(57)【要約】【課題】弾力性を有すると共に強度を有する管腔構造体、及び、その管腔構造体の製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る管腔構造体１００は、コラーゲンゲル成形体からなる管腔状であって、コラーゲン線維２００が管軸に対して円周方向又は螺旋状に配向している。この管腔構造体１００の製造方法は、管状の型にコラーゲン水溶液と架橋剤溶液との混合水溶液を加えて架橋及び線維化を行って管腔コラーゲン構造体を作成する成形工程と、管腔コラーゲン構造体の管内部に棒状部材を挿入し、変性温度以上で加熱処理をする加熱処理工程と、前記加熱処理工程の後に、架橋剤を加えて再架橋を行う再架橋工程とを有する。架橋剤は、例えば水溶性カルボジイミドである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内に埋め込んで使用するためのコラーゲンゲル成形体からなる管腔構造体であって、少なくとも一部のコラーゲン線維が管軸に対して円周方向又は螺旋状に配向していることを特徴とする管腔構造体。
【請求項２】
前記螺旋状に配向しているコラーゲン線維の前記管軸に対する配向角度は、４５度以上８９度以下であることを特徴とする請求項１記載の管腔構造体。
【請求項３】
人工血管の管内腔面に血液抗凝固剤が固定化又は吸着されていることを特徴とする請求項１又は２記載の管腔構造体。
【請求項４】
人工血管の管壁中に血液抗凝固剤が含有されていることを特徴とする請求項１又は２記載の管腔構造体。
【請求項５】
前記血液抗凝固剤は、ヘパリン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物、アルガトロバン、メシル酸ナファモスタット、ワルファリン、及びアスピリン及びそれらの誘導体の少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項３又は４記載の管腔構造体。
【請求項６】
前記管腔構造体の弾性率が、３００ｋＰａ／ｍｍ以上８００ｋＰａ／ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の管腔構造体。
【請求項７】
前記管腔構造体のコラーゲン密度が、５（ｗ／ｖ）％以上であることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載の管腔構造体。
【請求項８】
生体組織材料の存在する環境下に留置することにより、前記生体組織材料の存在する環境から得られる生体組織を、構造体周囲の少なくとも一部に被覆したことを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の管腔構造体。
【請求項９】
血管、気管、胆管、腸管、尿管、卵管、又は膵管から選ばれる脈管の代替管として使用することを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の管腔構造体。
【請求項１０】
コラーゲン溶液と、緩衝液を溶媒とする架橋剤溶液と、を管状の型内において混合させることにより架橋及び線維化を行って、管腔コラーゲン構造体を作成する成形工程と、
前記管腔コラーゲン構造体の管内部に棒状部材を挿入し、変性温度以上で加熱処理をする加熱処理工程と、
前記加熱処理工程の後に、架橋剤を加えて再架橋を行う再架橋工程と、を有することを特徴とする管腔構造体の製造方法。
【請求項１１】
前記コラーゲン溶液と前記架橋剤溶液との重量混合比率は、１：２〜１：１であることを特徴とする請求項１０記載の管腔構造体の製造方法。
【請求項１２】
前記架橋剤は、生体適合性架橋剤であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の管腔構造体の製造方法。
【請求項１３】
前記生体適合性架橋剤は、水溶性カルボジイミドであることを特徴とする請求項１２記載の管腔構造体の製造方法。
【請求項１４】
前記管状の型の輪切りの断面積に対する前記管腔構造体の輪切りの断面積の収縮割合が、４．０％以下であることを特徴とする請求項１０乃至１３の何れか１項に記載の管腔構造体の製造方法。
【請求項１５】
前記成形工程におけるコラーゲン溶液において、コラーゲンの膨潤率は８００％以上２０００％以下であることを特徴とする請求項１０乃至１４の何れか１項に記載の管腔構造体の製造方法。
【請求項１６】
前記再架橋工程において、前記棒状部材が管内部に挿入された状態で再架橋を行うことを特徴とする請求項１０乃至１５の何れか１項に記載の管腔構造体の製造方法。
【請求項１７】
前記再架橋工程にて管内部に挿入される棒状部材の外径は、前記加熱処理工程にて管内部に挿入される棒状部材の外径より小さいことを特徴とする請求項１６記載の管腔構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内に埋め込んで使用するためのコラーゲンゲル成形体からなる管腔構造体、及びその管腔構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に埋め込んで使用される管腔構造体の一種である人工血管は、生体血管の病変部位を切除した欠損部の補填や病変部を迂回して血行を維持するバイパスとして、又は血液透析で血液の体外循環のため使用する血液導管として、更にはシャントチューブ等として使用されている。
【０００３】
従来、医療業界において人工血管に多く用いられている材料として、デュポン社製のポリエステル繊維(商品名：ダクロン（登録商標）)を編む、又は延伸性ポリテトラフルオロエチレン（ｅ−ＰＴＦＥ）を圧縮成形等によって筒状にしたものが挙げられる。
【０００４】
これらの中でも延伸性ＰＴＦＥチューブは、ＰＴＦＥを延伸した後焼成したものであり、繊維（フィブリル）と繊維によって互いに連結された結節（ノード）により微細な多孔質構造が形成されており、この多孔質構造が生体適合性に優れ、しかもＰＴＦＥ素材自体が抗血栓性に優れていることから、主として小口径動脈や大口径静脈等の領域における人工血管として実用化されてきた。
【０００５】
しかし、これらの素材は人工的に合成された高分子であり、通常生体内ではほとんど分解しない。そのため生体内において成長（拡径）することができず、成長期の患者への応用に制限を受ける。
【０００６】
そこで、特許文献１及び特許文献２に記載されているように、ポリ乳酸やポリグリコール酸等の加水分解性を有する高分子が素材に用いられて、人工血管が作成されている。
【０００７】
このような人工血管では、予め細胞を播種することでハイブリッド化させ、これを移植することによって人工血管基材が徐々に分解し、同時に生体組織が侵入し、自己血管化できる。
【０００８】
しかし、ポリ乳酸やポリグリコール酸から作成された人工血管は固く弾性に乏しい。そのため小口径の人工血管として応用することは困難である。
【０００９】
そこで、特許文献３及び非特許文献１には、サケコラーゲンを架橋処理して得られるサケコラーゲンゲルを熱処理することにより伸縮性コラーゲンゲル成形体を得る手法が記載されており、この伸縮性コラーゲンゲル成形体を筒状に成形加工することにより、小口径人工血管として利用できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−１２６１２５号公報（第２頁）
【特許文献２】特開２００４−１５９８４９号公報（第２頁、第３頁）
【特許文献３】特開２００５−３３４６２５号公報（第２頁）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Journal of Biomed Materials Reserch B,2008,87,432-439
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、上述の手法により作成された伸縮性コラーゲンゲル成形体から成形された人工血管は強度が不十分であり、移植後に瘤化や破裂する場合がある。
【００１３】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、伸縮性を有すると共に強度を有するコラーゲンゲル成形体からなる管腔構造体、及び、その管腔構造体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の観点に係る管腔構造体は、生体内に埋め込んで使用するためのコラーゲンゲル成形体からなる管腔構造体であって、少なくとも一部のコラーゲン線維が管軸に対して円周方向又は螺旋状に配向していることを特徴とする。
【００１５】
前記螺旋状に配向しているコラーゲン線維の前記管軸に対する配向角度は、４５度以上８９度以下であることが好ましい。
【００１６】
更に、管腔構造体の管内腔面に血液抗凝固剤が固定化又は吸着されていることが好ましい。
【００１７】
また、管腔構造体の管壁中に血液抗凝固剤が含有されていることが好ましい。
【００１８】
前記血液抗凝固剤は、ヘパリン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物、アルガトロバン、メシル酸ナファモスタット、ワルファリン、及びアスピリン及びそれらの誘導体の少なくとも何れか一つを含むものであることが好ましい。
【００１９】
また、前記管腔構造体の弾性率が、３００ｋＰａ／ｍｍ以上８００ｋＰａ／ｍｍ以下であることが好ましい。
【００２０】
また、前記管腔構造体のコラーゲン密度が、５（ｗ／ｖ）％以上であることが好ましい。
【００２１】
また、前記管腔構造体は、生体組織材料の存在する環境下に留置することにより、前記生体組織材料の存在する環境から得られる生体組織を、構造体周囲の少なくとも一部に被覆したものであることも可能である。
【００２２】
また、前記管腔構造体は、例えば、血管、気管、胆管、腸管、尿管、卵管、又は膵管から選ばれる脈管の代替管として使用される。
【００２３】
本発明の第２の観点に係る管腔構造体の製造方法は、コラーゲン溶液と、緩衝液を溶媒とする架橋剤溶液と、を管状の型内において混合させることにより架橋及び線維化を行って、管腔コラーゲン構造体を作成する成形工程と、前記管腔コラーゲン構造体の管内部に棒状部材を挿入し、変性温度以上で加熱処理をする加熱処理工程と、前記加熱処理工程の後に、架橋剤を加えて再架橋を行う再架橋工程と、を有することを特徴とする。
【００２４】
前記コラーゲン溶液と前記架橋剤溶液との重量混合比率は、１：２〜１：１であることが好ましい。
【００２５】
前記架橋剤は、生体適合性架橋剤であることが好ましい。
【００２６】
前記生体適合性架橋剤は、水溶性カルボジイミドであることが好ましい。
【００２７】
また、前記管状の型の輪切りの断面積に対する前記管腔構造体の輪切りの断面積の収縮割合が、４．０％以下であることが好ましい。
【００２８】
また、前記成形工程におけるコラーゲン溶液において、コラーゲンの膨潤率は８００％以上２０００％以下であることが好ましい。
【００２９】
また、前記再架橋工程において、前記棒状部材が管内部に挿入された状態で再架橋を行うことが好ましい。
【００３０】
更に、前記再架橋工程にて管内部に挿入される棒状部材の外径は、前記加熱処理工程にて管内部に挿入される棒状部材の外径より小さいことが好ましい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、伸縮性を有すると共に高い強度を有する管腔構造体が得られるので、耐久性に優れ、移植後に瘤化や破裂する可能性は極めて少ない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】第１実施形態に係る管腔構造体の斜視外観図である。
【図２】管腔構造体の製造工程を説明する説明図であり、そのうち（ａ）は成形工程を説明する図であり、（ｂ）は加熱処理工程を説明する図であり、（ｃ）は再架橋工程を説明する図である。
【図３】コラーゲン線維が螺旋状に配向している第２実施形態に係る管腔構造体の斜視外観図である。
【図４】管腔構造体の製造工程の写真図であり、そのうち（ａ）は成形工程を説明する写真図であり、（ｂ）は外側シリンダを取り除いた写真図であり、（ｃ）は中空部に棒状部材を挿入した写真図であり、（ｄ）は加熱処理工程を説明する写真図である。
【図５】管腔構造体のヘマトキシリンエオシン染色の光学顕微鏡写真図であり、そのうち（ａ）は実施例１の写真図であり、（ｂ）は実施例２の写真図である。
【図６】人工血管として生体組織に３ヶ月間埋植した管腔構造体のMRI撮影写真図であり、そのうち（ａ）は本発明の実施例１の管腔構造体の写真図であり、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれ比較例１と比較例２のコラーゲンゲル成形体の写真図である。
【図７】本発明の管腔構造体に挿入したシリコーン棒の上に形成される生体コラーゲン組織の写真図であり、そのうち（ａ）はシリウスレッド染色の光学顕微鏡写真図であり、（ｂ）はシリウスレッド染色の偏光顕微鏡写真図である。
【図８】シリコーン棒の上に形成される生体コラーゲン組織の写真図であり、そのうち（ａ）はシリウスレッド染色の光学顕微鏡写真図であり、（ｂ）はシリウスレッド染色の偏光顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明する。図１は、本実施形態に係る管腔構造体１００の斜視外観図である。図１に示すように、管腔構造体１００は管腔状であり、管腔構造体の管軸Ｔａに対して、コラーゲン線維２００が円周方向に配向している。
【００３４】
コラーゲン分子には構造の違いによって１９種類の型の存在が報告されており、更に同じ型に分類されるコラーゲンにも数種類の異なる分子種が存在する場合がある。中でもＩ、II、III型及びIV型コラーゲンが主にバイオマテリアルの原料として用いられている。Ｉ型はほとんどの結合組織に存在し、生体内に最も多量に存在するコラーゲン型である。II型は軟骨を形成するコラーゲンである。III型は少量ではあるがＩ型と同様の部位に存在することが多い。IV型は基底膜を形成するコラーゲンである。Ｉ、II及びIII型はコラーゲン線維として生体内に存在し、主に組織あるいは器官の強度を保つ役割を果たしている。本発明で利用されるコラーゲン類は、線維化能を有するものであればそのタイプについて特に限定されるものではないが、工業的な利用という観点から、Ｉ、II、III型又はそれら２種類以上の混合物であることが好ましい。
【００３５】
コラーゲンの構造は、分子量１０万近くの一本鎖のポリペプチド（α鎖）が３本重なり、右巻きの螺旋構造を形成して、一つのコラーゲン分子（トロポコラーゲン）を形成するものである。トロポコラーゲンの長さは３００ｎｍ、太さは１．５ｎｍである。図１におけるコラーゲン線維２００は、トロポコラーゲンが管軸Ｔａに対して円周方向に配向している状態を模式的に示すものである。Ｏｄは、コラーゲン線維２００の配向の方向を示す。
【００３６】
コラーゲンの由来については、特に限定されるものではなく、脊椎動物から抽出したコラーゲン（以下、「動物コラーゲン」という。）だけでなく、植物由来のコラーゲン様タンパク質（以下、「植物コラーゲン」という。）も含まれる。人工的に抽出可能であれば、その由来について限定されない。
【００３７】
動物コラーゲンの抽出源である脊椎動物としては、魚類、哺乳類、鳥類等が挙げられるが、近年、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）問題が顕在化し、牛皮由来を含む家畜由来の原料を用いたコラーゲン製品により、人間に対して病原体が感染する危険性を潜在的に指摘されるに至っており、安全性と資源量等の観点から、魚類由来コラーゲンが好ましい。なお、一般的には魚類由来コラーゲンは変性温度が低いために材料としての熱安定性が不十分であるが、後述するように、架橋剤により架橋されたコラーゲン線維からなるゲルを熱処理することで、十分な熱安定性を持つコラーゲン成形体を製造できる。
【００３８】
魚類としては、無顎上綱、軟骨魚類、ニシン目、コイ目、ナマズ目、ウナギ目、カライワシ目、ソトイワシ目、サケ目、ニギス目、ヒメ目、イワシ目、ワニトカゲ目、シャチブリ目、アンコウ目、マトウダイ目、ヨウジウオ亜目、トゲウオ目、ギンメダイ目、タラ目、アシロ目、フグ目、カサゴ目、ボラ目、イワシ目、ダツ目、タウナギ目、カレイ目、スズキ目等が挙げられ、これらの中では、軟骨魚類、ウナギ目、サケ目、タラ目、カレイ目、カサゴ目、スズキ目、ニシン目等が挙げられ、特にサメ、ウナギ、シロサケ、マス、タラ、スケトウダラ、ヘイク、ヒラメ、ホッケ、オヒョウ、マグロ、ニシン等が好ましい。また、哺乳類としては、ウシ、ブタ、ヤギ、馬、羊等が、鳥類としては、ニワトリ等が挙げられる。これらの中では、特にシロサケ又はスズキ目のテラピアが好適に利用される。
【００３９】
また、植物コラーゲンは、エクステンシンとよばれる植物の細胞壁に存在する糖タンパク質であり、アミノ酸組成中に動物コラーゲンに含まれるヒドロキシプロリン（旧名称：Ｌ−オキシプロリン）を含んでいるので、カバー材として利用した場合に、動物コラーゲンと同様に機能することが期待される。植物コラーゲンの抽出源としては、セリ科、アオイ科、マメ科等が挙げられ、これらの中では、ニンジン属、ビロードアオイ属、ダイズ科が好ましく、特にダーカスカロット、ダイズ、マーシュマロウが好ましい。
【００４０】
また、これらのコラーゲン類は、動物コラーゲンにおいては、約４０％が皮等に、約２０％が骨等に存在するといわれており、コラーゲン収率の観点から、本発明で利用されるコラーゲンの抽出部位は、骨や皮（魚類であれば鱗も含む。）等であることが好ましく、植物コラーゲンにおいては、葉や根等であることが好ましい。特に、本発明においては、シロサケの皮から抽出されたコラーゲン類が好適に利用される。
【００４１】
本発明の管腔構造体１００の弾性率は、特に限定されるものではないが、例えば３００ｋＰａ／ｍｍ〜８００ｋＰａ／ｍｍであることが好ましい。係る範囲の弾性率にあることにより、管腔構造体１００の伸縮性が高くて強度も高いからである。なお、管腔構造体１００の引っ張りによる弾性率の測定は、例えば、Photocurable surgical tissue adhesive glues composed of photoreactive gelatin and poly(ethylene glycol) diacrylate. J Biomed Mater Res 48, Issues 4, 1999, Pages 511-521.に記載の手法にて行うことが可能である。
【００４２】
本発明の管腔構造体１００の膨潤率は、特に限定されるものではないが、例えば８００％〜２０００％であることが好ましく、より好ましくは１０００％〜１８００％である。係る範囲にあることにより、コラーゲンの架橋密度が適切な範囲のものとなるからである。なお、膨潤には生理食塩水を用い、膨潤率は〔（膨潤後の重量−膨潤前の重量）／膨潤前の重量〕×１００＝膨潤率（％）にて計算を行うことが可能である。
【００４３】
本発明の管腔構造体１００は、コラーゲン密度が５（ｗ／ｖ）％以上であることが好ましい。コラーゲン密度が５（ｗ／ｖ）％以上であることにより、管腔構造体の強度及び弾性率が向上するからである。なお、コラーゲン密度の上限は、特に限定されるものではないが、例えば２０％以下であることが望ましい。
【００４４】
通常広く使用されている０．５（ｗ／ｖ）％濃度のコラーゲン溶液を用いて、５（ｗ／ｖ）％以上のコラーゲン密度を有する管状構造体を得るためには、作製時に使用する外部シリンダと内部マンドリルからなる作製鋳型の輪切り断面積に対して、得られる管状構造体の輪切り断面積の比（後述にて示す表１中における断面積収縮比）が、４．０％以下に収縮することが好ましい。なお、断面積収縮比の下限は、特に限定されるものではないが、例えば１．０％以上であることが望ましい。
【００４５】
管腔構造体１００の管内腔面には血液抗凝固剤が化学的処理又は物理的処理により固定化、又は吸着されている。血液抗凝固剤は、特に限定されるものではなく、例えばヘパリン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物、アルガトロバン、メシル酸ナファモスタット、及びワルファリンの少なくとも何れか一つを含むものである。ヘパリン化合物としては、例えばヘパリンナトリウム、ヘパリンカルシウム、低分子ヘパリンのナトリウム塩、低分子ヘパリンのカルシウム塩等のいずれのヘパリン化合物であっても使用できる。また、クエン酸化合物としては、例えばクエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム等を使用できる。また、シュウ酸化合物としては、例えばシュウ酸ナトリウム又はシュウ酸カリウム等を使用できる。また、血小板の粘着、凝集を抑制する目的で、血栓形成を予防する効果のあるアスピリン等の抗血小板薬が管腔構造体１００の管内腔面に固定化されていてもよい。物理的処理は、例えばγ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射、熱脱水反応による処理等を使用できる。化学的処理は、例えばジアルデヒド、ポリアルデヒド等のアルデヒド類、エポキシ類、カルボジイミド類、イソシアネート類等との反応、タンニン処理、クロム処理等を使用できる。また、アルガトロバン等の水不溶性薬剤をアルコール等の有機溶媒に溶解させて作製した溶液をコーティングや噴霧等によって血液抗凝固剤を管内腔面に吸着させることができる。
【００４６】
また、血液抗凝固剤は、管腔構造体１００の管内腔面に固定化されるのみならず、管腔構造体１００の管壁中に含有されることも可能である。
【００４７】
このようにして得られた管腔構造体１００は、特に限定されるものではないが、例えば血管、気管、胆管、腸管、尿管、卵管、膵管等の各種の管状組織体の代替材として活用することができる。
【００４８】
本実施形態の管腔構造体１００を人工血管として使用する場合は、大口径の人工血管としても、小口径の人工血管としても使用することができる。大口径の人工血管は、先天性疾患、動脈硬化症といった血管疾患の治療に際して使用され、内径は例えば５ｍｍ〜３０ｍｍである。小口径の人工血管は、動脈硬化症、血管れん縮、末梢血管の損傷、瘤形成、腫瘍の浸潤といった血管疾患の治療に際して使用され、内径は例えば０．５ｍｍ〜５ｍｍである。
【００４９】
次に、本実施形態に係る管腔構造体１００の製造方法について説明する。図２は、管腔構造体１００の製造方法の工程を説明する説明図であり、そのうち（ａ）は成形工程を説明する図であり、（ｂ）は加熱処理工程を説明する図であり、（ｃ）は再架橋工程を説明する図である。
【００５０】
図２（ａ）・（ｂ）・（ｃ）に示すように、本実施形態に係る管腔構造体１００の製造方法は、管腔コラーゲン構造体４１０を作成する成形工程と、管腔コラーゲン構造体４１０を加熱処理する加熱処理工程と、熱処理が施された管腔コラーゲン構造体４１０に再架橋処理を施す再架橋工程とを有する。
【００５１】
コラーゲン分子の両末端に存在する非螺旋領域（テロペプチド）は抗原性を有するという報告がある。線維化能を有する限り、テロペプチドが除去されていても除去されていなくても構わないが、生体マテリアルへ応用する場合の安全性を考慮すれば、除去することが好ましい。そのため、本実施形態では、ペプシン処理によってテロペプチドを除去した抗原性の低いアテロコラーゲン水溶液を利用する。
【００５２】
アテロコラーゲン水溶液のコラーゲン濃度は、コラーゲンの溶解性、溶液の粘性等の観点から、例えば０．０１〜３．０（ｗ／ｖ）％の範囲であることが好ましく、より好ましくは０．０５〜２．０（ｗ／ｖ）％である。コラーゲン溶液の濃度が０．０１（ｗ／ｖ）％よりも低い場合には、コラーゲン成形体の強度が不足する可能性があり、また、濃度が３．０（ｗ／ｖ）％よりも高い場合には、溶液の粘性が高すぎて取り扱い上の利便性が失われる可能性があるからである。
【００５３】
まず、図２（ａ）に示すように、アテロコラーゲン水溶液と緩衝液を溶媒とする架橋剤との混合水溶液４００を、外部シリンダ３１０及び内部マンドリル３２０からなる管状の型に入れる。そして低温条件下にしてコラーゲン線維を再形成させる。アテロコラーゲン溶液と架橋剤とを混合する際の温度は、コラーゲンの変性温度を大きく超えない温度に保って行われる必要があり、混合後の溶液温度が、使用するコラーゲン類の変性温度＋５℃以下であることが好ましい。例えばシロサケからコラーゲンを抽出した場合であれば、低温条件は４℃である。
【００５４】
なお、血液抗凝固剤を管腔構造体１００の管壁中に含有させる場合は、上記アテロコラーゲン水溶液に血液抗凝固剤を含有させる。
【００５５】
低温条件下でコラーゲン線維を再形成させた結果、線維化（fibril formation）と架橋（cross-linking）を同時に引き起こし、変性温度が上昇している管腔コラーゲン構造体４１０が得られる。
【００５６】
架橋剤は、特に限定されるものではなく、カルボジイミド系、エポキシド系、アルデヒド系、及びイミダゾール系架橋剤が、安全性、経済性及び操作性の観点から好ましく用いられる。特に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを使用することが、生体親和性が高いうえに、架橋速度がマイルドであるため線維化と架橋との同時進行を引き起こしやすいので、好適である。架橋剤として水溶性カルボジイミドを使用する場合、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミドを共存させることで架橋効率を高めることができる。なお、線維化と架橋とは必ずしも同時進行である必要は無く、架橋剤の種類、濃度等を適宜選択する等により、線維化を行った後に架橋を行うことも可能である。
【００５７】
架橋剤として、ポリエポキシ化合物やグルタルアルデヒドを使用する場合は、架橋結合中に架橋剤が残り、分解後に架橋剤が遊離して細胞毒性を示すおそれがあるため、十分に架橋後に洗浄をすることが望ましい。
【００５８】
アテロコラーゲン水溶液と架橋剤溶液との重量混合比率は、特に限定されるものではないが、例えば１：２〜１：１とすることができ、好ましくは２：３である。
【００５９】
次に加熱処理工程では、図２（ｂ）に示すように、成形工程で得られた管腔コラーゲン構造体４１０の中空部に棒状部材３３０を挿入して、変性温度以上で加熱処理を行う。変性温度以上で加熱処理するとゲルが溶解することなく収縮して伸縮性のコラーゲンに変化する。収縮するメカニズムは明らかではないが、コラーゲン分子内のランダムコイル部分がバネのような働きをして伸縮性を与えていると考えられる。そして、本実施形態では、加熱処理工程において、管腔コラーゲン構造体４１０の中空部に棒状部材３３０を挿入している状態で自由収縮させているから、収縮量が規制され、コラーゲンに円周方向に更に収縮しようとする張力が発生し、その張力によって、コラーゲンが管軸に対して円周方向に配向している伸縮性配向コラーゲン成形体４２０が得られる。ランダムな網目状から、少なくとも一部が円周方向に配向することにより、管の強度が増加し、裂けやすさが改善され、耐久性も向上させることができる。
【００６０】
加熱処理の温度は、コラーゲンの変性温度以上であれば特に限定されるものではないが、例えば５５〜６５℃であり、好ましくは５８℃〜６３℃である。加熱処理工程により、伸縮性配向コラーゲン成形体４２０の外径は、管腔コラーゲン構造体４１０の外径の例えば３５％〜４５％となる。
【００６１】
内部マンドリル３２０の外径に対して棒状部材３３０の外径は、３０％〜７０％が好ましく、４０％〜６０％がより好ましく、４５％〜５５％が更に好ましい。内部マンドリル３２０の外径と棒状部材３３０の外径との口径差が大き過ぎる場合には、収縮過程において、円周方向への張力が働きにくく、コラーゲンの円周方向への配向が起こりにくくなる。棒状部材３３０を用いない場合の自然収縮時に得られる内径収縮比（１９％〜２５％）より少なくとも大きな口径差が必要である。また口径差が小さ過ぎる場合には、収縮過程において過度の張力がかかりコラーゲンの破損が生じやすくなる。
【００６２】
また、内部マンドリル３２０の外径に対して外部シリンダ３１０の内径は、１２０％〜４００％が好ましく、１３０％〜３００％がより好ましく、１５０％〜２００％が更に好ましい。内部マンドリル３２０の外径と外部シリンダ３１０の内径との口径差が大き過ぎる場合には、収縮過程において、円周方向への張力が働きにくく、コラーゲンの円周方向への配向が起こりにくくなり、また口径差が小さ過ぎる場合には、収縮過程において過度の張力がかかりコラーゲンの破損が生じやすくなる。
【００６３】
次に再架橋工程では、図２（ｃ）に示すように、加熱処理工程で得られた伸縮性配向コラーゲン成形体４２０について、架橋剤を加えて再架橋を行う。架橋剤は、特に限定されるものではなく、例えば成形工程で使用した架橋剤と同じものを使用できる。これにより、十分な強度を有すると共に伸縮性を有する管腔構造体１００が得られる。なお、再架橋工程において、棒状部材３３０は抜去して行なうことも可能であるが、ゲルを充分に収縮させてコラーゲンの伸縮性を向上させるため、棒状部材３３０を挿入した状態で行なうことが好ましい。
【００６４】
また、再架橋工程で使用する棒状部材の外径と、加熱処理工程で使用する棒状部材の外径とを異なるものとすることも、管腔構造体の強度を高めるのに有効であり、強度及び収縮性を向上させるため、再架橋工程で使用する棒状部材の外径は、加熱処理工程で使用する棒状部材の外径よりも小さくすることが可能である。例えば、内径１５ｍｍの外部シリンダ３１０と外径８ｍｍの内部マンドリル３２０を用いて、管腔コラーゲン構造体を得、これに外径４ｍｍの棒状部材３３０を入れて加熱処理を行い、次いで外径２ｍｍの棒状部材に入れ替えて加熱処理を繰り返すことで、外径２ｍｍの棒状部材のみを用いて加熱処理を行なう場合に比べてより強度を高めることができる。
【００６５】
（実施形態２）
上述の実施形態では、コラーゲン線維は管軸に対して円周方向に配向していたが、本発明に係る管腔構造体はこのような実施形態に限定されない。図３は、コラーゲン線維が螺旋状に配向している管腔構造体１００の斜視外観図である。図３に示すように、管腔構造体１００は、コラーゲン線維２００が管腔構造体の管軸Ｔａに対して角度θにて配向している。Ｏｄは、コラーゲン線維２００の配向の方向を示す。角度θは、特に限定されるものではなく、例えば４５度〜８９度であることが好ましく、より好ましくは７５度〜８９度である。
【実施例】
【００６６】
次に、本発明の具体的な実施例を以下に示すが、これは本発明の実施態様を例示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６７】
〈実施例１〜５、比較例１〜３〉
本発明の管状構造体を、下記の方法で製造した。コラーゲンは、鮭皮由来のコラーゲン（変性温度：１７℃）を使用した。魚皮として鮭（シロサケ、学名；Oncorhynchus Keta）の皮を用いた。鱗と身をメスで除去した鮭皮を３ｃｍ四方に細断した。これをクロロホルム／メタノールの等容量混合溶液を用いて３回脱脂を繰り返し、メタノールを用いて２回洗浄してクロロホルムを除去し、水を用いて３回洗浄してメタノールを除去した。
【００６８】
次に、得られた脱脂鮭皮１３０ｇを４℃で０．５Ｍ酢酸５Ｌに浸漬し、４日間静置した。膨潤した鮭皮を医療用ガーゼで濾過し、その濾液を１０，０００×ｇで３０分遠心して不溶物を沈殿させ、濾液の上清１．５Ｌを回収した。その上清にペプシン粉末５０ｍｇを混合して２日間おだやかに撹拌した。得られたペプシン粉末入り濾液の上清に対し、終濃度５％になるように塩化ナトリウムを加え、ガラス棒で１分間おだやかに撹拌した後、２４時間静置した。塩析により生じた白い不溶物を１０，０００×ｇで３０分遠心して沈殿を回収し、その沈殿を０．５Ｍ酢酸２Ｌに加え、３日間おだやかに撹拌して溶解した。この操作を一回繰り返して、無色透明なコラーゲン溶液を得た。このコラーゲン溶液を、セルロースチューブを用い、透析外液のｐＨが中性を示すまで脱イオン水を繰り返し交換し、この透析により得られた中性のコラーゲン溶液を凍結乾燥し、白色のスポンジ状コラーゲンを得た。
【００６９】
次に、得られた白色のスポンジ状コラーゲンを、シリカゲル入りデシケーターで減圧乾燥し、その精秤値を用いて０．５（ｗ／ｖ）％になるようにｐＨ３．０希塩酸に加え、おだやかに撹拌して溶解し、最後に、ポアサイズ１０μｍ、０．６５μｍ、０．４５μｍのメンブランフィルターで順次濾過して０．５％酸性鮭皮アテロコラーゲン水溶液を得た。
【００７０】
塩化ナトリウム５８．３ｍＭを含む、ｐＨ６．８リン酸ナトリウム緩衝水溶液２５ｍＭを溶媒として、架橋剤水溶液である１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩水溶液８３．３ｍＭを調製した。
【００７１】
（実施例１）
１）４℃にて、０．５％酸性鮭皮アテロコラーゲン水溶液１０ｍＬを上記の架橋剤水溶液１５ｍＬと混合し、速やかに、下記表１に示すように、外部シリンダ（内径１５ｍｍ）及び内部マンドリル（外径８ｍｍ）からなる管状の型に入れた。これにより線維化と架橋とを同時に引き起こし、図４（ａ）に示すように、管腔コラーゲン構造体（変性温度：５６℃）を得た。
【００７２】
２）図４（ｂ）に示すように外側シリンダを取り除いた。そして、管腔コラーゲン構造体から内部マンドリルを抜き取り、図４（ｃ）に示すように、代わりに管腔コラーゲン構造体の中空部に棒状部材（外径４ｍｍ）を挿入した。
【００７３】
３）変性温度以上（６０℃）で加熱処理すると、コラーゲンゲルが溶解することなく収縮して、図４（ｄ）に示すように、伸縮性配向コラーゲン成形体が得られた。加熱処理により、伸縮性配向コラーゲン成形体の内径は、管腔コラーゲン構造体の内径の５０％となった。
【００７４】
４）伸縮性配向コラーゲン成形体を１％水溶性カルボジイミドを含む７０％エタノール水に１日浸漬させることにより、管腔構造体を得た。棒状部材を抜きとり、得られた管腔構造体の内径は３．９８ｍｍであり、外径は４．６６ｍｍであった。再架橋により、管腔構造体の内径は、管腔コラーゲン構造体の内径の５０％となり、管腔構造体の外径は、管腔コラーゲン構造体の外径の３１％となった。
【００７５】
（実施例２〜５）
実施例２については、内径１５ｍｍの外部シリンダ３１０と外径８ｍｍの内部マンドリル３２０を用いて、管腔コラーゲン構造体を得、次に加熱処理工程にてこれに外径４ｍｍの棒状部材３３０を入れて加熱処理を行い、次いで再架橋工程にて外径２ｍｍの棒状部材に入れ替えて加熱処理を繰り返した。他は実施例１と同様の操作であった。また、他の実施例３〜５に関しては、実施例１と同様の操作で、下記表１に記載の寸法の外部シリンダ、内部マンドリル、及び棒状部材を組み合わせて行った。
【００７６】
（比較例１）
１）４℃にて、０．５％酸性鮭皮アテロコラーゲン水溶液１０ｍＬを上記の架橋剤水溶液１５ｍＬと混合し、速やかに、下記表１に示すように外部シリンダ（内径１５ｍｍ）及び内部マンドリル（外径８ｍｍ）からなる管状の型に入れた。これにより線維化と架橋とを同時に引き起こし、図４（ａ）に示すように、管腔コラーゲン構造体（変性温度：５６℃）を得た。
【００７７】
２）図４（ｂ）に示すように外側シリンダを取り除いた。そして、管腔コラーゲン構造体から内部マンドリルを抜き取った。
【００７８】
３）変性温度以上（６０℃）で加熱処理すると、コラーゲンゲルが溶解することなく収縮して、伸縮性配向コラーゲン成形体が得られた。
【００７９】
４）伸縮性配向コラーゲン成形体を、１％水溶性カルボジイミドを含む７０％エタノール水に１日浸漬させることにより、再架橋体を得た。得られた体の内径は１．８０ｍｍであり、外径は３．２７ｍｍであった。再架橋により、再架橋体の内径は、管腔コラーゲン構造体の内径の２２％となり、再架橋体の外径も、管腔コラーゲン構造体の外径の２２％となった。
【００８０】
（比較例２，３）
他の比較例２，３に関しては、比較例１と同様の操作で、下記表１に記載の寸法の外部シリンダならびに内部マンドリルを組み合わせて行った。
【００８１】
〈管腔構造体の弾性率〉
上述の実施例１で作製した管腔構造体の弾性率を測定した。弾性率の測定方法は、Photocurable surgical tissue adhesive glues composed of photoreactive gelatin and poly(ethylene glycol) diacrylate. J Biomed Mater Res 48, Issues 4, 1999, Pages 511-521.内に記載の方法に従って行った。測定の結果、５５４．５ｋＰａ/ｍｍであった（配向２回架橋）。同様にして実施例２〜５及び比較例１〜３についても弾性率を測定した。また、実施例１において、再架橋をする前の伸縮性配向コラーゲン成形体の弾性率を測定した結果、６３ｋＰａ/ｍｍであった（配向１回架橋）。また、上述の比較例１（棒状部材を使用しないこと以外は実施例１と同様の工程）の弾性率を測定した結果、１７５．６ｋＰａ/ｍｍであった（２回架橋）。また、比較例１において、再架橋を行う前にて、伸縮性コラーゲン成形体の弾性率を測定した結果、１３．５ｋＰａ/ｍｍであった（１回架橋）。このように、棒状部材を用いて収縮過程を規制し、更に再架橋を行う本発明の製造方法により製造された管腔構造体の弾性率は、その他のコラーゲン成形体よりも優れており、本発明の管腔構造体が柔軟性に富み、且つ強度が高いことが理解される。
【００８２】
〈コラーゲンの膨潤率〉
実施例１〜５及び比較例１〜３における管腔構造体の膨潤率を測定した。膨潤率の測定方法は下記に示す手法であった。膨潤率の値は下記表１に示す。
１）凍結乾燥した管状構造体の重量（１０±１ｍｇの範囲内の細片とする）を測定する。
２）凍結乾燥した管状構造体を１００ｍｌの生理食塩水に１時間入れる。
３）膨潤後の管状構造体の重量を測定する。
４）膨潤前の重量を基準に、膨潤率を算出する。
また、膨潤率の計算は、｛（膨潤後の重量-膨潤前の重量）／膨潤前の重量｝×１００＝膨潤率（％）にて行った。
【００８３】
【表１】
2011130995.tif 000003
【００８４】
従来の棒状部材を用いない場合には、比較例１〜３に示すとおり、作製されるコラーゲン成形体の内径は１．５ｍｍ〜２．１ｍｍとなった（内径収縮比：１９％〜２５％）。一方、棒状部材を用いて行なうと、実施例１に示すとおり、加熱処理工程における収縮量が規定されるため、作製される管腔構造体１００の内径は棒状部材の外径にほぼ近い値となる。即ち、４ｍｍの外径を有する棒状部材を用いると、４．０ｍｍ（内径収縮比：５０％）の内径を有する管腔構造体１００が得られた。また、６ｍｍ（実施例３）、４ｍｍ（実施例４）、３ｍｍ（実施例５）の各外径を有する内部マンドリル３２０と、外径２ｍｍの棒状部材とを組み合わせて行なうと、夫々、内径は１．７ｍｍ、１．９ｍｍ、１．９ｍｍでほぼ同じ管腔構造体１００（内径収縮比：３３％〜６７％）が作製された。また、実施例２に示すように、加熱処理工程にて外径４ｍｍの棒状部材を入れて加熱処理を行い、次いで再架橋工程にて外径２ｍｍの棒状部材に入れ替えて加熱処理を繰り返すことで、管腔構造体の強度を高めることができた。このように、実施例１〜５に示されるように、本発明の管腔構造体は、従来にはなかった伸縮性及び強度を有することが明らかとなった。
【００８５】
〈コラーゲンの配向性の確認〉
この管腔構造体から組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン(ＨＥ)染色を用いて染色して、光学顕微鏡を用いて断面を観察した。写真撮影した実施例１の結果を図５（ａ）に、実施例２の結果を（ｂ）に示す。図５（ａ）（ｂ）に示すように、コラーゲン線維が管軸に対して円周方向に配向していた。
【００８６】
〈管腔構造体の内腔面の血液抗凝固剤の固定化〉
ヘパリン４０ｍｇ／ｍｌ濃度の水溶液に１００ｍｇ／ｍｌの水溶性カルボジイミド水溶液を混合し、０℃で３０分間撹拌した後、乾燥重量１０±１ｍｇの範囲内の本発明の管腔構造体を入れ、室温で１晩撹拌を行った。管腔構造体を取り出し、流水下で１晩透析精製を行った。
【００８７】
（ヘパリンの固定の確認）
ヘパリン修飾した管状構造体を０．１％トルイジンブルー染色液に浸け、流水で洗浄を行うと、管状構造体が青紫色に染色され、ヘパリンが固定化されていることが確認できた。また、ESCAを用いて、表面の元素分析を行うと、ヘパリンを固定化した管状組織体の表面ではヘパリンに由来する硫黄のシグナルが検出されたことからも、ヘパリンの固定化が確認された。
【００８８】
（抗血栓性の確認）
内腔面に血液抗凝固剤を固定化した管腔構造体をラット腹部大動脈に移植を行った。７日後摘出し、内腔面を観察すると、全く血栓の形成を認めなかった。一方、固定化していないラットでは、４日以内に全て血栓形成がおこり、大動脈が閉塞し、死亡した。
【００８９】
〈埋植実験〉
次に、上記の管腔構造体を人工血管としてラットの背中の動脈に埋植する実験を行った。塩酸ケタミン３ｍＬ（動物用ケタラール：三共エール薬品株式会社）、アザペロン５ｍＬ（動物用ストレスニル：三共株式会社）、及び硫酸アトロピン１ｍＬ（扶桑薬品工業株式会社）を混合した薬品を、ラットに投与することにより、ラットに初期麻酔をした。次に、イソフルラン吸入剤（エスカイン：メルク・ホエイ）をラットに吸入させることにより全身麻酔を行った。全身麻酔下においてラット背中を切開して動脈を露出させた。露出した動脈を２．０ｃｍ切除し、この箇所に、本発明の人工血管を縫合糸を用いて各断端を縫合した。埋込まれた管状構造体を埋植後３ヶ月後にMRIにて瘤化の有無を確認した。実施例１の結果を図６（ａ）に示す。図６（ａ）から理解されるように、本発明の手法により作製した人工血管は、３ヶ月を経過しても瘤化が見られず、破裂することもなかった。
【００９０】
次に、比較例１及び比較例２に係る人工血管を同様にラットの背中の動脈に埋植し、埋込まれた人工血管を埋植後３ヶ月後にMRIにて瘤化の有無を確認した。比較例１の結果を図６（ｂ）、比較例２の結果を図６（ｃ）に示す。図６（ｂ）から理解されるように、比較例１に係る人工血管には埋植後３ヶ月後に嚢状瘤が見られた。また、図６（ｃ）から理解されるように、比較例２に係る人工血管には埋植後３ヶ月後に瘤化が見られた。
【００９１】
〈生体コラーゲン組織の配向〉
次に、本発明の管腔構造体を生体内に埋入して、その管腔構造体の上に形成される生体コラーゲン組織の配向を観察した。
【００９２】
実施例１の管腔構造体の中空部に、外径４．０ｍｍ、長さ２０ｍｍのシリコーン製の丸棒を密着させて挿入し、その後、通常手技によって局所麻酔、剃毛されたラットの背部の表皮をイソジン消毒後に速やかに１ｃｍ切開し、シリコーン棒を中空部に挿入した管腔構造体を皮下組織の下へ埋入して縫合した。埋入から４週間後に埋入時と同様の手順にて摘出し、丸棒を抜去して結合組織管を得た。この結合組織管は、サケコラーゲンが生分解され、生来由来のコラーゲンが、管腔構造体のコラーゲン線維の方向に沿って配向して形成されていた。この結合組織管から組織切片を作成し、図７（ａ）に示すように、シリウスレッド染色用いて染色した。更に、シリウスレッド染色用いて染色した組織切片を偏光顕微鏡にて観察した。図７（ｂ）に示すように、コラーゲン線維が管軸に対して円周方向に配向していた。
【００９３】
一方、比較例として、外径４．０ｍｍ、長さ２０ｍｍのシリコーン製の丸棒を用い、このシリコーン棒をエチレンオキサイドガス滅菌した。その後、通常手技によって局所麻酔、剃毛されたラットの背部の表皮をイソジン消毒後に速やかに１ｃｍ切開し、シリコーン棒を皮下組織の下へ埋入して縫合した。埋入から４週間後に埋入時と同様の手順にてシリコーン棒を摘出し、シリコーン棒を抜去して結合組織管を得た。この結合組織管から組織切片を作成し、図８（ａ）に示すように、シリウスレッド染色用いて染色した。更に、シリウスレッド染色用いて染色した組織切片を偏光顕微鏡にて観察した。図８（ｂ）に示すように、コラーゲン線維は配向しておらずランダムに形成されていた。
【符号の説明】
【００９４】
１００：管腔構造体
２００：コラーゲン線維
３１０：外部シリンダ
３２０：内部マンドリル
３３０：棒状部材
４００：混合水溶液
４１０：管腔コラーゲン構造体
４２０：伸縮性配向コラーゲン成形体
【図１】
2011130995.tif 000004
【図２】
2011130995.tif 000005
【図３】
2011130995.tif 000006
【図４】
2011130995.tif 000007
【図５】
2011130995.tif 000008
【図６】
2011130995.tif 000009
【図７】
2011130995.tif 000010
【図８】
2011130995.tif 000011