(57)【要約】【課題】本発明は、より短い照射時間でグラム陰性菌について生菌と死菌とを識別することができる微生物の生菌の検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、被検試料中の微生物の生菌を検出する方法であって、ａ）被検試料を界面活性剤で処理し、ｂ）界面活性剤で処理した被検試料をエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドで処理し、ｃ）次いで、被検試料に可視光を照射し、ｄ）可視光を照射した被検試料からDNAを抽出し、ｄ）可視光を照射した被検試料からＤＮＡを抽出し、ｅ）ａ）からｄ）の工程中のいずれかにおいてトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理し、ｆ）抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅方法により増幅することを特徴とする前記検出方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の微生物の生菌を検出する方法であって、
ａ）被検試料を界面活性剤で処理し、
ｂ）界面活性剤で処理した被検試料をエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドで処理し、
ｃ）次いで、被検試料に可視光を照射し、
ｄ）可視光を照射した被検試料からＤＮＡを抽出し、
ｅ）ａ）からｄ）の工程中のいずれかにおいてトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理し、
ｆ）抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅方法により増幅することを特徴とする前記検出方法。
【請求項２】
被検試料が微生物としてグラム陽性菌及びグラム陰性菌を含み、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の生菌を同時に検出する請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤がアムサクリンである請求項１又は２の何れかに記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中あるいは環境中に存在する微生物を対象とし、生きている微生物のみを検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食品中の微生物を検査する方法として、食品衛生検査指針準拠の培地培養法が従来より用いられてきた。しかし、培地培養法では微生物の検出に２日以上の時間がかかり、複数種の検査を行う場合には、各々異なった培地培養を行う必要があり、手間がかかり、高コストとなっている。
【０００３】
一方、より短時間で微生物の有無を判断する技術として、ＰＣＲ法により微生物のある特定の遺伝子を増幅して微生物の有無を判別する方法があり、食品衛生検査や環境検査、感染症検査の一部で用いられている（非特許文献１及び非特許文献２参照）。しかしながら、短時間での検出が可能であり、検出感度も良いが、微生物のＤＮＡを利用していることから、試料に含まれている死菌も同時に検出されてしまうため、仮に陽性を示しても、必ずしも生きている微生物が試料に存在しているとはいえなかった。
【０００４】
微生物の生菌と死菌とを識別する方法として、被検試料をエチジウムモノアジドで処理し、被検試料に可視光を照射した後に被検試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡのターゲット領域をＰＣＲにより増幅することによって生菌と死菌とを識別する方法が提案されている（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４１２７８４７号公報
【特許文献２】特開２００８−１７３１３２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】結核菌検査指針  ２００７
【非特許文献２】食安監発第１１０２００４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、生菌と死菌とを識別する前記方法では、被検試料に可視光を照射する時間が、微生物の種類によって、すなわちグラム陽性菌とグラム陰性菌とで異なり、グラム陰性菌について生菌と死菌とを識別するためには、より長い照射時間が必要であった。そのため、この方法では、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の生菌を同時に検出することはできなかった。
本発明は、より短い照射時間でグラム陰性菌について生菌と死菌とを識別することができる微生物の生菌の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、被検試料中の微生物の生菌を検出する方法であって、ａ）被検試料を界面活性剤で処理し、ｂ）界面活性剤で処理した被検試料をエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドで処理し、ｃ）次いで、被検試料に可視光を照射し、ｄ）可視光を照射した被検試料からＤＮＡを抽出し、ｅ）ａ）からｄ）の工程中のいずれかにおいてトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理し、
ｆ）抽出されたDNAのターゲット領域を核酸増幅方法により増幅することを特徴とする前記検出方法を提供する。
本発明の検出方法においては、被検試料が微生物としてグラム陽性菌及びグラム陰性菌を含み、グラム陽性菌及びグラム陰性菌の生菌を同時に検出すること、
トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤がアムサクリンであること、
が好適である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、より短い照射時間でグラム陰性菌について生菌と死菌とを識別することにより、同時にグラム陰性菌とグラム陽性菌の生菌の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】EMA添加後の静置時間と光照射時間の検討における、電気泳動写真である。
【図２】EMA添加後の静置時間と光照射時間の検討における、電気泳動写真である。
【図３】界面活性剤の添加効果の検討における、電気泳動写真である。
【図４】界面活性剤の添加効果の検討における、電気泳動写真である。
【図５】界面活性剤の添加効果の検討における、電気泳動写真である。
【図６】界面活性剤の添加効果の検討における、電気泳動写真である。
【図７】界面活性剤の添加効果の検討における、電気泳動写真である。
【図８】プロピジウムモノアジド溶液を用いた場合の界面活性剤の添加効果の検討における、電気泳動写真である。
【図９】プロピジウムモノアジド溶液を用いた場合の界面活性剤の添加効果の検討における、電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の被検試料中の微生物の生菌を検出する方法は、ａ）被検試料を界面活性剤で処理し、ｂ）界面活性剤で処理した被検試料をエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドで処理し、ｃ）次いで、被検試料に可視光を照射し、ｄ）可視光を照射した被検試料からＤＮＡを抽出し、ｅ）ａ）からｄ）の工程中のいずれかにおいてトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理し、
ｆ）抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅方法により増幅することを特徴とする。
【００１２】
被検試料としては、例えば牛乳、水、緑茶、酸性飲料等の飲料や食肉、チルド食品、生鮮食品（肉、野菜、魚）、弁当・総菜などの幅広い食品や、飼料などが利用可能である。更に、食品製造の設備や製造環境中の空気などの環境試料も本発明の被検試料として利用可能である。被検試料の性状は固体、液体及び気体のいずれであってもよい。被検試料は、前記のような製品又は生体試料そのものを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、又は遠心分離などが挙げられる。
【００１３】
微生物としては、細菌、糸状菌、及び酵母などが挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。グラム陽性菌としては、ストレプトコッカス属細菌、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）などのリステリア属細菌、及びバチラス・サブチリス（Bacillus subtilis）などのバチラス属細菌、及びマイコバクテリウム属細菌などが挙げられる。グラム陰性菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）などのエシェリヒア属細菌、エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazakii）などのエンテロバクター属細菌、サルモネラ属細菌、ビブリオ属細菌、及びシュードモナス属細菌などが挙げられる。
【００１４】
生菌とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）であり、細胞壁の損傷がほとんど無い微生物をいう。前記代謝活性としては、ATP活性、及びエステラーゼ活性などが挙げられる。
死菌とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。
【００１５】
本発明の検出方法においては、被検試料を界面活性剤で処理する（工程ａ））。イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤のいずれも、前記界面活性剤として使用することができる。
イオン性界面活性剤としては、アニオン系界面活性剤の脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、カチオン性界面活性剤のアルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、両性界面活性剤のアルキルカルボキシベタイン、アルキルアミンオキシド、アルキルアミノ脂肪酸塩などが挙げられる。
非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルポリグルコシド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
被検試料の界面活性剤による処理は、被検試料に界面活性剤を添加することにより行われる。界面活性剤の添加量は、界面活性剤を添加した後の被検試料の重量を基準として、好ましくは０．１〜０．００００１重量％であり、より好ましくは０．０１〜０．０００１重量％である。
【００１６】
本発明の検出方法においては、次いで界面活性剤で処理した被検試料をエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドで処理する（工程ｂ））。被検試料のエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドによる処理は、被検試料にエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドを添加し、一定時間静置することにより行われる。エチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドの添加量は、終濃度で０．５〜１００μｇ／ｍｌが好ましい。また、添加するエチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドの温度は、４〜１０℃が好ましい。さらに、被検試料の温度も４〜１０℃が好ましい。また、エチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドを被検試料に添加した後の静置時間は、好ましくは３〜６０分間であり、より好ましくは５〜２０分間である。なお、エチジウムモノアジド又はプロピジウムモノアジドによる処理は、遮光下で行うことが好ましい。
【００１７】
本発明の検出方法においては、次いで被検試料に可視光を照射する（工程ｃ））。可視光としては、５５０〜７００ｎｍの波長の光を含む可視光が好ましい。可視光の照射は、被検試料から、例えば５〜５０ｃｍの距離から１００〜７５０Ｗの可視光を３分〜１時間照射する。なお、可視光照射は、低温下で、例えば試料を氷冷して行うことが好ましい。
【００１８】
本発明の検出方法においては、次いで可視光を照射した被検試料からＤＮＡを抽出する（工程ｄ））。被検試料からＤＮＡを抽出する方法としては、例えばフェノール抽出法、フェノール・クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法が挙げられる。また、市販のＤＮＡ抽出試薬や核酸自動抽出装置を用いてＤＮＡを抽出する方法が挙げられる。
【００１９】
本発明の検出方法においては、工程ａ）〜工程ｄ）のいずれかにおいて被検試料をトポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理する（工程ｅ））。トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤とは、トポイソメラーゼ（Topoisomerase）及びＤＮＡジャイレース（DNA Gyrase）のＤＮＡ切断活性は阻害せずに、ＤＮＡの再結合を阻害するもの、又はＤＮＡを切断する速度を促進させるものをいう。トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、生菌と、死菌に対する作用が異なるものであることが好ましい。より具体的には生菌の細胞壁よりも死菌の細胞壁に対して透過性の高いものであることが好ましい。
【００２０】
トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡジャイレース阻害剤による処理の条件は適宜設定することが可能であり、例えば、検出対象の微生物の生菌及び死菌の懸濁液に、種々の濃度のトポイソメラーゼ阻害剤を添加し、種々の時間を置いた後、微生物のDNAを抽出しPCRで分析することで、生菌と死菌を区別しやすい条件を決定することができる。このような条件としてアムサクリンでは終濃度１〜１００μｇ／ｍｌ、２５〜３７℃、５分〜３６時間が挙げられる。
【００２１】
本発明の検出方法においては、次いで抽出されたＤＮＡのターゲット領域を核酸増幅方法により増幅する（工程ｆ））。ターゲット領域とは、染色体ＤＮＡのうち、核酸増幅方法により増幅できる領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。ターゲット領域の長さとしては、通常８０〜１０００塩基、好ましくは１００〜５００塩基が挙げられる。核酸増幅方法としては、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction）、ＳＤＡ法（strand displacement amplification）、ＬＣＲ法（ligase chain reaction）、ＬＡＭＰ法（loop-mediated isothermal amplification），ＩＣＡＮ法（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）などが存在し、その中でもＰＣＲ法を用いることが好ましい。
【００２２】
本発明で用いたＰＣＲプライマーは、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。具体的には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に対応するプライマーとして、配列番号１及び２に示すプライマーセット、又は配列番号３及び２に示すプライマーセットが挙げられる。
本発明の検出方法において、ＰＣＲ増幅は公知の方法を用いて行われる。例えば、抽出されたＤＮＡを鋳型とし、熱変性によりＤＮＡを一本鎖にした後（例えば９４℃）、これにプライマーをアニーリングさせ（例えば、６０℃）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を合成する（例えば、７２℃）、というサイクルを、例えば２０〜４０回繰返すことにより、目的とする遺伝子領域だけを増幅させる。
得られたＰＣＲ増幅産物は、公知の方法、例えば電気泳動やクロマトグラフィー、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）などによって解析することができる。
【実施例】
【００２３】
１．使用した菌
グラム陰性細菌：大腸菌（Escherichia coli ATCC 8739）
グラム陽性細菌：枯草菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）
【００２４】
２．生菌溶液及び死菌溶液の調整
ＬＢ培地を用いて３５℃で培養し、対数増殖期の培養液を取りだした。次いで、滅菌希釈液Ｐｒｏ−ｍｅｄｉａ  ＭＴ−１１（株式会社エルメックス）を用いて段階的に希釈して各濃度の生菌懸濁液とした。生菌懸濁液１ｍｌを計りとり、ペトリフィルム培地生菌数測定用ＡＣプレート（住友スリーエム社）で測定した。
また、生菌懸濁液１ｍｌを１．５ｍｌチューブに入れ、ヒートブロックにて１００℃で３分間加熱し（大腸菌について）、又は１００℃で１０分間加熱し（枯草菌について）、次いで氷で急冷したものを死菌懸濁液とした。
【００２５】
３．試薬
2011142865.tif 000002
【００２６】
４．実験方法
（１）ＥＭＡ添加後の静置時間と光照射時間の検討
大腸菌の生菌懸濁液及び死菌懸濁液、並びに枯草菌の生菌懸濁液及び死菌懸濁液を、１×１０7ｃｆｕ／ｍｌで各々１００μｌずつ１．５ｍｌチューブに取り、１ｍｇ／ｍｌのアムサクリン溶液を１μｌ添加した。遮光下で１ｍｇ／ｍｌのエチジウムモノアジド溶液を１μｌ添加した。これを遮光下４℃で、５、１０又は３０分間静置した後、氷上に静置した。各懸濁液から２５〜３０ｃｍの距離に設置した１００Ｖ−５００Ｗライト（東芝ライテック  ＡＬ−ＵＦ−６−２）を５又は１０分間照射した。
その後、遮光下３０℃で３０分間静置した後、０．２Ｎ  水酸化ナトリウム溶液を１００μｌ加えて１００℃、１０分加熱後、氷中で急冷し１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）と滅菌水を加え、４℃、１６０００×ｇ、５分遠心することでＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ溶液を用い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲ組成及び反応条件を以下に示す。
【００２７】
ＰＣＲ組成（大腸菌）
2011142865.tif 000003
反応条件
2011142865.tif 000004
【００２８】
PCR組成（枯草菌）
2011142865.tif 000005
反応条件
2011142865.tif 000006
【００２９】
ＰＣＲ後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動完了後、ＴＡＥバッファーで１００００倍に希釈したＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（TaKaRa）溶液に３０分間漬けてアガロースゲルを染色し、ＵＶトランスイルミネーターでＰＣＲ増幅産物を観察した。結果を図１及び２に示す。図１及び２から明らかであるように、グラム陰性菌である大腸菌の生菌のＤＮＡのみを検出するためには４℃静置時間３０分と光照射１０分が必要であるが、グラム陽性菌である枯草菌で４℃静置時間３０分と光照射１０分を行った場合、生菌のＤＮＡも分解されてしまい、この条件では、グラム陰性菌とグラム陽性菌の生菌を同時に検出することはできなかった。
一方、グラム陽性菌である枯草菌の生菌のＤＮＡのみを検出するためには４℃静置時間５分と光照射５分にする必要があるが、グラム陰性菌である大腸菌で４℃静置時間５分と光照射５分を行った場合、生菌及び死菌の両方が検出されてしまい、この条件でも、グラム陰性菌とグラム陽性菌の生菌を同時に検出することはできなかった。
【００３０】
（２）界面活性剤の添加効果の検討
大腸菌の生菌懸濁液及び死菌懸濁液、並びに枯草菌の生菌懸濁液及び死菌懸濁液を、１×１０7ｃｆｕ／ｍｌ及び１×１０3ｃｆｕ／ｍｌで各々１００μｌずつ１．５ｍｌチューブに取り、１ｍｇ／ｍｌのアムサクリン溶液を１μｌ添加した。さらに各濃度（１０重量％、１重量％、０．１重量％、及び０．０１重量％）の界面活性剤（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を１μｌ又は１０重量％の界面活性剤（ＳＤＳ、ＣＴＡＢ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を１１μｌ添加した。遮光下で１ｍｇ／ｍｌのエチジウムモノアジド溶液を１μｌ添加した。これを遮光下４℃で５分静置した後、氷上に静置した。各懸濁液から２５〜３０ｃｍの距離に設置した１００Ｖ−５００Ｗライト（東芝ライテック  ＡＬ−ＵＦ−６−２）を５分間照射した。
その後、遮光下３０℃で３０分間静置した後、０．２Ｎ  水酸化ナトリウム溶液を１００μｌ加えて１００℃、１０分加熱後、氷中で急冷し１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）と滅菌水を加え、４℃、１６０００×ｇ、５分遠心することでＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ溶液を用い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲを行った。なお、ＣＴＡＢ添加したものサンプルは、ＰＣＲ時の残存ＣＴＡＢの影響を避けるため、ＤＮＡ溶液をさらに１００倍希釈して用いた。ＰＣＲ組成及び反応条件は上記（１）で使用した組成及び条件と同じである。
ＰＣＲ後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動完了後、ＴＡＥバッファーで１００００倍に希釈したＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（TaKaRa）溶液に３０分間漬けてアガロースゲルを染色し、ＵＶトランスイルミネーターでＰＣＲ増幅産物を観察した。結果を図３〜７に示す。図３〜７から明らかであるように、５分間の光照射により、グラム陰性菌である大腸菌及びグラム陽性菌である枯草菌の生菌のＤＮＡのみが検出された。これらの結果のまとめを表１に示す。
【００３１】
【表１】
2011142865.tif 000007
【００３２】
（３）プロピジウムモノアジド溶液を用いた場合の界面活性剤の添加効果の検討
大腸菌の生菌懸濁液及び死菌懸濁液、並びに枯草菌の生菌懸濁液及び死菌懸濁液を、１×１０7ｃｆｕ／ｍｌ及び１×１０3ｃｆｕ／ｍｌで各々１００μｌずつ１．５ｍｌチューブに取り、１ｍｇ／ｍｌのアムサクリン溶液を１μｌ添加した。さらに１重量％の界面活性剤（ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を１μｌ添加した。遮光下で１ｍｇ／ｍｌのプロピジウムモノアジド溶液を１μｌ添加した。これを遮光下４℃で５分間静置した後、氷上に静置した。各懸濁液から２５〜３０ｃｍの距離に設置した１００Ｖ−５００Ｗライト（東芝ライテック  ＡＬ−ＵＦ−６−２）を５分間照射した。
その後、遮光下３０℃で３０分間静置した後、アルカリ溶解法にてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡ溶液を用い、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲ組成及び反応条件は上記（１）で使用した組成及び条件と同じである。
ＰＣＲ後、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動完了後、ＴＡＥバッファーで１００００倍に希釈したＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（TaKaRa）溶液に３０分間漬けてアガロースゲルを染色し、ＵＶトランスイルミネーターでＰＣＲ増幅産物を観察した。結果を図８及び９に示す。なお、図８及び９中の１〜１６のサンプル番号は以下をあらわしている。
1: PMA、AMSA非添加
2: PMA、AMSA添加
3: PMA、AMSA、0.01%SDS添加
4: PMA、AMSA、0.01%TritonX-100添加
5: PMA、AMSA非添加
6: PMA、AMSA添加
7: PMA、AMSA, 0.01%SDS添加
8: PMA、AMSA, 0.01%TritonX-100添加
9: PMA、AMSA非添加
10: PMA、AMSA添加
11: PMA、AMSA、0.01%SDS添加
12: PMA、AMSA、0.01%TritonX-100添加
13: PMA、AMSA非添加
14: PMA、AMSA添加
15: PMA、AMSA、0.01%SDS添加
16: PMA、AMSA、0.01%TritonX-100添加
【図１】
2011142865.tif 000008
【図２】
2011142865.tif 000009
【図３】
2011142865.tif 000010
【図４】
2011142865.tif 000011
【図５】
2011142865.tif 000012
【図６】
2011142865.tif 000013
【図７】
2011142865.tif 000014
【図８】
2011142865.tif 000015
【図９】
2011142865.tif 000016
【配列表】
2011142865000001.app