(57)【要約】      （修正有）【課題】光照射により活性を下向き調節することのできる光感受性遺伝子発現調節システムを提供する。【解決手段】Ｃｒｙ４タンパク質等のポリペプチドのアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと連結された第１の融合タンパク質をエンコードする第１のポリヌクレオチドと、Ｃｒｙ４タンパク質等のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドのアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、転写活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインのいずれかと連結された第２の融合タンパク質をエンコードする第２のポリヌクレオチドと、前記ＤＮＡ結合ドメインと特異的に結合するポリヌクレオチド。また、上記ポリヌクレオチドを含む光感受性組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと連結された第１の融合タンパク質をエンコードする第１のポリヌクレオチドと、
Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドのアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、転写活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインのいずれかと連結された第２の融合タンパク質をエンコードする第２のポリヌクレオチドと、
前記ＤＮＡ結合ドメインと特異的に結合するポリヌクレオチドを含む第３のポリヌクレオチドとを含むことを特徴とする、光感受性遺伝子発現調節システム。
【請求項２】
前記第１のポリヌクレオチドは、Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドと、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかとからなる第１の融合タンパク質をエンコードし、
前記第２のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＰ１タンパク質又はＣＲＩＰ２タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドと、転写活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインのいずれかとからなる第２の融合タンパク質をエンコードすることを特徴とする、請求項１に記載の光感受性遺伝子発現調節システム。
【請求項３】
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドのアミノ酸配列が、連結部位ごとに独立に０個ないし２０個のアミノ酸残基からなるスペーサオリゴペプチドのアミノ酸配列を介して、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと直列に連結される、第１の融合タンパク質をエンコードし、
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドのアミノ酸配列が、連結部位ごとに独立に０個ないし２０個のアミノ酸残基からなるスペーサオリゴペプチドのアミノ酸配列を介して、前記転写活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインのうち、第１の融合タンパク質に含まれないドメインと直列に連結される、第２の融合タンパク質をエンコードすることを特徴とする、請求項１に記載の光感受性遺伝子発現調節システム。
【請求項４】
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列が、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと直列に連結される、第１の融合タンパク質をエンコードし、
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列が、前記転写活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインのうち、第１の融合タンパク質に含まれないドメインと直列に連結される、第２の融合タンパク質をエンコードすることを特徴とする、請求項１に記載の光感受性遺伝子発現調節システム。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと結合するポリペプチドと、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと結合するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列からなり、
前記転写活性化ドメインは、配列番号２５に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２５に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドとの融合タンパク質を形成するとき、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドの３’側に連結されたプロモーターエレメントからのＲＮＡ転写を活性化するポリペプチドと、配列番号２５に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドとの融合タンパク質を形成するとき、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドの３’側に連結されたプロモーターエレメントからのＲＮＡ転写を活性化するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列からなり、
前記ＤＮＡ結合ドメインと特異的に結合するポリヌクレオチドは、配列番号２８のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からなることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の光感受性遺伝子発現調節システム。
【請求項６】
前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号２３のいずれか１つのヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、
前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号７又は配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、
前記第３のポリヌクレオチドは、配列番号２８のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとを含むことを特徴とする、請求項１に記載の光感受性遺伝子発現調節システム。
【請求項７】
暗条件か、赤色光の下かでは遺伝子発現が誘導されるが、緑色光又は青色光の下では遺伝子発現が実質的に抑制されることを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の光感受性遺伝子発現調節システム。
【請求項８】
Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第１の化合物と、
Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第２の化合物とを含むことを特徴とする、光感受性組成物。
【請求項９】
Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第１の化合物と、
ＣＲＩＰ１タンパク質又はＣＲＩＰ２タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第２の化合物とを含むことを特徴とする、光感受性組成物。
【請求項１０】
前記第１の化合物は、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結し、
前記第２の化合物は、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結することを特徴とする、請求項８又は９に記載の光感受性組成物。
【請求項１１】
第１の化合物と第２の化合物とは、暗条件か、赤色光の下かで会合するが、緑色光又は青色光の下では会合しないことを特徴とする、請求項８ないし１０のいずれか１つに記載の光感受性組成物。
【請求項１２】
請求項１ないし７のいずれか１つに記載の光感受性遺伝子発現調節システムを含むことを特徴とする、細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞を含むことを特徴とする、菌類か、植物か、ヒトを除く動物かのいずれかの生物個体。
【請求項１４】
（１）Ｃｒｙ４タンパク質のアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと連結された第１の融合タンパク質を発現する第１の組換えベクターと、転写活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインとｃＤＮＡインサートにエンコードされるポリペプチドとが連結された第２の融合タンパク質を発現する第２の組換えベクターと、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが相互作用をするとき、選択培地で増殖する宿主細胞とを用意するステップと、
（２）前記第２の組換えベクターを用いてｃＤＮＡライブラリを構築するステップと、
（３）前記第１の組換えベクターと前記ｃＤＮＡライブラリとを前記宿主細胞内に導入するステップと、
（４）暗条件下で選択培地で増殖するコロニー由来の細胞のうち、青色光照射下では選択培地で増殖しない細胞をスクリーニングするステップと、
（５）前記スクリーニングにより得られた光感受性増殖細胞に含まれる第２の組換えベクターにエンコードされるｃＤＮＡインサートを単離するステップとを含むことを特徴とする、Ｃｒｙ４と光感受性の相互作用を行うタンパク質をエンコードするｃＤＮＡをスクリーニングする方法。
【請求項１５】
配列番号２に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドを含み、暗条件又は赤色光の下で他のタンパク質と会合するが、緑色光又は青色光の下では該他のタンパク質とは会合しないことを特徴とする、光感受性スイッチ素子。
【請求項１６】
配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１つのポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドをエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを発現することを特徴とする組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞を含むことを特徴とする、菌類か、植物か、ヒトを除く動物かのいずれかの生物個体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光感受性遺伝子発現調節システムに関し、より具体的には、暗条件下で強い発現を誘導するが、明条件では完全に発現を抑制することのできる、従来とは逆の光感受特性を有する遺伝子発現調節システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
光を利用して生体内で遺伝子やタンパク質の活性や量を変化させるための従来のアプローチには、（１）光によって誘起される化学反応を利用して特定の化合物を変化させ、生じた物質を利用する方法と、（２）光感受性のタンパク質と光依存的に相互作用する物質を利用し、両者の結合状態の変化を利用する方法とがある。（１）のアプローチは実用化されており、紫外線感受性のケージド化合物が有名である。また、蛍光タンパク質に通常よりも強い刺激光を照射して強制的に退色させる方法などもこの方法に近い。ケージド化合物を用いる方法では、ケージド化合物をあらかじめ細胞に導入する必要があり、化合物によって導入が困難である場合や、細胞毒性が強く導入できない場合がある。また、励起に用いる紫外線が細胞に与える影響も大きいという欠点がある。蛍光タンパク質をエンコードする遺伝子を細胞に導入し、発現した蛍光タンパク質に光を照射する方法もあるが、これはタンパク質の分布や移動の観察のために開発された方法であり、任意の遺伝子やタンパク質の活性制御には向いていない。一方、（２）のアプローチでは、植物由来のフィトクロムを用いた方法（特許文献１）が提案されている。この方法は、真核細胞である酵母において光で遺伝子活性を制御できるという利点があるものの、発色団を外部より供給しなければならないという点と、赤色を刺激に利用するため赤色光を安全光に使用できない、という２つの欠点がある。また、前記従来のアプローチは全て、光照射により活性を上向き調節するものであり、光照射により活性を下向き調節する手段は従来知られていない。さらに、従来報告される感光性タンパク質は主に植物由来のものであり、体温の高い恒温動物の細胞や、３５°Ｃを超える温度でのインキュベーションが必要な発酵に必ずしも適しているとはいえない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０３０１８７７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、光照射により活性を下向き調節することのできる光感受性遺伝子発現調節システムを開発する必要がある。また、生物種を問わず普遍的に細胞内に存在する物質を発色団として利用することにより、細胞外から発色団を供給しなくてもよい光感受性遺伝子発現調節システムを開発する必要がある。さらに、光感受特性スペクトルが人間の可視光波長の範囲より狭く、いわゆる安全光として利用可能な光の波長範囲が存在するような光感受性遺伝子発現調節システムを開発する必要がある。また、体温の高い恒温動物の細胞や、３５°Ｃを超える温度でのインキュベーションが必要な発酵に適した光感受性遺伝子発現調節システムを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は光感受性遺伝子発現調節システムを提供する。本発明の光感受性遺伝子発現調節システムは、Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと連結された第１の融合タンパク質をエンコードする第１のポリヌクレオチドと、Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドのアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、転写活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインのいずれかと連結された第２の融合タンパク質をエンコードする第２のポリヌクレオチドと、前記ＤＮＡ結合ドメインと特異的に結合するポリヌクレオチドを含む第３のポリヌクレオチドとを含む。
【０００６】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムにおいて、前記第１のポリヌクレオチドは、Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドと、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかとからなる第１の融合タンパク質をエンコードし、前記第２のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＰ１タンパク質又はＣＲＩＰ２タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドと、転写活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインのいずれかとからなる第２の融合タンパク質をエンコードする。
【０００７】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムにおいて、前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドのアミノ酸配列が、連結部位ごとに独立に０個ないし２０個のアミノ酸残基からなるスペーサオリゴペプチドのアミノ酸配列を介して、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと直列に連結される、第１の融合タンパク質をエンコードし、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個ないし５個のポリペプチドのアミノ酸配列が、連結部位ごとに独立に０個ないし２０個のアミノ酸残基からなるスペーサオリゴペプチドのアミノ酸配列を介して、前記転写活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインのうち、第１の融合タンパク質に含まれないドメインと直列に連結される、第２の融合タンパク質をエンコードする。
【０００８】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムにおいて、前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列が、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと直列に連結される、第３の融合タンパク質をエンコードし、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列が、前記転写活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインのうち、第１の融合タンパク質に含まれないドメインと直列に連結される、第２の融合タンパク質をエンコードする。
【０００９】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムにおいて、前記ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと結合するポリペプチドと、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと結合するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列からなり、前記転写活性化ドメインは、配列番号２５に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２５に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドとの融合タンパク質を形成するとき、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドの３’側に連結されたプロモーターエレメントからのＲＮＡ転写を活性化するポリペプチドと、配列番号２５に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、該ポリペプチドが配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドとの融合タンパク質を形成するとき、配列番号２８に列挙されるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドの３’側に連結されたプロモーターエレメントからのＲＮＡ転写を活性化するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドのアミノ酸配列からなり、前記ＤＮＡ結合ドメインと特異的に結合するポリヌクレオチドは、配列番号２８のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる場合がある。
【００１０】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムにおいて、前記第１のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号２３のいずれか１つのヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、前記第２のポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号７又は配列番号１７のいずれか１つのヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであり、前記第３のポリヌクレオチドは、配列番号２８のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列に１個又は数個のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドと、配列番号２８のヌクレオチド配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるヌクレオチド配列のポリヌクレオチドであって、配列番号２４に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと結合するポリヌクレオチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの場合がある。
【００１１】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムは、暗条件か、赤色光の下かでは遺伝子発現が誘導されるが、緑色光又は青色光の下では遺伝子発現が実質的に抑制される場合がある。
【００１２】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムにおいて、第１のポリヌクレオチドは、第１の融合タンパク質を細胞内で発現するための転写及び翻訳制御エレメントを含む第１の組換えベクターに含まれ、第２のポリヌクレオチドは、第２の融合タンパク質を細胞内で発現するための転写及び翻訳制御エレメントを含む第２の組換えベクターに含まれ、第３のポリヌクレオチドは第３の組換えベクターに含まれ、該第３の組換えベクターには、本発明の光感受性遺伝子発現調節システムを用いて光感受性の遺伝子発現を調節させる遺伝子が、第３のポリヌクレオチドの３’末端に直接連結されるか、数個又は数十個のポリヌクレオチドを介して連結される場合がある。前記本発明の光感受性遺伝子発現調節システムを用いて光感受性の遺伝子発現を調節させる遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑蛍光タンパク質等のレポータ又はマーカー遺伝子のほか、転写調節因子、シグナル伝達関連分子、神経関連分子その他の細胞又は個体レベルの生命現象に関係する遺伝子であって、ＲＮＡ又はタンパク質として機能する遺伝子の場合がある。
【００１３】
本発明は、本発明の光感受性遺伝子発現調節システムの第１の組換えベクターと、第２の組換えベクターと、第３の組換えベクターとを含む細胞を提供する。
【００１４】
本発明は、本発明の光感受性遺伝子発現調節システムの組換えベクターを含む細胞を含む、菌類か、植物か、ヒトを除く動物かのいずれかの生物個体を提供する。
【００１５】
本発明は、光感受性組成物を提供する。本発明の光感受性組成物は、Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第１の化合物と、Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第２の化合物とを含む。
【００１６】
本発明の光感受性組成物は、Ｃｒｙ４タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第１の化合物と、ＣＲＩＰ１タンパク質又はＣＲＩＰ２タンパク質と、その変異体、誘導体及び／又は修飾体とからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結した第２の化合物とを含む場合がある。
【００１７】
本発明の光感受性組成物において、前記第１の化合物は、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９か、配列番号１６かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結し、前記第２の化合物は、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドが共有結合で連結する場合がある。
【００１８】
本発明の光感受性組成物は、第１の化合物と第２の化合物とは、暗条件か、赤色光の下かで会合するが、緑色光又は青色光の下では会合しない場合がある。
【００１９】
本発明は、本発明の光感受性遺伝子発現調節システムを含む細胞を提供する。
【００２０】
本発明は、本発明の細胞を含む、菌類か、植物か、ヒトを除く動物かのいずれかの生物個体を提供する。
【００２１】
本発明は、Ｃｒｙ４と光感受性の相互作用を行うタンパク質をエンコードするｃＤＮＡをスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、（１）Ｃｒｙ４タンパク質のアミノ酸配列を少なくとも１個エンコードし、ＤＮＡ結合ドメイン又は転写活性化ドメインのいずれかと連結された第１の融合タンパク質を発現する第１の組換えベクターと、転写活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインとｃＤＮＡインサートにエンコードされるポリペプチドとが連結された第２の融合タンパク質を発現する第２の組換えベクターと、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが相互作用をするとき、選択培地で増殖する宿主細胞とを用意するステップと、（２）前記第２の組換えベクターを用いてｃＤＮＡライブラリを構築するステップと、（３）前記第１の組換えベクターと前記ｃＤＮＡライブラリとを前記宿主細胞内に導入するステップと、（４）暗条件下で選択培地で増殖するコロニー由来の細胞のうち、青色光照射下では選択培地で増殖しない細胞をスクリーニングするステップと、（５）前記スクリーニングにより得られた光感受性増殖細胞に含まれる第２の組換えベクターにエンコードされるｃＤＮＡインサートを単離するステップとを含む。
【００２２】
本発明は、光感受性スイッチ素子を提供する。本発明の光感受性スイッチ素子は、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号２に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号８か、配列番号９かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドとからなるグループから選択されるいずれか１個のポリペプチドを含み、暗条件又は赤色光の下で他のタンパク質と会合するが、緑色光又は青色光の下では該他のタンパク質とは会合しない。
【００２３】
本発明は、Ｃｒｙ４と光感受性の相互作用を行うタンパク質を提供する。前記タンパク質は、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドである。
【００２４】
本発明は、Ｃｒｙ４と光感受性の相互作用を行うタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドは、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドと、配列番号８又は配列番号９に列挙されるアミノ酸配列との相同性が、８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドであって、配列番号２か、配列番号１０か、配列番号２１かに列挙されるアミノ酸配列のポリペプチドと暗条件下で相互作用するポリペプチドからなるグループから選択される１つのポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドである。
【００２５】
本発明は、本発明のＣｒｙ４と光感受性の相互作用を行うタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを発現する組換えベクターを提供する。
【００２６】
本発明は、本発明のＣｒｙ４と光感受性の相互作用を行うタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを発現する組換えベクターを含む細胞を提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のＣｒｙ４と光感受性の相互作用を行うタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを発現するベクターを含む細胞を含む、菌類か、植物か、ヒトを除く動物かのいずれかの生物個体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】照射光の波長の違いがＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との相互作用に与える影響を調べる実験の結果を示す写真。
【図２】照射光の強度の違いがＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との相互作用に与える影響を調べる実験の結果を示す写真。
【図３】日本列島の形状を描いた露光原板を用いて露光されたゲルの写真。
【図４】２量体又は単量体のプレイ及びバイトタンパク質が２重に形質転換された酵母の暗条件下特異的なコロニー形成を示す写真。
【図５】単量体、２量体又は４量体バイトプラスミド（それぞれＣＲＹ４×１、ＣＲＹ４×２及びＣＲＹ４×４）と、単量体プレイプラスミドＣＲＩＰ１とで２重形質転換された酵母が、暗条件（Ｄ）又は青色光照射による明条件（Ｌ）で３時間培養された間に発現が誘導されたβ−ガラクトシダーゼ活性を示す棒グラフ。
【図６】３種類の異なるバイトプラスミドのいずれかと、同一のプレイプラスミドとで２重に形質転換された酵母で発現誘導されるβ−ガラクトシダーゼ活性に対する照射光の波長及び強度の影響を示す線グラフ。
【図７】ともに単量体のバイトプラスミド及びプレイプラスミドで２重に形質転換された酵母について、遮光により暗条件に移行後の培養時間と、最後まで明条件下で培養された酵母でのβ−ガラクトシダーゼ活性に対する暗条件培養後のβ−ガラクトシダーゼ活性の比とを示すグラフ。
【図８Ａ】明条件下で終夜培養された酵母について、さらに５時間明条件下で培養されるグループ（Ｌ）と、５時間暗条件下で培養されるグループ（Ｄ）との明暗スケジュールの模式図。
【図８Ｂ】３種類の異なるバイト及びプレイプラスミドと、レポータコンストラクトとで多重形質転換された酵母でのレポータタンパク質ＧＳＴ−ＭＥ２５（ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇ）の発現を比較したウェスタンブロット結果図。
【図９Ａ】暗条件下で終夜培養された酵母について、さらに５時間暗条件下で培養されるグループ（Ｄ）と、５時間明条件下で培養されるグループ（Ｌ）との明暗スケジュールの模式図。
【図９Ｂ】３種類の異なるバイト及びプレイプラスミドと、レポータコンストラクトとで多重形質転換された酵母でのレポータタンパク質ＧＳＴ−ＭＥ２５（ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇ）の発現を比較したウェスタンブロット結果図。
【００２９】
本発明においてＣｒｙ４タンパク質は、いずれかの生物種のＣＲＹ４遺伝子にエンコードされるタンパク質をいう。ＣＲＹ４遺伝子は、Ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ遺伝子ファミリーの構成メンバーのうち、脊椎動物のＣＲＹ１／２遺伝子、ＣＲＹ  ＤＡＳＨ遺伝子及び６−４フォトリアーゼとは明確に区別されるグループに属し、Ｋｕｂｏ，  Ｙ．ら、（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９７：１１５５−１１６５（２００６））のニワトリＣＲＹ４（以下、「ｃＣＲＹ４」という。）や、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｙ．ら、（Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ５：７２５−７３８（２００）らのゼブラフィッシュのＣＲＹ４を含む。ｃＣｒｙ４タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に添付される配列表に配列番号２として列挙される。本発明は、Ｃｒｙ４タンパク質が、細胞内で、他の特定のタンパク質と光感受性の相互作用を行うという発明者による発見に基づく用途発明である。
【００３０】
本発明において、ＣＲＩＰ１及びＣＲＩＰ２タンパク質は、以下の実施例に説明されるとおり、ｃＣｒｙ４タンパク質との光感受性の相互作用を示すタンパク質として酵母ツーハイブリッド法でスクリーニングされたニワトリのタンパク質と、これらに相同ないずれかの生物種のタンパク質であって、当該生物種のＣｒｙ４タンパク質と光感受性の相互作用を示すタンパク質をいう。ニワトリのＣＲＩＰ１及びＣＲＩＰ２のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８及び９に列挙される。ＣＲＩＰ１及び２は、ニワトリのゲノム内で異なる遺伝子座にエンコードされる。
【００３１】
本発明において、Ｃｒｙ４、ＣＲＩＰ１又はＣＲＩＰ２について変異体とは、これらのタンパク質のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列のポリペプチドか、これらのタンパク質のアミノ酸配列との相同性が８０％、８５％、９０％又は９５％を超えるアミノ酸配列のポリペプチドか、これらのタンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列かであって、Ｃｒｙ４の場合であればＣＲＩＰ１又はＣＲＩＰ２と、ＣＲＩＰ１又はＣＲＩＰ２の場合であればＣｒｙ４と暗条件下で相互作用するポリペプチドをいう。
【００３２】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００３３】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６×  ＳＳＣ及び０．２％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２×  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００３４】
本明細書において、本発明のタンパク質の光感受性、あるいは、本発明のタンパク質の光感受性の相互作用とは、Ｃｒｙ４タンパク質と、他の特定のタンパク質、例えば、ＣＲＩＰ１又はＣＲＩＰ２タンパク質とが、暗条件下で会合し、明条件下、特に青色光の下では解離する性質をいう。前記Ｃｒｙ４タンパク質と、前記他のタンパク質との相互作用は、一方にＤＮＡ結合ドメインを融合させたタンパク質を発現するプラスミドと、他方に転写活性化ドメインを融合させたタンパク質を発現するプラスミドとを、前記ＤＮＡ結合ドメインが特異的に結合するポリヌクレオチドを含む転写制御エレメントの支配下で選択可能なマーカー遺伝子を発現するプラスミドとともに宿主細胞に導入して、前記マーカー遺伝子が発現するときに前記宿主細胞が増殖するように選択することによって、検出することができる。前記プラスミドが導入された細胞における前記相互作用の定量は、前記マーカー遺伝子のかわりに酵素活性アッセイ方法が確立した適当な酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等をエンコードする遺伝子を用いることによって容易に実施される。また、精製された前記融合タンパク質間か、Ｃｒｙ４タンパク質と前記他のタンパク質との間かでの前記相互作用の定量は、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴法その他の方法を用いることによって容易に実施される。
【００３５】
本明細書において、本発明のタンパク質か、その変異体かの誘導体とは、本発明のタンパク質か、その変異体かに、スペーサオリゴペプチドや特異的結合タグペプチドのような、本発明のタンパク質の光感受性に影響を与えることのないアミノ酸残基１個ないし５０個、好ましくは、アミノ酸残基３個、５個、１０個又は２０個のオリゴペプチドが連結されたものをいう。
【００３６】
本明細書において、特異的結合タグペプチドとは、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドをいう。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本明細書の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、本発明のタンパク質の光感受性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００３７】
本明細書において、本発明のタンパク質か、その変異体か、その誘導体かの修飾体とは、本発明のタンパク質と、その変異体と、その誘導体とからなるグループから選択されるいずれかが、いずれかの組み合わせで２個ないし５個、好ましくは、２個又は４個、直列に連結されたものをいう。
【００３８】
本発明において、ＤＮＡ結合ドメイン（以下、「ＤＢＤ」という。）及び転写活性化ドメイン（以下、「ＡＤ」という。）とは、例えば、酵母Ｇａｌ４転写因子で詳しく解析されたように、遺伝子の転写調節に関与するＤＮＡ配列エレメントと特異的に結合する機能と、ＲＮＡポリメラーゼを含む転写関連タンパク質の複合体と特異的に結合する機能とを有する転写タンパク質のそれぞれの機能だけを担う領域をさす。ＤＢＤと、これに特異的に結合するオリゴヌクレオチドと、ＡＤとは、本発明の光感受性遺伝子発現調節システムが機能することを条件として、いかなる生物種の転写調節因子に由来するものであってもかまわない。
【００３９】
本明細書において、暗条件とは、完全暗黒条件の他、本発明の光感受性遺伝子発現調節システムの感光特性によると、完全暗黒条件とほぼ同等の遺伝子発現を誘導することができる程度の光が照射される条件をいう。本発明の赤色光とは、一般に人間が赤い色として認識する６１０ｎｍないし７８０ｎｍの範囲のいずれかの波長の光をいい、６３４ｎｍの光の場合がある。本明細書において、緑色光とは、５００ｎｍないし５７０ｎｍの範囲のいずれかの波長をいい、５４２ｎｍの光の場合がある。本明細書において、青色光とは、４３０ｎｍないし５００ｎｍの範囲のいずれかの波長の光をいい、４７１ｎｍの光の場合がある。
【００４０】
本発明の光感受性組成物は、本発明のＣｒｙ４タンパク質と、ＣＲＩＰ１又はＣＲＩＰ２タンパク質との会合の光感受性を利用して、任意の物質の細胞内局在を、光の明暗又は照射光の波長の変化により操作するために用いられる場合がある。あるいは、繊維状のポリマー分子間の架橋状態を、光の明暗又は照射光の波長の変化により操作するために用いられる場合がある。前者の場合には、本発明の光感受性組成物の第１及び第２の化合物は、本発明のタンパク質、その変異体、誘導体及び／又は修飾体が、タンパク質、核酸、多糖類、脂肪酸その他の生物学的分子と共有結合で連結される。後者の場合には、本発明の光感受性組成物の第１及び第２の化合物は、いずれかの生体分子又は合成高分子と共有結合で連結される。
【００４１】
本発明のベクターは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。
【００４２】
本発明の組換えベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。
【００４３】
本発明の細胞は、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記生物は、古細菌と、大腸菌、枯草菌等の細菌とのような原核生物と、酵母と、菌類、植物、動物等の多細胞生物とのような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。
【００４４】
本発明の生物個体は、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される多細胞生物の個体である。前記生物個体は、菌類、植物、動物等の多細胞生物とのような真核生物とを含む。
【００４５】
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムは、ニワトリ由来のＣｒｙ４（ｃＣｒｙ４）を感光性タンパク質として利用する。ｃＣｒｙ４の発色団であるフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）は、酸化還元酵素の補酵素として広範な生物種の細胞で使われている物質であるため、外部から供給する必要がない。また、本発明の光感受性遺伝子発現調節システムは、人間の可視光波長範囲のうち、赤色光への感度が低いため、赤色光を安全光として作業を行うことができる。さらに、ニワトリの体温は４０°Ｃと比較的高いため、３７°Ｃ前後の体温の哺乳動物の細胞での利用や、３５°Ｃを超える温度でのインキュベーションが必要な発酵に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
材料
１．細胞
以下の実験では、酵母ＭａＶ２０３株（ＭＡＴα；  ｌｅｕ２−３，１１２；  ｔｒｐ１−９０１；  ｈｉｓ３Δ２００；  ａｄｅ２−１０１；  ｃｙｈ２Ｒ；  ｃａｎ１  Ｒ；  ｇａｌ４Δ；  ｇａｌ８０Δ；  ＧＡＬ１：：ｌａｃＺ；  ＨＩＳ３ＵＡＳＧＡＬ１：：ＨＩＳ３＠ＬＹＳ２；  ＳＰＡＬ１０：：ＵＲＡ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が宿主として用いられた。前記酵母菌はＹＰＡＤ培地を用いて培養された。前記酵母菌にプラスミドを形質転換する場合には、ＳＤ−ＬＷＵ培地その他の選択培地を用いて培養された。寒天プレート培地上に培養する場合には、前記培地のいずれかに２％アガーが添加された培地が用いられた。
【００４８】
２．培地及びバッファー
ＹＰＡＤ培地
０．６７％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏ（商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２％（ｗ／ｖ）Ａｇａｒ、０．０３ｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  （Ａｄｅｎｉｎ）、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ（商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ
ＳＤ−ＬＷ培地
０．６７％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏ（商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２％（ｗ／ｖ）Ａｇａｒ、０．０３ｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎ、０．６２ｇ／Ｌ  −Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｈｉｓ  ＤＯ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、０．０７６ｇ／Ｌ  Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  Ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ
ＳＤ−ＬＷＨ（＋１０ｍＭ  ３−ＡＴ）培地
０．６７％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏ（商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２％  （ｗ／ｖ）  Ａｇａｒ、０．０３ｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎ、０．６２ｇ／Ｌ  −Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｈｉｓ  ＤＯ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、０．８４ｇ／Ｌ  ３−Ａｍｉｎｏ−１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｅ
ＳＤ−ＬＷＵ培地
０．６７％（ｗ／ｖ）Ｄｉｆｃｏ（商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、２％（ｗ／ｖ）グルコース、２％（ｗ／ｖ）  Ａｇａｒ、０．０３ｇ／Ｌ  Ａｄｅｎｉｎ、０．６２ｇ／Ｌ  −Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｕｒａ  ＤＯ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）
Ｚバッファー
終濃度組成が、６．１ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、５．５ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７５ｇ／Ｌ  ＫＣｌ及び０．２４６ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏとなるように試薬が混合された後、室温でｐＨ  ７．０に調整されてから、オートクレーブにより滅菌された。
破砕バッファー溶液
終濃度組成が、８Ｍ  尿素、５％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（室温ｐＨ６．８）及び０．４ｍｇ／ｍＬ  ＢＰＢとなるように試薬が混合され、滅菌水でメスアップされた。
完全破砕バッファー
タンパク質分解酵素阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ、型番：１６９７４９８）を２ｍＬの滅菌水に溶かして調製された２５×阻害剤ストック液が用意され、使用時に、前記破砕バッファー溶液で希釈され、さらに、１／１００容  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）が添加された。
【００４９】
３．ＣＲＩＰ１及びＣＲＩＰ２遺伝子のクローニング
ＣＲＩＰ１及びＣＲＩＰ２遺伝子は酵母ツーハイブリッド法で単離された。孵化１６日目の夜中と１７日目の真昼とに屠殺されたヒヨコ網膜より常法により抽出されたＲＮＡが等量ずつ混合され、逆転写反応によりｃＤＮＡが合成され、酵母ツーハイブリッドスクリーニング用プレイベクターｐＥＸＰ−ＡＤ５０２（配列番号１）に挿入してｃＤＮＡライブラリが作製された。バイトとして、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のＣ末端側にニワトリＣＲＹ４（ｃＣＲＹ４（配列番号２）、Ｋｕｂｏら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ９７：１１５５−１１６５（２００６））の全長が連結した融合タンパク質（ＤＢＤ−ｃＣＲＹ４（配列番号３））をエンコードするポリヌクレオチドが、酵母ツーハイブリッドスクリーニング用バイトベクターｐＤＢＬｅｕ（配列番号４）にサブクローニングされた（ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４（配列番号５））。ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４と、前記ｃＤＮＡライブラリとで２重に形質転換された酵母ＭａＶ２０３株は遮光されたＳＤ−ＬＷＨ（ロイシン、トリプトファン及びヒスチジン欠乏ＳＤ）寒天培地上で選択された。
【００５０】
ＳＤ−ＬＷＨ寒天培地上で形成された多数の酵母コロニーからｃＤＮＡを含むプラスミドが抽出・解析された。その結果、ｃＣＲＹ４と暗所にて結合すると考えられるポリペプチドがＧＡＬ４の転写活性化ドメイン（ＡＤ）のＣ末端側に連結した融合タンパク質をエンコードする２種類のクローンが得られ、それぞれｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１Ｎ（配列番号６）及びｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ２（配列番号７）と命名された。両者に対応する完全長ｃＤＮＡクローンを単離して、そのオープン・リーディング・フレームのアミノ酸配列を前記融合タンパク質のアミノ酸配列と比較した。ＣＲＩＰ１及びＣＲＩＰ２のオープン・リーディング・フレームのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８及び配列番号９に示される。ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１ＮにはＣＲＩＰ１の全長ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが含まれるが、ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ２にはＣＲＩＰ２の全長ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの一部しか含まれていなかった。
【実施例２】
【００５１】
ＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との相互作用に対する照射光の波長及び強度の影響
１．材料及び方法
バイトプラスミド（ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４）と、プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１Ｎ）とでＭａＶ２０３酵母が形質転換され、ＳＤ−ＬＷ寒天プレート培地上で単離コロニーが形成された。コロニーが爪楊枝でつついて釣り上げられ、３ｍＬの栄養要求性液体培地へ植菌され、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで一晩振盪培養された。培養液のＯＤ６００が測定され、ＯＤ６００１．０の培養液に換算して数十μＬ分の培養液が１０ｍＭの３−ＡＴを含むＳＤ−ＬＷＨ寒天プレート培地（１０ｃｍシャーレ）に均一に塗布された。前記寒天プレート培地の入ったシャーレは、暗条件か、以下の光条件の下、３０°Ｃのインキュベータ内で数日間培養された。照射光の波長の影響を調べる実験の光条件は、一定光子数３×１０１３個／ｃｍ２／秒、照射光源はＬＥＤ、ピーク波長は、４０５ｎｍ（紫色）か、４７１ｎｍ（青色）か、５４２ｎｍ（緑色）か、６３４ｎｍ（赤色）かであった。照射光の強度の影響を調べる実験の光条件は、光源がピーク波長４７１ｎｍ、光量が光子数１．９×１０１２個／ｃｍ２／秒（３Ｌｕｘ）ないし８．３×１０１２個／ｃｍ２／秒（１４Ｌｕｘ）であった。
【００５２】
２．結果
図１は、照射光の波長の違いがＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との相互作用に与える影響を調べる実験の結果を示す写真である。４０５ｎｍ又は４７１ｎｍの光を照射しながら培養されたシャーレでは、２重に形質転換された酵母菌のコロニーは全く形成されなかった。５４２ｎｍ又は６３４ｎｍの光を照射しながら培養されたシャーレと、暗条件、すなわち、遮光状態で培養されたシャーレとではコロニー形成がみられたが、暗条件で培養されたシャーレで形成されたコロニーの数が最も多く、６３４ｎｍの光を照射しながら培養されたシャーレで形成されたコロニーの数は暗条件で培養されたシャーレで形成されたコロニーの数よりも明らかに少なく、５４２ｎｍの光を照射しながら培養されたシャーレで形成されたコロニーの数は６３４ｎｍの光を照射しながら培養されたシャーレで形成されたコロニーの数よりも格段に少なかった。この結果から、照射光の波長が短いほどＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との結合は強く阻害されることが示唆された。
【００５３】
図２は、照射光の強度の違いがＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との相互作用に与える影響を調べる実験の結果を示す写真である。光子数１．９×１０１２個／ｃｍ２／秒（３Ｌｕｘ）の光を照射しながら培養されたシャーレで形成されたコロニーの数は、暗条件下で培養されたシャーレで形成されたコロニーの数よりも著しく少なく、毎秒光子数２．６×１０１２個／ｃｍ２（４Ｌｕｘ）の光を照射しながら培養されたシャーレで形成されたコロニーの数は、毎秒光子数１．９×１０１２個／ｃｍ２（３Ｌｕｘ）の光を照射しながら培養されたシャーレで形成されたコロニーの数より明らかに少なかった。、毎秒光子数５．０×１０１２個／ｃｍ２（８Ｌｕｘ）及び８．３×１０１２個／ｃｍ２（１４Ｌｕｘ）の光を照射しながら培養されたシャーレでは、まったくコロニーが形成されなかった。この結果から、３ｌｕｘの青色光ではＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との結合が強く阻害されるが、まだプラトーには達しておらず、３ｌｕｘと４ｌｕｘとの差は検出可能であった。
【実施例３】
【００５４】
酵母菌の光感受性増殖を利用した酵母菌フィルム現像
１．材料及び方法
バイトプラスミド（ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４）と、プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１Ｎ）とで２重に形質転換されたＭａＶ２０３酵母が１０ｍＭ  ３−ＡＴを含むＳＤ−ＬＷ液体培地に接種され、前記酵母が対数増殖期に入るまで（ＯＤ６００が約０．６になるまで）、約１６時間振盪培養された（３０°Ｃ、２６０ｒｐｍ）。寒天プレートと同等の大きさに切られた黒紙が、超純水で洗浄された後、紫外線照射により滅菌処理を施された。滅菌された前記黒紙が１０ｍＭ  ３−ＡＴを含むＳＤ−ＬＷＨ寒天プレート培地上に敷かれた。４％アガロースが添加されたＳＤ−ＬＷＨ液体培地が調製され、オートクレーブで滅菌され（１２１°Ｃ、２０分）、４８°Ｃの温浴中で保温された。厚さ１ｍｍのスペーサーを挟んだ２枚のガラス板で構成されるゲル凝固用組立体が、４８°Ｃのインキュベータ内で保温された。露光用原板として、所望の画像を透明な背景に黒く描いたＯＨＰシート（プラス株式会社、ＯＨ−００１）が用意された。この先の作業は写真用安全光下で行われた。前記４％アガロースが添加されたＳＤ−ＬＷＨ液体培地５０ｍＬに、ＯＤ６００が約０．６の酵母液１，０００μＬが混合され、前記ゲル凝固用組立体内に注入され、室温にて凝固された。凝固が完了した後、前記組立体が分解され、前記酵母が懸濁されたＳＤ−ＬＷＨ液体培地を含むアガロースゲルは、黒紙を挟んで前記寒天プレート培地上に戴置された。前記酵母を懸濁したアガロースゲルと、前記寒天プレート培地とが収容されたシャーレの蓋に、前記露光用原板が戴置された。前記露光用原板を透過した光だけが酵母に照射されるように、前記シャーレは、蓋の表面以外がアルミホイルで覆うことにより遮光された。青色ＬＥＤ（ＬｕｘｅｏｎＫ２，  ｂｌｕｅ、プレート面にて８４μＷ／ｃｍ２）の光を前記シャーレに上から照射しながら、前記シャーレは３０°Ｃで３日間培養された。
【００５５】
２．結果
図３は、日本列島の形状を描いた露光原板を用いて露光されたゲルの写真である。図３に示されるとおり、本実施例の露光方法を用いると、アガロース中に包埋された酵母は、前記露光原板の透明な背景部分では、照射光によってＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との結合が強く阻害されるために、酵母の増殖が阻害されるが、前記露光原板の黒色の描画部分では、照射光が遮られるので酵母の増殖は阻害されない。こうして前記露光原板の画像が、アガロース中での酵母の増殖パターンとして写し取られた。本実施例の結果から、ＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との相互作用を利用する遺伝子発現制御システムは、画像の輪郭を写し取ることが可能なほど鋭敏な光感受性を有することが明らかになった。
【実施例４】
【００５６】
２量体化による光感受特性の改変の定性的評価
１．２量体バイトプラスミドの作成
ｃＣｒｙ４のオープン・リーディング・フレーム全長をエンコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに終始コドンに対応するオリゴヌクレオチドが連結されたポリヌクレオチドとが、ＰＣＲ法によって調製され、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングされた(それぞれ、「ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ｃＣＲＹ４．２」及び「ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ｃＣＲＹ４」という。）。これらに基づいて、ｃＣｒｙ４の２量体（配列番号１０、以下、「ｃＣｒｙ４．２−ｃＣｒｙ４」という。）をエンコードするポリヌクレオチドが、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターにサブクローニングされた（ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４）。ｃＣｒｙ４．２−ｃＣｒｙ４は、２個のｃＣｒｙ４全長ポリペプチドが、ＮＮＳＲＲというアミノ酸残基５個のスペーサオリゴペプチド（配列番号１１）を介して直列に配置された構成を有する。ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ｃＣＲＹ４と、ｐＤＥＳＴ３２ベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、型番：ＰＱ１０００１０１）との組換え反応によって、ｐＤＥＳＴ３２−ｃＣＲＹ４（配列番号１２）が作成された。ｐＤＥＳＴ３２−ｃＣＲＹ４は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のＣ末端側にｃＣｒｙ４の全長ポリペプチドが連結した融合タンパク質（配列番号１３、以下、「ＤＢＤ−Ｃｒｙ４」という。）をエンコードする。同様に、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４と、ｐＤＥＳＴ３２ベクターとの組換え反応によって、ｐＤＥＳＴ３２−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４（配列番号１４）が作成された。プラスミドｐＤＥＳＴ３２−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）のＣ末端側にｃＣｒｙ４．２−ｃＣｒｙ４ポリペプチドが連結した融合タンパク質（配列番号１５、以下、「ＤＢＤ−ｃＣｒｙ４．２−ｃＣｒｙ４」という。）を発現することができる。
【００５７】
２．２量体プレイプラスミドの作成
前記２量体バイトプラスミドの作成の場合と同様に、ＣＲＩＰ２部分ポリペプチド２量体（配列番号１６、以下、「ＣＲＩＰ２−ＣＲＩＰ２＿４６９６−７７８２」という。）をエンコードするポリヌクレオチドがｐＥＸＰ−ＡＤ５０２ベクターにサブクローニングされた（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ２−ＣＲＩＰ２＿４６９６−７７８２、配列番号１７）。ＣＲＩＰ２−ＣＲＩＰ２＿４６９６−７７８２は、２個のＣＲＩＰ２部分ポリペプチドが、アスパラギン（Ｎ）３個のスペーサオリゴペプチドを介して直列に配置された構成を有する。プラスミドｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ２−ＣＲＩＰ２＿４６９６−７７８２は、ＧＡＬ４の転写活性化ドメイン（ＡＤ）のＣ末端側にＣＲＩＰ２−ＣＲＩＰ２＿４６９６−７７８２ポリペプチドが連結した融合タンパク質（配列番号１８、以下、「ＡＤ−ＣＲＩＰ２−ＣＲＩＰ２＿４６９６−７７８２」という。）を発現することができる。
【００５８】
バイトタンパク質及びプレイタンパク質の相互作用に対する２量体化の影響
単量体バイトプラスミド（ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４又はｐＤＥＳＴ３２−ｃＣＲＹ４）か、２量体バイトプラスミド（ｐＤＥＳＴ３２−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４）か、空バイトプラスミド（ｐＤＥＳＴ３２、配列番号１９）かと、単量体プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ２）か、２量体プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ２−ＣＲＩＰ２＿４６９６−７７８２）か、空プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２）かとの組合せで、ＭａＶ２０３酵母が２重に形質転換された。形質転換された酵母がＳＤ−ＬＷ寒天プレート培地上で選択され、コロニーが形成された。コロニーが爪楊枝でつついて釣り上げられ、３ｍＬのＳＤ−ＬＷ液体培地へ植菌され、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで一晩振盪培養された。培養液のＯＤ６００が測定され、ＯＤ６００１．０の培養液５００μＬ分が１．５  ｍＬチューブに分注された。形質転換された酵母は、滅菌水でリンスされた後、白金耳を用いて１０  ｍＭの３−ＡＴを含むＳＤ−ＬＷＨ寒天プレート培地に稙菌され、暗条件又は明条件（約４４１μＷ／ｃｍ２の青色光）の下、３０°Ｃで３日間培養された。
【００５９】
結果
図４は、２量体又は単量体のプレイ及びバイトタンパク質が２重に形質転換された酵母の暗条件下特異的なコロニー形成を示す写真である。図４に示されるとおり、バイトタンパク質は、単量体より２量体のほうが暗条件下でより多くのコロニーが形成された。そこで、単量体よりも２量体のほうが強い相互作用を行うことが明らかになった。
【実施例５】
【００６０】
多量体化による光感受特性の改変の定量的評価（１）
暗条件下での遺伝子発現の増強
１．２量体及び４量体バイトプラスミドの作成
ｃＣｒｙ４の２量体ｃＣｒｙ４．２−ｃＣｒｙ４をエンコードするｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４プラスミドから、Ｎ末端側のｃＣｒｙ４と、スペーサオリゴペプチドとを含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが制限酵素Ｃｐｏ  Ｉによって切り出され、同じ制限酵素Ｃｐｏ  Ｉで切断されたｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４プラスミドに読み枠がシフトしないように挿入された。このようにして、ＤＢＤドメインと、ｃＣｒｙ４の２量体ｃＣｒｙ４．２−ｃＣｒｙ４との融合タンパク質をエンコードするｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４（配列番号２０）が作成された。ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４が制限酵素Ｃｐｏ  Ｉで部分消化され、１カ所だけで消化された部分消化ベクターが精製された。一方、ｐＥＮＴＥＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４が制限酵素Ｃｐｏ  Ｉで完全消化され、ｃＣｒｙ４の２量体のうち、転写開始点に近い側のｃＣＲＹ４のＣ末端側と、スペーサオリゴペプチドと、転写開始点から遠い側のｃＣＲＹ４のＮ末端側とを含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが切り出されて、前記部分消化ベクターに挿入された。このようにして、ＤＢＤドメインと、ｃＣｒｙ４の４量体（配列番号２１、以下、「ｃＣｒｙ４．２×３−ｃＣｒｙ４」という。）との融合タンパク質（配列番号２２、以下、「ＤＢＤ−ｃＣｒｙ４．２×３−ｃＣｒｙ４」という。）をエンコードするプラスミドｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２×３−ｃＣＲＹ４（配列番号２３）が作成された。
【００６１】
２．バイト及びプレイタンパク質の相互作用によるβ−ガラクトシダーゼ酵素発現誘導の定量測定
ｃＣｒｙ４の単量体、２量体又は４量体と、ＤＢＤドメインとの融合タンパク質をエンコードするバイトプラスミド（ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４、ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４又はｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２×３−ｃＣＲＹ４）と、ＣＲＩＰ１Ｎの単量体プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１Ｎ）との組合せで、ＭａＶ２０３酵母が２重に形質転換された。形質転換された酵母がＳＤ−ＬＷ寒天プレート培地上で選択され、コロニーが形成された。形質転換に用いたプラスミドの組合せごとに、３個のコロニーが爪楊枝でつついて釣り上げられ、１０ｍＬのＳＤ−ＬＷ液体培地が入った試験管３本のそれぞれにコロニー１個ずつ植菌された。前記１０ｍＬの試験管は、コロニーの酵母を均一に分散した後、５ｍＬずつ明条件下で培養する試験管と暗条件下で培養する試験管とに分けられ、暗条件下で培養する試験管がアルミホイルで遮光された後、全ての試験管が振盪培養装置に取り付けられた。前記振盪培養装置は、青色パネル発光装置を有し、さらに前記振盪培養装置全体を覆うことのできる暗幕を備えている。そこで、前記振盪培養装置を前記暗幕で覆うことにより、外光から遮断された状態で、該振盪培養装置の上から青色光を前記試験管に照射しながら振盪培養を行うことができる。前記試験管中の酵母は、約７７μＷ／ｃｍ２の青色光照射条件下、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで終夜振盪培養された。翌日、培養液のＯＤ６００が測定され、ＯＤ６００１．０の培養液１５００μＬ分が別の試験管に分注され、全量が５ｍＬとなるようにＹＰＡＤ液体培地が添加された。暗条件下で培養する試験管がアルミホイルで遮光された後、全ての試験管が前記振盪培養装置に固定され、約７７μＷ／ｃｍ２の青色光照射条件下、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで再び３時間振盪培養された。
【００６２】
前記３時間の振盪培養の後、各試験管の培養液のＯＤ６００が測定された。そして、前記試験管の培養液５ｍＬから１．５ｍＬが分取され、１０，０００×ｇ、室温、３０秒間の遠心の後、ペレットが１．５ｍＬのＺバッファーに懸濁された。さらに前記ペレットは、１０，０００×ｇ、室温、３０秒間の遠心により洗浄され、３００μＬのＺバッファーに再懸濁された。前記３００μＬのＺバッファーのうち１００μＬが別の試験管に分取され、該試験管は液体窒素に３０秒間浸されて、酵母の菌体細胞が完全に凍結された。前記試験管は３７°Ｃの湯浴に１分間浸され、前記酵母細胞は融解された。この凍結及び融解のステップをもう１度繰り返して得られた細胞溶解液は、５μＬずつ１．５ｍＬ試験管に分注され、測定用サンプルとして用いられた。
【００６３】
十分な量のＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＫｉｔＩＩ、ＣＬＯＮＴＥＣＨ、型番６３１７１２）が分注され、アルミホイルで遮光された状態で室温に戻された。室温に戻された前記Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒに１／５０量のＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（前記キットに付属）が添加され、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅが調製された。また、終濃度が２０、４０、１２０、４００及び８００ユニット／ＬとなるようにＺバッファーで希釈されたＰｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（前記キットに付属）溶液が５μＬずつ１．５ｍＬ試験管に分注され、較正用サンプルとして用いられた。
【００６４】
前記各サンプルに４０μＬの前記Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｓｔａｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅが添加され、穏やかに混和された。全てのサンプルは室温で１時間インキュベートされた後、１６，０００×ｇ、４°Ｃ、１分間遠心された。各サンプルの遠心上清の発光量（ＲＬＵ値）が５秒間ルミノメーター（ＧＥＮＥ  ＬＩＧＨＴ  ５５（Ｍｉｃｒｏｔｅｃ、ＧＬ−１００Ａ）、測定感度：５×１０−１３Ｍ（モル／Ｌ  ＡＴＰ））で測定された。測定されたＲＬＵ値を前記３時間の振盪培養後の培養液のＯＤ６００で割った商が、各サンプルの実験値とされた。較正用サンプルのβ−ガラクトシダーゼ活性からβ−ガラクトシダーゼ活性と発光量との較正曲線が作成され、前記各サンプルの実験値を前記較正曲線にプロットすることにより、各サンプルのβ−ガラクトシダーゼ活性測定値が算出された。
【００６５】
３．結果
図５は、単量体、２量体又は４量体バイトプラスミド（それぞれＣＲＹ４×１、ＣＲＹ４×２及びＣＲＹ４×４）と、単量体プレイプラスミドＣＲＩＰ１とで２重形質転換された酵母が、暗条件（Ｄ）又は青色光照射による明条件（Ｌ）で３時間培養された間に発現が誘導されたβ−ガラクトシダーゼ活性を示す棒グラフである。図の中の数字は、同一のバイトプラスミドで形質転換された酵母の暗条件と明条件とでのβ−ガラクトシダーゼ活性の比か、あるいは、単量体バイトプラスミドと２量体バイトプラスミドとで形質転換された酵母の明条件でのβ−ガラクトシダーゼ活性の比か、２量体バイトプラスミドと４量体バイトプラスミドとで形質転換された酵母の明条件でのβ−ガラクトシダーゼ活性の比かを表す。暗条件のグラフは同一条件で行った３個の異なるコロニー由来の培養でのβ−ガラクトシダーゼ活性測定値の平均値で、それぞれの誤差棒は前記測定値の標準偏差を示す。異なる実験条件の棒グラフを結ぶ線に付されたアステリク印は、それぞれの実験条件の間でのステューデントｔテストの結果、有意差（ｐ＜０．０１）が認められたことを表す。図５から明らかなとおり、単量体バイトプラスミドで形質転換された酵母と２量体バイトプラスミドで形質転換された酵母とでは、β−ガラクトシダーゼ活性が３５倍増強され、単量体バイトプラスミドで形質転換された酵母と４量体バイトプラスミドで形質転換された酵母とでは、β−ガラクトシダーゼ活性が５８倍増強された。この結果から、ｃＣｒｙ４をバイトタンパク質に用いる場合には、単量体より２量体のほうがプレイタンパク質との相互作用が３５倍増強され、２量体より４量体のほうが１．６倍増強されることが明らかになった。
【実施例６】
【００６６】
多量体化による光感受特性の改変の定量的評価（２）
照射光の波長及び強度の影響
１．異なる波長及び強度の光照射条件下での形質転換酵母の培養
実施例５と同様に、ｃＣｒｙ４の単量体、２量体又は４量体と、ＤＢＤドメインとの融合タンパク質をエンコードするバイトプラスミド（ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４、ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２−ｃＣＲＹ４又はｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２×３−ｃＣＲＹ４）と、ＣＲＩＰ１Ｎの単量体プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１Ｎ）との組合せで、ＭａＶ２０３酵母が２重に形質転換された。形質転換された酵母がＳＤ−ＬＷ寒天プレート培地上で選択され、コロニーが形成された。形質転換に用いたプラスミドの組合せごとに、３個のコロニーが爪楊枝でつついて釣り上げられ、２ｍＬのＳＤ−ＬＷ液体培地が入った試験管３本のそれぞれにコロニー１個ずつ植菌された。
【００６７】
前記試験管は採光窓付きの暗箱に収容されて振盪培養に供されるが、該暗箱は、直方体の形状を有し、その１つの面の一部が切り取られて採光窓が設けられ、該採光窓に５０％又は２５％減光用（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）フィルターが取り付けられるか、減光用フィルターなしかの３種類がある。振盪培養装置は、４７０ｎｍ（青色）、５２５ｎｍ（緑色）又は５９０ｎｍ（橙色）の波長の光を一定の強度で照射できるＬＥＤ発光装置を有し、さらに前記振盪培養装置全体を覆うことのできる暗幕を備えている。そこで、前記振盪培養装置を前記暗幕で覆うことにより、外光から遮断された状態で、該振盪培養装置の横から青色光を前記暗箱内の試験管に照射しながら振盪培養を行うことができる。前記試験管中の酵母は、アルミホイルで遮光されるか、採光窓に５０％又は２５％減光用フィルターが取り付けられた暗箱に収容されるか、減光用フィルターなしの採光窓付きの暗箱に収容されるかの状態で、４７０ｎｍ、５２５ｎｍ又は５９０ｎｍの波長の光を、毎秒光子数５．９２×１０１３個／ｃｍ２（４７０ｎｍの光で２５μＷ／ｃｍ２の強度に相当する）の強度で照射する条件下で２３０ｒｐｍ、３０°Ｃ終夜振盪培養された。翌日、培養液のＯＤ６００が測定され、ＯＤ６００１．０の培養液６００μＬ分が別の試験管に分注され、全量が２ｍＬとなるようにＹＰＡＤ液体培地が添加された。暗条件下で培養する試験管がアルミホイルで遮光された後、終夜培養と同一の照射条件下で、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで再び３時間振盪培養された。培養後の酵母は実施例５と同じ手順によって処理され、各サンプルのβ−ガラクトシダーゼ活性測定値が算出された。
【００６８】
２．結果
図６は、３種類の異なるバイトプラスミドのいずれかと、同一のプレイプラスミドとで２重に形質転換された酵母で発現誘導されるβ−ガラクトシダーゼ活性に対する照射光の波長及び強度の影響を示す線グラフである。図６から明らかなとおり、照射光が強いほど、暗条件に比べて明条件でのβ−ガラクトシダーゼ活性が下がるため、明条件でのβ−ガラクトシダーゼ活性に対する暗条件でのβ−ガラクトシダーゼ活性の比（Ｄ／Ｌ）は照射光の強度が高いほど大きくなった。また、バイトタンパク質が単量体から２量体、４量体と多量体化が進むにつれて、暗条件で誘導されるβ−ガラクトシダーゼ活性そのものが高くなった。照射光の波長が５２５ｎｍ（緑色）又は５９０ｎｍ（橙色）のときには明条件でもほとんどβ−ガラクトシダーゼ活性の低下はみられなかった。
【実施例７】
【００６９】
遮光によるＣＲＩＰ１とｃＣｒｙ４との相互作用の回復
１．遮光後のβ−ガラクトシダーゼ活性の経時変化
実験群として、ｃＣｒｙ４の単量体と、ＤＢＤドメインとの融合タンパク質をエンコードするバイトプラスミド（ｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４）と、ＣＲＩＰ１Ｎの単量体プレイプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１Ｎ）との組合せで、ＭａＶ２０３酵母が２重に形質転換された。形質転換された酵母がＳＤ−ＬＷ寒天プレート培地上で選択され、コロニーが形成された。陽性対照として、ＧＡＬ４（ＤＢＤとＡＤとを分割していないもともとの転写因子）を発現するプラスミドで形質転換されたＭａＶ２０３酵母株が用いられた。また、陰性対照として、ＧＡＬ４のＤＢＤドメイン（配列番号２４）のみをエンコードするプラスミド（ｐＤＢＬｅｕ、配列番号２５）と、ＧＡＬ４の転写活性化ドメイン（配列番号２５）のみをエンコードするプラスミド（ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２）とで２重に形質転換されたＭａＶ２０３酵母が用いられた。それぞれの２重形質転換酵母は、ＳＤ−ＬＷ寒天プレート培地上で選択され、形成されたコロニーが爪楊枝でつついて釣り上げられ、５ｍＬのＳＤ−ＬＷ液体培地が入った試験管のそれぞれにコロニー１個ずつ植菌された。
【００７０】
全ての試験管が振盪培養装置に取り付けられた。前記振盪培養装置は、青色パネル発光装置を有し、さらに前記振盪培養装置全体を覆うことのできる暗幕を備えている。前記試験管中の酵母は、約１５．２μＷ／ｃｍ２の青色光照射条件下、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで終夜振盪培養された。翌日、培養液のＯＤ６００が測定され、ＯＤ６００１．０の培養液１５００μＬ分ずつが別の試験管６本に分注され、全量が５ｍＬとなるようにＹＰＡＤ液体培地が添加された。陰性対照及び陽性対照についても、同じ濃度に調整され、全量が５ｍＬとなるようにＹＰＡＤ液体培地が添加された試験管が６本ずつ用意された。
【００７１】
前記試験管は全て約１５．２μＷ／ｃｍ２の青色光照射条件下、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで２１０分間振盪培養された。そして、培養開始時からアルミホイルで遮光される試験管が、暗条件で２１０分培養されるサンプルとして用意され、1培養開始後３０分、１２０分、１８０分及び２００分にアルミホイルで遮光され、引き続き振盪培養される試験管が、それぞれ、暗条件で１８０分、９０分、３０分及び１０分培養されるサンプルとして用意された。培養後の酵母は実施例５と同じ手順によって処理され、各サンプルのβ−ガラクトシダーゼ活性測定値が算出された。
【００７２】
２．結果
図７は、ともに単量体のバイトプラスミド及びプレイプラスミドで２重に形質転換された酵母と、陽性対照の酵母と、陰性対照の酵母とについて、遮光により暗条件に移行後の培養時間と、最後まで明条件下で培養された酵母でのβ−ガラクトシダーゼ活性に対する暗条件培養後のβ−ガラクトシダーゼ活性の比とを示すグラフである。各実験条件ごとのサンプル数は２である。図７のグラフの各ポイントは、菱形（◇）が実験群で、三角（△）が陰性対照で、四角（□）が陽性対照であった。図７から明らかなとおり、暗条件下での培養開始３７分後からβ−ガラクトシダーゼ活性が上昇しはじめ、ほぼ直線的に増加した。陽性対照及び陰性対照は、いずれも暗条件に移行してもβ−ガラクトシダーゼ活性は明条件下とほぼ同じであった。この結果から、本発明のｃＣｒｙ４とＣＲＩＰ１との相互作用は、光が遮られてもすぐには検出されず、半時間を超えるタイムラグが必要であるので、比較的緩慢に進行することが明らかとなった。
【実施例８】
【００７３】
光感受性の遺伝子発現調節特性
１．レポータコンストラクトの作成 
本発明の光感受性遺伝子発現調節システムが、任意の遺伝子の調節に利用可能であることを実証するための新たなレポータコンストラクトとして、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と、発明者らが作成したゼブラフィッシュＣＲＹ４のＣ末端部分に対するモノクローナル抗体（Ｄ１ｍＡｂ）が認識するアミノ酸１０残基からなるエピトープとを含むアミノ酸残基２５個からなる融合タンパク質（配列番号２６、以下、「ＧＳＴ−ＭＥ２５」という。）をエンコードするポリヌクレオチドが、Ｇａｌ１プロモーターの下流に連結され、本発明のバイト及びプレイタンパク質の相互作用によって誘導可能にされたプラスミドｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＧＳＴ−ＭＥ２５（配列番号２７）が作成された。
【００７４】
２．陽性又は陰性対照のバイト及びプレイプラスミドの作成
光感受性のない陽性対照として、ＤＢＤドメインとｃＦｏｓポリペプチドの一部との融合タンパク質をエンコードする対照バイトプラスミド（ｐＰＣ９７−ｃＦｏｓ）と、ＡＤドメインとｃＪｕｎポリペプチドの一部との融合タンパク質をエンコードする対照プレイプラスミド（ｐＰＣ８６−ｃＪｕｎ）とが用意された。またＧａｌ１プロモーターの転写誘導活性のない陰性対照として、ＤＢＤドメインのみをエンコードするｐＤＢＬｅｕと、ＡＤドメインのみをエンコードするｐＥＸＰ−ＡＤ５０２とが用意された。
【００７５】
３．多重形質転換酵母の調製
前記レポータコンストラクトｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＧＳＴ−ＭＥ２５と、ｃＣｒｙ４の４量体を含むバイトタンパク質を発現するｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２×３−ｃＣＲＹ４と、ＣＲＩＰ１の単量体を含むプレイタンパク質を発現するｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１ＮとでＭａＶ２０３酵母が形質転換された。陽性対照として、前記レポータコンストラクトｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＧＳＴ−ＭＥ２５と、ｐＰＣ９７−ｃＦｏｓと、ｐＰＣ８６−ｃＪｕｎとでＭａＶ２０３酵母が形質転換された。陰性対照として、前記レポータコンストラクトｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２−ＧＳＴ−ＭＥ２５と、ｐＤＢＬｅｕと、ｐＥＸＰ−ＡＤ５０２とでＭａＶ２０３酵母が形質転換された。
【００７６】
４．転写誘導活性の検出
それぞれの３重形質転換酵母は、ＳＤ−ＬＷＵ寒天プレート培地上で選択され、形成されたコロニーが爪楊枝でつついて釣り上げられ、１０ｍＬのＳＤ−ＬＷＵ液体培地が入った試験管のそれぞれにコロニー１個ずつ植菌された。
【００７７】
全ての試験管が振盪培養装置に取り付けられた。前記振盪培養装置は、青色パネル発光装置を有し、さらに前記振盪培養装置全体を覆うことのできる暗幕を備えている。前記試験管中の酵母は、約１００μＷ／ｃｍ２の青色光照射条件下、２３０ｒｐｍ、３０°Ｃで終夜振盪培養された。暗条件培養の試験管は、アルミホイルで遮光された。翌日、培養液のＯＤ６００が測定され、ＯＤ６００１．０以上であることを確認し、ＯＤ６００２．０の培養液８００μＬ分ずつが別の５０ｍＬ試験管に分注され、全量が２０．４ｍＬとなるようにＹＰＡＤ液体培地が添加された。陰性対照及び陽性対照についても、同じ濃度に調整され、全量が２０．４ｍＬとなるようにＹＰＡＤ液体培地が添加された５０ｍＬ試験管が用意された。
【００７８】
明条件下で終夜培養された酵母は、さらに５時間明条件下で培養されるグループと、４時間は明条件下で培養されるが、最後の１時間だけ暗条件下で培養されるグループとに分けられた（図８Ａ）。同様に、暗条件下で終夜培養された酵母は、さらに５時間暗条件下で培養されるグループと、４時間は暗条件下で培養されるが、最後の１時間だけ明条件下で培養されるグループとに分けられた（図９Ａ）。
【００７９】
全ての試験管は、培養終了後、氷上で５分間以上静置された。４００μＬを用いて、再度ＯＤ６００が測定された。前記ＯＤ６００測定値と、培養液の体積（ｍＬ）との積として各試験管についてＯＤ６００ユニットが計算された。各試験管について、７．５ＯＤ６００ユニットあたり１００μＬの完全破砕バッファーが調製され、６０°Ｃに加温された。氷上で静置された前記試験管は、１，０００×ｇ、４°Ｃ、５分間遠心され、上清が除去された後、ペレットは１．０ｍＬの氷冷滅菌水に懸濁され、１．５ｍＬチューブに移された。再度１，０００×ｇ、４°Ｃ、５分間遠心され、上清が除去された。ペレットが７．５ＯＤ６００ユニットあたり１００μＬの完全破砕バッファーで懸濁された。この懸濁液１００μＬが、ガラスビーズ８０μＬを含む１．５ｍＬチューブに移された。前記１．５ｍＬチューブは１０分間、７０°Ｃに加温され、ボルテックスで１分間撹拌されて、酵母菌体が破砕された。その後、前記１．５ｍＬチューブは１８，０００×ｇ、４°Ｃ、５分間遠心された。１００°Ｃで５分間処理された後、撹拌され、１８，０００×ｇ、４°Ｃ、５分間遠心した後、上清５０μＬが新たな１．５ｍＬチューブに移された。前記上清は１０分間、９０°Ｃに加温された後、液体窒素で瞬間凍結されて、−８０°Ｃで保存された。その後、前記上清はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法と、Ｄ１ｍＡｂを用いたウェスタンブロッティング法とに供され、各サンプル中のＧＳＴ−ＭＥ２５融合タンパク質の発現が解析された。大腸菌で産生された組換えＧＳＴ−ＭＥ２５融合タンパク質の精製標品が、サンプルとともにＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及びウェスタンブロッティング法とに供され、発現量の定量に用いられた。
【００８０】
５．結果
図８Ａは、明条件下で終夜培養された酵母について、さらに５時間明条件下で培養されるグループ（Ｌ）と、５時間暗条件下で培養されるグループ（Ｄ）との明暗スケジュールの模式図である。図８Ｂは、３種類の異なるバイト及びプレイプラスミドと、レポータコンストラクトとで多重形質転換された酵母でのレポータタンパク質ＧＳＴ−ＭＥ２５（ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇ）の発現を比較したウェスタンブロット結果図である。前記３種類の異なるバイト及びプレイプラスミドとは、ｃＣｒｙ４の４量体を含むバイトタンパク質を発現するｐＤＢＬｅｕ−ｃＣＲＹ４．２×３−ｃＣＲＹ４と、ＣＲＩＰ１の単量体を含むプレイタンパク質を発現するｐＥＸＰ−ＡＤ５０２−ＣＲＩＰ１Ｎとの組み合わせ（ＤＢＤ−ｃＣＲＹｘ４／ＡＤ−ＣＲＩＰ）と、陰性対照として、ＤＢＤドメインのみをエンコードするｐＤＢＬｅｕと、ＡＤドメインのみをエンコードするｐＥＸＰ−ＡＤ５０２との組み合わせ（空ベクター）と、陽性対照として、ＤＢＤドメインとｃＦｏｓポリペプチドの一部との融合タンパク質をエンコードする対照バイトプラスミド（ｐＰＣ９７−ｃＦｏｓ）と、ＡＤドメインとｃＪｕｎポリペプチドの一部との融合タンパク質をエンコードする対照プレイプラスミド（ｐＰＣ８６−ｃＪｕｎ）との組み合わせ（ＤＢＤ−ｃＦｏｓ／ＡＤ−ｃＪｕｎ）とである。図８Ｂから明らかなとおり、ＤＢＤ−ｃＣＲＹｘ４／ＡＤ−ＣＲＩＰは、明条件から暗条件への移行後５時間（Ｄ）でレポータタンパク質ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇの発現が検出されたが、明条件のまま（Ｌ）ではレポータタンパク質ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇの発現は検出されなかった。これに対し、陰性対照（空ベクター）では、光照射の有無にかかわらずレポータタンパク質ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇの発現は検出されなかった。逆に陽性対照（ＤＢＤ−ｃＦｏｓ／ＡＤ−ｃＪｕｎ）では、光照射の有無にかかわらずレポータタンパク質ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇの強い発現が検出された。この結果から、明条件下では本発明のバイトプラスミド及びプレイプラスミドは遺伝子発現を完全に抑制し、５時間連続して暗条件下で培養するだけで、遺伝子及びタンパク質の有意な発現がみられた。
【００８１】
図９Ａは、暗条件下で終夜培養された酵母について、さらに５時間暗条件下で培養されるグループ（Ｄ）と、５時間明条件下で培養されるグループ（Ｌ）との明暗スケジュールの模式図である。図９Ｂは、３種類の異なるバイト及びプレイプラスミドと、レポータコンストラクトとで多重形質転換された酵母でのレポータタンパク質ＧＳＴ−ＭＥ２５（ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇ）の発現を比較したウェスタンブロット結果図である。前記３種類の異なるバイト及びプレイプラスミドとは、図８Ｂと同じである。図９Ｂから明らかなとおり、ＤＢＤ−ｃＣＲＹｘ４／ＡＤ−ＣＲＩＰは、暗条件のまま（Ｄ）ではレポータタンパク質ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇの強い発現が検出された。５時間の暗条件下の培養で、約５０μｇ／Ｌのレポータタンパク質の発現が認められた。一方、暗条件から明条件への移行後５時間（Ｌ）でレポータタンパク質ＧＳＴ−Ｄ１ｔａｇの発現は全く検出されなくなった。この結果から、暗条件下では本発明のバイトプラスミド及びプレイプラスミドは遺伝子発現を強く誘導するが、５時間連続して明条件下で培養すると、レポータタンパク質の発現は完全に消失していた。
【００８２】
本実施例で示すとおり、本発明の光感受性の遺伝子発現調節システムは、暗条件下では遺伝子発現を強く誘導することができ、明条件では遺伝子発現を完全に抑制することができる。また、暗条件から明条件に切り替えると、速やかに遺伝子発現が強く抑制され、逆に、明条件から暗条件に切り替えても、遺伝子発現の強い誘導はみられない。このような光感受特性は従来のものとは全く逆である。
【図７】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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