(57)【要約】【課題】煩雑な操作を必要とせずに、生体試料中の核酸のように固形成分中に含まれている核酸中の核酸を、高精度で検出することができ、かつ再現性の高い方法の提供。【解決手段】核酸を検出する方法であって、（Ａ）核酸を含有する固形成分を含む核酸含有溶液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して反応液に添加する工程と、（Ｂ）前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して均一化処理を行った後に、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行い、核酸を検出する工程と、を有し、前記核酸含有溶液が、生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液とを混合して得られた懸濁液であることを特徴とする、核酸の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を検出する方法であって、
（Ａ）核酸を含有する固形成分を含む核酸含有溶液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して反応液に添加する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行い、核酸を検出する工程と、
を有することを特徴とする、核酸の検出方法。
【請求項２】
前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して均一化処理を行った後に、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行うことを特徴とする請求項１に記載の核酸の検出方法。
【請求項３】
前記工程（Ｂ）が、
（Ｂ’−１）前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、逆転写反応を行う工程と、
（Ｂ’−２）前記工程（Ｂ’−１）の後、前記反応液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して核酸増幅反応用反応液に添加する工程と、
（Ｂ’−３）前記工程（Ｂ’−２）において調製した核酸増幅反応用反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、核酸増幅反応を行い、核酸を検出する工程と、
であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の検出方法。
【請求項４】
前記工程（Ｂ’−１）において、前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して均一化処理を行った後に、逆転写反応を行い、
前記工程（Ｂ’−３）が、前記工程（Ｂ’−２）において調製した核酸増幅反応用反応液に対して均一化処理を行った後に、核酸増幅反応を行うことを特徴とする請求項３に記載の核酸の検出方法。
【請求項５】
前記核酸含有溶液が、生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液とを混合させた後に所定時間保存された懸濁液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項６】
前記核酸含有溶液が、生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液とを混合させた後に所定時間保存された懸濁液を希釈した懸濁液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項７】
前記核酸含有溶液が、
（ａ）生体試料を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液に混合させた後、得られた懸濁液を所定時間保存する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記懸濁液から固形成分を回収する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）により回収された固形成分に、ｐＨが２以上である酸性緩衝液又は前記核酸安定化剤溶液を添加して混合させて、懸濁液を調製する工程と、
により得られた懸濁液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項８】
前記核酸安定化剤溶液が、前記水溶性有機溶媒として、水溶性アルコール、ケトン類、及びアルデヒド類からなる群より選択される１種以上を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項９】
前記水溶性有機溶媒が、前記水溶性アルコールとして、エタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１種以上を含むことを特徴とする請求項８記載の核酸の検出方法。
【請求項１０】
前記水溶性有機溶媒が、前記ケトン類として、アセトン及び／又はメチルエチルケトンを含むことを特徴とする請求項８記載の核酸の検出方法。
【請求項１１】
前記核酸安定化剤溶液のｐＨが２〜６．５であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の生体試料中の核酸の検出方法。
【請求項１２】
前記核酸安定化剤溶液が、さらに、プロテアーゼ阻害剤及びポリカチオンからなる群より選択される１種以上を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、糞便、血液、又は尿であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１４】
前記固形成分中に含まれている哺乳細胞由来の核酸を検出することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸の検出方法。
【請求項１５】
前記哺乳細胞が、消化管細胞又は大腸剥離細胞であることを特徴とする請求項１４記載の核酸の検出方法。
【請求項１６】
前記哺乳細胞由来の核酸が、新生物性転化を示すマーカー又は炎症性消化器疾患を示すマーカーであることを特徴とする請求項１４又は１５記載の核酸の検出方法。
【請求項１７】
前記哺乳細胞由来の核酸が、Ｃｏｘ−２遺伝子由来核酸であることを特徴とする請求項１４又は１５記載の核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固形成分に含まれている核酸中の核酸を、十分な精度で簡便に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子解析技術の発展により、生体試料中の核酸を解析し、疾患の診断や治療等に役立てようとする試みがなされている。糞便や血液等の生体試料中の核酸を用いることにより、内視鏡検査等の他の臨床検査に比べて、より侵襲性が低く、患者への負担が小さい、という利点がある。また、核酸解析により、疾患に関連する遺伝子を直接検査するため、信頼性の高い結果が得られるという利点もある。例えば、糞便中や血液中のがん細胞の有無やがん細胞由来遺伝子の有無を調べることにより、がんの早期発見や進行の度合いを調べることができる。
【０００３】
糞便中に含まれている核酸を検出する方法としては、例えば特許文献１には、糞便を無処理のままＤＮＡ増幅法に供することにより、糞便中の目的核酸を検出する方法が開示されている。当該方法により、コレラ菌等の病原菌への感染の有無を簡便に調べることができる。しかしながら、糞便や血液等の生体試料には核酸以外にも多種多様な物質が含まれているため、核酸は非常に分解され易いという問題がある。このため、無処理のまま糞便を用いた場合には、ＤＮＡ増幅反応が行われる前に分解等により核酸が損なわれ、実際には生体試料中にがん細胞が含まれていたにも関わらず、がん細胞由来核酸が検出されず、擬陰性となる可能性が高い。よって、生体試料中に極微量にしか含まれていないがん細胞由来核酸を検出するためには、生体試料から検査に供する核酸含有試料を調製する際に、生体試料中の核酸の分解を防止し、検査操作時まで安定して保存し得るようにすることが重要である。
【０００４】
生体試料を核酸抽出前に安定して保存するための方法としては、例えば特許文献２には、生体試料を、試料中の蛋白質分解物質の蛋白質分解活性や核酸分解物質の核酸分解活性に必要な微量金属に結合する、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む組成物に暴露する方法が開示されている。当該方法では、生体試料を、キレート剤を含む組成物と混合させることにより、保存中の核酸の分解を抑制している。
【０００５】
また、生体試料中のＤＮＡの安定的な保管とＰＣＲ等に使用するための前処理とを同時に行う方法として、例えば、特許文献３には、生物学的サンプルを、アルカリ、グリコール、アルコール及びそれらの混合物を含む群から選択される有機溶媒を含む保管試薬とを混合して、約−８０℃〜約５０℃の範囲の温度で保管する方法が開示されている。当該方法では、グリコールやアルコールにより生体試料中のＤＮＡを安定化させると同時に、アルカリ処理により、生体試料を溶解させて、ＤＮＡを放出させる。つまり、当該方法では、ＤＮＡの保存と、生体試料からのＤＮＡ抽出とを同時に行っている。
【０００６】
一方で、生体試料から核酸を回収した場合には、元々生体試料中に含まれていた夾雑物（核酸以外の物質）のキャリーオーバー（持込）が多くなり、十分な純度の核酸を回収することが困難である場合が多い。生体試料から回収された核酸の純度が不十分である場合には、この回収された核酸を用いて検査・解析を行ったとしても、回収効率が悪い場合と同様、得られた結果の信頼性が低いという問題がある。そこで、糞便等の生体試料から核酸を抽出・精製する際に、生体試料中の阻害物質のキャリーオーバーを抑制するための方法も幾つか開示されている。例えば、特許文献４には、有機溶媒で被検試料を洗浄して核酸の酵素的増幅反応を阻害する物質を除去し、該被検試料中に含まれる細胞の核酸を酵素的に増幅させることを含む、核酸の酵素的増幅方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平５−１０３６７２号公報
【特許文献２】特開２００４−１５９６４８号公報
【特許文献３】特表２００８−５２６２２６号公報
【特許文献４】国際公開第００／０８１３６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記特許文献２に記載の実施例では、比較的夾雑物の少ない尿を生体試料としており、キレート剤を含む組成物により尿中の淋菌ＤＮＡを安定して保存し得ることが示されている。しかしながら、糞便のように夾雑物の多い生体試料では、キレート剤のみを有効成分とする組成物では、十分に核酸を安定化することは困難である。
【０００９】
また、特許文献３に記載の方法では、アルカリの保管試薬を用いて、保存と生体試料からの核酸抽出とを同時に行っており、保管試薬中に抽出された状態で核酸は保存される。つまり、アルカリ溶液中で核酸は保存されるため、保存期間中に核酸が分解され易いという問題がある。
【００１０】
一方、特許文献４に記載の方法では、阻害物質のキャリーオーバーを抑制するために、糞便等の生体試料を有機溶媒で洗浄する、という固液分離処理を行い、得られた沈殿の一部を逆転写反応等の反応に用いている。生体試料に含まれていた核酸の大部分は、沈殿中に含まれているものの、沈殿から単に適当な容量を分取して反応に用いた場合には、再現性に乏しく、得られた結果の信頼性に問題がある。
【００１１】
本発明は、煩雑な操作を必要とせずに、生体試料中の核酸のように固形成分中に含まれている核酸中の核酸を、高精度で検出することができ、かつ再現性の高い方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、核酸を含有する固形成分を鋳型として逆転写反応や核酸増幅反応を行う場合、当該固形成分を含む懸濁液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して反応液に添加し、さらに、反応前に、反応液に対して均一化処理を行うことにより、固形成分から核酸の抽出や精製を行うことなく、十分な精度で再現性良く反応を行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）核酸を検出する方法であって、
（Ａ）核酸を含有する固形成分を含む核酸含有溶液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して反応液に添加する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行い、核酸を検出する工程と、
を有することを特徴とする、核酸の検出方法、
（２）  前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して均一化処理を行った後に、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行うことを特徴とする前記（１）に記載の核酸の検出方法、
（３）  前記工程（Ｂ）が、
（Ｂ’−１）前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、逆転写反応を行う工程と、
（Ｂ’−２）前記工程（Ｂ’−１）の後、前記反応液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して核酸増幅反応用反応液に添加する工程と、
（Ｂ’−３）前記工程（Ｂ’−２）において調製した核酸増幅反応用反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、核酸増幅反応を行い、核酸を検出する工程と、
であることを特徴とする前記（１）に記載の核酸の検出方法、
（４）  前記工程（Ｂ’−１）において、前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して均一化処理を行った後に、逆転写反応を行い、
前記工程（Ｂ’−３）が、前記工程（Ｂ’−２）において調製した核酸増幅反応用反応液に対して均一化処理を行った後に、核酸増幅反応を行うことを特徴とする前記（３）に記載の核酸の検出方法、
（５）  前記核酸含有溶液が、生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液とを混合させた後に所定時間保存された懸濁液であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の核酸の検出方法、
（６）  前記核酸含有溶液が、生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液とを混合させた後に所定時間保存された懸濁液を希釈した懸濁液であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の核酸の検出方法、
（７）  前記核酸含有溶液が、
（ａ）生体試料を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液に混合させた後、得られた懸濁液を所定時間保存する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記懸濁液から固形成分を回収する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）により回収された固形成分に、ｐＨが２以上である酸性緩衝液又は前記核酸安定化剤溶液を添加して混合させて、懸濁液を調製する工程と、
により得られた懸濁液であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の核酸の検出方法、
（８）  前記核酸安定化剤溶液が、前記水溶性有機溶媒として、水溶性アルコール、ケトン類、及びアルデヒド類からなる群より選択される１種以上を含むことを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の核酸の検出方法、
（９）  前記水溶性有機溶媒が、前記水溶性アルコールとして、エタノール、プロパノール、及びメタノールからなる群より選ばれる１種以上を含むことを特徴とする前記（８）記載の核酸の検出方法、
（１０）  前記水溶性有機溶媒が、前記ケトン類として、アセトン及び／又はメチルエチルケトンを含むことを特徴とする前記（８）記載の核酸の検出方法、
（１１）  前記核酸安定化剤溶液のｐＨが２〜６．５であることを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の生体試料中の核酸の検出方法、
（１２）  前記核酸安定化剤溶液が、さらに、プロテアーゼ阻害剤及びポリカチオンからなる群より選択される１種以上を含むことを特徴とする前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の核酸の検出方法、
（１３）  前記生体試料が、糞便、血液、又は尿であることを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか一つに記載の核酸の検出方法、
（１４）  前記固形成分中に含まれている哺乳細胞由来の核酸を検出することを特徴とする前記（１）〜（１３）のいずれか一つに記載の核酸の検出方法、
（１５）  前記哺乳細胞が、消化管細胞又は大腸剥離細胞であることを特徴とする前記（１４）記載の核酸の検出方法、
（１６）  前記哺乳細胞由来の核酸が、新生物性転化を示すマーカー又は炎症性消化器疾患を示すマーカーであることを特徴とする前記（１４）又は（１５）記載の核酸の検出方法、
（１７）  前記哺乳細胞由来の核酸が、Ｃｏｘ−２遺伝子由来核酸であることを特徴とする前記（１４）又は（１５）記載の核酸の検出方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の核酸の検出方法により、生体試料中の核酸のように固形成分中に含まれている核酸中の核酸を、固形成分から核酸の抽出や精製を行うことなく、高精度かつ再現性よく検出することができる。本発明の核酸の検出方法は、特に、糞便等のような比較的夾雑物が多く含有されており、かつ核酸が損なわれ易い生体試料中の核酸の検出に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、ＭＤＲ１遺伝子の発現量の定量結果を示した図である。
【図２】実施例２において、β２Ｍ遺伝子の発現量の定量結果を示した図である。
【図３】実施例３において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の相対値を算出した結果を示した図である。
【図４】参考例１において、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の相対値を算出した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明及び本願明細書において、核酸増幅反応とは、ポリメラーゼ又はリガーゼによる塩基鎖の伸長反応を利用して核酸を増幅する反応を意味する。ポリメラーゼによる塩基鎖伸長反応としては、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リアルタイムＰＣＲ、ＳＤＡ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等が挙げられる。リガーゼによる塩基鎖伸長反応としては、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）等が挙げられる。
【００１７】
一般的に、逆転写反応や核酸増幅反応は、反応液の容量が２０μＬ程度と極微量であるため、反応液を調製する際には、全ての試薬を添加した後、添加した全ての試薬がきちんと混合されるように、軽く遠心分離処理を行う。これに対して、本発明者は、鋳型として固形成分中に含まれている核酸を用いる場合には、遠心分離処理を行うことにより、固形成分が反応容器の底に沈殿してしまい、十分な反応が進行しないことを見出した。特に、細胞等を水溶性有機溶媒で処理して得られた固形成分は沈殿を生じ易い。このため、遠心分離処理を低速で行った場合でも沈殿してしまう場合が多い。また、沈殿する固形成分量は反応液ごとに異なるため、再現性が低く、ばらつきの多い結果となる。
【００１８】
本発明の核酸の検出方法（以下、「本発明の核酸検出方法」ということがある。）は、本発明者によるこの新規な知見に基づいてなされた。すなわち、本発明の核酸検出方法は、核酸を検出する方法であって、下記工程（Ａ）〜（Ｂ）を有することを特徴とする。
（Ａ）核酸を含有する固形成分を含む核酸含有溶液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して反応液に添加する工程と、
（Ｂ）前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行い、核酸を検出する工程。
【００１９】
本発明の核酸検出方法では、核酸を含有する固形成分を直接反応液に添加し、当該固形成分中に含まれている核酸を鋳型として逆転写反応や核酸増幅反応を行う際に、当該固形成分が含まれる懸濁液を予め均一に分散させた状態で反応液に添加し、さらに、調製した反応液に対して遠心分離処理を行うことなく、当該反応液中の固形成分を分散させた状態で反応を開始する。均一に分散させた懸濁液を反応液に添加するだけではなく、反応に必要な全ての試薬を添加し終えた後、反応開始前に、遠心分離処理を行わずに反応を行うことにより、反応を十分に進行させることができ、核酸を精度よく検出することができる上に、再現性の高い結果を得ることができる。
【００２０】
本発明及び本願明細書において、核酸を含有する固形成分を含む核酸含有溶液とは、固形成分（不溶物）を含む懸濁液であって、当該固形成分中に核酸が含有されているものを意味する。なお、「固形成分に核酸が含有されている」とは、固形成分の内部に核酸が包含されているものと、固形成分の表面に核酸が結合しているもののいずれをも意味する。
【００２１】
生体試料に含まれる大部分の核酸は、細胞や組織内に包含されている。このため、細胞や組織片等の固形成分を含む生体試料は、核酸含有溶液として用いることができる。本発明の核酸検出方法に供される核酸含有溶液としては、核酸安定化剤を含む核酸安定化剤溶液と生体試料とを混合して得られる懸濁液であることが好ましい。核酸安定化剤溶液と混合することにより、予め生体試料中の核酸を安定化するため、生体試料中の核酸の分子学的プロファイリングに対する経時的な変化を最小限に抑えつつ、微生物や酵素等の夾雑物の多い生体試料中の核酸を精度よく検出することができる。
【００２２】
本発明の核酸検出方法に供される核酸含有溶液に含まれる生体試料としては、細胞や組織片等の不溶物（固形成分）を含む生体試料であれば、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、糞便、尿、血液、骨髄液、リンパ液、喀痰、唾液、精液、胆汁、膵液、腹水、滲出液、羊膜液、腸管洗浄液、肺洗浄液、気管支洗浄液、又は膀胱洗浄液等が挙げられる。その他、培養細胞等の培養物であってもよい。本発明の核酸検出方法に供される生体試料としては、特に、糞便、血液、尿、又は培養細胞等の培養物であることが好ましい。また、生体試料は、生物から採取されたものであれば特に限定されるものではないが、哺乳動物由来のものであることが好ましく、ヒト由来のものであることがより好ましい。例えば、定期健診や診断等のためにヒトから採取された生体試料であることが好ましいが、家畜や野生動物等の生体試料であってもよい。また、採取後一定期間保存されたものであってもよいが、採取直後のものであることが好ましい。生体試料が糞便である場合には、本発明の核酸検出方法に供される糞便は、排泄直後のものであることが好ましいが、排泄後時間を経たものであってもよい。
【００２３】
本発明及び本願明細書において、「核酸安定化剤」とは、核酸の分解や核酸鎖合成を阻害する作用効果を有する化合物を意味する。つまり、生体試料を核酸安定化剤と混合させることにより、生体試料中の核酸の分解等による損失を最小限に抑えることができ、かつ、新たに核酸鎖が合成されることも抑制することができる。
【００２４】
本発明において用いられる核酸安定化剤としては、水溶性有機溶媒、プロテアーゼ阻害剤、ポリカチオン、及び塩類からなる群より選択される１種以上であることが好ましい。例えば、水溶性有機溶媒又はその希釈液を核酸安定化剤溶液としてもよい。また、プロテアーゼ阻害剤若しくはポリカチオンを、水溶性有機溶媒若しくはその希釈液に溶解させたものを、核酸安定化剤溶液としてもよい。
【００２５】
本発明及び本願明細書において、水溶性有機溶媒とは、水に対する溶解度が高い又は水と任意の割合で混合可能な有機溶媒を意味する。糞便等の生体試料は、通常多量の水分を含有しており、このため、水に対する溶解度が高い溶媒や水と任意の割合で混合可能である溶媒である水溶性有機溶媒を核酸安定化剤溶液の有効成分として用いることにより、生体試料と核酸安定化剤溶液とを速やかに混合することができる。
【００２６】
水溶性有機溶媒が核酸安定化剤として機能し得る理由は明らかではないが、水溶性有機溶媒成分が有する脱水作用により、生体試料中に含まれている哺乳細胞や微生物等の細胞活性が顕著に低下するため、及び、水溶性有機溶媒成分が有するタンパク質変性作用により、生体試料中のプロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の各種分解酵素の活性が顕著に低下するために得られると推察される。
【００２７】
核酸安定化剤として用いられる水溶性有機溶媒としては、具体的には、アルコール類、ケトン類、又はアルデヒド類であって、直鎖構造を有し、室温付近、例えば１５〜４０℃において液状である溶媒を意味する。直鎖構造を有する水溶性有機溶媒を有効成分とすることにより、ベンゼン環等の環状構造を有する有機溶媒を有効成分とするよりも、生体試料との混合を素早く行うことができる。環状構造を有する有機溶媒は、一般的に水と分離しやすいため、例えば糞便等の生体試料と混合しにくく、高い核酸高回収効果を得ることは難しい。たとえ水にある程度溶解する溶媒であったとしても、糞便等の生体試料を均一に分散させるためには、激しく混合したり、加温する必要があることが多いためである。なお、核酸含有試料と環状構造を有する有機溶媒を混合しやすくするために、予め有機溶媒と水の混合溶液を作製した後、生体試料と該混合溶液を混合させることも考えられる。しかしながら、該混合溶液を作製するためには、環状構造を有する有機溶媒と水を激しく混合したり、加温する必要がある場合が多く好ましくない。
【００２８】
本発明において用いられる核酸安定化剤としては、水に対する溶解度が１２重量％以上の水溶性有機溶媒であることが好ましく、水に対する溶解度が２０重量％以上の水溶性有機溶媒であることがより好ましく、水に対する溶解度が９０重量％以上の水溶性有機溶媒であることがさらに好ましく、水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒であることが特に好ましい。水と任意の割合で混合可能である水溶性有機溶媒として、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、アセトン、ホルムアルデヒド等がある。
【００２９】
本発明において核酸安定化剤として用いられる水溶性有機溶媒は、上記定義を充足するものであって、核酸高回収効果を奏することができる溶媒であれば特に限定されるものではない。該水溶性有機溶媒として、例えば、アルコール類としては、水溶性アルコールであるメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、メルカプトエタノール等があり、ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン（水に対する溶解度９０重量％等があり、アルデヒド類としては、アセトアルデヒド(アセチルアルデヒド)、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）等がある。プロパノールは、ｎ−プロパノールであってもよく、２−プロパノールであってもよい。また、ブタノールは、１−ブタノール（水に対する溶解度２０重量％）であってもよく、２−ブタノール（水に対する溶解度１２．５重量％）であってもよい。本発明において用いられる水溶性有機溶媒としては、水溶性アルコール、アセトン、メチルエチルケトン、ホルムアルデヒドであることが好ましい。水に対する溶解度が十分に高いためである。入手容易性、取り扱い性、安全性等の点から、水溶性アルコールであることがより好ましく、エタノール、プロパノール、メタノールであることがさらに好ましい。特にエタノールは、最も安全性が高く、家庭内でも容易に扱うことが可能であるため、定期健診等のスクリーニング検査において特に有用である。
【００３０】
核酸安定化剤溶液中の水溶性有機溶媒の濃度は、核酸の安定化効果を奏することができる濃度であれば、特に限定されるものではなく、水溶性有機溶媒の種類等を考慮して、適宜決定することができる。核酸安定化剤溶液中の水溶性有機溶媒濃度が充分に高濃度であることにより、生体試料と核酸安定化剤溶液を混合した場合に、生体試料全体に水溶性有機溶媒成分が迅速に浸透し、上記効果を速やかに奏することができる。
【００３１】
例えば、水溶性アルコールやケトン類を用いる場合には、核酸安定化剤溶液中の水溶性有機溶媒濃度は３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５０〜８０％であることがさらに好ましく、６０〜７０％であることが特に好ましい。水溶性有機溶媒濃度が高い程、水分含量の多い糞便に対しても少量の核酸安定化剤溶液を用いることによって、充分な効果を得ることができる。
【００３２】
また、アセトン、メチルエチルケトンを用いる場合には、核酸安定化剤溶液中の水溶性有機溶媒濃度は３０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましい。その他、有効成分として、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサールを用いる場合には、核酸安定化剤溶液中の水溶性有機溶媒濃度は０．０１〜３０％であることが好ましく、０．０３〜１０％であることがより好ましく、３〜５％であることがさらに好ましい。アルデヒド類は、アルコール類やケトン類よりも低濃度においても、核酸高回収効果を奏することができる。
【００３３】
その他、本発明において用いられる核酸安定化剤溶液は、１種類の水溶性有機溶媒のみを含有していてもよく、２種類以上の水溶性有機溶媒の混合溶液であってもよい。例えば、２種類以上のアルコールの混合溶液であってもよく、アルコールと他種類の水溶性有機溶媒との混合溶液であってもよい。核酸安定化効果がより改善されるため、アルコールとアセトンの混合溶液であることも好ましい。
【００３４】
また、本発明においては、核酸安定化剤として、核酸分解に対する阻害剤ではなく、プロテアーゼ阻害剤を有効成分として用いることが好ましい。通常、生体試料中の核酸は、細胞内に含まれた状態で存在している。その後、生体試料中に含まれているプロテアーゼにより細胞膜のタンパク質等が分解される結果、細胞膜に生じた孔等から細胞外へと流出し、この細胞外へ流出した核酸等の細胞由来成分は、やはり生体試料中に多量に存在する核酸分解酵素等の働きにより分解されてしまう。そこで、本発明においては、核酸安定化剤としてプロテアーゼ阻害剤を用いることにより、生体試料中の細胞膜タンパク質の分解を効果的に抑制し、核酸等の細胞由来成分を、分解酵素等が比較的少量な細胞内に維持することにより、細胞由来成分の保存性を向上させることができる。
【００３５】
本発明において、核酸安定化剤として用いられるプロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ、ペプチド結合の加水分解を触媒し得る酵素）の酵素活性を阻害し得るものであれば、特に限定されるものではなく、プロテイナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）阻害剤であってもよく、ペプチダーゼ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）阻害剤であってもよい。また、セリンプロテアーゼを阻害し得るものであってもよく、システインプロテアーゼを阻害し得るものであってもよく、アスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）（ａｓｐａｔｒｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）を阻害し得るものであってもよく、金属プロテアーゼ（ｍｅｔａｌｌｏ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）を阻害し得るものであってもよい。
【００３６】
本発明において用いられるプロテアーゼ阻害剤としては、公知のプロテアーゼ阻害剤の中から適宜選択して用いることができる。本発明において用いられるプロテアーゼ阻害剤としては、例えば、ＡＥＢＳＦ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｂｅｓｔａｉｎ、Ｃａｌｐａｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｌ、Ｃａｌｐａｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＩＩ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、３，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｏｕｍａｉｎ、Ｅ−６４、Ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ＭＧ−１１５、ＭＧ−１３２、ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、ＰＭＳＦ、Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等が挙げられる。その他、一般に「プロテアーゼ阻害剤カクテル」と呼ばれる、複数種類のプロテアーゼ阻害剤を組合せたものを使用することもできる。
【００３７】
また、生体試料に添加される前述のプロテアーゼ阻害剤の濃度は、生体試料中のプロテアーゼを阻害するために十分な濃度であれば、特に限定されるものではなく、添加されるプロテアーゼ阻害剤の種類や、生体試料との混合比、生体試料と混合して調製された懸濁液のｐＨや温度等を考慮して適宜決定することができる。表１に、生体試料と混合して調製された懸濁液中における各プロテアーゼ阻害剤の好ましい濃度を記載する。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
本発明において用いられるプロテアーゼ阻害剤としては、上記のようなペプチド系プロテアーゼ阻害剤であってもよく、還元剤であってもよく、タンパク質変性剤であってもよく、キレート剤であってもよい。なお、本発明において、「ペプチド系プロテアーゼ阻害剤」とは、プロテアーゼと相互作用をすることにより、プロテアーゼ活性を阻害し得るペプチド、又はその修飾体を意味する。
【００４０】
キレート剤としてはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノフェニルエチレングリコール）エチレンジアミン四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トランスー１，２−ジアミノシクロヘキサンーエチレンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、１，３−ジアミノー２−ヒドロキシブロパンーエチレンジアミン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二プロバン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミン二メチレンホスホン酸１水和物（ＥＤＤＰＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミン四メチレンホスホン酸（ＥＤＴＰＯ）、Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、１，６−ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、１，２−ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロパン酸（ＮＴＰ）、ニトリロ三メチレンホスホン酸三ナトリウム塩（ＮＴＰＯ）、エチレンジアミン四（２−ピリジルメチル）（ＴＰＥＮ）、及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）等が挙げられる。
プロテアーゼ阻害剤として生体試料に添加されるキレート剤の濃度は、生体試料中のプロテアーゼを阻害するために十分な濃度であれば、特に限定されるものではなく、キレート剤の種類等を考慮して適宜決定することができる。好ましくは、生体試料と混合して調製された懸濁液中における最終濃度が０．１ｍＭ〜１Ｍとなるように、各キレート剤を添加する。
【００４１】
還元剤としては、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、βメルカプトエタノール等が挙げられる。
プロテアーゼ阻害剤として生体試料に添加される還元剤の濃度は、生体試料中のプロテアーゼを阻害するために十分な濃度であれば、特に限定されるものではなく、還元剤の種類等を考慮して適宜決定することができる。好ましくは、生体試料と混合して調製された懸濁液中における最終濃度が０．１ｍＭ〜１Ｍとなるように、各還元剤を添加する。
【００４２】
タンパク質変性剤としては、尿素、グアニン、グアニジン塩等が挙げられる。
プロテアーゼ阻害剤として生体試料に添加されるタンパク質変性剤の濃度は、生体試料中のプロテアーゼを阻害するために十分な濃度であれば、特に限定されるものではなく、タンパク質変性剤の種類等を考慮して適宜決定することができる。好ましくは、生体試料と混合して調製された懸濁液中における最終濃度が０．１ｍＭ〜１０Ｍとなるように、各タンパク質変性剤を添加する。
【００４３】
なお、核酸安定化剤としては、１種類のプロテアーゼ阻害剤のみを用いてもよく、２種類以上のプロテアーゼ阻害剤を用いてもよい。また、ＡＥＢＳＦ等のペプチド系のプロテアーゼ阻害剤を複数種類組み合わせて用いてもよく、ペプチド系プロテアーゼ阻害剤とキレート剤、ペプチド系プロテアーゼ阻害剤と還元剤のように、異なる種類のプロテアーゼ阻害剤を用いてもよい。
【００４４】
本発明においては、核酸安定化剤として、ポリカチオンを用いることも好ましい。生体試料をポリカチオンと混合させることにより、生体試料中に含まれている夾雑物による核酸分解・合成反応を効率よく低減させることができる。また、生体試料中には、核酸増幅反応等の核酸解析に用いられる反応を阻害する物質も多く含まれているが、生体試料をポリカチオンと混合させることにより、阻害物質による阻害作用を低減させることもできる。
【００４５】
なお、本願明細書において、阻害物質とは、核酸を基質とする酵素反応に対して阻害的に作用する物質を意味する。当該酵素反応としては、核酸を基質とする酵素反応であれば特に限定されるものではなく、例えば、逆転写反応や核酸増幅反応等の核酸解析において一般的に用いられる酵素反応等が挙げられる。該阻害物質としては、具体的には、胆汁酸、胆汁酸塩等が挙げられる。
【００４６】
本発明及び本願明細書において、ポリカチオンとは、陽イオン性官能基を含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩を意味する。陽イオンとしては、例えば、アミノ基等がある。具体的には、下記式（１）に示されるポリリジン等の側鎖に陽イオン性官能基を有するポリペプチドや、ポリアクリルアミド等の陽イオン性官能基を側鎖に含むモノマーを重合して得られるポリマー等が挙げられる。なお、これらのポリペプチドやポリマーは、分子全体として電気的に陽性であればよく、全ての繰り返し単位（アミノ酸やモノマー）の側鎖に陽イオン性官能基を有している必要はないが、全ての繰り返し単位の側鎖に陽イオン性官能基を有していることが好ましい。このようなポリカチオンとして、具体的には、ポリリジンやポリアクリルアミドに加えて、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリエチルアミン、ポリメタリルアミン、ポリビニルメチルイミダゾール、ポリビニルピリジン、ポリアルギニン、キトサン、１，５−ジメチル−１，５−ジアザウンデカメチレン−ポリメトブロマイド、ポリ（２−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート）、ポリ（２−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート）、ポリ（２−トリメチルアンモニウムエチル（メタ）アクリレート）、ポリジメチルアミノメチルスチレン、ポリトリメチルアンモニウムメチルスチレン、ポリオルニチン、及びポリヒスチジン等が挙げられる。本発明においては、ポリカチオンとして、ポリリジン又はポリアクリルアミドであることが好ましく、ポリリジンであることがより好ましい。なお、本発明において用いられる核酸安定化剤としては、１種類のポリカチオンのみを用いてもよく、２種類以上のポリカチオンを用いてもよい。
【００４７】
【化１】
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【００４８】
核酸安定化剤として生体試料に添加されるポリカチオンの濃度は、生体試料中に含まれている阻害物質による阻害作用を低減させる効果（阻害作用低減効果）が得られるために十分な濃度であれば、特に限定されるものではなく、ポリカチオンの種類や、核酸含有試料の種類、核酸安定化剤溶液のｐＨ、核酸安定化剤溶液と核酸含有試料との混合比等を考慮して適宜決定することができる。例えば、ポリカチオンとしてポリリジンを含有する場合には、核酸安定化剤溶液のポリリジン濃度は、０．０１〜１．０ｍ重量％であることが好ましく、０．０１２５〜０．８ｍ重量％であることがより好ましく、０．０５〜０．４ｍ重量％であることがさらに好ましい。なお、本願明細書中、「ｍ重量％」は「×１０−３重量％」を意味する。
【００４９】
さらに、核酸安定化剤としては、高塩濃度溶液を用いてもよい。高塩濃度溶液が核酸安定化剤として機能し得る理由は明らかではないが、塩析により各種分解酵素が析出してしまうため、高濃度の塩成分が有する脱水作用により、哺乳細胞や腸内常在菌等のバクテリアの細胞活性が顕著に低下して経時的な変化が抑制されるため、及び、最適塩濃度から外れたため、糞便中のプロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の各種分解酵素の活性が顕著に低下するためと推察される。
【００５０】
核酸安定化剤溶液に有効成分として含まれる塩としては、生体試料を調製又は解析する際に通常用いられている塩の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、塩酸塩であってもよく、硫酸塩であってもよく、酢酸塩であってもよい。また、有効成分としては、１種類の塩を用いてもよく、２種類以上の塩を組み合わせて用いてもよい。本発明において用いられる核酸安定化剤溶液としては、有効成分として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、重硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硫酸セシウム、硫酸カドミウム、硫酸セシウム鉄（ＩＩ）、硫酸クロム（ＩＩＩ）、硫酸コバルト（ＩＩ）、硫酸銅（ＩＩ）、塩化リチウム、酢酸リチウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫化ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、及び硫酸亜鉛からなる群より選択される１種以上を含むことが好ましい。中でも、入手容易性、取り扱い性、安全性等の点から、塩化ナトリウム及び／又は硫酸アンモニウムを含む溶液であることが好ましい。特に塩化ナトリウムは、最も安全性が高く、家庭内でも容易に扱うことが可能であるため、定期健診等のスクリーニング検査において特に有用である。
【００５１】
核酸安定化剤溶液中の有効成分として含まれる塩の濃度（以下、単に「塩濃度」ということがある。）は、核酸安定化剤として機能する濃度であれば特に限定されるものではなく、用いる塩や溶媒の種類等を考慮して、適宜決定することができる。なお、各塩において、塩濃度の上限値は飽和濃度である。一方、下限値は、用いる塩の種類により異なるものの、当業者であれば予め実験的に求めることが可能である。
【００５２】
例えば、下限値は以下のようにして求めることができる。まず、飽和濃度以下の複数の濃度の塩溶液を調製し、これらの塩溶液に所定期間浸漬させた糞便から核酸を回収する。
この回収された核酸量が、塩溶液未処理の糞便から回収された核酸量よりも多くなる場合の最低塩濃度値を、有効成分として含まれる塩の塩濃度の下限値とすることができる。また、例えば、生体試料として糞便を用いる場合には、糞便に代えて模擬糞便試料として、バクテリアの培養液や、哺乳細胞培養株の培養液とバクテリアの培養液との混合溶液を用いることもできる。
【００５３】
本発明においては、より高い核酸安定化効果を得るためには、塩の種類に関わらず、核酸安定化剤溶液の塩濃度は、有効成分とする塩の飽和濃度の１／２以上の濃度であることが好ましく、飽和濃度の４／５以上の濃度であることがより好ましく、飽和濃度に近いことがさらに好ましく、実質的に飽和濃度であることが特に好ましい。塩濃度が充分に高濃度であることにより、糞便を高塩濃度の核酸安定化剤溶液に混合した場合、糞便に成分が迅速に浸透し、核酸を速やかに安定化することができる。加えて、塩濃度が高い程、水分含量の多い糞便に対して少量の核酸安定化剤溶液を用いた場合であっても、充分な効果を奏することができる。なお、「飽和濃度の１／２倍以上の濃度の溶液」や「飽和濃度の４／５倍以上の濃度の溶液」は、例えば、常法により調製した飽和溶液を溶媒で適宜希釈することにより調製することができる。
【００５４】
例えば、有効成分として塩化ナトリウムを用いる場合には、塩濃度は１３％（ｗｔ／ｗｔ）以上であることが好ましく、２０％（ｗｔ／ｗｔ）以上であることがより好ましく、２６％（ｗｔ／ｗｔ）以上であることがさらに好ましく、２６％（ｗｔ／ｗｔ）から飽和濃度までの濃度であることが特に好ましい。硫酸アンモニウムを用いる場合には、塩濃度は２０％（ｗｔ／ｗｔ）以上であることが好ましく、３０％（ｗｔ／ｗｔ）以上であることがより好ましく、３０〜４６％（ｗｔ／ｗｔ）であることがさらに好ましい。
【００５５】
本発明において用いられる核酸安定化剤溶液は、核酸安定化剤を適当な溶媒で希釈することにより、所望の濃度に調整することができる。核酸安定化剤の希釈に用いる溶媒としては、核酸安定化剤による効果、すなわち、生体試料中の核酸の分解等を防止し、核酸を安定して保持する効果を損なわないものであれば、特に限定されるものではない。例えば、水であってもよく、ＰＢＳ等の緩衝液であってもよい。
【００５６】
本発明において用いられる核酸安定化剤溶液としては、核酸安定化剤、特に水溶性有機溶媒を、ｐＨが２〜７．５である緩衝液で希釈した溶液であることが好ましく、ｐＨが２以上の範囲内に維持されるような緩衝作用を有する酸性緩衝液で希釈した溶液であることがより好ましい。当該酸性緩衝液のｐＨは２〜６．５であることが好ましく、３〜６であることがより好ましく、３．５〜５．５であることがさらに好ましく、４．０〜５．０であることが特に好ましい。生体試料を酸性条件下で保持することにより、生体試料中の核酸の加水分解をより効果的に抑制することができる。
【００５７】
核酸安定化剤溶液の調製の際に、核酸安定化剤の希釈に用いられる酸性緩衝液としては、有機酸と当該有機酸の共役塩基とを含有するものであって、当該有機酸とその共役塩基とにより緩衝作用を奏するものであることが好ましい。中でも、クエン酸／水酸化ナトリウム緩衝系、乳酸／乳酸ナトリウム緩衝系、及び酢酸／酢酸ナトリウム緩衝系からなる群より選択される緩衝液であることが好ましい。このような緩衝液は、例えば、水や適当な溶媒に、有機酸と当該有機酸のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩とを添加することにより、所望のｐＨに調整することにより調製できる。その他、水や適当な溶媒に有機酸を添加した後に、アルカリ金属やアルカリ土類金属の水酸化物を用いてｐＨを調整してもよい。
【００５８】
その他、核酸安定化剤の希釈に用いられる酸性緩衝液としては、有機酸と鉱酸の双方を含む溶液であって、適当な緩衝作用を有するものであってもよい。例えば、グリシン／ＨＣｌ緩衝系、カコジル酸Ｎａ／ＨＣｌ緩衝系、又はフタル酸ＨＫ／ＨＣｌ緩衝系等の、酸性側で緩衝作用を有する緩衝系であってもよい。
【００５９】
なお、本発明及び本願明細書において、酸性緩衝液のｐＨは、ガラス電極法を測定原理としたｐＨメーター（例えば東亜ディーケーケー社製）を、フタル酸塩標準液と中性リン酸塩標準液によって校正した後に、測定して得られた値である。
【００６０】
本発明において用いられる核酸安定化剤溶液には、核酸安定化効果を損なわない限り、その他にも、例えば、カオトロピック塩、界面活性剤、着色剤等を添加してもよい。
【００６１】
核酸安定化剤溶液にカオトロピック塩や界面活性剤を添加することにより、生体試料中の細胞活性や各種分解酵素の酵素活性をより効果的に阻害することができる。核酸安定化剤溶液に添加させ得るカオトロピック塩として、例えば、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナトリウム等がある。核酸安定化剤溶液に添加させる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。該非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等がある。カオトロピック塩や界面活性剤の濃度は、核酸安定化効果が得られる濃度であれば、特に限定されるものではなく、生体試料量やその後の核酸回収・解析方法等を考慮して、適宜決定することができる。
【００６２】
核酸安定化剤溶液、若しくは生体試料と核酸安定化剤溶液を混合させて得られた懸濁液に着色剤を添加することにより、誤飲防止、生体試料の色が緩和される等の効果が得られる。該着色剤としては、食品添加物として使用される着色料であることが好ましく、青色や緑色等が好ましい。例えば、ファストグリーンＦＣＦ（緑色３号）、ブリリアントブルーＦＣＦ（青色１号）、インジゴカルミン（青色２号）等が挙げられる。また、複数の着色剤を混合して添加してもよく、単独で添加しても良い。
【００６３】
核酸安定化剤を含む核酸安定化剤溶液と生体試料とを混合して得られる懸濁液を、本発明の核酸検出方法に供される核酸含有溶液として用いる場合、核酸含有溶液に含まれる生体試料の量は特に限定されるものではなく、生体試料の種類、核酸の検出に用いる反応の種類等を考慮して、適宜決定することができる。例えば糞便の場合には、１０ｍｇ〜１ｇであることが好ましい。糞便量があまりに多くなってしまうと、採取作業に手間がかかり、採便容器も大きくなってしまうため、取り扱い性等が低下するおそれがある。逆に糞便量があまりに少量である場合には、糞便中に含まれる大腸剥離細胞等の哺乳細胞数が少なくなりすぎるため、必要な核酸量を回収できず、目的の核酸解析の精度が低下するおそれがある。また、糞便はヘテロジニアスである、つまり、多種多様な成分が不均一に存在しているため、哺乳細胞の局在の影響を避けるために、採糞時には、糞便の広範囲から採取することが好ましい。
【００６４】
糞便等の固形成分の多い生体試料である場合には、採取された生体試料と混合させる核酸安定化剤溶液の容量は、特に限定されるものではないが、生体試料と核酸安定化剤溶液との混合比率は、生体試料容量１に対して核酸安定化剤溶液容量が１以上であることが好ましい。生体試料と等量以上の核酸安定化剤溶液を用いることにより、生体試料の全表面を核酸安定化剤溶液に浸らせることができ、生体試料に水溶性有機溶媒等の有効成分を十分に作用させることが可能となるためである。特に、生体試料に対して、５倍以上の容量の核酸安定化剤溶液を混合させることにより、核酸安定化剤溶液中への生体試料の分散を迅速かつ効果的に行うことができ、さらに、生体試料に含有されている水分による水溶性有機溶媒等の有効成分の濃度の低下の影響を抑えることもできる。一方、生体試料と核酸安定化剤溶液との混合物の総量は比較的少量であるほうが、取り扱いが容易となって好ましい場合も多い。例えば、糞便を用いる場合には、予め核酸安定化剤溶液を備えた採便容器に糞便を採取し、当該容器内で混合物を調製することができるが、この場合に、例えば、糞便と核酸安定化剤溶液が等量である場合には、核酸安定化剤溶液入り採便容器の軽量化・小型化が可能となる。このように、生体試料及び得られる懸濁液の取り扱い性と、生体試料の核酸安定化剤溶液への分散性とを、バランス良く向上させることが可能となるため、生体試料が糞便である場合には、生体試料と核酸安定化剤溶液の混合比率が、１：１〜１：２０であることがより好ましく、１：３〜１：１０であることがさらに好ましく１：５程度であることがより好ましい。
【００６５】
生体試料と核酸安定化剤溶液との混合は、生体試料を核酸安定化剤溶液に浸漬させ、特段の攪拌操作を行わないものであってもよい。特に、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液は、水分含有量の多い糞便等の生体試料に対しても非常に馴染みやすいため、混合する生体試料の量や状態によっては、単に核酸安定化剤溶液に浸漬させて特段の攪拌操作を行わない場合であっても、生体試料中に十分に浸透し、十分な核酸安定化効果が奏されるためである。
【００６６】
生体試料と核酸安定化剤溶液との混合は、生体試料を核酸安定化剤溶液に投入して浸漬させた後に攪拌してもよい。攪拌することにより、生体試料を十分に核酸安定化剤溶液に分散させ、懸濁させることができる。生体試料を投入した核酸安定化剤溶液を攪拌して懸濁液を調製する場合には、該攪拌は、速やかに行われることが好ましい。生体試料を速やかに核酸安定化剤溶液中に分散させることにより、迅速に、生体試料中の細胞に水溶性有機溶媒等の有効成分を浸透させたり、生体試料中の夾雑物に対し水溶性有機溶媒等を作用させることができ、より優れた核酸安定化効果が得られるためである。
【００６７】
なお、生体試料と核酸安定化剤溶液を混合し懸濁液を調製する方法は、物理的手法により混合する方法であれば、特に限定されるものではない。例えば、予め核酸安定化剤溶液を入れておいた密閉可能な容器に、採取された生体試料を投入して密閉した後、該容器を上下に転倒させることにより、混合してもよく、該容器をボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよい。また、生体試料と核酸安定化剤溶液を、混合用粒子の存在下で混合してもよい。速やかに混合させることができるため、振とう機を用いる方法や、混合用粒子を用いる方法であることが好ましい。特に、予め混合用粒子を含有させた採取用容器を用いることにより、家庭等の特殊な装置のない環境においても迅速に混合することができる。
【００６８】
混合用粒子としては、核酸安定化剤溶液による核酸安定化効果を損なわない組成物であって、糞便等の生体試料にぶつかることにより、生体試料を迅速に核酸安定化剤溶液中に分散させ得る硬度や比重を有する粒子であれば、特に限定されるものではなく、１種類の材質からなる粒子であってもよく、２種類以上の材質からなる粒子であってもよい。このような混合用粒子として、例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス、金属等からなる粒子がある。その他、混合用粒子は、磁性粒子であってもよく、非磁性粒子であってもよい。
【００６９】
本発明の核酸検出方法に供される核酸含有溶液としては、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液と生体試料とを混合して得られる懸濁液であることが好ましい。糞便等のように阻害物質を多く含む生体試料の場合、固形成分（不溶物）と共に大量の阻害物質が反応系に持ち込まれてしまう。このため、逆転写反応や核酸増幅反応において、糞便等由来の固形成分が反応系に存在していると、反応が阻害され、信頼できる結果が得られ難い。これに対して、核酸安定化剤として水溶性有機溶媒を用いた場合には、糞便等の比較的阻害物質が多く含まれている生体試料中に含まれている核酸を、固形成分から抽出・精製することなく、核酸安定化剤溶液に懸濁させた状態で反応液に添加しても、生体試料から抽出・精製された核酸と同様に、逆転写反応や核酸増幅反応によって所望の反応産物を良好に得ることができる
【００７０】
生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸含有溶液との懸濁液を核酸含有溶液とした場合に、本発明の核酸検出方法において、生体試料から抽出・精製することなく、逆転写反応や核酸増幅反応により生体試料中の核酸を精度よく検出し得る理由は明らかではないが、水溶性有機溶媒の核酸安定化効果と阻害物質溶出効果によると推察される。水溶性有機溶媒の核酸安定化効果により、核酸安定化剤溶液と生体試料とからなる懸濁液を長時間保存した場合でも、当該懸濁液中の核酸を安定して保存することができる。そして、水溶性有機溶媒を含む核酸安定化剤溶液に生体試料を所定の時間浸漬させることにより、生体試料中の固形成分から阻害物質を溶出させることができる。よって、生体試料を十分量の核酸安定化剤溶液と混合させることにより、核酸が存在する固形成分自体に含まれる阻害物質量を、逆転写反応等の反応に影響を及ぼさない程度にまで低減させた懸濁液を調製することができる。これにより、固形成分を含んだ状態の懸濁液を反応液に添加した場合に、固形成分から過剰な阻害物質が持ち込まれることを防止することができ、核酸を精度よく検出することができる。
【００７１】
水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液と生体試料との混合により得られた懸濁液は、逆転写反応等に供される前に、所定時間保存されていることが好ましい。懸濁液を保存することにより、生体試料を十分に水溶性有機溶媒に暴露することができ、高い核酸安定化効果を得ることができる。と同時に、生体試料を核酸安定化剤溶液に混合させた状態で所定時間保存することにより、生体試料に含まれていた阻害物質を、核酸安定化剤溶液に効率よく溶出することができる。
【００７２】
水溶性有機溶媒によるこのような阻害物質溶出効果は、水溶性有機溶媒に対する阻害物質と核酸の溶解性の差によるものと推察される。すなわち、胆汁酸等の阻害物質は、アルコール等の水溶性有機溶媒には溶解しやすいが、非極性有機溶媒に溶けにくい。一方、核酸はアルコール中では塩の効果で不溶化し、アルコール等の水溶性有機溶媒には溶解しにくい。したがって、糞便等の生体試料をアルコール等の水溶性有機溶媒に混合させると、阻害物質を水溶性有機溶媒中に溶出させ、水溶性有機溶媒成分に不溶な核酸との分離が可能となると推察される。
【００７３】
懸濁液を保存する時間は、核酸安定化効果及び阻害物質溶出効果を奏し得る時間であれば、特に限定されるものではなく、水溶性有機溶媒の種類や濃度、生体試料と核酸安定化剤溶液との混合比、保存温度等を考慮して適宜決定することができる。本発明の核酸検出方法においては、１時間以上保存することが好ましく、１２時間以上保存することがより好ましく、２４時間以上保存することがさらに好ましく、７２時間以上保存することが特に好ましい。また、１６８時間以上保存してもよい。
【００７４】
水溶性有機溶媒による核酸安定化効果及び阻害物質溶出効果は、懸濁液中に充分量の水溶性有機溶媒が存在する限り、特に温度条件に影響を受けるものではない。したがって、懸濁液の調製を、糞便等の生体試料の採取が通常行われる温度、すなわち、室温において行う場合であっても、生体試料中の核酸の損失を抑えることができる。但し、該懸濁液の保存は、５０℃以下で行うことが好ましい。高温条件下で長期間保存することにより、揮発等により、該混合物中の水溶性有機溶媒の濃度が、効果を奏するに充分な濃度よりも低下するおそれがあるためである。
【００７５】
水溶性有機溶媒による阻害物質溶出効果は、生体試料を保存する温度が低温の場合よりもむしろ温度が高いほうが高い効果が得られる。具体的には、懸濁液の保存温度は、４℃以上であることが好ましく、２０℃以上であることがより好ましい。
【００７６】
懸濁液の保存温度は、４℃以上であれば核酸安定化効果及び阻害物質溶出効果を奏し得る。すなわち、懸濁液の保存は、恒温装置等を用いて温度制御された環境下で行ってもよいが、温度制御された特別な環境を必要とせず、室温で行ってもよい。また、通常糞便の採取や糞便試料の輸送等が行われる温度で行うこともできる。したがって、例えば、生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液とを混合して得られた懸濁液を、温度非制御下で輸送する場合には、この輸送期間を保存期間とすることができる。より具体的には、定期健診等の場合のように、採便者が糞便試料を調製する場所と核酸検出操作を行う場所とが離れており、調製された懸濁液が核酸検出操作を行う場所に輸送される場合に、輸送時の温度が４〜５０℃であれば、温度制御の有無にかかわらず、この輸送時間を懸濁液の保存時間とすることができる。
【００７７】
なお、生体試料と水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液との混合比によっては、得られた懸濁液の阻害物質濃度が高く、当該懸濁液をそのまま反応液に添加した場合には、持ち込まれた阻害物質が逆転写反応や核酸増幅反応に影響を及ぼしてしまう場合がある。また、用いる核酸安定化剤の種類によっては、当該懸濁液をそのまま反応液に添加した場合には、持ち込まれた核酸安定化剤の濃度が高くなりすぎ、やはり反応に影響を及ぼしてしまうおそれがある。これらの場合には、生体試料と核酸安定化剤溶液との懸濁液を希釈した後、得られた希釈後の懸濁液を、工程（Ａ）における核酸含有溶液として用いることができる。
【００７８】
懸濁液の希釈倍率は、逆転写反応又は核酸増幅反応の反応液に添加した際に、持ち込まれた阻害物質が反応に影響しない程度にまで、希釈後の懸濁液の阻害物質の濃度を低減できる範囲内の希釈倍率であれば、特に限定されるものではなく、生体試料の種類や阻害物質の含有量、水溶性有機溶媒の種類、生体試料と核酸安定化剤溶液との混合比等を考慮して、適宜決定することができる。
【００７９】
希釈するために懸濁液に添加される溶媒としては、水溶性有機溶媒による核酸安定化効果及び阻害物質溶出効果を損なわないものであれば、特に限定されるものではない。具体的には、核酸安定化剤溶液の調製において、水溶性有機溶媒の希釈に用いられる溶媒として挙げられたものを挙げることができる。また、核酸安定化剤溶液を用いてもよい。本発明においては、懸濁液に、ｐＨが２以上である酸性緩衝液、核酸安定化剤溶液、又は精製水を添加することにより希釈することが好ましい。
【００８０】
その他、懸濁液中の固形成分を一度洗浄した後に、新たに適当な溶媒を加えて調製された懸濁液を、工程（Ａ）における核酸含有溶液として用いてもよい。具体的には、下記工程（ａ）〜（ｃ）により得られた懸濁液を、核酸含有溶液とする。
（ａ）生体試料を、水溶性有機溶媒を有効成分とする核酸安定化剤溶液に混合させた後、得られた懸濁液を所定時間保存する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の後、前記懸濁液から固形成分を回収する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）により回収された固形成分に、ｐＨが２以上である酸性緩衝液又は前記核酸安定化剤溶液を添加して混合させて、懸濁液を調製する工程。
【００８１】
上記工程（ｂ）における固形成分の回収方法は、特に限定されるものではなく、懸濁液から固形成分を回収する際に用いられる公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、懸濁液を遠心分離処理し、上清を除去し、沈殿物を回収してもよく、適当な孔径のフィルターを用いてフィルター濾過を行い、フィルター面上に残留した固形成分を回収してもよい。
【００８２】
フィルター濾過に用いられるフィルターの孔径は、液状成分のみを透過可能な大きさであれば特に限定されるものではなく、当該分野で汎用されている孔径のフィルターから適宜選択して用いることができる。例えば、糞便や血液等の固形成分が比較的多い生体試料を用いた場合には、あまりに孔径の小さいフィルターを用いた場合には目詰まりが生じ易いため、比較的孔径の大きいフィルターを用いることが好ましい。
【００８３】
なお、工程（ｃ）において用いられるｐＨが２以上である酸性緩衝液としては、具体的には、核酸安定化剤溶液の調製において用いられる酸性緩衝液と同じものを用いることができる。
【００８４】
以下、本発明の核酸検出方法を、工程ごとに説明する。
まず、工程（Ａ）として、核酸を含有する固形成分を含む核酸含有溶液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して反応液に添加する。核酸含有溶液中の固形成分を均一に分散させた状態で分取することにより、核酸含有溶液中の固形成分のうち、核酸含有溶液全量に対する分取量の割合に相当する量の固形成分が反応液に添加される。つまり、分取量が等しい場合には、反応液に持ち込まれる固形成分量も等しくなる。このように、核酸含有溶液から反応液に添加される固形成分量（すなわち、核酸量）のばらつきが抑制されるため、より再現性・信頼性に優れた検出結果を得ることができる。
【００８５】
核酸含有溶液の固形成分を均一に分散させる方法としては、懸濁液中の固形成分を十分に分散させることができる処理であれば、特に限定されるものではなく、例えば、ボルテックス等を用いた攪拌操作や、ピペット等を用いたピペッティング操作等の公知の均一化処理のいずれを用いて行ってもよい。
【００８６】
逆転写反応又は核酸増幅反応の反応液に添加される核酸含有溶液の量は、核酸含有溶液から核酸と共に持ち込まれる阻害物質や水溶性有機溶媒等の核酸安定化剤が、それぞれの反応に与える影響が無視し得る程度にまで抑えられる範囲内となるように、適宜設定することができる。例えば、核酸安定化剤溶液の水溶性有機溶媒としてエタノール等のアルコールやアセトン等のケトン類を用いている場合には、反応液中のアルコール濃度やケトン類濃度が１％以下となるように、反応液に添加する核酸含有溶液の量を調整することが好ましい。アルコールとケトン類の両方を用いている場合には、反応液中のアルコールとケトン類を合計した濃度が１％以下となるように、反応液に添加する核酸含有溶液の量を調整することが好ましい。また、水溶性有機溶媒としてホルムアルデヒド等のアルデヒド類を用いている場合には、反応液中のアルデヒド類濃度が０．０１％以下となるように、反応液に添加する核酸含有溶液の量を調整することが好ましい。
【００８７】
次いで、工程（Ｂ）として、工程（Ａ）において調製した反応液に対して遠心分離処理を行わずに、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行い、核酸を検出する。遠心分離処理を行わないことにより、固形成分の沈殿を抑制し、固形成分が反応液中で分散された状態で反応を行うことができる。
【００８８】
特に、水溶性有機溶媒等の核酸安定化剤溶液と混合した場合、生体試料由来の固形成分は沈殿し易い傾向がある。このため、工程（Ａ）において調製した反応液に対して均一化処理を行った後に、逆転写反応及び／又は核酸増幅反応を行うことが好ましい。反応開始前に、反応液に対して均一化処理を行うことにより、反応液中の固形成分をより均一に分散させた状態で反応を開始することができる。均一化処理としては、反応液中の固形成分を十分に分散させることができる処理であれば、特に限定されるものではなく、核酸含有溶液の固形成分を均一に分散させる方法で挙げられたものと同様の方法で行うことができる。
【００８９】
生体試料を核酸安定化剤溶液に混合して得られた核酸含有溶液中には、ＤＮＡとＲＮＡの両方が含まれ得る。例えば、核酸含有溶液中のＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことにより、標的の核酸を検出することができる。同様に、核酸含有溶液中のＲＮＡを鋳型として、ＮＡＳＢＡ等の核酸増幅反応を行うことにより、標的の核酸を検出することもできる。また、核酸含有溶液中のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行った後、得られたｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を行うことにより、標的の核酸を検出することができる。なお、逆転写反応及び核酸増幅反応は、当該分野において公知の方法により行うことができる。
【００９０】
核酸含有溶液中のＤＮＡを検出対象とする場合には、例えば、核酸増幅反応を利用して、ＤＮＡ上の変異解析やエピジェネティック変化解析を行うことができる。変異解析としては、例えば、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位の解析等が挙げられる。また、エピジェネティック変化解析としては、例えば、メチル化や脱メチル化の解析等が挙げられる。また、マイクロサテライトを含む塩基配列領域等の遺伝的変異の有無を検出することにより、がんの発症の有無を調べることができる。一方、核酸含有溶液中のＲＮＡを検出対象とする場合には、例えば、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異を検出することができる。その他、機能性ＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）解析、例えば、転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ、ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）等の解析を行うことができる。その他、ＲＮＡ発現量を検出し解析することもできる。特に、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析等を行うことが好ましい。なお、これらの解析は、当該分野において公知の方法により行うことができる。
【００９１】
逆転写反応により得られたｃＤＮＡを、核酸増幅反応以外の公知の核酸解析法に供することによって、標的の核酸を検出してもよい。具体的には、前記工程（Ｂ）に代えて、下記工程（Ｂ’−１）〜（Ｂ’−３）を行う。
（Ｂ’−１）前記工程（Ａ）において調製した反応液に対して遠心分離処理を行わずに、逆転写反応を行う工程と、
（Ｂ’−２）前記工程（Ｂ’−１）の後、前記反応液の一部を、固形成分を均一に分散させた状態で分取して核酸増幅反応用反応液に添加する工程と、
（Ｂ’−３）前記工程（Ｂ’−２）において調製した核酸増幅反応用反応液に対して遠心分離処理を行わずに、核酸増幅反応を行い、核酸を検出する工程。
【００９２】
つまり、反応液中の固形成分を分散させた状態で逆転写反応を開始し、逆転写反応後にも反応液を均一に分散させた状態でその一部を分取して核酸増幅反応用反応液に添加し、当該核酸増幅反応用反応液を分散させた状態で核酸増幅反応を行う。このように、一連の工程において、反応系中の固形成分の沈殿を抑制することにより、反応ごとのばらつきが抑制され、より再現性・信頼性に優れた検出結果を得ることができる。
【００９３】
また、逆転写反応前の反応液と核酸増幅反応開始前の反応液に対して、均一化処理を行った後に、各反応を開始することが好ましい。均一化処理としては、反応液中の固形成分を十分に分散させることができ、かつ、反応液中の酵素等の活性を阻害しない処理であれば、特に限定されるものではなく、例えば、ボルテックス等を用いた攪拌操作や、ピペット等を用いたピペッティング操作等の公知の均一化処理のいずれを用いて行ってもよい。
【００９４】
本発明の核酸検出方法では、目的に応じて、生体試料中に含まれているいずれの生物種由来の核酸を検出してもよいが、哺乳細胞由来の核酸を検出することが好ましい。また、生体試料として糞便を用いた場合には、当該糞便を排泄した哺乳動物の消化管細胞や大腸剥離細胞由来の核酸を検出することが好ましい。
【００９５】
本発明の核酸検出方法では、特に、新生物性転化を示すマーカーや炎症性消化器疾患を示すマーカーを検出することが好ましい。該新生物性転化を示すマーカーとして、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）等の公知のがんマーカーや、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無等がある。また、ｐ１６、ｈＭＬＨＩ、ＭＧＭＴ、ｐ１４、ＡＰＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＳＲ１、ＳＦＲＰ２等の遺伝子のメチル化の検出も、大腸疾患の診断マーカーとして有用である（例えば、Lind et al.、「A CpG island hypermethylation profile of primary colorectal carcinomas and colon cancer cell lines」、Molecular Cancer、２００４年、第３巻第２８章参照。）。その他、糞便試料中のヘリコバクターピロリ菌由来のＤＮＡが、胃がんマーカーとして用いられ得ることが既に報告されている（例えばNilsson et al.、Journal of Clinical Microbiology、２００４年、第４２巻第８号、第３７８１〜８ページ参照。）。一方、炎症性消化器疾患を示すマーカーとして、例えば、Ｃｏｘ−２遺伝子由来核酸等がある。なお、Ｃｏｘ−２遺伝子由来核酸は、新生物性転化を示すマーカーとしても用いられる。例えば、本発明の核酸検出方法を用いることにより、生体試料として糞便を用い、工程（Ｃ）における核酸の検出でＣｏｘ−２遺伝子由来核酸を検出することができる。こうして得られた検出結果は、大腸癌の検出に利用することができる。
【実施例】
【００９６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に記載が無い場合には、「％」は「体積％」を意味する。また、培養細胞であるＣａｃｏ−２細胞及びＨｅＬａ細胞は、常法により培養した。
【００９７】
［実施例１］
大腸がん患者擬似糞便を生体試料とし、本発明の核酸検出方法により、大腸がん患者擬似糞便中に含まれるＭＤＲ１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ１）遺伝子に由来する核酸を検出した。
健常人の糞便０．５ｇに対し、ＭＤＲ１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ１）遺伝子を高発現しているヒト大腸がん由来培養細胞Ｃａｃｏ−２細胞を５．０×１０５  ｃｅｌｌｓ混合させたものを、大腸がん患者擬似糞便とした。
また、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝系の緩衝液によって酸性に調整された７０％エタノール溶液（ｐＨ５．０）を、核酸安定化剤溶液として用いた。
【００９８】
具体的には、該大腸がん患者擬似糞便を、１５ｍＬのポリプロピレンチューブ２本にそれぞれ０．５ｇずつ分取し、１０ｍＬの核酸安定化剤溶液をそれぞれ混合して懸濁液を調製した。調製した懸濁液を、室温（２５℃）の恒温インキュベータにおいて３日間保存した。当該懸濁液を、工程（Ａ）において用いる核酸含有溶液とした。
保存後、２本のポリプロピレンチューブのうちの１本の中の懸濁液に対して下記調整法１により逆転写反応の鋳型溶液（ＲＴ鋳型溶液）を調製し、残る１本の中の懸濁液に対して下記調整法２によりＲＴ鋳型溶液を調製した。つまり、いずれの調整法によっても、糞便試料からＲＮＡを抽出・精製することなく、ＲＴ鋳型溶液を調製した。
【００９９】
調製法１：
懸濁液を、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離処理し、上清の大部分を除去した。その後、沈殿を含む懸濁物から１μＬを１０回分取し、それぞれをＲＴ鋳型溶液とした。
調製法２：
遠心分離処理を行うことなく、懸濁液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化された懸濁液から１μＬを１０回分取し、それぞれをＲＴ鋳型溶液とした。
【０１００】
２種類の調製法から得られた計２０のＲＴ鋳型溶液をそれぞれ鋳型としてＲＴ反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＭＤＲ１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの検出を試みた。
ＲＴ反応は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）を用いて、ＲＴ鋳型溶液１μＬをｃＤＮＡに逆転写した。具体的には、表２に示す組成のＲＴ反応液を調製し、２５℃で１０分間、次いで４２℃で５０分間、さらに７０℃で１５分間の熱処理を行い、ＲＴ反応を行った。
【０１０１】
【表２】
2011250758.tif 000004
【０１０２】
ＲＴ反応後の溶液２０μＬ中１μＬをリアルタイムＰＣＲの鋳型とし、ヒトＭＤＲ１遺伝子の検出を行った。ＰＣＲのプライマーとして、アプライドバイオシステム社製のＭＤＲ１プライマープローブＭＩＸ（カタログＮｏ：Ｈｓ００１８４５００＿ｍ１）を用いた。具体的には、０．２ｍＬの９６ウェルＰＣＲプレートに、得られたｃＤＮＡを１μＬずつそれぞれ分取した。その後、各ウェルに８μＬの超純水と１０μＬの核酸増幅（塩基鎖伸長）試薬「ＴａｑＭａｎ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（アプライドバイオシステム社製）を添加し、さらに、１μＬのＭＤＲ１プライマープローブＭＩＸ（アプライドバイオシステム社製）をそれぞれ添加して混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。該ＰＣＲプレートを、ＡＢＩリアルタイムＰＣＲ装置に設置し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１５秒、６０℃で１分間の熱サイクルを４０サイクル行い、サイクルごとに蛍光強度を計測しながらＰＣＲを行った。蛍光強度の計測結果を分析して、各糞便試料中のＭＤＲ１遺伝子の発現量を定量した。なお、発現量決定のための検量線にはＭＤＲ１プラスミドを用いた。
【０１０３】
【表３】
2011250758.tif 000005
【０１０４】
ＭＤＲ１遺伝子の発現量の定量結果を表３及び図１に示す。調製法１により調製されたＲＴ鋳型溶液を用いた場合には、発現量の平均値は高いもののばらつきが非常に大きく、安定した結果は得られなかった。これに対して、調製法２により調製されたＲＴ鋳型溶液を用いた場合には、発現量のばらつきが小さく、精度の高いデータを得ることができた。これは、調製法１では遠心後の沈殿を鋳型として用いているため、遠心による濃縮で鋳型の量は調整法２よりも多くなるが、沈澱が不均一なために発現量が安定して得られなかったと考えられる。調製法２では、均一に分散させた後の懸濁液を鋳型として用いているため、均一な結果が得られたと考えられる。
遺伝子検査に限らず、臨床検査では再現性が重要である。調整法１では結果のばらつきが大きいため、場合によって検査結果の誤判定を招いてしまう。よって、調整法２のような、すなわち、本発明の核酸検出方法で用いているように、再現性の高い調製方法が有用であると考えられる。
【０１０５】
［実施例２］
生体試料と核酸安定化剤溶液とを混合して得られた懸濁液をＲＴ反応に鋳型として用いる場合に、当該懸濁液の分散状態が、ＲＴ反応やその後の核酸増幅反応に与える影響について調べた。
１５ｍＬのポリプロピレンチューブ３本に、実施例１と同様にして、大腸がん患者擬似糞便を酢酸／酢酸ナトリウム緩衝系の緩衝液によって酸性に調整された７０％エタノール溶液（ｐＨ５．０）とを混合して調製した懸濁液を室温（２５℃）の恒温インキュベータにおいて３日間保存した。
保存後、３本のポリプロピレンチューブのうちの１本の中の懸濁液に対して、ボルテックスで３０秒間混合した後、均一化された懸濁液から１μＬを１０回分取し、それぞれをＲＴ鋳型溶液（均一化処理後）とした。
残る２本のポリプロピレンチューブのうちの１本の中の懸濁液に対して、２０００×ｒｐｍで１０秒間遠心分離処理（フラッシングの遠心分離処理）した後、上清から１μＬを１０回分取し、それぞれをＲＴ鋳型溶液（弱遠心処理後）とした。
残る１本のポリプロピレンチューブ中の懸濁液に対して、８０００×ｒｐｍで５分間遠心分離処理した後、上清から１μＬを１０回分取し、それぞれをＲＴ鋳型溶液（遠心処理後）とした。
【０１０６】
３種類の調製法から得られた計３０のＲＴ鋳型溶液をそれぞれ鋳型として、実施例１と同様に、表２に示す組成のＲＴ反応液を調製した。その後、各ＲＴ反応液に対してボルテックス処理を３０秒間行い、均一に分散させた後、２５℃で１０分間、次いで４２℃で５０分間、さらに７０℃で１５分間の熱処理を行い、ＲＴ反応を行った。
【０１０７】
ＲＴ反応後の溶液２０μＬ中１μＬをリアルタイムＰＣＲの鋳型とし、ヒトβ２Ｍ遺伝子の検出を行った。具体的には、ＰＣＲのプライマーとして、アプライドバイオシステム社製のβ２ＭプライマープローブＭＩＸ（カタログＮｏ：４３２６３１９Ｅ）を用いた以外は、実施例１と同様にして、ＰＣＲ反応溶液を調製し、サイクルごとに蛍光強度を計測しながらＰＣＲを行った。蛍光強度の計測結果を分析して、各糞便試料中のβ２Ｍ遺伝子の発現量を定量した。なお、発現量決定のための検量線にはβ２Ｍプラスミドを用いた。
【０１０８】
β２Ｍ遺伝子の発現量の定量結果を図２に示す。この結果、ＲＴ鋳型溶液（弱遠心処理後）を用いてＲＴ反応及びＰＣＲを行った場合には、ＲＴ鋳型溶液（均一化処理後）を用いた場合よりも明らかにβ２Ｍ遺伝子の発現量が低かった。また、ＲＴ鋳型溶液（遠心処理後）を用いた場合には、β２Ｍ遺伝子の発現が確認できなかった。これらの結果から、標的の核酸を精度よく検出するためには、核酸含有溶液を鋳型として反応液に添加する際には、遠心分離処理を行わず、固形成分を分散させた状態で分取することが重要であることが明らかである。特に、水溶性有機溶媒で安定化された細胞は沈殿し易いため、効率よく核酸を検出するためには、十分に分散させた状態で分取することが重要である。
【０１０９】
［実施例３］
逆転写反応及びその後に続く核酸増幅反応の一連の工程において、遠心分離処理が結果に与える影響、特に検出される発現量とデータのばらつきに与える影響を調べた。核酸含有溶液として、常法により培養したＨｅＬａ細胞を回収した後、ＰＢＳに希釈して得られたＨｅＬａ細胞懸濁液を用いた。なお、ＨｅＬａ細胞懸濁液は、１ｍＬを予め１．５ｍＬファルコンチューブに分取しておいた。このＨｅＬａ細胞懸濁液１μＬを、ＲＴ鋳型溶液として用いた。
反応の各段階でフラッシングの遠心分離処理がある場合とない場合とで条件を変えた５種類の方法により、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の検出を行った。ＲＴ反応は、ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。具体的には、０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに、１μＬのＨｅＬａ細胞懸濁液、１０μＬの２×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ、１μＬの２０×Ｅｎｚｙｍｅ  ＭＩＸ、及び８μＬの水溶性有機溶媒含有精製水を混合した後、３７℃で６０分間、次いで９５℃で５分間の熱処理を行い、ｃＤＮＡを合成した。その後、ＲＴ反応後の溶液２０μＬ中１μＬをリアルタイムＰＣＲの鋳型とし、１μＬのＧＡＰＤＨプライマープローブＭＩＸ（アプライドバイオシステム社製、カタログＮｏ：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇｌ）を用いて、実施例１と同様にしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の検出を行った。
方法１〜５におけるフラッシングの遠心分離処理の有無を、表４に示す。表中、「有り」は、ボルテックスで３０秒間混合した後に、小型遠心機により５秒間の遠心分離処理（フラッシングの遠心分離処理）を行ったことを意味する。
【０１１０】
方法１：
ＨｅＬａ細胞懸濁液をボルテックスで３０秒間混合した後、フラッシングの遠心分離処理を行った。遠心分離処理後の上清から１μＬを分取し、ＲＴ用反応液に添加した。調製されたＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＲＴ反応を行った。ＲＴ反応終了後、合成されたｃＤＮＡが含まれているＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化された反応液から１μＬを分取し、ＰＣＲ用反応液に添加した。調製されたＰＣＲ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＰＣＲを行った。
【０１１１】
方法２：
ＨｅＬａ細胞懸濁液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化されたＨｅＬａ細胞懸濁液から１μＬを分取し、ＲＴ用反応液に添加した。調製されたＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合し、さらにフラッシングの遠心分離処理を行った後に、ＲＴ反応を行った。ＲＴ反応終了後、ＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化された反応液から１μＬを分取し、ＰＣＲ用反応液に添加した。調製されたＰＣＲ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＰＣＲを行った。
【０１１２】
方法３：
ＨｅＬａ細胞懸濁液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化されたＨｅＬａ細胞懸濁液から１μＬを分取し、ＲＴ用反応液に添加した。調製されたＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＲＴ反応を行った。ＲＴ反応終了後、ＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後、さらにフラッシングの遠心分離処理を行った。遠心分離処理後の上清から１μＬを分取し、ＰＣＲ用反応液に添加した。調製されたＰＣＲ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＰＣＲを行った。
【０１１３】
方法４：
ＨｅＬａ細胞懸濁液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化されたＨｅＬａ細胞懸濁液から１μＬを分取し、ＲＴ用反応液に添加した。調製されたＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＲＴ反応を行った。ＲＴ反応終了後、ＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化された反応液から１μＬを分取し、ＰＣＲ用反応液に添加した。調製されたＰＣＲ用反応液をボルテックスで３０秒間混合し、さらにフラッシングの遠心分離処理を行った後に、ＰＣＲを行った。
【０１１４】
方法５：
ＨｅＬａ細胞懸濁液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化されたＨｅＬａ細胞懸濁液から１μＬを分取し、ＲＴ用反応液に添加した。調製されたＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＲＴ反応を行った。ＲＴ反応終了後、ＲＴ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後、均一化された反応液から１μＬを分取し、ＰＣＲ用反応液に添加した。調製されたＰＣＲ用反応液をボルテックスで３０秒間混合した後に、ＰＣＲを行った。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
蛍光強度の計測結果を分析し、発現量の相対値基準として、遠心分離処理を一切行わなかった方法５の結果を１とし、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の相対値を算出した。算出結果を図３に示す。この結果、全ての工程で遠心を行わなかった方法５と比較して、遠心分離処理を行った後に鋳型を分取した方法１及び３では、発現量が減少し、データばらつきも大きくなった。また、反応前に反応液の遠心分離処理を行った方法２及び４では、データのばらつきこそ方法１や３ほど大きくはなかったが、反応効率が落ち、発現量が減少した。これは、ＨｅＬａ細胞懸濁液を分取前に遠心分離処理を行うと、均一に細胞をＲＴ用反応液に投入することができず、結果のばらつきが大きくなるためであり、ＲＴ反応開始前にＲＴ用反応液を遠心分離処理すると、鋳型ＲＮＡを含有する細胞が沈殿し、反応効率が悪くなるためと考えら得る。また、ＲＴ反応後に反応液を分散させずに分取してＰＣＲの鋳型とした場合には、結果のばらつきが大きくなり、ＰＣＲ用反応液を分散させずにＰＣＲを行った場合には、反応効率が悪くなる。これは、ＲＴ反応により合成されたｃＤＮＡが、細胞の内部や細胞の周囲の固形成分に吸着してしまい、固形成分が沈殿することにより、ｃＤＮＡも沈殿してしまうためと推察される。
【０１１７】
通常、これらの酵素反応を行う場合、反応液の調整の際には全試薬の混合後、チューブ壁などに飛び散った液を落とすために小型遠心機による遠心分離処理を行う。しかしながら、細胞から核酸を抽出精製せずに反応を行う場合、細胞中に含まれる核酸が鋳型となったり、細胞中や細胞に鋳型の核酸が吸着された状態で反応が少なからず起こったりするため、抽出精製された核酸を扱う場合よりも、反応液中の分散性が大きく結果に影響してくると考えられる。よって、各段階で遠心分離処理を行わないようにし、分散性を高めることが、より信頼性のあるデータが得ることにつながる。また、上記ＲＴやＰＣＲの反応中には熱による対流が起こるため、若干反応液の分散性が改善されているものの、反応の途中でも分散機構を設けることにより、反応液の分散性がより高まり、反応効率の向上が期待できる。
【０１１８】
［参考例１］
精製した核酸を鋳型として使用し、ＲＴ反応及びＰＣＲに対する、反応液中に混入される水溶性有機溶媒（エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド）の影響を調べた。
常法により培養したＨｅＬａ細胞からＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）により抽出したサンプルを鋳型ＲＮＡとした。
ＲＴ反応は、ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。ＲＴ反応液に有機溶媒の最終濃度が、１、５、１０、若しくは３０％のエタノール、１、５、１０、若しくは３０％のアセトン、又は、０．０１、０．１、１、若しくは１０％のホルムアルデヒドとなるように調製した。対照として、水溶性有機溶媒を添加しないＲＴ反応液も調製した。
具体的には、０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに、１μＬの鋳型ＲＮＡ、１０μＬの２×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ、１μＬの２０×Ｅｎｚｙｍｅ  ＭＩＸ、及び８μＬの水溶性有機溶媒含有精製水を混合した後、３７℃で６０分間、次いで９５℃で５分間の熱処理を行い、ｃＤＮＡを合成した。その後、ＲＴ反応後の溶液２０μＬ中１μＬをリアルタイムＰＣＲの鋳型とし、１μＬのＧＡＰＤＨプライマープローブＭＩＸ（アプライドバイオシステム社製、カタログＮｏ：Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇｌ）を用いて、実施例１と同様にしてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子の検出を行った。
【０１１９】
蛍光強度の計測結果を分析し、発現量の相対値基準として、水溶性有機溶媒を添加しなかったＲＴ反応液の結果を１とし、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の相対値を算出した。算出結果を図３に示す。図３（Ａ）はエタノールを混入した場合の結果を、図３（Ｂ）はアセトンを混入した場合の結果を、図３（Ｃ）はホルムアルデヒドを混入した場合の結果を、それぞれ示す。図中、「Ｘ％」は各水溶性有機溶媒の混入割合を示す。
図３（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ＲＴ反応液にエタノールやアセトンを混入させた場合には、最終濃度が３０％では発現量が全く得られず、反応が阻害されているのが分かった。また、１０％から濃度が下がるにつれ発現量が上昇しており、１％では０％（水溶性有機溶媒の添加なし）と同等となり、水溶性有機溶媒の混入による影響（阻害作用）が全く見られなくなった。
一方で、図３（Ｃ）に示すように、ホルムアルデヒドでは、ＲＴ反応液への混入割合が０．１％以下の場合に発現量が得られ、０．０１％で水溶性有機溶媒の混入による影響（阻害作用）が全く見られなくなった。
【０１２０】
つまり、生体試料と核酸安定化剤溶液との懸濁液を核酸含有溶液としてＲＴ反応に用いる場合、ＲＴ反応液における水溶性有機溶媒の最終濃度を考慮し、添加する懸濁液量を決定することが好ましく、特に、ＲＴ反応液における最終濃度が、エタノールやアセトンでは１０％以下、好ましくは５％以下、さらに好ましくは１％以下となるように、またホルムアルデヒドでは、０．１％以下、好ましくは０．０１％以下となるように、添加する懸濁液量を決定すると良いと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明の核酸検出方法により、煩雑な操作を必要とせずに、生体試料中の核酸のように固形成分中に含まれている核酸中の核酸を、高精度かつ再現性よく検出することができるため、特に生体試料を用いた定期健診等の臨床検査等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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