(57)【要約】【課題】点眼送達系を有する２種類の組成物を、安定化剤として角膜矯正術中または術後に使用し、角膜の元の内部湾曲へと戻る角膜組織の弛緩を防止または遅延する。【解決手段】第一の安定化剤は、断続した３本鎖らせんを有し、角膜コラーゲン原繊維と相互作用してコラーゲン繊維を互いに付着させる橋を形成する作用をもつ原線維結合型コラーゲン組成物（ＦＡＣＩＴ）および／または小ロイシン−富化リピートプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）を含み、角膜組織を安定化させ、変化した角膜形状を維持するために使用する安定化剤である。第二の安定化剤は、トランスグルタミナーゼ（第XIII因子）などの、組織、血漿、または表皮の正常成分として見出される酵素を含み、角膜組織を安定化させ、変化した角膜形状を維持するために使用する安定化剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜コラーゲン原繊維と相互作用してコラーゲン繊維を互いに付着させる橋を形成する作用をもつ下記ａ，ｂの少なくとも１つを含み、角膜組織を安定化させ、変化した角膜形状を維持するために使用する、安定化剤。
ａ．断続した三本鎖らせんを有する原線維結合型コラーゲン（ＦＡＣＩＴ）
ｂ．小ロイシン−富化リピートプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）
【請求項２】
前記ａのＦＡＣＩＴがＶＩ型コラーゲンである、請求項１記載の安定化剤。
【請求項３】
前記ｂのＳＬＲＰが硫酸ケラタンである、請求項１記載の安定化剤。
【請求項４】
前記ａのＦＡＣＩＴおよび前記ｂのＳＬＲＰは、ｐＨ６．８〜７．６の溶液に溶解させて緩衝化されている、請求項１記載の安定化剤。
【請求項５】
前記ａのＦＡＣＩＴおよび前記ｂのＳＬＲＰの濃度が４０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲内である、請求項４記載の安定化剤。
【請求項６】
触媒としてカルシウムを加えて投与するトランスグルタミナーゼ（第XIII因子）の溶液を含み、角膜組織を安定化させ、変化した角膜形状を維持するために使用する、安定化剤。
【請求項７】
前記溶液がｐＨ６．８〜７．６である、請求項６記載の安定化剤。
【請求項８】
角膜矯正レンズにより形状を矯正した角膜に使用する、請求項１〜７のいずれかに記載の安定化剤。
【請求項９】
未軟化角膜組織を新しい角膜形状へ矯正するように設計された角膜矯正レンズと、
請求項１〜７のいずれかに記載の安定化剤と、
を含んで構成された角膜矯正キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜矯正術の手順から得られた角膜湾曲の維持に適した化学組成物、および、化学組成物を製造する方法、および、角膜矯正療法を受けた後に角膜の湾曲を維持するために角膜に該化学組成物を適用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト角膜の構造および組成：角膜は、眼の光学系の中で最初のそして最も強力な屈折表面である。網膜受容体での鮮明な画像の生成には、角膜が透明であり、適切な屈折力を有することが必要である。角膜の屈折力は、主に２つの因子、すなわちその湾曲およびその屈折率に依存する。角膜が歪んだり、もしくは眼軸の長さが長すぎたり短すぎたりする場合、または眼のレンズが異常に機能している場合、近視、乱視、遠視等の種々の視覚に関連した問題が生じ得る。眼鏡またはコンタクトレンズは、この問題の修正に必要である。眼鏡は、光が角膜に到達する前に光をレンズで屈折させ、光が角膜に侵入する角度を変化させることにより、屈折エラーを矯正する。コンタクトレンズは、歪んだ角膜を、眼を正視とするように計算されたコンタクトレンズのフロントカーブで置き換えることにより、眼の屈折エラーを矯正する。しかし、レンズを取り外すと、角膜は、依然として歪んでるか、または欠陥があり、屈折エラーは依然として存在する。
【０００３】
角膜は、湿潤重量に基づいて７５％〜８０％の水分を含む。残りの２０％〜２５％の固体の中で、大半は、コラーゲン、または他のタンパク質、およびグリコサミノグリカンである。角膜間質の骨格を形成する、角膜原線維は緻密に組織化され、典型的な６４〜６６ｎｍのコラーゲン周期を示す。しかし、角膜コラーゲンの物理化学的特性は、腱および皮膚コラーゲンのものと有意に異ならない。これらの他の起源由来のコラーゲンと同様に、角膜コラーゲンは、窒素、グリシン、プロリン、およびヒドロキシプロリンの含量が高い。沸騰水または酸中で、角膜コラーゲンはゼラチンに変換され、コラーゲンは、コラゲナーゼ、ペプシン、またはパパインなどのタンパク質分解酵素により溶解され得る。
【０００４】
角膜矯正術の手順：角膜矯正術は、眼の屈折エラーを改善するための、手術ではない手順であり、例えば眼のレーザー手術の代替法である。具体的には、角膜矯正術は、患者の角膜の湾曲を新しい形状にする治療手順である。慣用的な角膜矯正術の手順は、次第に角膜を新しい形状にし、より球面の前方の湾曲を生じることを目的とした、一連のプログレッシブコンタクトレンズの使用を含む。プロセスは、３〜６対のコンタクトレンズをはめることを含み、伝統的には、光学的な新形状の達成には約３〜６ヶ月を要する。この手順は、近視および乱視を軽減または消失し、従って、自然視を改善し、正視（視覚の屈折エラーが０であるか、または矯正が全く必要でない状態）を生じることが判明した。角膜矯正レンズの設計の近年の改善により、正視を、はるかにより迅速に達成することが可能である。多くの場合、これは、１対の最終結果レンズを１晩装着することにより達成され得る。
【０００５】
角膜矯正術に関する問題は、新しい形状の角膜組織はその最初の湾曲の記憶を保ち、レンズを外した後に、弛緩し最初の湾曲に戻る傾向のあることである。したがって、角膜矯正術の患者が最大の結果に達した場合、結果を安定化させるために、１日中または一部の時間装着するための、リテイナーコンタクトレンズを処方する。リテイナーコンタクトレンズは、典型的には、硬い気体透過性物質で作られている。所望の結果を迅速に得るために、夜中もリテイナーコンタクトレンズを装着する角膜矯正術の患者が増えており、日中の活動中には、ほぼ正視で過ごしている。このような様式の欠点は、角膜がその以前の形状へと減退しないようにするために、毎晩リテイナーコンタクトレンズを装着する必要があることである。
【０００６】
角膜形成術：この問題の解決に向けられた関連の手順は、角膜軟化剤を使用して、一過性に角膜を軟化し、その結果、所望の立体配置へとより容易に新しい形状にして、正視をもたらすことができる。角膜形成術は、１回の来診または数週間の期間にわたり実施する３段階のプロセスである。３段階のプロセスは、最初に、軟化剤を角膜に適用して、角膜組織を軟化させ；第二に、硬いコンタクトレンズを角膜に置き、眼を正視とし；そして第三に、安定化剤を適用することを含む。次いで、角膜は新しい形状になり、硬いコンタクトレンズにより示される所望の立体配置に即応する。角膜軟化剤の投与は、より短期間で、より大きな屈折エラーの矯正を補助する。
【０００７】
しかし、角膜組織の新しい形状化を制御するために、視覚軸に関して、成形コンタクトレンズを正確に配置することが困難であることが判明した。いくつかの失敗した適用において、角膜形成術は、成形コンタクトレンズの誤配置により引き起こされるエラーにより、乱視または複視を誘導した。さらに、３つのすべての段階が、１回の来診で実施されるので、患者は、新しい形状の角膜組織の結果に反応する機会がない。患者は、プロセス中に、「試して、様子を見る」、または、決心を変えることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記の点で、患者が矯正を永久的とすることを選択するまで、手順は可逆性とするなどの、前の視力レベルに戻る選択肢を保持しつつ、患者が迅速に正視に達することができる、視力矯正手順を実施するための改善された方法が必要である。さらに、角膜マトリックスを安定化する組成物を製造および適用するための組成物および方法が必要である。組成物は、角膜矯正術の手順から生じる角膜湾曲を安定化できる必要があり、その結果、角膜矯正術の患者は、硬いリテイナーコンタクトレンズを装着しなくてすみ、軟化剤を適用しなくてすみ、依然として患者が矯正を永久的としたいと確信するまで最初の角膜湾曲まで戻る機会がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の利点および目的は、一部は以下の記載で示されるか、一部は、記載から明らかであるか、または本発明の実施により学習し得る。本発明の利点および目的は、添付の特許請求の範囲に特に指摘した要素および組合せにより実現および達成されるだろう。
【００１０】
利点を得るために、および本明細書に具現および広く記載したような本発明の目的により、本発明の第一の態様は、断続した３本鎖らせんを有するフィブリン結合型コラーゲン（「ＦＡＣＩＴ」）および小ロイシン−富化リピートプロテオグリカン（「ＳＬＲＰ」）から選択される少なくとも１つの化合物を含む安定化剤に関する。あるいは、タンパク質由来のトランスグルタミナーゼを含む安定化剤に関する。これら安定化剤は、角膜組織を安定化して、所望の形状を維持する。
【００１１】
上記安定化剤に関連して、角膜矯正術の手順後に所望の形状の角膜組織を維持する方法は、患者に、ＦＡＣＩＴおよびＳＬＲＰの少なくとも１つを含む、安定化剤形のコラーゲン組成物を投与する段階を含む。これにより、安定化剤は、角膜組織を安定化して、所望の形状を維持する。
【００１２】
上記安定化剤に関連して、角膜矯正術の手順後に所望の形状の角膜組織を維持する方法は、患者に、タンパク質由来のトランスグルタミナーゼからの安定化剤を投与する段階を含み、これにより、安定化剤は、角膜組織を安定化して、所望の形状を維持する。
【００１３】
角膜矯正術の手順から生じた角膜湾曲を維持する方法に関し、上記安定化剤を角膜に適用して、コラーゲン原線維と反応させることにより角膜湾曲を安定化し（ここで該安定化剤は、角膜軟化剤を投与せずに適用する）、そして角膜のコラーゲン原線維に連結した橋を構築し、コラーゲン原線維の動きを拘束する段階を含む。
【００１４】
安定化剤の製造に関する方法は、ＦＡＣＩＴおよびＳＬＲＰから選択された少なくとも１つの化合物を、生理的に適合可能な溶液に溶かし、そして該溶液を、生理的に適合可能なｐＨレベルまで緩衝化する段階を含む。
【００１５】
角膜矯正術の手順から生じる、新しい形状の角膜上に適用するための、安定化剤の製造法に関する方法は、緩衝溶液中でトランスグルタミナーゼを調製し、溶液を混合し、滅菌水で希釈し、そして塩化カルシウムを添加する段階を含む。
【００１６】
上記安定化剤に関連して、患者の角膜湾曲を矯正するための角膜矯正術の手順は、角膜矯正レンズを、患者の眼に挿入して、角膜矯正レンズにより示される予め選択した形状に沿って、眼の未軟化角膜組織を新しい形状にし、該予め選択した形状で角膜組織を安定化するために安定化剤を患者の眼に適用する段階を含む。
【００１７】
本発明の第二の態様は、患者の眼に挿入し、未軟化角膜組織を、角膜矯正レンズにより示される予め選択された角膜形状へと新しい形状にするように構成された、当該角膜矯正レンズ、および、患者の眼に投与し、前記予め選択した形状で角膜組織を安定化する安定化剤を含む、角膜矯正術のキットに関する。
【００１８】
前記の一般的な記載および以下の詳細な記載は、例示であり、単なる説明であり、特許請求されている本発明を制限するものではないことが理解される。追加の利点が以下の記載に示され、一部は記載から理解されるか、または本発明の実施により学習し得る。本発明の利点および目的は、添付の請求の範囲に示した組合せを用いて得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例７における共焦点顕微鏡による検査結果を示す図。
【図２】処置プロトコルにより処置した角膜の標本。（３３８０５４３）
【図３】未処理角膜の標本。（３３８０５６２）
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のいくつかの態様を詳細に言及する。本願は組成物を開示し、前記組成物の製造法および前記組成物を前記角膜に適用する方法を教示し、角膜矯正レンズの装着期間中または期間後に適用すると、角膜矯正結果は実質的に維持され、これにより、硬い保持コンタクトレンズを装着する必要がなくなる。
【００２１】
本発明による加速角膜矯正術の手順は、１対の角膜矯正レンズを装着して角膜組織を新しい形状にし、そして新形状の角膜組織を安定化して、最初の角膜湾曲へと角膜組織が弛緩するのを遅延する段階を含む。安定化剤により、角膜組織の新形状化は永久となる。加速的な角膜矯正術の手順により、予め決定した期間、例えば約２４時間、正視が得られる。
【００２２】
加速的な角膜矯正術の手順において、本発明によると、患者は、角膜矯正レンズを、おそらく夕方にリテイナーレンズとして、安定化剤を適用することなく、装着することを選択することができ、新しい形状の角膜組織を通して見ることを楽しむことができる。結果が不満足である場合、患者は、眼科医または検眼士の診察を受け、角膜を検査し得、新しい対の角膜矯正レンズを嵌めることができる。患者が満足し、この結果を永久化すると決めた場合、患者は、安定化剤を適用して、その最初の角膜湾曲への角膜組織の弛緩を遅延することにより、新しい形状の角膜組織を永久的に安定化し得る。安定化剤が、新しい形状になった後に、その新しい立体配置で角膜組織を迅速に安定化する。
【００２３】
角膜矯正レンズは、好ましくは、瞼の機械的圧力、および、天然または人工の涙液の水圧ポンプ作用を利用して、角膜組織を次第に形状変化するように設計される。
【００２４】
本発明によると、安定化剤として使用するのに適した、少なくとも２つの代替のタイプの組成物が開示される。各組成物は、独立して作用し、角膜湾曲を安定化する上で異なるアプローチを示す。これらの組成物は、一般に、少なくとも１つのＦＡＣＩＴまたはＳＬＲＰを含む組成物として、またはトランスグルタミナーゼ酵素組成物として特徴づけられる。
【００２５】
本発明の第一のアプローチによると、安定化剤用の組成物は、眼のコラーゲンマトリックスの安定化に適切な、好ましくは生物学的に適合性のある、組成物に関する。角膜コラーゲン原線維は、天然結合巨大分子と会合している。本発明による安定化剤は、一般に、２つのこのような巨大分子の群、すなわち、「ＦＡＣＩＴ」と略称する、断続した３本鎖らせんを有する原線維結合型コラーゲン、および、「ＳＬＲＰ」と略称する、小ロイシンリッチリピートプロテオグリカンから選択される少なくとも１つの化合物からなる。
【００２６】
適用において、ＦＡＣＩＴおよびＳＬＲＰの細胞外マトリックス成分は、角膜コラーゲン原線維と架橋して、原線維直径を制御することにより、安定化剤として作用する。安定化剤も橋を形成することができ、原線維を一緒に結合して、原線維が次々と滑る能力を制限する。これらの橋により、ある程度の柔軟性を可能にするが、原線維が移動できる距離を制限する。
【００２７】
本発明の生物学的に適合性のコラーゲン反応生成物を形成するのに有用ないくつかの種類のコラーゲンは、ＶＩ型コラーゲン、ＸＸ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、およびＸＩＶ型コラーゲンを含む群から選択することができる。これらの種類のコラーゲンは、ＦＡＣＩＴのメンバーである。種々の種類のＦＡＣＩＴを抽出し、Ｓｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ研究所（マサチューセッツ州ボストン）などの学術的な起源から精製または獲得できる。
【００２８】
安定化組成物の成分は、ＳＬＲＰなどのプロテオグリカンも含む。これらのＳＬＲＰの組成物への添加は、角膜の安定化に効果的であることが判明した。誤解を招きやすい命名だが、ＳＬＲＰは、大きな分子である。例えば、いくつかの種類のＳＬＲＰは、デコリン、ケラトカン、ビグリカン、エピフィカン、ルミカン、ミミカン、およびフィブロモジュリンから選択できる。デコリンはデルマタン硫酸グリコサミノグリカン鎖を含み、ケラトカンはケラタン硫酸グルコサミノグリカン鎖を含む。多くのＳＬＲＰ（例えばビグリカン、ケラタン、硫酸プロテオグリカン、デオリン、ラミニン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカン）も、シグマケミカル社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）（「シグマ」）などの市販源から入手できる。他のものは、学術機関から入手できるか、または当技術分野において既知のプロセスにより調製できる。
【００２９】
以下は、ＦＡＣＩＴ族の種々の種類のコラーゲンの詳細な説明を提供する。コラーゲンタンパク質は、多くの発達的および生理的機能に関連した、大きな異種クラスの分子を含む。少なくとも２０個のコラーゲンが現在同定されており、これらの中の約１１個が、角膜構造の発達に関与する。全コラーゲン分子が共通して有するようである２つの特徴は、３つの鎖（α鎖と称する）からなり、これらの鎖が三本鎖らせんで配置した、少なくとも１つのドメインを有する。慣例により、各種類のコラーゲンに数を割当て（ローマ数字で）、それが発見された年代順を反映する。ＦＡＣＩＴは、以下に考察するような角膜原線維コラーゲンの組織化に主な役割を果たす。
【００３０】
ＶＩ型コラーゲンは、大半の間質結合組織に見られるビーズ形の繊条を有することが当分野で知られている。成人ヒト角膜間質において、該分子は、原線維コラーゲンの量に近い量で存在する。これらのビーズ様の繊条が間に介入し、横紋状原線維および角膜プロテオグリカンと相互作用するようである。
【００３１】
発達中のトリ角膜においてＦＡＣＩＴ分子ＸＩＩおよびＸＩＶ型の発現に関する研究を実施した。「発達中のトリ角膜で発現される新規の原線維関連コラーゲンＸＸ型」にＧｏｒｄｏｎら（１９９９年１月２２〜２３日に、マサチューセッツ州ボストンのＳｃｈｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ研究所の後援による巨大分子形態形成シンポジウムの「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」の抄録、以後「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」）によって詳述されたような、これらの研究は、角膜原線維の組織化に関与し得る、ＸＸ型を含む新規のＦＡＣＩＴを同定した。これらの研究は、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＸ型コラーゲンの発達発現パターンは、トリ角膜におけるこれらの分子が機能を有する可能性に関連していると結論づけた。ＸＸ型のより小さいアミノ末端ＮＣ３ドメインにより、コラーゲン原線維はそれぞれより近接できることが示唆される。
【００３２】
間質構築の適切な発達および維持が、角膜透明度に必要であることが、Ｄａｖｉｄ Ｅ．Ｂｉｒｋ（「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」の抄録）による「角膜細胞外マトリックスの集合は多段階プロセスであり、各段階は、独立して、異なる巨大分子相互作用により調節されている」で実証された。原線維構造は、角膜機能の１つの重要な決定因子である。コラーゲン原線維は、最初は、セグメントと称される、中間体として集合している。これらの中間体は、発達中の細胞外マトリックスに取り込まれ、発達が進行すると、調節された成熟が生じる。この原線維成熟は、より長い成熟原線維への、未成熟角膜間質内での中間体の転換を含む。角膜では、長さの増加は、直径が変化することなく生じるが、他の組織では、長さおよび直径の両方が増加する。トリ角膜を使用して、コラーゲン原線維形成の調節を研究した。角膜では、コラーゲンＩおよびＶ型のヘテロタイプな相互作用が、原線維セグメントの初期集合を調節する。優性ネガティブなアプローチを使用すると、Ｖ型コラーゲン組成物は、新しく形成された原線維セグメントの直径を決定する。この効果は、アミノ末端ドメインにより媒介される。Ｖ型コラーゲンの存在に因る分子集合の変化により、原線維成長は制限され、新しい原線維セグメントの開始が好まれる。これは、急速な間質の増殖中に存在する原線維の数を増加するように作用する。
【００３３】
原線維増殖の次の段階は、長さの増加であり、成熟原線維を生じる。１つの研究は、線維会合プロテオグリカンをこの段階の調節に関係づける。１つの理論は、セグメントは、分子転位後に、沈着後融合を受け、より長い原線維の成熟組織を生じるというものである。この理論に基づき、実験を設計し、発達中の異なる段階では、セグメント表面に会合した成分には時間的および空間的変化があると予測された。これらの変化は、原線維形成の異なる段階を安定化または脱安定化するように作用する。プロテオグリカンを、単離された原線維の表面から除去することにより、異常な原線維増殖が生じ、より長くより大きな直径の原線維が生じる。プロテオグリカンを添加し戻すと、この異常な増殖を用量依存的に防止する。
【００３４】
ＳｕｎｄａｒＲａｊら（「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」）による「ＸＩＩ型コラーゲンと角膜形態形成」の間の関係に関する別の研究において、ＸＩＩ型コラーゲンの２つの別のスプライス変異体の発達調節分布は、組織凝結に関与する特定の形態形成事象に関連し得る。
【００３５】
他の研究者により実施された免疫組織化学的解析により、ＸＩＩ型コラーゲンの短い変異体は、角膜発達の初期段階（１４日目）のウサギ角膜間質および強膜に発現されることが示された。短い形はまた、眼瞼ひだ形成の初期段階からの眼瞼の結合組織にも存在した。しかし、長い形は、最初に、より後の段階（２４日目まで）で後部間質で発現された。出生前および出生後の発達のより後の段階中に、長い変異形の分布は、後部間質から前部間質に進行した（パターンは、角膜発達中の間質凝縮のパターンと類似）。長い形は、表皮下の限定された領域に一過性に発現され、そこで、眼瞼は共に集まり融合した。角膜上皮膜（「ＢＭ」）帯におけるＸＩＩ型コラーゲンの外見は、眼瞼の開口のすぐ前に明らかであった。
【００３６】
研究により、ＸＩＩ型コラーゲンの長いおよび短い変異体の時間的および空間的分布により、これらの変異体は、角膜発達において異なる機能を有し得ることが示唆されると結論づけられる。ＸＩＩ型コラーゲンの長い変異形は、角膜間質凝縮に関与し得る。ＢＭ帯でのその相互作用および機能は、間質のそれとは異なるようである。
【００３７】
したがって、種々のタイプのＦＡＣＩＴに関連した前記研究は、これらの独特なコラーゲンは、角膜間質の組織化に寄与する間質コラーゲン原線維と相互作用し、原線維増殖を調節し、角膜の透明性および安定性を提供することを示す。
【００３８】
以前に考察したように、ＳＬＲＰをコラーゲン混合物に添加することは、角膜を効果的に安定化させることが判明した。以下は、さらに詳細にＳＬＲＰを考察する。Ｓ．Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ（「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」の抄録）による「遺伝子標的化ルミカン欠損マウス：ルミカンによるコラーゲン原線維集合および角膜透明性の調節」において、角膜プロテオグリカンが、角膜の透明性に必要とされる高度に組織化されたコラーゲンマトリックスの重要なレギュレーターであると仮定した研究が設計された。この研究は、主な角膜ケラタン硫酸（「ＫＳ」）プロテオグリカンであるルミカンの、コラーゲン構築の調節および角膜透明性の獲得における役割を解明した。この研究は、ルミカンが、コラーゲン原線維集合および角膜透明性において重要な役割を果たしたと結論づけた。濁度の進行は、より古い突然変異体で観察される、コラーゲン異常の年齢依存的増加の直接的な結果であり得る。ルミカン欠損マウスにおける全ＫＳ含量の減少は、角膜の特定の水和作用およびその他の生理的特性に影響を及ぼすようであった。
【００３９】
Ｇ．Ｗ．Ｃｏｎｒａｄら（「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」の抄録）による角膜ケラタン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質の遺伝子の進化起源に関するいくつかの推測」において、科学者は、デコリンもルミカンコアタンパク質遺伝子のどちらも角膜特異的な方法では発現されないが、ルミカンは、角膜で独特にグリコシル化されていることを示唆した。ミメカンは、より限定されたアレイの組織で発現され、一方、ケラトカン発現は、種に応じて、完全またはほぼ完全に角膜特異的であった。十分なゲノム配列データが、現在では、いくつかの脊椎動物から入手可能であり、ミメカン遺伝子（８エキソン）のゲノム構造を、ケラトカン遺伝子（３エキソン）のゲノム構造と比較できる。そのヌクレオチド配列に基づき、ケラタン硫酸鎖を有するコアタンパク質を発現している遺伝子族の樹状図により、ミメカンは、ケラトカンよりも、その配列が、明らかにより多岐であることが示唆される。始原ゲノム（これからこれらの遺伝子が進化した）は単純であり得、イントロンが後に出現するか（従って、ミメカンは進化の後期に出現する）、または正にその逆の順序で進化し得、原始的イントロンが時間の経過と共に排除される（従って、ミメカンは進化の初期に出現する）。この問題の解決は、角膜を有する他の生物のゲノムの解析から得ることができる。
【００４０】
角膜損傷中に角膜を検査するために、Ｖ．Ｔｒｉｎｋａｕｓ−Ｒａｎｄａｌｌら（「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」の抄録）による「間質における増殖因子およびプロテオグリカン」の間の関係に関する研究により、ＴＧＦβは、創傷修復のプロセスに役割を果たすことが示された。ＴＧＦβは、コアタンパク質およびＧＡＧの両方のレベルで、間質線維芽細胞中の細胞外マトリックスの組成を変化させた。パールカンの増加は、βＦＧＦの応答性を増強することができ、かつ細胞表面へのその結合を変化させることができる。
【００４１】
Ｗ．Ｗ．−Ｙ．Ｋａｏ（「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」の抄録）による「マウス角膜上皮の創傷治癒におけるルミカンの役割」に関する実験において、ルミカンは、上皮細胞遊走を調節することができ、従って、角膜上皮創傷治癒に寄与することができると結論づけられた。
【００４２】
Ｒ．Ｖ．Ｉｏｚｚｏ（「Ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｌｏｏｋｉｎｇ Ｇｌａｓｓ」の抄録）によるプロテオグリカンシグナル伝達によるマトリックス集合および細胞増殖の制御」に関する研究において、小ロイシン−富化プロテオグリカンの増加中の族の原型メンバーであるデコリンは、主に、原線維コラーゲンに結合でき、原線維形成を遅延できることから、マトリックス会合の制御に直接関与したことが示された。研究により、デコリンは、細胞増殖の直接的なモジュレーターとして作用することも観察された。例えば、デコリンのレベルは、増殖停止および静止中にも顕著に上昇し、その発現は、ウイルス形質転換により廃止される。研究により、デコリンタンパク質コアとＥＧＦ受容体の間の直接的な相互作用が実証された。したがって、創傷治癒または癌増殖のいずれかにおける、間質エレメントによるデコリンの生合成の増大は、天然の増殖制御機序を示し得る。
【００４３】
したがって、ＳＬＲＰに関する上記の研究により、これらの独特なマトリックス成分は間質コラーゲン原線維に結合して、マトリックス組織化を制御し、マトリックス組成物を安定化することが示される。
【００４４】
本発明によると、所望の形状の角膜組織が、角膜矯正術の手順により達成された後、安定化剤を角膜組織に適用して、所望の形状を維持する。この安定化剤は、角膜組織に直接適用すべきである。その後、成形レンズは、安定化剤がその機能を実施するのに十分な時間で存在するまで、角膜組織に戻すことができるが、その必要性はない。以下に考察するように、本発明の安定化剤は、角膜がその前の形状に戻る前にその機能を実施し得ることが判明した。しかし、ある安定化剤では、安定化剤を適用した後、１日間、角膜に角膜矯正レンズを装着することが有利であるだろう。
【００４５】
ＦＡＣＩＴおよびＳＬＲＰ 本発明の第一の態様において、ＦＡＣＩＴおよびＳＬＲＰから選択した少なくとも１つの化合物を、生理的に適合可能な緩衝溶液に溶解または懸濁する。一般に、ＦＡＣＩＴの濃度は、約１０〜約５００μｇ／ｍｌの範囲である。好ましくは、ＦＡＣＩＴの濃度は、約２０〜約２５０μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約４０〜約１００μｇ／ｍｌの範囲である。ＳＬＲＰが、単独でまたはＦＡＣＩＴと組合せて含まれる場合、ＳＬＲＰは、例えば、約１０〜約５００μｇ／ｍｌ、約２０〜約２５μｇ／ｍｌ、約４０〜約１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度を有し、これらの範囲内に包含される任意の整数の範囲を含む。
【００４６】
ＦＡＣＩＴおよび／またはＳＬＲＰは、例えば、ｐＨの範囲が６．５〜８．５、好ましくは約６．８〜約７．６である、約０．００５〜０．５Ｍの中性ｐＨリン酸緩衝液などの緩衝液に希釈または溶解する。他の適切な緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）（シグマ−アルドリッチまたはＴＲＩＳ緩衝液の他の業者）または当該技術で公知の他の生物学的に適切な緩衝液（これも、約０．００５〜約５Ｍの濃度であり得る）を含む。
【００４７】
次いで、この安定化剤溶液を、角膜に、液滴の形で、角膜矯正レンズを装着する期間中または期間後、約１日間〜約１４日間の期間、適用する。角膜コラーゲンとの相互作用を最適化するために緩衝系およびｐＨを変更することができる。例えば、緩衝ｐＨは７．６またはそれ以上に上昇させて、コラーゲンマトリックス構造を広げ、組成物の眼組織への送達を増加させ得る。当業者が認識しているように、ｐＨは、眼組織に対する損傷の可能性から限定される。一般に、適切なｐＨは、前記損傷の危険性から、約８．０を超えない。
【００４８】
この溶液は、角膜でコラーゲン原線維と相互作用し、１つのコラーゲン線維を別の隣接した線維に付着する橋を形成することにより、線維直径を制御する。これらの橋により、原線維の柔軟性が可能であるが、原線維が移動する距離は制限される。その後、角膜組織は、さらに成形レンズを使用しなくても、その形状を維持するだろう。
【００４９】
実施例１
一連の、生体外での研究室での実験を、ブタの摘出した角膜で実施して、安定化の効果を最適化した。ブタの摘出した眼を、オプティゾール溶液に保存し、２〜８℃で保存した。処理した眼を、視覚的に、および生体顕微鏡を使用して検査し、角膜上皮、間質、角膜の濁り、角膜固縮、前部チャンバー応答、および角膜の厚さに対する効果をモニタリングした。処理した眼は、機械的な試験を受け、以下に詳細に記載したように、低および高弾性での変化を評価し、圧縮力下での負荷およびひずみを評価した。低弾性の減少により、液体を追い出す能力の増加により、軟化すなわちコラーゲンネットワークを圧縮するのに必要とされる力の減少が示された。これに対し、低弾性での増加は硬化を示した。高弾性でのいかなる変化によっても、コラーゲン原線維ネットワークに対する損傷が示された。
【００５０】
これらの生体外実験の第一期において、計１２個のブタの眼を前もってスクリーニングした。摘出した眼を、１ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、０．００５Ｍのリン酸ナトリウムでｐＨを約７．２まで緩衝化した、ウサギ角膜ＶＩ型コラーゲン（Ｓｃｈｌｅｐｅｎｓ Ｅｙｅ研究所から入手可能）からなる、安定化剤の液滴に曝露する。眼をオプティゾールから取り出し、平衡塩溶液（「ＢＳＳ」）またはリン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）ですすいだ後、液滴を７日間にわたり毎日２回適用する。次いで、眼をオプティゾールに戻す。全ての眼を室温で保存し、天然光に曝露する。２つの濃度の各物質を、処理に使用する。次いで、スライドを、処理した眼の角膜表面に適用し、親指圧を使用して、または機械的に配置して、平らな表面を作成する。７日後、局所解剖学図解析により最小の再結合が示される。
【００５１】
これらの生体外実験の第二期において、同じ安定化剤をさらに、角膜矯正レンズを嵌めたブタの摘出した眼で評価する。安定化剤は、角膜矯正レンズを着用中に適用する。眼を、視覚的に、生体顕微鏡により、および装置を使用して検査し、角膜計測および／または局所解剖学図により、角膜湾曲を測定する。これらの実験の結果により、７日後に最小の再結合が示される。
【００５２】
実施例２
試験眼は、成形レンズによる成型処置、次いで、５００μｇ／ｍｌの濃度を有し、０．０４Ｍのリン酸ナトリウムで約７．２のｐＨまで緩衝化した、ＳＬＲＰであるデコリンの投与の両方を受けた。溶液は、以下の計画に従って適用した：型を金曜日の午後に適用し、月曜日の朝まで放置し、その時に型を取り外した。型を除去した後、次いで、デコリン溶液１００μｌに眼を曝露した。型を各眼に再適用した。次いで、各眼をオプティゾール溶液に戻した。デコリンの適用は、火曜日と水曜日に繰返した。
【００５３】
型を一方の眼に再適用した。その眼の主観的な写真による評価により、再適用した型とデコリンによる処理により、再結合していない平らな角膜が得られた。
【００５４】
第二の眼に関して、眼を水曜日にデコリンに曝露した後、成型を再適用しなかった。これは、眼がその最初の形状に再結合して戻るかどうかを決定するために実施した。さらに３日後、その眼の主観的な写真による評価により、角膜組織の再結合は無視できるかまたは全くないことが示された。
【００５５】
実施例３
試験眼は、成形レンズでの成型処置、次いで、１００μｇ／ｍｌの濃度を有し、０．０４Ｍリン酸二ナトリウムでｐＨを約７．２まで緩衝化した、ＳＬＲＰである硫酸ケラタンの投与の両方を受けた。溶液は、以下の計画に従って適用した：型を金曜日の午後に適用し、月曜日の朝まで放置し、その時に型を取り外した。型を除去した後、次いで、眼を１００μｌに曝露した。型を各眼に再適用した。次いで、各眼をオプティゾール溶液に戻した。硫酸ケラタンの適用は、火曜日と水曜日に繰返した。
【００５６】
型を一方の眼に再適用した。写真によるその眼の主観的な評価により、再適用した型と硫酸ケラタンによる処置により、再結合していない平らな角膜が得られた。
【００５７】
第二の眼に関して、水曜日に眼を硫酸ケラタンに曝露した後、型を再適用しなかった。これは、眼がその最初の形状に再結合して戻るかどうかを決定するために実施した。さらに３日後、写真によるその眼の主観的な評価により、角膜組織の中程度の再結合が示された。
【００５８】
トランスグルタミナーゼ
本発明の角膜を安定化する第二のアプローチにより、安定化剤（これも好ましくは生物学的に適合性である）は、表皮などの組織に通常見られる酵素から誘導されることができる。酵素は、リジンとグルタミン残基の間の共有結合により形成される、トランスグルタミナーゼ、例えばトランスグルタミナーゼ（第ＸＩＩＩ因子）架橋タンパク質を含むことができる。
【００５９】
本発明により、トランスグルタミナーゼを、例えば、約０．０１Ｍ〜約０．２５Ｍまたは約０．０５Ｍ〜約０．１５Ｍの範囲のＥＤＴＡと混合する。トランスグルタミナーゼの濃度は、約０．０１Ｍ〜約０．２５Ｍまたは約０．０５Ｍ〜約０．１Ｍの範囲であり得、これらの範囲内に包含されるいかなる整数の範囲も含む。トランスグルタミナーゼは、活性化するためにカルシウムイオンを必要とするので、ＥＤＴＡを安定化剤溶液に加えて、早発のトランスグルタミナーゼ活性化を誘導し得るカルシウムイオンに結合する。勿論、ＥＤＴＡは多くの状況で添加する必要のないことが理解されよう。
【００６０】
溶液は、例えば、約６．８〜７．６、または約７．０〜約７．２のｐＨ範囲、またはこれらの範囲内に包含されるいかなる整数の範囲までも緩衝化すべきである。適切な緩衝剤は、グリシン緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、およびビシン緩衝液を含む。しかし、緩衝液は、リン酸塩を含むべきではない。なぜなら、リン酸塩は、カルシウムの存在下で沈降する傾向があるからである。次いで、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲の塩化カルシウムを、触媒として、トランスグルタミナーゼ溶液に加える。送達系は、角膜への適用中に成分を添加する、２部装置を含む。前記装置により、使用者は、別々の溶液または２つの別々の装置を必要とすることなく、適切な時点で、トランスグルタミナーゼ溶液とカルシウム触媒を合わせることができる。
【００６１】
実施例４
トランスグルタミナーゼ組成物は、トランスグルタミナーゼ１０ｍｇを、２％スクロース、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、および５ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ７．２）を含む滅菌水１０ｍＬに添加することにより調製した。トランスグルタミナーゼは、シグマ、カタログ番号Ｔ−５３９８から、モルモット肝臓またはヒト組換え源を用いて得た。成分を混合し、次いで滅菌水で９０ｍｌまで希釈した。第二溶液は、２５ｍＭ塩化カルシウムを含んだ。
【００６２】
角膜への適用前に、塩化カルシウム溶液１０ｍＬを、トランスグルタミナーゼ組成物に加え、穏やかに混合した。この混合物の液滴を、ちょうど点眼薬を添加するように、角膜表面に加え、約１０分間反応させた。次いで、眼を滅菌水または滅菌緩衝液、例えば「ＢＳＳ」で洗浄し、過剰のトランスグルタミナーゼ混合物を除去した。結果として、トランスグルタミナーゼ混合物は、角膜間質中のコラーゲンのペプチド結合リジンの種々の第１級アミン基の間の供給結合架橋を媒介した。
【００６３】
上記の組成物はまた、ブタの摘出角膜での一連の生体外の研究室実験を受け、安定化の効果を最適化した。ブタの摘出した眼を、処置するまで氷に入れた。処置前に、各眼を、安定性のためにブラケットに入れ、Ｏｐｔｉｋｏｎ２０００システムを使用して局所解剖学的評価にかけた。各眼の６つの局所解剖図をとり、真の複合物を作成した。角膜表面を、滅菌ゲージを使用して乾燥し、次いで、０．０２Ｍのリン酸二ナトリウムの液滴で湿潤化した。湿潤化した眼を再度乾燥し、０．０２Ｍのリン酸二ナトリウムの液滴に曝露した。ガラススライドを、角膜の表面上で平衡化した。トランスグルタミナーゼおよび塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の溶液を、５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．５）中で調製した。ＴＲＩＳ緩衝液のｐＨを、２．５Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の添加により調整した。トランスグルタミナーゼは、ＴＲＩＳ緩衝液１０ｍＬ中で１ｍｇ／ｍＬで調製した。ＣａＣｌ２は、ＴＲＩＳ緩衝液５０ｍＬ中で２５ｍＭの濃度で８．５に調製した。
【００６４】
投与前に、ＣａＣｌ２溶液１ｍＬを、トランスグルタミナーゼ溶液９ｍＬと混合した。その理由は、トランスグルタミナーゼは、触媒としてＣａ++触媒が必要であるからである。トランスグルタミナーゼ／ＣａＣｌ２溶液は、ガラススライド周囲の領域に滴下して加えた。酵素溶液約１ｍＬを、２分間適用した。次いで、スライドを取り出し、眼を、ｐＨ７．４の０．００４Ｍリン酸緩衝液で洗浄した。次いで、眼を、局所解剖学的に再検査し、写真を撮影した。局所解剖学的評価後に、眼を、さらなる評価まで保存のためにオプティゾールに入れた。３つの眼を、このプロトコルを使用して処理した。
【００６５】
ガラススライドを平衡化している間、酵素溶液の適用の困難さから、最初に２つの眼を処理するのにはいくらかの困難がある。第三の試みにおいて、トランスグルタミナーゼの液滴を角膜に適用し、スライドを角膜表面に適用し、親指圧を使用して配置した。酵素溶液の液滴を、その後、ガラススライド周囲の角膜表面に適用した。最初の２つの眼には平板化効果は認められなかった。最初の眼の局所解剖学的結果は、以下の表１に示したような勾配の角膜を示すようであった。しかし、局所解剖学的マップにより明らかに、第三の眼における中心角膜の平板化が実証された。屈折力は、約１．５ジオプター減少した。すべての眼は、視覚検査により清澄のようであった。眼を、保存のためにオプティゾールに入れた。
【００６６】
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【００６７】
処理後、角膜ボタン様腫瘤を解剖し、オプティゾールに入れ、負荷−ひずみの解析のためにラトガーズ大学に発送した。負荷−ひずみ解析において、角膜ボタン様腫瘤を、僅かに凸状の表面に置き、圧縮力に曝露した。負荷−ひずみ曲線は、％で示したようなある一定の量の角膜を圧縮するのに必要な、単位面積の横断面あたりの力を示す。得られた曲線は、いくつかの明確な相を示す。より低い部分（低弾性領域）は、コラーゲン原線維間の液体をしぼり出す抵抗を示す。中部（ここでは、負荷−ひずみ曲線は変化しない）および上部（高弾性領域）は、コラーゲン原線維の圧縮を示す。低弾性の減少は、角膜がより軟らかいことを示す。増加は、角膜ボタン様腫瘤がより硬く、安定化されていることを示す。
【００６８】
トランスグルタミナーゼ処理により、奨励される結果が得られた。局所解剖学的評価により、トランスグルタミナーゼで処理し、その後、ガラススライドを使用して角膜を平板化した、１つのブタ眼は、ガラススライドを除去した後に、約１．５ジオプトリーの屈折力の減少を示すことが示された。２つのさらなる眼が、この処理のシリーズに含まれることを注記することが重要である。ガラススライドも、これらのブタ眼に適用した。しかし、酵素の添加は、水平位置で眼に適用し、ガラススライド下から角膜に流れないようであった。これらの眼では、局所解剖学的評価による屈折力の減少の証拠が全くなかった。これらの眼は、ガラススライド適用後に角膜中央の平板化を全く示さないので、成功裡の眼に観察された角膜の平板化は、単に、ガラススライドの適用の結果ではないようであった。
【００６９】
実施例５
さらなる実験を実施して、トランスグルタミナーゼ液滴が、角膜矯正術中の角膜を効果的に安定化できることが実証された。１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、および１ｍｇ／ｍＬを含む、少なくとも３つの異なるレベルのトランスグルタミナーゼを評価する。１処理あたり３つの眼が、２つの偽の対照、すなわちトランスグルタミナーゼを含まず緩衝液のみを含むレンズ適用、および全く処置を行なわない１つの対照と共に含まれる。
【００７０】
このシリーズで、実験手順は、眼をブラケットホールダーに入れ、各眼について６回の解読という局所解剖学的評価を実施することを含む。次いで、平板化レンズを適用し、ゴムバンドまたは他の類似装置を使用して穏やかに配置する。眼を水平から約４５°に配置し、０．０５Ｍ ＴＲＩＳ ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．６）の液滴で調節する。緩衝液を１分間相互作用させる間、トランスグルタミナーゼ溶液を、９：１の比でＣａＣｌ2溶液と混合する。その後、眼を、カルシウムを含むトランスグルタミナーゼ液滴（各液滴は約０．１ｍＬの溶液を含む）で、３０秒間の間隔で２分間、次いで、０．０５ＭのＴＲＩＳ ＨＣｌ緩衝液の液滴を適用する。次いで、眼を局所解剖学的に評価し、細隙灯生物顕微鏡検査を使用して検査し、球から解剖し、次いで圧縮解析のためにラトガーズ大学に発送した。
【００７１】
局所解剖学的評価により、ジオプター力の１．５〜２．０の減少、および、低弾性の増加が示され、これは、角膜組織の硬化を示す。
【００７２】
実施例６
試験眼は、成形レンズでの成型処理、次いで、０．０５Ｍ ＴＲＩＳ ＨＣｌでｐＨを約７．２まで緩衝化した１ｍｇ／ｍｌの濃度のトランスグルタミナーゼを有する、トランスグルタミナーゼ溶液と２５ｍＭの濃度の０．０５Ｍ ＴＲＩＳ ＨＣｌ緩衝液中の塩化カルシウムの投与の両方を受けた。溶液は、以下の計画に従って適用した：型を金曜日の午後に適用し、月曜日の朝まで放置し、その時に型を取り外した。成型を除去した後、次いで、眼をトランスグルタミナーゼ溶液１００μｌに曝露した。型を各眼に再適用した。次いで、各眼をオプティゾール溶液に戻した。トランスグルタミナーゼ溶液の適用は、火曜日および水曜日に繰返した。
【００７３】
型を一方の眼に再適用した。写真によるその眼の主観的な評価により、再適用した型トランスグルタミナーゼで処理し、再結合していない平らな角膜が得られた。
【００７４】
第二の眼に関して、眼を水曜日にトランスグルタミナーゼに曝露した後、型を再適用しなかった。これは、眼がその最初の形状に再結合して戻るかどうかを決定するために実施した。さらに３日後、写真によるその眼の主観的な評価により、角膜組織のほんの僅かな再結合が示された。
【００７５】
要約すると、本発明は、加速的な角膜矯正術の手順により矯正された角膜組織を維持または安定化するための、角膜矯正レンズの着用中または着用後に使用するための、点眼送達系を有する、種々の組成物を教示する。該組成物を角膜に適用して、角膜中のコラーゲン原線維に結合し、原線維直径を制御し、そしてコラーゲン原線維間に橋を形成する。
【００７６】
本発明は、すでに角膜矯正術を受けた患者の角膜の安定化に使用できると期待する。安定化手順は、角膜の形状を維持するために、リテイナーレンズを着用し続ける必要性をなくす。これらの患者に安定化段階を単純に使用することが可能であろうが、角膜が、再安定化して新しい立体配置をとり得る前に、脱安定化しなければならないと予期される。
【００７７】
実施例７
ネコ眼におけるデコリンの毒性評価のプロトコル 以下の評価の目的は、（１）眼に対するデコリンの使用に関連した毒性があるかを決定すること；（２）デコリンの角膜への浸透を評価すること；および（３）デコリンの外的適用後に、角膜中のデコリンを定量することであった。
【００７８】
デコリンの毎日１、３および５回の適用を、モデル系として正常角膜を有する雌ネコ（６ヶ月〜２歳）を使用して評価した。デコリンは、乾燥粉末（シグマ）として得られ、０．１Ｍリン酸緩衝液中で復元した。顕微鏡評価を実施するために、デコリンを、モレキュラープローブからの商業的に入手可能なキットを使用して、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４で標識した。
【００７９】
５匹のネコを試験に使用した。各ネコを、医薬の局所適用または眼の写真撮影前に鎮静させた。全動物が、処置前に、眼の検査および写真撮影を受けた（全眼、細隙灯、および内皮細胞）。眼を、無作為に処置群に割当てた。デコリンを、コンタクトレンズ内部に適用し、レンズをネコの眼に配置した。レンズを１０分間眼の上に放置した。全動物を試験中毎日観察した。３つの眼を無作為に処置または対照群に割当てた。少なくともさらに２つの眼が、ヒストグラム、ＴＥＭ、および共焦点顕微鏡評価の各々における対照として使用するために得られた。
【００８０】
各３つの処置群からの１つの眼を、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４９標識デコリンで処置した。
処置群１の眼は、１日目に、１００μｌ緩衝液中５０μｇのデコリンの１回の適用を受けた。写真撮影および検査は、処置の直後、および再び処置の２、４および８日後に行われた。次いで、その月の残りは、試験および写真撮影を毎週実施した。
処置群２の眼は、１、２、および３日目に１００μｌの緩衝液中５０μｇのデコリンの１回の適用を受けた。写真撮影および試験は、処置の直後、および２、３、５および８日目に行われた。その後、その月の残りは、試験および写真撮影を毎週実施した。
処置群３の眼は、１、２、３、４および５日目に、１００μｌの緩衝液中５０μｇのデコリンの１回の適用を受けた。写真撮影および試験は、毎日および再び８日目に行われた。その後、その月の残りは、試験および撮影を毎週実施した。
全動物を１ヵ月目に安楽死させた。目を摘出した。各目を半分に切断した。半分を、毒性の組織学的解析（Ｈ＆Ｅ染色）のためにホルマリンに固定した。他方の半分をさらに半分に分割し、一方の切片をデコリンのＴＥＭ可視化に使用し、残りを、標識デコリンで処置したネコについて共焦点顕微鏡を使用して検査した。
【００８１】
図１に示した結果（共焦点顕微鏡写真）により、デコリンは、眼の角膜組織を貫通していることが示される。さらに、図２（標本番号３３０８０５４３）は、上記の処置プロトコルによりデコリンで５回処置した角膜（処置群３）は、図３(標本番号３３８０５６２)に示した未処理角膜よりも、多くのコラーゲン原線維会合型デコリンを含むことを示す。初期定量解析により、処置した眼のデコリン繊条は、より長く「より太い」ようである。これらの「より太い」繊条は、上皮領域、中間質、および内皮領域を含む、間質切片を通して観察された。
【００８２】
これらの観察により、外的に加えたデコリンは、眼の角膜組織に浸透でき、間質マトリックスに結合できることが示される。さらに、ネコ角膜への外的デコリン適用に関連したあらゆる眼の毒性または副作用がないようである。
【００８３】
組成物、組成物の製造法、および、本発明における前記組成物の適用法、並びに本発明の態様に、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、種々の変更および変形を行うことは、当業者には明らかであろう。
【００８４】
本発明の他の実施態様は、明細書を考察し、本明細書に記載の本発明の実施から、当業者には明らかであろう。明細書および実施例は、単なる例を意図するものであり、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲およびその等価物により示される。
【図１】
2011063602.tif 000003
【図２】
2011063602.tif 000004
【図３】
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