(57)【要約】【課題】新規の豚サーコウイルス２型及びその用途を提供する。【解決手段】宿主細胞で複製能にすぐれる新規のＰＣＶ２及びその用途を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化されたサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択される一つ以上の不活性化されたウイルスを含む、動物でサーコウイルスの感染を治療または予防するための組成物。 
【請求項２】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４が、配列番号１のヌクレオチド配列を有するゲノム配列を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５が、配列番号４のヌクレオチド配列を有するゲノム配列を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記不活性化が、前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択される一つ以上のウイルスを、ホルムアルデヒドと反応させることによる不活性化であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５が、それぞれ一回容量当たり１０４．５ＴＣＩＤ５０ないし１０６．５ＴＣＩＤ５０の量で含まれることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
感染を予防または治療する対象である前記サーコウイルスが、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
感染を予防または治療する対象である前記サーコウイルスが、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
獣医学的に許容可能な賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記賦形剤が、montanide gelであることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記賦形剤が、組成物総重量を基準に、５％ないし１５％の量で含まれることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記動物が、豚、マウス及びモルモットからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択された一つ以上のウイルスを、ホルマリンと反応させて不活性化されたサーコウイルスを得る段階を含む、不活性化されたサーコウイルスを生産する方法。
【請求項１３】
前記ホルマリンが、反応溶液総重量に対して、０．２ないし０．５重量％であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
有効量の請求項１ないし請求項１１のうちいずれか１項に記載の組成物を、動物に投与する段階を含む、動物のサーコウイルスの感染を治療または予防する方法。
【請求項１５】
前記動物が、豚、マウス及びモルモットからなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が、経口投与または非経口投与であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が、注射によってなされることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１のヌクレオチド配列を有するゲノムを含むサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４。
【請求項１９】
配列番号４のヌクレオチド配列を有するゲノムを含むサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０５。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の豚サーコウイルス２型及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２：porcine circovirus type ２）は、小さく（直径１７ないし２２ｎｍ）、正２０面体型（icosahedral）、外皮のない単鎖円形ゲノムを含むＤＮＡウイルスである。ＰＣＶ２は、ＰＣＶ１（porcine circovirus type １）と約８０％の配列同一性を有している。しかし、ＰＣＶ１が一般的に非病原性であるのに比べ、ＰＣＶ２に感染した豚は、離乳後、全身消耗性症候群（ＰＭＷＳ：porcine multisystemic wasting syndrome）、豚呼吸器複合疾病（ＰＲＤＣ：porcine respiratory disease complex）、ＰＣＶ２による腸炎、ＰＣＶ２に起因する生殖器疾患、豚皮膚炎腎臓炎症候群（ＰＤＮＳ：porcine dermatitis nephritis syndrome）、萎縮、呼吸器症状、下痢、黄疸及び胃潰瘍を含んだ症状を引き起こす。ＰＣＶ２は、サーコウイルス科（circoviridae）の一員である。ＰＣＶ２ゲノムは、ウイルスＤＮＡ−ポリメラーゼをコーディングせず、その感染サイクルの完成は、細胞酵素に依存する。
【０００３】
ＰＣＶ２が豚に接種された場合、ウイルス複製は、多くの変異（variation）がある。ＰＣＶ２は、ＰＲＲＳＶ（porcine reproductive and respiratory syndrome virus）または豚パルボウイルス（porcine parvovirus）のような他のウイルスと同時に接種される場合、さらに多く複製されるということが観察されている（非特許文献１，２）。
【０００４】
ＰＣＶ２に感染された細胞の培地中でのＰＣＶ２の力価は、一般的に３．４ないし４．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであると知られている。特許文献１には、豚サーコウイルスを、培養培地中の連続動物細胞株の細胞に接種する段階と、前記連続動物細胞株をエンドゾーム・リソゾームシステム酸性化の一つ以上の抑制剤の存在下で、培地中で培養する段階と、前記培地及び／または感染された連続動物細胞株から、前記豚サーコウイルスを分離する段階とを含む豚サーコウイルスのインビトロ（in vitro）培養方法が開示されている。
【０００５】
前記先行技術によっても、宿主細胞で高い複製能を有する新しいＰＣＶ２が相変らず要求されている。特に、エンドゾーム・リソゾームシステム酸性化の一つ以上の抑制剤のようなウイルス複製促進剤を別途に付加せずとも、複製能にすぐれるウイルスが依然として要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７，５６６，５６２号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Allan et al．，(2000) Arch Virol．145，2421-2429
【非特許文献２】Allan et al．，(2000) J Vet Med B．47，81-94
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一具体例は、宿主細胞で複製能にすぐれる新規のＰＣＶ２ウイルスを提供することである。
【０００９】
本発明の他の具体例は、宿主細胞で複製能にすぐれる新規のＰＣＶ２ウイルスを不活性化させる方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の具体例は、宿主細胞で複製能にすぐれる新規のＰＣＶ２ウイルスの不活性化された形態を含む免疫原性組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の具体例は、前記免疫原性組成物を利用し、動物においてＰＣＶ２ウイルスの感染を予防または治療する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために、本発明は、不活性化されたサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択された一つ以上の不活性化されたウイルスを含む、動物のサーコウイルス感染を治療または予防するための組成物を提供する。
【００１３】
前記課題を解決するために、本発明はまた、サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択された一つ以上のウイルスをホルマリンと反応させて不活性化されたサーコウイルスを得る段階を含む、不活性化されたサーコウイルスを生産する方法を提供する。
【００１４】
前記課題を解決するために、本発明はまた、有効量の前記組成物を動物に投与する段階を含む、動物のサーコウイルス感染を治療または予防する方法を提供する。
【００１５】
前記課題を解決するために、本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド配列を有するゲノムを含むサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４を提供する。
【００１６】
前記課題を解決するために、本発明はまた、配列番号４のヌクレオチド配列を有するゲノムを含むサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０５を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の一具体例によるサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及び／またはＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、宿主細胞で高い複製能を有する。
【００１８】
本発明の一具体例による組成物によれば、多様なＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂのうち、一つ以上のウイルスに対して免疫原性を有することができる。
【００１９】
本発明の一具体例による不活性化されたサーコウイルスを生産する方法によれば、不活性化されたサーコウイルスを生産できる。
【００２０】
本発明の一具体例による動物へのサーコウイルスの感染を治療または予防する方法によれば、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂのうち、一つ以上のウイルス感染から動物を効率的に予防または治療できる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＰＣＶ２の濃度によって、リアルタイムＰＣＲを行った結果を示すグラフである。
【図２】子豚に、実験群別のＰＣＶ２単独攻撃接種後、鼻腔を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示すグラフである。
【図３】子豚に、実験群別のＰＣＶ２とＰＲＲＳＶとの混合攻撃接種後、鼻腔を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示すグラフである。
【図４】子豚に、実験群別のＰＣＶ２単独攻撃接種後、糞便を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示すグラフである。
【図５】子豚に、実験群別にＰＣＶ２とＰＲＲＳＶとの混合攻撃接種後、糞便を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の一具体例は、不活性化されたサーコウイルスＰＣＶ２（ＰＣＶ２：porcine circovirus type ２） ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択される一つ以上の不活性化されたウイルスを含む、動物でサーコウイルスの感染を治療または予防するための組成物を提供する。
【００２３】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するゲノム配列を有するものでありうる。前記ゲノムは、それぞれ配列番号１の５１番ないし９９２番の配列によって構成されるＯＲＦ１ヌクレオチド配列、及び配列番号１の１０３７番ないし１７３５番の配列に相補的な配列によって構成されるＯＲＦ２ヌクレオチド配列を有するものでありうる。ＯＲＦ１ヌクレオチド配列は、正鎖（positive strand）であり、レプリカ剤蛋白質をコーディングできる。ＯＲＦ２ヌクレオチド配列は、負鎖（negative strand）であり、キャプシド（capsid）蛋白質をコーディングできる。前記ＯＦＲ１蛋白質及びＯＲＦ２蛋白質は、それぞれ配列番号２及び３のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００２４】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、宿主細胞で高い増殖性を有しており、ウイルス粒子を得るのに有利である。従って、前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、不活性化サーコウイルス・ワクチンを製造するのに効率的に使われうる。前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、例えば、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ ９００ｍｌ、ＦＢＳ １００ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン２００ＩＵ／ｍｌ及びカナマイシン１００μｇ／ｍｌ）培地中で、単層が形成されたＰＫ−１５細胞の培地を除去した後、トリプシン処理を行って細胞を切除し、１０４．６ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＰＣＶ２を細胞浮遊液に添加して接種し、３７℃で３，４日間静置培養した後、細胞に対して三回凍結融解を反復して細胞を完全に破壊した後、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後で得られた上層液でのウイルス含有量が、平均１０５．６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上、例えば１０５．６ないし１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌと高い増殖性を有するものでありうる。前記高い増殖性は、増殖促進剤、例えば、グルコサミン不在下でも達成されうる。
【００２５】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、配列番号４のヌクレオチド配列を有するゲノム配列を有するものでありうる。前記ゲノムは、それぞれ配列番号４の５１番ないし９９２番のヌクレオチド配列からなるＯＦＲ１のヌクレオチド配列、及び配列番号４の１０３６番ないし１７３４番のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＯＦＲ２のヌクレオチド配列を有するものでありうる。ＯＲＦ２ヌクレオチド配列は、負鎖であり、キャプシド蛋白質をコーディングできる。前記ＯＦＲ１蛋白質及びＯＲＦ２蛋白質は、それぞれ配列番号５及び６のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００２６】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、宿主細胞で高い増殖性を有しており、ウイルス粒子を得るのに有利である。従って、前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、不活性化サーコウイルス・ワクチンを製造するのに効率的に使われうる。前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、例えば、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ９００ｍｌ、ＦＢＳ１００ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン２００ＩＵ／ｍｌ及びカナマイシン１００μｇ／ｍｌ）培地中で、単層が形成されたＰＫ−１５細胞の培地を除去した後、トリプシン処理を行って細胞を切除し、１０４．６ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＰＣＶ２を細胞浮遊液に添加して接種し、３７℃で３，４日間静置培養した後、細胞に対して三回凍結融解を反復して細胞を完全に破壊した後、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後で得られた上層液でのウイルス含有量が、平均１０５．６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上、例えば、１０５．６ないし１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌと高い増殖性を有するものでありうる。前記高い増殖性は、増殖促進剤、例えば、グルコサミン不在下でも達成されうる。
【００２７】
サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択された一つ以上のウイルスは、それらウイルスのゲノム配列から、当業界に公知の方法によって生産されうる。前記ウイルスの生産は、例えば、前記ゲノム配列をＰＣＶ２の宿主細胞または宿主動物に投与し、投与された宿主細胞または宿主動物から、感染性あるＰＣＶ２ウイルスを分離することによってなされうる。前記宿主細胞は、ＰＫ−１５細胞でありうる。前記宿主動物は、豚でありうる。例えば、前記ウイルスの生産は、配列番号１または２のヌクレオチド配列を有するサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４またはＰＣＶ２ ＧＣ０５０５のゲノムＤＮＡを得て、前記ＤＮＡを組換えベクターに導入した後、ＰＣＶ２の宿主細胞または宿主動物に投与し、投与された宿主細胞または宿主動物から、感染性あるＰＣＶ２ウイルスを分離することによってなされうる。例えば、配列番号１または２のＰＣＶ２ ＧＣ０５０４またはＰＣＶ２ ＧＣ０５０５のゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ合成法によって準備されうる。前記合成は、ゲノムＤＮＡの全部またはその断片の形態で合成できる。断片の形態で合成された場合、前記合成された断片を連結（ligation）し、前記ゲノムＤＮＡを準備できる。前記連結には、ＤＮＡ連結酵素（ligation enzyme）及びＤＮＡキナーゼ（kinase）などの酵素が使われうる。ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４またはＰＣＶ２ ＧＣ０５０５のゲノムＤＮＡは、約１．８ｋｂの長さを有するものであり、当業界に公知の技術によって容易に合成されうる。前記合成されたゲノムＤＮＡは、それ自体またはベクターに導入された形態で、宿主細胞または宿主動物に投与されうる。前記ウイルスの生産は、例えば、援用によってその全体内容が本明細書に含まれる米国特許公開第２００４／０２５３２７０Ａ１号公報（例えば、００８４ないし００８６、実施例２ないし５及び図１）及びFenaux，Ｍら（Ｊ．Vir．Jan．2002，p．541-551）に記載された方法によってなされうる。それらの方法をＰＣＶ２ ＧＣ０５０４またはＰＣＶ２ ＧＣ０５０５を生産するのに作用させれば、合成されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、唯一の制限酵素部位、例えばＳＡｃＩＩ部位を有するフォワード及びリバースのプライマー対を使用し、ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４またはＰＣＶ２ ＧＣ０５０５の全長ゲノムをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅できる。ＰＣＶ２ゲノム連続ダイマー（tandem dimer）を含むＤＮＡクローンを得るために、前記ＰＣＲ産物をベクター、例えば、ＴＡｇｅ plasmid vector（Clontech，Palo Alto，Clif）に連結させ、大腸菌ＤＨ５ａ能力細胞（competent cell）を形質転換させることができる。形質転換された細胞からベクターを分離し、全長ゲノムの存在を確認し、前記制限酵素、例えば、ＳＡｃＩＩで前記ベクターを切り、切除されたＰＣＶ２ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼ（ligase）を使用して互いに連結することによって、連続ダイマーを製造できる。その後、前記連続ダイマーは、ｐBluescript ＳＫ（＋） vector（ｐＳＫ）（Stratagene Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）にクローニングされ、ＰＣＶ２ゲノムの連続ダイマーを含む組換えプラスミド（以下、ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローン（ＰＣＶ２ molecula rＤＮＡ clone）とする）が製造されうる。次に、前記ＰＣＶ２分子ＤＮＡクローンは、ＰＫ−１５細胞にインビトロ（in vitro）トランスフェクション（transfection）されうる。前記トランスフェクションされた細胞を培養した後、細胞を破砕した後でウイルスを分離することによって、前記ＰＣＶ２ウイルスを得ることができる。このように得られたＰＣＶ２ウイルスは、インビボ（in vivo）で宿主動物、例えば豚に接種例えば、鼻腔を介して接種され、前記動物から分離されうる。
【００２８】
前記不活性化されたサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、宿主細胞に感染せずに病理学的症状を引き起こさずに免疫原性を有するもの、または宿主細胞に感染するが、病理学的症状を引き起こさずに免疫原性を有するものでありうる。前記病理学的症状は、サーコウイルスと関連した業界で公知のサーコウイルスの宿主感染によって引き起こされる細胞、組織または個体で発生する症状でありうる。前記病理学的症状は、例えば、先天性振戦（congenital tremor）、離乳後の全身性消耗性症候群（ＰＭＷＳ：postweaning multisystem wasting syndrome）、衰弱（wasting）、呼吸困難（dyspnea）、頻呼吸（tachypnea）、黄疸、下痢、せき、中枢神経系不安、体重損失、急性血管炎（Langohr，2010，Vet pathol．Vol 47，p140-147）、繁殖疾患（流産、死産、ミイラ胎児など）（Hansen，2010，Vet Microbiol．，Epub ahead of print）及び豚皮膚炎腎炎症候群（ＰＤＮＳ：porcine dermatitis nepropathy syndrome）からなる群から選択される一つ以上の症状でありうる。
【００２９】
前記不活性化（attenuation）は、当業界に公知の任意の方法によってなされうる。例えば、前記不活性化は、細胞、例えばＰＫ−１５細胞のような細胞株で継代培養（repeated passage）したり、ウイルス関連のエンドヌクレアーゼの活性化によってなされうる。また、前記不活性化は、化学的方法、例えば、前記ウイルスをホルムアルデヒド（ホルマリン）、パラホルムアルデヒド、β−プロピオラクトンまたはエチレンイミンあるいはその誘導体に曝露させること、またはＵＶ（ultraviolet）照射によってなされうる。前記不活性化の一例として、前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択された一つ以上のウイルスを、ホルムアルデヒドと反応させることによって、不活性化されたものでありうる。前記反応でホルムアルデヒドは、反応液の総重量に対して、０．２ないし０．５重量％の量で含まれるものでありうる。前記反応は、室温で撹拌、例えば１００ｒｐｍで１０ないし２４時間なされうる。
【００３０】
前記組成物は、対象動物でＰＣＶ２の感染によって引き起こされる病理学的症状を治療または予防するためのものでありうる。前記病理学的症状は、例えば、先天性振戦、離乳後の全身性消耗性症候群（ＰＭＷＳ）、衰弱、呼吸困難、頻呼吸、黄疸、下痢、せき、中枢神経系不安、体重損失、及び豚皮膚炎腎炎症候群（ＰＤＮＳ）からなる群から選択される一つ以上の症状でありうる。
【００３１】
前記組成物において、前記組成物に含まれるＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５の量は、選択される動物、疾病の軽重、年齢及び組成物の剤形などによって、当業者が適切に選択できる。例えば、ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５の量は、それぞれ一回容量当たり１０４．５ＴＣＩＤ５０以上の量、例えば、１０４．５ＴＣＩＤ５０ないし１０６．５ＴＣＩＤ５０の量で含まれるものでありうる。
【００３２】
前記組成物において、感染を予防または治療する対象である前記サーコウイルスは、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂからなる群から選択されるものでありうる。例えば、前記サーコウイルスは、ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｂを含むものでありうる。ＰＣＶ２は、現在までＰＣＶ２ａ，２ｂ ２つの遺伝型に分類されると報告されており、ＰＣＶ２ａとＰＣＶ２ｂとの二種の遺伝型は、さらに細部ストレイン（strain）には分類されないと知られている。従って、本発明の一具体例による不活性化されたＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５を含む前記組成物は、ＰＣＶ２ａまたはＰＣＶ２ｂに属するウイルス、すなわちＰＣＶ２を、いずれも防御できる。
【００３３】
前記組成物は、獣医学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。前記担体は、前記組成物の免疫原性を維持するために当業界に公知の任意のものになりうる。例えば、前記担体は、希釈剤、賦形剤、アジュバント（adjuvant）及び凍結乾燥安定化剤（freeze-drying stabilizer）からなる群から選択された一つ以上を含むものでありうる。前記希釈剤は、例えば、滅菌水を含んだ水及びバッファからなる群から選択される一つ以上になりうる。前記アジュバントは、前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５の免疫原性を増大させることができるものであり、当業界に公知の任意のものでありうる。例えば、前記アジュバントは、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリホスファゼン及びmontanide gel（登録商標）からなる群から選択される一つ以上でありうる。前記凍結乾燥安定化剤は、例えば、ソルビトール、マニトール、澱粉、蔗糖、デキストリンまたはブドウ糖のような炭水化物、アルブミンまたはカゼインのような蛋白質、それら化合物の誘導体またはアルカリ金属リン酸塩のようなバッファになりうる。前記担体は、選択される担体の種類などによって、当業者がその量を適切に決定できる。前記組成物は、例えば、組成物総重量を基準に前記担体は、５％ないし１５％の量で含まれるものでありうる。
【００３４】
本発明の一具体例は、前記組成物で、前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、１ｍｌ当たり１０４．５ＴＣＩＤ５０以上の量、例えば、１０４．５ＴＣＩＤ５０ないし１０６．５ＴＣＩＤ５０の量で含み、組成物総重量を基準に、５％ないし１５％のmontanide gel（登録商標）を含むものでありうる。montanide gel（登録商標）（ＳＥＰＰＩＣ、Paris、France）は、合成ポリマーと水性ゲルとからなる組成物である。
【００３５】
前記組成物は、免疫原性組成物として当業界に公知の任意の剤形でありうる。前記組成物は、非経口または経口型剤形の形態でありうる。前記組成物は、例えば、凍結乾燥された形態、顆粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、または乾燥シロップ剤または注射剤の形態でありうる。凍結乾燥された形態は、使用前に滅菌された液体担体、例えば滅菌水に溶かして使用できる。
【００３６】
前記組成物の投与は、免疫原性組成物を投与する方法に係わる当業界に周知の任意の方法によって投与されうる。例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮（transdermal）、粘膜、鼻内（intranasal）、気管内（intratracheal）または皮下投与のような任意の投与経路を介して個体に投与できる。前記組成物は、全身的にまたは局部的に投与されうる。
【００３７】
前記組成物において、前記動物は、豚、マウス及びモルモット（guinea pig）からなる群から選択されるものでありうる。
【００３８】
本発明の他の具体例は、サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる群から選択された一つ以上のウイルスをホルマリンと反応させて不活性化されたサーコウイルスを得る段階を含む、不活性化されたサーコウイルスを生産する方法を提供する。
【００３９】
前記反応は、前記ホルマリンを含む反応溶液中に、前記ウイルスを添加して放置することによってなされうる。前記ホルマリンは、反応溶液総重量に対して、０．２ないし０．５重量％の量で含まれるものでありうる。前記反応は、室温でなされうる。反応時間は、１０時間ないし２４時間でありうる。前記反応は、撹拌、例えば、１００ｒｐｍで撹拌しつつなされうる。
【００４０】
本発明の他の具体例は、有効量の前記のような本発明の一具体例による組成物を動物に投与する段階を含む、動物のサーコウイルス感染を治療または予防する方法を提供する。
【００４１】
前記投与は、免疫原性組成物を投与する方法に係わって、当業界に周知の任意の方法によってなされうる。前記投与は、経口または非経口で投与されるものでありうる。前記投与は、例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、鼻内、気管内、直腸内または皮下投与するものでありうる。前記投与は、前記組成物を全身的にまたは局部的に投与するものでありうる。前記投与は、注射（injection）または注入（infusion）によってなされるものでありうる。
【００４２】
前記投与は、一回以上、例えば二回以上投与されるものでありうる。前記投与は、二回投与されるものであり、例えば、一回投与後の二週間後に、二回目の投与を行うものでありうる。前記投与の対象になる動物は、豚、マウス及びモルモットからなる群から選択されるものでありうる。
【００４３】
前記「有効量（effective amount）」は、動物でＰＣＶ２の感染を予防または治療するのに効果的な量を意味する。前記治療または予防というのは、動物でＰＣＶ２の感染を防止するだけではなく、ＰＣＶ２感染によって引き起こされる症状を除去及び減少させるものを含む。前記有効量は、選択される動物、疾病の軽重、年齢及び組成物の剤形などによって、当業者が適切に選択できるのである。例えば、前記有効量は、一回容量当たりそれぞれ１０４．５ＴＣＩＤ５０以上の量、例えば、１０４．５ＴＣＩＤ５０ないし１０６．５ＴＣＩＤ５０の量のＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５ウイルスをそれぞれ含む量でありうる。
【００４４】
前記組成物については、前記の通りである。前記動物は、ＰＣＶ２感染によって病理学的症状が引き起こされる任意の動物になりうる。例えば、前記動物は、豚、マウス及びモルモットからなる群から選択されるものでありうる。
【００４５】
本発明の他の具体例は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するゲノムを含むサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４を提供する。
【００４６】
前記ゲノムは、それぞれ配列番号１の５１番ないし９９２番の配列によって構成されるＯＲＦ１ヌクレオチド配列、及び配列番号１の１０３７番ないし１７３５番の配列に相補的な配列によって構成されるＯＲＦ２ヌクレオチド配列を有するものでありうる。ＯＲＦ１ヌクレオチド配列は、正鎖であり、レプリカ剤蛋白質をコーディングできる。ＯＲＦ２ヌクレオチド配列は、負鎖であり、キャプシド蛋白質をコーディングできる。前記ＯＦＲ１蛋白質及びＯＲＦ２蛋白質は、それぞれ配列番号２及び３のアミノ酸配列を有するものでありうる。
【００４７】
前記サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、配列番号１のゲノム配列によって発現されるウイルス粒子であるならば、いずれのものも含む。前記サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、配列番号２及び３のアミノ酸配列からなる前記ＯＦＲ１及びＯＲＦ２からなる一つ以上のアミノ酸配列をウイルス粒子中に含むものでありうる。前記サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、ＰＣＶ２−２ａウイルスである。
【００４８】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、宿主細胞で高い増殖性を有しており、不活性化サーコウイルス・ワクチンを製造するのに効率的である。前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、例えば、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ ９００ｍｌ、ＦＢＳ １００ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン２００ＩＵ／ｍｌ及びカナマイシン１００μｇ／ｍｌ）培地中で単層が形成されたＰＫ−１５細胞の培地を除去した後、トリプシン処理を行って細胞を切除し、１０４．５ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＰＣＶ２を細胞浮遊液に添加して接種し、３７℃で３，４日間静置培養した後、細胞に対して三回凍結融解を反復して細胞を完全に破壊した後、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後で得られた上層液でのウイルス含有量が、平均１０５．６ないし１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌと高い増殖性を有するものでありうる。ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、ＰＣＶ２−２ａに属するウイルスである。
【００４９】
前記サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、不活性化される場合、多種のＰＣＶ２ａのストレインに対して免疫原性を有することができる。
【００５０】
本発明の他の具体例は、配列番号２のヌクレオチド配列を有するゲノムを含むサーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０５を提供する。
【００５１】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、配列番号４のヌクレオチド配列を有するゲノム配列を有するものでありうる。前記ゲノムは、それぞれ配列番号４の５１番ないし９９２番のヌクレオチド配列からなるＯＦＲ１のヌクレオチド配列、及び配列番号４の１０３６番ないし１７３４番のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるＯＦＲ２のヌクレオチド配列を有するものでありうる。ＯＲＦ１ヌクレオチド配列は、正鎖であり、レプリカ剤蛋白質をコーディングできる。ＯＲＦ２ヌクレオチド配列は、負鎖であり、キャプシド蛋白質をコーディングできる。前記ＯＦＲ１蛋白質及びＯＲＦ２蛋白質は、それぞれ配列番号５及び６のアミノ酸配列を有するものでありうる。前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、前記配列番号４のゲノムによって発現されるウイルス粒子であるならば、いずれのものも含む。前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、例えば、配列番号５及び６のアミノ酸配列からなる前記ＯＦＲ１及びＯＲＦ２からなる一つ以上のアミノ酸配列をウイルス粒子中に含むものでありうる。ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、ＰＣＶ２−２ｂに属するウイルスである。
【００５２】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、宿主細胞で高い増殖性を有しており、不活性化サーコウイルス・ワクチンを製造するのに効率的である。前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、例えば、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ ９００ｍｌ、ＦＢＳ １００ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン２００ＩＵ／ｍｌ及びカナマイシン１００μｇ／ｍｌ）培地中で単層が形成されたＰＫ−１５細胞の培地を除去した後、トリプシン処理を行って細胞を切除し、１０４．５ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＰＣＶ２を細胞浮遊液に添加して接種し、３７℃で３，４日間静置培養した後、細胞に対して三回凍結融解を反復して細胞を完全に破壊した後、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後で得られた上層液でのウイルス含有量が、平均１０５．６ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上、例えば１０５．６ないし１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌと高い増殖性を有するものでありうる。
【００５３】
前記サーコウイルスＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、不活性化される場合、多種のＰＣＶ２ｂのストレインに対して免疫原性を有することができる。
【００５４】
前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５のそれぞれは、豚細胞株でインビトロまたはインビボで複製されうる。前記細胞株は、例えば、不死化された（immortalized）ものでありうる。前記細胞株は、例えば、豚腎臓の表皮細胞株（epithelial cell line）ＰＫ−１５及びＳＫ、モノミエロイド細胞株３Ｄ４／３１及び精巣細胞株（testicular cell line ＳＴ）からなる群から選択されるものでありうる。
【００５５】
本明細書に言及された配列は、配列目録ファイルを介しても提出され、それら配列目録は、本明細書に援用によってその全体内容が含まれうる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
１．ウイルスの分離及び増殖性の確認
２００５年から２００７年までの間、依頼された豚検査サンプルからのＰＣＲ（polymerase chain reaction）及びＩＦＡ（indirect immunoflorescence assay）診断法を介して、ＰＣＶ（porcine circovirus）ウイルスを分離した。それら分離株を、ＰＫ−１５細胞に感染させて培養し、増殖されたウイルス粒子の数を測定した後、増殖性が最も高い分離株を選別した。
【００５８】
まず、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ ９００ｍｌ、ＦＢＳ １００ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン２００ＩＵ／ｍｌ及びカナマイシン１００μｇ／ｍｌ）培地中で、ＰＫ−１５細胞を３７℃で培養し、細胞単層を形成させた。次に、単層が形成されたＰＫ−１５細胞の培地を除去した後、トリプシン処理を行って細胞を切除し、得られたウイルス含有細胞浮遊液に含まれたウイルスの含有量が、１０４．５ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌに調整されたＰＣＶ２を添加して接種し、３７℃で３，４日間静置培養した。培養後で得られた細胞に対して三回凍結融解を反復し、細胞を完全に破壊した後、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後に得られた上層液に対し、ＰＣＲ及びＩＦＡを利用し、ＰＣＶ２ウイルスの含有量を測定した。その結果、２個の分離株が高いウイルス含有量を示すことを確認し、それら分離株を、それぞれＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５と命名した。ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４は、ＰＣＶ２−２ａタイプのウイルスであり、配列番号１のゲノム配列を有する。ＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、ＰＣＶ２−２ｂタイプのウイルスであり、配列番号２のゲノム配列を有する。前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、それぞれ平均して１０５．６ないし１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ細胞培養液の含有量で複製され、一般的に公知のＰＣＶ２ウイルスの増殖性に比べ、１０倍以上高い増殖性を示すことを確認した。従って、前記ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５からなる一つ以上のウイルスは、増殖性が高いために、弱毒化(attenuation)または不活性化されたワクチンを製造するのに必要なウイルスを効率的に提供できる。このように得られたＰＣＶ２ウイルス（以下、「バルクウイルス」とする）を、以下のウイルス不活性化に使用した。
【００５９】
ここで、前記ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ（real−ＰＣＲ）法によって行われた。リアルタイムＰＣＲに適用する試薬として、タカラバイオ（株）のＳＹＢＲ green製品を使用した。１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌのＰＣＶ２ ＧＣ０５０５が１０倍希釈された試料をテンプレートとして、ＰＣＶ２のＯＲＦ２に特異的なプライマー（５’−ＴＡＧ ＧＴＴ ＡＧＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＴ−３’：フォワードプライマー、配列番号７）、及び５’−ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＴＡ ＴＡＣ ＴＧ−３’：リバースプライマー、配列番号８）をプライマーとして、９４℃で１０秒間維持した後、９４℃で５秒及び６０℃で４０秒間４０回反復した。増幅産物の予想サイズは、２６３ｂｐである。その結果、１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度でも、前記ウイルスを首尾よく検出できた（図１）。図１は、ＰＣＶ２の濃度によってリアルタイムＰＣＲを行った結果を示す図面である。
【００６０】
前記リアルタイムＰＣＲで測定されたＣｔ値と、ＩＦＡ法によって測定されたウイルス力価との相関関係は、下記数式１のように表示される。
【００６１】
【数１】
2011162534.tif 000003
【００６２】
数式１で、ｙはＣｔ値、ｘはＩＦＡ力価（ｌｏｇ１０）であり、単位は、ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌである。数式１による相関係数Ｒ２＝０．９９８８であり、９９．９％ほどの信頼度を示す。このように確立されたリアルタイムＰＣＲは、１０ＴＣＩＤ５０／１ｍｌのウイルス濃度まで検出できる高い敏感度を有しており、測定時間も短いので、本発明の実施例で、ウイルス測定方法として使用した。
【００６３】
また、サンドウィッチ間接ＥＬＩＳＡ（sandwich indirect ＥＬＩＳＡ）でもって、次の通りの過程を行い、ＰＣＶ２ウイルスに対する抗体を測定した。
【００６４】
まず、ＰＣＶ２特異抗体を、５ないし１０μｌ／ｍｌでコーティング・バッファ（coating buffer）（ＮａＨＣＯ３ ２．９３ｇ、Ｎａ２ＣＯ３ １．５９ｇ、水１，０００ｍｌ：０．５Ｍカルボネートバッファ、ｐＨ９．６）に希釈し、１００μｌずつＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分注し、３７℃で２時間吸着させた。抗体が吸着したＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ（phosphate buffered saline）−Ｔで三回洗浄した。遮断バッファ（blocking buffer）（ＢＳＡ（bovine serum albumin） １ないし２ｇ、ＰＢＳ １００ｍｌ：１ないし２％ＢＳＡ）２００μｌずつ全てのウェルに入れ、３７℃で２時間反応させた。プレートを三回洗浄した。次に、ＰＣＶ２抗原をＰＢＳで１０倍ないし２０倍希釈した後、全てのウェルに入れ、３７℃で１時間反応させた。プレートを三回洗浄し、抗原が感作されたプレートに、検査試料（血清）を、希釈バッファ(dilution buffer）（ＮａＣｌ ８．０ｇ、無水ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ、無水Ｎａ２ＨＰＯ４ １．１９ｇ、ＫＣｌ ０．２ｇ、水１，０００ｍｌ：ｐＨ７．２−７．４）を利用し、１：５０に希釈してウェルに分注した後、３７℃で１時間反応させた。洗浄バッファ（washing buffer）（Tween ２０ ０．５ｍｌ、ＰＢＳ １，０００ｍｌ：０．０５％ＰＢＳＴ）で五回洗浄し、前記希釈バッファで希釈されたanti−ＧＰ ＩｇＧ ＨＲＰ接合体（conjugate）を１００μｌずつ添加した後、３７℃で１時間反応させた。プレートを五回洗浄し、１００μｌオルトフェニレンジアミン(ＯＰＤ)基質を各ウェルに分注して室温で１０分間反応させた後、５０μｌ停止溶液（stop solution）（２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を添加した後、４９２ｎｍで吸光度を測定した。
【００６５】
前記分離されたＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５は、それぞれ単層が形成されたＰＫ−１５細胞にウイルスを接種して３７℃で７２時間培養し、ウイルス感染液を回収し、２，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、その上層液または前記上層液を凍結乾燥し、−８０℃以下の温度で保存した。
【００６６】
２．ウイルス不活性化及び不活性化ウイルスを含む免疫原性組成物の製造
（２．１）ウイルス不活性化
前記１で回収されたバルクウイルスのうち、含有量が１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上であるものを選別し、不活性化に使用した。バルクウイルス（８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ ９００ｍｌ、ＦＢＳ １００ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリンＩＵ／ｍｌ及びカナマイシン１００μｇ／ｍｌ）培地中のウイルス）に、ホルマリンの最終濃度が０．３％なるように添加した後、２４時間室温で放置し、ＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５をそれぞれ不活性化させた。このように不活性化されたＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５を免疫原性組成物を製造するためのバルクとした。
【００６７】
（２．２）免疫原性組成物の製造
（２．１）で準備されたＰＣＶ２ ＧＣ０５０４及びＰＣＶ２ ＧＣ０５０５ウイルスは、それぞれの最終濃度が１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌになるように調節した後、４５：４５の割合で混合し、Motanide gel（登録商標）を１０％（ｗ／ｗ）になるように添加し、１時間以上室温で１００ｒｐｍで撹拌した。このように得られた免疫原性組成物は、ｐＨ６．０−８．０の範囲に維持し、ホルマリン含有量がｐＨ０．３重量％以下になるように維持した。取り立てての言及がない限り、ここで製造された免疫原性組成物を、以下の実験で使用した。前記免疫原性組成物を、以下「ワクチン」という。
【００６８】
（３）不活性化確認及び安全性確認
（３．１）不活性化確認試験
不活性化された試料を遠心させた後、適当量を透析膜に入れ、４℃で試料の１００倍量以上のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で一晩透析し、不活性化剤を除去したものを試験材料とした。
【００６９】
豚初代腎臓細胞またはＰＫ−１５細胞を、組織培養用フラスコ（２５ｃｍ２）で増殖させた。初代培養細胞は、４ないし７日間培養された細胞を使用し、ＰＫ−１５細胞は、試験前にサーコウイルス１型の感染がないことを確認した。増殖された細胞から細胞培養液を除去した後、前記試験材料１mlを組織培養された細胞に接種し、３７℃で１時間感作させた。１時間後、新しい細胞維持用培地を加え、７日間培養しつつ細胞変性効果を確認した。上層液を除去した後、ＩＦＡ法を利用して豚サーコウイルスが増殖したか否かを確認した。
【００７０】
その結果、豚初代腎臓細胞またはＰＫ−１５細胞で、豚サーコウイルスによる特異な細胞変性効果（ＣＰＥ）、またはその他ウイルスによるＣＰＥは、確認されなかった。また、細胞上層液で、鶏、豚の血球について凝集（ＨＡ）が起こらず、ＩＦＡについても、ウイルスは検出されなかった。
【００７１】
（３．２）安全性確認試験
体重１５〜２０ｇのマウス８匹、体重３００〜４００ｇのモルモット４匹を試験動物として使用した。また、ＰＣＶ２関連ワクチンを接種せず、関連疾病に露出されていない生後３ないし５週齢の健康な子豚２匹を試験動物として使用した。
【００７２】
マウス８匹は、それぞれ０．５ｍｌ（１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）の前記組成物を腹腔に接種し、モルモット４匹は、前記組成物を筋肉または皮下に２ｍｌずつ（１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）接種し、残りの２匹は、２ｍｌずつ腹腔に接種し、７日間観察し、異常なく生存しているか否か観察した。子豚２匹に一回容量（dose、１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）の量を、右側首部位の筋肉に接種した後、１ないし２時間以内に、過敏反応及び発熱反応が示されているか否かを調べ、注射部位に化膿及び懐死のような副作用なしに生存しているか否かを２１日間観察した。その結果、記述された試験方法によって、それぞれのロット別に、マウス、モルモット及び子豚に前記組成物を接種した結果、試験期間の間何の異常もなしにいずれも生存した。
【００７３】
（３．３）力価試験
前記免疫原性組成物を動物に投与し、血清で抗体を測定した。抗体測定試験は、前記のようなＥＬＩＳＡ法または間接蛍光抗体検査法（ＩＦＡ）を実施した。
【００７４】
体重３００ないし３５０ｇのモルモット１０匹を準備し、８匹は接種群、２匹は対照群として、接種群には皮下に、前記組成物０．５ｍｌ（１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を接種し、３週間後に２匹の対照群と共に採血し、ＩＦＡまたは間接サンドウィッチＥＬＩＳＡで抗体価を測定した。
【００７５】
ＥＬＩＳＡ試験で、抗体力価は、接種群平均吸光度（Ｏ．Ｄ．）値（Ｔ）を、対照群平均吸光度（Ｏ．Ｄ．）値（Ｃ）で割ったＴ／Ｃ値が２．０以上であり、ＩＦＡ試験で、接種群の抗体力価は、平均１２８倍以上であり、対照群は、陰性であるものを免疫原性組成物として適切性についての判定基準とした。下記表は、ＥＬＩＳＡを利用して測定された抗体力価を示している。
【００７６】
【表１】
2011162534.tif 000004
【００７７】
前記表１に示されているように、前記免疫原性組成物は、対照群に比べて実験群において、免疫原性組成物として適切な程度に高い免疫原性があると確認された。
【００７８】
３．免疫原性組成物の有効性確認
ここでは、前記免疫原性組成物が、動物で免疫を誘導するのに必要な最小量（以下、「最小免疫に必要な抗原量」とする）を決定し、前記免疫原性組成物が動物に接種されたとき、免疫誘導能と増体率との差異など、有効性が認定されるか否かを確認した。
【００７９】
前記最小免疫量の測定には、ＰＣＶ２の力価がそれぞれ１０３．５，１０４．５，１０５．５または１０６．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌになるようにしたことを除いては、前記免疫原性組成物と同じ組成物を使用した（４倍数として使用する）。有効性測定には、前記免疫原性組成物を使用した。
【００８０】
最小免疫に必要な抗原量は、子豚に対して実験した。豚サーコウイルスに対して抗体が陰性である１５匹の３週齢子豚に２週間隔で、ＰＣＶ２ワクチン抗原含有量が、それぞれ１０３．５，１０４．５，１０５．５，１０６．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌである試験ワクチンを、一次、二次接種し、３匹を対照としておき、ワクチン接種前、二次接種後２週間目に採血し、ＰＣＶ２に対するＥＬＩＳＡ抗体価を測定した。
【００８１】
前記免疫原性組成物の有効性は、子豚に対して実験した。豚サーコウイルスに対して抗体が陰性である４匹の３週齢子豚に２週間隔で、前記免疫原性組成物を一次、二次接種し、２匹を対照としておき、二次接種２週間、４週間、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月後に採血し、前記方法のようにＰＣＶに対するＥＬＩＳＡ抗体価及びＩＦＡを介したＳＮ抗体価（Fortら，2007，Vet Microbiol 125，p244-255）を測定した。ＥＬＩＳＡ抗体価は、抗原によって誘導される全ての抗体を示し、ＳＮ抗体価は、血清中和抗体価であり、血清内に存在する抗体のうち、ウイルスのような病源体を中和させることができる抗体のレベルを示す。
【００８２】
また、子豚について、前記免疫原性組成物において、豚増体率に及ぼす影響を測定した。接種前、二次接種前、二次接種２週後、二次接種６週間後、子豚の体重を測定して増体率を確認した。
【００８３】
最小免疫に必要な抗原量を測定した結果、ＰＣＶ２抗原含有量別に、二回接種した後、ＥＬＩＳＡ抗体価を測定した結果、表２に示されるように、１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌでも、抗体価の変化が確認されたが、１０４．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上の抗原含有量で接種したとき、対照群に比べて、非常に有意性のある（ｐ＜０．０５）抗体価上昇が誘導された（表２）。
【００８４】
【表２】
2011162534.tif 000005
【００８５】
表３は、前記免疫原性組成物を子豚に投与し、抗体価を測定した結果を示す表である。
【００８６】
【表３】
2011162534.tif 000006
【００８７】
表４及び表５は、前記免疫原性組成物を子豚に投与し、子豚の体重を測定した結果を示す表である。該表は、前記組成物を接種する前から接種した後の６週まで、接種群と対照群との体重を測定した結果である。接種群は、二次接種２週後である７週齢から、対照群に比べて平均体重が１ｋｇほどさらに重く、１３週齢で、平均体重が対照群に比べて４ｋｇさらに重かった。
【００８８】
【表４】
2011162534.tif 000007
【００８９】
【表５】
2011162534.tif 000008
【００９０】
以上のように、不活性化された豚サーコウイルスを含む免疫原性組成物の有効性を確認するために動物に投与した後、抗体価を測定した結果、接種群は、対照群に比べて、優秀な抗体価上昇を確認することができた。抗原含有量別に、子豚に前記免疫原性組成物を投与した結果、１０４．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上で、抗体価上昇が有意的に誘導されたということが分かるとき、前記免疫原性組成物に前記不活性化されたウイルスが、最小１０４．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上の含有量で含まれねばならないことを確認することができた。子豚の免疫原性試験を介しても、投与群の抗体価が対照群に比べ、はるかに上昇することを確認することができた。子豚に対する増体率試験でも、投与群が対照群に比べて高い増体率を示した。
【００９１】
４．子豚に対する攻撃接種試験
前記免疫原性組成物を豚に投与し、ＰＣＶ２を前記豚に投与し、前記豚が前記組成物の投与によって防御能が向上しているか否かを確認した。
【００９２】
免疫原性組成物は、前記の（２．２）によって製造されたものを使用した。生後３週齢の子豚１４匹を攻撃接種対象とした。子豚攻撃接種用ウイルス株は、緑十字の獣医薬品で分離したＰＣＶ２ストレインを使用した。ＰＣＶ２の場合、ＰＫ−１５細胞で３７℃、４８時間培養して採毒した後、５，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上層液を１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌになるように希釈して使用した。
【００９３】
前記組成物の投与は、前記組成物の子豚に対する防御能を確認するために、３週齢のＳＰＦ（specific pathogen free）子豚１４匹を選定し、８匹には接種群として前記組成物１ｍｌ（１０６．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を２週間隔で二回筋肉接種し、残りの６匹には、ワクチンを接種しなかった。
【００９４】
二次接種２週後に、試験群２グループと対照群２グループとに分け、準備されたウイルス株で攻撃接種を実施した後、１４日間臨床症状を観察した。
【００９５】
−第１グループ試験群（ＰＣＶ２攻撃接種）：第１グループ試験群には、３週齢の子豚４匹を選定し、前記組成物１ｍｌを２週間隔で二回筋肉接種し、２週後（７週齢）にＰＣＶ２を攻撃接種した。
【００９６】
−第１グループ対照群（ＰＣＶ２攻撃接種）：第１グループ対照群には、３週齢の子豚２匹を選定し、７週齢でＰＣＶ２を攻撃接種した。
【００９７】
−第２グループ試験群（ＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶ（porcine reproductive and respiratory syndrome virus）攻撃接種）：第２グループ試験群には、３週齢の子豚４匹を選定し、前記組成物１ｍｌを２週間隔で二回筋肉接種し、２週後（７週齢）に、ＰＣＶ２とＰＲＲＳＶとを攻撃接種した。
【００９８】
−第２グループ対照群（ＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶ攻撃接種）：第２グループ対照群には、３週齢の子豚２匹を選定し、７週齢でＰＣＶ２とＰＲＲＳＶとを攻撃接種した。
【００９９】
−無接種対照群：無接種対照群には、３週齢の子豚２匹を選定し、７週齢でワクチン接種や攻撃接種を行わなかった。
【０１００】
また、攻撃接種された子豚で、ＰＣＶ２ウイルスが排出されているか否かを確認した。ウイルスが排出されているか否かは、攻撃接種日、攻撃接種後３日，７日，１０日，１４日，１７日，２０日，２５日，３１日目で、それぞれ鼻腔と直腸とを滅菌された綿棒でスワッブ（swab）し、ウイルス含有量を測定した。前記ＰＣＶ２ウイルス含有量は、リアルタイムＰＣＲ（ＳＹＢＲ Premix Ｅｘ Ｔａｑ ２Ｘ、ＴＡＫＡＲＡ（登録商標））を介して決定した。前記鼻腔及び直腸のスワッブで得たＰＢＳ由来のそれぞれ１００μｌ試料から抽出したＤＮＡをテンプレートとして、次のＰＣＲプライマーと条件とを使用し、リアルタイムＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲを利用して得たＣｔ値から、あらかじめ求めておいたＩＦＡを介したＴＣＩＤ５０の相関関係、すなわち、前記数式１を利用してＩＦＡ力価（titer）を求めた。
【０１０１】
リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＶ２のＯＲＦ２に特異的なプライマー（５’−ＴＡＧ ＧＴＴ ＡＧＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＴ−３’：フォワードプライマー、配列番号７、及び５’−ＣＣＧ ＣＡＣ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＴＡ ＴＡＣ ＴＧ−３’：リバースプライマー、配列番号８）をプライマーとして、９５℃で１０秒間維持した後、９５℃で５秒及び６０℃で４０秒間３０回反復した後、９５℃で１分間維持した後、５５℃で３０秒及び９５℃で３０秒間維持した。増幅産物の予想サイズは、２６３ｂｐである。ＰＣＲ混合物の組成（総体積２５μｌ）は、蒸溜水９．５μｌ、ＳＹＢＲ Premix Ｅｘ Ｔａｑ ２Ｘ １２．５μｌ、プライマー（フォワード（１０ｐｍｏｌ）０．５μｌ、リバース（１０ｐｍｏｌ）０．５μｌ、テンプレート（ＤＮＡ）２μｌを含んでいる。
【０１０２】
攻撃接種実験の結果、ＰＣＶ２を攻撃接種した第１グループ試験群と、ＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶを攻撃接種した第２グループ試験群とでは、これといった異常が観察されなかったが、前記組成物を接種せずにＰＣＶ２を攻撃接種した対照群では、目やに、下痢などのＰＣＶＡＤ（porcine circovirus associated disease）関連症状が観察された。特に、ＰＣＶ２を攻撃接種した第１グループ対照群と、ＰＣＶ２とＰＲＲＳＶとを同時に攻撃接種した第２グループ対照群とでは、接種後１週間後から、沈欝、軟便、荒くなった皮毛、萎縮、リンパ節肥大のような典型的なＰＣＶ２感染症状が観察され、第２グループ対照群で、攻撃接種後１１日目に１匹が斃死した。前記組成物接種群と無接種対照群は、ほぼ正常所見をしめした。
【０１０３】
表６は、攻撃接種後の第１グループ（ＰＣＶ２攻撃接種群）試験群の臨床症状を示す。
【０１０４】
【表６】
2011162534.tif 000009
【０１０５】
表７は、攻撃接種後の第１グループ（ＰＣＶ２攻撃接種群）対照群（非ワクチン群）の臨床症状を示す。
【０１０６】
【表７】
2011162534.tif 000010
【０１０７】
表８は、攻撃接種後の第２グループ（ＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶ攻撃接種群）試験群（ワクチン群）の臨床症状を示す。
【０１０８】
【表８】
2011162534.tif 000011
【０１０９】
表９は、攻撃接種後の第２グループ（ＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶ攻撃接種群）対照群（非ワクチン群）の臨床症状を示す。
【０１１０】
【表９】
2011162534.tif 000012
【０１１１】
鼻腔を介したウイルス排出を測定した結果、前記ワクチン接種後にＰＣＶ２を攻撃接種した第１グループ試験群と、ワクチン接種後にＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶを攻撃接種した第２グループ試験群とでは、対照群に比べて、鼻腔を介したＰＣＶ２の排出が顕著に減ったことを確認することができた。第１グループ試験群と第２グループ試験群は、一日平均排出量が、最大１００．１２ＴＣＩＤ５０／０．１mlの排出量だけを示したが、対照群は、最大１００．８１ＴＣＩＤ５０／０．１mlのＰＣＶ２排出を示した。ＰＣＶ２を接種した第１グループ対照群と、ＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶを接種した第２グループ対照群とでは、接種後３日目からＰＣＶ２の排出が確認された。第１グループ対照群は、一日平均排出量が、最大１０１．１７ＴＣＩＤ５０／０．１ml、試験群Ｂは、最大１０１．７３ＴＣＩＤ５０／０．１mlの範囲を示してＰＣＶ２を排出した。これに比べ、無接種対照群では、ＰＣＶ２ウイルスの排出が確認されなかった（図２及び図３参照）。
【０１１２】
図２は、子豚に試験群別へのＰＣＶ２単独攻撃接種後、鼻腔を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示す図面である。図２で、ＤＰＩは、接種後の日数（date after post infection）を示し、ｙ軸のＩＦＡｌｏｇ１０は、リアルタイムＰＣＲを介して測定されたＣｔ値をＩＦＡ力価に換算した値である。
【０１１３】
図３は、子豚に試験群別に、ＰＣＶ２とＰＲＲＳＶとの混合攻撃接種後、鼻腔を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示す図面である。図３で、ｘ軸及びｙ軸は、図２に示したところと同一である。
【０１１４】
直腸を介したウイルス排出を測定した結果、前記ワクチン接種後にＰＣＶ２を攻撃接種した第１グループ試験群と、前記ワクチン接種後にＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶを攻撃接種した第２グループ試験群とでは、対照群に比べて糞便を介したＰＣＶ２の排出が顕著に減ったことを確認することができた。第１グループ試験群と第２グループ試験群は、一日平均排出量が、最大１００．４２ＴＣＩＤ５０／０．１mlの排出量だけを示したが、無接種対照群は、最大１０１．５８ＴＣＩＤ５０／０．１mlのＰＣＶ２排出を示した。ＰＣＶ２を接種した第１グループ対照群と、ＰＣＶ２＋ＰＲＲＳＶを接種した第２グループ対照群とでは、接種後の３日目からＰＣＶ２の排出が確認された。第１グループ対照群は、一日平均排出量が、最大１０１．９５ＴＣＩＤ５０／０．１ml、第２グループ対照群は、最大１０１．４４ＴＣＩＤ５０／０．１mlの範囲を示してＰＣＶ２を排出した。これに比べて、無接種対照群では、ＰＣＶ２ウイルスの排出が確認されなかった（図４及び図５参照）。
【０１１５】
図４は、子豚に、試験群別へのＰＣＶ２単独攻撃接種後に、糞便を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示す図面である。図４で、ｘ軸及びｙ軸は、図２に示したところと同一である。
【０１１６】
図５は、子豚に、試験群別へのＰＣＶ２とＰＲＲＳＶとの混合攻撃接種後、糞便を介したＰＣＶ２排出を測定した結果を示す図面である。図５で、ｘ軸及びｙ軸は、図２に示したところと同一である。
【０１１７】
以上のように、本実施例で製造された不活性化された豚サーコウイルスを含むワクチンの有効性を確認するために、豚を利用して病原性試験及び防御効能試験を行った。その結果、ワクチン接種後、攻撃接種を行ったグループが、ワクチン接種を行わずに攻撃接種をしたグループに比べ、特異的な臨床症状がほぼ観察されず、鼻腔や糞便を介したウイルスの排出期間が、ワクチン接種群が対照群に比べてさらに短く、ウイルス排出量も、ワクチン接種群が非ワクチン群に比べて有意的に少ないことを確認した。これによって、前記ワクチンは、豚における防御能にすぐれるワクチンであることを確認することができた。
【０１１８】
５．野外臨床試験及び結果
（５．１）野外臨床試験
本実施例で製造された不活性化された豚サーコウイルスを含むワクチンを、一般野外農場で生育される豚に投与した後、ワクチンとしての安全性及び有効性があるか否かを確認した。
【０１１９】
前記ワクチンは、前記のように製造し、野外試験農場は、３ヵ所の農場を選択し、３ヵ所の農場は、それぞれ約５００匹あまり（以下、第１群農場）、２００匹あまり（以下、第２群農場）、及び２００匹あまり（以下第３群農場）の親豚を生育させる規模の農場であり、農場の地理的位置は、互いに異なっている。試験に提供された豚の匹数と採血に利用された豚の匹数は、下記表１０に示した。
【０１２０】
【表１０】
2011162534.tif 000013
【０１２１】
ワクチンの接種は、生後３〜４週齢の接種群子豚に、前記ワクチンを一頭当たり１ｍｌずつ一次筋肉接種し、約２週後に同じ方法で二次接種を実施した。採血は、子豚の場合、ワクチン接種前（３週齢）、二次接種２週後（７週齢）、５週後（１０週齢）、８週後（１３週齢）、１１週後（１６週齢）に採血して血清を分離した。
【０１２２】
子豚の臨床症状は、次の通り観察した。まず、接種後、接種反応を観察するために、ワクチン接種直後に、局所的、全身的な接種反応を観察した。
【０１２３】
試験期間の間、ワクチン接種群及び対照群いずれも、採血時期と同一に周期別に、臨床症状を観察し、主要臨床症状観察項目として、咳、食欲不良、くしゃみ、鼻漏、呼吸困難、嘔吐、高熱、出血（鼻、口）、元気不足、全身衰弱、下痢などを確認し、その成績を記録した。試験ワクチンの野外効果と安全性とを確認するために、ワクチン接種後、体温測定、体重測定、抗体価測定を施行した。体温測定は、接種前、接種後４時間後、接種後１日から２日目までは、朝昼晩の三回体温を測定し、３日目から７日目まで１日一回測定し、体重測定は３週齢、１０週齢、１３週齢、１６週齢で測定した。
【０１２４】
ＰＣＶ２に対する抗体価測定は、３週齢、７週齢、１０週齢、１３週齢、１６週齢で実施した。採血された全ての動物の抗体価は、ＰＣＶ２の競争的ＥＬＩＳＡ（competitive ＥＬＩＳＡ）抗体価（Synbiotics社）を測定した。具体的な抗体検査ＥＬＩＳＡ法は、下記の通りである。
【０１２５】
ＰＣＶ２ Ａｂ Mono Blocking（ＰＣＶ２ competitive ＥＬＩＳＡ）法：
まず、対照液及びサンプルを準備した。使用前にバイアル（vial）を振った後、Ａ１とＡ２とのウェルに陰性対照液１００μｌ、ウェルのＢ１とＢ２とには、陽性対照液１００μｌを分注した。次に、サンプルをサンプル希釈液を利用して１：１００に希釈した後、１ウェル当たり１００μｌずつ分注した。１つのサンプル当たり、１ウェルにだけ分注したり、あるいは１サンプル当たり２つのウェルに分注して平均値を得た。接着フィルムでウェルを覆った。３７℃±３℃で、１時間±５分培養した。洗浄液で１：１０に希釈した後、プレートの接着フィルムを除去して四回洗浄した。
【０１２６】
接合体液を、接合体液希釈液を利用して１：１００に希釈した。希釈された接合体液を、１ウェル当たり１００μｌずつ分注し、新しい接着フィルムでウェルを覆った。３７℃±３℃で１時間±５分培養した。洗浄液で１：１０に希釈した後、プレートの接着フィルムを除去して四回洗浄した。次に、基質液を１ウェル当たり１００μｌ分周し、プレートを軽く振った。光を遮断した後、室温で３０分±５分培養した。培養後、反応停止液を１ウェル当たり５０μｌ入れ、プレートを振った。波長４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
【０１２７】
結果は、次の基準によって判定した。対照液のＯＤ値範囲は、次の通りである。
−陰性対照液のＯＤ値範囲＞０．５００
−陽性対照液のＯＤ値範囲≦０．３００
【０１２８】
中和抗体価（ＳＮｃ）は、次の数式２によって計算した。
【０１２９】
【数２】
2011162534.tif 000014
【０１３０】
また、野外試験農場の試験に使われた豚の斃死率を測定し、斃死豚のＰＣＶ２検査（ＰＣＲ、ＩＨＣ（immunohistochemistry）、サルモネラ検査（ＰＣＲ））を実施した。
【０１３１】
（５．２）野外臨床試験の結果
（５．２．１）第１群農場
ワクチン接種前並びにワクチン接種後の７日間、ワクチン接種群と対照群との体温を毎日測定した。その結果、ワクチン接種群と対照群との全ての個体が、ワクチン接種後７日間、正常体温範囲内であると確認された。
【０１３２】
ワクチン接種前（生後３週）と１０週齢、１３週齢、１６週齢とで、ワクチン接種群と対照群との体重を測定した。ワクチン接種前、ワクチン群の平均体重が多少低かったが、１０週齢時には、ワクチン接種群と対照群との体重差がほとんどなく、１３週齢と１６週齢とのとき、ワクチン接種群の体重が対照群に比べ、平均して多少大きく示された。表１１は、ワクチン接種群と対照群との体重変化（単位：ｋｇ、ｎ＝２０）を示す。
【０１３３】
【表１１】
2011162534.tif 000015
【０１３４】
ワクチン接種前（生後３週）並びに７週齢、１０週齢、１３週齢、１６週齢で、ワクチン接種群と対照群とからそれぞれ採血し、ＰＣＶ２のＥＬＩＳＡ抗体価と、ＩＦＡを利用した中和抗体価（ＳＮ）とを測定した。ワクチン接種群の場合、二次接種２週後（７週齢）に、抗体陽性率が接種前よりはるかに上昇し、１６週齢まで陽性率が維持されると分かった。対照群の場合、試験期間の間、抗体陽性率が上昇または低下し、しワクチン接種群に比べて低い数値を示した。中和抗体価は、接種前（３週齢）に対照群がむしろワクチン群より高かったが、ワクチン接種後の２週間目後である７週齢では、逆転現象が現れ、ワクチン群が対照群に比べて、有意性のある高い中和抗体価を示した（ｐ＜０．０５）。表１２（ワクチン接種群のＰＣＶ２抗体価を測定した結果）と表１３（対照群のＰＣＶ２抗体価を測定した結果）は、第１群農場で、ワクチン接種群と対照群とのＰＣＶ２抗体価を測定した結果を示す。
【０１３５】
【表１２】
2011162534.tif 000016
【０１３６】
【表１３】
2011162534.tif 000017
【０１３７】
ワクチン接種群の場合、ワクチン接種後の１６週間に斃死がなく、対照群で、７週齢で１匹が斃死した。対照群の斃死豚の組織試料をテンプレートにしたＰＣＲ検査の結果、リンパ節及び肺いずれもＰＣＶ２陽性を示し、組織ＩＨＣ染色で陰性であった。  
【０１３８】
試験期間中、斃死豚を対象にサルモネラ検査を実施し、いずれも陰性と確認された。
【０１３９】
ワクチン接種群と対照群との臨床症状を１６週齢まで観察した。ワクチン接種群の場合、ほぼ正常所見を示したが、対照群では、沈欝、軟便、荒くなった皮毛、萎縮などのＰＣＶ２感染症状を示す個体を観察できた。表１４（ワクチン接種群の臨床症状）と表１５（対照群の臨床症状）は、ワクチン接種群と対照群との臨床症状観察の結果を示す。
【０１４０】
【表１４】
2011162534.tif 000018
【０１４１】
【表１５】
2011162534.tif 000019
【０１４２】
（５．２．２）第２群農場
ワクチン接種前並びにワクチン接種後７日間、ワクチン接種群と対照群との体温を毎日測定した。その結果、ワクチン接種群と対照群との全ての個体が、ワクチン接種後７日間、正常体温範囲内であると確認された。
【０１４３】
ワクチン接種前（生後３週）及び１０週齢、１３週齢、１６週齢で、ワクチン接種群と対照群との体重を測定した。１０週齢までは、ワクチン接種群と対照群との体重差がほとんどなく、１３週齢と１６週齢とのとき、ワクチン接種群の体重が、対照群に比べて、平均して多少多く示された。表１６は、ワクチン接種群と対照群との体重変化（単位：ｋｇ、ｎ＝２０）を示す。
【０１４４】
【表１６】
2011162534.tif 000020
【０１４５】
ワクチン接種前（生後３週）及び１０週齢、１３週齢、１６週齢で、ワクチン接種群と対照群とからそれぞれ採血し、ＰＣＶ２のＥＬＩＳＡ抗体価と、ＩＦＡによる中和抗体価（ＳＮ）とを測定した。ワクチン接種群の場合、二次接種２週後（７週齢）に、抗体が接種前より大きく増加し、１６週齢まで高いレベルの抗体が維持されると分かった。対照群の場合、徐々に陽性率と抗体価とが上昇し、１３週齢からワクチン群と類似したレベルで示された。中和抗体価は、接種前１０倍以下と類似したレベルであったが、ワクチン二回接種後２週目（７週齢）には、ワクチン群の場合に平均２５倍、対照群の場合に平均１０倍のレベルと、有意性ある差（ｐ＜０．０５）を示し、１０週齢までは、その差がさらに大きくなったが、１３週齢からは、対照群も抗体価が上昇し、ワクチン群と類似したレベルに示された。表１７（ワクチン接種群のＰＣＶ２抗体価変化）と表１８（対照群のＰＣＶ２抗体価変化）は、第２群農場で、ワクチン接種群と対照群とのＰＣＶ２抗体価を測定した結果を示す。
【０１４６】
【表１７】
2011162534.tif 000021
【０１４７】
【表１８】
2011162534.tif 000022
【０１４８】
ワクチン接種群及び対照群いずれも、観察期間中には斃死がなかった。
【０１４９】
ワクチン接種群と対照群との臨床症状を１６週齢まで観察した。ワクチン接種群の場合、ほぼ正常所見を示したが、対照群では、３匹ほどが軟便、荒くなった皮毛などの所見を示しただけであり、特別の臨床症状は観察されなかった。表１９（ワクチン接種群の臨床症状）と表２０（対照群の臨床症状）は、ワクチン接種群と対照群との臨床症状観察の結果を示す。
【０１５０】
【表１９】
2011162534.tif 000023
【０１５１】
【表２０】
2011162534.tif 000024
【０１５２】
（５．２．３）第３群農場
ワクチン接種前並びに接種後７日間、ワクチン接種群と対照群との体温を毎日測定した。その結果、測定期間内で、ワクチン接種群及び対照群いずれも、正常体温範囲を維持した。
【０１５３】
ワクチン接種前（生後３週）及び１０週齢、１３週齢、１６週齢で、ワクチン接種群と対照群との体重を測定した。１０週齢後、ワクチン接種群の体重が対照群に比べて平均し大きく示された。表２１は、ワクチン接種群と対照群との体重変化（単位：ｋｇ、ｎ＝２０）を示す。
【０１５４】
【表２１】
2011162534.tif 000025
【０１５５】
ワクチン接種前（生後３週）及び１０週齢、１３週齢、１６週齢で、ワクチン接種群と対照群とからそれぞれ採血し、ＰＣＶ２のＥＬＩＳＡ抗体価と、ＩＦＡを使用した中和抗体価（ＳＮ）とを測定した。ワクチン接種群の場合、二次接種２週後（７週齢）に、抗体陽性匹数と抗体価とが接種前より大きく増加し、１６週齢では、いずれも陽性と高レベルの抗体が維持されると分かった。対照群の場合、徐々に抗体陽性匹数が増加したが、１６週齢でも陰性個体が確認された。中和抗体価は、ワクチン接種前１０倍以下と類似したレベルであったが、二次ワクチン接種後、ワクチン群平均抗体が３３倍、対照群平均抗体が１５倍と、有意性ある差を示した（ｐ＜０．０５）。そして、このような有意性ある差は、１６週齢まで維持された。表２２（ワクチン接種群のＰＣＶ２抗体価変化）と表２３（対照群のＰＣＶ２抗体価変化）は、第３群農場で、ワクチン接種群と対照群とのＰＣＶ２抗体価を測定した結果を示す。
【０１５６】
【表２２】
2011162534.tif 000026
【０１５７】
【表２３】
2011162534.tif 000027
【０１５８】
試験期間の間、ワクチン群及び対照群いずれでも斃死は発生しなかった。
【０１５９】
ワクチン接種群と対照群との臨床症状を１６週齢まで観察した。ワクチン接種群及び対照群いずれも、ほぼ正常所見を示したが、対照群では、一部個体が咳、軟便などの症状を示したが、抗生物質の治療後、まもなく回復した。表２４（ワクチン接種群の臨床症状）と表２５（対照群の臨床症状）は、ワクチン接種群と対照群との臨床症状観察の結果を示す。
【０１６０】
【表２４】
2011162534.tif 000028
【０１６１】
【表２５】
2011162534.tif 000029
【０１６２】
（５．３）結論
以上の試験を介して、本実施例の不活性化された豚サーコウイルスを含むワクチンに対する野外農場での安全性と免疫原性との立証を試みた。
【０１６３】
本試験は、野外農場３ヵ所で、子豚１３０頭を共試して実施され、適用方法は、子豚には３週齢一次、５週齢二次で１ｍｌずつ筋肉接種した。接種後の接種反応について述べれば、接種後１〜２時間後に現れる局所的、全身的反応は、全く観察されず、試験期間の間の臨床症状を観察した結果、呼吸困難、嘔吐、出血、高熱、全身衰弱などの特異な臨床症状は全く示されなかった。いくつかの個体で食欲低下現象が発生したが、数日内に再び食欲を回復する様相を示した。
【０１６４】
３ヵ所の野外農場の結果から、二次接種を実施した後、全体的な抗体価レベルについて述べれば、子豚における接種前の抗体価に比べ、二次接種後のサーコウイルスに対する抗体陽転率（sero-conversion）が９０％以上を示し、優秀な免疫原性を示した。
【０１６５】
そして、ワクチン接種後１６週齢まで、自然累積斃死率は、ワクチン群及び対照群いずれもほとんど見られなかったが、増体率は、ワクチン群が対照群に比べて高く、同じ日齢台の平均体重において、大差を示した。以上の結果から見るとき、前記ワクチンは、野外農場での安全性と防御効果とが十分にあることが立証された。
【０１６６】
６．比較実験
本発明の不活性化された豚サーコウイルスを含むワクチンと、既許可の他の類似製品との効能比較試験を実施し、本願発明のワクチンの有効性を評価した。比較対象製品は、サーコフレックス（Ingelvac CircoFlex（登録商標） ３０９−１２９、３０９９１−ｋｒ２）（ベーリンガーインゲルハイム動物薬品（株）、韓国）を使用した。Ingelvac CircoFlex（登録商標）は、精製されたサーコウイルス抗原（purified circovirus antigen：ＰＣＶ（登録商標））を抗原として含んでおり、賦形剤は、イムプラン・フレックス（Impran FLEX（登録商標））という水性ポリマー（aqueous polymer）を含む製品である。
【０１６７】
比較試験に使われた動物は、前記第１群農場の３週齢子豚であった。試験群Ａは、本発明のワクチンの接種群であり、３週齢と５週齢とに１ｍｌずつ耳根部に筋肉接種し、試験群Ｂは、サーコフレックス接種群であり、３週齢に１ｍｌずつ一回耳根部に筋肉接種した。そして、試験群Ｃは、非ワクチン対照群とした（表２６）。
【０１６８】
【表２６】
2011162534.tif 000030
【０１６９】
効能比較はサーコフレックスの製品特性上、血清学的変化がなく、ワクチン接種後の離乳匹数、７週齢体重、出荷匹数、斃死率を記録して効能を比較した。
【０１７０】
離乳率では、全ての試験群で大差は見られなかったが、出荷率では、対照群に比べて、ワクチン群がさらに高い率を示し、ワクチン群内でも、サーコフレックスワクチン群に比べて、本発明のワクチン接種群が高い率を示した（表２７）。そして、７週齢時の平均体重も、対照群に比べてワクチン群が、高いレベルに示され、ワクチン群間の平均体重は、類似したレベルであった（表２７）。表２７は、ワクチン接種後の離乳数（率）、７週齢平均体重（ｎ＝２０）及び出荷数（率）の比較結果を示す。
【０１７１】
【表２７】
2011162534.tif 000031
【０１７２】
以上のように、現在市販中の類似製品である「サーコフレックス」と本発明のワクチンとの効能を、養豚場で一定期間の間適用して試験した結果、７週齢時の平均体重と出荷率とにおいて、サーコフレックスよりも優秀な成績を示し、本発明のワクチンの効能が非常に優秀であるということを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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