(57)【要約】【課題】疾患または障害の診断および治療のためのＡＮＧＰＴＬ４組成物、およびそのような組成物、およびそのアゴニストまたはアンタゴニストを用いる方法であって、細胞の増殖、細胞の接着および細胞の移動を変調することを含む方法を提供すること。【解決手段】例えば、この方法は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを、肝細胞またはプレ肝細胞の集団に投与し、それにより、増殖を誘導することを含む。１つの態様において、該投与工程は、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸を投与することを含む。ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４のアゴニストは、肝臓の機能障害、疾患および損傷の治療で用いることができる。１つの態様において、ＡＮＧＰＴＬ４は，ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸によって供される。本発明の１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストはαＶβ５受容体に対するアゴニストである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における生物学的活性を刺激するための、有効量のアンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）アゴニストを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、セクション１１９（ｅ）の下、２００４年７月２０日に出願された米国仮出願番号６０／５８９，８７５（この明細書は、本明細書で参考として援用される）の利益に対し優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）に関する。本発明は、状態または障害の診断および治療用の、ＡＮＧＰＴＬ４およびそのアゴニストおよびアンタゴニストを用いる組成物ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）は、分泌型タンパク質のアンジオポエチンファミリーのメンバーである。アンジオポエチンファミリーの保存された領域は、コイルドコイルドメインおよびＣ末端フィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインを含む。例えば、非特許文献１を参照のこと。該ファミリーの他のメンバーはアンジオポエチン１、アンジオポエチン２およびアンジオポエチン３を含む。アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、およびアンジオポエチン３／アンジオポエチン４はＴｉｅ２受容体に結合する。例えば、非特許文献２、非特許文献３および非特許文献４ならびに特許文献１、特許文献２および特許文献３を参照のこと。アンジオポエチン１および４はＴｉｅ２受容体に対するアゴニストであるように見え、他方、アンジオポエチン２および３はＴｉｅ２受容体に対するアンタゴニスト（および恐らくはアゴニスト）であるように見える。例えば、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献３および非特許文献７を参照のこと。Ｔｉｅ２受容体は内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼのファミリーに属し、これはＴｉｅ１オーファン受容体も含む。該ファミリーのもう１つのメンバーである、アンジオポエチン様３タンパク質はインテグリンαＶβ３に結合することが見出された。例えば、特許文献４および非特許文献８を参照のこと。
【０００４】
ＡＮＧＰＴＬ４は他の用語によって知られている。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４は、肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質（ＨＦＡＲＰ）（非特許文献１）、ＰＰＡＲγアンジオポエチン関連タンパク質（ＰＧＡＲ）（非特許文献９）、および空腹時（ｆａｓｔｉｎｇ）誘導アジポース因子（ＦＩＡＦ）（非特許文献１０）としても知られている。
【０００５】
ＡＮＧＰＴＬ４のインビトロおよびインビボ研究および特徴付けは、ＡＮＧＰＴＬ４の活性および／または発現に関連する状態または機能不全の予防、軽減または修正で有用な治療剤および／または治療の価値ある同定および発見を提供することができる。例えば、組織培養実験および遺伝子工学により作製されたマウスは、免疫学、癌、神経生物学、心血管生物学、肥満その他多くのものを含めた、ヒト状態に関連する生物学的プロセスの機能的解明のための貴重なツールであることが判明している。ＡＮＧＰＴＬ４の多くの生物学的機能を発見し、理解する要望が存在する。本発明は、以下の開示に鑑みると明らかなように、これらおよび他の要望に取り組む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，５２１，０７３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６５０，４９０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８１４，４６４号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００３０２１５４５１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０００）３４６：６０３−６１０
【非特許文献２】Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ（１９９６）８７，１１６１−１１６９
【非特許文献３】Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７７，５５−６０
【非特許文献４】Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６，１９０４−１９０９
【非特許文献５】ＦｏｌｋｍａｎおよびＤ’Ａｍｏｒｅ．Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：１１５３−１１５５
【非特許文献６】Ｓｕｒｉら、Ｃｅｌｌ（１９９６）８７：１１７１−１１８０
【非特許文献７】ＷａｒｄおよびＤｕｍｏｎｔ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）１３：１９−２７
【非特許文献８】Ｃａｍｅｎｉｓｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００２）２７７（１９）：１７２８１−１７２９０
【非特許文献９】Ｙｏｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０００）２０：５３４３−５３４９
【非特許文献１０】Ｋｅｒｔｅｎら、Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７５：２８４８８−２８４９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）に関する。本発明は、異常なＡＮＧＰＴＬ４の発現もしくは活性によって特徴付けられる状態もしくは疾患、ならびに／またはＡＮＧＰＴＬ４発現および／もしくは活性に関連する状態もしくは疾患を治療するための、ＡＮＧＰＴＬ４もしくはそのサブ配列、またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストの使用を提供する。
【０００９】
ＡＮＧＰＴＬ４、またはそのアゴニストまたはアンタゴニストによって肝細胞の増殖を変調する方法が提供される。ある実施形態において、方法は、肝細胞の増殖を誘導することを含む。例えば、方法は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを、肝細胞またはプレ肝細胞（ｐｒｅ−ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）の集団に投与し、それにより、増殖を誘導することを含む。１つの態様において、該投与工程は、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸を投与することを含む。別法として、または加えて、肝細胞またはプレ肝細胞においてＡＮＧＰＴＬ４の産生を誘導する有効量の因子を投与して、増殖を刺激することができる。ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４のアゴニストは、有効量のＡＮＧＰＴＬ４またはアゴニストを投与することによって、肝臓の機能障害、疾患および損傷の治療で用いることができる。１つの態様において、ＡＮＧＰＴＬ４は，ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸によって供される。本発明の１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストはαＶβ５受容体に対するアゴニストである。
【００１０】
肝細胞の増殖を阻害するための方法も提供される。ある実施形態においては、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物の有効量を肝細胞またはプレ肝細胞の集団に投与することを含む。１つの態様において、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の産生を阻害する因子（例えば、アンチセンス分子またはリボザイム分子）である。１つの態様において、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体である。もう１つの態様において、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは抗αｖβ５アンタゴニスト抗体である。１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストはＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡである。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを肝細胞に投与することによって、例えば、肝癌または望ましくない肝臓肥大の治療で用いることができる。
【００１１】
肝細胞の細胞接着を変調するための方法も提供される。ある実施形態において、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを含む組成物の有効量を肝細胞の集団に投与することによって、肝細胞の細胞接着を誘導することを含む。他の実施形態において、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物の有効量を肝細胞の集団に投与し、それにより、肝細胞の細胞接着を阻害することを含む。
【００１２】
脂質ホメオスタシスに関与する、肝細胞の増殖および細胞接着を変調することに加えて、ＡＮＧＰＴＬ４は、血清中のトリグリセリドおよびコレステロールのレベルを変調し、やはり脂質ホメオスタシスに関与するプレ脂肪細胞（ｐｒｅ−ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）の増殖を刺激する。本発明は、脂質ホメオスタシスの多数の種々の態様を変調する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを含む組成物の有効量をプレ脂肪細胞の集団に投与し、それにより、プレ脂肪細胞の増殖を誘導することによって、プレ脂肪細胞の増殖を刺激することを含む。プレ脂肪細胞の増殖を阻害する方法も提供される。例えば、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物の有効量をプレ脂肪細胞の集団に投与することを含む。プレ脂肪細胞の細胞移動を変調する方法も含まれる。例えば、本発明の方法は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストをプレ脂肪細胞の集団に投与することによってプレ脂肪細胞の細胞移動を誘導することを含む。プレ脂肪細胞の細胞移動を阻害する方法も提供され、これは、例えば、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストをプレ脂肪細胞の集団に投与し、それにより、細胞移動を阻害することを含む。
【００１３】
被験体においてトリグリセリドまたはコレステロールの血清中レベルを変調する方法も本発明で提供される。例えば、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物の有効量を被験体に投与し、それにより、被験体におけるトリグリセリドおよび／またはコレステロールの血清中レベルを変調することを含む。１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストが投与され、その結果、対照と比較して被験体の血清中にトリグリセリドおよび／またはコレステロールが蓄積される。もう１つの実施形態において、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが被験体に投与され、それにより、被験体の血清中の少なくとも１つのトリグリセリド、遊離脂肪酸および／またはコレステロールのレベルを低下させる。本発明のある実施形態において、対照は治療前の被験体、または治療を受けていないまたは治療を減らした被験体由来の血清である。
【００１４】
ＡＮＧＰＴＬ４およびＡＮＧＰＴＬ４モジュレーター（そのアゴニストまたはアンタゴニスト）を使用して、これらの分子の有効量を被験体に投与することによる脂質ホメオスタシス障害の治療で用いることができる。本明細書中における「定義」の項目の「脂質ホメオスタシス障害」参照。例えば、方法は、高脂血症を治療するのに有効な量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物を被験体に投与することを含む。
【００１５】
被験体において肥満を治療し、および／または全体重を低下させる方法も提供される。例えば、該方法は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４モジュレーターを被験体に投与し、それにより、治療無し、または対照での処置と比較して、被験体において肥満を治療し、および／または全体重を低下させることを含む。１つの実施形態において、被験体の肥満症（脂肪）が低下する。このようにして、肥満に関連する状態、例えば、心血管疾患、糖尿病なども治療することができる。
【００１６】
本発明のある実施形態において、細胞、例えば、肝細胞、プレ脂肪細胞は被験体中のものである。典型的には、被験体はヒトである。
【００１７】
本発明のＡＮＧＰＴＬ４は、全長タンパク質ならびに生物学的に活性な分子、例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ−末端、Ｎ−末端コイルドコイルドメイン、Ｃ末端、Ｃ末端フィブリノーゲン様ドメイン、またはＡＮＧＰＴＬ４（１〜１８３）、ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）、ＡＮＧＰＴＬ４（１〜約１６２）、ＡＮＧＰＴＬ４（約１６２〜４０６）、ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４０６）、もしくはＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）アミノ酸サブ配列、および／またはマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＡＮＧＰＴＬ４（１〜１８３）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（１〜約１６５）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜約１６５）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）またはｍＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４１０）アミノ酸サブ配列に対応する残基を含む。他のサブ配列は、限定されるものではないが、例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４０６、６０〜４０６、８０〜４０６、１００〜４０６、１２０〜４０６、１４０〜４０６、および１６０〜４０６、および例えば、ｍＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４１０、６０〜４１０、８０〜４１０、１００〜４１０、１２０〜４１０、１４０〜４１０、および１６０〜４１０も含む。アゴニストＡＮＧＰＴＬ４は、ＡＮＧＰＴＬ４を活性化する分子、またはＡＮＧＰＴＬ４活性を生じる分子、例えば、活性なポリペプチド、低分子、およびＡＮＧＰＴＬ４の活性または発現を増加させる分子を含む。ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストはαｖβ５アゴニストも含む。
【００１８】
本発明のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、ＡＮＧＰＴＬ４の活性を阻害するか、または低下させる分子である。ＡＮＧＰＴＬ４阻害剤は低分子量の物質、ポリヌクレオチド、アンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、ＡＮＧＰＴＬ４またはその受容体ポリペプチドに対するリボザイム、ポリペプチド、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニスト改変体、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはその結合体または融合タンパク質を含むことができ、それは、直接的または間接的にＡＮＧＰＴＬ４活性を阻害する。本発明のある実施形態において、アンタゴニストＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の特異的なサブ配列または領域、例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ４のＮ−末端、Ｎ−末端コイルドコイルドメイン、Ｃ末端、Ｃ末端フィブリノーゲン様ドメイン、またはＡＮＧＰＴＬ４（１〜１８３）、ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）、ＡＮＧＰＴＬ４（１〜約１６２）、ＡＮＧＰＴＬ４（約１６２〜４０６）、ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４０６）、またはＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）アミノ酸サブ配列、および／またはマウスＡＮＧＰＴＬ４のｍＡＮＧＰＴＬ４（１〜１８３）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（１〜約１６５）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜約１６５）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）またはｍＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４１０）アミノ酸サブ配列に結合することによって、ＡＮＧＰＴＬ４の活性を阻害し、または低下させる抗体である。他のサブ配列は、限定されるものではないが、例えばｈＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４０６、６０〜４０６、８０〜４０６、１００〜４０６、１２０〜４０６、１４０〜４０６、および１６０〜４０６ならびに、例えば、ｍＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３、６０〜１８３、８０〜１８３、１００〜１８３、１２０〜１８３、１４０〜１８３、４０〜４１０、６０〜４１０、８０〜４１０、１００〜４１０、１２０〜４１０、１４０〜４１０、および１６０〜４１０も含む。本発明のある実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストは抗―αｖβ５抗体、例えば、アンタゴニスト抗―αｖβ５抗体である。ある実施形態において、本発明の抗体はヒト化抗体である。本発明のある実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストはＳｉＲＮＡ分子である。１つの実施形態において、ＳｉＲＮＡ分子はＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子であり、該分子は、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸のＤＮＡ配列（例えば、ＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡ）（配列番号３）を標的とする。ＡＮＧＰＴＬ４のイムノアドヘシンは、少なくとも、免疫グロブリン配列に融合したＡＮＧＰＴＬ４の受容体―結合領域を含む。ある実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４、アゴニストまたはアンタゴニストは担体、例えば、医薬上許容される担体と一緒にされる。
【００１９】
ＡＮＧＰＴＬ４トランスジェニックおよびノックアウト動物が記載され、これらのトランスジェニック動物の使用も提供される。本発明は、そのゲノムがＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物に由来する単離された細胞も提供する。ある実施形態において、単離された細胞はマウス細胞（例えば、胚性幹細胞）を含む。
【００２０】
ＡＮＧＰＴＬ４の突然変異型の遺伝子破壊の結果、アテローム性動脈硬化症を含む、心血管、内皮または血管形成障害；脂質ホメオスタシス障害を含む異常な代謝障害；または免疫学的障害および炎症障害を含む、種々の疾患状態または機能不全に関連する表現型が観察された。本発明の方法は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４のアゴニストまたはアンタゴニストを被験体に投与し、それにより、当該障害または疾患を効果的に治療することによって、心血管、内皮または血管形成障害；異常な代謝障害、免疫学的障害；脂質ホメオスタシス障害、あるいはＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊に関連した、あるいはＡＮＧＰＴＬ４活性に関連した腫瘍学的障害を治療することを含む。
【００２１】
ＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊に関連した表現型を同定する方法も提供される。例えば、該方法は（ａ）そのゲノムがＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定し；次いで、（ｂ）測定された生理学的特徴を、性が一致する野生型動物のそれと比較することを含む。遺伝子破壊に由来する表現型は、野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴として同定される。非ヒトトランスジェニック動物は、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
【００２２】
ＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊に関連する表現型を変調する因子を同定する方法も提供される。例えば、該方法は、（ａ）そのゲノムがＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定し；次いで、（ｂ）（ａ）の測定された生理学的特徴を、性が一致する野生型動物のそれと比較することを含む。非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に由来する表現型は、野生型動物の生理学的特徴とは異なる非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴である。試験因子を（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物に投与し；次いで、試験因子が遺伝子破壊に関連する同定された表現型を変調するか否かを決定する。表現型を変調する試験因子は、その表現型を変調する因子である。
【００２３】
ある実施形態において、性が一致する野生型同腹仔と比較した、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子破壊に関連する表現型、または非ヒトトランスジェニック動物によって呈された表現型は、以下のうちの少なくとも１つであるが、これらに限定されない：例えば、心血管、内皮または血管形成障害；免疫学的障害；脂質ホメオスタシス障害；または異常な代謝障害。
【００２４】
ＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊に関連する生理学的特徴を変調する因子を同定する方法も提供される。ある実施形態において、該方法は、（ａ）そのゲノムが、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物によって呈される生理学的特徴を測定し；次いで、（ｂ）（ａ）の測定された生理学的特徴を、性が一致する野生型動物のそれと比較することを含む。野生型動物によって呈される生理学的特徴とは異なる、非ヒトトランスジェニック動物によって呈される生理学的特徴は、遺伝子破壊に関連する生理学的特徴として同定される。試験因子を（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物に投与し；次いで、遺伝子破壊に関連する生理学的特徴が変調されたか否かを決定する。生理学的特徴を変調する試験因子は、その特徴を変調する因子である。
【００２５】
ある実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、性が一致する野生型同腹仔と比較した以下の生理学的特徴、例えば、平均血清中コレステロールレベルにおける変調、平均血清中トリグリセリドレベルにおける変調、グルコース耐性テストにおける変調、グルコースホメオスタシスの変調、平均血清中グルコースレベルの減少；平均血清インスリンレベルの増加；平均血清中インスリンレベルの減少；平均血清中ＩｇＭレベルの増加および平均絶対好中球カウントの増加、平均パーセント体脂肪の増加；体重の減少および身長、全組織質量および脂肪以外の（ｌｅａｎ）体質量の減少、全脂肪質量の減少、体重および身長の減少に伴う成長の遅延、および／または全体脂肪、全組織質量の平均パーセントの減少の少なくとも１つを呈する。１つの実施形態において、平均血清中コレステロールレベルにおける変調は、平均血清中コレステロールレベルの減少である。１つの実施形態において、平均血清中トリグリセリドレベルにおける変調は平均血清中トリグリセリドレベルの減少である。もう１つの実施形態において、グルコース耐性テストにおける変調はグルコース耐性の増強である。
【００２６】
ＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子における破壊に関連した、心血管、内皮または血管形成障害；免疫学的障害；腫瘍学的障害；脂質代謝障害；または異常な代謝障害を緩和する因子を同定する方法が提供される。例えば、該方法は（ａ）試験因子を、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子における破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物に投与し；次いで、（ｂ）試験因子が、非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する心血管、内皮または血管形成障害；免疫学的障害；腫瘍学的障害；脂質代謝障害；または代謝障害を緩和するか否かを決定することを含む。
【００２７】
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊に関連する状態に影響することができる治療剤を評価する方法を提供する。例えば、該方法は、（ａ）そのゲノムがＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊を含む、非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴を測定し；（ｂ）（ａ）の測定された生理学的特徴を、性が一致する野生型動物のそれと比較し；（ｃ）試験因子を（ａ）の非ヒトトランスジェニック動物に投与し；次いで、（ｄ）非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に関連する同定された状態に対する試験因子の効果を評価することを含む。野生型動物の生理学的特徴とは異なる、非ヒトトランスジェニック動物の生理学的特徴は、非ヒトトランスジェニック動物における遺伝子破壊に由来する状態として同定される。例えば、該状態は心血管、内皮または血管形成障害；免疫学的障害；腫瘍学的障害；脂質ホメオスタシス障害；または代謝障害である。
【００２８】
ＡＮＧＰＴＬ４の発現を変調する因子を同定する方法も提供される。例えば、該方法は、（ａ）試験因子を、ＡＮＧＰＴＬ４を発現する宿主細胞と接触させ；次いで、（ｂ）試験因子が、宿主細胞によるＡＮＧＰＴＬ４の発現を変調するか否かを決定することを含む。
【００２９】
前記方法のいずれかによって同定された因子も本発明に含まれる。１つの実施形態において、該因子はアゴニストを含む。もう１つの実施形態において、該因子はＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニストを含む。治療剤である因子もまた、治療剤を含む医薬組成物と共に本発明に含まれる。
本発明の種々の方法において、本発明の分子、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４のアゴニストまたはアンタゴニスト、因子などを全身送達系を通じて被験体に投与することができる。１つの態様において、全身送達系は、主題の因子の組換え形態を発現する哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含む細胞調製物を含む。もう１つの態様において、全身送達系は、精製された因子およびポリマーマトリクスを含む徐放調製物を含むことができる。ある実施形態において、該分子を、医薬上許容される担体と共に被験体に投与する。別法として、本発明の分子は、該分子をコードする核酸を含む組織（例えば、脂肪細胞、肝臓等）標的化遺伝子送達ベクターを介して投与することができる。遺伝子治療のためのよく確立されたウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを、本発明における組織標的化遺伝子送達ベクターとして用いることができる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
肝細胞の増殖を刺激する方法であって、該方法は、有効量のアンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）を肝細胞またはプレ肝細胞の集団に投与し、それにより、増殖を刺激する工程を包含する、方法。
（項目２）
前記肝細胞が被験体内にある、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記被験体がヒトである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＡＮＧＰＴＬ４がヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸残基２３〜４０６を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＡＮＧＰＴＬ４がヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸残基１８４〜４０６を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
投与工程が、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする核酸配列を投与する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目７）
肝細胞の増殖を刺激する方法であって、該方法は、肝細胞またはプレ肝細胞においてＡＮＧＰＴＬ４の産生を刺激する因子の有効量を投与し、それにより、増殖を刺激する工程を包含する、方法。
（項目８）
肝細胞の増殖を刺激する方法であって、該方法は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを肝細胞またはプレ肝細胞の集団に投与する工程を包含する、方法。
（項目９）
前記アンタゴニストが前記肝細胞においてＡＮＧＰＴＬ４タンパク質の産生を阻害する因子である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記因子がアンチセンスまたはリボザイム分子である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体である、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗αｖβ５抗体である、項目８に記載の方法。
（項目１３）
肝細胞の細胞接着を誘導する方法であって、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４を含む組成物の有効量を肝細胞の集団に投与し、それにより、肝細胞の細胞接着を誘導する工程を包含する、方法。
（項目１４）
前記ＡＮＧＰＴＬ４がヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸残基２３〜４０６を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＡＮＧＰＴＬ４がヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸残基１８５〜４０６を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物が担体と共にＡＮＧＰＴＬ４を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
肝細胞の細胞接着を阻害する方法であって、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物の有効量を肝細胞の集団に投与し、それにより、肝細胞の細胞接着を阻害する工程を包含する、方法。
（項目１８）
前記アンタゴニストが抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記アンタゴニストが抗αｖβ５抗体である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
プレ脂肪細胞の増殖を刺激する方法であって、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４またはアゴニストを含む組成物の有効量をプレ脂肪細胞の集団に投与し、それにより、プレ脂肪細胞の増殖を誘導する工程を包含する、方法。
（項目２１）
前記プレ脂肪細胞が被験体内にある、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記被験体がヒトである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物が担体と共にＡＮＧＰＴＬ４を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記ＡＮＧＰＴＬ４がヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸残基２３〜４０６を含む、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記ＡＮＧＰＴＬ４が約２３〜約１６２のアミノ酸残基を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
プレ脂肪細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物の有効量をプレ脂肪細胞の集団に投与する工程を包含する、方法。
（項目２７）
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
ＡＮＧＰＴＬ４の生物学的活性を阻害する方法であって、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４のＣ末端に結合するＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目２９）
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが抗αｖβ５抗体である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ４がαｖβ５に結合することをブロックする、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記生物学的活性が細胞増殖または細胞分化を誘導することを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
ＡＮＧＰＴＬ４のＣ末端に結合する抗体。
（項目３４）
前記抗体が中和抗体である、項目３２に記載の抗体。
（項目３５）
ＡＮＧＰＴＬ４の改変体を含む組成物であって、該改変体ＡＮＧＰＴＬ４はタンパク質分解により処理されない、組成物。
（項目３６）
ＡＮＧＰＴＬ４の前記改変体がアミノ酸１６２および／または１６４の改変を含む、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記改変が置換である項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記置換が位置１６２および位置１６４におけるものである項目３７に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＡＮＧＰＴＬ４の核酸配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトＡＮＧＰＴＬ４の核酸配列（配列番号１）（図１Ａの続き）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、図１に示された配列番号１のコード配列に由来するヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図１に示された配列番号１のコード配列に由来するヒトＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列（配列番号２）（図２Ａの続き）を示す。
【図３Ａ】図３、パネルＡは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在（１０ｍＭ）または非存在下で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（４〜２０％）で分離された精製組換えマウスＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）を示す。
【図３Ｂ】図３、パネルＢは、ＳＤＳゲルにより分離され、ウェスタンブロッティングによって検出された野生型（レーン１）および改変体ｈＡＮＧＰＴＬ４（レーン２）を示し、該改変体ｈＡＮＧＰＴＬ４はＲ１６２ＧおよびＲ１６４Ｅ置換を有する。
【図４】図４は、ヒト肝細胞の細胞―接着を誘導するＡＮＧＰＴＬ４を模式的に示す。
【図５】図５は、肝細胞増殖を誘導するＡＮＧＰＴＬ４を模式的に示す。
【図６Ａ】図６、パネルＡおよびＢは、初代ヒト内臓プレ脂肪細胞増殖（パネルＡ）および皮下プレ脂肪細胞増殖（パネルＢ）を誘導する細胞外ＡＮＧＰＴＬ４を模式的に示す。
【図６Ｂ】図６、パネルＡおよびＢは、初代ヒト内臓プレ脂肪細胞増殖（パネルＡ）および皮下プレ脂肪細胞増殖（パネルＢ）を誘導する細胞外ＡＮＧＰＴＬ４を模式的に示す。
【図７】図７は、ＦＡＣＳ分析によって、初代ヒト皮下脂肪細胞に結合するＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４０６）およびＩｇＧ−キメラヒトＡＮＧＰＴＬ４形態を模式的に示す。
【図８Ａ】図８、パネルＡ、ＢおよびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４が、初代ヒト皮下プレ脂肪細胞の細胞移動を誘導することを示す。パネルＡおよびＢは、一晩（パネルＡ）、７時間（パネルＢ）の、初代プレ脂肪細胞の細胞移動をＡＮＧＰＴＬ４が誘導することを示す。
【図８Ｂ】図８、パネルＡ、ＢおよびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４が、初代皮下ヒトプレ脂肪細胞の細胞移動を誘導することを示す。パネルＡおよびＢは、一晩（パネルＡ）、７時間（パネルＢ）の、初代プレ脂肪細胞の細胞移動をＡＮＧＰＴＬ４が誘導することを示す。
【図８Ｃ】図８、パネルＡ、ＢおよびＣは、ＡＮＧＰＴＬ４が、初代皮下ヒトプレ脂肪細胞の細胞移動を誘導することを示す。パネルＣは、７時間における、ＡＮＧＰＴＬ４での初代プレ脂肪細胞の移動を模式的に示し、（１）は血清添加無しであり、（２）は１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）であり、（３）はＰＤＧＦ−ＢＢであり、および（４）はｍＡＮＧＰＴＬ４である。
【図９Ａ】図９、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ＡＮＧＰＴＬ４のインテグリンαｖβ５への結合を示す。パネルＡは、（μｇ／ｍｌ）で表した底部に示した濃度のｍＡＮＧＰＴＬ４またはビトロネクチンいずれかで被覆したプレートへの２９３−１９５３（αｖβ５）細胞の接着を示し、ＢＳＡは対照として用いられる。
【図９Ｂ】図９、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ＡＮＧＰＴＬ４のインテグリンαｖβ５への結合を示す。パネルＢは、抗―αｖβ５および抗―ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体がＡＮＧＰＴＬ４細胞接着活性をなくすことを示し、（１）はＢＳＡであり、（２）はビトロネクチンであり、（３）はｍＡＮＧＰＴＬ４である。
【図９Ｃ】図９、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ＡＮＧＰＴＬ４のインテグリンαｖβ５への結合を示す。パネルＣは、示された量を用いるタンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）の、αｖβ５被覆プレートへの結合を示す。
【図９Ｄ】図９、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ＡＮＧＰＴＬ４のインテグリンαｖβ５への結合を示す。パネルＤは、抗―ｈＡＮＧＰＴＬ４での、タンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ４、ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端、またはｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端）のαｖβ５被覆プレートへの結合への阻害を示し、抗―ダウン症候群決定領域（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）１タンパク質（Ｄｓｃｒ）抗体対照、５Ｇ７または培地を対照として用いる。
【図９Ｅ】図９、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ＡＮＧＰＴＬ４のインテグリンαｖβ５への結合を示す。パネルＥはＡＮＧＰＴＬ４およびαｖβ５の結合を示し、（１）はプレート上に被覆されたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（２）はプレート上に被覆され、抗―ｈＡＮＧＰＴＬ４と共にインキュベートされたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（３）はプレート上に被覆され、抗―Ｄｓｃｒと共にインキュベートされたｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端であり、（４）はプレート上に被覆されたビトロネクチンであり、（５）はαｖβ５を加える前に、プレート上に被覆されたＢＳＡである。
【図１０】図１０は、ＡＮＧＰＴＬ４およびＡＮＧＰＴＬ４の改変体を尾静脈注射されたマウスのトリグリセリドレベルを示し、（１）はＡｄ−ＧＦＰであり、（２）はＡｄ−Ｇｄであり、（３）はＡＮＧＰＴＬ４（１〜４０６）であり、（４）はＡＮＧＰＴＬ４（１〜１８３）であり、（５）はＡＮＧＰＴＬ４（１８４−４０６）であり、（６）はＡＮＧＰＴＬ４改変体Ｒ１１６２ＧおよびＲ１６４Ｅであり、（７）はＡＮＧＰＴＬ４（１〜４０８）であり、（８）は対照である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に説明する前に、本発明は、当然変動し得る特定の組成物または生物系に制限されないことが理解されるべきである。また、本明細書中に用いる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的であり、限定的であることを意図しないことも理解されるべきである。本明細書および添付の請求の範囲で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明瞭に他のことを指示しない限り複数への言及を含む。かくして、例えば、「ある分子」に対する言及は、所望により、２以上のそのような分子の組み合わせを含む。他に定義されない限り、全ての科学的および技術的用語は、それが属する分野で通常用いられるものと同一の意味を有すると理解される。本発明の目的では、以下の用語が後に定義される。
【００３２】
用語「ＡＮＧＰＴＬ４」または「Ａｎｇｐｔｌ４」とは、その天然に存在する対立遺伝子、分泌された形態およびプロセシングされた形態と共に、アンジオポエチン様４ポリペプチドまたはタンパク質をいう。例えば、ヒト由来のＡＮＧＰＴＬ４は４０６アミノ酸のタンパク質であり、他方、マウスＡＮＧＰＴＬ４は４１０アミノ酸のタンパク質である。用語「ＡＮＧＰＴＬ４」は、例えば、ヒトアンジオポエチン様４タンパク質のＮ−末端フラグメント、コイルドコイルドメイン、Ｃ末端フラグメント、フィブリノーゲン様ドメイン、アミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６２、２３〜約１６２、２３〜４０６、１８４〜４０６、約１６２〜４０６、または２３〜１８４、あるいはマウスアンジオポエチン様４タンパク質のアミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６５、２３〜約１６５、２３〜４１０、または１８４〜４１０を含むポリペプチドのフラグメント（例えば、サブ配列、短縮形態等）をいうためにも用いられる。他のフラグメントは、限定されるものではないが、例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３，６０〜１８３，８０〜１８３，１００〜１８３，１２０〜１８３，１４０〜１８３，４０〜４０６，６０〜４０６，８０〜４０６，１００〜４０６，１２０〜４０６，１４０〜４０６，および１６０〜４０６ならびに、例えば、ｍＡＮＧＰＴＬ４の４０〜１８３，６０〜１８３，８０〜１８３，１００〜１８３，１２０〜１８３，１４０〜１８３，４０〜４１０，６０〜４１０，８０〜４１０，１００〜４１０，１２０〜４１０，１４０〜４１０および１６０〜４１０を含む。ＡＮＧＰＴＬ４のいずれかのそのような形態への言及は、例えば、「ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４０６）、「ＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４０６）」、「ＡＮＧＰＴＬ４（２３〜１８３）」、「ｍＡＮＧＰＴＬ４（２３〜４１０）」、「ｍＡＮＧＰＴＬ４（１８４〜４１０）」等によって、本出願において確認することもでき、ｍはマウス配列を示す。フラグメントの天然ＡＮＧＰＴＬ４についてのアミノ酸位置は、天然ＡＮＧＰＴＬ４配列で示されるようにナンバリングされる。例えば、フラグメントのＡＮＧＰＴＬ４におけるアミノ酸位置２２（Ｓｅｒ）は、天然ヒトＡＮＧＰＴＬ４における位置２２（Ｓｅｒ）でもある。例えば、図２参照。一般には、フラグメントの天然ＡＮＧＰＴＬ４は生物学的活性を有する。
【００３３】
「天然配列」のポリペプチドは、天然に由来するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。かくして、天然配列のポリペプチドは、いずれかの哺乳動物由来の、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。そのような天然配列のポリペプチドは天然から単離することができるか、あるいは組換えまたは合成手段によって製造することができる。用語「天然配列」のポリペプチドは、具体的には、当該ポリペプチドの天然に存在する短縮形態または分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、当該ポリペプチドの天然に存在する改変体形態（例えば、可変スプライシングされた形態）および天然に存在する対立遺伝子改変体を含む。
【００３４】
ポリペプチド「改変体」は、対応する天然配列のポリペプチドに対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチド、またはそのフラグメントを意味する。そのような改変体は、例えば、１以上のアミノ酸残基が当該ポリペプチドのＮ−および／またはＣ末端において付加されているか、または欠失されているポリペプチドを含む。通常、改変体は、天然配列のポリペプチド、またはそのフラグメントに対して少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％アミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するであろう。
【００３５】
本明細書中で用いる用語「ＡＮＧＰＴＬ４改変体」とは、前記した改変体および／または天然ＡＮＧＰＴＬ４配列において１以上のアミノ酸突然変異を含むＡＮＧＰＴＬ４を言う。所望により、１以上のアミノ酸突然変異はアミノ酸置換を含む。本発明で用いられるＡＮＧＰＴＬ４およびその改変体は、当該分野でよく知られた種々の方法によって調製することができる。ＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列改変体は、ＡＮＧＰＴＬ４のＤＮＡ中の突然変異によって調製することができる。そのような改変体は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のアミノ酸配列（例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０９２８４下で寄託されたか、あるいは図２に示される、核酸によってコードされたヒトアミノ酸配列）内での残基の欠失、残基の挿入、または残基の置換を含む。欠失、挿入、および置換のいずれの組み合わせを、所望の活性を有する最終的構築体に至るように作製し得る。改変体をコードするＤＮＡにより作製される突然変異は、配列をリーディングフレームから外してはならず、好ましくは、二次的なｍＲＮＡ構造を生じるかも知れない相補的領域を生じさせないものである。ＥＰ７５，４４４Ａ。
【００３６】
ＡＮＧＰＴＬ４改変体は、所望により、天然ＡＮＧＰＴＬ４をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発、またはファージ提示技術によって調製され、それにより、改変体をコードするＤＮＡが生じ、その後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させる。
【００３７】
アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されるが、突然変異それ自体は予め決定される必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を最適化するためには、標的コドンまたは領域においてランダムな突然変異誘発を行うことができ、発現されたＡＮＧＰＴＬ４改変体を、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることができる。例えば、部位特異的突然変異誘発のような、公知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位において置換突然変異を行うための技術はよく知られている。本明細書中に記載されたＡＮＧＰＴＬ４改変体の調製は、ＰＣＴ公開ＷＯ  ００／６３３８０に記載されたようなファージ提示技術によって達成することができる。
【００３８】
そのようなクローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を取り出し、タンパク質生産のための適当なベクター、一般には、適当な宿主の形質転換で使用することができるタイプの発現ベクターに入れることができる。
【００３９】
アミノ酸配列の欠失は、一般には、約１〜３０残基、所望により１〜１０の残基、所望により１〜５以下の残基の範囲であり、典型的には、連続している。
【００４０】
アミノ酸配列の挿入は、本質的に制限されていない長さのポリペプチドへの１つの残基のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（すなわち、天然ＡＮＧＰＴＬ４配列内の挿入）は、一般には、約１〜１０残基、所望により１〜５残基、または所望により１〜３残基の範囲とすることができる。末端挿入の例は、組換え宿主からの分泌を促進するための、Ｎ−末端に対する、宿主細胞に対して同種または異種であるかを問わず、シグナル配列の融合を含む。
【００４１】
さらなるＡＮＧＰＴＬ４改変体は、天然ＡＮＧＰＴＬ４における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその箇所に挿入されたものである。本発明の１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４改変体は、ＡＮＧＰＴＬ４の１６２および／または１６４での置換、およびｍＡＮＧＰＴＬ４の１６９での置換を含む。そのような置換は、表１に示されたものに従ってなすことができる。ＡＮＧＰＴＬ４改変体は、本明細書中に記載された非天然アミノ酸を含むこともできる。
【００４２】
アミノ酸は、それらの側鎖の特性における類似性に従ってグループ分けすることができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第二版，頁７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）
別法として、天然に存在する残基は共通の側鎖特性に基づいグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖の向きに影響する残基；Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ．
【００４３】
【表１】
2011235179.tif 000002
「天然に存在するアミノ酸残基」（すなわち、遺伝暗号によってコードされたアミノ酸残基）は：アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リシン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）よりなる群から選択することができる。「天然に存在しないアミノ酸残基」とは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる、先に列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基をいう。天然に存在しないアミノ酸残基の例は、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、およびＥｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）、および米国特許出願公開２００３０１０８８８５および２００３００８２５７５に記載されたもののような他のアミノ酸残基アナログを含む。簡単に述べれば、これらの手法は、天然に存在しないアミノ酸残基でのサプレッサーｔＲＮＡの活性化、続いて、ＲＮＡのインビトロまたはインビボ転写および翻訳を含む。例えば、米国特許出願公開２００３０１０８８８５および２００３００８２５７５；Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）；およびＥｌｌｍａｎら、上記を参照のこと。
【００４４】
本明細書での「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大％配列同一性を達成させた後に、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義され、配列同一性の一部としてあらゆる保存的置換を考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当該分野の技術範囲内にある種々の方法で達成することができる。当業者であれば、比較すべき配列の全長にわたって最大限の整列を達成するのに必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、整列を測定するための適当なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的では、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いることによって以下に記載するように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著され、これは使用者書面（ｕｓｅｒ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とともに合衆国著作権局（Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出されて、合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されており、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを通じて公に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、例えば、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄで用いるために編集されなければならない。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
【００４５】
本明細書の目的のために、所定のアミノ酸配列Ｂとの、またはそれに対する所定のアミノ酸配列Ａ（所定のアミノ酸配列Ｂとの、またはそれに対するある％アミノ酸配列同一性を有するか、またはそれを含む所定のアミノ酸配列Ａと代わりに言うこともできる）の％アミノ酸配列同一性は、以下のように計算される：
率Ｘ／Ｙの１００倍。
【００４６】
ここで、Ｘは、ＡとＢとのプログラムによる整列における配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２の同一マッチとしてスコア付けされるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同等でない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性はＡに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されるであろう。
【００４７】
「単離された」ポリペプチドはその天然環境の成分から同定、分離および／または回収されたものである。その天然環境の混入成分は、ポリペプチドに関する診断使用または治療使用に干渉する物質であり、それとしては酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が挙げられ得る。ある実施形態において、ポリペプチドは（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって決定されるポリペプチドの９５重量％より高くか、もしくは９９重量％より高くか、（２）回転カップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ）配列決定装置を使用して、Ｎ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度までか、または（３）クーマシーブルーまたは銀染色を用いる還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製される。単離されたポリペプチドとしては、組換え細胞内のイン・サイチュのポリペプチドが挙げられる。なぜなら、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００４８】
用語「ＡＮＧＰＴＬ４モジュレーター」とは、ＡＮＧＰＴＬ４またはその発現を活性化できる分子（例えば、アゴニスト）、あるいはＡＮＧＰＴＬ４の活性またはその発現を阻害することができる分子（例えば、アンタゴニスト（または阻害剤））をいう。ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは抗体および活性なフラグメントを含む。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストとは、ＡＮＧＰＴＬ４の活性（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αｖβ５）へのその結合を含む、細胞の増殖または成長、移動、接着または代謝（例えば、脂質）変調、またはその発現）の中和、ブロック、阻害、妨害、低下、またはそれに対する干渉を可能とする分子をいう。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストとしては、例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体およびその抗原−結合フラグメント、受容体分子、およびＡＮＧＰＴＬ４に特異的に結合し、それにより、１以上の受容体へのその結合を隔離する誘導体、抗ＡＮＧＰＴＬ４受容体抗体、および受容体の低分子阻害剤のようなＡＮＧＰＴＬ４受容体アンタゴニストが挙げられる。他のＡＮＧＴＰＬ４アンタゴニストはＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニスト改変体、アンチセンス分子（例えば、ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、およびＡＮＧＰＴＬ４またはその受容体に対するリボザイムも含む。ある実施形態において、アンタゴニストＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４の特異的サブ配列または領域、例えば、ヒトアンジオポエチン様４タンパク質のＮ−末端フラグメント、コイルドコイルドメイン、Ｃ末端フラグメント、フィブリノーゲン様ドメイン、アミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６２、２３〜約１６２、２３〜４０６、１８４〜４０６、約１６２〜４０６または２３〜１８４、およびマウスアンジオポエチン様４タンパク質のアミノ酸１〜１８３、２３〜１８３、１〜約１６５、２３〜約１６５、２３〜４１０、または１８４〜４１０へ結合することによってＡＮＧＰＴＬ４の活性を阻害し、または低下させる抗体である。他のサブ配列は、限定されるものではないが、例えば、ｈＡＮＧＰＴＬ４の４０−１８３，６０−１８３，８０−１８３，１００−１８３，１２０−１８３，１４０−１８３，４０−４０６，６０−４０６，８０−４０６，１００−４０６，１２０−４０６，１４０−４０６，および１６０−４０６ならびに、例えば、ｍＡＮＧＰＴＬ４の４０−１８３，６０−１８３，８０−１８３，１００−１８３，１２０−１８３，１４０−１８３，４０−４１０，６０−４１０，８０−４１０，１００−４１０，１２０−４１０，１４０−４１０および１６０−４１０も含む。
【００４９】
ＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーターは、ＡＮＧＰＴＬ４の活性を変調する分子、例えば、アゴニストおよびアンタゴニストである。用語「アゴニスト」は、ＡＮＧＰＴＬ４のペプチドおよび非ペプチドアナログ、およびそのようなＡＮＧＰＴＬ４分子に特異的に結合する抗体をいうのに用いられ、但し、それらは天然ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αｖβ５インテグリン）を通じてシグナル伝達する能力を有する。用語「アゴニスト」は、ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αｖβ５）の生物学的役割の文脈で定義される。ある実施形態においては、アゴニストは、細胞の増殖、移動および／または接着の促進、および／または脂質ホメオスタシスの変調のような、先に定義される天然ＡＮＧＰＴＬ４の生物学的活性を保有する。
【００５０】
用語「アンタゴニスト」は、それらがＡＮＧＰＴＬ４またはその受容体、例えば、αｖβ５に結合する能力を有するか否かに拘らず、ＡＮＧＰＴＬ４の生物学的活性を阻害する能力を有する分子をいうのに用いられる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４またはその受容体に結合する能力を有するアンタゴニストは抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体および抗αｖβ５抗体を含む。ＡＮＧＰＴＬ４の発現を阻害するアンタゴニスト、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡが含まれる。アンタゴニストＡＮＧＰＴＬ４は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４の活性、例えば、接着、移動、増殖、および／またはＡＮＧＰＴＬ４の脂質ホメオスタシス活性の変調を阻害することによって評価することができる。αｖβ５インテグリン受容体活性に関してαｖβ５インテグリン受容体のモジュレーターは、当該分野で知られた方法によって測定することができる。例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２２６７−１２２７１（１９９０）中でＪ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈら、によって記載された方法を用いることができる。
【００５１】
用語「抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体」は、十分な親和性および特異性でＡＮＧＰＴＬ４に結合する抗体である。本発明のある実施形態において、本発明の抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４活性が関与する疾患または状態を標的とし、それに干渉する治療剤として用いることができる。一般に抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、通常は、他のＡＮＧＰＴＬ４ホモログ、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３に結合しない。
【００５２】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、所望の生物学的活性を呈する限り、（全長またはインタクトなモノクローナル抗体を含めた）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメント（以下参照）を含む。
【００５３】
特記しない限り、表現「多価抗体」は、本明細書を通じて、３以上の抗原結合部位を含む抗体を示すのに用いられる。多価抗体は、典型的には、３以上の抗原結合部位を有するように設計され、一般には、天然配列のＩｇＭでもＩｇＡ抗体でもない。
【００５４】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部のみを含み、これとしては、一般には、インタクトな抗体の抗原結合部位が挙げられ、したがって抗原に結合する能力を保有する。本定義に含まれる抗体フラグメントの例は：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端において１以上のシステイン残基を有するＦａｂフラグメントであるＦａｂ’フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメイン、およびＣＨ１ドメインのＣ末端の１以上のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント；（ｖ）抗体の片方のアーム（ａｒｍ）のＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインよりなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ
３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィドブリッジによって連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｘ）単一鎖抗体分子（例えば、単一鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ８５：５８７９−５８８３（１９８８））；（ｘ）同一ポリペプチド鎖中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」（例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）参照）；（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって抗原結合領域の一部を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む「直線状抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７  １０６２（１９９５）；および米国特許第５，６４１，８７０号）を含む。
【００５５】
本明細書中で用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は少量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原に対して向けられる。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して向けられる。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製することができるか、あるいは、組換えＤＮＡ方法によって作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）またはＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２；５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００５６】
本明細書において、モノクローナル抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、他方、該鎖の残りは別の種に由来するか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物学的活性を呈する限り、そのような抗体フラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００５７】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体性能をさらに精巧化するようになされる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、この超可変ループの全てまたは実質的な全ては非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲの全てまたは実質的な全てはヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照。
【００５８】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のそれに対応するアミノ酸配列を保有し、および／または本明細書中に開示されたヒト抗体を作製する技術のいずれかを用いて作製されたものである。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を排除する。ヒト抗体は、当該分野で知られた種々の技術を用いて産生することができる。１つの実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４（１９９６）；Ｓｈｅｅｔｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）  ９５：６１５７−６１６２（１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にか、または完全に不活化されているマウスに導入することによって作製することもできる。抗原投与に際して、ヒト抗体産生が観察されており、これは、遺伝子再編成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含めて、全ての点においてヒトで観察されるものと酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号；および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。別法として、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製することができる（そのようなＢリンパ球は個体から回収することができるか、あるいはインビトロで免疫化することができる）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）；および米国特許第５，７５０，３７３号参照。
【００５９】
用語「可変」とは、可変ドメインのある部分の配列が抗体の間でかなり異なっている事実をいい、その特定の抗原に関して、各特定の抗体の結合および特異性で用いる。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメイン双方において超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、βシート構造を連結し、ある場合にはその部分を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって連結された、大まかなβシート立体配置を取る４つのＦＲを含む。各鎖中の超可変領域はＦＲによって近接して一緒に保持され、他の鎖由来の超可変領域と共に、抗体の抗原−結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体が抗原に結合するのに直接的には関与していないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を呈する。
【００６０】
用語「超可変領域」は、本明細書中で用いる場合、抗原−結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、一般には、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ
Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、および重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、ここに定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６１】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、インタクトな抗体を異なる「クラス」に帰属させることができる。インタクトな抗体の５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらに「サブクラス」（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１（非ＡおよびＡアロタイプを含む）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２に分けることができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、各々、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニットの構造および三次元立体配置はよく知られている。
【００６２】
任意の脊椎動物種由来の抗体の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ（６）およびλ（８）と呼ばれる２つの明瞭に区別されるタイプの１つに帰属させることができる。
【００６３】
用語「Ｆｃ領域」は、インタクトな抗体のパパイン消化によって生じさせることができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するのに用いられる。Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または改変体Ｆｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、およそ位置Ｃｙｓ２２６または位置Ｐｒｏ２３０におけるアミノ酸残基から、Ｆｃ領域のカルボキシル−末端に延びると定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般には、２つの定常領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、所望により、ＣＨ４ドメインを含む。「Ｆｃ領域鎖」とは、本明細書中においては、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００６４】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常、およそ位置２３１におけるアミノ酸残基から、およそ位置３４０におけるアミノ酸残基まで広がる。ＣＨ２ドメインは、それがもう１つのドメインと密接にペアを形成しない点でユニークである。むしろ、２つのＮ結合型分岐炭水化物鎖は、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に位置する。炭水化物はドメイン−ドメイン対合のための代替物を提供することができ、ＣＨ２ドメインの安定化に役立つことができると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。ＣＨ２ドメインは、本明細書中においては、天然配列ＣＨ２ドメインまたは改変体ＣＨ２ドメインであり得る。
【００６５】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインに対してＣ末端側である残基のストレッチを含む（すなわち、ＩｇＧのおよそ位置３４１におけるアミノ酸残基から、およそ位置４４７におけるアミノ酸残基）。ＣＨ３領域は、本明細書中においては、天然配列ＣＨ３ドメインまたは改変体ＣＨ３ドメイン（例えば、その１つの鎖における導入された「プロトロベランス（ｐｒｏｔｒｏｂｅｒａｎｃｅ）」およびその他の鎖に導入された対応する「キャビティ（ｃａｖｉｔｙ）」を有するＣＨ３ドメイン；本明細書において、参考として明示的に援用する米国特許第５，８２１，３３３号参照）であり得る。そのような改変体ＣＨ３ドメインを用いて、本明細書中に記載された多重特異性（例えば、二特異性）抗体を作製することができる。
【００６６】
「ヒンジ領域」は、一般には、ヒトＩｇＧ１のおよそＧｌｕ２１６またはＣｙｓ２２６から、およそＰｒｏ２３０までのストレッチと定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５））。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初および最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによって、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。ヒンジ領域は、本明細書中においては、天然配列ヒンジ領域または改変体ヒンジ領域であり得る。改変体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、一般には、改変体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖が２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成できるように、一本のポリペプチド鎖あたり少なくとも１つのシステイン残基を保有する。好ましいヒンジ領域は、本明細書中においては、天然配列ヒトヒンジ領域、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【００６７】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を保有する。例示的な「エフェクター機能」はＣ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどを含む。そのようなエフェクター機能は、一般には、Ｆｃ領域が、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを必要とし、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当該分野で知られた種々のアッセイを用いて評価することができる。
【００６８】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然で見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００６９】
「改変体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変によって、天然配列Ｆｃ領域のそれとは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、改変体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と、または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域における、約１〜約１０アミノ酸置換、好ましくは、約１〜約５アミノ酸置換）を有する。改変体Ｆｃ領域は、本明細書中においては、例えば、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域に対して少なくとも約８０％配列同一性、またはそれらに対して少なくとも約９０％配列同一性、あるいはそれらに対して少なくとも約９５％配列またはそれ以上の同一性を典型的には保有する。
【００７０】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、引き続いて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応をいう。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、他方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたもののようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイで有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。別法として、あるいは加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されたもののような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【００７１】
「ヒトエフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。典型的には、該細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含み；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が一般には好ましい。エフェクター細胞はその天然源から、例えば、本明細書中に記載された血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【００７２】
用語「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するのに用いられる。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、対立遺伝子改変体およびこれらの受容体の可変スプライシングされた形態を含めた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは類似のアミノ酸配列を有するが、その細胞質ドメインにおいて主に異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシン−ベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシン−ベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）で概説されている）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲは本明細書中においては用語「ＦｃＲ」に含まれる。該用語は、母親のＩｇＧの胎児への移動を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【００７３】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下における標的の溶解をいう。補体活性化経路は、同起源の抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への、補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されたＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００７４】
用語「イムノアドヘシン」とは、異種タンパク質の結合特異性を、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と組み合わせる抗体様分子（「付着分子」）をいう。
【００７５】
構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識および結合部位以外である（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列、および免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合体を含む。イムノアドヘシン分子の付着分子の部分は、典型的には、受容体またはリガンドの少なくとも結合部位を含む、連続するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭのような任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００７６】
本発明の目的での「活性な」または「活性」とは、天然または天然に存在するＡＮＧＰＴＬ４の生物学的および／または免疫学的活性を保有するＡＮＧＰＴＬ４の形態をいい、「生物学的」活性は、天然または天然に存在するＡＮＧＰＴＬ４によって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の天然または天然に存在するＡＮＧＰＴＬ４によって引き起こされる生物学的作用（阻害性作用または刺激性作用のいずれか）をいい、「免疫学的」活性とは、天然または天然に存在するＡＮＧＰＴＬ４によって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいう。
【００７７】
「親和性成熟化」抗体は、改変を保有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改良をもたらすその１以上のＣＤＲにおける１以上の改変を有するものである。好ましい親和性成熟化抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度またはピコモル濃度までの親和性を有する。親和性成熟化抗体は、当該分野で知られた手法によって産生される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）は、ＶＨおよびＶＬドメインシャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による親和性成熟化を記載する。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）によって記載されている。
【００７８】
抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合することができるものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同程度に強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原への抗体の結合を評価するための公知の種々の方法のいずれか１つを用いて測定可能であるはずである。さらに、多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は、本明細書中においては、定量的に同一である必要はない。本明細書中におけるマルチマー抗体では、機能的抗原結合部位の数は、超遠心分離分析を用いて評価することができる。分析のこの方法に従えば、マルチマー抗体に対する標的抗原の異なる比率を組み合わせ、複合体の平均分子量は、機能的結合部位の異なる数を前提として計算される。これらの理論的値は、得られた現実の実験値と比較して機能的結合部位の数を評価する。
【００７９】
指定の抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、それを、同一抗原に結合する他の抗体と区別する抗体の生物学的特徴を１以上保有するものである。目的の抗体によって結合された抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするためには、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されたもののような慣用的な交差ブロッキングアッセイを行うことができる。
【００８０】
「ポリペプチド鎖」は、非共有結合性の相互作用ともジスルフィド結合とも異なり、そのドメインの各々がペプチド結合によって他のドメインに連結されるポリペプチドである。
【００８１】
「フレキシブルリンカー」は、本明細書中においては、ペプチド結合によって連結された２以上のアミノ酸残基を含むペプチドをいい、それにより連結された２つのポリペプチド（例えば、２つのＦｄ領域）へより大きな回転自由度を提供する。そのような回転自由度により、フレキシブルリンカーによって連結された２以上の抗原結合部位が、各々、より効果的に標的抗原に接近するのが可能となる。適当なフレキシブルリンカーペプチド配列の例は、ｇｌｙ−ｓｅｒ、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ、ａｌａ−ｓｅｒ、およびｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒを含む。
【００８２】
「二量体化ドメイン」は、少なくとも２つのアミノ酸残基（一般には、システイン残基）、または（同一、または異なるアミノ酸配列を有し得る）少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチドの会合によって形成される。ペプチドまたはポリペプチドは、共有結合および／または非共有結合を通じて相互作用することができる。二量体化ドメインの例は、本明細書中においては、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１−ＣＬ対；米国特許第５，８２１，３３３号（本明細書において、参考として明示的に援用される）に記載された、操作された「ノブ（ｋｎｏｂ）」および／または「プロトルベランス（ｐｒｏｔｒｕｂｅｒａｎｃｅ）」との「境界面」；ロイシンジッパー（例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Ｋｏｓｔｅｌｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−１５５３（１９９２）参照；または酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー）；イソロイシンジッパー；受容体ダイマー対（例えば、インターロイキン−８受容体（ＩＬ−８Ｒ）；およびＬＦＡ−１およびＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａのようなインテグリンヘテロダイマー）、またはその二量体化領域；ダイマーリガンドポリペプチド（例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；Ａｒａｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４５）：２７８３３−２７８３９（１９９４）およびＲａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２（４８）：１３５０（１９９３））、またはその二量体化領域；ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基の対；各々が、ジスルフィド結合をペプチドまたはポリペプチドの間で形成できるように少なくとも１つのシステイン残基（例えば、約１、２または３〜約１０システイン残基）を含むペプチドまたはポリペプチドの対（以下、「合成ヒンジ」）；および抗体可変ドメインを含む。最も好ましい二量体化ドメインは、本明細書中においては、Ｆｃ領域またはヒンジ領域である。
【００８３】
句「細胞の増殖を刺激する」は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、未処理細胞または処理を減らした細胞と比較して、細胞の成長および／または再生の程度を増加させる工程を含む。細胞培養における細胞増殖の増大は、目的の分子への曝露の前および後において細胞の数をカウントすることによって検出することができる。増殖の程度は、密集の程度の顕微鏡観察を介して定量することができる。細胞増殖は、当該分野で知られたアッセイ、例えば、チミジン取り込みアッセイ、および市販のアッセイを用いて定量することもできる。句「細胞の増殖を阻害する」は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、未処理細胞または処理を減らした細胞と比較して、細胞の成長および／または再生の程度を減少させる工程を含む。それは前記したように定量することができる。
【００８４】
１以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（並行）および／またはいずれかの順序での連続投与を含む。
【００８５】
治療の目的での「被験体」は任意の動物をいう。一般には、動物は哺乳動物である。治療の目的での「哺乳動物」とは、哺乳動物として分類される任意の動物をいい、ヒト、家畜および農場動物、およびイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどのような動物園、スポーツまたはペット動物を含む。典型的には、哺乳動物はヒトである。
【００８６】
本明細書中で用いるように、用語「緩和する」または「緩和」とは、異常または症状を含めた、状態、疾患、障害または表現型の減少、低下または排除をいう。
【００８７】
「障害」は、本発明の分子での治療から利益を受けるであろういずれかの状態である。これは、問題とする障害に対して被験体が罹りやすい病理学的状態を含めた慢性および急性の障害または疾患を含む。
【００８８】
用語「有効量」または「治療有効量」とは、被験体において疾患または障害を治療するのに有効な薬物の量をいう。
【００８９】
「処置」とは、治療的処置および予防的または防止的手段の両方をいう。処置を必要とするものは、既に障害を有するもの、ならびに障害を予防すべきものを含む。
【００９０】
本明細書中で用いるように、「肥大」は、腫瘍形成を伴わない、ネイティブな成長とは独立した器官または構造の質量の増加と定義される。器官または組織の肥大は、個々の細胞の質量の増加（真の肥大）、または組織をなす細胞の数の増加（過形成）のいずれか、または両方に起因する。例えば、脂肪細胞の肥大成長は、脂質蓄積によって刺激される脂肪細胞のサイズの増加である。脂肪細胞の過形成成長は、脂肪組織における脂肪細胞の数の増加である。
【００９１】
句「心血管および内皮障害」、「心血管および内皮機能障害」および「心血管、内皮または脈管形成障害」は交換可能に用いられ、典型的には、脈管形成および／または心血管形成を刺激する全身性の障害をいう。これは、血管に影響する疾患、ならびに動脈、毛細血管、静脈および／またはリンパ管のような血管それ自体の疾患を含む。そのような障害は、限定されるものではないが、例えば、アテローム性動脈硬化症、真性糖尿病、高血圧、炎症性脈管炎、レーノルド病およびレーノルド現象、動脈瘤、および動脈再狭窄のような動脈疾患；血栓性静脈炎、リンパ管炎、およびリンパ浮腫のような静脈およびリンパ管障害；血管腫瘍、例えば、血管腫（毛細血管および空洞性）、糸球腫瘍、毛細血管拡張症、棹状血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、カポシ肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫のような癌；腫瘍脈管形成；ならびに末梢血管病、外傷（例えば、創傷、火傷および他の傷害組織）、インプラント固定、瘢痕、虚血性再灌流損傷、慢性関節リウマチ、脳血管疾患、腎臓病（例えば、急性腎不全）のような他の血管障害；発作、冠動脈病、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、および／または骨粗しょう症を含む。これはアンギナ、急性心筋梗塞のような心筋梗塞、心臓肥大、およびうっ血性心不全（ＣＨＦ）のような心不全を含むであろう。例えば、限定されるものではないが、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心不全、発作、種々の冠動脈病、肥満、糖尿病等を含めた、異脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）に伴う心血管疾患も含まれる。
【００９２】
用語「脂質ホメオスタシス障害」は、脂質代謝の異常な調節（例えば、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）に関連するか、それに起因するか、および／またはそれに伴う障害、疾患または状態を含む。脂質ホメオスタシス障害は、異常な脂肪分解、異常な脂質取り込み、異常な脂質合成および／または分泌、異常な細胞内脂質放出および／または代謝回転、異常な細胞内トリグリセリド放出および／または代謝回転、異常な細胞内脂質および／またはトリグリセリドの量、および／または細胞、例えば、肝臓細胞内の、またはそれらからの異常に分泌された脂質および／またはトリグリセリドの量に起因し得るか、あるいはそれに関連し得る。脂質ホメオスタシス障害は、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、肥満、肥満に関連する状態、糖尿病、インスリン耐性、高脂血症、低脂血症、異脂肪血症、高コレステロール血症、低コレステロール血症、トリグリセリド貯蔵疾患、心血管疾患、冠動脈疾患、高血圧、発作、体重過剰、食欲不振、悪液質、高リポタンパク質血症、低リポタンパク質血症、ニーマンピック病、高トリグリセリド血症、低トリグリセリド血症、膵臓炎、汎発性特発性骨増殖症（ＤＩＳＨ）、アテローム発生性リポタンパク質表現型（ＡＬＰ）、癲癇、肝臓病、脂肪肝、脂肪肝炎、多嚢胞卵巣症候群、癌等を含む。用語「脂質代謝障害」とは、コレステロールおよびトリグリセリドの異常な臨床化学レベルをいう。用語「高脂肪血症」または「高脂血症」とは、正常な血清脂質レベルよりも高いレベルである状態をいう。血清脂質はコレステロール（エステルおよび遊離）、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸および他のステロールを含む。１つの態様において、これらの脂質の増大したレベルはアテローム性動脈硬化症に対する指標である。
【００９３】
用語「肥満」とは、哺乳動物が、少なくとも２５．９の、体重（ｋｇ）／身長２（メートル２）として計算されるボディマス指数（ＢＭＩ）を有する状態をいう。通常、正常な体重を有する個人は１９．９〜２５．９未満のＢＭＩを有する。肥満は、本明細書中においては、遺伝的または環境的を問わず、あらゆる原因に起因し得る。肥満をもたらし得る、または肥満の原因となり得る障害の例は、例えば、限定されるものではないが、過食および過食症、多嚢胞卵巣病、頭蓋咽頭腫、プラーダー−ヴィリー症候群、フローリッヒ症候群、ＩＩ型糖尿病、ＧＨ−欠乏被験体、正常な変種の低身長、ターナー症候群、および代謝活性の低下、または脂肪を含まない総質量のパーセンテージとしての休止時のエネルギー消費の減少を示す他の病理学的状態、例えば、急性リンパ芽球白血病を有する小児を含む。「肥満−決定特性」は脂肪細胞および組織（例えば、脂肪パッド）、合計体重、筋肉、肝臓および脂肪におけるトリグリセリドレベル、ならびに血液中のレプチン、遊離脂肪酸およびトリグリセリドの空腹時レベルおよび非空腹時レベルを含む。
【００９４】
用語「肥満に関連する状態」とは、限定されるものではないが、感染のような皮膚科学的障害、静脈瘤、黒色表皮腫、および湿疹、運動非耐性、真性糖尿病、インスリン耐性、高血圧、高コレステロール血症、胆石症、骨関節炎、整形外科的傷害、血栓塞栓症、癌（例えば、乳癌、結腸癌、前立腺癌等）、および冠動脈（または心血管）心臓疾患、被験体において高トリグリセリドおよび遊離脂肪酸に関連する特定の心血管状態のような、肥満の結果であるか、またはそれによって悪化する状態をいう。
【００９５】
肥満は、西側世界における中年人口の推定３０〜５０％に影響する体重障害の最も流行しているものである。あわせて西側世界の女性人口のほぼ０．２％に影響する、神経性食欲不振および神経性過食症のような他の体重障害もまた健康に深刻な脅威を与える。さらに、食欲不振および悪液質（るいそう）のような障害もまた、癌、嚢胞性線維症、およびＡＩＤＳのような他の疾患の顕著な特徴である。
【００９６】
用語「るいそう」障害（例えば、るいそう症候群、悪液質、サルコペニア）とは、体重の望ましくない減少および／または不健康な減少または体細胞質量の減少に起因する障害をいう。高齢者ならびにＡＩＤＳ患者および癌患者においては、消耗病の結果、脂肪および脂肪を含まない区画の両方を含む体重の望ましくない減少が起こり得る。消耗病は、食物の不適切な摂取および／または疾患に関連する代謝の変化および／または老化のプロセスの結果であり得る。癌患者およびＡＩＤＳ患者、ならびに重大な外科的処置後の患者、または慢性感染、免疫疾患、甲状腺機能亢進症、小腸外クローン病、精神病、慢性心不全または他の重度の外傷を有する患者は、頻繁に消耗病（時折、悪液質、代謝障害および摂食障害ともいわれる）にかかる。悪液質は、加えて、過剰代謝および過剰異化によって特徴づけられる。悪液質および消耗病は頻繁に交換可能に用いられて、るいそう状態をいうが、悪液質を、脂肪を含まない質量（特に、体細胞質量）の減少としてのるいそう症候群から区別する少なくとも一群の研究がある（Ｍａｙｅｒ，１９９９，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２９（１Ｓ  Ｓｕｐｐｌ．）：２５６Ｓ−２５９Ｓ）。老化する個体に影響し得るさらにもう１つのそのような障害であるサルコペニアは、典型的には、筋肉質量の減少によって特徴づけられる。最終段階の上記消耗病は、悪液質またはサルコペニアいずれかに罹った個体において発症し得る。
【００９７】
糖尿病は、動物において炭水化物、脂肪およびタンパク質代謝に影響する慢性障害である。糖尿病は成人における失明、腎不全および下肢切断の主な原因であり、心血管疾患および発作に対する主な危険因子である。
【００９８】
Ｉ型真性糖尿病（またはインスリン依存性真性糖尿病（「ＩＤＤＭ」）または若年発症糖尿病）は、糖尿病の全症例のほぼ１０％を構成する。該疾患は、膵臓のβ細胞によるインスリン分泌機能の進行性喪失によって特徴づけられる。この特徴は、その起源を膵臓病に有する非特発性または「二次的」糖尿病も有する。Ｉ型真性糖尿病は以下の臨床的兆候または症状、例えば、持続的に増大した血漿中グルコース濃度または高脂血症、多尿症；多渇症および／または過食症；網膜障害、腎臓障害および神経障害のような慢性微小血管合併症；ならびに、失明、最終段階の腎臓病、四肢切断および心筋梗塞をもたらし得る高脂血症および高血圧のような大血管（ｍａｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）合併症に関連する。
【００９９】
ＩＩ型真性糖尿病（非インスリン依存性真性糖尿病またはＮＩＤＤＭ）は、グルコース代謝の調節不全およびインスリン感度障害に関連する代謝障害である。ＩＩ型真性糖尿病は、通常、成人期に発症し、身体が十分なインスリンを利用または生成することが不可能になることに関連する。標的組織で観察されるインスリン耐性に加えて、ＩＩ型真性糖尿病に罹った患者は、相対的なインスリン欠乏を有し、すなわち、患者は所定の血漿グルコース濃度に対して予測されるインスリンレベルよりも低いレベルを有する。ＩＩ型真性糖尿病は以下の臨床的兆候または症状、例えば、持続的に増大した血漿中グルコース濃度または高脂血症、多尿症；多渇症および／または過食症；網膜障害、腎臓障害および神経障害のような慢性微小血管合併症；ならびに、失明、最終段階の腎臓病、四肢切断および心筋梗塞をもたらし得る高脂血症および高血圧のような大血管合併症によって特徴づけられる。
【０１００】
インスリン耐性症候群（ＩＲＳ）、代謝症候群または代謝症候群Ｘとも言われる症候群Ｘは、診断上の冠動脈カテーテル処置のほぼ２％において認められる。しばしば体に障害をおこし、それはＩＩ型真性糖尿病、および例えば、グルコース耐性障害（ＩＧＴ）、空腹時グルコース障害（ＩＦＧ）、高インスリン血症、インスリン耐性、異脂肪血症（例えば、高トリグリセリド、低ＨＤＬ）、高血圧および肥満を含めた心血管疾患の発症に関する症状または危険因子を示す。
【０１０１】
免疫学的障害は、限定されるものではないが、例えば、全身性エリテマトーデス；慢性関節リウマチ；若年性慢性関節炎；脊椎関節障害；全身性硬化症（強皮症）；特発性炎症筋肉障害（皮膚筋炎、多発性筋炎）；シェーグレン症候群；全身性血管炎；サルコイドーシス；自己免疫溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）；自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介性血小板減少症）；甲状腺炎（グレーヴズ病、橋本甲状線炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）；真性糖尿病；免疫−媒介性腎臓病（糸球体腎炎、管状間隙性腎炎）；多発性硬化症、特発性脱髄多発性神経障害またはギヤン−バレー症候群、および慢性炎症性脱髄多発性神経障害のような中枢および末梢神経系の脱髄疾患；感染性肝炎（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎および他の非肝臓向性ウイルス肝炎）、自己免疫慢性活性（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｃｔｉｖｅ）肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎のような肝胆管疾患；炎症性腸疾患（潰瘍性結腸炎：クローン病）；グルテン感受性腸症、およびホウィップル病；水泡性皮膚病、多形性紅斑および接触皮膚炎、乾癬を含めた自己免疫性または免疫媒介性皮膚病；喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症およびじんま疹のようなアレルギー疾患；好酸球性肺炎、特発性肺線維症および過敏性肺実質炎のような肺の免疫学的疾患；ならびに／または移植片拒絶および移植片対宿主病を含めた移植関連疾患を含む。発生障害（例えば、胚性致死）、神経学的障害（例えば、開放視野活動（ｏｐｅｎ  ｆｉｅｌｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）テストの間における応答のような不安の減少、ホームケージ活動（ｈｏｍｅ  ｃａｇｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）テストの間における異常な概日リズム等）、眼の異常（例えば、網膜異常）；および／あるいは骨代謝異常または障害（例えば、関節炎、骨粗しょう症、および／または大理石骨病）のような他の障害が存在し得る。
【０１０２】
語「標識」は、本明細書中で用いる場合には、ポリペプチドに直接的または間接的に結合体化する検出可能な化合物または組成物をいう。標識はそれ自体が検出可能であり（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変を触媒し得る。
【０１０３】
「単離された」核酸分子は、それが通常ポリペプチド核酸の天然源においては会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定および分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、それが天然で見出される形態または設定ではない。単離された核酸分子は、従って、それが天然細胞に存在する場合、核酸分子から区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、通常はポリペプチドを発現する細胞に含まれた核酸分子を含み、例えば、核酸分子は天然細胞のそれとは異なる染色体位置にある。
【０１０４】
表現「制御配列」とは、特定の宿主生物において、作動可能に連結したコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【０１０５】
核酸は、それがもう１つの核酸配列との機能的関係に置かれる場合に「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、もしそれが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響するならば、コード配列に作動可能に連結されており；あるいはリボソーム結合部位は、もしそれが転写を容易にするように位置しているならば、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続し、かつ読み枠を合わせてあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要がない。連結は、便利な制限部位における連結によって達成される。もしそのような部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、慣用的な実施に従って用いる。
【０１０６】
本明細書中で用いるように、表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は相互交換可能に用いられ、全てのそのような指定は子孫を含む。かくして、語「形質転換体」および「形質転換された細胞」は、初代の被験体細胞、および移行の回数に関連することなくそれに由来する培養物を含む。また、全ての子孫は、計画的または偶発的な突然変異に起因して、ＤＮＡ含有量において正確には同一ではない可能性があることが理解される。形質転換された元の細胞においてスクリーニングされた同一の機能または生物学的活性を有する突然変異体の子孫が含まれる。区別される指定が意図される場合、文脈からそれは明らかであろう。
【０１０７】
用語「遺伝子」とは（ａ）ＡＮＧＰＴＬ４をコードするＤＮＡ配列を含有する遺伝子、例えば、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２８４、または図１参照；（ｂ）ＡＮＧＰＴＬ４アミノ酸配列をコードするいずれかのＤＮＡ配列（例えば、図２参照）、および／あるいは；（ｃ）本明細書中で開示されたコード配列の相補体にハイブリダイズするいずれかのＤＮＡ配列をいう。ある実施形態においては、該用語はコード領域ならびに非コード領域を含み、好ましくは正常な遺伝子発現に必要な全ての配列を含む。
【０１０８】
用語「遺伝子標的化」とは、ゲノムＤＮＡのフラグメントが哺乳動物細胞に導入された場合に起こる相同組換えのタイプをいい、そのフラグメントは内因性相同配列に位置し、それと組み換えられる。相同組換えによる遺伝子標的化は、特定のゲノム配列を特別な設計の内因性ＤＮＡと置き換えるために組み換えＤＮＡ技術を使用する。
【０１０９】
用語「相同組換え」とは、２つのＤＮＡ分子の間の、または相同ヌクレオチド配列の部位における染色分体の間のＤＮＡフラグメントの交換をいう。
【０１１０】
用語「標的遺伝子」（あるいは、「標的遺伝子配列」または「標的ＤＮＡ配列」といわれる）とは、相同組換えによって改変すべきいずれかの核酸分子、ポリヌクレオチド、または遺伝子をいう。標的配列はインタクトな遺伝子、エクソンまたはイントロン、調節配列または遺伝子の間のいずれかの領域を含む。標的遺伝子は、個体のゲノムＤＮＡにおける特定の遺伝子または遺伝子座の一部を含み得る。
【０１１１】
ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の「破壊」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントを内因性相同配列とともに配置し、それらが組み換えられる場合に起こり、該破壊は天然遺伝子またはその部分の欠失、あるいは天然遺伝子中の突然変異であり、あるいは該破壊は天然遺伝子の機能的不活化である。別法として、配列の破壊は、遺伝子捕捉ベクター（すなわち、ランダムに挿入された導入遺伝子を含有し、それを発現する非ヒトトランスジェニック動物；例えば、２００２年８月２０日に発行された米国特許第６，４３６，７０７号参照）を用いる非特異的挿入不活化によって生成することができる。これらの配列の破壊または改変はＤＮＡ配列の挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失または置換、あるいは置き換えまたはそのいずれかの組み合わせを含むことができる。挿入は、動物、植物、真菌、昆虫、原核生物またはウイルス起源のものであり得る全遺伝子の挿入を含む。破壊は、例えば、その生産を部分的または完全に阻害することによって、あるいは正常な遺伝子産物の活性を増強することによって、正常な遺伝子産物を改変することができる。１つの実施形態において、該破壊は完全な（ｎｕｌｌ）破壊であり、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の有意な発現は存在しない。
【０１１２】
用語「ネイティブな発現」とは、野生型マウスに存在する発現レベルでの、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドの発現をいう。かくして、内因性ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の「ネイティブな発現がない」破壊とは、哺乳動物の単一細胞、選択された細胞、または細胞の全ての内因性ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子によってコードされるポリペプチドの少なくとも一部の発現の部分的または完全な低下をいう。
【０１１３】
用語「ノックアウト」とは、天然遺伝子の機能的不活化；天然遺伝子またはその部分の欠失；または天然遺伝子中の突然変異をもたらすＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の破壊をいう。
【０１１４】
用語「ノック−イン」とは、マウスオルソログ（または他のマウス遺伝子）を、ＡＮＧＰＴＬ４−コード遺伝子またはその改変体をコードするヒトｃＤＮＡで置き換えることをいう（すなわち、該破壊の結果、天然マウス遺伝子が天然ヒト遺伝子で置き換えられる）。
【０１１５】
用語「構築体」とは、標的組織、細胞株または動物に導入すべき人工的に組み立てられたＤＮＡセグメントをいう。典型的には、該構築体は、特に目的の遺伝子または核酸配列、マーカー遺伝子および適当な制御配列を含む。本明細書中で提供されるように、標的化ＡＮＧＰＴＬ４構築体は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の少なくとも１つの部分に相同なＤＮＡ配列を含み、宿主細胞においてＡＮＧＰＴＬ４遺伝子に破壊を生じさせることができる。
【０１１６】
用語「トランスジェニック細胞」とは、遺伝子標的化方法によって完全または部分的に破壊され、修飾され、改変され、または置き換えられたＡＮＧＰＴＬ４遺伝子をそのゲノム内に含有する細胞をいう。
【０１１７】
用語「トランスジェニック動物」とは、本明細書中に記載された方法、あるいは当該分野で他によく知られた方法によって、破壊され、あるいはそうでなければ改変され、または突然変異された特定の遺伝子をそのゲノム内に含有する動物をいう。ある実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は哺乳動物である。１つの実施形態において、哺乳動物はラットまたはマウスのようなげっ歯類である。加えて、「トランスジェニック動物」はヘテロ接合性動物（すなわち、１つの不完全な対立遺伝子および１つの野生型対立遺伝子）またはホモ接合性動物（すなわち、２つの不完全な対立遺伝子）であり得る。胚は、動物の定義内に入ると考えられる。動物の規定は、接合またはその他によるか否かを問わず、および胚が出産に至るか至らないかを問わず、子宮内における胚または胎児の規定を含む。
【０１１８】
本明細書中で用いるように、用語「選択マーカー」および「位置選択マーカー」とは、ある条件下で遺伝子を保持する細胞のみが生存および／または成長することを可能とする産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する植物および動物細胞は化合物Ｇ４１８に対して耐性である。Ｎｅｏｒマーカー遺伝子を保持しない細胞はＧ４１８によって死滅させられる。他の陽性選択マーカーは当業者に知られているか、あるいは当業者の範囲内にある。
【０１１９】
本明細書中で用いる用語「変調する」または「変調」とは、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子の機能、発現、活性、または代替的にＡＮＧＰＴＬ４遺伝子に関連する表現型の減少、阻害、低下、緩和、増加または増強をいう。
【０１２０】
用語「異常」とは、病理学的状態および挙動的観察を含む、ＡＮＧＰＴＬ４が関連する任意の疾患、障害、状態または表現型もいう。
【０１２１】
（ＡＮＧＰＴＬ４）
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４の生物学的機能、および疾患状態におけるその役割をさらに解明する要望に起因する。ＡＮＧＰＴＬ４発現は、主として、胎盤、脂肪、肝臓および腎臓組織に見出される。本発明は、肝細胞、脂肪細胞および脂質ホメオスタシスの領域におけるＡＮＧＰＴＬ４およびＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーターのさらなる使用を提供する。また、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子中に破壊を含有するトランスジェニックまたはノックアウトマウス、およびその使用も記載する。
【０１２２】
アンジオポエチン様４タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ４）は分泌タンパク質であり、アンジオポエチンファミリーのメンバーである。それは、肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質（ＨＦＡＲＰ）（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００））、ＰＧＡＲ（ＰＰＡＲγアンジオポエチン関連タンパク質）（Ｙｏｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２０：５３４３−５３４９（２０００））、空腹時誘導脂肪因子（ＦＩＡＦ）（Ｋｅｒｔｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２８４８８−２８４９３（２０００））；アンジオポエチン関連タンパク質（ＡＲＰ−４）；ＮＬ２（米国特許第６，３４８，３５０号；第６，３７２，４９１号；および第６，４５５，４９６号を参照のこと）；およびＡｎｇ６としても知られている。
【０１２３】
ヒト由来のＡＮＧＰＴＬ４タンパク質は４０６アミノ酸タンパク質であり（例えば、米国特許第６，３４８，３５０号、第６，３７２，４９１号および第６，４５５，４９６号）、他方、マウスＡＮＧＰＴＬ４は４１０アミノ酸タンパク質（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００））である。マウスおよびヒトはアミノ酸レベルで約７５％の同一性を有する。Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００）。ＡＮＧＰＴＬ４はシグナルペプチド、３つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位、および分子内ジスルフィド結合に関与し得る４つのシステインを有する。ＡＮＧＰＴＬ４は、例えば、図３、パネルＡに示されるように、より高次の分子構造を形成する。また、例えば、Ｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３）：２０３８−２０４５（２００４）；Ｇｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４５：２０７１−２０７９（２００４）；およびＭａｎｄａｒｄら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３３）：３４４１１−３４４２０（２００４）参照。ＡＮＧＰＴＬ４はタンパク質分解によりプロセシングされ得、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４のＲ１６２ＧおよびＲ１６４Ｅの置換の結果、野生型タンパク質よりもＳＤＳ−ゲル上でより高い分子量にて泳動する改変体ＡＮＧＰＴＬ４が得られる（図３、パネルＢ参照）。また、例えば、Ｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３）：２０３８−２０４５（２００４）；およびＭａｎｄａｒｄら、Ｊ．ｏｆ
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（３３）：３４４１１−３４４２０（２００４）参照。
【０１２４】
アンジオポエチンファミリーの保存された領域は、コイルドコイルドメインおよびＣ末端フィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインを含む。例えば、Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４６：６０３−６１０（２０００）参照。ＡＮＧＰＴＬ４は制御された様式でタンパク質分解によりプロセシングされて、Ｃ末端フィブリノーゲン様ドメインを放出すると示唆される。例えば、Ｇｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（３）：２０３８−２０４５（２００４）参照。
【０１２５】
ＡＮＧＰＴＬ４はインテグリンαｖβ５に結合する。例えば、図９、パネルＡ〜Ｅ参照。該ファミリーのもう１つのメンバーであるアンジオポエチン様３タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ３）は、インテグリンαｖβ３に結合する脈管形成因子である。例えば、２００３年１１月２０日に公開された米国特許出願２００３０２１５４５１、およびＣａｍｅｎｉｓｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１９）：１７２８１−１７２９０（２００２）参照。ＡＮＧＰＴＬ３は受容体Ｔｉｅ２に結合しないようである。Ｃａｍｅｎｉｓｈら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１９）：１７２８１−１７２９０（２００２）。ＡＮＧＰＴＬ３は血漿中脂質レベルの調節因子でもある。例えば、Ｋｏｉｓｈｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３０：１５１−１５７（２００２）参照。
【０１２６】
インテグリンαｖβ５は、ビトロネクチンおよびＤｅｌ−１を含めた細胞外マトリクスタンパク質に対する受容体である（例えば、Ｓｔｕｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１５：３７２９−３７３８（２００２）参照）。αｖ−インテグリンは腫瘍の進行および転移に関連付けられている。例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ  Ｆ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，Ｉ  Ｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｂｉｏｌ．７（３）：１２９−３８（１９９６）参照。加えて、脈管形成の間におけるαｖ−インテグリンの役割もまた示されている。例えば、Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｂ  Ｐ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ  Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：７４１−７５０（１９９８）参照。例えば、αｖβ５に対するモノクローナル抗体は、ウサギ角膜およびニワトリ絨毛尿膜モデルにおいてＶＥＧＦ誘導性脈管形成を阻害することが示されている。例えば、Ｍ．Ｃ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１５００−１５０２（１９９５）参照。αｖβ３およびαｖβ５のアンタゴニストもまた、成長因子および腫瘍誘導性脈管形成を阻害することが示されている。例えば、Ｅｌｉｃｅｉｒｉ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３：５６３−５６８（２００１）参照。
【０１２７】
（ＡＮＧＰＴＬ４およびＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーターの使用）
本発明は、種々の細胞活性およびプロセス（例えば、肝細胞増殖および／または細胞接着および、プレ脂肪細胞増殖および／またはプレ脂肪細胞移動）を変調する、ＡＮＧＰＴＬ４またはそのアンタゴニストもしくはアゴニストの使用を提供する。ＡＮＧＰＴＬ４は、トリグリセリドおよびコレステロールの血清中レベルの変調に関与する。加えてＡＮＧＰＴＬ４は、炎症性応答の負の調節因子でもあり得る。ＡＮＧＰＴＬ４のモジュレーターを用いて、これらの活性に関連する障害および疾患を治療することができる。
【０１２８】
（肝臓）
ＡＮＧＰＴＬ４は肝細胞の増殖および肝細胞の接着を刺激する。肝臓はコレストロールホメオスタシスについての主な器官である。本明細書中における、セクション「脂質ホメオスタシス」も参照。肝臓はコレステロール生合成およびコレステロールの異化を担う。肝臓は超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を合成し、分泌する。循環において、ＶＬＤＬは代謝されて、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）となり、これは血漿中の主要なコレステロール担持リポタンパク質である。
【０１２９】
肝臓は消化管と身体のそれら以外のものとの間に置かれた保護者として作用する。主な肝臓の機能は、炭水化物、脂質、アミノ酸、ビタミンおよび微量元素のような多量の物質の効果的な取り込み、貯蔵、代謝、および血液および胆汁への分配を含む。肝臓のもう１つの機能は、相Ｉ（酸化／還元）機構および相ＩＩ（抱合）機構の両方を介しての生体異物汚染物、薬物および内因性代謝産物の解毒である。
【０１３０】
肝臓は、数千の、該器官の機能的単位である微細な小葉（肝小葉）を含むヒト身体の主な代謝制御器官である。肝臓組織は２つの主な分化した細胞型：実質細胞（すなわち、肝細胞）および非実質細胞を含有する。肝臓の複雑な機能の大部分は肝細胞によって実行され、他方、クップファー細胞、伊東細胞および肝臓洞様毛細血管内皮細胞（ＬＳＥＣ）のような非実質細胞は、肝細胞に対する供給を支持および提供する重要な役割を果たす。Ｍｏｃｈｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２６：１７６−１７９（１９９６）。
【０１３１】
初期発生の間における正常な成長に加えて、肝臓組織は成人段階において再生するユニークな能力を有する。肝組織の喪失後の肝臓の再生は、肝毒性、ウイルス感染、血管損傷および部分的肝臓切除のような種々の形態の肝臓損傷に応答する修復プロセスの基本的な構成要素である。部分的肝臓切除後、例えば、肝臓のサイズは、通常、約６日以内にその元の質量に回復する。肝臓の成長および再生は、肝細胞および洞様毛細血管内皮細胞のような非実質細胞の両方の増殖を含む。典型的に、肝細胞がまず増殖し、肝臓の他の細胞は肝細胞から約２４時間後にＤＮＡ合成に入る。Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  ＤｅＦｒａｎｃｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：６０−６５（１９９７）。
【０１３２】
本発明は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４またはそのアゴニストを投与することによって、肝臓成長および／または肝細胞増殖を促進する方法を提供する。本発明の促進効果は、当該分野で知られた方法を用い、インビトロまたはインビボいずれかで評価することができる。例えば、Ｄｒａｋｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４２６８（１９９７）；Ｏｍｏｒｉら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２６：７２０（１９９７）；および米国特許第５，２２７，１５８号参照。例えば、細胞増殖は、限定されるものではないが、ＤＮＡ合成の速度の測定（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２：１４５０（１９８４））、トリパンブルー染料排除／血球計算板のカウント（例えば、Ｏｍｏｒｉら、（１９９７）前掲参照）、またはフローサイトメトリー（例えば、Ｄｒａｋｅｓ（１９９７）前掲参照）を含めた当該分野で公知の方法を用いて培養の間に評価される。
【０１３３】
本発明のある実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４またはそのアゴニストを投与して、肝細胞の細胞接着を誘導する。肝細胞の接着は、例えば、クリスタルバイオレットアッセイを含めた当該分野で知られた方法によって評価することができる。また、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６７：３７９−３８８（１９８４）参照。本発明の１つの実施形態において、肝細胞および他の非実質肝細胞は標的の肝臓から単離され、ＡＮＧＰＴＬ４またはそのアゴニストを含む適当な組織培養培地に再懸濁されて、細胞接着を誘導する。必要であれば、異なる速度での異なる時間の間の遠心分離によって、異なる細胞画分をさらに分離することができる（例えば、非実質細胞から実質細胞を）。
【０１３４】
もう１つの実施形態において、全体としての肝細胞および肝臓器官に対するＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストの増殖効果は、例えば、肝臓組織試料の組織化学アッセイを用いてインビボで測定される。１つの態様において、肝細胞のインビボ増殖は、非増殖細胞よりも増殖細胞においてより高い濃度で存在することが知られているタンパク質（例えば、増殖している細胞の核の抗原（ＰＣＮＡまたはサイクリン））に対して向けられる抗体に対する反応性によって評価される。Ｒｏｄｇｅｒｓら、Ｊ．Ｂｕｒｎ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｈａｂｉｌ．１８：３８１−３８８（１９９７）。もう１つの態様において、ＢｒｄＵ免疫組織化学アッセイは、Ｇｅｒｂｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６：１１４９−１１５９（１９９９）によって記載されたように用いることができる。
【０１３５】
生命に対するその必須の役割のため、肝臓の機能不全および疾患は、しばしば、衰弱させ、そして生命を脅かす。多数の急性または慢性病理学的状態は、肝臓の構造的および／または機能的異常に関連する。これらは、限定されるものではないが、肝臓不全、肝炎（急性、慢性またはアルコール性）、肝硬変、中毒性肝臓損傷、薬物性肝臓損傷、肝性脳障害、肝性昏睡および肝臓壊死を含む。肝細胞の細胞成長促進は、肝臓病を治療するのに有用であり得る。本発明の化合物および方法は、肝臓損傷の修復を提供できる。理論に拘束されないが、これは、肝臓細胞を刺激して成長させ、分裂させることによって、直接的または間接的に達成することができると考えられる。１つの実施形態によると、本発明は、有効量の本発明のＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを投与することによって、被験体において病理学的肝臓状態を治療する方法を提供する。
【０１３６】
句「病理学的肝臓状態」は「肝臓障害」または「肝臓病」と交換可能に用いて、任意の構造的および／または機能的な肝臓の異常を示す。病理学的肝臓状態の非限定的例は、肝臓不全、肝炎（急性、慢性またはアルコール性）、肝硬変、中毒性肝臓損傷、薬物性肝臓損傷、肝性脳障害、肝性昏睡または肝臓壊死と関連する状態を含む。
【０１３７】
１つの態様において、本発明は、肝臓損傷の状態またはその原因因子に感受性である被験体において肝臓を損傷から保護する方法を提供する。句「肝臓損傷」は、本明細書中においては、最も広い意味で用いられ、内部または外部因子あるいはそれらの組み合わせから直接的または間接的に由来する任意の構造的または機能的な肝臓傷害を示す。肝臓損傷は、限定されるものではないが、肝毒性化合物への曝露、放射線曝露、機械的な肝臓傷害、遺伝的素因、ウイルス感染、自己免疫慢性肝炎のような、かつアクチビンおよびＴＧＦ−βのようなタンパク質のインビボレベルの増大の結果としての自己免疫疾患を含めた多数の因子によって誘導され得る。肝毒性化合物によって誘導された肝臓損傷は、薬物過敏反応、胆汁うっ滞、および血管内皮への傷害を含めた直接的細胞傷害を含む。
【０１３８】
治療的または純粋に有害な多くの化学薬剤および生物学的薬剤は肝臓損傷を誘導し得、それゆえ肝毒性である。肝毒性化合物は、脂肪肝、肝炎、肝硬変、および肝臓の血管および新形成病変を含めた慢性肝臓病の重要な原因でもある。（Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５６９−５７５（１９９２），編集者，Ｋｅｌｌｅｙ；出版社，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．）。本発明においては、ＡＮＧＰＴＬ４またはアゴニストを被験体に投与することを含む、肝毒性剤への曝露による損傷から被験体の肝臓を保護する方法が提供され、該ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは肝臓を損傷から効果的に保護する。１つの態様において、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは、肝毒性剤への該被験体への曝露の前にか、またはそれと同時に投与され、該肝毒性剤は癌を治療するための化学療法剤または放射線剤（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）のような治療剤である。したがって、該方法は、被験体を高用量の治療剤に耐性とすることによって、治療の効力を増大させるように働く。もう１つの態様において、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは、肝毒性剤への被験体の曝露後であるが、被験体における任意の肝臓損傷が検出可能である前に投与される。そのような方法は、肝毒性剤への被験体の偶発的な曝露による肝臓損傷を治療するのに有用であり得る。
【０１３９】
肝毒性剤は、直接的にか、または毒性代謝産物の産生（このカテゴリーは、薬物アレルギーを模倣する過敏反応を含む）；胆汁うっ滞（胆管の閉塞による胆汁の流れの阻止）；および血管病変（例えば、血管内皮への傷害が肝静脈血栓をもたらす血管内（ｉｎ  ｖｅｎｏ）閉塞病（ＶＯＤ））を介する、肝臓への細胞毒性によって肝臓損傷を誘導し得る。肝毒性剤によって誘導された肝臓損傷に対する個体の罹患性は、遺伝的因子、年齢、性別、栄養状態、他の薬物への曝露および全身疾患によって影響を受ける（Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，前掲）。
【０１４０】
多くの肝毒性化合物は、受容者に、低い比率で肝臓損傷を予想外に生成する。数人の患者において、肝臓損傷は過敏反応と言われ、薬物反応のそれと似ており、患者は発熱と共に、発疹および好酸球増加症を呈し、薬物の再投与に際して症状が再発する。他の状況において、傷害に対する機構は知られておらず、これは肝毒性代謝産物の産生または蓄積を許容する感受性患者において異常な代謝を呈し得る。
【０１４１】
直接的な化学物質の攻撃により細胞毒性を誘導する薬物としては、以下が挙げられる：エンフルラン、フルオロキセン、ハロタン、およびメトキシフルランのような麻酔剤、コカイン、ヒドロジド、メチルフェニデート、および三環系剤（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃｓ）のような神経精神作用剤（ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｉｃｓ）；フェニトインおよびバルプロ酸のような抗痙攣剤；アセトアミノフェン、クロルゾキサゾン、ダントロレン、ジクロフェナク、イブプロフェン、インドメタシン、サリシレート、トルメチン、およびゾキサゾラミンのような鎮痛剤；アセトヘキサミド、カルブタミド、グリピジト、メタヘキサミド、プロピルチオウラシル、タモキシフェン、ジエチルスチルベストロールのようなホルモン；アンホテリシンＢ、クリンダマイシン、ケトコナゾール、メベンダゾール、メトロニダゾール、オキサシリン、パラアミノサリチル酸、ペニシリン、リファンピシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、およびジドブジンのような抗菌剤；アミオダロン、ジリチアゼム、ａ−メチルドパ、メキシレチン、ヒドラザリン、ニコチン酸、パパベリン、ペルヘキシリン、プロカインアミド、キニジン、およびトカインアミド（ｔｏｃａｉｎａｍｉｄｅ）のような心血管薬物；ならびに、アスパラキナーゼ、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、メトトレキセート、ニトラマイシン、６−ＭＰ、ニトロソ尿素、タモキシフェン、チオグアニン、およびビンクリスチンのような免疫抑制剤および抗新形成剤；ならびに、ジスルフィラン、ヨウ素イオン、オキシフェンイサチン、ビタミンＡおよびパラアミノ安息香酸のようなその他の薬物。
【０１４２】
肝臓において過敏反応を生じる肝毒性化合物は以下のものを含む：フェニトイン、パラアミノサリチル酸、クロルプロマジン、スルホンアミド、エリスロマイシンエストレート、イソニアジド、ハロタン、メチルドパ、およびバルプロ酸。胆汁うっ滞（胆汁の流れの阻止）を含む肝毒性化合物はいくつかの形態を取り得る。中心性の（ｃｅｎｔｒｉｂｕｌａｒ）胆汁うっ滞には、門脈の炎症の変化が伴う。エリスロマイシンのようないくつかの薬物で胆管変化が報告されており、他方、純粋な小管胆汁うっ滞は、同化ステロイドのような他の薬物の特徴である。慢性胆汁うっ滞はメチルテストステロンおよびエストラジオールのような薬物に関連付けられてきた。
【０１４３】
胆汁うっ滞疾患に関連する肝毒性化合物は以下のものを含む：避妊ステロイド、アンドロゲンステロイド、同化ステロイド、アセチルサリチル酸、アザチオプリン、ベンゾジアゼピン、ケノデオキシコール酸、クロルジアゼポキシド、エリスロマイシンエストレート、フルフェナジン、フロセミド、グリセオフルビン、ハロペリドール、イミプラミン、６−メルカプトプリン、メチマゾール、メトトレキセート、メチルドパ、メチレンジアミン、メチルテストステロン、ナプロキセン、ニトロフラントイン、ペニシラミン、パーフェナジン、プロクロルペラジン、プロマジン、チオベンダゾール、チオリダジン、トルブタミド、トリメトプリムスルファメトキサゾール、砒素、銅、およびパラクアット。
【０１４４】
数種の薬物は、主として胆汁うっ滞性であるが、肝毒性も生成し得、それゆえそれらが引き起こす肝臓傷害は混合される。混合性肝臓傷害を引き起こす薬物は、例えば、以下のものを含む：クロルプロマジン、フェニルブタゾン、ハロタン、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、アロプリノール、フェノバルビタール、ナプロキセン、プロピルチオウラシル、クロラムフェニコール、トリメトプリム‐スルファメトキサゾール、アムリノン、ジソピラミド、アザチオプリン、シメチジン、およびラニチジン。
【０１４５】
肝静脈の血栓症、肝細静脈の閉塞または静脈閉塞病（ＶＯＤ）、および紫斑病性肝炎を含めた肝臓の血管病変は薬物によって生成され得る。加えて、洞様毛細血管拡張、洞様毛細血管周囲線維症、および肝門脈硬化症を含めた病変が起こり得る。中間帯および中央周囲洞様毛細血管拡張は、経口避妊療法の合併症として最初に報告された。紫斑病性肝炎は、内皮バリアーを通過しての赤血球の漏洩、続いての洞様毛細血管周囲線維症に由来する大規模な血液で満たされた内腔（ｃａｖｉｔｙ）よりなる状態である。それは、経口避妊薬、同化ステロイド、アザチオプリンおよびダナゾールを服用する患者で記載されてきた。中央肝臓細静脈の傷害および閉塞は、ブッシュティー（ｂｕｓｈ  ｔｅａ）のようなピロリジジンアルカロイドの摂取に関連することが知られている。最初の病変は、細静脈管腔直径の進行性の減少を伴う中心壊死である。これらの病変の全ては、薬物を停止した場合に部分的に可逆的にあるにすぎず、肝硬変は発達し得る。
【０１４６】
数種のタイプの良性および悪性肝新生物は肝毒性化合物の投与に由来し得る。出産可能な年代の女性に限定される病変であるアデノーマは、避妊ステロイドの使用に関連し、その危険性は使用の持続に伴って増加する。肝細胞癌腫は、無形成貧血または下垂体機能不全症に対してアンドロゲンホルモンを服用する患者において観察され得る。
【０１４７】
肝臓病変を引き起こすことが知られている肝毒性化合物は以下のものを含む：避妊ステロイド、ピロリジジンアルカロイド、ウレタン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、マイトマイシン、ＢＣＮＵ、ビンクリスチン、アドリアマイシン、静脈内ビタミンＥ、同化−アンドロゲンステロイド、アザチオプリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、硫酸エストロン、タモキシフェン、無機砒素物質、二酸化トリウム、ビタミンＡ、メトトレキセート、メチルアンフェタミン塩酸塩、ビタミンＡ、コルチコステロイド、二酸化トリウム、およびラジウム療法。
【０１４８】
他の因子によって引き起こされた肝臓損傷は、通常、同様の形態を取る。肝臓損傷は、化合物、放射線療法、遺伝的素因、機械的傷害、またはそのようなおよび他の因子のいずれかの組み合わせの肝毒性によって引き起こされたかを問わず、いくつかの手段によって検出することができる。生化学テストが、肝毒性の標準的尺度として、臨床的に長年用いられてきた。ほとんどの生化学的テストは、一般的には、以下の２つのカテゴリーに分けられる：特定の肝臓マーカー、例えば、プロトロンビン凝固時間、および／または肝臓血流を測定するテスト、または壊死、胆汁うっ滞、進行性線維形成、または肝癌の検出のために血清マーカーを分析するテスト（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，Ｃ．ｉｎ  Ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｍｅｅｋｓら編、ｐｇｓ．１８１−１８５（１９９１））。そのようなテストの重要性は、それらの簡便性、およびそれらが非侵襲性であるという事実にある。肝臓損傷を評価することにおいて血清酵素を用いる合理性は、通常は肝臓細胞に含まれるこれらの酵素が、肝臓細胞が傷害した場合に、一般的な循環への進入することである。
【０１４９】
血清酵素活性の増大は、壊死および／または胆汁うっ滞を示す。血清ビリルビン結合体のレベルの増大は、肝臓内または肝臓外胆汁うっ滞を示す。しかしながら、肝臓傷害を診断する単一手段として、血清酵素レベルの使用にはある限界が存在する。血清酵素レベルは、化学物質によって引き起こされた特異的な肝臓傷害よりはむしろ因子の全身的効果での浸透性の改変による細胞からの漏出の結果として増加し得る。肝臓の組織病理学的調査は、肝臓傷害の性質および程度を同定および定量する際の次の論理的工程である。
【０１５０】
肝臓傷害のマーカーとしての血清酵素は、肝臓傷害に対する特異性および感受性に基づいて４つのグループに分けることができる（Ｋｏｄａｖａｎｔｉら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２０（４）：５５６−６９（１９９２）；Ｋｏｄａｖａｎｔｉら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ６３（５）：３６７−７５（１９８９））。
グループＩ：これらの酵素は増大した場合により選択的に肝臓胆汁うっ滞を示す。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、５′−ヌクレオチターゼ（５′−ＮＤ）、およびａ−グルタミルトランスペプチダーゼ（Ｇ−ＧＴ）およびロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）。グループＩＩ：これらの酵素は、増大した場合に実質性傷害を示す。例えば、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、フルクトース−１，６−二リン酸アルドラーゼ（ＡＬＤ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）、オルニチン−カルバモイル−トランスフェラーゼ（ＯＣＴ）、およびソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）アルギナーゼおよびグアナ―ゼ。グループＩＩＩ：これらの酵素は、増大した場合に他の組織の傷害を表す。例えば、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）。グループＩＶ：これらの酵素は肝臓傷害において減少する。例えば、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）。
【０１５１】
他の血清マーカーは、肝臓線維形成が活性であるか否かを評価するためのプロコラーゲンＩＩＩ型ペプチドレベル（ＰＩＩＩＰ）；肝性脳障害におけるアンモニア血中レベル；壊死および肝癌におけるレベルでのリガンド；肝臓内皮細胞損傷によるヒアルロネートレベル；肝癌を検出するためのａ−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベル；肝臓への癌の転移を検出するための癌胎児性抗原（ＣＥＡ）レベル；ミトコンドリア、および核および特異的肝臓膜タンパク質のような種々の細胞成分に対する抗体の増大；アルブミン、グロビン、アミノ酸、コレステロール、および他の脂質のようなタンパク質の検出を含む。また、肝臓バイオプシーから得られた種々の無機質、代謝産物、および酵素の生化学分析は、遺伝性、後天性、および実験的に誘導された肝臓障害における特異的生化学的欠陥を調べることにおいて有用であり得る。
【０１５２】
肝機能のテストを行って、肝臓傷害を評価することができる。肝機能のテストは以下のものを含む：グループＩ、ビリルビン、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、スルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）および胆汁酸のような有機アニオンの肝臓クリアランスの評価；グループＩＩ、ガラクトースおよびＩＣＧクリアランスの測定による肝臓血流の評価；グループＩＩＩ、アミノプリン呼気テストおよびカフェインクリアランステストの使用を介する、肝臓ミクロソーム機能の評価。例えば、血清ビリルビンを測定して、黄疸の存在および重症度を確認し、実質肝臓病で見られる、高ビリルビン血症の程度を決定することができる。アミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）の増大は活性な肝細胞損傷の重症度を反映し、他方アルカリホスファターゼ増大は胆汁うっ滞および肝臓浸潤に伴って見出される（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ．ａｎｄ  Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎら編、２：１３０１−１３０８（１９９１））。血清酵素分析を行うための方法は当該分野で知られており、例えば、Ｋｏｄａｖａｎｔｉら、前掲に記載されている。
【０１５３】
広範な肝臓傷害はアルブミン、プロトロンビン、フィブリノーゲン、および肝細胞によって専ら合成される他のタンパク質の血中レベルの減少をもたらし得るので、これらのタンパク質のレベルは肝臓傷害の指標として測定することができる。血清酵素の測定とは対照的に、血清タンパク質レベルは単に細胞傷害よりはむしろ肝臓合成機能を反映する（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎら編、２：１３０８−１３１１（１９９１））。
【０１５４】
多くの患者において、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波、シンチスキャン、または肝臓バイオプシーが、肝臓病の性質を決定するのに必要とされ得る（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ，ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｌ．ａｎｄ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｌ．ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎら編、２：１３０３−１３０７（１９９１））。
【０１５５】
本発明は被験体において療法の効果を増強する方法を提供し、該方法は、該療法に先立って、またはそれと同時に、肝毒性化合物によって引き起こされた損傷から被験体の肝臓を保護するのに有効な方法で、ＡＮＧＰＴＬ４、またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを被験体に投与し、それにより、該療法に対する被験体の耐性を増加させることを含む。例えば、化学療法の過程の間に用いられる化学療法剤は、肝細胞に対して細胞毒性効果を有しかねず、従って、患者に投与すべき化学療法剤の用量および／または期間を制限する。ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを含む組成物に肝臓を曝露することによって、そのような毒性効果を防止し、または低下させることができる。それゆえ、化学療法剤の用量は増加させることができ、それにより、癌療法の効率を高めることができる。
【０１５６】
ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは、本明細書中で記載した方法において他の因子と組み合わせることができる。例えば、いくつかの成長因子およびサイトカイン、最も顕著には、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−（ＴＧＦ−）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子−（ＴＮＦ−α）、塩基性および酸性線維芽細胞成長因子、ＣＴＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、およびノルエピネフリンは、肝臓再生を誘導することができるものとして示されている。Ｆｕｊｉｗａｒａら、Ｈｅｐａｔｏｌ．１８：１４４３−９（１９９３）；Ｂａｒｕｃｈら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２３：３２８−３２（１９９５）；Ｉｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８：２５−３１（１９９４）；Ｓｕｚｕｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４０７２５−３１（２０００）；およびＭｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  ＤｅＦｒａｎｃｅｓ（１９９７）前掲。これらはＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストと組み合わせることができる。
【０１５７】
ＨＧＦ（最も強力な肝臓マイトゲンの１つ）が、培養した肝細胞においてＤＮＡ合成を刺激することができる因子としてまず同定されたが、今日では、種々の表皮細胞に対して多数の区別される機能を有することが知られている。Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２：１４５０（１９８４）；およびＲｕｓｓｅｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１９：１８３−１９２（１９８４）。ＨＧＦは細胞分散因子（ＳＦ）としても知られており、命名ＨＧＦ／ＳＦにつながる。Ｓｔｏｋｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙｍａｎ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．７７：２０９−２２３（１９８５）；およびＧｈｅｒａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：２２８（１９９０）。ＨＧＦの生物学的効果は、単一のチロシンキナーゼ受容体を介して、Ｍｅｔプロトオンコジーンの産物であるＭｅｔに変換される。肝臓においては、ＨＧＦは伊東細胞およびＬＳＥＣのような非肝細胞で発現され、他方、Ｍｅｔ転写物は肝細胞で強く発現される。Ｈｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４２：１８２３−１８３０（１９９３）。化学的または機械的な肝臓傷害後に、ＨＧＦのレベルは鋭敏に増加し、強力な肝細胞増殖に導く。Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２３：１７４−１８３（１９９５）。ＨＧＦの肝臓−特異的過剰発現を伴うトランスジェニックマウス由来の肝臓は、対照動物の肝臓の２倍のサイズであり、それは部分的な肝臓切除後にかなり速く再生する。Ｓａｋａｔａら、（１９９６）  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７：１５１３−１５２３；Ｓｈｉｏｔａら、（１９９４）  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９：９６２−９７２。
【０１５８】
脈管形成は、血管内皮細胞が増殖し、余分な部分を取り除き、再度組織されて、予め存在する血管ネットワークから新しい血管を形成するという重要な細胞的事象である。血管供給の発達は、正常なおよび病理学的な増殖プロセスに必須であるという強力な証拠がある（Ｆｏｌｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２−４４７）。再生している肝臓は、迅速に成長している腫瘍と同様に、新しい支質および血管を合成するはずである。例えば、ＷＯ  ０３／１０３５８１；Ｙａｍａｎｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：２６８３−２６９０（１９９４）；Ｍｏｃｈｉｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２６：１７６−１７９（１９９６）；Ａｊｉｏｋａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２９：３９６−４０２（１９９９）；およびＡｓｓｙら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３０：９１１−９１５（１９９９）。Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  ＤｅＦｒａｎｃｅｓ（１９９７）前掲；Ｍｏｃｈｉｄａら、（１９９６）。本発明の１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは、脈管形成剤、例えば、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのアクチベーターと組み合わせて投与される。「脈管形成因子または脈管形成剤」は、血管の発達を刺激し、例えば、脈管形成、内皮細胞成長、血管の安定性、および／または脈管形成等を促進する成長因子である。例えば、脈管形成因子は限定されるものではないが、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン）、ＡＮＧＰＴＬ３、エフリン等を含む。それは、成長ホルモン、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、およびＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのような、創傷治癒を加速する因子も含む。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、公知の脈管形成因子を列挙する表１）；およびＳａｔｏ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）参照。
【０１５９】
（脂質ホメオスタシス）
ＡＮＧＰＴＬ４は、肝臓以外に、エネルギーホメオスタシスの他の態様の変調に関連する。ＡＮＧＰＴＬ４は脂肪分化（ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、全身脂質代謝、および脈管形成に関連付けられている。例えば、Ｙｏｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０（１４）：５３４３−５３４９（２０００）；Ｌｅ  Ｊａｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）；およびＥＰ  １４０３３６７参照。ＡＮＧＰＴＬ４の発現は脂肪組織においてＰＰＡＲガンマおよびアルファによっても誘導され、空腹時によって誘導される。例えば、Ｙｏｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：５３４３−５３４９（２０００）；およびＫｅｒｓｔｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：２８４８８−２８４９３（２０００）参照。ＡＮＧＰＴＬ４の発現は空腹時の間にアップレギュレートされ、豊富な血漿中のタンパク質は高脂肪供給により減少する。
【０１６０】
加えて、ＡＮＧＰＴＬ４はリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性を阻害する。例えば、ＥＯ１４０３３６７参照。リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）は、キロミクロンに存在するトリグリセリドおよび超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を加水分解して、遊離脂肪酸およびリン脂質を生じさせることによって、リポタンパク質代謝を媒介する分泌糖タンパク質である。
【０１６１】
本明細書中で提供するように、ＡＮＧＰＴＬ４ノックアウトマウスは、その性が一致する野生型同腹仔と比較してコレステロールおよび血清トリグリセリドのレベルが低い。本明細書のトランスジェニックノックアウト動物および実施例４との表題のセクション参照。加えて、ＡＮＧＰＴＬ４の静脈内注射はマウスにおいて循環血漿脂質レベルを増加させ、超低密度リポタンパク質のレベルを増加させる。例えば、Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３：１７７０−１７７２（２００２）および図１０参照。
【０１６２】
被験体においてトリグリセリドまたはコレステロールの血清中レベルを変調する方法が本発明で提供される。例えば、該方法は、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストもしくはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを含む組成物の有効量を被験体に投与し、それにより、被験体におけるトリグリセリドまたはコレステロールの血清中レベルを変調することを含む。１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを投与し、その結果、トリグリセリドまたはコレステロールが血清に蓄積される。もう１つの実施形態において、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを被験体に投与し、それにより、処置前の被験体、または処置を受けていない、または減じた処置を受けた被験体と比較して、被験体の血清中の少なくとも１つのトリグリセリド、遊離脂肪酸および／またはコレステロールのレベルを低下させる。平均血清中コレステロールおよびトリグリセリドレベルは当該分野で知られているようにアッセイできる。
【０１６３】
ＡＮＧＰＴＬ４は脂肪細胞を変調することもできる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４はプレ脂肪細胞の増殖を刺激し、またはプレ脂肪細胞の細胞移動を誘導することができる。脂肪組織は、エネルギーホメオスタシスにおいて非常に重要な役割を演じる脂肪細胞から主になる。脂肪細胞は脂質を合成し、栄養素が豊富な場合には脂質を貯蔵し、栄養素が必要な場合には脂肪酸を循環に放出する。白色脂肪組織（ＷＡＴ）および褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は脊椎動物に見出される。ＷＡＴは動物の栄養要求に応じて脂肪を貯蔵し、放出する。ＷＡＴ貯蔵脂肪は、（１）断熱（例えば、皮下脂肪）、（２）（例えば、内臓を囲う）機械的クッション、および（３）エネルギーの源として用いられる。ＢＡＴは脂肪を燃焼し、より低い温度に応答して熱発生を増加させることによって恒温性を維持するために、そしてカロリー摂取の増加に応答してエネルギー消費を増加させることによってエネルギーバランスを維持するために、熱発生を通じてエネルギーを熱として放出する。例えば、Ｓｅａｒｓ，Ｉ．Ｂ．ら、（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（７）：３４１０−３４１９（１９９６）参照。一般にＢＡＴは年齢と共に減少するが、ある条件下、例えば、冷気への長時間の曝露、高脂肪食の維持、および腫瘍を生じるノルアドレナリンの存在下で再度活性化され得る。
【０１６４】
脂肪生成は、形態学的変化、成長の阻止、脂質生成酵素の発現、脂質蓄積に関連し、種々のホルモン、例えば、インスリンに対する感受性を獲得する。有効量のＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを投与することによって、脂肪細胞の増殖を刺激することを含む方法が提供される。細胞増殖は、限定されるものではないが、ＤＮＡ合成の速度の測定（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２：１４５０（１９８４）参照）、トリパンブルー染料排除／へマサイトメーターカウンティング（例えば、Ｏｍｏｒｉら、（１９９７）前掲）、またはフローサイトメトリー（例えば、Ｄｒａｋｅｓ（１９９７）前掲参照）を含めた、当該分野で知られた方法を用いて培養の間に評価することができる。ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは、例えば、限定されるものではないが、（例えば、数種類の癌、免疫無防備状態の患者（例えば、ＡＩＤＳに罹った人等）、高齢の個体のような）消耗病を含めた、追加的な脂肪細胞が有益であろう障害において脂肪細胞の増殖を誘導するのに有用であり得る。また、有効量のＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを投与することによって、プレ脂肪細胞移動を誘導することを含む方法も提供される。
【０１６５】
ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストは、脂肪細胞の分化を促進する他の因子と組み合わせることもできる。これらの因子は、限定されるものではないが、例えば、ＩＧＦ−１、インスリン、グルココルチコイド、３，３’，５−トリヨードチロニン、レチノイン酸、ＰＧＦ２α、ＰＧＩ２等を含む。さらなる因子は、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストと組み合わせることもできる。例えば、脂肪生成はホルモンおよび転写制御に供される。例えば、脂肪生成は、例えば、ペルオキシソーム増殖剤−活性化受容体（ＰＰＡＲ）、例えば、（ＰＰＡＲα、γ）ファミリー、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）ファミリー、および塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパー（ｂＨＬＨ）ファミリー、例えば、ＡＤＤ１／ＳＲＥＢＰ１のメンバーを含めた転写因子のカスケードによって媒介され得る。例えば、Ｗｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：６８９−６９４（１９９９）；Ｒｏｓｅｎ
ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６：１４５−１７１（２０００）；Ｇｒｅｇｏｉｒｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７８（３）（１９９８）；およびＫｉｍ  ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａ
ｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌ  １０：１０９６−１１０７（１９９６）参照。ＰＰＡＲγは脂肪組織で作用し、脂肪生成および脂質貯蔵を促進する。例えば、Ｒｏｓｅｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６：１４５−１７１（２０００）；Ｒｏｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４：６１１−６１７（１９９９）；Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２７−３２（２００２）；Ｒｏｓｅｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６：２２−２６（２００２）；およびＦｕｋｕｍｕｒａら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９３：ｅ８８−ｅ９７（２００３）参照。ＰＰＡＲもまた、脂肪細胞および他の細胞においてリポタンパク質リパーゼｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを媒介し（例えば、Ｇｂａｇｕｉｄｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１２：８５−９０（２００２）参照）、ＰＰＡＲもまた癌に関連付けられている（例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０４：５９７−６０２（２００３）；およびＫｕｂｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：３３４４−５２（１９９８）参照）。
【０１６６】
しかしながら、脂肪組織の成長および／または形成はしばしば望まれない。例えば、肥満は、エネルギー摂取がエネルギー消費を超える場合に典型的には起こり、その結果、肥大および過形成成長を介して脂肪組織の成長および／または形成がもたらされる。肥大成長は、脂質蓄積によって刺激された脂肪細胞のサイズの増大である。過形成成長は、脂肪組織における脂肪細胞の数の増加と定義される。
【０１６７】
肥満は、現代社会において高度に蔓延する慢性疾患であり、社会の汚点のみならず、寿命の短縮、および有害な精神学的発達、多嚢胞性卵巣病のような生殖器障害、感染、静脈瘤、黒色表皮肥厚症、および湿疹のような皮膚科学的障害、運動非耐性、インスリン耐性、高血圧、高コレステロール血症、胆石症、骨関節炎、整形外科的傷害、血栓塞栓症、癌、および冠動脈心臓病を含めた多数の医学的問題に関連する。Ｒｉｓｓａｎｅｎら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，３０１：８３５−８３７（１９９０）。肥満の治療は、食欲抑制剤および他の体重低下インデューサー、食事改変等の使用を含むが、インスリン耐性を有する患者と同様に、肥満患者の大部分は経時的に主要な節食に失敗し、それにより、理想的な体重を達成できない。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを用いて、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを用い、被験体において肥満を治療し、および／または全体重を減少させることができる。肥満は、当該分野で知られており、かつ本明細書中に記載するＢＭＩおよび／または肥満−決定特性によって決定することができる。例えば、肥満の治療とは、一般には、哺乳動物のＢＭＩを約２５．９未満まで低下させ、その体重を少なくとも６ヶ月間維持することをいう。該治療の結果、適切に、哺乳動物による食物またはカロリー摂取が低下する。加えて、この意味での治療は、もし治療を肥満状態の発症に先立って投与すれば、肥満が起こるのを妨げることを言う。治療は、肥満哺乳動物における脂肪生成、すなわち、人および動物肥満の主な特徴の一つである脂肪細胞における脂質の過剰な蓄積、または脂肪細胞の蓄積の阻害および／または完全な抑制ならびに全体重の低下を含む。全体重の低下は、標準的な技術（例えば、秤）を用いて測定することができる。１つの実施形態において、被験体の脂肪症（脂肪）が低下する。このようにして、肥満に関連する状態、例えば、心血管疾患、糖尿病等を治療することもできる。
【０１６８】
ＡＮＧＰＴＬ４は、脂肪細胞−由来ホルモンであるレプチンの変調にも関連する。サイトカインに構造的に関連するレプチンは、サイトカイン−受容体スーパーファミリーに属する受容体に作用する。例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：２０６−２０９（１９９７）；Ｔａｒｔａｇｌｉａ  Ｌ  Ａら、Ｃｅｌｌ  ８３：１２６３−１２７１（１９９５）；およびＬｅｅ  Ｇ  −Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：６３２−６３５（１９９６）参照。レプチンは肥満（ｏｂ）突然変異により影響を受ける遺伝子によってコードされる（Ｚｈａｎｇ  Ｆら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：２０６−２０９（１９９７））。レプチン受容体の長い形態は糖尿病（ｄｂ）突然変異において影響を受ける遺伝子によってコードされる（Ｔａｒｔａｇｌｉａ  Ｌ  Ａら、Ｃｅｌｌ  ８３：１２６３−１２７１（１９９５））。いくつかのイソ形態があるレプチン受容体は、ＩＬ−６、ＬＩＦおよびＣＮＴＦのようなサイトカイン、およびエリスロポエチンのような成長ホルモンに対するホルモン受容体によって活性化されるｇｐ１３０、およびＬＩＦＲシグナル変換サブユニットに最も密接に関連する。例えば、Ｔａｒｔａｇｌｉａ  Ｌ  Ａら、前掲参照。機能的レプチンまたはその受容体の欠如は、重度の肥満を引き起こす。例えば、Ｚｈａｎｇら、前掲；Ｌｅｅら、前掲；およびＣｈｅｎ  Ｈら、Ｃｅｌｌ  ８４：４９１−４９５（１９９６）参照。レプチンは脳の特定の領域（例えば、視床下部）において作用して、食物摂取、エネルギー消費および神経内分泌機能を調整することが知られており、例えば、それは脂肪貯蔵の重要な調節因子であることが示されており、レプチンレベルは脂肪貯蔵の増加と共に増加する。例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：４２５−４３２（１９９４）；Ｈａｌａａｓ  Ｊ  Ｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４３−５４６（１９９５）；Ｃａｍｐｆｉｅｌｄ  Ｌ  Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４６−５４９（１９９５）；およびＰｅｌｌｙｍｏｕｎｔｅｒ  Ｍ  Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４０−５４３（１９９５）参照。
【０１６９】
レプチンは脈管形成因子であることも判明した。例えば、Ｓｉｅｒｒａ−Ｈｏｎｉｇｍａｎｎら、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ａｓ  ａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１６８３−１６８６（１９９８）；およびＢｏｕｌｏｕｍｉｅら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３：１０５９−１０６６（１９９８）参照。脂肪組織の成長は新生血管形成に依存する。例えば、Ｒｕｐｎｉｃｋら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９９（１６）：１０７３０−１０７３５（２００２）参照。レプチンは免疫においても役割を演じる。例えば、Ｌａ  Ｃａｖａ  ａｎｄ  Ｍａｔａｒｅｓｅ，“Ｔｈｅ  Ｗｅｉｇｈｔ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ４：３７１−３７９（２００４）参照。他のレプチンの活性は生殖の変調、造血の変調、グルコースの代謝の変調、および炎症誘発性免疫応答の変調を含む。例えば、Ｃｈｅｌａｂら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：３１８−３２０（１９９６）；Ｓｔｒｏｅｂｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：２１３−２１５（１９９８）；Ｃｌｅｍｅｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：３９８−４０１（１９９８）；Ｃｉｏｆｆｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：５８５−５８９（１９９６）；Ｇａｉｎｓｆｏｒｄら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９３：１４５６４−１４５６８（１９９６）；Ｋａｍｏｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：３７４−３７７（１９９７）；Ｌｏｆｆｒｅｄａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２：５７−６５（１９９８）；およびＬｏｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：８９７−９０１（１９９８）参照。
【０１７０】
ＡＮＧＰＴＬ４はｏｂ／ｏｂ（レプチンノックアウト）およびｄｂ／ｄｂ（レプチン受容体ノックアウト）マウスにおいてアップレギュレートされる。本発明は、有効量のＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを投与することによって、レプチンおよび／またはレプチン活性を変調する方法を提供する。レプチンレベルは、標準的な技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロット等を用いてアッセイすることができる。
【０１７１】
ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストおよび／またはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、限定されるものではないが、例えば、心臓障害、心血管、内皮、または脈管形成障害、異脂肪血症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈病（ＣＡＤ）、冠動脈心臓病、高コレステロール血症、心不全、発作、糖尿病、膵臓機能障害、骨関節炎、胆石、癌、緑内障、肥満のような代謝疾患、ならびに脂肪症、摂食障害、るいそう症候群（悪液質）、睡眠無呼吸、その他のような関連障害を含む、脂質ホメオスタシスおよび脂肪の代謝の破壊に関連する疾患および障害の治療で用いることができる。例えば、いくつかのヒトの状態は、組織、細胞、膜、および細胞外領域または構造の区別される脂質組成物によって特徴付けられる。例えば、アテローム性動脈硬化症においては、コレステロール（未エステル化、エステル化、および酸化された形態）および他の脂質が、細胞、および動脈壁の細胞外領域その他に蓄積する。これらの脂質は、例えば、遺伝子発現を含めた細胞機能を変化させることによって、および血管内腔を狭め、血流を閉塞することによって、潜在的に有害な生物学的効果を有する。脂質レベルの調節は、多数の実質的な利点を供するであろう。ＡＮＧＰＴＬ４、アゴニストまたはアンタゴニストの投与の効果は、同様に、脂肪体のような脂肪細胞および組織、全体重、筋肉、肝臓および脂肪におけるトリグリセリドのレベル、レプチンの空腹時および非空腹時レベル、および血液中の遊離脂肪酸およびトリグリセリドのレベルの分析を含めた、当該分野で知られた種々のアッセイによって測定することができる。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを用いて、有効量のＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを投与することによりプレ脂肪細胞の移動を阻害することもできる。
【０１７２】
本発明のある態様において、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト治療剤を他の治療レジメンと組み合わせるのが望ましい。ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、例えば、本明細書中に記載されたもののような他の因子の投与と組み合わせることができる。アンタゴニストに関しては、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、例えば、限定されるものではないが、ナイアシン、コレスチラミン、コレスチポール、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、スタチン、フルバスタチン（レスコール）、プラバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチンカルシウム（ＺＤ−４５２２）、ピタバスタチン（ＮＫ−１０４）、プレマリン／プラバポール（エストロゲン／プラバスタチン）、エゼチミブ／シンバスタチン、スーパースタチン、リピトール、ＣＥＴｉ−１ワクチン、ＣＥＴＰ（コレステロールエステル転移タンパク質）に対する抗体、ＢＭＳ−２０１０３８（ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質）、ＦＭ−ＶＰ４（コレステロール輸送阻害剤）、フィオスタノール、低血糖症剤、インスリン、プラムリンタイド、アミリン、ＡＣ２９９３合成エキセンジン−４、キセニカール（オリスタット）、線毛神経栄養因子、アキソカイン（Ａｘｏｋｉｎｅ）、メトフォルミンＸＴ、メルフォルミン、グルコバンス（メトフォルミン／グリブリド）、デクスリポタム（Ｒ＋／−アルファ−リポ酸）、ＰＰＡＲアゴニスト、β−３−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、リパーゼ阻害剤、ＡＴＬ−９６２、レプチン、食欲不振剤または食欲抑制剤、フェンテルミン、メリジア（シルブトラミン）、ウェルブトリン（ブプロイオン）、プロサイグレム（Ｐｒｏｃｙｇｌｅｍ）（ジアゾキシド）、テヌエート（ジエチルプロピオン）、レビア（ナルトレキソン）、ボントリル（フェンジメトラジン）、ゾロフト（セルトラリン）、線毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アキソカイン、ＣＢ１−カンナビノイド受容体アンタゴニスト、ＳＲ１４１７１６、フィトファルム、ＡＯＤ９６０４，ｈＧＨ  １７７−１９１、体重減少剤、およびそれらの誘導体（例えば、塩、ＰＥＧ化バージョン等）を含めた、高脂血症（および高脂血症に関連する疾患、例えば、肥満、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、真性糖尿病、甲状腺機能低下症、クッシング症候群）を治療するための治療剤の投与と組み合わせることができる。また、ＷＯ  ９６／０４２６０（ＩＩ型糖尿病の治療用の化合物）、ＷＯ  ９４／０１４２０、ＷＯ  ９５／１７３９４、ＷＯ  ９７／３６５７９、ＷＯ  ９７／２５０４２、ＷＯ  ９９／０８５０１、ＷＯ  ９９／１９３１３、およびＷＯ  ９９／１６７５８参照。ライフスタイルの変化も本発明の治療剤と組み合わせることができる。それらは、限定されるものではないが、例えば、節食、運動、制限されたコレステロール摂取、禁煙等を含む。また、ＷＯ
９１／１９７０２（低血糖症および低コレステロール血症剤）参照。ある態様において、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、例えば、サイトカインおよび他の炎症誘発性分子、および脂肪生成を阻害するいくつかの成長因子と組み合わせることができる。これらは、限定されるものではないが、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＩＬ−１、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α、−β、プレ脂肪細胞因子−１（ｐｒｅｆ−１）等を含む。例えば、Ｇｒｅｇｏｉｒｅら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７８（３）：７８３−８０９（１９９８）参照。
【０１７３】
「体重減少剤」とは、肥満の治療または予防で有用な分子をいう。そのような分子は、例えば、ホルモン（カテコールアミン、グルカゴン、ＡＣＴＨ、およびＩＧＦ−１と組み合わせた成長ホルモン；Ｏｂタンパク質；クロフィブレート；ハロゲネート；シンコカイン；クロルプロマジン；マチンドールおよびフェネチルアミンの誘導体、例えば、フェニルプロパノールアミン、ジエチルプロピオン、フェンテルミン、フェンジメトラジン、ベンズフェタミン、アンフェタミン、メタムフェタミン、およびフェンメトラジンのようなノルアドレナリン作動性神経伝達物質に作用する食欲−抑制薬物；フェンフルラミン、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、フルオキセチン、およびセルトラリンのようなセロトニン神経伝達物質に作用する薬物；ナロキソン、ニューロペプチド−Ｙ、ガラニン、コルチコトロピン−放出ホルモン、およびコレシストキニンのような中枢的に活性な薬物；ピリドスチグミンのようなコリン作動性アゴニスト；リソスフィンゴ脂質またはその誘導体のようなスフィンゴ脂質；甲状腺ホルモンのような熱発生薬物；エフェドリン；β−アドレナリン作動性アゴニスト；酵素阻害剤のような胃腸管に影響する薬物、例えば、テトラヒドロリポスタチン、スクロースポリエステルのような非消化性食物、およびスレオ−クロロクエン酸またはその誘導体のような胃内容物排出の阻害剤；イソプロテレノールおよびヨヒンビンのようなβ−アドレナリン作動性アゴニスト；ヨビンヒン、クロニジンのようなα２−アドレナリン作動性ブロッキング薬物単独での、または成長−ホルモン放出ペプチドと組み合わせた場合のβ−アドレナリン作動性様効果を増加させるためのアミノフィリン；メトフォルミンおよびフェンフォルミンのような、ビグアニドのような腸吸収に干渉する薬物；メチルセルロースのような増量充填剤；ヒドロキシシトレートのような代謝ブロッキング薬物；プロゲステロン；コレシストキニンアゴニスト；ケト酸を模倣する低分子；コルチコトロピン放出ホルモンに対するアゴニスト；体脂肪貯蔵を減少させるための麦角関連プロラクチン−阻害化合物（１９９８年１１月８日に発行された米国特許第４，７８３，４６９号）；β−３−アゴニスト；ブロモクリプチン；オピオイドペプチドに対するアンタゴニスト；ニューロペプチドＹに対するアンタゴニスト；グルココルチコイド受容体アンタゴニスト；成長ホルモンアゴニスト；その組み合わせ；等を含む。
【０１７４】
（他の使用）
ＡＮＧＰＴＬ４は炎症応答の負の調節因子であるようである。本発明のある実施形態においては、例えば、望ましくないまたは有害な免疫応答の場合において、例えば、移植片拒絶または移植片対宿主病において、免疫応答を阻害するために、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを用いることができる。ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、免疫系を刺激することにおいて有用であり得る。例えば、免疫系の刺激は白血病、他のタイプの癌、免疫無防備状態の患者（例えば、ＡＩＤＳに罹ったヒト等）等で望まれうるであろう。
【０１７５】
ＡＮＧＰＴＬ４は癌にも関連する。ＡＮＧＰＴＬ４は、腫瘍細胞で発現させた場合、腫瘍細胞増殖をインビトロおよびインビボで引き起こす（全ての目的で参考として援用される仮出願第６０／５８９，７８２号および本出願と同時に出願された代理人書類番号Ｐ２１４４Ｒ１参照）。ＡＮＧＰＴＬ４が抗脈管形成因子、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体で治療されている腫瘍で発現される場合、腫瘍は依然として成長する能力を維持する。それは、腎臓癌においてアップレギュレートされることも示されている。例えば、代理人書類番号Ｐ５０３２Ｒ１；ＷＯ  ０２／０７９４１；およびＬｅ  Ｊａｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）参照。加えて、ＡＮＧＰＴＬ４は脈管形成促進因子であり（Ｓ．Ｌｅ  Ｊａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）参照）、これは癌療法に対する標的であり、内皮細胞に対するアポトーシス生存因子である（例えば、Ｋｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｋ．３４６：６０３−６１０（２０００））。ＶＥＧＦ（Ｓｈｗｅｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９２：７６８−７７２（１９９５））のようにＡＮＧＰＴＬ４発現は低酸素に応答して増加する。例えば、Ｌｅ  Ｊａｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６２（５）：１５２１−１５２８（２００３）参照。研究者は、脈管形成および脂肪生成または脂肪組織成長の間の関連を報告している。例えば、Ｓｉｅｒｒａ−Ｈｏｎｉｇｍａｎｎら、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ａｓ  ａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１６８３−１６８６（１９９８）；Ｒｕｐｎｉｃｋら、“Ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｓｓ  ｃａｎ  ｂｅ
ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（１６）：１０７３０−１０７３５（２００２）；Ｋｏｌｏｎｉｎら、“Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｙ  ９，２００４：１−８；およびＦｕｋｕｍｕｒａら、“Ｐａｒａｃｒｉｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．”
Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９３：ｅ８８−ｅ９７（２００３）参照。
【０１７６】
ＡＮＧＰＴＬ４は診断アッセイで用いることもできる。多くの異なるアッセイおよびアッセイ形式を用いて、対照試料に対する試料中のＡＮＧＰＴＬ４の量を検出することができる。これらの形式が、今度は、本発明の診断アッセイで有用であり、これを用いて、被験体において本明細書中で記載した障害の存在または発症を検出する。
【０１７７】
可溶性分析物の測定のための当該分野で知られたいずれの手法も、本発明の実施で用いることができる。そのような手法は、限定されるものではないが、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、例えば、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈降素反応、ゲル拡散反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体−固定アッセイ、イムノラジオメトリーアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、および免疫電気泳動アッセイのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系を含む。例えば、米国特許第４，８４５，０２６号および第５，００６，４５９号参照。
【０１７８】
（ＡＮＧＰＴＬ４のトランスジェニックノックアウト動物）
ＡＮＧＰＴＬ４またはその改変形態をコードする核酸を用いて、今度は、治療上有用な試薬の開発およびスクリーニングで有用なトランスジェニック動物または「ノックアウト」動物いずれかを創製することもできる。トランスジェニック動物（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含有する細胞を有する動物であり、その導入遺伝子は誕生前、例えば、胚段階で、動物、または動物の先祖に導入されたものである。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４をコードするｃＤＮＡを提供し、これを用いて、ＡＮＧＰＴＬ４をコードするＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を創製するのに用いられる確立された技術およびゲノム配列に従ってＡＮＧＰＴＬ４をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。
【０１７９】
当該分野で知られたいずれかの技術を用いて、標的遺伝子導入遺伝子を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始系を生産することができる。そのような技術は、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号、第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号）；生殖系へのレトロウイルス媒介性遺伝子導入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２：６１４８−６１５２（１９８５））；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１（１９８９））；遺伝子トラップベクターを用いる非特異的挿入不活化（米国特許第６，４３６，７０７号）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４（１９８３））；および精子媒介性遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３（１９８９））；等を含む。
【０１８０】
典型的には、特定の細胞は、組織−特異的エンハンサーによるＡＮＧＰＴＬ４導入遺伝子取り込みについて標的化されるであろう。胚段階で動物の生殖系に導入されたＡＮＧＰＴＬ４をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を用いて、ＡＮＧＰＴＬ４ポリペプチドをコードするＤＮＡの増大した発現の効果を調べることができる。そのような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの保護を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として用いることができる。本発明のこの局面に関連して、動物を該試薬で処理し、導入遺伝子を保持する未処理動物と比較した、病理学的状態の発生率の低下は、病理学的状態についての潜在的治療介入を示すであろう。
【０１８１】
別法として、ＡＮＧＰＴＬ４の非ヒトホモログを用いて、ＡＮＧＰＴＬ４をコードする内因性遺伝子および動物の胚性幹細胞に導入されたＡＮＧＰＴＬ４をコードする改変ゲノムＤＮＡの間の相同組換えの結果として、ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質をコードする欠陥または改変遺伝子を有するＡＮＧＰＴＬ４「ノックアウト」動物を構築することができる。ある実施形態において、ノックアウト動物は哺乳動物、例えば、ラットまたはマウスのようなげっ歯類である。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４をコードするｃＤＮＡを用いて、確立された技術に従い、ＡＮＧＰＴＬ４をコードするゲノムＤＮＡをクローン化することができる。ＡＮＧＰＴＬ４をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失させるか、あるいは組み込みをモニターするのに用いることができる選択マーカーをコードする遺伝子のようなもう１つの遺伝子で置き換えることができる。典型的には数キロベースの（５’および３’双方における）未改変の隣接するＤＮＡのを、ベクターに含める（例えば、相同組換えベクターの記載についてはＴｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）参照）。
【０１８２】
ベクターは（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入し、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ．６９：９１５（１９９２）参照）。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注入して、凝集キメラを形成させる（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２参照）。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌仮腹動物に着床させ、該胚を出産まで導いて「ノックアウト」動物を作製する。生殖細胞に相同組換えＤＮＡを保有する子孫は標準的な技術によって同定することができ、これを用いて、動物の全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育種することができる。ノックアウト動物は、例えば、ある病理学的状態に対して防御する能力について、およびＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の非存在に起因する病理学的状態の発症について特徴付けすることができる。
【０１８３】
加えて、ノックアウトマウスは、薬物標的についての遺伝子機能および医薬用途の発見、ならびに所定の標的に関連する潜在的かつ正確な副作用の決定においてかなりの情報を与えることができる。遺伝子機能および病理学はマウスおよびヒトの間でかなり十分に保存されている。というのは、それらは共に哺乳動物であって、種の間で高度に保存された同様な数の遺伝子を含むからである。例えば、マウス第１６染色体上の遺伝子の９８％がヒトオルソログを有することは最近十分に記載されている（Ｍｕｒａｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１６６１−７１（２００２））。
【０１８４】
胚性幹（ＥＳ）細胞における遺伝子標的化は、ヒト疾患に関連する多くの遺伝子においてヌル突然変異を有するマウスの構築を可能としたが、全ての遺伝病がヌル突然変異に帰属させることはできない。マウス遺伝子座を破壊し、突然変異を有するヒト対応物に導入する遺伝子置き換え（ノック−イン）のための方法を確立することによって、ヒト疾患の価値あるマウスモデルを設計することができる。その結果、ヒトタンパク質を標的化するインビボ薬物研究を行うことができる（Ｋｉｔａｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．２２２：７４２−４７（１９９６））。
【０１８５】
（トランスジェニック動物の使用）
ある実施形態において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ４を模倣するもの（アゴニスト）、またはＡＮＧＰＴＬ４の効果を妨げるもの（アンタゴニスト）を同定するための化合物をスクリーニングする方法を含む。ＡＮＧＰＴＬ４を模倣するアゴニストは、例えば、本明細書中に記載したように、ＡＮＧＰＴＬ４の活性を誘導する際に、およびそのゲノムがＡＮＧＰＴＬ４をコードする遺伝子の破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物での発見に基づいて負の表現型が観察される場合において、特に治療的に価値があろう。ＡＮＧＰＴＬ４の効果を妨げるアンタゴニストは、例えば、本明細書中に記載されたように、ＡＮＧＰＴＬ４活性を妨げる際に、および非ヒトトランスジェニックノックアウト動物での観察に基づいて正の表現型が観察される場合に、特に治療的に価値があろう。アンタゴニスト薬物候補についてのスクリーニングアッセイは、本明細書中で確認される遺伝子によってコードされるＡＮＧＰＴＬ４に結合し、それと複合体化し、あるいはそうでなければ、他の細胞タンパク質、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４受容体（例えば、αｖβ５）、リポリパーゼタンパク質等とのコードされたポリペプチドの相互作用に干渉する化合物を同定するように設計される。
【０１８６】
例えば、ＡＮＧＰＴＬ４に対するアンタゴニストの効果は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストを野生型マウスに投与して、公知のノックアウト表現型を模倣することによって評価することができる。かくして、最初に、目的のＡＮＧＰＴＬ４遺伝子をノックアウトし、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子をノックアウトし、そして破壊した結果としての、得られた表現型を観察する。引き続いて、ＡＮＧＰＴＬ４に対するアンタゴニストを野生型マウスに投与することによって、ＡＮＧＰＴＬ４に対するアンタゴニストの有効性を評価することができる。有効なアンタゴニストはノックアウト動物で最初に観察された表現型効果を模倣すると予測される。
【０１８７】
同様に、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストを非ヒトトランスジェニックマウスに投与して、公知の負のノックアウト表現型を緩和することによって、ＡＮＧＰＴＬ４に対するアゴニストの効果を評価することができよう。かくして、最初に、目的のＡＮＧＰＴＬ４遺伝子をノックアウトし、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子をノックアウトし、または破壊する結果としての、得られた表現型を観察する。引き続いて、ＡＮＧＰＴＬ４に対するアゴニストを非ヒトトランスジェニックマウスに投与することによってＡＮＧＰＴＬ４に対するアゴニストの有効性を評価することができる。効果的なアゴニストは、ノックアウト動物で最初に観察された負の表現型効果を緩和すると予測されるであろう。
【０１８８】
アンタゴニストについての、もう１つのアッセイにおいて、受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、候補化合物の存在下で標識されたＡＮＧＰＴＬ４と共にインキュベートする。次いで、この相互作用を増強し、またはブロックする化合物の能力を測定することができよう。
【０１８９】
（抗体）
本発明の抗体は抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体またはＡＮＧＰＴＬ４の抗原−結合フラグメント、抗αｖβ５抗体または本明細書中に記載された他の抗体を含む。例示的抗体は、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、フラグメント、多特異的、ヘテロ結合体化、多価、エフェクト（ｅｆｆｅｃｔｏ）機能等の抗体を含む。抗体はアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【０１９０】
（ポリクローナル抗体）
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含むことができる。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業者に知られている。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４に対するポリクローナル抗体は関連する抗原およびアジュバントの単回または複数回の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において惹起させる。二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じての結合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用い、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に対して関連抗原を結合体化するのが有用であり得る。
【０１９１】
例えば、（各々、ウサギまたはマウスのための）１００μｇまたは５μｇのタンパク質または結合体を３容量のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、該溶液を複数の部位にて皮内注射することによって動物をＡＮＧＰＴＬ４、免疫原性結合体、または誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、動物を複数部位での皮下注射によってフロイントの完全アジュバント中のペプチドまたは結合体の元の１／５〜１／１０の量をブースター注射する。７〜１４日後に、動物から採血し、血清を抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーとなるまで動物にブースター注射する。典型的には、動物に、同一抗原の結合体であるが、異なるタンパク質に対して、および／または異なる架橋剤を通じて結合体化した結合体をブースター注射する。結合体は、タンパク質融合体として組換え細胞培養において作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を適切に用いて、免疫応答を増強させる。
【０１９２】
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製することができるか、あるいは組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。
【０１９３】
ハイブリドーマ方法においては、マウス、あるいはハムスターまたはカニクイザルのような他の適当な宿主動物を前記したように免疫化して、免疫化で用いられるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を生産する、または生産することができるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球はインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用い、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０１９４】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、典型的には、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を含有する適当な培養培地に撒き、増殖させる。例えば、もし親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマに対する培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、この物質は、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１９５】
典型的な骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体−生産細胞による抗体の安定な高レベル生産を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。それらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞のようなマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１９６】
ハイブリドーマ細胞がその中で増殖している培養培地を、ＡＮＧＰＴＬ４に対して向けられたモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって測定することができる。そのような技術およびアッセイは当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスカチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析によって測定することができる。
【０１９７】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を生じるハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈法によってクローンをサブクローン化し、標準的な方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的のための適当な培養培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は動物において腹水液腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１９８】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような慣用的な免疫グロブリン精製手法によって、培養培地、腹水液、または血清から適切に分離される。
【０１９９】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたもののような組換えＤＮＡ方法によって作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの源として役だつ。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、これを、次いで、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞によるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体の組換え生産は後により詳細に記載する。
【０２００】
もう１つの実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載された技術を用いて生じさせた抗体ファージライブラリから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、各々、ファージライブラリを用いるマウスおよびヒト抗体の単離を記載する。引き続いての刊行物は、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびにコンビナトーリアル感染、および非常に大きなファージライブラリを構築するための戦略としてのインビトロ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））による、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生産を記載する。かくして、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替法である。
【０２０１】
ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのためのコード配列を置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、改変することもできる。
【０２０２】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインと置き換え、あるいはそれらは抗体の１つの抗原−組み合わせ部位の可変ドメインと置き換えて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原−組み合わせ部位、および異なる抗原に対する特異性を有するもう１つの抗原−組み合わせ部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０２０３】
（ヒト化抗体およびヒト抗体）
本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含むことができる。ヒト化抗体は、非ヒトである源由来のそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「輸入」残基といい、これは、典型的には、「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列をげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置き換えることによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って本質的に行うことができる。従って、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトなヒト可変領域よりも実質的に少ないものが、非ヒト種由来の対応する配列によって置き換えられている。現実には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および、恐らくは、いくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の同様な部位由来の残基によって置き換えられたヒト抗体である。
【０２０４】
ヒト化抗体を作製するのに用いられる、軽鎖および重鎖双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるのに非常に重要である。いわゆる「ベスト−フィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変−ドメイン配列の全ライブラリに対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類のそれに最も近いヒト配列をヒト化抗体についてのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同一フレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体のために用いることができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【０２０５】
抗体は、抗原に対する高い親和性および他の好都合な生物学的特性を保持させつつヒト化するのがさらに重要である。この目標を達成するためには、典型的な方法に従って、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いる親配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは通常に入手可能であり、当業者は精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の恐らくは三次元立体配座構造を説明し、それを表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示の精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このように、ＦＲ残基を、標的抗原に対する増大した親和性のような所望の抗体特徴が達成されるように、レシピエントおよび輸入配列から選択し、組み合わせることができる。一般には、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響するのに直接的かつ最も実質的に関与している。
【０２０６】
別法として、免疫化に際して、内因性免疫グロブリン生産の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生産することが今日では可能である。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体生産の完全な阻害がもたらされることが記載されている。そのような生殖系突然変異体マウスへの、ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入の結果、抗原投与に際してヒト抗体が生産されるであろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）参照。ヒト抗体はファージ−ディスプレイライブラリから得ることもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０２０７】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含めた、当該分野で知られた種々の技術を用いて生産することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄのようなフィラメント状バクテリオファージの主要または微量なコートタンパク質遺伝子いずれかにイン・フレームにてクローン化し、ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとして提示される。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子も選択される。かくして、該ファージはＢ−細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ  Ｊ．，Ｃｕｒ  Ｏｐｉｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３：５６４−５７１（１９９３）に概説された種々の形式で行うことができる。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの源は、ファージディスプレイで用いることができる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓から得られたＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトーリアルライブラリから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。未免疫化ヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、（自己−抗原を含めた）抗原の多様なアレイに対する抗体を、例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に本質的に従うことによって単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号も参照。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒら、の技術もヒトモノクローナル抗体の調製で入手可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。ヒト抗体はインビトロ活性化Ｂ細胞によって作製することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
【０２０８】
（抗体フラグメント）
抗体フラグメントも本発明に含まれる。抗体フラグメントの生産のために種々の技術が開発されている。伝統的には、これらのフラグメントはインタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、これらのフラグメントは、今日、組換え宿主細胞によって直接的に生産できる。例えば、抗体フラグメントは、前記した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントはＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収することができ、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。もう一つのアプローチに従い、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。抗体フラグメントの生産のための他の技術は当業者に明らかであろう。他の実施形態において、選択した抗体は単一鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号参照。ＦｖおよびｓＦｖは、定常領域を欠くインタクトな組み合わせ部位を有する唯一の種であり、かくして、それらはインビボで用いる間は低下した非特異的結合のために適切である。ＳＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端いずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築することができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，前掲参照。抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体フラグメントは単特異性または二重特異性であってよい。
【０２０９】
（多重特異性抗体（例えば、二重特異性））
本発明の抗体は、例えば、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する多重特異性抗体も含む。そのような分子は通常は２つの抗原のみに結合する（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体のようなさらなる特異性を有する抗体は、本明細書中で用いる場合にこの表現に含まれる。ＢｓＡｂの例は、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ−細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎臓細胞癌腫、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌腫）、抗ＣＤ３／抗メラノサイト刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦ受容体／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎癌腫関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３のような、細胞抗原に対して向けられた一つのアーム、および細胞傷害誘発性分子に対して向けられた他方のアームを有するもの；抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリトーマーイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドのような、細胞上の抗原に特異的に結合する一つのアーム、および毒素に結合する一つのアームを有するＢｓＡｂ；（リン酸マイトマイシンプロドラッグからマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼのような酵素活性化プロドラッグを変換するためのＢｓＡｂ；抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ−タイプのプラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）のような、フィブリン溶解剤として用いることができるＢｓＡｂ；抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）のような細胞表面受容体に対する免疫複合体を標的化するためのＢｓＡｂ；抗ＣＤ３／抗単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ−細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶのような感染症の療法で用いるＢｓＡｂ；抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテンのようなインビトロまたはインビボでの腫瘍検出のためのＢｓＡｂ；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ；および抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼのような診断ツールとしてのＢｓＡｂを含む。三重特異性抗体の例は抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７および抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７を含む。二重特異性抗体は全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０２１０】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野で知られている。全長二重特異性抗体の伝統的生産は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づき、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クワドローマ）は、そのうち１つのみが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生じる。通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる正しい分子の精製はむしろ面倒であり、生成物の収率は低い。同様な手法はＷＯ  ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０２１１】
異なるアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原組み合わせ部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。該融合は、好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、構築で用いる３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率を適用する場合の実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調整する際に高い柔軟性が提供される。しかしながら、等しい比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、あるいは該比率が特に有意性がない場合、１つの発現ベクターに２または３つすべてのポリペプチド鎖についてのコード配列を挿入するのが可能である。
【０２１２】
このアプローチの１つの実施形態において、二重特異性抗体は、１つのアームにおける第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖および他のアームにおける（第二の結合特異性を供する）ハイブリット免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される。この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離を容易とすることが見出された。というのは、二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在は、分離の容易な方法を提供するからである。このアプローチはＷＯ  ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）参照。
【０２１３】
ＷＯ  ９６／２７０１１に記載されたもう１つのアプローチに従うと、抗体分子の対の間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大とするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法においては、第一の抗体分子の界面からの１以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きな側鎖に対して同一または同様なサイズの補填性「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第二の抗体分子の界面に作り出す。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない目的産物よりもヘテロダイマーの収率を増大させる機構を供する。
【０２１４】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製するための技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解により切断されて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる手法を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール複合体化剤である亜ヒ酸ナトリウム存在下で還元させ、隣接するジチオールを安定化し、分子内ジスルフィド形成を妨げる。次いで、生じたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、メルカプトエチルアミンでの還元によって、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’−チオールに再度変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。生じた二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための因子として用いることができる。
【０２１５】
最近の進歩は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接的回収を容易とし、これは、化学的にカップリングさせて、二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）は、十分にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生産を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントをＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌し、インビトロでの誘導性の化学的カップリングに付して、二重特異性抗体を形成した。かく形成された二重特異性抗体は、ＶＥＧＦ受容体を過剰発現する細胞、および正常なヒトＴ細胞に結合し、ならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０２１６】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作製し、単離する種々の技術もまた記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて生産された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元させ、モノマーを形成し、次いで、再度酸化して、抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモダイマーの生産のために利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）によって記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替機構を提供している。該フラグメントは、余りにも短くて、同一鎖上の２つのドメインの間の対合できないリンカーによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインをもう１つのフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合させ、それにより、２つの抗原−結合部位を形成する。単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するためのもう１つの戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）参照。
【０２１７】
２価を超える抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０２１８】
（ヘテロ結合体抗体）
二重特異性抗体は架橋されたまたは「ヘテロ結合体」抗体を含み、これらは本発明の抗体である。例えば、ヘテロ結合体における抗体の１つはアビジンにカップリングさせることができ、他方はビオチンに結合体化させることができる。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療のために提案されている（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３、およびＥＰ  ０３０８９）。ヘテロ結合体抗体は、いずれかの便利な架橋方法を用いて作製することができる。適当な架橋剤は当該分野で良く知られており、多数の架橋技術と共に、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０２１９】
（多価抗体）
本発明の抗体は多価抗体を含む。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって二価抗体よりも速く内部移行され、（および／または異化）され得る。本発明の抗体は、３以上の抗原結合部位を有する（例えば、四価抗体）（ＩｇＭクラス以外のものである）多価抗体であり得、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え体発現によって容易に生産することができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインはＦｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはそれよりなる）。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域、および該Ｆｃ領域に対してアミノ末端側の３以上の抗原結合部位を含む。本明細書において好ましい多価抗体は、３〜約８、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれよりなる）。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖（好ましくは、２つのポリペプチド鎖）を含む。該ポリペプチド鎖は２以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖はＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、ＶＤ１は第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は第二の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、そしてｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖はＶＨ−ＣＨ１−フレキシブルリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含むことができる。多価抗体は、本明細書において好ましくはさらに、少なくとも２つの（好ましくは４つの）軽鎖可変ドメインポリペプチドを含む。多価抗体は、本明細書において例えば、約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。ここで考えられている軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、所望により、さらにＣＬドメインを含む。
【０２２０】
（エフェクター機能工学）
エフェクター機能に関しては本発明の抗体を改変して、例えば、癌を治療することにおいて抗体の有効性を増強させるのが望ましいであろう。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とすることができる。かく生じたホモダイマー抗体は、改良された内部移行能力および／または増加した補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。増大した標的化活性を有するホモダイマー抗体は、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されたように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。別法として、二重（ｄｕａｌ）Ｆｃ領域を有し、それにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）参照。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体フラグメント）に取り込むことができる。本明細書中に記載するように、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させることを担うＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。
【０２２１】
（免疫結合体）
本発明は、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント）のような細胞傷害性剤、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））に結合体化した本明細書中に記載された抗体を含む免疫結合体にも関する。放射性結合体抗体の生産のために、種々の放射性核種が入手可能である。その例は、限定されるものではないが、例えば、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを含む。
【０２２２】
そのような免疫結合体の生成で有用な化学療法剤は前記した。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載された集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として知られた因子のファミリー、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）（米国特許第５，８７７，２９６号）等（また、本明細書中における化学療法剤の定義も参照）を、抗ＡＮＧＰＴＬ４または抗脈管形成抗体またはそのフラグメントに結合体化することができる。
【０２２３】
細胞の選択的破壊のためには、抗体は強い放射性の原子を含むことができる。放射性結合体化抗ＡＮＧＰＴＬ４またはそのフラグメントの生産のために種々の放射性同位体が入手可能である。その例は、限定されるものではないが、例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、１１１Ｉｎ、Ｌｕの放射性同位体などを含む。該結合体を診断で用いる場合、それは、シンチグラフィー実験のための放射性原子、例えば、９９ｍｔｃまたは１２３Ｉ、またはヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガトリニウム、マンガンまたは鉄のような、（磁気共鳴イメージングＭＲＩとしても知られた）核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージングのためのスピン標識を含むことができる。
【０２２４】
放射性または他の標識を公知の方法で結合体に取り込むことができる。例えば、ペプチドを生合成することができるか、あるいは例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適当なアミノ酸前駆体を用いる化学的アミノ酸合成によって合成することができる。９９ｍｔｃまたは１２３Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅおよび１１１Ｉｎのような標識をペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０をリシン残基を介して結合させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７（１９７８））を用いて、ヨウ素−１２３を取り込むことができる。例えば、他の方法を詳細に記載するＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）参照。
【０２２５】
用いることができる酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントはジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチインタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルジカカランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルチン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロリン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、ネオマイシン、およびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２参照。
【０２２６】
抗体および細胞傷害因子の結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビス−アジド化合物、（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トリエン２，６−ジイソシアネート）のようなジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されたように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンゾイル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲージョンのための例示的キレート化剤である。ＷＯ  ９４／１１０２６参照。リンカーは、細胞における細胞傷害薬剤の放出を容易とする「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸−不安定性リンカー、ペプチダーゼ−感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド−含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を用いることができる。
【０２２７】
別法として、抗ＡＮＧＰＴＬ４および細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製することができる。ＤＮＡの長さは、相互に隣接した、あるいは結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離された、結合体の２つの部分をコードする各領域を含むことができる。
【０２２８】
ある実施形態において、抗体を、細胞プレ標的化（ｐｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）での利用のために（ストレプトアビジンのような）「受容体」に結合体化させ、抗体−受容体結合体を患者に投与し、続いて、清澄化因子を用いて循環から未結合結合体を除去し、次いで、細胞傷害因子（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合体化された「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。ある実施形態において、抗体、および核溶解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレオアーゼのようなＤＮＡエンドヌクレアーゼ；Ｄｎａｓｅ）の間で免疫結合体が構成される。
【０２２９】
（メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ））
本発明は、１以上のメイタンシノイド分子に結合体化された本発明の抗体を提供する。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは、最初に、東アフリカ低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。引き続いて、ある種の微生物もまた、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルのようなメイタンシノイドを生じることも発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノールおよびその誘導体およびアナログは、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号：第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号に開示されている。
【０２３０】
例えば、抗―ＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗―αｖβ５抗体は、該抗体またはメイタンシノイド分子いずれかの生物学的活性を有意に減少させることなくメイタンシノイド分子に結合体化される。抗体分子当たり結合体化した平均３〜４のメイタンシノイド分子は、毒素／抗体の１つの分子さえが、裸の抗体の使用よりも細胞傷害性を増強するにもかかわらず、抗体の機能または溶解性に悪影響を与えることなく標的分子の細胞傷害性を増強するのに効果を示した。メイタンシノイドは当該分野でよく知られており、公知の技術によって合成することができるか、あるいは天然源から単離することができる。適当なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、および前記にて言及した他の特許および非特許刊行物に開示されている。１つの実施形態において、メイタンシノイドは、種々のメイタンシノールエステルのような、芳香族環においてか、またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されたメイタンシノールおよびメイタンシノールアナログである。
【０２３１】
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号またはＥＰ特許０  ４２５  ２３５  Ｂ１、およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されたものを含めた抗体―メイタンシノイド結合体を作製するための当該分野で知られた多くの連結基が存在する。連結基は、前記した特許に開示されたジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペクチダーゼ不安定基、またはエステラーゼ不安定基を含み、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。
【０２３２】
抗体およびメイタンシノイドの結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、（ジメチルアジピミデートＨＣＬのような）イミドエステルの二官能性誘導体、（ジスクシンイミジルスベレートのような）活性エステル、（グルタルアルデヒドのような）アルデヒド、（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンのような）ビスーアジド化合物、（ビスー（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアニンのような）ビス−ジアゾニウム誘導体、（トルエン２，６−ジイソシアネートのような）ジイソシアネート、および（１，５−ジフルオロー２，４−ジニトロベンゼンのような）ビス−活性フッ素化合物のような種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。典型的なカップリング剤は、ジスルフィド結合を提供するための、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７  ［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を含む。
【０２３３】
リンカーは、結合のタイプに応じて、種々の位置においてメイタンシノイド分子に結合させることができる。例えば、エステル結合は、慣用的なカップリング技術を用いるヒドロキシル基との反応によって形成することができる。反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位置、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位置で起こり得る。該結合はメイタンシノールまたはメイタンシノールアナログのＣ−３位置で形成される。
【０２３４】
（カリケアミシン）
目的のもう１つの免疫結合体は、１以上のカリケアミシン分子に結合体化された抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体または抗αｖβ５抗体を含む。抗生物質のカリケアミシンファミリーは、ピコモル以下の濃度において二本鎖ＤＮＡ切断を生じさせることができる。カリケアミシンファミリーの結合体の調製については、例えば、（全てＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに対する）米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号参照。用いることができるカリケアミシンの構造的アナログは、限定されるものではないが、γ１Ｉ，α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθＩ１を含む（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ５３；３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄに対する前記した米国特許）。抗体を結合体化することができるもう１つの抗腫瘍薬物は、抗葉酸であるＱＦＡである。カリケアミシンおよびＱＦＡは、共に、細胞内作用部位を有し、原形質膜を容易に横切らない。従って、抗体媒介性内部移行を介するこれらの因子の細胞の取り込みは、それらの細胞傷害性効果を大いに増強させる。
【０２３５】
（他の抗体の改変）
抗体の他の改変は、本明細書で意図される。例えば、抗体は種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのコポリマーのうちの１つに連結することができる。抗体は、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）において、あるいはマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術によって、あるいは界面重合（例えば、各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−ミクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）ミクロカプセル）によって調製されたミクロカプセルに捕捉することもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０）に開示されている。
【０２３６】
（リポソームおよびナノ粒子）
本発明のポリペプチドは、リポソームに処方することができる。例えば、本発明の抗体は免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）として処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されたような当該分野で知られた方法によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。一般に、リポソームの処方および使用は当業者に知られている。
【０２３７】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発方法によって生じさせることができる。リポソームは規定されたポアサイズのフィルターを通して押し出して、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されたようにリポソームに結合体化させることができる。ナノ粒子またはナノカプセルを用いて、本発明のポリペプチドを捕捉することもできる。１つの実施形態において、生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子を本発明のポリペプチドと共に用いることができる。
【０２３８】
（他の使用）
抗―ＡＮＧＰＴＬ４抗体は種々の用途を有する。例えば、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、例えば、本明細書中に記載された障害の疾患検出のために、例えば、特異的な細胞、組織または血清におけるその発現を検出する、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４のフラグメントについての診断アッセイで用いることができる。１つの実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、本明細書中で提供した方法での治療のために患者集団を選択するのに用いられる。不均一相または均一相のいずれかで行われる、競合結合アッセイ、直接的または間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイのような、当該分野で知られた種々の診断アッセイ技術を用いることができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）  ｐｐ．１４７−１５８）。診断アッセイで用いる抗体は検出可能な部分で標識することができる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じさせることができるべきである。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ，３２Ｐ，３５Ｓ、または１２５Ｉのような放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンのような蛍光または化学発光化合物、またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素であり得る。抗体を検出可能な部分に結合体化するための当該分野で知られた任意の方法を使用することもでき、それは、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３；１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）に記載された方法を含む。
【０２３９】
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、組換え細胞培養物または天然源由来のＡＮＧＰＴＬ４のアフィニティー精製でも有用である。このプロセスにおいて、ＡＮＧＰＴＬ４に対する抗体は、当該分野で良く知られた方法を用い、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙のような適当な支持体に固定化される。次いで、固定化された抗体を、精製すべきＡＮＧＰＴＬ４を含有する試料と接触させ、その後、固定化された抗体に結合するＡＮＧＰＴＬ４を除いて、試料中の実質的に全ての物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、支持体を、抗体からＡＮＧＰＴＬ４を放出するもう１つの適当な溶媒で洗浄する。
【０２４０】
（ベクター、宿主細胞および組換え方法）
本発明のポリペプチドは、容易に得ることができる技術および物質を用い、組換えにより生産することができる。
【０２４１】
本発明のポリペプチド、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体、または抗αｖβ５抗体の組換え生産のためには、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローン化（ＤＮＡの増幅）のために、あるいは発現のために複製可能なベクターに挿入する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、慣用的な手法を用いて容易に単離し、配列決定される。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、単離され、配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分は、一般には、限定されるものではないが、シグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終止配列のうちの１以上を含む。
【０２４２】
（シグナル配列の成分）
本発明のポリペプチドは、直接的のみならず、典型的には、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え生産され得る。選択された異種シグナル配列は、典型的には、宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然ポリペプチドシグナル配列を認識せず、処理しない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱−安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置き換えられる。酵母の分泌では、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  α−因子リーダーを含めた）α因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ  ９０／１３６４６に記載されたシグナルによって天然シグナル配列を置き換えることができる。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純疱疹ｇＤシグナルが入手可能である。
【０２４３】
そのような前駆体領域についてのＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに読み枠にて連結させる。
【０２４４】
（複製起点の成分）
発現ベクターおよびクローリングベクターは、共に、１以上の選択された宿主細胞においてベクターが複製できるようにする核酸配列を含有する。一般には、クローニングベクターにおいては、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡから独立して複製できるようにするものであり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点はほとんどのグラム−陰性細菌で適しており、２μプラスミド起点は酵母で適しており、および種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞においてベクターをクローン化するのに有用である。一般に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターでは必要がない（ＳＶ４０起点が典型的に使用され得る。なぜならそれは単に初期プロモーターを含有するからである）。
【０２４５】
（選択遺伝子成分）
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも言われる選択遺伝子を含有することができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養素要求株の欠損を補う、または（ｃ）天然培地からは入手できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０２４６】
選択スキームの１つの例は、宿主細胞の成長を阻止する薬物を利用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換される細胞は薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、かくして、選択レジメンで生き残る。そのような優性選択の例は、薬物ネオマイシン、マイコフェノール酸およびハイグロマイシンを用いる。
【０２４７】
哺乳動物細胞についての適当な選択マーカーのもう１つの例は、抗体核酸（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、典型的には霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等）を取り込む形質転換受容性の細胞の同定を可能とするものである。
【０２４８】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、まず、メトトレキセート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合アンタゴニスト）を含有する培養培地中で形質転換体の全てを培養することによって同定される。適当な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲを使用する場合、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０２４９】
別法として、本発明のポリペプチド、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のようなもう１つの選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時トランスフェクトされた宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８のような選択マーカーについての選択因子を含有する培地中での細胞増殖によって選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号参照。
【０２５０】
酵母で用いるのに適した選択遺伝子は酵母プラスミドＹｒｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにより増殖する能力を欠如する酵母の突然変異体株についての選択マーカーを提供する（例えば、ＡＴＣＣ  ＮＯ．４４０７６またはＰＥＰ４−１）。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）参照。ついで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファン非存在下での増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保持する公知のプラスミドによって補充される。
【０２５１】
加えて、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されたベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換で用いることができる。別法として、組換え子ウシキモシンの大規模生産のための発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓで報告された。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの工業株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９；９６８−９７５（１９９１）。
【０２５２】
（プロモーター成分）
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、本発明のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。原核生物宿主で用いるのに適したプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが適当である。細菌系で用いられるプロモーターは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有するであろう。
【０２５３】
プロモーター配列は真核生物で知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からほぼ２５〜３０塩基上流に位置したＡＴ−リッチな領域を有する。多くの遺伝子の転写の起点から７０〜８０塩基上流に見出されるもう１つの配列は、Ｎがいずれかのヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端においては、コード配列３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全ては、適切に、真核生物発現ベクターに挿入される。
【０２５４】
酵母宿主で用いるための適当な促進配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、あるいはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他の解糖酵素についてのプロモーターを含む。
【０２５５】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモーター領域である。酵母発現で用いる適当なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ  ７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーもまた、有利には、酵母プロモーターと共に用いられる。
【０２５６】
哺乳動物宿主細胞におけるベクター由来の本発明のポリペプチドの転写は、ウイルスのゲノム（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、（アデノウイルス２のような）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび、典型的には、サルウイルス４０（ＳＶ４０））、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーター、または免疫グログリンプロモーター）、熱−ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され、但し、そのようなプロモーターは宿主細胞株と適合するものとする。
【０２５７】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは便宜的には、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、便宜的には、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得られる。ベクターとしてのウシパピローマウイルスを用いて哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現についてはＲｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）参照。別法として、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートをプロモーターとして用いることができる。
【０２５８】
（エンハンサーエレメント成分）
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、しばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大する。多くのエンハンサー配列が、今日、哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）。典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いる。その例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。また、真核生物プロモーターの活性化のための促進エレメントについてはＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）参照。エンハンサーは、ポリペプチド−コード配列に対して５’または３’側の位置にてベクターに接続され得るが、典型的には、プロモーターから５’側の部位に配置する。
【０２５９】
（転写終止成分）
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）で用いられる発現ベクターは、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。そのような配列は、通常、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、場合によっては、３’の非翻訳領域から入手できる。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ  ９４／１１０２６およびそこに開示された発現ベクター参照。
【０２６０】
（宿主細胞の選択および形質転換）
本明細書において、ベクターにおいて本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをクローン化または発現させるのに適した宿主細胞は原核生物、酵母、または前記した高等真核生物細胞である。この目的で適当な原核生物はグラム−陰性またはグラム−陽性生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ  ２６６，７１０に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）のようなＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような真性細菌を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）のような他の株は適当であるが、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉクローン化宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ
３１，４４６）である。これらの例は限定的であるというよりも説明的である。
【０２６１】
原核生物に加えて、フィラメント状真菌または酵母のような真核生物微生物は、本発明のコードベクターのポリペプチドについての適当なクローン化または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または通常のパン酵母は、下等な真核生物宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓのようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのようなＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍのようなフィラメント状真菌、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主のような多数の他の属、種および株が通常は入手可能であって、本明細書では有用である。
【０２６２】
本発明のグリコシル化ポリペプチドの発現に適した宿主細胞が多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は植物および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株および改変体、およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（青虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主由来の対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１改変体、およびＢｏｍｄｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公に入手可能であり、そのようなウイルスは、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書でウイルスとして用いることができる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【０２６３】
しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最大となり、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は慣用的手法となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓系（懸濁培養における増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部癌種細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓腫系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２６４】
宿主細胞は、本発明のポリペプチドの生産のために前記した発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換し、適切であれば、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために改変された慣用的な栄養培地中で培養する。
【０２６５】
（宿主細胞の培養）
本発明のポリペプチドを生産するのに用いる宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、肝細胞のための通常の増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）、プレ脂肪細胞のための増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）のような市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ  ９０／０３４３０；ＷＯ  ８７／００１９５；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載された培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として用いることができる。これらの培地のいずれも、必要であれば、（インスリン、トランスフェリン、または表皮成長因子のような）ホルモンおよび／または他の成長因子、（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩のような）塩、（ＨＥＰＥＳのような）緩衝剤、（アデノシンおよびチミジンのような）ヌクレオチド、（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標）薬物のような）抗生物質、（ミクロモラー範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される）微量元素、およびグルコースまたは同等なエネルギー源を補充することができる。いずれの他の必要な補充物も、当業者に知られた適当な濃度で含めることができる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で従前に用いられるものであり、当業者に明らかであろう。
【０２６６】
（ポリペプチド精製）
組換え技術を用いる場合、本発明のポリペプチド、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体、または抗αｖβ５抗体は、細胞内で、ペリプラズム空間において生産することができ、あるいは直接的に培地に分泌することができる。本発明のポリペプチドは培養培地から、あるいは宿主細胞溶解物から回収することができる。膜結合型である場合、それは、適当な洗剤溶液（例えば、トリトン−Ｘ  １００）を用い、あるいは酵素切断によって膜から放出することができる。本発明のポリペプチドの発現で使用される細胞は、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤のような種々の物理的または化学的手段によって破壊することができる。
【０２６７】
本発明のポリペプチドを、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドから精製するのが望ましくあり得る。以下の手法は適当な精製手順の例である：イオン−交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上でのクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラム、ＤＥＡＥ等のような）アニオンまたはカチオン交換樹脂上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような混入物を除去するためのプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；および本発明のポリペプチドのエピトープタグ付き形態に結合させるための金属キレーティングカラム。タンパク質精製の種々の方法を使用することができ、そのような方法は当該分野で知られており、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択された精製工程は、例えば、用いる生産プロセスの性質、および生産される本発明の特定のポリペプチドに依存するであろう。
【０２６８】
例えば、細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーは典型的な精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適当性は、抗体に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスイソタイプで、およびヒトγ３で推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが結合したマトリクスは大半はアガロースであるが、他のマトリクスが利用可能である。制御された多孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるより速い流速およびより短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（登録商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）は精製で有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、先に示した技術もまた、回収すべき抗体に応じて利用可能である。Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手法を記載するＣａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）を参照。
【０２６９】
（本発明のポリペプチドに対する共有結合修飾）
本発明のポリペプチド、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４、またはポリペプチドアゴニストまたはポリペプチドアンタゴニストの共有結合修飾は本発明の範囲内に含まれる。それらは、適用可能であれば、化学的合成によって、あるいはポリペプチドの酵素的または化学的切断によって作製することができる。ポリペプチドの他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖またはＮ−またはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と、ポリペプチドの標的化アミノ酸残基と反応させることによって、あるいは改変されたアミノ酸または非天然アミノ酸を伸長するポリペプチド鎖に取り込むことによって、分子に導入される。例えば、Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）；Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）；および米国特許出願第２００３０１０８８８５号および第２００３００８２５７５号。
【０２７０】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基もまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
【０２７１】
ヒスチジル残基はｐＨ  ５．５〜７．０でのジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化される。なぜならば、この因子はヒスチジル側鎖に比較的特異的であるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、反応は典型的には、ｐＨ６．０において０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０２７２】
リシニルおよびアミノ−末端残基をコハク酸もしくは他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの因子での誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ−含有残基を誘導体化するための他の適当な試薬はメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ−触媒反応のようなイミドエステルを含む。
【０２７３】
アルギニル残基は、１または数個の慣用的試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、反応がグアニジン官能基の高いｐＫａのためアルカリ性条件で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬はリシンの基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基と反応させることができる。
【０２７４】
チロシル残基の特定の修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってスペクトル標識をチロシル残基に導入することができ、特に興味深い。最も一般的にはＮ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、各々、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基を、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化して、ラジオイムノアッセイで用いられる標識されたタンパク質を調製する。
【０２７５】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような、ＲおよびＲ′が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０２７６】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、各々対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。これらの残基は、中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は、本発明の範囲内に入る。
【０２７７】
他の修飾は、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびいずれかのＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０２７８】
もう１つのタイプの共有結合修飾は、本発明のポリペプチドへグリコシドを化学的にまたは酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手法は、それらが、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞でのポリペプチドの生産を必要としない点で有利である。用いるカップリング態様に応じて、糖は（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのそれのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのそれのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのそれのような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ  ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０２７９】
本発明のポリペプチド上に存在するいずれの炭水化物部分の除去も、化学的または酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または同等な化合物へのポリペプチドの曝露を必要とする。この処理の結果、ポリペプチドをインタクトにしつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除いてほとんどのまたは全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化はＨａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。例えば、抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）によって記載された種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼを用いることによって達成することができる。
【０２８０】
本発明のポリペプチドの共有結合修飾のもう１つのタイプは、種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号；または第４，１７９，３３７号に記載されたようにポリペプチドを連結することを含む。
【０２８１】
（医薬組成物）
本発明に従って用いる、本発明の分子、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの治療処方物は、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で、所望により医薬上許容される担体、賦形剤または安定化剤の所望の程度の純度を有する分子、例えば、ポリペプチドを混合することによって貯蔵のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用される用量および濃度において受容者に対して非毒性であり、これは、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）保存剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩−形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０２８２】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、あるいは界面重合、例えば、各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されるマイクロカプセル、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）、あるいはマクロエマルジョンに捕捉することもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。また、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ，“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，ｅｄｓ，（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５），ｐｐ．４３９−４６２；ＷＯ  ９７／０３６９２，ＷＯ  ９６／４００７２，ＷＯ  ９６／０７３９９；および米国特許第５，６５４，０１０号も参照。
【０２８３】
ある実施形態において、インビボ投与で用いられる処方物は滅菌されている。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。
【０２８４】
徐放性調製物を調製することもできる。徐放性調製物の適当な例は本発明のポリペプチドを含有する固体体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは、成形製品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルである。徐放マトリクスの例はポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドよりなる注射可能なマイクロスフェア）のような、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸のような分解性乳酸−グリコール酸コポリマーを含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日にわたっての分子の放出を可能とするが、あるヒドロゲルはより短い時間の間タンパク質を放出する。カプセル化抗体は身体中で長時間留まる場合、それらは３７℃における水分への曝露の結果として変性または凝集し得、その結果、生物学的活性を喪失し、免疫原性の変化が起こる可能性がある。関係する機構に応じて、安定化のために合理的戦略を工夫することができる。例えば、もし凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見されれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、適当な添加剤を用いて水分含有量を制御し、次いで、特定のポリマーマトリクス組成物を生じることによって達成することができる。例えば、ポリ電解質被覆を有するカプセルを記載する米国特許第６，６９９，５０１号も参照。
【０２８５】
さらに、本発明の治療タンパク質剤（ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト）は遺伝子治療によって被験体に導入し得ることも意図される。遺伝子治療とは、核酸を被験体へ投与することによって行われる療法をいう。遺伝子治療適用においては、遺伝子を細胞に導入して、その結果、例えば、欠陥遺伝子の置き換えのために、治療上有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」は、持続する効果が単一の処置によって達成される慣用的な遺伝子療法、および治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む遺伝子治療剤の投与を共に含む。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、インビボでのある遺伝子の発現をブロックするための治療剤として用いることができる。例えば、本明細書中に記載されたＡｄ−ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ参照。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による制限された摂取に起因する低い細胞内濃度にも拘らず、それらが阻害剤として作用する細胞に移入することができることは既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：４１４３−４２４６（１９８６））。例えば、それらの負に荷電したホスホジエステル基を非荷電基によって置き換えることによって、オリゴヌクレオチドを改変して、それらの摂取を増強することができる。遺伝子療法の方法の一般的な概説については、例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ
３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；およびＭａｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１５５−２１５（１９９３）参照。用いることができる組換えＤＮＡ技術の当該分野で通常知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに記載されている。
【０２８６】
核酸を生きた細胞に導入するために利用できる種々の技術がある。該技術は、核酸がインビトロにて培養細胞に導入されるか、あるいはインビボにて意図した宿主の細胞に導入されるかに応じて変化する。インビトロでの核酸の哺乳動物細胞への導入に適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法等の使用を含む。例えば、インビボ遺伝子導入技術は、限定されるものではないが、例えば、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでのトランスフェクション、およびウィルスコートタンパク質−リポソーム媒介性トランスフェクションを含む（Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：２０５−２１０（１９９３））。例えば、インビボ核酸導入技術は、（アデノウイルス、単純疱疹Ｉウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ関連ウイルスのような）ウイルスベクター、および脂質−ベースの系でのトランスフェクションを含む（例えば、遺伝子の脂質−媒介性導入のための有用な脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）。遺伝子療法においてウイルスベクターを用いる例は、Ｃｌｏｗｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍら、Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ
ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１（１９９３）；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）；Ｂｏｕｔら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；およびＷａｌｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）に見出すことができる。
【０２８７】
いくつかの状況においては、核酸源に、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンド等のような、標的細胞を標的とする因子を供するのが望ましい。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に対して向性であるキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局所化を標的とし、細胞内半減期を高めるタンパク質を、標的化するため、および／または摂取を容易とするために用いることができる。受容体−媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，８０８−８１３（１９９２）参照。
【０２８８】
（用量および投与）
本発明の医薬組成物の用量および所望の薬物濃度は、考えられる特定の使用に応じて変化し得る。適当な用量または投与の経路の決定は、十分に、通常の医師の技量内である。動物実験は、ヒト療法についての有効用量の決定のための信頼性があるガイドラインを提供する。有効用量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．”Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ
ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ”  Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら、Ｅｄｓ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−９６によって公開された原理に従って行うことができる。
【０２８９】
疾患のタイプおよび重症度に応じて、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）は、例えば、１以上の別々の投与によるか、または連続的注入によるかを問わず、患者への投与のための最初の候補用量である。ＡＮＧＰＴＬ４または、そのアゴニストまたはアンタゴニストのインビボ投与を使用する場合、通常の用量は、投与の経路に応じて、１日あたり、哺乳動物の体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜１００ｍｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日まで変化し得る。送達の特定の用量および方法に関するガイドラインは、文献において提供されている。例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；第５，２０６，３４４号；または第５，２２５，２１２号参照。異なる処方物は、異なる治療化合物および異なる障害で有効であり、１つの器官または組織を標的とする投与は、例えば、もう１つの器官または組織に対するものとは異なる様式の送達を必要とするであろうと予測される。数日以上にわたる反復投与については、条件に依存して、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、治療を維持する。しかしながら、他の用量レジメンが有用であり得る。典型的には、臨床家は、必要な生物学的効果を供する用量に到達するまで、本発明の分子を投与するであろう。本発明の療法の進行は、慣用的な技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０２９０】
本発明の治療組成物は、限定されるものではないが、非経口、皮下、腹腔内、肺内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、クモ膜下腔内、経口、局所および鼻腔内投与を含めたいずれかの適当な手段によって投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与を含む。加えて、治療組成物は、適当には、特に減らした用量の抗体でのパルス注入によって投与される。ある実施形態において、治療組成物は、部分的には、投与が短期または長期であるかに応じて、注射、例えば、静脈内または皮下注射によって与えられる。
【０２９１】
本明細書中で記載するように、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストは、１以上の治療剤と組み合わせることができる。組み合わせた投与は、別々の処方物、または単一の医薬処方物を用いる同時投与、およびいずれかの順序での連続的投与を含む。複数の薬剤の使用もまた本発明に含まれる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４またはＡＮＧＰＴＬ４アゴニストはさらなる治療剤の投与に先立つか、それに続くか、それと交互とするか、あるいはそれと同時に与えることができる。１つの実施形態において、双方（または全て）の活性な薬剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する期間が存在する。
【０２９２】
ある実施形態において、本発明の治療は、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、および１以上の治療剤の組み合わせ投与を含む。本発明では、複数の阻害剤の投与が考えられる。組み合わせた投与は、別々の処方物、または単一の医薬処方物を用いる同時投与、およびいずれかの順序での連続的投与を含む。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストはさらなる治療剤の投与に先立つか、それに続くか、それと交互とするか、あるいはそれと同時に与えることができる。１つの実施形態において、双方（または全て）の活性な薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間が存在する。
【０２９３】
疾患の予防または治療のためには、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの適当な用量は、前記定義の、治療すべき疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、該薬剤が予防的目的で投与されるのかあるいは治療的目的で投与されるのか、従前の療法、患者の臨床的履歴、および薬剤への応答、および主治医の裁量に依存するであろう。薬剤は、適当には、一度に、または一連の治療にわたって患者に投与される。組み合わせ療法レジメンにおいては、本発明の組成物は、治療有効量にて、または治療上相乗的な量にて投与される。本明細書中に用いるように、治療有効量は、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、および１以上の他の治療剤の同時投与、あるいは本発明の組成物の投与の結果、標的化疾患または状態の低下または阻害がもたらされるような量である。治療上相乗的な量は、特定の疾患に関連する状態または症状を相乗的に、または有意に低下または排除するのに必要な、例えば、本明細書中に記載された、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニスト、および１以上の他の治療剤の量である。
【０２９４】
（製品）
本発明のもう１つの実施形態において、前記した方法および障害の治療で有用な物質を含有する製品が提供される。該製品は容器、ラベルおよび添付文書を含む。適当な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成することができる。容器は状態を治療するのに有効な組成物を保有し、滅菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性な薬剤はＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストである。容器上の、または容器に付随するラベルは、組成物が選択された状態を治療するのに用いることを示す。製品は、さらに、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液のような医薬上許容される緩衝液を含む第二の容器を含むことができる。それは、さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジを含めた、商業的およびユーザーの見地から望ましい他の物質を含むことができる。所望により、説明書、一般には書面による説明書の組が含まれ、それは、本明細書中に記載された障害のためのＡＮＧＰＴＬ４、アゴニストまたはアンタゴニストの使用および用量に関する。キットに含まれる説明書は、一般には、障害の治療のための、用量、投与スケジュール、および投与の経路に関する情報を含む。ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴＬ４アゴニストまたはＡＮＧＰＴＬ４アンタゴニストの容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）、またはサブユニット用量であってよい。
【０２９５】
（材料の寄託）
以下の材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託されている。
【０２９６】
【表２】
2011235179.tif 000003
寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約、およびその下の規則（ブダペスト条約）の規定の下でなされた。これは、寄託日から３０年の間、寄託の生きた培養の維持を確実とする。寄託は、ブダペスト条約の条項下で、かつ、関連米国特許の発行に際して、またはいずれかの米国または外国特許出願の公衆への公開に際してのいずれか早いときに、公衆への寄託の培養の子孫の永久的かつ制限のない利用可能性を保障し、かつ（８８６  ＯＧ  ６３８に特に言及する３７  ＣＦＲ  §  １．１４を含めた）３５  ＵＳＣ  §  １２２およびそれに従う米国特許および商標局長官の規則に従って権利がある該長官によって決定されるものに対する子孫の利用可能性を保証する、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＡＴＣＣの間の合意に従って利用可能とされるであろう。
【０２９７】
本出願の譲受人は、もし寄託された材料の培養が適当な条件下で培養された場合に死滅し、または失われ、または破壊されれば、該材料は通知によりそのもう１つの材料で迅速に置き換えられることに合意した。寄託された材料の利用可能性は、その特許法に従ういずれの政府の当局の下で許可された権利に違反して本発明を実施するライセンスと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２９８】
（実施例１：ＡＮＧＰＴＬ４はヒト肝細胞の細胞−接着および増殖を誘導する）
アデノウイルスベクターの創製および形質導入：アデノウイルス構築体は、実質的に製造業者によって記載されたように、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）からのＡｄ−ｅａｓｙベクター構築キットのポリリンカー部位にＮｏｔ１−Ｎｏｔ１  ｃＤＮＡインサートをクローン化することによって構築した。例えば、Ｈｅｓｓｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１０４（１）：１４９−１５８（２００４）参照。
【０２９９】
ｈＡｎｇｐｔｌ４（２３−４０６）（ＰＵＲ９３８４）、ｍＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４１０）−ＩｇＧ（ＰＵＲ９３８８）およびｍＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）（ＰＵＲ９４５２）単一のｆｌａｇタグ付きタンパク質の創製：回収された細胞培養液を抗ｆｌａｇ  Ｍ２樹脂（Ｓｉｇｍａ＃Ａ−２２２０）に一晩通した。カラムをＰＢＳでベースラインまで洗浄し、次いで、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．０で溶出させた。この容量をＡｍｉｃｏｎ−１５  １０，０００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮した。この最後の工程は１ｍＭ  ＨＣｌ／Ｓｕｐｅｒ  Ｑ水への透析、および０．２ｕｍ濾過であった。４〜２０％トリス／グリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＥＣ６０２８ｂｏｘ）ＳＤＳ  ｐａｇｅゲル＋／−１０ｍＭ  ＤＴＴを用いて、純度を測定した。正しいタンパク質は、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃまたはエドマンｎ−末端配列決定いずれかによって同定された。
【０３００】
ｎ−末端ｈｕＦｃタグが直列で続くｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４０６）−ＩｇＧ（ＰＵＲ  ９４４１）ｎ−末端ｆｌａｇタグの創製：回収された細胞培養液をＰｒｏＳｅｐ  Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃１１３１１１８３５）に一晩通した。カラムをＰＢＳでベースラインまで洗浄した。続いて、４カラム容量０．５Ｍ  ＴＭＡＣ／ＰＢＳ  ｐＨ７．５洗浄工程に続いて、ベースラインまでＰＢＳ洗浄を行った。溶出工程は５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．０  ｂｕｍｐであった。この容量をＡｍｉｃｏｎ−１５  １０，０００ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮した。最終工程は、１ｍＭ  ＨＣｌ／Ｓｕｐｅｒ  Ｑ水への透析、および０．２ｕｍ濾過であった。４〜２０％トリス／グリシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃ＥＣ６０２８ｂｏｘ）  ＳＤＳ  ｐａｇｅゲル＋／−  １０ｍＭ  ＤＴＴを用いて、純度を測定する。正しいタンパク質はＭａｓｓ  Ｓｐｅｃまたはエドマンｎ−末端配列決定いずれかによって同定した。当該分野で知られた標準的技術を用い、組換えタンパク質も作製することもできる。
【０３０１】
Ａｄ−ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡの創製：４つの潜在的ＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ分子（Ｑｉａｇｅｎ）を全長ｈＡＮＧＰＴＬ４配列に基づいて創製した。ｈＡＮＧＰＴＬ４発現を阻害するＳｉＲＮＡの能力に基づいて、１つのＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡを選択した。それは、ＡＮＧＰＴＬ４の以下のＤＮＡ標的配列、すなわち、ＧＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡ（配列番号３）、例えば、（ｒ（ＧＧＣＣＡＡＧＣＣＵＧＣＣＣＧＡＡＧＡＵＵ）（配列番号４）および／またはｒ（ＵＣＵＵＣＧＧＧＣＡＧＧＣＵＵＧＧＣＣＡＣ）（配列番号５）を標的化する。ＳｉＲＮＡは、ＲＮＡプロモーター、例えば、Ｈ１プロモーター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を有するＣＭＶｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｈ１．１導入ベクターにクローン化した。次いで、ＳｉＲＮＡ発現カセットをクローン化して、アデノウイルスＡｄｈＡＮＧＰＴＬ４−ＳｉＲＮＡ構築体を創製した。アデノウイルス構築体は、実質的に製造業者によって記載されているように、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）からのＡｄ−ｅａｓｙベクター構築キットのポリリンカー部位へ、Ｎｏｔ１−Ｎｏｔ１  ｃＤＮＡインサートをクローン化することによって構築されたものである。例えば、Ｈｅｓｓｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，１０４（１）：１４９−１５８（２００４）参照。
【０３０２】
ＡＮＧＰＴＬ４の発現は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウェスタンブロッティング分析によって確認した。強力に発現する１クローンを選択し、製造業者の指示に従って力価を増幅した。ウイルス調製物は、ＣｓＣｌ遠心分離によって精製し、ＰＣＲによって復帰変異体についてテストした。ウイルス力価は、製造業者の指示に従って、９６ウェル細胞溶解実験によって決定した。これらのベクターは、供給されたｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ−ｌａｃＺと共に、Ｅ１およびＥ３領域が欠失されたＡｄ５ゲノムを含有するＡｄＥａｓｙベクターを有するＢＪ５１８３エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細菌中で組み換えた。初代ウイルスストックは、組み換えられたＡｄＥａｓｙプラスミドを宿主ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトすることによって調製した。アデノウイルスストックをＨＥＫ２９３細胞においてさらに増幅し、製造業者によって記載されたＣｓＣｌグラジエント精製方法を用いて精製した。アデノウイルス作動力価は、Ｅｌｉｓａアッセイによって得られた。
【０３０３】
ｍＡＮＧＰＴＬ４の創製：２９３細胞を、全長ｍＡＮＧＰＴＬ４（１−４１０）をコードする核酸を含有する構築体で一過的にトランスフェクトした。ｍＡＮＧＰＴＬ４を上清から精製し、実験で用いた。
【０３０４】
肝細胞の細胞接着：初代肝細胞の細胞接着を誘導するＡＮＧＰＴＬ４の能力を、９６−ウェルプレートにおいて評価した。プレートは、種々の濃度，例えば、コーティング無し、６０μｌ中の０．３μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌまたは３０μｇ／ｍｌの、マウスＡｎｇｐｔｌ４サブ配列２３−４１０、フィブロネクチンまたは対照タンパク質ＮＬ４で４℃にて一晩被覆した。過剰のタンパク質を除去し、被覆したウェルを、ＰＢＳ中の３％ＢＳＡの２００μｌで３７℃にて１時間３０分間ブロックした。インキュベーションの後、上清を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄した。
【０３０５】
初代ヒト肝細胞を調製し、通常の増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で増殖させた。細胞を
ＰＢＳで３回洗浄した。細胞をトリプシン処理し、続いてトリプシン中和溶液（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で処理した。次いで、細胞を通常の増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）に再懸濁させた。細胞を１．５×１０４細胞／２００μｌ総容量のウェルにて撒いた。投与の２４時間前に、細胞を５％血清中に分けた。細胞をウェル中で３７℃にて２時間インキュベートした。上清を除去した。クリスタルバイオレットアッセイを用い、細胞の付着を測定した。５０μｌの１０％ホルマリン溶液をウェルに加え、１０分間固定した。細胞をＰＢＳで１回注意深く洗浄した。使用前に濾過した５０μｌの０．５％クリスタルバイオレット溶液を加えた。溶液を室温にてウェル中で３０分以上インキュベートした。ウェルをＰＢＳで３〜５回洗浄した。ＰＢＳをウェルから除き、乾燥した。９６ウェルプレートをＯＤ５５０で読み取った。図４参照。ＬａｎｄｅｇｒｅｎのＰＮＡＧ方法を用いることができる。Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．（１９８４）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６７：３７９−３８８参照。図４で見られるように、組換えｍＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）は、インビトロにて初代肝細胞の細胞−接着を誘導する。
【０３０６】
肝細胞の増殖：初代ヒト肝細胞に対するＡｎｇｐｔｌ４の増殖効果を調べた。Ａｄ−ヒト（ｈ）Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｄ−ＬａｃＺおよびＡｄ−Ａｎｇｐｔｌ３のアデノウイルス構築体を調製した。例えば、Ｈｅｓｓｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  １０４（１）：１４９−１５８（２００４）参照。初代ヒト肝細胞を、アデノウイルス−Ａｎｇｐｔｌ４構築体（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４）、対照としてのアデノウイルス−ＬａｃＺ構築体（Ａｄ−ＬａｃＺ）、またはアデノウイルス−Ａｎｇｐｔｌ３構築体（Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ３）を含む構築のいずれかで、１０、１００および１０００の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。通常の肝細胞培養培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）中で肝細胞を増殖させて５日後に、細胞をカウントした。図５に示すように、Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ４は１０のＭＯＩにてインビトロで肝細胞増殖を誘導する。
【０３０７】
（実施例２：ＡＮＧＰＴＬ４はプレ脂肪細胞の増殖を誘導する）
プレ脂肪細胞増殖：プレ脂肪細胞増殖を誘導するＡＮＧＰＴＬ４の能力を評価した。血清を含有する３ｍｌ容量の増殖培地（プレ脂肪細胞増殖培地（Ｃａｍｂｒｅｘ））中で３０，０００細胞／ウェルの密度にて細胞を分けることによって、ヒトプレ脂肪細胞（内臓または皮下）を６ウェルディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ，Ｐｒｉｍａｒｉａ）上で増殖させた。以下の濃度（ｒｍＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）（５μｇ／ｍｌ）；ＩｇＧ−ｍＡｎｇｐｔｌ４（５μｇ／ｍｌ））にて、アデノウイルス構築体、例えば、Ａｄ−ＬａｃＺ（４）、Ａｄ−ヒト（ｈ）Ａｎｇｐｔｌ４（２３−４０６）（５）またはＡｄ−ヒト（ｈ）Ａｎｇｐｔｌ３（全長タンパク質）（６）、または組換えタンパク質（組換えマウスＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）（２）；ＩｇＧ−ｍＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４１０）（３）または無添加（１）で形質導入されたＣＯＳ細胞からの５００μｌのＣＯＳ細胞馴化培地を、細胞に撒いた後に直接的に加えた。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて５日間増殖させた。細胞を、５００μｌの１×トリプシンで３〜５分間トリプシン処理した。細胞混合物（０．５ｍｌ）をピペットで９．５ｍｌの等張緩衝液に入れ、（希釈係数２０を考慮して）細胞カウンターバイアル中でカウントした。図６、パネルＡで示されるように、組換えマウスＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）（２）およびｈＡｎｇｐｔｌ１４（２３−４０６）（５）を含有する馴化ＣＯＳ細胞培地は、共に、初代ヒト内臓プレ脂肪細胞の増殖を誘導する。図６、パネルＢは、組換えマウスＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）（２）、およびｈＡｎｇｐｔｌ４（２３−４０６）（５）を含有する馴化ＣＯＳ細胞培地が、共に、初代ヒト皮下プレ脂肪細胞増殖を誘導することを示す。
【０３０８】
ヒト初代脂肪細胞へのＡｎｇｐｔｌ４結合のＦＡＣＳ分析：ヒト初代脂肪細胞へのＡＮＧＰＴＬ４の結合を、ＦＡＣＳ分析によって調べた。初代ヒト皮下脂肪細胞を、５００，０００〜１×１０６細胞／試料ウェルにて１０ｃｍ培養ディッシュに入れた。ＦＡＣＳの前日に細胞を分けた。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次に、ＰＢＳ中の２０ｍＭ  ＥＤＴＡを１０ｍｌ加え、１０〜２０分間インキュベートした。２０分後、細胞をプレートから剥がした。ＰＢＳ中の５％ＦＣＳを１０ｍｌ加え、細胞を５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移した。細胞を１．８Ｋ  ｒｐｍにて４℃、５分間回転沈降させた。上清を除去し、細胞をＰＢＳ中の１ｍｌの５％ＦＣＳに再懸濁させた。１００μｌの細胞懸濁液を、１μｇのタンパク質を含有する５ｍｌのＦＡＣＳチューブに分配し、氷上で３０分以上インキュベートした。以下のタンパク質を用いた：ｍＡｎｇｐｔｌ４（２３−４１０）、ＰＵＲ９４５２、０．４２８ｍｇ／ｍｌ（２μｌ／試料）；ｈＡｎｇｐｔｌ４（２３−４０６）、ＰＵＲ  ９３８４、＋／−９０μｇ／ｍｌ（１０μｌ／試料）；ｍＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４１０）−ＩｇＧ、ＰＵＲ９３８８、８．５ｍｇ／ｍｌ（０．２μｌ／試料）；ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４０６）−ＩｇＧ、ＰＵＲ  ９４４１、１．５ｍｇ／ｍｌ（１μｌ／試料）；および対照ＦＬＡＧ−ＢＡＰ（Ｓｉｇｍａ）  ０．１ｍｇ／ｍｌ（２μｌ／試料）。インキュベーションの後に、氷上で、チューブを、５ｍｌのＰＢＳ中５％ＦＣＳで満たした。細胞を２Ｋ  ｒｐｍにて５分間回転沈降させた。上清を除去した。抗ＦＬＡＧ−ＦＩＴＣ抗体（Ｓｉｇｍａ）を加え（２μｌの抗体（１００μｇ／ｍｌストック））、氷上で５分間以上インキュベートした。最終抗体濃度は１μｇ／ｍｌであった。ＰＢＳ中の５％ＦＣＳの５ｍｌを加え、細胞を１．８ｋ  ｒｐｍにて４℃にて５分間回転沈降させた。上清を除去し、細胞を、氷上の５％ＦＣＳを含む０．２５ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。０．０５％アジ化ナトリウムを存在させて、受容体の内部移行を防止することもできる。１試料あたり、１μｌのヨウ化プロビジウム（ＰＩ）の１：５０希釈ストックを加えた。次いで、細胞をＦＡＣＳに供した。図７に示すように、これらの条件下でヒトＡｎｇｐｔｌ４形態、ｒｈＡｎｇｐｔｌ４（２３−４０６）、およびｒｈＩｇＧ−ｈＡｎｇｐｔｌ４（１８４−４０６）は、共に、マウスオルソログと比較してより効果的に皮下脂肪細胞に結合する。
【０３０９】
（実施例３：Ａｎｇｐｔｌ４は初代ヒト皮下プレ脂肪細胞の移動を誘導する）
Ａｎｇｐｔｌ４は細胞移動を誘導する：本発明者らは、初代ヒト皮下プレ脂肪細胞の細胞移動を誘導するＡｎｇｐｔｌ４の能力を調べた。細胞移動度は、３μｍのポアサイズを有するＨＴＳマルチウェル組織培養インサート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）を用いて、記載されているように測定した（例えば、Ｃａｍｅｎｉｓｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１９）：１７２８１−１７２９０（２００２）参照）。ｈＡＮＧＰＴＬ４（１−４０６）を５０／５０／０．１％ＢＳＡ中で５、１および０．２μｇ／ｍｌに希釈した。陽性対照として、膜を、１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）含有培地または０．１μｇ／ｍｌの組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）いずれかと共にインキュベートした。ＰＢＭ／０．１％ＢＳＡを陰性対照として用いた。初代ヒト脂肪細胞をＰＢＳで３回洗浄し、回収し、約２〜５×１０５細胞／ｍｌにてＰＢＭ／０．１％ＢＳＡに懸濁させた。以下の細胞調製物をテストし、ＡＮＧＰＴＬ４をＮＬ２として示す。
【０３１０】
【表３】
2011235179.tif 000004
調製物は底部チャンバーに加え、調製物を３７℃にて１９時間インキュベートした。
【０３１１】
細胞懸濁液（２５０μｌ）を上部チャンバーに加え、５％ＣＯ２湿潤化インキュベーター中で細胞を３７℃にて一晩移動させた。インキュベーションの後、培地を頂部および底部チャンバーから吸引し、膜の下方表面に移動した細胞をメタノールで固定し（４００μｌのＭｅＯＨ、４℃にて３０分、ＭｅＯＨを除去し、４０分間風乾）、ヨウ化ＹＯ−ＰＲＯ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ）（１０μｍにおいて、４００μｌのヨウ化ＹＯ−ＰＲＯ−１（１ｍＭストックからの１：１００））で染色した。Ｏｐｅｎｌａｂソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，ＭＡ）を用い、移動の結果は、２０倍倍率での細胞の平均数／顕微鏡視野について定量する。図８、パネルＡで見られるように、初代ヒト皮下プレ脂肪細胞に加えられたｈＡｎｇｐｔｌ４はそれらを移動するように誘導する。図８、パネルＢは７時間における移動を示す。図８、パネルＣは、血清無し（１）１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（２）、ＰＤＧＦ−ＢＢ（３）、ｍＡＮＧＰＴＬ４（４）、いずれかでの処理の７時間後における脂肪細胞の移動を図で示す。
【０３１２】
（実施例４：Ａｎｇｐｔｌ４の改変体）
改変体ＡＮＧＰＴＬ４は、製造業者のプロトコルに従い、標準突然変異誘発キット（例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））を用いて作製した。２つのアミノ酸置換を、ヒトＡＮＧＰＴＬ４配列において行った（例えば、図２参照）。置換は位置１６２および１６４におけるものであり（Ｒ１６２ＧおよびＲ１６４Ｅ）、その結果、ＲＫＲからＧＫＥへの変化がもたらされた。ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（Ｌ２８０プラスミド、ａａ１−４０６）または改変体ＡＮＧＰＴＬ４は、一過的にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞の上清から単離した。精製のために、上清をニッケルカラムにロードした。タンパク質は抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ抗体でのウエスタンブロットによって検出した。図３、パネルＢ参照。置換を行い、改変体ＡＮＧＰＴＬ４を天然または野生型ＡＮＧＰＴＬ４タンパク質と比較した場合、改変体ＡＮＧＰＴＬ４は、ウェスタンブロッティングによって、天然ＡＮＧＰＴＬ４よりも高い分子量を有することが判明した。天然タンパク質の位置１６２および１６４におけるＲＫＲからＧＫＥへの置換は、ＡＮＧＰＴＬ４のタンパク質分解を妨げた。
【０３１３】
（実施例５：Ａｎｇｐｔｌ４はインテグリンαｖβ５に結合する）
アンジオポエチンは、それらのフィブリノーゲン（ＦＢＮ）様ドメインを介して、内皮細胞特異的チロシンキナーゼ受容体Ｔｉｅ２へ結合することによって脈管形成を調節する分泌因子である。分泌リガンドのファミリーに存在するコイルドコイルドメインは、リガンドのオリゴマー化に必要であることが判明した（例えば、Ｐｒｏｃｏｐｉｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：３０１９６−２０１（１９９９）参照）。
【０３１４】
アンジオポエチンと同様に、ＡＮＧＰＴＬ３およびＡＮＧＰＴＬ４は分泌タンパク質であり、各々は、Ｎ−末端シグナルペプチド、それに続いて、コイルドコイルドメイン／およびＣ末端ＦＢＮ様ドメインよりなる。ＡＮＧＰＴＬ３はＦＢＮ様ドメインインを介してαｖβ３に結合すると判断された。本発明者らは、ＡＮＧＰＴＬ４がαｖβ５に結合すると判断した。αｖβ５インテグリンで安定にトランスフェクトされる２９３−１９５３細胞株を、ＡＮＧＰＴＬ４被覆プレートに結合または接着する能力についてテストした。細胞を回収し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する無血清培地中に１０５細胞／ｍｌに希釈した。細胞を抗インテグリンαｖβ５抗体（ＭＡＢ１９６１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））またはペプチドによってか、またはそれら無しで、３７℃にて１５分間プレインキュベートした。組換えｍＡＮＧＰＴＬ４、ＢＳＡまたはビトロネクチン（１μｇ、３μｇ、１０μｇまたは３０μｇ／ｍｌ）を、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６−ウェル平底マイクロタイタープレート上に４℃にて一晩被覆し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中の３％ＢＳＡの２００μｌで３７℃にて１．５時間ブロックした。細胞懸濁液（５×１０４細胞／１００μｌ／ウェル（５×１０５／ｍｌ））を被覆されたウェルに加え、プレートを３７℃にて５．５時間インキュベートした。非接着性細胞をＰＢＳ洗浄によって除去し、２００μｌのＣｙＱｕａｎｔ  ＧＤ染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））（１：４００）／細胞溶解緩衝液を加えることによって、細胞付着を測定し、２〜５分間インキュベートした。４８０ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光最大を用い、試料の蛍光を測定した。ＬａｎｄｅｇｒｅｎのＰＮＡＧ方法を用いることができる（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６７：３７９−３８８（１９８４）参照）。αｖβ５を発現する細胞は、ＢＳＡ、陰性対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ４およびビトロネクチン（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、陽性対照に対する付着を呈した。図９、パネルＡ参照。
【０３１５】
αｖβ５インテグリンがＡＮＧＰＴＬ４細胞接着を媒介するのに十分か否かを判断するために、ブロッキング抗体を、細胞接着アッセイにおいて接着を阻害する能力についてテストした。機能的ブロッキング抗体（抗αｖβ５抗体（ＭＡＢ１９６１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ））または抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体）を、タンパク質被覆（ＢＳＡ（１）、ビトロネクチン（２）またはＡＮＧＰＴＬ４（３））ウェルでのインキュベーションに先立って２９３−１９５３細胞に加えた。図９、パネルＢ参照。抗αｖβ５および抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体はＡＮＧＰＴＬ４細胞接着活性をなくした。
【０３１６】
さらなる実験を行って、ＡＮＧＰＴＬ４がαｖβ５に結合することを確認した。ＥＬＩＳＡ実験を行って、ｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端（１−１８３）および／またはＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端（１８４−４０６）がαｖβ５（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ，３７Ｋ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）被覆プレートに結合するかどうかを検出した。コーティング緩衝液を含む１００μｌ／ウェルのインテグリンαｖβ５希釈液（１μｇ／ｍｌコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩／炭酸水素塩，ｐＨ９．６））を、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ）を、温和に攪拌しつつ、室温にて１時間で加えた。種々の量（０、０．０７０μｇ、０．２２μｇ、０．６６μｇ、２μｇ、または６μｇ）の試料、ｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端（１−１８３）および／またはＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端（１８４−４０６）を試料緩衝液（０．５％  ＢＳＡ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で調製し、３０分間インキュベートした。試料をプレートに加え（前記でインキュベートした量にて１００μｌ／ウェル）、温和に攪拌しつつ室温にて２時間インキュベートした。プレートを緩衝液で洗浄し、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中の１００μｌ／ウェルの抗Ｆｌａｇ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，＃１０９−０３６−０９８）を加え、温和に攪拌しつつ、室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．）を加え、良好な色が室温にて発色するまで、プレート中でインキュベートした。１００μｌ／ウェルの停止溶液（１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４）を加えて、反応を停止させた。プレートを６３０ｎｍで読み取った。ｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端およびＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端はαｖβ５被覆プレートに結合したが、わずかにより多くのＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端がプレートに結合した。図９、パネルＣ参照。
【０３１７】
抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、ＡＮＧＰＴＬ４のαｖβ５被覆プレートへの結合を阻害する。ＥＬＩＳＡ実験を行った。コーティング緩衝液を含む１００μｌ／ウェルのインテグリンαｖβ５希釈液（１μｌ／ｍｌコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩／炭酸水素塩、ｐＨ９．６））を４℃にて一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、温和に攪拌しつつ、１００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ）を室温にて１時間で加えた。試料緩衝液（０．５％ＢＳＡ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中の０．６μｇ〜６．０μｇの試料、ｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端（１−１８３）および／またはＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端（１８３−４０６）を、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（１．５μｇ）または抗Ｄｓｃｒ（１．５μｇ）と共に３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、温和に攪拌しつつ、１００μｌ／ウェルの試料＋／−抗体をプレートと共に室温にて２時間インキュベートした。プレートを緩衝液で洗浄し、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中の１００μｌ／ウェルの抗Ｆｌａｇ−ＨＲＰ  １００ｎｇ／ｍｌ）を加え、温和に攪拌しつつ、室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのＴＭＢを加え、良好な色が室温で発色するまで、プレート中でインキュベートした。１００μｌ／ウェルの停止溶液（１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４）を加えて、反応を停止させた。プレートを６３０ｎｍにおいて読み取った。抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体は、抗Ｄｓｃｒ抗体、５Ｇ７モノクローナル抗体または培地と比較して、αｖβ５被覆プレートへｍＡＮＧＰＴＬ４、ＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｎ末端およびＩｇＧ−ｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端が結合する量を低下させた。図９、パネルＤ参照。
【０３１８】
もう１つの実験において、ＡＮＧＰＴＬ４およびインテグリンαｖβ５の結合はＥＬＩＳＡによって示された。この実験において、８０μｌ／ウェルのｈＡＮＧＰＴＬ４−Ｃ末端、ビトロネクチンまたはＢＳＡ（５μｇ／ｍｌ）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩／炭酸水素塩、ｐＨ９．６）にてプレートに加え、４℃にて一晩インキュベートした。プレートを洗浄し（洗浄緩衝液：ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、培地、抗ｈＡＮＧＰＴＬ４抗体（１５μｇ／１００μｌ）または抗Ｄｓｃｒ抗体（１５μｇ／１００μｌ）のいずれかを含む１００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ）を加え、温和に攪拌しつつ、室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ（３〜９μｇ／ｍｌ）のαｖβ５を加え、温和に攪拌しつつ、室温にて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１μｇ／ｍｌ（１：１０００）の抗αｖβ５抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）（５μｇ／１００μｌ）をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）に加え、温和に攪拌しつつ、室温にて１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗マウス（１：５０００）をアッセイ緩衝液に加えた。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を加え、良好な発色があるまで室温にてインキュベートした。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で停止させ、プレートを６３０ｎｍで読み取った。αｖβ５はＡＮＧＰＴＬ４（レーン１）、およびビトロネクチン（レーン４）被覆プレートに結合する。結合は、対照抗体である抗Ｄｓｃｒを用いた場合（レーン３）または対照タンパク質をプレートに被覆した場合（レーン５）を除いて、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体（レーン２）でブロックされる。図９、パネルＥ参照。
【０３１９】
よって、これらの知見は、組換えＡＮＧＰＴＬ４がαｖβ５インテグリンに特異的に結合することを示す。
【０３２０】
（実施例６：Ａｎｇｐｔｌ４は、静脈内注射した場合に、マウスにおいてトリグリセリドを増加させる）
トリグリセリドレベルを、ＡＮＧＰＴＬ４を含む種々のアデノウイルス構築体を注射したＣ５７Ｂ１−６マウスにおいて測定した。Ｃ５７Ｂ１−６マウスに、（１）アデノウイルスＧＦＰ構築体、（２）アデノウイルスＧｄ構築体、（３）アデノウイルスＡＮＧＰＴＬ４（１−４０６）構築体、（４）アデノウイルスＡＮＧＰＴＬ４（１−１８３）構築体、（５）アデノウイルスＡＮＧＰＴＬ４（１８４−４０６）構築体、（６）アデノウイルスＡＮＧＰＴＬ４改変体構築体；（７）アデノウイルスＡＮＧＰＴＬ４（１−４０８）構築体および（８）アデノウイルス対照構築体のいずれかを尾に静脈内注射した。（ｍｇ／ｄｌ）で表したトリグリセリドレベルは、注射から７日後に、マウス由来の血液試料から測定した。図１０に見られるように、ＡＮＧＰＴＬ４のＮ−末端構築体（１−１８３）は、全長ＡＮＧＰＴＬ４構築体およびＡＮＧＰＴＬ４改変体構築体と共にトリグリセリドレベルに対して最も顕著な影響を有する。
【０３２１】
（実施例７：ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子破壊を含むマウスの創製および分析）
ＡＮＧＰＴＬ４の役割を調べるために、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子における破壊を相同組換えによって生じさせた。具体的には、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウス（すなわち、ノックアウトマウス）を、遺伝子標的化または遺伝子トラッピングいずれかによって創製した。突然変異は、５’および３’双方の末端での正しい標的化を確認するためのサザーンブロット分析によって確認した。ゲノムＰＣＲによって遺伝子−特異的ジェノタイピングも行って、挿入の部位に近接するエクソンにアニールするプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって示されたように、内因性天然転写物の喪失を確認した。標的化ベクターを１２９株ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、標的化クローンを同定した。標的化クローンを宿主胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラを得た。キメラをＣ５７動物と交雑させて、Ｆ１へテロ接合体を得た。ヘテロ接合体を異種交配させて、Ｆ２野生型、ヘテロ接合体およびホモ接合体コホートを作製し、これを表現型分析で用いた。例外的に、もし十分なＦ１ヘテロ接合体が作製されなければ、Ｆ１ｈｅｔを野生型Ｃ５７マウスに交配させて、十分なヘテロ接合体を作製して、表現型について分析すべきコホートのために育種した。全ての表現型分析は誕生から１２〜１６週に行った。
【０３２２】
（結果）
ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子破壊を含むマウスの創製および分析：これらのノックアウト実験において、ＡＮＧＰＴＬ４（ＤＮＡ２２７８０−１０７と命名されるＰＲＯ１９７ポリペプチド；ＵＮＱ１７１）をコードする遺伝子を破壊した。これらの実験についての遺伝子の具体的な情報は以下の通りである：突然変異したマウス遺伝子はヌクレオチド参照：ＮＭ ０２０５８１に対応する。登録：ＮＭ ０２０５８１  ＮＩＤ：１０１８１１６３；またはＭｕｓ筋アンジオポエチン様４（Ａｎｇｐｔｌ４）；タンパク質参照：Ｑ９Ｚ１Ｐ８。登録：Ｑ９ＳＺ１Ｐ９  ＮＩＤ；またはＭｕｓ筋（マウス）。ＮＧ２７（肝臓アンジオポエチン関連タンパク質）（仮定タンパク質４２５Ｏ１８−１）（フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質）（アンジオポエチン様タンパク質）（アンジオポエチン様４）。ＭＯＵＳＥＳＴＲＮＲＤＢ；ヒト遺伝子配列参照：ＮＭ １３９３１４。登録：ＮＭ １３９３１４  ＮＩＤ：２１５３６３９７ヒトアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）；ヒトタンパク質配列は参照：Ｑ９ＢＹ７６に対応する。登録：Ｑ９ＢＹ７８  ＮＩＤ：またはホモサピエンス（ヒト）。アンジオポエチン関連タンパク質３前駆体（アンジオポエチン様４）（肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質）（ＨＦＡＲＰ）（アンジオポエチン様タンパク質ＰＰ１１５８）。ＨＵＭＡＮＳＴＲＮＲＤＢ。
【０３２３】
破壊されたマウス遺伝子はＡｎｇｐｔｌ４（アンジオポエチン様４）であり、これはヒトＡＮＧＰＴＬ４のオルソログである。アリアーゼは本明細書中に記載されたもの、ならびにＢＫ８９、Ｂｋ８９、ＦＩＡＦ、ＮＧ２７、Ｎｇ２７、ＨＦＡＲＰ、Ｆａｒｐ−ｐｅｎｄｉｎｇ、フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質、主要組織適合複合体領域ＮＧ２７、ＡＲＰ４、ＰＧＡＲ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰ１１５８、ＡＮＧＰＴＬ２、空腹時−誘導脂肪因子、ＰＰＡＲＧアンジオポエチン関連タンパク質、肝臓アンジオポエチン関連タンパク質、および肝臓フィブリノーゲン／アンジオポエチン関連タンパク質を含む。
【０３２４】
標的化または遺伝子トラップ突然変異を、株１２９ＳｖＥＶＢｒｄ−由来胚性幹細胞（ＥＳ）細胞において生じさせた。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊアルビノマウスに交配させて、Ｆ１ヘテロ接合性動物を創製した。これらの子孫を異種交配させて、Ｆ２野生型、ヘテロ接合性、およびホモ接合性突然変異体子孫を創製した。例外的な場合（例えば、非常に少数のＦ１マウスしかキメラから得られない場合）には、Ｆ１へテロ接合性マウスを１２９ＳｖＥＶＢｒｄ／Ｃ５７ハイブリッドマウスに交配させて、Ｆ２マウスを生じさせるための異種交配用のさらなるヘテロ接合性動物を得た。表現型分析を、以下に記載したように、この世代からのマウスで行った。
【０３２５】
【表４】
2011235179.tif 000005
Ｃｈｉ−Ｓｑ．＝２．７６  有意性＝０．２６２９４（ホモ／ｎ）＝０．１６ 平均同腹仔サイズ＝７
レトロウイルス挿入（ＯＳＴ）が起こり、コードエクソン２および３の間の遺伝子を破壊した（ＮＣＢＩ登録ＮＭ ０２０５８１．１）。
【０３２６】
標的遺伝子の野生型発現は、胚性幹（ＥＳ）細胞において、およびＲＴ−ＰＣＲによってテストされた全ての成体組織試料で、尾を除いて検出された。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、転写物が分析した（−／−）マウスで存在しないことを明らかとした。
【０３２７】
（１．表現型分析）
総じての表現型のまとめ：ヒトアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）のオルソログをコードする遺伝子の突然変異の結果、（−／−）マウスにおいてコレステロールおよびトリグリセリドレベルが低下した。加えて、雄（−／−）マウスはグルコース耐性テストにおいてグルコース耐性の増強を呈した。突然変異体（−／−）マウスは、それらの（＋／＋）同腹仔と比較した場合に、増大した平均血清中ＩｇＭレベルおよび平均絶対好中球カウントを含めた免疫学的異常も呈した。転写物はＲＴ−ＰＣＲによって存在しなかった。
【０３２８】
心血管表現型分析／代謝血液化学：心血管生物学の分野においては、表現型テストを行って、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心不全、発作、種々の冠動脈病のような心血管、内皮または脈管形成障害、高コレステロール（高コレステロール血症）および増大した血清トリグリセリド（高トリグリセリド血症）のような異脂肪血症、癌および／または肥満の治療のための潜在的標的を同定した。表現型テストは、血清コレステロールおよびトリグリセリドの測定を含む。加えて、血液化学表現型分析は、インスリン感受性、およびグルコース代謝の変化を測定するためのグルコース耐性テストも含んだ。異常グルコース耐性テストの結果は、限定され得るものではないが、１型および２型糖尿病、症候群Ｘなどの障害または状態を示す。
この場合における表現型テストは、血清コレステロールおよびトリグリセリドの測定を含んだ。
【０３２９】
（血液脂質）
手法：４の野生型および８のホモ接合体雄のコホートをこれらのアッセイで用いた。平均血清コレステロールおよびトリグリセリドレベルを測定し、性が一致する（＋／＋）同腹仔と比較した。グルコース耐性の同時テストを行った。というのは、このテストは、哺乳動物においてグルコースホメオスタシス障害を規定するための標準だからである。グルコース耐性テストは、Ｌｉｆｅｓｃａｎグルコメーターを用いて行った。動物に送達されるＤ−グルコースを２ｇ／ｋｇにて２０％溶液として腹腔内注射し、注射から０、３０、６０および９０分後、血中グルコースレベルを測定した。ＣＯＢＡＳ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００（Ｒｏｃｈｅ）を、マウスに対して血液化学テストを実行するために用いた。
【０３３０】
結果：性が一致する野生型同腹仔および過去の平均と比較した場合に、雄および雌ホモ接合性突然変異体マウスは顕著に減少した平均トリグリセリドレベルを呈した。また、これらの突然変異体は、それらの野生型同腹仔と比較した場合に、平均血清中コレステロールレベルの減少を示した。同時に、雄（−／−）マウスは、それらの性に合致した（＋／＋）同腹仔および過去の平均と比較した場合に、テストした全ての３つの間隔において正常な空腹時グルコースの存在下でグルコース耐性の増強を呈し、他方、雌（−／−）マウスは平均血清中グルコースレベルの減少を示した。まとめると、これらのノックアウトマウスは、脂質および／またはグルコース代謝に関して陽性表現型を呈した。かくして、ＡＮＧＰＴＬ４遺伝子が欠損した突然変異体マウスは、心血管疾患の治療のためのモデルとして役立ち得る。ＡＮＧＰＴＬ４のアンタゴニスト、またはそれをコードする遺伝子は、血液中脂質を調節するのに、特に、正常なコレステロールおよびトリグリセリド代謝を維持するのに重要な役割を演じるであろう。ＡＮＧＰＴＬ４のそのような阻害剤またはアンタゴニストは、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心不全、発作、種々の冠動脈病、肥満および／または糖尿病のような異脂肪血症に関連した心血管疾患の治療で有用であろう。
【０３３１】
免疫学表現型分析：免疫関連疾患および炎症疾患は、通常の生理学においては、傷害（ｉｎｓｕｌｔ）または傷害（ｉｎｊｕｒｙ）に応答し、傷害または傷害からの修復を開始し、および外来性生物からの先天性および後天性防御を設置するのに非常に重要である、かなり複雑で、しばしば多数の相互に関係する生物学的経路の発現または結果である。これらの正常な生理学的経路が、応答の強度に直接的に関連してか、異常な調節または過剰な刺激の結果としてか、自己に対する反応としてか、またはそれらの組み合わせとしてのいずれかでさらなる傷害または傷害を引き起こす場合に、疾患または病理が起こる。
【０３３２】
これらの疾患の発生は、しばしば、複数工程の経路、しばしば、複数の異なる生物系／経路に関連したが、これらの経路の１以上における重要な地点での介入は、緩和または治療効果を有することができる。治療的介入は、有害なプロセス／経路の拮抗作用、または有益なプロセス／経路の刺激のいずれかによって起こり得る。
【０３３３】
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、哺乳動物免疫応答の重要な成分である。Ｔ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）内の遺伝子によってコードされた自己分子に関連する抗原を認識する。抗原は、抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片等の表面にあるＭＨＣ分子と共に提示され得る。Ｔ細胞系は、宿主動物に健康の脅威を与えるこれらの変化した細胞を排除する。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を含む。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞上の抗原−ＭＨＣ複合体の認識後、広範に増殖する。ヘルパーＴ細胞は種々のサイトカイン、例えば、リンホカインも分泌し、これは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および免疫応答に参画する種々の他の細胞の活性化において中枢的な役割を演じる。
【０３３４】
多くの免疫応答において、炎症細胞は傷害または感染の部位に浸潤する。移動する細胞は、影響された組織の組織学的調査によって判断できるように、好中性、好酸性、単球性またはリンパ球性であり得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照。
【０３３５】
多くの免疫関連疾患が知られており、広範に研究されてきた。そのような疾患は免疫−媒介性炎症疾患（例えば、慢性関節リウマチ、免疫媒介性腎臓病、肝胆嚢病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、乾癬、および喘息）、非免疫媒介性炎症疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、新形成および移植片拒絶等を含む。免疫学の領域においては、炎症および炎症性障害の治療のために標的が同定された。
【０３３６】
免疫学の領域においては、本明細書では、炎症および炎症性障害の治療のために標的が同定されてきた。免疫関連疾患は、１つの例においては、免疫応答を抑制することによって治療できる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体の使用は、免疫媒介性および炎症疾患の治療で有益であろう。免疫応答を阻害する分子を利用して（タンパク質を直接的にか、または抗体アゴニストの使用を介して）、免疫応答を阻害し、かくして、免疫関連疾患を緩和することができる。
以下のテストを行った。
【０３３７】
血清免疫グロブリンイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）アッセイ：血清免疫グロブリンイソタイピングアッセイは、サイトメトリビーズアレイ（ＣＢＡ）キットを用いて行った。このアッセイを用いて、単一試料において、マウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖イソタイプを迅速に同定した。値は「相対的蛍光単位」であり、カッパ軽鎖の検出に基づくものである。６より小さいいずれの値も有意ではない。
【０３３８】
結果：血清免疫グロブリンイソタイピングアッセイは、突然変異体（−／−）マウスが、それらの性が一致する（＋／＋）同腹仔と比較して、ＩｇＭ血清免疫グロブリンの増大を呈したことを明らかとした。ＩｇＭ免疫グロブリンは、細菌毒素の中和に対する液性免疫応答においてまず産生され、補体系を活性化するのに特に重要である。同様に、ＩｇＧ免疫グロブリンは中和効果を有し、程度は低いが、補体系についての活性化で重要である。加えて、（−／−）マウスは、それらの（＋／＋）同腹仔、および過去の平均と比較した場合に、増大した平均絶対好中性カウントを呈した。観察された表現型は、ＡＮＧＰＴＬ４が炎症応答の負の調節因子であることを示唆する。これらの免疫学的異常は、ＡＮＧＰＴＬ４の阻害剤（アンタゴニスト）が、（Ｔ細胞増殖のような）免疫系を刺激でき、この効果が、白血病の場合、他のタイプの癌の場合、およびＡＩＤＳに罹ったもののような免疫無防備状態の患者において個体に対して有益であろう場合に利用性を見出す重要な因子であり得ることを示唆する。従って、ＡＮＧＰＴＬ４またはそのアンタゴニストは、免疫応答を阻害する際に役割を果たし得、例えば、移植片拒絶または移植片対宿主病の場合に、有害な免疫応答を抑制するための有用な候補であろう。
【０３３９】
（実施例８：Ａｎｇｐｔｌ４に結合する抗体の調製）
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生産するための技術は、当該分野で知られており、かつ本明細書中に記載される。使用できる抗原（または免疫原）は、本発明の精製されたタンパク質、タンパク質フラグメント、そのようなタンパク質を含有する融合タンパク質、および細胞表面で組換えタンパク質および／またはタンパク質フラグメントを発現する細胞を含む。抗原の選択は、過度な実験無くして、当業者が為すことができる。
【０３４０】
Ｂａｌｂ／ｃのようなマウスは、完全フロイントアジュバント中に乳化させた抗原で免疫化し、１〜１００マイクログラムの量で皮下または腹腔内注射される。別法として、抗原はＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）中に乳化され、動物の後足パッドに注射される。次いで、１０〜１２日後に、選択されたアジュバント中に乳化されたさらなる抗原を免疫化マウスにブースター注射する。その後、数週間の間、マウスにさらなる免疫化注射をブースター注射することができよう。血清試料は、ＥＬＩＳＡアッセイをテストするために眼窩後採血して、抗体を検出することによって、マウスから周期的に得ることができる。
【０３４１】
適当な抗体力価が検出された後に、抗体に「陽性」である動物に、与えられたリガンドの最終的な動脈内注射を注射することができる。３日または４日後に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を回収した。次いで、（３５％ポリエチレングリコールを用いて）脾臓細胞を、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ  １５９７から入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１のような選択されたマウス骨髄腫細胞株に融合させる。融合により、ハイブリドーマ細胞が生じ、次いで、これを、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）培地を含有する９６ウェル組織培養プレート中で平板培養して、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害することができる。
【０３４２】
ハイブリドーマ細胞は、抗原に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。本明細書において、ＡＮＧＰＴＬ４に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、十分に当業者内の技量内のものである。
【０３４３】
陽性ハイブリドーマ細胞を同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、抗ＡＮＧＰＴＬ４モノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせることができる。別法として、ハイブリドーマ細胞は組織培養フラスコまたはローラーボトル中で増殖させることができる。腹水中で生じたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈殿、続いてのゲル排除クロマトグラフィーを用いて達成することができる。別法として、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを使用することができる。
【０３４４】
例えば、１、４０および７０日に、Ｅ．ｃｏｌｉで生じた５００μｇの組換えヒトＡＮＧＰＴＬ４タンパク質（２３−４０６）でウサギを免疫化することによって、ポリクローナルウサギ抗体を生じさせた。免疫化から８０および１２０日後に血清を回収し、プロテイン−Ａセファデックスカラムによって抗体を精製した。
【０３４５】
（実施例９：ブロッキングまたは中和抗体）
本明細書中で記載された抗原、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４に対する抗体は、当該分野で公知の種々の技術、例えば、ＥＬＩＳＡによって同定することができる。例えば、プレートを目的のポリペプチド、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４またはそのフラグメントで被覆し、そのポリペプチド、例えば、ＡＮＧＰＴＬ４に対して生じた抗体と共にインキュベートすることができる。（例えば、米国特許第６，３４８，３５０号、第６，３７２，４９１号および第６，４５５，４９６号参照）。結合した抗体は種々の方法によって検出することができる。
【０３４６】
アンタゴニスト（例えば、ブロッキングまたは中和）抗体は、競合アッセイおよび／または活性アッセイによって同定することができる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ４の発現は細胞肝細胞またはプレ脂肪細胞の増殖、脂肪細胞の移動を刺激するか、トリグリセリドの量を調節するか、またはαｖβ５インテグリンに結合する。ＡＮＧＰＴＬ４に対するブロッキングまたは中和抗体の決定は、例えば、これらの活性をブロックする抗体の能力によって示すことができる（例えば、図９、パネルＢ、ＤおよびＥ）。例えば、肝細胞またはプレ脂肪細胞を平板培養し、抗ＡＮＧＰＴＬ４抗体または対照抗体またはＰＢＳと共にＡｄ−ｈＡｎｇｐｔｌ４で形質導入されたＣＯＳ７細胞からの上清と共にインキュベートすることができる。数日後、細胞をトリプシン処理し、カウントすることができる。細胞の数を低下させる抗体は、ブロッキングまたは中和抗体として同定される。また、ＡＮＧＰＴＬ４は肝細胞接着およびプレー脂肪細胞移動を誘導することが示されており、かくして、ＡＮＧＰＴＬ４に対するブロッキングまたは中和抗体の決定は、肝細胞接着および／またはプレ脂肪細胞移動をブロックする抗体の能力によって示すことができる。また、ＡＮＧＰＴＬ４は脈管形成促進因子であることが示されている。例えば、Ｌｅ  Ｊａｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１６４（５）：１５２１−１５２８（２００３）参照。かくして、ＡＮＧＰＴＬ４に対するブロッキングまたは中和抗体を、脈管形成アッセイ、例えばＣＡＭアッセイにおいてＡＮＧＰＴＬ４と組み合わせた抗体を用いることによって同定することができる。
【０３４７】
明細書は、当業者が本発明を実施できるのに十分であると考えられる。本明細書中に記載された実施例および実施形態は説明目的のためのみのものであると理解される。本発明は寄託された構築体によって範囲が限定されるものではない。というのは、寄託された実施形態は本発明のある態様の単一の説明を意図するものであり、機能的に同等ないずれの構築体も本発明の範囲内にあるからである。本明細書の材料の寄託は、書面による記載が、その最良のものを含めた本発明のいずれの態様の実施を可能とするのに不十分なものであるという自認を構成するものではなく、また、特許請求の範囲をそれが表す特定の説明に限定するものと解釈されるべきではない。事実、本明細書中で示され、記載されたものに加えて本発明の種々の改変はこれまでの記載から当業者に明らかになり、それは添付の請求の範囲内に入る。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、参考として、全ての目的でその全体を援用する。
【図１Ａ】
2011235179.tif 000006
【図１Ｂ】
2011235179.tif 000007
【図２Ａ】
2011235179.tif 000008
【図２Ｂ】
2011235179.tif 000009
【図３Ａ】
2011235179.tif 000010
【図３Ｂ】
2011235179.tif 000011
【図４】
2011235179.tif 000012
【図５】
2011235179.tif 000013
【図６Ａ】
2011235179.tif 000014
【図６Ｂ】
2011235179.tif 000015
【図７】
2011235179.tif 000016
【図８Ａ】
2011235179.tif 000017
【図８Ｂ】
2011235179.tif 000018
【図８Ｃ】
2011235179.tif 000019
【図９Ａ】
2011235179.tif 000020
【図９Ｂ】
2011235179.tif 000021
【図９Ｃ】
2011235179.tif 000022
【図９Ｄ】
2011235179.tif 000023
【図９Ｅ】
2011235179.tif 000024
【図１０】
2011235179.tif 000025
【配列表】
2011235179000001.app
【外国語明細書】
2011235179000001.pdf