(57)【要約】  【課題】種苗登録した品種の育成者権を保護するため、客観的で効率的なノリの品種判別方法及びそれに用いるプライマーを提供する。  【解決手段】被検試料中のＤＮＡを鋳型として、配列番号（２ｎ−１）及び２ｎ（ｎは１〜１８の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの全１８種類を用いて増幅処理し、得られる各プライマーセット毎の増幅産物パターンを、予め作成された既知品種のパターンと照合するノリの品種判別法及びこれに用いるプライマー。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のＤＮＡを鋳型として、配列番号（２ｎ−１）及び２ｎ（ｎは１〜１８の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの全１８種類を用いて増幅処理し、得られる各プライマーセット毎の増幅産物パターンを、予め作成された既知品種のパターンと照合することを特徴とするノリの品種判別法。
【請求項２】
被検試料中のＤＮＡを鋳型として、配列番号（２ｍ−１）及び２ｍ（ｍは１〜７３の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの全７３種類を用いて増幅処理し、得られる各プライマーセット毎の増幅産物パターンを、予め作成された既知品種のパターンと照合することを特徴とするノリの品種判別法。
【請求項３】
上記増幅処理がＰＣＲ法で、増幅産物のパターンが電気泳動によるパターンである請求項１又は２に記載のノリの品種判別法。
【請求項４】
被検試料中のＤＮＡを鋳型として増幅処理し、得られる増幅産物のパターンからノリ品種を判別するプライマーとして用いられる、配列番号（２ｍ−１）及び２ｍ（ｍは１〜７３の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの少なくとも１種類からなるノリの品種判別用プライマー。
【請求項５】
被検試料中のＤＮＡを鋳型として、増幅処理し、得られる増幅産物のパターンを照合するノリの品種判別法にプライマーとして用いられる、配列表の配列番号（２ｎ−１）及び２ｎ（ｎは１〜１８の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの少なくとも１８種類を含むノリの品種判別用プライマーキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アマノリ属ノリの品種判別方法及びそれに用いるプライマーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ノリの品種は外部形態では判別が困難であるため、品種の区別はあいまいな点が多かった。このため、これまで新規品種を種苗登録しても真の意味で育成者権を保護することは、困難であった。
【０００３】
現在、実際に漁場で使用されているアマノリ属養殖品種約７５品種の内、入手可能品種として、スサビノリ種５５品種、アサクサノリ種１３品種の合計６８品種を用いて、これらの品種に該当するかどうかを判別できれば、ノリ養殖品種のほとんどを区別できることになる。
ところで、ＤＮＡの塩基配列比較やＰＣＲ‐ＲＦＬＰ分析などの分子生物学的手法の進歩により、スサビノリ種とアサクサノリ種の判別が容易となってきた(非特許文献１〜５)。また、しかしながら、これらの方法では、ＤＮＡシーケェンサー等、大掛かりな装置を用いる必要があり、また品種レベルでの判別はできていなかった。
また、アオノリ属の海藻であるか否かを決定する方法も提案されているが（特許文献１）、アマノリ属はアオノリ属とは判別に使用できるＤＮＡが全く異なり、またこの方法も品種レベルでの判別方法までは提案していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３０４６０４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kunimoto et al. J. Appl. Phycol.，11，203‐209（1999）
【非特許文献２】Kunimoto et al. J. Appl. Phycol.，15，337‐343（2003）
【非特許文献３】Niwa et al. J. Phycol.，41，294‐304（2005）
【非特許文献４】Niwa et al. Phycol. Res.，53，296‐302（2005）
【非特許文献５】Niwa et al. Aquaculture，274，126‐131（2008）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
解決しようとする問題点は、アマノリ属の品種レベルでの判別方法がなかった点であり、本発明の目的は、種苗登録した品種の育成者権を保護するため、客観的で効率的なノリの品種判別方法及びそれに用いるプライマーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決する本発明は、次のとおりである。
（１）被検試料中のＤＮＡを鋳型として、配列番号（２ｎ−１）及び２ｎ（ｎは１〜１８の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの全１８種類を用いて増幅処理し、得られる各プライマーセット毎の増幅産物パターンを、予め作成された既知品種のパターンと照合するノリの品種判別法。
（２）被検試料中のＤＮＡを鋳型として、配列番号（２ｍ−１）及び２ｍ（ｍは１〜７３の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの全７３種類を用いて増幅処理し、得られる各プライマーセット毎の増幅産物パターンを、予め作成された既知品種のパターンと照合するノリの品種判別法。
（３）上記増幅処理がＰＣＲ法で、増幅産物のパターンが電気泳動によるパターンである上記（１）又は（２）に記載のノリの品種判別法。
（４）被検試料中のＤＮＡを鋳型として増幅処理し、得られる増幅産物のパターンからノリ品種を判別するプライマーとして用いられる、配列番号（２ｍ−１）及び２ｍ（ｍは１〜７３の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの少なくとも１種類からなるノリの品種判別用プライマー。
（５）被検試料中のＤＮＡを鋳型として、増幅処理し、得られる増幅産物のパターンを照合するノリの品種判別法にプライマーとして用いられる、配列表の配列番号（２ｎ−１）及び２ｎ（ｎは１〜１８の整数）の塩基配列或いはその相補的な塩基配列を有する１組のプライマーセットの少なくとも１８種類を含むノリの品種判別用プライマーキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のノリの品種判別法は、現在漁場で用いられているノリ養殖品種をＤＮＡにより客観的かつ簡便に判別することができ、ノリ製品の適正な表示等の科学的根拠となりうる情報を提供できる。また、新規に種苗登録した品種の育成者権を保護するための科学的根拠となりうる情報を提供でき、育成者が登録した品種の第三者による無断使用を証明することで、育成者の知的財産権を適正に保護することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２の被検試料のＤＮＡを１８種類のプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅処理した増幅産物の電気泳動パターンを示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の被検試料は、アマノリ属に属するノリであれば、養殖ノリ、野生ノリのいずれでもよい。本発明では、まず、被検試料からＤＮＡを抽出するが、このＤＮＡは、胞子、糸状体、葉状体のいずれから抽出してもよいが、一般には保存が糸状体でなされているので、この糸状体から抽出することが好ましい。この抽出は、分子生物学の分野で慣用されている手法にしたがって行い、必要に応じて精製し、供試試料として調製すればよい。たとえば、市販の植物などからのＤＮＡ抽出キットISOPLANT II（NIPPON GENE Co. Ltd.）などを用いると簡便である。
【００１１】
次に、この抽出されたＤＮＡを鋳型として、プライマーを用いて増幅処理を行うが、この場合、プライマーとしては、表１ａ〜表１ｃに示した塩基配列又はそれに対応する相補的な塩基配列を有するものが用いられる。この場合、配列番号の（２ｍ−１）のフォワード側の塩基配列及び配列番号２ｍのリバース側の塩基配列、あるいはこれらの相補的な塩基配列を１組のプライマーセットとして用いる。なお、ｍは１〜７３の整数である。
【００１２】
後述するように、このうちの表１ａの配列番号の（２ｎ−１）のフォワード側の塩基配列及び配列番号２ｎのリバース側の塩基配列、あるいはこれらの相補的な塩基配列を１組とするプライマーセット１８種類を用いることにより、スサビノリ種の５５品種、アサクサノリ種の１３品種の合計６８品種のどの品種に該当するかを判別できる。なお、ｎは１〜１８の整数である。したがって、少なくともこの１８種類のプライマーセットは、アマノリ属のノリ品種判別用プライマーキットとすることができる。
ところで、表４から明らかなように、配列番号１７及び１８のプライマーセットでは、Ｐ−１３品種しか増幅パターンが見られないため、Ｐ−１３品種かどうかの確認を行いたいときは、このプライマーセットのみを用いればよい。同様に、例えば、Ｐ−１品種かどうかを確認したいときには、配列番号３及び４、配列番号２５及び２６並びに配列番号３３及び３４の３種類のプライマーセットを、Ｐ−２の品種では、配列番号２５及び２６のプライマーセットをそれぞれ選択して用い、これらのすべてで増幅パターンが得られれば、確認できる。しかし、これは外部形態等で品種を予測できた場合の最終確認的な判別に用いることができる方法である。
【００１３】
また、表１ａ〜表１ｃのプライマーセット７３種類を用いることにより、上記６８品種のどれに該当するか、また新品種であるかどうかを、より正確に判別できる。
後述の表４ａ〜表４ｄの増幅パターンに該当する品種がない場合、被検試料は新品種と判別される。このような場合、後述したように、１８種類のプライマーセットを選定したのと同様の方法、すなわち、この増幅パターンを、表４ａ〜表４ｄの他の品種間の増幅パターンと比較して、異なるプライマーセットを選定し、これを上記１８種類のプライマーセットに追加し、新たなアマノリ属のノリ品種判別用プライマーキットとすることができる。新品種が見出されるごとに、これを繰り返すことにより、ノリ品種判別用プライマーキットを充実させることができる。
なお、この表１ａ〜表１ｃのプライマーセット７３種類は、アマノリ属のノリ品種に対し特異的な増幅が認められ、しかも増幅の安定性が高く、ノリ品種判別用プライマーとして、極めて優れたものである。
【００１４】
【表１ａ】
2011130690.tif 000002
【００１５】
【表１ｂ】
2011130690.tif 000003
【００１６】
【表１ｃ】
2011130690.tif 000004
【００１７】
上記プライマーを用いたＤＮＡの増幅は、公知のＤＮＡ増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）などを用いることができる。また、この増幅を行う際の反応液の組成やサイクリングの条件は、プライマーのTm値、サーマルサイクラーの仕様などに合わせて適宜選定するとよい。
本発明の方法では、このようにして得られたＤＮＡ増幅産物の有無を、例えば、電気泳動法などに供して、そのパターンに基いて識別する。すなわち、判別を行いたい品種から得られたＤＮＡ増幅産物を、予め作製した表１ａ〜表１ｃに示したプライマーとスサビノリ種５５品種、アサクサノリ種１３品種から抽出、調製されたＤＮＡ増幅産物による表４ａ〜表４ｄ、または表５に示したＤＮＡ増幅有無のバンドパターンと比較して、品種の判別を行なう。
【実施例１】
【００１８】
（プライマーの設計）
元株保有機関から分与された起源の明らかなスサビノリ種５５品種、アサクサノリ種１３品種の合計６８品種のノリを単藻化し、表２に示す条件で室内培養を行った。
【００１９】
【表２】
2011130690.tif 000005
この培養により得られたフリー糸状体を液体窒素で凍結して粉砕後、ISOPLANTII（NIPPON GENE Co. Ltd.）を用いて、プロトコールにしたがって、ＤＮＡを抽出し、精製した。
次に、約６００種類の１０塩基からなるＲＡＰＤプライマーを、一部は市販品を、他は通常のオリゴヌクレオチド合成法にしたがって調製し、上記により得られたＤＮＡをi-Cyclerサーマルサイクラー（BIO-RAD社製）を用いて、表３に示した条件でＰＣＲ法により増幅した。
【００２０】
【表３】
2011130690.tif 000006
【００２１】
増幅後の断片を、２％アガロースゲルで、１×TAEバッファーを用いて電気泳動し、泳動後に、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外線により比較判別して、品種特異的な断片４５０種類を選定した。この４５０種類の品種特異的増幅断片をTOPO TAクローニングキット（Invitrogen社製）を用いて、それぞれクローニングを行い、このクローニング産物の塩基配列を解読し、品種判別用プライマー候補４００種類を設計した。
この品種判別用プライマー候補４００種類を用いて、上記と同様の方法により、６８品種のノリのＤＮＡをＰＣＲ法により増幅し、品種特異的増幅が認められ、かつ増幅の安定性が高い表１ａ〜表１ｃに示した塩基配列を有する７３種類のプライマーセットをノリ品種判別用プライマーに選定した。
【００２２】
（品種の判定用パターン）
上記７３対のプライマーと６８品種のノリＤＮＡの増幅断片の有無の関係を表４ａ〜表４ｄに示した。それぞれのプライマーにおいて、増幅断片が観察された場合を＋で表し、それ以外は空欄のままとした。この表から明らかなように、この７３対のプライマーのいずれかを用いると、被検試料がアマノリ属の６８品種に該当するか否かを判定できることが分かる。
なお、本発明に関するノリ６８品種の品種名称と品種記号との対応表は（独）水産総合研究センター西海区水産研究所が管理し、照合のための６８品種の基準株の保存・培養を継続している。
【００２３】
【表４ａ】
2011130690.tif 000007
【００２４】
【表４ｂ】
2011130690.tif 000008
【００２５】
【表４ｃ】
2011130690.tif 000009
【００２６】
【表４ｄ】
2011130690.tif 000010
【００２７】
次に、上記表４ａ〜表４ｄのパターンから、６８品種間でパターンの異なるプライマーを選択すると、表４に示す１８種類のプライマーセットが選定される。すなわち、６８品種のノリを判別するためには、この表５の１８種類のプライマーセットの全てを用いれば、どの品種に該当するかを判別できる。また、被検試料の品種がかなり絞り込める場合は、該当しそうな品種で増幅が認められるプライマーセットを数種類組み合わせて用いることにより、より少ない増幅操作で、その品種を判別できることが分かる。なお、この１８種類の増幅断片塩基のサイズを表６に示した。
【００２８】
【表５】
2011130690.tif 000011
【００２９】
【表６】
2011130690.tif 000012
【実施例２】
【００３０】
判別を依頼されたノリを表２の条件で室内培養し、得られたフリー糸状体を液体窒素で凍結・粉砕し、ISOPLANTIIを用いて、プロトコールにしたがって、ＤＮＡを抽出し、精製した。
次に、表１ａに示した塩基配列を有するプライマーセット１８種類、及びＰＣＲ増幅の成否のチェック用として表７に示した塩基配列を有するポジティブコントロール用プライマー１（配列番号１４７，１４８：増幅断片長１９３８塩基）、プライマー２（配列番号１４９，１５０：増幅断片長１３４１塩基）を用い、上記により得られたＤＮＡをi-Cyclerサーマルサイクラーを用いて、表８に示した条件でＰＣＲ法により増幅した。増幅後の断片を、表５に示す配列番号順に、２％アガロースゲルで、１×TAEバッファーを用いて電気泳動し、泳動後に、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外線照射下に増幅パターンを観察した。図１に示すように、増幅断片が観察されたプライマーは、左から１２、１３、１７、１８番目に位置する配列番号２３及び２４、２５及び２６、３３及び３４並びに３５及び３６であったので、表５のパターンから、被検試料は品種Ｐ−５であることが判別された。
【００３１】
【表７】
2011130690.tif 000013
【００３２】
【表８】
2011130690.tif 000014
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のノリの品種判別法は、現在漁場で用いられているノリ養殖品種をＤＮＡにより客観的かつ簡便に判別することができ、ノリ製品の適正な表示等の科学的根拠となりうる情報を提供できるため、産業上有用である。また、新規に種苗登録した品種の育成者権を保護するための科学的根拠となりうる情報を提供でき、育成者が登録した品種の第三者による無断使用を証明することで、育成者の知的財産権を適正に保護することができるため、産業上有用である。
【符号の説明】
【００３４】
１〜１８  表１ａの配列番号（２ｎ−１）及び２ｎ（ｎは１〜１８の整数）の塩基配列            或いはその相補的な塩基配列を有するプライマーセットによる増幅の有無
１９      ポジティブコントロール１
２０      ポジティブコントロール２
２１      増幅された特異的断片
【図１】
2011130690.tif 000015
【配列表】
2011130690000001.app