(57)【要約】【課題】ベニクスノキタケ子実体の派生物による抗炎症用途を提供する。【解決手段】エタノール抽出物、無水プロピオン酸抽出物とＡｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａを含む該子実体派生物を特徴とするものであり、該エタノール抽出物、無水プロピオン酸抽出物とＡｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは、一酸化窒素合成酵素またはシクロオキシゲナーゼ２の生成を低減させて、炎症誘発性分子の生成を抑制する効果がある。【選択図】図１
2011162462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥ベニクスノキタケの子実体が提供され、該乾燥ベニクスノキタケの子実体を一定の温度で、エタノールで抽出するという手順で得られたことを特徴とするベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項２】
該乾燥の方法は、冷凍乾燥であることを特徴とする請求項１に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項３】
該温度は、４２〜４５℃であることを特徴とする請求項１に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項４】
該エタノールは、体積百分率９５％のエタノールであることを特徴とする請求項１に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項５】
乾燥ベニクスノキタケの子実体が提供されており、該乾燥ベニクスノキタケの子実体を一定の温度でエタノールを抽出して、エタノール抽出物が得られるが、該エタノール抽出物を濃縮して、濃縮産物が得られ、該濃縮産物を無水プロピオン酸と水でパーティション（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）するという手順で得られた該無水プロピオン酸の抽出物であることを特徴とするベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項６】
該乾燥の方法は冷凍乾燥で行われていることを特徴とする請求項５に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項７】
該濃縮の方法は真空濃縮で行われていることを特徴とする請求項５に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項８】
該温度は、４２〜４５℃で行われていることを特徴とする請求項５に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項９】
該エタノールは、体積百分率９５％のエタノールで行われていることを特徴とする請求項５に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項１０】
該無水プロピオン酸は、体積百分率５０％の無水プロピオン酸で行われていることを特徴とする請求項５に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物。
【請求項１１】
炎症誘発性分子の生成を抑制することを特徴とする請求項１〜請求項１０の何れかの一つに記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物の用途。
【請求項１２】
該抽出物は、一酸化窒素（ＮＯ）または前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）という炎症誘発性分子を抑制することを特徴とする請求項１１に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物の用途。
【請求項１３】
該抽出物は、一酸化窒素合成酵素とシクロオキシゲナーゼ２を減少させて、それぞれ該一酸化窒素（ＮＯ）と該前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成を抑制することを特徴とする請求項１２に記載のベニクスノキタケ子実体の抽出物の用途。
【請求項１４】
一酸化窒素（ＮＯ）の生成を抑制することを特徴とするａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの用途。
【請求項１５】
該ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａで、一酸化窒素合成酵素を減少させて、該一酸化窒素（ＮＯ）の生成を抑制することを特徴とする請求項１４に記載のａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの用途。
【請求項１６】
前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成を抑制することを特徴とするａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの用途。
【請求項１７】
該ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは、シクロオキシゲナーゼ２を減少させて、該前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成を抑制することを特徴とする請求項１６に記載の用途。
【請求項１８】
被験者を請求項１７に記載のいずれかの一つの抽出物またはａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａと接触させることを含むことを特徴とする炎症誘発性分子生成の抑制方法。  
【請求項１９】
該炎症誘発性分子は、一酸化窒素（ＮＯ）または前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベニクスノキタケ子実体の派生物に関わり、特にベニクスノキタケ子実体の派生物による抗炎症用途（Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ  ｆｒｕｉｔ  ｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は多くの病理学的状態で、主要特徴の一つになるが、細菌感染を例として、細菌表面にあるリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ，別称：内毒素）は、宿主体内のマクロファージを活性化させるが、正常の状態で、当該活性化過程において、宿主の免疫システム全体を活性化して、病原菌を消滅する目的が達成される。しかし、一部の異常な生理的反応（疾患の発生で生じられた、または疾患発生の主因になるもの）で、活性化されたマクロファージは、過量の一酸化窒素（ＮＯ）の生成を引き起こし、宿主細胞の死亡を加速化することになるため、多くの病理学的状態で、炎症反応への制御は疾患治療の重要な一環であろう。
【０００３】
炎症的刺激として知られる腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、一酸化窒素（ＮＯ）と前立腺素Ｅ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−Ｅ２，  ＰＧＥ２は、アラキドン酸がシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）ルートの代謝）で生成されたもので、それは免疫反応の重要な部分であり、例えば、敗血症または敗血症ショック（ｓｅｐｔｉｃ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ）、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）や粥状動脈硬化（ａｒｔｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の発症は、上述の媒介物が大量に検出された。従って、新薬の開発は、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の遺伝子を抑制し、リポ多糖（ＬＰＳ）が誘導する情報伝達の主なレセプターまたは酵素活性を阻害して、一酸化窒素（ＮＯ）と前立腺素Ｅ２の生成を低減させることに重点が置かれている。
【０００４】
ベニクスノキタケ（Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）は真菌の一種で、非常に珍貴な漢方生薬として見られており、多くの科学的研究結果により、ベニクスノキタケ菌糸体からのメチルアルコール抽出物と熱水抽出物、その子実体のメチルアルコール抽出物、エタノール抽出物と無水プロピオン酸抽出物は、優れた抗ガン活性があることが分かった。そして、一部の研究によると、ベニクスノキタケの菌糸体と子実体は、幾らかのトリテルぺノイド化合物が含まれている、抗炎症の潜在力を持つ化合物であると指摘された。しかし、ベニクスノキタケ及びその含まれたトリテルぺノイド化合物が、炎症反応を制御する作用メカリズムと生理的活性を更に解明する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ベニクスノキタケ子実体の派生物及びその用途を提供することを目的とし、それにより、炎症誘発性分子の生成を抑制し、優れた抗炎症機能がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述の目的を達成させるために、本発明は、乾燥ベニクスノキタケの子実体が提供され、該乾燥ベニクスノキタケの子実体を一定の温度で、エタノールで抽出するという手順で得られたことを特徴とするベニクスノキタケの子実体の抽出物を提供する。
【０００７】
本発明は、また、乾燥ベニクスノキタケの子実体が提供されており、該乾燥ベニクスノキタケの子実体を一定の温度でエタノールを抽出して、エタノール抽出物が得られるが、該エタノール抽出物を濃縮して、濃縮産物が得られ、該濃縮産物を無水プロピオン酸と水でパーティション（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）するという手順で得られた該無水プロピオン酸抽出物というベニクスノキタケ子実体の抽出物を提供することを特徴とする。
【０００８】
該乾燥の方法は、冷凍乾燥で行われていることを特徴とする。
該温度は、４２〜４５℃で行われていることを特徴とする。
該エタノールは、体積百分率９５％のエタノールで行われていることを特徴とする。
【０００９】
該濃縮の方法は、真空濃縮で行われていることを特徴とする。
該無水プロピオン酸は、体積百分率５０％の無水プロピオン酸で行われていることを特徴とする。
【００１０】
本発明は更に、炎症誘発性分子の生成を抑制することを特徴とする該抽出物の用途を提供する。
該抽出物は、一酸化窒素（ＮＯ）または前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）という該炎症誘発性分子を抑制することを特徴とする。
該抽出物は、一酸化窒素合成酵素とシクロオキシゲナーゼ２を減少させて、それぞれ該一酸化窒素（ＮＯ）と該前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成を抑制することを特徴とする。
【００１１】
本発明は、また更に、一酸化窒素（ＮＯ）の生成を抑制することを特徴とするａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの用途を提供する。
該ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは、一酸化窒素合成酵素を減少させて、該一酸化窒素（ＮＯ）の生成を抑制することを特徴とする。
本発明は、そのうえ、前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成を抑制することを特徴とするａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの用途を提供する。
該ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは、シクロオキシゲナーゼ２を減少させて、該前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成を抑制することを特徴とする。
【００１２】
本発明は、また、被験者を請求項１７に記載のいずれかの一つの抽出物またはａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａと接触させることを含むことを特徴とする炎症誘発性分子生成の抑制方法を提供する。
該炎症誘発性分子は、一酸化窒素（ＮＯ）または前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）であることを特徴とする。
【００１３】
上述の内容をまとめると、本発明において、ベニクスノキタケ子実体の派生物による抗炎症の効果は、本発明に掲示したベニクスノキタケ子実体の派生物による抗炎症の生理的活性及び作用メカリズムが更に明確になった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のエタノール抽出物、無水プロピオン酸抽出物と水溶性留分が有する、一酸化窒素生成の抑制率を示すグラフ。
【図２Ａ】本発明のエタノール抽出物が影響した一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の生成量を示すグラフ。
【図２Ｂ】本発明のエタノール抽出物が影響したシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量を示すグラフ。
【図３】本発明の無水プロピオン酸抽出物の１７留分が有する、一酸化窒素生成の抑制率を示すグラフ。
【図４Ａ】ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａが影響した一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）の生成量を示すグラフ。
【図４Ｂ】ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａが影響したシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）の生成量を示すグラフ。
【図５Ａ】ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａが影響した一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の生成量を示すグラフ。
【図５Ｂ】ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａが影響したシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ベニクスノキタケ子実体の派生物及びその用途に関わり、それにより、炎症誘発性分子の生成を抑制して、優れた抗炎症機能がある。該“派生物”とは、ベニクスノキタケ子実体の抽出物及びその成分化合物のことを意味し、もっとはっきりと言えば、本発明でいう“派生物”は、ベニクスノキタケ子実体のエタノール抽出物、無水プロピオン酸抽出物またはａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａのことをいう。
【００１６】
リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）は、脂質と多糖を共同結合して構成され、グラム陰性菌の細胞表面の主要分子で、内毒素とも言われる。リポ多糖は宿主の体内で激しい炎症反応を引き起こすが、この激しい炎症反応は通常、マクロファージで活性化された免疫反応であり、それゆえ、本発明は、リポ多糖で誘発したマウス体内またはマクロファージ株による炎症反応を実験することを、本発明におけるベニクスノキタケ子実体が抗炎症反応に関わる役割を検討するモデルとする。
【００１７】
以下に掲示した実施例は、本発明を詳しく説明するために挙げられた例であり、それらを以って、本発明の特許請求の範囲を制限してはならない。
【実施例１】
【００１８】
実験設計
［材料］
本発明に使用するベニクスノキタケの子実体は、台湾高雄六亀で採集した野生株であり、牛胎児血清（ＦＢＳ）はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）から購入、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），  ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１２７：１３８／ＬＰＳ）ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）とグリース試薬（Ｇｒｉｅｓｓ  ｒｅａｇｅｎｔ）は、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。本発明に使用するあらゆる化学薬品及び溶剤はいずれも試薬またはＨＰＬＣクラスである。
【００１９】
［実験マウス］
実験マウスは、ＢｉｏＬａｓｃｏ（台北、台湾）から購入した生後四週間のオスＩＣＲ系マウス（約２５〜２８ｇ）で、実験前、実験マウスを環境に慣らさせるために、温度２５±２℃、相対湿度５５±５％、明暗周期は１２時間（より明確に言えば、毎日午前六時から午後六時を明期とする）、自由に摂食と飲水を行わせる条件下で、少なくとも一週間飼育しておいた。すべての動物実験処理は、実験動物飼育管理（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）、使用ガイド及び台湾の動物保護法に関する規定に従い、また現地の道徳委員から承認を得てから行われた。
【００２０】
［細胞培養］
本発明は、マウスマクロファージ株ＲＡＷ  ２６７．４で、一酸化窒素と前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成量を検討した。ＲＡＷ２６７．４細胞の培養では、まず、培養培地に培養されていた（７５ｃｍ２）ＲＡＷ  ２６７．４細胞を接種密度２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、９６孔培養プレートに接種し、それを培養箱（３７℃，５％ＣＯ２）に入れて培養し、培養液はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の意見を受けて、培養液ＤＭＥＭを使用し、それに牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）１０％を加えて、ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）とストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，１００ｇ／ｍｌ）を培養する。
【００２１】
［ウェスタンブロット法分析］
細胞の全蛋白質（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を得てから、それと同様な量の蛋白質を５〜７％勾配電気泳動ゲル孔内（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に加えて、３００ｍＡで９０分間分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）し、大きさにより分離した蛋白質ブロッティング（１００Ｖ，１時間）をフッ化ポリビニリデン膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ，ＰＶＤＦ，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転写したあと、フッ化ポリビニリデン膜を、ブロッキング緩衝液で（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ，  １０％w/v脱脂乳粉末をＴＢＳＴ  緩衝液の中に入れて）１時間作用する。
【００２２】
それから、フッ化ポリビニリデン膜を抗一酸化窒素合成酵素の抗体溶液（ａｎｔｉ−ｉＮＯＳ，１：１０００，Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）または抗シクロオキシゲナーゼ２の抗体溶液（ａｎｔｉ−ＣＯＸ−２，１：１０００，Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に浸かり、それから、ＴＢＳＴ  緩衝液０．１％（Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％含有のＴＢＳ緩衝液）で二回洗浄して、非特異的（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合の抗体抗原を洗い落とす。
その後、フッ化ポリビニリデン膜を西洋わさびペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の抗ウサギ二級抗体溶液（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）に浸かったあと、化学発光試薬（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｅ  ｒｅｇｅｎｔｓ，ＥＣＬ，Ｐｉｅｒｃｅ）を加えて、各組の蛍光強度を検出し、そしてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）の生成量を蛋白の制御対照にする。
【００２３】
［逆転写ポリメラーゼ連鎖反応］
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、抽取細胞の全リボ核酸（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応でｉＮＯＳ，ＣＯＸ−２和Ｇ３ＰＤＨの伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）をｃＤＮＡに逆転写し、それから、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ＰＣＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２とＧ３ＰＤＨの生成漁を測定する。
【００２４】
該定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡ結合蛍光剤グリーン核酸ゲル染色液（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）でＰＣＲ産物を検出するが、温度サイクル（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅ）は、９５℃で５分間を１サイクルの後、９５℃で１分間、５５℃で４５秒、及び７２℃で３０秒を４０サイクルにするが、プライマー配列は  Ｉｎｏｓ順向き５’−ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＣＣＡ  ＡＡＣ−３’；ｉＮＯＳ逆向き５’−ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  Ｃ−３’；ＣＯＸ−２順向き５’−ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＴＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣＣ−３’；ＣＯＸ−２逆向き５’−ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＴＣＡ  ＡＡＴ  ＣＣ−３’；Ｇ３ＰＤＨ順向き５’−ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＧＧ−３’；Ｇ３ＰＤＨ逆向き５’−ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  Ｃ−３’であり、Ｇ３ＰＤＨはハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ）で、細胞内に安定し大量な遺伝子があり、実験中でｉＮＯＳとＣＯＸ−２の量を標準化する。
【実施例２】
【００２５】
本発明のベニクスノキタケ子実体のエタノール抽出物と無水プロピオン酸抽出の製造
まず、ベニクスノキタケの子実体を冷凍乾燥法で乾燥し、それから、４２〜４５℃下で、冷凍乾燥したベニクスノキタケの子実体５８０ｇをエタノール９５％で抽出して、本発明のエタノール抽出物（ＡＣＥ）を得る。この乾燥法は、制限することがなく、所属分野で知られている何れかの乾燥法で行ってもよい。
【００２６】
それから、該エタノール抽出物を真空（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で濃縮して、濃縮産物１８３．９ｇを得た。得られた濃縮産物を無水プロピオン酸と水で無水プロピオン酸層と水溶性層に分離し（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）し、該水溶性層は水溶性留分（ＡＣＥ−ｗａｔｅｒ）と表示され、該無水プロピオン酸層はすなわち、本発明の無水プロピオン酸抽出物（ＡＣＥ−ＥＡ）である。
【実施例３】
【００２７】
実施例２のエタノール抽出物（ＡＣＥ）、無水プロピオン酸抽出物（ＡＣＥ−ＥＡ）と水溶性留分（ＡＣＥ−ｗａｔｅｒ）による一酸化窒素の活性抑制試験：  マクロファージ株ＲＡＷ  ２６７．４
本実施例では、マクロファージ株ＲＡＷ  ２６７．４により、実施例二で得られたベニクスノキタケの子実体エタノール抽出物（ＡＣＥ）、無水プロピオン酸抽出物（ＡＣＥ−ＥＡ）と水溶性留分（ＡＣＥ−ｗａｔｅｒ）による一酸化窒素の活性抑制試験を行う。
【００２８】
まず、ＲＡＷ  ２６７．４細胞は、実施例1に述べた細胞培養法で培養したあと、実験組一（エタノール抽出物、ＡＣＥ）、実験組二（無水プロピオン酸抽出物、ＡＣＥ−ＥＡ）と実験組三（水溶性留分、ＡＣＥ−ｗａｔｅｒ）の三組に分ける。各組の細胞を濃度（１，１０，２５，５０ｇ／ｍｌ）により、該エタノール抽出物、該無水プロピオン酸抽出物と該水溶性留分をそれぞれ培養液に入れ、それから、リポ多糖（ＬＰＳ）を培養液に加えて、ＲＡＷ  ２６７．４細胞に一酸化窒素の生成を誘導させるが、２４時間後、グリース反応法（Ｇｒｉｅｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で亜硝酸塩の含有量を測定し、一酸化窒素の生成量を間接的に測定するが、その実験設計は次の表１に示す。
【００２９】
【表１】
2011162462.tif 000003
“＋”  は添加あり、“−”  は無添加を表す。
図に示すのは、グリース反応法で測定した一酸化窒素の生成量、及び一酸化窒素生成の抑制率の統計結果を表す。図を見て分かるように、実施例２から得たベニクスノキタケエタノール抽出物と無水プロピオン酸抽出物はいずれも、一酸化窒素への活性抑制効果があり、特に濃度５０ｇ／ｍｌのときその効果がより顕著になる。
【実施例４】
【００３０】
実施例２のエタノール抽出物（ＡＣＥ）による一酸化窒素の活性抑制試験：  マウス生体実験
本実施例はマウス生体で、実施例二で得られたエタノール抽出物（ＡＣＥ）による一酸化窒素の活性抑制試験を行う。マウスは実施例１に述べた条件下での実験マウスを使用する。
【００３１】
［実験設計］
まず、六匹のマウスを一組にし、計六組あり、下表２の配置により、リポ多糖（５ｇ／ｋｇ）の注射前、各組マウスにそれぞれ腹腔内注射法（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で、濃度の異なった実施例２で得たベニクスノキタケエタノール抽出物（ＡＣＥ，１００，３００，５００ｍｇ／ｋｇ）、クルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）を注射し、または注射しないが、その中、制御組にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）だけを注射し、また、抗炎症薬剤として知られるクルクミン（ｃｕｒｃｕｍｉｎ）は、本実施例における陽性対照組に使用される。マウスにリポ多糖を注射したあと、更にエーテルで麻酔し、１２時間後、断頭法（ｄｅｃａｐｉｔａｔｉｏｎ）で犠死させた。
【００３２】
【表２】
2011162462.tif 000004
“＋”  は添加あり、“−”  は無添加を表す。
制御組にリポ多糖を投与せず、その代わりにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を投与した。
【００３３】
［実験結果］
眼窩採血法または心臓採血法で採血したあと、その血液をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有の試験管に注ぎ、温度４℃で、５００ｇで１０分間の遠心により血清を集め、それから、グリース反応法で血清中の一酸化窒素濃度を測定するが、その結果は次の表３に示す。
【００３４】
【表３】
2011162462.tif 000005
表３の結果により、実施例２のエタノール抽出物は、生体実験にも、一酸化窒素の生成量への抑制は効果が顕著であり、それがクルクミンの效果に類似している。
そして、犠死させた実験マウスの肝臓を摘出し、よく知られている実験方法で全蛋白質を抽出し、蛋白質濃度の定量はＢｒａｄｆｏｒｄ法で５９５ｎｍ的吸光度値で測定するが、得られた全蛋白質は、ウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ、実施例１におけるウェスタンブロット法の分析説明を参照）の一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量の測定に用いられる。図２Ａと図２Ｂの表示結果から分かるように、実施例２のエタノール抽出物は、生体実験において、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量が顕著に低下したが、実施例２のエタノール抽出物が一酸化窒素の生成を抑制したからだと考えられる。
【実施例５】
【００３５】
Ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの分離
実施例２で得られた無水プロピオン酸抽出物（ＡＣＥ−ＥＡ）を、クロマトグラフ法（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で、流動相の濃度勾配で１７つの留分に分けるが、該クロマトグラフ法に用いれる固体相はシリコン（６０−８０ｍｅｓｈ）は、流動相為ｎ−へキサン／無水プロピオン酸混合液。該濃度勾配はｎ−へキサンと無水プロピオン酸の体積百分率が９５：５，９０：１０，８５：１５，８０：２０，７０：３０，６０：４０，５０：５０，４０：６０，０：１００という順であるｎ−へキサン／無水プロピオン酸混合液を流動相として、該クロマトグラフ法で行う。
【００３６】
得られた１７つの留分について、それぞれＲＡＷ２６７．４細胞（実施例１における細胞培養の内容を参照）で一酸化窒素への活性抑制試験を行う。まず、ＲＡＷ２６７．４細胞を１７組に分け、該１７つの留分（５０ｇ／ｍｌ）をそれぞれ培養培地に加え、それから、それぞれリポ多糖（ＬＰＳ，１ｇ／ｍｌ）を加えて、一酸化窒素の生成を誘発させるが、２４時間後、グリース反応法（Ｇｒｉｅｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で亜硝酸塩の含有量を測定し、一酸化窒素の生成量を間接的に測定して、一酸化窒素生成の抑制率を計算する。実験結果は図３に示すように、第１，７，１０留分はそれぞれ、一酸化窒素生成の抑制率が８７％，  ４８％と６４％となる。
【００３７】
次は、該第１留分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で更に分離純化し、その構成成分（固体相：シリコン管柱、流動相：体積比８５：１５のｎ−へキサン／無水プロピオン酸混合液、流速：３ｍｍ／分、ＵＶ波長：２５４ｎｍ）を得て、そして、含有量の最も高い成分を分光測定で分析し分子量２４７．１４を得たが、それは分子式Ｃ１５Ｈ１９Ｏ３と推定。当該成分を更にプロトン核磁気共鳴分光法で解析すると、その分子構造は次のようになり、
【００３８】
【化１】
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当該化合物はＡｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａ．であることを明らかにした。
【００３９】
実施例６：Ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａによる炎症誘発性分子生成の活性抑制試験：マクロファージ株ＲＡＷ  ２６７．４
本実施例では、マクロファージ株ＲＡＷ  ２６７．４により、実施例５で得られたＡｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａによる炎症誘発性分子生成の活性抑制試験を行う。  
【００４０】
一酸化窒素の生成量の実験は、まず、ＲＡＷ２６７．４細胞を実施例１に述べた細胞培養法で培養したあと、異なる濃度のａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａ（１，  ５，１０，２０ｇ／ｍｌ）またはｃｕｒｃｕｍｉｎ（１０ｇ／ｍｌ）を加えて１時間放置し、それから、リポ多糖（１ｇ／ｍｌ）を加えて２４時間放置したあと、グリース反応法（Ｇｒｉｅｓｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で亜硝酸塩の含有量を測定し、一酸化窒素の生成量を間接的に測定する。
【００４１】
前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成量の実験は、まず、ＲＡＷ２６７．４細胞を実施例一で述べた細胞培養法で培養したあと、培養液にアスピリン５００ｍを加えて３時間放置して、内生的シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ−１）の活性を喪失させる。それから、異なる濃度のａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａ（１，５，１０，２０ｇ／ｍｌ）またはｃｕｒｃｕｍｉｎ（１０ｇ／ｍｌ）を加えて１時間放置し、更に、リポ多糖（１ｇ／ｍｌ）を加えて１６時間放置したあと、最後に、酵素免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で、細胞培養中の上清液から、内生的アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）から生じられた前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成量を測定する。
本実施例で実験した組別は表４に示す。
【００４２】
【表４】
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“＋”  は添加あり、“−”  は無添加を表す。
制御組にはリポ多糖を投与せず、その代わりにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を投与した。
【００４３】
なお、よく知られているＭＴＴ法で、Ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの細胞毒性を測定する。該ＭＴＴ法は生物学でよく用いられる、細胞生存率またはその増殖を測定する方法であり、その原理として、生きている細胞内のミトコンドリアにある琥珀酸脱水素酵素の働きにより、ＭＴＴのｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ代謝が青色の産物に変換されるが、そこへジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて、細胞に堆積した青色の代謝物を溶かしたあと、分光器で青色の代謝産物の量を測定して、生きている細胞数が間接的に推定できる。
その実験結果を次の表５にまとめる。
【００４４】
【表５】
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この結果から分かるように、ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは炎症誘発性分子の生成を低下させられるが、顕著な効果が出る濃度は２０ｇ／ｍｌであり、この濃度下で、ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは細胞毒性の発生がないと言える。
【００４５】
また、各組の細胞から抽出した全リボ核酸（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）と全蛋白質（ｔｏｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を、実施例１に述べた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、及びウェスタンブロット法で、遺伝物質（ｍＲＮＡ）と蛋白質の視点から、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量をそれぞれ評価する。
【００４６】
図４Ａと図４Ｂに示すのは、それぞれ一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）の生成量。  その結果から分かるように、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）の生成量及びａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの間は、薬剤用量に関わり、薬剤用量の高いａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）の量を有効に低下させることができる。
【００４７】
図５Ａ  と図５Ｂに示すのは、それぞれ一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量であり、その図を見て分かるように、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量とａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａの間は、薬剤用量に関わり、薬剤用量の高いａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量を有効に低下させられるが、特に濃度２０ｇ／ｍｌのときにその効果が顕著に見られる。
【００４８】
その結果数値をまとめると、ａｎｔｒｏｃａｍｐｈｉｎ  Ａは、遺伝物質の転写または蛋白質の視点から見ても、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）とシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）の生成量を低下させ、更に炎症誘発性分子、例えば一酸化窒素と前立腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）の生成を抑制する効果がある。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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