(57)【要約】【課題】六価クロムの還元能力に優れ、六価クロムを含有する環境のバイオレメディエーションに好適な微生物の活性化法を提供する。【解決手段】放線菌（Actinomycetales）目に属する微生物であって、受託番号FERM P-20563で寄託された放線菌ST13株を、廃糖蜜含有培地で活性化して六価クロムを除去する方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌（Actinomycetales）目に属し、受託番号FERM P-20563で寄託された放線菌ST13株である六価クロムを還元する能力を有する微生物に、廃糖蜜含有培地で栄養を供給する微生物活性化方法。
【請求項２】
請求項１記載の微生物と廃糖蜜含有培地を六価クロムに接触させる、六価クロム還元方法。
【請求項３】
廃糖蜜含有培地の廃糖蜜含有量が約0.056％（重量/重量）以上である、請求項１記載の微生物活性化方法。
【請求項４】
六価クロムを含有する環境に対して、請求項１記載の微生物と培地を接触させる環境浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境汚染物質として知られる六価クロムを還元できる微生物の活性化方法に関し、また、この微生物の活性化方法を利用した六価クロム還元方法及び環境浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステンレスなどの各種合金の成分として重要な金属であるクロムには、金属クロム、三価クロム、六価クロムという３種類の形がある。このうち、六価クロムは、生体毒性と発がん性を示すことが知られており、工場廃水や土壌といった各種環境に含まれることで深刻な環境問題を惹起している。例えば、クロムメッキ工場などの跡地においては、土壌中に六価クロムを含有している可能性があり、その土地の再利用には浄化の必要性がある。
【０００３】
一般に、汚染環境の修復としては、環境中に含まれる環境汚染物質を化学的或いは生物学的に処理して無毒化している。六価クロムについては、一般的に、化学的処理により三価クロムに無毒化される。六価クロムを除去する化学処理方法としては、酸性溶液中で亜硫酸水素ナトリウムなどの還元剤を添加して、六価クロムから三価クロムに還元している。しかし、この化学処理法には、六価クロムの濃度が低いと処理効率が悪くなるといった問題がある。さらに、六価クロムの還元に使用する還元剤そのものが有害物質であるといった問題もある。
【０００４】
このような問題に対する有効な手段として、生物学的に六価クロムを還元する手法が検討されている。すなわち、バイオレメディエーション（Bioremediation）の技術を適用し、環境中に含まれる六価クロムを三価クロムに還元することで、効率的に低コストで環境浄化できることが期待されている。
【０００５】
しかしながら、従来、六価クロム還元能を有する微生物としては、例えば特許文献１に開示された微生物がしらているが、その還元能力の低さから実用化にいたっていない。これに対して特許文献２に開示された微生物は、六価クロム還元能を有する従来の微生物と比較して、優れた六価クロム還元能を有する。この微生物を使用することによって、環境中に含まれる六価クロムを効率的に還元し、当該環境の無害化を低コストで実現することが可能となった。
【０００６】
バイオレメディエーションは上述の利点を持つが、浄化完了までに時間がかかるという欠点も存在する。微生物による六価クロム還元を行うためには、そのための栄養を供給する必要がある。微生物を培養するための培地は栄養源として使用できる。栄養源として廃糖蜜を六価クロム汚染個所に直接添加して、該環境中に存在する環境微生物の六価クロム浄化作用を利用する方法が特許文献３、４および５に記載されている。しかし、廃糖蜜を栄養源とする微生物が該環境中にいないか少ない場合には、浄化は困難である。浄化完了に要する時間を短縮できるか示されていない。さらに嫌気的な条件下を形成することが好ましいとされ、好気的な環境下での浄化に課題があった。また、単離された六価クロム還元微生物の培養に、廃糖蜜を炭素源として利用する方法が非特許文献１に記載されているが、浄化に多くの時間を要しており、微生物が直接利用できるグルコースを利用した場合よりも活性化効率が上がっているか示されていない。
【０００７】
【特許文献１】特開2002-281960号公報
【特許文献２】特開2007-020540号公報
【特許文献３】米国特許第6143177号
【特許文献４】米国特許第6322700号
【特許文献５】特開2006-204963号公報
【非特許文献１】Elangovan, R., Ligy, P. Performance evaluation of variousbioreactors for the removal of Cr(VI) and organic matter from industrialeffluent. (2009) 44, p.4-186
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、六価クロムの還元能力に優れ、六価クロムを含有する環境のバイオレメディエーションに好適な微生物の活性化法、及びこれを用いた六価クロム還元方法並びに環境浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討したした結果、優れた六価クロム還元能を有する微生物の活性化に成功し、本発明を完成するに至った。なお、本発明者が使用した微生物は、平成17年6月14日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）にFERM P-20563として寄託されている。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を包含する。
【００１１】
(1)  放線菌（Actinomycetales）目に属し、受託番号FERM P-20563で寄託された放線菌ST13株である六価クロムを還元する能力を有する微生物に、廃糖蜜含有培地で栄養を供給する微生物活性化方法。
【００１２】
(2)  上記(1)の微生物と廃糖蜜含有培地を六価クロムに接触させる、六価クロム還元方法。
【００１３】
(3)  廃糖蜜含有培地の廃糖蜜含有量が約0.056％（重量/重量）以上である、上記(1)記載の微生物活性化法。
【００１４】
(4)  六価クロムを含有する環境に対して、上記(1)記載の微生物と培地を接触させる環境浄化方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、受託番号FERM P-20563で寄託された微生物に対して、従来の培養法（微生物が直接利用できるグルコースを栄養源として利用した培養法）で栄養を供給した場合と比較して、該微生物の六価クロム還元能を高めて短時間に浄化を完了できる。本発明の効果は好気的条件で有効である。本発明の栄養源を添加する培地としては、通常の微生物の生育に必要であって本微生物が資化可能であれば、どのような物質も使用可能である。例えば廃糖蜜以外の物質としてM9塩を利用したものも使用することが可能である。本発明に係る活性化した微生物を使用することによって、環境中に含まれる六価クロムを効率的に還元し、当該環境の無害化を低コストで実現することが可能となる。
【００１６】
以下にM9塩の組成を示す。
【００１７】
培地1リットル中に次の塩類を含む。Na2PO4:
6.2 g, KH2PO4: 3.0 g, NaCl: 0.5
g, NH4Cl: 1.0 g; pH7.0
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る微生物は、放線菌（Actinomycetales）目に属する微生物であって、受託番号FERM P-20563で寄託された放線菌ST13株である。本発明に係る廃糖蜜は、サトウキビ等から精糖した工程からできる副産物を指し、製造業者によらずほぼ一定のブッリクス、総糖分、灰分含量を有するものである。廃糖蜜を含有する培地で培養した放線菌ST13株は、微生物培養で一般に使用される培地で培養した放線菌ST13株と比較して、優れた六価クロム還元能を有するといった有利な特徴を備えている。
【００１９】
ここで、放線菌ST13株を特定する方法としてリボソームを構成するrRNA群のうち16S rRNAをコードするDNA（すなわち、16S rDNA）の部分塩基配列の比較を挙げることができる。塩基配列を比較して微生物を特定することは当業者にとって容易である。また微生物の特徴を形態学的、生化学的に比較することで放線菌ST13株を特定することができる。その比較によって微生物を特定することは当業者にとって容易である。
【００２０】
本発明の微生物活性法に関わる培地としては、廃糖蜜を含有する固体培地、液体培地のどちらであってもよい。六価クロムが存在する環境において、六価クロムに対して培地と活性化した微生物が有効的に接触する形態の培地が望ましい。
【００２１】
一方、本発明において、六価クロム還元能を測定する手法としては、特に限定されないが、例えば、六価クロムを含有する培地で供試菌株を培養し、培地中の六価クロムの減少量を測定するか三価クロムの増加量を測定する方法を挙げることができる。より具体的には、ジフェニルカルバジド比色法による六価クロムの定量分析により、液体培地中の六価クロムの減少量を測定しても良い。例えば、0.6mMの濃度で六価クロムを含有する液体培地で供試菌株を３日間程度培養し、液体培地に含まれる六価クロム量を経時的に測定する。六価クロム量は、例えば1,5-ジフェニルカルボノヒドラジド水溶液とサンプリングした液体培地とを混合し、波長540nmの吸光度を測定することで算出することができる。
【００２２】
したがって、このような手法を適用することで、廃糖蜜を添加した培地が放線菌ST13株の六価クロム還元能を高めるかを判別することができる。
【００２３】
本発明に係る活性化した微生物は、六価クロムを環境汚染物質として含有する環境の浄化に利用することができる。浄化対象の環境としては、液体廃棄物、工場排水等の水環境、スラッジ、表層土壌、地下の堆積物等の汚染土壌を含む、各種環境を挙げることができる。本発明に係る活性化した微生物を用いた環境浄化方法は、具体的には、従来公知のいわゆるバイオレメディエーション技術を適用して実現することができる。バイオレメディエーション技術としては、原位置処理プロセス及び移動処理プロセスのいずれを適用しても良いが、両者を組み合わせて適用しても良い。原位置処理プロセスとは、汚染環境の存在している場所で処理することを意味する。移動処理プロセスとは、地上にあるリアクター或いは専用の場所で汚染物質を処理すべく、汚染土壌や液体廃棄物を汚染環境の存在している場所以外に移動させて処理することを意味する。
【００２４】
いずれのプロセスを適用する場合であっても、本発明に係る活性化した微生物を浄化対象の環境に接触させることによって、当該環境に含まれる六価クロム量を減少させることができ、当該環境を無害化することができる。なお、環境に含まれる六価クロムが還元されて生成した三価クロムは従来公知の手法により、当該環境から水酸化クロムとして回収することも可能である。
【００２５】
例えばクロムメッキ工程の廃水処理においては、まずクロムメッキした試料の水による洗浄工程で排出される酸性の六価クロム含有水を、水酸化ナトリウムなどで適度に中和する。その後、処理すべき六価クロム含有水中の六価クロム濃度を水や培養液で適度に薄めて（例えば10分の1程度の濃度）放線菌ST13株を接触させる。一定時間、適度な温度で接触させることによって六価クロムを三価クロム含有水に変換する。このような処理プロセスによって安全かつ効率的に六価クロムを処理できる。接触の方法は、放線菌ST13株を培養している培養液と六価クロム含有水を混合して撹拌する方法や、フィルターなどで放線菌ST13株が漏れ出ないように詰め込まれているカラム状の容器に適当な流速で六価クロム含有水を1回または複数回通過させることなどを挙げることができるが、これら方法に限定されない。生成される三価クロム含有水の処理は、水酸化ナトリウムや水酸化カルシウムなどを添加する工程を次に行うことによって、水酸化クロムのスラッジ固形物として回収することが挙げられるが、この方法に限定されない。                                          
【実施例】
【００２６】
以下、本発明に係る微生物及びこれを用いた六価クロム還元方法を、実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
［実施例１］  廃糖蜜を添加した培地と微生物による六価クロム還元
微生物の培地としてグルコースM9培地とグルコース廃糖蜜M9培地およびISP培地を調製した。
【００２８】
グルコースM9培地（6.2 g/l Na2PO4、3.0
g/l KH2PO4、0.5 g/l NaCl、1.0 g/l
NH4Cl、0.5% (w/w) グルコース; pH 7.0）
【００２９】
グルコース廃糖蜜M9培地（6.2 g/l Na2PO4、3.0
g/l KH2PO4、0.5 g/l NaCl、1.0 g/l
NH4Cl、0.5% (w/w) グルコース、0.5% (w/w) 廃糖蜜; pH 7.0）
【００３０】
ISP培地（1 g Yeast extract、2.5 g Malt
extract、250 ml H2O、11 ml 1 M グルコース; pH 7.3）
【００３１】
放線菌ST13株をISP培地に示す液体培地で、27 ℃で48時間の前培養を行った。培養液を6000×gで5分間の遠心分離を行い、上清を除いた。培地を完全に取り除くために、M9塩の溶液を加えて微生物を再懸濁し、遠心分離を繰り返した。このM9塩溶液による洗浄を2回繰り返し、得られた菌体にグルコースM9培地またはグルコース廃糖蜜M9培地を添加して、分光光度計の600
nm吸光度が約2になるように微生物を懸濁した。これらの微生物懸濁培地に対して、10 mM CrO3溶液を終濃度0.1
mMになるように添加した。これを好気的に27 ℃、200 rpmで振盪培養器にて培養した。一定時間後に培養液をサンプリングして6000×gで5分間の遠心分離を行い、上清液に含まれる六価クロム濃度を測定した。測定値は、以下の方法で定量化した。
【００３２】
4.85
mgの1,5ジフェニルカルボノヒドラジドを2 mlのアセトンに溶解し、10 mM濃度のジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を調製した。10
mMジフェニルカルボノヒドラジド1容量とH2SO4 9容量を混合して、1
mMジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を調製した。ST13の培養遠心上清液と1 mMジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を１対１で混合して、室温で10分間静置した。また、ST13の培養遠心上清液のかわりに種々濃度の六価クロムを含有する培地と1mMジフェニルカルボノヒドラジド水溶液を１対１で混合して、室温で10分間静置した。六価クロムが存在すると色を呈するので、この呈色を分光光度計を用いて540nmの吸光度として測定した。種々濃度の六価クロムを含有する培地からの測定結果を基準にして、放線菌ST13株の培養遠心上清液の六価クロム濃度を算出した。図１に放線菌ST13株による六価クロムの還元を示す。
【００３３】
六価クロム初期濃度0.1 mM の溶液は、放線菌ST13株とグルコースを接触させることで、9時間後に六価クロム含有溶液から約18％の六価クロムを除去した。22時間後に約40％の六価クロムを除去した。これに対して放線菌ST13株と廃糖蜜を接触させることで、9時間後には既に約60％の六価クロムを除去した。22時間後では、約96％の六価クロムを除去し、ほとんどの六価クロムが溶液から除去されたことが示された。
【００３４】
すなわち、好気的条件下で、廃糖蜜が放線菌ST13株の六価クロム還元能を高めて、短時間に六価クロム浄化を完了させることができることが示された。廃糖蜜は比較的に安価で入手も容易なことから、本方法による放線菌ST13株の活性化法は極めて有用と結論づけられた。
【００３５】
［実施例２］  種々濃度の廃糖蜜を添加した培地と微生物による六価クロム還元
微生物の培地として、M9塩の溶液に0.5％（重量/重量）グルコース、0.019％（重量/重量）廃糖蜜、0.056％（重量/重量）廃糖蜜、0.17％（重量/重量）廃糖蜜または0.5％（重量/重量）廃糖蜜を添加した培地を調製した。さらにそれぞれの培地に六価クロム濃度が0.1
mMになるように添加した六価クロム含有培地を調製した。
【００３６】
まず、放線菌ST13株を〔表３〕に示す液体培地で、27 ℃で48時間の前培養を行った。培養液を6000×gで5分間の遠心分離を行い、上清を除いた。培地を完全に取り除くために、M9塩の溶液を加えて微生物を再懸濁し、遠心分離を繰り返した。このM9塩溶液による洗浄を2回繰り返し、得られた菌体に前述の培地を添加して、分光光度計の600
nm吸光度が約1.5になるように微生物を懸濁した。これらの微生物懸濁培地に対して、10 mM CrO3溶液を終濃度0.1
mM になるように添加した。これを好気的に27 ℃、200 rpmで振盪培養器にて培養した。約14時間後に培養液をサンプリングして6000×gで5分間の遠心分離を行い、上清液に含まれる六価クロム濃度を測定した。測定値は、
[実施例1]で示した方法と同様に操作して解析した。図２に放線菌ST13株による六価クロム還元を示す。
【００３７】
六価クロム初期濃度が0.1 mMの溶液は、放線菌ST13株と0.5%グルコースを接触させることで、六価クロム含有溶液から約19％の六価クロムを除去した。これに対して放線菌ST13株と0.5％廃糖蜜添を接触させることで約69％の六価クロムを除去した。六価クロム除去効率は廃糖蜜の濃度依存性があり、濃度が高いほど除去効率が高くなった。0.056％廃糖蜜を使用した場合は、0.5％グルコースを使用した場合と同等の六価クロム除去効率を示した。さらに濃い濃度の0.17％廃糖蜜を使用した場合は、0.5％グルコースを使用した場合よりも有意に溶液中の六価クロム濃度の減少が認められ（student
t-test: P < 0.01, n = 3）、約33％の六価クロムを除去した。
【００３８】
すなわち、放線菌ST13株と0.056％廃糖蜜を接触させることで、0.5％グルコースを使用した時と比較して同等の六価クロム除去効率を示し、グルコースと比較して廃糖蜜は少量の使用量で効果があることが示された。廃糖蜜の濃度依存的に効果が上がることから、六価クロム汚染浄化に要する時間を廃糖蜜の使用濃度によって制御できると考えられた。本方法は六価クロム汚染浄化コストの削減に貢献する有用な方法であると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】放線菌ST13株による六価クロム還元能に対する、グルコース含有培地と、グルコース含有培地に廃糖蜜を添加した培地の違いを示す特性図である。初期濃度0.1mM六価クロム溶液の六価クロム濃度経時変化を示す。白丸は六価クロム含有グルコースM9培地での結果を示し、黒丸は六価クロム含有グルコース廃糖蜜M9培地での結果を示す。
【図２】放線菌ST13株による六価クロム還元に対する廃糖蜜の濃度効果を示す特性図である。初期濃度0.1 mM六価クロム溶液の、13.5時間後の六価クロム濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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