(57)【要約】【課題】抗ＨＣＶ抗体についてのイムノアッセイを提供すること。【解決手段】本発明は、複数エピトープ融合抗原との組み合わせでのＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープの使用が、初期のＨＣＶセロコンバージョンを検出するための高感度かつ確実な方法を提供するという知見に一部基づいている。本明細書中で記載されるアッセイはまた、６つの公知のＨＣＶ遺伝子型のいずれかによって引き起こされるＨＣＶを検出し得る。複数エピトープ融合タンパク質の使用はまた、マスキングの問題を低減し、基質単位面積当たりのより多数のエピトープを可能にすることによって、抗体の検出における感度を改善し、そして選択性を改善するというさらなる利点を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的にウイルスの診断に関連する。特に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染を正確に診断するために複数のＨＣＶ抗原を使用するイムノアッセイに関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、主に輸血および体液交換を介して感染する、非経口の非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主な原因である。このウイルスは、アメリカ合衆国における総人口の０．４〜２．０％に存在する。慢性肝炎は、感染者の５０％で発症し、そしてこれら感染した個体のおおよそ２０％が、肝硬変を発症し、これはしばしば肝細胞癌腫を引き起こす。従って、この疾患の研究および制御は、医学的に重要である。
【０００３】
ＨＣＶは、ＨｏｕｇｈｔｅｎらによってＮＡＮＢＨの原因として、最初に同定され、そして特徴付けされた。このＨＣＶのウイルスゲノム配列を得るための方法が公知であるのと同様に、この配列も公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；同ＷＯ９０／１１０８９；および同ＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶは、９．５ｋｂのポジティブセンス、単鎖ＲＮＡゲノムを有し、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅファミリーウイルスのメンバーである。少なくとも６つの別個ではあるが、系統発生分析に基づいてゲノタイプが関連しているＨＣＶが、同定されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１〜２３９９）。これらのウイルスは、３０００を超えるアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６９；Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１〜２４５５；Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１〜１７１５）。ポリタンパク質は、翻訳と同時に、そして翻訳後に、構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセシングされる。
【０００４】
特に、図１に示されるように、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断生成物の順番および学名は以下である：ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−Ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。ポリタンパク質の最初の切断は、３つの構造タンパク質（Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）ならびに２つのエンベロープ糖タンパク質（「Ｅ１」（Ｅとしても公知）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても公知）））ならびにウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を遊離する、宿主プロテアーゼによって触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂと呼ばれる。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する必須の膜タンパク質である。ＮＳ２は、単独でか、またはＮＳ３と組み合わせてのいずれかで、ＮＳ２−ＮＳ３シスル結合を切断し、これは次にＮＳ３のＮ末端を生じ、セリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼの両方の活性を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセシングするために役立つ。ポリタンパク質成熟の終了は、ＮＳ３−ＮＳ４ａの連結部での自己触媒的切断（ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される）によって開始される。引続くＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３媒介切断は、別のポリペプチドのＮＳ３分子によるポリタンパク質切断連結部の認識に関連するようである。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ（ＮＳ５Ａはリン酸化機能を有する）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離する。
【０００５】
ＨＣＶに関する免疫学的試薬および診断的試薬として有用なＨＣＶポリタンパク質由来の多数の一般的なポリペプチドならびに特定のポリペプチドが記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、欧州公開番号３１８，２１６および同３８８，２３２；Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２〜３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１〜３８８；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８を参照のこと。これらの出版物は、一般的に、ＨＣＶならびにＨＣＶポリペプチドの免疫学的試薬の製造および使用についての広範な背景を提供する。
【０００６】
ＨＣＶ保有者およびＨＣＶに汚染された血液または血液製剤をスクリーニングおよび同定するための高感度で特異的な方法は、医薬品の重要な進歩を提供する。輸血後肝炎（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（ＰＴＨ）は、輸血された患者のおおよそ１０％で発症し、そしてＨＣＶは、これらの場合の最大９０％の原因であった。患者の看護ならびに血液および血液製剤によるか、または緊密な個人的接触によるＨＣＶの予防および感染についての、確実な診断手段および予後診断手段が必要とされる。従って、いくつかのアッセイがＨＣＶ感染の血清診断のために開発されてきた。例えば、Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２〜３６４；Ｃｈｏｏら、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．（１９９０）４６：４２３〜４４１；Ｅｂｅｌｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：９８２〜９８３；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：５５８〜５６０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３７：３１７〜３１９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９；ならびにＫａｓｈｉｗａｋｕｍａら、米国特許第５，８７１，９０４号を参照のこと。
【０００７】
血清に基づくいくつかのアッセイが遭遇した重大な問題は、ウイルスの感染と検出との間に有意な間隔（しばしば、８０日間を超える）が存在することである。このアッセイの間隔は、輸血レシピエントに対して重大な危険性を生じ得る。この問題を解決するために、直接ウィルスＲＮＡを検出する核酸に基づく試験（ＮＡＴ）、および抗体応答の代わりに￥にウイルス抗原をアッセイするＨＣＶコア抗原試験が開発された。例えば、Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａら、米国特許第５，８７１，９０４号を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、十分な患者の看護を提供し、そして血液および血液製剤によるか、または密接な個人的接触によるＨＣＶの感染を防ぐための高感度で正確な診断手段および予後診断手段の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、複数エピトープ融合抗原との組み合わせでのＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープの使用が、初期のＨＣＶセロコンバージョンを検出するための高感度かつ確実な方法を提供するという知見に一部基づいている。本明細書中で記載されるアッセイはまた、６つの公知のＨＣＶ遺伝子型のいずれかによって引き起こされるＨＣＶを検出し得る。複数エピトープ融合タンパク質の使用はまた、マスキングの問題を低減し、基質単位面積当たりのより多数のエピトープを可能にすることによって、抗体の検出における感度を改善し、そして選択性を改善するというさらなる利点を有する。
【００１０】
従って、１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａのコンフォメーションエピトープおよびそれに結合する複数エピトープ融合抗原から実質的になる、イムノアッセイ固体支持体に関連し、ここでこのＮＳ３／４ａエピトープおよび／またはこの複数エピトープ融合抗原は、ＨＣＶに感染した個体からの生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応する。
【００１１】
ＮＳ３／４ａエピトープは、その配列がプロテアーゼ活性を有する限りにおいて、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、またはその配列に少なくとも８０％の配列同一性、もしくはその配列に９０％の配列同一性、もしくはその配列に少なくとも９８％の配列同一性、もしくはその間の任意の整数の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列からなる。
【００１２】
さらなる実施形態において、複数エピトープ融合抗原は、その配列に少なくとも９８％の配列同一性、もしくはその配列がＨＣＶに感染した個体由来のサンプルに存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する限りにおいて、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、またはその配列に少なくとも８０％の配列同一性、もしくはその配列に９０％の配列同一性、もしくはその間の任意の整数の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、複数の融合エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる。
【００１３】
なお別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープおよびそれに結合する複数エピトープ融合抗原から実質的になるイムノアッセイ固体支持体に関連し、ここで上記ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、またはその配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列（これは、プロテアーゼ活性を有する）を含み、そして上記複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、またはその配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸（これは、ＨＣＶに感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する）を含む。特定の実施形態において、ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープおよび複数エピトープ融合抗原は、ＮＳ３／４ａ配列がプロテアーゼ活性を有し、そして複数エピトープ融合抗原が、ＨＣＶに感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体に特異的に反応する限りにおいて、図３Ａ〜３Ｄおよび図５Ａ〜５Ｆのアミノ酸配列にそれぞれ少なくとも９０％、９８％（または、その間の任意の整数）の配列同一性を有する。特定の実施形態において、ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列からなり、そして複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープおよびそれに結合する複数エピトープ融合抗原から実質的になるイムノアッセイ固体支持体に関連し、ここで、上記３／４ａコンフォメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列からなり、そして上記複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる。
【００１５】
なおさらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出するための方法に関連し、本方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）上記のようなイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）ＨＣＶ抗体（生物学的サンプル中に存在する場合）が、上記ＮＳ３／４ａエピトープおよび／または上記複数エピトープ融合抗原との結合するのを可能にする条件下で、生物学的サンプルとこの固体支持体とを組合せて、第一の免疫複合体を形成する工程。
【００１６】
（ｃ）複合体を形成する条件下で、工程（ｂ）からの固体支持体に、検出可能に標識した抗体を添加する工程であって、ここでこの標識された抗体が、上記免疫複合体と反応性である、工程；
（ｄ）検出可能に標識された抗体と生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標としての第一の免疫複合体（存在する場合）との間に形成される第二の免疫複合体を検出する工程。
【００１７】
なおさらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法に関連し、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープおよびそれに結合する複数エピトープ融合抗原から実質的に構成される、イムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、ここで上記ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列から構成され、そして上記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列から構成される、工程；
（ｂ）ＨＣＶ抗体（生物学的サンプル中に存在する場合）が、上記ＮＳ３／４ａエピトープおよび／または上記複数エピトープ融合抗原に結合する条件下で、生物学的サンプルと上記固体支持体とを組み合せて、第一の免疫複合体を形成する工程；
（ｃ）複合体を形成する条件下で、工程（ｂ）からの固体支持体に、検出可能に標識された抗体を添加する工程であって、ここでこの標識された抗体は、上記免疫複合体と反応性である、工程。
【００１８】
（ｄ）検出可能に標識された抗体と生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標としての第一の免疫複合体（存在する場合）との間で形成される、第二の免疫複合体を検出する工程。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、上記のようなイムノアッセイ固体支持体、および免疫診断試験を実施するための説明書を備える、免疫診断試験キットに関連する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は以下を含むイムノアッセイ固体支持体を生成する方法に関連する：
（ａ）固体支持体を提供する工程；および
（ｂ）少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンフォメーションエピトープと複数エピトープ融合抗原とを固体支持体に結合させる工程であって、ここでこのＮＳ３／４ａエピトープおよび／またはこの複数エピトープ融合抗原が、ＨＣＶに感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する、工程。
【００２１】
特定の実施形態において、コンフォメーションエピトープは、この配列がプロテアーゼ活性を有する限りにおいて、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、またはその配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその配列に９０％の同一性、またはその配列に少なくとも９８％の配列同一性、または任意の整数の間の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして複数エピトープ融合抗原は、その配列がＨＣＶに感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する限りにおいて、図５Ａ〜５Ｆに記載されるアミノ酸配列、またはその配列に少なくとも８０％の配列同一性、またはその配列に９０％の配列同一性、またはその配列に少なくとも９８％の配列同一性、またはその間の任意の整数の間の配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
【００２２】
なおさらなる実施形態において、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに記載されるアミノ酸配列からなり、そして複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに記載されるアミノ酸配列からなる。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、イムノアッセイ固体支持体を生成する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）固体支持体を提供する工程；および
（ｂ）この固体支持体を、少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープおよび複数エピトープ融合タンパク抗原に結合する工程であって、ここで、このＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに記載されるアミノ酸配列からなり、そして、この複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに記載されるアミノ酸配列からなる。
【００２４】
なおさらなる実施形態において、本発明は、図５Ａ〜５Ｆに記載されるアミノ酸配列を含む複数エピトープ融合抗原、あるいはそれに対して、少なくとも８０％の配列合同一性を有するか、９０％の配列同一性を有するか、または少なくとも９８％の配列同一性またはその間の任意の整数の配列同一性を有するアミノ酸配列（この配列は、ＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する）に関する。
【００２５】
特定の実施形態において、この複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる。
【００２６】
他の実施形態において、本発明は、複数エピトープ融合抗原についてのコード配列を含むポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御エレメントを含む組換えベクター（これによって、コード配列が、宿主細胞において転写および翻訳され得る）、この組換えベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに、組換え複数エピトープ融合抗原を作製する方法に関し、この方法は、上記のような宿主細胞の集団を提供する工程およびこの組換えベクター中に存在するコード配列によってコードされる多重エピトープ融合抗原が発現される条件下でこの細胞の集団を培養する工程を包含する。
【００２７】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して、明らかとなる。
【００２８】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  イムノアッセイ固体支持体であって、本質的に、該支持体に結合する少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープおよび複数エピトープ融合抗原からなり、ここで、該ＮＳ３／４ａエピトープおよび／または該複数エピトープ融合抗原は、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する、固体支持体。
（項目２）  前記ＮＳ３／４ａエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目３）  前記ＮＳ３／４ａエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目４）  前記ＮＳ３／４ａエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目５）  前記ＮＳ３／４ａエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列からなる、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目６）  前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目７）  前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目８）  前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目９）  前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる、項目１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目１０）  イムノアッセイ固体支持体であって、本質的に、該支持体に結合する少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープおよび複数エピトープ融合抗原からなり、ここで、該ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含み、そして該複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、固体支持体。
（項目１１）  前記ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目１０に記載のイムノアッセイ個体支持体。
（項目１２）  前記ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含み、そして前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目１０に記載のイムノアッセイ個体支持体。
（項目１３）  前記ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示される前記アミノ酸配列からなり、そして前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示される前記アミノ酸からなる、項目１０に記載のイムノアッセイ固体支持体。
（項目１４）  イムノアッセイ固体支持体であって、本質的に、該支持体に結合する少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープおよび複数エピトープ融合抗原からなり、ここで、該ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープは、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列からなり、そして該複数エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる、固体支持体。
（項目１５）  免疫診断試験キットであって、項目１〜１４のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体、および該免疫診断試験を実施するための指示書を備える、キット。
（項目１６）  イムノアッセイ固体支持体を作製する方法であって、以下：
（ａ）固体支持体を提供する工程；ならびに
（ｂ）少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープおよび複数エピトープ融合抗原を該固体支持体に結合する工程、
を包含し、ここで、該ＮＳ３／４ａエピトープおよび／または該複数エピトープ融合抗原は、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する、方法。
（項目１７）  前記ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含み、そして該，複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）  前記ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列からなり、そして前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）  イムノアッセイ固体支持体を作製する方法であって、以下：
（ａ）固体支持体を提供する工程；ならびに
（ｂ）少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープおよび複数エピトープ融合抗原を該固体支持体に結合する工程、
を包含し、ここで、該ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、図３Ａ〜３Ｄに示されるアミノ酸配列からなり、そして該複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる、方法。
（項目２０）  複数エピトープ融合抗原であって、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、複数エピトープ融合抗原。
（項目２１）  前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の複数エピトープ融合抗原。
（項目２２）  前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するアミノ酸配列を含む、項目２０に記載の複数エピトープ融合抗原。
（項目２３）  前記複数エピトープ融合抗原が、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる、項目２０に記載の複数エピトープ融合抗原。
（項目２４）  項目２０〜２３のいずれか１項に記載の複数エピトープ融合抗原のコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
（項目２５）  前記ポリヌクレオチドが、図５Ａ〜５Ｆに示される核酸配列、または該核酸配列に少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２６）  前記ポリヌクレオチドが、図５Ａ〜５Ｆに示される核酸配列、または該核酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２７）  前記ポリヌクレオチドが、図５Ａ〜５Ｆに示される核酸配列、または該核酸配列に少なくとも９８％の配列同一性を有し、ＨＣＶ感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、項目２４に記載のポリヌクレオチド。
（項目２８）  組換えベクターであって、以下：
（ａ）項目２４〜２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御エレメントであって、これによって、前記コード配列が、宿主細胞で転写および翻訳され得る、制御エレメント、
を含む、組換えベクター。
（項目２９）  項目２８に記載の組換えベクターで形質転換された、宿主細胞。
（項目３０）  組換え複数エピトープ融合抗原を作製する方法であって、以下：
（ａ）項目２９に記載の宿主細胞の集団を提供する工程；および
（ｂ）前記組換えベクター中に存在する前記コード配列によってコードされる該複数エピトープ融合抗原が発現される条件下で、該細胞集団を培養する工程
を包含する、方法。
（項目３１）  生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法において使用するための診断試薬を製造するための、項目１〜１４のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体の使用。
（項目３２）  生物学的サンプ中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）項目１〜１４のいずれか１項に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）ＨＣＶ抗体が生物学的サンプル中に存在する場合に、ＨＣＶ抗体が前記ＮＳ３／４ａエピトープおよび／または前記複数エピトープ融合抗原と結合して、第１の免疫複合体を形成し得る条件下で、生物学的サンプルを該固体支持体と合わせる工程；
（ｃ）複合体形成条件下で、工程（ｂ）からの該固体支持体に、検出可能な標識抗体を添加する工程であって、ここで、該標識抗体が、該免疫複合体と反応する、工程；
（ｄ）存在する場合、該検出可能な標識抗体と該第１の免疫複合体の間で形成された第２の免疫複合体を、該生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として検出する工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＨＣＶゲノムの模式図であり、本発明のアッセイ試薬（タンパク質および抗体）が由来するポリタンパク質の種々の領域を示す。
【図２】図２は、本発明の代表的なイムノアッセイの模式図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、本発明のアッセイにおける使用のための代表的なＮＳ３／４ａコンホメーション抗原のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。図３Ａ〜３Ｄの４０３位および４０４位のアミノ酸は、ＨＣＶ−１のネイティブなアミノ酸配列のＰｒｏのＴｈｒでの置換、およびＩｌｅのＳｅｒでの置換を表す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、本発明のアッセイにおける使用のための代表的なＮＳ３／４ａコンホメーション抗原のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。図３Ａ〜３Ｄの４０３位および４０４位のアミノ酸は、ＨＣＶ−１のネイティブなアミノ酸配列のＰｒｏのＴｈｒでの置換、およびＩｌｅのＳｅｒでの置換を表す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、本発明のアッセイにおける使用のための代表的なＮＳ３／４ａコンホメーション抗原のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。図３Ａ〜３Ｄの４０３位および４０４位のアミノ酸は、ＨＣＶ−１のネイティブなアミノ酸配列のＰｒｏのＴｈｒでの置換、およびＩｌｅのＳｅｒでの置換を表す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、本発明のアッセイにおける使用のための代表的なＮＳ３／４ａコンホメーション抗原のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。図３Ａ〜３Ｄの４０３位および４０４位のアミノ酸は、ＨＣＶ−１のネイティブなアミノ酸配列のＰｒｏのＴｈｒでの置換、およびＩｌｅのＳｅｒでの置換を表す。
【図４】図４は、ＭＥＦＡ７．１の模式図である。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｆは、ＭＥＦＡのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｆは、ＭＥＦＡのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｆは、ＭＥＦＡのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｆは、ＭＥＦＡのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｆは、ＭＥＦＡのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｆは、ＭＥＦＡのＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、本発明のイムノアッセイとともに使用するための代表的なＭＥＦＡを示す。図６Ａは、ＭＥＦＡ３の模式図である。図６Ｂは、ＭＥＦＡ５の模式図である。図６Ｃは、ＭＥＦＡ６の模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ｐｓＭＥＦＡ７の構築の図である。
【図８】図８は、ｐｓＭＥＦＡ７．１の構築の図である。
【図９】図９は、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩの構築の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内の、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に完全に説明される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、最新添付（ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ））；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容がそうではないと明らかに示さない限り、複数の参照をも含む。従って、例えば、「抗原」に対する参照は、２以上の抗原の混合物を含む、など。
【００３２】
以下のアミノ酸の略語は、この明細書を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）          アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）      アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）        グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）      グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）        イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）          リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）        フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）          セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）        トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）          バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００３３】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい。そして生成物の最小長に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質の所望の活性が維持される限り、ネイティブな配列に対する、改変（例えば、欠失、付加および置換（天然では、一般に保存的））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介してのように意図的であり得るか、またはこのタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介するような、偶発的なものであり得る。
【００３４】
ＨＣＶポリペプチドは、上記のように、ＨＣＶポリタンパク質に由来するポリペプチドである。このポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来する必要はないが、合成的にまたは組換え的に生成され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のＨＣＶ株および単離物のいずれか（例えば、限定されないが、ＨＣＶの株１、２、３、４、５または６由来の単離物のいずれか）に由来し得る。多くの保存領域および可変領域が、これらの株で既知であり、そして一般に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合に、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より大きい、好ましくは４０％より大きいアミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ３／４ａ」ポリペプチドは、種々のＨＣＶ株のいずれかに由来するネイティブなＮＳ３／４ａ、ならびに以下にさらに定義されるようなＮＳ３／４ａアナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメントをいう。多くのこれらの株の完全な遺伝子型は、公知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２３８８００ならびにＡＪ２３８７９９を参照のこと。
【００３５】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、参照分子の生物学的に活性な誘導体またはこのような誘導体のフラグメント（これらは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性のような所望の活性を維持する）をいう。一般に、用語「アナログ」は、改変が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブ分子に対して、１以上のアミノ酸付加、置換（一般に、天然においては保存される）、および／または欠失を有するネイティブなポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」は、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチドをいい、例えば、国際公開番号ＷＯ  ９１／０４２８２に記載される。好ましくは、このアナログまたはムテインは、ネイティブな分子と少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００３６】
特に好ましいアナログは、天然では保存的である置換（すなわち、それらの側鎖が関係するアミノ酸のファミリー内で起こる置換）を含む。具体的に、アミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷で極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの単独置換、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸の類似の保存的な置換は、生物学的活性に対して、主要な効果は有さないことが、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、もしくは約１５〜２５までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは５〜２５の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を有し得る。当業者は、当該分野で周知の、Ｈｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することによって、変化を許容し得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００３７】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドを意図する。このフラグメントは、ネイティブなポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般に、全長分子の少なくとも約５〜１０連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５連続するアミノ酸残基、および最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０以上連続するアミノ酸残基（これらは、エピトープを規定する）を含み、または５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続するアミノ酸残基を含むが、ただし、問題のフラグメントは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性を保持する。例えば、好ましい免疫原性フラグメントとしては、例えば、ポリタンパク質のアミノ酸１０〜４５、１０〜５３、６７〜８８、および１２０〜１３０、エピトープ５−１−１（ウイルスゲノムにおけるＮＳ４ａ／ＮＳ４ｂ領域において）、ならびに図１に示されるポリタンパク質の領域のいずれかに由来する規定されたエピトープ（例えば、限定されないが、Ｅｌ、Ｅ２、ＮＳ３（例えば、ＮＳ３領域由来のポリペプチドｃ３３ｃ）、ＮＳ４（例えば、ＮＳ３／ＮＳ４領域由来のポリペプチドｃ１００）、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａおよびＮＳ５領域、ならびにＨＣＶポリタンパク質から同定される他の種々のエピトープのいずれか）を含むＨＣＶコアのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ  ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ、Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ  ９４／０１７７８；米国特許第６，１５０，０８７号および同第６，１２１，０２０号を参照のこと。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５、好ましくは約５〜１０または１５、および約１０００アミノ酸以下（またはこの間の任意の整数のアミノ酸）の配列をいい、これは、それ自体によって、またはより大きな配列の一部として、このような配列に応答して産生される抗体に結合する配列を規定する。フラグメントの長さに臨界的な上限は存在せず、このフラグメントは、ほぼ全長のタンパク質配列、またはＨＣＶポリタンパク質由来の２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえ含み得る。本発明における使用のためのエピトープは、これが由来する親タンパク質の一部分の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際に、ウイルスゲノムは、一定のフラックスの状態にあり、そして単離物間で比較的高い程度の変異性を示すいくつかの可変領域を含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブな配列に同一な配列、ならびにネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に、天然においては保存される））を包含する。
【００３９】
エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野で公知の、任意の数のエピトープマッピング技術を使用して、同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、多数のペプチド（これらのペプチドは、タンパク質分子の一部分に対応する）を固体支持体上で同時に合成し、そしてこれらのペプチドを固体支持体になおも付着させつつ、これらのペプチドを抗体を反応させることによって決定され得る。これらの技術は、当該分野で公知であり、そして以下に記載される：米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．ＩｍｍｕｎｏＬ  ２３：７０９−７１５。このような技術を使用して、ＨＣＶの多くのエピトープが同定されている。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  （１９９４）３２０−３２４頁、およびさらに以下を参照のこと。同様に、コンホメーションエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間的立体配座を決定することによって容易に決定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性および疎水性親水性指標プロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されたもの）を使用して、同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためのＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８）、および疎水性親水性指標プロットのためのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２）を使用する。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「コンホメーションエピトープ」とは、全長の天然のタンパク質内の、エピトープをコードするアミノ酸配列にネイティブな構造的特徴を有する、全長タンパク質、またはそのアナログまたはムテインの一部をいう。ネイティブな構造的特徴としては、グリコシル化および三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、幅広い変動に供され得る。なぜなら、これらのエピトープは、抗原の三次元形状（例えば、折り畳み）によって形成されると考えられるからである。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない数であり得るが、分子の長さに沿って幅広く分散し得、折り畳みにより正確なエピトープコンフォメーションにされる。エピトープを規定する残基間の抗原の部分は、エピトープのコンフォメーショナルな構造に重要ではなくてもよい。例えば、これらの介在する配列の欠失または置換は、エピトープのコンフォメーションに重要な配列（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）が維持される限り、コンホメーションエピトープに影響しなくてもよい。
【００４１】
ＮＳ３／４ａ領域に存在するコンホメーションエピトープは、上で議論される方法を使用して容易に同定される。さらに、所与のポリペプチドにおけるコンホメーションエピトープの存在または非存在は、抗体（コンホメーションエピトープに対するポリクローナル血清またはモノクローナル血清）を用いて目的の抗原をスクリーニングし、そしてその反応性を線形のエピトープのみ（存在する場合）を保持する変性版の抗原の反応性と比較することによって容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清を、最初に変性抗原を用いて吸収し、そして目的の抗原に対する抗体を保持するか否かを観測することが有利であり得る。さらに、ＮＳ３／４ａの場合において、ネイティブなコンフォメーションを保存する分子は、プロテアーゼ酵素活性そして必要に応じて、ヘリカーゼ酵素活性を有する。このような活性は、以下にさらに記載されるように、酵素アッセイを使用して、検出され得る。
【００４２】
好ましくは、コンホメーションエピトープは、組換え的に産生され、そして、例えば、エピトープの変性なしにその所望の構造的特徴を保存する条件下で抽出可能である細胞において発現される。このような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。ＨＣＶポリタンパク質からの組換えコンホメーションエピトープの発現および単離は、例えば、国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１、ＷＯ９４／０１７７８、ＷＯ９５／３３０５３、ＷＯ９２／０８７３４に記載される。あるいは、抗原を発現し、そしてさらに、回収の後にタンパク質を再生することが可能である。化学合成によってまた、「ネイティブ」な抗原のコンホメーションエピトープと交差反応するコンフォメーショナル抗原ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）が提供され得ることがまた理解される。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「複数エピトープ融合抗原」または「ＭＥＦＡ」は、複数のＨＣＶ抗原がアミノ酸の単一の連続した鎖の一部であるポリペプチドを意図し、この鎖は、天然に存在しない。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合によって互いに直接的に結合され得るか、または介在するアミノ酸配列によって分離され得る。融合抗原はまた、ＨＣＶポリタンパク質に対して外来性の配列を含み得る。さらに、存在するＨＣＶ配列は、複数のゲノム型由来であり得、そして／またはＨＣＶの単離体であり得る。本発明のイムノアッセイにおける使用のための特定のＭＥＦＡの例は、例えば、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９に詳細に記載され、そして以下にさらに記載される。
【００４４】
「抗体」は、化学的手段または物理的手段によって、目的のポリペプチドに特異的に結合する分子を意図する。従って、例えば、ＨＣＶコア抗体は、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合する分子である。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方、ならびに以下：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９；および米国特許番号第４，８１６，５６７号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９〜２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１〜４０９６を参照のこと）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照のこと）；二量体および三量体の抗体フラグメント構築物；ミニ体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ
３１：１５７９〜１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０〜１２６を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；および１９９４年９月２１日に公開された英国特許公開番号ＧＢ２，２７６，１６９を参照のこと）；ならびに、このような分子から得られる任意の機能性フラグメントから得られる抗体を含み、ここで、このようなフラグメントは、親の抗体分子の免疫学的結合特性を保持する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル分子」とは、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されず、それが作製される方法によっても限定されることを意図しない。従って、この用語は、マウスハイブリドーマから得た抗体、ならびにマウスハイブリドーマよりもむしろヒトを使用して得たヒトモノクローナル抗体を包含する。例えば、Ｃｏｔｅら、Ｍｏｎｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ．７７を参照のこと。
【００４６】
「単離された」とは、ポリペプチドをいう場合、示された分子が、その分子が天然に見出される生物全体から分離され、そして別々であるか、または同じ型の他の高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然においてそのポリヌクレオチドと通常関連する配列の全てまたは一部を欠いた核酸分子；または天然で存在するが、その配列に関連する異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子である。
【００４７】
「等価な抗原決定基」とは、ＨＣＶの異なる亜種または株（例えば、ＨＣＶの株１、２または３）由来の抗原決定基を意味する。より詳細には、エピトープ（例えば、５−１−１）が、公知であり、そしてこのようなエピトープは、株１、２および３の間で変わる。従って、３つの異なる株由来のエピトープ５−１−１は、等価な抗原決定基であり、従って、たとえそれらの配列が同一でないとしても、「コピー」である。一般的に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より大きい、好ましくは４０％より大きい、アミノ酸配列相同性）を有する。
【００４８】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性の割合をいう。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００４９】
一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド−ヌクレオチドの対応またはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。同一性の割合は、それらの配列を整列させ、２つの整列された配列の間の一致の正確な数を数え、短い方の配列の長さによって割り、そして結果に１００を掛けることによる、２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって決定され得る。
【００５０】
容易に入手可能なコンピュータプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５、３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（これは、ペプチド分析のために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適合させる））は、相同性または同一性の分析を助けるために使用され得る。ヌクレオチド配列相同性を決定するためのプログラム（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する））は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において入手可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、そして上に参照されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメーターを用いて容易に使用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の相同性の割合は、６つのヌクレオチド位置のデフォルトスコアリングテーブルおよびギャップペナルティーを用いてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００５１】
本発明の状況において相同性の割合を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによる著作権があり、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一そろいのパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し得、ここで、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブルのために使用される（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）。生成されるデータから、「一致」値が「配列相同性」を反映する。配列間の同一性の割合または相同性の割合を計算するための他の適切なプログラムは、当該分野において一般的に公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅ）＝縮重なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５２】
あるいは、相同性は、相同な領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリペプチドのハイブリダイゼーション、続いて、単鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズの決定によって決定され得る。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について規定されるように、例えばストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照のこと。
【００５３】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節配列の制御下に配置される場合、インビトロまたはインビボで、転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列の３’側に配置され得る。
【００５４】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載される成分が、それらの所望の機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結される所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、コード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得（イントロンは転写され得る）、プロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００５５】
核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、その起源または操作により、天然に付随するポリヌクレオチドのうちの全てまたは一部を付随しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、以下にさらに記載のように、クローン化され、次いで、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
【００５６】
「制御エレメント」とは、それが連結するコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、ならびに適切な場合、リーダー配列およびエンハンサー（これらは、集合的に、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を提供する）を含む。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合し得、それに作動可能に連結される下流の（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、しばしば、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００５８】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、ｍＲＮＡにコード配列を転写する場合、細胞においてコード配列の「転写を指示し」、次いで、このｍＲＮＡは、コード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される。
【００５９】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。この発現カセットは、上記のような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に（これらの転写を指向するように）作動可能に連結されプロモーター）を含み、そしてしばしば、同様に、ポリアデニル化配列を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの構成成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、１種以上の選択マーカー、このプラスミド構築物が単鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３の複製起点）、少なくとも１ヶ所のマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、複製のＳＶ４０起点またはアデノウイルス起点）を含み得る。
【００６０】
本明細書中で使用される「形質転換」とは、挿入のために使用される方法（例えば、直接的な取り込み、トランスフェクション、感染などによる形質転換）に係わらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入をいう。トランスフェクションの特定の方法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、または宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００６１】
「宿主細胞」とは、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換された細胞、または形質転換され得る細胞をいう。
【００６２】
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織または流体のサンプルをいい、このサンプルは、一般に、被験体によって産生された抗体を含む。このような抗体を含む代表的なサンプルは、当該分野で公知であり、そして以下が挙げられるが、これらに限定されない：血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、皮膚、気道、腸管、および尿生殖路の分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検材料、ならびにまた培養培地（例えば、組換え細胞、および細胞成分）中での細胞および組織の増殖から得られる馴化培地を含むがこれに限定されないインビトロ細胞培養構築物のサンプル。
【００６３】
「共通の固体支持体」とは、被験体のイムノアッセイにおいて使用されるＨＣＶポリペプチドが、共有結合または疎水性吸着のような非共有結合手段で結合している、単一の固体基質をいう。
【００６４】
「免疫学的反応」とは、目的の抗原が、ＨＣＶに感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶと特異的に反応することを意味する。
【００６５】
「免疫複合体」とは、抗体が抗原上でエピトープに結合する場合に形成される組み合わせを意図する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、以下を含むが、これらに限定されない検出可能な分子をいう：放射活性同位元素、蛍光剤、化学ルミネッセンサー（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、発光団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発光団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎｅ）またはハプテン）など。用語「発光団」とは、検出可能な範囲で、蛍光を示し得る物質またはその一部をいう。本発明において使用され得る標識の特定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、ＴｅｘａＳレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシラーゼ。
【００６７】
（ＩＩ．発明の実施の形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の式に限定されず、プロセスパラメータ自体は、当然、変化し得ることが理解されなければならない。本明細書中で使用される技術が、本発明の特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定することを意図しないことが理解されなければならない。
【００６８】
本明細書中に記載される組成物および方法と類似しているかまたは等価の、多数の組成物および方法が、本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載されている。
【００６９】
上記のように、本発明は、初期ＨＣＶ感染を正確に検出するための、新規の診断方法の発見に基づく。本発明の方法は、高度に免疫原性のＨＣＶ抗原の同定および使用に依存し、このＨＣＶ抗原は、ＨＣＶのセロコンバージョンの初期段階中に存在し、これによって、検出精度を上昇させ、そして誤った結果の発生を減少させる。特に、本明細書中に記載されるイムノアッセイは、同一または異なるいずれかのＨＣＶ遺伝子型および単離型（ｉｓｏｌａｔｅ）由来の、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域から誘導される高度に免疫原性のコンホメーションエピトープ、および種々のＨＣＶポリペプチドを含む複数のエピトープ融合抗原（例えば、複数の免疫優性エピトープ（例えば、ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、５−１−１、ｃ１００−３およびＮＳ５配列の主に線状エピトープ））を利用する。これらの方法は、以下に記載される数種のアッセイ形態（例えば、ＨＣＶ抗原が結合する固体支持体を利用するアッセイ形態を含むが、これらに限定されない）のいずれかを使用する、単一のアッセイにより従来から実施され得る。
【００７０】
ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域が記載されており、このアミノ酸配列およびこのタンパク質の全体構造は、例えば、Ｙａｏら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９９年１１月）７：１３５３−１３６３；Ｓａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７：３３９２−３４０１；およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．（１９９９）６：１６５−１８１に開示されている。また、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許第５，８４３，７５２号を参照のこと。本発明のイムノアッセイは、天然に存在するＨＣＶ粒子またはその感染産物において見出されるようなコンホメーション中に存在する、ＮＳ３／４ａ領域由来の少なくとも１種類のコンホメーションエピトープを利用し、プロテアーゼ、必要に応じて、ＮＳ３／４ａ遺伝子産物によって通常示されるヘリカーゼ酵素活性および／またはＨＣＶ感染被験体由来の生物学的サンプル中での抗原と抗体との免疫活性の保持、ならびに抗原の変性におけるエピトープ免疫活性の減少によって明らかとなる。例えば、このコンホメーションエピトープは、加熱、極度に酸性または塩基性のｐＨの変化によって、または公知の有機的変性（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または適切な界面活性剤）を添加することによって崩壊され得る。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、上記のように処理されない産物と比較される変性産物を参照ここと。
【００７１】
プロテアーゼ活性およびヘリカーゼ活性は、当該分野で周知の標準的な酵素アッセイを使用して決定され得る。例えば、プロテアーゼ活性は、以下の実施例において記載される手順の使用、および当該分野で周知のアッセイの使用により決定され得る。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９−７５５；Ｓａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９８）７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９９）２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５２−１５８；およびＫｉｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２−４８を参照のこと。同様に、ヘリカーゼ活性アッセイは、当該分野で周知であり、そしてＮＳ３／４ａエピトープのヘリカーゼ活性は、例えば、以下を使用して決定され得る：例えば、Ｈｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）２５３：５９４−５９９に記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイ；Ｋｙｏｎｏら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５７：１２０−１２６に記載されるようなシンチレーション近接アッセイ系（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）；例えば、Ｈｉｃｈａｍら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．（２０００）４６：１８１−１９３およびＫｗｏｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０００）２４：９７−１１６に記載されるようなハイスループットスクリーニングアッセイ；ならびに当該分野で公知の他のアッセイ方法。例えば、Ｋｈｕら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．（２００１）７５：２０５−２１４；Ｕｔａｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）２７３：３１６−３２４；Ｐａｏｌｉｎｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．（２０００）８１：１３３５−１３４５；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：５１７４−５１８３；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（１９９８）１９：３５３−３６４；ならびにＨｅｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：２６１９−２６２５を参照のこと。
【００７２】
抗原の長さは、免疫反応性コンホメーションエピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を維持するのに十分である。しばしば、使用される抗原を含むポリペプチドは、ほとんど全長であるが、このポリペプチドはまた、例えば、可溶性を増加させるためか、または分泌を改善するために切断され得る。一般に、ＮＳ３／４ａ中に見出されるコンホメーションエピトープは、細胞中で組換えポリペプチドとして発現され、そしてこのポリペプチドは、以下で詳細に記載されるような所望の形態のエピトープを提供する。
【００７３】
ＮＳ３／４ａポリペプチドに関する代表的なアミノ酸配列は、図３Ａ〜３Ｄに示される。この図の２位〜６８６位に示されるアミノ酸配列は、ＨＣＶ−１のアミノ酸の１０２７位〜１７１１位に対応する。Ｍｅｔをコードする開始コドン（ＡＴＧ）は、１位として示される。さらに、ＨＣＶ−１の１４２８位（図３のアミノ酸の４０３位）に通常存在するＴｈｒは、Ｐｒｏに変異され、ＨＣＶ−１の１４２９位（図３のアミノ酸の４０４位）に通常存在するＳｅｒは、Ｉｌｅに変異される。しかし、このエピトープが、プロテアーゼ活性および必要に応じてヘリカーゼ活性が保持されるように、そのネイティブコンホメーションを保持または回復する方法を使用して産生される限り、Ｎ末端にＭｅｔを有するか、もしくは有さないネイティブ配列、Ｎ末端にＭｅｔを有するか、もしくは有さない描写アナログ（ｄｉｐｉｃｔｅｄ  ａｎａｌｏｇ）、または他のアナログおよびフラグメントのいずれかは、本発明のアッセイにおいて使用され得る。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら、米国特許第５，９９０，２７６号（これらの両方は、ＮＳ３／４ａのアナログを記載する）。
【００７４】
ＮＳ３／４ａのＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた約１０２７位〜約１２０７位（図３の２位〜１８２位）（例えば、Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照のこと）において見出される。ＮＳ３プロテアーゼの構造および活性部位は、公知である。例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１−６４０を参照のこと。通常、耐性であるネイティブ配列に対する変化は、分子の活性部位の以外の変化である。特に、図３のアミノ酸１位〜１５５位または２位〜１５５位を保持し、ほとんど置換されないか、または保存的置換のみされることが所望される。１５５を超えて存在するアミノ酸は、より大きな変化に耐性である。さらに、図３に見出されるＮＳ３／４ａ配列のフラグメントが使用される場合、これらのフラグメントは、一般に、Ｎ末端にＭｅｔを有するか、または有さない、少なくともアミノ酸１位〜１５５位または２位〜１５５位、好ましくは、アミノ酸１位〜１７５位または２位〜１７５位、そして最も好ましくは、アミノ酸１位〜１８２位または２位〜１８２位を含む。このヘリカーゼドメインは、ＨＣＶ−１の約１１９３位〜約１６５７位（図３の２０７位〜６３２位）に見出される。従って、ヘリカーゼ活性が所望される場合、この分子の位置は、ほとんど変化しないか、または保存的変化のみされた状態で維持される。当業者は、ＮＳ３／４ａの既知の構造に基づく変化に耐える他の領域を容易に決定し得る。
【００７５】
本明細書中で記載されるイムノアッセイはまた、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９に記載されるような、複数のエピトープ融合抗体（「ＭＥＦＡ」と呼ばれる）を利用する。このようなＭＥＦＡは、図１および表１に示されるＨＣＶポリタンパク質の種々のウイルス領域のうち２種以上から誘導される複数のエピトープを含む。特に、図１および表１に示されるように、ＨＣＶポリタンパク質の切断により、ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨのオーダーで、少なくとも１０個の異なる産物を産生する。このコアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた、１位〜１９１位に存在する（ＨＣＶ−１ゲノムに関して、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。このポリペプチドは、さらに、アミノ酸約１位〜約１７３位を含むＨＣＶポリペプチドを産生するように処理される。このエンベロープポリペプチド（Ｅ１およびＥ２）は、それぞれ、約１９２位〜約３８３位および約３８４位〜約７４６位に存在する。Ｐ７ドメインは、約７４７位〜約８０９位に見出される。ＮＳ２は、タンパク質分解性を有する完全な膜タンパク質であり、そしてこのポリタンパク質の約８１０位〜約１０２６位に見出される。ＮＳ２は、単独か、またはＮＳ３（約１０２７位〜約１６５７位に見出される）と組み合わせてかのいずれかで、ＮＳ２−ＮＳ３単結合（ｓｉｓｓｌｅ  ｂｏｎｄ）を切断し、次に、ＮＳ３  Ｎ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。このＮＳ３プロテアーゼ（約１０２７位〜約１２０７位に見出される）は、残りのポリタンパク質を処理するのに役立つ。ヘリカーゼ活性は、約１１９３位〜約１６５７位に見出される。ポリタンパク質の成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼにより触媒される、ＮＳ３−ＮＳ４ａ結合の自己触媒による切断より開始される。ＨＣＶポリタンパク質の続くＮＳ−３媒介切断は、別のポリペプチドのＮＳ３分子による、ポリタンパク質の切断部の認識に関与するようである。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（約１６５８位〜約１７１１位に見出されるＮＳ４ａ）、２個のタンパク質（約１７１２位〜約１９７２位に見出されるＮＳ４ｂ、および約１９７３位〜約２４２０位に見出されるＮＳ５ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（約２４２１位〜約３０１１位に見出されるＮＳ５ｂ）を遊離する。
【００７６】
【表１】
2011125350.tif 000002
【００７７】
＊ＨＣＶ−１に対して番号付けられている。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５を参照のこと。
【００７８】
複数のＨＣＶ抗原は、鎖が天然には存在しないアミノ酸の単一の連続した鎖の一部である。従って、エピトープの線形順序は、エピトープが生じるゲノムにおけるそれらの線形順序とは異なる。本明細書中における使用のためのＭＥＦＡの配列の線形順序は、好ましくは、最適な抗原性のために配置される。好ましくは、これらのエピトープは、１つより多いＨＣＶ株由来であり、従って、１つのアッセイで複数のＨＣＶ株を検出する付加能力を提供する。従って、本明細書中における使用のためのＭＥＦＡは、上記のポリタンパク質由来の様々な免疫原性領域を含み得る。さらに、このポリタンパク質のコア領域におけるフレームシフトから生じるタンパク質（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／６３９４１に記載されるようなタンパク質）は、ＭＥＦＡにおいて使用され得る。所望ならば、ＨＣＶポリタンパク質由来の１つ以上のエピトープの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、またはそれ以上は、融合タンパク質中で生じ得る。
【００７９】
例えば、例えば、Ｅ２の超可変領域（例えば、アミノ酸３８４〜４１０または３９０〜４１０にわたる領域）由来のエピトープは、ＭＥＦＡ抗原に含まれ得る。特に有効なＥ２エピトープは、この領域由来のコンセンサス配列（例えば、コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（これは１型ＨＣＶゲノムのアミノ酸３９０〜４１０のコンセンサス配列を表す））を含むエピトープである。本発明のＭＥＦＡに存在する代表的なＥ２エピトープは、アミノ酸３９０〜４４４にわたるハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸４１１〜４４４のネイティブのアミノ酸配列に融合したアミノ酸３９０〜４１０を表すコンセンサス配列を含み得る。
【００８０】
さらに、抗原は、様々なＨＣＶ株由来であり得る。ＨＣＶの複数のウイルス株が公知であり、そしてこれらの株のいずれか由来のエピトープは、融合タンパク質において使用され得る。生物体の任意の所定の種は、個々の生物体ごとに異なり、さらにウイルスのような所定の生物体は多数の異なる株を有することが周知である。例えば、上で説明されたように、ＨＣＶは、少なくとも６個の遺伝型を含む。これらの遺伝型の各々は、等価な抗原決定基を含む。より詳細には、各株は、ウイルスの全ての株に存在するが、ウイルス株ごとにわずかに異なる多数の抗原決定基を含む。例えば、ＨＣＶは、５−１−１として公知の抗原決定基を含む（図１を参照のこと）。この特定の抗原決定基は、ＨＣＶの３つの異なるウイルス株上で３つの異なる形態で現れる。従って、本発明の好ましい実施形態において、５−１−１の３つ全ての形態は、目的のイムノアッセイにおいて使用される複数エピトープ融合抗原上に現れる。同様に、異なるＨＣＶ株のコア領域由来の等価な抗原決定基がまた存在する。一般的に、等価な抗原決定基は、アミノ酸配列に関して高度な相同性を有し、この相同性の程度は、整列された場合、一般に３０％以上、好ましくは４０％以上である。本発明の多コピーエピトープはまた、同じエピトープの正確なコピーである複数のコピーを含み得る。
【００８１】
図４および６Ａ〜６Ｃは、本発明における使用のための、ＨＣＶ由来の代表的なＭＥＦＡを示す。しかし、ＨＣＶゲノム由来の他のエピトープもまた本発明のアッセイを用いる用途を見出すことが理解されるべきである。
【００８２】
代表的な複数エピトープ融合抗原であるＭＥＦＡ  ７．１のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を、図５Ａ〜５Ｆに示す。ＭＥＦＡ  ７．１の一般構造式は、図４に示され、そして以下のとおりである：ｈＳＯＤ−Ｅ１（タイプ１）−Ｅ２  ＨＶＲコンセンサス（タイプ１ａ）−Ｅ２  ＨＶＲコンセンサス（タイプ１および２）−ヘリカーゼ（タイプ１）−５−１−１（タイプ１）−５−１−１（タイプ３）−５−１−１（タイプ２）−ｃ１００（タイプ１）−ＮＳ５（タイプ１）−ＮＳ５（タイプ１）−コア（タイプ１＋２）−コア（タイプ１＋２）。この多コピーエピトープは、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた以下のアミノ酸配列を含む（以下に記載されるアミノ酸配列の番号付けは、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５で提供される番号付けの指示に従い、ここでアミノ酸＃１は、コア領域のコード配列によりコードされる１番目のメチオニンである）：スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、タンパク質の組換え発現を促進するために使用される）のアミノ酸１〜１５６；Ｅ１領域由来のポリタンパク質のアミノ酸３０３〜３２０；ＨＣＶ−１ａ  Ｅ２の超可変領域のコンセンサス配列を表すポリタンパク質のアミノ酸３９０〜４１０；ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−２のＥ２超可変領域のコンセンサス配列を表す、領域Ｅ２由来のポリタンパク質のアミノ酸３８４〜４１４；ヘリカーゼを規定するＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸１１９３〜１６５８；５−１−１のアミノ酸１６８９〜１７３５由来のエピトープの３つのコピー（１つはＨＣＶ−１由来であり、１つはＨＣＶ−３由来であり、そして１つはＨＣＶ−２由来であり、これらのコピーは、ＨＣＶの３つの異なるウイルス株由来の等価な抗原決定基である）；ＨＣＶ−１のＨＣＶポリペプチドＣ１００である、ポリタンパク質のアミノ酸１９０１〜１９３６；ＨＣＶ−１のＮＳ５領域由来のエピトープの２つの正確なコピー（この各々はＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２７８〜２３１３を有する）；およびコア領域由来のエピトープの２つのコピー（１つはＨＣＶ−１由来であり、１つはＨＣＶ−２由来であり、これらのコピーは、ＨＣＶ−１のアミノ酸９〜３２、３９〜４２および６４〜８８、ならびにＨＣＶ−２のアミノ酸６７〜８４により表される等価な抗原決定基である）。
【００８３】
表２は、本明細書中の図５Ａ〜５Ｆを参照して、様々なエピトープのアミノ酸位置を示す。
【００８４】
【表２】
2011125350.tif 000003
【００８５】
図２に示される本発明の一実施形態において、迅速な捕獲リガンドイムノアッセイを、ＮＳ３／４ａ由来のコンホメーションエピトープおよび１つ以上の複数エピトープ融合抗原（例えば、ＭＥＦＡ  ７．１）を使用して実施する。サンプルを、以下にさらに記載されるようにして、抗原（これは固体支持体上に存在し得る）と合わせる。このサンプルがＨＣＶに感染している場合、この固体支持体上に存在するエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体支持体成分に結合する。検出は、検出マーカー（例えば、図２に示されるような西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））の抗原／抗体複合体のメンバーへの結合による。結合は、共有結合的手段により得るか、または続く検出可能に標識された抗体の結合（例えば、標準的なサンドイッチアッセイ）により得るか、または酵素反応（この反応の生成物が検出可能である）により得る。検出マーカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：発色団、抗体、抗原、酵素、酵素反応化合物（この切断生成物が検出可能である）、ローダミンまたはローダミン誘導体、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、蛍光化合物、化学発光化合物（例えば、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ、Ｃｉｂａ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．））、これらのマーカーの誘導体および／または組み合わせ。検出可能に標識した抗ヒト抗体（存在するヒトＩｇＧ分子を検出し得る）は、都合良く使用され得る。
【００８６】
本発明のさらなる理解のために、イムノアッセイおよびこのイムノアッセイを行う方法において使用するためのポリペプチドの生成に関してより詳細な考察が以下に提供される。
【００８７】
（ＨＣＶイムノアッセイにおける使用のための抗原の生成）
上で説明したように、本発明の分子は、一般に、組換え的に生成される。従って、本発明と共に使用するための、ＨＣＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的な技術を使用して作製され得る。例えば、上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して（例えば、この遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって）得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、当該分野（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号）に記載される技術を使用して、ウイルス核酸分子から直接単離され得る。目的の遺伝子はまた、クローン化よりむしろ合成的に生成され得る。これらの分子は、特定の配列について適切なコドンを用いて設計され得る。次いで、完全配列は、標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、そして完全コード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【００８８】
従って、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を保有するベクターから得られ得るか、または当該分野で公知の様々なオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、適切な場合、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して、完全にもしくは部分的に合成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、（前出）を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機で生成される重複合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングし、続いて適切なＤＮＡリガーゼで連結し、そしてＰＶＲによりこの連結したヌクレオチド配列を増幅することによるものである。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８１〜４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド指向型合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５〜８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向型変異誘発（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７、およびＶｅｒｈｏｅｙｅら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６）、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用するギャップオリゴヌクレオチド（ｇａｐｐｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の酵素充填（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３）を本発明で使用して、改変されたかもしくは増大された抗原結合能力、および／または減少した免疫原性を有する分子を提供し得る。
【００８９】
一旦、コード配列が調製または単離されると、このような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、そして適切なクローニングベクターの選択が可能である。適切なベクターとしては、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体または適切なコントロールエレメントと会合した場合に複製し得るウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
次いで、コード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切なコントロールエレメントの制御下に置かれる。従って、このコード配列は、プロモータ、リボソーム結合部位（細菌の発現のため）、および必要に応じて、オペレーターの制御下に置かれ、その結果、目的のＤＮＡ配列は、適切な形質転換体によってＲＮＡに転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列（これは後に、翻訳後プロセシングにおいて、宿主によって除去され得る）を含んでも含まなくても良い。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照のこと。
【００９１】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連した配列の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが所望であり得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、調節化合物を含む、化学的刺激または物理的刺激に対してオンまたはオフにされる遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。他の型の調節エレメントはまた、ベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増加するために本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ
Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８））が挙げられる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞において自律的に複製するための複製起点、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限部位、高いコピー数についての可能性および強力なプロモーターを含む。
【００９２】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列と共にベクター中に位置するように構築され、制御配列に対するコード配列の位置および配向は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写されるように存在する（すなわち、制御配列のＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成するために所望である。例えば、いくつかの場合において、適切な配向で配列が制御配列に付着するように（すなわち、リーディングフレームを維持するように）配列を改変することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列および適切な制限部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
【００９３】
上に説明されるように、目的の抗原の変異体またはアナログを生成することが所望であり得る。これは、特にＮＳ３／４ａに当てはまる。そうするための方法は、例えば、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら、米国特許５，９９０，２７６号において記載されている。目的のアッセイにおける使用のためのこのＨＣＶタンパク質および他のＨＣＶタンパク質の変異体またはアナログは、配列の挿入によって、そして／または配列内での１つ以上のヌクレオチドの置換によって、目的のポリペプチドをコードする配列の一部を欠失することによって調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための方法（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６４０９を参照のこと。
【００９４】
分子は、昆虫系、哺乳動物系、細菌系、ウイルス系および酵母系を含む広範な種々の系において発現され得、これらは全て当該分野で公知である。
【００９５】
例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ．１５５５（１９８７）において記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から市販されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、において記載されている。酵母発現系はまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎにおいて記載されている。
【００９６】
上の系を用いる使用のための多数の適切な宿主細胞がまた公知である。例えば、哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そして例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（「ＭＤＢＫ」）細胞、およびその他を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含む。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．のような細菌宿主において、本発明の構築物を用いる用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターを用いる使用のための昆虫細胞としては特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【００９７】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の遺伝子送達技術を使用して、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中の安定なエピソームエレメント上に維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【００９８】
選択される発現系および宿主に依存して、分子は、タンパク質が発現される条件下で、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖することによって生成される。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系が、タンパク質を増殖培地中に分泌する場合、生成物は、培地から直接精製され得る。生成物が分泌されない場合、生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当該分野内である。
【００９９】
上記の複数エピトープ融合タンパク質において使用される抗原を含む、種々のＨＣＶ抗原の生成が、記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号および同第５，６８３，８６４号；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；および共有に係る、特許になった米国特許出願番号０８／４０３，５９０および同０８／４４４，８１８を参照のこと。
【０１００】
（免疫診断アッセイ）
一旦生成されると、ＨＣＶ抗原は、抗体を見出するための公知の抗原を使用する事実上任意のアッセイ形式で使用され得る。これらのアッセイの全ての共通の特徴は、抗原が成分中に存在する任意のこのような抗体に結合するのを可能にする条件下で、抗原が、ＨＣＶ抗体を含むことが疑われている身体成分と接触されることである。このような条件は、代表的に、過剰の抗原を使用する際の生理学的温度、ｐＨおよびイオン強度である。抗原の試料とのインキュベーションの後、この抗原からなる免疫複合体が検出される。
【０１０１】
イムノアッセイの設計は、たくさんのバリエーション、および当該分野で公知の多数の形式に供される。プロトコルは、例えば、固体支持体または免疫沈降を使用し得る。多数のアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含む；この標識は、上に詳細に議論されるように、例えば、酵素学的標識、蛍光標識、化学発光標識、放射活性標識、または色素分子標識であり得る。免疫複合体由来のシグナルを増幅するアッセイもまた公知である；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、および酵素標識媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）である。
【０１０２】
イムノアッセイは、制限することなく、異種形式または同種形式、および標準型または競合型の異種形式または同種形式であり得る。異種形式において、ポリペプチドは、代表的に、インキュベーション後にポリペプチドからのサンプルの分離を容易にするために、固体マトリクスまたは固体支持体に結合される。本発明の目的のための固体支持体は、不溶性マトリクスである任意の物質であり得、そして硬式または半硬式の表面を有し得る。例示的な固体支持体としては、ニトロセルロースのような基板（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；フッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ；磁気反応性樹脂などが挙げられるがこれらに限定されない。特定の支持体としては、プレート、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空糸、針、ピン、固体線維、セルロースビーズ、孔−ガラスビーズ、シリカゲル、ジビニルベンゼンと必要に応じて架橋したポリスチレンビーズ、グラフトされたコポリ（ｃｏ−ｐｏｌｙ）ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、Ｎ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンと必要に応じて架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングしたガラス粒子が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０３】
所望な場合、固体支持体に付加される分子は、スチレン部分またはアクリル部分を作製するために機能化され得る。従って、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖類、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエステル、エポキシ、シリカガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリリン酸塩、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどの他のポリマーの取り込みを可能にする。
【０１０４】
１つの状況において、固体支持体は、分子が十分に支持体に固定されるように、適切な結合条件下で、まずＨＣＶ抗原（本明細書中で集団的に「固相成分」と呼ばれる）と反応される。時々、支持体への固定は、より優れた固相結合特性を有するタンパク質への抗原および／または抗体を最初に結合することによって強化され得る。適切な結合タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵白アルブミンのような高分子、および当業者に周知の他のタンパク質を含むがこれらに限定されない。支持体に分子を結合するために使用され得る他の試薬としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー状アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。このような分子および抗原にこれらの分子を結合させる方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：１１７−１２４を参照のこと。
【０１０５】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の非固定固相成分を、洗浄することによって支持体から取り除き、次いで支持体結合成分は、適切な結合条件下でＨＣＶ抗体（本明細書中で集合的に「リガンド分子」と呼ばれる）を含むことが疑われている生物学的サンプルと接触される。ＨＣＶ抗体がサンプル中に存在する場合、これらは、ＨＣＶ抗原と複合体を形成する。非結合リガンド分子を取り除くための洗浄後、検出可能に標識された抗異種（例えば、抗ヒト）抗体（これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する）が添加される。これらの抗体は、複合体形成に起因して結合する。
【０１０６】
同種形式で、試験サンプルは、溶液中の抗原の組み合わせと共にインキュベートされる。例えば、これは、形成される任意の抗原−抗体複合体を沈澱させる条件下であり得る。同種アッセイについての標準形式および競合形式の両方がまた、当該分野で公知である。
【０１０７】
標準形式において、抗体−抗原複合体を形成するＨＣＶ抗体の量は、直接的にモニターされる。これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識された抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が、複合体形成に起因して結合するか否かを決定することによって達成され得る。競合形式において、サンプル中のＨＣＶ抗体の量は、複合体中の標識された抗体（または他の競合リガンド）の既知の量の結合に与える競合的影響をモニタリングすることによって推定される。
【０１０８】
より詳細には、抗ＨＣＶ抗体を含む形成された複合体（または、競合アッセイの場合、競合する抗体の量）は、形式に依存して、多数の公知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の未標識のＨＣＶ抗体は、標識（例えば、酵素標識）と複合体化した抗異種Ｉｇの結合体を使用して検出され得る。免疫沈降または凝集アッセイ形式で、ＨＣＶ抗原と抗体との間の反応は、溶液または懸濁液から沈澱するネットワークを形成し、そして沈澱物の可視層またはフィルムを形成する。抗ＨＣＶ抗体が試験サンプル中に存在しない場合、可視沈澱物は形成されない。
【０１０９】
上記アッセイ試薬（結合抗体および抗原と共にイムノアッセイ固体支持体を含む）ならびに捕獲されたサンプルと反応する抗体および抗原は、上記のイムノアッセイを行なうために、適切な説明書および他の必要な試薬と共に、キット中に提供され得る。このキットは通常、別々の容器に、抗原の組み合わせ（固体マトリクスにすでに結合しているかまたは抗原をそのマトリクスに結合させるための試薬を伴って別々に）、コントロール抗体処方物（陽性および／または陰性）、標識抗体（アッセイ形式が同一物を必要とする場合）、およびシグナル生成試薬（例えば、酵素基質）（標識がシグナルを直接生成しない場合）を含む。アッセイを実行するための説明書（例えば、書類、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）は通常、キットに含まれる。キットはまた、使用される特定のイムノアッセイに依存して、他のパッケージ化試薬および物質（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。標準イムノアッセイ（上記のようなアッセイ）は、これらのキットを使用して行なわれ得る。
【０１１０】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。本実施例は、例示目的のみのために提供され、そして本発明の範囲をいずれにも限定することは意図されない。
【０１１１】
使用した数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
（ＭＥＦＡ  ７およびＭＥＦＡ  ７．１の構築）
以下の実施例は、複数のＨＣＶエピトープのポリタンパク質カセットの調製を示す。複数エピトープのカセットから発現されるポリタンパク質を、本明細書中において、複数エピトープ融合抗原（ＭＥＦＡ）と称する。好ましくは、エピトープが反復される場合、超過のコピーは、同じ方向に縦列方向で配置される。エピトープとして使用されるウイルスコード配列の領域は、わずかに変化され、なおかつ抗原性活性を保持し得ること、ならびにアミノ酸の番号付けの指定が種間で変化し得ることが、理解される。従って、反復エピトープは、種配列バリエーションおよび／または番号付けの指定に起因して、一方のエピトープのアミノ酸配列と他方のエピトープのアミノ酸配列が変化し得る。好ましくは、ＭＥＦＡ内の反復エピトープのアミノ酸配列は、アミノ酸レベルで少なくとも３０％の相同性であり、より好ましくはアミノ酸レベルで少なくとも４０％の相同性である。
【０１１３】
特有の制限酵素部位を導入して、規定された順番でエピトープを連結し、そしてキメラ抗原の設計において改変を促進することによって、本発明の有用性を増強した。制限酵素部位およびクローニング手順の選択は、組換えＤＮＡ技術の当業者によって容易に決定される。好ましくは、エピトープ連結部（クローニングに起因してエピトープ間で作製されるアミノ酸配列）は、非特異的エピトープを生成しない。非特異的エピトープは、例えば、天然ではＨＣＶエピトープに隣接して存在しない非ＨＣＶ配列である。非特異的エピトープは、偽陽性のアッセイ結果を引き起こす試験サンプル中の抗体に結合し得る。好ましくは、複数エピトープ融合タンパク質を、エピトープ連結部において生じるそのような配列に起因する偽陽性結果について試験する。連結配列に起因するＭＥＦＡとの非特異的相互作用を回避するために、連結部をコードするＤＮＡ配列を、例えば、変異アミノ酸配列との非特異的相互作用が減少され、そしてエピトープフラグメントのクローニングが可能になるように、変異し得る。
【０１１４】
ＨＣＶ  ＭＥＦＡ  ７発現カセットおよびＨＣＶ  ＭＥＦＡ  ７．１発現カセットを、図４に示すように縦列配置で、主要なエピトープを含むコードヌクレオチド配列をクローニングすることによって、構築した。主要なエピトープは、エピトープへの抗体反応頻度および抗体反応強度（力価）に基づいて選択した（Ｃｈｅｉｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９４）Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３２０−３２４頁）。ＨＣＶエピトープをコードする種々のＤＮＡセグメントを、ＰＣＲ増幅または合成オリゴヌクレオチドによって構築した。各セグメントのアミノ酸は、上記の表２および図５Ａ〜５Ｆに示す。完全ＨＣＶ−１アミノ酸配列（３０１１アミノ酸）を、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５によって決定した。ＨＣＶに結合し得るオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，３５０，６７１号に記載される。本発明のエピトープ中のアミノ酸の番号付けは、Ｃｈｏｏら（前出）によって提供される番号付けの指定に従い、ここで、アミノ酸番号１は、他に特定しない限り、コア領域のコード配列によってコードされる最初のメチオニンである。例えば、ＮＳ５由来の１つのエピトープセグメントは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２７８〜２３１３によって表される。Ｅ１領域由来のエピトープは、ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関して番号付けられたアミノ酸３０３〜３２０によって表される。
【０１１５】
ＭＥＦＡ  ７およびＭＥＦＡ  ７．１は、各々、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３由来のエピトープを含み、単一アッセイにおける複数の型のウイルスの検出を可能にする。ＨＣＶ血清型を決定する方法は、ＷＯ  ９６／２７１５３に見出される。例えば、５−１−１領域由来のエピトープは、ＨＣＶの血清型間で変化することが見出されている。本明細書中に記載されるＭＥＦＡ中に存在するＨＣＶ型特異的５−１−１エピトープの各々のコピーは、試験生物学的サンプル中に存在し得るＨＣＶ型のいずれかの結合を可能にする。
【０１１６】
ＭＥＦＡ  ７構築物およびＭＥＦＡ  ７．１構築物を、酵母発現ベクターのｐＢＳ２４．１を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のために遺伝子操作した。この酵母発現ベクターのｐＢＳ２４．１は、酵母における自律複製のための２μ配列および酵母遺伝子ｌｅｕ２−ｄおよび選択マーカーとしてのＵＲＡ３を含む。細菌中でのプラスミド複製に必要とされるβ−ラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点もまた、この発現ベクター中に存在した。ＭＥＦＡ７のための酵母発現ベクター（ｐｓ．ＭＥＦＡ７）を、最初に構築した。引き続いて、ＭＥＦＡ７．１抗原をコードするプラスミドｐｓ．ＭＥＦＡ７．１を作製するために、このプラスミドのＨＣＶコアエピトープについてのコード領域を改変した。
【０１１７】
詳細には、図７Ａ〜７Ｄに示されるように、ＭＥＦＡ  ７についての酵母発現プラスミドを、以下のように構築した。最初に、１８９６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーター、ｈＳＯＤ（アミノ酸１〜１５６）、続いてＥ１エピトープ（アミノ酸３０３〜３２０、ＨＣＶ１系）をコードする）を、国際公開番号ＷＯ  ９７／４４４６９に記載されるように、ｐｓ．ＭＥＦＡ６（ＭＥＦＡ６をコードする発現プラスミド）から単離した。次に、２６９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ合成ＤＮＡフラグメント（Ｅ２  ＨＶＲ１ａコンセンサスエピトープ（アミノ酸３９０〜４１０、ＨＣＶ−１）、Ｅ２  ＨＶＲ１＋２コンセンサスエピトープ（アミノ酸３８４〜４１４、ＨＣＶ１＋２）およびへリカーゼドメインの５’末端（アミノ酸１１９３〜１２２９、ＨＣＶ−１）についてのコード配列を含む）を作製した。１２６４ｂｐのＳｐｈＩ／ＥｃｌＸＩフラグメント（ヘリカーゼドメインの残りをコードする（アミノ酸１２３０〜１６５１、ＨＣＶ−１）を、ｐＴａｃ５／ＨｅｌＩプラスミドＤＮＡからゲル精製した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ合成ＤＮＡフラグメントおよびＳｐｈＩ／ＥｃｌＸＩの１２６４ｂｐフラグメントを、ベクターのｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸＩベクターに連結して、ｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸＩ／ｅ２ヘリカーゼを生成した。このベクターは、ｐＳＰ７２由来のＰｒｏｍｅｇａ，Ｍｓｄｉｓｏｎ，ＷＩから市販されるＥ．ｃｏｌｉベクターである（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６５３３２を参照のこと）。詳細には、いくつかのＭＥＦＡ７エピトープのサブクローニングを容易にするために、新規マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）ポリリンカーを、合成オリゴを介して、ｐＳＰ７２のＳｐｈＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位の間に導入した。このＭＣＳ中に特有の部位を有する新規プラスミド（ｐＳＰ７２ｎｅｗと命名する）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｌＸＩ（ＥａｇＩとしても公知である）を用いて消化した。次いで、これを脱リン酸化し、そしてゲルで精製した。
【０１１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテント細胞を、このプラスミドを用いて形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬｕｒｉａゲルプレートにプレートした。所望のクローンを、ミニプレップＤＮＡ分析を用いて同定した。配列確認の後、プラスミドｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸＩ／ｅ２．ヘリカーゼ  サブクローン番号４を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｌＸＩ（ＥａｇＩ）を用いて消化し、１５３４ｂｐのフラグメントを作製した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｌＸ１フラグメントを、ゲル精製し、そしてヘリカーゼドメインの最後の最後のアミノ酸（アミノ酸１６５１〜１６５８、ＨＣＶ−１）をコードするＥｃｌＸＩ／ＳｐｈＩオリゴヌクレオチドと共に、ｐＧＥＭ７  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩベクターに連結した。ＨＢ１０１コンピテント細胞を、形質転換し、Ｌｕｒｉａ−アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）上にプレートした。所望のクローンの同定および配列確認の後、ｐＧＥＭ７ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ  サブクローン番号９を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化して、１５６０ｂｐのフラグメントを作製し、これを、ゲルで精製した（図７Ａを参照のこと）。
【０１１９】
ＭＥＦＡ  ７の３’末端部分を組み立てるために、以下の工程を実行した。ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−３およびＨＣＶ−２（この順番で）の５−１−１エピトープ（アミノ酸１６８９〜１７３５）を、ｐｓ．ＭＥＦＡ６（ＭＥＦＡ  ６をコードする発現プラスミド）（国際公開番号ＷＯ  ９７／４４４６９に記載される）から、４４１ｂｐのＳｐｈＩ／ＡｖａＩフラグメントとしてゲル精製した。このフラグメントを、ｃ１００エピトープ（アミノ酸１９０１〜１９３６）をコードする合成ＡｖａＩ／ＸｂａＩオリゴヌクレオチドをと共に、ｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＳｐｈＩ／ＸｂａＩベクターに連結した。ＨＢ１０１の形質転換、クローンの同定、および配列の確認後、ｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸｉ  サブクローン番号６を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＸｂａＩ／ＮｏｔＩベクターを調製した。さらに、ＮＳ５エピトープ（アミノ酸２２７８〜２３１３、ＨＣＶ−１）の二重反復をコードする２２１ｂｐのＸｂａＩ／ＮｃｏＩフラグメントを、ｐｓ．ＭＥＦＡ６から単離した。Ｘｂａ／ＮｃｏＩフラグメントを、ＨＣＶ−１コアエピトープの第１アミノ酸（アミノ酸９〜１７）をコードするＮｃｏＩ／ＮｏｔＩオリゴヌクレオチド（ここで、９位のＬｙｓはＡｒｇに変更し、そして１１位のＡｓｎはＴｈｒに変更した）と共に、上記の調製したｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＸｂａＩ／ＮｏｔＩベクターに連結した。ＨＢ１０１形質転換体を分析し、そしてそれらのプラスミドＤＮＡを配列決定した。ｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸ／ＸＮｉ
番号３と命名したサブクローンを、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩを用いて消化し、引続くサブクローニングのためにベクターを調製した（図７Ｂを参照のこと）。
【０１２０】
ＭＥＦＡ  ７の３’末端の組立てを完了するために、ＨＣＶ−１のアミノ酸９〜５３を有するコアエピトープをコードする配列の二重反復、およびコア領域の２つの遺伝子型特異的エピトープ（アミノ酸６４〜８８、ＨＣＶ−１およびアミノ酸６７〜８４、ＨＣＶ−２）を、以下のように、ＮｏｔＩ−ＳａｌＩで消化したｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸ／ＸＮｉ  サブクローン番号３にサブクローン化した。第１に、コアエピトープのアミノ酸１８〜５１をコードする９２ｂｐのＮｏｔＩ／ＸｍｎＩフラグメントを、ｐｄ．Ｃｏｒｅ１９１ＲＴ  クローン番号２０から単離した。プラスミドｐｄ．Ｃｏｒｅ１９１ＲＴは、ｐＢＳ２４．１  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクター、ＡＤＨ２／ＧＡＰＨＤプロモーターの１３６５ｂｐのＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩフラグメント、およびＨＣＶ−１コアの最初の１９１アミノ酸をコードする６１５ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩフラグメント（アミノ酸９をＬｙｓからＡｒｇに、そしてアミノ酸１１をＡｓｎからＴｈｒに変異させた）を連結することによって構築した。上記と同じ２つの変異を有するアミノ酸１〜１９１についてのコア配列がクローン化された６１５ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクター由来であった。
【０１２１】
９２ｂｐのＮｏｔＩ／ＸｍｎＩフラグメントを、ｐＳＰ７２ｎｅｗＮｏｔ／Ｋｐｎベクターおよび完全コアエピトープの３’末端をコードするＸｍｎＩ／ＫｐｎＩオリゴヌクレオチドと連結した。陽性クローンの配列確認の後、ｐＳＰ７２ｎｅｗＮＫｉ  サブクローン番号４を、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩで消化し、そして２２４ｂｐのフラグメントを、ゲルで精製した。このＮｏｔＩ／ＫｐｎＩフラグメントを、上記のコアエピトープの完全反復をコードする２８４ｂｐのオリゴヌクレオチド（ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ末端）と共に、上記のｐＳＰｎｅｗＳＸ／ＸＮｉ  ＮｏｔＩ／ＳａｌＩベクターに連結した。ＨＢ１０１の形質転換、クローンの同定および配列の確認後、ｐＳＰ７２ｎｅｗＳＸ／ＸＮ／ＮＳｉ  サブクローン番号１８を、ＳｐｈＩおよびＳａｌＩで消化し、そして１３１７ｂｐのフラグメントを、ゲルで精製した（図７Ｃを参照のこと）。
【０１２２】
最後に、以下のフラグメント（上記に記載される）を、ｐＢＳ２４．１  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクターに連結し、ｐｓ．ＭＥＦＡ７を作製した（図７Ｄを参照のこと）：
１８９６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（図７Ａ）
１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩフラグメント（図７Ａ）
１３１７ｂｐのＳｐｈＩ／ＳａｌＩフラグメント（図７Ｃ）。
【０１２３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３を、ｐｓ．ＭＥＦＡ７を用いて形質転換し、単一の形質転換体を、培地中のグルコースの枯渇後に発現についてチェックした。組換えタンパク質が、クマシーブルー染色によって検出されたように、酵母において高レベルで発現した。詳細には、酵母細胞を、酢酸リチウムプロトコールを用いてＭＥＦＡ発現プラスミドで形質転換した。Ｕｒａ−形質転換体を、単一コロニーについて画線し、そしてＬｅｕ−／８％グルコースプレート上にパッチし（ｐａｔｃｈ）、プラスミドコピー数を増加させた。Ｌｅｕ−開始培養物を、２４時間３０℃で増殖させ、次いで、ＹＥＰＤ（酵母抽出物バクトペプトン２％グルコース）中で１：２０に希釈した。細胞を、３０℃で４８時間増殖させ、そして収集した。ＭＥＦＡ  ７組み換え抗原の発現を試験するために、細胞のアリコートを、溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ）中、ガラスビーズを用いて溶解した。溶解物を、高速で遠心分離した。上清および不溶性ペレットを、ＳＤＳタンパク質ゲル上で分析した。ＭＥＦＡ  ７は、不溶性ペレット分画中に非常に富んでいた。
【０１２４】
ＭＥＦＡ  ７抗原を、以下のように精製した。ＭＥＦＡ  ７を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、上記のように収集した。細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）中に懸濁し、そしてＤｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または等価な容器中でガラスビーズを用いて溶解した。溶解物を、低速条件（３，０００〜５，０００ｒｐｍ、１５分）で遠心分離し、そして不溶性分画を含むペレットを、溶解緩衝液中の漸増濃度の尿素（１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ）を用いて洗浄した。タンパク質を、溶解緩衝液中の０．１Ｎ  ＮａＯＨ、４Ｍ  尿素を用いて遠心分離ペレットから可溶化した。細胞の破片を、３，０００〜５，０００ｒｐｍで１５分間の低速遠心分離によって取り除いた。上清を、６Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ８．０に調整し、これらの条件下で不溶性タンパク質を沈澱させた。
【０１２５】
沈澱物を、遠心分離によって取り除き、そして上清を、２．３％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０に調整し、そして３分間煮沸した。混合物中のタンパク質を、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むｐＨ７．４に調整したリン酸緩衝化生理食塩水中、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００でゲル濾過によって分画した。ＭＥＦＡ  ７を含むカラム溶出画分を収集し、プールし、そしてＡｍｉｃｏｎ  ＹＭ−３０膜で濃縮した。ゲル濾過を、同じカラムおよび条件を用いてプールした分画に対して繰り返した。
【０１２６】
試験アッセイにおけるＭＥＦＡ  ７の分析の間、検出結合体として使用したモノクローナル抗体が、コアエピトープの特定の配列（アミノ酸３３〜３８）と反応したことが発見された。従って、ｐｓ．ＭＥＦＡ７．１を、コアエピトープ領域からアミノ酸３３〜３８を排除するように設計した。
【０１２７】
ＭＥＦＡ  ７．１についての酵母発現ベクターは、以下のように作製した。最初に、ｐｓ．ＭＥＦＡ  ７の３’末端においてコアエピトープの二重反復を改変した。このようにするために、最初のコアエピトープ反復（ＨＣＶ−１のアミノ酸９〜３２、３９〜４２および６４〜８８、ＨＣＶ−２のアミノ酸６７〜８２）をコードする２０６ｂｐのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ合成フラグメント、ＨＣＶ−２のアミノ酸８３および８４、続く第２のコアエピトープ反復（ＨＣＶ−１のアミノ酸９〜３２、アミノ酸３９〜４２およびアミノ酸６４〜８８、ＨＣＶ−２のアミノ酸６７〜８４）をコードする２３３ｂｐのＫｐｎＩ／ＳａｌＩ合成フラグメントを、それぞれ、ｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＮｃｏＩ／ＫｐｎＩベクターおよびｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＫｐｎＩ／ＳａｌＩベクターにサブクローン化した。ＨＢ１０１の形質転換、クローンの同定および配列の確認後、ｐＳＰ７２ｎｅｗ．ＮＫｉ  クローン番号２１を、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩを用いて消化して、２０６ｂｐのベクターＮｃｏＩ／ＫｐｎＩフラグメントを単離し、そしてｐＳＰ７２ｎｅｗＮＳｉ  クローン番号３２を、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩを用いて消化して、２３３ｂｐのＫｐｎＩ／ＳａｌＩフラグメントを単離した。
【０１２８】
プラスミドｐｓ．ＭＥＦＡ７．１を、以下のフラグメントをｐＢＳ２４．１  ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクター（図８を参照のこと）へと連結することによって組み立てた：
ｐｓ．ＭＥＦＡ７について上記の１８９６ｂｐのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；
ｐｓ．ＭＥＦＡ７について上記の１５６０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩフラグメント；
５−１−１エピトープ、ｃ１００エピトープおよびＮＳ５エピトープをコードする、ｐｓ．ＭＥＦＡ７から単離された７７６ｂｐのＳｐｈＩ／ＮｃｏＩフラグメント；
２０６ｂｐのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩフラグメント；ならびに
２３３ｂｐのＫｐｎＩ／ＳａｌＩフラグメント。
【０１２９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３をｐｓ．ＭＥＦＡ７．１で形質転換し、そして１つの形質転換体を、上記のように、培地中のグルコースの枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、クーマシーブルー染色によって検出したところ、酵母において高いレベルで発現された。
【０１３０】
ＭＥＦＡ  ７．１抗原を以下の通りに精製した。ＭＥＦＡ  ７．１を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を上記の通りに収集した。この細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に懸濁し、そしてガラスビーズを用いて、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または等価な装置において溶解した。溶解産物をＪＡ−１０ローター中で１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、そして不溶タンパク質画分を含むペレットを、溶解緩衝液中の漸増濃度（１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ）の尿素で洗浄した。タンパク質を、溶解緩衝液中の０．１Ｎ  ＮａＯＨ、４Ｍ  尿素、５０ｍＭ  ＤＴＴを用いて遠心分離ペレットから可溶化した。細胞破片を、ＪＡ−１４ローター中で１４，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって除去した。上清を６Ｎ  ＨＣｌでｐＨ８．０に調整してこれらの条件下で不溶性のタンパク質を沈澱させた。
【０１３１】
沈澱物を、ＪＡ−１４ローター中で１４，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって除去した。上清を２．３％  ＳＤＳに調整し、そして煮沸水中で７０℃〜７５℃まで加熱し、次いで室温まで冷却した。混合物中のタンパク質を、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有し、ｐＨ７．４に調整されたＰＢＳ中でのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲでのゲルろ過によって分画した。ＭＥＦＡ  ７．１を含有するカラム溶出画分を収集し、プールし、そしてＡｍｉｃｏｎ  ＹＭ−３０メンブレンで濃縮した。プールしたゲルろ過画分を２．３％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴに調整し、そして上記の通りに加熱／冷却した。このプールを、第一のゲルろ過工程と同じ条件下でのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲカラムでの二回目のゲルろ過工程に供した。
【０１３２】
（実施例２：ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの組換え産生）
ＮＳ３／４ａのコンホメーションエピトープを以下の通りに得た。このエピトープは、図３Ａ〜３Ｄで指定した配列を有し、ネイティブな配列とは４０３位（ＨＣＶ−１全長配列のアミノ酸１４２８）および４０４位（ＨＣＶ−１全長配列のアミノ酸１４２９）で異なる。特に、ネイティブな配列の１４２８位で通常生じるＴｈｒはＰｒｏへと変異しており、そしてネイティブな配列の１４２９位で生じるＳｅｒは、Ｉｌｅへと変異している。
【０１３３】
特に、用いられる酵母発現ベクターは、上記のｐＢＳ２４．１であった。このイムノアッセイにおいて用いられるプラスミドｐｄ．ｈｃｖ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩを、代表的なＮＳ３／４ａエピトープをコードし、以下の通りに産生した。二工程手順を用いた。最初に、以下のＤＮＡ片を一緒に連結した：（ａ）５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、続いて配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ、イニシエーターＡＴＧ、およびアミノ酸１０２７で始まりアミノ酸１０４６でＢｇｌＩ部位へと続くＨＣＶ１ａについてのコドンを提供する合成オリゴヌクレオチド；（ｂ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ由来の６８３ｂｐのＢｇｌＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（アミノ酸１０４６〜１２７４をコードする）；ならびに（ｃ）ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、脱リン酸化し、そしてゲル精製したｐＳＰ７２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６５３３２）。プラスミドｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩを、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されるバキュロウイルス発現ベクターであるｐＡｃＨＬＴから誘導した。特に、ｐＡｃＨＬＴ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクターならびに以下のフラグメントを調製した：ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１０２７〜１３３６に対応する９３５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１３３６〜１４１９に対応する２４７ｂｐのＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１４４９〜１５０９に対応する１７５ｂｐのＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１５１０〜１７１１に対応する６１９ｂｐのＢｇｌＩ−ＰｓｔＩ＋転写終結コドン。ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１４２０〜１４４８に対応し、ＰＩ変異（Ｐｒｏへと変異させたＴｈｒ−１４２８、Ｉｌｅへと変異させたＳｅｒ−１４２９）を含む、合成によって作製した９１ｂｐのＳａｃＩＩ−ＨｉｎｆＩフラグメントを上記の１７５ｂｐのＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩフラグメントおよび６１９ｂｐのＢｇｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントと連結し、そしてＳａｃＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）ベクター中にサブクローン化した。ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）は、市販のＥ．ｃｏｌｉベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６５３０８）である。コンピテントなＨＢ  １０１細胞の形質転換、個々のクローンのミニスクリーニング分析および配列確認後、ｐＧＥＭ５．ＰＩクローン２由来の８８５ｂｐのＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、上記のＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩ  ９３５ｂｐフラグメント、ＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩ  ２４７ｂｐフラグメントおよびｐＡｃＨＬＴ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクターと連結した。得られた構築物を、ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩと命名した。
【０１３４】
上記の連結混合物をＨＢ１０１コンピテント細胞中に形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートにプレーティングした。個々のクローンのミニプレップ分析によって推定のポジティブを同定し、そのうちの２つを増幅した。ｐＳＰ７２  １ａＨＣのクローン番号１およびクローン番号２についてのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて調製し、そして配列決定した。
【０１３５】
次いで、以下のフラグメントを一緒に連結した：（ａ）ｐＳＰ７２１ａＨＣ  ＃１由来の７６１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩフラグメント（ｐＳＰ７２．１ａＨＣを、以下を一緒に連結することによって作製した：ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化したｐＳＰ７２、５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を提供する合成オリゴヌクレオチド、続いて配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ、開始コドンＡＴＧおよびアミノ酸１０２７で始まり、アミノ酸１０４６でのＢｇｌＩＩ部位へと続く、ＨＣＶ１ａについてのコドン、ならびにｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ由来の６８３ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（アミノ酸１０４６〜１２７４をコードする））；（ｂ）酵母ハイブリッドプロモーターＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨについての１３５３ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；（ｃ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ由来の１３２０ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメント（Ｔｈｒ  １４２８がＰｒｏへと変異し、そしてＳｅｒ  １４２９がＩｌｅへと変異したＨＣＶ１ａアミノ酸１０４６〜１７１１をコードする）；ならびに（ｄ）ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、脱リン酸化し、そしてゲル精製したｐＢＳ２４．１酵母発現ベクター。連結混合物をコンピテントなＨＢ１０１中へと形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートにプレーティングした。個々のクローンのミニプレップ分析によって、予想された３４４６ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入物（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、イニシエーターコドンＡＴＧおよびアミノ酸１０２７〜１７１１のＨＣＶ１ａ  ＮＳ３／４ａ（図３Ａ〜図３Ｄのアミノ酸１〜６８６として示す）（Ｔｈｒ  １４２８（図３Ａ〜３Ｄのアミノ酸位置４０３）がＰｒｏへと変異し、そしてＳｅｒ  １４２９（図３Ａ〜３Ｄのアミノ酸位置４０４）がＩｌｅへと変異している）から構成される）を有するクローンを同定した。この構築物を、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ（図９を参照のこと）と命名した。
【０１３６】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３をｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩで形質転換し、そして１つの形質転換体を、培地中のグルコースの枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、クーマシーブルー染色によって検出し、そしてＮＳ３のヘリカーゼドメインに対するポリクローナル抗体を用いて免疫ブロット分析によって確認したところ、酵母において高いレベルで発現された。
【０１３７】
（実施例３：ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの精製）
ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープを以下の通りに精製した。ＮＳ３／４ａエピトープを発現する、上記由来のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、上記の通りに収集した。この細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチン）中に懸濁し、そして１：１：１の細胞：緩衝液：０．５ｍｍガラスビーズの比でガラスビーズを用いて、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または等価な装置において溶解した。溶解産物を４℃で３０１００×ｇで３０分間遠心分離し、そして不溶タンパク質画分を含むペレットを洗浄緩衝液（６ｍｌ／ｇ出発細胞ペレット重量）に添加し、そして室温で１５分間揺り動かした。洗浄緩衝液は、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０５％オクチルグルコシド、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチンからなっていた。細胞破片を、３０１００×ｇで３０分間、４℃での遠心分離によって取り出した。上清を捨て、そしてペレットを保持した。
【０１３８】
タンパク質を、このペレットから以下の通りに抽出した。６ｍｌ／ｇの抽出緩衝液を添加し、そして室温で１５分間揺り動かした。この抽出緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチンからなっていた。これを、３０１００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を保持し、そして以下の式を用いて１７．５％になるように硫酸アンモニウムを添加した：上清の容積（ｍｌ）×ｘ％硫酸アンモニウム／（１−ｘ％硫酸アンモニウム）＝上清へと添加される４．１Ｍ飽和硫酸アンモニウムのｍｌ。氷上で攪拌しながら硫酸アンモニウムを滴下し、そして溶液を氷上で１０分間攪拌した。溶液を１７７００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、そしてペレットを保持し、そして２℃〜８℃で４８時間まで保存した。
【０１３９】
ペレットを再懸濁し、そしてポリＵカラム（Ｐｏｌｙ  Ｕ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に４℃で以下の通りに流した。ペレットを、ペレットの重量１グラムあたり６ｍｌのポリＵ平衡化緩衝液中に再懸濁した。この平衡化緩衝液は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ（新たに添加した）、１０％グリセロール、１．２オクチルグルコシドからなっていた。この溶液を４℃で１５分間で揺り動かし、そして３１０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。
【０１４０】
ポリＵカラム（１グラムの出発ペレット重量あたり１ｍｌ樹脂）を調製した。線形流速は６０ｃｍ／時間であり、そしてパッキング流速は６０ｃｍ／時間の１３３％であった。このカラムを平衡化緩衝液で平衡化し、そして再懸濁した硫酸アンモニウムペレットの上清を、この平衡化したカラムにローディングした。このカラムを、平衡化緩衝液でベースラインになるまで洗浄し、そしてタンパク質を、以下のポリＵ溶出緩衝液中で１段階溶出で溶出させた：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ（新たに添加した）、１０％グリセロール、１．２オクチルグルコシド。カラムの溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色した）で泳動し、そしてアリコートを凍結して−８０℃で保存した。ＮＳ３／４ａエピトープの存在を、ＮＳ３プロテアーゼドメインに対するポリクローナル抗体および５−１−１エピトープ（ＨＣＶ  ４ａ）に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した。
【０１４１】
さらに、プロテアーゼ酵素活性を、以下の通りにして精製の間、モニタリングした。ＮＳ４Ａペプチド（ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ）およびＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ含有サンプルを９０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．０５  ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、５ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈し、そして室温で３０分間混合させた。９０μｌの混合物をマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に添加し、そして１０μｌのＨＣＶ基質（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）を添加した。プレートを混合し、そしてＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダーで読み取った。結果を、１分間あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表した。
【０１４２】
これらの方法を用いて、１Ｍ  ＮａＣｌ抽出物の産物は３．７ＲＦＵ／分の活性を含んでおり、硫酸アンモニウム沈澱物は７．５ＲＦＵ／分の活性を有し、そしてポリＵ精製の産物は１８．５ＲＦＵ／分の活性を有していた。
【０１４３】
（実施例４：ＨＣＶ抗原での固体支持体のコーティング）
ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープおよびＭＥＦＡ  ７．１抗原を、以下の通りにプレートにコーティングした。ＨＣＶコーティング緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ  ７．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％クロロアセトアミド）を、０．２２μフィルターユニットを通して濾過した。次いで、以下の試薬を、ＨＣＶコーティング緩衝液に順次添加し、そして各添加後に攪拌した：１０ｍｇ／ｍｌ溶液（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐ．Ｐｅｎｔｅｘ，Ｋａｎｋａｋｅｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からの２μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（スルフヒドリル改変）；１Ｍ溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からの５ｍＭ  ＤＴＴ；０．４５μｇ／ｍｌ  ＮＳ３／４ａ（０．３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）；０．３７５μｇ／ｍｌ  ＭＥＦＡ  ７．１（１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度）。最終溶液を室温で１５分間攪拌した。
【０１４４】
２００μｌの上記溶液をＣｏｓｔａｒ高結合平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の各ウェルに添加し、そしてこのプレートを加湿チャンバー中で一晩インキュベートした。次いで、このプレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０）で洗浄し、タップ乾燥（Ｔａｐｐｅｄ  ｄｒｙ）し、そして２８５μｌのＯｒｔｈｏ  Ｐｏｓｔ−Ｃｏａｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１％  ＢＳＡ、３％スクロース）を添加した。このプレートを、少なくとも１時間にわたってインキュベートし、タップし、そして２〜８℃で一晩乾燥した。このプレートを、将来の使用のために乾燥剤と共に袋に入れた。
【０１４５】
（実施例５）
（初期セロコンバージョン研究）
併用アッセイ（ＨＣＶ４．０）におけるＮＳ３／４ａおよびＭＥＦＡ７．１抗原の性能を、セロコンバージョン検出の限界を試験し、そしてこれらの限界と他の市販のアッセイにおいて獲得される限界とを比較するために他のＨＣＶアッセイと比較した。ＨＣＶ感染させた市販のヒト血液サンプルのパネルを使用した。以下の表に示すＰＨＶパネルを、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡ（ＢＢＩ）から購入した。６２１２パネルを、Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ（ＢＣＰ）から購入した。ＳＣパネルを、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃｏＲａｔａｎ，ＦＬ（ＮＡＢＩ）から購入した。血液サンプルを獲得した日を、表に示す。
【０１４６】
ＨＣＶ４．０アッセイを、以下の通り実施した。２００μｌの試料希釈緩衝液（１ｇ／ｌ  カゼイン、１００ｍｇ／ｌ  組換えヒトＳＯＤ、１ｇ／ｌ  クロロアセトアミド、１０ｇ／ｌ  ＢＳＡ、５００ｍｇ／ｌ  酵母抽出物、０．３６６ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、１．１６２ｇ／ｌ  ＫＰＯ４、５ｍｌ／ｌ  Ｔｗｅｅｎ−２０、２９．２２ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１．６２７ｇ／ｌ  ＮａＰＯ４、１％  ＳＤＳ）を、コーティングしたプレートに添加した。次いで、２０μｌのサンプルを添加した。これを、３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを、洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて洗浄した。２００μｌの結合緩衝液（マウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（例えば、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＳＡＶｅバルク結合希釈剤（Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いてＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ中で１：２２，０００希釈したマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ））を添加し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。これを上記のようにして洗浄し、そして２００μｌの基質溶液（１  ＯＰＤ錠剤／１０ｍｌ）を添加した。ＯＰＤ錠剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応による着色のためのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび過酸化水素を含む。これを、暗所にて室温で３０分間インキュベートした。この反応を、５０μｌ  ４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより停止し、そしてプレートを、６９０ｎｍでの吸光度（コントロール）と比較して、４９２ｎｍで読み取った。
【０１４７】
この研究において用いられた他のアッセイは以下の通りであった。
【０１４８】
Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）は市販されており、そして抗体ベースの検出アッセイである。このアッセイを、製造元の説明書を用いて実施した。
【０１４９】
ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＨＣＶ３．０）（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）は、抗体ベースの検出アッセイである。このアッセイを、製造元の説明書を用いて実施した。
【０１５０】
Ｐａｓｔｅｕｒ  ＭＯＮＯＬＩＳＡ  ａｎｔｉ−ＨＣＶ  Ｐｌｕｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２アッセイ（Ｓａｎｏｆｉ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｍａｒｎｅｓ−ｌａ−Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）は、抗体ベースの検出アッセイである。このアッセイを、製造元の説明書を用いて実施した。
【０１５１】
ＨＣＶ４．０アッセイの性能を、ＨＣＶ３．０、ＰＲＩＳＭ、およびＰａｓｔｅｕｒアッセイと比較した（表３および表４を参照のこと）。血液パネルに存在するＨＣＶ抗体（抗ｃ３３ｃまたは抗ｃ２２）を表４に示す。詳細には、上記の３つの販売元由来の１７のセロコンバージョンパネルを、上記の技術を用いてアッセイした。見られ得る通り、ｃ３３ｃパネルについて、ＨＣＶ４．０は、９つのｃ３３ｃパネル中の９つにおいて、（１〜３回の採血により）ＨＣＶ３．０よりも早期の検出を示し、そして９つのパネル中の６つにおけるＰＲＩＳＭよりも早期の検出および９つのパネル中の３つにおけるＰＲＩＳＭと比較して等価な検出を示した。ｃ２２パネルについて、ＨＣＶ４．０は、８つのパネル中の３つにおけるＨＣＶ３．０よりも早期の検出および他の５つのパネルにおける等価な検出を示した。ＨＣＶ４．０はまた、８つのパネル中の２つにおけるＰＲＩＳＭよりも早期の検出および８つのパネル中の６つにおける等価な検出を示した。観察された改善の範囲は、ＨＣＶ３．０およびＰＲＩＳＭアッセイの両方よりも２〜１４日であった。
【０１５２】
【表３】
2011125350.tif 000004
【０１５３】
2011125350.tif 000005
【０１５４】
2011125350.tif 000006
【０１５５】
【表４】
2011125350.tif 000007
【０１５６】
（実施例６）
（ＨＣＶ４．０遺伝子型の感度）
ＨＣＶ４．０アッセイの遺伝子型の感度を、上記のＨＣＶ３．０およびＰａｓｔｅｕｒアッセイと比較した。詳細には、表５に示される１０の異なるＨＣＶ遺伝子型由来のサンプルを、表に示されるように希釈し（最初のサンプル力価測定に基づき２倍または１０倍）、そして上記の手順を用いて３つのアッセイにおいて使用した。３つの試験全てを同時に実施した。これらのデータをシグナルまたは未処理のＯ．Ｄ．として示す。これらのデータは、ＨＣＶ４．０プロトタイプが、希釈した遺伝子型サンプルを検出するのにより高感度であることを示唆する。
【０１５７】
【表５】
2011125350.tif 000008
【０１５８】
（実施例７）
（競合研究）
以下の競合研究を、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、他のＨＣＶ抗原と異なる抗体を検出するか否かを評価するために実施した。詳細には、ＮＳ３／４ａ抗原を、以下のようにしてｃ２００抗原と比較した。
【０１５９】
上記のようにして生成された０．５μｇおよび１．０μｇのＮＳ３／４ａまたはｃ２００（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）１５：１９−２５、ＯＲＴＨＯ
ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙにおいて利用可能）を、総量２２０μｌ（１×ＰＢＳ）で２０μｌのサンプルＰＨＶ９１４−５（感染個体の血液から獲得された初期セロコンバージョンの採血）と混合した。この混合物を、マイクロウェル中で３７℃で１時間インキュベートした。次いでこの混合物を、ＮＳ３／４ａコーティングしたプレートに移し、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そして以下のようにしてアッセイした。
【０１６０】
１μｇのｃ２００抗原を、総量約２２０μｌ中の１０μｌのサンプルＰＨＶ９１４−５に添加した。この混合物を、マイクロウェル中で３７℃で１時間インキュベートし、そして２００μｌをＮＳ３／４ａコーティングしたプレートに移し（１００ｎｇ／アッセイ）、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、１×ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて５回洗浄した。２００μｌの結合溶液（上記）を添加し、そしてプレートをインキュベートして、ＨＣＶ４．０アッセイについて実施例４に記載されるようにアッセイした。ＰＨＶ９１４−５および１×ＰＢＳからなるコントロール（抗原を含まない）もまた上記の通り処理した。
【０１６１】
結果を表６に示す。４列目に示される％阻害結果は、３列目−｛（２列目／３列目）×１００｝として算出する。見られ得る通り、これらのデータは、ＮＳ３４ａが、初期セロコンバージョン抗体により中和され、そしてｃ２００は中和されないことを示す。ＰＨＶ９１４−５  ｃ３３ｃ  初期セロコンバージョンパネルのメンバーにおける抗体が、プレート上にコーティングされたＮＳ３４ａと反応する場合、強いシグナルを達成した。ｃ２００抗原は、これらの抗体により中和されなかった。このことは、表６の上パネルに示される。ＮＳ３４ａをＰＨＶ９１４−５サンプルと混合した場合、それは中和されず、従って、マイクロプレート上にコーティングされたＮＳ３４ａと反応する抗体はサンプル中に存在しなかった。これらのデータは、ＮＳ３４ａが、ｃ２００により検出される抗体とは異なるクラスの抗体を検出し得ることを示す。
【０１６２】
【表６】
2011125350.tif 000009
【０１６３】
（実施例８）
（ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの安定性の研究）
アッセイの性能に対するＮＳ３／４ａエピトープの安定性の役割を評価するために、以下の研究を実施して、室温での時間に対するＮＳ３／４ａの免疫反応性を決定した。小アリコートのストックＮＳ３／４ａを、表７に示される間隔で、室温に静置し、次いで凍結させた。全てのバイアルを同時にコーティングし、そして２つの初期ＮＳ３セロコンバージョンパネルに対して試験した。アッセイを、ＨＣＶ４．０について上記の実施例５に記載されるように実施した。
【０１６４】
表７に見られる通り、ＮＳ３／４ａストックは安定ではなく、そして時間と共に免疫反応性が減少する。さらに、ＮＳ３／４ａのコンホメーションを維持することは、免疫反応性のために必須である。
【０１６５】
さらなる安定性の研究を以下の通り実施した。標準的な手順を用いてＮＳ３／４ａに対して作製された２つのコンホメーションモノクローナル抗体を、抗ＨＣＶ初期セロコンバージョンパネルと置き換えた。ストックＮＳ３／４ａバイアルを、室温にて３、６、および２４時間間隔で保存した。凍結バイアル由来のＮＳ３／４ａを９０ｎｇ／ｍｌでコーティングし、そして上記の手順を用いてアッセイした。結果は、２つのモノクローナル抗体が実際にコンホメーション抗体であり、そしてそれらの反応性は室温でのストックＮＳ３／４ａ抗原の操作に対して感受性であったことを示唆した。ポジティブコントロールのモノクローナル抗体の反応性は変化しなかった。
【０１６６】
【表７】
2011125350.tif 000010
【０１６７】
（実施例９）
（変性ＮＳ３／４ａに対するＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの免疫反応性）
上記のように生成されたＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの免疫反応性を、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ調製物に最終濃度２％でＳＤＳを添加することにより変性させたＮＳ３／４ａと比較した。変性ＮＳ３／４ａおよび立体構造性ＮＳ３／４ａを、上記のようにマイクロタイタープレート上にコーティングした。ｃ２００抗原（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）１５：１９−２５、ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ
Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙにおいて利用可能）もまた、マイクロタイタープレート上にコーティングした。処方物中の還元剤（ＤＴＴ）および界面活性剤（ＳＤＳ）の存在に起因して非立体構造性であると推測されるｃ２００抗原を、比較として用いた。
【０１６８】
免疫反応性を、上記のＥＬＩＳＡアッセイ手順を用いて、２つの初期ＨＣＶセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０４およびＰＨＶ９１４（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡから市販されているヒト血液サンプル）に対して試験した。これらの結果を表８に示す。これらのデータは、変性または直鎖形態のＮＳ３／４ａ（およびｃ２００）が、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープと同じくらい早く初期セロコンバージョンパネルを検出しないことを示唆する。
【０１６９】
【表８】
2011125350.tif 000011
【０１７０】
コンホメーションエピトープの免疫反応性を、標準的な手順を用いて作製されたＮＳ３／４ａに対するモノクローナル抗体を用いても試験した。次いで、これらのモノクローナル抗体を、ＮＳ３／４ａおよび変性ＮＳ３／４ａならびにｃ２００抗原に対して、上記のＥＬＩＳＡフォーマットにおいて試験した。これらのデータは、抗ＮＳ３／４ａモノクローナル抗体が、表９に示すセロコンバージョンパネルと同様の様式で、ＮＳ３／４ａおよび変性ＮＳ３／４ａと反応することを示す。この結果はまた、初期ｃ３３ｃセロコンバージョンパネルに対する反応性において類似するモノクローナル抗体が作製され得る場合、ＮＳ３／４ａが本質的に立体構造性であることのさらなる証拠を提供する。
【０１７１】
【表９】
2011125350.tif 000012
【０１７２】
従って、新規のＨＣＶ検出アッセイを開示した。前述のことから、本発明の特定の実施形態が、例示の目的で本明細書中に記載されているが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2011125350.tif 000016
【図３Ｃ】
2011125350.tif 000017
【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
2011125350.tif 000020
【図５Ｂ】
2011125350.tif 000021
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2011125350.tif 000023
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2011125350.tif 000029
【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2011125350000001.app
【外国語明細書】
2011125350000001.pdf