(57)【要約】【課題】ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を容易に識別する方法を提供する。【解決手段】ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別する方法であって、該方法は、該雑種のゲノムDNAを鋳型にしてSNP1〜SNP8の各々を含む領域を増幅する工程、増幅産物を配列決定しSNP1〜SNP8の各塩基を決定する工程、並びにSNPと樹種との関係を示す表に基づいて該雑種の親種を特定する工程を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別する方法であって、該方法は、該雑種のゲノムDNAを鋳型にしてSNP1〜SNP8の1又は2以上のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅する工程、増幅産物を配列決定しSNP1〜SNP8の1又は2以上のSNPの各塩基を決定する工程、並びに下記の表に記載のSNP1〜SNP8と樹種との関係に基づいて該雑種の親種を特定する工程を含み、ここで、該SNP1〜SNP8の各々を含む領域を増幅するためのプライマー及び増幅産物を配列決定するためのプライマーのそれぞれが、SNP1〜SNP8の各塩基を含む領域を増幅するためのユーカリゲノム配列由来のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの組合せからなり、SNP1及びSNP2が、E. grandisのゲノムDNA断片配列（scaffold 522）の約180000番目の塩基から約181000番目の塩基までの領域に相当する領域に存在し、SNP3〜SNP8の各SNPが、該ゲノムDNA断片配列の約193500番目の塩基から約194000番目の塩基までの領域に相当する領域に存在する、上記方法。
【表１】
2011130741.tif 000009
【請求項２】
前記SNP1〜SNP8の各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーと増幅産物を配列決定するためのプライマーとの組合せが、下記の(1)〜(3):
(1)SNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(2)SNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(3)SNP3〜SNP8の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、及び、配列決定プライマーがETS2（配列番号19）/ETS4（配列番号21）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するためのPCRプライマーセットであって、該PCRプライマーセットがSNP1〜SNP8の各々を含む領域を増幅するためのプライマーと増幅産物を配列決定するためのプライマーとの組合せを含み、該組合せが、下記の(1)〜(3)：
(1)SNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(2)SNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(3)SNP3〜SNP8の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、及び、配列決定プライマーがETS2（配列番号19）/ETS4（配列番号21）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
からなる、上記プライマーセット。
【請求項４】
ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するための、SNP1〜8と樹種との関係を示す下記の表の使用方法。
【表２】
2011130741.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の一塩基多型（SNP；Single Nucleotide Polymorphism）を利用してユーカリ属の種間雑種の樹種を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーカリ属植物は、東南アジアを中心に植林が行われており、紙の原料として多く使われている。このような植物では、天然然交雑に由来する種間交雑個体群のなかに親種に比べて優れた形質を有する場合があることが知られている。例えば、ユーカリ・ペリータとユーカリ・ブラシアーナ間の種間雑種は優れた特性を示すことから、東南アジアで植林へ利用し始めている。雑種集団から優良個体選抜など育種的試みも行われている。すなわち、このような植物では、天然交雑による種子の獲得が可能である。ユーカリ属植物では、優れた特性をもつ種間交雑種を容易に選抜することが望まれている。
【０００３】
従来、形態的特徴の比較やアイソザイム分析から雑種の判定を行っているのが一般的である。しかし、形態による判定は、識別者の経験に基づく主観的判断であり、必ずしも正確な判定法ではない。また、アイソザイム分析では、タンパク質を扱うため個体の生育条件や分析時のプロテアーゼによる分解などの不確定要因により、必ずしも正確な判定が可能ではない。近年ではさらに、アカシア属植物などの熱帯早生樹、シバ属植物、果樹などにおいてDNAを用いた雑種の識別法が開発され、その手法として、例えばRAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)法、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)法、SSR(Simple Sequence Repeat; Microsatellite)マーカー、ゲノムDNAの種特異的な塩基配列の長さの違い、などによる判定方法が使用されている（特許文献1、2、3、及び非特許文献1）。
【０００４】
RAPD法やAFLP法は、操作が簡便で少量のDNAで分析可能であり、雑種の識別の他に個体識別などにも利用されているが、再現性が悪いとい欠点があるため、必ずしも正確で確実な雑種識別法ではない。また、塩基配列の長さの違いによる種別鑑定法は、実用的に雑種を見つけ出すために約1,000個体以上の大量サンプルを対比する必要が生じるため、分析時間や費用の点で実用的ではない。SSRマーカーを使用する方法もまた、ゲノムの全塩基配列が解析されていない植物の場合、多数存在するといわれているゲノムDNAの繰り返し（マイクロサテライト）領域を検出し、他の多くの雑種との対比を行わなければならないため、効率が悪く、多くの労力と費用を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2005-295925号公報
【特許文献２】特開平10-229898号公報
【特許文献３】特開2008-245572号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】林建樹, 果樹研究所報告4号, 1-11頁, 2005年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の背景技術に記載されたように、植物の種間雑種または種内雑種を正確にかつ簡単に識別または判別するための手法が非常に少ないことが分かった。ユーカリ属植物についてもこれらの交雑種のなかに成長性、病害性などの特性の点で優良な品種が存在することが認められるため、そのような優良品種を選抜するためにひとつひとつ栽培して各交雑種の特性を調べるやり方では多大の時間と労力を要することは明らかである。
【０００８】
実際に、例えば主要樹種であるユーカリ・グロブラス（E. globulus）およびユーカリ・カマルドレンシス（E. camaldulensis）の種間雑種には、両者の利点を兼ね備えた新品種が得られる可能性があるため、形態的には雑種と思われる候補木が遺伝的にも雑種であるかを識別する手法を開発する必要性がある。また、ラオスをはじめとする東南アジア植林地では、外部から導入したユーカリ雑種クローンあるいは将来目標にあげている種間雑種の両親樹種が何であるかを調べる必要性が高まっているし、今後も東南アジアを中心とした国々で様々なクローンあるいは雑種が導入されることが予想され、樹種識別ツールは将来にわたって有用であると予想される。
【０００９】
このため、本発明は、ユーカリ属植物の種間雑種を複数のSNPを利用して正確かつ容易に識別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ユーカリ属由来の多数の樹種のサンプルを種々の産地から集め、全ゲノム中で近縁種間のSNPが存在すると考えられる2領域を中心に解析して樹種間で差のある8つのSNPを見出し、そして、これらのSNPでユーカリ属9樹種を5つのグループに分類できることを見出し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
【００１１】
本発明は、第1の態様において、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別する方法であって、該方法は、該雑種のゲノムDNAを鋳型にしてSNP1〜SNP8の1又は2以上のSNPの各々を含む領域をPCRによって増幅する工程、増幅産物を配列決定しSNP1〜SNP8の1又は2以上のSNPの各塩基を決定する工程、並びに下記の表（実施例1の表4と同じ。）に記載のSNP1〜SNP8と樹種との関係に基づいて該雑種の親種を特定する工程を含み、ここで、該SNP1〜SNP8の各々を含む領域を増幅するためのプライマー及び増幅産物を配列決定するためのプライマーのそれぞれが、SNP1〜SNP8の各塩基を含む領域を増幅するためのユーカリゲノム配列由来のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの組合せからなり、SNP1及びSNP2が、E. grandisのゲノムDNA断片配列（scaffold 522）の約180000番目の塩基から約181000番目の塩基までの領域に相当する領域に存在し、SNP3〜SNP8の各SNPが、該ゲノムDNA断片配列の約193500番目の塩基から約194000番目の塩基までの領域に相当する領域に存在する、上記方法。
【００１２】
2011130741.tif 000002
【００１３】
本発明の実施形態において、前記SNP1〜SNP8の各々を含む領域をPCRによって増幅するためのプライマーと増幅産物を配列決定するためのプライマーとの組合せが、下記の(1)〜(3):
(1) SNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(2) SNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(3) SNP3〜SNP8の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、及び、配列決定プライマーがETS2（配列番号19）/ETS4（配列番号21）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
からなる。
【００１４】
本発明はまた、第2の態様において、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するためのPCRプライマーセットであって、該PCRプライマーセットがSNP1〜SNP8の各々を含む領域を増幅するためのプライマーと増幅産物を配列決定するためのプライマーとの組合せを含み、該組合せが、下記の(1)〜(3)：
(1) SNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(2) SNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(3) SNP3〜SNP7の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、及び、配列決定プライマーがETS2（配列番号19）/ETS4（配列番号21）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
からなる、上記プライマーセットを提供する。
【００１５】
本発明は、第3の態様において、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数のSNPを利用して識別するための、SNP1〜8と樹種との関係を示す上記表（実施例1の表4と同じ。）の使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を実験室レベルで容易にかつ正確に識別することが可能になり、これにより、各雑種をひとつひとつ栽培してその特性を調べる必要性がなくなった。すなわち、約1,000種以上も存在するといわれるユーカリ属植物の天然交雑種のなかから優良品種を従来法と比べてより効率よく正確に選抜することを本発明の方法が可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ユーカリ属植物は、主にオーストラリア原産であるが、今日では、東南アジア、オーストラリア、南米などの地域に植林されるようになり、世界的に有用な産業造林樹種のひとつであり、特に、紙パルプ、製材、木炭、オイルなどとして利用されている。この植物には、多数の種間交雑種が存在する。種間交雑には、天然交雑、人工交配、その他の交雑が含まれる。天然交雑は、分布域と開花期が重なった場合に起こり、例えばユーカリ・ペリータ×ユーカリ・ブラシアーナ、ユーカリ・グロブラス×ユーカリ・カマルドレンシスなどでこの種の交雑が認められている。人工交配は、優良木同士の人工交配であり、例えばユーカリ・ユーロフィラ×ユーカリ・グランディスなどで雑種育種が試みられている。
【００１８】
多数存在する交雑種について、現在の種間雑種の判別法は形態的な指標によるものであり、より早期により確実に判別する方法としてDNAマーカーを利用する方法が求められてきた。
【００１９】
このような状況のなかで、本発明は、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数のSNPを利用して識別する方法であって、該雑種のゲノムDNAを鋳型にしてSNP1〜SNP8の各々を含む領域を増幅する工程、増幅産物を配列決定しSNP1〜SNP8の各塩基を決定する工程、並びに後記実施例中の表4に基づいて該雑種の親種を特定する工程を含んでなる方法を提供する。
【００２０】
本発明においてユーカリ属植物の種間雑種の樹種を識別するために利用する親種および交雑種は、基本的に表4に示される5つの群、すなわち、
(1群)ユーカリ・グロブラス(E. globulus)、
(2群)ユーカリ・カマルドレンシス(E. camaldulensis)又はユーカリ・ブラシアーナ(E. brassiana)、又はユーカリ・テレティコルニス（E.tereticornis）
(3群)ユーカリ・グランディス(E. grandis)、又はユーカリ・サリグナ（E.saligna）
(4群)ユーカリ・デグルプタ(E. deglputa)、
(5群)ユーカリ・ペリータ(E. pellita)又はユーカリ・ユーロフィラ(E. urophylla)、
に分類される９つの親種、並びに、
4種の交雑種、すなわちE. pel.×E. bra., E. gra.×E. uro., E. cam.×E. glo., 及びE. gra.×E. cam.である。
【００２１】
これらの親種及び交雑種は、表4（実施例1参照）にSNP1〜SNP8として示される各特定塩基（すなわち、ヌクレオチド）を有している。ここで、表中のスラッシュ(/)を挟む塩基は、各アレルの塩基を表す。
【００２２】
上記のSNP1〜SNP8のうち、SNP1とSNP2はユーカリゲノムDNAの領域1（NS(すなわち、18S rRNA(DNA))領域)に由来し、SNP3〜SNP8はユーカリゲノムDNAの領域2（葉緑体ETS(external transcribed spacer)に由来する。ユーカリゲノム配列(scaffold 522、http://eucalyptusdb.bi.up.ac.za/)に基づくSNP1〜SNP8の位置は次のとおりである。
SNP1:scaffold 522,180133番目T又はC
SNP2:scaffold 522,180769番目A又はG
SNP3:scaffold 522,193840番目A又はG
SNP4:scaffold 522,193651番目G又はA
SNP5:scaffold 522,193650番目T又はC
SNP6:scaffold 522,193624番目G又はC
SNP7:scaffold 522,193591番目T又はC
SNP8:scaffold 522,193545番目A又はG
（ここで、scaffold 522は、ユーカリ・グランディスのゲノムDNA断片の番号を表す。）
【００２３】
本発明の方法では、まず、樹種が不明のユーカリ属植物の組織（例えば、葉、根、茎など）からゲノムDNAを抽出する。具体的には、組織を粉砕し、フェノール/クロロホルムを用いてDNAを抽出し、エタノールを加えて沈殿するDNAを回収する。DNAの抽出は、市販のDNA抽出キットを使用して実施することができる。
【００２４】
次に、抽出されたゲノムDNAを鋳型にしてSNP1〜SNP8の1又は2以上のSNPの各々を含む領域をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅し、その後、各増幅産物に対し配列決定用プライマーを使用してPCRを行って相補鎖DNAを合成し、その塩基配列を決定し、これによってSNP1〜SNP8の1又は2以上の各塩基を決定する。増幅工程及び配列決定工程の各プライマーの組合せは、SNP1〜SNP8の各塩基を含む領域を増幅するのに適したユーカリゲノム配列由来のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの組合せであり、例えば、下記の(1)〜(3):
(1)SNP1について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS11（配列番号12）/NS2（配列番号2）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
(2)SNP2について、増幅プライマーがNS11（配列番号12）/NS13（配列番号14）の組合せ又はNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ又はNS11(配列番号12)/NS6(配列番号6)の組合せ、及び、配列決定プライマーがNS3（配列番号3）/NS4（配列番号4）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい;並びに、
(3)SNP3〜SNP8の各々について、増幅プライマーがETS4（配列番号21）/ETS2（配列番号19）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、及び、配列決定プライマーがETS2（配列番号19）/ETS4（配列番号21）の組合せ又はETS18S（配列番号16）/ETSMyrtF（配列番号17）の組合せ、但し各組合せのプライマーは、独立に、前記配列番号の各塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーであってもよい；
からなる。
【００２５】
上記プライマーは、通常、塩基数17〜30、好ましくは20〜25のサイズのDNAからなり、また、自然界で植物の突然変異が起こりうることを考慮して、それぞれの上記配列番号の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなるプライマーを使用することができる。変異は、1、2又は3個の塩基の置換、欠失又は挿入（若しくは、付加）を含む。
【００２６】
配列に関する「同一性」は、2つの塩基配列を、最大の一致率となるようにギャップを導入して又はギャップを導入しないで整列（アラインメント）したときに、ギャップを含めての塩基の総数に対する同一塩基数の割合(%)を表す。%同一性は、BLAST、FASTAなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる(Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990);Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997);McGinnis, S & Madden, T.L., Nucleic Acids Res. 32:W20-W25 (2004)等)。
【００２７】
PCRは、変性、アニーリング及び伸長反応を1サイクルとして約20〜40サイクルを繰り返すことによって行うことができる。
【００２８】
変性は、二本鎖DNAを加熱によって解離して一本鎖にする、すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖に分離する、ステップであり、そのための条件は、例えば約94〜96℃の温度で約10〜60秒間二本鎖DNAを含む溶液を加熱処理することを含む。
【００２９】
アニーリングは、センス鎖及びアンチセンス鎖の各鋳型DNAに、それらに対応するプライマー、すなわちフォワードプライマー又はリバースプライマー、を結合するステップであり、そのための条件は、鋳型DNAとプライマーを含む溶液を約50〜65℃で約10〜60秒間加熱処理することを含む。
【００３０】
伸長反応は、鋳型DNAにアニーリングしたプライマーを起点にして相補的DNA鎖を合成するステップであり、そのための条件は、耐熱性DNAポリメラーゼ及びdNTPs(NはA,T,G,Cである。)の存在下で、プライマーがアニーリングした鋳型DNAを含む溶液を約60〜80℃で約10〜60秒間加熱処理することを含む。
【００３１】
PCRの緩衝液は、dNTPs及びMgCl2を含むPCR用緩衝液であり、伸長反応に際して、このなかにさらに、耐熱性DNAポリメラーゼ、例えばTaqポリメラーゼ（Thermus aquatics由来）やPfuポリメラーゼ（Pyrococcus furiosus由来）など、が添加される。
【００３２】
PCRは市販のサーマルサイクラーを使用して実施することによって自動的なDNA増幅が可能になる。サーマルサイクラーは、例えば宝酒造、Applied Biosystems、Bio-Rad Labsなどから市販されている。
【００３３】
本発明の方法では、増幅されたDNAを回収、精製し、さらに配列決定のために、精製DNAを鋳型にしてPCRを行い、増幅産物のDNA配列を決定する。
【００３４】
DNAの回収、精製のために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの電気泳動の使用のほかに、市販のPCR産物精製キット、例えばQIAquick PCR purification kit（QIAGEN）、などを使用すると便利である。
【００３５】
また、塩基配列の決定は、ジデオキシ法(Sanger法)を利用した自動DNAシークエンサーを使用する方法などによって行うことができる。
【００３６】
Sanger法では、上記のPCR条件（ただし、4種類の基質(dNTPs)のほかに、蛍光標識された特異的競合阻害剤(ddNTPs)を加える。）で鋳型DNAに相補的なDNAを合成するが、この合成の際に基質と阻害剤の間で競合反応が起こり、阻害剤が取り込まれると反応が停止し、生成する相補鎖DNAはその3'末端がいずれもddNTP（N=A,T,G又はC）で停止した種々の長さのDNA断片として得られ、これをゲル電気泳動でサイズ分離し、それを読み取って塩基配列を決定する。読み取りに際しては、レーザー光を励起し、その蛍光を検出するなどの手法を使用できる。
【００３７】
上記のようにして決定されたテストサンプルのSNP1〜SNP8の各塩基について、表4（後述の実施例）に示されたSNP1〜SNP8の塩基と特定の親種及び交雑種との関係に基づいて、後述の実施例2の樹種の識別例のようにして交雑種の親種の樹種を決定することができる。すなわち、テストサンプルのSNP1〜SNP8の塩基がそれぞれT/C, G/G, A/G, G/A, T/C, G/C, C/C, A/Aであれば、そのサンプルの樹種は、E. camaldulensis×E. deglputaであると推定される。
【００３８】
したがって、本発明には、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を複数の一塩基多型(SNP)を利用して識別するための、SNPと樹種との関係を示す表4（後述）の使用方法も包含される。
【００３９】
この表に記載されるSNP/樹種の関係を利用することによって、上記のとおり、ユーカリ属植物の種間雑種の樹種を識別することが可能になる。
【実施例】
【００４０】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
【００４１】
[実施例１]
（ユーカリ属の樹種間で差のあるSNPの探索）
ユーカリ属植物の全ゲノム中で近縁種間のSNPが存在すると考えられる2領域を中心に解析し、それらの領域に含まれる複数のSNPを組み合わせることにより、未知の樹種の識別の信頼性を高めることを目的とする。これらの2領域（すなわち、領域1及び領域2）を、E. camaldulensisとE. globulusを例に以下に示す。
【００４２】
【化１】
2011130741.tif 000003
【００４３】
ここで、領域1は、SNP1とSNP2が存在する領域であり、scaffold 522として知られるE. grandisのゲノムDNA断片配列の約180000番目の塩基から約181000番目の塩基までの領域に相当する領域であり、領域2は、SNP3〜SNP8の各SNPが存在する領域であり、該ゲノムDNA断片配列の約193500番目の塩基から約194000番目の塩基までの領域に相当する領域である。SNP1〜SNP8のゲノム上の各位置は、雑種によって幾分異なる場合もあると予想されるが、これらの領域は比較的保存性が高いため、当業者であれば、SNP周辺の配列との対比から各SNPの位置を特定することは容易である。
【００４４】
材料
発見したSNPが個体間ではなく樹種間で差のあるものであることを確かめるため、それぞれの樹種で大量のサンプルについて調査した。解析に使用したサンプルは、表1に示した。
【００４５】
【表１】
2011130741.tif 000004
【００４６】
方法
（ユーカリ属全DNAの抽出）
乾燥したユーカリ属の葉約50ngをジルコニアボールとともにマイクロチューブミキサーで粉砕し、東洋紡Plant genomeを用いてゲノムDNAを抽出した。得られたDNAは滅菌水に溶解した。
【００４７】
（標的領域の増幅）
得られたユーカリ属のゲノムDNAを鋳型としてPCR増幅を行った。PCRはゲノムDNA50ng、プライマー（NS0/NS9, ETS4/ETS2）各終濃度0.3μM、KOD-Plus-ver.2（東洋紡） 1Unit、dATP、dTTP、dGTP、dCTP各200μM、MgCl21.5mMを加えた緩衝液50μl中で行った。反応条件はサーマルサイクラー（Dice、宝酒造社製）中で、鋳型DNAを94℃で2分間変性させ、その後、変性：94℃で10秒間、アニーリング：58℃で30秒間、伸長反応：68℃で1分間を1サイクルとして30サイクル繰り返した。
増幅及び配列決定に使用したプライマーは、次の表2及び表3に示したとおりである。
【００４８】
【表２】
2011130741.tif 000005
【００４９】
【表３】
2011130741.tif 000006
【００５０】
上記の表2及び表3に示したプライマーの塩基配列は、配列番号22〜24のDNAの塩基配列に基づいて設計された。ここで、配列番号22は、Eucalyptus lehmanniiの18S rRNA(DNA)遺伝子の部分配列（登録番号AM235528）を示し、配列番号23は、Eucalyptus camaldulensisのexternal transcribed spacer（ETS）と18S rRNA(DNA)遺伝子の部分配列（登録番号DQ352528）を示し、配列番号24は、Eucalyptus perrinianaの葉緑体external transcribed spacer（ETS）の部分配列（登録番号AM489907）を示す。
【００５１】
（PCR産物の精製）
得られたPCR産物をQIAquick PCR purification kit（QIAGEN）を用いて精製した。
【００５２】
（配列決定反応）
精製したサンプルを塩基長に応じて10〜20ng、プライマー（NS0/NS2/NS3/NS4/NS5/NS6/NS9、ETS2/ETS4）各終濃度0.16μM、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）を用いてシークエンス反応を行った。反応条件はサーマルサイクラー（Dice、宝酒造社製）中で、鋳型ＤＮＡを96℃で1分間変性させたのち、変性：96℃で10秒間、アニーリング：50℃で5秒間、伸長反応：60℃で1分間を1サイクルとして25サイクル繰り返した。
【００５３】
（精製）
得られたサンプルをBig Dye Xterminator（ABI）を用いて精製した。
【００５４】
（配列決定）
Genetic Analyzer 3130xl（ABI）を用いて配列決定を行った。解析条件はBDx_FASTseq_POP7_BDv3を用いた。得られたデータは変異検出ソフトSeqScape（ABI）を用いて解析した。
【００５５】
結果
それぞれ2領域を解析した結果、樹種間で差のあるSNPが7つ見つかった（表4）。これらのSNPでユーカリ属9樹種を5つのグループに分類できる可能性が高い。
【００５６】
【表４】
2011130741.tif 000007
【００５７】
表中、1〜8の数字はそれぞれSNP1〜SNP8を表す。また、例えばA/AGという表記は、A/A又はA/Gを意味する。また、同様に、GA/GAという表記は、G/G、G/A、A/G又はA/Aのいずれかを意味する。なお、領域1及び領域2の括弧内の「NS」は18S rRNA(DNA)領域、「ETS」はexternal transcribed spacerをそれぞれ表す。
【００５８】
SNP1〜SNP8のユーカリゲノム上の位置について、SNP1とSNP2はユーカリゲノムDNAの領域1に、SNP3〜SNP8はユーカリゲノムDNAの領域2にそれぞれ由来し、ユーカリゲノム配列(http://eucalyptusdb.bi.up.ac.za/)に基づくSNP1〜SNP8の位置は、上で説明したとおりである。
【００５９】
また、SNP1〜SNP8の各塩基をPCRによって特定するために、SNP1〜SNP8を含む領域を増幅するプライマー、及び増幅産物を配列決定するためのプライマーを次のように決定した。
SNP1:NS11/NS13又はNS11/NS2又はNS11/NS6で増幅し、NS11及びNS2を用いて配列決定する。
SNP2: NS11/NS13又はNS3/NS4又はNS11/NS6で増幅し、NS3及びNS4を用いて配列決定する。
SNP3〜SNP8：ETS4/ETS2又はETS18S/ETSMyrtFで増幅し、ETS2/ETS4、あるいは、ETS18S/ETSMyrtFで配列決定する。
【００６０】
[実施例２]
（ユーカリ属樹種の識別例）
供試材料
・ユーカリ・カマルドレンシスと考えられるユーカリ（DH2）の葉
・ユーカリ・カマルドレンシス×ユーカリ・デグルプタと考えられるユーカリ（K7）の葉
【００６１】
方法
１）DNA抽出：乾燥した葉約20mgをMag - Extractor Plant Genome（TOYOBO）用いて抽出した。
２）PCR：KOD-plus-ver.2（TOYOBO）を用いて対象領域を増幅した。対象領域はNS, ETSの2領域でそれぞれに対応したプライマー（NS11-NS13 もしくは NS11-NS2/ NS3-NS4, ETS4-ETS2）を用いた。PCR条件は変性94℃10sec, アニール60℃30sec, 伸長68℃30-60sec, 30cycleとした。PCR後、マルチスクリーンμ96（Millipore）を用いて精製した。
３）配列決定：Genetic Analyzer 3130xl（ABI）を用いて配列解析を行った。配列決定プライマーはそれぞれSNP1:NS11/NS2, SNP2:NS3/NS4, SNP3-SNP8: ETS4/ETS2を用いた。
【００６２】
結果
結果を表5（樹種「unkown DH2」及び「unkown K7」）に示す。
【００６３】
DH2は、ユーカリ・カマルドレンシスである可能性が高いことが確認できた。また、K7は、ユーカリ・カマルドレンシス×ユーカリ・デグルプタの雑種である可能性が高いことが確認できた。
【００６４】
【表５】
2011130741.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により、ユーカリ属植物の種間雑種を正確にかつ容易に識別することが可能になるため、ユーカリ天然交雑種のなかの優良品種の選抜が容易に行えるようになり、林業、紙パルプなどの産業で利用価値が高いと考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列番号1〜21：プライマー
【配列表】
2011130741000001.app