(57)【要約】      （修正有）【課題】効率の良いペプチドの製造方法を提供する。【解決手段】Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来アミノ酸エステルトランスペプチダーゼ（ＡＥＴ）のＮ末端シグナルペプチドをＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由来のものへと置換したＡＥＴ発現株、およびＮ末端のシグナルペプチドを様々な箇所で欠損させたＡＥＴ発現株を構築し、サイトゾルに局在し、酵素活性に優れるＡＥＴ培養物を得た、該培養物とカルボキシ成分と、アミン成分とを混合し、ペプチドを生成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）群、（Ｂ）群、（Ｃ）群、（Ｄ）群、ならびに（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを含む形質転換体を培養し、培養物を調製する、培養物調製工程と、
前記培養物と、カルボキシ成分と、アミン成分とを混合し、ペプチドを生成する、反応工程とを含み、
前記（Ａ）群が、
（Ａ１８）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第１８番目のロイシン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ１９）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第１９番目のヒスチジン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２０）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２０番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２１）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２１番目のグルタミン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２２）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２２番目のスレオニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２３）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２３番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、および
（Ａ２４）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２４番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
からなる群であり、
前記（Ｂ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｃ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｄ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｅ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群である、
ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記（Ａ）群が、前記（Ａ１８）、（Ａ１９）、（Ａ２０）、および（Ａ２１）からなる群である、請求項１に記載のペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記培養物調製工程において、形質転換体を２７℃以上３５℃以下の温度条件下で培養する、請求項１または２に記載のペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記形質転換体の宿主が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項５】
生成するペプチドが、ジペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項６】
カルボキシ成分がアミノ酸エステルである、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項７】
カルボキシ成分がアスパラギン酸ジメチルエステルであり、アミン成分がフェニルアラニンであり、生成するペプチドがα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルである、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
【請求項８】
下記（Ａ）群、（Ｂ）群、（Ｃ）群、（Ｄ）群、ならびに（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを含む形質転換体を作製し、前記形質転換体を培養して前記タンパク質を発現させる工程を含み、
前記（Ａ）群が、
（Ａ１８）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第１８番目のロイシン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ１９）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第１９番目のヒスチジン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２０）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２０番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２１）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２１番目のグルタミン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２２）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２２番目のスレオニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２３）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２３番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、および
（Ａ２４）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２４番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
からなる群であり、
前記（Ｂ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｃ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｄ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｅ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群である、
タンパク質の製造方法。
【請求項９】
前記形質転換体を２７℃以上３５℃以下の温度条件下で培養する、請求項８に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
前記形質転換体の宿主が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項８または９に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチドの製造方法に関し、詳しくは、ペプチドの製造方法およびこれに用いるタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、医薬品、食品等のさまざまな分野で利用されている。例えば、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンはＬ−グルタミンに比べ安定かつ水溶性も高いことから、輸液や無血清培地の成分として広く用いられている。  
【０００３】
ペプチドの製造法としては従来から化学合成法が知られているが、その製造法は必ずしも簡便さ、効率性の点で満足のいくものではなかった。
【０００４】
他方、酵素を用いたペプチドの製造方法も開発されてきた（例えば特許文献１、２など）。しかしながら、従来の酵素を用いたペプチドの製造方法では、ペプチド生成速度が極めて遅い、ペプチド生成収率が低いなどの点で改善の余地が残されるものであった。このような背景の下、工業的にも効率の良いペプチドの製造法の開発が望まれている。その一つの方策として、ペプチドの工業的製造に適した酵素の発掘、改良などが試みられている。
【０００５】
ペプチド生成活性に優れた酵素として、スフィンゴバクテリウムに由来する酵素が見出されている（例えば、特許文献３〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＥＰ  ２７８７８７  Ａ１公報
【特許文献２】ＥＰ  ３５９３９９  Ｂ１公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０１１６５３号
【特許文献４】特開２００５−０５８２１２号公報
【特許文献５】国際公開第２００６／０７５４８６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、効率の良いペプチドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはペプチドの製造方法に用いる酵素として、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ（スフィンゴバクテリウム・マルチボラム、以下、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍと記す場合がある）由来アミノ酸エステルトランスペプチダーゼ（以下、ＡＥＴと略記する場合がある）に着目した。Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴのＮ末端には、イン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）の配列予測によると、配列番号２の配列における１番目のメチオニン残基から２０番目のアラニン残基がシグナルペプチドであると推定された。そのため、一般的に考えると、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴはペリプラズムに局在すると予想された。
【０００９】
本発明者らは、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、以下、Ｅ．ｃｏｌｉと略記する場合がある）で発現させた際のＡＥＴの局在を確認したところ、予想外に、可溶化ＡＥＴおよび不溶化ＡＥＴいずれの局在もサイトゾルであり、いずれにおいてもシグナルペプチドは切断されていることを見出した。すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現において、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴのシグナルペプチドは切断されるものの、ペリプラズムへの移行にシグナルペプチドはあまり寄与していないと推定された。このような現象は、シグナルペプチドを有するタンパク質としては一般的ではない。
【００１０】
さらに本発明者らは、酵素活性の観点からすると、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴをＥ．ｃｏｌｉで発現させた際の局在はサイトゾルまたはペリプラズムのいずれが適しているかについて判断するため、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴのＮ末端シグナルペプチドをＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由来のものへと置換したＡＥＴ発現株、およびＮ末端のシグナルペプチドを様々な箇所で欠損させたＡＥＴ発現株を構築し、種々の実験を行った。その結果、配列番号２の配列における２番目のリジン残基から、第１８番目のロイシン残基あるいは第１９番目のヒスチジン残基あるいは第２０番目のアラニン残基あるいは第２１番目のグルタミン残基あるいは第２２番目のスレオニン残基あるいは第２３番目のアラニン残基あるいは第２４番目のアラニン残基を欠損させたＳ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴが、サイトゾルに局在し、しかも培養物として酵素活性に優れるという知見を得て、本発明を完成させた。本発明は係る知見に基づき、下記ペプチドの製造方法およびこれに用いるタンパク質の製造方法を提供するものである。
【００１１】
〔１〕下記（Ａ）群、（Ｂ）群、（Ｃ）群、（Ｄ）群、ならびに（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを含む形質転換体を培養し、培養物を調製する、培養物調製工程と、
前記培養物と、カルボキシ成分と、アミン成分とを混合し、ペプチドを生成する、反応工程とを含み、
前記（Ａ）群が、
（Ａ１８）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第１８番目のロイシン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ１９）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第１９番目のヒスチジン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２０）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２０番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２１）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２１番目のグルタミン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２２）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２２番目のスレオニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２３）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２３番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、および
（Ａ２４）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２４番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
からなる群であり、
前記（Ｂ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｃ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｄ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｅ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群である、
ペプチドの製造方法。
〔２〕前記（Ａ）群が、前記（Ａ１８）、（Ａ１９）、（Ａ２０）、および（Ａ２１）からなる群である、上記〔１〕に記載のペプチドの製造方法。
〔３〕前記培養物調製工程において、形質転換体を２７℃以上３５℃以下の温度条件下で培養する、上記〔１〕または〔２〕に記載のペプチドの製造方法。
〔４〕前記形質転換体の宿主が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
〔５〕生成するペプチドが、ジペプチドである、上記〔１〕から〔４〕のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
〔６〕カルボキシ成分がアミノ酸エステルである、上記〔１〕から〔５〕のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
〔７〕カルボキシ成分がアスパラギン酸ジメチルエステルであり、アミン成分がフェニルアラニンであり、生成するペプチドがα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルである、上記〔１〕から〔６〕のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
〔８〕下記（Ａ）群、（Ｂ）群、（Ｃ）群、（Ｄ）群、ならびに（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを含む形質転換体を作製し、前記形質転換体を培養して前記タンパク質を発現させる工程を含み、
前記（Ａ）群が、
（Ａ１８）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第１８番目のロイシン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ１９）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第１９番目のヒスチジン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２０）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２０番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２１）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２１番目のグルタミン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２２）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２２番目のスレオニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
（Ａ２３）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２３番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、および
（Ａ２４）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２４目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質、
からなる群であり、
前記（Ｂ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｃ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｄ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群であり、
前記（Ｅ）群が、前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群である、
タンパク質の製造方法。
〔９〕前記形質転換体を２７℃以上３５℃以下の温度条件下で培養する、上記〔８〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔１０〕前記形質転換体の宿主が、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、上記〔８〕または〔９〕に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、可溶化しやすく、単位量あたりの酵素活性が高い培養物を用いてペプチドを製造するため、効率の良いペプチドの製造方法が提供される。本発明のペプチドの製造方法では、酵素を含有する培養物の調製が簡便であり、工業的なペプチドの製造方法において有利である。また、酵素活性の高い培養物を調製し得るため、培養物の添加量を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す図である。各レーンの画分は次のとおりである。第１レーン：ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第２レーン：第１レーンの遠心上清画分。第３レーン：第１レーンの遠心沈殿画分。第４レーン：ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第５レーン：第４レーンの遠心上清画分。第６レーン：第４レーンの遠心沈殿画分。第７レーン：ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第８レーン：第７レーンの遠心上清画分。第９レーン：第７レーンの遠心沈殿画分。
【図２】図２は、サイトゾル画分（Ｃｙ）とペリプラズム画分（Ｐｅ）の活性の総和を１００％としたときの、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル生成活性およびグルコース６燐酸デヒドロゲナーゼ活性の相対値を示す。（以下、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステルをＡＭＰと略記する場合がある。）
【図３−１】図３−１は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて展開した結果を示す。各レーンの画分は次のとおりである。第１レーン：２５℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第２レーン：第１レーンの遠心上清画分。第３レーン：第１レーンの遠心沈殿画分。第４レーン：２５℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第５レーン：第４レーンの遠心上清画分。第６レーン：第４レーンの遠心沈殿画分。第７レーン：２５℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第８レーン：第７レーンの遠心上清画分。第９レーン：第７レーンの遠心沈殿画分。
【図３−２】図３−２は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて展開した結果を示す。各レーンの画分は次のとおりである。第１レーン：３０℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第２レーン：第１レーンの遠心上清画分。第３レーン：第１レーンの遠心沈殿画分。第４レーン：３０℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第５レーン：第４レーンの遠心上清画分。第６レーン：第４レーンの遠心沈殿画分。第７レーン：３０℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第８レーン：第７レーンの遠心上清画分。第９レーン：第７レーンの遠心沈殿画分。
【図４】図４は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて展開した結果を示す。各レーンの画分は次のとおりである。第１レーン：２５℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第２レーン：第１レーンの遠心上清画分。第３レーン：第１レーンの遠心沈殿画分。第４レーン：２５℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第５レーン：第４レーンの遠心上清画分。第６レーン：第４レーンの遠心沈殿画分。第７レーン：２５℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２５−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第８レーン：第７レーンの遠心上清画分。第９レーン：第７レーンの遠心沈殿画分。第１０レーン：２５℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２６−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第１１レーン：第１０レーンの遠心上清画分。第１２レーン：第１０レーンの遠心沈殿画分。第１３レーン：３０℃培養したｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２７−ＡＥＴ発現株の菌体破砕全画分。第１４レーン：第１３レーンの遠心上清画分。第１５レーン：第１３レーンの遠心沈殿画分。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、以下に挙げる種々の遺伝子工学的な技法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第４版、村松ら編、羊土社（２００３年）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献を参考にすることにより当業者であれば実施可能である。
【００１５】
本明細書において用いられる用語は、基本的に、化学分野、生命科学分野、遺伝子工学分野などにおける標準的な意味に従って用いられるが、本発明をより明確に説明するために本明細書において用いられる用語の一部について、以下説明する。
本明細書において、酵素とは、化学反応を触媒する活性を有するタンパク質のことをいう。
本明細書においてペプチドとは、２個以上のアミノ酸またはその誘導体がペプチド結合によって結合した化合物のことをいう。本明細書では、化合物としてのペプチドとポリペプチドとは同義である。
本明細書において、ジペプチドとは、２個のアミノ酸またはその誘導体がペプチド結合によって結合した化合物をいう。
本明細書においてトリペプチドとは、３個のアミノ酸またはその誘導体が２つのペプチド結合を介して結合した化合物のことをいう。
本明細書においてオリゴペプチドとは、分子中に含まれるアミノ酸残基が少数であるポリペプチドのことをいう。オリゴペプチドは、ポリペプチドとしては低分子量のポリペプチドである。オリゴペプチドのアミノ酸残基数は、必ずしも明確に定めることを要しないが、例えば、２〜２０程度であり、または２〜１０程度であり、または２〜５程度であり得る。
本発明は酵素反応を利用したペプチドの製造方法を提供する。本明細書では、生成目的のペプチドを単にペプチドと表記する場合がある。
本明細書においてペプチド生成活性とは、アミン成分とカルボキシ成分とからペプチドを生成する反応を触媒する活性のことをいう。  
本明細書において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらのハイブリッドであり得る。
また、本明細書においては、特に断らない限り、配列番号は配列表中の配列番号を示す。
【００１６】
本発明のペプチドの製造方法は、ペプチド生成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを含む形質転換体を培養し、培養物を調製する、培養物調製工程と、前記培養物と、カルボキシ成分と、アミン成分とを混合し、ペプチドを生成する、反応工程とを含む。以下、各工程に沿って順次説明する。
【００１７】
１．培養物調製工程
１．１  本発明で用いられるタンパク質
培養物調製工程では、（Ａ）群、（Ｂ）群、（Ｃ）群、（Ｄ）群、ならびに（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを含む形質転換体を培養し、培養物を得る。
（Ａ）群は、次の（Ａ１８）から（Ａ２４）からなる群により構成される。
（Ａ１８）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第１８番目のロイシン残基までを欠失させた配列である、タンパク質。
（Ａ１９）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第１９番目のヒスチジン残基までを欠失させた配列である、タンパク質。
（Ａ２０）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２０番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質。
（Ａ２１）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２１番目のグルタミン残基までを欠失させた配列である、タンパク質。
（Ａ２２）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２２番目のスレオニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質。
（Ａ２３）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２３番目のアラニン残基までを欠失させた配列である、タンパク質。
（Ａ２４）アミノ酸配列が、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から、第２４番目のアラニン酸残基までを欠失させた配列である、タンパク質。
【００１８】
（Ａ１８）から（Ａ２４）の各タンパク質は、配列番号２の配列に照らして明らかなように、次のとおり言い換えることができる。
（Ａ１８）Ｎ末端がメチオニンであり、これに続いて、配列番号２の配列における第１９番目のヒスチジン残基から第６１９番目のアスパラギン酸残基までの全長配列からなるアミノ酸配列で構成されるタンパク質。
（Ａ１９）Ｎ末端がメチオニンであり、これに続いて、配列番号２の配列における第２０番目のアラニン残基から第６１９番目のアスパラギン酸残基までの全長配列からなるアミノ酸配列で構成されるタンパク質。
（Ａ２０）Ｎ末端がメチオニンであり、これに続いて、配列番号２の配列における第２１番目のグルタミン残基から第６１９番目のアスパラギン酸残基までの全長配列からなるアミノ酸配列で構成されるタンパク質。
（Ａ２１）Ｎ末端がメチオニンであり、これに続いて、配列番号２の配列における第２２番目のスレオニン残基から第６１９番目のアスパラギン酸残基までの全長配列からなるアミノ酸配列で構成されるタンパク質。
（Ａ２２）Ｎ末端がメチオニンであり、これに続いて、配列番号２の配列における第２３番目のアラニン残基から第６１９番目のアスパラギン酸残基までの全長配列からなるアミノ酸配列で構成されるタンパク質。
（Ａ２３）Ｎ末端がメチオニンであり、これに続いて、配列番号２の配列における第２４番目のアラニン酸残基から第６１９番目のアスパラギン酸残基までの全長配列からなるアミノ酸配列で構成されるタンパク質。
（Ａ２４）Ｎ末端がメチオニンであり、これに続いて、配列番号２の配列における第２５番目のアスパラギン酸残基から第６１９番目のアスパラギン酸残基までの全長配列からなるアミノ酸配列で構成されるタンパク質。
【００１９】
アミノ酸配列が配列番号２で表されるタンパク質は、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴであり、ペプチド生成活性を有する。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、コドンの縮重により複数の塩基配列によりコードされ得る。配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、例えば、配列番号１の配列において表される塩基配列が挙げられる。
【００２０】
配列番号１における塩基配列で特定されるポリヌクレオチドおよび配列番号２のアミノ酸配列で特定されるタンパク質は、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍから単離し得る。より具体的な例としては、これらのポリヌクレオチドおよびタンパク質は、スフィンゴバクテリウム・マルチボラム  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１６３株（寄託者が付した識別のための表示：Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ  ＡＪ２４５８）から単離し得る。ＦＥＲＭ番号が記載されている菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に寄託されており、受託番号を参照して分譲を受けることができる。配列番号１のポリヌクレオチドおよび配列番号２のタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、当業者であれば、スフィンゴバクテリウム属に属する微生物、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍなどから単離し得る。
【００２１】
（Ａ）群のタンパク質は、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴのアミノ酸配列のＮ末端側の領域であって、シグナルペプチドに該当すると推定される配列番号２の配列における第１番目のメチオニン残基から第２０番目のアラニン残基のうち、第２番目のリジン残基から第２０番目のアラニン残基の一部または全部を欠失させたものである（以下、本明細書においては、シグナルペプチドに相当すると推定される配列番号２の配列における第１番目のメチオニン残基から第２０番目のアラニン残基を単にシグナルペプチドと略称する場合がある）。（Ａ）群のタンパク質は、ペプチド生成活性を有する。シグナルペプチドを具備しないため、細菌の体内で発現した際に、サイトゾルに局在する傾向が強い。また（Ａ）群のタンパク質はシグナルペプチドを含むタンパク質に比べ、水溶液に可溶化しやすい。また（Ａ）群のタンパク質を発現する細胞を培養して得られる培養物は、シグナルペプチドを含むタンパク質を発現する細胞を培養して得られる培養物に比べ、培養物単位量あたりの酵素活性が向上する。さらに、（Ａ）群のタンパク質は、シグナルペプチドを含むタンパク質と比べ、より高温条件下でも活性を維持する傾向が認められる。そのため、培養物の調製温度を高めに設定してもよく、培養物の調製時間を短縮することが可能である。これらの特性は、（Ａ）群のタンパク質は封入体を形成しにくいという特性とも関連すると考えられる。
【００２２】
前記（Ａ）群に属するタンパク質のうちでも、ペプチドの生成活性や可溶化の観点から総合的に判断すると、ペプチドの工業的生産においては、（Ａ１８）、（Ａ１９）、（Ａ２０）、および（Ａ２１）のタンパク質が好ましく、より好ましくは（Ａ１９）および（Ａ２０）のタンパク質が挙げられる。
【００２３】
本発明のペプチド製造方法では、（Ａ）群のタンパク質のみならず、これと実質的に同等のタンパク質群も用いる。（Ａ）群のタンパク質と同等のタンパク質群としては、次の（Ｂ）群、（Ｃ）群、（Ｄ）群および（Ｅ）群のいずれかの群に属するタンパク質が挙げられる。
（Ｂ）群：前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群。
（Ｃ）群：前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群。
（Ｄ）群：前記（Ａ）から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群。
（Ｅ）群：前記（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質からなる群。
【００２４】
（Ｂ）群、（Ｃ）群、（Ｄ）群および（Ｅ）群の各群のタンパク質は、（Ａ）群のタンパク質の立体構造または活性を大きく損なわないような範囲で、アミノ酸配列（またはこれをコードするヌクレオチド）が異なるタンパク質である。（Ｂ）群から（Ｅ）群の各群のタンパク質としては、（Ａ）群に属する（Ａ１８）から（Ａ２４）の各タンパク質に対応したタンパク質が含まれる。
【００２５】
（Ｂ）群のタンパク質として、以下の（Ｂ１８）から（Ｂ２４）のタンパク質が含まれる。
（Ｂ１８）：（Ａ１８）のタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｂ１９）：（Ａ１９）のタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｂ２０）：（Ａ２０）のタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｂ２１）：（Ａ２１）のタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｂ２２）：（Ａ２２）のタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｂ２３）：（Ａ２３）のタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｂ２４）：（Ａ２４）のタンパク質に、さらに置換、欠失、挿入、および付加からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸残基の変異を含み、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
【００２６】
（Ｃ）群のタンパク質として、以下の（Ｃ１８）から（Ｃ２４）のタンパク質が含まれる。
（Ｃ１８）：（Ａ１８）のタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ１９）：（Ａ１９）のタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ２０）：（Ａ２０）のタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ２１）：（Ａ２１）のタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ２２）：（Ａ２２）のタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ２３）：（Ａ２３）のタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ２４）：（Ａ２４）のタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
【００２７】
（Ｄ）群のタンパク質として、以下の（Ｄ１８）から（Ｄ２４）のタンパク質が含まれる。
（Ｄ１８）：（Ａ１８）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｄ１９）：（Ａ１９）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｄ２０）：（Ａ２０）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｄ２１）：（Ａ２１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｄ２２）：（Ａ２２）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｄ２３）：（Ａ２３）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｄ２４）：（Ａ２４）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
【００２８】
（Ｅ）群のタンパク質として、以下の（Ｅ１８）から（Ｅ２４）のタンパク質が含まれる。
（Ｅ１８）：（Ａ１８）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｅ１９）：（Ａ１９）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｅ２０）：（Ａ２０）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｅ２１）：（Ａ２１）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｅ２２）：（Ａ２２）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｅ２３）：（Ａ２３）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
（Ｅ２４）：（Ａ２４）のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされ、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質。
【００２９】
（Ｂ）群から（Ｅ）群のタンパク質は、ペプチド生成活性を保持する。（Ｂ）群から（Ｅ）群のタンパク質としては、２０℃、ｐＨ８．５の条件下で、対応する（Ａ）群のタンパク質が有するペプチド生成活性の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上を保持していることが望ましい。
【００３０】
（Ｂ）群のタンパク質としては、（Ａ）群に属する（Ａ１８）から（Ａ２４）の各タンパク質にそれぞれ対応したタンパク質が含まれる。アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、用語「１又は数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００３１】
（Ｃ）群のタンパク質は、（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質と、７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質である。アミノ酸配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上である。複数の配列間における同一性を示す数値は、配列解析用のソフトウエアによって算出可能である。なお、本明細書において示すアミノ酸配列の同一性の数値は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ポリペプチド鎖全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ  ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させて算出された数値である。
【００３２】
（Ｄ）群のタンパク質は、（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質である。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件は、例えば、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄である。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００３３】
（Ｅ）群のタンパク質は、（Ａ）群から選ばれるいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、７０％以上の塩基配列同一性を有し、かつ、ペプチド生成活性を有するタンパク質である。塩基配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上である。複数の配列間における同一性を示す数値は、配列解析用のソフトウエアによって算出可能である。なお、本明細書において示す塩基配列の同一性の数値は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ポリヌクレオチド鎖全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝６、ｐｉｃｋ  ｕｐ  ｌｏｃａｔｉｏｎ＝１でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させて算出された数値である。
【００３４】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、及び硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、及びグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００３５】
本発明で用いられるタンパク質は、部位特異的変異法等の変異導入法により、または精製用配列等のタグ配列を有する発現ベクターに、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより調製され得る。また、上記のようなアミノ酸配列を有するタンパク質は、従来知られている突然変異処理によって取得してもよい。突然変異処理としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列で特定されるタンパク質をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び当該タンパク質をコードするＤＮＡを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３６】
また、上記のような変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、配列番号２のアミノ酸配列により特定されるタンパク質と実質的に同等のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００３７】
１．２  培養物の調製（タンパク質の製造方法）
培養物調製工程では、上記（Ａ）群から（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質を形質転換体に産生させ、形質転換体を培養することによって、上記（Ａ）群から（Ｅ）群のタンパク質を含む培養物を調製する。
【００３８】
（Ａ）群から（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質を発現する形質転換体は、当該タンパク質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築し、これを適切な宿主に導入することにより得ることができる。例えば、（Ａ１８）のタンパク質をコードする塩基配列として、配列番号１の配列の第４番目のアデニンから第５４番目のアデニンまでの塩基配列を除いた配列からなるＤＮＡ断片を調製し、このＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターを構築し、この発現ベクターを適切な宿主に導入することにより、（Ａ１８）のタンパク質を発現する形質転換体を得ることができる。他のタンパク質を発現する形質転換体も同様にして調製し得る。
【００３９】
所定のＤＮＡを宿主に導入するために用いる発現ベクターは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらのＤＮＡを、ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで構築することができる。
【００４０】
タンパク質を発現させるための宿主としては、培養による増殖性が高く、取扱の容易な細胞が好適であり、一般に、微生物を用い得る。宿主として好ましい微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用いることができ、工業的なペプチドの製法においては、培養や取扱の容易性などの観点から、Ｅ．ｃｏｌｉが好適である。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉについて詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択し得る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などの文献に記載されている。
【００４１】
以下、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００４２】
ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ＲＳＦ１０１０、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＱＥ３０およびその誘導体等を用いてもよい。ベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が好適である。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモータを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。
【００４３】
形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモータを持つ発現ベクターが市販されている（例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製））。
【００４４】
プロモータとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００４５】
生産量を増大させるためには、目的タンパク質をコードするＤＮＡの下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、Ｅ．ｃｏｌｉｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００４６】
プロモータと、ペプチド生成活性を有する目的タンパク質またはその目的タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子と、任意のターミネータとを、この順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを所定の制限酵素を用いて連結し、発現ベクターを構築し得る。
【００４７】
得られた発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、このＥ．ｃｏｌｉを培養すると、所定のタンパク質が発現することにより生産される。
【００４８】
宿主の種類に応じて適当な培地で培養増殖せしめることにより、所望のタンパク質を大量生産することができる。培地はその宿主が増殖し得るものであれば特に制限はなく、通常の炭素源、窒素源、リン源、硫黄源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常の培地でよい。
【００４９】
宿主が微生物の場合を主に想定すると、培地に加える成分としては次のような成分が挙げられる。
例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フラクトース、マルトース、アミロース等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸などの有機酸類及びこれらの塩類、パラフィンなどの炭水化物類あるいはこれらの混合物などを使用し得る。
【００５０】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの有機窒素化合物あるいはこれらの混合物を使用し得る。
【００５１】
他に無機塩類、微量金属塩、ビタミン類等、通常の培地に用いられる栄養源を適宜混合して用い得る。
【００５２】
生産培地として、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、Ｅ．ｃｏｌｉを培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主などの種類に応じて適宜選択し得る。
【００５３】
本発明のペプチドの製造方法で用いる培養物は、上記のように形質転換体を培養し得られ、上記の（Ａ）群から（Ｅ）群から選ばれるいずれかのタンパク質を含有するものである。培養物の具体的な形態としては、例えば、培養された形質転換体、培養に用いた培地、および培養された形質転換体により生成された物質、およびこれらの混合物などが挙げられる。例えば、微生物を宿主とする場合、培養された微生物そのもの、その微生物を培養した培地、培養された微生物により精製された物質、およびこれらの混合物などを培養物として用い得る。菌体処理物を培養物として用いてもよく、菌体処理物の形態としては、菌体の破砕物、溶菌物、凍結乾燥物などが挙げられる。さらに培養物を粗精製処理してペプチド生成活性を有するタンパク質濃度を高めてもよい。
【００５４】
本発明のペプチドの製造方法の一実施形態としては、得られた菌体またはこれを含む混合物を培養物として利用する形態が挙げられる。菌体をそのまま用いることができるため、菌体を破砕または溶菌するなどの手間を要しない、破砕または溶菌により露出した菌体由来のペプチド分解酵素と、生成目的物としてのペプチドとの接触のおそれを低減することができるなどの利点がある。
【００５５】
形質転換体の培養温度は、形質転換体の宿主の種類などによって調整してよい。本発明の一つの側面として、培養温度の下限値は、好ましくは２７℃以上、より好ましくは２８℃以上、さらに好ましくは２９℃以上を提示し得る。上記（Ａ）群から（Ｅ）群のタンパク質のようにシグナルペプチドを当初から除いたタンパク質は、上記下限値以上の温度としても、シグナルペプチドが付属したままのタンパク質と比べて封入体を形成しにくく、可溶化しやすい（これに対して、シグナルペプチドを備えたままの場合、２７℃以上では封入体を形成し、不溶化しやすい）。Ｅ．ｃｏｌｉなど宿主として汎用される微生物は一般に上記の下限値よりも高い温度条件下とすることにより増殖速度が高めることができる。すなわち、上記（Ａ）群から（Ｅ）群のタンパク質のように、当初からシグナルペプチドを除いたタンパク質を発現させることにより、形質転換体の増殖速度を向上させるように温度の設定をしやすく、目的とするペプチド生成活性を有するタンパク質の生産効率を向上させることができる。上限値は、目的のタンパク質が変性しない温度、または宿主の増殖性などの観点から適宜定められる。培養温度の上限値は、例えば、５５℃以下、または４０℃以下、または３５℃以下とし得る。上記のように、培養温度の下限および上限はそれぞれ調整可能であるが、培養温度の好ましい一形態としては、２９〜３０℃に調整される。
【００５６】
２．ペプチドを生成する反応工程
本発明のペプチドの製造方法は、上記のようにして調製された培養物と、カルボキシ成分と、アミン成分とを混合して、カルボキシ成分とアミン成分とを反応させ、ペプチドを生成する反応工程とを含む。
【００５７】
反応温度は、例えば０℃以上６０℃以下であり、好ましくは５℃以上４０℃以下である。本発明において用いるタンパク質は、シグナルペプチドを当初から欠失した状態で発現しており、シグナルペプチドが付属したままのタンパク質よりも高い温度条件下でも酵素活性を維持している。そのためシグナルペプチドが付属したままのタンパク質を用いる場合よりも、比較的高温条件下で反応工程を実施可能であり、ペプチドの生成反応が促進されやすい温度条件設定が可能である。
反応ｐＨは、例えば６．５〜１０．５であり、好ましくは７．０〜１０．０である。
【００５８】
培養物の使用量は、目的とする効果を発揮する量（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められる。
ペプチドの生成反応を行うための好ましい一実施形態としては、５０ｍＭ  アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩、７５ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニン、１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２０℃の培養条件において、反応液１ｍｌにつき２．２Ｕ分の酵素（培養液）を添加する形態が挙げられる。この条件を満たすための、シグナルペプチドを有する酵素の発現菌の添加量、およびシグナルペプチド欠損酵素の発現菌の添加量を、下記実施例中の表３−１の数値を利用して求めると、それぞれ次のようになる。下記実施例中の表３−１によると、シグナルペプチドを有する酵素の発現菌ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴでは、ＯＤ１あたりのＡＭＰ生成活性は２．９６Ｕ／ｍｌである。これに対して、シグナルペプチド欠損酵素の発現菌の一つであるｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１  ＡＥＴでは、４．６９Ｕ／ｍｌである。したがって、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴでは、ＯＤ１あたりの菌体が０．７４ｍｌ必要となるのに対して、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１  ＡＥＴではＯＤ１あたりの菌体が０．４４ｍｌ必要であり、後者の方が菌体の添加量を０．３０ｍｌ低減することができる。
【００５９】
２５℃の培養条件において、反応液１ｍｌにつき２．２Ｕ分の酵素（培養液）を添加する場合の菌体の添加量を対比すると次のようになる。下記実施例中の表３−２によると、シグナルペプチドを有する酵素の発現菌ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴでは、ＯＤ１あたりのＡＭＰ生成活性は１．１５Ｕ／ｍｌである。これに対して、シグナルペプチド欠損酵素の発現菌の一つであるｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２０  ＡＥＴでは、４．５８Ｕ／ｍｌである。したがって、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴでは、ＯＤ１の菌体が１．９１ｍｌ必要となるのに対して、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２０  ＡＥＴではＯＤ１の菌体が０．４８ｍｌ必要であり、後者の方が菌体の添加量を１．４３ｍｌ低減することができる。
【００６０】
上記培養物調整工程で得られる培養物は、可溶性が高く、培養物の単位量あたりの酵素活性が高いものとすることができる。そのため、培養物の添加量を抑制することができ、製造コストの低減を図ることが可能である。また、生成物であるペプチドは、例えばフィルターなどを使って回収することができる。そのため、培養物の添加量を抑制することができることにより、フィルターに対する負荷を低減することが可能であり、例えばフィルターの交換回数を減らすことが可能である。したがって、この点からも製造コストの低減を図ることが可能である。さらに、培養物の単位量あたりの酵素活性の向上によって反応系に添加する菌体量を低減できるため、宿主由来のペプチド分解酵素によって生成目的とするペプチドを分解してしまうリスクを低減し得る。
【００６１】
なお、微生物の培養物を用いる場合には、ペプチドの生成に関与せずに生成ペプチドを分解する酵素が存在する場合があり、この場合には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属プロテアーゼ阻害剤を添加するほうが好ましい場合がある。添加量は、０．１ｍＭから３００ｍＭの範囲で、好ましくは１ｍＭから１００ｍＭである。
【００６２】
基質として、カルボキシ成分およびアミン成分が、ペプチドを生成するための反応系に添加される。本明細書において、カルボキシ成分とは、ペプチド結合（−ＣＯＮＨ−）を形成する反応において、カルボニル基（−ＣＯ−）を供与する成分のことをいい、アミン成分とは、アミノ基（−ＮＨ−）を供与する成分のことをいう。
【００６３】
カルボキシ成分としては、もう一つの基質であるアミン成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものを使用してよい。カルボキシ成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸エステル、Ｄ−アミノ酸エステル、Ｌ−アミノ酸アミド、Ｄ−アミノ酸アミド、およびアミノ基の有さない有機酸エステル等が挙げられる。また、アミノ酸エステルとしては、天然型のアミノ酸に対応するアミノ酸エステルだけでなく、非天然型のアミノ酸もしくはその誘導体に対応するアミノ酸エステルなども例示される。また、アミノ酸エステルとしては、α−アミノ酸エステルの他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸のエステルなども例示される。アミノ酸エステルの代表例としては、アミノ酸のメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｉｓｏ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｉｓｏ−ブチルエステル、およびｔｅｒｔ−ブチルエステル等が挙げられる。
【００６４】
アミン成分としては、もう一つの基質であるカルボキシ成分と縮合してペプチドを生成できるものであれば、いかなるものも使用してよい。アミン成分としては、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｃ保護Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、Ｃ保護Ｄ−アミノ酸、およびアミンなどが挙げられる。また、アミンとしは、天然型アミンだけでなく、非天然型のアミンもしくはその誘導体などが例示される。また、アミノ酸としては、天然型アミノ酸だけではなく非天然型アミノ酸もしくはその誘導体も例示される。α−アミノ酸の他、アミノ基の結合位置の異なる、β−、γ−、ω−等のアミノ酸なども例示される。
【００６５】
出発原料であるカルボキシ成分およびアミン成分の濃度は各々１ｍＭ〜１０Ｍ、好ましくは０．０５Ｍ〜２Ｍであるが、カルボキシ成分に対してアミン成分を等量以上添加したほうが好ましい場合がある。また、基質が高濃度だと反応を阻害するような場合には、反応中にこれらを阻害しない濃度にして逐次添加してもよい。
【００６６】
本発明のペプチドの製造方法は、各種のペプチドの製造するために好適である。ペプチドとしては、例えば、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（ｉ．ｅ．，  α−Ｌ−（β−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ａｓｐａｒｔｙｌ）−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（略称：α−ＡＭＰ）Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ａｌａ−Ｇｌｎ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ａｌａ−Ｐｈｅ）、Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン（Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）、Ｌ−ロイシル−Ｌ−メチオニン（Ｌｅｕ−Ｍｅｔ）、Ｌ−イソロイシル−Ｌ−メチオニン（Ｉｌｅ−Ｍｅｔ）、Ｌ−メチオニル−Ｌ−メチオニン（Ｍｅｔ−Ｍｅｔ）、Ｌ−プロリル−Ｌ−メチオニン（Ｐｒｏ−Ｍｅｔ）、Ｌ−トリプトファニル−Ｌ−メチオニン（Ｔｒｐ−Ｍｅｔ）、Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン（Ｖａｌ−Ｍｅｔ）、Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−メチオニン（Ａｓｎ−Ｍｅｔ）、Ｌ−システイニル−Ｌ−メチオニン（Ｃｙｓ−Ｍｅｔ）、Ｌ−グルタミル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｎ−Ｍｅｔ）、グリシル−Ｌ−メチオニン（Ｇｌｙ−Ｍｅｔ）、Ｌ−セリル−Ｌ−メチオニン（Ｓｅｒ−Ｍｅｔ）、Ｌ−スレオニル−Ｌ−メチオニン（Ｔｈｒ−Ｍｅｔ）、Ｌ−チロシニル−Ｌ−メチオニン（Ｔｙｒ−Ｍｅｔ）、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−メチオニン（Ａｓｐ−Ｍｅｔ）、Ｌ−アルギニル−Ｌ−メチオニン（Ａｒｇ−Ｍｅｔ）、Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−メチオニン（Ｈｉｓ−Ｍｅｔ）、Ｌ−リジル−Ｌ−メチオニン（Ｌｙｓ−Ｍｅｔ）、Ｌ−アラニル−グリシン（Ａｌａ−Ｇｌｙ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−スレオニン（Ａｌａ−Ｔｈｒ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン酸（Ａｌａ−Ｇｌｕ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ａｌａ−Ａｌａ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン酸（Ａｌａ−Ａｓｐ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−セリン（Ａｌａ−Ｓｅｒ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン（Ａｌａ−Ｍｅｔ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−バリン（Ａｌａ−Ｖａｌ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−リジン（Ａｌａ−Ｌｙｓ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アスパラギン（Ａｌａ−Ａｓｎ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−システイン（Ａｌａ−Ｃｙｓ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン（Ａｌａ−Ｔｙｒ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−イソロイシン（Ａｌａ−Ｉｌｅ）、Ｌ−アルギニル−Ｌ−グルタミン（Ａｒｇ−Ｇｌｎ）、グリシル−Ｌ−セリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、グリシル−Ｌ−（ｔ−ブチル）セリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ））、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシルイソロイシル−フェニルアラニン（ＨＩＬ−Ｐｈｅ）などのジペプチド；Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン（ＡＦＡ）、Ｌ−アラニル−グリシル−Ｌ−アラニン（ＡＧＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−アラニン（ＡＨＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニン（ＡＬＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン（ＡＡＡ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−グリシン（ＡＡＧ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン（ＡＡＰ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＡＡＱ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−チロシン（ＡＡＹ）、グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アラニン（ＧＦＡ）、Ｌ−アラニル−グリシル−グリシン（ＡＧＧ）、Ｌ−トレオニル���グリシル−グリシン（ＴＧＧ）、グリシル−グリシル−グリシン（ＧＧＧ）、Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニル−グリシン（ＡＦＧ）などのトリペプチド；グリシル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン（ＧＧＦＭ）などのテトラペプチド；Ｌ−チロシル−グリシル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−メチオニン（ＹＧＧＦＭ）などのペンタペプチドが挙げられる。
【００６７】
本発明のペプチドの製造方法の好ましい一形態としては、カルボキシ成分がアスパラギン酸ジメチルエステルであり、アミン成分がフェニルアラニンであり、生成するペプチドがアスパルチルフェニルアラニンである。より具体的には、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−メチルエステル（ｉ．ｅ．，  α−Ｌ−（β−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ａｓｐａｒｔｙｌ）−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（略称：α−ＡＭＰ）の製造方法として、本発明のペプチドの製造方法は好適である。α−ＡＭＰは、甘味料として大きな需要があるα−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−α−メチルエステル（製品名：アスパルテーム）製造の重要な中間体である。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明について、実施例を示し、より詳細に説明するが、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００６９】
＜実施例１  発現プラスミドの構築＞  
＜１−１＞  ｐｅｌＢシグナルペプチド置換ＡＥＴ発現プラスミドの構築
Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴ全長を含む発現プラスミドｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ（ＷＯ２００６／０７５４８６  Ａ１）を鋳型とし、センスプライマーとして配列番号３の配列で表されるプライマー（ＮｃｏＩ認識配列の後にＳ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴのＮ末端より２１番目のアミノ酸に対応するコドンから増幅するようデザインしたプライマー）およびアンチセンスプライマーとして配列番号４の配列で表されるプライマー（ＸｈｏＩ認識配列の後にＡＥＴの停止コドンから増幅するようデザインしたプライマー）を用いて、９４℃で３０秒、５２℃で１分、６８℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化した後に、アガロース電気泳動にて目的の約１．８ｋｂのＤＮＡを切り出し、ｐＥＴ２２ｂ（ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩサイトに連結した。塩基配列を確認し、正しいものをｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴと名付けた。ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴは、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来の全長ＡＥＴに含まれるシグナルペプチドがシグナルペプチドｐｅｌＢに置換された、「ｐｅｌＢシグナルペプチド置換ＡＥＴ」を発現するプラスミドである。ｐｅｌＢは、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａに由来するシグナルペプチドである。
【００７０】
＜１−２＞  シグナルペプチド欠損ＡＥＴ発現プラスミドの構築
Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴ全長を含む発現プラスミドｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ（ＷＯ２００６／０７５４８６  Ａ１）を鋳型とし、センスプライマーとして配列番号５の配列で表されるプライマー（ＮｄｅＩ認識配列の後にＡＥＴのＮ末端より２１番目のアミノ酸に対応するコドンから増幅するようデザインしたプライマー）とアンチセンスプライマーとして配列番号４の配列で表されるプライマーを用いて９４℃で３０秒、５２℃で１分、６８℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで処理した後に、アガロース電気泳動にて目的の約１．８ｋｂのＤＮＡを切り出し、ｐＥＴ２２ｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトに連結した。塩基配列を確認し、正しいものをｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴと名付けた。ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴは、配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第２０番目のアラニン残基まで欠失したＡＥＴ、すなわちＳ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来の全長ＡＥＴに含まれるシグナルペプチドが欠損したＡＥＴを発現するプラスミドである。
【００７１】
＜１−３＞  ＡＥＴ発現プラスミドの構築
コントロール発現プラスミドとして、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴのシグナルペプチドを有する発現プラスミドについても構築した。Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴ全長を含む発現プラスミドｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ（ＷＯ２００６／０７５４８６  Ａ１）を鋳型とし、センスプライマーとして配列番号６の配列で表されるプライマー（ＮｄｅＩ認識配列の後にＳ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴのＮ末端より２番目のアミノ酸に対応するコドンから増幅するようデザインしたプライマー）とアンチセンスプライマーとして配列番号４の配列で表されるプライマーを用いて、９４℃で３０秒、５２℃で１分、６８℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで消化した後に、アガロース電気泳動にて目的の約１．９ｋｂのＤＮＡを切り出し、ｐＥＴ２２ｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトに連結した。塩基配列を確認し、正しいものをｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴと名付けた。ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴは、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来の全長ＡＥＴ、すなわち野生型のシグナルペプチドを含むＡＥＴを発現するプラスミドである。
【００７２】
＜実施例２  ＡＥＴのＥ．ｃｏｌｉでの発現＞
実施例１で作製した３つの発現プラスミド、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ、およびｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴのそれぞれで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、それぞれｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株と名付けた。ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で２０℃、１６時間前培養した。次に、前培養した各種酵素発現株を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌの培地（４ｇ／ｌ  グリセロール、２４ｇ／ｌ  酵母エキス、１２ｇ／ｌ  ペプトン、２．３ｇ／ｌ  リン酸二水素カリウム、１２．５ｇ／ｌ  リン酸水素二カリウム、２０ｍｌ／ｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１、５０ｍｌ／ｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ２、１ｍｌ／ｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３）を張り込んだ普通試験管に１白金耳植菌し、２０℃、４０時間、１５０往復／分の本培養を実施、培養菌体を得た。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１〜３は、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ１（ｎｏｖａｇｅｎ社）に付属された溶液である。）
【００７３】
＜実施例３  ＡＥＴの活性測定＞
実施例２で得られたそれぞれの培養菌体を、５０ｍＭ  アスパラギン酸ジメチルエステル塩酸塩、７５ｍＭ  Ｌ−フェニルアラニンを含む１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し、２０℃にて反応させた。生成物は、以下に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量し、ＡＥＴ生成活性を求めた。培養菌体添加量は、２％（ｖ／ｖ）とした。
【００７４】
（ＨＰＬＣ）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス社）、溶離液：１００ｍＭ  燐酸水溶液（ｐＨ２．１）、１３％  アセトニトリル、流速：１．０ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、検出：２１０ｎｍ
【００７５】
測定結果を表１に示す。シグナルペプチドと推測される配列番号２の配列における第１番目のメチオニン残基から第２０番目のアラニン残基のうち第２番目のリジン残基から第２０番目のアラニン残基を欠損させたＡＥＴ発現株（ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株）は、コントロール株（ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株）と比較して培養液あたりのＡＭＰ（α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン−β−エステル）生成活性向上が確認された。他方、ｐｅｌＢシグナルペプチドで置換したＡＥＴ発現株（ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株）の培養液あたりの活性は、コントロール株とほぼ同等であった。
【００７６】
各培養液から、菌体を集菌し、超音波破砕した全画分、遠心上清画分、遠心沈殿画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて展開した結果を図１に示す。ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株では、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株と比較して、遠心上清画分のＡＥＴ量増加および遠心沈殿画分のＡＥＴ量減少が認められた。すなわち、シグナルペプチドと推測される配列番号２の配列における第１番目のメチオニン残基から第２０番目のアラニン残基のうち第２番目のリジン残基から第２０番目のアラニン残基を欠損させたＡＥＴは可溶化しやすく、可溶化しやすくなった事により、培養液の菌体あたりの活性が向上していることが分かった。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
＜実施例４  ＡＥＴの局在＞
実施例２で得られた培養菌体を２５ｇ／ｄｌのスクロース溶液を用いた浸透圧ショック法により、ペリプラズム画分とサイトゾル画分に分画した。２５ｇ／ｄｌのスクロース溶液に浸した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）溶液に浸し、この遠心上清をペリプラズム画分とした。また、その遠心沈殿を再懸濁し、超音波破砕したものをサイトゾル画分とした。サイトゾルを分離したことを確認するため、サイトゾルに存在することが知られているグルコース６燐酸デヒドロゲナーゼの活性を指標とした。測定法は、１ｍＭ  グルコース６燐酸、０．４ｍＭ  ＮＡＤＰ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、３０℃の反応溶液の中に適当量の酵素を添加し、３４０ｎｍの吸光度の測定によりＮＡＤＰＨの生成を測定することにより行なった。
【００７９】
サイトゾル画分（Ｃｙ）とペリプラズム画分（Ｐｅ）の活性の総和を１００％としたときの相対値を図２に示す。グルコース６燐酸デヒドロゲナーゼ活性がペリプラズム画分の混入していないことは、サイトゾル画分にペリプラズム画分が混入していないことを示す。ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株では活性のうち約９０％、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株では約９６％、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株では約９９％がサイトゾル画分に回収された。すなわち、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴは、アミノ酸配列よりペリプラズム酵素であると予測されたが、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現時はＮ末端のシグナル配列は切断されるもののペリプラズムへは移行せずサイトゾル画分に発現した。また、シグナルペプチドと推測される配列番号２の配列における第１番目のメチオニン残基から第２０番目のアラニン残基のうち、第２番目のリジン残基から第２０番目のアラニン残基を欠損させたＡＥＴは可溶化しやすく、培養液の菌体あたりの活性が高かった。
【００８０】
＜実施例５  培養温度の検討＞
シグナルペプチドを欠損させる事でＡＥＴが可溶化しやすい事が分かったため、シグナル配列を欠損したＡＥＴは、より高温の培養温度においても活性発現する事が期待された。そこで、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株を、実施例２に記載の方法にて２５℃、３０℃にて培養し、実施例３に記載の方法にて培養液の菌体あたりの活性を測定した。
【００８１】
結果を表２−１（培養温度２０℃）、表２−２（培養温度２５℃）、および表２−３（培養温度３０℃）に示す。培養温度を２０℃から２５℃に向上させる事により、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株で約４０％にまで培養液あたりの活性が低減したのに対し、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株では約８６％の活性を保持していた。培養温度３０℃では、更なる活性の低下が認められたが、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株が培養液の容量あたりの活性で最も高活性であった。
【００８２】
次に、２５℃および３０℃の培養液から、菌体を集菌し、超音波破砕した全画分、遠心上清画分、遠心沈殿画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて展開した結果を、図３−１および図３−２に示す。２５℃培養にて、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株では、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株と比較して、遠心上清画分（可溶化画分）に著量のＡＥＴが確認された（図３−１）。また、３０℃培養においては、ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株では遠心上清画分にＡＥＴは確認されなかったが、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株ではＡＥＴが確認された（図３−２）。すなわち、シグナルペプチドを欠損させたｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株は、シグナルペプチドを有するｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株、ｐＥＴ２２ｂ  ｐｅｌＢ２１−ＡＥＴ株と比較して、より高温の培養温度においても活性発現する事が明らかとなった。
【００８３】
【表２−１】
2011223896.tif 000003
【００８４】
【表２−２】
2011223896.tif 000004
【００８５】
【表２−３】
2011223896.tif 000005
【００８６】
＜実施例６  開始アミノ酸の至適化＞
ｐＥＴ２２ｂ  ＡＥＴ株の培養液から菌体を集菌し、超音波破砕した遠心上清画分のＡＥＴのＮ末端アミノ酸配列の解析を実施したところ、約３２％がグルタミンであった。これは、アミノ酸配列からの予測通り、配列番号２の配列における第１番目のメチオニン残基から、第２０番目のアラニン残基までが切断されたものと推測された。一方で、約１４％のアスパラギン酸、約１１％のアラニン、約９％のヒスチジンも検出され、他箇所においても切断されている可能性が考えられた。そこで、Ｎ末端の至適化を目的として、以下に示す方法にて、各種シグナル配列欠損発現プラスミドを構築した。
【００８７】
＜シグナルペプチド欠損ＡＥＴ発現プラスミドの構築＞  
Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ由来ＡＥＴ全長を含む発現プラスミドｐＳＦ＿Ｓｍ＿Ａｅｔ（ＷＯ２００６／０７５４８６  Ａ１）を鋳型とし、センスプライマーとして配列番号７〜１４の配列で表されるプライマー（ＮｄｅＩ認識配列の後にＡＥＴのＮ末端より１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７番目のアミノ酸に対応するコドンから増幅するようデザインしたプライマー）とアンチセンスプライマーとして配列番号４の配列で表されるプライマーを用いて９４℃で３０秒、５２℃で１分、６８℃で２分の条件で３０サイクルのＰＣＲを行った。
【００８８】
次に、得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで処理した後に、アガロース電気泳動にて約１．８ｋｂのＤＮＡを切り出し、ｐＥＴ２２ｂ（ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトに連結した。塩基配列を確認し、正しいものをｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ１９−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第１８番目のロイシン残基まで欠失）、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２０−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第１９番目のヒスチジン残基まで欠失）、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２２−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第２１番目のグルタミン残基まで欠失）、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２３−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第２２番目のスレオニン残基まで欠失）、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２４−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第２３番目のアラニン残基まで欠失）、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２５−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第２４番目のアラニン残基まで欠失）、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２６−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第２５番目のアスパラギン酸残基まで欠失）、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２７−ＡＥＴ（配列番号２の配列における第２番目のリジン残基から第２６番目のセリン残基まで欠失）と名付けた。
【００８９】
次に、作製したそれぞれの発現プラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、実施例２に記載の方法にて培養を行ない、実施例３に記載の方法に従って、培養液あたりの活性を測定した。
【００９０】
ＡＭＰ生成活性の測定結果を、表３−１（培養温度２０℃）、表３−２（培養温度２５℃）、および表３−３（培養温度３０℃）に示す。培養温度２５℃、３０℃では、ｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２１−ＡＥＴ株よりもｐＥＴ２２ｂ  ｎ／ｓ２０−ＡＥＴ株の方が培養液あたりの活性が高い事がわかった。
【００９１】
次に、２５℃の培養液から、菌体を集菌し、超音波破砕した全画分、遠心上清画分、遠心沈殿画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にて展開した結果を図４に示す。第５レーン、第８レーン、第１１レーンおよび第１４レーンを比較すると、Ｎ末端からの欠損領域が長いほど、遠心上清画分のＡＥＴ量が減少する傾向が認められた。他方、第６レーン、第９レーン、第１２レーンおよび第１５レーンを比較すると、Ｎ末端からの欠損領域が長いほど、遠心沈殿画分のＡＥＴ量が増加する傾向が認められた。このことから、Ｎ末端からの欠損領域が長いほど、培養液あたりのＡＭＰ生成活性が低下するのは、発現量の低下ではなく封入体形成によるものと推定された。
【００９２】
【表３−１】
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【００９３】
【表３−２】
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【００９４】
【表３−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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