(57)【要約】【課題】一回投与後に感染からの免疫を有利に与える改良されたＢＲＳＶワクチン組成物。【解決手段】修飾生ＢＲＳウイルスおよびアジュバントからなり、共同して、一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与え、かつ、ＢＲＳＶに特異的で、細胞性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫を含む免疫応答を誘起するＢＲＳＶワクチン組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物を免疫するためのワクチン組成物であって、
該組成物が一回投与後にＢＲＳＶ感染からの防御免疫を誘起し、かつ、ＢＲＳＶに特異的で、細胞性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫から選択される免疫応答を誘起するように、修飾生ＢＲＳウイルス、アジュバント、および医薬上許容される担体からなるワクチン組成物であり、ここで該アジュバントがスクアランおよびスクアレン；ブロックコポリマー；洗浄剤；クイルＡ、鉱油、植物油；コリネバクテリウム由来のアジュバント；プロピオニバクテリウム由来のアジュバント；ウシ型結核菌；インターロイキン；モノカイン；腫瘍壊死因子；インターフェロン；サポニン-水酸化アルミニウムまたはクイル-Ａ水酸化アルミニウムの組み合わせ；リポソーム；イスコムアジュバント；ミコバクテリア細胞壁抽出物；合成グリコペプチド；アブリジン；脂質Ａ；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥ-デキストラン、または、リン酸アルミニウムを添加したＤＥＡＥ-デキストラン;カルボキシポリメチレン；ＥＭＡ；アクリルコポリマー乳濁液；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタンパク；サブウイルス粒子アジュバント；コレラ毒素；ジメチルジオクレデシルアンモニウムブロミド；およびそれらの混合物からなる群より選択されるところの、ワクチン組成物。
【請求項２】
アジュバントがポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーおよび不飽和テルペン炭化水素からなる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
不飽和テルペン炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、コポリマーが平均分子量３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し、ポリオキシエチレン成分が全分子の１０〜２０％を構成する請求項２記載の組成物。
【請求項４】
コポリマーが０．０１〜１％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在し、炭化水素成分が０．０２〜２％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在する請求項２記載の組成物。
【請求項５】
アジュバントが付加的に界面活性剤を含有する請求項２記載の組成物。
【請求項６】
アジュバントがまた０．００１５〜０．２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在する界面活性剤を含有する請求項４記載の組成物。
【請求項７】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである請求項５または６記載の組成物。
【請求項８】
炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、コポリマーが平均分子量３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し、ポリオキシエチレン成分が全分子の１０〜２０％を構成する請求項４記載の組成物。
【請求項９】
さらにウシ鼻気管炎ウイルス（ＢＨＶ−ＩＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、およびパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ−３Ｖ）を含有する請求項１〜８のいずれか記載の組成物。
【請求項１０】
ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物を免疫するためのワクチン組成物であって、
該組成物が一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与えるように、修飾生ＢＲＳウイルス、医薬上許容される担体、および、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーおよび不飽和テルペン炭化水素からなるアジュバントからなるワクチン組成物。
【請求項１１】
炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、コポリマーが平均分子量３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し、ポリオキシエチレン成分が全分子の１０〜２０％を構成する請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
ブロックコポリマーが０．０１〜１％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在し、有機成分が０．０２〜２％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在する請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
アジュバントが付加的に０．００１５〜０．２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在する界面活性剤を含有する請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
さらにウシ鼻気管炎ウイルス（ＢＨＶ−ＩＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、およびパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ−３Ｖ）からなる群から選択される少なくとも１種の修飾生ウイルスを含有する請求項１０〜１４のいずれか記載の組成物。
【請求項１６】
ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）によって引き起こされる疾患に対して動物を防御する方法であって、
該組成物が一回投与後にＢＲＳＶ感染からの防御免疫を誘起し、かつ、ＢＲＳＶに特異的で、細胞性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫から選択される免疫応答を誘起するように、修飾生ＢＲＳウイルス、アジュバント、および医薬上許容される担体からなり、ここで該アジュバントがスクアランおよびスクアレン；ブロックコポリマー；洗浄剤；クイルＡ、鉱油、植物油；コリネバクテリウム由来のアジュバント；プロピオニバクテリウム由来のアジュバント；ウシ型結核菌；インターロイキン；モノカイン；腫瘍壊死因子；インターフェロン；サポニン-水酸化アルミニウムまたはクイル-Ａ水酸化アルミニウムの組み合わせ；リポソーム；イスコムアジュバント；ミコバクテリア細胞壁抽出物；合成グリコペプチド；アブリジン；脂質Ａ；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥ-デキストラン、または、リン酸アルミニウムを添加したＤＥＡＥ-デキストラン;カルボキシポリメチレン；ＥＭＡ；アクリルコポリマー乳濁液；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタンパク；サブウイルス粒子アジュバント；コレラ毒素；ジメチルジオクレデシルアンモニウムブロミド；およびそれらの混合物からなる群より選択されるところの、免疫原性医薬組成物を該動物に投与する工程からなる方法。
【請求項１７】
前記ウイルスが１ミリリットルあたり１０３〜１０６感染単位の範囲内で存在する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記投与工程が、筋肉内、皮下、腹腔内、経口、および鼻腔内投与の１つからなる請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
アジュバントが最終濃度０．０１〜１％（ｖ／ｖ）のポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーおよび最終濃度０．０２〜２％（ｖ／ｖ）の不飽和テルペン炭化水素からなる請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
アジュバントが付加的に最終濃度０．００１５〜０．２０％（ｖ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含有する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
炭化水素がスクアレンおよびスクアランの一方であり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり、コポリマーが平均分子量３２５０〜４０００のポリオキシプロピレン成分を有し、ポリオキシエチレン成分が全分子の１０〜２０％を構成する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
さらにウシ鼻気管炎ウイルス（ＢＨＶ−ＩＶ）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、およびパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩ−３Ｖ）の同時投与を包含する請求項１６〜２１のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に受容動物に一回量で投与するのに適した修飾生ワクチンを採用して、ウシ呼吸器シンシチア（ＲＳ）ウイルス（ＢＲＳＶ）に対する防御免疫を誘発する改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）は、ウシ呼吸器疾患症候群（ＢＲＤＣ）の重要な病因因子であると認識されている。この疾患は、急速な呼吸、咳、食欲の減退、眼や鼻の分泌物、および高い体温によって特徴づけられる。急性発生の場合、徴候の発現から４８時間以内に死に至りうる。
ＢＲＳＶは、乳児期の子ウシを含めて、あらゆる年齢のウシに感染する。ＢＲＳＶは、子ウシの流行性肺炎の最も一般的なウイルス病原体であると考えられ、新たに離乳した子ウシの肺気腫とも関連している。それゆえ、このウイルスに対する有効な予防法が子ウシや乳牛において必要とされている。
ＢＲＳＶに対する防御免疫を確立することは問題がある。いくつかの他のウイルス性疾患の場合のように、ＢＲＳＶに対する血清抗体のレベルは、疾患に対する防御と必ずしも相関してしない。この現象は、ＢＲＳＶに向けて局所的に産生されたＩｇＡに対する役割（キムマン（Kimman）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J. Clin. Microbiol.）25：1097-1106，1987）および／または細胞性免疫がこのウイルスに対する有効な防衛を行う必要条件を反映しうる。乳児期の子ウシの防御免疫を確立することは、ＢＲＳＶに対する母系抗体が注入された免疫原を枯渇させ、ワクチンを効果的に中和しうるので、付加的な障害を与える。最後に、多数回のワクチン接種が不便で経費の掛かることから、一回量（single-dose）ワクチンが望まれている。それゆえ、当該分野では、活力のある多面的な免疫応答を誘起する一回投与（one-dose）ＢＲＳＶワクチン製剤が必要とされている。
【０００３】
従来技術のＢＲＳＶワクチンに対する標準的な投与計画は、二回投与（two doses）である（ストット（Stott）ら、ジャーナル・オブ・ハイジーン・オブ・ケンブリッジ（J. Hyg. Camb.）93：251-261，1984；トーマス（Thomas）ら、アグリ-プラクティス（Agri-Practice）5：1986；およびシブルード（Syvrud）ら、ヴェテリナリー・メディスン（Vet. Med.）83：429-430，1988；ヴェテリナリー・ファーマシューティカルズ・アンド・バイオロジカルズ（Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals)，第８版，1993/94年，484，740-741，956-960，982-983頁)。クセラ（Kucera）ら（アグリ-プラクティス（Agri-Practice)，ヴェテリナリー・メディスン（Vet. Med.）Vol.78，1983年10月，1599-1604頁，1983）に示されているように、一回の実験的なＢＲＳＶワクチン接種はＢＲＳＶに対して比較的低いレベルの血清中和（ＳＮ）抗体価を誘発したが、ワクチンの二回投与は１：１０〜１：３２０のＳＮ抗体価を誘起した。さらに、野外試験の間に明らかにＢＲＳＶに接触した牛群の場合、呼吸器疾患の治療を必要としたのが、一回量および二回量ワクチンを接種された動物では、それぞれ２７％および２１％であったのに比べて、ワクチン接種を受けなかった動物では、約４８％であった。しかしながら、野外試験における呼吸器疾患の原因因子がＢＲＳＶであるという決定的な証明は行われなかった。また、一回量ワクチンが非常に免疫原性であるわけではないことが注目された。その後の評価によると、良好な防御を得るには、このワクチンを二回投与することが必須であるらしいと結論された（ボーバイン・ベテリナリー・フォーラム（Bovine Vet. Forum）1：No.2，2-16頁，1986；シブルード（Syvrud）ら、ヴェテリナリー・メディスン（Vet. Med.）429-430,1988)。欧州特許出願第129,923号（1985年２月１日付で公開され、1988年７月９日付で特許として発行された）には、水中油型の乳剤として処方された１種またはそれ以上の抗原（特に不活化インフルエンザウイルス）を含有する不活化ワクチンに生ワクチンを溶解することからなるＢＲＳＶ生ワクチンの調製方法が記載されている。まだ母系免疫を有する若い動物では、血清学的応答が得られた。この出願には、ＢＲＳＶおよびアジュバントを含有する修飾生製剤も記載されている。しかしながら、ＢＲＳＶ攻撃に対するＢＲＳＶワクチンの防御効力に関するデータは全く示されなかった。
【０００４】
本発明のある目的は、ＢＲＳＶに対する有効なワクチンを提供することであり、かかるワクチンは防御免疫を誘起し、かつ、このウイルスによって引き起こされる疾患を予防する。
本発明のさらなる目的は、ＢＲＳＶワクチンに用いるのに適したアジュバントを提供することである。このアジュバントは、かかるワクチンの一回量を投与した後に防御免疫を誘起するようにウイルスの免疫原性を増強する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ブロックコポリマー（例えば、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレン（ＰＯＰ-ＰＯＥ）ブロックコポリマー（好ましくは、プルロニック  （PluronicR）Ｌ１２１（例えば、米国特許第4,722,466号)）など）および有機成分（例えば、代謝可能な油（例えば、不飽和テルペン（turpin）炭化水素（好ましくは、スクアラン（２,６,１０,１５,１９,２３-ヘキサメチルテトラコサン）またはスクアレン)）など）からなる、免疫応答を増強する組成物を包含する。この組成物はまた、非イオン性の洗浄剤または界面活性剤（好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、ツイーン（TweenR）洗浄剤 （最も好ましくは、ツイーン（TweenR)-８０（すなわち、ポリオキシエチレン （２０）ソルビタンモノオレエート)）など)）を含有してもよい。
【０００６】
この保存アジュバント混合物において、ブロックコポリマー、有機油、および界面活性剤は、それぞれ約１０〜約４０ｍｌ/Ｌ、約２０〜約８０ｍｌ/Ｌ、および約１.５〜約６.５ｍｌ/Ｌの範囲内の量で存在しうる。保存アジュバントの好ましい具体例では、有機成分は約４０ｍＬ/Ｌの量で存在するスクアランであり、界面活性剤は約３.２ｍｌ/Ｌの量で存在するポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ツイーン（TweenR）-８０）であり、ＰＯＰ-ＰＯＥブロックコポリマーは約２０ｍｌ/Ｌの量で存在するプルロニック（PluronicR）Ｌ１２１である。プルロニック（PluronicR）Ｌ１２１は、１５〜４０℃で液体のコポリマーである。なお、ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）成分は分子量が３２５０〜４０００であり、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）成分は全分子の約１０〜２０％（好ましくは、１０％）を構成する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、上記アジュバントおよび医薬上許容される安定剤、担体または希釈剤と組み合わせた修飾生ＢＲＳウイルスからなる、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物を免疫する免疫原性組成物を提供する。アジュバントは、約１〜２５％（ｖ/ｖ)（好ましくは、５％（ｖ/ｖ)）の最終濃度で、このワクチン組成物中に存在する。この組成物はまた、他のウイルス（例えば、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ)、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ)、およびパラインフルエンザ３型（ＰＩ-３Ｖ)）を含有してもよく、筋肉内または皮下経路で投与すればよい。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、修飾生ＢＲＳＶおよびアジュバントからなる上記ワクチンの一回量を投与することによって、ウシＲＳウイルスによって引き起こされる疾患に対して動物を保護する方法を提供する。
【０００９】
ここで引用するすべての特許、特許出願、および他の文献は、出典を示すことによって、それらの全体を明細書の一部とする。矛盾が生じる場合には、本開示が優先する。
【００１０】
ここで用いるように、「修飾生ワクチン」は、疾患を引き起こす能力を弱めるために、典型的には組織培養細胞中に通過させることによって、変性されているが、動物に投与された場合には、疾患または感染に対して防護する能力を保持しているウイルスからなるワクチンである。
「アジュバント」とは、ワクチン組成物中でＢＲＳＶと組み合わせた場合に、ＢＲＳＶの免疫原性および効力を増強する１種またはそれ以上の物質からなる組成物を意味する。
ＢＲＳＶの「感染単位」は、ＴＣＩＤ５０、すなわち組織培養細胞の５０％を感染または死滅させるのに必要なウイルスの量として定義される。
【００１１】
本発明は、一回量での投与に適した、ＢＲＳＶに対するワクチンを提供する。このワクチンは、修飾生ウイルス品種のものである。これは、ウイルスの病原性を低減するが、その免疫原性および／または効力は保存するという利点を与える。  このワクチンは、当該分野で標準的な方法によって、新しく採取されたウイルス培養物から調製すればよい（以下の実施例１を参照)。すなわち、ウイルスは、ヒト二倍体繊維芽細胞または好ましくはＭＤＢＫ（マーディン-ダービィ(Madin-Darby）ウシ腎臓）または他のウシ細胞などの組織培養細胞中で増殖させればよい。ウイルスの増殖を標準的な技術（細胞変性効果の観察、免疫蛍光または他の抗体に基づく測定法）によってモニターし、充分に高いウイルス力価が達成されたら採取する。保存ウイルスは、ワクチン製剤に配合する前に、従来法によって、さらに濃縮または凍結乾燥してもよい。他の方法（例えば、トーマス（Thomas）ら、アグリ-プラクティス（Agri-Practice）V.7 No.5，26-30頁に記載のもの）を採用することができる。
【００１２】
本発明のワクチンは、１種またはそれ以上の医薬上許容される安定剤、担体およびアジュバントと組み合わせた修飾生ワクチンからなる。使用に適した担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、最少必須培養液（ＭＥＭ)、または、ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加したＭＥＭが挙げられる。安定剤としては、ショ糖、ゼラチン、ペプトン、消化タンパク抽出物（例えば、ＮＺ-アミンまたはＮＺ-アミンＡＳなど）が挙げられるが、これらに限定されない。特に、本発明は、修飾生ウイルスの免疫原性を増強し、かつ、防御免疫を誘起するための一回投与を規定するアジュバントを包含する。
【００１３】
適当なアジュバントの非限定的な例としては、スクアランおよびスクアレン （または動物起源の他の油)；ブロックコポリマー（例えば、プルロニック（PluronicR)（Ｌ１２１）サポニンなど)；洗浄剤（例えば、ツイーン（TweenR）-８０など)；クイル（QuilR）Ａ、鉱油（例えば、ドラケオール（DrakeolR）またはマルコール（MarcolR）など)、植物油（例えば、落花生油など)；コリネバクテリウム（Corynebacterium）由来のアジュバント（例えば、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）など)；プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）由来のアジュバント（例えば、プロピオンバクテリウム・アクネ （Propionibacterium acne）など)；ウシ型結核菌（カルメットおよびゲラン桿菌、すなわちＢＣＧ)；インターロイキン（例えば、インターロイキン２およびインターロイキン１２など)；モノカイン（例えば、インターロイキン１など)；腫瘍壊死因子；インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロンなど)；組合せ（例えば、サポニン-水酸化アルミニウムまたはクイル（QuilR）-Ａ 水酸化アルミニウムなど)；リポソーム；イスコム（iscom）アジュバント；ミコバクテリア細胞壁抽出物；合成グリコペプチド（例えば、ムラミルジペプチドまたは他の誘導体など)；アブリジン(Avridine)；脂質Ａ；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥ-デキストラン、または、リン酸アルミニウムを添加したＤＥＡＥ-デキストラン;カルボキシポリメチレン（例えば、カルボポール（CarbopolR）など)；ＥＭＡ；アクリルコポリマー乳濁液（例えば、ネオクリル（NeocrylR）Ａ６４０（例えば、米国特許第5,047,238号）など)；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタンパク；サブウイルス粒子アジュバント（例えば、オルビウイルスなど)；コレラ毒素；ジメチルジオクレデシルアンモニウムブロミド；またはそれらの混合物が挙げられる。
好ましいアジュバント混合物の処方は、以下の実施例２に記載されている。
【００１４】
本発明のワクチンは、好ましくは筋肉内または皮下経路によって投与することができ、また、それほど好ましくはないが、鼻腔内、腹腔内、または経口経路によって投与することもできる。
【００１５】
一回量で投与する場合、このワクチンは、約１０３．０〜約１０６．０ ＴＣＩＤ５０/ｍｌ、好ましくは１０４〜１０５ ＴＣＩＤ５０/ｍｌに相当する量のＢＲＳＶを含有している必要がある。動物１頭あたり、約１〜５ｍｌ、好ましくは２ｍｌを、筋肉内、皮下、または腹腔内に投与すればよい。１〜１０ｍｌ、好ましくは２〜５ｍｌを経口または鼻腔内に投与してもよい。
【００１６】
以下の実施例は、本発明を、その範囲を限定することなく、さらに詳しく説明することを意図するものである。
実施例１：ＢＲＳＶの増殖および採取
Ａ）保存ウイルスの説明：
ＢＲＳＶは、多くの容易に入手可能な供給源から得ることができる。ある具体例では、ＢＲＳＶ３７５株を用いればよい。このＢＲＳＶの病原性株は、アイオワ州立大学（エイメス（Ames)、アイオワ）由来であった。いかなる適当なＢＲＳＶ株も意図しており、本発明の範囲内に包含される。同様に、ＢＨＶ-１、ＢＶＤＶ、およびＰＩ-３Ｖは、容易に入手可能なウイルスである。病原性の形態で得た場合、これらのウイルスは、公知手段によって弱毒化し、ワクチン用に適した修飾生ウイルスを与えることができる。また、ウイルスは、従来法によって死菌とし、ワクチン用に適した不活化ウイルスを与えることもできる。ワクチン用にウイルスを弱毒化または不活化する方法は、公知である。修飾生および／または死菌ＢＲＳＶ、ＢＨＶ-１、ＢＶＤＶ、およびＰＩ-３Ｖウイルスワクチンは公知であり、市販品を利用することができる。例えば、トーマス（Thomas）ら、前掲文献、およびヴェテリナリー・ファーマシューティカルズ・アンド・バイオロジカルズ（Veterinary Pharmaceuticals ＆ Bio logicals)、前掲および付録２，A-31-45を参照されたい。
【００１７】
Ｂ）細胞培養：
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから、ＢＶＤを含まないＭＤＢＫ（ＮＢＬ-１）細胞系を購入した。それは、１０％(ｖ/ｖ）までのウシ血清、０.５％までのラクトアルブミン加水分解物（ジェイ・アール・エイチ（ＪＲＨ)、レネクサ（Lenexa)、ＫＳ)、３０ｍｃｇ/ｍｌまでのポリミキシンＢ（ファイザー（Phizer)、ＮＹ、ＮＹ）およびネオマイシン（アップジョン（Upjohn)、カラマズー（Kalamazoo)、ＭＩ)、および２.５ｍｃｇ/ｍｌまでのアンホテリシンＢ(シグマ・ケミカルズ・カンパニー（Sigma Chemical Co.)、セントルイス（St. Louis)、ＭＯ）を補足したＯptiＭＥＭ（ギブコ（Gibco)、グランド・アイランド（Grand Island)、ＮＹ）中で保持した。また、細胞増殖を維持する必要があるなら、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、Ｌ-グルタミンおよび塩化カルシウムを添加してもよい。
ウイルス増殖用には、ＯptiＭＥＭ、イーグル（Eagle）ＭＥＭ、メディウム （Medium）１９９または等価な培養液を、２％までのウシ血清、０.５％までのウシ血清アルブミン、０.５％までのラクトアルブミン加水分解物、３０ｍｃｇ/ｍｌまでのポリミキシンＢおよびネオマイシン、および２.５ｍｃｇ/ｍｌまでのアンホテリシンＢを補足する。また、細胞増殖を維持する必要があるなら、ピルビン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、Ｌ-グルタミンおよび塩化カルシウムを添加してもよい。
【００１８】
Ｃ）培養物の接種：
１：５〜１：５,０００感染単位/細胞の感染多重度を用いて、ＭＤＢＫ細胞の個々の準密集培養物にＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ、ＰＩ-３Ｖ、またはＢＨＶ-１Ｖを接種した。これら細胞の増殖培養液を捨て、ウイルス増殖培養液（前記参照）で置き換えた後、種ウイルスを培養容器に直接添加した。ウイルス感染した培養物を３６℃で保持した。
ウイルス増殖は、細胞変性効果を顕微鏡で調べるか、あるいは、蛍光抗体染色法によって測定した。ＢＲＳＶの場合、感染細胞は融合細胞および伸長した紡錘状形細胞の形成を示したが、それらは実質的に完全細胞シートを含むまで進行した。ＢＨＶ-１Ｖの場合、感染細胞は、細胞質顆粒化を示した後、感染細胞の円形化および／または風船様拡大を示す。ＢＶＤＶの場合、感染細胞は、細胞内液胞を形成し、集合し、細胞を欠く区画領域が残る。ＰＩ-３Ｖ-感染細胞における細胞変性変化は、ＢＨＶ-１Ｖ-感染細胞におけるものと同様である。
【００１９】
Ｄ）ウイルスの採取：
培養液を滅菌容器に採取した。多数回の採取は、５０％の細胞シートが特徴的な細胞病理を示したときに始め、１００％の細胞が影響を受けるまで続ければよい。ウイルス液は、必要に応じて、遠心または濾過によって清澄化してもよい。ウイルス液は、−５０℃またそれ以下で保存するか、または凍結乾燥して２〜８℃で保存する。
最終ワクチンを調製するためには、保存ウイルスを単独または組み合わせてアジュバントと混合する。
液体保存ウイルスを用いる場合には、１９部の保存ウイルスを１部のアジュバント（好ましくは、実施例２のアジュバント）と混合する。凍結乾燥保存ウイルスを用いる場合には、生理食塩水溶液中の５％（ｖ/ｖ）希釈溶液を調製する（１部のアジュバントと１９部の生理食塩水とを混合する)。凍結乾燥保存ウイルスを希釈アジュバントで復元（再水和）して、最終ワクチン組成物を形成する。最終処方物には、１：１０,０００の最終濃度までチメリゾールを添加してもよい。
【００２０】
実施例２：好ましい保存アジュバントの処方
本発明で用いるのに好ましいアジュバントは、以下の処方に従って調製した：
【表１】
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これらの成分を混合し、安定な塊または乳濁液が形成されるまで均質化する。均質化の前に、これらの成分または混合物をオートクレーブに付すことができる。乳濁液は、さらに濾過滅菌してもよい。ホルマリンは、０.２％の最終濃度まで添加してもよい。チメロサールは、１：１０,０００の最終希釈倍率まで添加してもよい。
【００２１】
実施例３：修飾生ＢＲＳＶワクチンの増強
この実験用として、２種のＢＲＳＶワクチンを調製したが、その一方は実施例２に記載のアジュバント混合物を含有しており、他方はそれを含有していなかった。アジュバントを欠くワクチンは２ｍｌあたり２.５２ ｌｏｇ感染単位のＢＲＳＶを含んでいたが、アジュバントを含有するワクチンは２ｍｌあたり２.９６ ｌｏｇ感染単位および５％（ｖ/ｖ）アジュバントを含んでいた。
２０頭のウシの各々に、アジュバントを欠くワクチンを２ｍｌ量ずつ投与したが、そのうち１０頭には筋肉内投与し、残りの１０頭には皮下投与した。さらに５頭のウシに、アジュバントを含有するワクチンを２ｍｌ量ずつ投与した。すべてのワクチン接種を２１日目に繰り返した。血清試料は２回目のワクチン接種後６日目に取得し、これを抗ＢＲＳＶ血清中和抗体の存在について試験した。血清中和抗体アッセイについては、実施例４に記載する。
この実験の結果によると、アジュバント含有ＢＲＳＶワクチンを接種した５頭の子ウシのうち４頭が抗ＢＲＳＶ抗体の形跡（セロコンバージョン）を示したが、アジュバントを欠くＢＲＳＶワクチンを接種した２０頭の動物は全く抗体の形跡を示さなかった。このことは、実施例２に記載のアジュバントが修飾生ＢＲＳＶワクチンの免疫原性を増強する性質を有することを示している。
【００２２】
実施例４：修飾ＢＲＳＶワクチンの一回量投与
以下のワクチン接種および攻撃実験は、アジュバントと処方した単一免疫化修飾生ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）がウシの防御免疫を誘起するか否かを決定するために実施した。第二に、この実験は、修飾生ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ-１またはＩＢＲＶ)、およびウシパラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）の同時投与がＢＲＳＶに対する防御免疫の誘起を妨害するか否かを決定するために設計した。
【００２３】
Ａ）実験的ワクチン：
マスター種から５継代目の修飾生ウシＲＳウイルス （ＢＲＳＶ）を、保存マスター細胞２０継代目のマーディン・ダービー（Madin Darby）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞上で増殖させた。簡単に説明すると、ＭＤＢＫ細胞は、５％ウシ血清、０.５％ＬＡＨ、および３０μｇ/ｍＬゲンタマイシンを含有する最少必須培養液（ＭＥＭ）を入れた回転ボトルあたり３×１０７個の細胞という密度で、８５０ｃｍ２の回転ボトルに移植した。細胞は、ウイルスを感染させる前に、３７℃で２日間増殖させた。回転ボトルから培養液を傾瀉し、ボトルあたり１００ｍＬのウイルス増殖培養液（２％ウシ血清、０.５％ＬＡＨ、および３０μｇ/ｍＬゲンタマイシンを含有するＭＥＭ）中に１：６００の感染多重度でウイルスを添加した。感染の７日後に、１００％細胞病理学が示され、上澄み液を採取した。ウイルスを２５％（ｖ/ｖ）ＳＧＧＫ３安定剤で安定化させ、凍結乾燥した。ワクチン接種日に、生理食塩水希釈液中に希釈した５％（ｖ/ｖ）アジュバントで凍結乾燥ウイルスを復元した（実施例２を参照)。復元ＢＲＳＶウイルスは、ＰＩ３、ＢＶＤＶ、およびＢＨＶ-１ウイルスと合わせた。ワクチンの各成分の力価は、ワクチン接種日の力価測定を繰り返すことによって測定した。
【００２４】
Ｂ）用いた実験動物：
この実験には合計３０頭のウシを用いた。これらのウシは、試験動物についてはワクチン接種日に、また、対照については攻撃日に、血清中和（ＳＮ）抗体価が２未満であることによって示されるように、ＢＲＳＶに対して感受性である。動物は屋外で飼育したが、３方向が囲われ南側が開口したシェルターに近づけるようにした。対照は、ワクチンウイルスと接触するのを避けるために、攻撃前にワクチン接種を受けた動物から隔離して飼育した。完全な食餌を１日１回与え、干し草および水は自由に供給した。
【００２５】
Ｃ）ワクチン接種：
ワクチンを接種すべき動物に、２ｍＬ容量の混合型ワクチンを１回投与した。２０頭の動物にワクチン接種を（１０頭は皮下経路で、１０頭は筋肉内経路で）行ったが、残りの１０頭の動物は、ワクチン接種を行わずに、攻撃対照として供した。
【００２６】
Ｄ）実験的攻撃：
ワクチン接種の１４日後に、動物を病原性ＢＲＳＶウイルスで攻撃した。最少限の１０５．７ ＴＣＩＤ５０の病原性ＢＲＳＶウイルスをエアゾール攻撃によって３日間連続で各々の子ウシに投与した。
【００２７】
Ｅ）臨床的観察：
ウシは、疾患および発熱（直腸体温）の臨床的徴候について、攻撃の２日前から１４日後まで毎日観察した。ウシは、鼻や眼の分泌物、結膜炎、咳、呼吸困難、食欲不振、およびうつ病を含む（これらに限定されない）ＢＲＳＶ感染の徴候について観察した。直腸体温は、観察期間を通して毎日記録した。
【００２８】
Ｆ）アッセイ：
１．血清中和抗体アッセイ（ＳＮ）
１００〜５００のＴＣＩＤ５０のＢＲＳＶを用いた変動血清・一定ウイルス中和試験においては、熱不活化血清の系列希釈物を、等量のウイルス懸濁液と混合した。血清ウイルス混合物は３７℃で１時間インキュベートし、次いで９６穴マイクロタイタープレート中のＶＥＲＯ細胞に接種した。ＳＮ抗体価の存在は、細胞変性効果によって検出されるウイルスの不在によって示された。ＳＮ抗体価の測定に際して、５０％中和終点は、リード（Reed）およびミュンヒ（Muench）の方法に従って計算した。
【００２９】
２．ワクチンの最終希釈物中におけるウイルスの力価測定
ワクチンのＢＲＳＶウイルス力価は、ワクチン接種日の力価測定を繰り返すことによって測定した。簡単に説明すると、混合型ワクチンを、適当な中和抗血清と合わせた。ワクチンおよび抗血清の混合物は、３７℃で４５〜６０分間インキュベートした。ワクチンおよび抗血清の系列希釈物を調製し、ＶＥＲＯ細胞に接種した。ウイルスの存在は、細胞変性効果の存在によって示され、特異的な免疫蛍光法（ＦＡ）によって確認した。ウイルス力価は、リード（Reed）およびミュンヒ（Muench）の方法によって、各レプリケートについて計算した。ワクチンのＢＲＳＶ画分の平均的な力価は、１０３．４ ＴＣＩＤ５０/投与量であった。
【００３０】
３．攻撃ウイルスの力価測定
投与したＢＲＳＶ攻撃ウイルスの希釈物を系列希釈し、９６穴マイクロタイタープレート中のＭＤＢＫ細胞に接種した。ウイルスの存在は、細胞変性効果の存在によって示され、ウイルス単離について説明したように、特異的免疫蛍光法によって確認した。
結果を解釈するために、臨床スコアを以下のように割り当てた：
【表２】
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【００３１】
屋外で飼育したウシの場合、軽度の漿液性の鼻や眼の分泌物は正常であると見なした。発熱は、それが基準体温よりも少なくとも１度高い場合のみを有意であると見なした。基準体温は、攻撃前日および攻撃当日の各動物の平均体温として測定した。
各動物の全臨床スコアを総計した。ワクチン接種動物および対照の臨床スコアを、マン・ホイットニー・ランクド・サム・アナリシス（Mann Whitney Ranked Sum Analysis）によって比較した。
【００３２】
疾患の臨床的徴候は、攻撃の５〜１０日後の対照ウシにおいて観察された（表１)。すべての対照（１００％）は、複数の日に呼吸器系疾患の徴候を有していることが観察された。呼吸器系疾患の特異的徴候としては、重度の漿液性鼻分泌物（実際に鼻孔から垂れる分泌物)、粘液膿性鼻分泌物、眼の分泌物および咳が挙げられる。対照子ウシについての平均的な臨床スコアは、３.７であった。
比較すると、ワクチン接種を受けた動物では、呼吸器系の徴候がほとんど見られなかった。ワクチン接種を受けた動物のうち、何らかの呼吸器系の徴候を示したのは、わずか４０％であり、複数の日に臨床的徴候を示したのは、わずか２頭（１０％）であった。ワクチン接種群の平均的な臨床スコアは１.０であった。マン・ホイットニー・ランクド・サム・アナリシス（Mann Whitney Ranked Sum Analysis）によって対照と比較すると、ワクチン接種を受けた動物には、臨床的疾患の統計学的に有意な低減が見られた（ｐ＜０.０５)。
【００３３】
これらのデータは、本発明によるアジュバント添加修飾生ＢＲＳＶウイルスワクチンの一回量投与が病原性ＢＲＳＶの攻撃に対する防御を与えることを示している。このワクチンおよび方法は、他のワクチンをＢＲＳＶワクチンと同時投与した場合にさえ有効である。
【００３４】
それゆえ、本発明は、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）による感染に対して動物を免疫するためのワクチン組成物を提供する。このワクチンは、修飾生ＢＲＳウイルス、アジュバント、および医薬上許容される担体からなり、かかる組合せは一回投与後にＢＲＳＶ感染からの免疫を与え、かつ、ＢＲＳＶに特異的で、細胞性免疫および局所（分泌型ＩｇＡ）免疫から選択される免疫応答を誘起する。
【００３５】
細胞性免疫としては、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞および遅延型過敏反応Ｔ細胞の刺激、ならびに、マクロファージ、単球および他のリンホカインやインターフェロン産生の刺激が挙げられる。細胞性免疫の存在は、従来のインビトロおよびインビボ・アッセイで評価し得る。分泌型ＩｇＡなどの局所免疫は、１〜２またはそれより大きい血清中和抗体価を示す従来のＥＬＩＳＡまたはＩＦＡアッセイによって評価することができる。本発明によれば、その結果生じる細胞性免疫または局所免疫は、ＢＲＳＶに特異的であるか、あるいは、それと関連している。