ラットの甲状腺の明視野像を、図５は、発がんモデルラットの甲状腺の明視野像を、それぞれ、示している。各図に於いて、上段（Ａ）は、本発明の方法に従って、緑色バンドパスフィルター（ＧＦ）を用いて、撮影した像であり、下段（Ｂ）は、ＧＦを用いずに撮影した像である。図４及び図５から理解される如く、（Ａ）、（Ｂ）のそれぞれに於いて、ＲＧＢ合成像とＧ成分像とを比較して、Ｇ成分像に於いて、血管の像が明瞭であることが観察され、（Ａ）の像と（Ｂ）の像とを比較して、（Ａ）の像に於いて、より明瞭に血管の像が高いコントラストにて写し出されている様子が観察できる。かかるＧ成分の像を、それぞれ、実施例１と同様に二値化すると、（Ａ）の像に於いて、（Ｂ）の像に比して、血管の構造が細部に亙って検出された。そこで、図５（Ａ）、（Ｂ）の二値化画像に於いて、実線枠内のシグナル領域（黒色領域）の面積を算出したところ（画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用）、ＧＦを用いたときの血管像の面積は、ＧＦを用いないときの面積の略２倍の値となった（図６参照）。このことは、ＧＦを用いることにより、血管の像をより細部まで捉えることが可能となったことを示している。また、図４（Ａ）の二値化像と図５の（Ａ）の二値化像を比較して、発がんモデルラットの甲状腺に於いて、血管新生が亢進している様子が、図４（Ｂ）の二値化像と図５の（Ｂ）の二値化像を比較する場合よりも、明瞭に観察することが可能であった。
【００３５】
かくして、上記の実施例から、実験用小動物の観察に於いて、観察試料に照明光として白色光を当てながら、カメラ前に戻り光波長を緑色光に制限するバンドパスフィルターにて制限することにより、簡便にコントラストの高い血管の像を捉えることができることが示された。かかる構成によれば、観察試料に照明光として白色光を当てられているので、例えば、観察者は、血管の像の撮影中に、接眼レンズにて白色光で照明された試料を観察ながら、切開領域を広げたり、試料の向きを変えるといった操作を容易に行うことが可能となる。
【００３６】
以上の説明は、本発明の実施の形態に関連してなされているが、当業者にとつて多くの修正及び変更が容易に可能であり、本発明は、上記に例示された実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の概念から逸脱することなく種々の方法に適用されることは明らかであろう。
【００３７】
例えば、上記の実施例に於いて、バンドパスフィルターは、任意に出し入れできるようになっていてよく、これにより、簡便に、観察領域のカラー画像と血管像を切り換えることができるようになっていてよい。また、ハーフミラー２５に代えて、戻り光の光路の向きを接眼レンズ側とカメラ側との間で任意に切り換えられる切換ミラーが用いられていてもよい。本発明の方法の原理、即ち、撮像手段へ入射する戻り光の波長帯域を照明光の波長帯域内の緑色光の波長帯域又はヘモグロビンの光吸収が極大となる波長を含む所定の帯域に狭められるよう制限し、これにより、高コントラストの血管の像を得るという原理は、実験用動物の観察だけでなく、任意の生体の組織に於ける血管の観察に於いても適用可能であることは理解されるべきである。
【符号の説明】
【００３８】
１０…試料（実験用小動物）
２０…イメージング装置
２２…対物レンズ系
２４…光源
２５…ハーフミラー
２６…ＣＣＤカメラ
２６ａ…検出光用フィルター
２８…バンドパスフィルター
３０…コントローラ
３０ａ…モニター
【図１】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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