(57)【要約】      （修正有）【課題】トウモロコシを含めた単子葉植物における導入遺伝子の発現のための方法および組成物を提供する。【解決手段】遺伝子サイレンシングは、形質転換のための属Ｃｏｉｘの植物からの単子葉植物−相同配列の使用によって回避される。これらの導入遺伝子配列に含まれるものはＣｏｉｘプロモーター、エンハンサー、コーディング配列およびターミネータである。トウモロコシ−由来導入遺伝子に対する適当な代替物は相同性−ベースの遺伝子サイレンシングが導入遺伝子発現を制限しまたは効果的に排除することができる点で、発現に望ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）選択された遺伝子を準備するステップと、
（ｂ）Ｃｏｉｘプロモーターに作動可能に連結した該遺伝子を含む構築物を調製するステップと、
（ｃ）Ｃｏｉｘ以外の単子葉植物からの受容細胞を該構築物により形質転換するステップと、
（ｄ）該受容細胞から該遺伝子を発現する単子葉植物を再生するステップとを含むことを特徴とする選択された遺伝子を発現するＣｏｉｘ以外の単子葉植物を作成する方法。
【請求項２】
該単子葉植物が、イネ、コムギ、オートムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガムおよびトウモロコシよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
該単子葉植物が、トウモロコシである請求項２記載の方法。
【請求項４】
形質転換の該ステップが、微粒子銃法、プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維媒介形質転換またはアグロバクテリウム媒介形質転換である請求項１記載の方法。
【請求項５】
該微粒子銃法が、微粒子を該構築物を含むＤＮＡ荷よりコートすることと、該受容細胞を該微粒子と接触させることとを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
該選択された遺伝子が、昆虫抵抗性遺伝子、真菌病抵抗性遺伝子、ウイルス病抵抗性遺伝子、細菌病抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響を与える遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子、植物農学的特性に影響を与える遺伝子、環境抵抗性遺伝子、およびストレス抵抗性遺伝子よりなる群から選択される遺伝子を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
該Ｃｏｉｘプロモーターが、ガンマゼイン、オレオシンｏｌｅ１６、グロブリン１、アクチン１、アクチンｃ１、スクロースシンテターゼ、ＩＮＯＰＳ、ＥＭＢ５、グロブリン２、ｂ−３２、ＡＤＰＧ−ピロホスホリラーゼ、Ｌｔｐ１、Ｌｔｐ２、オレオシンｏｌｅ１７、オレオシンｏｌｅ１８、アクチン２、花粉特異的タンパク質、花粉特異的ペクテートリアーゼ、葯特異的タンパク質、葯特異的遺伝子ＲＴＳ２、花粉特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子ＲＡＢ２４、アンスラニレートシンターゼアルファサブユニット、アルファゼイン、アンスラニレートシンターゼベータサブユニット
、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、Ｔｈｉ１、アルコールデヒドロゲナーゼ、ｃａｂ結合タンパク質、Ｈ３Ｃ４、ＲＵＢＩＳＣＯ  ＳＳ澱粉分岐酵素、ＡＣＣａｓｅ、アクチン３、アクチン７、調節タンパク質ＧＦ’１４−１２、リボソームタンパク質Ｌ９、セルロース生合成酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｃキナーゼ受容体、ホスホグリセレートムターゼ、根特異的ＲＣｃ３  ｍＲＮＡ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、ピロホスフェート−フラクトース６−リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ユビキチン、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、３３ｋＤａ光系ＩＩ、酸素発生タンパク質、６９ｋＤａ空胞ＡＴＰａｓｅサブユニット、メタロチオネイン様タンパク質、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、Ａ
ＢＡおよび成熟誘導様タンパク質、フェニルアラントインアンモニアリアーゼ、アデノシントリホスファターゼＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、αチューブリン、ｃａｂ、ＰＥＰＣａｓｅ、Ｒ、レクチン、集光性複合体、熱ショックタンパク質、カルコンシンターゼ、ゼイン、グロブリン１、ＡＢＡ、オーキシン結合タンパク質、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子、ＭＰＩ、アクチン、オペク２、ｂ７０、およびオレオシンよりなる群から選択される遺伝子に相同なＣｏｉｘ遺伝子からのプロモーターである請求項１記載の方法。
【請求項８】
該Ｃｏｉｘプロモーターが、ガンマコイキシンプロモーターである請求項１記載の方法。
【請求項９】
（ａ）請求項１記載の単子葉植物を作成するステップと、
（ｂ）該植物を第２の植物または該植物自体と交雑させるステップとを含むことを特徴とする子孫植物の生産方法。
【請求項１０】
（ａ）請求項９記載の方法による子孫植物を得るステップと、
（ｂ）該植物を該植物自体または第２の植物と交雑させるステップと
を含むことを特徴とする植物育種の方法。
【請求項１１】
（ａ）Ｃｏｉｘプロモーターを準備するステップと、
（ｂ）選択された遺伝子に作動可能に連結された該Ｃｏｉｘプロモーターを含む構築物を調製するステップと、
（ｄ）Ｃｏｉｘ以外の単子葉植物からの受容細胞を該構築物により形質転換するステップと、
（ｅ）該受容細胞からの該遺伝子を発現する植物を再生するステップであって、それにより、該植物が遺伝子サイレンシングを呈しないステップと
を含むことを特徴とするＣｏｉｘ以外の単子葉植物において遺伝子サイレンシン
グを防止する方法。
【請求項１２】
該単子葉植物が、コメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、ソルガムおよびトウモロコシよりなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該単子葉植物が、トウモロコシである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
形質転換の該ステップが、微粒子銃法、プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維媒介形質転換またはアグロバクテリウム媒介形質転換である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
該微粒子銃法が、微粒子を該構築物を含むＤＮＡによりコートすることと、該受容細胞を該微粒子と接触させることとを含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該選択された遺伝子が、昆虫抵抗性遺伝子、真菌病抵抗性遺伝子、ウイルス病抵抗性遺伝子、細菌病抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響する遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子、植物農学的特性に影響を与える遺伝子、環境抵抗性遺伝子、およびストレス抵抗性遺伝子よりなる群から選択される遺伝子を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
該Ｃｏｉｘプロモーターが、ガンマゼイン、オレオシンｏｌｅ１６、グロブリン１、アクチン１、アクチンｃ１、スクロースシンテターゼ、ＩＮＯＰＳ、ＥＭＢ５、グロブリン２、ｂ−３２、ＡＤＰＧ−ピロホスホリラーゼ、Ｌｔｐ１、Ｌｔｐ２、オレオシンｏｌｅ１７、オレオシンｏｌｅ１８、アクチン２、花粉特異的タンパク質、花粉特異的ペクテートリアーゼ、葯特異的タンパク質、葯特異的遺伝子ＲＴＳ２、花粉特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子ＲＡＢ２４、アンスラニレートシンターゼアルファサブユニット、アルファゼイン、アンスラニレートシンターゼベータサブユニッ
ト、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、Ｔｈｉ１、アルコールデヒドロゲナーゼ、ｃａｂ結合タンパク質、Ｈ３Ｃ４、ＲＵＢＩＳＣＯ  ＳＳ澱粉分岐酵素、ＡＣＣａｓｅ、アクチン３、アクチン７、調節タンパク質ＧＦ’１４−１２、リボソームタンパク質Ｌ９、セルロース生合成酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｃキナーゼ受容体、ホスホグリセレートムターゼ、根特異的ＲＣｃ３  ｍＲＮＡ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、ピロホスフェート−フラクトース６−リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ユビキチン、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、３３ｋＤａ光系ＩＩ、酸素発生タンパク質、６９ｋＤａ空胞ＡＴＰａｓｅサブユニット、メタロチオネイン様タンパク質、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＢＡおよび成熟誘導様タンパク質、フェニルアラントインアンモニアリアーゼ、アデノシントリホスファターゼＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、αチューブリン、ｃａｂ、ＰＥＰＣａｓｅ、Ｒ、レクチン、集光性複合体、熱ショックタンパク質、カルコンシンターゼ、ゼイン、グロブリン１、ＡＢＡ、オーキシン結合タンパク質、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子、ＭＰＩ、アクチン、オペク２、ｂ７０、およびオレオシンよりなる群から選択されるＣｏｉｘ以外の単子葉植物からの遺伝子に相同なＣｏｉｘ遺伝子からのプロモーターである請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
該準備するステップが、Ｃｏｉｘ以外の単子葉植物種の遺伝子からのＤＮＡまたはそのフランキング配列を、ＣｏｉｘからのＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
Ｃｏｉｘ以外の該単子葉植物種およびＣｏｉｘ以外の該単子葉植物が、同一種のメンバーである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｃｏｉｘからの該ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡクローンのライブラリーを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
Ｃｏｉｘプロモーターを準備するステップがＰＣＲTMを含む請求項１１記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）請求項１１記載の方法による植物を作成するステップと、
（ｂ）該植物を第２の植物または該植物自体と交雑させるステップとを含むことを特徴とする子孫の生産方法。
【請求項２３】
（ａ）請求項２２記載の方法により該構築物を含む子孫植物を得るステップと、
（ｂ）該植物を該植物自体または第２の植物と交雑させるステップとを含むことを特徴とする植物育種の方法。
【請求項２４】
（ａ）望ましい発現プロフィールを有するＣｏｉｘ以外の単子葉植物から第１のプロモーターを同定するステップと、
（ｂ）該第１のプロモーターに相同なＣｏｉｘプロモーターを単離するステップと、
（ｃ）選択された遺伝子に作動可能に連結した該Ｃｏｉｘプロモーターを含む発現ベクターを構築するステップと
を含むことを特徴とする単子葉植物発現ベクターを調製する方法。
【請求項２５】
該単子葉植物が、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、オートムギおよびトウモロコシよりなる群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該単子葉植物が、トウモロコシである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該選択された遺伝子が、昆虫抵抗性遺伝子、真菌病抵抗性遺伝子、ウイルス病抵抗性遺伝子、細菌病抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響する遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子、植物農学特性に影響を与える遺伝子、環境抵抗性遺伝子、およびストレス抵抗性遺伝子よりなる群から選択される特性をコードする請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
該単子葉プロモーターが、ガンマゼイン、オレオシンｏｌｅ１６、グロブリン１、アクチン１、アクチンｃ１、スクロースシンテターゼ、ＩＮＯＰＳ、ＥＭＢ５、グロブリン２、ｂ−３２、ＡＤＰＧ−ピロホスホリラーゼ、Ｌｔｐ１、Ｌｔｐ２、オレオシンｏｌｅ１７、オレオシンｏｌｅ１８、アクチン２、花粉特異的タンパク質、花粉特異的ペクテートリアーゼ、葯特異的タンパク質、葯特異的遺伝子ＲＴＳ２、花粉特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子ＲＡＢ２４、アンスラニレートシンターゼアルファサブユニット、アルファゼイン、アンスラニレートシンターゼベータサブユニット
、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、Ｔｈｉ１、アルコールデヒドロゲナーゼ、ｃａｂ結合タンパク質、Ｈ３Ｃ４、ＲＵＢＩＳＣＯ  ＳＳ澱粉分岐酵素、ＡＣＣａｓｅ、アクチン３、アクチン７、調節タンパク質ＧＦ’１４−１２、リボソームタンパク質Ｌ９、セルロース生合成酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｃキナーゼ受容体、ホスホグリセレートムターゼ、根特異的ＲＣｃ３  ｍＲＮＡ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、ピロホスフェート−フラクトース６−リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ユビキチン、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、３３ｋＤａ光系ＩＩ、酸素発生タンパク質、６９ｋＤａ空胞ＡＴＰａｓｅサブユニット、メタロチオネイン様タンパク質、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、Ａ
ＢＡおよび成熟誘導様タンパク質、フェニルアラントインアンモニアリアーゼ、アデノシントリホスファターゼＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、αチューブリン、ｃａｂ、ＰＥＰＣａｓｅ、Ｒ、レクチン、集光性複合体、熱ショックタンパク質、カルコンシンターゼ、ゼイン、グロブリン１、ＡＢＡ、オーキシン−結合タンパク質、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子、ＭＰＩ、アクチン、オペク２、ｂ７０、およびオレオシンよりなる群から選択される遺伝子である請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
該同定するステップが、該単子葉植物遺伝子からのＤＮＡまたはそのフランキング配列を、ＣｏｉｘからのＤＮＡにハイブリダイゼーションさせることを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
Ｃｏｉｘからの該ＤＮＡが、ゲノムＤＮＡクローンのライブラリーを含む請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
Ｃｏｉｘプロモーターを同定する該ステップが、ＰＣＲTMを含む請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
配列番号８の核酸配列から単離可能な単離されたガンマコイキシンプロモーター。
【請求項３３】
配列番号８の約８０ないし約８９４の連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列。
【請求項３４】
配列番号８の約２２２ないし約８９４の連結ヌクレオチドを含む請求項３３記載の単離された核酸配列。
【請求項３５】
配列番号１８の核酸配列を含む請求項３４記載の単離された核酸配列。
【請求項３６】
配列番号８の核酸配列の約４１２ないし約８９４の連続ヌクレオチドを含む請求項３５記載の単離された核酸配列。
【請求項３７】
配列番号１９の核酸配列を含む請求項３６記載の単離された核酸配列。
【請求項３８】
配列番号１１の核酸配列から単離可能な単離されたガンマコイキシンターミネーター。
【請求項３９】
配列番号１１の核酸配列の約８０ないし約４１２の連続ヌクレオチドを含む核酸配列。
【請求項４０】
配列番号１１の核酸配列の約２００ないし約４１２の連続ヌクレオチドを含む請求項３９記載の核酸配列。
【請求項４１】
配列番号１１の約３２５ないし約４１２の連続ヌクレオチドを含む請求項４０記載の核酸配列。
【請求項４２】
配列番号１１の核酸配列を含む請求項４１記載の核酸配列。
【請求項４３】
配列番号１７の核酸配列から単離可能なＣｏｉｘオレオシン３ターミネーター。
【請求項４４】
配列番号１７の核酸配列の約５０ないし約３７７の連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列。
【請求項４５】
核酸配列配列番号１７の約１２０ないし約３７７の連続ヌクレオチドを含む請求項４４記載の単離された核酸配列。
【請求項４６】
核酸配列配列番号１７の約２２０ないし約３７７の連続ヌクレオチドを含む請求項４５記載の単離された核酸配列。
【請求項４７】
核酸配列配列番号１７の約３００ないし約３７７の連続ヌクレオチドを含む請求項４６記載の単離された核酸配列。
【請求項４８】
核酸配列配列番号１７を含む請求項４７記載の単離された核酸配列。
【請求項４９】
ガンマコイキシンプロモーターを含む選択されたＤＮＡを含む稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項５０】
該プロモーターが、請求項３２記載の核酸配列、請求項３３記載の核酸配列、請求項３４記載の核酸配列、請求項３５記載の核酸配列、請求項３６記載の核酸配列を含む請求項４９記載の植物。
【請求項５１】
該プロモーターが、昆虫抵抗性遺伝子、細菌病抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響する遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子、植物農学特性に影響を与える遺伝子、環境抵抗性遺伝子、およびストレス抵抗性遺伝子よりなる群から選択される外因性遺伝子に作動可能に連結した請求項５０記載の植物。
【請求項５２】
該ガンマコイキシン遺伝子に対して天然でないプロモーターに作動可能に連結したガンマコイキシンをコードする遺伝子を含む選択されたＤＮＡを含む稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項５３】
ガンマコイキシンをコードする該遺伝子が、配列番号１６の核酸配列によってコードされたポリペプチドをコードする請求項５２記載の稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項５４】
ガンマコイキシンターミネーターを含む選択されたＤＮＡを含む稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項５５】
該ガンマコイキシンターミネーターが、請求項３９記載の核酸配列、請求項４０記載の核酸配列、請求項４１記載の核酸配列、および請求項４２記載の核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含む請求項５４記載の稔性トランスジェニック植物。
【請求項５６】
Ｃｏｉｘオレオシン３ターミネーターを含む選択されたＤＮＡを含む稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項５７】
該Ｃｏｉｘオレオシン３ターミネーターが、請求項４４記載の核酸配列、請求項４５記載の核酸配列、請求項４６記載の核酸配列、請求項４７記載の核酸配列および請求項４８記載の核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含む請求項５６記載の稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項５８】
該子孫植物が、該選択されたＤＮＡを含む請求項４９、５２、５４または５６記載の植物のいずれかの世代の子孫植物。
【請求項５９】
該植物が、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガムおよびトウモロコシよりなる群から選択される単子葉植物である請求項４９、５２、５４または５６記載の稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項６０】
該単子葉植物が、トウモロコシである請求項５９記載の稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項６１】
該植物が、タバコ、トマト、ジャガイモ、大豆および綿よりなる群から選択される双子葉植物である請求項４９、５２、５４または５６記載の稔性を有するトランスジェニック植物。
【請求項６２】
請求項４９、５２、５４または５６記載の稔性を有するトランスジェニック植物またはそのトランスジェニック子孫植物を、その植物自体または第２の植物と交雑させることを特徴とする植物育種の方法。
【請求項６３】
オレオシンｏｌｅ１６、グロブリン１、アクチン１、アクチンｃ１、スクロースシンテターゼ、ＩＮＯＰＳ、ＥＭＢ５、グロブリン２、ｂ−３２、ＡＤＰＧ−ピロホスホリラーゼ、Ｌｔｐ１、Ｌｔｐ２、オレオシンｏｌｅ１７、オレオシンｏｌｅ１８、アクチン２、花粉特異的タンパク質、花粉特異的ペクテートリアーゼ、葯特異的タンパク質、葯特異的遺伝子ＲＴＳ２、花粉特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子ＲＡＢ２４、アンスラニレートシンターゼアルファサブユニット、アルファゼイン、アンスラニレートシンターゼベータサブユニット、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、Ｔｈｉ１、アルコールデヒドロゲナーゼ、ｃａｂ結合タンパク質、Ｈ３Ｃ４、ＲＵＢＩＳＣＯ  ＳＳ澱粉分岐酵素、ＡＣＣａｓｅ、アクチン３、アクチン７、調節タンパク質ＧＦ’１４−１２、リボソームタンパク質Ｌ９、セルロース生合成酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｃキナーゼ受容体、ホスホグリセレートムターゼ、根特異的ＲＣｃ３  ｍＲＮＡ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、ピロホスフェート−フラクトース６−リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ユビキチン、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、３３ｋＤａ光系ＩＩ、酸素発生タンパク質、６９ｋＤａ空胞ＡＴＰａｓｅサブユニット、メタロチオネイン様タンパク質、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＢＡおよび成熟誘導様タンパク質、フェニルアラントインアンモニアリアーゼ、アデノシントリホスファターゼＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、αチューブリン、ｃａｂ、ＰＥＰＣａｓｅ、Ｒ、レクチン、集光性複合体、熱ショックタンパク質、カルコンシンター
ゼ、ゼイン、グロブリン１、ＡＢＡ、オーキシン−結合タンパク質、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子、ＭＰＩ、オレオシン、アクチン、オペク２およびｂ７０よりなる群から選択されるＣｏｉｘ遺伝子をコードする単離された核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般にトランスジェニック植物に関する。さらに詳しくは、本発明は植物において導入遺伝子を発現する方法および組成物に関する。
【０００２】
関連技術の記載
分子生物学における最近の進歩は、動物および植物の生殖質を操作する科学者の能力を劇的に高めた。特異的表現型、例えば、昆虫、抗生物質および除草剤抵抗性を与える特定のポリペプチドを制御する遺伝子はある生殖質内に位置付けられ、それから単離された。より重要なのは、１つの生物から単離された遺伝子を採取する、およびそれらをもう１つの生物に導入する能力であった。この形質転換は、受容(recipient)生物が、遺伝子を供与したものからの異なる門、属または種からのものである場合にさえ達成され得る（異種形質転換）。
【０００３】
多数の遺伝子作成技術を用いて外因性遺伝子を導入することによって所望の特性を植物ゲノムに遺伝的作成しようとする試みがなされてきた。受容植物細胞による新しいＤＮＡの摂取は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｎｅｓｔｅｒら，９８４）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ＤＮＡ摂取（Ｌｏｒｚら，１９８５）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら，１９８６）および微粒子銃（Ｋｌｅｉｎら，１９８７）を含めた手段によって達成されてきた。
【０００４】
前記した技術のいくつかにより、植物の形質転換をほとんどルーチン的なものとなってきたが、外因性ＤＮＡの発現は面倒なものであった。遭遇してきた最も深刻な問題の１つは「共抑制(co-suppression )」として知られている現象である。この用語は相同導入遺伝子の導入後に外因性遺伝子の遺伝子発現の阻害を記載するために作られたものであり（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９０）、ペチュニアにおけるカルコーンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子につき最初に記載された（Ｎａｐｏｌｉら，１９９０；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら，１９９０）。共抑制はＣＨＳに対してユニークではないが、トランスジェニック植物に影響する一般的現象であるように見える。共抑制の程度は個々の形質転換体で変化するが、ある植物では、ｎｕｌｌ表現型が関与する遺伝子座につき生産される程度まで起こることができる。
【０００５】
多数のトランスジェニック植物系が、少なくとも部分的に相同の導入遺伝子または導入遺伝子および相同内因性配列の多数コピーいずれかを含むことができる、相同依存性「遺伝子サイレンシング」の現象を呈してきた（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９５；ＭａｔｚｋｅおよびＭａｔｚｋｅ，１９９５；Ｍｅｙｅｒ，１９９５）。サイレンシングの種々のケースを区別する最も基本的なメカニズムは、観察された不活化が転写または転写後レベルで起こるかであり、これは今度は相互作用する配列の間の相同性の領域によって決定される。転写サイレンシングはプロモーターの相同性の結果として大いに起こる（Ｎｅｕｈｕｂｅｒら，１９９４）。
【０００６】
プロモーター相同性依存性遺伝子サイレンシングに干渉し、時々、パラ突然変異を引き起こし、導入遺伝子の分離後に執拗に存在する遺伝子発現および／またはＤＮＡ修飾における遺伝可能な変化に導く（Ｌｉｎｂｄｏら，１９９３；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９５；ＭａｔｚｋｅおよびＭａｔｚｋｅ，１９９５；Ｐａｒｋら，１９９６）。遺伝子発現におけるかかる変化の原因は余り理解されていないが、サイレンシングは相同性の長さによっておよび相互作用配列の位置によって影響されることが知られている。
【０００７】
ノパリンシンターゼプロモーターの場合において、相同性の３００ｂｐ領域はタバコにおいて共抑制を媒介するのに十分であることが判明した（Ｍａｔｚｋｅら，１９９３）。また、ノパリンシンターゼプロモーターに対する相同性を有するＨ2として知られている内因性配列がノパリンシンターゼプロモーターによって駆動される遺伝子の優れたサイレンサーであることも判明した（Ｍａｔｚｋｅら，１９９３；Ｍａｔｚｋｅら，１９９４）。これは、サイレンシングおよび標的遺伝子座におけるノパリンシンターゼプロモーターコピーの対合、続いてのサイレンサーによる自律的に獲得されるものと同様の程度までの標的コピーに対してメチル化が課されることを含むと考えられている（Ｍａｔｚｋｅら，１９９４）。共抑制の最も効果的な例は、各々、ＣａＭＶの１９Ｓおよび３５Ｓプロモーターによって駆動される２つの遺伝子を含む導入遺伝子インサートを担うタバコ系である。２つのプロモーターに連結した両遺伝子は抑制され、この遺伝子座は、共通相同性の少なくとも９０ｂｐを供する新しく導入された構築物を不活化する（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，１９９３）。
【０００８】
転写サイレンシングは、特定の導入遺伝子の発現のための最も有用なプロモーターの多くが宿主ゲノムに対して天然である点で農業技術に対して特に面倒である。これは農業の最も重要な穀物のうちの１つであるトウモロコシにつき特に当てはまる。所望の発現プロフィールを持ついくつかのトウモロコシプロモーターの例はＡｄｈおよびスクロースシンターゼ遺伝子のもののごときほとんど構成的トウモロコシプロモーター（Ｗａｌｋｅｒら，１９８７；ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌｌ，１９９０）、トウモロコシゼインおよび集光性複合体プロモーターのごとき組織特異的プロモーター（Ｃｏｎｋｌｉｎｇら，１９９０；Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９８６）、およびトウモロコシ熱ショックタンパク質のもののごとき誘導性プロモーター（Ｏｄｅｌｌら，１９８５）を含む。
【０００９】
従って、植物、特に耕種学的に重要なトウモロコシのごとき単子葉植物における内因性遺伝子の発現のための改良された方法に対する大きな要望が当該分野にある。特に、単子葉植物プロモーターの所望の特徴を科学者が開発することができるようにするが、異種配列の共抑制に関連する問題を回避する方法が要求される。現行の技術は、耕種学的に重要な単子葉植物種に対して天然のプロモーターに対する適当な別法の欠如によってこの点に関して制限されている。
【００１０】
発明の概要
従って、本発明の第１の態様は、（ａ）選択された遺伝子を準備するステップと、（ｂ）Ｃｏｉｘプロモーターに作動可能に連結した該遺伝子を含む構築物を調製するステップと、（ｃ）受容側（レシピエント）の単子葉植物細胞を該構築物で形質転換するステップと、（ｄ）該遺伝子を発現する単子葉植物を再生するステップとを含むことを特徴とする単子葉植物において遺伝子を発現する方法を提供する。本発明の特別の実施態様において、単子葉植物はコメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガムおよびトウモロコシよりなる群から選択される植物である。形質転換のステップは、例えば、微粒子銃、プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維媒介形質転換、またはアグロバクテリウム媒介形質転換を含めた植物を安定に形質転換できるいずれの方法も含むことができる。本発明の好ましい実施態様において、形質転換のステップ
は、微粒子を該構築物を含むＤＮＡでコートすることと、受容細胞を微粒子と接触させることを含む。
【００１１】
該遺伝子は、昆虫抵抗性遺伝子、病気抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響する遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー遺伝子、植物耕種学特性に影響する遺伝子、および環境またはストレス抵抗性遺伝子を含めた、トランスジェニック植物で発現させることが望まれるいずれの潜在的遺伝子でもあり得る。本発明の特別の実施態様において、Ｃｏｉｘからのプロモーターはガンマゼイン、オレオシンｏｌｅ１６、グロブリン１、アクチン１、アクチンｃ１、スクロースシンテターゼ、ＩＮＯＰＳ、ＥＭＢ５、グロブリン２、ｂ−３２、ＡＤＰＧ−ピロホスホリラーゼ、Ｌｔｐ１、Ｌｔｐ２、オレオシンｏｌｅ１７、オレオシンｏｌｅ１８、アクチン２、花粉特異的タンパク質、花粉特異的ペクテートリアーゼ、葯特異的タンパク質、葯特異的遺伝子ＲＴＳ２、花粉特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子ＲＡＢ２４、アンスラニレートシンターゼアルファサブユニット、アルファゼイン、アンスラニレートシンターゼベータサブユニット、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、Ｔｈｉ１、アルコールデヒドロゲナーゼ、ｃａｂ結合タンパク質、Ｈ３Ｃ４、ＲＵＢＩＳＣＯ  ＳＳ澱粉分岐酵素、ＡＣＣａｓｅ、アクチン３、アクチン７、調節タンパク質ＧＦ’１４−１２、リボソームタンパク質Ｌ９、セルロース生合成酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｃキナーゼ受容体、ホスホグリセレートムターゼ、根特異的ＲＣｃ３  ｍＲＮＡ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、ピロホスフェート−フラクトース６−リン酸ホスホトランスフェラー
ゼ、ユビキチン、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、３３ｋＤａ光系ＩＩ、酸素発生タンパク質、６９ｋＤａ空胞ＡＴＰａｓｅサブユニット、メタロチオネイン様タンパク質、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＢＡおよび成熟誘導様タンパク質、フェニルアラントインアンモニアリアーゼ、アデノシントリホスファターゼＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、αチューブリン、ｃａｂ、ＰＥＰＣａｓｅ、Ｒ、レクチン、集光性複合体、熱ショックタンパク質、カルコンシンターゼ、ゼイン、グロブリン１、オーキシン結合タンパク質、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子、ＭＰＩ、アクチン、オペク２、ｂ７０よりなる群から選択される遺伝子からのプロモーターである。本発明の１つの実施態様において、Ｃｏｉｘプロモーターはガンマコイシキンプロモーターである。
【００１２】
もう１つの態様において、本発明は（ａ）前記した方法により単子葉植物を調製するステップと、（ｂ）該植物を第２の植物または該植物自体と交雑させるステップとを含む子孫の生産方法を提供する。もう１つの態様において、本発明は（ａ）前記した方法により調製した単子葉植物のいずれかの世代の、該構築物を含む子孫植物を得るステップと、（ｂ）該植物を該植物自体または第２の植物と交雑させるステップとを含む植物育種方法を提供する。
【００１３】
なおさらにもう１つの態様において、本発明は（ａ）該単子葉植物からのプロモーターに相同であるＣｏｉｘプロモーターを同定するステップと、（ｂ）該Ｃｏｉｘプロモーターをクローニングするステップと、（ｃ）選択された遺伝子に作動可能に連結した該Ｃｏｉｘプロモーターを含む構築物を調製するステップと、（ｄ）該単子葉植物の受容細胞を該構築物で形質転換ステップと、（ｅ）該受容細胞からの該遺伝子を発現させる植物を再生するステップとを含む、単子葉植物において遺伝子サイレンシングを防止する方法を提供する。単子葉植物はコメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガムおよびトウモロコシを含めた潜在的にいずれの単子葉植物であってもよい。本発明の１つの実施態様において、単子葉植物はトウモロコシである。
【００１４】
形質転換のステップは、微粒子銃法、プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換、エレクトロポレーション、炭化ケイ素繊維媒介形質転換、またはアグロバクテリウム媒介形質転換を含めた、ＤＮＡを植物ゲノムに導入するためのいずれかの適当な方法を含むことができる。本発明の好ましい実施態様において、形質転換のステップは、微粒子を該構築物を含むＤＮＡでコートし、該受容細胞を該微粒子と接触させることによって達成される微粒子銃法を含む。選択された遺伝子は、例えば、昆虫抵抗性遺伝子、病気抵抗性遺伝子、（細菌、ウイルス、菌類または線虫）、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響する遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー、植物耕種学特性に影響する遺伝子、または環境またはストレス抵抗性遺伝子を含むことができる。本発明の特別の実施態様において、該プロモーターはガンマゼイン、オレオシンｏｌｅ１６、グロブリン１、アクチン１、アクチンｃ１、スクロースシンテターゼ、ＩＮＯＰＳ、ＥＭＢ５、グロブリン２、ｂ−３２、ＡＤＰＧ−ピロホスホリラーゼ、Ｌｔｐ１、Ｌｔｐ２、オレオシンｏｌｅ１７、オレオシンｏｌｅ１８、アクチン２、花粉特異的タンパク質、花粉特異的ペクテートリアーゼ、葯特異的タンパク質、葯特異的遺伝子ＲＴＳ２、花粉特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子ＲＡＢ２４、アンスラニレートシンターゼアルファサブユニット、アルファゼイン、アンスラニレートシンターゼベータサブユニット、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、Ｔｈｉ１、アルコールデヒドロゲナーゼ、ｃａｂ結合タンパク質、Ｈ３Ｃ４、ＲＵＢＩＳＣＯ  ＳＳ澱粉分岐酵素、ＡＣＣａｓｅ、アクチン３、アクチン７、調節タンパク質ＧＦ’１４−１２、リボソームタンパク質Ｌ９、セルロース生合成酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｃキナーゼ受容体、ホスホグリセレートムターゼ、根特異的ＲＣｃ３  ｍＲＮＡ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、ピロホスフェート−フラクトース６−リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ユビキチン、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、３３ｋＤａ光系ＩＩ、酸素発生タンパク質、６９ｋＤａ空胞ＡＴＰａｓｅサブユニット、メタロチオネイン様タンパク質、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＢＡおよび成熟誘導様タンパク質、フェニルアラントインアンモニアリアーゼ、アデノシントリホスファターゼＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、αチューブリン、ｃａｂ、ＰＥＰＣａｓｅ、Ｒ、レクチン、集光性複合体、熱ショックタンパク質、カルコンシンターゼ、ゼイン、グロブリンー１、オーキシン−結合タンパク質、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子、ＭＰＩ、オレオシン、アクチン、オペク２、ｂ７０、およびオレオシンよりなる群から選択される遺伝子からのものである。
【００１５】
本発明の特定の実施態様において、同定するステップは単子葉植物プロモーターからのＤＮＡまたはそのフランキング配列のＣｏｉｘからのＤＮＡへのハイブリダイゼーションを含む。ＣｏｉｘからのＤＮＡはゲノムＤＮＡクローンのライブラリを含むことができる。本発明の他の実施態様において、Ｃｏｉｘプロモーターを同定するステップはＰＣＲTMを含む。
【００１６】
なおさらにもう１つの態様において、本発明は（ａ）前記した方法により単子葉植物を調製するステップと、（ｂ）該植物を第２の植物または該植物自体と交雑させるステップとを含む子孫の生産方法を提供する。
【００１７】
なおさらにもう１つの態様において、本発明は（ｂ）本発明の方法により調製した単子葉植物のいずれかの世代の、本発明の構築物を含む子孫植物を得るステップと、（ｂ）該植物を該植物自体または第２の植物と交雑させるステップとを含む植物育種方法を提供する。
【００１８】
なおさらにもう１つの態様において、本発明は（ａ）望ましい発現プロフィールを有する単子葉植物プロモーターを同定するステップと、（ｂ）トウモロコシプロモーターに相同であるＣｏｉｘプロモーターを単離するステップと、（ｃ）選択された遺伝子に作動可能に連結した該Ｃｏｉｘプロモーターを含む発現ベクターを構築するステップとを含む、トウモロコシ発現ベクターを調製する方法を提供する。本発明の特別の実施態様において、単子葉植物はコメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガムおよびトウモロコシよりなる群から選択される。本発明の好ましい実施態様において、単子葉植物はトウモロコシである。本発明のさらなる実施態様において、選択された遺伝子は、昆虫抵抗性遺伝子、病気抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響する遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー、植物耕種学特性に影響する遺伝子、および環境またはストレス抵抗性遺伝子よりなる群から選択される特性をコードする。
【００１９】
本発明のもう１つの実施態様において、単子葉植物プロモーターはガンマゼイン、オレオシンｏｌｅ１６、グロブリン１、アクチン１、アクチンｃ１、スクロースシンテターゼ、ＩＮＯＰＳ、ＥＭＢ５、グロブリン２、ｂ−３２、ＡＤＰＧ−ピロホスホリラーゼ、Ｌｔｐ１、Ｌｔｐ２、オレオシンｏｌｅ１７、オレオシンｏｌｅ１８、アクチン２、花粉特異的タンパク質、花粉特異的ペクテートリアーゼ、葯特異的タンパク質、葯特異的遺伝子ＲＴＳ２、花粉特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子、タペータム特異的遺伝子ＲＡＢ２４、アンスラニレートシンターゼアルファサブユニット、アルファゼイン、アンスラニレートシンターゼベータサブユニット、ジヒドロジピコリネートシンターゼ、Ｔｈｉ１、アルコールデヒドロゲナーゼ、ｃａｂ結合タンパク質、Ｈ３Ｃ４、ＲＵＢＩＳＣＯ  ＳＳ澱粉分岐酵素、ＡＣＣａｓｅ、アクチン３、アクチン７、調節タンパク質ＧＦ’１４−１２、リボソームタンパク質Ｌ９、セルロース生合成酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｃキナーゼ受容体、ホスホグリセレートムターゼ、根特異的ＲＣｃ３  ｍＲＮＡ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、ピロホスフェート−フラクトース６−リン酸ホスホトランスフェラーゼ、ユビキチン、ベータ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、３３ｋＤａ光系ＩＩ、酸素発生タンパク質、６９ｋＤａ空胞ＡＴＰａｓｅサブユニット、メタロチオネイン様タンパク質、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＢＡおよび成熟誘導様タンパク質、フェニルアラントインアンモニアリアーゼ、アデノシントリホスファターゼＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ、αチューブリン、ｃａｂ、ＰＥＰＣａｓｅ、Ｒ、レクチン、集光性複合体、熱ショックタンパク質、カルコンシンターゼ、ゼイン、グロブリンー１、ＡＢＡ、オーキシン−結合タンパク質、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子、ＭＰＩ、オレオシン、アクチン、オペク２、ｂ７０、およびオレオシンよりなる群から選択される遺伝子からのものである。
【００２０】
本発明の１つの実施態様において、同定する工程は該単子葉植物遺伝子からのＤＮＡまたはそのフランキング配列のＣｏｉｘからのＤＮＡへのハイブリダイゼーションを含み、それにより、ＣｏｉｘからのＤＮＡはゲノムＤＮＡクローンのライブラリーを含むことができる。本発明のもう１つの実施態様において、Ｃｏｉｘプロモーターを同定する工程はＰＣＲTMを含む。
【００２１】
本発明のなおさらにもう１つの態様は、配列番号８の核酸配列から単離可能な単離されたガンマコイキシンプロモーターを提供する。また、本発明により提供されるのは、配列番号８の約８０から約８９４の連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。本発明のもう１つの実施態様において、単離された核酸配列は配列番号８の約２２２から約８９４の連続ヌクレオチドを含み、さらに配列番号１８の核酸配列を含むことができる。単離された核酸配列は配列番号８の核酸配列の約４１２から約８９４の連続ヌクレオチドを含むことができ、なおさらに配列番号１９の核酸配列を含むことができる。
【００２２】
本発明のさらになおもう１つの態様は、ガンマコイキシンタンパク質またはペプチドをコードする単離されたＤＮＡを提供する。本発明の特別の実施態様において、ＤＮＡセグメントは配列番号１６によってコードされるポリペプチドをコードする。該ＤＮＡセグメントは配列番号１６の核酸配列の約１００から約６０３または約３５０から約６０３の連続ヌクレオチドを含むこともでき、あるいは配列番号１６の核酸配列を含むことができる。
【００２３】
本発明のさらになおもう１つの態様は配列番号１１の核酸配列から単離可能な単離されたガンマコイキシンターミネーターを提供する。該ガンマコイキシンターミネーターは配列番号１１の核酸配列の約８０から約４１２の連続ヌクレオチドも含むことができる。本発明のさらなる実施態様において、ターミネーターは配列番号１１の核酸配列の約２００から約４１２または約３２５から約４１２の連続ヌクレオチドを含むことができる。また、ターミネーターは配列番号１１の核酸配列を含むことができる。
【００２４】
本発明のなおさらにもう１つの態様は配列番号１７の核酸配列から単離可能なＣｏｉｘオレオシン３ターミネーターを提供する。また、本発明によって提供されるのは配列番号１７の約５０から約３７７、約１２０から約３７７、約２２０から約３７７、または約３００から約３７７の連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列である。本発明の１つの実施態様において、核酸は核酸配列配列番号１７を含む。
【００２５】
本発明のなおさらにもう１つの態様は、選択されたＤＮＡを含む稔性トランスジェニック植物を提供し、該選択されたＤＮＡはガンマコイキシンプロモーターを含む。本発明の特別の実施態様において、ガンマコイキシンプロモーターは配列番号８の核酸配列から単離可能である。本発明の他の実施態様において、プロモーターは配列番号８の約８０ないし約８９４、約２２２ないし約８９４、または約４１２ないし約８９４連続ヌクレオチドを含む単離された核酸配列を含む。本発明のさらに他の実施態様において、プロモーターは配列番号８、配列番号１８、または配列番号１９の核酸配列を含む。プロモーターは、昆虫抵抗性遺伝子、病気抵抗性遺伝子、除草剤抵抗性遺伝子、穀類の組成または品質に影響する遺伝子、栄養素利用遺伝子、マイコトキシン減少遺伝子、雄性不稔遺伝子、選択マ
ーカー遺伝子、スクリーニング可能なマーカー遺伝子、ネガティブ選択マーカー、植物耕種学特性に影響する遺伝子、および環境またはストレス抵抗性遺伝子を含めた潜在的にいずれの外因性遺伝子にも作動可能に連結することができる。
【００２６】
本発明のなおさらにもう１つの態様は、選択されたＤＮＡを含む稔性トランスジェニック植物を提供し、該選択されたＤＮＡはガンマコイキシンをコードする遺伝子を含む。本発明の特別の実施態様において、ガンマコイキシンをコードする遺伝子は配列番号１６によってコードされるポリペプチドをコードする。本発明のさらに他の実施態様において、ガンマコイキシンをコードする遺伝子は配列番号１６の核酸配列の約１００から約６０３、または約３５０から約６０３の連続ヌクレオチドを含む。本発明のさらなる実施態様において、ガンマコイキシンをコードする遺伝子は配列番号１６の核酸配列を含む。
【００２７】
本発明のなおさらにもう１つの態様は、選択されたＤＮＡを含む稔性トランスジェニック植物を提供し、該選択されたＤＮＡはガンマコイキシンターミネーターをコードする。本発明の特別の実施態様において、ガンマコイキシンターミネーターは配列番号１１の核酸配列から単離可能である。本発明の他の実施態様において、ガンマコイキシンターミネーターは配列番号１１の核酸配列の約８０ないし約４１２、約２００ないし約４１２、または約３２５ないし約４１２連続ヌクレオチドを含む核酸配列を含む。本発明のさらなる実施態様において、ガンマコイキシンターミネーターは配列番号１１の核酸配列を含む。
【００２８】
本発明のなおさらにもう１つの態様は、選択されたＤＮＡを含む稔性トランスジェニック植物を提供し、該選択されたＤＮＡはＣｏｉｘオレオシン３ターミネーターを含む。本発明の特別の実施態様において、Ｃｏｉｘオレオシン３ターミネーターは配列番号１７の核酸配列から単離可能である。本配列のもう１つの実施態様において、ターミネーターは配列番号１７の核酸配列の約５０から約３７７、約１２０から約３７７、約２２０から約３７７、または約３００から約３７７の連続ヌクレオチドを含む。本発明の１つの実施態様において、ターミネーターは核酸配列配列番号１７を含む。
【００２９】
本発明のなおさらにもう１つの態様は、前記した植物のいずれかの世代の、該選択されたＤＮＡを含む子孫植物を提供する。本発明の特別の実施態様において、該植物はムギ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ソルガムおよびトウモロコシよりなる群から選択される。本発明の１つの実施態様において、単子葉植物はトウモロコシである。本発明のもう１つの実施態様において、植物はタバコ、トマト、ジャガイモ、大豆および綿よりなる群から選択される双子葉植物である。
【００３０】
本発明のなおさらにもう１つの態様は、本発明の稔性トランスジェニック植物、または本発明の外因性ＤＮＡを受け継いだそのトランスジェニック子孫植物を該植物自体または第２の植物と交雑させることを含む植物育種方法を提供する。
【００３１】
添付した図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに示すために含める。本発明は、明細書に提示した特定の実施態様の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによってよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】プラスミドｐＤＰＧ８４４のマップ。該プラスミドはガンマコイキシン遺伝子からの８９４ｂｐプロモーター（配列番号８）、ＧＵＳレポーター遺伝子のコーディング配列およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図２】プラスミドｐＤＰＧ８４５のマップ。該構築物はガンマコイキシン遺伝子からの８９４ｂｐプロモーター（配列番号８）、コメ・アクチン１イントロン１、ＧＵＳレポーター遺伝子のコーディング配列およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図３】プラスミドｐＤＰＧ８４６のマップ。該プラスミドはガンマコイキシン遺伝子からの４１２ｂｐプロモーター（配列番号１９）、コメ・アクチン１イントロン１、ＧＵＳレポーター遺伝子のコーディング配列およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図４】プラスミドｐＤＰＧ８４７のマップ。該プラスミドはガンマコイキシン遺伝子からの４１２ｂｐプロモーター（配列番号１９）、ＧＵＳレポーター遺伝子のコーディング配列（ＧＵＳ）、およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図５】プラスミドｐＤＰＧ８４８のマップ。該プラスミドはガンマコイキシン遺伝子からの２２２ｂｐプロモーター（配列番号１８）、コメ・アクチン１イントロン、ＧＵＳレポーター遺伝子およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図６】プラスミドｐＤＰＧ８４９のマップ。該プラスミドはガンマコイキシン遺伝子からの２２２ｂｐプロモーター（配列番号１８）、レポーター遺伝子のコーディング配列（ＧＵＳ）、およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図７】プラスミドｐＤＰＧ８６９のマップ。該構築物はガンマコイキシン遺伝子からの８９４ｂｐプロモーター（配列番号８）、コメ・アクチン１イントロン１、ガンマコイキシン遺伝子のコーディング配列（配列番号１６）、およびガンマコイキシンターミネーター（配列番号１１）よりなる発現カセットを含有する。
【図８】トウモロコシ、ソルガムおよびＣｏｉｘからのガンマ−プロラミンコーディング遺伝子のプロモーター領域の配列比較。３つの配列において同一のヌクレオチドはシェーディングによって示す。トウモロコシ、Ｃｏｉｘおよびソルガムプロモーター配列は、各々、ガンマゼイン（配列番号２３）、ガンマコイキシン（配列番号８）およびガンマカフィリン（配列番号２２）として示される。
【図９】プラスミドｐＤＰＧ８５１のマップ。該構築物はガンマコイキシン遺伝子からの８９４ｂｐプロモーター（配列番号８）、コメ・アクチン１イントロン１、ガンマコイキシン遺伝子のコーディング配列（配列番号１６）、およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図１０】プラスミドｐＤＰＧ８６２のマップ。該構築物はガンマコイキシン遺伝子からの８９４ｂｐ配列プロモーター（配列番号８）、コメ・アクチン１イントロン１、ガンマコイキシン遺伝子のコーディング配列（配列番号１６）、およびｎｏｓターミネーターよりなる発現カセットを含有する。
【図１１】プラスミドｐＤＶ１０８のマップ。該構築物はガンマコイキシンターミネーター（配列番号１１）を含有する。
【００３３】
本発明は遺伝子サイレンシングを排除または減少させる導入遺伝子発現のための方法を提供することによって先行技術の欠点を克服する。本発明は、それが、宿主ゲノムのものと同様の発現プロフィールを有するが、遺伝子サイレンシングを制限するのに配列が十分似ていない単子葉植物における外因性植物の発現用のプロモーターを提供する点で重要である。本発明の特別の実施態様において、本発明によって提供されるプロモーターは属Ｃｏｉｘからのものである。Ｃｏｉｘに由来するプロモーターはトウモロコシ、ならびにコムギ、コメ、オオムギ、ライムギ、ソルガムおよびサトウキビのごとき他の単子葉植物、ならびに双子葉植物種において特に有用であろう。
【００３４】
共抑制、センス抑制、およびセンス共抑制ともいわれてきた遺伝子サイレンシングの現象は、天然の相同コピーを有する配列の導入に際しての遺伝子発現の減少または排除である（Ｎａｐｏｌｉら，１９９０；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら，１９９０）。遺伝子サイレンシングは、導入遺伝子の調節および／またはコーディング領域で作用でき、サイレンスト領域のメチル化と頻繁に関連する。農業生物工学の分野において、調節領域のサイレンシングは、多くの内因性プロモーターが導入遺伝子発現についての特に有用な特徴を有する点で特に問題である。
【００３５】
本発明の利用性は、プロモーターに加えて、Ｃｏｉｘからのエレメントを含む発現ベクターの創製まで拡大できることが、本発明者らによって特に考えられる。特に、遺伝子−サイレンシングおよび導入遺伝子エレメントと天然配列との間の相同性に関連する他の問題の回避は、Ｃｏｉｘ以外の単子葉植物で発現された導入遺伝子におけるＣｏｉｘ配列の使用によって回避することができると考えられる。例えば、トウモロコシ遺伝子に相同なコーディング領域はトウモロコシで効果的に発現され、他方、天然トウモロコシ遺伝子はサイレンスされるであろう。また、特に有用であるとみなされるのは、Ｃｏｉｘからのエンハンサーエレメントおよびターミネーターである。
【００３６】
１．本発明で使用するためのプロモーター
本発明は、トウモロコシのごとき単子葉植物における外因性遺伝子の発現のための属Ｃｏｉｘからのプロモーターの使用を含む。かかるプロモーターはＣｏｉｘからデ・ヌボで単離することができるか、あるいは公知の単子葉植物プロモーターからの遺伝的情報に基づいて単離することができる。Ｃｏｉｘプロモーターの同定のための本発明者らによって考えられる特に効果的な手段は、トウモロコシ遺伝子またはプロモーターに由来するプライマーまたはプローブを用いてＣｏｉｘから異種配列を単離することを含む。
【００３７】
（ｉ）例示的プロモーター
有用なプロモーターは、記載されている誘導性、ウイルス性、合成の、構成的（Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉら，１９８９；Ｏｄｅｌｌら，１９８５）、一時的に調節され、空間的に調節され、および空間的かつ一時的に調節される（Ｃｈａｎら，１９８９）ものを含む。プロモーターは、形質転換植物細胞またはトランスジェニック植物転写活性をコーディング領域に向けるその能力につき選択される。Ｃｏｉｘプロモーターの単離に特に有用であるとみなされるトウモロコシ配列のいくつかの例はＡｄｈ（Ｗａｌｋｅｒら，１９８７；ＰａｕｌおよびＦｅｒｌ，１９９１；Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｓ４５０２２）、スクロースシンターゼ（ＹａｎｇおよびＲｕｓｓｅｌ，１９９０）、ｃａｂ（Ｓｕｌｌｉｖａｎら，１９８９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１４７９４）、ＰＥＰＣａｓｅ（ＨｕｄｓｐｅｔｈおよびＧｒｕｌａ，１９８９；ＹａｎａｇｉｈａｒａおよびＩｚｕｉ，１９８９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１４５７９，Ｘ１４５８１、Ｘ１４５８０）およびＲ遺伝子複合体−関連遺伝子（Ｃｈａｎｄｌｅｒら，１９８９；Ｃｏｎｓｏｎｎｉら，１９９３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５７２７６，Ｓ４８０２７）のものを含む。他の単子葉植物からの配列、例えば、コメ・アクチンプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｓ４４２２１）も有用であり得る。
【００３８】
組織−特異的プロモーターの単離についての例示的遺伝子はトウモロコシ・スクロースシンテターゼ（Ｙａｎｇら，１９９０）、トウモロコシ・アルコールデヒドロゲナーゼＩ（Ｖｏｇｅｌら，１９８９；Ｄｅｎｎｉｓら，１９８４，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０４０４９、Ｘ００５８１）；トウモロコシ集光性複合体（Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９８６；Ｂａｎｓａｌら，１９９２，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ８７０２０）、トウモロコシ熱ショックタンパク質（Ｏｄｅｌｌら，１９８５；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒら，１９８６，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０３７１４）、トウモロコシゼイン（Ｒｅｉｎａら，１９９０，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５３５１４；Ｋｒｉｚら，１９８７，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０５９１１；ＷａｎｄｅｌｔおよびＦｅｉｘ，１９８９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１４３３４；ＬａｎｇｒｉｄｇｅおよびＦｅｉｘ，１９８３，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｋ００５４３；Ｒｅｉｎａら，１９９０；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５３５１５）、グロブリン１（ＢｅｌａｎｇｅｒおよびＫｒｉｚら，１９９１，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ２２３４４，Ｌ２２２９５）、およびカルコンシンターゼ遺伝子（Ｆｒａｎｋｅｎら，１９９１；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６０２０４）である。
【００３９】
他の同様の公知のトウモロコシ配列は根細胞プロモーター（Ｃｏｎｋｌｉｎｇら，１９９０）、および組織特異的エンハンサー（Ｆｒｏｍｍら，１９８９）を含む。誘導性プロモーターの例は、オーキシン結合タンパク質のＡＢＡおよび膨圧誘導性プロモーターを含む（Ｓｃｗｏｂら，１９９３；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ０８４２５）。異種プロモーターを単離するのに使用することができるさらに他の公知のトウモロコシ配列はＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシル−トランスフェラーゼ遺伝子（Ｒａｌｓｔｏｎら，１９８８；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０７９４０；Ｙ７８９８８）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ４５８５９；Ｋｏｌｅｒら，１９９５，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ４０８０３；Ｑｕｉｇｌｅｙら，１９８９，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ１５４０８，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，１９８９，Ｇｅｎｂａｎｋ
受託番号Ｘ１５５９６）、ならびにクロロプラスト遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８６５６３）を含む。
【００４０】
トウモロコシおよび他の単子葉植物における発現用のＣｏｉｘ配列の単離のための本発明者らによって特に考えられる例示的遺伝子エレメントを以下の表１にリストする。多数のこれらのエレメントは、後記で示すごとく、発現ベクターの調製のために本発明者によって使用されてきた。
【００４１】
【表１】
2011101653.tif 000002
2011101653.tif 000003
【００４２】
（ｉｉ）Ｃｏｉｘからの相同配列のクローニング
本発明の一部は、トウモロコシ遺伝子に由来するプローブもしくはプライマーまたはそのフランキング配列の使用によって属Ｃｏｉｘから調節領域を単離することを含む。該プローブまたはプライマーはクローニングされたトウモロコシＤＮＡから直接的になり、あるいはＤＮＡ配列データに基づいて合成により調製することができる。加えて、トウモロコシ以外の種に由来するが、依然としてトウモロコシおよびＣｏｉｘに密接に関連する配列を用いてプロモーターを単離することができる。Ｃｏｉｘにおける異種プロモーターの同定に特に有用であると見なされる他の種は、ライムギ、コムギ、オオムギ、オートムギ、ソルガム、コメおよびサトウキビのごとき単子葉植物を含む。
【００４３】
本明細書中で定義される用語プライマーとは、鋳型依存性プロセスにおいて新生の核酸の合成の起点となることができるいずれの核酸も含むことを意味する。典型的には、プライマーは長さが１０ないし２０塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を使用することができる。プライマーは二本鎖または一本鎖形態で供することができるが、一本鎖形態が好ましい。プローブは異なって定義されるが、それらはプライマーとして作用することができる。プローブは、恐らくは起点となることができるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計され、増幅プロセスで用いられる必要がない。
【００４４】
好ましい実施態様において、プローブまたはプライマーは、放射性種（32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ、3Ｈ、または他の標識）で、蛍光物質（ローダミン、フルオレセイン）、抗原（ビオチン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン）、または化学ルミネセンス剤（ルシフェラーゼ）または酵素（アルカリ性ホスファターゼ）との直接的複合で標識される。
【００４５】
プローブまたはプライマーの調製に続き、異種プロモーターのクローニングにおける最初のステップは、典型的には、この場合にはＣｏｉｘからのゲノムＤＮＡライブラリーのごときクローンの適当なライブラリーを調製し、それをスクリーニングすることを含む。スクリーニングは、トウモロコシプロモーター配列の部分の考慮、または遺伝子または関連遺伝子のＤＮＡ配列から設計された、オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに基づくことができる。かかるスクリーニングプロトコルの操作は当業者によく知られており、後記にて、および文献にて、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。
【００４６】
１．鋳型依存的増幅
鋳型依存的増幅方法、例えばＰＣＲはＣｏｉｘからのトウモロコシ相同配列または他の配列の単離のための１つの効果的な手段を表す。特に、プライマーは、Ｃｏｉｘプロモーターを含む核酸の鋳型依存的増幅で使用することができる相同配列からの遺伝情報に基づいて設計することができる。与えられた鋳型試料に存在する配列を増幅するには、多数の鋳型依存的プロセスが利用できる。最良の公知の増幅方法の１つはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲTMという）であり、これは引用することにより、その全部を本明細書の一部とみなす米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，８００，１５９号に記載されている。
【００４７】
略言すれば、ＰＣＲTMにおいて、マーカー配列の対向相補的鎖上の領域に相補的な２つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼと共に反応混合物に添加する。もしマーカー配列が試料中に存在すれば、プライマーはマーカーに結合し、ポリメラーゼはプライマーがヌクレオチドへの添加によってマーカー配列に沿って延長されるようにする。反応混合物の温度を上昇させ、および低下させることによって、延長されたプライマーはマーカーから解離されて反応産物を形成し、過剰なプライマーはマーカーおよび反応産物に結合し、プロセスを反復する。
【００４８】
逆転写酵素ＰＣＲTM増幅手法を行って、増幅されたｍＲＮＡの量を定量することができる。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されている。逆転写のための別の方法は熱安定性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は１９９０年１２月２１日に出願されたＰＣＴ／ＷＯ９０／０７６４１に記載されている。ポリメラーゼ鎖反応方法は当業者によく知られている。
【００４９】
増幅のためのもう１つの方法は、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなすＥＰ０  ３２０  ３０８に開示されているリガーゼ鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲにおいて、２つの相補的プローブ対を調製し、標的配列の存在下では、各対はそれらが隣接するように標的の反対側相補鎖に結合するであろう。リガーゼの存在下で、２つのプローブ対は連結して単一のユニットを形成するであろう。温度サイクリングによって、ＰＣＲTMにおけるごとく、結合した連結ユニットは標的から解離し、次いで、過剰のプローブ対の連結のための「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号はプローブ対を標的配列に結合させるためのＬＣＲに類似した方法を記載する。
【００５０】
ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載されているｑｂｅｔａレプリカーゼを、本発明におけるさらにもう１つの増幅方法として用いることもできる。この方法において、標的のそれに相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下で試料に添加する。ポリメラーゼは複製配列をコピーし、これは次いで検出することができる。
【００５１】
制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを用いて、制限部位の１つのストランドにヌクレオチド５’−［αチオ］−トリホスフェートを含有する標的分子の増幅を達成する等温増幅方法もまた本発明における核酸の増幅で有用であり得る（Ｗａｌｋｅｒら，  １９９２）。
【００５２】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、複数ラウンドの鎖置換および合成、すなわち、ニックトランスレーションを含む核酸の等温増幅を行うもう１つの方法である。修復鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる同様の方法は、増幅のために標的化した領域全体でいくつかのプローブをアニールし、続いて４つの塩基のうちの２つのみが存在する修復反応を行うことを含む。他の２つの塩基は容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加することができる。同様のアプローチがＳＤＡで用いられる。環状プローブ反応（ＣＰＲ）を用いて標的特異的配列を検出することもできる。ＣＰＲにおいては、非特異的ＤＮＡの３’および５’配列および特異的ＲＮＡの中央配列を有するプローブを、試料に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションに際して、反応をＲＮａｓｅＨで処理し、プローブの産物を、消化する後に放出された区別される産物として同定される。元の鋳型をもう１つのサイクリングプローブにアニールし、反応を反復する。
【００５３】
引用することにより各々その全体を本明細書の一部とみなすＧＢ２  ２０２  ３２８およびＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に記載されたさらにもう１つの増幅方法は本発明に従って用いることができる。前者の出願において、「修飾された」プライマーがＰＣＲTM／様、鋳型および酵素依存性合成で使用される。プライマーは、捕獲部位（例えば、ビオチン）および／またはディテクター部位（例えば、酵素で標識することによって修飾することができる。後者の出願において、過剰の標識されたプローブを試料に添加する。標的配列の存在下で、プローブは結合し、触媒により切断される。切断後、標的配列を無傷で放出させて、過剰のプローブによって結合させる。標識されたプローブの切断は標的配列の存在を信号化する。
【００５４】
他の核酸増幅手法は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡおよびＳｒを含めた転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）を含む。（Ｋｗｏｈら，１９８９；Ｇｉｎｇｅｒａｓら；ＰＣＴ／ＷＯ８８／１０３１５；引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす）。ＮＡＳＢＡにおいて、標準フェノール／クロロホルム抽出、臨床試料の熱変性、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離のための溶解緩衝液およびミニスピンカラムでの処理またはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出による増幅のために核酸を調製することができる。これらの増幅技術は標的特異的配列を有するプライマーをアニールすることを含む。重合に続き、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅ  Ｈで消化し、他方、二本鎖ＤＮＡ分子を再度熱変性する。いずれの場合においても、第２の標的特異的プライマーの添加、続いての重合によって一本鎖ＤＮＡを十分に二本鎖とする。次いで、Ｔ７またはＳＴ６のごときＲＮＡポリメラーゼによって、二本鎖ＤＮＡ分子を多重転写する。等温サイクル反応において、ＲＮＡを一本鎖ＤＮＡに逆転写し、次いで、これを二本鎖ＤＮＡに変換し、次いで、Ｔ７またはＳＰ６のごときＲＮＡポリメラーゼで再度１回転写する。切形であるかまたは完全であるかを問わず、得られた生成物は標的特異的配列を有する。
【００５５】
ＥＰ  ０  ３２９  ８２２（引用することによりその全部を本明細書の一部とみなす）は、本発明に従って使用することができる、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成することを含む核酸増幅プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは第１のプライマーオリゴヌクレオチドのための鋳型であり、これは逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡまたはＲＮＡいずれかとのデュプレックスにおいてＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって、該ＲＮＡを得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖から除去する。得られたｓｓＤＮＡは第２のプライマーのための鋳型であり、これは鋳型に対するその相同性の５’側の（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列を含む。次いで、（Ｅ．  ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」断片によって例示される）ＤＮＡポリメラーゼによってこのプライマーを延長し、その結果、プライマー間の元のＲＮＡのそれと同一の配列を有し、加えて、その一端にプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）が得られる。このプロモーター配列は、適当なＲＮＡポリメラーゼによって用いて、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作成することができる。次いで、これらのコピーはサイクルに再度入れて、非常に迅速な増幅に導くことができる。酵素を適切に選択し、この増幅は各サイクルにおいて酵素の添加なくして等温的になすことができる。このプロセスのサイクル性質のため、出発配列を選択してＤＮＡまたはＲＮＡいずれかの形態とすることができる。
【００５６】
（引用することによりその全部を本明細書の一部とみなす）ＰＣＴ／ＷＯ８９／０６７００は、標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、続いての配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームはサイクル的ではなく、すなわち、新しい鋳型は得られたＲＮＡ転写体から生じない。他の増幅方法は「ＲＡＣＥ」および「片側ＰＣＲTM」を含む（Ｆｒｏｈｍａｎ，  １９９０；Ｏｈａｒａら，  １９８９；引用することによりその全部を本明細書の一部とみなす）。
【００５７】
得られた「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有し、それにより、ジオリゴヌクレオチドを増幅する核酸の存在下で２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドの連結に基づく方法もまた本発明の増幅工程で用いることができる（Ｗｕら，  １９８９，引用することによりその全部を本明細書の一部とみなす）。
【００５８】
増幅に続き、１つの段階またはもう１つの段階において、特異的増幅が起こったか否かを決定する目的で、鋳型および過剰プライマーから増幅産物を分離するのが通常は望ましい。１つの態様において、増幅産物は、標準的な方法を用い、アガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  １９８９）。
【００５９】
別法として、クロマトグラフィー技術を用いて分離を行うことができる。本発明で用いることができる多くの種類のクロマトグラフィー、すなわち吸着、分配、イオン交換およびモレキュラーシーブ、およびカラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィーを含めたそれらを用いる多くの特殊化された技術がある（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，１９８２）。
【００６０】
生成物を可視化して、マーカー配列の分離を確認することができる。１つの典型的な可視化技術は、臭化エチジウムでのゲルの染色および紫外光下での可視化を含む。別法として、もし増幅産物が放射標識ヌクレオチドまたは蛍光標識ヌクレオチドで一体的に標識されれば、次いで、増幅産物をＸ線フイルムに暴露することができ、あるいは適当な刺激スペクトル下で可視化し、続いて分離することができる。
【００６１】
１つの実施態様において、可視化は間接的に達成される。増幅産物の分離に続き、標識核酸プローブを増幅されたマーカー配列と接触させる。プローブは好ましくは色原体に複合させるが、放射性標識することができる。もう１つの実施態様において、プローブは、抗体またはビオチンのごとき結合パートナーに複合させ、結合対の他のメンバーは検出可能な部位を担う。
【００６２】
もう１つの実施態様において、検出は標識されたプローブによる。関連技術は当業者によく知られており、分子プロトコルについての多くの標準的本で見いだすことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）。例えば、色原体または放射性プローブまたはプライマーは増幅の間またはその後に標的を同定する。
【００６３】
前記の１つの例は、引用することにより本明細書の一部とみなす米国特許第５，２７９，７２１号に記載されており、これは核酸の自動電気泳動および導入のための装置および方法を開示する。該装置はゲルの外部操作なくして電気泳動およびブロッティングを可能とし、理想的には、本発明による方法を行うのに適する。
【００６４】
加えて、前記した増幅産物は配列分析に付して、標準的な配列分析技術を用い、特定の種類の変化を同定することができる。ある方法内では、最適配列決定のために設計したプライマーセットを用いる配列分析によって、遺伝子の消耗分析を行う（Ｐｉｇｎｏｎら，１９９４）。この発明は、これらのタイプの分析のいずれかまたは全てで用いることができる方法を提供する。
【００６５】
２．サザーン／ノーザンブロッティング
ブロッティング技術は、当業者によく知られ、本発明において核酸の同定のために使用することができる他の方法を表す。サザーンブロッティングは、例えば、トウモロコシ遺伝子の発現で有用な候補Ｃｏｉｘプロモーターを含有するＤＮＡのセグメントを単離するのに用いることができる。特に、トウモロコシからのｃＤＮＡプローブの、Ｃｏｉｘ植物のゲノムＤＮＡクローンへのハイブリダイゼーションを介して、対応する遺伝子のプロモーター領域を含むクローンを単離することができる。別法として、プロモーターそれ自体の配列は、異種Ｃｏｉｘプロモーターを直接的に同定するためのプローブとして使用することができる。
【００６６】
サザーンブロッティングは標的としてのＤＮＡの使用を含むが、ノーザンブロッティングは標的としてのＲＮＡの使用を含む。多くの態様においてはｃＤＮＡブロッティングはブロッティングまたはＲＮＡ種に類似するものの、各々は異なるタイプの情報を提供する。略言すれば、プローブは、適当なマトリックス、しばしばニトロセルロースのフィルター上に固定化されたＤＮＡまたはＲＮＡ種標的化するのに使用される。異なる種は空間的に分離して分析を容易とすべきである。これはしばしば核酸種ゲル電気泳動、続いてフィルターへの「ブロッティング」によって達成される。
【００６７】
引き続いて、変性および再ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、ブロットされた標的を（通常は標識された）プローブと共にインキュベートする。該プローブは標的とで塩基対合するように設計されているので、該プローブは再生条件下で標的配列の一部に結合するであろう。次いで、未結合のプローブを除去し、前記したごとく検出を達成する。
【００６８】
３．チップ技術
本発明者らによって特に考えられるものは、Ｈａｃｉａら（１９９６）およびＳｈｏｅｍａｋｅｒら（１９９６）によって記載されたもののごとくチップベースのＤＮＡ技術である。略言すれば、これらの技術は非常に多数の遺伝子を迅速かつ正確に分析する定量的方法を含む。遺伝子にオリゴヌクレオチドのタグを付すことによって、あるいは固定されたプローブアレイを用いることによって、チップ技術を使用して標的分子を高密度アレイとして分離し、ハイブリダイゼーションに基づいてこれらの分子をスクリーニングすることができる（Ｐｅａｓｅら，  １９９４；Ｆｏｄｏｒら，１９９１）。
【００６９】
（ｉｉｉ）Ｃｏｉｘプロモーターのde nobo単離
本発明では、他の種のプロモーターに由来するプローブまたはプライマーを使用することなく単離されたＣｏｉｘプロモーターの使用が考えられる。プロモーターのクローニングおよびトウモロコシにおける外因性遺伝子の形質転換および発現に適したベクターへのその構築のための手段は当業者に知られており、例えば、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなすＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９に開示されている。Ｃｏｉｘプロモーターのタイプはトウモロコシにおける導入遺伝子発現で特に有用であると見なされ、構成的または非構成的に高レベルで発現されるものである。望ましい非構成的プロモーターは、組織で発現されるおよび／または一次的に特異的に、または誘導可能なものを含む。一次的に特異的にとは、１以上の特異的発生期間において発現を指令するプロモーターを意味する。
【００７０】
プロモーターのクローニングにおける典型的な最初のステップは、所望の方法で、すなわち、構成的にまたは組織で発現され／一次的に特異的に発現される標的遺伝子の同定を含む。このための効果的な手段は、１以上の同定された標的組織からのｃＤＮＡライブラリーの調製、およびその中での高コピークローンの同定を含むであろう。特に有利なのは、高度に表されるが、遺伝子コピーの数が少ないｃＤＮＡクローンであろう。次いで該ｃＤＮＡクローンを用いて、当業者に知られている標準的ライブラリースクリーニングを用い、プロモーター領域を含めた、コーディング配列を近接して挟む５’領域を含むゲノムＤＮＡを単離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。
【００７１】
プロモーターのクローニングのための好ましい方法は、例えば、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなすＳｉｅｂｅｒｔら，１９９５に記載されている「抑制ＰＣＲ」技術の使用である。遺伝子特異的アンカー配列が知られている限り、この方法はクローニングされてなくかつ知られていない配列のＰＣＲ増幅を可能とする。この技術を用い、相同またはホモログ（同族）のｃＤＮＡ配列のごとき公知の配列を用いて、プロモーター、エンハンサーまたはターミネーターを含めたフランキング調節エレメントをクローニングすることができる。
【００７２】
１．相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲTMへの遺伝子発現の定量
ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）、続いて相対的定量的ＰＣＲTM（ＲＴ−ＰＣＲTM）を用いて、植物から単離された特異的ｍＲＮＡ種の相対的濃度を決定することができる。特異的ｍＲＮＡ種の濃度が変化することを測定することによって、特異的ｍＲＮＡ種をコードする遺伝子が分化段階で発現されることが示される。このようにして、トウモロコシ形質転換用の発現ベクターの構築で使用されるＣｏｉｘから、候補プロモーターを迅速に同定しスクリーニングすることができる。
【００７３】
ＰＣＲTMにおいて、増幅された標的ＤＮＡの分子の数は、いくつかの試薬が制限的になるまで、反応の各サイクルで２に近づくファクターだけ増加する。しかる後、増幅の速度は、サイクル間で増幅標的の増加がなくなるまで徐々に減少するようになる。サイクル数をＸ軸とし、増幅された標的ＤＮＡの濃度の対数をＹ軸としてグラフをプロットすると、特徴的な形状の曲線がプロットされた点をつなぐことによって形成される。最初のサイクルで開始し、この線の傾きは正であって一定である。これは該曲線の直線部分であると言われる。試薬が制限的となった後、該線の傾きは減少し始め、結局はゼロとなる。この時点において、増幅された標的ＤＮＡの濃度はいくらかの固定された値まで漸近する。これは曲線のプラトー部分であると言われる。
【００７４】
ＰＣＲTM増幅の直線部分における標的ＤＮＡの濃度は、反応が開始する前の標的の出発濃度に直接的に比例する。同一数のサイクルを完了し、その直線範囲にあるＰＣＲTM反応における標的ＤＮＡの増幅産物の濃度を測定することによって、元のＤＮＡ混合物中の特異的標的配列の相対濃度を決定することが可能である。もしＤＮＡ混合物が異なる組織または細胞から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであれば、標的配列が由来する特異的ｍＲＮＡの相対的豊富さを、各組織または細胞につき決定することができる。ＰＣＲTM産物の濃度および相対的ｍＲＮＡ豊富さの間のこの直接的比例性はＰＣＲTM反応の直線範囲でのみ当てはまる。
【００７５】
曲線のプラトー部分における標的ＤＮＡの最終濃度は、反応ミックスにおける試薬の利用性によって決定され、標的ＤＮＡの元の濃度から独立している。従って、ｍＲＮＡ種の相対的豊富さがＲＮＡ集団のコレクションにつきＲＴ−ＰＣＲTMによって決定できる前に満たさなければならない最初の条件は、ＰＣＲTM反応がそれらの曲線の直線部分にある場合に、増幅されたＰＣＲTM産物の濃度がサンプリングされなければならないことである。
【００７６】
特定のｍＲＮＡ種の相対的豊富さを守備よく決定するためのＲＴ−ＰＣＲTMで実験で満たさなければならない第２の条件は、増幅可能なｃＤＮＡの相対濃度がいくつかの独立した標準に対して正規化されなければならないことである。ＲＴ−ＰＣＲTM実験の目標は、試料中の全てのｍＲＮＡ種の平均豊富さに対する特定のｍＲＮＡ種の豊富さを決定することである。
【００７７】
競合ＰＣＲTMについてのほとんどのプロトコルは標的とほぼ同程度に豊富な内部ＰＣＲTM標準を利用する。ＰＣＲTM増幅の産物がその直線相の間にサンプリングされれば、これらの戦略は効果的である。もし反応がプラトー相に近づく場合にサンプリングされれば、豊富でない産物が比較的過剰に表される。異なる発現につきＲＮＡ試料を調べる場合に当てはまるごとく、多くの異なるＲＮＡ試料でなされた相対的豊富さの比較は、ＲＮＡの相対的豊富さの差異がそれらが現実にそうであるよりも小さく見えるようにするように歪められる。もし内部標準が標的よりもかなり豊富であればこれは重要な問題ではない。もし内部標準が標的よりも豊富であれば、直接的な直線的比較がＲＮＡ試料の間でなされ得る。
【００７８】
前記した考察は植物組織についてのＲＴ−ＰＣＲTMアッセイのための理論的考慮を記載する。植物組織試料固有の問題は、それが可変量である（正規化を問題があるものとし）、それが可変質であり（好ましくは標的よりもサイズが大きい信頼できる内部対照の共増幅を必要とする）である。もしＲＴ−ＰＣＲTMが内部標準でもって相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲTMとして行われ、ここに、内部標準が標的ｃＤＮＡ断片よりも大きい増幅可能なｃＤＮＡ断片であり、内部標準をコードするｍＲＮＡの豊富さが標的をコードするｍＲＮＡよりも大まかに５ないし１００倍高ければ、これらの問題は共に克服される。このアッセイは、各ｍＲＮＡ種の絶対的豊富さではなく相対的豊富さを測定する。
【００７９】
他の実験は、外部標準プロトコルを持ってより通常の相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲTM  アッセイを用いて実行することができる。これらのアッセイは、その増幅曲線の直線部分においてＰＣＲTM産物をサンプリングする。サンプリングに最適なＰＣＲTMサイクルの数は各標的ｃＤＮＡ断片につき経験的に決定されなければならない。加えて、種々の組織試料から単離された各ＲＮＡ集団の逆転写酵素産物は、等濃度の増幅可能なｃＤＮＡにつき注意深く正規化されなければならない。該アッセイは絶対ｍＲＮＡ豊富さを測定するので、この考慮は非常に重要である。絶対ｍＲＮＡ豊富さは、正規化された試料でのみ異なる遺伝子発現の尺度として用いることができる。増幅曲線の直線範囲の経験的決定およびｃＤＮＡ調製の正規化は退屈で時間を消費するプロセスであるが、得られたＲＴ−ＰＣＲTMアッセイは、内部標準にての相対的定量的ＲＴ−ＰＣＲTMアッセイに由来するもの
より優れることができる。
【００８０】
この利点の１つの理由は、内部標準／コンペティターなくして、増幅曲線の直線範囲において試薬の全てを単一ＰＣＲTM産物に変換することができ、かくして、当該アッセイの感度を増加させることである。もう１つの理由は、ただ１つのＰＣＲTM産物の場合、電気泳動ゲルでの産物の表示、すなわち他の表示方法はあまり複雑ではなく、バックグラウンドが少なく、かつ解釈するのがより容易であることである。
【００８１】
２．非標的化プロモーター単離
所望の発現プロフィールを持つ遺伝子をまず同定することによって標的化された特異的方法にてプロモーターをクローニングするのと同様に、「ショットガン」スクリーニング戦略を利用してＣｏｉｘプロモーターをクローニングすることができる。例えば、ＣｏｉｘＤＮＡのランダムセグメントに連結した選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む非常に多数のベクターを創製することができる。かかるベクターは、制限消化マーカー遺伝子ＤＮＡの部分およびＣｏｉｘの全ゲノムＤＮＡを混合し連結し、該ＤＮＡを適当なベクターにクローニングすることによって調製することができる。別法として、クローニング部位がマーカー遺伝子に先行し、さもなければプロモーターを欠く「ヘッドレスホースマン」構築物を用いることができる。この場合、マーカー遺伝子は、プロモーターがクローニング部位にクローニングされた場合にのみ発現されるであろう。一旦構築されれば、該ベクターを用いて非常に多数のトウモロコシ細胞を形質転換することができる。マーカー遺伝子を発現する形質転換体についての選択によって、トウモロコシにおける発現を指令することができる新規なＣｏｉｘプロモーターが同定されるであろう。
【００８２】
（ＩＶ）プロモーターのアッセイ
一旦クローニングされれば、配列決定および／または発現アッセイによって、プロモーターの同一性および／または利用性を確認することができる。植物については、該発現アッセイは、胚形成または非胚形成細胞、あるいは全植物を利用する系を含むことができる。細胞アッセイを用いる利点は、非常に多数の植物の再生が必要ではないが、当該系は、非再生細胞におけるプロモーター活性が植物での発現とは直接的に相関し得ない点で制限されている。加えて、組織または発生特異的プロモーターのアッセイは一般には可能ではない。
【００８３】
アッセイすべき生物学的試料は、標準的な方法によりいずれかの植物材料の細胞から単離された核酸を含むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）。該核酸はゲノムＤＮＡであってよく、または分画されたもしくは全細胞ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡが用いられる場合、該ＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換するのが望ましいであろう。１つの実施態様において、該ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり；もう１つの実施態様において、それはポリーＡ  ＲＮＡである。通常、該核酸は増幅される。
【００８４】
様式に依存して、注目する特異的核酸は、増幅を用い、あるいは増幅後の第２の既知の核酸にて直接的に試料中で同定される。次に、同定された産物を検出する。ある適用において、該検出は目で見る手段（例えば、ゲルの臭化エチジウム染色）によって行うことができる。別法として、該検出は、化学ルミネセンスを介する産物の間接的同定、電気的または加熱インパルスシグナルを用いる系を介する放射性標識または蛍光標識の放射性シンチグラフィーを含むことができる（Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｌｌｕｓ，１９９４）。
【００８５】
検出に続き、所与の植物で観察された結果を非形質転換対照植物の統計学的に有意な参照群と比較することができる。典型的には、非形質転換対照植物は、形質転換植物と同様の遺伝的バックグラウンドのものであろう。このようにして、種々の形質転換植物で検出されたタンパク質の量または種類の差異を検出することが可能である。別法として、細胞のクローン培養、例えば、カルスまたは未成熟胚を他の細胞試料と比較することができる。
【００８６】
示したごとく、本発明の細胞または植物および関連プロモーターのスクリーニングにおいて、種々の異なるアッセイが考えられる。これらの技術を場合により用いて、特定の遺伝子の存在および発現の双方ならびに遺伝子構築物で起こり得る再配置につき検出することができる。該技術は限定されるものではないが、蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、パルスドフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）分析、サザーンまたはノーザンブロッティング、一本鎖立体配座分析（ＳＳＣＡ）ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子−特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析、変性グラジエントゲル電気泳動、ＲＦＬＰおよびＰＣＲTM−ＳＳＣＰを含む。
【００８７】
プロモーターを含むクローンが本発明に従って単離された場合、該クローン内の必須プロモーター領域を定めることが望まれることが考えられる。このための効果的な手段は欠失分析を含む。欠失分析において、一連の構築物を調製し、各々は該クローンの異なる部分を含有し（サブクローン）、次いでこれらの構築物をプロモーター活性につきスクリーニングする。活性につきスクリーニングする適当な手段は、欠失したプロモーター構築物を選択可能またはスクリーニング可能マーカーに付着させ、マーカー遺伝子を発現する細胞のみを単離することである。このようにして、多数の異なる欠失したプロモーター構築物が同定され、これは依然としてプロモーター活性を保有する。それにより、プロモーター活性に要求される最小のセグメントを、選択された構築物の比較により同定する。次いで、このセグメントを、外因性遺伝子の発現のためのベクターの構築で用いることができる。
【００８８】
ＩＩ．突然変異誘発プロモーターを調製する方法
Ｃｏｉｘプロモーターを突然変異誘発して、トウモロコシにおける導入遺伝子の発現用のプロモーターの利用性を潜在的に改良することができることが本発明者らによって特に考えられている。Ｃｏｉｘプロモーターの突然変異誘発はランダムに行うことができ、突然変異誘発したプロモーターを試行錯誤方法により利用性につきスクリーニングすることができる。別法として、Ｃｏｉｘプロモーターに望ましい発現特性を与える特定の配列を同定し、これらまたは同様の配列を突然変異を介してトウモロコシプロモーターに導入することができる。トウモロコシに加えて、他の種からのプロモーターを突然変異誘発させて、それらにＣｏｉｘプロモーターの望ましい特性を与えることができる。例えば、コメ、オートムギ、ソルガム、オオムギまたはコムギからのプロモーターを突然変異誘発させて、突然変異誘発プロモーターにトウモロコシにおける導入遺伝子発現での増強された利用性を与えることができる。
本発明のプロモーターのコードするＤＮＡセグメントを突然変異誘発する手段は当業者によく知られている。かかるプロモーター領域に対する修飾は、ランダムまたは部位−特異的突然変異誘発手法によってなすことができる。プロモーター領域は、対応する非修飾プロモーター領域をコードする配列からの１以上のヌクレオチドの付加または欠失を介してその構造を変化させることによって修飾することができる。
【００８９】
突然変異誘発は、特定のプロモーター領域の配列内に１以上の突然変異を有するオリゴヌクレオチドを合成することのごとき当業者に公知の技術のいずれかに従って行うことができるが、それに限定されるものではない。特に、部位−特異的突然変異誘発は、基礎となるＤＮＡの特異的突然変異誘発を介するプロモーター突然変異体の調製で有用な技術である。該技術は、さらに、１以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、例えば、１以上の前記考慮を取り込んで、配列変異体を調製しテストする能力を提供する。部位−特異的突然変異誘発は、横切るべき欠失接合の両側に安定なデュプレックスを変性するのに十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を供するために、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、ならびに十分な数の
隣接ヌクレオチドの使用を介して突然変異体の生産を可能とする。典型的には、長さが約１７ないし約７５ヌクレオチドまたはそれ以上のプライマーが好ましく、配列の接合の両側の約１０ないし約２５またはそれ以上の残基が変化する。
【００９０】
一般に、部位−特異的誘発の技術は、種々の刊行物によって例示されるごとく当業者によく知られている。認められているごとく、該技術は、典型的には、一本鎖および二本鎖形態双方に存在するファージベクターを使用する。部位−指向突然変異誘発で有用な典型的ベクターはＭ１３ファージのごときベクターを含む。これらのファージは容易に商業的に入手でき、それらの使用は一般に当業者によく知られている。注目する遺伝子をプラスミドからファージに移す工程を排除する部位−指向性突然変異誘発で、二本鎖プラスミドもルーチン的に使用される。
【００９１】
一般に、これに従った部位−指向性突然変異誘発は、まず、一本鎖ベクターを得るか、または所望のプロモーター領域もしくはペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む二本鎖ベクターの２つのストランドを融解して離すことによってなされる。所望の突然変異配列を担うオリゴヌクレオチドプライマーを一般的には合成により調製する。次いで、このプライマーを一本鎖ベクターと共にアニールし、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩクレノウ断片のごときＤＮＡ重合酵素に付して突然変異担持ストランドの合成を完了する。かくして、ヘテロデュプレックスが形成され、ここに、１つのストランドは元の非突然変異配列をコードし、第２のストランドは所望の突然変異を担う。次いで、このヘテロデュプレックスベクターを用いて、トウモロコシ細胞のごとき適当な細胞を形質転換またはト
ランスフェクトし、突然変異配列配置を担う組換えベクターを含む細胞を選択する。遺伝的選択スキームは、突然変異誘発オリゴヌクレオチドを取り込むクローンを豊富とするようにＫｕｎｋｅｌら（１９８７）によって工夫された。別法として、Ｔａｑポリメラーゼのごとき商業的に入手可能な熱安定性酵素でのＰＣＲTMの使用を用いて、突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを増幅ＤＮＡ断片に取り込み、次いで、これを適当なクローニングまたは発現ベクターにクローニングすることができる。Ｔｏｍｉｃら（１９９０）およびＵｐｅｎｄｅｒら（１９９５）のＰＣＲTM−媒介突然変異誘発手法はかかるプロトコルの２つの例を提供する。熱安定性ポリメラーゼに加えて熱安定性リガーゼを使用するＰＣＲTMを用いて、リン酸化突然変異誘発オリゴヌクレオチドを増幅ＤＮＡ断片に取り込
み、次いで、これを適当なクローニングまたは発現ベクターにクローニングすることができる。Ｍｉｃｈａｅｌ（１９９４）によって記載された突然変異誘発手法は１つのかかるプロトコルの例を提供する。
【００９２】
部位−指向性突然変異誘発を用いる選択されたプロモーターをコードするＤＮＡセグメントの配列変異体の調製が、潜在的に有用な種を生産する手段として提供され、ＤＮＡ配列の配列変異体を得ることができる他の方法があるのでこれは限定的なことを意味しない。例えば、所望のプロモーター配列をコードする組換えベクターをヒデロキシルアミンのごとき突然変異誘発剤で処理して配列変異体を得ることができる。
【００９３】
本明細書で用いるごとく、用語「オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発手法」とはその初期濃度に対する特異的核酸分子の濃度の増加、または増幅のごとき検出可能シグナルの濃度の増加の結果となる、鋳型−依存的プロセスおよびベクター−媒介増殖を言う。本明細書で用いるごとく、用語「オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発手法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ」とは、プライマー分子の鋳型−依存的延長を含むプロセスを言うことも意図する。用語鋳型−依存的プロセスとは、核酸の新しく合成されたストランドの配列が相補的塩基対合のよく知られた規則によって指令されるＲＮＡまたはＤＮＡ分子の核酸合成を言う（例えば、ＷａｔｓｏｎおよびＲａｍｓｔａｂ，１９８７）。典型的には、ベクター媒介方法
は、核酸断片のＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン増幅、増幅された核酸断片の回復を含む。かかる方法の例は、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第４，２３７，２２４号によって供される。多数の鋳型依存的プロセスが、試料中に存在する注目する標的配列を増幅するのに入手可能であり、かかる方法は当業者によく知られており、後に本明細書中で具体的に開示する。
【００９４】
ＩＩＩ．形質転換
ＤＮＡセグメントを細胞に形質転換する多くの方法があるが、全てがＤＮＡを植物細胞に送達するのに適しているのではない。本発明で使用される適当な方法は、ＤＮＡを、プロトプラストのＰＥＧ−媒介形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら，１９９３）による、乾燥／阻害−媒介ＤＮＡ摂取（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，１９８５）による、エレクトロポレーション（引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，３８４，２５３号）による、炭化ケイ素繊維での撹拌（Ｋａｅｐｐｌｅｒら，１９９０；引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，３０２，５２３号；および引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，４６４，７６５号）による、アグロバクテリウム−媒介形質転換（米国特許第５，５９１，６１６号および米国特許第５，５６３，０５５号；共に、引用することにより本明細書の一部とみ
なす）によるおよびＤＮＡ被覆粒子の加速（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８７７号；および米国特許第５，５３８，８８０号；各々、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす）によるごときＤＮＡの直接的送達によるような、ＤＮＡが細胞に導入できる実質的にいずれの方法も含むと考えられる。これらのごとき技術の適用を通じて、トウモロコシ細胞ならびに実質的にいずれの他の植物種の細胞も安定に形質転換でき、これらの細胞をトランスジェニック植物に発生させることができる。ある実施態様において、加速方法が好ましく、例えば、微粒子銃等を含む。
【００９５】
（ｉ）エレクトロポレーション
エレクトロポレーションによってＤＮＡを導入しようと望む場合、Ｋｒｚｙｚｅｋら（引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，３８４，２５３号）の方法が特に有利であると考えられる。この方法において、ペクチン−分解酵素のごときある細胞壁−分解酵素を用いて、標的受容細胞を、未処理細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換により感受性とする。別法として、受容細胞は機械的に傷つける形質転換により感受性とする。
【００９６】
エレクトロポレーションによる形質転換を行うには、細胞または胚形成カルスの懸濁培養のごとき脆い組織を使用することができ、あるいは未成熟胚または他の組織化組織を直接的に形質転換することができる。この技術において、選択された細胞をペクチン−分解酵素（ペクトリアーゼ）に暴露するかまたは制御された方法で機械的に傷つけることによって該細胞の細胞壁を部分的に分解させる。無傷細胞のエレクトロポレーションによって形質転換されたいくつかの種の例はトウモロコシ（米国特許第５，３８４，２５３号；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎら，１９９２；Ｒｈｏｄｅｓら，１９９５）、コムギ（Ｚｈｏｕら，１９９３）、トマト（ＨｏｕおよびＬｉｎ，１９９６）、大豆（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら，１９８７）およびトマト（Ｌｅｅら，１９８９）を含む。
【００９７】
植物のエレクトロポレーション形質転換のためにプロトプラストを使用することもできる（Ｂａｔｅｓ，１９９４；Ｌａｚｚｅｒｉ，１９９５）。例えば、子葉−由来プロトプラストのエレクトロポレーションによるトランスジェニック大豆植物の創製は国際出願ＷＯ９２１７５９８（引用することにより本明細書の一部とみなす）においてＤｈｉｒおよびＷｉｄｈｏｌｍによって記載されている。プロトプラスト形質転換が記載されている種の他の例はオオムギ（Ｌａｚｅｒｒｉ，１９９５，ソルガム（Ｂａｔｔｒａｗら，１９９１）、トウモロコシ（Ｄｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら，１９９７）、コムギ（Ｈｅら，１９９４），トマト（Ｔｓｕｋａｄａ，１９８９）、および大豆（Ｄｈｉｒら，１９９０）を含む。
【００９８】
（ｉｉ）微粒子銃
本発明による形質転換ＤＮＡセグメントを植物細胞に送達する好ましい方法は微粒子銃である（米国特許第５，５５０，３１８号；米国特許第５，５３８，８８０号；米国特許第５，６１０，０４２号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／０９６９９；各々、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす）。この方法においては、粒子を核酸でコートし、推進力によって細胞に送達することができる。例示的な粒子はタングステン、白金および金よりなるものを含む。ある場合には、金属粒子へのＤＮＡ沈殿が、微粒子銃を用いる受容細胞へのＤＮＡ送達に必要ではないと考えられる。しかしながら、粒子はＤＮＡで被覆されるよりもＤＮＡを含有すると考えられる。よって、ＤＮＡ−被覆粒子は粒子衝撃を介するＤＮＡ送達のレベルを増加させ得ると考えられるが、それ自体は必要ではない。
【００９９】
加速によりＤＮＡをトウモロコシ細胞に送達する方法の例示的実施態様はＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍであり、これを用い、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンのごときスクリーンを通してＤＮＡまたは細胞で被覆した粒子を、懸濁液中で培養した単子葉植物細胞で被覆したフィルター表面へと推進することができる。該スクリーンは粒子が大きな凝集体にて受容細胞に送達されないように粒子を分散させる。プロジェクタイル装置および衝撃させるべき細胞の間に介在するスクリーンはプロジェクタイル凝集体のサイズを減少させ、あまりにも大きいプロジェクタイルによる受容細胞に与えられる損傷を減少させることによって形質転換のより高い頻度に寄与することができると考えられる。
【０１００】
微粒子銃技術はよく適用でき、これを用いて実質的にいずれの植物種も形質転換することができる。微粒子銃によって形質転換された種の例は、トウモロコシ（ＰＣＤ出願ＷＯ９５／０６２１８）、オオムギ（Ｒｉｔａｌａら，１９９４；Ｈｅｎｓｇｅｎｓら，１９９３）、コムギ（引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，５６３，０５５号）、コメ（Ｈｅｎｓｇｅｎｓら，１９９３）、オートムギ（Ｔｏｒｂｅｔら，１９９５；Ｔｏｒｂｅｔら，１９９８）、ライムギ（Ｈｅｎｓｇｅｎｓ，１９９３）、サトウキビ（Ｂｏｗｅｒら，１９９２）およびソルガム（Ｃａｓａら，１９９３；Ｈａｇｉｏら，１９９１）のごとき単子葉植物種；ならびにタバコ（Ｔｏｍｅｓら，１９９０；ＢｕｉｓｉｎｇおよびＢｅｎｂｏｗ，１９９４）、大豆（引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，３２２，７８３号）、ヒマワリ（Ｋｎｉｔｔｅｌら，１９９４）、落花生（Ｓｉｎｇｓｉｔら，１９９７）、綿（Ｍ
ｃＣａｂｅおよびＭａｒｔｉｎｅｌｌ，１９９３）、トマト（ＶａｎＥｃｋら，１９９５）、および一般的な豆科植物（引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，５６３，０５５号）を含めた多数の双子葉植物を含む。
【０１０１】
該衝撃には、懸濁液中の細胞をフィルターまたは固体培養培地に濃縮する。別法として、未成熟胚または他の標的細胞を固体培養培地に配置させることができる。衝撃すべき細胞を微粒子停止プレート下方の適当な距離に位置させる。所望であれば、加速デバイスおよび衝撃すべき細胞の間に１以上のスクリーンを位置させることができる。
【０１０２】
（ｉｉｉ）アグロバクテリウム−媒介形質転換
アグロバクテリウム−媒介導入は、植物細胞に遺伝子を導入するためのよく適用できる系である。なぜならばＤＮＡが全植物細胞に導入でき、それにより、プロトプラストからの無傷細胞の再生の必要性を回避するからである。ＤＮＡを植物細胞に導入するためのアグロバクテリウム−媒介植物統合ベクターの使用は当業者によく知られている。例えば、引用することによりその全体を本明細書の一部とみなすＦｒａｌｅｙら（１９８５）Ｒｏｇｅｒｓら（１９８７）および米国特許第５，５６３，０５５号参照。
【０１０３】
アグロバクテリウム−媒介形質転換は双子葉植物で最も効果的であり、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，タバコ、トマトおよびジャガイモを含めた双子葉植物の形質転換で好ましい方法である。事実、アグロバクテリウム−媒介形質転換は長年双子葉植物でルーチン的に用いられてきたが、それは最近では単子葉植物に適用可能となった。アグロバクテリウム−媒介形質転換技術の進歩は今や当該技術をほとんど全ての単子葉植物に適用できるようにした。例えば、アグロバクテリウム−媒介形質転換技術は今やコメ（Ｈｉｅｉら，１９９７；Ｚｈａｎｇら，１９９７；引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，５９１，６１６号）、コムギ（ＭｃＣｏｒｍａｃら，１９９８）、オオムギ（Ｔｉｎｇａｙら，１９９７；ＭｃＣｏｒｍａｃ，１９９８）およびトウモロコシ（Ｉｓｈｉｄｉａら，１９９６）に適用されてきた。
【０１０４】
現代のアグロバクテリウム形質転換ベクターはＥ．ｃｏｌｉならびにアグロバクテリウム中で複製することができ、記載されているごとく便利な操作を可能とする（Ｋｌｅｅら，１９８５）。さらに、アグロバクテリウム−媒介遺伝子導入のためのベクターにおける最近の技術的進歩は、ベクター中での遺伝子および制限部位の配置を改良して、種々のポリペプチドコーディング遺伝子を発現できるベクターの構築を容易とした。記載されたベクター（Ｒｏｇｅｒｓら，１９８７）は、プロモーターおよび挿入されたポリペプチドコーディング遺伝子の直接的発現用のポリアデニル化部位によって近接挟まれる便利なマルチリンカー領域を有し、この目的に適する。加えて、アームドおよびディスアームドＴｉ遺伝子を共に含有するアグロバクテリウムは形質転換に用いることができる。アグロバクテリウム−媒介形質転換が効果的な植物株において、それは遺伝子導入の容易かつ明らかな性質のため選択される方法である。
【０１０５】
（ｉｖ）他の形質転換方法
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組合せに基づく方法を用いて達成することができる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，１９８５；Ｌｏｒｚら，１９８５；Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら，１９９３；Ｆｒｏｍｍら，１９８６；Ｕｃｈｉｍｉｙａら，１９８６；Ｃａｌｌｉｓら，１９８７；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，１９８８参照）。
【０１０６】
これらの系の異なる植物株への適用は、プロトプラストからその特定の植物株を再生する能力に依存する。プロトプラストからの穀類の再生のための例示的方法は記載されている（Ｆｕｊｉｍａｒａら，１９８５；Ｔｏｒｉｙａｍａら，１９８６；Ｙａｍａｄａら，１９８６；Ａｂｄｕｌｌａｈら，１９８６；Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら，１９９３および米国特許第５，５０８，１８４号；引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす）。穀類プロトプラストの直接的摂取形質転換の使用の例はコメ（Ｇｈｏｓｈ−Ｂｉｓｗａｓら，１９９４）、ソルガム（ＤａｔｔｒａｗおよびＨａｌｌ，１９９１）、オオムギ（Ｌａｚｅｒｒｉ，１９９５）、オートムギ（ＺｈｅｎｇおよびＥｄｗａｒｄｓ，１９９０）およびトウモロコシ（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら，１９９３）の形質転換を含む。
【０１０７】
プロトプラストから首尾よく再生できない植物株を形質転換するには、ＤＮＡを無傷細胞または組織に導入する他の方法を利用することができる。例えば、未成熟胚または外植体からの穀類の再生は記載されているごとくに行うことができる（Ｖａｓｉｌ，１９８９）。また、炭化ケイ素繊維−媒介形質転換をプロトプラスティングにてまたはそれなくして用いることができる（Ｋａｅｐｐｅｒ，１９９０；Ｋａｅｐｐｅｒら，１９９２；引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす米国特許第５，５６３，０５５号）。この技術での形質転換は、ＤＮＡ溶液中の細胞と共に炭化ケイ素繊維を撹拌することによって達成される。細胞に穴があけられるのでＤＮＡは能動的に侵入する。この技術は、例えば、単子葉植物穀類トウモロコシ（引用することによりその全体を本明細書の一部とみなすＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９５）およびコメ（Ｎａｇａｔａｎｉ，１９９７）で成功して用いられてきた。
【０１０８】
ＩＶ．微粒子銃の最適化
本発明による微粒子銃形質転換では、物理的および生物学的両パラメーターを最適化することができる。物理的因子は、ＤＮＡ／微粒子沈殿を操作することを含むものおよびマクロ粒子又は微粒子いずれかの飛行および速度に影響するものである。生物学的因子は、衝撃に関連する外傷を軽減するのを助ける標的細胞の浸透圧調整、粒子弾道に対する未成熟胚または他の標的組織の向き、および線状化ＤＮＡまたは無傷スーパーコイルドプラスミドのごとき形質転換ＤＮＡの性質のような、衝撃前およびその直後の細胞の操作に関連する全ての工程を含む。プレ−衝撃操作は未成熟胚の成功した形質転換で特に重要であると考えられる。
【０１０９】
従って、小さなスケールの実験で衝撃パラメーターの種々のものを調整して条件を十分に最適化することが望まれると考えられる。特に、ＤＮＡ濃度、ギャップ距離、飛行距離、組織距離およびヘリウム圧力のごとき物理的パラメーターを調整することが望まれるであろう。さらに、ヘリウムのグレードは形質転換効率に影響し得ると考えられる。例えば、形質転換効率の差異は産業グレード（９９．９９％純度）または超純粋ヘリウム（９９．９９％純度）を用いる衝撃間で認めることができるが、いずれのものが衝撃で使用するのにより有利であるかは現在はっきりしていない。また、受容細胞の生理学的状態に影響し、したがって、形質転換および取り込み効率に影響し得る条件を修飾することによって、外傷減少因子（ＴＲＦ）を最適化することができる。例えば、浸透圧状態、組織水和およびサブ培養段階または受容細胞の細胞周期を最適形質転換のために調整することができる。
【０１１０】
弾道形質転換のさらなる最適化のために、衝撃についての物理的および生理学的両パラメーターに向けることができる。物理的因子はＤＮＡ／微粒子沈殿を操作することを含むものまたはマクロ微粒子又はマイクロ微粒子いずれかの飛行および速度に影響するものである。生物学的因子は衝撃の直前および直後の細胞の操作に関連するすべての工程を含む。浸透圧環境、衝撃パラメーターおよびプラスミド立体配置のごときプレ衝撃培養条件を調整して安定な形質転換体の最大数が得られている。
【０１１１】
（ｉ）物理的パラメーター
１．ギャップ距離
可変ネスト（マクロホールダー）を調整して破壊リスクおよび微粒子の間の距離、すなわち、ギャップ距離を変化させることができる。この距離は０ｃｍから２ｃｍまで変化させることができる。より短いギャップの予測される効果はマクロ微粒子又はマイクロ微粒子双方の速度の増加、（組織スプラタリングおよび増加した組織外傷に導く）増大した衝撃波、および微粒子のより深い侵入である。より長いギャップ距離は反対の効果を有するが、生存率、従って、回復する安定な形質転換体の合計数を増加させ得る。
【０１１２】
２．飛行距離
（可変ネスト内に含まれる）固定ネストは、微粒子が通過する飛行経路を調整するためのスペーサーリングを置くことによって、所定の０．５ｃｍ増加分にて０．５および２．２５ｃｍの間で変化させることができる。短い飛行経路は飛行中の微粒子のより大きな安定性を可能とするが、微粒子の全速度を低下させる。飛行中の増大した安定性は、例えば、中心のＧＵＳ焦点の数を増加させる。（ある地点までの）より大きな飛行距離は速度を増加させるが、飛行中の不安定性をも増加させる。観察に基づくと、衝撃は典型的には約１．０ｃｍないし１．５ｃｍの飛行経路の長さで行うことが推奨される。
【０１１３】
３．組織距離
ガン・チャンバー内での組織の置き換えは微粒子侵入に対してかなりの効果を有し得る。微粒子の飛行経路を増加させると、速度および衝撃波に関連する外傷を減少させるであろう。速度の減少は微粒子のより狭い侵入の結果となろう。
【０１１４】
４．ヘリウム圧力
破壊リスクのタイプおよび数の操作によって、ガス加速チューブ内で４００および０００ｐｓｉの間で変化させることができる。安定な形質転換のための最適圧力は０００および１２００ｐｓｉの間であると決定されている。
【０１１５】
５．微粒子のコーティング
微粒子銃では、その形質転換に適した形態でそれが受容細胞に送達されるようにＤＮＡを微粒子に付着させる（すなわち、「被覆させる」）。この点において、形質転換ＤＮＡの少なくともいくつかは、形質転換が起こるように標的細胞に利用可能でなければならず、同時に、送達の間にＤＮＡは微粒子に付着されなければならない。従って、微粒子からの形質転換ＤＮＡの利用性は、微粒子の標的細胞への送達に続く形質転換ＤＮＡおよび微粒子間の結合の物理的復帰を含むことができる。しかしながら、これが当てはまる必要はない。というのは標的細胞に対する利用可能性は、微粒子への物理的付着を含むＤＮＡのまたは他の分子の未結合セグメントの破壊の結果として起こり得るからである。利用可能性は、さらに、微粒子に直接的または間接的に付着した、形質転換ＤＮＡおよび他の分子の間の結合の結果として起こり得る。さらに、標的細胞の形質転換は、形質転換ＤＮＡおよび受容細胞のゲノムＤＮＡの間の直接的組換えによって起こり得ると考えられる。従って、本明細書中で用いるごとく、「被覆した」微粒子は、形質転換ＤＮＡが標的細胞に送達されるが、形質転換が起こり得るように標的細胞に接近可能である点で、標的細胞を形質転換するのに使用することができるものである。
【０１１６】
形質転換ＤＮＡの標的細胞への送達を可能とする微粒子をコートするいずれの技術を用いることもできる。本発明で効果を発揮することが示されている微粒子をコートする方法は本明細書中で具体的に開示した。しかしながら、別の技術を用いてＤＮＡを微粒子に結合させることができる。例えば、粒子はストレプトアビジンでコートすることができ、ＤＮＡの末端は長鎖チオール切断可能ビオチン化ヌクレオチド鎖で標識することができる。ストレプトアミジン−ビオチン相互作用のため該ＤＮＡは粒子に接着するが、細胞に存在する剤を減少させることを介してチオール結合の減少により細胞中で放出される。
【０１１７】
別法として、金酸化物粒子の表面を機能性化し、遊離アミン基を供することによって粒子を調製することができる。強力な負の電荷を有するＤＮＡは機能性化粒子に結合する。さらに、荷電粒子はＰＤＳ−１０００ビオリスティックスデバイスで使用されるマイラーフライアーディスクの表面に制御された配列にて蒸着させ、それにより、標的組織に送達された粒子の制御された分布を容易とすることができる。
【０１１８】
前記したごとく、さらに、微粒子をコートするのに使用されるＤＮＡの濃度は、導入遺伝子の単一コピーを含有する形質転換体の回復に影響し得ると考えられる。例えば、低濃度のＤＮＡは形質転換の効率を必ずしも変化させることができないが、その代わりに単一コピー事象の割合を増加させることができる。この点に関し、ほぼ１ｎｇないし２０００ｎｇの形質転換ＤＮＡを各１．８ｍｇの出発微粒子の当たりに用いることができる。本発明の他の実施態様において、ほぼ２．５ｎｇないし１０００ｎｇ、２．５ｎｇないし７５０ｎｇ、２．５ｎｇないし５００ｎｇ、２．５ｎｇないし２５０ｎｇ，２．５ｎｇないし１００ｎｇ、または２．５ｎｇないし５００ｎｇの形質転換ＤＮＡを各１．８ｍｇの出発微粒子当たりに用いることができる。
【０１１９】
また、種々の他の方法を用いて、形質転換効率を増加させおよび／または低コピー形質転換事象の相対的割合を増加させることができる。例えば、本発明者らは、アルカリ性ホスファターゼまたは形質転換に先立ってＤＮＡ末端を平滑とする剤での形質転換ＤＮＡの末端修飾を考える。なおさらに、インサートキャリアーＤＮＡを形質転換ＤＮＡと共に含めて、それにより、使用するＤＮＡの全量を低下させることなく効果的な形質転換ＤＮＡ濃度を低下させることができる。これらの技術はさらに、１９９７年１２月２２日に出願された米国特許出願第０８／９９５，４５１号に記載されており、その開示を引用することによりその全部を本明細書の一部とみなす。
【０１２０】
（ｉｉ）生物学的パラメーター
培養条件および他の因子は標的細胞の生理学的状態に影響し得、形質転換および取り込み効率に大きな影響を有し得る。まず、衝撃の作用はエチレンの生産を刺激し、これは組織の老化に導き得る。抗エチレン化合物の添加は形質転換効率を増加し得る。第２に、細胞周期におけるある地点は導入されたＤＮＡの取り込みにより適し得ると考えられる。よって、細胞培養の同調は形質転換体の生産の頻度を増強し得る。例えば、同調は冷処理、アミノ酸飢餓、または他の細胞周期阻止剤を用いて達成することができる。第３に、組織水和の程度は衝撃に関連する外傷の量ならびに細胞壁に侵入する微粒子の能力に寄与し得る。
【０１２１】
粒子弾道に対する胚または他の標的組織の位置および向きも重要であり得る。例えば、ＰＤＳ−１０００バイオリスティックスデバイスは標的ペトリ皿の表面にわたって均一に広げた粒子を生じない。プレートの中央にある粒子の速度はペトリ皿の中心からさらなる距離にある粒子速度よりも高い。従って、「死滅のゾーン」とある場合には言われる、皿の中央を回避するごとく、標的組織をペトリ皿上に位置させるのが有利である。さらに、標的の弾道に対する標的組織の向きも重要である。組織を粒子流に向けて植物を再生させるように組織を向けるのが望ましいと考えられる。例えば、未成熟胚の胚盤は最大の胚形成能力の細胞を含み、従って、粒子流に向けられるべきである。
【０１２２】
わずかに原形質分離した酵母細胞が増大した形質転換効率を可能とすることも報告されている（Ａｒｍａｌｅｏら，１９９０）。細胞の変化した浸透圧状態は微粒子の侵入に関連する外傷を低下させるのを助けたと仮定された。加えて、増殖および細胞周期段階は形質転換に関して重要であり得る。
【０１２３】
１．浸透圧調整
浸透圧予備処理は、原形質分離細胞の低下した膨圧の結果としての衝撃関連損傷を潜在的に低下させ得ると提案されている。従前の研究においては、新鮮な培地および浸透圧的に調整された培地双方への継代培養に続いて、ＧＵＳを一時的に発現する細胞の数が増加した（引用することによりその全部を本明細書の一部とみなすＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８）。９０分の予備処理時間はより短い時間よりもＧＵＳ発現フォーカスのより多い数を示した。５００ｍｏｓｍ／ｋｇ培地中で９０分間インキュベートした細胞は対照よりも一過性ＧＵＳフォーカスのほぼ３．５倍増加を示した。好ましくは、未成熟胚を１２％スクロースを含有する培養培地で衝撃に先立って４から５時間予備培養す。１２％スクロース上の第２の培養は衝撃に続いて１６から２４時間行われる。別法として、タイプＩＩ細胞を衝撃に先立って３から４時間０．２Ｍマンニトール上で予備処理する。１から６時間の他の浸透圧的に活性な溶質での細胞の予備処理も望ましいであろ
うと考えられる。
【０１２４】
２．プラスミド立体配置
ある場合には、限定されるものではないが、アンピシリン、カナマイシンおよびテトラサイクリン抵抗性を含めた抗生物質抵抗性遺伝子、および原核生物ＤＮＡ複製起点のごとき、細菌宿主、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉにおけるプラスミドベクターの維持に必要なＤＮＡ配列を含有しないトウモロコシ細胞にＤＮＡを送達するのが望ましいであろう。かかる場合、形質転換ＤＮＡを含有するＤＮＡ断片を形質転換に先立って精製することができる。精製の例示的方法は１．２％低融解温度アガロースゲル上でのゲル電気泳動、続いての、６から１０倍過剰のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、７０℃から７２℃中でゲルスライスを融解させることによってアガロースから回収し；凍結し解凍し（３７℃）；遠心によってアガロースをペレット化する。次
いで、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑ−１００カラムをＤＮＡの精製で用いることができる。ＤＮＡの効果的な回収では、カラムの流速を４０ｍｌ／時間に調整することができる。
【０１２５】
単離されたＤＮＡ断片は、種々の電気溶出技術、アガロースの酵素消化、またはＤＮＡのガラスビーズへの結合を用いてアガロースゲルから回収することができる（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ）。加えて、ＨＰＬＣおよび／または磁性粒子の使用を用いてＤＮＡ断片を単離することができる。ＤＮＡ断片の単離の代替法として、プラスミドベクターを制限酵素で消化し、発現カセット断片の先行精製なくしてこのＤＮＡをトウモロコシ細胞に送達することができる。
【０１２６】
Ｖ．形質転換のための受容細胞
組織培養は培地および制御された環境を必要とする「培地」とはインビトロですなわち、無傷の生きた生物の外部で細胞を増殖させるのに使用される多数の栄養素混合物をいう。該培地は、通常、ほとんどの細胞型の増殖に必要な種々のカテゴリーの成分（塩、アミノ酸、成長調節剤、糖、緩衝液）の懸濁液である。しかしながら、各特異的細胞型は成長のために特別の範囲の成分割合、より特異的範囲の最適成長についての処方を必要とする。また、細胞増殖の速度はその細胞型の成長を可能とする培地のアレイで開始した培養内で変化するであろう。
【０１２７】
栄養素培地は液体として調製されるが、これは、固体支持体を供することができる物質に液体を添加することによって固化させることができる。寒天はこの目的で最も普通に用いられる。バクトアガー、ハゼルトンアガー、ゲルライト、およびゲルグロは、組織培養において植物細胞の増殖に適した特別タイプの固体支持体である。
【０１２８】
いくつかの細胞型は液体懸濁液中または固体培地上いずれかで増殖し分裂するであろう。本明細書中で開示するごとく、トウモロコシ細胞は懸濁液中または固体培地上で増殖するが、懸濁培養からの植物の再生は、発育のいくつかの地点において液体から固体培地への移動を必要とする。培養中の細胞の分化のタイプおよび程度は、使用する培地のタイプおよび環境、例えば、ｐＨのみならず培地が固体であるか液体であるかによって影響されるであろう。表２は受容細胞の創製および植物再生で有用な種々の培地の組成を説明する。
【０１２９】
受容細胞標的は、限定されるものではないが、シュート先端（米国特許第５，７３６，３６９号、タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩカルス、未成熟胚および小胞子、花粉、精子および卵子細胞のごとき配偶子細胞を含めた分裂組織細胞を含む。稔性植物がそれから再生できるいずれの細胞も受容細胞として有用であると考えられる。タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩカルスは、限定されるものではないが、未成熟胚、実生先端分裂組織、小胞子等を含めた組織源から開始することができる。カルスのごとき増殖することができる細胞もまた遺伝的形質転換のための受容細胞である。本発明は、未成熟胚を形質転換し、引き続いて稔性トランスジェニク植物を再生する技術を提供する。未成熟胚の形質転換は受容細胞培養の長期発育の必要性を軽減する。花粉ならびにその前駆体細胞
、小胞子は遺伝的形質転換のための受容細胞として、受精の間の一体化のための外来性ＤＮＡを運ぶベクターとして機能することができる。直接的花粉形質転換は細胞培養の必要性を緩和するであろう。分裂組織細胞（すなわち、連続的細胞分裂ができ、未分化細胞学的外観によって特徴づけられ、根の先端、茎の先端、側方蕾のごとき植物における成長点または組織で通常は見いだされる植物細胞）はもう１つのタイプの受容植物細胞を代表することができる。その未分化増殖および器官分化の能力および全能性のため、単一の形質転換された分裂組織細胞を完全な形質転換植物として回収することができる。事実、胚形成懸濁培養はインビトロ分裂組織細胞系であり得、未分化状態で継続した細胞分裂の能力を保持し、培地の環境によって制御される。
【０１３０】
所望のＤＮＡセグメントでの形質転換のための受容細胞として働くことができる培養植物細胞は、トウモロコシ細胞、より具体的にはＺｅａ  ｍａｙｓ  Ｌからの細胞を含めたいずれの植物細胞であってもよい。体細胞は種々のタイプのものである。胚形成細胞は、胚形成を通じて植物を再生するように誘導できる体細胞の１つの例である。非胚形成細胞は、典型的には、そのようには応答しないものである。非胚形成細胞はあるＢｌａｃｋ  Ｍｅｘｉｃａｎ  Ｓｗｅｅｔ（ＢＭＳ）トウモロコシ細胞である。
【０１３１】
例えば、形質転換用の受容細胞としての、本発明の意味で有用な胚形成トウモロコシカルスおよび懸濁培養の開発は米国特許第５，１３４，０７４号；および米国特許第５，４８９，５２０号に記載されており；その各々を引用することによりその全体を本明細書の一部とみなす。
【０１３２】
細胞集団内で受容細胞を豊富化するある技術を用いることができる。例えば、タイプＩＩカルス発育、続いての脆い胚形成組織の手による選択および培養の結果、微粒子形質転換で使用される受容細胞が豊富化される。特に本明細書中で開示する培地を用いる懸濁培養は、いずれかの所与の集団において非受容細胞に対する受容細胞の比率を改良することができる。受容細胞を選択するのに使用できる手動選択技術は、例えば、細胞形態および分化の評価を含むことができ、あるいは種々の物理的または生物学的手段を使用することができる。低温保存もまた受容細胞につき選択する可能な方法である。
【０１３３】
例えば、タイプＩＩカルスの表面から胚形成細胞を選択することによる受容細胞の手動選択は、（固体培地上でまたは懸濁液中で培養されたかを問わず）培養に先立って受容細胞につき豊富化する試みで使用することができる１つの手段である。好ましい細胞は細胞クラスターの表面に位置するものであり得、さらに、分化のその欠如、そのサイズおよびその密な細胞質によって同定することができる。好ましい細胞は、一般には、分化の程度が低いか、または未だ分化にいたっていない細胞であろう。かくして、細胞質が密で、（例えば、細胞学的観察によって決定して）高い核−対−細胞質比率で比較的空胞化されておらず、サイズが小さく（例えば、１０から２０μｍ）、保持された分裂および体細胞プロ胚形成できる細胞を同定し選択するのが望まれる。
【０１３４】
かかる細胞を同定する他の手段もまた使用することができると考えられる。例えば、胚形成細胞のごとき比較的非透過性膜を持つ細胞によって排除され、（いわゆるそのスネーク様外観のため）根様細胞およびスネーク細胞のごとき比較的分化した細胞によって摂取されるエバンズブルーのような染料の使用を介する。
【０１３５】
受容細胞を同定する１つの可能な手段は細胞化学染色によって検出することができるグルタミン酸デヒドロゲナーゼのごとき胚形成細胞のイソ酵素マーカーの使用を含む（Ｆｒａｎｓｚら，１９８９）。しかしながら、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含めたイソ酵素マーカーの使用は、それにもかかわらず比較的高い代謝活性を有する根状細胞のごとき非胚形成細胞からのある程度の偽陽性に導き得る。
【０１３６】
（ｉ）形質転換用の受容側（レシピエント）である細胞の培養
トウモロコシ細胞の培養を調製し低温保存する能力は、それが形質転換用の細胞を再現性よくかつ首尾よく調製する手段を提供する点で、本発明のある態様で重要である。種々の異なるタイプの培地が従前に開発されており、本発明の種々の態様を実施するのに使用することができる。以下の表２は本発明のこれらの態様を実施するための本発明者らが好む培地の組成を記載する。
【０１３７】
【表２】
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【０１３８】
形質転換で用いることができる多数の例示的トウモロコシ培地が開発されており、引用することにより本明細書の一部とみなすＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８に開示されている。
【０１３９】
（ｉｉ）培地
本発明のある実施態様において、受容細胞を以下の培養中の増殖により選択することができる。使用する場合、培養した細胞を固体支持体上で、または液体懸濁液の形態で増殖させることができる。いずれの場合においても、栄養物を培地の形態で細胞に供することができ、環境条件を制御することができる。種々のアミノ酸、塩、糖、増殖調節剤およびビタミンよりなる多くのタイプの組織培養培地がある。本発明の実施で使用される培地のほとんどはいくつかの同様の成分を有し（表２参照）、しかし、想定される特定の適用において、組成およびその成分の割合は異なり得る。例えば、種々の細胞タイプが、通常、１を超えるタイプの培地中で増殖するが、増殖培地に依存して、異なる増殖速度および異なる形態を呈するであろう。いくつかの培地において、細胞は生存するが分裂しない。
【０１４０】
植物細胞の培地に適した種々のタイプの培地は従前に記載されている。これらの培地の例は限定されるものではないが、Ｃｈｕら（１９７５）によって記載されているＮ６培地およびＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２）を含む。高いアンモニア／硝酸塩比率を有するＭＳのごとき培地は、それが形態形成能力の喪失を促進する点で受容細胞の生成に逆効果である。他方、Ｎ６培地は幾分低いアンモニア／硝酸塩比率を有し、持続性分裂できるプロ胚状態に細胞を維持することによって受容細胞の生成を促進すると考えられる。
【０１４１】
（ｉｉｉ）維持
細胞培養の維持の方法は形質転換用の受容細胞の源としてその利用性に寄与することができる。新鮮な培養培地への移動のための細胞の手動選択、新鮮な培養培地への移動の頻度、培養培地の組成、および限定されるものではないが光の質および量および温度を含めた環境因子は、全て、受容細胞の源として有用であるカルスおよび／または懸濁培養を維持するにおいて重要な因子である。異なる培養条件間でカルスを改変することは培養内で受容細胞を豊富とするのに有利であり得ると考えられる。例えば、細胞を懸濁培養で培養することができるが、規則的間隔にて固体培地に移すことができると考えられる。固体培地上での増殖の後、細胞を手動で液体培養培地に戻すために選択することができる。新鮮な培養培地へ戻すこの系列を反復することによって、受容細胞を豊富化するのが可能であ
ることが考えられる。また、細胞培養を１．９ｍｍふるいに通すことはカルスまたは懸濁培養の脆さを維持するのに有用であり、形質転換可能な細胞を豊富化するのに有益であると考えられる。
【０１４２】
（ｉｖ）低温保存方法
低温保存は、延長された培養期間に関連する累積有害効果を排除しつつ将来の使用のために既知の形質転換可能な細胞培養を維持し保持するのを可能とするため重要である。
【０１４３】
細胞懸濁液およびカルスは従前に報告されている方法の修飾を用いて低温保存された（Ｆｉｎｋｌｅ，１９８５；Ｗｉｔｈｅｒｓ＆Ｋｉｎｇ，１９７９）。
【０１４４】
低温保存プロトコルは、１ないし２時間にわたって予め冷却した（０℃）濃縮低温保護剤混合物を添加して細胞を予備冷却する（０℃）ことよりなるものであった。混合物をこの間中０℃に維持した。混合物を段階的に添加した低温保護剤の容量は細胞懸濁液の初期容量と等しく（１：１添加）、低温保護剤添加剤の最終濃度は１０％ジメチルスルホキシド、１０％ポリエチレングリコール（６０００ｍｗ）、０．２３Ｍプロリンおよび０．２３Ｍグルコースであった。混合物を０℃で３０分間平衡化し、その間に細胞懸濁液／低温保護剤混合物を１．５ｍｌアリコットにて（０．５ｍｌ充填細胞容量）２ｍｌポリエチレン低温バイアルに分割した。チューブを０．５℃／分にて−８℃まで冷却し、氷核形成のためにこの温度に保持した。
【０１４５】
一旦細胞外氷核形成が目で確認されれば、該チューブを０．５℃／分にて−８℃ないし−３５℃まで冷却した。それらをこの温度に４５分間保持して（細胞クラスター全体の均一な凍結−誘導脱水を確認した）。この時点で、細胞はその浸透圧容量の大部分を喪失し（すなわち、細胞に残る遊離水はほとんどない）、それらは貯蔵のために安全に液体窒素中に入れることができた。−３５℃ないし−１９６℃の迅速な冷却速度と組み合わせて細胞に残存する少量の遊離水は大きな組織化された氷結晶が細胞中で形成されるのを妨げた。細胞を液体窒素中に保存し、これは細胞を効果的に固定化し、代謝プロセスを長期貯蔵が有害ではない点まで遅らせる。
【０１４６】
細胞外溶液の解凍は低温チューブを液体窒素から取り出し、それをほぼ２分間滅菌４２℃水中で撹拌することによって達成された。最後の氷結晶が融解し組織の加熱を妨げた直後にチューブを加熱から取り出した。（低温保護剤混合物中に依然としてある）細胞懸濁液をフィルター上でピペットで移し、ＢＭＳ細胞の層（回収の間にナース効果を供するフィーダー層）上においた。ピペッティングにより低温保護剤溶液を除去する。細胞培地は浸透圧強度が増大したカルス増殖培地よりなるものであった。低温保護剤の希釈は、溶質がフィルターを通って拡散し、栄養物が回収細胞に向けて拡散するにつれてゆっくりと起こった。一旦解凍した細胞の引き続いての増殖が観察されれば、増殖組織を新鮮な培養培地に移した。もし懸濁培養の開始が望まれれば、十分な細胞マスが回復される（通常１ないし２週間以内）や否や、液体懸濁培地に戻した。別法として、細胞を固体カルス増殖培地上で培養した。培養を液体中で再度確立（さらに１ないし２週間以内）した後、それを形質転換実験で用いた。所望すれば、従前に低温保存した培養を貯蔵のために再度凍結することができる。
【０１４７】
ＶＩ．安定に形質転換されたトウモロコシの生産および特徴づけ
外因性ＤＮＡの受容細胞への送達を行ったのち、次の工程は一般にはさらに培養するために形質転換細胞を同定し、植物を再生することに関する。前記したごとく、形質転換体を同定する能力を改善するためには、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を注目する発現可能な遺伝子としてまたはそれに加えて使用することが望まれる。この場合、次いで一般的には、細胞を選択剤または複数の選択剤に暴露することによって潜在的に形質転換された細胞集団をアッセイするか、あるいは所望のマーカー遺伝子の特性につき細胞をスクリーニングする。
【０１４８】
（ｉ）選択
いずれの１つの実験においても、ＤＮＡは標的細胞の小さな割合にしか導入されない。ＤＮＡを受容する細胞を同定しそれをそのゲノムに組み込むための効果的な系を提供するためには、安定に形質転換された細胞を選択する手段を使用することができる。かかる方法の１つの例示的実施態様は、宿主細胞に、抗生物質または除草剤のごとく、いくつかの通常に阻害的剤に対する抵抗性を付与するマーカー遺伝子を導入することである。使用することができる抗生物質の例はアミノグリコシド抗生物質ネオマイシン、カナマイシンおよびパルモマイシン、あるいは抗生物質ヒグロマイシンを含む。アミノグリコシド抗生物質に対する抵抗性は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）またはＮＰＴ
【０１４９】
Ｉのごときアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ酵素によって付与され、他方、ヒグロマイシンに対する抵抗性はヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼによって付与される。
【０１５０】
次いで、潜在的に形質転換された細胞を選択剤に暴露する。生存する細胞の集団には、一般に、抵抗性−付与遺伝子が組み込まれ、細胞生存を可能とする十分なレベルで発現される細胞がある。細胞をさらにテストして外因性ＤＮＡの安定な組み込みを確認することができる。本明細書中で開示する技術を用いて４０％を超える衝撃胚は形質転換体を生じさせることができる。
【０１５１】
望ましい選択剤として提案されてきた１つの除草剤は広域スペクトル除草剤ビアラホスである。ビアラホスはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって生産されたポリペプチド抗生物質であり、ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）、Ｌ−グルタミン酸のアナログおよび２つのＬ−アラニン残基よりなる。細胞内ペプチターゼによるＬ−アラニン残基の除去に際し、該ＰＰＴが放出され、それはグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アンモニア同化および窒素代謝に関与する重要な酵素の優れた阻害剤である（Ｏｇａｗａｒａ，１９７３）。合成ＰＰＴ、除草剤ＬｉｂｅｒｔｙTMにおける有効成分もまた選択剤として効果的である。ＰＰＴによる植物におけるＧＳの阻害はアンモニアの迅速な蓄積および植物細胞の死滅を引き起こす。
【０１５２】
ビアラホスを生産する生物および属Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの他の種もまたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓにおけるｐａｒ遺伝子およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓにおけるｐａｔ遺伝子によって酵素されるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）を合成する。ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする除草剤抵抗性遺伝子の使用はＤＥ  ３６４２  ８２９Ａに言及されており、そこでは、該遺伝子がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓから単離される。細菌源生物において、この酵素は自己毒性を妨げるＰＰＴの遊離アミノ基をアセチル化する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９８７）。該ｄａｒ遺伝子はクローニングされており（Ｍｕｒａｋａｍｉら，１９８６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９８７）、トランスジェニックタバコ、トマト、ジャガイモ（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ，１９８７）、アブラナ属植物（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ，１９８９およびトウモロコシ米国特許第５，５５０，３１８号）で発現されている。従前の報告において、抵抗性遺伝子を発現したいくつかのトランスジェニック植物は温室においてＰＰＴおよびビアラホスの商業的処方に完全に抵抗性であった。
【０１５３】
本発明の実施において形質転換された細胞系の選択で有用な除草剤のもう１つの例は広域スペクトル除草剤グリフォセートである。グリフォセートは芳香族アミノ酸生合成経路で活性な酵素ＥＰＳＰＳの作用を阻害する。この酵素の阻害はアミノ酸フェニルアラニン、チオシンおよびトリプトファンおよびそれに由来する二次代謝産物の飢餓に導く。米国特許第４，５３５，０６０号は、ＥＰＳＰＳ，ａｒｏＡにつきＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ遺伝子に対してグリフォセート抵抗性を付与するＥＰＳＰＳ突然変異の単離を記載する。該ＥＰＳＰＳ遺伝子はＺｅａ  ｍａｙｓからクローニングされ、グリフォセート抵抗性ａｒｏＡ遺伝子で見いだされたものと同様な突然変異がインビトロで導入された。グリフォセート抵抗性ＥＰＳＰＳ酵素をコードする突然変異体遺伝子は、例えば、国際出願ＷＯ９７／４１０３に記載されている。グリフォセート抵抗性を付与する最良に特徴づけられた突然変異体ＥＰＳＰＳ遺伝子は残基１０２および１０６におけるアミノ酸変化を含むが、他の突然変異もまた有用であると予測される（ＰＣＴ／ＷＯ９７／４１０３）。
【０１５４】
ｂａｒ／ビアラホスまたはＥＰＳＰＳ−グリフォセート選択系を使用するには、衝撃組織を非選択培地上で０−２８日間培養し、引き続いて、適当には、１−３ｍｌ／ｌビアラホスまたは１−３ｍＭグリフォセートを含有する培地に移した。１−３ｍｌ／ｌビアラホスまたは１−３ｍＭグリフォセートの範囲が典型的には好ましいが０．１−５０ｍｇ／ｌビアラホスまたは０．１−５０ｍＭグリフォセートの範囲が本発明の実施で利用性があると考えられる。限定されるものではないがフィルターおよび固体培養培地を含めた、衝撃用のいずれかの多孔性の不活性で固体もしくは半固体支持体上に組織を置くことができる。ビアラホスおよびグリフォセートは形質転換体の選択に適した剤の例として供されるが、本発明の技術はそれに限定されない。
【０１５５】
さらに、除草剤ＤＡＬＡＰＯＮ、２，２−ジクロロプロピオン酸は形質転換細胞の同定に有用である得ると考えられる。該酵素２，２−ジクロロプロピオン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｅｈ）は２，２−ジクロロプロピオン酸の除草剤活性を不活化し、従って、デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子を発現する細胞または植物に除草剤抵抗性を付与する（Ｂｕｃｈａｎａｍ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎら，１９９２；ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８；米国特許第５，５０８，４６８号；米国特許第５，５０８，４６８号）。
【０１５６】
別法として、あるアミノ酸アナログ、例えば、５−メチルトリプトファンまたは６−メチルアンスラニレートに抵抗性を付与するアンスラニレートシンターゼ遺伝子をコードする遺伝子は選択マーカー遺伝子として有用であり得る。選択マーカーとしてのアンスラニレートシンターゼ遺伝子の使用は米国特許第５，５０８，４６８号；および米国特許出願０８／６０４，７８９号に記載されていた。
【０１５７】
スクリーニング可能なマーカー特性の例はトウモロコシにおけるＲ−遺伝子座の制御下で生産された赤色色素である。この色素は、この段階で増殖を支持することができる栄養培地を含有する固体支持体上で細胞を培養し、着色したコロニー（細胞の目に見える凝集体）から細胞を選択することによって検出することができる。これらの細胞は懸濁液または固体倍地上いずれかで培養することができる。Ｒ−遺伝子座は衝撃下未成熟胚からの形質転換の選択で有用である。同様にして、Ｃ１およびＢ遺伝子の導入の結果、着色細胞および／または組織が得られるであろう。
【０１５８】
酵素ルシフェラーゼは本発明の意味ではスクリーニング可能なマーカーとして使用することができる。基質ルシフェリンの存在下で、ルシフェラーゼを発現する細胞は光を発し、これは、夜の視野を増強するデバイスによって、またはホトン計数カメラのごとき高度に光感受性のビデオカメラによって、ルミノメーター（または液体シンチレーションカウンター）にて写真またはＸ線フィルムで検出することができる。これらのアッセイのすべては非破壊的であり、形質転換細胞を同定後にさらに培養することができる。ホトン計数カメラは特に価値あるものである。というのはそれはルシフェラーゼを発現する特異的細胞または細胞の群を同定し、リアルタイムにてそれを操作することを可能とするからである。使用することができるもう１つのスクリーニング可能なマーカーは緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である（Ｓｈｅｅｎら，１９９５）。
【０１５９】
さらに、スクリーニング可能および選択可能マーカーの組合せは形質転換細胞の同定で有用であろうと考えられる。いくつかの細胞または組織タイプにおいて、ビアラホスまたはグリフォセートのような選択剤は形質転換細胞を明瞭に認識するのに十分な死滅活性を供しないか、あるいは形質転換体および同様に非形質転換体の実質的に非選択的阻害を引き起こさず、かくして、効果的でない選択効果を引き起こす。１００％阻害、引き続いてルシフェラーゼのごときスクリーニング可能なマーカー遺伝子の発現につき増殖組織をスクリーニングするもの未満の濃度のビアラホスまたはグリフォセートのような増殖阻害化合物での選択は、選択単独に対して適用できない細胞または組織タイプからの形質転換体の回収を可能とするであろうと考えられる。選択およびスクリーニングの組合せは非常に
種々の細胞および組織タイプにおいて形質転換体を同定するのを可能にしうると考えられる。
【０１６０】
（ｉｉ）再生および種生産
選択剤の暴露で生存する細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性であるとスコアが付された細胞は、植物の再生を支持する培地中で培養することができる。例示的実施態様において、ＭＳおよびＮ６培地は成長調節剤のごとき物質をさらに含めることによって修飾することができる（表２参照）。かかる目的のための好ましい成長調節剤はジカンバまた２，４−Ｄである。しかしながら、ＮＡＡ、ＮＡＡ＋２，４−Ｄまたは恐らくはピクロラムさえ含めた他の成長調節剤を使用することもできる。これらおよび同様の方法での培地改良は特定の発生段階で細胞の増殖を促進すると判明した。十分な組織が植物再生努力を開始するのに入手可能となるまで、あるいは反復ラウンドの手動選択に続き、組織の形態が少なくとも２週間で再生で適当となり、次いで胚の成熟に導く培地に移すまで、成長
調節剤を含む基礎培地に組織を維持することができる。培養を２週間ごとにこの培地に移す。シュート発生は成長調節剤を欠く培地に移す時刻をシグナルで与えるであろう。
【０１６１】
選択またはスクリーニングによって同定され、再生を支持する適当な培地中で培養された形質転換細胞は、次いで、植物に成熟できるであろう。発育するプラントレットを無土壌植物成長ミックスに移し、例えば、約８５％相対湿度、６００ｐｐｍ  ＣＯ2、および２５−２５０ミクロアインシュタインｍ-2ｓ-1の光の環境が制御されたチャンバー中で丈夫にする。植物は好ましくは成長チャンバーまたは温室中で成熟させる。最初の組織に応じて、形質転換体が同定された後、植物を約６週間ないし１０ヶ月間再生する。再生の間、組織培養容器中の固体培地上で細胞を増殖させる。かかる容器の例示的実施態様はペトリ皿およびＰｌａｎｔ  Ｃｏｎｓである。再生する植物は好ましくは約１９ないし２８℃で増殖させる。再生植物がシュートおよび根発育の段階に到達した後、それをさらに成長およびテストのために温室に移すことができる。
【０１６２】
しかしながら、形質転換植物の仁は場合によっては仁発育の停止および植物の未成熟老化による胚救済を必要とし得ることに注意する。発育する胚を救済するには、表面消毒した仁からそれを花粉形成後１０−２０日に切り出し、培養する。この段階の培養で用いる培地の実施態様はＭＳ塩、２％スクロースおよび５．５ｇ／ｌアガロースを含む。胚救済において、大きな胚（長さが３ｍｍを超えると定義される）を適当な培地上で直接的に発芽させる。１０-5Ｍでアブシジン酸と共に前記成分を含有する培地で１週間培養することができるものよりも小さな胚を、次いで、発芽のために無成長調節剤培地に移す。
【０１６３】
形質転換植物から子孫を回収し、葉などの植物の部分に適当な基質を局所適用することによって外因性の発現可能な遺伝子の発現につきテストすることができる。ｂａｒ形質転換植物の場合には、テストした形質転換親植物（Ｒ0）およびいずれかの世代のその子孫は、インビトロ酵素アッセイによって評価して植物中に機能的ＰＡＴ活性がないならば、除草剤バスタを葉に局所適用した後にビアラホス−関連壊死を呈しないことが判明した。全てのテストしたＰＡＴ陽性子孫はｂａｒを含有し、酵素の存在およびビアラホスに対する抵抗性はマーカー遺伝子の生殖系を通じての伝達に関連することが確認される。
【０１６４】
（ｉｉｉ）特徴づけ
再生植物における外来性ＤＮＡまたは「導入遺伝子」の存在を確認するために、種々のアッセイを行うことができる。かかるアッセイは、例えば、サザーンおよびノーザンブロッティングＰＣＲTMのごとき「分子生物学」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）によってまたは酵素機能によって、タンパク質産物の存在を検出するごとき「生化学」アッセイ；葉または根アッセイのごとき植物部分アッセイ；および全再生植物の表現型を分析することによるものを含む。
【０１６５】
１．ＤＮＡ組み込み、ＲＮＡ発現および遺伝
ゲノムＤＮＡはカルス細胞系またはいずれかの植物の部分から単離して、当業者によく知られた技術を使用することによって外因性遺伝子の存在を測定することができる。恐らくは細胞中の配列の再配置または欠失により無傷配列は常には存在しないことに注意する。
【０１６６】
本発明の方法を通じて導入されたＤＮＡエレメントの存在はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲTM）によって測定することができる。この技術を用い、ゲル電気泳動によってＤＮＡの区別される断片が増幅され検出される。このタイプの分析は、遺伝子が安定な形質転換体に存在するか否かを決定することを可能とするが、導入された遺伝子の宿主細胞ゲノムへの組み込みは判明しない。しかしながら、ＰＣＲTM分析により遺伝子の存在を示すすべての形質転換体のゲノムにＤＮＡが組み込まれたというのが本発明者らの経験である。加えて、形質転換体がゲノムの異なる部位に導入された外来性遺伝子を有するか否か、すなわち、形質転換体が独立した起源であるか否かを決定するのにＰＣＲTM技術を使用するのは不可能である。ＰＣＲTM技術を用い、導入された遺伝子に隣接する宿主ゲノムＤＮＡの断
片をクローニングすることが可能であろうと考えられる。
【０１６７】
宿主ゲノムへのＤＮＡ組み込みの肯定的証拠および形質転換体の独立した同一性はサザーンハイブリダイザーションの技術を用いて決定することができる。この技術を用い、宿主ゲノムに導入された特異的ＤＮＡ配列およびフランキング宿主ＤＮＡ配列を同定することができる。よって、与えられた形質転換体のサザーンハイブリダイザーションパターンはその形質転換体の特徴を同定するものとして働く。加えて、サザーンハイブリダイザーションを通じて高分子量ＤＮＡ中の導入遺伝子の存在を証明する、すなわち、導入遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれたことを確認することが可能である。サザーンハイブリダイザーションの技術は、ＰＣＲTMを用いて得られた情報、例えば、遺伝子の存在を提供するが、ゲノムへの組み込みも証明し、各個々の形質転換体を特徴づける。
【０１６８】
サザーンハイブリダイザーション技術の修飾であるドットもしくはスロットブロットハイブリダイザーションの技術を用いて、ＰＣＲTMに由来する同一情報、例えば、遺伝子の存在を得ることができると考えられる。
【０１６９】
ＰＣＲTMおよびサザーンハイブリダイザーション技術双方を用いて導入遺伝子の子孫への伝達を証明することができる。ほとんどの場合、与えられた形質転換体についての特徴的なサザーンハイブリダイザーションパターンは１以上のメンデル遺伝子として子孫で分離し（Ｓｐｅｎｃｅｒら，１９９２）、これは導入遺伝子の安定な遺伝を示す。
【０１７０】
ＤＮＡ分析技術は植物のいずれかの部分から単離されたＤＮＡを用いて行うことができるが、ＲＮＡは特定の細胞または組織タイプで発現されるにすぎず、よって、これらの組織から分析用ＲＮＡを調製する必要があろう。ＰＣＲTM技術もまた導入遺伝子から生産されたＲＮＡの検出および定量で用いることができる。ＰＣＲTMのこの適用において、逆転写酵素のごとき酵素を用い、ＲＮＡをＤＮＡに転写し、次いで、通常のＰＣＲTM技術の使用を介してＤＮＡを増幅することがまず必要である。ほとんどの場合、ＰＣＲTM技術は有用であるがＲＮＡ産物の一体性を証明しないであろう。ＲＮＡ産物の性質についてのさらなる情報はノーザンブロッティングによって得ることができる。この技術はＲＮＡ種の存在を証明し、そのＲＮＡの一体性についての情報を与えるであろう。ＲＮＡ種の存在また
は不存在はドットもしくはスロットブロットノーザンハイブリダイザーションを用いて決定することもできる。これらの技術はノーザンブロッティングの修飾であり、ＲＮＡ種の存在または不存在を証明するにすぎないであろう。
【０１７１】
２．遺伝子の発現
サザーンブロッティングおよびＰＣＲTMを用いて問題の遺伝子を検出することができるが、それらは当該遺伝子が発現されつつあるか否かに関する情報を提供しない。発現は導入された遺伝子のタンパク質産物を特異的に同定するか、あるいはその発現によって行われた表現型変化を評価することによって評価することができる。
【０１７２】
特異的タンパク質の生産および同定に関するアッセイはタンパク質の物理−化学構造、機能または他の特性を利用することができる。ユニークな物理−化学または構造特性は当該タンパク質が天然もしくは変性ゲル電気泳動または等電点電気泳動のごとき電気泳動手法によって、あるいはイオン交換またはゲル排除クロマトグラフィーのごときクロマトグラフィー技術によって分離され同定されることを可能とする。個々のタンパク質のユニークな構造は、ＥＬＩＳＡアッセイのごとき様式でそれらの存在を検出するための特異的抗体の使用についての機会を与える。アプローチの組合せは、電気泳動技術によって分離された個々の遺伝子産物を突き止めるのに抗体が使用されるウエスタンブロッティングのごときより大きな特異性を持って使用することができる。さらなる技術を使用して、精製後
のアミノ酸配列決定による評価のごとく注目するタンパク質の同一性を絶対的に確認することができる。これらは最も通常に使用されているもののうちにあるが、他の手法をさらに用いることもできる。
【０１７３】
アッセイ手法を用いて、その機能、特に特異性基質および産物を含む特異的化学反応を触媒する酵素の能力によってタンパク質の発現を同定することもできる。これらの反応に続き、物理的または化学的手法によって基質の喪失または反応の産物の創製を供し定量することができる。その例は分析すべき酵素により変化し、２つを挙げれば、ホスフィノスリシンおよび14Ｃ−アセチルＣｏＡからの放射性方式アセチル化ホスフィノスリシンの生産を追跡することによるＰＡＴ酵素活性についての、あるいはアンスラニレートの蛍光の喪失を追跡することによるアンスラニレートシンターゼ活性についてのアッセイを含むことができる。
【０１７４】
非常にしばしば、遺伝子産物の発現はその発現の表現型結果を評価することによって測定される。また、これらのアッセイは限定されるものではないが植物の化学的組成、形態、または生理学的特性における変化を分析することを含めて多くの形態を取ることができる。化学的組成は、アミノ酸組成を変化させる酵素または貯蔵タンパク質をコードする遺伝子の発現によって改変することができ、アミノ酸分析によって、あるいは近赤外反射スペクトロメトリンによって分析することができる澱粉量を変化させる酵素によって検出することができる。形態学的変化はより大きな丈または厚い茎を含むことができる。課された処理に対する植物または植物部分に応答する最も頻繁な変化はバイオアッセイとよばれる注意深く制御された条件下で評価される。
【０１７５】
ＶＩＩ．本発明の育種植物
本発明による構築物での特定の遺伝子型の直接的形質転換に加えて、本発明の植物は、本発明の構築物を有する植物を該構築物を欠く第２の植物に交雑させることによって作成することができる。従って、本発明は本発明により形質転換された細胞から直接的に再生された植物のみならず、該植物の子孫も含む。本明細書中で使用する用語「子孫」とは本発明により調製した親植物のいずれかの世代の子孫をいう。本明細書中に開示するように、出発植物系に対する１以上の付加された導入遺伝子を有する植物系を供するための植物の「考察」は、本発明の導入遺伝子を含むドナー植物系と出発系とを交雑させることによって、植物系に導入された本発明の導入遺伝子が得られる技術と定義される。これを達成するためには、一般的には以下の工程、
（ａ）第１（出発系）および第２（本発明の導入遺伝子を含むドナー植物）親植物の種子を植え、
（ｂ）第１および第２親植物の種を花を咲かす植物に成長させ、
（ｃ）第１の親植物の雌花に第２の親植物の花粉を与え、次いで、
（ｄ）雌花を咲かす親植物で生産された種子を収穫する、
ことを行う。
【０１７６】
戻し交配の変換は、本明細書においては、
（ａ）所望の遺伝子、ＤＮＡ配列またはエレメントを含有する第１の遺伝子型の植物を該所望の遺伝子、ＤＮＡ配列またはエレメントを欠く第２の遺伝子型の植物に交配させ、
（ｂ）所望の遺伝子、ＤＮＡ配列またはエレメントを含有する１以上の子孫植物を選択し、
（ｃ）子孫植物を第２の遺伝子型の植物に交雑させ、次いで
（ｄ）第１の遺伝子型の植物から該所望の遺伝子、ＤＮＡ配列またはエレメントを第２の遺伝子型の植物に移動させる目的で工程（ｂ）および（ｃ）を反復する、
工程を含むプロセスと定義される。
【０１７７】
植物遺伝子型へのＤＮＡエレメントの遺伝質浸透は戻し交配変換のプロセスの結果と定義される。ＤＮＡ配列が遺伝質浸透された植物遺伝子型は戻し交配変換遺伝子型、系、同型繁殖体またはハイブリッドということができる。同様に、該所望のＤＮＡ配列を欠く植物遺伝子型は未変換遺伝子型、系、同型繁殖体またはハイブリッドということができる。
【０１７８】
ＶＩＩＩ．植物導入遺伝子組成物
本発明の特に重要な進歩は、それがマーカー遺伝子その他を含めた導入遺伝子を発現する改良された方法を提供する点にある。かかる導入遺伝子は、しばしば、特定のタンパク質またはポリペプチド産物の発現を指令する遺伝子であろうが、それらは非発現可能ＤＮＡセグメント、例えば、それ自身の転移を指令しないＤｓのごときトランスポゾンでもあり得る。本明細書で用いるごとく、「発現可能遺伝子」とはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）に転写されることができ、あるいはタンパク質に翻訳でき、注目する特性等として発現され、および限定されるものではないが選択可能、スクリーニング可能または非選択可能マーカー遺伝子であるいずれかの遺伝子である。また、本発明では、必ずしもマーカー遺伝子ではない発現可能遺伝子をマーカー遺伝子と組み合わせて使用する場合、同一または異なる形質転換用のＤＮＡセグメントのいずれかで別の遺伝子を使用することができると考えられる。後者の場合、異なるベクターを同時に受容細胞に送達して共形質転換を最大化する。
【０１７９】
受容細胞に送達されるべき特定のＤＮＡセグメントの選択はしばしば形質転換の目的に依存する。作物植物の形質転換の主要な目的の１つは、いくつかの商業的に望ましく耕種学的に重要な特性を植物に付与することである。かかる特性は、限定されるものではないが、除草剤抵抗性または寛容性；昆虫抵抗性または寛容性；病気抵抗性または寛容性（ウイルス、細菌、菌類、線虫）；干ばつ、加熱、冷却、凍結、過剰水分、塩、ストレスに対する抵抗性または寛容性によって例示されるストレス寛容性および／または抵抗性；酸化ストレス；増大した収率；食品の含有量および体裁；物理的外観；雄性不稔；乾燥；標準性；増殖性；澱粉特性；油の量および質等を含む。例えば、除草剤抵抗性をコードする遺伝子または複数遺伝子のごときいずれかのかかる望ましい特性または複数特性を付与する
１以上の遺伝子を組み込むことが望まれるであろう。
【０１８０】
ある実施態様において、本発明では、１を超える有利な導入遺伝子での受容細胞の形質転換が考えられる。区別される導入遺伝子コーディングベクターを用い、あるいは２以上の遺伝子コーディング配列を組み込む単一ベクターを用い、２以上の導入遺伝子を単一形質転換事象で供給することができる。もちろん、除草剤、昆虫、病気（ウイルス、細菌、菌類、線虫）または干ばつ抵抗性、雄性不稔、乾燥、標準性、増殖性、澱粉特性、油の量および質を付与するもの、あるいは収率または栄養質を増加させるもののごとき、いずれかの記載のいずれかの２以上の導入遺伝子を所望であれば使用することができる。
【０１８１】
実質的にいずれのＤＮＡ組成物もいずれかの与えられた形質転換技術にて導入して、結局は稔性トランスジェニック植物を生産することができるのは当業者によく知られている。本発明と組み合わせて使用することができるベクターの構築は本開示に鑑みて当業者に知られるであろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；Ｇｅｌｖｉｎら，１９９０）。本発明の技術は、かくして、特定のＤＮＡ配列には限定されない。例えば、ベクターおよびプラスミドの形態のＤＮＡセグメント、またはある場合には植物で発現されるべきＤＮＡエレメントのみを含有する線状ＤＮＡ断片を使用することができる。
【０１８２】
ある実施態様において、単子葉植物形質転換において複製−コンピテントウイルスベクターを使用することが望まれると考えられる。かかるベクターは、例えば、ｐＷ１−１１およびＰＷ１−ＧＵＳのごときコムギ、小人ウイルス（ＷＶＤ）「シャトル」ベクターを含む（Ｕｇａｋｉら，１９９１）。これらのベクターはトウモロコシ細胞ならびにＥ．ｃｏｌｉで自律複製可能であり、それ自体トランスジェニック細胞に送達されたＤＮＡを検出するための増大した感度を提供することができる。複製ベクターはＡｃ、ＤｓまたはＭｕのごとき転移因子からのＤＮＡ配列によって近接挟まれた遺伝子の送達で有用である。トウモロコシゲノム内のこれらのエレメントの転移はＤＮＡ複製を要すると提案されている（Ｌａｕｆｓら，１９９０）。また、転移因子は細菌中のプラスミドベクターの選択お
よび維持に必要なエレメント、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子およびＤＮＡ複製起点を欠くＤＮＡ断片を導入するのに有用であろうと考えられる。また、Ａｃ、ＤｓまたはＭｕのごとき転移因子の使用は所望のＤＮＡの組み込みを能動的に促進し、よって、安定に形質転換された細胞の頻度を増加させると考えられる。
【０１８３】
さらに、植物または植物細胞を２以上のベクターで共形質転換することが望まれると考えられる。共形質転換は、マーカーおよび注目するもう１つの遺伝子または複数遺伝子を含有するベクターを用いて達成することができる。別法として、異なるベクター、例えばプラスミドは注目する異なる遺伝子を含有することができ、プラスミドは受容細胞に同時に送達することができる。この方法を用い、マーカーが導入された細胞のあるパーセンテージは注目する他の遺伝子も受け取ったと推定される。かくして、マーカーの手段によって選択されたすべての細胞が、同時に細胞に提示された注目する他の遺伝子を発現するのではなかろう。
【０１８４】
植物細胞を形質転換するのに使用されるベクター、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）および他のＤＮＡセグメントは、もちろん、一般に、細胞に導入することが望まれるｃＤＮＡ、遺伝子または複数遺伝子を含むであろう。これらのＤＮＡ構築物は、さらに、所望であればプロモーター、エンハンサー、ポリリンカーまたは調節遺伝子さえのごとき構造を含むことができる。細胞導入で選択されたＤＮＡセグメントまたは遺伝子は、しばしば、スクリーニング可能なまたは選択可能な特性が得られるごとく得られた組換え体細胞で発現されるであろうおよび／または改良された表現型を再生植物に与えるであろうタンパク質をコードするであろう。しかしながら、これは常には成立せず、本発明は非発現導入遺伝子を組み込むトランスジェニック植物を
も含む。本発明で使用されるベクターと共に含まれるべきであろう好ましい成分は以下のものである。
【０１８５】
（ｉ）制御エレメント
本発明によって作成した構築物は、一般に、トウモロコシまたは他のモンコット（ｍｏｎｃｏｔ）で沈黙する遺伝子を制限するプロモーターを含む。このように、このプロモーターは、移入遺伝子の発現が所望される単子葉植物以外の種から単離される。好ましい構築物は、一般に、Ｃｏｉｘ属から得られるプロモーターを含む。そのプロモーターは、Ｃｏｉｘからデノバで単離されるか、もう一方の選択股としては、既知遺伝子またはプロモーターから得られるデータに基づいて単離しうる。Ｃｏｉｘから得られるプロモーターの単離に特に有用であると思われる既知単子葉植物遺伝子およびプロモーターの例は、特に上でここに記述された。
【０１８６】
プロモーターに加えて、他の型のエレメントは、遺伝子発現を制御できる。そのようなエレメントの１つは、転写開始部位と、未翻訳リーダー配列と称されるコーディング配列の起点との間にあるＤＮＡ配列である。リーダー配列は、遺伝子発現に影響を及ぼすことができ、そしてリーダー配列の複雑化がなされて、最適または最適に近い配列を推定し、そして「共通」で好ましいリーダー配列を作成した（Ｊｏｓｈｉ、１９８７年）。好ましいリーダー配列は、付着遺伝子の最適な発現を指示することが推定される配列を有するものを含むこと、すなわち、ｍＲＮＡの安定性を増大させるか、または維持し、そして翻訳の不適切な開始を防止しうる好ましい共通リーダー配列を含むことが考えられる。このような配列の選択は、本発明に照らしてみれば当業者に知られる。植物、そして特にトウモ
ロコシで非常に発現される遺伝子から由来する配列が最も好ましい。
【０１８７】
転写エンハンサーまたはエンハンサーの複写を使用して、発現を増大させることができるであろう。これらのエンハンサーは、しばしば、５’から真核生物の細胞で機能するプロモーターにおける転写の出発点までに見られるが、しかし、順または逆配向５’または３’からコーディング配列までにしばしば挿入できる。ある種の例では、これらの５’増強エレメントは、イントロンである。エンハンサーの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、オクトピンシンターゼ遺伝子（Ｅｌｌｉｓら、１９８７年）、コメのアクチン１遺伝子、トウコロモシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、トウモロコシのシュランケン１遺伝子から得られるエレメント、および植物でない真核生物（例えば、酵母；Ｍａら、１９８８年）から得られるプロモーターが挙げられる。
【０１８８】
本発明によって使用されることが特に意図されるのは、ｏｃｓエンハンサーエレメントを含むベクターである。このエレメントは、最初、アグロバクテリウムのオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子から得られる１６ｂｐ回文エンハンサーとして同定された（Ｅｌｌｉｓら、１９８７年）が、少なくとも１０個の他のプロモーター中に存在する（Ｂｏｕｃｈｅｚら、１９８９年）。ｏｃｓエレメントのようなエンハンサーエレメント、そして特にそのエレメントの複数のコピーの用途は、単子葉植物の形質転換の状況で使用されるときに隣接プロモーターから得られる転写のレベルを増大させるのに使用しうることが提案される。
【０１８９】
１つ以上の遺伝子を含む大型のＤＮＡ配列の導入が望みうることが考えられる。このような配列の導入は、細菌または酵母の人工染色体（それぞれ、ＢＡＣまたはＹＡＣ）、または植物の人工染色体さえを使用することによって促進されうる。例えば、アグロバクテリウム依存性形質転換のためにＢＡＣを使用することは、Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９９６年）によって開示された。
【０１９０】
最後に、単子葉植物ゲノムへの導入のために最も好ましいＤＮＡセグメントは、所望の特徴（例えば、１エーカー当たりの収量が増加されること）をコードし、そして本発明によって新規プロモーターまたはエンハンサーの制御下で導入される相同な遺伝子または遺伝子ファミリーでありうる。組織特異的制御領域は、この点で特に有用でありうる。実際、本発明の特定の使用が、組織特異的方法で標的にされる移入遺伝子を含む形質転換体を産生させうることが想像される。例えば、昆虫耐性遺伝子は、ヨーロッパ・トウモロコシ穿孔虫（ＥＣＢ）のそれぞれ第１および２の幼虫のための標的である輪生および頸領／葉鞘組織で特異的に発現されうる。同様に、ネクイムシに対して特に活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、根の組織に直接的に標的にされうる。さらに、その穀物の栄養組成に影響を及ぼすある種の遺伝子の発現は、種子、例えば胚乳または胚に標的
とされるに違いない。
【０１９１】
トランスジェニック植物での遺伝子発現の組織特異的ターゲティングに使用するベクターは、一般に、組織特異的プロモーターを含み、そしてエンハンサー配列のような他の組織特異的制御エレメントも含みうる。本発明によるある種の植物組織での特異的または増強発現を指示するプロモーターは、本発明の開示に照らしてみれば当業者に知られる。
【０１９２】
組織特異的発現は、その遺伝子産物が望まれない組織のものにのみ発現されるアンチセンス遺伝子と組合わせて構造的に発現される遺伝子（全組織）を導入することによって機能的に達成されうることも考えられる。例えば、ビー．スリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）から得られる結晶性毒素タンパク質をコードする遺伝子は、構造的プロモーターを使用して、例えばＣｏｉｘから得られるアクチンプロモーターを用いて全組織で発現されるように導入されうる。さらに、１つ以上のプロモーターから得られるエレメントと組合わせるプロモーターが有用でありうることが考えられる。例えば、米国特許番号第５，４９１，２８８号では、カリフラワー・モザイクウイルス・プロモーターをヒストン・プロモーターと組合わせることが開示されている。例えば、ゼイン・プロモーターを用いた、トウモロコシ穀粒中のＢｔ遺伝子のアンチセンス転写物の発現は、種子中のＢｔタンパク質の消費を防止する。したがって、導入された遺伝子によってコードされるタンパク質は、穀粒以外の全ての組織に存在する。
【０１９３】
一方の選択股としては、誰でも、本発明により使用するためのＣｏｉｘから新規組織特異的プロモーター配列を得ることを望みうる。これを達成するために、最初に、関与している組織からｃＤＮＡクローンを単離し、そして例えば、ノーザンブロッティングを用いて、その組織で特異的に発現されるクローンのものを確認しうる。原則的には、誰もが、高いコピー数で存在しないが、その遺伝子産物が、特定の組織で比較的豊富である遺伝子を同定したい。その後、対応するゲノムクローンのプロモーターおよび制御エレメントを、当業者に知られた分子生物学の技術を使用して局在化できる。
【０１９４】
組織特異的プロモーターを同定するための別の有用な方法は、ディファレンシャルディスプレー（例えば、米国特許第５，５９９，６７２号参照、その開示は、全体に参照してここに特に組み込まれる）である。ディファレンシャルディスプレーでは、ｍＲＮＡを、異なる組織型と比較する。特定の組織型のみ、または一組の組織型に存在するｍＲＮＡ種を同定することによって、誰もが、組織特異的手段で、発現される対応の遺伝子を同定することができる。ＲＮＡを、逆転写酵素によって転写して、ｃＤＮＡを産生することができ、そしてそのｃＤＮＡは、順に使用して、全長の遺伝子を含むクローンを単離する。ここで特別に開示されるとおり、ｃＤＮＡも、例えば、抑制ＰＣＲを使用して、それぞれの遺伝子から同質または相同なプロモーター、エンハンサーまたはターミネーターを単離す
るに使用できる。
【０１９５】
トランスジェニック植物中のある種の遺伝子の発現が、特定の条件下でのみ望まれることが意図される。例えば、乾燥のような環境的ストレス因子に対する耐性を供与するある種の遺伝子の発現が、実際のストレス条件下でのみ望まれることが提案される。さらに、植物発生を通してのこのような遺伝子の発現は、有害な影響を示しうることが意図される。その環境に応答する多数の遺伝子が存在することが知られている。例えば、リブロース・ビスホスフェートカルボキシラーゼの小さなサブユニットをコードするｒｂｃＳのようなある種の遺伝子の発現は、フィトクロムを通して指向されるとおり、光によって制御される。他の遺伝子は、二次刺激によって誘導される。例えば、アブシジン酸（ＡＢＡ）の合成は、それに限定されないが、水のストレスを含めた特定の環境因子によって誘導される。多数の遺伝子は、ＡＢＡによって誘導されることが示された（ＳｋｒｉｖｅｒおよびＭｕｎｄｙ、１９９０年）。昆虫捕食に対する耐性を供与する遺伝子の発現は、実際の昆虫侵入の条件下でのみ望まれることも予想される。したがって、ある種の所望の特徴については、トランスジェニック植物での遺伝子の誘導できる発現が望まれる。
【０１９６】
本発明のある種の具体例では、トランスジェニック植物中の遺伝子の発現は、植物の発生の間の特定の時期にのみ望まれることが提案される。発生のちょうどよい時期は、頻繁に、組織特異的遺伝子の発現と相互に関係がある。例えば、ゼイン保存タンパク質の発現は、受精の約１０日後、胚乳で開始される。
【０１９７】
ＤＮＡそれ自身を細胞内で標的にするのに有用でありうることも考えられる。例えば、これが、形質転換の頻度を増加する可能性がある場合、導入されたＤＮＡを核に標的にさせることが有用でありうる。核それ自身の内で、部位特異的組み込みを達成するために遺伝子を標的にするのに有用である。例えば、形質転換を通して導入された遺伝子が細胞中に存在する遺伝子に取って代わらせるのに有用である。
【０１９８】
（ｉｉ）ターミネーター
構築物は、一般に、転写を終止させるシグナルとして作用する３’末端ＤＮＡ配列と一緒に目的の遺伝子を含み、そして結果物であるｍＲＮＡのポリアデニル化に対処する。最も好ましい３’エレメントは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ｎｏｓ３’末端）（Ｂｅｖａｎら、１９８３年）のノパリンシンターゼ遺伝子から得られるもの、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子から得られるＴ７転写物のためのターミネーター、およびジャガイモまたはトマトから得られるプロテアーゼ阻害剤ＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端であることが意図される。ＡｄｈイントロンＩ（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７年）のような制御エレメント、ショ糖シンターゼイントロン（Ｖａｓｉｌら、１９８９年）またはＴＭＶオメガ・エレメント（Ｇａｌｌｉｅら、１９８９年）は、さらに、所望される場合に含まれる。一方の選択股としては、ターミネーターは、プロモーター配列について上で記述されるとおり、本発明によりＣｏｉｘから単離することができる。
【０１９９】
特に好ましいターミネーターは、Ｃｏｉｘから単離されたものである。例えば、ガンマ・コイクシン・ターミネーターおよびＣｏｉｘのオレオシン３ターミネーターである。これらのターミネーターのクローニングは、例２および例３に以下で記述される。ガンマ・コイクシンおよびオレオシン３ターミネーターの核酸配列は、例えば、それぞれ、配列番号１１および配列番号１７に示される。
【０２００】
（ｉｉｉ）輸送またはシグナルペプチド
最初の翻訳産物から後期翻訳で除去され、そして細胞内膜への、または細胞外膜を通してのタンパク質の輸送を促進する、耐性遺伝子のコーディング配列に結合される配列は、輸送（通常、液胞、小胞、色素体および他の細胞内オルガネラへの）およびシグナル配列（通常、小胞体、ゴルジ体に、および細胞膜の外側に）と称される。細胞の内側および外側の区分へのタンパク質の輸送を促進させることによって、これらの配列は、それらをタンパク質分解性分解から保護する遺伝子産物の蓄積を増加しうる。これらの配列は、その遺伝子のコーディング配列に付着されるべき非常に発現された遺伝子から得られる別のｍＲＮＡ配列に対処しうる。リボソームによって翻訳されるべきｍＲＮＡは、裸のｍＲＮＡよりいっそう安定であるので、遺伝子の正面にある翻訳可能なｍＲＮＡの存在が、その遺
伝子から得られるｍＲＮＡ転写物の全体の安定性を増大させ、それによって、その遺伝子の産物の合成を増加させうる。輸送およびシグナル配列は、通常、後期翻訳で当初の翻訳産物から除去されるので、これらの配列の使用は、最終ポリペプチドに現れ得ない余分の翻訳配列の付加に対処する。特定のタンパク質のターゲティングは、そのタンパク質の安定性を増強するために望みうることがさらに意図される（米国特許番号第５，５４５，８１８号、全体に参照してここに組み込れる）。
【０２０１】
さらに、ベクターは、トランスジェニック植物の細胞内の特定の遺伝子産物の細胞内ターゲティングで、または細胞外環境にタンパク質を指示するときに構築され、そして使用されうる。これは、一般に、輸送またはシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を、特定の遺伝子のコーディング配列に繋げることによって達成される。結果物の輸送またはシグナルペプチドは、そのタンパク質を、それぞれ特定の細胞内または細胞外目的地に輸送し、そしてその後、後期翻訳で除去される。
【０２０２】
このような使用の特定の例は、突然変異体ＥＰＳＰＳタンパク質のような、細胞質に対するよりもむしろ葉緑体のような特定のオルガネラに除草剤耐性を供与するタンパク質を指示することに関する。これは、ｒｂｃＳ輸送ペプチド、米国特許番号第５，７２８，９２５号に記述される葉緑体輸送ペプチド、またはタンパク質の色素体特異的ターゲティングを供与する米国特許番号第５，５１０，４７１号に記述される最適化輸送ペプチドの使用によって例示される。さらに、ミトコンドリアに対する雄の不稔性の原因である特定の遺伝子を標的にするか、または細胞外空間に対する植物性病原性生物に対する耐性についてのある種の遺伝子を標的にするか、または液胞に対するタンパク質を標的にすることが望みうる。別の使用法は、アミノ酸生合成または色素体に対する油合成に関与した酵素の指示に関する。このような酵素としては、飼料中のリシン含量を増加することに寄与しうるジヒドロジピコリン酸シンターゼが挙げられる。
【０２０３】
（ｉｖ）マーカー遺伝子
形質転換体を同定する能力を改善するために、目的の発現性遺伝子として、またはそれに加えて、選択可能であるか、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用することができる。「マーカー遺伝子」は、マーカー遺伝子を発現する細胞に異なる表現型を与え、そしてその結果、このような形質転換細胞に、マーカーを有しない細胞から区別させる遺伝子である。このような遺伝子は、マーカーが、化学的手段により、すなわち選択剤（例えば、除草剤、抗生物質、または同等物）の使用を通して「選択」できる特性を付与するかどうか、あるいは、それが、単に、観察または試験を通して、すなわち「スクリーニング」（例えば、緑色蛍光タンパク質）によって同定できる特徴であるかどうかによって、選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカーのいずれかをコードする。もちろ
ん、適切なマーカー遺伝子の多くの例は、当業界で公知であり、そして本発明の実施に使用できる。
【０２０４】
語句選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に含まれるのは、その分泌が、形質転換細胞を同定または選択する手段として検出されうる「分泌可能なマーカー」をコードする遺伝子でもある。例としては、抗体相互作用によって同定できる分泌可能な抗原をコードするマーカー、またはそれらの触媒活性によって検出できる分泌可能な酵素さえも挙げられる。分泌可能なタンパク質は、例えばＥＬＩＳＡによって検出可能な小型の拡散性タンパク質、細胞外溶液（例えば、α−アミラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ）中で検出可能な小型の活性酵素、および細胞壁に挿入されるか、捕捉されるタンパク質（例えば、エクステンシンまたはタバコＰＲ−Ｓの発現単位に見られるもののようなリーダー配列を含むタンパク質）を含めた多数のクラスに入る。
【０２０５】
選択可能な分泌性マーカーに関して、細胞壁に隔離されるタンパク質をコードする遺伝子の使用、およびどのタンパク質が、特徴的なエピトープを含むかが、特に有利であると考えられる。このような分泌抗原マーカーは、理論的に、十分な発現を与え、そして原形質膜を越えてターゲティングし、そして細胞壁に結合され、そしてまだ抗体に接続可能なタンパク質を産生するプロモーター−リーダー配列である、植物組織中に低いバックグランドを供するエピトープ配列を使用する。正常に分泌された壁タンパク質は、全てのこのような要求を満足する特徴的なエピトープを含むように修飾した。
【０２０６】
この方法での修飾に適切なタンパク質の１つの例は、エクステンシン、あるいはヒドロキシプロリン富糖タンパク質（ＨＰＲＧ）である。この分子が分子生物学、発現およびタンパク質構造の点で十分に特徴づけられるとき、トウモロコシＨＰＲＧ（Ｓｔｅｉｆｅｌら、１９９０年）の使用が好ましい。しかし、様々のエクステンシンおよび／またはグリシン富壁タンパク質（Ｋｅｌｌｅｒら、１９８９年）のいずれか１つは、抗原部位を追加することによって修飾して、スクリーニング可能なマーカーを作ることができる。
【０２０７】
分泌性のスクリーニング可能なマーカーの１つの例示の具体例は、ネズミのインターロイキン−１−β（ＩＬ−１−β）の後部領域から得られる１５個の残渣エピトープを含むように修飾された、壁タンパク質ＨＰＲＧをコードするトウモロコシ配列の使用に関する。しかし、当業者に知られる非常に広範で多様な抗原：抗体の組合せから選択されるとおり、実質的に任意で検出可能なエピトープを、そのような具体例に使用することができる。その後、ＩＬ−１βまたは任意の他のタンパク質またはエピトープ物質から誘導されようと、特徴的な細胞外エピトープを、色素原または蛍光補助剤と結合して標識する抗体を使用して、直線的に検出することができる。
【０２０８】
１．選択可能なマーカー
多くの選択可能なマーカー遺伝子は、それに限定されないが、カナマイシン耐性をコードし、そしてカナマイシン、Ｇ４１８、パロモマイシン等を使用するために選択されうるｎｅｏ遺伝子（Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、１９８５年）、ビアラホス耐性を供与するｂａｒ遺伝子、グリホスフェート耐性を供与する突然変異体ＥＰＳＰシンターゼタンパク質（Ｈｉｎｃｈｅｅら、１９８８年）、ブロモキシニルに対する耐性を供与するクレブシエラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｚａｅｎａｅ）から得られるｂｘｎのようなニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８８年）、イミダソリノン、スルホニルウレアまたは他のＡＬＳ阻害化学物質に対する耐性を供与する突然変異体アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許出願番号第１５４，２０４号、１９８５年）、除草剤ダラポンに対する耐性を供与するダラポン・デヒドロゲナーゼ遺伝子であるメトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔら、１９８８年）、または５−メチル・トリプトファンに対する耐性を供与する突然変異アントラニレートシンターゼ遺伝子を含めて、本発明に関連して使用することができる。突然変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子が使用される場合、別の利益が、適切な葉緑素輸送ペプチド、ＣＴＰ（米国特許第５，１８８，６４２号）またはＯＴＰ（米国特許第５，６３３，４４８号）の組み込みおよび修飾トウモロコシＥＰＳＰＳ遺伝子（ＰＣＴ出願ＷＯ９７／０４１０３）の使用を通して認識されうる。
【０２０９】
形質転換体を選択するシステムで使用される能力のある選択可能なマーカー遺伝子の例示的具体例は、ステレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）から得られるｂａｒ遺伝子、またはストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）から得られるｐａｔ遺伝子のような酵素ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。酵素ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、除草剤ビアラホス、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）中の活性成分を不活化する。ＰＰＴは、アンモニアの迅速な蓄積と細胞死を起すグルタミンシンターゼを阻害する（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９８６年；Ｔｗｅｌｌら、１９８９年）。
【０２１０】
本発明の実施にビアラホス耐性遺伝子を使用することを望む場合、発明者は、この目的のために特に有用な遺伝子が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、ＡＴＣＣ番号第２１，７０５号）の種から得られるｂａｒまたはｐａｔ遺伝子であることを知見した。ｂａｒ遺伝子のクローニングは、植物の状況でｂａｒ遺伝子の使用を示す（ＤｅＢｌｏｃｋら、１９８７年；ＤｅＢｌｏｃｋら、１９８９年；米国特許番号第５，５５０，３１８号）とおり記述された（Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９８６年；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８７年）。
【０２１１】
２．スクリーニング可能なマーカー
使用しうるスクリーニング可能なマーカーとしては、様々な色素原基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）、植物組織中のアントシアニン色素（赤色）の産生を制御する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、１９８８年）、種々の色素原基質が知られる酵素（例えば、ＰＡＤＡＣ、色素原セファロスポリン）をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９７８年）、色素原カテコールを変換できるカテコール・ジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Ｚｕｋｏｗｓｋｙら、１９８３年）、α−アミラーゼ遺伝子（Ｉｋｕｔａら、１９９０年）、チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化させ、順に凝集して簡単に検出できる化合物メラニンを形成する能力のある酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Ｋａｔｚら、１９８３年）、色素原基質がある酵素をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、バイオルミネッセンス検出に対処するルシフェラーゼ（ｌｕｘ）遺伝子（Ｏｗら、１９８６年）、カルシウム感受性バイオルミネッセンス検出に使用しうるエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒら、１９８５年）、または緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（Ｓｈｅｅｎら、１９９５年；Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７年；Ｒｅｉｃｈｅｌら、１９９６年；Ｔｉａｎら、１９９７年；ＷＯ９７／４１２２８）が挙げられる。
【０２１２】
トウモロコシＲ遺伝子複合体から得られる遺伝子は、スクリーニング可能なマーカーとして特に有用であると考えられる。トウモロコシ中のＲ遺伝子複合体は、ほとんどの種子および植物組織中でアントシアニン色素の産生を制御するために作用するタンパク質をコードする。トウモロコシ株は、発生および組織特異的手段で組合わせて色素化を制御する１つ、または４つと同じくらい多くのＲ対立遺伝子を有しうる。したがって、このような細胞に導入されたＲ遺伝子は、赤色色素の発現を引起し、そして安定に組み込れた場合、赤色セクターとして可視的に記録されうる。トウモロコシラインが、アントシアニン生合成経路（Ｃ２、Ａ１、Ａ２、ＢｚｌおよびＢｚ２）での酵素的中間体をコードする遺伝子についての優性な対立遺伝子を担持するが、Ｒ遺伝子座に劣性対立遺伝子を担持する場合、Ｒを有するそのラインから得られる任意の細胞の形質転換は、赤色色素形成を生じる。例示のラインとしては、ｒｇ−スタドラー対立遺伝子およびＴＲ１１２を含むウイスコンシン２２；ｒ−ｇ、ｂ、Ｐ１であるＫ５５誘導体が挙げられる。一方、Ｃ１およびＲ対立遺伝子が一緒に導入されるときには、任意の遺伝子型のトウモロコシを利用できる。
【０２１３】
Ｒ遺伝子制御領域は、キメラ遺伝子の発現を制御する機構を提供するために、キメラ構築物に使用できることがさらに提案される。さらに多様な遺伝子型発現は、他のいかなる遺伝子座でよりＲ遺伝子座で知られている（Ｃｏｅら、１９８８年）。領域５’から構造的Ｒ遺伝子までに得られる制御領域が、例えば、昆虫耐性、除草剤寛容性または他のタンパク質コーディング領域のための遺伝子の発現を指示する上で価値があることが考えられる。本発明の目的のために、種々のＲ遺伝子ファミリー構成員の内のいずれかが、うまく使用しうる（例えば、Ｐ、Ｓ、Ｌｃら）と思われる。しかし、最も好ましくは、一般に、Ｓｎ（特に、Ｓｎ：ｂｏｌ３）である。Ｓｎは、Ｒ遺伝子複合体の主要な構成員であり、そしてＳｎが、特定の苗木および植物細胞中でのアントシアニン色素の組織特異的沈着を
制御し、したがって、その遺伝子型がＲに類似する点で、ＲおよびＢ遺伝子座に機能的に類似する。
【０２１４】
本発明に使用することが意図される別のスクリーニング可能なマーカーは、Ｌｕｘ遺伝子によってコードされるホタル・ルシフェラーゼである。形質転換細胞中のｌｕｘ遺伝子の存在は、例えばＸ線フィルム、シンチレーション計数、蛍光分光光度計、低照度ビデオカメラ、光子計数カメラまたは多重ウエルのルミノメトリーを用いて検出できる。このシステムは、組織培養プレート上のような、バイオルミネセンスのための集団スクリーニングのため、または全植物のスクリーニングのためにさえ開発されうることも想像される。緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、特に有用なレポーターと考えられる（Ｓｈｅｅｎら、１９９５年；Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７年；Ｒｅｉｃｈｅｌら、１９９６年；Ｔｉａｎら、１９９７年；ＷＯ９７／４１２２８）。緑色蛍光タンパク質の発現は、特定の波長の光による発光に続く蛍光として、細胞または植物で可視化されうる。
【０２１５】
（ｖ）単子葉植物の修飾のための移入遺伝子
本発明の特に重要な利点は、それが、マーカー遺伝子に加えて、またはそれ以外に遺伝子の植物細胞中での十分な発現のための方法および組成物を提供することである。このような移入遺伝子は、しばしば、特定のタンパク質またはポリペプチド産物の発現を指示する遺伝子であるが、しかしそれらは、非発現性ＤＮＡセグメント、例えば、それら自身の転位を指示しないＤｓのようなトランスポゾンでもありうる。ここで使用される場合、「発現性遺伝子」は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）に転写されるか、または目的の特徴または同等物として発現されるタンパク質に翻訳される能力があり、そして選択可能で、スクリーニング可能な、または非選択性マーカー遺伝子に限定されない任意の遺伝子である。本発明は、必然的にマーカー遺伝子でない発現性遺伝子が、マーカー遺伝子と組合わせて両方使用される場合、形質転換のための同じか、または異なるＤＮＡセグメントのいずれかで別々の遺伝子を使用しうる。後者の場合、異なるベクターは、享受細胞に共存して送出されて、同時形質転換を最大限にさせる。
【０２１６】
享受細胞に送出されるべき特定のＤＮＡセグメントの選択は、しばしば、形質転換の目的に依る。作物植物の形質転換の主要な目的の内の１つは、植物にある種の市販で所望しうる耕種学的に重要な特徴を付加させることである。このような特徴としては、それに限定されないが、除草剤耐性または寛容性、昆虫耐性または寛容性、疾病耐性または寛容性（ウイルス、細菌、真菌、線虫）、乾燥、加熱、冷却、凍結、過剰湿度、塩ストレスに対する耐性または寛容性によって例示される場合のストレス寛容性および／または耐性、酸化的ストレス、収量が増加されること、食物含量および組成、物理的外観、雄の不稔性、ドライダウン、防御能力、多作性、澱粉の量および品質、油の量および品質、タンパク質の品質および量、アミノ酸の組成等が挙げられる。例えば、遺伝子または除草剤耐性をコ
ードする遺伝子のような任意のこのような所望しうる特徴または複数の特徴を供与する１つまたはそれ以上の遺伝子を組み込むことを所望しうる。
【０２１７】
ある種の具体例では、本発明は、１つ以上の外因性遺伝子を用いた享受細胞の形質転換を意図する。ここで使用される場合、「外因性遺伝子」は、同じ状況で宿主ゲノム中で正常に見られない遺伝子である。これにより、遺伝子が、宿主ゲノムのものと異なる種から単離されるか、または一方の選択股としては、宿主ゲノムから単離されるが、未改変の生来の遺伝子で見られるものと異なる１つまたはそれ以上の制御領域に操作可能に結合されうることが意図される。２つまたはそれ以上の外因性遺伝子は、異なる移入遺伝子をコードするベクターを使用するか、または２つまたはそれ以上の遺伝子コーディング配列を組み込む単独ベクターを使用するかいずれかで、単独形質転換の事象に供給されることもできる。例えば、一点に向かうか、分出するか、または同一線の配向のいずれかでｂａｒお
よびａｒｏＡ発現単位を担持するプラスミドは、特に有用であると考えられる。さらに好ましい組合せは、ｐｉｎＩＩのようなプロテアーゼ阻害剤遺伝子と一緒にＢｔ遺伝子のような昆虫耐性遺伝子のもの、または上記遺伝子のいずれかと組合わせたｂａｒの使用である。もちろん、除草剤、昆虫、疾病（ウイルス、細菌、真菌、線虫）または乾燥耐性、雄の不稔性、ドライダウン、防御能力、多作性、澱粉の特性、油の量および品質を供与するもの、または収量または栄養的品質を増大させるもののような任意の種類の任意の２つまたはそれ以上の移入遺伝子を、所望の場合、使用しうる。
【０２１８】
１．除草剤耐性
ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒおよびｐａｔ）をコードする遺伝子、グリホセート寛容性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、グリホセートオキシドレダクターゼをコードするグリホセート分解性酵素遺伝子ｇｏｘ、ｄｅｈ（ダラポンを不活性化するデハロゲナーゼ酵素をコードする）、除草剤耐性（例えば、スルホニルウレアおよびイミダゾリノン）アセトラクテートシンターゼ、およびｂｘｎ遺伝子（ブロモキシニルを分解するニトリラーゼ酵素をコードする）は、形質転換に使用するための除草剤耐性遺伝子の優れた例である。ｂａｒおよびｐａｔ遺伝子は、除草剤ホスフィノトリシンを不活性化し、そしてこの化合物が、グルタミンシンターゼ酵素を阻害するのを防止する酵素ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードする。酵素５−エノー
ルピルビルシキメート・３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）は、除草剤Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン（グリホセート）によって正常に阻害される。しかし、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵素をコードする遺伝子が知られている。これらの遺伝子は、特に、単子葉植物の形質転換に使用されると考えられる。ｄｅｈ遺伝子は、酵素ダラポン・デヒドロゲナーゼをコードし、そして除草剤ダラポンに対する耐性を供与する。ｂｘｎ遺伝子は、ブロモキシニルを非除草剤性の分解産物に変換する特異的ニトリラーゼ酵素をコードする。
【０２１９】
２．昆虫耐性
導入されうる強力な昆虫耐性遺伝子としては、バシルス・ツリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶性毒素遺伝子またはＢｔ遺伝子（Ｗａｔｒｕｄら、１９８５年）が挙げられる。Ｂｔ遺伝子は、欧州トウモロコシ穿孔虫（ＥＣＢ）のような鱗翅目または甲虫目の害虫に対する耐性を供しうる。このような具体例に使用するための好ましいＢｔ毒素遺伝子としては、ＣｒｙＩＡ（ｂ）およびＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子が挙げられる。昆虫の成長または発生に影響を及ぼすビー．ツリンジエンシスの他の種から得られる内毒素遺伝子も、この観点で使用されうる。
【０２２０】
ここに開示される形質転換プロトコールに使用するための好ましいＢｔ遺伝子は、コーディング配列が、植物、そしてさらに特にはトウモロコシで発現が増大される効果を示すように修飾されたものであることが考えられる。合成遺伝子を作成する手段は、当業界でよく知られ、そして例えば、米国特許第５，５００，３６５号および米国特許番号第５，６８９，０５２号に開示され、その開示の各々は、全体に参照してここに特別に組み込れる。このような修飾Ｂｔ毒素遺伝子の例としては、合成ＢｔＣｒｙＩＡ（ｂ）遺伝子（Ｐｅｒｌａｋら、１９９１年）、および１８００ｂ（ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８）と称される合成ＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子が挙げられる。当業者に知られる他のＢｔ毒素遺伝子のいくつかの例は、以下に表３で示される。
【０２２１】
【表３】
2011101653.tif 000010
2011101653.tif 000011
【０２２２】
プロテアーゼ阻害剤は、昆虫耐性（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８９年）をも提供でき、したがって、植物の形質転換で利用性を示す。トマトまたはジャガイモから得られるプロテアーゼ阻害剤ＩＩ遺伝子ｐｉｎＩＩの使用は、特に有用であると予想される。いっそう有益なのは、Ｂｔ毒素遺伝子と組合せてｐｉｎＩＩ遺伝子を使用することであり、その組合せ効果は、相互作用の殺虫剤活性を生じることが知見された。昆虫の消化系の阻害剤をコードする他の遺伝子、または阻害剤の産生を促進する酵素またはコファクターをコードするものも、有用でありうる。この群は、小麦および大麦から得られるもののようなオリザシスタチンおよびアミラーゼ阻害剤によって例示できる。
【０２２３】
さらに、レクチンをコードする遺伝子は、別の、または選択的殺虫剤特性を供与しうる。レクチン（元々、植物性血球凝集素と称される）は、広範な種から得られる赤血球細胞を凝集する能力を有する多価炭水化物結合タンパク質である。レクチンは、ゾウムシ、ＥＣＢおよびネクイムシに対する活性を有する殺虫剤として最近確認された（Ｍｕｒｄｏｃｋら、１９９０年；ＣｚａｐｌａおよびＬａｎｇ、１９９０年）。有用であると考えられるレクチン遺伝子としては、例えば、大麦および小麦細菌性アグルチニン（ＷＧＡ）およびイネのレクチン（Ｇａｔｅｈｏｕｓｅら、１９８４年）が挙げられ、ＷＧＡが好まれる。
【０２２４】
害虫に導入されるときに、細菌溶解ペプチド、ペプチドホルモンおよび毒素および毒液のような、昆虫に対する大型または小型のポリペプチド活性の産生を制御する遺伝子は、本発明の別の態様を形成する。例えば、特別な害虫に指示される幼弱ホルモンエステラーゼの発現は、殺虫剤活性も生じうるか、またはおそらく変態の中止を引起すことが考えられる（Ｈａｍｍｏｃｋら、１９９０年）。
【０２２５】
完全な状態の昆虫表皮に影響を及ぼす酵素をコードする遺伝子を発現するトランスジェニック・トウモロコシは、本発明のさらに別の態様を形成する。このような遺伝子としては、例えば、キチナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼをコードするもの、および、キチン合成を阻害する化合物である、ニッコマイシンの産生のための遺伝子も挙げられ、そのうちのいずれかの導入は、昆虫耐性トウモロコシ植物を生成すると考えられる。エクジステロイドＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼの産生に影響を及ぼすもののような、昆虫脱皮に影響を及ぼす活性をコードする遺伝子も、本発明の有用な移入遺伝子の範囲に入る。
【０２２６】
害虫に対する宿主植物の栄養的品質を減じる化合物の産生を促進する酵素をコードする遺伝子も、本発明に包含される。例えば、そのステロール組成を変えることによって植物における殺虫活性を付与することが可能でありうる。ステロールは、それらの食餌から昆虫によって獲得され、そしてホルモン合成および膜安定性のために使用される。したがって、新規遺伝子、例えば歓迎されないステロールの産生を直接的に促進するもの、または所望のステロールを歓迎されない形態に変換するものの発現による植物ステロール組成物での変化は、昆虫成長および／または発生における負の効果を示し、したがって、その植物に殺虫剤活性を授けることができた。リポキシゲナーゼは、昆虫における抗栄養効果を示し、そしてそれらの食餌の栄養品質を減じることが示された天然に生じる植物酵素であ
る。したがって、本発明の別の具体例は、昆虫給餌に耐性のありうるリポキシゲナーゼ活性が増加していることを示すトランスジェニック植物に関する。
【０２２７】
トリプサクム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍ  ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ）は、トウモロコシのネクイムシを含めたある種の昆虫に耐性のあるイネ科草木の１種である。昆虫に対して毒性があるか、または昆虫に毒性のある化合物の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、トリプサクムから単離されること、そしてこれらの新規遺伝子が、昆虫に対する耐性を付与する上で有用であることが予想される。上の耐性が、性的交雑を介してジア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）に移行されたので、トリプサクムにおける昆虫耐性の根拠が、遺伝的であることが知られている（ＢｒａｎｓｏｎおよびＧｕｓｓ、１９７２年）。他の穀物、単子葉植物または双子葉植物種が、昆虫耐性のあるトウモロコシ植物を生産するのに有用である、昆虫に対する毒性のあるタンパク質をコードする遺伝
子を有することが、さらに予想される。
【０２２８】
強力な殺虫剤活性を示すと特徴づけられるタンパク質をコードする別の遺伝子も、この方法にしたがって移入遺伝子として使用されうる。このような遺伝子としては、例えば、ネクイムシ妨害物として使用されうるササゲ豆トリプシン阻害剤（ＣｐＴＩ；Ｈｉｌｄｅｒら、１９８７年）；トウモロコシのネクイムシ妨害物として特に有用であることが立証されうるアベルメクチンをコードする遺伝子（アベルメクチンおよびアバメクチン、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｗ．Ｃ．編、１９８９年；Ｉｋｅｄａら、１９８７年）；タンパク質遺伝子を不活性化するリボソーム、および植物構造を制御する遺伝子さえが挙げられる。抗昆虫抗体遺伝子および植物の外側に塗布される毒性のない殺虫剤（後殺虫剤）を、植物内で殺虫剤に変換できる酵素をコードする遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシも考
えられる。
【０２２９】
３．環境およびストレス耐性
それに限定されないが、乾燥、過剰の湿度、冷却、凍結、高温、塩および酸化的ストレスのような様々の環境ストレスに寛容であるトウモロコシの能力を改善することも、新規遺伝子の発現を通して影響される可能性がある。利益は、ウインター・フランダー（Ｃｕｔｌｅｒら、１９８９年）のもの、またはその合成遺伝子誘導体のような「抗凍結」タンパク質の導入を通して凍結温度に対する耐性が増大する点で認識しうることが提案される。冷却寛容性が改善されることも、葉緑素中のグリセロール−３−ホスフェート・アセチルトランスフェラーゼの発現が増大することを通して供与されうる（Ｗｏｌｔｅｒら、１９９２年）。酸化的ストレスに対する耐性（高い照度と組合せた冷却温度のような条件によってしばしば悪化させられる）は、スーパーオキシド・ジスムターゼの発現によって供与することができ（Ｇｕｐｔａら、１９９３年）、そしてクルタチオンレダクターゼによって改善することができる（Ｂｏｗｌｅｒら、１９９２年）。このような攻略法は、初期の相対的成熟ゾーンに対する多様性を非常に生じる後期成熟を伸長すること同様に、新たに発生した分野で凍結することに対する寛容性に対処しうる。
【０２３０】
植物の水含量、総水ポテンシャル、浸透ポテンシャル、および膨圧を有利に達成する新規遺伝子の発現が、乾燥に耐える植物の能力を増強することが考えられる。ここに使用される場合、語句「乾燥耐性」および「乾燥寛容性」は、正常な環境に比較するとき、水の利用性における減少によって誘導されるストレスに対する植物増加耐性または寛容性、および低い水環境で機能および生存する植物の能力に当てはまるときに使用される。本発明のこの態様では、例えば、ポリオール化合物のような浸透的に活性な溶質の生合成をコードする遺伝子の発現が、乾燥に対する保護を与えうることが提案される。このクラス内には、マンニトール−Ｌ−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（ＬｅｅおよびＳａｉｅｒ、１９８２年）およびトレハロース−６−ホスフェートシンターゼ（Ｋａａｓｅｎら、１９９２年）をコードする遺伝子がある。細胞中の生来のホスファターゼの連続作用を
通して、または特定のホスファターゼの導入および同時発現によって、この導入遺伝子は、それぞれ、マンニトールまたはトレハロースのいずれかの蓄積を生じ、その両方は、ストレスの影響を軽減することのできる保護的化合物として立証されている。トランスジェニック・タバコにおけるマンニトール蓄積は、承認され、そして予備結果では、高いレベルのこの代謝産物を発現する植物が、使用された浸透ストレスに耐えることができることが示される（Ｔａｒｃｚｙｎｓｋｉら、１９９２年、１９９３年）。
【０２３１】
同様に、酵素機能（例えば、アラノピンまたはプロピオン酸）または膜の完全な状態（例えば、アラノピン）のいずれかを保護する上で他の代謝産物の効力が立証され（Ｌｏｏｍｉｓら、１９８９年）、したがって、これらの化合物の生合成をコードする遺伝子の発現は、マンニトールに類似するか、または賛辞する方法で乾燥耐性を供与しうる。乾燥および／または乾燥保存の間に浸透的に活性である、および／またはある程度の直接的保護効果を供する天然に生じる代謝産物の他の例は、フルクトース、エリスリトール（Ｃｏｘｓｏｎら、１９９２年）、ソルビトール、デュルシトール（Ｋａｒｓｔｅｎら、１９９２年）、グルコシルグリセロール（Ｒｅｅｄら、１９８４年；ＥｒｄＭａｎｎら、１９９２年）、ショ糖、スタキオース（ＫｏｓｔｅｒおよびＬｅｏｐｏｌｄ、１９８８年；Ｂｌａｃｋｍａｎら、１９９２年）、ラフィノース（Ｂｅｒｎａｌ−ＬｕｇｏおよびＬｅｏｐｏｌｄ、１９９２年）、プロリン（Ｒｅｎｓｂｕｒｇら、１９９３年）、グリシンベタイン、オノニトールおよびピニトール（ＶｅｒｎｏｎおよびＢｏｈ
ｎｅｒｔ、１９９２年）が挙げられる。ストレスの間じゅう天蓋の成長が継続すること、および生殖適合が増大することは、上で検討された浸透的に活性な化合物および他のこのような化合物を制御するもののような遺伝子の導入および発現によって増大される。浸透的に活性なポリオール化合物の合成を促進する最近好まれる遺伝子は、酵素マンニトールホスフェート・デヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−ホスフェート・シンターゼおよびミオイノシトール０−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。
【０２３２】
特定のタンパク質の発現が、乾燥寛容性をも増大しうることが考えられる。後期胚形成のタンパク質の３つのクラスは、構造的類似性に基づいて割当てられた（Ｄｕｒｅら、１９８９年参照）。全ての３つのクラスのＬＥＡは、種子を成熟させる（すなわち乾燥保存する）上で示された。これらの３つの型のＬＥＡタンパク質の内、ＩＩ型（デヒドリン型）は、一般に、栄養植物部分での乾燥および／または乾燥保存の寛容性に関与していた（すなわち、ＭｕｎｄｙおよびＣｈｕａ、１９８８年；Ｐｉａｔｋｏｗｓｋｉら、１９９０年；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、１９９２年）。最近、タバコでのＩＩＩ型ＬＥＡ（ＨＶＡ−１）の発現は、植物の高さ、成熟度および乾燥寛容性に影響することが分かった（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ、１９９３年）。イネでは、ＨＶＡ−１遺伝子の発現は、水欠損および塩分に対する寛容性に影響した（Ｘｕら、１９９６年）。
したがって、全ての３つのＬＥＡ群から得られる構造的遺伝子の発現は、乾燥寛容性を供与しうる。水ストレスの間じゅう誘導される他の型のタンパク質としては、チオールプロテアーゼ、アルドラーゼ、および乾燥ストレスの間じゅう種々の保護的および／または修復型の機能を供与しうる膜間輸送媒体（Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、１９９０年）が挙げられる。脂質生合成に影響する遺伝子も考えられ、したがって、膜組成物も、植物に乾燥耐性を供与する上で有用でありうる。
【０２３３】
乾燥耐性を改善するための多くのこれらの遺伝子は、相補的態様の作用を示す。したがって、これらの遺伝子の組合せは、トウモロコシでの乾燥耐性を改善する上で付加的および／または相互作用的効果を示しうることが予想される。多くのこれらの遺伝子は、凍結寛容性（または耐性）も改善する。凍結および乾燥の間じゅう受ける物理的ストレスは、自然に類似性があり、そして類似の形態で軽減されうる。これらの遺伝子の構造的発現を介して利益が供与されうるが、これらの新規遺伝子を発現する好ましい方法は、膨圧誘導プロモーター（参照してここに組み込れるＧｕｅｒｒｅｒｏら、１９９０年およびＳｈａｇａｎら、１９９３に記述された膨圧誘導遺伝子のためのプロモーターのような）を使用することであると考えうる。これらの遺伝子の空間的および時間的発現は、トウモロコシがストレスによく耐えさせることができる。
【０２３４】
乾燥土壌からの水抽出物が増加することに対処する特定の形態上の特徴に関与する遺伝子の発現が、有益なものであることが提案される。例えば、根の特徴を変化させる遺伝子の導入および発現は、水取込みを増強しうる。ストレスの間じゅう生殖適合を増強する遺伝子の発現が、非常に価値があるものであることも考えられる。例えば、花粉の杼口の同調性およびメスの花の部分の生殖性、すなわち、トウモロコシの毛を改善する遺伝子の発現は、有益なものである。さらに、ストレスの間じゅう穀粒の発育不全を最小限にする遺伝子の発現は、収穫されるべき穀物の量を増加させ、したがって、価値があるものであることが提案される。
【０２３５】
収量を測定する上で水の全体の役割が示される場合、新規遺伝子の導入および発現を通して、トウモロコシがいっそう効果的に水を利用する能力を与えることは、土壌の水利用性が制限されない場合でさえ全体の成果を改善することが考えられる。水利用性に関する全範囲のストレスを越えてトウモロコシが水の使用を最大限にする能力を改善する遺伝子を導入することによって、収量安定性または収量成果の一貫性を認識できる。
【０２３６】
４．疾病耐性
疾病に対する耐性が増大することが、トウモロコシのような単子葉植物への遺伝子の導入を通して認識されうることが提案される。ウイルス、細菌、真菌および線虫によって起される疾病に対する耐性を生じることが可能である。マイコトキシン産生生物の制御が、導入遺伝子の発現を通して認識されうることも考えられる。
【０２３７】
ウイルスに対する耐性は、新規遺伝子の発現を通して生じうる。例えば、トランスジェニック植物でのウイルス被覆タンパク質の発現は、そのウイルスおよびおそらく他の密接に関連したウイルスによる植物の感染に対する耐性を与えることができることが例示された（Ｃｕｏｚｚｏら、１９８８年、Ｈｅｍｅｎｗａｙら、１９８８年、Ａｂｅｌら、１９８６年）。必須のウイルス機能で標的にされるアンチセンス遺伝子の発現が、上記ウイルスに対する耐性を与えることが考えられる。例えば、ウイルス核酸の複製の原因である遺伝子で標的にされるアンチセンス遺伝子は、複製を阻害し、そしてウイルスに対する耐性に至る可能性がある。アンチセンス遺伝子の使用を通して他のウイルス機能での干渉も、ウイルスに対する耐性が増大しうると思われる。さらに、限定されないが、サテライトウイルスの使用を含めた他のアプローチ法を介してウイルスに対する耐性を達成することが可能でありうることが提案される。本発明によるトランスジェニック植物に耐性を導入することができたウイルスおよびウイルス様疾病の例は、表４で以下に列挙される。
【０２３８】
【表４】
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2011101653.tif 000013
【０２３９】
細菌および真菌によって起される疾病に対する耐性が増大することは、新規遺伝子の導入を通して認識されうることが提案される。いわゆる「ペプチド抗生物質」、病原体関連（ＰＲ）タンパク質、毒素耐性、および形態的特長のような宿主病原体の相互作用に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子は、有用であることが考えられる。ペプチド抗生物質は、細菌および他の微生物の成長に対して阻害性があるポリペプチド配列である。例えば、そのクラスのペプチドは、多くの種の細菌および真菌の成長を阻害するセクロピンおよびマガイニンに当たる。トウモロコシのような単子葉植物でのＰＲタンパク質の発現は、細菌疾病に対する耐性を付与するのに有用であることが提案される。宿主植物における病原体の攻撃に続いてこれらの遺伝子が誘導され、そして少なくとも５つのクラスのタ
ンパク質に分けられた（Ｂｏｌ、ＬｉｎｔｈｏｒｓｔおよびＣｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ、１９９０年）。ＰＲタンパク質はもとより含まれるのは、β−１、３−グルカナーゼ、キチナーゼ、およびオスモチンおよび疾病生物に対する植物耐性で機能すると思われる他のタンパク質である。他の遺伝子は、抗真菌特性、例えばＵＤＡ（イラクサレクチンを刺激する）およびヘベイン（Ｂｒｏａｋａｅｒｔら、１９８９年；Ｂａｒｋａｉ−Ｇｏｌａｎら、１９７８年）を示すことが認識された。ある種の植物疾病は、植物毒素の産生によって引起されることが知られている。これらの疾病に対する耐性は、植物毒素を分解またはさもなければ不活性化する能力のある酵素をコードする新規遺伝子の発現を通して達成されることが提案される。宿主植物と病原体との間の相互作用を変える新規遺伝子の発現が、宿主植物の組織に侵入する疾病生物の能力を減らす上で、例えば葉の表皮の潤滑性または他の形態上の特性における増加に有用であることも考えられる。本発明によりトランスジェニック植物に対する耐性を導入することができる穏やかなウドンコ病（ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗｓ）を含めた細菌および真菌疾病の例は、表５、６および７に以下で列挙される。
【０２４０】
【表５】
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【０２４１】
【表６】
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【０２４２】
【表７】
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【０２４３】
植物寄生線虫は、トウモロコシを含む多くの植物の疾病の原因である。新規遺伝子の発現によりこれらの生物に耐性のコーン植物の製造が可能となるであろうことを提唱する。線虫侵襲の制御は、線虫がホスト植物を認識または付着する能力を変化させることにより、および／または植物が、タンパク質を含むがこれに限定されない殺線虫化合物を産生できるようにすることにより達成される。本発明に従ってトランスジェニック植物に耐性を導入できる線虫関連植物病の例を、下の表８に示す。
【０２４４】
【表８】
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【０２４５】
５．マイコトキシン減少／排除
トウモロコシなどの単子葉植物に付着した真菌によるアフラトキシンおよびフモニシンを含むマイコトキシンの産生は、穀粒を駄目にする重大な要因である。これらの真菌生物は、疾病症状を引き起こさず、および／または植物の成長を妨害しないが、動物に毒性の化学物質（マイコトキシン）を産生する。これらの真菌の増殖の阻害によりこれらの毒性物質の合成は減少し、よってマイコトキシン汚染による穀粒損失は減少すると考えられる。また、トウモロコシなどの単子葉植物に、真菌の増殖を妨害することなくマイコトキシンの合成を阻害する新規遺伝子を導入できるであろうことが提唱される。さらに、マイコトキシンを無毒にできる酵素をコードする新規遺伝子の発現は、穀粒のマイコトキシン汚染の減少の達成に有用であろうと考えられる。上記の機序のいずれの結果も、穀粒上のマイコトキシンの存在の減少となる。
【０２４６】
６．穀粒組成または品質
遺伝子を、単子葉植物、特にトウモロコシなどの商業的に重要な穀物に導入して、穀粒を改良し得、穀物を主に成長させる。このように産生された広範囲の新規トランスジェニック植物を、穀粒の特定の最終用途に応じて想定し得る。
【０２４７】
トウモロコシ穀粒の最大の用途は、飼料または食物である。穀粒の組成を変化させる遺伝子の導入により、飼料または食物の価値は大きく増大し得る。トウモロコシ穀粒の主成分は、デンプン、タンパク質、および油である。トウモロコシ穀粒のこれらの各主成分は、そのレベルまたは組成を変化させることにより改良し得る。説明のために数例を記載するが、可能な例の網羅的なリストを提供するものではない。
【０２４８】
トウモロコシを含む穀物穀粒のタンパク質は、特にブタ、家禽、およびヒトに供給する場合の飼料または食物としては最適以下である。該タンパク質は、これらの種の食事に必須なアミノ酸の数個が欠乏しており、穀粒に補充の添加が必要である。制限必須アミノ酸は、リジン、メチオニン、トリプトファン、スレオニン、バリン、アルギニン、およびヒスチジンを含み得る。単にコーンに飼料調合のために他の投入物を補充した後に、いくつかのアミノ酸が制限される。例えば、コーンにリジン要求を満たすために大豆ミールを補充すると、メチオニンが制限される。種子および穀粒中のこれら必須アミノ酸のレベルは、アミノ酸の生合成を増加させるか、アミノ酸の分解を減少させるか、タンパク質中のアミノ酸の貯蔵を増加させるか、または種子または穀粒へのアミノ酸の輸送を増加させる遺伝子の導入を含むがこれに限定されない機序により上昇し得る。
【０２４９】
アミノ酸生合成を増加させる１つの機序は、植物が、産生されるレベルをもはや適切に制御できないように、アミノ酸生合成経路を調節解除する遺伝子を導入することである。これは、経路のアミノ酸最終生成物のレベルにより通常調節されるアミノ酸生合成経路の段階を調節解除または迂回することにより実施され得る。例は、リジンおよびスレオニン産生を増加させるアスパルトキナーゼまたはジヒドロジピコリン酸（ＤＨＤＰ）シンターゼ並びにトリプトファン産生を増加させるアントラニル酸シンターゼの調節解除型酵素をコードする遺伝子の導入を含む。アミノ酸の異化の減少は、酵素リジン−ケトグルタル酸レダクターゼなどの異化経路の段階を触媒する酵素をコードしている遺伝子の発現を減少または排除するＤＮＡ配列の導入により達成され得る。アミノ酸生合成に関連した遺伝子
の発現を、種子の胚乳または胚に標的化することが望ましくあり得ると予測される。より好ましくは、遺伝子を胚に標的化する。また、アミノ酸生合成に関与するタンパク質をコードしている遺伝子が、タンパク質を、色素体輸送ペプチド配列を使用して色素体に標的化させることが好ましい。
【０２５０】
穀粒のタンパク質組成を、天然タンパク質の発現上昇、不十分な組成のタンパク質の発現減少、天然タンパク質の組成の変化、または優れた組成をもつ完全に新規なタンパク質をコードしている遺伝子の導入を含む様々な方法で変化させ、アミノ酸の平衡を改良し得る。例は、ゼインファミリーのメンバーの貯蔵タンパク質の発現を減少させるＤＮＡの導入を含み得る。このＤＮＡは、ゼインタンパク質の発現またはｏｐａｑｕｅ−２遺伝子産物などのゼイン発現の制御因子の発現を障害するように指示されたリボザイムまたはアンチセンス配列をコードし得る。また、穀粒のタンパク質組成は、共抑制の減少により、すなわち、形質転換により導入された同一構造遺伝子または遺伝子断片の発現による内因性遺伝子の発現の阻害により修飾され得ることが提唱される（Ｇｏｒｉｎｇら、１９９１）
。さらに、導入ＤＮＡは、ゼインを分解する酵素をコードしていてもよい。達成されるゼイン発現の減少は、より望ましいアミノ酸組成をもつタンパク質の増加またはデンプンなどの他の主要な種子の構成成分の増加を伴い得る。別に、グロブリンタンパク質の１つまたはトウモロコシの１０ｋＤδゼイン、２０ｋＤδゼインまたは２７ｋＤγゼインなどの適切なアミノ酸組成の天然タンパク質のコード配列およびプロモーターまたは該タンパク質の発現を上昇させるように設計された他の調節配列を含むキメラ遺伝子を導入してもよい。該遺伝子のコード配列は、必須アミノ酸の付加または置換コドンを含んでもよい。さらに、別の種から得られたコード配列、または、種子のアミノ酸組成を増強させるように設計された完全に独特なペプチド配列をコードしている部分的または完全な合成配列を使
用してもよい。優れた組成をもつタンパク質をコードしているこれらの導入遺伝子の発現を、種子の胚乳に標的化することが好ましくあり得ると予測される。
【０２５１】
穀粒の油含量を変化させる遺伝子の導入は価値があり得る。油含量の増加により、代謝可能なエネルギー含量並びに飼料および食物に使用する種子の密度は増加し得る。導入遺伝子は、脂肪酸または脂質生合成の律速または調節段階を除去または減少する酵素をコードし得る。該遺伝子は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＣＰ−アシルトランスフェラーゼ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、および他の公知の脂肪酸生合成活性をコードする遺伝子を含み得るがこれに限定されない。他の可能例は、アシルキャリアータンパク質などの酵素活性を有さないタンパク質をコードする遺伝子である。より健康的または栄養的な飼料を与える、油に存在する脂肪酸の平衡を変化させる遺伝子を導入し得る。導入ＤＮＡはまた、下記したような穀粒に存在する脂肪酸の比率を変化させ、脂肪酸生合成に関与する酵素の発現を遮断する配列をコードしていてもよい。油組成特徴の変化したトランスジェニック植物の創製の使用に本発明者により具体的に考えられる遺伝子のいくつかの他の例は、２−アセチルトランスフェラーゼ、オレオシン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、アセチルＣｏＡシンセターゼ、ＡＴＰクエン酸リアーゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、およびカルニチン−ＣｏＡ−アセチル−ＣｏＡシャトルの遺伝子を含む。油生合成に関連した遺伝子の発現は、色素体輸送ペプチド配列を使用して色素体に標的化し、好ましくは種子胚に発現されると予測される。
【０２５２】
例えば分枝度の増加により、穀粒のデンプン成分の栄養価を増強する遺伝子を導入し得、その結果その代謝の遅延によりウシでのデンプン利用は向上する。デンプン生合成に関連した遺伝子の発現は、好ましくは、種子の胚乳に標的化されると予測する。
【０２５３】
穀粒の主構成成分に影響を及ぼす以外に、飼料或いは食物に使用される穀粒の様々な他の栄養素、加工、または他の品質態様に影響を及ぼす遺伝子を導入してもよい。例えば、穀粒の色素沈着を増加または減少させ得る。黄色色素沈着の増強および安定性がいくつかの動物飼料に望ましく、これはキサントフィルおよびカロテンの産生の律速段階を排除することによりその産生増強をもたらす遺伝子の導入により達成され得る。該遺伝子は、酵素フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、またはリコピンシンターゼの変形をコードし得る。別に、色素のない白色コーンが多くの食物製品の製造に望ましく、これは色素産生経路の段階を遮断または排除するＤＮＡの導入により産生され得る。
【０２５４】
穀粒のリン含有物の大半は、単胃動物により代謝されないホスフェート貯蔵形のフィテート形である。それ故、種子ホスフェートの利用性を増加させるために、種子のフィテート量を減少させ、遊離リンの量を増加させることを望むと予測される。別に、単胃動物の胃系で例えばｐＨにより活性化され、フィターゼなどのフィテートからホスフェートを遊離する遺伝子をコーン種子に発現してもよい。
【０２５５】
主にトウモロコシまたは他の穀物穀粒を含む飼料または食物は、ビタミン量が不十分であり、適切な栄養価を与えるために補充しなければならない。例えば、ビタミンＡ、Ｅ、Ｂ12、コリン等を含む、種子でのビタミン生合成を増強する遺伝子の導入を想定し得る。トウモロコシ穀粒は、最適の栄養価に十分なミネラル含量も有していない。リン、硫黄、カルシウム、マンガン、亜鉛、および鉄をとりわけ含む化合物の蓄積または利用性に影響を及ぼす遺伝子は価値があろう。例は、フィチン酸産生を減少させるか、またはフィチン酸分解を増強する酵素フィターゼをコードする遺伝子の導入であり得る。これらの遺伝子は、食事中の利用可能なホスフェートのレベルを増加させ、ミネラルホスフェートで補充する必要が減少する。
【０２５６】
飼料または食物用のトウモロコシまたは他の穀物の改良の多くの他の例を記載し得る。改良は、必ずしも穀粒を含まないが、例えば、サイレージ用のコーンの価値を向上させ得る。これを達成するＤＮＡの導入は、ウシ用の優れた飼料価値に関連した「褐色中肋」表現型をもたらす配列などの、リグニン産生を変化させる配列を含み得る。
【０２５７】
飼料または食物価値の直接的な向上に加えて、コーンの加工を向上させ、加工から得られる製品の価値を向上させる、遺伝子も導入し得る。コーンを加工する主な方法は、湿式製粉による。トウモロコシは、浸漬時間の減少などにより、効率を高め、加工の費用を減少させる新規遺伝子の発現により改良され得る。
【０２５８】
湿式製粉製品の価値の向上は、デンプン、油、コーングルテンミール、またはコーングルテン飼料の成分の量または質の変化を含み得る。デンプンの増加は、デンプン生合成の律速段階の同定および削除により、またはデンプンの比例的増加をもたらす穀粒の他の成分のレベルの減少により達成され得る。前者の例は、調節活性の変化したまたは高レベルで発現されたＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ酵素をコードしている遺伝子の導入であり得る。後者の例は、例えば、仁発達の後期の段階で発現されるタンパク質または油生合成の選択的阻害剤を含み得る。
【０２５９】
デンプンの特性は、アミロースとアミロペクチンの比、デンプン分子のサイズ、またはその分枝パターンを変化させることにより有益に変化させ得る。これらの変化を通じて、ゼラチン化温度、ゼラチン化熱、フィルムおよびペーストの透明度、レオロジー特性等を含むがこれに限定されない広範囲の特性が修飾され得る。特性のこれらの変化を達成するために、顆粒結合または可溶性デンプンシンターゼ活性または分枝酵素活性をコードする遺伝子を単独でまたは組合せて導入し得る。アンチセンス作成物などのＤＮＡを使用して、これらの酵素の内因活性レベルを減少させてもよい。導入遺伝子または作成物は、デンプン生合成およびデンプン粒発達におけるその発現を特定の間隔に合わせる調節配列を有し得る。さらに、デンプン分子のグルコース部分のインビボ誘導体化または他の修飾をもたらす遺伝子の導入および発現は価値があり得る。任意の分子の共有結合を想定し得、誘導体化を触媒する酵素の存在およびデンプン粒の適切な基質の到達性によってのみ制限される。重要な誘導例は、続くインビトロ誘導体化の部位を提供するか、またはイオン荷電の導入によりデンプン特性に影響を及ぼす、アミン、カルボキシル、またはホスフェート基などの官能基の付加を含み得る。他の修飾例は、ヒドロキシル基の欠失などのグルコース単位の直接的な変化またはアルデヒドまたはカルボキシル基へのその酸化を含み得る。
【０２６０】
油は、コーンの湿式製粉の別の産物であり、その価値は、遺伝子の導入および発現により向上し得る。湿式製粉により抽出できる油の量は、上記の飼料および食物に記載したアプローチにより増加させ得る。また、油の特性も変化させて、料理油、ショートニング、潤滑剤または他の油由来製品の製造および使用におけるその性能を向上し得るか、または食物関連適用に使用した場合のその健康属性を向上し得る。抽出時に化学合成の出発原料として役立ち得る新規脂肪酸も合成し得る。油特性の変化は、油に存在する脂肪酸の種類、レベル、または脂質配置の変化により達成され得る。これは次いで、新規脂肪酸およびそれらを有する脂質の合成を触媒する酵素をコードする遺伝子の追加により、または、おそらく前駆体のレベルを減少させつつ、天然脂肪酸のレベルを増加させることにより達成され得る。別に、前駆脂肪酸中間体を増加させる、脂肪酸生合成の段階を遅延または遮断するＤＮＡ配列を導入してもよい。加え得る遺伝子は、脂肪酸中間体に関与する反応を触媒する、デサチュラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドラターゼ、デヒドラターゼ、および他の酵素を含む。遮断され得る触媒段階の代表例は、それぞれステアリン酸およびオレイン酸の蓄積をもたらす、ステアリン酸からオレイン酸およびオレイン酸からリノレン酸への不飽和化を含む。別の例は、Ｃ8−Ｃ12飽和脂肪酸の蓄積をもたらす、伸長段階の遮断である。
【０２６１】
他の主要なコーン湿式製粉製品のコーングルテンミールおよびコーングルテン飼料の改良も、遺伝子の導入により達成され得、新規コーン植物が得られる。代表的な可能例は、食物および飼料の価値の向上で上記したものを含むがこれに限定されない。
【０２６２】
加えて、コーン植物を、以前にはコーン植物に全く産生されていなかったか、または同レベルでは産生されていなかった有用な生物学的化合物の産生または製造に使用することがさらに考えられ得る。これらの化合物を産生している新規コーン植物は、コーン形質転換法による遺伝子の導入および発現により可能となる。莫大な可能例は、タンパク質、核酸、一次および中間代謝物、炭水化物ポリマー等の任意の生物により現在産生される任意の生物学的化合物を含むがこれに限定されない。該化合物は、植物により産生され、収穫および／または加工時に抽出され、いくつか例をあげると医薬、香水、および工業的酵素などの任意の現在認識されている有用な目的に使用され得る。
【０２６３】
トランスジェニック植物の導入遺伝子により潜在的にコードされた穀粒特色または特性の範囲を例示するさらなる可能例は、γ−ゼイン合成を増強する遺伝子の導入により、輸出用に破損しにくく、乾式製粉により加工した場合に粗粉サイズのより大きな穀粒、果皮厚を増加させる遺伝子によるはじけ品質および膨張容積の向上したポップコーン、色素産生経路に関与する酵素の発現を効率的に遮断する遺伝子の導入による食物使用のより白色な穀粒のコーン、およびスイートコーンのｓｈｒｕｎｋｅｎ１遺伝子（スクロースシンターゼをコードしている）またはｓｈｒｕｎｋｅｎ２遺伝子（ＡＤＰＧピロホスホリラーゼをコードしている）などの芳香に影響を及ぼす遺伝子の導入のよるアルコール飲料またはスイートコーンの品質の向上を含む。
【０２６４】
７．植物農学的特長
コーンが成長できる場所を決定する因子の２つは、成長季節中の毎日の平均温度および降霜時季間の時間の長さである。コーンが成長できる地域内に、成長して成熟し収穫を可能とする最大時間には可変的な制限がある。特定の地域で成長したコーンを、可能な最大収量で必要な時間内に成熟して収穫可能な湿気含量まで乾燥できるかで選択する。それ故、様々な成熟度のコーンが、異なる成長場所で発達する。収穫するに十分なまで乾燥する必要とは別に、最大限の乾燥が野原で行われ、収穫後の追加の乾燥に必要なエネルギー量を最小限にすることが望ましい。また、より容易に穀粒を乾燥できるほど、成長および仁充填に利用できる時間は多くなる。成熟に影響を及ぼすおよび／または乾燥させる遺伝子を同定し、形質転換技術を使用してコーン系に導入し、異なる成長場所に適したまたは同じ成長位置に適するが、収穫時の収率対湿気比の向上した、新規なコーン変種を創製できると考えられる。植物発達の調節に関与する遺伝子、例えば、コーンで同定された無葉舌およびラフ型梢遺伝子の発現は特に有用であり得る。
【０２６５】
起立性および他の植物成長特徴を向上させる遺伝子を単子葉植物に導入し得ると考えられる。より強い柄を付与し、根系を向上させ、または穂落下量を防止または減少させる新規遺伝子の発現は、農場主にとって非常に価値があろう。例えば光分布および／または妨害を増加させることにより利用できる光合成産物の全量を増加させる遺伝子の導入および発現は有利であろうと提唱される。さらに、光合成の効率および／または林冠を増加させる遺伝子の発現は、穀粒の生産性をさらに増加させるだろう。コーンでのフィトクロム遺伝子の発現は、有利であり得ると考えられる。該遺伝子の発現は、頂芽優性を減少させ、植物に半矮性を付与し、耐陰性を増加させ得る（米国特許第５，２６８，５２６号）。該アプローチは、野原での植物個体群の増加を可能とする。
【０２６６】
季節後期の植物老化の遅延は、同化産物の穀粒への流入を増加させ、従って収率を増加させる。「緑の維持」に関連した遺伝子のコーン内での過剰発現および老化を遅延させる任意の遺伝子の発現が有利であろうと提唱される。例えば、非黄化変異体が、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（Ｄａｖｉｅｓら、１９９０）で同定された。この遺伝子並びに他の遺伝子の発現は、クロロフィルの成熟前の分解を防ぎ得、従って林冠機能を維持し得る。
【０２６７】
８．栄養利用
入手可能な栄養素の利用能は、トウモロコシなどの単子葉植物の生長の制限因子であり得る。新規遺伝子の導入により、栄養取込み、耐ｐＨ極限、植物中での移動、貯蔵プール、および代謝活性の利用性を変化させることが可能であろうと提唱される。これらの修飾により、トウモロコシなどの植物はより効率的に利用可能な栄養素を利用できる。例えば、植物に通常存在し栄養利用に関与する酵素の活性の増加は、栄養素の利用性を増加させると考えられる。該酵素の例はフィターゼである。コーン植物による窒素利用の増加が望ましいとさらに考えられる。トウモロコシでのグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ｇｄｈＡ遺伝子の発現により、有機化合物の窒素固定は増加し得る。さらに、コーンでのｇｄｈＡの発現により、過剰のアンモニアをグルタメートに取込み、よって、アンモニアを解毒することにより除草剤グルホシネートへの耐性が増強し得る。また、新規遺伝子の発現は、より複雑な分子、おそらく巨大分子から栄養価のある成分を放出する酵素などの、以前では得られなかった利用可能な栄養源を作り得ると考えられる。
【０２６８】
９．雄性不稔性
雄性不稔性は、ハイブリッド種子の産生に有用である。雄性不稔性は、新規遺伝子の発現により産生され得ると提唱される。例えば、雄性花序および／または配偶体の発達を妨害するタンパク質をコードする遺伝子の発現は雄性不稔性をもたらすことが示された。トランスジェニックタバコおよびアブラナの葯に発現されるキメラリボヌクレアーゼ遺伝子は、雄性不稔性をもたらすことが実証された（Ｍａｒｉａｎｉら、１９９０）。
【０２６９】
細胞質雄性不稔性を付与する多くの変異がトウモロコシで発見された。特にＴ細胞質と呼ばれる１つの変異はまた、南方コーン葉枯への感受性に関連する。Ｔ細胞質と関連するＴＵＲＦ−１３と呼称されるＤＮＡ配列（Ｌｅｖｉｎｇｓ、１９９０）が同定された。形質転換を介したＴＵＲＦ−１３の導入により、疾病感受性から雄性不稔性を分離することが可能であろうと提唱される。繁殖目的および穀粒産生のために雄性不稔性を回復することが必要であるので、雄性不稔性の回復をコードしている遺伝子も導入し得ると提唱される。
【０２７０】
１０．ネガティブ選択マーカー
選択できる特色をコードしている遺伝子の導入は、望ましくない連鎖遺伝子の排除に有用であり得る。２つ以上の遺伝子を同時形質転換により共に導入する場合、遺伝子は宿主染色体上で共に連鎖されると考えられる。例えば、植物に昆虫耐性を付与するＢｔ遺伝子をコードしている遺伝子を、選択マーカーとして有用なｂａｒ遺伝子と共に植物に導入し、植物に除草剤リバティー（登録商標）への耐性を付与し得る。しかし、除草剤リバティー（登録商標）にも耐性である昆虫耐性植物を有することは望ましくない。ｂａｒ遺伝子の発現を望まない組織、例えば全植物部分に発現されたアンチセンスｂａｒ遺伝子を導入できると提唱される。従って、ｂａｒ遺伝子は発現され選択マーカーとして有用であるが、全植物に除草剤耐性を付与するには有用ではない。ｂａｒアンチセンス遺伝子は、ネガティブ選択マーカーである。
【０２７１】
また、ネガティブ選択は、遺伝子標的化により産生された稀な相同的組換え体について形質転換体の個体群をスクリーンするために必要であると考えられる。例えば、相同的組換え体は、細胞で以前に発現された遺伝子の不活性化により同定され得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）に対するアンチセンス遺伝子が、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのネガティブ選択マーカーとして調査された（ＸｉａｎｇおよびＧｕｅｒｒａ、１９９３）。この例で、センスおよびアンチセンスＮＰＴ  ＩＩ遺伝子の両方を、形質転換により植物に導入し、得られた植物は抗生物質カナマイシンに感受性である。宿主細胞染色体のアンチセンスＮＰＴ  ＩＩ遺伝子の部位に組み込れ、アンチセンス遺伝子を不活性化する導入遺伝子により、植物はカナマイシンおよび他のアミノグリコシド抗生物質に耐性となる。それ故、稀な部位特異的組換え体は、抗生物質耐性についてスクリーニングすることにより同定され得る。同様に、活性化時に化合物に耐性を付与する、植物に天然のまたは形質転換により導入された任意の遺伝子が、ネガティブ選択マーカーとして有用であり得る。
【０２７２】
ネガティブ選択マーカーは、別様にも有用であり得ると考えられる。１つの適用は、トランスジェニック系の作成であり、非連鎖部位への遺伝子転移を選択できる。タギングのプロセスで、同染色体上の遺伝的連鎖部位に転写因子が移動することは最も一般的である。遺伝子転移が非連鎖座に生じる稀な植物の回収の選択マーカーが有用である。例えば、酵素シトシンデアミナーゼがこの目的に有用であり得る（Ｓｔｏｕｇｇａｒｄ、１９９３）。この酵素の存在下で、化合物５−フルオロシトシンは、植物および動物細胞に毒性の５−フルオロウラシルに変換される。転移因子が酵素シトシンデアミナーゼの遺伝子に連鎖している場合、得られた植物が５−フルオロシトシンに耐性となっている遺伝子転移事象を選択することにより、非連鎖部位への遺伝子転移を選択し得る。親植物および連鎖部位に遺伝子転移を含む植物は、依然として５−フルオロシトシンに感受性である
。５−フルオロシトシンへの耐性は、転移因子およびシトシンデアミナーゼ遺伝子の遺伝的分離によるシトシンデアミナーゼ遺伝子の欠失に起因する。植物をある化合物に耐性とさせるタンパク質をコードする他の遺伝子もこの趣旨に有用である。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴ−ＤＮＡ遺伝子２は、α−ナフタレンアセタミド（ＮＡＭ）からα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）への変換を触媒するタンパク質をコードし、植物細胞を高濃度のＮＡＭに感受性とする（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８８）。
【０２７３】
また、ネガティブ選択マーカーは、トランスポゾンタギング系の作成にも有用であり得ると考えられる。例えば、Ａｃ、マスターＭｕ、またはＥｎ／Ｓｐｎなどの自律転移因子をネガティブ選択マーカーと共に作ることにより、自律因子がゲノムに安定に組み込れていない形質転換体を選択できる。これは、例えば、自律因子の一過性発現が、Ｄｓなどの欠陥転移因子の遺伝子転移をトランスで活性化することが望ましいが、自律因子の安定な組み込みが望ましくない場合に、望ましいと提唱される。自律因子の存在は、欠損因子を安定化させるために、すなわちさらなる遺伝子転移から防ぐために望ましくあり得る。しかし、自律転移因子の安定な組み込みが、植物に望ましい場合、ネガティブ選択マーカーの存在は、繁殖プロセス中の自律因子の排除を可能とし得ると提唱される。
【０２７４】
（ｖｉ）非タンパク質発現配列
１．ＲＮＡ発現
ＤＮＡを、コーンおよび他の単子葉植物に、依然としてタンパク質に翻訳されていない植物表現型に影響を及ぼすように機能するＲＮＡ転写物を発現する目的で導入し得る。２つの例は、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイム活性をもつＲＮＡである。両方共、天然または導入された植物遺伝子の発現の減少または排除に潜在的な機能を果たし得る。
【０２７５】
転写時に、標的メッセンジャーＲＮＡ（群）の全部または一部に相補的なアンチセンスＲＮＡを産生する遺伝子を作成または単離し得る。アンチセンスＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡのポリペプチド産物の産生を減少させる。ポリペプチド産物は、植物ゲノムによりコードされた任意のタンパク質であり得る。前記の遺伝子は、アンチセンス遺伝子と呼ばれる。従って、アンチセンス遺伝子は、形質転換法により植物に導入され、目的の選択タンパク質の発現の減少した新規トランスジェニック植物を産生し得る。例えば、タンパク質は、植物の反応を触媒する酵素であり得る。酵素活性の減少は、脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、核酸等の植物の任意の酵素的に合成された化合物を含む反応産物を減少または排除し得る。別に、タンパク質は、ゼインなどの貯蔵タンパク質、または構造タンパク質であり得、その発現の減少は、種子アミノ酸組成の変化または植物形態学的変化をそれぞれもたらし得る。上記に列挙した可能例は、単に例示のために提供され、適用の全範囲を示すものではない。
【０２７６】
転写時に、エンドリボヌクレアーゼとして作用し、選択配列をもつＲＮＡ分子の切断を触媒できる、ＲＮＡ酵素またはリボザイムを産生する遺伝子も作成または単離し得る。選択メッセンジャーＲＮＡの切断により、そのコードされたポリペプチド産物の産生は減少し得る。これらの遺伝子を使用して、それらを有する新規トランスジェニック植物を調製し得る。トランスジェニック植物は、アンチセンスＲＮＡにより影響され得る上記に列挙したポリペプチドを含むがこれに限定されない、レベルの減少したポリペプチドを有し得る。
【０２７７】
また、遺伝子を導入して、共抑制の機序により天然遺伝子産物の発現が減少した新規トランスジェニック植物を産生し得ることも可能である。天然遺伝子のセンス転写物の発現は、アンチセンス遺伝子で観察されたのと類似の様式で天然遺伝子の発現を減少または排除することが、タバコ、トマト、およびペチュニア（Ｇｏｒｉｎｇら、１９９１；Ｓｍｉｔｈら、１９９０；Ｎａｐｏｌｉら、１９９０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、１９９０）で実証された。導入遺伝子は、標的天然タンパク質の全部または一部をコードし得るが、その翻訳はその天然タンパク質のレベルの減少には必要ではないことがある。
【０２７８】
２．非ＲＮＡ発現
Ｄｓ、Ａｃ、またはＭｕなどの転移因子のものを含むＤＮＡ因子を遺伝子に導入して、変異を引き起こし得る。これらのＤＮＡ因子は、遺伝子を不活性化（または活性化）し、よって、特定の特色を「タグ」するために挿入し得る。この場合、転移因子は、タグ変異の不安定性を引き起こさない。因子の利用はゲノム内での運動能に依存しないからである。一旦所望の特色がタグされれば、導入ＤＮＡ配列を使用して、例えば、ＰＣＲ遺伝子クローニング技術と共にＰＣＲプライマーとして導入ＤＮＡ配列を使用して、対応する遺伝子をクローニングし得る（Ｓｈａｐｉｒｏ、１９８３；Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａら、１９８８）。一旦同定されると、所望の制御または調節領域を含む特定の特色の全遺伝子（群）を、所望のように単離、クローニング、および操作し得る。遺伝子タギングの目的で生物に導入されたＤＮＡ因子の利用は、ＤＮＡ配列に独立的であり、ＤＮＡ配列の任
意の生物活性、すなわちＲＮＡへの転写またはタンパク質への翻訳には依存しない。ＤＮＡ因子の唯一の機能は、遺伝子のＤＮＡ配列を破壊することである。
【０２７９】
新規合成配列を含む非発現ＤＮＡ配列は、細胞に、それらの細胞および植物およびその種子の専有「標識」として導入できると考えられる。標識ＤＮＡ因子が、宿主生物に内因性の遺伝子の機能を破壊する必要はない。このＤＮＡの唯一の機能は生物の起源の同定であるからである。例えば、独特なＤＮＡ配列を植物に導入でき、このＤＮＡ因子は、その標識源から生じた全ての細胞、植物およびこれらの細胞の子孫を同定する。標識ＤＮＡの封入により、専有生殖質またはこれ由来の生殖質を、非標識生殖質から識別できると提唱される。
【０２８０】
導入され得る別の可能な因子は、チキンリゾチームＡ因子（Ｓｔｉｅｆ、１９８９）などのマトリックス結合領域因子（ＭＡＲ）であり、これは、目的の発現性遺伝子の周辺に位置し、遺伝子の全体的な発現の増加を引き起こし、植物ゲノムへの取込み時には位置依存的効果を減少させることができる（Ｓｔｉｅｆら、１９８９；Ｐｈｉ−Ｖａｎら、１９９０）。
【０２８１】
ＩＸ．導入遺伝子の部位特異的組み込みまたは切出し
本発明に従って調製した導入遺伝子の部位特異的組み込みまたは切出しの技術を使用できることが本発明者により特に考えられる。部位特異的組み込みまたは切出しの利点は、導入遺伝子が典型的には宿主ゲノムにランダムに複数のコピーで組み込れる慣用的な形質転換技術に関連した問題を克服するのに使用できることである。導入ＤＮＡの宿主細胞のゲノムへのこのランダムな挿入は、外来ＤＮＡが必須遺伝子に挿入した場合には致命的であり得る。さらに、導入遺伝子の発現は、周りのゲノムＤＮＡにより引き起こされる「位置効果」により影響され得る。さらに、遺伝子サイレンス、組換えおよび予測不可能な遺伝を含む、複数の導入遺伝子のコピーの形質転換に関連した難点のために、典型的には、挿入ＤＮＡのコピー数を制御することが望ましく、しばしばＤＮＡ配列の単一のコピーの
挿入を望む。
【０２８２】
導入遺伝子または導入遺伝子の一部の部位特異的組み込みまたは切出しは、相同的組換えにより植物で達成できる（例えば、米国特許第５，５２７，６９５号参照、その全体を参考として本明細書に具体的に取込む）。相同的組換えは、類似のヌクレオチド配列を有する任意のＤＮＡ配列対間の反応であり、２つの配列は相互作用（組換え）して新規な組換えＤＮＡ種を形成する。相同的組換えの頻度は、共有するヌクレオチドＤＮＡ配列の長さが増加するにつれ増加し、環状プラスミド分子よりも線形プラスミド分子の方が高い。相同的組換えは、同一以下の２つのＤＮＡ配列間で起こり得るが、組換え頻度は、２つの配列間の相違が増加するにつれ下降する。
【０２８３】
導入ＤＮＡ配列は、相同的組換えを通じて、目的のＤＮＡ分子を、宿主細胞の内因性配列と相同性を共有する配列に連結させることにより標的化できる。一旦ＤＮＡが細胞に侵入すると、２つの相同的配列は相互作用して、相同的ゲノムＤＮＡ配列が位置する部位に導入ＤＮＡを挿入できる。それ故、導入ＤＮＡ上に含まれる相同的配列の選択は、導入ＤＮＡを相同的組換えにより組み込む部位を決定する。例えば、目的のＤＮＡ配列が宿主植物細胞の単一コピー遺伝子と相同性を共有しているＤＮＡ配列に連結する場合、目的のＤＮＡ配列は、相同的組換えにより、その単一の特異的部位にのみ挿入される。しかし、目的のＤＮＡ配列が宿主真核細胞のマルチコピー遺伝子に相同性を共有しているＤＮＡ配列に連結する場合、目的のＤＮＡ配列は、相同的組換えにより、遺伝子のコピーが位置する
各特異的部位で挿入できる。
【０２８４】
ＤＮＡは、宿主ゲノムに、単一相互組換え（導入ＤＮＡの全長の挿入が得られる）または二重相互組換え（２つの組換え事象間に位置するＤＮＡのみの挿入が得られる）を含む、相同的組換え反応により挿入できる。例えば、外来遺伝子を、選択遺伝子が位置するゲノム部位に挿入したい場合、導入ＤＮＡは、選択遺伝子に相同的な配列を含む。その後、単一の相同的組換え事象により、全導入ＤＮＡ配列が選択遺伝子に挿入される。別に、二重組換え事象が、目的のＤＮＡ配列（ゲノムに挿入する予定の配列）の各末端を、選択遺伝子に相同的なＤＮＡ配列でフランキングすることにより達成できる。各相同的フランキング領域を含む相同的組換え事象により、外来ＤＮＡが挿入される。従って、ゲノム相同性を共有する２つの領域間に位置するＤＮＡ配列のみが、ゲノムに組み込れる。
【０２８５】
導入配列は、相同的組換えを介した特異的ゲノム部位への挿入に標的化できるが、高等真核生物では、相同的組換えは、ランダム挿入事象に比べて比較的稀な事象である。植物細胞では、外来ＤＮＡ分子は、細胞のゲノムに相同配列を見出し、約０．５−４．２×１０-4の頻度で組換えられる。従って、相同的組換えにより組み込れた導入ＤＮＡ配列を含む任意の形質転換細胞も、ランダムに組み込れた導入ＤＮＡ配列の多くのコピーを含むようである。それ故、コピー数および挿入ＤＮＡの位置の制御を維持するために、これらのランダムに挿入されたＤＮＡ配列を除去できる。これらのランダムな挿入断片を除去する１つの様式は、部位特異的リコンビナーゼ系を使用することである。一般に、部位特異的リコンビナーゼ系は、３つの因子：２対のＤＮＡ配列（部位特異的組換え配列）および特異的酵素（部位特異的リコンビナーゼ）からなる。部位特異的リコンビナーゼは、２つの部位特異的組換え配列間のみの組換え反応を触媒する。
【０２８６】
バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系（米国特許第５，６５８，７７２号、その全体を参考として具体的に本明細書に取込む）、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系（ＧｏｌｉｃおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、１９８９）、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（Ｍａｅｓｅｒら、１９９１）、Ｅ．コリのＰｉｎリコンビナーゼ（Ｅｎｏｍｏｔｏら、１９８３）、およびｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系（Ａｒａｋｉら、１９９２）を含むがこれに限定されない、多くの異なる部位特異的リコンビナーゼ系を本発明に従って使用できる。バクテリオファージＰ１  Ｃｒｅ／ｌｏｘおよび酵母ＦＬＰ／ＦＲＴ系は、導入遺伝子の部位特異的組み込みまたは切出しに特に有用な２つの系からなる。これらの系で、リコンビナーゼ（ＣｒｅまたはＦＬＰ）は、そのそれぞれの部位特異的組換え配列（それぞれｌｏｘまたはＦＲＴ）と特異的に相互作用して、介入配列を反転または切出しする。これらの各２つの系の配列は比較的短く（ｌｏｘでは３４ｂｐおよびＦＲＴでは
４７ｂｐ）、それ故、形質転換ベクターでの使用に簡便である。
【０２８７】
ＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼ系は、植物細胞で効率的に機能することが実証された。トウモロコシおよびイネの両方のプロトプラストのＦＬＰ／ＦＲＴ系の性能に関する実験により、ＦＲＴ部位構造および存在するＦＬＰタンパク質の量は、切出し活性に影響を与えることが示される。一般に、短い不完全なＦＲＴ部位は、完全な全長ＦＲＴ部位よりも切出し産物の蓄積が高くなる。系は、トウモロコシプロトプラストの細胞内および細胞間反応の両方を触媒でき、ＤＮＡ切り出し並びに組み込み反応でのその有用性が示される。組換え反応は可逆的であり、この可逆性は、各方向の反応の効率を妥協できる。部位特異的組換え配列の構造を変化させることはこの状況を直す１つのアプローチである。部位特異的組換え配列は、組換え反応産物が逆反応の基質としてもはや認識されず、よって組み
込みまたは切出し事象を安定化させるように変異させることができる。
【０２８８】
バクテリオファージＰ１で発見されたＣｒｅ−ｌｏｘ系では、ｌｏｘＰ部位間での組換えは、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で起こる（例えば、米国特許第５，６５８，７７２号参照、その全体を参考として具体的に本明細書に組み込む）。この系は、酵母ゲノムに導入された２つのｌｏｘ部位間に位置する遺伝子の切出しに使用された（Ｓａｕｅｒ、１９８７）。Ｃｒｅは、誘導酵母ＧＡＬ１プロモーターから発現され、このＣｒｅ遺伝子は、自律複製酵母ベクター上に位置した。
【０２８９】
ｌｏｘ部位は非対称ヌクレオチド配列であるので、同ＤＮＡ分子上のｌｏｘ部位は、互いに関して同一または逆の配向を有し得る。同配向のｌｏｘ部位間の組換えにより、２つのｌｏｘ部位間に位置するＤＮＡセグメントおよび元のＤＮＡ分子の得られた末端間の結合部が欠失する。欠失ＤＮＡセグメントは、環状ＤＮＡ分子を形成する。元のＤＮＡ分子および得られた環状分子は各々、単一のｌｏｘ部位を含む。同ＤＮＡ分子上の逆配向のｌｏｘ部位間の組換えにより、２つのｌｏｘ部位間に位置するＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列は反転する。さらに、２つの異なるＤＮＡ分子上に位置するｌｏｘ部位に近接するＤＮＡセグメントの相互交換が起こり得る。全てのこれらの組換え事象は、Ｃｒｅコード領域の産物により触媒される。
【０２９０】
Ｘ．タンパク質の精製
本発明の特定の実施形態において、本発明の導入遺伝子によりコードされたタンパク質を精製することが望ましくあり得る。別に、単離タンパク質をコードしている遺伝子、または遺伝子の発現を指示しているプロモーターをクローニングする努力の一部として、天然タンパク質が植物から単離され得る。一旦タンパク質が得られると、タンパク質をシークエンスにかけ、遺伝子のコード配列を推定できる。プローブまたはプライマーを、推定ＤＮＡ配列を基にして製造でき、よって対応する遺伝子の効率的なクローニングが可能となる。
【０２９１】
タンパク質精製技術は当業者には公知である。これらの技術は、あるレベルでの、細胞環境からのポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への粗分画を含む。ポリペプチドを他のタンパク質から分離したので、目的のポリペプチドは、クロマトグラフィーまたは電気泳動技術を使用してさらに精製し、部分的または完全な精製（または均一に精製）を達成し得る。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動である。特に効率的なペプチド精製法は、タンパク質高速液体クロマトグラフィーまたはさらにはＨＰＬＣである。
【０２９２】
タンパク質精製に使用するに適切な様々な技術が当業者には公知である。これらは、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等での沈降または熱変性、次いで遠心分離、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー段階、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、および該および他の技術の組合せを含む。当分野では一般的に公知のように、様々な精製段階の実施順序は変更しても、またはある段階を省いてもよく、依然として実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法が得られると信じられている。
【０２９３】
タンパク質またはペプチドが常に最も精製された状態で提供される必要は一般にない。実際、実質的に精製度の低い産物でも、ある実施形態に有用性を有すると考えられる。部分的精製は、より少ない精製段階を組合せて使用することにより、または異なる形の同一般精製スキームを利用することにより達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施したカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィー系を利用した同技術よりも、何「倍」もの精製が得られると認識される。相対的に低い精製度を示す方法は、タンパク質産物の全回収、または発現タンパク質の活性の維持に利点を有し得る。
【０２９４】
ポリペプチドの移動は、時に有意に、異なる条件のＳＤＳ／ＰＡＧＥにより変化し得ることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。それ故、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製発現産物の見かけの分子量は変化し得ると認識される。
【０２９５】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、非常に迅速な分離とピークの並はずれた分解を特徴とする。これは、非常に微細な粒子および適切な流速を維持する高圧の使用により達成される。分離は、分単位でまたは多くても１時間で達成できる。さらに、粒子がとても小さく緊密に充填され、空隙容積が床容積の非常に小部分であるので、非常に少量のサンプルが必要とされるだけである。また、バンドが狭く、サンプルはほとんど希釈されないので、サンプル濃度はあまり高い必要はない。
【０２９６】
ゲルクロマトグラフィー、または分子ふるいクロマトグラフィーは、分子サイズに基づく特殊な型の分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの背後にある理論は、小孔を含む不活性物質の小粒子を用いて調製したカラムが、そのサイズに応じて、孔またはその周辺を通過するにつれ、小さな分子から大きな分子を分離するというものである。粒子を作る材料が分子を吸収しない限り、流速を決定する唯一の要因はサイズである。従って、形が比較的一定である限り、分子はサイズを減少させながらカラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、分離が、ｐＨ、イオン強度、温度等などの全ての他の因子に独立的であるので、異なるサイズの分子の分離には卓越している。事実上全く吸収はなく、ゾーンの広がりも少なく、溶出容量は、分子量に単純に関連している。
【０２９７】
アフィニティークロマトグラフィーは、単離する物質とそれに特異的に結合できる分子の間の特異的親和性に依拠したクロマトグラフィー手順である。これは受容体−リガンド型相互作用である。カラム材料は、結合対の１つを不溶性マトリックスに共有結合させることにより合成する。その後、カラム材料は、溶液からの物質を特異的に吸着できる。溶出は、結合が起こらない条件へと条件を変化させることにより起こる（ｐＨ、イオン強度、温度等の変化）。
【０２９８】
炭水化物含有化合物の精製に有用な特定の型のアフィニティークロマトグラフィーはレクチンアフィニティークロマトグラフィーである。レクチンは、様々な多糖および糖タンパク質に結合する物質の１クラスである。レクチンは通常、臭化シアンによりアガロースに結合する。セファロースに結合したコンカナバリンＡは、使用されたこの種の最初の材料であり、多糖および糖タンパク質の単離に広く使用され、含まれる他のレクチンは、レンチルレクチン、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製に有用な小麦胚芽凝集素およびＨｅｌｉｘ  ｐｏｍｏａｔｉａレクチンを含む。レクチン自体は、炭水化物リガンドとアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製する。ラクトースは、トウゴマおよびピーナッツからレクチンを精製するのに使用され、マルトースは、レンズマメおよびタチナタマメからのレクチンの抽出に有用であり、Ｎ−アセチル−Ｄガラクトサミンは、大豆からのレクチンの精製に使用され、Ｎ−アセチルグルコサミニルは、小麦胚芽由来のレクチンに結合し、Ｄ−ガラクトサミンは、クラム由来のレクチンを得るのに使用され、Ｌ−フコースはロータス由来のレクチンに結合する。
【０２９９】
マトリックスは、それ自体では有意な範囲で分子を吸着せず、広範囲の化学的、物理的および熱的安定性を有する物質である。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさないように結合させる。リガンドはまた、比較的堅い結合を与える。サンプルまたはリガンドを破壊することなく物質を溶出できる。アフィニティークロマトグラフィーの最も一般的な形は、イムノアフィニティークロマトグラフィーである。本発明の使用に適切な抗体の作成は下記で議論する。
【０３００】
ＸＩ．定義
外因性遺伝子：外因性遺伝子の存在形で、与えられた宿主ゲノムには通常存在しない遺伝子。これに関し、遺伝子自体は、宿主ゲノムに天然であり得るが、しかし、外因性遺伝子は、１つ以上の異なる調節因子の付加または欠失により変化した天然遺伝子を含む。本発明に特に有用であると本発明者により考えられる外因性遺伝子の１つの型は、Ｃｉｏｘ属由来のプロモーターに機能的に連鎖したトウモロコシ遺伝子を含む。
発現：ポリペプチドを産生する構造遺伝子などのコードＤＮＡ分子により受ける転写および翻訳を含む、細胞内プロセスの組合せ。
子孫：特定の親植物または親植物のセット由来の、種子およびそれ由来の植物を含む、任意の後続の世代。
プロモーター：構造遺伝子の発現制御因子を与えるＤＮＡ配列または一群のＤＮＡ配列上の認識部位であって、それにＲＮＡ  Ａポリメラーゼが特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始する。
再生：植物細胞（例えば、植物プロトプラストまたは外植）から植物を成長させるプロセス。
【０３０１】
選択ＤＮＡ：宿主ゲノムに導入されたＤＮＡセグメント。好ましい選択ＤＮＡは、１つ以上の外因性遺伝子、並びに、プロモーターおよびターミネーターなどの宿主細胞で外因性遺伝子を発現させる因子を含む。利点は、１つ以上のエンハンサー因子を選択ＤＮＡと共に含ませることにより実現され得る。
形質転換：外因性ＤＮＡ配列または作成物（例えば、ベクターまたは発現カセット）を細胞またはプロトプラストに導入するプロセスであって、該外因性ＤＮＡは、染色体に取り込まれるか、または自律複製できる。
形質転換細胞：外因性ＤＮＡ分子のその細胞への導入によりＤＮＡが変化した細胞。
導入遺伝子：宿主ゲノムに導入されるＤＮＡセグメント。例示的導入遺伝子は、対応する非形質転換細胞または植物に比べ、新規な表現型をもつ、宿主細胞またはそれから再生された植物を与える。導入遺伝子は、タンパク質、ＲＮＡのみをコードし得るか、または転写または翻訳されない。個々の植物は、直接形質転換により、または親植物から遺伝されるか、またはその両方により導入遺伝子を与え得る。
【０３０２】
トランスジェニック細胞：形質転換細胞由来またはそれから再生された任意の細胞。例示的トランスジェニック細胞は、形質転換植物細胞由来の植物カルス、および、トラスジェニック植物から得られた葉、根、幹、例えば体細胞、または生殖（胚）細胞を含む。
トランスジェニック植物：形質転換植物細胞またはプロトプラストの、植物またはそれ由来の任意の後続の世代の子孫であって、植物ＤＮＡは、同株の天然の非トランスジェニック植物には元来存在しない導入外因性ＤＮＡ分子を含む。トランスジェニック植物は、追加的に、形質転換植物に天然な配列を含み得るが、ここで、「外因性」遺伝子は、遺伝子の発現のレベルまたはパターンを変化させるために遺伝子技術手段により変化している。
【０３０３】
輸送ペプチド：細胞内の特定の細胞小器官または他の場所にポリペプチドを指示できるポリペプチド配列。
ベクター：宿主細胞中で複製でき、および／または別のＤＮＡセグメントが、結合セグメントの複製をもたらすように機能的に連鎖できる、ＤＮＡ分子。プラスミドは、新規遺伝子を細胞に運ぶのに使用される例示的ベクターまたはＤＮＡ分子である。プラスミドは、独立的で、安定で、ＤＮＡの自己複製片である、例示的ベクターである。
【０３０４】
ＸＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実践によく機能すると本発明者により発見された技術を示し、従って、その実践の好ましい形態を構成できることが当業者により認識される。しかし、当業者は、本開示を鑑みて、多くの変化を、開示された具体的な実施形態に行うことができ、依然として本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、同等または類似の結果を得ることができることを認識する。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連したある物質を、本明細書に記載した物質と置換しても、同一または類似の結果が得られることは明らかである。当業者には明らかな全てのかかる類似置換および修飾は、添付した特許請求の範囲により定義された本発明の精神、範囲および概念内にあると考える。
【０３０５】
例１
Ｃｏｉｘからの相同的配列のクローニング
Ｃｏｉｘ  ｌａｃｒｙｍａ−ｊｏｂｉ種子（ＰＩ３２０８６５）は、ＵＳＤＡ／ＡＲＳプラント・イントロダクション・ステーション、エームズ、アイオワ州から得た。種子を発芽させ、数週間温室で成長させた。ゲノムＤＮＡを、以下のプロトコルに従って、２−３週目の葉材料から調製した。凍結葉組織（２ｇの新鮮重量）を、液体窒素下でガラス棒を用いて微細粉末に粉砕した。粉末化組織を十分に、８ｍｌの抽出緩衝液（１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０；５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１％ｖ／ｖ  ＳＤＳ；５００ｍＭ  ＮａＣｌ）と混合し、６０℃に前以て加熱し、次いで、６０℃で４５分間インキュベートした。次いで、サンプルを２．５ｍｌの氷冷５Ｍ酢酸カリウムと混合し、氷上で２０分間インキュベートした。タンパク質凝集物を、２０分間、３７５０ｒｐｍで遠心分離して除去し、上清を、ミラクロス層を通して注ぎ、次いで、５ｍｌのイソプロピルアルコールとの混合によりＤＮＡを沈降させた。沈降ＤＮＡを、１５分間、３７５０ｒｐｍで遠心分離して回収した。上清をペレット化ＤＮＡから注ぎ出し、チューブを５分間反転させて、残余上清がペレットから排出できるようにした。ＤＮＡを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３μｌのＲＮアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ原液）を含む、３００μｌの水に再度懸濁した。ＤＮＡを、５０μＬの４．４Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５．２、および３５０μＬのイソプロピルアルコールと混合し、次いで、１０分間、１４，０００ｒｐｍでマイクロ遠心機で遠心分離することにより、再度沈降させた。ＤＮＡペレットを、７５０μＬの８０％ｖ／ｖエタノールで洗浄し、次いで、１０分間反転させることにより排出させた。ＤＮＡを、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む、
２００μｌの水に再度懸濁した。ゲノムＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲ鋳型として使用するために、製造業者の指示に従って、ゲノムウォーカーＰＣＲキット（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア）を用いて作成した。
【０３０６】
次いで、γ−コイキシンタンパク質コード配列の５'に位置するＤＮＡセグメントを、以下の通りにＰＣＲ増幅した。ｇＣｏｉｘ５'ｎｅｓｔ２（配列番号１）およびｇＣｏｉｘ５'ｎｅｓｔ３（配列番号２）と称した、発表されたγコイキシン配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５９８５０）のそれぞれ２６７−２８８および２６−５３位に対応する、オリゴヌクレオチドプライマーの入れ子状態のセットを調製した。ＡＰ１（配列番号３）およびＡＰ２（配列番号４）と称したプライマーも使用し、（クロンテック）からの「ゲノムウォーカー」キットに提供した。プライマーの配列は、以下の通りである。
【０３０７】
ｇＣｏｉｘ５'ｎｅｓｔ２＝ＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＣＴＴＧＧＡ
ｇＣｏｉｘ５'ｎｅｓｔ３＝ＧＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴ
ＣＡＴＧＧ
ＡＰ１＝ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＡＰ２＝ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ
【０３０８】
ＰＣＲは以下の通りに実施した。第１に、長鋳型ＰＣＲシステム（ベーリンガーマンハイム（インディアナポリス、インディアナ）を、製造業者の指示に従って、以下の例外を除いて実施し、各反応は、３５０μＭ  ｄＮＴＰ、５００ｎＭの各プライマー、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２；１４ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ2およびゲノムウォーカーライブラリーからの２μｌ（＜２５ｎｇ）の鋳型ＤＮＡを含んだ。最初に使用したプライマーは、ｇＣｏｉｘ５'ｎｅｓｔ２およびアダプタープライマーＡＰ１であった。以下のサイクル条件を、加熱された蓋とＭＪリサーチＰＴＣ−１００サーモサイクラーを使用して実施した。
【０３０９】
９５°−１分間  １サイクル
９４°−３０秒間
７２°−３分間  ７サイクル
９４°−３０秒間
６７°−３分間  ３２サイクル
６７°−４分間  １サイクル
４°−維持
【０３１０】
次いで、この反応由来産物を、水で１：２５に希釈し、２μｌを鋳型として２ラウンドの増幅に使用した。プライマーを、ｇＣｏｉｘ５'ｎｅｓｔ３の入れ子状態のセットおよびアダプタープライマーＡＰ２に交換した。唯一の他の変化は、サイクル自体であり、これは以下の通りであった。
【０３１１】
９５°−１分間  １サイクル
９４°−３０秒間
７２°−３分間  ５サイクル
９４°−３０秒間
６７°−３分間  ２０サイクル
６７°−４分間  １サイクル
４℃−維持
【０３１２】
適切なサイズのバンド（５００ｂｐまたはそれ以上）を、ゲル電気泳動およびバンド切出しにより単離し、製造業者（インビトロゲン、カールズバッド、カリフォルニア）の指示に従って、プラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローニングした。ＤＮＡシークエンスを、慣用的なオリゴヌクレオチドまたはベクター局在プライマーおよびＡＢＩダイ−デオキシシークエンスキット（パーキンエルマー、アプライドバイオシステムズ、ノーウォーク、コネクチカット州）を使用して、製造業者の指示に従って実施した。シークエンス反応は、ＡＢＩプリズム３７３ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー、アプライドバイオシステムズ）を使用して分析した。ＰＣＲ産物の３'および５'末端の配列を得た後、プライマーを、簡便な制限酵素部位テイルを用いて設計し、ゲノムＤＮＡから直接γコイキ
シンプロモーターの増幅および続くクローニングを可能とした。プライマーｇｃｘ−１０００ｓｅｑ５'ｘｈｏ（配列番号５）、ｇｃｘ−１ｐｃｒ３'ｘｂａ（配列番号６）およびｇｃｘ−１ｐｃｒ３'ｎｃｏ（配列番号７）を合成した。プライマーの配列は以下の通りであった。
【０３１３】
ｇｃｘ−１０００ｓｅｑ５'ｘｈｏ＝ＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＣＣＧＧＴＴＡＣ
ＡＧＣＡＣＡＣＣＡＣＴＧ
ｇｃｘ−１ｐｃｒ３'ｘｂａ＝ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＴＣＧＡＴＣＴＴＣＴ
ＧＴＧＣＴＣＴ
ｇｃｘ−１ｐｃｒ３'ｎｃｏ＝ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＴＧＴＣＧＡＴＣＴＴＣＴ
ＧＴＧＣＴＣＴ
【０３１４】
次いで、γコイキシンプロモーターの増幅は、ｇｃｘ−１ｐｃｒ３'ｎｃｏおよびｇｃｘ−１０００ｓｅｑ５'ｘｈｏプライマーと共に、高忠実度ＰＣＲキット（ベーリンガーマンハイム）を使用して実施した。反応混液は、２００ｎｇのＣｏｉｘゲノムＤＮＡ鋳型、２００μＭ  ｄＮＴＰ、５００ｎＭの各プライマー、および５μｌの１０×緩衝液２番を含んだ。加熱された蓋とＭＪリサーチＰＴＣ−１００サーモサイクラーを用いて実施したサイクル条件は、以下の通りであった。
【０３１５】
９５°−２分間  １サイクル
９４°−１分間
５６°−１分間
７２°−１分間  ３２サイクル
７２°−４分間
４°−維持
【０３１６】
増幅後、アンプリコンを、ＧＵＳ発現ベクターｐＤＰＧ８２７（ｐＳＰ７２バックボーンのｍｃｓ／ＧＵＳ／ｎｏｓ；プロメガ社、マジソン、ウィスコンシン州）への方向性クローニング用に、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した。全プロモーター挿入断片、並びに、挿入接合部をシークエンスし、ベクターをｐＤＰＧ８４４（図１）と称した。次いで、ＤＮＡシークエンスを、慣用的なオリゴヌクレオチドまたはベクター局在プライマーおよびＡＢＩダイ−デオキシシークエンスキット（パーキンエルマー、アプライドバイオシステムズ、ノーウォーク、コネクチカット州）を使用して、製造業者の指示に従って実施した。シークエンス反応は、ＡＢＩプリズム３７３ＤＮＡシークエンサー（パーキンエルマー、アプライドバイオシステムズ）を使用して分析した。プロモーター挿入断片の配列は配列番号８に示す。
【０３１７】
γコイキシンプロモーター断片の平行的増幅を、ｇｃｘ−１ｐｃｒ３'ｘｂａおよびｇｃｘ−１０００ｓｅｑ５'ｘｈｏプライマーを使用して実施した。増幅産物を、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＧＵＳ発現ベクターｐＤＰＧ８２８（ｐＳＰ７２バックボーンのｍｃｓ／ｒｉｃｅアクチン  イントロンＩ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）にライゲートした。挿入接合部並びに全挿入断片をシークエンスし、ベクターはｐＤＰＧ８４５（図２）と称した。
【０３１８】
プラスミドｐＤＰＧ８４６（図３）およびｐＤＰＧ８４７（図４）の作成のために、γコイキシンプロモーターの増幅を、高忠実度ＰＣＲキット（ベーリンガーマンハイム）およびｇｃｘ−ｌｐｃｒ３'ｘｂａ（配列番号６）およびｇｃｘ−（４００）ｐｃｒ５'ｘｈｏ（配列番号２４）プライマーを使用して実施した。増幅産物をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＧＵＳ発現ベクターｐＤＰＧ８２７（ｐＳＰ７２バックボーンのｍｃｓ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）およびｐＤＰＧ８２８（ｐＳＰ７２バックボーンのｍｃｓ／ｒｉｃｅアクチン  イントロンＩ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）にライゲートし、それぞれ、ベクターｐＤＰＧ８４７およびｐＤＰＧ８４６を創製した。挿入接合部および全プロモーター挿入断片をシークエンスし、適切なベクターの作成を確認した。プロモーター挿入断片の配列は配列番号１９に示す。
【０３１９】
プラスミドｐＤＰＧ８４８（図５）およびｐＤＰＧ８４９（図６）を、ｐＤＰＧ８４６およびｐＤＰＧ８４７の作成に平行して作成した。γコイキシンプロモーター断片を、高忠実度ＰＣＲキット（ベーリンガーマンハイム）およびプライマーｇｃｘ−ｌｐｃｒ３'ｘｂａ（配列番号６）およびｇｃｘ−（２２０）ｐｃｒ５'ｘｈｏ（配列番号２５）を使用して増幅した。増幅産物をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＧＵＳ発現ベクターｐＤＰＧ８２７（ｐＳＰ７２バックボーンのｍｃｓ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）およびｐＤＰＧ８２８（ｐＳＰ７２バックボーンのｍｃｓ／ｒｉｃｅアクチン  イントロンＩ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）にライゲートし、それぞれ、ベクターｐＤＰＧ８４９およびｐＤＰＧ８４８を創製した。挿入接合部および全プロモーター挿入断片をシークエンスし、適切なベクターの作成を確認した。プロモーター挿入断片の配列は配列番号１８に示す。ｇｃｘ−（４０
０）ｐｃｒ５'ｘｈｏおよびｇｃｘ−（２２０）ｐｃｒ５'ｘｈｏの配列は下記および配列番号２４および配列番号２５に示した通りである。
【０３２０】
ｇｃｘ−（４００）ｐｃｒ５'ｘｈｏ  ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＴＡＴＧＣＡ
ＧＧＡ
ｇｃｘ−（２２０）ｐｃｒ５'ｘｈｏ  ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＴＣＧＧＣＴＴ
ＧＣＴ
【０３２１】
例２
γコイキシンターミネーターおよびコード配列の単離およびｐＤＰＧ８６９の作成
γコイキシンプロモーターの単離に使用したゲノムウォーカーキットおよびゲノムＤＮＡライブラリーは、γコイキシンターミネーター配列の単離にさらに使用した。全ＰＣＲ濃度およびサイクル条件は、全ラウンドについて（例１）プロモーター単離に使用したのと同一を維持した。唯一の変化は、使用したコイキシン特異的プライマーにあった。第１ラウンドのＰＣＲを、プライマーｇｃｘ５'ｐｃｒ２（配列番号９）およびＡＰ１を使用して実施し、２ラウンドは、プライマーｇＣｏｉｘ３'ｎｅｓｔ２（配列番号１０）およびＡＰ２を用いて実施した。プライマーの配列は以下の通りであった。
【０３２２】
ｇｃｘ５'ｐｃｒ２＝（ＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡ）
ｇＣｏｉｘ３'ｎｅｓｔ２＝（ＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＴＣ
）
【０３２３】
増幅産物は、ゲル電気泳動により分離し、次いで、適切なサイズのバンドを切出し、バンドを溶出し、製造業者の指示に従って、ＤＮＡをベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン、カールズバッド、カリフォルニア）にクローニングし、シークエンスした。γコイキシンターミネーターを含むこのクローンはＤＶ１０８（図１１）と称した。ターミネーターの配列は、配列番号１１に示す。
【０３２４】
γコイキシンタンパク質コード配列を得るために、ＰＣＲ増幅を、γコイキシン遺伝子のコード配列およびプロモーターの両方を含む増幅産物の単離に使用した。増幅は、下記に示した、プライマーｇｃｘ−１０００ｓｅｑ５'ｘｈｏ（配列番号１２）およびｇＣｏｉｘ３'ｐｃｒ（配列番号１３）を使用して実施した。
【０３２５】
ｇｃｘ−１０００ｓｅｑ５'ｘｈｏ＝ＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＣＣＧＧＴＴＡＣ
ＡＧＣＡＣＡＣＣＡＣＴＧ
ｇＣｏｉｘ３'ｐｃｒ＝ＴＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣ
【０３２６】
「マスターアンプ」キット（エピセンターテクノロジーズ、マジソン、ウィスコンシン）を使用して増幅を最適化した。プロモーター／コード増幅産物の配列は、緩衝液Ｄおよびロボサイクラー（ストラタジーン）での以下のプログラムを使用して得た。
【０３２７】
９４°−２分間  １サイクル
９４°−１分間
７３°−１分間
７２°−１分間  ３２サイクル
７２°−４分間  １サイクル
６°−維持
【０３２８】
次いで、この増幅物をｐＣＲ２．１にクローニングした。このプラスミド作成物を鋳型として使用して、次のＰＣＲ戦略を設計して、コード配列およびプロモーターを別々の反応産物として得た。以下のプライマーｇＣｏｉｘ５'ｐｃｒ＋４（配列番号１４）およびｇＣｏｉｘ３'ｐｃｒ＋ｓａｃ（配列番号１５）を、コード配列単独の増幅用に設計した。
【０３２９】
ｇＣｏｉｘ５'ｐｃｒ＋４＝ＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣＧＴＴＧＣＣＣＴＣ
ｇＣｏｉｘ３'ｐｃｒ＋ｓａｃ＝ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＧＧＣＡ
ＣＣＧＣＣＧＧＣ
【０３３０】
これらのプライマーは、上記に示したＧｅｎｂａｎｋ配列の塩基３１−５１および６０７−６２７にそれぞれ対応する。プライマーｇＣｏｉｘ５'ｐｃｒ＋４の使用により、γコイキシンタンパク質の開始コドンが欠失した増幅産物が得られる。ベーリンガーマンハイムの高忠実度ＰＣＲキットを、１００ｐｇのプラスミド鋳型、５００ｎＭの各プライマー１×緩衝液１および３ｍＭの最終濃度のＭｇＣｌ2中の２００μＭ  ｄＮＴＰの反応混液と共に使用した。加熱された蓋とＭＪサーチＰＴＣ−１００サーモサイクラーを使用して、サイクル条件を以下の通り実施した。
【０３３１】
９５°−２分間  １サイクル
９４°−１分間
６２°−１分間
７２°−１分間  ３２サイクル
７２°−４分間  １サイクル
４°−維持
【０３３２】
次いで、この反応産物をゲル電気泳動およびゲル切出しにより精製し、ｐＤＰＧ８４５へのクローニング用にＳａｃＩで消化した。プラスミドｐＤＰＧ８４５を、ＮｃｏＩで消化し、続いて、２単位のクレノウ酵素およびｄＮＴＰを各最終濃度０．２ｍＭとなるまで添加することにより、クレノウで５'オーバーハングを充填することにより調製した。これにより、ＡＴＧ開始コドンを直接γコイキシンタンパク質コード配列の５'末端にライゲートすることが可能となり、従って、γコイキシンの完全なオープンリーディングフレームが回復する。次いで、ベクターを、ＳａｃＩで消化し、ＧＵＳコード配列を除去して、γコイキシンコード配列の３'末端に適合性の部位を残す。次いで、調製されたｐＤＰＧ８４５ベクターおよびγコイキシンコード配列を共にライゲートし、ｐＤＰＧ８５１（図９）と称した新規なベクターを形成した。
【０３３３】
γコイキシンターミネーターによるｐＤＰＧ８５１でのｎｏｓターミネーターの置換を容易にするために、発現カセットを、より適切なベクター、例えば、ｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）に移動した。これは、ｐＢＫ−ＣＭＶを、ＳｃａＩ（平滑）で、およびｐＤＰＧ８５１をＸｈｏＩおよびＣｌａＩで消化し、続いて５'オーバーハングをクレノウで充填することにより（２単位のクレノウおよび０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ）実施された。ｐＤＰＧ８５１カセットおよびｐＢＫ−ＣＭＶのバックボーンをゲル精製した。次いで、２つのプラスミドをライゲートし、ｐＤＰＧ８６２（図１０）を作成した。
【０３３４】
γコイキシンターミネーターを、ｐＤＰＧ８６２のγコイキシンコード配列の３'末端にクローニングした。これは、最初に、ｎｏｓターミネーターを除去し、次いで、下記に示した段階の実施により、精製コイキシンターミネーターをその場所でクローニングすることにより実施された。ガンマコイキシンコード配列は、ＳｃａＩ部位を、報告されたＧｅｎｂａｎｋ配列の６２０−６２５の位置に有する。ゲノムウォーカー手順により得られたコード配列の一部の結果としてのｐＤＰＧ８６２およびＤＶ１０８に存在するこの制限部位を、ＳｃａＩ並びにＮｏｔＩで切断した。次いで、γコイキシンターミネーター配列を、ｐＤＰＧ８６２のバックボーンと同様に、ゲル精製した。これらの２つの断片をライゲートし、ｐＤＰＧ８６９（図７）を作成した。γコイキシンコード配列の配列は、配列
番号１６に示す。これらの各遺伝子作成物を、下記の例５および６に記載したトウモロコシの再生細胞に粒子衝撃により導入した。
【０３３５】
例３
Ｃｏｉｘオレオシン３ターミネーターの単離
例１および２でプロモーターおよびターミネーター配列の単離に使用したゲノムウォーカーキットおよびゲノムＤＮＡライブラリーはまた、Ｃｏｉｘオレオシン３ターミネーターの単離にも使用した。全ＰＣＲ濃度およびサイクル条件は、全ラウンドのＰＣＲについてこれらの例に使用したのと同一を維持した。唯一の変化は、使用したＣｏｉｘ特異的プライマーにあった。第１ラウンドのＰＣＲを、プライマーｃｘ−Ｌ３  ３'ｎｅｓｔ１（配列番号２６）およびＡＰ１（配列番号３）を使用して実施し、２ラウンドは、プライマーｃｘ−Ｌ３  ３'ｎｅｓｔ２（配列番号２７）、ｃｘ−Ｌ３  ３'ｎｅｓｔ３（配列番号２８）およびＡＰ２（配列番号４）を用いて実施した。プライマーの配列は以下の通りであった。
【０３３６】
ｃｘ−Ｌ３  ３'ｎｅｓｔ１  ＣＧＧＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡＣＣ
ＧＴ
ｃｘ−Ｌ３  ３'ｎｅｓｔ２  ＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＴＧＴＡＣＡＡＧＴ
ＡＣ
ｃｘ−Ｌ３  ３'ｎｅｓｔ３  ＴＣＣＡＡＧＧＣＣＣＧＣＧＡＣＧＴＣＡＡＧＧ
Ａ
【０３３７】
増幅産物を、ゲル電気泳動し、次いで、適切なサイズのバンド（＞５００ｂｐ）を切出し、バンドを溶出することにより分離し、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン）へのＤＮＡのクローニングは、製造業者の指示に従って実施し、クローニングＤＮＡを上記の通りシークエンスした。Ｃｏｉｘオレオシンターミネーターを含むこのクローンをＤＶ１１２と称した。オレオシンターミネーターの配列は配列番号１７に示す。
【０３３８】
例４
γコイキシンプロモーターとトウモロコシおよびソルガム由来の相同的プロモーターの配列比較
γ−プロラミンは、Ｃｏｉｘ、ソルガムおよびトウモロコシの胚乳に存在する種子貯蔵タンパク質の１クラスである。例１に記載の通りに本発明者によりクローニングされた、Ｃｏｉｘのγプロラミンプロモーター（γコイキシン、配列番号１８）、およびソルガム（γカフィリン、配列番号２２、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ６２４８０）およびトウモロコシ（γゼイン、配列番号２３、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５６１１７）由来の対応する配列のγプロラミンプロモーター領域間の配列類似性を決定するために、分析を実施した。ジーンワークスＤＮＡ分析ソフトウェア（インテリジェネティクス社、マウンテンビュー、カリフォルニア）を使用して翻訳開始コドンの上流８９４ヌクレオチドにアラインメントがなされた。アラインメントを容易にするためにギャップを導入した。各配列の３'最末端は、ＡＴＧ開始コドンに対応する。比較の結果は図８および表９に示す。分析により、γコイキシンとγカフィリンの間に６５％の配列同一性およびγコイキシンとγゼインの間に６３％の配列同一性が示される。これらの結果により、各３種のプロモーター領域間の有意な差異が示された。
【０３３９】
【表９】
2011101653.tif 000021
【０３４０】
例５
微粒子銃の調製
微粒子銃は、以下の通り調製した。６０ｍｇの０．６μｍの金粒子（バイオラッド、製造番号１６５−２２６２）を１０００μｌの無水エタノールに加え、少なくとも３時間室温でインキュベートし、次いで−２０℃で貯蔵することにより金粒子を調製した。２０−３５μｌの滅菌金粒子およびより好ましくは３０−３５μｌの金粒子（３０μｌは１．８ｍｇの粒子を含む）をマイクロ遠心機で１分以下遠心分離した。上清を除去し、１ｍｌの滅菌水をチューブに加え、２−５分間、１８００−２０００ｒｐｍで遠心分離した。微粒子銃粒子を、約２５０ｎｇのベクターＤＮＡを含む２５−３０μｌのＤＮＡ溶液に再度懸濁した。
【０３４１】
次いで、２２０μｌの滅菌水、２５０μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ2および５０μｌの原液スペルミジン（９８６μｌの水中１４μｌのスペルミジン）を、粒子含有溶液に加えた。次いで、溶液を十分に混合し、氷上に配置し、１０分間４℃でボルテックスをかけ、５分間、５００ｒｐｍで遠心分離した。上清を除去し、ペレットを６００μｌの無水エタノールに再度懸濁した。５分間、５００ｒｐｍで遠心分離した後、ペレットを、３６−３８μｌの無水エタノールに再度懸濁し、約２０秒間ボルテックスをかけ、２０−３０秒間超音波にかけた。この段階で、粒子を典型的には２−５分間静置させ、その後５−１０μｌの上清を除去し、フライアディスクの表面に分配し、エタノールを完全に乾燥させた。別に、粒子は、再度懸濁し、３６μｌ−３８μｌのエタノールに２０−３０秒間ボルテックスをかけた後に直接取り出し、フライアディスク上に配置し、静置処置で実施し
たと同様に乾燥させた。次いで、衝撃チャンバーを、衝撃前に約２８ｉｎ．Ｈｇまで排除した。次いで、粒子をデュポン微粒子銃ＰＤＳ１０００Ｈｅ粒子衝撃装置を使用して、約１１００プサイのヘリウム衝風による衝撃に使用した。
【０３４２】
例６
Ｈｉ−ＩＩ未成熟胚のボンバードメント
トウモロコシ遺伝子型Ｈｉ−ＩＩの未成熟胚（長さ１．２〜３．０ｍｍ）を、受粉の１０日〜１２日後のＨｉ−ＩＩの表面を滅菌し、温室で生長させた穂から切り取った。Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型は、Ａ１８８×Ｂ７３交雑（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１）から発育させた。ペトリ皿あたり約３０個の胚を、１ｍｇ／１，２，４−Ｄ、１００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、６ｍＭ  Ｌ−プロリン、０．５ｇ／ｌ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．７５ｇ／ｌ  ＭｇＣｌ2、および２ｇ／ｌ  Ｇｅｌｇｒｏでの２％凝固スクロース（ｐＨ５．８）（＃７３５培地）を含む改変Ｎ６培地に軸側を下にしてプレートした。胚を、２４℃の暗所で２〜４日間培養した。
【０３４３】
ボンバードメントの約３〜４時間前に、胚を、スクロース濃度を３％〜１２％に増加した上記の培地に移した。胚を高浸透圧培地に移した場合、胚は、ペトリ皿の中心から１ｃｍの場所から胚の根鞘の末端をペトリ皿の中心に向かうようにしてプレート上に同心円状に整列した。通常、プレートあたり２つの同心円を形成し、これはプレートあたり２５〜３５個の胚を有する。
【０３４４】
胚を含むプレートを、ストッピングスクリーンより５ｃｍ下の底から第３番目の棚に置いた。ボンバードメント用に、１１００ｐｓｉのラプチャーディスクを使用した。胚の各プレートを、ＤｕＰｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ＰＤＳ１０００Ｈｅ粒子銃で１回打ち込んだ。ボンバードメント後、胚を、一晩（１６〜２４時間）の高浸透圧培地（７３５、１２％スクロース）から回収し、１ｍｇ／ｌバイアラホス（＃７３９、７３５＋１ｍｇバイアラホスまたは＃７５０、７３５＋０．２Ｍマンニトール、および１ｍｇ／ｌバイアラホス）を含む選択培地に移した。胚を、２４℃の暗所に維持した。最初の選択プレートから３〜４週間後、約９０％の胚が典型的にＩＩ型カルスを形成し、３ｍｇ／ｌバイアラホス（＃７５８）を含む選択培地に移した。次いで、形質転換体の分析にサザン分析を使用することができ、遺伝子発現のアッセイを行うことができる。形質転換に使用
した構築物および形質転換体の数を、以下の表１０に示した。
【０３４５】
【表１０】
2011101653.tif 000022
例７
推定プロモーター調節エレメントの同定
各プロモーター配列内の推定調節エレメントの同定を、類似の組織特異的または発生的に固有の様式で発現することが公知のプロモーター配列との比較によって開始する。類似の発現パターンを有するプロモーター間で共有されている配列は、転写因子の結合の候補であるようであり、従って発現パターンを付与するエレメントであるようである。これらの推定調節エレメントの確認を、各プロモーターの欠失分析、その後の各構築物に機能的に結合したレポーター遺伝子のアッセイによる各欠失構築物の機能分析によって行う。
【０３４６】
このような分析を、クローニングしたγコイキシンプロモーターにより行った。トウモロコシγゼインおよびサトウモロコシγカフィリン遺伝子のプロモーターを有するＣｏｉｘγコイキシンプロモーターのＤＮＡ配列アラインメントを、例４に記載のように行い、これにより潜在的な転写因子結合部位を示す相同性を示すいくつかの短い領域が明らかとなった。これらの部位のいくつかはまた、サトウモロコシ貯蔵タンパク質プロモーターの推定調節配列として以前に同定されている（Ｏｔｔｏｂｏｎｉら、１９９３、ｄｅ  Ｆｒｅｉｔａｓら、１９９４）。４つの推定調節領域を同定した。２つの領域は、潜在的に窒素の状態に応答する可能性のある一般的なプロモーター活性を付与すると推定され、これらの領域を、ＧＣＮ４様領域と呼ぶ。２つの更なる領域は、組織特異的発現を付与すると
推定されプロラミン−ボックス結合領域と呼ぶ。このエレメントは、転写開始部位から１８０塩基対と７００塩基対との間で、メチオニン開始コドン（−１９０ｂｐ）に最も近位のＧＣＮ４ボックス、プロラミンボックス（−３９５ｂｐ）、第２のＧＣＮ４ボックス（−５２５ｂｐ）、そして最後に第２のプロラミンボックス（−６５０ｂｐ）の順に整列している。
【０３４７】
短縮プロモーター配列を、４１２ｂｐ（配列番号１９）および２２２ｂｐ（配列番号１８）（転写開始部位からの距離）のプロモーターフラグメントの作製によって推定組織特異的調節エレメントを特異的に取り除くように設計した。４１２ｂｐのプロモーターフラグメントには、近位ＧＣＮ４およびプロラミンボックスモチーフのみを含み、一方、２２２ｂｐフラグメントは、近位ＧＣＮ４モチーフのみを含み、両プロラミンボックスが取り除かれている。全長γコイキシンプロモーターに加えて、これらのプロモーターフラグメントを、発現を増大させるコメアクチン１イントロン１を含むか含まないＧＵＳレポーター遺伝子を含むベクターでクローニングした。これらのベクターを、ｐＤＰＧ８４４，８４５、８４６、８４７、８４８、および８４９と示し、それらの構築は上に記載している。各構築物を、未成熟のトウモロコシ胚に撃ち込み（例６に記載）、各プロモーター（導入遺伝子としてＧＵＳ構築物）を含む植物を作製した。
【０３４８】
これらの導入遺伝子を含む植物を、全ての植物組織において、多数の異なる発生段階でのＧＵＳレポーター遺伝子の発現について分析する。最も短いプロモーター構築物（２２１ｂｐ、ｐＤＰＧ８４８およびｐＤＰＧ８４９）は組織特異的発現パターンを示さないことが推定される。なぜなら、このプロモーターは、プロラミンボックス調節領域を欠いているからである。さらに、４１２ｂｐのプロモーター構築物ｐＤＰＧ８４６およびｐＤＰＧ８４７は組織特異性を保持するが、全長プロモーター構築物（ｐＤＰＧ８４４およびｐＤＰＧ８４５）と比較した場合、より低い発現レベルを駆動することが推測される。
【０３４９】
例８
トランスジェニックトウモロコシにおけるα−ゼイン遺伝子のセンス抑制およびＣｏｉｘプロモーターの使用による抑制の排除
トウモロコシにおけるセンスゼイン発現抑制カセットの発現は、ゼイン遺伝子がトウモロコシプロモーターによって調節されている場合、内因性ゼイン発現の抑制が誘導されることが示されている。Ｃｏｉｘプロモーターを使用した場合抑制が起こらないことを示すために、形質転換研究を行い、トウモロコシまたはＣｏｉｘｋプロモーターによって発現した構築物間で比較を行うことができる。このような研究を、以下のように行う。
【０３５０】
トウモロコシ細胞を、トウモロコシＺ４センスコード配列およびノパリンシンターゼ３’領域に作動可能に連結したトウモロコシＺ２７プロモーターを含むプラスミドベクターｐＤＰＧ５３１で１９９６年１２月９日に提出された米国出願第０８／７６３，７０４号（特に、その開示の全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のように形質転換した。ｐＤＰＧ５３１を、ベクターＳＰＺ４Ｅｎｔから約９６０塩基対のフラグメントを切断し、末端に充填することによって作製した（１９９６年１２月９日に提出された米国特許出願第０８／７６３，７０４号）。本質的に、全Ｚ４転写単位は、ＳＰＺ４Ｅｎｔ中に含まれ、全挿入サイズは９６０ヌクレオチドである。Ｚ４遺伝子を、２つのＺ４サブクローン（ｐＳＰＺ４Ｒ３’およびｐＳＰＺ４５’）から再構築した。親ベクターは、Ｚ４配列のヌクレオチド６３０からヌクレオチド１３４１の、中央の反復３’ヌクレ
オチド配列の７１３個のヌクレオチドを含むｐＳＰＺ４Ｒ３’であった。Ｚ４配列の５’末端を、ＳａｃＩ（挿入遺伝子の外側のポリリンカー配列を切断する）およびＢａｍＨＩでの消化によって遊離し、ＳａｃＩ（これもまたポリリンカー配列を切断する）およびＢａｍＨＩ消化によって得たｐＳＰＺ４５’由来の５’配列を含むインサートを、直線化ｐＳＰＺ４Ｒ３’ベクターにライゲートして、インタクトなＺ４転写単位を再構築した。得られたベクターは、プロモーターとターミネーターとの間に固有のＮｃｏＩ部位を含むｐＢＫ（−）中にＺ２７プロモーター：：Ｎｏｓ３’領域構築物を含む。ベクターおよびインサートを平滑末端に切断し、ライゲートした。クローンを、Ｚ４  ＤＮＡ配列（ｐＤＰＧ５３１）のセンス配向を用いて同定した。ｐＤＰＧ５３１は、２２ｋＤゼインタンパク質（αゼイン）への転写および翻訳が可能である。プラスミドｐＤＰＧ５３１お
よびｐＤＰＧ１６５を、以下の同時ボンバードメントによってトウモロコシ中に移入した。
【０３５１】
形質転換体を、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６１２８および１９９６年１２月９日に提出された米国特許出願第０８／７６３，７０４号（特に、これら両方の開示の全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のように再生した。手順を、以下に示した：遺伝子型Ａ１８８×Ｂ７３のトウモロコシ植物を、Ｈｉ−ＩＩトウモロコシ植物に交雑した（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１）。未成熟胚（長さ１．２〜２．０ｍｍ）を、受粉の１１日〜１２日後のＨｉ−ＩＩの表面を滅菌した、温室で生長させた穂から切り取った。未熟な胚由来のＩＩ型カルスの高頻度発達のために、Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型を、Ａ１８８×Ｂ７３交雑（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１）から発育させた。ペトリ皿あたり約３０個の胚を、１ｍｇ／１，２，４−Ｄ、１００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、６ｍＭ  Ｌ−プロリ
ン、０．５ｇ／ｌ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．７５ｇ／ｌ  ＭｇＣｌ2、および２ｇ／ｌ  Ｇｅｌｇｒｏでの２％凝固スクロース（ｐＨ５．８）（＃７３５培地）を含む改変Ｎ６培地に軸側を下にしてプレートした。胚を、２４℃の暗所で２〜４日間培養した。
【０３５２】
ボンバードメントの約４時間前に、胚を、スクロース濃度を３％〜１２％に増加した上記の培地に移した。胚を高浸透圧培地に移した場合、胚は、ペトリ皿の中心から２ｃｍの場所から胚の根鞘の末端をペトリ皿の中心に向かうようにしてプレート上に同心円状に整列した。通常、プレートあたり２つの同心円を形成し、これは２５〜３５個の胚を有する。胚を含むプレートを、ストッピングスクリーンより５ｃｍ下の底から第３番目の棚に置いた。１１００ｐｓｉのラプチャーディスクを使用した。胚の各プレートに、１回打ち込んだ。胚を、選択の開始前に高浸透圧強度の培地で一晩置いてから回収した。
【０３５３】
一晩（１６〜２４時間）の高浸透圧培地（７３５、１２％スクロース）から回収後、胚を、１ｍｇ／ｌバイアラホス（＃７３９、７３５＋１ｍｇバイアラホスまたは＃７５０、７３５＋０．２Ｍマンニトール、および１ｍｇ／ｌバイアラホス）を含む選択培地に移した。胚を、２４℃の暗所に維持した。最初の選択プレートから３〜４週間後、約９０％の胚がＩＩ型カルスを形成し、３ｍｇ／ｌバイアラホス（＃７５８）を含む選択培地に移した。バイアラホス耐性組織を、約２週間ごとに新鮮な選択培地（＃７５８）に交換しながら継代培養した。形質転換胚形成カルスを、再生培養培地（０．９１ｍｇ／Ｌ  Ｌ−アスパラギン、１．４ｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン、２０ｇ／Ｌ  Ｄ−ソルビトール、０．０４ｍｇ／Ｌ酢酸ナフタレン（ＮＡＡ）、および３ｍ／Ｌ  ６−ベンジルアミノプリンを含むＭＳ
培養培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ、１９６２））に移した。細胞を、この培地で約２週間毎に新鮮な培地に移しながら約４週間成長させた。次いで、形質転換体を、ＭＳ０培養培地（植物ホルモン無添加のＭＳ培地）に移した。再生植物を、土壌に移した。植物を、純系トウモロコシ（ＡＷ、ＣＶ、およびＤＪと呼ばれる）と交雑した。Ｚ２７発現カセットを含む種子を、ｏｐａｑｕｅ−２変異穀粒の穀粒に類似の表現型である不透明体であった。植物を、３つのＺ２７−Ｚ４センス発現カセットから再生し、ＡＷ、ＣＶ、およびＣＮと呼ばれる純系と交雑した。
【０３５４】
非形質転換トウモロコシ植物およびＺ２７−Ｚ４センス形質転換体に存在するα−ゼインタンパク質の量を、以下に記載のようにコマジブルー染色ポリアクリルアミドゲルによって比較した。５０ｍｇの粉末の穀粒を、０．５ｍｌの７０％エタノール、１％のβ−メルカプトエタノール中に懸濁し、室温で３０分〜一晩抽出した。サンプルをボルテックスし、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ゼインタンパク質を含む５０μｌの上清を取り出し、乾燥した。ゼインタンパク質を、１％のβ−メルカプトエタノールを含む５０：１のＳＤＳポリアクリルアミドゲルローディング緩衝液中に再懸濁した。タンパク質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離して、コマジーブルーで染色した。
【０３５５】
Ｚ２７Ｚ４センス形質転換体に存在するαゼインタンパク質レベルの驚くべき減少したという結果を示した。この減少を、アンチセンス形質転換体において観察される減少と比較した。センス形質転換体におけるゼインタンパク質濃度の予想外の減少に加えて、ゼイン含有量が減少した種子もまた、不透明体表現型およびＺ２７ゼインレベルの減少が、一般に示された。
【０３５６】
各穀粒由来の種子におけるリジンおよびロイシン濃度もまた分析した。アミノ酸を、以下のように３つの独立した形質転換系由来の未熟な穀粒から抽出した。５０ｍｇの粉末コーンミールを、アルゴンガス下の１１０℃で２４時間１ｍｌの６Ｎ  ＨＣｌ中で水和した。サンプルを、５０ｍｌに希釈し、０．４５ミクロンのフィルターでろ過した。ＨＰＣＬ分析前に、内部標準としてノルバリンを、各サンプルに添加した。アミノ酸を、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−８  ＨＰＣＬカラム（Ｊａｒｒｅｔｔら、１９８６、Ｊｏｎｅｓら、１９８３、ＡＡＣＣ、１９９５）で分離した。単一の穀粒の分析結果により、形質転換穀粒と非形質転換穀粒との間の相違が、ｐ＜０．０５のレベルで有意であることが明らかになった。１つの形質転換体（ＫＱ０１８と呼ばれる）では、リジンおよびロイシンレベルは、同質遺伝子的形質転換種子および非形質転換種子において統計的に同一であった。しかし、ＫＱ０１２と呼ばれる形質転換体では、リジンレベルは、形質転換体において統計的に増加し、ロイシンレベルは、形質転換体において統計的に有意に減少した。従って、Ｚ２７プロモーター−Ｚ４センス形質転換体は、アンチセンス形質転換体において認められるものと類似の種子形態、タンパク質、およびアミノ酸組成表現型を産生することを示す。これは、相同性依存遺伝子サイレンシングの結果として起こると考えられる。
【０３５７】
トウモロコシＺ２７プロモーターが相同性Ｃｏｉｘ遺伝子由来のＣｏｉｘプロモーターと置換される場合に相同性ベースの遺伝子サイレンシングが起こらないことを示すために、Ｚ２７遺伝子に相同性を有するＣｏｉｘ遺伝子から単離されたプロモーターを含むプラスミドベクターを構築した。このプロモーターはＺｅａ  ｍａｙｓ  Ｚ４コード配列に作動可能に連結されている。プロモーター配列を、例１に記載のストラテジーを用いて単離する。次いで、Ｃｏｉｘ−プロモーター−Ｚ４コード配列ベクターを、上記のトウモロコシ中に形質転換する。ベクターを含むトランスジェニック植物を、上記のように再生し、非形質転換純系と交雑する。次いで、α−ゼインの量を測定してＣｏｉｘ由来のプロモーター−Ｚ４構造遺伝子発現カセットを含む形質転換体における導入遺伝子発現の減少していないことを示す。さらに、形質転換体を含む天然のプロモーターと比較したＣ
ｏｉｘ由来のプロモーター−Ｚ４構造遺伝子発現カセットの発現の増加を、Ｃｏｉｘ由来のプロモーター−Ｚ４構造遺伝子発現カセットを有する植物における不透明体表現型の欠如によって示す。Ｃｏｉｘプロモーター−Ｚ４構造遺伝子発現カセット形質転換体のリジンおよびロイシン濃度の分析もまた、リジンレベルが増加せず、ロイシンレベルは減少しないことが示され、これにより、トウモロコシＺ２７プロモーターを用いて示されたように、センス同時抑制は、Ｃｏｉｘ由来のプロモーターを含むトウモロコシ形質転換体には認められないことが示される。
【０３５８】
例９
Ｈ９９未成熟胚またはカルスの形質転換およびパロモマイシンを用いた選択  トウモロコシ未成熟胚（１．２〜３．０ｍｍ、受粉後１０〜１４日目）を、自家受粉または同胞受粉されている温室で生長したＨ９９植物から単離する。未成熟胚を、７３５培地において約２７℃の暗所で培養する。未成熟胚を、単離の１〜６日後に撃ち込むか、ボンバードメントに使用される胚形成カルスを作製するために培養する。胚形成カルスを拡大し、２〜３週間間隔で新鮮な７３５培地を交換しながら継代培養することによって維持する。ボンバードメントの前に、培養した胚または胚形成カルス（約２〜４ｍｍの凝集塊に細分）を、１２％スクロースを含む７３５培地に移し、３〜６時間静置する。ボンバードメント後、例６に記載のように、組織培養物を一晩インキュベートし、５００ｍｇ／Ｌパロモマ
イシンを含む７３５培地に移す。２〜３週間後、カルスを小片（直径約２〜４ｍｍ）に細分し、新鮮な選択培地に移す。この継代培養工程を、ボンバードメント後２〜３週間間隔での細分を約１５週間反復し、健全に生長しているカルスについて視覚的選択を行う。
【０３５９】
パロモマイシン耐性カルスを、２，４−Ｄを含まないが、３．５２ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰを含む７３５培地に移して２７℃の暗所で３〜９日間静置し、その後Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（Ｓｉｇｍａ）中に溶解した１００ｍｇ／Ｌパロモマイシンを含む１１０培地（１／２×ＭＳ塩、０．５ｍｇ／Ｌチアミン、０．５ｍｇ／Ｌニコチン酸、３％スクロース、３．６ｇ／Ｌ  Ｇｅｌｇｒｏ、ｐＨ５．８）に移し、２７℃の明所で培養する。次いで、Ｐｈｙｔａｔｒａｙ中で３〜６週間発育させた植物を、土壌に移す。植物をグロースチャンバーに馴化させ、成熟するまで温室で生長させる。
【０３６０】
例１０
γコイキシンプロモーターの調節下でのＧＵＳレポーター遺伝子の発現
標準的な組織化学的ＧＵＳ活性染色
１）ＧＵＳアッセイ緩衝液用のストック溶液を合わせ、新鮮な溶液を調製する。
フェリシアン化カリウム    ５０ｍＭストック              １ｍＬ
フェロシアン化カリウム    ５０ｍＭストック              １ｍＬ
リン酸ナトリウム緩衝液    ２００ｍＭストック（ｐＨ７．０）  ５ｍＬ
ＥＤＴＡナトリウム        １０ｍＭストック（ｐＨ８．０）  １ｍＬ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １０％ｖ／ｖストック          １ｍＬ
【０３６１】
２）アッセイ緩衝液混合物を０．２ミクロンのフィルターでろ過滅菌する。
【０３６２】
３）発色基質は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に２５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したＸ−ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）である。
【０３６３】
４）以下の試薬を合わせることによってＧＵＳアッセイ作用溶液を調製する。
リン酸ナトリウム緩衝液      ２００ｍＭ（ｐＨ７．０）    ２６ｍＬ
ＧＵＳアッセイ緩衝液        （上記の工程１と同一）      ９ｍＬ
Ｘ−ｇｌｕｃ基質            ２５ｍｇ／ｍＬストック      １．２ｍＬ
【０３６４】
５）組織を、３７℃のＧＵＳアッセイ混合液中でインキュベートする。活性ＧＵＳ酵素を含む組織において青色を呈する。必要ならば、組織を、室温で一晩かそれより長い時間インキュベートすることができる。
【０３６５】
例７に記載のトランスジェニック植物由来の穀粒を、ＧＵＳ遺伝子発現についてアッセイした。穀粒を、受粉の９日後（ＤＡＰ）〜２７ＤＡＰの各Ｒ０トランスジェニック植物から得た。穀粒を、カミソリの刃で長軸方向にスライスした。穀粒切片を、２４ウェルマイクロタイターディッシュのウェルに置き、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎによって記載された方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．、１９８７）を用いて室温のＧＵＳアッセイ溶液中でインキュベートした。ＧＵＳ活性を示す青色を０〜４（０、青色を呈さない；４、強い青色を呈する）のスケールを用いて記録した。
【０３６６】
穀粒におけるＧＵＳの発現についてＲ０段階をアッセイした植物のうち、青色を呈した植物は、ＧｃｘＰｒｏ（９００）／ＧＵＳ／ＮＯＳ構築物を含む９つの植物のうち５つ、ＧｃｘＰｒｏ（９００）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ構築物を含む９つの植物のうち４つ、ＧｃｘＰｒｏ（４００）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ構築物を含む１２つの植物のうち３つ、およびＧｃｘＰｒｏ（２２０）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ構築物を含む６つの植物のうち２つにおいて認められた（表１１）。試験した植物のうちＧｃｘＰｒｏ（４００）／ＧＵＳ／ＮＯＳ構築物またはＧｃｘＰｒｏ（２２０）／ＧＵＳ／ＮＯＳ構築物のいずれかを含む植物は、穀粒にいて青色を全く呈さなかった。
【０３６７】
穀粒の異なる部分における青色染色に関して空間的なパターンもまた観察した。ＧｃｘＰｒｏ（９００）／ＧＵＳ／ＮＯＳ植物由来の穀粒は、デンプン質の内胚乳において最も強く染色し、いくつかの穀粒に限ってアリューロンにおいて染色を示する排他的な発現パターンを示し、ＧｃｘＰｒｏ（９００）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ植物由来の穀粒は、主に内胚乳のデンプンにおいて染色パターンを示し、いくつかの穀粒に限って胚では軽度の染色を示し、ＧｃｘＰｒｏ（４００）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ植物またはＧｃｘＰｒｏ（２２０）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ植物のいずれか由来の穀粒では、内胚乳および胚のいずれも染色し、内胚乳特異的発現パターンの損失を示した。ＧｃｘＰｒｏ（４００）／ＧＵＳ／ＮＯＳ植物またはＧｃｘＰｒｏ（２２０）／ＧＵＳ／
ＮＯＳ植物由来の穀粒では青色は検出できなかった。ＧｃｘＰｒｏ（９００）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ導入遺伝子またはＧｃｘＰｒｏ（９００）／ｒＡｃｔｉｎ１／ＧＵＳ／ＮＯＳ導入遺伝子のいずれかを発現する植物はまた、一時的に調節された染色パターンを示し、古い種子は幼若な種子よりも青色染色度が高い（表１２）。
【０３６８】
【表１１】
2011101653.tif 000023
【０３６９】
【表１２】
2011101653.tif 000024
【０３７０】
例１１
微粒子銃法についての一般的方法
微粒子法の技術は多数の変形が当該分野で周知であり、本発明に有用であると思われる。微粒子法の例示的な手順は、たとえば、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８（特に、その全体が本明細書中で参考として援用される）で考察されている。例として、本発明で使用することができる標的組織には、未成熟胚、Ｉ型カルス、ＩＩ型カルス、ＩＩＩ型カルス、懸濁培養、および分裂組織（ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０４３９２）が含まれる。トウモロコシ形質転換に特に有用ないくつかの遺伝子型が、本明細書中ならびに例えばＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８で特に開示されている。好ましい遺伝子型は、容易に形質転換でき、また再生して稔性トランスジェニック植物を得ることができる遺伝子型である。
【０３７１】
任意の微粒子の加速法を用いて本発明の植物細胞を潜在的に形質転換することができる。好ましい方法は、ＤｕＰｏｎｔ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ＰＤＳ１０００Ｈｅ粒子ボンバードメントデバイスなどのガス圧式粒子銃である。例として、ボンバードメント用の粒子には、タングステン、金、白金などからなる粒子が含まれる。本発明では金粒子が特に有用であると思われ、０．６μｍまたは０．７μｍの金粒子が好ましく、０．６μｍの粒子が最も好ましい。最も好ましい粒子は、ＤＮＡコーティングされた平均サイズが０．６μｍと１．０μｍとの間の粒子である。
【０３７２】
本明細書中で開示のように、任意のＤＮＡ配列が形質転換に潜在的に使用される。形質転換に使用されるＤＮＡセグメントには、１つまたは複数の選択マーカー、分泌マーカー、またはスクリーニングマーカーが含まれることが好ましい。このような多くの例が当該分野で周知であり、特に、本明細書中で開示されている。選択マーカーの場合、固体または液体培地中で選択することができる。好ましくは、使用したＤＮＡセグメントには、単独または他の配列との組み合わせのいずれかで、形質転換植物の所望の表現型を付与する１つまたは複数の遺伝子も含まれる。例として、形質転換用の遺伝子およびこれらの配列によって形質転換植物に付与することができる対応表現型を、本明細書中で開示する。
【０３７３】
例１２
優秀な純系および雑種への導入遺伝子の遺伝子移入
戻し交雑を用いて開始植物を改良することができる。戻し交雑により、ある供給源からの特定の所望の特性をその特性を欠く雑種または他の植物に導入する。これは、例えば、最初により優れた純系（Ａ）（再現性のある親）と目的の性質の適切な遺伝子を保有するドナー雑種（非再現性の親）（例えば、本発明で調製された構築物）との交雑により行うことができる。この最初の交雑の子孫において非再現性の親から導入された所望の性質を得た子孫を選択し、選択した子孫を優れた再現性のある親（Ａ）に戻し交雑する。所望の性質についての選択を用いた５回またはそれ以上の戻し交配後、子孫は、導入された特徴を調節する遺伝子座についてヘミ接合性であるが、多数またはほとんどの他の遺伝子については優れた親と同様である。最後の戻し交雑世代は、少なくとも１回自家受粉して、導
入遺伝子について純粋交配される子孫（すなわち、１つまたは複数の形質転換事象）を得るだろう。
【０３７４】
従って、一連の育種操作、選択ストラテジーによって、さらなる組換え操作を必要とせず、ある系統を全く異なる系統に移動させることができる。導入遺伝子は、典型的には、それらが他の任意の遺伝子として遺伝的にふるまい、他の任意のトウモロコシ遺伝子と同一の様式での育種技術によって操作することができるという点で価値がある。したがって、１つまたは複数の導入遺伝子のための真の育種である純系植物を作製することができる。異なる純系植物の交雑によって、異なる導入遺伝子の組み合わせを有する多数の異なる雑種を作製することができる。この方法では、雑種に頻繁に関連する所望の農学的性質（「雑種強勢」）ならびに１つまたは複数の導入遺伝子によって付与される所望の特徴を有する植物を作製することができる。
【０３７５】
例１３
マーカー補助による選択
遺伝子マーカーを用いて、ある遺伝的背景由来の本発明の１つまたは複数の導入遺伝子の他の遺伝子への遺伝子移入を補助することができる。マーカー補助による選択は、表現型の変異によって生じるエラーを回避することができるという点で、従来の育種と比較して利点がある。さらに、遺伝子マーカーは、特定の交雑の各子孫における優秀な生殖質の相対度に関するデータを得ることができる。例えば、他の非農学的に所望の遺伝的背景を有する所望の特性を有する植物が優秀な親と交雑した場合、遺伝子マーカーを使用して目的の特性を保有するだけでなく所望の生殖質の比率が比較的多い子孫を選択することができる。この方法で、１つまたは複数の性質を特定の遺伝子背景に遺伝子移入するために必要な世代数が最小化される。
【０３７６】
マーカー補助による育種の方法では、ＤＮＡ配列を使用して、植物育種の方法における所望の農学的特性（Ｔａｎｋｓｌｅｙら、１９８９）を追跡する。マーカー補助による育種を、以下のように行うことができる。所望の特性を有する植物の種子を、温室または野外の土壌に植える。任意の成長点でのＤＮＡの調製用に、葉の組織を植物から収穫したが、植物の生存度を損なうことなく、その植物の成長点から約１ｇの葉の組織を取り出すことができる。Ｓｈｕｒｅら、１９８３を改変した手順を用いて、ゲノムＤＮＡを単離する。芽生え由来の約１ｇの葉の組織を、１５ｍｌのポリプロピレンチューブ中で一晩凍結乾燥した。凍結乾燥組織を、そのチューブ中でガラス製の棒を用いて粉末に挽く。粉末組織を、３ｍｌの抽出緩衝液（７．０尿素、０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％サルコシン）を用いて完全に混合する。組織／緩衝液ホモジネートを、３ｍｌのフェノール／クロロホルムで抽出する。水相を遠心分離によって分離し、１／１０体積の４．４Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）および同体積のイソプロパノールを用いて２回沈殿させる。沈殿物を７５％エタノールで洗浄し、１００〜５００μｌのＴＥ（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中に再懸濁する。
【０３７７】
次いで、ゲノムＤＮＡを、３倍過剰の制限酵素で消化し、０．８％アガロース（ＦＭＣ）で電気泳動し、１０×ＳＣＰ（２０ＳＣＰ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．６Ｍリン酸ニナトリウム、０．０２ＭＥＤＴＡ二ナトリウム）を用いてＮｙｔｒａｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）にトランスファーする（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）。ろ紙を、６×ＳＣＰ、１０％硫酸デキストラン、２％サルコシン、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡならびにランダムプライミング（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ＆Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９８３）によって作製した32Ｐ標識プローブ中でプレハイブリダイズする。ハイブリダイズしたろ紙を、６５℃の２×ＳＣＰ、１％ＳＤＳ中で３０分間洗浄し、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ５フィルムを用いたオートラジオグラフィーによって視覚化する。目的の特性に遺伝的に連結した遺伝的多形使用して目的の特性の有無を推測する。
【０３７８】
植物組織からＤＮＡを単離するための多数の異なる方法が存在し、同一の結果を得るサザンハイブリダイゼーション用の多数の異なるプロトコールが存在することが当業者に認識される。サザンブロットによりオートラジオグラフィー後の放射性プローブを取り除き、異なるプローブで再探索することができることが当業者に認識される。この様式では、植物に存在する種々の各導入遺伝子を同定することができる。さらに、特性の相対的な有無を同定する目的で、目的の領域で多形性である任意の型の遺伝子マーカーを使用することができ、このような情報をマーカー補助による育種に使用することができることが当業者に理解される。
【０３７９】
サザンブロットの各レーンは、１つの植物から単離したＤＮＡを示す。同一のゲノムＤＮＡブロットのプローブとしての様々な遺伝子組み込み事象の使用によって、各植物の組み込み成分を同定することができる。植物の表現型への特定の組み込み事象の寄与との間の関連を確立することができる。組み込み事象の所望の組み合わせを含む植物のみが、成熟に利点があり、受粉に使用することができる。特定の導入遺伝子組み込みに相当するＤＮＡプローブは、農耕用の植物を生長させアッセイすることなく特定の組み込み事象を同定および組み合わせるための植物育種の過程における有用なマーカーである。
【０３８０】
１つまたは複数の制限酵素を単独か組み合わせて使用してゲノムＤＮＡを消化することが予想される。多くの異なる制限酵素が有用であり、制限酵素の選択がプローブとして使用される導入遺伝子の組み込み事象のＤＮＡ配列および導入遺伝子を取り囲むゲノム中のＤＮＡ配列に依存することが当業者に認識される。プローブ用に、形質転換のために使用したＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を使用することが望まれる。導入遺伝子組み込み事象として同定可能なハイブリダイゼーション後のＤＮＡフラグメントを作製する制限酵素が選択される。従って、特に有用な制限酵素は、特定の導入遺伝子または目的の特性に遺伝的に連結した多形性を明らかにする制限酵素である。
【０３８１】
例１４
一般的なアッセイ法
形質転換植物のＤＮＡ分析を以下のように行う。ゲノムＤＮＡを、Ｓｈｕｒｅ，ｅｔ  ａｌ．、１９８３を改変した手順で単離する。約１ｍｇのカルスまたは葉の組織を、液体窒素中で乳鉢および乳棒を用いて細かい粉末状に挽く。粉末組織を、４ｍｌの抽出緩衝液（７．０尿素、０．３５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１％サルコシン）を用いて完全に混合する。組織／緩衝液ホモジネートを、４ｍｌのフェノール／クロロホルムで抽出する。水相を遠心分離によって分離し、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈでろ過し、１／１０体積の４．４Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２）および同体積のイソプロパノールを用いて２回沈殿させる。沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、２００〜５００μｌのＴＥ（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））中に再懸濁する。
【０３８２】
形質転換細胞中のＤＮＡ配列の存在を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって検出することができる。この技術を使用して、ＤＮＡの特定のフラグメントを増幅し、その後のアガロースゲル電気泳動によって検出することができる。例えば、２００ｎｇ〜１０００ｎｇのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌゼラチン、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、正方向および逆方向ＤＮＡプライマー、２０％グリセロール、ならびに２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物に添加する。反応を、サーマルサイクリング装置で以下のように行う。９４℃で３分間保温後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で３０秒を３９サイクル、その後７２℃で５分間合成。２０μｌの各反応混合物を、ＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ
酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の３．５％ＮｕＳｉｅｖｅゲルで５０Ｖで２〜４時間分離する。この手順を用いて、例えば、正方向プライマーＣＡＴＣＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣ（配列番号２０）および逆方向プライマーＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡ（配列番号２１）を用いてｂａｒ遺伝子の存在を検出することができる。
【０３８３】
フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の存在の検出法には、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０６１２８（特に、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素反応および薄層クロマトグラフィーの使用が含まれる。この手順を、潜在的に形質転換された細胞のホモジネートおよび形質転換もバイアラホス選択に暴露もしていないコントロール細胞からの種々のタンパク質抽出物の調製、ＰＰＴおよび14Ｃ−アセチル補酵素Ａとのインキュベーションによるアッセイ、その後の薄層クロマトグラフィーによって行う。このアッセイの結果により、ＰＡＴをコードするｂａｒ遺伝子の発現が確認される。
【０３８４】
サザンブロット分析用に、ゲノムＤＮＡを、３倍過剰の制限酵素で消化し、０．８％アガロース（ＦＭＣ）で電気泳動し、１０×ＳＣＰ（２０×ＳＣＰ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．６Ｍリン酸ニナトリウム、０．０２ＭＥＤＴＡ二ナトリウム）を用いてＮｙｔｒａｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）にトランスファーする（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）。プローブを、ランダムプライミング法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて32Ｐで標識し、Ｑｕｉｋ−Ｓｅｐ（登録商標）スピンカラム（Ｉｓｏｌａｂ  Ｉｎｃ．、Ａｋｒｏｎ、ＯＨ）を用いて精製する。ろ紙を、６×ＳＣＰ、１０％硫酸デキストラン、２％サルコシン、および５００μｇ／ｍｌヘパリン（Ｃｈｏｍｅｔら、１９８７）中で１５分間プレハイブリダイズする。次いで、ろ紙を６５℃の１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび32Ｐ標識プローブを含む６×ＳＣＰ中で一晩
ハイブリダイズする。ろ紙を、６５℃の２×ＳＣＰ、１％ＳＤＳ中で３０分間洗浄し、Ｋｏｄａｋ  ＸＡＲ５フィルムを用いたオートラジオグラフィーによって視覚化する。再ハイブリダイゼーション用に、ろ紙を、蒸留水中で１０分間ボイルして最初のプローブを取り除いた後、上記のように再ハイブリダイズする。
【０３８５】
例１５
トランスジェニック作物の利用
植物形質転換の最終目的は、人類に有用な植物を作製することである。これに関して、本発明で作製したトランスジェニック植物を、生産者または消費者に価値があると思われる任意の目的のために実質的に使用することができる。例えば、トランスジェニック植物由来の種子の収穫を所望することができる。この種子を、広範な種々の目的のために代用することができる。この種子を、植付け用に生産者に販売するか、動物またはヒトの食物として直接使用することができる。あるいは、種子自体から製品を作製することができる。例として、この種子から作製することができる製品には、油、デンプン、動物またはヒトの食物、医薬品、および種々の産業製品が含まれる。穀粒のヒトによる消費に加えて、トウモロコシの食品としての使用には、乾式および湿式製粉産業製品が含まれる。トウモロコシ乾式製粉による主な製品は、粗びき粉、ひき割り粉、および粉末である。トウモロコシの湿式製粉により、食用のトウモロコシデンプン、トウモロコシシロップ、およびデキストロースを得ることができる。乾式および湿式製粉の副産物として、トウモロコシ胚からトウモロコシ油が回収される。
【０３８６】
植物の子実および非子実部分を含むトウモロコシはまた、主に、肉牛、乳牛、ブタ、家禽類の家畜の餌として広く使用されている。トウモロコシの産業的使用には、湿式製粉産業においては、エタノールおよびトウモロコシデンプンの生産、および乾式製粉産業においてはトウモロコシ粉の生産が含まれる。トウモロコシデンプンおよびトウモロコシ粉の産業的適用は、粘度、フィルム形成、粘着性、および粒子の懸濁能力などの機能的性質に基づく。トウモロコシデンプンおよびトウモロコシ粉は、製紙および繊維産業に適用される。他の産業用途には、接着剤、建材、鋳造結合剤、洗濯糊、爆発物、油井のボーリング泥水、および他の鉱山業への適用が含まれる。トウモロコシの子実以外の植物部分も産業に使用されており、たとえば、軸および皮を使用して紙および壁張り用材を作製し、穂軸
は燃料や炭の作製に使用されるる。植物利用の他の手段（本発明を用いて作製することができる手段など）が、農業発祥時から周知であり、本発明の開示と照らして当業者に公知である。作物の特定の利用法は、例えば、Ｓｐｒａｇｕｅ  ａｎｄ  Ｄｕｄｌｅｙ（１９８８）およびＷａｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｍｓｔａｄ（１９８７）から見出すことができる。
【０３８７】
本明細書中で開示され請求された組成物および方法の全てが、本発明の開示に照らして過度の実験を行わずに作製および遂行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物および方法ならに方法の工程または工程の順序を変更することができることが当業者には自明である。より詳細には、化学的および物理的に関連する特定の薬剤を本明細書中に記載の薬剤と交換することができ、それにより同一または類似の結果が得られることが自明である。
【０３８８】
参考文献
以下の参照文献は、本明細書に示される方法及び詳記を補足する例示的な方法及び詳記の程度で、引用することにより、本明細書に特に組み込まれるものとする。
【０３８９】
【表１３】
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【０３９０】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011101653.tif 000047
【図８−１】
2011101653.tif 000048
【図８−２】
2011101653.tif 000049
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2011101653000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月26日(2011.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）選択された遺伝子を準備するステップと、
（ｂ）Ｃｏｉｘプロモーターに作動可能に連結した該遺伝子を含む構築物を調製するステップと、
（ｃ）Ｃｏｉｘ以外の単子葉植物からの受容細胞を該構築物により形質転換するステップと、
（ｄ）該受容細胞から該遺伝子を発現する単子葉植物を再生するステップとを含むことを特徴とする選択された遺伝子を発現するＣｏｉｘ以外の単子葉植物を作成する方法。