(57)【要約】【課題】粒子サイズを基準にしてリポプロテインのサブクラスを規定し、血清サンプルに含まれるリポプロテインをサブクラス間で比較する事は混乱を生じることなる。【解決手段】被験試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質粒子に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程とを含む。【選択図】図１
2011053227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質粒子に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、
リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（エクストラ・エッセンシャル・ピーク：extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程とを含む、
リポタンパク質粒子の分析方法。
【請求項２】
上記アンカーピークのうち１以上のアンカーピークを、VLDL、LDL及びHDLのサイズ範囲が狭いというリポタンパク質代謝を示す代謝異常症患者において観察される溶出時間によって規定することを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
上記アンカーピークは、溶出位置が44.5±2.1 nmであるピーク、溶出位置が36.8±2.5 nmであるピーク、溶出位置が31.3±1.0 nmであるピーク、溶出位置が25.5±0.4 nmであるピーク、溶出位置が23.0±0.5 nmであるピーク、溶出位置が13.5±0.4 nmであるピーク、溶出位置が10.9±0.2 nmであるピーク、及び溶出位置が9.8±0.2 nmであるピークから選ばれる少なくとも１つのピークであることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項４】
上記他の必須ピークにおける溶出位置とピーク幅は、上記アンカーピーク間をほぼ等間隔に埋めるものとして設定することを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項５】
上記近似曲線は２０個のコンポーネントピークから構成されることを特徴とする請求項１記載の分析方法。
【請求項６】
診断対象者から採取した被験試料を準備する工程と、
上記被験試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質粒子に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、
リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程と、
上記算出した近似波形を解析する工程とを含む、
内臓脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法。
【請求項７】
上記アンカーピークのうち１以上のアンカーピークを、VLDL、LDL及びHDLのサイズ範囲が狭いというリポタンパク質代謝を示す代謝異常症患者において観察される溶出時間によって規定することを特徴とする請求項６記載の診断方法。
【請求項８】
上記アンカーピークは、溶出位置が44.5±2.1 nmであるピーク、溶出位置が36.8±2.5 nmであるピーク、溶出位置が31.3±1.0 nmであるピーク、溶出位置が25.5±0.4 nmであるピーク、溶出位置が23.0±0.5 nmであるピーク、溶出位置が13.5±0.4 nmであるピーク、溶出位置が10.9±0.2 nmであるピーク、及び溶出位置が9.8±0.2 nmであるピークから選ばれる少なくとも１つのピークであることを特徴とする請求項６記載の診断方法。
【請求項９】
上記他の必須ピークにおける溶出位置とピーク幅は、上記アンカーピーク間をほぼ等間隔に埋めるものとして設定することを特徴とする請求項６記載の診断方法。
【請求項１０】
上記近似曲線は２０個のコンポーネントピークから構成されることを特徴とする請求項６記載の診断方法。
【請求項１１】
上記解析する工程では、大VLDL、中VLDL、小VLDL、中LDL、小LDL、極小LDL、大HDL及び中HDLに含まれるコレステロール量と基準値とを比較することを特徴とする請求項６記載の診断方法。
【請求項１２】
上記解析する工程では、大LDLに含まれるコレステロール量と基準値と比較することによって動脈硬化症と診断することを特徴とする請求項６記載の診断方法。
【請求項１３】
上記解析する工程では、小VLDL、小LDL、極小LDL及び大HDLに含まれるコレステロール量と基準値と比較することによって冠動脈疾患と診断することを特徴とする請求項６記載の診断方法。
【請求項１４】
請求項１〜５いずれか一項記載のリポタンパク質の分析方法を用いて、診断対象者から採取した被験試料に含まれるリポタンパク質を解析する工程と、
(I)〜(V)から選ばれる少なくとも１つの式により値を算出する工程とを含む、
(I)   Vs + Ls - Hs;
(II)  Vs + Ls;
(III)  Ls;
(IV) (Vs + Ls)/Hs
(V)  Ls/Hs,
（“Vs”は小VLDLに含まれるコレステロール量を示し、“Ls”は小LDL及び極小LDLに含まれるコレステロール量の合計を示し、“Hs”は大HDLに含まれるコレステロール量を示している。）
冠動脈疾患の診断方法。
【請求項１５】
上記算出した値と基準値とを比較する工程を更に含む請求項１４記載の冠動脈疾患の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるリポプロテインを各サブクラスに分画することによって、各種疾患の診断に有効なデータ解析を可能とするリポプロテインの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲル濾過液体クロマトグラフィー法により被験試料に含まれるリポプロテインを粒子サイズに依存して分離し、その後、分離したリポプロテインに含まれるコレステロール及びトリアシルグリセロールを定量する方法において、得られたクロマトグラムをガウス分布曲線近似法等の波形処理によって、カイロミクロン、超低比重リポプロテイン、低比重リポプロテイン及び高比重リポプロテインに分画する方法が特開平９−１５２２５号公報に開示されている。
【０００３】
ゲル濾過液体クロマトグラフィー法により被験試料に含まれるリポプロテインを粒子サイズに依存して分離し、その後、分離したリポプロテインに含まれるコレステロール及びトリアシルグリセロールを定量する方法において、リポプロテインを２０個のサブクラスに分離する方法が特開２００２−１３９５０１号公報に開示されている。
【０００４】
しかしながら、特許文献２に開示された分離方法は、特定のカラムを使用した場合にのみ適用され、２０個のサブクラスに関する各ピーク位置（すなわち粒子サイズ）についても根拠となる理論的な裏付けのないものであった。例えば、LDL（low density lipoprotein）の粒子サイズについても、GGE法（ポリアクリルアミド密度勾配ゲル電気泳動法）では25.5nmをカットオフ値に設定し、NMR法では電子顕微鏡で観察したサイズを基準にして20nm程度と設定し、ゲルろ過FPLC法ではGGE法におけるサイズを基準にして25.5nmと設定し、ゲルろ過HPLCではラテックスビーズや球状蛋白質を基準にして25.5nmと設定している。また、光散乱法を基準にすれば、これらサイズの見積もり方によってまちまちの値になる。さらに、超遠心平衡法で分子量を求めてサイズを計算すれば、また別の値になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、粒子サイズを基準にしてリポプロテインのサブクラスを規定し、血清サンプルに含まれるリポプロテインをサブクラス間で比較する事は混乱を生じることなる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上述した実状に鑑みて、本発明者は、リポタンパク代謝からVLDL、LDL及びHDLサイズの範囲が狭いと考えられる代謝異常症患者などにおいて観測されるピークの位置を基準にすることによって、分離能や分離範囲の異なるゲルろ過カラムを使った場合であっても、複数のサンプルにおけるサブクラス間の比較が可能となることを見いだした。
【０００７】
本発明を適用したリポプロテインの分析方法は、被験試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質粒子に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（エクストラ・エッセンシャル・ピーク：extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号をもちいて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程とを含む。
【０００８】
また、分離したリポタンパク質粒子に含まれる上記成分の例としては、コレステロール、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等を挙げることができる。  本発明に係るリポプロテインの分析方法において、上記近似波形は、コレステロール、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等の少なくとも１つの成分に由来する、検出された信号に基づいて算出してもよい。
【０００９】
アンカーピークは実験的に決められるピークである。一方、他の必須ピークは数学的にピークの位置と幅が決まるものである。LDLとHDLにおいてサブクラスの分布幅はほぼ同じと仮定し、アンカーピークの間をほぼ等間隔に埋めるように、他の必須ピークの位置及び幅を決定する。
【００１０】
コンポーネントピークの数としては、特に限定されないが、13〜20個とすることができる。例えば、液体クロマトグラフィーに使用するカラムとして、リポタンパクの分画範囲の広い（CMからHDLまで分子可能な）TSKのXLカラムを使用した場合には、最大で２０個のコンポーネントピークを設定することができる。また、カラムとしてVLDLからHDLが分画範囲（CMは分画範囲でない）のファルマシアのカラムでは、20個未満のコンポーネントピークを設定することができる。さらに、カラムとして例えばTSKのG3000SWXLを使用した場合には、最低13個のコンポーネントピークを設定することができる。
【００１１】
アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、健常中年男性の集団由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズの平均溶出時間として定義することができる。また、アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズの平均溶出位置として定義することができる。さらに、アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるHDLサイズの平均溶出位置として定義することができる。さらにまた、アンカーピークの溶出時間（粒子サイズ）としては、アポE2/2のIII型高脂血症例由来の上記試料を用いて得られたプロファイルにおけるVLDLサイズの平均溶出位置として定義するとこができる。
【００１２】
コレステロール由来の検出信号に基づいて定義されたコンポーネントピークを用いて、コレステロール由来のプロファイルに関する近似曲線を算出しても良いが、コレステロール以外の成分、例えば、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等の成分由来のプロファイルに関する他の近似曲線を算出してもよい。
【００１３】
また、本発明を適用した内蔵脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法は、診断対象者から採取した被験試料を準備する工程と、上記試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離する工程と、分離したリポタンパク質に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピークからなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号をもちいて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程と、算出された近似波形を分析する工程とを含む。
【００１４】
内臓脂肪の蓄積に起因する疾患としては、例えば、虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患を挙げることができる。すなわち、近年、生活習慣の変遷に伴って栄養過多や運動不足に陥り、脂肪蓄積、肥満を来たし、その結果、多数のリスクファクターの集積を伴って虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患の増加を招いている。これはインスリン抵抗性を起こす遺伝的素因に肥満などの後天的因子が加わり、インスリン抵抗性が生じて発症するものである。上流に位置する成因基盤としては、腹腔内内臓脂肪蓄積が重要である。肥満者はもちろん非肥満者においても腹腔内内臓脂肪の蓄積は糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患（coronary artery disease (CAD)）の発症に密接に関与している。したがって、内臓脂肪おの蓄積に起因する疾患としては、糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患を挙げることができる。
【００１５】
本発明を適用した内臓脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法によれば、例えば、内臓脂肪面積と大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量とが正の相関を、また内臓脂肪面積と大中HDLサブクラスのコレステロール量とが負の相関を示した。言い換えれば、内臓脂肪の蓄積に起因する疾患は、大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量の増加、大中HDLサブクラスのコレステロール量の減少によって診断される。
【００１６】
また、LDLのコレステロールの高値は、重要なリスク因子の１つである。LDLのコレステロール濃度が正常な群（LDL-C＜130mg/dL）では、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と負の相関を示したのに対して、大LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と正の相関を示した。これは、LDLの中に善玉LDLサブクラスが存在することを意味するもので、大LDLサブクラスが内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症を抑制する作用をもつことを意味している。大LDLサブクラスのコンポーネントピークは、他の必須ピークであり、VLDLとLDLの間の遷移成分として決められたものであるが、本発明により、臨床的意義をもつ新しいサブクラスとして新たに評価することができる。言い換えると、内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症は、大LDLサブクラスのコンポーネントピークのコレステロール量によって診断することができる。
【００１７】
また、冠動脈疾患では小VLDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の減少が見られることから、小VLDL、小及び極小LDL、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の測定によって、冠動脈疾患を診断することができる。
【００１８】
本発明に係る冠動脈疾患の診断方法において、診断対象者から採取した被験試料に含まれるリポタンパク質を本発明に係るリポタンパク質の分析方法を用いて分析する工程と、以下の（I）〜（V）から選ばれる少なくとも１つの式に基づいて値を算出する工程とを含んでいる。
(I)   Vs + Ls - Hs;
(II)  Vs + Ls;
(III)  Ls;
(IV) (Vs + Ls)/Hs; and
(V)  Ls/Hs,
【００１９】
ここで、“Vs”は小VLDLに含まれるコレステロール量を示し、“Ls”は小LDL及び極小LDLに含まれるコレステロール量の合計を示し、“Hs”は大HDLに含まれるコレステロール量を示している。
【００２０】
本発明に係る冠動脈疾患の診断方法において、上記分析する工程は、更に算出された値を基準値と比較する工程を含むことが好ましい。
【００２１】
なお、冠動脈疾患で有意に増加する小VLDLサブクラスのコンポーネントピークは、アポE2/2のIII型高脂血症のVLDLサイズから求めたアンカーピークであり、アポE2/2のIII型高脂血症で増加しているレムナントに相当するもので、冠動脈の重要なリスク因子であるレムナントを本プログラムにおける小VLDLサブクラスに対応するコンポーネントピークから見積もることができると評価できる。
【発明の効果】
【００２２】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、分離能や分離範囲の異なるゲルろ過カラムを使った場合であっても、複数のサンプルにおけるサブクラス間の比較が可能となるリポタンパク質粒子の分析装置及び分析方法を提供することができる。本発明に係るリポタンパク質の分析装置及び分析方法によれば、従来公知の手法及び装置と比較して信頼性の高いデータを取得することができる。本発明に係るリポタンパク質の分析装置及び分析方法によって取得されたデータは、糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患といった内臓脂肪蓄積に起因する各種の疾患の診断に有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】被験試料に含まれるリポタンパク質粒子に含まれるコレステロール及びトリグリセリドを定量するリポタンパク質分析装置のシステム構成図である。
【図２】横軸を溶出時間（min）とし、縦軸を検出値（mV）として、コレステロールに関するクロマトグラムとトリグリセリドに関するクロマトグラムとを重ねて表示した特性図である。
【図３】２つのTSKgel LipopropalXLカラム（東ソー（株）製）を使用して得られた、アンカーピークとして定義する際の根拠となるデータを示す特性図である。
【図４】Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムファルマシア社製）を使用して得られた、アンカーピークとして定義する際の根拠となるデータを示す特性図である。
【図５】SkylightPak-LDLカラム（スカイライトバイオテック社製）を使用して得られた、アンカーピークとして定義する際の根拠となるデータを示す特性図である。
【図６】(a)は健常女性由来の血清試料を用いて得られた、コレステロール量を示すプロファイルであり、 (b)はリポタンパクリパーゼ欠損症患者由来の血清試料を用いて得られた、コレステロール量を示すプロファイルである。
【図７】(a)は高LDL-C群（○）及び低LDL-C群（●）について内臓脂肪面積と大LDL-C濃度との関係を示す散布図であり、(b)は高LDL-C群（○）及び低LDL-C群（●）について内装脂肪面積と小LDL-C濃度との関係を示す散布図であり、(c)は高LDL-C群（○）及び低LDL-C群（●）について内臓脂肪面積と極小LDL-C濃度との関係を示す散布図である。
【図８】(a)は健常者由来の血清プールについてSuperose 6HR 10/30カラムを用いてコレステロールの分析を行った結果を示す特性図であり、(b)は健常者由来の血清プールについてSuperose 6HR 10/30カラムを用いてトリグリセリドの分析を行った結果を示す特性図である。
【図９】(a)は健常者由来の血清プールについて２つのTSKgel LipopropakXカラムを用いてコレステロールの分析を行った結果を示す特性図であり、(b)は健常者由来の血清プールについて２つのTSKgel LipopropakXLカラムを用いてトリグリセリドの分析を行った結果を示す特性図である。
【図１０】(a)は健常者由来の血清プールについてSkylightPak-LDLカラムを用いてコレステロールの分析を行った結果を示す特性図であり、(b)は健常者由来の血清プールについてSkylightPak-LDLカラムを用いてトリグリセリドの分析を行った結果を示す特性図である。
【図１１】表８に示した59人の被験者についてSuperose 6HR 10/30カラムを使用して得られた結果（図８）に基づいて、ピークG7〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示す特性図である。
【図１２】表８に示した59人の被験者についてTSKgel LipopropakXLカラムを使用して得られた結果（図９）に基づいて、ピークG7〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示す特性図である。
【図１３】表８に示した59人の被験者における図１１及び１２に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG7〜G13（小VLDL〜LDLサブクラスまでの範囲に対応）に含まれるコレステロール量について、Superose 6HR 10/30カラムを使用した場合とTSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合との比較結果を示す特性図である。
【図１４】表８に示した59人の被験者における図１１及び１２に示した結果に基づい2て、コンポーネントピークG14〜G20（HDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、Superose 6HR 10/30カラムを使用した場合とTSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合との比較結果を示す特性図である。
【図１５】表９に示した44人の被験者についてTSKgel LipopropakXLカラムを使用して得られた結果（図９）に基づいて、ピークG6〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示す特性図である。
【図１６】表９に示した44人の被験者についてSkylightPak-LDLカラムを使用して得られた結果（図１０）に基づいて、ピークG6〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示す特性図である。
【図１７】表９に示した44人の被験者における図１５及び１６に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG6〜G13（中VLDL〜LDLサブクラスまでの範囲に対応）に含まれるコレステロール量について、TSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合とSkylightPak-LDLカラムを使用した場合との比較結果を示す特性図である。
【図１８】表９に示した44人の被験者における図１５及び１６に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG14〜G20（HDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、TSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合とSkylightPak-LDLカラムを使用した場合との比較結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
本分析方法及び分析プログラムが適用されるリポタンパク質分析装置は、例えば、図１に示すように、被験試料に含まれるリポタンパク質成分を分離するためのカラム１と、カラム１から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液を２分配するスプリッター２と、スプリッター２によって分配された第１流路３及び第２流路４と、第１流路３に配置されたコレステロール（以下「TC」と称する）反応部５と、第２流路４に配置されたトリグリセリド（以下「TG」と称する）反応部６と、第１流路３におけるTC反応部５の下流に配置されたTC検出部７と、第２流路４におけるTG反応部６の下流に配置されたTG検出部８と、本装置の動作制御及びTC検出部７並びにTG検出部８から信号が入力されるシステムコントローラー９と、システムコントローラー９に接続された演算装置１０とを備えている。ここで、被験試料とは、特に限定されず、血清、血漿、髄液、組織液及びリンパ液等の生体由来液体サンプル、並びに細胞培養系由来の分泌粒子を含有するサンプルを意味する。
【００２５】
また、リポタンパク質分析装置は、血清試料をカラム１に供給するサンプラー１１と、カラム１に溶離液を供給するための第１ポンプ１２と、第１ポンプ１２によってカラム１に供給する溶離液から気体を除去するデガッサー１３とを備えている。
【００２６】
リポタンパク質分析装置においてカラム１としては、特に限定されないが、ゲルろ過用充填剤を充填してなるカラムを用いることが特に好ましい。特に、カラム１としては、８００〜１２００オングストロームの平均細孔径の充填剤を有するものを例示できる。平均細孔径が８００オングストローム未満の充填剤ではＣＭやＶＬＤＬなどの分子サイズの大きいリポタンパク質は細孔内に入り難くなり、一方、平均細孔径が１２００オングストロームを超える充填剤ではＬＤＬやＨＤＬなどの分子サイズの小さいリポタンパク質の分離が悪化するため、前述の通り平均細孔径が８００〜１２００オングストロームのものが好ましい。中でも平均細孔径が９００〜１１００オングストロームの充填剤は、分離能に優れるため、最終的により精度の高いリポタンパク質の分析を行うことを可能とする。
【００２７】
また、充填剤としては、液体クロマトグラフィーでの使用に充分耐える機械的強度を有するものを選択する必要がある。このような充填剤は、例えば、シリカゲル、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシメタクリレート及びその他の親水性樹脂を基材とするもの（例えばTSK gel Lipopropak、商品名、東ソー（株）製）を一例として例示することできる。
【００２８】
溶離液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液等を例示できるが、リポタンパク質を分離できるものであれば特に制限はない。緩衝液の濃度としては２０〜２００ｍＭ、特に好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲が良い。緩衝液の濃度が２０ｍＭ未満では緩衝能が小さく、２００ｍＭを超えると後述の酵素試薬とTC又はTGの反応が阻害される恐れが生じるからである。緩衝液のｐＨは、５〜９、特に好ましくは７〜８である。緩衝液のｐＨが５未満、あるいはｐＨが９を超えると、前記同様、酵素試薬との反応が阻害される恐れが生じるからである。しかし、TC及び／又はTGの測定を、酵素を用いないで行う場合等はこの限りではない。
【００２９】
TC反応部５は、カラム１から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液に含まれるTCを定量するための試薬を備えるTC用試薬タンク１４と第２ポンプ１５を介して連結されている。ここで、TCを定量するための試薬としては、特に限定されないが、例えば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、パーオキシダーゼなどの酵素と、N-エチル-N-(3-メチルフェニル)-N'- サクシニルエチレンジアミン、4-アミノアンチピリン、N-エチル-N-(3-スルホプロピル)-m-アニシジンなどの色素とを組み合わせた酵素−色素試薬を用いることができる。試薬としては、例えば、市販のデタミナーL TCII(協和メデックス株式会社)、LタイプCHO・H（和光純薬工業株式会社）試薬を好適に用いることができる。なお、これらの試薬は、TCと反応して、蛍光検出器や紫外可視検出器などの分光器で検出可能な蛍光や吸収を有する反応生成物を与える。
【００３０】
TG反応部６は、カラム１から溶出されたリポタンパク質を含む溶離液に含まれるTGを定量するための試薬を備えるTC用試薬タンク１６と第２ポンプ１５を介して連結されている。ここで、TGを定量するための試薬としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３リン酸オキシダーゼ、リポプロテインリパーゼ及びパーオキシダーゼ等の酵素と、キノン系発色色素等の色素とを組み合わせた酵素−色素試薬を用いることができる。キノン系発色色素としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン又はＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジンと４−アンチアミノピリジンの酸化縮合体が挙げられる。試薬としては、例えば、市販のデタミナーL TGII(協和メデックス株式会社)、LタイプTG・H（和光純薬工業株式会社）試薬を好適に用いることができる。
【００３１】
なお、これら、TC反応部５及びTG反応部６は、上述した試薬とTC又はTGとの反応温度を制御するための反応コイルをそれぞれ備えている。TC反応部５及びTG反応部６において、上述した試薬とTC又はTGとの反応温度は、３５〜５０℃、好ましくは４５〜５０℃とする。反応温度が３５℃未満では反応が不十分になりやすく、また、５０℃を超えると反応中に酵素が劣化する恐れが生じるからある。
【００３２】
TC検出部７は、TC反応部５でTCと試薬とが反応して生成した反応生成物の吸光度を検出するための、例えば紫外可視光検出器を備えている。また、TG検出器８は、TG反応部６でTGと試薬とが反応して生成した反応生成物の吸光度を検出するための、例えば紫外可視光検出器を備えている。例えば、上述した試薬としてキノン系発色色素を用いた場合、紫外可視検出器の測定波長は、５４０〜５６０ｎｍとすれば良い。
【００３３】
システムコントローラー９は、TC検出部７及びTG検出部８からの出力信号が入力され、TCに関するクロマトグラム及びTGに関するクロマトグラムを結果として出力する機能を備えている。システムコントローラー９から出力されるクロマトグラムとしては、例えば、図２に示すように、横軸を溶出時間（min）とし、縦軸を検出値（mV）として、TCに関するクロマトグラムとTGに関するクロマトグラムとを重ねて表示することができる。
【００３４】
演算装置１０としては、例えば、後述する分析プログラムをインストールしたコンピュータを使用することができる。演算装置１０は、システムコントローラー９と接続されており、システムコントローラー９から出力されるクロマトグラムを分析プログラムによってデータ処理し、被験試料に含まれるリポタンパク質を２０個のコンポーネントピークに分離するとともにTC量及びTG量を算出する機能を有する。なお、この演算装置１０は、インターネット、LAN或いはイントラネット等の情報通信回線網を介してシステムコントローラー９と接続されていても良い。
【００３５】
上述したリポタンパク質分析装置によれば、先ず、カラム１によって粒子サイズに依存して各種リポタンパク質を分離し、その後、カラム１から溶出された溶出液に含まれるTC及びTGを定量している。したがって、リポタンパク質分析装置によれば、カラム１の分離能に依存して、リポタンパク質のサブクラス毎にTC及びTGを定量することができる。
【００３６】
なお、リポタンパク質は、その粒子の大きさ、水和密度、及び電気泳動度などの性質の違いにより幾つかのクラスに分類されている。本分析装置においては、以下に説明する分析プログラムに従って、血清試料に含まれるリポプロテインを２０個のコンポーネントピークに分離する。
【００３７】
以下、分析プログラムについて説明する。分析プログラムは、ステップ１及びステップ２からなるフローチャートに従って演算装置１０を制御する。
【００３８】
先ず、ステップ１では、演算装置１０の入力手段を介してシステムコントローラー９から出力されるクロマトグラムを入力信号として入力する。すなわち、分析プログラムは、ステップ１によって、システムコントローラー９から出力されるクロマトグラムを入力信号として入力する検出手段としてコンピュータを実行させる。
【００３９】
ステップ１を詳細に説明すると、先ず、演算装置１０の入力手段を介して、図２に示したようなTCに関するクロマトグラムとTGに関するクロマトグラムとを入力すると、例えば、演算装置１０に内在する記憶装置或いは演算装置１０により記録可能な記録媒体にこれらクロマトグラム及び/又はクロマトグラムの基となる数値データが記憶される。
【００４０】
次に、ステップ２では、入力したクロマトグラムを波形処理して２０個のサブクラスに分離し、ガウス近似波形を算出する。すなわち、分析プログラムは、ステップ２によって、ガウス近似波形を算出する波形処理手段としてコンピュータを実行させる。波形処理手段により、ステップ１で入力したクロマトグラムを２０個の独立したピークに分離することができる。以下の説明において、２０個の独立したピークを、サイズの大きいものから順にG1〜G20と称する。G1及びG2はカイロミクロン（CM）に相当するコンポーネントピークであり、G3〜G7は超低密度（比重）リポタンパク（VLDL）に相当するコンポーネントピークであり、G8〜G13は低密度リポタンパク（LDL）に相当するコンポーネントピークであり、G14〜G20は高密度リポタンパク（HDL）に相当するコンポーネントピークである。VLDLに相当するコンポーネントピークの中で、G3〜G5は大VLDLであり、G6は中VLDLであり、G7は小VLDLである。LDLに相当するコンポーネントピークのなかで、G8は大LDLであり、G9は中LDLであり、G10は小LDLであり、G11〜G13は極小LDLである。HDLに相当するコンポーネントピークのなかで、G14及びG15は極大HDLであり、G16は大HDLであり、G17は中HDLであり、G18は小HDLであり、G19及びG20は極小HDLである。
【００４１】
ステップ２における波形処理手段は、ステップ１で入力したクロマトグラム或いは数値データを２０個のコンポーネントピークに分離して、G1〜G20を含むガウス近似波形を算出する処理を演算装置１０に実行させる手段である。ここで、２０個のコンポーネントピークは、リポプロテインのサイズにより分類されるコンポーネントピークである。
【００４２】
２０個のコンポーネントピークの各ピーク位置は、以下のように定義される。G1〜G20からなる２０個のピークについて、先ず基準となるピーク（アンカーピーク）のピーク位置（溶出時間）が決められ、次にアンカーピークを除くピーク（他の必須ピーク）のピーク位置が決められる。具体的に、一例として、G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17及びG18をアンカーピークとし、G1〜G4、G8、G11〜G14、G16、G19及びG20を他の必須ピークとする。G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17及びG18をアンカーピークとして定義する際の根拠となるデータの例を図３に示す。
【００４３】
健常中年男性（３０〜４０歳代）の集団におけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズはある範囲の幅に分布することから、アンカーピークのうちG6、G9及びG17の溶出位置を決定する（図３(a)参照）。より具体的には、複数の健常中年男性（３０〜４０歳代）について、採取した血清試料を用いて図２に示したようなTCに関するクロマトグラム及びTGに関するクロマトグラムを取得する。取得したクロマトグラムには、大分類としてのVLDL、LDL及びHDLに相当するピークがこの順に出現している。複数の健常中年男性について取得したクロマトグラムにおける、VLDL、LDL及びHDLに相当するピーク位置の平均値を算出し、平均VLDLサイズ、平均LDLサイズ及び平均HDLサイズをそれぞれG6、G9及びG17の溶出位置（粒子サイズ）として定義する。
【００４４】
また、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例では、TGリッチリポタンパクのトリグリセリドが分解されず、VLDLは大サイズのまま血中に留まっている。従ってリポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低くい症例の集団はVLDLのサイズは健常男性より有意に大きく、所定のサイズの範囲内に分布している。このVLDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG5の溶出位置として定義する（図３(b)参照）。
【００４５】
さらに、血中に存在するコレステロールエステル転送蛋白の働きによって、VLDLからLDLへトリグリセリドが渡され、その代わりにコレステロールエステルがLDLからVLDLに渡される。LDLはトリグリセリドリッチな粒子となり、肝性リパーゼによってLDL内のトリグリセリドが分解され、LDLは小型化する。この小型化されたLDLのサイズはリポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例の集団では、健常男性のLDLサイズより有意に小さく、あるサイズの範囲内に分布している。従って、このLDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG10の溶出位置として定義する（図３(b)参照）。
【００４６】
さらにまた、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例では、LDLやVLDLからHDLにトリグリセリドが渡され、その代わりにHDLからコレステロールエステルがLDLやVLDLに渡される。その結果、HDLはトリグリセリドリッチとなり、HDL内のトリグリセリドは肝性リパーゼによって分解されHDLは小型化する。したがって、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例の集団では、HDLのサイズは健常男性のHDLより有意にサイズ小さく、そのサイズもある範囲内に分布している。したがって、このHDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG18の溶出位置として定義する（図３(b)参照）。
【００４７】
さらにまた、コレステロールエステル転送蛋白欠損症ではHDLからLDLやVLDLにコレステロールエステルを渡し、その代わりにLDLやVLDLからトリグリセリドを受け取れないため、HDLはコレステロールエステルリッチになってそのサイズは大型化する。特にコレステロールエステル転送蛋白完全欠損症ではHDL中にはトリグリセリドがほとんど存在しない。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症のHDLサイズは、健常男性より有意に大型化し、あるサイズの範囲内に分布している。したがって、このHDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG15の溶出位置として定義する（図３(d)参照）。
【００４８】
さらにまた、アポE2/2のIII型高脂血症例においては、アポEの158番目のArgがCysへ置換する事により、アポEをリガンドとするLDL受容体（アポB/E）、LDL受容体関連蛋白質、VLDL-受容体との結合領域のコンフォーメーション変異して、小VLDL(レムナント)の取り込みが低下し、血中に小VLDLに相当する成分が増加し、特異的なピークが観察される。従って、この症例群におけるVLDLの平均溶出位置を、アンカーピークのうちG7の溶出位置として定義する（図３(c)参照）。小VLDLの溶出位置は、超遠心分離によって1.006 g/mlと1.019 g/mlの間に密度を有する画分として、アポE2/2のIII型高脂血症例を含む複数の被験者から分離された中密度（比重）リポタンパク（IDL）に対応している(Shinichi Usui, Yukichi Hara, Seijin Hosaki, and Mitsuyo Okazaki, Journal of Lipid Research, Volume 43, p 805-814, (2002)参照)。さらに、IDL画分のコレステロール量は、本発明における小VLDLにおけるコレステロール量と高度に相関している。したがって、アンカーピークG7によって規定される小VLDLは、アポE2/2のIII型高脂血症例において顕著に増加しており、レムナントリポタンパク質及び/又はIDLに対応している。
【００４９】
図３に示したデータは、TSKgel LipopropalXLカラム（東ソー（株）製）を使用して得られたデータであるが、アンカーピークとして定義する際の根拠となるデータとしては、他のカラムを使用して得られるデータを使用しても良い。
【００５０】
例えば、図４に示すように、Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムファルマシア社製）を用いて同様にデータを得ることができ、このデータに基づいてアンカーピークを定義することもできる。この場合、健常中年男性（３０〜４０歳代）プロファイルからG9及びG17の溶出位置を定義できる（図４(a)）。リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例のプロファイルからG10及びG18の溶出位置を定義できる（図４(b)）。アポE2/2のIII型高脂血症例のプロファイルからG7の溶出位置を定義できる（図４(c)）。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症のプロファイルからG15の溶出位置を定義できる（図４(d)）。
【００５１】
更に、図５に示すように、SkylightPak-LDLカラム(スカイライトバイオテック社製)を用いて同様にデータを得ることができ、このデータに基づいてアンカーピークを定義することもできる。この場合、健常中年男性（３０〜４０歳代）プロファイルからG6、G9及びG17の溶出位置を定義することができる（図5(a)）。リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例のプロファイルからG10及びG18の溶出位置を定義することができる（図5(b)）。アポE2/2のIII型高脂血症例のプロファイルからG7の溶出位置を定義できる（図5(c)）。コレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症のプロファイルからG15の溶出位置を定義できる（図5(d)）。
【００５２】
以上のようにして、G5、G6、G7、G9、G10、G15、G17及びG18をアンカーピークとして、それぞれの溶出位置を定義する。
【００５３】
次に、他の必須ピークについては、数学的にピークの位置と幅が決まるものである。他の必須ピークは、コンポーネントピークのサイズとその分布を固定した（時間と幅固定）ガウス近似によるコンポーネントピークの解析をするために必要なピークである。他の必須ピークに相当するリポタンパク質のサブクラスの分布幅は、LDLとHDLではほぼ同じと仮定し、アンカーピークの間をほぼ等間隔に埋めるもとする。G10とG15の間には4個の他の必須ピーク (peak11-14)を設定し、G7とG９の間には1個の他の必須ピーク (peak8)を設定し、G15とG17の間には1個の他の必須ピーク (peak16)を設定し、G18の後に2個の他の必須ピーク(peak19-20)を設定する。なお、HDLに属する他の必須ピーク (peak 16-20)の位置は、別のHDL専用カラムによる分析で、健常者集団のピーク観測頻度と再クロマトによる実験値との対応を参考に定義することができる。
【００５４】
またコンポーネントピークのG8〜G20については、ほぼその位置は等間隔で幅も同等となるように決めた。さらにコンポーネントピークの2,3,4はVoidのpeak1とアンカーピークのG5の間におけるガウス近似をするために必要なピークで、ピーク間隔と幅の規則から決めた。
【００５５】
さらに、コンポーネントピークの幅の最小値は、その分析系で得られる遊離グリセロール（分子量92のサイズが単一の粒子であり、図２中FGと表記）幅、最大値は隣り合うピーク間隔の2倍と定義することができる。
【００５６】
20個のコンポーネントピークに対して、ピーク幅は、SD(分)＝ピークの半値幅（秒）÷143で表される数値で設定することができる。具体的に20個のコンポーネントピークのピーク幅としては、G01について0.33 min、G02について0.40 min、G03について0.55 min、G04について0.55 min、G05について0.55 min、G06について0.50 min、G07について0.40 min、G08について0.38 min、G09について0.38 min、G10について0.38 min、G11について0.38 min、G12について0.38 min、G13について0.38 min、G14について0.38 min、G15について0.38 min、G16について0.38 min、G17について0.38 min、G18について0.38 min、G19について0.38 min、G20について0.48minを入力或いは予め設定する。
【００５７】
ステップ２における波形処理手段は、例えば、ガウス波形処理計算アルゴリズムを適用して実行することができる。ガウス波形処理計算アルゴリズムによれば、以下のようにして２０個のコンポーネントピークに分離することができる。
【００５８】
すなわち、先ず、クロマトグラム上の単一ピークの形を対称ガウス分布であると仮定すると、時刻tにおけるピークの高さh(t)は、
h(t)=H×exp(-(t-T)2/2σ2)
と書ける。ここで、Tはピーク位置でありσは幅（標準偏差）であり、（Hはピークの高さの最大値）。なお、ピーク形は他に、(1)Peason VII, (2)Lorentzian, (3)exponentially modified Gaussian, (4)Weibull, (5)bi-Gaussian, (6)poisson, (7)Gram-Charlier, (8)combination of Gauss and Cauchy functions, (9)combination of statistical moments, (10)cam-driven analog peakなどが知られており、これら(1)〜(8)のいずれかの形であると仮定することも可能である。
【００５９】
そして、n番目のピークの高さhn(t)は、n番目のピークの位置Tn、幅（標準偏差）σnをもちいて
hn(t)= Hn×exp(-(t-Tn)2/2σn2)  …I
と書ける（Hnはｎ番目のピーク最大値（高さ））。
【００６０】
ここで、exp(-(t-Tn)2/2σn2)=Gn(t)とおくと式Iは
hn(t)= Hn×Gn(t)    …II
と書ける。
【００６１】
N個のピークはそれぞれ独立であると仮定すると、時刻tにおける合成波形A(t)は、
A(t)＝h1(t)+ h2(t)+・・・・+ hn-1(t)+ hn(t)
= H1×G1(t)+ H2×G2(t) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(t) + Hn×Gn(t)  …III
となる。
【００６２】
データポイント数をmとすると、III式は下のようにｍ個かける。
A(t1)= H1×G1(t1)+ H2×G2(t1) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(t1) + Hn×Gn(t1)
A(t2)= H1×G1(t2)+ H2×G2(t2) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(t2) + Hn×Gn(t2)
・・・・・
A(tm)= H1×G1(tm)+ H2×G2(tm) + ・・・・+ Hn-1×Gn-1(tm) + Hn×Gn(tm)
時刻tにおける実際のクロマトグラム波形をR(t)とすると、R(t)＝A(t)となるようなピーク数n、ピークの位置T、幅（標準偏差）σを求めるのが、curve fitting methodである。実際には、非線形最小二乗法により、すべての時刻でR(t)＝A(t)とはならないから、(R(t)-A(t))2の和が最小となるパラメータを求める。
【００６３】
なお、curve fitting method以外でも、例えば、iterative method (Fletcher Powell, Marquardt, Newton-Raphson, Simplex minimization, Box-Complex methodなど)を適用することもできる。但し、curve fitting method以外の手法においては、initial valueが計算結果に影響を及ぼすこと、波形（GaussianなのかLorentzianなのか）をあらかじめ仮定しなければならないこと、ピーク数が大きいと（４個以上）収束が難しいこと、などが欠点とされている。したがって、いかに真の値に近い初期値を求めるかがポイントとなり、これらの欠点をクリアするためのピーク分離法として、(1)factor analysis、(2)moments analysis、(3)orthogonal polynominal analysis及び(4)inverse diffusion modelなどが最近報告され、これらを本アルゴリズムに適用することもできる。
【００６４】
ここで ti (i=1,2,・・・,m)は定数であるため、任意のGn(ti)も定数となる。すると上記III式は、
A(t1)= H1×G1(t1)+ H2×G2(t1) + ・・・・+ H19×Gn-1(t1) + H20×G20(t1)
A(t2)= H1×G1(t2)+ H2×G2(t2) + ・・・・+ H19×Gn-1(t2) + H20×G20(t2)
・・・・・
A(tm)= H1×G1(tm)+ H2×G2(tm) + ・・・・+ H19×G19(tm) + H20×G20(tm)
のようにｍ個できる。R(t)＝A(t)とすると、未知数がH1、H2、・・・・、H19、H20の20個で構成される一次式がｍ個できることとなる。仮に、m=20なら解は一次連立方程式を解くことにより、解は求まる。
【００６５】
実際のデータにおいてはデータポイント数が20ではないが、本アルゴリズムにおいては、高速処理するために計算しやすい20ポイント（例えば、２０個のサブクラムにおけるピークの位置20ヵ所）を便宜的に選んで計算する。なお、本アルゴリズムにおいては、データポイント数を20ヶ所に選択せずに、最小二乗法で求めることも可能である。
【００６６】
以上で説明したステップ１及びステップ２からなるフローチャートによれば、システムコントローラー９から出力されたクロマトグラム（例えば図２に示すクロマトグラム）を２０個のサブクラスに分離することができる。２０個のサブクラスに分離することによって得られるプロファイルは、内臓脂肪面積 (VFA)との相関関係が顕著に見られることから、VFAの蓄積に起因する疾患のリスクを検査する際に有効に利用される。
【００６７】
内臓脂肪の蓄積に起因する疾患としては、例えば、虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患を挙げることができる。すなわち、近年、生活習慣の変遷に伴って栄養過多や運動不足に陥り、脂肪蓄積、肥満を来たし、その結果、多数のリスクファクターの集積を伴って虚血性心疾患を中心とする動脈硬化性疾患の増加を招いている。これはインスリン抵抗性を起こす遺伝的素因に肥満などの後天的因子が加わり、インスリン抵抗性が生じて発症するものである。上流に位置する成因基盤としては、腹腔内内臓脂肪蓄積が重要である。肥満者はもちろん非肥満者においても腹腔内内臓脂肪の蓄積は糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患（coronary artery disease (CAD)）の発症に密接に関与している。したがって、内臓脂肪の蓄積に起因する疾患としては、糖尿病、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患を挙げることができる。
【００６８】
本発明を適用した内臓脂肪の蓄積に起因する疾患の診断方法によれば、例えば、内臓脂肪面積と大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量とが正の相関を、また内臓脂肪面積と大中HDLサブクラスのコレステロール量とが負の相関を示した。言い換えれば、内臓脂肪の蓄積に起因する疾患は、大中小のVLDLサブクラス、中小極小LDLサブクラスのコレステロール量の増加、大中HDLサブクラスのコレステロール量の減少によって診断される。
【００６９】
また、LDLのコレステロールの高値は、重要なリスク因子の１つである。LDLのコレステロール濃度が正常な群（LDL-C＜130mg/dL）では、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と負の相関を示したのに対して、大LDLサブクラスのコレステロール濃度が内蔵脂肪面積と正の相関を示した。これは、LDLの中に善玉LDLサブクラスが存在することを意味するもので、大LDLサブクラスが内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症を抑制する作用をもつことを意味している。大LDLサブクラスのコンポーネントピークは、他の必須ピークであり、VLDLとLDLの間の遷移成分として決められたものであるが、本発明により、臨床的意義をもつ新しいサブクラスとして新たに評価することができる。言い換えると、内蔵脂肪蓄積に起因する動脈硬化の発症は、大LDLサブクラスのコンポーネントピークのコレステロール量によって診断することができる。
【００７０】
また、冠動脈疾患では小VLDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、小及び極小LDLサブクラスのコレステロール濃度の増加、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の減少が見られることから、小VLDL、小及び極小LDL、大HDLサブクラスのコレステロール濃度の測定によって、冠動脈疾患を診断することができる。
【００７１】
したがって、本発明によれば、冠動脈疾患の診断方法を提供することができる。冠動脈疾患の診断方法は、上述したステップ１及びステップ２から構成されるフローチャートに従って分離された２０個のコンポーネントピークを利用する。具体的に、冠動脈疾患の診断方法は、診断対象の被験者から採取した被験試料に含まれるリポタンパク質を上述したステップ１及びステップ２から構成されるフローチャートに従って分析して、当該被験者由来の２０個のコンポーネントピークを取得する工程と、以下の（I）〜（V）から選ばれる少なくとも１つの式に基づいて値を算出する工程とを含んでいる。
(I)   Vs + Ls - Hs;
(II)  Vs + Ls;
(III)  Ls;
(IV) (Vs + Ls)/Hs; and
(V)  Ls/Hs,
【００７２】
ここで、“Vs”は小VLDLに含まれるコレステロール量を示し、“Ls”は小LDL及び極小LDLに含まれるコレステロール量の合計を示し、“Hs”は大HDLに含まれるコレステロール量を示している。
【００７３】
冠動脈疾患の診断方法によって取得された上記値は、冠動脈疾患の臨床検査に有用である。冠動脈疾患の診断方法において、上記分析する工程は、算出された上記値を基準値と比較する工程を更に含んでいても良い。この基準値は、標準の被験者群及び冠動脈疾患の被験者群を解析した結果に基づいて算出された、所定の数値として設定することができる。基準値は、年代別、人種別及び性別についてそれぞれ設定してもよい。
【００７４】
なお、冠動脈疾患で有意に増加する小VLDLサブクラスのコンポーネントピークは、アポE2/2のIII型高脂血症のVLDLサイズから求めたアンカーピークであり、アポE2/2のIII型高脂血症で増加しているレムナントに相当するもので、冠動脈の重要なリスク因子であるレムナントを本プログラムにおける小VLDLサブクラスに対応するコンポーネントピークから見積もることができると評価できる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
[実施例１]
<方法>
被験者
本実験では、１５人の健常者ボランティアと４７人の大阪大学病院に入院している４７人の患者を含む６２人の男性（２２〜６７歳）が登録された。全ての被験者は、大阪大学病院倫理委員会に従って、本実験を行う前にインフォームドコンセントを行った。全ての患者は、重度の肝疾患又は腎疾患を患っておらず、且つ、インスリン作用又は血清リポタンパク質レベルに影響することが知られている如何なる薬剤も投与されていない。静脈血は、夜間絶食の後に採取された。血清サンプルは、冷蔵庫に保管され、血液採取から７日以内に分析に供された
【００７６】
HPLC Method
簡単に述べると、5mlの全血清サンプルを２連のTSKgel LipopropakXL (東ソー社製)カラムに注入し、TSKeluent Lp-1 (東ソー社製)によって溶出された。カラムからの溶出液を、市販のキット、デタミナーL TC (協和メデックス社製)を用いたオンライン酵素反応の後、550nmで連続的にモニターした。主要リポタンパク質及びそのサブクラスに含まれるコレステロール濃度は、数学的処理によって重複するピークを解く修正されたガウス分布曲線近似法によって、複合的なクロマトグラムを処理するように設計された独自のコンピュータープログラムによって算出した。
【００７７】
我々は、サブクラス解析のため各ガウス・コンポーネントピークを決定し、動物及びヒト由来の様々なサンプルの十分な曲線適合分析を、各ガウス波形におけるピーク幅及びピーク位置を変更することなく一定の条件下で実行した。この目的のため、先ず、健常な正常血中脂質男性（n=28）におけるVLDL及びLDL粒子サイズの平均値を優先的に参照した。したがって、コンポーネントピーク6及び9の位置は、健常な被験者における、それぞれVLDLの位置 (36.8±2.5 nm)及びLDLの位置(25.5±0.4 nm)とした。同様に、ピーク5及び10の位置は、リポタンパクリパーゼ(LPL)を有する又は有しない極度の高トリグリセリド血症の被験者（>1000 mg/dL、n=9）における、それぞれVLDLの位置(44.5±2.1 nm)及びLDLの位置(23.0±0.5 nm)とした。ピーク7はアポE2/2のIII型高脂血症例(n=5)におけるLDL (又はVLDL; 31.3±1.0 nm)に対応していた。ピーク15はコレステロールエステル転送蛋白の完全欠損症(n=6)におけるHDL(13.5±0.4 nm)に対応していた。HDLサブクラスにおける他のコンポーネントピーク(ピーク16 〜20)は、HDLの範囲のみ分離するゲル浸透カラム(G3000SW)を用いたHPLCによって決定された５つのサブクラスに基づくもとした。上述した実験的裏付けによって決定された１１個のコンポーネントピークに加えて、９つの追加ピーク(ピーク1〜4、8及び11〜14)を導入し、各ガウス曲線の高さのみを変更することによって最良の曲線近似解析を可能とした。ピーク８の位置(28.6 nm)を、ピーク７とピーク９の中間位置として決定した。このピーク８は、TGリッチなレムナントリポタンパク質からLDLへのtransition componentを示している。４つのピーク(ピーク11〜14)は、ピーク８からピーク２０までの間隔と類似するようにピーク１０〜１５の間に一定の間隔で挿入された。さらに、最良の曲線近似を実行するため、３つのピーク（ピーク2〜4）を、少なくともボイド（ピーク1）とピーク5の間に導入した。追加のピークを異なるように設定しても、オリジナルのクロマトグラムに関する曲線近似分析の精度を低下させる結果となった。溶出時間の粒子径への変換は、標準サンプルにおける粒子径の対数を溶出時間に対してプロットしたカラム較正曲線を用いて行った。標準サンプルとしては、25nm径並びに37nm径のラテックスビーズ（マグスフィア社製）及びチログロブリン(17 nm)、フェリチン(12.2 nm)、カタラーゼ(9.2 nm)、アルブミン(7.1 nm)並びにオボアルブミン(6.1 nm)を含む高分子量キャリブレーター（ファルマシア社製）を用いた。
【００７８】
他の臨床及び脂質パラメーター分析
血清TC及びTGは、市販のキット（協和メディックス社製）を用いて酵素的に決定した。HDL-Cはヘパリン- Ca2+沈殿法によって定量した。LDL-Cは、Friedewaldらの式から算出した。尿酸（UA）絶食時免疫反応性インスリン（IRI）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（PAI）-1は、それぞれ酵素法及び二抗体ラジオイムノアッセイによって測定した。
【００７９】
体脂肪分布は、以前に報告した背臥位におけるコンピュータ断層撮影（CT）スキャン(ゼネラル・エレクトリック社製：General Electric CT/T scanner)によって決定した。ハウンズフィールド単位-40から-140までの注目領域とし、皮膚及び筋肉の間における腹膜腔外領域への脂肪層を、皮下脂肪面積（SFA）として定義した。SFAと同じ密度である腹腔内の領域をVFAとして定義した。SFA及びVFAは臍孔のレベルで測定した。
【００８０】
統計分析
データは、別段明記した場合を除き、平均±SDで表示した。様々な変数間の相関は、統計的に相違すると考えられるP-value <0.05であるピアソン相関係数（r-value）として示した。
【００８１】
<結果>
被験者における臨床的特徴及び脂質レベル
本実験における６２人の男性に関する被験者における臨床的特徴及び脂質レベルを表１に示す。
【００８２】
【表１】
2011053227.tif 000003
【００８３】
広い範囲の体脂肪値（肥満度指数(BMI)が21〜43 kg/cm2であり、 VFAが24〜255 cm2であり、 SFAが55〜512 cm2である）をカバーするように被験者を募集したため、大幅に広い範囲の身体測定値を得ることができた。代謝パラメータは、基準値と比較して変動を示した。例えば、UAは3.8から12.5 mg/dLであり、IRIは2〜43 μU/mLであり、PAI-1は5.0から75.7 ng/mLであった。
【００８４】
主要リポタンパク質及びそのサブクラスにおける血清コレステロールレベルの決定に対するHPLC分析性能
表２に示すように、3つのVLDLサブクラス(大、中及び小)、4つのLDLサブクラス(大、中、小、及び極小)及び5つのHDLサブクラス(極大、大、中、小及び極小)をリポタンパク質の粒子サイズに基づいて定義した（カイロミクロン(>80 nm、ピーク1〜2)、VLDL(30〜nm、ピーク3〜7)、LDL(16〜30 nm、ピーク8〜13)及びHDL(8〜16 nm、ピーク14〜20)）。
【００８５】
【表２】
2011053227.tif 000004
【００８６】
正常血中脂質被験者(TC=131mg/dL、TG=39mg/dL)及び高脂血症被験者 (LPL欠損症、TC=219mg/dL、TG=1420mg/dL)について、曲線近似解析した代表的なクロマトグラムを図６に示した。
【００８７】
図６において、（a）は健康な女性の代表的なHPLCパターンを示し、（b）はLPL欠損症患者の代表的なHPLCパターンを示している。5μLの血清サンプルを２連のゲル透過カラム(TSKgel LipopropakXL)に注入し、TSKeluent LP-1 を用いて 流速0.7mL/minで溶出した。実線はTC試薬によるオンライン酵素反応によって検出された実際のHPLCパターンである。破線は、ガウス総和法を用いた曲線近似によって決定した、個々のサブクラス及びそれらのガウス曲線の合計である。血清TCレベル及び血清TGレベルは、それぞれ（a）において131mg/dL及び39mg/dLであり、（b）において219mg/dL及び1420mg/dLであった。観察されたピーク時間から決定される粒子径(nm)も示した。
【００８８】
２０個のサブクラス及び主要クラスにおけるコレステロール決定の同時再現性は、２つの異なる集団サンプルを用いて決定した。表２に示すように、集団１はTC=177mg/dL及びTG=56 mg/dLであり、集団２はTC=163mg/dL及びTG=428mg/dLであった。
【００８９】
LDL粒子サイズ及びHDL粒子サイズについての同時再現性は、集団１においてそれぞれ25.20±0.07 nm (変動係数[CV]は0.27%) 及び11.25±0.04 nm (CVは0.36%)であり、集団２においてそれぞれ25.63±0.14 nm (CVは0.56%)及び11.03±0.05 nm (CVは0.45%)であった。
【００９０】
２０個のガウス曲線の合計面積は、元々のクロマトグラムにおける面積に対して100.2±0.4%（なお、99.1〜101.7%であった（n=62））であった。HDLに対応するピーク（ピーク１４〜２０）の合計面積は、元々のクロマトグラムにおけるHDｌピーク面積に対して99.7±1.1%（なお98.3〜103.9%であった（n=62））であった。
【００９１】
沈殿法によって決定したHDL-C（x軸とする）と、HPLCによって決定した全てのHDLサブクラスを含む全HDL（y軸とする）との間にははっきりとした相関が得られた（なおy=0.975x+5.29 (r=0.973, n=62, P<0.0001)）。また、Friedewald方程式により算出されたLDL-C（x軸とする）と、HPLCによって決定した全てのLDLサブクラスを含む全LDL-C（y軸とする）との間にもまたはっきりとした相関が得られた（y=0.903x+6.28 (r=0.977, n=62, P<0.0001)）。
【００９２】
HPLCによるコレステロールプロファイルと臨床パラメータとの相関
主要リポタンパク質とそれらのサブクラスにおけるコレステロールレベルと、様々な臨床パラメータ(年齢、BMI、VFA、SFA、UA、IRI及びPAI-1)及び血清TGとの単純な相関を表３にまとめた。さらに、LDL粒子サイズとHDL粒子サイズとの相関もまた表３に示した。
【００９３】
【表３】
2011053227.tif 000005
【００９４】
年齢については、中HDL-Cと小HDL-Cとの間に有意な負の相関(P<0.01)が見られた。BMIについては、HDLパラメータ（すなわち、大HDL-C (P<0.01)及びHDL粒子サイズ(P<0.01)）についてのみ有意な負の相関が見られた。SFAとリポタンパク質サブクラスの全てとの間には相関が見られなかったが、VFAとVLDL-Cサブクラス（大、中及び小）との間及びVFAとLDL-C（中、小及び極小）との間には有意な正の相関(P<0.01)がみられ、また、VFAと大HDL-C及び中HDL-Cとの間、VFAとLDLとの間並びにVFAとHDL粒子サイズとの間に有意な負の相関(P<0.01)が見られた。
【００９５】
UAについては、VLDL-Cサブクラス（中及び小）との間に正の相関(P<0.01)が見られ、大HDL-C及びHDL粒子サイズとの間に負の相関(P<0.01)が見られた。IRIの場合には、小LDL-C及び極小LDL-Cとの間に正の相関(P<0.01)が見られ、大HDL-C及びHDL粒子サイズとの間に負の相関(P<0.01)が見られた。PAI-1については、小HDL-C及び極小HDL-Cとの間に正の相関(P<0.01)が見られた。血清TGレベルについては、VFAとVLDL-Cサブクラス（大、中及び小）との間並びにVFAとLDL-Cサブクラス（小及び極小）との間に有意な正の相関(P_0.01)が見られ、VFAと大LDL-Cとの間、VFAとHDL-Cサブクラス（大及び中）との間、VFAとLDLとの間並びにVFAとHDL粒子サイズとの間に負の相関(P<0.01)が見られた。
【００９６】
VFAとリポタンパク質サブクラスの間の相関に対する従来の脂質パラメータの影響
表３に示した身体測定値のなかで、VFAレベルがリポタンパク質サブクラスに対して最も強い相関を示した。したがって、VFAとリポタンパク質サブクラスの間の相関に対する従来の脂質パラメータの影響を、血清TGレベル、血清TCレベル及びLDL-Cレベルのそれぞれ（表４）の調整によって検討した。VFAと小LDL-Cとの間及びVFAと極小LDL-Cとの間の正の相関は、それぞれTG、TC、HDL-C及びLDL-Cの調整の後においても有意(P<0.01)のままであった。 
【００９７】
【表４】
2011053227.tif 000006
【００９８】
VLDLサブクラスについては、単純相関解析によって、全てのVLDLサブクラスはVFAに正に相関するが、血清TGレベルの調整の後に大VLDL及び小VLDLはそれぞれ負に相関及び正に相関していた。LDLサブクラスの場合、LDL-Cの調整によって大LDLとVFAとの間に有意な正の相関(P<0.01)が見られたが、中LDLとVFAとの間の有意な正の相関は除外された。
【００９９】
VFAとLDLサブクラスとの間の相関に及ぼすLDL-Cの影響
被験体を、全LDL-Cレベル（全てのLDLサブクラスの総和）の中間値によって、低LDL-C集団(n=31であり、LDL-C<130 mg/dLである)と高LDL-C集団(n=31であり、LDL-C≧130 mg/dLである)からなるサブ集団に分けた。全集団(n=62)において、表３に示したように、VFAと全LDL-Cとの間に有意な正の相関(r=0.431, P<0.001)が見られた。低LDL-C集団においては、VFAと全LDL-Cとの間に相関が無かったが、高LDL-C集団においては有意な正の相関(r=0.546, P<0.002)が見られた。VFAとLDLサブクラスとの間の散布図を図７に示す。
【０１００】
図７において、(a)は大LDL-Cに対するVFAの散布図であり、(b)は小LDL-Cに対するVFAの散布図であり、(c)は極小LDL-Cに対するVFAの散布図であり、高LDL-C集団については（○）で示し、低LDL-C集団着いては（●）で示した。破線は低LDL-C集団についての直線回帰を示している。相関係数及びP値は低LDL-C集団について示している(n=31)。
【０１０１】
大LDL-Cは、全集団及び高LDL-C集団においてVFAと有意な相関を示さなかったが、低LDL-C集団においては有意な負の相関(r= -0.446及びP<0.02)を示した。小LDL-C及び極小LDL-Cは、全集団及び両サブ集団においてVFAと有意な正の相関を示したが、高LDL-C集団において極小LDL-CはVFAと相関を示さなかった。
【０１０２】
〔実施例２〕
<方法>
被験者
1996年12月から1998年12月までの2年間に山形大学木病院で心臓カテーテルを経験した609人の男性患者から62人の被験者を選抜した。なお、被験者は、いかなる脂質低下治療も行われておらず、糖尿病や腎臓及び肝臓疾患に罹患していない者である。被験者は、本実験に入る前に山形大学病院倫理委員会に従ってインフォームドコンセントを行った。
【０１０３】
62±9歳である選択された被験者(41〜76歳の範囲)は、CADの存在に基づいて２つのグループに分けられた。CADを伴う患者群においては、21人の患者が心筋梗塞(MI)の病歴を有しており（３名が急性心筋梗塞、1ヶ月以内の心筋梗塞が11名、陳旧性心筋梗塞が7名）、7人の患者が労作性狭心症であり、11人の患者が血管攣縮性狭心症であり、4人の患者が不安定狭心症であり、2名の患者は重篤な冠動脈狭窄を伴う心臓疾患の症状を有していなかった(無症候性心筋虚血)。CADを有しないコントロール群(n=17)においては、4人の患者が非典型的胸痛であり、6人の患者が心筋症であり、4人の患者が大動脈弁疾患であり、3人の患者が心電図異常であった。
【０１０４】
本実験において、血管疾患の重篤性を評価することを目的として、以下の5つのランク（-1から3）を定義した。”-1”は血管疾患なし、”0”は75％未満の狭窄を伴う血管疾患、”1”は75％以上の狭窄を伴う一枝疾患、”2”は75％以上の狭窄を伴う二枝疾患、”3”は75％以上の狭窄を伴う三枝疾患。
夜間絶食の後に静脈血が採取された。血漿試料は冷蔵庫に保管され、採血から7日以内に分析された。
【０１０５】
HPLC法
血漿リポタンパク質は実施例１に記載した方法に従って分析した。
【０１０６】
他の臨床及び脂質パラメータ解析
血漿TGは市販のキット（協和メディックス社製）を用いて酵素的に決定した。血漿アポリポタンパク質A-I、A-II、B、C-II、C-III及びEレベルは、第一化学薬品（東京、日本）の免疫比濁法によって決定した。空腹時血糖は酵素法によって測定した。病歴とアンケートを利用して、年齢、体重、身長、喫煙履歴、家系、血圧、陳旧性心筋梗塞、狭心症、糖尿病及び薬剤使用に関するデータを取得した。肥満度指数(BMI)は、体重及び身長から算出した（体重(kg)/[身長(m)]2）。
【０１０７】
統計解析
データは、別段明記した場合を除き、平均±SDで表示した。スチューデントt-検定を用いて群間の統計的有意差を決定した。様々な変数間の相関は、統計的に相違すると考えられるP-value <0.05であるピアソン相関係数（r-value）として示した。
【０１０８】
結果
臨床的特徴、脂質レベル及びリポタンパク質の比較
本実験における62人の男性について臨床的特徴、脂質レベル及びリポタンパク質レベルを表５に示した。年齢、BMI、FBS、危険マーカーの百分率分布（現在喫煙者、高血圧及び家系）、血漿TCレベル及び血漿TGレベルについては、患者群及びコントロール群間に有意差はなかった。アポリポタンパク質プロファイルについては、アポリポタンパク質B及びアポリポタンパク質Eは患者群において有意に高い値が得られた（それぞれP<0.05及びP<0.01）。
【０１０９】
【表５】
2011053227.tif 000007
【０１１０】
主要リポタンパク質（全VLDL、全LDL及び全HDL）とともに、３つのVLDLサブクラス（大、中及び小）、４つのLDLサブクラス（大、中、小及び極小）、５つのHDLサブクラス（極大、大、中、小及び極小）についてHPLC後の成分分析によってコレステロールレベルを決定した。表６に患者群における主要リポタンパク質及びそれらのサブクラスにおけるコレステロールレベルをコントロール群と比較した。
【０１１１】
【表６】
2011053227.tif 000008
【０１１２】
主要リポタンパク質クラスについては、患者群において有意に高い全LDL-C(P<0.05)及び有意に低い全HDL-C(P<0.05)を示したが、全VLDL-Cレベルに有意差はなかった。リポタンパク質サブクラスについては、患者群において有意に小VLDL-C(P<0.001)、小LDL-C(P<0.05)及び極小LDL-C(P<0.001)が増加していたが、有意に大HDH-C(P<0.001)が減少していた。従来の危険マーカー、非HDL、TC/HDL-C並びにLDL-C/HDL-Cの比率がコントロール群よりも患者群において有意に高い値を示した。
【０１１３】
より明確に2つの群を識別するため、幾つかの派生した変数を各サブクラスから算出した。患者群において有意に増加した３つのサブクラス（小VLDL、小LDL及び極小LDL）を組み合わせて“Vs+Ls”と表現した。“Vs”は小VLDL中のコレステロールレベルを示している。“Ls”は小LDL及び極小LDLにおけるコレステロールレベルの合計を示している。層化したサブクラス(Vs+Ls)、及び減少したサブクラス（大HDL）の差又は比は、“Vs + Ls - Hs”、“(Vs + Ls)/Hs”又は“Ls/Hs”と表現することができる。“Hs”は大HDL中のコレステロールレベルを示している。
【０１１４】
これらすべての派生変数もまた、コントロール群よりも患者群において有意に高い値を示し、なかでも“Vs + Ls - Hs”が最も強い有意差を示す。
【０１１５】
主要リポタンパク質、それらのサブクラス及び派生変数におけるコレステロールレベルと血管疾患スコアとの相関
主要リポタンパク質及びそれらのサブクラスにおけるコレステロールレベルとCADの指標となるVDスコアとの単純相関を表７に示した。VDスコアは、小VLDL-C及び小LDL-Cとの間において強く正に相関しており(P<0.01)、大HDL-Cとの間に負に相関していた(P<0.01)。
【０１１６】
【表７】
2011053227.tif 000009
【０１１７】
VDスコアと表６に示した幾つかの派生変数との相関を検討した。表７に示すように、すべての派生変数は、VDスコアに対してr=0.333 (n=62, P<0.01) 以上の高さで強く正に相関しており、最も強い相関(r=0.428, P<0.001)は“Vs + Ls - Hs”において見られた。従来の脂質危険マーカーについては、VDスコアは、LDL-C/HDL-C比及びLDL-C/HDL-C比との有意な相関(P<0.01)が見られたが非HDL-Cについては相関していなかった（データは示さず）。
【０１１８】
CAD重篤度のリポタンパク質サブクラス及びそれらの派生変数への相関に対する、従来の脂質パラメータの影響
VDスコア、リポタンパク質及びそれらの派生変数の間の相関に対する従来の脂質パラメータの影響を検討し、CAD重篤度に関連するそれら変数の臨床的有用性を評価した。表７は、従来の各変数（TG、TC、HDL-C、LDL-C及びアポリポタンパク質B）、又は非HDL-C、TC/HDL-C及びLDL-C/HDL-Cといった変数の各組み合わせをコントロールした後におけるHPLC変数とVD変数との間の部分相関係数を示している。血漿TG、TC及びHDL-Cについてコントロールしても、VDスコアとHPLC変数との間の相関には大きな影響がなかった。一方、極小LDL-CとVDスコアとの正の相関については、LDL-C、アポリポタンパク質B又は非HDL-Cのコントロール後には有意差がなくなっていった。LDL-Cの調整の後に大LDL-CとVDスコアとの有意な負の相関が見られた。TC/HDL-C又はLDL-C/HDL-Cについてコントロールすることによってすべての有意な相関はなくなったが、TC/HDL-Cをコントロールすることによって中VLDL-CとVDスコアとの負の相関はより有意になった。“Vs + Ls - Hs”とVDスコアとの正の相関は、いかなる要素をコントロールした後においても有意なままであった。さらに、“Vs + Ls”とVDスコアとの有意な正の相関は、TC/HDL-C又はLDL-C/HDL-Cをコントロールした場合を除いて、維持された。
【０１１９】
〔実施例３〕
本実施例では、Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムファルマシア社製）及び２つのTSKgel LipopropalXLカラム（東ソー（株）製）を用いて、表８に示す59サンプルについて分析し、得られた結果を比較した。
【０１２０】
【表８】
2011053227.tif 000010
【０１２１】
本実施例では、Superose 6HR 10/30カラム（アマシャムファルマシア社製）及び２つのTSKgel LipopropalXLカラム（東ソー（株）製）を用いて、表９に示す44サンプルについて更に分析し、得られた結果を比較した。
【０１２２】
【表９】
2011053227.tif 000011
【０１２３】
本実施例では、表１０に示すように、20個のコンポーネントピークの溶出時間（粒子サイズ）を定義した。
【０１２４】
【表１０】
2011053227.tif 000012
【０１２５】
健常被験者から採取されたプールされた血清について、Superose 6HR 10/30カラムを用いて得られた分析結果を図８(a)及び(b)に示し、TSKgel LipopropakXLカラムを用いて得られた分析結果を図９(a)及び(b)に示し、SkylightPak-LDLカラムを用いて得られた分析結果を図１０(a)及び(b)に示す。図８(a)、９(a)及び１０(a)において太線は、コンポーネントピークに分割する前のコレステロールのプロファイルを示している。図８(b)、９(b)及び１０(b)において太線は、コンポーネントピークに分割する前のトリグリセリドのプロファイルを示している。
【０１２６】
図１１は、表８に示した59人の被験者についてSuperose 6HR 10/30カラムを使用して得られた結果（図８(a)）に基づいて、ピークG7〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１２は、表８に示した59人の被験者についてTSKgel LipopropakXLカラムを使用して得られた結果（図９(a)）に基づいて、ピークG7〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１３は、表８に示した59人の被験者における図１１及び１２に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG7〜G13（小VLDL〜LDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、Superose 6HR 10/30カラムを使用した場合とTSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合との比較結果を示している。さらに、図１４は、表８に示した59人の被験者における図１１及び１２に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG14〜G20（HDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、両カラムを使用した場合の比較結果を示している。
【０１２７】
図８(a)、９(a)及び１１〜１４から判るように、１４個のコンポーネントピークG7〜G20に含まれるコレステロール量は、Superose 6HR 10/30カラム及びTSKgel LipopropakXLカラムのいずれを用いた場合においてもほぼ一致していた。
【０１２８】
図１５は、表９に示した44人の被験者についてTSKgel LipopropakXLカラムを使用して得られた結果（図９(a)）に基づいて、ピークG6〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１６は、表９に示した44人の被験者についてSkylightPak-LDLカラムを使用して得られた結果（図１０(a)）に基づいて、ピークG6〜G20のそれぞれに含まれるコレステロール量の平均を算出した結果を示している。図１７は、表９に示した44人の被験者における図１５及び１６に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG6〜G13（中VLDL〜LDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、TSKgel LipopropakXLカラムを使用した場合とSkylightPak-LDLカラムを使用した場合との比較結果を示している。さらに、図１８は、表９に示した44人の被験者における図１５及び１６に示した結果に基づいて、コンポーネントピークG14〜G20（HDLサブクラスまでに対応）に含まれるコレステロール量について、両カラムを使用した場合の比較結果を示している。
【０１２９】
図９(a)、１０(a)及び１５〜１８から判るように、１５個のコンポーネントピークG6〜G20に含まれるコレステロール量は、TSKgel LipopropakXLカラム及びSkylightPak-LDLカラムのいずれを用いた場合においてもほぼ一致していた。
【０１３０】
したがって、本発明に係る分析方法によれば、分離能等の特性に関わらず如何なるカラムを用いても、信頼性に優れたデータ解析結果を示すことができる。また、図８(b)、９(b)及び１０(b)に示すように、本発明に係る分析方法は、上述したコレステロールの解析と同様にトリグリセリドの解析にも適用できる。言い換えれば、本発明に係る分析方法によれば、コレステロールに由来する検出信号に基づいて定義されたコンポーネントピークを用いて、トリグリセリド、遊離コレステロール、リン脂質及びアポリポタンパク質等に由来するプロファイルについて近似曲線を算出することができる。
【図１】
2011053227.tif 000013
【図２】
2011053227.tif 000014
【図３】
2011053227.tif 000015
【図４】
2011053227.tif 000016
【図５】
2011053227.tif 000017
【図６】
2011053227.tif 000018
【図７】
2011053227.tif 000019
【図８】
2011053227.tif 000020
【図９】
2011053227.tif 000021
【図１０】
2011053227.tif 000022
【図１１】
2011053227.tif 000023
【図１２】
2011053227.tif 000024
【図１３】
2011053227.tif 000025
【図１４】
2011053227.tif 000026
【図１５】
2011053227.tif 000027
【図１６】
2011053227.tif 000028
【図１７】
2011053227.tif 000029
【図１８】
2011053227.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月4日(2011.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
診断対象者から採取した被験試料を準備する工程と、
上記被験試料に含まれる複数クラスのリポタンパク質を液体クロマトグラフィーで分離し、分離したリポタンパク質粒子に含まれる成分に由来する信号を検出する工程と、
リポプロテインが、アンカーピーク及び他の必須ピーク（extra essential peaks）からなるコンポーネントピークから見積もられるサブクラスにより構成されていると仮定し、上記検出した信号を用いて、コンポーネントピークに対応する近似波形を算出する工程と、
上記算出した近似波形を内臓脂肪の蓄積に起因する疾患を検出するために解析する工程とを含む方法。
【請求項２】
上記信号を検出する工程では、上記液体クロマトグラフィーで分離したリポタンパク質粒子に含まれるVLDL、LDL及びHDLに由来する信号を検出し、
上記近似波形を算出する工程では、健常中年男性の集団におけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズの平均値からそれぞれ中VLDLアンカーピーク、中LDLアンカーピーク及び中HDLアンカーピークが規定され、リポタンパクリパーゼ活性が無いかまたは非常に低い症例におけるVLDLサイズ、LDLサイズ、HDLサイズの平均値からそれぞれ大VLDLアンカーピーク、小LDLアンカーピーク及び小HDLアンカーピークが規定され、コレステロールエステル転送蛋白欠損症におけるHDLサイズの平均値から極大HDLアンカーピークが規定され、III型高脂血症におけるVLDLサイズの平均値から小VLDLアンカーピークが規定されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記中VLDLアンカーピークは溶出位置が36.8±2.5 nmであり、上記中LDLアンカーピークは溶出位置が25.5±0.4 nmであり、上記中HDLアンカーピークは溶出位置が10.9±0.2 nmであり、上記大VLDLアンカーピークは溶出位置が44.5±2.1 nmであり、上記小LDLアンカーピークは溶出位置が23.0±0.5 nmであり、上記小HDLアンカーピークは溶出位置が9.8±0.2 nmであり、極大HDLアンカーピークは溶出位置が13.5±0.4 nmであり、上記小VLDLアンカーピークは溶出位置が31.3±1.0 nmであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記他の必須ピークにおける溶出位置とピーク幅は、上記アンカーピーク間をほぼ等間隔に埋めるものとして設定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記近似曲線は２０個のコンポーネントピークから構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記解析する工程では、大VLDL、中VLDL、小VLDL、中LDL、小LDL、極小LDL、大HDL及び中HDLに含まれるコレステロール量と基準値とを比較することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記解析する工程では、大LDLに含まれるコレステロール量と基準値とを比較することによって動脈硬化症を検出するための解析を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記解析する工程では、小VLDL、小LDL、極小LDL及び大HDLに含まれるコレステロール量と基準値とを比較することによって冠動脈疾患を検出するための解析を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記解析する工程では、(I)〜(V)から選ばれる少なくとも１つの式により値を算出し、冠動脈疾患を検出するための解析を行うことを特徴とする請求項１記載の方法。
(I)   Vs + Ls - Hs;
(II)  Vs + Ls;
(III)  Ls;
(IV) (Vs + Ls)/Hs
(V)  Ls/Hs,
（“Vs”は小VLDLに含まれるコレステロール量を示し、“Ls”は小LDL及び極小LDLに含まれるコレステロール量の合計を示し、“Hs”は大LDLに含まれるコレステロール量を示している。）
【請求項１０】
上記算出した値と基準値とを比較する工程を更に含む請求項９記載の方法。