(57)【要約】      （修正有）【課題】飲食品又は医薬品に利用可能な、高い抗酸化活性を示す抗酸化剤の提供。【解決手段】分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上の大豆蛋白質加水分解物を含有する、さらにはビタミン類、ポリフェノール類、カロチノイド類、サポニン類及びアリシンから選択される１種以上の抗酸化物質をさらに含む、高い抗酸化活性を示す抗酸化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上である大豆蛋白質加水分解物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
前記大豆蛋白質加水分解物は加水分解後の不溶物が除去されている大豆蛋白質加水分解物である、請求項１記載の抗酸化剤。
【請求項３】
ビタミン類、ポリフェノール類、カロチノイド類、サポニン類及びアリシンから選択される１種以上の抗酸化物質をさらに含む、請求項１又は２記載の抗酸化剤。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか一項に記載の抗酸化剤が添加された飲食品。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか一項に記載の抗酸化剤を有効成分とする医薬品。
【請求項６】
抗酸化剤の製造における、蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上である大豆蛋白質加水分解物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大豆蛋白質白加水分解物を含有する抗酸化剤、及び大豆蛋白質加水分解物の抗酸化剤としての使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む好気性生物は生存のために呼吸により酸素を取り込むが、このとき体内に取り込まれた酸素の一部はエネルギー代謝の際にスーパーオキシドラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカル等の活性酸素種に変わる。このような活性酸素種は、元来、細菌やウイルスの感染時におけるマクロファージの病原体除去機構をはじめとする生体防御に関わるなど、健康維持に重要な役割を果たしている。しかし、大気汚染や紫外線などの環境要因や喫煙等の生活習慣、精神的ストレスなどにより生体内でのバランスが崩れ、活性酸素種がひとたび過剰となると生体中の蛋白質や脂質、ＤＮＡなどと反応して、蛋白質の変性や過酸化脂質の生成、遺伝損傷などを起こし、生活習慣病の発症や老化の促進をもたらすと考えられている。以上のことから、生体に備わったメカニズムに加え、食事由来の抗酸化活性成分の摂取が健康維持に重要と考えられるようになり、抗酸化物質は７番目の栄養素として積極的な摂取が奨励されてきている。
【０００３】
大豆は多くの生理機能を有していることが報告されており、抗酸化活性についてもいくつか報告されている。たとえば、大豆イソフラボンは他のフラボノイド類と同様に高い抗酸化活性を有していることが確認されている。また、大豆蛋白質加水分解物の抗酸化活性に関しては、抗酸化活性を示すペプチド配列について同定されている。しかしながら、大豆蛋白質加水分解物から特定のペプチドを大量に単離して抗酸化剤として使用することは製造上困難である。そこで、様々なペプチドの混合物である大豆蛋白質加水分解物そのものを抗酸化剤として用いることができれば有用である。
その中で、特許文献１には、抗酸化力を増大させた大豆蛋白質の加水分解物が記載され、ペプチドの平均分子量は３ｋＤａ〜３０ｋＤａ（３０００〜３００００）であることが記載されている。本文献は加水分解しすぎることによる苦味の発現を回避するために、比較的高分子量のペプチドを得ている。
【０００４】
また特許文献２及び３にも抗酸化力を示す大豆蛋白質の加水分解物が記載されているが、特許文献２に記載されているペプチドの平均分子量は５００〜５０００であり、特許文献３のペプチドの平均アミノ酸鎖長は１０〜１００個で、この分子量はおおよそ１２００以上に相当する。
さらに、特許文献４には、抗酸化活性を有する大豆蛋白質加水分解物として、バチルス・ズブチリスやアスペルギルス・オリゼ等由来の種々のプロテーゼによる加水分解物が記載されており、該加水分解物は分子量が２０００以下のものをろ取すること、該加水分解物の遊離アミノ酸の含有割合が２０〜３０重量％であることが記載されている。
これらの大豆蛋白質加水分解物は一定の抗酸化活性を有すると認められるが、該活性は必ずしも抗酸化剤として実用化できるレベルではなく、さらに高い抗酸化活性を示す大豆蛋白質加水分解物が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−８０６６８号公報
【特許文献２】特開平１０−２０３９９４号公報
【特許文献３】特開２０００−４８９６号公報
【特許文献４】特開２００３−２１０１３８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，５２，４０２６−４０３７，２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、飲食品又は医薬品に利用可能な、高い抗酸化活性を示す抗酸化剤を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は本課題について鋭意検討した結果、蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上の大豆蛋白質加水分解物を得ることで、従来よりも高い抗酸化活性を示す抗酸化剤とすることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち本発明は、以下の（１）〜（６）を提供する。
（１）蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上である大豆蛋白質加水分解物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
（２）前記大豆蛋白質加水分解物は加水分解後の不溶物が除去されている大豆蛋白質加水分解物である、上記（１）記載の抗酸化剤。
（３）ビタミン類、ポリフェノール類、カロチノイド類、サポニン類及びアリシンから選択される１種以上の抗酸化物質をさらに含む、上記（１）又は（２）記載の抗酸化剤。
（４）上記（１）〜（３）いずれかに記載の抗酸化剤が添加された飲食品。
（５）上記（１）〜（３）いずれかに記載の抗酸化剤を有効成分とする医薬品。
（６）抗酸化剤の製造における、蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上である大豆蛋白質加水分解物の使用方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、大豆蛋白質加水分解物から特定の抗酸化活性を有するペプチドを単離するのではなく、大豆蛋白質加水分解物（ペプチド混合物）そのものを用いた実用的な、高い抗酸化活性を示す抗酸化剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量とＯＲＡＣ値との相関関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の抗酸化剤は、蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上である大豆蛋白質加水分解物を含有することを特徴とする。以下、本発明について具体的に説明する。
【００１３】
（大豆蛋白質原料）
本発明に係る大豆蛋白質加水分解物は、大豆蛋白質原料をプロテアーゼにより加水分解したものである。ここで大豆蛋白質原料の一例として、丸大豆や脱脂大豆等から蛋白質成分を水で抽出し、オカラ成分を除去した全脂豆乳や脱脂豆乳が挙げられる。大豆蛋白質原料の別の一例として、これら豆乳から、限外ろ過膜による処理や酸を用いた等電点沈殿等により蛋白質を濃縮した分離大豆蛋白質が挙げられる。大豆蛋白質原料のさらに別の例として、大豆から酸洗浄やエタノール洗浄によりホエー成分を除去して蛋白質を濃縮した濃縮大豆蛋白質や、大豆を粉砕した大豆粉が挙げられる。これらの大豆蛋白質原料は殺菌・乾燥した物でもよい。尚、最終的に得られる大豆蛋白質原料は、蛋白質を乾燥重量で８０重量％以上含むことが好ましく、例えば分離大豆蛋白質等が好ましい。
分離大豆蛋白質は一般には以下の様に調製されるものである。すなわち、脱脂大豆に水を加え、中性付近にて抽出を行い、オカラを分離して豆乳を得る。次に豆乳をｐＨ４．５付近に調整し、等電点沈殿物を回収する。沈殿物に水及びアルカリ剤を加え、固形分濃度５〜１５重量％、ｐＨ５．７〜８．０好ましくはｐＨ６．８〜７．５付近の水溶液を得る。この様にして得られた分離大豆蛋白質は、溶液をそのまま以下の工程に用いても良いし、未殺菌の物又は殺菌した物を乾燥後に改めて溶解して用いても良い。還元糖を予め水溶液とし、これに大豆蛋白質原料を溶解させることも可能である。ただし、分離大豆蛋白質は上記製法のみに限定されるものではなく、該製法を種々改変したものであってもよいことは無論である。
【００１４】
（大豆蛋白質加水分解物）
本発明に係る大豆蛋白質加水分解物は、上記大豆蛋白質原料をプロテアーゼ処理することによって得られるペプチド混合物である。該蛋白質加水分解物は分解度がより高いことが好ましく、特に加水分解物中におけるペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００未満のペプチドの割合が高いことが好ましい。具体的には、蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上であることが重要であり、６０重量％以上であることがさらに好ましい。
この分子量５００未満のペプチドは、アミノ酸が２〜３分子結合したジペプチドおよびトリペプチドから実質的に構成されるものである。
分子量５００未満のペプチドの含量は、ペプチド用ゲルろ過クロマトグラフィーにより蛋白質加水分解物における分子量５００未満のペプチド及び遊離アミノ酸画分の割合を測定した後、アミノ酸分析により算出した蛋白質加水分解物中の遊離アミノ酸含量を差し引くことにより算出するものとする。
上記のように特定される大豆蛋白質加水分解物は分子量５００未満のペプチド以外のペプチド及び遊離アミノ酸の割合をできるだけ低減したものが好ましい。すなわち、蛋白質加水分解物中の遊離アミノ酸含量はペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して１２重量％以下であることが好ましく、５重量％以下であることがより好ましく、３重量％以下がさらに好ましい。さらに、該蛋白質加水分解物中のペプチド体はより低分子であることが望ましいことから、蛋白質加水分解物中の分子量５００以上の画分の割合がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して４０重量％以下であることが好ましく、３８重量％以下であることがより好ましく、３５重量％以下がさらに好ましい。
【００１５】
（プロテアーゼ）
本発明に係る大豆蛋白質加水分解物を得るために使用するプロテアーゼは、動物起源、植物起源又は微生物起源を問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。特に２種類以上、あるいは３種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次若しくは同時に作用させる分解方法が分子量５００未満のペプチドの割合を増加させることができ、好ましい。
【００１６】
このプロテアーゼの分類は、酵素科学の分野において通常行なわれている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはＢａｃｉｌｌｕｓ由来中性プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来中性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来中性プロテアーゼ、『サモアーゼ』等が挙げられ、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来酸性プロテアーゼ、『スミチームＦＰ』等が挙げられ、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン、パパイン等が挙げられ、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来アルカリプロテアーゼ、『アルカラーゼ』、『ビオプラーゼ』等が挙げられる。これら以外の酵素でも作用ｐＨや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるため、「切れ残り」を減らし、効率よく酵素分解物を得ることができる。また、異なった起源の（起源生物）の酵素を併用することで、更に効率よく酵素分解物を製造することができる。同分類でも起源が異なれば、基質である蛋白質への作用部位も異なり、結果として分子量５００未満のペプチドの割合を増やすことができる。これらプロテアーゼはエキソプロテアーゼ活性が少ないことが好ましい。
【００１７】
プロテアーゼ処理の反応ｐＨや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すれば良く、通常、反応ｐＨは至適ｐＨ付近で行ない、反応温度は至適温度付近で行なえば良い。概ね反応温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃である。反応後は酵素を失活させるのに十分な温度（６０〜１７０℃程度）まで加熱し、残存酵素活性を失活させる。
【００１８】
プロテアーゼ処理後の反応液は、そのまま又は濃縮して用いることもできるが、通常、殺菌し、噴霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用する。殺菌は、加熱殺菌が好ましく、加熱温度は１１０〜１７０℃が好ましく、１３０〜１７０℃が更に好ましい。加熱時間は３〜２０秒間が好ましい。また、反応液を任意のｐＨに調整してもよい。プロテアーゼ処理時やｐＨ調整時に発生する不溶物（沈殿物や懸濁物）を遠心分離やろ過等により除去してもよい。不溶物の除去は、大豆蛋白質加水分解物の抗酸化活性を向上させることができるため、好ましい。更に活性炭や吸着樹脂により精製してもよい。
【００１９】
（抗酸化作用）
本発明に係る蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上である大豆蛋白質加水分解物は、高い抗酸化活性を示す。該加水分解物が持つ抗酸化活性については、非特許文献１に記載の方法にて測定される「ＯＲＡＣ」（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｃａｐａｃｉｔｙ：活性酸素吸収能力）の値（単位：μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ）を指標とすることができる。なお、単位の「ＴＥ」は“Ｔｒｏｌｏｘ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ”の略であり、「Ｔｒｏｌｏｘ」は標準物質である「６−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，５，７，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ」の登録商標である。ＯＲＡＣ値が高いほど活性酸素吸収能力すなわち抗酸化活性が高いことを示し、本発明に係る蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドが高い大豆蛋白質加水分解物のＯＲＡＣ値は３５０μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ以上であることが好ましく、４５０μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ以上がより好ましく、５００μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ以上がさらに好ましい。
【００２０】
（他の抗酸化物質との併用）
本発明に係る蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上である大豆蛋白質加水分解物をその他の抗酸化活性を示す物質又はこれらを含むエキスを１種以上併用することにより、抗酸化活性を相乗的に高めることができる。
他の抗酸化物質としては、例えばビタミン類、ポリフェノール類、カロチノイド類、サポニン類、アリシン等が挙げられる。ビタミン類としては、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ等が挙げられる。ポリフェノール類としては、イソフラボン、ケルセチン、ミリセチン、ケンフェロール、ヘスペリジン、ナリンジン、アントシアニン、カテキン、クリシン、アピゲニン、ルテオリン等のフラボノイド類や、セサミン、セサミノール、セサミノール、エピセサミン、セサモール、セサモリン等のリグナン類のほか、ピクノジェノール、クルクミン、クロロゲン酸、没食子酸、ロズマリン酸、エラグ酸、クマリン、フェルラ酸、ショウガオール、カカオマスポリフェノール等が挙げられる。カロチノイド類としては、カロテン（α−，β−，γ−，δ−）やリコピン等のカロテン類、あるいは、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン、カプサイシン等のキサントフィル類等が挙げられる。サポニン類としては、キラヤサポニン等の生薬由来のサポニンや、大豆サポニン、茶サポニン等が挙げられる。これらの抗酸化物質を用いる場合、これらが含まれる植物エキスを代わりに用いることができ、例えばアントシアニンを用いる場合はブルーベリーエキス、カシスエキス、アサイーエキス、エルダーベリーエキスなどを用いることができる。上記抗酸化活性を示す物質又はエキスのうち、特にビタミンＣ、ピクノジェノール、アサイーエキス、クルクミン又はセサミンを併用するとより相乗効果が強く好ましい。
【００２１】
（飲食品における利用）
本発明に係る蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上の大豆蛋白質加水分解物は、これを有効成分とする抗酸化剤として、様々な飲食品に利用することができる。例えば、飲食品自体の酸化防止を目的として飲食品に添加することができる。また、本発明に係る蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上の大豆蛋白質加水分解物を添加することにより摂取した者に生理機能としての抗酸化力が発揮される飲料、タブレット、フードバー、サラダ用ドレッシング、肉製品、スナック菓子、デザート、菓子類及び栄養補助剤などを得ることができる。
【００２２】
（医薬品における利用）
本発明に係る蛋白質加水分解物中の分子量５００未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して５０重量％以上の大豆蛋白質加水分解物は、医薬品としても利用することができる。生体の酸化がもたらす疾病として動脈硬化、心筋梗塞、ガン、糖尿病、アルツハイマー、花粉症などが挙げられるが、これらの疾病を予防及び治療するための医薬品として利用することができる。医薬品の形態として供する場合は、液体、散薬、錠剤、カプセル等の種々の形態で使用することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００２４】
（測定方法）
まず実施例で用いた各種測定方法について以下にまとめる。
【００２５】
＜蛋白質含量＞
１０５℃、１２時間乾燥した大豆蛋白質画分の重量に対して、ケルダール法により測定した蛋白質量の重量を、乾燥物中の蛋白質含量として「％」で表した。なお、窒素換算係数は６．２５とした。
【００２６】
＜遊離アミノ酸及びペプチドの含量＞
大豆蛋白質加水分解物の分子量分布を、以下のゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ法により測定した。
ペプチド用ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣシステムを組み、分子量マーカーとなる既知のペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた。なお、分子量マーカーは、オクタペプチドとして［β−Ａｓｐ］−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩのβ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量１０４６）、ヘキサペプチドとしてＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶのＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量７７５）、ペンタペプチドとしてＬｅｕ−ＥｎｋｅｐｈａｌｉｎのＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（分子量５５５）、トリペプチドとしてＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（分子量４０５）、遊離アミノ酸としてＰｒｏ（分子量１１５）を用いた。蛋白質加水分解物（１％）を１０，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離した上清を、ゲルろ過用溶媒で２倍に希釈し、その５μｌをＨＰＬＣにアプライした。
蛋白質加水分解物中の遊離アミノ酸及び分子量５００未満のペプチド画分の割合（％）は、全体の吸光度のチャート面積に対する、分子量５００未満の範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた（使用カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ７．５／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、溶媒：１％ＳＤＳ／１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、カラム温度２５℃、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）。
また蛋白質加水分解物中の分子量５００以上のペプチド画分の割合（％）は、上記と同様に、全体の吸光度のチャート面積に対する、分子量５００以上の範囲の面積の割合によって求めた。
次に、アミノ酸分析により蛋白質加水分解物中の遊離アミノ酸含量の測定を行った。蛋白質加水分解物（４ｍｇ／ｍｌ）を等量の３％スルホサリチル酸に加え、室温で１５分間振とうした。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上澄みを０．４５μｍフィルターでろ過し、アミノ酸分析器「ＪＬＣ５００Ｖ」（日本電子（株）製）にて、遊離アミノ酸を測定した。蛋白質加水分解物中の遊離アミノ酸含量はケルダール法にて得られた蛋白質含量に対する割合として算出した。
以上より得られた、「遊離アミノ酸及び分子量５００未満のペプチド画分の割合」から「遊離アミノ酸含量」を差し引いた値を、蛋白質分解物中の「分子量５００未満のペプチドの含量」とした。
【００２７】
＜ＯＲＡＣ値の測定＞
得られたサンプルについてそれぞれ、１００ｍｇ秤量し５０％エタノールに溶解させ１００ｍｌに定容し、非特許文献１記載の方法に準じて測定を行った。定量は標準物質として「Ｔｒｏｌｏｘ」（登録商標、キシダ化学（株）より購入）を用い、各測定値を用いて算出した。
【００２８】
（製造例１）  分離大豆蛋白質の調製
低変性脱脂大豆から以下のように分離大豆蛋白質を調製した。
（１）低変性脱脂大豆の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
（２）得られた脱脂豆乳のｐＨを４．５に調整して等電点沈殿し、遠心分離機にて酸沈殿カードを得て中和した。
（３）得られた各画分を中和して、１２０℃で１０秒間加熱殺菌を行った。
【００２９】
（製造例２）  大豆蛋白質加水分解物の調製  （大豆蛋白質加水分解物Ａ、Ｂ）
製造例１で得られた分離大豆蛋白質の１０％溶液を作成し、『アルカラーゼ』（ノボザイムズジャパン（株）製）を０．２％、若しくは０．５％添加し、５５℃、１５分間酵素反応を行った。酵素反応後に９０℃、２０分間の加熱処理により反応を停止させた後、凍結乾燥を行い試料とした（大豆蛋白質加水分解物Ａ、Ｂ）。
【００３０】
（製造例３）  大豆蛋白質加水分解物の調製  （大豆蛋白質加水分解物Ｃ、Ｄ）
製造例１で得られた分離大豆蛋白質の３％溶液を作成し、金属プロテアーゼ『サモアーゼ』（起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  Ｒｏｋｋｏ、大和化成（株））を蛋白質当たり１％又は２％加え、ｐＨ９．０、５８℃で６０分間酵素反応を行った。
次にセリンプロテアーゼ『ビオプラーゼ』（起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、ナガセケムテックス（株））を蛋白質当たり０．５％又は１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間酵素反応を行った。
次に金属プロテアーゼ『スミチームＦＰ』（起源；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、新日本化学工業（株））を蛋白質当たり０．５％又は１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間酵素反応を行った。
以上の酵素反応後、酵素反応液を９０℃、２０分間の加熱処理により反応を停止させた後、凍結乾燥を行い試料とした（大豆蛋白質加水分解物Ｃ、Ｄ）。
【００３１】
（製造例４）  大豆蛋白質加水分解物の調製  （大豆蛋白質加水分解物Ｅ、Ｆ、Ｇ）
製造例１で得られた分離大豆蛋白質の３％溶液を作成し、製造例３と同じ『サモアーゼ』を蛋白質当たり１％、１．５％又は２％加え、ｐＨ９．０、５８℃で６０分間酵素反応を行った。
次に製造例３と同じ『ビオプラーゼ』を蛋白質当たり０．５％、０．７５％又は１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間酵素反応を行った。
次に製造例３と同じ『スミチームＦＰ』を蛋白質当たり０．５％、０．７５％又は１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間酵素反応を行った。
以上の酵素反応後、酵素反応液を９０℃、２０分間の加熱処理により反応を停止させ、さらに酵素反応により生じた不溶物を遠心分離及び孔径１．０μｍのメンブレンフィルターによるろ過で除去し、凍結乾燥を行い試料とした（大豆蛋白質加水分解物Ｅ、Ｆ、Ｇ）。
【００３２】
（試験例１）
製造例２〜４にて得られた大豆蛋白質加水分解物Ａ〜Ｇについて蛋白質含量（％）、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００未満のペプチド含量（％）、分子量５００以上のペプチド含量及び遊離アミノ酸含量、並びに、ＯＲＡＣ値（μｍｏｌ  ＴＥ／ｇ）を測定した（比較例１〜４、実施例１〜３）。各蛋白質加水分解物の調製条件及び分析結果を表１及び図１にまとめた。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
図１に示すとおり、分子量５００未満のペプチド含量とＯＲＡＣ値には高い相関が見られ、相関係数は０．９２であった。比較例３と比較例４を比較すると、分子量５００未満のペプチド含量については比較例４が８％程度高いにもかかわらず、ＯＲＡＣ値に差はほとんど見られなかった。一方で比較例３と酵素反応条件は同一であるが、酵素反応後に不溶物を除去した実施例１では、ＯＲＡＣ値が大きく向上した。
【００３５】
（試験例２）大豆蛋白質加水分解物と抗酸化成分との併用による相乗効果
次に、製造例４で得られた大豆蛋白質加水分解物Ｇと、抗酸化活性が高いことが既に分かっている抗酸化物質又はこれを含むエキスとの相乗効果について、ＯＲＡＣ値を測定することにより検証した。
サンプルはビタミンＣと、各種ポリフェノールの代表例として大豆イソフラボン、カテキン、ブルーベリーエキス、カシスエキス、ピクノジェノール、アサイーエキス、クルクミン、セサミンを用いた。方法は、それぞれのサンプル１００ｍｇを１００ｍｌに定容した溶液と大豆蛋白質加水分解物Ｇ１００ｍｇを１００ｍｌに定容した溶液を１：１で混合し、規定の希釈倍率にて測定を行った。
【００３６】
ＯＲＡＣ値の測定の結果を下記表２に示した。表１によると大豆蛋白質加水分解物Ｇは単独でのＯＲＡＣ値は５５１μｍｏｌ  ＴＥ／ｇであるが、各種の抗酸化成分と併用することにより、いずれも各成分が単独で持つ抗酸化性（無添加（−）データ参照）を相乗的に増強していることが確認された（添加（＋）データ参照）。さらに、抗酸化性の相乗効果は大豆蛋白加水分解物Ｇと食品成分を１：１で混合した物の値であるため、食品成分の添加量を半分に減らしても抗酸化効果は食品成分単独よりも高い値を示していることになる。特に、ビタミンＣ、ピクノジェノール、アサイーエキス、クルクミン、セサミンと併用した場合には、これら単独の抗酸化活性の２倍以上の増強効果を示し、高い相乗効果を示すことが確認された。
【００３７】
【表２】
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【図１】
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