(57)【要約】      （修正有）【課題】マウスの感情を，マウスが発する音声により容易に把握でき、ヒトが聞き取ることができる音域で音声を発生するマウスの提供。【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士を交配する工程を繰り返すことで、ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスを得ることができる。ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスは、特定のアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウス同士を交配させて得られる。上記のマウス同士を交配させることで、さえずり変異マウスを得ることができる。【選択図】図６
2011101596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウス。
【請求項２】
請求項１に記載のマウスであって，
２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，低周波領域及び高周波領域における声量より多いマウス。
【請求項３】
請求項１に記載のマウスであって，
２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，高周波領域における声量の１．５倍以上であるマウス。
【請求項４】
請求項１に記載のマウスであって，
配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスを交配して得られるマウス。
【請求項５】
請求項１に記載のマウスであって，
ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配して得られるマウス。
【請求項６】
請求項１に記載のマウスであって，
ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士を交配して得られるマウス。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスは，
配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスである，
請求項５又は請求項６に記載のマウス。
【請求項８】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスを交配させる工程を含む，
ヒトの可聴音域において音声を発する，マウスの製造方法。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配させる工程を含む，
ヒトの可聴音域において音声を発する，マウスの製造方法。
【請求項１０】
前記マウスを交配させる工程は，
ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士を交配させる工程である請求項９に記載のマウスの製造方法。
【請求項１１】
平常時にヒトの可聴音域における音声を発するマウス。
【請求項１２】
請求項１１に記載のマウスであって，
平常時にヒトの可聴音域における音声を恒常的に発するマウス。
【請求項１３】
請求項１１に記載のマウスであって，
１年以上の寿命を有するマウス。
【請求項１４】
請求項１１に記載のマウスであって，
疾患に罹患していないマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ヒトが聞き取ることができる音域で鳴くマウスなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスは，哺乳類の実験モデルとして幅広く利用されている。しかしながら，マウスをヒトの高次神経活動の実験モデルとしての利用するためには，多くの限界がある。たとえば，従来，マウスの感情を計測することは難しかった。
【０００３】
一方，成体のマウスが超音波音域で発する音声には，時間的な構造があることが明らかにされている（Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｅ.  Ｈｏｌｙ,  Ｚｈｏｎｇｓｈｅｎｇ  Ｇｕｏ  ／  ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５）。すなわち，マウスは，何らかの意味のある鳴き声を発している可能性がある。よって，マウスの感情を実験的に計測することが検討された。すなわち，マウスが発する音声を適切に把握できれば，脳神経系に関わる新薬の開発などにも有効であると考えられる。しかしながら，超音波音域を解析するためには，特別な装置が必要とされる。このことは，マウスの発する音声について多面的な研究を進める上で，大きな障害になる。
【０００４】
成体マウスは，ヒトが聞き取れる音域でも音声を発する。しかしながら，このような音声は，マウス同士が喧嘩するなど，平常時とは異なる状況に置かれた際に発される音声のみである。よって，通常の成体マウスからは，時間的な構造を持った音声を直接観察することができない。このため，通常の成体マウスを用いても，マウスの感情を適切に把握できない。
【非特許文献１】Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｅ.  Ｈｏｌｙ,  Ｚｈｏｎｇｓｈｅｎｇ  Ｇｕｏ  ／  ＰＬｏＳ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は，ヒトが聞き取ることができる音域で音声を発生するマウスを提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は，マウスの感情を，マウスが発する音声により容易に把握できるマウスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は，基本的には，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士を交配する工程を繰り返すことで，ヒトの可聴音域において音声を発する，マウス（以下，「さえずり変異マウス」ともよぶ）を得ることができるという知見に基づくものである。
【０００８】
すなわち，本発明の第１の側面は，ヒトの可聴音域において音声を発するマウスに関する。具体的には，本発明の第１の側面は，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスに関する。このマウスを用いることで，マウスの感情を容易に把握できる。また，このマウスを用いることで，所定の条件が哺乳類にもたらす感情への影響を測定できる。さらに，このマウスを，脳神経系における新薬の開発に有効に利用できると考えられる。本発明のマウスは，平常時にヒトの可聴音域における音声を発する。また，本発明のマウスは，特に重篤な疾患に罹患している様子は見られなかった。このため，本発明のマウスは，１年以上の寿命を有し，正常な生殖能力をも有していた。よって，本発明によれば，マウスの感情を，マウスが発する音声により容易に把握できることとなる。さらに，そのような研究を，遺伝的に均質なマウス系統を用いて，体系的に行なうことができる。
【０００９】
第１の側面の好ましい態様は，２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，低周波領域及び高周波領域における声量より多いマウスに関する。
【００１０】
第１の側面の好ましい態様は，２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，高周波領域における声量の１．５倍以上であるマウスに関する。
【００１１】
第１の側面の好ましい態様は，配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスを交配して得られるマウスに関する。このようにして，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスを得ることができる。また，第１の側面の好ましい態様は，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配して得られるマウスに関する。すなわち，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配する。このようにして，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスを得ることができる。特に，そのようなマウス同士を交配させることで，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスを得ることができる。
【００１２】
第１の側面の好ましい態様は，配列番号１（ＤＮＡポリメラーゼδのアミノ酸配列）で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスを交配させて得られるマウスである。すなわち，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスのうち，実施例で示された上記のマウスを交配させることで，さえずり変異マウスを得ることができる。また，さえずり変異マウス同士を交配させることで，さえずり変異マウス系統を効率的に得ることができる。
【００１３】
本発明の第２の側面は，さえずり変異マウスの製造方法に関する。本発明の第２の側面は，たとえば，配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスを交配させる工程を含む。これにより，ヒトの可聴音域において音声を発するマウスを製造できる。また，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多い，マウスを製造できる。
【００１４】
本発明の第２の側面の別の態様は，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配させる工程を含む。これにより，ヒトの可聴音域において音声を発するマウスを製造できる。後述する実施例に示されたとおり，本発明のさえずり変異マウスを得るためには，交配するマウスの一方がＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスであり，もう一方が野生型であってもよい。
【００１５】
本発明の第２の側面の好ましい態様は，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士を交配させる工程を行う。これにより，ヒトの可聴音域において音声を発するマウスを製造できる。また，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスを作出できる。交配させるマウスは，配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスであることが好ましい。実施例で示されたように，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士の交配を繰り返していくことで，効率的にヒト非可聴音域における音量に比べて，ヒト可聴音域における音量が多いマウス系統を製造することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば，ヒトが聞き取ることができる音域で音声を発生するマウスを提供することができる。
【００１７】
本発明によれば，マウスの感情を，マウスが発する音声により容易に把握できるマウスを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の第１の側面は，ヒトの可聴音域において音声を発する，マウスに関する。具体的には，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスに関する。非特許文献１では，３０ｋＨｚ以上の音域で音声を発生するマウスが作出された。しかし，３０ｋＨｚはヒトの可聴領域ではない。よって，この文献に基づいて作出されたマウスを用いても，マウスの鳴き声を直接ヒトが観測できない。よって，このマウスでは，マウスの感情や，マウスの言語メカニズムなどを把握することは難しい。
【００１９】
一方，本発明のマウスは，ヒトの可聴音域において音声を発するマウス（さえずり変異マウス）に関する。このマウスを用いることで，マウスの感情を容易に把握できる。換言すると，本発明のマウスは，平常時にヒトの可聴音域における音声を発するマウスに関する。平常時とは，マウスを安静にした状態においてという意味である。後述する実施例で示された様に，本発明のマウスは，平常時にヒトの可聴音域における音声を発する。特に図６に示されるように，このマウスは，平常時にヒトの可聴音域における音声を恒常的に（連続的に）発する。通常であれば，マウスは平常時にヒトが聞こえる声を発生しない。一方，マウスは，ヒトの非可聴音域における超音波を用いてコミュニケーションをとっていると考えられる。本発明のマウスは，ヒトの可聴音域において恒常的に音声を発する。これは，コミュニケーションをとるための音声の周波数が，低くシフトしたものと考えられる。よって，本発明のマウスを用いれば，マウスの感情を的確に把握できることとなる。これにより，本発明のマウスは，脳神経系に関わる新薬の開発などにも有効であると考えられる。また，本発明の製造方法により作出されたマウスは，一般に重篤な疾患に罹患していない。病的な表現形を有する変異マウスなど，疾患を抱えているマウスには，平常時にヒト可聴音域における奇声を発するものがある。このようなマウスは，重篤な疾患に罹患している，あるいは行動異常を来たしたマウスなので，健康な状態においてマウスの感情を把握する目的で使用できない。一方，本発明のマウスは，特に重篤な疾患に罹患している様子は見られなかった。このため，本発明のマウスは，健常なマウス同様に１年以上の寿命を有していた。よって，本発明のマウスは，声が低い以外は，通常のマウスであると考えられる。さらに，さきに述べた，疾患あるいは異常により可聴音域における発声をするマウスは，一般に短命であるほか正常な生殖能力を欠いている。一方で，本発明のマウスは，正常な生殖能力を有しており，通常の交配操作により同等の形質を有するマウスを，任意の時期および数で容易に得ることができる。すなわち，本発明のマウスを用いれば，健康なマウスの感情を的確に把握できることとなる。また，そのような研究を，遺伝的に均質なマウス系統を用いて，体系的に行なうことができる。一般に，ヒトの可聴音域は，２０Ｈｚ以上２０ｋＨｚ以下とされる。よって，このマウスは，２０Ｈｚ以上２０ｋＨｚ以下の音域においてよく鳴くマウスである。また，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスは，ＤＮＡポリメラーゼδが有するＤＮＡ複製時の校正機能が欠失している。このため，ＤＮＡ複製時の突然変異の発生率が上昇するので，腫瘍などに罹患しやすい。よって，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配させて得られるマウスは，一般的には短命である。一方，本発明によれば，腫瘍に罹患せず，比較的長寿命なマウスを得ることができる。本発明のマウスの寿命として，１年以上があげられる。よって，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士を交配させることができるので，ＤＮＡポリメ���ーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス系統を効率的に製造することができる。このようなマウス系統は，交配ごとに突然変異が蓄積していくので，本発明のマウス同士の交配を繰り返すことで，突然変異が蓄積したマウス系統を作製することができる。
【００２０】
マウスの音域を評価するためには，たとえば以下の様にすればよい。単独のマウスを安静にさせ，１分間その音声を録音する。録音した音声の周波数分布を測定する。複数の時間における周波数成分毎の声量を足し合わせる。この作業を３回繰り返し，平均値を求める。このようにして，マウスの音域を評価できる。本発明におけるマウスの種類は，どのような種類のマウスであってもよい。なお，ラットは，ねずみの一種であって，本発明のマウスに含まれる。
【００２１】
第１の側面の好ましい態様は，２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，低周波領域及び高周波領域における声量より多いマウスに関する。低周波領域とは，２０Ｈｚ以下の周波数領域である。この低周波領域の音は，通常のヒトには聞こえない。一方，高周波領域とは，２０ｋＨｚよりも高い周波数領域を意味する。この高周波領域の音は，通常のヒトには聞こえない。実施例により実証されたとおり，以下に説明する製造方法を用いて作出したマウスは，特に１０ｋＨｚ以下の音域において大きな鳴き声を発する。第１の側面の好ましい態様は，２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，高周波領域における声量の１．５倍以上であるマウスに関する。
【００２２】
第１の側面の好ましい態様は，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配して得られるマウスに関する。すなわち，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを交配する。このようにして，ヒトの可聴音域において音声を発する，マウスを製造できる。また，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスを得ることができる。なお，得られるマウスは，２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，高周波領域における声量の多い（たとえば，１．５倍以上である）マウスであってもよい。後述する実施例に示されたとおり，本発明のさえずり変異マウスを得るためには，交配するマウスの一方がＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスであり，もう一方が野生型であってもよい。この場合は，メスがＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスであることが好ましい。さらに，後述する実施例に示されたとおり，上記ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスと野生型のマウスを交配して出生したメスの子孫を野生型又はヘテロ接合型（相同染色体の一方のエキソヌクレアーゼ活性が欠失）マウスと交配させても「さえずり変異マウス」を得ることができる。交配させる一方が野生型又はヘテロ接合型マウスである場合，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する「さえずり変異マウス」を得ることができる。また，このようにして得たＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する「さえずり変異マウス」同士の交配を繰り返すことで，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する「さえずり変異マウス」系統を作製することができる。
【００２３】
ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスを得る方法は公知である。たとえば，特開２００７−１４３５６２号公報に開示された方法を用いてこのようなマウスを得ても良い。また，たとえば，ゴルスビーらの文献（Ｇｏｌｄｓｂｙ,  Ｒ.  Ｅ．,  Ｌ.  Ｅ.  Ｈａｙｓ,  Ｘ.  Ｃｈｅn,  Ｅ.  Ａ.  Ｏｌｍｓｔｅｄ,  Ｗ.  Ｂ.  Ｓｌａｙｔｏｎ,  Ｇ.  Ｊ.  Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ,  ａｎｄ  Ｂ.  Ｄ.  Ｐｒｅｓｔｏｎ.  ２００２.  Ｈｉｇｈ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｄｅｌｔａ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ.  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９:１５５６０−５.）に記載された方法に基づいて，このようなマウスを得ても良い。ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスとして，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン（配列番号１の１２８番目〜４７５番目）内のアミノ酸が変異したマウスがあげられる。具体的には，配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウス同士を交配させればよい。「他のアミノ酸」としてグリシン，アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，リシン，アルギニン，グルタミン酸が好ましく，さらに好ましくはアラニンである。「アスパラギン酸」を「アラニン」に変異させる塩基配列の変異として，配列番号３（ＤＮＡポリメラーゼδの塩基配列（エキソンのみ））の１１１８番目から１１２０番目の配列（ＧＡＣ）（配列番号１の４００番目のアスパラギン酸に相当するコドン）をＧＣＴ，ＧＣＣ，ＧＣＡ，又はＧＣＧとする変異があげられる。すなわち，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウスのうち，実施例で示された上記のマウス同士を交配させることで，さえずり変異マウスを得ることができる。さらに，さえずり変異マウス同士の交配を繰り返すことによって，効率的にさえずり変異マウス系統を作製することができる。
【００２４】
さらに，配列番号１で示されるアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウス同士を交配させてもよい。相同性が高い配列として，９０％以上の相同性を有する配列があげられ，好ましくは９８％以上の相同性を有する配列があげられる。配列番号１で示されるアミノ酸配列から，１又は２個のアミノ酸残基が置換した配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウス同士を交配させてもよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列から，１又は２個のアミノ酸残基が決失した配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウス同士を交配させてもよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列に，１又は２個のアミノ酸残基が付加したタンパク質を有するマウス同士を交配させてもよい。配列番号１で示されるアミノ酸配列に，１又は２個のアミノ酸残基が挿入されたたタンパク質を有するマウス同士を交配させてもよい。
【００２５】
本発明の第２の側面は，さえずり変異マウスの製造方法に関する。具体的には，この方法は，ＤＮＡポリメラーゼδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したマウス同士を交配させる工程を，１回または２回以上含む。これにより，ヒトの可聴音域において音声を発する，マウスを作出できる。また，これにより，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスを作出できる。交配させるマウスは，配列番号１で示されるアミノ酸配列の４００番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸に変異したタンパク質を有するマウスであることが好ましい。実施例に示されたとおり，さえずり変異マウス同士を交配させることによって，効率的にさえずり変異マウス系統を作製することができる。
【実施例１】
【００２６】
遺伝子ターゲティングベクターの構築
ターゲティングベクターは，ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に４つの遺伝子フラグメントをクローニングして構築した。バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−４０６Ｈ２１は，マウスのｐｏｌｄ１遺伝子をコードする領域（配列番号２）を含んでいる。相同組換えのための３’側のフラグメント（６．９ｋｂ）は，エキソン１０（配列番号２：４２４０〜４３８０）・１１（配列番号２：４５７８〜４６８８）間のイントロン（配列番号２：４３８１〜４５７８）からエキソン２５（配列番号２：１０４３６〜１０５３３）までをＥｃｏＲＩとＳａｃＩでＢＡＣから切り出した。５’側のフラグメント（１．６ｋｂ）は，エキソン５（配列番号２：１９３０〜２０９８）からエキソン１０（配列番号２：４２４０〜４３８０）・１１（配列番号２：４５７８〜４６８８）間のイントロン（配列番号２：４３８１〜４５７８）までの配列で，配列番号１の４００番目のアスパラギン酸に相当するコドンがアラニンになるように置換されている。変異遺伝子断片は，５’−ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＴＣ−３’（アラニンのコドンは下線を付した）（配列番号４）とその相補配列のオリゴヌクレオチド（プライマー）を用いたＰＣＲを繰り返して作製した。８００ｂｐのＳＶ４０スプライシング／ポリアデニル化シグナルとポジティブ選抜（薬剤選抜）のためのネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子カセットを含むＦｌｏｘフラグメントは，ｐｏｌｄ１との相同組換えのための５’および３’配列の間に挿入されている。ネガティブ選抜のためのジフテリア毒素Ａ（ＤＴ−Ａ）遺伝子フラグメントは，相同組換えのための５’配列の外側に配置されている。ターゲティングベクターは，制限酵素処理とシークエンシング（塩基配列解読）によって，構築の成否を確認した。
【００２７】
ｐｏｌｄ１ターゲティングマウスの作製
ＳａｃＩで直鎖化したターゲティングベクターをＣ５７ＢＬ／６Ｊ（マウスの標準的な系統）の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に電気穿孔法で導入した。組換えクローンの候補はＧ４１８（ネオマイシン）存在下で生育させることで選抜した。適当な相同組換え体を，ＰＣＲ，サザンブロット，及びＤＮＡシークエンシングで検証した。ＰＣＲは，プライマーＰ０（５’−ＴＴＧＡＣＣＴＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＣＡＧ−３’）（配列番号５）とＰ２（５’−ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号６），ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼを用いて行なった。サザンブロットは，ゲノムＤＮＡをＤｒａＩとＮｈｅＩで完全に消化（切断）し，図１（Ｂ）に示すように，［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したＤＮＡフラグメントをプローブとして用い行った。組換えＥＳ細胞をＢａｌｂ／ｃ（マウス系統）の胞胚に注入し，キメラマウスを作製した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのメスと交配することによって，ヘテロ型（ｐｏｌｄ１＋/−）マウスを作製した。ｐｏｌｄ１ｅｘｏ/＋マウスは，ｐｏｌｄ１＋/−マウスとＳｙｃｐ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを交配させて作製した。本研究で用いた全ての変異は，同系繁殖系統上で維持した。これらｐｏｌｄ１ターゲティングマウスのジェノタイピング（遺伝子型の判別）のために，Ｐ１（５’−ＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＴＧＣＧＴＴＡＣ−３’）（配列番号７），Ｐ２（５’−ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号８），Ｐ３（５’−ＣＡＧＡＴＴＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＡＴＣ−３’）（配列番号９）の３つのプライマーを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲはＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼを用い，９４℃で１分間の後，９４℃にて１分間，６０℃で３０秒間，及び７２℃で４０秒間を３０サイクル繰り返すことによって行なった。
【００２８】
ｐｏｌｄ１ｅｘｏ/＋ＥＳ細胞系の構築
ｐｏｌｄ１ｅｘｏ/＋ＥＳ細胞系を得るために，環状ｐＣｒｅ−Ｐａｃプラスミドをｐｏｌｄ１＋/−ＥＳ細胞に電気穿孔法で導入した。候補ＥＳ細胞は，一時的にピューロマイシンに曝すことによって選抜し，その後通常のＥＳ細胞用培地によるサブカルチャー（暫定的な培養）に供した。Ｃｒｅを介した組換え体の遺伝子型は，ＰＣＲとサザンブロットによって確認した。
【００２９】
Ｓｙｃｐ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウスの構築
Ｓｙｃｐ１−Ｃｒｅトランスジェニックマウス構築のためのプラスミドは，２つの遺伝子フラグメントから構築した。ひとつ目のフラグメントはマウスのオスの生殖細胞で発現するｓｙｃｐ１遺伝子のプロモーター配列で，転写開始点上流７３７番目から下流８７番目までの塩基配列（配列番号１６）を含む。もう一方は，核移行シグナル配列（ＮＬＳ）とＣｒｅ組み換え酵素をコードする配列（配列番号１７）にポリアデニル化シグナル配列（ｐＡ）（配列番号１８）を付加したフラグメントである。両フラグメントは，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIのＳｐｅＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入した。プラスミドをＳａｌＩとＮｏｔＩで消化したあと精製したフラグメントをＣ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に微小注入（マイクロインジェクト）した。得られた子孫から，Ｃｒｅに特異的なプライマー（５’−ＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＴＴＣ−３’）（配列番号１０）と（５’−ＣＴＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号１１）を用いてゲノムＰＣＲによって，トランスジーンが挿入された子孫を選別した。
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲと３’ＲＡＣＥ分析
全ＲＮＡは，ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いてＥＳ細胞から抽出し，ゲノムＤＮＡの混入を除くためにＤＮａｓｅＩ処理した。ｃＤＮＡはオリゴ（ｄＴ）２５プライマーを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により調製した。ＰＣＲはｐｏｌｄ１の５’末端プライマー（５’−ＧＧＣＧＴＡＴＣＴＴＧＴＧＧＣＧＧＧＡＡ−３’（配列番号１２））および３’末端プライマー（５’−ＣＣＴＴＧＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＧＧＴＣＡ−３’（配列番号１３））を用いて行なった。３’ＲＡＣＥはアダプター配列つきオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写を行なった後，Ｐ４（５’−ＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＣ−３’（配列番号１４）），Ｐ５（５’−ＴＧＧＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１５））（図１（Ｇ））および２種類のアダプタープライマーを用いたＰＣＲを繰り返すことにより行なった。
【００３１】
ウエスタンブロッティング
Ｅ１２．５全胚を氷冷溶解バッファー（０．１％ＮＰ−４０，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．２］，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，３μｇ／ｍＬロイペプチン，３μｇ／ｍＬペプスタチンＡ，１０μｇ／ｍＬアプロチニン）で溶解し，ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）でホモジナイズし，その後，一時的に超音波処理を行った。ライセートは遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）によって清澄化した。その上清を回収し，ウエスタンブロッティングに使用した。等量を１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ，ニトロセルロース膜に転写した。膜はａｎｔｉ−Ｐｏｌｄ１  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎポリクローナル抗体（Ｃ−２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎモノクローナル抗体（ＡＣ−１５，Ｓｉｇｍａ）で検出した。
【００３２】
Ｐｏｌｄ１遺伝子ターゲティングマウスの作製
全Ｐｏｌδ及びその３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の生理学的機能を分析するために，２種類のｐｏｌｄ１変異マウスを開発した。ｐｏｌｄ１遺伝子は，Ｐｏｌδ複合体の触媒サブユニットｐ１２５をコードしている。このサブユニットはＤＮＡポリメラーゼドメインと３’−５’エキソヌクレアーゼドメインを含む。機能的なマウスのＰｏｌｄ１タンパク質を破壊するために，ＳＶ４０由来のスプライシング／ポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ））シグナルを，Ｐｏｌδポリメラーゼドメインをコードする上流領域に挿入した（図１（Ａ））（配列番号３）。ＧＡＣ（野生型）からＧＣＣの点変異を用い，３’−５’エキソヌクレアーゼ活性欠損マウスをＤ４００Ａ置換によって開発した。Ｄ４００Ａ置換は，エキソヌクレアーゼ活性部位（ＥｘｏＩＩ）に位置し，腫瘍感受性が高いマウスが有している。マウスのＤ４００Ａ変異は，インビトロの生化学分析によって，３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害が引き起こされることが確認されている。遺伝子ターゲティング戦略においてＣｒｅを介するｌｏｘＰ組換えシステムを用いて，２種のｐｏｌｄ１変異マウス：Ｐｏｌδ−ヌル（ｐｏｌｄ１−／−）マウスと３’−５’エキソヌクレアーゼ活性欠損（ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏ）マウスを作製した（図１（Ｂ））。
【００３３】
ｐｏｌｄ１遺伝子ターゲティングベクターは，Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚幹（ＥＳ）細胞に電気穿孔法で導入した。相同組み換え体を得るためにＧ４１８耐性クローンをＰＣＲ（図１（Ｃ））とサザンブロッティングでスクリーニングを行った。点変異（Ｄ４００Ａ）はＤＮＡシークエンシングで検証した。ターゲティングＥＳ細胞クローンは，生殖細胞系列によって標的対立遺伝子を伝達したキメラマウスを作製するために，Ｂａｌｂ／ｃ胚盤胞にマイクロインジェクションを行った。キメラはＣ５７ＢＬ／６Ｊのメスに交配し，ｐｏｌｄ１＋／−マウスを産出した。Ｐｏｌδ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性欠損マウスは，ｐｏｌｄ１＋／−マウスと，生殖系列細胞にＣｒｅリコンビナーゼを発現させるマウスＳｙｃｐ１遺伝子プロモーター−Ｃｒｅ導入遺伝子を含むＣｒｅ発現トランスジェニック動物とを交配させることで作製した。Ｐｏｌｄ１＋／−とＰｏｌｄ１ｅｘｏ／＋マウスの両方をＰＣＲ及びサザンブロティングで確認した（図１（Ｄ），図１（Ｅ））。
【００３４】
これらの標的対立遺伝子からｐｏｌｄ１遺伝子の発現を確認するために，ターゲティングＥＳ細胞のｍＲＮＡを分析した。ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／＋ＥＳ細胞は環状Ｃｒｅ−ｐａｃプラスミドをｐｏｌｄ１＋／−ＥＳ細胞に電気穿孔法で導入し，適当なクローンを選択することで得た。ＲＴ−ＰＣＲは，全長のｐｏｌｄ１をコードする領域をカバーする２つのプライマーを用いて，Ｐｏｌｄ１＋／−とＰｏｌｄ１ｅｘｏ／＋ＥＳ細胞から転写を行った。これらのＲＴ−ＰＣＲ産物のダイレクトシークエンシングによって，置換された対立遺伝子（ＧＡＣ→ＧＣＣ）はｐｏｌｄ１ｅｘｏ／＋ＥＳ細胞には発現するが，ｐｏｌｄ１＋／−ＥＳ細胞には発現しないことが示された（図１（Ｆ））。これらの結果から，全長ｍＲＮＡはｐｏｌｄ１−対立遺伝子からは発現しないことが明らかになった。変異対立遺伝子からの発現を詳しく調べるために，３’ＲＡＣＥ分析によってｐｏｌｄ１−対立遺伝子の転写末端位置を決定した。ｐｏｌｄ１＋／−ＥＳ細胞からの３’ＲＡＣＥ産物では，全長のｐｏｌｄ１をコードするフラグメントと切断されたフラグメントが観察され；ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／＋ＥＳ細胞からの産物は全長のフラグメントのみが観察された。これらのフラグメントをサブクローニングした後，ＤＮＡシークエンシングを行った。ＤＮＡシークエンシングから，ｐｏｌｄ１＋／−ＥＳ細胞からの切断されたフラグメントは置換された配列（ＧＣＣ）を含み，３’末端は挿入したＳＶ４０  ポリ（Ａ）配列によって途中で止まり，これらの切断されたフラグメントは２つの異常なスプライシング型からなることが分かった（図１（Ｇ））。ｐｏｌｄ１＋／−ＥＳ細胞からの全長フラグメント配列は，野生型の配列（ＧＣＣ）とｐｏｌｄ１遺伝子由来の内因性のポリ（Ａ）シグナル配列を含むのみであった。ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／＋ＥＳ細胞では，ｍＲＮＡは正常に終結し，置換された配列と野生型の配列両方を含んでいた（それぞれサブクローン５個のうち２個と３個）。これらの結果は，挿入したＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルによって終結したｍＲＮＡはｐｏｌｄ−対立遺伝子で発現し，Ｄ４００Ａ（ＧＡＣ→ＧＣＣ）置換を持つ全長の転写物はｐｏｌｄ１ｅｘｏ対立遺伝子で発現することを示唆する。ｐｏｌｄ１−対立遺伝子ではＰｏｌｄ１タンパク質の発現を損なわれることを確認するために，Ｐｏｌｄ１タンパク質をウエスタンブロッティングで分析した。ａｎｔｉ−Ｐｏｌｄ１  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ抗体を用いるｐｏｌｄ１＋／＋及びｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏのＥ１２．５全胚から調整した抽出物のウエスタンブロッティングによって，Ｐｏｌｄ１タンパク質量はｐｏｌｄ１＋／−胚では約半分に減少しているが，ｐｏｌｄ１＋／＋及びｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏ及のＥ１２．５の胚抽出物のＰｏｌｄ１タンパク質量は同程度であることが示された（図１（Ｈ））。これらの結果は，ｐｏｌｄ１−対立遺伝子は途中で終結したポリメラーゼドメインのため適切に機能しないこと，およびｐｏｌｄ１ｅｘｏ対立遺伝子は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているにもかかわらず野生型対立遺伝子と同様のＰｏｌδ量を発現することを示唆している。
【実施例２】
【００３５】
胚盤胞の培養及びジェノタイピング
全胚は自然交配によって作製した。膣栓が検出された日をＥ０．５として設定した。胚はＭ２培地（Ｓｉｇｍａ）を用いて子宮を灌流することでＥ３．５又はＥ４．５を回収した。培養の際には，回収した胚は白血病抑制因子を含む完全ＥＳ培地で培養した。
【００３６】
ジェノタイピングのために，それぞれの胚は５μｌＰＣＲ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］，５０ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．４５％  ＮＰ−４０，０．４５％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．２ｍｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ）中，５５℃で一晩インキュベーションすることによって溶解させた。それぞれの変異対立遺伝子を検出するために，それぞれのＰＣＲはマウスのジェノタイピングに利用したのと同じ３つのプライマー：Ｐ１，Ｐ２，およびＰ３を用いて行った。ＰＣＲはＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼを用い，９４℃で１分間の後，９４℃で１分間−５８℃で３０秒間−７２℃で５０秒間を３５サイクル繰り返すことによって行った。
【００３７】
子孫死亡率の算定
このモデルでは，劣性致死性変異のみの影響を扱った。Ｓ（ｎ．ｉ）は正常のエラーフリー条件と比較したときのＦ（ｎ）世代子孫の生存頻度であり；ｎは経た世代数を示し，ｉは致死性変異の発生頻度を示す。Ｆ（０）はミューテーターマウスの交配する最初の対として定義する。Ｓ（ｎ，ｉ）は以下の式（ｎ＞２のとき）によって得られる。
【数１】
2011101596.tif 000003
【００３８】
Ｐｏｌｄ１欠損は着床期前後での胎生致死を引き起こす
ヘテロ接合型ｐｏｌｄ１＋／−マウスは１８月を超えても検出可能な発達異常は見られず，外観上正常で繁殖することができた。これらの動物からの胎児繊維芽細胞の増殖に異常は見られなかった（データは示さず）。対照的に，ホモ接合型ｐｏｌｄ１−／−マウスは，ｐｏｌｄ１＋／−マウスとの交雑受精から生まれた２５６匹の中には存在せず（表１），機能的なｐｏｌｄ１対立遺伝子１つは胚及び出生後の発達に重要であるが，両対立遺伝子の不活性化は胎生致死につながることが示された。
【表１】
2011101596.tif 000004
【００３９】
ｐｏｌｄ１−／−胚の発達中に死に至る時期を調べるために，妊娠期間が異なるｐｏｌｄ１＋／−マウスの交雑受精から胚を集め，それぞれの胚についてＰＣＲでジェノタイピングを行った。ホモ接合型ｐｏｌｄ１欠損胚は，Ｅ７．５又はそれ以上では検出されなかった（表１）。妊娠したメスの子宮を灌流することで日数Ｅ３．５及びＥ４．５の胚を採取した。ホモ接合型ｐｏｌｄ１−／−変異胚盤胞は，野生型およびヘテロ接合型の胚と形態学的に区別ができなかった（図２（Ａ））。これらの観察はｐｏｌｄ１−／−マウスはＥ４．５とＥ７．５の間に死亡することを示している。
【００４０】
ｐｏｌｄ１欠損胚の発達異常をさらに明らかにするために，ｐｏｌｄ１＋／−交雑受精由来のＥ３．５胚盤胞を採取し，それぞれをインビトロで数日培養し，写真を撮影し，その後ＰＣＲでそれらをジェノタイピングした。ｐｏｌｄ１＋／＋及びｐｏｌｄ１＋／−胚盤胞では，３日間培養後，栄養膜は透明帯から孵化した後培養ディッシュ上に広がり，さらに内部細胞塊（ＩＣＭ）が栄養膜層上に成長した。ｐｏｌｄ１−／−胚では，栄養膜は再度付着し，ディッシュ上に広がったが，栄養膜層の広がりはゆっくりで，ＩＣＭは増殖することができず，出現後すぐに退化した（図２（Ｂ））。インビトロで１日培養したＰｏｌｄ１−ヌル胚盤胞は，インビボでの約Ｅ４．５に相当し，野生型とヘテロ接合型の胚で明らかな違いは認められなかった。３日間培養したｐｏｌｄ１−／−胚盤胞は，約Ｅ６．５に相当し，細胞の増殖は見られなかった。
【実施例３】
【００４１】
免疫細胞化学とアポトーシス細胞の検出方法
胚は１．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）洗浄し，４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳに４℃で３０分間おき固定し，その後０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に室温で２０分間透過させた。胚をＢｒｄ−Ｕ処理するために，０．２５Ｎ  ＨＣｌおよび０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で室温で２０分間透過し，ＤＮＡを変性させ，１．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで十分に洗浄した。胚は特異的な一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。この研究で使用した一次抗体はマウスａｎｔｉ−Ｂｒｄ−Ｕ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）とｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３（Ｓｅｒ−１０）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇｎａｌｉｎｇ）であった。蛍光ラベルされた２次抗体はモレキュラープローブから購入した。アポトーシス細胞を検出するためにＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）アッセイはＩｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
【００４２】
Ｐｏｌｄ１欠損はＤＮＡ合成欠損及びアポトーシスの頻出を引き起こす
培養したＰｏｌｄ１−／−胚盤胞の増殖欠損がＰｏｌδ破壊によって引き起こされるＤＮＡ合成阻害によるものかどうかを調べるため，ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みアッセイによって培養した胚盤胞中のＤＮＡ合成を評価した。通常のＥＳ培地で１または３日間胚盤胞を培養し，その後３時間ＢｒｄＵの存在下で培養した。これらの培養した胚盤胞はＢｒｄＵに特異的な抗体で免疫染色を行った。全胚が広範囲にわたって標識されており，１日培養した胚盤胞の核へのＢｒｄＵの取り込みはそれぞれのジェノタイプ間で違いはなかった（図３（Ａ））。１日培養したＰｏｌｄ１−／−胚盤胞の胚細胞が分裂期に入るかどうかを検証するために，Ｍ期細胞をマークするために使用される共通の分裂マーカ−であるｐｈｏｓｈｏｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３（Ｓｅｒ−１０）に対する抗体を用いて同時に免疫染色を行った。ジェノタイプにかかわらず全胚においてｐｈｏｓｐｈｏｈｉｓｔｏｎｅＨ３陽性細胞が認められた（図３（Ａ））。これらの結果から，ｐｏｌｄ１−／−胚は新しいＤＮＡ鎖を合成することができ，これは細胞周期のＳ期に相当し，培養胞胚期の１日後に分裂期に入ることができることが示唆された。対照的に３日後の培養胚盤胞増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は，ｐｏｌｄ１＋／＋とｐｏｌｄ１＋／−の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）のどちらもＩＣＭおよび栄養膜巨（ＴＧ）細胞へのＢｒｄＵの強い取り込みを示したが，ｐｏｌｄ１−／−の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）はほとんど取り込みを示さなかった（図３（Ｂ））。ＴＧ細胞では，ＤＮＡ合成は核内倍加によっておこり，そのためＧ及びＳ期の一連の周期（ｒｏｕｎｄ）は分裂なしで進行することがこれまでに示されている。結果として，ｅｎｄｏｃｙｃｌｉｎｇ  ｇｉａｎｔ細胞は核内にＤＮＡを大量に獲得し，そのため倍数体となる。このようなｐｏｌｄ１−／−増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）中の欠損は，Ｐｏｌδの破壊がＴＧ細胞の核内倍加欠損を含み明らかなＤＮＡ合成欠損を引き起こすことを示している。
【００４３】
ＤＡＰＩで染色した３日間培養したｐｏｌｄ１−／−の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）では，アポトーシス細胞死を示している可能性がある，凝縮および断片化した小核が検出された（図３（Ｂ））。これらの小核はヘテロ接合体および野生型の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）ではめったに検出されなかった。このアポトーシスの可能性を確認するために，ＴＵＮＥＬアッセイを３日間培養した胚盤胞の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）で行った。ｐｏｌｄ１−／−の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）のうちこれらの異常な核はすべてＴＵＮＥＬ陽性であったが，ＴＵＮＥＬ陽性細胞はまれにｐｏｌｄ１＋／＋およびｐｏｌｄ１＋／−増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）中にも存在した（図３（Ｃ））。回収したＥ３．５胚盤胞中のアポトーシス細胞死をさらに調べた。ｐｏｌｄ１−／−胚盤胞（ｎ＝４）と他のジェノタイプをもつ胚盤胞（ｎ＝１７）との間に明らかな違いは観察されなかった（データは示さず）。これらのデータは，ｐｏｌｄ１−／−の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）における増殖欠損は少なくともある程度，着床前後のアポトーシスの発生によるものであったことを示している。
【実施例４】
【００４４】
３’−５’エキソヌクレアーゼの１欠損ｐｏｌｄ１ｅｘｏ対立遺伝子は胚発生が可能であるが，腫瘍感受性が増大する。
Ｐｏｌδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の生理学的な役割を調べるために，マウスの発達においてその破壊が与える影響について検討した。Ｐｏｌδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性欠損マウスにおいて，変異対立遺伝子が胚の生存能力に影響を与えないこと，およびホモ接合型変異マウスは繁殖力があることが示されている。しかしながら，劣性突然変異体は癌になりやすく，そして死亡しやすい。ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏ及びｐｏｌｄ１ｅｘｏ／＋マウスは正常に成長し，繁殖することができることが分かった（表２）。胚形成期Ｅ１２．５では，ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏと野生型の胚の間での形態学的違いは見つからなかった。さらにｐｏｌｄ１ｅｘｏ／−マウスは，ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏおよびｐｏｌｄ１＋／−マウス間の交配で作製されるが，出産することができ，そして明らかに正常で繁殖力もあった（表２）。これらの結果から，マウスの発達のためにＰｏｌδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は重要ではなく，ｐｏｌｄ１ｅｘｏ対立遺伝子１つで十分であることが示された。
【表２】
2011101596.tif 000005
【００４５】
ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏとｐｏｌｄ１ｅｘｏ／−マウスは発達上は正常であるけれども，３〜８月の間に異常な胸腺肥大により高頻度で死亡する（ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏ動物１０匹中４匹，ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／−動物１２匹中４匹）（図４（Ａ））。そして，胸腺肥大のない生存マウスの多くは12月後に尾に瘤が発現した（図４（Ｂ））。これらの観察はＰｏｌδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の欠如による典型的な癌症状と一致する。胸腺肥大の組織学的分析では核対細胞質の比率が高い及び有糸分裂の頻度が高い，リンパ芽球性リンパ腫の典型的な形態学的特徴を有する，細胞の均質集団が明らかとなった（データは示さず）。ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／＋マウスおよび野生型マウスは肥大や尾にそのような表現型を発現しなかった（各表現型で動物２０匹以上観察した）。このように，Ｐｏｌδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の欠失はＣ５７ＢＬ／６マウスの癌感受性をも増大したが，以前見られていたようなＣ５７ＢＬ／６Ｊ及び１２９ＳｖＪを交配したマウスではなかった。さらに，ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／−マウスは同様の腫瘍を発現させた。
【実施例５】
【００４６】
ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏマウスを用いる変異蓄積モデルの作製
Ｐｏｌδはインビボでの哺乳動物のＤＮＡ複製に必須であり，３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したＰｏｌδは頻発するＤＮＡ複製エラーの結果，マウスにおいて癌感受性が増大することが示唆されてきた。加えて，ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏマウスは繁殖力があり，マウスの多くは次の世代に継代するのに十分な期間を生存することができる。さらにＣ５７ＢＬ／６系統でｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏマウスを作製した。本発明では，ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏマウスの同胞交配を繰り返すことによって，同じＣ５７ＢＬ／６系統由来し及びそれぞれ多数の変異を蓄積した複数のマウス系統を作製することを試みた。分析によって，マウスの生殖系列に蓄積した変異の影響および蓄積の過程を評価した。
【実施例６】
【００４７】
ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏマウスからの新規表現型の取得
ｐｏｌｄ１ｅｘｏ／ｅｘｏマウス系統から新規表現型を取得するために，およそ1カ月齢の時点で目に見える異常がないかどうかすべてのマウスをチェックし，マウスの尾を切りマウスのゲノムＤＮＡを保存した。次に異常行動を観察するためそれらのケージを周期的に観察した。新規表現型が認められた場合は，その遺伝率について算定した。マウスの新規表現型は複数の遺伝子変異によってもたらされると予想された。したがって，以下の手順によって遺伝率を算出した。最初に，子孫（Ｇ１世代）を得るために，新規表現型のマウス（Ｇ０世代）を野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配した。Ｇ１世代のマウスは，Ｇ２世代のマウスを得るために再度Ｇ０世代のマウスと戻し交配した（図７（Ｅ））。確率論的には，その表現型関係する遺伝子変異の数が多くて４つまででありその浸透度がほぼ完全である場合，２４匹のＧ２世代のマウスのうち何匹かが同様の表現型を示すと予想された。それに当てはまらない場合は，非遺伝性の表現型あると判断した。表現型に遺伝性が認められた場合，Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＤＢＡ２多型間のリンケージ解析による遺伝変異の同定を行なうため，ＤＢＡ２系統のマウスと交配して，新規変異マウス系統を樹立した。
【００４８】
これまでに，２種類の遺伝性の表現型を含む，いくつかの新しい表現型を得た。遺伝性の表現型のうちひとつは，鳥のように人間の可聴周波数帯で明瞭な鳴き声を発する「さえずり（ｃｈｉｒｐｉｎｇ）変異体」である。歌の録音の分析は，歌が一連の発生から構成されていることを示した（図６（Ａ））。子孫の遺伝性の観察から，この表現型はＰｏｌδの改変とは独立の，おそらくＸ染色体上の劣性遺伝形質であることが示された（図６（Ｂ）〜図６（Ｅ））。現在，ＤＢＡ２マウス系統であるこれらのマウスを交配することによって，リンケージ解析を用いて，突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）の同定を試みている。マウスがある種の超音波発声をし，これらの発生のひとつは複数の異なる音節から構成されていることが知られている。さえずり（ｃｈｉｒｐｉｎｇ）変異体が発する発声音がそのような超音波発声と関係があるか否かについては，興味深い問題である。
【００４９】
歌を録音し，音域を分析した結果，得られたマウスは，ヒトの非可聴音域における声量に比べて，ヒトの可聴音域における声量が多いマウスであった。特に図６（Ａ）に示される２０Ｈｚ以上１０ｋＨｚ以下の音域における声量が，多いマウスであった。
【００５０】
別の遺伝性の表現型は足の変異体であり，足の数が５（図７（Ｄ））から４（図７（Ａ）〜図７（Ｃ））へ減少していた。子孫の遺伝性の観察によると（図７（Ｅ）），９匹のＧ１世代マウスのうち０匹，１８匹のＧ２世代マウスのうち５匹が異常な足の表現型を発現した。このことにより，足変異体は独立した２つの変異が関係する劣性遺伝形質であることが示される。加えて，毛色表現型（図８（Ａ）），下顎が不完全な表現型（図８（Ｂ）），回転行動をする表現型（図８（Ｃ）），２種類の尾の表現型（図８（Ｄ），図８（Ｅ））を含む他の変異遺伝型を得た。これらのマウスの遺伝パターンは評価されていなかった。
【実施例７】
【００５１】
マウス生殖系列での変異蓄積の影響と過程
均一な遺伝的背景（Ｃ５７ＢＬ／６）由来の自然変異を独立して蓄積した５つのマウス系列を開発し，繁殖をつづけた。コントロールとして，野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス系列も同じように繁殖した。先祖から子孫へ生殖系列での変異の発生と淘汰の過程を調べるために，すべてのマウスの遺伝ＤＮＡを−８０℃で保存してきた。変異蓄積マウスは交雑受精による最初の子孫から５世代を経過している。
【００５２】
蓄積変異の有害な影響を見積もるために，生殖系列自然変異率と劣性致死変異を考慮することのみによって得た実験データに該当する１つの数理モデルを用いて子孫間の死亡頻度間の関係を算定した（図９）。このモデルに従えば，標準を１０倍上回る変異率の増加（Ｄｒａｋｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｂ．Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ，Ｄ．Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ，ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｃｒｏｗ．  １９９８を標準と定義した）は，子孫数の重大な減少を引き起こすことが推測される。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は，実験用マウスを製造する実験用器材などの産業において好適に利用されうる。また，本発明のマウスは，医薬開発にも有用であるので，医薬産業においても好適に利用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１（Ａ）】図１は，遺伝子ターゲティングストラテジーによる２種類のｐｏｌｄ１変異マウスの作製方法を示す。図１（Ａ）は，ｐｏｌｄ１遺伝子ターゲティング法での，Ｐｏｌｄ１ドメイン構造および変異の位置を示す概略図である。
【図１（Ｂ）】図１（Ｂ）は，ターゲティングベクターと相同組換え及びＣｒｅを介した組換えの前後のマウスｐｏｌｄ１遺伝子座の部分制限酵素マップを示す。エキソンは垂直の黒塗の四角，イントロンは横線を間に入れることで表している。＊はＤ４００Ａ置換を示す。サザンブロッティング用のプローブとして使用した遺伝子フラグメントは，Ｐｏｌｄ１遺伝子座のエキソンとイントロンを示す図の下に横線で示した。制限酵素：ＤはＤｒａＩを示す；ＮはＮｈｅＩを示す。ＰＣＲプライマーであるＰ０及びＰ２は相同組み換えＥＳ細胞のスクリーニングに用いた。ＰＣＲプライマーであるＰ１，Ｐ２，及びＰ３は，ジェノタイピングに用いた。
【図１（Ｃ）】図１（Ｃ）は，相同組み換え体のＰＣＲスクリーニングの結果を示すアガロースゲルの図面にかわる写真である。２４３０ｂｐのバンドは，Ｐ０−Ｐ２のプライマーの組み合わせで増幅し，相同組み換え体に特異的なバンドである。レーン１〜３は別々の相同組み換えＥＳ細胞である；レーン４は野生型ＥＳ細胞である。
【図１（Ｄ）】図１（Ｄ）は，マウスの尾のＤＮＡのＰＣＲジェノタイピングの結果を示すアガロースゲルの図面にかわる写真である。４９９ｂｐの野生型のバンドと６５４ｂｐのｐｏｌｄ１ｅｘｏバンドは，Ｐ１−Ｐ３のプライマーの組み合わせで増幅し，３３４ｂｐのｐｏｌｄ１−のバンドはＰ１−Ｐ２のプライマーの組み合わせで増幅した。これらのプライマーは，図１（Ｂ）に示す。
【図１（Ｅ）】図１（Ｅ）は，マウスの尾のＤＮＡを用いて，それぞれのｐｏｌｄ１対立遺伝子を同定するためにサザンブロッティング分析を行った結果を示す図面にかわる写真である。ＤｒａＩ消化では，１５．９ｋｂのフラグメントは野生型の対立遺伝子に相当し，１６．０ｋｂのフラグメントはｐｏｌｄ１ｅｘｏ対立遺伝子（２本が重複している）に相当し，６．４ｋｂのフラグメントはｐｏｌｄ−対立遺伝子に相当する。ＮｈｅＩ消化では，１４．６ｋｂのフラグメントは野生型対立遺伝子を示すが，６．０ｋｂのフラグメントはｐｏｌｄ１−及びｐｏｌｄ１ｅｘｏ対立遺伝子の両方を示す。
【図１（Ｆ）】図１（Ｆ）は，ヘテロ接合体のｐｏｌｄ１＋／−及びｐｏｌｄ１ｅｘｏ／＋ＥＳ細胞から得たＲＴ−ＰＣＴ産物のＤＮＡシークエンスの結果を示す。ｐｏｌｄ１ｅｘｏ対立遺伝子では，アミノ酸Ｄがアミノ酸Ａに置換されている。
【図１（Ｇ）】図１（Ｇ）は，ｐｏｌｄ１＋／−中のＰｏｌｄ１−対立遺伝子から得た３’ＲＡＣＥ産物のヌクレオチドシークエンスの結果の概略図を示す。プライマーＰ４及びＰ５は増幅を繰り返す３’ＲＡＣＥで用いた。ｐｏｌｄ−対立遺伝子から得た３’ＲＡＣＥ産物はＤ４００Ａの置換をシークエンスによって区別した。
【図１（Ｈ）】図１（Ｈ）は，Ｅ１２．５の全胚から抽出した２対の抽出物のイムノブロッティング結果を示す図面にかわる写真である。１対は，同腹の胚のｐｏｌｄ１＋／−とｐｏｌｄ１＋／＋を比較する。もう１対は，ｐｏｌｄ１＋／−とｐｏｌｄ１＋／＋の胚を比較する。抗体は，Ａｎｔｉ−Ｐｌｏｄ１抗体とＡｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ（コントロール）抗体を用いた。
【図２】図２は，胚盤胞の形態学的分析と胚盤胞の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を示す図面にかわる写真である。図２（Ａ）は，変異胚の外観を示す図面にかわる写真である。Ｅ３．５及びＥ４．５の胚は子宮から還流して得た。Ｅ４．５の胚は，Ｍ２培地で２時間培養した。明視野条件下写真を撮影した後，Ｅ３．５及びＥ４．５の胚はＰＣＲでジェノタイピングを行った。図２（Ｂ）はインビトロでのＰｏｌｄ１欠失胚盤胞の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）の増殖障害を示す図面にかわる写真である。胚盤胞はＥ３．５で採取し，インビトロで数日間培養し，その後，ＰＣＲでジェノタイピングを行った。黒横棒は５０μｍを示す。
【図３】図３は，Ｐｏｌｄ１欠損胚のＤＮＡ合成障害と自発的アポトーシスを示す図面にかわる写真である。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）は，インビトロで培養した胚盤胞のＢｒｄＵ取り込みを測定し，ＤＮＡ合成を観察した結果を示す図面にかわる写真である。Ｅ３．５の胚は２４時間培養した後，ＢｒｄＵ存在下で３時間培養した。ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ抗体とａｎｔｉ−ｐＨＨ抗体を用いて間接免疫蛍光を行い，ＤＡＰＩによる対比染色を行った後，胚はＰＣＲでジェノタイピングを行った（図３（Ａ））。Ｅ３．５の胚は３日間培養し，ＢｒｄＵ存在下で３時間培養し，ＢｒｄＵに対する免疫染色及びＤＡＰＩ対比染色のための処理を行った。その後，各胚のジェノタイピングを行った（図３（Ｂ））。白い横棒は１００μｍを示す。図３（Ｃ）はＴＵＮＥＬアッセイによる自発的アポトーシスの分析結果を示す。ＴＵＮＥＬ陽性細胞がｐｏｌｄ１−ヌル胚盤胞の増生物（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を表す図面にかわる写真である。写真撮影後，各胚のジェノタイプをＰＣＲで調べた。白い横棒は１００μｍを示す。
【図４】図４は，Ｐｏｌδの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性欠損が引き起こす腫瘍を示す図面に代わる写真である。図４（Ａ）は，４月齢のｐｏｌｄ１ｅｘｏ／−マウスの腫脹した胸腺の写真である。Ｔｈは胸腺，Ｈは心臓を示す。図４（Ｂ）は１４月齢のｐｏｌｄ１ｅｘｏ／−マウスの小塊が形成された尾の写真である。
【図５】図５は，変異蓄積実験マウスの概略図である。変異マウスは，致死性変異を有するマウスはＤＮＡを子孫に伝えることができないので，世代が繰り返される間に効果的に，中立突然変異を含む非致死性変異を多く蓄積する。
【図６】図６は，さえずり変異体（ｃｈｉｒｐｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ）を示す。図６（Ａ）は，さえずり変異体（ｃｈｉｒｐｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ）が発する音の代表的なソノグラムを示す。縦軸は可聴周波数（ｋＨｚ）を示し，横軸は時間（ｓ）を示し，ドットの濃さは音の強さを示す。図６（Ｂ）〜図６（Ｅ）は，さえずり（ｃｈｉｒｐｉｎｇ）の表現型の遺伝的形質を特性化した図である。丸はメス，四角はオス，黒塗の形状はさえずり（ｃｈｉｒｐｉｎｇ）の表現型であることを示す。丸の中に番号１が記載されているものは，図６（Ｂ）型から得られたメスであることを示す。
【図７】図７は，足の変異体を示す。図７（Ａ）〜図７（Ｃ）は，変異体の足の図面にかわる写真である。図７（Ｄ）は，野生型の足の図面にかわる写真である。図７（Ｅ）は足の表現型の遺伝形質を示す系統図である。丸はメス，四角はオス，黒塗は足の表現型が発現したマウスを示す。図７（Ｅ）の「ｌｏｓｓ」は，出生した仔の中で指数が減少している仔の数を示す。
【図８】図８は，可視的な表現型の図面に代わる写真である。図８（Ａ）は，毛色の一部がブラウンであるマウスの図面にかわる写真である。図８（Ｂ）は，下顎が未成熟なマウスの図面にかわる写真である。図８（Ｃ）は，異常行動：継続的に右に回転をするマウスの図面にかわる写真である。図８（Ｄ）は，尾が巻いているマウスの図面にかわる写真である。図８（Ｅ）は，コントロールの通常の尾（下）に比べて尾が短い（上）マウスの図面にかわる写真である。
【図９】図９は，理論モデルによって得られるグラフを示す。図９（Ａ）は，自然致死変異率，すなわち第一交配組から経た世代の数と，子孫間での死亡頻度との間の関係を示す。図９（Ｂ）は，無限に世代を経た後の自然致死変異率と子孫間での死亡頻度との関係を示す。
【図１（Ａ）】
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【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図１（Ｄ）】
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【図１（Ｅ）】
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【図１（Ｆ）】
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【図１（Ｇ）】
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【図１（Ｈ）】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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