(57)【要約】【課題】光学的オートフォーカス動作を必要とせず、容易に精度よくサンプルを光学的に検出可能なサンプル検出装置と、それを含む検体分析装置を提供する。【解決手段】基板上のサンプルを光学的に検出するサンプル検出装置が、基板３３に光を照射する光学系３４〜４０と、予め求められている基板３３に関する情報に基づいて、基板３３上のサンプルを検出する領域外の３点を、それぞれ個別に光軸方向あるいは光軸方向を基準線としたチルト方向に沿って移動させ、基板上に合焦させるためのチルト動作を行う手段と、を有する。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上のサンプルを光学的に検出するサンプル検出装置において、
前記基板に光を照射する光学系と、
予め求められている前記基板に関する情報に基づいて、前記基板上の前記サンプルを検出する領域外の３点を、それぞれ個別に光軸方向あるいは光軸方向を基準線としたチルト方向に沿って移動させ、前記基板上に合焦させるためのチルト動作を行う手段と、を有することを特徴とするサンプル検出装置。
【請求項２】
前記チルト動作を行う手段は、前記基板上の前記３点にそれぞれ当接し、前記光軸方向にそれぞれ移動させる３本のロッドを有する請求項１に記載のサンプル検出装置。
【請求項３】
前記基板は透光性を有するものであり、
前記光学系は、前記基板の、サンプルが存在する可能性のある面と反対側の面に対向するように配置されている、請求項１または２に記載のサンプル検出装置。
【請求項４】
前記基板に関する情報を入力するための入力部を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサンプル検出装置。
【請求項５】
前記基板に関する情報が記録された記録部を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサンプル検出装置。
【請求項６】
前記記録部はバーコードである、請求項５に記載のサンプル検出装置。
【請求項７】
前記記録部はＩＣタグである、請求項５に記載のサンプル検出装置。
【請求項８】
前記記録部に記録されている前記基板に関する情報を読み取るための読み取り部を有する、請求項５〜７のいずれか１項に記載のサンプル検出装置。
【請求項９】
前記基板に関する情報は該基板の厚さを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のサンプル検出装置。
【請求項１０】
前記基板を含む生化学反応カートリッジを有し、
前記基板に関する情報は、該基板の基準平面から、前記生化学反応カートリッジと前記移動手段との接点までの距離を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のサンプル検出装置。
【請求項１１】
前記基板には複数のＤＮＡプローブが設けられており、該ＤＮＡプローブに捕捉された前記サンプルを光学的に検出する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のサンプル検出装置。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のサンプル検出装置と、
前記サンプル検出装置による前記サンプルの検出結果に基づいて、前記サンプル検出装置に供給される検体の生化学反応の有無および／または生化学反応状態を知ることによって、前記検体を分析する処理装置と
を含む、検体分析装置
【請求項１３】
前記サンプル検出装置の、前記検体が供給される生化学反応カートリッジをセットして、前記検体の生化学反応を行わせるための実験装置をさらに含む、請求項１２に記載の検体分析装置。
【請求項１４】
前記チルト動作を行う手段と対向して前記基板を付勢するための設置部をさらに有する請求項１〜１１のいずれか１項に記載のサンプル検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の細胞、微生物、染色体、核酸等のサンプルを、抗原抗体反応や核酸ハイブリダイゼーション反応等の生化学反応を利用して検出するサンプル検出装置と、それを含む検体分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液等の検体を分析する検体分析装置には、抗原抗体反応を利用した免疫学的な方法、例えば、被検出物質と特異的に結合する抗体または抗原等のタンパク質をプローブとして用い、微粒子、ビーズ、またはガラス板等の固相表面に固定して、検体中の被検出物質との抗原抗体反応を行わせるものや、核酸ハイブリダイゼーションを利用した方法、例えば、一本鎖の核酸をプローブとして用い、微粒子、ビーズ、ガラス板等の固相表面に固定して、検体中の被検出物質と核酸ハイブリダイゼーションを行わせるものがある。これらは、酵素、蛍光性物質、または発光性物質等の、検知感度の高い標識物質を担持した特異的な相互作用を有する標識化物質である標識化抗体、標識化抗原、または標識化核酸等を用いて、抗原抗体化合物またはハイブリダイズされた二本鎖の核酸を検出して、被検出物質（サンプル）の有無の検出やその定量を行うものである。
【０００３】
これらの技術を発展させたものとして、例えば特許文献１には、互いに異なる塩基配列を有する多数のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）プローブを、基板上にアレイ状に並べた、いわゆるＤＮＡアレイが開示されている。
【０００４】
また、非特許文献１には、多種類のタンパク質をメンブレンフィルタ上に並べ、ＤＮＡアレイと同様な構成のタンパク質アレイを作製する方法が開示されている。このように、ＤＮＡアレイやタンパク質アレイ等を用いることによって、極めて多数の項目の検査を一度に行うことが可能になってきている。
【０００５】
また、様々な検体分析における、検体による汚染の軽減、反応の効率化、装置の小型化、作業の簡便化等の目的で、内部で生化学反応を行わせる使い捨て可能な生化学反応カートリッジが提案されている。例えば、特許文献２においては、ＤＮＡアレイを含む生化学反応カートリッジ内に複数のチャンバを配設し、圧力差を利用して溶液を各チャンバへ移動させることにより検体中のＤＮＡの抽出、増幅、またはハイブリダイゼーション等の反応を内部で行わせることが可能な生化学反応カートリッジが開示されている。
【０００６】
そして、このような生化学反応カートリッジ内に外部から溶液を注入する方法としては、外部の電動シリンジポンプや真空ポンプを利用する方法がある。また、生化学反応カートリッジ内部で溶液を移動する方法としては、圧力差以外にも、重力や毛細管現象や電気泳動を利用する方法が知られている。さらに、生化学反応カートリッジの内部に配設できる小型のマイクロポンプとして、特許文献２にはダイアフラムポンプ、特許文献３には発熱素子を利用したポンプ、特許文献４には圧電素子を利用したポンプがそれぞれ開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４４５，９３４号明細書
【特許文献２】特表平１１−５０９０９４号公報
【特許文献３】特許第２８３２１１７号明細書
【特許文献４】特開２０００−２７４３７５号公報
【非特許文献１】アンジェリカ ロイキング（Angelika Lueking）他５名、「プロテイン マイクロアレイズ フォー ジーン エクスプレッション アンド アンチボディ スクリーニング（Protein Microarrays for Gene Expression and Antibody Screening）」、アナリティカル バイオケミストリー（Analytical Biochemistry） Vol.270(1)、アカデミック プレス（Academic Press）、１９９９年５月１５日、p.103〜111
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記した種類の生化学反応カートリッジを含む検体分析装置においてプローブ検出を行なう際に、被検出物質（サンプル）が生化学反応カートリッジのチャンバの内部に存在するため、生化学反応カートリッジを構成する基板の外側から、この基板を介して被検出物質の検出を行なわなければならない場合がある。例えば、励起レーザー光等の光を被検出物質に照射して光学的な検出を行う場合には、基板の厚さのばらつき（公差）によって、被検出物質に照射される励起レーザー光の合焦位置や、検出器（ディテクター）である光電子倍増管における蛍光の合焦位置がずれることがある。したがって、被検出物質と光学系（特に対物レンズ）の相対位置を、例えば光学的オートフォーカス機構によって適宜に調整する必要がある。
【０００９】
ところが、被検出物質が蛍光物質を含む場合には、オートフォーカス動作において照射される励起レーザー光によってこの蛍光物質が褪色してしまい、正確な輝度測定の障害となる。また、オートフォーカス動作、具体的には読み取り、演算、フィードバック等の動作に時間を要するという問題があった。
【００１０】
本発明の目的は、光学的オートフォーカス動作を必要とせず、容易に精度よくサンプルを光学的に検出可能なサンプル検出装置と、それを含む検体分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、基板上のサンプルを光学的に検出するサンプル検出装置において、基板に光を照射する光学系と、予め求められている基板に関する情報に基づいて、基板上のサンプルを検出する領域外の３点を、それぞれ個別に光軸方向あるいは光軸方向を基準線としたチルト方向に沿って移動させ、基板上に合焦させるためのチルト動作を行う手段と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、光学的オートフォーカス動作が不要であるため、オートフォーカス動作時のレーザー照射によるサンプル中の蛍光物質の褪色を防止でき、それによって光学的なサンプル検出の精度が向上する。また、光学的オートフォーカス動作のための読み取り、演算、フィードバックの各処理を省略できるため、動作時間を削減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の生化学反応カートリッジ内で反応を生じさせるための実験装置の構成を示すブロック図である。
【図２】本発明の生化学反応カートリッジの斜視図である。
【図３】図２に示す生化学反応カートリッジの平面断面図である。
【図４】図１に示す実験装置における処理工程を示すフローチャートである。
【図５】図２，３に示す生化学反応カートリッジのチャンバの一部を通る縦断面図である。
【図６】図２，３に示す生化学反応カートリッジの他のチャンバを通る縦断面図である。
【図７】本発明の第１の実施形態のサンプル検出装置を示す概略図である。
【図８】図７に示すサンプル検出装置の要部の平面図である。
【図９】図７に示すサンプル検出装置のロッドおよびその駆動系を示す正面図である。
【図１０】図７に示すサンプル検出装置における検出工程を示すフローチャートである。
【図１１】本発明の第２の実施形態のサンプル検出装置を示す概略図である。
【図１２】本発明の第３の実施形態のサンプル検出装置を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００１５】
［第１の実施形態］
図１は、本発明の第１の実施形態における検体分析装置のうち、検体の生化学反応を行わせるための実験装置を概略的に示している。この実験装置は、本実施形態において反応場となる生化学反応カートリッジ１が載置されるテーブル１３を有している。このテーブル１３上には、生化学反応カートリッジ１内に電磁力を作用させるための電磁石１４と、生化学反応カートリッジ１の温度を制御するためのペルチェ素子１５，１６が配置されており、これらは実験装置全体を制御する制御部１７に接続されている。
【００１６】
テーブル１３の両側には、電動シリンジポンプ１８，１９と、これらのポンプ１８，１９によって空気を排出または吸引するための出入口であり、それぞれ１０個ずつのポンプノズル２０，２１を有するポンプブロック２２，２３とが配置されている。電動シリンジポンプ１８，１９とポンプノズル２０，２１の間には、図示しない複数の電動切換バルブが配置されている。図示しない電動切換バルブとポンプ１８，１９は制御部１７に接続されている。
【００１７】
制御部１７は検査者が入力を行う入力部２４に接続されている。この制御部１７は、ポンプノズル２０，２１を１個ずつ独立して開閉して電動シリンジポンプ１８，１９に対する接続および遮断を制御したり、全てのポンプノズル２０，２１を同時に開閉するなどの制御を行うことができる。また、制御部１７は、電磁石１４およびペルチェ素子１５，１６を適宜に作動させることによって、生化学反応カートリッジ１内での生化学反応を実行させる。
【００１８】
次に、この実験装置における反応場となる生化学反応カートリッジ１について詳細に説明する。
【００１９】
生化学反応カートリッジ１の本体（筐体）はポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）共重合体、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリ塩化ビニル等の透明または半透明の合成樹脂から構成されている。なお、生化学反応カートリッジ１内の反応物について、光学的な測定を必要としない場合には、本体の材質は透明でなくてもよい。
【００２０】
図２に示すように、生化学反応カートリッジ１の上部には、注射器等を用いて血液等の検体を注入するための検体入口２ａが設けられ、ゴムキャップ２により封止されている。また、生化学反応カートリッジ１の側面には、内部の溶液を移動させるためにノズルを挿入して加圧または減圧を行うための複数のノズル入口３ａ〜３ｊが設けられ、ゴムキャップ３により封止されている。カートリッジ１の両面とも同様の構成になっている。
【００２１】
図３は生化学反応カートリッジ１の平面断面図を示している。前記したように片側の側面には１０個のノズル入口３ａ〜３ｊが設けられ、反対側の側面にも１０個のノズル入口３ｋ〜３ｔが設けられている。各ノズル入口３ａ〜３ｔのほとんどは、それぞれの空気が流れる空気流路４ａ〜４ｔを介して、溶液を貯蔵する場所または反応を起こす場所であるチャンバ５ａ〜５ｔに連通している。つまり、ノズル入口３ａ〜３ｊは流路４ａ〜４ｊを介してチャンバ５ａ〜５ｊに連通し、反対側のノズル入口３ｋ，３ｌ，３ｍ，３ｏ，３ｒ，３ｔは、それぞれ流路４ｋ，４ｌ，４ｍ，４ｏ，４ｒ，４ｔを介してチャンバ５ｋ，５ｌ，５ｍ，５ｏ，５ｒ，５ｔに連通している。ただし、本実施形態では、ノズル入口３ｎ，３ｐ，３ｑ，３ｓはチャンバに連通しておらず予備になっており、使用されない。
【００２２】
検体入口２はチャンバ７に連通し、チャンバ７は流路６ａ，６ｂ，６ｃ，６ｋを介してチャンバ５ａ，５ｂ，５ｃ，５ｋに連通しているとともに、流路１０を介してチャンバ８に連通している。チャンバ８は流路６ｇ，６ｏを介してチャンバ５ｇ，５ｏに連通しているとともに、流路１１を介してチャンバ９に連通している。チャンバ９は流路６ｈ，６ｉ，６ｊ，６ｒ，６ｔを介してチャンバ５ｈ，５ｉ，５ｊ，５ｒ，５ｔに連通している。また、流路１０は流路６ｄ，６ｅ，６ｆ，６ｌ，６ｍを介してチャンバ５ｄ，５ｅ，５ｆ，５ｌ，５ｍに連通している。
【００２３】
また、チャンバ９の底面には角孔が開けられ、この角孔にＤＮＡマイクロアレイ１２が、プローブ面を上にしてに貼り付けられている。ＤＮＡマイクロアレイ１２は、１平方インチ（約６４５ｍｍ2）程度の大きさを持つガラス板（図７に示す基板３３）の固相表面に、数十〜数十万種類の異なるＤＮＡプローブ（図８参照）が高密度に並べられたものである。本実施形態では、このＤＮＡマイクロアレイ１２を用いて、検体中のＤＮＡとハイブリダイゼーション反応を行わせることによって、一度に数多くの遺伝子を検査できるものである。これらのＤＮＡプローブはマトリックス状に規則正しく並べられており、それぞれのＤＮＡプローブのアドレス（何行・何列と示される位置）を、情報として容易に取り出すことができる。なお、検査の対象となる遺伝子としては、感染症ウィルス、細菌、疾患関連遺伝子、各個人の遺伝子多型等がある。
【００２４】
ここで、本実施形態において検体の処理を行うための、各チャンバ５ａ〜５ｔのセッティングの一例を示す。チャンバ５ａには、細胞壁を破壊するＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む第１の溶血剤が、チャンバ５ｂには、界面活性剤等のタンパク質変性剤を含む第２の溶血剤がそれぞれ収容されている。チャンバ５ｃには、ＤＮＡが吸着するシリカコーティングされた磁性体粒子が収容されている。チャンバ５ｌ、チャンバ５ｍには、ＤＮＡの抽出の際にＤＮＡの精製を行うために用いられる第１、第２の抽出洗浄剤が収容されている。
【００２５】
チャンバ５ｄには、ＤＮＡを磁性体粒子から溶出する低濃度塩のバッファからなる溶出液が収容されている。チャンバ５ｇには、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に必要な薬剤、すなわち、プライマ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ溶液、バッファ、蛍光剤を含むＣｙ３−ｄＵＴＰ（アマシャム バイオサイエンス株式会社製の蛍光標識）等の混合液が収容されている。チャンバ５ｈ，５ｊには、ハイブリダイゼーションしなかった蛍光標識付きの検体ＤＮＡと蛍光標識とを洗浄するための界面活性剤を含む洗浄剤が、チャンバ５ｉには、ＤＮＡマイクロアレイ１２を含むチャンバ９内を乾燥させるためのアルコールがそれぞれ収容されている。
【００２６】
なお、チャンバ５ｅは血液のＤＮＡ以外の塵埃を溜めるためのチャンバである。チャンバ５ｆは、チャンバ５ｌ，５ｍからの第１、第２の抽出洗浄剤の廃液を溜めるためのチャンバである。チャンバ５ｒは第１、第２の洗浄剤の廃液を溜めるためのチャンバである。チャンバ５ｋ，５ｏ，５ｔは、溶液がノズル入口に流れ込まないようにするために設けられたブランクのチャンバである。
【００２７】
本実施形態では、この生化学反応カートリッジ１に血液等の液体状の検体を注入して、前記した実験装置（図１参照）にセットすることによって、生化学反応カートリッジ１の内部で、ＤＮＡ等の抽出および増幅を行わせ、増幅された検体ＤＮＡと生化学反応カートリッジ１の内部にあるＤＮＡマイクロアレイ１２のＤＮＡプローブとの間でハイブリダイゼーションを行わせ、さらに、ハイブリダイゼーションしなかった蛍光標識付きの検体ＤＮＡと蛍光標識の洗浄とを行うことができる。
【００２８】
このような実験装置および生化学反応カートリッジ１を用いて、本実施形態において検体の生化学反応を生化学反応カートリッジ１内にて生じさせる方法について具体的に説明する。
【００２９】
まず、検査者が、検体である血液を収容した注射器の針（図示せず）を、生化学反応カートリッジ１の検体入口２を塞いでいるゴムキャップを貫通させて、注射器内の血液を検体入口２からチャンバ７に注入する。その後に、検査者は生化学反応カートリッジ１をテーブル１３上に置く。そして、検査者が、図示しないレバーを操作することにより、ポンプブロック２２，２３を図１の矢印の方向に移動させると、ポンプノズル２０，２１が、生化学反応カートリッジ１の両側部のノズル入口３ａ〜３ｔに、ゴムキャップ３を貫通して挿入される。
【００３０】
検査者が、入力部２４から実験開始の命令を入力すると処理が始まる。図４は生化学反応およびその後処理の手順を説明するフローチャートである。まず、ステップＳ１で、制御部１７が、ポンプノズル２０，２１を制御してノズル入口３ａ，３ｋのみを開にし、電動シリンジポンプ１８から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１９から空気を吸引することによって、チャンバ５ａ内の第１の溶血剤を血液の入ったチャンバ７に流し込む。このように、ノズル入口３ａにポンプノズル２０を挿入して空気を噴出して加圧し、ノズル入口３ｋにポンプノズル２１を挿入して空気を吸引して減圧することによって、チャンバ５ａ内の第１の溶血剤が、血液の入ったチャンバ７内に流れ込む様子が、チャンバ５ａ，７，５ｋを通る断面図である図５に示されている。
【００３１】
本実施形態では、空気の供給および吸引のタイミングをずらすことによって、各チャンバへの加圧および減圧を制御してカートリッジ１内を溶液を円滑に流すことができる。さらに、電動シリンジポンプ１９による空気の吸引を、ポンプ１８からの空気の開始時からリニアに増加させるなどの細かな制御を行って、溶液をより円滑に流すことも可能である。例えば、溶血剤の粘性や流路の抵抗にもよるが、ステップＳ１において、電動シリンジポンプ１９からの空気の吸引を、電動シリンジポンプ１８からの空気の噴出を開始してから１０〜２００ミリ秒後に開始するように制御すると、流れる溶液の先頭で溶液が飛び出すことがなく、溶液が円滑に流れる。これは、以下の各工程における溶液の移動についても同様である。
【００３２】
また、電動シリンジポンプ１８，１９を用いて空気の供給を容易に制御しつつ、ノズル入口３ａ，３ｏのみを開にして、電動シリンジポンプ１８，１９によって空気の噴出および吸引を交互に繰り返して、チャンバ７の溶液を流路１０に流し、その後に戻す動作を繰り返して攪拌を行う。あるいは、電動シリンジポンプ１９から空気を連続して噴出することによって、気泡を発生させながら攪拌を行う。
【００３３】
次に、ステップＳ２において、ノズル入口３ｂ，３ｋのみを開にして、ステップＳ１と同様の原理でチャンバ５ｂ内の第２の溶血剤をチャンバ７に流し込む。さらに、ステップＳ３において、ノズル入口３ｃ，３ｋのみを開にして、ステップＳ１，Ｓ２と同様の原理でチャンバ５ｃ内の磁性体粒子をチャンバ７に流し込む。ステップＳ２，Ｓ３のいずれにおいても、ステップＳ１と同様の攪拌を行う。ステップＳ３によって、ステップＳ１，Ｓ２において細胞が溶解して得られたＤＮＡが磁性体粒子に付着する。
【００３４】
そして、ステップＳ４で電磁石１４をオンにし、ノズル入口３ｅ，３ｋのみを開にし、電動シリンジポンプ１９から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１８から空気を吸引して、チャンバ７内の溶液をチャンバ５ｅに移動させる。この移動の際に、磁性体粒子およびＤＮＡを、流路１０の電磁石１４の上方位置で捕捉する。なお、電動シリンジポンプ１８，１９による空気の吸引および噴出を交互に繰り返して、溶液をチャンバ７と５ｅの間を２回往復させることにより、ＤＮＡの捕捉効率を向上させている。さらに往復回数を増やせば、捕捉効率を一層高めることができる。ただし、処理時間が余分に掛かることになる。
【００３５】
このように、ステップＳ１〜Ｓ４にて、幅１〜２ｍｍ程度で高さ０．２〜１ｍｍ程度の小さい流路１０上で、流動状態のＤＮＡを、磁性体粒子を利用して極めて効率良く捕捉する。なお、仮に、捕捉ターゲット物質がＤＮＡではなく、ＲＮＡまたはタンパク質の場合にも同様に効率の良い捕捉が行える。
【００３６】
次に、ステップＳ５において電磁石１４をオフにし、ノズル入口３ｆ，３ｌのみを開とし、電動シリンジポンプ１９から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１８から空気を吸引して、チャンバ５ｌ内の第１の抽出洗浄液をチャンバ５ｆに移動させる。この際に、ステップＳ４で捕捉された磁性体粒子およびＤＮＡが、抽出洗浄液と共に移動して洗浄が行われる。電磁石１４をオンにして、ステップＳ４と同様の原理で磁性体粒子およびＤＮＡと抽出洗浄液とをチャンバ５ｌ内とチャンバ５ｆの間を２回往復させることによって、洗浄された磁性体粒子およびＤＮＡを流路１０の電磁石１４の上方位置に回収し、第１の抽出洗浄液をチャンバ５ｌに戻す。
【００３７】
ステップＳ６において、ノズル入口３ｆ，３ｍのみを開いてステップＳ５と同様の工程を行い、チャンバ５ｍ内の第２の抽出洗浄液と、磁性体粒子およびＤＮＡとを移動させて、磁性体粒子およびＤＮＡをさらに洗浄してから電磁石１４の上方位置に回収し、第２の抽出洗浄液をチャンバ５ｍに戻す。
【００３８】
続いて、ステップＳ７において電磁石１４をオンにしたまま、ノズル入口３ｄ，３ｏのみを開にし、電動シリンジポンプ１８から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１９から空気を吸引することにより、チャンバ５ｄ内の溶出液をチャンバ８に移動させる。この溶出液の作用によって、磁性体粒子とＤＮＡが分離し、ＤＮＡのみが溶出液とともにチャンバ８に移動し、磁性体粒子は流路１０内に残る。このようにして、ＤＮＡの抽出および精製が行われる。本実施形態では、抽出洗浄液を収容するチャンバ５ｌ，５ｍと、洗浄後の廃液を溜めるためのチャンバ５ｆが用意されているので、カートリッジ１内でＤＮＡの抽出および精製を行うことが可能である。
【００３９】
次に、ステップＳ８において、ノズル入口３ｇ，３ｏのみを開にし、電動シリンジポンプ１８から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１９から空気を吸引して、チャンバ５ｇ内のＰＣＲ用薬剤（例えば、プライマ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ溶液、バッファ、蛍光標識等の混合液）をチャンバ８に流し込む。さらに、ノズル入口３ｇ，３ｔのみを開にし、電動シリンジポンプ１８，１９による空気の噴出および吸引を交互に繰り返し、チャンバ８の溶液を流路１１に流して、その後に戻す動作を繰り返して攪拌を行う。そして、ペルチェ素子１５を制御して、チャンバ８内の溶液を９６℃の温度に１０分保持した後に、９６℃・１０秒、５５℃・１０秒、７２℃・１分のサイクルを３０回繰り返してＰＣＲを行い、溶出されたＤＮＡを増幅する。
【００４０】
ステップＳ９でノズル入口３ｇ，３ｔのみを開にし、電動シリンジポンプ１８から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１９から空気を吸引して、チャンバ８内の溶液をチャンバ９に移動させる。さらに、ペルチェ素子１６を制御して、チャンバ９内の溶液を４５℃で２時間保持し、ハイブリダイゼーションを行わせる。この時、電動シリンジポンプ１８，１９による空気の噴出および吸引を交互に繰り返して、チャンバ９内の溶液を流路６ｔに移動し、その後に戻す動作を繰り返して攪拌を行いながら、ハイブリダイゼーションを進める。
【００４１】
次にステップＳ１０において、同じく４５℃に保持したまま、今度はノズル入口３ｈ、３ｒのみを開にし、電動シリンジポンプ１８から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１９から空気を吸引して、チャンバ９内の溶液をチャンバ５ｒに移動させるとともに、チャンバ５ｈ内の第１の洗浄液を、チャンバ９を通してチャンバ５ｒに流し込む。このように、ノズル入口３ｈにポンプノズル２０を挿入して空気を噴出して加圧し、ノズル入口３ｒにポンプノズル２１を挿入して空気を吸引して減圧することによって、チャンバ５ｈ内の第１の洗浄液が、チャンバ９を通してチャンバ５ｒ内に流れ込む様子が、チャンバ５ｈ，９，５ｒを通る断面図である図６に示されている。電動シリンジポンプ１８，１９の吸引および噴出を交互に繰り返して、この溶液をチャンバ５ｈ，９，５ｒの間を２回往復させ、最後にチャンバ５ｈに戻す。このようにして、ハイブリダイゼーションしなかった蛍光標識付きの検体ＤＮＡと蛍光標識とが洗浄される。
【００４２】
さらに、ステップＳ１１において、同じく４５℃に保持したまま、ノズル入口３ｊ、３ｒのみを開いて、ステップＳ１０と同様の工程を行い、チャンバ５ｊ内の第２の洗浄液をチャンバ９を通してチャンバ５ｒに流し込んでＤＮＡの洗浄をさらに行い、最後に溶液をチャンバ５ｊに戻す。このように本実施形態では、第１、第２の洗浄液を収容するチャンバ５ｈ，５ｊと、洗浄後の廃液を溜めるためのチャンバ５ｒが用意されているので、生化学反応カートリッジ１内でＤＮＡマイクロアレイ１２の洗浄を行うことが可能である。
【００４３】
ステップＳ１２で、ノズル入口３ｉ，３ｒのみを開にし、電動シリンジポンプ１８から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１９から空気を吸引して、チャンバ５ｉ内のアルコールを、チャンバ９を通してチャンバ５ｒに移動させる。その後に、ノズル入口３ｉ，３ｔのみを開にし、電動シリンジポンプ１８から空気を噴出し、電動シリンジポンプ１９から空気を吸引してチャンバ９内を乾燥させる。
【００４４】
以上述べたステップＳ１〜Ｓ１２によって、検体の生化学反応（例えばＤＮＡのハイブリダイゼーション）を生化学反応カートリッジ１内で行わせることができる。
【００４５】
なお、本実施形態では、ノズル入口３ａ〜３ｔがカートリッジ１の２つの面、つまり両側部に集中して設けられているため、電動シリンジポンプ１８，１９、電動切換バルブ、ポンプノズルを内蔵したポンプブロック２２，２３等の形状や配置を単純化することができる。さらに、必要なチャンバや流路を確保しながら、ポンプブロック２２，２３により生化学反応カートリッジ１を同時に挟み込むという単純な動作だけで、ポンプノズル２０，２１を挿入することができ、ポンプブロック２２，２３の構成も簡単にすることができる。また、ノズル入口３ａ〜３ｔを全て同じ高さに直線的に並ぶように配置することによって、ノズル入口３ａ〜３ｔに接続される流路４ａ〜４ｔの高さは全て同じになり、流路４ａ〜４ｔの作製が容易になる。
【００４６】
また、図１に示す実験装置において、ｎ個の生化学反応カートリッジ１を同時に使用できるようにポンプブロック２２，２３をｎ倍に長くした構成にすれば、ｎ個の生化学反応カートリッジ１を直列に並べて、ｎ個の生化学反応カートリッジ１のそれぞれに対して必要な工程を同時に行うことができる。したがって、構成は極めて簡単でありながら多数の生化学反応カートリッジにおいて同時に生化学反応を行わせることが可能である。
【００４７】
以上述べたステップＳ１〜Ｓ１２を行って、生化学反応カートリッジ１内で生化学反応を生じさせた後に、検査者が図示しないレバーを操作して、ポンプブロック２２，２３を生化学反応カートリッジ１から離れる方向に移動させ、ポンプノズル２０，２１を生化学反応カートリッジ１のノズル入口３ａ〜３ｔから外す。そして、検査者はこの生化学反応カートリッジ１を、図７に示すサンプル検出装置にセットして、生化学反応の測定および解析を行う。
【００４８】
図７は本実施形態のサンプル検出装置の概略図を表したものである。ここでは、図１に示す実験装置と、図７に示すサンプル検出装置を含めて、検体分析装置と総称する。
【００４９】
このサンプル検出装置のカートリッジ設置部３０にはばね３１が設けられており、生化学反応カートリッジ１を図７の矢印Ａ方向に付勢している。なお、図７においては、ばね３１は、生化学反応カートリッジ１の基板（ＤＮＡマイクロアレイ１２の基板）３３に直接接しているが、生化学反応カートリッジ１内のどこに接していても構わない。そして、矢印Ａ，Ａ’方向に移動可能なロッド３２ａ〜３２ｃの先端が基板３３に接触し、ばね３１からの力と相まって生化学反応カートリッジ１（基板３３）を矢印Ａ，Ａ’方向に移動可能にしている。３本のロッド３２ａ〜３２ｃが存在するため、生化学反応カートリッジ１（基板３３）の姿勢は一義的に決定する。ロッド３２の先端は表面粗さが小さく、かつ半球状であり、基板３３を点支持し、基板３３に傷を付け難いようになっている。なお、図７の矢印Ｂ方向に生化学反応カートリッジ１を見た図である図８に示されているように、ロッド３２が基板３３を加圧できるように、生化学反応カートリッジ１には、ＤＮＡマイクロアレイ１２の領域外かつ基板３３の領域内に、ロッド３２が挿入されるための穴４２が設けられている。
【００５０】
図９にロッド３２の駆動系の詳細を示す。カートリッジ設置部３０またはその近傍に駆動モータ４５が設けられている。後述するようにロッド３２を正確に位置決めするために、駆動モータ４５はサーボモータあるいはエンコーダを伴ったステッピングモータであり、駆動モータ制御部４７（図７参照）に接続されている。一方、ロッド３２にはギア４６に噛み合うためのギアが形成されており、駆動モータ４５の駆動力は、ギア４６を介してロッド３２に伝えられる。また、ロッド３２には雄ネジが切ってあり、カートリッジ設置部３０にはロッド３２が回転しながら矢印Ａ，Ａ’方向に移動するための雌ネジが切ってある。そして、駆動モータ４５およびギア４６は３本のロッド３２のそれぞれに対して独立して存在しており、生化学反応カートリッジ１（基板３３）のチルト動作および矢印Ａ、Ａ’方向への移動を可能にしている。
【００５１】
図７に示すように、駆動モータ制御部４７が接続されているＣＰＵ４８にバーコードリーダ４４が接続されている。このバーコードリーダ４４は、生化学反応カートリッジ１に記載されているバーコード４３からの情報を読取りＣＰＵ４８に伝達する。ＣＰＵ（処理装置）４８は、バーコードリーダ４４からの情報をもとに駆動モータ４５の回転量を決定し、それを駆動モータ制御部４７に伝えて駆動モータ４５を制御させている。
【００５２】
このサンプル検出装置には、基板３３に対向する対物レンズ３７と、生化学反応カートリッジ１内のサンプル（検体）中の蛍光物質を励起するためのレーザー光源３４と、レーザー光源３４からのレーザー光およびサンプルからの蛍光を透過および反射するハーフミラー３５と、レーザー光を対物レンズに導く反射鏡３６と、レーザー光によって励起され、ハーフミラー３５にて反射された蛍光のうちの特定の周波数帯のみを透過させるフィルター３８と、フィルター３８を透過した光を集光するレンズ３９と、レンズ３９により集光された光が入射され、その入射光を検出する光電子倍増管４０が設けられている。光電子倍増管４０はＣＰＵ４８に接続されている。
【００５３】
カートリッジ設置部３０には、基板３３上にマトリックス状に配列されたＤＮＡプローブ（ＤＮＡマイクロアレイ１２）と同じかそれよりも大きい検出窓４１が設けられており、反射鏡３６および対物レンズ３７は、この基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２全体をスキャンできるように、不図示の駆動機構によって駆動可能である。
【００５４】
このような構成であるため、レーザー光源３４からハーフミラー３５および反射鏡３６を介して対物レンズ３７に入射した平行光（レーザー光）が、対物レンズによって基板３３上に合焦する。そして、レーザー光によって励起された蛍光物質から発せられる蛍光が、対物レンズ３７によって平行光にされた後、反射鏡３６およびハーフミラー３５を介してフィルター３８に入射し、フィルター３８を透過して光電子倍増管４０に入射した特定の周波数帯の光が、光電子倍増管４０によって検出される。
【００５５】
ここで、バーコード４３に記録される情報について詳説する。本実施形態のように、ロッド３２がガラス基板３３に直接接する構成の場合には、以下のいずれかの情報をバーコード４３に記録することが考えられる。
【００５６】
１．基板３３の厚さ（サンプル検出装置にセットされる生化学反応カートリッジ１の基板３３の材質が常に一定の場合）
２．基板３３の厚さと基板３３の材質の屈折率（サンプル検出装置にセットされる生化学反応カートリッジ１の基板３３の材質が一定でない場合）
３．レーザー光が基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２に合焦するために必要な、３本のロッド３２ａ〜３２ｃの矢印Ａ，Ａ’方向への移動量
レーザー光が基板３３上のマトリックス状のＤＮＡマイクロアレイ１２に合焦するために必要な、３本のロッド３２ａ〜３２ｃの矢印Ａ，Ａ’方向への移動量は、基板３３の厚さと基板３３の材質の屈折率とから計算される。例えば、基板３３の厚さの称呼寸法（予備寸法）が１.０００（ｍｍ）で、その実測値が１．０１５（ｍｍ）であり、基板３３の材質の屈折率が１．４６である場合には、ロッド３２ａ〜３２ｃの位置は、称呼寸法の場合よりも（１．０１５−１．０００）/１．４６＝約０．０１（ｍｍ）だけＡ’方向に移動させる必要がある。なお、この計算例は対物レンズ３７が平凸レンズの場合であるが、平凸レンズに限定するものではない。基板３３の光学系に対する相対移動は、対物レンズ３７から基板３３へ照射されるレーザー光の光軸方向に沿って行われても、この光軸方向を基準線として所定角度だけ傾いたチルト方向に沿って行われてもよい。
【００５７】
本実施形態では、前記した情報のいずれかがバーコード４３に記録されている。バーコード４３に、基板３３の厚さ、または基板３３の厚さと基板３３の材質の屈折率が記録されている場合には、前記した移動量の計算はＣＰＵ４８において行なわれる。もちろん、この計算を予め行って求めた移動量をバーコード４３に記録しておいても構わない。
【００５８】
このような本実施形態のサンプル検出装置を用いた検出工程について、図１０のフローチャートを参照して説明する。生化学反応カートリッジ１をカートリッジ設置部３０に設置し、不図示の入力部から動作開始命令を入力すると、ステップＳ１３において、バーコードリーダ４４がバーコード４３を読み取り、そのバーコード４３に記録されている情報をＣＰＵ４８に伝える。そして、ステップＳ１４において、バーコード４３に記録されている情報に基づいてＣＰＵ４８が駆動モータ４５の回転量を決定する。前記したように、バーコード４３に基板３３の厚さ、または基板３３の厚さと基板３３の材質の屈折率が記録されている場合には、ＣＰＵ４８がロッド３２ａ〜３２ｃの移動量を計算して、それに基づいて駆動モータ４５の回転量を決定する。また、バーコード４３にロッド３２ａ〜３２ｃの移動量が記録されている場合には、それに基づいてＣＰＵ４８が駆動モータ４５の回転量を決定する。そして、ステップＳ１５において、駆動モータ４５を駆動させる。それにより、基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２が、対物レンズ３７によるレーザー光の合焦位置に移動する。そこで、Ｓ１６において、反射鏡３６および対物レンズ３７がＤＮＡマイクロアレイ１２を網羅する領域においてスキャンを行いながら、前記した通りレーザー光源３４からのレーザー光の照射と、それに基づく蛍光の、光電子倍増管４０による検出とを行うことによって、蛍光物質が付着しているＤＮＡプローブの検出が完了する。
【００５９】
光電子倍増管４０が、ＤＮＡマイクロアレイ１２を構成する、マトリックス状に並んだ様々なＤＮＡプローブのうちのいずれかに蛍光標識が付着していることを検出すると、その検出データがＣＰＵ４８に送られる。ＣＰＵ４８は、光電子倍増管４０からの検出データに基づいて、ステップＳ１〜Ｓ１２の処理工程で行われた生化学反応の結果を推定し、その結果を分析することによって、検体中の感染症ウィルス、細菌、疾患関連遺伝子、遺伝子多型等を検出することができる。すなわち、本実施形態では、ＣＰＵ４８が、合焦動作のための基板３３と光学系３４〜４０（特に対物レンズ３７）の相対位置の調整のための演算処理を行うのみならず、サンプル検出結果に基づいて検体の分析を行う処理装置としても機能する。ただし、合焦動作のための基板３３と光学系３４〜４０（特に対物レンズ３７）の相対位置の調整のための演算処理を行うＣＰＵと、サンプル検出結果に基づく検体分析を行う処理装置とを別々に設けてもよい。
【００６０】
本実施形態によれば、予め求められている基板に関する情報（例えば、基板の厚さ、基板の材質の屈折率、ロッドの移動量）にしたがって対物レンズ３７と基板３３との相対位置を調節することによって、合焦動作が行える。このことは、従来の光学的なオートフォーカス動作が不要であることを意味する。それによって、オートフォーカス動作のためのレーザー光照射によって、ＤＮＡプローブに付着した蛍光物質の褪色を防止できる。また、オートフォーカス動作のための読み取り、演算、フィードバックの各処理を省略でき、動作時間を削減できる。さらに、基板３３の、ＤＮＡマイクロアレイ１２の反対側において蛍光を検出する構成の場合にも、基板の厚さの公差による輝度のばらつきを無くすことができる。
【００６１】
なお、本実施形態では、前記した情報のいずれかをバーコード４３に記録し、それをバーコードリーダ４４によって読み取る構成であるが、バーコード４３およびバーコードリーダ４４は２次元バーコードおよびそのリーダでもよい。また、バーコード４３およびバーコードリーダ４４の代わりにＩＣタグとその読取装置を設けても構わない。さらに、このような情報を、検査者が不図示の入力部から分析の都度入力する構成にしても構わない。
【００６２】
［第２の実施形態］
次に、本発明の第２の実施形態を詳細に説明する。
【００６３】
本実施形態は、図１１に示すように、ロッド３２ａ〜３２ｃが生化学反応カートリッジ１の基板３３以外の部位に接する点が、第１の実施形態と異なる。それ以外の点については第１の実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００６４】
本実施形態は、例えば生化学反応カートリッジ１に穴が空いており、内部のチャンバや流路を構成できない場合に有効である。
【００６５】
本実施形態においては、以下の情報のいずれかがバーコード３３に記録される。
【００６６】
１．基板３３の厚さと、基板３３の表面または裏面を基準平面とした時の、生化学反応カートリッジ１におけるロッド３２が接する３点のＺ座標（サンプル検出装置にセットされる生化学反応カートリッジ１の基板３３の材質が常に一定の場合）
２．基板３３の厚さと、基板３３の材質の屈折率と、基板３３の表面または裏面を基準平面とした時の、生化学反応カートリッジ１におけるロッド３２が接する３点のＺ座標（サンプル検出装置にセットされる生化学反応カートリッジ１の基板３３の材質が一定でない場合）
３．レーザー光が基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２に合焦するために必要な、３本のロッド３２ａ〜３２ｃの矢印Ａ，Ａ’方向への移動量
レーザー光が基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２に合焦するために必要な、３本のロッド３２ａ〜３２ｃの矢印Ａ，Ａ’方向への移動量は、基板３３の厚さと、基板３３の材質の屈折率と、基板３３の表面または裏面を基準平面とした時の、生化学反応カートリッジ１におけるロッド３２が接する３点のＺ座標とから計算される。例えば、基板３３の厚さの称呼寸法（予備寸法）が１.０００（ｍｍ）で、その実測値が１．０１５（ｍｍ）であり、基板３３の材質の屈折率が１．４６であり、基準平面のＺ座標を４．０００ｍｍとした時のロッド３２ａが接する点のＺ座標を４．１５２ｍｍ、ロッド３２ｂが接する点のＺ座標を３．９８３ｍｍ、ロッド３２ｃが接する点のＺ座標を４．０２１ｍｍとすると、ロッド３２ａを（４．１５２−４．０００）−（１．０１５−１．０００）/１．４６＝０．０９４（ｍｍ）だけＡ方向に移動させ、ロッド３２ｂを（３．９８３−４．０００）−（１．０１５−１．０００）/１．４６＝−０．０２２（ｍｍ）だけＡ方向に、すなわち０．０２２（ｍｍ）だけＡ’方向に移動させ、ロッド３２ｃを（４．０２１−４．０００）−（１．０１５−１．０００）/１．４６＝０．００４（ｍｍ）だけＡ方向に移動させる必要がある。
【００６７】
説明を繰り返さないが、本実施形態では、第１の実施形態（図１０参照）と全く同様の工程を行うことによって、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。
【００６８】
［第３の実施形態］
次に、本発明の第３の実施形態を詳細に説明する。
【００６９】
本実施形態は、光学系３４〜４０と基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２との相対位置関係が第１，２の実施形態とは異なる。すなわち、第１，２の実施形態では基板３３のＤＮＡマイクロアレイ１２と反対側の面からレーザー光（励起光）を照射する構成であるが、本実施形態では、図１２に示すように基板３３のＤＮＡマイクロアレイ１２と対向する位置に配置されている光学系３４〜４０からレーザー光を照射する構成であり、検出窓４１の位置が第１，２の実施形態とは異なる。また、生化学反応カートリッジ１のＤＮＡマイクロアレイ１２側の筐体は、少なくともＤＮＡプローブが配列されている範囲において入射光をある程度透過可能な材質、例えばアクリルや石英ガラスによって構成されている。本実施形態は、装置構成の都合上光学系（特に対物レンズ３７）をＤＮＡマイクロアレイ１２と同じ側に配置することが好ましい場合に有効である。前記した以外の点については第１，２の実施形態と同様であるので説明を省略する。
【００７０】
本実施形態においては、以下の情報のいずれかがバーコード３３に記録される。
【００７１】
１．チャンバ４９内の媒質の厚さと、生化学反応カートリッジ１のＤＮＡプローブが配列された領域の筐体の厚さと、基板３３の表面または裏面を基準平面とした時の、生化学反応カートリッジ１におけるロッド３２が接する３点のＺ座標（サンプル検出装置にセットされる生化学反応カートリッジ１の基板３３の材質、チャンバ４９内の媒質、生化学反応カートリッジ１のＤＮＡプローブが配列された領域の筐体の材質が常に一定である場合）
２．チャンバ４９内の媒質の屈折率および厚さと、基板３３の材質の屈折率と、生化学反応カートリッジ１のＤＮＡプローブが配列された領域の筐体の屈折率および厚さと、基板３３の表面または裏面を基準平面とした時の、生化学反応カートリッジ１におけるロッド３２が接する３点のＺ座標（サンプル検出装置にセットされる生化学反応カートリッジ１の基板３３の材質、チャンバ４９内の媒質、生化学反応カートリッジ１のＤＮＡプローブが配列された領域の筐体の材質が一定でない場合）
３．レーザー光が基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２に合焦するために必要な、３本のロッド３２ａ〜３２ｃの矢印Ａ，Ａ’方向への移動量
レーザー光が基板３３上のＤＮＡマイクロアレイ１２に合焦するために必要な、３本のロッド３２ａ〜３２ｃの矢印Ａ，Ａ’方向への移動量は、基板３３の厚さと、基板３３の材質の屈折率と、基板３３の表面または裏面を基準平面とした時の、生化学反応カートリッジ１におけるロッド３２が接する３点のＺ座標とから計算される。例えば、チャンバ４９内の媒質の厚さの称呼寸法（予備寸法）が１.０００（ｍｍ）で、その実測値が１．０５０（ｍｍ）で、その屈折率が１．３３であり、生化学反応カートリッジ１のＤＮＡプローブが配列された領域の筐体の称呼寸法（予備寸法）が３.０００（ｍｍ）で、その実測値が２.９９８（ｍｍ）で、その屈折率が１．４９であり、基準平面のＺ座標を４．０００ｍｍとした時のロッド３２ａが接する点のＺ座標を４．１５２ｍｍ、ロッド３２ｂが接する点のＺ座標を３．９８３ｍｍ、ロッド３２ｃが接する点のＺ座標を４．０２１ｍｍとすると、ロッド３２ａを（４．１５２−４．０００）＋（１．０５０−１．０００）/１．３３＋（２．９９８−３．０００）/１.４９＝０．１８８（ｍｍ）だけＡ方向に移動させ、ロッド３２ｂを（３．９８３−４．０００）＋（１．０５０−１．０００）/１．３３＋（２．９９８−３．０００）/１.４９＝０．０１９（ｍｍ）だけＡ方向に移動させ、ロッド３２ｃを（４．０２１−４．０００）＋（１．０５０−１．０００）/１．３３＋（２．９９８−３．０００）/１.４９＝０．０５７（ｍｍ）だけＡ方向に移動させる必要がある。
【００７２】
説明を繰り返さないが、本実施形態では、第１、２の実施形態（図１０，１１参照）と全く同様の工程を行うことによって、装置構成上の都合により基板３３のＤＮＡマイクロアレイ１２と対向する位置に光学系（特に対物レンズ３７）が構成されている場合においても、第１，２の実施形態と同様な効果を得ることができる。
【符号の説明】
【００７３】
１  生化学反応カートリッジ
１２  ＤＮＡマイクロアレイ
３１  バネ（移動手段）
３２  ロッド（移動手段）
３３  基板
３４  レーザー光源（光学系）
３５  ハーフミラー（光学系）
３６  反射鏡（光学系）
３７  対物レンズ（光学系）
３８  フィルター（光学系）
３９  レンズ（光学系）
４０  光電子倍増管（光学系）
４３  バーコード（記録部）
４４  バーコードリーダ（読み取り部）
４５  駆動モータ（移動手段）
４６  ギア（移動手段）
４７  駆動モータ制御部（移動手段）
４８  ＣＰＵ（処理装置）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2011237439.tif 000011
【図１０】
2011237439.tif 000012
【図１１】
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【図１２】
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