(57)【要約】【課題】本発明は，対応する類似した野生型エピトープと比べて、免疫応答をもたらす増強された能力を有するエピトープを含むペプチドを、調製する方法を提供する。【解決手段】クラスＩエピトープのヘテロクリティックアナログは、これらのエピトープの３および／または５および／または７位で保存的または半保存的アミノ酸置換を提供することで調製される。このアナログは、対応する野生型エピトープに関連する免疫応答の誘発において有用である。本発明はまた、エピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法を提供する。本発明はまた、上記の方法によって得られ得るクラスＩエピトープを含むペプチドを少なくとも１つ含む組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、特許仮出願番号６０／１６６，５２９（１９９９年１１月１８日に出願）および同６０／２３９，００８（２０００年１０月６日に出願）に対する優先権を主張する。これらはその全体が参照として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は所定のＴ細胞に対する増加した刺激能力を有する、元のペプチドのヘテロクリティック（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）アナログを生成するための方法に関係する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
数々の研究は、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）が、免疫系による感染性の疾患およびガンの根絶に中心的な役割を果たすことを示唆する（Ｂｙｒｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．５１：６８２（１９８４）、ＭｃＭｉｃｈｅａｌら、Ｎ．Ｅｎｇｌｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．，３０９：１３（１９８３））。ＣＴＬはエピトープを含むペプチドにより刺激されると、ＣＴＬ応答を刺激するエピトープに基づくワクチンの開発においてかなりの努力が進められている。ヘテロクリティックアナログと命名したエピトープの一つのクラスは、ワクチン成分としての利点を提供する。なぜならこれらのアナログは、ネイティブエピトープによって誘導されるＴ細胞応答よりも強力なＴ細胞応答を誘導するからである。ヘテロクリティックアナログは、所定の用量に対する応答の増加もしくは同じ応答を達成するためのより少ない必要量によって測定されるような、特定のＴ細胞に対する増加した刺激能力もしくは刺激効力を有するペプチドと定義される。
【０００４】
臨床適応におけるヘテロクリティックアナログの使用と関連する利点は、以下のとおりである。第一に、ヘテロクリティックアナログは、Ｔ細胞アネルギーの状態を逆転することによってか、Ｔ細胞の非寛容化交差反応クローンを活性化することによってか、または、「免疫偏向」（すなわち、産生されるＣＴＬの型（例えば、Ｔｈ１またはＴｈ２））を媒介することによって、寛容を崩壊／克服する能力を有する。最近の研究は、ヘテロクリティックアナログが内因的にプロセシングされたエピトープを認識するＣＴＬを誘導し得るという点で、ヘテロクリティックアナログが免疫原であることを示す（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５７：４５７０（１９９７）；Ｒｉｖｏｌｔｏｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９：３０１（１９９９）；Ｓｅｌｂｙら、１６２（２）：６６９（１９９９））。これは異なる免疫系における研究によって確認される（Ｚｕｇｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１：１７０５（１９９８）、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９０：９８３（１９９９）、Ｍｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２：３５６６（１９９９）。例えば、Ｚｕｇｅｌらの研究（Ｚｕｇｅｌら、前出）は、成体マウスにおいて免疫優性のＴ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容が、ペプチドのそのヘテロクリティック交差反応性ペプチドアナログで免疫することによって克服され得ることを示す。
【０００５】
この事は、ガンのワクチンの分野で特に有意であり、ここで、ＣＴＬエピトープの大部分が、自己抗原から誘導される。ガン関連抗体が、しばしば、自己抗原であるという事実に起因して、これらの抗原に対する既存の寛容が存在し得るという対応した現象が存在し、それによって、そのようなエピトープに対するＴ細胞応答の発生が課題である。ヘテロクリティックアナログによる寛容の崩壊は、マウスクラスＩＩ系における最近の研究で示されている（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：９８３（１９９９）。この研究では、寛容の崩壊に関与するメカニズムがアネルギーの逆転よりむしろ、寛容化の低親和性クローンの刺激であった。本明細書中で実証されるヘテロクリシティーは、高いアビディティのＣＴＬの誘導に関連しており、これは重要な差異を表す。
【０００６】
第二に、ペプチドアナログは、Ｔ細胞からのサイトカイン産生を調節することが示されている（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８１：１５６９（１９９５）、Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：４２３７（１９９７）、Ｓａｌａｚａｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８５（６）：８２９−３８（２０００）、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（２）：２０５−１３（２０００））。そのようなアナログによって誘導される免疫偏向は、Ｔｈ細胞応答の特定のサブセットの発生が腫瘍退行に相関する、（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：８７（１９９６）、Ｃｅｌｌｕｚｚｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：２８３（１９９６））または、自己免疫疾患もしくは感染性の疾患の臨床結果に影響を与える（Ｒｏｍａｇｎａｎｉら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．、１２：２２７−５７（１９９４））数々の疾患状態と関連を有する。従って、ヘテロクリティックアナログを伴う免疫は、エフェクターＴ細胞の特定のサブセットの誘導によってサイトカイン産生を調節する能力を提供し、それによって、疾患の経過を変化させる。
【０００７】
第三に、ヘテロクリティックアナログは、薬剤の開発において利点を有する。なぜなら、それらは強力な生物学的効力により、有意により少量のペプチドが、処置用量に必要とされるからである。この特徴は、特定の製造および毒性の懸念を克服する。この事については、黒色腫患者において抗原特異的Ｔ細胞を生じた、ＭＡＲＴ−１ペプチドのヘテロクリティックアナログが、ネイティブエピトープよりはるかに低濃度で活性であることが示されている（Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：３０１（１９９９）。同様の結果が、ＣＥＡ由来ＣＡＰ１エピトープのヘテロクリティックアナログに関して、Ｓｃｈｌｏｍおよび共同研究者によって報告された。（Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：４５７０（１９９７））。しかし、野生型ペプチドに対する並行したｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ分析もしくはＴＣＲアビディティ分析は、行われなかった。
【０００８】
従って、それらの生物学的関連性もために、所定のエピトープにヘテロクリティック活性を与えるアミノ酸置換を予測することが非常に有用である。しかしながら、本開示以前では、そのような置換を予想するための簡単な方法は存在しない。しかし、以前の研究では（非特許文献１、非特許文献２）、黒色腫細胞から天然に存在する変異ペプチドを溶出することによってか、または、エピトープ内のほとんど全ての位置での変異からなる多くのアナログを系統的にスクリーニングすることによって、ヘテロクリティックエピトープが、偶発的に同定された（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。あるいは、ヘテロクリティックアナログは、ランダムコンビナトリアムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。このライブラリーはまた、多くのペプチドの困難な合成およびスクリーニングを必要であった（非特許文献６）。ＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングのような、遺伝学的なアプローチが、ＣＴＬエピトープおよびアナログの生成のための別の方法を提供する（非特許文献７、非特許文献８）。しかし、このアプローチは、生成されるエピトープの潜在的な少ない量および複雑性が問題になり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６２（２）：６６９（１９９９）
【非特許文献２】Ｓｋｉｐｐｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：５２７（１９９６）
【非特許文献３】Ｚａｒｅｍｂａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：４５７０（１９９７）
【非特許文献４】Ｌｏｆｔｕｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２４３３（１９９８）
【非特許文献５】Ｂｌａｋｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８：１２１（１９９６）
【非特許文献６】Ｐｉｎｉｌｌａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１：１９３−２０２（１９９９）
【非特許文献７】Ｂｏｏｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７−６５（１９９４）
【非特許文献８】Ｇａｖｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（９）：２１２４−３３（１９９４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
本発明は，対応する類似した野生型エピトープと比べて、免疫応答をもたらす増強された能力を有するエピトープを含むペプチドを、調製する方法を提供する。この得られた「ヘテロクリティックアナログ」は、ウイルス性疾患、ガン、および標的細胞上の提示された抗原によって特徴付けられる他の疾患の処置のための、免疫学的組成物として有用である。また、本発明は以下を提供する：
（項目１）  エピトープを含むペプチドの免疫原性を高める方法であって、該方法が、以下：
ｉ）第一のクラスＩエピトープを含むペプチドを提供する工程であって、ここで該エピトープが、本質的にＮ末端およびＣ末端ならびに少なくとも１つの一次アンカー残基を有するアミノ酸配列からなり、ここで該アミノ酸残基が、連続して数えられ、そして該エピトープのＮ末端に最も近い一次アンカー残基が、２位または３位である、工程；および
ｉｉ）該エピトープのＮ末端とＣ末端との間の３位および／もしくは５位および／もしくは７位での１つ以上の保存的、または半保存的置換を誘導する工程であって、ただし、該位が一次アンカー残基でない、工程、
それにより第二のクラスＩエピトープを含むペプチドを構築する工程であって、該エピトープが、該第一のクラスＩエピトープと比較して高められた免疫原性を示す、工程、
を包含する、方法。
【００１１】
（項目２）  前記第二のクラスＩエピトープが、前記第一のクラスＩエピトープと比較して、特定のＴ細胞について少なくとも約５０％増加した効力を示す、項目１に記載の方法。
【００１２】
（項目３）  １つの置換のみが導入される、項目１に記載の方法。
【００１３】
（項目４）  前記置換が保存的置換である、項目１に記載の方法。
【００１４】
（項目５）  前記置換が半保存的置換である、項目１に記載の方法。
【００１５】
（項目６）  項目１に記載の方法であって、前記ペプチドがＨＬＡクラスＩ分子によって結合されそして細胞傷害性のＴ細胞と接触する場合、前記第二のクラスＩエピトープを含むペプチドが、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方を誘導する、方法。
【００１６】
（項目７）  前記第一のクラスＩエピトープが、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群より選択されるスーパーモチーフを含む、項目１に記載の方法。
【００１７】
（項目８）  項目１に記載の方法であって、ここで前記第一のクラスＩエピトープが、ウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生生物抗原、細菌抗原または真菌抗原由来である、方法。
【００１８】
（項目９）  項目１の方法によって調製された第二のクラスＩエピトープを含むペプチド。
【００１９】
（項目１０）  免疫応答を誘発する方法であって、該方法が細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と項目９に記載のペプチドとを接触させる工程を包含する、方法。
【００２０】
（項目１１）  前記接触させる工程がインビトロで、抗原提示細胞の存在下で実施される、項目１０に記載の方法。
【００２１】
（項目１２）  前記接触工程が、被験体に前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する工程によって実施される、項目１０に記載の方法。
【００２２】
（項目１３）  少なくとも１つのペプチドを含む組成物であって、該ペプチドが、項目１に記載の方法によって得られ得るクラスＩエピトープを含む、組成物。
【００２３】
（項目１４）  前記ペプチドが、９個〜１５個のアミノ酸を含む、項目１３に記載の組成物。
【００２４】
（項目１５）  項目１３に記載の組成物であって、前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
【００２５】
（項目１６）  前記ペプチドがＣＴＬエピトープと混ぜられるか、または連結される、項目１３に記載の組成物。
【００２６】
（項目１７）  前記ペプチドが、ＨＴＬエピトープと混ぜられるか、または連結される、項目１３に記載の組成物。
【００２７】
（項目１８）  前記ＨＴＬエピトープが、ｐａｎ−ＤＲ結合分子である、項目１７に記載の組成物。
【００２８】
（項目１９）  リポソームをさらに含む、項目１３に記載の組成物。
【００２９】
（項目２０）  前記エピトープが、脂質に結合される、項目１３に記載の組成物。
【００３０】
（項目２１）  前記エピトープが、ヘテロポリマーに含まれる、項目１３に記載の組成物。
【００３１】
（項目２２）  前記エピトープが、ホモポリマーに含まれる、項目１３に記載の組成物。
【００３２】
（項目２３）  前記エピトープが、ＨＬＡ重鎖、β２ミクログロブリン、およびストレプトアビジン複合体に結合され、これによりトリマーが形成される、項目１３に記載の組成物。
【００３３】
（項目２４）  項目１３に記載の組成物であって、抗原提示細胞をさらに含み、ここで、前記エピトープが、該抗原提示細胞上または抗原提示細胞内にある、組成物。
【００３４】
（項目２５）  項目２４に記載の組成物であって、前記エピトープが前記抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合し、これにより、該ＨＬＡ分子に制限される細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合、該ＣＴＬのレセプターが該ＨＬＡ分子と該エピトープとの複合体に結合する、組成物。
【００３５】
（項目２６）  前記抗原提示細胞が、樹状細胞である、項目２５に記載の組成物。
【００３６】
（項目２７）  項目１３に記載の組成物であって、ＨＬＡ分子をさらに含み、ここで、前記ペプチドが、該ＨＬＡ分子により結合される、組成物。
【００３７】
（項目２８）  標識をさらに含む、項目１３に記載の組成物。
【００３８】
（項目２９）  項目２８に記載の組成物であって、ここで、前記標識が、ビオチン、蛍光部分、非哺乳動物糖、放射性標識、またはモノクローナル抗体が結合する低分子である、項目２８に記載の組成物。
【００３９】
（項目３０）  項目１３に記載の組成物であって、以下：
前記ペプチドの単位投薬量、および
薬学的賦形剤、
を含む、ワクチンである、組成物。
【００４０】
（項目３１）  項目１に記載の方法により得られ得る第二のクラスＩエピトープを含む、９〜１５個のアミノ酸のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【００４１】
（項目３２）  項目３１に記載の核酸分子であって、前記ペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２０、からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるエピトープを含む、核酸分子。
【００４２】
（項目３３）  前記ヌクレオチド配列の発現のための制御配列をさらに含む、項目３２に記載の核酸分子。
【００４３】
（項目３４）  項目３１に記載の核酸分子を、活性成分として含む、薬学的組成物。
【００４４】
従って、一つの局面において、本発明は、エピトープを含むペプチドの免疫原性を増強するための方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：Ｉ）第一のクラスＩエピトープを含むペプチドを提供する工程であって、ここで、このエピトープは、本質的に、Ｎ末端およびＣ末端ならびに少なくとも一つの一次アンカー残基を有するアミノ酸配列からなり、ここで、このエピトープのアミノ酸残基は連続的に番号付けられ、そして、このエピトープのＮ末端に最も近い一次アンカー残基は、位置２または位置３である工程；ＩＩ）一次アンカー残基を含まない位置３および／または５および／または７で、このエピト−プのＮ末端とＣ末端との間に一つ以上の保存的または半保存的な置換を導入する工程で、これにより、増強された第一のクラスＩエピトープと比較される抗原原性を示す第二のクラスＩエピトープを含むペプチドを構成する工程。
【００４５】
上記の第二のクラスＩエピトープは、一般に「ヘテロクリティックアナログ」と称する。
【００４６】
好ましい実施形態において、このヘテロクリティックアナログは、対応する野生型クラスＩエピトープに比較して、特定のＴ細胞に対する少なくとも約５０％増加した効力を示す。このアナログは、１つの置換のみを含み得るか、または２もしくは３つの置換を含み得、そしてこの置換は、保存的または半保存的であり得る。このヘテロクリティックアナログは、ＨＬＡクラスＩ分子に結合され、そして関連する細胞傷害性Ｔ細胞と接触された場合、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方を誘導し得る。好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２からなる群から選択されたスーパーモチーフを含み、より好ましくは、クラスＩエピトープは、Ａ２スーパーモチーフ、最も好ましくは、Ａ２．１モチーフを含む。
【００４７】
本発明はまた、事前に選択したクラスＩペプチドエピトープに対してヒト細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：上記のヘテロクリティックアナログを提供する工程；および、ヒトＣＴＬにこのヘテロクリティックアナログを接触させる工程。
【００４８】
いくつかの局面において、この接触の工程は、インビトロで実施される。いくつかの局面において、この接触の工程は、このヘテロクリティックアナログペプチドエピトープをコードする配列を含む核酸分子を、被験者に投与することによって実施される。
【００４９】
本発明はまた、上記の方法によって入手可能であるヘテロクリティックアナログエピトープを含むペプチドに関する。特に、そして、好ましくは、そのようなペプチドとしては、そのエピトープが、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸の配列からなる、ペプチドが挙げられる。このペプチドは、９〜２０アミノ酸、好ましくは、９〜１６アミノ酸、より好ましくは９〜１５アミノ酸を含み得るが、また、全部で９、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸のみを含み得る。定義されたヘテロクリティックアナログエピトープは、より長いポリペプチドまたはタンパク質に含まれ得、このタンパク質またポリペプチドは、同じエピトープのホモポリマーであるか、あるいは、種々のこのようなエピトープを含むかまたは野生型ペプチドと組み合わせてヘテロクリティックアナログエピトープを含む、ヘテロポリマーである。これらペプチドおよびタンパク質は、薬学的使用のために設計される組成物に含まれ得る。
【００５０】
ヘテロクリティックアナログエピトープを含むペプチドまたはヘテロポリマーもしくはホモポリマーは、他の成分を結合させ、免疫応答の誘発におけるそれらの活性をさらに増強し得るか、または調節し得る。これらさらなる変更物は、共有結合的に結合され得るか、または混合物中に非共有結合的に含まれ得る。従って、ヘテロクリティックアナログエピトープは、ＣＴＬエピトープまたはこのＨＴＬエピトープに混合され得るか、または投与され得る。特にＨＴＬエピトープは、ｐａｎ−ＤＲ結合分子である。ヘテロクリティックアナログエピトープを含む組成物は、さらにリポソームを含み得る。ここで、このエピトープは、リポソーム上もしくはリポソーム中に存在するか、またはこのエピトープは、脂質に結合され得る。このヘテロクリティックエピトープは、ＨＬＡ重鎖、β２−ミクログロブリンおよびストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）複合体に結合され得、それによって、４量体が形成される。さらに、このヘテロクリティックエピトープは、抗原提示細胞を含む組成物において改変され得る。ここで、このエピトープは、抗原提示細胞上または抗原提示細胞中にあり、ここで、このエピトープは、抗原提示細胞上のＨＬＡ分子に結合される。従って、ＨＬＡ分子に制限される細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合、ＣＴＬのレセプターは、ＨＬＡ分子とそのエピトープの複合体に結合する。抗原提示細胞は、樹状細胞であり得る。この組成物はまた、単にＨＬＡ分子を含み得る。ここで、このエピトープを含むペプチドは、ＨＬＡ分子に結合される。この組成物は、モノクローナル抗体が結合する標識（例えば、ビオチン）、蛍光部分、非哺乳動物性の糖、放射標識または小さい分子をまた含み得る。
【００５１】
記載される組成物は、対応する野生型エピトープに対する免疫応答の誘発において有用である。代表的には、ヘテロクリティックアナログは、適切な賦形剤をさらに含むそのような組成物に含まれる。活性な成分であるヘテロクリティックエピトープは、投薬形態単位で存在し得る。被験体の処置に有用な組成物はまた、これらの核酸分子は、上記のペプチドをコードする核酸分子を含み得、それらの発現のための制御配列を必要に応じて含む。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１−１】図１Ａおよび１Ｂは、ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２のそれぞれのアナログのパネルを、その対応するＣＴＬにおいてＩＦＮγ産生を誘導する能力について、試験した結果を示す。
【図１−２】図１Ｃおよび１Ｄは、それぞれＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２ヘテロクリティックアナログについてその対応する用量応答曲線である。
【図２−１】図２Ａは、ＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６、およびＨＢＶＰｏｌ．４５５エピトープアナログのアナログのパネルを、対応するＣＴＬにおいてＩＦＮγ産生を誘導するこれらのアナログの能力に関して、試験した結果を示す。
【図２−２】図２Ｂは、ＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６、およびＨＢＶＰｏｌ．４５５エピトープアナログのアナログのパネルを、対応するＣＴＬにおいてＩＦＮγ産生を誘導するこれらのアナログの能力に関して、試験した結果を示す。
【図２−３】図２Ｃは、ＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６、およびＨＢＶＰｏｌ．４５５エピトープアナログのアナログのパネルを、対応するＣＴＬにおいてＩＦＮγ産生を誘導するこれらのアナログの能力に関して、試験した結果を示す。
【図２−４】図２Ｄは、首尾よいＨＩＶＰｏｌ．４７６アナログについての関連した用量応答曲線である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、適切なＣＴＬからＩＦＮγ産生またはＩＬ１０産生を誘導する能力に関して、野生型との比較におけるＭＡＧＥ２．１５７のヘテロクリティックアナログの用量応答曲線の結果を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、適切なＣＴＬにおいてＩＦＮγおよびＩＬ１０の産生に対する、野生型およびＨＩＶＰｏｌ．４７６のヘテロクリティックアナログについての用量応答曲線である。
【図５】図５は、エピトープｐ５３．１４９Ｍ２の潜在的なヘテロクリティックアナログのパネルを、適切なＣＴＬからのＩＦＮγの産生に関して、試験した結果である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ｐ５３．１４９Ｍ２の首尾よいヘテロクリティックアナログによるＩＦＮγおよびＩＬ１０の産生に対する、対応する用量応答曲線である。
【図７】図７は、ＣＴＬにおけるＩＦＮγ産生に対するｐ５３．Ｍｕ１８４エピト−プの潜在的なアナログのパネルを試験した結果である。
【図８】図８は、ＩＦＮγ産生に関する、野生型、およびｐ５３．Ｍｕ１８４の２つ首尾よいヘテロクリティックアナログについての用量応答曲線である。
【図９】図９Ａ〜Ｄは、対応する野生型エピトープに関する、ヘテロクリティックアナログの反応交差性を示す。図９Ａおよび９Ｂにおいて、ＩＦＮγ産生は、免疫ペプチドによる刺激を使用して、濃度の関数としてプロットされる。図９Ｃおよび９Ｄは、野生型エピトープが、ＣＴＬの初期誘導のために使用されるヘテロクリティックアナログとは対抗的に、刺激剤として使用される場合の、対応する結果である。
【図１０】図１０は、ｐ５３．２６１およびそのヘテロクリティックアナログによる誘導に関する、ＩＦＮγの放出である。
【図１１】図１１は、種々のヘテロクリティックアナログに関するＥｌｉｓｐｏｔの結果である。
【図１２】図１２は、種々のヘテロクリティックアナログを使用する内因性のペプチドに対するＣＴＬ活性の刺激の結果である。
【図１０１−１】図１０１は、実施例で用いられるペプチド、および腫瘍抗原およびウイルス抗原から同定されたヘテロクリティックアナログの特徴を示す、表１である。
【図１０１−２】図１０１は、実施例で用いられるペプチド、および腫瘍抗原およびウイルス抗原から同定されたヘテロクリティックアナログの特徴を示す、表１である。
【図１０２−１】図１０２は、所定のアミノ酸置換を、保存的置換、半保存的置換、または非保存的置換であるとして特徴付けし得るように、任意の所定のアミノ酸対の間の類似性の割り当てを示す、表２である。
【図１０２−２】図１０２は、所定のアミノ酸置換を、保存的置換、半保存的置換、または非保存的置換であるとして特徴付けし得るように、任意の所定のアミノ酸対の間の類似性の割り当てを示す、表２である。
【図１０３−１】図１０３は、表３である。
【図１０３−２】図１０３は、表３である。
【図１０４−１】図１０４は、表４である。
【図１０４−２】図１０４は、表４である。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
（発明を実施するための形態）
（１．概要）
本発明は、ＨＬＡクラスＩ分子に結合するヘテロクリティックアナログの設計の方法に関連する。本明細書中に記載される「ヘテロクリティックアナログ」は、特定のＴ細胞に対する増強された効力を持つエピトープを含むペプチドである。それは、所定の投与量に対する増強された応答によって、または相同性のあるクラスＩペプチドとして同じ応答を達成するより少ないの必要量によって測定される。本発明の方法は、特に、ヒトの癌および前癌性の状態に関連する、ウイルス、細菌、真菌および原生動物の寄生虫のような感染性の病原体に由来する、ならびに任意のクラスＩペプチドの改変に有用である。
【００５４】
重要なことに、ヘテロクリシティーの現象は、個々のクラスＩエピトープに結合するＨＬＡ分子にわたってあてはまる。例えば、Ａ２スーパーモチーフを有するヘテロクリティックアナログペプチドは、ＨＬＡ−スーパータイプ（例えば、Ａ０２０１、Ａ０２０２、Ａ０２０３、Ａ０２０４、Ａ０２０５、Ａ０２０６、Ａ０２０７など）における全てのＨＬＡ分子にわたって、ヘテロクリティック（すなわち、より高い効力を有する）である。同様に、異なる配列モチーフ（例えば、Ａ１、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８、Ｂ６２など）を有するヘテロクリティックアナログペプチドは、その特定のＨＬＡ−スーパーファミリーにおける全てのＨＬＡ分子にわたって、免疫応答をより強力にする。
【００５５】
出願者は、対応する野生型エピトープに対する、免疫応答を高めるヘテロクリティックアナログを設計する特定の法則を見つけた。これらの法則は、任意のクラスＩ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子に結合するモチーフ、またはス−パーモチーフを有するエピトープに関して適応できる。従って、これらの法則の使用によって、任意の「野生型」または「ネイティブ」クラスＩエピトープの免疫原性を高めることが可能である。
【００５６】
簡略には、この法則は、野生型クラスＩエピトープが、エピトープの位置３および／または位置５および／または位置７として保存的または半保存的なアミノ酸の置換によって改変されることを述べる。置換されるべき保存的または半保存的アミノ酸の性質は、本明細書以下の、調製Ｂの記載によって定義され、この結果は表２に要約される。従って、表２を参照すれば、これらの位置での置換のための適した候補を決め得る。表２に示されるように、表の最上段にわたって示されるそれぞれのアミノ酸は、残存する１９の遺伝的にコードされるアミノ酸と数値的に規定された関係を有する。指標がより低いほど、保存性はより高く；同じアミノ酸は、１．０の類似性の割当を有し；最も大きく異なるアミノ酸は、２０に近い類似割当を有する。調製Ｂ中で示す方法を使用すると、遺伝子コードされないアミノ酸もまた、類似性の指標を割り当てられ得、そして保存的または半保存的（または非保存的）として、任意に天然に存在するアミノ酸について、分類され得る。
【００５７】
本発明のヘテロクリティックアナログペプチドは、被験体の免疫系が耐性となる抗原に対する免疫応答を誘導するのに特に有用である。ヒト被験体は、特に好ましいが、この方法はまた、これらの被験体に関して、対応するＨＬＡモチーフを考慮にいれることにより、他の哺乳動物、例えば実験室マウスにも適用し得る。耐性は、先立つ抗体への曝露によって誘導される特定の免疫学的な非反応性をいう。耐性は、患者が耐性である特定のクラスＩペプチドエピトープを同定することによって、本発明の方法に従ってペプチドエピトープ配列を改変することによって、および寛容化エピトープ（抗原）に対する交差反応をする免疫反応を誘導することによって、克服され得る。例えば、被験体の免疫系がウイルス抗原または腫瘍関連抗原に耐性である場合、耐性の克服は特に望ましく、後者の抗原は、細胞の形質転換の結果として、しばしば過剰発現する自己タンパク質である。
【００５８】
ヘテロクリティックを設計するための法則を決定するため、いくつかの種々のＣＴＬ株がアナログパネルに対する反応性によりスクリーニングされた。Ｔ細胞刺激容量の改変は一次ＭＨＣアンカーの変更なしに達成された。
【００５９】
その野生型エピトープとしては、上皮細胞の癌において特異的に上方制御され、そして免疫原性であることが示された自己抗原に由来する腫瘍エピトープが挙げられる。ＨＩＶおよびＨＢＶのポリメラーゼ遺伝子由来のエピトープのような使用されるウイルスのエピトープは、同様に免疫原性であることが示された。
【００６０】
本明細書中に記載した法則は、ヘテロクリティックなアナログを設計するための基盤を提供し、そうでなければ要求されるスクリーニングを劇的に減少させ、そして癌および感染性疾患のためのエピトープを基礎としたワクチンの設計に非常に有用である。
【００６１】
以下に示す実施例において、スクリーニングされた（本明細書に開示されるヘテロクリティックの法則に適合する）総アナログの１７％がヘテロクリティックであった（１６／９５）。これは、二つの理由において有意である：第１に、ヘテロクリティック置換の法則に従ったアナログを使用することでヘテロクリティック検出の効率が２．２％から１７％まで上昇した；第２に、合成されることが必要なペプチドの数が一つのエピトープあたり約１００アナログから約１５アナログに劇的に減少され、この工程費用を効果的にし、高い処理能力に耐えられるようにする。本発明のヘテロクリティック置換の法則の適用を通して、ヘテロクリティックアナログが生じる効率は、１００から１０００倍近く、０．２％（２３３のＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２アナログのスクリーニングから４つが同定された）から３０％（９つの予測されたアナログのスクリーニングから３つが同定された）まで増加した。後者の頻度は、最初のアッセイにおいて潜在的なヘテロクリティック活性を示した６つのアナログのうちの４つのみをさらなる分析に供したので、ひどい過小評価でありうる。
【００６２】
以前の研究は、ヘテロクリティックアナログによるＴ細胞応答の調節が、ＴＣＲ接触残基を含むことを示した（Ｂｙｒｎｅら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５１：６８２（１９８４）、  ＭｃＭｉｃｈａｅｌら、  Ｎ．  Ｅｎｇｌａｎｄ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０９：１３（１９８３）、  Ｚｕｇｅｌら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１：１７０５（１９９８）、  Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：３０１（１９９９）、  Ｐａｒｈｕｒｓｔら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７：２５３９（１９９６））が、本研究ではこれを発見しなかった。例えば、ＣＥＡ．６９１エピトープに対しては、ＴＣＲ接触残基が８位であり、一方で、ヘテロクリティックは、３および５位でアナログ置換が認められた。いかなる仮定によっても束縛されることを意図しないが、ＭＨＣ結合の変更は機構となり得る。このアナログに対して実施された結合分析は、大多数の場合（８０％）において好むと好まざるとにかかわらずＭＨＣ結合における変更があることを示した。ＨＬＡ−Ａ２結合について試験された１３アナログのうち１０アナログはＭＨＣ結合の変更を持ち、６アナログは、野生型のペプチドおよび野生型より結合の悪い４アナログよりも良好に結合するが、まだ実質的に増加した生物学的応答を生じた。いくつかの研究ではＭＨＣ結合を増強するために一次のＭＨＣアンカー残基を修飾する（この手段は、アナログを生じるためにいくつかのグループによって用いられた（Ｐｆｅｉｆｆｅｒら、  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８１：１５６９（１９９５）、  Ｖａｌｍｏｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１７５０−１７５８（１９９８））。一次のＴＣＲの接触残基あるいは一次のＭＨＣアンカー残基の変化無しに生物学的応答の増加は本研究においては認められなかった。応答の増加がＭＨＣ結合における変更にともない媒介されるので、その効果は二次アンカーの位置の変化により媒介しうることを前提とする。これを支持するさらなる証拠は、ヘテロクリティックの置換がそのペプチドの中間における奇数位置（３、５、７）で起こるという発見から生じる。３、５および７のこれらの位置全ては、ＨＬＡ−Ａ２分子に対する結合にとって二次アンカー位置であると示された（Ｂｏｏｎら、  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：３３７−６５  （１９９４）、  Ｉｓｈｉｏｋａら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２（７）：３９１５−２５  （１９９９）  ）。
【００６３】
これらの位置のうちの２つ（３および７）は、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合するための二次アンカー位置であることがいくつかのグループにより示された（Ｒｕｐｐｅｒｔら、  Ｃｅｌｌ  ７４：９２９（１９９３）、  Ｍａｄｄｅｎ、  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：５８７−６２２（１９９５））。そのような二次アンカー位置の変更は、Ｔ細胞認識差異に転換しうる（Ｖａｌｍｏｒｉら、  Ｊ．  Ｉｍｍｎｏｌ．  １６０：１７５０（１９９８）；  Ｄａｖｉｓら、  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｎｏｌ．  １６：５２３  （１９９８））が、これらの研究では、Ｔ細胞の認識差異は、ＭＨＣ結合における変化に付随し、ヘテロクリティックの獲得に関与するアミノ酸置換の種類に関する法則は規定されなかった。二次アンカーの変化からＴ細胞の認識の変化へのこのような転換が生じる機構は現在不明瞭である。しかし、いくつかのモデルは、二次アンカーの位置の残基がＭＨＣと結合する様式の変化がＴＣＲ接触残基の配向における変更あるいは増加した可撓性を引き起こし得ることを示唆しており、それは、ＴＣＲに対するこれらのアナログの結合の増加に帰着する（Ｋｅｒｓｈら、  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８４：１２５９（１９９６）、  Ｅｖａｖｏｌｄら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：３４７（１９９２）、  Ａｌａｍら、  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２２７（１９９９）、  Ｈａｍｐｌら、  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：３７９−８５（１９９７））。また、いくつかの以前の研究では、ヘテロクリティックアナログによるＴ細胞応答の調節が主なＴＣＲ接触残基に直接関与することを意味していた（Ｚａｒｅｍｂａら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５７：４５７０（１９９７）、  Ｌｏｆｔｕｓら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２４３３（１９９８）、  Ｄｒｅｓｓｅｌら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５９：４９４３（１９９７））。けれどもこの発見は、現在の体系的解析により実証されない。本研究において同定されたアナログに対して増加したＴ細胞認識は、おそらくＭＨＣ結合容量の増加に起因しないが、増加される結合は、おそらく一次アンカーの位置が最適化されたアナログの場合において、重要な役割を果たす。本研究は、ヘテロクリティックアナログが、おそらくＴＣＲあるいはＭＨＣの結合容量の大きな変更によるよりもむしろ構造における微妙な変更により生じることを示唆する。
【００６４】
Ｔｈ１あるいはＴｈ２サイトカイン産生の調節差異は認められなかった。それどころか、本データは、ヘテロクリティックアナログがＴｈ１およびＴｈ２両応答の産生を増加することを示唆したが、その増加の大きさおよび動力学が異なり得る。事実、いくつかのグループ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２（２）：２０５−１３（２０００）、  Ｐａｒｈｕｒｓｔら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７：２５３９（１９９６））は、最近ペプチドアナログによるそのような全体刺激を報告した。これは、アナログによって誘起されるより強いＴＣＲのシグナルに起因するが、そのような全体刺激の機構は、今後解明されるべきである。
【００６５】
関連する腫瘍モデルあるいは自己抗原に対する寛容が存在するモデルを使用するインビボでのヘテロクリティックアナログの効力は評価される。従って、効果的なＣＴＬを生じさせることが攻撃であるとこれまで判明している腫瘍に対するワクチン化として、ヘテロクリティックアナログでの免疫化がより効果的で有効な戦略であることが見出される。
【００６６】
要約すると、本出願人らが癌およびウイルス起源のＨＬＡ−Ａ２．１制限ＣＴＬエピトープのいくつもの異なるヘテロクリティックアナログを同定した。その適切な野生型エピトープは表１に示される。全てのこれらのエピトープは本発明者らのより早い報告において免疫原性であることが示された（Ｋａｗａｓｈｉｍａら、  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５９：１−１４（１９９８）、  Ｉｓｈｉｏｋａら、  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２（７）：３９１５−２５（１９９９））。最初の実験の中で、ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２ＣＴＬエピトープの２３３のアナログの抗原性が調査された。同定された４つのヘテロクリティックアナログの性質は、ヘテロクリティック置換が３、５および７の位置で保存的な置換を含むことを示した。この仮説は、３つのさらなるエピトープであるＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶＰｏｌ．４７６およびＨＢＶＰｏｌ．４５５が関与する引き続きの研究において試験された。このように同定された全てのヘテロクリティックアナログは、提案した本法則、すなわちヘテロクリティックアナログが３、５および／または７の位置での保存的あるいは半保存的な置換に付随されることに一致した。
【００６７】
癌免疫治療におけるヘテロクリティックアナログの臨床的適用をより綿密に模倣するため、マウスのエピトープ、ｐ５３．２６１もまた修飾された。Ｔ細胞寛容の部分的な状態はこのエピトープに関して報告された（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９２：１１９９３−１１９９７（１９９５）、  Ｔｈｅｏｂａｌｄら、  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８５（５）：８３３−８４１（１９９７））。予想された９つのｐ５３．２６１アナログのうち４つは、未変性ペプチドにより誘導されるＣＴＬ応答に比べてインビボでのアナログ特異的ＣＴＬの応答をより強く誘導することが発見された。より顕著に、ヘテロクリティックアナログによる免疫化により生じたＣＴＬの交差反応性が解析された場合に、３つのｐ５３．２６１アナログが未変性のｐ５３．２６１エピトープに対して活発に応答するＣＴＬを誘導した。最終的に、ヒトＣＴＬについてこれらの発見の妥当性はＭＡＧＥ３．１１２エピトープのヘテロクリティックアナログがインビトロでのヒトＴ細胞に対して免疫原性であることを実証することにより考慮された。帰着するＣＴＬは腫瘍細胞株の形態において自然に作用される野生型抗原を認識しうる。
【００６８】
ヘテロクリティックアナログが、研究されたすべてのエピトープに対して同定されたので、本明細書に示した研究は、ヘテロクリシティーが全世界的な現象であることを証明する。加えて、本願は、クローンのＴ細胞集団（以前の研究で明示されたような）およびインビボでの免疫化の後の大部分のＴ細胞集団の両方におけるヘテロクリティックアナログを検出することが可能であることを示す。さらに、本明細書において、ヘテロクリシティー（ＨＬＡ  Ａ２．１系におけるものと他のクラスＩスーパーモチーフに関するものとの両方）が、合理的なヘテロクリシティーの予測を見込む別々の構造上の特徴に付随することが実証される。
【００６９】
さらに、ｐ５３．２６１ヘテロクリティックアナログがより高いアビディティによりＣＴＬを誘導し、また、野生型ペプチドにより誘導されるより多数の（前駆体出現率）これらの細胞を誘導することが実証される；インビボでのヘテロクリティックＣＴＬの誘導およびＴ細胞の寛容を中断するためのその適用は実証される。
【００７０】
ヘテロクリティックアナログは、インビボでの免疫化に続いて大部分の特異的なＴ細胞集団を生じるのに効果的であった。多数のＴＣＲ遺伝子由来のＴＣＲを提示するポリクローナルの応答は臨床背景で疾患状態を治療するのにより有効である。最終的に、野生型エピトープに対する強い交差反応性のアビディティを有するＣＴＬの高い前駆体出現率を生じるための能力が、通常は免疫系に対して寛容であるエピトープに対する効果的なＣＴＬ応答が要求される例において重要である。
【００７１】
（２．定義）
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセットであるか、またはＴ細胞の状況においては、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるＨＬＡの状況に提示される場合にＴ細胞レセプタータンパク質による認識にとって必要な残基である。インビトロまたはインビボでの免疫系の設定において、エピトープは、一次、二次および三次ペプチド構造、ならびに電荷のような分子の集団的特徴であり、これらは一緒になって、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によりコードされる部位を形成する。本開示を通してエピトープおよびペプチドは、しばしば交換可能に使用される。しかし、本発明のエピトープより大きくかつ本エピトープを含む、分離または精製されたタンパク質またはペプチド分子が、まだ本発明の範囲内にあることは、評価されることである。
【００７２】
「クラスＩエピトープ」は、クラスＩ  ＨＬＡ分子に対して結合するペプチドをいう。本明細書において記載されたように、クラスＩエピトープは代表的に約８から約１３アミノ酸長である。ＨＬＡ分子に対する結合は、２つの一次アンカー残基により主に調節され、このうちの一方はエピトープのＣ末端にあり、そして他方は、２または３位にある。結合は、また、１つ以上の二次アンカー残基により補助されうる。読み手の利便性のために、様々な一次ＨＬＡクラスＩ結合アンカーは、表４にて示される。アンカーのパターンは、「モチーフ」と称される。「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるＨＬＡ分子により共有されるペプチド結合の特異性である。好ましくは、スーパーモチーフ保有ペプチドは、高いまたは中間の親和性（本明細書で定義されるような）で２つ以上のＨＬＡ抗原により認識される。クラスＩスーパーモチーフの例としては、例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ２７、Ｂ４４、Ｂ５８およびＢ６２が挙げられる。
【００７３】
本開示をとおして、「結合データ」の結果を、しばしば「ＩＣ50」に換算して表す。ＩＣ50は、参照ペプチドの結合の５０％阻害が認められる、結合アッセイにおけるペプチドの濃度である。アッセイを行う条件（すなわち、制限ＨＬＡタンパク質濃度および標識ペプチド濃度）が付与されると、これらの値は、Ｋｄ値を概算する。結合を測定するためのアッセイは、例えば、参考として本明細書に援用される、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５に、詳細に記載される。ＩＣ50値が、アッセイ条件が変化する場合、そして使用する特定の試薬（例えば、ＨＬＡ調製物など）に依存して、（しばしば、劇的に）変化し得ることに留意する。例えば、過剰濃度のＨＬＡ分子は、所定のリガンドの見かけの測定されたＩＣ50を増加する。あるいは、結合は、参照ペプチドと関連して表される。特定のアッセイが、より高感度またはより低感度になるにつれて、試験するペプチドのＩＣ50は、幾分変化し得るが、参照ペプチドに関連する結合は、有意には変化しない。例えば、参照ペプチドのＩＣ50が１０倍増加するような条件下で行うアッセイにおいて、試験ペプチドのＩＣ50値もまた、約１０倍シフトする。従って、あいまい性を回避するために、ペプチドが良好、中程度、弱いあるいはネガティブな結合因子であるかの評価は、一般に、標準ペプチドのＩＣ50に対する、そのペプチドのＩＣ50に基づく。結合はまた、当該分野において公知の他のアッセイ系を使用して測定され得る。
【００７４】
「カルボキシルあるいはＣ末端」としてのエピトープ中の残基の位置の指定は、ペプチドのカルボキシル末端に最も近いエピトープの末端の残基の位置をいい、これは以下に定義したような従来の命名法を使用して指定される。エピトープの「Ｃ末端」は、ペプチドあるいはポリペプチドの末端に実際に対応してもよいし、対応しなくてもよい。
【００７５】
「Ｎ末端」または「アミノの末端の位置」としてのエピトープ中の残基の位置の指定は、ペプチドのＮ末端に最も近いエピトープの末端の残基の位置をいい、これは以下に定義したような従来の命名法を使用して指定される。エピトープの「Ｎ末端」は、ペプチドあるいはポリペプチドの末端に実際に対応してもよいし、対応しなくてもよい。
【００７６】
「コンピューター」または「コンピューターシステム」は、一般に、以下を備える：プロセッサー；少なくとも１つの情報記憶／検索装置、例えば、ハードドライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど；少なくとも１つの入力装置、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、またはマイクロホンなど；およびディスプレイ構造。さらに、コンピューターは、ネットワークと連絡する通信チャネルを備え得る。このようなコンピューターは、多かれ少なかれ、上記に列挙したものを備え得る。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「保存性」または「保存的」および「半保存性」または「半保存的」であるアミノ酸は、調製Ｂに従って定義され、表２に示される。
【００７８】
本明細書中で使用される場合、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高い親和性」とは、５０ｎＭ以下のＩＣ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合である。ＨＬＡクラスＩＩ分子への結合に関する「高い親和性」とは、１００ｎＭ以下のＩＣ50またはＫD値での結合として定義され；「中程度の親和性」とは、約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ50またはＫD値での結合である。
【００７９】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」とは、そのペプチドがＨＬＡ分子を結合し、そしてＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従って、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し、そしてその後、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を誘導し得る。
【００８０】
句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブ状態において見い出されるような通常その材料に付随する成分を、実質的または本質的に含まない材料をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくは、そのインサイチュ環境下でそのペプチドに通常会合する物質を含まない。
【００８１】
「ＰａｎＤＲ結合ペプチド」は、１つより多くのＨＬＡクラスＩＩＤＲ分子（例えば、ＰＡＤＲＥTMペプチド、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を結合する分子ファミリーのメンバーである。ＰＡＤＲＥTMファミリーの分子を定義するパターンは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフとして考えられ得る。ＰＡＤＲＥTM分子に見い出されたパターンを含むペプチドは、大部分ＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、インビトロおよびインビボでヒトヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を刺激する。
【００８２】
「薬学的に受容可能な」は、一般に、非毒性の、不活性な、および／または生理学的に適合性の組成物をいう。
【００８３】
（３．本発明のペプチド）
本発明に従うペプチドは、組み換えＤＮＡ技術または化学合成によるか、あるいは天然腫瘍あるいは病原性生物のような天然源から合成的に調製されうる。ペプチドエピトープは、個々にまたはポリエピトープペプチドとして合成され得る。ペプチドは、好ましくは、他の天然に存在する宿主細胞のタンパク質およびそのフラグメントを実質的に有しないが、いくつかの実施形態において、ペプチドは、天然フラグメントまたは粒子に合成的に結合体化され得る。
【００８４】
ＨＬＡクラスＩペプチドは、当該分野において周知であり、ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドとして定義される。本発明に従うペプチドは、様々な長さであり、そしてそれらの中性（非荷電）形態または塩である形態のいずれかであり得る。本発明に従うペプチドは、グリコシル化、側鎖酸化、もしくはリン酸化反応のような修飾を有しないか、またはそれらは修飾が本明細書中に記載されるようなペプチドの生物学的活性を破壊しない条件を前提としてこれらの修飾を含むかのいずれかである。
【００８５】
対応する「野生型」として役目を果たすクラスＩエピトープは、任意のタンパク質源に由来し得る。例えば、クラスＩペプチドは、ウイルス性抗原、腫瘍付随抗原、寄生物抗原、細菌抗原、または真菌抗原由来であり得る。本発明のいくつかの好ましい局面において、クラスＩペプチドは、被験体の免疫系が寛容（すなわち先の抗原に対する曝露により引き起こされる特異的免疫学的非応答性）を発現する抗原に由来する。
【００８６】
従って、いくつもの潜在的標的エピトープに基するヘテロクリティックアナログは、本発明にて利用され得る。適合した腫瘍付随抗原の例としては、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、黒色腫抗原ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ−１１、ＭＡＧＥ−Ａ１０、並びにＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＬＡＧＥ−１、ＣＡＧ−３、ＤＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ１８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ４、ＢＲＣＡ２、ＮＹ−ＬＵ−１、ＮＹ−ＬＵ−７、ＮＹ−ＬＵ−１２、ＣＡＳＰ８、ＲＡＳ、ＫＩＡＡ−２−５、ＳＣＣｓ、ｐ５３、ｐ７３、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ２、ｇｐ７５／ＴＲＰ１、カリクレイン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＴ１−１、Ｂ−カテニン、ＰＲＡＭＥ、テロメラーゼ、ＦＡＫ、サイクリンＤ１タンパク質、ＮＯＥＹ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＳＡＲＴ−１、ＣＡＰＢ、ＨＰＶＥ７、ｐ１５、葉酸レセプターＣＤＣ２７、ＰＡＧＥ−１、そしてＰＡＧＥ−４が挙げられる。適合した感染症付随抗原の例としては、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）抗原、そしてヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＣｈｌａｍｙｄｉａが挙げられる。適合する真菌抗原の例としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｉｓに由来する抗原が挙げられる。適合する原性動物の寄生物抗原の例としては、Ｐ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐなどを含む、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．由来のものが挙げられる。
【００８７】
対応するヘテロクリティックアナログを構築するために本発明の法則が適用される野生型の配列として用いられ得るエピトープは、任意のクラスＩエピトープに対応することが見出され得る。上に記載されるもののような任意の抗原に対して、特定のクラスＩ対立遺伝子に付随するモチーフは、このようなエピトープが備わっている抗原のアミノ酸配列中の位置を決定する指針として利用され得る。この決定は、視覚的にかまたは好ましくはコンピューター技術および関連のソフトウェアを使用して行われ得る。従って、例えば２位のバリンおよびＣ末端のアルギニンを含むような、例えばＡ３スーパーモチーフの認識により、要求される任意の抗原のアミノ酸配列は、このモチーフを保有するエピトープについて調査され得る。次いで、そのエピトープは、要求されるアナログを獲得するために本発明に記載される法則に従って修飾され得る。
【００８８】
可能ならば、本発明のＨＬＡクラスＩ結合エピトープを最適化することが所望され得、例えばこれは、約８から約１３、しばしば８から１１、好ましくは９から１０アミノ酸残基長に対するポリエピトープの構築に利用され得る。好ましくは、ペプチドエピトープは、内在的に処理される関連するＨＬＡ分子に対して結合される病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズにおいて同一基準であるが、本発明のエピトープを含むペプチドの同定および調製は、また、本明細書に記載された技術を利用して行われ得る。
【００８９】
代替の実施形態において、本発明のエピトープは、ポリエピトープペプチドとして、または、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として関連づけられ得る。
【００９０】
別の実施形態において、高濃度のクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む天然のペプチド領域を同定することが好ましい。そのような配列は、１つのアミノ酸長に対して最大のエピトープ数を含むことを基として通常選択される。エピトープが、ネスティングされるか、もしくは重なる様式で存在し得ることは、評価されることであり、例えば、１０アミノ酸長ペプチドは、２つの９アミノ酸長エピトープならびに１つの１０アミノ酸長エピトープを含み得た；細胞内のプロセシングにおいて、それぞれのエピトープは、そのようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子により曝露および結合されうる。このより大きく、好ましいマルチ−エピトープのペプチドは、合成的、組換え、あるいは天然素材からの切断を経て生じ得る。
【００９１】
本発明のペプチドは、広く多様な方法から調製され得る。好ましい比較的短いサイズに関しては、ペプチドは、従来の技術に従って溶液中あるいは固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機は、市販されており、公知のプロトコールに従って使用され得る。（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ＆  Ｙｏｕｎｇ、ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、１９８４年を参照）。さらに、個々のペプチドエピトープは、いまだ本発明の範囲内であるより大きなペプチドを作製するために化学連結を使用して結合され得る。
【００９２】
あるいは、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチドの配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現のために適切な条件下で培養される、組換えＤＮＡの技術が利用され得る。これらの製法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に一般に記載されるように、当該分野において一般的に公知である。従って、１つ以上の本発明のペプチド配列を含む組換えポリペプチドは、適切なＴ細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【００９３】
本明細書において企図される好ましい長さのペプチドエピトープに対応するヌクレオチドがコードする配列は、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法のような化学技術により合成され得る。ペプチドアナログは、天然ペプチド配列をコードする核酸塩基を、適切で、また要求される核酸塩基で置換することにより簡単に作製され得る；典型的な核酸の置換は、本明細書において、モチーフ／スーパーモチーフにより定義されるアミノ酸をコードするものである。次いで、コード配列は、適切なリンカーに供され、また当該分野において通例利用可能な発現ベクター中に連結され得、そしてそのベクターは、要求される融合タンパク質を作製するために適切な宿主を形質転換するために使用され得る。いくつものそのようなベクターおよび適切な宿主系は現在使用可能である。融合タンパク質の発現のために、コードする配列は、作動可能に連結される開始および終止コドン、プロモーターおよびターミネータ領域、ならびに通例要求される細胞の宿主での発現のための発現ベクターを提供する複製系を提供される。例えば、細菌の宿主との適合性を持つプロモーター配列は、要求されるコード配列の挿入のための便利な制限部位を含むプラスミドに提供される。得られる発現ベクターは、適切な細菌の宿主に形質転換される。もちろん、酵母、昆虫あるいは哺乳動物の細胞の宿主はまた、適切なベクター、ならびに制御配列を用いて使用され得る。
【００９４】
本発明のアナログは、生じるペプチドの物理的特性（例えば、安定性または溶解性）を修飾するための置換を含むペプチドが含まれ得る。例えば、ペプチドはシステイン（Ｃ）のα−アミノ酪酸での置換によって修飾され得る。この化学的特質に起因して、システインはジスルフィド架橋を形成する傾向を有し、そして結合能力を減らすようにペプチド構造を十分に変化させる。Ｃの代わりにα−アミノ酪酸を用いることは、この問題を緩和させるだけでなく、実際に特定の例において結合および交差結合能力を改善する。システインをα−アミノ酪酸と置換することは、ペプチドエピトープの任意の残基で、すなわちアンカー位置または非アンカー位置のいずれかで起こり得る。
【００９５】
種々のアミノ酸模倣物または非天然のアミノ酸を有する修飾されたペプチドは特に有用である。なぜならそれらはインビボにおいて増加した安定性を表す傾向があるからである。このようなアナログはまた、改善された貯蔵寿命または製造の特性を有し得る。より詳細には、重要ではないアミノ酸はタンパク質中の天然に存在するアミノ酸（例えばＬ−α−アミノ酸またはそれらのＤ−異性体）に制限される必要はないが、非天然のアミノ酸、例えばアミノ酸の模倣物（例えばＤ−ナフチルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎ）またはＬ−ナフチルアラニン；Ｄ−フェニルグリシンまたはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−２−チエニルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）またはＬ−２−チエニルアラニン；Ｄ−１、−２、３−もしくは４−ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎ）またはＬ−１、−２、３−もしくは４−ピレネイルアラニン；Ｄ−３−チエニルアラニンまたはＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−（２−ピリジニル）−アラニンまたはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−（３−ピリジニル）−アラニンまたはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−（２−ピラジニル）−アラニンまたはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシンまたはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ρ−フルオロフェニルアラニン；Ｄ−ρ−ビフェニルフェニルアラニンまたはＬ−ρ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−ρ−メトキシビフェニルフェニルアラニンまたはＬ−ρ−メトキシビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−インドール（アルキル）アラニンまたはＬ−２−インドール（アルキル）アラニンおよびＤ−２−アルキルアラニンまたはＬ−アルキルアラニン（ここでアルキル基はメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソ−ペンチルまたは酸性ではないアミノ酸に置換され得るかまたは置換されない）が挙げられ得る。非天然のアミノ酸の芳香環として、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンジミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環が挙げられる。
【００９６】
ペプチドの安定性は多数の方法でアッセイされ得る。例えば、ペプチダーゼおよびヒト血漿および血清のような種々の生物学的培地は安定性を試験するために用いられている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  １１：２９１（１９８６）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて簡便に決定される。そのプルトコールは一般的に以下のようである：プールしたヒト血清（ＡＢ型、熱で不活性化されていない）を使用する前に遠心分離により脱脂する。次いで血清をＲＰＭＩ−１６４０または別の適切な組織培養培地で２５％に希釈する。予め決定された時間間隔で、少量の反応溶液が取り出され、そして６％のトリクロロ酢酸水溶液（ＴＣＡ）またはエタノールのいずれかを加えられる。濁った反応サンプルは４℃に１５分間冷却され、その後スピンして沈殿した血清タンパク質をペレットにする。次いでペプチドの存在は安定性特異的なクロマトグラフィ条件を用いて逆相ＨＰＬＣによって決定される。
【００９７】
（４．クラスＩモチーフ）
過去数年間で、ＨＬＡクラスＩ分子の巨大な割合が比較的少ないスーパータイプに分類され得、それぞれは広く重複するペプチド結合のレパートリーおよび主なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造によって特徴付ける、ということを実証する証拠が集まってきている。従って本発明のペプチドは、いくつかのＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフのうちのいずれか１つによってか（例えば表３〜４を参照のこと）、またはモチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ抗原に結合する能力に対応する場合はスーパーモチーフによって同定されている。特定のアミノ酸スーパーモチーフを有するペプチドに結合するＨＬＡ分子は、集合的にＨＬＡ「スーパータイプ」という。
【００９８】
読者に便利にするため、以下に記載され表３〜４に要約されるペプチドのモチーフおよびスーパーモチーフは同定のための手引きおよび発明に従うペプチドエピトープの用途を提供する。これは、アナログを構築するための本明細書中に示される法則を適用するために、以下の実施例に示されるものとは異なる種々のクラスＩモチーフに対応する候補野生型エピトープまたは以下に示されるものを保有するが異なる抗原の中にあるエピトープの同定を可能にする。
【００９９】
ヘテロクリティックアナログは、ペプチドが属するモチーフまたはスーパーモチーフに関わり無く、そのペプチドから発明の方法に従って設計され得る。下記に描いたＨＬＡクラスＩペプチドエピトープのスーパーモチーフおよびモチーフの一次アンカー残基を表３に要約する。表３（ａ）で述べたＨＬＡクラスＩモチーフは、ここで主張される本発明に最も著しい関連のモチーフである。ＨＬＡクラスＩスーパータイプファミリーを含む対立遺伝子特異的なＨＬＡ分子を表４に列挙する。いくつかの例において、ペプチドエピトープはモチーフおよびスーパーモチーフの両方に列挙され得る。特定のモチーフとそれぞれのスーパーモチーフとの関係は、個々のモチーフの説明中に示される。
【０１００】
（ｉ．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフは、２位おける小さな（ＴまたはＳ）または疎水性（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）の一次アンカー残基のペプチドリガンド中の存在、そしてエピトープのＣ末端位置における芳香族（Ｙ、ＦまたはＷ）の一次アンカー残基の存在により特徴付けられる。Ａ１スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）は、少なくともＡ*０１０１、Ａ*２６０１、Ａ*２６０２、Ａ*２５０１、およびＡ*３２０１を含む（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５９３０，１９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６２０，１９９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４５：２４９，１９９７を参照のこと）。Ａ１スーパーファミリーのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表４に示される。
【０１０１】
（ｉｉ．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ）
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカーの特異性（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−２９６，１９９１；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−１２６３，１９９２；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７，１９９２；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ  ７４：９２９−９３７，１９９３を参照のこと）およびＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子の間での交差反応性結合が記載される（例えば、関連データの総説については、Ｆｒｕｃｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１８７−１９２，１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：１５５−１６２，１９９４；Ｄｅｌ  Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３，１９９５；Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２，１９９４を参照のこと）。これらの一次アンカー残基は、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを規定し；ペプチドリガンド中の存在は、いくつかの異なるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２８分子を結合する能力に対応する。ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、２位に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを有するペプチドリガンド、およびエピトープのＣ末端位置に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有するペプチドリガンドを含む。
【０１０２】
ＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドを結合するＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくとも以下を含む：Ａ*０２０１、Ａ*０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*０２０９、Ａ*０２１４、Ａ*６８０２およびＡ*６９０１。Ａ２スーパーファミリーのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表４に示される。
【０１０３】
（ｉｉｉ．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとしてのＡ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴのペプチドリガンド中の存在、そしてエピトープのＣ末端位置における（例えば、９マーの９位に）正に荷電した残基ＲまたはＫの存在により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９，１９９６を参照のこと）。Ａ３スーパーモチーフを結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）の例示的メンバーとしては、少なくとも：Ａ*０３０１、Ａ*１１０１、Ａ*３１０１、Ａ*３３０１およびＡ*６８０１が挙げられる。Ａ３スーパータイプのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【０１０４】
（ｉｖ．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとして芳香族残基（Ｆ、Ｗ、またはＹ）または疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＴ）がペプチドリガンド中に存在し、そしてエピトープのＣ末端位置に一次アンカーとしてのＹ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、ＩまたはＭの存在により特徴付けられる（例えば、ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９９９を参照のこと）。Ａ２４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ａ２４スーパータイプ）としては、少なくともＡ*２４０２、Ａ*３００１およびＡ*２３０１が挙げられる。Ａ２４スーパータイプのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【０１０５】
（ｖ．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、一次アンカーとして２位にプロリンを有するペプチド、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカーとして疎水性アミノ酸または脂肪族アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、Ｗ、またはＹ）により特徴付けられる。Ｂ７スーパーモチーフを結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）は、少なくとも２６のＨＬＡ−Ｂタンパク質を含み、これらとしては以下が挙げられる：Ｂ*０７０２、Ｂ*０７０３、Ｂ*０７０４、Ｂ*０７０５、Ｂ*１５０８、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０２、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０４、Ｂ*３５０５、Ｂ*３５０６、Ｂ*３５０７、Ｂ*３５０８、Ｂ*５１０１、Ｂ*５１０２、Ｂ*５１０３、Ｂ*５１０４、Ｂ*５１０５、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１、Ｂ*５５０２、Ｂ*５６０１、Ｂ*５６０２、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１（例えば、関連データの総説については、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７，１９９５；Ｂａｒｂｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１７９，１９９５；Ｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：４３４，１９９２；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１７８，１９９５を参照のこと）。Ｂ７スーパータイプのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【０１０６】
（ｖｉ．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとしての正に荷電した残基（Ｒ、Ｈ、またはＫ）のペプチドリガンド中の存在、そしてエピトープのＣ末端位置における一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、Ａ、またはＶ）の存在により特徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）１９９９を参照のこと）。Ｂ２７スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ２７スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも：Ｂ*１４０１、Ｂ*１４０２、Ｂ*１５０９、Ｂ*２７０２、Ｂ*２７０３、Ｂ*２７０４、Ｂ*２７０５、Ｂ*２７０６、Ｂ*３８０１、Ｂ*３９０１、Ｂ*３９０２、およびＢ*７３０１が挙げられる。Ｂ２７スーパータイプのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【０１０７】
（ｖｉｉ．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、２位における一次アンカーとしての負に荷電した残基（ＤまたはＥ）のペプチドリガンド中の存在、そしてエピトープのＣ末端位置における一次アンカーとしての疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、またはＡ）の存在により特徴付けられる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：２６１，１９９６参照のこと）。Ｂ４４スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ４４スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１８０１、Ｂ*１８０２、Ｂ*３７０１、Ｂ*４００１、Ｂ*４００２、Ｂ*４００６、Ｂ*４４０２、Ｂ*４４０３、およびＢ*４００６。
【０１０８】
（ｖｉｉｉ．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、２位での一次アンカー残基としての小さな脂肪族残基（Ａ、Ｓ、またはＴ）のペプチドリガンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としての芳香族または疎水性の残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、またはＡ）の存在によって、特徴付けられる（例えば、関連するデータの総説についてはＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ５８スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ５８スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１５１６、Ｂ*１５１７、Ｂ*５７０１、Ｂ*５７０２、およびＢ*５８０１。Ｂ５８スーパータイプのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【０１０９】
（ｉｘ．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ）
ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、２位での一次アンカーとしての極性脂肪族残基Ｑまたは疎水性脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｉ、またはＰ）のペプチドリガンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカーとして疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、またはＡ）の存在によって、特徴付けられる（例えば、ＳｉｄｎｅｙおよびＳｅｔｔｅ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，印刷中、１９９９を参照のこと）。Ｂ６２スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、Ｂ６２スーパータイプ）の例示的なメンバーとしては、少なくとも以下が挙げられる：Ｂ*１５０１、Ｂ*１５０２、Ｂ*１５１３、およびＢ５２０１。Ｂ６２スーパータイプのメンバーであると推定される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表３に示される。
【０１１０】
（ｘ．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＴ、Ｓ、またはＭのペプチドリガンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＹの存在によって、特徴付けられる。代替の対立遺伝子特異的Ａ１モチーフは、２位よりむしろ３位における、一次アンカー残基によって特徴付けられる。このモチーフは、Ｄ、Ｅ、Ａ、またはＳの一次アンカー残基としての３位における存在、および、エピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＹの存在によって、特徴付けられる（例えば、関連するデータの総説については、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：６２０、１９９４；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４５：２４９、１９９７；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３、１９９４を参照のこと）。
【０１１１】
（ｘｉ．ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ２*０２０１モチーフは、２位での一次アンカー残基としての、ＬまたはＭのペプチドリガンドにおける存在、およびＬまたはＶの９残基ペプチドのＣ末端位置での一次アンカー残基としての存在によって特徴付けられることが決定され（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０−２９６、１９９１を参照のこと）、そしてさらに、９アミノ酸ペプチドの２位にＩを含み、そしてＣ末端位置にＩまたはＡを含むことが、見出された（例えば、Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１２６１−１２６３、３月６日、１９９２；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−３５８７、１９９２を参照のこと）。Ａ*０２０１対立遺伝子特異的モチーフはまた、本発明者らによって、さらにＶ、Ａ、Ｔ、またはＱを、一次アンカー残基としてこのエピトープの２位に含み、そしてＭまたはＴを、一次アンカー残基としてこのエピトープのＣ末端位置に含むことが規定された（例えば、Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２、１９９４を参照のこと）。従って、ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフは、２位に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｔ、またはＱを有し、そしてこのエピトープのＣ末端位置に一次アンカー残基としてＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＴを有する、ペプチドリガンドを含む。ＨＬＡ−Ａ*０２０１モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける、好ましい許容される残基は、Ａ２スーパーモチーフを記載する残基と同一である。
【０１１２】
（ｘｉｉ．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＬ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、Ｇ、またはＤのペプチドリガンドにおける存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＫ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、またはＡの、存在によって、特徴付けられる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１５０８、１９９３；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４を参照のこと）。
【０１１３】
（ｘｉｉｉ．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＶ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、またはＦのペプチドリガンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＫ、Ｒ、Ｙ、またはＨの存在によって、特徴付けられる（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２２１７−２２２１、１９９３；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４を参照のこと）。
【０１１４】
（ｘｉｖ．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ）
ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、２位での一次アンカー残基としてのＹ、Ｆ、Ｗ、またはＭのペプチドリガンド中の存在、およびエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＦ、Ｌ、Ｉ、またはＷの存在によって、特徴付けられる（例えば、Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２、１９９５；およびＫｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３−３９２４、１９９４を参照のこと）。
【０１１５】
（５．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ）
一旦、本発明のヘテロクリティックアナログが合成されると、それらは、Ｔ細胞応答を誘発する能力について試験され得る。モチーフ保有ペプチド（例えば、ヘテロクリティックアナログ）の調製および評価は、ＰＣＴ公報ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５に記載される。簡単に述べると、特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドが合成され、適切なＨＬＡタンパク質に結合するそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、放射性ヨウ素標識した参照ペプチドの結合に関して、精製されるＨＬＡクラスＩ分子への本発明のペプチドの結合を評価する工程を包含し得る。あるいは、空のクラスＩ分子を発現する細胞（すなわち、その中にペプチドを含まない）は、免疫蛍光染色およびフローマイクロ蛍光定量法によってペプチド結合について評価され得る。ペプチド結合を評価するために使用され得る他のアッセイは、ペプチド依存クラスＩアセンブリアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害を含む。代表的に、５００ｎＭ以下の親和性でクラスＩ分子に結合するそれらのペプチドは、感染された個体または免疫化された個体から誘導体化されたＣＴＬに対する標的として作用する能力について、および、疾患に関連する選択された標的細胞と反応し得るＣＴＬ集団を引き起こし得る一次インビトロＣＴＬ応答または一次インビボＣＴＬ応答を誘発する能力について、さらに評価される。
【０１１６】
Ｔ細胞応答を検出するために使用される従来のアッセイとしては、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接細胞傷害性アッセイ、および限界希釈アッセイが挙げられる。このようなアッセイは、ヘテロクリティックアナログのペプチドによる免疫応答の誘導を、非ヘテロクリティックアナログのクラスＩペプチド（例えば、ここからヘテロクリティックアナログ配列が基礎にされた）により誘導される応答と比較する際に有用である。例えば、ペプチドを用いてインキュベートされた抗原提示細胞は、応答細胞集団（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）においてＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞であり得る。あるいは、内部的にプロセスされたペプチドを有するクラスＩ分子を装填するそれらの能力が欠乏し、そして適切なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた変異体非ヒト哺乳動物細胞株が、インビトロで一次ＣＴＬ応答を誘発するペプチドの能力について試験するために使用され得る。
【０１１７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前躯体の応答細胞源として使用され得る。適切な抗原提示細胞は、ペプチドと共にインキュベートされ、次いでこの後、ペプチド装填した抗原提示細胞が、最適な培養条件下で応答細胞集団と共にインキュベートされる。陽性ＣＴＬ活性化は、放射性標識した標的細胞（特定のペプチドをパルスされた標的およびペプチド配列が誘導される内因的にプロセスされた形態の抗原を発現する標的細胞）を殺傷するＣＴＬの存在について培養物をアッセイすることによって決定され得る。
【０１１８】
さらに、フルオレセイン標識したＨＬＡ四量体複合体で染色することによって抗原特異的Ｔ細胞の直接的定量を可能にする方法が、もたらされた（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０３３０、１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４，１９９６）。他の比較的最近の技術的開発としては、細胞内リンホカインの染色、およびインターフェロン−γ放出アッセイまたはＥｌｉｓｐｏｔアッセイが挙げられる。四量体染色、細胞内リンホカイン染色およびＥｌｉｓｐｏｔアッセイは全て、さらなる従来のアッセイより少なくとも１０倍より感度が高いようである（Ｌａｌｖａｎｉ，Ａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９、１９９７；Ｄｕｎｂａｒ、Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３、１９９８；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１７７、１９９８）。
【０１１９】
所望される場合、ＨＴＬの活性化はまた、当該分野で公知の技術（例えば、Ｔ細胞増殖およびリンホカイン（例えば、ＩＬ−２）の分泌）を使用して評価され得る（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：７５１〜７６１、１９９４を参照のこと）。
【０１２０】
あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化は、ペプチドエピトープの免疫原性を決定するために使用され得る。いくつかのトランスジェニックマウスモデル（ヒトＡ２．１、Ａ１１（これはＨＬＡ−Ａ３エピトープを分析するためにさらに使用され得る）、およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含む）が特徴付けられ、そして他のマウス（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４に対するトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルもまた開発されている。他のＨＬＡ対立遺伝子を有するさらなるトランスジェニックマウスモデルが、必要な場合作製され得る。マウスは、不完全フロイトアジュバント中の乳化したペプチドで免疫化され得、そして得られるＴ細胞は、ペプチドをパルスされた標的細胞および適切な遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識するそれらの能力について試験される。ＣＴＬ応答は、上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され得る。同様に、ＨＴＬ応答は、Ｔ細胞増殖またはリンホカインの分泌のようなアッセイを使用して分析され得る。
【０１２１】
本発明のヘテロクリティックアナログは、しばしばＴｈ１サイトカイン応答およびＴｈ２サイトカイン応答の両方を誘導する。それゆえ、ヘテロクリティックな候補物を予め選択されたクラスＩペプチドと比較するための１つの方法は、Ｔｈ１サイトカインおよびＴｈ２サイトカインの誘導を試験するための方法である。予め選抜したクラスＩペプチドは、代表的にヘテロクリティックアナログに誘導されるペプチド、または、そのようなペプチドが存在しない場合は候補物に対して最も高い類似性を有するクラスＩペプチドである。本発明のヘテロクリティックアナログは、代表的にＴｈ１サイトカイン応答およびＴｈ２サイトカイン応答の両方を誘導するが、これはアナログが誘導されたクラス１ペプチドに比較して非常に増強されたレベルにおいてである。例えば、所定のヘテロクリティックアナログは、等しいレベルのＴｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカイン（５０〜１００ｐｇ／ｍｌ）を、このアナログが誘導された野生型ペプチドと比較して１０倍以下の用量で刺激する。さらに、クラスＩペプチドがＴｈ１応答またはＴｈ２応答のどちらかのみ、またはいずれかを主に誘導する場合、ヘテロクリティックアナログはＴｈ１応答およびＴｈ２応答の両方を誘導し得る。Ｔｈ１サイトカインとしては、例えばＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ３が挙げられる。Ｔｈ２サイトカインとしては、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０が挙げられる。サイトカインの産生は、例えばＥＬＩＳＡ法または他の免疫学的定量法を用いて測定される。（例えば、ＭｃＫｉｎｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３７：１０５〜１１７、２０００を参照のこと）
（６．診断薬としておよび免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用）
本発明の一実施形態において、本明細書中に記載されるようなヘテロクリティックアナログペプチドが、免疫応答を評価するための試薬として使用される。評価される免疫応答は、免疫原として任意の因子を使用することによって、誘導され、この因子は、試薬として用いられるペプチドエピトープを認識し、そしてこれに結合する抗原特異性ＣＴＬまたはＨＴＬの誘導を生成し得る。ペプチド試薬は、免疫原として使用される必要はない。このような分析のために使用され得るアッセイシステムとしては、比較的最近の技術開発（例えば、細胞内リンホカインに関する四量体染色およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥｌｉｓｐｏｔアッセイ）が挙げられる。
【０１２２】
例えば、本発明のペプチドは、腫瘍細胞抗原または免疫原の曝露後の抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価するために、四量体染色アッセイにおいて使用される。ＨＬＡ四量体複合体を使用して、抗原特異性ＣＴＬを直接可視化し（例えば、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８；およびＡｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７４：９４〜９６、１９９６を参照のこと）、そして末梢血単核細胞のサンプル中の抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を決定する。本発明のペプチドを使用する四量体試薬は、以下のように生成され得る：ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、三分子複合体を生成するために、対応するＨＬＡ重鎖およびβ2−ミクログロブリンの存在下で再折り畳まれる。この複合体は、先にタンパク質中の操作された部位において重鎖のカルボキシル末端でビオチン化される。四量体形成は、次いで、ストレプトアビジンの付加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて、抗原特異的細胞を染色するために四量体が使用され得る。これらの細胞は、次いで、例えば、フローサイトメトリーによって同定され得る。このような分析は、診断目的または予後目的のために使用され得る。この手順によって同定された細胞はまた、治療目的のために使用され得る。
【０１２３】
本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用される（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３〜５１３、１９９７、およびＰｅｎｎａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５６５〜１５７０、１９９１を参照のこと）。例えば、癌を有する個体由来の患者のＰＢＭＣサンプルは、特定のペプチドを使用して、抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬの存在について分析され得る。単核細胞を含む血液サンプルは、ＰＢＭＣを培養し、そして本発明のペプチドでその細胞を刺激することによって評価され得る。適切な培養期間の後、拡大された細胞集団は、例えば、ＣＴＬまたはＨＴＬ活性について分析され得る。
【０１２４】
ペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用される。免疫原をワクチン接種された患者から得たＰＢＭＣは、例えば、上記の方法のいずれかを使用して分析され得る。患者は、ＨＬＡ型であり、そしてその患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が、分析のために選択される。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの存在によって示される。
【０１２５】
本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製するために使用され（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと）、これは癌を診断またはモニターするための試薬として有用であり得る。このような抗体としては、ＨＬＡ分子の状況においてペプチドを認識する抗体（すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体）が挙げられる。
【０１２６】
（７．ワクチン組成物）
免疫学的に有効な量の本明細書中に述べるような１つ以上のペプチドを含むワクチンおよびそのワクチンを準備する方法は、本発明のさらなる実施形態である。一旦、適切な免疫原性エピトープが規定されると、それらは様々な手段により分類され送達され得るが、本明細書中ではこれらを「ワクチン」組成物と呼ぶ。このようなワクチン組成物は、例えば以下のようなものが挙げられる：リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ、Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）ミクロスフィアに封入されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：６７５−６８１，１９９５）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）により包まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３４４：８７３−８７５，１９９０；Ｈｕら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，１９９８）、多抗原ペプチドシステム（ＭＡＰｓ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５４０９−５４１３，１９８８；Ｔａｍ、Ｊ．Ｐ．，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１７−３２，１９９６）、多価のペプチドとして処方されるペプチド；銃式送達システム（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）に処方されるペプチド、代表的には結晶化されたペプチド、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｉｎ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編  ｐ．３７９，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：５３５，１９８６、Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：５３７，１９８６；Ｋｉｎｅｙ，Ｍ．−Ｐ．ら、ＡＩＤＳ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．  １２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７５；５３５，１９９０），ウイルス性もしくは合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｄｇｅ、Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．および  Ｃｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５，１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７：１３１，１９９６）、あるいは裸または粒子吸着されたｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．，およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｖ��ｃｃｉｎｅ  １１：９５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編、ｐ．４２３，１９９６；Ｃｅａｓｅ，  Ｋ．Ｂ．，およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３，１９９４  および  Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，  Ｊ．  Ｈ．  ら、Ｓｅｍ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）。Ａｖａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の技術のようなレセプター媒介標的化（ｒｅｃｅｐｔｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）として公知の毒素標的とする送達技術もまた使用され得る。
【０１２７】
本発明のワクチンは核酸が介在する様式を含む。一つ以上の本発明のペプチドをコードしているＤＮＡまたはＲＮＡはまた患者に投与され得る。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５  （１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ  ９８／０４７２０に記載され、さらに詳細は以下に記載される。ＤＮＡに基づく送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ」、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド介在）送達、陽イオン性液体複合体、粒子媒介（「遺伝子銃」）もしくは圧力媒介送達（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）が挙げられる。
【０１２８】
治療的または予防的免疫処置の目的で、本発明のペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、痘疹や鶏痘などの弱毒化したウイルス宿主が挙げられる。このアプローチの例のように、ワクシニアウイルスは本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして使用される。腫瘍を保有する宿主に導入する際、組換え型ワクシニアウイルスは免疫原性のペプチドを発現し、それによってＣＴＬおよび／またはＨＴＬを誘発する。ワクシニアベクターおよび免疫処置プロコトルにおいて有用な方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターについてはＳｔｏｖｅｒ  ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉベクター、無毒化した炭疽毒素ベクターなど発明のペプチドの治療的投与または免疫処置に有用な幅広い種々の他のベクターは、本明細書中の記載から当業者にとっては明白である。
【０１２９】
さらに、本発明に従ったワクチンは、一つ以上の特許請求されるペプチドの組成物を包含する。ペプチドは個々にワクチン中に存在し得る。あるいは、このペプチドは同一のペプチドの複数のコピーから構成されるホモポリマーまたは様々なペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは免疫反応を増大するという利点を有し、そしてこのポリマーをつくるために異種のペプチドエピトープが使われる場合、免疫応答の標的となる病原体生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原性決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導する更なる能力という利点を持つ。本組成物は抗原の天然に存在する領域であり得るか、あるいは例えば組換えまたは化学合成によって調製され得る。
【０１３０】
本発明のワクチンとともに使われる担体は当該分野において周知であり、例えば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、ポリＬ−ロイシン、ポリＬ−グルタミン酸のようなポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。本ワクチンは水または食塩水、好ましくはリン酸緩衝化食塩水のような生理学的に耐性な（すなわち、受容されうる）希釈剤を含み得る。本ワクチンは、代表的なものにまたアジュバントを含む。フロイントの不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは当該分野で周知の材料例である。加えて、本明細書中で開示したように、ＣＴＬ応答はトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ3ＣＳＳ）のような本発明のペプチドの脂質への結合によって開始され得る。
【０１３１】
本発明に従ってペプチド組成物を用いて免疫処置を行う際、注入的、エアロゾル的、経口的、経皮的、経粘膜的、胸膜内腔的、クモ膜下腔的、またはその他の適切な経路を介して、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な多量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することにより本ワクチンに応答する。結果として、宿主はその後の感染に対して少なくとも部分的に免疫されるか、または現在進行中の慢性的な感染が進展することに対して少なくとも部分的に耐性をもつか、あるいは抗原が腫瘍関連の場合は少なくとも治療的利益を導き出す。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、本発明のヘテロクリティックアナログペプチドを、中和抗体およびまたはヘルパーＴ細胞の興味ある標的抗原に対する応答を誘導するか、あるいは促進する成分と結合することは望ましいことであり得る。このような組成物の好ましい実施形態は本発明に従って、クラスＩエピトープとクラスＩＩエピトープを包含する。このような組成物の代替の実施形態は、ＰＡＤＲＥTM（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）分子（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載されている）のようなｐａｎ−ＤＲ結合ペプチドに加え、本発明に従ったクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを包含する。
【０１３３】
本発明のワクチンはまた、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）を本発明のペプチドを提供するための媒体として包含する。ワクチン組成物は樹状細胞の動員および採取につづいてインビトロでつくられ得、これによって樹状細胞の負荷がインビトロで生じる。例えば、樹状細胞は例えば、本発明に従ったミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を伴ってトランスフェクションされるかまたはペプチドとともにパルスされる。それから、樹状細胞は、インビボで免疫応答を誘発するために患者に投与され得る。
【０１３４】
ＤＮＡまたはペプチドのいずれかに基づくワクチン組成物は、また樹状細胞の動員と組み合わせてインビボに投与され得、これによって樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
【０１３５】
抗原性のペプチドは同様にエキソビボでＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発するために用いられる。結果として生じるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、他の従来の治療形式では応答しないか、あるいは本発明の治療的なワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者の腫瘍を処置するのに使われ得る。エキソビボでのある特定の腫瘍関連する抗原に対するＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、患者または遺伝的に適合性のあるＣＴＬもしくはＨＴＬ前駆細胞を樹状細胞のような抗原提示細胞の供給源と適切な免疫原性のペプチドとともに組織培養中でインキュベートすることにより誘導される。適切なインキュベーション時間（代表的には約７〜２８日）経過後、この期間中この前駆細胞は活性化され効果細胞へと発展するが、この細胞は患者に再注入され、ここでこれらは特定の標的細胞（感染した細胞または腫瘍細胞）を破壊するか（ＣＴＬ）またはその破壊の促進を行う（ＨＴＬ）。トランスフェクションされた樹状細胞はまた抗原提示細胞として使われ得る。
【０１３６】
本発明のワクチン組成物は、またＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどのような免疫アジュバントと組み合わせる使用法を含む、癌に対する他の処置と組み合わせて使用され得る。
【０１３７】
好ましくは、ワクチンの用途でポリエピトープ組成物においてアレイのエピトープを封入のために選択する場合に、またはワクチンに取り込むため、および／またはミニ遺伝子のように核酸にコードされるために別個のエピトープを選択する場合、次の原則が利用される。選択を行うために、以下の原則のそれぞれのバランスを保つことが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれた複数のエピトープは、エピトープが誘導される天然の抗原の配列と隣接し得るが、しかしながらこれは隣接する必要はない。
【０１３８】
１）投与されると、腫瘍クリアランスに相関することが観察された免疫応答を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡ  Ｉ型について、これは少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＴＡ）に由来する３〜４個のエピトープを含む。ＨＬＡ  ＩＩ型について、類似の原理が採用される；再び、３〜４個のエピトープは、少なくとも１つのＴＴＡから選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。一つのＴＡＡからのエピトープは一つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープとの組み合わせで使用され得、頻出発現ＴＡＡ（ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ＴＡＡ）の様々な発現パターンを持つ腫瘍を標的とするワクチンを産生する。
【０１３９】
２）免疫原性と相関することが確立された必須結合親和性を有するエピトープが選択される：ＨＬＡ  Ｉ型は、５００ｎＭ以下しばしば２００ｎＭ以下のＩＣ50を有し、ＩＩ型については、１０００ｎＭ以下のＩＣ50を有する。
【０１４０】
３）十分なスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイは、広い集団適用範囲を与えるように選択される。例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカルロ解析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用範囲の広さまたは冗長性を評価し得る。
【０１４１】
４）癌関連性抗原からエピトープを選択する場合、患者は天然のエピトープに対して寛容性を発達し得ているため、アナログを選択することがしばしば有用である。感染疾患関連性抗原についてエピトープを選択する場合、天然のエピトープまたはアナログのエピトープのいずれかを選択することが好ましい。
【０１４２】
５）「入れ子状（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」と称されるエピトープは特定の関連性を有する。少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列において重複している場合、入れ子状エピトープが生じる。入れ子状ペプチド配列は、ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩエピトープの両方を包含する。入れ子状エピトープを提供する場合、一般的な目的は、一配列あたりの最多数のエピトープを提供することである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端より長いペプチドを提供しないようにすることである。多重エピトープ性配列（例えば、入れ子状エピトープを含む配列）を提供する場合、一般的にこれが病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、この配列をスクリーニングすることが重要である。
【０１４３】
６）ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを含む最小のペプチドを生成することが目的である。入れ子状エピトープを含むペプチドを選択する場合に用いられるものと同じではない場合、この原理は類似している。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用いて、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間の任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスを保たれる。スペーサーアミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ（免疫系により認識されるエピトープであって、標的抗原には存在せず、そしてエピトープの人工並列によってのみ作製される）を回避するため、またはエピトープ間の切断を促進し、それによりエピトープ提示を増大するために導入され得る。接合部エピトープは一般的に回避されるべきである。なぜなら、レシピエントは、非ネイティブのエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合部エピトープは特に関心をもたれる。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少または抑制されるこのような強力な応答を導き得る。
【０１４４】
（８．ミニ遺伝子ワクチン）
複数のエピトープを同時に送達し得る多数の異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子に含まれるエピトープは、好ましくは、前の章に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の１つまたは複数のエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物（ｍｉｎｉｇｅｎｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を使用する。
【０１４５】
多重エピトープ性ミニ遺伝子の使用は、以下に記載される（例えば、同時係属出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４；Ｉｓｈｉｏｋａ  ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９１５−３９２５，１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ  ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：４２６，１９９８）。例えば、ＴＡＡ、ＰＡＤＲＥTM汎用ヘルパーＴ細胞エピトープのようなｐａｎ＿ＤＲ結合ペプチドおよび小胞体トランスロケイティングシグナル（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）配列の複数の領域に由来する、スーパーモチーフおよび／またはモチーフを保有するエピトープ（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＡＰ、およびｈＫ２）をコードする多重エピトープ性ＤＮＡプラスミドが操作され得る。ワクチンはまた、他のＴＡＡ由来のエピトープを包含し得る。
【０１４６】
多重エピトープ性ミニ遺伝子の免疫原性をトランスジェニックマウスで試験して、この試験したエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価し得る。さらに、インビボにおいてＤＮＡでコードされたエピトープの免疫原性を、ＤＮＡプラスミドでトランスフェクションした標的細胞に対する特異的ＣＴＬ株のインビトロ応答と相関させ得る。従って、これらの実験は、このミニ遺伝子が以下の両方に有用であることを示し得る：１）ＣＴＬ応答を発生させること、および２）誘導ＣＴＬがコードされたエピトープを発現する細胞を認識すること。
【０１４７】
例えば、ヒトの細胞中での発現のために選択したエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を産生するために、このエピトープのアミノ酸配列は、逆翻訳され得る。ヒトのコドン使用表を利用して、各アミノ酸に対するコドン選択を誘導し得る。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列は、直接隣接されてもよく、その結果、翻訳される場合、連続するポリペプチド配列を産生する。発現および／または免疫原性を最適にするために、さらなるエレメントがミニ遺伝子の設計に取り込まれ得る。逆翻訳され得、そしてミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン結合シグナル配列、および／または小胞体標的シグナル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然に存在する、ＣＴＬエピトープまたはＨＴＬエピトープに隣接する隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を含むことによって改良され得；エピトープ（単数または複数）を含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０１４８】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを構築することによってＤＮＡに変換され得る。重複性オリゴヌクレオチド（３０〜１００の塩基長）を、周知の技術を使用する適切な条件下で、合成、リン酸化、精製およびアニールし得る。オリゴヌクレオチドの末端を、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して結合し得る。この合成ミニ遺伝子（エピトープポリペプチドをコードする）を、所望の発現ベクターにクローニングし得る。
【０１４９】
当業者に周知の標準調節配列は、好ましくは、標的細胞での発現を確実にするためにベクター中に含まれる。いくつかのベクターエレメントが所望される：ミニ遺伝子の挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；効果的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉの複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ  選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。多数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【０１５０】
さらなるベクターの改変は、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンは、効果的な遺伝子発現のために必要とされ、そして１つ以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンは、ミニ遺伝子の転写領域に取り込まれ得る。ミニ遺伝子の発現を増加させるために、ｍＲＮＡ安定化配列（ｍＲＮＡ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および哺乳動物細胞中での複製のための配列の封入がまた考慮され得る。
【０１５１】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドを、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、そしてＤＮＡを標準的な技術を使用して調製する。ミニ遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる他の全エレメントは、制限マップおよびＤＮＡ配列解析を使用して確認される。正確なプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンク（ｍａｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）および作業用細胞バンク（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）として保存され得る。
【０１５２】
さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性の役割を果たすようである。これらの配列は、所望の場合、免疫原性を増強するために、ミニ遺伝子コード配列の外側のベクター中に含まれ得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープと第二タンパク質（免疫原性を増強または減少させるために含まれる）との両方の産生を可能にするｂｉ−シストロン（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターを使用し得る。同時発現する場合、免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、またはＨＴＬ応答、ｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（例えば、ＰＡＤＲＥTM，Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープを細胞内標的シグナルに結合し、そして発現したＣＴＬエピトープから別個に発現し得る。これにより、ＨＴＬエピトープをＣＴＬエピトープとは異なる細胞画分に指向させることを可能にする。必要である場合、これにより、ＨＴＬエピトープのＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効果的な参加を可能にし、これによりＨＴＬ誘導を改良する。ＨＴＬまたはＣＴＬ誘導に対して、免疫抑制性の分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有用であり得る。
【０１５４】
治療量のプラスミドＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでの発酵、続く精製により産生され得る。作業用細胞バンクからのアリコートを、増殖培地に接種するために使用し、周知の技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で飽和まで増殖させる。プラスミドＤＮＡを、標準的なバイオ分離技術（例えば、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相陰イオン交換樹脂）を使用して精製し得る。必要とされる場合、スーパーコイルＤＮＡを、ゲル電気泳動または他の方法を使用して開環形態および線状形態から単離し得る。
【０１５５】
精製したプラスミドＤＮＡを、種々の処方物を使用して注入のために調製し得る。これらの最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の凍結乾燥したＤＮＡの再構成物である。「裸のＤＮＡ」として公知のこのアプローチは、現在、臨床試験において筋内（ＩＭ）投与のために使用されている。ミニ遺伝子のＤＮＡワクチンの免疫療法的効果を最大にするために、精製したプラスミドＤＮＡを処方するための代替方法が所望され得る。種々の方法が記載され、そして新規の技術が利用可能になり得る。カチオン性脂質、糖脂質、およびフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームがまた処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ  ＆  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｓｑｕｅｓ６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９号；およびＦｅｌｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３（１９８７）を参照のこと）。さらに、保護的、相互作用的、非縮合（ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）化合物（ＰＩＮＣ）として集合的に言及されるペプチドおよび化合物はまた、精製されたプラスミドＤＮＡに複合体化されて、安定性、筋内分散、または特定の器官もしくは細胞型への輸送のような変数に影響を与える。
【０１５６】
標的細胞の感作は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡは、標準的ＣＴＬのクロム放出アッセイ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ＣＴＬ  ｃｈｒｏｍｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）に対する標的として適切である哺乳動物細胞株に導入される。使用されるトランスフェクションの方法は、最終の処方物に依存する。エレクトロポレーションが「裸の」ＤＮＡのために使用され、一方、カチオン性脂質は、直接的なインビトロでのトランスフェクションを可能にする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは同時にトランスフェクションされて、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用してトランスフェクションされた細胞の濃縮を可能にし得る。次いで、これらの細胞は、クロミウム−５１（51Ｃｒ）で標識され、エピトープ特異的ＣＴＬ株のための標的細胞として使用される；51Ｃｒ放出によって検出された細胞溶解は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産生とミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープのＨＬＡ提示との両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して、類似様式で評価され得る。
【０１５７】
インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子のＤＮＡ処方物の機能的試験についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、ＤＮＡ産物で免疫される。投与の用量および経路は、処方物に依存する（例えば、ＰＢＳ中でのＤＮＡに対するＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡに対する腹腔内（ＩＰ））。免疫の２１日後、脾細胞を収集し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激した。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的な技術を使用してペプチド負荷した51Ｃｒで標識した標的細胞の細胞溶解についてアッセイを行う。ミニ遺伝子コード化エピトープに対応する、ペプチドエピトープで負荷したＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボでの誘導についてＤＮＡワクチン機能を証明する。ＨＴＬエピトープの免疫原性を、類似の様式でトランスジェニックマウスにおいて評価する。
【０１５８】
あるいは、例えば、注入または例えば米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような銃式送達によって、核酸を皮内に投与し得る。この技術を使用して、単独でＤＮＡを含む粒子を投与する。さらなる代替の実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０１５９】
ミニ遺伝子はまた、当該分野で他の周知の細菌性またはウイルス性の送達システムを使用して送達され得る。例えば本発明のエピトープをコードしている発現構築物はワクシニアのようなウイルスベクターに組み込まれ得る。
【０１６０】
（９.  ヘルパーペプチドとＣＴＬペプチドの組み合わせ）
本発明のペプチドを含むワクチンの組成物は、血清中における改良された半減期のような所望の性質を与えるため、または免疫原性を増大させるために改変され得る。
【０１６１】
例えば、Ｔヘルパー細胞の応答を誘導し得るエピトープを少なくとも１つ含むペプチドを結合させることにより、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は増大され得る。免疫原性を増大させるための、ＣＴＬエピトープと組み合わせたＴヘルパーエピトープの使用の例が、例えば以下の同時係属中出願、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／８２０，３６０、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１９７，４８４、およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／４６４，２３４に記載されている。
【０１６２】
ＣＴＬペプチドはＴヘルパーペプチドと直接結合し得るが、しばしばＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体はスペーサー分子により連結される。スペーサーは、代表的に生理的条件下において、実質的に荷電を帯びていないアミノ酸またはアミノ酸ミメティックのような、比較的小さな中性の分子を含む。スペーサーは、代表的に、例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、またはその他の中性の非極性アミノ酸および中性の極性アミノ酸の中性スペーサーから選択される。必要に応じて存在するスペーサーは同じ残基から構成される必要はなく、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることと理解される。スペーサーが存在する場合、通常、スペーサーは少なくとも１つまたは２つの残基であるが、さらに通常には３〜６つの残基、時には１０残基以上になる。ＣＴＬペプチドエピトープはＴヘルパーペプチドエピトープと直接またはスペーサーを介してのどちらかで、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで結合され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端はアシル化され得る。
【０１６３】
特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、集団の大部分に存在するＴヘルパー細胞により認識されるものである。これは、多数の、ほとんどの、あるいは全てのＨＬＡ  クラスＩＩ分子と結合するアミノ酸配列の選択によって達成され得る。これらのことは「ゆるいＨＬＡ制限」、または「乱雑な」Ｔヘルパー配列として、公知である。乱雑なペプチドの例としては、破傷風毒の位置８３０〜８４３（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（ＣＳ）タンパク質の位置３７８〜３９８（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  １８ｋＤ  タンパク質の位置１１６（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ）のような抗原由来の配列が挙げられる。その他の例としては、ＤＲ１−４−７スーパーモチーフ、もしくはＤＲ３モチーフのいずれかを保有するペプチドが挙げられる。
【０１６４】
あるいは、ゆるいＨＬＡ制限様式において、天然では見出されないアミノ酸配列を使用して、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ刊行物ＷＯ９５／０７７０７を参照）。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥTM、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ.，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物はほとんどのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に、最も優先的に結合するよう設計されている。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（ここで、「Ｘ」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、「ａ」はＤ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有するｐａｎ−ＤＲ結合エピトープペプチドは、それらのＨＬＡ型に関わらずほとんどのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）と結合すること、およびほとんどの個体由来のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見出されている。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」の天然アミノ酸を含み、エピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【０１６５】
ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的性質を変えるように修飾され得る。例えば、それらはＤ−アミノ酸を含むように修飾されて、それらのプロテアーゼ耐性を増大させ、そしてそれらの血清中半減期を延長させ得、または、それらを例えば、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子と結合させて、それらの生物学的活性を増大し得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて１以上のパルミチン酸鎖と結合され得る。
【０１６６】
（１０．Ｔ細胞刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）因子とＣＴＬペプチドの組み合わせ）
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激する成分が、本発明の薬学的組成物に含まれることが所望され得る。脂質は、インビボでウイルス抗原に対し、ＣＴＬ刺激をなし得る因子として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば１つ以上の連結した残基（例えばＧｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなど）を介して免疫原性ペプチドに結合され得る。次いで、脂質化ペプチドは、直接にミセルまたは微粒子のいずれかで投与され得るか、リポソームへ組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば不完全フロイントアジュバント）へ乳化され得る。好ましい免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基と結合したパルミチン酸を含み、このＬｙｓは、例えばＳｅｒ−Ｓｅｒのような結合を介して、免疫原性ペプチドのアミノ末端と結合している。
【０１６７】
ＣＴＬ応答を刺激する脂質のもう１つの例として、Ｅ．ｃｏｌｉのリポタンパク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（ｔｒｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｓ−ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ−ｓｅｒｉｎｅ：Ｐ3ＣＳＳ）は、ある適切なペプチドに共有結合した場合に、ウイルス特異的ＣＴＬを刺激することに使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓ，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１，１９８９を参照）。本発明のペプチドは、例えば、Ｐ3ＣＳＳに結合され得、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に刺激するため、個体に投与され得る。さらに、中和抗体の誘導もまた、Ｐ3ＣＳＳ結合エピトープにより刺激され得るため、２つのそのような組成物は、組み合わされて、体液性および細胞媒介性応答の両方をさらに効果的に誘発し得る。
【０１６８】
ＣＴＬおよび／あるいはＨＴＬペプチドは、ペプチドの末端へのアミノ酸の付加によっても修飾され、あるペプチドをもう１つのペプチドへ結合することの容易さ、キャリア支持体またはより大きなペプチドへの結合、ペプチド、オリゴペプチドなどの物理学的または化学的特性の修飾を提供し得る。アミノ酸（例えばチロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸など）は、ペプチドまたはオリゴペプチド、特にクラスＩペプチドのＣ−末端またはＮ−末端に導入され得る。しかしながら、ＣＴＬエピトープのカルボキシ末端においての修飾が、いくつかの場合において、ペプチドへの結合特性を変化させ得ることは注意されるべきである。さらに、ペプチド配列またはオリゴペプチド配列は末端のＮＨ2アシル化（例えば、アルカノイル（Ｃ1〜Ｃ20）またはチオグリコリルアセチル化）による、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミンなど）によって修飾されることによって天然の配列と異なり得る。いくつかの例において、これらの修飾は、支持体または他の分子との結合のための部位を提供し得る。
【０１６９】
（１１．ＣＴＬおよび／またはＨＴＬペプチドでパルス化（ｐｕｌｓｅｄ）されたＤＣを含むワクチン組成物）
本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、患者の血液由来のＰＢＭＣへのエピトープ保有ペプチドのカクテル、またはＰＢＭＣから単離したＤＣへのエピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を包含する。ＤＣの採取を容易にする薬（例えばＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎTM（Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用され得る。ペプチドでＤＣをパルス化した後でかつ、患者に再注入する前に、ＤＣは結合していないペプチドを除くため洗浄される。この実施形態において、ワクチンは、ＨＬＡ分子とその表面で複合体になった、パルス化されたペプチドエピトープを提示するペプチドパルス化ＤＣを包含する。
【０１７０】
ＤＣは、エキソビボでペプチドカクテル（それらのうちのいくつかは、目的の１つ以上の抗原に対するＣＴＬ応答を刺激する）でパルス化され得る。必要に応じて、ヘルパーＴ細胞ペプチド（例えば、ＰＡＤＲＥTMファミリー分子）は、ＣＴＬ応答を容易にするするため、含有され得る。
【０１７１】
（１２．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与）
本発明のペプチド、本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、代表的に癌の処置のために治療的に使用される。本発明のペプチドを含有したワクチン組成物は、代表的に、１つ以上の抗原の発現に関連した悪影響を有する癌患者へ投与される。あるいは、ワクチン組成物は、癌の進行に対して影響を受けやすい、さもなくば癌の進行の危険にある個人に対し投与され得る。
【０１７２】
治療適用において、ペプチド組成物および／もしくは核酸組成物は、腫瘍抗原に対する効果的なＣＴＬ応答および／もしくはＨＴＬ応答を誘発するため、そして症状および／もしくは合併症を治癒するか、少なくとも部分的に止める、もしくは遅らせるために十分な量で患者に投与される。これを満たすのに十分な量は、「治療的有効用量」と定義される。この使用に十分な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与方法、治療される疾患の段階および重篤度、患者の体重および全般的な健康状態、ならびに処方医の判断に依存する。
【０１７３】
上に記載したように、本発明のＣＴＬエピトープおよび／もしくはＨＴＬエピトープを含むペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬ特異的にＨＬＡ分子によって提示される場合、およびこのペプチドに含まれるエピトープに特異的なＣＴＬまたはＨＴＬと接触される場合に、免疫応答を誘導する。ペプチド（またはそれらをコードするＤＮＡ）は、個別に、または１つ以上のペプチド配列の融合物として投与され得る。ペプチドがＣＴＬまたはＨＴＬと接触される方法は、本発明には重要でない。例えば、ペプチドは、インビボもしくはインビトロのいずれかで、ＣＴＬまたはＨＴＬと接触し得る。接触が、インビボで起きる場合、ペプチド自体が患者に投与され得るか、または他のビーイクル（例えば、１つ以上のペプチドをコードしたＤＮＡベクター、ペプチドをコードしたウイルスベクター、リポソームなど）が、本明細書中に記載されるように使用され得る。
【０１７４】
ペプチドが、インビトロで接触する場合、ワクチン因子は、細胞の集団（例えば、ペプチドパルス化樹状細胞）、または抗原提示細胞をペプチドでパルス化すること、もしくは本発明品のミニ遺伝子を抗原提示細胞にトランスフェクトすることによって誘導されたＴＡＡ特異的ＣＴＬを含有し得る。そのような細胞集団は、続いて、治療的有効用量で患者に投与される。
【０１７５】
治療に用いるために、投与は、一般的に、最初の癌の診断の時点で始まるべきである。これに続いて、少なくとも実質的に症状がやわらげられるまで、そしてその後ある期間にわたって追加抗原投与量がブーストされる。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、例えばペプチドカクテル、ポリエピトープ性ポリペプチド、ミニ遺伝子、またはＴＡＡ特異的ＣＴＬ、またはパルス化された樹状突起細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない）は、疾患の段階、あるいは患者の健康状態によって変り得る。例えば、ＴＡＡ特異的ＣＴＬを含むワクチンは、進行した疾患を有する患者中において、腫瘍細胞を殺傷する際に、代変の実施形態より効果的であり得る。
【０１７６】
本発明のワクチン組成物はまた、外科手術などの処置と組み合わせても、治療的に用いられ得る。１つの例は、患者が、原発性腫瘍を取り除くための手術を受けており、次いで、ワクチンが、再発および／もしくは転移を、遅らせるか、または予防するために使用される状況である。
【０１７７】
感受性の個体（例えば、前立腺腫瘍を発病するような遺伝的素因があると診断され得る個体）が、癌の診断に先立って特定される場合、組成物が、彼らに対して標的化され得、したがってより大きな集団への投与の必要性を最小にす得る。
【０１７８】
最初の、治療的免疫のための用量決定は、一般的に、下限の値が、約１、５、５０、５００、または１，０００μｇであり、そして上限の値が、約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇの単位投薬範囲にある。ヒトについての投薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。確立された間隔（例えば、４週間から６ヶ月）で、ブースト投薬前の、最初の投薬は、患者を効果的に処置するため、ことによると長期の時間の間、必要とされ得る。ブーストレジメンに従って、数週間から数ヶ月にわたる、ペプチドの約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のブースト投薬は、患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定することによって決定される患者の応答および状態に依存して投与され得る。
【０１７９】
少なくとも臨床的症状または実験的試験が、腫瘍が除去されたかまたは腫瘍細胞荷重が実質的に減少したことを示すまでそしてその後のある期間の間、投薬が続けられるべきである。投薬、投与の経路、および投薬スケジュールは、当該分野で公知の方法論に従って調節される。
【０１８０】
ある実施形態において、本発明のペプチドおよび組成物は、重症な疾患状態、すなわち、生命を危うくする状況または潜在的に生命を危うくする状況で使用される。このような場合において、最小量の外来の物質および本発明の好ましい組成物におけるペプチドの比較的非毒性の性質の結果として、これらの記述された投薬量に対して実質的に過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが、可能であり、そして処置する医師によって望ましいと感じられ得る。
【０１８１】
本発明のワクチン組成物は、予防因子としても使用され得る。例えば、組成物は、前立腺癌進行の危険性を有する個体に投与され得る。一般的に、最初の予防的免疫のための一般的な投与量は、下限の値が約１、５、５０、５００、または１０００μｇであり、そして上限の値が約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬範囲にある。ヒトについての投薬量の値は、典型的に、７０キログラムの患者あたり約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、最初のワクチン投与後、約４週間〜約６ヶ月の規定された間隔で投与される、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のペプチドがブースト投薬される。ワクチンの免疫原性は、患者の血液のサンプルから得られたＣＴＬおよびＨＴＬの特異的活性を測定することによって評価され得る。
【０１８２】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的投与、局所的投与、経口投与、くも膜下投与、または局所投与に意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、皮下に、皮内に、または筋内に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解されるかまたは懸濁される免疫原性ペプチドの溶液を含む非経口投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリアは、例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌化技術によって滅菌化され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、そのままでの使用のためにパッケージングされ得るか、または凍結乾燥され得、この凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と組み合わせられる。この組成物は、およそ生理学的条件に必要とされる薬学的に受容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤、緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤、保存剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。
【０１８３】
薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、幅広く、すなわち、約０．１重量％未満、通常、約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％以上の多さまでで変化し得、主に、選択される投与の特定の様式に従って、流体容積、粘度などによって選択される。
【０１８４】
ペプチド組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そしてこのような組成物のヒトへの投与に使用されるための当業者によって公知の流体の容積で投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄｉｔｏｒ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８５を参照）。
【０１８５】
本発明のペプチドはまた、リポソームを介して投与され得、リポソームは、ペプチドを特定の組織（例えば、リンパ組織）に標的化させるために、または感染した細胞に選択的に標的化させるために、そしてペプチド組成物の半減期を増加させるために役立つ。リポソームには、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、層状層などが挙げられる。この調製物において、送達されるべきペプチドは、リポソームの一部として、単独であるいはリンパ系細胞に広く行き渡るレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）とともに、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成物とともに組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで負荷されるかまたは装飾（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）されるかのいずれかのリポソームが、リンパ系細胞の部位に指向され得、ここで、そのときリポソームがペプチド組成物を送達する。本発明に従う使用のためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これには、一般的に、中性および陰性に荷電されたリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）が挙げられる。脂質の選択は、一般的に、例えば、リポソームサイズ、酸不安定性および血流中のリポソームの安定性を考慮してガイドされる。種々の方法が、リポソームを調製するために利用可能であり、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載される。
【０１８６】
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに組み込まれるリガンドには、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局所的（ｌｏｃａｌｌｙ、ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）などで、特に投与の方法、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変化する用量で投与され得る。
【０１８７】
固体組成物について、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、これには、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたもの）および一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド）、より好ましくは、２５％〜７５％の濃度で組み込むことによって形成される。
【０１８８】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤とともに細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的な割合は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、１重量％〜１０重量％である。界面活性剤は、もちろん非毒性でなければならず、そして好ましくは噴霧剤に可溶である。このような薬剤の代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分エステル、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびオレイン酸と、脂肪族多水酸基アルコールまたはその環式無水物である。混合エステル（例えば、混合または中性グリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、０．２５〜５重量％を構成し得る。組成物の残りは、通常、噴霧剤である。キャリアはまた、望ましいならば、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンとともに含まれ得る。
【０１８９】
（１３．キット）
本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示書とともにキットの形態で提供され得る。代表的なキットは、容器内に、好ましくは、単位用量形態の所望のペプチド組成物および投与のための指示書を含む。代替的なキットは、投与のための指示書とともに、容器内に、好ましくは単位用量形態で、本発明の所望の核酸を伴うミニ遺伝子構築物を含む。ＩＬ−２またはＩＬ−１２のようなリンホカインもまた、キットに含まれ得る。所望であり得る他のキット構成要素には、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および他の所望の賦形剤が挙げられる。
【０１９０】
本発明に従うエピトープは、免疫応答を誘導するために首尾良く使用された。これらのエピトープを用いる免疫応答は、種々の形態においてエピトープを投与することによって導入された。エピトープは、ペプチドとして、核酸として、そして本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターとして投与された。ペプチドに基づくエピトープ形態の投与において、免疫応答は、エピトープを細胞で発現される空のＨＬＡ分子上に直接負荷することによって、そしてエピトープのインターナリゼーションを介して、そしてＨＬＡ  Ｉ型経路を介してプロセスすることによって導入された；いずれの場合においても、エピトープを発現するＨＬＡ分子は、次いで、相互作用し得、そしてＣＴＬ応答を誘導し得た。ペプチドは、直接的に、またはリポソームのような薬剤を使用して送達され得る。これらは、さらに、銃式送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ここで、ペプチドは、代表的には、結晶形態である）を使用して送達され得る。ＤＮＡが免疫応答を誘導するために使用される場合、裸のＤＮＡとして（一般的に、約１〜５ｍｇの投薬範囲）または銃式「遺伝子銃」送達を介して（代表的に、約１０〜１００μｇの投薬範囲）のいずれかで投与される。ＤＮＡは、種々のコンホメーション（例えば、線状、環状など）で送達され得る。種々のウイルスベクターもまた、本発明に従ってエピトープをコードする核酸を含んで首尾良く使用されている。
【０１９１】
従って、本発明に従う組成物は、いくつかの形態で存在する。本発明に従うこれらの組成物形態のそれぞれの実施形態は、免疫応答を誘導するために首尾良く使用されている。
【０１９２】
本発明に従う１つの組成物は、複数のペプチドを含む。この複数またはカクテルのペプチドは、一般的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤と混合される。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含み得るか、またはペプチドの混合物を含み得る。ペプチドは、天然のエピトープのアナログであり得る。ペプチドは、人工のアミノ酸および／または化学的改変（例えば、脂質化；アセチル化、グリコシル化、ビオチニル化、リン酸化のような表面活性分子の添加）を含み得る。ペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープであり得る。好ましい実施形態において、ペプチドカクテルは、複数の異なるＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。ＨＴＬエピトープは、天然または非天然（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であり得る。本発明の実施形態における異なるエピトープの数は、一般的に、１〜１５０の整数（ｗｈｏｌｅ  ｕｎｉｔ  ｉｎｔｅｇｅｒ）である（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、・・・、１５０）。
【０１９３】
本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド多重エピトープ性構築物（すなわち、ポリエピトープペプチド）を含む。本発明に従うポリエピトープペプチドは、当該分野において周知の技術の使用によって調製される。これらの公知の技術の使用によって、本発明に従うエピトープは、互いに接続される。ポリエピトープペプチドは、線状または非線状（例えば、多価）であり得る。これらのポリエピトープ構築物は、人工アミノ酸、スペーシングまたはスペーサーアミノ酸、隣接アミノ酸（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、または隣接エピトープユニット間の化学改変を含み得る。ポリエピトープ構築物は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーであり得る。ポリエピトープ構築物は、一般的に、２〜１５０の間の任意の整数の量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、・・・、１５０）でエピトープを含む。ポリエピトープ構築物は、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。構築物中の１つ以上のエピトープは、例えば、表面活性物質（例えば、脂質）の付加によって改変され得るか、または化学的に改変され得る（例えば、アセチル化など）。さらに、多重エピトープ性構築物における結合は、ペプチド結合以外（例えば、共有結合、エステルまたはエーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など）であり得る。
【０１９４】
あるいは、本発明に従う組成物は、ネイティブな配列に対する相同性を有する（すなわち、対応するかまたは接触（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）する）アミノ酸の系列、配列、ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む構築物を含む。このアミノ酸のストレッチは、より長い系列のアミノ酸から切断されるかまたは単離される場合、本発明に従って、ＨＬＡ  Ｉ型エピトープまたはＨＬＡ  ＩＩ型エピトープとして機能するアミノ酸の少なくとも１つのサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。この実施形態において、ペプチド配列は、当該分野で公知であるかまたは提供される多数の技術を使用することによって、本明細書中に規定されるような構築物になるように改変される。ポリエピトープ構築物は、７０〜１００％（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％）の任意の整数の増分でネイティブな配列に対して相同性を含み得る。
【０１９５】
本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明に従う１つ以上のエピトープを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、「専門的」抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）であり得る。抗原提示細胞は、当該分野において公知の任意の手段または当該分野において決定された任意の手段によって本発明のエピトープを含み得る。このような手段には、樹状細胞を１つ以上の個々のエピトープまたは複数のエピトープを含む１つ以上のペプチドで、銃式核酸送達のような核酸投与によって、または核酸の投与について当該分野の他の技術（ベクターに基づく（例えば、ウイルスベクター）核酸の送達を含む）によって適用することを含む。
【０１９６】
本発明に従う組成物のさらなる実施形態は、本発明の１つ以上のペプチドをコードする核酸、または本発明に従うポリエピトープペプチドをコードする核酸を含む。当業者によって理解されるように、種々の核酸組成物が、遺伝子コードの冗長性に起因して同じペプチドをコードする。これらの核酸組成物のそれぞれは、本発明の範囲内に含まれる。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、特定の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。本発明に従うペプチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明に従う任意の他のペプチドに基づく組成物が、本発明の範囲内であることが理解される。
【実施例】
【０１９７】
（実施例）
（調製Ａ）
（ペプチド合成およびペプチドアナログの生成）
これらの実施例で用いられるペプチドを表１に示す。腫瘍関連抗原に由来している全ての野生型ヒトＣＴＬエピトープならびにＨＩＶおよびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ2）のポリメラーゼ遺伝子に由来している野生型ウイルスエピトープは、ヒトおよびトランスジェニックマウスの系における免疫原性が示されている（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）５９：１；Ｉｓｈｉｏｋａ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２：３９１５）。
【０１９８】
ヘテロクリティックな活性について最初に試験されたペプチドは、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖｉｃｔｏｒ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって合成された。さらなる生物学的特徴付けを必要としているペプチドは、（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７４：９２９）の方法を用いてＥｐｉｍｍｕｎｅにて合成され、分析用逆相ＨＰＬＣによって決定された場合に、これらのペプチドの純度は通常９５％より高かった。後者のペプチドの正体を質量スペクトル分析によって確認した。
【０１９９】
（調製Ｂ）
（単一アミノ酸置換の選択についてのスキーム）
表２は、所定のアミノ酸置換を、保存的置換、半保存的置換、または非保存的置換であるとして特徴付けし得るように、任意の所定のアミノ酸対の間の類似性の割り当てを示す。
【０２００】
アミノ酸対の間の類似性の程度を、各アミノ酸対について、ＰＡＭ２５０に関する順位係数スコア（ｒａｎｋ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ）、疎水性度および以下に述べるような側鎖の体積を平均化することによって定量した。これらの複合した順位の平均値に基づいて、この表は各対が保存されているか、半保存されているか、または保存されていないかを示す。
【０２０１】
Ｄａｙｈｏｆｆ  ＰＡＭ２５０スコア（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５巻，補遺３．（１９７８）Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編．Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，３４５頁；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（１９９３）（第２版）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ；ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ａａｉｎｆｏ／ｐａｍ２５０．ｈｔｍｌ）は、規定された時間枠の範囲内で受容可能な点変異（ＰＡＭ）の百分率を測定する、一般的に利用されるタンパク質アラインメントスコア付けマトリクスである。これらの変異の頻度はランダム変異の確率から予想されるものとは異なり、恐らく、置換に関与するアミノ酸対の物理的および化学的類似性の程度に起因する偏向を反映する。類似性の他の尺度を用いて標準化され得るアミノ酸類似性のスコアを得るために、ＰＡＭ２５０スコアを順位値（ｒａｎｋ  ｖａｌｕｅ）に変換した。ここで、１は受容された変異であるという最も高い確率を示している。
【０２０２】
２０個の天然に存在するアミノ酸の相対的疎水性度を表すために、最もよく一般的に利用されるスケール（Ｃｏｒｎｅｔｔｅ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（１９８７）１９５：６５９）は、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＲ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５）、ならびにＦａｕｃｈｅｒｅおよびＰｌｉｓｋａ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．およびＶ．Ｐｌｉｓｋａ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９８３）１８：３６９）による実験データを基礎として発展したものである。Ｋｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスケールは個々のアミノ酸のＨ2Ｏ／有機溶媒分配を測定する。このスケールは折り畳まれたタンパク質のアミノ酸の位置を考慮するので、このスケールは、タンパク質の状況下におけるネイティブな疎水性度を最も正確に反映し得る。Ｆａｕｃｈｅｒｅ／ＰｌｉｓｋａスケールはＮ−アセチルアミノ酸アミドのオクタノール／Ｈ2Ｏ分配を測定し、変性タンパク質および／または、低分子合成ペプチドの状況下における疎水性度を最も正確に反映する。疎水性度についてのスコアを得るために、各アミノ酸残基をＫｙｔｅ／ＤｏｏｌｉｔｔｌｅおよびＦａｕｃｈｅｒｅ／Ｐｌｉｓｋａ疎水性度スケールの両方において順位付けした。２つのスケール間の平均順位を計算し、各対についての疎水性度の差の平均を計算した。
【０２０３】
最後に、アミノ酸側鎖の体積を計算するために、１分子または１グラムのいずれかのアミノ酸残基を添加した後の水の体積の増加を留意することによって得られる溶液中の分体積を考慮した。（Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ａ．Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８４）１３：１４５；Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７２）２４：１０７）。２０個の天然に存在するアミノ酸に関して可能な各対の分体積の絶対的差異を計算し、そして順位付けた。ここで、１は最も類似する体積を有する残基、そして２０は最も異なる体積を有する残基を示した。
【０２０４】
（調製Ｃ）
（アッセイのための材料）
（１．ＡＰＣ株）
ＨＬＡ−Ａ２．１の状況下でぺプチドを提示する細胞株は以下のように調製された：
．２２１Ａ２．１細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子をＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ−ヌル変異体ＥＢＶ−形質転換ヒトＢ−リンパ芽球細胞株３Ａ４−７２１．２２１（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）５９：１）にトランスフェクションすることによって生成した。
【０２０５】
腫瘍細胞株はメチルコラントレン（ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ）誘導性肉腫であるＭｅｔｈ  Ａ細胞のトランスフェクションによって調製した。そして、Ｊｕｒｋａｔ細胞株ではＨＬＡ−Ａ２．１またはＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋb導入遺伝子のトランスフェクションを、他（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．らＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１７３：１００７）で述べた方法を用いて行った。ＨＬＡ型黒色腫細胞株６２４ｍｅｌ（Ａ２．１+，ＭＡＧＥ+）および８８８ｍｅｌ（Ａ２．１-，ＭＡＧＥ-）の組み合わせはＹ．ＫａｗａｋａｍｉおよびＳ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の御好意により提供され、そして内因的にプロセシングされたＭＡＧＥ３エピトープの提示を測定するために用いられた。（Ｂｏｏｎ，Ｔ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：３３７）。その黒色腫細胞株をＡＰＣとして使用する前に、１００ＩＵ／ｍｌヒトＩＦＮγ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で４８時間、３７℃で処理した。
【０２０６】
本研究で用いた全ての細胞は、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖させた。
【０２０７】
（２．インビトロでのヒトＰＢＭＣからのＣＴＬの誘導およびヒトＣＴＬ株の誘導体化）
ＭＡＧＥ３．１１２および癌胎児抗原（ＣＥＡ）エピトープであるＣＥＡ．６９１に対するペプチド特異的なＣＴＬ株を生成するために、インビトロにおいて正常な被験体からのＰＢＭＣを、（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．らＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）５９：１）に記載のようなペプチドを用いて繰り返し刺激した。簡潔には、ペプチドを適用した（ｐｕｌｓｅｄ）樹状細胞（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４中で培養することによって接着性ＰＢＭＣから区別した）を、抗体でコーティングしたビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｗａｙ）を用いたポジティブ選択によって得られた自己ＣＤ８+Ｔ細胞とともに、４８ウェルプレート中で共存培養した。ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１０の存在下での培養の７日目後、インビトロにおいて、ペプチドを適用した（ｐｕｌｓｅｄ）接着性ＰＢＭＣを用いて各ＰＢＭＣ培養物（ウェル）を再刺激した。次いで、ペプチドの存在下または非存在下において、腫瘍ＡＰＣ．２２１Ａ２．１を用いて刺激した後のＩＦＮγ生成を測定することによって、ＣＴＬ活性について培養物を試験した。ＣＴＬ株はペプチド特異的なＩＦＮγ応答を示したＰＢＭＣ培養物から、ペプチドを適用した接着性ＰＢＭＣを用いたさらなるインビトロ刺激よって増殖した。
【０２０８】
（３．マウスＣＴＬ株）
エピトープＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５およびＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６ペプチドに対するＣＴＬ株を、他（Ｉｓｈｉｏｋａ、Ｇ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２：３９１５）に記載されているようなＤＮＡ免疫によって、ＨＬＡ−Ａ２．１／ＫbXSトランスジェニックマウス中で産生した。ＨＬＡ−Ａ２．１／ＫbXSおよびＨＬＡ−Ａ２．１／ＫbXdトランスジェニックマウスはＥｐｉｍｍｕｎｅで飼育された。これらの株は、Ｃ５７ＢＬ／６のバックグラウンド（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．らＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９１）１７３：１００７）において作製されたＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbトランスジェニック株と、それぞれＳＪＬまたはＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）との間の交雑のＦ１世代を表す。ＭＡＧＥ２．１５７エピトープに対するＣＴＬ株は、８〜１２週齢ＨＬＡ−Ａ２．１／ＫbXSマウスの尾部の基部に、ＩＦＡ中で乳化された５０μｇのペプチドおよび１４０μｇのＨＢＶ  Ｃｏｒｅ．１２８ＴｈエピトープであるＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ（配列番号３０）を免疫し、そしてインビトロでペプチドを用いて繰り返し初回刺激した脾細胞を再刺激することよって生じた。
【０２０９】
（調製Ｄ）
（アッセイ方法）
（１．ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対するペプチド結合親和性の測定）
放射性標識された標準ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１への結合について、所定の試験ペプチドによって誘導される競合のレベルを決定することによって、試験ペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１への結合を測定した。ゲル濾過によってＭＨＣ結合性放射能の百分率を決定し、そして、標識された標準ペプチドの結合の５０％を阻害した試験ペプチドの濃度（ＩＣ50）を計算した（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９３）７４：９２９；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）３１：８１３）。標準ペプチドはＨＢＶ  Ｃｏｒｅ．１８エピトープであった（配列ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ）。
【０２１０】
（２．ＣＴＬによるマウスおよびヒトのＩＦＮγ、ＩＬ５およびＩＬ１０産生の測定）
インサイチュの捕捉ＥＬＩＳＡを、ＣＴＬからのＩＦＮγ放出を測定するために使用した（ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０００）２３７：１０５）。簡潔には、ＣＴＬを抗マウスＩＦＮγ（クローンＲ４−６Ａ２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または抗ヒトＩＦＮγ  ｍＡｂ（クローンＮＩＢ４２，Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）のいずれかをプレコーティングしたＥＬＩＳＡ等級の９６ウェル平底ウェル中においてＡＰＣおよびペプチドを用いて刺激した。細胞培養後、ウェルを洗浄し、ビオチン化した抗マウスＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ｍＡｂまたは抗ヒトＩＦＮγ（クローン４Ｓ．Ｂ３，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）ｍＡｂを加えた後、酵素結合体化ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）および３，３'，５，５'テトラメチルベンジジン基質（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＴＭＢ基質キット、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加えることによって現像した。各ウェルの吸光度は４５０ｎｍでＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＲＣ  ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて測定した。各ウェルで生成されたＩＦＮγのレベルを、同じアッセイ方法で確立されたマウスまたはヒトのＩＦＮγの検量線から外挿することによって決定づけた。
【０２１１】
マウスおよびヒトのＩＬ５およびＩＬ１０をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて培養上清中で測定した。これらのアッセイを定量的サンドイッチＥＬＩＳＡ技術を用い、製造業者のプロトコールに従って行った。
【０２１２】
（３．エキソビボＣＴＬ応答を測定するための酵素結合免疫スポット（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイ）
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを標準プロトコール（Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９８）８：１７７；Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８７：３９１）に従って行った。簡潔には、平底９６ウェルニトロセルロースプレート（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を抗ＩＦＮγｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ，クローンＲ４−６Ａ２）でコーティングし、４℃で一晩中インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で３７℃で１時間でブロックした。磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって単離された４×１０5個の脾性ＣＤ８+細胞および１０μｇ／ｍｌのペプチドを適用された５×１０4個のＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋb細胞を各ウェルに加え、細胞を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いてプレートを徹底的に洗浄した後、ビオチン化した抗ＩＦＮγ  ｍＡｂ（２μｇ／ｍｌ，クローン  ＸＭＧ１．２）を各プレートに加え、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む）およびＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  キット；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で４回洗浄した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄し、次いでさらに３回１×ＰＢＳで洗浄した。スポットを現像するために１００μｌのＡＥＣ溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた。反応は流水している水道水のもとで４−６分後に停止した。スポットをコンピューター支援画像分析（Ｚｅｉｓｓ  ＫＳ  Ｅｌｉｓｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてカウントした。１０6個のＣＤ８+細胞あたりの正味のスポット数を、以下［(関連ペプチドに対するスポット数）−（非関連ペプチドに対するスポット数）］×２．５として計算した。
【０２１３】
（実施例１）
（ヘテロクリティックな活性についてのペプチドアナログのスクリーニング）
（Ａ．ＩＦＮγ放出の増加に関与しているＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２アナログの同定）
アナログのスクリーニングの前に、広範囲な野生型ペプチド用量にわたってＣＴＬ株からのＩＦＮγ生成のペプチド用量滴定を、行った。．２２１Ａ２．１腫瘍細胞に異なる用量のペプチドを適用し、次いで、１０5個のペプチド負荷細胞を同数のマウスまたはヒトＣＴＬと共に培養した。３７℃で２４時間（マウス）または４８時間（ヒト）のインキュベーション後、ＣＴＬによって放出されたＩＦＮγのレベルをインサイチュ捕捉ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。用量滴定曲線を決定した後、ペプチドアナログのパネルの抗原性をスクリーニングするために、野生型ペプチドに対する活性がほとんど検出可能でない最適以下ペプチド用量を選択した。全てのマウスおよびヒトＣＴＬ株について、この最適以下用量の範囲は０．１〜１μｇ／ｍｌであった。マウスＣＴＬ株は第３ドメイン内のマウスＨ−２Ｋb配列を有しているＨＬＡ分子を発現するＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbxsトランスジェニックマウスにおいて生成されたが、すべてがネイティブなＨＬＡ−Ａ２．１分子を発現するＡＰＣ上に提示されているペプチドに反応したということに留意すべきである。
【０２１４】
ペプチドアナログのスクリーニングについて、．２２１Ａ２．１細胞に選択された最適以下用量の各アナログを適用し、前述したようにペプチド負荷ＡＰＣをＣＴＬと共に培養した。次いで、さらなる特徴づけのために、野生型ペプチドと比較して増強されたＣＴＬ応答を誘導するアナログを選択した。これらのアナログを、前述したのと同じ条件のもとで野生型エピトープと並行してペプチド用量滴定を行うことによって特徴付けた。
【０２１５】
ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２エピトープに特異的なＣＴＬ株を、調製Ｃで記載したように、インビトロにおいてペプチド負荷樹状細胞または接着性単球を用いてヒトＰＢＭＣの再刺激を繰り返すことによって、誘導した。
【０２１６】
１７個の異なる単一アミノ酸で各残基を体系的に置換することによって合計１１７ＣＥＡ．６９１および１１６個のＭＡＧＥ３．１１２アナログを作製した。ＣＥＡ．６９１はＩＭＩＧＶＬＶＧＶ（配列番号１）；ＭＡＧＥ３．１２２はＫＶＡＥＬＶＨＦＬ（配列番号５）である。Ｃｙｓ、ＴｒｐおよびＭｅｔ残基は、それらが保存的変化に対応しない限り、一般に回避した。主なＭＨＣアンカー位置、位置２およびＣ末端以外のペプチドの全ての位置で置換を導入した。
【０２１７】
次いで、インビトロでこれらのアナログのを、その抗原性について試験した。野生型ペプチドに応答するＩＦＮγ生成がほとんど検出可能でない抗原濃度を規定にするために、前述したように、予備的な用量滴定実験を各ＣＴＬ株について行った。ついで、Ｔ細胞刺激の許容量の増加に関連したアナログを同定するために、引き続きこの最適以下濃度をアナログペプチドの各エピトープについてのすべての抗原性分析に用いた。このような抗原性分析の結果を図１に示す。図１Ａに示すように、最適以下１００ｎｇ／ｍｌ用量では、野生型ＣＥＡ．６９１ペプチドは最低限のＩＦＮγ生成（５０ｐｇ／ウェル未満）しか生じなかった。対照的に、いくつかのＣＥＡ．６９１アナログ（Ｍ３、Ｌ４、Ｐ４、Ｈ５、Ｌ５、Ｈ６、Ｔ６およびＩ７）は、同じ用量で、１５０〜３５０ｐｇ／ウェルの範囲内で検出可能なレベルのＩＦＮγの産生を、誘導した。図１Ｂに示したように、野生型ペプチドのＭＡＧＥ３．１１２特異的ＣＴＬ株１００ｎｇ／ｍｌが１００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγの放出を誘導したが、２つのアナログ（Ｉ５およびＷ７）は３００ｐｇ／ウェル以上のＩＦＮγレベルの誘導に関連していた。
【０２１８】
さらなる特徴付けのために、１００ｐｇ／ウェルを超えるＩＦＮγを刺激したＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２の全てのアナログを選択し、完全な用量滴定はヘテロクリティックなアナログを同定するために実施した。ヘテロクリティックなアナログは野生型ペプチドの１０倍以下のペプチド濃度で、有意なＩＦＮγ放出（１００ｐｇ／ウェルより大きい）を刺激するアナログである。ＣＥＡ．６９１エピトープについては２つの異なるアナログ、Ｍ３（配列番号２）およびＨ５（配列番号３）を同定した。図１Ｃで見られるように、エピトープＣＥＡ６９１について、アナログＭ３およびＨ５が０．０１ｎｇ／ｍｌ程度の少ないペプチドを用いて有意な放出を刺激したが、野生型ペプチドは１〜１００μｇ／ｍｌの用量範囲で有意に検出可能なＩＦＮγシグナルを産出した。これらの基準によると、これらの２つのＣＥＡ．６９１アナログは、モル濃度に基づき、ＩＦＮγ放出の点において、その未改変野生型対応物よりも１００，０００倍以上強力である。
【０２１９】
同様に、ＭＡＧＥ３．１１２エピトープについて、２つのヘテロクリティックなアナログ、Ｉ５およびＷ７を同定した。図１Ｄに示すように、等価な応答を刺激するためには、０．１ｎｇ／ｍｌのＩ５（配列番号６）またはＷ７（配列番号７）アナログのいずれかが必要であったが、１μｇ／ｍｌの野生型ペプチド濃度が有意なＩＦＮγの放出に必要とされた。これは、野生型ペプチドと比較して１００，０００倍より高い生物学的な活性の増加に対応する。
【０２２０】
一般的に、ヘテロクリティックなアナログは用量応答変化を誘導するのみならず、野生型ペプチドと比較してより高いレベルのＩＦＮγを産出するためのＣＴＬ応答を刺激した。その結果、アナログに応答して達成される最大用量応答（プラトー）は未改変抗原に応答して得られる応答よりはるかに高かった。
【０２２１】
（実施例２）
（さらなるヘテロクリティックなアナログの同定）  
３つのさらなるＡ２．１拘束エピトープ、ＭＡＧＥ２．１５７  ＹＬＱＬＶＦＧＩＥＶ、配列番号７腫瘍エピトープ、およびウイルス抗原からの２つのエピトープ、ＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５、ＧＬＳＲＹＶＡＲＬ（配列番号１６）およびＨＩＶ  ｐｏｌ．４７６  ＩＬＫＥＰＶＨＧＦ（配列番号１８）を分析した。これらのエピトープは全て、ＣＴＬに対して免疫原性であることが以前に示されている。
【０２２２】
調製Ｂおよび表２で述べたアミノ酸保存性割り当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を使って、２４０個の異なるアナログのパネルを、３つのエピトープのそれぞれにおいてエピトープ位置３、５、７、およびエピトープ位置１、４、６に、５つの保存的アミノ酸置換および５つの非保存的アミノ酸置換を含むように合成した。これらのアナログを、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbxsトランスジェニックマウスで生じたマウスＴＣＬ株を使用し、そしてＣＥＡ．６９１およびＭＡＧＥ３．１１２エピトープについての実施例１で述べたものと類似した実験ストラテジーに従い、へテロクリシティーについて試験した。マウス株の生成および維持に関連した技術的容易さに起因して、ＨＬＡトランスジェニックマウス由来のマウスＣＴＬ株をヒトＣＴＬ株の代わりに用いた。
【０２２３】
この結果を図２ＤのＨＩＶ  ｐｏｌ．４６７について対応する用量滴定プロフィールと共に図２Ａ（ＭＡＧＥ２．１５７）、２Ｂ（ＨＢＶ  ｐｏｌ．４５５）、および２Ｃ（ＨＩＶ  ｐｏｌ．４７６）に示した（ＭＡＧＥ２．１５７およびＨＩＶ  Ｐｏｌ．４５５について、実施例３を参照のこと）。
【０２２４】
試験されたＭＡＧＥ２．１５７エピトープの総計８５個の異なるアナログの分析は、野生型ペプチドより１／１００〜１／１００，０００倍の用量でＩＦＮγ応答を刺激した２つのヘテロクリティックなアナログ、Ｉ５（配列番号８）およびＦ５（配列番号９）の同定を生じた（図１）；これらのアナログは両方ともペプチドの中央部の奇数位置（５位）において天然に存在している保存的または半保存的な置換を有していた。
【０２２５】
ＨＩＶ  ｐｏｌ．４７６エピトープについては、スクリーニングされた７８個の異なるアナログの中から、２つ（Ｈ３（配列番号１９）およびＬ３（配列番号２０））が、ヘテロクリティックな活性を有するとして同定された（表１)；両方のアナログはペプチド中央部の奇数位置に保存的または半保存的置換のいずれかを保有していた。７７個の試験されたものの中から、ＨＩＶ  ｐｏｌ．４５５エピトープの１つのヘテロクリティックなアナログの正体が同定された。このアナログはペプチド（配列番号１７）の位置７に保存的置換基（Ｐ）を有していた（表１)。
【０２２６】
従って、腫瘍およびウイルス起源の３つのさらなるエピトープ（ＭＡＧＥ２．１５７、ＨＩＶ  ｐｏｌ．４７６およびＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５）についての２４０個アナログから得られたデータは、実施例１で示したようなＭＡＧＥ３．１１２およびＣＥＡ．６９１エピトープの分析と一致する。
【０２２７】
ヘテロクリシティーな分析をまた、２つのｐ５３エピトープにおいて行った。１つのエピトープＰ５３．１４９Ｍ２、ＳＭＰＰＰＧＴＲＶ（配列番号１０）はＭＨＣ結合を増強するメチオニン残基置換を有するヒトｐ５３エピトープの固定アンカーアナログ（ｆｉｘｅｄ  ａｎｃｈｏｒ  ａｎａｌｏｇ）を表す。第２のエピトープ、Ｐ５３Ｍｕ．１８４、ＧＬＡＰＰＱＨＬＩＲＶ（配列番号１３）はマウスとヒトとの間で完全に保存された配列を有している（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、９２（２６）：１１９９３（１９９５））。
【０２２８】
ｐ５３．１４９Ｍ２において行った用量滴定分析によって、１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌ用量範囲における最適および最適以下応答が明らかになった。ｐ５３．１４９Ｍ２（各位置で５つの保存的および５つの半保存的置換）についての７６個のアナログのパネルがスクリーニングされ、わずか２つのアナログ、Ｃ１（配列番号１１）およびＰ７（配列番号１２）が同定された。この両方とも、最適以下用量で１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ放出を与える、図５。さらに分析すると、両方のアナログは野生型ペプチドの１／１０倍の濃度で有意なＩＦＮγ産生を誘導した。さらに、Ｃ１アナログもまた１／１００倍のペプチド濃度で有意なＩＬ１０レベルを誘導した、図６。
【０２２９】
ｐ５３ｍｕ．１８４エピトープに関して、用量滴定分析を行った後、ペプチドの最適および最適以下レベルは、それぞれ５００ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌであると決定した。６３個の保存的および半保存的置換アナログのパネルを免疫原性について試験した。増強された免疫原性を有する２つのアナログが見い出された−Ｔ３（配列番号１４）およびＴ３、Ｅ６（配列番号１５）。図７および８を参照のこと。
【０２３０】
（実施例３）
（ヘテロクリティックなアナログによって誘導されるリンホカインプロフィ  
ール）
ヘテロクリティックなアナログはＴ細胞からのサイトカインの生成を示差的に活性化することが以前に示されており、それにより、いくつかのアナログがＴｈ１サイトカインを生成するために特異的にＴ細胞を活性化するが、他は優先的にＴｈ２サイトカインの生成を活性化する。本発明のヘテロクリティックなアナログに関連するリンホカイン放出のパターンを研究するため、ＣＴＬ株からのＴｈ２サイトカインであるＩＬ５および／またはＩＬ１０の生成をＩＦＮγの生成と比較した。２つの異なるエピトープからの代表的なデータを図３および４に示した。
【０２３１】
図３はＭＡＧＥ２．１５７アナログによって誘導されたリンホカインのプロフィールを示す。アナログＩ５もしくはＦ５、または野生型（ＷＴ）ペプチドを適用した．２２１Ａ２．１標的に応答して、ＭＡＧＥ２．１５７特異的ＣＴＬ株によって生成されたＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ１０（Ｂ）をいくつかの異なる用量に対して測定した。点線はＩＦＮγ（１００ｐｇ／ウェル）またはＩＬ１０（５０ｐｇ／ｍｌ）の有意なレベルを示している。図３Ａで見られるように、ＭＡＧＥ２．１５７のＦ５およびＩ５アナログは、それぞれ野生型ペプチドの１／１００倍または１／１０，０００倍の濃度でＩＦＮγ生成の有意なレベルを誘導した。さらに、同じアナログはまた、野生型ペプチドの１／１０倍または１／１００倍のペプチド濃度で、有意なＩＬ１０生成誘導した。
【０２３２】
同じ傾向を示す、別のエピトープＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５からのデータを、図４Ａおよび４Ｂに示した。いくつかの異なるペプチド用量に対して、アナログＰ７または野生型（ＷＴ）ペプチドに応答してＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５ＣＴＬ株によって放出されたＩＦＮγ（Ａ）またはＩＬ１０（Ｂ）を示した。再度、ＨＢＶ
Ｐｏｌ．４５５のＰ７アナログは、有意なレベルのＩＦＮγ（図４Ａ）およびＩＬ１０（図４Ｂ）を野生型ペプチドの１／１００倍のペプチド濃度において誘導した。Ｔｈ２サイトカイン（表１）の誘導について試験した全てのヘテロクリティックなアナログをまとめたデータを総合すると、ほとんどのヘテロクリティックなアナログは増加したＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方の生成を刺激することが示される。
【０２３３】
（実施例４）
（ヘテロクリティックアナログのＨＬＡ−Ａ２．１との結合親和力）
観察されたＣＴＬ株によって向上した認識が、アナログエピトープとＭＨＣとの結合能力における偶然の増加に起因しないことを実証するために、精製したＨＬＡ−Ａ２．１分子を、インビトロで利用して全てのヘテロクリティックアナログとＭＨＣとの結合親和力を測定し、そして調製Ｄに記載されているように未改変の野生型対照物と比較した。
【０２３４】
表１に概説されているように、３つのアナログ（ＭＡＧＥ３．１１２Ｗ７、ＨＩＶ  Ｐｏｌ．４７６Ｈ３、およびＨＩＶＰｏｌ．４７６Ｌ３）は、ＨＬＡ−Ａ２．１と野生型ペプチドよりも４倍以上高い親和力で結合し、そして２つのアナログ（ＭＡＧＥ２．１５７Ｉ５、ＭＡＧＥ２．１５７Ｆ５）は低い親和力で結合した。残る４つのヘテロクリティックアナログであるＭＡＧＥ３．１１２Ｉ５、ＣＥＡ．６９１Ｍ３、ＣＥＡ．６９１Ｈ５、およびＨＢＶ  Ｐｏｌ．４５５Ｐ７は、ＨＬＡ−Ａ２．１との結合能力において、ほとんどあるいは全く変化なしで結合した。これらのデータからひとまとめにして、増加した結合性とヘテロクリシティーとの間に相関はないことが示唆される。
【０２３５】
（実施例５）
（マウスｐ５３．２６１エピトープに関するアナログの予測および免疫原性）
インビボで免疫原性に関して試験するために、ＨＬＡ−Ａ２．１を制限したマウスｐ５３．２６１エピトープを使用した。この理由は、このエピトープに対するＣＴＬ応答は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbトランスジェニックマウスにおいて局部的に寛容化されることが示されているためである。これはインビボでＴ細胞の耐性を破壊すると予測されたヘテロクリティックアナログの能力の分析を可能にする。従来まで、ヘテロクリティックアナログは野生型エピトープに対して引き起こされるＣＴＬ株とともにインビトロでのスクリーニングを通じて検出されてきたが、置換法によって同定したアナログは野生型エピトープに対してヘテロクリティックであるＣＴＬをインビトロで潜在的に誘導し得り、寛容な腫瘍関連エピトープに対するワクチンを設計するための目的の適応である。
【０２３６】
ｐ５３．２６１の予測されるアナログに関する免疫原性を、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbxdトランスジェニックマウスにおいて、ｐ５３．２６１エピトープ（ＬＬＧＲＤＳＦＥＶ）５０μｇ、または予測されるアナログおよびＩＦＡにおけるＨＢＶ  Ｃｏｒｅ．１２８ヘルパーエピトープ１４０μｇとを用いてマウスを共同免疫することで試験した。１１日後、プライム化脾臓細胞を収集し、そして１０μｇ／ｍｌのペプチドでパルスした照射同系ＬＰＳ活性化脾臓細胞とともにインビトロで培養した。培養から１０日後、ＣＴＬをＩＬ２の供給源としてＣｏｎ  Ａの馴化培地の存在下で、ペプチドでパルスしたＬＰＳ芽細胞で再刺激した（Ｉｓｈｉｏｋａ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６２：３９１５）。
予測アナログによって免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を、野生型ペプチド（交差反応性、アビディティおよび野生型抗原に応答するＣＴＬの前駆体度数を決定するため）とそれぞれの免疫化アナログ（アビディティとアナログに応答するＣＴＬの前駆体度数を決定するため）の両方に対してインビトロで刺激した。ＡＰＣとしてＪｕｒｋａｔ−Ａ２．１腫瘍細胞を用いることで、インビトロでの２回目の再刺激の５日後でのＩＦＮγのインサイチュのＥＬＩＳＡアッセイによるペプチドの特異性に関して、ＣＴＬのバルク集団を全ての短い周期で試験した。あるいは、ＣＴＬ応答を、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて免疫化動物から新たに単離した脾臓細胞上で実施した。
【０２３７】
９マーペプチドの３、５および７の位置における３つの保存的、または半保存的置換からなるｐ５３．２６１エピトープの９つのアナログのパネルを、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbxdトランスジェニックマウスにおける免疫原性について試験した。その結果、それぞれ９つのアナログでのマウスの免疫、およびそれぞれの免疫化アナログでのプライム化脾細胞のインビトロでの膨張により６つのアナログ（Ｌ７、Ｄ３、Ｈ７、Ｈ３、Ｎ５、およびＧ５）を同定し、これは野生型ペプチドを用いてインビボで誘導され、そしてインビトロで膨張されたＣＬＴと比較して、かなりより低いペプチド濃度で、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生によって特徴づけられたＣＴＬ応答が得られた。
【０２３８】
ＷＴペプチドまたは適応したアナログのいずれかによって免疫化されたマウス由来の脾臓細胞を、インビトロで対応する免疫ペプチド（図９ＡおよびＢ）またはＷＴペプチド（図９ＣおよびＤ）を用いて刺激した。次いで、これらのＣＴＬによるＩＦＮγの放出を、免疫ペプチド（図９ＡおよびＢ）またはＷＴペプチド（図９ＣおよびＤ）を用いてパルス化した標的に対して用量範囲にわたって測定した。１００ｐｇ／ウェルにおけるＩＦＮγの放出を点線で示す。これらの結果より、アナログの有意なパーセンテージは、野生型ペプチドそれ自体で誘導されたアビディティよりも高いアビディティのＣＴＬを誘導することが示される。
【０２３９】
野生型ペプチドに対するヘテロクリティックアナログでプライム化されたＣＴＬの交差反応性を、図９Ｃおよび図９Ｄに示す。野生型ペプチドで免疫化し、そして再刺激した動物由来のＣＴＬは、０．１から１０μｇ／ｍｌの間のペプチド用量において１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導した。もう一方で、Ｌ７、Ｈ３、およびＤ３アナログで免疫化し、そして野生型ペプチドを用いてインビトロで刺激し、そして試験した動物から得られたＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するために、それぞれ１０倍、１００倍または１０００倍低い用量の野生型ペプチドが必要であった（図４Ｃ）。これにより、６つのケースの内３つのケースにおいて、予測されるヘテロクリティックアナログは、野生型抗原に対して寛容である一部のＣＴＬが存在する条件において、野生型ペプチドと応答するＣＴＬを誘導するのに１０〜１０００倍の活性および能力であったことが示唆される。
【０２４０】
（実施例６）
（野生型との交差反応性）
Ｄ３およびＨ３アナログにより誘導されたＣＴＬの交差反応性もまた、自然処理された野生型エピトープに対してＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbを用いてトランスフェクトされたｐ−５３発現Ｍｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞クローンによって試験した。野生型エピトープに対してヘテロクリティックであるｐ−５３．２６１アナログによって産生したＣＴＬは、Ｍｅｔｈ  Ａ／Ａ２．１Ｋb腫瘍細胞によって出現した内因的に処理されたｐ−５３．２６１エピトープと応答することが明らかとなった。
【０２４１】
ＣＴＬ集団（１０5／ウェル）は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋbと共にトランスフェクトされたＭｅｔｈ  Ａクローン、または２．５×１０4のＭｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞とともに培養し、ＩＦＮγの放出はインサイチュＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図１０に示しているように、ｐ−５３．２６１エピトープのＤ３とＨ３アナログの両方に対して増加したＣＴＬ株は、Ｍｅｔｈ  Ａ／Ａ２．１Ｋb腫瘍細胞クローンによって発現された内因性エピトープと応答し、親ＨＬＡ−Ａ２．１ネガティブＭｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞株とは応答しなかった。
【０２４２】
（実施例７）
（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いた前駆体度数の分析）
野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫化されたマウスにおいて産生されることを確証するために、インビトロでのさらなるＣＴＬ膨張なしでアナログまたは野生型ペプチドで免疫化されたマウスの脾臓細胞からＣＤ８+細胞を単離し、そして野生型またはアナログのどちらか一方に対するＣＴＬ反応性の前駆体度数をＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて測定した。
【０２４３】
ＷＴエピトープ、またはＤ３、Ｈ３、Ｌ７およびＨ７アナログの何れか一方で免疫化されたマウスから単離したＣＤ８+細胞を、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいてＷＴエピトープで刺激した場合のＩＦＮγの放出する能力について分析した。図１１に示すように、野生型ペプチド反応性ＣＴＬの前駆体度数は、野生型ペプチドで免疫化されたマウスにおいて１／６６，０００（１５点／１０6）であったのに対して、予測アナログで免疫化されたマウスにおける野生型ペプチド反応性細胞の前駆体度数は、Ｄ３、Ｈ３およびＬ７アナログに対してほぼ１／１５，０００（６０〜７５点／１０6細胞）であり、そしてＨ７アナログに対して１／８３，０００（１２点／１０6）であった。これより、野生型反応性細胞は、天然ペプチドで免疫化されたマウスに比べて４つのアナログのうち３つのアナログで免疫化されたマウスにおいて４倍高い度数で存在していたことが示される。この発見は、インビボ−プライム化ＣＴＬのインビトロでの膨張を回避する、より直接的な分析システムを用いたヘテロクリティックアナログでのインビボ免疫化は、野生型ペプチドに対して実際により複数のＣＴＬ反応性を誘導することを示すので重要である。
【０２４４】
（実施例８）
（ヘテロクリティックアナログはインビトロで腫瘍細胞を認識し得るヒトＣＴＬを誘導する）
調製Ｃに記載されているように、ＭＡＧＥ３．１１２のヘテロクリティックアナログの免疫原性もまた、ＭＡＧＥ３．１１２ペプチド、またはこのエピトープのＩ５およびＷ７アナログのどちらか一方に対するＰＢＭＣから１次ＣＴＬを誘導することによって試験した。インビトロでの２回目の刺激の後、４８ウェルのＰＢＭＣ培養は、正味のＩＦＮγ産物が１００ｐｇ／ウェルより多い場合にはＣＴＬ誘導に対して陽性を記録し、そして産物はペプチドの存在下、または非存在下で．２２１−Ａ２．１  ＡＰＣで刺激した後ではバックグラウンドより少なくとも２倍以上となった。
【０２４５】
ヒト腫瘍抗原に対する本発明者らの所見の生理学的な関連性を強調するために、本発明者らはインビトロでの１次誘導システムにおいて、ＭＡＧＥ３．１１２エピトープのヘテロクリティックアナログがヒトＣＴＬを誘導し得るかどうかを試験した。正常のドナー由来の新しい未処理のヒトＰＢＭＣを、前述しているように野生型またはアナログのどちらか一方を用いてインビトロで繰り返し刺激した（Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）５９：１）。ペプチド特異的ＣＴＬ応答を、野生型ペプチド（図１２Ａ）またはＩ５アナログ（図１２Ｂ）およびＷ７アナログ（図１２Ｃ）のいずれかで刺激された培地中で検出した。手短に言えば、．２２１−Ａ２．１細胞をＷＴペプチド（図１２Ａ）、Ｉ５アナログ（図１２Ｂ）またはＷ７アナログ（図１２Ｃ）１０μｇ／ｍｌで一晩パルスした。４８ウェルプレートの個々のウェルに成長しているＣＴＬによるＩＦＮγ産物を、ペプチドの存在下、または非存在下で．２２１−Ａ２．１細胞に対して、あるいは内因性ネガティブエピトープ８８８メル腫瘍細胞株および内因性ポジティブエピトープ６２４メル腫瘍細胞株に対して試験した。ポジティブペプチド特異的ＣＴＬ応答を示すウェルのみが示される。
【０２４６】
さらに重要なことに、これらのアナログとともに誘導された培地により、内因的に処理し、そして野生型配列を示す６２４メル腫瘍細胞株が認識された。これは、ヘテロクリティックアナログは腫瘍細胞によって示される内因的に産生された野生型エピトープを認識する生理学的に関連性のあるヒトＣＴＬを誘導し得ることの証拠であり、そしてその現象は、ヒトとトランスジェニックマウスシステムの両方に関連性があることの証拠である。
【０２４７】
（実施例９）
（ＨＬＡ  Ａ２スーパーファミリーメンバーにおけるＨＬＡ−Ａ２．１スーパーモチーフから誘導されたヘテロクリティックアナログの合成および分析）
Ａ２スーパーファミリー内部の他のＨＬＡ分子におけるヘテロクリティック置換法則をさらに確認するために、３、５および７の位置における３つの保存的、または半保存的置換よりなる、以前に議論したｐ５３．２６１エピトープの９つのアナログのパネルを、以下に示すヒトＨＬＡ分子（Ａ*０２０２、Ａ*０２０３、Ａ*０２０４、Ａ*０２０５、Ａ*０２０６、Ａ*０２０７、Ａ*０２０９、Ａ*０２１４、Ａ*６８０２、Ａ*６９０１）の１つを発現しているトランスジェニックマウスにおける免疫原性についてインビボで試験した。
【０２４８】
上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産生は、野生型ペプチド（例えば、ｐ５３．２６１エピトープ）で誘導され、そして再刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型エピトープ自体に対するよりも、天然野生型エピトープに対してより高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２４９】
代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られたＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２５０】
（実施例１０）
（ＨＬＡ  Ｂ７スーパーファミリーメンバーにおけるＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフから誘導されたヘテロクリティックアナログの合成および分析）
ヘテロクリティック置換法則をさらに確認するために、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフの内部に配列を持っているペプチドから誘導されたヘテロクリティックアナログを用いて追加研究を行った。例えば、アナログをインビボで免疫原性について試験し得る。
【０２５１】
本研究では、ペプチドを持ったＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフであるＡＰＲＴＬＶＹＬＬエピトープを選択し、そして合成した。９マーペプチドの３、５および７の位置における３つの保存的、または半保存的置換よりなるアナログのパネルを、ＨＬＡ−Ｂ*０７０２／Ｋbトランスジェニックマウスにおける免疫原性について試験した。パネルはＡＰＥＴＬＶＹＬＬ、ＡＰＲＴＷＶＹＬＬおよびＡＰＲＴＬＶＰＬＬを含み、それぞれ３、５および７番目の位置における半保存的置換と対応している。
【０２５２】
上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγの誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産生は、野生型ペプチド（例えば、ＡＰＲＴＬＶＹＬＬ）で誘導され、そして再刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自体よりも高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２５３】
代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られたＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２５４】
Ｂ７スーパーファミリー内部の他のＨＬＡ分子についてヘテロクリティック置換法則をさらに確認するために、ＡＰＥＴＬＶＹＬＬ、ＡＰＲＴＷＶＹＬＬおよびＡＰＲＴＬＶＰＬＬペプチドを、以下のヒトＨＬＡ分子（Ｂ*０７０２、Ｂ*０７０３、Ｂ*０７０４、Ｂ*０７０５、Ｂ*１５０８、Ｂ*３５０１、Ｂ*３５０２、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０３、Ｂ*３５０４、Ｂ*３５０５、Ｂ*３５０６、Ｂ*３５０７、Ｂ*３５０８、Ｂ*５１０１、Ｂ*５１０２、Ｂ*５１０３、Ｂ*５１０４、Ｂ*５１０５、Ｂ*５３０１、Ｂ*５４０１、Ｂ*５５０１、Ｂ*５５０２、Ｂ*５６０１、Ｂ*５６０２、Ｂ*６７０１、およびＢ*７８０１）の１つを発現しているトランスジェニックマウスにおける免疫原性についてインビボで試験した。
【０２５５】
上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産生は、野生型ペプチド（例えば、ＡＰＲＴＬＶＹＬＬ）で誘導され、そして再刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自体より高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２５６】
代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られたＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２５７】
（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いた前駆体度数の分析）
野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫化されたマウスにおいて産生されることを確証するために、インビトロでのさらなるＣＴＬ膨張なしでアナログまたは野生型ペプチドで免疫化された脾臓からＣＤ８+細胞を単離した。この材料より、野生型、またはアナログのどちらか一方に対するＣＴＬ反応性の前駆体度数をＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて測定した。代表的に、野生型ペプチドの反応性ＣＴＬの前駆体度数は、アナログの前駆体度数よりもかなり低い。
【０２５８】
（ヘテロクリティックアナログによってインビトロでエピトープを認識し得るヒトＣＴＬを誘導し得る）
ヘテロクリティックアナログを、インビトロでの１次誘導システムにおけるＣＴＬの誘導について分析し得る。前記のように、４８ウェルプレートにおいて正常のドナーからの新しい未処理のヒトＰＢＭＣを、野生型またはアナログのどちらか一方を用いてインビトロで繰り返し刺激した。次に、ペプチド特異的ＣＴＬ応答を、野生型ペプチドまたはヘテロクリティックアナログのどちらか一方で刺激された培地中で検出する。これらのアナログで誘導された培地において、内因的に処理され、そして野生型配列を示す標的を認識し得る。これは、ヘテロクリティックアナログが内因的に産生された細胞上で発現した野生型ペプチドを認識する生理学的に関連性のあるヒトＣＴＬを誘導し得ることの証拠であり、そしてその現象はヒトとトランスジェニックマウスシステムの両方に関連性があることの証拠である。
【０２５９】
（実施例１１）
（ＨＬＡ  Ａ３スーパーファミリーメンバーにおけるＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフから誘導されたヘテロクリティックアナログの合成および分析）
ヘテロクリティック置換法則をさらに進んで確認するために、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフの内部に配列を有するペプチドから誘導されたヘテロクリティックアナログを用いて追加研究を行う。例えば、インビボで免疫原性についてアナログを試験し得る。
【０２６０】
本研究では、ペプチドを有するＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフであるＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ（配列番号２２）エピトープを選択し、そして合成する。９マーペプチドの３、５および７の位置における３つの保存的／半保存的置換よりなる配列番号２２のアナログのパネルを、ＨＬＡ−Ａ*３１０１／Ｋbトランスジェニックマウスにおける免疫原性について試験した。パネルはＫＶＨＰＹＡＬＩＮＫ、ＫＶＦＰＱＡＬＩＮＫおよびＫＶＦＰＹＡＫＩＮＫを含み、それぞれ３、５および７番目の位置における半保存的変化と対応している。
【０２６１】
上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産生は、野生型ペプチド（例えば、ＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ）で誘導され、そして再刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自体より野生型に対して高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２６２】
代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られたＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２６３】
Ａ３スーパーファミリー内部の他のＨＬＡ分子についてヘテロクリティック置換法則をさらに確認するために、ＫＶＨＰＹＡＬＩＮＫ、ＫＶＦＰＱＡＬＩＮＫおよびＫＶＦＰＹＡＫＩＮＫペプチドを、以下のヒトＨＬＡ分子（Ａ*０３０１、Ａ*１１０１、Ａ*３１０１、Ａ*３３０１、Ａ*６８０１）の１つを発現しているトランスジェニックマウスにおけるインビボでの免疫原性について試験する。
【０２６４】
上述したアナログで免疫化されたマウス由来のＣＴＬを、少なくとも１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγ産生の誘導について試験した。代表的に、このＩＦＮγ産生は、野生型ペプチド（例えば、ＫＶＦＰＹＡＬＩＮＫ）で誘導され、そして再刺激されたペプチド濃度よりもさらに低いペプチド濃度で存在する。これらの結果は、本発明者らの予測したヘテロクリティックアナログは、野生型ペプチド自体より高いアビディティＣＴＬを誘導するのにより強力であることを示す。
【０２６５】
代表的に、野生型ペプチドで免疫化され、そして再刺激された動物から得られたＣＴＬは、５〜１０μｇ／ｍｌ用量のペプチドにおいて１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するが、上述したアナログで免疫化された動物から得られ、野生型ペプチドでインビトロで刺激し、そして試験したＣＴＬは、１００ｐｇ／ウェルのＩＦＮγを誘導するために野生型ペプチドの用量よりもそれぞれ１０倍、１００倍または１０００倍までも低い用量を必要とする。
【０２６６】
（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを用いた前駆体度数の分析）
野生型ペプチドに対する交差反応性ＣＴＬが、アナログで免疫化されたマウスにおいて産生することを確証するために、インビトロでのさらなるＣＴＬ膨張なしでアナログまたは野生型ペプチドで免疫化された脾臓からＣＤ８+細胞を単離した。この材料より、野生型、またはアナログのどちらか一方に対するＣＴＬ反応性の前駆体度数をＥｌｉｓｐｏｔアッセイを用いて測定した。代表的に、野生型ペプチドの反応性ＣＴＬの前駆体度数は、アナログの前駆体度数よりもかなり低い。
【０２６７】
（ヘテロクリティックアナログはインビトロでエピトープを認識し得るヒトＣＴＬを誘導し得る。）
ヘテロクリティックアナログを、インビトロでの１次誘導システムにおけるＣＴＬの誘導について分析する。前記したように、４８ウェルプレートにおいて正常のドナー由来の新しい未処理のヒトＰＢＭＣを、野生型またはアナログのどちらか一方を用いてインビトロで繰り返し刺激した。次に、ペプチド特異的ＣＴＬ応答を、野生型ペプチドまたはヘテロクリティックアナログのどちらか一方で刺激された培地中で検出する。これらのアナログで誘導された培地において、内因的に処理し、そして野生型配列を示す標的を認知する。これは、ヘテロクリティックアナログが内因的に産生される細胞上に発現した野生型ペプチドを認識する生理学的に関連性のあるヒトＣＴＬを誘導することの証拠であり、そしてその現象はヒトとトランスジェニックマウスシステムの両方に関連性があることの証拠である。
【０２６８】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のためだけであり、本発明に照らして、様々な改良または変更は当業者に示唆され、そして本出願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。この結果、本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１０１−１】
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【図１０１−２】
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【図１０２−１】
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【図１０２−２】
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【図１０３−１】
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【図１０３−２】
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【図１０４−１】
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【図１０４−２】
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【配列表】
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