(57)【要約】【課題】真菌を属又は種レベルで同定することができ、微生物群集の解析が可能な、住環境真菌の検出方法を提供する。【解決手段】５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域についてＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、得られた制限酵素断片長の多型を解析するＴ−ＲＦＬＰ（Terminal  Restriction  Fragment  Length  Polymorphism）法により解析し、住環境真菌の検出を行う、住環境真菌の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域についてＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、得られた制限酵素断片長の多型を解析するＴ−ＲＦＬＰ（Terminal  Restriction  Fragment  Length  Polymorphism）法により解析し、住環境真菌の検出を行うことを特徴とする住環境真菌の検出方法。
【請求項２】
前記制限酵素がEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１記載の住環境真菌の検出方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲ産物をEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれる少なくとも２種の制限酵素で切断することを特徴とする請求項１又は２記載の住環境真菌の検出方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲ産物をEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれる少なくとも１種の制限酵素で切断することを特徴とする請求項１又は２記載の住環境真菌の検出方法。
【請求項５】
下記（ｃ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域を増幅することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の住環境真菌の検出方法。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して８０％以上の相同性を有しかつ前記ＤＮＡ領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して８０％以上の相同性を有しかつ前記ＤＮＡ領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
【請求項６】
両方又は一方が蛍光色素で標識された前記（ｃ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅することを特徴とする請求項５記載の住環境真菌の検出方法。
【請求項７】
１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅して、得られたＰＣＲ産物を鋳型として、前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域を増幅することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の住環境真菌の検出方法。
【請求項８】
下記（ａ）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、前記１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅することを特徴とする請求項７記載の住環境真菌の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して８０％以上の相同性を有しかつ前記ＤＮＡ領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
【請求項９】
住環境真菌が環境Exophiala属真菌、Acremonium属真菌、Fusarium属真菌、Scolecobasidium属真菌、Phoma属真菌、Phialophora属真菌、Cladosporium属真菌、Ochroconis属真菌、Alternaria属真菌、Saccharomyces属真菌、Rhodotorula属真菌、Aspergillus属真菌、Penicillium属真菌、Aureobasidium属真菌、Candida属真菌、Pichia属真菌、Capronia属真菌及びRamichloridium属真菌からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の住環境真菌の検出方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか記載の住環境真菌の検出方法に用いる住環境真菌検出用キットであって、前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット、及びEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれる少なくとも１種の制限酵素を含む住環境真菌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、住環境真菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
住居、商業用ビル、病院等の建物の洗濯機、浴室等に生育する真菌、又は衣服に付着する微生物は多数存在する。このうち、子嚢菌門又は不完全菌門等の真菌は、カビ汚れ、カビアレルギー、肺真菌症、皮膚真菌症等の病気の原因となる。したがって、環境衛生上の観点から、このような真菌の検出が極めて重要である。
【０００３】
従来、真菌の検出は、生菌分離法により行なわれてきた。しかし、生菌分離法は、解析に時間を要し、分離できた生菌についてのみしか解析することができないため、結果の信頼性に課題が残る。さらに、生菌を分離できなければ、真菌の検出自体が不可能である。
【０００４】
微生物の分子生物学的検出方法がこれまでに提案されている（例えば、特許文献１〜２及び非特許文献１〜４参照）。しかし、従来の方法では、住環境等に多数存在する真菌を同時に検出することはできない。したがって、１種又は２種以上の真菌を高感度で短時間に検出でき、住環境等に多数に存在する真菌の菌叢を解析できる方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−９４８０３号公報
【特許文献２】特開２００９−８２１５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Microbial  Ecology、43（3）、p．329-340、2002
【非特許文献２】Molecular  Ecology、16、p．4624-4636、2007
【非特許文献３】Holzforschung、61、p．104-111、2007
【非特許文献４】Journal  of  Food  Protection、62、p．1191-1197、1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、住環境真菌を属又は種レベルで同定することができ、住環境真菌群集の解析が可能な、住環境真菌の検出方法の提供を課題とする。さらに、本発明は、住環境から真菌を分離することなく、生菌分離法では通常分離、解析できない菌株であっても検出が可能な、住環境真菌の検出方法の提供を課題とする。また、本発明は、前記検出方法に好適に用いることができる住環境真菌検出用キットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述のように、１種又は２種以上の真菌を高感度で短時間に検出でき、住環境等に多数に存在する真菌の菌叢を解析できる、真菌の網羅的な検出を困難にしている一因としては、住環境より微生物を分離培養後単離した後に種の同定をする必要があり、種の同定には遺伝子情報と形態情報の両方が必要であること、また真菌は細菌と比較して遺伝子情報に基づく種又は属の特定に必要な遺伝子データベースの整備が不十分であること等が挙げられる。
【０００９】
このような課題に鑑み、本発明者等は、住環境真菌を属又は種レベルで識別することができ、かつ網羅的に住環境真菌を検出しうる新たなＤＮＡ領域を探索すべく、鋭意検討を行った。その結果、住環境真菌のｒＲＮＡをコードするｒＤＮＡの特定領域についてＴ−ＲＦＬＰ（Terminal  Restriction  Fragment  Length  Polymorphism：制限酵素断片長多型解析）法により解析を行うことにより、住環境真菌を属又は種レベルで同定することができ、住環境真菌群集の解析が可能となることを見い出した。さらに、この方法によると住環境から真菌を分離することなく、生菌分離法では通常分離、解析できない菌株であっても検出することが可能となることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づき完成するに至った。
【００１０】
本発明は、５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域についてＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、得られた制限酵素断片長の多型を解析するＴ−ＲＦＬＰ（Terminal  Restriction  Fragment  Length  Polymorphism：制限酵素断片長多型解析）法により解析し、住環境真菌の検出を行うことを特徴とする住環境真菌の検出方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、前記住環境真菌の検出方法に用いる住環境真菌検出用キットであって、前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット、及びEcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIからなる群より選ばれる少なくとも１種の制限酵素を含む住環境真菌検出用キットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の住環境真菌の検出方法によれば、カビ汚れ、カビアレルギー、肺真菌症、皮膚真菌症等の原因とされている住環境真菌を属又は種レベルで同定することができ、住環境真菌群集の解析が可能となる。また、本発明の住環境真菌の検出方法によれば、住環境から真菌を分離することなく、生菌分離法では通常分離、解析できない住環境真菌であっても検出することができる。さらに、本発明の住環境真菌検出用キットは、前記検出方法に好適に適用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の住環境真菌の検出方法は、５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域についてＰＣＲ法により増幅し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素で切断し、得られた制限酵素断片長の多型を解析するＴ−ＲＦＬＰ法により解析し、住環境真菌の検出を行うことを特徴とする。本発明の住環境真菌の検出方法においては、検出対象とする試料から住環境真菌を分離するか否かに関わらず、住環境真菌を検出することができる。
【００１４】
本発明において「住環境真菌」とは、住居、商業用ビル、研究所、工場、病院、学校、飲食店、浴場等の建築物に存在する真菌、衣服に付着する真菌、空調機器、洗濯槽、製造設備、医療機器、調理用具等に存在する真菌をいう。
【００１５】
前記で示すような住環境真菌としては、子嚢菌門又は不完全菌門の真菌が知られている。具体的には、洗濯水、洗濯槽、家庭用排水、浴室、家庭用浴室又は公衆浴場の風呂水、排水汚泥から子嚢菌門及び不完全菌門の真菌が検出されている（例えば、Bokin  Bobai、30(11)、p．703-708(2002)；生活衛生、49(3)、p．161-167(2005)；Mycopathologia、97、p．17-23(1987)；Bokin  Bobai、30(6)、p．369-376(2002)；「カビによる病気が増えている」、p．139-144、農分協、２００６年、等参照）。本発明の住環境真菌の検出方法により、このような真菌を検出することができる。
【００１６】
本発明の住環境真菌の検出方法により検出できる住環境真菌の具体例としては、Exophiala属真菌、Acremonium属真菌、Fusarium属真菌、Scolecobasidium属真菌、Chetomium属真菌、Phoma属真菌、Phialophora属真菌、Cladosporium属真菌、Ochroconis属真菌、Alternaria属真菌、Saccharomyces属真菌、Rhodotorula属真菌、Aspergillus属真菌、Penicillium属真菌、Aureobasidium属真菌、Candida属真菌、Pichia属真菌、Ramichloridium属真菌、Capronia属真菌、Trichoderma属真菌、Alcaligenes属真菌、Eurotium属真菌、Carvularia属真菌、Cruptococcus属真菌、Chrysosporium属真菌、Byssochlamys属真菌、Botrytis属真菌、Epicoccum属真菌、Geotricham属真菌、Gliocladium属真菌、Monascus属真菌、Monillia属真菌、Mucor属真菌、Nigrospora属真菌、Oidium属真菌、Paecilomyces属真菌、Pestalotia属真菌、Rhizopus属真菌、Rhizoctonia属真菌、Scopulariopsis属真菌、Stachybotrys属真菌、Symcephalastrum属真菌、Trichothesium属真菌、Ulocladium属真菌及びWallemia属真菌が挙げられる。しかし、本発明はこれらに制限するものではない。
【００１７】
本発明の検出方法により、浴室、洗濯槽、衣類、製造現場、空調機器等に存在する住環境真菌を検出することができる。
【００１８】
本発明の検出方法において、まず住環境真菌の検出を行う試料を採取する。試料の採取は、例えば、汚れ部分あるいは着色部分を剥がし取る、切り取る又は擦り取るなどの方法により行うことができる。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００１９】
次いで、採取した試料から通常の方法によりＤＮＡ又はＲＮＡを抽出し、ＰＣＲグレードまで精製する。ＤＮＡの抽出・精製法は種々採用でき、たとえば、界面活性剤やメルカプトエタノール等を含む溶液中で菌体を破砕後フェノール・クロロホルムで精製する方法、各種ＤＮＡ抽出キットを用いる方法が挙げられる。ＲＮＡの抽出は、例えば、チオシアン酸グアニジンとフェノールなどの変性剤を含む溶液中で菌体を破砕後クロロフォルムやイソプロピルアルコール等で精製する方法、各種ＲＮＡ抽出キットを用いる方法が挙げられる。抽出したＲＮＡは逆転写酵素を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡ化する。逆転写反応に用いるプライマーとして、ランダムヘキサマー等を利用できる。
【００２０】
本発明の検出方法において、５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域についてＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法により増幅する。この工程で用いる核酸プライマーとしては、住環境真菌の当該ＤＮＡ領域を増幅できるものであれば特に制限はなく、例えば、真菌同定用のユニバーサルプライマーとして汎用されているＩＴＳ３プライマー（配列番号３）及びＮＬ４プライマー（配列番号２）、又はこれらのプライマーと約８０％以上の相同性を有するプライマーを用いることができる。これらのユニバーサルプライマーは、例えば、the  fungal  Holomorph：Mitotic，Meiotic  and  Pleomorphic  Specioation  in  Fungal  Systematics，pp．225-233(1993)等を参考に合成委託することで入手できる。
住環境真菌の前記ＤＮＡ領域を増幅するために、下記（ｃ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることが好ましい。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して８０％以上の相同性を有しかつ前記ＤＮＡ領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して８０％以上の相同性を有しかつ前記ＤＮＡ領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
前記（ｃ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号３及び２に記載の塩基配列に対する相同性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドには、配列番号３若しくは２に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号３又は２に記載の塩基配列に適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２１】
前記ＰＣＲにおいて、フォワードプライマー及びリバースプライマーの２種のプライマーが用いられる。Ｔ−ＲＦＬＰ法により解析を行う本発明の検出方法において、前記２種類のプライマーの一方又は両方を蛍光色素で標識する。
【００２２】
前記蛍光色素としては、Ｔ−ＲＦＬＰ法で通常用いられるものであればよく、例えば、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ、青色）、ＰＥＴ（赤色）、ＮＥＤ（黄色）、ＶＩＣ（緑色）、ＬＩＺ（橙色）、ＴＥＴ（6-carboxy-2',4,7,7'-tetrachlorofluorescein）、ＨＥＸ（6-carboxy-2',4,4',5',7,7'-hexachlorofluorescein）、ＲＯＸ（6-carboxy-x-rhodamine）、ＴＡＭＲＡ（6-carboxytetramethylrhodamine）、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。
また、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方を蛍光色素によりラベル化する場合、蛍光色が互いに異なる蛍光色素で前記２種のプライマーをそれぞれ標識するのが好ましい。
【００２３】
５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域のＰＣＲ法による増幅に関して説明する。
本発明におけるＰＣＲ条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、ＰＣＲ反応に用いる鋳型としての２本鎖ＤＮＡ量は０．１ｎｇ以上が好ましく、１〜５０ｎｇがより好ましい。また、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９２〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６０℃で１０〜６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を６０〜７２℃で５〜１２０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを２０〜４０サイクル行う。サイクル反応の前に初期変性反応を行い、サイクル反応後に追加の伸長反応をおこなうことが好ましい。
ＰＣＲにおける初期変性反応条件について、変性温度は９２〜９８℃が好ましく、９２〜９６℃がより好ましく、約９４℃がさらに好ましい。変性時間は３０秒〜１０分が好ましく、１〜５分がより好ましく、約２分がさらに好ましい。
ＰＣＲにおけるサイクル反応時の変性条件について、変性温度は９２〜９６℃が好ましく、約９４℃がより好ましい。変性時間は２０〜４０秒が好ましく、約３０秒がより好ましい。
ＰＣＲにおけるアニーリング条件について、アニーリング温度は５２〜５８℃が好ましく、約５５℃がより好ましい。アニーリング時間は２０〜４０秒が好ましく、約３０秒がより好ましい。
ＰＣＲにおける伸長反応条件について、伸長反応温度は６８〜７２℃が好ましく、約７２℃がより好ましい。伸長反応時間は２０〜６０秒が好ましく、約３０秒がより好ましい。
ＰＣＲにおけるサイクル数は、２５〜３５サイクルが好ましく、約３０サイクルがより好ましい。
ＰＣＲにおけるサイクル反応後の追加の伸長反応条件について、温度は約７２℃が好ましい。時間は３０秒〜１０分が好ましく、１〜１０分がより好ましく、約５分がさらに好ましい。
【００２４】
本発明の検出方法において、予め１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅して、得られたＰＣＲ産物（本明細書において、第１次ＰＣＲ産物ともいう）を鋳型として前記５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物（本明細書において、第２次ＰＣＲ産物ともいう）についてＴ−ＲＦＬＰ法により解析することが好ましい。
【００２５】
前記、１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域の増幅に用いられる核酸プライマーとしては、住環境真菌の当該ＤＮＡ領域を増幅できるものであれば特に制限はなく、例えば、真菌同定用のユニバーサルプライマーとして汎用されているＩＴＳ５プライマー（配列番号１）及びＮＬ４プライマー（配列番号２）、又はこれらのプライマーと約８０％以上の相同性を有するプライマーを用いることができる。これらのユニバーサルプライマーは、例えば、the  fungal  Holomorph：Mitotic，Meiotic  and  Pleomorphic  Specioation  in  Fungal  Systematics，pp．225-233(1993)等を参考に合成委託することで入手できる。
住環境真菌の前記ＤＮＡ領域を増幅するために、下記（ａ）及び前記（ｂ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることが好ましい。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は当該塩基配列に対して８０％以上の相同性を有しかつ前記ＤＮＡ領域の増幅が可能なオリゴヌクレオチド
前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチドにおいて、配列番号１及び２に記載の塩基配列に対する相同性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましい。また、前記オリゴヌクレオチドには、配列番号１若しくは２に記載の塩基配列において１又は数個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、よりさらに好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１又は２に記載の塩基配列に適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００２６】
１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域のＰＣＲ法による増幅に関して説明する。
本発明におけるＰＣＲ条件は、目的のＤＮＡ断片を検出可能な程度に増幅することができれば特に制限されない。例えば、ＰＣＲ反応に用いる鋳型としての２本鎖ＤＮＡ量は０．１ｎｇ以上が好ましく、１〜５０ｎｇがより好ましい。また、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応を９２〜９８℃で１０〜６０秒間行い、プライマー対を１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を５０〜６０℃で１０〜６０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を６０〜７２℃で５〜１２０秒間行い、これらを１サイクルとしたものを２０〜４０サイクル行う。サイクル反応の前に初期変性反応を行い、サイクル反応後に追加の伸長反応をおこなうことが好ましい。
ＰＣＲにおける初期変性反応条件について、変性温度は９２〜９８℃が好ましく、９２〜９６℃がより好ましく、約９４℃がさらに好ましい。変性時間は３０秒〜１０分が好ましく、１〜５分がより好ましく、約２分がさらに好ましい。
ＰＣＲにおけるサイクル反応時の変性条件について、変性温度は９２〜９６℃が好ましく、約９４℃がより好ましい。変性時間は２０〜４０秒が好ましく、約３０秒がより好ましい。
ＰＣＲにおけるアニーリング条件について、アニーリング温度は５２〜５８℃が好ましく、約５５℃がより好ましい。アニーリング時間は２０〜４０秒が好ましく、約３０秒がより好ましい。
ＰＣＲにおける伸長反応条件について、伸長反応温度は６８〜７２℃が好ましく、約７２℃がより好ましい。伸長反応時間は２０〜６０秒が好ましく、約３０秒がより好ましい。
ＰＣＲにおけるサイクル数は、２５〜３５サイクルが好ましく、約３０サイクルがより好ましい。
ＰＣＲにおけるサイクル反応後の追加の伸長反応条件について、温度は約７２℃が好ましい。時間は３０秒〜１０分が好ましく、１〜１０分がより好ましく、約５分がさらに好ましい。
【００２７】
本発明の検出方法において、５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域についてＰＣＲ法により増幅したＰＣＲ産物について制限酵素処理を行う。本発明に用いる制限酵素としては特に制限はないが、６塩基の特定の配列を認識する制限酵素が好ましく、EcoRI（制限酵素認識部位：G/AATTC）、BsaHI（制限酵素認識部位：GRCGYC）、NlaIV（制限酵素認識部位：GGNNCC）、BsoBI（制限酵素認識部位：CYCGRG）及びAvaI（制限酵素認識部位：CYCGRG）からなる群より選ばれる少なくとも１種の制限酵素を用いるのが好ましい。
【００２８】
制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物について、プライマーにラベルした蛍光標識を指標として切断されたフラグメントの塩基配列の長さを決定する。フラグメントの塩基配列の長さの決定はＤＮＡシークエンサーを用いた電気泳動法などの通常の方法により行うことができる。具体的には、フラグメントサンプルと同時にＤＮＡシーケンサーに供するサイズスタンダードの蛍光検出ピークのサイズからフラグメントサンプルの蛍光検出ピークの塩基長を算出することで、フラグメントサンプルのサイズを決定する。サイズスタンダードとしては、ＤＮＡサイズマーカーや分子量マーカーを使用することが可能である。
【００２９】
実施例でも示すように、住環境真菌の５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域において、制限酵素認識部位が微生物種の属又は種レベルで異なる。したがって、蛍光標識された制限酵素処理産物のサイズに基づき、微生物の属を特定することができる。
【００３０】
住環境真菌の属の特定に際して、データベースを構築する。ここでいうデータベースとは、制限酵素の種別、その制限酵素を用いてＰＣＲ産物を処理したときの標識されたフラグメントのサイズ、及び住環境真菌の属及び／又は種とを対応させたデータベースである。このようなデータベースは、解析対象とする遺伝子配列が既知の菌株又は環境分離菌など解析対象とする遺伝子配列が未知の菌株を対象として構築することができる。データベースは、解析対象とする遺伝子配列が既知の菌株については、通常のＤＮＡデータベースを利用する、当該菌株からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の塩基配列を決定し、制限酵素処理産物のサイズを算出する、あるいは、当該菌株からＤＮＡを抽出し、それを鋳型として色素標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を制限酵素処理し、得られた制限酵素処理産物のサイズをＤＮＡシーケンサーなどを用いて決定する、といった方法で構築することができる。また、環境分離菌など解析対象とする遺伝子配列が未知の菌株については、その菌株からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の塩基配列を決定し、制限酵素処理産物のサイズを算出する、あるいは、当該菌株からＤＮＡを抽出し、それを鋳型として色素標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を制限酵素処理し、得られた制限酵素処理産物のサイズをＤＮＡシーケンサーなどを用いて決定する、といった方法で構築することができる。なお、環境分離菌においては、その微生物種又は属の同定は、ｒＤＮＡ等の領域の塩基配列の解析により行ってもよいし、形態観察により行ってもよいが、これら両方を併用するのがより好ましい。
【００３１】
下記に本発明の住環境真菌の検出方法について好ましい態様を説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００３２】
真菌の属又は種が特定されている住環境真菌については、既存のＤＮＡデータベースから、用いる制限酵素の種別、その制限酵素を用いて５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域を鋳型として増幅したＰＣＲ産物を処理したときの標識されたフラグメントのサイズ、及び住環境真菌の属及び／又は種とを対応させたデータベースを構築する。あるいは、真菌の属又は種が特定されている住環境真菌あるいは真菌の属又は種が特定されていない住環境真菌については、その菌株からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の塩基配列を決定し、制限酵素処理産物のサイズを算出し、得られた結果を基にデータベースを構築する。あるいは、真菌の属又は種が特定されている住環境真菌あるいは真菌の属又は種が特定されていない住環境真菌については、その菌株からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅産物の制限酵素処理を行い、制限酵素処理産物のサイズＤＮＡシーケンサーなどを用いて算出し、得られた結果を基にデータベースを構築する。
【００３３】
次に、本発明の検出方法による住環境真菌の検出には目的の場所からサンプルを採取し、採取したサンプルからＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの抽出は採取したサンプルから直接ＤＮＡを抽出してもよいし、採取したサンプルの一定量をポテトデキストロース寒天培地、グルコースペプトン寒天培地、サブローグルコース寒天培地、コーンミール寒天培地、ツァペックドックス寒天培地、モルトエキストラクト培地、素寒天培地、ＹＭ培地等にて約２５℃で７〜１４日培養し、培地から菌体を回収し、回収した菌体からＤＮＡを抽出してもよい。
【００３４】
真菌同定用として汎用されているユニバーサルプライマーＩＴＳ５（配列番号１）及びＮＬ４（配列番号２）を用いて、住環境真菌の１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲにより増幅する。
【００３５】
得られたＰＣＲ産物を鋳型とし、真菌同定用として汎用されているユニバーサルプライマーＩＴＳ３（配列番号３）及びＮＬ４（配列番号２）を用いて、住環境真菌の５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲにより増幅する。このとき、前記ユニバーサルプライマーＩＴＳ３及びＮＬ４の両方又は一方を蛍光色素で標識する。
【００３６】
得られたＰＣＲ産物に制限酵素を添加し、酵素処理を行い、制限酵素処理により得られた蛍光標識されたフラグメントのサイズを決定する。
【００３７】
このようにして得られたフラグメントのサイズから、予め構築したデータベースを基に住環境真菌の種類を特定する。
【００３８】
本発明の住環境真菌の検出方法に用いることができるプライマーセットを予めパッケージングしてキット化することができる。
例えば、本発明の住環境真菌検出用キットは、（ｉ）住環境真菌の５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域を増幅することができる２種類のプライマー（例えば、前記（ｃ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド、好ましくは真菌検出用として汎用されているユニバーサルプライマーＩＴＳ３（配列番号３）及びＮＬ４（配列番号２））であって当該プライマーの両方又は一方が蛍光色素により標識されたもの、及び（ｉｉ）制限酵素（例えば、EcoRI、BsaHI、NlaIV、BsoBI及びAvaIから選ばれる少なくとも１種の制限酵素）を含有する。好ましくは、本発明の住環境真菌検出用キットはさらに、（ｉｉｉ）前記ＤＮＡ領域を増幅する際に鋳型として用いるＤＮＡを増幅するためのプライマー対（例えば、前記（ａ）及び（ｂ）のオリゴヌクレオチド、好ましくは真菌検出用として汎用されているユニバーサルプライマーＩＴＳ５（配列番号１）及びＮＬ４（配列番号２））を含有する。本発明の住環境真菌検出用キットは、前記核酸プライマーの他に、目的に応じ、緩衝液、核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）、酵素基質（ｄＮＴＰ，ｒＮＴＰ等）等、住環境真菌の検出に通常用いられる物質を含有する。本発明のキットには、本発明のプライマーによってＰＣＲ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明の検出方法により増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【００３９】
本発明の住環境真菌の検出方法においては、５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部をコードするＤＮＡ領域を対象としてＴ−ＲＦＬＰ法により解析を行う。
なお、前記ＤＮＡ領域を対象とすることで、Ｔ−ＲＦＬＰ法だけではなく、単鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（Single  strand  conformation  polymorphism)法（例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(Denaturing  Gradient  Gel  Electorophoresis）、温度勾配ゲル電気泳動（Temperature  Gradient  Gel  Electorophoresis））などによっても、住環境真菌の検出が可能となる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
試験例１
表１に示す住環境からの分離菌１〜１７について、ＭｉｃｒｏＳｅｑＤ２Ｋｉｔ（商品名アプライドバイオシステムズ社）を用い、ｒＤＮＡのＤ２領域約５００ｂｐの塩基配列解析を行い、環境分離菌の属又は種の特定を行った。また、環境分離菌１（Exophaiala  sp．type  Ａ）、環境分離菌７（Phoma  sp．）及び環境分離菌８（Phialophora  sp．）については、前記遺伝子解析の他に形態観察（コロニー形態と光学顕微鏡による分生子の観察）を併用して、属の特定を行った。
【００４２】
【表１】
2011130747.tif 000002
【００４３】
住環境真菌として、前記の方法により属の特定を行ったExophaiala  sp．type  A（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  B（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  C（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  D（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  E（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  F（環境分離株）、Phoma  sp．（環境分離株）、Phialophora  sp．（環境分離株）、Ochroconis又はScolecobasidium  sp．（環境分離株）、Cladosporium  sp．（環境分離株）、Alternaria  sp．（環境分離株）、Candida  sp．（環境分離株）、Pichia  sp．（環境分離株）、Aureobasidium  sp．（環境分離株）、Capronia  sp．（環境分離株）、Ramichloridium  sp．（環境分離株）、Fusarium  sp．（環境分離株）並びに、微生物株保存機関より譲渡されたSaccharomyces cerevisiae  IFO1661（購入株）及びRhodotorula mucilaginosa  NBRC0909（購入株）をそれぞれポテトデキストロース寒天培地にて２５℃で７〜１４日間培養し、各菌体からＤＮＡ抽出キット（商品名：Ｇｅｎとるくん（酵母用）、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、精製した。
【００４４】
次に、抽出したＤＮＡ  １ｎｇ以上を鋳型とし、表２に示したＩＴＳ５及びＮＬ４のプライマーセット（ニッポンイージーティー社に合成委託）を用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ａ（１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行ない、第１次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００４５】
【表２】
2011130747.tif 000003
【００４６】
次に、下記工程（１）又は（２）に示す方法により、各供試菌株（前記環境分離菌、Saccharomyces cerevisiae  IFO1661株、及びRhodotorula mucilaginosa  NBRC0909株）のフラグメントサイズを決定した。
【００４７】
工程（１）
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、表３に示したＩＴＳ３及び5'末端側をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でラベルした５’ＦＡＭ−ＮＬ４のプライマーセット（ニッポンイージーティーに合成委託）を用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分領域Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００４８】
【表３】
2011130747.tif 000004
【００４９】
次に、得られた第２次ＰＣＲ産物２．５μＬに対し、EcoRI（タカラバイオ社）５０Ｕ又はBsaHI（ニューイングランド社）１０Ｕを添加し、３７℃で一晩酵素処理を行い、ＦＡＭで標識された3'末端側のフラグメントをキャピラリーＤＮＡシーケンサ（商品名：３１３０ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製、キャピラリー：３０ｃｍ）に供し、サイズスタンダードとして、ＬＩＺ１２００  size  standard（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、解析のアプリケーションとしてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ−Ｇｅｎｅｒｉｃ（商品名）を適用し、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒソフトウェア（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてフラグメントサイズを決定した。その結果を表５に示す。
【００５０】
工程（２）
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、表４に示したＩＴＳ３及びＮＬ４のプライマーセット（ニッポンイージーティー社に合成委託）を用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００５１】
【表４】
2011130747.tif 000005
【００５２】
続いて、得られた第２次ＰＣＲ産物の塩基配列を通常の方法により決定し、決定した塩基配列中に存在する制限酵素部位を確認し、NlaIV、AvaI又はBsoBIで制限酵素処理を行ったときの3'末端側の切断断片サイズを算出した。その結果を表５に示す。
【００５３】
さらに、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースに登録されているAspergillus niger  NRRL6411株、Penicillium Citrinum  NRRL35459株及びAcremonium  ｓｐ．NG-N-B12株について、塩基配列中に存在する制限酵素部位を確認し、EcoRI、BsaHI、NlaIV、AvaI又はBsoBIで制限酵素処理を行ったときの3'末端側の切断断片サイズを算出した。その結果を表５に示す。
【００５４】
【表５】
2011130747.tif 000006
【００５５】
表５に示すように、制限酵素断片サイズ（フラグメントサイズ）は住環境真菌種の属又は種レベルで異なる。したがって、上記のように本手法を用いてデータベースを構築できる。さらに構築したデータベースを用いて、Ｔ−ＲＦＬＰにより住環境真菌を網羅的に検出できることがわかる。
【００５６】
実施例１
種名未知の住環境真菌株として、住環境（浴室、洗濯槽、衣類など）から分離した黒カビＡ〜Ｓをそれぞれポテトデキストロース寒天培地にて２５℃で７〜１４日間培養し、各菌体からＤＮＡ抽出キット（商品名：Ｇｅｎとるくん（酵母用）、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、精製した。
【００５７】
次に、抽出したＤＮＡ  １ｎｇ以上を鋳型とし、前記表２に示したＩＴＳ５及びＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ａ（１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第１次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００５８】
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、前記表３に示したＩＴＳ３及び５’ＦＡＭ−ＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分領域Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００５９】
次に、得られた第２次ＰＣＲ産物２．５μＬに対し、EcoRI（タカラバイオ社）５０Ｕ又はBsaHI（ニューイングランド社）１０Ｕを添加し、３７℃で一晩酵素処理を行い、ＦＡＭで標識された3'末端側のフラグメントをキャピラリーＤＮＡシーケンサ（商品名：３１３０ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製、キャピラリー：３０ｃｍ）に供し、サイズスタンダードとして、ＬＩＺ１２００  size  standard（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、解析のアプリケーションとしてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ−Ｇｅｎｅｒｉｃ（商品名）を適用し、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒソフトウェア（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてフラグメントサイズを決定した。その結果を表６に示す。
さらに、上記のようにして決定したフラグメントサイズと、試験例１で構築した表５に示すデータベースを基に、住環境から分離した黒カビＡ〜Ｓの同定を行った。その結果も表６に示す。
【００６０】
【表６】
2011130747.tif 000007
【００６１】
表６に示すように、制限酵素で処理したフラグメントのサイズが住環境真菌の属又は種に一致した。これら菌株について、ＭｉｃｒｏＳｅｑＤ２Ｋｉｔ（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、ｒＤＮＡのＤ２領域約５００ｂｐの塩基配列解析を行い、真菌の属又は種を同定したところ、Ｔ−ＲＦＬＰ解析による同定結果と一致した。これらの結果から、本発明により住環境真菌の属又は種を同定できることがわかった。さらに、本発明により住環境からこれら真菌を検出できることが明らかとなった。
【００６２】
実施例２
浴室のパッキンに形成されたカビ汚れ、洗濯機の脱水槽に形成された汚れ、衣料上に形成された汚れに存在する住環境真菌の検出を下記の通り行なった。
【００６３】
まず、カビ汚れが付着した浴室内パッキンをパッキンごと剥がし取り、それぞれ異なる箇所からカビ汚れを回収し、サンプルＮｏ．１１〜１５を調製した。
さらに、洗濯機の脱水槽に形成された暗色汚れ部分約２平方センチメートルを滅菌したピンセットで剥がし取り、それぞれ異なる箇所から洗濯機の脱水槽に形成された汚れを回収し、サンプルＮｏ．２１〜２７を調製した。
さらに、衣料上に形成された着色汚れ部分を滅菌したハサミで切り取ったのち、滅菌したピンセットで単繊維までほぐし、それぞれ異なる箇所から汚れ部分のみを回収し、サンプルＮｏ．３１〜４４を調製した。
【００６４】
上記の方法で調製したサンプルからＤＮＡ抽出キット（商品名：Ｇｅｎとるくん（酵母用）、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、精製した。
【００６５】
次に、抽出したＤＮＡ  １ｎｇ以上を鋳型とし、前記表２に示したＩＴＳ５及びＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ａ（１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第１次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００６６】
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、前記表３に示したＩＴＳ３及び５’ＦＡＭ−ＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分領域Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００６７】
次に、得られた第２次ＰＣＲ産物２．５μＬに対し、EcoRI（タカラバイオ社）５０Ｕ又はBsaHI（ニューイングランド社）１０Ｕを添加し、３７℃で一晩酵素処理を行い、ＦＡＭで標識された3'末端側のフラグメントをキャピラリーＤＮＡシーケンサ（商品名：３１３０ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製、キャピラリー：３０ｃｍ）に供し、サイズスタンダードとして、ＬＩＺ１２００  size  standard（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、解析のアプリケーションとしてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ−Ｇｅｎｅｒｉｃ（商品名）を適用し、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒソフトウェア（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてフラグメントサイズを決定した。
【００６８】
浴室のパッキンに形成されたカビ汚れについて、EcoRIを用いてＴ−ＲＦＬＰ解析によって検出された3'末端側のフラグメントのサイズを表７に、BsaHIを用いてＴ−ＲＦＬＰ解析によって検出された3'末端側のフラグメントのサイズを表８に示す。
【００６９】
【表７】
2011130747.tif 000008
【００７０】
【表８】
2011130747.tif 000009
【００７１】
表７及び８に示す結果及び試験例１の表５から、EcoRIを用いた場合及びBsaHIを用いた場合のいずれの場合においても、浴室のパッキンに形成されたカビ汚れから調製したサンプルのうち、No.11及び12からAlternaria属真菌が検出され、No.13からExophaiala真菌が検出され、No.14からPhoma属真菌が検出され、No.15からPhoma属真菌及びCladosporium属真菌が検出された。このように、本発明の方法により、浴室のパッキンに形成されたカビ汚れの中に住環境真菌が存在することを明らかとすることができた。
【００７２】
洗濯機の洗濯槽に形成された汚れについて、EcoRIを用いてＴ−ＲＦＬＰ解析によって検出された3'末端側のフラグメントのサイズを表９に、BsaHIを用いてＴ−ＲＦＬＰ解析によって検出された3'末端側のフラグメントのサイズを表１０に示す。
【００７３】
【表９】
2011130747.tif 000010
【００７４】
【表１０】
2011130747.tif 000011
【００７５】
表９及び１０に示す結果及び試験例１の表５から、EcoRIを用いた場合及びBsaHIを用いた場合のいずれの場合においても、洗濯機の洗濯槽に形成された汚れから調製したサンプルのうち、No.21からExophaiala属真菌、Phialophora属真菌、及びOchroconis又はScolecobasidium属真菌が検出され、No.22からPhoma属真菌、及びOchroconis又はScolecobasidium属真菌が検出され、No.23及び24からPhoma属真菌が検出され、No.25からExophaiala属真菌が検出され、No.26からOchroconis又はScolecobasidium属真菌が検出され、No.27からExophaiala属真菌及びPhoma属真菌が検出された。このように、本発明の方法により、洗濯機の洗濯槽に形成された汚れの中に住環境真菌が存在することを明らかとすることができた。
【００７６】
衣料上に形成された汚れについて、EcoRIを用いてＴ−ＲＦＬＰ解析によって検出された3'末端側のフラグメントのサイズを表１１に、BsaHIを用いてＴ−ＲＦＬＰ解析によって検出された3'末端側のフラグメントのサイズを表１２に示す。
【００７７】
【表１１】
2011130747.tif 000012
【００７８】
【表１２】
2011130747.tif 000013
【００７９】
表１１及び１２に結果及び試験例１の表５から、EcoRIを用いた場合及びBsaHIを用いた場合のいずれの場合においても、衣料上に形成された汚れから調製したサンプルのうち、No.31からExophaiala属真菌及びRhodotorula mucilaginosaが検出され、No.32〜34からExophaiala属真菌が検出され、No.35及び39からPhoma属真菌及びRhodotorula mucilaginosaが検出され、No.36、37、40及び41からPhoma属真菌が検出され、No.38及び43からPhoma属真菌及びCladosporium属真菌が検出され、No.42からExophaiala属真菌及びPhialophora属真菌が検出され、No.44からOchroconiss又はScolecobasidium属真菌、Cladosporium属真菌及びSaccharomyces cerevisiaeが検出された。このように、本発明の方法により、衣料上に形成された汚れの中に住環境真菌が存在することを明らかとすることができた。
【００８０】
以上の結果から、検出されるフラグメントサイズに基づき、サンプル中に存在する住環境真菌を属又は種レベルで同定でき、住環境真菌群集の解析が可能となる。さらに、住環境から採取したサンプルから真菌を分離することなく、住環境真菌の検出が可能であった。したがって、本発明によれば、住環境真菌を簡便かつ網羅的に検出でき、短時間で住環境真菌の群集構造を低コストかつ効率的に分析することができる。
【００８１】
試験例２
住環境真菌として、試験例１で属の特定を行ったExophaiala  sp．type  A（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  B（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  C（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  D（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  E（環境分離株）、Exophaiala  sp．type  F（環境分離株）、Phoma  sp．（環境分離株）、Phialophora  sp．（環境分離株）、Ochroconis又はScolecobasidium  sp．（環境分離株）、Cladosporium  sp．（環境分離株）、Alternaria  sp．（環境分離株）、Candida  sp．（環境分離株）、Pichia  sp．（環境分離株）、Aureobasidium  sp．（環境分離株）、Capronia  sp．（環境分離株）、Ramichloridium  sp．（環境分離株）及びFusarium  sp．（環境分離株）、Saccharomyces cerevisiae  IFO1661（購入株）並びにRhodotorula mucilaginosa  NBRC0909（購入株）をそれぞれポテトデキストロース寒天培地にて２５℃で７〜１４日間培養し、各菌体からＤＮＡ抽出キット（商品名：Ｇｅｎとるくん（酵母用）、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、精製した。
【００８２】
次に、抽出したＤＮＡ  １ｎｇ以上を鋳型とし、前記表２に示したＩＴＳ５及びＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ａ（１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第１次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００８３】
次に、下記工程（１１）又は（１２）に示す方法により、各供試菌株（前記環境分離菌、Saccharomyces cerevisiae  IFO1661株、及びRhodotorula mucilaginosa  NBRC0909株）のフラグメントサイズを決定した。
【００８４】
工程（１１）
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、前記表１３に示した5'末端側をＰＥＴでラベルした５’ＰＥＴ−ＩＴＳ３及び5'末端側をカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）でラベルした５’ＦＡＭ−ＮＬ４のプライマーセット（ニッポンイージーティー社に合成委託）を用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分領域Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００８５】
【表１３】
2011130747.tif 000014
【００８６】
次に、得られた第２次ＰＣＲ産物２．５μＬに対し、BsaHI（ニューイングランド社）を１０Ｕ添加し、３７℃で一晩酵素処理を行い、ＰＥＴで標識された5'末端側のフラグメント及びＦＡＭで標識された3'末端側のフラグメントをそれぞれキャピラリーＤＮＡシーケンサ（商品名：３１３０ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製、キャピラリー：３０ｃｍ）に供し、サイズスタンダードとして、ＬＩＺ１２００  size  standard（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、解析のアプリケーションとしてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ−Ｇｅｎｅｒｉｃ（商品名）を適用し、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒソフトウェア（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてフラグメントサイズを決定した。その結果を表１４に示す。
【００８７】
工程（１２）
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、前記表４に示したＩＴＳ３及びＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００８８】
続いて、得られた第２次ＰＣＲ産物の塩基配列を通常の方法により決定し、決定した塩基配列中に存在する制限酵素部位を確認し、BsaHIで制限酵素処理を行ったときの5’末端側及び3'末端側の切断断片サイズを算出した。その結果を表１４に示す。
【００８９】
さらに、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のデータベースに登録されているAspergillus niger  NRRL6411株及びPenicillium Citrinum  NRRL35459株について、塩基配列中に存在する制限酵素部位を確認し、BsaHIで制限酵素処理を行ったときの5’末端側及び3'末端側の切断断片サイズを算出した。その結果を表１４に示す。
【００９０】
【表１４】
2011130747.tif 000015
【００９１】
表１４に示すように、制限酵素断片サイズ（フラグメントサイズ）は住環境真菌種の属又は種レベルで異なる。したがって、本手法を用いてデータベースを構築できる。さらに構築したデータベースを用いて、Ｔ−ＲＦＬＰにより住環境真菌を網羅的に検出できることがわかる。
【００９２】
実施例３
実施例１で用いた黒カビＢ、黒カビＣ、黒カビＤ、黒カビＥ、黒カビＦ、黒カビＨ、黒カビＪ、黒カビＫ、黒カビＭ、黒カビＮ、黒カビＰ及び黒カビＳから実施例１と同様にＤＮＡを抽出し、精製した。
【００９３】
次に、抽出したＤＮＡ  １ｎｇ以上を鋳型とし、前記表２に示したＩＴＳ５及びＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ａ（１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第１次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００９４】
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、前記表１３に示した５’ＰＥＴ−ＩＴＳ３及び５’ＦＡＭ−ＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分領域Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【００９５】
次に、得られた第２次ＰＣＲ産物２．５μＬに対し、BsaHI（ニューイングランド社）を１０Ｕ添加し、３７℃で一晩酵素処理を行い、ＰＥＴで標識された5'末端側のフラグメント及びＦＡＭで標識された3'末端側のフラグメントをそれぞれキャピラリーＤＮＡシーケンサ（商品名：３１３０ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製、キャピラリー：３０ｃｍ）に供し、サイズスタンダードとして、ＬＩＺ１２００  size  standard（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、解析のアプリケーションとしてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ−Ｇｅｎｅｒｉｃ（商品名）を適用し、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒソフトウェア（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてフラグメントサイズを決定した。その結果を表１５に示す。
さらに、上記のようにして決定したフラグメントサイズと、試験例２で構築した表１４に示すデータベースを基に、住環境から分離した黒カビＢ、黒カビＣ、黒カビＤ、黒カビＥ、黒カビＦ、黒カビＨ、黒カビＪ、黒カビＫ、黒カビＭ、黒カビＮ、黒カビＰ及び黒カビＳの同定を行った。その結果も表１５に示す。
【００９６】
【表１５】
2011130747.tif 000016
【００９７】
表１５に示すように、制限酵素で処理したフラグメントのサイズが住環境真菌の属又は種に一致した。これら菌株については実施例１で示したように、ＭｉｃｒｏＳｅｑＤ２Ｋｉｔ（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、ｒＤＮＡのＤ２領域約５００ｂｐの塩基配列解析を行い、真菌の属又は種を同定しており、本実施例のＴ−ＲＦＬＰ解析による同定結果と一致した。これらの結果から、本発明により住環境真菌の属又は種を同定できることがわかった。さらに、本発明により住環境からこれら真菌を検出できることが明らかとなった。
【００９８】
実施例４
浴室のパッキンに形成されたカビ汚れに存在する住環境真菌の検出を下記の通り行なった。
【００９９】
まず、カビ汚れが付着した浴室内パッキンをパッキンごと剥がし取り、それぞれ異なる箇所からカビ汚れを回収し、サンプルＮｏ．５１〜５５を調製した。
【０１００】
上記の方法で調製したサンプルからＤＮＡ抽出キット（商品名：Ｇｅｎとるくん（酵母用）、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、精製した。
【０１０１】
次に、抽出したＤＮＡ  １ｎｇ以上を鋳型とし、前記表２に示したＩＴＳ５及びＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分配列Ａ（１８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第１次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【０１０２】
前記第１次ＰＣＲ産物を滅菌イオン交換水又はトリスＥＤＴＡ緩衝液を用いて１／１００倍又は１／１０００倍濃度に希釈した溶液１μＬを鋳型とし、前記表１３に示した５’ＰＥＴ−ＩＴＳ３及び５’ＦＡＭ−ＮＬ４のプライマーセットを用いて、住環境真菌のｒＲＮＡ遺伝子の部分領域Ｂ（５．８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分、ＩＴＳ−２及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの一部分）をコードするｒＤＮＡ遺伝子の部分配列をＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は２５μＬの容量で行い、第２次ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ法による増幅は、変性温度を９４℃として２分間維持し、その後、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒というサイクルを単位として３０サイクル行い、その後７２℃を５分間維持することで実施した。
【０１０３】
次に、得られた第２次ＰＣＲ産物２．５μＬに対し、BsaHI（ニューイングランド社）を１０Ｕ添加し、３７℃で一晩酵素処理を行い、ＰＥＴで標識された5'末端側のフラグメント及びＦＡＭで標識された3'末端側のフラグメントをキャピラリーＤＮＡシーケンサ（商品名：３１３０ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、アプライドバイオシステムズ社製、キャピラリー：３０ｃｍ）に供し、サイズスタンダードとして、ＬＩＺ１２００  size  standard（商品名、アプライドバイオシステムズ社）を用い、解析のアプリケーションとしてＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ−Ｇｅｎｅｒｉｃ（商品名）を適用し、Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｅｒソフトウェア（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いてフラグメントサイズを決定した。その結果を表１６に示す。
【０１０４】
【表１６】
2011130747.tif 000017
【０１０５】
表１６に示す結果及び試験例２の表１４から、浴室のパッキンに形成されたカビ汚れから調製したサンプルのうち、No.51〜53からAlternaria属真菌が検出され、No.54からExophaiala属真菌及びPhoma属真菌が検出され、No.55からCladosporium属真菌が検出された。このように、本発明の方法により、浴室のパッキンに形成されたカビ汚れの中に住環境真菌が存在することを明らかとすることができた。
【０１０６】
以上の結果から、検出されるフラグメントサイズに基づき、サンプル中に存在する住環境真菌を属又は種レベルで同定でき、住環境真菌群集の解析が可能となる。さらに、住環境から採取したサンプルから真菌を分離することなく、住環境真菌の検出が可能であった。したがって、本発明によれば、住環境真菌を簡便かつ網羅的に検出でき、短時間で住環境真菌の群集構造を低コストかつ効率的に分析することができる。
【配列表】
2011130747000001.app