(57)【要約】【課題】長い繰返し配列を持ち疾患原因となる変異型対立遺伝子のような長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物を、短い繰返し配列を持つ正常型対立遺伝子のような短鎖繰返し配列を持つ遺伝子又は遺伝子産物よりも選択又は優先的に回収する方法を提供する。【解決手段】本発明の長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法は、以下の工程：（ａ）生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、及び（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、を含む。【選択図】図２
2011125219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法であって、以下の工程：
（ａ）生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、及び
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、
を含む、前記長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法。
【請求項２】
前記長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物が、繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患の原因となる変異型対立遺伝子であり、そして、工程（ａ）が、前記疾患が疑われる生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする、請求項１に記載の長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法。
【請求項３】
工程（ａ）では、前記合成標識化ＲＮＡプローブとして、遺伝子又は遺伝子産物中の繰返し配列の５‘側に標識としてビオチンを付加した合成ビオチン化ＲＮＡプローブを使用し、工程（ｂ）では、ＤＮＡ又はＲＮＡと合成ビオチン化ＲＮＡプローブとの結合体を、ビオチン−アビジン反応を利用して回収する、請求項１又は２に記載の長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法。
【請求項４】
さらに、以下の工程：
（ｃ）工程（ｂ）で回収したＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体に、繰返し配列を増幅する疾患遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅する、
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法法。
【請求項５】
繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患が、ハンチントン病、遺伝性の脊髄小脳変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ失調症、筋緊張性ジストロフィー又は脆弱性Ｘ症候群である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法。
【請求項６】
繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患の原因となる長鎖繰返し配列を持った変異型対立遺伝子を生体毎に同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記疾患が疑われる生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、及び
（ｄ）工程（ｂ）で回収したＤＮＡ−合成標識化ＲＮＡプローブ結合体について、変異型対立遺伝子のＳＮＰ部位のタイピングと、それに基づくハプロタイプを決定する、
を含む、前記変異型対立遺伝子の同定方法。
【請求項７】
繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患用のテーラーメイド医薬の調製方法であって、以下の工程：
（ａ）生体から取得したゲノムＤＮＡ全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、
（ｄ）工程（ｂ）で回収したＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体について、対立遺伝子のＳＮＰタイピングと、それに基づくハプロタイプを決定する、及び
（ｅ）工程（ｄ）で同定された対立遺伝子のＳＮＰ部位であって、もう一方の対立遺伝子とはヘテロ接合した前記ＳＮＰ部位に対してＲＮＡｉを引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を調製する
を含む、前記テーラーメイド医薬の調製方法。
【請求項８】
工程（ｅ）で、前記ＳＮＰ部位に対してＲＮＡiを引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を二種以上混合することを特徴とする、請求項７に記載のテーラーメイド医薬の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法と、回収された遺伝子等の利用に関し、より詳細には、トリプレットリピート病のような繰返し配列の異常伸長が原因で発病する疾患の原因遺伝子である変異型対立遺伝子を選択又は優先的に回収する方法とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
繰返し配列の異常伸長が原因で発病する疾患の代表例として、トリプレットリピート病（三塩基リピート病ともいう）がある。トリプレットリピート病は、疾患原因遺伝子中のＣＡＧ、ＣＴＧ、ＣＧＧ等の三塩基の繰返し配列が通常よりも長くなることにより発症する疾患群である。遺伝子の非翻訳領域での三塩基の伸長は、ＲＮＡ転写産物レベルでの異常を引き起こし、翻訳領域での三塩基の伸長は、主にタンパク質レベルでの異常を引き起こす。疾患の重篤度は、三塩基の伸長度（繰返しの数）に依存する。これらの疾患は次世代に遺伝し、さらに異常伸長が進む傾向にあることから、親よりも子供や孫の方で症状が重篤になりやすく、発症年齢も早くなるという特徴を有する。
【０００３】
ＣＡＧ繰返し配列（ＣＡＧリピート）のＣＡＧ三塩基がグルタミンに翻訳される場合、ポリグルタミン病とも呼ばれる。その場合、翻訳後のポリグルタミン鎖は遺伝子産物に含まれてしまう。ポリグルタミン病は、この遺伝子産物の異常伸長したポリグルタミン鎖の原因によって発症すると考えられる。
【０００４】
トリプレットリピート病は、疾患原因遺伝子の遺伝によって起こる病気であるため、疾患の発症の予測は、疾患原因遺伝子をＰＣＲ増幅して電気泳動法による確認、又はゲノムＤＮＡを用いたサザンブロッディング法によって異常伸長した疾患原因遺伝子を確認する等の遺伝子診断により可能である。しかし、トリプレットリピート病の発症機序が詳細にわかっていないため、根本的治療方法は未だ確立していない。
【０００５】
今後の有望な治療方法の一つとして、ＲＮＡ干渉（以下、「ＲＮＡｉ」と略す）による変異型対立遺伝子特異的ＲＮＡｉノックダウンがある。この方法は、疾患原因となる変異型対立遺伝子に特異的な塩基配列をターゲットに、目的の変異型対立遺伝子だけを特異的に発現抑制するものである。この疾患原因となる変異型対立遺伝子の特異的なＲＮＡｉノックダウンは、副作用の少ない安全な治療を実現するための重要な技術となり得る。実際、ＲＮＡｉ誘導技術をトリプレットリピート病に展開する試みがなされている（特許文献１及び２）。特許文献１には、ハンチントン病の原因遺伝子であるハンチンチン遺伝子（以下、「ＨＴＴ遺伝子」と略す）におけるＣＡＧリピートの上流近傍領域にあるｍＲＮＡの特異配列を標的として、該配列に相同な小さな二本鎖ＲＮＡを用いて、ハンチンチン遺伝子の発現抑制を行うことが記載されている。
【０００６】
トリプレットリピート病の疾患原因(対立)遺伝子は、トリプレットリピートの伸長度にのみ異常が生じるため、疾患原因対立遺伝子における変異、すなわち繰返し配列の伸長度は患者毎に変化する。また、患者は、遺伝により、正常なリピート伸長度を持つ（正常）対立遺伝子も受け継ぐ。変異部位であるトリプレットリピートを直接ＲＮＡｉのターゲットにした場合、正常型対立遺伝子までもノックダウンされてしまい、該遺伝子の完全な機能喪失につながる。よって、病因となる変異型対立遺伝子のみを発現抑制する必要がある。トリプレットリピート病のような繰返し配列の異常伸長が原因で発病する疾患にＲＮＡｉを応用する場合には、生体（患者）毎に異なる長鎖の変異型対立遺伝子を特定するための新たな塩基指標が必要となる。
【０００７】
その指標として、一塩基多型（以下、「ＳＮＰ」と略す）が検討されている（非特許文献１）。非特許文献１の技術では、ＣＡＧ繰返し配列の長さとヘテロなＳＮＰとの関係を見つけるために、Long-range  ＰＣＲ増幅産物の分子間ライゲーション操作を含むＳＬｉＣ法と呼ぶ手法を用いる。この手法によれば、変異型対立遺伝子に特異的なＳＮＰを分析期間２週間以内で見つけることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００４／１０１７８７
【特許文献２】ＷＯ２００４／０１３２８０
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌ．５  Ｎｏ．１１  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００８  ｐｐ９５１−９５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
長く伸長した繰返し配列を含む長鎖の変異型対立遺伝子を、クローニングを基本とする従来の手法を使って単離し、その変異型対立遺伝子のＳＮＰを決定することは、非常に多くの時間と労力を要する困難な作業である。しかも、その再現性や正確性について、十分注意を払わなければならない。
【００１１】
上記したように、トリプレットリピート病に代表される繰返し配列の異常伸長が原因で発病する疾患において、その異常伸長を起こした長鎖の変異型対立遺伝子を特定し、その特徴付けを行うことが、治療戦略上、極めて重要である。そこで、本発明の目的は、長い繰返し配列を持ち疾患原因となる変異型対立遺伝子のような遺伝子又は遺伝子産物を、短い繰返し配列を持つ正常型対立遺伝子のような遺伝子又は遺伝子産物よりも選択又は優先的に回収する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明は、また、上記選択又は優先的回収方法により取得された繰返し配列が異常伸長を起こした変異型対立遺伝子の利用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、疾患原因対立遺伝子の回収と同定について鋭意研究する中で、意外にも、繰返し配列含有合成標識化ＲＮＡプローブを用いた新規な方法によって、長鎖繰返し配列を持った変異型対立遺伝子を、短鎖繰返しを持った正常型対立遺伝子よりも優先的に回収することに成功した。上記の知見に基づいて、本発明は、長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法であって、以下の工程：
（ａ）生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、
遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、及び
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、
を含む、前記長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法を提供する。
【００１４】
前記長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物は、特に繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患の原因となる変異型対立遺伝子であり、そして、工程（ａ）は、前記疾患が疑われる生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせることを特徴とする。すなわち、本発明は、繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患の原因となる変異型対立遺伝子の選択又は優先的回収方法であって、以下の工程：
（ａ）前記疾患が疑われる生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、及び
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、
を含む、前記変異型対立遺伝子の選択又は優先的回収方法である。
【００１５】
以下、本発明の長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物の選択又は優先的回収方法、特に変異型対立遺伝子の選択又は優先的回収方法を、単に本発明の選択的回収方法ということがある。また、前記変異型対立遺伝子は、本明細書において、正常型対立遺伝子が持つ繰返し配列よりも伸長し（すなわちリピート数が多く）、その伸長が原因で疾患を誘発するような遺伝子を意味するために使用する。
【００１６】
本発明は、また、繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患の原因となる長鎖繰返し配列を持った変異型対立遺伝子を生体毎に同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記疾患が疑われる生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、及び
（ｄ）工程（ｂ）で回収したＤＮＡ−合成標識化ＲＮＡプローブ結合体について、変異型対立遺伝子のＳＮＰ部位のタイピングと、それに基づくハプロタイプを決定する、
を含む、前記変異型対立遺伝子の同定方法を提供する。
【００１７】
本発明は、また、繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患用のテーラーメイド医薬の調製方法であって、以下の工程：
（ａ）生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、
（ｄ）工程（ｂ）で回収したＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体について、対立遺伝子のＳＮＰタイピングと、それに基づくハプロタイプを決定する、及び
（ｅ）工程（ｄ）で同定された対立遺伝子のＳＮＰ部位であって、もう一方の対立遺伝子とはヘテロ接合した前記ＳＮＰ部位に対してＲＮＡｉを引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を調製する
を含む、前記テーラーメイド医薬の調製方法を提供する。前記「二本鎖ＲＮＡ分子」とは、本明細書において、一本鎖ＲＮＡ同士が全体的又は部分的にハイブリダイズして得られるＲＮＡ分子を意味する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の選択的回収方法によれば、従来の手法と比べて極めて簡単な操作や手順で、長く伸長した繰返し配列を持った変異型対立遺伝子等を選択又は優先的に回収することができる。本発明によれば、変異型対立遺伝子を分析期間１日程度で回収することも可能である。また、回収した核酸をＰＣＲ法により増幅し、電気泳動法を用いて解析することで、長い繰返し配列を持った（すなわち、変異型の）バンドの検出がきわめて容易となる。患者毎に異なる変異型対立遺伝子を格段に早く正確に取得することは、患者毎の疾患原因遺伝子の同定に非常に有効である。また、長鎖繰返し配列含有遺伝子等が病因遺伝子とされる疾患の治療研究や、疾患治療中(治療効果の確認等)や予後の研究にも有用である。
【００１９】
本発明の選択的回収方法は、疾患原因遺伝子が異なっても、その原因となる繰返し配列（ＣＡＧ等）が同じであれば、同じ合成標識化ＲＮＡプローブを用いて選択的回収が可能である。このことは、本発明の大きな特徴かつ利点である。
【００２０】
本発明の変異型対立遺伝子の同定方法によれば、患者毎に異なる変異型対立遺伝子の同定が迅速かつ容易である。本発明によれば、変異型対立遺伝子の選択又は優先的回収を含めても、分析期間１日以内で、患者のＳＮＰハプロタイプを同定することが可能である。同定された情報は、以下に示すテーラーメイド医薬の調製に有用である。
【００２１】
本発明のテーラーメイド医薬の調製方法によれば、前記選択又は優先的回収方法及び同定方法で取得された変異型対立遺伝子を利用することにより、患者毎に最適なテーラーメイド医療を可能とする。それは、生体（患者）毎の変異型対立遺伝子の所定のＳＮＰ部位を調べ、それがヘテロ接合であれば、ＲＮＡｉのためのｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を作成することにより可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の選択的回収方法に従う実験手順と必要な試薬の組成等を示す図である。
【図２】二種類のハンチントン病（ＨＤ）患者由来不死化細胞（(1)Ｃ０１４２；(2)Ｃ０２２１）から調製した未処置のｃＤＮＡ（−）、及び本発明の選択的回収方法によって得られたｃＤＮＡ（＋）を用いて、ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子のＣＡＧ反復配列に対するＰＣＲ増幅を行った後の電気泳動図である。
【図３Ａ】本発明のビオチン化ＲＮＡプローブを用いた選択的回収方法の効果を対立遺伝子判別試験によって解析した図である。ＨＴＴ遺伝子転写配列内に存在する４つのＳＮＰ部位について対立遺伝子判別試験を行った。選択的回収方法を行っていない未処置サンプル（○）を用いて作成された検量線に対して、選択的回収方法で得られたサンプル（●）は、検量線から離れた位置にプロットされた。
【図３Ｂ】図３Ａの４つのＳＮＰ部位のタイピングから推定されるハプロタイプ（対立遺伝子のＳＮＰ構成）を示す図である。
【図４Ａ】ＨＴＴ遺伝子のｒｓ３６３０９９のＳＮＰ部位の対立遺伝子に対して最も強い抑制効果と高いＳＮＰ識別能を示したｓｉＲＮＡ（表６Ａ、表７）について、ＩＣ５０試験を行なった結果を示す図である。
【図４Ｂ】ＨＴＴ遺伝子のｒｓ３６２３３１のＳＮＰ部位の対立遺伝子に対して最も強い抑制効果と高いＳＮＰ識別能を示したｓｉＲＮＡ（表６Ｂ、表７）について、ＩＣ５０試験を行なった結果を示す図である。
【図４Ｃ】ＨＴＴ遺伝子のｒｓ３６２２７３のＳＮＰ部位の対立遺伝子に対して最も強い抑制効果と高いＳＮＰ識別能を示したｓｉＲＮＡ（表６Ｃ）について、ＩＣ５０試験を行なった結果を示す図である。
【図４Ｄ】ＨＴＴ遺伝子のｒｓ３６２２７２のＳＮＰ部位の対立遺伝子に対して最も強い抑制効果と高いＳＮＰ識別能を示したｓｉＲＮＡ（表６Ｄ）について、ＩＣ５０試験を行なった結果を示す図である。
【図５Ａ】本発明の方法に従って判定したＨＤ患者由来不死化細胞の変異型ＨＴＴ遺伝子ハプロタイプに基づき選定したｓｉＲＮＡ（表８に示す個別又は４種混合）をＨＤ患者由来不死化細胞に導入し、ＲＮＡｉを誘導後、ＳＮＰ部位ｒｓ３６３０９９に対して対立遺伝子判別試験を実施した結果である。
【図５Ｂ】本発明の方法に従って判定したＨＤ患者由来不死化細胞の変異型ＨＴＴ遺伝子ハプロタイプに基づき選定したｓｉＲＮＡ（表８に示す個別又は４種混合）をＨＤ患者由来不死化細胞に導入し、ＲＮＡｉを誘導後、ＳＮＰ部位ｒｓ３６２３３１に対して対立遺伝子判別試験を実施した結果である。
【図５Ｃ】本発明の方法に従って判定したＨＤ患者由来不死化細胞の変異型ＨＴＴ遺伝子ハプロタイプに基づき選定したｓｉＲＮＡ（表８に示す個別又は４種混合）をＨＤ患者由来不死化細胞に導入し、ＲＮＡｉを誘導後、ＳＮＰ部位ｒｓ３６２２７３に対して対立遺伝子判別試験を実施した結果である。
【図５Ｄ】本発明の方法に従って判定したＨＤ患者由来不死化細胞の変異型ＨＴＴ遺伝子ハプロタイプに基づき選定したｓｉＲＮＡ（表８に示す個別又は４種混合）をＨＤ患者由来不死化細胞に導入し、ＲＮＡｉを誘導後、ＳＮＰ部位ｒｓ３６２２７２に対して対立遺伝子判別試験を実施した結果である。
【図６】ヒト由来株化細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から調製した未処置のｃＤＮＡ（−）、及び本発明の選択的回収方法によって得られたｃＤＮＡ（＋）を用いて、ＤＲＰＬＡ原因遺伝子（ＡＴＮ１）のＣＡＧ反復配列に対するＰＣＲ増幅を行った後の電気泳動図である。
【図７】ヒト由来株化細胞であるＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞及びＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞から調製した未処置のｃＤＮＡ（−）、及び本発明の選択的回収方法によって得られたｃＤＮＡ（＋）を用いて、ＳＣＡ３原因遺伝子（ＡＴＸＮ３）のＣＡＧ反復配列に対するＰＣＲ増幅を行った後の電気泳動図である。
【図８】ＨＤ患者由来不死化細胞（Ｃ０２２１）から調製した未処置のｃＤＮＡ（−）、及び本発明の選択的回収方法によって得られたｃＤＮＡ（＋）を用いて、ＳＣＡ６原因遺伝子（ＣＡＣＮＡ１Ａ）のＣＡＧ反復配列に対するＰＣＲ増幅を行った後の電気泳動図である。
【図９】本発明の方法に従って判別された疾患アリルへのＲＮＡｉによる疾患遺伝子特異的ノックダウンの概略を示す図である。
【図１０】本発明の方法に従って患者毎の疾患アリルの複数ＳＮＰ部位へＲＮＡｉを誘導することにより、疾患遺伝子を特異的にノックダウンする概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、本発明の選択的回収方法、変異型対立遺伝子の同定方法、及びテーラーメイド医薬の調製方法を説明する。本発明の選択的回収方法は、長い繰返し配列の発現によって発病する疾患の原因となるその変異型対立遺伝子等の長鎖繰返し配列を含有する遺伝子又は遺伝子産物を選択又は優先的に回収する。該方法は、（ａ）生体、特に前記疾患が疑われる生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の、特に疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる工程、及び、（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する工程が必須である。
【００２４】
工程（ａ）：ハイブリダイゼーション
工程（ａ）では、長い繰返し配列を有する変異型対立遺伝子と合成標識化ＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを行う。ここで、本方法が対象とする繰返し配列の異常伸長が原因で発病する疾患の例としては、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄小脳変性症１型（ＳＣＡ１）、脊髄小脳変性症２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳変性症３型（マシャド・ジョセフ病ともいう）（ＳＣＡ３）、脊髄小脳変性症６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳変性症７型（ＳＣＡ７）、脊髄小脳変性症８型（ＳＣＡ８）、脊髄小脳変性症１２型（ＳＣＡ１２）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）[以上、ＣＡＧ三塩基の伸長]、フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）[ＧＡＡ三塩基の伸長]、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）[ＣＴＧ三塩基の伸長]、脆弱性Ｘ症候群[ＣＧＧ三塩基の伸長]等が含まれる。これらのうち、筋緊張性ジストロフィー及び脆弱性Ｘ症候群でトリプレットリピートが遺伝子非翻訳領域に存在し、そしてフリードライヒ失調症ではイントロンに存在し、それ以外の疾患では翻訳領域に存在する。
【００２５】
異常伸長したＣＡＧ三塩基（以下トリプレット塩基とも言うことがある）のトリプレットリピートが全てグルタミンに翻訳されるポリグルタミン病は、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性の脊髄小脳変性症（ＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１２等）及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症が含まれる。
【００２６】
本発明の選択的回収方法を使用する生体は、ヒトを含む生物個体である。好ましくは、ヒトや実験動物である。前記生体からの疾患原因遺伝子の採取には、ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡが含まれているものであればよく、血液、口腔内細胞、体液の一部、毛根鞘の付いた毛髪、皮膚、骨、歯肉、臓器等の組織片やホルマリン固定された組織等が使われる。好ましくは、血液、皮膚、生検組織、前記生体に由来する培養細胞等である。
【００２７】
本発明の選択的回収方法は、生体から取得したゲノムＤＮＡや全ＲＮＡをそのまま使用してもよく、さらに、取得した全ＲＮＡから得られるｃＤＮＡを使用してもよい。ゲノムＤＮＡを使用する場合、目的とする疾患原因遺伝子によっては必要に応じて制限酵素等によるゲノムの断片化を行い、これを用いてもよい。
【００２８】
ｃＤＮＡを使用する場合は、生体の全ＲＮＡから逆転写反応を行うことでｃＤＮＡを取得する。全ＲＮＡの取得は、従来公知の方法や市販のキットを特に制限なく使用できる。具体的には、Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法やグアニジン−塩化セシウム超遠心法に従って、細胞溶液や組織等の生体試料にタンパク質変性剤を添加して全ＲＮＡを抽出する。ＡＧＰＣ法では、例えば市販のＴＲＩｚｏｌ試薬（登録商標、インビトロジェン社）等を使用することができる。
【００２９】
抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写合成する。逆転写酵素による合成反応の開始には、ＲＮＡ上に反応の開始起点となるプライマーをアニールさせ、３’から５’方向にｃＤＮＡを合成させる。プライマーには、ｍＲＮＡに特徴的なｐｏｌｙＡ構造を対象とするオリゴｄＴプライマー、既知ＲＮＡ配列に特異的なプライマー、ランダムプライマー等がある。逆転写酵素には、Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）由来の逆転写酵素、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ（ＭｏＭｕＬＶ）由来の逆転写酵素、市販品としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（インビトロジェン社）等を用いる。ｃＤＮＡ合成後は、アルカリ水酸化物によるアルカリ処理又はＲＮａｓｅ  Ｈを添加して鋳型ＲＮＡを分解する。
【００３０】
次いで、ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は前記で取得したｃＤＮＡに、疾患遺伝子中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる。疾患遺伝子中の繰返し配列とは、疾患がハンチントン病であればＣＡＧリピートであり、フリードライヒ失調症であればＧＡＡリピートである。患者（生体）にリピート病が疑われる場合、一種類のＲＮＡプローブを用いて、本発明の選択的回収方法を一回実施するだけで、そこから得られるサンプルを使って同種類の繰返し配列（例えばＣＡＧ）を有した各種リピート病原因遺伝子（ＨＤ，ＳＣＡ３等）に対するＰＣＲ解析及びＳＮＰタイピングを実行することができる。つまり、繰返し配列が同じであればリピート病の種類（ＨＤ，ＳＣＡ３等）を問わず、リピート長の判定、そして変異型対立遺伝子のハプロタイプの決定が同時に可能である。
【００３１】
合成ＲＮＡプローブの長さは、通常、１０〜４０塩基でよく、好ましくは１５〜２５塩基であり、特に好ましくは２０塩基である。プローブ長が、１０塩基よりも短すぎると、リピート配列に対して特異性が低くなるという不具合を生じることがある。なお、全ＲＮＡと合成ＲＮＡプローブとをハイブリダイゼーションする場合、合成ＲＮＡプローブの配列は、ターゲット繰返し配列の相補的配列となる。
【００３２】
プローブの標識は、ハイブリダイゼーション後の回収及び精製のために必要であり、回収に使用できるものなら特に限定されない。標識の例には、ビオチン、アビジンやジゴキシゲニンを用いる標識、後に抗原-抗体反応で回収可能なＦＩＴＣ等の蛍光標識やブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等の核酸アナログによる標識が挙げられる。また、プローブとラテックス粒子や磁気を帯びた粒子等を直接又は間接的に結合させたものも使用できる。標識用マーカーの結合位置は、ＲＮＡプローブの５’側、３’側のいずれの末端でもよいが、５’側末端が好ましい。
【００３３】
ハイブリダイゼーション作業は、溶液中で反応させる。ハイブリダイゼーションバッファーには、核酸同士がハイブリダイゼーション可能な塩濃度を含む緩衝溶液であれば特に限定されない。例えば、１０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，３．１Ｍ塩化ナトリウム及び１Ｍクエン酸ナトリウムを用いる。ハイブリダイゼーションバッファーには、核酸同士の結合を調節するための溶液として、ＳＤＳのような界面活性剤、フォルムアミド等を添加することもできる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションの作業は、ＤＮＡ等と合成標識化ＲＮＡプローブとの混合液を、通常、８０〜１００℃、好ましくは９５℃に加熱し、その温度で通常、１〜１０分間、好ましくは５分間保持する。その後、通常、４〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃で、通常、２分間以上、好ましくは３０〜６０分間のアニーリングを行う。反応時の液量は、通常、１０〜２００μＬ、好ましくは２０〜１００μＬで行う。
【００３５】
上記ハイブリダイゼーションによって、意外にも、繰返し配列の長い変異型対立遺伝子が繰返し配列の短い正常型対立遺伝子よりも選択又は優先的にＲＮＡプローブに結合させることができることが判明した。その証拠は、実施例１に示すとおりである。
【００３６】
工程（ｂ）：ｃＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体の回収及び精製
以下、全ＲＮＡより合成したｃＤＮＡを用いた実施例について詳述する。ｃＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収する。例えば、標識がビオチンの場合、ビオチン−アビジン反応による回収及び精製を行えばよい。具体的には、ｃＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体にアビジン−レジン担体（製品名：ＳｏｆｔＬｉｎｋ  Ｓｏｆｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｒｅｓｉｎ、プロメガ社製）を作用させる。
【００３７】
また、ｃＤＮＡと標識プローブとの結合体を効率よく回収及び精製するために、ブロッキングバッファーを添加する。ブロッキングバッファーには、例えば１０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ塩化ナトリウム，１％ウシ血清アルブミン及び１ｍｇ／ｍＬイーストＲＮＡを用いる。ブロッキングバッファーの組成は、核酸のハイブリダイゼーションに使用されるもの、また、各標識法に使用さるものであれば特に限定されない。イーストＲＮＡやＣｏｔ１  ＤＮＡ等の核酸系試薬、血清又はそれに由来するアルブミン、脱脂粉乳又はそれに由来するカゼイン等の蛋白系試薬等が使用できる。
【００３８】
アビジン−レジン担体を効率よく作用させるため、ブロッキングバッファーを添加し、通常、２５〜５０℃、好ましくは３０〜３７℃の一定温度で攪拌しつつ、通常、３０〜１２０分、好ましくは６０分以上作用させる。
【００３９】
攪拌後、変異型対立遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡを、各標識法に基づいて回収する。具体的には、ｃＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体にアビジン−レジン担体を作用させた場合、遠心処理により沈殿物として回収する。標識が磁気粒子であればマグネットにより、ＦＩＴＣ等の蛍光物質やＢｒｄＵ等の化学物質であれば公知の特異的抗体及び公知の回収方法（プロテインセファロース等）により回収すればよい。
【００４０】
回収したｃＤＮＡ結合ビオチン化ＲＮＡプローブ−アビジン−レジン担体から、アビジン−レジン担体を解離させる。通常、アルカリ溶液の添加や加熱によりｃＤＮＡの解離が可能であるが、好ましくは、ビオチン溶液によって解離させる。具体的には、ＳｏｆｔＬｉｎｋ  Ｓｏｆｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｒｅｓｉｎ（プロメガ社）を用いた場合、１０μＬの５ｍＭビオチン溶液により、アビジン−レジン複合体を解離させる。その後、上記に示した遠心処理等の公知の回収方法により、レジン担体を除去し、ｃＤＮＡ−合成標識化ＲＮＡプローブ結合体を得る。
【００４１】
工程（ｃ）：ＰＣＲ増幅
工程（ｂ）で回収したビオチン化ＲＮＡプローブと結合したｃＤＮＡが正常型と変異型のどちらの対立遺伝子であるかを早期に確認したい場合等のために、適宜、繰返し配列を含む領域の増幅を可能にする特異的プライマーを用いて、回収物をＰＣＲ増幅してもよい。例えば、疾患がハンチントン病であれば、実施例１の表２に示すように、ハンチンチン遺伝子のＣＡＧ反復配列を挟み込むようなフォワードプライマーとリバースプライマーとを選択する。ＰＣＲ条件は、従来公知の条件を、疾患遺伝子とそのプライマーに応じて適宜修正して用いる。
【００４２】
上記ＰＣＲ増幅物をゲル電気泳動にかけて、長い繰返し配列を持つ変異型対立遺伝子の発現を確認する。実施例１の図２及び実施例２の図６〜８に示すように、ゲル電気泳動図には繰返し配列の長い変異型対立遺伝子のみが検出され、繰返し配列の短い正常型対立遺伝子が回収されていないことが確認される。また、検出バンドの位置から、繰返し配列の伸長度（リピート数）が把握される。
【００４３】
工程（ｂ）で回収したｃＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体は、生体毎に繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患の原因となる、その長い繰返し配列を持った対立遺伝子を同定する方法に使用することができる。すなわち、本発明は、繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患の原因となる長鎖繰返し配列を持った変異型対立遺伝子を生体毎に同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）前記疾患が疑われる生体から取得したゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、及び
（ｄ）工程（ｂ）で回収したＤＮＡ−合成標識化ＲＮＡプローブ結合体について、変異型対立遺伝子のＳＮＰ部位のタイピングと、それに基づくハプロタイプを決定する、
を含む、前記変異型対立遺伝子の同定方法を提供する。
【００４４】
上記同定方法の（ａ）及び（ｂ）工程は、上記の選択又は優先的回収方法での工程（ａ）及び（ｂ）と同様である。
【００４５】
工程（ｄ）：長鎖変異型対立遺伝子のＳＮＰタイピング
工程（ｄ）では、工程（ｂ）のＤＮＡ−合成標識化ＲＮＡプローブ結合体について、対立遺伝子内のＳＮＰを調べることで、そのハプロタイプを同定する。なお、工程（ｂ）で回収したＤＮＡ−合成標識化ＲＮＡプローブ結合体の代わりに、工程（ｃ）のＰＣＲ増幅物をＳＮＰタイピングに用いることもできる。
【００４６】
ＳＮＰタイピングは、ＴａｑＭａｎ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、一塩基伸長法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ法、ダイレクトシークエンス法等の公知の手法を用いることができる。市販のキットも使用でき、例えば、ＴａｑＭａｎ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（アプライドバイオシステムズ社）等が挙げられる。
【００４７】
各疾患原因遺伝子のＳＮＰ部位は、ハプロタイプのデータベース（ＨａｐＭａｐデータベース，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈａｐｍａｐ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．ｊａ）から公知である。データベースから、ヘテロ接合性の高いＳＮＰ部位を複数選択する。好ましくは２個以上のＳＮＰ部位を選択する。
【００４８】
上記同定方法で得られた変異型対立遺伝子のＳＮＰ部位の生体毎のハプロタイプは、繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患に対するテーラーメイド医薬の調製方法に使用することができる。すなわち、本発明は、繰返し配列の異常伸長によって発病する疾患用のテーラーメイド医薬の調製方法であって、以下の工程：
（ａ）生体から取得したゲノムＤＮＡ全ＲＮＡ又は全ＲＮＡより合成されるｃＤＮＡに、疾患遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖塩基配列中の繰返し配列を含有する合成標識化ＲＮＡプローブをハイブリダイゼーションさせる、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ又はＲＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体を、その標識に基づいて回収及び精製する、
（ｄ）工程（ｂ）で回収したＤＮＡと合成標識化ＲＮＡプローブとの結合体について、対立遺伝子のＳＮＰタイピングと、それに基づくハプロタイプを決定する、及び
（ｅ）工程（ｄ）で同定された対立遺伝子のＳＮＰ部位であって、もう一方の対立遺伝子とはヘテロ接合した前記ＳＮＰ部位に対してＲＮＡｉを引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を調製する
を含む、前記テーラーメイド医薬の調製方法を提供する。
【００４９】
上記調製方法の工程（ａ）〜（ｄ）は、選択又は優先回収方法及び同定方法のものと同様である。
を含む。
【００５０】
工程（ｅ）：ＳＮＰ部位に対してＲＮＡiを引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子の調製
工程（ｅ）では、工程（ｄ）及び工程(c)によって同定された長い繰返し配列を持つ変異型対立遺伝子のＳＮＰ部位であって、短い繰返し配列を持つ正常型対立遺伝子とはヘテロ接合した前記ＳＮＰ部位をターゲットにすることで、変異型対立遺伝子に対してＲＮＡiを引き起こす二本鎖ＲＮＡ分子を調製する。
【００５１】
ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡと相補的な塩基配列を持つｍＲＮＡが分解される現象である。そして、ＲＮＡｉ法は、ＲＮＡｉの現象を利用して、人為的に二本鎖ＲＮＡを細胞に導入する、又は発現させることによって、任意の遺伝子の発現を特異的に抑制する方法である。このＲＮＡｉを引き起こす二本鎖ＲＮＡをｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」と略す）と名付けられている。標的となる変異型対立遺伝子の塩基配列を知ることができれば、ＲＮＡｉを誘導するｓｉＲＮＡを合成し、細胞に導入することにより、標的変異型対立遺伝子を特異的にノックダウンすることができる。ＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制の原理は、図９を用いて説明する。約２１ヌクレオチド鎖長のｓｉＲＮＡを化学合成し、細胞内に導入すると、ｓｉＲＮＡは複数のタンパク質と一緒になってＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）を形成する。ＲＩＳＣは、取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つ標的遺伝子のｍＲＮＡを認識し、ＲＩＳＣ内のヌクレアーゼ活性によりｍＲＮＡ側のｓｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ結合部位を切断する。これにより、標的とする遺伝子の発現が阻止される。
【００５２】
変異型対立遺伝子のＳＮＰのハプロタイプが同定されれば、ＲＮＡｉの高い配列特異性を利用してＳＮＰの一塩基配列の違いを識別するｓｉＲＮＡを設計することも可能である。概略を述べると、ｓｉＲＮＡ分子は、そのアンチセンス鎖が標的対立遺伝子のＳＮＰ周囲配列と相補的となるよう設計される。ｓｉＲＮＡ分子の長さは、二本鎖部分が通常、１８〜２３塩基、好ましくは１９〜２１塩基からなる。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端が二本鎖部分から突出してもよく、好ましくは２塩基突出する。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、３’末端が二本鎖部分から突出してもよく、好ましくは０〜２塩基突出する。
【００５３】
ｓｉＲＮＡの対立遺伝子識別能を改善して、ノックダウン能力を高めるために、ｓｉＲＮＡにミスマッチ塩基を導入することができる。ミスマッチｓｉＲＮＡは、二本鎖部分におけるセンス鎖の３’末端側にアンチセンス鎖とミスマッチするヌクレオチドが１個以上、好ましくは１〜４個導入され、かつ、その二本鎖部分におけるセンス鎖中のアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチドの数が細胞内における両鎖のハイブリダイゼーションを可能とするものである。ミスマッチｓｉＲＮＡの作成については、本発明者らによるＷＯ２００５／０１７１５４に詳細に記載されている。ＷＯ２００５／０１７１５４の明細書の内容を、参照のために本明細書に挿入する。
【００５４】
ｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖ＲＮＡ分子自体のほかに、ｓｉＲＮＡのそれぞれのＲＮＡ鎖を転写可能なＤＮＡ配列を組み込んだ発現ベクター等でもよい。発現ベクターには、公知のプラスミドやウイルスベクターが挙げられる。また、ＲＮＡと同等に使用可能な、ヌクレオチドの糖―リン酸骨格を改変したＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｃｉｄ  （ＬＮＡ）やＰｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｃｉｄ  （ＰＮＡ）等の修飾核酸を含んでもよい。
【００５５】
各疾患の特定のＳＮＰに対してＲＮＡｉを引き起こすｓｉＲＮＡ分子を予めストックしておくと、本発明の長鎖変異型対立遺伝子の同定方法により患者毎のハプロタイプが決定された時点で、ストックされたｓｉＲＮＡからなるテーラーメイド医薬を迅速に供給することが可能である。
【００５６】
図１０に示すように、ＲＮＡiノックダウンを、ヘテロ接合の複数個のＳＮＰ部位、好ましくは２〜４個のＳＮＰ部位に対して誘導することが、ノックダウン効果を強固かつ安定にする上で好ましい。そのために、本発明のテーラーメイド医薬の調製方法では、ｓｉＲＮＡ分子を複数混合したカクテルを調製することが好ましい。その場合、本発明の長鎖変異型対立遺伝子の同定方法により患者毎のハプロタイプが決定された時点で、予めストックされた複数種のｓｉＲＮＡ分子を患者のハプロタイプに応じて適宜混合してカクテルとすることにより、患者毎に効果的なテーラーメイド医薬を迅速に提供することができる。
【００５７】
設計したｓｉＲＮＡ分子が変異型対立遺伝子特異的ノックダウンを誘起するか否かの確認は、常法を用いて行うことができる。
【００５８】
前記細胞は、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ現象を起こすことが可能であり、かつ変異型対立遺伝子を発現する、好ましくは哺乳動物細胞である。具体的には、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル等に由来するものが挙げられる。また、株化培養細胞としては、患者由来不死化細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＯＳ−７細胞等が挙げられる。
【００５９】
ｓｉＲＮＡ分子及び遺伝子又はその一部の細胞への共導入は、公知である。例えば、これらをプラスミド等に挿入したものをリポフェクション法、電気穿孔法等で細胞へ導入する。
【００６０】
ｓｉＲＮＡによる変異型対立遺伝子特異的ＲＮＡｉノックダウンの有無、そして効果を確認するために、ｓｉＲＮＡのターゲットとなる塩基配列を含んだレポーター遺伝子を構築し、それを細胞に導入して検証するレポーター・アッセイがある。このレポーター・アッセイも公知である。レポーター遺伝子には、例えばホタル・ルシフェラーゼ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子等を用いる。
【００６１】
二本鎖ＲＮＡ分子等のテーラーメイド医薬としての使用において、生体、組織又は細胞への導入に、導入部位に基づいて、適宜、公知の導入方法を採用し得る。例えば、二本鎖ＲＮＡ分子やその発現ベクターを、脳内、四肢、血管、腹腔内等へ注射し、あるいは鼻粘膜から経皮吸収させる。さらに、ウイルス感染を利用して導入することも可能である。
【実施例】
【００６２】
以下に本発明の実施例を示すことにより、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明が以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
１．選択的回収方法
本発明の選択的回収方法を、図１のフローチャートを用いて説明する。テスト疾患として、ハンチントン病（ＨＤ）を対象とした。ＨＤは、中年以降に発症する常染色体優性遺伝の遺伝性慢性進行性の疾患である。その臨床症状は、不随意運動、知能障害、認知症、精神症状、行動異常、歩行障害等を含む。ＨＤの原因遺伝子は、第４染色体短腕（４ｐ１６．３）に存在するハンチンチン(ＨＴＴ)遺伝子である。ＨＴＴ遺伝子のＥｘｏｎ１に存在する塩基のＣＡＧ繰返し配列は正常型で平均２０回程度であるところ、平均４０回以上に伸長することで変異型タンパク質の立体構造異常が起き、これが核内に蓄積することで神経細胞のアポトーシスを起こし、発症に至るとされている。
【００６３】
まず、ＨＤ患者由来不死化細胞（(1)Ｃ０１４２及び(2)Ｃ０２２１、国立精神・神経センター病院，神経内科から入手）から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（登録商標、インビトロジェン社）を使って全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡからオリゴｄＴプライマー（１５塩基、プロメガ社）と逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡを合成し、その後、ＲＮＡｓｅＨ（インビトロジェン社）を用いて鋳型ＲＮＡの消化を行った。
【００６４】
合成したｃＤＮＡ（１００ｎｇ／１０μＬ）と、表１の２０塩基配列の５‘側にビオチンを付加した合成ビオチン化ＲＮＡプローブ（１００ｐｍｏｌ）とを、最終容量４０μＬとなるようハイブリダイゼーションバッファー中（１０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，３．１Ｍ塩化ナトリウム，１Ｍクエン酸ナトリウム）にて混合した。前記混合溶液を、９５℃で５分間熱処理後、室温にて３０分間のアニール反応を行った。
【００６５】
【表１】
2011125219.tif 000003
【００６６】
アニーリング後、１０μＬのアビジン−レジン担体（商品名：ＳｏｆｔＬｉｎｋ  Ｓｏｆｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｖｉｄｉｎ  Ｒｅｓｉｎ、プロメガ社）を加え、さらにブロッキングバッファー（１０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ塩化ナトリウム，１％（ｗ／ｖｏｌ）ウシ血清アルブミン，１ｍｇ／ｍＬイーストＲＮＡ）を加えて、最終容量４００μＬとした。なお、前記アビジン−レジン担体は、上記ブロッキングバッファー（１ｍL）にて３７℃で３０分間前処理したものを使用した。
【００６７】
最終容量４００μＬとした混合溶液を３７℃で３０分間攪拌（１８０ｒｐｍ）して、ビオチンとアビジンとの結合反応を行った。その後、洗浄のため１ｍＬの洗浄液（１０ｍＭトリス塩酸，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ塩化ナトリウム）を添加し、遠心（１５００ｇ，１分間）を行った。上清を除去後、同様にして１ｍＬの洗浄液を添加し、遠心、上清除去の操作を２回繰り返し、沈殿物（ｃＤＮＡ結合ビオチン化ＲＮＡプローブ−アビジン−レジン担体）を得た。
【００６８】
最後に、沈殿物に対して１０μＬの５ｍＭビオチン溶液を加えて１０分間室温に放置し、ｃＤＮＡ結合ビオチン化ＲＮＡプローブ−アビジン−レジン担体のアビジン−レジン担体側から、ｃＤＮＡ結合ビオチン化ＲＮＡプローブを解離させた。その後、遠心（１５００ｇ，１分間）を行い、上清をサンプル（ｃＤＮＡ結合ビオチン化ＲＮＡプローブ）として回収した。この回収物を、以降のＰＣＲ解析及び対立遺伝子判別試験に供した。
【００６９】
２．ＰＣＲ解析
本発明の選択的回収方法の効果を確認するために、前記手法により回収したｃＤＮＡが正常型と変異型のどちらの対立遺伝子であるかをＰＣＲ解析で調べた。
【００７０】
ＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ社）と、ハンチンチン遺伝子のＣＡＧ反復配列を増幅する特異的なプライマー（表２）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、初期変性（９５℃，５分間）後、変性（９８℃，１０秒間）、アニール（６０℃，５秒間）、伸長反応（７２℃，３０秒間）の３段階を２６回繰返した。
【００７１】
【表２】
2011125219.tif 000004
【００７２】
ＰＣＲ増幅産物を、電気泳動法（５％ポリアクリルアミドゲル、５０ｍＡ、２時間）にて解析した。図２に示すとおり、ＨＤ患者由来不死化細胞由来の未処置のｃＤＮＡ（−）を増幅したＰＣＲ産物からは、ＣＡＧ反復配列の長さの異なる２本のバンド、すなわち、正常型と変異型のＨＴＴ遺伝子が検出された。それに対して、本発明の選択的回収方法によって得られたｃＤＮＡ（＋）から増幅したＰＣＲ産物からは、ＣＡＧ反復配列の長い（すなわち、変異型の）バンドが検出され、ＣＡＧ反復配列の短い（すなわち、正常型）バンドは極わずかか、あるいは殆ど認められなかった。
【００７３】
３．対立遺伝子判別試験
ＨＤ患者由来不死化細胞（Ｃ０１４２，Ｃ０２２１）から調整したｃＤＮＡ（−）とその後選択的回収方法によって得られたｃＤＮＡ（＋）を、対立遺伝子判別試験（ＴａｑＭａｎ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，アプライドバイオシステムズ社）によって解析し、ＣＡＧ反復配列長の異なる正常型と変異型ハンチンチン対立遺伝子の存在比が変化したか否かを判定した。ＨＴＴ遺伝子転写配列内には、ヘテロ接合度が明らかなものだけで２３個のＳＮＰ部位が存在する。この対立遺伝子判別試験ではヘテロ接合度の高いｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７３及びｒｓ３６２２７２の４つのＳＮＰ部位を対象とした。
【００７４】
判別試験結果の図３Ａの作成方法を簡単に説明する。Ｘ軸及びＹ軸を互いヘテロ接合の関係にあるアリルの存在レベルとするグラフを作成する。本発明の選択的回収方法を行っていない未処置のｃＤＮＡ（１０、１、０．０１、及び、０  ｎｇ）を用いて検量線を作成して比較対照とする。ヘテロ接合の場合、検量線は原点から濃度依存的な傾き（約４５度の傾き）を持った直線を示し、一方、ホモ接合の場合、検量線は、Ｘ軸又はＹ軸に対して平行な直線を示す。検量線は、選択的回収方法による効果の検討を、サンプル濃度のバラツキや、ＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅの反応の偏りに左右されず評価するためにも必要である。
【００７５】
選択的回収方法によって、正常型と変異型のＨＴＴ対立遺伝子の存在比が変化すると、そのＳＮＰタイピングの結果は、検量線に対して左斜め上又は右斜め下に判別結果として表示される。タイピング結果が検量線から離れれば離れるほど、存在比に大きな変化が生じたことを意味する。この判定により、選択的回収方法によって得られたＨＴＴ遺伝子のハプロタイプ（対立遺伝子のＳＮＰ構成）だけでなく、存在比に偏りが生じたか否かも判定することができる。
【００７６】
ＨＴＴ遺伝子転写配列内に存在する４つのＳＮＰ（ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７３及びｒｓ３６２２７２）部位について、対立遺伝子判別試験（ＴａｑＭａｎ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を行った結果を、図３Aに示す。
【００７７】
図３Ａで、選択的回収方法を行っていない未処置のｃＤＮＡサンプル（○）を用いて作成した検量線に対し、本発明の選択的回収方法で得られたサンプル（●）は離れた位置にプロットされた。これにより、本発明の選択的回収方法を行うことで、正常型と変異型ＨＴＴ遺伝子の存在比に偏りが生じたことが確認された。
【００７８】
また、ＨＤ患者由来不死化細胞ゲノムＤＮＡを用いて、上記と同じように４つのＳＮＰ部位に対する対立遺伝子判別試験を行った。その結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2011125219.tif 000005
【００８０】
ゲノムＤＮＡを用いて行なった対立遺伝子判別試験の結果は、ｃＤＮＡを用いた上記対遺伝子立判別試験結果と一致した。Ｃ０２２１細胞におけるｒｓ３６２３３１部位のタイピング結果は、同ＳＮＰが「Ｃ／Ｃ」のホモ接合であることを意味する。Ｃ０２２１細胞のそれ以外の３部位、及びＣ０１４２細胞の全４部位は、「Ａ／Ｇ」又は「Ｃ／Ｔ」のヘテロ接合を意味する。
【００８１】
前記ハプロタイプデータベース（ＨａｐＭａｐデータベース）から入手したＨＴＴ遺伝子の全人種及び日本人における４つのＳＮＰに対するハプロタイプの頻度を表４に示す。
【００８２】
【表４】
2011125219.tif 000006
１；  Ｃ０１４２
２；  Ｃ０２２１
【００８３】
図３Ａから導かれるハプロタイプ（対立遺伝子のＳＮＰ構成）を図３Ｂに示す。図３Ｂの結果は、表３に示したゲノムＤＮＡのタイピング結果や表４に示した日本人と全人種におけるハプロタイプ頻度の統計と矛盾しない結果であることが示唆される。
【００８４】
４．ＨＴＴ遺伝子ＳＮＰ含有レポーター遺伝子発現プラスミドの構築
対立遺伝子特異的発現抑制可能なｓｉＲＮＡの選定と評価のため、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を発現するｐＧＬ３−ＴＫプラスミド（Ｏｈｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を発現するｐｈＲＬ−ＴＫプラスミド（プロメガ社）を用いた。
【００８５】
対立遺伝子配列として、ＨＴＴ遺伝子転写配列内においてヘテロ接合度の高いＳＮＰ部位（ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７３又はｒｓ３６２２７２）を含む４１塩基からなる合成オリゴＤＮＡを選定した。ＳＮＰのどちらの塩基についても対応可能とするために、ＳＮＰの両塩基に対する合成オリゴＤＮＡを設計した。ハンチンチン遺伝子転写配列内ＳＮＰ周辺配列（合成オリゴＤＮＡ配列）を表５に示す。これを各レポーター遺伝子の非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入して、ハンチンチン遺伝子ＳＮＰ含有レポーター遺伝子発現プラスミドを構築した。
【００８６】
【表５】
2011125219.tif 000007
上表中、制限酵素部位及びＳＮＰを、ぞれぞれ、小文字及び下線で示した。
各ＳＮＰに対するヘテロ接合度は、ＮＣＢＩ  ＳＮＰデータベースを参照した。
ｓｓ；センス鎖（遺伝子のコード鎖と相同な配列を有するヌクレオチド鎖）
ａｓ；アンチセンス鎖（遺伝子のコード鎖と相補的な配列を有するヌクレオチド鎖）
【００８７】
上記ＨＴＴ遺伝子転写配列内のＳＮＰ部位に対して設計した対立遺伝子特異的ｓｉＲＮＡとその配列を表６Ａ〜６Ｄに示す。
【００８８】
【表６Ａ】
2011125219.tif 000008
【００８９】
【表６Ｂ】
2011125219.tif 000009
【００９０】
【表６Ｃ】
2011125219.tif 000010
【００９１】
【表６Ｄ】
2011125219.tif 000011
ＳＮＰ部位に下線を付した。
ｓｓ；  センス鎖
ａｓ；  アンチセンス鎖
【００９２】
５．細胞培養
ヒト由来株化細胞であるＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、インビトロジェン社）及び抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、和光社）含有ＤＭＥＭ培養液（インビトロジェン社）の存在下で培養した。ヒト神経芽細胞腫由来株化細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、上記血清と抗生物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液（インビトロジェン社）の存在下で培養した。
【００９３】
６．遺伝子導入およびレポーター・アッセイ
遺伝子導入前日、ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞をトリプシン消化により分散後、細胞密度１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて２４ウェル培養プレートに播種し、抗生物質不含ＤＭＥＭ培養液にて培養を行った。
【００９４】
２４時間後、各ＳＮＰを標的としたｓｉＲＮＡ（終濃度２０ｎＭ）、ＨＴＴ遺伝子ＳＮＰ含有レポーター対立遺伝子発現プラスミド［ｐＧＬ３−ＴＫ−ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ（３００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、ｐｈＲＬ−ＴＫ−ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）］、及びＲＮＡｉノックダウンを受けないβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現プラスミド［ｐＳＶ−ｂｅｔａ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｌａｓｍｉｄ（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ，プロメガ社）：ルシフェラーゼ活性の標準化のための外部標準化用プラスミド］を共導入した。
【００９５】
比較対照として、ＲＮＡｉを誘導しないｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；終濃度２０ｎＭ、キアゲン社）を用いて同様の遺伝子導入も行った。
【００９６】
導入２４時間後、細胞抽出液を調製し、発現したレポーター対立遺伝子（ルシフェラーゼ２種）、及び外部標準であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の活性を、それぞれ、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）、及びＢｅｔａ−Ｇｌｏ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性の測定値をβ−ガラクトシダーゼ活性の測定値で除した値（標準化された値）をレポーターの発現量として評価した。
【００９７】
さらに、レポーターに関して、２種のルシフェラーゼ活性の違いによる偏りをなくすため、各ＳＮＰ部位に対しレポーター遺伝子を入れ替えた実験も行なった。
【００９８】
７．ミスマッチｓｉＲＮＡによる対立遺伝子識別能の改善
上記レポーター・アッセイで対立遺伝子特異的ＲＮＡｉノックダウンが誘導できなかったＳＮＰ部位（ｒｓ３６３０９９  Ｃ−アリル，ｒｓ３６２３３１  Ｃ−アリル）に対して、対立遺伝子識別能力が低くても両対立遺伝子に対する抑制効果が強かったｓｉＲＮＡを用いて、それらのｓｉＲＮＡ配列中に新たなミスマッチを導入し対立遺伝子識別能の改善が得られるか検討した。これらの効果は、上記と同じ手法にて評価を行って。改良したｓｉＲＮＡ（ミスマッチｓｉＲＮＡ）の配列を表７に示す。
【００９９】
【表７】
2011125219.tif 000012
ＳＮＰ部位及びミスマッチヌクレオチドを、それぞれ、下線及び小文字で示した。  
ｓｓ；  センス鎖
ａｓ；  アンチセンス鎖
【０１００】
８．選定したｓｉＲＮＡのＩＣ５０試験
対立遺伝子識別能及び抑制効果が強かったｓｉＲＮＡに対して、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）試験を行った。選定した強い抑制効果と高いＳＮＰ識別能を持った対立遺伝子特異的ｓｉＲＮＡとその配列を、表８に示す。
【０１０１】
【表８】
2011125219.tif 000013
ＳＮＰ部位及びミスマッチヌクレオチドを、それぞれ、下線及び小文字で示す。
ｓｓ；センス鎖
ａｓ；アンチセンス鎖
【０１０２】
HeLa細胞を９６ウェル培養プレートに培養し、２４時間後、上記と同じ条件で３種のプラスミドとｓｉＲＮＡを導入した。この時、ｓｉＲＮＡは、各終濃度（４０、２０、１０、５、１．２５、０．３２、０．０８、０．０２、０．００５、０．００１、０  ｎＭ）に調整し、プラスミドと共に導入した。
【０１０３】
その後、上記と同じ手法にて、レポーター遺伝子及び外部標準遺伝子の発現を測定した。ＩＣ５０試験におけるグラフ化と数値算出は、ヒル係数を１としたシグモイド曲線への適合によって求めた（図４Ａ〜４Ｄ）。図４Ａ〜Ｄ中、●はホタル・ルシフェラーゼの活性、■はウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性であり、外部標準であるガラクトシダーゼの活性により標準化された値として示している。また、上記と同様に、レポーターに関して、２種のルシフェラーゼ活性の違いによる偏りをなくすため、各ＳＮＰ部位に対しレポーター遺伝子を入れ替えた実験も行なった。
【０１０４】
ｒｓ３６３０９９（図４Ａ）、ｒｓ３６２３３１（図４Ｂ）、ｒｓ３６２２７３（図４Ｃ）、及びｒｓ３６２２７２（図４Ｄ）のＳＮＰ部位の対立遺伝子に対して、それぞれ最も強い抑制効果と高いＳＮＰ識別能を示したｓｉＲＮＡ（表８）についてＩＣ５０試験を行なった結果、テストしたｓｉＲＮＡは、標的とするＳＮＰ部位の両対立遺伝子に対して対立遺伝子特異的かつ強いＲＮＡｉ抑制効果を示した。
【０１０５】
９．ＨＤ患者由来不死化細胞を用いた内在性変異型ハンチンチン遺伝子の特異的発現抑制
本発明の選択的回収方法と対立遺伝子判別試験及びＰＣＲ解析によって決定した変異型ＨＴＴ遺伝子のＳＮＰハプロタイプの情報に基づいて４つのＳＮＰ部位（ｒｓ３６３０９９、ｒｓ３６２３３１、ｒｓ３６２２７３、及びｒｓ３６２２７２）に対して機能性ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲｓ０９９＿Ｔ１０、ｓｉＲｓ３３１＿Ｃ９（Ｃ１５）、ｓｉＲｓ２７３＿Ｇ９、及びｓｉＲｓ２７２＿Ａ９）を選定し、長鎖変異型対立遺伝子特異的ＲＮＡｉノックダウンを行った。また、前記４種全てを等量混合したｓｉＲＮＡのカクテル（ｓｉＣｏｃｋｔａｉｌ）の導入試験も行った。比較対照として、ＲＮＡｉを誘導しないｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）の導入試験も行なった。
【０１０６】
約１ｘ１０６個のＨＤ患者由来不死化細胞（Ｃ０１４２）に対し終濃度５μＭのｓｉＲＮＡを電気穿孔法（遺伝子導入システムＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、アマクサ社）に導入しＲＮＡｉを誘導した。導入４８時間後、細胞を回収した。
【０１０７】
全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成、そして各ＳＮＰ部位に対して対立遺伝子判別試験を実施し、選定したｓｉＲＮＡの対立遺伝子特異的ＲＮＡｉ効果を評価した。これは、前述の対立遺伝子判別試験と同様に、ｓｉＲＮＡを導入していない未処置サンプルを用いて検量線を作成し、これを基準としてｓｉＲＮＡを導入したサンプルがどれだけ離れた位置にプロットされるかで評価した。結果を図５Ａ〜５Ｄに示す。図５Ａ〜５Ｄ中、マークの意味は次のとおりである。
○：      ｓｉＲＮＡを導入していない未処置サンプル（検量線作成用）
●：      一種類のｓｉＲＮＡを導入したサンプル
◎：      ４種類のｓｉＲＮＡを等量混合したｓｉＲＮＡカクテル（ｓｉＣｏｃｋｔａｉｌ）を導入したサンプル
■：      ＲＮＡｉを誘導しないｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を導入したサンプル
【０１０８】
図５Ａ〜５Ｄに示すように、一種類のｓｉＲＮＡを導入したサンプル（●）及び４種類のｓｉＲＮＡを等量混合したｓｉＲＮＡカクテル（ｓｉＣｏｃｋｔａｉｌ）を導入したサンプル（◎）では、図３Aとは対照的に検量線の反対側にシフトし、すなわち、正常対立遺伝子と比較して変異型ＨＴＴ対立遺伝子の発現が有意に抑制された。特に、ｓｉＲｓ０９９＿Ｔ１０（●）、及び、４種のｓｉＲＮＡを等量混合したｓｉＣｏｃｋｔａｉｌ（◎）という２組のｓｉＲＮＡが、最も強い対立遺伝子特異的発現抑制効果を示した。
【０１０９】
〔実施例２〕ＨＴＴ遺伝子以外のＣＡＧトリプレットリピート病原因遺伝子についての解析
本発明の方法が、ＨＤに限らず、その他のＣＡＧ反復配列の異常伸長が原因で発症する疾患においても有効であることを確認するため、表９に示すＨＤ以外のＣＡＧトリプレットリピート病について、実施例１と同様に、本発明の選択的回収方法とＰＣＲ解析を行った。
【０１１０】
【表９】
2011125219.tif 000014
【０１１１】
１．選択的回収方法
ＨＤ患者由来不死化細胞と三種のヒト由来株化細胞（ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）を用いた。実施例１と同じ合成ビオチン化ＲＮＡプローブを用いて各細胞から得られたｃＤＮＡとハイブリダイゼーションを行った。
【０１１２】
２．ＰＣＲ解析
上記のハイブリダイゼーションで得られたｃＤＮＡ結合ビオチン化ＲＮＡプローブ−アビジン−レジン担体から、ｃＤＮＡ結合ビオチン化ＲＮＡプローブを回収後、ＣＡＧ反復配列を増幅する各疾患遺伝子に特異的なプライマー（表１０）を用いて行った。
ＰＣＲ条件は、ＳＣＡ３及びＤＲＰＬＡの原因遺伝子の増幅についてはＨＤと同じ条件で行ったが、ＳＣＡ６の原因遺伝子（ＣＡＣＮＡ１Ａ）の増幅に関しては、繰返し反応を３６回に変更した。
【０１１３】
【表１０】
2011125219.tif 000015
【０１１４】
電気泳動法は、実施例１と同じ条件で行った。電気泳動の結果を、図６〜８に示す。図６で、ＨＤ患者由来不死化細胞と３種のヒト由来株化細胞におけるＡＴＮ１遺伝子の発現を解析した結果、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてＣＡＧ反復配列長の異なる２種のＡＴＮ１転写産物の発現（ＰＣＲ産物）が認められた。このＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のｃＤＮＡを用いて上記と同じ実験を行ったところ、得られたｃＤＮＡ（＋）から増幅したＡＴＮ１の殆どが、ＣＡＧ反復配列の長いＰＣＲ産物であることが分かった。
【０１１５】
図７で、未処置（−）の各細胞（（１）ＨＥＫ２９３細胞、（２）ＨｅＬａ細胞、（３）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）におけるＡＴＸＮ３の発現を調べた結果、ＨｅＬａ細胞においてＣＡＧ反復配列の長いＡＴＸＮ３が発現していた。そこで、ＨｅＬａ細胞（（２）；反復配列が長い）とＨＥＫ２９３細胞（（１）；反復配列が短い）、もしくはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（（３）；反復配列が短い）の未処置ｃＤＮＡを等量混合し（（１）＋（２）、（２）＋（３））、選択的回収方法とＰＣＲ解析を行ったところ、ｃＤＮＡ（＋）から増幅したＰＣＲ産物の殆どが、反復配列の長いタイプ（ＨｅＬａ細胞由来）のＡＴＸＮ３であることが分かった。
【０１１６】
図８で、ＨＤ患者由来不死化細胞Ｃ０２２１は、長さの異なる２種のＣＡＣＮＡ１Ａを発現したが、得られたｃＤＮＡ（＋）を増幅したＰＣＲ産物の殆どがＣＡＧ反復配列の長いＣＡＣＮＡ１Ａであることが示された。
【図１】
2011125219.tif 000016
【図２】
2011125219.tif 000017
【図３Ａ】
2011125219.tif 000018
【図３Ｂ】
2011125219.tif 000019
【図４Ａ】
2011125219.tif 000020
【図４Ｂ】
2011125219.tif 000021
【図４Ｃ】
2011125219.tif 000022
【図４Ｄ】
2011125219.tif 000023
【図５Ａ】
2011125219.tif 000024
【図５Ｂ】
2011125219.tif 000025
【図５Ｃ】
2011125219.tif 000026
【図５Ｄ】
2011125219.tif 000027
【図６】
2011125219.tif 000028
【図７】
2011125219.tif 000029
【図８】
2011125219.tif 000030
【図９】
2011125219.tif 000031
【図１０】
2011125219.tif 000032
【配列表】
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