(57)【要約】      （修正有）【課題】パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科ニューモウイルス（Pneumovirinae）亜科に属する、単離された哺乳動物マイナス鎖ＲＮＡウイルス、すなわちメタニューモウイルス（ＭＰＶ）、及び当該ウイルスを用いた診断および治療方法の提供。【解決手段】メタニューモウイルスを含む、ウイルスの組換え形態またはキメラ形態を含めたウイルスを含有する、ワクチン製剤。及び、２価および３価のワクチン調製物を含めた多価ワクチンを包含する、ワクチン調製物。【選択図】図１
2011250786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタニューモウイルス（ＭＰＶ）を生成する方法であって、
ａ）異種ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞に、
ＭＰＶのｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子であって、異種ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡ分子を
導入すること、及び、
ｂ）前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離すること
を含む方法。
【請求項２】
メタニューモウイルスを生成する方法であって、
ａ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞に、
ＭＰＶのｃＤＮＡを含むＤＮＡ分子であって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡ分子
を導入すること、及び、
ｂ）前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離すること
を含む方法。
【請求項３】
メタニューモウイルスを生成する方法であって、
（ａ）ｐｏｌＩ及びｐｏｌＩＩポリメラーゼを発現する宿主細胞に、ＭＰＶのｃＤＮＡを正方向に含むＤＮＡ分子であって、前記ｐｏｌＩポリメラーゼによって転写されるＤＮＡ分子を導入すること、及び
（ｂ）前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離すること
を含む方法。
【請求項４】
転写調節配列に機能的に連結した、ウイルスのＮ、Ｐ、及びＬタンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ分子を、ｐｏｌＩ及びｐｏｌＩＩポリメラーゼを発現する宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記メタニューモウイルスが哺乳動物メタニューモウイルスである、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞がＭ２−１をコードするＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項８】
前記宿主細胞がＢＨＫ細胞系である、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が２９３Ｔ細胞である、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞がＶｅｒｏ細胞である、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスを生成する方法であって、転写調節配列に機能的に連結したウイルスのＮ、Ｐ、及びＬタンパク質をコードする１つ又は複数のＤＮＡ分子を宿主細胞に導入することを含み、前記Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質が、レスキューしようとするウイルス種以外のウイルス種に由来する、上記方法。
【請求項１２】
単離された哺乳動物メタニューモウイルスであって、前記哺乳動物メタニューモウイルスがパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）に属するマイナスセンス１本鎖ＲＮＡウイルスであり、かつ、前記哺乳動物メタニューモウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）に関連するよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関係しているものであり、（ｉ）前記ウイルスの少なくとも１つの領域が、哺乳動物メタニューモウイルスの異なる分離株からの類似の領域に置き換えられており、又は、（ｉｉ）前記ウイルスの少なくとも１つの領域が除去されており、又は、（ｉｉｉ）前記ウイルスの少なくとも１つの領域が、哺乳動物メタニューモウイルスの異なる分離株からの類似の領域に置き換えられおり、かつ、前記ウイルスの少なくとも１つの領域が除去されている、哺乳動物メタニューモウイルス。
【請求項１３】
前記領域の長さが、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド（ｎｔ）、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも２５ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、少なくとも７５ｎｔ、少なくとも１００ｎｔ、少なくとも２５０ｎｔ、少なくとも５００ｎｔ、少なくとも７５０ｎｔ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、又は少なくとも５ｋｂである、請求項１２に記載のウイルス。
【請求項１４】
前記領域が、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２−２  ＯＲＦ、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、Ｌ遺伝子、リーダー領域、トレーラー領域、又は非コード領域の断片である、請求項１２に記載のウイルス。
【請求項１５】
前記領域が、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２−２  ＯＲＦ、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、Ｌ遺伝子、リーダー領域、トレーラー領域、又は非コード領域である、請求項１２に記載のウイルス。
【請求項１６】
前記ウイルスが弱毒化されている、請求項１２、１３、又は１４に記載のウイルス。
【請求項１７】
以下のアミノ酸位置、すなわち、Ｆタンパク質のアミノ酸９９位から１０２位までのＲＱＳＲ、Ｌタンパク質のアミノ酸４５６位のＰｈｅ、Ｌタンパク質のアミノ酸７４９位のＧｌｕ、Ｌタンパク質のアミノ酸１２４６位のＴｙｒ、Ｌタンパク質のアミノ酸１０９４位のＭｅｔ、及び、Ｌタンパク質のアミノ酸７４６位のＬｙｓの１つ又は複数に、少なくとも１つの改変をもたらす少なくとも１つの遺伝子組換えを含む弱毒化ｈＭＰＶ。
【請求項１８】
前記遺伝子組換えが欠失、置換、又は付加である、請求項１７に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項１９】
少なくとも１つの遺伝的改変が、１コドンあたり２又は３ヌクレオチドの置換又は欠失からなる、請求項１７に記載の弱毒化ウイルス。
【請求項２０】
弱毒化哺乳動物メタニューモウイルスであって、前記哺乳動物メタニューモウイルスのゲノム中の少なくとも１つのオープンリーディングフレームの位置が変化している、弱毒化哺乳動物メタニューモウイルス。
【請求項２１】
前記オープンリーディングフレームが、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２タンパク質、ＳＨタンパク質、Ｇタンパク質、又はＬタンパク質をコードする、請求項２０に記載の弱毒化哺乳動物メタニューモウイルス。
【請求項２２】
ウイルスを増殖する方法であって、ウイルスに感染している細胞を、前記細胞の成長に最適な温度より低い温度で培養することを含む方法。
【請求項２３】
ウイルスを増殖する方法であって、（ｉ）ウイルスに感染させる前に、第１の温度で細胞を培養すること、（ｉｉ）細胞をウイルスに感染させること、及び、（ｉｉｉ）細胞をウイルスに感染させた後に、第２の温度で細胞を培養することを含み、第２の温度が第１の温度より低いものである、上記方法。
【請求項２４】
ウイルスを増殖する方法であって、血清の非存在下でウイルスに感染している細胞を培養することを含む方法。
【請求項２５】
ウイルスを増殖する方法であって、（ｉ）ウイルスに感染させる前に、血清の存在下で細胞を培養すること、（ｉｉ）細胞をウイルスに感染させること、及び、（ｉｉｉ）細胞をウイルスに感染させた後に、血清の非存在下で細胞を培養すること含む方法。
【請求項２６】
ウイルスを増殖する方法であって、ウイルスに感染している細胞を、前記細胞の成長に最適である温度より低い温度で、無血清で培養することを含む方法。
【請求項２７】
前記ウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、請求項２２、２３、２４、２５、又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスがメタニューモウイルスである、請求項２２、２３、２４、２５、又は２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスが哺乳動物メタニューモウイルスである、請求項２２、２３、２４、２５、又は２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項２２、２３、２４、２５、又は２６に記載の方法。
【請求項３１】
細胞が哺乳動物メタニューモウイルスに感染するのを阻害する方法であって、細胞を７回反復配列に接触させることを含み、前記７回反復配列が、哺乳動物メタニューモウイルスのＨＲに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は少なくとも９９．５％同一である、上記方法。
【請求項３２】
哺乳動物が哺乳動物メタニューモウイルスに感染するのを予防、治療、又は管理する方法であって、治療上有効な量の７回反復配列を前記哺乳動物に投与することを含み、前記７回反復配列が、前記哺乳動物メタニューモウイルスのＨＲに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は少なくとも９９．５％同一である、上記方法。
【請求項３３】
前記７回反復配列が、ＨＲＡ、ＨＲＢ、又はこれらの組合せである、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、選択される第２の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第１の核酸と、サンプルとを接触させることを含み、第２の核酸の配列が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１である、上記方法。
【請求項３６】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、タンパク質をコードする第２の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第１の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記タンパク質の配列が、配列番号３２２、配列番号３６６、配列番号３７４、配列番号３５８、配列番号３１４、配列番号３３８、配列番号３４６、配列番号３８２、配列番号３３０、配列番号３２５、配列番号３６９、配列番号３７７、配列番号３６１、配列番号３１７、配列番号３４１、配列番号３４９、配列番号３８５、配列番号３３３、配列番号３２３、配列番号３６７、配列番号３７５、配列番号３５９、配列番号３１５、配列番号３３９、配列番号３４７、配列番号３８３、配列番号３３１、配列番号３２４、配列番号３６８、配列番号３７６、配列番号３６０、配列番号３１６、配列番号３４０、配列番号３４８、配列番号３８４、又は配列番号３３２である、上記方法。
【請求項３７】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、配列番号３６６に対して少なくとも９０％同一である、配列番号３７４に対して少なくとも７０％同一である、配列番号３５８に対して少なくとも９０％同一である、配列番号３１４に対して少なくとも８２％同一である、配列番号３３８に対して少なくとも８５％同一である、配列番号３４６に対して少なくとも６０％同一である、配列番号３３０に対して少なくとも８５％同一である、配列番号３２２に対して少なくとも２０％同一である、配列番号３８２に対して少なくとも３０％同一であるタンパク質をコードする第２の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第１の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項３８】
第１の核酸が、サブタイプＡ１、Ｂ１、Ａ２、又はＢ２のｈＭＰＶのゲノムに対して特異的にハイブリダイズする、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
第１の核酸の長さが、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、又は少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４０】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、タンパク質、又はタンパク質の断片を特異的に認識する抗体又はそのフラグメントと、前記サンプルとを接触させることを含み、前記タンパク質の配列が、配列番号３７４、配列番号３５８、配列番号３１４、配列番号３３８、配列番号３４６、配列番号３３０、配列番号３２２、配列番号３８２、配列番号３６６、配列番号３２４、配列番号３６８、配列番号３７６、配列番号３６０、配列番号３１６、配列番号３４０、配列番号３４８、配列番号３８４、配列番号３３２、配列番号３２５、配列番号３６９、配列番号３７７、配列番号３６１、配列番号３１７、配列番号３４１、配列番号３４９、配列番号３８５、配列番号３３３、配列番号３２３、配列番号３６７、配列番号３７５、配列番号３５９、配列番号３１５、配列番号３３９、配列番号３４７、配列番号３８３、又は配列番号３３１である、上記方法。
【請求項４１】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、配列番号３７４に対して少なくとも７０％同一である、配列番号３５８に対して少なくとも９０％同一である、配列番号３１４に対して少なくとも８２％同一である、配列番号３３８に対して少なくとも８５％同一である、配列番号３４６に対して少なくとも６０％同一である、配列番号３３０に対して少なくとも８５％同一である、配列番号３２２に対して少なくとも２０％同一である、配列番号３８２に対して少なくとも３０％同一である、配列番号３６６に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質又はタンパク質の断片を特異的に認識する抗体又はそのフラグメントと、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項４２】
哺乳動物のＭＰＶ感染を血清診断する方法であって、前記哺乳動物から得たサンプル中における、ＭＰＶ又はその構成要素に対して特異的な抗体又はそのフラグメントの存在を、配列番号３７４に対して少なくとも７０％同一である、配列番号３５８に対して少なくとも９０％同一である、配列番号３１４に対して少なくとも８２％同一である、配列番号３３８に対して少なくとも８５％同一である、配列番号３４６に対して少なくとも６０％同一である、配列番号３３０に対して少なくとも８５％同一である、配列番号３２２に対して少なくとも２０％同一である、配列番号３８２に対して少なくとも３０％同一である、配列番号３６６に対して少なくとも９０％同一であるタンパク質又はタンパク質の断片と、前記サンプルとを反応させることによって検出することを含み、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）に関連するよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連している、上記方法。
【請求項４３】
哺乳動物のＭＰＶ感染を血清診断する方法であって、前記哺乳動物から得たサンプル中における、ＭＰＶ又はその構成要素に対して特異的な抗体又はそのフラグメントの存在を、ＭＰＶ又はその構成要素と前記サンプルとを反応させることによって検出することを含み、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）に関連するよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連している、上記方法。
【請求項４４】
サンプル中の変種Ｂ１哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質（配列番号３２４）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質（配列番号３６８）に対して少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質（配列番号３７６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質（配列番号３６０）に同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質（配列番号３１６）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３４０）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質（配列番号３８４）に対して少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列、又は
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第２の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第１の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項４５】
サンプル中の変種Ａ１哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質（配列番号３２２）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質（配列番号３６６）に対して少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質（配列番号３７４）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質（配列番号３５８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質（配列番号３１４）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３３８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質（配列番号３８２）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列、又は、
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のウイルスのＬタンパク質（配列番号３３０）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第２の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第１の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項４６】
サンプル中の変種Ｂ２哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質（配列番号３２５）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質（配列番号３６９）に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質（配列番号３７７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質（配列番号３６１）に同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質（配列番号３１７）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３４１）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列：
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質（配列番号３８５）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列、又は、
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質（配列番号３３３）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第２の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第１の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項４７】
サンプル中の変種Ａ２哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質（配列番号３２３）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質（配列番号３６７）に対して少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質（配列番号３７５）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質（配列番号３５９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質（配列番号３１５）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３３９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質（配列番号３８３）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列、又は、
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質（配列番号３３１）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第２の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第１の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項４８】
第１の核酸の長さが、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、又は少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項４４、４５、４６、又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
サンプル中の変種Ｂ１哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質（配列番号３２４）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質（配列番号３６８）に対して少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質（配列番号３７６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質（配列番号３６０）に同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦｐタンパク質（配列番号３１６）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３４０）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質（配列番号３８４）に対して少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列、又は、
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項５０】
サンプル中に変種Ａ１哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質（配列番号３２２）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質（配列番号３６６）に対して少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質（配列番号３７４）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質（配列番号３５８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質（配列番号３１４）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３３８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質（配列番号３８２）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列、又は、
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のウイルスのＬタンパク質（配列番号３３０）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項５１】
サンプル中の変種Ｂ２哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質（配列番号３２５）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質（配列番号３６９）に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質（配列番号３７７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質（配列番号３６１）に同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質（配列番号３１７）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３４１）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質（配列番号３８５）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列、又は、
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質（配列番号３３３）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項５２】
サンプル中の変種Ａ２哺乳動物ＭＰＶを検出する方法であって、
（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質（配列番号３２３）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質（配列番号３６７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質（配列番号３７５）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質（配列番号３５９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質（配列番号３１５）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３３９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質（配列番号３８３）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列、又は、
（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質（配列番号３３１）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
【請求項５３】
サンプル中のＭＰＶを検出する方法であって、核酸又はその断片と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記核酸が、配列番号３７８、配列番号３６２、配列番号３１８、配列番号３４２、配列番号３５０、配列番号３２６、配列番号３３４、配列番号３８６、配列番号３７０、配列番号３７９、配列番号３６３、配列番号３１９、配列番号３４３、配列番号３５１、配列番号３２７、配列番号３３５、配列番号３８７、配列番号３７１、配列番号３８０、配列番号３６４、配列番号３２０、配列番号３４４、配列番号３５２、配列番号３２８、配列番号３３６、配列番号３８８、配列番号３７２、配列番号３８１、配列番号３６５、配列番号３２１、配列番号３４５、配列番号３５３、配列番号３２９、配列番号３３７、配列番号３８９、配列番号３７３、又は配列番号３５７である、上記方法。
【請求項５４】
サンプル中のＭＰＶを検出する方法であって、核酸又はその断片と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記核酸が、配列番号８４〜１１８、配列番号１５４〜２３３、配列番号３１８〜３２１、配列番号３２６〜３２９、配列番号３３４〜３３７、配列番号３４２〜３４５、配列番号３５０〜３５７、配列番号３６２〜３６５、配列番号３７０〜３７３、配列番号３７８〜３８１、及び配列番号３８６〜３８９からなる群より選択される、上記方法。
【請求項５５】
前記断片の長さが、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、又は少なくとも１０００ヌクレオチドである、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、
（ｉ）レポーター遺伝子をコードするミニレプリコンを含む細胞と、前記サンプルとを接触させること、及び、
（ｉｉ）前記レポーター遺伝子の発現を測定すること
を含む方法。
【請求項５７】
前記ミニレプリコンが、前記細胞で増幅された哺乳動物メタニューモウイルスのウイルス粒子中にパッケージングされる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記レポーター遺伝子の発現が、前記哺乳動物メタニューモウイルスの存在下で刺激される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、第３の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれぞれハイブリダイズする第１の核酸及び第２の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含み、第３の核酸が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１、又はその断片である、上記方法。
【請求項６０】
サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、
ａ）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１に特異的にハイブリダイズする第１の核酸と、前記サンプルとを接触させること、及び、
ｂ）第１の核酸配列がハイブリダイズした位置からＭＰＶ核酸の断片を増幅すること
を含み、前記断片は、断片の全長にわたって、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１に対して少なくとも８９％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、配列番号３６６に対して少なくとも９０％同一、配列番号３７４に対して少なくとも７０％同一、配列番号３５８に対して少なくとも９０％同一、配列番号３１４に対して少なくとも８２％同一、配列番号３３８に対して少なくとも８５％同一、配列番号３４６に対して少なくとも６０％同一、配列番号３３０に対して少なくとも８５％同一、配列番号３２２に対して少なくとも２０％同一、あるいは配列番号３８２に対して少なくとも３０％同一である、上記方法。
【請求項６１】
前記断片が、断片の全長にわたって、配列番号３６６、配列番号３７４、配列番号３５８、配列番号３１４、配列番号３３８、配列番号３４６、配列番号３３０、配列番号３２２、又は配列番号３８２に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％同一である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
第１の核酸の長さが、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、又は少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記断片の長さが、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、又は少なくとも１０００ヌクレオチドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
第１の核酸が、配列番号２２〜８３からなる群より選択される核酸配列の核酸配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
（ｉ）配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１に特異的にハイブリダイズする第２の核酸を、前記サンプルと接触させ、かつ、（ｉｉ）第１及び第２の核酸がそれぞれ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれの少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、又は少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも３０００ヌクレオチド、又は少なくとも４０００ヌクレオチド以内の範囲で、第３の核酸配列にハイブリダイズし、第３の核酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号８４〜１１８、配列番号１５４〜２３３、配列番号３１８〜３２１、配列番号３２６〜３２９、配列番号３３４〜３３７、配列番号３４２〜３４５、配列番号３５０〜３５７、配列番号３６２〜３６５、配列番号３７０〜３７３、配列番号３７８〜３８１、及び配列番号３８６〜３８９からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記増幅断片の検出をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
哺乳動物のＭＰＶ感染を診断する方法であって、前記哺乳動物のサンプル中で、ＭＰＶ又はその構成要素の存在を、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｍ、Ｐ、Ｍ２、Ｇ、及びＳＨからなる群より選択されるＭＰＶタンパク質を特異的に認識する抗体と、前記サンプルとを接触させることによって決定することを含む方法。
【請求項６８】
ヒトのＭＰＶ感染を診断する方法であって、ヒトのサンプル中で、ＭＰＶ又はその構成要素の存在を、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｍ、Ｐ、Ｍ２、Ｇ、及びＳＨからなる群より選択されるｈＭＰＶタンパク質を特異的に認識する抗体と、前記サンプルとを接触させることによって決定することを含む方法。
【請求項６９】
ＭＰＶを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）に関連するよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号３６６に対して少なくとも９０％同一、配列番号３７４に対して少なくとも７０％同一、配列番号３５８に対して少なくとも９０％同一、配列番号３１４に対して少なくとも８２％同一、配列番号３３８に対して少なくとも８５％同一、配列番号３４６に対して少なくとも６０％同一、配列番号３３０に対して少なくとも８５％同一、配列番号３２２に対して少なくとも２０％同一、配列番号３８２に対して少なくとも３０％同一であるタンパク質を、１つ又は複数の容器の中に含むキット。
【請求項７０】
タンパク質を検出する手段をさらに含む、請求項６９７１に記載のキット。
【請求項７１】
ＭＰＶを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）に関連するよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号３６６に対して少なくとも９０％同一、配列番号３７４に対して少なくとも７０％同一、配列番号３５８に対して少なくとも９０％同一、配列番号３１４に対して少なくとも８２％同一、配列番号３３８に対して少なくとも８５％同一、配列番号３４６に対して少なくとも６０％同一、配列番号３３０に対して少なくとも８５％同一、配列番号３２２に対して少なくとも２０％同一、配列番号３８２に対して少なくとも３０％同一であるタンパク質に特異的に結合する抗体を１つ又は複数の容器の中に含むキット。
【請求項７２】
前記抗体を検出する手段をさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項７３】
ＭＰＶを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）に関連するよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号３６６に対して少なくとも９０％同一、配列番号３７４に対して少なくとも７０％同一、配列番号３５８に対して少なくとも９０％同一、配列番号３１４に対して少なくとも８２％同一、配列番号３３８に対して少なくとも８５％同一、配列番号３４６に対して少なくとも６０％同一、配列番号３３０に対して少なくとも８５％同一、配列番号３２２に対して少なくとも２０％同一、配列番号３８２に対して少なくとも３０％同一であるタンパク質をコードする核酸を１つ又は複数の容器の中に含むキット。
【請求項７４】
ＭＰＶを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）に関連するよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号３７８、配列番号３６２、配列番号３１８、配列番号３４２、配列番号３５０、配列番号３２６、配列番号３３４、配列番号３８６、配列番号３７０、配列番号３７９、配列番号３６３、配列番号３１９、配列番号３４３、配列番号３５１、配列番号３２７、配列番号３３５、配列番号３８７、配列番号３７１、配列番号３８０、配列番号３６４、配列番号３２０、配列番号３４４、配列番号３５２、配列番号３２８、配列番号３３６、配列番号３８８、配列番号３７２、配列番号３８１、配列番号３６５、配列番号３２１、配列番号３４５、配列番号３５３、配列番号３２９、配列番号３３７、配列番号３８９、配列番号３７３、配列番号３５７、配列番号３１４、及び配列番号２２〜８３からなる核酸の群から選択される核酸に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である１つ又は複数の核酸又はその断片を含むキット。
【請求項７５】
前記核酸又はその断片を検出する手段をさらに含む、請求項７３又は７４に記載のキット。
【請求項７６】
前記断片の長さが、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、又は少なくとも２５ヌクレオチドである、請求項７３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．導入
本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖ＲＮＡウイルス、すなわちパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科のニューモウイルス（Pneumoviridae）亜科に属するメタニューモウイルス（ＭＰＶ）に関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素に系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖ＲＮＡウイルスにも関する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株、特にヒトメタニューモウイルスの分離株のゲノムヌクレオチド配列に関する。本発明は、診断及び治療方法を目的とした、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の配列情報の使用に関する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルス及びトリニューモウイルスの両方を含むメタニューモウイルスのゲノム又はその一部をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、該ヌクレオチド配列によりコードされるキメラウイルス又は組換えウイルスを包含する。本発明はまた、１以上の非天然又は異種配列を含むキメラ及び組換え哺乳動物ＭＰＶに関する。本発明はさらに、哺乳動物又はトリニューモウイルス（該ウイルスの組換え及びキメラ形態を含む）を含むワクチン製剤に関する。本発明のワクチン製剤は、多価ワクチン、例えば二価及び三価ワクチン製剤を包含する。
【０００２】
配列表の書類は本出願において本明細書の表１５として記載されている。
【背景技術】
【０００３】
関連出願
本出願は、米国特許仮出願第６０／４６５，８１１号（２００３年４月２５日出願）、米国特許仮出願第６０／４６６，７７６号（２００３年４月３０日出願）、米国特許仮出願第６０／４８０，６５８号（２００３年６月２０日出願）、米国特許仮出願第６０／４９８，６４０号（２００３年８月２８日出願）、米国特許仮出願第６０／５５０，９１１号（２００４年３月５日出願）（これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００４】
２．発明の背景
古典的には、破壊的な疾患媒体としてパラミクソウイルスは、毎年世界中の多数の動物やヒトの死亡の原因となっている。パラミクソウイルスは、モノネガウイルス目（Mononegavirales）（マイナス−センス１本鎖ＲＮＡウイルス）内の科であり、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）とニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）からなる。後者の亜科は現在分類学的に、ニューモウイルス属（Pneumovirus）とメタニューモウイルス属（Metapneumovirus）とに分けられる（Pringle, 1999, Arch. Virol. 144/2,2065-2070）。ニューモウイルス属（Pneumovirus）の１つの種であるヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）は、世界中で幼児及び小児の間の下気道感染症の単一の最も重要な原因である（Domachowske & Rosenberg, 1999, Clin. Microbio. Rev. 12(2):298-309）。ニューモウイルス属の他のメンバーには、ウシ及びヒツジの呼吸器合胞体ウイルスとマウスのニューモウイルス（ＰＶＭ）がある。
【０００５】
過去数十年間に、哺乳動物の疾患、特にヒトの、特に呼吸器疾患（ＲＴＩ）の数種類の原因物質が同定されている（Evans, Viral Infections of Humans, Epidemiology and Control. 第３版中（Evans, A.S.編）、22-28（プレヌム出版社（Plenum Publishing Corporation）、ニューヨーク、1989）。哺乳動物のＲＴＩの古典的原因物質は、ヒト（ｈＲＳＶ）及びウシ又はヒツジ（ｂＲＳＶ及び／又はｏＲＳＶ）のような反芻動物中に存在するニューモウイルス属に属する呼吸器合胞体ウイルスである。ヒトＲＳＶでは、逆交差中和アッセイ、免疫学的アッセイにおけるＧタンパク質の反応性、及びＧ遺伝子のヌクレオチド配列の相違が、２つのｈＲＳＶ抗原性サブグループを定義するのに使用される。このサブグループ内では、アミノ酸配列は９４％（サブグループＡ）又は９８％（サブグループＢ）の同一性を示し、サブグループ間ではわずかに５３％のアミノ酸配列同一性しか存在しない。さらなる変動が、モノクローナル抗体、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、及びＲＮＡｓｅ保護アッセイに基づいてサブグループ内で観察される。両方のサブグループからのウイルスは世界的に分布し、単一の季節に存在する。感染は、あらかじめ存在する免疫の存在下で起きることがあり、抗原性の変動は再感染には厳密に必須ではない。例えば、Sullender, 2000, Clinical Microbiology Reviews 13(1):1-15; Collinsら、Fields Virology, B.N. Knipe、Howley, P.M. 編、1996, フィラデルフィア：リッペンコット−ラーベン（Lippencott-Raven）, 1313-1351; Johnsonら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(16):5625-9; Collins, The Paramyxoviruses中、D.W. Kingsbury編者、1991, プレヌム・プレス（Plenum Press）：ニューヨーク、p. 103-153。
【０００６】
別の古典的ニューモウイルスは、一般に実験室マウスに存在するマウス肺炎ウイルス（ＰＶＭ）である。しかし哺乳動物で観察される疾患の比率にまでは、公知の病原体には割り当てられていない。
【０００７】
２．１  トリメタニューモウイルス
トリニューモウイルス（ＡＰＶ）が引き起こす呼吸系疾患は、南アフリカで１９７０年代後半に最初に記載され（Buysら、1980, Turkey 28:36-46）、そこでは七面鳥産業にとって壊滅的な影響があった。七面鳥の疾患は副鼻腔炎と鼻炎を特徴とし、七面鳥鼻気管炎（ＴＲＴ）と呼ばれた。ＡＰＶのヨーロッパ分離株はまた、ニワトリの頬腫れ症候群（swollen head syndrome）の要因であることが強く示唆されている（O'Brien, 1985, Vet. Rec. 117:619-620）。元々この疾患は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）に感染したブロイラーニワトリの群に出現し、ニューカッスル病（ＮＤ）に関連する二次的問題であると考えられた。ヨーロッパＡＰＶに対する抗体が、ＳＨＳの発症後罹患したニワトリで検出され（Cookら、1998, Avian Pathol. 17:403-410）、ＡＰＶが原因であることを示唆している。
【０００８】
七面鳥の上気道感染であるトリ鼻気管炎の原因物質である七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）として知られているトリニューモウイルス（ＡＰＶ）（Giraudら、1986, Vet. Res. 119:606-607）は、最近指定されたメタニューモウイルス属の唯一のメンバーであり、感染症に関連せず、又は哺乳動物の疾患には関連しないと最近まで言われていた。ＡＰＶの血清学的サブグループは、Ｇ糖タンパク質のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、及びＧ糖タンパク質も認識するモノクローナル抗体を使用する中和検査に基づいて区別することができる。しかしヌクレオチド配列及びアミノ酸配列中の他の相違を使用して、ＡＰＶの血清学的サブグループを区別することができる。サブグループＡ、Ｂ及びＤ内で、Ｇタンパク質はサブグループ内で９８．５％〜９９．７％の配列同一性、及びサブグループ間の３１．２％〜３８％のアミノ酸同一性が観察される。例えばCollinsら、1993, Avian Pathology, 22: p. 469-479；Cookら、1993, Avian Pathology, 22:257-273；Bayon-Auboyerら、J Gen Virol, 81(Pt 11):2723-33；Seal, 1998, Virus Res, 58(1-2):45-52；Bayon-Auboyerら、1999, Arch Virol, 144(6):91-109；Juhaszら、1994, J Gen Virol, 75 (Pt 11):2873-80を参照されたい。
【０００９】
ＡＰＶのさらなる血清型は、ＷＯ００／２０６００号（参照することにより本明細書に組み込まれる）に提供され、これはＡＰＶのコロラド分離株を記載し、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏ血清中和検査を用いて既知のＡＰＶ又はＴＲＴ株と比較している。まずコロラド分離株を、認識されているＴＲＴ分離株に対する単一特異的ポリクローナル抗血清に対して試験した。コロラド分離株は、ＴＲＴ株のいずれに対する単一特異的抗血清によっても中和されなかった。しかしこれは、サブグループＡ株に対して生起された高度免疫抗血清により中和された。この抗血清は、相同ウイルスを１：４００の力価に、そしてコロラド分離株を１：８０の力価に中和した。上記方法を使用して、コロラド分離株はＴＲＴモノクローナル抗体に対して試験した。各ケースで、逆数中和力価は＜１０であった。コロラド分離株に対して生起された単一特異的抗血清はまた、両方のサブグループのＴＲＴ株に対して試験された。試験したＴＲＴ株のいずれも、コロラド分離株に対する抗血清により中和されなかった。
【００１０】
ＡＰＶのコロラド株は、ＴＲＴウイルスのサブグループＡ又はサブグループＢ株による抗原刺激に対してＳＰＦニワトリを防御しない。これらの結果は、コロラド分離株がトリニューモウイルスの別の血清型の最初の例かも知れないことを示唆する（Bayon-Auboyerら、2000, J Gen Virol, 81:2723-33を参照）。
【００１１】
トリニューモウイルスは、１本鎖の非セグメント化ＲＮＡウイルスであり、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）のメタニューモウイルス属（metapneumovirus）に属する（CavanaghとBarrett, 1988, Virus Res. 11:241-256; Lingら, 1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715; Yuら, 1992, J. Gen. Virol. 73:1355-1363）。パラミクソウイルス科は、２つの亜科に分けられる：すなわち、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）とニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）。パラミクソウイルス亜科は、特に限定されないがパラミクソウイルス属（Paramyxovirus）、ルブラウイルス属（Rubulavirus）、及びモルビリウイルス属（Morbillivirus）を含む。最近ニューモウイルス亜科は、遺伝子の順序と配列相同性に基づき２つの属に分けられた：すなわち、ニューモウイルス（pneumovirus）とメタニューモウイルス（metapneumovirus）（Naylorら、1998, J. Gen. Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159）。ニューモウイルス属には、特に限定されないが、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ｈＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス（ｂＲＳＶ）、ヒツジ呼吸器合胞体ウイルス、及びマウスニューモウイルスがある。メタニューモウイルス属には、特に限定されないが、ヨーロッパトリニューモウイルス（サブグループＡとＢ）があり、これはｈＲＳＶ（ニューモウイルス属の標準種）から区別される（Naylorら、1998, J. Gen. Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159）。ＡＰＶのＵＳ分離株は、ヨーロッパ分離株とは抗原及び遺伝子の点で異なることがわかったため、メタニューモウイルス属内の第３のサブグループ（サブグループＣ）である（Seal, 1998, Virus Res. 58:45-52; Senneら、1998, Proc. 47th WPDC, カリホルニア、67-68頁）。
【００１２】
陰性染色されたＡＰＶの電子顕微鏡観察は、長さが１０００〜２０００ｎｍの範囲の長い繊維を有する、多形性の、特に球形の直径が８０〜２００ｎｍの範囲のウイルス粒子を明らかにする（CollinsとGough、J. Gen. Virol. 69:909-916）。このエンベロープは、長さが１３〜１５ｎｍのとげが散在した膜からなる。ヌクレオカプシドはらせん形で、直径１４ｍｍでピッチが７ｍｍである。ヌクレオカプシドの直径は、パラミクソウイルス（Paramyxovirus）属やモルビリウイルス（Morbillivirus）属のもの（これらは通常約１８ｎｍの直径を有する）より小さい。
【００１３】
トリニューモウイルス感染は、世界中に何年も存在しているにもかかわらずアメリカ合衆国では新たに起きている疾患である。１９９６年の５月にコロラドで、非常に感染性の強い七面鳥の疾患が出現し、後にアイオワ州Ａｍｅｓの国立家畜サービス研究所（National Veterinary Services Laboatory (NVSL)）で単離された（Senneら、1997, Proc. 134th Ann. Mtg., AVMA, pp.190）。この時期以前は、米国とカナダにはトリニューモウイルスはいないものだと考えられていた（Personら、1993, Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control、78-83頁中；HeckerとMyers, 1993, Vet. Rec. 132:172）。１９９７年の初期に、ミネソタ州の七面鳥で血清学的にＡＰＶの存在が検出された。最初に診断が確認されるまでに、すでにＡＰＶ感染症は多くの農場に広がっていた。この疾患は、上気道の臨床症状（泡沫状の目、鼻汁、及び鼻腔の腫脹）を引き起こす。これは２次感染により悪化する。感染した鳥の罹患率は１００％にもなる。死亡率は１〜９０％の範囲であり、６〜１２週齢の家禽で最大になる。
【００１４】
トリニューモウイルスは接触により伝搬する。鼻汁、感染した鳥の行動、汚染水、汚染された装置；汚染された飼料トラック、及び荷下ろし活動などが、ウイルスの伝搬に寄与する。回収された七面鳥はキャリアーであると考えられる。ウイルスは卵を生む七面鳥の卵管上皮に感染することが証明されており、ＡＰＶは若い家禽で検出されているため、卵伝搬は可能性が考えられる。
【００１５】
２．２  ＰＩＶ感染
パラインフルエンザウイルス感染は、幼児と小児で重症の呼吸器疾患を引き起こす（Taoら、1999, Vaccine 17:1100-08）。感染性パラインフルエンザウイルス感染症は、世界中で呼吸器感染症にかかった小児患者のすべての入院数の約２０％を占める。同上。
【００１６】
ＰＩＶは、パラミクソウイルス科のレスピロウイルス属（ＰＩＶ１、ＰＩＶ３）又はルブラウイルス属（ＰＩＶ２、ＰＩＶ４）のメンバーである。ＰＩＶは２つの構造モジュール（module）から構成されている：（１）内部リボ核タンパク質コア、又はヌクレオカプシド（ウイルスゲノムを含む）、（２）外部のほぼ球形のリポタンパク質エンベロープ。そのゲノムは、マイナスセンスＲＮＡの１本鎖からなり、これは、約１５，４５６ヌクレオチド長であり、少なくとも８個のポリペプチドをコードする。これらのタンパク質には、ヌクレオカプシド構造タンパク質（属によりＮＰ、ＮＣ、又はＮ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、融合糖タンパク質（Ｆ）、血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質（ＨＮ）、大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、及び機能が未知のＣタンパク質とＤタンパク質がある（同上）。
【００１７】
パラインフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ、ＮＣ、又はＮ）は、ＲＮＡと直接相互作用するアミノ末端ドメイン（分子の約３分の２を含む）と、構築されたヌクレオカプシドの表面上に存在するカルボキシ末端ドメインとを含む、各タンパク質内の２つのドメインからなる。これらの２つのドメインの結合部にヒンジが存在すると考えられ、従ってこのタンパク質にある程度の可撓性を付与している（Fieldsら（編）、1991, Fundamental Virology, 第2版参照、ラーベンプレス（Raven Press）、ニューヨーク、これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。マトリックスタンパク質（Ｍ）は明らかにウイルス構築に関与し、ウイルス膜とヌクレオカプシドタンパク質の両方と相互作用する。リン酸化を受けるリンタンパク質（Ｐ）は、転写において制御的役割を果たし、またメチル化、リン酸化及びポリアデニル化にも関与している可能性がある。融合糖タンパク質（Ｆ）はウイルス膜と相互作用し、まず不活性前駆体として産生され、次に翻訳後切断を受けて２つのジスルフィド結合で結合したポリペプチドを産生する。活性Ｆタンパク質はまた、ウイルスエンベロープと宿主細胞原形質膜との融合を促進することにより、宿主細胞へのパラインフルエンザウイルス粒子の貫通を促進する（同上）。糖タンパク質である血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）は、エンベロープから突き出て、ウイルスが血球凝集素活性ノイラミニダーゼ活性を含有することを可能にする。ＨＮはアミノ末端で強い疎水性であり、これがＨＮタンパク質を脂質二重層中に固定されることを可能にする。同上。最後に大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）は、転写と複製の両方で重要な役割を果たす（同上）。
【００１８】
２．３  ＲＳＶ感染症
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、幼児と小児の重症の下気道疾患の主原因である（Feigenら（編）、1987、Textbook of Pediatric Infectious Diseases中、ダブリュー・ビー・ソンダース（WB Saunders）、フィラデルフィア、1653〜1675頁；New Vaccine Development, Establishing Priorities、第1巻、1985、ナショナルアカデミープレス（National Academy Press）、ワシントンDC、397〜409頁；及びRuuskanenら、1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79）。ＲＳＶ感染の毎年の流行性は世界的に明らかであるが、ある季節のＲＳＶ疾患の発症率と重症度は地域により変動する（Hall, 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110）。北半球の温帯地域では、これは通常晩秋に始まり晩春に終わる。１次ＲＳＶ感染はほとんど６週齢〜２才の小児で起き、まれに院内流行中に生後４週間以内に起きる（Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396）。ＲＳＶ感染のリスクの高い小児には、特に限定されないが、早産児（Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396）、気管支肺異形成の小児（Groothuisら、1988, Pediatrics 82:199-203）、先天性心疾患（MacDonaldら、New Engl. J. Med. 307:397-400）、先天性又は後天性免疫不全症（Ograら、1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249；及びPohlら、1992, J. Infect. Dis. 165:166-169）、及び嚢胞性繊維症（Abmanら、1988, J. Pediatr. 113:826-830）がある。ＲＳＶ感染で入院した心疾患又は肺疾患の幼児の死亡率は、３％〜４％である（Navasら、1992, J. Pediatr. 121:348-354）。
【００１９】
ＲＳＶは幼児や小児と同様に成人にも起きる。健常成人ではＲＳＶは、主に上気道疾患を引き起こす。一部の成人（特に老人）は、以前報告されているよりはるかに高率に症候性ＲＳＶ感染症を有することが、最近明らかになっていきた（Evans, A.S.（編）、Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 第3版、Plenum Medical Book, ニューヨーク、525〜544頁）。養護施設患者及び施設の若者の間でもいくつかの流行が報告されている（Falsey, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608；及びGarvieら、1980, Br. Med. J. 281:1253-1254）。最後にＲＳＶは、免疫抑制者、特に骨髄移植患者で重症の疾患を引き起こすことがある（Hertzら、1989, Medicine 68:269-281）。
【００２０】
確立したＲＳＶ疾患の治療の選択肢は限定されている。下気道の重症のＲＳＶ疾患はしばしば、加湿酸素の投与と呼吸補助を含むかなりの補助治療が必要である（Fieldsら編、1990, Virology, 第2版、第1巻、ラーベンプレス（Raven Press）、ニューヨーク、1045-1072頁）。
【００２１】
ワクチンによりＲＳＶ感染及び／又はＲＳＶ関連疾患を予防できる可能性があるが、まだこれを適応症として認可されたワクチンは無い。ワクチン開発に対する大きな障害は安全性である。ホルマリンで不活性化したワクチンは免疫原性であるが、これは予想外に、免疫した幼児で同様に調製した３価ワクチンを免疫した幼児において、ＲＳＶによるより高率かつ重症の下気道疾患を引き起こした（Kimら、1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434；及びKapikianら、1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-421）。いくつかのＲＳＶワクチン候補が断念されており、いくつかは開発中である（Murphyら、1994, Virus Res. 32:13-36）が、安全性の問題が解決してもワクチンの効力も改良する必要がある。解決すべき多くの問題がある。下気道疾患の発症率のピークは生後２〜５ヶ月であるため、誕生直後の新生児期免疫が必要である。新生児の免疫応答の未成熟さが母親から獲得したＲＳＶ抗体の高力価と組合わさって、新生児期のワクチンの免疫原性を低下させると予測される（Murphyら、1988, J. Virol. 62:3907-3910；及びMurphyら、1991, Vaccine 9:185-189）。最後に、１次ＲＳＶ感染と疾患は、以後のＲＳＶ疾患に対して充分防御するものではない（Hendersonら、1979, New Engl. J. Med. 300:530-534）。
【００２２】
現在ＲＳＶ疾患の予防のために認可されている唯一の手法は受動免疫である。ＩｇＧの防御性役割を示唆する最初の証拠は、フェレット（Prince, G.A., 博士論文、カリホルニア大学ロサンゼルス校、1975）とヒト（Lambrechtら、1976, J. Infect. Dis. 134:211-217；及びGlezenら、1981, J. Pediatr. 98:708-715）の母親の抗体が関与する観察結果から得られた。Hemmingら（Morellら編、1986、Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins、アカデミックプレス（Academic Press）、ロンドン、285-294頁）は、新生児敗血症が疑われる新生児の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の薬物動態が関与する試験中に、ＲＳＶ感染の治療又は予防においてＲＳＶ抗体が有用である可能性を認識した。この試験では、その呼吸器分泌物がＲＳＶを与えた一人の幼児がＩＶＩＧ注入後に急速に回復することが観察された。ＩＶＩＧロットの以後の解析により、異常に高力価のＲＳＶ中和抗体が明らかになった。この同じ研究者のグループは次に、ＲＳＶ中和抗体が濃縮された高度免疫抗体又は免疫グロブリンが、ＲＳＶ感染に対してコットンラット及び霊長類を防御する能力を調べた（Princeら、1985, Virus Res. 3:193-206；Princeら、1990, J. Virol. 64:3091-3092；Hemmingら、1985, J. Infect. Dis. 152:1083-1087；Princeら、1983, Infect. Immun. 42:81-87；及びPrinceら、1985, J. Virol. 55:517-520）。これらの研究の結果は、ＩＶＩＧが、ＲＳＶ感染の予防、さらにはＲＳＶ関連障害の治療又は予防に使用しうることを示している。
【００２３】
最近の臨床試験は、この受動的に投与されたＲＳＶ高度免疫グロブリン（ＲＳＶ  ＩＶＩＧ）が、リスクのある小児をＲＳＶによる重症の下気道感染から防御する能力を証明した（Groothiusら、1993, New Engl. J. Med. 329:1524-1530；及びPREVENT研究グループ、1997, Pediatrics 99:93-99）。これは、ＲＳＶ感染の予防に対して大きな進歩であるが、この治療法は広く使用されるにはいくつかの限界がある。第１にＲＳＶ  ＩＶＩＧは、その有効用量を達成するためには数時間にわたる静脈内注入が必要である。第２に高度免疫グロブリン中の有効成分の濃度は、リスクのある成人又は心肺機能が低下したほとんどの小児を治療するのに不充分である。第３に静脈内注入では、ＲＳＶシーズンには毎月通院する必要がある。最後に、この製品に対する需要を満たすのに、ＲＳＶに対する高度免疫グロブリンを産生するための充分なドナーを選択することが困難である。現在、高度免疫グロブリンを産生するのに充分なＲＳＶ中和抗体力価を持つのは、正常ドナーの約８％のみである。
【００２４】
免疫グロブリンの比活性を改良するための１つの方法は、１つ以上の高力価のＲＳＶ中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を開発することであろう。好適な薬物動態を保持し、かつヒト抗マウス抗体応答の出現を避ける（ＲＳＶシーズンの間繰り返し投与が必要であろうことから）ために、このようなＭＡｂはヒトであるか又はヒト化されている必要がある。ＲＳＶ表面上の２つの糖タンパク質（ＦとＧ）が、中和抗体の標的であることが証明されている（Feildsら、1990, 前述；及びMurphyら、1994, 前述）。
【００２５】
ＲＳＶのＦタンパク質のＡ抗原性部位中のエピトープに対するヒト化抗体（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））は、ＲＳＶシーズン（北半球では１１月〜４月）中に、ＲＳＶにより引き起こされた重症の下気道疾患の予防のために、推奨された月毎の投与量の１５ｍｇ／ｋｇ体重で小児患者に筋肉内投与することが認可されている。ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）は、ヒト（９５％）とマウス（５％）抗体配列の複合体である。Johnsonら、1997, J. Infect. Diseases 176:1215-1224及びUS Patent No. 5,824,307（その全内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。Cor（Pressら、1970、Biochem. J. 117:641-660）とCess（Takashiら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:194-198）のヒトＩｇＧ１の定常ドメインとＶＨ遺伝子の可変フレームワーク領域からヒト重鎖配列が得られた。ヒト軽鎖配列は、Ｃκの定常ドメインと、Ｊκ−４（Bentleyら、1980, Nature 288:5194-5198）を有するＶＬ遺伝子の可変フレームワーク領域から得られた。マウス配列は、ヒト抗体フレームワークへのマウス相補性決定領域の移植を含む方法により、マウスモノクローナル抗体Ｍａｂ１１２９（Beelerら、1989, J. Virol. 63:2941-2950）から得られた。
【００２６】
ヒトの呼吸系疾患の大部分は、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）とニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）のメンバーにより引き起こされる。ヒトに感染する別の哺乳動物ニューモウイルス亜科（ｈＭＰＶ）の同定は、本明細書において初めて記載されている。呼吸器感染症を引き起こす種々のウイルスに対して防御性を付与する有効なワクチンに対するニーズが存在する。
【００２７】
２．４  宿主細胞へのウイルス侵入
エンベロープを有するウイルスのいくつか、例えばレトロウイルス、オルトミクソウイルス、フィロウイルス及びパラミクソウイルスは、宿主細胞への侵入を獲得する融合機構を利用している可能性が出てきている（Eckertら、2001, Annu. Rev. Biochem. 70:777-810；Weissenhornら、1999, Mol. Membr. Biol. 16:3-9；Lambら、1999, Mol. Membr. Biol. 16:11-19；Skehelら、2000, Annu. Rev. Biochem. 69:531-569；Bentz, J., 2000, Biophys J. 78:886-900；Peisajovichら、2002, Trends Biochem. Sci. 27:183-190）。このモデルにおいて、融合タンパク質はコンフォメーション変化を受け、パラミクソウイルスのＦタンパク質のＮ末端に存在する融合ペプチドが露出して、例えば細胞膜へ挿入される（Wangら、2003, Biochem. Biophys. Res. Comm. 302:469-475）。この高度に保存された７回反復（ＨＲ）領域は、融合過程の促進に関与している（Wangら、2003, Biochem. Biophys. Res. Comm. 302:469-475）。従って、この７回反復配列は、宿主細胞との融合を阻害することによりウイルス感染及び／又は増殖の予防のための魅力的な標的である。
【００２８】
本明細書における参照文献の引用又は論述は、そのようなものが本発明に対する従来技術であることを認めたと解釈されるものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２９】
３．発明の概要
本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖ＲＮＡウイルス、すなわちパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科のニューモウイルス（Pneumoviridae）亜科に属するメタニューモウイルス（ＭＰＶ）に関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素に系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖ＲＮＡウイルスにも関する。特に本発明は、Ｃ型ＡＰＶに関連するものよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より近縁の哺乳動物ＭＰＶに関する。より具体的な実施形態で、哺乳動物ＭＰＶは、変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２哺乳動物ＭＰＶでありうる。しかし本発明の哺乳動物ＭＰＶは、まだ同定されていない追加の変種を包含することができ、変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２に限定されない。
【００３０】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株、特にヒトメタニューモウイルスの分離株のゲノムヌクレオチド配列に関する。本発明は、診断及び治療方法を目的とした、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の配列情報の使用に関する。本発明は、種々のメタニューモウイルス分離株間でのゲノムヌクレオチド配列の相違と、この相違を本発明の診断及び治療方法に使用することに関する。特定の実施形態では、Ｎ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｍ２−１，Ｍ２−２，ＳＨ、又はＧ  ＯＲＦをコードする哺乳動物ＭＰＶのヌクレオチド配列を使用して、本発明のウイルスを同定することができる。他の特定の実施形態では、Ｎ、Ｍ、Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、ＳＨ、又はＧ  ＯＲＦをコードする哺乳動物ＭＰＶのヌクレオチド配列を使用して、哺乳動物ＭＰＶを変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２に分類することができる。特定の実施形態では、本発明は、診断を目的とした、種々のメタニューモウイルス分離株における１塩基多型（ＳＮＰ）の使用に関する。
【００３１】
本発明は、哺乳動物ＭＰＶ又はトリニューモウイルス（ＡＰＶ）由来の組換えウイルス及びキメラウイルスに関する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性の又は天然のゲノム配列あるいは非天然のゲノム配列によってコードされた哺乳動物ＭＰＶ又はＡＰＶから得られたものである。本発明によれば、非天然配列は、天然の又は内在性のゲノム配列に対する、限定されるものではないが、点変異、再配列、挿入、欠失などを含めた１つ又は複数の変異によって、これらのゲノム配列とは異なっているものであるが、これらの変異は表現型の変化を生じるものであってもよいし又は生じなくてもよい。本発明によれば、本発明のキメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えＭＰＶ又は組換えＡＰＶである。本発明によれば、キメラウイルスは、その配列中で、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているヌクレオチド配列、あるいは、内在性の又は天然のヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列に置換されているヌクレオチド配列によってコードされうる。ある実施形態で、本発明のキメラウイルスは、その中で、１つ若しくは複数のＯＲＦ又はその一部が、別の株のメタニューモウイルスの相同なＯＲＦ又はその一部に置換されているＭＰＶ又はＡＰＶに由来する。例示的な実施形態では、哺乳動物ＭＰＶのＦ遺伝子のＯＲＦを、ＡＰＶのＦ遺伝子のＯＲＦに置換する。別のある実施形態では、本発明のキメラウイルスは、１つ又は複数のＯＲＦを哺乳動物ＭＰＶの相同なＯＲＦに置換したＡＰＶから得られる。
【００３２】
本発明は、メタニューモウイルス（哺乳動物株及びトリ株を含む）のゲノム又はその一部をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、メタニューモウイルスの遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に関する。特に本発明は、ＭＰＶのＦタンパク質、Ｇタンパク質、Ｍタンパク質、ＳＨタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍ２タンパク質、又はＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関するが、これらに限定されない。特に本発明は、ＭＰＶの変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２などであるがこれらに限定されない哺乳動物ＭＰＶの変種のＦタンパク質、Ｇタンパク質、Ｍタンパク質、ＳＨタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍ２タンパク質、又はＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、哺乳動物メタニューモウイルス及びトリメタニューモウイルスの両方を含めたメタニューモウイルスのゲノム又はその一部をコードするｃＤＮＡ又はＲＮＡに関し、加えて、これらのウイルスのゲノムに対して異種又は非天然のヌクレオチド配列にも関する。本発明はさらに、前記ｃＤＮＡ又はＲＮＡによってコードされたキメラウイルス又は組換えウイルスを包含する。
【００３３】
本発明はさらに、哺乳動物ＭＰＶ及び哺乳動物ＭＰＶの種々の変種の、Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、Ｍタンパク質、ＳＨタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍ２タンパク質、又はＬタンパク質のポリペプチド及びアミノ酸配列に関する。本発明はさらに、哺乳動物ＭＰＶ及び哺乳動物ＭＰＶの種々の変種の、Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、Ｍタンパク質、ＳＨタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍ２タンパク質、又はＬタンパク質に対する抗体に関する。抗体は、診断及び治療方法で使用することができる。より具体的なある実施形態では、抗体は哺乳動物ＭＰＶに特異的である。ある実施形態では、抗体は、哺乳動物ＭＰＶの変種に特異的である。本発明はさらに、下記のもの、すなわち哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質、Ｇタンパク質、Ｍタンパク質、ＳＨタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍ２タンパク質、及び／又はＬタンパク質の１つ又は複数を含むワクチン製剤及び免疫原性組成物に関する。
【００３４】
本発明はさらに、哺乳動物又はトリのメタニューモウイルス（該ウイルスの組換え形態又はキメラ形態を含む）を含む、ワクチン製剤又は免疫原性組成物に関する。特に本発明は、ＭＰＶ及び／又はＡＰＶの組換え形態又はキメラ形態を含むワクチン製剤を包含する。本発明はさらに、１つ又は複数のＡＰＶタンパク質をコードし、任意選択でさらに１つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現する、キメラＭＰＶを含むワクチンに関する。また本発明は、１つ又は複数のｈＭＰＶタンパク質をコードし、任意選択でさらに１つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現する、キメラＡＰＶを含むワクチンにも関する。また本発明は、２価及び３価のワクチンを含めた多価ワクチンにも関する。特に本発明の多価ワクチンは、同じ又は異なるニューモウイルスベクターにより発現される２つ以上の抗原ポリペプチドを包含する。多価ワクチンの抗原ポリペプチドには、ＭＰＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ、ＲＳＶ、インフルエンザ又は別のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、あるいは麻疹ウイルスなど別のウイルスの抗原ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明はさらに、被験体における呼吸器感染を治療する方法に関する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物ＭＰＶを含むワクチン製剤を被験体に投与することによって、被験体の呼吸器感染症を治療することに関する。特定の実施形態で、被験体の呼吸器感染症を治療する方法は、組換え又はキメラの哺乳動物ＭＰＶ又はＡＰＶを含むワクチン製剤又は免疫原性組成物を、被験体に投与することを含む。より具体的な実施形態では、組換え又はキメラの哺乳動物ＭＰＶを弱毒化させる。特定の実施形態では、本発明は、組換えＡＰＶ又はキメラＡＰＶ、あるいはＡＰＶのＦタンパク質、Ｇタンパク質、Ｍタンパク質、ＳＨタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍ２タンパク質、又はＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むワクチン製剤をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者の呼吸器感染症の治療に関する。
【００３６】
本発明は、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科ニューモウイルス（Pneumovirinae）亜科に属し、かつメタニューモウイルス（Metapneumovirus）属に系統学上相当するものとして同定可能な、単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡウイルスＭＰＶを提供し、このウイルスは、トリ鼻気管炎の病因物質であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスよりも、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のヌクレオチド配列を含むウイルス分離株に、系統学上より近縁のものである。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号１８のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号１９のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号２０のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は、単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスであってそのウイルスのゲノムが配列番号２１のヌクレオチド配列を含むものを提供する。ある実施形態では、本発明は単離された核酸を提供し、この核酸は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１に対して少なくとも７０％が同一であるヌクレオチド配列を有し、この場合、配列の同一性は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１の全長にわたり決定されるものである。ある実施形態では、本発明は、核酸が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質（配列番号３２４）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質（配列番号３６８）に対して少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質（配列番号３７６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質（配列番号３６０）に同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質（配列番号３１６）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３４０）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質（配列番号３８４）に対して少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質（配列番号３２２）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質（配列番号３６６）に対して少なくとも９９．５％同一であ��アミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質（配列番号３７４）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質（配列番号３５８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質（配列番号３１４）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３３８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質（配列番号３８２）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のウイルスのＬタンパク質（配列番号３３０）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質（配列番号３６７）に対して少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質（配列番号３７５）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質（配列番号３５９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質（配列番号３１５）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３３９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質（配列番号３８３）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質（配列番号３３１）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質（配列番号３２５）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質（配列番号３６９）に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質（配列番号３７７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質（配列番号３６１）に同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質（配列番号３１７）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３４１）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４９��に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質（配列番号３８５）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質（配列番号３３３）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、単離された核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、核酸が、哺乳動物ＭＰＶの核酸に対して高いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、又は低いストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする、単離された核酸を提供する。
【００３７】
ある実施形態では、本発明は、配列番号１８〜２１のヌクレオチド配列又はその断片を含むウイルスを提供する。
【００３８】
ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質（配列番号３２４）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質（配列番号３６８）に対して少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質（配列番号３７６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質（配列番号３６０）に同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質（配列番号３１６）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３４０）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質（配列番号３８４）に対して少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質（配列番号３２２）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質（配列番号３６６）に対して少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質（配列番号３７４）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質（配列番号３５８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質（配列番号３１４）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３３８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質（配列番号３８２）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のウイルスのＬタンパク質（配列番号３３０）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質（配列番号３２３）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質（配列番号３６７）に対して少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質（配列番号３７５）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質（配列番号３５９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質（配列番号３１５）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３３９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質（配列番号３８３）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質（配列番号３３１）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、タンパク質が、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質（配列番号３２５）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質（配列番号３６９）に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質（配列番号３７７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質（配列番号３６１）に同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質（配列番号３１７）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３４１）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質（配列番号３８５）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質（配列番号３３３）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質を提供する。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質（配列番号３２４）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質（配列番号３６８）に対して少なくとも９８．５％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質（配列番号３７６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質（配列番号３６０）に同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質（配列番号３１６）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３４０）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質（配列番号３８４）に対して少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列；（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質（配列番号３２２）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質（配列番号３６６）に対して少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質（配列番号３７４）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質（配列番号３５８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質（配列番号３１４）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３３８）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４６）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質（配列番号３８２）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のウイルスのＬタンパク質（配列番号３３０）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質（配列番号３２３）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質（配列番号３６７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質（配列番号３７５）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質（配列番号３５９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質（配列番号３１５）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３３９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質（配列番号３８３）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質（配列番号３３１）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質（配列番号３２５）に対して少なくとも６６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質（配列番号３６９）に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列；（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質（配列番号３７７）に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列；（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質（配列番号３６１）に同一であるアミノ酸配列；（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質（配列番号３１７）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３４１）に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４９）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質（配列番号３８５）に対して少なくとも８４％同一であるアミノ酸配列；又は、（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質（配列番号３３３）に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、サンンプル中の変種Ｂ１哺乳動物ＭＰＶを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、変種Ｂ１に特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、サンプル中の変種Ａ１哺乳動物ＭＰＶを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、変種Ａ１に特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、サンプル中の変種Ａ２哺乳動物ＭＰＶを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、変種Ａ２に特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、サンプル中の変種Ｂ２哺乳動物ＭＰＶを検出する方法を提供し、前記方法は、サンプルを、Ｂ２に特異的な抗体と接触させることを含む。
【００３９】
ある実施形態では、本発明は、ウイルス分離株を哺乳動物ＭＰＶとして同定する方法を提供し、前記方法は、前記分離株又はその構成要素を哺乳動物ＭＰＶに特異的な抗体と接触させることを含む。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物のＭＰＶ感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記哺乳動物のサンプルをＭＰＶに特異的な抗体と接触させることにより、前記サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を決定する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、被験体における哺乳動物ＭＰＶ感染をウイルス学的に診断する方法であって、被験体からサンプルを得ること、及びそのサンプルをＭＰＶに特異的な抗体と接触させることを含む方法を提供し、その抗体がサンプルに結合する場合には被験体が哺乳動物ＭＰＶに感染している状態にある。
【００４０】
ある実施形態では、本発明は感染性組換えウイルスを提供し、この組換えウイルスは、哺乳動物ＭＰＶのゲノムを含み、さらに非天然ＭＰＶ配列を含むものである。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）ＭＰＶ  Ａ１変種のＧポリペプチドをコードする核酸と、（ｉｉ）非天然ＭＰＶポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）ＭＰＶ  Ａ２変種のＧポリペプチドをコードする核酸と、（ｉｉ）非天然ＭＰＶポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）ＭＰＶ  Ｂ１変種のＧポリペプチドをコードする核酸と、（ｉｉ）非天然ＭＰＶポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。ある実施形態では、本発明は、（ｉ）ＭＰＶ  Ｂ２変種のＧポリペプチドをコードする核酸と、（ｉｉ）非天然ＭＰＶポリペプチドをコードする核酸とを含む組換え核酸を提供する。
【００４１】
ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスが第１の変種の哺乳動物ＭＰＶのゲノムを含み、この第１の変種の哺乳動物ＭＰＶのゲノムにおけるオープンリーディングフレームの１つ又は複数を第２の変種の哺乳動物ＭＰＶ由来の類似のオープンリーディングフレームに置換したものである感染性キメラウイルスを提供する。ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスが第１の変種の哺乳動物ＭＰＶのゲノムを含み、第２の変種の哺乳動物ＭＰＶのオープンリーディングフレームの１つ又は複数を第１の変種の哺乳動物ＭＰＶのゲノムに挿入したものである感染性キメラウイルスを提供する。
【００４２】
ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスが哺乳動物ＭＰＶのゲノムを含み、哺乳動物ＭＰＶのゲノムにおけるオープンリーディングフレームの１つ又は複数を、トリＭＰＶ  Ｆタンパク質、トリＭＰＶ  Ｇタンパク質、（ｉｉｉ）トリＭＰＶ  ＳＨタンパク質、（ｉｖ）トリＭＰＶ  Ｎタンパク質、（ｖ）トリＭＰＶ  Ｐタンパク質、（ｖｉ）トリＭＰＶ  Ｍ２タンパク質、（ｖｉｉ）トリＭＰＶ  Ｍ２−１タンパク質、（ｖｉｉｉ）トリＭＰＶ  Ｍ２−２タンパク質、又は（ｉｘ）トリＭＰＶ  Ｌタンパク質の１つ又は複数をコードするＯＲＦに置換したものである感染性キメラウイルスを提供する。ある実施形態では、本発明は、感染性キメラウイルス、すなわちキメラウイルスがトリＭＰＶのゲノムを含み、トリＭＰＶのゲノムにおけるオープンリーディングフレームの１つ又は複数を、（ｉ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｆタンパク質、（ｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｇタンパク質、（ｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ  ＳＨタンパク質、（ｉｖ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｎタンパク質、（ｖ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｐタンパク質、（ｖｉ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｍ２タンパク質、（ｖｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｍ２−１タンパク質、（ｖｉｉｉ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｍ２−２タンパク質、又は（ｉｘ）哺乳動物ＭＰＶ  Ｌタンパク質の１つ又は複数をコードするＯＲＦに置換したものである感染性キメラウイルスを提供する。
【００４３】
ある実施形態では、本発明は感染性のキメラウイルス又は組換えウイルスを提供し、このキメラウイルス又は組換えウイルスは、種間又は種内ポリメラーゼ（interspecies or intraspecies polymerase）を使用してレスキューされる。一実施形態では、本発明はキメラウイルス又は組換えウイルスを提供し、このキメラウイルス又は組換えウイルスは、ＭＰＶポリメラーゼを使用してレスキューされる。一実施形態では、本発明は、レスキューされるウイルスのポリメラーゼとは異なるウイルス、すなわち、異なるクレード、サブタイプ、又は他の種に由来するポリメラーゼを使用する。別の実施形態では、本発明は、感染性のキメラウイルス又は組換えウイルスを提供し、このキメラウイルス又は組換えウイルスは、限定されるものではないが、ＰＩＶ、ＡＰＶ又はＲＳＶのポリメラーゼを含めた、別のウイルス由来のポリメラーゼを使用してレスキューされる。可能な組合せの制限としてではなく、例として挙げれば、ＭＰＶをレスキューするのにＲＳＶポリメラーゼを使用することができ、ＲＳＶをレスキューするのにＭＰＶポリメラーゼを使用することができ、あるいは、ＭＰＶをレスキューするのにＰＩＶポリメラーゼを使用することができる。本発明のさらに別の実施形態では、組換えウイルスをレスキューするのに使用されるポリメラーゼ複合体が、異なったウイルス由来のポリメラーゼタンパク質によってコードされる。可能な組合せの制限としてではなく、例として挙げれば、一実施形態では、ＭＰＶのＮ遺伝子、ＰＩＶのＬ遺伝子、ＲＳＶのＰ遺伝子、及びＭＰＶのＭ２−１遺伝子によって、ポリメラーゼ複合体タンパク質がコードされる。他の実施形態では、Ｍ２−１遺伝子がポリメラーゼ複合体の構成要素とならない。本発明の別の実施形態では、ＲＳＶのＮ遺伝子、ＲＳＶのＬ遺伝子、ＡＰＶのＰ遺伝子、及びＲＳＶのＭ２−１遺伝子によって、ポリメラーゼ複合体タンパク質がコードされる。本発明の別の実施形態では、本発明の組換えウイルスをレスキューするのに、Ｍ２−１遺伝子を必要としない。当業者ならば、ポリメラーゼ複合体タンパク質をコードするのに使用でき、それによって本発明の組換えキメラウイルスがレスキューされるような組合せのタイプに精通しているであろう。
【００４４】
ある実施形態では、本発明は、本発明の感染性組換えウイルスを含む免疫原性組成物を提供する。
【００４５】
ある実施形態では、本発明は、サンプルを本発明の核酸配列と接触させることを含む、サンプル中の哺乳動物ＭＰＶを検出する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の感染性組換えウイルスを含む医薬品組成物を提供する。
【００４６】
ある実施形態では、本発明は、ＭＰＶに関連した核酸、プロセシングされた産物、又はその誘導体に対する増幅又はプローブ検出を含む、サンプル中の哺乳動物ＭＰＶを検出する方法を提供する。より具体的な実施形態では、本発明は、サンプル中のＭＰＶの検出を行うポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ＭＰＶに関連した核酸、プロセシングされた産物、又はその誘導体の存在の特異的な検出に使用できるオリゴヌクレオチドプローブを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ウイルスに感染した宿主内のＭＰＶ抗体を検出する診断方法を提供する。
【００４７】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、哺乳動物における呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【００４８】
ある実施形態では、本発明は、本発明の組換え哺乳動物メタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、哺乳動物における呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【００４９】
ある実施形態では、本発明は、トリメタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、哺乳動物の呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、トリメタニューモウイルスを含むワクチンを投与することを含む、ヒトの呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明の組成物を被験体に投与することを含む、被験体の呼吸器感染症を治療又は予防する方法を提供する。
【００５０】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物ＭＰＶによる感染の治療に有用な化合物を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）動物を哺乳動物ＭＰＶに感染させるステップと、（ｂ）その動物に試験化合物を投与するステップと、（ｃ）その試験化合物が動物の感染に及ぼす影響を決定するステップとを含み、感染の範囲を減少させ又は感染に伴う症状を軽くする試験化合物を、哺乳動物ＭＰＶによる感染の治療に有用な化合物であると定める。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物ＭＰＶによる感染の治療に有用な化合物を同定する方法を提供し、この方法は、（ａ）細胞培養物を哺乳動物ＭＰＶに感染させるステップと、（ｂ）その細胞培養物を試験化合物と共にインキュベートするステップと、（ｃ）その試験化合物が細胞培養物の感染に及ぼす影響を決定するステップとを含み、感染の範囲を減少させる試験化合物を、哺乳動物ＭＰＶによる感染の治療に有用な化合物であると同定する。ある実施形態では、本発明は、動物の哺乳動物ＭＰＶ感染を診断する方法を提供し、この方法は、動物のサンプルを、トリニューモウイルスの構成要素に対して反応性を有する核酸又は抗体と反応させることによって、前記サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を決定することを含み、前記核酸又は抗体は、ＭＰＶの構成要素と交差反応するものである。
【００５１】
ある実施形態では、本発明は、動物由来のサンプルを本発明のタンパク質と接触させることを含む、動物の哺乳動物ＭＰＶ感染を血清診断する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、動物由来のサンプルをＡＰＶのタンパク質と接触させることを含む、動物の哺乳動物ＭＰＶ感染を血清診断する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、動物由来のサンプルを本発明のタンパク質と接触させることを含む、トリのＡＰＶ感染を診断する方法を提供する。
【００５２】
ある実施形態では、本発明は、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科ニューモウイルス（Pneumovirinae）亜科に属しかつ系統学上メタニューモウイルス（Metapneumovirus）属に相当するものとして同定可能な単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡウイルスＭＰＶを提供し、このウイルスは、トリ鼻気管炎の病因物質であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルスよりも、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より近縁のものである。
【００５３】
３．１  慣用語と略語
ｃＤＮＡ        相補的ＤＮＡ
Ｌ              大タンパク質
Ｍ              マトリックスタンパク質（エンベロープの内側の線）
Ｆ              融合糖タンパク質
ＨＮ            血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質
Ｎ、ＮＰ又はＮＣ  核タンパク質（ＲＮＡに関係しポリメラーゼ活性に必要）
Ｐ              リンタンパク質
ＭＯＩ          感染多重度
ＮＡ            ノイラミニダーゼ（エンベロープ糖タンパク質）
ＰＩＶ          パラインフルエンザウイルス
ｈＰＩＶ        ヒトパラインフルエンザウイルス
ｈＰＩＶ３      ヒトパラインフルエンザウイルス３型
ＡＰＶ／ｈＭＰＶ  ｈＭＰＶ配列を有する組換えＡＰＶ
ｈＭＰＶ／ＡＰＶ  ＡＰＶ配列を有する組換えｈＭＰＶ
哺乳動物ＭＰＶ  哺乳動物メタニューモウイルス
ｎｔ            ヌクレオチド
ＲＮＰ          リボ核タンパク質
ｒＲＮＰ        組換えＲＮＰ
ｖＲＮＡ        ゲノムウイルスＲＮＡ
ｃＲＮＡ        抗ゲノムウイルスＲＮＡ
ｈＭＰＶ        ヒトメタニューモウイルス
ＡＰＶ          トリニューモウイルス
ＭＶＡ          改変ワクシニアウイルスアンカラ
ＦＡＣＳ        蛍光活性化細胞分取器
ＣＰＥ          細胞変性効果
１位            転写されるウイルスゲノムの第１遺伝子の位置
２位            天然のウイルスゲノムの第１オープンリーディングフレームと第２オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第２遺伝子の位置
３位            天然のウイルスゲノムの第２オープンリーディングフレームと第３オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第３遺伝子の位置
４位            天然のウイルスゲノムの第３オープンリーディングフレームと第４オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第４遺伝子の位置
５位            天然のウイルスゲノムの第４オープンリーディングフレームと第５オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第５遺伝子の位置
６位            天然のウイルスゲノムの第５オープンリーディングフレームと第６オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第６遺伝子の位置
ｄｐｉ（感染後の日数）
Ｆ（融合）
ＨＡＩ（血球凝集抑制）
ＨＮ（血球凝集素−ノイラミニダーゼ）
ｈｐｉ（感染後の時間）
ＭＯＩ（感染多重度）
ＰＯＩ（感染時）
ｂＰＩＶ−３（ウシパラインフルエンザウイルス３型）
ｈＰＩＶ−３（ヒトパラインフルエンザウイルス３型）
ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）
ＳＦＭ（血清不含培地）
ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）
4.図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１：分離株００−１とニューモウイルス科の他のメンバーのアミノ酸配列間で見出される相同性％。百分率（×１００）は、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、及びＬの２つのＲＡＰ−ＰＣＲ断片（８及び９／１０）のアミノ酸配列について示す。
【図２】図２：免疫蛍光アッセイ及びウイルス中和アッセイを用いた、年齢群により分類したヒトにおけるＭＰＶの血清陽性率。
【図３】図３：ウイルス分離株００−１（Ａ１）に対してＲＡＰ−ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲを用いて得られた断片の一及びサイズを示したＡＰＶのゲノムの概要図。断片１〜１０は、ＲＡＰ−ＰＣＲを用いて得られた。断片Ａは、ＲＡＰ−ＰＣＲ断片１及び２におけるプライマーと、ＡＰＶとＲＳＶのリーダー及びトレーラー配列のアライメント（Randhawaら、1997, J. Virol. 71: 9849-9854）に基づいて設計されたプライマーを用いて得られた。断片Ｂは、ＲＡＰ−ＰＣＲ断片１及び２と、ＲＡＰ−ＰＣＲ断片３において設計されたプライマーを用いて得られた。断片Ｃは、ＲＡＰ−ＰＣＲ断片３と、ＲＡＰ−ＰＣＲ断片４、５、６及び７において設計されたプライマーを用いて得られた。
【図４ａ】図４：ニューモウイルス亜科のメンバー及びウイルス分離株００−１（Ａ１）のＮ、Ｐ、Ｍ及びＦのＯＲＦの比較。アライメントは、ウイルス分離株００−１（Ａ１）の完全なＮ、Ｆ、Ｍ及びＰタンパク質、並びに部分的なＬタンパク質のアミノ酸配列を示す。分離株００−１（Ａ１）と他のウイルスとで異なるアミノ酸を示し、同じアミノ酸は点で示す。ギャップはハイフンで示す。数値はタンパク質におけるアミノ酸の位置に対応する。略語は以下の通りである：ＡＰＶ−Ａ、Ｂ又はＣ：トリニューモウイルスＡ型、Ｂ型又はＣ型；ｈＲＳＶ：ウシ又はヒト呼吸器合胞体ウイルス；ＰＶＭ：マウス肺炎ウイルス；Ｌ８：Ｌに位置するＲＡＰ−ＰＣＲで得られる断片８；Ｌ９／１０：Ｌに位置するＲＡＰ−ＰＣＲで得られる断片９及び１０のコンセンサス。Ｌのアライメントについては、ｂＲＳＶ、ｈＲＳＶ及びＡＰＶ−Ａ配列のみが利用可能であった。
【図４ｂ】図４の続き。
【図４ｃ】図４の続き。
【図５】図５：ＭＰＶと他のニューモウイルスの核タンパク質の推定アミノ酸配列のアライメント。保存領域は四角で示し、Ａ、Ｂ及びＣで標識している。ニューモウイルスにおける保存領域は灰色の網掛けで示す。ギャップはハイフンで示し、点はＭＰＶと比較して同じアミノ酸残基の位置を示す。
【図６】図６：ＭＰＶと他のニューモウイルスのリンタンパク質のアミノ酸配列比較。類似性の高い領域は四角で示し、グルタミン酸に富む領域は灰色の網掛けで示す。ギャップはハイフンで示す。点はＭＰＶと比較して同じアミノ酸残基の位置を示す。
【図７】図７：ＭＰＶと他のニューモウイルスのマトリックスタンパク質の推定アミノ酸配列の比較。保存ヘキサペプチド配列は灰色の網掛けで示す。ギャップはハイフンで示す。点はＭＰＶと比較して同じアミノ酸残基の位置を示す。
【図８】図８：ＭＰＶ分離株００−１（Ａ１）のゲノムマップ。開始コドン及び停止コドンのヌクレオチド位置を各ＯＲＦの下に示す。ＬのＯＲＦと交差する二本線はＬ遺伝子の省略形を示す。マップの下にある３つのリーディングフレームは、一次Ｇ  ＯＲＦ（ｎｔ６２６２−６９７２）を示し、潜在的な二次ＯＲＦと重複する。
【図９】図９：ＭＰＶと他のニューモウイルスの融合タンパク質の推定アミノ酸配列のアライメント。保存システイン残基は四角で示す。Ｎ結合型糖鎖付加（グリコシル化）部位に下線を付している。Ｆ０の切断部位には二重下線を付しており、融合ペプチド、シグナルペプチド及び膜固定ドメインは灰色の網掛けで示す。ギャップはハイフンで示し、点はＭＰＶと比較して同じアミノ酸残基の位置を示す。
【図１０】図１０：ＭＰＶと他のニューモウイルスのＭ２  ＯＲＦのアミノ酸配列の比較。Ｍ２−１  ＯＲＦのアライメントをパネルＡに示し、保存アミノ末端を灰色の網掛けで示す。３つの保存システイン残基は太字であり、＃で示す。Ｍ２−２  ＯＲＦのアライメントをパネルＢに示す。ギャップはハイフンで示し、点はＭＰＶと比較して同じアミノ酸の位置を示す。
【図１１】図１１：ＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦのアミノ酸配列分析。（Ａ）ＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦのアミノ酸配列。セリン及びトレオニン残基を灰色の網掛けで、システイン残基を太字で、疎水性領域を二重下線で示す。可能性のあるＮ結合型糖鎖付加（グリコシル化）部位は一本下線で示す。矢印は疎水性ドメインに隣接する塩基性アミノ酸の位置を示す。（Ｂ）ＭＰＶ、ＡＰＶ−Ａ及びｈＲＳＶ−ＢのＳＨタンパク質の疎水性プロットのアライメント。１７アミノ酸のウインドウを使用した。矢印は強力な疎水性ドメインを示す。ＯＲＦ内の位置をＸ軸に示す。
【図１２】図１２：ＭＰＶのＧ  ＯＲＦのアミノ酸配列分析。（Ａ）ＭＰＶのＧ  ＯＲＦのアミノ酸配列。セリン、トレオニン及びプロリン残基を灰色の網掛けで、システイン残基を太字で、疎水性領域を二重下線で示す。可能性のあるＮ結合型糖鎖付加（グリコシル化）部位は一本下線で示す。（Ｂ）ＭＰＶ、ＡＰＶ−Ａ及びｈＲＳＶ−ＢのＧタンパク質の疎水性プロットのアライメント。１７アミノ酸のウインドウを使用した。矢印は疎水性ドメインを示す。ＯＲＦ内の位置をＸ軸に示す。
【図１３】図１３：ＭＰＶ及び他のパラミクソウイルスのポリメラーゼ遺伝子の保存ドメインのアミノ酸配列の比較。ドメインＩＩＩは、ドメインＩＩＩ内の４つの保存ポリメラーゼモチーフ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）（Poch他、1989 EMBO J 8:3867〜74; Poch他、1990、J.Gen.Virol 71:1153〜62）を四角で囲んで示す。ギャップはハイフンで表し、点は、ＭＰＶと比較して同じアミノ酸残基の位置を示す。略称は下記の通りである：ｈＰＩＶ−３：ヒトパラインフルエンザウイルス３型；ＳＶ：センダイウイルス；ｈＰＩＶ−２：ヒトパラインフルエンザウイルス２型；ＮＤＶ：ニューカッスル病ウイルス；ＭＶ：麻疹ウイルス；ｎｉｐａｈ：ニパウイルス。
【図１４】図１４：ニューモウイルス属のメンバー及びウイルス分離株００−１（Ａ１）の、Ｎ、Ｆ、Ｍ、及びＦ  ＯＲＦの系統学的分析。系統学的分析は、以下の遺伝子、すなわちＦ（パネルＡ）、Ｎ（パネルＢ）、Ｍ（パネルＣ）、及びＰ（パネルＤ）由来のウイルス配列に関して行った。系統樹は、１００回のブートストラップ及び３回のジャンブルを使用した最尤解析に基づく。ヌクレオチドの変化の数を表すスケールを、各ツリーごとに示す。
【図１５】図１５：ＭＰＶ及び選択されたパラミクソウイルスのＭ２−１及びＬ  ＯＲＦの系統学的分析。Ｍ２−１  ＯＲＦを、ニューモウイルス属の他のメンバーのＭ２−１  ＯＲＦとアライメントし（Ａ）、Ｌ  ＯＲＦは、ニューモウイルス属のメンバー及び図１３の説明に記載されている選択された他のパラミクソウイルスのＬ  ＯＲＦとアライメントした。系統樹は、１００回のブートストラップ及び３回のジャンブルを使用した最尤解析によって作成した。ヌクレオチドの変化の数を表すスケールを、各ツリーごとに示す。ツリー中の数は、コンセンサスツリーに基づくブートストラップ値を表す。
【図１６】図１６：Ｆ（パネルＡ）、Ｎ（パネルＢ）、Ｍ（パネルＣ）２０、及びＬ（パネルＤ）ＯＲＦ部分に関する、１次ＭＰＶ分離株９個と、これらと遺伝学的に近縁のＡＰＶ−Ｃとの系統学上の関係。系統樹は最尤解析に基づいている。ヌクレオチドの変化の数を表すスケールを、各ツリーごとに示す。ＡＰＶ−Ｃに関するアクセッション番号：パネルＡ：Ｄ００８５０；パネルＢ：Ｕ３９２９５；パネルＣ：Ｘ５８６３９；及びパネルＤ：Ｕ６５３１２。
【図１７ａ】図１７：４つの変種、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２全てのｈＭＰＶの、種々の分離株のＦ遺伝子のアライメント。
【図１７ｂ】図１７の続き。
【図１７ｃ】図１７の続き。
【図１７ｄ】図１７の続き。
【図１７ｅ】図１７の続き。
【図１７ｆ】図１７の続き。
【図１７ｇ】図１７の続き。
【図１７ｈ】図１７の続き。
【図１７ｉ】図１７の続き。
【図１７ｊ】図１７の続き。
【図１７ｋ】図１７の続き。
【図１８ａ】図１８：４つの変種、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２全てのｈＭＰＶの、種々の分離株のＦタンパク質のアライメント。
【図１８ｂ】図１８の続き。
【図１８ｃ】図１８の続き。
【図１８ｄ】図１８の続き。
【図１８ｅ】図１８の続き。
【図１９ａ】図１９：４つの変種、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２全てのｈＭＰＶの、種々の分離株のＧ遺伝子のアライメント。
【図１９ｂ】図１９の続き。
【図１９ｃ】図１９の続き。
【図１９ｄ】図１９の続き。
【図１９ｅ】図１９の続き。
【図１９ｆ】図１９の続き。
【図１９ｇ】図１９の続き。
【図１９ｈ】図１９の続き。
【図１９ｉ】図１９の続き。
【図１９ｊ】図１９の続き。
【図１９ｋ】図１９の続き。
【図２０ａ】図２０：４つの変種、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２全てのｈＭＰＶの、種々の分離株のＧタンパク質のアライメント。
【図２０ｂ】図２０の続き。
【図２０ｃ】図２０の続き。
【図２０ｄ】図２０の続き。
【図２１】図２１：種々のｈＭＰＶ分離株と、それぞれのｈＭＰＶ変種との系統学上の関係を示す、Ｆ遺伝子配列に基づいた系統樹。
【図２２】図２２：種々のｈＭＰＶ分離株と、図１３に示すそれぞれのｈＭＰＶ変種との系統学上の関係を示す、Ｇ遺伝子配列に基づく系統樹。
【図２３】図２３：Ｖｅｒｏ細胞内のｈＭＰＶ分離株００−１（Ａ１）の増殖曲線。Ｖｅｒｏ細胞は、ＭＯＩ０．１で感染させた。
【図２４ａ】図２４：ＣＡＴ−ｈＭＰＶミニレプリコン構築体の配列。配列のセグメントによりコードされる機能を、その配列の下に示す。
【図２４ｂ】図２４の続き。
【図２４ｃ】図２４の続き。
【図２５】図２５：ＣＡＴ−ｈＭＰＶミニレプリコンからのＣＡＴの発現。トランスフェクションに使用される種々の構築体をｘ軸上に示し、ＣＡＴ発現の量をｙ軸上に示す。この図は、トランスフェクションの２４時間後のＣＡＴ発現、及びトランスフェクションの４８時間後のＣＡＴ発現を示す。基準はＣＡＴタンパク質の希釈物とした。
【図２６】図２６：リーダー配列とトレーラー配列の比較。示した種々のウイルスのリーダー配列とトレーラー配列のアライメントを示す。
【図２７】図２７：ｈＭＰＶゲノム分析。ｈＭＰＶゲノム構成に対するｈＭＰＶゲノム配列のＰＣＲ断片を示す。変異の位置を、ＰＣＲ断片を表す垂直な棒の下に示す。
【図２８】図２８：ｈＭＰＶ分離株００−１（Ａ１）及びｈＭＰＶ分離株９９−１（Ｂ１）の制限マップ。それぞれの分離株における制限部位を、ｈＭＰＶのゲノム構成図の下に示す。図の最上部のスケールは、ｈＭＰＶゲノムにおける位置を、ｋｂを単位として示す。
【図２９Ａ】図２９Ａ：ｈＭＰＶ  ｃＤＮＡ構築。上部の図はｈＭＰＶのゲノム構成を示し、その下のバーは、ウイルスをコードする完全長ｃＤＮＡが得られるようにアセンブルされたＰＣＲ断片（図２７参照）を示す。ＰＣＲ断片を表すバーの上部に付された数は、塩基対内のウイルスゲノムにおける位置を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ｂ：ｈＭＰＶ  ｃＤＮＡ構築。上部の図はｈＭＰＶのゲノム構成を示し、その下のバーは、ウイルスをコードする完全長ｃＤＮＡが得られるようにアセンブルされたＰＣＲ断片（図２７参照）を示す。ＰＣＲ断片を表すバーの上部に付された数は、塩基対内のウイルスゲノムにおける位置を示す。
【図３０ａ】図３０：ＭＰＶ分離株００−１（Ａ１）のゲノムの３’末端からの、ヌクレオチド及びアミノ酸配列情報。ＯＲＦが示されている。Ｎ：核タンパク質のＯＲＦ；Ｐ：リンタンパク質のＯＲＦ；Ｍ：マトリックスタンパク質のＯＲＦ；Ｆ：融合タンパク質のＯＲＦ；ＧＥ：遺伝子の終わり；ＧＳ：遺伝子の開始。
【図３０ｂ】図３０の続き。
【図３０ｃ】図３０の続き。
【図３１】図３１Ａ及びＢ：ＭＰＶ分離株００−１（Ａ１）のポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）において得られた断片からのヌクレオチド及びアミノ酸配列情報。Ｌにおける断片の位置決めは、ＡＰＶ−Ａ（アクセッション番号Ｕ６５３１２）とのタンパク質相同性に基づく。翻訳された断片８（図３１Ａ）は、アミノ酸番号８〜２４３に位置し、断片９及び１０のコンセンサス（図３１Ｂ）は、ＡＰＶ−Ａ  Ｌ  ＯＲＦのアミノ酸番号１３５８〜１４６４に位置する。
【図３２】図３２：ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）及び／又はｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）を接種した１２匹のモルモット１５の、咽喉及び鼻のスワブに関するＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果。
【図３３Ａ】図３３Ａ：ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）を感染させ、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）（ＧＰ４、５、及び６）又はｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）（ＧＰ１及び３）を再感染させたモルモットの、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）及びｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）に対するＩｇＧ応答。
【図３３Ｂ】図３３Ｂ：ｎｅｄ／９９／０１を感染させ、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）（ＧＰ８及び９）又はｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）（ＧＰ１０、１１、１２）を再感染させたモルモットの、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）及びｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）に対するＩｇＧ応答。
【図３４】図３４：ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）又はｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）を感染させたモルモットから得た血清に対する、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）及びｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）のＥＬＩＳＡの特異性。
【図３５】図３５：３匹の同種（００−１／００−１）感染、２匹の同種（９９−１／９９−１）感染、２匹の異種（９９−１／００−１）感染、及び２匹の異種（００−１／９９−１）感染モルモットの、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）及びｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）ＥＬＩＳＡに対する平均ＩｇＧ応答。
【図３６】図３６：ｈＭＰＶ感染モルモットのＡＰＶ阻害の平均パーセンテージ。
【図３７】図３７：ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）、ｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）、及びＡＰＶ−Ｃに対する、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）及びｎｅｄ／９９／０１（Ｂ１）に感染したモルモットの、ウイルス中和力価。
【図３８】図３８：ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）を接種した（２回）カニクイザルの、咽喉のスワブに関するＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果。
【図３９】図３９Ａ（上部２つのパネル）：ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）に（再）感染した２匹のカニクイザルの、ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＧ応答。図３９Ｂ（下部パネル）：ｎｅｄ／００／０１（Ａ１）に感染した２匹のカニクイザルの、ＡＰＶに対するＩｇＧ応答。
【図４０】図４０：ヒト血清中のＩｇＧ抗体を検出するための、ｈＭＰＶ  ＥＬＩＳＡの使用とＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡの使用との比較。
【図４１ａ】図４１：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株をＡＰＶ−Ａ及びＡＰＶ−Ｃとの比較。様々なウイルスタンパク質をコードする核酸に関するＤＮＡ類似性マトリックスである。
【図４１ｂ】図４１：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株をＡＰＶ−Ａ及びＡＰＶ−Ｃとの比較。様々なウイルスタンパク質をコードする核酸に関するＤＮＡ類似性マトリックスである。
【図４２ａ】図４２：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株をＡＰＶ−Ａ及びＡＰＶ−Ｃとの比較。様々なウイルスタンパク質に関するタンパク質類似性マトリックスである。
【図４２ｂ】図４２ｂ：哺乳動物ＭＰＶの４つのプロトタイプのコード配列の比較。左の欄は核酸配列の比較を示し、右の欄はアミノ酸配列の比較を示す。ＮＬ／１／００は、変種Ａ１のプロトタイプである（配列番号１９）。ＮＬ／１７／００は、変種Ａ２のプロトタイプである（配列番号２０）。ＮＬ／１／９９は、変種Ｂ１のプロトタイプである（配列番号１８）。ＮＬ／１／９４は、変種Ｂ２のプロトタイプである（配列番号２１）。
【図４３】図４３：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、核タンパク質のアミノ酸アライメント。
【図４４】図４４：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、リンタンパク質のアミノ酸アライメント。
【図４５】図４５：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、マトリックスタンパク質のアミノ酸アライメント。
【図４６】図４６：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、融合タンパク質のアミノ酸アライメント。
【図４７】図４７：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、Ｍ２−１タンパク質のアミノ酸アライメント。
【図４８】図４８：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、Ｍ２−２タンパク質のアミノ酸アライメント。
【図４９】図４９：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、短い疎水性タンパク質のアミノ酸アライメント。
【図５０】図５０：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、付着糖タンパク質のアミノ酸アライメント。
【図５１】図５１：２つのプロトタイプのｈＭＰＶ分離株の、ポリメラーゼタンパク質のＮ末端のアミノ酸アライメント。
【図５２】図５２：ｈＭＰＶ分離株００−１（Ａ１）の非コード配列。（Ａ）ＯＲＦ間及びゲノム末端の非コード配列をプラスセンスで示す。左から右に、示されるＯＲＦの停止コドンが示され、その後に、非コード配列、遺伝子開始シグナル、及び示される後続のＯＲＦの開始コドンが続く。数値は、ｈＭＰＶマップにおける開始及び停止コドンの最初の位置を示す。公開されている遺伝子末端シグナルとの類似性を表示する配列には下線を付し、ＵＡＡＡＡＡＵ／Ａ／Ｃとの類似性を表示する配列は、その配列の上に線を付して表す。（Ｂ）ｈＭＰＶのゲノム末端のヌクレオチド配列を示す。ｈＭＰＶのゲノム末端を互いにアライメントし、またＡＰＶのゲノム末端ともアライメントする。下線を付した領域は、ＡＰＶ及びＲＳＶの３’及び５’末端配列に基づくＲＴ−ＰＣＲアッセイで使用されるプライマー配列を表す。太字のイタリックで示すヌクレオチドは、Ｎ遺伝子の遺伝子開始シグナルの一部である。Ｌｅ：リーダー、Ｔｒ：トレーラー。
【図５３−１】図５３：ｈＭＰＶ分離株００−１（Ａ１）とｈＭＰＶ分離株９９−１（Ｂ１）とのゲノム配列の配列比較。
【図５３−２】図５３−１の続きである。
【図５３−３】図５３−２の続きである。
【図５３−４】図５３−３の続きである。
【図５３−５】図５３−４の続きである。
【図５３−６】図５３−５の続きである。
【図５３−７】図５３−６の続きである。
【図５３−８】図５３−７の続きである。
【図５３−９】図５３−８の続きである。
【図５３−１０】図５３−９の続きである。
【図５３−１１】図５３−１０の続きである。
【図５３−１２】図５３−１１の続きである。
【図５３−１３】図５３−１２の続きである。
【図５３−１４】図５３−１３の続きである。
【図５３−１５】図５３−１４の続きである。
【図５３−１６】図５３−１５の続きである。
【図５３−１７】図５３−１６の続きである。
【図５３−１８】図５３−１７の続きである。
【図５３−１９】図５３−１８の続きである。
【図５３−２０】図５３−１９の続きである。
【図５３−２１】図５３−２０の続きである。
【図５３−２２】図５３−２１の続きである。
【図５３−２３】図５３−２２の続きである。
【図５３−２４】図５３−２３の続きである。
【図５３−２５】図５３−２４の続きである。
【図５３−２６】図５３−２５の続きである。
【図５３−２７】図５３−２６の続きである。
【図５３−２８】図５３−２７の続きである。
【図５３−２９】図５３−２８の続きである。
【図５３−３０】図５３−２９の続きである。
【図５３−３１】図５３−３０の続きである。
【図５３−３２】図５３−３１の続きである。
【図５３−３３】図５３−３２の続きである。
【図５３−３４】図５３−３３の続きである。
【図５３−３５】図５３−３４の続きである。
【図５３−３６】図５３−３５の続きである。
【図５３−３７】図５３−３６の続きである。
【図５３−３８】図５３−３７の続きである。
【図５３−３９】図５３−３８の続きである。
【図５３−４０】図５３−３９の続きである。
【図５３−４１】図５３−４０の続きである。
【図５４】図５４：ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）ＮＬ／１／００（Ａ１）ゲノムＲＮＡのリーダー配列を、ポリアデニル化法と３’ＲＡＣＥ法との組合せを使用して決定した。
【図５５】図５５：ＰＣＲ産物に関する直接的な配列決定解析及びＰＣＲクローンに関する配列決定解析を示し、どちらも、ｈＭＰＶのリーダー領域が、そのリーダー配列中の３’末端に最も近い２０ヌクレオチドで５’ＡＣＧ  ＣＧＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＧＣ  ＧＴＡ  ＴＡ（プラスセンスｃＤＮＡ配向として表わす）からなることを示していた。新たに同定された２つのヌクレオチドに下線を引く。
【図５６】図５６：ＡＰＶリーダー及びトレーラーを有する組換えｈＭＰＶクローン＃２からの感染性ウイルスのレスキューの成功により得られるプラーク形成。
【図５７】図５７：レスキューした組換えｈＭＰＶの免疫染色。モルモットポリクローナル抗体とその後の抗モルモットＨＲＰ及びＤＡＫＯ  ＡＥＣ基質を免疫染色に使用した。陽性免疫染色は種々のクレード（Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２）からのｈＭＰＶの証拠であり、全てのサブグループにおいてレスキューが成功したことを示している（ｐＩ＝感染後）。
【図５８】図５８：サンプル中のｈＭＰＶの存在を検出するために用いたＲＴ−ＰＣＲ及びＤＮＡブロッティングアッセイの結果。ｈＭＰＶのＬ及びＮ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物を膜に写し、その後それぞれＬ遺伝子又はＮ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて検出した。ハイブリダイゼーションはストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いてプローブ検出した。結果は、アッセイがｈＭＰＶのＬ及びＮ遺伝子の両方を検出するための感度を有していたことを示す。
【図５９Ａ】図５９：ｈＭＰＶを検出するために用いたＴａｑｍａｎアッセイ結果。Ａ）４つのｈＭＰＶプロトタイプウイルス株からの力価測定ウイルスＲＮＡに対するＮＬ−Ｎ  ＴａｑｍａｎアッセイはｈＭＰＶの４つ全てのプロトタイプ株についてアッセイの感度が等しいことを示す。
【図５９Ｂ】図５９：ｈＭＰＶを検出するために用いたＴａｑｍａｎアッセイ結果。Ｂ）ＲＮＡ転写産物の定量により、５コピー程度の少ないＲＮＡにおいてＴａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける陽性シグナルが生じたことが示された。
【図５９Ｃ】図５９：ｈＭＰＶを検出するために用いたＴａｑｍａｎアッセイ結果。Ｃ）試験した種々のプライマー／プローブセットについての４つのプロトタイプｈＭＰＶ株のオリゴヌクレオチドアニーリング部位のエントロピープロット。
【図５９Ｄ】図５９：ｈＭＰＶを検出するために用いたＴａｑｍａｎアッセイ結果。Ｄ）既に公開されているアッセイを用いた４つのプロトタイプｃＤＮＡ株のウイルスｃＤＮＡの増幅により、ｈＭＰＶ  Ａウイルスに関するＮＬ−Ｎアッセイよりも感度が低く、ｈＭＰＶ  Ｂウイルスについての検出が行えなかったことが示された。
【図６０】図６０：種々のウイルス遺伝子の置換により得られるヒトメタニューモウイルスの弱毒化。Ａ）ｈＭＰＶの分離株９９−１の種々の遺伝子（配列番号１８）をｈＭＰＶの分離株００−１の各類似遺伝子（配列番号１９）と置換することにより作製された、種々のキメラ形態のｈＭＰＶにおけるＣＡＴ酵素のレベルを示す。Ｂ）ｈＭＰＶの分離株００−１の種々の遺伝子（配列番号１９）をｈＭＰＶの分離株９９−１の各類似遺伝子（配列番号１８）と置換することにより作製された、種々のキメラ形態のｈＭＰＶにおけるＣＡＴ酵素のレベルを示す。
【図６１】図６１：Ｍ２欠失変異体の作製。
【図６２】図６２：Ａ：野生型ｈＭＰＶ（ｗｔ  ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００）、Ｆタンパク質の１０１位にプロリンを有する組換えｈＭＰＶ（ｒｅｃ  ｈＭＰＶ／１０１Ｐ）、及びＦタンパク質の１０１位にセリンを有する組換えｈＭＰＶ（ｒｅｃ  ｈＭＰＶ／１０１Ｓ）のＶｅｒｏ細胞におけるプラークを示す。ウイルスの増殖をトリプシンの存在下又は不在下で行った。Ｂ：野生型ｈＭＰＶ、Ｆタンパク質の１０１位にプロリンを有する組換えｈＭＰＶ、及びＦタンパク質の１０１位にセリンを有する組換えｈＭＰＶのメチルセルロース下での感染後６日におけるプラークを示す。ウイルスの増殖はトリプシンの存在又は不在下で行った。
【図６３】図６３：野生型ｈＭＰＶ（ｗｔ  ｈＭＰＶ）、Ｆタンパク質の１０１位にプロリンを有する組換えｈＭＰＶ（ｒｅｃ  ｈＭＰＶ）、及びＦタンパク質の１０１位にセリンを有する組換えｈＭＰＶ（Ｐ１０１Ｓ  ｉｎ  Ｆ）の増殖曲線を示す。実験の種々の期におけるトリプシンの存在又は不在をグラフの上部に示す。
【図６４】図６４：トリプシンの存在下又は不在下で増殖させた、野生型ｈＭＰＶ（ｗｔＰｒｏ）、Ｆタンパク質の１０１位にプロリンを有する組換えｈＭＰＶ（＃５  Ｐｒｏ）、及びＦタンパク質の１０１位にセリンを有する組換えｈＭＰＶ（＃７  Ｓｅｒ）に感染させたＶｅｒｏ細胞の上清（Ａ）又は細胞（Ｂ）のウエスタンブロット分析。切断されていないＦ０タンパク質及び切断産物Ｆ１を矢印で示す。
【図６５】図６５：トリプシンの存在下又は不在下における組換えｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の増殖曲線。ｗｔ  ｈＭＰＶ＝野生型ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００；ｒｅｃ  ｈＭＰＶ（＃２１）＝ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の配列を有する組換えウイルス；ｒｅｃ  ｈＭＰＶ（Ｃ４Ａ）（＃５）＝ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の配列を有する組換えウイルス。
【図６６】図６６：ハムスターの上及び下気道における野生型及び組換えｈＭＰＶの複製。
【図６７】図６７：トリプシンの存在下又は不在下における組換えｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の増殖曲線。ｗｔ  ｈＭＰＶ＝野生型ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００；ｒｅｃ  ｈＭＰＶ（＃２１）＝ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の配列を有する組換えウイルス；ｒｅｃ  ｈＭＰＶ（Ｃ４Ａ）（＃５）＝ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の配列を有する組換えウイルス。
【図６８】図６８：ｈＭＰＶ／ＧＦＰ２を用いたプラーク減少と微量中和との線形相関。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
５．発明の詳細な説明
本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖ＲＮＡウイルス、すなわちパラミクソウイルス科ニューモウイルス亜科内の、メタニューモウイルス（ＭＰＶ）及びその変種に関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素（component）に系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖ＲＮＡウイルスにも関する。本発明の哺乳動物ＭＰＶは、変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２哺乳動物ＭＰＶでありうる。しかし本発明の哺乳動物ＭＰＶは、まだ同定されていないＭＰＶの追加の変種を包含することができ、変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２に限定されない。
【００５６】
本発明は、変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２の分離株も含めた哺乳動物メタニューモウイルス（ＭＰＶ）分離株、特にヒトメタニューモウイルスの分離株の、種々の変種のゲノムヌクレオチド配列に関する。本発明は、診断及び治療方法を目的とした、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の配列情報の使用に関する。本発明は、種々のメタニューモウイルス分離株でのゲノムヌクレオチド配列の相違と、この相違を本発明の診断及び治療方法に使用することに関する。詳細には本発明は、診断及び治療方法を目的とした、種々のメタニューモウイルス分離株での１塩基多型（ＳＮＰ）の使用に関する。また本発明は、診断及び治療方法を目的として、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の血清学上の特徴を単独で又は種々の分離株の配列情報と組み合わせて使用することにも関する。
【００５７】
本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスとトリメタニューモウイルス（ＡＰＶ）の両方を含めたメタニューモウイルスの、ゲノム又はその一部をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスとトリメタニューモウイルスの両方を含めたメタニューモウイルスの、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、ウイルスゲノムに対して異種の又は非天然のヌクレオチド配列の他、哺乳動物メタニューモウイルス及びトリメタニューモウイルスの両方を含めたメタニューモウイルスのゲノム又はその一部をコードする核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）に関する。本発明はさらに、前記ヌクレオチド配列によってコードされる、組換え又はキメラウイルスを包含する。
【００５８】
本発明において、組換えウイルスは、内在性の又は天然のゲノム配列あるいは非天然のゲノム配列によってコードされる哺乳動物ＭＰＶ又はＡＰＶに由来するものである。本発明においては、非天然配列は、ゲノム配列に対する点変異、再構成、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない１つ又は複数の変異があることに起因して天然の又は内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよい。本発明においては、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えＭＰＶ又はＡＰＶである。本発明において、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されあるいは内在性の又は天然のヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列に置換されたヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００５９】
本発明はさらに、哺乳動物又はトリのメタニューモウイルス（該ウイルスの組換え形態を含む）を含む、ワクチン製剤に関する。詳細には本発明は、ＭＰＶ若しくはＡＰＶの糖タンパク質及び／又は非天然ＭＰＶ若しくはＡＰＶ糖タンパク質を含む抗原性糖タンパク質を発現するＭＰＶ又はＡＰＶの組換え又はキメラ形態を含むワクチン製剤を包含する。また本発明は、別のマイナス鎖ＲＮＡウイルス（ＰＩＶ又はＲＳＶを含む）の抗原性配列をコードするＭＰＶ又はＡＰＶの組換え形態、あるいはメタニューモウイルスの別の種又は株の異種糖タンパク質を含む、ワクチン製剤も包含する。本発明はさらに、１つ又は複数のＡＰＶタンパク質をコードし、また任意選択でさらに１つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現するキメラｈＭＰＶを含むワクチンに関する。また本発明は、１つ又は複数のｈＭＰＶタンパク質をコードし、任意選択でさらに１つ又は複数の異種配列又は非天然配列を発現するキメラＡＰＶを含むワクチンにも関する。また本発明は、２価及び３価のワクチンを含めた多価ワクチンにも関する。詳細には、本発明の２価及び３価のワクチンは、ＭＰＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ、ＲＳＶ、インフルエンザウイルス又は別のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、あるいは麻疹ウイルスの抗原タンパク質をコードする、同じ又は異なるニューモウイルスベクターにより発現される２つ以上の抗原ポリペプチドを包含する。
【００６０】
５．１  哺乳動物メタニューモウイルス
哺乳動物メタニューモウイルスの構造的特徴
本発明は哺乳動物ＭＰＶを提供する。哺乳動物ＭＰＶは、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）のニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）に属するマイナスセンス１本鎖ＲＮＡである。さらに哺乳動物ＭＰＶは系統発生的にメタニューモウイルス属に属するものとして同定され、ここで哺乳動物メタニューモウイルスは、系統発生的に、トリ鼻気管炎の原因物質である七面鳥鼻気管炎ウイルスより、ＣＮＣＭ（パリ）にＩ−２６１４として寄託されているウイルス分離株（配列番号１９）に、より近縁である。ウイルスは、例えばウイルスの核酸配列情報を得て、これを系統発生分析で試験することにより、系統発生的にメタニューモウイルス属に対応するとして同定される。当業者に公知の任意の方法を使用して、ウイルス株の間の系統発生的関係を決定することができる。方法の例はセクション５．９を参照のこと。ＷＯ０２／０５７３０２号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ０２／０００４０号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に、他の方法が開示されている。特にＰＣＴ／ＮＬ０２／０００４０号は、１２頁２７行〜１９頁２９行（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）で系統発生解析に適した核酸配列を開示している。ウイルスは、下記でさらに詳述されるような配列類似性の基づいて哺乳動物ＭＰＶとしてさらに同定することができる。
【００６１】
本明細書に開示の哺乳動物ＭＰＶに対するウイルスの系統発生的関連性と配列類似性以外に、本明細書に開示の哺乳動物ＭＰＶのゲノム構成に対するウイルスのゲノム構成の類似性を使用して、ウイルスを哺乳動物ＭＰＶとして同定することもできる。哺乳動物ＭＰＶの代表的なゲノム構成については図２７を参照のこと。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶのゲノム構成は、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）のニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）内のニューモウイルスのゲノム構成とは異なる。メタニューモウイルスとニューモウイルスの２つの属の分類は主にその遺伝子配置に基づく：メタニューモウイルスは一般的にＮＳ１又はＮＳ２のような非構造タンパク質が欠如し（Randhawaら、1997, J. Virol. 71:9849-9854も参照）、遺伝子の順序はニューモウイルスとは異なる（ＲＳＶ：３’−ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ−５’、ＡＰＶ：３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｍ２−ＳＨ−Ｇ−Ｌ−５’）（Lungら、1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715；Yuら、1992, Virology 186:426-434；Randhawaら、1997, J. Virol. 71:9849-9854）。
【００６２】
さらに本発明の哺乳動物ＭＰＶは、その免疫学的性質により同定することができる。ある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶを中和できる哺乳動物ＭＰＶに対する特異的抗血清を作製することができる。哺乳動物ＭＰＶを中和することもできるＭＰＶに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を作製することができる（ＷＯ０２／０５７３０２号の 〜 頁を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００６３】
本発明の哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主すなわち哺乳動物培養細胞又は哺乳動物に感染できる能力をさらに特徴とする。ＡＰＶと異なり哺乳動物ＭＰＶは、ニワトリや七面鳥中で複製しないか又は低レベルでのみ複製する。しかし哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主、例えばマカークザル（cynomolgous macaques）中で複製する。より具体的なある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主中で複製できる能力をさらに特徴とする。より具体的なある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物ＭＰＶのゲノムにコードされるタンパク質を哺乳動物宿主に発現させる能力をさらに特徴とする。さらに具体的な実施形態において哺乳動物ＭＰＶにより発現されるウイルスタンパク質は、哺乳動物宿主の細胞質膜中に挿入される。ある実施形態において本発明の哺乳動物ＭＰＶは哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物ＭＰＶの新しい感染性ウイルス粒子を哺乳動物宿主に産生させることができる。本発明の哺乳動物ＭＰＶの機能的特徴のさらに詳細な説明については、セクション５．１．２を参照のこと。
【００６４】
ある実施形態において電子顕微鏡でのウイルスの出現又はクロロホルムに対するその感受性を使用して、哺乳動物ＭＰＶとしてウイルスを同定することができる。本発明の哺乳動物ＭＰＶは、電子顕微鏡でパラミクソウイルス様粒子として現れる。哺乳動物ＭＰＶは、一貫してクロロホルムによる処理に対して感受性である；哺乳動物ＭＰＶはｔＭＫ細胞又はこれと機能的同等の細胞で培養することが最適であり、これは基本的にほとんどの細胞培養物中でトリプシン依存性である。さらに哺乳動物ＭＰＶは典型的な細胞変性作用（ＣＰＥ）を有し、赤血球の分子種に対して血球凝集活性が欠如している。ＭＰＶ分離株により誘導されるＣＰＥは、ｈＲＳＶにより誘導されるＣＰＥと同様であり、特徴的なシンシチウム形成の後に細胞の迅速な内部破壊と培養プレートからの以後のはく離が起きる。ほとんどのパラミクソウイルスは血球凝集活性を有し、ほとんどのニューモウイルスはこれを持たない（Pringle, C.R.、The Paramyxoviruses；（D.W. Kingsbury）1-39中（プレヌム・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク、1991））。哺乳動物ＭＰＶは、Ｍ２タンパク質をコードする核酸断片中に第２の重複ＯＲＦ（Ｍ２−２）を含有する。この第２の重複ＯＲＦの存在は、Ahmadinaら、1999, J. Gen. Vir. 80:2011-2016中に示されるように他のニューモウイルス中に存在する。
【００６５】
ある実施形態において、本発明は、ウイルス分離株を哺乳動物ＭＰＶとして同定する方法を提供する。試験サンプルは、例えば動物又はヒトから得られる。次にサンプルを、ニューモウイルス亜科のウイルスの存在について試験する。ニューモウイルス亜科のウイルスが存在するなら、本明細書に記載のように哺乳動物ＭＰＶの任意の特徴、例えば特に限定されないが、哺乳動物ＭＰＶに対する系統発生的関連性、哺乳動物ＭＰＶのヌクレオチド配列とのヌクレオチド配列同一性、哺乳動物ＭＰＶのアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性／相同性、及びゲノム構成について試験することができる。さらにウイルスは、ＭＰＶ分離株からの核酸配列を使用して交差ハイブリダイゼーション実験により、哺乳動物ＭＰＶに特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより、又は哺乳動物ＭＰＶ分離株に対する抗体を使用して古典的交差血清学実験により、哺乳動物ＭＰＶとして同定することができる。他のある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、動物の抗血清による定量的中和により測定されるようなその免疫学的特殊性に基づいて同定することができる。抗血清は、例えば哺乳動物ＭＰＶに感染したフェレット、ブタ又はマカークザルから得ることができる（例えば実施例８参照）。
【００６６】
ある実施形態において血清型は、哺乳動物ＭＰＶ以外のウイルスと交差反応しない。他の実施形態において血清型は、両方向に同種対異種の力価比＞１６を示す。中和がいずれか又は両方の方向に２つのウイルスの間である程度の交差反応（同種対異種の力価比が８又は１６）を示すなら、ＤＮＡ配列の実質的な生物物理的／生化学的相違が存在するなら血清型の特殊性が仮定される。中和がいずれか又は両方の方向に２つのウイルスの間で顕著な交差反応（同種対異種の力価比が８より小さい）を示すなら、試験中の分離株の血清型の同一性が仮定される。本明細書においてＭＰＶ分離株００−１としても知られている分離株Ｉ−２６１４は、プロトタイプとして使用することができる。
【００６７】
ある実施形態においてウイルスは、配列又は寄託により本明細書に開示されるウイルス分離株のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列と比較して、ウイルスタンパク質又は核酸の配列相同性／同一性を用いて哺乳動物ＭＰＶとして同定することができる。特に、ウイルスのゲノムが、Ｉ−２６１４としてＣＮＣＭ（パリ）に寄託されたウイルス分離株とパーセント核酸同一性（これは、ＡＰＶ−Ｃと比較して本発明において下記で同定されるＬタンパク質、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質又はＦタンパク質をコードする核酸について本発明で同定されるパーセントより高い）を有する核酸配列を含有する時、ウイルスは哺乳動物ＭＰＶとして同定される（表１を参照）（ＰＣＴ  ＷＯ０２／０５３０２号、１２〜１９頁を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。理論に拘束されるつもりは無いが一般に、ウイルス種、特にＲＮＡウイルス種は、しばしばウイルス群のメンバーが配列不均一性を示す準種を構成する。すなわちそのような個々の分離株は、ＡＰＶ−Ｃと比較するといくぶん異なるパーセントの配列同一性を有するかも知れないと予測される。
【００６８】
今日までのＭＰＶのタンパク質と同じファミリーの既知の他の任意のウイルスとの最も高いアミノ配列同一性は、ＡＰＶ−ＣとヒトＭＰＶとの同一性である。ヒトＭＰＶとＡＰＶ−Ｃの間では、図３０に示す配列を比較した場合に推定されるように、マトリックスタンパク質のアミノ酸配列同一性は８７％、核タンパク質について８８％、リンタンパク質について６８％、融合タンパク質について８１％、及びポリメラーゼタンパク質の部分について５６〜６４％である（表１も参照のこと）。これらの最大値と比較してより高い相同性を有するタンパク質をコードするＯＲＦを含有するウイルス分離株は、哺乳動物ＭＰＶであると見なされる。他のウイルスと同様に、哺乳動物ＭＰＶの異なる分離株の間にある程度の変動がある。
【表１】
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【００６９】
ある実施形態において、本発明は、哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＳＨタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３８２（分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質：表１４を参照）のアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である。配列番号３８２（分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質：表１４を参照）と少なくとも３０％同一であるＳＨタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３８２（分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質：表１４を参照）と少なくとも３０％同一であるＳＨタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３８２（分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質：表１４を参照）と少なくとも３０％同一であるＳＨタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７０】
ある実施形態において、本発明は、哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＧタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３２２（分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質：表１４を参照）のアミノ酸配列と少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である。配列番号３２２（分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質：表１４を参照）と少なくとも２０％同一であるＧタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３２２（分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質：表１４を参照）と少なくとも２０％同一であるＧタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３２２（分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質：表１４を参照）と少なくとも２０％同一であるＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７１】
ある実施形態において、本発明は、哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＬタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３０（分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質：表１４を参照）のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である。配列番号３３０（分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質：表１４を参照）と少なくとも８５％同一であるＬタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３３０（分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質：表１４を参照）と少なくとも８５％同一であるＬタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３３０（分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質：表１４を参照）と少なくとも２０％同一であるＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７２】
ある実施形態において、本発明は、哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＮタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。配列番号３６６アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるＮタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３６６とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＮタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７３】
本発明はさらに哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＰタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。配列番号３７４とアミノ酸配列が少なくとも７０％同一であるＰタンパク質を含む哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３７４とアミノ酸配列が少なくとも７０％同一であるＰタンパク質を含む哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Ｐタンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３７４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７４】
本発明はさらに哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＭタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％同一である。配列番号３５８とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＭタンパク質を含む哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３５８とアミノ酸配列が９０％同一であるＭタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Ｍタンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるＭタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７５】
本発明はさらに哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。配列番号３１４とアミノ酸配列が少なくとも８５％同一であるＦタンパク質を含む哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３１４とアミノ酸配列が８５％同一であるＦタンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Ｆタンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７６】
本発明はさらに哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。配列番号３３８とアミノ酸配列が少なくとも８５％同一であるＭ２−１タンパク質を含む哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３３８とアミノ酸配列が８５％同一であるＭ２−１タンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Ｍ２−１タンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３３８のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるＭ２−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７７】
本発明はさらに哺乳動物ＭＰＶを提供し、該哺乳動物ＭＰＶのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３４６のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である。配列番号３４６とアミノ酸配列が少なくとも６０％同一であるＭ２−２タンパク質を含む単離された哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができる。ある実施形態において配列番号３４６とアミノ酸配列が６０％同一であるＭ２−２タンパク質を含む単離されたマイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、哺乳動物宿主中で複製することができる。アミノ酸同一性は、Ｍ２−２タンパク質の全長にわたって計算される。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、配列番号３４６のアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるＭ２−１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。
【００７８】
ある実施形態において、本発明は哺乳動物ＭＰＶを提供し、マイナスセンス１本鎖ＲＮＡメタニューモウイルスは、（ｉ）配列番号３６６と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＮタンパク質；（ｉｉ）配列番号３７４と少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性を有するＰタンパク質；（ｉｉｉ）配列番号３５８と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＭタンパク質；（ｉｖ）配列番号３１４と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するＦタンパク質；（ｖ）配列番号３３８と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するＭ２−１タンパク質；及び（ｖｉ）配列番号３４６と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＭ２−２タンパク質よりなる群から選択される、少なくとも２つのタンパク質、少なくとも３つのタンパク質、少なくとも４つのタンパク質、少なくとも５つのタンパク質、又は６つのタンパク質をコードする。
【００７９】
本発明は２つのサブグループ（サブグループＡとサブグループＢ）の哺乳動物ＭＰＶを提供する。本発明はまた、４つの変異体Ａ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２を提供する。哺乳動物ＭＰＶが、分離株９９−１（配列番号１８）より分離株００−１（配列番号１９）に系統発生的により近いなら、サブグループＡのメンバーとして同定することができる。哺乳動物ＭＰＶが、分離株００−１（配列番号１９）より分離株９９−１（配列番号１８）に系統発生的により近いなら、サブグループＢのメンバーとして同定することができる。他の実施形態において個々のＯＲＦのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列相同性を使用して、サブグループＡ又はＢに属するとして哺乳動物ＭＰＶを分類することができる。
【００８０】
哺乳動物ＭＰＶの異なる分離株は４つの変種（変種Ａ１、変種Ａ２、変種Ｂ１、変種Ｂ２）に分けられる（図２１と２２を参照）。分離株００−１（配列番号１９）は、哺乳動物ＭＰＶの変種Ａ１の例である。分離株００−１（配列番号１８）は、哺乳動物ＭＰＶの変種Ｂ１の例である。こうして哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物ＭＰＶの他の変種のメンバーに系統発生的に関連するより、変種の既知のメンバーに系統発生的により密接に関連するなら、特定の変種に属する。任意のＯＲＦ及びコードされるポリペプチドを、特定のサブグループ又は変種（Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｍ２又はＦポリペプチド）に属するとしてＭＰＶ分離株を型判定するのに使用してもよい。具体的な実施形態において変種への哺乳動物ＭＰＶの分類は、Ｇタンパク質の配列に基づく。理論に拘束されるつもりは無いが、哺乳動物ＭＰＶの異なる変種のＧタンパク質の中の変動の程度が大きいため、Ｇタンパク質配列は、系統発生分析に非常に適している。
【００８１】
本発明のある実施形態において配列相同性は、後述のようにある条件下でハイブリダイズする２つの配列の能力により決定される。哺乳動物ＭＰＶの核酸にハイブリダイズ可能な核酸、又はその逆相補体、又はその相補体は、配列相同性及び互いの同一性を決定するために本発明の方法で使用することができる。ある実施形態において核酸は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズされる。
【００８２】
ハイブリダイゼーション条件（例えば特に限定されないが、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度）は当業者に公知である。（例えば、Sambrookら、1989, 第9〜11章、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨークを参照されたい。参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。ある実施形態においてハイブリダイゼーションは水溶液中で行われ、溶液のイオン強度は一定に維持されるが、ハイブリダイゼーション温度は、ハイブリダイズされる配列の間の配列相同性の程度に応じて変化する。互いに１００％同一であり２００塩基対より長いＤＮＡ配列については、ハイブリダイゼーションは完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の約１５〜２５℃低い温度で行われる。融解温度（Ｔｍ）は以下の式を使用して計算される（BoltonとMcCarthy, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1390）：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／ｌ）
ここで、（Ｔｍ）は融解温度であり、［Ｎａ＋］はナトリウム濃度であり、Ｇ＋Ｃはグアニンとシトシン含量であり、ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。配列間のミスマッチの影響は、Bonnerらの式を使用して計算することができる（Bonnerら、1973, J. Mol. Biol. 81:123-135）：ハイブリッド中の塩基のミスマッチの各１％について、融解温度は１〜１．５℃低下する。
【００８３】
すなわち、２つの配列がハイブリダイズする温度を測定することにより、当業者はある配列が既知の配列にどの程度似ているかのを推定することができる。これは、例えば経験的に決定されたハイブリダイゼーション温度を、その完全な一致でハイブリダイズする既知の配列について計算されたハイブリダイゼーション温度と比較することにより行われる。Ｂｏｎｎｅｒらの式を使用することにより、ハイブリダイゼーション温度とパーセントミスマッチの関係を利用して配列類似性についての情報が得られる。
【００８４】
例えば特に限定されないが、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する方法は以下の通りである。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからのバッファー中で６５℃で８時間から一晩行われる。フィルターは、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡと５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識ＰＢを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で６５℃で４８時間行われる。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコール、０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中で３７℃で１時間行われる。次に０．１×ＳＳＣで５０℃で４５分洗浄した後、オートラジオグラフィーを行う。使用される他の高ストリンジェンシー条件は当該分野で公知である。本発明の他の実施形態においてハイブリダイゼーションは、中〜低ストリンジェンシー条件下で行われ、そのような条件は当業者に公知である（例えば、Sambrookら、1989, 第9〜11章、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク；また、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」の研究室技術マニュアルシリーズ、1987〜1997 Curren Protocols（登録商標）, 1994〜1997、John Wiley and Sons Inc.を参照されたい。これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。低ストリンジェンシー条件の例が以下のバッファー系により提供される：３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、及び１０％（ｗ／ｗ）のデキストラン硫酸を含むバッファー中で４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーション、２×ＳＳＣ、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳからなるバッファー中で洗浄し、２×ＳＳＣ、２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳからなるバッファー中で６０℃で１．５時間洗浄。
【００８５】
ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物ＭＰＶの特定の変種に特異的なプローブを使用して、変種の１つの中に分類することができる。そのようなプローブには、ＲＴ−ＰＣＲのプライマー及び抗体がある。哺乳動物ＭＰＶを特定の変種のメンバーとして同定するための方法の例は以下のセクション５．９において説明する。
【００８６】
本発明のある実施形態において哺乳動物ＭＰＶの異なる変種は、異なるウイルスタンパク質のアミノ酸配列により互いに区別することができる（例えば図４２ｂ参照）。他の実施形態において哺乳動物ＭＰＶの異なる変種は、ウイルスゲノムにコードされる異なるＯＲＦのヌクレオチド配列により区別することができる（例えば図４２ｂ参照）。哺乳動物ＭＰＶの変種は、特に限定されないがＡ１、Ａ２、Ｂ１又はＢ２でもよい。しかしながら本発明はまた、まだ同定されていない別の変種のメンバーである哺乳動物ＭＰＶの分離株も包含する。本発明はまた、ウイルスが、１つの変種に近縁の１以上のＯＲＦ及び別の変種に系統発生的に近縁の１以上のＯＲＦを有している可能性も包含する。そのようなウイルスは、そのＯＲＦの大部分が系統発生上近縁である変種に分類されることになりうる。系統発生の関係を調べるために非コード配列を使用してもよい。
【００８７】
哺乳動物ＭＰＶの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株：ＮＬ／１／００（配列番号１９）、ＮＬ／１７／００（配列番号２０）及びＮＬ／１／９４（配列番号２１）に関連するより、ウイルス分離株ＮＬ／１／９９（配列番号１８）により密接に関連するなら、変種Ｂ１として分類される。哺乳動物ＭＰＶの１つ以上のＯＲＦを使用して、哺乳動物ＭＰＶを変種に分類することができる。もしそのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３２４）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質と少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３６８）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質と少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３７６）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質と少なくとも９６％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３６０）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質と同一なら；もしそのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３１６）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質と少なくとも９９％同一なら；もしそのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３４０）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質と少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３４８）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３８４）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質と少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９（配列番号３３２）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら、哺乳動物ＭＰＶはＭＰＶ変種Ｂ１として分類することができる。
【００８８】
哺乳動物ＭＰＶの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株：ＮＬ／１／９９（配列番号１８）、ＮＬ／１７／００（配列番号２０）及びＮＬ／１／９４（配列番号２１）に関連するより、ウイルス分離株ＮＬ／１／００（配列番号１９）により密接に関連するなら、変種Ａ１として分類される。哺乳動物ＭＰＶの１つ以上のＯＲＦを使用して、哺乳動物ＭＰＶを変種に分類することができる。もしそのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３２２）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質と少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３６６）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質と少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３７４）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質と少なくとも９６％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３５８）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３１４）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質と少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３３８）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３４６）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質と少なくとも９６％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３８２）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質と少なくとも８４％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００（配列番号３３０）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＬタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら、哺乳動物ＭＰＶはＭＰＶ変種Ａ１として分類することができる。
【００８９】
哺乳動物ＭＰＶの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株：ＮＬ／１／９９（配列番号１８）、ＮＬ／１／００（配列番号１９）及びＮＬ／１／９４（配列番号２１）に関連するより、ウイルス分離株ＮＬ／１７／００（配列番号２０）により密接に関連するなら、変種Ａ２として分類される。哺乳動物ＭＰＶの１つ以上のＯＲＦを使用して、哺乳動物ＭＰＶを変種に分類することができる。もしそのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３３２）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質と少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３６７）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質と少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３７５）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質と少なくとも９６％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３５９）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３１５）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質と少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３３９）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３４７）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質と少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３８３）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質と少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００（配列番号３３１）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら、哺乳動物ＭＰＶはＭＰＶ変種Ａ２として分類することができる。
【００９０】
哺乳動物ＭＰＶの分離株は、系統発生的にそれが以下の任意の他のウイルス分離株：ＮＬ／１／９９（配列番号１８）、ＮＬ／１７／００（配列番号１９）及びＮＬ／１７／００（配列番号２０）に関連するより、ウイルス分離株ＮＬ／１／９４（配列番号２１）により密接に関連するなら、変種Ｂ２として分類される。哺乳動物ＭＰＶの１つ以上のＯＲＦを使用して、哺乳動物ＭＰＶを変種に分類することができる。もしそのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３２５）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質と少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３６９）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３７７）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質と少なくとも９６％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３６１）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質と同一なら；もしそのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３１７）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３４１）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質と少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３４９）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；もしそのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３８５）により示される哺乳動物Ｍ
ＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質と少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら；及び／又は、もしそのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４（配列番号３３３）により示される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質と少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一なら、哺乳動物ＭＰＶはＭＰＶ変種Ｂ２として分類することができる。
【００９１】
ある実施形態において配列同一性のパーセントは、完全長タンパク質のアライメントに基づく。他の実施形態において配列同一性のパーセントは、タンパク質の連続的アミノ酸配列のアライメントに基づき、ここでアミノ酸配列は、２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１２５アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、２００アミノ酸、２２５アミノ酸、２５０アミノ酸、２７５アミノ酸、３００アミノ酸、３２５アミノ酸、３５０アミノ酸、３７５アミノ酸、４００アミノ酸、４２５アミノ酸、４５０アミノ酸、４７５アミノ酸、５００ｖ７５０アミノ酸、１０００アミノ酸、１２５０アミノ酸、１５００アミノ酸、１７５０アミノ酸、２０００アミノ酸、又は２２５０アミノ酸の長さでありうる。
【００９２】
５．２  哺乳動物ＭＰＶの機能的特徴
哺乳動物ＭＰＶの構造的定義以外に、哺乳動物ＭＰＶはその機能的特徴により規定することができる。ある実施形態において本発明の哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができる。哺乳動物宿主は、哺乳動物細胞、組織、臓器又は哺乳動物でもよい。具体的な実施形態において哺乳動物宿主は、ヒト又はヒト細胞若しくは臓器である。当業者に公知の任意の方法を使用して、哺乳動物宿主が哺乳動物ＭＰＶに感染しているかどうかを試験することができる。ある実施形態においてウイルスは、哺乳動物細胞に結合する能力について試験される。他のある実施形態においてウイルスは、哺乳動物細胞中にゲノムを輸送する能力について試験される。具体的な実施形態においてウイルスのゲノムは、検出可能なように例えば放射能標識される。次にウイルスを、哺乳動物細胞と少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１５分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも１日インキュベートする。次に細胞を洗浄し、細胞からウイルス粒子を除去し、次に細胞を検出可能な標識物によりウイルスゲノムの存在について試験する。別の実施形態において細胞中のウイルスゲノムの存在は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して哺乳動物ＭＰＶ特異的プライマーを使用して検出される（ＰＣＴ  ＷＯ０２／０５７３０２号、３７〜４４頁を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００９３】
ある実施形態において哺乳動物ウイルスは哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物ＭＰＶの一部が哺乳動物宿主の細胞質膜中に挿入されるようにする。哺乳動物宿主は、培養哺乳動物細胞、臓器、組織、又は哺乳動物でもよい。具体的な実施形態において哺乳動物細胞は、哺乳動物ウイルスとインキュベートされる。次に細胞は、細胞の表面からウイルスを除去する条件下で洗浄する。当業者に公知の任意の方法を使用して、哺乳動物細胞の細胞質膜に挿入される新に発現されたウイルスタンパク質を検出することができる。例えばウイルスで細胞を感染後、細胞は、検出可能な標識アミノ酸を含む培地中で維持される。次に細胞を採取し、溶解し、細胞質画分を膜画分から分離する。次に膜画分の部分を可溶化し、次に哺乳動物ＭＰＶの部分に特異的な抗体（例えば特に限定されないが、Ｆタンパク質又はＧタンパク質）を使用して免疫沈降する。免疫沈降タンパク質は次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す。次にウイルスタンパク質の存在は、オートラジオグラフィーにより検出することができる。別の実施形態において宿主細胞の細胞質膜中のウイルスタンパク質の存在は、哺乳動物ＭＰＶの部分に特異的な１つ以上の抗体を使用して免疫細胞化学により検出することができる。
【００９４】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物ＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができ哺乳動物宿主中で複製することができる。哺乳動物宿主は、培養哺乳動物細胞、臓器、組織、又は哺乳動物でもよい。当業者に公知の任意の方法を使用して、ウイルスが哺乳動物細胞に感染することができるか、及び哺乳動物宿主中で複製することができるかを決定することができる。具体的な実施形態において哺乳動物細胞にウイルスに感染させる。次に細胞を、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日、又は少なくとも２日維持する。細胞中のウイルスゲノムＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、又はインサイチューハイブリダイゼーションを使用して、ウイルスゲノムに特異的なプローブを使用して追跡することができる。ウイルスゲノムＲＮＡの増加は、ウイルスが哺乳動物細胞に感染することができ、哺乳動物細胞内に複製することができることを証明する。
【００９５】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物ＭＰＶは哺乳動物宿主に感染することができ、ここで感染は哺乳動物宿主に新しい感染性哺乳動物ＭＰＶを産生させる。哺乳動物宿主は、培養哺乳動物細胞又は哺乳動物でもよい。ウイルスが哺乳動物宿主に感染することができ、かつ新しい感染性ウイルス粒子を哺乳動物宿主に産生させることができるかどうかを調べるのに、当該分野で公知の任意の方法を使用することができる。例として哺乳動物細胞に哺乳動物ウイルスを感染させる。次に細胞を洗浄し、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも１週間、又は少なくとも１２日インキュベートする。ウイルスの力価は、当業者に公知の任意の方法によりモニターする。方法の例はセクション５．８に記載される。
【００９６】
ある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶはヒトＭＰＶである。このセクションに記載の試験はまた、ヒトＭＰＶを用いて行うことができる。ある実施形態においてヒトＭＰＶは、哺乳動物宿主（例えば哺乳動物又は哺乳動物培養細胞）に感染することができる。
【００９７】
ある実施形態においてヒトＭＰＶは哺乳動物宿主に感染することができ、ヒトＭＰＶの一部が哺乳動物宿主の細胞質膜中に挿入されるようにする。
【００９８】
さらに別の実施形態において、本発明のヒトＭＰＶは哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物宿主中で複製することができる。
【００９９】
さらに他の実施形態において本発明のヒトＭＰＶは、哺乳動物宿主に感染することができ、哺乳動物宿主中で複製することができ、ここで感染と複製は、哺乳動物宿主が新しい感染性ヒトＭＰＶを産生しパッケージングするようにする。
【０１００】
ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶは、たとえ哺乳動物宿主に感染することができても、トリ宿主（例えばトリ又はトリ培養細胞）に感染することもできる。ある実施形態において哺乳動物ＭＰＶはトリ宿主に感染することができ、哺乳動物ＭＰＶがトリ宿主の細胞質膜中に挿入されるようにする。さらに他の実施形態において本発明の哺乳動物ＭＰＶは、トリ宿主に感染することができ、トリ宿主中で複製することができる。さらに他の実施形態において本発明の哺乳動物ＭＰＶは、トリ宿主に感染することができ、トリ宿主中で複製することができ、ここで感染と複製は、トリ宿主が新しい感染性ヒトＭＰＶを産生しパッケージさせるようにする。
【０１０１】
５．３  組換え及びキメラメタニューモウイルス
本発明は、哺乳動物変種及びトリ変種を含む、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされる組換え又はキメラウイルスを包含する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性の又は天然のゲノム配列あるいは非天然のゲノム配列によってコードされる哺乳動物ＭＰＶ及びＡＰＶから得られたものである。本発明によれば、非天然配列は、天然の又は内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない１つ又は複数の変異があることに起因する。本発明の組換えウイルスは、哺乳動物変種及びトリ変種を含む、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされたウイルスを包含し、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよい。本発明によれば、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターは、哺乳動物メタニューモウイルスの１つのＯＲＦの少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するものであり、ＯＲＦによってコードされるポリペプチドは、前掲のセクション５．１及び表１で述べたアミノ酸配列同一性を有している。
【０１０２】
本発明によれば、本発明の組換えウイルスは、哺乳動物メタニューモウイルス（ＭＰＶ）、特にヒトメタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされるウイルスを包含する。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、メタニューモウイルスＡ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２変種のゲノムから得られる。本発明によれば、これらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよい。
【０１０３】
本発明によれば、本発明の組換えウイルスは、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）とも呼ばれるトリニューモウイルス（ＡＰＶ）のゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされるウイルスを包含する。本発明の特定の実施形態で、ウイルスベクターは、ＡＰＶサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤのゲノムから得られる。好ましい実施形態で、ウイルスベクターはＡＰＶサブグループＣのゲノムから得られる。本発明によれば、これらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよい。
【０１０４】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルスは、ＡＰＶサブグループＣのＦ−ＯＲＦをコードする核酸配列を含有するＡＰＶのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされたウイルスを包含する。ある実施形態で、ＡＰＶのゲノムから得られたウイルスベクターは、少なくともＡＰＶのＮ−ＯＲＦ、Ｐ−ＯＲＦ、Ｍ−ＯＲＦ、Ｆ−ＯＲＦ、Ｍ２−１−ＯＲＦ、Ｍ２−２−ＯＲＦ、又はＬ−ＯＲＦをコードする核酸配列を含有するものである。
【０１０５】
本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えＭＰＶ又はＡＰＶである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているヌクレオチド配列、あるいは内在性の又は天然のヌクレオチド配列を異種ヌクレオチド配列に代えたヌクレオチド配列によって、コードすることができる。
【０１０６】
本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む本発明のウイルスベクターによってコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよいウイルスベクターによってコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列が付加され、挿入され、あるいは天然の又は非天然の配列で置換されているウイルスベクターによってコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、哺乳動物ＭＰＶの種々の株から得られたヌクレオチド配列によってコードすることができる。特にキメラウイルスは、ＭＰＶの種々の株から得られた抗原ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１０７】
本発明によれば、キメラウイルスは、ＭＰＶの１つ又は複数の株から得られた抗原ポリペプチドをコードする異種配列をさらにコードするＡＰＶ、特にサブグループＣのゲノムから得られたウイルスベクターによって、コードすることができる。
【０１０８】
キメラウイルスは、２種以上のウイルスから保護する組換えワクチンの生成に特に有用なものでよい（Tao他、J.Virol. 72、2955〜2961; Durbin他、2000、J. Virol. 74、6821〜6831; Skiadopoulos他、1998、J.Virol. 72、1762〜1768; Teng他、2000、J.Virol. 74、9317〜9321）。例えば、ＭＰＶの１つ又は複数のタンパク質を発現するＲＳＶ又はＲＳＶベクターなど、別のマイナス鎖ＲＮＡウイルスの１つ又は複数のタンパク質を発現するＭＰＶ又はＡＰＶウイルスベクターは、そのようなベクターが接種された個体を両方のウイルス感染から保護すると考えることができる。ＰＩＶ又はその他のパラミクソウイルスに関しては同様の手法を考えることができる。弱毒化した複製欠陥ウイルスは、他のウイルスに関して示されたように、生ワクチンを用いたワクチン接種に有用なものでよい（本明細書に参照により援用するＰＣＴ  ＷＯ０２／０５７３０２号、第６及び２３頁参照）。
【０１０９】
本発明によれば、本発明の組換え又はキメラウイルスをコードするウイルスベクターに組み込む異種配列には、種々のメタニューモウイルスの株、トリニューモウイルスの株、その他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスの株であってＲＳＶ、ＰＩＶ、及びインフルエンザウイルスを含むがこれらに限定されないもの、麻疹ウイルスを含むその他のウイルスから得られ又は誘導された配列が含まれる。
【０１１０】
本発明のある実施形態で、本発明のキメラ又は組換えウイルスは、１つ又は複数の配列、遺伝子間領域、終端配列、あるいは一部又は全体のＯＲＦが異種配列又は非天然配列で置換されているウイルスゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされる。本発明のある実施形態において、本発明のキメラウイルスは、１つ又は複数の異種配列がベクターに付加されているウイルスゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされる。
【０１１１】
ある実施形態において、本発明のウイルスは、異種核酸を含有する。好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの位置１に挿入され又は付加される。別の好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの位置２に挿入され又は付加される。さらに別の好ましい実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの位置３に挿入され又は付加される。ウイルスゲノムのより低い数字の位置に核酸配列を挿入し又は付加すると、ウイルスゲノム全体にわたる転写勾配が原因となって、より高い数字の位置に挿入した場合に比べて異種ヌクレオチド配列の発現がより強く又はより高いレベルになる。したがって、異種ヌクレオチド配列の高い発現レベルが望まれる場合、より低い数字の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入し又は付加することは、本発明の好ましい実施形態である。
【０１１２】
理論に拘泥するものではないが、異種配列の挿入又は付加の位置は、組換え又はキメラウイルスの複製速度に影響を及ぼす。異種配列をウイルスゲノムの位置２又は位置１に挿入し又は付加する場合、より高い複製速度を実現することができる。異種配列を位置３、位置４、位置５、又は位置６に挿入し又は付加する場合、複製速度は低下する。
【０１１３】
理論に拘泥するものではないが、ウイルス遺伝子と異種配列との間の遺伝子間領域のサイズは、ウイルスの複製速度及び異種配列の発現レベルをさらに決定する。
【０１１４】
ある実施形態において、本発明のウイルスベクターは、２つ以上の異なる異種ヌクレオチド配列を含有する。好ましい実施形態において、１つの異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置１にあり、第２の異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置２にある。別の好ましい実施形態において、１つの異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置１にあり、第２の異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置３にある。さらに別の好ましい実施形態において、１つの異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置２にあり、第２の異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムの位置３にある。その他のある実施形態では、異種ヌクレオチド配列を、ウイルスゲノムのその他のより高い数字の位置に挿入する。本発明によれば、異種配列の位置は、配列がウイルスゲノムから転写される順序を指し、例えば位置１の異種配列は、ゲノムから転写される最初の遺伝子配列になる。
【０１１５】
ウイルスベクターの選択は、ウイルス感染を治療し又はウイルス感染から保護する被験体の種に依存すると考えられる。被験体がヒトである場合、抗原性配列を得るために、弱毒化した哺乳動物メタニューモウイルス又はトリニューモウイルスを使用することができる。
【０１１６】
本発明によれば、メタニューモウイルスによる感染に対して予防を行う抗原性配列が得られるように、すなわち哺乳動物メタニューモウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ＭＰＶ変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２から得られた配列と、ＡＰＶサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤを含むがＣであることが好ましいトリニューモウイルスから得られた配列を含めた抗原性配列が得られるように、ウイルスベクターを設計製作することができる。ウイルスベクターは、インフルエンザ、ＲＳＶ、又はＰＩＶであってＰＩＶ３も含めたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含む、別のウイルスによる感染又は疾患に対して予防を行う抗原性配列が得られるように、設計製作することができる。ウイルスベクターは、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の抗原性配列が得られるように設計製作することができる。本発明によれば、抗原性配列は、同じウイルスから、あるいは同型ウイルスの異なる株又は変種から、あるいは麻疹ウイルスを含めた異なる変種から得ることができる。
【０１１７】
本発明のある実施形態では、本発明のウイルスのゲノムに挿入する異種ヌクレオチド配列がメタニューモウイルスから得られる。本発明のある特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスから得られる。別の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がトリニューモウイルスから得られる。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスのＦ遺伝子をコードする。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスのＧ遺伝子をコードする。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、トリニューモウイルスのＦ遺伝子をコードする。より具体的には、本発明の異種ヌクレオチド配列は、トリニューモウイルスのＧ遺伝子をコードする。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、配列番号１から配列番号５までと配列番号１４及び配列番号１５のいずれか１つでよい。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号６から配列番号１３までと配列番号１６及び配列番号１７のいずれか１つのタンパク質をコードする。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列はキメラＦタンパク質をコードする。例示的な実施形態において、キメラＦタンパク質の外部ドメインはヒトＭＰＶの外部ドメインであり、膜貫通ドメイン及び管腔ドメインは、トリメタニューモウイルスのＦタンパク質から得られる。理論に拘泥するものではないが、ヒト外部ドメイン及びトリルミノール／膜貫通ドメインからなるキメラＦタンパク質をコードするキメラヒトＭＰＶは、Ｆタンパク質のトリ部分により弱毒化されるが、依然として、ヒト外部ドメインによりｈＭＰＶに対する免疫原性が高い。
【０１１９】
ある実施形態では、哺乳動物及びトリを含むメタニューモウイルスゲノムから得られた、２つの異なる異種ヌクレオチド配列を、本発明のウイルスベクターに挿入し又は付加する。例えば異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス、ＲＳＶ、ＰＩＶ、又はインフルエンザから得られる。好ましい実施形態において、異種配列は、ヒトメタニューモウイルス、トリニューモウイルス、ＲＳＶ、又はＰＩＶのＦタンパク質をそれぞれコードする。別の実施形態において、異種配列は、インフルエンザのＨＡタンパク質をコードする。
【０１２０】
ある実施形態では、本発明のウイルスベクターは２つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有し、第１の異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得られ、第２のヌクレオチド配列が呼吸器合胞体ウイルスから得られる（表２参照）。特定の実施形態において、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのＦ遺伝子である。その他の特定の実施形態において、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのＧ遺伝子である。特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列よりも低い数字の位置に挿入される。別の特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列よりも高い数字の位置に挿入される。
【０１２１】
ある実施形態では、本発明のウイルスは２つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有し、第１の異種ヌクレオチド配列がヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得られ、第２のヌクレオチド配列が、ＰＩＶ３などであるがこれに限定されないパラインフルエンザウイルスから得られる（表２参照）。特定の実施形態において、ＰＩＶから得られた異種ヌクレオチド配列はＰＩＶのＦ遺伝子である。その他の特定の実施形態において、ＰＩＶから得られた異種ヌクレオチド配列はＰＩＶのＧ遺伝子である。特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶから得られた異種ヌクレオチド配列よりも低い数字の位置に挿入される。別の特定の実施形態において、メタニューモウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶから得られた異種ヌクレオチド配列よりも高い数字の位置に挿入される。
【０１２２】
本発明により得られた発現産物及び／又は組換え若しくはキメラウイルス粒子は、ワクチン製剤に利用できることが有利である。本発明の発現産物及びキメラウイルス粒子は、ウイルス及び細菌抗原、腫瘍抗原、アレルゲン抗原、自己免疫異常に関わる自己抗原を含めた広範な病原体に対するワクチンが生成されるように、設計製作することができる。特に本発明のキメラウイルス粒子は、ＰＩＶ、ＲＳＶ、及び／又はメタニューモウイルスによる感染から被験体を保護するワクチンが生成されるように設計製作することができる。
【０１２３】
別の実施形態では、抗ＨＩＶワクチンが生成されるように本発明のキメラウイルス粒子を設計製作することができ、脊椎動物の体液及び細胞媒介型の両方の免疫応答を誘発させることができるワクチンが構成されるように、ＨＩＶのｇｐ１６０及び／又は内部タンパク質由来の免疫原性ポリペプチドを糖タンパク質ＨＮタンパク質に設計製作する。さらに別の実施形態において、本発明は、組換えメタニューモウイルスベクターと、変異抗原をコードするよう設計製作されたウイルスに関する。変異抗原は、野生型ウイルスタンパク質、すなわちそこから変異抗原が得られる野生型ウイルスタンパク質に対し、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有する。
【０１２４】
ある実施形態では、本発明は、本発明の組換え又はキメラウイルスを含む３価ワクチンに関する。特定の実施形態において、３価ワクチンの主成分として使用されるウイルスは、ＲＳＶから得られた第１の異種ヌクレオチド配列とＰＩＶから得られた第２の異種ヌクレオチド配列を含有するキメラトリ−ヒトメタニューモウイルス又はキメラヒト−トリメタニューモウイルスである。例示的な実施形態において、そのような３価ワクチンは、（ａ）キメラトリ−ヒトメタニューモウイルスを使用するのか又はキメラヒト−トリメタニューモウイルスを使用するのかに応じてそれぞれヒトメタニューモウイルス又はトリニューモウイルスのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子の遺伝子産物に、（ｂ）ＲＳＶから得られる異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、（ｃ）ＰＩＶから得られる異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、特異的なものになる。特定の実施形態において、第１の異種ヌクレオチド配列は、呼吸器合胞体ウイルスのＦ遺伝子であり位置１に挿入され、第２の異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶのＦ遺伝子であり位置３に挿入される。さらに多くの組合せが本発明に包含され、その一部を例として表２に示す。さらに、キメラＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用することができる（前掲参照）。いくつかのそれほど好ましくはない実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムのより高い数字の位置に挿入することができる。
【表２】
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【０１２５】
ある実施形態では、ウイルス抗原、腫瘍抗原、及び自己免疫障害に関わる自己抗原を含めた広範な病原体に対するワクチンが生成されるように、本発明の発現産物と組換え又はキメラウイルス粒子を設計製作することができる。この目標を達成する１つの方法では、既存のメタニューモウイルス遺伝子がそのそれぞれの外部ドメインに外来の配列を含有するよう変性させる。異種配列が病原体のエピトープ又は抗原である場合、これらのキメラウイルスは、これらの決定基が得られる病原体に対して防御免疫応答を誘発させるのに使用することができる。
【０１２６】
したがって本発明は、広範なウイルス及び／又は抗原に対するワクチンを処方するために、ウイルスベクターと組換え又はキメラウイルスを使用することに関する。本発明のウイルスベクター及びキメラウイルスは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することによって、又は抗原に対する寛容性を刺激することによって被験体の免疫系を調節するのに使用することができる。本明細書で使用する被験体とは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリの各種とげっ歯類を意味する。
【０１２７】
本発明は、限定しようとするのではなくただ説明することを目的として以下の段階に分けることができ、すなわち（ａ）組換えｃＤＮＡ及びＲＮＡ鋳型の構築、（ｂ）組換えｃＤＮＡ及びＲＮＡ鋳型を使用した異種遺伝子産物の発現、（ｃ）組換えウイルス粒子での異種遺伝子のレスキュー、及び（ｄ）本発明の組換えウイルス粒子を含むワクチンの生成及び使用に分けることができる。
【０１２８】
５．４  組換えｃＤＮＡ及びＲＮＡの構築
ある実施形態では、ウイルスベクターが、本発明のヒト又は哺乳動物メタニューモウイルスのゲノムから得られる。その他の実施形態では、ウイルスベクターはトリニューモウイルスのゲノムから得られる。ある実施形態では、ウイルスベクターは哺乳動物ＭＰＶ及びＡＰＶから得られた配列を含有し、したがってキメラヒトＭＰＶ／ＡＰＶウイルスはこのウイルスベクターによってコードされるようになる。例示的な実施形態では、キメラｈＭＰＶ／ＡＰＶウイルスが構成されるように、ヒトメタニューモウイルスのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子をトリニューモウイルスのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子に置き換えている。その他の実施形態では、ウイルスベクターが、ＡＰＶ及び哺乳動物ＭＰＶから得られた配列を含有し、その結果、キメラＡＰＶ／ｈＭＰＶウイルスがウイルスベクターによってコードされるようになる。さらに例示的な実施形態では、キメラＡＰＶ／ｈＭＰＶウイルスが構築されるように、トリニューモウイルスのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子がヒトメタニューモウイルスのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子に置き換えられている。
【０１２９】
本発明は、ウイルスゲノムに対して内在性の又は天然の配列を含有し、かつウイルスゲノムに対して非天然の配列を含有しても含有しなくてもよい、哺乳動物ＭＰＶ又はＡＰＶゲノムから得られたウイルスベクターを含む組換えウイルスも包含する。非天然の配列には、表現型に変化をもたらしてももたらさなくてもよい、天然の又は内在性の配列とは異なるものが含まれる。本発明の組換えウイルスは、ワクチン製剤に使用するのにより適した表現型を有するウイルス、例えば弱毒化表現型を有し又は抗原性が高められたウイルスをもたらす配列を含有することができる。変異及び変性は、ウイルスのコード領域、遺伝子間領域、リーダー及びトレーラー配列内でよい。
【０１３０】
ある実施形態では、本発明のウイルスベクターは、ｈＭＰＶ、ＡＰＶ、ｈＭＰＶ／ＡＰＶ、又はＡＰＶ／ｈＭＰＶから得られたヌクレオチド配列を含み、天然のヌクレオチド配列が異種配列で置換されており、又は異種配列が天然のメタニューモウイルス配列に付加されている。
【０１３１】
より具体的な実施形態では、キメラウイルスが、ＭＰＶ、ＡＰＶ、ＡＰＶ／ｈＭＰＶ、又はｈＭＰＶ／ＡＰＶから得られたウイルスベクターを含み、これはＰＩＶから得られた異種配列が付加されているものである。より具体的な実施形態では、組換えウイルスが、ＭＰＶ、ＡＰＶ、ＡＰＶ／ｈＭＰＶ、又はｈＭＰＶ／ＡＰＶから得られたウイルスベクターを含み、配列は、ＰＩＶから得られた異種配列で置換されている。その他の具体的な実施形態では、キメラウイルスが、ＭＰＶ、ＡＰＶ、ＡＰＶ／ｈＭＰＶ、又はｈＭＰＶ／ＡＰＶから得られたウイルスベクターを含み、これはＲＳＶから得られた異種配列が付加されているものである。より具体的な実施形態では、キメラウイルスが、ＭＰＶ、ＡＰＶ、ＡＰＶ／ｈＭＰＶ、又はｈＭＰＶ／ＡＰＶから得られたウイルスベクターを含み、配列は、ＲＳＶから得られた異種配列で置換されている。
【０１３２】
ウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーターの補体、例えば本発明の３’−ｈＭＰＶウイルス末端の補体（complement）、又は３’−及び５’−ｈＭＰＶウイルス末端の両方の補体で挟まれる異種遺伝子コード配列は、当技術分野で知られている技法を使用して構築することができる。より具体的な実施形態では、本発明の組換えウイルスが、ｈＭＰＶ又はＡＰＶのリーダー及びトレーラー配列を含有する。ある実施形態では、遺伝子間領域がｈＭＰＶ又はＡＰＶから得られる。得られるＲＮＡ鋳型は、極性が負のものと考えられ、ウイルスＲＮＡ合成装置でその鋳型を認識することが可能な適切な末端配列を含有する。あるいは、ウイルスＲＮＡ合成装置で鋳型を認識することが可能な適切な末端配列を含有する、極性が正のＲＮＡ鋳型を使用してもよい。これらのハイブリッド配列を含有する組換えＤＮＡ分子は、バクテリオファージＴ７やＴ３、ＳＰ６ポリメラーゼ又は真核性ポリメラーゼであってポリメラーゼＩなどの、ＤＮＡ誘導型ＲＮＡポリメラーゼでクローニングし転写することができ、それによって、ウイルスポリメラーゼの認識及び活動を可能にする適切なウイルス配列を持った組換えＲＮＡ鋳型を、生体外又は生体内で生成することができる。より具体的な実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは鶏痘ウイルスＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ又はＭＶＡ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。
【０１３３】
これらのハイブリッド分子を構築するための例示的な手法は、異種ヌクレオチド配列をｈＭＰＶ、ＡＰＶ、ＡＰＶ／ｈＭＰＶ、又はｈＭＰＶ／ＡＰＶゲノムのＤＮＡ補体（complement）に挿入することであり、したがって異種配列は、ウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス配列、すなわちウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーターで挟まれ、以後これをウイルスポリメラーゼ結合部位、及びポリアデニル化部位と呼ぶ。好ましい実施形態において、異種コード配列は、５’及び３’末端の複製プロモーター、遺伝子開始配列及び遺伝子終止配列、５’及び／又は３’末端に見出されるパッケージングシグナルを含むウイルス配列で挟まれる。代替の手法では、ウイルスポリメラーゼ結合部位、例えば３’末端の補体あるいはウイルスゲノムセグメントの両端の補体をコードするオリゴヌクレオチドを異種コード配列にライゲートして、ハイブリッド分子を構築することができる。外来遺伝子又は外来遺伝子のセグメントを標的配列内に配置することは、以前はその標的配列内に適切な制限酵素部位を存在させることによって行っていた。しかし分子生物学における近年の進歩により、この問題が大幅に解消されている。制限酵素部位は、部位指向性の変異誘発性を用いることによって、標的配列内のどこにでも容易に配置することができる（例えば、Kunkel、1985、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 82;488に記述されている技法を参照）。以下に述べるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術の変化によっても、配列の特異的挿入が可能になり（すなわち制限酵素部位）、ハイブリッド分子を容易に構成することが可能になる。あるいは、ＰＣＲ反応を使用することにより、クローニングの必要なく組換え鋳型を調製することができた。例えばＰＣＲ反応を使用して、ＤＮＡ誘導型ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばバクテリオファージＴ３、Ｔ７、又はＳＰ６）を含有する２本鎖ＤＮＡ分子と、異種遺伝子及びＰＩＶポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列を調製することができた。次いでこの組換えＤＮＡからＲＮＡ鋳型を直接転写することができた。さらに別の実施形態においては、ＲＮＡリガーゼを使用して、異種遺伝子の負の極性を指定するＲＮＡとウイルスポリメラーゼ結合部位とをライゲートすることにより、組換えＲＮＡ鋳型を調製することができる。
【０１３４】
さらに、ウイルスのレスキューを得るのに重要と考えられる「６の法則（Rule of Six）」に従って、１つ又は複数のヌクレオチドを非翻訳領域に付加することができる。「６の法則」は数多くのパラミクソウイルスに適用され、この法則によれば、ＲＮＡヌクレオチドゲノムは６分割可能で機能するものでなければならない。ヌクレオチドの付加は、QuickChange変異誘発キット（Stratagene）などの商用の変異誘発キットを使用するような、当技術分野で知られている技法によって実現することができる。適切な数のヌクレオチドを付加した後、適切な制限酵素による消化及びゲル精製によって妥当なＤＮＡ断片を単離することができる。本発明により使用することができるウイルスポリメラーゼの活性及び構成に関する配列要件については、以下のサブセクションで述べる。
【０１３５】
理論に拘泥するものではないが、いくつかのパラメータは、組換えウイルスの複製速度及び異種配列の発現レベルに影響を与える。特に、ｈＭＰＶ、ＡＰＶ、ｈＭＰＶ／ＡＰＶ、又はＡＰＶ／ｈＭＰＶにおける異種配列の位置と、この異種配列を挟む遺伝子間領域の長さは、複製速度と異種配列の発現レベルを決定する。
【０１３６】
ある実施形態において、ウイルスのリーダー配列及び／又はトレーラー配列は、野生型ウイルスに対して変更が加えられる。あるより具体的な実施形態においては、リーダー及び／又はトレーラーの長さが変わる。その他の実施形態において、リーダー及び／又はトレーラーの配列は、野生型ウイルスに対して変異している。より詳細に関してはセクション５．７を参照されたい。
【０１３７】
本発明の組換えウイルスの生成は、マイナスセンスイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）ゲノムの部分又は完全長コピー、あるいはその相補的コピー（ｃＲＮＡ）の複製を利用する。このｖＲＮＡ又はｃＲＮＡは、核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により生成され、又は核酸のトランスフェクションによって細胞内で生成された、感染性ウイルスから単離することができる。第２に、組換えマイナス鎖ウイルスの生成は、機能性ポリメラーゼ複合体を利用する。典型的な場合、ニューモウイルスのポリメラーゼ複合体は、Ｎ、Ｐ、Ｌ、及びおそらくはＭ２タンパク質からなるが、これらにかならずしも限定する必要はない。
【０１３８】
ポリメラーゼ複合体又はその構成要素は、ウイルス粒子から単離することができ、構成要素の１つ又は複数を発現する細胞から単離することができ、あるいは特異的な発現ベクターのトランスフェクションによって生成することができる。
【０１３９】
ＭＰＶの感染性コピーは、上記ポリメラーゼ複合体１６によって上記ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、又はこれらのＲＮＡを発現するベクターを複製する場合に得ることができる（Schnell他、1994、EMBO J 13: 4195〜4203; Collins他、1995、PNAS 92: 11563〜11567; Hoffmann他、2000、PNAS 97: 6108〜6113; Bridgen他、1996、PNAS 93: 15400〜15404; Palese他、1996、PNAS 93: 11354〜11358; Peeters他、1999、J.Virol. 73: 5001〜5009; Durbin他、1997、Virology 235: 323〜332）。
【０１４０】
本発明は、本発明による核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。ＭＰＶのポリメラーゼ構成要素（おそらくはＮ、Ｐ、Ｌ、及びＭ２であるが必ずしもこれらに限定しない）を含有するプラスミドベクター又はウイルスベクターを原核細胞内で生成し、関係ある細胞型（細菌、昆虫細胞、真核細胞）でその構成要素を発現させる。ＭＰＶゲノムの完全長又は部分コピーを含有するプラスミドベクター又はウイルスベクターが原核細胞内で生成され、ウイルス核酸が生体外又は生体内で発現する。後者のベクターは、キメラウイルス又はキメラウイルスタンパク質を生成するために他のウイルス配列を含有してよく、複製欠陥ウイルスを生成するためにウイルスゲノムの一部が欠けてもよく、さらに、弱毒化ウイルスを生成するために、変異、欠失、又は挿入が含まれていてもよい。
【０１４１】
ＭＰＶの感染性コピー（野生型、弱毒化、複製欠陥、又はキメラ）は、上記現況技術によるポリメラーゼ構成要素の共発現によって生成することができる。
【０１４２】
さらに、１つ又は複数の完全長又は部分ＭＰＶタンパク質を一時的に又は安定して発現する真核細胞を使用することができる。そのような細胞は、トランスフェクション（タンパク質又は核酸ベクター）、感染（ウイルスベクター）、又は形質導入（ウイルスベクター）によって作製することができ、上記野生型ウイルス、弱毒化ウイルス、複製欠陥ウイルス、又はキメラウイルスの相補性に役立てることができる。
【０１４３】
５．４．１  挿入する異種遺伝子配列
本発明によれば、本発明のウイルスベクターはさらに、異種配列を発現するよう設計製作することができる。本発明の実施形態において、異種配列は、ウイルスベクター以外の供給源から得られる。限定するのではなく一例として、異種配列は、ウイルスベクターが得られる種、サブグループ、又は変種よりも、メタニューモウイルスの様々な種、サブグループ、又は変種に属するウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする。限定するのではなく一例として、異種配列は、メタニューモウイルス以外のウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする。限定するのではなく一例として、異種配列は、その出所源がウイルスではない。この実施形態によれば、異種配列は、所望の生物学的性質又は活性を有する部分、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードすることができる。そのような異種配列は、タグ又はマーカーをコードすることができる。そのような異種配列は、生体応答調節物質、すなわちその例にはリンホカイン、インターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及び顆粒球コロニー刺激因子が含まれる生体応答調節物質をコードすることができる。
【０１４４】
ある実施形態において、挿入する異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルスから得られる。より具体的には、挿入する異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルス及び／又はトリニューモウイルスから得られる。
【０１４５】
ある実施形態において、異種配列は、ＰＩＶヌクレオカプシドリンタンパク質、ＰＩＶ  Ｌタンパク質、ＰＩＶマトリックスタンパク質、ＰＩＶ  ＨＮ糖タンパク質、ＰＩＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＩＶ  Ｙ１タンパク質、ＰＩＶ  Ｄタンパク質、ＰＩＶ  Ｃタンパク質、ＰＩＶ  Ｆタンパク質、又はＰＩＶ  Ｐタンパク質をコードする。ある実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ＰＩＶヌクレオカプシドリンタンパク質、ＰＩＶ  Ｌタンパク質、ＰＩＶマトリックスタンパク質、ＰＩＶ  ＨＮ糖タンパク質、ＰＩＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＰＩＶ  Ｙ１タンパク質、ＰＩＶ  Ｄタンパク質、ＰＩＶ  Ｃタンパク質、ＰＩＶ  Ｆタンパク質、又はＰＩＶ  Ｐタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が同種であるタンパク質をコードする。異種配列は、ＰＩＶ  １型、ＰＩＶ  ２型、又はＰＩＶ  ３型から得ることができる。より具体的な実施形態においては、異種配列は、ヒトＰＩＶ  １型、ＰＩＶ  ２型、又はＰＩＶ  ３型から得ることができる。その他の実施形態においては、異種配列は、ＲＳＶ核タンパク質、ＲＳＶリンタンパク質、ＲＳＶマトリックスタンパク質、ＲＳＶ疎水性小タンパク質、ＲＳＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質、あるいはＲＳＶ  Ｍ２−１又はＭ２−２タンパク質をコードする。ある実施形態では、異種配列は、ＲＳＶ核タンパク質、ＲＳＶリンタンパク質、ＲＳＶマトリックスタンパク質、ＲＳＶ疎水性小タンパク質、ＲＳＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同種であるタンパク質をコードする。異種配列は、ＲＳＶサブタイプＡ及びＲＳＶサブタイプＢから得ることができる。より具体的な実施形態では、異種配列は、ヒトＲＳＶサブタイプＡ及びＲＳＶサブタイプＢから得られる。その他の実施形態で、異種配列は、ＡＰＶ核タンパク質、ＡＰＶリンタンパク質、ＡＰＶマトリックスタンパク質、ＡＰＶ疎水性小タンパク質、ＡＰＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＰＶ  Ｆタンパク質、ＡＰＶ  Ｇタンパク質、あるいはＡＰＶ  Ｍ２−１又はＭ２−２タンパク質をコードする。ある実施形態において、異種配列は、ＡＰＶ核タンパク質、ＡＰＶリンタンパク質、ＡＰＶマトリックスタンパク質、ＡＰＶ疎水性小タンパク質、ＡＰＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＰＶ  Ｆタンパク質、又はＡＰＶ  Ｇタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が同種であるタンパク質をコードする。トリニューモウイルスは、ＡＰＶサブグループＡ、ＡＰＶサブグループＢ、又はＡＰＶサブグループＣでよい。その他の実施形態においては、異種配列は、ｈＭＰＶ核タンパク質、ｈＭＰＶリンタンパク質、ｈＭＰＶマトリックスタンパク質、ｈＭＰＶ疎水性小タンパク質、ｈＭＰＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＭＰＶ  Ｆタンパク質、ｈＭＰＶ  Ｇタンパク質、あるいはｈＭＰＶ  Ｍ２−１又はＭ２−２をコードする。ある実施形態においては、異種配列は、���ＭＰＶ核タンパク質、ｈＭＰＶリンタンパク質、ｈＭＰＶマトリックスタンパク質、ｈＭＰＶ疎水性小タンパク質、ｈＭＰＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｈＭＰＶ  Ｆタンパク質、又はｈＭＰＶ  Ｇタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が同種であるタンパク質をコードする。ヒトメタニューモウイルスは、ｈＭＰＶ変種Ａ１、ｈＭＰＶ変種Ａ２、ｈＭＰＶ変種Ｂ１、又はｈＭＰＶ変種Ｂ２でよい。
【０１４６】
ある実施形態においては、ＰＩＶ、ＲＳＶ、ヒトメタニューモウイルス、又はトリニューモウイルス由来の種々の異種配列の任意の組合せを、本発明のウイルスに挿入することができる。
【０１４７】
本発明のある好ましい実施形態においては、挿入する異種ヌクレオチド配列が、ＲＳＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶ、又はｈＭＰＶ由来のＦ遺伝子から得られる。
【０１４８】
ある実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、キメラタンパク質をコードする。より具体的な実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、ＲＳＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶ、又はｈＭＰＶのキメラＦタンパク質をコードする。キメラＦタンパク質は、ヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスなどの種々のウイルス由来のＦタンパク質の一部を含むことができる。その他のある実施形態においては、異種配列はキメラＧタンパク質をコードする。キメラＧタンパク質は、ヒトメタニューモウイルスやトリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスなどの種々のウイルス由来のＧタンパク質の一部を含むことができる。特定の実施形態において、Ｆタンパク質は、メタニューモウイルスのＦタンパク質の外部ドメイン、パラインフルエンザウイルスのＦタンパク質の膜貫通ドメイン、及びパラインフルエンザウイルスのＦタンパク質の管腔ドメインを含む。
【０１４９】
ある特定の実施形態において、本発明の異種ヌクレオチド配列は、配列番号１から配列番号５までと配列番号１４及び配列番号１５のいずれか１つである。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号６から配列番号１３までと配列番号１６及び配列番号１７のいずれか１つのタンパク質をコードする。
【０１５０】
呼吸器合胞体ウイルスから得られた異種ヌクレオチド配列に関しては、例えば参照によりその全体を本明細書に援用するＰＣＴ／ＵＳ９８／２０２３０号を参照されたい。
【０１５１】
好ましい実施形態において、本発明の組換えウイルス内に発現することのできる異種遺伝子配列には、センダイウイルスや感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）などの呼吸器疾患をもたらすウイルスの抗原エピトープや糖タンパク質、例えばインフルエンザ糖タンパク質であって特に血球凝集素Ｈ５、Ｈ７、呼吸器合胞体ウイルスエピトープ、ニューカッスル病ウイルスエピトープなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態においては、異種ヌクレオチド配列はＲＳＶ又はＰＩＶから得られる。本発明のさらに別の実施形態において、本発明のキメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列には、ウイルスエピトープ及びウイルスの糖タンパク質であって、例えばＢ型肝炎表面抗原、Ａ又はＣ型肝炎表面糖タンパク質、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、シミアンウイルス５又は流行性耳下腺炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルスの糖タンパク質、ヘルペスウイルスの糖タンパク質、ポリオウイルスのＶＰＩ、及びレンチウイルスから得られた配列であるがこれらに限定されないものが含まれ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型又は２型が好ましいがこれらに限定されない。さらに別の実施形態において、本発明のキメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列には、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）エピトープ、感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＬＶ）のエピトープ、ニワトリ貧血ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、狂犬病、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、及び豚痘ウイルスのエピトープが含まれるが、これらに限定されない（参照によりその全体を本明細書に援用するFields他(編)、1991、Fundamental Virology、第2版、Raven Press、New York参照）。
【０１５２】
本発明のその他の異種配列は、自己免疫疾患に特有の抗原を含む。これらの抗原は、典型的な場合、哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどから得られ、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、悪性貧血、アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、及び円板状エリテマトーデスに特有の抗原が含まれる。
【０１５３】
アレルゲンである抗原は、一般にタンパク質又は糖タンパク質を含み、花粉、ダスト、カビ、胞子、フケ、昆虫、及び食物由来の抗原が含まれる。さらに、腫瘍抗原に特有の抗原は、典型的な場合、腫瘍組織細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などから得られる。その例には、腫瘍タンパク質に特有の抗原、すなわち変異した発癌遺伝子によりコードされたタンパク質、腫瘍に関連したウイルスタンパク質、及び糖タンパク質が含まれる。腫瘍には、口唇癌、鼻咽頭癌、咽頭及び口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、喉頭癌、肺及び気管支癌、皮膚黒色腫、乳癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮癌、脳及びその他の神経系部分の腫瘍、甲状腺癌、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、及び白血病などの癌のタイプから得られたものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本発明の１つの特定の実施形態においては、異種配列が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のゲノム、好ましくはヒト免疫不全ウイルス１型又はヒト免疫不全ウイルス２型のゲノムから得られる。本発明の別の実施形態においては、メタニューモウイルスタンパク質内に異種ペプチド配列を含有するキメラ遺伝子産物が発現するように、異種コード配列を、ウイルス骨格の遺伝子コード配列内に挿入することができる。本発明のそのような実施形態においては、異種配列を、ヒト免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス１型又はヒト免疫不全ウイルス２型のゲノムから得てもよい。
【０１５５】
異種配列がＨＩＶ由来のものである場合、そのような配列には、ｅｎｖ遺伝子（すなわちｇｐ１６０、ｇｐ１２０、及び／又はｇｐ４１の全て又は一部をコードする配列）、ｐｏｌ遺伝子（すなわち逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、及び／又はインテグラーゼの全て又は一部をコードする配列）、ｇａｇ遺伝子（すなわちｐ７、ｐ６、ｐ５５、ｐ１７／１８、ｐ２４／２５の全て又は一部をコードする配列）、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、及び／又はｖｐｘから得られた配列を含めることができるが、これらに限定されない。
【０１５６】
さらに別の実施形態においては、キメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列が、免疫強化活性を有するタンパク質をコードするものを含む。免疫強化タンパク質の例には、サイトカイン、インターフェロン１型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、−２、−４、−５、−６、−１２が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
さらに、キメラウイルスに設計製作することができるその他の異種遺伝子配列には、細菌表面糖タンパク質などの細菌から得られた抗原、真菌から得られた抗原、様々なその他の病原体及び寄生虫から得られた抗原が含まれる。細菌性病原体から得られる異種遺伝子配列の例には、以下の属の種、すなわちサルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クラミジア（Chlamydia）、ヘリコバクター（Helicobacter）、エルシニア（Yersinia）、ボルダテラ（Bordatella）、シュードモナス（Pseudomonas）、ナイセリア（Neisseria）、ビブリオ（Vibrio）、ヘモフィラス（Haemophilus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、トレポネマ（Treponema）、コキシエラ（Coxiella）、エーリキア（Ehrlichia）、ブルセラ（Brucella）、ストレプトバチルス（Streptobacillus）、フゾスピロヘータ（Fusospirocheta）、スピリラム（Spirillum）、ウレアプラズマ（Ureaplasma）、スピロヘータ（Spirochaeta）、ミオコプラズマ（Myocoplasma）、アクチノマイセテス（Actinomycetes）、ボレリア（Borrelia）、バクテロイデス（Bacteroides）、トリコモラス（Trichomoras）、ブランハメラ（Branhamella）、パスツレラ（Pasteurella）、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、リステリア（Listeria）、バチルス（Bacillus）、エリシペロスリックス（Erysipelothrix）、ロドコッカス（Rhodococcus）、エッシェリヒア（Escherichia）、クレブシエラ（Klebsiella）、シュードマナス（Pseudomanas）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、レジオネラ（Legionella）、マイコバクテリア（Mycobacterium）、プロテウス（Proteus）、カムピロバクター（Campylobacter）、エンテロコッカス（Enterococcus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、モルガネラ（Morganella）、モラクセラ（Moraxella）、シトロバクター（Citrobacter）、リケッチア（Rickettsia）、ロクリメ（Rochlimeae）から得られた抗原、並びにＰ．アエルギノーサ、大腸菌、Ｐ．セパシア、Ｓ．エピデルミス、Ｅ．ファエカリス、Ｓ．ニューモニアス、黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウス）、髄膜炎菌（Ｎ．メニンギチジス）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ピロゲネス）、パスツレラ菌（パスツレラ・ムルトシダ）、梅毒トレポネーマ（トレポネーマ・パリダム）及びＰ．ミラビリスなどの細菌種から得られた抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
病原真菌由来の異種遺伝子配列の例には、クリプトコッカス・ネオホルマンス；ブラストマイセス・デルマティティジス；アイエロマイセス・デルマティティジス；ヒストプラズマ・カプスラタム；コクシジオイデス・イミティス；Ｃ．アルビカンス、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．パラプシローシス、Ｃ．ギリエルモンジイ、及びＣ．クルセイを含めたカンジダ種；Ａ．フミガタス、Ａ．フラバス、及びＡ．ニジェールを含めたアスペルギルス種；リゾプス種；リゾムコール種；クンニンガメラ種；Ａ．サクセナエ、Ａ．ムコール、及びＡ．アブシジアを含めたアポフィソマイセス種；スポロスリックス・シェンキイ；パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス；シューダレシェリア・ボイジイ；トルロプシス・グラブラータ；トリコフィトン種；ミクロスポラム種；及びデルマトフィレス種などの真菌から得られた抗原、並びに任意のその他の酵母菌あるいは現在知られており又は後に病原性であると同定される菌などから得られた抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５９】
最後に、寄生虫由来の異種遺伝子配列の例には、例えばバベシア（Babesia）、トキソプラズマ（Toxoplasma）、プラスモジウム（Plasmodium）、アイメリア（Eimeria）、イソスポラ（Isospora）、アトキソプラズマ（Atoxoplasma）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、ハンモンジア（Hammondia）、ベスニオイチア（Besniotia）、サルコシスティス（Sarcocystis）、フレンケリア（Frenkelia）、ヘモプロテウス（Haemoproteus）、ロイコシトゾーン（Leucocytozoon）、テイレリア（Theileria）、ペルキンサス（Perkinsus）、及びグレガリナ（Gregarina）種などのアピコンプレクサ門のメンバー；ニューモシスティス・カリニイ（Pneumocystis carinii）；例えばノセマ（Nosema）、エンテロシトゾーン（Enterocytozoon）、エンセファリトゾーン（Encephalitozoon）、セプタータ（Septata）、ムラゼキア（Mrazekia）、アムブリオスポラ（Amblyospora）、アメゾン（Ameson）、グルゲア（Glugea）、プレイストフォーラ（Pleistophora）、及びミクロスポリジウム（Microsporidium）種などの微胞子虫門のメンバー；例えばハプロスポリジウム（Haplosporidium）種などのアセトスポラ門のメンバー、並びに熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（P.vivax）、卵形マラリア原虫（P.ovale）、四日熱マラリア原虫（P.malaria）を含めた種；トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）；メキシコリーシュマニア（Leishmania mexicana）、熱帯リーシュマニア（L.tropica）、Ｌ．マジョール（L.major）、Ｌ．アエチオピカ（L.aethiopica）、ドノバンリーシュマニア（L.donovani）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、Ｔ．ブルーセイ（T.brucei）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ビルハルツ住血吸虫（S.haematobium）、日本住血吸虫（S.japonium）；旋毛虫（Trichinella spiralis）；バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）；マレー糸状虫（Brugia malayli）；赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）；ヒトギョウチュウ（Enterobius vermiculoarus）；有鉤条虫（Taenia solium）、無鉤条虫 （T.saginata）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginatis）、Ｔ．ホミニス（T.hominis）、Ｔ．テナックス（T.tenax）；ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）；クリプトスポリジウム・パルバム（Cryptosporidium parvum）；ニューモシスティス・カリニイ（Pneumocytis carinii）、バベシア・ボビス（Babesia bovis）、Ｂ．ディヴァージェンス（B.divergens）、Ｂ．ミクロティ（B.microti）、イソスポラ・ベリ（Isospora belli）、Ｌ．ホミニス（L hominis）；ジエンタモエバ・フラギリス（Dientamoeba fragilis）；回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）；回虫（Ascaris lumbricoides）；アメリカ鉤虫（Necator americanis）；ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）；糞線虫（Strongyloides stercoralis）；フィリピン毛頭虫（Capillaria philippinensis）；広東住血線虫（Angiostrongylus cantonensis）；ヒメノレピス・ナナ（Hymenolepis nana）；広節裂頭条虫（Diphyllobothrium latum）；単包条虫（Echinococcus granulosus）、多包条虫（E.multilocularis）；ウェステルマン肺吸虫（Paragonimus westermani）、Ｐ．カリエンシス（P.caliensis）；クロノルチス・シネンシス（Chlonorchis sinensis）；ネコ肝吸虫（Opisthorchis felineas）、Ｇ．ビベリーニ（G.Viverini）、肝蛭（Fasciola hepatica）、ヒゼンダニ（Sarcoptes scabiei）、ヒトジラミ（Pediculus humanus）；フチルラス・プビス（Phthirlus pubis）；及びヒトヒフバエ（Dermatobia hominis）、並びに現在知られており又は後に病原性であると同定される任意のその他の寄生���から得られた抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６０】
５．４．２  異種遺伝子配列の挿入
本発明のウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、ウイルスコード領域を異種配列で完全置換することによって、又は部分置換することによって、又はウイルスゲノムに異種ヌクレオチド配列を付加することによって行うことができる。完全置換は、ＰＣＲ誘導型の変異誘発性を使用することにより、おそらく最良に行われると考えられる。簡単に説明すると、ＰＣＲプライマーＡは、５’末端から３’末端まで、クラスＩＩＳ制限酵素部位などの固有の制限酵素部位（すなわち「シフター」酵素；特定の配列を認識するがその配列の上流又は下流でＤＮＡを切断する）；置換される遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドの伸長部；及び異種配列のカルボキシ末端コード部分に相補的なヌクレオチドの伸長部を含有すると考えられる。ＰＣＲプライマーＢは、５’末端から３’末端まで、固有の制限酵素部位；置換される遺伝子に相補的なヌクレオチドの伸長部；及び異種又は非天然遺伝子の５’コード部分に対応するヌクレオチドの伸長部を含有すると考えられる。これらのプライマーを使用して、クローニングした異種又は非天然遺伝子のコピーについてＰＣＲ反応させた後、固有の制限部位を使用して生成物を切り出しクローニングすることができる。クラスＩＩＳ酵素による消化、及び精製したファージポリメラーゼによる転写によって、結果的に異種又は非天然遺伝子の挿入を持つようになったウイルス遺伝子の正確な非翻訳末端を含有するＲＮＡ分子が生成されると考えられる。代替の実施形態においては、ＰＣＲによる刺激を受けた反応を使用して、バクテリオファージプロモーター配列及びハイブリッド遺伝子配列を含有する２本鎖ＤＮＡを調製することができ、その結果、ＲＮＡ鋳型をクローニングすることなく直接転写できるようになる。
【０１６１】
異種ヌクレオチド配列は、本発明のウイルスの様々な位置に付加し又は挿入することができる。一実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置１に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置２に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置３に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置４に付加し又は挿入する。別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置５に付加し又は挿入する。さらに別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を位置６に付加し又は挿入する。本明細書で使用する「位置」という用語は、転写するウイルスゲノム上の異種ヌクレオチド配列の位置を指し、例えば位置１は、第１の遺伝子が転写されることを意味し、位置２は、第２の遺伝子が転写されることを意味する。ウイルスのより低い数字の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入すると一般に、より大きい数字の位置に挿入した場合比べて異種ヌクレオチド配列の発現が強くなるが、これはウイルスのゲノム全体にわたって生ずる転写勾配が原因である。しかしこの転写勾配は、特定の割合のウイルスｍＲＮＡももたらす。外来遺伝子を挿入するとこの割合が乱れ、その結果、種々の量のウイルスタンパク質が合成されて、ウイルスの複製に影響を及ぼす可能性がある。このように、挿入部位を選択する場合には、転写勾配と複製動態の両方を考慮しなければならない。より低い数字の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入することは、異種ヌクレオチド配列の強力な発現が望まれる場合、本発明の好ましい実施形態になる。好ましい実施形態においては、異種配列を位置１、２、又は３に付加し又は挿入する。
【０１６２】
本発明のウイルスに異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果が実現されるように、異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させることができる。本明細書で使用する「遺伝子間領域」という用語は、１つの遺伝子の停止シグナルと、その隣の下流にあるオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドン（例えばＡＵＧ）との間のヌクレオチド配列を指す。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域、すなわち遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始点（ＡＵＧ）との間を構成することができる。この非コード領域は、いくつかのウイルス遺伝子内で自然に生ずる。
【０１６３】
様々な実施形態において、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との間の遺伝子間領域は、互いに独立に、少なくとも長さ１０ｎｔに、少なくとも長さ２０ｎｔに、少なくとも長さ３０ｎｔに、少なくとも長さ５０ｎｔに、少なくとも長さ７５ｎｔに、少なくとも長さ１００ｎｔに、少なくとも長さ１２５ｎｔに、少なくとも長さ１５０ｎｔに、少なくとも長さ１７５ｎｔに、又は少なくとも長さ２００ｎｔになるように設計製作することができる。ある実施形態において、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との遺伝子間領域は、互いに独立に、最大でも長さ１０ｎｔに、最大でも長さ２０ｎｔに、最大でも長さ３０ｎｔに、最大でも長さ５０ｎｔに、最大でも長さ７５ｎｔに、最大でも長さ１００ｎｔに、最大でも長さ１２５ｎｔに、最大でも長さ１５０ｎｔに、最大でも長さ１７５ｎｔに、又は最大でも長さ２００ｎｔになるように設計製作することができる。様々な実施形態において、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域も、互いに独立に、少なくとも長さ１０ｎｔに、少なくとも長さ２０ｎｔに、少なくとも長さ３０ｎｔに、少なくとも長さ５０ｎｔに、少なくとも長さ７５ｎｔに、少なくとも長さ１００ｎｔに、少なくとも長さ１２５ｎｔに、少なくとも長さ１５０ｎｔに、少なくとも長さ１７５ｎｔに、又は少なくとも長さ２００ｎｔになるように設計製作することができる。ある実施形態において、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域も、互いに独立に、最大でも長さ１０ｎｔに、最大でも長さ２０ｎｔに、最大でも長さ３０ｎｔに、最大でも長さ５０ｎｔに、最大でも長さ７５ｎｔに、最大でも長さ１００ｎｔに、最大でも長さ１２５ｎｔに、最大でも長さ１５０ｎｔに、最大でも長さ１７５ｎｔに、又は最大でも長さ２００ｎｔになるように設計製作することができる。
【０１６４】
異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果を実現するために、位置的な作用と遺伝子間領域の操作を組み合わせて用いることができる。例えば異種ヌクレオチド配列は、位置１、２、３、４、５、及び６からなる群から選択された位置に付加し又は挿入することができ、異種ヌクレオチド配列とこれに隣接する下流の遺伝子との間の遺伝子間領域を変化させることができる（表３参照）。本発明に包含される組合せのいくつかを、例として表３に示す。
【表３】
2011250786.tif 000005
【０１６５】
挿入された異種ヌクレオチド配列の目的（例えば強力な免疫原性をもたせるなど）に応じ、挿入の位置と挿入された異種ヌクレオチド配列の遺伝子間領域の長さとは、以下の非限定的なアッセイ例、すなわちプラークアッセイ、蛍光焦点（fluorescent-focus）アッセイ、感染中心アッセイ、形質転換アッセイ、終点希釈アッセイ、平板効率、電子顕微鏡法、血球凝集素、ウイルス酵素活性の測定、ウイルス中和、血球凝集素抑制、補体結合法、免疫染色、免疫沈降及び免疫ブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ、核酸検出（例えばサザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析）、増殖曲線、レポーター遺伝子の使用（例えば、タンパク質発現を観察するために、対象の異種遺伝子と同じ手法でウイルスゲノムに組み込まれた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）などのレポーター遺伝子の使用）、又はこれらの組合せによって測定された、複製動態及びタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルも含むがこれらに限定されない様々な指標によって、決定することができる。これらのアッセイを行う手順は、当技術分野で周知であり（例えば、Flint他、PRINCIPLES OF VIROLOGY,MOLECULAR BIOLOGY,PATHOGENESIS,AND CONTROL、2000、ASM Press、第25〜56頁参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）、非限定的な例を以下の実施例のセクションに示す。
【０１６６】
例えば発現レベルは、培養中の細胞を本発明のウイルスに感染させ、その後、例えば異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やＥＬＩＳＡでタンパク質発現レベルを測定することによって、又は例えば異種配列に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でＲＮＡ発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に異種配列の発現レベルは、動物モデルに感染させて、動物モデルにおける本発明の組換えウイルスの異種配列から発現したタンパク質のレベルを測定することによって、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析又はＥＬＩＳＡにかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、異種配列の遺伝子産物に対する動物によって産生された抗体の力価は、ＥＬＩＳＡを含むがこれに限定されない当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。
【０１６７】
異種配列は、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と同種である可能性があるので、プローブ及び抗体が異種配列又はその遺伝子産物に対して確かに特異的になるように注意を払うべきである。
【０１６８】
ある特定の実施形態において、キメラトリ−ヒトメタニューモウイルス由来のｈＭＰＶのＦタンパク質の発現レベルは、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。Ｆタンパク質の発現レベルは、培養中の細胞を本発明のキメラウイルスに感染させ、例えばｈＭＰＶのＦタンパク質及び／又はＧタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やＥＬＩＳＡなどでタンパク質発現レベルを測定することによって、あるいは例えばヒトメタニューモウイルスのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でＲＮＡ発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に異種配列の発現レベルは、動物モデルを使用し、その動物モデルに感染させて動物モデルにおけるＦタンパク質及び／又はＧタンパク質のレベルを測定することにより、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列のＦタンパク質及び／又はＧタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析又はＥＬＩＳＡにかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、Ｆタンパク質及び／又はＧタンパク質に対する動物によって産生された抗体の力価は、ＥＬＩＳＡを含むがこれに限定されない当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。
【０１６９】
本発明の組換えウイルスの複製速度は、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。
【０１７０】
ある実施形態においては、ウイルスゲノムにおける異種配列の最適な位置と遺伝子間領域の最適な長さの特定を容易にするために、異種配列がレポーター遺伝子をコードする。最適なパラメータを決定したら、そのレポーター遺伝子を、選ばれた抗原をコードする異種ヌクレオチド配列に置き換える。当業者に知られる任意のレポーター遺伝子は、本発明の方法と共に使用することができる。より詳細に関してはセクション５．８を参照されたい。
【０１７１】
組換えウイルスの複製速度は、当業者に知られている任意の標準的技法により決定することができる。複製速度はウイルスの増殖率で表され、感染後の時間に対してウイルス力価をプロットすることにより決定することができる。ウイルス力価は、当業者に知られている任意の技法によって測定することができる。ある実施形態においては、ウイルスを含有する懸濁液を、ウイルスに感染し易い細胞と共にインキュベートする。本発明の方法と共に使用することができる細胞型には、Ｖｅｒｏ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ−２細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＬＦ  １０４３（ＨＥＬ）細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ｔＭＫ細胞、２９３Ｔ細胞、ＱＴ６細胞、ＱＴ３５細胞、又はニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）が含まれるがこれらに限定されない。ウイルスを細胞と共にインキュベートした後、感染した細胞の数を決定する。ある特定の実施形態においては、ウイルスがレポーター遺伝子を含む。したがってレポーター遺伝子を発現する細胞の数は、感染した細胞の数を表す。特定の実施形態においては、ウイルスが、ｅＧＦＰをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、ｅＧＦＰを発現する細胞の数、すなわちウイルスに感染した細胞の数は、ＦＡＣＳを使用して決定される。
【０１７２】
ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、その組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、最大でもその２０％である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、及びその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば位置１におけるＰＩＶのＦ遺伝子によるＡＰＶ／ｈＭＰＶの複製速度は、最大でもＡＰＶの複製速度の２０％である。
【０１７３】
ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、最大でもその５％、最大でも１０％、最大でも２０％、最大でも３０％、最大でも４０％、最大でも５０％、最大でも７５％、最大でも８０％、最大でもその９０％である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、少なくともその５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくともその９０％である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下での複製速度に対し、その５％から２０％の間、１０％から４０％の間、２５％から５０％の間、４０％から７５％の間、５０％から８０％の間、又は７５％から９０％の間である。
【０１７４】
ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのＦタンパク質の発現レベルに対し、最大でもその２０％である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、及びその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば、ｈＭＰＶの位置１におけるＰＩＶ３のＦタンパク質の異種配列の発現レベルは、ｈＭＰＶのＦタンパク質の発現レベルに対して最大でも２０％である。
【０１７５】
ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのＦタンパク質の発現レベルに対し、最大でもその５％、最大でも１０％、最大でも２０％、最大でも３０％、最大でも４０％、最大でも５０％、最大でも７５％、最大でも８０％、最大でもその９０％である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのＦタンパク質の発現レベルに対し、少なくともその５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくともその９０％である。ある実施形態において、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの同じ条件下でのＦタンパク質の発現レベルに対し、その５％から２０％の間、１０％から４０％の間、２５％から５０％の間、４０％から７５％の間、５０％から８０％の間、又は７５％から９０％の間である。
【０１７６】
５．４．３  異種遺伝子配列のＧ遺伝子への挿入
Ｇタンパク質は、メタニューモウイルスの膜貫通タンパク質である。特定の実施形態においては、ウイルスエンベロープの表面に発現するように、外部ドメインをコードするＧ−ＯＲＦの領域に異種配列を挿入する。１つの手法では、いかなるウイルス配列も欠失させることなく、異種配列を抗原部位に挿入することができる。別の手法では、異種配列がＧ−ＯＲＦの配列に取って代わる。そのような構築物の発現産物は、外来抗原に対するワクチンに役立てることができ、ワクチン接種した宿主での組換えウイルスの増殖に伴う問題を確かに回避することができる。抗原部位のみが置換されている無傷のＧ分子によって、Ｇ機能が可能になり、したがって生存可能なウイルスの構築物が可能になる。したがってこのウイルスは、さらなるヘルパー機能を必要とせずに、増殖することができる。ウイルスは、あらゆる偶発的な逸脱の危険性が回避されるように、その他の方法で弱毒化してもよい。
【０１７７】
その他のハイブリッド構築物は、細胞表面にタンパク質が発現するように、又はタンパク質が細胞から遊離するように作製することができる。
【０１７８】
５．４．４  ２シストロンＲＮＡの構築物
２シストロン性ｍＲＮＡは、ウイルス配列の翻訳の内部開始が可能になるように、また規則的な末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現が可能になるように、構築することができる。あるいは２シストロン性ｍＲＮＡ配列は、ウイルス配列が規則的な末端オープンリーディングフレームから翻訳されるがその一方で外来配列が内部部位から開始するものを構成することができる。ある特定の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を利用することができる。選択されるＩＲＥＳ配列は、ＭＰＶパッケージングの限界に影響を与えないように、十分短いものであるべきである。したがって、そのような２シストロン的手法を目的として選択されるＩＲＥＳは、その長さが５００ヌクレオチド以下であることが好ましい。特定の実施形態において、ＩＲＥＳは、１つのピコルナウイルスから得られ、いかなる追加のピコルナウイルス配列も含まない。特定のＩＲＥＳ要素には、哺乳動物ＢｉＰ  ＩＲＥＳとＣ型肝炎ウイルスＩＲＥＳが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
あるいは外来タンパク質を、転写単位が開始部位及びポリアデニル化部位を有する新しい内部転写単位から発現させることができる。別の実施形態においては、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝子をＭＰＶ遺伝子に挿入する。
【０１８０】
５．５  組換えｃＤＮＡ及びＲＮＡ鋳型を使用した異種遺伝子産物の発現
上述のように調製されたウイルスベクター及び組換え鋳型は、適切な宿主細胞に異種遺伝子産物が発現するように、又は異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスが生成されるように、様々な方法で使用することができる。一実施形態においては、組換えｃＤＮＡを使用して適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、得られたＲＮＡを用いて異種遺伝子産物の発現を高いレベルで実施することができる。高レベルの発現をもたらす宿主細胞系は、それぞれＡＰＶ又はＭＰＶに重感染した細胞系、ＡＰＶ又はＭＰＶ機能を補完するよう設計製作された細胞系など、ウイルス機能を提供する連続した細胞系を含む。
【０１８１】
本発明の代替の実施形態においては、異種遺伝子産物の発現を実現するために、組換え鋳型を使用して、ウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系をトランスフェクトすることができる。このため、Ｌタンパク質などのポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換された細胞系を、適切な宿主細胞として利用することができる。宿主細胞は、その他のウイルス機能又はＧやＮなどの追加の機能が得られるように同様に設計製作することができる。
【０１８２】
別の実施形態において、ヘルパーウイルスは、異種遺伝子産物の発現を実現するために、細胞によって利用されるＲＮＡポリメラーゼタンパク質を提供することができる。さらに別の実施形態においては、細胞に、Ｎ、Ｐ、Ｌ、及びＭ２−１タンパク質などのウイルスタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトすることができる。
【０１８３】
５．６  組換えウイルス粒子のレスキュー
本発明のキメラ及び組換えウイルスを調製するために、プラス又はマイナスセンスで本発明の組換え又はキメラウイルスのゲノムをコードするｃＤＮＡを使用して、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質及び機能をもたらす細胞にトランスフェクトすることができる。あるいは、本発明の組換えウイルスをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子によるトランスフェクションの前、間、又は後に、細胞にヘルパーウイルスをトランスフェクトすることができる。本発明の合成組換えプラスミドＤＮＡ及びＲＮＡは、例えば１９９２年１１月２４日発行の米国特許第５，１６６，０５７号；１９９８年１２月２９日発行の米国特許第５，８５４，０３７号；１９９６年２月２０日公開の欧州特許公開ＥＰ０７０２０８５Ａ１；米国特許出願第０９／１５２，８４５号；１９９７年４月３日公開の国際特許公開ＰＣＴ  ＷＯ９７／１２０３２号；１９９６年１１月７日公開のＷＯ９６／３４６２５；欧州特許公開ＥＰ−Ａ７８０４７５；１９９９年１月２１日公開のＷＯ  ９９／０２６５７；１９９８年１１月２６日公開のＷＯ９８／５３０７８号；１９９８年１月２２日公開ＷＯ９８／０２５３０号；１９９９年４月１日公開のＷＯ９９／１５６７２号；１９９８年４月２日公開のＷＯ９８／１３５０１号；１９９７年２月２０日公開のＷＯ９７／０６２７０号；及び１９９７年６月２５日公開のＥＰＯ７８０４７ＳＡ１であって、その全体が参照により本明細書に援用されているものに記載されているような、当技術分野で知られている数多くの技法によって、感染性ウイルス粒子に複製し又はレスキューすることができる。
【０１８４】
本発明の一実施形態においては、ウイルスポリメラーゼによる認識に不可欠でありかつ成熟したウイルス粒子の生成に必要とされるパッケージングシグナルに不可欠な、マイナス鎖ウイルスＲＮＡの非コード領域（リーダー及びトレーラー）を含有する合成組換えウイルスＲＮＡを調製することができる。逆遺伝学的手法をレスキューマイナス鎖ＲＮＡウイルスに適用するのに使用することが可能な、いくつかの異なる手法がある。まず、組換えＲＮＡを組換えＤＮＡ鋳型から合成し、精製したウイルスポリメラーゼ複合体を用いて生体外で再構成し、それによって、細胞にトランスフェクトするのに使用することができる組換えリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。別の手法では、生体外又は生体内での合成ＲＮＡの転写中にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションを実現する。この手法によれば、合成ＲＮＡをｃＤＮＡプラスミドから転写することができるが、これは、ポリメラーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドと共に生体外で同時転写され、又はポリメラーゼタンパク質の存在下で生体内で転写され、すなわちポリメラーゼタンパク質を一時的に又は構造上の要素として発現する細胞内で転写されたものである。
【０１８５】
本明細書で述べる追加の手法では、感染性のキメラ又は組換えウイルスは、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系内で複製され（例えばウイルス／宿主細胞発現系内で；ポリメラーゼタンパク質を発現するように設計製作された形質転換細胞系など）、したがって感染性のキメラ又は組換えウイルスが複製され、レスキューされる。この場合、この機能は、発現するウイルスポリメラーゼタンパク質によって得られるので、ヘルパーウイルスを利用する必要がない。
【０１８６】
本発明によれば、当業者に知られている任意の技法を使用して、組換え及びキメラウイルスの複製及びレスキューを実現することができる。ある手法では、宿主細胞をトランスフェクトする前に生体外での複製に必要なウイルスタンパク質及びウイルス機能を提供する。そのような実施形態においては、ウイルスタンパク質を、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、精製ウイルスタンパク質、又は組換え発現したウイルスタンパク質の形で提供することができる。ウイルスタンパク質は、キメラウイルスをコードする合成ｃＤＮＡ又はＲＮＡを転写する前、転写する間、又は転写した後に提供することができる。宿主細胞をトランスフェクトするには、混合物全体を使用することができる。別の手法では、複製に必要とされるウイルスタンパク質及びウイルスの機能を、キメラウイルスをコードする合成ｃＤＮＡ又はＲＮＡを転写する前、又は転写する間に提供することができる。そのような実施形態において、複製に必要とされるウイルスタンパク質及びウイルスの機能は、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイルス抽出物、合成ｃＤＮＡ又はＲＮＡであってウイルスタンパク質を発現する形で提供され、これらが感染又はトランスフェクションによって宿主細胞内に導入される。この感染／トランスフェクションは、キメラウイルスゲノムをコードする合成ｃＤＮＡ又はＲＮＡを導入する前、又は導入と同時に行う。
【０１８７】
特に望ましい手法では、本発明の全てのウイルス遺伝子あるいはキメラ又は組換えウイルスを発現するように設計製作された細胞、すなわちＡＰＶ、ＭＰＶ、ＭＰＶ／ＡＰＶ、又はＡＰＶ／ＭＰＶを発現するように設計製作された細胞により、所望の遺伝子型を含有する感染姓ウイルスが産生され、したがって選択系の必要性がなくなる。理論上、ＭＰＶの構造タンパク質をコードするＯＲＦのいずれか１つ、又はそのようなＯＲＦのいずれか１つの一部を、外来の配列に代えることができる。しかしこのような状況で必要な部分とは、欠陥ウイルス（正常なウイルス遺伝子の産物が失われ又は変化しているので欠陥がある）を増殖させる能力である。この問題を回避するため、いくつかの可能な手法が存在する。ある手法では、変異タンパク質を有するウイルスを、同じタンパク質の野生型バージョンを恒常的に発現するよう構成された細胞系内で増殖させることができる。この方法により、細胞系は、ウイルス内の変異体を補完する。同様の技法を使用して、ＭＰＶ遺伝子のいずれかを恒常的に発現する形質転換細胞系を構成することができる。ウイルスタンパク質を発現するように作製されたこれらの細胞系を使用して、キメラ又は組換えウイルスの欠陥を補完し、それによって増殖させることができる。あるいは、ある特定の範囲の天然宿主系を利用して、キメラ又は組換えウイルスを増殖させることができる。
【０１８８】
さらに別の実施形態において、複製に必要とされるウイルスタンパク質及びウイルスの機能は、合成ｃＤＮＡ又はＲＮＡの形の遺伝物質として提供することができ、その結果、キメラウイルスをコードする合成ｃＤＮＡ又はＲＮＡと共転写されるようになる。特に望ましい手法では、キメラウイルス及びウイルスポリメラーゼ及び／又はその他のウイルス機能を発現するプラスミドが、宿主細胞内に同時にトランスフェクトされる。例えば、１つ又は複数の異種配列を持つか又は持たないゲノム又は抗ゲノムＡＰＶ、ＭＰＶ、ＭＰＶ／ＡＰＶ、又はＡＰＶ／ＭＰＶ  ＲＮＡをコードするプラスミドを、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質Ｎ、Ｐ、Ｌ、又はＭ２−１をコードするプラスミドと共に宿主細胞内に同時にトランスフェクトすることができる。あるいは、本発明の組換えウイルスのレスキューは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする変性ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の使用、又はポリメラーゼタンパク質（Ｎ、Ｐ、及びＬ）をコードするプラスミド及びＭＶＡの組合せによって実現することができる。例えば、ＭＶＡ−Ｔ７又はＦｏｗｌ  Ｐｏｘ−Ｔ７を、Ｖｅｒｏ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ−２細胞、ＨＥｐ−２細胞、ＬＦ  １０４３（ＨＥＬ）細胞、ｔＮＫ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＨＵＴ  ２９２、ＦＲＨＬ−２（アカゲザル）、ＦＣＬ−１（ミドリザル）、ＷＩ−３８（ヒト）、ＭＲＣ−５（ヒト）細胞、２９３Ｔ細胞、ＱＴ６細胞、ＱＴ３５細胞、及びＣＥＦ細胞に感染させることができる。ＭＶＡ−Ｔ７又はＦｏｗｌ  Ｐｏｘ−Ｔ７に感染した後、本発明の組換えウイルスをコードする完全長抗ゲノム又はゲノムｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、Ｌ、及びＭ２−１コード発現プラスミドと共に細胞にトランスフェクトすることができる。あるいはポリメラーゼは、プラスミドのトランスフェクションによって得ることができる。その後、細胞及び細胞の上澄みを収集し、凍結融解サイクルに１回かけることができる。次いで得られた細胞溶解産物を使用して、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、ワクシニアウイルスの複製阻害剤の存在下、新しいＶｅｒｏ細胞の単層に感染させ、それによってウイルスストックを生成することができる。次いでこれらのプレートからの上澄み及び細胞を収集し、一度凍結融解することができ、本発明の組換えウイルス粒子の存在を、特定のウイルスに特異的な抗血清を使用するウイルスプラークの免疫染色によってアッセイすることができる。
【０１８９】
キメラ又は組換えウイルスを増殖させる別の手法では、野生型ウイルスと共に培養することができる。これは、単に組換えウイルスを得て、このウイルス及び別の野生型ウイルスを細胞に共感染させることにより行われる。野生型ウイルスは、欠陥遺伝子産物を補完して、野生型ウイルスと組換えウイルスの両方の成長を可能にすべきである。あるいは、ヘルパーウイルスを使用して、組換えウイルスの増殖を支援することができる。
【０１９０】
別の手法では、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する組換えウイルスを共感染させた細胞内で、合成鋳型を複製することができる。実際に、この方法を使用して、本発明による組換え感染性ウイルスをレスキューすることができる。このために、ウイルス発現ベクター（例えばワクシニアウイルスやアデノウイルス、バキュロウイルスなど）又はポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系（例えばKrystal他、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83: 2709〜2713参照）を含むがこれらに限定されない任意の発現ベクター／宿主細胞系内で、メタニューモウイルスポリメラーゼタンパク質を発現させることができる。さらに、全てのメタニューモウイルスタンパク質を発現する宿主細胞の感染により、感染性キメラウイルス粒子の産生が生じる。ウイルスの生存能力を変化させることなく、組換えウイルスを構成することが可能と考えられることに、留意すべきである。次いでこれらの変化したウイルスは増殖能力を持ち、複製するのにヘルパー機能を必要としないと考えられる。
【０１９１】
本発明の方法に従って組換えによってウイルスを生成するためには、ウイルスゲノムをコードする遺伝物質が転写されなければならない（転写ステップ）。このステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（宿主細胞の外）でもｉｎ  ｖｉｖｏ（宿主細胞内）でも達成できる。ウイルスゲノムを遺伝物質から転写して、ウイルスゲノムのプラスセンスコピー（アンチゲノムコピー）、又はウイルスゲノムのマイナスセンスコピー（ゲノムコピー）のいずれかを生成することができる。次のステップでは、ウイルスゲノムを複製し、さらに、複製されたゲノムをウイルス粒子中にパッケージングする必要がある（複製及びパッケージングのステップ）。このステップは、十分なレベルのウイルスポリメラーゼと、ウイルスの複製及びパッケージングに必要な構造タンパク質とを供給するように設計製作された宿主細胞の細胞内で行われる。
【０１９２】
転写ステップがｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる場合、それに続いて、ウイルスゲノムの細胞内複製及びパッケージングが行われる。転写ステップがｉｎ  ｖｉｖｏで行われる場合、ウイルスゲノムの転写は、当業者に知られている様々な方法を用いて、ウイルスゲノムをコードするウイルス性遺伝物質の発現の前に、同時に、又は後で行うことができ、このウイルスゲノムは様々な供給源から得られるか、又は生成することできる。遺伝物質は、ウイルスそれ自体から単離されたものでよい。例えば、ウイルスＲＮＡゲノムとポリメラーゼタンパク質との複合体（リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ））を、ウイルス全体から単離することができる。その後、ウイルスＲＮＡゲノムから付随タンパク質、例えばウイルスＲＮＡポリメラーゼ及び核タンパク質が取り除かれる。
【０１９３】
ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、標準的な組換え技法を用いて生成できる。遺伝物質は完全長ウイルスゲノムをコードする場合も、その一部をコードする場合もある。あるいは、遺伝物質は、ウイルスゲノムのリーダー配列及び／又はトレーラー配列が隣接している異種配列をコードするものでよい。完全長ウイルスゲノムは、当技術分野で知られている技法を用いて、いくつかの、より小さなＰＣＲ断片から構成することができる。ｈＭＰＶにおける種々の分離株の制限マップを図２８に示す。完全長構築体を組み立てるのに、それらの制限部位を用いることができる。ある実施形態では、ＰＣＲ反応から生成する断片が、その５’末端近傍の制限部位と、その３’末端近傍の制限部位とを有するように、ＰＣＲプライマーを設計する。その後、ＰＣＲ産物をそれぞれの制限酵素で消化し、次に隣接するＰＣＲ断片と連結することができる。
【０１９４】
ウイルスゲノムの複製及びパッケージングを実現するためには、リーダー配列及びトレーラー配列が、ウイルスポリメラーゼによる認識に必要なシグナルを保持していることが重要である。ウイルスＲＮＡゲノム用のリーダー配列及びトレーラー配列は、ウイルスの複製及びレスキューを改善及び促進するために、最適化又は改変することができる。あるいは、ウイルスの複製及びパッケージングの効率を低下させて、その結果として、弱毒化表現型を有するウイルスをレスキューするために、リーダー配列及びトレーラー配列を改変することもできる。種々のリーダー配列及びトレーラー配列の例には、パラミクソウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、リーダー配列及びトレーラー配列は、野生型ｈＭＰＶ又は変異されたｈＭＰＶの配列である。本発明の別の実施形態では、リーダー配列及びトレーラー配列が、ＰＩＶ、ＡＰＶ、又はＲＳＶの配列である。本発明のさらに別の実施形態では、リーダー配列及びトレーラー配列が、異なったウイルス出自のものを組み合わせた配列である。可能な組合せの制限としてではなく、例として挙げれば、リーダー配列及びトレーラー配列は、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶ、ＲＳＶ、又は任意の他のパラミクソウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列のうちの任意のものの組合せでよい。リーダー配列及びトレーラー配列に対する改変の例には、ウイルスプロモータに対する間隔の変更、配列の変更、例えばＧ残基の数（通常０〜３）の変更、並びに、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、又はリボザイム触媒能を保持したその断片を含めたリボザイム配列の使用、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたランオフＲＮＡに対する制限酵素の使用による５’末端又は３’末端の決定が含まれる。
【０１９５】
代替の一実施形態では、ウイルスゲノムが六量体長である場合に、ウイルスの複製及びレスキューの効率が改善されうる。ウイルスゲノムが適切な長さのものであることを確実にするために、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、又はリボザイム触媒能を保持したそれらの断片を含めたリボザイム配列を使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたランオフＲＮＡに対して制限酵素を使用して、５’末端又は３’末端を決定することができる。
【０１９６】
ウイルスゲノムをコードする遺伝物質が転写されるには、その遺伝物質が適切な転写制御配列、例えば、ポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列の制御下に配置されるように設計製作する。好ましい実施形態では、プロモーター配列がＴ７、Ｓｐ６、又はＴ３ポリメラーゼによって認識される。さらに別の実施形態では、プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ  Ｉ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）などの、細胞性のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識される。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、ウイルスゲノムのプラス鎖コピー又はマイナス鎖コピーのいずれかが転写されるように、転写制御配列の制御下に配置することができる。ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、プラスミドベースのベクター、例えば、ＣＭＶの即時型プロモーターなどのｐｏｌ  ＩＩプロモーターを備えたプラスミド、Ｔ７プロモーターを備えたプラスミド、又はウイルスベースのベクター、例えば、ワクシニアベクター、ＭＶＡ−Ｔ７、及び鶏痘ベクターを含めた痘疹ウイルスベクターなど、発現ベクター中において転写制御配列に機能的に連結されるように、組換えによって設計製作する。
【０１９７】
ウイルスゲノムをコードする遺伝物質は、選択されたポリメラーゼによる発現を促進するように改変すること、例えば、Ｔ７プロモーターから発現を最適化するためにリーダー配列又はトレーラー配列の上流にあるＧ残基の数（通常０から３）を変化させることができる。
【０１９８】
ウイルスゲノムの複製及びパッケージングは、ウイルスの複製及びパッケージングを許容する宿主細胞の細胞内で起こる。宿主細胞を設計製作するいくつかの方法があり、それらによって複製及びパッケージングに必要なウイルスポリメラーゼ及び構造タンパク質を十分なレベルで提供するように宿主細胞を設計製作することができるが、そのような宿主細胞には、適切なヘルパーウイルスに感染している宿主細胞、ウイルスポリメラーゼ及び構造タンパク質を安定的又は構成的に発現するように設計製作されている宿主細胞、あるいは、ウイルスポリメラーゼ及び構造タンパク質を一時的に、若しくは誘導によって発現するように設計製作されている宿主細胞が含まれる。
【０１９９】
ＭＰＶウイルスの複製及びパッケージングに必要なタンパク質機能には、ポリメラーゼタンパク質Ｐ、Ｎ、Ｌ、及びＭ２−１が含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
一実施形態では、発現されるタンパク質が天然又は野生型のＭＰＶタンパク質である。別の実施形態では、発現されるタンパク質を、標準的な組換え技法の使用によって、それらの発現レベル及び／又はポリメラーゼ活性を促進するように改変することができる。あるいは、ポリメラーゼ活性を保持するポリメラーゼタンパク質の断片、誘導体、類似体、又は末端切断型を発現させることもできる。さらに別の実施形態では、ＡＰＶなどの他のニューモウイルス又は任意の他のパラミクソウイルスに由来する類似のポリメラーゼタンパク質を発現させることができる。さらに、ＭＰＶのある株のタンパク質を別の株のゲノムと共に発現させることによって弱毒化ウイルスを生成することもできる。例えば、ＭＰＶのある株のポリメラーゼタンパク質を別の株のゲノムと共に発現させて、弱毒化表現型を生成することができる。
【０２０１】
ウイルスポリメラーゼタンパク質は、ヘルパーウイルスによって提供することができる。本発明に従って使用できるヘルパーウイルスには、ＭＰＶやＡＰＶなど、ポリメラーゼウイルスタンパク質を天然に発現するものが含まれる。あるいは、ポリメラーゼウイルスタンパク質を提供するように組換えによって設計製作されたヘルパーウイルスを使用することもできる。
【０２０２】
あるいは、発現ベクターによってウイルスポリメラーゼタンパク質を提供することもできる。ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードする配列は、適切な転写制御配列、例えばポリメラーゼによって認識されたプロモーター配列の制御下に配置されるように設計製作する。好ましい実施形態では、プロモーター配列がＴ７、Ｓｐ６、又はＴ３ポリメラーゼによって認識される。さらに別の実施形態では、プロモーター配列がＰｏｌ  Ｉ又はＰｏｌ  ＩＩポリメラーゼによって認識される。あるいは、プロモーター配列は、ＣＭＶなどのウイルスのポリメラーゼによって認識される。ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードする配列は、プラスミドベースのベクター、例えば、ＣＭＶ駆動のプラスミド、Ｔ７駆動のプラスミドや、ウイルスベースのベクター、例えば、ワクチニアベクター、ＭＶＡ−Ｔ７、及び鶏痘ベクターを含めた痘疹ウイルスベクターなどの発現ベクター中において転写制御配列に機能的に連結されるように組換えによって設計製作する。
【０２０３】
ウイルスの効率的な複製及びパッケージングを実現するためには、ポリメラーゼタンパク質の発現レベルが高いことが好ましい。そのようなレベルは、パラミクソウイルスのタンパク質をコードするＬ／ｐＣＩＴＥプラスミド１００〜２００ｎｇ、Ｎ／ｐＣＩＴＥプラスミド２００〜４００ｎｇ、Ｐ／ｐＣＩＴＥプラスミド２００〜４００ｎｇ、及びＭ２−１／ｐＣＩＴＥプラスミド１００〜２００ｎｇを、ＭＶＡ−Ｔ７に感染している細胞にトランスフェクトされている完全長ウイルスｃＤＮＡをコードするプラスミド２〜４μｇと共に使用して得る。別の実施形態では、ｐＳＨ２５（ＣＡＴを発現する）０．１〜２．０μｇ、ｐＲＦ５４２（Ｔ７ポリメラーゼを発現する）０．１〜３．０μｇ、Ｎ  ｃＤＮＡインサートを有するｐＣＩＴＥベクター０．１〜０．８μｇ、並びに、Ｐ、Ｌ、及びＭ２−１  ｃＤＮＡインサートを含有する３つのｐＣＩＴＥベクター各０．１〜１．０μｇを使用する。あるいは、精製されたリボ核タンパク質で細胞をトランスフェクトすることによって、遺伝物質と共に、１つ又は複数のポリメラーゼ及び構造タンパク質を細胞に導入することができる。ＭＰＶウイルスの複製及びパッケージングを許容する宿主細胞が好ましい。好ましい宿主細胞の例には２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ｔＭＫ、及びＢＨＫが含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞の他の例には、ＬＬＣ−ＭＫ−２細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＬＦ１０４３（ＨＥＬ）細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＨＵＴ２９２、ＦＲＨＬ−２（アカゲザル）、ＦＣＬ−ｌ（ミドリザル）、ＷＩ−３８（ヒト）、ＭＲＣ−５の（ヒト）細胞、ＱＴ６細胞、ＱＴ３５細胞、及びＣＥＦ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０４】
本発明の代替的実施形態では、トランスフェクション及び／又は感染の効率、タンパク質発現のレベルを向上させるために、ウイルスの複製及びパッケージングを最適化するために、いくつかの方法を用いて宿主細胞の処理を行うことができる。そのような処理方法には、超音波処理、凍結／解凍、及び熱ショックが含まれるが、これらに限定されない。さらに、限定されるものではないが、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型のトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクチン処理、リポソーム媒介型のトランスフェクション、エレクトロポレーションを含めた、当業者に知られている標準的な技法を使用して、トランスフェクション及び／又は感染プロトコールを最適化することができる。当業者ならば、トランスフェクション／感染プロトコールの最適化に利用可能な標準的な技法にも精通しているであろう。利用可能な技法を限定するのではなく例として挙げれば、使用することのできる方法には、必要なタンパク質の提供にウイルスを使用する際に、トランスフェクションとの比較における感染のタイミングを操作すること、異なるプラスミドのトランスフェクションのタイミングを操作すること、及び、ウイルスとトランスフェクトされたプラスミドとの相対量に影響を与えることが含まれる。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明は、レスキューされるもの以外のウイルスに由来するポリメラーゼを使用して、ｃＤＮＡから生きているウイルスをレスキュー又は生成することに関する。ある実施形態では、限定されるものではないが、種間ポリメラーゼ及び種内ポリメラーゼを含めたいくつかのポリメラーゼのうち任意のものを使用して、ｈＭＰＶをｃＤＮＡからレスキューする。ある実施形態では、ｈＭＰＶ複製に必要な最小限の複製単位を発現する宿主細胞内で、ｈＭＰＶをレスキューする。例えば、限定されるものではないが、ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＭＰＶ、又はＰＩＶのポリメラーゼを含めたいくつかのポリメラーゼを使用して、ｈＭＰＶをｃＤＮＡからレスキューすることができる。本発明の特定の実施形態では、ＲＮＡウイルスのポリメラーゼを使用してｈＭＰＶをレスキューする。本発明のより具体的な実施形態では、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼを使用してｈＭＰＶをレスキューする。本発明のさらに具体的な実施形態では、ＲＳＶポリメラーゼを使用してｈＭＰＶをレスキューする。本発明の別の実施形態では、ＡＰＶポリメラーゼを使用してｈＭＰＶをレスキューする。本発明のさらに別の実施形態では、ＭＰＶポリメラーゼを使用してｈＭＰＶをレスキューする。本発明の別の実施形態では、ＰＩＶポリメラーゼを使用してｈＭＰＶをレスキューする。
【０２０６】
本発明のさらに特定の実施形態では、ｈＭＰＶポリメラーゼタンパク質の複合体を使用して、ｈＭＰＶをｃＤＮＡからレスキューする。例えば、Ｌ、Ｐ、Ｎ、及びＭ２−１タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を使用してｈＭＰＶミニレプリコンをレスキューすることができる。本発明の別の実施形態では、ポリメラーゼ複合体がＬ、Ｐ、及びＮタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態では、限定されるものではないが、ＲＳＶ、ＰＩＶ、及びＡＰＶなどの他のウイルスに由来するポリメラーゼタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を使用してｃＤＮＡからｈＭＰＶをレスキューする。詳細には、ＲＳＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶ、ＭＰＶ、又はこれらの任意の組合せのＬ、Ｐ、Ｎ、及びＭ２−Ｉタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を使用しても、ｈＭＰＶをｃＤＮＡからレスキューすることができる。本発明のさらに別の実施形態では、ｃＤＮＡからｈＭＰＶをレスキューするのに使用されるポリメラーゼ複合体がＲＳＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶ、ＭＰＶ、又はこれらの任意の組合せのＬ、Ｐ、及びＮタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態では、ポリメラーゼ複合体を形成するのに様々なウイルスに由来する異なったポリメラーゼタンパク質を使用することができる。そのような実施形態では、ＲＳＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶ、又はＭＰＶポリメラーゼの異なった構成要素によって、ｈＭＰＶをレスキューするのに使用されるポリメラーゼを形成することができる。複合体を形成する際の可能な組合せを制限としてではなく、例として挙げれば、Ｎタンパク質は、ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ、又はＭＰＶのＮ遺伝子でコードされたものでよく、一方、Ｌタンパク質は、ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ、又はＭＰＶのＬ遺伝子によってコードされたものでよく、そして、Ｐタンパク質は、ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ、又はＭＰＶのＰ遺伝子でコードされたものでよい。当業者ならば、ｃＤＮＡからｈＭＰＶをレスキューするのに必要なポリメラーゼ複合体を形成するのに使用できる可能な組合せを決定することができよう。
【０２０７】
ある実施形態では、頑健でありかつ生産性の高い細胞培養（これは例えば、本発明のウイルスワクチン候補の製造に有益であろう）を生成するのにウイルス増殖の条件を最適化する。重要なパラメータを特定することができ、生産工程は、まず、拡張性、頑健さ、及び再現精度を決定する小規模実験で最適化することができ、後に、ウイルスの大規模生産に適合させることができる。ある実施形態では、本発明の方法を使用して増殖が行われるウイルスがｈＭＰＶである。ある実施形態では、本発明の方法を使用して増殖が行われるウイルスが組換えｈＭＰＶ又はキメラｈＭＰＶである。ある実施形態では、本発明の方法を使用して増殖が行われるウイルスが、以下のウイルス科、すなわち、アデノウイルス科（Adenoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、アストロウイルス科（Astroviridae）、バキュロウイルス科（Baculoviridae）、ブンヤウイルス科（Bunyaviridae）、カリシウイルス科（Caliciviridae）、カウリモウイルス（Caulimovirus）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、シストウイルス科（Cystoviridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ハイポウイルス科（Hypoviridae）、イダエオウイルス（Idaeovirus）、イノウイルス科（Inoviridae）、イリドウイルス科（Iridoviridae）、レビウイルス科（Leviviridae）、リポスリックスウイルス科（Lipothrixviridae）、ルテオウイルス（Luteovirus）、マクロモウイルス（Machlomovirus）、マラフィウイルス（Marafivirus）、ミクロウイルス科（Microviridae）、ミオウイルス科（Myoviridae）、ネクロウイルス（Necrovirus）、ノダウイルス科（Nodaviridae）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、パルチチウイルス科（Partitiviridae）、パルボウイルス科（Parvoviridae）、フィコドナウイルス科（Phycodnaviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、プラズマウイルス科（Plasmaviridae）、ポドウイルス科（Podoviridae）、ポリドナウイルス科（Polydnaviridae）、ポティウイルス科（Potyviridae）、ポックスウイルス科（Poxviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、セキウイルス科（Sequiviridae）、シフォウイルス科（Siphoviridae）、ソベモウイルス（Sobemovirus）、テクチウイルス科（Tectiviridae）、テヌイウイルス（Tenuivirus）、テトラウイルス科（Tetraviridae）、トバモウイルス（Tobamovirus）、トブラウイルス（Tobravirus）、トガウイルス科（Togaviridae）、トムブスウイルス科（Tombusviridae）、トチウイルス科（Totiviridae）、トリコウイルス（Trichovirus）、モノネガウイルス目（Mononegavirales）のうちの１つのウイルスである。ある実施形態では、本発明の方法で増殖が行われるウイルスがＲＮＡウイルスである。ある実施形態では、このウイルスは、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスではない。ある実施形態では、このウイルスは、ＨＳＶではない。
【０２０８】
ある実施形態では、対象のウイルス又はウイルス構築体に感染している細胞培養を、培養される細胞の標準的な培養温度と比較して、それより低い感染後培養温度でインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築体に感染している細胞培養を、３３℃又は約３３℃（例えば、３３±１℃）でインキュベートする。ある実施形態では、感染後培養温度が、約２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、又は３７℃である。
【０２０９】
ある実施形態では、ウイルスに感染させる前に、細胞を細胞の成長に最適化された温度でインキュベートし、細胞をウイルスに感染させた後、すなわち感染後に、温度をさらに低い温度に移行させることによってウイルスの増殖を行う。ある実施形態では、温度移行が少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、又は少なくとも１２℃である。ある実施形態では温度移行が、最大でも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、又は最大でも１２℃である。特定の実施形態では、温度移行が４℃である。
【０２１０】
ある実施形態では、対象のウイルス又はウイルス構築体に感染させる前には、血清を含有する培地中で細胞を培養し、そのウイルス又はウイルス構築体に感染させた後には、無血清の培地中で細胞を培養する。無血清で感染細胞を増殖させることに関するより詳細な記述には、「無血清培地中のウイルスのプラスミドのみの回収」という題のセクションを参照されたい。特定の実施形態では、血清がウシ胎仔血清であり、培養容積の５％、培養容積の２％、又は培養容積の０．５％の濃度で存在する。
【０２１１】
ある実施形態では、ウイルスに感染した細胞を血清の非存在下でインキュベートすることによってウイルスの増殖を行う。ある実施形態では、ウイルスに感染した細胞を、５％未満の血清、２．５％未満の血清、１％未満の血清、０．１％未満の血清、０．０１％未満の血清、又は０．００１％未満の血清を含有している培地中でインキュベートすることによってウイルスの増殖を行う。
【０２１２】
ある実施形態では、ウイルスに感染させる前に、血清を含有している培地中で細胞をインキュベートする。ある実施形態では、細胞をウイルスに感染させた後に、血清の非存在下で細胞をインキュベートする。他の実施形態では、最初に、血清を含有している培地中で細胞をインキュベートし；  次に細胞を無血清の培地に移し；  そしてその後、ウイルスに感染した細胞をウイルスの非存在下でさらにインキュベートする。
【０２１３】
ある実施形態では、細胞から血清含有培地を除去し、そして無血清の培地を添加することによって、血清を含有している培地から血清を含有しない培地に細胞を移行させる。他の実施形態では、細胞を遠心し、血清を含有している培地を除去し、そして無血清の培地を添加する。ある実施形態では、ウイルスに一旦感染した細胞が血清の非存在下でインキュベートされることを確実にするために、細胞を無血清の培地で洗浄する。ある特定のより具体的な実施形態では、細胞を無血清培地で少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、又は少なくとも１０回洗浄する。
【０２１４】
さらに他の実施形態では、ウイルス又はウイルス構築体に感染させる前には、細胞の成長に最適の温度で、血清を含有している培地で細胞を培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、より低い温度（対応するウイルス又はウイルスベクターにとって標準的な培養温度と比較して）で細胞培養をインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築体に感染させる前には、血清を含有している培地中で細胞を３７℃で培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、３３℃又は約３３℃（例えば３３±１℃）で細胞培養をインキュベートする。
【０２１５】
さらに他の実施形態では、ウイルス又はウイルス構築体に感染させる前には、細胞の成長に最適の温度で、血清を含有している培地で細胞を培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、より低い温度（対応するウイルス又はウイルスベクターにとって標準的な培養温度と比較して）で、無血清で細胞培養をインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築体に感染させる前には、血清を含有している培地中で細胞を３７℃で培養し、そして、対象のウイルス構築体に感染させた後には、３３℃又は約３３℃（例えば３３±１℃）で、無血清で細胞培養をインキュベートする。
【０２１６】
本発明のウイルス構築体及び方法は、ウイルスの商業生産、例えばワクチン生産に使用することができる。ワクチンの商業生産では、ワクチンが不活性化ウイルスのみを含有しているか、あるいは感染性ウイルス若しくは混入ウイルス核酸を全く含まないウイルスタンパク質のみを含有しているか、あるいは、病原性に戻らない弱毒化生ワクチンを含有していることが好ましい。また、生産中における外来性物質の導入によるワクチンの汚染も回避するべきである。本発明のワクチンの商業生産には、当技術分野で知られている、ウイルス又はウイルスタンパク質を大規模生産する方法を使用することができる。一実施形態では、本発明のワクチンを商業生産するのに、バイオリアクター又は発酵槽中で細胞を培養する。バイオリアクターは、１リットル未満から１００リットル超までの容積で利用可能であり、例えば、Ｃｙｔｏ３バイオリアクター（Osmonics、Minnetonka, MN）；ＮＢＳバイオリアクター（New Brunswick Scientific、Edison, N.J.）；並びに、B.Braun Biotech International製の実験規模及び商業規模のバイオリアクター（B.Braun Biotech、Melsungen、Germany）がある。別の実施形態では、ウイルスの商業生産の前に小規模のプロセス最適化研究を行い、最適化された条件を選択し、ウイルスの商業生産に使用する。
【０２１７】
無血清培地でのプラスミドレスキュー
本発明のある実施形態では、ヘルパーウイルスなしでウイルスを回収することができる。より詳細には、ウイルスゲノムをコードするプラスミドと、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質をコードするプラスミドとを細胞内に導入することによってウイルスを回収することができる。ある実施形態では、細胞を無血清培地で成長させ、維持する。ある実施形態では、エレクトロポレーションによってプラスミドを細胞内に導入する。特定の実施形態では、ウイルスのアンチゲノムｃＤＮＡをＴ７プロモーターの制御下にコードするプラスミドと、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミドと、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質をそれぞれＴ７プロモーターの制御下にコードするプラスミドとを、エレクトロポレーションでＳＦ  Ｖｅｒｏ細胞の中に導入する。Ｖｅｒｏ細胞は、ＡＴＣＣから入手して、以下のステップ（Ｍｉｋｅ  Ｂｅｒｒｙの研究室で開発された）に従って、無血清培地中で成長するように適合させた。
【０２１８】
１．Ｔ−２５フラスコ内、ＤＭＥＭ＋５％ｖ／ｖＦＢＳ中のＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１バイアルを解凍する、Ｐ１２１；
２．ＤＭＥＭ＋５％ｖ／ｖＦＢＳ中で５代継代培養する、Ｐ１２６；
３．ＦＢＳ生育細胞をＴ−２２５フラスコ中のＯｐｔｉＰＲＯ（Invitrogen Corporation）に直接移す；
４．ＯｐｔｉＰＲＯ中で７代継代培養する；
５．継代数１３３〜７でプレマスター細胞バンク株を凍結させる；
６．ＯｐｔｉＰＲＯ中で４代継代培養する；
７．継代数１３７でマスター細胞バンク株を凍結させる；
８．ＯｐｔｉＰＲＯ中で４代継代培養する；
９．継代数１４１で作業細胞バンク株（Working Cell Bank Stock）を凍結させる；
１０．  解凍させて、エレクトロポレーション及びウイルス増幅用に増殖させる。
【０２１９】
ウイルス粒子をレスキューする方法は、「組換えウイルス粒子のレスキュー」とういう題のセクション５．６に記述する。
【０２２０】
ある実施形態では、ウイルスのレスキューに使用される細胞は、動物又はヒトに由来する成分を添加しなくても生育及び／又は維持できる細胞である。ある実施形態では、ウイルスのレスキューに使用される細胞は、無血清での成長に適合させる細胞である。特定の実施形態では、ＳＦ  Ｖｅｒｏ細胞をウイルスのレスキューに使用する。ある実施形態では、４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ（Invitrogen Corporation）中で、細胞を生育及び／又は維持する。ある実施形態では、血清を添加した培地中で細胞を生育するが、ウイルス粒子のレスキュー用には、細胞を無血清培地中に移す。特定の実施形態では、ウイルスのレスキューが無血清環境で行われることを確実にするために、細胞を無血清培地で洗浄する。
【０２２１】
細胞内へのプラスミドの導入は、その細胞で使用することができる、当業者に知られている方法のうち任意のものによって、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、又はリポソーム媒介型のトランスフェクションによって行われる（Short Protocols in Molecular Biology、1999、Ausubel他編、John Wiley & Sons, Inc.、Chapter 9を参照）。特定の実施形態では、細胞内にプラスミドＤＮＡを導入するのにエレクトロポレーションを使用する。ＳＦ  Ｖｅｒｏ細胞は、リポフェクションに対して抵抗性を有する。必要なプラスミドでトランスフェクトされた細胞を選択するために、プラスミドは特定のマーカーを保持することもできる。そのようなマーカーには、限定されるものではないが、特定の抗生物質（例えば、カナマイシン、ブラストサイジン、アンピシリン、ハイグロマイシンＢ、プロマイシン、及びゼオシン（商標））に対する耐性、特定の独立栄養特性を、マーカーなしではこの特性を持たない細胞に付与するマーカーが含まれ、あるいは、マーカーは、細胞の成長に必要であるが、プラスミドが導入される細胞では変異している遺伝子でもよい。
【０２２２】
ウイルスゲノム及び／又はウイルス遺伝子の転写は、プロモーターによる転写制御を受ける。したがって、ウイルスゲノム又はウイルスタンパク質をコードする配列はプロモーター配列に機能的に連結される。本発明の方法では、当業者に知られている任意のプロモーター／ＲＮＡポリメラーゼ系を使用することができる。ある実施形態では、プロモーターが、その細胞の内在的なＲＮＡポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）やＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）など、細胞性のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列でありうる。ある実施形態では、プロモーターが誘導性のプロモーターでありうる。ある実施形態では、プロモーターが、その細胞に内在しないＲＮＡポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーターでありうる。ある特定のより具体的な実施形態では、プロモーターがＴ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、又はＣＭＶプロモーターである。使用されるプロモーターのタイプに応じて、そのプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドも、適切なＲＮＡポリメラーゼを提供するために、細胞内に導入する。特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、又はＣＭＶ  ＲＮＡポリメラーゼである。特定の実施形態では、ウイルス遺伝子及びウイルスゲノムの転写がＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを提供するためにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするプラスミドを導入する。ポリメラーゼの転写は、使用される細胞型で機能する任意のプロモーター系の制御下に置くことができる。特定の実施形態では、ＣＭＶプロモーターを使用する。
【０２２３】
ウイルスゲノムの方向はプラスでもマイナスでもよい。したがって、ウイルスゲノムを遺伝物質から転写させることによって、ウイルスゲノムのプラスセンスコピー（アンチゲノムコピー）又はウイルスゲノムのマイナスセンスコピー（ゲノムコピー）のいずれかを生成させることができる。ある実施形態では、ウイルスゲノムが、本発明の組換えの、キメラの、かつ／又は弱毒化されたウイルスである。ある実施形態では、ウイルスゲノムが六量体長である場合に、ウイルスの複製及びレスキューの効率が促進されることがある。ウイルスゲノムが適切な長さのものであることを確実にするために、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、又はリボザイム触媒能を保持したそれらの断片を含めたリボザイム配列を使用して、５’末端又は３’末端を決定することができる。
【０２２４】
ある実施形態では、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質に、Ｎ、Ｐ、及びＬ遺伝子が含まれる。ある特定のより具体的な実施形態では、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質に、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１、及びＬ遺伝子が含まれる。
【０２２５】
５．７  組換えウイルスの弱毒化
本発明の組換えウイルスはさらに、弱毒化表現型を示すよう遺伝子組換えを行うことができる。特に本発明の組換えウイルスは、ウイルスがワクチンとして投与される被験体において、弱毒化表現型を示す。弱毒化は、当業者に知られている任意の方法によって実現することができる。理論に拘泥するものではないが、組換えウイルスの弱毒化表現型は、例えば意図される宿主において自然な状態では十分に複製されないウイルスを使用する（例えばヒトにおけるＡＰＶを使用する）ことによって、また、野生型のウイルス株に比べ、ウイルスゲノムの複製を減少させることによって、ウイルスが宿主細胞に感染する能力を低下させることによって、又はウイルスタンパク質が感染性ウイルス粒子に構成する能力を低下させることによって、引き起こすことができる。リーダー配列やトレーラー配列など、ウイルスのある配列の生存能力は、ミニゲノムアッセイを使用して試験することができる（セクション５．８参照）。
【０２２６】
本発明の組換えウイルスの弱毒化表現型は、当業者に知られている任意の方法によって試験することができる（例えばセクション５．８参照）。例えば候補ウイルスは、それが宿主に感染できるかどうかについて、又は細胞培養系での複製速度について試験することができる。ある実施形態では、変化した遺伝子がＮ、Ｐ、Ｌ、Ｍ２、Ｆ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、又はこれらの組合せである場合、ミニゲノム系を使用して弱毒化ウイルスの試験をする。ある実施形態では、種々の温度での増殖曲線を使用して、ウイルスの弱毒化表現型について試験をする。例えば弱毒化ウイルスは３５℃で増殖することができるが、３９℃又は４０℃では増殖することができない。ある実施形態では、種々の細胞系を使用して、ウイルスの弱毒化表現型を評価することができる。例えば弱毒化ウイルスは、サルの細胞系で増殖することができるだけでヒト細胞系では増殖することができず、又は種々の細胞系で実現可能なウイルス力価は、弱毒化ウイルスによって異なる。ある実施形態で、ハムスター、コットンラット、マウス、及びモルモットを含むがこれらに限定されない小動物モデルの気道におけるウイルス複製は、ウイルスの弱毒化表現型を評価するのに使用される。その他の実施形態では、抗体力価（例えばプラーク減少中和アッセイ又はＥＬＩＳＡによってアッセイされる）を含むがこれに限定されないウイルスによって誘発される免疫応答が、ウイルスの弱毒化表現型を評価するのに使用される。特定に実施形態では、プラーク減少中和アッセイ又はＥＬＩＳＡを低用量で実施する。ある実施形態では、組換えウイルスが動物モデルにおいて病理学的症状を誘発させる能力に関し、試験をすることができる。動物モデルにおいて、ウイルスが病理学的症状を誘発させる能力が低下することは、弱毒化表現型であることを示している。特定の実施形態では、候補ウイルスを、粘膜産生によって示される鼻感染に関してサルのモデルで試験する。
【０２２７】
本発明のウイルスは、ウイルスの機能的特徴の１つ又は複数が損なわれるよう弱毒化することができる。ある実施形態において、弱毒化は、弱毒化ウイルスが得られる野生型のウイルス株と比較して測定される。その他の実施形態において、弱毒化は、異なる宿主系での弱毒化ウイルスの増殖と比較することによって決定される。したがって非限定的な例で、ヒト宿主におけるＡＰＶの増殖がトリ宿主におけるＡＰＶの増殖に比べて減少している場合、ＡＰＶは、ヒト宿主で増殖させた場合に弱毒化すると言える。
【０２２８】
ある実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは宿主に感染することができ、感染性ウイルス粒子が産生されるように宿主内で複製することができる。しかし野生型の株と比較すると、弱毒化した株はより低い力価に増殖し、又はよりゆっくりと増殖する。弱毒化ウイルスの増殖曲線を決定し、それを野生型ウイルスの増殖曲線と比較するには、当業者に知られている任意の技法を使用することができる。例示的な方法に関しては、以下の実施例のセクションを参照されたい。特定の実施形態において、弱毒化ウイルスは、例えば実施例２２で述べる条件下、Ｖｅｒｏ細胞内で１０５ｐｆｕ／ｍｌ未満、１０４ｐｆｕ／ｍｌ未満、１０３ｐｆｕ／ｍｌ未満、又は１０２ｐｆｕ／ｍｌ未満の力価まで増殖する。
【０２２９】
ある実施形態において、本発明の弱毒化ウイルス（例えばキメラ哺乳動物ＭＰＶ）はヒト細胞内で複製することができないが、野生型ウイルス（例えば野生型哺乳動物ＭＰＶ）は複製することができる。しかし弱毒化ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞などインターフェロン機能に欠けている細胞系内では、十分に複製することができる。
【０２３０】
その他の実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは、宿主に感染することができ、宿主内で複製することができ、本発明のウイルスのタンパク質を細胞質膜に挿入することができるが、弱毒化ウイルスは、宿主に新たな感染性ウイルス粒子を産生させることができない。ある実施形態において、弱毒化ウイルスは、野生型哺乳動物ウイルスと同じ効率で、宿主に感染し、宿主内で複製し、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入することができる。その他の実施形態において、弱毒化ウイルスがウイルスタンパク質を宿主細胞内の細胞質膜に挿入する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。ある実施形態において、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主内で複製する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。当業者に知られる任意の技法を使用して、ウイルスが哺乳動物細胞に感染できるかどうか、宿主内で複製できるかどうか、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入できるかどうかを決定することができる。例示的な方法に関してはセクション５．８を参照されたい。
【０２３１】
ある実施形態において、本発明の弱毒化ウイルスは、宿主に感染することができる。しかし野生型哺乳動物ＭＰＶとは対照的に、弱毒化哺乳動物ＭＰＶは、宿主内で複製することができない。特定の実施形態において、弱毒化哺乳動物ウイルスは宿主に感染することができ、その宿主によってウイルスタンパク質をその細胞質膜に挿入することができるが、弱毒化ウイルスは宿主内で複製することができない。弱毒化哺乳動物ＭＰＶが宿主に感染したがどうか、さらにその宿主によってウイルスタンパク質がその細胞質膜に挿入されたかどうか、当業者に知られている任意の方法を使用して試験することができる。
【０２３２】
ある実施形態において、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主に感染する能力は、同じ宿主に野生型ウイルスが感染する能力に比べて低下している。当業者に知られている任意の技法を使用して、ウイルスが宿主に感染可能かどうか決定することができる。例示的な方法に関してはセクション５．８を参照されたい。
【０２３３】
ある実施形態においては、変異（例えばミスセンス変異）をウイルスゲノムに導入して、弱毒化表現型を持つウイルスを生成する。変異（例えばミスセンス変異）は、組換えウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、又はＬ遺伝子に導入することができる。変異は、付加、置換、欠失、又はこれらの組合せでよい。特定の実施形態においては、Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、又はＭ２タンパク質に対して単一のアミノ酸欠失変異を導入し、これを、ミニゲノムアッセイ系で機能性に関してスクリーニングすることができ、ウイルス内で予測される機能性に関して評価することができる。より具体的な実施形態において、ミスセンス変異は低温感受性変異である。その他の実施形態において、ミスセンス変異は熱感受性変異である。一実施形態において、ウイルスのＰタンパク質の主なリン酸化部位は除去される。別の実施形態においては、１つ又は複数の変異がウイルスのＬ遺伝子に導入されて、温度感受性株を生成する。さらに別の実施形態において、Ｆ遺伝子の切断部位は、切断が生じないように又は切断が非常に低い効率で生じるように変異する。特定のより具体的な実施形態において、ｈＭＰＶのＦタンパク質のアミノ酸第９９〜１０２位にアミノ酸配列ＲＱＳＲを有するモチーフを変異する（図９参照）。変異は、限定されるものではないが、１以上のアミノ酸の欠失、１以上のアミノ酸の付加、１以上のアミノ酸の置換（保存若しくは非保存置換）、又はそれらの組合せでありうる。ｈＭＰＶのいくつかの株では、切断部位がＲＱＰＲである（実施例「Ｐ１０１Ｓ」参照）。特定の実施形態において、アミノ酸配列内の切断部位はＲＱＰＲが変異されている。より具体的な実施形態において、ｈＭＰＶのＦタンパク質の切断部位は、ｈＭＰＶの感染性が低減するように変異される。特定の実施形態において、ｈＭＰＶの感染性は、少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５又は少なくとも１０６分の１に低減される。特定の実施形態において、ｈＭＰＶの感染性は、最大５、１０、５０、１００、５００、１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５又は最大１０６分の１に低減される。
【０２３４】
その他の実施形態においては、組換えウイルスのゲノムに欠失を導入する。さらに具体的な実施形態においては、組換えウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、又はＬ遺伝子に欠失を導入する。特定の実施形態において、欠失は、本発明の組換えウイルスのＭ２遺伝子にある。その他の具体的な実施形態において、欠失は、本発明の組換えウイルスのＳＨ遺伝子にある。さらに別の具体的な実施形態においては、Ｍ２遺伝子とＳＨ遺伝子の両方が欠失している。
【０２３５】
ある実施形態においては、組換えウイルスの遺伝子間領域が変化している。一実施形態においては、遺伝子間領域の長さが変化している。別の実施形態においては、遺伝子間領域が、ウイルスゲノムの５’末端から３’末端まで組み替えられている。
【０２３６】
その他の実施形態においては、組換えウイルスの１つ又は複数の遺伝子のゲノム位置が変化している。一実施形態においては、Ｆ又はＧ遺伝子が、ゲノムの３’末端に移動している。別の実施形態においては、Ｎ遺伝子がゲノムの５’末端に移動している。
【０２３７】
ある実施形態において、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスの遺伝子を異なる種（例えば、ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ３若しくはマウスニューモウイルス）、異なるサブグループ、又は異なる種のウイルスの類似遺伝子に代えることによって実現される。例示的な実施形態においては、哺乳動物ＭＰＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、又はＬ遺伝子を、それぞれＡＰＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、又はＬ遺伝子に代える。その他の例示的な実施形態においては、ＡＰＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、又はＬ遺伝子を、それぞれ哺乳動物ＭＰＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、又はＬ遺伝子に代える。好ましい実施形態において、ウイルスの弱毒化は、１つ又は複数のポリメラーゼ関連遺伝子（例えばＮ、Ｐ、Ｌ、又はＭ２）を異なる種のウイルスの遺伝子に代えることで実現される。
【０２３８】
ある実施形態において、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスタンパク質の１つ又は複数の特定のドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質から得られたドメインに代えることによって実現される。例示的な実施形態においては、ＡＰＶのＦタンパク質の外部ドメインを、哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質の外部ドメインに代える。好ましい実施形態においては、Ｌ、Ｎ、又はＰタンパク質の１つ又は複数の特定ドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質から得られたドメインに代える。その他のある実施形態において、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスのタンパク質の１つ又は複数の特定ドメインを欠失させることによって実現される。特定の実施形態においては、Ｆタンパク質の膜貫通ドメインを欠失させる。
【０２３９】
本発明のある実施形態においては、本発明の組換えウイルスのリーダー配列及び／又はトレーラー配列を改変することによって、弱毒化表現型を実現することができる。より具体的なある実施形態においては、リーダー及び／又はトレーラー配列の長さを、野生型ウイルスよりも少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、又は少なくとも６ヌクレオチドだけ短くする。その他のより具体的なある実施形態においては、組換えウイルスのリーダー及び／又はトレーラー配列を変異させる。特定の実施形態において、リーダー配列とトレーラー配列は、互いに１００％相補的である。その他の実施形態において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、又は１０ヌクレオチドは互いに相補的ではなく、リーダー及びトレーラー配列の残りのヌクレオチドは互いに相補的である。ある実施形態において、非相補的ヌクレオチドは互いに同一である。その他のある実施形態において、非相補的ヌクレオチドは互いに異なっている。その他の実施形態においては、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがプリンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。その他の実施形態においては、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがピリミジンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。特定の実施形態において、本発明の組換えウイルスのリーダー及び／又はトレーラー配列は、別のウイルスのリーダー及び／又はトレーラー配列と、例えばＲＳＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ３、マウスニューモウイルスのリーダー及び／又はトレーラー配列と、又は組換えウイルスのタンパク質コード部分が由来するヒトメタニューモウイルスとは異なるサブグループ又は変異体のヒトメタニューモウイルスのリーダー及び／又はトレーラー配列と、置換しうる。
【０２４０】
弱毒化生ワクチンを使用する場合、その安全性についても考慮しなければならない。ワクチンは、疾患を引き起こしてはならない。本発明では、ワクチンを安全なものにすることができる当技術分野で知られている任意の技法を使用することができる。弱毒化技法に加え、その他の技法を使用することができる。１つの非限定的な例は、ウイルス粒子膜に組み込むことができない可溶性の異種遺伝子を使用することである。例えば、可溶性のＲＳＶ  Ｆ遺伝子の単一のコピー、すなわち膜貫通及びサイトゾルドメインが欠けているＲＳＶ遺伝子変種を、使用することができる。ウイルス粒子膜に組み込むことができないので、ウイルスの屈性の変化が期待されない。
【０２４１】
ワクチンの安全性について試験をするには、様々なアッセイを使用することができる。以下のセクション５．８を参照されたい。特に、ショ糖勾配アッセイと中和アッセイを使用して、安全性を試験することができる。異種タンパク質がウイルス粒子に挿入されるかどうかを決定するには、ショ糖勾配アッセイを使用することができる。異種タンパク質がウイルス粒子に挿入される場合、そのウイルス粒子は、親株が症状を引き起こさない場合であっても症状を引き起こすことができるかどうかについて、試験をすべきである。理論に拘泥するものではないが、異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれる場合、ウイルスは、獲得された新しい、おそらくは病理学的性質を有する可能性がある。
【０２４２】
特定の実施形態において、１以上の遺伝子がｈＭＰＶゲノムから削除されて弱毒化ウイルスが生成される。より具体的な実施形態において、Ｍ２−２  ＯＲＦ、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子及び／又はＧ２遺伝子が削除される。
【０２４３】
他の実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をウイルス複製に関与する遺伝子に導入して、弱毒化ウイルスを生成する。より具体的な実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をＮ、Ｌ又はＰ遺伝子に導入する。特定の具体的な実施形態において、以下の１以上のアミノ酸を組換えｈＭＰＶのＬ遺伝子において変異させて、弱毒化ウイルスを生成する：アミノ酸４５６位のＰｈｅ、アミノ酸７４９位のＧｌｕ、アミノ酸１２４６位のＴｙｒ、アミノ酸１０９４位のＭｅｔ、及びアミノ酸７４６位のＬｙｓ。変異は、例えばアミノ酸の欠失又は置換でありうる。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよいし又は非保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的アミノ酸交換の具体例は、アミノ酸側鎖の構造的及び／又は機能的性質を維持するアミノ酸置換であり、例えば芳香族アミノ酸を別の芳香族アミノ酸で置換し、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換し、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換し、脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置換する。一方、非保存的アミノ酸交換の例は、アミノ酸側鎖の構造的及び／又は機能的性質を維持しないアミノ酸置換であり、例えば、芳香族アミノ酸を塩基性、酸性又は脂肪族アミノ酸で置換し、酸性アミノ酸を芳香族、塩基性又は脂肪族アミノ酸で置換し、塩基性アミノ酸を酸性、芳香族又は脂肪族アミノ酸で置換し、脂肪族アミノ酸を芳香族、酸性又は塩基性アミノ酸で置換する。さらにより具体的な実施形態において、アミノ酸４５６位のＰｈｅをＬｅｕで置換する。
【０２４４】
特定の実施形態において、１つの核酸を、１つのアミノ酸交換をコードするように置換する。他の実施形態において、２又は３つの核酸を１つのアミノ酸交換をコードするように置換する。２又は３つの核酸を置換して、野生型タンパク質配列に復帰するリスクを低減することが好ましい。
【０２４５】
他の実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をウイルス構築に関与する遺伝子に導入して、弱毒化ウイルスを生成する。より具体的な実施形態において、小さな単一アミノ酸欠失をＭ遺伝子又はＭ２遺伝子に導入する。好ましい実施形態において、Ｍ遺伝子を変異させる。
【０２４６】
さらに他の実施形態において、ウイルスゲノムにおける遺伝子の順序を野生型ウイルスの遺伝子順序と変化させて、弱毒化ウイルスを生成する。より具体的な実施形態において、Ｆ、ＳＨ及び／又はＧ遺伝子をウイルスゲノムの３’末端に移動する。別の実施形態において、Ｎ遺伝子をウイルスゲノムの５’末端に移動する。
【０２４７】
他の実施形態において、１以上の遺伝子開始部位（遺伝子開始部位の位置については、例えば表８参照）を、変異させるか、あるいは別のウイルス（例えばＲＳＶ、ＰＩＶ３、ＡＰＶ若しくはマウスニューモウイルス）の、又は組換えウイルスのタンパク質コード部分が由来するヒトメタニューモウイルスとは異なるヒトメタニューモウイルスのサブグループ若しくは変種の、類似の遺伝子開始部位と置換する。より具体的な実施形態において、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子及び／又はＬ遺伝子の遺伝子開始部位を変異させる、あるいは別のウイルス（例えばＲＳＶ、ＰＩＶ３、ＡＰＶ若しくはマウスニューモウイルス）の、又は組換えウイルスのタンパク質コード部分が由来するヒトメタニューモウイルスのとは異なるヒトメタニューモウイルスのサブグループ若しくは変種の、それぞれのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子及び／又はＬ遺伝子の遺伝子開始部位と置換する。
【０２４８】
５．７．１  ウイルス遺伝子の置換による弱毒化
本発明の特定の実施形態において、弱毒化は、ウイルスの１以上の遺伝子を、異なるウイルス、異なる株又は異なる分離体の類似遺伝子と置換することにより達成する。特定の実施形態において、メタニューモウイルス、例えばｈＭＰＶ又はＡＰＶなどの哺乳動物メタニューモウイルスの１以上の遺伝子を、別のパラミクソウイルスの類似遺伝子と置換する。より具体的な実施形態において、哺乳動物メタニューモウイルス（例えばｈＭＰＶ）のＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２−２  ＯＲＦ、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子若しくはＬ遺伝子、又はこれらの２つ以上の遺伝子の任意の組合せを、他のウイルス種、株又は分離体の類似遺伝子と交換し、ここで別のウイルス種は、例えば限定されるものではないが、別の哺乳動物メタニューモウイルス、ＡＰＶ又はＲＳＶでありうる。
【０２４９】
より具体的な実施形態において、ヒトメタニューモウイルスの１以上の遺伝子をヒトメタニューモウイルスの別の分離株の類似遺伝子と置換する。例えば、分離株ＮＬ／１／９９（９９−１）、ＮＬ／１／００（００−１）、ＮＬ／１７／００又はＮＬ／１／９４のＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２−２  ＯＲＦ、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子若しくはＬ遺伝子、又はこれらの２以上の遺伝子の任意の組合せを、異なる分離株、例えばＮＬ／１／９９（９９−１）、ＮＬ／１／００（００−１）、ＮＬ／１７／００又はＮＬ／１／９４の類似遺伝子又は遺伝子の組合せ、すなわちＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２−２  ＯＲＦ、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子若しくはＬ遺伝子と置換する。
【０２５０】
特定の実施形態において、ウイルスのゲノムの１以上の領域を、異なるウイルス種、株又は分離体のゲノムに由来する類似領域と置換する。特定の実施形態において、領域は、ウイルスゲノムのコード領域内の領域である。他の実施形態において、領域は、ウイルスゲノムの非コード領域内の領域である。特定の実施形態において、２つのウイルスの２つの領域は、その２つの領域が２つのウイルスにおいて同じ又は類似の機能を担う場合には、互いに類似している。特定の他の実施形態において、２つのウイルスの２つの領域は、その２つの領域が２つのウイルスにおいて同じ又は類似の構造エレメントを提供する場合に類似している。より具体的な実施形態において、２つの領域は、２つのウイルスにおいて類似するタンパク質ドメインをコードしている場合に類似しており、類似するタンパク質ドメインは、同じ又は類似の機能及び／又は機能を有するドメインである。
【０２５１】
特定の実施形態において、メタニューモウイルス、例えばｈＭＰＶ又はＡＰＶなどの哺乳動物メタニューモウイルスのゲノムの１以上の領域を別のパラミクソウイルスのゲノムの類似領域と置換する。特定の実施形態において、パラミクソウイルスのゲノムの１以上の領域を、哺乳動物メタニューモウイルス（例えばｈＭＰＶ又はＡＰＶ）のゲノムの類似領域と置換する。より具体的な実施形態において、哺乳動物メタニューモウイルス（例えばｈＭＰＶ）のＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２−２  ＯＲＦ、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子若しくはＬ遺伝子の領域、又はこれらの遺伝子の２以上の領域の任意の組合せを、別のウイルス種、株、又は分離体の類似領域と置換する。別のウイルス種としては、限定されるものではないが、別の哺乳動物メタニューモウイルス、ＡＰＶ又はＲＳＶが挙げられる。
【０２５２】
より具体的な実施形態において、ヒトメタニューモウイルスの１以上の領域をヒトメタニューモウイルスの別の分離株の類似領域と置換する。例えば、分離株ＮＬ／１／９９（９９−１）、ＮＬ／１／００（００−１）、ＮＬ／１７／００又はＮＬ／１／９４のＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、Ｍ２−１  ＯＲＦ、Ｍ２−２  ＯＲＦ、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子若しくはＬ遺伝子の１以上の領域、又は２以上の領域の任意の組合せを、ｈＭＰＶの異なる分離株、例えばＮＬ／１／９９（９９−１）、ＮＬ／１／００（００−１）、ＮＬ／１７／００又はＮＬ／１／９４の類似領域と置換する。
【０２５３】
特定の実施形態において、領域は、少なくとも５ヌクレオチド（ｎｔ）長、少なくとも１０ｎｔ長、少なくとも２５ｎｔ長、少なくとも５０ｎｔ長、少なくとも７５ｎｔ長、少なくとも１００ｎｔ長、少なくとも２５０ｎｔ長、少なくとも５００ｎｔ長、少なくとも７５０ｎｔ長、少なくとも１ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、又は少なくとも５ｋｂ長である。特定の実施形態において、領域は、最大５ヌクレオチド（ｎｔ）長、最大１０ｎｔ長、最大２５ｎｔ長、最大５０ｎｔ長、最大７５ｎｔ長、最大１００ｎｔ長、最大２５０ｎｔ長、最大５００ｎｔ長、最大７５０ｎｔ長、最大１ｋｂ、最大１．５ｋｂ、最大２ｋｂ、最大２．５ｋｂ、最大３ｋｂ、最大４ｋｂ、又は最大５ｋｂ長である。
【０２５４】
５．８  本発明と共に使用されるアッセイ
細胞培養系、動物モデル系、又は被験体におけるキメラ又は組換えウイルスの増殖速度を決定するために、本発明においていくつかのアッセイを用いることができる。キメラ及び組換えウイルスがウイルス粒子の感染、複製、又はパッケージングを行う要件を決定するために、本発明によるいくつかのアッセイを用いることもできる。
【０２５５】
本明細書で述べるアッセイは、経時的なウイルス力価をアッセイしてウイルスの増殖特性を決定するのに使用することができる。特定の実施形態において、ウイルス力価は、感染した細胞又は感染した被験体からサンプルを得、そのサンプルの連続希釈液を調製し、単一のプラークを出現させるウイルスの希釈度でウイルスに感染しやすい細胞の単層に感染させることによって決定される。次いでこのプラークをカウントし、ウイルス力価を、サンプル１ミリリットル当たりのプラーク形成単位として表すことができる。本発明の特定の実施形態において、被験体における本発明のウイルスの増殖速度は、被験体内のウイルスに対する抗体の力価によって評価される。理論に拘泥するものではないが、被験体の抗体力価は、被験体におけるウイルス力価だけではなく抗原性も反映している。ウイルスの抗原性が一定である場合、被験体内での抗体力価の増大を使用して、被験体におけるウイルスの増殖曲線を求めることができる。好ましい実施形態において、動物又はヒトにおけるウイルスの増殖曲線は、感染後の複数の時点での宿主の生物学的流体をサンプリングし、ウイルス力価を測定することによって、最良に試験される。
【０２５６】
細胞培養系又は被験体での異種遺伝子配列の発現は、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。ある実施形態においては、異種遺伝子の発現は、転写物のレベルを定量することにより測定する。転写物のレベルは、転写物に特異的なプローブ又はプライマーをそれぞれ使用するノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲによって、測定することができる。ウイルスはアンチセンス方向にあり、一方、転写物はセンス方向にあるので、転写物はウイルスのゲノムと区別することができる。ある実施形態において、異種遺伝子の発現は、異種遺伝子のタンパク質産物のレベルを定量することによって測定される。タンパク質のレベルは、タンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット分析によって、測定することができる。
【０２５７】
特定の実施形態においては、異種遺伝子にペプチドタグを付ける。ペプチドタグは、このペプチドタグに対する抗体を使用して検出することができる。検出されたペプチドタグのレベルは、異種遺伝子から発現したタンパク質のレベルを表している。あるいは異種遺伝子から発現したタンパク質は、ペプチドダグによって単離することができる。精製したタンパク質の量は、異種遺伝子の発現レベルと相関している。そのようなペプチドタグと、そのようなペプチドタグに融合したタンパク質を単離する方法は、当技術分野で周知である。免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Petty、1996、Metal-chelate affinity chromatography、Current Protocols in Molecular Biology、第1〜3巻(1994〜1998)、Ausubel,F.M.、Brent,R.、Kunston,R.E.、Moore,D.D.、Seidman,J.G.、Smith,J.A.、及びStruhl,K.編、John Wiley and Sons,Inc.、USA、Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience発行）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ；Smith、1993、Methods Mol.Cell Bio. 4:220〜229）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Guan他、1987、Gene 67:21〜30）、様々なセルロース結合ドメイン（米国特許第５，４９６，９３４；  第５，２０２，２４７号；第５，１３７，８１９号；Tomme他、1994、Protein Eng. 7:117〜123）、ＦＬＡＧエピトープ（Short Protocols in Molecuar Biology、1999、Ausubel他編、John Wiley&Sons,Inc.、Unit 10.11）などであるがこれらに限定することのない異種遺伝子の修飾には、当技術分野で知られている様々なペプチドタグを使用することができる。その他のエピトープタグは、特異的な結合パートナーによって認識され、したがって、好ましくは固定化されかつ／又は固体支持体上にある結合パートナーへの親和性結合により、単離が促進される。当業者に理解されるように、上記ペプチドダグのコード領域を得るために、ＤＮＡクローニング、ＤＮＡ増幅、及び合成方法を含むがこれらに限定することのない数多くの方法を使用することができる。ペプチドタグのいくつか及びそれらを検出し単離するための試薬は市販されている。
【０２５８】
被験体由来のサンプルは、当業者に知られている任意の方法によって得ることができる。ある実施形態において、サンプルは、鼻吸引液、咽頭スワブ、痰、又は気管支肺胞洗浄液からなる。
【０２５９】
５．８．１  ミニレプリコン構築
ｃＤＮＡからの生ウイルスの作製は、ｈＭＰＶを特性決定する手段と、弱毒化ワクチン及び免疫原性化合物の作製のための手段を提供する。この目的を達成するため、レポーター遺伝子を含有するｖＲＮＡをコードするｃＤＮＡ及びミニレプリコンは、ウイルスをレスキューするため、そしてまたＲＮＡの増幅、発現及びビリオンへの組込みに関与するヌクレオチド配列及びタンパク質を同定するために用いることができる。当業者に知られている任意のレポーター遺伝子を本発明で使用することができる（セクション５．８．２参照）。例えば、使用しうるレポーター遺伝子としては、限定されるものではないが、ＧＦＰ、ＨＲＰ、ＬＵＣ及びＡＰをコードする遺伝子が挙げられる（レポーターの例のさらなるリストについてはセクション５．８．２も参照のこと）。一つの特定の実施形態において、使用するレポーター遺伝子はＣＡＴをコードする。本発明の別の特定の実施形態において、レポーター遺伝子はリーダー配列とトレーラー配列に挟まれている。レポーター遺伝子と隣接して配置するために使用しうるリーダー及びトレーラー配列は、任意のマイナスセンスイルス、例えば限定されるものではないが、ＭＰＶ、ＲＳＶ、及びＡＰＶのものである。例えば、レポーター遺伝子は、肝炎デルタリボザイム（Ｈｅｐ−ｄ  Ｒｉｂｏ）及びＴ７ポリメラーゼ終結（Ｔ−Ｔ７）シグナルに結合しているマイナスセンスｈＭＰＶ又はＡＰＶリーダーと、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの後に続くｈＭＰＶ又はＡＰＶトレーラー配列によって挟むことができる。
【０２６０】
ある実施形態においては、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。宿主細胞は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子、及びＭ２．１遺伝子を発現する。ある実施形態においては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子、及びＭ２．１遺伝子をコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。その他の実施形態においては、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、その宿主細胞にヘルパーウイルスを感染させる。
【０２６１】
ｈＭＰＶミニレプリコンは、いくつかのポリメラーゼ、例えば限定されるものではないが、種内及び種間ポリメラーゼを用いてレスキューしうる。特定の実施形態において、ｈＭＰＶミニレプリコンは、ｈＭＰＶ複製に必要な最小複製単位を発現する宿主細胞においてレスキューする。例えば、ｈＭＰＶは、いくつかのポリメラーゼ、例えば限定されるものではないが、ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＭＰＶ又はＰＩＶのポリメラーゼを用いてｃＤＮＡからレスキューしうる。本発明の特定の実施形態において、ｈＭＰＶは、ＲＮＡウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のより具体的な実施形態において、ｈＭＰＶはマイナス鎖ＲＮＡウイルスのポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のさらにより具体的な実施形態において、ｈＭＰＶはＲＳＶポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の別の実施形態において、ｈＭＰＶはＡＰＶポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明のさらに別の実施形態において、ｈＭＰＶはＭＰＶポリメラーゼを用いてレスキューする。本発明の別の実施形態において、ｈＭＰＶはＰＩＶポリメラーゼを用いてレスキューする。
【０２６２】
本発明の別の実施形態において、ｈＭＰＶは、ｈＭＰＶポリメラーゼタンパク質の複合体を用いてｃＤＮＡからレスキューする。例えば、ｈＭＰＶミニレプリコンは、Ｌ、Ｐ、Ｎ及びＭ２−１タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューしうる。本発明の別の実施形態において、ポリメラーゼ複合体は、Ｌ、Ｐ、及びＮタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態において、ｈＭＰＶミニレプリコンは、他のウイルス、例えば限定されるものではないがＲＳＶ、ＰＩＶ及びＡＰＶに由来するポリメラーゼタンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューしうる。特に、ｈＭＰＶミニレプリコンは、ＲＳＶ、ＰＩＶ又はＡＰＶのＬ、Ｐ、Ｎ及びＭ２−１タンパク質からなるポリメラーゼ複合体を用いてレスキューしうる。本発明のまた別の実施形態において、ｈＭＰＶミニレプリコンをレスキューするために使用するポリメラーゼ複合体は、ＲＳＶ、ＰＩＶ又はＡＰＶのＬ、Ｐ、及びＮタンパク質からなる。本発明のさらに別の実施形態において、種々のウイルス由来の種々のポリメラーゼタンパク質を用いて、ポリメラーゼ複合体を形成してもよい。そのような実施形態において、ｈＭＰＶミニレプリコンをレスキューするために用いるポリメラーゼは、ＲＳＶ、ＰＩＶ又はＡＰＶポリメラーゼの種々の構成要素により形成されうる。例えば、可能性ある組合せを限定するものではないが、複合体の形成においては、Ｎタンパク質はＲＳＶ、ＡＰＶ又はＰＩＶのＮ遺伝子によりコードされ得、それに対してＬタンパク質はＲＳＶ、ＡＰＶ又はＰＩＶのＬ遺伝子によりコードされ得、Ｐタンパク質はＲＳＶ、ＡＰＶ又はＰＩＶのＰ遺伝子によりコードされ得る。当業者であれば、ｈＭＰＶミニレプリコンをレスキューするために必要なポリメラーゼ複合体を形成するために用いることができる組合せの可能性を決定することができるだろう。ミニレプリコン系において、レポーター遺伝子の発現を測定して、ウイルスのレスキューの成功を確認し、そしてまたウイルスの特性を決定することができる。レポーター遺伝子の発現レベル及び／又はその活性は、セクション５．８．２に記載されている方法などであるがこれらに限定することのない、当業者に知られている任意の方法によってアッセイすることができる。
【０２６３】
より具体的なある実施形態において、ミニレプリコンは、以下のエレメント、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ、リーダー配列、遺伝子開始点、ＧＦＰ、トレーラー配列、肝炎デルタリボザイム配列又はＲＮＡポリメラーゼＩ終結配列を、列挙した順番で含む。Ｔ７をＲＮＡポリメラーゼとして使用する場合、肝炎デルタリボザイム配列は終結配列として使用すべきである。ＲＮＡポリメラーゼＩを使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼＩ終結配列は、終結シグナルとして使用することができる。レスキュー系に応じて、ミニレプリコンの配列をセンス方向又はアンチセンス方向にすることができる。ある実施形態においては、リーダー配列をｈＭＰＶの野生型リーダー配列に対して変化させることができる。リーダー配列の前には、任意選択でＡＣを置くことができる。Ｔ７プロモーター配列は、Ｇダブレット又はトリプレットを持ち又は持たないものでよく、Ｇダブレット又はトリプレットによって転写が増加する。
【０２６４】
特定の実施形態においては、Ｔ０で細胞にｈＭＰＶを感染させる。２４時間後、Ｔ２４で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。Ｔ０後４８時間及びＴ０後７２時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合（例えばＧＦＰ）、レポーター遺伝子の発現は、ＦＡＣＳを使用して試験することができる。
【０２６５】
別の実施形態においては、細胞に、Ｔ＝０時間で６個のプラスミドをトランスフェクトする。次いで細胞をＴ＝４０時間及びＴ＝６０時間で収集し、ＣＡＴ又はＧＦＰ発現に関して分析する（図２５参照）。
【０２６６】
別の特定の実施形態においては、細胞に、Ｔ０でＭＶＡ−Ｔ７を感染させる。１時間後、Ｔ１で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。Ｔ０後２４時間で、細胞にｈＭＰＶを感染させる。Ｔ０後７２時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合（例えばＧＦＰ）、レポーター遺伝子の発現は、ＦＡＣＳを使用して試験することができる。
【０２６７】
５．８．２  レポーター遺伝子
ある実施形態においては、組織培養物又は動物モデルでのレポーター遺伝子発現を測定するアッセイを、本発明の方法で使用することができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列を、ＡＰＶやｈＭＰＶ、ｈＭＰＶ／ＡＰＶ、ＡＰＶ／ｈＭＰＶなどのウイルスにクローニングするが、この場合、（ｉ）レポーター遺伝子の位置が変化しており、（ｉｉ）レポーター遺伝子を挟む遺伝子間領域の長さは様々なものである。種々の組合せについて試験をして、レポーター遺伝子の最適な発現速度、及びレポーター遺伝子を含むウイルスの最適な複製速度を決定する。
【０２６８】
ある実施形態において、ミニレプリコン構築物は、レポーター遺伝子を含むように生成される。ミニレプリコン構築物の構築については本明細書で述べる。
【０２６９】
レポーター遺伝子産物の存在量は、当業者に知られている任意の技法によって決定することができる。そのような技法には、レポーター遺伝子に特異的なプローブ又は抗体をそれぞれ使用するノーザンブロット分析又はウェスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７０】
ある実施形態において、レポーター遺伝子は、ＦＡＣＳ中で検出することができる蛍光シグナルを放出する。ＦＡＣＳは、レポーター遺伝子が内部で発現する細胞を検出するのに使用することができる。
【０２７１】
本発明の特定の態様を実施するための技法は、他に特に示さない限り、当業者により日常的に実施されている分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ操作及び生成の従来の技法を用いることになる。例えば、Sambrook他、Molecular cloning、a laboratory manual、第2版、第1〜3巻（Cold Spring Harbor Laboratory、1989）、A Laboratory Manual、第2版; DNA Cloning、第I及びII（Glover編、1985）；及びTranscription and Translation（Hames&Higgins編、1984）を参照されたい。
【０２７２】
レポーター遺伝子産物の生化学的活性は、レポーター遺伝子の発現レベルを表す。レポーター遺伝子の活性の全体的レベルは、本発明の組換えウイルスの複製速度にも依存する。したがって組換えウイルス由来のレポーター遺伝子の真の発現レベルを決定するには、全発現レベルを細胞培養物又は動物モデルにおける組換えウイルスの力価で割るべきである。
【０２７３】
本発明の方法で使用することができるレポーター遺伝子には、以下の表４に列挙する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【表４】
2011250786.tif 000006
【０２７４】
レポーター遺伝子の存在量は、とりわけウェスタンブロット分析又はノーザンブロット分析によって、あるいはヌクレオチド配列の転写、そのｍＲＮＡタンパク質の存在量を定量するために使用される任意のその他の技法によって、測定することができる（Short Protocols in Molecular Biology、Ausubel他(編)、John Wiley&Sons,Inc.、第4版、1999参照）。ある実施形態において、レポーター遺伝子産物の活性は、組換えウイルス由来のレポーター遺伝子発現の読取り値として測定される。レポーター遺伝子産物の活性の定量では、レポーター遺伝子産物の生化学的特性を用いることができる（表４参照）。レポーター遺伝子産物の生化学的活性を測定する方法は、当業者に周知である。本発明の方法で使用することができる例示的なレポーター遺伝子のより詳細な記述を以下に示す。
【０２７５】
５．８．３  感染率の測定
感染率は、例えば臨床サンプル（例えば鼻腔ぬぐい分泌液）について本発明のウイルスが存在するかどうか、抗ＡＰＶ抗原抗体、抗ｈＭＰＶ抗原抗体、抗ＡＰＶ抗原抗体、及び／又は抗体であって異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的なものを使用する免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によってそれぞれ試験をすることであるがこれに限定することのない、当技術分野で周知の任意の方法によって決定することができる。
【０２７６】
ある実施形態においては、無傷の細胞を含有するサンプルを直接処理することができるが、無傷の細胞を持たない分離株は、許容細胞系（例えばＨＥｐ−２細胞）でまず培養すべきである。例示的な実施形態においては、培養細胞懸濁液を、例えば室温で３００×ｇの遠心単離に５分間かけ、その後、同じ条件下でＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋含まず）で洗浄することによって、清澄にすべきである。細胞ペレットを、少量のＰＢＳに再懸濁して分析にかける。無傷の細胞を含有する一次臨床分離株をＰＢＳと混合し、室温で５分間、３００×ｇの遠心分離にかける。粘液を、滅菌ピペットの先端との界面から除去し、細胞ペレットを同じ条件下でもう一度ＰＢＳで洗浄する。次いでペレットを少量のＰＢＳに再懸濁し、分析にかける。アセトン洗浄した１２ウェルＨＴＣスーパーキュアガラススライド上の５ｍｍウェル当たり、各細胞懸濁液５〜１０マイクロリットルをスポッティングし、空気乾燥させる。スライドを冷（−２０℃）アセトン中に１０分間固定する。各ウェルにＰＢＳ−１％ＢＳＡを添加し、その後室温で１０分間インキュベートすることによって、反応を阻止する。スライドをＰＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、空気乾燥する。ブロッキング緩衝液中２５０ｎｇ／ｍｌに希釈した各一次抗体試薬１０マイクロリットルで、ウェルごとにスポットし、反応物を、加湿した３７℃の環境下で３０分間インキュベートする。次いでスライドを、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を３回交換して十分に洗浄し、空気乾燥する。ブロッキング緩衝液中２５０ｎｇ／ｍｌに希釈した適切な二次複合抗体試薬１０マイクロリットルで、それぞれのウェルごとにスポットし、反応物を、加湿した３７℃の環境下でさらに３０分間インキュベートする。次いでスライドを、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を３回交換して洗浄する。５マイクロリットルのＰＢＳ−５０％グリセロール−１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０−１ｍＭ  ＥＤＴＡで反応ウェルごとにスポットし、スライドにカバーガラスを取り付ける。その後、各反応ウェルを、Ｂ−２Ａフィルタ（ＥＸ４５０〜４９０ｎｍ）を使用する２００×の倍率での蛍光顕微鏡法により分析する。染色していない細胞又は二次試薬のみで染色した細胞から得られた自己蛍光バックグラウンドに対して、陽性反応を記録する。陽性反応は、感染した細胞の細胞質内にある小封入体で強調された、明るい蛍光を特徴とする。
【０２７７】
５．８．４  血清力価の測定
抗体血清力価は、当技術分野で周知の任意の方法によって決定することができ、例えば、血清サンプル中の抗体又は抗体断片の量をサンドイッチＥＬＩＳＡで定量することができるが、これに限定するものではない。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡは、血清中の抗体又は抗体断片を認識する抗体で、４℃で一晩マイクロタイタープレートを被覆することからなる。次いでこのプレートを、室温で約３０分間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−０．５％ＢＳＡで遮断する。ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ−ＢＳＡ中に希釈した精製済みの抗体又は抗体断片を使用して標準曲線を構成し、サンプルをＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈する。サンプル及び標準液を、アッセイプレートの２つ組のウェルに加え、室温で約１時間インキュベートする。次に非結合抗体をＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで洗い落とし、結合抗体については、室温で約１時間、標識二次抗体（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ）で処理する。標識に特異的な色素生成基質を添加し、例えば分光光度計によって基質の代謝回転速度を測定することにより、標識抗体の結合を検出する。血清中の抗体又は抗体断片レベルの濃度は、サンプルに関する基質の代謝回転速度と標準曲線での基質の代謝回転速度とを、ある希釈率で比較することによって決定する。
【０２７８】
５．８．５  血清検査
本発明のある実施形態においては、哺乳動物ＭＰＶの構成要素に結合する抗体が存在するかどうか検出する。特に、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質に対する抗体の存在は被験体内で検出することができ、それによって、被験体内の哺乳動物ＭＰＶの存在を診断する。哺乳動物ＭＰＶの構成要素に対する抗体の存在を検出するには、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。
【０２７９】
別の実施形態において、血清検査は、ＭＰＶに感染していることが疑われる宿主由来のサンプルと、ＭＰＶ又はその構成要素に対する抗体とを接触させ、複合体の形成を検出することにより実施しうる。そのような実施形態において、血清検査は、ＭＰＶへの曝露に応答した宿主の抗体応答の存在を検出しうる。宿主の抗体又はＭＰＶ構成要素を検出するための本発明のアッセイで用いることができる抗体は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて作製することができる。そのような抗体は、種々のエピトープ、例えば限定されるものではないが、核酸、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、タンパク質、炭水化物又はそれらの任意の組合せ、を検出するために操作しうる。本発明の別の実施形態において、血清検査は、ＭＰＶに感染していることが疑われる宿主由来のサンプルと、ＭＰＶの構成要素とを接触させ、複合体の形成を検出することにより実施しうる。そのような方法の例は当技術分野で周知であり、例えば限定されるものではないが、直接免疫蛍光法、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、イムノクロマトグラフィなどがある。
【０２８０】
例示的な実施形態においては、哺乳動物ＭＰＶの構成要素を固体支持体に結合させる。特定の実施形態において、哺乳動物ＭＰＶの構成要素はＦタンパク質又はＧタンパク質であるが、これらに限定されない。その後、哺乳動物ＭＰＶに対する抗体の存在に関して試験をする物質を、哺乳動物ＭＰＶ構成要素と抗体との結合に至る条件下で、固体支持体と共にインキュベートする。その後、固体支持体を、非特異的に結合している抗体全てが除去される条件下で洗浄する。洗浄ステップの後、結合した抗体の存在を、当業者に知られている任意の技法を使用して検出することができる。特定の実施形態においては、検出可能に標識された抗体と哺乳動物ＭＰＶの構成要素に結合した抗体との結合に至る条件下で、哺乳動物ＭＰＶタンパク質−抗体複合体を、被験体の種に応じて生成された抗体を認識する検出可能に標識された抗体と共にインキュベートするが、例えば被験体がコットンラットである場合、検出可能に標識された抗体はラット抗体を対象とする。特定の実施形態において、検出可能に標識された抗体は、酵素活性に結合する。別の実施形態において、検出可能に標識された抗体は、放射性標識されたものである。次いで哺乳動物ＭＰＶタンパク質−抗体−検出可能に標識された抗体の複合体を洗浄し、その後、検出可能に標識された抗体の存在を、当業者に知られている任意の技法によって定量するが、ここで使用される技法は、検出可能に標識された抗体の標識のタイプに応じて異なるものである。
【０２８１】
５．８．６  ビアコアアッセイ
抗体結合の動態パラメータの決定は、例えば、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＨＢＳ緩衝液にモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を様々な濃度で溶かしたもの２５０μＬを、抗原が固定されているセンサチップ表面に注入することによって、決定することができる。抗原は、哺乳動物ＭＰＶの任意の構成要素でよい。特定の実施形態において、抗原は哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質又はＧタンパク質でよいが、これらに限定されない。流量は、７５ｕＬ／分で一定に維持する。解離データを１５分間、又は必要に応じてそれ以上収集する。各注入／解離サイクルの後、希釈酸、典型的な場合には１０〜１００ｍＭ  ＨＣｌの短い１分間のパルスを使用して、抗原表面から結合ｍＡｂを除去するが、状況が許すならその他の再生剤を使用する。
【０２８２】
より具体的には、会合速度ｋｏｎ及び解離速度ｋｏｆｆの測定では、標準的なアミンカップリングの化学的性質、すなわちＥＤＣ／ＮＨＳ法を用いて、抗原をセンサチップ表面に直接固定化する（ＥＤＣ＝Ｎ−ジエチルアミノプロピル）−カルボジイミド）。簡単に説明すると、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃに溶かした抗原の５〜１００ｎＭ溶液（ｐＨ４又はｐＨ５）を調製し、約３０〜５０ＲＵ（Biacore Resonance Unit）相当の抗原が固定化されるまで、この溶液をＥＤＣ／ＮＨＳ活性化表面に通す。この後、未反応の活性エステルを、１Ｍ  Ｅｔ−ＮＨ２を注入することによって「キャップ」する。参照用として、同一の固定条件下で抗原を含まないブランク表面を調製する。適切な表面を調製したら、抗体試薬のそれぞれに関して適切な連続希釈液をＨＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０で調製し、連続して接続されている抗原と参照用の両方の細胞表面に通す。調製される抗体濃度の範囲は、平衡結合定数ＫＤがどのような値になるかに応じて異なる。上述のように、適切な再生剤を使用して、各注入／解離サイクルの後の結合抗体を除去する。
【０２８３】
全データ集合を収集したら、機器製造業者BIAcore,Inc.（Piscataway、NJ）から供給されたアルゴリズムを使用して、得られる結合曲線を全体的に当てはめる。全てのデータは、１：１のラングミュア結合モデルに適合する。これらのアルゴリズムはｋｏｎとｋｏｆｆの両方を計算し、そこから見掛けの平衡結合定数ＫＤが２つの速度定数の比（すなわちｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として推定される。個々の速度定数をどのように導き出すかについてのより詳細な処理は、BIAevaluation Software Handbook（BIAcore,Inc.、Piscataway、NJ）に見出すことができる。
【０２８４】
５．８．７  微量中和アッセイ
抗体又はその抗原結合フラグメントがウイルス感染力を中和する能力を、微量中和アッセイにより決定する。この微量中和アッセイは、Anderson他（1985、J.Clin.Microbiol. 22:1050〜1052、その開示全体を参照により本明細書に援用する）により記述された手順に変更を加えたものである。この手順は、その開示全体を参照により本明細書に援用するJohnson他、1999、J.Infectious Diseases 180:35〜40にも記載されている。
【０２８５】
抗体希釈液を、９６ウェルプレートを使用して３本作製する。１０６ＴＣＩＤ５０の哺乳動物ＭＰＶを、抗体又はその抗原結合フラグメントの連続希釈液と共にインキュベートして、これを９６ウェルプレートのウェル内で、３７℃で２時間の試験にかける。次いでＶｅｒｏ細胞（２．５×１０４）などであるがこれに限定することのない、哺乳動物ＭＰＶに感染し易い細胞を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２中３７℃で５日間培養する。５日後に培地を吸引し、８０％メタノール及び２０％ＰＢＳで細胞を洗浄しプレートに固定する。次いでＦタンパク質発現など、ウイルス抗原によってウイルスの複製を決定する。固定された細胞を、抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体（例えばｐａｎ  Ｆタンパク質、Ｃ部位特異的ＭＡｂ１３３−１Ｈ）などのビオチン結合抗ウイルス抗原と共にインキュベートし、洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合アビジンをウェルに添加する。ウェルを再び洗浄し、基質ＴＭＢ（チオニトロ安息香酸）の代謝回転を４５０ｎｍで測定する。中和力価は、ウイルスのみの対照細胞から４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）で少なくとも５０％の低下を引き起こす抗体濃度として表す。
【０２８６】
本明細書で述べる微量中和アッセイは、単なる一例である。別法として、ウイルスが抗体によってどのように大きな影響を受けるかを決定する際、標準的な中和アッセイを使用することができる。
【０２８７】
５．８．８  ウイルス融合阻害アッセイ
このアッセイは、抗体を添加する前に細胞をそれぞれのウイルスに４時間感染させ、読取りが細胞の融合の存否に関するものであること以外、基本的に微量中和アッセイと同一である（Taylor他、1992、J.Gen.Virol. 73:2217〜2223）。
【０２８８】
５．８．９  等温滴定熱量測定
熱力学的結合親和性及びエンタルピーを、抗体とそれに対するそれぞれの抗原との相互作用に関して等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）から決定する。
【０２８９】
抗体を透析液中に希釈し、その濃度を、２８０ｎｍのピーク最大値で吸光係数２１７，０００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、Perkin-Elmer Lambda 4B分光光度計を用いたＵＶ分光分析吸収測定により決定した。希釈した哺乳動物ＭＰＶ−抗原濃度は、当初のサンプルの質量と希釈したサンプルの質量との比から計算するが、それはこの吸光係数が、大量のサンプルを用いることなくまた失うことなく正確な濃度を決定するのに低すぎるからである。
【０２９０】
ＩＴＣ測定
抗体の結合熱力学を、Microcal,Inc. VP滴定熱量計を使用したＩＴＣ測定により決定する。ＶＰ滴定熱量計は、断熱性エンクロージャ内に封入されたサンプル用と参照用容器（１．４０９ｍｌ）の一対の組合せと、このサンプル容器に対してリガンド溶液を滴定するための回転スターラ−シリンジとからなる。ＩＴＣ測定は、２５℃及び３５℃で行う。サンプル容器には、抗体を加えたリン酸緩衝液が入っていたが、参照容器には緩衝溶液のみ入っている。リン酸緩衝溶液は、HyClone,Inc.製の生理食塩水６７ｍＭ  ＰＯ４（ｐＨ７．４）である。５〜１０μｌという一定量の０．０５〜０．１ｍＭ  ＲＳＶ−抗原、ＰＩＶ−抗原、及び／又はｈＭＰＶ−抗原溶液を、３〜４分間あけて、熱交換シグナルが失われることからわかるように結合が飽和するまで抗体サンプル溶液中に滴定する。
【０２９１】
Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｉｎｃ．からの非線形最小２乗法による最小化ソフトウェアプログラムＯｒｉｇｉｎ５．０を使用して、以下の方程式（Ｉ）に従い、全熱量Ｑｔのｉ回目の滴定での増分熱量（ΔＱ（ｉ））を全滴定液濃度Ｘｔに当てはめる：
Qt＝nCtΔHb○V{1+Xt/nCt+1/nKbCt-[(1+Xt/nCt+1/nKbCt)2-4Xt/nCt]1/2}/2   (1a)
ΔQ(i)＝Q(i)+dVi/2V{Q(i)+Q(i-1)}-Q(i-1)   (1b)
上式でＣｔは、サンプル容器中の初期抗体濃度であり、Ｖはサンプル容器の容積であり、ｎは結合反応の化学量論的な量であり、これによってＫｂ、ΔＨｂ○、及びｎの値を得る。Ｋｂを決定するのに最適なサンプル濃度の範囲はＫｂの値に応じて異なり、以下の関係式によって定義される。
【０２９２】
ＣｔＫｂｎ≦５００      （２）
したがって１μＭで決定することのできる最大Ｋｂは２．５×１０８Ｍ−１未満である。最初の滴定液添加が結合等温式に適合しない場合、シリンジ開口と溶液との界面での気泡の放出を示す可能性があるので、それは最終分析で無視される。
【０２９３】
５．８．１０  イムノアッセイ
免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、１５９手法ニン、バナジン酸ナトリウム）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）などの溶解緩衝液に細胞集団を溶解し、対象の抗体を細胞溶解産物に添加し、４℃である時間（例えば４時間）インキュベートし、タンパク質Ａ及び／又はタンパク質Ｇセファロースビーズを細胞溶解産物に添加し、４℃で約１時間以上インキュベートし、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、ビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再懸濁することを含む。対象の抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウェスタンブロット分析によって評価することができる。当業者なら、抗体と抗原との結合が増加しまたバックグラウンドが低下するように（例えばセファロースビーズで細胞溶解産物をプレクリアする）修正可能なパラメータが理解されよう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察に関しては、例えばAusubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley&Sons,Inc.、New York、第10、16、1頁を参照されたい。
【０２９４】
ウェスタンブロット分析は一般に、タンパク質サンプルを調製し、ポリアクリルアミドゲルでタンパク質サンプルの電気泳動をし（例えば抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースやＰＶＤＦ、ナイロンなどの膜に移し、膜を遮断溶液（例えば３％ＢＳＡや脱脂乳をを含むＰＢＳ）中に遮断し、膜を洗浄緩衝液（例えばＰＢＳＴｗｅｅｎ２０）で洗浄し、膜を、遮断緩衝液で希釈した一次抗体（対象の抗体）と共にインキュベートし、膜を洗浄緩衝液中で洗浄し、膜を、遮断緩衝液で希釈した酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）又は放射性分子（例えば１２Ｐや１２１Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体、例えば抗ヒト抗体を認識する）と共にインキュベートし、膜を洗浄緩衝液中で洗浄し、抗原の存在を検出することを含む。当業者なら、検出されるシグナルを増大させまたバックグラウンドノイズを低減させるように修正可能なパラメータが理解されよう。ウェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えばAusubel他編1994、GinTent Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley&Sons,Inc.、New York、10.8.1を参照されたい。
【０２９５】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆し、ウェルに結合しなかった抗原を洗い落とし、酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に結合された対象の抗体をウェルに添加して、ある時間インキュベートし、結合していない抗体又は非特異的結合抗体を洗い落とし、ウェルを被覆している抗原に特異的に結合された抗体の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、対象の抗体が、検出可能な化合物に結合していなくてもよく、代わりに、検出可能な化合物に結合している二次抗体（対象の抗体を認識する）をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原で被覆する代わりに、抗体をウェルに被覆してもよい。その場合、検出可能な分子は、酵素基質（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に結合した抗原でよい。シグナル検出及びその他のＥＬＩＳＡの変化が増大するように修正可能なパラメータは、当業者に周知である。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、例えばAusubel他編1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley&Sons,Inc.、New York、11.2.1を参照されたい。
【０２９６】
抗原に対する抗体（ｓｃＦｖ、あるいは抗体フラグメント又はその変種を含み、あるいは抗体フラグメント又はその変種からなるその他の分子を含む）の結合親和性と、抗体抗原相互作用のオフレートは、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの一例は、標識されていない抗原の量が増加している状態で、標識抗原（例えば３Ｈや１２１Ｉ）と問題にされている抗体とをインキュベートすること、及び標識抗原に結合している抗体を検出することを含む、ラジオイムノアッセイである。
【０２９７】
５．８．１１  ショ糖勾配アッセイ
異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかという問題は、当業者に知られている任意の生化学的アッセイを使用することによってさらに調べることができる。特定の実施形態においては、異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかを決定するのに、ショ糖勾配アッセイを使用する。
【０２９８】
感染細胞溶解産物は、２０〜６０％ショ糖勾配に分画することができ、様々な画分を収集して、例えばウェスタンブロット分析により異種タンパク質及びベクタータンパク質の存在及び分布について分析する。画分及びウイルスタンパク質は、プラークアッセイにより、ピークウイルス力価に関してアッセイすることもできる。異種タンパク質がウイルス粒子を共に移行する場合、異種タンパク質はウイルス粒子と会合する。
【０２９９】
５．９  ＭＰＶの新しい分離株を同定する方法
本発明は、哺乳動物ＭＰＶ、特にｈＭＰＶに関する。本発明は、ＭＰＶの２つの血清学的サブグループＡ及びＢの特性決定と、ＭＰＶ  Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２の４つの変種の特性決定を行うが、本発明はこれらのサブグループ及び変種に限定されない。本発明は、本明細書に記載されるサブグループ及び変種に属すると特性決定し、あるいはまだ特徴付けられていないサブグループ又は変種に属すると特性決定されたものも含めた、任意のまだ同定されていないＭＰＶ分離株を包含する。
【０３００】
所与のサンプル中に存在するタンパク質構成要素を特性決定するために、イムノアッセイを使用することができる。イムノアッセイは、同定のためウイルスのペプチド構成要素を使用してウイルス分離株を比較するのに効果的な方法である。例えば本発明は、本明細書において、本明細書で提供されたＭＰＶの別の分離株を同定する方法を提供し、この方法は、本質的にＭＰＶに感染していないか又は特異的な病原体のないモルモット又はフェレット（詳細な説明では、動物は鼻内に接種されているが、筋肉内接種や皮内接種などその他の手法で接種したもの、及びその他の実験動物を使用することも可能である）にプロトタイプの分離株Ｉ−２６１４又は関係する分離株を接種することを含むものである。この動物から、接種後０日、２週間、及び３週間経過したときに血清を収集する。ウイルス中和（ＶＮ）アッセイ（ＶＮアッセイの例に関しては実施例１６参照）及び間接的ＩＦＡ（ＩＦＡの例に関しては実施例１１又は１４参照）で測定されたように、それぞれの分離株Ｉ−２６１４に対して特異的に血清変換された動物と、血清変換された動物由来の血清を、前記別の分離株の免疫学的検出で使用する。一例として本発明は、パラニューモウイルス科の新しいメンバー、すなわち重篤なＲＴＩをヒトに引き起こす可能性のあるヒトメタニューモウイルス又はメタニューモウイルス様ウイルス（その最終的な分類についてはウイルス分類学委員会による議論が待たれるので、本明細書でＭＰＶは、例えば分類学上ＡＰＶに相当すると記載する）（ＭＰＶ）の特性決定を行う。ＭＰＶにより引き起こされる疾患の臨床症状は、咳や筋肉痛、嘔吐、発熱性細気管支炎又は肺炎、可能な結膜炎、あるいはこれらの組合せなど、本質的にｈＲＳＶにより引き越されたものと同様である。ｈＲＳＶに感染した子供に見られるように、特に非常に幼い子供の場合は入院が必要になる可能性がある。一例として、２００１年１月１９日にＣＮＣＭ、Institute Pasteur（パリ）にＩ−２６１４として寄託されたＭＰＶ、又はそれに系統学上相当するウイルス分離株を、本明細書では提供する。それと共に本発明は、核酸、又は配列番号１９の核酸配列に系統学上相当する機能的断片、あるいはこれに構造上相当するものを含むウイルスを提供する。詳細には本発明は、１００回のブートストラップ及び３回のジャンブルを使用して最尤樹を生成する系統樹分析で試験した後で、トリ鼻気管炎の病因物質であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）とも呼ばれるトリニューモウイルス（ＡＰＶ）のウイルス分離株に関係するよりも、ＣＮＣＭ（パリ）にＩ−２６１４として寄託されたウイルス分離株のほうに対して系統学上より密接に相当することが見出されることを特徴とするウイルスを提供する。特に前記系統樹分析では、本質的に非哺乳動物ウイルスではあるが最も近い類縁にあるＡＰＶ−Ｃウイルス分離株を、外集団として使用することが有用である。
【０３０１】
５．９．１  バイオインフォマティックスによる配列アライメント
２つ以上のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ（Altschul,S.F.他、1990、J.Mol.Biol. 215:403〜410）によって比較して、それらの互いの配列相同性及び配列同一性を決定することができる。２つ以上のヌクレオチド配列は、これらをＢＬＡＳＴ（Altschul,S.F.他、1990、J.Mol.Biol. 215:403〜410）によって比較して、互いの配列相同性及び配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴ比較は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ法（Mac Vector(tm)）を使用して実施することができる。ある特定の実施形態においては、コンピュータプログラムによる２つ以上の配列のアライメントの後に、マニュアルで再調整することができる。
【０３０２】
２つの配列同士の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin及びAltschul、1990、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:2264〜1168のアルゴリズムであって、Karlin及びAltschul、1993、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5873〜5877で修正が加えられたものである。そのようなアルゴリズムは、Altschul他、1990、J.Mol.Biol. 215:403〜410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド比較は、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴアミノ酸配列比較は、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施することができる。比較を目的としたギャップ付きアライメントを得るには、Altschul他、1997、Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402に記載されているようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいはＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子同士の類縁関係を検出する反復探索を実行することができる（Altschul他、1997、前掲）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers及びMiller、1988、CABIOS 4:11〜17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量算分表を使用することができる。ギャップ長ペナルティは当業者により設定することができる。２つの配列間の同一性％は、ギャップを考慮し又は考慮しない状態で、上述と同様の技法を使用して決定することができる。同一性％の計算では、典型的には厳密にマッチしているものし
かカウントしない。
【０３０３】
５．９．２  ハイブリダイゼーション条件
本発明の方法では、哺乳動物ＭＰＶの核酸と、又はその逆相補鎖と、又はその相補鎖とのハイブリダイゼーションが可能な核酸を使用して、それらの配列の互いの相同性及び同一性を決定することができる。ある実施形態においては、ストリンジェンシーの高い条件下で核酸をハイブリダイズする。限定ではなく一例としての、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する手順は、以下の通りである。ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中、６５Ｃで８時間から一晩にわたり実施する。フィルタは、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、６５Ｃで４８時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、及び０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７Ｃで１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ中、５０Ｃで４５分間洗浄してから、オートラジオグラフィにかける。使用することができるその他の高ストリンジェンシー条件は、当技術分野で周知である。本発明のその他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、穏かな低ストリンジェンシー条件下で実施するが、そのような条件は問う業者に周知である（例えば、Sambrook他、1989、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York参照; またAusubel他編、the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals、1987〜1997 Current Protocols、(著作権) 1994〜1997 John Wiley and Sons,Inc.も参照）。
【０３０４】
５．９．３  系統学的分析
本発明は、哺乳動物ＭＰＶ分離株間の系統学上の関係の推論に関する。系統学上の関係の分析では、多くの方法又は手法を利用することができ、そのような方法には、距離法、最尤法、及び最大節約法が含まれる（Swofford,DL.他、Phylogenetic Inference. Molecular Systematics. Hillis,DM、Mortiz,C、及びMable,BK編、1996. Sinauer Associates: Massachusetts、USA. 第407〜514頁; Felsenstein,J.、1981、J.Mol.Evol. 17:368〜376）。この他ブートストラップ技法は、得られる系統樹の信頼区間を準備し調べるのに有効な手段である（Felsenstein,J.、1985、Evolution. 29:783〜791）。系統学上の関係を確立するには、哺乳動物ＭＰＶ分離株を比較するためにヌクレオチド又はペプチド配列情報を使用する任意の方法又は手法を使用することができ、距離法、最尤法、及び最大節約法又は手法が含まれるが、これらに限定されない。系統学的データの質を分析するには、ブートストラップを含むがこれに限定することのない当技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。系統学的手法に使用されるヌクレオチド又はペプチド配列データのアライメントには、マニュアルアライメント、コンピュータペアワイズアライメント、及びコンピュータマルチプルアライメントが含まれるが、これらに限定されない。当業者なら、必要とされる情報及び許される時間に基づいて使用される好ましいアライメント法又は系統学的手法に精通しているであろう。
【０３０５】
一実施形態においては、ｈＭＰＶ分離株同士の関係を推測するために、ＤＮＡ最尤法を使用する。別の実施形態においては、前記系統学的手法の１つを使用して作成された系統学的データの確実性を決定するために、ブートストラップ技法を使用する。別の実施形態においては、系統学的分析に対する配列順序エントリーの影響を最小限に抑えるために、データ入力の前に、ジャンブル技法を系統学的手法に適用する。ある特定の実施形態においては、ＤＮＡ最尤法をブートストラップと共に使用する。別の特定の実施形態においては、ＤＮＡ最尤法をブートストラップ及びジャンブルと共に使用する。別のさらに具体的な実施形態においては、ＤＮＡ最尤法を５０回のブートストラップと共に使用する。別の具体的な実施形態においては、ＤＮＡ最尤法を５０回のブートストラップ及び３回のジャンブルと共に使用する。別の特定の実施形態においては、ＤＮＡ最尤法を１００回のブートストラップ及び３回のジャンブルと共に使用する。
【０３０６】
一実施形態においては、ｈＭＰＶ分離株由来の核酸又はペプチド配列情報を、他のｈＭＰＶ分離株の配列と比較し又はアライメントする。アミノ酸配列は、Ｌタンパク質、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、又はＦタンパク質のアミノ酸配列でよい。別の実施形態では、１つのｈＭＰＶ分離株又はいくつかのｈＭＰＶ分離株由来の核酸又はペプチド配列情報を、他のウイルスの配列と比較し又はアライメントする。別の実施形態では、系統学上の関係を推測することができかつ／又は系統樹を構成することができるように、系統学的手法を配列アライメントデータに適用する。ＨＭＰＶ分離株と比較するためにヌクレオチド又はペプチド配列情報を使用する任意の方法又は手法は、前記系統学上の関係を推測するのに使用することができ、距離法、最尤法、及び最大節約法又は手法が含まれるがこれらに限定されない。
【０３０７】
系統学的分析のためのその他の方法は、ＷＯ０２／０５７３０２号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ０２／０００４０号に開示されており、その全体を本明細書に援用する。特にＰＣＴ／ＮＬ０２／０００４０号は、第１２頁２７行目から第１９頁２９行目に、系統学的分析に適切な核酸配列を開示しており、これを参照により本明細書に援用する。
【０３０８】
系統学的分析では、ウイルスと比較される外集団として、ＭＰＶではない核酸配列を得ることが最も有用であり、非常に有用な外集団分離株はトリニューモウイルス血清型Ｃ（ＡＰＶ−Ｃ）から得ることができ、例えば図１６を参照されたい。
【０３０９】
ＢｉｏＥｄｉｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＴｒｅｅＶｉｅｗ、及びＮＪＰｌｏｔが含まれるがこれらに限定されない数多くの方法及びプログラムが当技術分野で知られており、系統学上の関係の推測に使用することができる。配列をアライメントし、系統樹又はその関係を生成するのに使用される方法は、比較される配列情報の入力が必要になる。ＦＡＳＴＡ、ＮＢＲＦ、ＥＭＢＬ／ＳＷＩＳＳ、ＧＤＥタンパク質、ＧＤＥヌクレオチド、ＣＬＵＳＴＡＬ、及びＧＣＧ／ＭＳＦが含まれるがこれらに限定されない数多くの方法又はフォーマットが当技術分野で知られており、配列情報を入力するのに使用することができる。配列をアライメントし、系統樹又はその関係を生成するのに使用される方法は、結果の出力が必要になる。情報又は結果の出力では、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＮＢＲＦ／ＰＩＲ、ＭＳＦ、ＰＨＹＬＩＰ、及びＧＤＥを含むがこれらに限定されない数多くの方法又はフォーマットを使用することができる。一実施形態では、系統学上の関係を生成するために、１００回のブートストラップ及び３回のジャンブルによるＤＮＡ最尤法と併せて、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用する。
【０３１０】
５．１０  抗体の作製
本発明は、哺乳動物ＭＰＶによりコードされたタンパク質に対する抗体の作製にも関する。詳細には本発明は、哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質、Ｎタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、Ｇタンパク質、又はＰタンパク質を含めた、全てのＭＰＶ抗原に対する抗体の作製に関する。本発明によれば、哺乳動物ＭＰＶ、その誘導体、類似体、又は断片によりコードされた任意のタンパク質を免疫原として使用して、そのような免疫原と免疫特異的に結合する抗体を産生することができる。本発明の抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及びエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち免疫学的に抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）又はサブクラスでよい。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、抗体をペプシンやパパインなどの酵素で処理することによって産生することができるＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、ヒトＭＰＶによりコードされたタンパク質に対する抗体が産生される。別の実施形態では、ヒトＭＰＶによりコードされたタンパク質のドメインに対する抗体が産生される。
【０３１１】
当技術分野で知られている様々な手順は、哺乳動物ＭＰＶ、その誘導体、類似体、又は断片によってコードされたタンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するために使用することができる。抗体の産生では、天然のタンパク質、又はその合成変種、又はその誘導体（例えば断片）を注射することにより、ウサギやマウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない様々な宿主動物を免疫化することができる。免疫学的応答を増大させるために、宿主の種に応じて様々なアジュバントを使用することができ、そのようなアジュバントには、フロイント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、表面活性物質であって例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールと、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０３１２】
哺乳動物ＭＰＶ、その誘導体、類似体、又は断片によってコードされたタンパク質に対するノクローナル抗体の調製では、培養中の連続細胞系により抗体分子の産生を行う任意の技法を使用することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって当初開発されたハイブリドーマ技法（1975、Nature 256:495〜497）、並びにトリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor他、1983、Immunology Today 4:72）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole他、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss,Inc.、第77〜96頁)がある。本発明の別の追加の実施形態では、最近の技術を利用して（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５号）モノクローナル抗体を無菌動物で産生することができる。本発明によればヒト抗体を使用してよく、このヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Cote他、1983、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 80:2026〜2030）又はヒトＢ細胞を生体外でＥＢＶウイルスで形質転換することによって（Cole他、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss、第77〜96頁）、そのヒト抗体を得ることができる。実際に本発明によれば、適切な生物学的活性を持つヒト抗体分子由来の遺伝子と共に、哺乳動物ＭＰＶ、その誘導体、類似体、又は断片によりコードされたタンパク質に特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライスすることによって、「キメラ抗体」を産生するために開発された技法（Morrison他、1984、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81:6851〜6855; Neuberger他、1984、Nature 312:604〜608; Takeda他、1985、Nature 314: 452〜454）を使用することができるが、そのような抗体は本発明の範囲内にある。
【０３１３】
本発明によれば、一本鎖抗体の産生に関して述べた技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、特異的一本鎖抗体の産生に適用することができる。本発明の追加の実施形態は、哺乳動物ＭＰＶ、その誘導体、類似体、又は断片によってコードされたタンパク質に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを、迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーの構成に関して述べた技法（Huse他、1989、Science 246:1275〜1281）を利用する。
【０３１４】
イディオタイプの分子を含有する抗体フラグメントは、既知の技法により産生することができる。例えばそのような抗体には、抗体分子のペプシン消化により産生することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により産生することができるＦａｂ’フラグメント、抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより産生することができるＦａｂフラグメント、及びＦｖフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０３１５】
抗体の産生では、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）などの当技術分野で知られている技法によって、所望の抗体のスクリーニングを行うことができる。例えば、哺乳動物ＭＰＶによりコードされたタンパク質の特異的ドメインを認識する抗体を選択するために、そのようなドメインを含有する哺乳動物ＭＰＶによってコードされたタンパク質の断片に結合する産物に関して産生されたハイブリドーマをアッセイすることができる。
【０３１６】
本発明により提供される抗体は、ＭＰＶを検出するために、またＭＰＶによる感染を治療するための治療方法に使用することができる。
【０３１７】
本発明の方法により作製された抗体の特異性及び結合親和性は、当業者に知られている任意の技法によって試験をすることができる。ある実施形態で、本発明の方法により産生された抗体の特異性及び結合親和性は、セクション５．８．５、５．８．６、５．８．７、５．８．８、又は５．８．９で述べたように試験をすることができる。
【０３１８】
５．１１  抗ウイルス剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本発明は、哺乳動物ＭＰＶが宿主又は宿主細胞に感染する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物ＭＰＶが宿主又は宿主細胞内で複製する能力を低下させる化合物を同定するための方法を提供する。哺乳動物ＭＰＶが宿主に感染しかつ／あるいは宿主又は宿主細胞内に複製する能力を消失させ又は低下させる化合物をスクリーニングするには、当業者に周知の任意の技法を使用することができる。特定の実施形態では、哺乳動物ＭＰＶがヒトＭＰＶである。
【０３１９】
ある実施形態では、本発明は、哺乳動物ＭＰＶが哺乳動物又は哺乳動物細胞内で複製する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、哺乳動物ＭＰＶが哺乳動物又は哺乳動物細胞に感染する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物ＭＰＶが哺乳動物細胞内で複製する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞がヒト細胞である。ウイルス力価の決定に使用することができるアッセイの詳細な記述に関しては、セクション５．７を参照されたい。
【０３２０】
ある実施形態では、細胞を試験化合物に接触させ、哺乳動物ＭＰＶに感染させる。ある実施形態では、試験化合物が存在しない状態で、対照培養物に哺乳動物ウイルスを感染させる。細胞は、哺乳動物ＭＰＶを感染させる前に、又は感染と同時に、又は感染させた後に、試験化合物に接触させることができる。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。より具体的な実施形態の場合、細胞はヒト細胞である。ある実施形態では、細胞を試験化合物と共に少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも１日インキュベートする。ウイルスの力価は、アッセイ中の任意の時間で測定することができる。ある実施形態では、培養物中のウイルス増殖の時間的経過を求める。試験化合物の存在下でウイルス増殖が阻害され又は低下する場合、その試験化合物は、哺乳動物ＭＰＶの増殖又は感染を阻害し又は低下させるのに有効であることが確認される。特定の実施形態では、哺乳動物ＭＰＶの増殖を阻害し又は低下させる化合物について、その哺乳動物ＭＰＶに対する特異性を試験するために、他のウイルスの増殖速度を阻害し又は低下させるかどうか試験をする。
【０３２１】
ある実施形態では、試験化合物をモデル動物に投与し、そのモデル動物を哺乳動物ＭＰＶに感染させる。ある実施形態では、試験化合物を投与せずに、対照モデル動物を哺乳動物ウイルスに感染させる。試験化合物は、哺乳動物ＭＰＶに感染させる前に、又は感染させると同時に、又は感染させた後に投与することができる。特定の実施形態では、モデル動物が哺乳動物である。さらにより具体的な実施形態では、モデル動物は、コットンラット、マウス、又はサルでよいが、これらに限定されない。モデル動物内のウイルスの力価は、アッセイ中の任意の時間で測定することができる。ある実施形態では、培養物中のウイルス増殖の時間的経過を求める。ウイルス増殖が試験化合物の存在下で阻害され又は減少する場合、その試験化合物は、哺乳動物ＭＰＶの増殖又は感染を阻害し又は低下させるのに有効であることが確認される。特定の実施形態では、モデル動物における哺乳動物ＭＰＶの増殖を阻害し又は低下させる化合物について、その哺乳動物ＭＰＶに対する特異性を試験するために、他のウイルスの増殖速度を阻害し又は低下させるかどうか試験をする。
【０３２２】
５．１２  ワクチン、抗体、及び抗ウイルスの製剤
好ましい実施形態で、本発明は、本発明による核酸によってコードされたタンパク様分子又はメタニューモウイルス特異的ウイルスタンパク質又はその機能的断片を提供する。有用なタンパク様分子は、例えば、本発明によるウイルスから得ることが可能な遺伝子又はゲノム断片のいずれかから得られる。本明細書で提供されるような分子又はその抗原性断片は、例えば、診断方法又はキットに有用であり、またサブユニットワクチンなどの医薬品組成物に有用である。特に有用なものは、抗原又はサブユニット免疫原として含まれるＦ、ＳＨ及び／又はＧタンパク質あるいはその抗原性断片であるが、不活性化した全ワクチンを使用することもできる。系統学的分析で同定された、組換え核酸断片によってコードされたタンパク様物質も特に有用であるが、当然ながら、生体内であろうと（例えば保護する目的で、又は診断用抗体を提供するために）生体外であろうと（例えばファージディスプレイ技術によって、又は合成抗体を産生するのに有用な別の技法によって）、特にＭＰＶ特異的抗体又はＴ細胞応答を誘発するために、系統学的分析に有用なＯＲＦの好ましい境界内にあるものが好ましい。
【０３２３】
本明細書では、天然のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体あるいは合成（例えば（ファージ）ライブラリー由来の結合分子）抗体であって、本発明によるタンパク様分子又はそのＭＰＶ特異的機能性断片を含む抗原と特異的に反応する抗体も提供する。そのような抗体は、ウイルス分離株がＭＰＶであると同定する方法、すなわち前記ウイルス分離株又はその化合物を本明細書で示した抗体と反応させることを含む方法に有用である。これは例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、又は種々のフォーマットの抗原検出アッセイ（Current Protocols in Immunology）を使用し、精製され又は精製されていないＭＰＶあるいはその一部（タンパク質、ペプチド）を使用することによって、実現することができる。あるいは、従来の蛍光抗体法又は免疫組織法を使用してウイルス抗原を同定するために、感染した細胞又は細胞培養物を使用することができる。
【０３２４】
本発明によるウイルス、核酸、タンパク用分子又はその断片、抗原、及び／又は抗体を含む医薬品組成物は、例えば、ＭＰＶ感染及び／又は呼吸器疾患を治療又は予防する方法、すなわち本発明による医薬品組成物を個体に与えることを含む方法で、使用することができる。これは、前記個体がヒトである場合、特に前記ヒトが５才以下である場合に最も有用であるが、それはこのような乳児及び幼児が本明細書で述べたヒトＭＰＶに最も感染し易いからである。一般に急性期の患者は、他の呼吸器疾患又はその他の疾患の素因となる上気道の症状に苦しむことになる。また、より重篤な疾患及びその他の重篤な疾患の素因となる下気道疾患も生じる可能性がある。本発明の組成物は、癌患者、被移植者、及び高齢者を含めた免疫無防備状態の個人を治療するのに使用することができる。
【０３２５】
また本発明は、本発明によるウイルスを含む細胞培養物又は実験動物を確立すること、前記培養物又は動物を候補抗ウイルス薬で治療すること、及び前記ウイルス又はその前記培養物又は動物への感染に対する前記薬剤の影響を決定することを含む、気道疾患の治療に有用な抗ウイルス薬を得る方法を提供する。そのような抗ウイルス薬の例には、本明細書で提供するＭＰＶ中和抗体又はその機能的構成要素が含まれるが、その他の性質の抗ウイルス薬も同様に得られる。また本発明は、医薬品組成物を調製するために、特に、具体的にはＭＰＶ感染又は関連する疾患によって引き起こされた気道疾患又は関連する疾患を治療するための医薬品組成物を調製するために、本発明による抗ウイルス薬を使用することも提供し、また、ＭＰＶ感染又は呼吸器疾患を治療又は予防するための方法であって、個体にそのような医薬品組成物を与えることを含む方法に有用な、本発明による抗ウイルス剤を含む医薬品組成物も提供する。
【０３２６】
本発明のある実施形態において、本発明のワクチンは、本明細書で定義した哺乳動物メタニューモウイルスを含む。より具体的なある実施形態においては、哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである。好ましい実施形態においては、ワクチン製剤に使用される哺乳動物メタニューモウイルスが、弱毒化表現型を有する。弱毒化表現型を実現する方法については、セクション５．６を参照されたい。
【０３２７】
本発明は、ＰＩＶ、ＲＳＶ、ＡＰＶ、及び／又はｈＭＰＶによる感染を予防し治療するためのワクチン製剤を提供する。ある実施形態において、本発明のワクチンは、本発明の組換え及びキメラウイルスを含む。ある実施形態において、ウイルスは弱毒化される。
【０３２８】
特定の実施形態において、ワクチンはＡＰＶを含み、ワクチンは、ヒトのｈＭＰＶ感染を予防し治療するために使用される。理論に拘泥するものではないが、ＡＰＶのＦタンパク質とｈＭＰＶのＦタンパク質との相同性の程度が高いので、ＡＰＶに感染すると、宿主内では抗体が産生され、ｈＭＰＶと交差反応し、ｈＭＰＶによる感染及び関連する疾患から宿主を保護する。
【０３２９】
別の特定の実施形態においては、ワクチンはｈＭＰＶを含み、このワクチンは、シチメンチョウなどであるがこれに限定されないトリへのＡＰＶ感染を予防し治療するために使用される。理論に拘泥するものではないが、ＡＰＶのＦタンパク質とｈＭＰＶのＦタンパク質との相同性の程度が高いので、ｈＭＰＶに感染すると、宿主内で抗体が産生され、ＡＰＶと交差反応し、ＡＰＶによる感染及び関連する疾患から宿主を保護する。
【０３３０】
特定の実施形態において、本発明は、ＡＰＶ及び／又はｈＭＰＶから保護するために、ワクチン製剤に改変されている組換え及びキメラＡＰＶ／ｈＭＰＶウイルスを使用することを包含する。ある実施形態において、ＡＰＶ／ｈＭＰＶは、ＡＰＶによる感染からトリを保護するために、トリに投与するワクチンに使用される。理論に拘泥するものではないが、ＡＰＶ遺伝子又はヌクレオチド配列をｈＭＰＶ遺伝子又はヌクレオチド配列に置き換えることにより、弱毒化表現型が得られ、キメラウイルスをワクチンとして使用することが可能になる。その他の実施形態においては、ＡＰＶ／ｈＭＰＶキメラウイルスをヒトに投与する。理論に拘泥するものではないが、ＡＰＶウイルスベクターは、ヒトに弱毒化表現型をもたらし、ｈＭＰＶ配列の発現によって、ｈＭＰＶ特異的免疫応答が誘発される。
【０３３１】
特定の実施形態において、本発明は、ＡＰＶ及び／又はｈＭＰＶから保護するために、ワクチン製剤に改変されている組換え及びキメラｈＭＰＶ／ＡＰＶウイルスを使用することを包含する。ある実施形態においては、ｈＭＰＶによる感染からヒトを保護するために、ヒトに投与するワクチンにｈＭＰＶ／ＡＰＶを使用する。理論に拘泥するものではないが、ｈＭＰＶ遺伝子又はヌクレオチド配列をＡＰＶ遺伝子又はヌクレオチド配列に置き換えることによって、弱毒化表現型が得られ、キメラウイルスをワクチンとして使用することが可能になる。その他の実施形態においては、ｈＭＰＶ／ＡＰＶキメラウイルスをトリに投与する。理論に拘泥するものではないが、ｈＭＰＶの骨格は弱毒化表現型をトリにもたらし、ＡＰＶ配列の発現によってＡＰＶ特異的免疫応答が誘発される。
【０３３２】
ある好ましい実施形態において、本発明のワクチン製剤は、メタニューモウイルスによる感染及び関連する疾患から保護するために使用される。より具体的には、ヒトメタニューモウイルス及び／又はトリニューモウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するために、本発明のワクチン製剤を使用する。ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、（ａ）ヒトメタニューモウイルス及び呼吸器合胞体ウイルス、及び／又は（ｂ）トリニューモウイルス及び呼吸器合法体ウイルスによる感染から保護するのに使用される。
【０３３３】
ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、（ａ）ヒトメタニューモウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルス、及び／又は（ｂ）トリニューモウイルス及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。
【０３３４】
ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、（ａ）ヒトメタニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルス、及び／又は（ｂ）トリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。
【０３３５】
ある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、ヒトメタニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。その他のある実施形態において、本発明のワクチン製剤は、トリニューモウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルスによる感染と、関連する疾患から保護するのに使用される。
【０３３６】
例示的なアミノ酸配列の比較については図９を参照されたいが、異なるウイルス種のＦタンパク質同士の相同性の程度が高いので、本発明のワクチン製剤は、Ｆタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が得られたものとは異なるウイルスから保護するために使用することができる。特定の例示的な実施形態において、ワクチン製剤は、トリニューモウイルスＡ型由来の異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含むウイルスを含有し、このワクチン製剤は、トリニューモウイルスＡ型及びトリニューモウイルスＢ型による感染から保護するのに使用される。本発明は、ＡＰＶ−Ｃ及びＡＰＶ−Ｄを含めたＡＰＶ、ｈＭＰＶ、ＰＩＶ、インフルエンザ、ＲＳＶ、センダイウイルス、流行性耳下腺炎、喉頭気管炎ウイルス、シミアンウイルス５、ヒト乳頭腫ウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、並びにその他のウイルス及び病原体と、関連する疾患から保護するのに有用な、ヒト及び動物に投与するワクチン製剤を包含する。本発明はさらに、ヒトメタニューモウイルス感染及びトリニューモウイルス感染と、関連する疾患から保護するのに有用な、ヒト及び動物に投与するワクチン製剤を包含する。
【０３３７】
一実施形態において、本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、及びイヌジシテンパーウイルスを含めた家畜の疾患を引き起こす物質に対して有用な、ワクチン製剤を包含する。さらに別の実施形態において、本発明は、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスから家畜を保護し、さらに狂犬病ウイルスから野生動物を保護するのに有用な、ワクチン製剤を包含する。
【０３３８】
逆遺伝学的手法によって産生された弱毒化ウイルスは、本明細書で述べたワクチン及び医薬品製剤に使用することができる。逆遺伝学的技法は、ワクチン産生に重要な他のウイルス遺伝子に対して追加の変異を設計製作するのにも使用することができ、すなわち有用なワクチン株変種のエピトープを弱毒化ウイルスに設計製作することができる。あるいは、その他のウイルス性又は非ウイルス性病原体由来の抗原を含めた完全に外来のエピトープを、弱毒化した株に設計製作することができる。例えば、ＨＩＶ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）寄生虫抗原（例えばマラリア）や細菌又は真菌抗原、腫瘍抗原など、関係のないウイルスの抗原を、弱毒化した株に設計製作することができる。あるいは、生体内でウイルスの屈性を変化させるエピトープを、本発明のキメラ弱毒化ウイルスに設計製作することができる。
【０３３９】
事実上任意の異種遺伝子配列を、ワクチンに使用される本発明のキメラウイルスに構築することができる。好ましくは生物学的応答調節剤として作用する部分及びペプチドである。様々な病原体のいずれかに保護免疫応答を引き起こすエピトープ、又は中和抗体に結合する抗原を、キメラウイルスによって又はキメラウイルスの一部として発現できることが好ましい。例えば、本発明のキメラウイルスに構成することができる異種遺伝子配列には、インフルエンザ及びパラインフルエンザ血球凝集素ノイラミニダーゼと、ヒトＰＩＶ３のＨＮ及びＦ遺伝子などの融合糖タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態において、キメラウイルスに設計製作することができる異種遺伝子配列には、免疫調節活性を備えたタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節タンパク質の例には、サイトカイン、インターフェロンＩ型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、−２、−４、−５、−６、−１２、及びこれらの薬剤の拮抗物質が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４０】
さらに、ワクチンに使用される本発明のキメラウイルスに構成することができる異種遺伝子配列には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、好ましくは１型又は２型由来の配列が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態においては、抗原の供給源になり得る免疫原性ＨＩＶ由来ペプチドはキメラＰＩＶに構築することができ、次に使用して、脊椎動物の免疫応答を誘発させることができる。そのようなＨＩＶ由来ペプチドには、ｅｎｖ遺伝子（すなわちｇｐ１６０、ｇｐ１２０、及び／又はｇｐ４１の全て又は一部をコードする配列）、ｐｏｌ遺伝子（すなわち逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、及び／又はインテグラーゼの全て又は一部をコードする配列）、ｇａｇ遺伝子（すなわちｐ７、ｐ６、ｐ５５、ｐ１７／１８、ｐ２４／２５の全て又は一部をコードする配列）、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、及び／又はｖｐｘ由来の配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０３４１】
その他の異種配列は、２〜３例を挙げると、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；Ａ型又はＣ型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン−バーウイルスの糖タンパク質；ヒト乳頭腫ウイルスの糖タンパク質；呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、又は流行性耳下腺炎ウイルスの糖タンパク質；インフルエンザウイルスの糖タンパク質；ヘルペスウイルスの糖タンパク質；ポリオウイルスのＶＰ１；細菌や寄生虫など非ウイルス性病原体の抗原決定基から得ることができる。別の実施形態においては、免疫グロブリン遺伝子の全て又は一部を発現することができる。例えば、そのようなエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を、本発明のキメラウイルスに構成することができる。
【０３４２】
その他の異種配列は腫瘍抗原から得ることができ、得られたキメラウイルスを使用して、腫瘍細胞に対する免疫応答を発生させ、その結果、生体内で腫瘍の退縮に至る。これらのワクチンは、腫瘍の治療のため、化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植などを含むがこれらに限定することのないその他の治療法と組み合わせて使用することができる。本発明によれば、組換えウイルスは、Ｔ細胞によって認識されるヒト腫瘍抗原（参照によりその全体を本明細書に援用するRobbins及びKawakami、1996、Curr.Opin.Immunol. 8:628〜636）、メラノサイト系タンパク質、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、チロシナーゼを含む；  腫瘍特異的な広く共用される抗原、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５；  腫瘍特異的変異抗原、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４；  乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、及び膵臓癌、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒト乳頭腫ウイルス−６Ｅ、−Ｅ７、ＭＵＣ−１に対する非メラノーマ抗原を含むがこれらに限定することのない、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するように設計製作することができる。
【０３４３】
さらに他の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列を、ヒトメタニューモウイルス及び／又はトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得る。さらに他の実施形態においては、本発明のウイルスは２つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有し、この場合、一方の配列はヒトメタニューモウイルス及び／又はトリニューモウイルスなどのメタニューモウイルスから得られ、他方の配列は呼吸器合胞体ウイルスから得られる。異種ヌクレオチド配列は、それぞれのウイルスのＦタンパク質又はＧタンパク質をコードする。特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列はキメラＦタンパク質をコードし、このキメラＦタンパク質は、メタニューモウイルスのＦタンパク質の外部ドメイン、及び膜貫通ドメイン、並びにパラインフルエンザウイルスのＦタンパク質の管腔ドメインを含有するものである。
【０３４４】
組換えウイルス生ワクチン又は不活性化した組換えウイルスワクチンを処方することができる。生ワクチンが好ましいと考えられるが、それは、宿主内での分裂増殖によって、自然感染の場合に生じるものと同様の種類及び大きさの刺激が延び、したがって実質的に長く続く免疫性がもたらされるからである。そのような組換えウイルス生ワクチン製剤の生成は、ニワトリ胚の細胞培養物又は尿膜でウイルスを増殖させ、その後に精製を行う従来の方法を使用して、行うことができる。
【０３４５】
特定の実施形態において、組換えウイルスは、これを投与する被験体に対して非病原性である。この点に関し、ワクチンを目的とした遺伝子組換えウイルスの使用は、これらの株に弱毒化特性が存在することが望まれると考えられる。トランスフェクションに使用される鋳型に適切な変異（例えば欠失）を導入することによって、弱毒化特性を持つ新規なウイルスを得ることができる。例えば、温度感受性又は低温適応性に関連した特異的ミスセンス変異を、欠失変異にすることができる。これらの変異は、低温又は温度感受性変異体に関連した点変異よりも安定であるべきであり、復帰変異頻度は極めて低いものであるべきである。
【０３４６】
あるいは、「自殺」特性を持つキメラウイルスを構成することができる。そのようなウイルスは、宿主内で１回だけ、又は２〜３回しか複製行わないと考えられる。ワクチンとして使用する場合、組換えウイルスは限られた複製サイクルを経て十分なレベルの免疫応答を引き起こすが、ヒト宿主ではさらに複製されず、疾患を引き起こす。それぞれ野生型ＡＰＶ及びｈＭＰＶの遺伝子の１つ又は複数が欠けており、あるいは野生型の株に比べて変異している遺伝子を持つ組換えウイルスは、連続して何回も複製を行うことができない。欠陥ウイルスは、そのような遺伝子を永久に発現する細胞系で生成することができる。必須の遺伝子が欠けているウイルスはこれらの細胞系で複製されるが、ヒト宿主に投与した場合は、１回の複製を終了することができない。そのような調製物は、免疫応答を引き起こすのに十分な数の遺伝子を、この不完全なサイクルで転写し翻訳する。あるいは、より多くの量の株を投与することができ、したがってこれらの調製物は、負活性化（死滅した）ウイルスワクチンとしての役割をする。不活性化ワクチンでは、異種遺伝子産物をウイルスの構成要素として発現させることが好ましく、したがって遺伝子産物はウイルス粒子に関連したものである。そのような調製物の利点は、天然のタンパク質を含有し、ホルマリン又はその他の死菌ウイルスワクチンの製造に使用される薬剤を用いた処理によって不活性化しないことである。あるいは、ｃＤＮＡから作製された本発明の組換えウイルスは、数回しか複製されないように大幅に弱毒化される。
【０３４７】
ある実施形態においては、本発明のワクチンは、弱毒化哺乳動物ＭＰＶを含む。理論に拘泥するものではないが、ウイルスタンパク質が宿主の細胞質膜に挿入され、それによって免疫応答を刺激するので、弱毒化ウイルスによって細胞から新しい感染性ウイルス粒子を発生させることができない場合であっても、弱毒化ウイルスをワクチンとして有効にすることができる。
【０３４８】
本発明のこの態様の別の実施形態においては、キメラウイルスを「死滅」させる従来の技法を使用して、不活性ワクチン製剤を調製することができる。不活性ワクチンは、その感染力が失われているという意味で「死んで」いる。ウイルスの感染力は、その免疫原性に影響を与えずに失われることが理想的である。不活性ワクチンを調製するために、キメラウイルスをニワトリ胚の細胞培養物中又は尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心分離によって精製し、ホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトンにより不活性化し、貯蔵することができる。得られたワクチンを、通常は筋肉内に接種する。
【０３４９】
不活性ウイルスは、免疫学的応答を高めるために、適切なアジュバントと共に処方することができる。そのようなアジュバントには、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム；リゾレシチンやプルロニックポリオール、ポリアニオンなどの表面活性物質；ペプチド；油性エマルジョン；ＢＣＧやコリネバクテリウムパルヴム、ＩＳＣＯＭＳ、ビロソームなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
【０３５０】
上述のワクチン製剤を導入するのに数多くの方法を使用することができ、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、及び鼻内、及び吸入経路が含まれるが、これらに限定されない。キメラウイルスワクチン製剤は、ワクチンの設計対象である病原体の自然な感染経路を経て導入することが好ましいと考えられる。
【０３５１】
ある実施形態においては、本発明は、免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、哺乳動物ＭＰＶを含む。特定の実施形態において、免疫原性組成物はヒトＭＰＶを含む。ある実施形態において、免疫原性組成物は、弱毒化哺乳動物ＭＰＶ又は弱毒化ヒトＭＰＶを含む。ある実施形態において、免疫原性組成物はさらに、医薬品として許容可能な担体を含む。
【０３５２】
５．１３  投薬計画、投与、及び製剤
本発明は、弱毒化形態のウイルス、組換え形態のＭＰＶ及びＡＰＶ、１つ又は複数の異種又は非天然の抗原性配列を発現するキメラＭＰＶ及びＡＰＶを含めたＭＰＶ及びＡＰＶを含む、ワクチン及び免疫原性調製物を提供する。本発明のワクチン又は免疫原性調製物は、１価、あるいは２価又は３価のワクチンを含めた多価ワクチンを包含する。本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、様々なウイルス感染からの保護を行うのに有用である。特に本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、宿主を呼吸器感染症から保護する。
【０３５３】
本発明の組換えウイルス及び／又はワクチン又は免疫原性製剤は、単独で、又はその他のワクチンと組み合わせて投与することができる。本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、呼吸器合胞体ウイルスワクチンやインフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、肺炎ワクチン、リケッチアワクチン、ブドウ球菌ワクチン、百日咳ワクチン、又は呼吸器癌に対するワクチンなどであるがこれらに限定することのない、呼吸器疾患からの保護を行うその他のワクチン又は免疫原性製剤と組み合わせて投与することが好ましい。好ましい実施形態において、本発明のウイルス及び／又はワクチンは、対応年齢で推奨される小児科ワクチンと同時に投与する。例えば、２、４、又は６カ月の月齢では、本発明のウイルス及び／又はワクチンを、ＤｔａＰ（ＩＭ）、Ｈｉｂ（ＩＭ）、ポリオ（ＩＰＶ又はＯＰＶ）、及びＢ型肝炎（ＩＭ）と同時に投与することができる。１２カ月又は１５カ月の月齢では、本発明のウイルス及び／又はワクチンを、Ｈｉｂ（ＩＭ）、ポリオ（ＩＰＶ又はＯＰＶ）、ＭＭＲＩＩ（登録商標）（ＳｕｂＱ）；Ｖａｒｉｖａｘ（登録商標）（ＳｕｂＱ）、及びＢ型肝炎（ＩＭ）と同時に投与することができる。本発明の方法と共に使用することができるワクチンは、様々な文献、例えばその内容全体を参照により本明細書に援用するThe Jordan Report 2000、Division of Microbiology and Infectious Diseases、National Institute of Allergy and Infectious Diseases、National Institutes of Health、United Statesで検討されている。
【０３５４】
本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、そのものを、あるいは医薬品又は治療用組成物の形態で被験体に投与することができる。本発明のアジュバント及び免疫原性抗原（例えばウイルス、キメラウイルス、変異ウイルス）を含む医薬品組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスを用いて製造することができる。医薬品組成物は、本発明の免疫原性抗原を医薬品として使用することのできる調製物に処理するのを容易にする、１つ又は複数の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤を使用した、従来の手法で処方することができる。適正な製剤は、とりわけ選択される投与経路に応じて異なる。
【０３５５】
本発明のワクチン又は免疫原性組成物がアジュバントを含み、あるいは１つ又は複数のアジュバントと共に投与する場合、使用することができるアジュバントには、無機塩アジュバント、又は無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、及び免疫刺激性アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。アジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、スクアレン又はスクアレン水中油アジュバント製剤、生分解性及び生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイドグリコシド又はサポニン（例えば、ＳＴＩＭＵＬＯＮ、ＩＳＣＯＰＲＥＰという商標でも販売されているＱｕｉｌＡ及びＱＳ−２１）、Ｎ−アセチル−ムラミル−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ＴＥＲＭＵＲＴＩＤＥという商標で販売されているＴｈｒｅｏｎｙｌ−ＭＤＰ）、ＬＰＳ、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬという商標で販売されている３Ｄ−ＭＬＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３５６】
本発明のワクチン又は免疫原性組成物を投与する被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトであるが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えばニワトリ、シチメンチョウ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、げっ歯類を含むがこれらに限定されないヒト以外の動物であってもよい。
【０３５７】
本発明のワクチン又は免疫原性組成物を導入するには、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、鼻内、及び吸入経路を含むがこれらに限定されない数多くの方法を使用することができ、また乱刺（例えば二又状の針（bifurcated needle）を使用して皮膚の最上層を掻爬する）によって導入することができる。
【０３５８】
局所投与では、当技術分野で知られているように、本発明のワクチン又は免疫原性調製物を、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液などとして処方することができる。
【０３５９】
鼻内又は吸入による投与では、本発明により使用される調製物を、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切な気体を用いて、加圧パック又はネブライザからエアロゾルスプレイを噴出させる形で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量分が送達されるように弁を設けることにより決定することができる。例えば吸入器又は注入器で使用されるゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物の粉末混合物及びラクトースやデンプンなどの適切な粉末基材を含有するものを処方することができる。
【０３６０】
注射の場合、ワクチン又は免疫原性調製物は、水溶液として処方することができ、好ましくはハンクス液やリンガー液、生理食塩水などの、生理学的に適合性のある緩衝液として処方することができる。この溶液は、懸濁剤や安定剤、及び／又は分散剤などの、処方可能な薬剤を含有してよい。あるいはタンパク質は、使用前に、例えば滅菌した発熱性物質を含まない水などの適切な賦形剤と共に構成するために、粉末形態にすることができる。
【０３６１】
投与するためのワクチン又は免疫原性製剤の有効な量の決定は、特に本明細書に記載される詳細な開示に照らし、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３６２】
有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで最初に推定することができる。例えば、ある用量は、当技術分野で周知の技法を使用して、免疫応答の誘発を実現させるために動物モデルで処方することができる。当業者なら、本明細書で述べる結果に基づいて、全ての動物種への投与を容易に最適化することができよう。投薬量及び投薬間隔は、個々に調節することができる。例えば免疫原性組成物として使用する場合、適切な用量とは、上述のように投与したときに抗体応答を誘発することが可能な組成物の量である。ワクチンとして使用する場合、本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、１〜３６週間で約１〜３回の服用として投与することができる。好ましくは、約２週間〜約４カ月の間隔で１回又は２回服用として投与し、その後周期的にブースターワクチン接種を行ってよい。個々の動物には代替のプロトコルが相応しい。適切な用量とは、上述のように投与したときに、免疫化した動物が少なくとも４〜１２カ月間感染から保護されるよう、その動物の免疫性応答を十分高めることが可能なワクチン製剤の量である。一般に、１回の用量に含まれる抗原の量は、宿主１ｋｇ当たり約１ｐｇから約１００ｍｇにわたり、典型的な場合は約１０ｐｇから約１ｍｇにわたり、好ましくは約１００ｐｇから約１μｇにわたる。適切な用量範囲は、注入経路及び患者のサイズと共に変化することになるが、典型的な場合、約０．１ｍＬから約５ｍＬにわたる。
【０３６３】
特定の実施形態において、本発明のウイルス及び／又はワクチンは、開始時の単回用量を少なくとも１０３ＴＣＩＤ５０、少なくとも１０４ＴＣＩＤ５０、少なくとも１０５ＴＣＩＤ５０、少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０として投与する。別の特定の実施形態において、本発明のウイルス及び／又はワクチンは、複数回用量として投与する。好ましい実施形態においては、２、４、及び６カ月の月齢では１次投薬計画を使用し、生後２年目の開始時にはブースター用量を使用する。複数回投薬計画では、各用量が少なくとも１０５ＴＣＩＤ５０又は少なくとも１０６ＴＣＩＤ５０とであることがより好ましい。
【０３６４】
５．１３．１  チャレンジ調査
このアッセイを使用して、本発明の組換えウイルス及び本発明のワクチンが、コットンラットやハムスターなどを含むがこれらに限定されない動物モデル系の下気道ウイルス感染を予防できるかどうか決定する。組換えウイルス及び／又はワクチンは、静脈内（ＩＶ）経路によって、筋肉内（ＩＭ）経路によって、又は鼻内経路（ＩＮ）によって投与することができる。組換えウイルス及び／又はワクチンは、当業者に周知の任意の技法によって投与することができる。このアッセイは、抗体が結合する肺のウイルス力価の減少に、抗体の血清濃度を相関させるのにも使用する。
【０３６５】
第０日目、コットンラット（Sigmodon hispidis、平均１００ｇ）カニクイザル（平均重量２．０ｋｇ）などであるがこれらに限定されない動物群に、筋肉内注射によって、又は静脈内注射によって、又は鼻内経路によって、対象の組換えウイルス又はキメラウイルス又はワクチン、あるいはＢＳＡを投与する。本発明の組換えウイルス又はワクチンを投与する前に、あるいは投与と同時に、あるいは投与した後に、野生型ウイルス、すなわち生成されたワクチンの対象であるウイルスを、動物に感染させる。ある実施形態においては、本発明の組換えウイルス及び／又はワクチンを投与した後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、１週間、又は１カ月以上経てから、動物に野生型ウイルスを感染させる。
【０３６６】
感染後、コットンラットを犠牲にし、その肺組織を収集し、プラーク力価測定によって肺性ウイルス力価を決定する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇ／ｋｇを陰性対照として使用する。上記組換えウイルス又はワクチン投与時の血清中の抗体濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定する。同様にマカクでも、鼻及び肺の洗浄液中のウイルス力価を測定することができる。
【０３６７】
５．１３．２  標的集団
本発明のある実施形態においては、本発明の治療及び診断法を目的とした標的集団を、年齢によって定義する。ある実施形態においては、本発明の治療及び／又は診断法を目的とした標的集団は、呼吸器感染の他に疾患又は障害を特徴とする。
【０３６８】
特定の実施形態において、標的集団は、２才未満の幼児を包含する。より具体的な実施形態において、２才未満の子供は呼吸器感染以外の病気に罹っていない。
【０３６９】
その他の実施形態において、標的集団は、５才を超える年齢の患者を包含する。より具体的な実施形態において、５才を超える年齢の患者は、嚢胞性線維症、白血病、及び非ホジキンリンパ腫を含めた別の疾患又は障害に罹っており、あるいは最近、骨髄又は腎臓移植を受けている。
【０３７０】
本発明の特定の実施形態において、標的集団は、ｈＭＰＶ感染が宿主の免疫抑制に関連している被験体を包含する。特定の実施形態において、被験体は、免疫無防備状態の個体である。
【０３７１】
ある実施形態において、本発明の方法を目的とした標的集団は、高齢者を包含する。
【０３７２】
特定の実施形態において、本発明の方法により治療し又は診断する被験体は、冬季数カ月でｈＭＰＶに感染したものである。
【０３７３】
５．１３．３  臨床試験
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及び動物モデルで試験をする本発明のワクチン又はその断片は、さらに、健常な成人志願者群において、安全性、耐性、及び薬物動態について調べることができる。志願者に、筋肉内、静脈内、又は肺送達系によって、単回用量の本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンを投与する。単回用量の本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンを受ける前に少なくとも２４時間、各志願者をモニターし、その投与を受けた後少なくとも４８時間は、各志願者の臨床部位をモニターする。次いで志願者を、外来患者として投与後３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、及び５６日目にモニターする。
【０３７４】
血液サンプルを、留置カテーテル又は直接静脈穿刺により１０ｍｌの赤いキャップ（red-top）の採血管（Vacutainer tube）を使用して、以下の間隔で、すなわち：（１）服用量の本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンを投与する前；（２）服用量の本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンを投与している間；（３）服用量の本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンを投与してから５分、１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、及び４８時間後；（４）服用量の本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンを投与してから３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、及び５６日後に収集する。サンプルを室温で凝固させ、遠心分離後に血清を収集する。
【０３７５】
患者由来のサンプル中の、本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンに対して生成された抗体の量は、ＥＬＩＳＡによって定量することができる。ＰＢＭＣ中、及び肺及び鼻の洗浄液中のＴ細胞免疫性（細胞障害性及びヘルパー応答）もモニターすることができる。
【０３７６】
志願者の血清中の抗体レベルの濃度は、服用量の本発明の組換えウイルス及び／又は本発明のワクチンを投与した後それぞれの収集間隔での血清レベルから投与前の血清レベル（バックグラウンドレベル）を差し引くことによって、補正する。各志願者ごとに、補正された血清抗体又は抗体断片濃度から、モデル依存型手法（Gibaldi他編、1982、Pharmacokinetics、第2版、Marcel Dekker、New York）に従い薬物動態パラメータを算出する。
【０３７７】
５．１４  哺乳動物ＭＰＶを検出及び診断するための方法
本発明は、ＭＰＶを診断及び／又は検出する手段及び方法を提供し、前記手段及び方法は、ＭＰＶ及びその構成要素と、その転写、翻訳、発現、増殖、及び代謝プロセスの産物の検出に用いられるものである。より詳細には、本発明は、動物及びヒトのＭＰＶ感染を診断する手段及び方法を提供し、前記手段及び方法には、ＭＰＶの構成要素、ＭＰＶのライフサイクルによる産物、及びＭＰＶ曝露又は感染に対する宿主の応答による産物の検出が含まれるが、これらに限定するものではない。
【０３７８】
ＭＰＶ又はその構成要素、並びにその転写、翻訳、発現、増殖及び代謝過程の産物を検出するために用いることができる方法は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、分子に基づく方法、抗体に基づく方法、細胞に基づく方法が挙げられる。分子に基づく方法の例としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、オリゴヌクレオチドプローブ検出、サザンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、サンプルとＭＰＶに相補的な又はＭＰＶと類似若しくは同一の核酸とを接触することを含む任意の方法、並びにこれらの方法の組合せ又は当技術分野の方法との組合せが挙げられる。使用しうる同一又は類似の核酸は本明細書に記載しており、また当業者に周知であり、ＭＰＶと、他のウイルス及び生物のゲノム物質又は関連する産物とを区別することが可能である。抗体に基づく方法の例としては、限定されるものではないが、抗体とＭＰＶの含有が疑われるサンプルとを接触させること、直接免疫蛍光法（ＤＩＦ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、イムノクロマトグラフィが挙げられる。細胞に基づく方法の例としては、限定されるものではないが、ＭＰＶ、その構成要素又はその産物に曝露された場合にシグナルを放出することができるレポーターアッセイが挙げら得る。別の実施形態において、レポーターアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイであり、それによりリポーターがＭＰＶ、その構成要素又はその産物に曝露された際に発現される。上記方法の例は当技術分野で周知であり、本明細書にも記載している。より具体的な実施形態において、ＮＡＳＢＡを用いて、総核酸のプールから特異的なＲＮＡ又はＤＮＡを増幅する。
【０３７９】
一実施形態において、本発明は、ＭＰＶを診断及び検出する手段及び方法であって、前記手段及び方法が、ＭＰＶに関連し又はＭＰＶに相補的なゲノム物質及びその他の核酸の検出と、処理済みであるものと未処理であるものの両方の、ＭＰＶの転写産物及び翻訳産物の検出と、ＭＰＶへの曝露又は感染に対する宿主応答の構成要素の検出を含むがこれらに限定されないものを提供する。
【０３８０】
一実施形態において、本発明は、核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチド、及びＭＰＶのゲノム内に存在する核酸配列の転写産物を、調製しかつ使用することによるＭＰＶの検出に関する。さらに本発明は、ＭＰＶゲノム及びその転写物の特定領域をコピーし又は増幅するために前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＭＰＶのゲノム及びその転写産物内に存在する核酸又はその配列を検出することに関する。コピーし又は増幅することができるＭＰＶゲノム及びその転写物の領域には、以下の物質、すなわちＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、及びＬ遺伝子の１つ又は複数の完全及び不完全伸長部が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、同定を行うために、ＭＰＶのＮ遺伝子又はその転写物をコピーし又は増幅する方法と併せてオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する。前記方法には、ＰＣＲアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ、プライマー伸長又はランオンアッセイ（run on assay）、ＮＡＳＢＡ、ＭＰＶの遺伝物質あるいはその転写物又は相補体を前記オリゴヌクレオチド由来の核酸配列伸長用の鋳型として用いるその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態においては、方法を組み合わせて用いてサンプル中のＭＰＶの存在を検出する。当業者であれば、各アッセイの必要条件及び適用性に精通しているはずである。例えば、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲは、核酸の増幅又は検出に有用でありうる。より具体的な実施形態において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲ産物の慣用のかつ信頼性ある定量に使用される。
【０３８１】
別の実施形態においては、本発明は、核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドと、ＭＰＶのゲノム内に存在する核酸配列の転写産物とを調製し使用することによってＭＰＶを検出することに関する。さらに本発明は、ＭＰＶゲノム及びその転写物内にあり又はそれらに相補的な特定領域にハイブリダイゼーションしかつその特定領域を検出するためのプローブとして前記オリゴヌクレオチド配列を使用して、ＭＰＶのゲノム及びその転写産物中に存在し又はそれらに相補的な核酸又はその配列を検出することに関する。ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができるＭＰＶゲノム及びその転写物の領域には、以下の物質、すなわちＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、及びＬ遺伝子の１つ又は複数の完全及び不完全伸長部が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、同定を行うため、ＭＰＶのＮ遺伝子又はその転写物を検出し、アニールし、又はそれらにハイブリダイズする方法と併せて、オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。前記方法には、ノーザンブロット、サザンブロットと、ＭＰＶゲノム内にあり又はＭＰＶゲノムに相補的な配列又は配列伸長部をハイブリダイゼーションし、アニールし、又は検出するために標的としてＭＰＶの遺伝物質又はその転写物及び補体を用いるその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０３８２】
哺乳動物ＭＰＶの核酸又はその逆相補体又はその相補体にハイブリダイズ可能な核酸を本発明で使用して、哺乳動物ＭＰＶの存在を検出することができる。ある実施形態においては、核酸を高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。限定しようとするのではなく一例として、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する手順は以下の通りである。ＤＮＡを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液中、６５Ｃで８時間から一晩かけて実施する。フィルタを、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、６５Ｃで４８時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄を、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、及び０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７Ｃで１時間行う。この後、０．１×ＳＳＣ中５０Ｃで４５分間洗浄し、その後オートラジオグラフィにかける。使用することが可能なその他の高ストリンジェンシー条件は、当技術分野で周知である。本発明のその他の実施形態においては、ハイブリダイゼーションを、当業者に周知であるような穏かな低ストリンジェンシー条件下で実施する（例えばSambrook他、1989、Molecular Cloning、A Laboratory Manual第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York参照; またAusubel他編、the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals、1987〜1997、Current Protocols、(著作権) 1994〜1997 John Wiley and Sons,Inc.も参照）。
【０３８３】
任意のサイズのオリゴヌクレオチドを本発明の方法において用いることができる。本明細書に記載するように、そのようなオリゴヌクレオチドは、種々の方法、例えば種々の検出又は分析手順におけるプライマー又はプローブとして有用である。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、少なくとも５塩基、少なくとも８塩基、少なくとも１０塩基、少なくとも１２塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも３５塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも４５塩基、少なくとも５０塩基、少なくとも５５塩基、少なくとも６０塩基、少なくとも７０塩基、少なくとも８０塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも２００塩基、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも１０００塩基、少なくとも２０００塩基、少なくとも３０００塩基、少なくとも４０００塩基、又は少なくとも５０００塩基である。別のより特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、ＭＰＶゲノム配列又はその相補配列などの標的配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％の相同性を有する、少なくとも５塩基、少なくとも８塩基、少なくとも１０塩基、少なくとも１２塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも３５塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも４５塩基、少なくとも５０塩基、少なくとも５５塩基、少なくとも６０塩基、少なくとも７０塩基、少なくとも８０塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも２００塩基、少なくとも３００塩基、少なくとも４００塩基、少なくとも５００塩基、少なくとも１０００塩基、少なくとも２０００塩基、少なくとも３０００塩基、少なくとも４０００塩基、又は少なくとも５０００塩基を含む。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も３’末端の塩基の少なくとも８塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も３’末端の塩基の少なくとも１０塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も３’末端の塩基の少なくとも１２塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も３’末端の塩基の少なくとも１５塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も３’末端の塩基の少なくとも２０塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の具体的な実施形態において、プライマー又はプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、任意の長さのものであり、標的配列のその最も３’末端の塩基の少なくとも２５塩基において、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、特異的な位置又はヌクレオチドが置換されるようにオリゴの縮重セットを用いる。縮重は、標的配列に対しストリンジェントな条件でハイブリダイズする領域内の、任意の位置又は任意の数の位置で生じてもよく、最も好ましくは少なくとも１つの位置で生じるが、さらに少なくとも２つの位置、少なくとも３つの位置、少なくとも１０の位置で生じてもよい。
【０３８４】
当業者であれば、当技術分野で公知のアッセイによってオリゴヌクレオチドの構造上の必要条件を十分に理解しうる。また、より体系的な手法を用いてオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを設計することも可能である。例えば、当業者であれば、好ましいアッセイに基づいてオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブの適当な長さ及び配列を、アニーリング温度及びオリゴの構造（すなわち配列）を決定しうる。さらに当業者であれば、標的配列に対するオリゴの特異性を温度に応じて高める又は低減するために、アッセイの温度を調節することによりオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブを用いたアッセイの特異性を決定しうる。好ましい実施形態において、プライマー又はプローブのアニーリング温度を、当技術分野で公知の方法を用いて決定し、アッセイを当該アニーリング温度にて実施する。当業者であれば、その特異的な標的配列に対するオリゴヌクレオチドに関連するアニーリング温度を計算する方法に精通している。
【０３８５】
例えば、アニーリング温度は、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにおける各Ｇ又はＣヌクレオチドに対してアニーリング温度に４℃を割り当てることによって大まかに計算することができる。別の例において、アニーリング温度は、標的配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにおける各Ａ又はＴヌクレオチドに対してアニーリング温度に２℃を割り当てることによって大まかに計算することができる。オリゴヌクレオチドのアニーリング温度は、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、並びに標的配列に対するオリゴの相補性に応じて必ずしも異なるものではなく、オリゴプライマー又はプローブとの結合事象のみがアニーリング温度に影響する。本明細書に記載のアニーリング温度の計算例は、例示を意味し、他のアニーリング温度の決定方法から本発明を限定することを意味するものではない。当業者であれば使用可能な他の方法に精通しており、そしてまたオリゴヌクレオチドのアニーリング又は融解温度を計算するための他のより最新の方法が本明細書に記載されている。より具体的な実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、少なくとも７０℃、少なくとも８０℃、少なくとも９０℃、又は少なくとも９９℃の温度でアニーリングする。
【０３８６】
本発明は、サンプル中のＭＰＶを同定又は検出するための細胞系アッセイ及び無細胞アッセイを提供する。本発明の細胞系アッセイ及び無細胞アッセイを実施するために種々の方法、例えば限定されるものではないがレポーターを用いる方法を用いることができる。
【０３８７】
レポーターの例は本明細書に記載しており、ハイスループットスクリーニングを用いてＭＰＶを同定又は検出するため、そして当業者に周知の他の任意の目的のために用いることができる。本発明のレポーターアッセイにおいてはいくつかの方法を用いることができる。例えば、細胞系アッセイは、サンプルとレポーター遺伝子を含む核酸配列を含有する細胞とを接触させ（ここでレポーター遺伝子はＭＰＶ遺伝子のプロモーターと結合しているか又はＭＰＶ遺伝子産物により認識されるプロモーターと結合している）、ＭＰＶ又はＭＰＶの構成要素への曝露の際にレポーター遺伝子の発現を測定することにより実施しうる。細胞系アッセイのさらなる実施形態において、ＭＰＶが感染しうる宿主細胞は、１以上のレポーター遺伝子をコードする核酸構築物でトランスフェクトし、その結果、該レポーター遺伝子からの発現がＭＰＶ又はＭＰＶ構成要素の存在下で生じる。そのような実施形態において、レポーター遺伝子の発現は、ＭＰＶ又はその構成要素により認識される核酸配列と機能的に結合し、それによりレポーター遺伝子の発現が生じる。サンプル中のＭＰＶの存在は、当技術分野で公知でありまた本明細書（セクション５．８．２）に記載する任意の方法を用いて検出することができるレポーター遺伝子の発現を誘導する。細胞系検出アッセイにおいて検出され用いられる宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、Ｖｅｒｏ、ｔＭＫ、ＣＯＳ７細胞がある。別の実施形態において、宿主細胞は、ＭＰＶを感染させうる任意の細胞である。それによりレポーター遺伝子の発現は、ＭＰＶ又はその構成要素の存在の指標となる。無細胞アッセイにおいて、サンプルは核酸配列と機能的に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸と接触させ、その結果、ＭＰＶ又はその構成要素の存在がｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレポーター遺伝子の発現を誘導する。例えば、無細胞アッセイは、ＭＰＶ又はその構成要素を含有することが疑われるサンプルとレポーター遺伝子を含む核酸とを接触させ（ここでレポーター遺伝子はＭＰＶのプロモーターと結合しているか又はＭＰＶ遺伝子産物により認識されるプロモーターと結合されている）、ＭＰＶ又はＭＰＶの構成要素への曝露の際にレポーター遺伝子発現を測定することにより実施し得る。それによりレポーター遺伝子の発現は、ＭＰＶ又はその構成要素の存在の指標となる。多数のレポーター化合物が当技術分野で公知であり、種々の例を本明細書において提供する（例えばセクション５．８．２参照）。
【０３８８】
別の実施形態において、本発明は、ミニレプリコン系を用いたＭＰＶ感染の検出に関する。例えば、宿主細胞を、１以上のレポーター遺伝子をコードするｈＭＰＶミニレプリコン構築物でトランスフェクトし、それによりｈＭＰＶ又はｈＭＰＶポリメラーゼの存在下でレポーター遺伝子からの発現が生じるようにする。レポーター遺伝子の例は、本明細書のセクション５．８．２に記載する。そのような実施形態において、ｈＭＰＶは、ミニレプリコン系によりコードされる１若しくは複数のレポーター遺伝子の発現を促進するようヘルパーウイルスとして作用する。
【０３８９】
何らかの制限に拘束されるものではないが、ｈＭＰＶは、ミニレプリコン系のレスキューを駆動し、それゆえ１若しくは複数のレポーター遺伝子の発現を駆動するポリメラーゼを提供する。特定の実施形態において、レポーター遺伝子をコードする、ｈＭＰＶミニレプリコンでトランスフェクトされた宿主細胞を、ｈＭＰＶを含有することが疑われるサンプルと接触させる。サンプル中のｈＭＰＶの存在が、当技術分野で公知でありまた本明細書（セクション５．８．２）に記載する任意の方法を用いて検出することができるレポーター遺伝子の発現を誘導する。宿主細胞の例としては、限定されるものではないが、Ｖｅｒｏ、ｔＭＫ、ＣＯＳ７細胞がある。別の実施形態において、宿主細胞は、ＭＰＶを感染させうる任意の細胞である。
【０３９０】
別の実施形態においては、本発明は、ＭＰＶ又はその遺伝子産物に特有のペプチド又は核酸に特異的でありそれらを認識することができる抗体、例えばモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、調製し使用することによって、動物又はヒト宿主におけるＭＰＶ感染を検出することに関する。前記ＭＡｂによって認識されたエピトープ又は抗原決定基には、ＭＰＶの増殖に関わるライフサイクル及び代謝プロセス中に合成されるタンパク様及び核酸産物が含まれるが、これらに限定されない。適切な抗体を生成するために抗原決定基として使用することができるタンパク様又は核酸産物には、ＭＰＶの以下の構成要素、すなわちＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、及びＬ遺伝子の１つ又は複数の完全及び不完全な転写及び発現産物が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態においては、生物学的サンプル中、例えば体液中に、ＭＰＶ発現Ｇペプチドが存在するかどうかを検出し又は確認するその他の方法と併せて、Ｇ遺伝子又はその一部のタンパク様産物に対して産生されたＭＡｂを使用する。前記方法には、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノ又は競合アッセイ、免疫沈降と、転写され又は発現したＭＰＶの遺伝子産物を標的として用いて前記標的又はその一部及び類縁体に対して産生されたＭＡｂによって検出を行うその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の別の実施形態においては、ｈＭＰＶの検出に使用しうる抗体は、４つのサブタイプ全てのＦ、Ｇ、Ｎ、Ｌ、Ｍ、Ｍ２−１、Ｐ及びＳＨタンパク質を認識する。
【０３９１】
別の実施形態においては、本発明は、ＭＰＶへの曝露又は感染に対する宿主の免疫応答に関連し、またそのような応答に特有のものである因子を検出することに関する。ＭＰＶに曝露され又は感染すると、宿主の免疫系は前記曝露又は感染に対する応答を誘発するが、これは、ウイルスの作用及び／又は増殖を排除し又は弱めることを目標とした抗体の宿主による生成を伴うものである。本発明は、宿主がＭＰＶに曝露され又は感染することにより生成される前記抗体を検出することによって、ＭＰＶに関連する疾患を診断する手段及び方法を提供する。前記抗体によって認識されるエピトープには、ペプチドとその露出した表面、すなわち宿主の免疫応答を受け易く、かつウイルスに対する宿主の免疫応答発生の際に抗原決定基として働くことのできる表面が含まれるが、これらに限定されない。抗体を生成するためのエピトープとして、宿主の免疫応答によって使用されるタンパク様及び核物質の一部には、ＭＰＶの以下の構成要素、すなわちＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、及びＬ遺伝子の１つ又は複数の産物が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態においては、ＭＰＶのＮ遺伝子コード化ペプチドの、部分的に又は完全に接触可能な部分に対する抗体を、宿主サンプル中で検出する。特定の実施形態においては、生物学的サンプル中、例えば体液中に、宿主由来の抗体が存在するかどうかを検出するその他の方法と併せて、Ｇ遺伝子又はその一部のタンパク様産物を使用する。前記方法には、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノ又は競合アッセイと、その他の方法、すなわち転写され又は発現したＭＰＶの遺伝子産物を標的として用い、前記産物を認識しかつ生物学的サンプル中に見出される宿主抗体によって検出を行うその他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０３９２】
また本発明は、診断アッセイ又は試験キットに関する手段及び方法と、生物学的サンプル、例えば体液を含むがこれらに限定されない様々な供給源からＭＰＶ感染物質を検出する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＭＰＶの核酸又はその相補体を同定するのに適したアッセイ、キット、プロトコル、及び手順に関する。別の実施形態では、本発明は、ＭＰＶ発現ペプチド又はその一部を同定するのに適したアッセイ、キット、プロトコル、及び手順に関する。別の実施形態では、本発明は、ＭＰＶへの曝露又は感染に対する宿主免疫応答の構成要素を同定するのに適したアッセイ、キット、プロトコル、及び手順に関する。
【０３９３】
宿主のＭＰＶ感染の診断確認の他、本発明は、ＭＰＶ分離株を異なる系統学上の群又はサブグループに分類する手段及び方法も提供する。一実施形態では、より有効でサブグループに特異的な治療を設計するために、この特徴を有利に使用して、種々のＭＰＶ変種、変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２を区別することができる。ＭＰＶの変種は、以下の物質、すなわちＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子、及びＬ遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸配列に基づいて差別化することができる。特定の実施形態で、ＭＰＶは、Ｇタンパク質又は糖タンパク質のヌクレオチド又はアミノ酸配列と、Ｇ糖タンパク質も認識するモノクローナル抗体を使用した中和試験とを使用して、特定のサブグループに差別化することができる。
【０３９４】
一実施形態において、ヒトにおけるＭＰＶ感染の診断は、当業者に周知の任意の技法、例えばイムノアッセイを使用して行う。免疫特異的結合及び交差反応性を分析するのに使用することができるイムノアッセイには、２〜３の例を挙げると、ウェスタンブロットやラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、蛍光イムノアッセイなどの技法を使用した競合及び非競合アッセイ系が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは日常的なもので、当技術分野で周知であり（例えば、その全体を参照により本明細書に援用するAusubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、Vol.1、John Wiley&Sons,Inc.、New York参照）、イムノアッセイの非限定的な例をセクション５．８に記載する。
【０３９５】
一実施形態において、本発明は、ＭＰＶゲノムの領域、例えばＮ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、及びＭ２遺伝子などの遺伝子又は遺伝子の一部であるがこれらに限定されないものが含まれるＭＰＶゲノムの領域をコピーし又は増幅するＰＣＲ又はプライマー伸長法と共に、オリゴヌクレオチドを使用して、ＭＰＶ感染を検出することに関する。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチドをＲＴ−ＰＣＲ法と併せて使用する。他の実施形態においては、増幅産物及び／又は遺伝物質を、様々なｈＭＰＶ株の間に保存され又は様々なｈＭＰＶ株の中で明らかに異なる特定の配列に相補的なオリゴヌクレオチドでプローブ検出することができる。後者の組のオリゴヌクレオチドにより、宿主の感染の原因であるｈＭＰＶの特定の株を同定することが可能になる。
【０３９６】
本発明は、宿主に感染することが可能なｈＭＰＶの種々のサブグループ及び変種を区別する方法を提供する。ある特定の実施形態においては、宿主感染の原因であるｈＭＰＶを、特定のサブグループ、例えばサブグループＡ又はサブグループＢに分類する。別の特定の実施形態においては、宿主感染の原因であるｈＭＰＶを、サブグループの特定の変種、例えば変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２として分類する。別の実施形態においては、本発明は、宿主感染の原因であるｈＭＰＶを新しいサブグループに、かつ／あるいは新しく又は既存のサブグループの新しい変種に分類する手段及び方法を提供する。ｈＭＰＶ株をサブグループ及び／又は変種のグループに分類することができる方法は、当業者に知られている。一実施形態においては、感染の病因物質がｈＭＰＶ株であると特定するのにポリクローナル抗体を使用し、前記株がｈＭＰＶの新しく又は知られているサブグループ及び／又は新しく又は知られている変種に特有のものであると識別するのに二次抗体を使用する。一実施形態においては、ｈＭＰＶに対して選択的な抗体を、免疫反応アッセイ、例えばＥＬＩＳＡやＲＩＡと併せて使用し、それによって、生物学的サンプル中のｈＭＰＶへの曝露又は感染の存在を特定する。他の実施形態においては、ｈＭＰＶタンパク質のペプチド配列中の特定のエピトープに対して選択的な二次抗体を使用することにより、前記特定されたｈＭＰＶ感染の病因物質をさらにサブグループ又は変種に分類する。ある特定の実施形態では、ｈＭＰＶの全てのサブグループの間で共用されるペプチドエピトープに対して産生された抗体を使用して、感染の病因物質がｈＭＰＶであると特定する。他の特定の実施形態では、ｈＭＰＶの種々のサブグループ及び／又は変種にそれぞれ固有のペプチドエピトープに対して産生された抗体を使用して、宿主感染の原因であるｈＭＰＶを、既知の又は新しいサブグループ及び／又は変種に分類する。ある特定の実施形態において、ｈＭＰＶの種々のサブグループ及び／又は変種を区別することができる抗体は、サブグループ又は変種に固有のｈＭＰＶペプチドのセグメントを認識する。前記ペプチドには、Ｎ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、及びＭ２遺伝子によってコードされたものが含まれるが、これらに限定するものではない。種々のｈＭＰＶサブグループ又は変種同士を区別することが可能な抗体を生成するのに使用することができるペプチド又はペプチドのセグメントは、様々なｈＭＰＶタンパク質の既知のペプチド配列中の相違と共に、診断アッセイで曝露され又は接触可能な溶媒であることが期待される適切なペプチドセグメントを同定する親水性プロットを使用して、選択することができる。一実施形態において、ｈＭＰＶの種々のサブグループ同士を区別することが可能な抗体は、ｈＭＰＶの種々のサブグループに固有のＦタンパク質における相違、例えば、完全長Ｆタンパク質の２８６位、２９６位、３１２位、３４８位、及び４０４位のアミノ酸を認識する。別の特定の実施形態において、ｈＭＰＶの種々のサブグループ及び／又は変種同士を区別することが可能な抗体は、特定のサブグループ又は変種に固有であるｈＭＰＶのＧタンパク質のセグメントを認識し、例えば、配列番号１１９のアミノ酸５０から６０までに対応するＧペプチド配列を使用して、サブグループＡとＢを区別し、同様に変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２を区別することができる。本発明の別の実施形態においては、ｈＭＰＶ分離株のヌクレオチド配列を使用して、ｈＭＰＶの種々のサブグループ及び／又は種々の変種同士を区別する。一実施形態においては、当業者に知られている方法、例えばＲＴ−ＰＣＲやＰＣＲ、プライマーランオンアッセイ、及び様々なブロット技法と共に、ｈＭＰＶゲノム内の配列に相補的なオリゴヌクレオチド配列、プライマー、及び／又はプローブを使用して、ｈＭＰＶ感染の病因物質を別個のサブグループ及び／又は変種に分類する。ある特定の実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲを使用してｈＭＰＶゲノムの特定のセグメントをコピーし複製するのに、生物学的サンプルを使用する。他の実施形態では、前記セグメントの配列を得、既知のｈＭＰＶ配列と比較し、前記比較を使用して、ｈＭＰＶ株を別個のサブグループ又は変種として単離し、あるいはｈＭＰＶ株を新しいサブグループ又は変種に分類する。別の実施形態では、本発明は、ｈＭＰＶの種々のサブグループ及び／又は変種同士を区別するのに使用することが可能な診断キットに関する。
【０３９７】
好ましい実施形態において、特定のウイルス感染の診断及び／又は治療は、前記感染を引き起こす前記特定のウイルスに最も特異的な試薬を用いて行う。この場合、ＭＰＶ感染の前記診断及び／又は治療は、ＭＰＶに最も特異的な試薬を用いて行うことが好ましいことを意味する。しかしこれは、特異性が低いが十分な交差反応性を有する試薬を、より容易に入手可能で当面の課題に十分対処できるなどの理由で代わりに使用する可能性を、決して排除するものではない。本明細書では、例えば、哺乳動物におけるＭＰＶ感染のウイルス学的及び／又は血清学的な診断を、ＡＰＶ由来の試薬、特にＡＰＶ−Ｃ由来の試薬を用いて行うことを提供し、本明細書の詳細な記述では、例えば、トリのＡＰＶ抗体が検出されるよう特異的に設計されたＥＬＩＳＡを使用することによって、哺乳動物におけるＭＰＶ感染の十分に信頼できる血清学的診断を実現できることが示されている。このために特に有用な試験は、ＡＰＶ抗体（例えば血清又は卵黄中）を検出するように設計されたＥＬＩＳＡ試験であり、その市販されているものの１つは、SVANOVA Biotech AB、Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala、スウェーデンにより作製されたＡＰＶ−Ａｂ  ＳＶＡＮＯＶＩＲ（登録商標）として知られている。逆の状況についても言えるが、その場合は例えば、哺乳動物におけるＡＰＶ感染のウイルス学的及び／又は血清学的診断を、ＭＰＶ由来の試薬を用いて行うことが提供され、本明細書の詳細な記述では、例えば、ＭＰＶ抗体が検出されるように設計されたＥＬＩＳＡを使用することによって、トリのＡＰＶ感染の十分信頼性ある血清学的診断を実現できることが示されている。抗原及び抗体が鍵と鍵穴の関係を有することを考えると、様々な抗原の検出は、十分な交差反応性を有する適切な抗体を選択することによって実現することができる。当然ながら、そのような交差反応性を利用する場合、様々なウイルスの様々な（糖）タンパク質間に存在するアミノ酸の相同性に基づいて試薬（抗原や抗体など）を選択することが最良であり、その場合、最も相当性の高いタンパク質に関する試薬が、前記交差反応性を利用する試験で使用するのに最も有用になる。
【０３９８】
核酸の検出ではさらに簡単であり、様々なウイルスの異種核酸配列に基づいてプライマー又はプローブを設計し、したがって本質的に哺乳動物又はトリのメタニューモウイルス同士の相違を検出する代わりに、高い相同性を示すウイルス特異的核酸配列の伸長部に基づいてプライマー又はプローブを設計し又は選択すれば十分である。一般に核酸配列の場合、相同性％が９０％以上であると、十分な交差反応性が、ハイブリダイゼーションのストリンジェント条件を利用する診断試験で利用されることが保証される。
【０３９９】
本発明は例えば、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトのＭＰＶ感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記動物サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を、前記サンプルと本発明によるＭＰＶ特異的核酸又は抗体とを反応させることによって決定することを含む方法と、哺乳動物のＭＰＶ感染を血清学的に診断する方法であって、前記哺乳動物サンプル中の、ＭＰＶ又はその構成要素を特異的に対象とする抗体の存在を、前記サンプルと本発明によるＭＰＶ特異的タンパク様分子又はその断片又は抗原とを反応させることによって決定することを含む方法を提供する。また本発明は、ＭＰＶ感染を診断するための診断キットも提供し、このキットは、本発明によるＭＰＶ、ＭＰＶ特異的核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原及び／又は抗体と、好ましくは前記ＭＰＶ、ＭＰＶ特異的核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原及び／又は抗体を検出するための手段とを含み、前記手段は、例えば蛍光体などの励起しうる基又は当技術分野で使用される酵素検出系を含むものである（適切な診断キットフォーマットの例には、ＩＦ、ＥＬＩＳＡ、中和アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲアッセイが含まれる）。核酸やタンパク様分子又はその断片など、今のところまだ同定されていないウイルス構成要素又はその合成類似体がＭＰＶに特異的なものであると特定することができるかどうかを決定するには、前記構成要素の核酸又はアミノ酸配列、例えば前記核酸又はアミノ酸の伸長部、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも４０のヌクレオチド又はアミノ酸（それぞれ）を、例えば本明細書で述べるような系統学的分析を使用して、既知のＭＰＶ配列及び既知の非ＭＰＶ配列（ＡＰＶ−Ｃを使用することが好ましい）との配列相同性を比較することにより分析すれば十分である。前記ＭＰＶ又は非ＭＰＶ配列との関係の程度に応じて、構成要素又は合成類似体を同定することができる。
【０４００】
また本発明は、哺乳動物のＭＰＶ感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記哺乳動物サンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を、前記サンプルと、ＡＰＶ由来の交差反応性核酸（好ましくは血清型Ｃ）又は前記ＡＰＶと反応しやすい交差反応性抗体とを反応させることによって決定することを含む方法と、哺乳動物のＭＰＶ感染を血清学的に診断する方法であって、前記哺乳動物サンプル中の、ＡＰＶ又はその構成要素も対象とする交差反応性抗体の存在を、前記サンプルと、タンパク様分子又はその断片あるいはＡＰＶ由来の抗原とを反応させることによって決定することを含む方法を提供する。さらに本発明は、当初ＡＶＰ又はＡＶＰ抗体検出用に設計された診断キットを、ＭＰＶ感染の診断用に、特にヒトにおける前記ＭＰＶ感染の検出用に使用することを提供する。
【０４０１】
また本発明は、トリのＡＰＶ感染をウイルス学的に診断する方法であって、前記トリのサンプル中のウイルス分離株又はその構成要素の存在を、前記サンプルと、ＭＰＶ由来の交差反応性核酸又は前記ＭＰＶと反応しやすい交差反応性抗体とを反応させることによって決定することを含む方法と、トリのＡＰＶ感染を血清学的に診断する方法であって、前記トリのサンプル中の、ＭＰＶ又はその構成要素も対象とする交差反応性抗体の存在を、前記サンプルと、タンパク様分子又はその断片あるいはＭＰＶ由来の抗原とを反応させることによって決定することを含む方法を提供する。さらに本発明は、当初ＭＰＶ又はＭＰＶ抗体検出用に設計された診断キットを、ＡＰＶ感染の診断用に、特にニワトリやアヒル、シチメンチョウなど家禽における前記ＡＰＶ感染の検出用に使用することを提供する。
【０４０２】
治療に関する診断では、特に当面の状況によって、より相同性のある手法を使用することがそれほど簡単ではない場合、種々の哺乳動物ＭＰＶの中で、またＭＰＶとその他のウイルス、例えばＡＰＶとの間での、程度の高い相同性を利用することができる。ＭＰＶ感染に対する緊急のワクチン接種など、待つことのできないワクチン接種は、より相同性の高いＭＰＶワクチンを入手することができない場合、例えばＡＰＶ（好ましくはＣ型）分離株から得られたワクチン調製物を用いて行うことができ、逆にＡＰＶ感染に対するワクチン接種は、ＭＰＶから得られたワクチン調製物を用いて行うことが考えられる。また、逆遺伝学的技法によれば、所望のレベルにまで弱毒化されるそれぞれの株の個々のフィールド分離株とは十分に異なった、ワクチンとして有用なキメラＡＰＶ−ＭＰＶウイルス構築物を生成することが可能になる。同様の逆遺伝学的技法によれば、ワクチン調製物で使用されるＲＳＶ−ＭＰＶやＰ１３−ＭＰＶ構築物などの、キメラパラミクソウイルス−メタニューモウイルス構築物を生成することも可能になる。そのような構築物は、呼吸器疾患と闘う併用ワクチンとして特に有用である。
【０４０３】
ＭＰＶ  ＣＰＥは、ｔＭＫ又はその他の細胞培養物中でｈＲＳＶ又はｈＰＩＶ−１により誘発されたものとは事実上区別できなかったので、ＭＰＶはこれまで十分に注目されていなかったと考えられる。ｔＭＫ（３次サル腎臓細胞、すなわち細胞培養における第３継代のＭＫ細胞）は、初代又は２次培養と比較して低コストであるので、これを使用することが好ましい。ＣＰＥは、従来のパラミクソウイルス科の一部の場合と同様に、合胞体を形成し、その後細胞が急速に内部分裂し、単層から細胞が離れることを特徴とする。細胞は、通常（常にとは限らない）、ウイルスを当初の物質から３回継代した後に、すなわち接種後１０〜１４日目にＣＰＥを提示したが、これはｈＲＳＶやｈＰＩＶ−１などのその他のウイルスによって引き起こされたＣＰＥよりも若干遅いものである。
【０４０４】
一例として本発明は、重篤なＲＴＩに罹患している２８人の子供から得た鼻咽頭吸引液サンプルから、まだ同定されていないパラミクソウイルスを提供する。これらの子供の臨床症状は、ｈＲＳＶによって引き起こされた症状とかなり類似していた。これらの患者のうち２７人は年齢５才未満の子供であり、その半分は１〜１２月齢であった。その他の患者は１８才であった。全ての患者は上気道感染症に罹患しており、咳、筋肉痛、嘔吐、及び熱から細気管支炎及び重篤な肺炎に至る症状があった。これらの患者の大多数は、１〜２週間入院した。
【０４０５】
これらの患者由来のウイルス分離株は、陰性対照電子顕微鏡検査においてパラミクソウイルス形態を有していたが、既知のヒト及び動物パラミクソウイルスに対して特異的な抗血清とは反応しなかった。分離株の２つに対して産生された血清を用いた間接的な免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって求められたように、これらは全て互いに密接に関係していた。これらの分離株のうち９個の配列分析では、ウイルスがＡＰＶに若干関係していることが明らかになった。ウイルス学的データ、配列相同性、並びにゲノム組織に基づいて、本発明者等は、ウイルスがメタニューモウイルス属のメンバーであることを提唱する。血清学的調査では、オランダにおける血清保有率が、年齢５才までのヒトの１００％に近付いていることから、このウイルスが比較的一般的な病原体であることが示された。さらに、この血清保有率は、１９５８年にヒトから収集された血清においても同様に高いことがわかったが、これは、ウイルスが４０年以上にもわたってヒトの集団内を循環していたことを示している。この提示された新しいメタニューモウイルス属のメンバーの同定は、診断アッセイ又は試験キット用の手段及び方法と、ウイルス呼吸器感染に関するワクチン又は血清又は抗体の組成物の開発ももたらし、さらにＭＰＶ感染の治療に有用な抗ウイルス剤に関して試験をし又はスクリーニングするための方法も提供する。
【０４０６】
本明細書で提供する方法及び手段は、ウイルス学的診断によるものであろうと血清学的診断によるものであろうと、ＭＰＶ感染を診断するための診断キットに特に有用である。そのようなキット又はアッセイは、例えば、本発明によるウイルス、核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原、及び／又は抗体を含んでよい。本発明によるウイルス、核酸、タンパク様分子又はその断片、抗原、及び／又は抗体の使用は、例えば、特にヒトにおけるＭＰＶ感染を治療又は予防するための、かつ／又は呼吸器疾患を治療又は予防するための医薬品組成物の製造も提供する。ウイルスの弱毒化は、この目的で開発された、その他の種の関連するウイルスの使用、実験室用動物及び／又は組織／細胞培養による連続継代、分子クローンの部位特異的変異誘発、及び関連するウイルス同士での遺伝子又は遺伝子断片の交換を含むがこれらに限定されない方法を確立することによって実現することができる。
【０４０７】
４つの別個のｈＭＰＶのサブタイプ（サブタイプＡ１、Ａ２、Ｂ１及びＢ２と称する）を記載した。本発明は、４つのサブタイプ全てについて感度を有する単一アッセイを用いた、宿主におけるｈＭＰＶの検出に関する。当技術分野で公知の任意の方法を用いて、宿主におけるｈＭＰＶの存在を検出することができる。本発明のより具体的な実施形態において、感受性のＴａｑｍａｎアッセイを用いて、宿主におけるｈＭＰＶの存在を検出する。当業者であれば、そのようなアッセイで使用するためのオリゴヌクレオチド及びプローブの設計に必要な条件に精通している。かかるオリゴヌクレオチド及びプローブは、ｈＭＰＶゲノム、転写産物又はプロセシングされた及びプロセシングされていない産物の任意の領域を特異的に認識するように設計しうる。本発明のより具体的な実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及びプローブは、ｈＭＰＶの全てのサブタイプ（例えばＡ１、Ｂ１、Ａ２及びＢ２）における配列、その転写産物又はプロセシングされた及びプロセシングされていない産物に対し相補性であるか、又は同一若しくは類似するものである。特に、オリゴヌクレオチド及びプローブは、ｈＭＰＶの４つ全てのサブタイプにおける配列、その転写産物又はプロセシングされた及びプロセシングされていない産物のマイナス又はプラスコピーに対し、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は９９．５％同一性を有する。別の実施形態において、ｈＭＰＶの４つ全てのサブタイプにおける配列のマイナスコピー又はプラスコピーに対し相補的である。本発明のアッセイの検出には、任意の長さのオリゴヌクレオチド及びプローブを用いることができる。用いることができる典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件は当技術分野で公知である。好ましくは、条件は、プローブが特異的に結合可能であり、非特異的結合の結合又は簡単な除去を防止するような条件である。本発明のまた別のより具体的な実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及びプローブは、ｈＭＰＶゲノム内のオープンリーディングフレーム、例えば限定されるものではないが、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｍ２遺伝子、ＳＨ遺伝子、Ｇ遺伝子及びＬ遺伝子、又はそのプロセシングされた及びプロセシングされていない産物のいずれかに対して相補的である。本発明のさらにまた具体的な実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド及びプローブは、Ｎ遺伝子、その転写産物、又はそのプロセシングされた及びプロセシングされていない産物を認識する。また別の実施形態において、４つ全てのサブタイプに由来するｈＭＰＶは等しい特異性で認識される。
【０４０８】
ウイルスは、宿主から得ることができる任意の生物学的サンプルから単離することができる。本発明のより具体的な実施形態において、鼻咽頭サンプルを本発明の検出アッセイにおいて使用するために宿主から採取する。ウイルスは、ｈＭＰＶを補助することができる種々の細胞系（例えば限定されるものではないが、Ｖｅｒｏ及びｔＭＫ細胞）において検出目的で増殖させることができる。ウイルスＲＮＡの検出は、当業者に公知のいくつかの方法を用いて実施しうる。一つの特定の実施形態において、ウイルスＲＮＡ検出は、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲに基づく方法を用いて実施する。
【０４０９】
５．１５  本発明の組成物及び哺乳動物メタニューモウイルスの構成要素
本発明は、哺乳動物ＭＰＶの核酸配列、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質、及び哺乳動物ＭＰＶのタンパク質に対する抗体に関する。本発明はさらに、哺乳動物ＭＰＶの核酸配列の相同体、及び哺乳動物ＭＰＶのタンパク質の相同体に関する。本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列に関し、この融合タンパク質は、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質又はその断片と、哺乳動物ＭＰＶ由来ではない１つ又は複数のペプチド又はタンパク質を含有するものである。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質又はその断片と、ポリヒスチジンタグなどであるがこれに限定することのないペプチドタグを含有する。本発明はさらに、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質又はその断片と、哺乳動物ＭＰＶ由来ではない１つ又は複数のペプチド又はタンパク質を含有する融合タンパク質に関する。また本発明は、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質をコードする核酸の誘導体にも関する。また本発明は、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質の誘導体にも関する。誘導体は、付加、欠失、切断、置換、及び逆位などであるがこれらに限定されないタンパク質の変異形態でよいが、これらに限定するものではない。誘導体は、さらに、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質のキメラ形態でよく、そのタンパク質の少なくとも１つのドメインが異なるタンパク質から得られたものである。誘導体は、例えば薬物などの別の分子に共有結合し又は非共有結合している哺乳動物ＭＰＶのタンパク質の形態でもよい。
【０４１０】
ＮＬ／１／００（又は００−１）と呼ばれるウイルス分離株は、変種Ａ１の哺乳動物ＭＰＶであり、そのゲノム配列は配列番号１９で示される。ＮＬ／１７／００と呼ばれるウイルス分離株は、変種Ａ２の哺乳動物ＭＰＶであり、そのゲノム配列は配列番号２０で示される。ＮＬ／１／９９（又は９９−１）と呼ばれるウイルス分離株は、変種Ｂ１の哺乳動物ＭＰＶであり、そのゲノム配列は配列番号１８で示される。ＮＬ／１／９４と呼ばれるウイルス分離株は、変種Ｂ２の哺乳動物ＭＰＶであり、そのゲノム配列は配列番号２１で示される。本願で開示される配列とそれに対応する配列番号のリストを表１４に示す。
【０４１１】
哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、又はＭ２−２タンパク質、あるいはその断片でよい。哺乳動物ＭＰＶのタンパク質の断片は、その長さが、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも７５アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１２５アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１７５アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２２５アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも２７５アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも３２５アミノ酸、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４２５アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも４７５アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも７５０アミノ酸、少なくとも１０００アミノ酸、少なくとも１２５０アミノ酸、少なくとも１５００アミノ酸、少なくとも１７５０アミノ酸、少なくとも２０００アミノ酸、又は少なくとも２２５０アミノ酸でよい。哺乳動物ＭＰＶのタンパク質の断片は、その長さが、多くとも２５アミノ酸、多くとも５０アミノ酸、多くとも７５アミノ酸、多くとも１００アミノ酸、多くとも１２５アミノ酸、多くとも１５０アミノ酸、多くとも１７５アミノ酸、多くとも２００アミノ酸、多くとも２２５アミノ酸、多くとも２５０アミノ酸、多くとも２７５アミノ酸、多くとも３００アミノ酸、多くとも３２５アミノ酸、多くとも３５０アミノ酸、多くとも３７５アミノ酸、多くとも４００アミノ酸、多くとも４２５アミノ酸、多くとも４５０アミノ酸、多くとも４７５アミノ酸、多くとも５００アミノ酸、多くとも７５０アミノ酸、多くとも１０００アミノ酸、多くとも１２５０アミノ酸、多くとも１５００アミノ酸、多くとも１７５０アミノ酸、多くとも２０００アミノ酸、又は多くとも２２５０アミノ酸でよい。
【０４１２】
本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型のＮタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１（これらの配列番号の記述に関しては表１４も参照）のウイルスゲノムによってコードされたＮタンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＮタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＮタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型のＮタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＰタンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＰタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＰタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型のＭタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＭタンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＭタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＭタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型のＦタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＦタンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＦタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型のＭ２−１タンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＭ２−１タンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＭ２−１タンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＭ２−１タンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型のＭ２−２タンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＭ２−２タンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＭ２−２タンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＭ２−２タンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型の任意のタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＧタンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＧタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＧタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型の任意のタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＳＨタンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＳＨタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＳＨタンパク質である。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、ＡＰＶ  Ｃ型の任意のタンパク質に関連するよりも、例えば配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＳＨタンパク質など哺乳動物ＭＰＶのＬタンパク質のほうに系統学上より密接に関連しているＬタンパク質である。
【０４１３】
本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＮタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＮタンパク質である（それぞれのＮタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３６６〜３６９に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質はＮタンパク質であり、Ｐタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＰタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である（それぞれのＰタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３７４〜３７７に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＭタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＭタンパク質である（それぞれのＭタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３５８〜３６１に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＦタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＦタンパク質である（それぞれのＦタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３１４〜３１７に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＭ２−１タンパク質である（それぞれのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３８〜３４１に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＭ２−２タンパク質である（それぞれのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３４６〜３４９に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＧタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＧタンパク質である（それぞれのＧタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３２２〜３２５に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＳＨタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＳＨタンパク質である（それぞれのＳＨタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３８２〜３８５に開示されている；表１４も参照）。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスゲノムによってコードされたＬタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一のＬタンパク質である（それぞれのＬタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３０〜３３３に開示されている；表１４も参照）。
【０４１４】
哺乳動物ＭＰＶのタンパク質の断片は、その断片と同種のタンパク質部分について、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスによってコードされた同種タンパク質に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である。特定の例示的な実施形態においては、本発明は、Ｆタンパク質の外部ドメインを含有する哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質の断片とその相同体を提供する。外部ドメインを含有するＦタンパク質の断片の相同体は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＦタンパク質の外部ドメインを含有する対応断片に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一である（それぞれのＦタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３１４〜３１７に開示されている；表１４も参照）。
【０４１５】
ある実施形態では、本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのタンパク質及びその断片を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＮタンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＮタンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＮタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＮタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＧタンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＧタンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＧタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＧタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＰタンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＰタンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＰタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＰタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＭタンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＭタンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＭタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＭタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＮタンパク質を提供し、Ｆタンパク質は、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＦタンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＦタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するものである。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＭ２−１タンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＭ２−１タンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＭ２−１タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＭ２−１タンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＭ２−２タンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＭ２−２タンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＭ２−２タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＭ２−２タンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＳＨタンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＳＨタンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＳＨタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＳＨタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＬタンパク質であって、配列番号１８又は配列番号２１によってコードされたウイルスによりコードされたＬタンパク質に関係するよりも、配列番号１９又は配列番号２０のウイルスによってコードされたＬタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＬタンパク質を提供する。
【０４１６】
その他の実施形態では、本発明は、サブグループＢの哺乳動物ＭＰＶのタンパク質又はその断片を提供する。本発明は、サブグループＢの哺乳動物ＭＰＶのＮタンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＮタンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＮタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＮタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＧタンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＧタンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＧタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＧタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＰタンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＰタンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＰタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＰタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＭタンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＭタンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＭタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＭタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＮタンパク質を提供し、Ｆタンパク質は、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＦタンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＦタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するものである。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＭ２−１タンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＭ２−１タンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＭ２−１タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＭ２−１タンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＭ２−２タンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＭ２−２タンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＭ２−２タンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＭ２−２タンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＳＨタンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＳＨタンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＳＨタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＳＨタンパク質を提供する。本発明は、サブグループＡの哺乳動物ＭＰＶのＬタンパク質であって、配列番号１９又は配列番号２０によってコードされたウイルスによりコードされたＬタンパク質に関係するよりも、配列番号１８又は配列番号２１のウイルスによってコードされたＬタンパク質のほうに系統学上より密接に関係するＬタンパク質を提供する。
【０４１７】
本発明はさらに、変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２の哺乳動物ＭＰＶのタンパク質を提供する。本発明のある実施形態において、哺乳動物ＭＰＶの種々の変種のタンパク質は、それらのアミノ酸配列の同一性を用いて互いに区別することができる（例えば図４２ｂ参照）。哺乳動物ＭＰＶの変種は、Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２でよいが、これらに限定されない。しかし本発明は、別の変種のメンバーである哺乳動物ＭＰＶの分離株も企図するものである。
【０４１８】
本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質を提供し、この哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質は、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＧタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＧタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＧタンパク質のほうに、系統学上より密接に関係している。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質であって、そのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＧタンパク質（配列番号３２４）に対して少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＮタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＮタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＮタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＮタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質であって、そのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＮタンパク質（配列番号３６８）に対して少なくとも９８．５％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＰタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＰタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＰタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＰタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質であって、そのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＰタンパク質（配列番号３７６）に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質であって、そのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭタンパク質（配列番号３６０）と同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＦタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＦタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＦタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＦタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質であって、そのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＦタンパク質（配列番号３１６）に対して少なくとも９９％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−１タンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−１タンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−１タンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−１タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質であって、そのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３４０）に対して少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−２タンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−２タンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−２タンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−２タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質であって、そのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４８）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＳＨタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＳＨタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＳＨタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質であって、そのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＳＨタンパク質（配列番号３８４）に対して少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質であって、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＬタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＬタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＬタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質であって、そのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９９に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ１のＬタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。
【０４１９】
本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＧタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＧタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＧタンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質であって、そのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＧタンパク質（配列番号３２２）に対して少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＮタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＮタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＮタンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＮタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質であって、そのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＮタンパク質（配列番号３６６）に対して少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＰタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＰタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＰタンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＰタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質であって、そのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＰタンパク質（配列番号３７４）に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭタンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質であって、そのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭタンパク質（配列番号３５８）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＦタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＦタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＦタンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＦタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質であって、そのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＦタンパク質（配列番号３１４）に対して少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−１タンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−１タンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−１タンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−１タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質であって、そのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−１タンパク質（配列番号３３８）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−２タンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−２タンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−２タンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−２タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質であって、そのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＭ２−２タンパク質（配列番号３４６）に対して少なくとも９６％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＳＨタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＳＨタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＳＨタンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質であって、そのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＳＨタンパク質（配列番号３８２）に対して少なくとも８４％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＬタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＬタンパク質、Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＬタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＬタンパク質に関係するよりも、変種Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＬタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のＬタンパク質であって、そのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ１のウイルスのＬタンパク質（配列番号３３０）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。
【０４２０】
本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＧタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＧタンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＧタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質であって、そのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＧタンパク質（配列番号３３２）に対して少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＮタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＮタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＮタンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＮタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質であって、そのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＮタンパク質（配列番号３６７）に対して少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＰタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＰタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＰタンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＰタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質であって、そのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＰタンパク質（配列番号３７５）に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭタンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質であって、そのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭタンパク質（配列番号３５９）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＦタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＦタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＦタンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＦタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質であって、そのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＦタンパク質（配列番号３１５）に対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−１タンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−１タンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−１タンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−１タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質であって、そのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３３９）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−２タンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−２タンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−２タンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−２タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質であって、そのＭ２−２タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４７）に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＳＨタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＳＨタンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＳＨタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質であって、そのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＳＨタンパク質（配列番号３８３）に対して少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＬタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質、又はＢ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＬタンパク質に関係するよりも、変種Ａ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＬタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質であって、そのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１７／００に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ａ２のＬタンパク質（配列番号３３１）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。
【０４２１】
本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＧタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＧタンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＧタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＧタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質であって、そのＧタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＧタンパク質（配列番号３２５）に対して少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＮタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＮタンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＮタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＮタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質であって、そのＮタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＮタンパク質（配列番号３６９）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＰタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＰタンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＰタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＰタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質であって、そのＰタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＰタンパク質（配列番号３７７）に対して少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭタンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質であって、そのＭタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭタンパク質（配列番号３６１）に対して同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＦタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＦタンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＦタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＦタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質であって、そのＦタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＦタンパク質（配列番号３１７）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−１タンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−１タンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−１タンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−１タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質であって、そのＭ２−１タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−１タンパク質（配列番号３４１）に対して少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＭ２−２タンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＭ２−２タンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＭ２−２タンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＭ２−２タンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質であって、アミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＭ２−２タンパク質（配列番号３４９）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＳＨタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＳＨタンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＳＨタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＳＨタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質であって、そのＳＨタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＳＨタンパク質（配列番号３８５）に対して少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質であって、変種Ｂ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９９のＬタンパク質、Ａ１のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／００のＬタンパク質、又はＡ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１７／００のＬタンパク質に関係するよりも、変種Ｂ２のプロトタイプである分離株ＮＬ／１／９４のＬタンパク質のほうに系統学上より密接に関係している哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質を提供する。本発明は、哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質であって、そのＬタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプＮＬ／１／９４に代表される哺乳動物ＭＰＶ変種Ｂ２のＬタンパク質（配列番号３３３）に対して少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるものを提供する。
【０４２２】
ある実施形態では、配列同一性％は完全長タンパク質のアライメントに基づく。その他の実施形態では、配列同一性％は、隣接するタンパク質のアミノ酸配列のアライメントに基づいており、アミノ酸配列は、その長さが２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１２５アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、２００アミノ酸、２２５アミノ酸、２５０アミノ酸、２７５アミノ酸、３００アミノ酸、３２５アミノ酸、３５０アミノ酸、３７５アミノ酸、４００アミノ酸、４２５アミノ酸、４５０アミノ酸、４７５アミノ酸、５００アミノ酸、７５０アミノ酸、１０００アミノ酸、１２５０アミノ酸、１５００アミノ酸、１７５０アミノ酸、２０００アミノ酸、又は２２５０アミノ酸でよい。
【０４２３】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１１９〜１５３；配列番号３２２〜３２５で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を有する、哺乳動物ＭＰＶのＧタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号２３４〜３１７で示されるアミノ酸配列の１つを有する、哺乳動物ＭＰＶのＦタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３３０〜３３３で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を有する、哺乳動物ＭＰＶのＬタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３３８〜３４１で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を有する、哺乳動物ＭＰＶのＭ２−１タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３４６〜３４９で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を有する、哺乳動物ＭＰＶのＭ２−２タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３５８〜３６１で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を含む、哺乳動物ＭＰＶのＭタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３６６〜３６９で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を有する、哺乳動物ＭＰＶのＮタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３７４〜３７７で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を有する、哺乳動物ＭＰＶのＰタンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号３８２〜３８５で示されるアミノ酸配列の１つ又はその断片を有する、哺乳動物ＭＰＶのＳＨタンパク質を提供する。
【０４２４】
本発明のある実施形態では、断片の長さが少なくとも２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１２５アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、２００アミノ酸、２２５アミノ酸、２５０アミノ酸、２７５アミノ酸、３００アミノ酸、３２５アミノ酸、３５０アミノ酸、３７５アミノ酸、４００アミノ酸、４２５アミノ酸、４５０アミノ酸、４７５アミノ酸、５００アミノ酸、７５０アミノ酸、１０００アミノ酸、１２５０アミノ酸、１５００アミノ酸、１７５０アミノ酸、２０００アミノ酸、又は２２５０アミノ酸である。本発明のある実施形態では、断片の長さが最大でも２５アミノ酸、５０アミノ酸、７５アミノ酸、１００アミノ酸、１２５アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、２００アミノ酸、２２５アミノ酸、２５０アミノ酸、２７５アミノ酸、３００アミノ酸、３２５アミノ酸、３５０アミノ酸、３７５アミノ酸、４００アミノ酸、４２５アミノ酸、４５０アミノ酸、４７５アミノ酸、５００アミノ酸、７５０アミノ酸、１０００アミノ酸、１２５０アミノ酸、１５００アミノ酸、１７５０アミノ酸、２０００アミノ酸、又は２２５０アミノ酸である。
【０４２５】
本発明はさらに、哺乳動物ＭＰＶ由来の核酸配列を提供する。また本発明は、哺乳動物ＭＰＶ由来の核酸配列の誘導体も提供する。ある特定の実施形態では、核酸は修飾されている。
【０４２６】
ある実施形態で、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物ＭＰＶのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物ＭＰＶのサブグループＡのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物ＭＰＶのサブグループＢのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物ＭＰＶの変種Ａ１のＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物ＭＰＶの変種Ａ２のＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物ＭＰＶの変種Ｂ１のＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質をコードする。ある実施形態において、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物ＭＰＶの変種Ｂ２のＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質をコードする。
【０４２７】
ある実施形態においては、本発明は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であるヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のヌクレオチド配列の断片に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％同一であり、この断片の長さは少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも７５０ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも１，２５０ヌクレオチド、少なくとも１，５００ヌクレオチド、少なくとも１，７５０ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも２，００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも１２，５００ヌクレオチド、又は少なくとも１５，０００ヌクレオチドである。特定の実施形態において、本発明の核酸配列は、配列番号８４〜１１８；配列番号１５４〜２３３；配列番号３１８〜３２１；配列番号３２６〜３２９；配列番号３３４〜３３７；配列番号３４２〜３４５；配列番号３５０〜３５３；配列番号３５４〜３５７；配列番号３６２〜３６５；配列番号３７０〜３７３；配列番号３７８〜３８１；又は配列番号３８６〜３８９のヌクレオチド配列の１つに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも１００％同一である。
【０４２８】
本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、又は中程度のストリンジェンシー条件下、又は高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１の核酸配列の１つとハイブリダイズすることが可能である。本発明の特定の実施形態において、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、又は中程度のストリンジェンシー条件下、又は高ストリンジェンシー条件下で、配列番号８４〜１１８；配列番号１５４〜２３３；配列番号３１８〜３２１；配列番号３２６〜３２９；配列番号３３４〜３３７；配列番号３４２〜３４５；配列番号３５０〜３５３；配列番号３５４〜３５７；配列番号３６２〜３６５；配列番号３７０〜３７３；配列番号３７８〜３８１；配列番号３８６〜３８９の核酸配列の１つとハイブリダイズすることが可能である。ある実施形態において、核酸は、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも１５０ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも７５０ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも１，２５０ヌクレオチド、少なくとも１，５００ヌクレオチド、少なくとも１，７５０ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも２，００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも１２，５００ヌクレオチド、又は少なくとも１５，０００ヌクレオチドの長さ全体にわたり、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【０４２９】
本発明はさらに、哺乳動物ＭＰＶのタンパク質と特異的に結合する抗体及び抗原結合断片を提供する。本発明の抗体は、哺乳動物ＭＰＶのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態において、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。ある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物ＭＰＶのサブグループＡのウイルスのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質に特異的に結合する。その他のある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物ＭＰＶのサブグループＢのウイルスのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質に特異的に結合する。より具体的なある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物ＭＰＶの変種Ａ１のウイルスのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質に特異的に結合する。その他の実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物ＭＰＶのサブグループＡ２のウイルスのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質に特異的に結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物ＭＰＶのサブグループＢ１のウイルスのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質に特異的に結合する。その他のある実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物ＭＰＶのサブグループＢ２のウイルスのＧタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍ２−１タンパク質、Ｍ２−２タンパク質、ＳＨタンパク質、又はＬタンパク質に特異的に結合する。
【０４３０】
５．１６  ７回反復配列を使用したウイルス細胞融合の阻害
ウイルスと宿主細胞の融合は、ＭＰＶを含めたいくつかのエンベロープウイルスの感染性生活環における必須ステップである。したがって、ウイルス細胞融合の阻害は、これらのウイルスを制御するための新規手法の一典型となるものである。この阻害方法は、宿主におけるＭＰＶの増殖と、ＭＰＶによる宿主の感染とを予防する代替的方法の一典型である。ウイルス細胞融合の阻害は、必要とされる付着タンパク質のタイプに依存している。Wang他、Biochem Biophys Res Comm 302(2003)469〜475。したがって、本発明の一実施形態においては、アッセイを用いて、様々な付着タンパク質に対するウイルス細胞融合の依存性の同定を行う。
【０４３１】
ある実施形態においては、本発明は、被験体におけるｈＭＰＶ感染を予防、治療、又は管理する方法を提供し、この方法は、薬学的に有効な量の７回反復配列（ＨＲ）ペプチドを投与することを含む。ある実施形態においては、薬学的に有効な量によって、ウイルス宿主細胞融合が少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％低減される。特定の実施形態においては、ＨＲが被験体における感染を引き起こすウイルスのＨＲである。ある実施形態においては、ＨＲがｈＭＰＶサブタイプＡ１のＨＲである。より具体的な実施形態においては、ＨＲ配列がｈＭＰＶのＦタンパク質におけるＨＲ配列の１つであるが、これらはＨＲＡ又はＨＲＢと呼ばれ、ＨＲＡはこのペプチドのＮ末端近傍にある７回反復配列であり、ＨＲＢはＣ末端近傍にある。ある実施形態においては、被験体におけるｈＭＰＶ感染を治療、予防、又は管理するために投与するＨＲがｈＭＰＶサブタイプＡ１、Ｂ１、Ａ２、又はＢ２のＨＲである。
【０４３２】
ある実施形態においては、ＨＲは、被験体における感染を引き起こすウイルスのＨＲに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は少なくとも９９．５％同一である。ある実施形態においては、ウイルスの融合を阻止するのに、ＨＲの誘導体を使用することができる。そのような誘導体には、非天然のアミノ酸で置換されているか、末端切断されて、アミノ酸の連続が除去されているか、あるいは延長されて、単一アミノ酸、又はアミノ酸の連続が付加されているＨＲペプチドが含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態においては、ｈＭＰＶ感染を治療、管理、又は予防するのに、単一のＨＲペプチドを使用する。さらになお別の実施形態においては、ｈＭＰＶ感染を治療、管理、又は予防するのに、ＨＲペプチドの組合せを投与する。
【０４３３】
下記に示す試験は、ｈＭＰＶが細胞と融合するのを阻止する、ＨＲの有効性を決定するのに使用することができ、したがって、被験体におけるｈＭＰＶ感染を治療、予防、又は管理するのに、いずれのＨＲ、又はその類似体若しくは誘導体が最も適しているかを決定するのに使用することができる。
【０４３４】
本発明の別の実施形態においては、可溶性の合成ＨＲペプチドのアッセイを行い、そのペプチドがウイルス細胞融合を阻止できるかどうか決定する。ｈＭＰＶウイルスと細胞の融合を阻害するのに、限定されるものではないが、ＲＳＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶ、及びｈＭＰＶに対するＨＲ配列を含めたいかなるＨＲ配列も使用することができる。好ましい実施形態においては、ＨＲ配列がｈＭＰＶの配列である。より具体的な実施形態においては、ＨＲ配列がｈＭＰＶのＦタンパク質におけるＨＲ配列の１つであるが、これらはＨＲＡ又はＨＲＢと呼ばれ、ＨＲＡはこのペプチドのＮ末端近傍にある７回反復配列であり、ＨＲＢはＣ末端近傍にある。本発明の別の実施形態においては、ｈＭＰＶウイルスと細胞の融合を阻害するのに使用されるＨＲＡ派生ペプチド及びＨＲＢ派生ペプチドに、ＲＳＶ、ＡＰＶ、及びＰＩＶのＨＲＡペプチド及びＨＲＢペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明のさらに別の実施形態においては、ｈＭＰＶウイルスと細胞の融合を阻害するのに、ＨＲＡペプチド及びＨＲＢペプチドの誘導体を使用する。例えば、ＨＲＡペプチド又はＨＲＢペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させることによって生成される誘導体が、ｈＭＰＶウイルスと細胞の融合を阻害するのに使用される。本発明の別の実施形態においては、ＨＲＡペプチド又はＨＲＢペプチドの特定の領域のトランケーション又は切除によって、誘導体を生成する。さらになお別の実施形態においては、使用されるＨＲＡペプチド又はＨＲＢペプチドが、内在性のＨＲ配列と比較して延長されている。さらになお別の実施形態においては、ｈＭＰＶウイルスと細胞の融合を阻害するのに、ＨＲＡペプチド又はＨＲＢペプチドの異なった領域の配列からなる短いペプチドのグループを使用する。本発明の別の実施形態においては、ｈＭＰＶのＨＲＡ及びＨＲＢから派生したペプチドを、ｈＭＰＶの相同株に対して又はｈＭＰＶの異種株に対して使用する。本発明のさらに別の実施形態においては、ウイルスと細胞の融合を阻害するのに、ＨＲＡペプチド及びＨＲＢペプチド、又はそれらの類似体若しくは誘導体を併用する。さらに好ましい実施形態においては、ＨＲＡペプチド若しくはＨＲＢペプチド、又はその類似体若しくは誘導体を単独で使用する。別の実施形態においては、使用されるＨＲＡペプチド誘導体又はＨＲＢペプチド誘導体が、内在性のＨＲペプチドに対して少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、又は５０％同一である。
【０４３５】
ウイルスの融合を阻害する７回反復配列の能力を検査するために、７回反復ペプチドを発現させ、さらに精製することができ、それによって、ウイルスの融合を阻害するそれらの能力を試験することができる。可溶性の７回反復ペプチドを発現させて、さらに精製することができ、それに続いて、ウイルス融合の遮断を試験するために、それらをアッセイで使用して内在性７回反復配列と競合させることができる。本発明の一実施形態においては、それぞれＨＲＡ及びＨＲＢと呼ばれる、ｈＭＰＶにおけるＦタンパク質の７回反復配列をコードする、合成の組換えＤＮＡを調製することができる。本発明の別の実施形態においては、精製を容易にするのに有用な配列タグも含有する７回反復ペプチドをコードする、合成の組換えＤＮＡを調製することができる。本発明の好ましい実施形態においては、７回反復ペプチドの活性が、その精製を容易にするタグによって妨害されない。本発明のさらに別の実施形態においては、ペプチド末端の１つにおける一連のヒスチジン残基、例えば、連続した６つのヒスチジンによってタグが構成され、これをヒスチジンタグと呼ぶ。可溶性のＨＲＡ及びＨＲＢを発現させて、精製するのに、いくつかの異なった手法を用いることができる。最初に、当業者に知られている方法を使用して、ＨＲＡをコードするＤＮＡベクターと、ＨＲＢをコードするＤＮＡベクターとを調製する。次に、形質転換によって、これらのプラスミドを、例えば大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）など、適切な発現宿主細胞中に導入し、当技術分野で慣用の方法を使用してタンパク質を発現させて、精製する。例えば、ヒスチジンタグを備えたＨＲペプチドをコードする遺伝子の発現は、ＩＰＴＧを使用してｐＥＴベクターから誘導することができる。その後、細胞を溶解させることができ、そして、発現されたペプチドは、Ｎｉキレートのセファロースアフィニティーカラムに固定させた後、それに続いて反対に荷電した分子種、例えばイミダゾールを用いて溶出することで単離することができる。
【０４３６】
発現された７回反復ペプチドがウイルスの融合を阻害する潜在的有効性を決定するために、ＨＲペプチド相互の複合体形成を確認するアッセイを用いることができる。この方法は、ウイルス融合阻害の有効性を決定するために、ペプチドの無細胞スクリーニングを可能にするであろう点において、細胞ベースのアッセイより有利であろう。本発明の一実施形態においては、複数のＨＲペプチドを同時に、複合体の形成を可能にするのに十分な時間インキュベートする。より具体的な実施形態においては、複合体を形成させるための時間が２８℃で１時間である。複合体形成は、限定されるものではないが、クロマトグラフィー、ＵＶ−可視光分光法、ＮＭＲ分光法、エックス線結晶法、遠心法、又は電気泳動法を含めた、当技術分野で知られているいかなる方法を用いて検出してもよい。本発明の別の特定の実施形態においては、複合体形成は、複合体の分子量を決定するための電気泳動と組み合わせたゲル濾過法を使用して検出する。本発明のさらに別の実施形態においては、この複合体形成アッセイを用いて、ウイルスの融合を阻害するのに有用な候補の同定、例えば、変異されたＨＲペプチドがウイルスの融合を阻害する有効性の決定を行う。本発明のさらになお別の実施形態においては、ウイルス融合の阻害におけるＨＲペプチド誘導体の有効性を、この複合体形成アッセイを使用して測定する。
【０４３７】
これらのペプチドの７回反復配列セグメントは、自然において螺旋状であることが知られている。この理由から、ウイルス融合の阻害に使用するのに適当な候補を同定するために、いくつかの方法を用いて、発現されたＨＲペプチドがアルファへリックスを形成しているかどうか決定することができる。そのような方法には、分光法、エックス線結晶法、及び顕微鏡法が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態においては、ＨＲペプチドの構造上の特性を決定するのに、ＣＤ（円二色性）分光法を使用する。
【０４３８】
ウイルス融合の阻害における、ＨＲペプチドの有効性を決定するのに細胞ベースのアッセイを用いることができる。アッセイには、ＭＰＶに感染させることのできるいかなる細胞を用いてもよく、それらには、ｔＭＫ、Ｈｅｐ２、又はＶｅｒｏ細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、使用される細胞のタイプがＨｅｐ２細胞である。宿主細胞をＭＰＶに感染させた上で、細胞をＨＲタンパク質調製物とインキュベートし、適当な時間インキュベートした後、融合したものの数を記録する。その後、ウイルス細胞融合が行われたかどうかを決定するために、細胞を染色してシンシチウム／多核体形成を検査する。
【実施例】
【０４３９】
６．  ウイルスの単離及び特性解析
６．１  実施例１：  検体の採取、ウイルスの単離、ウイルスの特性解析
ウイルスの存在についてアッセイするため、また同定されたウイルスを特性解析するために宿主から鼻咽頭吸引液の試料を得た。鼻咽頭吸引液は、気道感染症（ＲＴＩ）を罹患している子供から採取した。病気の原因が何であるかを決定するために、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス、ｈＲＳＶ、並びに１、２及び３型ヒトパラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ）に対する蛍光標識抗体を用いた直接免疫蛍光アッセイ（ＤＩＦ）ですべての鼻咽頭吸引液を試験した（実施例９の方法を参照）。ウイルスはまた、ＶＥＲＯ細胞、第３カニクイザル腎臓（ｔＭＫ）細胞、ヒト内皮肺（ＨＥＬ）細胞及びマービンドック（marbin dock）腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を含めた様々な細胞系で、高速シェルバイアル技法（Rothbarth他、1999、J of Virol. Methods、78:163-169）を用いて鼻咽頭吸引液から単離した。ＤＩＦアッセイで陰性であった２又は３回の継代後に細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す試料を、Ａ、Ｂ及びＣ型インフルエンザウイルス、Ａ及びＢ型ｈＲＳＶ、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、１〜４型ヒトパラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ）、センダイウイルス、５型サルウイルス、並びにニューカッスル病ウイルスに対するウイルス特異的抗体を用いた間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）（実施例１１の方法を参照）によって試験した。多くの場合に病原体を同定することができたが、一部の検体は試験したすべてのウイルスに対して陰性であった。
【０４４０】
これら２８種の未同定のウイルス分離株は、ｔＭＫ細胞中でゆっくりと増殖し、ＶＥＲＯ細胞及びＡ５４９細胞中であまり増殖せず、ＭＤＣＫ細胞やニワトリ孵化線維芽細胞でほとんど増殖しなかった。ほとんどのウイルス分離株が１０〜１４日目の間にｔＭＫ細胞でＣＰＥを誘発した。これは、ｈＲＳＶやｈＰＩＶなど他のウイルスに引き起こされるＣＰＥよりもいくらか遅かった。このＣＰＥはｔＭＫ細胞又は他の細胞培養物中のｈＲＳＶ又はｈＰＩＶに引き起こされたＣＰＥと実質上区別不可能であり、合胞体の形成を特徴とした。細胞内で観察された効果の一部には、迅速な内部破壊、次いで単層からの細胞の剥離が含まれる。
【０４４１】
感染ｔＭＫ細胞の上清を電子顕微鏡（ＥＭ）分析に用い、これにより、１３〜１７ナノメートルの範囲の短いエンベロープ突起を有する直径１５０〜６００ナノメートルの存在が明らかとなった。標準のクロロホルム又はエーテル処理により（Osterhaus 他、1985、Arch. of Virol.、86:239-25）ｔＭＫ細胞の感染力が１０４ＴＣＩＤ５０より大きく低下し、これは、パラミクソウイルス科のウイルスなどエンベロープを有するウイルスの生化学的特性と矛盾がなかった。ウイルスに感染したｔＭＫ細胞の培養物上清は、シチメンチョウ、ニワトリ及びモルモットの赤血球で赤血球凝集活性を示さなかった。培養中、ウイルス複製はトリプシン依存性であるように見えた。これらのウイルスデータを合わせると、新しく同定されたウイルスがパラミクソウイルス科の分類学上のメンバーであることが実証された。
【０４４２】
１５種の未同定のウイルス分離株に感染したｔＭＫ細胞のＲＮＡを、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析で使用するために、ｈＰＩＶ  １〜４、センダイウイルス、５型サルウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ｈＲＳＶ、麻疹、流行性耳下腺炎、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、ツパイ（Ｔｕｐａｉａ）ウイルス及びマプエラ（Mapuera）ウイルスなどのパラミクソウイルス科に特異的なプライマー組を用いて抽出した（K.B. Chua他、2000、Science、288:1432-1435）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、潜在的に関連しているウイルスを検出するために低ストリンジェンシー条件下で行った。同一源のウイルスストック由来のＲＮＡ分離株を対照として用いた。利用できる対照が関連するウイルス特異的プライマーで陽性に反応したのに対し、新しく同定したウイルス分離株はどのプライマー組とも反応せず、これは、このウイルスが試験したウイルスと近縁関係にないことを示している。
【０４４３】
ウイルスに感染したｔＭＫ細胞の培養物上清のうち２種を、モルモット及びフェレットに鼻腔内に接種した。接種後０日目、２週間目、及び３週間目にこれらの動物から血清試料を採取した。動物は臨床的症状は示していなかったが、すべての動物で抗体陽転が検出され、ウイルス中和（ＶＮ）（実施例１６の方法を参照）アッセイ及び同種ウイルスに対する間接ＩＦＡで測定した。血清は、間接ＩＦＡにおいて上述の既知のパラミクソウイルスのどれとも反応せず、またマウスのニューモウイルス（ＰＶＭ）とも反応しなかった。モルモット及びフェレットの感染前及び感染後の血清を用いて、現在までに未同定のウイルス分離株をスクリーニングした。これらのうち、２８種が間接ＩＦＡで明らかに陽性であり、感染後の血清は、ここまでに未同定のウイルス分離株が近縁である又は同一であることを示唆している。
【０４４４】
ウイルスをさらに特性解析するために、細胞系におけるウイルス感染の表現効果を観察した。簡単に説明すると、ガラス製スライドを含む２４ウェルプレート（Costar、Cambridge, UK）で、１０％ウシ胎児血清（BioWhittaker、Vervier, Belgium）を添加した以下に述べる培地中でｔＭＫ細胞を培養した。接種前にプレートをＰＢＳで洗浄し、０．５Ｌに０．２６ｇのＮａＨＣＯ３、０．０２５ＭのＨｅｐｅｓ（Biowhittaker）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Biowhittaker）、１００単位のペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン（Biowhittaker）、０．５ｇのラクトアルブミン（Sigma-Aldrich、Zwijndrecht, The Netherlands）、１．０ｇのＤ−グルコース（Merck、Amsterdam, The Netherlands）、５．０ｇのペプトン（Oxoid、Haarlem, The Netherlands）及び０．０２％のトリプシン（Life Technologies、Bethesda, MD）を添加した、ハンクス塩を含むイーグルＭＥＭ（ICN、Costa mesa, CA）を入れた。プレートに鼻咽頭吸引液試料の上清を接種し（１ウェルあたり０．２ｍｌを３つ組で）、次いで８４０×ｇで１時間遠心した。接種後、プレートを３７℃で最大１４日間インキュベートし、この間培地を週に１回交換し、培養物を毎日ＣＰＥについて検査した。１４日後に細胞を２代目継代から掻き取り、１４日間インキュベートした。このステップを３代目継代で繰り返した。ガラス製スライドは、以下に述べるようにウイルスの存在を間接ＩＦＡによって実証するために使用した。
【０４４５】
ＣＰＥは一般に、分離株に応じて３代目継代の後、すなわち８〜１４日目で観察された。ｈＲＳＶが４日目前後にＣＰＥを誘発する以外は、ｔＭＫ細胞又は他の細胞培養物中のｈＲＳＶ又はｈＰＩＶに引き起こされたＣＰＥは実質上区別不可能である。ＣＰＥは合胞体の形成によって特徴づけられ、その後、細胞は迅速な内部破壊、次いで単層からの細胞の剥離を示した。一部の分離株では、ＣＰＥの観察は困難であり、これらの培養物中のウイルスの存在を確認するためにＩＦＡを用いた。このＣＰＥが他のウイルス由来のＣＰＥと区別不可能であるという観察により、臨床的症状の目視検査によって診断を行うことができないことが示された。
【０４４６】
６．２  実施例２：  ヒト集団における血清陽性率
ヒト集団におけるこのウイルスの血清陽性率を調査するために、様々な年齢区分のヒト由来の血清を、未同定のウイルス分離株のうち１種に感染させたｔＭＫ細胞を用いた間接ＩＦＡによって分析した。調査により、このウイルスに対する抗体が６カ月齢〜１２カ月齢の子供の２５％で検出されることが明らかとなった。さらに、５歳までには、子供のほぼ１００％が血清陽性であった。全体で５６個の血清試料を間接ＩＦＡ及びＶＮアッセイで観察した。試料の５１個又は９１％で、ＶＮアッセイの結果、すなわち８を超える力価が、間接ＩＦＡの結果、すなわち３２を超える力価と一致した。ＩＦＡで陽性であることが判明した４個の試料試料がＶＮアッセイで陰性であった、すなわち力価が８未満であった。１個の血清試料がＩＦＡで陰性であった、すなわち、力価が３２未満であり、ＶＮ試験で陽性であった、すなわち、力価が１６であった（図２）。
【０４４７】
１９５８年に、８〜９９歳の範囲のヒトから採取した７２個の血清試料で実施したＩＦＡでは１００％の血清陽性率が明らかとなり、このウイルスが４０年以上もヒト集団内で循環していることが示された。さらに、これら血清試料のうちいくつかを、ＩＦＡデータを裏づけるためにＶＮアッセイで使用した（図２）。血清陽性率データは、このウイルスは長年の間ヒト集団における顕著な感染源であったことを示している。
【０４４８】
重度のＲＴＩに罹患している子供由来の臨床試料からこのウイルスを繰り返し単離することは、ＭＰＶの臨床的及び経済的影響が大きいかもしれないことを示している。ウイルス検出及び血清学に基づいた新しい診断的アッセイにより、罹患率並びにこのウイルス病原体の臨床的及び経済的影響のより詳細な分析が得られるであろう。
【０４４９】
ＩＦＡとＶＮの結果の僅かな差異（５個の試料）は、ＩＦＡではＩｇＧ血清抗体のみを検出するが、ＶＮアッセイでは抗体のクラスとサブクラスとの両方を検出することが原因であるかもしれない。あるいは、この差異は、両アッセイの感度の差が原因であるかもしれない。ＩＦＡでは閾値１６を使用したが、ＶＮでは閾値８を使用した。
【０４５０】
また、ＩＦＡアッセイとＶＮアッセイの結果の差異は、この新しく同定されたウイルスで存在する可能性のある血清型の差異も示しているかもしれない。ＭＰＶがＡＰＶに最も近縁であると考えられるので、このヒトウイルスがトリ起源であり得ることが推測された。１９５８年にヒトから採取した血清試料の分析により、ＭＰＶが４０年以上もヒト集団において蔓延していたことが明らかになり、これは、１９５８年よりもかなり前に動物原性感染事象が起こったことが推定されることを示している。
【０４５１】
６．３  実施例３：  ＨＭＰＶ分離株００−１のゲノム配列
未知のウイルス分離株の配列情報を得るために、ＲＡＰ−ＰＣＲ（Welsh他、1992、NAR、20:4965-4970）として知られるランダムＰＣＲ増幅戦略（実施例２１参照）。簡単に説明すると、ｔＭＫ細胞をウイルス分離株のうち１種（分離株００−１）並びに陽性対照として役割を果たすｈＰＩＶ−１に感染させた。両方の培養物が同等のレベルのＣＰＥを示した後、培養物上清中のウイルスを連続的な２０〜６０％スクロース勾配で精製した。ＥＭによって勾配画分をウイルス様粒子について検査し、約５０％のスクロースを含む分画からＲＮＡを単離し、これ中にヌクレオカプシドが観察された。両方のウイルス分画から単離したＲＮＡ分離株を等量ずつＲＡＰ−ＰＣＲで使用し、その後、試料を隣り合わせで３％  ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルに流した。次いで、未同定のウイルスに特異的な２０個の示差的に現れたバンドをゲルから精製し、プラスミドｐＣＲ２．１（Invitrogen）にクローニングし、ベクター特異的プライマーを用いて配列決定した（実施例２２参照）。National Library of Medicineから入手可能なＢＬＡＳＴプログラムを用いて、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで配列に対する相同性を検索することによって、２０個の断片のうち１０個がＡＰＶ／ＴＲＴＶ配列との類似性を示していることが判明した。
【０４５２】
これら１０個の断片は、核タンパク質（Ｎ；断片１及び２）、マトリックスタンパク質（Ｍ；断片３）、融合タンパク質（Ｆ；断片４、５、６、７）及びポリメラーゼタンパク質（Ｌ；断片８、９、１０）をコードしている遺伝子中に位置していた（図３）。ＰＣＲプライマーは、本発明者らのＲＡＰ  ＰＣＲ断片並びにニューモウイルス科の発表されているリーダー配列及びトレーラー配列（Randhawa他、1997、J. Virol.、71:9849-9854）に基づいて、ウイルスゲノムの３’末端の配列情報を完成するように設計した。３個の断片を増幅した、そのうち断片ＡはＮオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’最末端に及んでおり、断片Ｂはリンタンパク質（Ｆ）のＯＲＦに及んでおり、断片ＣはＭ  ＯＲＦとＦ  ＯＲＦとの間のギャップを埋めていた（図１６）。これら３個の断片を配列分析することで、ウイルスゲノムの３’最末端にＮＳ１及びＮＳ２  ＯＲＦが存在しないこと、並びにＦ  ＯＲＦがＭ  ＯＲＦのすぐ隣に位置することが明らかとなった。このゲノム機構は、やはり配列相同性と矛盾がなかったメタニューモウイルスＡＰＶのゲノム機構に似ていた。様々なウイルス間の関係は、図４のアミノ酸配列と他のウイルスのそれぞれのＮタンパク質のアミノ酸配列とを比較することによって推定することができる。全般的に、Ｎ、Ｐ、Ｍ及びＦ  ＯＲＦの翻訳された配列は、ニューモウイルス属のメンバーと平均３０〜３３％の相同性を示し、メタニューモウイルス属のメンバーと６６〜６８％の相同性を示した。ＳＨ及びＧ  ＯＲＦでは、どちらの属のメンバーとも認識できる相同性が見出されなかった。Ｎ  ＯＲＦのアミノ酸配列で見つかったアミノ酸の相同性では、ｈＲＳＶと約４０％、及び遺伝学的に最も近縁であるＡＰＶ−Ｃと８８％の相同性が示された。Ｐ  ＯＲＦのアミノ酸配列ではｈＲＳＶと約２５％及びＡＰＶ−Ｃと約６６〜６８％の相同性が示され、Ｍ  ＯＲＦではｈＲＳＶと約３６〜３９％及びＡＰＶ−Ｃと約８７〜８９％が示され、Ｆ  ＯＲＦではｈＲＳＶと約４０％及びＡＰＶ−Ｃと約８１％の相同性が示され、Ｍ２−１  ＯＲＦではニューモウイルスと約３４〜３６％及びＡＰＶ−Ｃと８４〜８６％の相同性が示され、Ｍ２−２  ＯＲＦではニューモウイルスと１５〜１７％及びＡＰＶ−Ｃと５６％の相同性が示され、Ｌ  ＯＲＦから得た断片ではニューモウイルスと平均４４％及びＡＰＶ−Ｃと６４％が示された。
【０４５３】
Ｎ、Ｍ、Ｐ及びＦ遺伝子の遺伝子分析により、ＭＰＶがニューモウイルス属よりも最近提示されたメタニューモウイルス属とより高い配列相同性を有し、したがってＡＰＶ／ＴＲＴＶに類似かつ似ているゲノム機構を示すことが明らかになった。ＲＳＶのゲノム機構（３’−ＮＳ１−ＮＳ２−Ｎ−Ｐ−Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌ−５’）とは対照的に、メタニューモウイルスはＮＳ１及びＮＳ２遺伝子を欠いており、また異なるゲノム機構を有する（具体的にはＭとＬ（３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｍ２−ＳＨ−Ｇ−Ｌ−５’）遺伝子との間）。本発明のウイルス分離株中のＭ遺伝子とＦ遺伝子との間のＯＲＦを欠いていること、Ｎに隣接するＮＳ１及びＮＳ２を欠いていること、並びにＡＰＶ内で見つかった高いアミノ酸配列相同性により、ヒトから単離したＭＰＶを哺乳動物、特にヒトのメタニューモウイルス属の最初のメンバーとして分類する提案に至った。
【０４５４】
系統的分析により、配列情報を得た９個のＭＰＶ分離株が近縁であることが明らかとなった。配列情報は限定されていたが、トリメタニューモウイルスのいずれとよりも、互いにより近縁であると思われる。記載したＡＰＶの４つの血清型のうち、血清型ＣがＭＰＶに最も近縁であると思われる。この結論は、Ｎ、Ｐ、Ｍ及びＦ遺伝子のヌクレオチド配列の類似性に基づいている。しかし、血清型ＤではＦ遺伝子の部分的な配列のみがＧｅｎｂａｎｋから入手可能であり、血清型ＢではＭ、Ｎ、Ｆ配列のみが入手可能であったことを留意されたい。本発明者らのＭＰＶ分離株は系統樹内で２つの集団を形成した。ｈＲＳＶ及びＡＰＶのいずれもで、異なる遺伝子学的及び血清学的サブタイプが記載されている。ＭＰＶ分離株の２つの遺伝子学的集団が機能的にも異なる血清学的サブグループを表すかどうかは、現在ではまだ不明である。本発明者らの血清学的調査では、ＭＰＶが一般的なヒトの病原体であることが示された。
【０４５５】
６．４  実施例４：  関連遺伝子のさらなる特性解析
ＭＰＶの核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び融合タンパク質（Ｆ）遺伝子の配列分析により、米国において主としてトリで見つかるＡＰＶ血清型Ｃとの最も高い度合の配列相同性が明らかとなった。また、これらの分析により、ウイルスゲノムの３’末端に非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２が存在しないこと、並びに融合タンパク質がマトリックスタンパク質のすぐ隣に位置することも明らかになった。２２Ｋ（Ｍ２）遺伝子、小さな疎水性（ＳＨ）遺伝子、結合（Ｇ）遺伝子、ポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子、遺伝子間領域、及びトレーラー配列の配列を決定した。既に記載した配列と組み合わせると、ここで提示する配列により、ゲノム末端の最末端の１２〜１５個のヌクレオチドを除いてＭＰＶのゲノム配列が完成し、ＭＰＶのゲノム機構が確立した。ＭＰＶゲノムの配列をＡＰＶサブタイプＡ、Ｂ及びＣ、ＲＳＶサブタイプＡ及びＢ、ＰＶＭ並びに他のパラミクソウイルスの配列と並べて比較することにより、メタニューモウイルス属におけるＭＰＶの分類の強力な証拠が提供される。
【０４５６】
核タンパク質（Ｎ）をコードしている遺伝子：上で示したように、ＭＰＶのゲノムマップの最初の遺伝子は３９４個のアミノ酸（ａａ）のタンパク質をコードしており、他のニューモウイルスのＮタンパク質と高い相同性を示す。Ｎ  ＯＲＦの長さはＡＰＶ−ＣのＮ  ＯＲＦの長さと同じであり（表５）、他のパラミクソウイルスの長さより短い（Barr他、1991、J Gen Virol、72:677-85）。アミノ酸配列の分析により、ＡＰＶ−Ｃと最も相同性が高いこと（８８％）、及び他のパラミクソウイルスとは７〜１１％しかないことが明らかとなった（表６）。
【０４５７】
モノネガウイルス目に属するウイルス間における３つの類似領域、Ａ、Ｂ及びＣを同定した（図２２）（Barr他、1991、J Gen Virol、72:677-85）。類似性は同一ウイルス科内の場合に最も高いが、これらの領域は観察したウイルス科の間で高度に保存されている。３つの領域すべてで、ＭＰＶはＡＰＶ−Ｃと９７％、ＡＰＶ−Ｂと８９％、ＡＰＶ−Ａと９２％、並びにＲＳＶ及びＰＹＭと６６〜７３％のアミノ酸配列の同一性を示した。アミノ酸残基１６０と３４０との間の領域がメタニューモウイルスの間で高度に保存されており、ニューモウイルス科でいくらか低い程度で保存されていると思われる（Miyahara他、1991、Arch Viral、124:255-68; Li他、1996、Virus Res、41:185-91; Barr、1991、J Gen Virol、72:677-85）。
【０４５８】
リンタンパク質（Ｐ）をコードしている遺伝子：ゲノムマップの第２のＯＲＦは、ＡＰＶ−ＣのＰタンパク質と６８％の配列相同性を共有し、ＲＳＶのＰタンパク質とは２２〜２６％しか共有しない（表７）２９４ａａのタンパク質をコードしている。ＭＰＶのＰ遺伝子は１つの実質的なＯＲＦを含み、この点では、多くの他のパラミクソウイルスのＰと類似している（Lamb他、Fields virology、(B.N. Knipe、Hawley, P.M.偏、LippencottRaven)、Philadelphia、1996; Sedlmeier他、1998、Adv Virus Res、50:101-39で総説）。
【０４５９】
ＡＰＶ  Ａ及びＢ並びにＰＶＭとは対照的に、またＲＳＶ並びにＡＰＶ−Ｃと類似して、ＭＰＶのＰ  ＯＲＦはシステイン残基を欠いている。すべてのニューモウイルス間で類似性が高い領域（アミノ酸１８５〜２４１）は、ＲＮＡ合成プロセス又はヌクレオカプシド複合体の構造的完全性の維持のいずれかにおいて役割を果たす（Ling他、1995、Virus Res、36:247-57）。この類似性の高い領域は、特に保存的置換を考慮した場合にＭＰＶ中でも見つかり（図６）、ＡＰＹＣと１００％、ＡＰＶ−Ａ及びＢと９３％、並びにＲＳＶと約８１％の類似性を示す。ＭＰＶのＰタンパク質のＣ末端は、ＡＰＶについて記載されているように（Ling他、1995、Virus Res、36:247-57）、グルタミン酸残基に富んでいる。
【０４６０】
マトリックス（Ｍ）タンパク質をコードしている遺伝子：ＭＰＶゲノムの第３のＯＲＦは、他のニューモウイルスのＭ  ＯＲＦに似ている２５４ａａのタンパク質をコードしている。ＭＰＶのＭ  ＯＲＦは他のメタニューモウイルスのＭ  ＯＲＦと全く同じサイズを有しており、ＡＰＶのマトリックスタンパク質と高いアミノ酸配列の相同性を示し（７８〜８７％）、ｉＲＳＶ及びＰＶＭのマトリックスタンパク質とより低い相同性を示し（３７〜３８％）、他のパラミクソウイルスのマトリックスタンパク質と１０％未満の相同性を示すパラミクソウイルス（表６）。
【０４６１】
すべてのニューモウイルスのマトリックスタンパク質の配列を比較し、残基１４〜１９で保存された７ペプチドがＭＰＶ中でも保存されていることが判明した（図７）（Easton他、1997、Virus Res、48:27-33）。ＲＳＶ、ＰＶＭ及びＡＰＶでは、Ｍの主ＯＲＦの内部又はそれと重複する小さい二次的ＯＲＦが同定された（ｂＲＳＶで５２ａａ及び５１ａａ、ＲＳＶで７５ａａ、ＰＶＭで４６ａａ、並びにＡＰＶで５１ａａ）（Yu他、1992、Virology、186:426-34; Easton他、1997、Virus Res、48:27-33; Samal他、1991、J Gen Virol、72:715-20; Satake他、1995、J Virol、50:92-9）。ヌクレオチド２２８１から開始する５４ａａ残基の１つの小さなＯＲＦが主Ｍ  ＯＲＦの内部に見つかり（断片１、図８）、ヌクレオチド２８９３から開始する３３ａａ残基の１つの小さなＯＲＦがＭの主なＯＲＦと重複して見つかった（断片２、図８）。ＲＳＶ及びＡＰＶの二次的ＯＲＦと同様に、これらの二次的ＯＲＦ間及び他のニューモウイルスの二次的ＯＲＦと有意な相同性はなく、明らかな開始コドンや停止コドンが欠如している。さらに、これらの二次的なＯＲＦからタンパク質合成が起こるという報告はない。
【０４６２】
融合タンパク質をコードしている遺伝子：ＭＰＶのＦ  ＯＲＦはＭ  ＯＲＦに隣接して位置し、これは、メタニューモウイルス属のメンバーに特徴的な特徴である。ＭＰＶのＦ遺伝子は、ＡＰＶ−ＣのＦよりも２ａａ残基長い５３９ａａタンパク質をコードしている。アミノ酸配列の分析により、ＡＰＶ−Ｃと８１％、ＡＰＶ−Ａ及びＢと６７％、ニューモウイルスＦタンパク質と３３〜３９％、並びに他のパラミクソウイルスとはわずか１０〜１８％の相同性が示された（表６）。パラミクソウイルスのＦタンパク質間で保存されており、ＭＰＶでも見られる特徴の１つは、システイン残基の分布である（Morrison他、1988、Virus Res、10:113-35; Yu他、1991、J. Gen Virol、72:75-81）。メタニューモウイルスはＥ１で１２個（７個はすべてのパラミクソウイルスで保存されている）、及びＥ２で２個のシステイン残基（１個はすべてのｌパラミクソウイルスで保存されている）を共有している。ＭＰＶのＦ  ＯＲＦ中に存在する３つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位のうち、ＲＳＶとはまったく共有されておらず、２個（７４位及び３８９位）がＡＰＶと共有されている。ＭＰＶの第３の、独特な、潜在的なＮ結合グリコシル化部位は２０６位に位置している（図９）。
【０４６３】
他のパラミクソウイルスとの配列相同性が低いにもかかわらず、ＭＰＶのＦタンパク質は、他のパラミクソウイルス科のメンバーのＦタンパク質に記載された特徴と矛盾しない、典型的な融合タンパク質の特徴を示した（Morrison他、1988、Virus Res、10:113-35）。パラミクソウイルス科のメンバーのＦタンパク質は不活性な前駆物質（Ｆ０）として合成され、これが宿主細胞のプロテアーゼによって切断され、アミノ末端のＥ２サブユニット及びカルボキシ末端の大きなＦ１サブユニットが生成される。提案された切断部位（Collins他、Fields virology、(B.N. Knipe、Howley, P.M.偏、Lippencott-Raven)、Philadelphia、1996）はパラミクソウイルス科のすべてのメンバー間で保存されている。ＭＰＶの切断部位は残基ＲＱＳＲを含む。いずれのアルギニン（Ｒ）残基もＡＰＶ及びＲＳＶで共有されているが、グルタミン（Ｑ）及びセリン（Ｓ）残基は１型ヒトパラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルスなどの他のパラミクソウイルスで共有されている。
【０４６４】
Ｆ１のアミノ末端の疎水性領域は膜融合ドメインとして機能すると考えられており、パラミクソウイルス及び麻疹ウイルス間で高い配列類似性を示し、より低い程度でニューモウイルスと配列類似性を示す（Morrison他、1988、Virus Res、10:113-35）。これら２６個の残基（１３７〜１６３位、図９）はＭＰＶ及びＡＰＶ−Ｃ間で保存されており、これは、この領域がメタニューモウイルス間で高度にの保存されていることと一致している（Naylor他、1998、J. Gen Virol、79:1393-1398; Seal他、2000、Virus Res、66:139-47）。
【０４６５】
ＡＰＶ及び他のパラミクソウイルスのＦ２サブユニットで見られたように、ＭＰＶは、ＲＳＶと比較して２２ａａ残基の欠失を示す（１０７〜１２８位、図９）。さらに、ＲＳＶ及びＡＰＶではシグナルペプチド及びアンカー（固定）ドメインがサブタイプ内で保存されていることが判明し、サブタイプ間で高度な可変性を示した（Plows他、1995、Virus Genes、11:37-45; Naylor他、1998、J. Gen Virol、179:1393-1398）。Ｆ２のアミノ末端のＭＰＶのシグナルペプチド（アミノ酸１０〜３５、図９）はＡＰＶ−Ｃといくらかの配列類似性を示し（２６ａａ残基中１８個が類似である）、他のＡＰＶやＲＳＶとより低い保存性を示す。Ｅ１のカルボキシ末端の膜固定ドメインではサブタイプ間ではるかに高い可変性が見られるが、それでもＡＰＶ−Ｃと多少の相同性が見られる。
【０４６６】
Ｍ２タンパク質をコードしている遺伝子：Ｍ２遺伝子はニューモウイルス科に独特であり、すべてのニューモウイルスで２つの重複するＯＲＦが観察されている。第１の主なＯＲＦはウイルスポリメラーゼの処理能力（processivity）（Collins他、1995、Proc Natl Acad Sci USA、92:11563-7; Collins他、Fields virology、(B.N. Knipe、Howley, P.M.偏、Lippencott-Raven)、Philadelphia、1996）、及びそれによる遺伝子間領域のリードスルー（Hardy他、1998、J Virol、72:520-6; Fearns他、1999、J Virol、73:5852-64）を促進する、Ｍ２−１タンパク質を表す。Ｆ遺伝子に隣接して位置するＭＰＶのＭ２−１遺伝子は１８７ａａのタンパク質をコードし、ＡＰＶ−ＣのＭ２−１と最も高い（８４％）相同性を示す。すべてのニューモウイルスＭ２−１タンパク質を比較することにより、タンパク質のアミノ末端側の半分で最も高く保存されていることが明らかとなり（Collins他、1990、J. Gen Virol、71:3015-20; Zamora他、1992、J. Gen Virol、73:737-41; Ahmadian他、1999、J. Gen Virol、80:2011-6）、これは、ＭＰＶがタンパク質の最初の８０ａａ残基でＡＰＶ−Ｃと１００％の類似性を示すことと一致している（図１０）。ＭＰＶのＭ２−１タンパク質は、最初の３０ａａ残基内に位置し、すべてのニューモウイルスで保存されている３個のシステイン残基を含む。このようなシステインの濃度はしばしば亜鉛結合タンパク質で見つかる（Cuesta他、2000、Gen Virol:74、9858-67）。
【０４６７】
ニューモウイルスのＭ２−１  ＯＲＦと重複する第２のＯＲＦ（Ｍ２−２）は、位置は保存されているが配列は保存されておらず、ウイルスのＲＮＡ複製と転写との切替えの制御に関与していると考えられている（Collins他、1985、J Virol、54:65-71; Elango他、1985、J Virol、55:101-10; Baybutt他、1987、J Gen Virol、68:2789-96; Collins他、1990、J. Gen Virol、71:3015-20; Ling他、1992、J. Gen Virol、73:1709-15; Zamora他、1992、J. Gen Virol、73:737-41; Alansari他、1994、J. Gen Virol:75:401-404; Ahmadian他、1999、J. Gen Virol、80:2011-6）。ＭＰＶでは、Ｍ２−２  ＯＲＦはＭ２−１  ＯＲＦのヌクレオチド５１２から開始し（図８）、これはＡＰＶ−Ｃと全く同じ開始位置アミノ酸である。Ｍ２−２  ＯＲＦの長さはＡＰＶ−ＣとＭＰＶとで同じであり、７１ａａ残基である。Ｍ２−２  ＯＲＦの配列の比較により（図１０）、ＭＰＶとＡＰＶ−Ｃとの間に６４％のアミノ酸配列の相同性があり、ＭＰＶとＡＰＶ−Ａ及びＢとの間には４４〜４８％のアミノ酸配列の相同性しかないことが明らかとなった。
【０４６８】
小さな疎水性（ＳＨ）遺伝子ＯＲＦ：ｈＭＰＶのＭ２に隣接する遺伝子は、恐らく１８３ａａのＳＨタンパク質をコードしている（図８）。このＯＲＦと他のＲＮＡウイルス遺伝子又は遺伝子産物との間に識別可能な配列同一性はない。ニューモウイルスのＳＨタンパク質間の配列類似性は一般的に低いので、このことは驚くべきことではない。ＳＨ  ＯＲＦのアミノ酸組成はＡＰＶ、ＲＳＶ及びＰＶＭのものと比較的類似しており、スレオニン及びセルン残基の割合が高い（ｈＭＰＶ、ＡＰＶ、ＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂ、ｂＲＳＶ及びＰＶＭでそれぞれ２２％、１８％、１９％、２０．０％、２１％及び２８％）。ｈＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦは１０個のシステイン残基を含み、ＡＰＶ  ＳＨは１６個のシステイン残基を含む。ｈＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦは２個の潜在的なＮ結合グリコシル化部位（アミノ酸７６及び１２１）を含み、ＡＰＶは１個、ＲＳＶは２個又は３個、ＰＶＭは４個有する。
【０４６９】
推定ｈＭＰＶ  ＳＨタンパク質並びにＡＰＶ及びＲＳＶのＳＨの親水性プロファイルでは、類似した特徴が明らかとなった（図１１Ｂ）。ＡＰＶ及びｈＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦは親水性のＮ末端、潜在的な膜貫通ドメインである中心疎水性ドメイン（ｈＭＰＶではアミノ酸３０〜５３）、第２の疎水性ドメイン（アミノ酸１５５〜１７０）及び親水性のＣ末端を有する。対照的に、ＲＳＶ  ＳＨはＡＰＶ及びｈＭＰＶ  ＯＲＦのＣ末端部分を欠いているように思われる。すべてのニューモウイルスＳＨタンパク質で、疎水性ドメインには塩基性アミノ酸残基が隣接しており、これもｈＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦ中で見つかる（アミノ酸２９及び５４）。
【０４７０】
結合糖タンパク質（Ｇ）をコードしている遺伝子：ｈＭＰＶの推定Ｇ  ＯＲＦは推定ＳＨ遺伝子に隣接して位置し、２３６ａａのタンパク質をコードしている（ｎｔ６２６２〜６９７２、図８）。このＯＲＦのすぐ後に第２の小さなＯＲＦが見つかり、これは潜在的に６８ａａ残基をコードしているが（ｎｔ６９７３〜７１７９）、開始コドンを欠いている。第２のリーディングフレーム中の１９４ａａ残基の第３の潜在的なＯＲＦはこれらのＯＲＦのいずれとも重複しているが、やはり開始コドンを欠いている（ｎｔ６４１６〜７０００）。このＯＲＦに続いて、同じリーディングフレーム中に６５ａａ残基の第４の潜在的なＯＲＦがあり（ｎｔ７００１〜７１９８）、これもまた開始コドンを欠いている。最後に、９７ａａ残基の潜在的なＯＲＦ（開始コドンを欠いている）が第３のリーディングフレーム中に見つかる（ｎｔ６４４４〜６７３７、図８）。第１のＯＲＦとは異なり、他のＯＲＦは明らかな遺伝子開始配列又は遺伝子停止配列を有さない（以下参照）。２３６ａａのＧ  ＯＲＦは恐らくｈＭＰＶ結合タンパク質の少なくとも一部を表しているが、何らかのＲＮＡ編集事象によって追加のコード配列が別のタンパク質として、又は結合タンパク質の一部として発現されることを排除することはできない。ＡＰＶ及びＲＳＶでは、第１のＧ  ＯＲＦの後に第２のＯＲＦはまったく同定されておらず、ＡＰＶ及びＲＳＶのどちらもがＧの主ＯＲＦ内に第２のＯＲＦを有することに注目されたい。しかし、これらのＯＲＦが発現される証拠はなく、様々なウイルスで予想されたアミノ酸配列間に配列同一性はない（Ling他、1992、J Gen Virol、73:1709-15）。ｈＭＰＶ  Ｇ中の第２のＯＲＦはＧタンパク質の特徴を示さず、追加のＯＲＦが発現されているかどうかにはさらなる調査が必要である。
【０４７１】
すべてのＯＲＦでのＢＬＡＳＴ分析では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列レベルで、他の既知のウイルス遺伝子又は遺伝子産物との識別可能な配列同一性は示されなかった。これは、ｈＲＳＶ  Ａ及びＢ（５３％）（Johnson他、1987、J Virol、61:163-6）並びにＡＰＶ  Ａ及びＢ（３８％）（Juhasz及びEaston、1994、J Gen Virol、75:2873-80）など、他のＧタンパク質で見られる低い割合の配列同一性と一致している。
【０４７２】
ｈＭＰＶ  ＯＲＦのほとんどが長さ及び配列のいずれについてもＡＰＶのものと似ているが、２３６ａａ残基のｈＭＰＶの推定Ｇ  ＯＲＦはＡＰＶのＧ  ＯＲＦよりも相当小さい（表４）。アミノ酸配列はセリン及びスレオニンの含有率３４％を示し、これはＲＳＶの３２％及びＡＰＶの２４％よりもさらに高い。推定Ｇ  ＯＲＦはまた、８．５％のプロリン残基を含み、これはＲＳＶの８％及びＡＰＶの７％よりも高い。ＡＰＶ、ＲＳＶ及びｈＭＰＶのＧタンパク質中にプロリン残基が異常に豊富に存在することは糖タンパク質でも観察され、これは、タンパク質３次元構造の主要な決定因子である（Collins及びWertz、1983、PNAS、80:3208-12; Wertz他、1985、PNAS、82:4075-9; Jentoft、1990、Trends Biochem Sci、15:291-4）。ｈＭＰＶのＧ  ＯＲＦは５個の潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含み、ｈＲＳＶは７個、ｂＲＳＶは５個、ＡＰＶは３〜５個有する。
【０４７３】
ｈＭＰＶ  Ｇの予想された親水性プロファイルにより、他のニューモウイルスに類似した特徴が明らかとなった。Ｎ末端は親水性領域、次いで短い疎水性の領域（ｈＭＰＶではアミノ酸３３〜５３）及び主に親水性のＣ末端を含む（図１２Ｂ）。この全体的な機構は、ＡＰＶ及びＲＳＶのＧタンパク質内の領域とよく対応している。ｈＭＰＶの推定Ｇ  ＯＲＦは、ＲＳＶ及びＡＰＶとは対照的に（それぞれ５個及び２０個）、１個のシステイン残基しか含まない。注目すべきことに、Ｇ遺伝子中の４つの第２のＯＲＦのうち２つだけが１つの追加のシステイン残基を含んでおり、これら４つの潜在的なＯＲＦは１２〜２０％のセリン及びスレオニン残基並びに６〜１１％のプロリン残基を示した。
【０４７４】
ポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）：他のマイナス鎖ウイルスと類似したＭＰＶゲノムの最後のＯＲＦは、複製及び転写複合体のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ構成要素である。ＭＰＶのＬ遺伝子は、ＡＰＶ−Ａタンパク質よりも１残基長い２００５ａａのタンパク質をコードしている（表５）。ＭＰＶのＬタンパク質は、ＡＰＶ−Ａと６４％、ＲＳＶと４２〜４４％、他のパラミクソウイルスと約１３％の相同性を共有している（表６）。セグメント化されていないマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質内の６つの保存されたドメインが同定された。ドメイン３がポリメラーゼ機能に必須の４つのコアポリメラーゼモチーフを含むことが判明した（Poch他、1990、J Gen Virol、71:1153-62; Poch他、1989、EMBO J、8:3867-74）。これらのモチーフ（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）はＭＰＶ  Ｌタンパク質内でよく保存されている。モチーフＡ、Ｂ及びＣでは、ＭＰＶはすべてのニューモウイルスと１００％の類似性を共有していおり、モチーフＤでは、ＭＰＶはＡＰＶと１００％、ＲＳＶと９２％の類似性を共有している。ドメインＩＩＩのすべてで（Ｌ  ＯＲＦのアミノ酸６２７〜９０３）、ＭＰＶはＡＰＶと７７％、ＲＳＶと６１〜６２％、他のパラミクソウイルスと２３〜２７％の同一性を共有する（図１３）。ポリメラーゼモチーフに加えて、ニューモウイルスＬタンパク質はコンセンサスＡＴＰ結合モチーフＫ（Ｘ）２１ＧＥＧＡＧＮ（Ｘ）２０Ｋと一致する配列を含む（Stec他、1991、Virology、183:273-87）。ＭＰＶのＬ  ＯＲＦはＡＰＶと類似したモチーフを含み、ここでは中間残基の間隔が残基１個シフトしている：Ｋ（Ｘ）２２ＧＥＧＡＧＮ（Ｘ）１９Ｋ。
【表５】
2011250786.tif 000007
【表６】
2011250786.tif 000008
【０４７５】
６．５  実施例５：  ＨＭＰＶ分離株１−９９のゲノム配列決定
ｈＭＰＶの別の分離株（１−９９）も同定かつ配列決定した。これを行うために、ｈＭＰＶ分離株１−９９を第３サル腎臓細胞で、既に記載された方法と全く同じように増殖させた（van den Hoogen他、2001、Nature Medicine、7(6):719-724）。ＭａｇｎａＰｕｒｅ  ＬＣ単離システム（Roche Applied Science）及び全核酸キットのプロトコルを用いてウイルスＲＮＡを単離した。標準のプロトコルを用い、ランダム６量体（Progema Inc. Leiden）をプライマーとして使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡへと変換した。このｃＤＮＡは、配列分析で使用するまで−２０℃又はそれより低い温度に維持した。このプロジェクトの全体で使用したプライマーは、プロトタイプｈＭＰＶ  １−００株から入手可能な配列に基づいているか、又はｈＭＰＶ株１−９９を用いて配列分析の後に得られた。
【０４７６】
重複する断片を作製するために、１６００塩基対までの大きさの範囲のＰＣＲ断片を作製した。標準の技術及びＡＢＩ３１００キャピラリー配列装置（Applied Biosystems、Nieuwerkerk Issel）を使用して、ＰＣＲ断片で配列分析を行った。作製されたヌクレオチド配列をまず最初に比較のためにプロトタイプｈＭＰＶ株１−００と比較した。ＧｅｎＢａｎｋデータベース内の関連配列と比較するためにＢｌａｓｔソフトウェアを使用した。配列のさらなる分析にはＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアそ使用し（DNASTAR Inc、Madison WI, U.S.A.）、系統的分析にはＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアプログラムを使用した。
【０４７７】
最初に、１−００分離株の配列情報に基づいて設計されたプライマーを用いて１−９９分離株の配列を得た。しかし、ゲノムのいくつかの部分は１−００分離株の情報に基づいて配列決定することができなかったので、１−９９分離株の配列情報、並びに１−００分離株の３’及び５’末端を配列決定することによって利用可能となった情報に基づいた新しいプライマーを使用した。
【０４７８】
ｈＭＰＶ分離株１−９９のプロトタイプ配列は１３，２２３塩基対を含んでおり、これは、平均の長さが４０４塩基対の全部で２２７個の個別の配列で配列決定した。この配列は配列番号１８である。
【０４７９】
ｈＭＰＶ  １−９９及び他のパラミクソウイルスのオープンリーディングフレームの長さの、絶対的な長さ及びアミノ酸同一性の割合を表７に示す。
【０４８０】
１−９９株と１−００株との間の同一性は、Ｎタンパク質（９５．２％）、Ｍ（９７．３％）、Ｆ（９３．７％）、Ｌ（９４．１％）及びＭ２−１（９４．１％）をコードしている遺伝子中で最も観察され、相同性の割合は９０％を超えていた。両株間のＰ及びＭ２−２遺伝子の相同性はそれぞれ８６．１及び８８．９％であることが見出された。また、この分離株はトリメタニューモウイルスのサブタイプＣと最も関連しており、Ｎタンパク質（８８．６％）、Ｍタンパク質（８７．１％）及びＭ２−１タンパク質（８４．３％）でアミノ酸同一性が見られた。Ｐ及びＭ２−２タンパク質との同一性はそれより低く、それぞれ６７．８％及び５６．９％であった。
【０４８１】
プロトタイプ１−００及び１−９９株の遺伝子はゲノムマップ上で同一であり、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｍ２１及びＭ２−２タンパク質でアミノ酸の数が同じである。推定ＳＨ遺伝子はアミノ酸６個短く、Ｇタンパク質はアミノ酸１２個短く、１−００及び１−９９株のＬ遺伝子は同じ大きさである。
【０４８２】
最後に、ゲノムマップにおける遺伝子の開始、及び遺伝子間に位置する非コード配列を表８に要約した。
【０４８３】
要約すると、ヒトメタニューモウイルスの１−９９株の配列情報は、同一のゲノムマップ機構を共有している１−９９とプロトタイプ株１−００との遺伝的関係を明らかに実証している。ＡＰＶのサブタイプＣではより系統性の低い関係が観察される。
【表７】
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【表８】
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【０４８４】
６．６  実施例６：系統的関係
ウイルス群の間、すなわちＭＰＶと他のウイルス間の関係を同定するために系統的な手法を用いることができる。さらに、同型のウイルスの様々な分離株について系統的関係を決定することができる。ＭＰＶと他のウイルスとの間の関係性を決定するために、またｈＭＰＶの様々な分離株間の関係性を決定するために、系統樹を決定した。たとえば、ＭＰＶと様々なウイルスとの間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを使用して系統樹を作製することができる。あるいは、ｈＭＰＶの様々な分離株間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを使用して系統樹を作製することができる。
【０４８５】
ＨＭＰＶと様々なウイルスとの間の系統的関係：未同定のウイルス分離株から得たヌクレオチド配列を用いたＢＬＡＳＴ検索により主にニューモウイルス科のメンバーとの相同性が明らかとなったが、タンパク質配列に基づいた相同性では他のパラミクソウイルスとのある程度の類似性も明らかとなった。新しく同定されたウイルス分離株とニューモウイルス科のメンバーとの間の関係性の指標として、これらのウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ及びＦ  ＯＲＦに基づいて系統樹を構築した。４つの系統樹すべてで、新しく同定されたウイルス分離株がＡＰＶに最も近縁であった（図１４）。記載されているＡＰＶの４つの血清型から（Bayon-Auboyer他、2000、J Gen. Virol、81:2723-2733）、米国において主にトリで見つかるメタニューモウイルスであるＡＰＶ血清型Ｃが、新しく同定されたウイルスと最も近い類似性を示した。しかし、ＡＰＶ血清型Ｄの配列情報は部分的にしか入手可能でないことに注意されたい。
【０４８６】
すべての系統樹で、ＤＮＡ配列はＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアパッケージを使用してアラインメントをとり、最大尤度の系統樹はＰｈｙｌｉｐ３．５プログラムのＤＮＡ−ＭＬソフトウェアパッケージを使用して、５０又は１００回のブートストラップ（bootstrap）及び３回のジャンブル（jumble）を用いて作製した（Brandenburg他、1997、J Med Virol、52:97-104）。系統樹の作製に用いた既に発表されている配列は以下の寄託番号の下でＧｅｎｂａｎｋから入手可能である。すべてのＯＲＦ：ｈＲＳＶ：ＮＣ００１７８１；ｂＲＳＶ：ＮＣ００１９８９；Ｆ  ＯＲＦ：ＰＹＭ、Ｄ１１１２８；ＭＶ−Ａ、Ｄ００８５０；ＭＶ−Ｂ、Ｙ１４２９２；ＭＶ−Ｃ、ＡＦ１８７１５２；Ｎ  ＯＲＦ：ＰＶＭ、Ｄ１０３３１；ＭＶ−Ａ、Ｕ３９２９５；ＭＶ−Ｂ、Ｕ３９２９６；ＭＶ−Ｃ、Ｍ１７６５９０；Ｍ  ＯＲＦ：ＰＭＶ、Ｕ６６８９３；ＭＶ−Ａ、Ｘ５８６３９；ＭＶ−Ｂ、Ｕ３７５８６；ＭＶ−Ｃ、ＡＥ２６２５７１；Ｐ  ＯＲＦ：ＰＶＭ、０９６４９；ＭＶ−Ａ、Ｕ２２１１０、ＭＶ−Ｃ、ＡＦ１７６５９１。
【０４８７】
ＭＰＶとニューモウイルス科のメンバーとの間の関係性の指標として、Ｎ、Ｐ、Ｍ、及びＦ  ＯＲＦに基づいた系統樹が既に構築されており（van den Hoogen他、2001、Nat Med、7(6):19-24）、これによりＭＰＶとＡＰＶ−Ｃの間に近い関係性があることが明らかとなった。ＭＰＶのＳＨ及びＧ遺伝子と他のパラミクソウイルスのそれらの遺伝子の相同性が低いので、これらの遺伝子について信頼性のある系統樹を構築することができない。さらに、ニューモウイルス属及びメタニューモウイルス属のメンバー間のゲノム機構が明白に異なることにより、全ゲノム配列に基づいた系統樹を作製することが不可能となる。既に発表されているものに加えて、Ｍ２及びＬ遺伝子の系統樹を構築した。これらの系統樹はどちらも、ニューモウイルス亜科内におけるＡＰＶとＭＰＶとの間の関係性が近いことを裏づけた（図１５）。
【０４８８】
系統樹を構築するために、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアパッケージを使用してＤＮＡ配列のアラインメントを行い、Ｐｈｙｌｉｐ３．５プログラムのＤＮＡ−ＭＬソフトウェアパッケージを使用して、１００回のブートストラップ及び３回のジャンブルを用いて最大尤度の系統樹を作製した。ブートストラップ値は、ＰＨＹＬＩＰコンセンサスパッケージで作製したコンセンサスの系統樹用に計算した。
【０４８９】
ここまでに得られたｈＭＰＶの様々な分離体の系統的分析に基づいて２つの主な遺伝型が同定され、ウイルス分離株００−１が遺伝型Ａのプロトタイプであり、分離株９９−１が遺伝型Ｂのプロトタイプである。
【０４９０】
遺伝型がサブタイプに関連しており、既に存在している免疫の存在下で両方のサブグループ由来のウイルスによる再感染が起こり、また再感染が起こるために抗原の変異が厳密に必要でないかもしれないという仮説が立てられている。さらに、ｈＭＰＶは主に家禽で見つかるウイルスであるトリニューモウイルスに近縁であると考えられる。両ウイルスのヌクレオチド配列は、ＳＨ及びＧタンパク質以外は高い割合の相同性を示す。これらのウイルスは、主に核タンパク質及びマトリックスタンパク質に基づいた試験で交差反応すると考えられるが、結合タンパク質に基づいた試験において異なる反応を示す。ウイルス中和力価における差異は、ｈＭＰＶの２つの遺伝型は１つのウイルスの２つの異なる血清型であり、ＡＰＶは異なるウイルスであるというさらなる証拠を提供する。
【０４９１】
異なるＨＭＰＶ分離体間の系統的関係：ＭＰＶの異なる分離株間の関係性を同定するために、系統的手法も用いることができる。たとえば、様々な対照から得られたいくつかのＭＰＶ分離株間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを用いて系統樹を作製することができる。この手法は、ＭＰＶウイルス集団内で起こる差異の理解に有用である。
【０４９２】
本発明者らの様々な新しく同定されたウイルス分離株の関係性を決定するために、８〜９個の分離株（Ｆで８個、Ｎ、Ｍ及びＬで９個）から得た配列情報に基づいて系統樹を構築した。Ｎ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、ＳＨ及びＬ  ＯＲＦ中の短い断片を増幅するために設計したプライマーでＲＴ−ＰＣＲを用い、その後それらを直接配列決定した。血清学的な観点から関連していると判明した９つのウイルス分離株（上記参照）は、遺伝学的にも近縁であることが判明した。実際、９つの分離株すべてが、ＡＰＶとよりも互いにより近縁であった。これらの系統樹に用いた配列情報は限定されているが、９つの分離株は２つのグループ、すなわち分離株９４−１、９９−１及び９９−２が１つのグループの集団、他の６つの分離株（９４−２、９３−１、９３−２、９３−３、９３−４、００−１）が他方の集団に分けられると考えられる（図１６）。
【０４９３】
４つの変種すべて、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２のｈＭＰＶの様々な分離株のＦ遺伝子のアラインメントを図１７に示す。
【０４９４】
４つの変種すべて、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２のｈＭＰＶの様々な分離株のＦタンパク質のアラインメントを図１８に示す。
【０４９５】
４つの変種すべて、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２のｈＭＰＶの様々な分離株のＧ遺伝子のアラインメントを図１９に示す。
【０４９６】
４つの変種すべて、すなわち変種Ａ１、Ａ２、Ｂ１、又はＢ２のｈＭＰＶの様々な分離株のＧタンパク質のアラインメントを図２０に示す。
【０４９７】
様々なｈＭＰＶ分離株の系統的関係性、及び対応するｈＭＰＶの変種とのその関係性を示す、Ｆ遺伝子配列に基づいた系統樹を図２１に示す。さらに、様々なｈＭＰＶ分離株の系統的関係性、及び対応するｈＭＰＶ変種とのその関係性を示す、Ｇ遺伝子配列に基づいた系統樹を図２２に示す。これらの系統樹は、ＤＮＡ最大尤度を使用して、５０回のブートストラップ及び３回のジャンブルを用いて計算した。
【０４９８】
ｈＭＰＶ分離株００−１の様々な遺伝子とｈＭＰＶ分離株９９−１、ＡＰＶ血清型Ｃ、及びＡＰＶ血清型Ａの様々な遺伝子との間の配列同一性を表９に示す。
【表９】
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【０４９９】
最初、系統的関係性は９つの異なる単離対でのみ推測していた。２つの潜在的な遺伝学的集団は、ウイルス分離株のＮ、Ｍ、Ｆ及びＬ  ＯＲＦの部分的ヌクレオチド配列を分析することによって同定した。９０〜１００％のヌクレオチド同一性が同一集団内で観察され、８１〜８８％の同一性が異なる集団間で観察された。さらに多くのウイルス分離株で得た配列情報により、２つの遺伝子型が存在することが確認された。集団Ａのプロトタイプとしてのウイルス分離株００−１、及び集団Ｂのプロトタイプとしてのウイルス分離株９９−１を交差−中和アッセイで使用して、遺伝型が様々な血清型又はサブグループと関連しているかどうかを試験した。
【０５００】
ポリメラーゼ遺伝子内に位置するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して、鼻咽頭吸引液試料から３０個のさらなるウイルス分離株を同定した。これら新しい分離株の基質及びポリメラーゼ遺伝子の部分的な配列情報を、先の９つの分離株の配列情報と共に用いて系統図を構築した（図１５）。これらの系統樹を分析することにより２つの遺伝学的集団、すなわちグループＡのプロトタイプウイルスとしてのウイルス分離株００−１及びグループＢのプロトタイプウイルスとしてのウイルス分離株９９−１の存在が確認された。同一グループ内におけるヌクレオチド配列の同一性は９２％を超えており、異なる集団間の同一性は８１〜８５％であった。
【０５０１】
６．７  実施例７：  ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）ＮＬ／１／００ゲノムＲＮＡのリーダー配列
ゲノム組成の大部分が決定したが、最末端にある真の（authentic）の末端配列が欠けていた。ウイルスＲＮＡのライゲーション、次いでライゲートした接合点のＰＣＲ増幅並びにポリアデニル化及び３’ＲＡＣＥ法を組み合わせて用いて、真のヌクレオチド配列を決定した（図５４）。ウイルスＲＮＡ末端のライゲーションによって作製したＰＣＲ断片の配列分析により、図２６に示すリーダー配列及びトレーラー配列が明らかとなった（配列番号１８〜２１参照）。このようにして得たトレーラー配列は、ＡＰＶを含めた他のパラミクソウイルスのトレーラー配列から予測された配列と矛盾がなかった。しかし、配列分析した７１個のクローンのうち２個のリーダー配列しか、現在までにすべてのパラミクソウイルスで見つかっている末端ヌクレオチド残基としてのＡＣを含んでいなかった。したがって、次いでポリアデニル化及び３’ＲＡＣＥ法を組み合わせて用いてｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００リーダーの末端ヌクレオチド配列を確認した。さらに、ｈＭＰＶ  ＮＬ／１／００の３’リーダー末端に２つの追加のヌクレオチドが同定された。
【０５０２】
本研究ではＶｅｒｏで増殖させたｈＭＰＶ  ＮＬ／１／００ウイルスを使用した。対照として、同定された末端配列と類似したゲノムサイズを有する、関連するマイナス鎖ＲＮＡウイルスである呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ａ２を含めた。ウイルスＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Qiagen）を用いて、製造者の指示に従って単離した。
【０５０３】
ウイルスＲＮＡをポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ambion）と共に、３７℃で１時間インキュベートし、次いでＮｕｃＡｗａｙスピンカラム（Ambion）を用いてクリーンアップすることによって、ウイルスＲＮＡをポリアデニル化した。その後、ポリ（Ａ）テール領域に相補的なプライマー及び逆転写酵素、Superscript I（Invitrogen）を用いてウイルスＲＮＡを逆転写した。配列決定分析用の、予想される大きさの所望の産物を増幅するために、末端に並列な（juxtaposed）ｈＭＰＶ特異的プライマーを使用してＰＣＲ及びＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を行った。ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてＰＣＲ産物をさらにｐＣＲＩＩベクターにクローニングした。末端の真のヌクレオチド配列を明らかにするために、ＰＣＲ  ＤＮＡ及びクローニングしたＰＣＲ産物の直接配列決定を実施した。
【０５０４】
ｈＭＰＶデータのみを図５５に示す。ＲＳＶ−Ａ２  ＲＮＡを用いた対照実験により、ＲＳＶ−Ａ２のリーダー配列が元の形のまま保たれ、同じ手法で検出可能であることが示された。ＰＣＲ産物の直接の配列決定分析（図５５）及びＰＣＲクローンの配列決定分析はどちらも、ｈＭＰＶのリーダー領域がリーダー配列の最も３’近位の２０個のヌクレオチドで5’ ACG CGA AAA AAA CGC GTA TA（プラス鎖センスｃＤＮＡ方向で表す）からなることを示した。２つの新しく同定されたヌクレオチドを図１０１中で下線を引いた。
【０５０５】
６．８  実施例８：  ＭＰＶ分離株の血清型決定及びサブグループ化
ｈＭＰＶのウイルス分離株を血清型又は遺伝型によって区別できるかどうかを決定するために、ウイルス中和アッセイを使用した（たとえば実施例１６参照）。ウイルス特異的抗血清を産生させるために、ウイルス分離株００−１及び９９−１をフェレットに接種した。００−１分離株では、個別の加圧したグローブボックス内で飼育した２匹の特定病原体除去フェレット及び２匹のモルモットを実験的に鼻腔内感染させることによって、ウイルスに対するフェレット及びモルモット特異的抗血清を産生させた。２〜３週間後、すべての動物を心室穿刺によって出血させ、その血清を対照血清として用いた。血清は、以下に記載のように間接ＩＦＡで、既に記載したすべてのウイルスについて試験した。これらの抗血清と９９−１分離株を用いて調製した抗血清とを、両方のウイルスでのウイルス中和アッセイで使用した（表１０）。
【表１０】
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【０５０６】
さらに６匹のモルモットにいずれか一方のウイルス（すなわち００−１及び９９−１）を接種した。鼻咽頭吸引液試料でのＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、感染後２日目〜１０日目までウイルス複製が示された。感染後７０日目に、モルモットを同種又は異種ウイルスのいずれかに感染させ、４つの事例すべてでウイルス複製が認められた。
【０５０７】
最初の感染後における抗血清を用いたウイルス中和アッセイでは、フェレットで行ったＶＮアッセイと本質的に同じ結果が示された（ＶＮ力価で＞１６倍の差）。
【０５０８】
本実施例で提示する結果は、ＭＰＶの２つの血清型に対応する２つの遺伝型が存在することを裏づけており、また異種及び同種ウイルスに繰り返し感染することの可能性を示している（表１１）。
【表１１】
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【０５０９】
７．  診断的アッセイ／検出方法
７．１  実施例９：  直接免疫蛍光アッセイ（ＤＩＦ）法
ＲＴＩを罹患している患者由来の鼻咽頭吸引液を、記載のようにＤＩＦによって分析した（Rothbarth他、1999、J. of Virol. Methods、78:163-169）。試料は−７０℃で保存した。簡単に説明すると、鼻咽頭吸引液を５ｍｌのダルベッコＭＥＭ（BioWhittaker、Walkersville, MD）で希釈し、ボルテックスミキサーで１分間、よく攪拌した。懸濁液を１０分間、８４０×ｇで遠心した。沈降物をマルチスポットスライド（Nutacon、Leimuiden, The Netherlands）上に広げ、上清をウイルス単離に使用した。乾燥させた後、細胞をアセトン中で１分間、室温で固定した。スライドを洗浄した後、これをインフルエンザＡ及びＢ、ｈＲＳＶ及びｈＰＩＶ１〜３などのウイルスに特異的な市販のＦＩＴＣ標識抗血清（Dako、Glostrup, Denmark）と共に１５分間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳで３回、水道水で１回洗浄した後、スライドをグリセロール／ＰＢＳ溶液（Citifluor、UKO、Canterbury, UK）に浸して覆った。その後、Ａｘｉｏｓｃｏｐ蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析した。
【０５１０】
７．２  実施例１０：  ＭＰＶのウイルス培養物
宿主由来の培養試料中におけるウイルスの検出は、宿主が現在かつ／又は過去にウイルスに曝された又は感染していたことの直接の指標である。
【０５１１】
第１継代の後にＣＰＥを示した試料を用いて、２４ウェルプレート中の培地中にサブコンフルエントな状態のｔＭＫ細胞の単層に接種した。培養物を毎日ＣＰＥについて検査し、培地を週に１回交換した。ＣＰＥが各分離株で異なっていたので、すべての培養物を、新しいウイルス分離体に対するフェレット抗体を用いた間接ＩＦＡで、１２〜１４日目に試験した。陽性の培養物を３回凍結−解凍し、その後、低速遠心によって上清を清浄にし、一定量に分割し、−７０℃で凍結保存した。記載のように、培養物上清中のウイルスの５０％組織培養物感染用量（ＴＣＩＤ５０）を決定した（Lennette, D.A.他、DIAGNOSTIC PROCEDURES FOR VIRAL, RICKETTSIAL, AND CHLAMYDIAL INFECTIONS、第7版、(Lennette, E.H.、Lennette, D.A.、Lennette, E.T.偏)、3-25、37-138、431-463、481-494、539-563、(American Public Health Association、Washington、1995)）。
【０５１２】
７．３  実施例１１：  間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）による抗原検出
感染細胞又は組織中のウイルスタンパク質を可視化するために抗体を使用することができる。間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）とは、蛍光指標にカップリングさせた第２の抗体がウイルスに特異的な抗体上の共通のエピトープを認識する感受性のある手法である。ＩＦＡは、その感度のレベルが高いのでＤＩＦよりも有利である。
【０５１３】
間接ＩＦＡを行うために、採取した検体を５ｍｌのダルベッコＭＥＭ培地（BioWhittaker、Walkersville, MD）で希釈し、ボルテックスミキサーで１分間、よく攪拌した。その後、懸濁液を１０分間、８４０×ｇで遠心した。沈降物をマルチスポットスライド上に広げた。乾燥させた後、細胞をアセトン中で１分間、室温で固定した。あるいは、ガラス製スライドを含む２４ウェルスライド中のｔＭＫ細胞でウイルスを培養した。これらのガラス製スライドをＰＢＳで洗浄し、アセトン中で１分間、室温で固定した。
【０５１４】
２種類の間接ＩＦＡを行った。第１の間接ＩＦＡでは、感染ｔＭＫ細胞を含むスライドをＰＢＳで洗浄し、その後、ウイルス特異的抗血清と共に３０分間、３７℃でインキュベートした。インフルエンザＡ、Ｂ及びＣ、１〜３型ｈＰＩＶ、並びにｈＲＳＶに対するモノクローナル抗体を使用した。４型ｈＰＩＶ、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、センダイウイルス、５型サルウイルス、及びニューカッスル病ウイルスでは、ポリクローナル抗体（ＲＩＶＭ）並びにフェレット及びモルモットの参照血清を使用した。ＰＢＳで３回、水道水で１回洗浄した後、スライドを第１のインキュベーションで使用した血清に対する二次抗体で染色した。ポリクローナル抗血清の二次抗体は、ヤギ抗フェレット（KPL、Guilford, UK、４０倍希釈）、マウス抗ウサギ（Dako、Glostrup, Denmark、２０倍希釈）、ウサギ抗ニワトリ（KPL、２０倍希釈液）及びマウス抗モルモット（Dako、２０倍希釈)であった。
【０５１５】
第２のＩＦＡでは、ＰＢＳで洗浄した後、スライドを３０分間、３７℃でＰＢＳ中で１：５０〜１：１００の希釈率の２０種のポリクローナル抗体と共にインキュベートした。ポリクローナル抗体を得るために免疫したフェレット及びモルモットを使用したが、これらの抗体は様々な動物で産生させることができ、ポリクローナル抗体の作業希釈率はそれぞれの免疫で変動し得る。ＰＢＳで３回、水道水で１回洗浄した後、スライドを３７℃で３０分間、ＦＩＴＣ標識のヤギ抗フェレット抗体（KPL、Guilford, UK、４０倍希釈）と共にインキュベートした。ＰＢＳで３回、水道水で１回洗浄した後、スライドをグリセロール／ＰＢＳ溶液（Citifluor、UKO、Canterbury, UK）に浸して覆った。Axioscop蛍光顕微鏡（Carl Zeiss B.V.、Weesp, the Netherlands）を用いてスライドを分析した。
【０５１６】
７．４  実施例１２：赤血球凝集アッセイ、クロロホルム感受性試験及び電子顕微鏡観察
ウイルスの検出には、ウイルスの様々な特徴を利用することができる。たとえば、多くのウイルスが赤血球に結合することができるタンパク質を含み、これにより格子が生じる。この特性は赤血球凝集と呼ばれ、ウイルスを検出するための赤血球凝集アッセイで使用することができる。電子顕微鏡（ＥＭ）の下でウイルスを可視化することもでき、またＰＣＲ技法によって検出することもできる。
【０５１７】
赤血球凝集アッセイ及びクロロホルム感受性試験は、記載のように行った（Osterhaus 他、1985、Arch. of Virol、86:239-25; Rothbarth他、J of Virol Methods、78:163-169）。
【０５１８】
ＥＭ分析では、４℃、１７０００×ｇの微量遠心で感染細胞の培養物上清からウイルスを濃縮し、その後、ペレットをＰＢＳに再懸濁させて陰性造影ＥＭで検査した。
【０５１９】
７．５  実施例１３：ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭクラスのｈＭＰＶ／ＡＶＰ抗体の検出
感染／病気中には、ウイルスに対する特異的抗体が産生される。したがって、宿主におけるウイルスに特異的な抗体の検出は、宿主が現在かつ／又は過去にそのウイルスに感染していたことの指標となる。
【０５２０】
ｈＭＰＶ抗体のＩｇＧクラスを検出するために、間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を用いた。このアッセイは、基本的に（Rothbarth他、1999、J. of Vir. Methods、78:163-169）に既に記載されているとおりに、マイクロタイタープレート中で行った。簡単に説明すると、１％のトリトンＸ−１００で処理することによって濃縮したｈＭＰＶを可溶化した。交差力価測定によって至適作業希釈率を決定した後、これをＰＢＳ中で、室温で１６時間、マイクロタイタープレートにコーティングした。次いで、ＥＩＡ緩衝液で１：１００に希釈した１００ｕｌ体積のヒト血清試料をウェルに加え、１時間、３７℃でインキュベートした。ヒトＩｇＧの結合は、ヤギ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Biosource、USA）を加え、ＴＭＢを基質として加え、プレートを展開しsubstrate developed plate、４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定することによって検出した。結果は、ＯＤのＳ（シグナル）／Ｎ（陰性）比として表した。Ｓ／Ｎ比が陰性対照＋基準物質の３倍であった場合に、血清がＩｇＧについて陽性であるとみなした。
【０５２１】
ＩｇＭ及びＩｇＡクラスのｈＭＰＶ抗体は、基本的に（Rothbarth他、1999、J Vir Methods、78:163-169）に既に記載されているとおりに、捕捉ＥＩＡによって血清中で検出した。ＩｇＡ及びＩｇＭの検出には、抗ヒトＩｇＭ又はＩｇＡ特異的モノクローナル抗体でコーティングされた市販のマイクロタイタープレートを使用した。血清を１：１００に希釈した。１時間３７℃インキュベートした後、至適作業希釈率のｈＭＰＶを各ウェルに加え（１００μｌ）、１時間３７℃でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識したポリクローナル抗ｈＭＰＶ抗体を加え、プレートを１時間３７℃でインキュベートした。ＴＭＢを基質として加え、プレートを展開し、４５０ｒｉｍでＯＤを測定した。結果は、ＯＤのＳ（シグナル）／Ｎ（陰性）比として表した。Ｓ／Ｎ比が陰性対照＋基準物質の３倍であった場合に、ＩｇＧについて陽性の結果とした。
【０５２２】
ＡＶＰ抗体をＡＶＰ阻害アッセイで検出した。ＡＰＶ阻害試験のプロトコルは、SVANOVA Biotech AB、Uppsala Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Sweden製造のＡＰＶ−Ａｂ  ＳＶＡＮＯＶＩＲ（登録商標）酵素免疫アッセイに含まれている。結果は、ＯＤのＳ（シグナル）／Ｎ（陰性）比として表した。Ｓ／Ｎ比が陰性対照＋基準物質の３倍であった場合に、血清がＩｇＧについて陽性であるとみなした。
【０５２３】
７．６  実施例１４：  ＥＬＩＳＡによるヒト、哺乳動物、反芻動物又は他の動物内の抗体の検出
ウイルスに特異的な抗体の検出には、ＭＰＶを感染させたｔＭＫ細胞を（上述のように）アセトンでカバーガラス上に固定し、ＰＢＳで洗浄し、１〜１６の希釈率の血清試料と共に３０分間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳで２回、水道水で１回洗浄した後、スライドを３７℃で３０分間、ＦＩＴＣ標識の使用した種に対する二次抗体（Ｄａｋｏ）と共にインキュベートした。上述のようにスライドを処理した。
【０５２４】
抗体を蛍光色素で直接標識することができ、これにより直接免疫蛍光アッセイがもたらされる。ＦＩＴＣを任意の蛍光色素で置き換えることができる。
【０５２５】
７．７  実施例１５：ＥＬＩＳＡによるヒト、哺乳動物、反芻動物又は他の動物内の抗体の検出
パラミクソウイルス科ではＮタンパク質が最も豊富なタンパク質であり、このタンパク質に対する免疫応答が感染の初期に起こる。そのため、ＭＰＶに対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを開発するためにＮタンパク質の組換え源を使用することが好ましい。抗体の検出に適した抗原には、ＭＰＶウイルスに曝された又はそれに感染した患者の任意のＭＰＶ特異的抗体と結合する、任意のＭＰＶタンパク質が含まれる。本発明の好ましい抗原には、ＭＰＶに曝された患者において免疫応答を優先的に引き起こし、したがって典型的には患者の抗体によって最も容易に認識されるものが含まれる。特に好ましい抗原には、ＭＰＶのＮ、Ｆ、Ｍ及びＧタンパク質が含まれる。免疫学的技法に用いられる抗原は、未改変抗原であっても、それを改変した形であってもよい。分子生物学における周知の技術を用いてＭＰＶ抗原のアミノ酸配列を変化させ、免疫学的技法で使用し得る改変した形の抗原を生成することができる。
【０５２６】
遺伝子をクローニングする方法、遺伝子を発現ベクター内へ及び発現ベクターから外へ操作する方法、並びにその遺伝子にコードされているタンパク質を異種製宿主中で発現させる方法は周知であり、このような技術を使用して、発現ベクター、宿主細胞、及び診断的アッセイで使用するための組換え抗原を産生させるために抗原をコードしているクローニングした遺伝子を宿主内で発現させる方法を提供することができる。たとえばMOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL AND CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY参照。
【０５２７】
ＭＰＶ抗原を産生させるために様々な発現系を使用し得る。たとえば、大腸菌、枯草菌、酵母菌、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞中でタンパク質を産生させるのに適した様々な発現ベクターが記載されており、これらのうち任意のものを使用して、曝露した患者で抗ＭＰＶ抗体を検出するのに適したＭＰＶ抗原を産生させ得る。
【０５２８】
バキュロウイルス発現系はタンパク質の必要なプロセシングを提供するという利点を有しているので、これが好ましい。この系は、ＭＰＶ抗原の発現を指揮するためにポリヘドリンプロモーターを利用する（Matsuura他、1987、J. Gen. Virol.、68:1233-1250）。
【０５２９】
組換えバキュロウイルスによって産生させた抗原は、患者において抗ＭＰＶ抗体を検出するために様々な免疫学的アッセイで使用することができる。ウイルス特異的抗体を検出する実質的にどの免疫学的アッセイにおいても天然ウイルスの代わりに組換え抗原を使用することができることは、確立されている。アッセイには、直接及び間接アッセイ、サンドイッチアッセイ、とりわけプレートやビーズを使用するものなどの固相アッセイ、及び液相アッセイが含まれる。適切なアッセイには、一次抗体及び二次抗体を使用するもの、並びにプロテインＡなどの抗体結合試薬を使用するものが含まれる。さらに、本発明では比色法、蛍光法、リン光法、化学発光法、発光法、及び放射能法を含めた様々な検出方法を使用することができる。
【０５３０】
たとえば、組換えＮタンパク質（昆虫（Ｓｆ９）細胞中で組換えバキュロウイルスを用いて産生した）を抗原として用いる間接ＩｇＧ  ＥＩＡを行うことができる。抗原の調製には、Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスに感染させ、感染後３〜７日目に採取する。細胞懸濁液をＰＢＳ、ｐＨ７．２で２回洗浄し、５．０×１０６個の細胞／ｍｌの細胞密度に調節し、３回凍結−解凍する。大きな細胞細片を低速遠心（５００×ｇ、１５分間）によってペレット化し、上清を収集し、使用時まで−７０℃で保存する。陰性対照の抗原には、未感染の細胞を同様に処理する。
【０５３１】
抗原を調製した後、１００μｌの凍結−解凍した溶菌液を用いて、１：５０〜１：１０００の範囲の希釈率でマイクロタイタープレートをコーティングする。未感染細胞の溶菌液を２つ組のウェルで流し、これは陰性対照として役割を果たす。終夜インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。試験血清をＥＬＩＳＡ緩衝液（２％の正常ヤギ血清、並びに０．５％のウシ血清アルブミン及び０．１％の乳を添加したＰＢＳ）で１：５０〜１：２００に希釈し、次いでウェル内で１時間、３７℃でインキュベートする。
【０５３２】
プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。ＥＬＩＳＡ緩衝液で１：３０００〜１：５０００に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒト（又は他の種に対するもの）ＩｇＧをウェルに加え、１時間３７℃でインキュベートする。その後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回、水道水で１回洗浄し、Ｓｉｇｍａから入手したものなど酵素基質ＴＭＢ、すなわち３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンと共に室温で１５分間インキュベートし、１００μｌの２Ｍリン酸で反応を停止させる。自動マイクロタイタープレート読取機を用いて４５０ｎｍの比色値を測定する。
【０５３３】
７．８  実施例１６：ウイルス中和アッセイ
被験体がウイルスに感染すると、そのウイルスに対する抗体のアレイが産生させる。これらの抗体の一部はウイルス粒子に結合してその感染力を中和することができる。ウイルス中和アッセイ（ＶＮ）は通常、血清又はモノクローナル抗体の希釈液をウイルスと混合し、これをインキュベートし、培養細胞、孵化卵、又は動物を用いて残存感染力をアッセイすることによって実施する。中和抗体はウイルス粒子上の型特異的な抗原ウイルス粒子を定義するために使用することができる。たとえば、ウイルスの血清型を定義するために中和抗体を使用することができる。さらに、幅広く中和する抗体も存在し得る。
【０５３４】
８倍希釈から開始して、ヒト及び動物の血清の連続２倍希釈液を用いてＶＮアッセイを行った。希釈した血清を１００  ＴＣＩＤ５０のウイルスと共に１時間インキュベートした後、９６ウェルプレート中で増殖させたｔＭＫ細胞に接種し、その後、プレートを８４０×ｇで遠心した。３〜６日後に培地を交換し、接種後８日目にＭＰＶに対するＦＴＩＣ標識のフェレット抗体でＩＦＡを実施した。ＶＮ力価は、細胞培養物において陰性ＩＦＡ及びＣＰＥの阻害をもたらす血清試料の最も低い希釈率として定義した。
【０５３５】
７．９  実施例１７：ＲＮＡの単離
宿主におけるウイルスの存在は、宿主から採取した試料中でウイルス核酸を検出することによっても診断することができる（たとえば実施例１８のＲＴ−ＰＣＲ及び実施例２１のＲＡＰ−ＰＣＲ参照）。
【０５３６】
ＲＮＡは、感染細胞培養物の上清から、又はスクロース勾配分画からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（Roche Diagnostics、Ahnere, The Netherlands）を用いて、製造者の指示に従って単離した。ＲＮＡはまた、当分野で知られている他の手順に従っても単離することができる（たとえば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、第1-3巻(1994-1998)、Ausubel, F.M.他偏、John Wiley and sons, Inc.、USA出版参照）。
【０５３７】
７．１０  実施例１８：  ＭＰＶを検出／診断するためのＲＴ−ＰＣＲ
生物学的サンプル中のウイルスの検出は、ウイルスのゲノム物質を複製又は増幅する方法を用いて行うことができる。既知のパラミクソウイルスにおけるＲＴ−ＰＣＲアッセイのためのウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド配列を本実施例中で以下に記載する。５０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトール、２００μＭずつの各ｄＮＴＰ、１０単位の組換えＲＮＡｓｉｎ（Promega、Leiden, the Netherlands）、１０単位のＡＭＶ  ＲＴ（Promega、Leiden, the Netherlands）、５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（PE Biosystems、Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands）、及び５μｌのＲＮＡを含む５０μｌの反応液中で、１ステップのＲＴ−ＰＣＲを行った。サイクル条件は、４２℃で４５分間及び９５℃で７分間を１回、９５℃で１分間、４２℃で２分間、及び７２℃で３分間を４０回繰り返し、７２℃で１０分間を１回である。プライマーの配列は配列表で提供する。より具体的には、核タンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号２８及び２９に対応するヌクレオチド配列を有するＮ３及びＮ４であり、これらを用いて１５１個のヌクレオチドの断片を増幅した。マトリックスタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号３０及び３１に対応するヌクレオチド配列を有するＭ３及びＭ４であり、これらを用いて２５２個のヌクレオチドの断片を増幅した。ポリメラーゼタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号３４及び３５に対応するヌクレオチド配列を有するＬ６及びＬ７であり、これらを用いて１７３個のヌクレオチドの断片を増幅した。Ｆタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号３２及び３３に対応するヌクレオチド配列を有するＦ７及びＦ８であり、これらを用いて２２１個のヌクレオチドの断片を増幅した。
【０５３８】
さらに、プローブを用いてｈＭＰＶゲノム配列が存在することを確認した。Ｍ遺伝子の検出に用いたプローブは、配列番号３６に対応するヌクレオチド配列を有していた。Ｎ遺伝子の検出に用いたプローブは、配列番号３７に対応するヌクレオチド配列を有していた。Ｌ遺伝子の検出に用いたプローブは、配列番号３８に対応するヌクレオチド配列を有していた。
【０５３９】
別の例では、既知の、又は配列決定によって得られたＭＰＶ配列に基づいてプライマー及びプローブを設計することができる。同様に、プライマーの様々な配列並びに特定の目的で使用するための様々な緩衝液及びアッセイ条件は、当業者には知られているであろう。
【０５４０】
既知のパラミクソウイルスの検出にもＲＴ−ＰＣＲを使用した。ｈＰＩＶ−１〜４、流行性耳下腺炎、麻疹、ツプシア（Tupsia）、マプエラ、及びヘンドラのプライマーを、入手可能な配列のアラインメントに基づいて所内で開発した。ニューカッスル病ウイルスのプライマーはSeal, J.,J.他、Clin. Microb.、2624-2630、1995から得た。ニパ及び一般パラミクソウイルスのＰＣＲのプライマーはChua他、2000、Science、288から得た。他の既知のパラミクソウイルスの検出に使用したプライマーは以下のとおりである。ｈＰＩＶ−１は配列番号５８及び５９の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ｈＰＩＶ−２は配列番号６０及び６１の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ｈＰＩＶ−３は配列番号６２及び６３の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ｈＰＩＶ−４は配列番号６４及び６５の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、流行性耳下腺炎は配列番号６６及び６７の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ＮＤＶは配列番号６８及び６９の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ツパイは配列番号７０及び７１の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、マプエラは配列番号７２及び７３の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ヘンドラは配列番号７４及び７５の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ニパは配列番号７６及び７７の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、ＨＲＳＶは配列番号７８及び７９の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、麻疹は配列番号８０及び８１の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出し、一般パラミクソウイルス科は配列番号８２及び８３の配列に対応するプライマー（それぞれフォワード及びリバースプライマー）で検出した。
【０５４１】
７．１１  実施例１９：ＰＣＲを使用したｈＭＰＶの検出
サンプル中のｈＭＰＶの存在を検出するために、迅速かつ単純なＰＣＲベースのアッセイを開発した。ｈＭＰＶのＬ配列及びＮ配列を標的とした標準通りのＲＴ−ＰＣＲ分析を、以下のプライマーセット、すなわち、Ｌ−フォワード（5’-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3’）及びＬ−リバース（5’-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3’）、並びに、プライマー、Ｎ−フォワード（5’-CATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3’）及びＮ−リバース（5’-TCTGCAGCATATTTGTAATCA-3’）を用いて実施した。反応混合物（全容積５０μｌ）は、ＲＮＡ  ５μｌ、各プライマー２００ｎＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ緩衝液（Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d IJssel, The Netherlands）、ｄＮＴＰ  ６００μＭ、ＤＴＴ  ２μＭ、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ、ＲＮＡｓｉｎ  ２０Ｕ、Ｔａｑポリメラーゼ５Ｕ、及びＡＭＶ逆転写酵素１０Ｕ（全ての酵素はPromega社から購入した）。ＲＴ−ＰＣＲのパラメータは、４２℃で６０分、そして９５℃で７分、続いて、９５℃で１分と、４５℃で２分と、７２℃で３分とを４０サイクルであった。全ての新規ＤＮＡ鎖の伸長が確実に完了するように、７２℃で１０分の最終インキュベーションを含めた。
【０５４２】
ＰＣＲ産物の検出は、ＰＣＲ反応試料１０μｌをＨｙｂｏｎｄＮ＋膜（Amersham Pharmacia biotech）に転写し、続いて、ビオチン標識されたプローブ（両方のアッセイに、それぞれ、Ｎ−プローブ（5’-ACAACTGCAGTGACACCTTCATCATTGCA-3’）及びＬ−プローブ（5’-CTGTTAATATCCCACACCAGTGGCATGC-3’））をハイブリダイズさせることによって行った。次に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体をプローブに結合させ、ＥＣＬ検出試薬（Amersham Pharmacia biotech）を添加した。ＤＮＡ断片は、ブロットをエックス線フィルムに曝露することによって可視化した（図５８）。これらの結果は、Ｎ配列又はＬ配列のいずれかに対する１セットのオリゴヌクレオチドを使用することによって、このＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイを用いて、４つのクレード全てのＭＰＶ株を検出できることを実証するものである。
【０５４３】
７．１２  実施例２０：  ヒトメタニューモウイルスの４つのサブタイプ全てを検出する単一アッセイの開発
全てのｈＭＰＶサブタイプ、すなわちＡ１、Ａ２、Ｂ１、及びＢ２の検出を可能にするため、感度のよい単一アッセイを開発した。このアッセイは、様々なサブタイプのｈＭＰＶ株の検出を、一定のセットの診断用設備と試薬とを使用して行うことを可能にしたので有利であった。この新規でかつ感度のよいＴａｑｍａｎアッセイは、４つのサブタイプ全てに対して等しく感度がよいと判定された。
【０５４４】
２セットのＴａｑｍａｎプライマー及びプローブは、５３株の臨床分離株から得られたｈＭＰＶヌクレオキャプシド遺伝子の配列情報に基づいて、ｈＭＰＶの４つのサブクレード（subclade）全てを同定するように設計した。４つのｈＭＰＶサブタイプ全てが、分離株のこのパネル中に存在していた。選択されたプライマー及びプローブは、全てのサブタイプで最もよく保存されている配列中に位置するものであった。アッセイ用に設計されたＴａｑｍａｎプライマーは、Ｍｅｄｉ−Ｎ−フォワード（5’-CAACAACATAATGCTAGGACATGTATC-3’）及びＭｅｄｉ−Ｎ−リバース（5’-CCGAGAACAACACTAGCAAAGTTG-3’）であり、プローブは、Ｍｅｄｉ−Ｎ−プローブ（5’-FAM-TGGTGCGAGAAATGGGTCCTGAATCTGG-TAMRA-3’）であった。ＮＬ−Ｎアッセイ用に設計されたプライマーは、ＲＦ９３０（5’-CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3’）及びＲＦ９３１（5’-CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG-3’）であり、プローブはＲＦ９２８（5’-FAM-TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-TAMRA-3’）であったが、配列中、Ｙは、Ｃ又はＴ残基のいずれかである。
【０５４５】
ＨＭＰＶ分離株は、冷凍の診断用鼻咽腔試料から得た。ウイルスは、ｔＭＫ細胞で増殖させて、−７０℃で保存した。設計したプライマー及びプローブを試験するために、全ての臨床ｈＭＰＶ分離株の中から、プロトタイプ分離株として、各サブタイプあたり１株の４株を選択した。これらのプロトタイプウイルスの完全な配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手することができる。すなわち、ｈＭＰＶサブタイプＡ１のプロトタイプウイルス（株ＮＬ／０１／００；アクセッション番号ＡＦ３７１３３７）、Ａ２のプロトタイプウイルス（株ＮＬ／１７／００；申請中）、Ｂ１のプロトタイプウイルス（株ＮＬ／９９１０１；申請中）、及びＢ２のプロトタイプウイルス（株ＮＬ／９４／０１；申請中）である。
【０５４６】
ウイルスゲノムのコピー数を定量することができるように、標準曲線を作成するためにＲＮＡランオフ転写産物を生成させた。ｈＭＰＶ  Ａ１プロトタイプウイルスのＮ配列は、改変ｐＣＩＴＥベクター中に、Ｔ７プロモーターの制御下となるようにクローニングした。ランオフ転写産物は、製造者の指示に従って、リボプローブシステム−Ｔ７システム（Promega）を使用して生成させた。ＲＮＡランオフ転写産物の純度は、ゲル電気泳動によって検査し、分光計でＡ２６０を測定することによって定量した。
【０５４７】
ＲＮＡは、製造者の指示に従って、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（Roche Diagnostics、Almere, The Netherlands）を用いて単離した。ＲＮＡの単離には、０．２ｍｌのサンプルを使用した。カラムへの結合、ＤＮアーゼＩ消化、及び洗浄を行った後、ヌクレアーゼ不含の再蒸留水５０μｌにＲＮＡを溶出させた。ｃＤＮＡの生成は、最終容積２０μｌ中に５μｌのＲＮＡサンプルを使用し、特異的なプライマーを用い、製造者の指示に従ってｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素酵素（Invitrogen）を使用して行った。リアルタイムＰＣＴの各反応には、５μｌアリコートのｃＤＮＡを使用した。
【０５４８】
ウイルスＲＮＡの検出は、ＲＴステップを別々に行い、製造者の指示に従ってＴａｑｍａｎユニバーサルＰＣＲマスター混和物（Applied Biosystems、Nieuwerkerk a/d IJessel, The Netherlands）を使用して行った。ワンステップ反応には、ＥＺ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Applied Biosystems）を使用した。増幅及び検出は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｔａｑｍａｎマシーン（Applied Biosystems）で行った。各反応混合物は、フォワードプライマー（ＲＦ９３０）５００ｎｍ、リバースプライマー（ＲＦ９３１）２５０ｎｍ、及び、５’末端をＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）で、そして３’末端をＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）で標識されたエンドヌクレアーゼプローブ（ＲＦ９２８）５００ｎＭを含有していた。増幅パラメータは、９５℃で５分間の変性／活性化、そして、９５℃で３０秒と、６０℃で１分とを４５サイクルであった。ワンステップ反応では、これらのサイクル条件に先行して、ＲＴステップとして、５０℃で２分そして６０℃で３０分を行った。
【０５４９】
ｈＭＰＶの４つのサブクレード全てを検出するように、２セットのプライマー及びプローブ（Ｍｅｄｉ−Ｎアッセイ用及びＮＬ−Ｎアッセイ用）を設計した。プライマー及びプローブは、ｈＭＰＶのヌクレオキャプシド遺伝子中で最も保存されている配列を標的にして、ｈＭＰＶの４つのサブクレード全てとハイブリダイズするように設計した。４つのプロトタイプｈＭＰＶウイルスの標的配列を検出する感度に関して、両アッセイを試験した。プロトタイプウイルス株のＮ配列からのランオフ転写産物を、両アッセイの感度を決定するのに使用した。両アッセイ（Ｍｅｄｉ−Ｎ及びＮＬ−Ｎ）相互の比較によって、両アッセイとも、ｈＭＰＶの４つのサブクレード全てからの標的配列を検出できることが明らかになった。ランオフ転写産物及びウイルス分離株の連続希釈は、Ａ１及びＡ２プロトタイプウイルス株の標的配列を検出する際に、ＮＬ−Ｎアッセイがより高い感度を有することを示した。したがって、その後の開発及び試験には、ＮＬ−Ｎアッセイを選択した。
【０５５０】
ＮＬ−Ｎアッセイ用に設計したプライマー及びプローブがｈＭＰＶに特異的であるかどうかを試験するために、他の１５の一般的な呼吸器ウイルス物質から得た鋳型ＲＮＡをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した。これらの鋳型は、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎、ＳＶ５、ＮＤＶ、ＲＳＶ  Ａ及びＢ、ＡＰＶ−Ａ、Ｂ、及びＣ、ＨＰＩＶ−１、２、３、及び４、並びにインフルエンザウイルスＡ及びＢからのＲＮＡを含めたウイルスストックから単離した。陽性対照試料は、ｈＭＰＶ  Ａ１  ＲＮＡ鋳型であった。ｈＭＰＶ以外のウイルスストックから単離されたＲＮＡ鋳型は、いずれも陽性シグナルを与えず、これによって、設計したプライマー及びプローブがｈＭＰＶに特異的であることが確認された。
【０５５１】
最適の増幅シグナルを得るために、様々な量のフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを試験した。予備実験は、リバースプライマー（ＲＦ９３１）との比較においてフォワードプライマー（ＲＦ９３０）の量を２倍にした非対称の混合物によって、最も感度のよい反応混合物が得られることを明らかにした。発明者らのアッセイの感度を決定するために、ｈＭＰＶの４つのプロトタイプウイルス全てから得たウイルスＲＮＡの連続希釈を試験した。ｈＭＰＶ  Ａ１及びＢ１のプロトタイプ株からの連続希釈は１０４の希釈まで陽性の結果を与え、ｈＭＰＶ  Ａ２及びＢ２プロトタイプ株からの、力価がより高いウイルスストックからのＲＮＡは、１０５倍まで希釈することができた（図５９Ａ）。このアッセイは、４つのプロトタイプウイルス全てに対して等しく感度がよいことが立証されており、検出限界は、ｈＭＰＶ  Ａ２プロトタイプウイルスに対してＴＣＩＤ５０が少なくとも０．００６、そして、他のプロトタイプウイルスに対しては、ＴＣＩＤ５０が０．０１であった。標準物質として、ｈＭＰＶ  Ａ１  Ｎ配列からのＲＮＡランオフ転写産物を生成した。これらのＲＮＡ転写物を定量し、連続希釈を作製したころ、最少ではＲＮＡ  ５コピーでも、発明者らのＴａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイで陽性シグナルが得られた（図５９Ｂ）。
【０５５２】
発明者らの新規のＲＴ−ＰＣＲアッセイ用のプライマー及びプローブは、４つのｈＭＰＶサブタイプ全てからのＮ遺伝子の配列に基づいたものである。しかし、以前に記載されているアッセイは、ｈＭＰＶのＮ配列（MacKay他、J.Clin.Microbiol. 41: 100〜105）又はＬ配列（Van Den Hoogen、2003、印刷中）を標的とするが、ｈＭＰＶ  Ａ１プロトタイプウイルスの配列のみに基づいたプライマーを使用するものであった。試験した様々なプライマー／プローブセットに関する、４つのプロトタイプｈＭＰＶ株におけるオリゴヌクレオチドアニーリング部位のエントロピープロットを図５９Ｃに示す。これらのアッセイがｈＭＰＶの４つのサブタイプ全てを検出できるかどうか決定するために、それらを試験した。プロトタイプウイルスのＲＮＡ連続希釈におけるこれらのアッセイの結果は、ＮＬ−Ｎアッセイより低い感度ではあるが、それらがｈＭＰＶ  Ａウイルスを検出し、しかしＢクレードからのウイルスは検出しないことを示した（図５９Ｄ）。
【０５５３】
７．１３  実施例２１：ＲＡＰ−ＰＣＲ
ＭＰＶ又は他のウイルスの遺伝物質は、ゲノム内の領域にハイブリダイズし、遺伝物質が増幅されるように特定の方向に伸張するプライマーを用いて検出又は増幅することができる。この種の技法は、特定の配列情報が入手不可であるか、また遺伝物質の最初の増幅を試料中で行う場合に有用である。このような技法の１つはＲＡＰ−ＰＣＲと呼ばれている。
【０５５４】
ＲＡＰ−ＰＣＲは、基本的に記載されているとおりに行った（Welsh他、1992、NAR、20:4965-4970）。ＲＴ反応には、１０ｎｇ／μｌのオリゴヌクレオチド、１０ｍＭのジチオトレイトール、それぞれ５００μｍずつの各ｄＮＴＰ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ及び３ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１０μｌの反応液中で、２μｌのＲＮＡを使用した。反応混合液を７０℃で５分間及び３７℃で５分間インキュベートし、その後、２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ酵素（LifeTechnologies）を加えた。３７℃でインキュベーションを５５分間続け、７２℃で５分間インキュベートすることによって反応を停止させた。ＲＴ混合液を希釈して、８ｎｇ／μｌのオリゴヌクレオチド、それぞれ３００μｌずつの各ｄＮＴＰ、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、６５ｍＭのＫＣｌ、３．０ｍＭのＭｇＣＬ２及び５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（FE Biosystems）を含む５０μｌのＰＣＲ反応液を得た。サイクル条件は、９４℃で５分間４０℃で５分間、及び７２℃で１分間を１回、次いで９４℃で１分間及び５６℃で２分間を４０回繰り返し、７２℃で５分間を１回であった。
【０５５５】
ＲＡＰ−ＰＣＲに使用したプライマーは以下のとおりである。配列番号４６に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＺＦ１、配列番号４７に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＺＦ４、配列番号４８に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＺＦ７、配列番号４９に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＺＦ１０、配列番号５０に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＺＦ１３、配列番号５１に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＺＦ１６、配列番号５２に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＣＳ１、配列番号５３に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＣＳ４、配列番号５４に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＣＳ７、配列番号５５に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＣＳ１０、配列番号５６に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＣＳ１３、及び配列番号５７に対応するヌクレオチド配列を有するプライマーＣＳ１６である。生成物は、３％のＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル（FMC BioProducts、Heerhugowaard, The Netherlands）に隣り合わせて流した。Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen、Leusden, The Netherlands）を用いてＭＰＶに特異的な示差的に表れた断片をゲルから精製し、ｐＣＲ２．１ベクター（Invitrogen、Groningen, The Netherlands）内に、製造者の指示に従ってクローニングした。２０個の断片の精製及び配列決定に成功した。１０個の断片でＡＰＶに対する配列相同性が見つかった。すなわち、ＺＦ７プライマーを用いて単離した断片１ではＮ遺伝子に相同性を有する３３５ｂｐの断片が得られ、ＺＦ１０プライマーを用いて単離した断片２ではＮ遺伝子に相同性を有する２３５ｂｐの断片が得られ、ＺＦ１０プライマーを用いて単離した断片３ではＭ遺伝子に相同性を有する８００ｂｐの断片が得られ、ＣＳ１プライマーを用いて単離した断片４ではＦ遺伝子に相同性を有する１２５０ｂｐの断片が得られ、ＣＳ１０プライマーを用いて単離した断片５ではＦ遺伝子に相同性を有する４００ｂｐの断片が得られ、ＣＳ１３プライマーを用いて単離した断片６ではＦ遺伝子に相同性を有する１４５０ｂｐの断片が得られ、ＣＳ１３プライマーを用いて単離した断片７ではＦ遺伝子に相同性を有する７５０ｂｐの断片が得られ、ＺＦ４プライマーを用いて単離した断片８ではＬ遺伝子に相同性を有する（タンパク質レベル）７８０ｂｐの断片が得られ、ＺＦ１０プライマーを用いて単離した断片９ではＬ遺伝子に相同性を有する（タンパク質レベル）３３０ｂｐの断片が得られ、ＺＦ１０プライマーを用いて単離した断片１０ではＬ遺伝子に相同性を有する（タンパク質レベル）２５０ｂｐの断片が得られた。
【０５５６】
遺伝子の発現のレベルを測定するためにＴａｑＭａｎアッセイを使用することができる。Ｌ遺伝子及びＮ遺伝子の発現を検査するためにＴａｑＭａｎアッセイを適合させた。これらのアッセイで使用したプライマーはｈＭＰＶグループのいずれか１つに特異的である必要はないが、以下に例を示す。反応は、５０μｌの全反応体積中、５００ｎＭ濃度のフォワードプライマー、２５０ｎＭ濃度のリバースプライマー、２５０ｎＭ濃度のオリゴヌクレオチドプローブ、２５μｌのユニバーサルＰＣＲマスターミックス（ＡＢＩから入手可能）、及び５μｌのｃＤＮＡで実施した。サイクル条件はＡＢＩ７０００配列検出システムで、９５℃で１０分間の第１ステップ、次いで９５℃で３０秒間及び６０℃で６０秒間からなる４５サイクルの第２ステップであった。
【０５５７】
ＴａｑＭａｎアッセイで使用するｈＭＰＶのＮ遺伝子のプライマーの他の例は以下のとおりである。すべてサブグループＡ１である分離株ＮＬ／１／００、ＢＩ／１／０１、ＦＩ／４／０１、ＮＬ／８／０１、及びＦＩ／２／０１では、配列番号３９のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループＡ１の分離株ＮＬ／３０／０１では、配列番号４０のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループＡ２の分離株ＮＬ／２２／０１及びＮＬ／２３／０１では、配列番号４１のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループＡ２の分離株ＮＬ／１７／０１では、配列番号４２のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループＡ２の分離株ＮＬ／１７／０１では、配列番号４３のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループＢ１の分離株ＮＬ／１／９９、ＮＬ／５／０１、ＮＬ／２１／０１及びＮＬ／９／０１では、配列番号４４のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。サブグループＢ１の分離株ＦＩ／１／０１及びＦＩ／１０／０１では、配列番号４５のヌクレオチド配列を有するプライマーを使用することができる。
【０５５８】
サブグループＡ１で使用することができる潜在的なプローブは配列番号３９０に対応し、サブグループＢ１で使用することができるプローブは配列番号３９１に対応し、サブグループＢ２で使用することができるプローブは配列番号３９２に対応する。
【０５５９】
７．１４  実施例２２：ＲＡＰ−ＰＣＲ産物の配列分析
ＲＡＰ−ＰＣＲを用いてセグメントを増幅した後、増幅したセグメントについて配列情報を得ることができる。これを行うためには、配列決定の前に作製した断片をベクター内にクローニングすることが有利である。
【０５６０】
ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen）内にクローニングしたＲＡＰ−ＰＣＲ産物をＭ１３特異的オリゴヌクレオチドを用いて配列決定した。Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen、Leusden, The Netherlands）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって得たＤＮＡ断片をアガロースゲルから精製し、ＰＣＲで使用したものと同じオリゴヌクレオチドを用いて直接配列決定した。配列分析は、Ｄｙｅｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーター配列決定キット（Amersham Pharmacia Biotech、Roosendaal, The Netherlands）及びＡＢＩ３７３自動ＤＮＡ配列決定装置（PE Biosystem）を用いて行った。すべての技法は、製造者の指示に従って行った。
【０５６１】
７．１５  実施例２３：  ＲＴ−ＰＣＲによるゲノム断片の作製
ＲＡＰ−ＰＣＲ法は配列中に、増幅又は複製されていないギャップを残す場合がある。完全な配列を得るために、ＲＴ−ＰＣＲを用いてギャップの配列情報を得ることができる。
【０５６２】
ＲＡＰ−ＰＣＲ断片の間のギャップＡ、Ｂ及びＣを含むＰＣＲ断片を作製するために（図３）、ウイルス分離株００−１から単離したＲＮＡ試料について既に記載したようにＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用した。
【０５６３】
断片Ａを作製するために以下のプライマーを使用した：配列番号２２のヌクレオチド配列に対応する、リーダー中に設計されたＴＲ１、及び配列番号２３の配列に対応する、Ｎで得られたＲＡＰ−ＰＣＲ断片の３’末端に設計されたＮ１。断片Ｂを作製するために以下のプライマーを使用した：配列番号２４のヌクレオチド配列に対応する、Ｎで得られたＲＡＰ−ＰＣＲ断片の５’末端に設計されたＮ２、及び配列番号２５のヌクレオチド配列に対応する、Ｍで得られたＲＡＰ−ＰＣＲ断片の３’末端に設計されたＭ１。断片Ｃを作製するために以下のプライマーを使用した：配列番号２６のヌクレオチド配列に対応する、Ｍで得られたＲＡＰ−ＰＣＲ断片の５’末端に設計されたＭ２、及び配列番号２７のヌクレオチド配列に対応する、Ｆで得られたＲＡＰ−ＰＣＲ断片の３’末端に設計されたＦ１。
【０５６４】
既に記載のように、電気泳動の後に断片を精製し、クローニングし、配列決定した。
【０５６５】
７．１６  実施例２４：  組換え核タンパク質を用いた捕捉抗ＭＰＶ  ＩｇＭ  ＥＩＡ
ｈＭＰＶウイルスを検出するために、様々な宿主内で抗体の存在を検出する免疫学的アッセイ。最も豊富に産生されるタンパク質であるので、一例では、Ｎタンパク質に対する抗体を使用する。この特徴は、ウイルスのゲノムに渡って起こる転写の勾配によるものである。
【０５６６】
Erdman他、1990、J. Clin. Microb.、29:1466-1471に既に記載されているアッセイを改変することによって、抗原として組換え核タンパク質又は任意の他の組換えタンパク質を使用する捕捉ＩｇＭ  ＥＩＡを行うことができる。
【０５６７】
マイクロタイタープレートのウェルに、Ｄａｋｏから入手したものなどのアフィニティー精製した抗ヒトＩｇＭ捕捉抗体（又は他の種に対するもの）を、０．１Ｍの炭酸緩衝液ｐＨ９．６中で１ウェルあたり２５０ｎｇの濃度で加えた。室温で終夜インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。ＥＬＩＳＡ緩衝液で１：２００〜１：１０００に希釈した１００μｌの試験血清を３つ組のウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄する。
【０５６８】
凍結−乾燥した（組換えウイルスに感染させた）Ｓｆ２１細胞の溶菌液をＥＬＩＳＡ緩衝液で１：１００〜１：５００に希釈し、ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。未感染細胞の溶菌液は陰性対照として役割を果たし、これを２つ組のウェルで流す。その後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＥＬＩＳＡ緩衝液で至適希釈率に希釈したＭＰＶに対するポリクローナル抗体１００μｌと共に、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した後、プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の二次抗体（ウサギ抗フェレットなど）と共にインキュベートし、プレートを３７℃で２０分間インキュベートした。
【０５６９】
その後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、たとえば「Ｓｉｇｍａ」から入手した酵素基質ＴＭＢ、すなわち３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンと共に室温で１５分間インキュベートし、１００μｌの２Ｍリン酸で反応を停止させた。自動マイクロタイタープレート読取機を用いて４５０ｎｍの比色値を測定した。
【０５７０】
組換え核タンパク質（又は他の組換えタンパク質）及び全ＭＰＶウイルスを用いた捕捉ＩｇＭ  ＥＩＡの感度を、臨床ＭＰＶウイルス感染を罹患している人由来の急性期及び回復期の血清の対を用いて比較した。組換え核タンパク質捕捉ＥＩＡの特異性は、健康な人及び他のパラミクソウイルス感染を罹患している人由来の血清検体を試験することによって決定した。
【０５７１】
バキュロウイルスでの発現によって産生した組換えＭＰＶ融合タンパク質及び糖タンパク質の使用におけるＥＩＡの潜在性。
【０５７２】
糖タンパク質Ｇ及びＦはＭＰＶビリオンの２つの膜貫通型エンベロープ糖タンパク質であり、主要な中和及び防御抗原を表す。バキュロウイルス系などのベクターウイルス系におけるこれら糖タンパク質の発現により、ＭＰＶに特異的な抗体を検出するアッセイで使用するための組換え抗原源が提供される。さらに、たとえば核タンパク質と組み合わせたそれらの使用により、ＭＰＶに対する抗体の検出において酵素免疫アッセイの感度がさらに増強される。
【０５７３】
様々な他の免疫学的アッセイ（Current Protocols in Immunology、第13巻、Coligan, J.E.、Kruisbeek, A.M.、Margulies, D.H.、Shevach, E.M.及びStrobe, W.、John Wiley and sons, Inc.、USA出版）を、本明細書中に記載した方法の代替方法として使用し得る。
【０５７４】
ウイルス分離株を見つけるために、鼻咽頭吸引液、咽頭及び鼻スワブ、気管支肺胞洗浄液並びにそれだけには限定されないが好ましくはヒト、食肉動物（イヌ、ネコ、アザラシなど）、ウマ、反芻動物（ウシ、ヒツジ、ヤギなど）、ブタ、ウサギ、トリ（家禽類、オーストリッジなど）由来の咽頭スワブを検査することができる。トリからは、総排泄腔及び腸管スワブ並びに糞も検査することができる。すべての試料で、ウイルスを検出するために血清学的技法（抗体及び抗原の検出など）、ウイルス単離及び核酸検出の技術を行うことができる。モノクローナル抗体は、マウス（又は他の動物）を精製ＭＰＶ又はその一部（タンパク質、ペプチド）で免疫し、次いで確立されたハイブリドーマ技術（Current Protocols in Immunology、John Wiley and sons, Inc.、USA出版）を使用することによって産生させることができる。あるいは、この目的のためにファージディスプレイ技術を使用することができる（Current Protocols in Immunology、John Wiley and sons, Inc.、USA出版）。同様に、ポリクローナル抗体は、感染したヒト又は動物から、あるいは免疫化したヒト又は動物から得ることができる（Current Protocols in Immunology、John Wiley and sons, Inc.、USA出版）。
【０５７５】
ＮＳ１及びＮＳ２タンパク質が存在すること又は存在しないことの検出は、ウェスタンブロット、ＩＦＡ、様々な抗体調製物を用いた免疫沈降技術を使用して行うことができる。ウイルス分離株中にＮＳ１及びＮＳ２遺伝子又はその相同体が存在すること又は存在しないことの検出は、既知のＮＳ１及び／又はＮＳ２遺伝子に基づいて設計されたプライマー組を用いたＰＣＲ、並びに様々な核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて行うことができる。
【０５７６】
ＮＳ１及びＮＳ２遺伝子がウイルスゲノムの３’末端に存在するかどうかを決定するために、ゲノムのこの３’末端に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことができる。本発明の場合、本発明者らはウイルスゲノムの３’非翻訳領域に特異的なプライマー及びＮ  ＯＲＦ中のプライマーを使用した。同じ目的のために他のプライマーを設計し得る。ＮＳ１／ＮＳ２遺伝子が存在しないことは、ＰＣＲ産物の長さ及び／又はヌクレオチド配列によって明らかとなる。ＮＳ１及び／又はＮＳ２遺伝子に特異的なプライマーを、ウイルスゲノムの３’末端の他の部分（非翻訳領域やＮ、Ｍ又はＦ  ＯＲＦなど）に特異的なプライマーと組み合わせて使用して、ＮＳ１又はＮＳ２遺伝子が存在することの確実な同定が可能になり得る。ＰＣＲに加えて、同じ目的のために分子クローニング、核酸ハイブリダイゼーションなど様々な技術を使用し得る。
【０５７７】
８．ＭＰＶ及びＭＰＶの組換え操作のための細胞培養物系及び動物モデル
８．１  実施例２５：様々な細胞系におけるｈＭＰＶの増殖
各ウイルスの特徴を検査するためにウイルス分離株を様々な細胞系で培養することができる。たとえば、培養物中で測定される力価レベルに基づいて様々なウイルス分離株の感染力を特徴とし、かつ区別することができる。あるいは、さらに分析するために、細胞を使用して培養物中のウイルス株を増殖又は増幅させることができる。
【０５７８】
一例では、ｈＭＰＶを増幅するために第３サル腎臓細胞を使用した。しかし、第３サル腎臓細胞は限られた回数しか継代し得ない一次細胞由来であり、かつｉｎ  ｖｉｖｏで３回継代培養されている。どの種類の不死化細胞系がｈＭＰＶウイルスの増殖を高い力価まで支持するかは知られていなかった。Ｖｅｒｏ、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＨＥｐ−２、及び肺線維芽細胞（ＬＦ１０４３）細胞などのいくつかのサル細胞系を、それがｈＭＰＶウイルスの複製を支持するかどうかを見るために試験した（表１２）。使用したトリプシンは、０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度のＴＰＣＫ−トリプシン（Worthington）であった。受精した１０日齢のニワトリの卵におけるこのウイルスの増殖も試験した。感染した卵は、ＡＦ収集の前に２及び３日間３７℃でインキュベートした。ウイルス力価は、１０日間３５℃でインキュベートしたトリプシンを含まないＶｅｒｏ細胞で、感染細胞の溶菌液のプラークアッセイによって決定し、モルモットｈＭＰＶ抗血清を用いて免疫染色した。結果は、Ｖｅｒｏ細胞及びＬＬＣ−ＭＫ２細胞がｈＭＰＶウイルス複製に最も適した基質細胞であり、１０６〜１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルスストック力価がもたらされた。この力価はｔＭＫ細胞で得られたものと類似していた。０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度でトリプチンを加えても、感知できるほどはウイルス力価は増加しなかった（表１２）。
【表１２】
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【０５７９】
Ｖｅｒｏ細胞におけるｈＭＰＶウイルス増殖のウイルス動力学を調査するために、０．１のＭＯＩを用いて増殖曲線を行った（図２３）。細胞及び細胞上清を２４時間毎に収集し、ウイルス力価を定量するためにプラークアッセイによって分析した。結果は、５日目にｈＭＰＶのピークに近い力価が観察されたことを示した。８日目に５．４ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌの絶対ピーク力価が得られた。ウイルス力価は１０日目まで非常に安定していた。細胞上清のみで同時に実施した増殖曲線では、非常に低いウイルス力価しか示されなかった。このデータにより、ｈＭＰＶの複製は、用いた条件下（０．１のＭＯＩ）では感染後８日目にピークに達し、またｈＭＰＶが概して細胞内ＲＮＡウイルスであることが実証された。
【０５８０】
２９３細胞のトランスフェクション：２９３細胞（ヒト腎臓上皮細胞）をＦＣＳ（１０％）、Ｌ−グルタミン（１：１００）及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１：１００）を添加したＤＭＥＭに入れ、３〜４日毎に１：１０に分割した。形質転換性を高めるために、細胞がコンフルエントになるまで増殖させないよう注意を払った。細胞はあまり接着性がなかった。これらをプラスチックの表面から放出させるためには、通常トリプシン−ＥＤＴＡ中で非常に短い（２分間以下）間インキュベーションすることで十分である。トリプシン処理のすぐ後に細胞を培地で希釈した。
【０５８１】
トランスフェクションの前日に細胞を分割した。トランスフェクションの際、細胞は約５０〜７５％コンフルエントであった。トランスフェクション手順の間中、細胞が脱離するのを防ぐためにゼラチン化したプラスチック製器具を使用した。プレート又はフラスコを０．１％のゼラチン（２％ストックの１：２０希釈）で１０分間覆い、ＰＢＳで１回洗浄した。正しい細胞密度を得るために、細胞は、Ｔ７５フラスコ又は１００ｍｍプレートあたり１×１０７個の細胞（１０ｍｌ中）、あるいは６ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０６個の細胞（２ｍｌ中）の濃度で使用した。
【０５８２】
トランスフェクションは最低７時間続けたが、終夜かけてトランスフェクションを行わせることが好ましい。滅菌チューブ内で以下を合わせ、簡単に混合した：３０ｍｇのＤＮＡ及び６２ｍｌの２Ｍ  ＣａＣｌ２並びにＨ２Ｏを５００ｍｌまで（Ｔ７５）、又は３ｍｇのＤＮＡ及び６．２ｍｌの２Ｍ  ＣａＣｌ２並びにＨ２Ｏを５０ｍｌまで（６ウェルプレート）。５００又は５０ｍｌの２×ＨＢＳの添加は滴下によって行い、沈殿物が形成されるまで溶液を５分間混合した。穏やかな対処方法を使用した、すなわち、ボルテックスは適用しなかった。古い培地を新しい事前に温めた培地と交換した（Ｔ７５フラスコあたり１０ｍｌ又は６ウェルプレートの１ウェルあたり１ｍｌ。ギルソンピペットでチューブに気泡を通すことによってＤＮＡを注意深く混合し、細胞を覆っている培地に沈殿物を滴下した。３７℃のＣＯ２雰囲気下で細胞をインキュベートした。
【０５８３】
細胞は小さな斑点に覆われているように見えた（沈殿物）。トランスフェクション培地を細胞から除去し、細胞ＰＢＳで丁寧に洗浄し、その後、新しい培地で入れ替えた。
【０５８４】
細胞は、必要になるまで、通常は８〜２４時間の間、３７℃のＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。
【０５８５】
８．１８％のＮａＣｌ、５．９４％のＨｅｐｅｓ及び０．２％のＮａ２ＨＰＯ４（すべてｗ／ｖ）を用いてＨＢＳの１０×ストックを調製した。溶液を濾過滅菌し、４℃で保存した。１０×ストックをＨ２Ｏで希釈し、１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．１２に調節することによって、２×溶液を調製した。溶液は一定分量ずつ−２０℃で保存した。溶液のｐＨを正確に滴定するよう注意を払った。ｐＨは、溶液をトランスフェクションに用いる直前に調節した。
【０５８６】
８．２  実施例２６：ＭＰＶのミニレプリコン構築体
ミニレプリコン構築体を、アンチセンスレポーター遺伝子を含むように作製することができる。ミニレプリコンの例であるＣＡＴ−ｈＭＰＶを図２４に示す。ミニレプリコン構築体の作製に使用したリーダー配列及びトレーラー配列を図２６に示す。比較のために、ＡＰＶ、ＲＳＶ及びＰＩＶ３のリーダー配列及びトレーラー配列のアラインメントも図２６に示す。
【０５８７】
２種類のミニレプリコン構築体を試験した。一方はリーダー末端に末端ＡＣ残基を有し（Ｌｅ＋ＡＣ）、他方はリーダー末端に末端ＡＣ残基を有さない（Ｌｅ−ＡＣ）。２種類の構築体は、いずれもこのアッセイで機能的であった（図２５）。図２５から、２４時間後と比べて４８時間後にはるかに高いＣＡＴ発現が起こったことが見られる。４８時間後では、トランスフェクションした細胞５００，０００個あたり約１４ｎｇのＣＡＴが観察された。この実験は、完全にプラスミドによって駆動されていた。レプリコンをＴ７ポリメラーゼプラスミドで共トランスフェクションさせ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｍ２．１遺伝子をｐＣＩＴＥ−２ａ／３ａから発現させた（ｐＣｉｔｅプラスミドはＴ７プロモーター、次いで脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ要素を有する）。Ｌ、Ｐ及びＮを排除した場合、ＣＡＴ発現は完全になくなった。Ｍ２．１発現をベクターから排除した場合、ＣＡＴ発現の顕著な低減が見られた。
【０５８８】
ミニレプリコンをトランスフェクションさせた細胞をｈＭＰＶポリメラーゼ構成要素（ＮＬ／１／００及びＮＬ／１／９９）あるいはＡＰＶ−Ａ、ＡＰＶ−Ｃ、ＲＳＶ又はＰＩＶ由来のポリメラーゼ構成要素で重感染させることによって、ミニレプリコン系の特異性（異種ウイルスに起因する）及びリーダーの末端残基の効果（同種ウイルスに起因する）も試験することができる。至適条件を決定するために、６つのプラスミドのそれぞれを様々な量で試験することもできる。
【０５８９】
ＣＡＴの代わりに他のレポーター遺伝子を使用することができる。他の例では、ＣＡＴの代わりにＧＦＰをミニレプリコン構築体に挿入することができる。
【０５９０】
８．３  実施例２７：ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＭＰＶ又はＰＩＶポリメラーゼを用いたミニレプリコンからのｈＭＰＶのレスキュー
ｈＭＰＶをレスキューするために、ミニレプリコン構築物は、レポーター遺伝子を含有するように作製しうる。ミニレプリコンの一例、すなわちＣＡＴ−ｈＭＰＶを図２４に示す。レポータータンパク質クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするｃＤＮＡを、５’と３’の非コードウイルス配列の間にマイナス鎖配向でクローニングしうる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列及び制限酵素の認識配列は、構築物を挟むように配置しうる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、精製されたポリメラーゼタンパク質と混合した場合に再構成されたＲＮＰ複合体を形成しうるウイルス様ＲＮＡが生じる。ＲＮＰを、例えばヘルパーウイルスを用いて、真核細胞にトランスフェクトしうる。あるいは、レスキューは、完全にプラスミドが駆動するものであってもよい、すなわちミニレプリコンは、Ｔ７ポリメラーゼプラスミドと共トランスフェクトしてもよく、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＭ２−１遺伝子はｐＣＩＴＥ−２ａ／３ａから発現された。ｈＭＰＶをレスキューするために使用されるポリメラーゼ構成要素は、ＲＳＶ、ＡＰＶ、ＰＩＶ、ＭＰＶ又はその任意の組合せのものでありうる（セクション５．８．１参照）。ウイルスは、ＣＡＴ活性を検出することができるいくつかのアッセイの任意のものを用いて検出しうる（実施例２４参照）。別の代替法において、ミニレプリコン系を用いたｈＭＰＶのレスキューはまた、ミニレプリコンをトランスフェクトした細胞に、ＭＰＶ、ＡＰＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶ、又はその任意の組合せからの１又は複数のｈＭＰＶポリメラーゼ構成要素（ＮＬ／１／００及びＮＬ／ｌ／９９）を重複感染させることにより実施し得る。
【０５９１】
より詳細には、リーダー領域及び隣接する遺伝子のｃＤＮＡは、合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発法により改変しうる。同様に、別のｈＭＰＶ遺伝子（例えばＬ遺伝子）の下流末端のｃＤＮＡ及び隣接するトレーラー領域は、隣接するＴ７  ＤＮＡポリメラーゼプロモーターを含有するように改変しうる。リーダー及びトレーラー断片は、発現ベクター（例えばｐＵＣ１９）のＣＡＴ遺伝子の挿入のいずれか一方の側にクローニングしうる。別のｈＭＰＶウイルス類似体をコードするｃＤＮＡは同じように構築することができる。構築物の構造は、配列決定を用いて確認しうる。ミニレプリコン構築物の作製に使用しうるリーダー及びトレーラー配列の例を図２６に示す。比較のため、ＡＰＶ、ＲＳＶ及びＰＩＶ３のリーダー及びトレーラー配列のアライメントもまた図２６に示す。
【０５９２】
８．４  実施例２８：完全長の感染性ｃＤＮＡの作製
ｈＭＰＶウイルスの遺伝子を発現する完全長ｃＤＮＡを構築して、感染性のウイルスを生成することができる。たとえば、ｈＭＰＶのすべての遺伝子又はすべての必須の遺伝子をコードしているｃＤＮＡを構築することができる。その後、ゲノムを発現させて感染性ウイルスを生成することができる。
【０５９３】
ｈＭＰＶの遺伝子操作を行うためにこのＲＮＡウイルスのゲノムをクローニングした。ｈＭＰＶの００−１分離株では１〜３ｋｂの長さが異なるＰＣＲ断片を作製した（図２７）。ＰＣＲ断片の配列決定を行い、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されているｈＭＰＶ配列と比較することによって配列の誤りについて分析した。２つのサイレント変異（ＳＨ遺伝子中のヌクレオチド５７８０のｉｌｅ：ｉｌｅ、Ｌ遺伝子中のヌクレオチド１２２１９のｃｙｓ：ｃｙｓ）は訂正しなかった。Ｌ遺伝子中のヌクレオチド８３５２の別の変更（ｔｒｐ：ｌｅｕ）も訂正しなかった。これは、この変異が２つの個別に作製したＰＣＲ断片（Ｃ及びＨ）、並びにｈＭＰＶ  ９９−１配列でも観察されたからである。同様に、Ｆ−Ｍ２の遺伝子間領域中のヌクレオチド４７１５における５個のヌクレオチドの挿入も訂正しなかった。これらの変更はどちらもｈＭＰＶの野生型配列に反映されているかもしれない。一方、Ｎ−Ｐ遺伝子間領域中のヌクレオチド１２４２で１個のＡ残基を除去し、Ｆ遺伝子中のヌクレオチド３３６７でｓｅｒ：ｐｒｏを訂正し、Ｇ遺伝子のヌクレオチド６２９６でａｓｐ：ｖａｌを変更し、Ｌ遺伝子のヌクレオチド７３３２で停止コドンをｇｌｕに変更した。
【０５９４】
ｈＭＰＶの様々な分離株の制限マップを図２８に示す。この制限部位を使用して完全長構築体を構成する（assemble）ことができる。
【０５９５】
その後、固有の制限酵素部位を利用して（図２９）、８つの訂正したＰＣＲ断片を配列へと構成した。遺伝子マーカーをヌクレオチド７５に導入して、アミノ酸配列を変化させずにＡｆｌＩＩ制限酵素部位を作製した。ｈＭＰＶ配列の３’末端に唯一の制限酵素部位、ＸｈｏＩを付加した。ファージＴ７ポリメラーゼプロモーター、次いで２個のＧ残基もｈＭＰＶ配列の３’末端に付加した。ｈＭＰＶゲノムの５’末端には、デルタ型肝炎リボザイムの配列及びＢｓｓＨＩＩ制限酵素部位を付加した。
【０５９６】
ｐＣＩＴＥプラスミド中のｈＭＰＶ  Ｌ、Ｎ、Ｐ及びＭ２−１遺伝子をコードしているヘルパープラスミドも作製した。完全長ｈＭＰＶ  ｃＤＮＡを作製した後、Ｔ７ポリメラーゼ源として伝染性上皮腫Ｔ７又はＭＶＡ−Ｔ７を使用して、逆遺伝学によるウイルスの回復をＶｅｒｏ細胞で行った。
【０５９７】
８．５  実施例２９：ＰＯＬＩ−ＰＯＬＩＩプロモーター系を利用したｈＭＰＶの回収
非セグメント化ＲＮＡウイルスの逆遺伝学系は、ゲノムＲＮＡ発現用のＴ７プロモーターを備えたプラスミドに基づいているが、これとは異なり、細胞の転写機構を利用する系は、より効率的である可能性があり、さらに、バクテリオファージＴ７由来のＲＮＡポリメラーゼを共発現する必要がない。ウイルスＲＮＡ分子を細胞内で発現させるのに、一方向性又は双方向性のｐｏｌＩ−ｐｏｌＩＩ転写システムを使用することができる。このシステムは、クローニングされたｃＤＮＡからのインフルエンザウイルスの生成に非常に効率的であることが立証された（Hoffmann他、PNAS、97 6108〜6113(2000)）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写産物とは異なり、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写産物は、それらの５’末端にキャップ構造を含有せず、そして、３’末端にポリＡテールを有しない。したがって、細胞の転写機構を利用するシステムは、ｐｏｌＩＩプロモーターからはタンパク質を発現し、そして、ｐｏｌＩプロモーターからはキャップ構造もポリＡテールも有しないウイルス（−）ｖＲＮＡ又は（＋）ｃＲＮＡを発現するように設計される。ウイルスの複製及び転写には末端構造が重要であるので、余分な非ウイルス配列を含有しないウイルス様一次転写物を提供することは極めて重要である。
【０５９８】
ＲＮＡポリメラーゼＩによるｈＭＰＶ  ｃＤＮＡｓの（−）ｖＲＮＡ転写又は（＋）ｃＲＮＡ転写がより効率的であるかどうかを評価するために、ミニゲノムシステムを、それぞれの複製効率を比較するように設計することができる。複製効率は、ミニゲノムによって発現されるレポーター分子、例えばＣＡＴ遺伝子の転写によって測定することができる。この手法では、ｈＭＰＶのＬ、Ｎ、Ｐ、及びＭ２−１遺伝子をｐｏｌＩＩプロモーターの制御下で発現するプラスミドを、ＣＡＴ−ミニゲノム−プラスミドと共に宿主細胞内に共トランスフェクションする。複製の相対的効率は、ＣＡＴレポーター分子の相対的発現レベルを決定することによって測定される。
【０５９９】
例えば、ｈＭＰＶウイルスゲノム（ｃＲＮＡ）のプラス鎖コピーを合成するのに、ＲＮＡ  ｐｏｌＩを使用することができる。簡単に説明すると、ウイルスｃＤＮＡをＲＮＡ  ｐｏｌＩプロモーターとターミネーター配列との間に挿入する。ｐｏｌＩ転写ユニット全体をＲＮＡ  ｐｏｌＩＩプロモーターとポリアデニル化部位との間にプラスセンスの方向で挿入する。２つのタイプのプラスセンスＲＮＡが合成される。ｐｏｌＩＩプロモーターからは、５’キャップ構造を有するｍＲＮＡが転写される。ｐｏｌＩプロモーターからは、５ｈ’端に三リン酸基を有する完全長プラスセンスｈＭＰＶ  ｃＲＮＡが細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩによって転写される。任意のｃＤＮＡ断片を挿入するのにクローニングベクター、例えばｐＨＷ１１を使用することができる（Hoffmann及びWebster、J.Gen Virol.、2000年12月、81(Pt 12): 2843〜7）。このプラスミドは、ｐｏｌＩＩプロモーター（ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーター）と、ｐｏｌＩターミネーター配列及びポリ（Ａ）部位の上流にあるヒトｐｏｌＩプロモーターを含有する。
【０６００】
ウイルスｃＲＮＡを表す一次転写物を複製するために、ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターなどのｐｏｌＩＩプロモーターを備えたプラスミドベクターによって、ウイルスポリメラーゼタンパク質を提供する。これらのプラスミドは、ｈＭＰＶの４つの遺伝子セグメント、すなわち、Ｌ遺伝子、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、及びＭ２−１遺伝子を表すｃＤＮＡを含有する。それらの４つのプラスミド（１〜５μｇ）を、ｈＭＰＶの完全長ゲノムを表すｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩプラスミド（１〜５μｇ）と共に、１０６〜１０７の２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ−７又はＶｅｒｏ細胞内に共トランスフェクションする。系の効率及び信頼性を向上させるために、２９３Ｔ細胞を、Ｖｅｒｏ細胞やｔＭＫ細胞など、ＭＰＶを許容する細胞と共培養することができる。細胞培地にトリプシンを添加すると、その結果感染性ウイルス粒子が生成される。ＭＤＣＫ細胞と霊長類細胞の共培養は、インフルエンザＡウイルスの効率的なレスキューに利用された（Hoffmann他、PNAS、97 6108〜6113(2000)）。ウイルス力価を測定するために、トランスフェクション後の様々な時間（すなわち３日から１０日）に上清の力価決定を行い、新たなＶｅｒｏ細胞に移した。ｐｏｌＩＩプロモーターから全ウイルス構造タンパク質（すなわち、Ｍ、Ｍ２−２、ＳＨ、Ｆ、及びＧ）を共発現させることによって、ウイルス回収の効率が改善されるかもしれない。
【０６０１】
完全長ｃＤＮＡを有するｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩプラスミドからは、キャップつきＲＮＡと、キャップなしのＲＮＡとが生成されるので、Ｎ遺伝子を表す第１のオープンリーディングフレームはＮ−タンパク質に翻訳されることが予測される。したがって、ｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩ手法を利用することによって、ウイルスレスキューに必要なプラスミドは４種類のみとなる。すなわち、Ｌ、Ｐ、及びＭ２−１タンパク質を発現する３種類のｐｏｌＩＩ−プラスミドと、Ｎタンパク質及びＭＰＶの完全長ＲＮＡを発現する１種類のｐｏｌＩ／ｐｏｌＩＩプラスミドである。
【０６０２】
８．６  実施例３０：  マイナス鎖ウイルス回収用のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞系
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞系を、組換えＭＰＶゲノムの複製及びパッケージングに使用することができる。例えば、ＣＭＶプロモーターの制御下にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するように、Ｖｅｒｏ細胞を設計製作することができる。この手法は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するポックスウイルスなどのヘルパーウイルスで共感染させる必要性を排除するので、有用である。この方法の別の利点は、ヘルパーウイルスを除去するのに必要な選択系の必要性を排除することである。
【０６０３】
簡潔に言うと、ｈＭＰＶのＬ、Ｎ、Ｐ、及びＭ２−１遺伝子をコードするｃＤＮＡをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にＴ７プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。プラス又はマイナス方向のＭＰＶゲノムをコードするｃＤＮＡをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にＴ７プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。これらの発現ベクターは、Ｔ７発現性の細胞系、例えばＴ７ポリメラーゼを発現するＢＨＫ細胞系に同時にトランスフェクションすることができる。これらのｃＤＮＡ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ転写は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって媒介される。感染細胞溶解物のプラークアッセイによって、ウイルスの力価を決定することができる。
【０６０４】
８．７  実施例３１：  ＣＭＶ又はＳＶ４０プロモーターからＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを一時的に発現するプラスミドの、ｈＭＰＶレスキューのための使用
ＣＭＶ又はＳＶ４０プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するプラスミドを設計製作して、それが細胞内で組換えＭＰＶゲノムの複製及びパッケージングに使用される細胞の中に一時的にトランスフェクトすることができる。例えば、Ｖｅｒｏ細胞及び２９３Ｔ細胞を、ＣＭＶプロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するように設計製作することができる。特定の一実施形態においては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を、ＣＭＶ  ＭＩＥプロモーターの制御下に保持するプラスミドを、Ｔ７プロモーターによって駆動される選択マーカー（例えばネオマイシン）と組み合わせて用いることができる。これによって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞系の効率的な選択が可能となるであろう。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞系を用いた手法は、Ｔ７ポリメラーゼを発現するポックスウイルスなどのヘルパーウイルスで共感染させる必要性を排除するので有用である。この方法の別の利点は、ヘルパーウイルスの混入を除去するための選択系の必要性が排除されることである。さらに、この手法は、２９３Ｔ細胞やＣＯＳ７細胞など、トランスフェクション効率が高い細胞系の使用を可能にする。したがって、トランスフェクトされた細胞は、複数コピーのＴ７ポリメラーゼ発現プラスミドを有し、この結果、１コピーしか有しない安定細胞系と比較して、一時的にトランスフェクトされた細胞より、１細胞あたりのＴ７ポリメラーゼタンパク質の量が多くなっている。
【０６０５】
簡潔に言うと、ｈＭＰＶのＬ、Ｎ、Ｐ、及びＭ２−１遺伝子をコードするｃＤＮＡをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にＴ７プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。あるいは、それらの４つの遺伝子を、ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で発現させる。プラス又はマイナス方向のＭＰＶゲノムをコードするｃＤＮＡをクローニングし、組換えによって、発現ベクター中にＴ７プロモーター配列の制御下となるように設計製作する。これらの発現ベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを発現するプラスミドと共に、ｈＭＰＶの複製を補助する細胞、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系、ｔＭＫ細胞系、２９３Ｔ細胞系、又は複数の細胞系の共培養の中に共トランスフェクトする。これらのｃＤＮＡ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ転写は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって媒介される。感染細胞溶解物のプラークアッセイによって、ウイルスの力価を決定することができる。
【０６０６】
Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを供給する代替の手法は、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモーターの制御下にあるＮ、Ｐ、Ｌ、Ｍ２−１、及び完全長のゲノムｃＤＮＡ又はアンチゲノムｃＤＮＡのプラスミドで細胞を、脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトする前に、後に、又はこれと同時に、Ｔ７ポリメラーゼタンパク質を細胞内にトランスフェクトすることからなる。
【０６０７】
８．８  実施例３２：  ｈＭＰＶのレスキュー
組換えｈＭＰＶをレスキューするための、成功した系が開発された。簡単に説明すると、様々なポリメラーゼタンパク質をコードする発現プラスミドを、レスキューするべきクローニングされたｈＭＰＶと共に適切な宿主細胞内に共トランスフェクトした。収集及び処理を行い、細胞及び上清を使用してＶｅｒｏ細胞に接種した。レスキューされた感染性のウイルスが、免疫染色法を用いて検出された。
【０６０８】
ｈＭＰＶをレスキューするために、ＴＣ６ウェルプレート中の２９３Ｔ細胞のコンフルエントな単層培養に、ＭＯＩ（感染多重度）＝０．５で鶏痘ウイルスを接種した。細胞は、その後３５℃で１時間インキュベートした。以下の量の発現プラスミドと、レスキューするべきクローニングされたｈＭＰＶとをｏｐｔｉＭＥＭ  １００μｌ（１ウェルあたり）に混合した。すなわち、ｈＭＰＶ  Ｐ遺伝子をコードするプラスミド（ｐＣＩＴＥ  ２ａ／３ａ中、クローン＃４１−６と称する）０．４μｇ、ｈＭＰＶ  Ｎ遺伝子をコードするプラスミド（ｐＣＩＴＥ  ２ａ／３ａ中、クローン＃３５−１１と称する）０．４μｇ、ｈＭＰＶ  Ｍ２遺伝子をコードするプラスミド（ｐＣＩＴＥ  ２ａ／３ａ中、クローン＃２５−６と称する）０．３μｇ、ｈＭＰＶ  Ｌ遺伝子をコードするプラスミド（ｐＣＩＴＥ  ２ａ／３ａ中、クローン＃２と称する）０．２μｇ、及び、ＡＰＶ様のリーダー及びトレーラーを有するクローン＃２、又は、ｈＭＰＶのリーダー配列及びトレーラー配列を有するクローン＃１０のｈＭＰＶプラスミド４μｇである。使用された発現プラスミドが、第２のアミノ酸位置に回復された野生型配列を有することは、注目に値する。
【０６０９】
次のステップでは、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（８μｌ）を１００μｌのｏｐｔｉＭＥＭと混合し、その後、プラスミド混合物に添加した。この併せた混合物を２９３Ｔ細胞に適用した。トランスフェクションの６日後に、細胞及び上清を収集し、冷凍し、解凍させて、Ｖｅｒｏ細胞に接種するのに使用した。接種の９日後に、感染した細胞をメタノールで固定し、モルモットのポリクロナール抗体で免疫染色し、抗モルモットＨＲＰ及びＤＡＫＯ  ＡＥＣ基質がそれに続いた。プラーク形成によって、レスキューされたウイルスが感染性であることが示された（図５６）。陽性の赤色免疫染色は、クローン＃２及び＃１０の両方のウェルで明らかであったが、ｈＭＰＶのリーダー及びトレーラーを有するクローン＃１０と比較して、ＡＰＶのリーダー及びトレーラーを有するｈＭＰＶクローン＃２のウェルに、より多くの免疫染色された細胞があった。陽性の免疫染色を、図５７に示す。
【０６１０】
レスキューされた配列を確認するために、感染の１０日後に収集されるであろうウイルスでＲＴ−ＰＣＲを実施するであろう。
【０６１１】
これらの結果は、組換えｈＭＰＶが成功裏にレスキューされたこと、そして、感染性ウイルスが生成されたことを示す。
【０６１２】
８．９  実施例３３：ｈＭＰＶのサブタイプを用いた動物宿主の感染
ＭＰＶ株の病原性を特性解析すために動物宿主を感染させることができる。たとえば、それぞれの株が生物内でどれほど感染性があるかを決定するために、様々な宿主を用いることができる。
【０６１３】
ｈＭＰＶの小動物モデルは確認されていない。１．３×１０６ｐｆｕ／匹の用量で、Ｂａｌｂ／ｃマウス、コットンラット、及びシリアンゴールデンハムスターをｈＭＰＶに感染させた。１．３×１０６ｐｆｕのｈＭＰＶを０．１ｍｌの体積で、動物の鼻腔内に接種した。組織試料はプラークアッセイによって定量した。これは、９日目にｈＭＰＶモルモット抗血清で免疫染色した。感染後４日目に動物を屠殺し、鼻甲介及び肺を摘出し、免疫染色のプラークアッセイによってｈＭＰＶ力価を定量した（表１３）。
【表１３】
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【０６１４】
結果は、ｈＭＰＶがシリアンゴールデンハムスター内で高い力価で複製されたことを示した。組織１ｇあたり５．３及び２．３  ｌｏｇ１０ｐｆｕの力価がそれぞれ鼻甲介及び肺で得られた。ｈＭＰＶはコットンラットの気道中では感知できるほどの力価レベルまでに複製されなかった。マウスでは、気道上部及び下部でそれぞれ組織１ｇあたり２．７及び２．２  ｌｏｇ１０ｐｆｕの力価が示された。これらの結果は、シリアンゴールデンハムスターがｈＭＰＶの複製及び免疫原性を研究するため、並びにｈＭＰＶのワクチン候補を評価するために適切な小動物であることを示唆している。
【０６１５】
モルモットの感染：２つのウイルス分離株、すなわち００−１（サブタイプＡ）及び９９−１（サブタイプＢ）を各サブタイプ６匹ずつのモルモットに接種した（気管内、鼻及び眼）。６匹のモルモットをｈＭＰＶ００−１に感染させた（１０ｅ６、５  ＴＣＩＤ５０）。６匹のモルモットをｈＭＰＶ９９−１に感染させた（１０ｅ４、１  ＴＣＩＤ５０）。モルモットに同種及び異種のサブタイプを接種した場合は（１０ｅ４  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）一次感染を５４日間進行させた、すなわち、異種感染を成すために２匹のモルモットで００−１により一次感染及び９９−１による二次感染を行い、同種感染を成すために３匹のモルモットで００−１により一次感染及び００−１による二次感染を行い、異種感染を成すために２匹のモルモットで９９−１により一次感染及び００−１による二次感染を行い、同種感染を成すために３匹のモルモットで９９−１により一次感染及び９９−１による二次感染を行った。
【０６１６】
感染後１２日（一次感染）又は８日（二次感染）において、咽頭及び鼻スワブを採取し、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによってウイルスの存在について試験した。ＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果（図３２）により、ウイルス分離株００−１を接種したモルモットが感染後１〜１０日目に気道上部の感染を示したことが示された。９９−１を接種したモルモットは、感染後１〜５日目に気道上部の感染を示した。９９−１によるモルモットの感染は、００−１による感染よりも重篤度が低いように見えた。上で説明したように、異種ウイルスによるモルモットの２回目の接種では、４匹中３匹のモルモットで再感染がもたらされた。同様に、同種ウイルスの場合、再感染は６匹中２匹のモルモットで起こった。再感染した動物では臨床的症状は僅かしか見られない又は全く見られず、再感染に対して保護された動物では臨床的症状が全く見られず、これは、野生型ウイルスを用いた場合でも１回目の感染による保護効果が起こったかもしれないことを実証している。また、これにより異種及び同種分離体をワクチンとして使用できることも示された。
【０６１７】
ｈＭＰＶのどちらのサブタイプでもモルモットを感染させることができたが、サブタイプＢ（９９−１）による感染の方が重篤度が低いように見えた、すなわち、ウイルスが鼻及び咽頭に存在している期間がサブタイプＡ（００−１）による感染よりも短かった。これは、サブタイプＡをより高い用量で与えたこと、又はサブタイプＢの病原性がより低いことが原因であるかもしれない。既存の免疫によっては同種及び異種ウイルスのいずれにおける再感染に対しても完全に保護されなかったが、ウイルスが存在する期間がより短く、すべての動物でウイルスが陽性となったわけではないという点で、感染はそれほど顕著ではないように見えた。
【０６１８】
ｈＭＰＶの両方のサブタイプに感染させたモルモットの血清学を観察した。０、５２、７０、８０、９０、１１０、１２６及び１６０日目にモルモットから血清を採取し、１：１００の希釈率で００−１及び９９−１抗原に対する全ウイルスＥＬＩＳＡで試験した。（それぞれのモルモット個体について００−１及び９９−１に対するＩｇＧ応答を示す図３３Ａ及びＢを参照。００−１及び９９−１  ＥＬＩＳＡの特異性を示す図３４も参照。ただし、同種再感染のモルモットからのデータを使用したことに注意。３匹の同種感染すなわち００−１及び００−１、２匹の同種感染すなわち９９−１及び９９−１、２匹の異種感染すなわち９９−１及び００−１、並びに２匹の異種感染すなわち００−１及び９９−１のモルモットの、００−１及び９９−１  ＥＬＩＳＡに対する平均ＩｇＧ応答を示す図３５も参照）。
【０６１９】
２種の異なるＥＬＩＳＡでは僅かな応答差しか観察されなかった。００−１又は９９−１に対する全ウイルスＥＬＩＳＡは、２つのサブタイプを区別するために使用することができなかった。
【０６２０】
モルモット中でｈＭＰＶに対して産生させた血清の、ＡＰＶ抗原に対する反応性を検査した。感染モルモットから血清を採取し、ＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡで試験した。（ｈＭＰＶに感染したモルモットにおけるＡＰＶ阻害の平均の割合を示す図３６参照）。モルモット中でｈＭＰＶに対して産生させた血清は、そのｈＭＰＶ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにおける反応と同様の様式で、ＡＰＶ阻害試験で反応した。９９−１に対して産生させた血清は、ＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡにおいて００−１に対して産生させた血清よりも低い割合の阻害を示した。９９−１に感染させたモルモットは、ｈＭＶＰ  ＥＬＩＳＡで見られた力価よりも低い力価を有していたかもしれない。あるいは、９９−１のＡＰＶとの交差反応は００−１のそれよりも低かったかもしれない。それでもなお、モルモットにおいてｈＭＰＶ抗体を検出するためにＡＰＶＡｂ阻害ＥＬＩＳＡを使用することができる。
【０６２１】
モルモット中でｈＭＰＶに対して産生させた血清を用いてウイルス中和アッセイを行った。感染後０日目、５２日目、７０日目及び８０日目に血清を採取し、００−１、９９−１、及びＡＰＶ−Ｃを用いたウイルス交差−中和アッセイで使用した。使用した開始希釈率は、１ウェルあたり１〜１０及び１００  ＴＣＩＤ５０のウイルスであった。中和後、ウイルスをｔＭＫ細胞に曝し（１５ｍｍ）、３５００ＲＰＭで遠心し、その後、培地を新しくした。ＡＰＶ培養物は４日間増殖させ、ｈＭＰＶ培養物は７日間増殖させた。細胞を８０％のアセトンで固定し、標識したサル抗ｈＭＰＶを用いてＩＦＡを実施した。染色後に陰性であったウェルを中和力価として定義した。各ウイルスには１０ｌｏｇ力価のウイルスストック及び２倍力価の作業溶液が含まれていた。（００−０１及び９９−１に感染したモルモットの、００−１、９９−１、及びＡＰＶ−Ｃに対するウイルス中和力価を示す図３７参照）。
【０６２２】
カニクイマカク（CYNOMOLOGOUS MACAGUE）の感染：ウイルス分離株００−１（サブタイプＡ）及び９９−１（サブタイプＢ）（１ｅ５  ＴＣＩＤ５０）を各サブタイプ２匹ずつのカニクイマカクに接種した（気管内、鼻及び眼）。一次感染の６カ月後、００−１を用いてマカクに２回目の接種を行った。感染後１４日（一次感染）又は８日（二次感染）において、咽頭スワブを採取し、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによってウイルスの存在について試験した（図３８）。
【０６２３】
００−１を接種したモルモットは、感染後１〜１０日目に気道上部の感染を示した。臨床的症状には化膿性鼻炎が含まれていた。同種ウイルスを用いてマカクに２回目の接種を行った結果、再感染が起こった。これはＰＣＲによって実証されたが、臨床的症状は見られなかった。
【０６２４】
一次感染の後６カ月の間に００−１を受けたマカクから血清を採取した（再感染は、サル３では２４０日目、サル６では２３９日目に起こった）。血清は、００−１又はＡＰＶのいずれかに対するＩｇＧ抗体の存在（図３９Ｂ）、並びに００−１に対するＩｇＡ及びＩｇＭ抗体の存在（図３９Ａ）ついて試験するために使用した。
【０６２５】
２匹のマカクを００−１に感染させることに成功し、００−１に対する抗体の存在下で異種ウイルスで再感染させた。ＩｇＡ及びＩｇＭ抗体に対する応答では、一次感染後にＩｇＭ抗体が産生されること、及び再感染後にそれが存在しないことが示された。ＩｇＡ抗体は再感染後でのみ検出され、これにより、一次感染後の免疫応答の即時性が示された。マカク中でｈＭＰＶに対して産生させた血清をＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡで試験すると、ｈＭＰＶ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡと類似した応答が示された。
【０６２６】
ｈＭＰＶ  ＥＬＩＳＡと同様の感度を用いて、ＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡでカニクイマカク中のｈＭＰＶに対する抗体が検出された。したがって、ＡＰＶ阻害ＥＩＡはヒト試料をｈＭＰＶ抗体の存在について試験するのに適していた。
【０６２７】
ｈＭＰＶに感染したカニクイマカクから採取した血清でウイルス交差−中和アッセイを行った。一次感染後０〜２２９日目に血清を採取し、これは００−１に対して低いウイルス中和力価しか示さず（０〜８０）、二次感染後に採取した血清は高い、すなわち１２８０を超える００−１に対する中和力価を示した。二次感染後に採取した血清のみが９９−１に対する中和力価を示し（８０〜６４０）、どの血清もＡＰＶ−Ｃウイルスを中和することができなかった。ウイルス交差−中和アッセイではＡＰＶ−ＣとｈＭＰＶとの間に交差反応は起こらなかったが、抗体応答のブースト後に００−１と９９−１との間に交差反応が起こった。
【０６２８】
ヒトの感染：６カ月未満〜２０歳を超える年の範囲の患者の血清は、ＩＦＡ及び００−１に対するウイルス中和アッセイを用いて既に試験されている。血清を、００−１に対するＥＬＩＳＡでＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体の存在について試験した。試料は、ＡＰＶ  ＥＬＩＳＡを阻害するその能力についても試験した。ヒト血清におけるＩｇＧ抗体の検出についてｈＭＰＶ  ＥＬＩＳＡ及びＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡの使用を比較し、ＩｇＧ  ｈＭＰＶ試験とＡＰＶ−Ａｂ試験との間に強い相関性が認められた。したがって、ＡＰＶ−Ａｂ試験によって、本質的にヒトにおいてｈＭＰＶに対するＩｇＧ抗体を検出することができた（図４０）。
【０６２９】
家禽類の感染：ＡＰＶに対するＩｇＧ抗体の存在についてニワトリを試験するために、ＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡ及び００−１  ＥＬＩＳＡを使用した。ｈＭＰＶ  ＥＬＩＳＡ及びＡＰＶ阻害ＥＬＩＳＡのどちらによってもＡＰＶに対する抗体が検出された。
【０６３０】
８．１０  実施例３４：ヒトにおけるワクチンとしてのＡＰＶ
ＡＰＶは、ヒトＭＰＶによる感染を予防するため、又はヒト宿主におけるヒトＭＰＶの感染力を低減させるためのワクチンとして使用することができる。ワクチンはＡＰＶ全体あるいはＡＰＶの配列及び加えて別のメタニューモウイルスの異種配列からなるそのキメラ若しくは組換え型又は誘導体であることができる。組換えウイルスワクチンを作製するバックボーンとしてＡＰＶのゲノムを使用することができる。たとえば、ＡＰＶのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子をヒトＭＰＶのＦ遺伝子又はＧ遺伝子で置換したワクチンを作製することができる。あるいは、ＡＰＶバックボーンの配列をＰＩＶ由来の配列をＡＰＶバックボーンに置換した又は付加した配列を含むワクチンを作製することができる。組換え／キメラワクチンのさらなる情報については、たとえばConstruction of the Recombinant cDNA and RNAを参照されたい。ワクチンは、それだけには限定されないが、皮下注射、鼻腔内投与、又は吸引を含めた、当業者に周知の様々な方法によって候補に投与することができる（上記セクション５．１３参照）。本発明のウイルス及び／又は少なくとも１０３ＴＣＩＤ５０〜１０６ＴＣＩＤ５０の開始用量で投与する。ウイルス及び／又はワクチンは、単一用量又は複数用量で投与する。たとえば、初回用量は、宿主生命の間中ずっと定期的な間隔で投与する１回又は複数回の後続又はブースター用量と共に投与することができる。臨床治験では、有効な用量レジメンが決定できるように、ウイルスの複製速度をワクチンの用量を調節する指標として使用することができる。研究集団内のウイルスの複製速度と有効であることが知られている所定の速度とを比較することができる。
【０６３１】
本発明は、本発明の個別の態様の単一の例示として意図される具体的な記載した実施形態によって範囲が限定されるべきでない。また、機能的に等価なすべての構築体、ウイルス又は酵素も本発明の範囲内にある。実際、前述の説明及び添付の図から、本明細書中に示しかつ記載したものに加えて、本発明の様々な改変が当業者には明らかとなるであろう。このような改変は添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【０６３２】
８．１１  実施例３５：トリにおけるワクチンとしてのＭＰＶ
ヒトＭＰＶは、ＡＰＶによる感染を予防するため、又はトリ宿主におけるＡＰＶの感染力を低減させるためのトリ用ワクチンとして使用することができる。ワクチンはＭＰＶ全体あるいはＭＰＶの配列及び加えて別のメタニューモウイルスの異種配列からなるそのキメラ若しくは組換え型又は誘導体であることができる。組換えウイルスワクチンを作製するバックボーンとしてＭＰＶのゲノムを使用することができる。たとえば、ヒトＭＰＶのＦ遺伝子及び／又はＧ遺伝子をＡＰＶのＦ遺伝子又はＧ遺伝子で置換したワクチンを作製することができる。組換え／キメラワクチンのさらなる情報については、たとえばConstruction of the Recombinant cDNA and RNAを参照されたい。
【０６３３】
ワクチンは、それだけには限定されないが、皮下注射、鼻腔内投与、又は吸引を含めた様々な方法によって候補に投与することができる。本発明のウイルス及び／又は少なくとも１０３ＴＣＩＤ５０〜１０６ＴＣＩＤ５０の開始用量で投与する。ウイルス及び／又はワクチンは、単一用量又は複数用量で投与する。たとえば、初回用量は、宿主生命の間中ずっと定期的な間隔で投与する１回又は複数回の後続又はブースター用量と共に投与することができる。臨床治験では、有効な用量レジメンが決定できるように、ウイルスの複製速度をワクチンの用量を調節する指標として使用することができる。研究集団内のウイルスの複製速度と有効であることが知られている所定の速度とを比較することができる。
【０６３４】
様々な出版物が本明細書中に引用されており、それらの開示はその全体で参照として組み込まれている。
【０６３５】
８．１２  実施例３６：ｈＭＰＶのＦタンパク質７回反復配列を使用したｈＭＰＶ融合の阻害
ウイルス細胞融合の阻害は、エンベロープウイルスを制御するための新規手法の一典型となるものである。この手法は、ｈＭＰＶウイルスの感染及び／又は増殖を阻止するのに有利であろう。融合過程中、Ｆタンパク質の７回反復配列（ＨＲ）セグメントが露出する。融合過程中に可溶性のＨＲペプチドを添加して、競合させれば、ウイルス融合が阻止されるであろう。Ｆタンパク質のＨＲペプチドによるｈＭＰＶ細胞融合の阻害は、強いウイルス細胞融合阻害活性を示すと予測される。
【０６３６】
ｈＭＰＶのＦタンパク質７回反復配列がウイルス融合を阻害する能力を検査するために、ＨＲペプチドを精製して、様々なアッセイで使用して、ウイルス融合に対するそれらの効果を決定することができる。ｈＭＰＶ  Ｆタンパク質のＨＲセグメントをコードする遺伝子、すなわち、ＨＲＡ及びＨＲＢと名付けられている遺伝子（下記参照）を発現ベクター、例えばｐＥＴ  ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。このクローニングストラテジーは、ｈＭＰＶのＦタンパク質ＨＲセグメントに対応する融合タンパク質を産生するだろう。４株の分離株において、ｈＭＰＶ  Ｆタンパク質のアミノ末端近傍にあるＨＲセグメントの配列は、ＨＲＡと名付けられており、
2011250786.tif 000016
【０６３７】
であると推定されている。
【０６３８】
同様に、ｈＭＰＶ  Ｆタンパク質のカルボキシ末端近傍にあるＨＲセグメントの配列は、ＨＲＢと名付けられており、
2011250786.tif 000017
【０６３９】
であると推定されている。
【０６４０】
タンパク質の発現及び精製
７回反復配列がウイルス融合を阻害する能力を検査するために、それらがウイルス融合を阻害する能力を試験できるように、７回反復ペプチドを発現させ、精製することができる。組換え発現ベクターで適当な細菌宿主、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換して、光学濃度が６００ｎｍで０．８〜１．０の時に発現を誘導する。ＩＰＴＧ  １．０ｍＭを使用した２５℃で５時間の誘導に続いて、細菌細胞を収集して、リン酸緩衝食塩水中で超音波処理によって溶解させる。その後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を最終濃度３％となるように添加して、溶解物を氷上で３０分間インキュベートし、その後、４℃、１２０００×ｇで１５分間遠心することによって清澄化する。発現されたＨＲタンパク質は、その後精製する。
【０６４１】
複合体形成及びゲル濾過による分析
発現された７回反復ペプチドがウイルス融合を阻害する潜在的有効性を決定するために、アッセイを用いて、ＨＲペプチド相互の複合体形成を確認することができる。それを行うために、等モル量のＨＲＡ及びＨＲＢを混合して、室温で１時間インキュベートする。融合タンパク質の形態にあるＨＲＡ及びＨＲＢの両方によるＨＲＡ／Ｂ複合体の形成を評価する。ゲル濾過には、Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で機能するＨｉｌｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ７５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にサンプルを添加する。ピーク画分を収集して、トリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。ピークの分子量を、同じカラム上を移動するタンパク質標準物質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と比較して推定した。
【０６４２】
ＣＤ分光法
これらのペプチドの７回反復配列セグメントは、自然において螺旋状であることが知られている。この理由から、ウイルス融合の阻害に使用するのに適当な候補を同定するために、いくつかの方法を用いて、発現されたＨＲペプチドがアルファへリックスを形成しているかどうか決定することができる。ＣＤスペクトルは、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中のタンパク質を用いて分光光度計で行う。波長スペクトルを、３７℃で０．１ｃｍ経路長のキュベットを用いて記録する。この分析には約２０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度を用いる。
【０６４３】
細胞融合アッセイ
ＨＲペプチドがウイルス融合を阻害する有効性を決定するのに、細胞ベースのアッセイを用いることができる。ＨＲＡペプチド及びＨＲＢペプチドによるウイルス細胞融合の阻害を試験するために、阻害試験を行う。Ｖｅｒｏ細胞の単層培養を１０〜１００  ＴＣＩＤ５０でｈＭＰＶに感染させる。感染の２時間後に、上清を吸引して、ウイルス種菌を除去するために細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。新たな培地（Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び０．３％ウシ血清アルブミンを含有するＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ））を添加して、細胞を３７℃でインキュベートする。ＨＲＡペプチド及びＨＲＢペプチドは、個別にｈＭＰＶ感染細胞とインキュベートされる。あるいは、様々な量のＨＲＡペプチド及びＨＲＢペプチドを、ｈＭＰＶ感染細胞とインキュベートする。ＡＰＶ、ＲＳＶ、又はＰＩＶ由来の対応するＨＲペプチドも、ｈＭＰＶ感染細胞とのインキュベーションによってｈＭＰＶウイルス融合を阻害するのに用いることができる。インキュベーションの２４〜７２時間後に、免疫蛍光分析（ＩＦＡ）を用いて細胞の記録を行う。ＩＦＡにおける染色は、感染細胞をモルモット抗ｈＭＰＶ血清と共にＰＢＳ中で１時間インキュベートして、それに続いて、ＦＩＴＣ標識されたウサギ抗モルモットポリクロナール抗体調製物と、ＰＢＳ中で１時間インキュベートすることによって行う。最後に、免疫蛍光顕微鏡で分析する前に、エリオクロムブラックでバックグランド染色を行う。高倍率（３２０×）下の５つのフィールド中で感染細胞の計数を行った。
【０６４４】
あるいは、細胞と細胞の融合を行った細胞を、感染後の適当な時期に記録する。クリスタルバイオレットで染色した後、シンシチウム／多核体形成によって細胞融合を測定し、核の総数に対する多核体の核数の比率として記録する。光学顕微鏡下における異なった５つの無作為のフィールドを計数し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法に従ってＩＣ５０を計算する。
【０６４５】
９．  弱毒化ウイルス
９．１  実施例３６：ウイルス遺伝子の置換によって起こる弱毒化
様々なウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームの置換を、クローニングされたウイルスゲノムのｃＤＮＡで標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して行う。様々なウイルス構築体におけるＣＡＴ活性に関しては、図６０を参照されたい。
【０６４６】
９．２  実施例３７：Ｍ２欠失変異体
ｈＭＰＶ株ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００のＭ２遺伝子マップを図６１に示す。Ｍ２遺伝子の欠失を生成するために、Ｂｓｐ  Ｅ１部位をヌクレオチド位置４７４１に構築し、さらに第２のＢｓｐ  Ｅ１部位をヌクレオチド位置５４４４に構築する。制限部位は部位特異的変異誘発によって構築する。制限エンドヌクレアーゼＢｓｐ  Ｅ１を使用して、２箇所のＢｓｐ  Ｅ１部位で組換えゲノムの制限消化を行い、続いて連結させると、その結果、ヌクレオチド位置４７４１とヌクレオチド位置５４４４との間の配列の欠失が得られる。
【０６４７】
Ｍ２遺伝子のＭ２−１オープンリーディングフレームの欠失を生成するために、ヌクレオチド位置４７４４及び５２４１にＮｈｅ  Ｉ部位を導入する。制限部位は部位特異的変異誘発によって構築する。制限エンドヌクレアーゼＮｈｅ  Ｉを使用して、２箇所のＮｈｅ  Ｉ部位で組換えゲノムの制限消化を行い、続いて連結させると、その結果、ヌクレオチド位置４７４４とヌクレオチド位置５２４１との間の配列の欠失が得られる。
【０６４８】
Ｍ２遺伝子のＭ２−２オープンリーディングフレームの欠失を生成するために、ヌクレオチド位置５３１１及び５４５３にＳｗａ  Ｉ部位を導入する。制限部位は部位特異的変異誘発によって構築する。制限エンドヌクレアーゼＳｗａ  Ｉを使用して、２箇所のＳｗａ  Ｉ部位で組換えゲノムの制限消化を行い、続いて連結させると、その結果、ヌクレオチド位置５３１１とヌクレオチド位置５４５３との間の配列の欠失が得られる。
【０６４９】
以下のプライマーセットを用いた：
制限酵素部位を導入するのに使用したプライマー：
４７４１から５４４４までのＭ２欠失を作製するために、ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００にＢｓｐＥＩを導入するため：
プライマーセット
2011250786.tif 000018
【０６５０】
及びプライマーセット
2011250786.tif 000019
【０６５１】
４７４４から５２４１までのＭ２−１欠失を作製するために、ｈＭＰＶにＮｈｅＩ部位を導入するため、そして、ｎｔ４７４２における開始部位をａｔｇからａｃｇに変えるため：
プライマーセット
2011250786.tif 000020
【０６５２】
プライマーセット
2011250786.tif 000021
【０６５３】
５３１１から５４５３までのＭ２−２欠失を作製するために、ｈＭＰＶにＳｗａＩ部位を導入するため：
プライマーセット
2011250786.tif 000022
【０６５４】
及びプライマー
2011250786.tif 000023
【０６５５】
ＳＨの中に欠失を有するｈＭＰＶ（ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００株）を作製するために５４７２から６０２６までの欠失を有するクローンを回収し、このクローンはＶｅｒｏ細胞培養で良好に増殖した。ＳＨ欠失を有するｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００ウイルスをクローニングするためのプライマーセットは以下の通りである。
【０６５６】
プライマーセット
2011250786.tif 000024
【０６５７】
プライマーセット
2011250786.tif 000025
【０６５８】
１０．  実施例：  エレクトロポレーションによる無血清Ｖｅｒｏ細胞におけるｈＭＰＶのプラスミドのみの回収
緒言
この方法は、ヘルパーウイルスの非存在下における、プラスミドのみを使用した組換えｈＭＰＶの回収を可能にする。ｈＭＰＶの回収は、ＳＦ  Ｖｅｒｏ細胞を使用して実施し、これらは、動物及びヒトに由来する産物の非存在下に増殖される。この方法は、ヘルパーウイルス（Ｔ７ポリメラーゼを発現する組換えワクチニアウイルス又は鶏痘ウイルス）を使用した以前の方法と同様の効率で組換えｈＭＰＶを回収するのを可能にする。この回収方法はヘルパーウイルスを必要としないので、ワクチンウイルスは混入物質を含まず、下流のワクチン生産を単純化する。ワクチンウイルス回収に使用される細胞は、動物又はヒトに由来する産物を含有しない培地で生育される。これは伝染性海綿状脳症（例えばＢＳＥ）に関する製品エンドユーザーの心配を取り除く。
【０６５９】
この方法は、動物又はヒトに由来する成分を全く含まない組換えワクチンシードの作製を可能にする。このシードは、混入ヘルパーウイルスも含まない。
【０６６０】
ｃＤＮＡからウイルスをレスキューするためのプラスミドベースの発現系については、例えば、RA Lerch他、Wyeth Vaccines、Pearl River NY, USA（XII International Conference on Negative Strand Virusesの要旨206、2003年6月14〜19日、Pisa Italy)、及びG.Neumann他、J.Virol.、76、406〜410頁に記載されている。
【０６６１】
方法及び結果
無血清培地中でエレクトロポレーションを使用してＳＦ  Ｖｅｒｏ細胞内に、ｈＭＰＶ  Ｎプラスミド（４μｇ；マーカー：カナマイシン抵抗性）、ｈＭＰＶ  Ｐプラスミド（４μｇ；マーカー：カナマイシン抵抗性）、ｈＭＰＶ  Ｌプラスミド（２μｇ；マーカー：カナマイシン抵抗性）、ｈＭＰＶアンチゲノムｃＤＮＡをコードするｃＤＮＡ（５μｇ；マーカー：カナマイシン抵抗性）、及びＴ７  ＲＮＡポリメラーゼをコードするｐＡＤＴ７（Ｎ）ＤｐＴ７（５μｇ；マーカー：ブラストサイジン）を導入する。
【０６６２】
ｈＭＰＶウイルスのレスキューには、４種類の発現プラスミドを使用する。それらはｈＭＰＶの遺伝子Ｎ、Ｐ、Ｌ、及びＭ２のためのものである。詳細には以下のプラスミドを使用する。すなわち、
ｈＭＰＶ  Ｎ  ｐＣＩＴＥプラスミド４μｇ、
ｈＭＰＶ  Ｐ  ｐＣＩＴＥプラスミド４μｇ、
ｈＭＰＶ  Ｍ２  ｐＣＩＴＥプラスミド３μｇ、
ｈＭＰＶ  Ｌ  ｐＣＩＴＥプラスミド２μｇ、
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプラスミド５μｇ、
及び、レスキューするべきウイルスゲノムをコードするウイルスｃＤＮＡ  ５μｇである。
【０６６３】
ｐＣＩＴＥプラスミドは、Ｖｅｒｏ細胞の細胞質で機能する配列内リボソーム進入部位を有し、それによって、Ｎ、Ｐ、Ｍ２、及びＬのタンパク質が細胞質で生成される。これらのタンパク質はウイルスポリメラーゼ複合体を形成する。
【０６６４】
レスキューするべきウイルスゲノムは、Ｔ７プロモーターを有する完全長プラスミドの中にある。理論に拘泥するものではないが、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、この完全長プラスミドを使用して完全長ウイルスＲＮＡゲノムの転写を行う。ウイルスゲノムが生成された後、ウイルスポリメラーゼ複合体がウイルスゲノムを転写し、ウイルスメッセンジャーＲＮＡを生成するであろう、そして、その後、ウイルスが回収される。
【０６６５】
電気穿孔のためのパルスは、２２０Ｖ、９５０マイクロファラッドである。電気穿孔１回あたり５．５×１０６のＳＦ  Ｖｅｒｏ細胞を使用する。電気穿孔された細胞は、ＯｐｔｉＣ（GIBCO Invitrogen Corporation製のカスタム処方）の存在下、３３℃で一晩かけて回復させる。回復した細胞は、カルシウム及びマグネシウムを含有する１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＬのＯｐｔｉＣをかぶせた。電気穿孔された細胞を、さらに５〜７日間、３３℃でインキュベートする。インキュベーション期間の最後に、細胞を培地中にこすり落とし、ｈＭＰＶが存在するかどうか全細胞溶解物を分析する。
【０６６６】
ウイルスの回収は、ｈＭＰＶ特異的なポリクロナール抗体を使用して、プラークアッセイの免疫染色によって確認する。
【０６６７】
１１．  実施例：ヒトメタニューモウイルスＦタンパク質の切断部位におけるプロリンからセリンへの変化によってＶｅｒｏ細胞における切断及び感染性が抑制される
最近になって記載されたパラミクソウイルスであるヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）は、呼吸器疾患を引き起こし、それには、重度の咳、細気管支炎、及び肺炎が含まれることがある。ニューモウイルス（Pneumovirus）亜科の他のメンバー、トリメタニューモウイルス（ＡＰＶ）、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）と同様に、ｈＭＰＶは、２つの表面糖タンパク質、すなわち１つの付着糖タンパク質（Ｇ）と、１つの融合タンパク質（Ｆ）とを発現する。ｈＭＰＶの結合及び進入の研究は、いまだ報告されていないが、他のパラミクソウイルスのＦタンパク質との配列アラインメントは、保存されている機能ドメインの存在を明らかにした（例えば図９参照）。理論に拘泥するものではないが、完全長融合タンパク質Ｆ０がＦ１及びＦ２に切断されることによって、Ｆ１断片のＮ末端にある融合ペプチドが露出し、これはウイルス膜が宿主細胞膜と融合するための前提条件である。
【０６６８】
株ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００（配列番号１９）は、Ｆタンパク質の切断部位に配列ＲＱＰＲを含有するが、他のｈＭＰＶ株の大部分は、Ｆタンパク質の切断部位にアミノ酸配列ＲＱＳＲを含有する。Ｆタンパク質のアミノ酸位置１０１にプロリン又はセリンのいずれかを有する完全長ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００をクローニングした。両ウイルスを、実施例３２で記載した通りに、トリプシンの存在下でレスキューし、増幅した（図６２及び６３）。しかし、トリプシンの非存在下では、セリン置換によって、Ｆタンパク質の切断（図６４）と、ウイルスの感染性が抑制された。切断、及びそれに続く感染性は、トリプシンの添加によって回復することができたが、１０１Ｓ変異体のプラークサイズは１０１Ｐウイルスより小さかった。これらの結果は、Ｆの切断がｈＭＶＰ／ＮＬ／１／００の感染性の前提条件であることを実証する。
【０６６９】
配列決定されたｈＭＰＶ株の他の多くは、Ｆタンパク質の位置１０１にセリンを有し、切断される可能性が高い。例えば、株ＣＡＮ  ９９−８１のＦタンパク質は、切断されることがウエスタンブロットを用いて示されている。
【０６７０】
１２．実施例：組換えｈＭＰＶの増殖挙動
実施例２８で記述したように、いくつかの組換えｈＭＰＶが構築された。実施例３２で記述したように、様々な組換えｈＭＰＶがレスキューされた。トリプシンの存在下及び非存在下における組換えｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の増殖曲線を図６５に示す。細胞（Ｖｅｒｏ細胞）はＭＯＩ  ０．１で感染させた。
【０６７１】
ハムスターの上気道及び下気道における野生型ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００及び組換えｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の複製を図６６に示す。ハムスターは、実施例３３で記述した通りに感染させた。
【０６７２】
Ｆタンパク質のアミノ酸位置９３におけるグルタミン酸がバリンにアミノ酸置換されている組換えｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００の、トリプシンの存在下及び非存在下における増殖曲線を図６７に示す。細胞（Ｖｅｒｏ細胞）は、ＭＯＩ  １で感染させた。
【０６７３】
１３．ｈＭＰＶ／ＧＦＰ２を使用した微量中和試験
ウイルスを動物に接種したときに、ウイルスに対する一群の抗体が産生される。これらの抗体の一部は、ウイルス粒子に結合して、ウイルスの感染性を中和することができる。この実施例では、微量中和試験を用いて、抗体を含有する血清の希釈液でウイルスをインキュベートした後におけるウイルスの残留感染力を分析した。連続希釈のために、９６ウェルプレートを、（ｉ）行Ａ（希釈率１：３２）；Ｂ（１：６４）；Ｃ（１：１２８）；Ｄ（１：２５６）；Ｅ（１：５１２）；Ｆ（１：１０２４）；Ｇ（１：２０４８）；及びＨ（抗体なし）に、そして、（ｉｉ）様々な試料用に列１〜１２（第１の試料：列１〜３；第２の試料：列４〜６；第３の試料：列７〜９；第４の試料：列１０〜１２）に分割した。２３０μｌの試料希釈液を行Ａに添加する。１１５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを行Ｂ〜Ｈに添加する。次に、１Ｂ、２Ｂ、及び３Ｂのウェルに第１の試料、４Ｂ、５Ｂ、及び６Ｂのウェルに第２の試料、７Ｂ、８Ｂ、及び９Ｂのウェルに第３の試料、そして、１０Ｂ、１１Ｂ、及び１２Ｂのウェルに第４の試料の１：３２希釈液１１５μｌを添加する。血清及び培地は、３回、上下にピペッティングすることよって穏やかに混合する。これらのステップを、行ＢからＣに、行ＣからＤに、行ＤからＥに、行ＥからＧに繰り返す。希釈された試料を行Ｇに添加して、混合した後に、行Ｇから１１５μｌを取り除き、廃棄する。
【０６７４】
微量中和試験は以下の通りに行った。血清は連続希釈した。各試験試料及び各対照は、２２．５μｌの血清を６９７．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（１×）に添加することによって１：３２に希釈した。血清及び培地は、反転によって穏やかに３回混合し、氷上に置いた。血清の各希釈液をｈＭＰＶ／ＧＦＰ２ウイルスと共にインキュベートした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で洗浄した。ＡＴＣＣから入手したＶｅｒｏ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、及び１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシンを添加したＭＥＭ（TRH Biosciences）中に維持する。ウイルス／血清混合物を細胞に添加して、３５℃で１時間インキュベートした。培地はウイルスを含有していたが、全ての培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を細胞に添加して、細胞培養を３日間インキュベートした。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ血清使用量低減培地（１×）（GIBCO31985-070）は、中でも、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２４００ｍｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、微量元素、成長因子、及び１．１  ｍｇ／Ｌに低減したフェノールレッドを含有する。ウイルスの残留感染力は、蛍光顕微鏡で捕捉されたイメージに現れたｅＧＦＰグリーンの細胞増殖巣を定量することによって測定した。微量中和試験の感度を比較するために、野生型ウイルス、例えば野生型ｈＭＰＶ／ＮＬ／１／００を使用したプラーク減少アッセイ（実施例１６を参照）を行った。結果を表１６、表１７、表１８、表１９、及び図６８に示す。
【０６７５】
結果は、ｈＭＰＶ／ＧＦＰ２を使用する微量中和試験が信頼性と再現性とを備えた結果を提供することを実証するものである。微量中和試験におけるｈＭＰＶ−ＧＦＰの使用は、フェレットやサルなどの動物モデルシステムにおける種々のワクチン及び抗体の高スループットスクリーニングを容易にする。この技法は、ヒトにおける感染を診断して、モニターするための効率的な方法も提供する。
【０６７６】
2011250786.tif 000026
【０６７７】
2011250786.tif 000027
【０６７８】
2011250786.tif 000028
【０６７９】
2011250786.tif 000029
【０６８０】
１４．実施例：アフリカミドリザルにおける、ＭＰＶの抗原性タンパク質を発現するｂ／ｈ  ＰＩＶ３の有効性及び免疫原性を評価する
ＭＰＶ／ＲＳＶ２価ワクチン候補株、例えば、ヒトＲＳＶの可溶性型Ｆタンパク質など、ＲＳＶの抗原性タンパク質を発現するｈＭＰＶ（「ｈＭＰＶ／ＲＳＶ  ＦＳＯＬ」）を、アフリカミドリザルなどの非ヒト霊長類モデルにおける有効性及び免疫原性に関して評価する。この可溶性型ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、膜貫通ドメイン及び管腔ドメインを欠失している。
【０６８１】
Ｖｅｒｏ細胞は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、抗生物質、及び１０％  ＦＢＳを添加した改変イーグル培地（ＭＥＭ）（JRH Biosciences）中に維持する。ＲＳＶの抗原性タンパク質を発現するｈＭＰＶ、例えばｈＭＰＶ／ＲＳＶ  ＦＳＯＬ、野生型ＭＰＶ、例えばｈＭＰＶ／ＮＬ／１００、及び野生型ＲＳＶ、例えば野生型ＲＳＶ  Ａ２をＶｅｒｏ細胞で増殖させる。細胞は、０．１ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスに感染させる。感染の３〜５日後に、細胞及び上清を収集し、１０×ＳＰＧ（１０×ＳＰＧは、２．１８Ｍショ糖、０．０３８Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０７２Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５４Ｍ  Ｌ−グルタミン酸である）を最終濃度が１×になるように添加することによって安定化させる。ウイルスストックは−７０℃で保存する。ウイルス力価は、プラークアッセイによってＶｅｒｏ細胞で決定する。ＰＩＶ３（ＶＭＲＤ）又はＭＰＶのヤギポリクローナル抗血清（Biogenesis）を使用した免疫ペルオキシダーゼ染色の後に、プラークを定量する。
【０６８２】
ＭＰＶ及びＲＳＶに対して血清陰性のアフリカのミドリザル（Cercopithecus aethiops）（３．５から６．５歳、２．６から５．８ｋｇ）は、研究開始日の１４日前に採取する霊長類プレ血清のＭＰＶ  Ｆ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（Immuno-Biological Laboratories）及びＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ（Immuno-Biological Laboratories）を用いて同定する。ＭＰＶ  Ｆ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡは次の通りに行う。製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡキット（Immuno-Biological Laboratories、Hamburg, Germany）を使用して、ＭＰＶ  Ｆ  ＩｇＧが存在するかどうか、１、２８、及び５６日目にワクチン接種された動物から得た霊長類血清を分析する。サル二次抗血清（Rockland Inc.）を、１：１０００希釈で使用する。ＭＰＶ  Ｆ  ＩｇＧ抗体価は、ｌｏｇ２  ＩｇＧ  Ｕ／ｍｌとして表す。製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡキット（Immuno-Biological Laboratories、Hamburg、Germany）を使用して、ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧが存在するかどうか、１、２８、及び５６日目にワクチン接種された動物から得た霊長類血清を分析する。サル二次抗血清（Rockland Inc.）を、１：１０００希釈で使用する。ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ抗体価は、ｌｏｇ２  ＩｇＧ  Ｕ／ｍｌとして表す。
【０６８３】
霊長類は、個別のＭｉｃｒｏ−Ｉｓｏｌａｔｏｒ（商標）ケージに収容する。サルをケタミン−バリウム混合物で麻痺させ、それぞれ、ＲＳＶの抗原性タンパク質を発現するｈＭＰＶベクター、例えばｈＭＰＶ／ＲＳＶ  ＦＳＯＬ、野生型ＭＰＶ、例えばｈＭＰＶ／ＮＬ／１００、及び野生型ＲＳＶ、例えば野生型ＲＳＶ  Ａ２に鼻腔内及び気管内感染させる。鼻腔用量容積は鼻孔あたり０．５ｍｌであり、気管内用量容積は１ｍｌである。１日目に、２〜３×１０５ＰＦＵのウイルスを含有する２ｍｌ用量を各動物に与える。プラセボ動物群には、同じ用量容積のＯｐｔｉ−ＭＥＭを与える。２８日目に、７×１０５  ＰＦＵの野生型ＲＳＶ  Ａ２（各部位に１ｍｌ）を用いて、全動物に対して気管内及び鼻腔内でチャレンジを行う。鼻咽腔（ＮＰ）スワブは１１日間毎日採取し、気管洗浄（ＴＬ）試料は免疫化及びチャレンジの１、３、５、７、及び９日後に採取する。大腿静脈から得られる血液試料は、血清学的解析のために０、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、及び５６日目に採取する。発熱を示す体温変化、風邪の徴候、鼻水、くしゃみ、食欲不振、及び体重について動物をモニターする。霊長類のＮＰ試料及びＴＬ試料中に存在するウイルスは、ＭＰＶヤギポリクローナル抗血清で免疫染色されるＶｅｒｏ細胞を使用したプラークアッセイによって定量する。平均ピークウイルス力価は、免疫化又はチャレンジの後の任意の１１日間に各動物で測定されたピークウイルス力価の平均を表す。
【０６８４】
プラーク減少中和アッセイ（ＰＲＮＡ）は、ｈＭＰＶ／ＲＳＶ  ＦＳＯＬに感染した霊長類から、投与の１、２８、及び５６日後に得られた血清に関して行う。霊長類血清は、２倍の連続希釈を行い、１００  ＰＦＵの野生型ＲＳＶ  Ａ２又は野生型ＭＰＶ、例えばｈＭＰＶ／ＮＬ／１００とそれぞれモルモット補体の存在下、４℃で１時間インキュベートする。ウイルス血清混合物をＶｅｒｏ細胞単層培養に移し、２％ＦＢＳ及び１％抗生物質を含有するＥＭＥＭ／Ｌ−１５培地（JRH Biosciences、Lenexa, KS）中に調製した１％メチルセルロースをかぶせる。３５℃で６日間インキュベートした後、定量のため、それぞれＲＳＶヤギポリクローナル抗血清又はｈＭＰＶヤギポリクローナル抗血清を使用して、単層培養を免疫染色する。中和力価は、５０％のウイルスプラークを阻害する最大の血清希釈率の逆数のｌｏｇ２として表される。
【０６８５】
ｈＭＰＶ微量中和試験及びＲＳＶ  Ａ２微量中和試験をそれぞれＶｅｒｏ細胞で行う。１：４に始まる、霊長類血清の２倍連続希釈を、それぞれ、１００  ＴＣＩＤ５０のｈＭＰＶ又はＲＳＶ  Ａ２と共に３７℃で、６０分間インキュベートする。続いて、ウイルス血清混合物を９６ウェルプレート中の細胞単層培養に移し、３７℃で、６日間インキュベートし、その後、全てのウェルをＣＰＥに関して観測する。中和力価は、ＣＰＥを阻害した最も高い血清希釈の逆数として表される。≦１：４（試験された最も低い血清希釈）の中和抗体価には、力価の逆数のｌｏｇ２として２を割り当てる。
【０６８６】
ＭＰＶ／ＲＳＶ２価ワクチン候補株の複製効率を検査するために、以下の通りに実験が設計されている。１日目に、ＭＰＶワクチン候補株、例えばｈＭＰＶ／ＲＳＶ  ＦＳＯＬを２〜３×１０５ＰＦＵの用量で鼻腔内投与及び気管内投与することによって、ＭＰＶ及びＲＳＶに対して血清陰性のアフリカミドリザル（一群あたり８頭の動物）を免疫する。陽性対照群の１つは野生型ＭＰＶ、例えばｈＭＰＶ／ＮＬ／１００に感染し、別の陽性対照群は野生型ＲＳＶ  Ａ２に感染し、そして、陰性対照群にはプラセボ培地が投与される。２８日目に、各群を２つのセクションに分割し、各群における１セクション全ての動物に対して、７×１０５ＰＦＵの野生型ＭＰＶ、例えばｈＭＰＶ／ＮＬ／１００を用いて、鼻腔内及び気管内でチャレンジを行う。各群のもう一方のセクションにおける全ての動物に対して、７×１０５ＰＦＵの野生型ＲＳＶ  Ａ２を用いて、鼻腔内及び気管内でチャレンジを行う。この検査の間、動物はＭｉｃｒｏ−Ｉｓｏｌａｔｏｒ  ケージに収容する。鼻咽腔スワブは免疫及びチャレンジの後１１日間、毎日採取し気管洗浄試料は免疫及びチャレンジの２、４、６、８、及び１０日後に採取する。抗体分析用の血清試料は、検査期間中を通して７日間毎に採取する。
【０６８７】
それぞれ、ＭＰＶ感染及びＲＳＶ感染に対する免疫防御を評価するために、ワクチン接種された霊長類に対して、免疫化の４週間後に、それぞれ、高用量の野生型ＭＰＶ、例えばｈＭＰＶ／ＮＬ／１００と、高用量の野生型ＲＳＶ  Ａ２とを用いてチャレンジを行った。有効性は、感染動物のＵＲＴ及びＬＲＴで除去されたチャレンジＭＰＶウイルスの力価の減少として測定する。
【０６８８】
ＭＰＶ／ＲＳＶ２価ワクチン候補株の有効性は、さらに、免疫化の４週間後に産生されたＭＰＶ中和抗体の抗体価のレベル、及び、ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ血清抗体の抗体価のレベルによって評価する。ＭＰＶ中和抗体の抗体価は、５０％プラーク減少中和アッセイ（ＰＲＮＡ）を用いて決定する。ＭＰＶ／ＲＳＶ２価ワクチン候補株によって誘発される免疫応答は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的なＩｇＧレベルを、投与前（１日）、投与の４週間後（２８日目）、そして誘発の４週間後（５６日目）に測定することによっても分析される。ＲＳＶ  Ｆ  ＩｇＧ血清抗体の存在は、ＥＬＩＳＡを用いて判定する。血清中のＭＰＶ中和活性の存在は、ｈＭＰＶ微量中和試験の使用によっても決定できる。
【０６８９】
ＭＰＶ／ＲＳＶ２価ワクチンによって、ＲＳＶ感染から保護できるかどうかを評価するために、ＲＳＶ中和の存在に関してもプラーク減少中和アッセイ又は微量中和試験を用いて霊長類血清を分析する。
【０６９０】
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【０６９１】
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【０６９２】
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【０６９３】
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【０６９４】
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【０６９５】
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【０６９６】
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【０６９７】
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【０６９８】
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【０６９９】
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【０７００】
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【０７０１】
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【０７０２】
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【０７０３】
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【０７０４】
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【０７０５】
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【０７０６】
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【０７０７】
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【０７０８】
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【０７０９】
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【０７１０】
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【０７１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
2011250786.tif 000072
【図１７ｄ】
2011250786.tif 000073
【図１７ｅ】
2011250786.tif 000074
【図１７ｆ】
2011250786.tif 000075
【図１７ｇ】
2011250786.tif 000076
【図１７ｈ】
2011250786.tif 000077
【図１７ｉ】
2011250786.tif 000078
【図１７ｊ】
2011250786.tif 000079
【図１７ｋ】
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【図１８ａ】
2011250786.tif 000081
【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
2011250786.tif 000084
【図１８ｅ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図１９ｃ】
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【図１９ｄ】
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【図１９ｅ】
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【図１９ｆ】
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【図１９ｇ】
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【図１９ｈ】
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【図１９ｉ】
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【図１９ｊ】
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【図１９ｋ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２０ｄ】
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【図２１】
2011250786.tif 000101
【図２２】
2011250786.tif 000102
【図２３】
2011250786.tif 000103
【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０ａ】
2011250786.tif 000113
【図３０ｂ】
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【図３０ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１ａ】
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【図４１ｂ】
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【図４２ａ】
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【図４２ｂ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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【図５３−４】
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【図５３−５】
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【図５３−６】
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【図５３−７】
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【図５３−８】
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【図５３−９】
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【図５３−１０】
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【図５３−１１】
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【図５３−１２】
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【図５３−１３】
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【図５３−１４】
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【図５３−１５】
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【図５３−１６】
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【図５３−１７】
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【図５３−１８】
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【図５３−１９】
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【図５３−２０】
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【図５３−２１】
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【図５３−２２】
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【図５３−２３】
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【図５３−２４】
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【図５３−２５】
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【図５３−２６】
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【図５３−２７】
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【図５３−２８】
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【図５３−２９】
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【図５３−３０】
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【図５３−３１】
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【図５３−３２】
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【図５３−３３】
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【図５３−３４】
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【図５３−３５】
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【図５３−３６】
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【図５３−３７】
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【図５３−３８】
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【図５３−３９】
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【図５３−４０】
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【図５３−４１】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図５９Ｄ】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【配列表】
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