(57)【要約】      （修正有）【課題】標的ＲＮＡ鎖の鎖切断に有用な、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドを含めたオリゴマー化合物の合成および使用方法の提供。【解決手段】ｄｓＲＮａｓｅを活性化する、２’−ペントリボフラノシルヌクレオシドのサブ配列を有するオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドを含むオリゴマー性化合物。さらに、哺乳動物リボヌクレアーゼ、すなわちＲＮＡを分解する酵素（ｄｓＲＮａｓｅ）、およびそのようなリボヌクレアーゼのための基質。上記化合物は、相補的核酸鎖に対する結合親和性、ならびにヌクレアーゼ耐性を増加させるための置換基を含むことができ、蛋白質の発現を調節するオリゴヌクレオチド療法や、その適合疾患の診断等のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズすることができる合成のオリゴマー性化合物であって、
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に対する前記化合物の結合親和性を、ＲＮＡ標的に対する修飾されていないオリゴリボヌクレオチドの結合親和性と比較して改良するよう修飾された少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第１のセグメント；および
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする、
合成のオリゴマー性化合物。
【請求項２】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に対する前記化合物の結合親和性を、ＲＮＡ標的に対する修飾されていないオリゴリボヌクレオチドの結合親和性と比較して改良するように修飾されている少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第３のセグメントをさらに含む、請求項１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３】
前記ＲＮＡ標的にハイブリダイズしたときに、二本鎖ＲＮＡｓｅ酵素を活性化して前記ＲＮＡ標的を切断することができる、請求項１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項４】
前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと前記第３のセグメントとの間に位置する、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５】
前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを含む、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項６】
前記第２のセグメントが４−１２個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項７】
前記第２のセグメントが５−９個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項６記載のオリゴマー性化合物。
【請求項８】
前記第２のセグメントが少なくとも５個のサブユニットを有し、前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを有する、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項９】
前記第２のセグメントが少なくとも７個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項８記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１０】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズすることができる合成のオリゴマー性化合物であって、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されている少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；および
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする、合成のオリゴマー性化合物。
【請求項１１】
修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されている少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第３のセグメントをさらに含む、請求項１０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ標的にハイブリダイズしたときに、二本鎖ＲＮＡｓｅ酵素を活性化して前記ＲＮＡ標的を切断しうる、請求項１０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１３】
前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと前記第３のセグメントとの間に位置する、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１４】
前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを含む、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１５】
前記第２のセグメントが４−１２個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１６】
前記第２のセグメントが５−９個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項１５記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１７】
前記第２のセグメントが少なくとも５個のサブユニットを有し、かつ前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを有する、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１８】
前記第２のセグメントが少なくとも７個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項１７記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１９】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｃ１−２０アルキル、２’−Ｏ−置換Ｃ１−２０アルキルまたは２’−フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有し、前記アルキル上の置換が、アミノ、ヒドロキシまたはＣ１−１０アルキルエーテル修飾である第１のセグメント；および
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定なヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とするオリゴマー性化合物。
【請求項２０】
少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｃ１−２０アルキル、２’−Ｏ−置換Ｃ１−２０アルキルまたは２’−フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第３のセグメントをさらに含み、ここで、前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはＣ１−１０アルキルエーテルである、請求項１９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２１】
前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと前記第３のセグメントとの間に位置する、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２２】
前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを含む、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２３】
前記第２のセグメントが４−１２個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２４】
前記第２のセグメントが５−９個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２５】
前記第２のセグメントが少なくとも５個のサブユニットを有し、および前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを有する、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２６】
前記第２のセグメントが少なくとも７個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２７】
前記ＲＮＡ標的とハイブリダイズしたときに、二本鎖ＲＮＡｓｅ酵素を活性化して前記ＲＮＡ標的を切断しうる、請求項１９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２８】
前記第１のセグメントおよび前記第３のセグメントの前記リボフラノシルヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、２’−Ｏ−Ｃ１−２０アルキル、２’−Ｏ−置換Ｃ１−２０アルキルまたは２’−フルオロを有するように修飾されており、かつ前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはＣ１−１０アルキルエーテルである、請求項２２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２９】
前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つが、ホスホロチオエート、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項１９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３０】
前記第１のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項１９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３１】
前記第１のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３２】
前記第２のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３３】
前記第３のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３４】
前記第３のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３５】
前記第１のサブユニット、前記第２のサブユニットおよび前記第３のサブユニットの前記ヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、ホスホロチオエート結合により連結されている、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３６】
前記第１のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノ結合により連結されている、請求項１９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３７】
前記第３のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノ結合により連結されている、請求項２０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３８】
配列中に少なくとも１２個のリボフラノシルヌクレオシドを含み、あらかじめ選択されたＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって；
前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されており；
前記化合物はギャップ部分が間に入った２つのウイング部分を有し；
ウイング部分はそれぞれ少なくとも１つの修飾ヌクレオシドサブユニットを含み、前記修飾ヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されており、
前記ギャップ部分は、少なくとも４個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、
ことを特徴とする化合物。
【請求項３９】
前記ギャップ部分が少なくとも５個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、請求項３８記載のオリゴマー性化合物。
【請求項４０】
複数の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；
少なくとも４個の連続する２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第２のセグメント；および
複数の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第３のセグメント；
を順に含み、オリゴマーのヌクレオシドサブユニットはホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、合成のオリゴマー性化合物。
【請求項４１】
前記第２のセグメントが少なくとも５個の連続する２’−ヒドロキシルリボヌクレオチドサブユニットを有する、請求項４０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項４２】
前記オリゴマーがあらかじめ選択されたＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる、請求項４０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項４３】
あらかじめ選択されたＲＮＡを特異的に切断する方法であって、
前記ＲＮＡを、少なくとも１２個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを前記あらかじめ選択されたＲＮＡと特異的にハイブリダイズしうる配列で含むオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されており；
前記化合物は、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドサブユニットを含む少なくとも１つのセグメントを有し、前記修飾ヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されており；
前記化合物は、少なくとも４個の連続する２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有するさらなるセグメントを有する、
ことを特徴とする方法。
【請求項４４】
前記さらなるセグメントが少なくとも５個の連続するリボヌクレオシドサブユニットを有する、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
蛋白質の望ましくない産生により特徴づけられる疾患を有する生物を治療する方法であって、
生物を、リボ核酸の相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有する本発明のオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
ヌクレオシドサブユニットの少なくとも１つは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記標的ＲＮＡに対する前記化合物の親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されており、
複数のヌクレオシドサブユニットは連続する配列中に位置しており、かつ２’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖成分を有する、
ことを特徴とする方法。
【請求項４６】
薬学的に有効な量のオリゴマー性化合物を薬学的に許容しうる希釈剤または担体中に含む組成物であって、前記オリゴマー性化合物は、ＲＮＡの相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を含み、オリゴマー性化合物の複数のヌクレオシドサブユニットは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記標的ＲＮＡに対する前記化合物の親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されており；
さらなる複数のヌクレオシドサブユニットが２’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖成分を有する、
ことを特徴とする組成物。
【請求項４７】
配列特異的標的ＲＮＡのインビトロ修飾の方法であって、ｄｓＲＮａｓｅ酵素および前記標的ＲＮＡを含む試験溶液を、前記標的ＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
ここでヌクレオシドサブユニットの少なくとも１つは、前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性を改良するように修飾されており；および
複数のヌクレオシドサブユニットは２’−ヒドロキシル−ペントフラノシル糖成分を有する、
ことを特徴とする方法。
【請求項４８】
生物においてハイブリダイゼーションおよびｄｓＲＮａｓｅ酵素活性化を同時に促進する方法であって、生物を、標的ＲＮＡの相補鎖と特異的にハイブリダイズしうるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー性化合物と接触させることを含み、
ここで、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも１つは、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変；の少なくとも１つを改良するように修飾されており、
複数のヌクレオシドサブユニットは２’−ヒドロキシ−ペントフラノシル糖成分を有することを特徴とする方法。
【請求項４９】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的と特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって；
少なくとも１つの代用物ヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；
連続する配列中に位置する少なくとも４個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含み、かつ２’−ヒドロキシル成分をそこに有する第２のセグメント；を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定なヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする化合物。
【請求項５０】
前記ヌクレオシドサブユニット代用物がペプチド核酸サブユニットである、請求項４９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５１】
前記ヌクレオシドサブユニット代用物がモルホリノヌクレオシドサブユニットである、請求項４９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５２】
前記ヌクレオシド代用物がシクロブチルヌクレオシドである、請求項４９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５３】
前記ヌクレオシド代用物がピロリジンヌクレオシドである、請求項４９記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５４】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的と特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
少なくとも２つのヌクレオシドサブユニットを含む第１のセグメント；前記第１のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、非リンヌクレオチド間結合により連結されており；および
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；前記第２のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定であるヌクレオチド間結合により連結されている、
を含む化合物。
【請求項５５】
前記非リン結合が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレン−ヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項５４記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５６】
前記非リンヌクレオチド間結合が、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、メチレンメチルイミノ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項５４記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５７】
前記第２のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットがホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項５４記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５８】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
少なくとも３個のヌクレオシドサブユニットを含む第１のセグメント；前記第１のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、交互のリンおよび非リンヌクレオチド間結合により連結されており；および
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；前記第２のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定なヌクレオチド間結合により連結されている、
を含む化合物。
【請求項５９】
前記非リン結合が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項５８記載のオリゴマー性化合物。
【請求項６０】
前記非リンヌクレオチド間結合が、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、メチレンメチルイミノ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノヌクレオチド間結合である、請求項５８記載のオリゴマー性化合物。
【請求項６１】
前記第２のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項５８記載のオリゴマー性化合物。
【請求項６２】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって；
少なくとも２つのヌクレオシドサブユニットを含む第１のセグメント；前記第１のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されており；および
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；前記第２のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対してより安定であるヌクレオチド間結合により連結されている、
を含む化合物。
【請求項６３】
少なくとも２つのヌクレオシドサブユニットの第３のセグメントを含み、前記第３のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されている、請求項６２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項６４】
前記第１のセグメントおよび第３のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットが、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステルホスフェート結合により連結されている、請求項６２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項６５】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズしうる合成のオリゴマー性化合物であって、
ＤＮＡまたはＲＮＡ主要構築ブロックヌクレオシドではない少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されたヌクレオチド間結合により連結されている、ことを特徴とする化合物。
【請求項６６】
前記第１のセグメントヌクレオシドサブユニットが、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−アルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの７−アルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、２−チオウラシルおよびシトシン、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルアデニンおよびグアニン、および５−トリフルオロメチルウラシルおよびシトシンをその複素環塩基として有するヌクレオシドから選択される、請求項６５記載の化合物。
【請求項６７】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的と特異的にハイブリダイズすることができ、
アデノシン、２’−デオキシアデノシン、グアノシン、２’−デオキシグアノシン、シチジン、２’−デオキシシチジン、ウリジンおよび２’−デオキシチミジンからなるヌクレオシド群を除く少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；
を含む合成のオリゴマー性化合物であって、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とするオリゴマー性化合物。
【請求項６８】
二本鎖基質の分解を触媒する活性を有する哺乳動物リボヌクレアーゼであって、前記基質の前記鎖の一方はｍＲＮＡであり、および前記基質の前記鎖の他方は、複数の２’修飾ヌクレオシドサブユニットを含む第１のセグメントおよび２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメントを順に有する化合物を含むことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
【請求項６９】
前記化合物の前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている、請求項６８記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７０】
前記化合物の前記第１のセグメントの前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項６８記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７１】
前記化合物の前記第２のセグメントの前記サブユニットが、ホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている、請求項７０記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７２】
前記化合物の前記第２のセグメントの前記サブユニットが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている、請求項７０記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７３】
前記化合物の前記第１のセグメントの前記サブユニットが、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドサブユニットである、請求項６８記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７４】
（Ａ）  前記活性はＮａＣｌにより阻害され；
（Ｂ）  前記活性はＭｇ＋＋を必要とし；および
（Ｄ）  前記哺乳動物リボヌクレアーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定して約５０から約８０キロダルトンの見かけの分子量を有する、
請求項６８記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７５】
前記リボヌクレアーゼが核から単離される、請求項６８記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７６】
前記リボヌクレアーゼが細胞質から単離される、請求項６８記載の哺乳動物リボヌクレアーゼ。
【請求項７７】
前記リボヌクレアーゼがヒト細胞または組織から単離しうる、請求項６８記載の哺乳動物蛋白質。
【請求項７８】
第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのデュープレックスを含む二本鎖ＲＮＡ基質であって、
（Ａ）  前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドはそれぞれホスホジエステル結合を有する少なくとも４個の連続するリボフラノシル残基を有する中心部分を有し、
ここで前記中心部分は、前記デュープレックス中で互いに塩基対を形成しており；
（Ｂ）  前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一本鎖ヌクレアーゼに対してそれらを耐性にする化学修飾を有する、前記中心部分に隣接する部分を有する
ことを特徴とする基質。
【請求項７９】
第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのデュープレックスを含む二本鎖ＲＮＡ基質であって、
（Ａ）  前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドはそれぞれホスホジエステル結合を有する少なくとも４個の連続するリボフラノシル残基を有する中心部分を有し、ここで前記中心部分は前記デュープレックス中において互いに塩基対を形成しており；
（Ｂ）  前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一本鎖ヌクレアーゼに対してそれらを耐性にし、かつデュープレックスの他方のオリゴヌクレオチドに対するそれらの親和性を増加させる化学修飾を有する、前記中心部分に隣接する部分を有する
ことを特徴とする基質。
【請求項８０】
前記化学修飾がホスホロチオエート結合または２’−メトキシ修飾である、請求項７８記載の二本鎖ＲＮＡ基質。
【請求項８１】
請求項７８記載のｄｓＲＮＡ基質を含む親和性マトリックス。
【請求項８２】
リボヌクレアーゼまたは非分解性ＲＮＡ結合蛋白質を精製する方法であって、前記リボヌクレアーゼまたは非分解性ＲＮＡ結合蛋白質を含む試料を請求項８１記載の親和性マトリックスと接触させることを含む方法。
【請求項８３】
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；および
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている少なくとも４個の連続する２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第２のセグメント
を順に含む、合成のオリゴマー性化合物。
【請求項８４】
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第３のセグメントをさらに含み、前記第２のセグメントは、前記オリゴマー性化合物中で前記第１のセグメントと前記第３のセグメントとの間に位置している、請求項８３記載の化合物。
【請求項８５】
前記第２のセグメントがホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する、請求項８３記載の化合物。
【請求項８６】
前記第２のセグメントがホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項８３記載の化合物。
【請求項８７】
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはホスホジエステルヌクレオチド間結合により連結されている少なくとも４個の連続する２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを有する第２のセグメント；および
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている複数の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドサブユニットを有する第３のセグメント
を順に含む、合成のオリゴマー性化合物。
【請求項８８】
前記第２のセグメントがホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項８７記載の化合物。
【請求項８９】
前記ｍＲＭＡによりコードされる蛋白質の望ましくない産生により特徴づけられる疾患を有する生物を治療するための、請求項６８記載の前記リボヌクレアーゼの使用。
【請求項９０】
前記ｍＲＮＡまたは前記ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の１つを同定するための、請求項６８記載の前記リボヌクレアーゼの使用。
【請求項９１】
生物において、前記ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質に関連する異常な状態を診断するための、請求項６８記載の前記リボヌクレアーゼの使用。
【請求項９２】
二本鎖基質の分解を触媒する活性を有する哺乳動物リボヌクレアーゼであって、前記基質の前記鎖の一方がｍＲＮＡであり、かつ前記鎖の他方が請求項１記載の化合物を含むことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
【請求項９３】
前記オリゴヌクレオチドの１つが配列番号８のヌクレオチド配列を有する、請求項７８記載の二本鎖ＲＮＡ基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、1996年６月６日出願の米国出願第08/659440号の一部継続である。
発明の分野
本発明は、標的ＲＮＡ鎖の鎖切断に有用な、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドを含めたオリゴマー化合物の合成および使用に関する。本発明に包含されるのは、修飾された糖、塩基またはリン酸基主鎖を有するオリゴリボヌクレオチド、並びに非リン酸基主鎖によって互いに結合した標準的な糖および塩基または修飾された糖および塩基を有するオリゴリボヌクレオシドである。本発明に更に包含されるのは、リン酸基かまたは非リン酸基の混合主鎖を有するキメラのオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドである。本発明に更に包含されるのは、哺乳動物リボヌクレアーゼ、すなわち、ＲＮＡを分解する酵素である。このようなリボヌクレアーゼは、本明細書中においてｄｓＲＮアーゼと称され、この「ｄｓ」は、若干の二本鎖ＲＮＡ基質に対するＲＮアーゼの特異性を示す。本発明のオリゴリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオシド、リボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼ基質は、治療薬、診断薬におよび研究用試薬として有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に対してハイブリッド形成することが知られている。ハイブリッド形成は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの核塩基（nucleobases）に対するオリゴヌクレオチドの核塩基の配列特異的塩基対水素結合である。このような核塩基対は、互いに相補的であるといわれている。  オリゴヌクレオチドの相補性は、多数の細胞性標的の阻害に用いられてきた。このような相補的オリゴヌクレオチドは、一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドであると記載されている。これらの研究の結果を記載している種々の論評が公表されており、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法の発達（Progress In Antisense Oligonucleotide Therapeutics），Crooke,S.T.および Bennett,C.F.，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,1996,36,107-129 が含まれる。これらオリゴヌクレオチドは、極めて強力な研修手段および診断薬であることが判明した。更に、有効であることが判った若干のオリゴヌクレオチドは、現在、ヒト臨床試験中である。
【０００３】
これまでに研究された大部分のオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチドであった。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、主として、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重らせんのＲＮＡ鎖を切断するエンドヌクレアーゼであるＲＮＡアーゼＨの作用によって、標的ＲＮＡレベルの減少を引き起こすと考えられる。ＤＮＡ複製においてある役割を果たしていると考えられるこの酵素は、細胞不含系においても、アフリカツメガエル卵母細胞においても、ＤＮＡ：ＲＮＡ二重らせんのＲＮＡ成分を切断できることが示された。ＲＮアーゼＨは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの構造変化に対して極めて感受性である。この感受性とは、オリゴヌクレオチドの化学修飾によって親和性、安定性、親油性および他の特性を増加させることによるオリゴヌクレオチドの効力を増加させる従来の試みが、もはやＲＮアーゼＨの基質ではないオリゴヌクレオチドをしばしば生じたというようなことである。更に、ＲＮアーゼＨ活性は極めて変化しやすい。したがって、ある与えられた疾患状態は、標的組織が不十分なＲＮアーゼＨ活性を有するという理由だけで、アンチセンス療法の候補ではないかもしれない。したがって、ＲＮアーゼＨに加えて、治療薬および他の薬剤の開発ための有効な終結機序が大いに価値があるということは明らかである。
【０００４】
いくつかの公報は、ＲＮアーゼＨおよびオリゴヌクレオチドの相互作用を記載している。最近の公報は、Crooke ら，Biochem. J., 1995, 312, 599-608 である。他の初期の論文は、（１）Dagle ら，Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751；（２）Dagle ら，Antisense Research And Development, 1991, 1, 11；（３）Eder ら，J.Biol.Chem.,1991,266,6472；および（４）Dagle ら，Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1805 である。これらの公報によれば、非修飾ホスホジエステルヌクレオシド間結合および修飾ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の両方を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、細胞ＲＮアーゼＨの基質である。それらは基質であるので、ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの切断を活性化する。しかしながら、これらの著者らは、アフリカツメガエル胚において、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合が両方とも、エキソヌクレアーゼ分解も受けるということに更に注目した。ヌクレアーゼ分解は、オリゴヌクレオチドを急速に減少させるので有害である。
【０００５】
参考文献（１）、（２）および（４）で記載されたように、ＲＮアーゼＨ活性化をなお与えながらヌクレアーゼ分解に対してオリゴヌクレオチドを安定化させるために、ホスホルアミデート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル結合の部分の間に位置するホスホジエステル結合ヌクレオシドの短部分を有する２’−デオキシオリゴヌクレオチドを構築した。ホスホルアミデート含有オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対して安定化されたが、参考文献（４）において、著者らは、それぞれのホスホルアミデート結合が、ホスホルアミデート含有オリゴヌクレオチドの測定されたＴｍ値を１．６℃減少させたことに注目した。このようなＴｍ値の減少は、オリゴヌクレオチドとその標的鎖との間のハイブリッド形成の減少を示すものである。
【０００６】
他の著者らは、その結果について、オリゴヌクレオチドとその標的鎖との間にこのようなハイブリッド形成の減少がありうると論評した。Saison-Behmoras ら（EMBO Journal, 1991, 10, 1111）は、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨの基質でありうるとしても、ＲＮアーゼＨによる切断効率は、ＭＲＮＡに対する弱いハイブリッド形成のために低かったことを認めた。その著者らはまた、オリゴヌクレオチドの３’末端でのアクリジン置換の包含が、オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼから保護したことに注目した。
【０００７】
1991年５月７日発行の米国特許第5,013,830号は、ホスホジエステル結合によってＤＮＡオリゴマーに対して結合したＲＮＡオリゴマーまたはその誘導体を含む混合オリゴマーを開示している。それらのＲＮＡオリゴマーは、２’−Ｏ−アルキル置換基も有する。しかしながら、ホスホジエステルであるので、それらオリゴマーはヌクレアーゼ切断に対して感受性である。
【０００８】
1989年11月２日公開の欧州特許出願第339,842号は、２’−Ｏ−メチルリボオリゴヌクレオチドホスホロチオエート誘導体を含めた２’−Ｏ−置換ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示している。上述の出願は、ヌクレアーゼ耐性を欠く２’−Ｏ−メチルホスホジエステルリボオリゴヌクレオチドも開示している。
【０００９】
1992年９月22日発行の米国特許第5,149,797号は、ホスホジエステル結合によって結合し且つ修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の一部分の両側に隣接したデオキシヌクレオチドの内部を含む混合リン酸基主鎖オリゴヌクレオチドを開示している。それら隣接した配列には、メチルホスホネート結合、ホスホロモルホリデート結合、ホスホロピペラジデート結合またはホスホルアミデート結合が含まれる。
【００１０】
1993年10月26日発行の米国特許第5,256,775号は、ホスホルアミアミデート結合およびホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合を包含する混合オリゴヌクレオチドを記載している。
【００１１】
1995年４月４日発行の米国特許第5,403,711号は、ＤＮＡを標的としたＲＮＡ：ＤＮＡプローブを記載している。それらプローブは標識され、そしてＲＮアーゼＨを含む系で用いられる。ＲＮアーゼＨ酵素は、ＤＮＡ標的に対して結合するそれらプローブを切断する。それらプローブは、修飾リン酸基を含むことができる。挙げられるのは、ホスホトリエステル、ヒドロゲンホスホネート、アルキル若しくはアリールホスホネート、アルキル若しくはアリールホスホルアミデート、ホスホロチオエートまたはホスホロセレネートである。
【００１２】
ＲＮアーゼＨ酵素による遺伝子発現の薬理学的阻害とは対照的に、細菌からヒトに至る生物は、内因性アンチセンスＲＮＡ転写物を用いて、若干の標的ｍＲＮＡの安定性を変化させ且つ遺伝子発現を調節するということが明らかになっている。Nellen, W.,および Lichtenstein, C.， Curr. Opin. Cell. Biol.,1993,18,419-424 および Nellen,W.,ら，Biochem. Soc. Trans. 1992, 20, 750-754 を参照されたい。おそらく、最もよい例の一つは、アンチセンスＲＮＡが、細胞障害性ｈｏｋタンパク質の翻訳に必要とされるｍｏｋＭＲＮＡの発現を調節しているある種の細菌による。例えば、アンチセンスレベルが降下するにつれて、ｍｏｋ  ｍＲＮＡレベルおよび結果としてｈｏｋタンパク質レベルは上昇し、そして細胞は死滅する。Gerdes,K.ら，J.Mol.Biol.,1992,226,637-649 を参照されたい。細菌のこのような機序によって調節される他の系には、ＣｏｌＥ１プラスミドのＲＮＡ  Ｉ−ＲＮＡ  IIハイブリッド（Haeuptle,M.T.，Frank,R.,および Dobberstein, B.，Nucleic Acids Res.1986,14,1427；Knecht,D.，Cell Motil. Cytoskel., 1989, 14, 92-102；および Maniak, M.,および Nellen, W.，Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5375-5380 を参照されたい）；バクテリオファージλのＯＯＰ−ｃII  ＲＮＡ調節（Krinke,L.,および Wulff,D.L.（1990）Genes Dev.,1990,4,2223-2233 を参照されたい）；および大腸菌（E.coli）中のｃｏｐＡ−ｃｏｐＴハイブリッドが含まれる。Blomberg,P.，Wanger,E.G.,および Nordstrom,K.，EMBO J.,1990,9,2331-2340 を参照されたい。大腸菌において、形成されたＲＮＡ：ＲＮＡ二重らせんは、エンドリボヌクレアーゼＲＮアーゼIIIによる調節された分解の基質であることが示されている。二重らせん依存性分解は、古細菌ハロバクテリウム・サリナリウム（Halobacterium salinarium）でも認められたが、ここでは、そのアンチセンス転写物がファージ遺伝子ｐｈｉＨの初期（Ｔ１）転写物の発現を減少させる。Stolt,P.,および Zillig,W.，Mol. Microbiol. ,1993, 7, 875-882 を参照されたい。いくつかの真核生物では、内因性アンチセンス転写物も認められている。これらには、ｐ５３（Khochbin および Lawrence，EMBO,1989,8,4107-4114 を参照されたい）；塩基性線維芽細胞成長因子（Volk ら，EMBO,1989,8,69,2983-2988 を参照されたい）；Ｎ−ｍｙｃ（Krystal,G.W.，Armstrong,B.C.,および Battey,J.F.，Mol. Cell. Biol., 1990, 10, 4180-4191 を参照されたい）；ｅＩＦ−２α（Noguchi ら，J. Biol. Chem., 1994,269,29161-29167 を参照されたい）が含まれる。内因的に発現されたアンチセンス転写物の進化の系統を越える保存は、それらの生物学的役割および分子作用機序が似ているらしいということを示唆する。
【００１３】
細菌において、ＲＮアーゼIIIは、若干のアンチセンス：センスＲＮＡ二重らせんの分解の原因となる二本鎖エンドリボヌクレアーゼ（ｄｓＲＮアーゼ）活性である。ＲＮアーゼIIIは、ｄｓＲＮＡ含有構造の部位特異的切断を行う。Saito,H.およびRichardson,C.C.，Cell,1981,27,533-541 を参照されたい。ＲＮアーゼIIIはまた、ｍＲＮＡプロセッシングにおいて、およびｒＲＮＡ前駆体の１６Ｓ、２３Ｓおよび５ＳリボソームＲＮＡ中へのプロセッシングにおいて重要な役割を果たしている。Dunn,J.J.および Studier,F.W.，J.Mol.Biol.,1975,99,487 を参照されたい。真核生物の場合、最近になって、大腸菌ＲＮアーゼIIIに対して相同性を有し且つリボソームＲＮＡプロセッシングにおいてｄｓＲＮアーゼ活性を示すタンパク質をコードする酵母遺伝子（ＲＮＴ１）がクローン化されている。Elela, S.A.，Igel, H.および Ares,M.，Cell,1996,85,115-124 を参照されたい。インターフェロンで処理されたトリ細胞は、ｄｓＲＮＡを分解できる可溶性ヌクレアーゼを生産し且つ分泌する。Meegan,J.および Marcus,P.I.，Science, 1989, 244, 1089-1091 を参照されたい。しかしながら、このような分泌ｄｓＲＮＡ活性は、アンチセンス：センスＲＮＡ二重らせんの細胞質分解に関与しそうな候補ではない。これらの知見にもかかわらず、ヒトまたは哺乳動物ｄｓＲＮアーゼ活性についてはほとんど何も知られていない。標的ＲＮＡ鎖の（何等かの機序による）調節は有用であると認識されてきたが、これまでのところ、このような作用を引き起こすための二つの機序しか知られていない。これらは、ハイブリッド形成阻止と、ＲＮＡ標的のＲＮアーゼＨ切断を行うためのオリゴデオキシヌクレオチドの使用である。したがって、標的ＲＮＡの調節のための方法および化合物はなお長く要求され続けている。標的ＲＮＡのこのような調節は、インビボおよびエクスビボ両方での治療目的に、更には、診断用試薬に、そして細胞の場合およびインビトロの場合両方の実験用の試薬を含めた研究用試薬として有用であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Crooke,S.T.および Bennett,C.F.，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,1996,36,107-129
【非特許文献２】Crooke ら，Biochem. J., 1995, 312, 599-608
【非特許文献３】Dagle ら，Nucleic Acids Research, 1990, 18, 4751
【非特許文献４】Dagle ら，Antisense Research And Development, 1991, 1, 11
【非特許文献５】Eder ら，J.Biol.Chem.,1991,266,6472
【非特許文献６】Dagle ら，Nucleic Acids Research, 1991, 19, 1805
【非特許文献７】Saison-Behmoras ら（EMBO Journal, 1991, 10, 1111）
【非特許文献８】Nellen, W.,および Lichtenstein, C.， Curr. Opin. Cell. Biol.,1993,18,419-424
【非特許文献９】Nellen,W.,ら，Biochem. Soc. Trans. 1992, 20, 750-754
【非特許文献１０】Gerdes,K.ら，J.Mol.Biol.,1992,226,637-649
【非特許文献１１】Haeuptle,M.T.，Frank,R.,および Dobberstein, B.，Nucleic Acids Res.1986,14,1427
【非特許文献１２】Knecht,D.，Cell Motil. Cytoskel., 1989, 14, 92-102
【非特許文献１３】Maniak, M.,および Nellen, W.，Nucleic Acids Res., 1990, 18, 5375-5380
【非特許文献１４】Krinke,L.,および Wulff,D.L.（1990）Genes Dev.,1990,4,2223-2233
【非特許文献１５】Blomberg,P.，Wanger,E.G.,および Nordstrom,K.，EMBO J.,1990,9,2331-2340
【非特許文献１６】Stolt,P.,および Zillig,W.，Mol. Microbiol. ,1993, 7, 875-88
【非特許文献１７】Khochbin および Lawrence，EMBO,1989,8,4107-4114
【非特許文献１８】Volk ら，EMBO,1989,8,69,2983-2988
【非特許文献１９】Krystal,G.W.，Armstrong,B.C.,および Battey,J.F.，Mol. Cell. Biol., 1990, 10, 4180-4191
【非特許文献２０】Noguchi ら，J. Biol. Chem., 1994,269,29161-29167
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第5,013,830号
【特許文献２】欧州特許出願第339,842号
【特許文献３】米国特許第5,149,797号
【特許文献４】米国特許第5,256,775号
【特許文献５】米国特許第5,403,711号
【発明の概要】
【００１６】
発明の概要
本発明により、予め選択されたＲＮＡ標的に対して特異的にハイブリッド形成しうる、結合したリボヌクレオシドサブユニットのリンカー配列から形成されるオリゴマー化合物を提供する。それらオリゴマー化合物は、少なくとも第一セグメントおよび第二セグメントを有する。第一セグメントは、少なくとも一つのリボヌクレオシドサブユニットを包含し、これは、その薬物動態学的性質、すなわち、標的ＲＮＡに対するその結合特性の少なくとも一つを向上させるようにまたはその電荷を変更するように修飾されている。第二セグメントは、少なくとも４個の連続的リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む。オリゴマー化合物のそれらサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に対して安定化されているヌクレオシド間結合によって、直鎖状配列で互いに連結している。
【００１７】
本発明の若干の好ましい実施態様において、化合物は、第一セグメントの性質に対応する性質を有する第三セグメントを含むであろう。第二セグメントを第一および第三セグメントの間に置き、結合したヌクレオシド単位の連続した直鎖状配列を形成するようにすることが好ましい。好ましい化合物において、このような結合したヌクレオシドサブユニットの数は、約８〜約５０個であり、更に好ましい範囲は、結合したヌクレオシドサブユニット約１２〜約３０個であろう。
【００１８】
薬物動態学的性質の変更には、化合物の結合性、吸収性、分布性またはクリアランス性の変更のいずれか一つまたはそれ以上が含まれる。結合特性の変更には、前記化合物のその標的ＲＮＡに対する親和性または特異性の変更が含まれる。前記化合物の電荷の変更には、非修飾化合物と比較される化合物の正味電荷の変更が含まれる。通常、電荷の変更は、リン結合オリゴマー化合物の全正味陰電荷を減少させて、陰電荷がより小さい、中性電荷を有するまたは正味陽電荷を有する化合物を与えるであろう。
【００１９】
更に、本発明により、予め選択されたＲＮＡ標的に対して特異的にハイブリッド形成しうる、結合したリボヌクレオシドサブユニットの直鎖状配列から形成されるオリゴマー化合物を提供する。それらオリゴマー化合物は、少なくとも第一セグメントおよび第二セグメントを有する。第一セグメントは、少なくとも一つのリボヌクレオシドサブユニットを包含し、これは、標的ＲＮＡに対するより大きい親和性を与えるように機能化されている。第二セグメントは、少なくとも４個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む。オリゴマー化合物のそれらサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して結合を分解に対して安定化するように修飾されているヌクレオシド間結合によって、直鎖状配列で互いに連結している。
【００２０】
本発明の若干の好ましいオリゴマー化合物において、オリゴマー化合物の第一または第一および第三セグメントは、そこに２’−置換基を含むヌクレオシドサブユニットから形成されている。好ましい実施態様において、その２’−置換基には、フルオロ、Ｃ１−Ｃ２０アルコキシ、Ｃ−Ｃ１アミノアルコキシ、アリルオキシ、イミダゾリルアルコキシおよびポリエチレングリコールが含まれる。好ましいアルコキシ置換基には、メトキシ、エトキシおよびプロポキシが含まれる。好ましいアミノアルコキシ置換基はアミノプロポキシである。好ましいイミダゾリルアルコキシ置換基はイミダゾリルプロポキシである。好ましいポリエチレングリコール置換基は、−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル、すなわち、メトキシエトキシまたは−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３である。
【００２１】
本発明の更に好ましいオリゴマー化合物において、オリゴマー化合物は、いくつか選択された核塩基をそこに含むことによって修飾されているヌクレオシドサブユニットから形成されている。好ましい実施態様において、それら選択された核塩基には、２，６−ジアミノプリン、Ｎ２−アルキルプリン、Ｎ２−アミノアルキルプリン、７−デアザ−７−置換プリン、５−置換ピリミジンおよび２−置換ピリミジンが含まれる。
【００２２】
本発明の他の好ましいオリゴマー化合物には、ホスホロチオエート結合、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレネート結合、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート結合、ボラノホスフェート結合、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）アミノホスホルアミデート結合、ヒドロゲンホスホネート結合、ボラノリン酸エステル結合、ホスホルアミデート結合、アルキルまたはアリールホスホネート結合およびホスホトリエステル結合を含めたリン結合によって連結したヌクレオシドサブユニットを有するオリゴリボヌクレオチドが含まれる。第二セグメントのヌクレオシドを結合する場合に用いるのに選択された群のオリゴリボヌクレオチド結合には、ホスホロチオエート、ホスフィネートおよびホスホルアミデートが含まれ、これらは全て荷電した種である。
【００２３】
本発明の更に好ましいオリゴマー化合物には、カーボネート結合、カルバメート結合、シリル結合、硫黄結合、スルホネート結合、スルホンアミド結合、ホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、オキシム結合、メチレンイミノ結合、メチレンメチルイミノ結合、メチレンヒドラゾ結合、メチレンジメチルヒドラゾ結合およびメチレンオキシメチルイミノ結合によって連結したヌクレオシドサブユニットを有するオリゴリボヌクレオシドも含まれうる。
【００２４】
本発明の更に好ましいオリゴマー化合物には、リンおよび非リン結合を変化させることによって連結したヌクレオシドサブユニットを有するものが含まれる。このような非リン結合には、カーボネート結合、カルバメート結合、シリル結合、硫黄結合、スルホネート結合、スルホンアミド結合、ホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、オキシム結合、メチレンイミノ結合、メチレンメチルイミノ結合、メチレンヒドラゾ結合、メチレンジメチルヒドラゾ結合およびメチレンオキシメチルイミノ結合が含まれるが、リン結合には、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレネート結合、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート結合、ボラノホスフェート結合、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）アミノホスホルアミデート結合、ヒドロゲンホスホネート結合、ボラノリン酸エステル結合、ホスホルアミデート結合、アルキルまたはアリールホスホネート結合およびホスホトリエステル結合が含まれる。
【００２５】
本発明の更に好ましいオリゴマー化合物には、標的ＲＮＡの相補鎖である配列中で結合している複数の結合したヌクレオシドサブユニットを有するオリゴリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオシドまたはオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドの混合物が含まれ、そしてここにおいて、その化合物の配列は、第一部分配列すなわちセグメントおよび第二部分配列すなわちセグメントに分けられる。第一部分配列は、２’−Ｏ−置換ペントフラノシル糖残基を有する結合したヌクレオシドサブユニットを含み、そして第二部分配列は、２’−ヒドロキシルペントフラノシル糖残基を有する結合したヌクレオシドサブユニットを含む。好ましくは、前記第二部分配列は、４〜１２個またはそれ以上のヌクレオシドサブユニット、そして更に好ましくは、５〜約９個のヌクレオシドサブユニットを有する。更に好ましい実施態様において、第三部分配列が存在し、そのヌクレオシドサブユニットは、第一部分配列について選択しうるものから選択される。第二部分配列は、第一部分配列と第三部分配列との間に位置していることが好ましい。本発明のこのようなオリゴマー化合物は、「キメラ」、「キメラの」または「ギャップ付き」オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドと称される。
【００２６】
本発明の更に好ましいオリゴマー化合物において、化合物の薬物動態学的結合性、吸収性、分布性またはクリアランス性：前記化合物のその標的ＲＮＡに対する親和性または特異性：または前記化合物の電荷の変更の内少なくとも一つを、非修飾化合物と比較して向上させるように修飾されている置換基を有するヌクレオシドサブユニットは、それらオリゴマー化合物の３’または５’末端の一方または両方に位置する。若干の好ましい化合物では、このような置換基で置換されている１〜約８個のヌクレオシドサブユニットが存在する。
【００２７】
それらヌクレオシドサブユニットは、直鎖状配列で互いに結合して、本発明のオリゴマー化合物を形成している。それぞれのヌクレオシドサブユニットには、塩基フラグメントおよび糖フラグメントが含まれる。その塩基フラグメントは、或いは以下に核塩基とも称される複素環式塩基を含む。塩基すなわち核塩基は、糖フラグメントに対して共有結合している。それら糖フラグメントには、２’−置換糖残基、２’−ヒドロキシル糖残基または糖代理物残基が含まれうる。
【００２８】
本発明の好ましい核塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよびチミンなどのプリンおよびピリミジン、更には、キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン；５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン；並びに７−メチルグアニンなどの他の合成および天然核塩基が含まれる。更に別のプリンおよびピリミジンには、米国特許第3,687,808号、同第5,484,908号、同第5,459,255号、同第5,457,191号および同第5,614,617号（米国特許出願第07/971,978号に該当する）で開示されたもの、並びに Concisse Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，858-859頁，Kroschwitz,J.I.,監修，John Wiley & Sons,1990 で開示されたものおよび Englisch ら，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613 で開示されたものが含まれる。
【００２９】
好ましい糖フラグメントは、ペントリボフラノシル糖残基、すなわち、メッセンジャーリボヌクレアーゼ核酸の「天然」糖残基である。本発明のオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドで用いるのに適当な他の糖様または糖代理化合物には、米国特許第5,359,044号で記載のシクロブチルヌクレオシド代理物、米国特許第5,519,134号で記載のピロリジンヌクレオシド代理物、米国特許第5,142,047号および同第5,235,033号、および関連特許開示で記載のモルホリノヌクレオシド代理物、およびＰＮＡ（ペプチド核酸）ヌクレオシド代理物が含まれる。
【００３０】
本発明の更に好ましい実施態様において、予め選択されたＲＮＡ標的と特異的にハイブリッド形成しうる合成オリゴマー化合物であって、少なくとも１個の代理ヌクレオシドサブユニットを含む第一セグメント、および連続的配列で位置した少なくとも４個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含み且つそこに２’−ヒドロキシル残基を有する第二セグメントを含む上記化合物を提供する。更に、オリゴマー化合物のヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に安定であるヌクレオシド間結合によって連結している。
【００３１】
本発明の他の好ましい実施態様において、予め選択されたＲＮＡ標的と特異的にハイブリッド形成しうる合成オリゴマー化合物であって、ＤＮＡまたはＲＮＡ「主要」ビルディングブロックヌクレオシドではない少なくとも一つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第一セグメント、およびそこに２’−ヒドロキシル残基を有する少なくとも４個の連続的リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第二セグメントを含む上記化合物を提供する。それら化合物のヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して結合が分解に対して安定化するように修飾されているヌクレオシド間結合によって連結している。本発明に関連してその用語が用いられているＤＮＡまたはＲＮＡ主要ビルディングブロックヌクレオシドではないヌクレオシドサブユニットは、アデノシン、２’−デオキシアデノシン、グアノシン、２’−デオキシグアノシン、シチジン、２’−デオキシシチジン、ウリジンおよび２’−デオキシチミジンから成る群のメンバーである。それとしてこの群は、ｔＲＮＡ中でまたは他の核酸中で見出されうる「少数の」ヌクレオシドを除外する。
【００３２】
本発明は、更に、予め選択されたＲＮＡを特異的に切断する方法を提供する。これらの方法は、予め選択されたＲＮＡと特異的にハイブリッド形成しうる配列で結合した少なくとも１２個のリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む化合物とＲＮＡとを接触させることを含む。それらヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して分解に安定であるヌクレオシド間結合によって結合されている。化合物は、少なくとも一つの修飾ヌクレオシドサブユニットを含む少なくとも一つのセグメントを有し、この修飾ヌクレオシドサブユニットは、化合物の薬物動態学的結合性、吸収性、分布性またはクリアランス性；化合物の標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または化合物の電荷の変更の内少なくとも一つを、非修飾化合物と比較して向上させるように修飾されている。その化合物は、更に、少なくとも４個のリボヌクレオシドサブユニットを有する追加のセグメントを含む。
【００３３】
本発明は、更に、望ましくないタンパク質生産を特徴とする疾患を有する生物を処置する方法を提供する。これら方法は、リボ核酸の相補鎖と特異的にハイブリッド形成できるヌクレオシドサブユニットの配列を有する本発明のオリゴマー化合物とその生物を接触させることを含み、それらヌクレオシドサブユニットの少なくとも一つは、天然ＲＮＡと比較して一つまたはそれ以上のオリゴマー化合物の性質の一つを変更するように機能化されている。その化合物は、更に、２’−ヒドロキシルペントフラノシル糖残基を有する複数のヌクレオシドサブユニットを含む。
【００３４】
更に、本発明により、ＲＮＡの相補鎖と特異的にハイブリッド形成できるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー化合物の薬学的有効量を含む組成物であって、ヌクレオシドサブユニットの少なくとも一つが、化合物の薬物動態学的結合性、吸収性、分布性またはクリアランス性；前記化合物のその標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の変更の内少なくとも一つを、非修飾化合物と比較して向上させるように修飾されている上記組成物を提供する。このような化合物において、複数のヌクレオシドサブユニットは、２’−ヒドロキシルペントフラノシル糖残基を有する。それら組成物は、更に、薬学的に許容しうる希釈剤または担体を含む。
【００３５】
本発明は、更に、ヒトＴ２４細胞、他の細胞系およびラット組織から単離しうる、オリゴリボヌクレオチド：ＲＮＡ二重らせん中のＲＮＡを分解する哺乳動物リボヌクレアーゼを提供する。このようなリボヌクレアーゼを、本明細書中においてｄｓＲＮアーゼと称するが、ここにおいて「ｄｓ」は、若干の二本鎖ＲＮＡ基質に対するＲＮアーゼの特異性を示す。このようなＲＮアーゼの有用な基質、更には、このような基質を含む親和性マトリクスも、本明細書中で提供する。
【００３６】
ｄｓＲＮアーゼ酵素、すなわち、二本鎖ＲＮアーゼ酵素および前記標的ＲＮＡを含有する試験溶液をオリゴマー化合物と接触させることを含む配列特異的標的ＲＮＡのインビトロ修飾の方法も提供する。そのオリゴマー化合物は、核酸の相補鎖に対して特異的にハイブリッド形成できるヌクレオシドサブユニットの配列を有し、この場合、それらヌクレオシドサブユニットの少なくとも一つは、核酸の相補鎖に対するオリゴリボヌクレオチドの結合親和性または結合特異性を増加させるように機能化されていて、そして複数のそれらヌクレオシドサブユニットは、２’−ヒドロキシルペントフラノシル糖残基を有する。
【００３７】
更に、生物中でのハイブリッド形成および／またはｄｓＲＮアーゼ酵素活性化を同時に促進する方法であって、標的ＲＮＡの相補鎖に対して特異的にハイブリッド形成できるヌクレオシドサブユニットの配列を有するオリゴマー化合物とその生物を接触させることを含む上記方法を提供する。それらヌクレオシドサブユニットの少なくとも一つは、化合物の薬物動態学的結合性、吸収性、分布性またはクリアランス性；前記化合物のその標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の変更の内少なくとも一つを、非修飾化合物と比較して向上させるように修飾されている。更に、複数のそれらヌクレオシドサブユニットは、２’−ヒドロキシペントフラノシル糖残基を有する。
【００３８】
本発明は、更に、生物または細胞中での異常ＲＮＡ分子または正常ＲＮＡ分子の異常な若しくは不適切な発現の存在または不存在を検出する診断方法を提供する。本発明は、更に、インビトロ溶液中でのｄｓＲＮアーゼ活性を含めた酵素活性を調節するための研究用試薬を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の若干の代表的なキメラのオリゴマー化合物を図示し、ここにおいて、白四角は２’−メトキシ修飾リボヌクレオチドを示し、黒丸は２’−ヒドロキシルリボヌクレオチドを示し、そしてホスホロチオエート結合は、図で示された化合物を通して用いられている。
【図２】図２は、完全な２’−メトキシまたはキメラＲＮＡギャップマー（gapmer）オリゴヌクレオチドで処理された細胞中のＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡレベルを示す。完全な２’−メトキシオリゴヌクレオチド（パネル２Ａ）または３ギャップオリゴリボヌクレオチド（パネル２Ｃ）の指定された用量で２４時間処理されたＴ２４細胞中のＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析を示す。上方のバンドはＨａ−ｒａｓのシグナルであり、このシグナルはＧ３ＰＤＨについて得られたシグナル（下方バンド）に対して標準化され、相対Ｈａ−ｒａｓレベルが決定されて、そしてグラフで示される（パネル２Ｃ〜２Ｄ）。どちらのオリゴヌクレオチド処理も、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡレベルを減少させなかった。
【図３−１】図３は、５、７若しくは９リボヌクレオチドギャップかまたは完全なリボヌクレオチド分子（それぞれ、左側パネル３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）を含有するキメラＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを用いることを除いて図２の場合のように処理されたＴ２４細胞のノーザンブロット分析を示し；細胞は、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列に対する４個の誤対合塩基対を含有する対照オリゴリボヌクレオチドでも処理された（左側パネル３Ｅ）。Ｈａ−ｒａｓシグナルをＧ３ＰＤＨのシグナルに対して標準化し、そして相対Ｈａ−ｒａｓレベルをグラフで示す（右側パネル）。
【図３−２】図３は、５、７若しくは９リボヌクレオチドギャップかまたは完全なリボヌクレオチド分子（それぞれ、左側パネル３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）を含有するキメラＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを用いることを除いて図２の場合のように処理されたＴ２４細胞のノーザンブロット分析を示し；細胞は、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列に対する４個の誤対合塩基対を含有する対照オリゴリボヌクレオチドでも処理された（左側パネル３Ｅ）。Ｈａ−ｒａｓシグナルをＧ３ＰＤＨのシグナルに対して標準化し、そして相対Ｈａ−ｒａｓレベルをグラフで示す（右側パネル）。
【図３−３】図３は、５、７若しくは９リボヌクレオチドギャップかまたは完全なリボヌクレオチド分子（それぞれ、左側パネル３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）を含有するキメラＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを用いることを除いて図２の場合のように処理されたＴ２４細胞のノーザンブロット分析を示し；細胞は、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡ配列に対する４個の誤対合塩基対を含有する対照オリゴリボヌクレオチドでも処理された（左側パネル３Ｅ）。Ｈａ−ｒａｓシグナルをＧ３ＰＤＨのシグナルに対して標準化し、そして相対Ｈａ−ｒａｓレベルをグラフで示す（右側パネル）。
【図４】図４において、インビトロでの二重らせんに対するＴ２４細胞質ゾル抽出物およびＲＮアーゼの作用を示す。３２Ｐ標識ＲＮＡ補体に対してアニーリングされたＨａ−ｒａｓを標的とした９ＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドから成る１７塩基対二重らせんを、３ｕｇのＴ２４細胞質ゾルタンパク質画分と一緒に３７℃で指定された時間インキュベートし、その反応を停止させ、そして生成物を変性ポリアクリルアミドゲル上で分割した。消化産物（矢印）は、二重らせんの切断がＲＮＡ：ＲＮＡ部分（二重らせんの図の右端を参照されたい）に制限されていることを示す。
【図５】図５は、大腸菌ＲＮアーゼＨと一緒にまたはそれを用いることなく（それぞれ、−および＋）インキュベートされた図４の場合と同様の９ＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重らせんを示す。消化産物の欠如は、この二重らせんがＲＮアーゼＨの基質ではないことを示す。完全なオリゴデオキシヌクレオチド（中央パネル）かまたは９ＤＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド（左側パネル）に対してアニーリングされた３２Ｐ標識ＲＮＡから成る二重らせんは、ＲＮアーゼＨによる切断の基質であるので、予想通りの消化産物を生じる（矢印）。
【図６】図６は、サイズ排除クロマトグラフィー後の濃縮ラット肝活性画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。分子量マーカーＭＷはキロダルトン（ｋＤ）で示されている。大部分の材料が５０〜約８０ｋＤの範囲の見掛けの分子量を有する約３５〜約１００ｋＤの範囲の見掛の分子量を有する画分３（列４）は、ｄｓＲＮアーゼ活性の最大量を有した。
【図７】図７は、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるｄｓＲＮアーゼ基質の消化産物の分析を示す。アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドを予めアニーリングし且つ細胞抽出物と一緒にインキュベートし、そして本明細書中で記載のようにｄｓＲＮアーゼを精製した。列１，未処理「センス」鎖ＲＮＡ；列２，０．０２単位のＲＮアーゼＶ１で処理された「センス」鎖ＲＮＡ；残りの列：０．０２単位（列３）および０．００２単位（列４）のＲＮアーゼＶ１で、未精製核抽出物で０分間（列５）または２４０分間（列６）、Ｍｇ＋＋不含の未精製核抽出物で２４０分間（列７）、未精製細胞質ゾル抽出物で２４０分間（列８）、イオン交換精製された細胞質ゾル抽出物でＭｇ＋＋の存在下（列９）または不存在下（列１０）において２４０分間、およびイオン交換／ゲル濾過精製された細胞質ゾル抽出物でＭｇ＋＋の存在下（列９）または不存在下（列１０）において２４０分間処理されたｄｓＲＮアーゼ基質。
【図８】図８は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるｄｓＲＮアーゼ基質の消化産物の分析を示す。列１，５×１０−３単位のＲＮアーゼＡで処理された「センス」鎖ＲＮＡ；列２，０．０２単位のＲＮアーゼＶ１で処理された「センス」鎖ＲＮＡ；列３〜９：０．０２単位（列３）および０．００２単位（列４）のＲＮアーゼＶ１で、未精製核抽出物で０分間（列５）または２４０分間（列６）、未精製細胞質ゾル抽出物で２４０分間（列７）、イオン交換精製された細胞質ゾル抽出物で２４０分間（列８）、およびイオン交換／ゲル濾過精製された細胞質ゾル抽出物で２４０分間（列９）処理されたｄｓＲＮアーゼ産物。列１０，塩基加水分解ラダー。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
好ましい実施態様の詳細な説明
理論に拘束されたくはないが、ここで、若干の化学修飾されたオリゴマー化合物の使用により、ヒト細胞を含めた真核生物細胞において、これら化合物と標的ＲＮＡ鎖との予想外の相互作用に起因する若干の酵素活性を利用して、若干の酵素によって切断される二本鎖ＲＮＡ様構造を形成することができると考えられる。従来、このような活性は、真核生物系において認識されても利用されてもいなかった。ここで、本発明のオリゴマー化合物は、それらが、標的とされたＲＮＡ部分を含む二本鎖構造を形成できる若干のＲＮＡのような特徴を有し、そして引続き、この二本鎖構造は、細胞または試験溶液中において真核性ｄｓＲＮアーゼ、すなわち、二本鎖ＲＮアーゼ酵素によって分解されるということが見出された。Ｔ２４ヒト膀胱癌細胞を代表的な真核生物細胞系として用いると、この活性は、核および細胞質両方の部分に同様のレベルで存在することが示された。
【００４１】
本発明を詳しく説明するために本明細書中で与えられた若干の代表的な手順において、若干の他の既知のヌクレアーゼ活性と共通して、この活性は、ＲＮＡ基質の切断後に５’リン酸基および３’ヒドロキシル基を脱離することが見出された。この５’リン酸基、３’ヒドロキシル末端の生成は、大腸菌のＤＮＡ：ＲＮＡ二重らせんのＲＮＡ成分を切断するＲＮアーゼＨＩおよびII、高分子量二本鎖ＲＮＡの加水分解を触媒し且つセンス−アンチセンス二重らせんの分解を媒介するＲＮアーゼIII、およびＲＮアーゼIVを含めた、二本鎖核酸分子を認識するいくつかの他のヌクレアーゼと共通の特徴である。
【００４２】
ｍＲＮＡ分解系の多数の成分は、原核生物と真核生物との間に保存されてきた。ここで、ＲＮアーゼIIIがセンス−アンチセンスハイブリッドの分解を行って何等かの遺伝子の発現を調節している原核生物のように、ヒト細胞は、同様の役割を果たしうる活性を保存してきたことが見出された。治療上および診断上の使用を含めた他の使用に加えて、この活性によって、本発明の化合物は、どのようにヒト細胞が内因的に発現されたアンチセンス転写物を用いて遺伝子発現を調節するのか理解する場合に役立つ研究用試薬として用いることができる。
【００４３】
診療室においてヒトに実験的に用いられまたは現在試験されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの大部分は、修飾オリゴデオキシヌクレオチドである。このようなオリゴデオキシヌクレオチドアンチセンス化合物とそれらの標的ＲＮＡとの間に形成されるヘテロ二本鎖は、この二重らせんのＲＮＡ鎖だけを切断する細胞内ヌクレアーゼＲＮアーゼＨによって認識されることが示された。標的ＲＮＡのＲＮアーゼＨに媒介される分解は有用な機序であることが判明したが、それには若干の制限がある。ＲＮアーゼＨは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して行われる構造的修飾に対して極めて感受性であるので、増加した親和性、増加したヌクレアーゼ耐性およびより大きい細胞透過性などの、治療的性質を向上させるように設計された修飾の大部分は、ＲＮアーゼＨによる切断を支持しないオリゴヌクレオチドをもたらした。アンチセンス作用の終結機序としてのＲＮアーゼＨに対するもう一つの制限は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ「様」であるにちがいないということであり、そしてＤＮＡ「様」である場合、このようなオリゴヌクレオチドは、それらの標的ＲＮＡに対して本質的に低い親和性を有する。この低い親和性を免れるように設計された計画は、中心にある非修飾デオキシオリゴヌクレオチドの伸長部分（ギャップ）と一緒に、５’および３’末端の高親和性化学修飾オリゴヌクレオチドの伸長部分（ウィング）から成る「ギャップマー」オリゴヌクレオチドの設計を含む。ＤＮＡギャップマー、すなわち、オリゴデオキシヌクレオチドギャップマーは、それらの標的に対してオリゴデオキシヌクレオチドより有意に高い親和性を有するが、しかしながら、ＤＮＡギャップの寸法に依存して、ＲＮアーゼＨは影響されることが示された。
【００４４】
ＲＮアーゼＨをＲＮＡ分解の終結機序として用いる場合、ＲＮアーゼＨの細胞内局在化および組織分布も考えるべきである。ＲＮアーゼＨ活性は、主として、核に局在しているが、更に低いレベルで細胞質中において検出された。ある与えられたｍＲＮＡの大部分は細胞の細胞質中で見出されるので、終結機序として利用するのに理想的な活性は、核および細胞質両方において高レベルのものであると考えられる。ＲＮアーゼＨ活性はまた、細胞系ごとにまたは組織間で極めて変化しやすいので、ある与えられた疾患状態は、標的組織が不十分なＲＮアーゼＨ活性を有するという理由だけで、ＲＮＡ分解の充分な候補であるとはいえない。標的ＲＮＡを分解するための代わりの終結機序が大いに望まれていることは明らかである。
【００４５】
他の使用の中で、現在認められている活性は、ここで、アンチセンス療法のためのＲＮアーゼＨに対する代わりの終結機序として利用することができる。標的に対して高い親和性を有し、それによってＤＮＡ様オリゴヌクレオチドより高い力価を有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドを用いる場合、活性はヒト細胞中で発現されうることが見出された。細胞質および核両方での活性の存在は、本発明の化合物を用いて、核の前ｍＲＮＡスプライシングから多数のＲＮＡプロセッシング現象を阻害し且つ細胞質中の成熟転写物の分解へ輸送することを可能にする。
【００４６】
本発明を詳しく説明し且つそれを他の既知のアンチセンス機序、例えば、ＲＮアーゼＨと比較するために、本発明の化合物によって引き起こされたｄｓＲＮアーゼ活性を、Ｈａ−ｒａｓのコドン１２に対して集中させることによって調べた。本明細書中にそのまま援用される、両方とも本出願と同一譲渡人の、出願第08/297,248号に該当する米国特許第5,297,248号およびその関連出願である1992年12月23日公開の国際公開第ＷＯ92/22651号で記載のように、ｒａｓ癌遺伝子は、原形質膜の内面に局在していて、しかもアミノ酸レベルで高度に保存され、高親和性および特異性でＧＴＰを結合し、そしてＧＴＰアーゼ活性を有することが示されている関連タンパク質をコードする遺伝子系列のメンバーである。ｒａｓ遺伝子産物の細胞内機能はまだ知られていないが、それらの生化学的性質は、ＧＴＰ結合性タンパク質すなわちＧタンパク質として知られるシグナル伝達タンパク質のクラスとのそれらの有意の配列相同性と共に、ｒａｓ遺伝子産物が、原形質膜を越える細胞外シグナル伝達に関連した基本的細胞調節機能において根本的な役割を果たしていることを示唆する。
【００４７】
Ｈ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓと称される３種類のｒａｓ遺伝子は、哺乳動物ゲノム中で識別された。哺乳動物ｒａｓ遺伝子は、それらのコーディング配列内の単一点突然変異似よって形質転換誘導性を獲得する。天然に存在するｒａｓ癌遺伝子の突然変異は、コドン１２，１３および６１に局在していた。ヒト腫瘍において見出される最も一般的に検出される活性化ｒａｓ突然変異は、Ｈ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２においてあり、ここにおいて、ＧＧＣからＧＴＣへの塩基変化は、ｒａｓタンパク質産物のＧＴＰアーゼ調節ドメインにおいてグリシン−バリン置換を引き起こす。この単一アミノ酸変化は、ｒａｓタンパク質機能の正常な制御を無効にして、それによって普通に調節される細胞タンパク質を継続して活性であるものに変換すると考えられる。このような正常ｒａｓタンパク質機能の脱調節は、正常から悪性の成長への形質転換の原因であると考えられる。
【００４８】
例証する目的で、本発明の化合物をｒａｓＲＮＡに対して集中させるが、当然ながら、他のＲＮＡの宿主も標的ＲＮＡとして適していることは理解される。したがって、本発明の化合物を用いて、細胞中に天然に存在する何等かの適当な標的ＲＮＡまたはインビトロの何等かの標的ＲＮＡの発現を調節することができる。  例証する目的で用いられたｒａｓ標的部位は、参考文献において確認された最もＲＮアーゼＨ感受性のオリゴヌクレオチド部位の一つである。ｒａｓ癌遺伝子などの突然変異した遺伝子の選択的阻害は、ｍＲＮＡのコード領域における調節化合物のハイブリッド形成を必要とする。これは、ポリソームによる化合物の置換を妨げるためのこのような化合物とｒａｓ  ｍＲＮＡとの高親和性相互作用かまたは、ある与えられた終結機序による標的ｍＲＮＡの急速分解を必要とする。再度、理論に拘束されたくはないが、本発明のＲＮＡ様化合物は、本質的に高い親和性も有するし、細胞ｄｓＲＮアーゼ活性も利用できる。
【００４９】
本発明の目的により、標的ＲＮＡ鎖に対して結合するおよびｄｓＲＮアーゼ酵素の基質である新規オリゴマー化合物を提供する。本発明のオリゴマー化合物には、オリゴリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオシドおよびそこに包含される結合したリボヌクレオチドサブユニットの直鎖状配列を有する他のオリゴマー化合物が含まれる。このような他のオリゴマー化合物は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）セグメントおよび結合したリボヌクレオチドの間に形成されたキメラ構造を含むであろう。したがって、本明細書の目的のために、「オリゴマー化合物」という用語は、単独でかまたは組合わせで用いられるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドという用語、更には、ＰＮＡセグメント（および他の代理ヌクレオシド成分）および結合したリボヌクレオシドセグメントの間に形成されたキメラ化合物を含めた他のオリゴマー化合物を含めることを意味する。本明細書および請求の範囲において用いられる通り、一つの意味において、オリゴマー化合物という用語は、オリゴリボヌクレオチドを示すのに用いられ、もう一つの意味においてオリゴリボヌクレオシドを示すのに、なおもう一つの意味においてオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドの混合物、そして他の場合において、上で識別されたＰＮＡキメラ化合物などの指定された更に別のキメラ化合物を示すのに用いられる。
【００５０】
本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、複数のヌクレオシドサブユニットから組立てられる。本発明の若干の好ましいオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドにおいて、それらヌクレオシドサブユニットの少なくとも一つは、核酸の相補鎖に対するオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドの結合親和性を増加させる置換基を有する。更に、それらヌクレオシドサブユニットの少なくともいくつかは、２’−ヒドロキシルペントフラノシル糖残基を含む。
【００５１】
オリゴヌクレオチドが特に有用である細胞性使用では、そのオリゴヌクレオチドは、細胞の標的核酸とそれが相互作用するのに充分な期間細胞中に生存するために、ヌクレアーゼに対して適度に安定であるべきである。したがって、本発明の若干の実施態様において、特定のヌクレオシドサブユニットまたはヌクレオシド間結合を機能化するかまたは選択して、そのオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。しかしながら、研究用試薬としておよび診断薬としての本発明のオリゴマー化合物の使用のような非細胞性用途では、このようなヌクレアーゼ活性は必要ないかもしれない。
【００５２】
相補的核酸に対する第一核酸の結合親和性の程度を測定する場合、その相補的核酸に対して結合する第一核酸の相対的能力は、特定のハイブリッド形成複合体の融解温度を決定することによって比較することができる。二本鎖ヌクレオチドの特徴的な物理的性質である融解温度（Ｔｍ）は、５０％のらせん（ハイブリッド形成した）対コイル（ハイブリッド形成していない）状態が存在する温度を示す。Ｔｍは、ＵＶスペクトルを用いてハイブリッド形成複合体の形成および破壊（融解）を確認することによって測定される。ハイブリッド形成中に起こる塩基スタッキングは、ＵＶ吸収の減少（淡色性）を伴う。結果として、ＵＶ吸収の減少は、より高いＴｍを示す。Ｔｍが高いほど、鎖間結合の強度は大きい。
【００５３】
本発明において、本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドの結合親和性は、これら化合物のヌクレオシドサブユニット中に置換基を包含することによって増加させうるということが判った。好ましい置換基は、２’置換基、すなわち、本発明の化合物のヌクレオシドサブユニットのペントフラノシル糖残基の２’位に位置する置換基である。現在好ましい置換基には、フルオロ、アルコキシ、アミノアルコキシ、アリルオキシ、イミダゾリルアルコキシおよびポリエチレングリコールが含まれる。アルコキシ基およびアミノアルコキシ基は、概して、低級アルキル基、特に、Ｃ１−Ｃ９アルキルを含む。ポリエチレングリコールは、構造（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−アルキルを有する。特に好ましい置換基は、式（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−アルキル（式中、ｎ＝１およびアルキル＝ＣＨ３）を有するポリエチレングリコール置換基である。この修飾は、オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の両方を増加させることが示された。
【００５４】
結合親和性を増加させる更に別の特に有用な２’−置換基は、２’−フルオロ基である。公表された研究（Synthesis and Biophysical Studies of 2'-dRIBO-F Modified Oligonucleotides，Conference On Nucleic Acid Therapeutics，クリアウォーター，ＦＬ，1991年１月13日）において、置換されたヌクレオシドサブユニットにつき１．６℃の結合親和性の増加が、オリゴヌクレオチドのヌクレオシドサブユニット５個に２’−フルオロ置換基を有する１５マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドについて報告された。オリゴヌクレオチドのヌクレオシドサブユニット１１個が２’−フルオロ置換基を有した場合、結合親和性は、置換されたヌクレオシドサブユニットにつき１．８℃まで増加した。この研究において、１５マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドは、対応するホスホロチオエート類似体に誘導体化された。その１５マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体と比較した場合、そのホスホロチオエート類似体は、１５マーホスホジエステルオリゴヌクレオチドの結合親和性の約６６％だけの結合親和性を有した。言い換えると、結合親和性は、オリゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体に誘導体化した場合に失われた。しかしながら、２’−フルオロ置換基が１５マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオシドサブユニット１１個に位置した場合、それら２’−置換基の結合親和性は、１５マーオリゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体に誘導体化することによって示される減少を十二分に克服した。この化合物、すなわち、２’−フルオロ置換基で置換された１１個のヌクレオシドサブユニットを有する１５マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおいて、その結合親和性は、置換基につき２．５℃まで増加した。
【００５５】
本発明の化合物のヌクレオシド構造サブユニットを製造する場合に用いるのに、これらヌクレオシドサブユニット中への包含に適した核塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジンおよびチミンなどのプリンおよびピリミジン、更には、キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン；５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンなどの他の合成および天然核塩基が含まれる。更に別のプリンおよびピリミジンには、米国特許第3,687,808号で開示されたもの、Concisse Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，858-859頁，Kroschwitz,J.I.,監修，John Wiley & Sons,1990 で開示されたものおよび Englisch ら，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613 で開示されたものが含まれる。これら核塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよび、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めたＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。他の修飾ピリミジンおよびプリン塩基もまた、核酸の相補鎖に対するオリゴマー化合物の結合親和性を増加させると予想される。
【００５６】
本発明による好ましいオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、好ましくは、約５〜約５０個のヌクレオシドサブユニットを含む。本発明の文脈中、これが、５〜５０個のヌクレオシドサブユニットを有する本明細書中前記の天然に存在しないオリゴマーを包含することは理解される。本発明のオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドが、約１５〜約２５個のヌクレオシドサブユニットを含むことは更に好ましい。理解されるように、「ヌクレオシドサブユニット」は、オリゴリボヌクレオチド中のリン結合によっておよびオリゴリボヌクレオシド中の非リン結合によって隣接するサブユニットに対して適当に結合した核塩基および糖または糖代理物組合わせである。この文脈中において、「ヌクレオシドサブユニット」という用語は、「ヌクレオシド単位」または「ヌクレオシド」という用語と同じ意味に用いられる。
【００５７】
本発明のオリゴリボヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）チオホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−（または−５’）デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−（または−５’）デオキシ−３’−（または−５’）アミノホスホルアミデート、ヒドロゲンホスホネート、ボラノリン酸エステル、ホスホルアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルのリン結合を含めたリン結合によって連結されたヌクレオシドサブユニットを有する。他方、本発明のオリゴリボヌクレオシドは、カーボネート結合、カルバメート結合、シリル結合、硫黄結合、スルホネート結合、スルホンアミド結合、ホルムアセタール結合、チオホルムアセチル結合、オキシム結合、メチレンイミノ結合、メチレンメチルイミノ結合、メチレンヒドラゾ結合、メチレンジメチルヒドラゾ結合およびメチレンオキシメチルイミノ結合によって連結したヌクレオシドサブユニットを有する。
【００５８】
本発明のオリゴマー化合物の全部の配列長さ全体の範囲内でｄｓＲＮＡアーゼ応答を引き出すためには、３個を越えるが、好ましくは、４個、５個またはそれ以上の連続的に結合した２’−ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシドサブユニットのセグメントすなわち部分配列が存在するであろう。オリゴマー化合物の追加の部分配列すなわちセグメントが、２’−ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列の両側に位置するように、オリゴマー化合物中に２’−ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列を包含することは、現在のところ好ましい。このような構成において、２’−ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド配列は、「中心」または「ギャップ」領域またはセグメントとも称され、そして他のヌクレオシド部分配列すなわちセグメントは、「フラキング」または「ウィング」領域またセグメントとも称される。例えば、「ギャップ」部分の両側に「ウィング」が隣接している。他の構成も可能であり、本発明のオリゴマー化合物の３’末端かまたは５’末端に２’−ヒドロキシルペントフラノシル含有ヌクレオシド部分配列が存在することが含まれる。これら他の構成は、「オープン」ギャップ付き構造と考えることができる、すなわち、そのギャップ部分はオリゴマー化合物の末端（３’末端かまたは５’末端）でオープンである。
【００５９】
本発明によって用いられるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、好都合に且つ常套で、周知の固相合成技術によって製造することができ、例えば、“Oligonucleotide sythesis,a practical approach”，M.J.Gait 監修，IRL Press,1984；“Oligonucleotide and Analogues, A Practical Approach”，F. Eckstein 監修，IRL Press,1991（特に、第１章、オリゴデオキシリボヌクレオチド合成の最新機械促進法、第２章、オリゴリボヌクレオチド合成、第３章、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド：合成および応用、第４章、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、第５章、オリゴヌクレオチドホスホロジチオエートの合成、第６章、オリゴ−２’−Ｏ−デオキシリボヌクレオシドメチルホスホネートの合成および第７章、修飾塩基を含有するオリゴデオキシヌクレオチド）を参照されたい。他の特に有用な合成法、試薬、保護基および反応条件は、Martin,P.，Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504；Beaucage, S.L.および Iyer, R. P.，Tetrahedron, 1992, 48,2223-2311、および Beaucage,S.L.および Iyer,R.P.，Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194、またはそれらで論及された参考文献で記載されている。
【００６０】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドの合成用装置は、Applied Biosystems を含めたいくつかの販売業者によって販売されている。２’−Ｏ−メチルアミダイトおよび２’−Ｏ−ヒドロキシルアミダイトを含めた種々のアミダイト試薬も、商業的に入手可能である。このような合成のための他の手段はいずれも用いることができる。オリゴヌクレオチドの実際の合成は、充分に当業者の技能の範囲内である。同様の技術を用いて、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを製造することも周知である。同様の技術並びに商業的に入手可能な修飾アミダイトおよび一定細孔ガラス（ＣＰＧ）製品、例えば、ビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはプソラレンで修飾されたアミダイトおよび／またはＣＰＧ（Glen Research，スターリング  ＶＡから入手可能）を用いて、蛍光標識された、ビオチニル化されたまたは他の複合したオリゴヌクレオチドを合成することも周知である。
【００６１】
もう一つの実施態様において、本発明は、ヒトＴ２４細胞および他の細胞系から単離可能な、アンチセンスオリゴリボヌクレオチド：ＲＮＡ二重らせん中のＲＮＡを分解する哺乳動物リボヌクレアーゼに関する。そのリボヌクレアーゼは、本明細書中においてｄｓＲＮアーゼと称され、この「ｄｓ」は、二本鎖ＲＮＡ基質に対するＲＮアーゼの特異性を示す。２’−メトキシ修飾糖残基を含有するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、それらの細胞ｍＲＮＡ標的に対して高親和性で結合するが、得られた［「ＤＮＡ様」］：［ＲＮＡ］二重らせんは、Ｔ２４細胞内の核溶解分解の基質ではない。実施例２で詳述されるように、Ｈａ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡのコドン１２を標的とする２’−メトキシホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−メトキシヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの中心のリボヌクレオチドの伸長部分で置換することによって修飾されて、２’−メトキシ／リボ／２’−メトキシキメラすなわち［ギャップマー」オリゴヌクレオチドを形成し、ホスホロチオエート結合は分子全体で維持された。これら「ＲＮＡ様」ギャップマーオリゴヌクレオチドは、それらの細胞ｍＲＮＡ標的に対して、完全な２’−メトキシオリゴデオキシヌクレオチドの親和性に匹敵する親和性で結合するが、［「ＤＮＡ様」］：［ＲＮＡ］二重らせんとは異なり、得られた［「ＲＮＡ様」］：［ＲＮＡ］二重らせんは、Ｔ２４細胞内の核溶解分解の基質である。［アンチセンス「ＲＮＡ様」ギャップマーオリゴヌクレオチド］：［Ｈａ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡ］二重らせんの分解は、そのアンチセンス分子中に包含されたリボヌクレオチドの数に依存する。１７塩基対９ＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重らせんは、ＲＮアーゼＨ切断の基質ではないが、Ｔ２４細胞溶解産物中における本発明のｄｓＲＮアーゼによる切断の基質である。更に、Ｔ２４細胞溶解産物で見られた切断部位は、二重らせんのＲＮＡ：ＲＮＡ部分に局在しているが、二重らせんの２’−メトキシ：ＲＮＡ部分では見られない。本発明のｄｓＲＮアーゼによる二重らせんの切断は、５’−リン酸末端および３’−ヒドロキシル末端を生じる。
【００６２】
本発明の化合物は、診断薬、治療薬および研究用試薬並びにキットとして用いることができる。それらは、有効量の本発明の化合物を適当な薬学的に許容しうる希釈剤または担体に対して加えることによって医薬組成物で用いることができる。それらは、更に、望ましくないタンパク質生産を特徴とする疾患を有する生物を治療するのに用いることができる。その生物は、望ましくないタンパク質をコードする標的核酸の鎖と特異的にハイブリッド形成しうる配列を有する本発明の化合物と接触することができる。
【００６３】
治療用組成物の製剤化およびそれらの引続きの投与は、当該技術の範囲内であると考えられる。概して、治療薬について、このような療法を必要とする患者は、本発明による化合物を、一般的には薬学的に許容しうる担体中で、患者の年齢および治療される疾患状態の重症度に応じて０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ（体重）の用量で投与される。更に、治療計画は、具体的な疾患の性状、その重症度および患者の全身状態に応じて異なるであろうし且つ１日１回〜２０年ごとに１回まで延長しうる期間継続してよい。処置後、その患者は、その状態の変化についておよび疾患状態の症状の軽減について監視される。化合物の投与量は、患者が現行の投薬レベルに対してほとんど応答しない場合に増加させることができるかまたは、疾患状態の症状の軽減が見られる場合若しくは疾患状態が消散した場合に減少させことができる。
【００６４】
若干の場合、本発明の化合物を他の伝統的治療法と一緒に用いて患者を処置するのがより好ましいことがありうる。例えば、ウイルス疾患について処置されている患者は、本発明の化合物を既知の抗ウイルス薬と一緒に投与されうるし、またはアテローム性動脈硬化症の患者は、血管形成術後に本発明の化合物で処置されて、処置された動脈の再閉塞を防止することができる。
【００６５】
成功した処置後、患者に維持療法を施して、疾患状態の再発を防止するのが望ましいことがあり、この場合、本発明の化合物は、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ（体重）の維持用量で１日１回またはそれ以上〜２０年ごとに１回投与される。  本発明の医薬組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかに依っておよび処置される部位に依って、多数の方式で投与することができる。投与は、局所（眼、腟、肛門、鼻腔内、経皮を含む）、経口または非経口であってよい。非経口投与には、静脈内滴注、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射、または包膜内若しくは室内投与が含まれる。
【００６６】
局所投与用製剤には、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤が含まれうる。慣用的な医薬用担体、水性、粉末または油状基剤、粘稠化剤等も必要でありうるしまたは望ましいことがありうる。コーティングコンドーム、グローブ等も有用でありうる。
【００６７】
経口投与用組成物には、散剤若しくは顆粒剤、水若しくは非水性基剤中の懸濁剤若しくは液剤、カプセル剤、サシェ剤または錠剤が含まれる。粘稠化剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望まれることがありうる。
【００６８】
包膜内または室内投与用組成物には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる滅菌水溶液が含まれうる。
非経口投与用製剤には、緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加剤も含有しうる滅菌水溶液が含まれうる。
【００６９】
投薬は、処置される疾患状態の重症度および応答性に依り、治療経過は、数日〜数か月まで、または治癒が起こるまでまたは疾患状態の軽減が得られるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬物蓄積の測定値から算定することができる。当業者は、最適用量、投薬法および反復率を容易に決定することができる。最適投薬量は、個々の化合物の相対力価に依って異なることがありうるし、そして概して、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であることが判明したＥＣ５０に基づいて算出することができる。概して、投薬量は、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ（体重）であり、しかも１日、１週間、１か月若しくは１年に１回若しくはそれ以上、または２〜２０年ごとに１回でも与えられることができる。
【００７０】
このような処置は、単細胞の原核生物および真核生物から多細胞の真核生物にいたる種々の生物で実施することができる。遺伝、代謝または細胞機構の基本的な部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−タンパク質翻訳を利用するいずれの生物も、このような診断、治療および／または予防の処置に対して感受性である。細菌、酵母、原生動物、藻類、植物、および温血動物を含めた高等動物の形態などの見掛上多様な生物は、この方法で処置することができる。更に、多細胞真核生物の各々の細胞も、それらの細胞活性の不可欠な部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写およびＲＮＡ−タンパク質翻訳の両方を含むので、このような治療および／または診断を、このような細胞集団でも実施することができる。更に、真核細胞の多数の細胞小器官、例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体もまた、転写および翻訳機序を含む。それゆえ、単細胞、細胞集団または細胞小器官もまた、本発明の治療用または診断用化合物で処置されることが可能な生物の定義の範囲内に包含されうる。本明細書中で用いられる治療とは、疾患状態の根絶、生物、例えば、細菌、原生動物若しくは他の感染の致死、または異常な若しくは望ましくない細胞成長若しくは発現の抑制を含むことを意味する。
【００７１】
本発明の文脈中、「標的ＲＮＡ」とは、相補的核酸様化合物とハイブリッド形成しうる何等かのＲＮＡを意味するものである。更に、本発明の文脈中、「ハイブリッド形成」とは、相補的核塩基間の水素結合を意味するものであり、ワトソン・クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合でありうる。本明細書中で用いられる「相補的」とは、二つの核塩基間の正確に対合する能力を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成によって対合する相補的核塩基である。本明細書中で用いられる「相補的」および「特異的にハイブリッド形成しうる」とは、ヌクレオシドサブユニットを含有する第一および第二核酸様オリゴマー間の正確な対合または配列相補性を意味する。例えば、第一核酸のある位置の核塩基が、第二核酸の同じ位置の核塩基と水素結合できる場合、その第一核酸および第二核酸は、その位置で互いに相補的であると考えられる。それら第一および第二核酸は、それぞれの分子中の充分に多数の対応する位置が、互いに水素結合できる核塩基で占められている場合、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリッド形成しうる」および「相補的」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子との間に安定且つ特異的な結合が生じるような充分な相補性の程度を示すのに用いられる用語である。本発明のオリゴマー化合物は、特異的にハイブリッド形成しうるその標的ＲＮＡ配列に対して１００％相補的である必要はないということは理解される。オリゴマー化合物は、そのオリゴマー化合物の標的ＲＮＡ分子に対する結合が、その標的ＲＮＡの正常な機能の妨げになって有用性を損なわせる場合に特異的にハイブリッド形成しうるし、そして特異的結合が望まれる条件下において、すなわち、インビボ検定若しくは治療的処置の場合またはインビトロ検定の場合の生理学的条件下において、それら検定が行われる条件下において、非標的配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を避けるのに充分な相補性の程度が存在する。
【００７２】
次の実施例および手順は、本発明を詳しく説明するが、発明を制限するためのものではない。本発明の説明において、実施例１は、本発明の若干の代表的なオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシド化合物の製造に有用である若干の市販ヌクレオシドアミダイトおよび他の追加のヌクレオシドアミダイトを確認する。実施例２〜５は、本発明の他の代表的なオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシド化合物を製造する場合に用いるための更に別のヌクレオシドアミダイトの製造を詳しく説明する。実施例６は、本発明のオリゴリボヌクレオチド化合物の製造を詳しく説明する。実施例７は、本発明のオリゴリボヌクレオシド化合物の製造を詳しく説明する。実施例８〜１６は、若干の「ギャップマー」、すなわち、「ギャップ」および「ウィング」構成を有する化合物を含めた本発明のキメラオリゴマー化合物の製造を詳しく説明する。実施例１７〜１８は、本発明の化合物の若干の有用な態様を詳しく説明する。実施例１９〜２８は、本発明の二本鎖リボヌクレアーゼ（ｄｓＲＮアーゼ）の識別、特性決定および精製を詳しく説明する。実施例２９は、本発明のｄｓＲＮアーゼ基質を包含するアフィニティーカラムを詳しく説明する。
【００７３】
代表的な実施例において、「ギャップマー」のいくつか異なった種類を例示する。これらには、結合したヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、結合したヌクレオシドの５’および３’「ウィング」セグメント間に位置している第一型、および「ギャップ」セグメントが、オリゴマー化合物の３’末端かまたは５’末端に位置している第二「オープンエンド」型が含まれる。全てのキメラオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドについての代表的な実施例において、特に断らない限り、２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは「ウィング」セグメントで用いられ、そして２’−ＯＨヌクレオシドは、各々のオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオシドの「ギャップ」セグメントで用いられる。
【００７４】
代表的な実施例のために、次の便法慣例を用いる。括弧、すなわち［  ］で示された構造は、ヌクレオシド省略形であるが、スラッシュマーク、すなわち／の後に示された構造は、ヌクレオシド、すなわち、オリゴリボヌクレオチドかまたはオリゴリボヌクレオシド化合物中でヌクレオシドを互いに結合している主鎖構造を連結するのに用いられるリンカーである。
【００７５】
この用語法を用いて、ヌクレオシド間のリン結合に次の略語を用いる。ホスホジエステルにＰＯ；ホスホロチオエートにＰＳ；ホスホロジチオエートにＰ２Ｓ；ホスホロセレネートにＰＳｅ；メチルホスホネートにＰＭｅ；メチルホスホトリエステルにＰＯＭｅ；ホスホルアミデートにＰＮ；３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートに３’ＮＰＮ；ホスフィネートにＰＩ；アルキルホスホノチオエートにＭｅＰＳ；ボラノホスフェートにＢＰを用いる。ヌクレオシド間の非リン酸結合に用いられる略語は、メチレンメチルイミノのＭＭＩ；メチレンジメチルヒドラゾのＭＤＨ；ホルムアセタールのＦＡ；チオホルムアセタールのＴＦＡ；エチレンオキシドのＥＴＯおよびメチレンカルボニルアミノの amide−３である。２’−ＯＨは、非修飾リボ糖、すなわち、ペントリボフラノシル糖の略語として用いられる。修飾ヌクレオシドに用いられる略語は、ペントリボフラノシル残基の２’位の一般アルキル基の２’−Ｏ−アルキル、具体的なアルキルは、メチル、エチル、プロピルおよびメトキシエチルにそれぞれ、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−Ｏ−Ｅｔ、２’−Ｏ−Ｐｒおよび２’−Ｏ−ＥｔＯＭｅとして示され；ペントリボフラノシル残基の２’位のフルオロ残基の２’−Ｆ；例えば、米国特許第5,459,255号の開示によるプリン核塩基置換のMod-Purine または；そして例えば、米国特許第5,484,908号の開示によるピリミジン核塩基置換の Mod-Pyr；例えば、米国特許第5,359,044号の開示による糖代理物のＳＳである。
【実施例】
【００７６】
実施例１
オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシド合成用アミダイト
２’−Ｏ−メチルヌクレオシドアミダイトおよび２’−ＯＨ（２’−ｔ−ブチルジメチルシリル誘導体として遮断された）ヌクレオシドアミダイトは、Glen Research，スターリング，ＶＡから入手可能である。他の２’−Ｏ−アルキル置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,506,351号、同第5,466,786号または同第5,514,786号で記載されているように製造される。シクロブチル糖代理化合物は、本明細書中に援用される米国特許第5,359,044号で記載されているように製造される。ピロリジン糖代理物は、本明細書中に援用される米国特許第5,519,134号で記載されているように製造される。モルホリノ糖代理物は、本明細書中に援用される米国特許第5,142,047号および同第5,235,033号、並びに他の関連特許開示で記載されているように製造される。Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,459,255号で記載されているように製造される。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,457,191号で記載されているように製造される。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,614,617号で記載されているように製造される。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、本明細書中に援用される米国特許第5,484,908号で記載されているように製造される。
実施例２
２’−Ｏ−（メトキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル置換ヌクレオシドアミダイトを、次の実施例２−ａ〜２−ｈのようにまたは代わりに、Martin,P.，Helvetica Chimica Acta,1995,78,486-504 の方法によって製造する。
実施例２−ａ
２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］
５−メチルウリジン（リボシルチミン，Yamasa，銚子，日本によって商業的に入手可能）（７２．０ｇ，０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ，０．４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４Ｍ）を、ＤＭＦ（３００ｍＬ）に対して加えた。その混合物を撹拌しながら加熱して還流させ、発生した二酸化炭素ガスを制御方式で放出させた。１時間後、その薄黒い溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップをジエチルエーテル（２．５Ｌ）中に撹拌しながら注いだ。その生成物はガムを形成した。エーテルを傾瀉し、そしてその残留物を最小量のメタノール（約４００ｍＬ）中に溶解させた。その溶液を新たなエーテル（２．５Ｌ）中に注いで、堅いガムを生成した。エーテルを傾瀉し、そしてそのガムを真空オーブン（１ｍｍＨｇで６０℃、２４時間）中で乾燥させて固体を与え、これを破砕して痰黄褐色粉末（５７ｇ，８５％粗収率）にした。ＮＭＲスペクトルは、フェノールをそのナトリウム塩として混入した（約５％）構造と一致した。その材料をそのままで更に別の反応に用いた（またはそれを、カラムクロマトグラフィーによって、メタノールの酢酸エチル中の勾配（１０〜２５％）を用いて更に精製して、白色固体，ｍｐ２２２〜４℃を与えることができる）。
実施例２−ｂ
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を、２Ｌステンレス鋼製圧力容器に対して加え、そして１６０℃で予熱された油浴中に入れた。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後、その容器を開け、そして溶液を蒸発乾固させ、そしてＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で研和した。その残留物を熱アセトン（１Ｌ）中に懸濁させた。不溶性塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、そして濾液を蒸発させた。残留物（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）中に溶解させ、そして蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中で充填した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中に溶解させ、そしてカラム上に加える前にシリカ（１５０ｇ）に吸収させた。その生成物を充填用溶媒で溶離して、１６０ｇ（６３％）の生成物を与えた。追加の材料は、不純画分を再生することによって得られた。
実施例２−ｃ
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ，０．５０６Ｍ）を、ピリジン（２５０ｍＬ）と一緒に共蒸発させ、そして乾燥した残留物をピリジン（１．３Ｌ）中に溶解させた。塩化ジメトキシトリチルの第一アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、そしてその混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ジメトキシトリチルの第二アリコート（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加え、そしてその反応を更に１時間撹拌した。次に、メタノール（１７０ｍＬ）を加えて、反応を停止させた。ＨＰＬＣは、約７０％生成物の存在を示した。その溶媒を蒸発させ、そしてＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）で研和した。その残留物をＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）中に溶解させ、そして２×５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３および２×５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。２７５ｇの残留物が得られた。その残留物を、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で充填され且つ溶離されるシリカゲルカラム３．５ｋｇ上で精製した。純粋画分を蒸発させて、１６４ｇの生成物を与えた。追加の約２０ｇを不純画分から得て、１８３ｇ（５７％）の全収量を与えた。
実施例２−ｄ
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよび１８８ｍＬのピリジンから製造された３：１混合物７５０ｍＬ）および無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８Ｍ）を一緒にし且つ室温で２４時間撹拌した。その反応をｔｌｃによって、ＭｅＯＨの添加でｔｌｃ試料を最初に急冷することによって監視した。ｔｌｃによって判断される反応の完了時に、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、そしてその混合物を３５℃で蒸発させた。その残留物をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）中に溶解させ、そして２×２００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウムおよび２×２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層を２００ｍＬのＣＨＣｌ３で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ且つ蒸発させて、１２２ｇの残留物（約９０％生成物）を与えた。その残留物をシリカゲルカラム３．５ｋｇ上で精製し且つＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を用いて溶離した。純生成物画分を蒸発させて、９６ｇ（８４％）を生成した。追加の１．５ｇは、後の画分から回収された。
実施例２−ｅ
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）中に溶解させることによって第一溶液を製造し、取っておいた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）を、トリアゾール（９０ｇ，１．３Ｍ）のＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）中溶液に対して加え、−５℃まで冷却し、そしてオーバーヘッドスターラーを用いて０．５時間撹拌した。０〜１０℃で維持されたその撹拌溶液に対して、ＰＯＣｌ３を３０分間にわたって滴加し、そして得られた混合物を更に２時間撹拌した。第一溶液を、その溶液に対して４５分間にわたって滴加した。得られた反応混合物を冷室内で一晩貯蔵した。その反応混合物から塩を濾過し、そしてその溶液を蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）中に溶解させ、そして不溶性固体を濾過によって除去した。その濾液を、１×３００ｍＬのＮａＨＣＯ３および２×３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ且つ蒸発させた。その残留物をＥｔＯＡｃで研和して、標題化合物を与えた。
実施例２−ｆ
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジオキサン（５００ｍＬ）およびＮＨ４ＯＨ（３０ｍＬ）中溶液を室温で２時間撹拌した。そのジオキサン溶液を蒸発させ、そして残留物をＭｅＯＨ（２×２００ｍＬ）と共沸させた。その残留物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解させ、そして２リットルステンレス鋼製圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和したＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、そしてその容器を１００℃まで２時間加熱した（ｔｌｃは完全な転化を示した）。容器内容物を蒸発乾固させ、そして残留物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）中に溶解させ且つ飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そしてその溶媒を蒸発させて、標題化合物８５ｇ（９５％）を与えた。
実施例２−ｇ
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）中に溶解させ、そして無水安息香酸（３７．２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間撹拌した後、ｔｌｃは、反応が約９５％完了したことを示した。その溶媒を蒸発させ、そして残留物をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸させた。その残留物をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）中に溶解させ、そして飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２×３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ且つ蒸発させて、残留物（９６ｇ）を与えた。その残留物を、シリカカラム１．５ｋｇ上において０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶離溶媒として用いてクロマトグラフィーによって分離した。純生成物画分を蒸発させて、標題化合物９０ｇ（９０％）を与えた。
実施例２−ｈ
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）中に溶解させた。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）および２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を、窒素雰囲気下において撹拌しながら加えた。得られた混合物を室温で２０時間撹拌した（ｔｌｃは、反応が９５％完了したことを示した）。その反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（３×３００ｍＬ）で抽出した。水性洗浄物をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で逆抽出し、そしてその抽出物を一緒にし、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ且つ濃縮した。得られた残留物を、シリカカラム１．５ｋｇ上においてＥｔＯＡｃ＼ヘキサン（３：１）を溶離溶媒として用いてクロマトグラフィーによって分離した。純生成物画分を一緒にして、標題化合物９０．６ｇ（８７％）を与えた。
実施例３
長鎖、すなわち（Ｃ２０）置換ヌクレオシドアミダイトの製造
長鎖、例えば、Ｃ２０置換基を２’位に有するヌクレオシドアミダイトの合成を、実施例３−ａ〜３−ｃで示す。
実施例３−ａ
２，６−ジアミノ−９−（２−Ｏ−オクタデシル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリンの合成
ＤＭＦ（１Ｌ）中の２，６−ジアミノ−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（５０ｇ，１８０ミリモル）および水素化ナトリウム（７ｇ）を加熱して２時間沸騰させた。ヨードオクタデカン（１００ｇ）を１５０℃で加え、そしてその反応混合物をＲＴまで冷却させた。その反応混合物をＲＴで１１日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。その生成物を５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶離した。適当な画分を蒸発させて、生成物（１１ｇ）を生成した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｔ，３，ＣＨ２）；１．２２（ｍ，３２，Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）１６）；１．８６（ｍ，２，Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）；３．２５（ｍ，２，Ｏ−ＣＨ２）；３．９３（ｄ，１，４’Ｈ）；４．２５（ｍ，１，３’Ｈ）；４．３８（ｔ，１，２’Ｈ）；５．０８（ｄ，１，３’−ＯＨ）；５．４８（ｔ，１，５’−ＯＨ）；５．７５（ｓ，２，６−ＮＨ２）；５．８４（ｄ，１，１’−Ｈ）；６．８（ｓ，２，２−ＮＨ２）；および７．９５（ｓ，１，８−Ｈ）。
実施例３−ｂ
２’−Ｏ−オクタデシルグアノシンの合成
０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＬ，ｐＨ７．４）、０．１Ｍトリス緩衝液（１０００ｍＬ，ｐＨ７．４）およびＤＭＳＯ（１０００ｍＬ）中の２，６−ジアミノ−９−（２−Ｏ−オクタデシル−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン（１０ｇ）を、ＲＴにおいてアデノシンデアミナーゼ（１．５ｇ）で処理した。３日目、５日目および７日目に、アデノシンデアミナーゼの追加のアリコート（それぞれ、５００ｍｇ，８８０ｍｇおよび２００ｍｇ）を加えた。その反応を合計９日間撹拌し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーによる精製は、生成物（２ｇ）を生じた。分析用試料は、ＭｅＯＨから再結晶された。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８４（ｔ，３，ＣＨ３），１．２２［ｓ，３２，Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）１６］，５．０７（ｍ，２，３’−ＯＨおよび５’−ＯＨ）；５．７８（ｄ，１，１’−Ｈ）；６．４３（ｓ，２，ＮＨ２），７．９７（ｓ，１，８−Ｈ）および１０．６４（ｓ，１，ＮＨ２）。
Ｃ２８Ｈ４９Ｎ５Ｏ５の分析計算値：Ｃ，６２．８０；Ｈ，９．１６；Ｎ，１２．９５。実測値：Ｃ，６２．５４；Ｈ，９．１８；Ｎ，１２．９５。
実施例３−ｃ
Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−オクタデシルグアノシンの合成
ピリジン（１５０ｍＬ）中の２’−Ｏ−オクタデシルグアノシン（１．９ｇ）を氷浴中で冷却し、そして塩化トリメチルシリル（２ｇ，５当量）および塩化イソブチリル（２ｇ，５当量）で処理した。その反応混合物を４時間撹拌し、その時間中にそれを室温まで暖めた。その溶液を冷却し、水を加え（１０ｍＬ）、そして更に３０分間撹拌した。濃水酸化アンモニウム（１０ｍＬ）を加え、そしてその溶液を真空中で濃縮した。その残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（３％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃで溶離された）によって精製して、生成物１．２ｇを生じた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ０．８５（ｔ，３，ＣＨ３），１．１５（ｍ，３８，Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ２）１６，ＣＨ（ＣＨ３）２），２．７７（ｍ，１，ＣＨ（ＣＨ３）２），４．２５（ｍ，２，２’−Ｈ）および３’−Ｈ）；５．０８（ｔ，１，５’−ＯＨ），５．１２（ｄ，１，３’−ＯＨ），５．８７（ｄ，１，１’−Ｈ），８．２７（ｓ，１，８−Ｈ），１１．６８（ｓ，１，ＮＨ２）および１２．０８（ｓ，１，ＮＨ２）。
Ｃ３２Ｈ５５Ｎ５Ｏ６の分析計算値：Ｃ，６３．４７；Ｈ，９．０９；Ｎ，１１．５７。実測値：Ｃ，６３．５３；Ｈ，９．２０；Ｎ，１１．５２。
この生成物をオリゴリボヌクレオチド中に包含させる前に、それを、1994年２月３日公開の国際公開第ＷＯ94/02501号で記載された手順にしたがって、Ｎ２−イソブチリル−５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−オクタデシルグアノシンに変換した後、ホスホルアミダイトに変換した。
実施例４
２’−フルオロヌクレオシドアミダイト
２’−フルオロ置換ヌクレオシドアミダイトを、次の実施例４−ａ〜４−ｄのようにまたは代わりに、Kawasaki ら，J.Med.Chem.,1993,36,831-841 の方法によって製造する。
実施例４−ａ
ｉ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン。
【００７７】
９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（１．０７ｇ，４．００ミリモル）を、無水ピリジン（２０ｍＬ）および無水ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させた。その溶液を０℃まで冷却し、そしてクロロトリメチルシラン（３．８８ｍＬ，３０．６ミリモル）を、その反応混合物に対してシリンジによって徐々に加えた。その反応混合物を０℃で３０分間撹拌した後、塩化ベンゾイル（２．３２ｍＬ，２０ミリモル）を徐々に加えた。その反応混合物を２０℃まで暖め且つ２時間撹拌した。その反応混合物を０℃まで冷却した後、冷水（８ｍＬ）を加え、そしてその混合物を１５分間撹拌した。濃水酸化アンモニウム（８ｍＬ）をその反応混合物に対して徐々に加えて、２Ｍのアンモニア最終濃度を与えた。冷反応混合物を３０分間撹拌した後、その溶媒を真空（６０トル）中において２０℃で蒸発させた後、真空（１トル）中において４０℃で蒸発させて油状物を与えた。この油状物をジエチルエーテル（５０ｍＬ）で研和して固体を与え、これを濾過し且つジエチルエーテルで３回洗浄した。この粗製固体をメタノール（１００ｍＬ）中において還流温度で３回研和し、そしてその溶媒を蒸発させて、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを固体（１．５０ｇ，１００％）として生成した。
ii．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン。
【００７８】
Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（２．６２ｇ，７．０６ミリモル）を、無水ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）中にアルゴン雰囲気下で溶解させ、そしてｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１．３２ｇ，６．９２ミリモル）を加えた。この溶液を０℃まで冷却し、そしてジヒドロピラン（１．２６ｍＬ，１３．８ミリモル）をシリンジによって加えた。その反応混合物を２０℃まで暖めた。５時間にわたって、合計１０当量のジヒドロピランを、記載された方式で２当量ずつ加えた。その反応混合物を０℃まで冷却し、飽和水性重炭酸ナトリウムをｐＨ８まで徐々に加えた後、水を７５０ｍＬの容量まで加えた。その水性混合物を塩化メチレン（４×２００ｍＬ）で抽出し、そして有機相を一緒にし且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。その固体を濾過し、そして溶媒を真空（６０トル）中において３０℃で蒸発させて少量の液体を与え、これを真空（１トル）中において４０℃で蒸発させて油状物を与えた。この油状物をｐ−キシレンと一緒に真空中において４０℃で共蒸発させて油状物を与え、これを塩化メチレン（１００ｍＬ）中に溶解させた。ヘキサン（２００ｍＬ）をその溶液に対して加え、そしてその低沸点溶媒を真空中において３０℃で蒸発させて、ヘキサン中に懸濁した白色固体を残した。この固体を濾過し且つヘキサン（３×１０ｍＬ）で洗浄した後、シリカゲルおよび溶離剤として塩化メチレン−メタノール（９３：７）を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。第一画分は標題化合物３を白色泡状物（３．１９ｇ，８３％）として生じ、そして第二画分は白色泡状物（０．８１ｇ）を与え、これを、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンの５’−モノテトラヒドロピラニル誘導体として特性決定した。
iii．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン。
【００７９】
Ｎ６−ベンゾイル−９−［３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（２．６５ｇ，４．９１ミリモル）を無水ピリジン（２０ｍＬ）中に溶解させ、そしてその溶媒を真空（１ｍｍＨｇ）中において４０℃で蒸発させた。得られた油状物を無水塩化メチレン（１３０ｍＬ）中にアルゴン下において溶解させ、無水ピリジン（３．３４ｍＬ，４１．３ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１．９５ｇ，１６．０ミリモル）を加えた。その反応混合物を０℃まで冷却し、そして無水トリフルオロメタンスルホン酸（１．３６ｍＬ，８．０５ミリモル）をシリンジによって徐々に加えた。その反応混合物を０℃で１時間撹拌した後、それを冷飽和水性重炭酸ナトリウム（１４０ｍＬ）中に注いだ。その混合物を振とうし、そして有機相を分離し且つ０℃で保持した。水性相を塩化メチレン（２×１４０ｍＬ）で抽出した。冷却した状態で絶えず保持された有機抽出物を一緒にし、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させた。その溶媒を真空（６０トル）中において２０℃で蒸発させた後、真空（１トル）中において２０℃で蒸発させて、Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンを粗製油状物として与え、これ以上精製しなかった。
iv．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン。
【００８０】
粗製油状物としてのＮ６−ベンゾイル−９−［２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（４．９ミリモル）を、無水テトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）中に溶解させ、そしてこの溶液をアルゴン下において０℃まで冷却した。水和物としてのフッ化テトラブチルアンモニウム（１２．８ｇ，４９．１ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中に溶解させ、そしてこの容量の半分を、冷反応混合物に対してシリンジによって徐々に加えた。０℃で１時間撹拌した後、試薬の残りを徐々に加えた。その反応混合物を０℃で更に１時間撹拌した後、溶媒を真空（６０トル）中において２０℃で蒸発させて油状物を与えた。この油状物を塩化メチレン（２５０ｍＬ）中に溶解させ、そしてブラインで３回洗浄した。有機相を分離し且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。固体を濾過し、そして溶媒を蒸発させて油状物を与えた。この粗生成物を、半融ガラス漏斗中でシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製し、そして酢酸エチルを溶離剤として用いた。Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニンは、油状物（２．０３ｇ，７６％）として得られた。
ｖ．  Ｎ６−ベンゾイル−９−（２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）アデニン。
【００８１】
Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−２−イル）−β−Ｄ−アラビノフラノシル］アデニン（１．３１ｇ，２．４２ミリモル）をメタノール（６０ｍＬ）中に溶解させ、Dowex 50W x 2-100（４ｃｍ３，２．４ミリ当量）をその反応混合物に対して加えた。その反応混合物を２０℃で１時間撹拌した後、０℃まで冷却した。次に、トリエチルアミン（５ｍＬ）をその冷反応混合物に対して徐々にｐＨ１２まで加えた。樹脂を濾過し、そしてメタノール中３０％トリエチルアミンで、洗浄物がもはやＵＶ吸収材料を含有しなくなるまで洗浄した。トルエン（５０ｍＬ）をそれら洗浄物に対して加え、そして溶媒を真空（６０トル、続いて１トル）中において２４℃で蒸発させて残留物を与えた。この残留物を塩化メチレン（３０ｍＬ）中に部分溶解させ、そしてその溶媒を分液漏斗に移した。残留物の残りを熱（６０℃）水中に溶解させ、そして溶媒を冷却した後、それも分液漏斗に加えた。二相系を抽出し、そして有機相を分離し且つ水（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた水性抽出物を真空（６０トル、続いて１トルＨｇ）中において４０℃で蒸発させて油状物を与え、これを無水ピリジン（５０ｍＬ）と一緒に蒸発させた。この油状物を、更に、五酸化リンの存在下の真空（１トルＨｇ）中において２０℃で一晩中乾燥させて、Ｎ６−ベンゾイル−９−（２’−フルオロ−ｂ−Ｄ−リボフラノシル）アデニンを黄色泡状物（１．０８ｇ，１００％）として与え、これは少量の不純物を含んでいた。
vi．  Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン。
【００８２】
少量の不純物を含有したＮ６−ベンゾイル−９−（２’−フルオロ−ｂ−Ｄ−リボフラノシル）アデニン（１．０８ｇ，２．８９ミリモル）を、無水ピリジン（２０ｍＬ）中にアルゴン下で溶解させ、そして乾燥トリエチルアミン（０．５２ｍＬ，３．７６ミリモル）を加えた後、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（１．１３ｇ，３．３２ミリモル）を加えた。２０℃で４時間撹拌した後、その反応混合物を分液漏斗に移し、そしてジエチルエーテル（４０ｍＬ）を加えて白色懸濁液を与えた。この混合物を水で３回洗浄し（３×１０ｍＬ）、有機相を分離し且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。トリエチルアミン（１ｍＬ）をその溶液に対して加え、そしてその溶媒を真空（６０トルＨｇ）中において２０℃で蒸発させて油状物を与え、これを、トリエチルアミン（１ｍＬ）含有トルエン（２０ｍＬ）と一緒に蒸発させた。この粗生成物を、シリカゲルおよび酢酸エチル−トリエチルアミン（９９：１）に続いて酢酸エチル−メタノール−トリエチルアミン（８０：１９：１）を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製して、生成物を二つの画分で与えた。それら画分を真空（６０トル、続いて１トルＨｇ）中において２０℃で蒸発させて泡状物を与え、これを、水酸化ナトリウムの存在下の真空（１トルＨｇ）中において２０℃で更に乾燥させて、Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニンを泡状物（１．０２ｇ，５２％）として与えた。
vii．  Ｎ６−ベンゾイル−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイト。
【００８３】
Ｎ６−ベンゾイル−９−［２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン（１．２６ｇ，１．８９ミリモル）を、無水ジクロロメタン（１３ｍＬ）中にアルゴン下で溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．８２ｍＬ，４．６６ミリモル）を加え、そしてその反応混合物を０℃まで冷却した。クロロ（ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（０．８８ｍＬ，４．０３ミリモル）を、２０℃まで暖められ且つ３時間撹拌されたその反応混合物に対して加えた。酢酸エチル（８０ｍＬ）およびトリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、そしてこの溶液をブライン（３×２５ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させた。固体の濾過後、その溶媒を真空中において２０℃で蒸発させて油状物を与え、これを、シリカゲルおよび溶離剤としてヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン（５０：４９：１）を用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。真空中において２０℃での画分の蒸発は泡状物を与え、これを、水酸化ナトリウムの存在下の真空（１トルＨｇ）中において２０℃で２４時間更に乾燥させて、Ｎ６−ベンゾイル−［２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）］−アデノシン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイトを泡状物（１．０５ｇ，６３％）として与えた。
実施例４−ｂ
２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイト）。
【００８４】
２，２’−シクロウリジンを、ジオキサン中７０％フッ化水素／ピリジンの溶液で１２０℃において１０時間処理して、溶媒の除去後に、７５％収率の２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンを与える。５’−ＤＭＴおよび３’−シアノエトキシジイソプロピルホスルアミダイトで誘導体化されたヌクレオシドを、標準的な文献手順［Gait 監修，Oligonucleotide Synthesis.A Practical Approach，IRL Press，ワシントン，ＤＣ（1984）］によって、または実施例４−ａの手順にしたがって得る。
実施例４−ｃ
２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−シチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイト）。
【００８５】
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン（２．５１ｇ，１０．３ミリモル）を、C.B.Reese,ら，J.Chem.Soc.Perkin Trans I，1171-1176頁（1982）の方法により、無水酢酸（３．１ｍＬ，３２．７ミリモル）を無水ピリジン（２６ｍＬ）中において室温で用いるアセチル化によって、対応するシチジン類似体に変換した。その反応をメタノールで急冷し、溶媒を真空（１トル）中で蒸発させて油状物を与え、これをエタノールおよびトルエンと一緒に共蒸発させた。３’，５’−Ｏ−ジアセチル−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンは、エタノールから結晶化して、無色結晶（２．３８ｇ，８１％）を与えた。
【００８６】
Ｎ−４−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−３’，５’−Ｏ−ジアセチル−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンは、３’，５’−Ｏ−ジアセチル−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジン（２．７５ｇ，９．６１ミリモル）と、１，２，４−トリアゾール（５．９７ｇ，８６．５ミリモル）、オキシ塩化リン（１．７３ｍＬ，１８．４ミリモル）およびトリエチルアミン（１１．５ｍＬ，８２．７ミリモル）との無水アセトニトリル中において室温での反応によって７０％収率で得られた。９０分後、その反応混合物を氷温まで冷却し、そしてトリエチルアミン（７．９８ｍＬ，５６．９ミリモル）を加えた後、水（４．０ｍＬ）を加えた。溶媒を真空（１トル）中で蒸発させて油状物を与え、これを塩化メチレン中に溶解させ、そして飽和水性重炭酸ナトリウムで洗浄した。その水性相を塩化メチレンで２回抽出し（２×１００ｍＬ）、そして有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒の蒸発は油状物を与え、これから、生成物Ｎ−４−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−３’，５’−Ｏ−ジアセチル−２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンが、エタノールからの結晶化によって得られた。
【００８７】
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは、濃水酸化アンモニウム（４．２６ｍＬ，８１．２ミリモル）をジオキサン中において室温で６時間用いる、保護されたトリアゾール−１−イル誘導体の処理によって与えられた。溶媒の蒸発後、その油状物をメタノール中の半飽和（氷温で）アンモニア中で１６時間撹拌した。その溶媒を蒸発させ、そして２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを酢酸エチル−メタノール（ｖ／ｖ，７５：２５）から結晶化させて、無色結晶（１．２４ｇ，７５％）を与えた。
【００８８】
Ｎ−４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは、無水安息香酸を無水ジメチルホルムアミド中で用いる選択的ベンゾイル化によって製造された。V.Bhat,ら，Nucleosides Nucleotides，８巻，179-183頁（1989）。５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−シアノエチルホスホルアミダイト）は、実施例４−ａにしたがって製造された。
実施例４−ｄ
ｉ．  ９−（３’，５’−［１，１，３，３−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【００８９】
グアノシンの３’および５’位を、Robins ら［Can.J.Chem.,61,1911(1983)］の手順により、ＴＰＤＳ（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル）保護基の添加によって保護した。ＤＭＳＯ（１６０ｍＬ）および無水酢酸（２０ｍＬ）の撹拌溶液に対して、ＴＰＤＳグアノシン（２１ｇ，０．０４０モル）を加えた。その反応を室温で３６時間撹拌した後、０℃まで冷却した。冷エタノール（４００ｍＬ，９５％）を加え、そしてその反応混合物をドライアイス／アセトン浴中で−７８℃まで更に冷却した。ＮａＢＨ４（２．０ｇ，１．３２モル当量）を加えた。その反応混合物を−２℃まで暖め、３０分間撹拌し、そして再度−７８℃まで冷却した。これを２回繰返した。ＮａＢＨ４の添加を完了した後、その反応を０℃で３０分間、続いて室温で１時間撹拌した。その反応を酢酸エチル（１Ｌ）中にとり、そしてＮａＣｌの飽和溶液で２回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ且つ減圧下で蒸発させた。その残留物をトルエンと一緒に２回共蒸発させ、そしてシリカゲルクロマトグラフィーによってＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（９：１）を溶離剤として用いて精製した。純生成物（６．０２ｇ）は、適当なカラム画分から、これらの画分の蒸発の際に沈澱し、そして追加の生成物１１．４９ｇは、それら画分の蒸発時の残留物として得られた。
ii．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−３’，５’−［１，１，３，３−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【００９０】
９−（３’，５’−［１，１，３，３−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（６．５ｇ，０．０１２４８モル）を、無水ピリジン（１５６ｍＬ）中にアルゴン下において溶解させた。ＤＭＡＰ（９．１５ｇ）を加えた。無水イソ酪酸（６．１２ｍＬ）を徐々に加え、そしてその反応混合物を室温で一晩中撹拌した。その反応混合物を冷飽和ＮａＨＣＯ３（１５６ｍＬ）中に注ぎ且つ１０分間撹拌した。その水溶液を酢酸エチル（１５６ｍＬ）で３回抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３で３回洗浄し、そして蒸発乾固させた。その残留物をトルエンと一緒に共蒸発させ、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってＣＨ２Ｃｌ２−アセトン（８５：１５）を用いて精製して、生成物５．６７ｇを生成した。
iii．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【００９１】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−イソブチリル−３’，５’−［１，１，３，３−テトライソプロピルジシロクス−１，３−ジイル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（９．８３ｇ，０．０１４７６モル）を、無水ＴＨＦ（８７．４ｍＬ）中にアルゴン下の室温で溶解させた。ＴＨＦ中１Ｍ  （ｎＢｕ）４Ｎ＋Ｆ−（２９．５２ｍＬ，２当量）を加え、そしてその反応混合物を３０分間撹拌した。その反応混合物を室温で蒸発させ、そしてその残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（８５：１５）を用いて精製して、生成物４．９８ｇ（８０％）を生成した。
iv．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−Ｏ−イソブチリル−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【００９２】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−イソブチリル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（４．９ｇ）を、無水１，４−ジオキサン（９８ｍＬ）中にアルゴン下の室温で溶解させた。ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．９７ｇ）を加えた後、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（ＤＨＰ，９．３４ｍＬ，８．８当量を加えた。その反応混合物を２時間撹拌した後、０℃まで冷却し、そして飽和ＮａＨＣＯ３（１２５ｍＬ）を加えて反応を急冷した。その反応混合物を１２５ｍＬずつのＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出し、そして有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させた。その有機相を蒸発させ、そして残留物を、最小量ではあるが、シロップではなくて透明液体を生じるのに充分な量のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させた後、ヘキサン（ＣＨ２Ｃｌ２の量の１０倍）中に滴下した。その沈澱を濾過して、生成物５．５９ｇ（８１．５％）を生成した。
ｖ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【００９３】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−イソブチリル−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（５．５８ｇ）を、ピリジン−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（６５：３０：１５，５２ｍＬ）中に室温で溶解させた。その溶液を０℃まで冷却し、そして５２ｍＬのＥｔＯＨ−ＭｅＯＨ（９５：５）中２Ｎ  ＮａＯＨを徐々に加えた後、０℃で２時間撹拌した。氷酢酸をｐＨ６まで加え、そして飽和ＮａＨＣＯ３をｐＨ７まで加えた。その反応混合物を減圧下で蒸発させ、そして残留物をトルエンと一緒に共蒸発させた。次に、その残留物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）中に溶解させ、そして飽和ＮａＨＣＯ３で３回洗浄した。有機相を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を溶離剤として用いて精製して、生成物３．８５ｇ（７８．３％）を生成した。
vi．  Ｎ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン。
【００９４】
Ｎ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニン（３．８４ｇ）を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（７９ｍＬ）、無水ピリジン（５ｍＬ）およびＤＭＡＰ（２．９３ｇ）中にアルゴン下の室温で溶解させた。その溶液を０℃まで冷却し、そして無水トリフルオロメタンスルホン酸（１．９９ｍＬ）を撹拌しながら徐々に加えた。その反応混合物を室温で１時間撹拌した後、１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３中に注いだ。水性相を冷ＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発させ、そして無水ＭｅＣＮと一緒に共蒸発させて、粗生成物を生成した。
vii．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン。
【００９５】
粗製Ｎ２−イソブチリル−９−（３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−２’−Ｏ−トリフルオロメチルスルホニル−β−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニンを、無水ＴＨＦ（１１３ｍＬ）中にアルゴン下の０℃で溶解させた。ＴＨＦ中１Ｍ  （ｎＢｕ）４Ｎ＋Ｆ−（ピリジンとの共蒸発によって乾燥された）（３６．９５ｍＬ）を撹拌しながら加えた。１時間後、ＴＨＦ中（ｎＢｕ）４Ｎ＋Ｆ−の追加のアリコート（３６．９５ｍＬ）を加えた。その反応混合物を０℃で５時間撹拌し、そして−３０℃で一晩貯蔵した。その反応混合物を減圧下で蒸発させ、そして残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１６０ｍＬ）中に溶解させ且つ脱イオン水で５回抽出した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ且つ蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ（９５：５）を用いて精製して、生成物５．２５ｇを生成した。
viii．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン。
【００９６】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−３’，５’−ジ−Ｏ−［テトラヒドロピラン−２−イル］−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン（３．８５ｇ）を、ＭｅＯＨ（８０ｍＬ）中に室温で溶解させた。予め洗浄された Dowex 50W 樹脂（１２．３２ｃｍ３）を加え、そしてその反応混合物を室温で１時間撹拌した。樹脂を濾過し、そして濾液を蒸発乾固させた。その樹脂をピリジン−トリエチルアミン−Ｈ２Ｏ（１：３：３）で、濾液が透明になるまで洗浄した。この濾液を蒸発させて油状物を得た。両方の濾液からの残留物をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）中で一緒にし、そしてＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）で洗浄した。水性相を蒸発乾固させ、そして残留物を熱ＭｅＯＨから再結晶させて、生成物０．２９９ｇを白色粉末として生成した。残りのＭｅＯＨ溶液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、ＥｔＯＨ−ＭｅＯＨ（４：１）での溶離によって生成物０．７８３ｇを更に生成した。
ix．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−［４，４−ジメトキシトリチル］−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン。
【００９７】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン（１．０９ｇ）を、ピリジン（２０ｍＬ）およびトリエチルアミン（０．５６ｍＬ）中にアルゴン下の室温で溶解させた。塩化４，４’−ジメトキシトリチル（１．２０ｇ，１．１５モル当量）を加え、そしてその反応混合物を室温で５時間撹拌した。その混合物を分液漏斗に移し、そしてジエチルエーテル（１００ｍＬ）で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３（３×７０ｍＬ）で洗浄し、そして水性相をジエチルエーテルで３回逆抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そしてトリエチルアミン（４ｍＬ）を加えて、その溶液を塩基性ｐＨで維持した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによってＥｔＯＡｃ−トリエチルアミン（１００：１）に続いてＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−トリエチルアミン（９５：５：１）を溶離剤として用いて精製して、生成物１．０３ｇを生成した。
ｘ．  Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−［４，４−ジメトキシトリチル］−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−β−Ｄ−シアノエチルホスホルアミダイト。
【００９８】
Ｎ２−イソブチリル−９−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−５’−Ｏ−［４，４’−ジメトキシトリチル］）−β−Ｄ−リボフラノシル）グアニン（０．５８７ｇ）を、無水ＣＨ２Ｃｌ２（３１ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ）中にアルゴン下の室温で溶解させた。その溶液を０℃まで冷却し、そしてクロロ（ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（０．４２ｍＬ）を徐々に加えた。その反応混合物を室温まで暖め且つ３．５時間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２−トリエチルアミン（１００：１，３５ｍＬ）を加え、そしてその混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（６ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ且つ減圧下で蒸発させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、２カラム容量のヘキサン−ＥｔＯＡｃ−トリエチルアミン（７５：２５：１）、続いてヘキサン−ＥｔＯＡｃ−トリエチルアミン（２５：７５：１）、そして最後にＥｔＯＡｃ−トリエチルアミンを用いて精製した。生成物含有画分をプールし、そして溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた油状物をＭｅＣＮと一緒に２回共蒸発させ且つ減圧下で乾燥させた。得られた白色固体をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中に溶解させ、そして撹拌されているヘキサン（３００ｍＬ）中に滴下した。得られた沈澱を濾過し、そして減圧下で乾燥させて、生成物０．６７３ｇ（８８％）を生成した。
実施例５
糖および塩基フラグメント上に置換を有するヌクレオシドアミダイトを、実施例５−ａ〜５−ｋで示す。
実施例５−ａ
他のヌクレオシドアミダイト
ｉ．  １−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］（７１ｇ，０．３２ミリモル）（実施例２−ａより）およびジオキサン（７００ｍＬ）を、２リットルステンレス鋼製ボンベ中に入れ、そしてＨＦ／ピリジン（１００ｇ，７０％）を加えた。その混合物を１２０〜１２５℃で１６時間加熱した後、氷浴中で冷却した。そのボンベを開け、そして混合物を３リットルの氷上に注いだ。この混合物に対して、炭酸水素ナトリウム（３００ｇ）および飽和重炭酸ナトリウム溶液（４００ｍＬ）を注意深く加えた。その混合物を濾過し、そしてその濾過ケーキを水（２×１００ｍＬ）およびメタノール（２×５００ｍＬ）で洗浄した。その水およびメタノール洗液を真空中で濃縮乾固させた。メタノール（２００ｍＬ）および粗シリカゲル（８０ｇ）をその残留物に対して加え、そしてその混合物を真空中で濃縮乾固させた。得られた材料をシリカゲル上で濃縮し、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、酢酸エチルおよびメタノールの勾配（１００：０〜８５：１５）を用いて精製した。生成物画分のプールおよび濃縮は、標題化合物３６．９ｇ（５１％，２段階収率）を与えた。
【００９９】
この反応から更に単離されたのは、１−（２−フェニル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（１０．３ｇ）であった。この材料は、ボンベ反応が不純材料で行われる場合、上記アンヒドロ反応からのフェノールおよびそのナトリウム塩から形成される。アンヒドロ材料が精製されている場合、この生成物は形成されない。形成された１−（２−フェニル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジンは、２’−フルオロ材料の場合と同様の反応条件を用いて、そのＤＭＴ／ホスホルアミダイトに変換された。
ii．  １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（３１．１５ｇ，０．１２モル）をピリジン（１５０ｍＬ）中に懸濁させ、そして塩化ジメトキシトリチル（４４．６２ｇ，０．１２モル）を加えた。その混合物を密封フラスコ中で２時間撹拌した後、メタノール（３０ｍＬ）を加えた。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物を飽和重炭酸塩溶液（５００ｍＬ）と酢酸エチル（３×５００ｍＬ）とに分配した。酢酸エチル部分をプールし且つ硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮して粘稠な油状物にした。その油状物をジクロロメタン（１００ｍＬ）中に溶解させ、シリカゲルカラムに対して加え、そして６０／３９／１〜７５／２４／１まで増加する酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミンで溶離した。生成物画分をプールし且つ真空中で濃縮して、標題化合物５９．９ｇ（８９％）を泡状物として与えた。
iii．  １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５９．８ｇ，０．１０６モル）を、ジクロロメタンおよび２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４６．９ｍＬ，０．１４８モル）中に溶解させ、そしてジイソプロピルアミンテトラゾリド（５．４６ｇ，０．３当量）を加えた。その混合物を１６時間撹拌した。その混合物を飽和重炭酸ナトリウム（１Ｌ）で洗浄し、そしてその重炭酸塩溶液をジクロロメタン（５００ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層をブライン（１Ｌ）で洗浄し、そしてそのブラインをジクロロメタン（１００ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して約２００ｍＬの容量にした。得られた材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによってヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン６０／４０／１を用いて精製した。生成物画分を真空中で濃縮し、アセトニトリル（５００ｍｌ）中に溶解させ、濾過し、真空中で濃縮し、そして乾燥させて泡状物にした。その泡状物を細断し且つ恒量まで２４時間乾燥させて、標題化合物６８．２ｇ（８４％）を与えた。
１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δ０．９−１．４（ｍ，１４Ｈ，４ｘＣＨ３，２ｘＣＨ），２．３−２．４（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＮ），２．６−２．７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＮ），３．３−３．８（ｍ，１３Ｈ，２ｘＣＨ３ＯＡｒ，５’ＣＨ２，ＣＨ２ＯＰ，Ｃ−５  ＣＨ３），４．２−４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３５−５．０（ｍ，１Ｈ，３’），４．９−５．２（ｍ，１Ｈ，２’），６．０−６．１（ｄｄ，１Ｈ，１’），６．８−７．４（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ），７．５−７．６（ｄ，１Ｈ，Ｃ−６），８．８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；１５１．４６８，１５１．６０９，１５１．７９０，１５１．９０４。
iv．  １−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
実施例５−ａ−ｉの手順によって製造された１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（２２．４ｇ，９２ミリモル，８５％純度）を、ピリジン（２×１５０ｍＬ）と一緒に共沸させ、そしてピリジン（２５０ｍＬ）中に溶解させた。無水酢酸（５５ｍＬ，０．５８モル）を加え、そしてその混合物を１６時間撹拌した。メタノール（５０ｍＬ）を加え、そして撹拌を３０分間続けた。その混合物を蒸発させてシロップにした。そのシロップを最小量のメタノール中に溶解させ、そしてシリカゲルカラム上に加えた。ヘキサン／酢酸エチル１：１を用いて生成物画分を溶離した。精製は、標題化合物１９．０ｇ（７４％）を与えた。
実施例５−ｂ
ｉ．  ４−トリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１，２，４−トリアゾール（１０６ｇ，１．５３モル）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）中に溶解させた後、トリエチルアミン（２５７ｍＬ，１．８４モル）を溶解させた。その混合物を、氷浴を用いて０〜１０℃に冷却した。ＰＯＣｌ３（３４．５ｍＬ，０．３７５モル）を、添加用漏斗によって徐々に加え、そしてその混合物を更に４５分間撹拌した。別のフラスコ中で、１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５６．９ｇ，０．１４４モル）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）中に溶解させた。その１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン含有溶液を、トリアゾール溶液に対してカニューレによって徐々に加えた。氷浴を除去し、そしてその反応混合物を室温まで１時間暖めた。アセトニトリルを真空中で除去し、そして残留物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（４００ｍＬ）とジクロロメタン（４×４００ｍＬ）とに分配した。有機層を一緒にし且つ真空中で濃縮した。得られた残留物を酢酸エチル（２００ｍＬ）中に溶解させ且つ固体の沈澱を開始させた。ヘキサン（３００ｍＬ）を加え、そして更に固体を沈澱させた。その固体を濾過によって集め且つヘキサン（２×２００ｍＬ）で洗浄し、そして真空中で乾燥させて６３．５ｇを与え、これを、更に精製することなくそのまま用いた。
ii．  ５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）シトシン
４−トリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−チミン（７５．５ｇ，０．１９８モル）を、ステンレス鋼製ボンベ中のアンモニア（４００ｍＬ）中に溶解させ、そして一晩密封した。そのボンベを冷却し且つ開け、そしてアンモニアを蒸発させた。メタノールを加えてその材料をフラスコに移し、そして約１０容量のエチルエーテルを加えた。その混合物を１０分間撹拌した後、濾過した。固体をエチルエーテルで洗浄し且つ乾燥させて、標題化合物５１．７ｇ（８６％）を与えた。
iii．  ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）シトシン
５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）シトシン（５４．６ｇ，０．２１モル）をピリジン（７００ｍＬ）中に懸濁させ、そして無水安息香酸（７０ｇ，０．３０９モル）を加えた。その混合物を室温で４８時間撹拌した。ピリジンを蒸発によって除去し、そしてメタノール（８００ｍＬ）を加え、そしてその混合物を撹拌した。沈澱が形成され、これを濾過し、メタノール（４×５０ｍＬ）で洗浄し、エーテル（３×１００ｍＬ）で洗浄し、そして真空オーブン中において４５℃で乾燥させて、標題化合物４０．５ｇを与えた。その濾液を真空中で濃縮し、そして飽和メタノール性アンモニアをボンベ中において室温で一晩用いて処理した。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。再循環された出発物質を上記のように再度処理して、標題化合物を更に４．９ｇ与え、合計４５．４ｇ（６１％）の標題化合物を与えた。
iv．  ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）シトシン
４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−シトシン（４５．３ｇ，０．１２４モル）を乾燥ピリジン２５０ｍｌ中に溶解させ、そして塩化ジメトキシトリチル（４６．４ｇ，０．１３７モル）を加えた。その反応混合物を室温で９０分間撹拌し、そしてメタノール（２０ｍＬ）を加えた。その混合物を真空中で濃縮し、そして酢酸エチル（２×１Ｌ）と飽和重炭酸ナトリウム（１Ｌ）とに分配した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、そして真空中で蒸発させた。得られた油状物をジクロロメタン（２００ｍＬ）中に溶解させ、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン５０：５０：１を用いて精製した。生成物画分をプールし、真空中で濃縮して乾燥させて、標題化合物６３．６ｇ（７６．６％）を与えた。
ｖ．  ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）シトシン
４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−シトシン（６１．８ｇ，９２．８ミリモル）を、ジクロロメン（３００ｍＬ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４０．９ｍＬ，０．１３０モル）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（４．７６ｇ，０．３当量）と一緒に室温で１７時間撹拌した。その混合物を飽和重炭酸ナトリウム（１Ｌ）で洗浄し、そしてその重炭酸塩溶液をジクロロメタン（５００ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層をブライン（１Ｌ）で洗浄し、そしてそのブラインをジクロロメタン（１００ｍＬ）で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して約２００ｍＬの容量にした。得られた材料を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによってヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン６０／４０／１を用いて精製した。生成物画分を真空中で濃縮し、アセトニトリル（５００ｍｌ）中に溶解させ、濾過し、真空中で濃縮し、そして乾燥させて泡状物にした。その泡状物を細断し且つ恒量まで２４時間乾燥させて、標題化合物７２．４ｇ（９０％）を与えた。
１Ｈ  ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ３）δ１．１７−１．３（ｍ，１２Ｈ，４ｘＣＨ３），１．５−１．６（ｍ，２Ｈ，２ｘＣＨ），２．３−２．４（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＮ），２．６−２．７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ２ＣＮ），３．３−３．９（ｍ，１３Ｈ，２ｘＣＨ３ＯＡｒ，５’ＣＨ２，ＣＨ２ＯＰ，Ｃ−５  ＣＨ３），４．２−４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３−４．７（ｍ，１Ｈ，３’），５．０−５．２（ｍ，１Ｈ，２’），６．０−６．２（ｄｄ，１Ｈ，１’），６．８−６．９（ｍ，４Ｈ，ＤＭＴ），７．２−７．６（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ，Ｂｚ），７．８２−７．８６（ｄ，１Ｈ，Ｃ−６），８．２−８．３（ｄ，２Ｈ，Ｂｚ）。
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；ｂｓ，１５１．７０６；ｂｓ，１５１．９４１。
実施例５−ｃ
ｉ．  １−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
５−メチルウリジン（７．８ｇ，３０．２ミリモル）および酸化ジブチルスズ（７．７ｇ，３０．９ミリモル）を、メタノール（１５０ｍＬ）中に懸濁させ且つ加熱して１６時間還流させた。その反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、そしてその固体をメタノール（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。得られた固体を乾燥させて、標題化合物１２．２ｇ（８０．３％）を与えた。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。ＮＭＲは構造と一致した。
ii．  １−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５．０ｇ，１０．２ミリモル）およびヨードプロパン（１４．７ｇ，７２．３ミリモル）を、ＤＭＦ中において１００℃で２日間撹拌した。その反応混合物を室温まで冷却し、濾過し、そして濃縮した。残留するＤＭＦをアセトニトリルと一緒に共蒸発させた。残留物を乾燥した後、２．４０ｇ（７８％）の標題化合物および３’−Ｏ−プロピル異性体を粗製混合物として得た。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
iii．  １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
粗製混合物としての１−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジンおよび３’−Ｏ−プロピル異性体（２．４ｇ，８．４ミリモル）を、ピリジン（２×４０ｍＬ）と一緒に共蒸発させ、そしてピリジン（６０ｍＬ）中に溶解させた。その溶液をアルゴン下の室温で１５分間撹拌し、そして塩化ジメトキシトリチル（４．２７ｇ，１２．６ミリモル）を加えた。その混合物をｔｌｃによって定期的に検査し、そして３時間で完了した。メタノール（１０ｍＬ）を加え、そしてその混合物を１０分間撹拌した。その反応混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、初めから終わりまで用いられる１％トリエチルアミンを含むヘキサン／酢酸エチル６０：４０を用いて精製した。適当な画分のプールおよび濃縮は、標題化合物１．３２ｇ（２６％）を与えた。
iv．  １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５０．０ｇ，８６ミリモル）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３８ｍＬ，１２０ミリモル）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（４．４５ｇ，２５．８ミリモル）をジクロロメタン（５００ｍＬ）中に溶解させ且つ室温で４０時間撹拌した。その反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×４００ｍＬ）およびブライン（１×４００ｍＬ）で洗浄した。その水性層をジクロロメタンで逆抽出した。ジクロロメタン層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル／ヘキサン４０：６０および１％トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて４３ｇ（６７％）を与えた。
ｖ．  １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（１０．０ｇ，１６．６ミリモル）をピリジン（５０ｍＬ）中に溶解させ、そして無水酢酸（４．７ｍｌ，５２．７ミリモル）を加えた。その反応混合物を１８時間撹拌し、そして過剰の無水酢酸をメタノール（１０ｍＬ）で中和した。その混合物を真空中で濃縮し、そして得られた残留物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）中に溶解させた。その酢酸エチルを飽和ＮａＨＣＯ３（１５０ｍＬ）で洗浄し、そしてその飽和ＮａＨＣＯ３洗液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で逆抽出した。酢酸エチル層を一緒にし、そして真空中で濃縮して、白色泡状物１１．３ｇを生成した。粗収率は１００％を越え、そしてＮＭＲは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
実施例５−ｄ
ｉ．  １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジン
トリアゾール（１０．５ｇ，１５２ミリモル）をアセトニトリル（１２０ｍｌ）およびトリエチルアミン（２３ｍＬ）中に無水条件下で撹拌しながら溶解させた。得られた溶液をドライアイスアセトン浴中で冷却し、そしてオキシ塩化リン（３．９ｍＬ，４１ミリモル）を５分間にわたって徐々に加えた。その混合物は、更に１０分間撹拌されて、生成物形成を示す希薄なスラリーになった。１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジン（１１．２ｇ，１６５ミリモル）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）中に溶解させ、そして上記スラリーに対して加え、ドライアイスアセトン浴温度を維持した。その反応混合物を３０分間撹拌した後、室温まで暖め且つ更に２時間撹拌した。その混合物を冷蔵庫中に０℃で１８時間置いた後、取出し、そして室温まで暖めた。その混合物の酢酸エチル／ヘキサン１：１中のｔｌｃは、出発物質の完全な転化を示した。その反応混合物を真空中で濃縮し、酢酸エチル（３００ｍＬ）中に再溶解させ、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×４００ｍＬ）およびブライン（４００ｍＬ）で抽出した。水性層を酢酸エチル（２００ｍＬ）で逆抽出した。酢酸エチル層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして真空中で濃縮した。粗収量は１１．３ｇ（９５％）であった。ＮＭＲは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
ii．  １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルシチジン
１−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジン（１１．２ｇ，１６．１ミリモル）を、ドライアイスアセトン温度の１００ｍＬボンベ中の液体アンモニア（５０ｍｌ）中に溶解させた。そのボンベを室温まで１８時間暖めた後、ドライアイスアセトン温度まで再冷却した。ボンベ内容物をビーカーに移し、そしてメタノール（５０ｍＬ）を加えた。その混合物を蒸発させてほぼ乾固させた。酢酸エチル（３００ｍＬ）を加え、そして若干の固体を濾去した後、飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×２５０ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、前に濾去された固体と一緒にし、そして真空中で濃縮して、１０．１ｇの材料を与えた。粗収率は１００％を越え、そしてＮＭＲは標題化合物の予想構造と一致した。この材料を更に精製することなく次の反応で用いた。
iii．  １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルシチジン（７．２８ｇ，１０．１ミリモル）および無水安息香酸（４．５ｇ，２０ミリモル）を、ＤＭＦ（６０ｍｌ）中に溶解させ且つ室温で１８時間撹拌した。その反応混合物を真空中で濃縮し、そして酢酸エチル（３００ｍＬ）中に再溶解させた。その酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×４００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル／ヘキサン１：２および１％トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて５．１ｇ（１−（２−Ｏ−プロピルジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−５−メチルウリジンで開始する４段階で５９％）を与えた。
iv．  １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン
１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリトロペントフラノシル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン（５．０ｇ，７ミリモル）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．６ｍＬ，１１．３ミリモル）およびジイソプロピルアミノテトラゾリド（０．４２ｇ，２．４ミリモル）をジクロロメタン（８０ｍＬ）中に溶解させ且つ室温で４０時間撹拌した。その反応混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２×４０ｍＬ）およびブライン（１×４０ｍＬ）で洗浄した。その水性層をジクロロメタンで逆抽出した。ジクロロメタン層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そして真空中で濃縮した。得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル／ヘキサン４０：６０および１％トリエチルアミンを用いて精製した。適当な画分をプールし、濃縮し、そして高真空下で乾燥させて７．３ｇ（９８％）を与えた。
実施例５−ｅ
ｉ．  ２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン
方法１：
粗製２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１０．０ｇ，０．０４１６モル）（実施例２−ａ）を、ステンレス鋼製ボンベ（１００ｍＬ容量）中のメタノール（８０ｍＬ）中に溶解させた。ホウ酸トリメチル（５．６ｍＬ，０．０４９モル）を加えた（注記１）。そのボンベを密封し且つ１５０℃の油浴中に入れ、そこで約５ａｔｍの圧力を生じさせた。４０時間後、そのボンベを氷中で冷却し、開け、そしてその内容物を減圧下で濃縮して、１２ｇの黄褐色泡状物にした。その粗製物のＮＭＲは、出発物質中の不純物を混入した生成物並びに微量のチミンおよび出発物質と一致した（注記２）。その粗生成物をそのまま次の工程で用いた。
【０１００】
ホウ酸トリアルキルは、ボランの溶液（例えば、ＴＨＦ中１Ｍ）を所望のアルコールに対して加え且つ得られた水素ガスを発生させることによって好都合に生成することができる。ヌクレオシドは、この点で、メタノールの酢酸エチル中の勾配（０〜１０％）を用いるカラムクロマトグラフィーおよび生成物を無水エタノールから結晶化させることによって精製して、白色針状結晶，ｍｐ１９２〜１９３℃（ｍｐ１９７−１９８℃）を与えることができる。この化合物の融点の文献基準は、E.Ootsuka，H.Inoue，1989年４月４日の特許公報第89-85456号に包含されている。
方法２：
純２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．０ｇ，４．１６ミリモル）およびホウ酸トリメチル（０．５６ｍＬ，４．９ミリモル）を、ステンレス鋼製ボンベ（１００ｍＬ）中のメタノール（２０ｍＬ）中に溶解させた。そのボンベを１５０℃の油浴中に入れた。８０時間後、ＴＬＣは、反応が概ね完了したことを示した。その溶媒を除去して白色泡状物を生じた。ＮＭＲは、９３：７の生成物対出発物質比率を示し、他の不純物は認められなかった。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって酢酸エチル中のメタノール勾配（０〜１０％）を用いて精製して、純粋な生成物８５０ｍｇ（７５％）およびまだ不純な生成物２５０ｍｇを生じた。分析的に純粋な試料をＮＭＲ用に調製した。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．７９（ｓ，３Ｈ，５−ＣＨ３），３．３５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．５−３．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’），３．７−３．９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３’，４’），４．１５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’），５．１７（ｍ，２Ｈ，３’，５’−ＯＨ），５．８７（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），７．８０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），１１．３７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）。
Ｃ１１Ｈ１６Ｎ２Ｏ６（２７２．２６）の分析計算値：Ｃ，４８．５２；Ｈ，５．９２；Ｎ，１０．２９。実測値：Ｃ，４８．５６；Ｈ，５．８８；Ｎ，１０．２２。
方法３：
方法２に記載した方法と同じ、ただし、３０ｍｇの炭酸水素ナトリウムが反応に加えられ（粗アンヒドロのナトリウム含量を一致させるため）、そのため反応が完了するのに２４時間かかった。塩化アンモニウム（５０ｍｇ）が塩基を中和するために加えられ、溶液を乾固させた。粗生成物のＮＭＲは３種の重要でないヌクレオシド不純物（総計で約６％）を示した。同様のカラムを行った後、残渣をメタノール／酢酸エチルから再結晶すると、最初に８５０ｍｇ、続いて１２０ｍｇの物質が得られ、両方ともなお２−３％の未知のヌクレオシド不純物を含んでおり、８５％の収率であった。
ｉｉ．５’−Ｏ−ジメトキシトリフェニルメチル−２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン
粗２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン（１２ｇ）をピリジン（２ｘ５０ｍＬ）と共蒸発させ、乾燥ピリジン（５０ｍＬ）に溶解した。塩化ジメトキシトリフェニルメチル（１８．１ｇ，０．０５４モル）を加え、フラスコに栓をして室温で４５分間放置した。反応を停止させるためにメタノール（１０ｍＬ）を加え、減圧下で溶液を濃縮すると油状物となった。残渣は酢酸エチル（２ｘ４００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５００ｍＬ）間に分配させた。有機層を併せて乾燥し（硫酸ナトリウム）、濾過して濃縮すると黄色あわ状物を得た。あわ状物は塩化メチレン（６０ｍＬ）に溶解し、シリカゲルカラムにのせ、酢酸エチル−ヘキサン−トリエチルアミン（６０：４０：１）で溶出した。生成物を含有している分画を集めて濃縮し、乾燥アセトニトリルと共蒸発させた（２ｘ５０ｍＬ）。得られた残渣は１ｍｍＨｇで２４時間乾燥すると、パリパリした白色あわ状物となった（５−メチルウリジンからの３工程で６０．４％）。
実施例５−ｆ
ｉ．２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチルウリジン
２５０ｍｌの３頚丸底フラスコ中、１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル  リボース（０．５００ｇ、１ミリモル）および５−メチル−２−チオウラシル（０．１５６ｇ、１．１ミリモル）を真空下で一夜乾燥させた。これらの成分は１０ｍＬの乾燥アセトニトリルに溶解し、８０℃へ加熱した。この温かい溶液にＮ−Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（０．５０９ｇ、２．５ミリモル）を加え、反応液は８０℃で１時間攪拌した。反応混合液を加熱装置から取り出して室温まで放置により冷却し、トリメチルシリルトリフレート（０．３３４ｇ、１．５ミリモル）を滴加した。反応混合物は次に５０℃に加熱し、４時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル／ヘキサン  １：１を使用するＴＬＣにより検査すると、反応が完了していることが示された。溶液を室温まで冷却し、５０ｍＬのジクロロメタンおよび５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液に分配した。水相をジクロロメタンで２回以上抽出し、有機層を併せ、硫酸マグネシウムで乾燥して濃縮すると淡黄色あわ状物を得た。このあわ状物はさらに精製することなく使用された。
ｉｉ．２−チオ−５−メチルウリジン
粗２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メチルウリジン（２０ｇ、３７ミリモル）を５００ｍＬのメタノールに溶解した。この溶液にナトリウムメトキシド（２．０ｇ、３７ミリモル）を加え、反応液を２時間攪拌した。反応液を酢酸エチル／ヘキサン  １：１および酢酸エチル／メタノール９：１を使用するＴＬＣにより検査すると、反応が完了していることが示された。Ｄｏｗｅｘ５０  Ｈ＋樹脂をｐＨ試験紙で溶液が中性になるまで加え、樹脂を濾過した。樹脂は別のメタノール１００ｍｌで洗浄し、併せた濾液を濃縮すると、表題化合物８．５ｇ（８４％）が淡黄色あわ状物として得られた。
実施例５−ｇ
２’−Ｏ−メチル−５−メチル−２−チオウリジン
攪拌した２−メチル−５−チオウリジン（０．５００ｇ、１．８ミリモル）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、酸化ジブチルスズ（０．５００ｇ、２．０ミリモル）ヨウ化テトラブチルアンモニウム（０．７３８ｇ、２ミリモル）およびヨウ化メチル（１．０２２ｇ、７．２ミリモル）を加える。反応フラスコを封じ、５０℃で１６時間加熱する。混合物を冷却し、追加のヨウ化メチル（１．０２２ｇ、７．２ミリモル）を加え、反応液をさらに１６時間加熱する。この時間の終了時に反応混合物を室温まで冷却して塩化メチレンで希釈し、塩化メチレン／メタノールの濃度勾配を用いてクロマトグラフィーを行った。適切な分画を集めて濃縮すると２’−Ｏ−メチル−５−メチル−２−チオウリジンが得られる。
実施例５−ｈ
２’−Ｏ−プロピル−５−メチル−２−チオウリジン
表題化合物はヨウ化メチルの代わりにヨウ化プロピル（１．２２ｇ、７．２ミリモル）を用いる実施例５−ｇの方法により製造される。
実施例５−ｉ
ｉ．２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チオウリジン
表題化合物はヨウ化メチルの代わりにブロモ−プロピルフタルイミド（０．６７ｇ、２．５ミリモル）を用いる実施例５−ｇの方法により製造され、追加（０．３００ｇ）は２日目に加えられる。
ｉｉ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２−チオウリジン
２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チオウリジン（２．６ｇ、３．６ミリモル）を乾燥ピリジンに溶解し２度共蒸発させた。得られたあわ状物は２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル（１．８ｇ、５．５ミリモル）続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ、０．４ミリモル）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に１ｍＬのメタノールを加えた。溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍＬのクロロホルム間に分配させた。水層を２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物が得られ、シリカゲルを中和するために０．５％ピリジンを加えたメタノール／クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
ｉｉｉ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２−チオウリジン（１ｇ、１．６ミリモル）をＤＭＦに溶解し、０℃に冷却した。この溶液に、トリエチルアミン（０．３００ｇ、３ミリモル）続いて塩化トルオイル（０．３００ｇ、１．９２ミリモル）を５分以上かけて滴加した。反応液は放置して室温まで温めて一夜攪拌し、反応が完了したらメタノールで停止させて濃縮すると油状物が得られた。油状物は次に２５０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム／クロロホルム１：１溶液間に分配させた。水層を２回、７５ｍＬのクロロホルムで抽出し、有機層を乾燥して濃縮すると油状物が得られた。保護ヌクレオシドはヘキサン／酢酸エチル濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の生成物はＮ−３トルオイルおよびＳ−２トルオイル化合物の混合物として集められた。この混合物はそのままフォスファイト化操作に使用された。
ｉｖ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５−メチル−２−Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルアミン−５−メチル−２Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン（１６．０１ｇ、２２ミリモル）およびジイソプロピルエチルアミン（１０ｍｌ）のＴＨＦ（２００ｍｌ）溶液に、０℃でクロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン（５．６ｍｌ、２５ミリモル）を加える。反応混合物は室温で２０時間攪拌した。反応液は濃縮し、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。１％トリエチルアミンを常に含む酢酸エチル／ヘキサン濃度勾配で溶出し、適切な分画を集めて濃縮すると表題化合物が得られる。
実施例５−ｊ
ｉ．２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジン
５００ｍｌフラスコ中、２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チオウリジン（５．０ｇ、１５．８ミリモル）を１００ｍｌのメタノールに溶解する。ヒドラジン（２．０２ｇ、６３．２ミリモル）を加え、混合物は攪拌しながら１４時間加熱還流（６０−６５℃）する。真空下、溶媒を蒸発させ、残渣はジクロロメタン（１５０ｍｌ）に溶解して等容量のＮＨ４ＯＨで２回抽出する。有機層を蒸発させると粗生成物が得られる。ＮＭＲが生成物純度の検定に使用された。生成物はさらに精製することなく次の反応に使用された。
ｉｉ．２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジン
２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジンをＭｅＯＨに溶解し、５当量のトリエチルアミン続けて１０当量のトリフルオロ酢酸エチルを加える。表題化合物が精製後に単離される。
ｉｉｉ．２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリジン
２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−メチル−２−チオウリジン（２．５ｇ、３．６ミリモル）を乾燥ピリジンに溶解し、２度共蒸発させる。得られた黄色あわ状物は２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル（１．８ｇ、５．５ミリモル）続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ、０．４ミリモル）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に１ｍＬのメタノールを加えた。溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍＬのクロロホルム間に分配させた。水層を２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮すると油状物が得られ、シリカゲルを中和するために０．５％ピリジンを加えたメタノール／クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると表題化合物が得られた。
ｉｖ．２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリジン
実施例５−ｊ−ｉｉｉの表題化合物を用い、実施例５−ｉ−ｉｖの方法により表題化合物が製造される。
実施例５−ｋ
ｉ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ−５−メチルウリジン
２−チオ−５−メチルウリジン（１ｇ、３．６ミリモル）を乾燥ピリジンに溶解し、２度共蒸発させる。得られた黄色あわ状物は２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解し、塩化ジメトキシトリチル（１．８ｇ、５．５ミリモル）続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５０ｇ、０．４ミリモル）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌した。反応混合物に１ｍＬのメタノールを加えた。溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍＬのクロロホルム間に分配させた。水層を２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物が得られ、シリカゲルを中和するために０．５％ピリジンを加えたメタノール／クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。
ｉｉ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ−５−メチルウリジン（１ｇ、１．７３ミリモル）を乾燥ＤＭＦと２度共蒸発させて乾燥ＤＭＦに溶解し、イミダゾール（０．１４１ｇ、２．０８ミリモル）続いてｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（０．３１３ｇ、２．０８ミリモル）を加えた。反応混合物は一夜攪拌した。反応液は酢酸エチル／ヘキサン１：１を使用するＴＬＣにより検査され、それは反応が完了していることを示した。次に反応混合物を５％炭酸水素ナトリウム内に注ぎ、クロロホルムで３回抽出した。併せた有機溶液は硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮すると油状物となった。得られた油状物はメタノール／クロロホルム濃度勾配を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、２’および３’シリル保護ヌクレオシドが別々に単離された。
ｉｉｉ．５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−２’−メタンスルホニル−５−メチル−２−チオウリジン
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチル−２−チオウリジン（１．０ｇ、１．４５ミリモル）をピリジンに溶解して０℃に冷却した。この溶液にメタンスルホニルクロリド（０．１８３ｇ、１．６ミリモル）を滴加した。ＴＬＣにより反応が完了したと認められるまで反応液を攪拌した。反応混合物をメタノールで中和して濃縮すると油状物が得られた。表題化合物はそのまま続いての反応に使用される。
ｉｖ．５’−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−２，２’−チオアンヒドロ−５−メチル−２−チオウリジン
実施例５−ｋ−ｉｉｉで得られたメシル化ヌクレオシドに５当量のナトリウムメトキシドを加え、チオアンヒドロ生成物の形成が完了するまで攪拌した。次に溶液をＤｏｗｅｘ５０Ｗ（Ｈ＋型）で中和し、樹脂を濾過して除き、得られた溶液を濃縮すると表題化合物が得られた。
ｖ．２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリジン
実施例５−ｋ−ｉｖで得られたチオアンヒドロヌクレオシドを無水ジオキサンに溶解した。この溶液に６当量のＨＦ／ピリジン複合体を加え、ＴＬＣにより反応が完了したと認められるまで反応液を攪拌した。反応混合物は等容量の氷に注ぎ、中性になるまで炭酸カルシウムを加えた。固形物を濾過し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると表題化合物が得られた。
ｖｉ．２’−フルオロ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５’−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリジン
２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリジンを実施例５−ｉ−ｉｖの方法により処理すると表題化合物が得られる。
実施例６
オリゴリボヌクレオチド合成
無置換および置換ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチド（本明細書においてＰＯ結合オリゴリボヌクレオチドとも称される）は、ヨウ素での酸化による標準ホスホロアミダイト化学を使用する自動化ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  モデル３８０Ｂ）により合成された。
【０１０１】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（本明細書においてＰＳ結合オリゴリボヌクレオチドとも称される）は、ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチドの方法により合成されるが、但し、標準酸化ボトルはホスファイト結合の段階的硫黄化のために３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オンの０．２Ｍアセトニトリル溶液に置換されていた。硫黄化待ち工程は６８秒に延長され、次にキャッピング工程が続いた。ＣＰＧカラムからの切断および５５℃での濃水酸化アンモニウム中での脱保護（１８時間）後、オリゴヌクレオチドは０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液から２．５容量のエタノールで２回沈澱させることにより精製された。分析ゲル電気泳動は２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５４ｍＭトリス−ホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０で行われた。オリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートはポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づいて、完全長物質の８０％より大きいことが判断された。
【０１０２】
ホスフィネート  オリゴリボヌクレオチド（本明細書においてＰＩ結合オリゴリボヌクレオチドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第５，５０８，２７０号に記載されているように製造される。
【０１０３】
アルキルホスホネート  オリゴリボヌクレオチド（本明細書においてＰＭｅ結合オリゴリボヌクレオチドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように製造される。
【０１０４】
ホスホロアミダイト  オリゴリボヌクレオチド（本明細書においてＰＮ結合オリゴリボヌクレオチドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第５，２５６，７７５号に記載されているように製造される。
【０１０５】
アルキルホスホノチオエート  オリゴリボヌクレオチド（本明細書においてＭｅＰＳ結合オリゴリボヌクレオチドとも記される）は本明細書において援用される公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（各々ＷＯ９４／１７０９３およびＷＯ９４／０２４９９として公開）に記載されているように製造される。
【０１０６】
３’−デオキシ−３’−アミノ  ホスホロアミデート  オリゴリボヌクレオチド（本明細書において３’ＮＰＮ結合オリゴリボヌクレオチドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第５，４７６，９２５号に記載されているように製造される。
【０１０７】
ホスホトリエステル  オリゴリボヌクレオチド（本明細書においてＰＯＭｅ結合オリゴリボヌクレオチドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第５，０２３，２４３号に記載されているように製造される。
【０１０８】
ボラノホスフェート  オリゴリボヌクレオチド（本明細書においてＢＰ結合オリゴリボヌクレオチドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第５，１３０，３０２および５，１７７，１９８号に記載されているように製造される。
実施例７−ａ
オリゴリボヌクレオシド合成
メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書においてＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとも記される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書においてＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとも記される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（本明細書においてａｍｉｄｅ−３結合オリゴリボヌクレオシドとも記される）およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（本明細書においてａｍｉｄｅ−４結合オリゴリボヌクレオシドとも記される）ならびに例えば、ＭＭＩおよびＰＯまたはＰＳ結合を交互に持つ混合主鎖化合物は本明細書において援用される米国特許第５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７号および公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４およびＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５（各々ＷＯ９２／２０８２２およびＷＯ９２／２０８２３として公開）に記載されているように製造される。
【０１０９】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシド（各々本明細書においてＦＡおよびＴＦＡオリゴリボヌクレオシドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第５，２６４，５６２および５，２６４，５６４号に記載されているように製造される。
【０１１０】
エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書においてＥＴＯ結合オリゴリボヌクレオシドとも記される）は本明細書において援用される米国特許第５，２２３，６１８号に記載されているように製造される。
実施例７−ｂ
ＰＮＡ
ペプチド核酸（ＰＮＡ）それ自体は既知であり、ペプチド核酸（ＰＮＡ）：合成、特性および可能性のある応用、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３、を参考とした任意の種々の方法に従って製造される。それらはまた、米国特許第５，５３９，０８３号（１９９４年２月２３日に出願された一連番号０８／２００，７４２に対応し、本出願と同じ譲受人に譲渡されている）に従っても製造される。これらの参照文献は本明細書において援用される。
実施例８
キメラ  ホスホロチオエート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートおよび２’−ＯＨホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを持つキメラ  オリゴリボヌクレオチドは上記のようなＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化ＤＮＡシンセサイザー  モデル３８０Ｂを使用して合成された。オリゴリボヌクレオチドは自動化シンセサイザーおよびＲＮＡ部分のために５’−ジメトキシトリチル−２’−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル  ３’−Ｏ−ホスホロアミダイトおよび５’および３’ウイングのために５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトを使用して合成された。環外アミン上の保護基は、ｒＡおよびｒＧのためにはフェノキシアセチル、ｒＣおよび２’−Ｏ−メチルＡおよび２’−Ｏ−メチルＣのためにはベンゾイル、および２’−Ｏ−メチルＧのためにはイソブチリルであった。標準合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基の送り込み後の待ち工程を６００秒に延長し、ＲＮＡのために４回および２’−メチルのために２回反復するように修正した。完全に保護されたオリゴリボヌクレオチドは支持体から切断され、アンモニア／エタノール３：１中、室温で一夜かけてホスフェート基を脱保護し、凍結乾燥した。次に、すべての塩基を脱保護するために室温で２４時間メタノール性アンモニアで処理し、試料は再び凍結乾燥した。ペレットは２’位を脱保護するためにＴＢＡＦの１Ｍ  ＴＨＦ溶液に室温で２４時間再懸濁した。反応を１Ｍ  ＴＥＡＡで停止させ、ロートバックで試料を１／２の容量に減じた後、Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩した。回収されたオリゴは収率が分光学的に、純度がキャピラリー電気泳動および質量分光計により分析された。
実施例９
キメラ  ”ギャップマー”オリゴリボヌクレオチド
ｉ．キメラのメチルホスフェート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＭｅ・［２’−ＯＨ］／ＰＭｅ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＭｅオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとメチルホスフェート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｉｉ．キメラ  ホスホロアミデート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＮ・［２’−ＯＨ］／ＰＮ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＮオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホロアミデート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｉｉｉ．キメラ  ホスホロアミデート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／３’ＮＰＮ・［２’−ＯＨ］／３’ＮＰＮ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／３’ＮＰＮオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いると３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミデート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｉｖ．キメラ  ホスフィネート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＩ・［２’−ＯＨ］／ＰＩ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＩオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスフィネート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｖ．キメラ  アルキルホスホノチオエート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭｅＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＭｅＰＳ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭｅＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホノチオエート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｖｉ．キメラ  ホスホロジチオエート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／Ｐ２Ｓ・［２’−ＯＨ］／Ｐ２Ｓ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／Ｐ２Ｓオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホロジチオエート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｖｉｉ．キメラ  ホスホセレネート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳｅ・［２’−ＯＨ］／ＰＳｅ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳｅオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとホスホセレネート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｖｉｉｉ．キメラ  ボラノホスフェート  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＢＰ・［２’−ＯＨ］／ＢＰ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＢＰオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとボラノホスフェート主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
ｉｘ．キメラ  メチルホスホトリエステル  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＯＭｅ・［２’−ＯＨ］／ＰＯＭｅ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＯＭｅオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法において、実施例６のオリゴリボヌクレオチドを用いるとメチルホスホトリエステル主鎖を持つキメラオリゴリボヌクレオチドが製造される。
実施例１０
キメラ  オリゴリボヌクレオシド
ｉ．キメラ  メチレンメチルイミノ  オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／MMＩ・［２’−ＯＨ］／ＭＭＩ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭＭＩオリゴリボヌクレオシド
実施例７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してメチレンメチルイミノ結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
ｉｉ．キメラ  メチレンジメチルヒドラゾ  オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／MＤＨ・［２’−ＯＨ］／ＭＤＨ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭＤＨオリゴリボヌクレオシド
実施例７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してメチレンジメチルヒドラゾ結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
ｉｉｉ．キメラ  ホルムアセタール  オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＦＡ・［２’−ＯＨ］／ＦＡ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＦＡオリゴリボヌクレオシド
実施例７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してホルムアセタール結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
ｉｖ．キメラ  チオホルムアセタール  オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＴＦＡ・［２’−ＯＨ］／ＴＦＡ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＴＦＡオリゴリボヌクレオシド
実施例７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してチオホルムアセタール結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
ｖ．キメラ  エチレンオキシド  オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＥＴＯ・［２’−ＯＨ］／ＥＴＯ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＥＴＯオリゴリボヌクレオシド
実施例７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してエチレンオキシド結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
ｖｉ．キメラ  メチレンカルボニルアミノ  オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ａｍｉｄｅ−３・［２’−ＯＨ］／ａｍｉｄｅ−３・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ａｍｉｄｅ−３オリゴリボヌクレオシド
実施例７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオシドを通してａｍｉｄｅ−３結合を持つキメラオリゴリボヌクレオシドが製造される。
実施例１１
キメラ  オリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド
ｉ．メチレンメチルイミノ／ホスホロチオエート  キメラ、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭＭＩオリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド
実施例６および７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つの”ウイング”にメチレンメチルイミノ結合、および中心部”ギャップ”および他の”ウイング”にホスホロチオエート結合を持っている。
ｉｉ．キメラ  メチルホスホネート／メチレンメチルイミノ／ホスホロチオエート  オリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＭｅ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭＭＩオリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド
実施例６および７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方の部分を持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つの”ウイング”にメチレンメチルイミノ結合、中心部”ギャップ”にホスホロチオエート結合、および他の”ウイング”にメチルホスホネート結合を持っている。
ｉｉｉ．キメラ  メチレンカルボニルアミノ／ホスホロチオエート／メチレンカルボニルアミノ  オリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ａｍｉｄｅ−３・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ａｍｉｄｅ−３オリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド
実施例６および７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は両方の”ウイング”にメチレンカルボニルアミノ結合、および中心部”ギャップ”にホスホロチオエート結合を持っている。
ｉｖ．キメラ  メチレンカルボニルアミノ／ホスホロチオエート／メチレンメチルイミノ  オリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ａｍｉｄｅ−３・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭＭＩオリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド
実施例６および７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物は一つの”ウイング”セグメントにメチレンカルボニルアミノ結合、中心部”ギャップ”セグメントにホスホロチオエート結合、および他の”ウイング”セグメントにメチレンメチルイミノ結合を持っている。
ｖ．メチレンメチルイミノ／ホスホジエステル／ホスホロチオエート  キメラ、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭＭＩ−ＰＯ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［−２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＭＭＩ−ＰＯオリゴリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオシド
実施例６および７の化学を用いた実施例８の方法で、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシド両方のセグメントを持つキメラ化合物が製造される。このキメラ化合物はその”ウイング”セグメントにメチレンメチルイミノおよびホスホジエステル結合を交互に、およびその中心部”ギャップ”セグメントにホスホロチオエート結合を持っている。
実施例１２
キメラの”末端”ギャップ形成ホスホロチオエート  オリゴリボヌクレオチド
ｉ．”３’−末端”ギャップ形成ホスホロチオエート  キメラ、例えば、［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その３’末端に”オープンギャップ”セグメント、その５’末端に”ウイング”セグメントおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉ．”５’−末端”ギャップ形成ホスホロチオエート  キメラ、例えば、［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その５’末端に”オープンギャップ”セグメント、その３’末端に”ウイング”セグメントおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉｉ．”３’−末端”ギャップ形成ホスホロチオエート  キメラ、例えば、［２’−Ｆ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その３’末端に”オープンギャップ”、その５’”ウイング”セグメントに２’−フルオロヌクレオシド、そのオープン”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例１３
単一形主鎖結合および変異ヌクレオシドサブユニットを持つキメラ  オリゴリボヌクレオチド
ｉ．キメラ  ２’−Ｏ−エチル  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｅｔ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−Ｅｔ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−エチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉ．キメラ  ２’−Ｏ−プロピル  オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−Ｐｒ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−Ｐｒ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−プロピルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉｉ．［２’−Ｏ−Ｆ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−Ｆ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−フルオロヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｖ．［２’−Ｏ−ＥｔＯＭｅ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−ＥｔＯＭｅ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｖ．［２’−Ｏ−ＥｔＯＭｅ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｆ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その５’”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシド、その３’”ウイング”セグメントに２’−フルオロヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｖｉ．［２’−Ｏ−ＥｔＯＭｅ］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その５’”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシド、その３’”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−メチルヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例１４
変異主鎖結合および変異ヌクレオシドを持つキメラオリゴリボヌクレオチド
ｉ．［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＭｅ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｆ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例６の化学を用いる実施例８の方法で、その５’”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシド、その３’”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−フルオロヌクレオシド、”ギャップ”セグメントおよび３’”ウイング”セグメント中にホスホロチオエート結合および５’”ウイング”セグメント中にメチルホスホネート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉ．［２’−Ｏ−Ｍｅ］／ＰＭｅ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｐｒ］／ＰＩオリゴリボヌクレオチド
実施例６の化学を用いる実施例８の方法で、その５’”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、その”ギャップ”に２’−ＯＨヌクレオシド、その３’”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−プロピルヌクレオシド、”ギャップ”セグメント中にホスホロチオエート結合、５’”ウイング”セグメント中にメチルホスホネート結合および３’”ウイング”セグメント中にホスフィネート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例１５
代用物ヌクレオシドを含むキメラオリゴリボヌクレオチド
ｉ．モルホリノヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［モルホリノヌクレオシド代用物］・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［モルホリノヌクレオシド代用物］オリゴリボヌクレオチド
実施例７および実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第５，５０６，３３７号の教えにより製造されたモルホリノヌクレオシド、およびその”ギャップ”セグメントにホスホロチオエート結合を通して連結された２’−ＯＨヌクレオシドを持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉ．シクロブチルヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［シクロブチルヌクレオシド代用物］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［シクロブチルヌクレオシド代用物］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例７および実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第５，３５９，０４４号の教えにより製造されたシクロブチル代用物ヌクレオシド、およびその”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉｉ．ピロリジンヌクレオシド代用物含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［ピロリジンヌクレオシド代用物］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［ピロリジン糖］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例７および実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第５，５１９，１３５号の教えにより製造されたピロリジン代用物ヌクレオシド、およびその”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｖ．”３’−末端”ギャップ形成ＰＮＡ・ホスホロチオエート  キメラ、例えば、ＰＮＡ・［２’−ＯＨ］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例７−ｂの化学を組み合わせた実施例８の方法により、ホスホロチオエート結合を持つ２’−ＯＨヌクレオシドから形成されたその３’末端に”オープンギャップ”および５’”ウイング”セグメントにＰＮＡ代用物を持つキメラ化合物が製造される。
実施例１６
修飾された塩基を持つヌクレオシドを含むキメラ  オリゴリボヌクレオチド
ｉ．Ｎ−２修飾プリン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［修飾プリン］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［修飾プリン］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第５，４５９，２５５号の教えにより製造された４，７，１０，１３−テトラアザヘキサデカ−１−イル  グアノシン  ヌクレオシド、その”ギャップ”に２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉ．Ｃ−５修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［修飾ピリミジン］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［修飾ピリミジン］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第５，４８４，９０８号の教えにより製造された５−プロピニルピリミジン  ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｉｉ．Ｎ−２、Ｃ−６修飾プリン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［修飾プリン］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［修飾プリン］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに米国特許第５，４５９，２５５号の教えにより製造された６−ヒドロキシ−２−フルオロプリン  ヌクレオシド、その”ギャップ”に２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｉｖ．２’−Ｏ−アルキル、Ｃ−５修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−プロピル修飾ピリミジン］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−プロピル修飾ピリミジン］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−プロピル−５−メチルシチジン  ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｖ．２’−Ｏ−アルキル、Ｎ−２、Ｃ−５修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−プロピル修飾ピリミジン］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−プロピル修飾ピリミジン］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−プロピル−２−チオ−５−メチルウリジン  ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｖｉ．２’−Ｏ−アミノアルキル、Ｎ−２、Ｃ−５修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−アミノプロピル修飾ピリミジン］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−アミノプロピル修飾ピリミジン］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−アミノプロピル−２−チオ−５−メチルウリジン  ヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
ｖｉｉ．２’−Ｏ−フルオロ、Ｎ−２、Ｃ−５修飾ピリミジン含有オリゴリボヌクレオチド、例えば、［２’−Ｏ−フルオロ修飾ピリミジン］／ＰＳ・［２’−ＯＨ］／ＰＳ・［２’−Ｏ−フルオロ修飾ピリミジン］／ＰＳオリゴリボヌクレオチド
実施例８の方法で、その”ウイング”セグメントに２’−Ｏ−フルオロ−２−チオ−５−メチル  ウリジンヌクレオシド、その”ギャップ”セグメントに２’−ＯＨヌクレオシドおよび全体を通してホスホロチオエート結合を持つキメラ化合物が製造される。
実施例１７
細胞培養およびｒａｓ標的のノーザンブロット分析
Ｔ２４細胞は、１０％ウシ胎児血清および１００単位／ｍｌペニシリンを補給したマッコイ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で単層として維持された。オリゴマー化合物で２４時間処理された後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、標準プロトコール（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）に従って全細胞ＲＮＡが単離された。Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの相対的存在量を定量するため、全ＲＮＡ（１０μｇ）がノーザンブロッティングによりＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｚｅｔａプローブメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上へ移され、ＵＶ架橋された（ＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒＴＭ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）。メンブレン結合ＲＮＡは３２Ｐ標識０．９ｋｂ  Ｈａ−ｒａｓ  ｃＤＮＡプローブ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）へハイブリダイズされ、ＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）へ暴露された。Ｈａ−ｒａｓ信号の相対量は、同一のメンブレンをとり、ヒトグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ，Ｃｏｌｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で探査した場合に得られた信号でＨａ−ｒａｓ信号を規格化することにより決定された。ノーザンブロットからの信号はホスホイメージャーおよびｉｍａｇｅ  ｑｕａｎｔソフトウェアー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量された。
実施例１８
細胞の化合物処理
単層で増殖している細胞は１５μｇ／ｍｌの最大濃度を持つオリゴの２００ｎＭ当たり５μｇ／ｍｌの濃度でリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含んでいるＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）培地を加えた。培地が完全血清培地で置き換えられた場合はオリゴマー化合物を加え、３７℃で４時間インキュベートした。化合物の存在下で２４時間後、細胞を採取してＲＮＡを次の分析のために調製する。
実施例１９
ＲＮａｓｅ  Ｈ分析
ＲＮａｓｅ  Ｈ分析は活性化された（コドン１２突然変異）Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの塩基（＋２３から＋４７）に対応する１７塩基オリゴリボヌクレオチドを用いて実施された。２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールおよび１００μｌの最終容量に対して４単位のＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ）を含む反応液中で、５’末端標識ＲＮＡ（２０ｎＭ）を１００倍モル過剰の種々の試験オリゴリボヌクレオチドとインキュベートした。オリゴリボヌクレオチドは９５℃に５分間加熱することにより融解させ、９０℃、２リットルの水浴中で室温まで徐々に冷却した。未変性ポリアクリルアミドゲル上、一本鎖末端標識センスＲＮＡおよびアニール化二重鎖間の移動度におけるシフトにより二重鎖形成が確認された。得られた二重鎖は大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）による消化のための基質として試験された。ＲＮａｓｅ  Ｈの１ｘ１０−９ｍｇ／ｍｌ溶液の１μｌを二重鎖反応液１０μｌに加え、３７℃で３０分間インキュベートし、変性装填緩衝液の添加により反応を停止させ、反応生成物は７Ｍ尿素を含む１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＸＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に暴露した。
実施例２０
無細胞インビトロヌクレアーゼアッセイ
無細胞Ｔ２４抽出物実験で使用される二重鎖は上記のようにアニール化されたが、ただし、二重鎖形成後、反応物は１μｌのＲＮａｓｅ  ＴおよびＡ混合物（Ａｍｂｉｏｎ  ＲＰＡＩＩキット、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を加えて３７℃で１５分間インキュベートし、未変性１２％ポリアクリルアミドゲルで精製した。Ｔ２４細胞核および細胞質分画は以前に記載されているように単離された（Ｓｚｙｆ，Ｍ．，Ｂｏｚｏｉｃ，Ｖ．ａｎｄ  Ｔａｎｉｇａｗａ，Ｇ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６，１００２７−１００３０）。アニール化二重鎖（１０μｌ）は３μｇのＴ２４細胞質抽出物と３７℃でインキュベートされた。反応はフェノール／クロロホルム抽出により停止し、担体として１０μｇのｔＲＮＡを添加してエタノール沈殿させた。ペレットは１０μｌの変性充填色素に再懸濁し、生成物を上記のように１２％ポリアクリルアミドゲルで分離した。分子量ラダーを発生させるため、３２Ｐ標識１７−塩基ＲＮＡを５０ｍＭ  ＮａＣＯ３存在下（ｐＨ＝９．０）９５℃に１０分間加熱することにより加水分解した。
実施例２１
５’および３’末端の決定
非標識二重鎖を上記のようにＴ２４抽出物で処理し、この反応液の半分を子ウシ小腸ホスファターゼ（ＣＩＰ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で処理し、半分は未処理のままで残した。ホスファターゼは９５℃に加熱することにより不活性化し、反応液をフェノール／クロロホルムで抽出し、担体としてグリコーゲンを添加してエタノール沈殿させた。沈殿物は次にＴ４ポリヌクレオチド  キナーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および３２Ｐ−γ−ＡＴＰ（ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）で処理した。試料は再びフェノール／クロロホルムで抽出してエタノール沈殿させ、生成物は１２％アクリルアミドゲルで分離し、ＸＡＲフィルムに暴露することにより可視化した。切断二重鎖の３’末端は、二重鎖消化生成物とＴ４  ＲＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および３２Ｐ−ｐＣｐ（ＩＣＮ）との反応により評価された。
実施例２２
Ｔ２４細胞中の標的ＲＮＡのキメラ２’−メトキシ  オリゴリボヌクレオチド媒介消化
種々の２’−糖修飾を含んでいる、Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子のコドン１２に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造活性分析はＭｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，１９９５４−１９９６２およびＭｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８，１４５１４−１４５２２に報告されている。これらの報告において、２’−修飾オリゴヌクレオチドは非修飾２’−デオキシ  オリゴよりも高い親和性でＲＮＡへハイブリダイズするけれども、それらはＨａ−ｒａｓ遺伝子発現の阻害においては全く有効ではなかった。これらの２’−修飾オリゴで観察された活性の欠如は、まさにＲＮａｓｅ  Ｈによる分解の基質として働くことができる二重鎖を作ることができないことによっている。同様のプロトコールに従って、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡを標的とする１７塩基２’−メトキシ  オリゴリボヌクレオチドの中心に連続したリボヌクレオチドが導入されて２’−メトキシ−２’−ヒドロキシ−２’−メトキシホスホロチオエート  オリゴリボヌクレオチド”ギャップ形成”キメラ化合物が形成され、それは中心ギャップセグメント中のリボヌクレオチド含量を変化させた（これらの化合物ならびにそれらの塩基配列の表示は図１を参照されたい）。それらの細胞標的にハイブリダイズした場合、生じた二重鎖は核酸分解の標的ではない二つの部分（２’−メトキシ”ウイング”）およびＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を認識する新規リボヌクレアーゼ活性の標的であることが見いだされている一つの２’−ヒドロキシオリゴリボヌクレオチド部分から成っている。Ｈａ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２位に活性化Ｇ−Ｔトランスバージョン突然変異を含むＴ２４膀胱癌細胞が使用された。この突然変異に特異的な”ギャップ形成”キメラ化合物は培養で増殖しているＴ２４細胞内へトランスフェクトされた。化合物と２４時間インキュベーション後、細胞を採取し、全細胞質ＲＮＡが単離され、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡレベルについてのノーザンブロット分析が実施された。完全に修飾された２’−メトキシオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡの核酸分解性切断を支援せず、従って試験された最も高い濃度でもＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの定常状態レベルの減少を導かなかった（図２ＡおよびＢ）。ギャップにただ３つのみのリボヌクレオチドを持つＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドもまた標的ＲＮＡの核酸分解性切断を誘導できなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。しかしながら、ギャップに５、７および９のリボヌクレオチドを含むＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド、ならびに完全ホスホロチオエート  オリゴリボヌクレオチド分子でＴ２４細胞を処理した場合はすべてＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの定常状態レベルの用量依存性減少を示した（図３Ｂ−３Ｄ）。４つの不適正塩基を配列に含んでいる対照９ＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドでＴ２４細胞を処理すると、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの用量依存性減少は示さず、標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションが活性に必須であることを示唆している（図３Ｅ）。ＲＮＡギャップマー化合物はＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの定常状態レベルの用量依存性阻害を示した。ＲＮＡギャップマー化合物の能力はＲＮＡギャップの大きさ、従ってインビボで形成されるＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の大きさに依存していた。３塩基ＲＮＡギャップマー化合物での細胞処理は標的の切断を起こさなかったが、一方、５、７および９塩基ＲＮＡギャップマー化合物ではＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡの減少が生じた（図４）。ギャップ中に３つのリボヌクレオチドを含むＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡの減少を誘導できないという事実は、標的への結合および切断のために少なくとも４つのリボヌクレオチドの最小ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖領域が活性には必要とされることを示唆している。興味あることに、リボヌクレオチドの代わりにギャップ中にデオキシヌクレオチドを含んでいるキメラＤＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈ媒介分解の基質を形成するために同じ最小ギャップサイズ要求性を示しており（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９６，３６，１０７）、ＲＮａｓｅおよびここに説明した二本鎖ＲＮａｓｅ活性は、それらの基質は明らかに異なっているけれどもいくつかの特性を共有しているであろうことを示唆している。
【０１１１】
図３Ｅに示されているように、４つの不適正塩基をその配列に含んでいる対照９ＲＮＡギャップマー化合物は予期されたように本質的にＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡを減少させなかった。完全ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド分子は５ギャップマーオリゴとほとんど同一の活性を持っていた（図３Ｄ）。このことは、２’−メトキシホスホロチオエート  オリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエート  オリゴリボヌクレオチドに比べてかなり安定であるので、インビボでの一本鎖リボヌクレアーゼによる不活性化により生じる完全オリゴリボヌクレオチドの安定性の相対的低下によるものであろう。Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７。Ｔ２４細胞の種々のオリゴヌクレオチドおよび８００ｎＭまでの種々の濃度での処理が三重に行われ、Ｈａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡレベルの定量は、非処理対照と比べた場合、６００ｎＭで５ギャップマーはＨａ−ｒａｓ  ｍＲＮＡを５１％、７ギャップマーは４９％、９ギャップマーは７７％および完全リボヌクレオチドは３８％減少させる。このことは２’−メトキシウイングにより保護されたＲＮＡギャップマー  オリゴリボヌクレオチドはより強力な分子であることを示唆している。この実施例で示したように、Ｔ２４ヒト膀胱癌細胞中のエンドリボヌクレアーゼ活性はキメラ二重鎖の内部ＲＮＡ：オリゴリボヌクレオチド部分を認識し、標的ｍＲＮＡレベルを減少させた。
実施例２３
Ｔ２４細胞抽出物中に存在する活性はインビトロで内部ＲＮＡ：ＲＮＡ部分内のギャップマーオリゴリボヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖の切断を誘導する
Ｔ２４細胞における二本鎖ＲＮＡ切断活性をさらに特徴付けるため、Ｔ２４細胞抽出物が調製され、インビトロにおいて９ギャップ  オリゴリボヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖を切断する能力が試験された。９ギャップ化合物：３２Ｐ末端標識ＲＮＡ二重鎖が３μｇの細胞質抽出物と３７℃にて図４に示した種々の時間インキュベートされ、続いてフェノール  クロロホルム抽出、エタノール沈殿および変性ゲルでの生成物の分離を行った。この二重鎖がＴ２４抽出物に存在する活性による消化の基質であったことは、完全長末端標識ＲＮＡの消失および図４で矢印により示されているより小さい分子量の消化生成物の出現により示される。さらに、二重鎖の切断に対応する活性は、それが産生する切断生成物のサイズにより示されるように二重鎖のＲＮＡ：ＲＮＡ部分に対する特異性を持っている（３２Ｐ末端標識ＲＮＡの物理地図を参照されたい、図４の最も右）。９デオキシヌクレオチド  ギャップ  オリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖のＲＮａｓｅ  Ｈ切断および９リボヌクレオチド  ギャップ  オリゴリボヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖のＴ２４細胞抽出物による切断は類似の消化生成物を生じるようである。このことは図４および５のゲルを比較することにより見ることができる。両方の活性はそれらの各々の二重鎖中の標的ＲＮＡの３’末端近くの好ましい切断部位を示し、そのことはそれらが結合ならびに機構的特性を共有しているであろうことを示唆している。ヒト臍帯静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト肺癌腫（Ａ５４９）およびヒーラー細胞株から調製された細胞抽出物はすべてインビトロにおいて９ＲＮＡギャップマー：ＲＮＡ標的二重鎖の切断を誘導できる活性を含んでいた。
実施例２４
細胞生成物の細胞質および核分画の両方における標的ＲＮＡの切断
ここで説明された二本鎖ＲＮａｓｅ活性の細胞分布がさらに評価された。核抽出物がＴ２４細胞から調製され、９ＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖を消化する能力が試験された。Ｔ２４細胞から調製された核抽出物は標的二重鎖を分解でき、その活性は細胞質分画の活性と同レベルで核分画に存在することが観察された。
【０１１２】
分子の全体を通してホスホロチオエート結合を含むＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドが合成された。これにより一本鎖ヌクレアーゼへの安定性が増加するので、同様にｄｓＲＮａｓｅによるアンチセンス鎖の切断を阻害することが推論される。従って、上記の活性がＲＮＡ二重鎖分子中の両方の鎖を切断できるかどうかを決定するため、２’メトキシヌクレオチド間のウイングにはホスホロチオエート結合を含んでいるが、ギャップ中の９のリボヌクレオチド間にはホスホジエステル結合を含む９ＲＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドが合成された。この３２Ｐ標識９ＲＮＡギャップマー  ホスホジエステル／ホスホロチオエート  オリゴヌクレオチドおよびその相補的オリゴリボヌクレオチドから成る二重鎖が、Ｔ２４抽出物中の二本鎖ＲＮａｓｅ活性の基質として試験された。活性はこの二重鎖のアンチセンス鎖ならびにセンス鎖を切断でき、消化生成物のパターンから切断が二重鎖のＲＮＡ：ＲＮＡホスホジエステル部分に再び制限されていることが示された。
実施例２５
ＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅ  Ｈの基質ではなかった
実施例２３に示した切断がＲＮａｓｅ  Ｈによるものではないかという可能性を排除するため、９ギャップマーオリゴリボヌクレオチドおよびその相補的５’３２Ｐ標識ＲＮＡの１７塩基対二重鎖を切断する大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｈの能力がインビトロで試験された。図５は二重鎖が形成され、一本鎖３２Ｐ末端標識ＲＮＡの隣で非変性ゲルにより分析された場合、電気泳動移動度に予期されるシフトを示している。図５の最も右のパネルに観察されるように、９ギャップマーオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅで処理された場合により低い分子量バンドは現れなかったのでＲＮａｓｅ  Ｈ切断の基質ではなかった。しかしながら、予期されたように完全デオキシオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖は同一条件下でＲＮａｓｅ  Ｈにより切断され、それはこの酵素で処理されたレーンにより小さな分子種が出現したことから明らかであった（図５、左パネル）。９ギャップマーＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびその相補的ＲＮＡから成る二重鎖はＲＮａｓｅ  Ｈ切断の基質であった。この特別な二重鎖中のＲＮａｓｅ  Ｈ切断部位が二重鎖のＤＮＡ：ＲＮＡ部分に局在化しているという事実は、ＲＮＡギャップマーオリゴリボヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅ  Ｈ消化の基質ではないことをさらに示している。
【０１１３】
９ＤＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖のＲＮａｓｅ  Ｈ切断（図５、左パネル）およびＴ２４細胞抽出物による９ＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ二重鎖の切断が同様の消化生成物を生じることに言及するのは興味を引かれることである（図４参照）。ＲＮａｓｅ  ＨおよびＴ２４細胞抽出物の活性は各々の二重鎖に対して同一の好ましい切断部位を示した。さらに、この部位において、両方のオリゴヌクレオチドは有効性が大まかに一致していた。切断は各々のアンチセンス分子のＤＮＡまたはＲＮＡギャップの反対側領域における標的ＲＮＡの３’末端に制限されている。.
特定の理論に結び付けられるのを望んでいるわけではないが、すぐ前に記載した結果は、ＲＮａｓｅ  Ｈおよび本発明のｄｓＲＮａｓｅは結合ならびに機構的特性を共有しているらしいことを示唆している。しかしながら、ｃ−Ｒａｆ  ｍＲＮＡ上の４つの部位を標的とするＤＮＡおよびＲＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドの分析は、ＲＮａｓｅ  Ｈおよび本明細書に記載したｄｓＲＮａｓｅ活性は明らかに異なった基質特異性を持っている。ｃ−Ｒａｆ  ｍＲＮＡを標的とした”ＲＮＡ様”ギャップマーオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの減少を誘導することはできなかったが、一方、同一の部位を標的としたＲＮａｓｅ  Ｈ活性オリゴデオキシヌクレオチドは標的ｍＲＮＡレベルを減少させることができた。Ｔ２４細胞中の４つのｃ−Ｒａｆ”ＲＮＡギャップマー”により誘導されない切断が考えられる配列特異性または切断によるものであったかどうかを決定するため、４つのｃ−Ｒａｆ”ＲＮＡ様ギャップマー”、ｒａｓ”ＲＮＡ様ギャップマー”および対応する”ＤＮＡ様ギャップマー”が３２Ｐ標識標的オリゴリボヌクレオチドと前もってハイブリダイズされ、Ｔ２４ホモジネートとインキュベートされた。ｒａｓ”ＲＮＡ様ギャップマー”は”ＤＮＡギャップマー”とほとんど同じくらい効率的にｒａｓ標的化ＲＮＡの切断を支援した。しかしながら、ｃ−Ｒａｆセグメントを標的とした”ＲＮＡ様ギャップマー”のただ１つのみが切断を支援し、”ＲＮＡ様ギャップマー”の切断速度は一致する”ＤＮＡ様ギャップマー”よりもかなり遅かった。従って、ＲＮａｓｅと対照的に、ｄｓＲＮａｓｅは無視できない配列特異性を示した。
実施例２６
ヌクレアーゼ活性は５’−リン酸および３’−ヒドロキル末端を発生させる
インビトロにおいて二重鎖のヌクレアーゼ切断により残される５’末端の性質を決定するため、非標識二重鎖が前記のようにＴ２４細胞抽出物とインキュベートされ、次に子ウシ小腸ホスファターゼで前処理して、またはしないでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［３２Ｐ−γ−ＡＴＰ］と反応させた。二重鎖生成物のホスファターゼ処理はポリヌクレオチドキナーゼとの反応間中の３２Ｐ標識取り込みに必須であることが観察され、５’末端のリン酸基の存在を示している。二重鎖消化生成物とＴ４  ＲＮＡリガーゼおよび３２Ｐ−ｐＣｐとの反応により３’末端が評価された。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは３２Ｐ−ｐＣｐの結合に遊離３’−ヒドロキシル末端を必要とする。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼにより３２Ｐ−ｐＣｐを取り込む二重鎖消化生成物の能力は３’−ヒドロキシル基の存在を示している。
実施例２７
哺乳類組織からの二本鎖リボヌクレアーゼの精製および特徴付け
哺乳類細胞（培養細胞株以外の）が二本鎖ＲＮａｓｅ活性を含んでいるかどうかを決定するため、およびそのようなリボヌクレアーゼが精製できるであろう供給源を提供するために、ラット肝臓ホモジネートからｄｓＲＮａｓｅを同定および精製する努力をした。
実施例２７−ａ
ｄｓＲＮａｓｅ用の基質およびアッセイ
予備的実験において、二本鎖ＲＮａｓｅ活性がラット肝臓ホモジネートに観察されたが、ホモジネートはまた高レベルの一本鎖ＲＮａｓｅも示し、そのことはｄｓＲＮａｓｅによる切断後にオリゴリボヌクレオチドの切断が重なることになるためにｄｓＲＮａｓｅ活性の分析を複雑化させる。この問題を解決するため、２つの追加の基質および非変性ゲルアッセイが使用された。”センス”鎖は８塩基ギャップ中にホスホジエステル結合を持ち、（ａ）ホスホロチオエート結合の残基かまたは（ｂ）ホスホロチオエート結合の２’−メトキシヌクレオシドのフランクを持つオリゴリボヌクレオチドであった。両方の基質の”アンチセンス”鎖はホスホジエステルかまたはホスホロチオエート結合を持つ８塩基リボヌクレオチドギャップのどちら側にも２’−メトキシ  ホスホロチオエートウイングを含んでいた（表１）。そのようなｄｓＲＮａｓｅ基質はオリゴリボヌクレオチドよりもエキソヌクレアーゼ消化に対してより安定であり、ホスホロチオエート結合および２’−メトキシヌクレオシド両方を持つ基質は特に安定であった。ラット肝臓においては二本鎖ＲＮａｓｅ活性に比較して一本鎖ＲＮａｓｅが豊富であるので、これらの特色は重要であり、非変性アッセイの使用により支援されている。
【０１１４】
【化１】
2011142911.tif 000002
【０１１５】
＊ボールド体残基は”アンチセンス”鎖中の２’−メトキシヌクレオチド残基を示している。
ラット肝臓細胞質および核抽出物の両方が二重鎖基質の切断を誘導した。両方の抽出物が非変性ゲル電気泳動分析でより急速に移動するバンドを生じた。細胞質抽出物は核抽出物よりも活性であるようである。二本鎖ＲＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ  Ｖ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）は基質を切断した；Ｔ２４抽出物もまた基質を切断した。ＲＮａｓｅ  Ａ（非常に高い濃度である程度の切断が起こった）を除いて、細菌または一本鎖ＲＮａｓｅは基質を切断しなかった。ＲＮａｓｅ  Ａによる切断は二本鎖ＲＮａｓｅの混入によるものか、または、ある条件下でＲＮａｓｅ  Ａが二本鎖基質を切断できるのかどうかは不明である。
実施例２７−ｂ
ラット肝臓細胞質および核抽出物からのｄｓＲＮａｓｅの精製
本明細書で同定された哺乳類ｄｓＲＮａｓｅを精製するため、０．５ｋｇのラット肝臓を緩衝液Ｘ［１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＫＣｌ、０．１５ｍＭスペルミン、０．５ｍＭスペルミジン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍスクロース、１０％グリセロール；すべてＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯからの試薬］中でホモジナイズし、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１Ｍ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用い、１０，０００ｒｐｍで１．５時間遠心した。上清は４０％硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）で沈殿させた。すべてのｄｓＲＮａｓｅ活性が４０％硫酸アンモニウム沈殿に回収された。ペレットは緩衝液Ａ［２０ｍＭヘペス（ｐＨ  ６．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍＭフェニルメチルスルホニウムフルオリド（ＰＭＳＦ）、０．１Ｍ  ＫＣｌ、５％グリセロール、０．１％ＮＰ４０、０．１％トリトンＸ−１００；すべての試薬はＳｉｇｍａから］に再懸濁し、透析して硫酸アンモニウムを除いた。約４０ｇの細胞質抽出物が０．５ｋｇの肝臓から得られた。
【０１１６】
前の実施例で調製された粗核ペレットは緩衝液Ｙ［２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．５）、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、２５％グリセロール］に再懸濁されホモジナイズされた。ホモジネートはＢｅｃｋｍａｎ  Ｊ２−２１Ｍ遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用い、１０，０００ｒｐｍで１．５時間遠心した。上清は７０％硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）で沈殿させた。ペレットは緩衝液Ａに再懸濁し、透析した。すべてのｄｓＲＮａｓｅ活性は７０％硫酸アンモニウム沈殿に回収された。約５ｇの核抽出物が０．５ｋｇの肝臓から得られた。
【０１１７】
本発明のｄｓＲＮａｓｅをさらに精製するために次にイオン交換カラムクロマトグラフィーが実施された。緩衝液Ａ中の核および細胞質抽出物はＦＰＬＣのためにＨｉ−Ｔｒａｐカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にのせた。抽出物はＮａＣｌの直線濃度勾配により溶出して試料を集めた。試料の２５７ｎｍでのＵＶ吸収が決定された。試料は８，０００ｇで１０分間遠心し、緩衝液Ａに再懸濁し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で濃縮して活性を分析した。ｄｓＲＮａｓｅ活性は３００−４５０ｍＭ  ＮａＣｌに対応する分画に溶出された。対照的に、核抽出物中のｄｓＲＮａｓｅ活性は７００−８００ｍＭ  ＮａＣｌに溶出された。
【０１１８】
イオン交換カラムクロマトグラフィーからの分画は濃縮され、サイズ排除クロマトグラフィーにかけられた。イオン交換カラムクロマトグラフィーからの活性試料を集め、ＴＳＫ  Ｇ−３０００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）にのせて１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで溶出した。試料（２００から４００μｌ）を集め、それらの２５７ｎｍでのＵＶ吸収が決定された。試料はＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心フィルター装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて濃縮し、活性を分析した。
【０１１９】
図６はイオン交換カラムクロマトグラフィー後の濃縮活性分画およびサイズ排除クロマトグラフィーからの分画のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示している。最も高いｄｓＲＮａｓｅ活性を持つ分画（レーン４、図６）は約５０から約８０キロダルトンの分子量範囲を持っており、約５０キロダルトンのバンドはプリキャストゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して実施された１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動では増強されたように思われた。
【０１２０】
表２には核および細胞質肝臓抽出物からのｄｓＲＮａｓｅ活性の精製および回収の要約が提供されている。
【０１２１】
【化２】
2011142911.tif 000003
【０１２２】
＊１単位は前記の条件下３７℃にて１５分間で１０ｆＭｏｌのｄｓＲＮＡ二重鎖を消化するのに必要とされる試料の量として定義されている。
肝臓核および細胞質からのｄｓＲＮａｓｅ活性の精製は、異なった性質を持つ少なくとも２つのｄｓＲＮａｓｅが二本鎖ＲＮＡを切断できることを示唆している。核ｄｓＲＮａｓｅはイオン交換カラムから細胞質ｄｓＲＮａｓｅよりも高いＮａＣｌ濃度で溶出された。しかしながら、両方ともＭｇ＋＋を必要とし、オリゴリボヌクレオチドギャップ内のいくつかの部位を切断する。両方とも二重鎖基質を必要とし、二重鎖がホスホロチオエートまたはホスホロチオエート−２’−メトキシヌクレオシド  ウイングを持っている場合、オリゴリボヌクレオチドの”センス”および２’−メトキシホスホロチオエート  キメラの”アンチセンス”鎖から作り上げられている二重鎖中のオリゴリボヌクレオチドを切断できる。
【０１２３】
（１）再現性のあるおよび活性特異的アッセイを確立し、（２）いくつかの供給源を決定し、および（３）前記の方法を経て本発明のｄｓＲＮａｓｅの十分な程度の精製を達成した後、ｄｓＲＮａｓｅは種々の方法によりさらに精製される。すべての場合において、本発明のｄｓＲＮａｓｅはアセトニトリルまたはメタノール中で不安定であるので有機溶媒の使用は避けなければならず（下記参照）、本明細書に記載したアッセイは試料中の所望のｄｓＲＮａｓｅの存在または不在を評価するために使用される。さらなる精製工程には以下の手段が含まれるが、それらに制限されるわけではない。
【０１２４】
いくつかの型のヘパリンカラムが種々のリボヌクレアーゼを精製するために使用されてきた。例えば、セファロースカラムはラナ  カテスベイアーナ（ウシガエル）卵母細胞からの配列特異的リボヌクレアーゼ（Ｌｉａｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，１３７１）、アフリカツメガエル卵母細胞からのリボヌクレアーゼ（Ｎｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｊｐｎ．）１９９３，１６，３５３）、好熱性古細菌スルフォバス  スルファタリカスからのいくつかのリボヌクレアーゼ（Ｆｕｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１１，３０５）、およびヒト脾臓からのリボヌクレアーゼ（Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９０，１９１，５２３）の精製に利用されている。
【０１２５】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは強力なタンパク質精製手段であり、それは所望のタンパク質およびそれらのリガンド間の疎水性相互作用を増強するための強力な塩析塩に依存している（Ｎａｒｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８９，１８２，２６６）。疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）は望まれない夾雑物を含むリボヌクレアーゼＡを精製するために使用された（Ｗｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９６，２７０，１２７；Ｗｅｔｌａｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８６，３５９，５５）。
【０１２６】
本発明のｄｓＲＮａｓｅはヒドロキシアパタイト  クロマトグラフィー（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｌ９９０，１８２，３３９）によってもさらに精製されるであろう。ヒドロキシアパタイト  クロマトグラフィーによりトリパノソーマ  ブルセイからエンド−およびエキソ−リボヌクレアーゼが精製されている（Ｇｂｅｎｌｅ，Ｅｘｐ．Ｐａｒｉｓｉｔｏｌ．，１９９０，７１，４３２；Ｇｂｅｎｌｅ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１９８５，１５，３７）。
【０１２７】
ＲＮＡアフィニティーカラムもまた本発明のｄｓＲＮａｓｅをさらに精製するために使用されるであろう。特に、市販品として入手可能な二本鎖ＲＮＡアフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が使用できる。もしくは、マトリックスが一つまたはそれ以上の本発明のｄｓＲＮａｓｅ基質を含むようにカラムが調製される（詳細は以下の実施例を参照されたい）。本発明のｄｓＲＮａｓｅの相対的配列特異性のため、後者の型のアフィニティーカラムが好適であろう。二本鎖アフィニティーマトリックスの両方の型のマトリックスの分解を防止するため、本発明のｄｓＲＮａｓｅを含む試料はマトリックスの二本鎖ＲＮＡ基質へ結合するｄｓＲＮａｓｅの能力を著しく変化させずにｄｓＲＮａｓｅの分解能力を制限するような様式で処理される。例えば、本発明のｄｓＲＮａｓｅの分解活性は、例えばＥＤＴＡのような適当なキレート剤の添加により利用可能なＭｇ＋＋を欠いた溶液中で、またはそのようなｄｓＲＮａｓｅを含む試料に少なくとも３００ｍＭの最終濃度でＮａＣｌを添加することにより阻害される（以下の副節を参照されたい）。
【０１２８】
当業者は上記の手段ならびに本明細書には記載されていない他の手段は、本発明のｄｓＲＮａｓｅの精製における最適な効率のために最適化される必要があることを認識するであろう。例えば、さらなる精製工程としての一つまたはそれ以上の前記手段の選択、およびそのような手段が応用される順序は処理されたｄｓＲＮａｓｅの純度および比活性の程度に影響するであろう。しかしながら、所望のｄｓＲＮａｓｅ活性に対するさらなる精製工程の影響を決定するために本明細書に記載したアッセイが当業者に容易にできるとするならば、そのような最適化は当業者に帰属すると信じられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのような本分野で知られている他の技術は前記の精製手段にかけられた試料の純度を決定するために使用できる。
実施例２７−ｃ
精製された哺乳類ｄｓＲＮａｓｅの特徴付け
ｄｓＲＮａｓｅ活性に対するいろいろな条件の影響が、イオン交換クロマトグラフィー後の活性分画を用いて評価された。ｄｓＲＮａｓｅ活性は約ｐＨ７から約ｐＨ１０のトリスまたはリン酸緩衝液で示すことができた。ｄｓＲＮａｓｅ活性はアセトニトリルまたはメタノール溶液中では不安定であった。さらに、活性はＮａＣｌにより阻害された；１０ｍＭ  ＮａＣｌで３０％、１００ｍＭ  ＮａＣｌで＞６０％、および３００ｍＭ  ＮａＣｌで１００％。６０℃、８０℃および１００℃で５分間の加熱はｄｓＲＮａｓｅを不活性化した。最適活性は約３７℃から約４２℃の温度範囲で観察された。２５℃で、ｄｓＲＮａｓｅ活性は３７℃で観察された活性の約５０％であった。ｄｓＲＮａｓｅ活性は１０、２０および５０ｍＭ  ＥＤＴＡで阻害されたが，５ｍＭでは阻害されなかったのはＭｇ＋＋の要求性と一致しており、多数回の凍結／融解に安定であった。
実施例２８
精製されたラットｄｓＲＮａｓｅを用いたｄｓＲＮａｓｅ切断部位のさらなる特徴付け
精製されたｄｓＲＮａｓｅを用いて切断部位をより詳しく特徴付けた。エンドヌクレアーゼ切断後および操作中（特に二重鎖の変性後）に起こる一本鎖切断を最小にする必要があった。従って、最も安定な二重鎖基質、すなわち、二重鎖の両方の鎖が２’−メトキシヌクレオシドおよびホスホロチオエート結合から成る隣接領域を含む基質が使用された。
実施例２８−ａ
オリゴヌクレオチドの３２Ｐ標識
センスオリゴヌクレオチドは［ｇ３２Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ４ポリヌクレオチド  キナーゼ、および標準法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ．ａｌ．，１９８９）を用いて５’末端が３２Ｐで標識された。標識オリゴヌクレオチドは１２％変性ＰＡＧＥでの電気泳動により精製された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，１９８９）。標識オリゴヌクレオチドの比活性は約５０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌであった。
実施例２８−ｂ
二本鎖ＲＮＡ消化アッセイ
オリゴヌクレオチド二重鎖は、１０ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび１０５ｃｐｍ３２Ｐ標識センスオリゴヌクレオチドを含む３０μＬの反応緩衝液［２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ］中で調製された。反応液は９０℃に５分間加熱され、３７℃で２時間インキュベートされた。オリゴヌクレオチド二重鎖は総タンパク質濃度で７５μｇの未精製細胞質抽出物、６０μｇの未精製核抽出物、５μｇのイオン交換精製細胞質分画、５μｇのイオン交換精製核分画、または０．５μｇのイオン交換およびゲル濾過精製核分画の未精製および半精製細胞抽出物とインキュベートした。消化反応液は３７℃で０−２４０分インキュベートした。インキュベーション後、各々の反応液の１０μＬをとり、変性ゲル充填緩衝液［５μＬ  ８Ｍ尿素、０．２５％キシレン  シアノールＦＦ、０．２５％ブロモフェノールブルー］の添加により反応を停止した。反応液は９５℃に５分間加熱し、１２％変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。残りの反応液は２μＬの非変性ゲル充填緩衝液［グリセロール、０．２５％キシレン  シアノールＦＦ］で停止した。反応液は１０℃にて、４４ｍＭトリス−ホウ酸および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む１２％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを用いて分析した。
【０１２９】
図７は非変性ゲルの結果を示している。レーン１は未処理３２Ｐ標識センス鎖が非変性ゲル中で移動する位置を示しており、レーン２は０．０２単位のＲＮａｓｅＶ１で処理された”センス”鎖ＲＮＡを示している。残りのレーンでは、０．０２（レーン３）および０．００２（レーン４）単位のＲＮａｓｅＶ１で、未精製核抽出物で０分（レーン５）または２４０分（レーン６）、未精製核抽出物でＭｇ＋＋非存在下２４０分（レーン７）、未精製細胞質抽出物で２４０分（レーン８）、イオン交換精製細胞質抽出物でＭｇ＋＋存在下（レーン９）または非存在下（レーン１０）、およびイオン交換／ゲル濾過精製細胞質抽出物でＭｇ＋＋存在下（レーン９）または非存在下（レーン１０）の、ｄｓＲＮａｓｅ基質を処理した結果を示している。
【０１３０】
図８は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるｄｓＲＮａｓｅ基質の消化生成物の分析結果を示している。レーン１は５ｘ１０−３単位のＲＮａｓｅＡで処理された”センス”鎖ＲＮＡを示しており、レーン２は０．０２単位のＲＮａｓｅＶ１で処理された”センス”鎖ＲＮＡを示している。残りのレーンは、０．０２（レーン３）および０．００２（レーン４）単位のＲＮａｓｅＶ１で、未精製核抽出物で０分（レーン５）または２４０分（レーン６）、未精製細胞質抽出物で２４０分（レーン７）、イオン交換精製細胞質抽出物で２４０分（レーン８）、およびイオン交換／ゲル濾過精製細胞質抽出物で２４０分（レーン９）、処理されたｄｓＲＮａｓｅ生成物を示している。レーン１０は大きさを測るためのＲＮＡ塩基加水分解ラダーである。一本鎖基質のＲＮａｓｅＶ１消化はほとんど分解を起こさなかった（レーン２）。二重鎖のＲＮａｓｅＶ１消化はギャップ内のいくつかの部位での切断を反映している分解を生じた（レーン３および４）。レーン４−９において、ゲルの一番上のバンドは、変性後でさえもいくつかの二重鎖はアニール化されたまま残っていることを示しており、２’−メトキシヌクレオシドから成る二重鎖の非常に強い親和性を反映している。レーン６−９は、核および細胞質リボヌクレアーゼの両方が三重鎖基質をオリゴリボヌクレオチドギャップを持ついくつかの部位で切断したこと、および分解部位がＲＮａｓｅＶ１の部位と異なっていたことを示している。レーン６−９における分解物の位置は、それらが２’−メトキシホスホロチオエート隣接領域（ウイング）であることと一致する。
実施例２９
ＲＮＡアフィニティーカラムおよびリボヌクレアーゼを精製する方法
核酸アフィニティーカラムを準備する技術は本分野では既知である（例えば、Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９１，２０８，１０を参照されたい）。そのようなアフィニティーカラムは、非特異的かまたは特異的様式で基質を結合する所望の化合物のための核酸基質を含むマトリックスから成っている。ＤＮＡ結合タンパク質の精製において最初に利用されたＲＮＡアフィニティーカラムがＲＮＡ結合タンパク質およびリボヌクレアーゼを精製するためにも使用された（例えば、Ｐｒｏｋｉｐｃａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，９２６１；Ｄａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６３，７６９１を参照されたい）。本発明の一つまたはそれ以上のｄｓＲＮａｓｅ基質を含むマトリックスは、多くの組織および細胞で優勢である一本鎖リボヌクレアーゼの作用に抵抗するｄｓＲＮＡ基質を提供するという利点を持っている。そのようなマトリックスはまた、適した保持体および保持体とｄｓＲＮａｓｅ基質間の架橋を提供するリンカーも含んでいる。
【０１３１】
適した保持体には移植片ポリマー（ＢａｙｅｒおよびＲａｐｐによる米国特許第４，９０８，４０５号）；ポリアクリルアミドゲル（Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，１８１９）；ポリアクリルモルホライド、ポリスチレンおよび誘導体化ポリスチレン樹脂（Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８８，１６，１１３２７；Ｉｔａｋｕｒａによる米国特許第４，３７３，０７１および４，４０１，７９６号），アミノメチルスチレン樹脂を含む（ＭｉｌｌｅｒおよびＴｓ’Ｏによる米国特許第４，５０７，４３３号）；Ｎ−ビニルピロリドンおよび酢酸ビニルのコポリマー（Ｓｅｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，１９７３，３１，２９１１；Ｓｅｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｅ  Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１９７５，１７６，６０９；およびＳｅｌｉｎｇｅｒ，Ｄｉｅ  Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１９７５，１７６，１６１１）；ＴＥＦＬＯＮＴＭ（Ｌｏｈｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ，１９８４，３，１２２；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，１６９，１０４）；制御孔ガラス（Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８８，１７５，６３）；アガロース（Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９１，２０８，１０；Ａｒｎｄｔ−Ｊｏｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７５，５４，４１１；Ｗｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７，２３８，１２４７；Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８８，１６，１０２８３）またはセルロース（Ｇｏｌｄｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８６，１４，９１７１；Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９７１，２１，１９８）またはそれらの誘導体、例えばＤＥＡＥ−セルロース（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９７５，１１５，４６１）またはホスホセルロース（Ｓｉｄｄｅｌｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７８，９２，６２１；Ｂｕｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８２，１０，７１６３；Ｎｏｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９７５，５，３０１；Ｂｕｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８２，１０，７１８１）のような多糖支持体；硫酸デキストラン（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８７，１５，５３７３）；ポリプロピレン（Ｍａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４，２１７，３０６）；アガロースビーズ（Ｋａｄｏｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６，８３，５８８９）；ラテックス粒子（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，６２２９）；ナイロンビーズ（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９１，１９，３３４５）；常磁性ビーズ（Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ��，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８９，１７，６２５３；Ｌｕｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８８，１６，１０８６１；Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９１，２７８，７３５）；シリカゲル（Ｙａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９２，６０３，１１１）；シリカゲルの誘導体形、ポリテトラフルオロエチレン  セルロースまたは金属オキサイド（Ｂｕｅｎｄｉａによる米国特許第４，８１２，５１２号）；および上記保持体の技術的に認識された均等物；マイクロタイタープレート（Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌ９９３，２６０，１６４９）；米国特許第５，３９１，６６７号に記載されているようなＮ−ビニルピロリドン、他のＮ−ビニル−ラクタムモノマーおよび少なくとも一つのアミンまたは機能的に置き換え可能なアミンの架橋コポリマーが含まれるが、これらに制限されるわけではない。好適な態様の一つの組においては、ポリスチレンまたは長鎖アルキルＣＰＧ（制御孔ガラス）ビーズが用いられる。好適な態様の他の組においては、顕微鏡ガラススライドが用いられる（Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５１，７６７；Ｍａｓｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，２０，１６７９；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，２２，５４５６；Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４，９１，５０２２）。
【０１３２】
リンカーに関しては、種々の化学連結基または鎖が本発明のマトリックスに用いられるであろう。保持体およびｄｓＲＮａｓｅ基質間に化学結合を形成できる任意の化学基または鎖が使用できるであろう。適したリンカーはオリゴヌクレオチド合成の種々の工程の間、化合物と反応性を示さないという望ましい特性を持っている。保持体およびｄｓＲＮａｓｅ基質の化学組成がリンカーの選択に影響するであろうことを当業者は理解するであろう。多くの適したリンカーは片方または両方の末端に一級アミン基を持っているであろうし、一級アミンを種々の他の化学基へ結合するための多くの化学反応が本分野で知られている；しかしながら、他の末端反応性残基も知られており、本発明で使用されるであろう。適したリンカーには、保持体へジスルフィド結合を導入するための末端チオール基を持つリンカー（Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９１，２７８，７３５；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，５３０５）；保持体へチオール−ブロモアセチル結合を導入するための末端ブロモアセチル基を持つリンカー（Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｌｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，１８１９）；オリゴヌクレオチドの活性化５’リン酸と反応できる末端アミノ基を持つリンカー（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，１９８３，２４，２４５；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８５，１３，２３９９；Ｚａｒｙｔｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９０，１８８，２１４）；ポリ（エチレンイミン）（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９１，１９，３３４５）；アシル鎖（Ａｋａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９８８，１０９３；Ｙａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９２，６０３，１１１）；ポリビニルアルコール（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９７５，１１５，４６１）；アルキル鎖（Ｇｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９０，５０８，２７９）；アルキルアミン鎖（Ｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，７６８）；ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン結合（Ｋａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８６，６，３１１７；Ｃｈｏｄｏｓｈ  ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８６，６，４７２３；Ｆｉｓｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９０，１８４，３２８）；および上記リンカーの技術的に認識された均等物が含まれるが、これらに制限されるわけではない。本発明の好適な態様において、ｎ−アミノアルキル鎖がリンカーである。適切な（すなわち、センサーアレーおよび標的オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの最適な程度および特異性を提供する）リンカー長を決定する方法は本分野では既知である（例えば、Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９１，２７８，７３５を参照されたい）。
【０１３３】
【化３−１】
2011142911.tif 000004
【０１３４】
【化３−２】
2011142911.tif 000005
【０１３５】
【化３−３】
2011142911.tif 000006
【図１】
2011142911.tif 000007
【図２】
2011142911.tif 000008
【図３−１】
2011142911.tif 000009
【図３−２】
2011142911.tif 000010
【図３−３】
2011142911.tif 000011
【図４】
2011142911.tif 000012
【図５】
2011142911.tif 000013
【図６】
2011142911.tif 000014
【図７】
2011142911.tif 000015
【図８】
2011142911.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月28日(2011.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらかじめ選択されたＲＮＡ標的に特異的にハイブリダイズすることができる合成のオリゴマー性化合物であって、修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されている少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有する第１のセグメント；および
２’−ヒドロキシル成分をそこに有する少なくとも４個の連続するリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第２のセグメント；
を含み、
前記オリゴマー性化合物の前記ヌクレオシドサブユニットは、ホスホジエステル結合と比較して前記結合を分解から安定化するように修飾されているヌクレオチド間結合により連結されていることを特徴とする、合成のオリゴマー性化合物。
【請求項２】
修飾されていない化合物と比較して、化合物の薬物動態学的結合、吸収、分布またはクリアランス特性；前記化合物の前記標的ＲＮＡに対する親和性または特異性；または前記化合物の電荷の改変、の少なくとも１つを改良するように修飾されている少なくとも１つのリボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含む第３のセグメントをさらに含む、請求項１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項３】
前記ＲＮＡ標的にハイブリダイズしたときに、二本鎖ＲＮＡｓｅ酵素を活性化して前記ＲＮＡ標的を切断しうる、請求項１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項４】
前記第２のセグメントが前記第１のセグメントと前記第３のセグメントとの間に位置する、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項５】
前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを含む、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項６】
前記第２のセグメントが４−１２個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項７】
前記第２のセグメントが５−９個のヌクレオシドサブユニットを含む、請求項６記載のオリゴマー性化合物。
【請求項８】
前記第２のセグメントが少なくとも５個のサブユニットを有し、かつ前記第１のセグメントおよび第３のセグメントがそれぞれ少なくとも３個のサブユニットを有する、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項９】
前記第２のセグメントが少なくとも７個のヌクレオシドサブユニットを有する、請求項８記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１０】
第１のセグメントが少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｃ１−２０アルキル、２’−Ｏ−置換Ｃ１−２０アルキルまたは２’−フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを有し、前記アルキル上の置換が、アミノ、ヒドロキシまたはＣ１−１０アルキルエーテル修飾である第１のセグメントを含む、
請求項２記載の合成オリゴマー性化合物。
【請求項１１】
第３のセグメントが少なくとも１つの２’−Ｏ−Ｃ１−２０アルキル、２’−Ｏ−置換Ｃ１−２０アルキルまたは２’−フルオロ修飾リボフラノシルヌクレオシドサブユニットを含み、ここで、前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはＣ１−１０アルキルエーテルである、請求項２記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１２】
前記第１のセグメントおよび前記第３のセグメントの前記リボフラノシルヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、２’−Ｏ−Ｃ１−２０アルキル、２’−Ｏ−置換Ｃ１−２０アルキルまたは２’−フルオロを有するように修飾されており、かつ前記アルキル上の置換がアミノ、ヒドロキシまたはアルキルエーテルである、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１３】
前記ヌクレオシドサブユニットの少なくとも２つが、ホスホロチオエート、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項１０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１４】
前記第１のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項１０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１５】
前記第１のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１６】
前記第２のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１０記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１７】
前記第３のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々が、ホスホロチオエート、３’−デオキシ−３’−チオ−ホスホロチオエート、５’−デオキシ−５’−チオ−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、３’−デオキシホスフィネート、５’−デオキシホスフィネート、ボラノホスフェート、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデート、５’−デオキシ−５’−アミノホスホルアミデート、水素ホスホネート、ボラノホスフェートエステル、ホスホルアミデート、アルキルホスホネート、アリールホスホネートまたはホスホトリエステル結合により連結されている、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１８】
前記第３のセグメントの前記ヌクレオシドサブユニットの各々がホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項１９】
前記第１のサブユニット、前記第２のサブユニットおよび前記第３のサブユニットの前記ヌクレオシドサブユニットがそれぞれ、ホスホロチオエート結合により連結されている、請求項１１記載のオリゴマー性化合物。
【請求項２０】
前記第１のセグメントのヌクレオシドサブユニットの各々が、カーボネート、カルバメート、シリル、イオウ、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、メチレンオキシメチルイミノまたはメチレンカルボニルアミノ結合により連結されている、請求項１０記載のオリゴマー性化合物。