(57)【要約】【課題】植物由来のバイオマスの効率的な糖化を目指し、セルロースの分解性をさらに向上させた新規なセルラーゼを提供する。【解決手段】A.aculeatus、好ましくはA.aculeatus No.F-50株由来のβ−グルコシダーゼ１の触媒ドメイン又はカルボキシメチルセルラーゼ１の触媒ドメインと、当該ドメインのＣ末端側及び／又はＮ末端側に、リンカーを介してA.aculeatus、好ましくはA.aculeatus No.F-50株由来のセロビオハイドロラーゼＩのセルロース結合ドメインを付加する。【選択図】図１
2011223962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
A.aculeatus由来のβ−グルコシダーゼ１の触媒ドメインを含む領域又はA.aculeatus由来のカルボキシメチルセルラーゼ１の触媒ドメインを含む領域と、当該領域に直接的又は間接的に付加されたA.aculeatus由来のセルロース結合ドメインを有するセルラーゼ。
【請求項２】
前記セルロース結合ドメインが、A.aculeatus由来のセロビオハイドロラーゼＩ又はA.aculeatus由来のセロビオハイドロラーゼIIのセルロース結合ドメインである請求項１に記載のセルラーゼ。
【請求項３】
前記セルロース結合ドメインが、A.aculeatus由来のβ−グルコシダーゼ１の触媒ドメインを含む領域又はA.aculeatus由来のカルボキシメチルセルラーゼ１の触媒ドメインを含む領域のＣ末端側及び／又はＮ末端側に付加された請求項１又は２のセルラーゼ。
【請求項４】
前記A.aculeatusは、A.aculeatus No.F-50株である請求項１〜３のいずれか１項に記載のセルラーゼ。
【請求項５】
配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ないし当該アミノ酸配列において１ないし数個の欠失・置換・付加されたアミノ酸配列を有しかつセルラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１〜４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１の何れかに示される塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項６及び請求項７に記載の配列を有するポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項１０】
前記形質転換細胞が、大腸菌、枯草菌、糸状菌、酵母の何れかである請求項９に記載の形質転換細胞。
【請求項１１】
請求項１〜４の何れか１項に記載のセルラーゼ、又は請求項９若しくは１０に記載された形質転換細胞を用いて植物系バイオマスを糖化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規セルラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスから生産する燃料は環境への負荷が小さく、資源として豊富であり、地球上に植物が存在する限り消費しても再生可能な資源であるため、化石燃料に代わる有力な燃料として注目を集めている。特に植物由来のバイオマスに著量存在するセルロースからエタノール（バイオエタノール）を生産する方法は、その資源量が多いことやバイオマス資源として世界的に利用可能なこと、エタノールに変換する過程で生成する糖や副産物を用いて石油製品に代わるポリマーを合成できるなどの利点がある。
【０００３】
植物由来のバイオマスからエタノールを生産する場合には、植物が持つセルロースを強酸やセルラーゼを用いて糖化し、その後酵母などによりアルコール発酵を行わせるのが一般的である。
【０００４】
セルラーゼはセルロースを加水分解する酵素の総称で、セルラーゼはその性質により大きく３種類に分類される。１つ目は結晶セルロースに作用し、セルロース鎖の末端から二糖単位で分解するセロビオヒドロラーゼ（cellobiohydrolase：ＣＢＨ）、２つ目は結晶セルロースを分解できないが、非結晶セルロース鎖をランダムに切断するエンドグルカナーゼ（endo-glucanase：ＥＧ）、そして３つ目が可溶化したセロビオース並びにセロオリゴ糖に作用し、グルコースを生成するβ−グルコシダーゼ（β−glucosidase：ＢＧＬ）である。これらの酵素によるセルロース分解において、それぞれ単独の酵素による反応では非常に遅い反応となるが、これらの酵素が複合して作用する場合には、それぞれの酵素が協奏的に作用し、効率的な分解を行うことが知られている（非特許文献１）。
【０００５】
ところで、セルロースはグルコースがβ−１、４結合で連なった直鎖状ポリマーであり、分子同士が互いに水素結合によって結合し強固な結晶構造をとっているため、セルラーゼによるセルロースの分解（糖化）は非常に遅い。また、結晶構造にもＩαとＩβという２相構造があることや、完全な結晶ではない非結晶領域（アモルファス）も含まれていることが知られており、これらに対するセルラーゼの反応性も異なる。さらに、セルロースは水溶性が低く、グルコースの重合度が６〜７程度のセルロースはほとんど水に溶けなくなるという性質もセルラーゼによる分解が困難な要因の一つとなっている。
【０００６】
糸状菌Trichoderma. reeseiはセルロースを分解する酵素として古くから研究され、それが生産するセルラーゼは最強のセルラーゼと言われている。このセルラーゼは結晶性セルロースの分解には優れるものの、単糖を生成する力は弱く、糖化液中にはセロオリゴ糖（β−グルカンオリゴ糖）が多く残ってしまう。また、植物性バイオマスに含まれるような天然のセルロースはセルロース単独で存在することは少なく、ヘミセルロースやリグニンなどを伴うためセルロースを分解するにはまずこれらを除く必要がある。しかし、T.reeseiのセルラーゼはヘミセルラーゼ活性が弱いため、天然セルロースを効率的に分解することができない。
【０００７】
T.reeseiのセルラーゼのこうした弱点を補い、かつT.reeseiのセルラーゼと強い相乗作用を示すセルラーゼ酵素群を生産する微生物として、A.aculeatus No.F-50株が知られている（非特許文献１）。この菌の生産するセルラーゼ酵素群は非常に強い単糖生成力を有することに加え、ヘミセルラーゼ活性も強く、セルロースだけでなくヘミセルロースを含めた植物性バイオマスの糖化に非常に有効である。A.aculeatusは基本的な上記３種類（３分類）のセルラーゼ（ＣＢＨ、ＥＧ、ＢＧＬ）を含む９種類のセルラーゼを生産する。A.aculeatusは３種類のＢＧＬを持つが、いずれも糖転移反応を起こさず単糖のみを生成するというセルロース分解にとっては、非常に優れた特長を持つ（非特許文献２）。中でもＢＧＬ１は、セロビオースだけでなくセロペンタオースやセロヘキサオースなど比較的長鎖のセロオリゴ糖に対しても強い分解活性を有し、単糖のみを生成するためセルロースの糖化に重要な役割を果たす。ＢＧＬ３はＢＧＬ１に比べセロビオースやセロトリオ―スのようなセロオリゴ糖基質に対する活性は低いものの、ＢＧＬ１同様、糖転移反応を起こさず単糖のみを生成する。ＢＧＬ２については、現段階では、ＢＧＬ１と同一の遺伝子から発現するものであるが糖鎖修飾の違いにより別の酵素として取得されたものである、と考えられている。
【０００８】
一方、ＥＧの一種であるcarboxymethylcellulase１（ＣＭＣ１）はA.aculeatusのセルラーゼの中でも発現量が多くセルロースの糖化に重要な役割を果たしていると考えられるが、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を持たないため結晶セルロースに作用することができない。逆に、ＣＭＣ２は、発現量は少ないがＣ末端側にセルロース結合ドメインを持ち、結晶セルロースに作用できるため、結晶セルロース中に部分的に含まれる非結晶部分を分解するのに重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００９】
Exo-glucanaseであるＣＢＨについては、A.aculeatusは２種類のＣＢＨ（ＣＢＨＩ、ＣＢＨII）に加えてさらに１種類のハイドロセルラーゼ（ＨＣａｓｅ）を有する。ＨＣａｓｅはAvicelをほとんど分解しないものの、アルカリ膨潤セルロース（ＡＳＣ）やリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）のような非結晶セルロースに対し高い活性を示す。ＣＢＨＩ及びＣＢＨIIはいずれもＣＢＤを持ち結晶セルロースを末端からセロビオース単位で分解するが、ＣＢＨＩはセルロース鎖の還元末端側から分解するのに対し、ＣＢＨIIは非還元末端側から分解する。
【００１０】
このように、セルラーゼ酵素群によるセルロースの分解においては、最強のセルラーゼ生産菌と言われているT.reeseiよりも有利であるとされるA.aculeatus No.F-50株においてさえ、単糖のみを生成しセルロースの加水分解にその重要な役割を果たすＢＧＬ１や発現量の多いＣＭＣ１はそれぞれセルロースに対する結合性が劣る。一方、セルロースに対する結合性が優れるＣＢＨＩやＣＢＨIIはセロビオース単位でセルロースを加水分解するので、単糖まで分解されず、アルコール発酵に必要とされる単糖（グルコース）の生成効率が悪いという状況にある。
【００１１】
かかる状況下、近年では、セルラーゼ酵素群中の各セルラーゼの最適な混合比を決定する、分子生物学的手法を用いて各セルラーゼの生産量を高める、各セルラーゼ自体の分解能や安定性を高める、異種セルラーゼタンパク質同士を融合させるなど、セルラーゼの機能を改善することについて様々な研究が行われている。この方法の一つとして、例えば、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を利用してセルラーゼの特性、すなわちセルラーゼが不溶性セルロースへ吸着するように改良、改変することが、開示されている。例えば、特開２００９−１４２２６０号公報（特許文献１）や特開２００８−１９３９９０号公報（特許文献２）、特表２００７−５３００５４号公報（特許文献３）、特表２００４−５３６５９３号公報（特許文献４）、特表２００３−５２２５１７号公表（特許文献５）、特表２００１−５０４３５２号公報（特許文献６）などに開示されている。
【００１２】
ＣＢＤは、セルロース加水分解ドメイン（触媒ドメイン）とつながった一つのタンパク質として生産され、セルロースの加水分解に重要な役割を果たす。ＣＢＤはそれ自身分解活性を持たないが、単独でセルロースに結合する能力を有する。ＣＢＤの機能として、不溶性の基質に吸着することで、基質周辺におけるＣＢＤに付随する触媒ドメインの濃度を上昇させてセルロースの分解速度を向上させたり、ＣＢＤの結合によってセルロース鎖間の水素結合を切り離して結晶構造を崩したりすることが知られている（非特許文献３、４）。また、結晶性セルロースを分解するセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）からＣＢＤを除くと可溶性基質に対する反応性は変わらないにも係わらず、結晶セルロースに対する分解活性や親和性が極端に低下することから、ＣＢＤは酵素が結晶セルロースに作用するために必要なドメインであると考えられている（非特許文献５）。逆に、本来ＣＢＤを持たないＥＧの一種にＣＢＤを付加することで結晶セルロースへの親和性や分解能が上昇するという報告もある（非特許文献６）。
【００１３】
しかしながら、これまでに数多くのＣＢＤが見つかっており、現在ではそのアミノ酸配列の相同性によりCarbohydrate-binding module（ＣＢＭ）familiyとして１７種類のFamilyに分類されていることに鑑みると（非特許文献７）、ＣＢＤとセルラーゼの組み合わせが数多く考えられ、あるＣＢＤを付加することによって、特定のセルラーゼ活性が向上することが必ずしも期待できるものでもなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００９−１４２２６０号公報
【特許文献２】特開２００８−１９３９９０号公報
【特許文献３】特表２００７−５３００５４号公報
【特許文献４】特表２００４−５３６５９３号公報
【特許文献５】特表２００３−５２２５１７号公表
【特許文献６】特表２００１−５０４３５２号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Murao S. Kanamoto J. Arai M. Isolation and identification of a cellulolytic enzyme producing microorganisms. J. Ferment Techol.,57, 151, 1979
【非特許文献２】阪本禮一郎 Aspergillus aculeatus No. F-50 のセルラーゼ系に関する研究, 大阪府立大学大学院 博士論文, 1984
【非特許文献３】Bolam DN, Ciruela A, McQueen-Mason S, Simpson P, Williamson MP, Rixon JE, Boraston A, Hazlewood GP, Gilbert HJ Pseudomonas cellulose-binding domains mediate their effects by increasing enzyme substrate proximity. Biochem J 331 (Pt3) 775-781, 1998
【非特許文献４】DIN N, DAMUDE HG, GILKES NR, MILLER RC, WARREN RAJ, KILBURN DG : C1-Cx, revisited: Intramolecular synergism in a cellulose. Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol. 91, pp. 11383-11387, 1994
【非特許文献５】Riedel K, Ritter F, Bauer S, Bronnenmeier K : The modular cellulase CelZ of the thermophilic bacterium Clostridium stercorarium contains a thermostabilizing domain. FEMS Microbiology Letters, 164 261-267, 1998
【非特許文献６】Mahadevan SA, Wi SG, Lee DS, Bae HJ : Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett 287 : 205-211, 2008
【非特許文献７】http://www.cazy.org/index.html
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、植物由来のバイオマス資源の効率的な糖化を目指し、セルロースの分解性をさらに向上させた新規なセルラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のセルラーゼは、Aspergillus aculeatus（A.aculeatus）由来のβ−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）の触媒ドメインを含む領域又はA.aculeatus由来のカルボキシメチルセルラーゼ１（ＣＭＣ１）の触媒ドメインを含む領域と、当該領域にリンカーを介するかあるいはリンカーを介さずに付加されたA.aculeatus由来のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を有するセルラーゼである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、ＣＢＤが付加された、不溶性セロオリゴ糖に対する分解活性の高いβ−グルコシダーゼ、及びＣＭＣに対する分解活性の高いカルボキシメチルセルラーゼが提供される。この何れか又はその両方を使用することによって、植物由来のバイオマス資源の中心であるセルロースを、糖転移反応を起こすことなく、また、発酵プロセスで微生物により資化されないセロオリゴ糖などの分解産物を生じることなく、単糖であるグルコースにまで分解できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＢＧＬ１にＣＢＤが結合したタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターの構築方法を示す図の一部である。
【図２】図１の続図である。
【図３】糸状菌用高発現ベクターpNAN8142の遺伝子構造を示す図である。Ａはその制限酵素地図、Ｂは改変されたプロモーターの構造を示す。
【図４】ＰＣＲ増幅産物の電気泳動による結果を示す画像である。レーン１はcbhl-LC、レーン２はcmc2-LC、レーン３はbgl1、レーン４はcbhII-CL、レーンＭはλDNA Pst I digestである。
【図５】Ａ、Ｂはそれぞれ細胞から遊離された粗タンパク質（酵素）の酵素活性を示す図である。
【図６】生産された粗タンパク質（酵素）の電気泳動による結果を示す画像である。レーン１はＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、レーン２はＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2、レーン３はpNAN8142vector、レーン４はＢＧＬ１、レーン５はＣＢＤCBHI-ＢＧＬ１、レーン６はＢＧＬ１、レーン７は精製されたＢＧＬ１、レーンＭは分子量マーカーである。
【図７】ＢＧＬ１粗タンパク質（酵素）の精製の際におけるカラムクロマトグラムであって、ＡはDEAE-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラム、ＢはButyl-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラムである。
【図８】ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI粗タンパク質（酵素）の精製の際におけるカラムクロマトグラムであって、ＡはDEAE-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラム、ＢはButyl-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラムである。
【図９】ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１粗タンパク質（酵素）の精製の際におけるカラムクロマトグラムであって、ＡはDEAE-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラム、ＢはButyl-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラムである。
【図１０】ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI粗タンパク質（酵素）の精製の際におけるカラムクロマトグラムであって、ＡはDEAE-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラム、ＢはButyl-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラムである。
【図１１】生産された精製タンパク質（酵素）の電気泳動による結果を示す画像である。レーン１、３はＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１、レーン２、４、７はＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、レーン５、６はＢＧＬ１、レーン８はＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2である。
【図１２】生産された精製タンパク質（酵素）のＡＳＣへの吸着を示すグラフである。
【図１３】生産された精製タンパク質（酵素）の基質分解活性を示すグラフである。ＡはＡＳＣの分解を、ＢはＩＣＯＳの分解を示す。
【図１４】生産された精製タンパク質（酵素）の安定性を示すグラフである。Ａは熱安定性を、ＢはｐＨ安定性を示す。
【図１５】生産された精製タンパク質（酵素）のＡＳＣ分解活性を示すグラフである。
【図１６】ＣＭＣ１にＣＢＤが結合したタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ大腸菌発現用ベクターの構築方法を示す図である。
【図１７】ＣＭＣ１にＣＢＤが結合したタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだA.oryzae発現用ベクターの構築方法を示す図である。
【図１８】ＰＣＲ増幅産物の電気泳動による結果を示す画像である。レーン１はcmc1g、レーン２はcmc1c、レーン３はλDNA Pst I digestである。
【図１９】大腸菌により生産されたタンパク質（酵素）の電気泳動（ＩＰＴＧ ０mM）による結果を示す画像である。Ｓは可溶性画分、Ｉは不溶性画分、Ｍは分子量マーカーである。
【図２０】大腸菌により生産されたタンパク質（酵素）の電気泳動（ＩＰＴＧ １mM）による結果を示す画像である。Ｓは可溶性画分、Ｉは不溶性画分、Ｍは分子量マーカーである。
【図２１】A.oryzaeによる生産物の電気泳動の結果を示す画像である。レーン１はＣＭＣ１-ＣＢＤCBHI、レーン２はA.oryzae８１４２である。
【図２２】大腸菌及びA.oryzaeによる生産物を分析した結果であって、Ａはその酵素活性について示す図、Ｂはその電気泳動による結果を示す画像である。Ｎｏ.１−５はＣＭＣ-ＣＢＤCBHIを、Ｎｏ.６−９はＣＭＣ１-ＣＢＤCMC2、Ｎｏ１０はpNAN8142vector、Ｍは分子量マーカーである。
【図２３】ＣＭＣ１-ＢＣＤCBHI粗タンパク質（酵素）の精製の際におけるカラムクロマトグラムであって、ＡはDEAE-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラム、ＢはButyl-TOYOPEARL650Ｍを用いたクロマトグラムである。
【図２４】ＣＭＣ１精製タンパク質（酵素）及びＣＭＣ１-ＢＣＤCBHI精製タンパク質（酵素）の電気泳動による結果を示す画像である。レーン１はＣＭＣ１-ＢＣＤCBHI、レーン２はＣＭＣ１、レーンＭは分子量マーカーである。
【図２５】ＣＭＣ１精製タンパク及びＣＭＣ１-ＢＣＤCBHI精製タンパク質（酵素）の基質への吸着を示すグラフである。ＡはＡＳＣの吸着を、ＢはＩＣＯＳの吸着を示す。
【図２６】ＣＭＣ１精製タンパク及びＣＭＣ１-ＢＣＤCBHI精製タンパク（酵素）の分解活性を示すグラフである。ＡはＡＳＣの分解を、ＢはＩＣＯＳの分解を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のセルラーゼは、（１）Aspergillus aculeatus由来のβ−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）の触媒ドメインを含む領域と当該領域に間接又は直接に付加されたAspergillus aculeatus由来のセルロース結合ドメイン（以下、「ＣＢＤ」という場合がある。）を有するセルラーゼ、又は（２）Aspergillus aculeatus由来のカルボキシメチルセルラーゼ１の触媒ドメインを含む領域と当該領域に間接又は直接に付加されたAspergillus aculeatus  由来のＣＢＤを有するセルラーゼである。本発明において、触媒ドメインとはいわゆる酵素としての活性ないし機能（酵素活性やセルロースに対する結合能）を発揮する最小限度のポリペプチドを意味する。また、ＣＢＤとは、それ自身分解活性を持たないが、単独でセルロースに結合する能力を有する最小限度のポリペプチドを意味する。従って、本発明においては、ＣＢＤに付随するリンカーに相当するポリペプチドはＣＢＤには含まれない。
【００２１】
本発明のセルラーゼはA.aculeatusが生産するセルラーゼのうち、ＣＢＤを有さないセルラーゼに対してＣＢＤセルロース結合ドメインを付加し、結晶性セルロースないし不溶性セロオリゴ糖に対する分解性を向上させたセルラーゼである。A.aculeatusは３種類のβ−グルコシダーゼ（以下「ＢＧＬ」と言う場合がある。）を生産するが、いずれも糖転移反応を起こさず単糖のみを生成するという非常に優れた特長を持つ。その中でもβ−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）は、セロビオースだけでなくセロペンタオースやセロヘキサオースなど比較的長鎖のオリゴ糖に対しても高い活性を持ち、単糖のみを生成する。本発明のセルラーゼ（１）は、このA.aculeatus由来のＢＧＬ１の特徴を利用したものであり、糖転移反応がなく、比較的長鎖のオリゴ糖に対しても高い活性を有するＢＧＬを提供する。
【００２２】
また、A.aculeatusは３種類のエンド−グルカナーゼであるカルボキシメチルセルラーゼ（以下「ＣＭＣ」という場合がある。）を生産するが、その中でもカルボキシメチルセルラーゼ１（ＣＭＣ１）は、A.aculeatusが生産するセルラーゼの中でも発現量が多くセルロースの糖化に重要な役割を果たしていると考えられる。本発明のセルラーゼ（２）はこの発現量の多いセルラーゼに着目したものであり、結晶セルロースに対する分解性を向上させたＣＭＣである。
【００２３】
A.aculeatusの菌株は適宜選択されるが、本発明においては、A.aculeatus No.F-50株が最も望ましく用いられる。この菌株は、他の菌株に比べ、非常に強い単糖生成力を有することに加え、ヘミセルラーゼ活性が強い酵素群を産生するので、セルロースだけでなくヘミセルロースも含有する植物性バイオマスの糖化に非常に有効であると考えられるからである。
【００２４】
A.aculeatusが生産するＢＧＬ１及びＣＭＣ１は、それぞれセルロース結合ドメイン（以下「ＣＢＤ」という場合がある。）を持たない。本発明のセルラーゼは、これらのＢＧＬ１及びＣＭＣ１に対してＣＢＤを付加したものである。本発明において用いられるＣＢＤの由来は問われないが、ＣＢＤとして、A.aculeatusが生産するエキソ−グルカナーゼであるハイドロセルラーゼ（以下「ＣＢＨ」という場合がある。）が有するＣＢＤが好ましく用いられる。A.aculeatusは２種類のＣＢＨを生産し、その両者（ＣＢＨＩ、ＣＢＨII）はいずれもＣＢＤを有し結晶セルロースを末端からセロビオース単位で分解するが、ＣＢＨＩはセルロース鎖の還元末端側から分解するのに対し、ＣＢＨIIは非還元末端側から分解する。しかしながら、セルロースの酵素分解においては、ＢＧＬ、ＣＭＣ、ＣＢＨの３種類の酵素からなる複合系ではそれぞれの酵素が協奏的作用することが望まれるので、A.aculeatusが有する高いセルラーゼ活性に着目すると、A.aculeatusが有する唯一のＣＢＤであるＣＢＨのＣＢＤが望ましいと言える。このＣＢＨのＣＢＤである限り、還元末端側から分解するＣＢＨＩのＣＢＤ及び非還元末端側から分解するＣＢＨIIのＣＢＤのいずれでも差し支えない。また、かかる観点から、本発明においては、ＣＢＤの由来であるA.aculeatusの菌株としても、A.aculeatus No.F-50株が最も望ましく用いられる。
【００２５】
本発明において用いられるＢＧＬ１、ＣＭＣ１のアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列をコードする塩基配列は既に明らかにされている（ＢＧＬ１：Kawaguchi T, et al., Gene. 1996 ）ep 16;173(2):287-8.、ＣＭＣ１：Ooi T, et al., Nucleic Acids Res., 18(19), 5884, 1990）。また、ＣＢＨＩやＣＢＨIIのＣＢＤのアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列をコードする塩基配列も既に明らかにされている（Takada G, Kawaguchi T, Sumitani J, Arai M, Cloning, nucleotide sequence, and transcriptional analysis of Aspergillus aculeatus No. F-50 cellobiohydrolase I (cbhI) gene. J Ferment Bioeng 85:1-9, 1998 31、内藤篤史, Aspergillus aculeatus由来cbhII型セルラーゼ遺伝子のクローニングと高発現. 大阪府立大学 学士論文, 2009）。本発明のセルラーゼにおいては、これらのポリペプチドが有する全てのアミノ酸配列を必ずしも備える必要はなく、いわゆる活性ないし機能（酵素活性やセルロースに対する結合能）を発揮するドメインを備えていればよい。また、当該活性ないし機能を発揮する限り、アミノ酸の一部が欠失、付加、置換、修飾されていても差し支えない。また、塩基配列においても、当該活性ないし機能を発揮する限り、塩基配列の全てを具備する必要はなく、８０％の相同性、好ましくは８５％、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有していればよい。
【００２６】
本発明のセルラーゼ（１）は、A.aculeatus由来のβ−グルコシダーゼ１の触媒ドメインを含む領域と当該領域に間接又は直接に付加されたA.aculeatus由来のＣＢＤを有するＢＧＬである。また、本発明のセルラーゼ（２）は、A.aculeatus由来のカルボキシメチルセルラーゼ１のドメイン領域と当該領域に間接又は直接に付加されたA.aculeatus由来のセルロース結合ドメインを有するＣＭＣである。ここにおいて、間接とは、ＢＧＬ１やＣＭＣ１の触媒ドメインを含む領域とＣＢＤとの間にリンカーを有することを意味する。リンカーは１〜１００程度のアミノ酸から構成される。リンカーはセルラーゼ活性等の酵素活性や機能を有しない部分であって、結合された触媒ドメインとＣＢＤの間に生じる立体障害を防止する機能を有する。リンカーのアミノ酸配列は限定されるものではないが、ドメイン同士の立体的配置の自由度を増すようなアミノ酸配列が好ましく用いられる。自然界で見いだされるＣＢＤにはリンカーが付随している。このようなリンカー、例えばＣＢＨＩやＣＢＨIIのＣＢＤに付随しているリンカー（ペプチド）がそのまま利用される。また、ＣＢＤに付随したリンカー（ペプチド）に、リンカーとして機能するペプチドが結合したペプチドもリンカーとして利用できる。直接とは、ＢＧＬ１やＣＭＣ１の触媒ドメインを含む領域とＣＢＤとの間にリンカーを介しないことを意味する。また、ＣＢＤの結合位置は、ＢＧＬ１やＣＭＣ１のＣ末端側、Ｎ末端側のいずれの位置でもよく、また、それらのＣ末端側、Ｎ末端側双方の位置に付加されてもよい。
【００２７】
本発明のセルラーゼは公知である種々の遺伝子工学的手法を用いて生産される。すなわち、セルラーゼ（１）の生産においては、少なくともＢＧＬ１の触媒ドメインをコードする塩基配列と少なくとも付加するＣＢＤのドメイン領域をコードする塩基配列を含むようにして、必要であればリンカーをコードする塩基配列を介在させて両者を結合し、目的とするセルラーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを作製する。また、セルラーゼ（２）の生産においては、少なくともＣＭＣ１の触媒ドメインをコードする塩基配列と少なくとも付加するＣＢＤのドメインをコードする塩基配列を含むようにして、必要であればリンカーをコードする塩基配列を介在させて両者を結合し、目的とするセルラーゼをコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを作製する。
【００２８】
得られたポリヌクレオチドは、常法によって、プロモーター、ターミネーターなどが付加された発現ベクターに組み入れられる。そして、当該ベクターは宿主細胞に導入されて、セルラーゼ遺伝子が発現してセルラーゼの生産が行われる。この際、大腸菌などの原核細胞を宿主細胞とする場合には、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いればよい。また、Aspergillus属糸状菌などのように真核細胞を宿主細胞とする場合には前記ポリヌクレオチドにイントロン領域を挿入してもよい。宿主細胞が真核細胞である場合、イントロンがスプライシングされたメッセンジャーＲＮＡができ、タンパク質の発現が行われやすいからである。このイントロンはコンセンサス配列を有し、イントロンとして機能する配列であればよく、具体的な配列は適宜決定される。さらに、必要に応じて宿主細胞において生産された酵素を細胞外に分泌するためのシグナル配列が付加される。当該シグナル配列も特定の塩基配列である必要はなく、その機能を発揮する限りにおいて任意的な配列であればよい。例えば、A.aculeatus由来のＢＧＬ１が備えているシグナル配列が用いられる。
【００２９】
配列番号１〜４に示された塩基配列は、本発明のセルラーゼを生産させるためのポリヌクレオチドの塩基配列の一例である。配列番号１〜４に示されたポリヌクレオチドはそれぞれ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２に示されたアミノ酸配列を有するセルラーゼ（ポリペプチド）をコードし、A.aculeatus属糸状菌のような真核細胞を宿主細胞に用いて生産させるために用いられるポリヌクレオチドである。配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１に示されるポリヌクレオチドはシグナル配列を含まない。配列番号１に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドは、A.aculeatus由来ＢＧＬ１のＣ末端側に制限酵素Nsi Iの認識部位とA.aculeatus由来のＣＢＨＩに付随するリンカー（ペプチド）を含むリンカーを介してA.aculeatus由来ＣＢＨＩのＣＢＤが結合したセルラーゼをコードする。配列番号２に示された塩基配列は、A.aculeatus由来ＢＧＬ１のＮ末端側にA.aculeatus由来のＣＢＨIIに付属するリンカー（ポプチド）を介してA.aculeatus由来ＣＢＨIIのＣＢＤが結合したセルラーゼをコードする。配列番号３に示された塩基配列は、A.aculeatus由来ＢＧＬ１のＮ末端側にA.aculeatus由来のＣＢＨIIに付属するリンカー（ペプチド）を介してA.aculeatus由来ＣＢＨIIに付随したＣＢＤが結合し、そのＣ末端側に制限酵素Nsi Iの認識部位とA.aculeatus由来のＣＢＨＩに付随するリンカー（ペプチド）を含むリンカーを介してA.aculeatus由来ＣＢＨＩのＣＢＤが結合したセルラーゼをコードする。配列番号４に示された塩基配列は、A.aculeatus由来ＣＭＣＩのＮ末端側に、制限酵素Nsi Iの認識部位とA.aculeatus由来のＣＢＨＩに付随するリンカー（ペプチド）を含むリンカーを介してA.aculeatus由来ＣＢＨＩのＣＢＤが結合したセルラーゼをコードする。これら配列番号１から配列番号４までで示したポリヌクレオチドは、いずれもイントロンを含んでいる。
【００３０】
本発明において用いるベクターや宿主細胞も限定されるものではないが、宿主細胞としては、原核細胞としては大腸菌や枯草菌などの細菌、また真核細胞としては酵母ないしAspergillus属やTrichoderma属の糸状菌、例えばA.aculeatus又はA.oryzaeが例示される。本発明においては、Aspergillus属の糸状菌が好ましい。Aspergillus属の糸状菌は、ＢＧＬ１、ＣＭＣ１及びＣＢＨが由来するA.aculeatusと同属であり、本発明のセルラーゼが発現しやすいからである。また、A.aculeatusは本発明のセルラーゼだけでなく、セルロースの糖化に必要な他のセルラーゼ酵素群も同時に生産できるので宿主としてより好ましい。ベクターとしては公知の細菌用、糸状菌用、酵母用のものを用いることができる。公知のベクターとして大腸菌用としてｐＢＲ３２２、ｐＫＫ２３３−２、糸状菌用としてはｐＡＵＲ３１６、酵母用としてＹｉｐ５、Ｙｒｐ１９などが例示される。
【００３１】
また、形質転換の方法としても、粒子又は遺伝子銃、アルカリなどを利用した細胞壁の透過、プロトプラスト法、エレクトポレーションなどの公知の方法を用いることができる。
【００３２】
宿主細胞において生産された酵素は、常法により菌体あるいは培養液から抽出される。また、細胞外に酵素が分泌される場合には、菌体あるいは培養液を直接植物系バイオマスの糖化に用いることができる。
【００３３】
本発明の植物系バイオマスを糖化する方法は、上記で得られたセルラーゼ（１）及び／又はセルラーゼ（２）を用いて植物系バイオマスを糖化する方法である。また、本発明におけるセルラーゼ（１）をコードする塩基配列及び／又は本発明にセルラーゼ（２）をコードする塩基配列を有するベクターを形質転換した形質転換体を用いて植物系バイオマスを糖化することもできる。例えば、配列番号１〜４に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドでAspergillus属糸状菌、特にA.aculeatusを形質転換した場合には、形質転換された糸状菌を用いて糖化できる。
【００３４】
植物系バイオマスは、草や木材、農業廃棄物、紙や食料廃棄物などいわゆるゴミのようなバイオマスが例示され、セルロースを含むものであれば特に限定されるものではない。バイオマスの糖化は公知の方法によればよく、バイオマスの粉砕、酸やアルカリを用いた前処理、高温高圧による前処理など各種前処理を経て、上記セルラーゼや形質転換体を用いてグルコースに糖化される。
【００３５】
本発明のセルラーゼ（１）や（２）は、結晶セルロースに対するセルロース結合ドメインを有するので、より緩やかな条件、例えば低い温度における前処理などの場合でも十分に糖化を行える。また、バイオマスによっては前処理を行わずして糖化処理することも可能となる。特に本発明のセルラーゼ（１）は、糖転移反応が少なく、単糖まで十分に分解できる能力を備えているので、糖化処理後に行われるアルコール発酵工程には非常に有利である。
【００３６】
次に、下記実施例に基づいて本発明について詳細に説明する。なお、下記実施例はあくまでも例示であって、本発明は下記の実施例に限られるものではない。
【実施例１】
【００３７】
〔セルラーゼ（１）の作製〕
まず、A.aculeatus由来のβ−グルコシダーゼ１にリンカーを介してA.aculeatus由来のセロビオハイドラーゼＩ（ＣＢＨＩ）又はII（ＣＢＨII）のＣＢＤを結合したセルラーゼを作製した。
【００３８】
A.aculeatus由来のβ−グルコシダーゼ１として、既に塩基配列が決定されているA.aculeatusのF-50株由来のβ−グルコシダーゼ１を用いた。セルロース結合ドメインには、既に塩基配列が決定されているF-50株由来のＣＢＨＩのＣＢＤ及び／又は同ＣＢＨIIのＣＢＤ並びにＣＭＣ２のＣＢＤを用いた。
【００３９】
ＣＢＤを結合したセルラーゼとして、β−グルコシダーゼ１のＣ末端側にＣＢＨＩのＣＢＤを結合したセルラーゼ（ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI）、β−グルコシダーゼ１のＮ末端側にＣＢＨIIのＣＢＤを結合したセルラーゼ（ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１）、β−グルコシダーゼ１のＣ末端側にＣＢＨＩのＣＢＤを、Ｎ末端側にＣＢＨIIのＣＢＤを結合したセルラーゼ（ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI）の３つのセルラーゼ（１）を作製した。セルラーゼ（ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI）のアミノ酸配列は配列番号６に、セルラーゼ（ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１）のアミノ酸配列は配列番号８に、セルラーゼ（ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI）のアミノ酸配列は配列番号１０に示される。また、ＣＭＣのＮ末側にＣＭＣ２のＣＢＤを結合したセルラーゼ（ＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2）も併せて作製した。
【００４０】
１.発現プラスミドの構築
ＢＧＬ１にＣＢＤを付加するため、ＰＣＲによって増幅したA.aculeatusのbgl1遺伝子と、cbhI、cbhII、cmc2からlinker領域とＣＢＤをコードするＤＮＡ配列のそれぞれのうちいずれかをクローニングベクターpBluescript II KS (+)上で結合させ、ＢＧＬ１のＮ末端側にＣＢＨII由来のＣＢＤとLinkerが、ＢＧＬ１のＣ末端側にＣＢＨＩもしくはＣＭＣ２由来のLinkerとＣＢＤが結合するようそれぞれの遺伝子を構築した（図１及び図２）。
【００４１】
次に構築された遺伝子はそれぞれ、糸状菌用高発現ベクターpNAN8142（図３参照：大関（株）による）のプロモーター下流領域にbgl1遺伝子断片を挿入し、宿主であるAspergillus oryzae niaD300株の染色体上にniaD部位で相同組替えを行った。
【００４２】
Ａ.コンピテントセルの調製
Inoueらの方法（Inoue H、Nojima H、Okayama H：High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96：23-28, 1990）に従った。大腸菌（E.coli DH５αF´株）をＬＢ培地plate（Ampicillin含まず）にストリークした後、３７℃で一晩培養した。２Ｌ三角フラスコ中の２５０ｍＬＳＯＢ培地に数コロニーを植菌し、ＯＤ660＝０.４〜０.６になるまで１８℃で振盪培養した。三角フラスコを氷上で１０分間冷却した後、遠心分離（３０００rpm、１０min、４℃）を行った。上清をデカンテーションで除いた後、沈澱した大腸菌をもとの培地に対して１／３量（約８４ｍＬ）の０℃に冷却したTransformation buffer（ＴＢ）（１０ｍＭPIPES、１５ｍＭCaCl2、１５ｍＭKCl、５５ｍＭMnCl2）に懸濁し氷上で１０分間冷却した後、再び遠心分離（３０００rpm、１０min、４℃）を行い、上清を除いた。沈澱した大腸菌を２０ｍＬの０℃に冷却したＴＢに懸濁した後、終濃度７.５％になるようDMSO（Dimethyl Sulfoxide）を添加し氷上で１０分間冷却した。その後エッペンチューブに２００μＬずつ分注し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【００４３】
Ｂ.大腸菌への形質転換
Cohenらの方法（Cohen SN、Chang AC、Hsu L：Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria : genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl AcadSci USA 69：2110-2114,1972）に従って行った。上記で調整されたコンピテントセルを氷上で溶解し、同じく氷上に静置した適量のプラスミド溶液もしくはライゲーション反応液を添加し、氷上で約３０分間静置した。その後、４２℃で４５秒間のヒートショック後、氷上で約２分間静置した。１０００μＬの２×ＴＹ培地を加え、４５分間、３７℃で振盪培養した後、１００μｇ／ｍＬのAmpicillinを含むＬＢ培地plateにスプレッドし、３７℃で一晩培養した。
【００４４】
Ｃ.プラスミドＤＮＡの調製
Alkalinelysis法（Sambrook J.、Russell DW：Molecular Cloning ：a laboratory manual. 1.31-1.34, 2001）に従った。ＬＢplate上で生育したシングルコロニーを２×ＴＹ培地（Ampicillinを含む）１.７ｍＬに爪楊枝を用いて接種し、３７℃にて一晩振盪培養を行った。培養液をエッペンチューブに入れ、遠心分離（１００００rpm、１min）により菌体を回収した。培養上清を取り除いた後、SolutionＩ（５０ｍＭGlucose、１０ｍＭEDTA、２５ｍＭTris-HCl（ｐＨ８.０））を１００μＬ添加し菌体を懸濁した。そこにSolutionII（０２ＮNaOH、１.０％ＳＤＳ）を２００μＬ添加し穏やかに撹拌した。５分間静置した後、SolutionIII（３ＭPotassium acetate（ｐＨ４.８））を１５０μＬ添加し、撹拌後、氷上で１０分間静置した。遠心分離（１５０００rpm、１０min）して上清を回収し、フェノール／クロロホルム抽出し、常温で遠心分離（１５０００rpm、５min）を行った。上清を別エッペンに分取し、２.５倍量のEtOH（ice cold）を加え、氷上で１０分間放置した。４℃にて遠心分離（１５０００rpm、５min）を行い、上清を取り除いた後、７０％EtOH（ice cold）にて洗浄後、再び４℃にて遠心分離（１５０００rpm、５min）を行い、上清を取り除いた後、真空乾燥させた。沈殿を約１００μＬのＴＥbuffer（１０ｍＭTris-HCl、１ｍＭEDTA、ｐＨ８.０）に溶解し、１０ｍｇ/ｍＬRNase A２μＬを添加し３７℃で３０分間放置し、これをプラスミド溶液とした。
【００４５】
Ｄ.アガロースゲル電気泳動
制限酵素等で消化したＤＮＡ断片等を分析するためにアガロース電気泳動に供した。Agarose-LE Classic TypeをＴＡＥbuffer（０.０４Tris、０.０２ＭAcetic acid、１ｍＭEDTA、ｐＨ８.０）に０.７〜１.５％（w/v）となるように加熱融解し臭化エジジウムを０.５μｇ／ｍＬになるように加えアガロースゲルとした。このゲルをＴＡＥbufferで満たされたMupidミニゲル電気泳動装置（Advance社製）に置き、ＤＮＡ溶液に対して１／１０量の１０×Loading Buffer（０.１％Bromophenol blue（ＢＰＢ）、１０％Glycerol、０.５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴＥで容量を調節する）を加えアガロースゲルに負荷した。５０Ｖもしくは１００Ｖの定電圧下で泳動後、トランスイルミネーター（VILVERLOURMAT社製）上でＤＮＡを観察した。
【００４６】
Ｅ.制限酵素処理および修飾酵素処理
制限酵素処理および修飾酵素処理は基本的に添付のプロトコルに従って行った。必要時にフェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。
【００４７】
Ｆ.アガロースゲルからのＤＮＡ断片の回収
Wangらの方法に従った（Wang Z., Rossman TG : Isolation of DNA fragments from agarose gel by centrifugation. Nucleic Acids Research, Vol. 22, No. 14, 2862-2863,1994）。制限酵素処理もしくはＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の断片を含むゲルを切り出しそこから以下のステップで回収を行った。
【００４８】
エッペンチューブの底に穴を開け、その穴を４ｍｍ径の濾紙（FILTER PAPER GA-100,ADVANTEC社製）で塞ぎ、SephadexG-10（ＴＥbufferに膨潤させたもの）を３００μＬ重層し、別のエッペンチューブにのせ遠心分離（１５０００rpm、１min）を行い、ＴＥbufferを取り除いた。上部のエッペンチューブに切り出したアガロースゲルを入れ、新しいエッペンチューブにのせ遠心分離（１５０００rpm、１０min、４℃）し、下部のエッペンに残ったＤＮＡ溶液に対してフェノール抽出、フェノール／クロロホルム抽出を行った後、エタノール沈澱（２.５倍量EtOH、１／１０倍量３ＭSodium acetate（ｐＨ５.２）を添加）を行った。氷上で１０分間静置した後遠心分離（１５０００rpm、１０min、４℃）を行った。沈澱を７０％EtOHで洗浄した後、真空乾燥を行い、適量のＴＥbufferに溶解しこれをＤＮＡ溶液とした。
【００４９】
Ｇ.ライゲーション反応
プラスミドを制限酵素処理した後、電気泳動後アガロースゲルから回収を行い、プラスミドベクターとした。ライゲーション反応条件としてはＤＮＡ断片とベクターのモル比を３：１とし、そこに１０×ligation bufferを全量の１／１０量を加えて撹拌後、T4 DNA ligase（５００unit／μＬ）を１μＬ添加し、１６℃で３時間反応させた。
【００５０】
Ｈ.ＰＣＲ法を用いたＤＮＡ断片の増幅
ＰＣＲ法にはPrime STARHS DNA polymerase（タカラバイオ社製）および各添付bufferを用いた。反応装置はTaKaRa Thermal cycler（タカラバイオ社製）を用いた。反応溶液の調製及び反応条件は以下に示した条件を基本とし、Template、primer対の組合せを表１に示した。但し、cbhIIかＣＢＤとLinkerをコードするＤＮＡ配列を増幅する時のみ、伸長時間を３０秒とした。また、各ＰＣＲ産物をそれぞれbgl1、cbhI-LC、cmc2-LC、cbhIICL-1と命名した。
【００５１】
（ＰＣＲreaction mixture）
Template（０.５ng/μＬ）                         ２
Fprimer（５μＭ）                                ２
Rprimer（５μＭ）                                ２
dNTP Mixture（２.５ｍＭeach）                    ４
５×Prime STAR buffer                          １０
Prime STARHS DNA polymerase（０.６２５Ｕ/μＬ）  ２
Distilled water                                ２８
Total                                          ５０（μＬ）
（ＰＣＲcondition）
Denature        ９８℃      ０min      １０sec
Anneal          ５５℃      ０min        ５sec    ３０cycle
Extend          ７２℃      ３min        ０sec
７２℃    １０min        ０sec      １cycle
【００５２】
【表１】
2011223962.tif 000003
【００５３】
Ｉ.発現プラスミドの構築
上記のＰＣＲ法によって得られたＰＣＲ産物cbhI-LC、cmc2-LCをEcoR IとBamH Iで消化し、pBluescript II KS (+)(pBs)のマルチクローニングサイト内にあるEcoR IサイトとBamH Iサイトに挿入した（pBs-CBDcbhI、pBs-CBDcmc2）。さらに、ＰＣＲ産物bgl1をNsi IとXho Iで消化し、pBs-CBDcbhI及びpBs-CBDcmc2のCBDの５´末端側に付加したNsi Iサイトと、さらにその上流にあるpBsのマルチクローニングサイト内のSal Iサイトに挿入した。これをbgl1の５´末端側に付加したNot Iサイトと、各ＣＢＤの３´末端側に付加したNde Iサイトで切断して目的遺伝子を切り出し、糸状菌用高発現ベクターpNAN8142のマルチクローニングサイト内にあるNot IサイトとNde Iサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドをpNAN-bgl1-CBDcbhI及びpNAN-bgl1-CBDcmc2とした。一方、ＢＧＬ１のＮ末端側にＣＢＤを付加させるため、ＰＣＲ産物cbhII-CL1の５´末端側をXho Iで消化したものを、pH3Kのbgl1遺伝子の翻訳開始点より６４ｂｐ上流にあるXho Iサイトと翻訳開始点から５４ｂｐ下流にあるEco47 IIIサイトに挿入した。これにより、bgl1のシグナル配列（５７ｂｐ）を除き、かつリンカーと触媒ドメインの間に１アミノ酸残基（アラニン）のみの挿入でＢＧＬ１のＮ末端側にＣＢＤを付加させた。これをＣＢＤの５´末端側に付加したXho Iサイトと、bgl1の終止コドンより３１９ｂｐ下流に存在するSph Iサイトで切り出し、pNAN8142のマルチクローニングサイト内にあるXho IサイトとSph Iサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドをpNAN-CBDcbhII-bgl1とし、それぞれ構築された計３種類のプラスミドをA.oryzaeの形質転換に用いた。
【００５４】
ＢＧＬ１のＮ末端及び／又はＣ末端にＣＢＤを結合させるため、bgl1の開始コドンから終止コドンを除く２９３７ｂｐ（図１参照）と、cbhIの１３８４ｂｐ目から終止コドンまでの２４０ｂｐ（図１参照）、cmc2の１１４０ｂｐ目から終止コドンまでの３２７ｂｐ（図１参照）、及びcbhIIの開始コドンから３７７ｂｐ目（図１参照）までをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供することで正しい長さの断片が増幅されたことを確認した（図４）。また、これらを組み合わせて構築した発現プラスミドpNAN-bgl1-CBDcbhI、pNAN-bgl1-CBDcmc2、pNAN-CBDcbhII-bgl1は目的遺伝子を発現ベクターに挿入する際に用いたNot IとNde Iや、Pst I、Sal Iなどを用いて目的遺伝子が正しく挿入されていることを確認した（データを示さず）。
【００５５】
Ｊ.使用試薬等
発現プラスミドの構築に使用した菌株、プラスミド、培地、プライマーなどは以下のとおりである。
ａ）使用菌株
Escherichia coli DH5αF´          F' / endA1 hsdR17(rK-mK+)supE44、thi-1、
recA1, gyrA (Nalr)、 relA1、
Δ(lacZYA-argF)U169 (m80lacZΔM15）
ｂ）使用プラスミド
pNAN8142
pBluescript II KS (+)
pH3K
pUC118、bgl1
pNANBGL1              pNAN8142、bgl1
pGA1                  pSL1180/1190、cbhI
pNANcbhII             pNAN8142、cbhII
pGC2                  pUC118/119、cmc2 genome
ｃ）使用培地
大腸菌の培養には以下の培地を使用した。平板培地には１.５％濃度の寒天を加えた。必要に応じて、終濃度が１００μｇ/ｍＬとなるようにAmpicillinを添加した。
ｉ）ＬＢ培地（ｐＨ７.０）
Polypepton                              １.０％
Bacto-yeast extract（Difco社製）        ０.５％
NaCl                                    ０.５％
ii）２×ＴＹ培地（ｐＨ７.０）
Bacto-tryptone（Difco社製）             １.６％
Bacto-yeast extract（Difco社製）        １.０％
NaCl                                    ０.５％
iii）ＳＯＢ培地（ｐＨ７.０）
Bacto-tryptone（Difco社製）             ２.０％
Bacto-yeast extract（Difco社製）        ０.５％
NaCl                                   １０ｍＭ
KCl                                   ２.５ｍＭ
MgCl2                                    ５ｍＭ
MgSO4                                    ５ｍＭ
ｄ）使用試薬
ｉ）制限酵素、修飾酵素
制限酵素および修飾酵素は、ニッポンジーン社製、東洋紡社製、タカラバイオ社製、あるいはNEW ENGLAND BIOLABS（NEB）社製のものを使用し、それぞれの処理は各社のプロトコルに従った。
制限酵素：BamHI、Eco47III、EcoRI、NdeI、NotI、NsiI、SalI、XhoI
修飾酵素：T4 DNA ligase、Prime STARHS DNA polymelase
ii）プライマー
目的遺伝子の増幅には表２に示すプライマーを使用した。
iii）その他の試薬
その他は特に示さない限り、和光純薬工業社製、またはナカライテスク社製の特級試薬を用いた。
【００５６】
【表２】
2011223962.tif 000004
【００５７】
２.A.oryzaeにおける酵素発現
上記で構築した発現プラスミドをA.oryzaeに形質転換して、酵素を発現させた。
Ａ.プロトプラスト調製
ＭＭ(NH4+)プレートに生育したA.oryzae niaD300株にTween８０／Saline solution（０.０１％Tween80、０.９％NaCl）１２ｍＬを加え、スプレッダーを用いて胞子を集めよく懸濁した。これを５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコ中のＭＭ(NH4+)１５０ｍＬに５ｍＬ加え、３０℃、１６０min-1で１６〜２０ｈ振盪した。培養終了後、菌体をミラクロス上で集菌しProtoplasting Buffer（ＰＢ、０.８ＭNaCl、１０ｍＭNaH2PO4）で洗浄した。回収した菌体の一部を５０ｍＬ容遠心チューブ中のYatalase４０mg、Lysing Enzyme３０ｍｇの入ったＰＢ１０ｍＬに懸濁し、３０℃で１２０分間ゆっくりと振盪しながらインキュベートした。この間、３０分毎にピペッティングによって菌体を穏やかにほぐした。反応後、菌糸などのかすを除くため反応液をミラクロスでろ過し、ろ液を４℃、２０００rpmで５分間遠心した。沈殿をAspergillus Transformation Buffer（ＡＴＢ、０.８ＭNaCl、１０ｍＭTris-HCl（ｐＨ７.５）、５０ｍＭCaCl2）約１０ｍＬに懸濁し４℃、２０００rpmで５分間遠心した。沈殿を適量のＡＴＢに懸濁しプロトプラスト溶液とした。
【００５８】
Ｂ. A.oryzaeの形質転換
プロトプラスト溶液１００μＬ（１×１０-9個-plotoplast／ｍＬ）に２×ＡＴＢを等量加えた各種プラスミド溶液（pNAN８142、pNAN-bgl1-CBDcbhI、pNAN-bgl1-CBDcmc2、pNAN-CBDcbhII-bgl1各１０μｇ-ＤＮＡ）を加えた。この溶液に対し２０％量のPEG solution（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍＭTris-HCl（ｐＨ７.５）、５０ｍＭCaCl2）を添加し、穏やかに混合した。氷上で１０分間静置した後、PEG solution１ｍＬを加えて緩やかに混和した。室温で１０分間静置した後、１０ｍＬのＡＴＢを加えてよく混合し、４℃、２０００rpmで５分間遠心した。沈殿を適量のＡＴＢに懸濁し、４５℃に保温したTop Agar（ＲＭに０.７％のAgaroseを溶解させたもの）５ｍＬと混合し、ＲＭプレート上に重層した。３０℃で３日間培養し、それぞれの形質転換体を得た。なお、取得した菌株をそれぞれ以下のように命名した。
プラスミド                      菌株名
pNAN8142                       A.oryzae8142
pNAN-bgl1-CBDcbh1                A.oryzaeBGL1-CBDCBHI1
pNAN-bgl1-CBDcmc2                A.oryzaeBGL1-CBDCMC1
pNAN-CBDcbhII-bgl1                A oryzaeCBDCBHII-BGL1
【００５９】
Ｃ.培養
目的タンパク質の発現を確認するため、取得された形質転換体をＭＭ(NO3-)で培養した。ＭＭ(NO3-)のGlucoseを５％、NaNO3を１％にした培地１０ｍＬが入った太試験管に１白金耳ずつ植菌し、３０℃、１７０min-1で３日間培養を行った。
【００６０】
Ｄ.ＢＧＬ１及びＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の遊離
ＢＧＬ１は分泌後、菌体表層に結合することが知られている。そこで、菌体表層に結合したＢＧＬ１及び各種ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１を遊離させるため、培養した形質転換体を以下のように処理した。
培養液を、菌体ごとろ紙を敷いたブフナー漏斗に流し込み、吸引ろ過して培地を除いた。ろ紙上に残った菌体を２０ｍＭAcetate buffer（ｐＨ５.０）１５０ｍＬで洗浄し、培地成分を完全に除いた。得られた菌体を培地と等量の遊離バッファー（Cycloheximide２０μｇ／ｍＬ、１ｍＭPhenylmethylsulfonyl fluoride、０.２％TritonＸ-１００、２０ｍＭAcetate buffer（ｐＨ５.０））に加え、３０℃、１６０min-1で４日間振盪した。
【００６１】
Ｅ.活性測定
ＢＧＬ１の酵素活性測定は、ｐＮＰ法により行った。基質として３ｍＭp-Nitrophenyl-β-Ｄ-glucopyranoside（pNP -Glc）溶液（in １００ｍＭ Acetate buffer ｐＨ５.０）を用い、酵素溶液は１００ｍＭAcetate buffer（ｐＨ５.０）で適切な濃度に希釈して用いた。また、ＢＧＬ１の安定化のため酵素溶液の希釈の際に、反応液中に１０μｇのオボアルブミンを含むように１ｍｇ／ｍＬオボアルブミンを加えた。酵素反応は、５分間３７℃でプレインキュベートした酵素溶液１００μＬに、同じくプレインキュベートした基質溶液１００μＬを加えてよく混合し、３７℃にて１０分間反応させることにより行った。反応後、２ｍＬの１ＭNa2CO3を加え反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度からp-Nitrophenol（ｐＮＰ）の吸光係数を用いて遊離したｐＮＰ濃度を算出し、活性を求めた。ブランクには、酵素溶液の代わりに１００ｍＭAcetate buffer（ｐＨ５.０）１００μＬを用いて、基質溶液１００μＬ、１ＭNa2CO3２ｍＬを加えたものを用いた。
【００６２】
また、１unit（１Ｕ）は１分間に１μmolのｐＮＰを遊離させる酵素量と定義し、以下の式により酵素活性を算出した。吸光係数は、ε(405)＝０.０１８５ｍＬ/nmol・cm-1を用いた。
酵素活性（units/ｍＬ）＝
ｘ/１８.５×２.２ｍＬ/（１０min）×（１/０.１ｍＬ）×希釈率
ｘ：Ａ405（ただしtest値からblank値を引いた値とする）
【００６３】
Ｆ.SDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
SDS-PAGEはLeammliの方法（Laemmli UK : Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 : 680-685、 1970）に従った。分離ゲルは９.０％、濃縮ゲルは５％の二層からなるポリアクリルアミドゲル（Acrylamide：N、N'-Methylene bisacrylamide＝２９.２：０.８）を作製した。試料酵素溶液に等量の２×Sample buffer（０.１２５ＭTris-HCl、２０％Glycerol、２％ＳＤＳ、２％1-Mercaptoethanol、０.００１％Bromophenol blue、ｐＨ６.８）を添加し、１００℃で１０分間処理して試料とした。縦型スラブ電気泳動装置（ATTO社製）を用い、泳動用緩衝液（０.１％ＳＤＳ、２５ｍＭTrisbase、１９２ｍＭGlycine）中で２０ｍＡの定電流下で電気泳動を行った。
【００６４】
Ｇ.使用試薬等
酵素発現のために使用した菌株、培地などは以下のとおりである。
ａ）使用菌株
A.oryzae niaD300（RIB40由来）    ΔniaD
A.oryzae BGL1                    bgl1
A.oryzae BGL1株は、A.aculeatusのbgl1を、pNAN8142ベクターを用いてA.oryzaeに組込んだ株であり、西槇らによって取得されたものである（西槇徹、Aspergillus aculeatus 由来b-glucosidase 1 遺伝子の Aspergillus oryzae における高発現、大阪府立大学大学院 修士論文、2003）。
ｂ）使用培地
A.oryzaeの培養には以下の培地を使用した。平板培地には１.５％濃度の寒天を加えた。
ｉ）Minimum medium(NO3-)(ＭＭ(NO3-))(ｐＨ６.５)
Salts solution※                        ５.０％
Trace element mixture※※               ０.１０％
Glucose                                    １.０％
NaNO3                                   ０.３％
ii）Minimum medium(NH4+)(ＭＭ(NH4+))(ｐＨ６.５）
ＭＭ（NO3-）のNaNO3の代わりにAmmonium tartrate ０.１８％を使用したもの。
iii）Regeneration Medium（ＲＭ）    （ｐＨ６.５）
Salts solution※                        ５.０％
Trace element mixture※※               ０.１０％
Glucose                                １.０％
NaNO3                                   ０.３％
NaCl                                   ４.６８％
※Salts solution
KCl                                ２.６％
MgSO4・７H2O                     ２.６％
KH2PO4                           ７.６％
※※Trace element mixture
Mo7O24・４H2O                   ０.１１％
H3BO3                            ０.１１％
CoCl・６H2O                       ０.１６％
CuSO4・５H2O                     ０.１６％
EDTA                            ５.０％
FeSO4・７H2O                     ０.５０％
MnCl2・４H2O                     ０.５０％
ZnSO4・７H2O                     ２.２％
ｃ）使用試薬
プロトプラスト調製のために、以下の酵素を使用した。
Yatalase（タカラバイオ社製）、Lysing Enzyme（Sigma社製）
ｄ）その他の試薬
その他は特に示さない限り、和光純薬工業社製、またはナカライテスク社製の特級試薬を用いた。
Ｈ.結果
上記で構築したpNAN-bgl１-CBDcbhI、pNAN-bgl１-CBDcmc2、pNAN-CBDcbhII-bgl１、及びインサートの入っていないpNAN8142ベクターを用いてA.oryzaeを形質転換した。モノスポア化を２〜３回繰り返し、最終的に得られた株はA.oryzae8142株が１６株、A.oryzae BGL１-CBDCBHI株が８株、A.oryzae BGL１-CBDCMC2株が７株、A.oryzae CBDCBHII-BGL１株が８株となった。
【００６５】
それぞれの株を複数株ずつ培養し、遊離操作を行ってpNP-Glcに対する活性を追跡したところ、A.oryzae8142株では活性がほとんど検出されなかったが、A.oryzae BGL１-CBDCBHI株とA.oryzae CBDCBHII-BGL１株ではA.oryzae BGL１株と同等の活性が検出された（図５）。また、SDS-PAGEによってＢＧＬ１よりサイズが僅かに大きい、それぞれBGL１-CBDCBHI、CBDCBHII-BGL１と思われるタンパク質の存在を確認した（図６）。一方、A.oryzae BGL１-CBDCMC2株では他のＣＢＤ結合型ＢＧＬ１に比べ遊離バッファー当たりの活性が低く酵素生産量も少なかった（図６）。
【００６６】
３.酵素の精製
Ａ.培養
上記１−２のＣ）の方法で種培養を行い、同培地２００ｍＬの入った５００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに種培養した培養液全量を加え、さらに３０℃、１６０min-1で３日間培養した。
【００６７】
Ｂ.粗酵素液の調製
上記２.Ｄ.に示したように、培養した菌体を回収後、Triton Ｘ-１００を含まない遊離バッファー（Cycloheximide ２０μｇｍＬ、１ｍＭPhenylmethylsulfonyl fluoride、２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））を用いて菌体表層から酵素を遊離させた（３０℃、１６０min-1、４days）。次に、この溶液を菌体ごとストッキングで濾して菌体を大まかに除き、更にろ液を遠心分離（４℃、１０８００rpm、３０min）して上清を取得することで菌体を完全に除いた。これを粗酵素液とし、以下の精製に用いた。
【００６８】
Ｃ.精製
各酵素は以下の要領で精製した。
粗酵素液を２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）で平衡化したDEAE-TOYOPEARL650Ｍに吸着させ、０〜０.３ＭNaCl溶液（in２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））１Ｌのリニアグラジェントで溶出した後、pNP-Glcに対する分解活性を示す画分を回収した。次に、回収した活性画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和となるように加え、予め３０％飽和硫酸アンモニウム溶液（in２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））で平衡化したButyl-TOYOPEARL650Ｍに吸着させ、３０〜０％飽和の硫酸アンモニウム溶液（in ２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））１Ｌのリバースリニアグラジェントで溶出した。活性画分を回収し硫酸アンモニウムを加えて８０％飽和とし、硫安塩析を行った。遠心分離（４℃、１０８００rpm、３０min）によって沈殿を回収後、少量の２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）に溶解した。これを、透析膜（三光純薬社製）を用いて２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）中で一晩透析し精製サンプルとした。一方、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、ＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１は等量の９９.５％エタノールを加えることによりエタノール沈殿を行った。沈殿を遠心分離（４℃、８０００rpm、３０min）によって回収し、５０％エタノール溶液（in ２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））で洗い、遠心分離（４℃、８０００rpm、３０min）によって再び沈殿を分離した。この洗浄を２回行った後、上清を完全に除き、デシケーターを用いて減圧乾燥し、沈殿を適量の２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）に溶解させ精製サンプルとした。
【００６９】
Ｄ.活性測定
上記２.Ｅ.活性測定と同様に行った。
【００７０】
Ｅ.SDS-PAGE
上記２.Ｆ.活性測定と同様に行った。
【００７１】
Ｆ.タンパク質量の測定
タンパク質量は２８０ｎｍの吸光度から、各酵素の吸光係数を用いて算出した。
各酵素の吸光係数はGillらの方法（Gill SC, Hippel PH : Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem 182 : 319-326, 1989）を参考に、Trpのモル吸光係数を５６９０cm-1・Ｍ-1、Tyrを１２８０cm-1・Ｍ-1、Cysを１２０cm-1・Ｍ-1とし、アミノ酸の一次配列から推定した。
【００７２】
Ｇ.結果
A.oryzaeで生産させたＢＧＬ１及びＣＢＤ結合型ＢＧＬ１をDEAE-TOYOPEARL650ＭやButyl-TOYOPEARL650Ｍ、またはPhenyl-TOYOPEARL650Ｓを用いて精製した（図７〜９）。各種精製酵素をSDS-PAGEに供したところ、ＢＧＬ１は約１３０kDa、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIは約１４０kDa、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１は約１４５kDa、ＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2は約１３０kDaの位置にそれぞれ単一のバンドが見られ、電気泳動的に均一なタンパク質として精製されたことが確認された。その結果を図１１及び表３に示す。
【００７３】
【表３】
2011223962.tif 000005
【００７４】
４.酵素の性質
次に、上記で精製された酵素を用いてＢＧＬ１へのＣＢＤ結合による影響を調べた。
Ａ.アルカリ膨潤セルロース（ＡＳＣ）の調製
ＡＳＣはHashの方法（Hash JH, King KW : On the nature of the b-glucosidases of Myrothecium verrucaria. J Biol Chem, 232 : 381-393, 1958）を用いてフナセル（フナコシ社製）から調製した。フナセル６gを氷冷した３５％NaOH２００ｍＬ中に攪拌しながら徐々に加えて浸漬させ、３０min静置した。その後、氷冷した蒸留水３Ｌを投入し、HClを加えてｐＨ３.０に調整した。ｐＨ調整後、４℃で３０〜４０min静置することでＡＳＣを沈殿させ、デカンテーションで上清を除き、予め４℃で冷やしておいた蒸留水３Ｌを加えた。これを５回繰り返した後、ＡＳＣを遠心分離（１０８００rpm、３０min、４℃）によって分離し、沈殿を再び蒸留水に懸濁した。これを５回繰り返した後、再び蒸留水に懸濁し、ULTRASONIC DISRUPTOR UD-201（TOMY社製）を用いて超音波破砕を行った（output８、duty５０、１０min、インターバル１０min、６セット）。蒸留水を加えて全量約４００ｍＬとし、ＡＳＣのストック液とした。還元糖量及び全糖量（Dubois M, Gilles K., Hamilton JK, Rebers PA, Smith F : A colorimetric method for the determination of sugars. Anal Chem 28 (3), 350-356, 1956）を測定し平均重合度を算出した。また、酵素反応の基質としては全糖量から求めたストック液の濃度を元に、１％（w/v）ＡＳＣ懸濁液（in ２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））として使用した。
【００７５】
Ｂ.基質特異性の検討
ａ）pNP-Glcに対する活性
pNP-Glcに対する活性は上記２.Ｅ.活性測定と同様に行った。
ｂ）Salicinに対する活性
Somogyi-Nelson法（福井作蔵：生物化学実験法１、還元糖の定量法、第２版、1990）により行った。適度に希釈した酵素溶液１００μＬl１％Salicin（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））１００μＬを混合し、３７℃で１０分間反応させた。Somogyi液５００μＬを加えることで反応を停止させ、蒸留水を加えて全量を１ｍＬとし、沸騰水中で１５分間煮沸した。煮沸後、流水で５分間冷やし、速やかにNelson液５００μＬを加えてよく混合した。２０分間静置させた後、イオン交換水３.５ｍＬを加えてよく混ぜ、５００ｎｍの波長の吸光度を測定した。得られた値を、グルコースを用いて得られたスタンダードカーブに代入し、還元糖量を算出した。１unitは１分間に１μmolの還元糖を生成する酵素量と定義した。
【００７６】
Ｃ.Cellobioseに対する活性
Glucose-oxidase法で行った。適度に希釈した酵素液１００μＬに１％Cellobiose（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））１００μＬを混合し、３７℃で１０分間反応させた。１ＭHCl５０μＬを加えることで反応を停止させ、５分間静置した後、中和液（１ＭTris：２ＭNaOH=８：２）５０μＬを加えた。この溶液から１００μＬを取り、発色試薬（グルコースCII-テストワコー（和光純薬社製））１００μＬと混合して３０℃で１５分間発色させ、５００ｎｍの波長の吸光度を測定した。得られた値を、グルコースを用いて得られたスタンダードカーブに代入し、生成グルコース量を算出した。１unitは１分間に２μmolのグルコースを生成する酵素量と定義した。
【００７７】
Ｄ.ＩＣＯＳ分解のタイムコース
１％（w/v）ＩＣＯＳ懸濁液（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）各１００μＬに、適度に希釈した酵素液１００μＬずつを分注することで反応を開始した。反応開始から３０分後、２時間後、４時間後、８時間後、１６時間後にそれぞれ１ＭHCl５０μＬを加えて反応を停止させ、上記Ｃ.Cellobioseに対する活性と同様Glucose-oxidase法で生成グルコース量を算出した。但し、ＩＣＯＳは不溶性のため、中和液を添加後、反応液をエッペンにとり、遠心分離（１５０００rpm、４℃、１０min）して得た上清１００μＬを発色試薬１００μＬと混合することで発色させた。１unitの定義は１分間に１μmolのグルコースを生成する酵素量と定義した。また、雑菌の繁殖を防ぐため、ＩＣＯＳの分解反応液中にはアジ化ナトリウムを０.０２％加えて反応を行った。
【００７８】
Ｅ.ＡＳＣ分解のタイムコース
ＡＳＣの分解は上記Ｄ.ＩＣＯＳ分解のタイムコースと同様の方法で行った。但し、基質量を１％ＡＳＣ懸濁液（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））３００μＬとし、反応時間を３０分、８時間、２４時間、４８時間とした。なお、全ての酵素反応において、ＧＢＬ１及びＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の安定化のため反応液中に１０μｇのオボアルブミンを加えている。
【００７９】
Ｆ.ＡＳＣに対する吸着
既知濃度の各酵素サンプルを任意の割合で希釈し、エッペン中で１ｍｇのＡＳＣと混合（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）、Total volume０.６ｍＬ）して氷上で１２０分間吸着させた。但し、吸着開始から３０分後、１時間後に反応液を軽く振り混ぜた。反応終了後、遠心分離（１５０００rpm、４℃、１min）してＡＳＣとそれに結合した酵素を沈殿させ、上清５００μＬを取得した。得られた上清の吸光度Ａ280から上清中の酵素濃度を算出し、初発酵素濃度との差を求めることで吸着した酵素量を算出した。
【００８０】
Ｇ.熱安定性
酵素２００μＬ（０.２６４μＭ、in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））をエッペンに取り、３０〜７５℃の任意の温度に設定したウォーターバス中で３０分間インキュベートした。インキュベート後、氷中で急冷し、pNG-Glcに対し残存活性を測定した。測定は上記２.Ｅ.活性測定と同様にして行った。
【００８１】
Ｈ.ｐＨ安定性
ｐＨの調整は下記表４に示した各種６０ｍＭのbufferを用いて酵素液を１０倍希釈することで行った。ｐＨ調整を行った酵素液１００μＬ（１.３２μＭ）をエッペンに取り、２５℃のエアインキュベーター中で１５時間静置した。静置後、速やかに１００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）を加えて１０倍に希釈することでｐＨ５.０に戻し、pNP-Glcに対しする残存活性を測定した。測定は上記２.Ｅ.活性測定と同様にして行った。
【００８２】
【表４】
2011223962.tif 000006
【００８３】
Ｉ.使用した試薬等
酵素の性質を調べるために使用した試薬は以下のとおりである。
ｉ）使用試薬
ａ）不溶性セロオリゴ糖（ＩＣＯＳ）
ＩＣＯＳは阪本らの方法（阪本禮一郎、Aspergillus aculeatus No. F-50 のセルラーゼ系に関する研究、 大阪府立大学大学院 博士論文、1984）を用いて仲谷らによってCellulosepowderD（ADVANTEC社製）から調製されたものを使用した。平均重合度は（全糖量）／（還元糖量）比から２６.７と求められている。
ｂ）Somogyi-Nelson試薬
Somogyi液
Na2SO4                        １８％
Na2CO3                        ２.４％
CuSO4・５H2O                   ０.４％
NaHCO3                        １.６％
(CH(OH)COO)2KNa・４H2O         １.２％
Nelson液
(NH4)6Mo7O24・４H2O              ５.０％
Na2HAsO4・７H2O                ０.６％
H2SO4                         ４.６％
【００８４】
Ｊ.結果
精製酵素を用いてＡＳＣに対する吸着検定を行ったところ、ＢＧＬ１ではＡＳＣへの吸着が見られなかったが、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI及びＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１では吸着が確認された（図１２）。両逆数プロット（Seki H, Suzuki A, Maruyama H : Adsorption of egg albumin onto methylated yeast biomass. Journal of Colloid and Interface Science 270 : 304-308, 2004）をとり吸着定数（Ｋa）及び最大吸着量（Ｂmax）を求めたところ、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIとＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１のＫaはそれぞれ６.０×１０6Ｍ-1、８.７×１０6Ｍ-1とＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１の方が僅かに高く、Ｂmaxはそれぞれ０.７８×１０-8mol/mg-ＡＳＣ、０.６４×１０-9mol/mg-ＡＳＣとＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIの方が僅かに高いという結果となった（表５）。なお、ＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2についてはＡＳＣへの吸着が見られなかったため、その他の性質検討は行わないこととした（データは示さず）。
【００８５】
【表５】
2011223962.tif 000007
【００８６】
ＢＧＬ１、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１について可溶性基質（Cellobiose、pNP-Glc、Salicin）に対する分解活性を調べたところ、ＢＧＬ１と各種ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の間に差は見られなかった（表６）。一方、不溶性基質（ＡＳＣ、ＩＣＯＳ）の分解においてはＢＧＬ１とＣＢＤ結合型ＢＧＬ１との間に有意な差が見られた。ＡＳＣに対し３７℃で４８時間は反応させた時点での生成グルコース量を測定したところ、ＢＧＬ１では１１.１μｇ、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIでは１８.１μｇ、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１では１４.７μｇとなり、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１はＢＧＬ１に対しそれぞれ１.６倍、１.３倍のグルコース量を生成した（図１３Ａ）。また、ＩＣＯＳに対する分解では３７℃、１６時間の反応でＢＧＬ１では２４.３μｇのグルコースを生成したのに対し、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１ではそれぞれ３７.０μｇ、３６.１μｇとなりＢＧＬ１に対し共に１.５倍のグルコースを生成した（図１３Ｂ）。
【００８７】
【表６】
2011223962.tif 000008
【００８８】
各種精製酵素の熱やｐＨに対する安定性を調べた。等濃度の酵素液２００μＬを３０〜７５℃の任意の温度で３０分間インキュベートし、急冷後、pNP-Glcに対する残存活性を測定したところ、野生型ＢＧＬ１とＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の間に差は見られなかった（図１４Ａ）。野生型、ＣＢＤ結合型は共に６５℃までは８０％以上の活性を保持していたが、６７.０℃で約５０％の活性を失い、７０℃ではほぼ完全に失活した。また、ｐＨ２.３〜１０.１の任意のｐＨに２５℃で１５時間さらした後、pNP-Glcに対する残存活性を測定したところ、野生型、ＣＢＤ結合型は共にｐＨ２.７〜９.１の範囲では８０％以上の活性を維持していたが、その範囲外では、活性が急激に低下した（図１４Ｂ、表５）。
【００８９】
今回精製したＢＧＬ１のサイズはSDS-PAGEで確認したところ約１３０kDaであった。これは以前の報告（西槇徹、Aspergillus aculeatus 由来β-グルコシダーゼ1のA.oryzaeにおける高発現、 大阪府立大学大学院 修士論文、2003）でA.oryzaeBGL1株から精製されたＢＧＬ１のサイズが約１３０kDaであったことと、またオーセンティックなＢＧＬ１は１３３kDaであること一致した。よって、今回精製されたＢＧＬ１はA.aculeatusのbgl１遺伝子から生産されたものであると断定した。
【００９０】
これに対し各種ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１はLinker及びＣＢＤを結合させた分、分子サイズが大きくなることが予想された。結果、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIとＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１はＢＧＬ１より大きい、それぞれ約１４０kDa、１４５kDaとなり、正しくLinker及びＣＢＤが結合した形で精製されたと推定された。また、これらの酵素について可溶性基質に対する比活性を求めたところ、測定に用いた全ての基質において差は見られず、ＣＢＤ付加によりＢＧＬ１の触媒活性が妨げられることはないとわかった。一方、ＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2はpNP-Glcに対する比活性はＢＧＬ１と同等であるが、SDS-PAGEによってＢＧＬ１と同じ約１３０kDaの位置にバンドが見られたため、Linker及びＣＢＤが結合していないことが疑われた。そのため、ＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2についてＡＳＣに対する吸着を調べたところ、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIなら十分に結合が確認できる濃度（Ａ280=０.２５６）で吸着させたにも関わらず、吸着量を表すＡ280差（（初発Ａ280）−（非吸着画分のＡ280））は僅か０.０２５となり、他のＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の２０％以下であった。また、本酵素は精製ステップの初期である粗酵素液の段階で、既にSDS-PAGEによって約１３０kDaの位置にバンドが示されいることから（データ示さず）、遺伝子が正しく発現されていない、もしくはＣＢＤCMC2またはLinker領域がプロテアーゼの作用を受けやすく、培養もしくは遊離処理の間に切断されてしまったのではないかと考えられる。以上のことからＢＧＬ１-ＣＢＤCMC2はＣＢＤを結合した状態では精製されていないと判断し、以下の検討は行わないことにした。
【００９１】
ＢＧＬ１及びＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１についてＡＳＣに対する吸着検定を行ったところＢＧＬ１では全く吸着がみられなかったのに対し、両ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１はＡＳＣに吸着した。これにより、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１がＣＢＤを結合した形で精製されていることが確認された。吸着定数や吸着最大量についてはそれぞれＫa＝６.０×１０6Ｍ-1、８.７×１０6Ｍ-1、Ｂmax＝０.７８×１０-9mol/mg-ＡＳＣ、０.６４×１０-9mol/mg-ＡＳＣとなった。T.reeseiのＣＢＨＩ及びＣＢＨIIのＫａ、Ｂmaxを参照すると、吸着温度４℃下でＣＢＨＩ、ＣＢＨIIのAvicelに対するＫaはそれぞれ０.９３×１０6Ｍ-1、１.９２×１０6Ｍ-1、Ｂmaxは０.７４×１０-9mol/mg、０.５２×１０-9mol/mgであった（Medve J, St_hlberg J, Tjerneld F : Isotherms for adsorption of cellobiohydrolase I and II from Trichoderma reesei on microcrystalline cellulose. Applied Biochemistry and Biotechnology 66:39-56,1997）。また、同ＣＢＨＩのＢＭＣＣへの吸着のＫaは８.３３×１０6Ｍ-1、Ｂmaxは６.０×１０-9mol/mgである（Reinikainen T, Teleman O, Teeri TT : Effects of pH and high ionic strength on the adsorption and activity of native and mutated cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. 22 : 392-403, 1995）。これらの値と比較すると、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI及びＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１はT.reeseiのＣＢＨＩのAvicelへの吸着と同程度の親和性、最大吸着量を示しており、ＣＢＤが遜色なく機能していると考えられた。
【００９２】
不溶性基質への分解に関しては、各ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の親和性の違いにより、ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の間でも差が見られると予想された。しかし、実際は同じ酵素量、同じ反応時間で測定した時、ＩＣＯＳに対しＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI及びＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１は共にＢＧＬ１の１.５倍のグルコースを生成しているが、ＡＳＣに対してはＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIとＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１の間でも差がみられた。これはＡＳＣへの吸着検定においてＫaがＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIの方が大きいことから、よりＡＳＣを分解するだろうという予想に反するものであった。これについて考察すると、ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１が不溶性基質のＢＧＬ１単独では分解できない部分を分解するには、まず不溶性基質への吸着が起こり、その後触媒ドメインが基質と結合し分解するという段階的な反応が起こっていると予想される（Igarashi K, Wada M, Hori R, Samejima M : Surface density of cellobiohydrolase on crystalline celluloses. A critical parameter to evaluate enzymatic kinetics at a solid-liquid interface. FEBS J 273 : 2869-2878, 2006）。そのため、基質への吸着から触媒ドメインの基質結合への移行がスムーズに行われるか否かも不溶性基質の分解速度に関わってくると考えられる。本研究においてはＮ末端もしくはＣ末端へのＣＢＤ付加という違いにより立体構造的にＣＢＤと触媒部位との空間的位置関係が異なることが予想される。また、両者はLinkerの長さも異なる（ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１の方が１４アミノ酸残基長い）。これらの違いから、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIの方が吸着から分解への移行がスムーズに行われ、ＡＳＣに対しより高い活性を示したのではないかと思われる。一方で、ＩＣＯＳの方は、ＡＳＣ（ＤＰ＝１６５）に対し平均重合度が低く（ＤＰ＝２６.７）、ＢＧＬ１にとってＡＳＣより分解しやすい基質であるため差が見られないと考えら得る。
【００９３】
Ｋ.ＡＳＣの分解試験
ＣＢＤ結合の効果をより厳密に評価するため、さらに以下の試験を行った。なお、ここにおいては、上記と同様の手順にして作製及び精製されたＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI（図１０）についても評価を行った。
１％ＡＳＣ懸濁液（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））各３００μｌに、６.６０μＭＢＧＬ１の溶液１００μｌずつを分注し、３７℃で１６時間反応させた。続けて、６.６０μＭのＢＧＬ１溶液１００μｌ、もしくは段階的に希釈した各種ＣＢＤが結合されたＣＢＤ結合型ＢＧＬ１（０.０９８５−４.８μＭ）１００μｌを加えて３７℃でさらに２４時間反応させ、１ＭHCl１２５μｌを加えて反応を停止させた。以下、Glucose-oxidase法で生成グルコース量を測定した。反応停止後、中和液（１ＭTris：２ＭNaOH＝８：２混合液）１２５μｌを加え、反応液全量をエッペンに取り１３５００rpm、４℃、１０ｍｉｎ遠心分離した上清を取得し、そのうちの１００μｌを９６穴プレート中で発色試薬（グルコースCII テストワコー）１００μｌと混合し、３０℃で１５分間反応させ、波長５００ｎｍにおける吸光度を測定した。得られた値を、グルコースを用いて得られたスタンダードカーブに代入し、生成グルコース量を算出した。blankは前反応（ＢＧＬ１だけを使用）１６時間の時点で１ＭＨＣｌ１００μｌを加えて反応を停止させ、上記と同様の方法で生成グルコース量を算出した。但し、中和液の添加は１００μｌとした。各サンプル（１６時間＋２４時間）の生成グルコース量から、blankの生成グルコース量（１６時間）を差し引き、新たに酵素を添加した時点から新規に生成されたグルコース量を求めた。新たに添加した酵素量に対して新規生成グルコース量をプロットし、ＢＧＬ１を添加したサンプルの新規生成グルコース量（６.９７μｇ）を挟む直近の２点間の一次式からＢＧＬ１と等量のグルコースを生成するのに必要なＣＢＤ結合型ＢＧＬ１量をそれぞれ算出した。なお、加水分解反応において、ＢＧＬ１及びＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の安定化のため反応液中に１０μｇのオボアルブミンを加えた。また、雑菌の繁殖を防ぐため、ＡＳＣの分解反応液中に０.０２％のアジ化ナトリウムを加えて反応を行った。この結果を図１５及び表７に示す。
【００９４】
【表７】
2011223962.tif 000009
【００９５】
ＢＧＬ１及びＢＧＬ１-ＣＢＤCBHI、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIについて可溶性基質（Cellobiose, pNP-Glc, Salicin）に対する分解活性を調べたところ、上記表６に示されたようにＢＧＬ１と各種ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１の間に差は見られなかった。一方、不溶性基質（ASC, ICOS）の分解においてはＢＧＬ１とＣＢＤ結合型ＢＧＬ１との間に有意な差が見られた。また、前反応として、ＢＧＬ１を用いてＡＳＣを３７℃で１６時間分解したところへ、ＢＧＬ１若しくは各種ＣＢＤ結合型ＢＧＬ１を加え、さらに３７℃で２４時間反応させ、新たに生成したグルコース量を測定した。その結果、ＢＧＬ１を加えたものは新たに６.９７μｇのグルコースを生成し、これと等量のグルコースを生成するために必要な酵素量を算出した結果、それぞれＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIは０.０２９９ｎｍｏｌ、ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIは０.０４３７ｎｍｏｌ、ＣＢＤCBHII-ＢＧＬ１-ＣＢＤCBHIは０.０５０４ｎｍｏｌとなり、ＢＧＬ１（０.６６２ｎｍｏｌ）と比べるとそれぞれ２２.２倍、１５.０倍、１３.１倍となった。
【００９６】
このように、A.aculeatus由来のＢＧＬ１のＣ末端側にCBHI由来のLinker及びＣＢＤを、もしくはＮ末端側にCBHII由来のＣＢＤ及びLinkerを付加することによりＢＧＬ１本来の性質を残したまま、不溶性セルロースへの親和性を高め、飛躍的に分解活性を向上させることができた。
【実施例２】
【００９７】
〔セルラーゼ（２）の作製〕
次に、A.aculeatus由来のカルボキシメチルセルラーゼ１にリンカー領域を介してA.aculeatus由来のセロビオハイドラーゼＩ又はIIのセルロース結合ドメインを結合したセルラーゼを作製した。
【００９８】
A.aculeatus由来のカルボキシメチルセルラーゼ１として、既に塩基配列が決定されているA.aculeatusのF-50株由来のカルボキシメチルセルラーゼ１を用いた。セルロース結合ドメインには、既に塩基配列が決定されているF-50株由来のセロビオハイドラーゼＩのＣＢＤ又は同セロビオハイドラーゼIIのＣＢＤを用いた。
【００９９】
ＣＢＤを結合したセルラーゼとして、カルボキシメチルセルラーゼ１のＣ末端側にＣＢＨＩのＣＢＤを結合したセルラーゼ（ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHI）、βカルボキシメチルセルラーゼ１のＣ末端側にＣＢＨIIのＣＢＤを結合したセルラーゼ（ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHI）の２つのセルラーゼを作製した。これらのセルラーゼは、大腸菌及びA.oryzaeの別々の宿主で発現させた。
【０１００】
１.発現プラスミドの構築
大腸菌用にはcmc1のcDNAからシグナル配列と終止コドンを除いた６６６ｂｐをA.oryzae用にはcmc1ゲノム遺伝子の開始コドンから終止コドン直前までの８９５ｂｐ（配列番号５）をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供することで正しい長さの断片が増幅されたことを確認した（図１８）。また、ＰＣＲ産物cmc1g及びcmc1cを実施例１の１.発現プラスミドの項で構築したpBs-CBDcbhI、pBs-CBDCMC2の各cbdの５´側に挿入することでＣＭＣ１のＣ末端側にＣＢＨＩもしくはＣＭＣ２由来のLinker及びＣＢＤが結合するよう遺伝子を構築した。これを発現ベクターpET20b (+)もしくはpNAN8142に組み込むことで、大腸菌用発現プラスミドpET-cmc1c-CBDcbhI、pET-cmc1c-CBDcmc2及び糸状菌用発現プラスミドpNAN-cmc1g-CBDcbhI、pNAN-cmc1g-CBDcmc2を得た。また、インサートを発現ベクターに挿入する際に用いたNot I、Nde Iや、EcoR I、Hinc IIなどを用いて目的遺伝子が正しく挿入されていることを確認した（データ示さず）。
【０１０１】
Ａ.ＰＣＲ法を用いたＤＮＡ断片の増幅
実施例１の１.発現プラスミドの構築における方法と同様の条件で行った。また、各ＰＣＲ産物をそれぞれcmc1g、cmc1cと命名した。Template、primer対の組合せを表８に示した。
【０１０２】
【表８】
2011223962.tif 000010
【０１０３】
Ｂ.発現プラスミドの構築
ＣＢＤ結合型ＣＭＣ１は、大腸菌、A.oryzaeの二通りの宿主で発現させるために、以下の要領でそれぞれの発現プラスミドを構築した。
ａ）大腸菌用発現プラスミドの構築
上記のＰＣＲ法によって得られたＰＣＲ産物cmc1cをXho IとNsi Iで消化し、Sal IとNsi Iで消化したpBs-CBDcbhI及びpBs-CBDcmc2に挿入した。これをcmc1cの５´末端側に付加したNde Iサイトと、各CBDの３´末端側に付加したBgl IIサイトで切断して目的遺伝子を切り出し、pET20b(+)のマルチクローニングサイト内にあるNde IサイトとBamH Iサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドをpET-cmc1c-CBDcbhI、pET-cmc1c-CBDcmc2とし、E.coli JM109（DE3）の形質転換に用いた（図１６）。
ｂ）糸状菌用高発現プラスミドの構築
上記のＰＣＲ法によって得られたＰＣＲ産物cmc1gをXho IとNsi Iで消化し、Sal IとNsi Iで消化したpBs-ＣＢＤcbhI及びpBs-ＣＢＤcmc2に挿入した。これをcmc1gの５´末端側に付加したNot Iサイトと、各ＣＢＤの３´末端側に付加したNde Iサイトで切断して目的遺伝子を切り出し、糸状菌用高発現ベクターpNAN8142のマルチクローニングサイト内にあるNot IサイトとNde Iサイトに挿入した。このようにして得られたプラスミドをpNAN-cmc1g-ＣＢＤcbhI、pNAN-cmc1g-ＣＢＤcmc2としA.oryzaeの形質転換に用いた（図１７）。
【０１０４】
Ｃ.その他遺伝子工学的操作
実施例１の１.発現プラスミドの構築と同様に行った。
【０１０５】
Ｄ.使用試薬等
発現プラスミドの構築に使用した菌株、プラスミド、培地、プライマーなどは以下のとおりである。
ａ）使用菌株
実施例１の１.発現プラスミドの構築に用いたものと同じである。
ｂ）使用プラスミド
pNAN8142
pET20b(+)
pCMG14            pUC18、cmc1（genome）
pCMC31            pUC13、cmc1（cDNA）
及び実施例１で構築したpBs-CBDcbhI、pBs-CBDcmc2
ｃ）使用培地
実施例１の１.発現プラスミドの構築で用いたものと同じである。
ｄ）使用試薬
ｉ）制限酵素、修飾酵素
制限酵素および修飾酵素は、ニッポンジーン社製、東洋紡社製、タカラバイオ社製、あるいは NEW ENGLAND BIOLABS (NEB) 社製のものを使用し、それぞれの処理は各社のプロトコルに従った。
制限酵素：BamH I、Bgl II、Nde I、Not I、Nsi I、Sal I、Xho I
修飾酵素：T4 DNA ligase、PrimeSTAR HS DNA polymelase
ii）プライマー
目的遺伝子の増幅には表９に示すプライマーを使用した。
iii）その他の試薬
その他は特に示さない限り、和光純薬工業社製、またはナカライテスク社製の特級試薬を用いた。
【０１０６】
【表９】
2011223962.tif 000011
【０１０７】
２.酵素発現
２−１.Escherichia coliにおける酵素発現
Ａ.E. coli JM 109（DE3）株の形質転換
実施例１のＢ. A.oryzaeの形質転換と同様の方法で行った。但し、プラスミド溶液はpET20b (+)、pET-cmc1c-CBDcbhI、pET-cmc1c-CBDcmc2を使用した。また、これにより得られた株をそれぞれE. coli pET株、E. coli CMC1c-CBDCBHI株、E. coli CMC1c-CBDCMC2株と命名し、以下の実験に用いた。
【０１０８】
Ｂ.その他遺伝子工学的操作
実施例１のＢ. A.oryzaeの形質転換と同様の方法で行った。
【０１０９】
Ｃ.培養
ＬＢplate上で生育した大腸菌のシングルコロニーを２×ＴＹ培地（Ampicillinを含む） １.７ｍＬに爪楊枝を用いて接種し、３０℃、１３０min-1で１５時間種培養を行った。培養液を、新しい２×ＴＹ培地（Ampicillinを含む）１.７ｍＬ/本×６本にそれぞれ１７μＬずつ植菌し、３本は３７℃で、残り３本は３０℃でさらに６時間培養を続けた。６時間後、各温度３本ずつある培養液に０.１Ｍ Isopropyl-β-Ｄ-thiogalactopyranoside（ＩＰＴＧ）をそれぞれ０μＬ（無添加）、１.７μＬ、１７μＬ加え、同じ温度でさらに６時間培養を続けた。
【０１１０】
Ｄ.菌体抽出液の調製
上記の、菌株、培養温度、ＩＰＴＧ濃度の違う計１８種類の培養液をそれぞれエッペンに移し、遠心分離（４℃、１００００rpm、１min）して上清を除き、菌体を回収した。そこへ２０ｍＭ Acetate buffer (ｐＨ５.０)１ｍＬを加えて菌体を懸濁し、氷水中でよく冷却しながらHandy Sonic UR-20P（TOMY SEIKO社製）を用いて超音波破砕を行った（３０sec、Power７、４セット）。破砕後、遠心分離（４℃、１５０００rpm、１０min）して得られた上清を可溶性画分として取得した。沈殿は２０ｍＭ Acetate buffer (ｐＨ５.０)１ｍＬに懸濁し不溶性画分とした。
【０１１１】
Ｅ.SDS-PAGEによる発現確認
実施例１のＢ. A.oryzaeの形質転換と同様に行った。ただし、分離ゲルの濃度は１５％のものを使用した。
【０１１２】
Ｆ.使用試薬等
形質転換のために使用した菌株、培地などは以下のとおりである。
ａ）使用菌株
Escherichia coli JM109（DE3）
endA1、 recA1、 gyrA96、 thi、 hsdR17 (rk- mk+)、 relA1、 supE44、
Δ(lac-proAB)、[F'、traD36、proAB、lacIqZΔM15]、λ(DE3)
ｂ）使用プラスミド
pET20b (+)、pET-cmc1c-ＣＢＤcbhI、pET-cmc1c-ＣＢＤcmc2
ｃ）使用培地
実施例１のＢ. A.oryzaeの形質転換で使用したものと同じである。
ｄ）使用試薬
特に示さない限り、和光純薬工業社製、またはナカライテスク社製の特級試薬を用いた。
【０１１３】
Ｇ.結果
上記で構築したpET-CMC1c-CBDcbhI、pET-CMC1c-CBDcmc2及びインサートの入っていないベクターpET20b (+) を用いてE. coli JM109（DE3）を形質転換した。取得した各菌株が目的遺伝子を持つことは、培養した形質転換体からプラスミド抽出を行い、制限酵素処理及びアガロースゲル電気泳動により確認した（データは示さず）。目的タンパク質の生産を確認するため、それぞれの形質転換体を培養温度とＩＰＴＧ濃度を変えて培養し、菌体破砕液の可溶性画分と不溶性画分をそれぞれSDS-PAGEに供した（図１９及び図２０）。タンパク質ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHI及びＣＭＣ１-ＣＢＤCMC2のアミノ酸は配列から推定される平均分子量はそれぞれ３２１００、３５２００であったが、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIにおいてはどの培養条件においても目的タンパク質の生産は見られなかった。一方、ＣＭＣ１-ＣＢＤCMC2においては各温度及びＩＰＴＧ濃度全ての培養条件において目的タンパク質と思われるバンド（約３５kDa）が確認されたが、いずれも可溶性画分には全く見られず、不溶性画分にのみ存在が確認された。これは、糸状菌由来の酵素のLinker領域には通常、Ｏ−結合型糖鎖が多く付加されるが（Reinikainen T, Teleman O, Teeri TT : Effects of pH and high ionic strength on the adsorption and activity of native and mutated cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. 22 : 392-403, 1995）、大腸菌では糖鎖付加が行われないため、タンパク質の相対的な疎水性が高まり凝集したと考えられる。図２１には、大腸菌及びA.oryzaeによる生産物を分析した結果を示す。
【０１１４】
２−２Aspergillus oryzaeにおける発現
Ａ.A.oryzaeの形質転換
実施例１のＢ. A.oryzaeの形質転換と同様に行った。また、取得した菌株をそれぞれ以下のように命名した。
プラスミド                            菌株名
pNAN-cmc1g-CBDcbhI                      A.oryzae CMC1-CBDCBHI
pNAN-cmc1g-CBDCMC2                      A.oryzae CMC1-CBDCMC2
【０１１５】
Ｂ.培養
実施例１のＢ. A.oryzaeの形質転換と同様に行った。但し、培養は６日間行い、培養３日目に２０％ Glucose溶液１ｍＬを添加した。
【０１１６】
Ｃ.活性測定
基質は０.６２５％ Carboxymethyl cellulose（ＣＭＣ）溶液（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））を用いた。基質４００μＬに酵素液１００μＬを加えて混合し、３７℃で１０分間反応させた。以下、実施例１の４.Ｂ.ｂ）Salicinに対する活性の項で示した通り生成還元糖量をSomogyi-Nelson法により測定した。ただし、ＯＤ500の測定はイオン交換水３.５ｍＬを加えて混合した後、遠心分離（４℃、２０００rpm、１０min）して不溶性成分を分離した上清について行った。
【０１１７】
Ｄ.SDS-PAGE（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
実施例１の２.Ｅ.SDS-PAGEと同様に行った。但し、分離ゲルの濃度は１５％のものを使用した。
【０１１８】
Ｅ.使用試薬等
酵素発現のために使用した菌株、培地などは以下のとおりである。
ａ）使用菌株及びプラスミド
菌株：        A.oryzae niaD300      ΔniaD
プラスミド    pNAN-cmc1g-CBDcbhI、pNAN-cmc1g-CBDcmc2
ｂ）使用培地
実施例１の２.A.oryzaeにおける酵素発現で用いたものと同じである。
ｃ）使用試薬
実施例１の２.A.oryzaeにおける酵素発現で用いたものと同じである。
ｄ）その他の試薬
その他の試薬は特に示さない限り、和光純薬工業社製およびナカライテスク社製の特級試薬を用いた。
【０１１９】
Ｆ.結果
上記で構築したpNAN-cmc1g-CBDcbhI、pNAN-cmc1g-CBDcmc2を用いてA.oryzaeを形質転換した。モノスポア化を２〜３回繰り返し、最終的に得られた株はA.oryzae CMC1-CBDCBHIが５株、A.oryzae CMC1-CBDCMC2が７株であった。目的タンパク質の生産を確認するため、得られた各菌株を複数株ずつ培養し、培養上清を用いてＣＭＣに対する活性測定及びSDS-PAGEを行ったところ、A.oryzae CMC1-CBDCBHI株のうちの１株が他の株に比べ培養液当たり約４倍の活性（６日目で２０.８unit/ｍＬ）を示し、約４５kDaの位置に酵素活性に比例した強度のバンドが検出された（図２１）。よって、この株をA.oryzae CMC1-CBDCBHI株を代表し以下の実験に用いることとした。一方、A.oryzae CMC1-CBDCMC2株においては、いずれも培養液当たりの活性が低く（６日目で２.８２unit/ｍＬ）、SDS-PAGEにおいてＣＭＣ１-ＣＢＤCMC2と思われるタンパク質の生産も確認できなかったため（データは示さず。）、今回は大量生産が確認されたＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIのみを精製し、以下の性質の検討に用いることとした。
【０１２０】
４.酵素の精製
Ａ.粗酵素液の調製
実施例１の３.Ａ.酵素の精製と同様の方法で種培養を３日間行った後、本培養を４日間行った。但し、本培養の３日目に栄養源の枯渇によるプロテアーゼの生産を抑えるため２０％ Glucose／５％NaNO3溶液を培地の１／４量加えた。培養後、培養液を菌体ごとストッキングで濾して菌体を大まかに除き、ろ液を遠心分離（４℃、１０８００rpm、３０min）して上清を取得することで菌体を完全に除いた。これを粗酵素液とし、以下の精製に用いた。
【０１２１】
Ｂ.精製
ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIの精製は以下の要領で行った。
粗酵素液に硫酸アンモニウムを加えて３０％飽和とし、予め３０％飽和硫酸アンモニウム溶液（in ２０ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））で平衡化したButyl-TOYOPEARL 650 Ｍに吸着させ、３０〜０％飽和の硫酸アンモニウム溶液１Ｌのリバースリニアグラジェントで溶出した。ＣＭＣに対し活性を有する画分を回収し、回収した活性画分に硫酸アンモニウム８０％飽和として硫安塩析を行った。遠心分離（４℃、１０８００rpm、３０min）により沈殿を回収後、少量の２０ｍＭGlycine-HCl buffer（ｐＨ３.５）に溶解し、予め２０ｍＭ Glycine-HCl buffer（ｐＨ３.５）で平衡化したBio-Gel P-2に通して脱塩した。脱塩後、活性画分を回収し、予め２０ｍＭ Glycine-HCl buffer（ｐＨ３.５）で平衡化したSP-TOYOPEARL 650Ｍに吸着させ、０〜０.３ＭNaCl １Ｌのリニアグラジェントによって溶出した。活性画分を回収後、再び硫酸アンモニウム８０％飽和として硫安塩析を行い、遠心分離（４℃、１０８００rpm、３０min）により沈殿を回収後、少量の２０ｍＭAcetate buffer（ｐＨ５.０）に溶解し、Viva Spin 20を用いて脱塩した。このようにして得られた溶液を精製サンプルとした。
【０１２２】
Ｃ.活性測定
実施例１の２.Ｅ.活性測定と同様に行った。
【０１２３】
Ｄ.SDS-PAGE
【０１２４】
実施例１の２.Ｆ.SDS-PAGEと同様に行った。但し、分離ゲルの濃度は１２.５％のものを用いた。
【０１２５】
Ｅ.タンパク質量の測定
実施例１の３.Ｆ.タンパク質量と同様に行った。
【０１２６】
Ｆ.使用試薬等
酵素の精製に使用した菌株などは次のとおりである。
ａ）使用菌株
A.oryzae CMC1-CBDCBHI、A.oryzae 8142
ｂ）使用培地
実施例２の２.酵素発現に用いたものと同様である。
ｃ）使用試薬
特に示さない限り、和光純薬工業社製、またはナカライテスク社製の特級試薬を用いた。
【０１２７】
５.酵素の性質
Ａ.基質特異性の検討
酵素反応後の生成還元糖量を上記実施例２の５.Ａ.基質特異性の検討と同様Somogyi-Nelson法によって測定した。１unitは、１分間当たりに１μmolの還元糖を生成する酵素量と定義した。
ａ）ＣＭＣに対する活性
実施例２の２−２、Ｃ.活性測定の項と同様の方法で行った。
ｂ）ＡＳＣに対する活性
０.５％ＡＳＣ懸濁液（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）１００μＬに酵素液１００μＬを加え、３７℃で１時間反応させた。
ｃ）ＩＣＯＳに対する活性
０.５％ＩＣＯＳ懸濁液（in １００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０））１００μＬに酵素液１００μＬを加え、３７℃で４時間反応させた。
ｄ）Avicelに対する活性
１％Avicel懸濁液２００μＬに、それぞれΔＯＤ500値が同じ値を示すように希釈した酵素液５００μＬを加え、３７℃で２４時間反応させた。
【０１２８】
Ｂ.不溶性基質に対する吸着
ａ）ＡＳＣに対する吸着
実施例２の５.Ａ.基質特異性の検討と同様の方法で行った。
ｂ）Avicelに対する吸着
ＡＳＣに対する吸着と同様に行った。ただし、吸着に用いるAvicel量は１０ｍｇとした。
【０１２９】
Ｃ.熱安定性試験
実施例２の５.Ａ.基質特異性の検討と同様の方法で行った。但し、酵素液は０.６８５μＭのものを２００μＬ使用し、残存活性はＣＭＣに対する活性を実施例２の２−２、Ｃ.活性測定の項と同様の方法で行った。
【０１３０】
Ｄ.ｐＨ安定性
ｐＨの調整は実施例１の５.Ｈ.ｐＨ安定性の項に示したbufferに加え、下記表１０に示したbufferを用いて酵素液を１０倍希釈することで行った。ｐＨ調整を行った酵素液２００μＬ（１.３７μＭ）をエッペンに取り、２５℃のエアインキュベーター中で４時間静置した。静置後、ｐＨ２.３〜９.６までのものには１００ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）を加えて１０倍に希釈することでｐＨ５.０に戻した。一方、ｐＨ１０.１以上のものについては２００ ｍＭ Acetate buffer（ｐＨ５.０）を加えて７倍に希釈することでｐＨ５.０に戻し、それぞれＣＭＣに対する残存活性を上記実施例２の５.と同様の方法で測定した。
【０１３１】
【表１０】
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【０１３２】
Ｅ.使用試薬等
酵素の性質に使用した菌株などは次のとおりである。
ａ）使用酵素
ＣＭＣ１、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHI
ＣＭＣ１は、A.aculeatusのcmc1をpNAN8142ベクターを用いてA.oryzaeで発現させたものであり、小林ら（小林恵理子 : Aspergillus aculeatus No. F-50株由来セルラーゼ成分の再構成系による相乗効果の検証, 大阪府立大学 学士論文, 2005）によって精製されたものである。
ｂ）その他の試薬
実施例１の４.酵素の性質で用いたものと同じである。
【０１３３】
Ｆ.結果
A.oryzaeで生産させたＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIをButyl-TOYOPEARL 650Ｍ及びSP-TOYOPEARL 650Ｍを用いて精製した（図２３、表１１）。精製したＣＭＣ-ＣＢＤCBHIをSDS-PAGEに供したところ、約４５kDaの位置に単一のバンドが観察され、電気泳動的に均一なタンパク質として精製されたことが確認された（図２４）。このサイズはアミノ酸配列から推定される平均分子量３２１００よりかなり大きいが、これはLinker領域への糖鎖付加によるものと考えられる（Srisodsuk M, Reinikainen T, Penttila M, Teeri TT : Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose. Journal of Biological Chemistry 268 : 20756-20761, 1993）。よって、これを精製ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIとし、既に精製されているＣＭＣ１（小林恵理子 : Aspergillus aculeatus No. F-50株由来セルラーゼ成分の再構成系による相乗効果の検証, 大阪府立大学 学士論文, 2005）を用い、以下の性質検討を行うこととした。
【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
不溶性セルロースに対する吸着を調べるため、ＡＳＣとAvicelに対して吸着検定を行った。その結果、野生型のＣＭＣ１はＡＳＣに対し、僅かな吸着しか見られなかったが、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIではＣＭＣ１と比べ明らかに吸着量が増加した。また、Avicelに対する吸着では、ＣＭＣ１はほとんど吸着が見られなかったが、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIではどちらの高い吸着活性を示した（図２５）。両逆数プロットをとって、吸着定数Ｋa及び吸着最大量Ｂmaxを算出したところ、ＡＳＣに対するＫa及びＢmaxはそれぞれ、ＣＭＣ１では０.７７×１０6Ｍ-1、０.３２×１０-9mol/mg-ASCとなったのに対し、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIでは２７×１０6Ｍ-1、０.９７×１０-9mol/mg-ASCとなり、親和性が約３５倍に、最大吸着量が約３倍に高まった。さらに、Avicelに対する吸着においてはＣＭＣ１ではほとんど吸着が見られなかったのに対し、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIではＫaが１.２×１０6Ｍ-1、Ｂmaxが０.１３×１０-9mol/mg-Avicelとなった。これらの結果より、ＣＢＤ付加により不溶性基質への親和性が向上したことが確認された（表１２）。
【０１３６】
次に、両酵素の基質特異性を調べた。可溶性基質であるCMCに対する両酵素の比活性には、ほとんど差がみられなかった。一方、不溶性基質であるＩＣＯＳ、ＡＳＣ、Avicelに対する活性はＣＭＣ１とＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIの間に有意な差が見られた。ＡＳＣを基質として３７℃で１時間反応させ、酵素活性を算出したところ、ＣＭＣ１及びＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIの活性はそれぞれ５.７９unit/μmol、６.６５unit/μmolとなり、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIはＣＭＣ１の１.２倍となった。また、ＩＣＯＳに対し３７℃で４時間反応させ、酵素活性を算出したところＣＭＣ１及びＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIの活性はそれぞれ１.５４unit/μmol、２.７８unit/μmolとなり１.８倍の活性となった。さらに、結晶セルロースであるAvicelに対して、等濃度の還元糖量を生成するようＣＭＣ１及びＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIの酵素濃度を調整し、３７℃で２４時間反応させたところ、ＣＭＣ１では０.００５９７unit/μmolとなったのに対し、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIでは０.０２６３nit/μmolとなり、４.４倍の活性が得られた（表１３）。これら不溶性基質に対する分解活性の向上は、ＣＢＤが付加されたことによる不溶性基質への親和性の増加によって、触媒ドメインが基質に作用できる領域が増加したことに起因すると考えられた。
【０１３７】
精製されたＣＭＣ１-ＣＢＤCBHI及びＣＭＣ１について酵素の安定性について調べたところ、ＣＭＣ１に比べＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIの熱安定性が僅かに低下していた（図２６Ａ）。等モル濃度に調製した両酵素を３０〜６７.５の任意の温度で３０分間インキュベートし、急冷後、ＣＭＣに対する活性を測定した。その結果、野生型ＣＭＣ１は６２.５℃まで８０％以上の活性を保持していたのに対し、ＣＭＣ１-ＣＢＤCBHIは同温度での残存活性は３２％となった。この熱安定性の低下は触媒ドメインのC末端へのＣＢＤ付加により、耐熱性酵素によく見られるＮ末端とＣ末端の結合やルーズエンド構造の固定（Voutilainen SP, Boer H, Alapuranen M, Janis J, Vehmaanpera J, Koivula A : Improving the thermostability and activity of Melanocarpus albomyces cellobiohydrolase Cel7B. Appl Microbiol Biotechnol 83 : 261-272, 2009）のような活性部位を安定化するような構造に変化をもたらし、熱安定性が低下したものと考えられる。一方、ｐＨ安定性については両酵素の間に差は見られなかった。任意のｐＨで２５℃、４時間インキュベートし、ｐＨ５.０に戻してＣＭＣに対する残存活性を測定したところ、両者は共にｐＨ２〜９.５の間で安定であり、ｐＨ１０以上で不安定化した（図２６Ｂ、表１２）。
【０１３８】
【表１２】
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【０１３９】
【表１３】
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【０１４０】
以上の結果より、ＣＭＣ１にＣＢＨＩ由来のLinker及びＣＢＤを付加することにより不溶性基質への親和性の向上、および分解活性の向上が達成され、ＣＭＣ１の高機能化が図れる。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明によると、セルロース結合ドメインを有し、セルラーゼ活性の高い新規なセルラーゼが提供される。このセルラーゼを用いることによって従来よりもさらに効率的なバイオマスの糖化を行うことができる。
【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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