(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫応答を発生させるための、または免疫賦活を必要としている患者を処置するための方法において用いるためのイムノマーおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチドを提供する。【解決手段】イムノマーは、好ましくは、新規なプリンを含み、これらの３’末端において結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド間結合または非ヌクレオチドリンカーへの官能化された核酸塩基または糖を含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、免疫調節性オリゴヌクレオチドであり、アクセス可能な５’末端を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３’末端もしくはヌクレオシド間結合において結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーへの官能化された核酸塩基もしくは糖を含むイムノマーであって、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、アクセス可能な５’末端を有し、構造ＲｐＧを有する免疫賦活性ジヌクレオチドを含む免疫調節性オリゴヌクレオチドであり、ここでＲが、図１５に示す構造を有し、Ｇが、グアノシン、２’−デオキシグアノシン、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−Ｏ置換アラビノグアノシンまたは他の非天然プリンヌクレオシドからなる群から選択されている、前記イムノマー。
【請求項２】
構造ＲｐＧを有し、ここでＲが、図１５に示す構造を有し、Ｇが、グアノシン、２’−デオキシグアノシン、２’デオキシ−７−デアザグアノシン、２’−デオキシ−６−チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−Ｏ置換アラビノグアノシンまたは他の非天然プリンからなる群から選択されている免疫賦活性ジヌクレオチドを含む、免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
構造
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中、
Ｙの塩基は、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり、
Ｚの塩基は、グアニン、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−アミノ−６−チオプリン、６−オキソ−プリンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
各々の存在におけるＮ１およびＮｎは、天然に存在するか、もしくは合成のヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、ホスホジエステルもしくは修飾されたヌクレオシド間結合により、３’側上の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択された免疫賦活性部分であり、修飾されたヌクレオチド間結合が、限定されずに、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されており、ここで、引用したオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドに直接的に、または間接的に結合している、
を有する、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項４】
構造
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中、
Ｙの塩基は、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり、
Ｚの塩基は、グアニン、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−アミノ−６−チオプリン、６−オキソ−プリンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、
各々の存在におけるＮ１およびＮｎは、天然に存在するか、もしくは合成のヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、ホスホジエステルもしくは修飾されたヌクレオシド間結合により、３’側上の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択された免疫賦活性部分であり、修飾されたヌクレオチド間結合が、限定されずに、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されている、
を有する、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
免疫賦活性部分が、脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、変性ヌクレオシド間結合により、３’側上の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択されており、修飾されたヌクレオチド間結合が、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート類、ホスホトリエステル類、ホスホチオトリエステル類、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、トリエステルプロドラッグ、スルホン類、スルホンアミド類、スルファメート類、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カーボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホラミデート類、特に第一アミノ−ホスホラミデート類、Ｎ３ホスホラミデート類およびＮ５ホスホラミデート類、並びに立体特異性結合、糖変性を有するヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボースおよび２’−デオキシ−２’−フルオロリボースが含まれるがこれらには限定されない２’置換ペントース糖類；３’−Ｏ−メチルリボースが含まれるがこれには限定されない３’−置換ペントース糖類；１’，２’−ジデオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖類、ヘキソース糖類、並びにアルファ−アノマー類、ペプチド核酸類（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸類（ＰＨＯＮＡ）、ロックされた核酸類（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸類、並びに約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有する主鎖リンカー部分を有するオリゴヌクレオチド、アルキルリンカーまたはアミノリンカー、ＤＮＡイソ型、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類、α−デオキシリボヌクレオシド類、非天然ヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシド類、並びに修飾された複素環式塩基を有するヌクレオシド類からなる群から選択されている、請求項３に記載のイムノマー。
【請求項６】
免疫賦活性部分が、脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、変性ヌクレオシド間結合により、３’側上の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択されており、修飾されたヌクレオチド間結合が、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート類、ホスホトリエステル類、ホスホチオトリエステル類、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、トリエステルプロドラッグ、スルホン類、スルホンアミド類、スルファメート類、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カーボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホラミデート類、特に第一アミノ−ホスホラミデート類、Ｎ３ホスホラミデート類およびＮ５ホスホラミデート類、並びに立体特異性結合、糖変性を有するヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボースおよび２’−デオキシ−２’−フルオロリボースが含まれるがこれらには限定されない２’置換ペントース糖類；３’−Ｏ−メチルリボースが含まれるがこれには限定されない３’−置換ペントース糖類；１’，２’−ジデオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖類、ヘキソース糖類、並びにアルファ−アノマー類、ペプチド核酸類（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸類（ＰＨＯＮＡ）、ロックされた核酸類（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸類、並びに約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有する主鎖リンカー部分を有するオリゴヌクレオチド、アルキルリンカーまたはアミノリンカー、ＤＮＡイソ型、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類、α−デオキシリボヌクレオシド類、非天然ヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシド類、並びに修飾された複素環式塩基を有するヌクレオシド類からなる群から選択されている、請求項４に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
イムノマーが、遺伝子に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項８】
イムノマーが、少なくとも１つのリボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項９】
イムノマーが、Ｇ３〜Ｇ１０領域を含む少なくとも１つのＮｎ部分を含む、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項１０】
免疫賦活性ジヌクレオチド中の１つのプリンヌクレオシドが、構造（ＩＩ）：
【化１】
2011101647.tif 000048
式中：
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体および親水性基からなる群から選択されており；
Ａは、水素結合受容体または親水性基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各々のＬは、独立して、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択された原子であり；
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環または天然に存在しない糖である、
を有する、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項１１】
糖環が、ホスフェート部分、修飾されたホスフェート部分または、プリンヌクレオシドを他のヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体に結合させるのに適する他のリンカー部分で誘導体化されている、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１２】
水素結合供与体が、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨからなる群から選択されている、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１３】
水素結合受容体が、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝および芳香族複素環の環窒素原子からなる群から選択されている、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１４】
天然に存在しないプリンが、２−アミノ−６−チオプリン、６−オキソプリンまたは２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリンである、請求項１０に記載のイムノマー。
【請求項１５】
非ヌクレオチドリンカーが、長さが約２オングストローム〜約２００オングストロームのリンカー、金属、可溶性または不溶性生分解性ポリマービーズ、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドへの結合を可能にする官能基を有する有機部分、生体分子、環式または非環式小分子、いずれかが随意に、オリゴヌクレオチドに結合した直鎖状鎖において、またはこれに付着して、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオ尿素からなる群から選択された１種または２種以上の官能基を含むことができる、脂肪族または芳香族炭化水素；アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテン抗生物質、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨで表され、式中ｏおよびｐは、独立して１〜約６の整数である、グリセロールまたはグリセロール類似体、並びに１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体からなる群から選択されている、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項１６】
ヌクレオシド間結合が、本質的にホスホジエステル結合からなる、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項１７】
請求項１に記載のイムノマーおよび、アクセス可能な５’末端以外の位置においてイムノマーに接合した抗原を含む、イムノマー接合体。
【請求項１８】
Ｇが、アラビノグアノシンまたは２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンまたは２’−デオキシ−６−チオグアノシンまたは２’−デオキシイノシンである、請求項１に記載のイムノマー。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが、遺伝子に相補的である、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
Ｇ３〜Ｇ１０領域を含む少なくとも１つのＮｎ部分を含む、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
免疫賦活性ジヌクレオチド中の１つのプリンヌクレオシドが、構造（ＩＩ）：
【化２】
2011101647.tif 000049
式中：
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体および親水性基からなる群から選択されており；
Ａは、水素結合受容体または親水性基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各々のＬは、独立して、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択された原子であり；
Ｓは、ペントースもしくはヘキソース糖環または天然に存在しない糖である、
を有する、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
糖環が、ホスフェート部分、修飾されたホスフェート部分または、プリンヌクレオシドを他のヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体に結合させるのに適する他のリンカー部分で誘導体化されている、請求項２２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
水素結合供与体が、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨからなる群から選択されている、請求項２２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
水素結合受容体が、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−Ｎ＝および芳香族複素環の環窒素原子からなる群から選択されている、請求項２２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
天然に存在しないプリンが、２−アミノ−６−チオプリンまたは２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリンである、請求項２２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
非ヌクレオチドリンカーが、長さが約２オングストローム〜約２００オングストロームのリンカー、金属、可溶性または不溶性生分解性ポリマービーズ、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドへの結合を可能にする官能基を有する有機部分、生体分子、環式または非環式小分子、いずれかが随意に、オリゴヌクレオチドに結合した直鎖状鎖において、またはこれに付着して、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオ尿素からなる群から選択された１種または２種以上の官能基を含むことができる、脂肪族または芳香族炭化水素；アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテン抗生物質、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨで表され、式中ｏおよびｐは、独立して１〜約６の整数である、グリセロールまたはグリセロール類似体、並びに１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体からなる群から選択されている、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
ヌクレオシド間結合が、本質的にホスホジエステル結合からなる、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド、およびアクセス可能な５’末端以外の位置においてイムノマーに接合した抗原を含む、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体。
【請求項３０】
Ｇが、アラビノグアノシンまたは２’−デオキシ−２’置換アラビノグアノシン、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンまたは２’−デオキシ−６−チオグアノシンまたは２’−デオキシイノシンである、請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項１に記載のイムノマーおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤。
【請求項３２】
請求項１に記載のイムノマーの、脊椎動物における免疫応答を発生させるための医薬の製造のための使用。
【請求項３３】
請求項１７に記載のイムノマー接合体の、脊椎動物における免疫応答を発生させるための医薬の製造のための使用。
【請求項３４】
請求項１に記載のイムノマーの、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項３５】
処置されるべき疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
請求項１７に記載のイムノマー接合体の、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項３７】
請求項１０に記載のイムノマーの、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項３８】
処置されるべき疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３９】
処置されるべき疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患である、請求項３７に記載の使用。
【請求項４０】
ワクチンがさらに投与可能である、請求項３２に記載の使用。
【請求項４１】
イムノマーもしくはワクチンまたは両方が、免疫原性タンパク質に結合している、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
アジュバントがさらに投与可能である、請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】
請求項２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドの、脊椎動物における免疫応答を発生させるための医薬の製造のための使用。
【請求項４４】
請求項２９に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体の、脊椎動物における免疫応答を発生させるための医薬の製造のための使用。
【請求項４５】
請求項４に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドの、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項４６】
処置されるべき疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
請求項２９に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体の、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項４８】
請求項２２に記載の免疫調節性オリゴヌクレオチドの、疾患または障害を有する患者を治療的に処置するための医薬の製造のための使用。
【請求項４９】
処置されるべき疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患である、請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
処置されるべき疾患または障害が、癌、自己免疫障害、気道炎症、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
ワクチンがさらに投与可能である、請求項４４に記載の使用。
【請求項５２】
イムノマーもしくはワクチンまたは両方が、免疫原性タンパク質に結合している、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
アジュバントがさらに投与可能である、請求項４４に記載の使用。
【請求項５４】
他の治療剤がさらに投与可能である、請求項４８に記載の使用。
【請求項５５】
他の治療剤が、ワクチン、抗体、アレルゲン、抗生物質および化学療法剤からなる群から選択されている、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
非ヌクレオチドリンカーにより５’から３’に共有結合した２つまたは３つ以上のオリゴヌクレオチドセグメントを含む、免疫賦活性オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドを免疫賦活剤として用いる免疫および免疫療法用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の概要
オリゴヌクレオチドは、現代の分子生物学における必須の手段となっており、診断的探索方法から遺伝子発現のアンチセンス阻害および免疫療法用途へのＰＣＲに至るまでの、広範囲の手法において用いられている。オリゴヌクレオチドのこの広範囲の使用により、オリゴヌクレオチドを合成するための迅速、安価かつ効率的な方法に対する増大する要求がもたらされた。
【０００３】
アンチセンスおよび診断用途のためのオリゴヌクレオチドの合成は、現在では常習的に達成され得る。例えば、Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal編、Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein編、1991);およびUhlmann and Peyman, 同上；Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995);およびAntisense Research and Applications (Crooke and Lebleu編、CRC Press, Boca Raton, 1993)を参照。初期の合成方法は、ホスホジエステルおよびホスホトリエステル化学を含んでいた。例えば、Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209 (1972)には、オリゴヌクレオチド合成のためのホスホジエステル化学が開示されている。Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143-3179 (1978)には、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成のためのホスホトリエステル化学が開示されている。これらの初期の方法は、大いに、合成のための一層効率的なホスホラミダイトおよびＨ−ホスホネート方法に移行した。
【０００４】
例えば、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)には、ポリヌクレオチド合成におけるデオキシリボヌクレオシドホスホラミダイトの使用が開示されている。Agrawal and Zamecnik, 米国特許第5,149,798号(1992)には、Ｈ−ホスホネート方法によるオリゴヌクレオチドの最適化された合成が開示されている。これらの現代的な方法の両方を用いて、種々の修飾されたヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドが合成された。Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987)には、ホスホラミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドメチルホスホネートの合成が教示されている。Connolly et al., Biochem. 23:3443 (1984)には、ホスホラミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成が開示されている。Jager et al., Biochem. 27:7237 (1988)には、ホスホラミダイト化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホラミデートの合成が開示されている。Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7079-7083 (1988)には、Ｈ−ホスホネート化学を用いたオリゴヌクレオチドホスホラミデートおよびホスホロチオエートの合成が開示されている。
【０００５】
一層最近、数人の研究者により、免疫療法用途における免疫賦活剤としてのオリゴヌクレオチドの使用の有効性が例証された。ホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、免疫賦活を誘発することができるという観察により、この副作用を治療手段として開発することにおける興味が生じた。これらの努力は、ジヌクレオチド天然ＣｐＧを含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに集中された。Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)には、ＣｐＧジヌクレオチドを含むパリンドロームを含むホスホジエステルオリゴヌクレオチドが、インターフェロンアルファおよびガンマ合成を誘発し、ナチュラルキラー活性を増強し得ることが教示されている。Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)には、ホスホロチオエートＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが免疫賦活性であることが開示されている。Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)には、このようなオリゴヌクレオチドが、ヒトＢ細胞を活性化することが開示されている。Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)には、ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を増強することが教示されている。McCluskie and Davis, J. Immunol. 161:4463-4466 (1998)には、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、有効なアジュバントとして作用し、Ｂ型肝炎表面抗原に対する免疫応答を増大することが教示されている。Hartman et al., J. Immunol 164:1617-1624 (2000)には、免疫賦活性配列が種特異的であり、マウスと霊長類とで異なることが教示されている。
【０００６】
ＣｐＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの他の修正はまた、免疫応答のモジュレーターとして作用するこれらの能力に影響し得る。例えば、Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182;  Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544;  Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (1997) 7:495-502;  Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458;  Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054;  Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267;およびKandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813を参照。
【０００７】
これらの報告により、免疫賦活性オリゴヌクレオチドにより生じた免疫応答を調節し、免疫賦活性配列の種特異性に打ち勝つことができる必要性が残留することが明らかになる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、オリゴヌクレオチド化合物により生じた免疫応答を調節するための方法を提供する。本発明の方法により、免疫療法用途への免疫賦活性オリゴヌクレオチドにより生じたサイトカインプロフィールの修正が可能である。本発明者らは、驚異的なことに、免疫賦活性ジヌクレオチドの修飾により、生じた免疫応答の性質における柔軟性が可能になることおよび、ある修飾により、免疫賦活性配列の現在まで観察されている種特異性に打ち勝つことを見出した。いくつかの好ましい態様において、修飾されたジヌクレオチドは、以下にさらに記載するように、「イムノマー(immunomer)」の状況にある。
【０００９】
従って、第１の観点において、本発明は、少なくとも１種の修飾したプリンまたはピリミジンを含む少なくとも１種の免疫賦活性ジヌクレオチドを含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーを提供する。
【００１０】
１つの観点において、免疫調節性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、式５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’で表され、式中Ｐｙｒは、天然の、または非天然のピリミジンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは、天然の、または非天然のプリンヌクレオシドである、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。他の好ましい態様において、免疫調節性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、式５’−Ｐｕｒ＊−Ｐｕｒ−３’で表され、式中Ｐｕｒ＊は、非天然のプリンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは、天然の、または非天然のプリンヌクレオシドである、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。特に好ましい合成プリンは、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである。この合成プリンが、ジヌクレオチドのＰｕｒ＊位置にある際には、免疫賦活効果の種特異性（配列依存性）に打ち勝ち、サイトカインプロフィールは、改善される。
【００１１】
他の態様において、免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択された免疫賦活性ジヌクレオチドを含み、式中、Ｃの塩基は、シトシンであり、Ｃ＊の塩基は、チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、４−チオウラシルまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドまたは２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり、ここで、塩基が、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである際には、これは、好ましくは、ペントースの１’位置に、塩基の１位を介して共有結合しており；Ｇの塩基は、グアニンであり、Ｇ＊の塩基は、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−アミノ−６−チオプリン、６−オキソプリンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されたヌクレオシド間結合である。いくつかの好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【００１２】
尚他の態様において、免疫調節性オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中、
Ｙの塩基は、シトシン、チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、４−チオウラシルまたは２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり、ここで、塩基が、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである際には、これは、好ましくは、ペントースの１’位置に、塩基の１位を介して共有結合しており；
Ｚの塩基は、グアニン、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−アミノ−６−チオプリンまたは６−オキソプリンであり、
【００１３】
Ｎ１およびＮｎは、各々の存在において独立して、好ましくは天然に存在するか、もしくは合成のヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、ホスホジエステルもしくは修飾されたヌクレオシド間結合により、３’側上の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択された免疫賦活性部分であり、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されずに、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されており；
【００１４】
ただし、Ｎ１またはＮｎの少なくとも一方は、随意に、免疫賦活部分であり；
ここで、ｎは、０〜３０の数であり；
ここで、３’末端、ヌクレオチド間結合または官能化された核酸塩基もしくは糖は、直接、または非ヌクレオチドリンカーを介して、免疫賦活性であってもなくてもよい他のオリゴヌクレオチドに結合していてもしていなくてもよい、
で表される免疫賦活性領域を含む。免疫調節性オリゴヌクレオチドが、他のオリゴヌクレオチドに結合している際には、これを、「イムノマー」と呼ぶ。
【００１５】
第２の観点において、本発明は、上記したイムノマーおよび、アクセス可能な５’末端以外の位置においてイムノマーに接合した抗原を含む、イムノマー接合体を提供する。同様に、オリゴヌクレオチドが、他のオリゴヌクレオチドに結合しておらず、このアクセス可能な５’末端以外のすべての位置において抗原に結合している場合には、これを、「免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体」と呼ぶ。
【００１６】
第３の観点において、本発明は、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーもしくはイムノマー接合体またはこれらの２種もしくは３種以上の組み合わせおよび生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。
【００１７】
第４の観点において、本発明は、脊椎動物における免疫応答を発生させる方法を提供し、このような方法は、脊椎動物に、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーもしくはイムノマー接合体またはこれらの２種もしくは３種以上の組み合わせを投与することを含む。いくつかの態様において、脊椎動物は、哺乳類である。
【００１８】
第５の観点において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、このような方法は、患者に、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーもしくはイムノマー接合体またはこれらの２種もしくは３種以上の組み合わせを投与することを含む。種々の態様において、処置されるべき疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、喘息、アレルギーまたは病原体により生じた疾患である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の代表的なイムノマーを図式的に表す図である。
【図２】本発明のいくつかの代表的なイムノマーを示す図である。
【図３】本発明のイムノマーの直線的な合成に適する代表的な小分子リンカーの群を示す図である。
【００２０】
【図４】本発明のイムノマーの平行する合成に適する代表的な小分子リンカーの群を示す図である。
【図５】本発明のイムノマーの直線的な合成のための合成スキームである。
【図６】本発明のイムノマーの平行する合成のための合成スキームである。
【００２１】
【図７】図７Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１〜３によるＩＬ−１２の誘発をグラフ的に表す図である。図７Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１〜３によるＩＬ−６（それぞれ完全な）の誘発をグラフ的に表す図である。図７Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１〜３による（それぞれ完全な）ＩＬ−１０の誘発をグラフ的に表す図である。
【図８】図８Ａは、それぞれアクセス不能な、およびアクセス可能な５’末端を有する、種々の濃度のイムノマー５および６による、細胞培養物中でのＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞増殖の誘発をグラフ的に表す図である。図８Ｂは、ＣｐＧモチーフの５’隣接配列における免疫原性化学的修飾を有する、イムノマー４〜６によるＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓の拡大をグラフ的に表す図である。
【００２２】
【図９】図９Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１２の誘発を、グラフ的に表す図である。図９Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−６の誘発を、グラフ的に表す図である。図９Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１０の誘発を、グラフ的に表す図である。
【図１０】図１０Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１４、１５および１６による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。図１０Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のイムノマー１４および１６によるＩＬ−１２による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。図１０Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のイムノマー１４および１６によるＩＬ−６による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。
【００２３】
【図１１】図１１Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。図１１Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−１２産生の誘発を、グラフ的に表す図である。図１１Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−６産生の誘発を、グラフ的に表す図である。
【図１２】オリゴヌクレオチド４並びにイムノマー１４、２３および２４を用いたＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓拡大を、グラフ的に表す図である。
【００２４】
【図１３】オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドを図式的に表す図である。
【図１４】例１３において用いる化学的置換を示す図である。
【図１５】例１３の修飾したオリゴヌクレオチドを用いて得られたサイトカインプロフィールを示す図である。
【００２５】
【図１６】グリセロールリンカーについての、アミノリンカーと比較しての相対的サイトカイン誘発を示す図である。
【図１７】種々のリンカーおよびリンカーの組み合わせについての相対的サイトカイン誘発を示す図である。
【図１８】Ａ〜Ｅは、種々のＰＳおよびＰＯイムノマー並びにオリゴヌクレオチドについての相対的ヌクレアーゼ耐性を示す図である。
【００２６】
【図１９】ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較しての、ＰＯイムノマーについての相対的サイトカイン誘発を示す図である。
【図２０】Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較しての、ＰＯイムノマーについての相対的サイトカイン誘発を示す図である。
【図２１】高濃度のイムノマーにおける、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較しての、ＰＯイムノマーについての相対的サイトカイン誘発を示す図である。
【００２７】
【図２２】いくつかのピリミジンおよびプリン構造を示す図である。
【図２３】本研究において用いられる数種の免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーを示す図である。
【図２４】天然のＣｐＧモチーフと、合成プリン−ｐＧジヌクレオチドを有する免疫賦活性モチーフとの比較を示す図である。
【図２５】本研究において用いた種々の免疫賦活性オリゴヌクレオチドのＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを示す図である。
【００２８】
【図２６】本研究において用いた追加の免疫賦活性オリゴヌクレオチドのＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを示す図である。
【図２７】本研究において用いた免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーのＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを示す図である。
【００２９】
【図２８】免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーにおけるマウスおよびヒトモチーフにより提供されたＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを比較する図である。
【００３０】
【図２９】種々の免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーで処理したＪ７７４細胞におけるＮＦ−κＢの活性化およびＩκ−Ｂαの分解を示す図である。
【図３０】ヒトＰＢＭＣ培養物におけるイムノマーの免疫賦活活性を示す図である。
【００３１】
好ましい態様の詳細な記載
本発明は、オリゴヌクレオチドの、免疫療法用途のための免疫賦活性剤としての治療的使用に関する。本明細書中で引用した刊行された特許、特許出願および参考文献は、各々が、参照により導入されることを特別に、および個別に示すのと同様に、同一の程度で参照により本明細書中に導入される。本明細書中で引用したすべての参考文献のすべての教示と本明細書との間で矛盾がある場合には、後者が、本発明の目的のために優勢である。
【００３２】
本発明は、免疫療法用途のために用いられる免疫賦活性化合物により生じた免疫応答を増強する方法を提供し、これは、例えば、癌、自己免疫障害、喘息、呼吸器アレルギー、食物アレルギー、並びに成人および小児のヒトおよび獣医学的用途における細菌、寄生生物およびウイルス感染の処置であるが、これには限定されない。従って、本発明は、さらに、免疫療法のための免疫賦活効果の最適なレベルを有する化合物およびこのような化合物を製造し、用いる方法を提供する。さらに、本発明の化合物は、ＤＮＡワクチン、抗体およびアレルゲンと組み合わせた；並びに化学療法剤および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせたアジュバントとして、有用である。
【００３３】
本発明者らは、驚異的なことに、免疫調節性オリゴヌクレオチドを修飾して、この５’末端を最適に提示することにより、この免疫賦活能力が劇的に影響されることを見出した。さらに、本発明者らは、免疫応答のサイトカインプロフィールおよび種特異性を、新規なプリンまたはピリミジン構造を、免疫調節性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーの一部として用いることにより調節することができることを見出した。
【００３４】
第１の観点において、本発明は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたは「イムノマー」を提供し、後者は、これらの３’末端において結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、またはヌクレオシド間結合または非ヌクレオチドリンカーへの官能化された核酸塩基もしくは糖を含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、免疫調節性オリゴヌクレオチドであり、アクセス可能な５’末端を有する。本明細書中で用いる、用語「アクセス可能な５’末端」は、オリゴヌクレオチドの５’末端が、イムノマーを認識し、これに結合し、免疫系を刺激する因子が、これへのアクセスを有するように、十分有用であることを意味する。
【００３５】
アクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドにおいて、末端糖の５’ＯＨ位置は、２つよりも多いヌクレオシド残基または５’末端との相互作用に干渉するすべての他の部分に共有結合していない。随意に、５’ＯＨは、ホスフェート、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート部分、芳香族もしくは脂肪族リンカー、コレステロールまたはアクセス可能性に干渉しないすべての実体に結合していてもよい。本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、好ましくは、さらに新規なプリンまたはピリミジンを含む免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明の免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、リンカーにより５’から３’に結合したオリゴヌクレオチド配列、例えば図１４に示すものを有することができる。
いくつかの態様において、イムノマーは、（イムノマーの状況において）同一であるかまたは異なっていてもよい、２種または３種以上の免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、各々のこのような免疫調節性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのアクセス可能な５’末端を有する。
【００３７】
ある態様において、１種または２種以上の免疫賦活性オリゴヌクレオチドに加えて、イムノマーはまた、遺伝子またはこのＲＮＡ生成物に相補的な少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中で用いる用語「〜に相補的な」は、オリゴヌクレオチドが、生理学的条件の下で、遺伝子の領域にハイブリダイズすることを意味する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を下方調節する。このような下方調節オリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムオリゴヌクレオチド、小さい阻害ＲＮＡおよびデコイオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。本明細書中で用いる用語「遺伝子を下方調節する」は、遺伝子の転写または遺伝子生成物の翻訳を阻害することを意味する。従って、本発明のこれらの態様におけるイムノマーを用いて、１種または２種以上の特定の疾患標的を標的し、一方また免疫系を刺激することができる。
【００３８】
ある態様において、イムノマーは、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中で用いる用語「リボザイム」は、触媒活性を有するオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、リボザイムは、特定の核酸標的に結合し、標的を切断する。本明細書中で用いる用語「デコイオリゴヌクレオチド」は、転写因子に配列に特異的な方式で結合し、転写活性を停止するオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、リボザイムまたはデコイオリゴヌクレオチドは、ステムループまたはヘアピン構造を含むがこれらには限定されない二次構造を示す。ある態様において、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドは、ポリ（Ｉ）−ポリ（Ｃ）を含む。ある態様において、少なくとも１つの群のＮｎは、３〜１０ｄＧｓおよび／またはＧｓまたは２’置換リボもしくはアラビノＧｓの線を含む。
【００３９】
本発明の目的のために、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成したポリヌクレオシドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含む在来の核酸供給源から得られるが、好ましくは合成的方法により製造される。好ましい態様において、各々のヌクレオシド単位は、複素環式塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’置換アラビノース、２’−Ｏ置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、互いに、多くの既知のヌクレオシド間結合のすべてにより結合することができる。このようなヌクレオシド結合には、限定されずに、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合が含まれる。
【００４０】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、１つまたは２つ以上の立体特異的なヌクレオシド間結合（例えば、（Ｒｐ）−もしくは（Ｓｐ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書中で用いる用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、結合がホスフェート基を含むか否かとは無関係に、すべてのこのようなヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明確に意図する。ある好ましい態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート結合またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００４１】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、各々、約３〜約３５個のヌクレオシド残基、好ましくは約４〜約３０個のヌクレオシド残基、一層好ましくは約４〜約２０個のヌクレオシド残基を有する。いくつかの態様において、イムノマーは、約５〜約１８個、または約５〜約１４個のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中で用いる用語「約」は、正確な数が臨界的に重要ではないことを示す。従って、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド残基の数は、臨界的には重要でなく、１つもしくは２つの一層少数のヌクレオシド残基または１つないしいくつかの追加のヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記した態様の各々の等価なものとして意図される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの１つまたは２つ以上は、１１個のヌクレオチドを有する。免疫賦活性オリゴヌクレオチドの状況において、好ましい態様は、約１３〜約３５個のヌクレオチド、一層好ましくは約１３〜約２６個のヌクレオチドを有する。
【００４２】
用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定されずに、タンパク質基、親油性基、挿入剤、ジアミン、葉酸、コレステロールおよびアダマンタンを含む追加の置換基を有するポリヌクレオシドを包含する。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、限定されずに、ペプチド核酸類（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸類（ＰＨＯＮＡ）、ロックされた核酸類（ＬＮＡ）、モルホリノ主鎖オリゴヌクレオチド、およびアルキルリンカーまたはアミノリンカーを有する主鎖部分を有するオリゴヌクレオチドを含むポリマーを含む、すべての他の核酸塩基を包含する。
【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシド、修飾されたヌクレオシドまたはこれらの混合物を含むことができる。本明細書中で用いる用語「修飾されたヌクレオシド」は、修飾された複素環式塩基、修飾された糖部分またはこれらの組み合わせを含むヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾されたヌクレオシドは、本明細書中に記載したように、非天然ピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。いくつかの態様において、修飾されたヌクレオシドは、２’置換リボヌクレオシド、アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシ−２’置換−アラビノシドである。
【００４４】
本発明の目的のために、用語「２’置換リボヌクレオシド」または「２’置換アラビノシド」は、ペントース部分の２’位置における水酸基が置換されて、２’置換または２’−Ｏ置換リボヌクレオシドを生成するリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドを含む。好ましくは、このような置換は、１〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含む低級アルキル基での、または６〜１０個の炭素原子を有するアリール基での置換であり、ここで、このようなアルキルまたはアリール基は、非置換であるか、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシもしくはアミノ基で置換されていてもよい。２’−Ｏ置換リボヌクレオシドまたは２’−Ｏ置換アラビノシドの例には、限定されずに、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチルアラビノシドおよび２’−Ｏ−メトキシエチルリボヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メトキシエチルアラビノシドが含まれる。
【００４５】
用語「２’置換リボヌクレオシド」または「２’置換アラビノシド」はまた、２’−水酸基が、１〜６個の飽和または不飽和炭素原子を含む低級アルキル基で、またはアミノもしくはハロ基で置換されているリボヌクレオシド類またはアラビノヌクレオシド類を含む。このような２’置換リボヌクレオシド類または２’置換アラビノシド類の例には、限定されずに、２’−アミノ、２’−フルオロ、２’−アリルおよび２’−プロパルギルリボヌクレオシド類またはアラビノシド類が含まれる。
【００４６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ハイブリッドおよびキメラオリゴヌクレオチドを含む。「キメラオリゴヌクレオチド」は、１つより多いタイプのヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドである。このようなキメラオリゴヌクレオチドの１つの好ましい例は、ホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域および非イオン性結合、例えばアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えば、Pederson et al. 米国特許第5,635,377号および5,366,878号を参照）。
【００４７】
「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」は、１つより多いタイプのヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドである。このようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの１つの好ましい例は、リボヌクレオチドまたは２’置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む（例えば、Metelev and Agrawal, 米国特許第5,652,355号、6,346,614号および6,143,881号を参照）。
【００４８】
本発明の目的のために、用語「免疫賦活性オリゴヌクレオチド」は、脊椎動物、例えば魚類、鳥類または哺乳類に投与した際に免疫応答を誘発する、上記したオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書中で用いる用語「哺乳類」には、限定されずに、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、畜牛、ウシ、ブタ、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトが含まれる。有用な免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、Agrawal et al., WO 98/49288、１９９８年１１月５日刊行；WO 01/12804、２００１年２月２２日刊行；WO 01/55370、２００１年８月２日刊行；PCT/US01/13682、２００１年４月３０日出願；およびPCT/US01/30137、２００１年９月２６日出願に記載されていることを見出すことができる。好ましくは、免疫調節性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００４９】
いくつかの態様において、免疫調節性オリゴヌクレオチドは、式５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’で表され、式中Ｐｙｒは、天然の、または合成のピリミジンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは、天然の、または合成のプリンヌクレオシドである、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい態様において、免疫調節性オリゴヌクレオチドは、式５’−Ｐｕｒ＊−Ｐｕｒ−３’で表され、式中Ｐｕｒ＊は、合成のプリンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは、天然の、または合成のプリンヌクレオシドである、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。種々の箇所において、ジヌクレオチドは、ＲｐＧ、Ｃ＊ｐＧまたはＹＺとして表され、この場合において、それぞれ、Ｒ、Ｃ＊またはＹは、合成プリンを表す。特に好ましい合成プリンは、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである。
【００５０】
この合成プリンが、ジヌクレオチドのＰｕｒ＊位置にある際には、免疫賦活効果の種特異性（配列依存性）に打ち勝ち、サイトカインプロフィールは、改善される。本明細書中で用いる用語「ピリミジンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分が単環式核酸塩基であるヌクレオシドを意味する。同様に、用語「プリンヌクレオシド」は、ヌクレオシドの塩基成分が、二環式核酸塩基であるヌクレオシドを意味する。本発明の目的のために、「合成」ピリミジンまたはプリンヌクレオシドは、天然に存在しないピリミジンもしくはプリン塩基、天然に存在しない糖部分またはこれらの組み合わせを含む。
【００５１】
本発明の好ましいピリミジンヌクレオシドは、構造（Ｉ）：
【化１】
2011101647.tif 000002
式中：
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択されており；
Ａは、水素結合受容体または親水性基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択されており；
Ｘは、炭素または窒素であり；
Ｓは、ペントースもしくはヘキソース糖環または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００５２】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾されたホスフェート部分または、ピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体に結合させるのに適する他のリンカー部分で誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体には、限定されずに、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨが含まれる。好ましい水素結合受容体には、限定されずに、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓおよび芳香族複素環の環窒素原子、例えばシトシンのＮ３が含まれる。
【００５３】
いくつかの態様において、（Ｉ）中の塩基部分は、天然に存在しないピリミジン塩基である。好ましい天然に存在しないピリミジン塩基の例には、限定されずに、５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシンおよび４−チオウラシルが含まれる。しかし、いくつかの態様において、５−ブロモシトシンは、特定的に排除される。
【００５４】
いくつかの態様において、（Ｉ）における糖部分Ｓ’は、天然に存在しない糖部分である。本発明の目的のために、「天然に存在する糖部分」は、核酸の一部として天然に存在する糖部分、例えばリボースおよび２’−デオキシリボースであり、「天然に存在しない糖部分」は、核酸の一部として天然に存在しないが、オリゴヌクレオチドのための主鎖において用いることができるすべての糖、例えばヘキソースである。アラビノースおよびアラビノース誘導体は、好ましい糖部分の例である。
【００５５】
本発明の好ましいプリンヌクレオシド類似体は、構造（ＩＩ）：
【化２】
2011101647.tif 000003
式中：
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体および親水性基からなる群から選択されており；
Ａは、水素結合受容体または親水性基であり；
Ｘは、炭素または窒素であり；
各々のＬは、独立して、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択された原子であり；
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環または天然に存在しない糖である、
を有する。
【００５６】
好ましくは、糖環は、ホスフェート部分、修飾されたホスフェート部分、またはピリミジンヌクレオシドを他のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体に結合させるのに適する他のリンカー部分で誘導体化されている。
好ましい水素結合供与体には、限定されずに、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＳＨおよび−ＯＨが含まれる。好ましい水素結合受容体には、限定されずに、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、−ＮＯ２および芳香族複素環の環窒素原子、例えばグアニンのＮ１が含まれる。
【００５７】
いくつかの態様において、（ＩＩ）中の塩基部分は、天然に存在しないプリン塩基である。好ましい天然に存在しないプリン塩基の例には、限定されずに、２−アミノ−６−チオプリンおよび２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリンが含まれる。いくつかの態様において、（ＩＩ）中の糖部分Ｓ’は、構造（Ｉ）について上記したように、天然に存在する糖部分である。
【００５８】
好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、式中、Ｃの塩基は、シトシンであり、Ｃ＊の塩基は、２’−チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、４−チオウラシルまたは他の非天然ピリミジンまたは２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、ここで、塩基が、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである際には、これは、好ましくは、ペントースの１’位置に、塩基の１位を介して共有結合しており；Ｇの塩基は、グアノシンであり、Ｇ＊の塩基は、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン、６−チオグアニン、６−オキソプリンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり、ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されたヌクレオシド間結合である。いくつかの好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【００５９】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、免疫賦活性部分を、免疫賦活性ジヌクレオチドの一方または両方の側上に含むことができる。従って、いくつかの態様において、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、構造（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中：
Ｙの塩基は、シトシン、チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、４−チオウラシルまたは他の非天然ピリミジンヌクレオシドまたは２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、ここで、塩基が、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである際には、これは、好ましくは、ペントースの１’位置に、塩基の１位を介して共有結合しており；
Ｚの塩基は、グアニン、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７デアザ−８−メチルプリン、２−アミノ−６−チオ−プリン、６−オキソプリンまたは他の非天然プリンヌクレオシドであり；
【００６０】
Ｎ１およびＮｎは、各々の存在において独立して、好ましくは天然に存在するか、もしくは合成のヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、ホスホジエステルもしくは修飾されたヌクレオシド間結合により、３’側上の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択された免疫賦活性部分であり、修飾されたヌクレオシド間結合は、限定されずに、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されており；
【００６１】
ただし、Ｎ１またはＮｎの少なくとも一方は、随意に、免疫賦活部分であり；
ここで、ｎは、０〜３０の数であり；
ここで、３’末端、ヌクレオチド間結合または誘導体化された核酸塩基もしくは糖は、直接、または非ヌクレオチドリンカーを介して、免疫賦活性であってもなくてもよい他のオリゴヌクレオチドに結合している、
で表される免疫賦活性領域を含む。
【００６２】
いくつかの好ましい態様において、ＹＺは、アラビノシチジンまたは２’−デオキシ−２’置換アラビノシチジンおよびアラビノグアノシンまたは２’デオキシ−２’置換アラビノグアノシンである。好ましい免疫賦活性部分には、天然のホスホジエステル主鎖および、限定されずにメチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシアミン、カーボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホラミデート、特に第一アミノ−ホスホラミデート、Ｎ３ホスホラミデートおよびＮ５ホスホラミデート、並びに立体特異性結合（例えば（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネートまたはホスホトリエステル結合）を含むホスフェート主鎖における修飾が含まれる。
【００６３】
本発明の好ましい免疫賦活性部分には、さらに、限定されずに、限定されずに２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース、２’−Ｏ−プロパルギルリボースおよび２’−デオキシ−２’−フルオロリボースが含まれる２’置換ペントース糖類；限定されずに３’−Ｏ−メチルリボースが含まれる３’−置換ペントース糖類；１’−２’−ジデオキシリボース；アラビノース；限定されずに１’−メチルアラビノース、３’−ヒドロキシメチルアラビノース、４’−ヒドロキシメチルアラビノース、３’−ヒドロキシアラビノースおよび２’置換アラビノース糖が含まれる置換アラビノース糖類；限定されずに１，５−アンヒドロヘキシトールが含まれるヘキソース糖類；並びにアルファ−アノマーが含まれる糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。修飾された糖が３’−デオキシリボヌクレオシドまたは３’−Ｏ置換リボヌクレオシドである態様において、免疫賦活性部分は、隣接するヌクレオシドに、２’−５’ヌクレオシド間結合により結合している。
【００６４】
本発明の好ましい免疫賦活性部分は、さらに、ペプチド核酸類（ＰＮＡ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸類（ＰＨＯＮＡ）、ロックされた核酸類（ＬＮＡ）、モルホリノ主鎖オリゴヌクレオチド、並びに限定されずにアルキルリンカーまたはアミノリンカーを含む、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有する主鎖リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを含む、他の炭水化物主鎖修飾および置換を有するオリゴヌクレオチドを含む。アルキルリンカーは、分枝状または非分枝状、置換または非置換、およびキラル的に純粋であるかまたはラセミ体混合物であってもよい。最も好ましくは、このようなアルキルリンカーは、約２〜約１８個の炭素原子を有する。いくつかの好ましい態様において、このようなアルキルリンカーは、約３〜約９個の炭素原子を有する。いくつかのアルキルリンカーは、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオエーテルからなる群から選択された１種または２種以上の官能基を含む。いくつかのこのような官能化されたアルキルリンカーは、式−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ（ｎ＝１〜９）で表されるポリ（エチレングリコール）リンカーである。いくつかの他の官能化されたアルキルリンカーは、ペプチドまたはアミノ酸である。
【００６５】
本発明の好ましい免疫賦活性部分は、さらに、限定されずにβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドおよびα−デオキシリボヌクレオシドを含む、ＤＮＡイソ型を含む。本発明の好ましい免疫賦活性部分は、３’修飾を包含し、さらに、限定されずに２’−５’、２’−２’、３’−３’および５’−５’結合を含む、天然ではないヌクレオシド間結合位置を有するヌクレオシドを含む。
【００６６】
本発明の好ましい免疫賦活性部分は、さらに、限定されずに５−ヒドロキシシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、好ましくはＮ４−エチルシトシン、４−チオウラシル、６−チオグアニン、７−デアザグアニン、イノシン、ニトロピロール、Ｃ５−プロピニルピリミジンおよび限定されずに２，６−ジアミノプリンを含むジアミノプリン類を含む、修飾された複素環式塩基を有するヌクレオシドを含む。
【００６７】
特定の例示により、および限定せずに、例えば構造（ＩＩＩ）で表される免疫賦活性領域において、位置Ｎ１またはＮｎにおけるメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、免疫賦活性部分であり、位置Ｘ１における約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカーは、免疫賦活性部分であり、位置Ｘ１におけるβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドは、免疫賦活性部分である。免疫賦活性部分の代表的な位置および構造について、以下の表１を参照。特定の位置における免疫賦活性部分としてのリンカーへの言及は、当該位置におけるヌクレオシド残基が、この３’−ヒドロキシルにおいて、示したリンカーで置換されており、これにより当該ヌクレオシド残基と３’側上の隣接するヌクレオシドとの間の修飾されたヌクレオシド間結合が作成されることを意味することが、理解されるべきである。同様に、特定の位置における免疫賦活性部分としての修飾されたヌクレオシド間結合への言及は、当該位置におけるヌクレオシド残基が、３’側上の隣接するヌクレオシドに、引用した結合により結合していることを意味する。
【００６８】
【表１】
2011101647.tif 000004
【００６９】
表２は、上流相乗作用領域を有する免疫調節性オリゴヌクレオチド内の免疫賦活性部分の代表的な位置および構造を示す。本明細書中で用いる用語「スペーサー９」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−で表され、式中ｎが３であるポリ（エチレングリコール）リンカーを意味する。用語「スペーサー１８」は、式−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−で表され、式中ｎが６であるポリ（エチレングリコール）リンカーを意味する。本明細書中で用いる用語「Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−Ｏ−で表され、式中ｑが、２〜１８の整数であるリンカーを意味する。従って、用語「Ｃ３リンカー」および「Ｃ３アルキルリンカー」は、式−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｏ−で表されるリンカーを意味する。スペーサー９、スペーサー１８およびＣ２〜Ｃ１８アルキルリンカーの各々について、リンカーは、隣接するヌクレオシドに、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合により結合している。
【００７０】
【表２】
2011101647.tif 000005
【００７１】
表３は、下流相乗作用領域を有する免疫調節性オリゴヌクレオチド内の免疫賦活性部分の代表的な位置および構造を示す。
【００７２】
【表３】
2011101647.tif 000006
【００７３】
本発明のイムノマーは、これらの３’末端もしくはヌクレオシド間結合において結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーによる官能化された核酸塩基もしくは糖を含む。本発明の目的のために、「非ヌクレオチドリンカー」は、オリゴヌクレオチドに、共有結合または非共有結合により結合することができるすべての部分である。好ましくは、このようなリンカーは、長さが約２オングストローム〜約２００オングストロームである。好ましいリンカーのいくつかの例を、以下に述べる。非共有結合には、静電相互作用、疎水性相互作用、π積み重ね相互作用および水素結合が含まれるが、これらには限定されない。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上記したように、ヌクレオシド間結合、例えば２つのヌクレオシドの３’−水酸基に直接結合するホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート官能基を表すことを意味しない。本発明の目的のために、このような直接的な３’−３’結合（リンカーを伴わない）は、「ヌクレオチド結合」であると考慮される。
【００７４】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されずに、金粒子を含む金属である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、可溶性または不溶性の生分解性ポリマービーズである。
【００７５】
尚他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、オリゴヌクレオチドへの結合を可能にする官能基を有する有機部分である。このような結合は、好ましくは、すべての好適な共有結合によるものである。非限定的な例として、リンカーは、図１３に示すように、ヌクレオシド上のすべての好適な位置に結合することができる。いくつかの好ましい態様において、リンカーは、３’−ヒドロキシルに結合する。このような態様において、リンカーは、好ましくは、好ましくは３’−ヒドロキシルにホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスフェートに基づかない結合により結合している、ヒドロキシル官能基を含む。
【００７６】
いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、限定されずにポリペプチド、抗体、脂質、抗原、アレルゲンおよびオリゴ糖類を含む生体分子である。いくつかの他の態様において、非ヌクレオチドリンカーは、小分子である。本発明の目的のために、小分子は、１，０００Ｄａよりも小さい分子量を有する有機部分である。いくつかの態様において、小分子は、７５０Ｄａよりも小さい分子量を有する。
【００７７】
いくつかの態様において、小分子は、いずれかが随意に、オリゴヌクレオチドに結合しているか、またはこれに付着している直鎖状鎖において、ヒドロキシ、アミノ、チオール、チオエーテル、エーテル、アミド、チオアミド、エステル、尿素およびチオ尿素からなる群から選択された１種または２種以上の官能基を含むことができる、脂肪族または芳香族炭化水素である。小分子は、環式であっても非環式であってもよい。小分子リンカーの例には、アミノ酸、炭水化物、シクロデキストリン、アダマンタン、コレステロール、ハプテンおよび抗生物質が含まれるが、これらには限定されない。しかし、非ヌクレオチドリンカーを記載する目的のために、用語「小分子」は、ヌクレオシドを含むことを意図しない。
【００７８】
いくつかの態様において、小分子リンカーは、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ２）ｐ−ＯＨで表され、式中ｏおよびｐは、独立して１〜約６、１〜約４または１〜約３の整数であるグリセロールまたはグリセロール相同体である。いくつかの他の態様において、小分子リンカーは、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンの誘導体である。いくつかのこのような誘導体は、式ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＯＨを有し、式中ｍは、０〜約１０、０〜約６、２〜約６または２〜約４の整数である。
【００７９】
本発明の数種の非ヌクレオチドリンカーにより、図１に図式的に示すように、２つよりも多いオリゴヌクレオチドの結合が可能である。例えば、小分子リンカーグリセロールは、オリゴヌクレオチドが共有結合することができる３つの水酸基を有する。従って、本発明の数種のイムノマーは、これらの３’末端において非ヌクレオチドリンカーに結合した、２つよりも多いオリゴヌクレオチドを含む。いくつかのこのようなイムノマーは、各々アクセス可能な５’末端を有する少なくとも２つの免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む。
【００８０】
本発明のイムノマーは、図５および６に図式的に示すように、並びにさらに例中に記載するように、自動合成装置およびホスホラミダイト方法を用いて、好都合に合成することができる。いくつかの態様において、イムノマーを、直線的な合成方法（図５を参照）により合成する。本明細書中で用いる用語「直線的な合成」は、イムノマーの一方の末端において開始し、他方の末端に直線的に進行する合成を意味する。直線的な合成により、同一の、または同一ではない（長さ、塩基組成および／または導入される化学的修飾の点で）モノマー単位をイムノマー中に導入することが可能である。
【００８１】
合成の代替のモードは、合成が中心的なリンカー部分から外方向に進行する「平行する合成」である（図６を参照）。リンカーが結合した固体の支持体を、米国特許第5,912,332号に記載されているように、平行する合成のために用いることができる。あるいはまた、一般的な固体支持体（例えば制御された孔のガラス支持体に結合したホスフェート）を、用いることができる。
【００８２】
イムノマーの平行する合成は、直線的な合成にまさるいくつかの利点を有する：（１）平行する合成により、同一のモノマー単位の導入が可能である；（２）直線的な合成とは異なり、両方（またはすべて）のモノマー単位を、同時に合成し、これにより、合成段階の数および合成に必要な時間は、モノマー単位のものと同一である；および（３）合成段階の減少により、最終的なイムノマー生成物の純度および収率が改善される。
【００８３】
直線的な合成または平行する合成プロトコルのいずれかによる合成の終了時に、修飾したヌクレオシドが導入されている場合には、イムノマーを、好都合に、濃アンモニア溶液で、または、ホスホラミダイト供給者により推薦されているように脱保護する(deprotected)ことができる。生成物イムノマーを、好ましくは、逆相ＨＰＬＣにより精製し、脱トリチル化し(detritylated)、脱塩し、透析する。
【００８４】
表４Ａおよび表４Ｂは、本発明の代表的なイムノマーを示す。追加のイムノマーは、例中に記載されていると見出される。
【００８５】
【表４】
2011101647.tif 000007
【００８６】
【表５】
2011101647.tif 000008
【００８７】
【表６】
2011101647.tif 000009
【００８８】
【表７】
2011101647.tif 000010
【００８９】
【表８】
2011101647.tif 000011
＊  Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシン；Ｇ２＝アラビノグアノシン。
Ｃ１＝２’−デオキシシチジン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン；
Ｃ２＝アラビノシチジン；Ｃ３＝２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジン。
Ｘ＝グリセロールリンカー。また、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、エチレングリコールリンカー、ポリエチレングリコールリンカー、分枝状アルキルリンカーであってもよい。
【００９０】
【表９】
2011101647.tif 000012
【００９１】
第２の観点において、本発明は、上記した免疫調節性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーおよび、アクセス可能な５’末端以外の位置においてイムノマーに接合した抗原を含む、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体およびイムノマー接合体を提供する。いくつかの態様において、非ヌクレオチドリンカーは、抗原を含み、これは、オリゴヌクレオチドに接合している。いくつかの他の態様において、抗原を、オリゴヌクレオチドに、この３’末端以外の位置において接合する。いくつかの態様において、抗原は、ワクチン効果を生じる。
【００９２】
抗原は、好ましくは、病原体と関連した抗原、癌と関連した抗原、自己免疫障害と関連した抗原および他の疾患、例えば獣医学的または小児科の疾患であるが、これらには限定されない疾患と関連した抗原からなる群から選択される。本発明の目的のために、用語「〜と関連する」は、抗原が、病原体、癌、自己免疫障害、食物アレルギー、呼吸器アレルギー、喘息または他の疾患が存在する際に存在するが、病原体、癌、自己免疫障害、食物アレルギー、呼吸器アレルギーまたは疾患が存在しない際には、存在しないかまたは減少した量で存在することを意味する。
【００９３】
免疫調節性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、抗原に共有結合するか、またはこれは、他の方法では、抗原に操作的に(operatively)関連する。本明細書中で用いる用語「〜と操作的に関連する」は、イムノマーと抗原との両方の活性を維持するすべての関連を意味する。このような操作的な関連の非限定的な例には、同一のリポソームまたは他のこのような送達ビヒクルもしくは試薬の一部であることが含まれる。イムノマーが、抗原に共有結合する態様において、このような共有結合は、好ましくは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドのアクセス可能な５’末端以外のイムノマー上のすべての位置においてである。例えば、抗原を、ヌクレオシド間結合において結合させるか、または非ヌクレオチドリンカーに結合させることができる。あるいはまた、抗原は、これ自体、非ヌクレオチドリンカーであってもよい。
【００９４】
第３の観点において、本発明は、本発明の免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーもしくはイムノマー接合体および生理学的に許容し得る担体を含む、医薬製剤を提供する。本明細書中で用いる用語「生理学的に許容し得る」は、イムノマーの有効性に干渉せず、生物学的系、例えば細胞、細胞培養物、組織または生物体と適合性である物質を意味する。好ましくは、生物学的系は、生きている生物体、例えば脊椎動物である。
【００９５】
本明細書中で用いる用語「担体」は、すべての補形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、脂質または医薬製剤において用いるために業界において十分知られている他の材料を包含する。担体、補形剤または希釈剤の特性は、特定の用途のための投与の経路に依存することが、理解される。これらの材料を含む薬学的に許容し得る製剤の調製は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１８版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００９６】
第４の観点において、本発明は、脊椎動物における免疫応答を発生させる方法を提供し、このような方法は、脊椎動物に、本発明の免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーまたはイムノマー接合体を投与することを含む。いくつかの態様において、脊椎動物は、哺乳類である。本発明の目的のために、用語「哺乳類」は、ヒトを含むことを明確に意図する。好ましい態様において、イムノマーまたはイムノマー接合体を、免疫賦活を必要としている脊椎動物に投与する。
【００９７】
本発明のこの観点による方法において、免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーまたはイムノマー接合体の投与を、限定されずに非経口、経口、舌下、経皮、局所的、鼻腔内、エーロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内が含まれるすべての好適な経路により、遺伝子銃、経皮パッチにより、または点眼剤もしくは洗口形態においてとすることができる。イムノマーの治療的組成物の投与を、既知の手順を用いて、疾患の徴候または代理のマーカーを減少させるのに有効な投与量において、および期間にわたり、行うことができる。全身的に投与する際には、治療組成物を、好ましくは、約０．０００１マイクロモル〜約１０マイクロモルのイムノマーの血中レベルを維持するのに十分な投与量で投与する。局所的な投与について、これよりはるかに低い濃度が、有効であり得、はるかに高い濃度が、許容され得る。好ましくは、イムノマーの合計の投与量は、患者あたり１日あたり約０．００１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり１日あたり約２００ｍｇの範囲内である。本発明の治療組成物の１種または２種以上の治療的に有効な量を、個体に、単一の処置エピソードとして、同時に、または連続して投与するのが望ましい場合がある。
【００９８】
ある好ましい態様において、本発明の免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーまたはイムノマー接合体を、ワクチン、抗体、細胞毒性剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、遺伝子療法ベクター、ＤＮＡワクチンおよび／またはアジュバントと組み合わせて投与して、免疫応答の特異性または規模を増強する。これらの態様において、本発明のイムノマーは、アジュバントとして種々に作用し、および／または直接的な免疫賦活効果を生じることができる。
【００９９】
免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマー、イムノマー接合体もしくはワクチンまたは両方を、随意に、免疫原性タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニットまたはすべての他の免疫原性担体タンパク質に結合することができる。過剰のアジュバントのすべてを用いることができ、これには、限定されずに、完全フロイントアジュバント、ＫＬＨ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ミョウバンおよびＱＳ−２１、イミキモド(imiquimod)、Ｒ８４８を含むサポニンまたはこれらの組み合わせが含まれる。
【０１００】
本発明のこの観点の目的のために、用語「〜と組み合わせて」は、同一の患者において同一の疾患を処置する経過におけることを意味し、イムノマーおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントを、同時の投与および数日間隔までの時間的に間隔をおいた順序を含むすべての順序で投与することを含む。このような組み合わせ処置はまた、イムノマー、および／または独立してワクチン、および／または独立してアジュバントの単一よりも多い投与を含むことができる。イムノマーおよび／またはワクチンおよび／またはアジュバントの投与は、同一の、または異なる経路によることができる。
【０１０１】
本発明のこの観点による方法は、免疫系のモデル研究に有用である。この方法はまた、ヒトまたは動物疾患の予防的または治療的処置に有用である。例えば、この方法は、小児科的および獣医学的ワクチン用途に有用である。
【０１０２】
第５の観点において、本発明は、疾患または障害を有する患者を治療的に処置する方法を提供し、このような方法は、患者に、本発明の免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーまたはイムノマー接合体を投与することを含む。種々の態様において、処置されるべき疾患または障害は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症障害、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患である。病原体には、細菌、寄生生物、真菌類、ウイルス、ウイロイドおよびプリオンが含まれる。投与を、本発明の第４の観点について記載したように行う。
【０１０３】
本発明の目的のために、用語「アレルギー」には、限定されずに、食物アレルギーおよび呼吸器アレルギーが含まれる。用語「気道炎症」には、限定されずに、喘息が含まれる。本明細書中で用いる用語「自己免疫障害」は、「自己の」タンパク質が、免疫系による攻撃を受ける障害を意味する。このような用語には、自己免疫喘息が含まれる。
【０１０４】
本発明のこの観点による方法のすべてにおいて、免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーまたはイムノマー接合体を、イムノマーの免疫賦活効果を消失させない疾患または症状を処置するのに有用であるすべての他の剤と組み合わせて投与することができる。例えば、癌の処置において、免疫調節性オリゴヌクレオチド、免疫調節性オリゴヌクレオチド接合体、イムノマーまたはイムノマー接合体を、化学療法化合物と組み合わせて投与することができることを意図する。
【０１０５】
以下の例は、本発明のある好ましい態様をさらに例示することを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０６】
例
例１：免疫調節性部分を含むオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、１μｍｏｌ規模で、自動ＤＮＡ合成装置(Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)を用いて、図５および６において概説した直線的な合成または平行する合成手順に従って合成した。
【０１０７】
デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイトを、Applied Biosystems (Foster City, CA)から得た。１’，２’−ジデオキシリボースホスホラミダイト、プロピル−１−ホスホラミダイト、２−デオキシウリジンホスホラミダイト、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）ペンチルアミジル］−２−プロパノールホスホラミダイトおよびメチルホスホラミダイトを、Glen Research (Sterling, VA)から得た。β−Ｌ−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイト、α−２’−デオキシリボヌクレオシドホスホラミダイト、モノ−ＤＭＴ−グリセロールホスホラミダイトおよびジ−ＤＭＴ−グリセロールホスホラミダイトを、ChemGenes (Ashland, MA)から得た。（４−アミノブチル）−１，３−プロパンジオールホスホラミダイトを、Clontech (Palo Alto, CA)から得た。アラビノシチジンホスホラミダイト、アラビノグアノシン、アラビノチミジンおよびアラビノウリジンを、Reliable Pharmaceutical (St. Louis, MO)から得た。アラビノグアノシンホスホラミダイト、アラビノチミジンホスホラミダイトおよびアラビノウリジンホスホラミダイトを、Hybridon, Inc. (Cambridge, MA)において合成した(Noronha et al. (2000) Biochem., 39:7050-7062)。
【０１０８】
すべてのヌクレオシドホスホラミダイトを、３１Ｐおよび１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより特徴づけした。修飾したヌクレオシドを、通常のカップリングサイクルを用いて、特定の部位において導入した。合成の後に、オリゴヌクレオチドを、濃水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、続いて透析した。ナトリウム塩としての精製したオリゴヌクレオチドを、使用前に、凍結乾燥した。純度を、ＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより試験した。
【０１０９】
例２：脾臓細胞増殖の分析
脾細胞増殖のインビトロでの分析を、以前に記載されている標準的な手順を用いて、行った（例えば、Zhao et al., Biochem Pharma 51:173-182 (1996)を参照）。結果を、図８Ａに示す。これらの結果は、一層高い濃度において、２つのアクセス可能な５’末端を有するイムノマー６により、アクセス可能な５’末端を有しないイムノマー５または、１つのアクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチド４によりもたらされるよりも大きい脾細胞増殖がもたらされることを例証する。イムノマー６はまた、ＬＰＳ陽性対照よりも大きい脾細胞増殖をもたらす。
【０１１０】
例３：インビボでの脾腫大アッセイ
インビトロでの結果のインビボでのモデルへの適用性を試験するために、選択されたオリゴヌクレオチドを、マウスに投与し、脾腫大の程度を、免疫賦活活性のレベルの指標として測定した。５ｍｇ／ｋｇの単一の用量を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４〜６週齢、Harlan Sprague Dawley Inc, Baltic, CT）に腹腔内に投与した。マウスを、オリゴヌクレオチド投与の７２時間後に絶命させ、脾臓を収穫し、秤量した。結果を、図８Ｂに示す。これらの結果は、２つのアクセス可能な５’末端を有するイムノマー６が、オリゴヌクレオチド４またはイムノマー５よりもはるかに大きい免疫賦活効果を有することを例証する。
【０１１１】
例４：サイトカイン分析
脊椎動物細胞、好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞またはヒトＰＢＭＣ中のＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体およびサイトカイン標準物質を含む所要の試薬を、PharMingen, San Diego, CAから購入した。ＥＬＩＳＡプレート(Costar)を、適切な抗体と共に、ＰＢＳＮ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中で、一晩４℃でインキュベートし、次に３７℃で３０分間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで遮断した。細胞培養上清液およびサイトカイン標準物質を、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳで適切に希釈し、プレートに３つ１組で加え、２５℃で２時間インキュベートした。
【０１１２】
プレートを、１μｇ／ｍＬの適切なビオチニル化抗体で被覆し、２５℃で１．５時間インキュベートした。次に、プレートを、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％トウィーン(Tween)２０）で頻繁に洗浄し、さらにストレプトアビジン接合ペルオキシダーゼ(Sigma, St. Louis, MO)を加えた後、２５℃で１．５時間インキュベートした。プレートを、シュアブルー(Sure Blue)（登録商標）(Kirkegaard and Perry)色素生産性試薬で現像し、反応を、停止溶液(Kirkegaard and Perry)を加えることにより終了した。色変化を、セレス(Ceres)９００ＨＤＩ分光光度計(Bio-Tek Instruments)上で測定した。結果を、以下の表５Ａに示す。
【０１１３】
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康な志願者の末梢血液から、フィコールパック(Ficoll-Paque)密度勾配遠心分離(Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)により単離した。要するに、ヘパリン処置した血液を、円錐遠心分離において、ヒストパック(Histopaque)−１０７７（等しい容積）上に層状に配置し、４００ｘｇで３０分間室温で遠心分離した。単核細胞を含むバフィーコートを、注意深く除去し、等張リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、２５０ｘｇで１０分間遠心分離することにより２回洗浄した。次に、得られた細胞ペレットを、Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地(MediaTech, Inc., Herndon, VA)中に再懸濁させ、１０％熱不活性化ＦＣＳおよびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を加えた。
【０１１４】
細胞を、２４ウェルプレート中で、種々の時間にわたり、１×１０６細胞／ｍｌ／ウェルにおいて、オリゴヌクレオチドの存在または不存在下で培養した。インキュベーション期間の終了時に、上清液を収穫し、ＩＬ−６(BD Pharmingen, San Diego, CA)、ＩＬ−１０(BD Pharmingen)、ＩＬ−１２(BioSource International, Camarillo, CA)、ＩＦＮ−α(BioSource International)およびγ(BD Pharmingen)並びにＴＮＦ−α(BD Pharmingen)を含む種々のサイトカインについて、サンドイッチＥＬＩＳＡによりアッセイするまで、−７０℃で凍結させて貯蔵した。結果を、以下の表５に示す。
【０１１５】
すべての例において、細胞培養上清液中のＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを、それぞれＩＬ−１２およびＩＬ−６についての同一の実験条件の下で構成された標準曲線から、計算した。細胞培養上清液中のＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−αのレベルを、それぞれＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−αについての同一の実験条件の下で構成された標準曲線から、計算した。
【０１１６】
【表１０】
2011101647.tif 000013
Ｄ１およびＤ２は、ドナー１および２である。
【０１１７】
【表１１】
2011101647.tif 000014
【０１１８】
正常相は、ホスホロチオエート結合を表し；イタリック相は、ホスホジエステル結合を表す。
【表１２】
2011101647.tif 000015
【０１１９】
さらに、図７Ａ〜Ｃに示す結果は、２個のアクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチド２が、それぞれ１個または０個のアクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチド１または３よりも低い濃度において、ＩＬ−１２およびＩＬ−６を上昇させるが、ＩＬ−１０を上昇させないことを例証する。
【０１２０】
例５：イムノマーの免疫賦活活性に対する鎖の長さの効果
オリゴヌクレオチド鎖の長さの効果を研究するために、各々の鎖中に１８個、１４個、１１個および８個のヌクレオチドを含むイムノマーを合成し、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を誘発するこれらの能力により測定して、免疫賦活活性について試験した（表６〜８）。本例において、およびすべてのその後の例において、サイトカインアッセイを、例４に記載したように、ＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞培養物中で行った。
【０１２１】
【表１３】
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【０１２２】
【表１４】
2011101647.tif 000017
【０１２３】
【表１５】
2011101647.tif 000018
【０１２４】
結果は、オリゴヌクレオチド鎖の長さに伴って増大するイムノマーの免疫賦活活性が、１８量体から７量体まで減少することを示唆する。６量体または５量体程度に短いオリゴヌクレオチド鎖の長さを有するイムノマーは、１個の５’末端を有する１８量体オリゴヌクレオチドの免疫賦活活性に匹敵する免疫賦活活性を示した。しかし、６量体または５量体程度に短いオリゴヌクレオチド鎖の長さを有するイムノマーは、リンカーが約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さである際に、増大した免疫賦活活性を有する。
【０１２５】
例６：非天然ピリミジンまたは非天然プリンヌクレオシドを含むイムノマーの免疫賦活活性
表９〜１１に示すように、免疫賦活活性は、非天然ピリミジンヌクレオシドまたは非天然プリンヌクレオシドを免疫賦活性ジヌクレオチドモチーフ中に有する種々の長さのイムノマーについて、維持された。
【０１２６】
【表１６】
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【０１２７】
【表１７】
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【０１２８】
【表１８】
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【０１２９】
例７：免疫賦活活性に対するリンカーの効果
２つのオリゴヌクレオチドを結合するリンカーの長さの効果を試験するために、同一のオリゴヌクレオチドを含むが、異なるリンカーを含むイムノマーを合成し、免疫賦活活性について試験した。表１２に示す結果は、リンカーの長さが、イムノマーの免疫賦活活性において作用を奏することを示唆する。最良の免疫賦活効果は、Ｃ３〜Ｃ６アルキルリンカーまたは分散したホスフェート電荷を有する脱塩基リンカーを用いて達成された。
【０１３０】
【表１９】
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【０１３１】
【表２０】
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【０１３２】
例８：免疫賦活活性に対するオリゴヌクレオチド主鎖の効果
一般的に、天然のホスホジエステル主鎖を含む免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖を有する同一の長さのオリゴヌクレオチドよりも免疫賦活性が低い。この比較的低い程度の免疫賦活活性は、部分的に、実験的条件下でのホスホジエステルオリゴヌクレオチドの迅速な分解のためであり得る。オリゴヌクレオチドの分解は、主に、３’末端からのオリゴヌクレオチドを消化する３’−エクソヌクレアーゼの結果である。本例のイムノマーは、遊離の３’末端を含まない。従って、ホスホジエステル主鎖を有するイムノマーは、実験的条件下で、対応するモノマーオリゴヌクレオチドよりも長い半減期を有しなければならず、従って改善された免疫賦活活性を示さなければならない。表１３に示す結果は、この効果を例証し、イムノマー８４および８５は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でのサイトカイン誘発により決定されたように、免疫賦活活性を示す。
【０１３３】
【表２１】
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【０１３４】
例９：イムノマー７３〜９２の合成
オリゴヌクレオチドを、１μｍｏｌ規模で、自動ＤＮＡ合成装置(Expedite 8909 PerSeptive Biosystems)を用いて合成した。デオキシヌクレオシドホスホラミダイトを、Applied Biosystems (Foster City, CA)から得た。７−デアザ−２’−デオキシグアノシンホスホラミダイトを、Glen Research (Sterling Virginia)から得た。１，３−ビス−ＤＭＴ−グリセロール−ＣＰＧを、ChemGenes (Ashland, MA)から得た。修飾したヌクレオシドを、通常のカップリングサイクルを用いて、特定の部位においてオリゴヌクレオチド中に導入した。合成の後に、オリゴヌクレオチドを、濃水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより精製し、続いて透析した。ナトリウム塩としての精製したオリゴヌクレオチドを、使用前に、凍結乾燥した。オリゴヌクレオチドの純度を、ＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Bruker Proflex III MALDI-TOF質量分析計）によりチェックした。
【０１３５】
例１０：イムノマー安定性
オリゴヌクレオチドを、１０％ウシ血清を含むＰＢＳ中で、３７℃で４、２４または４８時間インキュベートした。無処置のオリゴヌクレオチドを、毛細管ゲル電気泳動により決定した。結果を、表１４に示す。
【０１３６】
【表２２】
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【０１３７】
例１１：免疫賦活活性に対するアクセス可能な５’末端の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜８週齢）脾臓細胞を、ＲＰＭＩ完全培地中で培養した。マウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４(American Type Culture Collection, Rockville, MD)を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび抗生物質（１００ＩＵ／ｍLのペニシリンＧ／ストレプトマイシン）を加えたダルベッコ変法イーグル培地中で培養した。すべての他の培養試薬を、Mediatech (Gaithersburg, MD)から購入した。
【０１３８】
ＩＬ−１２およびＩＬ−６についてのＥＬＩＳＡ。ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞またはＪ７７４細胞を、２４ウェルの皿中に、それぞれ５×１０６または１×１０６細胞／ｍＬの密度で蒔いた。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解したＣｐＧ  ＤＮＡを、マウス脾臓細胞培養物に、０．０３、０．１、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬの最終濃度で、およびＪ７７４細胞培養物中に、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。次に、細胞を、３７℃で２４時間インキュベートし、上清液を、ＥＬＩＳＡアッセイのために採集した。実験を、各々のＣｐＧ  ＤＮＡについて２回または３回、各々の濃度について３つ１組で行った。
【０１３９】
ＩＬ−１２およびＩＬ−６の分泌を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。サイトカイン抗体および標準物質を含む所要の試薬を、PharMingenから購入した。ＥＬＩＳＡプレート(Costar)を、適切な抗体と共に、ＰＢＳＮ緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中で、一晩４℃でインキュベートし、次に３７℃で３０分間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで遮断した。細胞培養上清液およびサイトカイン標準物質を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで適切に希釈し、プレートに３つ１組で加え、２５℃で２時間インキュベートした。
【０１４０】
プレートを、１μｇ／ｍＬの適切なビオチニル化抗体で洗浄およびインキュベートし、２５℃で１．５時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０で頻繁に洗浄し、次にさらにストレプトアビジン接合ペルオキシダーゼ(Sigma)を加えた後、２５℃で１．５時間インキュベートした。プレートを、シュアブルー（登録商標）(Kirkegaard and Perry)色素生産性試薬で現像し、反応を、停止溶液(Kirkegaard and Perry)を加えることにより終了した。色変化を、セレス(Ceres)９００ＨＤＩ分光光度計(Bio-Tek Instruments)上で、４５０ｎｍにおいて測定した。細胞培養上清液中のＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを、それぞれＩＬ−１２およびＩＬ−６についての同一の実験的条件の下で構成した標準曲線から計算した。
【０１４１】
結果を、表１５に示す。
【表２３】
2011101647.tif 000026
ａ：化学構造ｂ〜ｌについてチャート１を参照；５’−ＣＧ−３’ジヌクレオチドを、下線を付して示す。
【０１４２】
チャート１
【表２４】
2011101647.tif 000027
【０１４３】
【表２５】
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【０１４４】
総合して、ここでの結果は、ＣｐＧ  ＤＮＡのアクセス可能な５’末端が、この最適な免疫賦活活性に必要であり、比較的小さい基、例えばホスホロチオエート、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチドが、ＣｐＧ  ＤＮＡの５’末端の、免疫賦活性経路に伴うレセプターまたは因子へのアクセス可能性を有効に遮断しないことを示唆する。しかし、ＣｐＧ  ＤＮＡの５’末端におけるフルオレセインと同等に大きいかまたは一層大きい分子の接合により、免疫賦活活性が抑止され得る。これらの結果は、ＣｐＧ  ＤＮＡ−抗原／ワクチン／モノクローナル抗体（ｍＡｂ）接合体の免疫賦活活性の研究に対して、直接的な影響を有する。大分子、例えばワクチンまたはｍＡｂのＣｐＧ  ＤＮＡの５’末端における接合により、ＣｐＧ  ＤＮＡの次善の免疫賦活活性がもたらされ得る。ＣｐＧ  ＤＮＡの３’末端における機能的なリガンドの接合は、増大したヌクレアーゼ安定性のみならず、インビボでのＣｐＧ  ＤＮＡの増大した免疫賦活効能にも寄与する。
【０１４５】
例１２：サイトカイン分泌に対するリンカーの効果
以下のオリゴヌクレオチドを、本研究のために合成した。これらの修飾したオリゴヌクレオチドの各々を、イムノマー中に導入することができる。
【表２６】
2011101647.tif 000029
【０１４６】
【表２７】
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ａ：置換１〜９の化学構造については図１４を参照。すべてのＣｐＧ  ＤＮＡは、修飾したホスホロチオエート主鎖である。
【０１４７】
免疫賦活活性の有効化のための最適なリンカーの大きさを評価するために、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における修飾されたＣｐＧ  ＤＮＡにより誘発されたＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を測定した。すべてのＣｐＧ  ＤＮＡは、濃度に依存するＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を誘発した。図１５は、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡと比較してのＣｐＧジヌクレオチドへの５’隣接配列における第５のヌクレオチド位置においてリンカーを有する、選択されたＣｐＧ  ＤＮＡ、１１６、１１９、１２６、１３０および１３４の１μｇ／ｍＬ濃度において得られたデータを示す。Ｃ２−（１）、Ｃ３−（２）およびＣ４−リンカー（３）を含むＣｐＧ  ＤＮＡは、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４のＩＬ−１２産生に類似するＩＬ−１２産生の分泌を誘発した。
【０１４８】
５’隣接配列におけるＣｐＧジヌクレオチドからの第５のヌクレオチド位置におけるＣ６およびＣ９リンカー（４および５）を含むＣｐＧ  ＤＮＡは、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡよりも低いレベルのＩＬ−１２分泌を誘発し（図１５）、このことは、Ｃ４リンカーよりも長いリンカーの置換により、ＩＬ−１２の一層低いレベルの誘発がもたらされることを示唆する。リンカーを有するすべての５つのＣｐＧ  ＤＮＡは、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡよりも２〜３倍高いＩＬ−６分泌を誘発した。これらのＣｐＧ  ＤＮＡ中のリンカーの存在により、リンカーを有しないＣｐＧ  ＤＮＡと比較しての、ＩＬ−６の誘発に対する顕著な効果が示された。しかし、本発明者らは、ＩＬ−６分泌に対する長さに依存するリンカー効果を観察しなかった。
【０１４９】
エチレングリコールリンカーを含むＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活活性に対する効果を試験するために、本発明者らは、ＣｐＧ  ＤＮＡ１３７および１３８を合成し、ここで、トリエチレングリコールリンカー（６）を、それぞれ、ＣｐＧジヌクレオチドの５’隣接配列中の第５のヌクレオチド位置において、および３’隣接配列中の第４のヌクレオチド位置において導入する。同様に、ＣｐＧ  ＤＮＡ１３９および１４０は、それぞれＣｐＧジヌクレオチドの５’または３’隣接配列中にヘキサエチレングリコールリンカー（７）を含んでいた。４種の修飾したＣｐＧ  ＤＮＡ（１３７〜１４０）のすべてを、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物において、サイトカイン誘発（ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）について、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４との比較において試験した。すべてのＣｐＧ  ＤＮＡは、試験した濃度範囲（０．０３〜１０．０μｇ／ｍＬ）にわたり、濃度依存性サイトカイン産生を誘発した（データは示していない）。０．３μｇ／ｍＬの濃度のＣｐＧ  ＤＮＡ１３７〜１４０において誘発されたサイトカインのレベルを、表１８に示す。
【０１５０】
５’隣接配列においてエチレングリコールリンカーを有するＣｐＧ  ＤＮＡ１３７および１３９は、基本ＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも高いレベルのＩＬ−１２（２１０６±１４３および２０６６±１５３ｐｇ／ｍＬ）およびＩＬ−６（２３６２±１６６および２５０７±６６ｐｇ／ｍＬ）分泌を誘発した（表１８）。同一の濃度において、１３７および１３９は、基本ＣｐＧ  ＤＮＡよりもわずかに低いレベルのＩＬ−１０分泌を誘発した（表１８）。３’隣接配列において比較的短いエチレングリコールリンカー（６）を有するＣｐＧ  ＤＮＡ１３８は、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡのＩＬ−１２分泌と同様のＩＬ−１２分泌を誘発したが、顕著に低いレベルのＩＬ−６およびＩＬ−１０を誘発した（表１８）。比較的長いエチレングリコールリンカー（７）を有するＣｐＧ  ＤＮＡ１４０は、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡと比較して、顕著に低いレベルの試験したすべての３種のサイトカインを誘発した（表１８）。
【０１５１】
トリエチレングリコールリンカー（６）は、Ｃ９リンカー（５）と同様の鎖の長さを有していたが、トリエチレングリコールリンカーを含むＣｐＧ  ＤＮＡは、脾臓細胞培養物中でのサイトカイン分泌の誘発により決定されたように、Ｃ９リンカーを含むＣｐＧ  ＤＮＡよりも良好な免疫賦活活性を有していた。これらの結果は、比較的長いアルキルリンカー（４および５）を含むＣｐＧ  ＤＮＡで観察された比較的低い免疫賦活活性が、これらの増大した長さに関連せず、これらの疎水性特性に関連し得ることを示唆する。この観察により、本発明者らは、免疫賦活活性に対する親水性官能基を含む分枝状アルキルリンカーの置換を試験することを鼓舞された。
【０１５２】
【表２８】
2011101647.tif 000031
【０１５３】
分枝状アルキルリンカーを含むＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活活性に対する効果を試験するために、ヒドロキシル（８）またはアミン（９）官能基を含む２種の分枝状アルキルリンカーを、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４中に導入し、得られた修飾したＣｐＧ  ＤＮＡ（１５０〜１５４、表１９）の免疫賦活活性に対する効果を、試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中（増殖）およびインビボでの（脾腫大）種々のヌクレオチド位置においてアミノリンカー９を含む、ＣｐＧ  ＤＮＡ１５０〜１５４について得られたデータを、表１９に示す。
【０１５４】
【表２９】
2011101647.tif 000032
【０１５５】
基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４は、０．１μｇ／ｍＬの濃度において３．７±０．８の増殖指数を示した。同一の濃度において、種々の位置においてアミノリンカー９を含む、修飾したＣｐＧ  ＤＮＡ１５１〜１５４により、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡよりも高い脾臓細胞増殖が生じた（表１９）。他のリンカーで観察されたように、置換を、ＣｐＧジヌクレオチド（１５０）に隣接させて配置した際には、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡと比較して低い増殖指数が記録され（表１９）、さらにＣｐＧジヌクレオチドに隣接するリンカー置換の配置が、免疫賦活活性に対して有害な効果を有することが確認された。一般的に、５’隣接配列における、アミノリンカーの２’−デオキシリボヌクレオシドでの置換（１５１および１５２）の結果、３’隣接配列における置換（１５３および１５４）で見出されたよりも高い脾臓細胞増殖がもたらされた。同様の結果が、脾腫大アッセイにおいて観察され（表１９）、脾臓細胞培養物中で観察された結果が確認された。グリセロールリンカー（８）を含む修飾したＣｐＧ  ＤＮＡにより、アミノリンカー（９）を含む修飾したＣｐＧ  ＤＮＡで観察された免疫賦活活性と同様であるかまたはこれよりわずかに高い免疫賦活活性が示された（データは示していない）。
【０１５６】
リンカー８および９を含むＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活効果を比較するために、本発明者らは、５’隣接配列における置換を有するＣｐＧ  ＤＮＡ１４５および１５２を選択し、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でのサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を誘発するこれらの能力をアッセイした。ＣｐＧ  ＤＮＡ１４５および１５２の両方は、濃度依存性サイトカイン分泌を誘発した。図４は、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４と比較しての、０．３μｇ／ｍＬの濃度における、マウス脾臓細胞培養物中で１４５および１５２により誘発されたＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを示す。両方のＣｐＧ  ＤＮＡは、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも高いレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘発した。グリセロールリンカー（８）を含むＣｐＧ  ＤＮＡは、アミノリンカー（９）を含むＣｐＧ  ＤＮＡよりもわずかに高いレベルのサイトカイン（特にＩＬ−１２）を誘発した（図１６）。これらの結果は、さらに、親水性基を含むリンカーが、ＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活活性のために一層好ましいことを確認する。
【０１５７】
本発明者らは、ＣｐＧ  ＤＮＡにおける多数のリンカー置換の２つの異なる観点を試験した。１つの群の実験において、本発明者らは、ヌクレオチド配列の長さを１３量体に維持し、５’末端における１〜５個のＣ３リンカー（２）置換を導入した（１２０〜１２４）。これらの修飾されたＣｐＧ  ＤＮＡにより、本発明者らは、リンカーの長さの増大の効果を、溶解性の問題を生じずに研究することが可能になった。第２の群の実験において、本発明者らは、同一のリンカー置換（３、４または５）の２つを、ＣｐＧジヌクレオチドへの５’隣接配列における隣接する位置において導入して、免疫賦活活性に対する付加的な効果があるか否かを研究した。
【０１５８】
修飾したＣｐＧ  ＤＮＡを、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４との比較においてＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でのサイトカイン産生を誘発するこれらの能力について研究した。すべてのＣｐＧ  ＤＮＡは、濃度依存性サイトカイン産生を誘発した。ＣｐＧ  ＤＮＡの１．０μｇ／ｍＬの濃度において得られたデータを、表２０に示す。このアッセイにおいて、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４は、１μｇ／ｍＬの濃度において、９６７±２８ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２、１５９３±９４ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６および１４±６ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１０分泌を誘発した。表２０に示すデータは、リンカー置換の数が減少するに従って、ＩＬ−１２誘発が減少することを示唆する。しかし、ＣｐＧ  ＤＮＡ１２３および１２４による一層低いレベルのＩＬ−１２分泌の誘発は、一層短い長さのＣｐＧ  ＤＮＡの結果であり得る。１５ヌクレオチドよりも短い修飾していないＣｐＧ  ＤＮＡを用いた本発明者らの研究により、顕著でない免疫賦活活性が示された（データは示していない）。リンカー置換の長さおよび数のいずれも、ＩＬ−６分泌に対する比較的低い効果を有しない。ＩＬ−１０分泌がリンカー置換に伴って増大したが、これらのＣｐＧ  ＤＮＡによる全体のＩＬ−１０分泌は、最小であった。
【０１５９】
５’隣接配列における第４の、および第５の位置における、ＣｐＧジヌクレオチドに対する２つのリンカー置換（リンカー３−１２７；リンカー４−１３１；リンカー５−１３５）を含むＣｐＧ  ＤＮＡ並びにそれぞれ対応する５’短縮形態１２８、１３２および１３６を、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でのサイトカイン分泌を誘発するこれらの能力について試験した。１．０μｇ／ｍＬ濃度において分泌されたＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを、図１７に示す。図１７に示す結果は、免疫賦活活性が、導入されたリンカーの性質に依存することを示唆する。第４および第５のヌクレオシドのＣ４リンカー３（ＣｐＧ  ＤＮＡ１２７）での置換は、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４と比較して、サイトカイン分泌に対する顕著でない効果を有しており、これは、これらの位置における核酸塩基および糖環が、レセプター認識および／または結合に必要ではないことを示唆する。
【０１６０】
リンカー置換を超えてのヌクレオチドの欠失（ＣｐＧ  ＤＮＡ１２８）により、ＣｐＧ  ＤＮＡ４および１２７で見出されたものよりも高いＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌が生じた。予測されるように、２つのＣ６リンカー（４）の置換により、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４により誘発されるものよりも低いＩＬ−１２分泌およびこれと同様のＩＬ−６分泌がもたらされた。５’短縮ＣｐＧ  ＤＮＡ１３２は、ＣｐＧ  ＤＮＡ１３１よりも高いサイトカイン分泌を誘発した。２つのＣ９リンカー（５）を有するＣｐＧ  ＤＮＡ１３５および１３６は、顕著でないサイトカイン分泌を誘発し、上記したものと同一のリンカーを含む単置換ＣｐＧ  ＤＮＡを用いて得られた結果を確認する。
【０１６１】
例１３：サイトカイン誘発に対するホスホジエステル結合の効果
イムノマーにより誘発されたサイトカイン誘発に対するホスホジエステル結合の効果を試験するために、以下の分子を合成した。
【表３０】
2011101647.tif 000033
ａ矢印は、各々のＤＮＡ分子におけるＣｐＧジヌクレオチドの５’−３’−方向性を示し、ＸおよびＹの構造を、ボックス中に示す。
ｂＰＳおよびＰＯは、それぞれホスホロチオエートおよびホスホジエステル主鎖を意味する。
ｃＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により決定された通り。
【０１６２】
ＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４（表２１）は、対照として作用するＰＯ−ＣｐＧ  ＤＮＡ１５５を有するマウス（データは示していない）における免疫応答を誘発することが見出された。ＰＯ−イムノマー１５６および１５７は、各々グリセリルリンカーＸ（表２１）を介してこれらの３’末端により接合された基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ１５５の２つの同一の、短縮されたコピーを含む。１５６および１５７は、各々１４個の塩基の同一のオリゴヌクレオチドセグメントを含む一方、１５７の５’末端は、２つのＣ３リンカーＹ（表２１）を加えることにより修飾された。すべてのオリゴヌクレオチド４、１５５〜１５７は、マウス免疫系を活性化することが知られている「ＧＡＣＧＴＴ」６量体モチーフを含む。
【０１６３】
ヌクレアーゼに対するＰＯ−イムノマーの安定性を、ＣｐＧ  ＤＮＡ４、１５５〜１５７を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（熱不活性化していない）を含む細胞培養培地中で、３７℃で４、２４および４８時間インキュベートすることにより評価した。次に、反応混合物中に残留する無処置のＣｐＧ  ＤＮＡを、ＣＧＥにより決定した。図１８Ａ〜Ｄは、１０％ＦＢＳ中で２４時間インキュベートした、ＣｐＧ  ＤＮＡ４、１５５〜１５７のヌクレアーゼ消化プロフィールを示す。各々の時点において残留する全長ＣｐＧ  ＤＮＡの量を、図１８Ｅに示す。予測されたように、基本的なＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４は、血清ヌクレアーゼに対して最も耐性である。約５５％の１８量体４は、４８時間のインキュベーションの後に未分解のままであった。対照的に、約５％のみの全長ＰＯ−イムノマー１５５が、同一の実験的条件の下で、４時間後に残留し、ホスホジエステル結合を含むＤＮＡが、迅速な分解を受けることが確認される。予測されたように、両方のＰＯ−イムノマー１５６および１５７は、血清ヌクレアーゼに対して、１５５よりも耐性であった。４時間後、それぞれ約６２％および７３％の１５６および１５７が、無処置であり、これと比較して、約５％の１５５が無処置であった（図１８Ｅ）。４８時間後でさえも、それぞれ約２３％および３７％の１５６および１５７が、未分解のままであった。３’−３’−結合ＰＯ−イムノマーが、血清ヌクレアーゼに対して一層安定であることを示すことに加えて、これらの研究は、５’末端における化学的修飾により、ヌクレアーゼ安定性がさらに増大し得ることを示す。
【０１６４】
ＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活活性を、ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス脾臓細胞培養物において、分泌されたサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを測定することにより、研究した。すべてのＣｐＧ  ＤＮＡは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物において、濃度依存性サイトカイン分泌を誘発した（図１９）。３μｇ／ｍＬにおいて、ＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４は、それぞれ２６５６±２５６および１２２３４±１１８０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘発した。基本的なＰＯ−ＣｐＧ  ＤＮＡ１５５は、１０μｇ／ｍＬの濃度における以外は、サイトカインレベルを背景よりも高く上昇させなかった。この観察は、ヌクレアーゼ安定性アッセイ結果と整合する。対照的に、ＰＯ−イムノマー１５６および１５７は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中で、ＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌の両方を誘発した。
【０１６５】
図１９に示す結果は、ＰＳ−およびＰＯ−ＣｐＧ  ＤＮＡのサイトカイン誘発プロフィールにおける明白な区別を示す。ＰＯ−イムノマー１５６および１５７は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも高いレベルのＩＬ−１２を誘発した（図１９Ａ）。対照的に、３μｇ／ｍＬまでの濃度において、これらは、無視できる量のＩＬ−６を産生した（図１９Ｂ）。最高の濃度（１０μｇ／ｍＬ）においてさえも、ＰＯ−イムノマー１５６は、ＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも顕著に少ないＩＬ−６を誘発した。Ｃ３リンカーが、ＰＯ−イムノマー１５７の５’末端に存在する結果、１５６と比較して、わずかに高いレベルのＩＬ−６分泌がもたらされた。しかし、重要なことに、ＰＯ−イムノマー１５７により産生されるＩＬ−６のレベルは、ＰＳ  ＣｐＧ  ＤＮＡ４により誘発されたものよりも、はるかに低い。図１９Ａの差込図は、３μｇ／ｍＬの濃度において分泌されたＩＬ−１２対ＩＬ−６の比率を示す。増大するＩＬ−１２分泌に加えて、ＰＯ−イムノマー１５６および１５７は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物においてＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも高いレベルのＩＦＮ−γを誘発した（データは示していない）。
【０１６６】
ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物においてＰＯ−およびＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡにより誘発された異なるサイトカインプロフィールにより、本発明者らは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス脾臓細胞培養物（ＬＰＳ低応答性株）中のＣｐＧ  ＤＮＡのサイトカイン誘発のパターンを研究することを鼓舞された。このアッセイにおいて試験した３種のＣｐＧ  ＤＮＡのすべては、濃度依存性サイトカイン分泌を誘発した（図２０ＡおよびＢ）。ＰＯ−ＣｐＧ  ＤＮＡ１５５は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でサイトカイン分泌を誘発しなかったため、これを、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ脾臓細胞培養物中でさらに試験しなかった。ＰＯ−イムノマー１５６および１５７の両方は、ＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも高いＩＬ−１２産生を誘発した（図２１Ａ）。しかし、３μｇ／ｍＬまでの濃度において、いずれもＩＬ−６産生を誘発しなかった。試験した最高の濃度（１０μｇ／ｍＬ）において、両方は、ＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも顕著に少ないＩＬ−６を誘発した（図２１Ｂ）。分泌されたＩＬ−１２対ＩＬ−６の比率を計算して、ＰＳおよびＰＯ  ＣｐＧ  ＤＮＡのサイトカイン分泌プロフィールを区別する（図２１Ａ差込図）。さらに、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ脾臓細胞培養物の結果は、ＣｐＧ  ＤＮＡで観察された応答が、ＬＰＳ汚染のためではないことを示唆する。
【０１６７】
ＰＳ−ＣｐＧ  ＤＮＡは、インビボで有効な抗腫瘍活性を誘発することが示された。ＰＯ−ＣｐＧ  ＤＮＡは、比較的高いヌクレアーゼ安定性を示し、インビトロアッセイで比較的高いレベルのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発したため、本発明者らは、ＰＯ−イムノマーのこれらの所望の特性が、インビボで抗腫瘍活性を改善するか否かを確認することに興味があった。本発明者らは、ＰＯ−イムノマー１５７を、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、１日おきに、野生型のｐ５３を発現するＭＣＦ−７乳癌細胞または突然変異したｐ５３を発現するＤＵ−１４５前立腺癌細胞の腫瘍異種移植を有するヌードマウスに皮下的に投与した。ＰＯ−イムノマー１５７は、生理食塩水対照と比較して、１５日においてＭＣＦ−７腫瘍の５７％成長阻害を生じた（図２２Ａ）。これはまた、３４日において、ＤＵ−１４５腫瘍の５２％成長阻害を生じた（図２２Ｂ）。これらの抗腫瘍研究は、提案された設計のＰＯ−イムノマーが、インビボで有効な抗腫瘍活性を示すことを示唆する。
【０１６８】
例１４：短いイムノマー
サイトカイン誘発に対する短いイムノマーの効果を試験するために、以下のイムノマーを用いた。これらの結果は、セグメントあたり５個のヌクレオチド程度に短いイムノマーが、サイトカイン産生を誘発するのに有効であることを示す。
【０１６９】
【表３１】
2011101647.tif 000034
【０１７０】
正常相は、ホスホロチオエート結合を表す。
【表３２】
2011101647.tif 000035
【０１７１】
例１５：２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンのマウス特異性およびヒト特異性免疫賦活性モチーフ中への導入の効果
マウス脾細胞を、例４に記載したようにして調製し、処理した。培養物を、培地またはオリゴヌクレオチド１７０、１７１もしくは１７２で処理した（図１５を参照）。すべてのオリゴヌクレオチドは、マウス特異性免疫賦活性モチーフ（ＧＡＣＧＴＴ）を含んでいたが、オリゴヌクレオチド１７１は、ＲｐＧ置換を含んでおり、オリゴヌクレオチド１７２は、ＣｐＲ置換を含んでおり、ここで、Ｒは、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである。結果を、図１７に示す。ＲｐＧ置換は、サイトカイン産生をもたらすマウス脾臓培養物により認識され、一方、ＣｐＲ置換は、認識されなかった。それぞれヒト特異性免疫賦活性モチーフＧＴＣＧＴＴを含むオリゴヌクレオチド１７３もしくは１７４での、またはＲｐＧ置換での培養物の処理は、ＲｐＧ置換を有するマウス脾細胞により、自然のヒト配列を有する脾細胞よりも良好な認識を示した（図１８）。
【０１７２】
それぞれのイムノマー１７５または１７６（各々ＲｐＧ置換を含む）と比較しての、基本的なオリゴヌクレオチド１７０（マウス特異性）または１７３（ヒト特異性）での処理により、イムノマーについての一層良好な結果が示され、ＲｐＧ置換のイムノマー中への導入が、種に依存する選択性に打ち勝ち得ることが示唆される（図１９）。ヒトマクロファージ様細胞培養物の、オリゴヌクレオチド１７０または１７３での、イムノマー１７５または１７６と比較しての処理により、さらに、ＲｐＧ置換のイムノマー中への導入が、種に選択的な活性に打ち勝つことが示唆される（図２０）。同様の結果が、Ｊ７７４細胞中でのＮＦ−κＢの活性化およびＩκ−Ｂαの分解について示される（図２１）。イムノマー１７６はまた、ヒト末梢血液単核細胞の培養物中での免疫賦活活性を示した（図２２）。
【０１７３】
例１６
ヒトＢ細胞および血漿細胞様(plasmacytoid)樹状細胞（ｐＤＣ）の単離
新たに取り出した健康な志願者の血液からのＰＢＭＣ(CBR Laboratories, Boston, MA)を、フィコール密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)により単離し、Ｂ細胞を、ＰＢＭＣから、陽性の選択により、ＣＤ１９細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、製造者の指示に従って単離した。
【０１７４】
例１７
Ｂ細胞アッセイ
Ｂ細胞を、９６ウェルプレート中に、１×１０６細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルを用いて蒔いた。イムノマーを、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬの最終濃度で、細胞培養物に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。次に、上清液を収穫し、ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬにより供給される）を用いてＩＬ−６およびＩＬ−１０についてアッセイした。表２３Ａ〜２３Ｄは、イムノマーを１０．０μｇ／ｍＬの最終濃度で有するドナー１〜４についての平均±ＳＤを示す。
【０１７５】
【表３３】
2011101647.tif 000036
【０１７６】
【表３４】
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【０１７７】
【表３５】
2011101647.tif 000038
【０１７８】
【表３６】
2011101647.tif 000039
【０１７９】
例１８
ヒトｐＤＣ培養
ｐＤＣを、ヒトＰＢＭＣから、ＢＤＣＡ−４細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、製造者の指示に従って単離した。ｐＤＣを、９６ウェルプレート中に、１×１０６細胞／ｍＬ、２００μＬ／ウェルを用いて蒔いた。イムノマーを、０．３、１．０、３．０または１０．０μｇ／ｍＬの最終濃度で、細胞培養物に加え、３７℃で２４時間インキュベートした。次に、上清液を収穫し、ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬにより供給される）を用いてＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αについてアッセイした。表２４Ａ〜２４Ｄは、イムノマーを１０．０μｇ／ｍＬの濃度で有するドナー１〜４についての、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの平均±ＳＤを示す。
【０１８０】
【表３７】
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【０１８１】
【表３８】
2011101647.tif 000041
【０１８２】
【表３９】
2011101647.tif 000042
【０１８３】
【表４０】
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【０１８４】
例１９
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康な志願者の末梢血液から単離し、例４に上記で記載したように調製した。表２５Ａ〜２５Ｄは、イムノマーを１０．０μｇ／ｍＬの濃度で有するドナー１〜４についてのＩＬ−６およびＩＬ−１０の平均±ＳＤを示す。
【０１８５】
【表４１】
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【０１８６】
【表４２】
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【０１８７】
【表４３】
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【０１８８】
【表４４】
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単に表２３Ａ〜２３Ｄ、２４Ａ〜２４Ｄおよび２５Ａ〜２５Ｄの目的のために：正常相は、ホスホロチオエート結合を表し；Ｇ１＝２’−デオキシ−７−デアザグアノシンであり、Ｇ２＝アラビノグアノシンであり、Ｃ１＝１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、Ｃ２＝アラビノシチジンであり、Ｃ３＝２’−デオキシ−５−ヒドロキシシチジンであり、Ｘ＝グリコールリンカーである。
【０１８９】
等価なもの
前述の発明を、明瞭および理解の目的のためにある詳細で記載した一方、当業者により、この開示を読むことから、形態および詳細における種々の変更を、本発明の真実の範囲および添付した特許請求の範囲から逸脱せずに行うことができることが、理解される。
【０１９０】
図面の簡単な説明
図１は、本発明の代表的なイムノマーを図式的に表す図である。
図２は、本発明のいくつかの代表的なイムノマーを示す。
図３は、本発明のイムノマーの直線的な合成に適する代表的な小分子リンカーの群を示す。
図４は、本発明のイムノマーの平行する合成に適する代表的な小分子リンカーの群を示す。
図５は、本発明のイムノマーの直線的な合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
図６は、本発明のイムノマーの平行する合成のための合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【０１９１】
図７Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１〜３によるＩＬ−１２の誘発をグラフ的に表す図である。これらのデータは、アクセス可能な５’末端を有するイムノマー２が、モノマーオリゴ１よりも強力なＩＬ−１２の誘導原であることおよび、アクセス可能な５’末端を有しないイムノマー３が、オリゴ１と比較して、免疫賦活を生じる等しいかまたは弱い能力を有することを示唆する。
図７Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１〜３によるＩＬ−６（それぞれ完全な）の誘発をグラフ的に表す図である。これらのデータは、アクセス可能な５’末端を有するイムノマー２が、モノマーオリゴ１よりも強力なＩＬ−６の誘導原であることおよび、アクセス可能な５’末端を有しないイムノマー３が、オリゴ１と比較して、免疫賦活を生じる等しいかまたは弱い能力を有することを示唆する。
図７Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１〜３による（それぞれ完全な）ＩＬ−１０の誘発をグラフ的に表す図である。
【０１９２】
図８Ａは、それぞれアクセス不能な、およびアクセス可能な５’末端を有する、種々の濃度のイムノマー５および６による、細胞培養物中でのＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞増殖の誘発をグラフ的に表す図である。
図８Ｂは、ＣｐＧモチーフの５’隣接配列における免疫原性化学的修飾を有する、イムノマー４〜６によるＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓の拡大をグラフ的に表す図である。再び、アクセス可能な５’末端を有するイムノマー（６）は、アクセス可能な５’末端を有しないイムノマー５およびモノマーオリゴ４と比較して、脾臓拡大を増大させる大きい能力を有する。
【０１９３】
図９Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１２の誘発を、グラフ的に表す図である。
図９Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−６の誘発を、グラフ的に表す図である。
図９Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４並びにイムノマー７および８によるＩＬ−１０の誘発を、グラフ的に表す図である。
【０１９４】
図１０Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるイムノマー１４、１５および１６による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。
図１０Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のイムノマー１４および１６によるＩＬ−１２による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。
図１０Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のイムノマー１４および１６によるＩＬ−６による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。
【０１９５】
図１１Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物におけるオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０による細胞増殖の誘発を、グラフ的に表す図である。
図１１Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−１２産生の誘発を、グラフ的に表す図である。
図１１Ｃは、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における種々の濃度のオリゴ４および１７並びにイムノマー１９および２０によるＩＬ−６産生の誘発を、グラフ的に表す図である。
【０１９６】
図１２は、オリゴヌクレオチド４並びにイムノマー１４、２３および２４を用いたＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓拡大を、グラフ的に表す図である。
図１３は、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシドを図式的に表す図であり、これは、非ヌクレオチド結合を、核酸塩基において、３’位置において、または２’位置においてヌクレオシドに結合させることができることを示す。
図１４は、例１３において用いる化学的置換を示す。
【０１９７】
図１５は、例１３の修飾したオリゴヌクレオチドを用いて得られたサイトカインプロフィールを示す。
図１６は、グリセロールリンカーについての、アミノリンカーと比較しての相対的サイトカイン誘発を示す。
図１７は、種々のリンカーおよびリンカーの組み合わせについての相対的サイトカイン誘発を示す。
図１８Ａ〜Ｅは、種々のＰＳおよびＰＯイムノマー並びにオリゴヌクレオチドについての相対的ヌクレアーゼ耐性を示す。
【０１９８】
図１９は、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較しての、ＰＯイムノマーについての相対的サイトカイン誘発を示す。
図２０は、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較しての、ＰＯイムノマーについての相対的サイトカイン誘発を示す。
図２１は、高濃度のイムノマーにおける、Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウス脾臓細胞培養物における、ＰＳイムノマーと比較しての、ＰＯイムノマーについての相対的サイトカイン誘発を示す。
【０１９９】
図２２は、いくつかのピリミジンおよびプリン構造を示す。
図２３は、本研究において用いられる数種の免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーを示す。
図２４は、天然のＣｐＧモチーフと、合成プリン−ｐＧジヌクレオチドを有する免疫賦活性モチーフとの比較を示す。
【０２００】
図２５は、本研究において用いた種々の免疫賦活性オリゴヌクレオチドのＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを示す。
図２６は、本研究において用いた追加の免疫賦活性オリゴヌクレオチドのＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを示す。
図２７は、本研究において用いた免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーのＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを示す。
図２８は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーにおけるマウスおよびヒトモチーフにより提供されたＩＬ−１２およびＩＬ−６プロフィールを比較する。
【０２０１】
図２９は、種々の免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびイムノマーで処理したＪ７７４細胞におけるＮＦ−κＢの活性化およびＩκ−Ｂαの分解を示す。
図３０は、ヒトＰＢＭＣ培養物におけるイムノマーの免疫賦活活性を示す。
【図１】
2011101647.tif 000050
【図２】
2011101647.tif 000051
【図３】
2011101647.tif 000052
【図４】
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【図５】
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【図６】
2011101647.tif 000055
【図７】
2011101647.tif 000056
【図８】
2011101647.tif 000057
【図９】
2011101647.tif 000058
【図１０】
2011101647.tif 000059
【図１１】
2011101647.tif 000060
【図１２】
2011101647.tif 000061
【図１３】
2011101647.tif 000062
【図１４】
2011101647.tif 000063
【図１５】
2011101647.tif 000064
【図１６】
2011101647.tif 000065
【図１７】
2011101647.tif 000066
【図１８】
2011101647.tif 000067
【図１９】
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【図２０】
2011101647.tif 000069
【図２１】
2011101647.tif 000070
【図２２】
2011101647.tif 000071
【図２３】
2011101647.tif 000072
【図２４】
2011101647.tif 000073
【図２５】
2011101647.tif 000074
【図２６】
2011101647.tif 000075
【図２７】
2011101647.tif 000076
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
2011101647000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月6日(2011.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造５’−ＣＴＧＴＣＧ２ＴＴＣＴＣ−Ｘ−ＣＴＣＴＴＧ２ＣＴＧＴＣ−５’または５’−ＴＣＧ１ＴＣＧ１ＴＴＣＴＧ−Ｘ−ＧＴＣＴＴＧ１ＣＴＧ１ＣＴ−５’（式中、Ｘはグリセロールリンカーであり、Ｇ１は２’−デオキシ−７−デアザグアノシンであり、Ｇ２はアラビノグアノシンである）を有する免疫賦活性オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと、生理学的に許容し得る担体とを含む組成物。
【請求項３】
癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患を有する脊椎動物を治療的に処置するための、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
脊椎動物における免疫応答を発生させるための、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
脊椎動物における癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、皮膚障害、アレルギー、喘息または病原体により生じた疾患を予防するための、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
投与経路が、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、エーロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣内、遺伝子銃、経皮パッチ、点眼および洗口から選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントをさらに含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗原、アレルゲン、化学療法剤またはアジュバントと共に投与される、請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
他の態様において、免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたはイムノマーは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択された免疫賦活性ジヌクレオチドを含み、式中、Ｃの塩基は、シトシンであり、Ｃ＊の塩基は、チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、４−チオウラシルまたは他の非天然ピリミジンまたは２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンであり、ここで、塩基が、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである際には、これは、好ましくは、ペントースの１’位置に、塩基の１位を介して共有結合しており；Ｇの塩基は、グアニンであり、Ｇ＊の塩基は、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−アミノ−６−チオプリン、６−オキソプリンまたは他の非天然プリンであり、ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されたヌクレオシド間結合である。いくつかの好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
Ｎ１およびＮｎは、各々の存在において独立して、好ましくは天然に存在するか、もしくは合成のヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、ホスホジエステルもしくは修飾されたヌクレオシド間結合により、３’側の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択された免疫賦活性部分であり、修飾されたヌクレオチド間結合は、限定されずに、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されており；
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
第１の観点において、本発明は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドまたは「イムノマー」を提供し、後者は、これらの３’末端またはヌクレオシド間結合または官能化された核酸塩基もしくは糖において非ヌクレオチドリンカーに結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、免疫調節性オリゴヌクレオチドであり、アクセス可能な５’末端を有する。本明細書中で用いる、用語「アクセス可能な５’末端」は、オリゴヌクレオチドの５’末端が、イムノマーを認識し、これに結合し、免疫系を刺激する因子が、これへのアクセスを有するように、十分有用であることを意味する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明の目的のために、用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成したポリヌクレオチドを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはｃＤＮＡを含む在来の核酸供給源から得られるが、好ましくは合成的方法により製造される。好ましい態様において、各々のヌクレオシド単位は、複素環式塩基およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’置換アラビノース、２’−Ｏ置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、互いに、多くの既知のヌクレオシド間結合のすべてにより結合することができる。このようなヌクレオシド結合には、限定されずに、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホラミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間結合が含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
いくつかの態様において、免疫調節性オリゴヌクレオチドは、式５’−Ｐｙｒ−Ｐｕｒ−３’で表され、式中Ｐｙｒは、天然の、または合成のピリミジンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは、天然の、または合成のプリンヌクレオシドである、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。いくつかの好ましい態様において、免疫調節性オリゴヌクレオチドは、式５’−Ｐｕｒ＊−Ｐｕｒ−３’で表され、式中Ｐｕｒ＊は、合成のプリンヌクレオシドであり、Ｐｕｒは、天然の、または合成のプリンヌクレオシドである、免疫賦活性ジヌクレオチドを含む。種々の箇所において、ジヌクレオチドは、ＲｐＧ、Ｃ＊ｐＧまたはＹＺとして表され、この場合において、それぞれ、Ｒ、Ｃ＊またはＹは、合成プリンヌクレオシドを表す。特に好ましい合成プリンは、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本発明の好ましいピリミジンヌクレオシドは、構造（Ｉ）：
【化１】
2011101647.tif 000080
式中：
Ｄは、水素結合供与体であり；
Ｄ’は、水素、水素結合供与体、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択されており；
Ａは、水素結合受容体または親水性基であり；
Ａ’は、水素結合受容体、親水性基、疎水性基、電子求引基および電子供与基からなる群から選択されており；
Ｘは、炭素または窒素であり；
Ｓ’は、ペントースもしくはヘキソース糖環または天然に存在しない糖である、
を有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは、ＣｐＧ、Ｃ＊ｐＧ、ＣｐＧ＊およびＣ＊ｐＧ＊からなる群から選択され、式中、Ｃの塩基は、シトシンであり、Ｃ＊の塩基は、２’−チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、４−チオウラシルまたは他の非天然ピリミジンまたは２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、ここで、塩基が、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである際には、これは、好ましくは、ペントースの１’位置に、塩基の１位を介して共有結合しており；Ｇの塩基は、グアニンであり、Ｇ＊の塩基は、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリン、６−チオグアニン、６−オキソプリンまたは他の非天然プリンであり、ｐは、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートからなる群から選択されたヌクレオシド間結合である。いくつかの好ましい態様において、免疫賦活性ジヌクレオチドは、ＣｐＧではない。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、免疫賦活性部分を、免疫賦活性ジヌクレオチドの一方または両方の側に含むことができる。従って、いくつかの態様において、免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、構造（ＩＩＩ）：
５’−Ｎｎ−Ｎ１−Ｙ−Ｚ−Ｎ１−Ｎｎ−３’      （ＩＩＩ）
式中：
Ｙの塩基は、シトシン、チミン、５−ヒドロキシシトシン、Ｎ４−アルキル−シトシン、４−チオウラシルまたは他の非天然ピリミジンまたは２−オキソ−７−デアザ−８−メチルプリンであり、ここで、塩基が、２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンである際には、これは、好ましくは、ペントースの１’位置に、塩基の１位を介して共有結合しており；
Ｚの塩基は、グアニン、２−アミノ−６−オキソ−７−デアザプリン、２−オキソ−７デアザ−８−メチルプリン、２−アミノ−６−チオ−プリン、６−オキソプリンまたは他の非天然プリンであり；
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
Ｎ１およびＮｎは、各々の存在において独立して、好ましくは天然に存在するか、もしくは合成のヌクレオシドまたは脱塩基ヌクレオシド類、アラビノヌクレオシド類、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド類、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド類および、ホスホジエステルもしくは修飾されたヌクレオシド間結合により、３’側の隣接するヌクレオシドに結合したヌクレオシド類からなる群から選択された免疫賦活性部分であり、修飾されたヌクレオシド間結合は、限定されずに、約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカー、ポリ（エチレングリコール）リンカー、２−アミノブチル−１，３−プロパンジオールリンカー、グリセリルリンカー、２’−５’ヌクレオシド間結合、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートヌクレオシド間結合から選択されており；
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
特定の例示により、および限定せずに、例えば構造（ＩＩＩ）で表される免疫賦活性領域において、位置Ｎ１またはＮｎにおけるメチルホスホネートヌクレオシド間結合は、免疫賦活性部分であり、位置Ｘ１における約２オングストローム〜約２００オングストロームの長さを有するリンカー、Ｃ２〜Ｃ１８アルキルリンカーは、免疫賦活性部分であり、位置Ｘ１におけるβ−Ｌ−デオキシリボヌクレオシドは、免疫賦活性部分である。免疫賦活性部分の代表的な位置および構造について、以下の表１を参照。特定の位置における免疫賦活性部分としてのリンカーへの言及は、当該位置におけるヌクレオシド残基が、この３’−ヒドロキシルにおいて、示したリンカーで置換されており、これにより当該ヌクレオシド残基と３’側の隣接するヌクレオシドとの間の修飾されたヌクレオシド間結合が作成されることを意味することが、理解されるべきである。同様に、特定の位置における免疫賦活性部分としての修飾されたヌクレオシド間結合への言及は、当該位置におけるヌクレオシド残基が、３’側の隣接するヌクレオシドに、引用した結合により結合していることを意味する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【表１】
2011101647.tif 000081
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
本発明のイムノマーは、これらの３’末端もしくはヌクレオシド間結合または官能化された核酸塩基もしくは糖において非ヌクレオチドリンカーを介して結合した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。本発明の目的のために、「非ヌクレオチドリンカー」は、オリゴヌクレオチドに、共有結合または非共有結合により結合することができるすべての部分である。好ましくは、このようなリンカーは、長さが約２オングストローム〜約２００オングストロームである。好ましいリンカーのいくつかの例を、以下に述べる。非共有結合には、静電相互作用、疎水性相互作用、π積み重ね相互作用および水素結合が含まれるが、これらには限定されない。用語「非ヌクレオチドリンカー」は、上記したように、ヌクレオシド間結合、例えば２つのヌクレオシドの３’−水酸基に直接結合するホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート官能基を表すことを意味しない。本発明の目的のために、このような直接的な３’−３’結合（リンカーを伴わない）は、「ヌクレオチド結合」であると考慮される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
リンカー８および９を含むＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活効果を比較するために、本発明者らは、５’隣接配列における置換を有するＣｐＧ  ＤＮＡ１４５および１５２を選択し、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞培養物中でのサイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６分泌を誘発するこれらの能力をアッセイした。ＣｐＧ  ＤＮＡ１４５および１５２の両方は、濃度依存性サイトカイン分泌を誘発した。図１６は、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４と比較しての、０．３μｇ／ｍＬの濃度における、マウス脾臓細胞培養物中で１４５および１５２により誘発されたＩＬ−１２およびＩＬ−６のレベルを示す。両方のＣｐＧ  ＤＮＡは、基本的なＣｐＧ  ＤＮＡ４よりも高いレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−６を誘発した。グリセロールリンカー（８）を含むＣｐＧ  ＤＮＡは、アミノリンカー（９）を含むＣｐＧ  ＤＮＡよりもわずかに高いレベルのサイトカイン（特にＩＬ−１２）を誘発した（図１６）。これらの結果は、さらに、親水性基を含むリンカーが、ＣｐＧ  ＤＮＡの免疫賦活活性のために一層好ましいことを確認する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
例１６
ヒトＢ細胞および形質細胞様(plasmacytoid)樹状細胞（ｐＤＣ）の単離
新たに取り出した健康な志願者の血液からのＰＢＭＣ(CBR Laboratories, Boston, MA)を、フィコール密度勾配遠心分離法(Histopaque-1077, Sigma)により単離し、Ｂ細胞を、ＰＢＭＣから、陽性の選択により、ＣＤ１９細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いて、製造者の指示に従って単離した。