(57)【要約】【課題】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドと異種蛋白質を融合してなる融合蛋白質を提供し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドと異種蛋白質を融合してなる融合蛋白質から異種蛋白質を製造する方法を提供する。【解決手段】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの少なくとも１位から８５７位を含んだＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドのカルボキシル末端に、直接に、又は１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質を融合した融合蛋白質。プロテアーゼを用いて本発明の融合蛋白質を加水分解し異種蛋白質を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類のカルボキシル末端に、直接に、又は１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質を融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項２】
異種蛋白質が、脊椎動物由来のポリペプチド、あるいは脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項３】
前記異種蛋白質が、蛋白質精製用の付加配列からなるペプチドを含む、請求項1又は２に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項４】
前記蛋白質精製用の付加配列からなるペプチドが、ポリヒスチジン、Ｓ−ペプチド、及びｃ−ｍｙｃペプチドからなる群から選ばれる、請求項３に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項５】
脊椎動物由来のポリペプチドが、配列番号２５に示した成長ホルモンレセプターの１位から２３８位のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号２６に示したエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位のアミノ酸からなるポリペプチド又は配列番号２７に示したエリスロポエチンの１位から１６６位のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項６】
リンカーが、１種類以上のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項７】
プロテアーゼが、エンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼである請求項６に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項８】
リンカーが、エンテロキナーゼ、トロンビン、活性化血液凝固Ｘ因子、ウロキナーゼ又はＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼのいずれかの基質となるアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項９】
プロテアーゼの基質となるアミノ酸配列が、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである請求項６に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項１０】
リンカーが、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ又はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏのいずれかのアミノ酸配列を有するリンカーであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質を生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌。
【請求項１３】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質をプロテアーゼで位置特異的に加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造法。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類融合蛋白質を、請求項１２に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用して製造することを特徴とする請求項１３に記載の異種蛋白質の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの部分配列からなるポリペプチドと、直接に、又は１残基以上のアミノ酸を介して、異種蛋白質が融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質及び当該融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドに関する。また本発明は、当該ポリヌクレオチドを有し、かつ、それを発現して当該融合蛋白質を生産することができる細胞、並びに当該細胞を使用するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を用いた蛋白質生産において、宿主である大腸菌とは異種の生物等に由来する外来の蛋白質、いわゆる異種蛋白質を生産させた場合に、生産された異種蛋白質は菌体内に蓄積され封入体を形成することが多い。封入体を形成した異種蛋白質は、その存在状態故に生物学的あるいは生化学的に不活性であるため、活性型の蛋白質を得るためには、可溶化、再生の操作がさらに必要となる。
【０００３】
これらの問題を解決するため、異種蛋白質に大腸菌菌体内で可溶性蛋白質として発現する蛋白質を融合させて発現する方法が知られている。異種蛋白質に融合する蛋白質としては、Ｔ７ファージの１０Ｂ配列のＣ末端部位からなるＳｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｔａｇ（ＳＥＴ）やＧＢ１ドメイン、ユビキチン、Ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｅｒ（ＳＵＭＯ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、Ｎ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ   ｓｕｂｓｔａｎｃｅ   Ａ（Ｎｕｓ  Ａ）を用いた融合発現（非特許文献１）やカルボキシル末端が欠失したシャペロニンを用いた融合発現（特許文献１）が知られている。
【０００４】
バクテリオファージであるＴ７ファージに由来するＲＮＡポリメラーゼであるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、異種蛋白質に融合させて発現させた例に関しては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを酵母内で機能させる目的で、酵母ＧＡＬ４蛋白質をＴ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端に融合させた発現させた例が知られている（非特許文献２）。なおＧＡＬ４蛋白質自体は大腸菌菌体内でも機能を有する蛋白質として発現することが知られている。
一方、これまでにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの部分配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドのカルボキシル末端側に異種蛋白質を連結した融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させた例や、発現させた融合蛋白質から異種蛋白質を調製した例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−３２１１４１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】加藤  淳ら，生物物理，Ｖｏｌ．４８，１８５−１８９（２００８）
【非特許文献２】Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ  Ｅ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２６１−１２６５（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、宿主に対して異種の蛋白質を、可溶化や再生の操作を必要としない活性型の蛋白質として発現させるための融合蛋白質として有用なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質及び該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質の製造法を提供するとともに、該Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を位置特異的に加水分解して、異種蛋白質を効率よく生産する製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、配列番号２４に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの部分配列からなるポリペプチドのカルボキシル末端に、場合によってはリンカーを介して異種蛋白質を連結したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質が、大腸菌の細胞質中に可溶性蛋白質として発現することを見出し、さらに、これらの可溶性蛋白質をプロテアーゼで位置特異的に加水分解することにより、所望の異種蛋白質を効率よく製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類のカルボキシル末端に、直接に、又は１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質に関するものである。
【００１０】
また、本発明は配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類のカルボキシル末端に、直接に、又は１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、脊椎動物由来のポリペプチドが融合した融合蛋白質あるいは脊椎動物由来のポリペプチドの１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質に関するものである。
【００１１】
また、本発明は配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類のカルボキシル末端に、直接に、又は１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、配列番号２５に示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号２６に示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位のアミノ酸からなるポリペプチドあるいは配列番号２７に示したヒトエリスロポエチンの１位から１６６位のアミノ酸からなるポリペプチドを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質に関するものである。
【００１２】
また、本発明は配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類のカルボキシル末端に、直接に、又は１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、配列番号２５に示したヒト成長ホルモンレセプターの１位から２３８位のアミノ酸からなるポリペプチド、配列番号２６に示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位から２２５位のアミノ酸からなるポリペプチドあるいは配列番号２７に示したヒトエリスロポエチンの１位から１６６位のアミノ酸からなるポリペプチドの、１残基以上のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換、及び／又は欠失、及び／又は付加したポリペプチドを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質に関するものである。
【００１３】
また、本発明は、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドを発現し、融合蛋白質を生産するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌に関するものである。
【００１４】
また、本発明は、本発明のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌を使用することを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質の製造法に関するものである。
【００１５】
さらに、本発明は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を１種類以上のプロテアーゼで加水分解することを特徴とする異種蛋白質の製造法に関するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を用いれば、目的の異種蛋白質を、例えば、大腸菌を用いて、可溶性の融合蛋白質として製造することができる。特に、目的の異種蛋白質を、例えばプロテアーゼによって位置特異的な加水分解が可能なリンカーを介してＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）に連結した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質は、所望の位置でＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）を含むポリペプチドを切除することにより、目的の異種蛋白質を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド、ヒト成長ホルモンレセプター（ｈＧＨＲ）及び、実施例１及び２のｈＧＨｂｐｆ１の一次構造の模式図
【図２】実施例１で調製したプラスミドｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１の構造の模式図
【図３】実施例２のｈＧＨｂｐｆ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図４】実施例３のｈＧＨｂｐｆ１のエンザイムイムノアッセイの結果を示す図
【図５】本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド、ヒトエリスロポエチンレセプター（ｈＥＰＯＲ）、実施例４及び５のＥＰＯｂｐｆ１の一次構造の模式図
【図６】実施例４で調製したプラスミドｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１の構造の模式図
【図７】実施例５のＥＰＯｂｐｆ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図８】本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド、ヒトエリスロポエチンレセプター（ｈＥＰＯＲ）、実施例６のＥＰＯｂｐｆ２、実施例７、１１，１５及び１６のＥＰＯｂｐｆ２Ｈの一次構造の模式図
【図９】実施例６で調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２の構造の模式図
【図１０】実施例７で調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈの構造の模式図
【図１１】本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド、ヒトエリスロポエチンレセプター（ｈＥＰＯＲ）、実施例８及び９のＥＰＯｂｐｆ３１Ｈの一次構造の模式図
【図１２】実施例８で調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈの構造の模式図
【図１３】実施例９のＥＰＯｆ３１ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１４】本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）、実施例１０、１２、及び１３のＥＰＯｆ２、実施例１１及び１２のＥＰＯｆ２Ｈの一次構造の模式図
【図１５】実施例１０で調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２の構造の模式図
【図１６】実施例１１で調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２Ｈの構造の模式図
【図１７】実施例１２のＥＰＯｆ２、ＥＰＯｆ２Ｈ、ＥＰＯｂｐｆ２及びＥＰＯｂｐｆ２ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１８】実施例１３のＥＰＯｂｐｆ２及びＥＰＯｆ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図１９】実施例１４のエンテロキナーゼで位置特異的に加水分解したＥＰＯｆ２のウエスタンブロッティングの結果を示す図
【図２０】実施例１５のＥＰＯｂｐｆ２ＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図
【図２１】実施例１６で得た画分のウエスタンブロッティングの結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質は、配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類を含む融合蛋白質である。
【００１９】
本発明において、配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類と直接、あるいは、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して融合する異種蛋白質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に対して異種の生物等に由来する外来の蛋白質を挙げることができ、具体的には、脊椎動物である哺乳類、鳥類、爬虫類、両性類、魚類に由来するポリペプチドを例示することができる。
【００２０】
さらに具体的には、異種蛋白質としては、例えば成長ホルモン、エリスロポエチン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）のサブユニットｐ３５、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、レプチン、プロラクチンなどのポリペプチド、あるいは、それらのポリペプチドの各レセプターの細胞外ドメインなどの、脊椎動物に由来するポリペプチドが例示できる。
【００２１】
また、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩIａ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩIｂ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩIＩａ（ＣＤ１６Ａ）、ＦｃγＲＩＩIｂ（ＣＤ１６Ｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）、Ｆｃα/μＲ、ＦｃＲｎ、ポリメリックＩｇレセプターなどの抗体レセプターの細胞外ドメイン、細胞接着分子（カドヘリン、インテグリン、セレクチンなど）の細胞外ドメイン、抗体のＨ鎖やＬ鎖などの、脊椎動物に由来するポリペプチドが例示できる。また脊椎動物に由来する、酵素、オリゴマー酵素の構成要素であるポリペプチド、酵素阻害蛋白質、膜結合型酵素の可溶性ドメインなどのポリペプチドが例示できる。
【００２２】
また本発明で用いる異種蛋白質は、例えば上記のような、脊椎動物に由来するポリペプチドに加えて、当該ポリペプチドに対して以下の（ア）から（ウ）から選択される一以上の変異を加えたものであって、当該異種蛋白質の活性、例えば酵素活性や結合活性などを有するものであっても良い。
（ア）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列中の一残基以上のアミノ酸を欠失したもの
（イ）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列中の一残基以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したもの
（ウ）上記ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の配列について、一残基以上のアミノ酸を付加したもの。
【００２３】
異種蛋白質のカルボキシル末端には、例えばポリヒスチジン、Ｓ−ペプチド、あるいはｃ−ｍｙｃペプチドなどの付加配列を連結してもよい。
【００２４】
異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、公知の方法により調製できる。例えば目的の異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、公知の情報を利用してオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを作製し、目的の異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを含んだ、市販のｃＤＮＡやｃＤＮＡライブラリー、あるいは、公知の方法で調製したｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、目的のポリヌクレオチドを増幅して調製すればよい。
【００２５】
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅反応は、例えば、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、タカラバイオ社製）を利用することができ、付属のプロトコールに従って実験的に、目的のポリヌクレオチドが増幅する条件を探せばよい。例えば付属の緩衝液を用いた反応溶液中で、例えば、０．０１Ｕ／μｌＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、反応に使用するプライマーの濃度は、最大０．３μＭ、鋳型となるプラスミドＤＮＡ０．２〜２０ｐｇ／ｍｌＬで反応を検討すればよい。反応の温度と時間は、例えば、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、ついで７２℃で、増幅したいＤＮＡの塩基対の数に０．０６を乗じた秒数の時間を、１サイクルとして、２５サイクルから３０サイクルの反応をおこなえばよい。また反応サイクルにおいて５５℃で５秒間の設定を、５６℃から７２℃の間のいずれかの温度に設定して、増幅したいＤＮＡが得られる温度を実験的に定めてもよい。
【００２６】
ＰＣＲによるポリヌクレオチドの増幅反応は公知の方法に基づいて行えばよく、上述の方法に限定されない。
【００２７】
また上述の調製方法で調製したポリヌクレオチドを鋳型に、アミノ酸の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加するように設計したプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅を行なう、又はエラープローンＰＣＲにて増幅を行なうことで、１残基以上のアミノ酸の置換、及び／又は欠失、及び／又は付加された、異種蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００２８】
ＰＣＲで増幅した目的のＤＮＡは、そのＤＮＡを含んだＰＣＲ反応液を、例えば、アガロース電気泳動したのち、そのゲルを臭化エチジウムで染色し、例えば波長３０２ｎｍあるいは波長３１２ｎｍの紫外線を照射して目的のＤＮＡを検出して、目的のＤＮＡを含んだ部分のゲルを切り出し、そこから、ＤＮＡを精製すればよい。ＤＮＡの精製は、市販のキットを利用して精製すればよく、例えば、ＭＥＲｍａｉｄ  Ｋｉｔ（商品名、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社）やＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，１５，ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ（商品名、ＭＯ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を精製したいＤＮＡのサイズに応じて利用すればよい。ＤＮＡの検出方法や精製の方法はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を遺伝子工学的に製造するために用いるポリヌクレオチドは、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドであればよく、当業者であれば公知の方法により調製することができる。
【００３０】
ポリヌクレオチドの調製法の一例としてはＰＣＲを利用した方法がある。
例えばＴ７ファージからＴ７ファージＤＮＡを調製して、それを鋳型に用いて、適当なオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーとリバースプライマーでＰＣＲを行って所望のポリヌクレオチドを得ることができる。ＰＣＲに用いるフォワードプライマーとリバースプライマーは、例えばＧｅｎＢａｎｋにａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ ０４１９６０に登録されているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの塩基配列を参考にして作製すればよく、配列番号１から２３のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類から選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドをコードした塩基からなるポリヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖ポリヌクレオチドをＰＣＲで増幅して作製することができる。
【００３１】
次に、例えば、下記の（Ａ）から（Ｆ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類から選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドと異種蛋白質が融合した、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３２】
すなわち、ＰＣＲで増幅して得た、配列番号１から２３に示したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド類から選択したひとつのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（以下、選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドと称する）をコードした塩基からなるポリヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖ポリヌクレオチド（Ａ）、連結させようとする異種蛋白質をコードした塩基からなるポリヌクレオチドとその相補鎖からなる二本鎖ポリヌクレオチド（Ｂ）、選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドの１位メチオニンから数アミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチドのフォワードプライマー（Ｃ）、選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドのカルボキシル末端から数残基上流までのアミノ酸と、例えば、それに連結させようとする異種蛋白質のアミノ末端から数残基下流までの数アミノ酸の両者に跨る部分をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｄ）、５’端側が（Ｄ）の５’端側と相補的な配列であり、その配列がコードした異種蛋白質のアミノ末端部分に続く配列のアミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチド、すなわち、（Ｄ）と（Ｂ）の相補鎖側の、両者に跨る部分をコードしたオリゴヌクレオチドのフォワードプライマー（Ｅ）及び、選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドと連結させようとする異種蛋白質の、例えば、カルボキシル末端を含んだカルボキシル末端側の数アミノ酸をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｆ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。
【００３３】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質のカルボキシル末端に、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、異種蛋白質が融合した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、先述の（Ｄ）のプライマーの代わりに、選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドに由来するカルボキシル末端と異種蛋白質のアミノ末端をコードしたポリヌクレオチドの間に１残基以上のアミノ酸をコードしたポリヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドのリバースプライマー（Ｇ）を用いれば調製することができる。
【００３４】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質と連結させようとする異種蛋白質のカルボキシル末端に付加配列を有する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、先述の（Ｆ）のプライマーの代わりに、融合させる異種蛋白質のカルボキシル末端を含むカルボキシル末端側の数アミノ酸と、そのカルボキシル末端に付加させる配列をコードしたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（Ｈ）を用いれば調製することができる。
【００３５】
また例えば、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｇ）および（Ｈ）をひとつの反応溶液中にて反応させるＰＣＲを行うことで、選択したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドのカルボキシル末端に、１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを介して、カルボキシル末端に付加配列を有する異種蛋白質が融合した本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを調製することができる。「１残基以上のアミノ酸からなるリンカー」は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を可溶性で発現できるリンカーであれば何でもよく、好ましくは１〜５０のアミノ酸からなるリンカーを指し、さらに好ましくは、１〜２０のアミノ酸から成るリンカーを指す。さらに好ましくは、１〜１０のアミノ酸からなるリンカー、又は１若しくは数残基のアミノ酸からなるリンカーを指す。
【００３６】
また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドの調製には、例えば特願２００７−３１２４６２号に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ ０４１９６０）をコードした、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＰやｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを調製して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを作製するためのＰＣＲの鋳型として利用してもよく、さらには本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドをコードするプラスミドの作製に用いてもよい。
【００３７】
またＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）と異種蛋白質の間には、場合によっては１残基以上のアミノ酸からなるリンカーを挿入してもよい。
該リンカーには、例えばＡｓｐ−Ｐｒｏ配列及び／又はＡｓｎ−Ｇｌｙ配列を含んだアミノ酸配列を有するリンカーを用いてもよい。
【００３８】
Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列は例えば７０％  ギ酸水溶液（ｐＨ２．５）で、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とプロリン（Ｐｒｏ）の間の結合が加水分解されることが知られている。またＡｓｎ−Ｇｌｙ配列は、例えば２Ｍ  ヒドロキシルアミン水溶液（ｐＨ９）で、アスパラギン（Ａｓｎ）とグリシン（Ｇｌｙ）の間の結合が加水分解されることが知られている。
異種蛋白質の分子内にＡｓｐ−Ｐｒｏ配列やＡｓｎ−Ｇｌｙ配列がある場合には、その箇所のアミノ酸を予め置換しておいてもよい。異種蛋白質の分子内にあるＡｓｐ−Ｐｒｏ配列のアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、例えばグルタミン酸（Ｇｌｕ）にアミノ酸置換すればよい。また異種蛋白質の分子内にあるＡｓｎ−Ｇｌｙ配列のアスパラギン（Ａｓｎ）は、例えばグルタミン（Ｇｌｎ）、また例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ）に、アミノ酸置換すればよい。
【００３９】
また、本発明に用いるリンカーには、例えば１種類以上のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列（以下、基質アミノ酸配列と称する。）からなるペプチドを用いてもよい。特に、加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼは、特定のアミノ酸配列を基質として認識し、特定のペプチド結合を選択的に加水分解することができることから、このようなプロテアーゼの基質アミノ酸配列からなるリンカーを有する本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質は、対応するプロテアーゼで加水分解すれば、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）と異種蛋白質を所望の位置で切り離すことができる。
【００４０】
加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼとその基質アミノ酸配列の組み合わせとしては、例えば、エンテロキナーゼには４個の連続したアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）の後にリジン残基（Ｌｙｓ）がつながったＡｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を、トロンビンにはロイシン残基−バリン残基−プロリン残基−アルギニン残基（Ｌｕｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を、活性化血液凝固Ｘ因子にはイソロイシン残基−グルタミン酸残基−グリシン残基−アルギニン残基（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を、ウロキナーゼにはプロリン残基−グリシン残基−アルギニン残基（Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）のアミノ酸配列を基質として認識し、それぞれの基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に結合したアミノ酸との間のペプチド結合を選択的に加水分解する。したがってこれらの基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に異種蛋白質のアミノ末端を結合させた場合には、対応するプロテアーゼで加水分解することにより、容易に異種蛋白質を切り出すことができる。
【００４１】
また例えば、ＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼは、ロイシン残基−グルタミン酸残基−バリン残基−ロイシン残基−フェニルアラニン残基−グルタミン残基−グリシン残基−プロリン残基（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）からなる基質アミノ酸配列を認識し、その配列のＧｌｎとＧｌｙの間のペプチド結合を位置特異的に加水分解する。したがって、例えばＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏからなる基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側に異種蛋白質のアミノ末端を結合させた場合には、ＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼで加水分解することにより、アミノ末端にＧｌｙ−Ｐｒｏが付加した異種蛋白質が得られるが、本発明はこれらの異種蛋白質も包含するものである。
【００４２】
加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼとその基質アミノ酸配列の組み合わせは、特にこれらに限定されるものではない。
【００４３】
さらに、本発明に用いるリンカーとして、上述の加水分解の位置特異性が高いプロテアーゼの基質アミノ酸配列のアミノ末端側及び／又はカルボキシル末端側に１残基以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるリンカーを用いてもよく、基質アミノ酸配列の少なくともカルボキシル末端側に１残基以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるリンカーを用いた場合には、対応するプロテアーゼで加水分解すると、少なくとも１残基以上のアミノ酸がアミノ末端に付加した異種蛋白質が得られるが、本発明はこれらの異種蛋白質も包含するものである。
【００４４】
また、複数種類のプロテアーゼの基質となるアミノ酸配列からなるリンカーを用いる場合には、異種蛋白質のアミノ末端に最も近い基質アミノ酸配列を対応するプロテアーゼで加水分解すればよく、その結果、１残基以上のアミノ酸がアミノ末端に付加した異種蛋白質が得られる場合であっても、本発明はこれらの異種蛋白質を包含するものである。
【００４５】
基質アミノ酸配列のカルボキシル末端側にプロリンがあると加水分解が起こらない場合があり、使用するプロテアーゼの性質とその基質配列については、公知の文献等で調べてから用いることが望ましい。
【００４６】
プロテアーゼを用いた加水分解においては、使用するプロテアーゼ、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質およびそれが加水分解されて生じる異種蛋白質が不溶化を起こさずに、該プロテアーゼが反応するように反応条件等を定めればよい。例えば、反応のｐＨは５から８、反応温度は４℃から４０℃から適宜選ばれた条件で行えばよく、本発明はこれらに限定されない。例えばアスパルティックプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、あるいはそれらのプロテアーゼに分類されるプロテアーゼであり耐熱性を有するプロテアーゼなどを用いる場合にはそれに応じた反応条件を探して用いればよい。
【００４７】
また反応溶液への添加物の添加については、塩の種類（例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩あるいはカルシウム塩など）とその濃度（例えば０Ｍから１Ｍ）、界面活性剤の種類（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マンノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マンノシドなど）とその濃度（例えば０％から１％）、還元剤の種類（例えばジチオスレイトール、メルカプトエタノール、グルタチオンなど）とその濃度（０ｍＭから１０ｍＭ）、変性剤の種類（例えば尿素、塩酸グアニジンなど）とその濃度（０Ｍから２Ｍ）など、あるいはそれらの組み合わせを、位置特異的な加水分解に使用するプロテアーゼについて、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質およびそれが位置特異的に加水分解されて生じる異種蛋白質が不溶化を起こさずに該プロテアーゼが反応するように定めればよい。
【００４８】
さらに具体的には、特異性が高いプロテアーゼとして、例えば、エンテロキナーゼを用いる場合には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドと異種蛋白質を連結する配列に、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓのアミノ酸配列を有する、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質（すなわちエンテロキナーゼの基質となる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質）を、例えばたとえば、０．０２Ｍ〜０．１Ｍの濃度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）の溶液中で反応させればよい。また反応を行う溶液には、０．００１Ｍ〜０．０２Ｍ塩化カルシウム、及び／又は、１Ｍ以下の濃度の塩化ナトリウム、より好ましくは０．３Ｍ以下の濃度の塩化ナトリウム、及び／又はおよび／または、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ２０（商品名）を０．０１％〜０．２％濃度加えることもできる。
反応温度は４℃〜４０℃から適宜選ばれた温度で、反応時間は数分間〜数日間から適宜選ばれた時間で、エンテロキナーゼの基質となる本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質の蛋白質濃度とエンテロキナーゼの蛋白質濃度の比は、例えば、１：１０から１：１００００で行えばよい。
【００４９】
さらに、例えばニッケルキレート樹脂にアフィニティーがあるポリヒスチジン、Ｓ−プロテインにアフィニティーがあるＳ−ペプチド、あるいはｃ−ｍｙｃ抗体にアフィニティーがあるｃ−ｍｙｃペプチドなどのアフィニティーリガンドをリンカーにしてもよい。
【００５０】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチドと異種蛋白質を連結するリンカーは、上記のような複数種類のリンカーを組み合わせて用いてもよい。
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドは、通常の遺伝子工学の分野で使用される相応のプラスミドを用いれば種々の宿主で発現することが可能であるが、取扱い易さ、培養の容易性、高密度培養の可否、更には遺伝子操作における宿主／ベクター系が整備されている細菌、中でもエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
【００５１】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を発現するためのプラスミドは、例えばｐＴｒｃ９９Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ、Ｕ１３８７２）、ｐＳＴＶ２８（商品名、（株）タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（以上は、商品名、メルク（株）社製）等のプラスミドを例示できる。
【００５２】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を発現するためのプラスミドで形質転換させる大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬＲ（ＤＥ３）などの菌株が例示できるが、本発明はこれらに限定されない。また本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を発現するためのプラスミドで形質転換する前の大腸菌が薬剤耐性を有する大腸菌である場合には、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を発現するためのプラスミド上の薬剤耐性マーカー遺伝子は、宿主となる大腸菌の薬剤耐性とは異なるものを選択すればよい。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質の発現にＴ７プロモーターを利用したプラスミドを使用する場合には、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬＲ（ＤＥ３）のようにＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子をもち、それを発現する大腸菌を宿主にすればよい。
【００５３】
形質転換した大腸菌はプラスミドにコードされている薬剤耐性マーカー遺伝子に対応する薬剤を加えた寒天培地で培養して選別すればよい。
【００５４】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌は、宿主に用いた大腸菌を培養するための公知の培地、例えばＬＢ培地や２ｘＹＴ培地に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミド上の薬剤マーカー遺伝子に対応する薬剤を添加して培養すればよい。培養温度は１５℃から３７℃で実験的に定めればよい。本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質をコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌に、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質を可溶性の蛋白質として発現させるためには、１５℃〜３７℃から適宜選ばれた温度、好ましくは２５℃〜３０℃から適宜選ばれた温度で培養を行うとよい。
【００５５】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（類）融合蛋白質は、それをコードしたポリヌクレオチドを組み込んだ発現用プラスミドで形質転換した大腸菌を適切に培養して、増殖させ、必要に応じて適当な誘導剤を培地に加えて遺伝子発現を誘導しながら更に培養した後、その菌を集菌して凍結融解、リゾチーム消化処理、超音波処理あるいはそれらの組み合わせにより、菌を破砕すれば、可溶性画分に得ることができる。
【００５６】
可溶性画分に含まれる本発明の融合蛋白質は、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー用いて精製することができる。
【００５７】
また例えば、Ｓ−ペプチドタグを付加した融合蛋白質であればＳ−プロテインを固定化した担体、例えば、Ｓ−プロテインアガロース（商品名、メルク社製）を用いて精製できる。
【００５８】
またポリヒスチジンからなるいわゆるヒスチジンタグが付加した融合蛋白質の場合には、ニッケルイオンやコバルトイオンなどの金属イオンをキレートした樹脂、例えばＨｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（商品名、メルク社製）、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などを用いて精製することができる。
【００５９】
上記の精製方法を必要に応じて組み合わせて融合蛋白質を精製してもよい。
【００６０】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
実施例１  プラスミドｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（配列番号１）の１位メチオニンから８５７位グルタミンまでのアミノ酸配列に続き、配列番号２５に示したヒト成長ホルモンレセプターの１位フェニルアラニンから２３８位グルタミンまでを連結した融合蛋白質（ｈＧＨｂｐｆ１、配列番号２９、図１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号３０）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１を以下のようにして作製した。
【００６２】
特願２００９−０２５９０１号に記載のプラスミドｐＥＴ−ｈＧＨｂｐ２５８を鋳型にして、配列番号３１と３２のプライマーセットを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、タカラバイオ社製）とその付属の試薬を使ってＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを合成した。そのＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得た０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−１と称する）を、プラスミドｐＲＳＦ−１ｂを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得た３．６ｋｂｐのＤＮＡとＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化させてプラスミドｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８を調製し、そのプラスミドにより大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換して大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８を得た。
【００６３】
次に特開２００９−１３６１５３号公報に記載のプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＭｆｅＩで消化し、次いで制限酵素ＢｌｎＩで消化して得た５．８ｋｂｐのＤＮＡと、プラスミドｐＲＳＦ−ｈＧＨｂｐ２３８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｌｎＩで二重消化して得られた０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−２と称する）を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２．１（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、ライゲーションして環化させてプラスミドを調製した。そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリンナトリウム、５ｇ／Ｌ  酵母エキス、１０ｇ／Ｌ  トリプトン及び１０ｇ／Ｌ  塩化ナトリウムを含む２０ｇ／Ｌ  寒天の固体培地（ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地と称する）で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１を得た。  調製したプラスミドｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１の構造の模式図を図２に示す。
【００６４】
実施例２  融合蛋白質ｈＧＨｂｐｆ１の発現
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１を、５０ｍｇ／ｌＬ   カルベニシリンナトリウム、１０ｇ／Ｌ  酵母エキス、１６ｇ／Ｌ  トリプトン、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウムを含む培地（２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地と称する）で、培養温度３０℃で一晩培養した。菌密度はＯ．Ｄ．600の値で３．８であった。その培養液を新鮮な培地で、Ｏ．Ｄ．600が０．５になるように希釈したのち２つに分け、その一方に濃度が０．１ｍＭ  になるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、それぞれを２５℃で２時間培養した。
【００６５】
培養した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１を、遠心分離して集菌したのち、０．００１Ｍ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄後、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値がおよそ３６になるように、０．１ｍｇ／ｍＬ  卵白リゾチーム、０．０００１Ｍ  ４−（アミノエチル）ベンゼンスルオニルフルオリド、０．０００１Ｍ  フェニルメタンスルオニルフルオリド、１ｍｇ／ｍＬ  ジメチルスルホキシド及び０．００１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（卵白リゾチーム溶液と称する）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で１時間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供した。破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分と不溶性画分を得た。不溶性画分は、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、菌の懸濁に用いた卵白リゾチーム溶液と同容量の、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
【００６６】
得られた可溶性画分と不溶性画分のそれぞれを等容量の２０ｍｇ／ｍＬ  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４％（Ｖ／Ｖ）  ２−メルカプトエタノール、５７０ｍｇ／ｍＬ  グリセリン及び１ｍｇ／ｍＬ  ブロモフェノールブルーを含む０．２５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）（ＳＤＳサンプル緩衝液と称する）を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。また、特開２００９−１３６１５３号公報に記載のプラスミドｐＣＤＦ２で形質転換した、ｈＧＨｂｐｆ１を発現しない大腸菌（ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２）から得られた可溶性画分と不溶性画分を比較対照としてあわせて分析した。
【００６７】
結果を図３に示した。図３のレーン１は分子量マーカー蛋白質（上から順に１７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、５８ｋＤａ、４６ｋＤａ、３０ｋＤａ、２５ｋＤａ、１７ｋＤａ）、ＩＰＴＧを加えずに培養した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２から得られた可溶性画分（レーン２）及び不溶性画分（レーン３）、ＩＰＴＧを加えずに培養した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１から得られた可溶性画分（レーン４）及び不溶性画分（レーン５）、及び、ＩＰＴＧを加えて培養した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１から得られた可溶性画分（レーン６）及び不溶性画分（レーン７）を電気泳動したのち、Ｃｏｏｍａｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０［６１０４−５９−２］で染色して蛋白質を検出した結果である。
図３のレーン４及び６に可溶性のｈＧＨｂｐｆ１（分子量１２３ｋＤａ）が発現していることがわかる。
【００６８】
実施例３  ヒト成長ホルモンへの融合蛋白質ｈＧＨｂｐｆ１の吸着
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１を２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地で、培養温度２８℃で一晩培養して、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）が３．６の培養液１０ｍＬを得た。
その培養液から大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１を、遠心分離して集菌したのち、１ｍｌＬの０．００１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したのち、遠心分離して菌を洗浄した。次にその菌を１ｍｌＬの０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、で洗浄した。
その菌を菌密度（Ｏ．Ｄ．600)の値が３６になるように、０．１ｍｇ／ｍｌＬ  卵白リゾチ−ムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で３０分間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供したのち、破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分（含まれるｈＧＨｂｐｆ１の濃度を１とする）を得た。
その可溶性画分に含まれるｈＧＨｂｐｆ１がヒト成長ホルモンに吸着することを、エンザイムイムノアッセイを行って調べた。
【００６９】
エンザイムイムノアッセイは、９６穴イムノプレートに１μｇ／ｍＬヒト成長ホルモンを、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、４℃で１８時間インキュベーションしたのち、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム及び０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ２０を含んだ０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（ＴＢＳ−Ｔと称する）でリンスしてＢ／Ｆ分離し、ついでＴＢＳ−Ｔで調製した５ｍｇ／ｍＬ  ウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液と称する）を１ウエルあたり２００μＬ加えて、３０℃で２時間インキュベーションしてブロッキングしてから行った。
【００７０】
ブロッキングしたプレートはＴＢＳ−ＴでリンスしてＢ／Ｆ分離したのち、ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈して調製した試料を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次いで０．５μｇ／ｍＬ  マウス抗ヒト成長ホルモンレセプター抗体（ＩｇＧ２ｂ）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションしたのち、Ｂ／Ｆ分離し、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたウサギ抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体（０．２５μｇ／ｍＬ）を１ウエルあたり１００μＬ加えて、３０℃で１時間インキュベーションした。それをＢ／Ｆ分離したのち、ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（２−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（製品名、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１ウエルあたり１００μＬ加えて室温で９０秒間反応し、それに１Ｍ  リン酸水溶液を１ウエルあたり５０μＬ加えて反応停止後、波長４５０ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０）を測定した。
図４に示したようにｈＧＨｂｐｆ１の濃度に依存してヒト成長ホルモンに吸着することがわかった。
【００７１】
実施例４  プラスミドｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（配列番号１）の１位メチオニンから８５７位グルタミンまでのアミノ酸配列に続き、１残基のフェニルアラニンを介して、配列番号２６に示したヒトエリスロポエチンレセプターの２位プロリンから２２５位アスパラギン酸までのアミノ酸配列と、それに続けてＴｈｒ−Ａｒｇの２残基が連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ１、配列番号３３、図５参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号３４）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１を以下のようにして作製した。
【００７２】
ヒトエリスロポエチンレセプターｃＤＮＡをコードしたプラスミド（ＯｒｉＧｅｎｅ社製、品番ＳＣ１２５４４０；以下ｐＣＭＶ６−ｈＥＰＯＲと称する）を鋳型にして、配列番号３５と３６のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを合成した。
【００７３】
そのＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩ、次いでＥｃｏＲＩで消化して０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−３と称する）を得た。そのＤＮＡ−３を、特開２００９−１３６１５３号公報に記載のプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＭｆｅＩで消化し、次いで制限酵素ＢｌｎＩで消化して得た５．８ｋｂｐのＤＮＡとライゲーションして環化させた。なお制限酵素ＭｆｅＩで消化して生じたＤＮＡの末端は制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して生じたＤＮＡの末端と互いに相補的であり、また、制限酵素ＳｐｅＩで消化して生じたＤＮＡの末端は制限酵素ＢｌｎＩで消化して生じたＤＮＡの末端と互いに相補的であるため、相補的な配列どおしが連結して環化したプラスミドが調製できる。そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１を得た。調製したプラスミドｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１の構造の模式図を図６に示す。
【００７４】
実施例５  融合蛋白質ｈＥＰＯｂｐｆ１の発現
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１を、実施例２の大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ｈＧＨｂｐｆ１の替わりに用いて、実施例２と同様にして可溶性画分と不溶性画分を得た。不溶性画分は、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でリンスしたのち、菌の懸濁に用いた卵白リゾチーム溶液と同容量の、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
【００７５】
得られた可溶性画分と再懸濁した不溶性画分のそれぞれを、等容量のＳＤＳサンプル緩衝液を加えて９８℃で５分間加熱してＳＤＳ化したのち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。また特願２００７−３１２４６２号に記載のプラスミドｐＣＤＦ２で形質転換した、ＥＰＯｂｐｆ１を発現しない大腸菌から得られた可溶性画分と不溶性画分を比較対照としてあわせて分析した。
【００７６】
結果は図７に示した。図７のレーン１は分子量マーカー蛋白質、ＩＰＴＧを加えずに培養した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２から得られた可溶性画分（レーン２）及び不溶性画分（レーン３）、ＩＰＴＧを加えずに培養した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１から得られた可溶性画分（レーン４）及び不溶性画分（レーン５）、並びに、ＩＰＴＧを加えて培養した大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ１から得られた可溶性画分（レーン６）及び不溶性画分（レーン７）を電気泳動したのち、ＣＢＢ染色して蛋白質を検出した結果である。
図７のレーン４及び６に可溶性のＥＰＯｂｐｆ１（分子量１２１ｋＤａ）が発現していることがわかる。
【００７７】
実施例６  プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（配列番号３）の１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号２６に示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位アラニンから２２５位アスパラギン酸までを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ２、配列番号３７、図８参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号３８）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２を以下のようにして作製した。
【００７８】
プラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＸｂａＩで消化して得た５．９ｋｂｐの直鎖ＤＮＡを、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡの末端を平滑化したのち、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションして環化して、制限酵素ＸｂａＩサイトを含まない、５．９ｋｂｐのプラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを得た。そのプラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＢｌｎＩ消化後、ウシ小腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化処理して得られた直鎖状ＤＮＡを、さらに制限酵素ＭｆｅＩで消化して５．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−４と称する）を得た。
【００７９】
一方、プラスミドｐＣＭＶ６−ｈＥＰＯＲを鋳型にして、配列番号３９と４０のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを合成した。そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩとＸｂａＩで二重消化して０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−５と称する）を得て、それをＤＮＡ−４とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２を得た。
調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２の構造の模式図を図９に示す。
【００８０】
実施例７  プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（配列番号３）の１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号２６に示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位アラニンから２２５位アスパラギン酸までと、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ２Ｈ、配列番号４１、図８参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号４２）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを作製した。
【００８１】
プラスミドｐＣＭＶ６−ｈＥＰＯＲを鋳型にして、配列番号４０と４３のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを合成した。
【００８２】
そのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩとＸｂａＩで二重消化して０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−６と称する）を得て、それを実施例６に記載したＤＮＡ−４とライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを得た。
調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈの構造の模式図を図１０に示す。
【００８３】
実施例８  プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（配列番号２３）の１位メチオニンから８７９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙの４残基を介して、配列番号２６に示したヒトエリスロポエチンレセプターの１位アラニンから２２５位アスパラギン酸までと、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈ、配列番号４４、図１１参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号４５）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈを以下のようにして作製した。
【００８４】
プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを鋳型にして、配列番号４６と４７のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．９ｋｂｐのＤＮＡを合成した。
そのＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで二重消化して０．８ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−７と称する）を得た。
また、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐ２Ｈを鋳型にして、配列番号４８と４９のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、０．７ｋｂｐのＤＮＡを合成した。
そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＢｌｎＩで二重消化して０．７ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−８と称する）を得た。
【００８５】
一方プラスミドｐＣＤＦ２０−Ｔ７ＲＰを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｌｎＩで二重消化して得られた５．１ｋｂｐのＤＮＡ（ＤＮＡ−９と称する）を得た。そのＤＮＡ−９と、ＤＮＡ−７及びＤＮＡ−８をライゲーションして環化させ、プラスミドを調製した。そのプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、ＬＢ／Ｃａｒｂ寒天培地で培養して、目的のプラスミドを有する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈを得た。
調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈの構造の模式図を図１２に示す。
【００８６】
実施例９  融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈの精製
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ３１Ｈを、１０ｍＬの２ｘＹＴ培地で、２５℃で、１６時間培養したのち集菌した。０．００１Ｍ  ＥＤＴＡを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値がおよそ３６になるように、卵白リゾチーム溶液に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で１時間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕して得た液を遠心分離して、可溶性画分３００μＬを得た。その画分を０．０５Ｍ  イミダゾール及び０．３Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（平衡化緩衝液‐Ａと称する）で平衡化したＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎ（商品名、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）にロードして、遠心分離して素通り画分を得た。そのカラムには３００μＬの平衡化緩衝液‐Ａをさらにロードして遠心分離し、先に得た素通り画分と合わせた。その液の５００μＬを、平衡化緩衝液‐Ａで平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）５０μＬを加えた１．５ｍＬ用マイクロ遠心チューブに添加して、樹脂を懸濁させた。それを４℃で一晩インキュベーションしたのち、再度樹脂を懸濁後、マイクロピペットで液（画分１）を取り除いた。その樹脂に５００μＬの平衡化緩衝液‐Ａを加えて、樹脂を懸濁後、液を取り除くことにより樹脂を洗浄した。その操作をもう一度おこなって液を取り除き、１回目に取り除かれた液と混合して画分２とした。
【００８７】
洗浄した樹脂には１５０μＬの０．２Ｍ  イミダゾール及び０．３Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加えて、懸濁したのち、マイクロピペットで液（画分３）を回収した。
【００８８】
図１３のレーン１はニッケルキレート樹脂での分画前の試料、レーン２は本実施例の画分１、レーン３は本実施例の画分２、レーン４は本実施例の画分３をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果であり、ほぼ均一に精製されたＥＰＯｂｐｆ３１Ｈ（分子量１２４ｋＤａ）を含んだ画分３を得た。
【００８９】
実施例１０  プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２の作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（配列番号３）の１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号２７に示したヒトエリスロポエチンの１位アラニンから１６６位アルギニンまでを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｆ２、配列番号５０、図１４参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号５１）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２を以下のようにして作製した。
【００９０】
配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８及び６９のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した、０．３４ｋｂｐのＤＮＡを制限酵素ＭｆｅＩとＰｓｔＩで二重消化したＤＮＡ（ＤＮＡ−１０と称する）を得た。
【００９１】
またプライマー配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び８１のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した、０．２５ｋｂｐのＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩとＢｌｎＩで二重消化したＤＮＡ（ＤＮＡ−１１と称する）を得た。実施例６に記載のＤＮＡ−４と、ＤＮＡ−１０及びＤＮＡ−１１をライゲーションして環化させ、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２を作製した。それを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換して、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２を得た。
調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２の構造の模式図を図１５に示す。
【００９２】
実施例１１  プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２Ｈの作製
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ様ポリペプチド（配列番号３）の１位メチオニンから８５９位アスパラギン酸までのアミノ酸配列に続き、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓの４残基を介して、配列番号２７に示したヒトエリスロポエチンの１位アラニンから１６６位アルギニンまでと、それに続けて６個のヒスチジンを連結した融合蛋白質（ＥＰＯｆ２Ｈ、配列番号８２、図１４参照）をコードしたポリヌクレオチド（配列番号８３）をコードした、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２Ｈを以下のようにして作製した。
【００９３】
配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０及び８４のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した０．２７ｋｂｐのＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＰｓｔＩで二重消化したＤＮＡ（ＤＮＡ−１２と称する）を得た。そのＤＮＡ−１２と、実施例１０に記載のＤＮＡ−１０及び実施例６に記載のＤＮＡ−４をライゲーションして環化させ、プラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２Ｈを作製した。それを用いて大腸菌ＨＢ１０１を形質転換して、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２Ｈを得た。
調製したプラスミドｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｆ２Ｈの構造の模式図を図１６に示す。
【００９４】
実施例１２  発現誘導剤存在下での融合蛋白質発現大腸菌の培養
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｆ２、ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｆ２Ｈ、ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ２及びＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地で、３７℃で、一晩、それぞれ培養した。それらの培養液を、新鮮な培地で、菌密度がＯ．Ｄ．600で０．１３になるように希釈して１．５時間培養し（Ｏ．Ｄ．600は０．６〜０．７）、発現誘導剤であるＩＰＴＧを濃度が１ｍＭになるように加えて、さらに３７℃で２時間培養した（Ｏ．Ｄ．600は２．４〜２．７）。それぞれを集菌し、実施例２と同様にして可溶性画分と不溶性画分を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を図１７に示した。
【００９５】
図１７のレーン１と１０は分子量マーカー蛋白質、レーン２はＥＰＯｆ２の可溶性画分、レーン３はＥＰＯｆ２の不溶性画分、レーン４はＥＰＯｆ２Ｈの可溶性画分、レーン５はＥＰＯｆ２Ｈの不溶性画分、レーン６はＥＰＯｂｐｆ２の可溶性画分、レーン７はＥＰＯｂｐｆ２の不溶性画分、レーン８はＥＰＯｂｐｆ２Ｈの可溶性画分、レーン５はＥＰＯｆｂｐ２Ｈの不溶性画分の分析結果で、図中のアローヘッド（黒三角）で指し示したとおり、ＥＰＯｆ２（分子量１１５ｋＤａ）、ＥＰＯｆ２Ｈ（分子量１１６ｋＤａ）、ＥＰＯｂｐｆ２（分子量１２１ｋＤａ）、及びＥＰＯｂｐｆ２Ｈ（分子量１２２ｋＤａ）は、いずれも、可溶性画分と不溶性画分に検出された。
【００９６】
実施例１３  発現誘導剤非存在下での融合蛋白質発現大腸菌の培養
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｂｐｆ２及びＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２−ＥＰＯｆ２を、２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地で、２５℃あるいは３７℃で、１４時間それぞれ培養したのち集菌し、実施例２と同様にして可溶性画分と不溶性画分を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１８のレーン１と１０は分子量マーカー蛋白質、レーン２は２５℃で培養して得たＥＰＯｂｐｆ２の可溶性画分、レーン３は２５℃で培養して得たＥＰＯｂｐｆ２の不溶性画分、レーン４は３７℃で培養して得たＥＰＯｂｐｆ２の可溶性画分、レーン５は３７℃で培養して得たＥＰＯｂｐｆ２の不溶性画分、レーン６は２５℃で培養して得たＥＰＯｆ２の可溶性画分、レーン７は２５℃で培養して得たＥＰＯｆ２の不溶性画分、レーン８は３７℃で培養して得たＥＰＯｆ２の可溶性画分、レーン９は３７℃で培養して得たＥＰＯｆ２の不溶性画分の分析結果で、図中のアローヘッド（黒三角）で指し示したとおり、ＥＰＯｂｐｆ２（レーン２と４）とＥＰＯｆ２（レーン６と８）が可溶性画分に検出された。
【００９７】
実施例１４  エンテロキナーゼによる融合蛋白質ＥＰＯｆ２の加水分解
実施例１３と同様にして得たＥＰＯｆ２の可溶性画分に、４ｕｎｉｔ／ｍＬ〜８０ｕｎｉｔ／ｍＬ  ＥＫｍａｘ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（以下、ＥＫｍａｘと称する；商品名、インビトロジェン社製）、０．１Ｍ  塩化ナトリウム及び０．００４Ｍ  塩化カルシウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、等容量混合して、２５℃で１８時間インキュベーションした。それをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したのち、１０％（Ｖ／Ｖ）  メタノール、０．０１Ｍ  シクロヘキシルアミノプロピパンスルホン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）中で電気泳動して、ＰＶＤＦ膜に転写した。その膜をＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中でブロッキングしたのち、ウエスタンブロッティング分析を行い、ＥＰＯｆ２（１２１ｋＤａ）と、それがリンカー部分で位置特異的に加水分解されて生じるＥＰＯ（１８ｋＤａ）を、抗ヒトエリスロポエチン抗体を用いて検出した。
【００９８】
ウエスタンブロッティングの手順は、まずブロッキングした膜を、０．５μｇ／ｍＬ  ビオチン標識マウス抗ヒトエリスロポエチン抗体を含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、ＴＢＳ−Ｔ溶液で順次洗浄してＢ／Ｆ分離した。次にその膜を０．６μｇ／ｍＬ  ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを含むＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ溶液中に浸漬して、室温で１時間振とうしたのち、Ｂ／Ｆ分離した。次にその膜に結合したＨＲＰ標識ストレプトアビジンのＨＲＰ活性を、０．１％過酸化水素及び５ｍＭ４−クロロナフトールを含む２４．３ｍＭクエン酸−５１．４ｍＭリン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）を基質溶液として用いて室温で２０分間呈色反応を行って検出し、エリスロポエチンの検出を行った。
【００９９】
図１９のレーン１は分子量マーカー蛋白質、レーン２は、検出のポジティブコントロールとして用いたＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチン（メルク社製）、レーン３はＥＰＯｂｐｆ２（可溶性画分）、レーン４から８はそれぞれＥＫｍａｘを２ｕｎｉｔ／ｍＬ、４ｕｎｉｔ／ｍＬ、１０ｕｎｉｔ／ｍＬ、２０ｕｎｉｔ／ｍＬ、４０ｕｎｉｔ／ｍＬになるように添加したＥＰＯｆ２（可溶性画分）、レーン９は４０ｕｎｉｔ／ｍＬ  ＥＫｍａｘのみの試料を、それぞれ分析した結果であり、ＥＰＯｆ２が位置特異的に加水分解されてＥＰＯ（分子量１８ｋＤａ）が生じたことがわかった。
【０１００】
実施例１５  融合蛋白質ＥＰＯｂｐｆ２Ｈの精製
大腸菌ＨＢ１０１／ｐＣＤＦ２０−ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを、２ｘＹＴ／Ｃａｒｂ培地で、２５℃で、１８時間培養した。菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値は、４．６であった。その培養液５００ｍＬを遠心分離して集菌したのち０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で順次洗浄後、菌密度（Ｏ．Ｄ．600）の値がおよそ３６になるように、卵白リゾチーム溶液に、菌を懸濁した。その懸濁液を０℃で１時間インキュベーションしたのち、−８０℃で凍結した。それを解凍後、超音波破砕機に供した。破砕して得た液を遠心分離して可溶性画分を得た。その画分を滅菌ろ過して、ろ液７２ｍＬを得て、それに７．２ｍＬの０．２２Ｍ硫安溶液を混合したのち、１．５８ｍＬの５％ポリエチレンイミン水溶液を混合した。それを０℃で１時間インキュベーションしたのち、遠心分離して可溶性画分を得て、それを、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で４℃、一晩透析した。
【０１０１】
その透析後に遠心分離をして不溶性の画分を除去したのち、０．０５Ｍになるようにイミダゾールを加えた。
【０１０２】
その溶液の１０ｍＬを実施例９に記載した平衡化緩衝液‐Ａで平衡化したニッケルキレート樹脂（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ、商品名、メルク社製）を２ｍＬ充填したカラムにロードしたのち、平衡化緩衝液‐Ａ５ｍＬで樹脂を洗い込み、素通り画分としてプールした。その樹脂をさらに平衡化緩衝液‐Ａ５ｍＬを３回ロードして洗浄したのち、０．２Ｍ  イミダゾール及び０．３Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で順次溶出させた。吸着画分はそれぞれフラクションサイズ１ｍＬで溶出して分取した。
【０１０３】
一連のカラム精製を３回行って得たフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１０４】
図２０はレーン１及び１３が分子量マーカー蛋白質、レーン２がニッケルキレート樹脂による分画前の試料、レーン３はニッケルキレート樹脂にロードした試料の素通り画分、レーン４から６は洗浄して得た画分、レーン７から１２は吸着画分を溶出して得た画分であり、レーン８から１２に、ほぼ均一に精製されたＥＰＯｂｐｆ２Ｈ（分子量１２２ｋＤａ）が検出された。ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを含んだフラクションをプールし、蛋白質濃度をγ−グロブリンを標準蛋白質に用いて、プロテインアッセイ（商品名、バイオラッド社）で比色定量した結果、３回のカラム精製で得られたＥＰＯｂｐｆ２Ｈは合計１１．７ｍｇであった。
【０１０５】
実施例１６  ＥＰＯｂｐｆ２Ｈを結合した樹脂によるエリスロポエチンの吸着
実施例９に記載した平衡化緩衝液‐Ａで平衡化したニッケルキレート樹脂１ｍＬに、ＥＰＯｂｐｆ２Ｈ（４．８ｍｇ）を結合させ、その樹脂に、平衡化緩衝液‐Ａで０．４２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチン（メルク社製）０．１２ｍＬをロードし、さらに０．８８ｍＬの平衡化緩衝液‐Ａを樹脂にロードして素通り画分（１ｍＬ）を得た。さらに１回あたり１ｍＬの平衡化緩衝液‐Ａを５回ロードして洗浄画分（１ｍＬｘ５）を得た。ついで、６Ｍ  尿素を含む平衡化緩衝液‐Ａで、フラクションサイズ１ｍＬで溶出画分を分取した。
【０１０６】
同様にＥＰＯｂｐｆ２Ｈを結合していない樹脂で上記と同様の素通り画分、洗浄画分及び溶出画分を得て比較試料とした。
【０１０７】
得た画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したのち、実施例１４に記載した方法と同様にウエスタンブロッティング分析を行いエリスロポエチンの検出を行った。
【０１０８】
図２１の（ａ）はＥＰＯｂｐｆ２Ｈを結合していない樹脂を用いて得た画分を分析した結果であり、（ｂ）はＥＰＯｂｐｆ２Ｈを結合した脂を用いて得た画分を分析した結果である。それぞれのレーン１は分子量マーカー蛋白質、レーン２と３はＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンのポジティブコントロールでそれぞれ、０．２５μｇ、０．５μｇを電気泳動したもの、レーン４は素通り画分、レーン５から９は洗浄画分、レーン１０から１４は溶出画分を分析した結果である。図２１の（ａ）の溶出画分にエリスロポエチンは検出されなかったが、図２１の（ｂ）のレーン１０と１１の溶出画分にはエリスロポエチンは検出され、樹脂に結合したＥＰＯｂｐｆ２ＨにＣＨＯ細胞由来リコンビナント・ヒトエリスロポエチンが吸着することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図３】
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【図７】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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