(57)【要約】【課題】皮膚のバリア機能の改善、皮膚の老化防止に有用な皮膚角化促進剤を提供する。【解決手段】アコヤ貝の貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末が産出するナクレインタンパク質を含み、このナクレインタンパク質は、（Ｉ）アコヤ貝等をキレート剤で脱灰して得られる物質を抽出して得られるタンパク質であるか、（ＩＩ）この抽出物質と大腸菌、酵母菌、または蚕のいずれか１つから選択される宿主細胞とを利用して遺伝子工学的に製造されるタンパク質である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末由来のナクレインタンパク質を含むことを特徴とする皮膚角化促進剤。
【請求項２】
前記貝殻がアコヤ貝であることを特徴とする請求項１記載の皮膚角化促進剤。
【請求項３】
前記ナクレインタンパク質が前記貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末をキレート剤で脱灰して得られる物質からの抽出物であることを特徴とする請求項１または請求項２記載の皮膚角化促進剤。
【請求項４】
前記ナクレインタンパク質が前記抽出物と大腸菌、酵母菌、または蚕のいずれか１つから選択される宿主細胞とを利用して遺伝子工学的に製造されることを特徴とする請求項３記載の皮膚角化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚の角化促進剤に関し、特にナクレインタンパク質を含む角化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとなっている。皮膚は、角質細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて変化（角化）し、これらの細胞中で細胞間脂質やＮＭＦ、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。しかし老化等によってこの角化の速度が低下すると、皮膚のくすみや肌荒れなどを引き起こすことが知られている。そのため皮膚の角化を促進する角化促進剤が開発されてきた。
例えば、皮膚の角化とともにコーニファイドエンベローブの成分として生成されるタンパク質であるソラヤシンの発現量を指標として、このソラヤシン発現が増強される物質を研究した結果、酪酸またはその誘導体、およびカルシウムイオン供給化合物を含有する皮膚角化促進剤が知られている（特許文献１）。
【０００３】
また、タイソウ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする表皮角化細胞増殖促進剤（特許文献２）、ハス胚芽抽出物を含有することを特徴とする表皮角化細胞増殖促進剤（特許文献３）がそれぞれ知られている。
【０００４】
一方、アコヤガイの貝殻は、炭酸カルシウムを主成分としており、貝殻外側の稜柱層は炭酸カルシウムとタンパク質が交互に重なった層状構造をなしている。この層状構造は、外套膜の表面で構築され、通常は血流に乗って運ばれてきたカルシウムイオンが外套膜より分泌されたタンパク質の触媒作用下に生成された炭酸イオンと結合し炭酸カルシウムの結晶としてタンパク質層の上に沈着して形成される。貝殻中に存在するタンパク質には、この結晶の大きさや真珠層の幅を制御している酸不溶性のタンパク質であるコンキオリンを始め、多数のタンパク質が知られている。その中で炭酸脱水素ドメインとＧｌｙ−Ｘａａ−Ａｓｎ（ここで、Ｘａａ＝Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ）ドメインから構成されているナクレインがある（非特許文献１）。
また、遺伝子工学的に産生される真珠タンパク質（ナクレイン）の製造方法が開示されている（特許文献４）。
また、粒度５０〜２００μｍに粉砕した真珠層をグアニジン塩酸塩で抽出したタンパク質成分を医薬目的の使用、およびそれらを含む組成物に利用する方法が知られている（特許文献５）。
【０００５】
しかしながら、従来の角化促進成分の作用は十分ではなく、また、ナクレインタンパク質が皮膚角化促進剤として使用できることは、従来知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−１５５２６９公報
【特許文献２】特開２００６−３１６０２８号公報
【特許文献３】特開２００２−６８９９３号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ９６／３５７８６号公報
【特許文献５】特表２０００−５０４３１４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３， ９６５７−９６６０（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題に対処するためになされたものであり、皮膚のバリア機能の改善、皮膚の老化防止に有用な皮膚角化促進剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
アコヤ貝貝殻中のナクレインタンパク質はカルシウムを結合・運搬し貝殻を形成する役割を担っている。一方、皮膚は角質細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて分化し、この分化につれてカルシウム濃度が高くなる。ナクレインタンパク質が皮膚の分化にどのように作用するのか試験した結果、皮膚の分化に関連の深いＳ１００Ａ７遺伝子の発現が確認された。本発明は、このような知見に基づくものである。
すなわち、本発明の皮膚角化促進剤は、貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末由来のナクレインタンパク質を含むことを特徴とする。特に貝殻がアコヤ貝の貝殻であることを特徴とする。
また、上記ナクレインタンパク質が貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末をキレート剤で脱灰して得られる物質からの抽出物であることを特徴とする。
また、上記ナクレインタンパク質は、貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末をキレート剤で脱灰して得られる物質からの抽出物と、大腸菌、酵母菌、または蚕のいずれか１つから選択される宿主細胞とを利用して遺伝子工学的に製造されるタンパク質であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、ナクレインタンパク質を配合するため、皮膚のバリア機能の改善、皮膚の老化防止に有用な皮膚角化促進剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】イオン交換クロマトグラフィー溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図２】Ｓ１００Ａ７の遺伝子発現量の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ナクレインタンパク質は、（Ｉ）貝殻、特にアコヤ貝の貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末をキレート剤で脱灰して得られる物質を抽出する方法、（ＩＩ）上記（Ｉ）の方法で得られるタンパク質を大腸菌、酵母菌、または蚕のいずれか１つから選択される宿主細胞とを利用する方法により製造される。
上記（Ｉ）の方法について説明する。
本発明で好ましく使用できる貝殻としては、特に限定はなくアコヤ貝（Ｐｉｃｔａｄａ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ）、イガイ（Ｍｙｔｉｌｕｓ  ｃｏｒｕｓｃｕｍ）、イケチョウガイ（Ｈｙｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）、カラスガイ（Ｃｒｉｓｔａｒｉａ  ｐｌｉｃａｔａ）等ウグイスガイ科、イガイ科、イシガイ科の貝類等が例示される。特に好適なものは、真珠養殖などで多量に得られるアコヤ貝（真珠貝）である。
真珠断片とは、真珠を割り核を取り除いた破砕片である。真珠断片の製造方法は粉砕するのではなく真珠をそのまままたは複数個の断片に割ることにより得られる。真珠としては、アコヤ貝、イケチョウ貝などの真珠貝より得られる球体真珠、マベ貝より得られるマベ半円真珠殻などが挙げられる。
【００１３】
本発明の皮膚角化促進剤に用いられるナクレインタンパク質は、貝殻もしくは真珠断片またはこれらの粉末を水に分散する工程と、上記分散された貝殻もしくは断片またはこれらの粉末に含まれるカルシウムイオンに対して等モル以上のキレート剤を加えて脱灰する工程を経て製造される物質を原料とする。
これより、酸に溶解する物質を抽出するか、イオン交換樹脂や、分子量分画、吸着樹脂等の１種または２種以上の方法を適用して、ナクレインタンパク質あるいはナクレインタンパク質を含む分画を製造できる。
【００１４】
キレート剤で脱灰して得られる物質を抽出する方法は、貝殻等をキレート剤で脱灰して得られる物質を抽出する方法である。
脱灰処理に使用できるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸塩、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジフォスホン酸、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジフォスホン酸四ナトリウム塩、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等のキレート剤であれば用いることができる。
これらの中でエチレンジアミン四酢酸塩が、他のキレート剤より効率的に脱灰処理を行なえるので好ましい。エチレンジアミン四酢酸塩としては、二ナトリウム塩、三ナトリウム塩、四ナトリウム塩等いずれも使用できる。
【００１５】
アコヤ貝の貝殻を原料とする脱灰処理方法について以下説明する。
（１）必要により、アコヤ貝貝殻を破砕して貝殻断片とする。
アコヤ貝貝殻は破砕する前に回転バレル研磨機、振動バレル研磨機等を用いて稜柱層を取り除くことが好ましい。稜柱層を取り除くことにより脱灰時間を短くすることができる。
また、破砕する場合、その方法は、回転バレル研磨機、振動バレル研磨機等で稜柱層を取り除く工程でその研磨強度を調整することによって行なうか、別途、ハンマーミル等で行なう。
【００１６】
（２）アコヤ貝貝殻断片または粉末を水に分散させて、この断片等に含まれるカルシウムイオンに対して等モル以上のエチレンジアミン四酢酸塩を加える。
アコヤ貝貝殻に含まれるタンパク質（約２重量％）を考慮して、また、貝殻断片が炭酸カルシウムとして、カルシウムイオン量を算出する。エチレンジアミン四酢酸塩は少なくとも１個のカルシウムイオンとキレートを形成するので、エチレンジアミン四酢酸塩はカルシウムイオンに対して等モル以上使用する。好ましくは等モル〜５倍等モル量である。
また、エチレンジアミン四酢酸塩は水に溶解し難いため、水に分散されているアコヤ貝貝殻の量が多い場合、あるいはエチレンジアミン四酢酸塩の濃度を高める場合には、アコヤ貝貝殻を分散させている水のｐＨを、水酸化ナトリウムなどのアルカリを添加することで、ｐＨ７．０〜９．０に調整することが好ましい。
分散液の条件として、分散されるアコヤ貝貝殻の濃度は、０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜３重量％である。０．１重量％未満であるとナクレインタンパク質の生産性が劣り、１０重量％をこえると脱灰処理に長い時間がかかる。
【００１７】
（３）上記分散液を、好ましくは穏やかな条件で撹拌する。ここで穏やかな条件とは、アコヤ貝貝殻の脱灰処理により炭酸カルシウムが除去されてナクレインタンパク質を含む溶液を得られる条件をいう。
【００１８】
得られた溶液から水、好ましくは酸により、それらに溶解する物質を抽出するか、イオン交換樹脂や、分子量分画、吸着樹脂等の１種または２種以上の方法を適用して、ナクレインあるいはナクレインを含む分画を得る。
【００１９】
上記ナクレインタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した結果、分子量約５５ｋＤａのタンパク質である。本発明においては、この特定の分子量を有するタンパク質と同時に、イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製されるナクレインを含む分画物も利用できる。
【００２０】
上記（Ｉ）の方法で得られるナクレインタンパク質は、大腸菌、酵母菌、または蚕のいずれか１つから選択される宿主細胞とを利用して、公知の遺伝子工学的に多量に製造することができる（上記（ＩＩ）の方法）。例えば、国際公開番号ＷＯ９６／３５７８６号公報記載の方法で製造できる。
【００２１】
本発明の皮膚角化促進剤は、皮膚角化促進剤の形態で皮膚に適用される。また、皮膚角化促進剤は、皮膚化粧料、外用医薬部外品、医療用皮膚外用剤に配合できる。
【００２２】
また、本発明の皮膚角化促進剤には、上記成分の他に医薬品や化粧品の各種製剤において使用されている界面活性剤、油性成分、保湿剤、高分子化合物、紫外線吸収剤、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、金属イオン封鎖剤、防腐剤、ビタミン類、色素、香料、水等を配合することができる。
ナクレインタンパク質の配合割合としては、皮膚角化促進剤全体に対して、０．００００１〜１．０重量％で、好ましくは０．００１〜０．５重量％である。
【００２３】
本発明の皮膚角化促進剤は、常法に従い、通常の皮膚角化促進剤として知られる種々の形態の基材に配合して調製することができる。その形態としては、特に限定されず、例えば、ローション類、乳液類、クリーム類、軟膏類、パック類等の任意の剤形を選択することができる。
【実施例】
【００２４】
実施例１
ナクレインタンパク質を以下の方法で製造した。
アコヤ貝貝殻の稜柱層を、バレル研磨機を用いて取り除いた。稜柱層を取り除き真珠層が主成分となった貝殻粉末２００ｇに、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した０．５ＭのＥＤＴＡ水溶液を１０００ｍｌ加えて、７２時間、温度４℃で撹拌した。
撹拌により得られた溶液を８２７０Ｇの遠心力で３０分間遠心分離した。上清を、３０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で、セロハンチューブ（三光純薬社製、商品名セルロースチューブＣ−１５０）を用いて透析した。透析外液は１回４０００ｍｌ使用し、３回交換した。透析後、さらに８２７０Ｇの遠心力で３０分間遠心分離した。上清を、目の粗さ０．４５μｍのフィルターでろ過した。以上の遠心分離および透析操作を４℃で行なった。
【００２５】
上記抽出液をイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。イオン交換クロマトグラフィーの分取条件を以下に示す。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー社製  ５５．０ｍｍΦ×２０．０ｃｍＬ）
移動層：３０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５〜１．０Ｍ塩化ナトリウムグラジエント、なお、塩化ナトリウムは０．５Ｍで６０分間流した後、１５０分かけて１．０Ｍにした。
流速  ：６．０ｍｌ／ｍｉｎ．
検出器：紫外線吸光度検出器２８０ｎｍ
分画  ：５分間隔
なお、分画は６０分後のグラジエント開始より検出器で確認しながら、吸光し始めた時点より開始した。
【００２６】
結果を図１に示す。図１はイオン交換クロマトグラフィー溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
フラクションＮｏ．４を分取して、蒸留水を外液として透析を行なった。透析外液は１回２０００ｍｌ使用し３回交換した。透析内液を凍結乾燥した。分取されたフラクションＮｏ．４の成分は、分子量５５ｋＤａのタンパク質であり、このタンパク質はナクレインであることが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに供し、得られたアミノ酸配列をＭａｓｃｏｔで相同性検索した結果より明らかとなった。
【００２７】
上記ナクレインタンパク質のヒト由来表皮細胞に対する影響を確認するため、表皮の分化に関わる代表的なタンパク質であるＳ１００Ａ７の遺伝子発現の変化を、リアルタイムＰＣＲを用いて評価した。
Ｓ１００Ａ７は、乾癬の皮膚に過剰発現している分泌タンパク質として最初に同定されたタンパク質であり多くの炎症性疾患においても、過剰発現が確認されている。またＳ１００Ａ７は、体の表面でバクテリアを殺す働きがある。従って抗菌タンパク質であることが明らかとなっている。
【００２８】
＜細胞培養＞
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ、ＳｔｒａｉｎＮｏ．４４５５２９）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、カルシウム濃度が０．５ｍＭおよび１．８ｍＭの２種類のＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、１０μＭおよび１００μΜ（終濃度）となるよう添加し、さらに２日間３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で８日間培養した。
【００２９】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００３０】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ  ＦＯＲ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
【００３１】
＜使用プライマー＞
Ｓ１００Ａ７：フォワードプライマーがＴＧＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧの塩基配列と、リバースプライマーがＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧの塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴの塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧの塩基配列とのセット
【００３２】
図２にリアルタイムＰＣＲの結果を示す。図２は、増殖培地（カルシウム濃度を０．１５ｍＭ）を１としたときの相対値で表したＳ１００Ａ７の遺伝子発現量である。
カルシウムは皮膚の分化に影響を及ぼす最もよく知られた成分で、表皮基底層から有棘層、顆粒層と分化が進むに従い、その濃度も高くなることが知られている。ナクレインタンパク質の皮膚の分化に対する作用を確認する目的で、中濃度（０．５ｍＭ）ならびに高濃度（１．８ｍＭ）のカルシウムの存在下で、１０μΜおよび１００μΜのナクレインタンパク質を作用し、表皮の分化と関連の深い、Ｓ１００Ａ７の遺伝子発現量の変化をリアルタイムＰＣＲを用い確認した。その結果、図２に示すように、カルシウム濃度による差は多少認められるが、Ｓ１００Ａ７が非常に強く誘導されることが判明した。
【００３３】
Ｓ１００Ａ７は、皮膚の角化とともにコーニファイドエンベローブの成分として生成されることが知られており、皮膚角化の指標として有用である。本発明の皮膚角化促進剤は、このＳ１００Ａ７の発現を顕著に増強させる。また、Ｓ１００Ａ７は、コーニファイドエンベローブの成分であるから、本発明の皮膚角化促進剤を用いれば、皮膚のバリア機能が改善される。また、Ｓ１００Ａ７は抗菌作用を有することが知られているため、本発明皮膚角化促進剤を用いれば、皮膚の抗菌作用が増強され、バリア機能が増大する。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は皮膚のバリア機能の改善、皮膚の老化防止に有用な皮膚角化促進剤が得られるため、滑らかな皮膚形成に役立つ基礎化粧品素材の開発が可能となる。
【図２】
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【図１】
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