(57)【要約】【課題】強いサイトカイン産生能および細胞障害活性を有するとともに、γδＴ細胞の増殖を促進することができるヒトリンパ球およびその製造方法並びに上記ヒトリンパ球を用いたγδＴ細胞の増殖方法を提供する。【解決手段】本発明にかかるヒトリンパ球は、少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって刺激されてなるヒトリンパ球であって、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、上記発現強度はフローサイトメトリーによって測定したものである。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって刺激されてなるヒトリンパ球であって、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、上記発現強度はフローサイトメトリーによって測定したものであることを特徴とするヒトリンパ球。
【請求項２】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ２５の発現強度が１０２以上であることを特徴とする請求項１に記載のヒトリンパ球。
【請求項３】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＨＬＡ−ＤＲの発現強度が１０２以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のヒトリンパ球。
【請求項４】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ８６の発現強度が１０２以上であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のヒトリンパ球。
【請求項５】
上記ヒトリンパ球は、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球の数が、全細胞数の１０％未満であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のヒトリンパ球。
【請求項６】
ヒトリンパ球の製造方法であって、上記ヒトリンパ球は請求項１から５のいずれか１項に記載のヒトリンパ球であり、
少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって、ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトリンパ球を刺激する工程を含むことを特徴とする、ヒトリンパ球の製造方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか１項に記載のヒトリンパ球と、γδＴ細胞とを、インターロイキン２、インターロイキン１８およびリン酸化合物を用いて刺激する工程を含むことを特徴とする、γδＴ細胞の増殖方法。
【請求項８】
上記ヒトリンパ球がケモカインを分泌しており、γδＴ細胞がケモカインレセプターを発現していることを特徴とする、請求項７に記載のγδＴ細胞の増殖方法。
【請求項９】
上記リン酸化合物は、ゾレドロネートであることを特徴とする、請求項７または８に記載のγδＴ細胞の増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ヒトリンパ球およびその製造方法並びにγδＴ細胞の増殖方法に関する。特に、特定の表面抗原を備え、強いサイトカイン産生能および細胞障害活性を有するとともに、γδＴ細胞の増殖に関与する能力を持つヒトリンパ球およびその製造方法並びに上記ヒトリンパ球を用いたγδＴ細胞の増殖方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
γδＴ細胞は、メモリータイプのリンパ球であり、感染や腫瘍に対する生体防御において重要な役割を担っている。ヒト末梢血中では、その数は少なく、通常の末梢Ｔリンパ球のうち１〜５％を占めるに過ぎない。γδＴ細胞の大部分はＶγ９Ｖδ２型で、ペプチドよりもリン酸抗原などに強く反応して活性化され、増殖する。
【０００３】
ヒト末梢血リンパ球からγδＴ細胞を増殖させるには、インターロイキン２（ＩＬ−２。以下、インターロイキンを「ＩＬ」と称する）の存在下でビスホスホネートや、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）誘導体でヒト末梢血リンパ球を刺激するという方法が用いられる。このようにして活性化され、増殖したγδＴ細胞は、強い抗腫瘍活性をもつことから、癌治療への応用が試みられており、実際、肺転移した癌に対して用いたところ、完全寛解したという報告もある（非特許文献１）。一方、本発明者は、ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を用いてＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を刺激すると、その増殖が著しく高められることを見出している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４２８１０７１号公報（２００９年６月１７日発行）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】kobayashi H et al., Anticancer Res. 30, 575-580, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に記載の発明においては、ＩＬ−１８がγδＴ細胞の増殖を促進する機序についてはまだ明らかになっていなかった。
【０００７】
本発明者が上記機序の解明を試みていたところ、ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を用いてヒト末梢血単核球（以下、「ＰＢＭＣｓ」と称する）を刺激すると、γδＴ細胞の増殖が促進され、細胞全体の主要部を占めるようになる一方、非Ｔ細胞の増殖も促進されることが見出された。そこで、上記非Ｔ細胞の構造および機能について鋭意検討したところ、フローサイトメトリーで測定したＣＤ５６およびＣＤ１１ｃの発現強度が所定の範囲にあり、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）および樹状細胞の性質を併せ持つ細胞であることが分かった。また、上記非Ｔ細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を用いてヒトリンパ球を刺激することによって増殖し、高いサイトカイン産生能および細胞障害活性を有し、γδＴ細胞の増殖に深く関与していることが見出された。
【０００８】
以上のことから、本発明は、ＣＤ５６およびＣＤ１１ｃの発現強度が所定の範囲にあり、強いサイトカイン産生能および細胞障害活性を有するとともに、γδＴ細胞の増殖を促進することができるヒトリンパ球およびその製造方法並びに上記ヒトリンパ球を用いたγδＴ細胞の増殖方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明にかかるヒトリンパ球は、少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって刺激されてなるヒトリンパ球であって、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、上記発現強度はフローサイトメトリーによって測定したものであることを特徴としている。
【００１０】
後述する実施例２に示すように、ＣＤ５６の発現強度が１０１〜１０３であり、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０３であるヒトリンパ球を含まないヒトリンパ球（ＣＤ５６陽性かつＣＤ１１ｃ陰性のヒトリンパ球。図６の（ｈ）（ｉ）を参照。）、および、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０３であり、ＣＤ５６の発現強度が１０１〜１０３であるヒトリンパ球を含まないヒトリンパ球（ＣＤ５６陰性かつＣＤ１１ｃ陽性のヒトリンパ球。図６の（ｅ）（ｆ）を参照。）は、γδＴ細胞の増殖を促進することができなかった。また、ＣＤ５６陽性かつＣＤ１１ｃ陽性のヒトリンパ球であっても、ＣＤ５６の発現強度が低い場合は、γδＴ細胞の増殖を促進することができず、サイトカイン産生能および細胞障害活性も不十分であった。
【００１１】
また、後述のように、ＩＬ−２のみによって刺激されたヒトリンパ球は、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であっても、γδＴ細胞の増殖を促進することができず、サイトカイン産生能および細胞障害活性も不十分であった。
【００１２】
上記構成によれば、少なくともＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激されたヒトリンパ球であって、ＣＤ５６およびＣＤ１１ｃの発現強度が最適であるため、γδＴ細胞の増殖を促進することができ、しかも高いサイトカイン産生能および細胞障害活性を示すことができるものと推測される。
【００１３】
本発明にかかるヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ２５の発現強度が１０２以上であることが好ましい。
【００１４】
また、本発明にかかるヒトリンパ球の８０％以上は、ＨＬＡ−ＤＲの発現強度が１０２以上であることが好ましい。
【００１５】
さらに、本発明にかかるヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ８６の発現強度が１０２以上であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明にかかるヒトリンパ球は、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球の数が、全細胞数の１０％未満であることが好ましい。
【００１７】
後述するように、本発明にかかるヒトリンパ球は、リンパ球でありながらアクセサリー機能を有するが、それは、このような表面抗原を所定量発現していることによるものと推測される。
【００１８】
本発明にかかるヒトリンパ球を生産する方法は、少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって、ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトリンパ球を刺激する工程を含むことを特徴としている。
【００１９】
本発明者は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を用いてヒト末梢血単核球を刺激すると、増殖される細胞の多くがγδＴ細胞となるが、それ以外に、ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトリンパ球が刺激されることにより、本発明にかかるヒトリンパ球が増殖することを見出した。ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって本発明にかかるヒトリンパ球が増殖されるメカニズムは必ずしも明らかではないが、上記ヒトリンパ球は後述のように、γδＴ細胞を増殖させる効果を持ち、優れたサイトカイン産生能および細胞障害活性を有するため、上記方法は、非常に有用であるといえる。
【００２０】
本発明にかかるγδＴ細胞の増殖方法は、本発明にかかるヒトリンパ球と、γδＴ細胞とを、インターロイキン２、インターロイキン１８およびリン酸化合物を用いて刺激する工程を含むことを特徴としている。
【００２１】
また、本発明にかかるγδＴ細胞の増殖方法では、上記ヒトリンパ球がケモカインを分泌しており、γδＴ細胞がケモカインレセプターを発現していることが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明にかかるγδＴ細胞の増殖方法では、上記リン酸化合物は、ゾレドロネートであることが好ましい。
【００２３】
後述するように、本発明にかかるヒトリンパ球は、γδＴ細胞を誘引してγδＴ細胞と接触し、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびリン酸化合物の刺激を受けると、γδＴ細胞と共に細胞クラスターを形成し、γδＴ細胞の増殖を促進する。よって、本発明にかかるヒトリンパ球はγδＴ細胞の増殖に必須の成分であり、非常に重要な役割を果たすことができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明にかかるヒトリンパ球は、少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって刺激されてなるヒトリンパ球であって、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、上記発現強度はフローサイトメトリーによって測定したものであるという構成であり、γδＴ細胞の増殖を促進することができ、しかも高いサイトカイン産生能および細胞障害活性を示すことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】γδＴ細胞の増殖に対するＩＬ−１８の効果を示す図である。
【図２】刺激後のＰＢＭＣｓの写真である。
【図３】ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートの刺激によるγδＴ細胞の増殖の様子を示す図である。
【図４】刺激後０日目および１４日目における、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３、およびＣＤ５６の発現を解析した結果を示す図である。
【図５】ＣＤ５６の発現強度が１０２以上であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０２であり、ＣＤ３陰性であるヒトリンパ球の細胞数が、γδＴ細胞の細胞数と並行して増加することを示す図である。
【図６】ＣＤ５６の発現強度が１０１〜１０３であるヒトリンパ球、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０３であるヒトリンパ球、またはＣＤ１４の発現強度が１０２以上であるヒトリンパ球を除去したＰＢＭＣｓを、ＩＬ−２およびゾレドロネート、または、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８で刺激した場合の、本発明にかかるヒトリンパ球の増殖およびγδＴ細胞の増殖の様子を示すものである。
【図７】ＣＤ３の発現強度が１０２．３を超える細胞を除去したＰＢＭＣｓ（ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ）を、ＩＬ−２およびゾレドロネート、または、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８の存在下で培養した場合における本発明にかかるヒトリンパ球の増殖を示すものである。
【図８】種々のサイトカイン、またはサイトカインおよびゾレドロネートの存在下で、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓを培養し、刺激前、培養５日目、培養８日目における生細胞数を測定した結果を示すものである。
【図９】ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓを、ＩＬ−２，ＩＬ−２およびＩＬ−１８、または、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって刺激し、本発明にかかるヒトリンパ球の増殖について検討した結果を示すものである。
【図１０】ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓにおけるＣＤ１４の発現が培養前後で変化する様子を示すものである。
【図１１】樹状細胞の誘導のために一般的に用いられるＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦが本発明にかかるヒトリンパ球の増殖を促進できるか否かを検討した結果を示すものである。
【図１２】ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓをＩＬ−２、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１８で１０日間刺激し、表面分子の発現の変化について検討した結果を示すものである。
【図１３】ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓを刺激して得られた培養上清中に産生されたサイトカインおよびケモカインと、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養したＰＢＭＣｓの細胞障害活性とを示す図である。
【図１４】γδＴ細胞上の共刺激分子の発現を示すものである。
【図１５】本発明にかかるヒトリンパ球がγδＴ細胞の移動を誘導する能力について検討した結果を示す図である。
【図１６】本発明にかかるヒトリンパ球とγδＴ細胞とがクラスターを形成する様子を示すものである。
【図１７】γδＴ細胞の増殖に対する、本発明にかかるヒトリンパ球の効果について検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本明細書において、「Ａ〜Ｂ」なる記載は、Ａ以上Ｂ以下であることを意味する。
【００２７】
（１．本発明にかかるヒトリンパ球）
本発明にかかるヒトリンパ球は、少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって刺激されてなるヒトリンパ球であって、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、上記発現強度はフローサイトメトリーによって測定したものである。
【００２８】
「少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって刺激されてなるヒトリンパ球」とは、少なくともＩＬ−２およびＩＬ−１８と接触したヒトリンパ球であることを意味する。刺激の対象となるヒトリンパ球は特に限定されるものではないが、サイトカイン等による刺激を未だ受けていないヒトリンパ球であることが好ましく、ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるリンパ球であることが好ましい。また、刺激の対象となるヒトリンパ球は、４０歳以下のヒトから得たものであることが好ましい。
【００２９】
刺激の方法としては、例えば次項で説明する方法を用いることができる。上記刺激は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８のみによって行えば十分である。ただし、これに限定されるものではなく、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１８に加えてゾレドロネート等の刺激剤を用いてもよい。しかし、ＩＬ−２のみ、ＩＬ−１８のみ、あるいはゾレドロネートのみをヒトリンパ球に接触させても、本発明にかかるリンパ球を得ることはできない。
【００３０】
本発明にかかるヒトリンパ球は、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、上記発現強度はフローサイトメトリーによって測定したものである。また、ＣＤ３の発現強度は１００以上１０２．３以下（ＣＤ３陰性）である。本明細書においてフローサイトメトリーの条件は一定であり、Becton-Dickinson immunocytometry systems, 1995.に記載されている条件に従って行った。なお、本明細書において、表面抗原の発現強度は、全てフローサイトメトリーによって測定した発現強度を意味する。
【００３１】
本発明にかかるヒトリンパ球は、後述する実施例に示すように、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの高い産生能、Ｋ５６２細胞に対する高い細胞障害活性、並びにγδＴ細胞の増殖促進能を有している。本発明にかかるヒトリンパ球は、このような特性を有するとともに、ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と称する）に特徴的な表面抗原であるＣＤ５６および樹状細胞に特徴的な表面抗原であるＣＤ１１ｃを強く発現している。よって本発明にかかるヒトリンパ球は、ＮＫ細胞および樹状細胞の両方の性質を持つ細胞であると考えられる。
【００３２】
本発明にかかるヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ２５の発現強度が１０２以上であることが好ましい。また、本発明にかかるヒトリンパ球の８０％以上は、ＨＬＡ−ＤＲの発現強度が１０２以上であることが好ましい。さらに、本発明にかかるヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ８６の発現強度が１０２以上であることが好ましい。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６は樹状細胞において特徴的に発現する表面抗原である。また、本発明にかかるヒトリンパ球は、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球の数が、全細胞数の１０％未満であることが好ましい。これらの割合は、ヒストグラムから表面抗原を発現している細胞をゲートすることによって自動的に算出することができる。
【００３３】
ＣＤ２５の発現強度が１０２以上であるヒトリンパ球の細胞数が本発明にかかるヒトリンパ球の細胞数に占める割合は、８５％以上であることがより好ましい。ＨＬＡ−ＤＲの発現強度が１０２以上であるヒトリンパ球の細胞数が本発明にかかるヒトリンパ球の細胞数に占める割合は、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましい。上記割合は多くても特に問題はないため、上限は特に規定されず、１００％であってもよい。本発明にかかるヒトリンパ球は、後述する実施例に示すように、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６の発現量が、刺激を受けていないヒトリンパ球や、ＩＬ−２のみによって刺激されたヒトリンパ球よりも非常に多い。
【００３４】
また、本発明にかかるヒトリンパ球においては、ＮＫＧ２Ｄの発現強度が１０１以上であるヒトリンパ球の細胞数が８０％以上であることが好ましい。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞において特徴的に発現する表面抗原である。
【００３５】
本発明にかかるヒトリンパ球は、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球の細胞数が、全細胞数の１０％未満であることが好ましい。本発明にかかるヒトリンパ球は、後述する実施例に示すように、ＣＤ１２２の発現量が、刺激を受けていないヒトリンパ球や、ＩＬ−２のみによって刺激されたヒトリンパ球よりも非常に少ない。
【００３６】
本発明にかかるヒトリンパ球は、少なくともＩＬ−２およびＩＬ−１８により刺激されたリンパ球であるが、後述する実施例に示すように、ＩＬ−２のみにより刺激されたリンパ球は、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であっても、本発明にかかるヒトリンパ球のようなサイトカイン産生能、細胞障害活性、γδＴ細胞の増殖促進能を示さなかった。
【００３７】
本発明にかかるヒトリンパ球が優れたサイトカイン産生能、細胞障害活性およびγδＴ細胞の増殖促進能を示すようになる理由は必ずしも明らかではないが、ＩＬ−１８は細胞死を抑制し、細胞生存を高める性質を有することが関係していると推測される。
【００３８】
また、後述する実施例に示すように、刺激を受けていないヒトリンパ球や、ＩＬ−２のみで刺激して得られた、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトリンパ球では、該ヒトリンパ球の８０％以上においてＣＤ２５の発現強度が１０２以上であること、該ヒトリンパ球の８０％以上においてＨＬＡ−ＤＲの発現強度が１０２以上であること、該ヒトリンパ球の８０％以上においてＣＤ８６の発現強度が１０２以上であること、該ヒトリンパ球において、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球の数が全細胞数の１０％未満であること、のいずれも満たされていなかった。つまり、これらの表面抗原の発現量が、本発明にかかるヒトリンパ球とは著しく異なっていた。このような、表面抗原の発現量の違いも、本発明にかかるヒトリンパ球が優れた特性を備えることに寄与していると推測される。
【００３９】
（２．本発明にかかるヒトリンパ球の製造方法）
本発明にかかるヒトリンパ球の製造方法は、少なくともインターロイキン２およびインターロイキン１８によって、ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり（つまり、ＣＤ３の発現が陰性であり）、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトリンパ球（以下、被刺激リンパ球とも称する）を刺激する工程を含む方法である。
【００４０】
上記被刺激リンパ球は、ヒトリンパ球中に含まれている。刺激は、例えばマグネットビーズを用いる純化等の方法によって予めヒトリンパ球から分離した上記被刺激リンパ球に対して行ってもよく、上記分離を行わず、例えばヒト血液、ヒトリンパ液またはＰＢＭＣｓなどを刺激し、刺激後に例えばマグネットビーズを用いる純化等の方法によって本発明にかかるヒトリンパ球を上記ヒト血液等から分離してもよい。
【００４１】
上記刺激は、少なくともＩＬ−２およびＩＬ−１８を上記被刺激リンパ球に接触させることによって行うことができる。刺激はＩＬ−２およびＩＬ−１８のみによって行ってもよいし、ＩＬ−２およびＩＬ−１８に加えて、例えばゾレドロネート等を刺激剤として用いてもよい。また、例えばＩＬ−１５のような他の補助因子を添加してもよい。接触させるための方法は特に限定されるものではなく、例えば、ヒトＡＢ型血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地などの従来公知の培地に、上記被刺激リンパ球、ヒト血液、ヒトリンパ液またはＰＢＭＣｓなどを添加し、さらにＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加して、ＣＯ２インキュベーターなどの従来公知の培養装置中で培養することによって、上記接触を行うことができる。
【００４２】
上記被刺激細胞の細胞数に対するＩＬ−２の使用量およびＩＬ−１８の使用量は、特に限定されるものではないが、例えば、上記被刺激細胞の濃度が２．５×１０５個／ｍｌ〜１×１０６個／ｍｌである培地に、ＩＬ−２を最終濃度が５〜１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１８を最終濃度が５０〜１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加することが好ましい。
【００４３】
培養温度、培養時間は特に限定されるものではないが、通常、摂氏３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養し、３−５日おきに新鮮な培地とＩＬ−２およびＩＬ−１８とを追加しながら１０−１４日間培養することが好ましい。
【００４４】
本発明にかかるヒトリンパ球は、刺激後の上記被刺激細胞をフローサイトメトリーによって解析し、ＣＤ５６およびＣＤ１１ｃの発現強度を測定することによって本発明にかかるヒトリンパ球を特定し、マグネットビーズを用いる純化のような方法によって、刺激後の上記被刺激細胞から分離することができる。
【００４５】
（３．γδＴ細胞の増殖方法）
本発明にかかるγδＴ細胞の増殖方法は、本発明にかかるヒトリンパ球と、γδＴ細胞とをインターロイキン２、インターロイキン１８およびリン酸化合物を用いて刺激する工程を含む方法である。
【００４６】
後述する実施例に示すように、本発明にかかるヒトリンパ球は、ケモカインであるＣＣＬ−２１を分泌することができ、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートを用いてＰＢＭＣｓを刺激して得られたγδＴ細胞は、ＣＣＬ−２１のレセプターであるＣＣＲ５およびＣＣＲ７を発現する。また、本発明にかかるヒトリンパ球から産生されるケモカインによって、γδＴ細胞が誘引され、本発明にかかるヒトリンパ球の共刺激分子と、γδＴ細胞のリガンドとが結合するので、本発明にかかるヒトリンパ球と、γδＴ細胞とを、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートを用いて刺激することによって、γδＴ細胞を著しく増殖させることができる。
【００４７】
上述のように、また、実施例に示すように、本発明にかかるヒトリンパ球の生産には、ＩＬ−２およびＩＬ−１８のみが必須であり、ゾレドロネートは必須ではない。一方、γδＴ細胞を増殖させる場合は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の他に、ゾレドロネートも必要となる。特許文献１の実施例には、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートによってＰＢＭＣｓを刺激することによってＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることができたことが開示されている。ここでは本発明にかかるリンパ球の存在および役割は明らかではなかったが、今回、ＩＬ−２およびＩＬ−１８による刺激によって増殖した本発明にかかるヒトリンパ球が、γδＴ細胞を誘引し、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびリン酸化合物の存在下でγδＴ細胞とクラスターを形成し、γδＴ細胞を著しく増殖させることが明らかとなった。
【００４８】
上記方法において用いられる、本発明にかかるヒトリンパ球およびγδＴ細胞の使用量、インターロイキン２、インターロイキン１８およびリン酸化合物の使用量は特に限定されるものではない。例えば、本発明にかかるヒトリンパ球の濃度が２．５×１０５個／ｍｌ〜１×１０６個／ｍｌであり、γδＴ細胞の濃度が２．５×１０５個／ｍｌ〜１×１０６個／ｍｌである培地に、ＩＬ−２を最終濃度が５〜１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１８を最終濃度が５０〜１００ｎｇ／ｍｌ、リン酸化合物を最終濃度が０．１〜５．０μＭとなるように添加することが好ましい。
【００４９】
上記リン酸化合物としては、ゾレドロネート、２−エチル−３−ブテニルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸などを用いることができ、ゾレドロネートであることが好ましい。また、上記リン酸化合物と反応するγδＴ細胞はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞であるが、γδＴ細胞からＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のみを分離して刺激する必要はないため、刺激対象としてはγδＴ細胞を用いれば十分である。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のみを刺激対象としてもよい。
【００５０】
培養温度、培養時間は特に限定されるものではないが、本発明にかかるヒトリンパ球、γδＴ細胞、通常、摂氏３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養し、３−５日おきに新鮮な培地とＩＬ−２、ＩＬ−１８およびリン酸化合物とを追加しながら１０−１４日間培養することが好ましい。
【００５１】
γδＴ細胞の増殖は、例えば本発明にかかるヒトリンパ球とのクラスターの形成を顕微鏡等によって観察すること等によって確認することができる。また、抗γδＴ細胞レセプター抗体や抗Ｖγδ２Ｔ抗体等を結合させたマグネティックビーズを用いる方法等によって、必要に応じて上記クラスターからγδＴ細胞を分離することができる。
【実施例】
【００５２】
（１．実験方法）
以下の実施例において用いた試薬類および実験方法は下記のとおりである。
【００５３】
＜試薬類＞
組換えヒトＩＬ−１８は、Glaxo-SmithKline社製、ＩＬ−２はR＆D Systems社製、ゾレドロネートはNovartis Pharma社製のものを用いた。
【００５４】
２−エチル−３−ブテニルピロリン酸（以下、２Ｍ３ＢＰＰと称する。２Ｍ３ＢＰＰはイソペンテニルピロリン酸のアナログである。）は、trichloroacetonitrile (Wako Pure Chemicals Co., Ltd. Osaka)の存在下で2-methyl-3-buten-1-ol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.) とditriethylammonium phosphate (Nacalai Tesque, Osaka, Japan)とを反応させることにより、化学合成した。
【００５５】
中和抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗ＩＬ−１８Ｒα、α鎖クローン：70625.1111）および、ビオチニル化した抗ＩＬ−１８Ｒα抗体およびビオチニル化した抗ＩＬ−１８Ｒβ抗体は、Ｒ＆Ｄシステム Inc.（ミネアポリス、ＭＮ）から購入した。
【００５６】
ヒトＡＢ血清は、ＧｅｍＣｅｌｌ（登録商標、ＵＳ Gemini, バイオプロダクツ）から購入した。ＣＤ３（クローン：ＨＩＴ３ａ）、γδ−Ｔ細胞レセプター（Ｃａｔ：５５５７１６）、Ｖδ２（Ｃａｔ：５５５７３８）、ＣＤ１１ａ（クローン：Ｈ１１１）、ＣＤ１８（クローン：ＴＳ１／１８）、ＣＤ１１ｃ（クローン：３．９）、ＣＤ２５（クローン：ＭＥＭ−１８１）、ＣＤ２８（クローン：ＣＤ２８．２）、ＣＤ５６（クローン：ＭＥＭ−１８８）、ＣＤ４０（クローン：ＨＢ１４）、ＣＤ４０Ｌ（クローン：２４−３１）、ＣＤ５４（クローン：ＭＥＭ−１１１）、ＣＣＲ５（ＣＤ１９５，クローン：Ｔ２１／８）、ＣＣＲ７（ＣＤ１９７，クローン３Ｄ１２）、ＣＤ８０（クローン：２Ｄ１０）、ＣＤ８３（クローン：ＨＢ１５ｅ）、ＣＤ８６（クローン：ＩＴ２．２）、ＣＤ１２２（Ｃａｔ：５５４５２２）およびＨＬＡ−ＤＲ（クローン：Ｌ２４３）に対する標識抗体は、すべてBD PharMingen（サンホセ、ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。
【００５７】
ＮＫＧ２Ｄ−ＡＰＣはIOTest Beckman Coulter Company（フランス、マルセイユ）より購入した。
【００５８】
＜細胞の調製および培養＞
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）は、健康なドナー（２５歳〜４０歳）の血液から、室温（摂氏２５℃）で、スイングローターＴＳ−７（トミー精工）を用い、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法によって分離した。ＰＢＭＣｓは、ストレプトマイシン、ペニシリン、グルタミン酸、および５％ＡＢ血清を添加したＡｌｙＳ５０５Ｎ−Ｏ培地（Iscov MEMをベースにした無血清培地。（株）細胞科学研究所製）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【００５９】
ＣＤ３を発現しているヒトリンパ球、ＣＤ５６を発現しているヒトリンパ球、ＣＤ１１ｃを発現しているヒトリンパ球、またはＣＤ１４を発現しているヒトリンパ球のＰＢＭＣｓからの除去は、ＣＤ３に対する抗体、ＣＤ５６に対する抗体、ＣＤ１１ｃに対する抗体またはＣＤ１４に対する抗体を結合させたマイクロビーズ（Miltenyi Biotec Inc. Auburn, CA95603, USA）を充填したＬＤカラムを用いて行った。生細胞はトリパンブルー色素排除試験によって解析し、細胞の組成はフローサイトメトリーによって解析した。
【００６０】
＜フローサイトメトリー＞
ＣＤ３、γδ−Ｔ細胞レセプター、Ｖδ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＬ−１８Ｒα、ＩＬ−１８Ｒβのそれぞれに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、細胞を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーター（使用装置： BECTON DICKINSON, FACS Calibur）を用いて解析した。データはCell Questソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス製）を用いて解析した。
【００６１】
＜ＤＥＬＦＩＡ法による細胞障害活性の測定＞
細胞障害活性は、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞障害活性試薬（登録商標、PerkinElmer製）を用いて測定した。該試薬は、蛍光を増強するリガンドであるＢＡＴＤＡを加水分解させ、親水性リガンドであるＴＤＡを細胞内部に形成させる試薬である。ターゲット細胞としては、ＮＫ細胞のターゲット細胞として知られるＫ５６２細胞を用いた。Ｋ５６２細胞は、フェノールレッドを含有せず、２％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、１×１０４cells/wellとなるように９６穴プレートに播種した。エフェクター細胞は、後述する実施例３で用いた「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」２．５×１０５個／ｍｌ〜１×１０６個／ｍｌを、ＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）によって刺激することによって誘導した。エフェクター細胞は、エフェクター細胞の細胞数とターゲット細胞の細胞数との割合が３：１、１０：１、または３０：１となるように培養系に添加し、さらに３時間培養した。
【００６２】
培養上清を回収し、ＤＥＬＦＩＡ  ユーロピウム溶液と混合した。ユーロピウムと親水性リガンド（ＴＤＡ）とは、上清中で、強い蛍光を発し、安定なキレート（ＥｕＴＤＡ）を形成し、ＥｕＴＤＡは蛍光シグナルを測定することによって定量した。特異的な細胞障害活性を、以下の式１に従って求めた。
【００６３】
特異的な細胞障害活性（％）＝（サンプルの蛍光強度−自発的に発せられる蛍光の強度）／（蛍光強度の最高値−自発的に発せられる蛍光の強度）×１００％・・・（１）
＜サイトカインのアッセイ＞
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＣＣＬ２１は、ＥＬＩＳＡ法を用いてアッセイした（使用装置：BioLegend製ELISAキット）。
【００６４】
＜統計分析＞
データは、平均値±標準偏差で表し、スチューデントのＴ検定またはボンフェローニの多重比較を用いて解析した。ｐ＜０．０５で有意差ありとした。
【００６５】
〔実施例１〕
＜ＰＢＭＣｓ中のγδＴ細胞の増殖および本発明にかかるヒトリンパ球の増殖に対するＩＬ−１８の効果＞
５％のヒトＡＢ型血清を含有するＰＲＭＩ１６４０培地にゾレドロネートまたはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を最終濃度１μＭとなるように加え、ＩＬ-２（最終濃度５ｎｇ/ｍｌ）、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１８（ＩＬ−２の最終濃度５ｎｇ/ｍｌ、ＩＬ−１８の最終濃度５０ｎｇ/ｍｌ）を添加した培養液に、健康なドナーから調製したＰＢＭＣｓを２．５×１０５〜１×１０６個／ｍｌとなるようにサスペンドした。図３の（ａ）に示すように、γδＴ細胞は上記ＰＢＭＣｓ中に約２％含まれている。
【００６６】
ＣＯ２インキュベーター中で、５％ＣＯ２存在下、摂氏３７℃で培養し、細胞が過剰増殖しないよう（培養液の色が黄色くならないよう）３−５日おきに、培養開始時に用いた上記培地の３−５倍量の新鮮な培地に、上記の濃度になるようにゾレドロネートもしくは２Ｍ３ＢＰＰと、ＩＬ−２とを添加した培養液、または、ゾレドロネートもしくは２Ｍ３ＢＰＰ、並びにＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した培養液を追加しながら１４日間培養した。
【００６７】
増殖したγδＴ細胞の解析は、細胞表面で発現されている抗原に対する標識抗体を用いてフローサイトメトリー法によって解析し（使用装置： BECTN DICKINSON, FACSCalibur）、γδＴ細胞が細胞全体に占める割合と全体の細胞数から、γδＴ細胞の絶対数を算出した。
【００６８】
図１は、γδＴ細胞の増殖に対するＩＬ−１８の効果を示すものである。ＩＬ−２およびゾレドロネート、または、ＩＬ−２および２Ｍ３ＢＰＰによって刺激したＰＢＭＣｓを黒塗りのグラフで表しており、さらにＩＬ−１８を添加して刺激したＰＢＭＣｓを白抜きのグラフで表している。また、ＩＬ−１８の代わりに抗ＩＬ−１８Ｒ抗体（２μｇ／ｍｌ）を添加して刺激したＰＢＭＣｓを、斜線のグラフで表している。縦軸はγδＴ細胞の絶対数を表している。γδＴ細胞の絶対数は、生細胞の数から計算し、γδＴ細胞の割合はフローサイトメトリーによって解析した。図中、＊＊はｐ＜０．００１であることを示す。
【００６９】
図２は、刺激後のＰＢＭＣｓの写真であり、（ａ）はＩＬ−２およびゾレドロネートで刺激したＰＢＭＣｓの写真、（ｂ）はＩＬ−２，ゾレドロネートおよびＩＬ−１８で刺激したＰＢＭＣｓの写真を示す。上記写真は、刺激剤を添加して１４日間培養したうちの培養５日目に、ニコンデジタルサイトＴＥ３００−ＨＭ−２（倍率１０倍）によって撮影したクラスターの写真であり、Lumina Vision ソフトウェアによって解析したものである。
【００７０】
図１より、ＩＬ−１８は、ＩＬ−２およびＺＯＬによって刺激したγδＴ細胞の増殖を顕著に（３０００〜８０００倍に）高めたことが分かる。また図２より、ＩＬ−１８は、γδＴ細胞のクラスター形成をラフに促進することが確認された。
【００７１】
ＩＬ−１８の代わりに、培養系に抗ＩＬ−１８Ｒ抗体を添加すると、γδＴ細胞の増殖の顕著な減少が見られた（図１）。ＩＬ−１８は、ＩＬ−２および２Ｍ３ＢＰＰによって誘導される増殖も促進した（図１）。図１に示す結果は、ＩＬ−１８が抗原提示の状態に関わらず、γδＴ細胞を刺激することを示唆している。
【００７２】
図３は、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートの刺激によるγδＴ細胞の増殖の様子を示す図である。横軸はＣＤ３の発現強度、縦軸はγδＴ細胞レセプターの発現強度を表す。ＰＢＭＣｓをＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートの存在下で１４日間培養し、ＣＤ３およびγδＴ細胞レセプターの発現を解析した。図３の（ａ）に示すように、健康なボランティアから得たＰＢＭＣｓは、２％しかγδＴ細胞を含んでいなかった。しかし、図３の（ｂ）に示すように、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートの存在下で１４日間培養した後は、γδＴ細胞は細胞全体の７４％を占め、残りは殆ど非Ｔ細胞であった。
【００７３】
図４は、刺激前（図中、「day0」と記載）および、１４日間刺激後のＰＢＭＣｓ（図中、「day14」と記載）における、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３、およびＣＤ５６の発現を解析した結果を示すものである。図４（ａ）〜（ｃ）において、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＣＤ３の発現強度が１００〜１０２．３と弱く、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０２である細胞）を枠囲みしており、上記枠囲みした細胞におけるＣＤ５６の発現を、それぞれ（ｄ）〜（ｆ）に示している。図４（ａ）〜（ｃ）の横軸はＣＤ３の発現強度を、縦軸はＣＤ１１ｃの発現強度を表す。図４（ｄ）〜（ｆ）の横軸はＣＤ５６の発現強度を表し、縦軸はＣＤ５６を発現した細胞の数を表している。なお、本明細書において、「発現強度」とは、フローサイトメトリーで測定した蛍光強度をいう。フローサイトメトリーの条件としては、Becton-Dickinson immunocytometry systems, 1995.に記載されている条件を用いた。
【００７４】
培養初期には、αβＴ細胞がＴ細胞の大部分を占めたが、１０日間で殆ど消滅した。刺激前のＰＢＭＣｓは、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞を４．８％含んでいた（図４の（ａ））。図４の（ｄ）のintと記載された部分に示すように、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞の約半数は、ＣＤ５６の発現強度が中間レベルであった。
【００７５】
ＩＬ−２およびゾレドロネートによって刺激した後のＰＢＭＣｓは、図４の（ｂ）に示すように、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞を８．８％含んでおり、図４の（ｅ）のintと記載された部分に示すように、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞の多くは、ＣＤ５６の発現強度が中間レベルであった。
【００７６】
一方、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８によって刺激した後のＰＢＭＣｓは、図４の（Ｃ）に示すように、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞を２２．２％含んでおり、当該ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞では、図４の（ｆ）のbrightと記載された部分に示すように、発現強度が１０２以上であるＣＤ５６の占める割合が顕著に増加していた。つまり、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０２であるヒトリンパ球（以下、ヒトリンパ球Ａと称する）が顕著に増殖したことが明らかとなった。表１は、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞において、ＣＤ５６の発現強度が１０１．５以上であるヒトリンパ球（以下、本実施例においてＣＤ５６＋細胞ａとも称する。図４の（ｄ）〜（ｆ）において「ＣＤ５６（＋）」と示した部分。）の数が占める割合を「ＣＤ５６（＋）」と表し、上記ヒトリンパ球Ａ（図４の（ｄ）〜（ｆ）において「bright」と示した部分）の数が占める割合を「ＣＤ５６bright」と表したものである。
【００７７】
【表１】
2011250711.tif 000003
【００７８】
刺激前（表中、「刺激前」と記載）は、ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋細胞に占めるヒトリンパ球Ａの割合は８．５０％であり、ＩＬ−２およびゾレドロネートによって１４日間刺激した場合（表中、「ＩＬ−２＋ＺＯＬ」と記載）は１８．５３％であったが、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８によって１４日間刺激した場合（表中、「ＩＬ−２＋ＺＯＬ＋ＩＬ−１８」と記載）は、５８．８０％にまで増加した。つまり、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８によって刺激されたＰＢＭＣｓにおいて、上記ヒトリンパ球Ａの数が約１３％を占めていたことになる。
【００７９】
図５は、上記ヒトリンパ球Ａの細胞数が、γδＴ細胞の細胞数と並行して増加することを示したものであり、（ａ）、（ｂ）はＩＬ−２およびゾレドロネートによってＰＢＭＣｓを刺激した場合、（ｅ）、（ｆ）はＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８によってＰＢＭＣｓを刺激した場合の、γδＴ細胞の増加の様子を示す。縦軸は細胞数を表す。また、（ｃ）、（ｄ）はＩＬ−２およびゾレドロネートによってＰＢＭＣｓを刺激した場合、（ｇ）、（ｈ）はＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８によってＰＢＭＣｓを刺激した場合の、上記ヒトリンパ球Ａの増加の様子を示す。細胞数は、図１について上述したのと同じ方法で計算した。ＩＬ−１８の代わりに中和抗体を添加すると、γδＴ細胞の増殖と同様に、ヒトリンパ球Ａの増殖も停止した（データ示さず）。
【００８０】
〔実施例２〕
＜ＣＤ５６陽性、ＣＤ１１ｃ陽性、またはＣＤ１４陽性のヒトリンパ球を除去した場合の、本発明にかかるヒトリンパ球の増殖およびγδＴ細胞の増殖＞
本実施例では、γδＴ細胞の増殖に対するアクセサリー細胞の関与について検討した。γδＴ細胞の数は加齢に伴い減少するので、４０歳以下のヒトから得たＰＢＭＣｓを実験に用いた。
【００８１】
図６は、ＣＤ５６の発現強度が１０１〜１０３であるヒトリンパ球（本実施例において「ＣＤ５６＋細胞ｂ」と称する）、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０３であるヒトリンパ球（本実施例において「ＣＤ１１ｃ＋細胞」と称する）、またはＣＤ１４の発現強度が１０２以上であるヒトリンパ球（本実施例において「ＣＤ１４＋細胞」と称する）を除去したＰＢＭＣｓを、ＩＬ−２およびゾレドロネート、または、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８で刺激した場合の、本発明にかかるヒトリンパ球の増殖およびγδＴ細胞の増殖の様子を示すものである。
【００８２】
図中、（ａ）〜（ｃ）はＰＢＭＣｓ、（ｄ）〜（ｆ）はＣＤ５６＋細胞ｂを除去したＰＢＭＣｓ、（ｇ）〜（ｉ）はＣＤ１１ｃ＋細胞を除去したＰＢＭＣｓ、（ｊ）〜（ｌ）はＣＤ１４＋細胞を除去したＰＢＭＣｓについて、それぞれ、ＣＤ３の発現強度を横軸に、γδＴ細胞、ＣＤ５６またはＣＤ１１ｃの発現強度を縦軸に取り、フローサイトメトリーの測定結果を示したものである。
【００８３】
図中、（ｍ）、（ｎ）はＰＢＭＣｓ、（ｏ），（ｐ）はＣＤ５６＋細胞ｂを除去したＰＢＭＣｓ、（ｑ），（ｒ）はＣＤ１１ｃ＋細胞を除去したＰＢＭＣｓ、（ｓ），（ｔ）はＣＤ１４＋細胞を除去したＰＢＭＣｓについて、それぞれ、刺激前（図中、「day０」と記載）および刺激後１４日目（図中、「day14」と記載）のヒトリンパ球ＡおよびγδＴ細胞の細胞数を縦軸にとって表したものである。
【００８４】
刺激後１４日目に、生細胞数および表面抗原をフローサイトメトリーによって解析した。刺激後１４日目の、ヒトリンパ球Ａの細胞数およびγδＴ細胞の細胞数は、ＰＢＭＣｓの総数と、ヒトリンパ球またはγδＴ細胞が上記総数に占める割合に基づき算出した。
【００８５】
刺激前のＰＢＭＣｓは、γδＴ細胞を約２．６％、ＣＤ５６＋細胞ｂを５．８％、ＣＤ１１ｃ＋細胞を２４．７％、ＣＤ１４＋細胞を１５％含んでおり（図６の（ａ）〜（ｃ））、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートによる刺激後は、図６の（ｍ）、（ｎ）に示すように、上記ヒトリンパ球ＡおよびγδＴ細胞が顕著に増殖した。刺激の方法は実施例１と同様である。
【００８６】
ＣＤ５６＋細胞ｂを刺激前にＰＢＭＣから除くと、γδＴ細胞の増殖と上記ヒトリンパ球Ａの増殖は見られなくなった（図６の（ｏ）、（ｐ））。同様に、ＣＤ１１ｃ＋細胞またはＣＤ１４＋細胞をＰＢＭＣから除くと、γδＴ細胞および上記ヒトリンパ球Ａの増殖が見られなくなった（図６の（ｇ）〜（ｔ））。ＣＤ５６＋細胞ｂを除去したＰＢＭＣｓは、図６の（ｆ）に示すように、ＣＤ５６＋細胞ｂを含まないＣＤ１１ｃ＋細胞を１５％含み、図６の（ｄ）に示すように、γδＴ細胞を３．４％含んでいた。
【００８７】
一方、ＣＤ１１ｃ＋細胞またはＣＤ１４＋細胞を除去したＰＢＭＣは、それぞれ３．３％（図６の（ｇ））、３．７％（図６の（ｊ））のγδＴ細胞の他に、ＣＤ１１ｃ＋を含まないＣＤ５６＋細胞ｂをそれぞれ４．１％（図６の（ｈ））、５．５％（図６の（ｋ））含んでいた。
【００８８】
図６の（ｐ）、（ｒ）、（ｔ）に示すように、γδＴ細胞はＣＤ５６＋細胞ｂ、ＣＤ１１ｃ＋細胞またはＣＤ１４＋細胞を除去したＰＢＭＣｓ中では殆ど増殖することはできなかった。このことは、ＣＤ１１ｃ＋を含まないＣＤ５６＋細胞ｂ、または、ＣＤ５６＋細胞ｂを含まないＣＤ１１ｃ＋細胞のみではγδＴ細胞の増殖を促進することはできないことを示唆している。一方、後述するように、上記ヒトリンパ球Ａのうち、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激されてなる細胞（つまり、本発明にかかるヒトリンパ球）は、γδＴ細胞の増殖を促進することができる。それゆえ、γδＴ細胞の増殖を促進するためには、少なくともＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激されてなり、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトリンパ球であることが必要であると考えられる。
【００８９】
〔実施例３〕
＜（３）ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓにおける、本発明にかかるヒトリンパ球のＩＬ−１８による増殖＞
上記ヒトリンパ球Ａの細胞数がγδＴ細胞の細胞数と並行して増加する現象（図５）は、一方の細胞が他方の増殖を助けているか、相互に増殖を促進しあっているか、ということを示唆しているため、以下の実験において検討した。
【００９０】
まず、上記ヒトリンパ球Ａの増殖に対する、ＣＤ３陽性細胞除去の効果を検討した。図７は、ＣＤ３の発現強度が１０２．３を超える細胞（以下、本実施例において「ＣＤ３陽性細胞」と称する）を除去したＰＢＭＣｓを、ＩＬ−２およびゾレドロネート、または、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８の存在下で培養した場合における上記ヒトリンパ球Ａの増殖を示すものである。なお、本明細書において、ＣＤ３の発現強度が１０２．３を超えることを「ＣＤ３陽性」、ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であることを「ＣＤ３陰性」とも称する。ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓのＣＤ３発現強度は、１００以上１０２．３以下である。
【００９１】
ＣＤ３陽性細胞を除去するとγδＴ細胞の増殖が阻害されたが、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓを、ＩＬ−２およびゾレドロネート、または、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８によって刺激すると、図７の（ｂ）、（ｃ）で枠囲みした範囲に示すように、上記ヒトリンパ球Ａが増殖した。この結果は、上記ヒトリンパ球ＡがＴ細胞とは独立して増殖できることを示しており、上記ヒトリンパ球ＡとγδＴ細胞とは、相互に増殖を促進しあう関係にはないことを示唆している。
【００９２】
図８は、種々のサイトカイン、またはサイトカインおよびゾレドロネートの存在下で、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓを培養し、刺激前、培養５日後、培養８日後における生細胞数を測定した結果を示すものである。
【００９３】
図８に示すように、培地からゾレドロネートを除去しても、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓの増殖に対する影響はなく、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓの数は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激のみによって、８日間で５倍以上に増加した。
【００９４】
図９は、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓを、ＩＬ−２、ＩＬ−２およびＩＬ−１８、または、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって刺激し、上記ヒトリンパ球Ａの増殖について検討した結果を示すものである。
【００９５】
上記ヒトリンパ球Ａが、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓに占める割合は、培養開始時（刺激前）には２〜４％であった（図７の（ａ））。ＩＬ−２およびゾレドロネート、または、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８によって刺激すると、刺激８日後には、上記ヒトリンパ球Ａは、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓのそれぞれ約６５％、約６０％を占めていた（図７の（ｂ）、（ｃ））。上記ヒトリンパ球Ａのうち、少なくともＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激したヒトリンパ球が、本発明にかかるヒトリンパ球に該当する。
【００９６】
図９に黒塗りのグラフで示すように、本発明にかかるヒトリンパ球は、ゾレドロネートが存在しなくても増殖することができ、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激によって、細胞数が刺激前の１５０倍に増加した。
【００９７】
図１０は、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓにおけるＣＤ１４の発現が培養前後で変化する様子を示すものである。ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ中の、ＣＤ１１ｃを強く発現している細胞は、図１０の（ａ）に示すように、ＣＤ１４を強く発現している。しかし、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓをＩＬ−２、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって１０日間刺激した後に得られた上記ヒトリンパ球Ａ（図１０の（ｂ）および（ｄ）の枠囲みした細胞）には、図１０の（ｄ）および（ｅ）に示すように、ＣＤ１４は殆ど見られなかった。
【００９８】
図１１は、樹状細胞の誘導のために一般的に用いられるＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦが上記ヒトリンパ球Ａの増殖を促進できるか否かを検討した結果を示すものである。ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓの培養系に加えた場合、図１１の（ｂ）〜（ｅ）に示すように、樹状細胞に一般的に見られる分子、例えばＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３の発現が見られるようになったが、上記ヒトリンパ球Ａは増加しなかった（図１１の（ａ）、図９）。
【００９９】
〔実施例４〕
＜本発明にかかるヒトリンパ球の特徴に関する検討＞
本実施例では、上記ヒトリンパ球Ａの特徴を調べた。図１２は、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓをＩＬ−２、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１８で１０日間刺激し、表面分子の発現の変化について検討した結果を示すものである。
【０１００】
図１２の（ａ）は、ＣＤ３陰性であって、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０２である、ＰＢＭＣｓから調製したヒトリンパ球（図１２の（ａ）の上段に示す最も左の図において、２〜４％を占めている細胞。刺激を受けていないヒトリンパ球Ａ。）の表面分子をフローサイトメトリーによって解析した結果を示している。図１２の（ｂ）は、刺激を受けていないヒトリンパ球ＡをＩＬ−２によって１０日間刺激することによって得られたヒトリンパ球（図１２の（ｂ）の上段に示す最も左の図において、６５％を占めている細胞）の表面分子をフローサイトメトリーによって解析した結果を示している。
【０１０１】
図１２の（ｃ）は、刺激を受けていないヒトリンパ球ＡをＩＬ−２およびＩＬ−１８によって１０日間刺激することによって得られたヒトリンパ球（図１２の（ｃ）上段の最も左の図において、６０％を占めている細胞）の表面分子をフローサイトメトリーによって解析した結果を示している。上記ヒトリンパ球が、本発明にかかるヒトリンパ球である。
【０１０２】
刺激を受けていないヒトリンパ球Ａは、図１２の（ａ）に示すように、ＩＬ−１８レセプターαおよびＩＬ−１８レセプターβを発現しており、ＮＫ細胞関連分子であるＣＤ１２２およびＮＫＧ２Ｄを発現していた。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ，ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）のような、樹状細胞に関連する抗原を発現しており、ＣＤ８６は検出されないが、ＣＤ８０およびＣＤ８３を低強度で発現していた。
【０１０３】
ＩＬ−２、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激されたヒトリンパ球Ａは、ＩＬ−１８レセプターαおよびＩＬ−１８レセプターβを発現していた（図１２の（ｂ）、（ｃ））。ＩＬ−１８はＣＤ２５の発現を強くアップレギュレートし、ＣＤ１２２の発現を強くダウンレギュレートした（図１２の（ｃ））。ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激されたヒトリンパ球Ａは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）と同様に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６のような、樹状細胞上に検出される分子を発現しており、特にＣＤ８６を強く発現した（図１２の（ｃ））。
【０１０４】
一方、ＩＬ−２のみによって刺激されたヒトリンパ球Ａでは、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激した場合のように、ＣＤ２５の発現の強いアップレギュレート、ＣＤ１２２の発現の強いダウンレギュレートは見られず、ＣＤ８６の発現は殆ど見られなかった（図１２の（ｂ））。なお、図１２の（ａ）〜（ｃ）において、フローサイトメトリーの結果を示す３つの図の横軸および縦軸は発現強度を示している。それ以外の図の横軸は発現強度を示し、縦軸は細胞数を示している。
【０１０５】
表２は、図１２の（ａ）〜（ｃ）に示される表面抗原のうち、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＮＫＧ２Ｄ、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６について、それぞれの表面抗原を発現しているヒトリンパ球Ａがヒトリンパ球Ａの総数に占める割合、および、それぞれの表面抗原の発現強度が１０２以上であるヒトリンパ球Ａがヒトリンパ球Ａの総数に占める割合（４回の実験の平均値）を示したものである。
【０１０６】
【表２】
2011250711.tif 000004
【０１０７】
表２に示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の刺激によって、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、ＮＫＧ２Ｄの発現強度が、刺激前や、ＩＬ−２のみで刺激した場合と比べて著しく増強され、いずれも、これらの表面抗原の発現強度が１０２以上であるヒトリンパ球Ａが、ヒトリンパ球Ａの総数の８０％以上を占めていた。また、ＣＤ１２２の発現は著しく低下し、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球Ａは、ヒトリンパ球Ａの総数の１０％以下となっていた。
【０１０８】
ヒトリンパ球Ａは、樹状細胞に特有な表面抗原であるＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６と、ＮＫ細胞に特有な表面抗原であるＮＫＧ２Ｄとを強く発現していたため、樹状細胞およびＮＫ細胞の特徴を併有するリンパ球であると言える。なお、ＮＫＧ２Ｄの発現強度が１０２．３以上と極めて高いヒトリンパ球Ａが、ヒトリンパ球Ａの総数の３８．５８％を占めていた。
【０１０９】
図１２の（ｃ）と、図１１との比較から分かるように、上記ヒトリンパ球Ａにおける表面抗原の発現は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４によって誘導した樹状細胞における表面抗原の発現とは異なっていた。図示していないが、上記ヒトリンパ球ＡはＣＤ１４を発現していなかった。
【０１１０】
〔実施例５〕
＜本発明にかかるヒトリンパ球によって生産されたサイトカインおよびケモカイン、ならびに本発明にかかるヒトリンパ球の細胞障害活性に関する検討＞
実施例３で用いた「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−２およびＩＬ−１８、ＩＬ−２および抗ＩＬ−１８Ｒα抗体またはＩＬ−１８の存在下で６日間培養し、培養上清中のサイトカインおよびケモカインのプロファイルを検討した。ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した上記ＰＢＭＣｓは、本発明にかかるヒトリンパ球を６０％含有していた。
【０１１１】
図１３は、上記培養上清中に産生されたサイトカインおよびケモカインと、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した上記ＰＢＭＣｓの細胞障害活性とを示す図である。図１３の（ａ）および（ｂ）に示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した上記ＰＢＭＣｓは、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生能が非常に高いことが分かった。また、図１３の（ｃ）に示すように、ケモカインであるＣＣＬ−２１を産生することも確認された。
【０１１２】
サイトカインおよびケモカインのこのような産生態様は、ＮＫ細胞および樹状細胞が示す産生態様に類似している。また、本発明にかかるリンパ球は、上述のように、樹状細胞およびＮＫ細胞の特徴を併有するリンパ球である。よって、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した上記ＰＢＭＣｓが示した、非常に高いサイトカイン産生能と、ＣＣＬ−２１の産生能とは、本発明にかかるリンパ球に起因するものであると考えられる。
【０１１３】
ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓの６５％がＮＫＧ２Ｄを強く発現していたため（図１２の（ｃ））、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した上記ＰＢＭＣｓが、Ｋ５６２細胞に対する細胞障害活性を示すかどうかについても検討した。結果を図１３の（ｄ）に示す。
【０１１４】
エフェクター細胞（図中、「Ｅ」と表示）として、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した上記ＰＢＭＣｓを、ターゲット細胞（図中、「Ｔ」と表示）としてＫ５６２細胞を用い、（１．実験方法）で説明した方法によって細胞障害活性を測定した。その結果、図１３の（ｄ）に示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した上記ＰＢＭＣｓは強い細胞障害活性を示し、本発明にかかるヒトリンパ球が強い細胞障害活性を有することが明らかとなった。なお、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で培養した、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓからはＴ細胞が除去されており、残りの細胞は殆どが本発明にかかるヒトリンパ球であるため、上記細胞障害活性は、本発明にかかるヒトリンパ球によるものであると言える。
【０１１５】
〔実施例６〕
＜γδＴ細胞の増殖に対する本発明にかかるヒトリンパ球の効果＞
γδＴ細胞に対する本発明にかかるヒトリンパ球の直接的な作用について検討した。図１４はγδＴ細胞上の共刺激分子の発現を示すものである。γδＴ細胞の表面分子は、フローサイトメトリーによって解析した。
【０１１６】
ヒトリンパ球ＡはＣＣＬ−２１を分泌し（図１３の（ｃ））、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートを用いてＰＢＭＣｓを刺激して得られたγδＴ細胞はケモカインのレセプターであるＣＣＲ５およびＣＣＲ７を発現していた（図１４）。そこで、上記ヒトリンパ球ＡがγδＴ細胞の移動を誘導する能力について検討した。
【０１１７】
走化性のアッセイは、２４穴のトランスウェル・チャンバー（Ｃｏｓｔａｒ製）に設けられた、ポアサイズ５μｍのポリカーボネートのフィルターを通過するγδＴ細胞の移動を測定することによって行った。
【０１１８】
実施例３で用いた「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（ＧＭ−ＣＳＦの最終濃度５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−４の最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（最終濃度５ｎｇ/ｍｌ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１８および抗ＣＤ８６抗体（ＩＬ−２の最終濃度５ｎｇ/ｍｌ、ＩＬ−１８の最終濃度５０ｎｇ/ｍｌ、抗ＣＤ８６抗体の最終濃度５μｇ／ｍｌ）、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１８（ＩＬ−２の最終濃度５ｎｇ/ｍｌ、ＩＬ−１８の最終濃度５０ｎｇ/ｍｌ）と共に８日間培養し、刺激した。
【０１１９】
刺激された細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートの存在下（ＩＬ−２の最終濃度５ｎｇ/ｍｌ、ＩＬ−１８の最終濃度５０ｎｇ/ｍｌ、ゾレドロネートの最終濃度１μＭ）で、下流側のチャンバーに入れ（２×１０５cells/0.6ml）、γδＴ細胞を上流側のチャンバーに入れた（２×１０５cells/0.1ml）。また、刺激された細胞の代わりに、移動のポジティブ・コントロールとして、ＣＣＬ−２１のみ（２０ｎｇ／ｍｌ）を下流側のチャンバーに入れた系も設けた。なお、下流側のチャンバーに入れた上記ＩＬ−２、Ｉｌ−１８およびゾレドロネートは、上流側のチャンバーに入れたγδＴ細胞を活性化するために用いた。
【０１２０】
３７℃で１８時間培養後、下流側のチャンバーに移動したγδＴ細胞をトリパンブルー染色によって計数し、移動したγδＴ細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定した。自発的に移動した細胞の数は、移動したγδＴ細胞の総数から差し引いた。移動した細胞の割合は、以下の式２に従い、γδＴ細胞の総数に対する割合として求めた。
【０１２１】
移動した細胞の割合（％）＝（移動したγδＴ細胞の数−自発的に移動したγδＴ細胞の数）／γδＴ細胞の総数×１００％・・・（２）
なお、自発的に移動したγδＴ細胞の数は、下流側のチャンバーに何もいれず、上流側のチャンバーに上記γδＴ細胞を入れて同じ実験を行い、上流側のチャンバーから減少した細胞数を数えることによって求めることができる。
【０１２２】
図１５は、本発明にかかるヒトリンパ球がγδＴ細胞の移動を誘導する能力について検討した結果を示す図である。図１５において、縦軸は、γδＴ細胞の総数に対する、移動したγδＴ細胞数の割合を示す。
【０１２３】
図１５の黒塗りのグラフに示すように、γδＴ細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激された、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ（本発明にかかるヒトリンパ球を６５％含有している）を下流側チャンバーに入れた場合に最もよく下流側チャンバーへ移動した。
【０１２４】
この結果から、本発明にかかるヒトリンパ球から放出されたＣＣＬ−２１によって、本発明にかかるヒトリンパ球とγδＴ細胞との直接的な相互作用が起こり、本発明にかかるヒトリンパ球とγδＴ細胞との接触が誘導されることが示唆された。
【０１２５】
次に、本発明にかかるヒトリンパ球はγδＴ細胞の増殖を助けることが示唆されたので（図６）、本発明にかかるヒトリンパ球が直接的な相互作用によってγδＴ細胞の増殖を促進するかどうかを調べた。
【０１２６】
図１６は、本発明にかかるヒトリンパ球とγδＴ細胞とがクラスターを形成する様子を示すものである。実施例３で用いた、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓを、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で８日間培養したところ、培養後の上記ＰＢＭＣｓには約７０％の本発明にかかるヒトリンパ球が含まれることが確認された。そこで、新たに調製したＰＢＭＣｓから精製されたγδＴ細胞を、培養後の上記ＰＢＭＣｓに、細胞数が１：１になるように加え、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートの存在下でさらに１８時間培養し、クラスター形成を確認した。
【０１２７】
結果を図１６の下段の左から三番目の写真に示す。図１６の「ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４刺激」は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の代わりに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いて上記「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」を刺激した系を表し、「ＩＬ−２刺激」は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の代わりに、ＩＬ−２のみを用いて上記「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」を刺激した系を表す。「γδＴ細胞なし」は、培養後の上記「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」にγδＴ細胞を加えない系を表し、「γδＴ細胞」は、培養後の「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」に、細胞数が１：１になるようにγδＴ細胞を加えた系を示す。下段の最も右の写真は、刺激を加えないγδＴ細胞の写真である。
【０１２８】
本発明にかかるヒトリンパ球は共刺激分子であるＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６を発現し（図１２の（ｃ））、ＣＣＬ−２１をも産生する。一方、γδＴ細胞は、ケモカインレセプターであるＣＣＲ５およびＣＣＲ７と、上記共刺激分子に対応するリガンドを発現する（図１４）。ＣＤ５４はＣＤ１１ａ／ＣＤ１８に、ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に、ＣＤ２８はＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６に対応するリガンドである。
【０１２９】
図１６に示すように、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって刺激した「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」（本発明にかかるヒトリンパ球を約７０％含む）を、γδＴ細胞と共に培養した場合に最も大きなクラスターが形成され、細胞は大幅に増殖した。これは、本発明にかかるヒトリンパ球が、ＣＣＬ−２１によってγδＴ細胞を誘引し、上記共刺激分子によってγδＴ細胞と接着し、さらにＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートによって刺激されたことによると考えられる。このようなクラスターの形成と細胞増殖は、γδＴ細胞の増殖には、γδＴ細胞上のＴ細胞レセプターが刺激されることが必要であることを示している。
【０１３０】
以上の結果から、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によって「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」を刺激することによって誘導された本発明にかかるヒトリンパ球が、γδＴ細胞の増殖に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【０１３１】
図１７は、γδＴ細胞の増殖に対する、本発明にかかるヒトリンパ球の効果について検討した結果を示す図である。横軸は培養後の日数、縦軸は生細胞の数を表す。
【０１３２】
実施例３で用いた「ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓ」を、ＩＬ−２およびＩＬ−１８の存在下で８日間培養したところ、培養後の上記ＰＢＭＣｓには約７０％の本発明にかかるヒトリンパ球が含まれることが確認された。新たに調製したＰＢＭＣｓから精製されたγδＴ細胞を、培養後の上記ＰＢＭＣｓに、細胞数が１：１になるように加え（図１７において「ＩＬ−２、ＩＬ−１８刺激ＰＢＭＣｓ＋γδＴ細胞」と記載）、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびゾレドロネートの存在下でさらに１０日間培養した。上記「ＩＬ−２、ＩＬ−１８刺激ＰＢＭＣｓ＋γδＴ細胞」の代わりに、非刺激ＰＢＭＣｓ（図１７において「ＰＢＭＣ」と記載）、γδＴ細胞（図１７において「γδＴ細胞」と記載）、培養後の上記ＰＢＭＣｓにγδＴ細胞を加えないもの（図１７において「ＩＬ−２、ＩＬ−１８刺激ＰＢＭＣｓ」と記載）を用いた場合の結果も示した。結果は３回同じ実験を行った平均値を記載した。培養１０日後において、「ＩＬ−２、ＩＬ−１８刺激ＰＢＭＣｓ＋γδＴ細胞」で最も細胞増殖が著しかった。よって、本発明にかかるヒトリンパ球をγδＴ細胞と共存させたときに、生細胞数が最もよく増加するといえる。
【０１３３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明にかかるヒトリンパ球は、優れたサイトカイン産生能、細胞障害活性、およびγδＴ細胞増殖促進能を有している。また、本発明にかかるγδＴ細胞の増殖方法は、癌治療等に有効なγδＴ細胞を非常に効率よく増殖させることができる。したがって、本発明は、製薬業等の生化学関係の産業全般において広く利用することができる。
【図１】
2011250711.tif 000005
【図４】
2011250711.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１４】
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【図２】
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【図３】
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【図８】
2011250711.tif 000014
【図９】
2011250711.tif 000015
【図１１】
2011250711.tif 000016
【図１２】
2011250711.tif 000017
【図１３】
2011250711.tif 000018
【図１５】
2011250711.tif 000019
【図１６】
2011250711.tif 000020
【図１７】
2011250711.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月25日(2010.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトＰＢＭＣｓを、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含む培地中で培養してなる細胞群に含有されるヒトリンパ球であって、
ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、
上記ＣＤ３、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ５６の発現強度は、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ５６のそれぞれに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーター（使用装置： BECTON DICKINSON, FACS Calibur）を用いて解析したものであることを特徴とするヒトリンパ球。
【請求項２】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ２５の発現強度が１０２以上であり、ＣＤ２５の発現強度は、ＣＤ２５に対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーター（使用装置： BECTON DICKINSON, FACS Calibur）を用いて解析したものであることを特徴とする請求項１に記載のヒトリンパ球。
【請求項３】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＨＬＡ−ＤＲの発現強度が１０２以上であり、ＨＬＡ−ＤＲの発現強度は、ＨＬＡ−ＤＲに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーター（使用装置： BECTON DICKINSON, FACS Calibur）を用いて解析したものであることを特徴とする請求項１または２に記載のヒトリンパ球。
【請求項４】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ８６の発現強度が１０２以上であり、ＣＤ８６の発現強度は、ＣＤ８６に対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーター（使用装置： BECTON DICKINSON, FACS Calibur）を用いて解析したものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のヒトリンパ球。
【請求項５】
上記ヒトリンパ球は、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球の数が、全細胞数の１０％未満であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のヒトリンパ球。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のヒトリンパ球を製造する方法であって、
ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトＰＢＭＣｓを、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含む培地中で培養する工程を含み、
上記ＣＤ３およびＣＤ１１ｃの発現強度は、ＣＤ３およびＣＤ１１ｃのそれぞれに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーター（使用装置： BECTON DICKINSON, FACS Calibur）を用いて解析したものであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか１項に記載のヒトリンパ球と、γδＴ細胞とを、インターロイキン２、インターロイキン１８およびリン酸化合物を用いて刺激する工程を含むことを特徴とする、γδＴ細胞の増殖方法。
【請求項８】
上記ヒトリンパ球がケモカインを分泌しており、γδＴ細胞がケモカインレセプターを発現していることを特徴とする、請求項７に記載のγδＴ細胞の増殖方法。
【請求項９】
上記リン酸化合物は、ゾレドロネートであることを特徴とする、請求項７または８に記載のγδＴ細胞の増殖方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
〔実施例１〕
＜ＰＢＭＣｓ中のγδＴ細胞の増殖および本発明にかかるヒトリンパ球の増殖に対するＩＬ−１８の効果＞
５％のヒトＡＢ型血清を含有するＰＲＭＩ１６４０培地にゾレドロネートまたは２Ｍ３ＢＰＰを最終濃度１μＭとなるように加え、ＩＬ-２（最終濃度５ｎｇ/ｍｌ）、または、ＩＬ−２およびＩＬ−１８（ＩＬ−２の最終濃度５ｎｇ/ｍｌ、ＩＬ−１８の最終濃度５０ｎｇ/ｍｌ）を添加した培養液に、健康なドナーから調製したＰＢＭＣｓを２．５×１０５〜１×１０６個／ｍｌとなるようにサスペンドした。図３の（ａ）に示すように、γδＴ細胞は上記ＰＢＭＣｓ中に約２％含まれている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
一方、ＣＤ１１ｃ＋細胞またはＣＤ１４＋細胞を除去したＰＢＭＣは、それぞれ３．３％（図６の（ｇ））、３．７％（図６の（ｊ））のγδＴ細胞の他に、ＣＤ１１ｃ＋を含まないＣＤ５６＋細胞ｂを４．１％（図６の（ｈ））、ＣＤ１４＋を含まないＣＤ５６＋細胞ｂを５．５％（図６の（ｋ））含んでいた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
図１２の（ａ）は、ＣＤ３陰性であって、ＣＤ５６の発現強度が１０２以上であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１〜１０２である、ＰＢＭＣｓから調製したヒトリンパ球（図１２の（ａ）の上段に示す最も左の図において、２〜４％を占めている細胞。刺激を受けていないヒトリンパ球Ａ。）の表面分子をフローサイトメトリーによって解析した結果を示している。図１２の（ｂ）は、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓをＩＬ−２によって１０日間刺激することによって得られたヒトリンパ球（図１２の（ｂ）の上段に示す最も左の図において、６５％を占めている細胞）の表面分子をフローサイトメトリーによって解析した結果を示している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
図１２の（ｃ）は、ＣＤ３陽性細胞を除去したＰＢＭＣｓをＩＬ−２およびＩＬ−１８によって１０日間刺激することによって得られたヒトリンパ球（図１２の（ｃ）上段の最も左の図において、６０％を占めている細胞）の表面分子をフローサイトメトリーによって解析した結果を示している。上記ヒトリンパ球が、本発明にかかるヒトリンパ球である。
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月10日(2011.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトＰＢＭＣｓを、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含む培地中で培養してなる細胞群に含有されるヒトリンパ球であって、
ＣＤ５６の発現強度が１０２以上、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であり、
上記ＣＤ３、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ５６の発現強度は、ＣＤ３、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ５６のそれぞれに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーターを用いて解析したものであることを特徴とするヒトリンパ球。
【請求項２】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ２５の発現強度が１０２以上であり、ＣＤ２５の発現強度は、ＣＤ２５に対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーターを用いて解析したものであることを特徴とする請求項１に記載のヒトリンパ球。
【請求項３】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＨＬＡ−ＤＲの発現強度が１０２以上であり、ＨＬＡ−ＤＲの発現強度は、ＨＬＡ−ＤＲに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーターを用いて解析したものであることを特徴とする請求項１または２に記載のヒトリンパ球。
【請求項４】
上記ヒトリンパ球の８０％以上は、ＣＤ８６の発現強度が１０２以上であり、ＣＤ８６の発現強度は、ＣＤ８６に対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーターを用いて解析したものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のヒトリンパ球。
【請求項５】
上記ヒトリンパ球は、ＣＤ１２２を発現しているヒトリンパ球の数が、全細胞数の１０％未満であることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のヒトリンパ球。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のヒトリンパ球を製造する方法であって、
ＣＤ３の発現強度が１００以上１０２．３以下であり、かつ、ＣＤ１１ｃの発現強度が１０１以上１０２以下であるヒトＰＢＭＣｓを、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含む培地中で培養する工程を含み、
上記ＣＤ３およびＣＤ１１ｃの発現強度は、ＣＤ３およびＣＤ１１ｃのそれぞれに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、上記ヒトリンパ球を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーターを用いて解析したものであることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか１項に記載のヒトリンパ球と、γδＴ細胞とを、インターロイキン２、インターロイキン１８およびリン酸化合物を用いて刺激する工程を含むことを特徴とする、γδＴ細胞の増殖方法。
【請求項８】
上記ヒトリンパ球がケモカインを分泌しており、γδＴ細胞がケモカインレセプターを発現していることを特徴とする、請求項７に記載のγδＴ細胞の増殖方法。
【請求項９】
上記リン酸化合物は、ゾレドロネートであることを特徴とする、請求項７または８に記載のγδＴ細胞の増殖方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
＜フローサイトメトリー＞
ＣＤ３、γδ−Ｔ細胞レセプター、Ｖδ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＮＫＧ２Ｄ、ＩＬ−１８Ｒα、ＩＬ−１８Ｒβのそれぞれに対する、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣおよびビオチンによって標識した抗体によって、細胞を４℃で２０分間染色し、フローサイトメーター（使用装置： BECTON DICKINSON, FACS Calibur（登録商標））を用いて解析した。データはCell Questソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス製）を用いて解析した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
増殖したγδＴ細胞の解析は、細胞表面で発現されている抗原に対する標識抗体を用いてフローサイトメトリー法によって解析し（使用装置： BECTN DICKINSON, FACSCalibur（登録商標））、γδＴ細胞が細胞全体に占める割合と全体の細胞数から、γδＴ細胞の絶対数を算出した。