(57)【要約】      （修正有）【課題】４塩基コドンに応答してホモグルタミンを蛋白質に組込む蛋白質生合成機構の成分として、直交リシルｔＲＮＡ、直交リシル−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びリシルｔＲＮＡ／シンテターゼ直交対の組成物とその作製方法の提供。【解決手段】蛋白質が野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む、前記蛋白質がホモグルタミンを含む、組成物。直交リシル−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びリシルｔＲＮＡ／シンテターゼ直交対の直交対の同定方法と、これらの直交対を使用してホモグルタミンを組込んだ蛋白質を生産する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質がホモグルタミンを含む前記組成物。
【請求項２】
蛋白質が野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ホモグルタミンを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法であって、
１）Ｏ−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに直交性である）と；
２）集団の１個以上の細胞においてＯ−ｔＲＮＡにホモグルタミンを負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；
３）選択マーカーをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと；
４）ホモグルタミン
を併有する細胞集団に選択を実施し、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と；
ターゲット細胞を選択することにより、活性Ｏ−ＲＳを選択する段階を含む前記方法。
【請求項５】
Ｏ−ｔＲＮＡにホモグルタミン以外のアミノ酸を負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択がポジティブ選択を含み、選択マーカーがポジティブ選択マーカーを含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
複数のＲＳが突然変異体ＲＳ、第１の種以外の１種以上の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両者を含む請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項９】
特定位置にホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
ホモグルタミンを提供する段階を含み；
前記細胞が更に、
セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
Ｏ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み；
更に、セレクターコドンに応答してホモグルタミンを特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１０】
Ｏ−ＲＳがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体に対応するアミノ酸配列を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
４塩基セレクターコドンを認識する第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
前記Ｏ−ｔＲＮＡに第１の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
終止セレクターコドンを認識する第２のＯ−ｔＲＮＡと；
第２のＯ−ｔＲＮＡに第２の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第２のＯ−ＲＳを含む翻訳系。
【請求項１２】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡである；
終止コドンがＵＡＧである；或いは
翻訳系が細胞を含む；請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
第１又は第２のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である；或いは
第１のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体であり、第２のＯ−ｔＲＮＡが直交チロシルｔＲＮＡ（チロシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である；請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
少なくとも４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンを含む核酸を更に含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡであり、終止セレクターコドンがＴＡＧ又はＵＡＧである；或いは
核酸が発現されたＲＮＡである；請求項１４に記載の翻訳系。
【請求項１６】
翻訳系が核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項１４に記載の翻訳系。
【請求項１７】
蛋白質がホモグルタミンを含む；或いは
蛋白質がミオグロビンに相同である；請求項１６に記載の翻訳系。
【請求項１８】
ホモグルタミンを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１９】
ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体をコードする核酸。
【請求項２０】
配列番号２４もしくは配列番号２６又はその保存変異体に対応するｔＲＮＡを含むか又はコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は仮特許出願ＵＳＳＮ６０／４８５，４５１（出願日２００３年７月７日）；仮特許出願ＵＳＳＮ６０／５２８，８１５（出願日２００３年１２月１０日）；及び仮特許出願ＵＳＳＮ６０／５３７，１４９（出願日２００４年１月１５日）の優先権と特典を主張し、その開示内容全体を参考資料として全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明はエネルギー省により交付された助成番号ＤＥ−ＦＧ０３００ＥＲ４５８１２として政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明は４塩基セレクターコドンや終止セレクターコドン等のセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）を蛋白質に組込む直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びその対の作製方法と組成物に関する。これは終止セレクターコドンと４塩基セレクターコドンに応答して単一蛋白質鎖に複数の異なる非天然アミノ酸を組込むことを含む。本発明は更に前記対及び関連組成物を使用して細胞で蛋白質を生産する方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
少数の例外を除き、全公知生物の遺伝コードは同一の２０種の標準アミノ酸をコードするが、ユニークｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対、アミノ酸源、及びアミノ酸に特異的なユニークセレクターコドンさえあれば生物のレパートリーに新規アミノ酸を付加することができる（Ｆｕｒｔｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９−４２６）。先に、本発明者らは夫々大腸菌（Ｗａｎｇら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０−５０１１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００；Ｗａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：５６−６１；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：１１０２０−１１０２４）と酵母（Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，３：１１３５−１１３７）において新規特性をもつ各種アミノ酸を遺伝的にコードするためにアンバーナンセンスコドンＴＡＧを直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及び大腸菌ｔＲＮＡ／シンテターゼ対と併用できることを示している。しかし、非コーディング三重項コドンの数が限られているため、任意生物によりコードされるアミノ酸の最終的な数は著しく制限される。
【０００５】
天然に存在する＋１フレームシフトサプレッサーは多数の例があり、グルタミンをコードするＳｕ７に由来するＵＡＧＮサプレッサー（Ｍａｇｌｉｅｒｙら，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０７：７５５−７６９）、スレオニンをコードするＡＣＣＮのｓｕｆＪ由来サプレッサー（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，９：２３７−２４４）及びｔＲＮＡＬｙｓとｔＲＮＡＧｌｎに由来するＣＡＡＡサプレッサー（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９５９８−６０８）か挙げられる。更に、遺伝的選択を使用して突然変異体ｔＲＮＡの大きなライブラリーから大腸菌ｔＲＮＡＳｅｒＵＣＣＵサプレッサー等の効率的な４塩基及び５塩基コドンサプレッサーｔＲＮＡが同定されている（Ｉｂｂａら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：４１８−４２３；Ｋｗｏｋ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，（１９８０）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：２１３−２１８）。化学的にアミノアシル化されたｔＲＮＡを使用してこの自然現象がｉｎ  ｖｉｔｒｏ非天然アミノ酸突然変異誘発に拡張されている。フルオロフォア／クエンチャー対（Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９：２５７−２６２）を含む各種アミノ酸がＡＧＧＵ及びＣＧＧＧに応答して蛋白質に組込まれている（Ｈｏｕら，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４１５７−４１６０；Ｙａｒｕｓら，（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９２：２３５−２５５；Ｍｉｌｌｅｒ，（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ）。遺伝コードを更に拡張するためには、生合成機構の改良及び／又は付加成分（例えば直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及び／又はユニークコドン）を開発することが必要である。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
【非特許文献１】Ｆｕｒｔｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９−４２６
【非特許文献２】Ｗａｎｇら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０−５０１１
【非特許文献３】Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００
【非特許文献４】Ｗａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：５６−６１
【非特許文献５】Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：１１０２０−１１０２４
【非特許文献６】Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，３：１１３５−１１３７
【非特許文献７】Ｍａｇｌｉｅｒｙら，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０７：７５５−７６９
【非特許文献８】Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，９：２３７−２４４
【非特許文献９】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９５９８−６０８
【非特許文献１０】Ｉｂｂａら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：４１８−４２３
【非特許文献１１】Ｋｗｏｋ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，（１９８０）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：２１３−２１８
【非特許文献１２】Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９：２５７−２６２
【非特許文献１３】Ｈｏｕら，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４１５７−４１６０
【非特許文献１４】Ｙａｒｕｓら，（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９２：２３５−２５５
【非特許文献１５】Ｍｉｌｌｅｒ，（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して蛋白質産物を生産する新規翻訳系を提供する。本発明は構築された翻訳系、翻訳系の使用方法、及び翻訳系により生産された翻訳産物に関する。この技術は本明細書に記載するような多数の用途に適用され、限定されないが、例えば、治療用製品、診断用試薬及び産業用酵素の生産が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１側面において、本発明は直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又は前記Ｏ−ｔＲＮＡの修飾変異体及び／又は直交リシルｔＲＮＡに１種以上のアミノ酸を優先的に負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）又は前記Ｏ−ＲＳの修飾変異体を使用する翻訳系を提供する。所定態様では、翻訳系は細胞（例えば大腸菌細胞）内に含まれる。場合によりＯ−ｔＲＮＡと結合されたアミノ酸は非天然アミノ酸、例えばホモグルタミンである。
【０００８】
翻訳系の所定態様において、リシルＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ｔＲＮＡの変異体、Ｏ−ＲＳ、又はＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳの両者はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＰｈＫＲＳ）に由来する。翻訳系で使用される各種Ｏ−ＲＳとしてはＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、及びＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体が挙げられる。所定態様では、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ  Ｏ−ＲＳは大腸菌細胞で発現されると、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体の毒性以下の毒性を示す。
【０００９】
リシルＯ−ｔＲＮＡ又は変異体Ｏ−ｔＲＮＡは場合により４塩基コドン又はアンバーコドンの認識配列を含む。例えば、リシルＯ−ｔＲＮＡ又は変異体はＡＧＧＡの認識配列を含む。翻訳系の関連側面において、リシルＯ−ｔＲＮＡ又は変異体はＣＵ（Ｘ）ｎＸＸＸＡＡ配列をもつアンチコドンループを使用する。この側面の所定態様では、ＣＵ（Ｘ）ｎＸＸＸＡＡ配列はＣＵＣＵＡＡＡ又はＣＵＵＣＣＵＡＡとすることができる。例としては、配列番号２４又は配列番号２６に記載の配列を含むリシルＯ−ｔＲＮＡ又はその変異体が挙げられる。
【００１０】
本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳ、リシルＯ−ｔＲＮＡ又は変異体はＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体を配列番号２４又は配列番号２６のＯ−ｔＲＮＡと併用する場合の少なくとも５０％の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する。他の態様では、翻訳系は付加Ｏ−ＲＳと付加Ｏ−ｔＲＮＡを使用し、これらの付加成分はリシルＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ変異体とリシルＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ変異体に優先的に負荷するＯ−ＲＳにより抑圧されるフレームシフトセレクターコドンとは異なるフレームシフトセレクターコドンを抑圧する。他の態様では、翻訳系はターゲットポリペプチドをコードするターゲット核酸において４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンの両者を抑圧する。４塩基セレクターコドンは場合によりＡＧＧＡ配列を使用し、終止セレクターコドンは場合によりＴＡＧ又はＵＡＧ配列を使用する。所定態様では、翻訳系は４塩基セレクターコドンを含むターゲット核酸を含む。翻訳系は場合によりターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含む。例えば、この蛋白質はホモグルタミン残基を含むことができる。
【００１１】
翻訳系は場合により４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンをコードするターゲット核酸を含む。所定側面では、翻訳系はターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質は少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む。
【００１２】
本発明は例えば４塩基セレクターコドンを認識する第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、前記Ｏ−ｔＲＮＡに第１の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、終止セレクターコドンを認識する第２のＯ−ｔＲＮＡと、第２のＯ−ｔＲＮＡに第２の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第２のＯ−ＲＳを使用する翻訳系を提供する。１態様では、４塩基セレクターコドンはＡＧＧＡであり、終止セレクターコドンはＵＡＧである。場合により、翻訳系は細胞内に含まれる。
【００１３】
翻訳系の所定態様では、第１又は第２のＯ−ｔＲＮＡは直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又は修飾変異体である。場合により、第１のＯ−ｔＲＮＡは直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又は適切な変異体であり、第２のＯ−ｔＲＮＡは直交チロシルｔＲＮＡ（チロシルＯ−ｔＲＮＡ）又は適切な変異体である。場合により、翻訳系は少なくとも４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンをコードする核酸を含む。これらの態様では、４塩基セレクターコドンはＡＧＧＡとすることができ、終止セレクターコドンはＴＡＧ又はＵＡＧとすることができ、翻訳すべき核酸は一般に発現されたＲＮＡである。所定態様では、核酸によりコードされる蛋白質は少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸（例えばホモグルタミンと求電子性アミノ酸等の第２の非天然アミノ酸）を含む。翻訳系は各種非天然アミノ酸の任意のものを含むことができ、例えばホモグルタミンが挙げられる。１例では、翻訳系内の蛋白質はミオグロビンに相同であるが、ホモグルタミン等の非天然アミノ酸を含む。
【００１４】
本発明は限定されないが、ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はこれらの蛋白質の保存変異体のアミノ酸配列を含む組成物を提供する。本発明は同様に、ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はこれらの配列の保存変異体をコードする核酸を提供する。本発明は配列番号２４もしくは配列番号２６又はこれらの配列の任意保存変異体に対応するｔＲＮＡを一部に含むか又は前記ｔＲＮＡのみから構成される核酸を提供する。
【００１５】
他の側面では、本発明は限定されないが、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む組成物を提供し、前記Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。このＯ−ＲＳはＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はこの蛋白質の任意保存変異体に対応する突然変異を含むことができる。所定態様では、前記Ｏ−ＲＳはＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉに由来する。Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの両者が組成物中に存在する所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは４塩基セレクターコドン（例えば、ＡＧＧＡ配列）を認識する。
【００１６】
上記組成物が細胞を含むか又は細胞内に存在する所定態様ではＯ−ＲＳは例えば大腸菌細胞とすることができる細胞内で１種以上の核酸によりコードすることができる。組成物は翻訳系を含むことができる。細胞を含み、Ｏ−ＲＳが前記細胞で１種以上の核酸によりコードされる組成物において、細胞は第１のセレクターコドンを認識する直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とホモグルタミンを更に含むことができ、例えば前記Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、細胞は該当ポリペプチドをコードするターゲット核酸を含むことができ、ターゲット核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンをコードする。
【００１７】
Ｏ−ｔＲＮＡは場合により配列番号２４もしくは配列番号２６に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列により完全又は部分的にコードされ、Ｏ−ＲＳはＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体に対応するアミノ酸配列、又は前記配列の任意保存変異体を含む。当然のことながら、本明細書に記載する任意核酸配列はＲＮＡ又はＤＮＡ形で表すことができ、従って、そうでないことが文脈から明らかな場合を除き、配列番号２４又は２５等の配列は明示しているか否かに拘わらず、場合によりＲＮＡ及び／又はＤＮＡ形を含む。所定態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡはＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、又はＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体を配列番号２４又は配列番号２６のＯ−ｔＲＮＡと併用する場合の少なくとも５０％の効率で終止又はフレームシフトセレクターコドンを抑圧する。組成物が細胞を含む態様では、細胞は大腸菌細胞とすることができる。この組成物の細胞は異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と異なる付加非天然アミノ酸を更に含むことができ、Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。細胞は場合により第１及び第２のセレクターコドンをコードするターゲット核酸を更に含むことができる。更に、この組成物の細胞はターゲット核酸によりコードされる蛋白質を含むことができ、前記蛋白質は少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む。
【００１８】
本発明は少なくとも１種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質も提供する。所定態様では、蛋白質は野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はこれらの蛋白質の任意部分の配列に少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、蛋白質は医薬的に許容可能なキャリヤーと併存している。
【００１９】
別の側面では、本発明はホモグルタミンを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法を提供する。これらの方法は細胞集団に選択を実施する第１段階を使用し、細胞は１）Ｏ−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに直交性である）と；２）集団の１個以上の細胞においてＯ−ｔＲＮＡにホモグルタミンを負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；３）選択マーカーをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンをコードするポリヌクレオチドと；４）ホモグルタミンを併有する。この選択では、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する。本方法の第２段階は活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を選択する選択操作である。本発明は更に前記選択法の任意のものにより同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを提供する。
【００２０】
これらの方法の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡにホモグルタミン以外のアミノ酸を負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する。所定態様では、選択はポジティブ選択であり、選択マーカーはポジティブ選択マーカーである。
【００２１】
これらの方法の各種態様では、複数のＲＳは各種起源の任意のものに由来することができ、限定されないが、突然変異体ＲＳ、第１の種以外の１種以上の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両者が挙げられる。
【００２２】
本発明は更に特定位置にホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法を提供する。本方法は、少なくとも１個のセレクターコドンをコードし、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階を含み、例えば細胞はセレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、Ｏ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を更に含み；更にホモグルタミンを提供する段階と；セレクターコドンに応答してホモグルタミンを特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。この方法の１態様では、Ｏ−ＲＳのアミノ酸配列はＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体のアミノ酸配列を完全又は部分的に使用する。
（定義）
【００２３】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「細菌」と言う場合には細菌混合物を含み、他の用語についても同様である。
【００２４】
本欄及び本明細書の他の欄で特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００２５】
直交リシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交リシルｔＲＮＡ（リシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交なｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するリシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するリシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体リシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体リシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）表１にリシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として示す任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）表１にリシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として示す任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。リシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷された状態でも負荷されない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「リシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼによりリジン以外のアミノ酸（例えばアミノ酸ホモグルタミン）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のリシル−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
【００２６】
直交リシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交リシルアミノ酸シンテターゼ（リシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてリシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。リシル−Ｏ−ＲＳをリシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本発明では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するリシルアミノ酸シンテターゼと同一もしくは相同であるか、又は表１にリシル−Ｏ−ＲＳとして示すシンテターゼと同一もしくは相同である。例えば、リシル−Ｏ−ＲＳは表１のリシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は表１のリシル−Ｏ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００２７】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、又は細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する場合に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する場合に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できず、例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率であることを意味する。直交分子は細胞中に機能的に正常な内在相補的分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又は検出不能である。別の例では、直交ＲＳが該当細胞中の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ＲＳが内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率に比較して低いか又は検出不能である。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に対して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において相互に共働する導入相補成分を含む。
【００２８】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共同機能する成分、例えば直交ｔＲＮＡと前記直交ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は「相補的」であると言うこともできる。
【００２９】
優先的にアミノアシル化する：「優先的にアミノアシル化する」なる用語はＯ−ＲＳが他のｔＲＮＡに負荷する場合よりも高い効率で特定ｔＲＮＡに所与アミノ酸を負荷することを意味する。例えば、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが非コグネイトｔＲＮＡ（例えばコグネイトＯ−ｔＲＮＡを例えば突然変異により作製するための基質として使用されるｔＲＮＡ）をアミノアシル化する場合に比較して所定効率（例えば７０％の効率、７５％の効率、８５％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は約９９％以上の効率）でコグネイトＯ−ｔＲＮＡに負荷することができる。
【００３０】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、一般に内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。典型例としては終止コドン、４塩基以上のコドン、及び／又は同等物が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループは例えば発現されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）中でセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸を翻訳系成分により翻訳中のポリペプチドに挿入する。例えば、本発明の１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは４塩基コドン等のセレクターコドンを認識し、翻訳プロセスにより生産中のポリペプチドにホモグルタミン等の非天然アミノ酸を付加する。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００３１】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
【００３２】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドン又は４塩基以上のコドン等のセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観察される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００３３】
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の手段を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたないポジティブ対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性ポジティブ対照マーカーが所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外はポジティブ対照マーカーが発現される条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「ネガティブ」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精確にすることができる。このネガティブ対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
【００３４】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に誘導体化ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼ（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）も導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ誘導体化ｌａｃＺ構築物から観察される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００３５】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができる。
【００３６】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種又は微量天然アミノ酸セレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体（例えばホモグルタミン）を意味する。
【００３７】
〜に由来：本明細書で使用する「〜に由来」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。
【００３８】
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、このマーカーに対応する形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）が前記形質をもたない細胞から識別されるマーカーを意味する。
【００３９】
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）と、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）前記性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
【００４０】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系のターゲット成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、ルミネッセントマーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、Ａｄｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
【００４１】
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は系統発生分類の真核生物に属する生物を意味し、例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００４２】
非真核生物：本明細書で使用する「非真核生物」なる用語は真核生物以外の生物を意味する。例えば、非真核生物は系統発生分類の真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）、又は系統発生分類の古細菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等）に属することができる。
【００４３】
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は翻訳成分を意味し、例えば類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳが挙げられる。例えば、Ｏ−ＲＳは相補的Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）でアミノアシル化するが、Ｏ−ｔＲＮＡと保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡは同一配列をもたない。保存変異体は保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
【００４４】
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
【００４５】
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡに担持される該当アミノ酸（例えばホモグルタミン等の非天然アミノ酸）を成長中のポリペプチド鎖に組込むプロセスを意味する。
【００４６】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列とは異なる第２の分子又は配列の生産を導くためにポリマー巨大分子又は配列中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の１本の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【００４７】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を導くためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスと同様にポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードする三重項コドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
ホモグルタミン等の付加合成アミノ酸を遺伝コードにｉｎ  ｖｉｖｏ付加するためには、翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼとｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとｔＲＮＡの新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定新規コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）のみで優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは内在シンテターゼでアミノアシル化されないことも望ましい。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種の内在ｔＲＮＡのいずれをも実質的にアミノアシル化しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種の内在シンテターゼのいずれでもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
【００４９】
本発明では、４塩基セレクターコドンＡＧＧＡに応答してアミノ酸ホモグルタミン（ｈＧｌｎ）をミオグロビンに効率的且つ選択的に組込む古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列に由来する新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製について報告する。ｈＧｌｎによるフレームシフト抑圧は蛋白質収率又は細胞増殖速度にさほど影響せず、第２のＯ−ｔＲＮＡ−ＯＲＳ対によるＴＡＧの抑圧と相互に直交性であることが判明した。本発明では利用可能な三重項コドンの数も翻訳機構自体もコードの更なる拡張の有意障害とならないことを示す。
【００５０】
非天然アミノ酸を四重項コドンでｉｎ  ｖｉｖｏコードするためには、このコドンを固有に認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）とこのＯ−ｔＲＮＡのみを該当非天然アミノ酸で固有にアミノアシル化する対応するシンテターゼを作製する必要がある。従来作製されている直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアンバーサプレッサーｔＲＮＡのアンチコドンループはコグネイトシンテターゼＪＹＲＳの主要認識成分であるので、４塩基コドンをデコードするようにこのループを拡張することは困難であった。ＪＹＲＳのアンチコドン結合特異性を緩和することは可能であると思われるが、アンチコドン配列のみを使用してアンバーサプレッサーと４塩基サプレッサーを区別する相互に直交性の対を構築することは困難であると思われる。従って、本発明では、異なる起源の直交対を使用して２種以上の異なるセレクターコドンに応答して２種以上の異なる非天然アミノ酸をポリペプチドに同時に組込むことができるシステムを達成する。
【００５１】
本発明は非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）を組込むために使用することができる付加直交ｔＲＮＡアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）の組成物とその同定及び作製方法を提供する。本発明の代表的Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡにより例えばｉｎ  ｖｉｖｏで認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質にホモグルタミンを組込むことができる。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えばホモグルタミン）をポリペプチドのこの部位に組込む。本発明の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡを特定非天然アミノ酸のみで優先的にアミノアシル化（又は負荷）する。
直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼとその対
【００５２】
１種以上の非天然アミノ酸を含む蛋白質の生産に適した翻訳系は国際公開第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ  ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」及びＷＯ２００２／０８５９２３号、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されている。更に、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）参照。これらの各出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸（本発明ではホモグルタミンがこのような非天然アミノ酸の１例である）含む細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミンでアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳを含む。本発明は個々の成分も提供する。
【００５３】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下で核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミン等の該当非天然アミノ酸でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定の望ましい側面では、細胞は付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンが各セレクターコドンを特異的に認識することができる。
【００５４】
本発明の所定態様では、細胞（例えば大腸菌細胞）は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、ホモグルタミンと、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と併用することができる。
【００５５】
１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
【００５６】
上述のように、本発明は場合により２種以上の非天然アミノ酸（例えばホモグルタミンと別の非天然アミノ酸）を組込むことができるように、細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対（例えばロイシル、リシル、グルタミル等）を含むことができる（第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン、例えばオパール、４塩基コドン等を認識する）。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
【００５７】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製する１ストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
【００５８】
直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
【００５９】
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質へのホモグルタミン等の非天然アミノ酸の組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
【００６０】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に誘導体化ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ誘導体化ｌａｃＺ構築物から観察される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００６１】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例を本明細書の配列表に記載する。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表、実施例及び図面も参照されたい。更に、本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。Ｏ−ＲＳ  ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。塩基に付加修飾を加えてもよい。
【００６２】
本発明は本明細書に記載する特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたない（と共に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい）分子が挙げられる。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【００６３】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミン等の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の「直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」のセクションも参照。
【００６４】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
【００６５】
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Ｄアーム又はループ、可変ループ、ＴＰＣアーム又はループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするような突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループの突然変異が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡの末端への付加配列（ＣＣＡ）の付加を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
【００６６】
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物について直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を使用することができる。１例では、原核生物である大腸菌で使用するための潜在直交性翻訳成分を選択するためには、原核生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。
【００６７】
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
【００６８】
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー、例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ）をコードするポリヌクレオチドの非必須位置（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
【００６９】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドンのｉｎ  ｖｉｖｏ抑圧（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス又はフレームシフト突然変異）に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観察される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
【００７０】
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交であるとき）には、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
【００７１】
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡをもつ細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡは両者選択後に生存している。
【００７２】
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
【００７３】
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の１側面では、初期ラウンド中には所望活性を低くすることができるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択条件を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー条件を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復する。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一とすることができる。
【００７４】
本発明ではセレクターコドンに応答してホモグルタミン等の非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングも使用することができる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方としては、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーが挙げられる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  ＳＡ．９０：１０４４４−８も参照。
【００７５】
組換え直交ｔＲＮＡの他の作製方法も例えば国際特許出願第ＷＯ２００２／０８６０７５号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ）」；並びにＵＳＳＮ６０／４７９，９３１及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＰＮＡＳ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ  １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
【００７６】
本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミン等の非天然アミノ酸で優先的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳの１例は本明細書の配列表及び実施例に記載するアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。代表的Ｏ−ＲＳ分子の配列については例えば本明細書の表及び実施例参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【００７７】
Ｏ−ｔＲＮＡと併用するための直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）、例えばＯ−ＲＳの同定方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術により本明細書に記載するように測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識アミノ酸又は非天然アミノ酸、例えば標識ホモグルタミン）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用するための効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
【００７８】
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）も参照。
【００７９】
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種の標準アミノ酸を負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、各種シンテターゼドメインを組み合わせることにより各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然及び非天然アミノ酸両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを例えばＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法により更に突然変異誘発することができる。
【００８０】
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングしてもよい。
【００８１】
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発させることができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の１側面では、段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
【００８２】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳを作製するための方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
【００８３】
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細についてはＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−ａｍｉｎｏａｃｙｌｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｐａｉｒｓ）」；及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）を参照されたい。
資源及び宿主生物
【００８４】
本発明の翻訳成分は一般に非真核生物に由来することができる。例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ資源として使用することができる。
【００８５】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。１好適態様では、例えば大腸菌系翻訳系で古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのリシルシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を直交対として使用する。本明細書に記載するように、この対は４塩基セレクターコドンを認識するように修飾することができ、Ｏ−ｔＲＮＡにホモグルタミン等の非天然アミノ酸を負荷するように修飾することができる。この直交対（又はその修飾形）を上記直交対（例えば終止セレクターコドンを認識するように修飾された例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交対）と組み合わせることができる。こうして、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対により各々認識される２個以上のセレクターコドンを含む前記蛋白質のコーディング核酸を付加することにより、該当翻訳系に２種の異なる非天然アミノ酸を含む蛋白質を生産することができる。
【００８６】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択又はスクリーニングすることができ、及び／又はホモグルタミン又は他の該当非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば非真核細胞、又は真核細胞）で使用することができる。非真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌や、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌が挙げられる。真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えば植物（例えば単子葉植物、又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等が挙げられる。本発明の翻訳成分を導入した細胞の組成物も本発明の特徴である。
【００８７】
別の種で使用するためにある種でＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングすることについては、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号（出願日２００４年４月１６日）も参照。
セレクターコドン
【００８８】
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン（例えばＡＧＧＡ）、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、３個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して複数の異なる非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
【００８９】
１態様では、本方法はホモグルタミンを細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、４塩基セレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳによりホモグルタミンでアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは翻訳系の内在アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発を使用して該当ポリペプチドをコードするターゲットポリヌクレオチドの該当部位にセレクターコドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら（１９８８），“５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，７９１−８０２も参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで併用すると、セレクターコドンに応答してホモグルタミンが組込まれ、特定位置にホモグルタミンを含むポリペプチドが得られる。
【００９０】
ホモグルタミン等の非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、終止セレクターコドンであるＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子１（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤のように、放出因子作用を調節する付加成分も加えてもよい。
【００９１】
例えばホモグルタミン等の非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全三重項コドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばＫｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ  ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【００９２】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ“Ｓｈｉｆｔｙ”Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
【００９３】
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏ組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、四重項ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。本明細書の実施例では、ＡＧＧＡセレクターコドンを認識し、蛋白質翻訳中にホモグルタミンを挿入する直交対について記載する。
【００９４】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
【００９５】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、三重項コドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び未完成非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２参照。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連文献は以下に挙げる。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｒｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定であり、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【００９７】
翻訳バイパス系を使用してホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
【００９８】
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のαアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
2011101656.tif 000002
により表される。
【００９９】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物（又は、当然のことながら人工的に製造した合成化合物）でもよい。
【０１００】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
【０１０１】
非天然アミノ酸を蛋白質に組込むにあたって特に重要な点は、ホモグルタミンを組込むことができることである。他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。所定態様では、非天然アミノ酸は光架橋基をもつ。１態様では、非天然アミノ酸はアミノ酸側鎖に結合した糖部分及び／又は他の糖鎖修飾をもつ。
【０１０２】
新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化２】
2011101656.tif 000003
の構造により表されるような修飾主鎖構造を含み、式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α−炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。本発明のその他の非天然アミノ酸構造としては例えばメチレン又はアミノ基がα炭素に隣接してサンドイッチされているホモβ型構造が挙げられ、例えばホモβ−チロシン、α−ヒドラジノチロシンの異性体が挙げられる。例えば、下記参照。
【化３】
2011101656.tif 000004
【０１０３】
多くの非天然アミノ酸は天然アミノ酸（例えばチロシン、グルタミン、フェニルアラニン等）をベースとする。例えば、チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ホモグルタミン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」の図１６、１７、１８、１９、２６及び２９に記載されている。
非天然アミノ酸の化学的合成
【０１０４】
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆  Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍ��ｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照されたい。
非天然アミノ酸の細胞取込み
【０１０５】
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、αアミノ酸の電荷密度が高いと、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／４１３４６号、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々の方法で容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
【０１０６】
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋから入手できる。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１０７】
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素又は他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅ���ｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダム化し、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ“Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＷＯ００／４６３４４参照。
【０１０８】
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の文献に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１０９】
例えば所望化合物を生産するように生物及び代謝経路を操作するための他の技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路操作アプローチを教示している文献の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
【０１１０】
使用する方法に関係なく、一般に本発明の人工生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を操作し、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
ホモグルタミンを組込むための直交成分
【０１１１】
本発明はセレクターコドン（例えば終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖にホモグルタミンを例えばｉｎ  ｖｉｖｏで組込むための直交成分の組成物と作製方法を提供する。例えば、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖にホモグルタミンを組込むために使用することができる。
【０１１２】
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、前記Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１を含むアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０１１３】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、前記Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
【０１１４】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は場合により細胞（例えば大腸菌細胞等の非真核細胞、又は真核細胞）、及び／又は翻訳系を含むことができる。
【０１１５】
本発明は翻訳系を含む細胞（例えば非真核細胞、又は真核細胞）も提供し、前記翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；ホモグルタミンを含む。一般に、Ｏ−ＲＳは配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。１態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１に記載のアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。
【０１１６】
本発明の細胞は場合により異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を更に含むことができ、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
【０１１７】
所定態様では、本発明の細胞は直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、ホモグルタミンと、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む大腸菌細胞を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書に記載する任意Ｏ−ＲＳ配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドの効率の少なくとも５０％の効率でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０１１８】
本発明の所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表もしくは実施例に記載するポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列表に記載するアミノ酸配列又はその保存変異体を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳ又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１１９】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は非真核生物）の任意のものに由来することができる。
【０１２０】
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは本明細書の配列表に記載するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドを含むか、及び／又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的である。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸と例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致するポリヌクレオチド（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸以外のものとする）を含み、前記ｔＲＮＡはセレクターコドン（例えば４塩基コドン）を認識する。上記の任意のものと例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチド及び／又は上記の任意のものの保存変異体を含むポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【０１２１】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
【０１２２】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１種のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と；セレクターコドンを認識できるように突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供する段階と、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の第１の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールが得られ、それにより少なくとも１種のＯ−ｔＲＮＡが得られる。本発明の方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも提供する。
【０１２３】
所定態様では、前記方法は更に第１の種の第２の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すｔＲＮＡプールのメンバーを含むものについて細胞を選択又はスクリーニングすることにより、Ｏ−ｔＲＮＡが得られる。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。
【０１２４】
ホモグルタミンをＯ−ｔＲＮＡに負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第１の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）のメンバーと；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。
【０１２５】
複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞（例えば宿主細胞）を選択又はスクリーニングする。これらの選択／スクリーニングした細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。この方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼも本発明の特徴である。
【０１２６】
ホモグルタミンを特定位置に組込んだ蛋白質を細胞（例えば大腸菌細胞等の非真核細胞、又は真核細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ホモグルタミンを提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置にホモグルタミンを組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１２７】
本発明は例えばホモグルタミンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は公知蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分）のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
【０１２８】
上記及び下記に記載するように、本発明は核酸ポリヌクレオチド配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、前記配列を含む例えば組成物、系及び方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）の例を本明細書に開示する（本明細書の配列表及び実施例参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は例えば実施例や配列表に記載する厳密な配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は例えば本明細書に記載する機能をもつ（例えば適切なＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをコードする）多数の関連及び非関連配列も提供する。
【０１２９】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば本明細書の配列表に記載するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に本明細書の配列表又は実施例に記載するアミノ酸配列のいずれかを含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする（天然ポリヌクレオチド以外の）人工核酸も本発明のポリヌクレオチドである。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドとは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
【０１３０】
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は本明細書の配列表もしくは実施例に記載する任意ｔＲＮＡもしくはそのコーディング核酸と例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上一致する人工ポリヌクレオチドも含む。
【０１３１】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【０１３２】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。
保存変異
【０１３３】
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異は本発明の特徴である。
【０１３４】
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明のポリペプチド配列の「保存変異」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０１３５】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
【表１】
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核酸ハイブリダイゼーション
【０１３６】
本発明の核酸の保存変異体を含めて本明細書の配列表に記載するような本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を無関係の核酸から識別する方法の１つである。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列表の配列により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０１３７】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１３８】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）及びＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１３９】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１４０】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０１４１】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１４２】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１４３】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１４４】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
【０１４５】
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は従来公知の任意ｔＲＮＡ及びＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０１４６】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は従来公知の任意ＲＳ配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０１４７】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
【０１４８】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１４９】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０１５０】
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上のホモグルタミン（例えば非天然アミノ酸）を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【０１５１】
配列比較及び相同性判定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０１５２】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
【０１５３】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０１５４】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
【０１５５】
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００３年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えばホモグルタミン、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
【０１５６】
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、ホモグルタミンをコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発を使用する。これらの例としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発を行うことができる。
【０１５７】
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７）、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０１５８】
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出），Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，世界ウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ参照）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，世界ウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ参照）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０１５９】
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えば後期核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
【０１６０】
例えば少なくとも１種のホモグルタミンを組込んだ該当蛋白質又はポリペプチドと、２種以上の異なる非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドも本発明の特徴である。賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）も蛋白質に添加することができる。場合により、本発明の蛋白質は翻訳後修飾を含む。
【０１６１】
ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を特定位置に組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み且つ蛋白質をコードする核酸を導入した細胞を適当な培地で増殖させる段階と、ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を提供する段階を含み；細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡをホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表及び実施例に記載するポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１６２】
本発明はホモグルタミンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等と少なくとも７５％一致しており、ホモグルタミン等の１種以上の非天然アミノ酸の導入によりターゲット蛋白質と相違するアミノ酸配列を含む。
【０１６３】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、ホモグルタミンは蛋白質に組込まれる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答して外部から増殖培地に添加することができるホモグルタミン（例えばチロシン又はフェニルアラニンアミノ酸の誘導体等の合成アミノ酸）のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
【０１６４】
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。１側面では、組成物は場合により、ホモグルタミンもしくは複数の非天然アミノ酸  を含む蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、又はｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
【０１６５】
ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を調整するために実施することができる。ホモグルタミンを組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、ホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療、診断、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。更に、１種以上の非天然アミノ酸をポリペプチドに組込み、例えばポリペプチドを固体支持体に固定するための分子タグを提供することができる。非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを使用してアレーを作製する方法の詳細については、例えばＷａｎｇとＳｃｈｕｌｔｚの２００３年１２月２２日付け出願、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」、代理人整理番号５４−０００８１０ＰＣ参照。
【０１６６】
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン及び／又は他の非天然アミノ酸）を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個がホモグルタミンで置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０１６７】
本明細書に記載する組成物と方法を使用してホモグルタミン等の非天然アミノ酸を組込むか、又は複数の異なる非天然アミノ酸（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）をコードするほぼ任意蛋白質（又はその部分）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を同定しようとするのではなく、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０１６８】
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上のホモグルタミンを組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１７８６号、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１種以上のホモグルタミンを組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ等が挙げられる。
【０１６９】
本明細書に記載するホモグルタミンのｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【０１７０】
本発明の蛋白質（例えば１種以上のホモグルタミンを組込んだ蛋白質）の１類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０１７１】
少なくとも１種のホモグルタミンを組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０１７２】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００３カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上のホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸（例えばホモグルタミン）へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
【０１７３】
他の各種蛋白質も本発明の１種以上のホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸をホモグルタミンで置換することができる。
【０１７４】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質もホモグルタミン又は他の非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
【０１７５】
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
【０１７６】
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えばホモグルタミンを組込むために１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１種以上のホモグルタミンを挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種のホモグルタミンを組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上のホモグルタミンをコードする１個以上のセレクターコドンをもつ任意核酸も含む。
【０１７７】
ホモグルタミン酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対によるホモグルタミンのｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び誘導体化すべき蛋白質をコードするベクターを発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
【０１７８】
本発明のポリペプチドは（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合にはホモグルタミンを含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴の１つである。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【０１７９】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＵＳＳＮ６０／４７９，９３１、６０／４６３，８６９、及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；２００３年１月１６日付け特許出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ＵＳＳＮ６０／４４１，４５０）」；及び２００２年１２月２２日付け特許出願、発明の名称「蛋白質アレー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ）」、代理人整理番号Ｐ１００１ＵＳ００に記載されている。
ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
【０１８０】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分をその後、宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、ホモグルタミンは蛋白質に組込まれる。特許出願“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ”，ＷＯ２００２／０８５９２３、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚらはこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌）に導入すると、前記対はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して外部から増殖培地に添加することができるホモグルタミンのｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質（例えばミオグロビン又は治療用蛋白質）組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。ホモグルタミンを組込んだ蛋白質は治療用蛋白質として使用することもできるし、蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用、蛋白質中の電子移動プロセス等の研究を助長するために使用することもできる。
キット
【０１８１】
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１種のホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳを収容する容器を含む。１態様では、キットは更にホモグルタミン含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。キット形態の生産に適した包装材料（例えば容器等）と本発明の任意組成物、系又は装置を組み合わせることもできる。
【０１８２】
以下、実施例により本発明を例証するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。
【実施例１】
【０１８３】
古細菌ｔＲＮＡＬｙｓに由来する直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのリシルｔＲＮＡシンテターゼから直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対を作製した。古細菌ｔＲＮＡｌｙｓ配列の多重配列アラインメントの一致に由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡを使用した処、３２％アンバー抑圧がβ−ガラクトシダーゼアッセイで観察された。従って、この対は大腸菌で非天然アミノ酸を蛋白質に選択的に組込むための高度に効率的なシステムである。
【０１８４】
２０種の標準アミノ酸以外に付加アミノ酸を付加するように生物の遺伝コードを拡張するには、非天然アミノ酸を選択的に活性化し、前記アミノ酸を内在ｔＲＮＡに転移しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、前記非天然アミノ酸を受容し、内在シンテターゼにより負荷されないコグネイト直交ｔＲＮＡの最低２種類の新規遺伝子が必要である（Ｆｕｒｔｅｒ，（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９−４２６）。更に、ｔＲＮＡは非コーディングコドン（例えばナンセンス又はフレームシフトコドン）に応答してアミノ酸を輸送する。これらの条件を満足するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼとコグネイトアンバーサプレッサーｔＲＮＡの対（Ｗａｎｇら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：５０１０−５０１１；Ｗａｎｇら，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：４９８−５００）が同定されており、ケト含有アミノ酸（Ｗａｎｇら，（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：５６−６１）や光架橋性アミノ酸を含む各種非天然アミノ酸を大腸菌で効率的に高い信頼性で蛋白質に組込むために使用されている（Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：１１０２０−１１０２４；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，３：１１３５−１１３７）。遺伝的にコードすることができる非天然アミノ酸の範囲と数を拡大するには、恐らく新規直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対と前記対をコードするための新規コドンが使用されると思われる（Ｍａｇｌｉｅｒｙら，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０７：７５５−７６９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，９：２３７−２４４）。
【０１８５】
最近、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍロイシルｔＲＮＡシンテターゼとＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１に由来するコグネイト直交アンバー、オパール、及び４塩基サプレッサーｔＲＮＡから誘導される直交対を構築するために新規アプローチが採用されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９５９８−６０８）。古細菌ロイシルｔＲＮＡの多重配列アラインメントのコンセンサス配列からこれらのサプレッサーｔＲＮＡを設計することにより、効率的な直交フレームシフトサプレッサーとオパールサプレッサーが得られた。頑丈な直交サプレッサーｔＲＮＡはＣＵ（Ｘ）ＸＸＸＡＡアンチコドンループ（（Ｘ）ＸＸＸはコドンの逆相補配列である）をもち、ステム領域にミスペア塩基がなかった。本発明では古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列と古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのリシルｔＲＮＡシンテターゼに由来する効率的な直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対の合理的設計におけるこの「コンセンサスサプレッサー」ストラテジーの使用を報告する。
【０１８６】
このｔＲＮＡ／シンテターゼ対は大腸菌で直交サプレッサー対を構築するために魅力的な多数の特徴をもつ。大腸菌で使用する直交ｔＲＮＡは大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと交差反応すべきでない。原核生物と古細菌はｔＲＮＡＬｙｓ配列が類似しているが、識別塩基７３が原核生物ではＡであり、古細菌ではＧである（Ｉｂｂａら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：４１８−４２３）ため、古細菌ｔＲＮＡを大腸菌シンテターゼの基質として利用することができない。実際に、大腸菌全細胞溶解液は古細菌Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍに由来するｔＲＮＡをあまりアシル化しないことが分かった（Ｋｗｏｋ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ，（１９８０）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：２１３−２１８）。サプレッサーｔＲＮＡを構築するためには、アミノアシル化活性に悪影響を与えずにアンチコドンの配列を変化させることが考えられる。古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのリシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈＫＲＳ）によるｔＲＮＡ認識に関する研究（Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９：２５７−２６２）の結果、ｔＲＮＡの認識を損なわずにアンチコドンを改変できることが判明した。従って、アンバーナンセンスコドンＵＡＧ等のコドンのサプレッサーｔＲＮＡをこれらのｔＲＮＡから構築できると思われる。更に、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸特異性の変化を助長するために、古細菌タイプＩリシルｔＲＮＡシンテターゼＰｈＫＲＳの結晶構造は入手可能である（Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９：２５７−２６２）。
【０１８７】
ＰｈＫＲＳが大腸菌で直交性であるか否かを調べるためには、シンテターゼが大腸菌ｔＲＮＡに有意程度まで負荷しないことを立証することが有用であった。ＰｈＫＲＳの遺伝子をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、プラスミドｐＢＡＤ−Ｍｙｃ／ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、過剰発現させた。得られたＰｈＫＲＳ蛋白質を均質まで精製した。Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１又は大腸菌に由来する全ｔＲＮＡでアミノアシル化アッセイを実施した。Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１とＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉに由来するｔＲＮＡＬｙｓの配列は高度に相同である（図１）。従って、好塩菌ｔＲＮＡはＰｈＫＲＳにより容易に負荷されると予想された。実際に、ＰｈＫＲＳは２０分間に大腸菌全ｔＲＮＡの１４倍の量の好塩菌全ｔＲＮＡに負荷する（図２；１０μＭ［ｔＲＮＡ］）。ＰｈＫＲＳは大腸菌ｔＲＮＡに弱く負荷することができるが、その程度は同一濃度の大腸菌全ｔＲＮＡに対する大腸菌シンテターゼの活性の２８分の１であり、バックグラウンド負荷の７倍に過ぎない。Ｍ．ｍａｒｉｐｌａｕｄｉｓに由来する高度に相同の古細菌シンテターゼは大腸菌リシルｔＲＮＡシンテターゼを欠損するｌｙｓＳ／ｌｙｓＵ二重突然変異体を弱くしか相補することができなかった（Ｉｂｂａら，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：４１８−４２３）。従って、ＰｈＫＲＳは大腸菌ｔＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ負荷に関して内在大腸菌シンテターゼとあまり競合しないと思われる。
【０１８８】
ＰｈＫＲＳの直交性を更に特性決定するために、本発明者らはＰｈＫＲＳ遺伝子を構成的発現ベクターｐＫＱに挿入しようと試みた。このプラスミドはリボソーム結合部位と、多重クローニング部位と、構成的グルタミンプロモーターの制御下のプラスミドｐＢＡＤ−Ｍｙｃ／ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するｒｒｎＢターミネーターを含む。このプラスミドは更にＣｏｌＥ１複製起点と、プラスミド維持用カナマイシン耐性選択マーカーを含む。残念ながら、野生型ＰｈＫＲＳ遺伝子は構成的に発現させた場合に毒性であることが判明した。しかし、大腸菌で発現させた場合に低毒性を示す偶発的Ｅ４４４Ｇ突然変異体（プラスミドｐＫＱ−ＰｈＥ４４４Ｇ）が同定された。Ｅ４４４Ｇ突然変異がこのシステムで明白な毒性を軽減するメカニズムは解明されていない。１つの可能性はこの突然変異がｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察される大腸菌ｔＲＮＡの低レベルの異種間ミスチャージを防ぐと予想される。
【０１８９】
次段階はＰｈＫＲＳにより負荷することができるナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの構築であった。ＰｈＫＲＳで観察される弱いアンチコドン結合決定基はこの酵素が各種アンチコドン配列をもつｔＲＮＡを受容することを示唆している（Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９：２５７−２６２）。アンバー抑圧は大腸菌で最も十分に特性決定され且つ最も効率的な抑圧形態である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，９：２３７−２４４）ので、本発明者らはコンセンサス配列から直交古細菌アンバーサプレッサーｔＲＮＡとしてＡＫＣＵＡを構築した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９５９８−６０８）。ＧＣＧプログラムｐｉｌｅｕｐを使用して入手可能なゲノム配列に由来する全古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列の多重配列アラインメントを実施した（図１）。整列させたｔＲＮＡのコンセンサス配列を決定し、クローバーリーフ構造図を作成した（図３）。次に、サプレッサー効率を低下させることがわかっているステム領域における非カノニカル塩基対又は塩基ミスマッチについて配列を調べた（Ｈｏｕら，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：４１５７−４１６０）。ｔＲＮＡＬｙｓコンセンサス配列にこのようなミスペアは存在していなかった。ＣＵＣＵＡＡＡはアンバー抑圧に最適であることが分かっている（Ｙａｒｕｓら，（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．．１９２：２３５−２５５）ので、アンチコドンループをこの配列に置換した。設計したｔＲＮＡ配列を合成オリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｏｓｙｓ）のオーバーラップ伸長により構築し、強力な構成的ｌｐｐプロモーターの制御下にプラスミドｐＡＣＧＦＰ（Ｍａｇｌｉｅｒｙら，（２００１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０７：７５５−７６９）のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ制限部位間に挿入した。得られたプラスミドｐＡＣ−ＡＫＣＵＡは更にｐ１５Ａ複製起点とクロラムフェノコール耐性選択マーカーを含む。
【０１９０】
この潜在的直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対の抑圧効率を試験するために、ＧｅｎｅＨｏｇｓ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｐＫＱ−ＰｈＥ４４４Ｇ、ｐＡＣ−ＡＫＣＵＡ、及びｌａｃＺレポータープラスミドｐＬＡＳＣ−ｌａｃＺ（ＴＡＧ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９５９８−６０８）で同時形質転換した。このプラスミドはｐＳＣ１０１から誘導され、アンピシリン耐性選択マーカーとｌｐｐプロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子を含む。ｌａｃＺ遺伝子の許容部位である残基２５には早期終結をもたらすアンバーコドンが存在する。アンバーサプレッサーｔＲＮＡの不在下では、ｐＬＡＳＣ−ｌａｃＺ（ＴＡＧ）を含む細胞は２５位にＡＡＡ（リジン）センスコドンを含むプラスミドｐＬＡＳＣ−ｌａｃＺ（Ｌｙｓ）で観察されるβ−ガラクトシダーゼの０．１７％に過ぎす、プラスミドを含まない細胞の活性の２倍でしかない。ＡＫＣＵＡが内在大腸菌シンテターゼにより負荷できないならば、ｔＲＮＡをｐＬＡＳＣ−ｌａｃＺ（ＴＡＧ）と同時発現させた場合にアンバー抑圧は殆ど認められないと思われる。ｐＡＣ−ＡＫＣＵＡとｐＬＡＳＣ−ｌａｃＺ（ＴＡＧ）を含む細胞では（ｌａｃＺ（ｌｙｓ）の発現に対して）１．７％の抑圧しか認められない。ＰｈＫＲＳが直交ｔＲＮＡに負荷できるならば、プラスミドｐＫＱ−ＰｈＥ４４４Ｇをこのシステムに導入すると、より高レベルのアンバー抑圧が認められると思われる。実際に、３２％の抑圧が認められる。比較として、大腸菌について従来記載されている直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来チロシンシンテターゼ−ｔＲＮＡ対の抑圧効率はコグネイトシンテターゼの存在下では１８．５％であり、このシンテターゼの不在下では０．２％である。Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ由来ロイシンアンバー直交対はコグネイトシンテターゼの存在下と不在下で夫々３３．２％と１．５％の抑圧効率である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９５９８−６０８）。
【０１９１】
本実施例では、非天然アミノ酸の部位特異的大腸菌組込み用直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対として、タイプＩリシルｔＲＮＡシンテターゼと古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列の多重配列アラインメントに由来するアンバーサプレッサーｔＲＮＡを同定した。ＰｈＫＲＳ／ＡＫＣＵＡ対で認められる高い効率（３２％抑圧）は効率的直交サプレッサーｔＲＮＡを構築するためにコンセンサス配列ストラテジーが有効であることを立証するものである。
【実施例２】
【０１９２】
ＰｈＫＲＳの毒性を除去する非天然アミノ酸によるフレームシフト抑圧
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉのタイプＩリシルｔＲＮＡシンテターゼに由来する直交ｔＲＮＡシンテターゼ対が大腸菌で使用するために開発されている。このシステムのｔＲＮＡ部分は直交アンバーサプレッサーとして非常に良好に機能した。シンテターゼ−発現プラスミドｐＫＱ−ＰｈＥ４４４ＧはこのｔＲＮＡに負荷することができたが、依然として毒性効果が認められた。単独で発現させると、ｐＫＱ−ＰｈＥ４４４Ｇを含む細胞はプラスミドを含まない細胞で観察される密度の５６％まで増殖した。レポータープラスミドｐＡＣ−ＡＫＣＵＡ及びｐＡＣ−ＡＫＣＵＡも中程度の毒性を示し、７１％及び５２％まで増殖した。ｐＫＱ−ＰｈＥ４４４ＧをプラスミドｐＡＣ−ＡＫＣＵＡと同時形質転換すると、細胞密度は１７％まで低下する。更に、β−ラクタマーゼレポータープラスミドｐＡＣ−ＡＫＣＵＡ（プラスミドｐＡＣＫＯ−Ａ１８４ＴＡＧの誘導体）と同時発現させると、細胞密度は僅か５％になる。従って、このシステムではｔＲＮＡとシンテターゼの両方に毒性があることが明らかである。更に、両者プラスミドで同時形質転換した細胞は生存率が劇的に低下するという相乗効果があると思われる。この問題に対処するために、ＰｈＫＲＳの低毒性突然変異体を検討した。
【０１９３】
ＰｈＫＲＳの点又は他の突然変異は負荷活性を維持しながらシンテターゼの毒性を低下できるのではないかと予想された。従って、ｐＫＱ−ＰｈＥ４４４Ｇを化学的にコンピテントなＸＬ１赤血球（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ寒天プレートに細胞をプレーティングした。この株は形質転換プラスミドに高率の突然変異誘発を生じる数個のゲノム突然変異をもつ。約１００個のコロニーをこのプレートから掻き取り、カナマイシンを補充した液体ＬＢ培地２５ｍＬで増幅した。ｐＫＱ−ＰｈＥ４４４Ｇの非毒性突然変異体は野生型よりも迅速に増殖し、細胞の継代培養によりこれらの突然変異体が蓄積されるであろうと予想された。各段階で１００００倍の希釈倍率で２回継代培養後に細胞からミニプレップし、プラスミドｐＡＣ−ＡＫＣＵＡを含むＧｅｎｅｈｏｇ細胞に導入し、カナマイシン及びクロラムフェノコール各２５μｇ／ｍＬと各種濃度のアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレートにプレーティングした。９０％を上回る形質転換細胞が明白な毒性を示さず、１０００μｇ／ｍＬアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレート上で生存することができた。１５００μｇ／ｍＬアンピシリンでもコロニーの縮小が観察され、効率的なアンバー抑圧が示された。１個の突然変異体シンテターゼｐＫＱ−ＰｈＫｅｐを単離し、ＰｈＫＲＳオープンリーディングフレームの制限マッピングと配列決定により特性決定した。突然変異体遺伝子は残基Ｓ３５７の後に７７８ｂｐの挿入配列を含むが、それ以外はプラスミドｐＫＱ−ＰｈＥ４４４Ｇと同一配列である。ＢＬＡＳＴ検索によると、この挿入配列はプラスミドｐ１６５８／９７に由来する「ｉｎｓＡｃｐ１」と注釈された配列と相同であるが、文献にこの配列の他の言及は認められず、この配列の起源は不明である。ＰｈＫＲＳの開始コドンから翻訳される場合に、この遺伝子の推定産物はＳ３５７の下流の６アミノ酸が短縮している。ＰｈＫＲＳの短縮が毒性の除去に関与しているか否かを試験するために、配列５’−ＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣ−３’をもつプライマーＣＡ５１０Ｒを合成し、プラスミドｐＫＱで短縮突然変異体を明示的に構築した。ＣＡ２７９とＣＡ５１０Ｒを使用してプラスミドｐＫＱ−ＰｈＫｅｐをＰＣＲ増幅し、産物をプラスミドｐＫＱのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＫＱ−ＰｈΔＡＤ（ｐＫＱ−Ｐｈ５１０とも言う）をプラスミドｐＡＣ−ＡＫＣＵＡと同時形質転換した処、得られた形質転換体はｐＫＱ−ＰｈＫｅｐで形質転換した細胞と同等のＩＣ５０をもち、明白な毒性をもたないことが判明した。
【０１９４】
残基Ｓ３５７後の短縮はＰｈＫＲＳのアンチコドン結合ドメインを欠失させると思われるので、本発明者らはこの欠失がシンテターゼのｔＲＮＡ認識特性にどのように影響するかを検討したいと思った。そこで、シンテターゼを過剰発現させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイを実施した。ＣＡ２７９とＣＡ５１１（５’−ＣＡＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＡＧＣＡＴＣＡＣ−３’）を使用してｐＫＱ−ＰｈＫｅｐから遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＢＡＤ−Ｍｙｃ／ＨｉｓＡのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位にＣ末端Ｍｙｃ／Ｈｉｓタグとインフレームでサブクローニングした。蛋白質をＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製した。
【実施例３】
【０１９５】
４塩基コドンと非天然アミノ酸による遺伝コードの拡張
少数の例外を除き、全公知生物の遺伝コードは同一の２０種の標準アミノ酸をコードするが、ユニークｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対、アミノ酸源、及びアミノ酸に特異的なユニークセレクターコドンさえあれば新規構成単位を付加することができる（Ｗａｎｇら，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）。先に、本発明者らは夫々大腸菌（Ｗａｎｇら，（２００３）Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｅｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００：５６−６１；Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４−８；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１０２０−１１０２４；Ｍｅｈｌら（２００３）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａ  ２１  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：９３５−９）と酵母（Ｃｈｉｎら（２００３）Ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７）において新規特性をもつ各種アミノ酸を遺伝的にコードするためにアンバーナンセンスコドンＴＡＧを直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ及び大腸菌ｔＲＮＡ／シンテターゼ対と併用できることを示している。しかし、非コーディング三重項コドンの数は限られているため、任意生物によりコードされるアミノ酸の最終的な数は著しく制限される。本発明では、４塩基コドンＡＧＧＡに応答してアミノ酸ホモグルタミン（ｈＧｌｎ）をミオグロビンに効率的且つ選択的に組込む古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列に由来する新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製について報告する。ｈＧｌｎによるフレームシフト抑圧は蛋白質収率又は細胞増殖速度にさほど影響せず、ＴＡＧの抑圧と相互に直交性であることが判明した。本発明では利用可能な三重項コドンの数も翻訳機構自体もコードの更なる拡張の有意障害とならないことを示唆する。
【０１９６】
天然に存在する＋１フレームシフトサプレッサーには多数の例があり、グルタミンをコードするＳｕ７に由来するＵＡＧＮ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ又はＴ）サプレッサー（Ｃｕｒｒａｎ  ａｎｄ  Ｙａｒｕｓ（１９８７）Ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  ｌｏｏｐ  ｓｔａｃｋｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５４５−５０）、スレオニンをコードするＡＣＣＮのｓｕｆＪ由来サプレッサー（Ｂｏｓｓｉ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈ（１９８１）Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ＡＣＣＡ，ＡＣＣＵ  ａｎｄ  ＡＣＣＣ  ａｒｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｕｆＪ．Ｃｅｌｌ  ２５：４８９−９６）及びｔＲＮＡＬｙｓとｔＲＮＡＧｌｎに由来するＣＡＡＡサプレッサー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（２００２）Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  ｌｏｏｐ  ｏｆ  ｔＲＮＡ（１）（Ｇｌｎ）（ｓｕｆＧ）ａｎｄ  ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）ｐｒｏｍｏｔｅ  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ  ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ＣＡＡＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：１９８５−１９９０）か挙げられる。更に、遺伝的選択を使用して突然変異体ｔＲＮＡの大きなライブラリーから大腸菌ｔＲＮＡＳｅｒＵＣＣＵサプレッサー等の効率的な４塩基及び５塩基コドンサプレッサーｔＲＮＡが同定されている（Ｍａｇｌｉｅｒｙら，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ“ｓｈｉｆｔｙ”ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  ｃｏｄｏｓａ  ａｎｄ  ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  ｓｉｚｅ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９：２３７−２４４；Ｈｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４２：７９−８０；Ｈｏｈｓａｋａら，（２００１）Ｆｉｖｅ−ｂａｓｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：３６４６−５１；Ｈｏｈｓａｋａ  ａｎｄ  Ｓｉｓｉｄｏ（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：８０９−１５）。
【０１９７】
非天然アミノ酸を四重項コドンでｉｎ  ｖｉｖｏコードするためには、このコドンを固有に認識するｔＲＮＡとこのｔＲＮＡのみを該当非天然アミノ酸で固有にアミノアシル化する対応するシンテターゼを作製する必要がある。従来作製されている直交Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアンバーサプレッサーｔＲＮＡのアンチコドンループはコグネイトシンテターゼＪＹＲＳの主要認識成分であるので、４塩基コドンをデコードするようにこのｔＲＮＡを操作することは困難であった。ＪＹＲＳのアンチコドン結合特異性を緩和することは可能であると思われるが、アンチコドン配列のみを使用してアンバーサプレッサーと４塩基サプレッサーを区別する相互に直交性の対を構築することは困難であると思われる。従って、異なる起源の２種の直交対を使用すれば２種の非天然アミノ酸をポリペプチドに同時に組込むことができるシステムが得られる可能性が高いが、新規直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の開発が必要である。
【０１９８】
古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＰｈＫＲＳ）のリシルシンテターゼ／ｔＲＮＡ対は、１）原核生物のＡ７３と古細菌のＧ７３の保存により直交性であると思われ（Ｉｂｂａら，（１９９９）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：４１８−４２３）、２）ＰｈＫＰＳはｔＲＮＡアンチコドンループ置換の耐性株であるため、サプレッサーｔＲＮＡに負荷することができ（Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９：２５７−２６２）、３）アミノ酸特異性の変化を助長するために、ＰｈＫＲＳの結晶構造は入手可能である（Ｔｅｒａｄａら，（２００２）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏｐｏｌｏｇｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，９：２５７−２６２）ので、本発明者らは候補直交対としてまずこの対に注目した。残念ながら、ＰｈＫＲＳは構成的に発現させた場合に毒性であることが判明した。しかし、突然変異誘発株ＸＬ１−ｒｅｄで継代培養した処、ｉｎｓＡｃｐ１と注釈されている７７８ｂｐ挿入エレメントにより残基Ｓ３５７の下流の６アミノ酸が短縮している非毒性変異体ＰｈΔＡＤが単離された。従って、アンチコドンループ結合ドメインが欠失しており、アンチコドンループ置換に起因すると思われる活性低下が更に最小になる。
【０１９９】
実施例１に詳細に記載したように、この短縮突然変異体が大腸菌で機能的且つ直交性であるか否かを調べるためには、シンテターゼがコグネイト古細菌ｔＲＮＡに対する活性を維持しながら大腸菌ｔＲＮＡに有意程度まで負荷できないことを立証することが有用であった。ＰｈΔＡＤとＥｃＫＲＳの遺伝子をクローニングし、過剰発現させ、蛋白質を均質まで精製した。古細菌、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１又は大腸菌に由来する全ｔＲＮＡのアミノアシル化をアッセイした。ＰｈΔＡＤは２０分間に大腸菌全ｔＲＮＡよりも多量の好塩菌全ｔＲＮＡに負荷する（図２；１０μＭ［ｔＲＮＡ］）。ＰｈΔＡＤは大腸菌ｔＲＮＡに弱く負荷することができるが、その程度は同一濃度の大腸菌全ｔＲＮＡに対する大腸菌シンテターゼの活性の２８分の１であり、バックグラウンド負荷の７倍に過ぎない。更に、ＰｈΔＡＤは大腸菌リシルｔＲＮＡシンテターゼを欠損するｌｙｓＳ／ｌｙｓＵ二重突然変異体であるＰＡＬΔＳΔＵＴＲ（ｐＭＡＫｌｙｓＵ）株（Ｃｈｅｎら，（１９９４）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：２６９９−７０５）を４３℃で相補することができなかった。しかし、（大腸菌株ＨＢ１０１のｌｙｓＵ遺伝子座からクローニングした）ＥｃＫＲＳは正常増殖を生じた。従って、ＰｈΔＡＤはＥｃＫＲＳに置換することができず、大腸菌ｔＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ負荷に関して内在大腸菌シンテターゼとあまり競合しないと思われる。
【０２００】
ＰｈΔＡＤが大腸菌で機能的であることを立証するために、本発明者らは直交アンバーサプレッサーｔＲＮＡによるβ−ラクタマーゼ抑圧アッセイをＰｈΔＡＤに実施した。このアプローチでは、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ直交対に従来開発されている選択スキームを使用することもできた。最近発表されたコンセンサス−サプレッサーストラテジー（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００３）Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ａｒｃｈａｅａｌ  Ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｐａｉｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ，Ａｍｂｅｒ，ａｎｄ  Ｏｐａｌ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：９５９８−６０８）を使用してサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡ（ＡＫＣＵＡ）を設計した。入手可能なゲノム配列に由来する全古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列の多重配列アラインメントを実施し、コンセンサス配列を決定した。アンチコドンループ配列をＣＵＣＵＡＡＡに置換し、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを得た（図１）。ＡＫＣＵＡの遺伝子を合成し、プラスミドｐＡＣＫＯ−Ａ１８４ＴＡＧ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００３）Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ａｒｃｈａｅａｌ  Ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｐａｉｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ，Ａｍｂｅｒ，ａｎｄ  Ｏｐａｌ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：９５９８−６０８）に挿入し、アンバー抑圧効率を試験した。このプラスミドは許容部位Ａ１８４にＴＡＧコドンをもつβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）の遺伝子を含む。ｔＲＮＡの不在下では、翻訳により観測可能な全長β−ラクタマーゼは得られず、５μｇ／ｍＬアンピシリンに感受性であった。ＡＫＣＵＡと同時発現させた場合にはアンピシリン耐性の増加は認められず、ｔＲＮＡは大腸菌シンテターゼにより負荷されないことが示唆された。ＰｈΔＡＤと同時発現させた場合には直交ｔＲＮＡは負荷され、効率的なアンバー抑圧と１０００μｇ／ｍＬアンピシリンに対する耐性が得られた。従って、ＰｈΔＡＤ／ＡＫＣＵＡ直交対は効率的な直交アンバー抑圧システムである。
【０２０１】
４塩基コドンＡＧＧＡを大腸菌ｔＲＮＡＳｅｒＵＣＣＵにより効率的に抑圧できることは従来示されている。この場合には、４塩基コドンの抑圧はサプレッサーｔＲＮＡの効率と毒性低下に関与すると思われるレアコドンＡＧＧと競合性である。アンチコドンループをＣＵＵＣＣＵＡＡに置換することによりＡＫＣＵＡからＡＧＧＡサプレッサーｔＲＮＡを設計し、プラスミドｐＡＣＫＯ−Ａ１８４ＡＧＧＡに挿入した。ｐＡＣＫＯ−Ａ１８４ＴＡＧと同様に、このプラスミドはＡ１８４位にＡＧＧＡコドンを含むため、翻訳できず、５μｇ／ｍＬアンピシリンにしか耐性でなくなる。残念ながら、このｔＲＮＡは大腸菌シンテターゼに直交性ではなくなる。設計したｔＲＮＡを含む細胞はＰｈΔＡＤの有無に拘わらず２００μｇ／ｍＬアンピシリンまで生存する。
【０２０２】
直交変異体を同定するために、本発明者らは１−４及び６９−７２位の受容体ステムの最後の４塩基対を同時にランダム化したライブラリーを構築した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００３）Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ａｒｃｈａｅａｌ  Ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｐａｉｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ，Ａｍｂｅｒ，ａｎｄ  Ｏｐａｌ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：９５９８−６０８）。これらのｔＲＮＡをＰｈΔＡＤと同時発現させ、細胞を２００μｇ／ｍＬのアンピシリン選択２ラウンドにかけ、活性ＡＧＧＡサプレッサーｔＲＮＡのプールを得た。直交変異体を同定するために、ｔＲＮＡプラスミドを単離し、３８４個の各個クローンをＰｈΔＡＤの不在下にアンピシリン感受性についてスクリーニングした。これらのうちで最も効率的な直交クローンはＰｈΔＡＤの存在下に７００μｇ／ｍＬアンピシリンに耐性であるが、その不在下では５μｇ／ｍＬまでしか生存しない。このｔＲＮＡ，ＡＫＵＣＣＵは多重受容体ステム置換と重要性が不明な偶発的Ａ３７Ｃ突然変異を含む（図５）。
【０２０３】
ＡＧＧＡに応答してホモグルタミンを組込むためには、次にＰｈΔＡＤの特異性を改変することが有用であった。ホモグルタミンはリジンと同等寸法であり、水素結合供与性と受容性の両者をもつので、改変シンテターゼの忠実度を試験するための初期ターゲットとして選択した。ＰｈＫＲＳ結晶構造の試験によると、リジンのε−アミノ基を特異的に認識する残基はＥ４１とＹ２６８の２種類だけである。ＰｈΔＡＤに由来する小活性部位ライブラリーの構築で飽和突然変異誘発によりこれらの残基を同時にランダム化した。ｈＧｌｎ特異的シンテターゼをスクリーニングするために、本発明者らはＡＫＣＵＡの遺伝子と、Ｍ１及びＱ１０７位に２個のＴＡＧコドンをもつＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子と、Ｔ７プロモーターの制御下のＧＦＰｕｖをコードするＧＦＰレポータープラスミドｐＲＥＰ２−ＡＫＣＵＡ（Ｓａｎｔｏｒｏら，（２００２）Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１０４４−８）を使用した。ｐＲＥＰ２−ＡＫＣＵＡとＰｈΔＡＤで同時形質転換すると、Ｔ７ＲＮＡＰのアンバーコドンは抑圧され、その結果、ＧＦＰｕｖ発現と緑色蛍光が生じる。シンテターゼの不在下では細胞は白色である。従って、蛍光を観察することにより活性シンテターゼを含む細胞を同定することができる。細胞をｐＲＥＰ２−ＡＫＣＵＡで同時形質転換した後にｈＧｌｎを含むプレートにライブラリーを播種した。個々の緑色コロニーを単離し、非天然アミノ酸の存在下と不在下に増殖させ、蛍光にｈＧｌｎを必要とするクローンを同定した。スクリーニングした１５個のコロニーのうち５個がｈＧｌｎを含むプレートで高い蛍光を示した。これらのうちで１個を除く全てがＹ２６８Ｓ置換を保存しており、これらのシンテターゼのうちで最も選択的なｈＧｌｎＲＳはＩ４１とＳ２６８をもっており、更に特性決定した。５個のコロニーに対応する５種の突然変異体はＰｈΔＡＤに比較して以下の配列置換があった。
【表２】
2011101656.tif 000006
【０２０４】
次に直交ｈＧｌｎＲＳ／ＡＫＴＣＣＴ対を使用してＧｌｙ２４→ＡＧＧＡ突然変異をもつミオグロビン蛋白質を発現させ、観察されるｈＧｌｎ依存性表現型が非天然アミノ酸の特異的組込みに起因するか否かを調べた。ｈＧｌｎＲＳの不在下に突然変異体ミオグロビン遺伝子を発現させた場合には、検出可能な蛋白質は生産されなかった。ｈＧｌｎＲＳと同時発現させた場合には、ミオグロビン１．８ｍｇ／ｍＬが単離された。比較として、野生型ミオグロビン遺伝子を含むプラスミドｐＢＡＤ−ＪＹＡＭＢを発現させた場合には、ミオグロビン３．８ｍｇ／ｍＬが生産された。精製蛋白質のトリプシンフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果、推定質量１６７６．８８Ｄａに一致する質量１６７６．８５Ｄａのペプチドであることが判明した。２４位にリジン又はグルタミンを含むペプチドの徴候は全く認められなかった。更に、ＡＧＧＡに応答するｈＧｌｎ組込み中に毒性は殆ど認められなかった。アラビノース誘導の不在下のミオグロビン発現に使用した条件下における対数増殖中期に、ＧｅｎｅＨｏｇｓ細胞の倍加時間はｈＧｌｎを含む細胞の２倍である。増殖速度のこの低下はｈＧｌｎの存在下と不在下の両者で認められ、低毒性はＡＧＧＡ抑圧よりもシンテターゼとｔＲＮＡの発現の結果であることが示唆された。従って、ＡＧＧＡサプレッサーとレアＡＧＧコドンの交差反応性はフレームシフト抑圧の実用化を制限しない。
【０２０５】
ｈＧｌｎ残基を組込むためのＡＧＧＡ抑圧によるミオグロビンの発現を図７Ａに示す。同図は抗Ｈｉｓ  Ｃ末端抗体でプローブしたウェスタンブロットを示す。ＡＫ５１４  ｔＲＮＡ、ｈＧｌｎＲＳ（ＰｈＫＲＳＡのｈＧｌｎ特異的変異体）及びｈＧｌｎ（レーン２−５）の全３成分の存在下のみにＧ２４位にＡＧＧＡコドンをもつミオグロビン遺伝子（Ｍｙｏ２４ＡＧＧＡ）から蛋白質が生産された。７５位のアンバー抑圧によるミオグロビン（Ｍｙｏ７５ＴＡＧ）の発現はＪＹＲＳとそのコグネイトアンバーｔＲＮＡの存在下のみに可能であり、リシルとチロシルの対の相互直交性が立証された（レーン６−９）。
【０２０６】
本発明者らは単一ポリペプチドでＴＡＧ及びＡＧＧＡの同時抑圧にＰｈΔＡＤ／ＡＫＵＣＣＵ対とＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシンシンテターゼ（ＪＹＲＳ）を併用する可能性を更に検討した。プラスミドｐＢＫ−ＪＹＲＳでＪＹＲＳと同時発現させた場合には、ｐＭｙｏ−ＡＫＵＣＣＵは検出可能なミオグロビンを生じなかった。従って、ＪＹＲＳはＡＫＵＣＣＵに負荷することができない。逆に、本発明者らはＰｈΔＡＤで負荷することによりプラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧからミオグロビンを発現させようと試みた。この発現プラスミドは４位にＴＡＧコドンをもつミオグロビン遺伝子と直交ｔＲＮＡＴｙｒであるＪ１７を含む。（Ｍｅｈｌら（２００３）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ａ  ２１  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：９３５−９）。ＪＹＲＳと同時発現させると、３．８ｍｇ／ｍＬのミオグロビンが生産され、ＰｈΔＡＤの存在下では蛋白質は観察されない。従って、ＰｈΔＡＤはＪ１７に負荷することができない。従って、これらのシンテターゼ／ｔＲＮＡ対は相互に直交性であり、交差反応せずに併用することができる。
【０２０７】
２種の非天然アミノ酸をミオグロビンに組込むために、Ｇｌｙ２４→ＡＧＧＡとＡｌａ７５→ＴＡＧをもつ突然変異体ミオグロビンを発現する単一プラスミドでＡＫＵＣＣＵとＪ１７を併用した。第２のプラスミドではＪＹＲＳに由来するＯ−メチル−Ｌ−チロシン特異的シンテターゼ（ＯＭｅＹＲＳ）（Ｃｈｉｎら，（２００２）Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１０２０−１１０２４）とｈＧｌｎＲＳを併用した。両方のプラスミドで同時形質転換した細胞を両者アミノ酸の存在下に増殖させた処、１．７ｍｇ／Ｌのミオグロビンが生産された。２種の非天然アミノ酸又はシンテターゼのいずれかを取り除くと、蛋白質は全く生産されなかった。
【０２０８】
ミオグロビンモデルシステムを使用して２種の異なる非天然アミノ酸を組込むための２種の直交ｔＲＮＡシステムの同時使用を図７Ｂに示す。同図は抗Ｈｉｓ  Ｃ末端抗体でプローブしたウェスタンブロットを示す。リシルとチロシルの直交対の存在下に２４位にＡＧＧＡコドンと７５位にＴＡＧコドンをもつミオグロビン遺伝子（Ｍｙｏ２４ＡＧＧＡ／７５ＴＡＧ）から蛋白質を発現させた。ｈＧｌｎＲＳとＯＭｅＴｙｒＲＳを使用することにより、単一ポリペプチドで２４位のＡＧＧＡ抑圧によりｈＧｌｎを組込み、７５位のアンバー抑圧によりＯ−メチルチロシン（ＯＭｅＴｙｒ）を組込んだ。同図に示すように、両者アミノ酸が存在する場合のみ、更に両者リシル及びチロシル直交システムが存在する場合のみにポリペプチドが生産される。
【０２０９】
図７Ａ及び７Ｂのウェスタンブロットで観察された結果は図８及び９に示す分析で更に確認される。図８は野生型ミオグロビン（ＭｙｏＷＴ；２４位にリシンを含むと推定される）と図７Ａで生産された突然変異体ミオグロビン（２４ＡＧＧＡ；ｈＧｌｎを含むと推定される）のトリプシンフラグメントのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間分析を示す。これらのミオグロビン種の分析を夫々上段と下段に示す。精製蛋白質のトリプシンペプチドフラグメントの分析の結果、推定質量１６７６．８８Ｄａに一致する質量１６７６．８５Ｄａのペプチドであることが判明した。２４位にリジン（トリプシン消化ペプチドでＰｈＫＲＳＡの存在下に発現させた蛋白質からの実測質量９５０．４６Ｄａ及び全長ペプチドの計算質量９５０．５３又は１，６６１．９１Ｄａ）又はグルタミン（計算質量１６６１．８７Ｄａ）を含むペプチドの徴候は全く認められなかった。
【０２１０】
図９は（図７Ｂで生産された）全長二重突然変異体のエレクトロスプレーＭＳ分析を示す。ＭＳ分析によると、Ｇ２４Ｋ及びＡ７５Ｙ置換をもつミオグロビンの計算質量１８，５１８．３Ｄａに比較して両者非天然アミノ酸を含むミオグロビンの質量は推定質量１８，５４６．６０（ＳＤ  ０．８１）に一致する１８，５４６．４０Ｄａ（ＳＤ  ０．１１）であることが判明した。
【０２１１】
要約すると、本発明者らは非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ部位特異的組込みのためのフレームシフト抑圧の使用を立証した。更に、本発明者らはこのＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉに由来するリシルｔＲＮＡシンテターゼとＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼに由来する直交対の相互直交性を立証し、２種の非天然アミノ酸を単一ポリペプチドに同時に組込むことができることを示した。相互に直交性の反応手又はフルオロフォアアミノ酸の組込みを可能にするシンテターゼ変異体を同定することが可能であると思われる。このような材料を使用すると、フルオロフォア対をＦＲＥＴ試験のためにポリペプチドにｉｎ  ｖｉｖｏ組込むことが可能である。同様に、非天然ポリマーのリボソーム生産のためにα−ヒドロキシ酸等のアミノ酸以外の部分を組込むことも可能である。大腸菌で効率的に抑圧されるＣＣＣＵ又はＣＵＡＧ等の付加コドンを使用することができる。あるいは、限定的コドン縮重により大腸菌のゲノムを再合成することにより、４３個までのコドンを再コーディングに利用可能にすることができる。
材料と方法
【０２１２】
シンテターゼ遺伝子のクローニングと発現：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手したＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ＡＴＣＣ；＃７００８６０）からゲノムＤＮＡを作製した。ＰｈＫＲＳをＰＣＲ増幅し、過剰発現用としてプラスミドｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。構成的発現には、シンテターゼ遺伝子をグルタミンプロモーターの制御下にｐＧＬＮとｐＫＱ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００３）Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ａｒｃｈａｅａｌ  Ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｐａｉｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ，Ａｍｂｅｒ，ａｎｄ  Ｏｐａｌ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：９５９８−６０８）にクローニングした。ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡに由来するこれらのプラスミドは夫々アンピシリン耐性とカナマイシン耐性を付与する。同様に、ＥｃＫＲＳを大腸菌株ＨＢ  １０１のｌｙｓＵ遺伝子座からクローニングした。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔキットについて記載されているプロトコールにより２ＹＴ培地で蛋白質を過剰発現させた後に１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；及び１０％グリセロールで透析した。
【０２１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイ：大腸菌全ｔＲＮＡはＲｏｃｈｅから購入し、好塩菌ｔＲＮＡはＲＮＡ／ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１（ＡＴＣＣ；＃７００９２２）から抽出した。アッセイは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、３０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭグルタチオン、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μＭ  ［３Ｈ］リジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、７５０ｎＭシンテターゼ、及び０、２、１０、又は４０μＭ全ｔＲＮＡを含有する反応液２０μＬ中にて３７℃で２０分間実施した。
【０２１４】
相補分析：ＰｈΔＡＤ、ＥｃＫＲＳを発現させるため、又はシンテターゼを発現させないようにＰＡＬΔＳΔＵＴＲ（ｐＭＡＫｌｙｓＵ）細胞をｐＧＬＮ誘導体で形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレートにて３０℃でレスキューした。ＰＡＬΔＳΔＵＴＲ株のシンテターゼ欠損増殖不良の４３℃相補は抗体を加えないＬＢ寒天プレート又は液体培地で実施した。ＧｅｎｅＨｏｇｓの増殖を陽性対照として使用してシンテターゼ発現からの毒性効果の可能性を排除した。液体培地では、飽和培養液を新鮮な培地で１００００倍に希釈し、６００ｎｍで８時間増殖をモニターした。
【０２１５】
ライブラリー構築：合成オリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｏｓｙｓ）のオーバーラップ伸長によりｔＲＮＡの遺伝子を構築し、ｐＡＣＫＯ−Ａ１８４ＴＡＧ又はｐＡＣＫＯ−Ａ１８４ＡＧＧＡのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位にサブクローニングした。ｐＡＣＹＣ１８４に由来するこれらのレポータープラスミドはｐ１５Ａ複製起点と、クロラムフェノコール耐性遺伝子と、ｔＲＮＡ遺伝子の発現を制御する強力な構成的プロモーターを含む。ＰｈΔＡＤに由来するライブラリーはプラスミドｐＫＱでＥＩＰＣＲにより構築した（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，Ｓ．Ｋ．（１９９２）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ：ａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｓｉｎｇｌｅ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：２１４−２０）。プレミックスしたホスホロアミダイトをライブラリー構築のためのオリゴヌクレオチド合成中に使用した。ライブラリーダイバーシティは理論ダイバーシティの９００倍であり、配列に偏りのないことが配列決定により示された。
【０２１６】
抑圧効率の測定：２５μｇ／ｍＬカナマイシン及びクロラムフェノコールと５〜１０００μｇ／ｍＬの各種濃度のアンピシリンを補充したＬＢ寒天培地にプレーティングすることにより抑圧効率を測定した。プレート当たり細胞１００個未満の濃度で細胞をプレーティングした。２番目に高い濃度と２番目に低い濃度が報告値の２０％以内となるような一連のプレートのうちでコロニーを形成するために細胞が生存した最高濃度として効率を報告した。
【０２１７】
ｈＧｌｎを含むミオグロビンの発現と特性決定：単一部位組込み実験用として、ｐ１５Ａ複製起点と、クロラムフェノコールアセチルトランスフェラーゼ、ＡＫＵＣＣＵ、及びマッコウクジラミオグロビンの遺伝子を使用してｐＭｙｏ−ＡＫＵＣＣＵを構築した。ミオグロビン遺伝子はアラビノースプロモーターの制御下におき、Ｇ２４位にＡＧＧＡコドンを含む。２部位組込み用として、ｐＭｙｏ−ＡＫＵＣＣＵでミオグロビン遺伝子のＡ７４位にＴＡＧコドンを導入することにより別のプラスミドを構築した。直交ｔＲＮＡＴｙｒであるＪ１７を第２のｌｐｐプロモーターの制御下に加えた。シンテターゼｈＧｌｎＲＳ及びＡｚＰｈｅＲＳをプラスミドｐＫＱから独立グルタミンプロモーター下に発現させた。リジンを除く１９種のアミノ酸各０．４ｍｇ／ｍｌ、ビタミン及び１ｍｇ／ｍｌ  ｈＧｌｎ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＧＭＭＬ培地で適当なシンテターゼとミオグロビンの発現プラスミドを含むＧｅｎｅＨｏｇｓ細胞を３７℃でＯＤ６００＝０．７まで増殖させ、０．０２％アラビノースで誘導した後、飽和まで増殖させた。細胞を音波処理により溶解させ、ミオグロビンをＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔキットで精製した。ＴＳＲＩ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＦａｃｉｌｉｔｙでトリプシンフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を実施した。
【実施例４】
【０２１８】
代表的リシルＯ−ＲＳ及びリシルＯ−ｔＲＮＡ
代表的Ｏ−ｔＲＮＡを実施例及び／又は表１に示す。代表的Ｏ−ＲＳも実施例及び／又は表１に示す。Ｏ−ＲＳをコードする代表的ポリヌクレオチド又はその一部は実施例及び／又は表１に示すものが挙げられる。
【０２１９】
本発明の更に詳細、特に実験の詳細については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ，“Ｐａｔｈｗａｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ［２００３］を参照されたい。
【０２２０】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０２２１】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列の配列アラインメントを示す。Ｐａ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ；Ｐｆ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ；Ｐｈ，Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ；Ｐｙａ，Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ；Ｔａ，Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ；Ｔｖ，Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｕｍ；Ａｆ，Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ；Ｈｈ，Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＮＲＣ−１；Ｍｊ，Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ；Ｍｔ，Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ；Ｍｍ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ；Ｓｔ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ；Ｓｓ，Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ；Ａｐ，Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘに由来するゲノム配列をＧＣＧプログラムｐｉｌｅｕｐで整列させ、プログラムｐｒｅｔｔｙｂｏｘで表示した。
【図２】図２Ａ及びＢは異種間ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化を示すヒストグラムである。ＥｃＫＲＳ（□）、ＰｈＫＲＳ（■）、又はシンテターゼなし（▲）による（Ａ）大腸菌全ｔＲＮＡ、又は（Ｂ）好塩菌全ｔＲＮＡのアミノアシル化を示す。アッセイは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５，３０ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３ｍＭグルタチオン，０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ，１０ｍＭ  ＡＴＰ，１μＭ［３Ｈ］リジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ），７５０ｎＭシンテターゼ，及び０、２、１０、又は４０μＭ全ｔＲＮＡを含有する反応液２０μＬ中にて３７℃で２０分間実施した。
【図３】コンセンサス由来アンバーサプレッサーｔＲＮＡを模式的に示す。古細菌ｔＲＮＡＬｙｓ配列ファミリーのコンセンサスをクローバーリーフ構造で示す。アンチコドンループをコンセンサスからＣＵＣＵＡＡＡに置換し、ＡＫＣＵＡを作製した。
【図４】直交シンテターゼ−ｔＲＮＡ対のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示すヒストグラムである。指定プラスミドで形質転換させるか又はプラスミドを導入しないＧｅｎｅＨｏｇｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）についてβ−ガラクトシダーゼ活性を４回ずつ測定した。ＰｈＫＲＳのＥ４４４Ｇ突然変異体はプラスミドｐＫＱから発現させた。シンテターゼを含まないサンプルにもプラスミドｐＫＱを使用した。ＡＫＣＵＡはプラスミドｐＡＣＧＦＰから発現させ、ｔＲＮＡを含まないサンプルにもｐＡＣＧＦＰを使用した。ｌａｃＺレポーター遺伝子はプラスミドｐＬＡＳＣ−ｌａｃＺに由来するものとした。適当な抗生物質を加えた２ＹＴ培地で細胞をＯＤ６００＝０．５まで増殖させた後、Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｉｌｌｅｒ，（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ）の方法によりアッセイした。
【図５】アンバー及び４塩基サプレッサーｔＲＮＡの構築を示す。多数のｔＲＮＡｌｙｓ配列の多重配列アラインメントからアンバーサプレッサーｔＲＮＡを構築した。直交ＡＧＧＡサプレッサーｔＲＮＡを受容体ステムライブラリーからの選択により同定した。
【図６】図６ＡはＰｈＫＲＳ活性部位の構造を示す。残基Ｅ４１及びＹ２６８はリジン基質と特異的に接触する。これらの残基を活性部位ライブラリーの構築のために同時にランダム化した。図６Ｂは各種アミノ酸の構造を示す。
【図７】図７Ａ及び７ＢはＡＧＧＡ抑圧によるミオグロビン発現を示す化学蛍光写真である。図７ＡではＧ２４位にＡＧＧＡコドンをもつミオグロビン遺伝子をＡＫＵＣＣＵｔＲＮＡとＰｈΔＡＤ、ｈＧｌｎ特異的変異体、又はＪＹＲＳの存在下に発現させた。同様に、ＰｈΔＡＤ又はＪＹＲＳを使用してＳ４位のアンバー抑圧によるミオグロビンの発現を試みた。図７Ｂでは、単一ポリペプチドで２４位のＡＧＧＡ抑圧によりｈＧｌｎを組込み、７５位のアンバー抑圧によりＡｚＰｈｅを組込んだ。
【図８】ホモグルタミン又はリジンを含むトリプシンフラグメントのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
【図９】２４位にホモグルタミンを含み、７５位にＯ−メチルチロシンを含む全長ミオグロビンのエレクトロスプレーＭＳ分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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