(57)【要約】【課題】ヒト血清トランスフェリンに代表される異種タンパク質を培養液中に高効率に分泌できる形質転換体の培養方法、および該培養方法を用いた異種タンパク質の生産方法の提供を目的とする。【解決手段】シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、異種タンパク質構造遺伝子を導入した形質転換体を、カザミノ酸を含む培養液中で培養し、異種タンパク質を該培養液中に分泌させる、形質転換体の培養方法。また、該培養方法により培養した培養液から、前記異種タンパク質を取得する、異種タンパク質の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）を宿主とし、異種タンパク質構造遺伝子を導入した形質転換体を、カザミノ酸（casamino acids）を含む培養液中で培養し、異種タンパク質を該培養液中に分泌させることを特徴とする形質転換体の培養方法。
【請求項２】
前記異種タンパク質がヒトトランスフェリン（ｈＴＦ）である、請求項１に記載の形質転換体の培養方法。
【請求項３】
前記培養液中のカザミノ酸の含有量が、培養液に対して０．０５〜２０質量％である、請求項１または２に記載の形質転換体の培養方法。
【請求項４】
前記培養液にさらにデキストラン硫酸ナトリウムが含まれている、請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体の培養方法。
【請求項５】
前記培養液中のデキストラン硫酸ナトリウムの含有量が、０．００１〜１質量％である、請求項４に記載の形質転換体の培養方法。
【請求項６】
前記培養液が、ＹＥＳ（yeast extract medium）培地、ＹＰＤ（yeast extract-polypeptone-dextrose）培地またはＭＭ（minimum media）培地である、請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換体の培養方法。
【請求項７】
前記形質転換体が、前記宿主の染色体に、分泌シグナル、プロモーター、異種タンパク質構造遺伝子およびターミネーターを含むベクターを導入して構築された形質転換体である、請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換体の培養方法。
【請求項８】
シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）を宿主とし、異種タンパク質構造遺伝子を導入した形質転換体を、カザミノ酸（casamino acids）を含む培養液中で培養し、異種タンパク質を培養液中に分泌させた後、該培養液から前記異種タンパク質を取得することを特徴とする異種タンパク質の生産方法。
【請求項９】
異種タンパク質がヒトトランスフェリン（ｈＴＦ）である、請求項８に記載の異種タンパク質の生産方法。
【請求項１０】
前記形質転換体が、前記宿主の染色体に、分泌シグナル、プロモーター、異種タンパク質構造遺伝子およびターミネーターを含むベクターを導入して構築された形質転換体である、請求項８または９に記載の異種タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換体の培養方法および異種タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスフェリンは、Ｆｅ３＋イオンと結合するタンパク質の１種であり、類似のタンパク質には、血清トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、メラノトランスフェリンがある。これらのトランスフェリンは、Ｎローブ（N-lobe）とＣローブ（C-lobe）の２つのドメインを有する約８０ｋＤａのタンパク質であり、鉄の代謝に深く関わっている。例えば、血清トランスフェリンは体内の鉄輸送に関わっており、ラクトフェリンは多くのほ乳動物の乳汁、涙等の体液中に含まれている。また、オボトランスフェリンは鳥類の卵白に含まれており、メラノトランスフェリンはメラニン細胞の表面に見られる。
【０００３】
トランスフェリンファミリーのうちヒト血清トランスフェリン（ｈＴＦ）は、６７９残基のアミノ酸からなり、１９個のジスルフィド結合と、Ｃローブに結合している２つのＮ結合型糖鎖とを有する。ヒト血清トランスフェリンは、鉄の輸送だけでなく、鉄の触媒活性により生じるフリーラジカルによる損傷に対する防御機構にも関与している。しかし、ヒト血清トランスフェリンは５０年以上前に同定されているものの、鉄の輸送および放出に関する機構はいまだ完全には解明されていない。
【０００４】
鉄の輸送等の機構の理解には、トランスフェリンの全長組換えタンパク質の利用が非常に有効である。トランスフェリン生産の最も一般的な方法としては、ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）を用いる方法が知られている。しかし、該方法は生産性が低い。これは、トランスフェリンが多くのジスルフィド結合を有しているためであると考えられる。前記方法以外にも多くのトランスフェリン生産方法が示されているが、それらの方法ではグリコシル化された全長トランスフェリンが得られない。例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は異種遺伝子発現に広く用いられる株であるが、該株からはＮローブまたはＣローブのいずれかを有する部分トランスフェリンしか分泌されないため、全長トランスフェリンの生産は困難である（非特許文献１）。
【０００５】
一方、異種タンパク質の生産においては、分子遺伝学的および細胞生物学的に最も良く研究されている分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）（以下、「Ｓ．ポンベ」という。）を用いる方法が知られている。Ｓ．ポンベは、出芽酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）とは異なり、細胞分裂および転写形態がヒトに近く、人体に悪影響を及ぼす物質を含まない。そのため、Ｓ．ポンベを用いた多くの発現系（ヒトアンチスタチン、ヒトパピロマウイルスＥ７タンパク質、ヒトＤ２ｓドーパミンレセプター、ヒト成長ホルモン等。）が開発されている。しかし、Ｓ．ポンベを用いる方法では、異種タンパク質の種類によっては分泌量はそれほど多くはない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Protein Expr. Purif.誌、１９９６年、第８巻１号、１１９−１２５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒト血清トランスフェリンに代表される異種タンパク質を培養液中に高効率に分泌できる形質転換体の培養方法、および該培養方法を用いた異種タンパク質の生産方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するために以下の構成を採用した。
［１］Ｓ．ポンベを宿主とし、異種タンパク質構造遺伝子を導入した形質転換体を、カザミノ酸（casamino acids、以下、「ＣＡＡ」という。）を含む培養液中で培養し、異種タンパク質を該培養液中に分泌させることを特徴とする形質転換体の培養方法。
［２］前記異種タンパク質がヒトトランスフェリンである、前記［１］に記載の形質転換体の培養方法。
［３］前記培養液中のＣＡＡの含有量が、培養液に対して０．０５〜２０質量％である、前記［１］または［２］に記載の形質転換体の培養方法。
［４］前記培養液にさらにデキストラン硫酸ナトリウムが含まれている、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換体の培養方法。
［５］前記培養液中のデキストラン硫酸ナトリウムの含有量が、０．００１〜１質量％である、前記［４］に記載の形質転換体の培養方法。
［６］前記培養液が、ＹＥＳ（yeast extract medium）培地、ＹＰＤ（yeast extract-polypeptone-dextrose）培地またはＭＭ（minimum media）培地である、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換体の培養方法。
［７］前記形質転換体が、前記宿主の染色体に、分泌シグナル、プロモーター、異種タンパク質構造遺伝子およびターミネーターを含むベクターを導入して構築された形質転換体である、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の形質転換体の培養方法。
［８］Ｓ．ポンベを宿主とし、異種タンパク質構造遺伝子を導入した形質転換体を、ＣＡＡを含む培養液中で培養し、前記異種タンパク質を培養液中に分泌させた後、該培養液から異種タンパク質を取得することを特徴とする異種タンパク質の生産方法。
［９］異種タンパク質がヒトトランスフェリンである、前記［８］に記載の異種タンパク質の生産方法。
［１０］前記形質転換体が、前記宿主の染色体に、分泌シグナル、プロモーター、異種タンパク質構造遺伝子およびターミネーターを含むベクターを導入して構築された形質転換体である、前記［８］または［９］に記載の異種タンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の形質転換体の培養方法によれば、培養により産生したヒト血清トランスフェリン等の異種タンパク質が培養液中に高効率に分泌される。
また、本発明の異種タンパク質の生産方法によれば、前記培養方法により、培養液中に異種タンパク質が高効率に分泌されるため、目的の異種タンパク質を簡便に生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本実施例で用いたｈＴＦ発現ベクターの構成図である。
【図２】本実施例で用いたｍ−ｈＴＦ発現ベクターの構成図である。
【図３】例４におけるｈＴＦ分泌量のウエスタンブロット法による解析写真である。
【図４】例５におけるｈＴＦ分泌量のウエスタンブロット法による解析写真である。
【図５】例６におけるｈＴＦ分泌量のウエスタンブロット法による解析写真である。
【図６】図５のｈＴＦバンドから各レーンのｈＴＦ分泌量を定量したグラフである。
【図７】例７における形質転換体の量の経時変化を示したグラフである。
【図８】例８におけるｈＴＦのｍＲＮＡ転写量のノーザンブロット法による解析写真である。
【図９】例９におけるｈＴＦ分泌量のウエスタンブロット法による解析写真である。
【図１０】図９のｈＴＦバンドから各レーンのｈＴＦ分泌量を定量したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜形質転換体の培養方法＞
本発明の形質転換体の培養方法は、Ｓ．ポンベを宿主とし、異種タンパク質構造遺伝子を導入した形質転換体を、ＣＡＡを含む培養液中で培養し、異種タンパク質を該培養液中に分泌させる方法である。該培養方法によれば、形質転換体で産生した異種タンパク質が培養液中に高効率に分泌される。
本発明における「異種タンパク質構造遺伝子」とは、異種タンパク質をコードする遺伝子を意味する。また、本発明において「異種タンパク質」とは、宿主であるＳ．ポンベが本来産生しない（野生型のＳ．ポンベがそのタンパク質をコードする遺伝子を有さない。）タンパク質を意味する。
【００１２】
（宿主）
本発明における宿主は、本発明における形質転換体を製造するための宿主であり、Ｓ．ポンベからなる。
本発明に用いるＳ．ポンベは、野生型であってもよく、必要に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には、Ｌａｔｏｕｒ法（Nucreic Acids Res.誌、２００６年、第３４巻２号、ｅ１１頁；国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させることができる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、２８−３３頁。）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させてもよい。特定遺伝子を欠失または失活させたＳ．ポンベ宿主としては、例えば、国際公開第２００２／１０１０３８号パンフレット、国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット等に記載されている。
【００１３】
特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型のＳ．ポンベとしては、８つのプロテアーゼ遺伝子を欠失させたＡ８株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｃ１９０Ｔ、△ｐｓｐ３、△ｉｓｐ６、△ｏｍａ１、△ｐｐｐ１６、△ｆｍａ２、△ｓｘａ２、△ａｔｇ４、△ｐｐｐ２０、Applied Microbiology and Biotechnology誌、２００９年８月１１日オンライン公開、http://www.springerlink.com/content/7414l6q51803m344/）が好ましい。Ａ８株は、８つのプロテアーゼが欠失していることで、産生した異種タンパク質の分解が低減されるため、異種タンパク質の生産性が向上する。
【００１４】
また、Ｓ．ポンベとしては、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。例えば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須であるＳ．ポンベを使用することが好ましい。形質転換体を製造する際のベクターにこの欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、該形質転換体は宿主の栄養要求性が消失する。この宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
例えば、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が欠失または失活してロイシン要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｌｅｕ１遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ロイシン要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｌｅｕ１遺伝子には限定されず、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）等であってもよい。
【００１５】
［形質転換体］
本発明における形質転換体は、宿主であるＳ．ポンベに、異種タンパク質構造遺伝子を有するベクターが導入されることで形質転換したものである。
該ベクターとしては、例えば、異種タンパク質構造遺伝子と、前記異種タンパク質構造遺伝子の５’末端側に配置された、Ｓ．ポンベ内で機能する分泌シグナル遺伝子とを含む発現カセットを含むベクターが挙げられる。本発明における発現カセットとは、異種タンパク質構造遺伝子がコードする異種タンパク質を発現させ、培養液中に分泌させるために必要なＤＮＡの組み合わせであり、分泌シグナル遺伝子、異種タンパク質構造遺伝子、Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むものである。発現カセットには、さらに、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。
【００１６】
プロモーターとターミネーターは、宿主であるＳ．ポンベ内で機能して異種タンパク質を発現できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい。）であってもよく、Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーター等。）であってもよい。プロモーターは、同一ベクター内に２種以上存在していてもよい。
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号パンフレット参照）、熱ショックタンパク質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号パンフレット参照）等が挙げられる。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、例えば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましく、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターが特に好ましい。
Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターであってもよく、Ｓ．ポンベが本来有しないターミネーターであってもよい。ターミネーターは、同一ベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、例えば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリポコルチンＩ（ＬＰＩ）ターミネーターが好ましい。
【００１７】
分泌シグナル遺伝子は、発現した異種タンパク質を宿主細胞外に分泌させる機能を有する分泌シグナルをコードする遺伝子である。分泌シグナル遺伝子が結合した異種タンパク質構造遺伝子からＮ末端側に分泌シグナルが結合した異種タンパク質が発現する。該タンパク質は、宿主内の小胞体やゴルジ装置等で分泌シグナルが削除され、その後分泌シグナルが削除された異種タンパク質が細胞外に分泌される。本発明における分泌シグナル遺伝子（および分泌シグナル）はＳ．ポンベ内で機能することが必要である。Ｓ．ポンベ内で機能する分泌シグナル遺伝子としては、例えば、国際公開第１９９６／２３８９０号パンフレットに記載のものが使用できる。具体的には、例えば、Ｐ３分泌シグナル（３４アミノ酸残基）をコードするＰ３分泌シグナル遺伝子等が挙げられる。
【００１８】
異種タンパク質構造遺伝子とは、異種タンパク質をコードする遺伝子である。異種タンパク質は、特に限定されないが、トランスフェリンが好ましく、ヒト血清トランスフェリン（以下、「ｈＴＦ」という。）が特に好ましい。
【００１９】
ベクター中の発現カセットの数は、１個のみであってもよく、２個以上であってもよい。ベクター中の発現カセットの数が２個以上であれば、Ｓ．ポンベの染色体の同一箇所に複数の発現カセットが連続して組み込まれる。
本発明におけるベクターは、発現カセットを１〜１６個有することが好ましく、２〜８個有することがより好ましい。
発現カセットの数が１個以上であれば、Ｓ．ポンベの染色体に組み込まれる発現カセットの数が増加し、異種タンパク質の発現量が増加する。発現カセットの数が１６個以下であれば、ベクターが大きくなりすぎることでベクターの組み込み効率が低下することを抑制しやすい。発現カセットの数が４個以下であれば、ベクターの組み込み効率を高くしやすい。
また、１つの発現カセット内に複数の異種タンパク質構造遺伝子が配置されているベクターを用いてもよい。
【００２０】
また、本発明におけるベクターは、前述したように、選択マーカーを含むことが好ましい。例えば、宿主の栄養要求性に応じて前記栄養要求性相補マーカーを組み込んだベクターを使用することが好ましい。
【００２１】
また、本発明においては、異種タンパク質の生産性の点から、プロモーター、分泌シグナル遺伝子、異種タンパク質構造遺伝子およびターミネーターを含む染色体組込型ベクターを用いて、宿主であるＳ．ポンベの染色体にそれらを組み込むことが好ましい。該方法は、異種タンパク質を分裂酵母で高効率かつ安定に発現させるのに効果的である（Biothechnol. Bioeng.誌、２００２年、第８０巻１号、２２−３２頁；J. Biosci. Bioeng.誌、２００４年、第９８巻５号、３６６−３７３頁；Yeast誌、第２３巻２号、８３−９９頁；Appl. Microbiol. Biotechnol.誌、２００６年、第７３巻２号、４０４−４２０頁参照）。
【００２２】
染色体組込型ベクターとしては、例えば、発現カセットが２つの組換え部位で挟み込まれているものが挙げられる。前記組換え部位とは、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位とは、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定することができる。
染色体組込型ベクターの具体例としては、例えば、２つのｌｅｕ１＋遺伝子の間に、プロモーター、分泌シグナル遺伝子、異種タンパク質構造遺伝子およびターミネーター含む発現カセットが挿入されたベクターが挙げられる。該染色体組込型ベクターを用いることにより、Ｓ．ポンベの染色体のｌｅｕ１遺伝子座に、発現カセットを直接組み込むことができる。
【００２３】
本発明におけるベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターであり、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状のＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡのような環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法、例えばＰＣＲによる酵素的な増幅法や化学合成法等で構築してもよい。
【００２４】
本発明におけるベクターを構築するためには、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。大腸菌由来のプラスミドを用いて構築したベクターは、通常、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域を有する。また、前述のような大腸菌由来のプラスミドを用いない場合であっても、本発明におけるベクターを構築し増幅するために大腸菌を使用する場合は前記「ｏｒｉ」が利用されるため、「ｏｒｉ」を有するベクターが得られる。
この場合、相同組換えに用いる際のベクターは、大腸菌内での複製のために必要であった「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、前述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる（特開２０００−２６２２８４号公報参照）。
【００２５】
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、発現カセットがない側の２つの組換え部位の間に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位（例えば、前述の２つのｌｅｕ１＋遺伝子。）を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して染色体組込型ベクターを得る方法であってもよい。
【００２６】
本発明におけるＳ．ポンベの形質転換方法は、特に限定されず、Ｏｋａｚａｋｉ等のリチウム酢酸を用いた形質転換法（Nucleic Acids Res.誌、１９９０年、１８巻２２号、６４８５−６４８９頁）、特開２０００−２６２２８４号公報に記載の形質転換法等の公知の方法が使用できる。
【００２７】
［培養液］
培養液としては、公知の酵母培養培地を用いることができ、Ｓ．ポンベが資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトンが挙げられる。
無機塩類としては、例えば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００２８】
培養液の具体例としては、例えば、ＹＥＳ（yeast extract medium）培地、ＭＭ（minimum media）培地、ＹＰＤ（yeast extract-polypeptone-dextrose）培地等が挙げられる。なかでも、異種タンパク質の分泌量が多く生産性に優れる点から、ＭＭ培地、ＹＰＤ培地が好ましく、コスト面からＭＭ培地が特に好ましい。
【００２９】
本発明における培養液は、ＣＡＡを含有している。培養液にＣＡＡが含まれていることにより、培養液中に分泌される異種タンパク質の量が増加する。
培養液中のＣＡＡの含有量は、培養液に対して、０．０５〜２０質量％が好ましく、０．５〜５質量％がより好ましい。ＣＡＡの含有量が培養液に対して０．０５質量％以上であれば、異種タンパク質の分泌量が向上する。ＣＡＡの含有量が培養液に対して２０質量％以下であれば、培養液に容易に溶解できる。
【００３０】
また、本発明の培養液には、ＣＡＡに加えて、他の添加剤が含有されていてもよい。他の添加剤としては、例えば、アニオン性界面活性剤であるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）、デオキシコール酸；ノニオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００等。）等が挙げられる。これらの添加剤を加えることにより、異種タンパク質の分泌量がさらに増加する。なかでも、生分解性かつ生体適合性のポリマーであり、医薬品でも広く応用されているＤＳＳが好ましい。ＤＳＳは、例えば、抗アテローム硬化症薬（Atherosclerosis誌、１９７８年、第３１巻２号、２１７−２２９頁参照）、遺伝子伝達システム（Eur. J. Pharm. Sci.誌、２００３年、第１９巻４号、１９１−２０２頁；Int. J. Pharm.誌、２００６年、第３２０巻１−２号、１４３−１４９頁）にも応用されている。
【００３１】
培養液中のＤＳＳの含有量は、０．００１〜１質量％が好ましく、０．０１〜０．１質量％がより好ましい。ＤＳＳの含有量が０．００１〜１質量％であれば、ＤＳＳによる効果が充分に得られやすい。
【００３２】
培養方法は、公知の酵母培養方法を用いることができ、例えば振とう培養、攪拌培養等が使用できる。
培養温度は、２３〜３７℃が好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。
【００３３】
＜異種タンパク質の生産方法＞
本発明の異種タンパク質の生産方法は、前述した形質転換体の培養方法を利用することで、目的の異種タンパク質を生産する方法である。すなわち、Ｓ．ポンベを宿主とし、異種タンパク質構造遺伝子を導入した形質転換体を、ＣＡＡを含む培養液中で培養し、異種タンパク質を培養液中に分泌させた後、該培養液から前記異種タンパク質を取得する方法である。
形質転換体の培養方法については、前述のとおりである。
【００３４】
培養液から異種タンパク質の取得は、公知のタンパク質取得方法を用いることができる。例えば、遠心分離等により培養液から菌体（形質転換体）を分離し、公知のタンパク質精製方法を行うことで異種タンパク質を取得できる。
本発明の異種タンパク質の生産方法では、目的の異種タンパク質が高効率で培養液中に分泌されてくるため、形質転換体を破砕する工程を経なくても、高い生産性で目的の異種タンパク質を生産できる。
【００３５】
また、本発明の異種タンパク質の生産方法は、連続培養により形質転換体を培養することで、効率良く異種タンパク質を取得することができる。例えば、一定時間培養した培養液から異種タンパク質を取得すると共に培養上清を回収し、該培養上清に再び培養液を加えて培養することを繰り返し、形質転換体を連続的に培養する方法が挙げられる。
【００３６】
以上説明した本発明の形質転換体の培養方法、および異種タンパク質の生産方法では、ＣＡＡを含む培養液を用いて培養を行うことで、培養液中に産生した異種タンパク質が高効率に分泌されるため、目的の異種タンパク質を簡便かつ高い生産性で生産できる。また、ＤＳＳ等の他の添加剤を加えれば、異種タンパク質の分泌量がさらに増加するため、より高い生産性が達成される。
ＣＡＡの添加により異種タンパク質の分泌量が増加する機構については明らかではないが、アニオン性界面活性剤であるＤＳＳ、デオキシコール酸等の添加による異種タンパク質の分泌量の増加は、分泌小胞のエキソサイトーシスを含む分泌機構の効率を向上させているものと思われる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例及び比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
［Ｓ．ポンベ］
本実施例では、Ｓ．ポンベとしてウラシル要求性株（ＡＲＣ０３９、遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｃ１９０Ｔ）、および、８つのプロテアーゼ遺伝子を欠失させたＡ８株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｃ１９０Ｔ、△ｐｓｐ３、△ｉｓｐ６、△ｏｍａ１、△ｐｐｐ１６、△ｆｍａ２、△ｓｘａ２、△ａｔｇ４、△ｐｐｐ２０）を用いた。前記Ａ８株は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のタンパク質分解の効率が最低であるＡ７−３株（遺伝子型：ｈ−  ｌｅｕ１−３２  ｕｒａ４−Ｃ１９０Ｔ、△ｐｓｐ３、△ｉｓｐ６、△ｏｍａ１、△ｐｐｐ１６、△ｆｍａ２、△ｓｘａ２、△ａｔｇ４、Applied Microbiology and Biotechnology誌、２００６年、第７３巻２号、４０４−４２０頁参照）由来であり、ｕｒａ４遺伝子カセットを用いた標的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子置換によりあらかじめ構築された株である。
【００３８】
［培地］
培養に用いた培地を以下に示す。
（１）ＹＥＳ（Yeast extract）培地：０．５％バクトイーストエキス（Becton Dichinson（ＢＤ）社製、米国）、３％グルコース、ＳＰサプリメント（Qbiogene社製、加国）。
（２）ＹＰＤ（yeast extract-polypeptone-dextrose）培地：１％バクトイーストエキス（ＢＤ社製、米国）、２％バクトペプトン（ＢＤ社製、米国）、２％グルコース。
（３）ＭＭ培地（最少培地、１，０００ｍＬ）：ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（２．２ｇ）、ＮＨ４Ｃｌ（５ｇ）、グルコース（２０ｇ）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１．０５ｇ）、ＣａＣｌ２（１１ｍｇ）、ＫＣｌ（１ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（４０ｍｇ）、パントテン酸（１ｍｇ）、ニコチン酸（１０ｍｇ）、イノシトール（１０ｍｇ）、ビオチン（１０μｇ）、ホウ酸（０．５ｍｇ）、ＭｎＳＯ４（０．４ｍｇ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．４ｍｇ）、ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．２ｍｇ）、Ｈ２ＭｏＯ４（０．０４ｍｇ）、ＫＩ（０．１ｍｇ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．０４ｍｇ）、クエン酸（１ｍｇ）、アデニン（７５ｍｇ）、ヒスチジン（７５ｍｇ）、リシン（７５ｍｇ）。
前記各培地には、栄養要求性を満たすために、必要に応じて培地１０００ｍＬに対してウラシル（３７．５ｍｇ）またはロイシン（７５ｍｇ）を添加した。
【００３９】
［形質転換体の培養条件］
形質転換体の培養は、前記ＹＥＳ、ＹＰＤ、ＭＭ培地ならびにＭＭ培地に寒天を含む最少培地（ＭＭＡ）を用いて３０℃で行った。
また、プラスミドベクターの調製には、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株（Invitrogen社製）を用いた。
【００４０】
［ウエスタンブロット法による解析］
形質転換体の培養液の上澄を、同量のアセトンに加え、一晩インキュベートした後、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上澄を除いて乾燥し、濃縮した抽出物を得た。該抽出物は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のサンプルバッファー５００μＬに溶解し、８０℃で５分間インキュベートした。その後、２０μＬのサンプルを、５〜２０％の濃度勾配を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad Laboratories社製、米国）にブロットした。一次抗体としては、１：５００に希釈したマウスポリクローナル抗ｈＴＦ抗体（cederlane Lab.社製）を用い、二次抗体としては、１：３，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗血清（GE healthcare, Piscataway社製、米国）を用いた。ブロットしたＰＶＤＦ膜に対し、吸引式免疫反応システム（SNAP i.d.、Millipore社製）を用いて免疫検出解析を行った。該免疫検出解析には、血中から精製したｈＴＦ（Ａｐｏ）（アポタンパク質、和光純薬社製）を標準マーカーとして用いた。また、該免疫検出解析におけるｈＴＦバンド（ｈＴＦに特異的なシグナル）は、高感度化学発光（ECL-plus、GE healthcare社製、米国）により可視化し、ＬＡＳ４０００イメージングシステム（富士フィルム社製）で検出した。検出したｈＴＦバンドは、マルチゲージイメージアナライザー（富士フィルム社製）を用いて定量化した。
【００４１】
［ＲＮＡの精製およびノーザンブロット法］
ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen社製）用いて、酵母から全ＲＮＡを単離し、得られたＲＮＡをホルムアルデヒドゲルで電気泳動し、ついでポール・バイオダイン転写膜（ポール社製、米国）にブロットした。プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションは、検出キット（AlkPhos Direct kit、GE healthcare社製、米国）を用いて、Ｃｏｏｐｅｒ等の方法（Nature誌、１９９７年、第３８５巻６６１８号、７４４−７４７頁）により行った。転写物はＣＤＰ−ｓｔａｒ検出試薬（GE healthcare社製、米国）を用いて可視化し、ＬＡＳ４０００イメージングシステムで検出した。
【００４２】
［例１］
＜ｈＴＦ発現ベクターの構築＞
Ｉｓｏａｉ等の方法（Biotechnol. Bioeng.誌、２００２年、８０巻１号、２２−３２頁参照）により、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ発現ベクターを基礎にして、ｈＴＦの分泌発現に用いる染色体組込型のｈＴＦ発現ベクター（マルチカセットベクター、ｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦ−４ＸＬ、図１）を構築した。該ｈＴＦ発現ベクターには、２つのｌｅｕ１＋遺伝子断片の間に、強力なプロモーターであるヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターと、該プロモーターの下流に配置されたｈＴＦ遺伝子とを含むｈＴＦ発現カセットが４つ連続して配置されている。該ｈＴＦ発現ベクターを用いることにより、Ｓ．ポンベの染色体のｌｅｕ１遺伝子座に前記４つのｈＴＦ発現カセットを直接組み込むことができる。
【００４３】
ｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦ−４ＸＬの構築手順は、以下のとおりである。
図１に示すように、ＦＬＡＧエピトープをコードするタグ配列を含むｈＴＦ遺伝子のＯＲＦ（２０９７塩基対）を合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ社（独国）に委託）。なお、前記合成断片におけるコドンは、Ｓ．ポンベの３つの高発現遺伝子（ａｄｈ１遺伝子、ｔｐｉ１遺伝子、ｇｄｐ１遺伝子）から得られる高バイアスのコドン表に照らして変換した。次に、前記合成断片を、ｈＣＭＶプロモーターとヒトリポコルチンＩ（ＬＰＩ）ターミネーターの間に挿入した遺伝子断片を作製し、該遺伝子断片を組込型ベクターｐＸＬ１のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入してベクターｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦを構築した。
次に、ｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦを制限酵素ＰｖｕＩ−ＮｈｅＩにより切断したｈＴＦ発現カセットを含む断片と、ｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦをＰｖｕＩ−ＳｐｅＩにより切断したｈＴＦ発現カセットを含む断片とを連結し、ｈＴＦ発現カセットが２つ連続して配置されたｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦ−２ＸＬを構築した。次に、前記と同様に、ｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦ−２ＸＬの２つのｈＴＦ発現カセットを含むＰｖｕＩ−ＮｈｅＩ断片と、２つのｈＴＦ発現カセットを含むＰｖｕＩ−ＳｐｅＩ断片を連結することにより、染色体組込型のｈＴＦ発現ベクターである、ｈＴＦ発現カセットが４つ連続して配置されたｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦ−４ＸＬを構築した。
前記ｈＴＦ発現ベクターは、ＢｓｉＷＩで直線化して形質転換に用いた。
【００４４】
［例２］  
＜変異型ｈＴＦ（ｍ−ｈＴＦ）発現ベクターの構築＞
糖鎖付加されない変異型トランスフェリン（ｍ−ｈＴＦ）を発現させるために、下記ｍ−ｈＴＦ発現ベクターを作製した。
ｈＴＦ遺伝子から２つのＮ−結合型糖鎖付加部位（Ｎ−Ｋ−Ｓ４４９、Ｎ−Ｖ−Ｔ６４７）を消失させ、かつその５’末端から５７塩基対を欠失させたｍ−ｈＴＦ遺伝子（２０４０塩基対）を合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ社（独国）に委託）。なお、前記ｍ−ｈＴＦ遺伝子のコドンは、前記ｈＴＦ発現ベクターの場合と同様に、Ｓ．ポンベにおける高バイアスのコドンに変換した。次に、ｍ−ｈＴＦ遺伝子を、染色体組込型ベクターｐＳＬ６Ｐ３におけるＰ３分泌シグナル（３４アミノ酸残基）遺伝子の下流にサブクローニングして、染色体組込型のｍ−ｈＴＦ発現ベクターであるｐＴＬ２Ｐ３ｈＴＦ（Ｓ４４９Ａ／Ｔ６４７Ａ）−ＳＬ６を作製した（図２）。
前記ｍ−ｈＴＦ発現ベクターは、ＢｓｉＷＩで直線化して形質転換に用いた。
【００４５】
［例３］  
＜形質転換体の作製＞
Ｏｋａｚａｋｉ等の酢酸リチウムを用いた形質転換法（Nucleic Acids Res.誌、１９９０年、１８巻２２号、６４８５−６４８９頁）により、ＢｓｉＷＩで直線化したｈＴＦ発現ベクター（ｐＴＬ２ＯＳＴＦＮ−ＣＦ−４ＸＬ）を用いて、８つのプロテアーゼ遺伝子に欠失のある変異型Ｓ．ポンベである前記Ａ８株を形質転換し、ｈＴＦ発現カセットをＳ．ポンベのｌｅｕ１遺伝子座に組み込んだ。形質転換体は、３０℃で１時間ＹＥＳ培地により培養した後、ロイシン不含ＭＭＡ培地を用いてスクリーニングした。形質転換体は、さらにＹＥＳ培地により３０℃で２〜３日振盪培養した後、ウエスタンブロット法による解析によってｈＴＦ分泌量を確認し、分泌量が最大の形質転換体（以下、この形質転換体を特に「形質転換体Ａ」という。）を選択した。
また、ｍ−ｈＴＦ発現ベクター（ｐＴＬ２Ｐ３ｈＴＦ（Ｓ４４９Ａ／Ｔ６４７Ａ）−ＳＬ６）を用いて、前記方法と同様にして、分泌量が最大の形質転換体（以下、この形質転換体を特に「形質転換体Ｂ」という。）を選択した。
なお、野生型Ｓ．ポンベ（ＡＲＣ０３９）を用いて同様にしてウエスタンブロット解析を行ったところ、Ａ８株は野生型Ｓ．ポンベに比べてｈＴＦ分泌量が多いことが確認された（データ省略）。これは、Ａ８株では、内在性のプロテアーゼによるタンパク分解活性が低いためであると考えられる。
【００４６】
［例４］  
＜ＣＡＡ添加によるｈＴＦ分泌量への影響＞
例３で得られた形質転換体Ａを、ＹＥＳ培地、ＭＭ培地、２％ＣＡＡを含むＭＭ培地、ＹＰＤ培地、２％ＣＡＡを含むＹＰＤ培地により、それぞれ６０時間培養し、得られた培養液の上澄を遠心分離してウエスタンブロット法により解析した。その結果を図３に示す。
図３は、形質転換体Ａを上記各培地で培養した後の培養液について、前記ウエスタンブロット法を実施し、培地の違いによるｈＴＦ分泌量の違いを解析したＬＡＳ４０００イメージングシステムによる検出写真である。図３のレーン１はｈＴＦ（１００ｎｇ）、レーン２はMagicMarkTM XPである。また、レーン３はＹＥＳ培地、レーン４はＭＭ培地、レーン５は２％ＣＡＡを含むＭＭ培地、レーン６はＹＰＤ培地、レーン７は２％ＣＡＡを含むＹＰＤ培地による培養結果である。
【００４７】
図３に示すように、ＹＥＳ培地による培養（レーン３）では、ＭＭ培地による培養（レーン４）に比べて、ｈＴＦ分泌量が少なかった。
また、ＭＭ培地による培養では、ＣＡＡを添加することにより、ｈＴＦ分泌量が顕著に増加した（レーン４、５）。同様に、ＹＰＤ培地による培養においても、ＣＡＡの添加によりｈＴＦ分泌量が顕著に増加した（レーン６、７）。該結果の原因としては、以下のことが考えられる。すなわち、Ａ８株には約５０個以上のプロテアーゼ遺伝子が残存していると推定されており、これらの残存するプロテアーゼによるタンパク質分解活性をＣＡＡが低下させることで、ｈＴＦ分泌量が増加している可能性が考えられる。
また、ＣＡＡの添加の有無に関わらず、ｈＴＦ分泌量は、ＭＭ培地を用いた場合とＹＰＤ培地を用いた場合とでほぼ同程度であった（レーン４〜７）。ＹＰＤ培地がＭＭ培地に比べて窒素含量が著しく多いことから、該結果はｈＴＦ分泌量が窒素量に依存しないことを示している。ＭＭ培地はＹＰＤ培地に比べて安価であるため、コスト面からＭＭ培地が好ましい。
【００４８】
［例５］  
＜他の添加物のｈＴＦ分泌量への影響＞
分泌経路においては、分泌タンパクの大部分が小胞体とゴルジ体を経由して輸送され、ついでエキソサイトーシスにより細胞外に分泌される。加えて、細胞壁の周囲の細胞膜領域または単細胞生物のペリプラズムは、タンパク分泌において効果的な浸透障壁として機能する。また、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）においては、これまでに質量平均分子量８０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ、デオキシコール酸等）またはノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ）により、α−アミラーゼの分泌量が増加することが報告されている（Lett. Appl. Microbiol.誌、２００３年、３６巻４号、１９１−１９６頁）。そこで、Ｓ．ポンベによるｈＴＦ生産において、界面活性剤等の他の添加物がｈＴＦ分泌量に与える影響について解析した。
【００４９】
培地は、ＭＭ培地を使用した。また、添加剤としては、界面活性剤であるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、質量平均分子量５０００）、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、デオキシコール酸およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と、界面活性剤以外のデキストラン（質量平均分子量５０００）、ＰＥＧ８０００を使用した。ポリエチレングリコールは分裂酵母の形質転換に用いられる合成ポリマーであり、細胞膜の浸透性を向上させると考えられている。
前記添加剤を０．００１％〜０．１％の範囲内でＭＭ培地に添加し、形質転換体Ａを３０℃で６０時間振とう培養した。その後、培養上澄を濃縮し、ｈＴＦ分泌量をウエスタンブロット法による解析で検出した。その結果を図４に示す。
図４は、前記添加剤を添加したＭＭ培地、または無添加のＭＭ培地で形質転換体Ａを培養した後の培養液について、前記ウエスタンブロット法を実施し、添加物の有無および種類によるｈＴＦ分泌量の違いを解析したＬＡＳ４０００イメージングシステムによる検出写真である。図４のレーン１および１１はｈＴＦ（１００ｎｇ）である。また、レーン２は添加剤なし、レーン３は０．０１％ＤＳＳ添加、レーン４は０．００２％ＤＳＳ添加、レーン５は０．０１％デキストラン添加、レーン６は０．００１％Ｔｗｅｅｎ２０添加、レーン７は０．００２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００添加、レーン８は０．０１％デオキシコール酸添加、レーン９は０．００２％デオキシコール酸添加、レーン１０は０．１％ＰＥＧ８０００添加のＭＭ培地による培養結果である。
【００５０】
図４に示すように、無添加のＭＭ培地による培養（レーン２）に比べて、ＤＳＳを添加したＭＭ培地による培養（レーン３、４）ではｈＴＦ分泌量が顕著に増加した。ＤＳＳは弱いポリアニオン性界面活性剤であり、１個のグルコシル残基に対し２〜３個の硫酸基を有する無水グルコースユニットの枝分かれ鎖を有している。一方、ＤＳＳと同じ骨格で硫酸基を有していない、同等の分子量の中性の多糖デキストランを添加した培養（レーン５）では、ｈＴＦ分泌量にはほとんど変化がなかった。この結果は、デキストランの添加量を０．００１％、０．０１％、０．１％と変化させても同様であった（データ省略）。該結果は、ＤＳＳの添加によるｈＴＦ分泌量が増加には、多糖骨格よりもむしろ硫酸基が影響していることを示唆している。
ノニオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０を添加した培養（レーン６）では、ｈＴＦ分泌量が減少した。０．００１％以上の濃度でＴｗｅｅｎ２０を添加すると形質転換体Ａの生育が阻害されるという結果が得られたことから（データ省略）、該生育阻害によりｈＴＦ分泌量が減少したと考えられる。また、ノニオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した培養（レーン７）では、形質転換体Ａの生育への影響はほとんど見られないものの（データ省略）、ｈＴＦ分泌量が増加した。
アニオン性界面活性剤であるデオキシコール酸を添加した培養（レーン８、９）では、ｈＴＦ分泌量が顕著に増加した。一方、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳを０．００１％以上添加した培養では、形質転換体Ａが生育しなかった。
また、ＰＥＧ８０００を０．１％添加した培養（レーン１０）では、ｈＴＦ分泌量が増加した。しかし、１％のＰＥＧ８０００を添加すると、形質転換体の生育が阻害された（データ省略）。
【００５１】
［例６］  
＜ＤＳＳおよびＣＡＡの添加によるｈＴＦ分泌量への影響＞
次に、ＤＳＳの添加がＣＡＡ存在下でｈＴＦ分泌量にどのような影響を与えるかを検討した。
０．０１％ＤＳＳもしくは２％ＣＡＡ、または０．０１％ＤＳＳと２％ＣＡＡの両方を添加したＭＭ培地で形質転換体Ａを６０時間培養し、その培養液の上澄を濃縮してウエスタンブロット法により解析した。その結果を図５に示す。
図５は、ＤＳＳおよび／またはＣＡＡを添加したＭＭ培地、または無添加のＭＭ培地で形質転換体Ａを培養した後の培養液について、前記ウエスタンブロット法を実施し、ＣＡＡ、ＤＳＳの添加によるｈＴＦ分泌量の違いを解析したＬＡＳ４０００イメージングシステムによる検出写真である。図５のレーン２および６はｈＴＦ（１００ｎｇ）である。また、レーン１は無添加、レーン３は０．０１％ＤＳＳ添加、レーン４は２％ＣＡＡ添加、レーン５は０．０１％ＤＳＳと２％ＣＡＡの添加のＭＭ培地による培養結果である。
また、レーン１およびレーン３〜５のｈＴＦ分泌量を定量した結果を図６に示す。図６は、図５の各レーンにおいて検出されたｈＴＦバンドを、マルチゲージイメージアナライザーを用いて定量した結果を示したグラフである。
【００５２】
図５および図６に示すように、無添加のＭＭ培地による培養（レーン１、カラム１）に比べて、ＤＳＳのみを添加した培養（レーン３、カラム２）では、ｈＴＦ分泌量が約３倍に増加した。また、ＣＡＡのみを添加した培養（レーン４、カラム３）では、無添加の培養に比べてｈＴＦ分泌量が約５倍に増加した。そして、ＤＳＳとＣＡＡを両方添加した培養（レーン５、カラム４）では、それらの相乗効果により、無添加の培養に比べてｈＴＦ分泌量が約７倍に増加した。このように、ＣＡＡのみを添加してもｈＴＦ分泌量が増加するが、ＤＳＳとＣＡＡを両方添加するとｈＴＦ分泌量がさらに増加することが確認された。
【００５３】
［例７］  
＜ＤＳＳおよびＣＡＡの添加による形質転換体の生育への影響＞
次に、ＤＳＳ、ＣＡＡの添加が形質転換体の生育に与える影響について検討した。
０．０１％ＤＳＳもしくは２％ＣＡＡ、または０．０１％ＤＳＳと２％ＣＡＡの両方を添加したＭＭ培地で形質転換体Ａを１２６時間培養し、細胞量（形質転換体量）の経時変化を６１０ｎｍの濁度（ＯＤ６１０）を測定することにより観察した。その結果を図７に示す。
図７において、●が添加剤を添加していないＭＭ培地による培養の結果であり、○が０．０１％ＤＳＳを添加したＭＭ培地による培養の結果であり、×が２％ＣＡＡを添加したＭＭ培地による培養の結果であり、■が０．０１％ＤＳＳと２％ＣＡＡの両方を添加したＭＭ培地による培養の結果である。
【００５４】
図７に示すように、ＤＳＳ、ＣＡＡの添加の有無にかかわらず、最終的な細胞量は同程度であった。該結果は、ＤＳＳおよびＣＡＡが形質転換体の生育において栄養として使われているわけではないことを示唆している。また、ＤＳＳのみを添加した培養では、培養の初期段階（２４−６０時間）では添加による効果はほとんどないが、ＣＡＡを添加した培養では初期段階でわずかに生育速度が低下した。該生育速度の低下は、ＣＡＡを添加することでｈＴＦが過剰に発現し、その過剰量のｈＴＦが形質転換体の生育に不利に働いたためであると考えられる。
これらの結果は、質量平均分子量５００，０００のＤＳＳを用いた場合でも同様であった（データ省略）。また、透析後のＤＳＳでも同様の効果が得られた（データ省略）。
【００５５】
［例８］  
＜ｈＴＦ遺伝子発現のノーザンブロット解析＞
ＣＡＡおよびＤＳＳの添加によるｈＴＦ分泌量の増加の要因を調べるため、ＣＡＡおよびＤＳＳがｈＴＦのｍＲＮＡ転写量に与える影響について検討した。
０．０１％ＤＳＳもしくは２％ＣＡＡ、または０．０１％ＤＳＳと２％ＣＡＡの両方を添加したＭＭ培地で、形質転換体Ａを３０℃で１６時間、および４８時間培養し、形質転換体Ａを遠心分離により回収し、ノーザンブロット法により解析した。ノーザンブロットのプローブとしては、ｈＴＦ遺伝子のＯＲＦにおける約５００塩基対のＤＮＡ断片を用いた。結果を図８に示す。
図８は、ＣＡＡおよび／またはＤＳＳを添加したＭＭ培地、または無添加のＭＭ培地で形質転換体Ａを培養した後の培養液について、前記ノーザンブロット法を実施し、添加物の有無および種類によるｍＲＮＡ転写量の違いを解析したＬＡＳ４０００イメージングシステムによる検出写真である。レーン１が無添加、レーン２が０．０１％ＤＳＳ添加、レーン３が２％ＣＡＡ添加、レーン４が０．０１％ＤＳＳおよび２％ＣＡＡ添加のＭＭ培地による培養結果である。また、図８においては、上側がｍＲＮＡの結果であり、下側がｒＲＮＡの結果である。
【００５６】
図８に示すように、１６時間の培養でも４８時間の培養でも、ＤＳＳ、ＣＡＡを添加した培養（レーン２〜４）におけるｍＲＮＡの転写量は、無添加の培養（レーン１）における転写量と同程度であった。このように、ＤＳＳ、ＣＡＡの添加は、ｍＲＮＡの転写量には影響を及ぼさなかった。
【００５７】
［例９］  
＜グリコシル化の有無のｈＴＦ分泌量への影響＞
ｈＴＦは２つのＮ−結合型グリコシル化部位を４３２位と６２９位に有しており、該Ｎ−グリコシル化部位のモチーフ配列はＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒで共通している。Ｓ．セレビシエ、Ｐ．パストリスでは、グリコシル化されていない変異型ｈＴＦを発現させることが報告されており、ｈＴＦ分泌量がｈＴＦのグリコシル化の有無に影響を受ける可能性が考えられる。また、Ｓ．ポンベにおいて、Ｎ−結合型オリゴサッカライドは、核となる骨格構造と、ガラクトマンナンからなる大きな外部鎖とからなる。そのため、この巨大な炭水化物構造が、ＤＳＳの添加によりｈＴＦ分泌量を増加させることに起因している可能性が考えられる。そこで、グリコシル化されていないｍ−ｈＴＦの分泌量が、ＤＳＳ、ＣＡＡの添加によって、どのような影響を受けるかを検討した。
【００５８】
０．０１％ＤＳＳもしくは２％ＣＡＡ、または０．０１％ＤＳＳと２％ＣＡＡの両方を添加したＭＭ培地で、例３で得られた形質転換体Ｂを６０時間培養し、その培養液の上澄を濃縮してウエスタンブロット法により解析した。その結果を図９に示す。
図９は、ＤＳＳおよび／またはＣＡＡを添加したＭＭ培地、または無添加のＭＭ培地で形質転換体Ｂを培養した後の培養液について、前記ウエスタンブロット法を実施し、ＣＡＡ、ＤＳＳの添加によるｈＴＦ分泌量の違いを解析したＬＡＳ４０００イメージングシステムによる検出写真である。レーン１は無添加、レーン２は０．０１％ＤＳＳ添加、レーン３は２％ＣＡＡ添加、レーン４は０．０１％ＤＳＳおよび２％ＣＡＡ添加のＭＭ培地による培養結果である。
また、レーン１〜４のｈＴＦ分泌量を定量した結果を図１０に示す。図１０は、図９の各レーンにおいて検出されたｈＴＦバンドを、マルチゲージイメージアナライザーを用いて定量した結果を示したグラフである。
【００５９】
図９および図１０に示すように、ＤＳＳのみを添加した培養（レーン２、カラム２）は、無添加のＭＭ培地による培養（レーン１、カラム１）に比べて、ｍ−ｈＴＦ分泌量が約３倍に増加した。また、ＣＡＡのみを添加した培養（レーン３、カラム３）では、無添加のＭＭ培地による培養に比べてｍ−ｈＴＦ分泌量が約４倍に増加した。さらに、ＤＳＳとＣＡＡを両方添加した培養（レーン４、カラム４）では、無添加のＭＭ培地による培養に比べてｍ−ｈＴＦ分泌量が約６倍に増加した。このように、ＤＳＳ、ＣＡＡの添加によるｍ−ｈＴＦ分泌量の増加割合は、例６の形質転換体ＡのｈＴＦ分泌量の結果と比較すると若干小さいものとなった。しかし、これは培養上澄中において、ｍ−ｈＴＦがｈＴＦよりもプロテアーゼによるタンパク分解に対する安定性が低いためであると考えられる。
該結果から、ＤＳＳ、ＣＡＡの添加によるｈＴＦ分泌量の増加は、ｈＴＦのグリコシル化には依存していないことがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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