(57)【要約】【課題】最近発見されたマクロファージ特異的受容体ＣＲＩｇ、ならびに、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）などの補体が関係している眼の症状を含む、補体が関係している障害の予防および処置におけるその使用を提供すること。【解決手段】１つの態様においては、本発明は、補体が関係している眼疾患の予防または処置のための方法に関する。これには、その必要がある被験体に、予防有効量または治療有効量の補体阻害因子（例えば、代替補体経路の阻害因子（例えば、ＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニスト））を投与する工程が含まれる。【選択図】図４９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、最近発見されたマクロファージ特異的受容体ＣＲＩｇ（以前はＳＴＩｇＭＡと呼ばれていた）、ならびに、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）などの補体が関係している眼の症状を含む、補体が関係している障害の予防および処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
補体系は、通常は、不活性なプロ酵素の形態で存在している血清糖タンパク質のシリーズから構成される複雑な酵素のカスケードである。３つの主要な経路（古典補体経路と代替補体経路）が補体を活性化させることができ、これらはＣ３のレベルで統合され、ここでは２種類の類似しているＣ３転換酵素によって、Ｃ３が切断されて、Ｃ３ａとＣ３ｂとなる。補体活性化のさらなる経路であるマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）経路もまた記載されている。
【０００３】
古典補体経路の成分は、Ｃと数字とで名前がつけられる（例えば、Ｃ１、Ｃ３）。これらが同定された順番の理由により、最初の４種類の成分は、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ２、およびＣ３と番号が付けられている。代替補体経路の成分は、文字が付けられている（例えば、Ｂ、Ｐ、Ｄ）。切断断片は、補体の表記の後ろに小文字を伴って示される（例えば、Ｃ３ａおよびＣ３ｂはＣ３の断片である）。不活性なＣ３ｂは、ｉＣ３ｂと示される。補体タンパク質のポリペプチド鎖は、成分の後にギリシャ文字を伴って示される（例えば、Ｃ３αおよびＣ３βは、Ｃ３のα鎖およびβ鎖である）。Ｃ３の細胞膜受容体は、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、およびＣＲ４と短縮される。
【０００４】
補体系の古典補体経路は、ヒトの免疫応答の体液分岐（ｈｕｍｏｒａｌ  ｂｒａｎｃｈ）の主要なエフェクターである。古典補体経路およびＭＢＬ経路の活性化の要因は、標的細胞上の抗原またはレクチンに結合したＩｇＧまたはＩｇＭ抗体のいずれかである。抗原への抗体の結合によって抗体上に１つの部位が露出し、これは、第１の補体成分であるＣ１に対する結合部位である。Ｃ１は少なくとも２つの抗原が結合した抗体の露出している領域に結合する。結果として、そのＣ１ｒおよびＣ１ｓサブユニットが活性化される。活性化されたＣ１ｓは次の２つの補体成分Ｃ４とＣ２とが関係している切断を担う。Ｃ４は２つの断片に切断される。そのうち、より大きいＣ４ｂ分子は、すぐ近くの標的膜に付着し、一方、小さいＣ４ａ分子は遊離させられる。沈殿したＣ４ｂ上の露出している部位は、次の補体成分であるＣ２と相互作用するために利用することができる。先の工程に見られるように、活性化されたＣ１ｓはＣ２分子を２つの断片へと切断し、そのうちＣ２ａは残り、小さいＣ２ｂ断片は遊離させられる。Ｃ４ｂ２ａはＣ３転換酵素としても知られており、これは、膜に結合したままとなる。このＣ３転換酵素によって、次の補体成分であるＣ３がその活性な形態へと変換される。
【０００５】
代替補体経路の活性化は、Ｃ３ｂが病原体の細胞壁および他の細胞成分に、そして／またはＩｇＧ抗体に結合すると始まる。次いで、Ｂ因子が細胞に結合したＣ３ｂと結合し、Ｃ３ｂＢを形成する。その後、Ｃ３ｂＢはＢ因子によってＢｂとＢａとに分けられて、代替補体経路のＣ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂを形成する。プロペルジン（血清タンパク質）が次いでＣ３ｂＢｂに結合して、Ｃ３転換酵素としての機能を担うＣ３ｂＢｂＰを形成する。これによりＣ３分子がＣ３ａとＣ３ｂとに酵素によって切断される。この時点で、別の補体系路が活性化される。Ｃ３ｂのいくつかはＣ３ｂＢｂに結合してＣ３ｂＢｂ３ｂを形成する。これは、Ｃ５分子をＣ５ａとＣ５ｂとに切断することができる。
【０００６】
代替補体経路は、自己増幅経路であり、これは、抗体が存在しない条件下での細菌および他の病原体のクリアランスおよび認識に重要である。この代替補体経路によってもまた、レクチンおよび／または古典補体経路のいずれかによる最初の補体の活性化後に、補体の活性化を増幅することができる。ヒトの代替補体経路の活性化における律速工程は、Ｂ因子を切断して代替補体経路のＣ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂを形成するＤ因子の酵素作用である。（非特許文献１）。アジュバント誘発関節炎（ＡＩＡ）、およびコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、ならびに種々の他の疾患および症状における補体の活性化と蓄積との役割については、有力な証拠がある。
【０００７】
最近、代替補体経路の制御の欠損が、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）およびＡＭＤを含む、腎臓疾患および眼疾患の発症と関係付けられた（非特許文献２、ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｄｉｒｅｃｔ．ｃｏｍにおいてオンライン上で入手できる）。Ｃ３は、マウスにおいてはＣＮＶの発症に不可欠であることが明らかにされている（非特許文献３）。
【０００８】
炎症症状と、関連する組織の損傷、自己免疫疾患、ならびに、補体が関係している疾患における補体系の役割もまた周知である
代替補体経路が、炎症において（非特許文献４）、虚血再潅流後の局所および離れた組織での傷害（Ｓｔａｈｌら、前出）；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ、非特許文献５）；心肺バイパス手術の間の補体活性化（非特許文献６）；皮膚筋炎（非特許文献７）；ならびに天疱瘡（非特許文献８）において重要な役割を担っていることが示唆されている。代替補体経路はまた、自己免疫疾患（例えば、ループス腎炎、および結果として生じる糸球体腎炎、および脈管炎（例えば、非特許文献９を参照のこと）；ならびに、関節リウマチ、例えば、若年性関節リウマチ（非特許文献１０および非特許文献１１））にも関係している。
【０００９】
補体の蓄積および活性化の局所的な増加は、疾患の重篤度と相関関係がある（非特許文献１２）。Ｃ５ａ受容体アンタゴニスト（例えば、ペプチドおよび有機低分子）は、関節炎（非特許文献１３）、および種々の他の免疫炎症性疾患（非特許文献１４；非特許文献１５の処置について試験されており；そして、複数の会社（例えば、Ｐｒｏｍｉｃｓ（オーストラリア））によって、同様の適応症におけるＣ５ａアンタゴニストの有効性を試験するためのヒトでの臨床試験が行われている。Ｃ５ａもまた、皮膚筋炎と天疱瘡とに関係している（非特許文献７）。抗Ｃ５ａモノクローナル抗体は、心肺バイパス、および心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能不全を軽減し（非特許文献１６）、コラーゲン誘導関節炎を予防し、そして確立されている疾患を緩和する（非特許文献１７）ことが示されている。
【００１０】
オプソニン食作用（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）は、粒子の表面上での補体断片の蓄積とそれに続く食細胞による取り込みのプロセスであり、これは、免疫複合体、アポトーシス細胞または細胞破片と、病原体とを含む循環している粒子のクリアランスに重要である（非特許文献１８）。組織常在性マクロファージは、補体によって媒介される循環からの粒子のクリアランスにおいて重要な役割を担っていることが知られている。その９０％以上が組織常在性マクロファージから構成されているクップファー細胞は、肝門静脈からの血液に途切れることなく曝されており、オプソニン化されたウイルス、腫瘍細胞、細菌、真菌、寄生虫、および有害物質の、消化管からの効率のよいクリアランスのために肝洞様毛細血管に戦略的に配置されている。このクリアランスプロセスは、オプソニンとしての補体Ｃ３の存在に大部分が依存する（非特許文献１９）。ｔｈｏｅｓｔｈｅｒを介して細菌の表面に結合すると、Ｃ３は切断されて、代替補体経路を増幅する。この反応から、マクロファージ上の補体受容体のリガンドとして作用することができるＣ３断片の更なる蓄積が導かれる。この経路の重要性は、細菌およびウイルス感染に対して、Ｃ３を欠失しているヒトが非常に感染を起こしやすいことによって示される（参考文献）。
【００１１】
これまでに特性決定された補体受容体ＣＲ１、３、および４は、ＰＫＣの活性化またはＦｃ受容体の刺激の後にのみ、Ｃ３ｂと食作用Ｃ３オプソニン化粒子とをインターナライズする（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。さらに、ＣＲ１はマウスのクップファー細胞の表面上では発現されない（非特許文献２３）。循環している粒子の恒常的なクリアランスにおいてＫＣを助ける補体受容体は、これまでのところは記載されていない。
【００１２】
抗Ｃ３ｂ（ｉ）抗体は、補体の活性化、Ｃ３ｂ（ｉ）の蓄積、およびリツキシマブによるＣＤ２０＋細胞の死滅を促進することが報告されている（非特許文献２４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｔａｈｌら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００３年，第１６２巻，ｐ．４４９−４５５
【非特許文献２】Ｚｉｐｆｅｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６年，第４３巻，ｐ．９７−１０６
【非特許文献３】Ｂｏｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５年，第１７４巻，第１号，ｐ．４９１−７
【非特許文献４】Ｍｏｌｌｎｅｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２年，第２３巻，ｐ．６１−６４
【非特許文献５】Ｓｃｈｅｉｎら、Ｃｈｅｓｔ，１９８７年，第９１巻，ｐ．８５０−８５４
【非特許文献６】Ｆｕｎｇら、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ，２００１年，第１２２巻，ｐ．１１３−１２２
【非特許文献７】Ｋｉｓｓｅｌ，ＪＴら、ＮＥＪＭ，１９８６年，第３１４巻，ｐ．３２９−３３４
【非特許文献８】Ｈｏｎｇｕｃｈｉら、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９８９年，第９２巻，ｐ．５８８−５９２
【非特許文献９】Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００年，第１６４巻，ｐ．７８６−７９４
【非特許文献１０】Ａｇｇａｒｗａｌら、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２０００年，第２９巻，ｐ．１８９−１９２
【非特許文献１１】Ｎｅｕｍａｎｎ  Ｅ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，２００２年，第４巻，ｐ．９３４−４５
【非特許文献１２】Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００３年，第１１２巻，ｐ．１６３９−１６４１
【非特許文献１３】Ｗｏｏｄｒｕｆら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２００２年，第４６巻，第９号，ｐ．２４７６−２４８５
【非特許文献１４】Ｓｈｏｒｔら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９９年，第１２６巻，ｐ．５５１−５５４
【非特許文献１５】Ｆｉｎｃｈら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，１９９９年，第４２巻，ｐ．１９６５−１０７４
【非特許文献１６】Ｔｏｆｕｋｕｊｉら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，１９９８年，第１１６巻，ｐ．１０６０−１０６９
【非特許文献１７】Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５年，第９２巻，第１９号，ｐ．８９５５−８９５９
【非特許文献１８】Ｇａｓｑｕｅ，Ｐ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００４年，第４１巻，ｐ．１０８９−１０９８
【非特許文献１９】Ｆｕｊｉｔａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００４年，第１９８巻，ｐ．１８５−２０２
【非特許文献２０】Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌ，１９９１年，第２巻，ｐ．４１−５５
【非特許文献２１】Ｓｅｎｇｅｌｏｖ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５年，第１５巻，ｐ．１０７−１３１
【非特許文献２２】Ｓｅｎｇｅｌｏｖら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，第１５３巻，ｐ．８０４−８１０
【非特許文献２３】Ｆａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８年，第１６０巻，ｐ．５２７３−５２７９
【非特許文献２４】Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｂｌｏｏｄ，２００３年，第１０１巻，第３号，ｐ．１０７１−１０７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
知られている、種々の疾患における補体カスケードの関与を考慮すると、補体が関係している疾患の予防および／または処置のための新規の薬剤の同定および開発が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、補体系と相互作用する補体受容体ファミリーの新規のメンバー、および第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーの同定に基づく。
【００１６】
１つの態様においては、本発明は、補体が関係している眼疾患の予防または処置のための方法に関する。これには、その必要がある被験体に、予防有効量または治療有効量の補体阻害因子（例えば、代替補体経路の阻害因子（例えば、ＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニスト））を投与する工程が含まれる。
【００１７】
補体が関係している眼の症状は、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病、および他の虚血に関係する網膜症、眼内炎、糖尿病黄斑浮腫（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍａｃｕｌａ  ｅｄｅｍａ）、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症（ｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生であり得る。好ましくは、補体が関係している眼の症状は、ＡＭＤまたはＣＮＶであり、これには、これらの症状の全ての段階が含まれる。
【００１８】
別の態様においては、本発明は、ＡＭＤの発症または進行の予防のための方法に関する。これには、少なくとも一方の眼においてＡＭＤを発症するリスクがあるか、または少なくとも一方の眼においてＡＭＤと診断された被験体に、有効量の補体阻害因子（例えば、代替補体経路の阻害因子（例えば、ＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニスト））を投与する工程が含まれる。
【００１９】
なお別の態様においては、本発明は、滲出型ＡＭＤ（乾式ＡＭＤ（ｄｒｙ  ＡＭＤ））の処置のための方法に関する。これには、その必要がある被験体に、治療有効量の補体阻害因子（例えば、代替補体経路の阻害因子（例えば、ＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニスト））を投与する工程が含まれる。
【００２０】
全ての実施形態においては、ＣＲＩｇポリペプチドは、例えば、配列番号２、４、６、および８のＣＲＩｇポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）から選択することができる。ＣＲＩｇポリペプチド（全長のポリペプチドとそれらのＥＣＤが含まれる）は、免疫グロブリン配列（例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域配列（例えば、Ｆｃ領域））に融合させることができ、得られる免疫接着物は、本発明の予防および処置方法においてＣＲＩｇアゴニストとして使用することができる。好ましくは、免疫グロブリンは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ−１またはＩｇＧ−２またはＩｇＧ−３またはＩｇＧ４）であり、より好ましくは、ＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３である。ＩｇＧ１重鎖定常配列には、例えば、少なくとも、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域、または、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域が含まれ得る。
【００２１】
さらなる態様においては、本発明は、補体が関係している疾患または症状の予防または処置のための方法に関する。これには、その必要がある被験体に、予防有効量または治療有効量の補体阻害因子（例えば、代替補体経路の阻害因子（例えば、ＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニスト））を投与する工程が含まれる。
【００２２】
別の態様においては、本発明は、哺乳動物の中でのＣ３ｂ補体断片の生産の阻害のための方法に関する。これには、上記哺乳動物に、有効量の補体阻害因子（例えば、代替補体経路の阻害因子（例えば、ＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニスト））を投与する工程が含まれる。
【００２３】
なお別の態様においては、本発明は、哺乳動物の代替補体経路の選択的阻害のための方法に関する。これには、上記哺乳動物に、有効量のＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニストを投与する工程が含まれる。
【００２４】
全ての態様において、ＣＲＩｇポリペプチドは、例えば、配列番号２、４、６、８のＣＲＩｇポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドの細胞外領域からなる群より選択することができる。アゴニストは、好ましくは、本明細書中で上に記載されたようなＣＲＩｇ−Ｉｇ融合タンパク質（免疫接着物）である。免疫グロブリン配列は、例えば、免疫グロブリン定常領域配列（例えば、免疫グロブリン重鎖の定常領域配列）であり得る。別の実施形態においては、免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、配列番号２、４、６、または８のＣＲＩｇポリペプチドの細胞外領域に融合させられる。さらなる実施形態においては、免疫グロブリン重鎖定常領域配列は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３）のものである。この場合、ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列には、例えば、少なくとも、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域が含まれ得る。
【００２５】
補体が関係している疾患は、例えば、炎症性疾患または自己免疫疾患であり得る。
【００２６】
１つの特異的な実施形態においては、補体が関係している疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再潅流後の離れた組織の傷害、心肺バイパス手術の間の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎および結果として生じる糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症（ｃｒｙｏｂｌｏｂｕｌｅｍｉａ）、抗リン脂質症候群、加齢性黄斑変性、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、同種移植、超急性拒絶、血液透析、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、遺伝性血管浮腫、発作性夜間血色素尿症、および吸引性肺炎からなる群より選択される。
【００２７】
別の特異的な実施形態においては、補体が関係している疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーヴス病、橋本病甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、特発性多発性神経障害）、肝胆汁性疾患（例えば、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、および他の非肝臓向性ウイルス））、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性および繊維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫性または免疫性皮膚疾患（水胞性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎が含まれる）、乾癬、肺のアレルギー性疾患（例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎）、移植に伴う疾患（移植拒絶および移植片対宿主病が含まれる）からなる群より選択される。
【００２８】
なお別の特異的な実施形態においては、補体が関係している疾患は関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、または喘息である。
全ての実施形態においては、被験体は哺乳動物であり得、例えば、ヒト患者である。
さらなる態様においては、本発明は、被験体の加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の予防または処置のための方法に関する。これには、被験体に、有効量の補体阻害因子（例えば、代替補体経路の阻害因子（例えば、ＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニスト））を投与する工程が含まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
補体が関係している眼の症状の予防または処置のための方法であって、その必要がある被験体に、予防有効量または治療有効量の補体阻害因子を投与する工程を含む方法。
（項目２）
前記補体阻害因子が代替補体経路の選択的阻害因子である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記補体阻害因子がＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニストである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号２、４、６、８のＣＲＩｇポリペプチド、および前記ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号２、４、６、または８のＣＲＩｇポリペプチドのＥＣＤである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号４または６のＣＲＩｇポリペプチドのＥＣＤである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが免疫グロブリン配列に融合されている、項目３に記載の方法。
（項目８）
前記免疫グロブリン配列が免疫グロブリン定常領域配列である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記免疫グロブリン定常領域配列が免疫グロブリン重鎖のものである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、ＣＲＩｇ−Ｉｇ融合タンパク質が生産されるように配列番号２、４、６、または８のＣＲＩｇポリペプチドの細胞外領域に融合されている、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記免疫グロブリン定常領域配列がＩｇＧのものである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＩｇＧがＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、少なくとも、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれている、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれている、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ＣＲＩｇ−Ｉｇ融合タンパク質には、ＣＲＩｇ配列とＩｇ配列との間にリンカーが含まれている、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記ＣＲＩｇ−Ｉｇ融合タンパク質が、配列番号２０、２１、２５、２６、２７、および２８からなる群より選択される核酸によってコードされる、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記補体が関係している眼の症状が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症および他の虚血が関係している網膜症、眼内炎、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、および網膜血管新生からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記補体が関係している眼疾患が、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記方法にＣＮＶの予防が含まれる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記方法にＡＭＤの進行の予防が含まれる、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記方法にＡＭＤのＣＮＶへの進行の予防が含まれる、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の発症または進行の予防のための方法であって、少なくとも一方の眼においてＡＭＤを発症するリスクがあるか、または少なくとも一方の眼においてＡＭＤと診断された被験体に、有効量のＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニストを投与する工程を含む方法。
（項目２３）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号２、４、６、または８のポリペプチドの細胞外ドメインである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号４または６のポリペプチドの細胞外ドメインである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記アゴニストが、免疫グロブリン配列に融合されたＣＲＩｇポリペプチド配列を含む融合ポリペプチドである、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記融合ポリペプチドに、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に融合された、配列番号４または６のポリペプチドの細胞外ドメインが含まれている、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記融合ポリペプチドが、配列番号２０、２１、２５、２６、２７、および２８のヌクレオチド配列によってコードされる融合ポリペプチドからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記被験体がヒトである、項目２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記ヒト被験体が、少なくとも一方の眼にＡＭＤを有していると診断されている、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＡＭＤが、カテゴリー３またはカテゴリー４の乾式ＡＭＤである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記被験体がＣＮＶを発症するリスクがあると同定されている、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記被験体が遺伝的にＣＮＶを発症するリスクがある、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ヒト被験体が、両方の眼にＡＭＤを有していると診断されている、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記ヒト被験体が両方の眼にカテゴリー３またはカテゴリー４のＡＭＤを有している、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記投与によってＡＭＤの進行が遅くなる、項目２８に記載の方法。
（項目３６）
前記投与によってＡＭＤのＣＮＶへの進行が遅くなる、項目２８に記載の方法。
（項目３７）
前記投与によってＡＭＤのＣＮＶへの進行が妨げられる、項目２８に記載の方法。
（項目３８）
前記ヒト被験体が一方の眼だけにＡＭＤを有していると診断されている、項目２９に記載の方法。
（項目３９）
前記投与によって他方の眼のＡＭＤの発症が遅れる、項目３８の方法。
（項目４０）
前記投与によって、他方の眼のＡＭＤの発症が妨げられる、項目３８の方法。
（項目４１）
前記投与が硝子体内注射によって行われる、項目２８に記載の方法。
（項目４２）
ＡＭＤまたはＣＮＶの予防または処置のためのさらなる薬剤の投与をさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目４３）
前記さらなる薬剤が抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
乾式加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の処置のための方法であって、その必要がある被験体に、予防有効量または治療有効量のＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニストを投与する工程を含む方法。
（項目４５）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号２、４、６、８のＣＲＩｇポリペプチド、および前記ポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）からなる群より選択される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号２、４、６、または８のＣＲＩｇポリペプチドの細胞外領域である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号４または６のＣＲＩｇポリペプチドの細胞外領域である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが免疫グロブリン配列に融合されている、項目４５に記載の方法。
（項目４９）
前記免疫グロブリン配列が免疫グロブリン定常領域配列である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記免疫グロブリン定常ドメイン配列が免疫グロブリン重鎖のものである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、配列番号２、４、６、または８のＣＲＩｇポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に融合されている、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記免疫グロブリン定常領域配列がＩｇＧのものである、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記ＩｇＧがＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれている、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれている、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
補体が関係している疾患または症状の予防または処置のための方法であって、そのような処置が必要である被験体を、予防有効量または治療有効量のＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニストで処置する工程を含む方法。
（項目５７）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号２、４、６、８のＣＲＩｇポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの細胞外領域からなる群より選択される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが免疫グロブリン配列に融合されている、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記免疫グロブリン配列が免疫グロブリン定常領域配列である、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記免疫グロブリン定常領域配列が免疫グロブリン重鎖のものである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、配列番号２、４、６、または８のＣＲＩｇポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に融合されている、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列がＩｇＧのものである、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ＩｇＧがＩｇＧ−１およびＩｇＧ−３から選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれている、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれている、項目６２に記載の方法。
（項目６６）
前記補体が関係している疾患が炎症性疾患または自己免疫疾患である、項目５６に記載の方法。
（項目６７）
前記補体が関係している疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再潅流後の離れた組織の傷害、心肺バイパス手術の間の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎および結果として生じる糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、加齢性黄斑変性、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、同種移植、超急性拒絶、血液透析、慢性閉塞性肺窮迫症候群（ＣＯＰＤ）、喘息、吸引性肺炎、蕁麻疹、慢性特発性蕁麻疹、溶血性尿毒症症候群、子宮内膜症、心原性ショック、虚血再潅流損傷、ならびに多発性硬化症（ＭＳ）からなる群より選択される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記補体が関係している疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーヴス病、橋本病甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、特発性多発性神経障害）、肝胆汁性疾患（例えば、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、および他の非肝臓向性ウイルス））、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性および繊維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫性または免疫性皮膚疾患（水胞性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎が含まれる）、乾癬、肺のアレルギー性疾患（例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎）、移植に伴う疾患（移植拒絶および移植片対宿主病が含まれる）、アルツハイマー病、発作性夜間血色素尿症、遺伝性血管浮腫、ならびにアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記補体が関係している疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、または喘息である、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
前記被験体が哺乳動物である、項目５７に記載の方法。
（項目７１）
前記哺乳動物がヒトである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
哺乳動物でのＣ３ｂ補体断片の生産の阻害のための方法であって、前記哺乳動物に有効量のＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニストを投与する工程を含む方法。
（項目７３）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが、配列番号２、４、６、８のＣＲＩｇポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの細胞外領域からなる群より選択される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記ＣＲＩｇポリペプチドが免疫グロブリン配列に融合されている、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記免疫グロブリン配列が免疫グロブリン定常領域配列である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記免疫グロブリン定常領域配列が免疫グロブリン重鎖のものである、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、配列番号２、４、６、または８のＣＲＩｇポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に融合されている、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列がＩｇＧのものである、項目７６に記載の方法。
（項目７９）
前記ＩｇＧがＩｇＧ−１およびＩｇＧ−３から選択される、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含
まれている、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ＩｇＧ−１重鎖定常領域配列に、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれている、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
哺乳動物での代替補体経路の選択的阻害のための方法であって、前記哺乳動物に有効量のＣＲＩｇポリペプチドまたはそのアゴニストを投与する工程を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、３２１アミノ酸のヒトＣＲＩｇポリペプチドのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、３２１アミノ酸のヒトＣＲＩｇポリペプチドのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、自然界に存在しているヒトＣＲＩｇの３９９アミノ酸の全長形態（ｈｕＣＲＩｇまたはｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、自然界に存在しているヒトＣＲＩｇの３９９アミノ酸の全長形態（ｈｕＣＲＩｇまたはｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号３および４）を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは、自然界に存在しているヒトＣＲＩｇの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５および６）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂは、自然界に存在しているヒトＣＲＩｇの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号５および６）を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、２８０アミノ酸の自然界に存在しているマウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８）を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、２８０アミノ酸の自然界に存在しているマウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８）を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、２８０アミノ酸の自然界に存在しているマウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号７および８）を示す。
【図５】図５は、ｍｕＣＲＩｇ（配列番号８）とともにアラインメントした、全長のｈｕＣＲＩｇ（配列番号４）およびｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ（配列番号６）のアミノ酸配列を示す。疎水性シグナル配列ＩｇＶ、ＩｇＣ、および膜貫通領域を示す。ｍｕＣＲＩｇは、推定される１つのＮ結合グリコシル化部位を１７０位（ＮＧＴＧ）に有している。ヒトＣＲＩｇ遺伝子のエキソン−イントロン境界に由来すると推定されるＩｇドメインの境界を示す。
【図６】図６は、マウスの肝臓凍結切片でのＣＲＩｇのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
【図７】図７は、ヒトの肝臓凍結切片でのＣＲＩｇのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
【図８】図８は、活性化させられた結腸および副腎のマクロファージ、クップファー細胞、ならびに胎盤のホーフバウワー細胞でのＣＲＩｇのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
【図９】図９は、ＲＡ滑膜細胞でのＣＲＩｇ  ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
【図１０】図１０は、脳の小グリア細胞でのＣＲＩｇ  ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
【図１１】図１１は、ヒトの喘息にかかった組織に由来する細胞でのＣＲＩｇ  ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
【図１２】図１２は、ヒトの慢性肝炎組織に由来する細胞でのＣＲＩｇ  ｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションを示す。
【図１３】図１３は、副腎マクロファージでのＣＲＩｇの免疫組織化学的分析を示す。
【図１４】図１４は、肝臓のクップファー細胞でのＣＲＩｇの免疫組織化学的分析を示す。
【図１５】図１５は、脳の小グリア細胞でのＣＲＩｇの免疫組織化学的分析を示す。
【図１６】図１６は、胎盤のホーフバウワー細胞でのＣＲＩｇの免疫組織化学的分析を示す。
【図１７】種々の組織の中でのｈｕＣＲＩｇの発現を示すノーザンブロット分析。１．５ｋｂと１．８ｋｂとの２種類の転写物が、ＣＲＩｇを発現するヒト組織に存在していた。
【図１８】（Ａ）骨髄単核細胞株ＨＬ６０およびＴＨＰ−１、ならびに分化したマクロファージの中でのｈｕＣＲＩｇの発現の増加を示すＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ分析。低レベルの発現がＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、ＭＯＬＴ３、ＭＯＬＴ４、およびＲＡＭＯＳ  Ｂ細胞株で見られた。（Ｂ）インビトロでの単球の分化の間のｈｕＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現の増加。ヒトの末梢血から単離した単球を、７日間、プラスチックに接着させることによって分化させた。全ＲＮＡを、分化の間の様々な時点で抽出した。（Ｃ）単球からマクロファージへの分化の間のｈｕＣＲＩｇタンパク質の発現の増加。単球は（Ｂ）で示したように処理し、細胞溶解物の全てをゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜に移動させ、これをｈｕＣＲＩｇに対するポリクローナル抗体（４Ｆ７）とともにインキュベートした。ポリクローナル抗体は、４８ｋＤａおよび３８ｋＤａのバンドを認識し、おそらくこれらは，ｈｕＣＲＩｇの長い形態と短い形態とを示している。
【図１９】細胞株でのｈｕＣＲＩｇタンパク質分子の特性決定。（Ａ）ｈｕＣＲＩｇ−ｇｄを２９３Ｅ細胞で一時的に発現させ、抗ｇｄで免疫沈降させ、ブロットを抗ｇｄまたはＣＲＩｇの細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体とともにインキュベートした。（Ｂ）２９３細胞で発現されたｈｕＣＲＩｇは単量体のＮ−グリコシル化タンパク質である。ＣＲＩｇはＨＥＫ２９３細胞をパーバナデートナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）で処理してリン酸化されたチロシンであるが、Ｓｙｋキナーゼは動員しない。リン酸化されたＣＲＩｇはリン酸化されていないＣＲＩｇと比較するとわずかに大きい分子量に移動した。
【図２０】図２０は、ヒト単球由来マクロファージ上でのｈｕＣＲＩｇの選択的発現。末梢血単核細胞を、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球に特異的な抗体、およびＣＲＩｇに対するＡＬＥＸＡ（商標）Ａ４８８結合モノクローナル抗体（３Ｃ９）で染色した。発現は、末梢血白血球の全て、ならびに単球由来の樹状細胞においては存在しなかったが、インビトロで分化させられたマクロファージで発現されていた。
【図２１Ａ】ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現は、ＩＬ−１０およびデキサメタゾンによって増加した。（Ａ）実時間ＰＣＲはＩＬ−１０での処理後のＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現の増加を示し、ＴＧＦ−βがデキサメタゾンによっては大きく誘導されたが、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαでの処理によってはダウンレギュレートされた。（Ｂ）Ｆｉｃｏｌｌで分離した末梢血単核細胞を種々のサイトカインおよびデキサメタゾンで５日間処理し、抗ＣＤ１４および抗ＣＲＩｇで二重染色した。フロー分析は、デキサメタゾンで処理し、ＩＬ−１０およびＬＰＳで処理した後の、単球の表面上でのＣＲＩｇの発現の劇的な増加を示している。
【図２１Ｂ】ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現は、ＩＬ−１０およびデキサメタゾンによって増加した。（Ａ）実時間ＰＣＲはＩＬ−１０での処理後のＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現の増加を示し、ＴＧＦ−βがデキサメタゾンによっては大きく誘導されたが、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαでの処理によってはダウンレギュレートされた。（Ｂ）Ｆｉｃｏｌｌで分離した末梢血単核細胞を種々のサイトカインおよびデキサメタゾンで５日間処理し、抗ＣＤ１４および抗ＣＲＩｇで二重染色した。フロー分析は、デキサメタゾンで処理し、ＩＬ−１０およびＬＰＳで処理した後の、単球の表面上でのＣＲＩｇの発現の劇的な増加を示している。
【図２２】単球由来マクロファージでのＣＲＩｇの細胞内局在化。単球を、マクロファージ分化培地で７日間培養し、アセトン中に固定し、ポリクローナル抗ＣＲＩｇ抗体６Ｆ１またはＣＤ６３および二次ヤギ抗ウサギＦＩＴＣで染色した。細胞を、共焦点顕微鏡において試験した。ＣＲＩｇは細胞質中に見られ、リソソーム膜タンパク質ＣＤ６３と一緒に局在化していた。ＣＲＩｇはまた、Ｆ−アクチンのパターンと同様のパターンでマクロファージの先頭および末の端でも発現されていた。目盛り棒＝１０μｍ。
【図２３】慢性炎症性疾患におけるＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの局在化。インサイチュハイブリダイゼーションによって、肺炎患者（Ａ、Ｂ）、または慢性喘息の患者（Ｃ、Ｄ）の組織から得た肺胞マクロファージでのＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの存在を示した。ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡはまた、慢性肝炎の患者の肝臓生検によって得た組織中の肝臓クップファー細胞（Ｅ、Ｆ）においても発現されていた。
【図２４】ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現は炎症を起こしている滑膜において増加していた。ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡは、関節に炎症を起こしていない患者（Ａ、Ｃ）のひざの代替手術によって得た関節の滑膜においては低いかまたは存在していなかったが、変形性関節症の患者（Ｂ、Ｄ）のパンヌスにおいては、細胞（おそらくは、滑膜細胞または滑膜マクロファージ）において高く発現されていた。
【図２５】変形性関節疾患の患者の滑膜を内層している細胞でのポリクローナル抗体６Ｆ１を用いたＣＲＩｇタンパク質の検出（Ａ、Ｂ、Ｃ）。ＣＲＩｇの免疫組織化学的検出は対照の滑膜においては見られなかった（Ｄ）。
【図２６】ＣＲＩｇタンパク質は、組織常在性マクロファージのサブタイプで発現されており、その発現は慢性炎症性疾患において増加していた。（Ａ）ＣＲＩｇはＣＲＩｇを安定して発現するＣＨＯ細胞の膜上で発現されていた。ＣＲＩｇタンパク質の高い発現が、慢性喘息の患者から得た組織の中の肺胞マクロファージ（Ｂ）で見られた。（Ｃ）ヒトの小腸の組織球でのＣＲＩｇの発現。切片は外科手術によって取り出した組織から得、これには腫瘍が含まれている可能性があった。（Ｄ）ヒトの出産予定日以前の胎盤のホーフバウワー細胞でのＣＲＩｇタンパク質の発現。マクロファージでのＣＲＩｇタンパク質の高い発現が、副腎の中（Ｅ）およびヒトの肝臓のクップファー細胞の中（Ｆ）に存在していた。染色を、５μｍの厚さのアセトンで固定した切片についてＤＡＢを色原体として使用して行った。画像を、２０×および４０×の倍率で撮影した。
【図２７】アテローム性動脈硬化症の患者から得た血管プラーク（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｌａｑｕｅ）上でのＣＤ６８およびＣＲＩｇの免疫組織化学的染色。連続する切片を固定し、ヒトＣＤ６８に対するモノクローナル抗体（Ａ、Ｂ）と、ヒトＣＲＩｇに対して惹起させたポリクローナル抗体６Ｆ１（Ｃ、Ｄ）とで染色した。ＣＲＩｇは、アテローム性プラークの中に存在するマクロファージの集団およびｐｈｏａｍ細胞の集団において明らかになり、連続する切片上での染色から判断するとＣＤ６８ポジティブマクロファージと重複していた。倍率：１０×（Ａ、Ｃ）および２０×（Ｂ、Ｄ）。
【図２８】心臓間質性マクロファージ上でのＣＲＩｇとＣＤ６８との同時染色。５μｍの切片をヒトの心臓（死体解剖）から入手し、ＣＲＩｇに対するモノクローナル抗体（３Ｃ９）と二次抗マウスＦＩＴＣ標識抗体とで染色した。ＣＤ６８を、ＣＤ６８に対するＰＥ標識モノクローナル抗体での染色によって検出した。倍率：２０×。
【図２９】ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡのレベルは、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および喘息の患者から得た結腸組織で顕著に高かった。実時間ＰＣＲを種々の組織から抽出した全ＲＮＡについて行った。ＣＲＩｇのｍＲＮＡは、潰瘍性大腸炎、クローン病、およびＣＯＰＤの患者から得た組織においては顕著に増大していた。統計分析を、マンホイットニーＵ検定を使用して行った。
【図３０】ヒトＣＲＩｇを発現する細胞は、ヒト内皮細胞に対する接着の増加を示した。（Ａ）ＣＲＩｇはヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株で安定に発現されていた。（Ｂ）細胞を蛍光色素ＢＣＥＣＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）とともにプレロードし、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理したかまたは処理しなかったヒトの臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単層をコーティングした９６ウェルプレートに添加した。３回の洗浄後、蛍光を、蛍光分光計でカウントし、これにより、ＨＵＶＥＣ細胞に対して接着したままである細胞の数を明らかにした。グラフは、４回の独立する実験の典型的なものである。
【図３１】ｍｕＣＲＩｇ  ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質によるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）のマウスモデルの進行の阻害。（ＣＩＡ）マウスの１つのグループ（ｎ＝７）に、１００μｇのｍｕＣＲＩｇ  ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質（四角）を投与し、一方、ＣＩＡマウスの対照グループ（ｎ＝８）には、１００μｇのマウスＩｇＧ１（丸）を、６週間にわたって１週間に３回投与した。マウスを、炎症の兆候について毎日観察し、０〜１６の尺度（実施例２５に詳細に記載）でスコアし、そして結果をグラフにプロットした（平均±ＳＤ、スチューデントＴ検定  対照ＩｇＧ１対試験ｍｕＣＲＩｇタンパク質については、ｐ値＝０．０００４）。
【図３２】図３２は、ＤＮＡ４２２５７（コンセンサス配列）のヌクレオチド配列（配列番号９）である。
【図３３】図３３は、ＣＲＩｇ−Ｆｃで処置したマウスの関節の腫れの軽減を示している。
【図３４】図３４は、ｍｕＣＲＩｇが関節の炎症を阻害することを示している。
【図３５】図３５は、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃで処置したマウスの関節における皮質骨量の保存を示している。
【図３６】図３６は、ＣＲＩｇ−Ｆｃでの処置によっては組織常在性マクロファージの数も形態も変化しないことを示している。
【図３７】図３７は、ｍｕＣＲＩｇでの処置によっては血清抗コラーゲン抗体力価に影響はないことを示している。
【図３８】図３８は、ｍｕＣＲＩｇはインビボでのＴ依存性Ｂ細胞応答を変化させないことを示している。
【図３９】図３９は、凍結した脱灰関節でのＦ４／８０染色によって生じた、抗体誘導関節炎（ＡＩＡ）後の関節におけるマクロファージの浸潤を示している。
【図４０】図４０は、ＣＲＩｇ−ＦｃがＢａｌｂ／ｃマウスの抗体誘導関節炎後の関節の腫れを防ぐことを示している。
【図４１】図４１は、ｍｕＣＩＲｇが抗体誘導関節炎における関節の炎症を阻害することを示している。
【図４２】図４２は、マウスＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質がＣ３オプソニン化ヒツジ赤血球（Ｅ−ＩｇＭ）に結合することを示している。
【図４３】図４３は、Ｅ−ＩｇＭに対するヒトＣＲＩｇ−Ｆｃの結合がＣ３依存性であることを示している。
【図４４】図４４は、ＣＲＩｇを発現するＣＨＯ細胞に対する血清オプソニン化粒子の結合を示している。
【図４５】図４５は、マウスＣＲＩｇ−Ｆｃが補体Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂには結合するが、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ３ｃ、およびＣ３ｄには結合しないことを示している。
【図４６】図４６は、マウスおよびヒトＣＲＩｇ−Ｆｃが補体Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂｉ、およびＣ３ｃには結合するが、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ３ａ、およびＣ３ｄには結合しないことを示している。
【図４７】図４７Ａは、マウスおよびヒトＣＲＩｇ−ＦｃがザイモサンのＣ３の蓄積を阻害することを示している。図４７Ｂは、マウスＣＲＩｇ−Ｆｃが血清でのＣ３の活性化を阻害することを示している。
【図４８Ａ】図４８は、マウスＣＲＩｇが代替補体経路によって誘導される溶血反応は阻害するが、古典補体経路の溶血反応には影響を及ぼさないことを示している。
【図４８Ｂ】図４８は、マウスＣＲＩｇが代替補体経路によって誘導される溶血反応は阻害するが、古典補体経路の溶血反応には影響を及ぼさないことを示している。
【図４９】図４９は、ＣＲＩｇ  ＥＣＤがＣ３およびＣ５の代替補体経路の転換酵素を阻害することを示している。（Ａ）ＣＲＩｇはＣ１ｑ欠損血清中のウサギ赤血球の溶血反応（代替補体経路）は阻害するが、ｆＢ欠損血清中のＩｇＭオプソニン化ヒツジ赤血球の溶血反応（古典補体経路）は阻害しない。（Ｂ）ＣＲＩｇは液相Ｃ３転換酵素活性を阻害する。（Ｃ）ＣＲＩｇは、Ｉ因子によって媒介されるＣ３の切断の補因子としては機能しない。（Ｄ）ＣＲＩｇはＣ３転換酵素のデコイの加速因子としては機能しない。（Ｅ）ＣＲＩｇ、はザイモシン粒子上に形成される代替補体経路のＣ５転換酵素を阻害する。
【図５０】ＣＲＩｇは組織常在性マクロファージのサブ集団上で選択的に発現される。（Ａ）ＣＲＩｇは、１つの（ヒトＣＲＩｇ  ｓｈｏｒｔ（ｍｕＣＲＩｇ（Ｓ））およびマウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）、または２つの（ｈｕＣＲＩｇＬ）免疫グロブリンドメインから構成されている膜貫通免疫グロブリンスーフパーファミリーの１つのメンバーである。左側のパネルの上部の尺度は、アミノ酸の大きさを示している。右側のパネルは、ｈｕＣＲＩｇとｍｕＣＲＩｇとが関節の接着分子−Ａ（ＪＡＭ−Ａ）およびＡ３３抗原と遠く関係していることを示している。右側のパネルの上部の目盛りは、アミノ酸の類似性の割合（％）を示している。（Ｂ）ＣＲＩｇは、マクロファージでは発現されているが、単球では発現されていない。１０％の自己血清および２０％のウシ胎児血清で７日間培養したヒトＣＤ１４＋単球とＣＤ１４＋単球とを、抗ヒトＣＲＩｇ  ＭＡｂ（３Ｃ９）を使用してフローサイトメトリーによってｈｕＣＲＩｇ染色について分析した。マウスＣＤ１１ｂ＋およびＦ４／８０＋肝臓クップファー細胞は、抗ｍｕＣＲＩｇ  ＭＡｂ（１４Ｇ６）を使用してｍｕＣＲＩｇ染色について分析した。（Ｃ）ヒトおよびマウスのマクロファージのウェスタンブロット分析。示した時間培養したヒトＣＤ１４＋単球由来の溶解物またはマウスの末梢マクロファージを、還元性のＳＤＳ緩衝液中で沸騰させ、４〜１０％のＴｒｉｓ−グリシンゲル上にロードし、ポリクローナル抗ＣＲＩｇ抗体（６Ｆ１、左側のパネル）または抗ｍｕＣＲＩｇモノクローナル抗体（１４Ｃ６、右側のパネル）とともにインキュベートした。プレ−免疫ＩｇＧ（左側のパネル）およびラットＩｇＧ２ｂ（右側のパネル）を、イソ型対照として使用した。左側のパネルの矢印は、５７ｋＤａと５０ｋＤａとのバンドの位置を示しており、これらはおそらく、ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）とｈｕＣＲＩｇ（Ｓ）とを示している。（Ｄ）肝臓クップファー細胞上でのＣＲＩｇとＣＤ６８の共局在。免疫染色を、ヒトおよびマウスの肝臓から得た切片について、モノクローナル抗ＣＲＩｇ（３Ｃ９ヒトおよび１４Ｇ６マウス）、ならびにモノクローナル抗ＣＤ６８抗体を使用して行った。
【図５１】末梢血白血球上でのＣＲＩｇの発現のフローサイトメトリー分析、およびＣＲＩｇを発現するＣＨＯ細胞に対するＣ３断片Ｃ３オプソニン化粒子の結合の分析。（Ａ）ヒトおよびマウスの、ヒト末梢白血球およびマウス末梢白血球上でのＣＲＩｇの発現についてのフローサイトメトリー分析。（Ｂ）マウスＣＲＩｇを発現するＣＨＯ細胞に対する可溶性Ｃ３断片または補体オプソニン化病原体の結合。ＪＡＭ−２を発現するＣＨＯ細胞に対しては結合しない。懸濁液中の細胞をＡ４８８標識補体オプソニン化粒子と共に、室温で３０分間、連続回転下でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、粒子の結合を、フローサイトメトリー分析によってモニターした。結果は、３回の別々の実験の典型である。
【図５２】可溶性ＣＲＩｇおよび細胞表面で発現されたＣＲＩｇは溶液中または細胞表面に堆積したＣ３断片に結合する。（Ａ）ＣＲＩｇ（Ｌ）でトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ−ＣＲＩｇ）は、Ｃ３およびＩｇＭオプソニン化ヒツジ赤血球（Ｅ−ＩｇＭ）とロゼット（ｒｏｓｅｔｔｅ）を形成するが、空のベクターでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ−対照）はこれを形成しない。柱状グラフ（左側のパネル）は、ヒトＣＲＩｇ（Ｌ）で安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞上でのＣＲＩｇの発現を示している。Ｃ３欠損（Ｃ３−）血清またはＣ３十分（Ｃ３＋）血清でオプソニン化したＥ−ＩｇＭを、ＣＲＩｇまたは対照ベクターでトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔと共に１時間混合した。実験は、３回の別々の実験の典型である。（Ｂ）ＩｇＭオプソニン化ヒツジ赤血球（Ｅ−ＩｇＭ）に対するＣＩｇ（Ｌ）−Ｆｃの結合は血清中のＣ３の存在に依存している。Ｅ−ＩｇＭを、漸増濃度の精製したヒトＣ３を添加したＣ３枯渇ヒト血清でオプソニン化した。その後、Ｅ−ＩｇＭをｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−Ｆｃタンパク質と共にインキュベートし、続いてこれを、フローサイトメトリーによって検出した抗ヒトＦｃポリクローナル抗体で検出した。実験は、３回の別々の実験の典型である。（Ｃ）Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂに対するＣＲＩｇ（Ｌ）−ＦｃおよびＣＲＩｇ（Ｓ）−Ｆｃの結合を示すＥＬＩＳＡ。漸増濃度のｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−ＦｃおよびｈｕＣＲＩｇ（Ｓ）−Ｆｃ融合タンパク質を、精製したＣ３ｂおよびｉＣ３ｂをコーティングしたｍａｘｉｓｏｒｂプレートに添加した。結合は、ＨＲＰＯ結合抗ｈｕＦｃ抗体を使用して検出した。示す結果は、融合タンパク質と精製した補体成分との異なるバッチを使用した４回の別々の実験の典型である。（Ｄ）ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−Ｆｃに対する可溶性Ｃ３ｂ二量体の結合を示す運動速度論的な結合データ。ＣＲＩｇ融合タンパク質に対するＣ３ｂの親和性は、表面プラズモン共鳴を使用して決定した。ＣＲＩｇタンパク質をＦｃ融合タグに対して指向させた抗体のアミンカップリングによってＣＭ５センサーチップの上に捕捉した。その後、二量体Ｃ３ｂを、飽和に到達させるために十分な時間をかけて注入した。Ｋｄは、濃度に対してプロットした、平衡時の応答を示す結合曲線から計算した。Ｃ３ｂ二量体は、ｈｕＣＲＩｇ（Ｓ）に対して４４ｎＭと計算された親和性で結合し、そしてｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）に対しては１３１ｎＭの親和性で結合した。（Ｅ）細胞表面上で発現されたＣＲＩｇはＡ４８８標識Ｃ３ｂ二量体（Ｃ３ｂ）２）に結合するが、自然界に存在しているＣ３には結合しない。左側のパネルは、フローサイトメトリー分析による、トランスフェクトしたＴＨＰ−１細胞上でのｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）の発現レベルを示す。（Ｃ３ｂ）２は、ＣＲＩｇでトランスフェクトしたＴＨＰ−１細胞に対する飽和性結合を示す。ＴＨＰ−１  ＣＲＩｇに対する（Ｃ３ｂ）２の結合は、（Ｃ３ｂ）２、Ｃ３ｂ、およびＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ＣＲＩｇ−ＥＣＤ）と競合したが、Ｃ３とは競合しなかった。結果は、３回の別々の実験の典型を示す。
【図５３】ＣＲＩｇ  ｋｏマウスの作成と特性決定。（Ａ）ＥＳ細胞での相同組換えに使用した標的化ベクターの作成。（Ｂ）ｗｔマウスと交配させたキメラマウスに由来するヘテロ接合型の雌の子孫でのＳＲＩｇ対立遺伝子の相同組換えのサザンブロットによる確認。（Ｃ）ｗｔおよびｋｏの雄および雌のマウスの末梢血中の白血球数の比較。（Ｄ）ＫＣではＣＲ１、ＣＲ２、およびＣＤ１１ｃの発現がないことを示すＦＡＣＳ分析。（Ｅ）ｗｔ  ＫＣおよびｋｏ  ＫＣに対するＣ３−Ａ４８８およびＣ３ｃ−Ａ４８８の結合のＦＡＣＳ分析。
【図５４】クップファー細胞上でのＣＲＩｇの発現はＣ３ｂおよびｉＣ３ｂの結合に不可欠である。（Ａ）ＣＲＩｇタンパク質はＣＲＩｇ  ＫＯマウスから得たマクロファージ上には存在しない。ＣＲＩｇ  ｗｔ、ＣＲＩｇ  ｈｅｔ、またはＣＲＩｇ  ｋｏマウスから得た末梢マクロファージを、抗ｍｕＣＲＩｇ  ｍＡｂ（１４Ｇ６：左側のパネル）とともにインキュベートした。ＣＲＩｇ  ｗｔおよびＣＲＩｇ  ｋｏマウスから得たクップファー細胞（ＫＣ）を抗体１４Ｇ６とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１８、補体受容体３のα鎖およびβ鎖、ならびにＣｒｒｙの発現レベルは、ＣＲＩｇ  ｗｅマウスおよびＣＲＩｇ  ｋｏマウスから得たクップファー細胞については類似していた。ＣＲＩｇ  ｗｔまたはＣＲＩｇ  ｋｏマウスから単離したクップファー細胞をＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、およびＣｒｒｙに対する抗体とともにインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｃ）ＣＲＩｇ  ｗｔまたはｋｏマウスから単離したクップファー細胞を、活性化したマウス血清（３７℃で３０分間のインキュベーションによって活性化した）、Ｃ３ｂ、（Ｃ３ｂ）２、およびｉＣ３ｂと共にインキュベートした。細胞表面に対する精製した補体成分の結合を、種々のＣ３由来の断片を認識するポリクローナル抗体で検出した。結果は４回の実験の典型である。（Ｄ）ＣＲＩｇ  ｋｏマウスから単離したＫＣは、Ｃ３十分マウス血清中でオプソニン化したＩｇＭでコーティングしたヒツジ赤血球（Ｅ−ＩｇＭ）によって低いリセットを示した。ＣＲＩｇ  ｗｔおよびＣＲＩｇ  ｋｏマウスの肝臓から単離したＫＣを、補体Ｃ３オプソニン化Ｅ−ＩｇＭと共に、対照ＩｇＧまたは抗ＣＲ３ブロック抗体（Ｍ１／７０）の存在下で、３０分間インキュベートした。細胞を固定し、Ｅ−ＩｇＭと共にロゼットを形成したＫＣの数を数え、ＫＣの総数の割合（％）として表した。＊＝ｐ＜０．０５。結果は、２回の別々の実験の典型である。
【図５５】クップファー細胞上のＣＲＩｇのリサイクル（Ａ）  Ｃ３  ｗｔ（パネル１、３、４、および６）、またはＣ３  ｋｏマウス（パネル２、５）由来のクップファー細胞（ＫＣ）を、Ａ４８８標識抗ＣＲＩｇ抗体（１４Ｇ６）および（Ｃ３ｂ）２と共に、４℃で１時間（パネル１〜３）、または３７℃で１０分間（パネル４〜６）インキュベートした。その後、細胞を４℃に移し、抗Ａ４８８抗体（赤色の柱状図）とともに、または抗体を伴わずに（黒色の柱状図）インキュベートして、細胞表面で発現された抗ＣＲＩｇまたはＣ３ｂに由来する細胞質を区別した。（Ｂ）ＣＲＩｇ  ｗｔでのＣＲＩｇとＣ３ｂとのインターナライゼーションおよび共局在。これは、ＣＲＩｇ  ｋｏ、ＫＣでは生じない。ＣＲＩｇ  ｗｔおよびＣＲＩｇ  ｋｏマウスの肝臓から単離したＫＣを、チャンバースライドで２日間培養しＡ４５５結合抗ＣＲＩｇ抗体およびＡ４８８結合Ｃ３ｂとともに、３７℃で３０分間インキュベートし、マウントし、そして写真を撮影した。（Ｃ）ＣＲＩｇ（Ｌａｍｐ１ではない）抗体は細胞表面上で再利用される。クップファー細胞を、Ａ４８８結合抗ｍｕＣＲＩｇ抗体または抗ｍｕＬａｍｐ１抗体とともに、３７℃で１０分間かけてロードし、洗浄し、その後、抗Ａ４８８停止抗体の存在下で、３７℃で示した時間インキュベートした。示す結果は、３回の独立した実験の典型である。
【図５６】ＣＲＩｇは、粒子の取り込み部位に動員される再利用されているエンドソーム上で発現される。（Ａ）細胞表面で発現されたＣＲＩｇは、Ｆ−アクチンポジティブ膜ラッフルに局在化される。単球由来マクロファージの７日間培養物を、Ａ４８８結合抗ＣＲＩｇ  Ａ４８８ｍＡｂ  ３Ｃ９（Ａ１、およびＡ３の中の緑色のチャネル）、およびＡｌｅｘａ  ５４６−ファロイジン（Ａ２、およびＡ３の中の赤色のチャネル）と共に、４℃でインキュベートした。矢印の先端は、ＣＲＩｇおよびアクチンの染色の両方が細胞表面の残りの部分よりも強い膜ラッフルを示す（Ａ３の中の重ね合わせた画像の中の黄色）。目盛り棒は２０μｍである。（Ｂ）ＣＲＩｇおよびＣ３ｂは、再利用されているエンドソームでトランスフェリンと一緒に局在化している。マクロファージを、ＣＲＩｇ−Ａ４８８（Ｂ１、Ｂ４の中の緑色のチャネル）またはＣ３０Ａ４８８（Ｂ２、Ｂ４の中の赤色のチャネル）と共に氷上で１時間インキュベートし、その後、Ａ６４７−トランスフェリン（Ｂ３、Ｂ４の中の青色のチャネル）の存在下で、３７℃で１０分間、追跡した。目盛り棒＝２０μｍ。（Ｃ）ＣＲＩｇは、ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｃｕｐとファゴソーム膜とに動員される。マクロファージを、Ａ６４７標識トランスフェリン（Ｃ２、６、および青色のチャネルＣ４、８）の存在下で、Ｃ３十分血清でオプソニン化したＩｇＭをコーティングした赤血球と共に、３７℃で１０分間（Ｃ１〜４）または２時間（Ｃ５〜８）、インキュベートした。その後、細胞を固定し、透過化し、そして抗ＣＲＩｇポリクローナル抗体（Ｃ１、２、およびＣ４、５の緑色のチャネル）およびＬＡＭＰ−１に対するＡ５５５結合抗体（Ｃ３、７、およびＣ４、８の中の赤色のチャネル）で染色した。
【図５７】ヒトの単球由来マクロファージでのＣＲＩｇの輸送（Ａ）７日目のＭＤＭ上での、ＣＲＩｇに対するＣ３ｂ−Ａ４８８の飽和性結合を示しているＦＡＣＳプロット。（Ｂ）ＭＤＭを、１０倍モル過剰のｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−ＥＣＤの存在下で、抗ＣＲＩｇ抗体およびＣ３ｂ−Ａ４８８で、３７℃で１０分間パルスした。抗ＣＲＩｇ抗体の結合および取り込みはＣＲＩｇに特異的であった。なぜなら、これは、１０倍モル過剰のＣＲＩｇ−ＥＣＤとの抗体の同時インキュベーションによって回避することができ（パネル１）、一方、トランスフェリンの取り込みは完全なまま残すことができた（パネル２）からである。（Ｃ）ＭＤＭを、リソソームプロテアーゼ阻害因子の存在下３７℃で２０時間、その後、細胞を洗浄し、１％のＰＦＡで固定し、取り込まれた抗体をＣｙ３標識抗マウスＩｇＧで検出した（Ｃパネル１、およびパネル３の中の赤色のチャネル）。細胞を、１０μｇ／ｍｌのウサギ抗ＣＲＩｇ  ６Ｆ１で、その後、ＦＩＴＣ抗ウサギで同時に染色して、全てのＣＲＩｇの分布を検出した（Ｃパネル２、およびＣパネル３の中の緑色のチャネル）。取り込まれた抗体は、ほぼ完全に、内因性ＣＲＩｇシグナルと重複しており（Ｃパネル３の中の重ね合わせた画像の中の黄色）、これは、抗体の取り込みがＣＲＩｇの輸送には影響を及ぼさないことを示している。目盛り棒は２０μｍであり、四角で囲んだ部分の４×の拡大挿入図においては５μｍを各チャネルの右下に示した。Ｃパネル４では、ヒトマクロファージを、Ｃ３枯渇血清で１３時間インキュベートし、その後、固定し、そしてウサギ抗ＣＲＩｇ  Ｆ１およびＦＩＴＣ抗ウサギで標識した。ＣＲＩｇの分布は、本質的にはＣ３十分血清での分布と同じであり、いずれもが、再利用されているエンドソームマーカーであるトランスフェリンとほぼ完全に重複していた（データは示さない）。目盛り棒は２０μｍである。（Ｄ）ＭＤＭを、１μｇ／ｍｌの抗ＣＲＩｇ−Ａ４８８（パネル１）、トランスフェリン−Ａ６４７（パネル２）とともに、３７℃で１０分間インキュベートし、４％のＰＦＡ中で固定し、サポニン緩衝液で透過化し、マウス抗ヒトＬａｍｐ−１−Ａ５５５とともにインキュベートした（パネル３）。矢印は、再利用されている区画へのＣＲＩｇとトランスフェリンとの共局在を示している。（Ｅ）ＭＤＭを、１μｇ／ｍｌの抗ＣＲＩｇ−Ａ４８８（パネル１、パネル４の中の緑色のチャネル）、トランスフェリン−Ａ６４７（パネル２、パネル４の中の青色のチャネル）とともに、３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてＰＫＨで染色した区画Ｃ３オプソニン化ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ，パネル３、パネル４の中の赤色のチャネル）とともに、１：１０のマクロファージ：ＳＲＢＣ比でインキュベートした。
【図５８】ＣＩＲｇを欠損しているマウスは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：ＬＭ）に感染しやすい。（Ａ）尾支脈への注射によって示した用量のＬＭに感染させた、雌のＣＲＩｇ  ｗｔおよびＣＲＩｇ  ｋｏマウスの生存曲線（１グループあたりｎ＝５〜７匹）。統計分析（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）：ｗｔ対ｋｏ  ２×１０ｅ４コロニー形成単位（ＣＦＵ）についてはｐ＜０．００５、５×１０ｅ４および２×１０ｅ５  ＣＦＵについてはｐ＜０．０００１。（Ｂ）ＬＭ感染（２×１０ｅ７  ＣＦＵ、１グループあたりｎ＝５）の１０分後の、心臓、肝臓、血液、および脾臓の中の細菌数の分析。統計分析（対応のあるｔ検定）：＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＬＭ感染の１日後のＣＲＩｇ  ｋｏマウスの血清中のサイトカインおよびケモカインの濃度の増大。統計分析（対応のないｔ検定）：＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｄ）ＣＲＩｇ  ｋｏマウスのＫＣにおけるＬＭ−Ａ４８８の取り込みの減少。マウスを２×１０ｅ７のＬＭ−Ａ４８８に感染させた。１時間後、肝臓を潅流させ、Ｆ４／８０に対する抗体とともにインキュベートし、そしてフローサイトメトリーによって分析した。その後、Ｆ４／８０ポジティブＫＣを、ＦＡＣＳによって選別し、蛍光顕微鏡による観察のためにポリ−リジンをコーティングしたスライドの上に回収した。インターナライズされたＬＭ−Ａ４８８の数を共焦点顕微鏡でカウントし、食作用指数を計算した。結果は、少なくとも２回の実験の典型である。（Ｅ）ＣＲＩｇマウスは、循環からのＬＭのクリアランスが低下している。ＣＲＩｇおよびＣ３二重または単独ｋｏマウスを、２×１０ｅ７  ＣＦＵのＬＭでｉ．ｖ．注射した。血液中のＣＦＵを感染の１０分後にカウントした。Ｃ３の存在下では、ＣＲＩｇ  ｋｏマウスは、循環からのＬＭの、有意に低いクリアランスを有していた（ｐ＜０．００１）。Ｃ３が存在しない条件では、ＣＲＩ  ｗｔマウスまたはＣＲＩｇ  ｋｏマウスにおいては、ＬＭのクリアランスの有意な減少はなかった。
【図５９】図５９は、ヒトＣＲＩｇ（ｓｈｏｒｔ）−ＩｇＧ融合体のヌクレオチド配列を示す（配列番号２０）。
【図６０】図６０は、ヒトＣＲＩｇ（ｌｏｎｇ）−ＩｇＧ融合体のヌクレオチド配列を示す（配列番号２１）。
【図６１】図６１は、２種類の構築物の中のＣＲＩｇ（ＳＴＩｇＭＡ）−Ｆｃ結合部分を示している。これらはいずれも、ｐＲＫ５ベクターの中にＣｌａＩ−ＸｂａＩ部位に挿入されている。
【図６２】図６２は、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質（対照Ｆｃ融合タンパク質はそうではない）が、ｗｔ（ＣＲＩｇ  ｋｏ細胞ではそうではない）においては循環からのＬＭのクリアランスを阻害することを示している。ＣＲＩｇ  ｗｔマウスおよびＣＲＩｇ  ｋｏマウスを、１２ｍｇ／ｋｇのｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃまたは対照−Ｆｃ融合タンパク質の２回の注射で、２×１０７  ＣＦＵのＬＭのｉ．ｖ．での注射の２４時間および１６時間前に処置した。血液中のＣＦＵを、注射の１０分後にカウントした。ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃで処置したＣＲＩｇ  ｗｔマウスは、対照−Ｆｃで処置したｗｔマウスと比較すると、循環からのＬＭの、有意に低いクリアランスを有していた（ｐ＜０．００１、対応のないスチューデントｔ検定）。ＣＲＩｇ  ｋｏマウスでは、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃでの処置によってはＬＭのクリアランスに影響はなかった。
【図６３】ｈｕＣＲＩｇ分子での補体によって媒介される免疫溶血反応の阻害。（Ａ）ｈＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔおよびｈＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ融合タンパク質を使用したＣｙｎｏ血清ＲＲＢＣの溶血反応の阻害。（Ｂ）ｈＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ  ＥＣＤを使用したｃｙｎｏ血清ＲＲＢＣの溶血反応の阻害。
【図６４】２種類の実験における、ｈＣＲＩｇ−ｌｏｎｇを用いたヒト血清の溶血反応の阻害。
【図６５】ｈＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−ＦｃおよびｈＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ−Ｆｃ融合タンパク質を用いたヒト血清の溶血反応の阻害。
【図６６】ｈＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ−ＥＣＤおよびｈＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−ＥＣＤをそれぞれ用いたヒト血清の溶血反応の阻害。
【図６７】図６７は、ｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ−Ｆｃ（「無柄」の構築物）をコードする核酸配列を示す（配列番号２５）。
【図６８】図６８は、ＣＲＩｇの膜貫通ドメインとＦｃ部分との間に「柄」が挿入されているｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ−Ｆｃをコードする核酸配列を示す（配列番号２６）。
【図６９】図６９は、ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−Ｆｃ（「無柄」の構築物）をコードする核酸配列を示す（配列番号２７）。
【図７０】図７０は、ＣＲＩｇの膜貫通ドメインとＦｃ部分との間に「柄」が挿入されているｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−Ｆｃをコードする核酸配列を示す（配列番号２８）。
【図７１】図７１ＡおよびＢは、実施例２３に記載するマウスＣＮＶの実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「ＰＲＯ３６２」、「ＪＡＭ４」、「ＳＴＩｇＭＡ」、および「ＣＲＩｇ」は同じ意味で使用され、自然界に存在している配列と改変体ＣＲＩｇポリペプチドとを意味する。
【００３１】
「自然界に存在している配列」のＣＲＩｇは、その調製の形式とは無関係に、自然界に由来するＣＲＩｇポリペプチドと同じアミノ酸配列を有しているポリペプチドである。したがって、自然界に存在している配列のＣＲＩｇは、自然界から単離することができ、また、組換え手段および／または合成の手段によって生産することもできる。用語「自然界に存在している配列のＣＲＩｇ」には、具体的に、自然界に存在している短縮型のＣＲＩｇまたは分泌型のＣＲＩｇ（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然界に存在している改変体形態（例えば、代替としてスプライシングされた形態）、ならびにＣＲＩｇの自然界に存在している対立遺伝子改変体が含まれる。自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドには、具体的には、配列番号２の３２１個のアミノ酸の長いヒトＣＲＩｇポリペプチド（図１に示される）が含まれ、これには、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、１位の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、配列番号２の約２７７位から３０７位のアミノ酸位置にある膜貫通ドメインの一部もしくは全てが含まれる場合もまた含まれない場合もある。自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドには、さらに、配列番号４の全長の３９９アミノ酸の長いヒトＣＲＩｇポリペプチド（ｈｕＣＲＩｇ、またはｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ、図２および５に示される）が含まれ、これには、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、１位の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、配列番号４の約２７７位から３０７位のアミノ酸位置にある膜貫通ドメインの一部もしくは全てが含まれる場合もまた含まれない場合もある。なおさらなる実施形態においては、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドは、ヒトＣＲＩｇの３０５アミノ酸の短い形態（ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ、配列番号６、図３に示される）であり、これには、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、１位の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、配列番号６の約１８３位から２１３位の位置にある膜貫通ドメインの一部もしくは全てが含まれる場合もまた含まれない場合もある。異なる実施形態においては、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドは、配列番号８の２８０アミノ酸の長い全長のマウスＣＲＩｇポリペプチド（ｍｕＣＲＩｇ、図４および５に示される）であり、これには、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、１位の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、配列番号８の約１８１位から２１１位のアミノ酸位置にある膜貫通ドメインの一部もしくは全てが含まれる場合もまた含まれない場合もある。高等霊長類および哺乳動物を含むヒト以外の他の動物のＣＲＩｇポリペプチドが、具体的にこの定義に含まれる。
【００３２】
「ＣＲＩｇ改変体」は、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有している、以下に定義される活性なＣＲＩｇポリペプチドを意味する。これには、Ｃ末端短縮型の３２１アミノ酸のｈｕＣＲＩｇ（配列番号２）、全長のｈｕＣＲＩｇ（配列番号４）、ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ（配列番号６）、およびｍｕＣＲＩｇ（配列番号８）が含まれるが、これらに限定はされない。これらのそれぞれには、Ｎ末端の開始メチオニンが含まれる場合もまた含まれない場合も、Ｎ末端シグナル配列が含まれる場合もまた含まれない場合も、膜貫通ドメインの全体もしくは一部が含まれる場合もまた含まれない場合も、そして、細胞内ドメインが含まれる場合もまた含まれない場合もある。特定の実施形態においては、ＣＲＩｇ改変体は、配列番号２の配列の成熟型の全長のポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を有する。別の実施形態においては、ＣＲＩｇ改変体は、配列番号４の成熟型の全長のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。なお別の実施形態においては、ＣＲＩｇ改変体は、配列番号６の配列の成熟型の全長のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。なおさらなる実施形態においては、ＣＲＩｇ改変体は、配列番号８の配列の成熟型の全長のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。このようなＣＲＩｇポリペプチド改変体には、例えば、配列番号２、４、６、もしくは８の配列のＮ末端またはＣ末端に１つ以上のアミノ酸残基が挿入されている、Ｎ末端またはＣ末端の１つ以上のアミノ酸残基が置換されている、および／あるいは、Ｎ末端またはＣ末端の１つ以上のアミノ酸残基が欠失されているＣＲＩｇポリペプチドが含まれる。他の改変体には、示されたポリペプチド配列の膜貫通領域に１つ以上のアミノ酸が挿入されている、膜貫通領域の中で１つ以上のアミノ酸が置換されている、および／または膜貫通領域の中で１つ以上のアミノ酸が欠失されている。
【００３３】
通常、ＣＲＩｇ改変体は、配列番号２、４、６、もしくは８の成熟アミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。好ましくは、最大の配列同一性は細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で生じる（配列番号２または４の１位または約２１位からＸ位のアミノ酸、ここでは、Ｘは２７１位から２８１位までの任意のアミノ酸残基である；あるいは、配列番号６の１位または約２１位からＸ位のアミノ酸、ここでは、Ｘは１７８位から１８６位までの任意のアミノ酸残基である；あるいは、配列番号８の１位または約２１位からＸ位のアミノ酸、ここでは、Ｘは１７６位から１８４位までの任意のアミノ酸残基である）。
【００３４】
ＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、ＣＲＩｇポリペプチドの１つの形態を意味する。これには、それぞれの全長分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは原則として含まれない。通常、ＣＲＩｇ  ＥＣＤには、このような膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインの１％未満が含まれており、このようなドメインの０．５％未満しか含まれないことが好ましい。上記で議論されたように、場合により、ＣＲＩｇ  ＥＣＤには、配列番号２、４、６、もしくは８の１位または約２１位からＸ位のアミノ酸残基が含まれる。ここでは、Ｘは、配列番号２もしくは４の約２７１位から２８１位までの任意のアミノ酸、配列番号６の約１７８位から１８６位までの任意のアミノ酸、配列番号８の約１７６位から１８４位までの任意のアミノ酸である。
【００３５】
「アミノ酸配列同一性の割合（％）」は、本明細書中で同定されたＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）配列に関しては、配列のアラインメント、および必要に応じた最大配列同一性の割合（％）を得るためのギャップの導入の後の、配列同一性の一部としての保存的置換を全く考慮しない、ＣＲＩｇ配列中のアミノ酸残基と同一である候補の配列中のアミノ酸残基の割合（％）として、それぞれ定義される。アミノ酸配列同一性の割合（％）を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の能力の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手することができるコンピュータープログラムを使用して行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを行うために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。その後、配列同一性は、より長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部と１００％の配列同一性を示した場合にもなお、全体的な配列同一性は１００％未満である場合がある。
【００３６】
「核酸配列同一性の割合（％）」は、本明細書中で同定されたＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）をコードする配列（例えば、ＤＮＡ４５４１６）に関しては、配列のアラインメント、および必要に応じた最大配列同一性の割合（％）を得るためのギャップの導入の後の、ＣＲＩｇをコードする配列中のヌクレオチドと同一である候補の配列中のヌクレオチドの割合（％）として、それぞれ定義される。核酸配列同一性の割合（％）を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の能力の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手することができるコンピュータープログラムを使用して行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを行うために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。その後、配列同一性は、より長い配列と比較して計算される。すなわち、より短い配列がより長い配列の一部と１００％の配列同一性を示した場合にもなお、全体的な配列同一性は１００％未満である場合がある。
【００３７】
「単離された」核酸分子は、同定され、そして核酸の自然界における供給源において通常は付随している少なくとも１つの混入している核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、自然界で見られる形態または環境以外の状態である。したがって、単離された核酸分子は、自然界に存在している細胞中に存在している核酸分子とは異なる。しかし、単離された核酸分子には、コードされるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれる核酸分子が含まれる。この場合、例えば、核酸分子は、自然界に存在している細胞とは異なる染色体位置にある。
【００３８】
「単離された」ＣＲＩｇポリペプチドをコードする核酸分子は、同定され、そしてＣＲＩｇをコードする核酸の自然界での供給源において通常付随している少なくとも１つの混入している核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＣＲＩｇポリペプチドをコードする核酸分子は、自然界で見られる形態または環境以外の状態である。したがって、単離されたＣＲＩｇポリペプチドをコードする核酸分子は、自然界に存在している細胞中に存在しているコード核酸分子（単数または複数）とは異なる。しかし、単離されたＣＲＩｇをコードする核酸分子には、ＣＲＩｇを通常発現する細胞に含まれるＣＲＩｇをコードする核酸分子が含まれる。この場合、例えば、核酸分子は、自然界に存在している細胞とは異なる染色体位置にある。
【００３９】
用語「補体が関係している疾患」は、本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、その発症に、例えば、補体欠損などの補体系の活性化の異常が関係している全ての疾患および病理学的症状が含まれる。この用語には、具体的に、Ｃ３転換酵素の阻害が有効である疾患および病理学的症状が含まれる。この用語には、さらに、代替補体経路の阻害（選択的阻害を含む）が有効である疾患および病理学的症状が含まれる。補体が関係している疾患としては、炎症性疾患および自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再潅流後の離れた組織の傷害、心肺バイパス手術の間の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎および結果として生じる糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、皮膚の変性疾患および他の補体が関係している眼の症状、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症および他の虚血が関係している網膜症、眼内炎、および他の眼内新生血管障害、例えば、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに、同種移植、超急性拒絶、血液透析、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、および吸引性肺炎が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４０】
用語「補体が関係している眼の症状」は、本明細書中では最も広い意味で使用され、これには、その発症に、古典補体経路および代替補体経路を含み、特に、代替補体経路の補体が関係している全ての眼の症状および疾患が含まれる。具体的には、このグループには、その発現、発症、または進行を代替補体経路の阻害によって制御することができる、代替補体経路に関係している全ての眼の症状および疾患が含まれる。補体が関係している眼の症状としては、眼の変性疾患、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階（乾式および湿式（非滲出形態と滲出形態）を含む）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症および他の虚血が関係している網膜症、眼内炎、および他の眼内新生血管障害、例えば、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに、網膜血管新生が挙げられるが、これらに限定はされない。補体が関係している眼の症状の好ましいグループには、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（滲出型（湿式）ＡＭＤおよび非滲出型（乾式または萎縮性）ＡＭＤを含む）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、および眼内炎が含まれる。
【００４１】
用語「炎症性疾患」および「炎症性障害」はほとんど同じ意味で使用され、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の罹患率に寄与している炎症応答を引き起こす、媒介する、または別の方法でこれに関係している疾患または障害を意味する。炎症応答の減少によって疾患の進行に対して緩和作用を有する疾患もまた含まれる。この用語には、免疫性の炎症性疾患が含まれ、これには自己免疫疾患が含まれる。
【００４２】
用語「Ｔ細胞によって媒介される」疾患は、Ｔ細胞が哺乳動物の罹患率を直接もしくは間接的に媒介する、またはＴ細胞が別の方法で関係している疾患を意味する。Ｔ細胞によって媒介される疾患は、細胞によって媒介される効果、リンホカインによって媒介される効果などに関係している場合があり、そして、Ｂ細胞が、例えば、Ｔ細胞によって分泌されるリンホカインによって刺激される場合にはＢ細胞に関係している効果に関係している場合がある。
【００４３】
免疫性の疾患および炎症性疾患の例（そのいくつかはＴ細胞によって媒介される）としては、炎症性腸疾患（ＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーヴス病、橋本病甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、特発性多発性神経障害）、肝胆汁性疾患（例えば、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、および他の非肝臓向性ウイルス））、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、ならびに硬化性胆管炎、炎症性および繊維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫性または免疫性皮膚疾患（水胞性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎が含まれる）、乾癬、肺のアレルギー性疾患（例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎）、移植に伴う疾患（移植拒絶および移植片対宿主病が含まれる）、アルツハイマー病、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４４】
「腫瘍」は、本明細書中で使用される場合は、悪性であるかもしくは良性であるか、そして全てが前ガン細胞であるか組織であるかにはかかわらず、全ての新生物細胞の成長および増殖を意味する。
【００４５】
用語「ガン」および「ガン性」は、通常、調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的症状を意味するか、またはこれを記載する。ガンの例としては、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定はされない。このようなガンのさらに具体的な例としては、乳ガン、前立腺ガン、結腸ガン、扁平上皮細胞ガン、小細胞性肺ガン、非小細胞性肺ガン、消化管ガン、膵臓ガン、膠芽細胞腫、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、肝ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、唾液腺ガン、腎臓ガン、肝臓ガン、女性の外陰部のガン、甲状腺ガン、肝ガン、および種々のタイプの頭頸部ガンが挙げられる。
【００４６】
「処置」は、障害の発症の予防、または障害の病状を変化させる目的で行われる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置と、予防的または防止的措置の両方を意味する。処置が必要なものとしては、すでに障害を有しているもの、ならびに障害を予防したいものが含まれる。免疫が関係している疾患の処置においては、治療薬によって、免疫応答の成分の応答の大きさが直接変化させられる場合も、また、他の治療薬（例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗炎症薬、化学療法薬など）による処置に対して疾患の感度がさらに高められる場合もある。補体が関係している疾患の処置においては、処置によって、例えば、疾患の進行が妨げられる場合も、また、疾患の進行が遅らせられる場合もある。したがって、補体が関係している眼の症状の処置には、具体的には、症状の発症の予防、阻害、または遅延、あるいは、症状の１つの段階から別の段階への、より進行した段階への、またはより重篤な関連する症状への進行の予防、阻害、または遅延が含まれる。
【００４７】
疾患（例えば、補体が関係している疾患）の「病状」には、患者の満足な暮らしを危険にさらす全ての現象が含まれる。これには、異常なまたは制御不可能な細胞増殖（好中球、好酸球、単球、リンパ球細胞）、抗体の生産、自己抗体の生産、補体の生産、近隣の細胞の正常な機能の妨害、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、任意の炎症応答または免疫学的応答の抑制または悪化、細胞空間への炎症性細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球）の浸潤、ドルーゼの形成、失明などが含まれるが、これらに限定はされない。
【００４８】
用語「哺乳動物」は、本明細書中で使用される場合は、哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。これには、ヒト、ヒト以外の霊長類、家畜動物、および動物園の動物、競技用動物、またはペット動物、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびフェレットなどが含まれるが、これらに限定はされない。本発明の好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトまたはヒト以外の霊長類であり、最も好ましくは、ヒトである。
【００４９】
１つ以上のさらなる治療薬「と組み合わせた」投与には、同時（併用）投与と任意の順序での連続投与とが含まれる。
【００５０】
用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質についての一般的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インシュリン、プロインシュリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝臓増殖因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β、ミュラー管抑制物質、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β血小板増殖因子）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子−Ｉおよびインシュリン様成長因子−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ））、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β）、ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書中で使用される場合は、用語サイトカインには、自然界の供給源に由来するタンパク質、または組換え細胞の培養によるタンパク質、ならびに自然界に存在している配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【００５１】
「治療有効量」は、状態、例えば、標的の疾患の病状または症状（例えば、補体が関係している（眼の）疾患または症状、あるいはガン）の測定可能な改善を得るために必要な、活性のあるＣＲＩｇ、ＣＲＩｇアゴニストおよびアンタゴニストの量である。
【００５２】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物の中での、作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適している制御配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００５３】
核酸は、これが別の核酸配列と機能的な関係になるように配置されている場合に「作動可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与える場合には、コード配列に作動可能に連結されている。あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合には、コード配列に作動可能に連結されている。一般的には、「作動可能に連結されている」は、連結されたＤＮＡ配列が連続していることを意味し、そして分泌リーダーの場合には、連続しており、リーディングフレームの中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも連続してはいない。連結は、便利な制限部位での連結によって行われる。このような部位が存在しない場合には、合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、通常の実施方法に従って使用される。
【００５４】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者が容易に決定することができ、そして通常は、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に応じて経験的に計算される。一般的には、より長いプローブには、適切なアニーリングのためにはより高い温度が必要であり、より短いプローブにはより低い温度が必要である。ハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖がそれらの融点より低い環境で存在すると再アニーリングする変性されたＤＮＡの能力を利用する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用することができる相対的な温度は高くなる。結果として、当然、相対温度が高ければ高いほど反応条件はよりストリンジェントになる傾向があり、一方、温度が低ければ低いほど、そのような傾向は小さいことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについてのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【００５５】
「ストリンジェントな条件」または「高いストリンジェンシーの条件」は、本明細書中で使用される場合は、以下のように同定することができる：（１）洗浄には、低いイオン強度と高温とを使用する、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性剤（例えば、ホルムアミド）を使用する、例えば、４２℃で、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を含む、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド；あるいは、（３）４２℃で、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケの精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を使用し、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）で、そして５５℃で５０％のホルムアミドで洗浄し、その後、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣで５５℃において高いストリンジェンシーで洗浄する。
【００５６】
「中程度のストリンジェンシーの条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されているように同定することができ、これには、上に記載されたものよりもストリンジェンシーが低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、および％ＳＤＳ）の使用が含まれる。中程度にストリンジェントな条件の一例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性させたせん断したサケの精子ＤＮＡを含む溶液中３７℃で一晩のインキュベーション、その後、１×ＳＳＣで約３７〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブの長さなどの要因に適応させる必要に応じて、温度、イオン強度などを調節するための方法を認識しているであろう。
【００５７】
用語「エピトープタグ化」は、本明細書中で使用される場合は、「タグポリペプチド」に融合された本発明のポリペプチドを含むキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作成することができるエピトープを提供するために十分な残基であり、これは、融合されるポリペプチドの活性を妨害することがないようになおも十分に短い。タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように極めて特異なものである。適切なタグポリペプチドは、一般的には、少なくとも６個のアミノ酸残基を有しており、通常は、約８個から５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０個から２０個の間のアミノ酸残基）を有している。
【００５８】
「活性な」または「活性」は、本発明のＣＲＩｇポリペプチドの改変体について、天然の、または自然界に存在している本発明のポリペプチドの生物学的活性および／または免疫学的活性を保持しているそのようなポリペプチドの形態（単数または複数）を意味する。好ましい生物学的活性は、Ｃ３ｂに結合する能力、および／または補体もしくは補体の活性化に影響を与える能力であり、具体的には、代替補体経路および／またはＣ３転換酵素を阻害する能力である。Ｃ３転換酵素の阻害は、例えば、コラーゲン誘導関節炎または抗体誘導関節炎の間の正常な血清でのＣ３の代謝回転の阻害を測定することによって測定することができるか、あるいは、Ｃ３の蓄積の阻害は関節炎の関節である。
【００５９】
「生物学的活性」は、ＣＲＩｇの生物学的活性を模倣し、本明細書中に開示されるスクリーニングアッセイによって同定することができる抗体、ポリペプチド、または別の分子について、Ｃ３ｂに結合する能力、および／または補体もしくは補体の活性化に影響を与えるそのような分子の能力を一部意味し、具体的には、代替補体経路および／またはＣ３転換酵素を阻害するそのような分子の能力を意味する。
【００６０】
用語ＣＲＩｇ「アゴニスト」は最も広い意味で使用され、これには、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドの質的な生物学的活性（本明細書中で上記で定義されたような）を模倣する任意の分子が含まれる。このＣＲＩｇアゴニストには、具体的に、ＣＲＩｇ−Ｉｇ（例えば、ＣＲＩｇ−Ｆｃ融合ポリペプチド（免疫接着物））が含まれるが、少なくとも１つのＣＲＩｇの生物学的活性を模倣する低分子も含まれる。好ましくは、生物学的活性は、補体経路（特に、代替補体経路）のブロックである。
【００６１】
用語「アンタゴニスト」は最も広い意味で使用され、これには、自然界に存在しているポリペプチド（例えば、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチド）の質的な生物学的活性を部分的または完全にブロックする、阻害する、または中和する任意の分子が含まれる。
【００６２】
適切なアゴニストまたはアンタゴニスト分子には、具体的には、本発明の自然界に存在しているポリペプチド、ペプチド、低分子（有機低分子を含む）のアゴニスト抗体もしくはアゴニスト抗体、または抗体断片、断片、融合体、またはアミノ酸配列改変体などが含まれる。
【００６３】
「低分子」は、約６００ダルトン未満、好ましくは、約１０００ダルトン未満の分子量を有すると本明細書中で定義される。
【００６４】
用語「抗体」は最も広い意味で使用され、これには具体的に、１つの抗ＣＲＩｇモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、ならびに多エピトープ特異性を有している抗ＣＲＩｇ抗体組成物が含まれるが、これらに限定はされない。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団に含まれる個々の抗体は主要ではない量で存在し得る自然界に存在している変異の可能性を除いて同一である）から得られる抗体を意味する。
【００６５】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有している糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンには抗体と、抗原特異性を欠いている抗体様分子との両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によっては低いレベルで、そして骨髄腫によっては高いレベルで生産される。用語「抗体」は最も広い意味で使用され、これには具体的に、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成された多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および抗体断片が、それらが所望の生物学的活性を示す場合には含まれるが、これらに限定はされない。
【００６６】
「自然界に存在している抗体」および「自然界に存在している免疫グロブリン」は、通常は、２つの同じ軽（Ｌ）鎖と２つの同じ重（Ｈ）鎖から構成されている、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合によって１つの重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖の間では異なる。それぞれの重鎖および軽鎖はまた、一定の間隔の鎖内ジスルフィド結合をも有している。個々の重鎖は、一方の末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、これに続いて、多数の定常ドメインを有している。個々の軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そしてその他方の末端に定常ドメインを有している。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと整列しており、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの接触面を形成していると考えられている。
【００６７】
用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が抗体間の配列で広範囲に異なり、そしてその特定の抗原に対する個々の特定の抗体の結合および特異性に使用されるという事実を意味する。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているわけではない。これは、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（いずれも、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインに存在している）と呼ばれる３つのセグメントの中に集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれている。自然界に存在している重鎖および軽鎖の可変ドメインにはそれぞれ、３つのＣＤＲ（これらは主としてβ−シート構造をとっている。これらはループ結合を形成し、そしていくつかはβ−シート構造の一部を形成している場合もある）によってつながれた４つのＦＲ領域が含まれている。それぞれの鎖のＣＤＲは互いに、ＦＲ領域によって近接近して保たれており、他の鎖に由来するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３３４２，Ｖｏｌ．Ｉ、６４７−６６９頁（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接は関与していないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与）を示す。
【００６８】
「抗体断片」には、完全な抗体の一部（好ましくは、完全な抗体の抗原結合領域または可変領域）が含まれる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディー；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；ならびに、抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。具体的には、本発明の定義に含まれる抗体断片の例として、以下が挙げられる：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１ドメインを有しているＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端にある１つ以上のシステイン残基を有しているＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有しているＦｄ断片；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインと、ＣＨ１ドメインのＣ末端にある１つ以上のシステイン残基とを有しているＦｄ’断片；（ｖ）抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインを有しているＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でのジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価の断片；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；およびＨｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８））；（ｘ）２つの抗原結合部位を有しており、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む「ダイアボディー」（例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））；（ｘｉ）タンデムＦｄセグメントを１対含む「直鎖抗体」（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）（これは、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成する）（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）；および米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００６９】
抗体のパパインでの消化によって、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同じ抗原結合断片（それぞれ、１つの抗原結合部位を有している）と、残りの「Ｆｃ」断片とが生じる。名称「Ｆｃ」は、容易に結晶化する能力を反映している。ペプシンでの処理によって、２つの抗原結合部位を有し且つ抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片が生じる。
【００７０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとが硬く非共有的に会合している二量体から構成されている。この立体構造においては、個々の可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位の輪郭を形成する。まとめると、６個のＣＤＲによって、抗体に対する抗原結合特異性が付与される。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）もなお、完全な結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し結合する能力を有している。
【００７１】
Ｆａｂ断片にはまた、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とが含まれる。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されていることによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離のチオール基を有しているＦａｂ’についての本明細書中での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片はもともと、その間にヒンジシステインを有しているＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
【００７２】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明らかに異なるタイプ（カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる）の１つに分けることができる。
【００７３】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは、様々なクラスに分けることができる。免疫グロブリンについては５つの主要なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ。これらのいくつかは、さらにサブクラス（イソ型）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）に分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、γ、μ、δ、α、およびεと呼ばれる。免疫グロブリンの様々なクラスのサブユニット構造と三次元立体配置とは周知である。
【００７４】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団に含まれる個々の抗体は主要ではない量で存在し得る自然界に存在している変異の可能性を除いて同一である）から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、１つの抗原性部位に対して指向される。さらに、従来の（ポリクローナル）抗体調製物（これには通常、種々の決定基（エピトープ）に対して指向された様々な抗体が含まれる）とは対照的に、個々のモノクローナル抗体は抗原における１つの決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養物によって合成される点で有利である。改変語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の生産が必要であるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成することができ、また、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作成することもできる。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。米国特許第５，７５０，３７３号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号もまた参照のこと。これらには、ファージミドおよびファージベクターを使用した抗体の調製が記載されている。
【００７５】
本明細書中のモノクローナル抗体には、具体的に、重鎖および／または軽鎖の部分は特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属している抗体中の対応する配列と同じであるかまたはそれと相同であるが、鎖（単数または複数）の残りは別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片中の対応する配列と同じであるかまたはそれと相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）が、それらが所望の生物学的活性を示す限りにおいては含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００７６】
ヒト以外（例えば、マウス）の抗体の「ヒト化」形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小配列を含むその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列）である。大部分は、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するいくつかまたはすべての残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有しているヒト以外の種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、もしくはウサギ）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられている。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンの特定のＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基もまた、対応するヒト以外の残基で置き換えることができる。さらに、ヒト化抗体には、レシピエント抗体にも、輸入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基が含まれる場合がある。これらの改変は、抗体の能力にさらに磨きをかけ、最大化するために行われる。一般的には、ヒト化抗体には、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全体が含まれる。この場合、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト以外の免疫グロブリンのものに対応し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体には、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含まれ、通常は、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部が含まれる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。ヒト化抗体には、「霊長類化」抗体が含まれ、体の抗原結合領域は目的の抗原でアカゲザル（ｍａｃａｑｕｅ  ｍｏｎｋｅｙ）を免疫化することによって生産される抗体に由来する。旧世界ザル（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  ｍｏｎｋｅｙ）に由来する残基を含む抗体もまた、おそらく本発明に含まれる。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号；同第５，６９３，７８０号；同第５，６８１，７２２号；同第５，７５０，１０５号；および同第５，７５６，０９６号を参照のこと。
【００７７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片には、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとが含まれる。これらのドメインは１つのポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドにはさらに、ｓＦｖが抗原の結合に所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーが含まれる。ｓＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００７８】
用語「ダイアボディー」は、２つの抗原結合部位を有している小さい抗体断片を意味する。この断片には、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が含まれる（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖にある２つのドメインの間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的なドメインと対を形成するように向けられ、２つの抗原結合部位が生じる。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に完全に記載されている。
【００７９】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで伸びている。ＣＨ２ドメインは、これが別のドメインと密接に対合しない点で特有である。むしろ、２つのＮ結合した分岐している炭水化物鎖が、完全な自然界に存在しているＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に置かれている。炭水化物は、ドメイン−ドメインの対合の代わりを提供することができ、ＣＨ２ドメインの安定化を助けると推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。本明細書中のＣＨ２ドメインは、自然界に存在している配列のＣＨ２ドメインまたは改変体ＣＨ２ドメインであり得る。
【００８０】
「ＣＨ３ドメイン」には、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端側の残基のストレッチ（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）が含まれる。本明細書中のＣＨ３領域は、自然界に存在している配列のＣＨ３ドメインである場合も、また、改変体ＣＨ３ドメイン（例えば、その１つの鎖の中に「プロトロベランス（ｐｒｏｔｒｏｂｅｒａｎｃｅ）」が導入されており、そしてその他方の鎖には対応する「孔（ｃａｖｉｔｙ）」が導入されているＣＨ３ドメイン；引用により本明細書中に組み入れられる米国特許第５，８２１，３３３号を参照のこと）である場合もある。このような改変体ＣＨ３ドメインは、本明細書中に記載されるような多特異的（例えば、二重特異的）抗体を作成するために使用することができる。
【００８１】
「ヒンジ領域」は、一般的には、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６、または約Ｃｙｓ２２６から、約Ｐｒｏ２３０まで伸びていると定義されている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５））。他のＩｇＧイソ型のヒンジ領域は、同じ位置で重鎖内Ｓ−Ｓ結合を形成している最初のシステイン残基および最後のシステイン残基の位置を決定することによって、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。本明細書中のヒンジ領域は、自然界に存在している配列のヒンジ領域である場合も、また改変体ヒンジ領域である場合もある。改変体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、一般的には、１つのポリペプチド鎖について少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、その結果、改変体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖が２つの鎖の間でジスルフィド結合を形成することができる。本明細書中の好ましいヒンジ領域は、自然界に存在している配列のヒトヒンジ領域であり、例えば、自然界に存在している配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
【００８２】
「機能的なＦｃ領域」は、自然界に存在している配列のＦｃ領域の少なくとも１つの「エフェクター機能」を有している。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒体性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能には、通常、結合ドメインと結合するＦｃ領域（例えば、抗体の可変ドメイン）が必要であり、そして、このような抗体のエフェクター機能を評価するための当該分野で公知の種々のアッセイを使用して評価することができる。
【００８３】
「自然界に存在している配列のＦｃ領域」には、自然界において見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列が含まれる。
【００８４】
「改変体Ｆｃ領域」には、少なくとも１つのアミノ酸の改変が原因で、自然界に存在している配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、改変体Ｆｃ領域には、自然界に存在している配列のＦｃ領域又はもとのポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば、自然界に存在している配列のＦｃ領域またはもとのポリペプチドのＦｃ領域において、約１個から約１０個のアミノ酸置換、および好ましくは、約１個から約５個のアミノ酸置換）を有している。本明細書中の改変体Ｆｃ領域は、通常、例えば、自然界に存在している配列のＦｃ領域および／またはもとのポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは、それらと少なくとも約９０％の配列同一性、あるいはそれらと少なくとも約９５％もしくはそれ以上の配列同一性を有する。
【００８５】
「親和性が成熟した」抗体は、それらの変化（単数または複数）を有していないもとの抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じる、１つ以上のそのＣＤＲに１つ以上の変化を有している抗体である。好ましい親和性が成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにはピコモルの親和性を有するであろう。親和性が成熟した抗体は、当該分野で公知の手順によって生産される。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）には、ＶＨドメインとＶＬドメインとのシャッフリングによる親和性の成熟が記載されている。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Ｂａｒｂｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；およびＨａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【００８６】
「可撓性リンカー」は、本明細書中では、ペプチド結合（単数または複数）によって連結され、連結された２つのポリペプチド（例えば、２つのＦｄ領域）に対してさらなる回転自由度を提供する、２つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味する。このような回転自由度により、２つ以上の抗原結合部位が可撓性リンカーによって連結されて、それぞれがより効率よく標的抗原（単数または複数）にアクセスできるようになる。適切な可撓性リンカーペプチド配列の例として、ｇｌｙ−ｓｅｒ、ｇｌｙ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ、ａｌａ−ｓｅｒ、およびｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒが挙げられる。
【００８７】
「単鎖Ｆｃ」または「ｓＦｖ」抗体断片には、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとが含まれる。これらのドメインは１つのポリペプチド鎖中に存在している。一般的には、ＦｖポリペプチドにはさらにＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーが含まれ、これによって、ｓＦｖが抗原への結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖの概要については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。
【００８８】
「単離された」ポリペプチド（例えば、抗体）は、同定され、分離され、そして／または、その自然界での環境の成分から回収されているものである。その自然界での環境の混入している成分は、抗体の診断用途または治療用途を妨害する物質であり、これには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性の溶質もしくは非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態においては、ポリペプチド（抗体を含む）は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合に９５重量％を超える抗体、最も好ましくは、９９重量％を超える抗体となるように、（２）回転式シークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な程度にまで、あるいは（３）クマシーブルー染色、または好ましくは、銀染色を使用して還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで、精製されるであろう。単離された化合物（例えば、抗体または他のポリペプチド）には、組換え細胞中のインサイチュの化合物が含まれる。なぜなら、化合物の自然界での環境の少なくとも１つの成分は存在しないからである。しかし、通常は、単離された化合物は、少なくとも１回の精製工程によって調製されるであろう。
【００８９】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合は、化合物（例えば、抗体またはポリペプチド）に直接または間接的に結合し、その結果、「標識された」化合物が生じる、検出可能な化合物または組成物を意味する。標識は、それ自体が検出可能である場合（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒する場合もある。
【００９０】
「固相」については、本発明の化合物が付着することができる非水性マトリックスが意味される。固相の例には、本明細書中では、ガラス（例えば、制御された孔を有しているガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、およびシリコンから一部または全体が形成されているものが含まれる。特定の実施形態においては、状況に応じて、固相にアッセイプレートのウェルが含まれ得る。他の実施形態においては、固相は精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語にはまた、離れた粒子の不連続な固相も含まれ、例えば、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているものである。
【００９１】
「リポソーム」は、種々のタイプの脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成される小さいベシクルであり、これは哺乳動物への薬剤（例えば、本明細書中に開示される抗ＥｒｂＢ２抗体、および場合により化学療法薬）の送達に有用である。リポソームの成分は、一般的には、生体膜の脂質配置と同様に、二重層の形態に配置されている。
【００９２】
用語「免疫接着物」は、本明細書中で使用される場合には抗体様分子を示し、これは、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とともに異種タンパク質（「接着物」）の結合特異性を兼ね備えている。構造的には、免疫接着物には、抗体の抗原認識および結合部位以外の所望の結合特異性を有しているアミノ酸配列（すなわち、これは「異種」である）と、免疫グロブリン定常ドメインの配列との融合体が含まれる。免疫接着物分子の接着部は、通常、受容体またはリガンドの結合部位を少なくとも含む連続しているアミノ酸配列である。免疫接着物の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ）から得ることができる。
【００９３】
「抗原性因子または抗原性物質」は、血管の発達を刺激する（例えば、血管形成、内皮細胞の増殖、血管の安定性、および／または脈管形成などを促進する）成長因子である。例えば、血管形成因子としては、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリーのメンバー、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）、ＴＩＥリガンド（アンギオポエチン）、エフェリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが挙げられるが、これらに限定はされない。これには、治癒を促進する因子、例えば、成長ホルモン、インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＶＩＧＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＣＴＧＦおよびそのファミリーのメンバー、ならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βもまた含まれる。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）；Ｆｅｒｒａｒａ  ＆  Ａｌｉｔａｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（１２）：１３５９−１３６４（１９９９）；Ｔｏｎｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：６５４９−６５５６（２００３）（例えば、血管形成因子が列挙されている表１）；ならびに、Ｓａｔｏ  Ｉｎｔ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：２００−２０６（２００３）を参照のこと。
【００９４】
「抗血管形成物質」または「血管形成阻害因子」は、血管形成、脈管形成、または望ましくない血管透過性を直接または間接的に阻害する、低分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、またはそれらの結合体もしくは融合タンパク質を意味する。例えば、抗血管形成物質は、上記で定義された血管形成物質に対する抗体または他のアンタゴニストであり、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦ受容体に対する抗体、ＶＥＧＦ受容体による情報伝達をブロックする低分子（例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８）である。抗血管形成物質にはまた、自然界に存在している血管形成阻害因子（例えば、アンギオスタチン、エンドスタチンなど）も含まれる。例えば、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５３：２１７−３９（１９９１）；Ｓｔｒｅｉｔ  ａｎｄ  Ｄｅｔｍａｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２：３１７２−３１７９（２００３）を参照のこと。
【００９５】
用語「有効量」は、哺乳動物の疾患または障害を処置（予防を含む）するために有効な薬剤の量を意味する。したがって、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）または慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の場合には、有効量の薬剤によって失明を軽減するまたは予防することができる。ＡＭＤ治療については、インビボでの効力は、例えば、以下の１つ以上によって測定することができる：所望の時間までのベースラインからの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均変化を評価すること、ベースラインと比較して所望の時点の視力における、１５文字未満を失った被験体の割合を評価すること、ベースラインと比較して所望の時点での視力における、１５文字以上を獲得した被験体の割合を評価すること、所望の時点で、２０／２０００またはそれよりも悪いｖｉｓｕａｌ−ａｃｕｉｔｙ  Ｓｎｅｌｌｅｎ等量を有している被験体の割合を評価すること、ＮＥＩ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅを評価すること、蛍光眼底血管造影によって評価される、所望の時点でのＣＮＶの大きさとＣＮＶの漏出量とを評価すること。適応症が乾式ＡＭＤから湿式ＡＭＤへの進行、またはＡＭＤからＣＭＶへの進行の予防である場合には、有効量の薬剤によって、このような進行を阻害、遅延、または部分的もしくは完全にブロックすることができる。この場合、有効量の決定には、疾患の段階付け、疾患の進行の経時的なモニタリング、および所望の結果を得るために必要な投与量の調整が含まれる。
【００９６】
（ＩＩ．詳細な説明）
本発明は、Ａ３３抗原およびＪＡＭ１に対して相同性を有している新規マクロファージ関連受容体の使用に関する。これは、胎児の肺のライブラリーからクローニングされ、そして１つの膜貫通Ｉｇスーパーファミリーのメンバーのマクロファージ関連（ｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）（ＳＴｉｇＭＡ）ポリペプチド、または免疫グロブリンファミリーの補体受容体（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆａｍｉｌｙ）（ＣＲＩｇ）ポリペプチドとして同定された。自然界に存在しているヒトＣＲＩｇは、２種類のスプライシングされた改変体として発現され、一方は、Ｎ末端ＩｇＶ様ドメインとＣ末端ＩｇＣ２様ドメインとを含んでおり、スプライシングされた形態はＣ末端ドメインを欠失している（それぞれ、配列番号４および６）。いずれの受容体も、１つの膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを有しており、これには、インビトロではマクロファージにおいて構成的にリン酸化されるチロシン残基が含まれている。マウスのホモログは、ヒトＣＲＩｇ（配列番号８）に対して６７％の配列相同性を有していることが明らかになった。全長のヒトＣＲＩｇポリペプチドにはまた、Ｎ末端セグメントが失われている短いバージョンも有する（配列番号２）。
【００９７】
以下の実施例に示すように、ＣＲＩｇは補体Ｃ３ｂに結合し、Ｃ３転換酵素を阻害する。ＣＲＩｇは、組織常在性マクロファージ上で選択的に発現され、その発現は、デキサメタゾンおよびＩＬ−１０によってアップレギュレートされ、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γによってダウンレギュレートされ、そして、Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答とは独立してコラーゲン誘導関節炎および抗体誘導関節炎を阻害する。
【００９８】
加えて、ＣＲＩｇはクップファー細胞にて高度に発現され、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂオプソニンに結合し、そして循環中の病原体の迅速なクリアランスに必要であることが明らかにされている。構造的には、ＣＲＩｇは、これが、ＣＲ１およびＣＲ２中の結合したＣ３ｂ−およびＣ４ｂ結合の短いコンセンサス反復配列、ならびに、Ｃ３およびＣＲ４中に存在しているインテグリン系（ｉｎｔｅｇｒｉｎｇ−ｌｉｎｅ）ドメインを欠いている点で、既知の補体受容体とは異なる。補体受容体ＣＲ１〜４は、広範囲の様々な細胞タイプで発現されるが、ＣＲＩｇ発現は、肝臓のクップファー細胞を含む組織常在性マクロファージに限られる。
【００９９】
枯渇実験によって、感染の初期の間のリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の迅速なＣ３依存性クリアランスにおけるクップファー細胞の役割が確立されている（Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１２９−１６３（１９９３）；Ｇｒｅｇｏｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：３０８−３１５（２００２））が、このプロセスに関与する受容体はこれまでのところは同定されていない。以下の実施例に示す実験は、マクロファージによって発現されたＣＲＩｇが、病原体の表面に蓄積したＣ３ｂおよびｉＣ３ｂに結合することを明らかにしている。Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂに対するこの二重結合活性が原因で、ＣＲＩｇは、Ｃ３分解成分の両方でオプソニン化されたリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：ＬＭ）の効率的なクリアランスに必要である。
【０１００】
Ｃ３オプソニン化粒子の迅速な肝臓でのクリアランスにおけるＣＲＩｇの重要性は、循環からＣ３−オプソニン化ＬＭを効率よくクリアランスするために、ＣＲＩｇノックアウト（ｋｏ）マウスの障害によってさらにサポートされる。これによって、種々の臓器における病原体の負荷量の増加および死亡率の増大が生じる。Ｃ３が存在しない場合には、ＣＲＩｇ  ｋｏ野生型（ｗｔ）マウスは、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）を同様に十分にクリアランスし、このことは、Ｃ３の存在に対するＣＲＩｇ機能の依存性を示している。
【０１０１】
肝臓のクップファー細胞によるＬＭのクリアランスにおける補体受容体Ｃ１〜４の役割は十分には確立されていない。ＣＲ１およびＣＲ２は、組織常在性マクロファージには存在せず、そして濾胞樹状細胞およびＢ細胞にて主に発現され、ここではこれらは、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答を調節する役割を担っている（Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒ  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８０：１１２−１２２（２００１）；Ｍｏｌｉｎａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１２１−１２９（１９９２）、および実施例）。ＣＲ３は、ＫＣでは低いレベルで発現されているが、ＣＲ３とＣＲ４との両方に共通しているＣＤ１８  β鎖を欠失しており、その結果、非機能性の受容体を生じるｋｏマウスは、感染しやすくなるのではなく、感染しにくくなることが示されている（Ｗｕら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：５９８６−５９９３（２００３））。したがって、ＣＲＩｇはＣ３−オプソニン化粒子の迅速なクリアランスにおける細網内皮食作用系の主要な成分を示す。
【０１０２】
肝臓のクップファー細胞におけるその発現に加えて、ＣＲＩｇは種々の組織（腹膜、心臓、肺、副腎、および腸を含む）中のマクロファージのサブ集団に存在する。これらのマクロファージは、死亡した細胞および細胞の破片の食作用において中心的な役割を担っていることが知られている（Ａｌｍｅｉｄａら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１９：１３５−１４０（２００４）；Ｃａｓｔｅｌｌｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｚａｃｃｈｅｏ，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２９６：４４３−４５１（１９８９）；Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９０１−９４４（２００５））。これらの常在性マクロファージでのＣＲＩｇの発現によって、種々の粒子の補体依存性オプソニン食作用（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）が媒介され得る。このことは、ＣＲＩｇ  ｋｏマウスは、循環ＭＬの負荷量が増加するにもかかわらず、それらの心臓および肝臓組織においてＬＭの低下を示すという知見によって支持される。したがって、ＣＲＩｇは、組織マクロファージで発現される新規の受容体を提示し、これは、補体でオプソニン化された病原体の迅速なクリアランスについてｋｅｐ  ｐｏｒｔａｌとしての役割を担っている。
【０１０３】
以下の実施例に示される結果は、再利用されているベシクルの細胞内プールにてＣＲＩｇが発現され、それによって、Ｃ３オプソニン化粒子への結合のための細胞表面でのＣＲＩｇの持続的な供給が確実になることをさらに示している。加えて、ＣＲＩｇを発現するエンドソームは、粒子の接触部位に迅速に動員され、これらは、膜がファゴソームを形成するように誘導されることを助けることができる。Ｃ３オプソニン化粒子の食作用におけるＣＲＩｇの重要性は、ＣＲＩｇを欠失しているＫＣがＣ３ｂおよびｉＣ３ｂに結合することができず、それによってＣ３オプソニン化リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：ＬＭ）の食作用の減少が生じることによって示される（実施例を参照のこと）。
【０１０４】
ＣＲＩｇの細胞内局在化および細胞内輸送は、既知の補体Ｃ３受容体とは異なる。ＣＲＩｇは構造的に再利用されているエンドソームに局在化させられるが、ＣＲ１、ＣＲ３、およびＣＲ４は、分泌ベシクルに存在しており、これは、細胞がサイトカインで刺激されると血漿膜と結合し（Ｓｅｎｇｅｌｏｖら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：８０４−８１０（１９９４）；およびＳｅｎｇｅｌｏｖら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１０７−１３１（１９９５））、そして受容体の架橋後にのみ、微飲作用のプロセスによってリガンドをインターナライズする（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌ．２：４１−５５（１９９１）；Ｂｒｏｗｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７６−８２（１９９１））。結果として、細胞表面でのＣＲＩｇの発現は細胞の刺激の後にダウンレギュレートされ、一方、ＣＲ１およびＣＲ３の細胞表面での発現は刺激の後に増加する。この増加は、結合および食作用の重要な工程を担っており、ＣＲＩｇと同様に、ＣＲ３は、ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｃｕｐおよびファゴソームに周辺のＣ３オプソニン化粒子を集める（Ａｄｅｒｅｍ  ａｎｄ  Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：５９３−６２３（１９９９））。休止しているマクロファージにおけるＣＲＩｇによるリガンドの構造的な再利用およびエンドサイトーシスは、炎症応答の前の細菌感染の初期の間の補体でオプソニン化された粒子の結合における役割（例えば、活性化された食細胞の動員）、ならびに、炎症が起こっていない条件下での循環からの粒子の除去の間の補体でオプソニン化された粒子の結合における役割を最初に有している。
【０１０５】
補体は、体の防御において、そして免疫系の他の成分とともに、体内への病原体の侵襲から個体を防御することにおいて重要な役割を担っている。しかし、適切に活性化または制御されないと、補体は、宿主組織に対して損傷を生じる可能性もある。補体の不適切な活性化は、補体が関係している疾患または障害（例えば、免疫複合体病および自己免疫疾患、ならびに種々の炎症性疾患（補体によって媒介される炎症組織の損傷を含む））と呼ばれる種々の疾患の発病に関係している。補体が関係している疾患の病状は様々であり、長期間または短期間の補体の活性化、カスケード全体の活性化、カスケードの１つ（古典補体経路、または代替補体経路）のみの活性化、カスケードのいくつかの成分のみの活性化などが含まれ得る。いくつかの疾患においては、補体断片の補体の生物学的活性によって組織の損傷および疾患が生じる。したがって、補体の阻害因子が、高い治療可能性を有する。代替補体経路の選択的阻害因子が特に有用である。なぜなら、古典補体経路による血液からの病原体および他の生物のクリアランスは不完全なままであるからである。
【０１０６】
Ｃ３ｂは体に侵襲する微生物の表面を共有結合によってオプソニン化し、食細胞に存在している補体受容体のリガンドとして作用し、最終的には病原体の食作用を導くことが知られている。上記で列挙されたような多くの病理学的状況においては、補体は、血管壁、関節の軟骨、肝臓の糸球体、本来備わっている補体阻害因子を欠いている細胞を含む細胞の表面で活性化される。補体の活性化によってアナフィラトキシンＣ３ａとＣ５ａとの化学走化特性によって引き起こされる炎症が生じ、そして膜攻撃複合体が生じることによって自己細胞に対する損傷が引き起こされ得る。いずれの特定の理論にもとらわれることなく、Ｃ３ｂの結合によって、ＣＲＩｇはＣ３転換酵素を阻害し、それによって、補体によって媒介される疾患（その例は上記に列挙されている）を予防または軽減すると考えられる。
【０１０７】
（本発明の化合物）
（１．自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドと改変体ＣＲＩｇポリペプチド）
自然界に存在しているＣＲＩｇ分子（それらの核酸配列およびポリペプチド配列を伴う）の調製は上記で議論されている。実施例１は、配列番号４の全長のｈｕＣＲＩｇのクローニングを示す。ＣＲＩｇポリペプチドは、ＣＲＩｇ核酸を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによって生産することができる。もちろん、当該分野で周知である別の方法を使用してＣＲＩｇを調製できることが予想される。例えば、ＣＲＩｇ配列またはその一部は、固相技術を使用する直接のペプチド合成によって生産することができる（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）を参照のこと）。インビトロでのタンパク質合成は、手作業による技術を使用して、または自動で行うことができる。自動による合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の説明書にしたがって使用して行うことができる。ＣＲＩｇの種々の部分を別々に化学合成し、化学的または酵素的方法を使用して結合させて全長のＣＲＩｇとすることもできる。
【０１０８】
ＣＲＩｇ改変体は、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドをコードするＤＮＡ内に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、または、所望のＣＲＩｇポリペプチドの合成によって調製することができる。当業者は、アミノ酸の変化によってＣＲＩｇの翻訳後プロセスを変化させることができる、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させるか、あるいは、膜結合特性を変化させることができることを十分に理解しているであろう。
【０１０９】
例えば、本明細書中に記載される自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドにおけるバリエーションは、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に示されている、保存的および非保存的変異についての任意の技術および指針を使用して作成することができる。バリエーションは、自然界に存在している配列のＣＲＩｇまたは改変体ＣＲＩｇをコードする１つ以上のコドンの置換、欠失、または挿入であり得、これによって、対応する自然界に存在している配列のＣＲＩｇまたは改変体ＣＲＩｇと比較してそのアミノ酸配列において変化が生じる。場合により、バリエーションは、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドの１つ以上のドメインにおいて、任意の他のアミノ酸を少なくとも１つのアミノ酸で置換することによるものである。所望の活性に悪影響を生じることなくどのアミノ酸残基を挿入、置換、または欠失させることができるかを決定する指針は、ＣＲＩｇの配列を相同である既知のタンパク質分子の配列と比較し、相同性が高い領域で作成されるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって捜し出すことができる。
【０１１０】
アミノ酸置換は、類似する構造および／または化学特性を有している別のアミノ酸での１つのアミノ酸の置き換え（例えば、セリンでのロイシンの置き換え）、すなわち、保存的なアミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、場合により１個から５個のアミノ酸の範囲であり得る。許容されるバリエーションは、配列の中にアミノ酸の挿入、欠失、または置換を体系的に作成し、そして、得られる改変体を以下の実施例に記載されるインビトロアッセイにおいて活性について試験することによって決定することができる。
【０１１１】
バリエーションは、オリゴヌクレオチドによって媒介される（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャン、およびＰＣＲ突然変異誘発などの、当該分野で公知の方法を使用して作成することができる。部位特異的突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７））、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５））、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６））、または他の公知の技術を、クローニングされたＤＮＡに対して行って、ＣＲＩｇ改変体ＤＮＡを得ることができる。
【０１１２】
スキャンアミノ酸分析もまた、連続している配列に沿って変化され得る１つ以上のアミノ酸を同定するために使用することができる。中でも、好ましいスキャンアミノ酸は比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。通常、アラニンがこのグループの中でも好ましいスキャンアミノ酸である。なぜなら、これによってβ−炭素を超える側鎖が排除され、改変体の主鎖の立体構造が変わる可能性は低いからである。アラニンは一般的にも好ましい。なぜなら、これは最も一般的なアミノ酸であるからである。さらに、これは、埋もれている位置および露出している位置の両方で頻繁に見られる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１（１９７６））。アラニン置換によって十分な量の改変体が得られない場合には、異性体（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を使用することができる。
【０１１３】
膜貫通領域および／または細胞質領域の全体または一部の除去あるいは不活化によってはＣＲＩｇの生物学的活性が損なわれることはないことが明らかになっている。したがって、膜貫通領域および／または細胞質領域が欠失／不活化されているＣＲＩｇ改変体が、本明細書中の範囲に具体的に含まれる。同様に、ｈｕＣＲＩｇの生物学的に活性な自然界に存在している短い形態とマウスホモログとの存在によって明らかであるように、ＩｇＣ２領域を、生物学液活性を損なうことなく除去することができる。
【０１１４】
自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドおよび改変体ＣＲＩｇポリペプチドの共有結合による改変が本発明の範囲に含まれる。共有結合による改変の１つのタイプには、ＣＲＩｇの標的化されるアミノ酸残基を、ＣＲＩｇポリペプチドの選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応させることができる有機誘導体化剤と反応させることが含まれる。二官能性物質での誘導体化は、例えば、水不溶性支持マトリックスまたは表面へのＣＲＩｇの架橋のために、例えば、抗ＣＲＩｇ抗体を精製するための方法での使用に有用である。一般的に使用されている架橋剤として、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル、例えば、４−アジドサリチル酸のエステル、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）などのジスクシンイミジルエステルを含む）、二官能性マレイミド、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン、ならびに、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオン酸イミドなどの物質が挙げられる。
【０１１５】
他の改変として、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，７９−８６頁（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１１６】
本発明の範囲に含まれるＣＲＩｇポリペプチドの別のタイプの共有結合による改変には、ポリペプチドの自然界でのグリコシル化パターンの変更が含まれる。「自然界でのグリコシル化パターンの変更」は、本明細書中での目的について、自然界に存在している配列のＣＲＩｇにおいて見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、ならびに／あるいは、自然界に存在している配列のＣＲＩｇには存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加すること、ならびに／または、グリコシル化部位（単数または複数）に結合させる糖残基の比および／もしくは組成を変化させることを意味するように意図される。マウスＣＲＩｇの予想される自然界でのグリコシル化部位は、１７０位において配列ＮＧＴＧに見られる。
【０１１７】
ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合を意味する。トリペプチド配列（アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン、式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。Ｏ結合グリコシル化は、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリンまたはスレオニン）に対する結合を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもＯ結合グリコシル化に含まれる場合がある。自然界に存在している配列のＣＲＩｇはわずかな量しかＮ−グリコシル化を有していない。ＣＲＩｇポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変化させることによって行うことができる。この変化は、例えば、自然界に存在している配列のＣＲＩｇへの１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または１つ以上のセリンもしくはスレオニン残基での置換によって（Ｏ結合グリコシル化部位について）、あるいは、Ｎ結合グリコシル化については認識配列の付加によって作成することができる。ＣＲＩｇアミノ酸配列は、場
合により、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳され得るコドンが生じるように予め選択された塩基でＣＲＩｇポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、変更することができる。
【０１１８】
ＣＲＩｇポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドに対するグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。このような方法は、当該分野、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０に、そしてＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５９−３０６頁（１９８１）に記載されている。
【０１１９】
ＣＲＩｇポリペプチドに存在している炭水化物部分の除去は、グリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの、化学的もしくは酵素的置換、または変異による置換によって行うことができる。化学的な脱グリコシル化技術は当該分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）、およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素による切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１３８：３５０（１９８７）に記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。
【０１２０】
ＣＲＩｇの別のタイプの共有結合による改変には、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載されている様式での、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つへのＣＲＩｇポリペプチドの連結が含まれる。
【０１２１】
本発明の自然界に存在しているＣＲＩｇおよび改変体ＣＲＩｇはまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたＣＲＩｇの断片を含む、ＣＲＩｇを含むキメラ分子を形成させるための方法で改変される場合もある。１つの実施形態においては、このようなキメラ分子には、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを提供するタグポリペプチドとのＣＲＩｇの融合体が含まれる。エピトープタグは、一般的には、ＣＲＩｇポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。このようなエピトープタグ化形態のＣＲＩｇポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。また、エピトープタグの供給により、ＣＲＩｇポリペプチドを、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリックスを使用する親和性精製によって容易に精製できるようになる。種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は当該分野で周知である。例として、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）タグまたはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８）；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５））；ならびに、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグとその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドとして、Ｆｌａｇ−ペプチド（Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２））；およびα−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１））；ならびに、Ｔ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０））が挙げられる。
【０１２２】
別の実施形態においては、キメラ分子には、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域とのＣＲＩｇポリペプチドまたはその断片の融合体が含まれ得る。二価の形態のキメラ分子については、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対する融合であり得る。これらの融合ポリペプチドは抗体様分子であり、これは、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能と異種タンパク質の結合特異性（接着）とを兼ね備えており、そして多くの場合には、免疫接着物と呼ばれる。構造的には、免疫接着物には、抗体の抗原認識および結合部位以外の所望の結合特異性を有しているアミノ酸配列（すなわち、異種）と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合体が含まれる。免疫接着物分子の接着部は、通常、受容体またはリガンドの結合部位を少なくとも含む連続しているアミノ酸配列である。免疫接着物の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ）から得ることができる。
【０１２３】
適切な免疫グロブリン定常ドメイン配列（免疫接着物）に連結された受容体配列から構築されたキメラは当該分野で公知である。文献で報告されている免疫接着物には、Ｔ細胞レセプターの融合体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４の融合体（Ｃａｐｏｎら、．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｅｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ，９：３４７−３５３（１９９０）；Ｂｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）の融合体（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４の融合体（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ，６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７の融合体（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４の融合体（Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２の融合体（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ，６６：１１３３−１１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体の融合体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：２８８３−２８８６（１９９１）；Ｐｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；ＮＰ受容体の融合体（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６０−２３０６７（１９９１））；ならびに、ＩｇＥ受容体αの融合体（Ｒｉｄｇｗａｙら、．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１５：ａｂｓｔｒ．１４４８（１９９１））が挙げられる。
【０１２４】
最も単純であり、最も直接的な免疫接着物の構造では、「接着」タンパク質の結合領域（単数または複数）が、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域およびＦｃ領域と組み合わされる。通常、本発明のＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラを調製する場合には、ＣＲＩｇポリペプチドまたはＣＲＩｇポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸が、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に対して、Ｃ末端で融合される。しかし、Ｎ末端での融合も可能である。
【０１２５】
通常、このような融合体においては、コードされるキメラポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域、ならびに定常領域のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持している。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端に対して、また、重鎖のＣＨ１に対してすぐＮ末端に、もしくは軽鎖の対応する領域に対して行うこともできる。
【０１２６】
融合が行われる正確な部位は重要ではない。特定の部位が周知であり、ＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するように選択することができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラは、単量体として、またはヘテロ二量体もしくはホモ多量体として、そして具体的には、ＷＯ９１／０８２９８に本質的に記載されている二量体または四量体としてアセンブリされる。
【０１２８】
好ましい実施形態において、自然界に存在している配列のヒトＣＲＩｇポリペプチド（例えば、ｈｕＣＲＩｇ（ｌｏｎｇ）（配列番号４）またはｈｕＣＲＩｇ（ｓｈｏｒｔ）（配列番号６）の配列、あるいは、ＣＲＩｇ細胞外ドメインの配列（ｈｕＣＲＩｇ（ｌｏｎｇ）およびｈｕＣＲＩｇ（ｓｈｏｒｔ）のＥＣＤを含む）が、免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１））のエフェクター機能を含む抗体（具体的には、Ｆｃドメイン）のＣ末端部分のＮ末端に融合される。ＣＲＩｇまたはＣＲＩｇ細胞外ドメイン配列に対して重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、パパイン切断部位（これによってＩｇＧ  Ｆｃが化学的に定義される；２１６位の残基、重鎖定常領域の最初の残基を１１４または他の免疫グロブリンの同様の部位とする）のすぐ上流にあるヒンジ領域で始まる配列が融合に使用される。特に好ましい実施形態において、ＣＲＩｇのアミノ酸配列が、ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３に、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合される。融合が行われる正確な部位は重要ではなく、最適な部位は日常的に行われる実験によって決定することができる。特異的なＣＲＩｇ−Ｉｇ免疫接着物の構造が図５９〜６１に示される。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩｇ−免疫グロブリンキメラは、多量体として、そして具体的には、ホモ二量体またはホモ四量体としてアセンブリされる。一般的には、これらのアセンブリされた免疫グロブリンは公知の単位構造を有するであろう。基本的な４つの鎖の構造単位は、その中にＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在している形態である。４つの単位はより大きな分子量の免疫グロブリンで繰り返される。ＩｇＭは、一般的には、ジスルフィド結合によって共に保たれる基本的な４単位の五量体として存在し、ＩｇＡグロブリン（および場合によってはＩｇＧグロブリン）もまた血清中では多量体形態で存在し得る。多量体の場合には、個々の４つの単位が同じである場合も、異なる場合もある。
【０１３０】
あるいは、ＣＲＩｇまたはＣＲＩｇ細胞外ドメインの配列を、免疫グロブリン重鎖配列と軽鎖配列との間に挿入することができ、その結果、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られる。この実施形態において、ＣＲＩｇ配列は、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとの間、またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のいずれかに、免疫グロブリンのそれぞれのアームの免疫グロブリン重鎖の３’末端に融合される。同様の構造が、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：１０２７−１０３７（１９９１）によって報告されている。
【０１３１】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明の免疫接着物においては必要ないが、免疫グロブリン軽鎖は、ＣＲＩｇ免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合されて、またはＣＲＩｇ細胞外ドメインに直接融合されて存在する場合がある。前者の場合には、通常は、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、ＣＲＩｇ−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと一緒に発現する。分泌されると、ハイブリッドの重鎖と軽鎖とが共有結合して、２つのジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造が提供される。このような構造の調製に適している方法は、例えば、１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【０１３２】
本発明の特定のＣＲＩｇ−Ｉｇ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、図５９、６０、および６７〜７０に示される。図６７〜７０に示すように、例えば、融合タンパク質には、ＣＲＩｇと免疫グロブリン配列との間にリンカー（例えば、短いペプチド配列（例えば、ＤＫＴＨＴ））が含まれる場合がある。加えて、いくつかの構築物の中では、ＣＲＩｇ膜貫通（ＴＭ）領域と免疫グロブリン（Ｆｃ）領域との間の配列（本明細書中では「ストーク（ｓｔａｌｋ）」配列と呼ばれる）を欠失することができる。図６７〜７０に示す種々のＣＲＩｇ構築物中のリンカーが始まるアミノ酸位置は、以下のとおりである：ｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ−Ｆｃ＋ｓｔａｌｋ；２６７位；ｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ−Ｆｃ−ｓｔａｌｋ：２３３位；ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−Ｆｃ＋Ｓｔａｌｋ：１７３位；ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−Ｆｃ−ｓｔａｌｋ：１４０位。
【０１３３】
（２．自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドおよび改変体ＣＲＩｇポリペプチドの調製）
自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡを有し、且つ検出可能なレベルでこれを発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。したがって、ヒトＣＲＩｇ  ＤＮＡは、実施例１に記載するように、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることが好都合であり得る。ＣＲＩｇをコードする遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、または、オリゴヌクレオチドの合成によって得ることもできる。
【０１３４】
ライブラリーは、目的の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、ＣＲＩｇに対する抗体、または少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）でスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの選択されたプローブでのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｉｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている標準的な手順を使用して行うことができる。ＣＲＩｇをコードする遺伝子を単離するための別の手段は、ＰＣＲ方法を使用することである（Ｓａｍｂｏｏｋら、前出；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５））。
【０１３５】
実施例１に、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための技術を記載する。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最小になるように十分な長さ且つ十分な明白性のものでなければならない。オリゴヌクレオチドは、それがスクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡにハイブリダイズすると検出できるように標識されることが好ましい。標識方法は当該分野で周知であり、これには、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射性同位元素標識、ビオチニル化、または酵素標識の使用が含まれる。中程度のストリンジェンシーおよび高いストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）において提供されている。
【０１３６】
このようなライブラリーのスクリーニング方法において同定された配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公のデータベースまたは他の個人的な配列のデータベースに蓄積されており、入手することができる他の既知の配列と比較し、整列させることができる。分子の定義された領域での、または全長の配列にわたる配列同一性（アミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルのいずれか）は、相同性を測定するために様々なアルゴリズムを使用する、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、およびＩＮＨＥＲＩＴなどのコンピューターソフトウェアプログラムを使用する配列アラインメントによって決定することができる。
【０１３７】
タンパク質をコードする配列を有している核酸は、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、最初に、本明細書中に開示される推定されるアミノ酸配列を使用してスクリーニングし、そして必要に応じて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）において記載されているような従来のプライマー伸長手順を使用して、ｃＤＮＡに逆転写されていない可能性があるｍＲＮＡの前駆体およびプロセシング中間体を検出することによって得られる場合もある。
【０１３８】
宿主細胞は、ＣＲＩｇの生産のために、本明細書中に記載される発現ベクターまたはクローニングベクターでトランスフェクトまたは形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切であるように改変された従来の栄養培地の中で培養される。培養条件（例えば、培地、温度、ｐＨなど）は、過度の実験を行うことなく当業者であれば選択することができる。一般的には、細胞培養物の生産性を最大にするための原理、プロトコール、および実践的技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に見ることができる。
【０１３９】
トランスフェクションの方法は当業者に公知であり、例えば、ＣａＰＯ４およびエレクトロポレーションである。使用される宿主細胞に応じて、形質転換が、そのような細胞に適切な標準的な技術を使用して行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されているような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションが、通常は、原核生物、または実質的な細胞壁バリアを含む他の細胞に使用される。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）での感染は、Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）および１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、特定の植物細胞の形質転換に使用される。そのような細胞壁を有さない哺乳動物細胞については、Ｇｒａｈａｍ
ａｎｄ  ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法を使用することができる。哺乳動物細胞宿主システムの形質転換の一般的な態様は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は、通常、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法にしたがって行われる。しかし、細胞にＤＮＡを導入するための他の方法（例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、完全な細胞との細菌プロトプラストの融合、またはポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチン）による）もまた使用することができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照のこと。
【０１４０】
本明細書中のベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適している宿主細胞として、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞が挙げられる。適切な原核生物として、真性細菌（例えば、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ））が挙げられるがこれらに限定はされない。種々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、およびＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５））を公に入手することができる。
【０１４１】
原核生物に加えて、真核微生物（例えば、糸状菌または酵母）が、ＣＲＩｇをコードするベクターに適しているクローニング宿主または発現宿主である。サッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、一般的に使用されている下等真核宿主微生物である。
【０１４２】
グリコシル化されたＣＲＩｇの発現に適している宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例として、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞、さらには、植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。さらに特異的な例として、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓細胞（２９３、または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；およびマウスの乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、当業者の能力の範囲内とみなされる。
【０１４３】
ＣＲＩｇをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために複製可能なベクターに挿入することができる。種々のベクターは公に入手することができる。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列を、種々の手順によってベクターに挿入することができる。一般的には、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に挿入される。ベクター成分には、通常、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列が含まれるが、これらに限定はされない。これらの成分の１つ以上を含む適切なベクターの構築には、当業者に公知である標準的な連結技術が使用される。
【０１４４】
ＣＲＩｇポリペプチドは、組換えによって直接的に生産することができるだけではなく、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有しているシグナル配列または他のポリペプチドであり得る異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産することができる。一般的には、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されるＣＲＩｇ  ＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーのグループから選択される原核生物のシグナル配列であり得る。酵母での選択については、シグナル配列は、例えば、酵母のインベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の“−因子リーダーを含む、後者は、米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、または酸性ホスファターゼのリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼのリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ  ３６２，１７９）、または１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列を、タンパク質の分泌を指示するために使用することができ、例えば、同じ種または関連する種の分泌型ポリペプチドに由来するシグナル配列、ならびにウイルスの分泌リーダーであり得る。
【０１４５】
発現ベクターおよびクローニングベクターのいずれにも、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞の中で複製することを可能にする核酸配列が含まれる。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、グラム陰性細菌に適している。２：プラスミド起点が酵母に適しており、そして種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＳＶ、またはＢＰＶ）が哺乳動物細胞中のクローニングベクターに有用である。
【０１４６】
発現ベクターおよびクローニングベクターには、通常、選択遺伝子が含まれ、これは選択マーカーとも呼ばれる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリン）、（ｂ）栄養要求性の欠損を補うタンパク質、あるいは（ｃ）複合培地から得ることができない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセミ化酵素をコードする遺伝子である。
【０１４７】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ＣＲＩｇ核酸を取り込む細胞の能力を同定することができるものであり、例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼである。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲが使用される場合には、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）に記載されているように調製され、増殖された、ＤＨＦＲ活性が欠損しているＣＨＯ細胞である。酵母での使用に適している選択遺伝子は、酵母のプラスミドＴＲｐ７中に存在しているｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））。ｔｒｐ１遺伝子によって、トリプトファン中で増殖する能力が欠失している酵母の変異株（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１）についての選択マーカーが提供される（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。
【０１４８】
発現ベクターおよびクローニングベクターには、通常、ｍＲＮＡの合成を指示するための、ＣＲＩｇ核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターが含まれる。種々の可能性のある宿主細胞によって認識されるプロモーターが周知である。原核生物宿主との使用に適しているプロモーターとして、□−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ  ３６，７７６）、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３））が挙げられる。細菌システムで使用されるプロモーターにはまた、ＣＲＩｇをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．））配列も含まれるであろう。
【０１４９】
酵母宿主での使用に適しているプロモーター配列の例として、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０））または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８））が挙げられ、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼがある。
【０１５０】
他の酵母のプロモーターは、増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有している誘導性プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係している分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトースとの利用を担う酵素である。酵母での発現に使用される適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ  ７３，６５７にさらに記載されている。
【０１５１】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのＣＲＩｇの転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、ニワトリポックスウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ  ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターによって、異種哺乳動物のプロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）によって、および熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞システムと適合するという条件で制御される。
【０１５２】
より高等な真核生物によるＣＲＩｇポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列の挿入によって増大させることができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常は、約１０から３００ｂｐであり、その転写を増大させるようにプロモーターに対して作用する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、およびインシュリン）に由来する多くのエンハンサー配列が現在公知である。しかし、通常は、真核生物細胞のウイルスに由来するエンハンサーが使用されるであろう。例として、複製起点の後ろ側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）にあるＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ベクターの中に、ＣＲＩｇをコードする配列に対して５’または３’の位置にスプライシングされ得るが、好ましくは、プロモーターから５’の位置に配置される。
【０１５３】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物に由来する有核細胞）で使用される発現ベクターにはまた、ｍＲＮＡの転写の終結および安定化に必要な配列も含まれるであろう。このような配列は、一般的には、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合によっては３’非翻訳領域から入手できる。これらの領域には、ＣＲＩｇをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化された断片として転写されるヌクレオチドセグメントが含まれる。
【０１５４】
組換え脊椎動物細胞培養物中でのＣＲＩｇの合成への適用に適しているなお他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）；ＥＰ  １１７，０６０；およびＥＰ  １１７，０５８に記載されている。
【０１５５】
遺伝子の増幅および／または発現は、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量化するための従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８９））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、または本明細書中で提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションによって、直接試料中で測定することができる。あるいは、特異的な二本鎖（ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖を含む）またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を特異的に認識することができる抗体を使用することができる。次いで、抗体が標識され得、アッセイが行われ得る。ここでは、二本鎖が表面に結合し、その結果、表面に二本鎖が形成すると、二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１５６】
あるいは、遺伝子の発現を、免疫学的方法（例えば、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色、および細胞培養物または体液のアッセイ）によって測定して、遺伝子産物の発現を直接定量化することができる。免疫組織化学的染色および／または試料液体のアッセイに有用な抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、これは任意の哺乳動物で調製することができる。通常、抗体は、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドに対して、または本明細書中で提供されるＤＮＡ配列に基づいた合成のペプチドに対して、または、ＣＲＩｇ  ＤＮＡに融合され且つ特異的な抗体エピトープをコードする外因性の配列に対して調製され得る。
【０１５７】
ＣＲＩｇ形態を、培養培地または宿主細胞溶解物から回収することができる。膜に結合している場合には、これは、適切な界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用して、または酵素による切断によって、膜から切り離すことができる。ＣＲＩｇの発現に使用される細胞は、種々の物理的または化学的手段（例えば、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的な破壊、または細胞溶解剤）によって破壊することができる。
【０１５８】
組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＣＲＩｇを精製することが望まれる場合もある。以下の手順は、適切な精製手順の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）でのクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；ゲル濾過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用する）；ＩｇＧなどの混入物質を除去するプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム；ならびに、ＣＲＩｇポリペプチドのエピトープタグ化形態に結合する金属キレート化カラムによる。種々のタンパク質精製方法を使用することができる。このような方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている。選択される精製工程（単数または複数）は、例えば、使用される生産プロセスの性質、および生産される特定のＣＲＩｇに応じて様々であろう。
【０１５９】
（３．ＣＲＩｇポリペプチドのアゴニスト）
ＣＲＩｇポリペプチドのアゴニストは、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドの質的な生物学的活性を模倣し得る。好ましくは、生物学的活性は、Ｃ３ｂに結合する能力、補体または補体の活性化に影響を与える能力であり、具体的には、代替補体経路および／またはＣ３転換酵素を阻害する能力である。アゴニストとして、例えば、免疫接着物、ペプチド模倣物、および自然界に存在しているＣＲＩｇの質的な生物学的活性を模倣する非ペプチドである有機低分子が挙げられる。
【０１６０】
ＣＲＩｇ−Ｉｇ免疫接着物は上記で議論されている。
【０１６１】
ＣＲＩｇアゴニストの別のグループは、自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドのペプチド模倣物である。ペプチド模倣物には、例えば、化合物が本明細書中に記載されるＣＲＩｇの生物学的活性を保持しているとの条件で、自然界には存在しないアミノ酸を含むペプチドが含まれる。同様に、ペプチド模倣物および類似体には、本発明のＣＲＩｇポリペプチドの重要な構造的エレメントの構造を模倣し、そしてＣＲＩｇの生物学的活性を保持している、非アミノ酸化学構造が含まれ得る。用語「ペプチド」は、本明細書中では、約５０未満のアミノ酸残基、好ましくは、約４０未満のアミノ酸残基の拘束された（すなわち、βターンまたはβプリーツシートを開始する、または例えば、ジスルフィド結合されたＣｙｓ残基の存在によって環化されるアミノ酸の存在などの、いくつかの構造エレメントを有している）、あるいは、拘束されていない（例えば、直鎖の）アミノ酸配列を意味し、これには、その二量体またはそれらの間での二量体などの多量体が含まれる。約４０未満のアミノ酸残基のペプチドのうち、約１０個から約３０個の間のアミノ酸残基、特に、約２０個のアミノ酸残基のペプチドが好ましい。しかし、本開示を読めば、当業者であれば、ペプチドを識別するものが、特定のペプチドの長さではなく、Ｃ３ｂに結合し、Ｃ３転換酵素を阻害するその能力、特に、代替補体経路のＣ３転換酵素を阻害するその能力であることを容易に理解するであろう。
【０１６２】
ペプチドは、通常は、固相ペプチド合成を使用して調製することができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６４）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２（１９８５））。固相合成は、推定されるペプチドのカルボキシル末端で、不活性な固体支持体に対して保護されたアミノ酸をカップリングさせることによって開始される。不活性な固体支持体は、最初のアミノ酸のＣ末端についてアンカーとして作用することができる任意の巨大分子であり得る。通常、巨大分子の支持体は、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（前出）の２〜４ページの図１−１および１−２に示されているような、架橋されたポリマー樹脂（例えば、ポリアミド樹脂またはポリスチレン樹脂）である。１つの実施形態において、Ｃ末端アミノ酸は、ポリスチレン樹脂にカップリングされてベンジルエステルが形成する。巨大分子の支持体は、ペプチドアンカーの連結が、ペプチド合成の間にブロックされたアミノ酸のα−アミノ基を脱保護するために使用される条件下で安定であるように選択される。塩基不安定性のα−保護基が使用される場合には、ペプチドと固体支持体との間に酸不安定性の連結を使用することが所望される。例えば、酸不安定性のエーテル樹脂は、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（前出）の１６頁に記載されているように、塩基不安定性のＦｍｏｃ−アミノ酸ペプチド合成に有効である。あるいは、酸分解に対して様々な不安定性を示すペプチドアンカーの連結およびα−保護基を使用することができる。例えば、アミノメチル樹脂（例えば、フェニルアセトアミドメチル（Ｐａｍ）樹脂）は、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（前出）の１１〜１２頁に記載されているように、Ｂｏｃ−アミノ酸ペプチド合成と組み合わせて十分に機能する。
【０１６３】
最初のアミノ酸が不活性な固体支持体に結合した後、最初のアミノ酸のα−アミノ保護基は、例えば、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去され、そして例えば、トリエチルアミン（ＴＥＡ）で中和される。最初のアミノ酸のα−アミノ基の脱保護の後、合成の際に次のα−アミノおよび側鎖が保護されたアミノ酸が付加される。残っているα−アミノ酸、必要に応じて側鎖が保護されたアミノ酸が、その後、所望の順序で縮合によって連続して結合され、固体支持体に結合された中間体化合物が得られる。あるいは、いくつかのアミノ酸は、所望されるペプチドの断片が形成されるように互いに結合され、その後、固相ペプチド鎖の成長のためにペプチド断片が付加される。
【０１６４】
２つのアミノ酸、またはアミノ酸とペプチド、またはペプチドとペプチドとの間での縮合反応は、ａｘｉｄｅ方法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、またはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法、ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、ならびにＷｏｏｄｗａｒｄ試薬Ｋ法などの通常の縮合方法にしたがって行うことができる。
【０１６５】
ペプチドの化学合成においては、適切な保護基でアミノ酸の任意の反応性側鎖基が保護されることが一般的である。最終的には、これらの保護基は所望されるポリペプチド鎖が連続的にアセンブリされた後に除去される。アミノ酸またはペプチド断片のα−アミノ基の保護もまた一般的であるが、アミノ酸またはペプチド断片のＣ末端カルボキシル基は、生長しつつある固相ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端アミノ基と反応し、その後、α−アミノ基が選択的に除去されて、固相ポリペプチド鎖に対する次のアミノ酸またはペプチド断片の付加が可能となる。したがって、ポリペプチドの合成においては、ペプチド鎖において所望の配列に配置されているアミノ酸残基のそれぞれを含む中間体化合物が生産されることが一般的である。この場合、個々の残基は、側鎖保護基をなおも有している。これらの保護基は、固相からの除去の後に、所望のポリペプチド産物が生じるように実質的に同時に除去することができる。
【０１６６】
α−およびε−アミノ側鎖は、ベンジルオキシカルボニル（Ｚと略される）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｚ（２Ｃｌ））、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（Ｚ（ＮＯ２））、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｚ（ＯＭｅ））），ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、およびジメチルホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保護することができる。
【０１６７】
カルボキシル官能基についての保護基は、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（Ｏｐｉｃ）などによって例示される。多くの場合には、アミノ基およびカルボキシル基以外の官能基を有している特異的なアミノ酸（例えば、アルギニン、システイン、およびセリン）が、適切な保護基によって保護される。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンズスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）などで保護することができる。システインのチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなどで保護することができる。
【０１６８】
上に記載されたブロックされたアミノ酸の多くは、市販の供給源（例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）、Ｂａｃｈｅｍ  ＣＡ（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，Ｃａｌｉｆ）、またはＰｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ）から入手することができる。
【０１６９】
Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（前出）によって、ペプチドを調製するための手順に関する詳細な情報が提供される。α−アミノ基の保護は、１４〜１８頁に記載されており、側鎖のブロックは１８〜２８頁に記載されている。アミン、ヒドロキシル、およびスルフヒドリル機能についての保護基の表は、１４９〜１５１頁に記載されている。
【０１７０】
所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドを固相支持体から切り離し、回収し、そして精製することができる。ペプチドは、ペプチド−固相の結合を破壊することができ、且つ場合によりペプチド上のブロックされた側鎖官能基を脱保護することができる試薬によって、固体支持体から切り離される。１つの実施形態において、ペプチドは、液体のフッ化水素（ＨＦ）での酸分解によって固相から切り離される。これによってはまた、任意の残っている側鎖保護基も除去される。好ましくは、ペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイン、およびチロシン残基のアルキル化）を回避するために、酸分解反応混合物には、チオ−クレゾールおよびクレゾールスカベンジャーが含まれる。ＨＦでの切断の後、樹脂は、エーテルで洗浄され、遊離ペプチドが、酢酸溶液での連続洗浄によって固相から抽出される。混合された洗浄液が凍結して、ペプチドが精製される。
【０１７１】
（４．ＣＲＩｇポリペプチドのアンタゴニスト）
自然界に存在している配列のＣＲＩｇポリペプチドのアンタゴニストは、過剰な補体の活性化が有効である症状の処置（腫瘍の処置を含む）において有用性が見出されている。
【０１７２】
アンタゴニストの好ましいグループには、自然界に存在しているＣＲＩｇに特異的に結合する抗体が含まれる。例示的な抗体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、およびヘテロ結合体抗体が挙げられる。
【０１７３】
ポリクローナル抗体を調製する方法が当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤と、所望によりアジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物において惹起させることができる。通常は、免疫化剤および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫化剤として、本発明のＣＲＩｇポリペプチドまたはその断片もしくは融合タンパク質が挙げられ得る。免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが既知であるタンパク質に免疫化剤を結合させることが有用である場合もある。このような免疫原性タンパク質の例として、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、および大豆トリプシン阻害因子が挙げられるが、これらに限定はされない。使用することができるアジュバントの例として、フロイトの完全なアジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピッドＡ、合成のトレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫化プロトコールは、当業者により過度の実験を行うことなく選択され得る。
【０１７４】
本発明のポリペプチドを認識して結合するか、またはそれに対するアンタゴニストとして作用する抗体は、代替的には、モノクローナル抗体である場合もある。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されている方法のようなハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法においては、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、通常、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するまたは生産することができるリンパ球を誘発させるために免疫化剤で免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。
【０１７５】
免疫化剤として、典型的には、本発明のＣＲＩｇポリペプチド、その抗原性断片または融合タンパク質が挙げられるであろう。一般的には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）のいずれかが、ヒト起源の細胞が所望される場合に使用され、また、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が、ヒト以外の哺乳動物である供給源が所望される場合に使用される。リンパ球は、その後、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して不死化細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、５９−１０３頁）。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、具体的には、齧歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常は、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は適切な培養培地のなかで培養することができ、これには、融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質が含まれていることが好ましい。例えば、もとの細胞が酵素であるヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失している場合には、ハイブリドーマの培養培地には通常は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンが含まれるであろう（「ＨＡＴ培地」）。これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１７６】
好ましい不死化細胞株は、効率よく融合し、選択された抗体生産細胞による抗体の安定な高レベルでの発現をサポートし、そしてＨＡＴ培地などの培地に対して敏感に反応する細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、マウスの骨髄腫株であり、これは例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、およびアメリカンタイプカルチャーコレクション，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手することができる。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の生産について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７），５１−６３頁）。
【０１７７】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、その後、本発明のポリペプチドに対して指向されるか、または本発明のポリペプチドと同様の活性を有しているモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはインビトロでの結合アッセイによって、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。このような技術およびアッセイは当該分野公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定することができる。
【０１７８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界稀釈手順によってサブクローニングされ、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，前出）によって増殖され得る。この目的に適している培養培地として、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水のように、インビボで増殖することができる。
【０１７９】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって、培養培地あるいは腹水から、単離または精製することができる。
【０１８０】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されている方法）によっても作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターの中に配置され得、その後、別の方法で免疫グロブリンタンパク質を生産することがない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞でのモノクローナル抗体の合成が得られる。ＤＮＡはまた、例えば、相同であるマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（前出））、または、免疫グロブリンコード配列全体もしくは免疫グロブリン以外のポリペプチドのコード配列の一部に共有結合することによって、改変され得る。このような免疫グロブリン以外のポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインで置き換えることができ、また、本発明の抗体の抗原結合部位の可変ドメインで置き換えることができ、キメラの二価抗体を生成することができる。
【０１８１】
抗体は、好ましくは、一価の抗体である。一価の抗体を調製する方法は当該分野で周知である。例えば、１つの方法には、免疫グロブリン軽鎖と改変された重鎖との組換えによる発現が含まれる。重鎖は、一般的には、重鎖の架橋を防ぐためにＦｃ領域中の任意の部位で短縮される。あるいは、関連するシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されるか、または架橋を防ぐために欠失される。
【０１８２】
インビトロでの方法は、一価の抗体の調製にも適している。抗体のその断片（特に、Ｆａｂ断片）を生じさせるための消化は、当該分野で公知の日常的な技術を使用して行うことができる。
【０１８３】
本発明の抗体には、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれる場合がある。ヒト以外の（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合サブ配列）であり、これには、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最小配列が含まれる。ヒト化抗体にはヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれ、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基で置き換えられる。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応するヒト以外の残基によって置き換えられる。ヒト化抗体には、レシピエント抗体にも、さらには輸入されたＣＤＲ配列にもフレームワーク配列にも見られない残基が含まれる場合もある。一般的に、ヒト化抗体には、少なくとも１つ、通常は２つの可変ドメインの実質的に全てが含まれ、ヒト以外の免疫グロブリンのものに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全て、およびＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体には、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含まれ、これは通常、ヒト免疫グロブリンのものである（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１８４】
ヒト以外の抗体をヒト化するための方法は当該分野で周知である。一般的には、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源に由来する１つ以上のアミノ酸残基がその中に導入されている。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、多くの場合、「輸入」残基と呼ばれ、通常、「輸入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、原則として、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法に従って（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって行うことができる。したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。この場合、実質的には全体よりも小さいヒト可変ドメインが、ヒト以外の種に由来する対応する配列で置換される。実際、ヒト化抗体は通常は、いくつかのＣＤＲ残基と可能性のあるいくつかのＦＲ残基とが齧歯類抗体の中の同様の部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
【０１８５】
ヒト抗体もまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ
Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））を含む、種々の当該分野で公知の技術を使用して生産することができる。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）；Ｕ．Ｓ．５，７５０，３７３）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物（例えば、マウス）中にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作成することができる。この場合、内因性の免疫グロブリン遺伝子は、部分的に不活化させられるか、または完全に不活化させられる。チャレンジされると、ヒト抗体の生産が観察される。これは、遺伝子の再配置、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含む全ての態様において、ヒトで見られるものと非常に似ている。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；ならびに以下の科学出版物：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０１８６】
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有しているモノクローナル抗体であり、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。この場合、結合特異性の１つは、本発明のポリペプチドに対するものであり得、他方は任意の他の抗原（好ましくは、細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニット）に対するものである。
【０１８７】
二重特異的抗体を作成するための方法は当該分野で公知である。従来的には、二重特異的抗体の組換えによる生産は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖の対の同時発現に基づく。この場合、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖と軽鎖とのランダムな組み合わせが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種類の異なる抗体分子の混合物を生じる可能性があり、そのうちの１つだけが正確な二重特異的構造を有している。正確な分子の精製は、通常は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる。同様の手順が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１８８】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有している抗体の可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメインの配列に融合させることができる。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合体の少なくとも１つに存在している軽鎖の結合に必要な部位を含む第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望により、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別の発現ベクターに挿入され、そして、適切な宿主生物に同時にトランスフェクトされる。二重特異的抗体の作成についてのさらなる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１８９】
ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合された抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系の細胞を標的化させるために（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されている。抗体は、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含む方法が含まれる）を使用してインビトロで調製できることが想定される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に適している試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが挙げられる。
【０１９０】
エフェクター機能に関して、例えば、免疫が関係している疾患の処置における抗体の有効性を高めるために、本発明の抗体を改変することが所望される場合がある。例えば、システイン残基（単数または複数）をＦｃ領域に導入することができ、それによって、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。このように作成されたホモ二量体抗体は、改善されたインターナライゼーション能力、および／または高い補体媒介性の細胞死滅と抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）とを有する可能性がある。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。高い抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することができる。あるいは、抗体は、これが二重のＦｃ領域を有し、それによって高い補体溶解能力とＡＤＣＣ能力とを有し得るように操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。
【０１９１】
本発明はまた、細胞傷害性物質（例えば、化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性のある毒素、またはそれらの断片）あるいは、放射性同位元素（すなわち、放射性結合体））に結合された抗体を含む免疫結合体にも関する。
【０１９２】
このような免疫結合体の生成に有用な化学療法薬は上に記載されている。使用できる酵素活性のある毒素およびその断片として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エクソトキシンＡ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害因子、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害因子、ゲロニン、ミトゲロニン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種が、放射性結合抗体の生産に有用である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１９３】
抗体と細胞傷害性物質との結合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング試薬（例えば，Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリレン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作成される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素−１４−標識１−イソチオシアネートベンゾイル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、抗体への放射性核種の結合のための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１９４】
別の実施形態において、抗体は、組織のプレ標的での利用のための「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）に結合することができる。この場合、抗体−受容体結合体は、患者に投与され、続いて、キレート化剤を使用して循環から結合していない結合体が除去され、その後、細胞傷害性物質（例えば、放射性核種）に結合された「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１９５】
（５．標的疾患）
（５．１  補体が関係している疾患および症状）
本発明のＣＲＩｇポリペプチドおよびそれらのアゴニスト（特に、ＣＲＩｇ−Ｉｇ免疫接着物）については、補体が関係している疾患および病状の予防および／または処置において有用性が見出されている。このような疾患および症状として、炎症性疾患および自己免疫性疾患が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１９６】
補体が関係している疾患の特異的な例として、関節リウマチ（ＲＡ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血再潅流後の離れた組織の傷害、心肺バイパス手術の間の補体活性化、皮膚筋炎、天疱瘡、ループス腎炎および結果として生じる糸球体腎炎および脈管炎、心肺バイパス手術、心臓麻痺によって誘導される冠動脈内皮機能不全、ＩＩ型膜性増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性腎不全、クリオグロブリン血症、抗リン脂質症候群、皮膚の変性疾患および他の補体が関係している眼の症状、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症および他の虚血が関係している網膜症、眼内炎、および他の眼内新生血管障害、例えば、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、ならびに、同種移植、超急性拒絶、血液透析、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、および吸引性肺炎が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１９７】
（５．２  補体が関係している眼の疾患）
ＣＲＩｇポリペプチドおよびそれらのアゴニスト（特に、ＣＲＩｇ−Ｉｇ免疫接着物）は、補体が関係している眼の症状（その発症に、古典補体経路および代替補体経路を含み、特に、代替補体経路の補体が関係している全ての眼の症状および疾患が含まれる、例えば、眼の変性疾患、例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の全ての段階（乾式および湿式（非滲出形態と滲出形態）を含む）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症および他の虚血が関係している網膜症、眼内炎、および他の眼内新生血管障害、例えば、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、ならびに、網膜血管新生）の予防および／または処置に特に有用である。補体が関係している眼の症状の好ましいグループには、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（滲出型（湿式）ＡＭＤおよび非滲出型（乾式または萎縮性）ＡＭＤを含む）、慢性脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、および眼内炎）が含まれる。
【０１９８】
ＡＭＤは眼の加齢に伴う変性であり、これは、６０歳を超えた個体での不可逆的な視力障害の主原因である。ＡＭＤには２つのタイプが存在しており、非滲出型（乾式）ＡＭＤと湿式（滲出型）ＡＭＤとがある。乾式、すなわち非滲出型には、根底にある中心網膜の網膜色素上皮（ＲＰＥ）の萎縮性および肥大性の変化（斑）、ならびにＲＰＥの蓄積（ドルーゼ）が含まれる。非滲出型のＡＭＤ患者は、湿式、すなわち、滲出型のＡＭＤに進行する可能性があり、この場合、脈絡膜新生血管（ＣＮＶＭ）と呼ばれる異常な血管が網膜下で生じ、体液および血液の漏出を生じ、最終的には、網膜内および網膜下に痛みが激しい円盤状の瘢痕が生じる。非滲出型ＡＭＤは、通常は、滲出型ＡＭＤの前兆であり、より一般的である。非滲出型ＡＭＤの症状は様々である；硬いドルーゼ、柔らかいドルーゼ、ＰＲＥの地理的萎縮、および色素凝集が発症し得る。補体成分は、ＡＭＤの初期にＲＰＥに蓄積し、ドルーゼの主要な構成成分である。
【０１９９】
本発明は特に、高リスクのＡＭＤの処置に関する。これには、カテゴリー３およびカテゴリー４のＡＭＤが含まれる。カテゴリー３のＡＭＤは、いずれの眼にも進行したＡＭＤはなく、少なくとも一方の眼が２０／３２以上の視力を有しているか、または少なくとも１つの大きなドルーゼ（例えば、１２５μｍ）、広範囲の（ドルーゼの面積によって測定した場合）中程度のドルーゼ、または地理的萎縮（ＧＡ）（斑の中心は含まれない）を有しているか、あるいはこれらの任意の組み合わせを特徴とする。カテゴリー３のＡＭＤ（「乾式」ＡＭＤとも考えられる）は、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）に転換するリスクが高い。
【０２００】
カテゴリー４の高リスクのＡＭＤ（「湿式」ＡＭＤと分類される）は、２０／３２以上の視力を有しており、眼指数（ｉｎｄｅｘ  ｅｙｅ）において進行したＡＭＤ（斑の中心、または脈絡膜新生血管の特徴を含むＧＡ）を有していないことを特徴とする。他眼は、進行したＡＭＤ、またはＡＭＤ黄斑変性症による２０／３２未満の視力を特徴とする。通常、高リスクのＡＭＤは、処置されなければ、カテゴリー１または２（高リスクではない）のＡＭＤの進行速度よりも約１０〜３０倍早い速度で、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）へと迅速に進行する。
【０２０１】
ＣＲＩｇおよびそのアゴニスト（例えば、ＣＲＩｇ−Ｉｇ免疫接着物）は、ＡＭＤ（特に、カテゴリー３またはカテゴリー４のＡＭＤにおいて）のＣＮＶへの進行の予防、ならびに／あるいは、罹患していない他眼またはひどくは罹患していない他眼のＡＭＤまたはＣＮＶの発症／進行の予防において特定の有用性が見出されている。これに関連して、用語「予防」は、疾患の進行の完全または部分的なブロックおよび遅延、ならびに、疾患のより重篤な形態への悪化の遅延を含めて、最も広い意味で使用される。高リスクのＡＭＤ（カテゴリー４）またはＣＮＶの発症またはそれらへの進行のリスクが高い患者には、本発明のこの態様が特に有効である。
【０２０２】
補体因子Ｈ（ＣＦＨ）多形がＡＭＤおよび／またはＣＮＶを発症する個体のリスクに関係していることは知られている。ＣＦＨの変異は、補体を活性化することができ、これは次いで、ＡＭＤ／ＣＮＶを導き得る。ＡＭＤのリスクの５０％が補体因子Ｈ（ＣＦＨ）多形に原因があることが、最近報告されている（Ｋｌｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８：３８５−９（２００５））。ＣＦＨの一般的なｈａｌｐｏｔｙｐｅ（ＨＦ１／ＣＦＨ）は、個体を加齢性黄斑変性にかかりやすくすることが明らかにされている（Ｈａｇｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２（２）：７２２７−７２３２（２００３））。ＡＭＤは、常染色体優性形質として分離されており、約３．２０の最大ロッドスコアで、染色体１ｑ２５−ｑ３１に、マーカーであるＤ１Ｓ４６６とＤ１Ｓ４１３との間に（Ｋｌｅｉｎら、Ａｒｃｈ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１６（８）：１０８２−９（１９９８）；Ｍａｊｅｗｓｋｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（３）：５４０−５０（２００３）；Ｓｅｄｄｏｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７３（４）：７８０−９０（２００３）；Ｗｅｅｋｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．１３２（５）：６８２−９２（２００１）；Ｉｙｅｎｇａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７４（１）：２０−３９（２００４））；２．３２／２．０３の最大ロッドスコアで、染色体２ｑ３／２ｑ３２に、マーカーであるＤ１２Ｓ１３１９とＤ２Ｓ１３８４との間に（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）；２．１９の最大ロッドスコアで、染色体３ｑ１３に、マーカーであるＤ１２Ｓ１３００とＤ１２Ｓ１７６３との間に（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出；Ｓｃｈｉｃｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．７２（６）：１４１２−２４（２００３））；３．５９／３．１７の最大ロッドスコアで、染色体６ｑ１４に、マーカーであるＤ６Ｓ１０５６とＤＳ２４９のと間に（Ｋｎｉａｚｅｖａら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈｌｍｏｌ．１３０（２）：１９７−２０２（２０００））；２．０６の最大ロッドスコアで、染色体９ｑ３３に、マーカーであるＤ９Ｓ９３４に（Ｍｅｊｗｓｋｉら、前出）；３．０６の最大ロッドスコアで、染色体１０ｑ２６に、マーカーＤ１０Ｓ１２３０に（Ｍａｊｅｗｓｋｉら、前出、Ｉｙｅｎｇａｒら、前出；Ｋｅｎｅａｌｙら、Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．１０：５７−６１（２００４）；３．１６の最大ロッドスコアで、染色体１７ｑ２５に、マーカーＤ１７Ｓ９２８に（Ｗｅｅｋｓら、前出）；そして２．０の最大ロッドスコアで、染色体２２ｑ１２に、マーカーＤ２２Ｓ１０４５に（Ｓｅｄｄｏｎら、前出）マッピングされている疾患遺伝子座を有する。したがって、遺伝子スクリーニングは、予防的処置（例えば、ＡＭＤからＣＮＶへの進行などのより重篤な形態への疾患の進行の予防を含む）について特に良好な候補である患者の同定の重要な部分である。
【０２０３】
加えて、補体の活性化と加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）との関連についての強力な証拠を考慮すると、本発明により、補体の阻害による（特に、代替補体経路を阻害することによる）ＣＮＶおよびＡＭＤの予防および処置のための新規の方法が提供される。ＣＲＩｇ以外の代替補体経路の阻害因子としては、融合タンパク質（例えば、免疫接着物）、アゴニスト抗ＣＲＩｇ抗体、ならびにペプチドおよび非ペプチド低分子が挙げられる。
【０２０４】
（５．３  炎症症状と自己免疫疾患）
補体が関係している疾患の例としての炎症症状のより広範囲に及ぶリストには、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーヴス病、橋本病甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、特発性多発性神経障害）、肝胆汁性疾患（例えば、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、および他の非肝臓向性ウイルス））、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性および繊維性肺疾患（例えば、嚢胞性線維症）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫性または免疫性皮膚疾患（水胞性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎が含まれる）、乾癬、肺のアレルギー性疾患（例えば、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎）、移植に伴う疾患（移植拒絶および移植片対宿主病が含まれる）が含まれる。
【０２０５】
全身性エリテマトーデスにおいては、疾患の中心的な媒介因子は、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の生産と、それに続く免疫によって媒介される炎症の発生である。抗体は、直接または間接のいずれかで、組織の損傷を媒介する。Ｔリンパ球は、組織の損傷に直接関係していることは示されていないが、Ｔリンパ球は、自己反応性抗体の発生に必要である。したがって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、骨格筋システム、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、消化管、骨髄、および血液を含む複数の臓器およびシステムが、臨床的に影響を受ける。
【０２０６】
関節リウマチ（ＲＡ）は、慢性的な全身性の自己免疫性炎症性疾患であり、これには、結果としての関節軟骨の損傷を伴う、複数の関節の滑膜が主に関係している。発症はＴリンパ球依存性であり、自己ＩｇＧに対する自己抗体であるリウマトイド因子の生産、結果として生じる、滑液および血液中で高いレベルに達する免疫複合体の形成が関係している。関節におけるこれらの複合体は、滑膜への顕著なリンパ球および単球の浸潤を誘導することができ、続いて、顕著な滑液の変化を誘導することができる。関節空間／流体は同様の細胞によって浸潤され、これには多数の好中球の付加が伴う。罹患組織は主に関節であり、多くの場合には対称のパターンである。しかし、関節以外の疾患もまた、２つの主要な形態において生じる。１つの形態は、進行中の関節疾患、ならびに、肺線維症、脈管炎、および皮膚の潰瘍の典型的な病変を有している関節以外の病変の発生である。関節以外の疾患の第２の形態はいわゆるフェルティ症候群であり、これは、ＲＡ疾患の経過において遅延を引き起こし、しばしば関節疾患後に沈静期になり、好中球減少症、血小板減少症、および脾腫の存在が関係している。これは、梗塞症、皮膚の潰瘍、および壊疽が形成されている複数の臓器において脈管炎を伴い得る。患者は、多くの場合には、罹患した関節に重なる皮下組織においてリウマチ結節も発症し；結節の後期段階には、混合された炎症性細胞の浸潤によって取り囲まれた壊死中心を有する。ＲＡにおいて起こり得る他の症状としては、心膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、およびリウマチ結節が挙げられる。
【０２０７】
若年性慢性関節炎は慢性の特発性炎症性疾患であり、これは、多くの場合には、１６歳未満で発祥する。この表現形はＲＡといくつかの類似点がある；リウマトイド因子ポジティブである一部の患者は、若年性関節リウマチと分類される。この疾患は、以下の３つの主要なカテゴリーに下位分類される：ｐａｕｃｉａｒｔｉｃｕｌａｒ型、ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ型、および全身型。この関節炎は重篤であり得、そして通常は破壊的であり、関節の強直と遅れた成長を導く。他の症状として、慢性的な前部ブドウ膜炎および全身性アミロイドーシスを挙げることができる。
【０２０８】
脊椎関節症は、いくつかの共通する臨床的特徴と、ＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子産物の発現との共通する関係を有している障害のグループである。この障害には、強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性腸疾患に伴う関節炎、乾癬にともなう脊椎炎、若年型脊椎関節症、および未分化脊椎関節症が含まれる。際立った特徴として、脊椎炎を伴うまたは伴わない仙腸骨炎；炎症性の非対称関節炎；ＨＬＡ−Ｂ２７との会合（クラスＩ  ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の血清学的に定義された対立遺伝子）；眼の炎症、および他のリウマチ疾患を伴う自己抗体が存在しないことが挙げられる。この疾患の誘導の鍵として最も考えられる細胞は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、これは、クラスＩ  ＭＨＣ分子によって提示される抗原を標的とする細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、これがＭＨＣクラスＩ分子によって発現される外来ペプチドであるかのように、クラスＩ  ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７に対して反応し得る。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープが、細菌または他の微生物の抗原性エピトープを模倣し得、したがって、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導し得るとの仮説が立てられている。
【０２０９】
全身性硬化症（強皮症）はその病因は明らかになっていない。この疾患の特徴は、活発な炎症プロセスによっておそらく誘導される皮膚の硬化である。強皮症は、限局性である場合も、また全身性である場合もある；血管の病変が一般的であり、微小血管系の内皮細胞の損傷が、全身性硬化症の発症における初期の重要な事象である；血管の損傷は免疫によって媒介され得る。免疫学的根拠は、多くの患者における皮膚の病変への単核細胞の浸潤の存在と抗核抗体の存在とによって暗示される。ＩＣＡＭ−１は、多くの場合、皮膚の病変における線維芽細胞の細胞表面でアップレギュレートされ、このことは、Ｔ細胞のこれらの細胞との相互作用が、この疾患の病因において役割を有している可能性があることを示唆している。関係している他の臓器として、消化管：異常な蠕動運動／運動性を生じる平滑筋の萎縮および線維化；腎臓：腎臓皮質の血流の減少を結果として生じる小さい弓状動脈および葉間動脈に影響を及ぼす集中的な内皮下血管内膜細胞の増殖は、タンパク尿、高窒素血症、および高血圧を生じる；骨格筋；萎縮症、腸線維症；炎症；肺：間質性肺炎および間質性線維症；ならびに心臓：収縮帯の壊死、瘢痕化／繊維化が挙げられる。
【０２１０】
皮膚筋炎、多発性筋炎などを含む特発性炎症性筋疾患は、筋肉の衰弱を生じる病因がわかっていない慢性的な筋肉の炎症の障害である。筋肉の損傷／炎症は、多くの場合、全身性であり進行性である。自己抗体がほとんどの形態に関係している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与している成分、タンパク質、およびＲＮＡに対して指向され、そしてその機能を阻害する。
【０２１１】
シェーグレン症候群は、免疫性の炎症と、それに続く涙腺および唾液腺の機能の破壊とが原因である。この疾患は、炎症性の結合組織疾患に付随する場合も、また、この疾患に炎症性の結合組織疾患が付随する場合もある。この疾患は、ＲｏおよびＬａ抗原に対する自己抗体の生産と関係している。これらの抗原はいずれも、小さいＲＮＡ−タンパク質複合体である。病変は、乾性角結膜炎、口腔乾燥症を生じ、これには、胆汁性肝硬変（ｂｉｌａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、末梢および感覚神経障害、ならびに明白な紫斑を含む他の兆候または関連が伴う。
【０２１２】
全身性脈管炎には、主な病変が炎症およびその後の血管の損傷であり、これによって、いくつかの場合には、罹患した血管によって供給される組織の虚血／壊死／変性と、最終的には標的器官の機能障害とが生じる。脈管炎はまた、二次的な病変として生じる場合も、また、他の免疫性−炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、全身性硬化症など（特に、免疫複合体の形成が関係している疾患において））の続発症として生じる場合もある。原発性の全身性硬化症のグループの疾患として：全身性の壊死性血管炎：結節性多発性動脈炎、アレルギー性血管炎および肉芽腫症、多発性血管炎；ヴェーゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；および巨細胞性動脈炎が挙げられる。多岐にわたる脈管炎として、粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳまたは川崎病）、単離されたＣＮＳ脈管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓血管炎（バージャー病）、および皮膚の壊死性細静脈炎が挙げられる。列挙された脈管炎のタイプのほとんどの病理学的機構は、主に、血管壁での免疫グロブリン複合体の蓄積、および、それに続く、ＡＤＣＣ、補体の活性化、またはそれらの両方のいずれかによる炎症性応答の誘導に起因すると考えられる。
【０２１３】
サルコイドーシスは、その病因が明らかになっていない症状であり、体内のほぼ全ての組織における類上皮肉芽腫の存在を特徴とする；肺が含まれることが最も一般的である。病因として、疾患の部位での活性化されたマクロファージおよびリンパ細胞の持続、それに続く、これらのタイプの細胞によって放出される局所的および全身的な活性産物の放出の結果として生じる慢性的な続発症が挙げられる。
【０２１４】
自己免疫性溶血性貧血、免疫性汎血球減少症、および発作性夜間血色素尿症を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球（およびいくつかの場合には、血小板などを含む他の血液細胞）の表面で発現される抗原と反応する抗体の生産の結果であり、そして、補体媒介性の溶解および／またはＡＤＣＣ／Ｆｃ受容体によって媒介される機構によるそのような抗体がコーティングされている細胞の除去の反映である。
【０２１５】
血小板減少性紫斑病を含む自己免疫性血小板減少症、および他の臨床状況における免疫性の血小板減少症、血小板破壊／除去は、血小板に対する抗体または補体のいずれかの付着、およびその後の補体溶解、ＡＤＣＣ、またはＦｃ−受容体によって媒介される機構による除去の結果として生じる。
【０２１６】
グレーヴス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、および萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺に存在し、多くの場合には甲状腺に特異的であるタンパク質と反応する抗体の生産を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果である。自然発生したモデル：（ラット（ＢＵＦおよびＢＢラット）およびニワトリ（肥満体のニワトリ株））；誘導性モデル：（サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）のいずれかでの動物の免疫化）を含む複数の実験モデルが存在している。
【０２１７】
Ｉ型真性糖尿病またはインシュリン依存性糖尿病は、膵島β細胞の自己免疫による破壊である。この破壊は、自己抗体および自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。インシュリンまたはインシュリン受容体に対する抗体はまた、インシュリン非反応性の表現形を生じる可能性もある。
【０２１８】
免疫性の腎疾患（糸球体腎炎および尿細管間質性腎炎を含む）は、抗体またはＴリンパ球によって媒介される腎臓組織の損傷の結果であり、腎臓抗原に対する自己反応性抗体もしくはＴ細胞の生産の結果として直接、あるいは、他の腎臓以外の抗原に対して反応する腎臓の中での抗体および／または免疫複合体の蓄積の結果として間接的のいずれかである。したがって、免疫複合体の形成を生じる他の免疫性の疾患もまた、間接的な続発症として免疫性の腎疾患を誘導する可能性がある。直接および間接的な免疫機構のいずれもが、臓器機能の不全、いくつかの場合には、腎不全の進行を伴う、腎臓組織内での病変の発生をもたらす／誘導する炎症性応答を生じる。体液性免疫機構および細胞性免疫機構の両方が、病変の発症に関係し得る。
【０２１９】
中枢神経系および末梢神経系の脱髄疾患（多発性硬化症、特発性多発性神経障害、またはギラン・バレー症候群を含む）および慢性炎症性脱髄性多発神経障害は、自己免疫に理由があると考えられており、そして乏突起膠細胞またはミエリンの損傷の直接の結果として神経の脱髄を生じる。ＭＳにおいては、疾患の誘導と進行がＴリンパ球依存していることを示唆している証拠が存在している。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発寛解型の経過または慢性的な進行性の経過のいずれかを有している脱髄疾患である。病因はわかっていない。しかし、ウイルス感染、遺伝的な素因、環境、および自己免疫の全てが関係している。病変には、主にＴリンパ球によって媒介されるミクログリア細胞および浸潤性マクロファージの浸潤が含まれる。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、病変で最も優性な細胞のタイプである。乏突起膠細胞の死滅およびそれに続く脱髄の機構はわかっていないが、おそらくは、Ｔリンパ球によって駆動される。
【０２２０】
炎症および繊維性肺疾患（好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎を含む）には、脱調節された免疫性の炎症応答が関与している可能性がある。その応答の阻害は、治療上有効である。
【０２２１】
自己免疫性または免疫性の皮膚疾患（水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、および接触皮膚炎を含む）は、自己抗体によって媒介される。その発症はＴリンパ球依存性である。
【０２２２】
乾癬は、Ｔリンパ球によって媒介される炎症性疾患である。病変には、Ｔリンパ球、マクロファージ、および抗原処理細胞、ならびに場合によっては好中球の浸潤が含まれる。アレルギー性疾患（喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症；および蕁麻疹を含む）は、Ｔリンパ球依存性である。これらの疾患は、Ｔリンパ球によって誘導される炎症、ＩｇＥによって媒介される炎症、または両方の組み合わせによって主に媒介される。
【０２２３】
移植に関係する疾患（移植片拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む）は、Ｔリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球機能の阻害は改善的である。
【０２２４】
（６．処置方法）
補体が関係している（免疫性の）疾患の予防、処置、または重篤度の低下のために、適切な投与量の本発明の化合物は、上記に定義されたような処置される疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、薬剤が予防目的のために投与されるのか、もしくは治療目的のために投与されるのか、事前の治療、患者の病歴、および化合物に対する反応、ならびにかかりつけの医師の判断に応じて様々であろう。化合物は、患者に、１回の処置、または一連の処置で適切に投与される。好ましくは、用量応答曲線および本発明の薬学的組成物を、最初にインビトロで、その後、ヒトでの試験の前に有用な動物モデルで決定することが所望される。
【０２２５】
例えば、疾患のタイプおよび重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチドが、例えば、１回以上の別々の投与によるかまたは持続注入によるかにはかかわらず、患者への投与のための最初の候補となる投与量である。典型的な一日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。症状に応じた数日間またはそれ以上の期間にわたる反復投与については、処置は、疾患の症状の所望の抑制が生じるまで維持される。しかし、他の投与レジュメも有用であり得る。この治療の進行は、従来技術およびアッセイによって容易にモニターされる。
【０２２６】
眼の疾患または症状の予防または処置のための本発明の化合物は、通常、眼注射、眼内注射、および／または硝子体内注射によって投与される。他の投与方法もまた使用され、これには、局所、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、および病変内投与が含まれるが、これらに限定はされない。非経口注入として、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。
【０２２７】
眼、眼内および／または硝子体内への投与のための処方物は、当該分野で公知の方法によって、当該分野で公知の成分を使用して調製することができる。効率的な処置のための主な用件は、眼を介した適切な浸透である。薬剤を局所投与することができる眼の前面の疾患とは異なり、網膜の疾患には、さらに部位特異的なアプローチが必要である。点眼薬および軟膏は、眼の裏側に浸透することは稀であり、血液−眼球バリアによって、全身投与された薬剤の眼球組織への浸透は阻まれる。したがって、通常は、網膜の疾患（例えば、ＡＭＤおよびＣＮＶ）を処置するための薬物の送達に選択される方法は、直接の硝子体内注射である。硝子体内注射は、通常、患者の症状、ならびに投与される薬剤の特性および半減期に応じた間隔で繰り返される。眼内への（例えば、硝子体内への）浸透については、通常、小さい分子が好ましい。ＣＲＩｇの場合には、ｈｕＣＲＩｇの短い形態および長い形態のＥＣＤ、それらのＩｇ（Ｆｃ）融合体、全長のｈｕＣＲＩｇの長い形態および短い形態、ならびにそれらのＩｇ（Ｆｃ）融合体を含む全ての形態が、全て、眼内（硝子体内）投与に適している。
【０２２８】
補体が関係している眼の症状（例えば、ＡＭＤまたはＣＮＶ）の処置効率は、眼内疾患を評価することに一般的に使用されている種々の評価項目によって測定することができる。例えば、失明を評価することができる。失明は、例えば、ベースラインから所望される時点までの最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均変化を測定すること（例えば、この場合、ＢＣＶＡはＥａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ
Ｓｔｕｄｙ（ＥＴＤＲＳ）視力チャートおよび４メートルの試験距離での評価に基づく）、ベースラインと比較して所望される時点の視力における、１５文字未満を失った被験体の割合を測定すること、ベースラインと比較して所望される時点での視力における、１５文字以上を獲得した被験体の割合を測定すること、所望される時点で、２０／２０００またはそれよりも悪いｖｉｓｕａｌ−ａｃｕｉｔｙ  Ｓｎｅｌｌｅｎ等量を有している被験体の割合を測定すること、ＮＥＩ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅを測定すること、例えば、蛍光眼底血管造影によって評価される、所望される時点でのＣＮＶの大きさとＣＮＶの漏出量を評価することなどによって評価することができるが、これらに限定はされない。眼の評価は、例えば、眼の検査を行うこと、眼内圧を測定すること、視力を評価すること、ｓｌｉｔｌａｍｐ  ｐｒｅｓｓｕｒｅを測定すること、眼内の炎症を評価することなどを含むがこれらに限定はされない方法で行うことができる。
【０２２９】
ＣＲＩｇアンタゴニスト（例えば、ＣＲＩｇに対する抗体）は、腫瘍（ガン）の処置のための免疫アジュバント療法に使用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することが現在十分に確立されている。遺伝子のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、およびＧＡＧＥファミリーによってコードされる腫瘍抗原の１つのグループは、全ての成体の正常組織においてはサイレントであるが、腫瘍（例えば、黒色腫、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、および膀胱ガン）においては有意な量で発現されている。ＤｅＳｍｅｔ，Ｃ．ら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：７１４９。Ｔ細胞の同時刺激によって腫瘍の抑制と抗腫瘍応答が誘導されることは、インビトロおよびインビボの両方で示されている。Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３：６８２；Ｋｗｏｎ，Ｅ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：８０９９；Ｌｙｎｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３：６２５；Ｆｉｎｎ，Ｏ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｏｔｚｅ，Ｍ．Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）２１：１１４。本発明のＣＲＩｇアンタゴニストは、アジュバントとして、単独で、または増殖調節因子、細胞傷害性物質、または化学療法薬と共に、Ｔ細胞の増殖／活性化および腫瘍抗原に対する抗腫瘍応答を刺激するために投与することができる。増殖調節物質、細胞傷害性物質、または化学療法薬は、公知の投与レジュメを使用して従来用いられている量で投与され得る。本発明のＣＲＩｇアンタゴニストによる免疫刺激活性により、増殖調節物質、細胞傷害性物質、または化学療法薬の量を減少させることができ、それによって、患者に対する毒性を減少させることができる。
【０２３０】
いくつかのマクロファージは腫瘍の根絶に関与しているが、多くの固形腫瘍は、腫瘍の増殖をサポートするマクロファージを含むことが知られている（Ｂｉｎｇｌｅら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １９６：２５４−２６５（２００２）；Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：５４９−５５５（２００２））。これらのマクロファージには、それらの表面にＣＲＩｇが含まれ得る。補体の活性化を阻害するＣＲＩｇの能力をブロックする抗体は、腫瘍細胞上の補体を活性化させ、補体によって媒介される溶解による腫瘍の根絶を助けるために使用することができる。このアプローチは、ＣＲＩｇポジティブマクロファージを含む腫瘍において特に有用である。
【０２３１】
本発明の処置方法においては、本明細書中の組成物は、標的である疾患または症状の予防または処置のための１つ以上のさらなる処置様式と組み合わせることができる。したがって、例えば、目的が、補体が関係している眼の症状の予防または処置である場合には、ＣＲＩｇの投与（全ての形態と、それらのＥＣ領域および／またはＩｇ融合体を含む）を、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｉｔｉｓ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）の投与と組み合わせる、またはＣＲＩｇの投与によって抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体ラニビズマブの投与を補うことができる。抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体ラニビズマブは、ＡＭＤの処置については臨床開発の段階にある。最近行われたＩＩＩ相臨床試験では、湿式ＡＭＤの患者での視力の維持についての研究の主要な効力の最終目標を満たすことに加えて、０．３ｍｇのＬｕｃｅｎｔｉｓで処置した患者の２５％（５９／２３８）、および０．５ｍｇのＬｕｃｅｎｔｉｓ（商標）で処置した患者の３４％（８１／２４０）においては、Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ（ＥＴＤＲＳ）視力チャートによって測定した場合には、対照グループの患者のおよそ５％（１１／２３８）と比較して、１５文字以上の獲得により視力が改善した。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）で処置した患者のおよそ４０％は、対照グループの１１パーセント（２６／２３８）と比較して、１２ヶ月で２０／４０またはそれ以上の視力スコアに達した。１２ヶ月では、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）で処置した患者は、実験の開始時と比較して視力において平均で７文字を獲得し、一方、対照グループは平均で１０．５文字を失った。
【０２３２】
目的が、補体が関係している炎症または自己免疫疾患の処置である場合には、ＣＲＩｇ（すべての形態を含む）の投与は、このような適応症についての他の治療と組み合わせることができる。したがって、例えば、標的が関節リウマチ（ＲＡ）である場合には、他の関節炎用の医薬品（例えば、ｓａｌｉｃｉａｌａｔｅ（例えば、アスピリン）、従来の非ステロイド系抗炎症分子（ＮＳＡＩＤ）（例えば、Ａｓａｉｄ、Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ，Ｃａｔａｆｌａｍ，イブプロフェン、Ｎａｐｒｏｘｅｎなど）、ＣＯＸ−２阻害因子（例えば、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ、Ｖｉｏｘｘ）である。これに関連して、「組み合わせ」は、任意の順序、そして任意の投与形態で、同じまたは異なる投与経路での、同時または連続する投与を意味する。
【０２３３】
（７．スクリーニングアッセイおよび動物モデル）
ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇアゴニスト（ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇ  ＥＣＤのＩｇ融合体を含む）は、補体が関係している疾患または症状の種々の細胞をベースとするアッセイおよび動物モデルにおいて評価することができる。
【０２３４】
したがって、例えば、関節炎の予防および／または処置の効率は、以下の実施例７に示すように、コラーゲン誘導関節炎のモデルにおいて評価することができる（Ｔｅｒａｔｏら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．３５：８２８−８３８（１９６６））。可能性のある関節炎の予防薬／治療薬もまた、Ｔｅｒａｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２１０３−８（１９９２）；Ｔｅｒａｔｏら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１３７−４７（１９９５）、および以下の実施例８に記載するように、４種類のモノクローナル抗体の混合物の静脈内注射によって誘導された抗体によって媒介される関節炎のモデルにおいてスクリーニングすることができる。関節炎の予防および／または処置の候補は、トランスジェニック動物モデル（例えば、ＴＮＦ−αトランスジェニックマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ））においても実験することができる。これらの動物は、ヒトの関節リウマチの病因に関係しているサイトカインである、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を発現する。これらのマウスでのＴＮＦ−αの発現は、前脚および後脚に重篤な慢性関節炎を生じ、炎症性関節炎の単純なマウスモデルを提供する。
【０２３５】
ここ数年の間に、乾癬の動物モデルもまた提供された。したがって、Ａｓｅｂｉａ（ａｂ）、パサパサした（ｆｌａｋｙ）皮膚（ｆｓｎ）、および慢性の増殖性皮膚炎（ｃｐｄ）は、乾癬様の皮膚の変化を伴う自然発生的なマウスの変異である。皮膚でサイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、インターロイキン−１α、ケラチノサイト増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−α、インターフェロン−６、血管内皮増殖因子、または骨形態形成タンパク質−６）が過剰発現されるトランスジェニックマウスもまた、インビボでの乾癬の研究に、そして乾癬の処置のための治療薬の同定に使用することができる。乾癬様の病変は、ＰＬ／Ｊ株に戻し交配したβ２−インテグリンハイポモルフ（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）マウスにおいて、β１−インテグリントランスジェニックマウスにおいて、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＢｈｉ  Ｔリンパ球を用いて再構築したｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスにおいて、ならびにＨＬＡ−Ｂ２７／ｈβ２ｍトランスジェニックラットにおいても記載されている。免疫不全マウスに移植したヒトの皮膚を使用する異種移植モデルもまた知られている。したがって、本発明の化合物は、Ｓｃｈｏｎ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１９９７）３：１８３に記載されているｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスモデルにおいて試験することができる。この場合、マウスは、乾癬と似た組織病理学的皮膚病変を示す。別の適切なモデルは、Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｂ．Ｊ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．（１９９５）１４６：５８０に記載されているように調製されるヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。さらなる詳細については、例えば、Ｓｃｈｏｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １１２：４０５−４１０（１９９９）を参照のこと。
【０２３６】
組換え体（トランスジェニック）動物モデルは、トランスジェニック動物の作成のための標準的な技術を使用して、目的の動物のゲノムに目的の遺伝子のコード部分を導入することによって操作することができる。トランスジェニック操作の標的とすることができる動物として、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、および
ヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジー、および他のサル）が挙げられるが、これらに限定はされない。このような動物にトランス遺伝子を導入するための当該分野で公知の技術としては、ｐｒｏｎｕｃｌｅｉｃマイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ  ａｎｄ  Ｗａｎｇｅｒ，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，６１４８−６１５（１９８５））；胚性幹細胞内での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５６．３１３−３２１（１９８９））；胚のエレクトロポレーション（（Ｌｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７，７１７−７３（１９８９））が挙げられる。概要については、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
【０２３７】
本発明の目的について、トランスジェニック動物として、それらの細胞の一部にだけトランス遺伝子を有している動物（「モザイク動物」）が挙げられる。トランス遺伝子は、１つのトランス遺伝子として、またはコンカタマー（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）（例えば、頭対頭、または頭対尾のタンデム）としてのいずれかで組み込まれ得る。特定の細胞のタイプへのトランス遺伝子の選択的導入は、例えば、Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，６２３−６３６（１９９２）の技術にしたがって行うこともできる。
【０２３８】
トランスジェニック動物の中でのトランス遺伝子の発現は、標準的な技術によってモニターすることができる。例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ増幅を、トランス遺伝子の組み込みを確認するために使用することができる。その後、ｍＲＮＡの発現のレベルを、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング分析、ＰＣＲ、または免疫細胞化学などの技術を使用して分析することができる。
【０２３９】
動物はさらに、例えば、特定の組織への免疫細胞の浸潤を決定するための組織学的実験によって、免疫疾患の病状の兆候について試験され得る。ブロッキング実験もまた行うことができ、この場合は、トランスジェニック動物は、補体および補体の活性化（伝統的な軽度と代替補体経路を含む）、またはＴ細胞の増殖に対する影響の程度を決定するために、ＣＲＩｇまたは候補のアゴニストで処置される。これらの実験では、本発明のポリペプチドに結合するブロッキング抗体が動物に投与され、目的の生物学的効果がモニターされる。
【０２４０】
あるいは、ＣＲＩｇが欠損している、またはＣＲＩｇをコードする別の遺伝子を有している「ノックアウト」動物を、ＣＲＩｇポリペプチドをコードする内因性遺伝子と動物の胚細胞に導入された同じポリペプチドをコードする別のゲノムＤＮＡの間での相同組換えの結果として、構築することができる。例えば、ＣＲＩｇをコードするｃＤＮＡは、確立されている技術にしたがって、ＣＲＩｇをコードするゲノムＤＮＡをクローニングするために使用することができる。ＣＲＩｇをコードするゲノムＤＮＡの部分は、欠失させることも、または別の遺伝子（例えば、組み込みをモニターするために使用することができる選択マーカーをコードする遺伝子）で置き換えることもできる。通常、数キロベースの変化していない隣接ＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）がベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターの記載については、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。ベクターは、胚性幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、そして導入されたＤＮＡが内因性のＤＮＡと相同組換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。選択された細胞は、その後、動物（例えば、マウスまたはラット）の未分化胚芽細胞に注入されて、キメラの集団が形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，編．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），１１３−１５２頁を参照のこと）。キメラ胚は、その後、適切な偽妊娠させた雌の里親動物に移植することができ、「ノックアウト」動物を作成するための胚が得られる。それらの生殖系細胞の中に相同組換えされたＤＮＡを有している子孫は、標準的な技術によって同定することができ、動物の全ての細胞に相同組換えされた細胞が含まれている動物を繁殖させるために使用することができる。ノックアウト動物は、例えば、それらの特定の病理学的症状に対する防御能力について、およびそれらのＣＲＩｇポリペプチドが存在しないことが原因である病理学的症状の発症について特性決定することができる。
【０２４１】
したがって、ＣＲＩｇまたはその可能性のあるアゴニストの生物学的活性は、以下の実施例７に記載するように、マウスＣＲＩｇノックアウトマウスにおいてさらに試験することができる。
【０２４２】
抗原によって誘導される気道の過敏反応、肺好酸球増多増加症、および炎症がオボアルブミンでの動物の感作、およびその後のエアゾールによって投与される同じタンパク質での動物のチャレンジによって誘導される、喘息のモデルが記載されている。いくつかの動物モデル（モルモット、ラット、ヒト以外の霊長類）は、エアゾール抗原でチャレンジすると、ヒトにおいてはアトピー性喘息と同様の症状を呈する。マウスモデルは、ヒトの喘息の特徴の多くを有する。ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇアゴニストを、活性および喘息の処置における有効性について試験するための適切な手順は、Ｗｏｌｙｎｉｅｃ，Ｗ．Ｗ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）１８：７７７およびその中で引用されている参考文献に記載されている。
【０２４３】
接触過敏症は、細胞によって媒介される免疫機能の簡単なインビボでのアッセイである。この手順においては、表皮細胞が外因性のハプテンに曝され、これによって遅延型の過敏反応が生じ、これが測定され、定量される。接触過敏症には、最初に感作期があり、その後に誘発期が含まれる。誘発期は、表皮細胞が、それらが以前に接触したことがある抗原に遭遇すると生じる。腫れおよび炎症が生じ、それによってこれがヒトのアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルとなる。適切な手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｏｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４，ｕｎｉｔ  ４．２に詳細に記載されている。Ｇｒａｂｂｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｔ．Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ  １９（１）：３７−４４（１９９８）もまた参照のこと。
【０２４４】
移植片対宿主病は、免疫応答性細胞が免疫抑制されている患者または寛容患者に移植されると生じる。ドナー細胞は、宿主抗原を認識し、これに応答する。応答は、生命を脅かすほどの重症の炎症から、下痢および体重の減少の穏やかな症状まで様々であり得る。移植片対宿主病のモデルによっては、ＭＨＣ抗原および主要ではない移植抗原に対するＴ細胞の反応性を評価する手段が提供される。適切な手段は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前出，ｕｎｉｔ  ４．３に詳細に記載されている。
【０２４５】
皮膚の同種移植片拒絶の動物モデルは、インビボでの組織の崩壊を媒介するＴ細胞の能力を試験する手段であり、これは、抗ウイルスおよび抗腫瘍免疫におけるそれらの役割の指標であり尺度でもある。最も一般的であり受け入れられているモデルでは、マウスの尾−皮膚移植が使用される。反復実験は、皮膚の同種移植片拒絶が、Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、およびキラーエフェクターＴ細胞によって媒介され、抗体によっては媒介されないことを示している。Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｈ．Ｊｒ．ａｎｄ  Ｓａｃｈｓ，Ｄ．Ｈ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，８８９−９９２。適切な手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前出，ｕｎｉｔ  ４．４に詳細に記載されている。ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇアゴニストを試験するために使用することができる他の移植拒絶モデルは、Ｔａｎａｂｅ，Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）５８：２３およびＴｉｎｕｂｕ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）４３３０−４３３８に記載されている同種心臓移植モデルである。
【０２４６】
遅延型過敏症の動物モデルによって、細胞媒介性免疫機能のアッセイが十分に提供される。遅延型過敏反応は、抗原でのチャレンジの後に一定の時間が経過するまで、ピークに達することのない炎症を特徴とする、Ｔ細胞によって媒介されるインビボでの免疫応答である。これらの反応はまた、組織特異的自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）および実験用の自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳのモデル）においても生じる。適切な手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前出，ｕｎｉｔ  ４．５に詳細に記載されている。
【０２４７】
ＥＡＥは、Ｔ細胞および単核細胞の炎症、ならびにそれに続く中枢神経系の軸索の脱髄を特徴とする、Ｔ細胞によって媒介される自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的には、ヒトのＭＳについての関連する動物モデルと考えられている。Ｂｏｌｔｏｎ，Ｃ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９９５）１：１４３。急性および再発性の両方の寛解型モデルが開発されている。ＣＲＩｇならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、上記のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｕｎｉｔ  １５．１および１５．２に記載されているプロトコールを使用して免疫媒介性の脱髄疾患に対するＴ細胞の刺激または阻害活性について試験することができる。乏突起膠細胞またはＳｃｈｗａｎｎ細胞が、Ｄｕｎｃａｎ，Ｉ．Ｄ．ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ（１９９７）５５４−５６１に記載されているような中枢神経系に移植されるミエリン疾患ついてのモデルもまた参照のこと。
【０２４８】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の動物モデルは、Ｃｃｌ−２またはＣｃｒ−２遺伝子にヌル変異を有しているマウスから構成される。これらのマウスは、ＡＭＤの心臓の特徴を生じ、これには、網膜の色素上皮（ＲＰＥ）でのリポフスチンの蓄積とその真下のドルーゼ、光受容体の萎縮、および脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）が含まれる。これらの特徴は、６ヶ月齢を超えてから発症する。ＣＲＩｇとＣＲＩｇアゴニストとは、ドルーゼの形成、光受容体の萎縮、および脈絡膜血管新生について試験することができる。
【０２４９】
ＣＮＶは、レーザーによって誘導される脈絡膜血管新生の種々のモデルにおいて試験することができる。したがって、例えば、ＣＮＶは、脈絡膜血管新生を生じる強いレーザー光凝固術により、ラットおよびカイクイザルにおいて誘導することができる。この症状の進行および処置は、例えば、様々な時間の間隔で、処置前および処置後の動物から回収した血清の、フルオレセイン血管造影法、組織病理学的および免疫組織化学的評価、ならびに薬物動態、溶血、抗体スクリーニング、および補体活性化アッセイによって評価することができる。予防的投与の効率は、フルオレセイン血管造影法、レーザー焼却部位での補体の蓄積の阻害、眼の試験、眼の写真撮影、硝子体および網膜組織を採ることなどによって、血管の漏れをモニターすることを含む同様の方法によってモニターすることができる。さらなる詳細は、以下の実施例に提供する。
【０２５０】
心筋の虚血再潅流のモデルは、マウスまたはラットで行うことができる。動物は気管切開され、小動物用の人工呼吸器で酸素供給される。ポリエチレンカテーテルが、平均動脈血圧の測定のために、内部頚動脈と外頸静脈とに挿入される。心筋の虚血再潅流は、６−Ｏ縫合での左下行前動脈（ＬＡＤ）の結紮によって開始される。虚血は、血管を完全に閉塞させるためにＬＡＤの周辺の可逆的な結紮を縫合することによって生じさせた。結紮は、３０分後に取り除き、そして心臓を４時間潅流させた。ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇアゴニストは、心臓の梗塞の大きさ、心臓のクレアチンキナーゼの活性、ミエロペルオキシダーゼ活性、および抗Ｃ３抗体を使用する免疫組織化学を測定することによってそれらの効力について試験することができる。
【０２５１】
糖尿病性網膜症のモデルには、ストレプトゾトシンでのマウスまたはラットの処置が含まれる。ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇアゴニストは、小静脈の拡張、網膜内微小血管の異常、ならびに、網膜および硝子体腔の新血管形成に対するそれらの影響について試験することができる。
【０２５２】
膜増殖性糸球体腎炎のモデルは以下のように確立することができる：雌のマウスを、ＣＦＡ中の０．５ｍｇの対照のウサギＩｇＧによりｉ．ｐ．で免疫化する（−７日目）。７日後（０日目）、１ｍｇのウサギ抗マウス糸球体基底膜（ＧＢＭ）抗体を、尾静脈を介してｉ．ｖ．注射する。血清中の抗ウサギＩｇＧ抗体の増加はＥＬＩＳＡによって測定される。２４時間の尿試料が代謝ケージの中でマウスから採取され、マウスの腎機能が血液尿窒素に加えて、尿タンパク質の測定によって評価される。
【０２５３】
（７．薬学的組成物）
本発明の活性のある分子（ポリペプチドおよびそれらのアゴニストを含む）、ならびに、上記で開示されたスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、炎症性疾患の処置のために、薬学的組成物の形態で投与することができる。
【０２５４】
活性のある分子（好ましくは、本発明のＣＲＩｇポリペプチドまたはＣＲＩアゴニスト）の治療用形態は、所望の純度の活性のある分子を最適な薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で混合することによって、保存用に調製される（Ｒｅｍｉｎｏｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに対して毒性はなく、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンズトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール：３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、ニ糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）：ならびに／あるいは、非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０２５５】
本発明のスクリーニングアッセイによって同定された化合物は、同様の様式で、当該分野で周知の標準的な技術を使用して処方することができる。
【０２５６】
リポフェクションまたはリポソームもまた、細胞にポリペプチド、抗体、または抗体断片を送達するために使用することができる。抗体断片が使用される場合は、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができ、そして／または組換えＤＮＡ技術によって生産することもできる（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，７８８９−７８９３（１９９３）を参照のこと）。
【０２５７】
本明細書中の処方物にはまた、処置される特定の適応症について不可欠な１つ以上の活性化合物が含まれる場合もあり、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼすことのない相補活性を有しているものである。あるいは、または加えて、組成物には、細胞傷害性物質、サイトカインまたは成長阻害因子が含まれる場合がある。このような分子は、意図される目的について有効である量での組み合わせで適切に存在する。
【０２５８】
活性分子は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、コロイド状の薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）またはマイクロエマルジョン中の、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に捕捉させることもできる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編，（１９８０）に開示されている。
【０２５９】
インビボでの投与に使用される処方物は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に行うことができる。
【０２６０】
徐放調製物が調製される場合がある。徐放調製物の適切な例として、抗体を含む固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、成形された物質（例えば、膜またはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と□エチルＬ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー（例えば、エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸）は１００日間を超えて分子を放出できるが、特定のヒドロゲルは、より短い時間の間しかタンパク質を放出できない。カプセル化された抗体が長時間体内にとどまる場合には、これらは、３７℃の水分に曝された結果として変性または凝集する場合があり、これによって、生物学的活性の消失、および免疫原性の変化の可能性が生じる。関与している機構に応じた安定化のための合理的方法を考えることができる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見されると、安定化は、スルフヒドリル残基を改変すること、酸溶液からの凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の開発によって行うことができる。
【０２６１】
眼内投与については、典型的な注射用処方物が使用され、通常、約６週間の間隔で投与される。眼はそれぞれの注射の前に麻酔される。
【０２６２】
しかし、硝子体内での放出のために、ＣＲＩｇまたはアゴニスト（例えば、ＣＲＩｇ−ＩｇまたはＣＲＩｇ  ＥＣＤ−Ｉｇ融合体）の徐放処方物の移植を使用することもまた可能である。
【０２６３】
以下の実施例は、説明の目的だけのために提供され、そしていかなる方法でも本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【０２６４】
本明細書中で引用される全ての特許および学術参考文献は、それらの全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【実施例】
【０２６５】
実施例で言及される市販の試薬は、他の場所で特に明記しない限りは、製造業者による説明書にしたがって使用した。これらの細胞の供給源は、以下の実施例において、そして本明細書を通じて、ＡＴＣＣ登録番号によって（ＡＴＣＣ登録番号は、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｎ，ＶＡ２０１１０−２２０９である）特定する。
【０２６６】
（実施例１）
（ヒトＣＲＩｇをコードするｃＤＮＡクローン（ＰＲＯ３６２）の単離）
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの公のタンパク質データベースによる約９５０個の既知の分泌型タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の配列（存在する場合には、分泌シグナルを含む）を使用して、発現される配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検察した。ＥＳＴデータベースには、公のＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と私有のＥＳＴ  ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標），Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）とが含まれる。検索は、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ−２（例えば、Ａｌｔｓｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０（１９９６））を使用して、ＥＳＴ配列の６つのフレームの翻訳物に対するＥＣＤタンパク質の比較として行った。既知のタンパク質をコードしない７０（またはいくつかの場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアを生じたこれらの比較を集め、そしてプログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ  Ｇｒｅｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．）を用いてコンセンサスＤＮＡにアセンブリした。
【０２６７】
コンセンサスＤＮＡ配列を、ｐｈｒａｐを使用して他のＥＳＴ配列と比較してアセンブリした。このコンセンサス配列を本明細書中ではＤＮＡ４２２５７（配列番号９）と命名した（図３２を参照のこと）。図３２に示したＤＮＡ４２２５７（配列番号９）コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを、１）目的の配列を含むｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲによって同定するために、そして２）ＣＲＩｇの全長のコード配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するために合成した。正方向および逆方向ＰＣＲプライマーは、一般的には２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、多くの場合には、約１００〜１０００ｂｐの長さのＰＣＲ産物を生じるように設計する。プローブ配列は、通常、４０〜５５ｂｐの長さである。いくつかの場合において、コンセンサス配列が約１〜１．５ｋｂｐよりも長い場合には、さらなるオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンについていくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリー由来のＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙにしたがって、ＰＣＲプライマーの対を用いてＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。その後、ポジティブライブラリーを使用し、プローブオリゴヌクレオチドと一対のプライマーとを使用して目的の遺伝子をコードするクローンを単離した。
【０２６８】
ＰＣＲプライマー（正方向および逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１（４２２５７．ｆ１）
【０２６９】
【化１】
2011246495.tif 000003
（配列番号１０）
正方向ＰＣＲプライマー２（４２２５７．ｆ２）
【０２７０】
【化２】
2011246495.tif 000004
（配列番号１１）
逆方向ＰＣＲプライマー１（４２２５７．ｒ１）
【０２７１】
【化３】
2011246495.tif 000005
（配列番号１２）
逆方向ＰＣＲプライマー２（４２２５７．ｒ１）
【０２７２】
【化４】
2011246495.tif 000006
（配列番号１３）。
【０２７３】
さらに、合成のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、コンセンサスＤＮＡ４２２５７配列から構築した。これは以下のヌクレオチド配列を有していた：
ハイブリダイゼーションプローブ（４２２５７．ｐ１）
【０２７４】
【化５】
2011246495.tif 000007
（配列番号１４）
全長クローンの供給源についていくつかのライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーに由来するＤＮＡを、上記のＰＣＲプライマーの対を用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングした。その後、ポジティブライブラリーを使用して、プローブオリゴヌクレオチドと一対のＰＣＲプライマーとを使用してＣＲＩｇ遺伝子をコードするクローンを単離した。
【０２７５】
ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡを、ヒトの胎児の脳組織（ＬＩＢ１５３）から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に使用したｃＤＮＡライブラリーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによる試薬などの市販の試薬を使用して標準的な方法によって構築した。ｃＤＮＡを、ＳａｌＩへミキナーゼアダプターに対して平滑末端で連結したＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動によって適切な大きさにし、そして定義された方向で適切なクローニングベクター（例えば、ｐＲＫＢまたはｐＲＫＤ：ｐＲＫ５ＢはｐＲＫ５Ｄの前駆体であり、ＳｆｉＩ部位を含まない；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１２７８−１２８０（１９９１））中に、特有のＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位においてクローニングした。
【０２７６】
記載したように単離したクローンのＤＮＡ配列によって、単離したＲＩｇポリペプチドのＤＮＡ配列を得た（本明細書中では、ＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）と指定した（配列番号１））。
【０２７７】
ＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）の全体のヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号１）。クローンＵＮＱ３６７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）（配列番号１）は、ヌクレオチド位置１０８２〜１０８４に明らかな翻訳開始部位を有している１つのオープンリーディングフレームを含む（図１、配列番号１）。推定されるポリペプチド前駆体は３２１アミノ酸の長さである（図１、配列番号２）。図１に示すＣＲＩｇタンパク質は、約３５，５４４ダルトンの推定分子量と、約８．５１のｐＩとを有する。図１に示すような３２１アミノ酸のＣＲＩｇポリペプチド（配列番号２）の分析によって、約１４９位のアミノ酸から約１５２位のアミノ酸までのグリコサミノグリカン結合部位と、約２７６位のアミノ酸から約３０６位のアミノ酸までの膜貫通ドメインの存在が明らかになった。クローンＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）を、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２０で寄託した。
【０２７８】
ＪＡＭファミリーのメンバーと同様に、ＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）（より最近は、ＣＲＩｇと呼ばれる）は、１型膜貫通分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ヒトＣＲＩｇの長い形態（ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ））の細胞外ドメインは、Ｖ型とＣ２型との両方の末端Ｉｇドメインをコードするが（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｘｕｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７４：５３０−５４５（１９９７））、短い形態（ｈｕＣＲＩｇ（Ｓ））は、１つのＶ型Ｉｇだけをコードし、マウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）と似ている（図４２Ａ）。ヒトおよびマウスＣＲＩｇのＣ末端細胞質ドメインは、コンセンサスＡＰ−２インターナライゼーションモチーフ（ＹＡＲＬおよびＤＳＱＡＬＩ、それぞれ、Ｂｏｎａｆａｃｉｎｏ  ＆  Ｔｒａｕｂ  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２，ｐ３９５（２００３））を含む。ｈｕＣＲＩｇおよびｍｕＣＲＩｇは、６７％の全体的な配列相同性を有しており、ＩｇＶドメインにおいては８３％の相同性がある。ＪＡＭファミリーのメンバーの間では、ｈｕＣＲＩｇは、ＪＡＭ−Ａに最も近く関係している。配列類似性によって、Ｉｇドメインの折り畳みを形成する残基のストレッチが保存されていることを確認した（図４２Ａ）。ヒトおよびマウスＣＲＩｇはいずれも、Ｘ染色体上のＸｑ１２位置に存在しており、これらは、ｈｅｐｈａｅｓｔｉｎとｍｏｅｓｉｎとが隣接している染色体上にシンテニー位置を有していた。
【０２７９】
（実施例２）
（タンパク質の生産および精製）
ｈｕＣＲＩｇおよびｍｕＣＲＩｇの細胞外ドメインを、ＣＲＩｇ配列の下流にヒトまたはマウスのＩｇＧ１  Ｆｃ領域をコードする改変されたｐＲＫ５発現ベクターにクローニングした。マウスＩｇＧ１のＦｃ部分は二重変異（Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ａ）を含み、これによってＦｃ受容体の結合を妨げる（Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：８１７−８２６（２００５）。これを、Ｆｃ受容体の調節を制御するために使用した。ヒトＩＲＥＭ−１およびマウスＣＬＭ−１  Ｆｃ融合タンパク質またはマウス抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ抗体を対照として使用した。ＬＦＨタグ化ＣＲＩｇを、酵母のロイシンジッパー、Ｆｌａｇ、およびＣ末端（６）ヒスチジンに対してＣＲＩｇのＥＣＤを融合することによって作成した。タンパク質を、一時的なトランスフェクションによってＣＨＯ細胞中で過剰発現させた。細胞を、Ｆ−１２／ダルベッコ改変イーグル培地をベースとする、Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  ＩｇＧ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＰｒｉｍａｔｏｎｅ  ＨＳ（Ｓｉｇｍａ）とを補充した培地を使用して全自動バイオリアクターで増殖させた。培養を、回収するまで７〜１２日間維持した。Ｆｃ融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、その後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ゲル濾過によって精製した。ＬＦＨ融合タンパク質をニッケルカラムで精製した。ヒトＣＲＩｇ−ＥＣＤタンパク質を、モノクローナル抗体３Ｃ９を吸着させたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｌｙｃｅｒｙｌ−ＣＰＧ（１７３７００４０４）カラムで親和性精製した。タンパク質を、ｐＨ３．０で溶出させ、そして，ｈｕＣＲＩｇ−ＨＩＳとｍｕＣＲＩｇ−ＨＩＳを、Ｃ末端（６）ヒスチジンを含むバキュロウイルス発現ベクターにＣＲＩｇ  ＥＣＤをクローニングすることによって作成した。プラスミドＤＮＡをＳｆ９細胞にトランスフェクトし、上清を使用してＨ５細胞を感染させ、そしてタンパク質をニッケルカラムで精製した。全ての精製したタンパク質の実体を、Ｎ末端配列分析によって確認し、リポ多糖濃度は、ヒトまたはマウスＣＲＩｇ調製物について＜５Ｅｕ／ｍｇであった。
【０２８０】
（実施例３）
（抗体の調製）
ポリクローナル抗体を、完全なフロイトアジュバント中の２００μｇのｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−ＨｉｓでのＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄウサギの免疫化、これに続く最初の免疫化の６週間後の追加免疫によって生成した。ｍｕＣＲＩｇおよびｈｕＣＲＩｇに対するモノクローナル抗体を、脚パッドへの注射による５０μｇのｈｉｓタグ化ＣＲＩｇ融合タンパク質でのＷｉｓｔａｒラットおよびＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化によって生成した。クローンを、ヒトおよびマウスＣＲＩｇ−ＥＣＤとの反応性に基づいて、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、および免疫組織化学によって選択した。他の場所で明記しない限り、得られた抗体を続く試験に使用した。
【０２８１】
（実施例４）
（モルモットの皮膚への炎症性細胞の浸潤）
以下の実施例は、モルモットの皮膚への炎症性細胞（すなわち、好中球、好酸球、単球、またはリンパ球）の浸潤を刺激するという点で、ｈｕＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）がプロ炎症性であることを示す。本明細書中に記載するアッセイによって、モルモットの皮膚への炎症性細胞の浸潤を誘導するこのタンパク質の能力をモニターする。炎症性の浸潤を刺激する化合物は、炎症応答の増強が有効である場合に、治療的に有用である。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、炎症応答の抑制が有効である場合に、治療的に有用である。治療薬は、例えば、マウス−ヒトキメラ、ＣＲＩｇに対するヒト化またはヒト抗体、低分子、ペプチドなど（ＣＲＩｇの生物学的活性を模倣する）、ＣＲＩｇ融合タンパク質、ＣＲＩｇ細胞外領域などの形態であることができる。
【０２８２】
３５０グラム以上の体重の無毛のモルモット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）を、筋肉内で、ケタミン（７５〜８０ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ体重）により麻酔した。ｈｕＣＲＩｇタンパク質および対照タンパク質のタンパク質試料を、１つの注射部位について１００μｌの容量で、それぞれの動物の背中に皮内注射した。１匹の動物について、およそ１６〜２４箇所の部位に注射した。１ｍＬのＥｖａｎｓ
ｂｌｕｅ色素（１％の生理緩衝食塩水）を、心内膜に注射した。動物を６時間後に麻酔し、個々の皮膚注射部位を生検し、ホルマリン中に固定した。皮膚を、組織病理学的評価のために準備した。それぞれの部位を、皮膚への炎症性細胞の浸潤について評価した。生存性の炎症性細胞を有している部位をポジティブとスコアした。炎症性細胞の浸潤を誘導する試料を、プロ炎症性物質としてスコアした。試験したＣＲＩｇはこのアッセイではポジティブであり、これは、抗炎症活性を示している。
【０２８３】
（実施例５）
（ＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）ｍＲＮＡおよびポリペプチドの発現）
（Ａ．インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学）
ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学、およびＲＴ−ＰＣＲによって、種々の組織のタイプで評価した。
【０２８４】
インサイチュハイブリダイゼーションのために、組織を固定し（４％のホルマリン）、パラフィンに包埋し、切片化し（３〜５μｍの厚み）、脱パラフィン化し、プロテイナーゼＫで徐タンパク（２０μｇ／ｍｌ）（３７℃で１５分間）し、そしてインサイチュハイブリダイゼーションのために処理した。本発明のポリペプチドに対するプローブをＰＣＲによって作成した。プライマーにはＴ７またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ開始部位を含めて、増幅した産物からのセンスまたはアンチセンスプローブのインビトロでの転写を可能にした。３３Ｐ−ＵＴＰで標識したセンスおよびアンチセンスプローブを一晩ハイブリダイズし（５５℃）、洗浄し（０．１×ＳＳＣ、５５℃で２時間）、ＮＢＴ２核トラックエマルジョン（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に浸し、焼き付け（４℃で４〜６週間）、そして現像して、ヘマトキシリンとエオシンとで対比染色した。代表的な対の明視野画像と暗視野画像とを典型的に示す。
【０２８５】
免疫組織化学的染色を、ＤＡＫＯ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒを使用して５ｍｍの厚さの凍結切片について行った。内因性のペルオキシダーゼ活性を、ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１：１０、２０℃で４分間）でブロックした。ＴＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０中の１０％のＮＧＳ（ＤＡＫＯ）を、希釈およびブロッキングに使用した。ＭＡｂ  ４Ｆ７２２．２抗ＣＲＩｇ（抗ＰＲＯ３６２）またはマウスＩｇＧは０．１３ｍｇ／ｍｌで使用した。ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を１：２００で使用し、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で検出した。スライドを、Ｐｉｅｒｃｅ金属増強ジアミノベンジジン（ｍｅｔａｌ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して現像した。ＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）とＣＤ６８との発現についての二重免疫組織化学を、マクロファージについてＣＲＩｇの発現の局在化を明らかにするために、凍結切片について行った。（ＤＡＫＯ）によるｍＡｂ  ４Ｆ７．２２．２抗ＣＲＩｇおよび抗ＣＤ６８  ｍＡｂ  ＫＰ−１を利用し、それぞれ、フィコエリスリンおよびＦＩＴＣマーカーによって検出した。
【０２８６】
発現を、ヒトおよび他の哺乳動物に由来する広範囲の種々の組織および細胞のタイプにおいて試験した。
【０２８７】
（ａ．正常組織）
試験した正常なヒトの成体組織には、扁桃腺、リンパ節、脾臓、腎臓、尿、膀胱、肺、心臓、大動脈、冠状動脈、肝臓、胆嚢、前立腺、胃、小腸、結腸、膵臓、甲状腺、皮膚、副腎、胎盤、子宮、卵巣、精巣、網膜、および脳（小脳、脳幹、大脳皮質）を含めた。Ｅ１２−１６週齢の脳、脾臓、腸、および甲状腺を含む正常なヒトの胎児の組織もまた試験した。さらに、マウスの肝臓での発現も調べた。
【０２８８】
（ｂ．炎症組織）
インサイチュハイブリダイゼーションによって試験した炎症組織には、慢性喘息、慢性気管支肺炎、慢性気管支炎／慢性閉塞性肺疾患による肺、慢性リンパ球性間質性腎炎による腎臓、ならびに慢性的な炎症および慢性的なＣ型肝炎感染、自己免疫性肝炎またはアルコール性肝硬変が原因である肝炎による肝臓などの、慢性的な炎症性疾患を有している組織を含めた。
【０２８９】
（ｃ．原発性新生物）
ＰＲＯ３６２の発現についてインサイチュハイブリダイゼーションによって試験した原発性のヒトの新生物には、乳ガン、肺扁平細胞ガン、肺腺ガン、前立腺ガン、および結腸腺ガンを含めた。
【０２９０】
（２．結果）
ＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）は、マウスの肝臓の凍結切片（図６）、ヒトの肝臓の凍結切片（図７）、および多数の組織マクロファージ様細胞（結腸マクロファージ（図８Ａ）、クップファー細胞（図８Ｂ）、副腎マクロファージ（図８Ｃ）、ホーフバウワー細胞（図８Ｄ）、滑膜細胞（図９）、肺胞マクロファージ、腸の固有層での常在性マクロファージ、ならびに多くの組織での間質性マクロファージを含む）で発現していることが明らかになった。ＣＲＩｇはまた、脳の小神経膠細胞の中でも有意に発現されていた（図１０）。ＣＲＩｇの発現は、新生物または炎症性疾患（関節リウマチ（図９）、炎症性腸疾患、慢性肝炎（図１２）、肺炎、慢性喘息（図１１）、神経膠腫、および気管支炎を含む）の存在によって活性化されると、これらの組織で有意に増加した。
【０２９１】
ＣＲＩｇの発現をさらに試験するために、免疫組織化学的染色を、種々の組織タイプについて行った。ＣＲＩｇおよびＣＤ６８についての二重免疫組織化学的染色を、組織マクロファージ（副腎マクロファージ、肝臓のクップファー細胞、脳の小神経膠細胞、胎盤のホーフバウワー細胞を含む）について行い、ＣＲＩｇとＣＤ６８とが同じ組織で発現されているかどうかを判定した。
【０２９２】
ＣＲＩｇは、副腎マクロファージ（図１３）、肝臓のクップファー細胞（図１４）、脳の小神経膠細胞（図１５）、および胎盤のホーフバウワー細胞（図１６）でＣＤ６８と同時発現していることが明らかになった。
【０２９３】
（実施例６）
（慢性の炎症におけるＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）の関与）
Ａ３３抗原およびＪＡＭ１に対して相同性を有している新規のマクロファージ関連受容体を、実施例１および以下に記載するようにクローニングし、これを、１つの膜貫通Ｉｇスーパーファミリーのメンバーのマクロファージ関連ポリペプチドとして同定した（ＣＲＩｇまたはＰＲＯ３６２）。
【０２９４】
ＣＲＩｇは、２種類のスプライシングされた改変体として発現する。１つの改変体は、Ｎ末端ＩｇＶ様ドメインとＣ末端ＩｇＣ２様ドメインとを含む３９９アミノ酸のポリペプチドであり、ｈｕＣＲＩｇまたはｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇと呼ばれる（配列番号４）。スプライシングされた形態（これは３５５アミノ酸の長さであり、Ｃ末端ドメインが欠失している）は、ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔと呼ばれる（配列番号６）。いずれの受容体も、１つの膜貫通ドメインと、そしてインビトロでマクロファージにおいて構造的にリン酸化されるチロシン残基を含む細胞質ドメインを有している。
【０２９５】
本研究によって、ＣＲＩｇが組織常在性マクロファージのサブセットで選択的に発現し、慢性的な炎症と関係していることが明らかになった。
【０２９６】
（材料および方法）
（細胞）
血液を、健常な成人のボランティアから、インフォームドコンセント後に静脈穿刺によって得、製造業者の説明書にしたがってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して分離した。ＰＢＭＣを界面から得、冷却したＰＢＳで洗浄し、０．２％のＮａＣｌで３０分間溶解させ、そして１．６％のＮａＣｌで中和した。細胞をカウントし、使用するまで氷上で維持した。末梢血サブセットを単離するために、未使用のＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を製造業者の説明書にしたがって使用した。マクロファージ表現形への分化を、１０％（ｖ／ｖ）の自己のヒト血清、２０％のウシ胎児血清、および１０ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＨＧ−ＤＭＥＭ培地で最大２週間、ＣＤ１４＋単球を培養することによって誘導した。５日目に培地を交換した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を、氷冷した細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を使用して培養皿から解離させた。ウェスタンブロット分析のための溶解物を、０．５ｍｌの溶解緩衝液をウェルに直接添加することによって調製した。溶解物を、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールとを含む試料緩衝液と混合し、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲルで泳動させ、そしてニトロセルロース膜に移した。細胞の生存性は、トリパンブルー色素排除法によって評価した。
【０２９７】
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリー分析に使用するための細胞を、２％のウシ胎児血清と５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧとを含むＰＢＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で、４℃で３０分間ブロックした。次に、細胞を３Ｃ９（抗ＣＲＩｇ（抗ＰＲＯ３６２）モノクローナル抗体）とともにインキュベートした。ＰＢＳでの洗浄後、細胞を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手したＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＣＤ１５、ＣＤ６８に対するフィコエリスリン（ＰＥ）結合抗体で染色した。
【０２９８】
（細胞−細胞接着実験）
全長のＣＲＩｇを含むｐＲＫ発現ベクターを、別の場所に記載したように、ネオマイシン選択と自動クローン選別（ａｕｔｏｃｌｏｎｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ）とを使用して、ヒトＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株で安定して発現させた。細胞を、蛍光色素ＢＣＥＣＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）とともにプレロードし、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理したまたは処理していないヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の単層をコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレート（ＣＯＲＮＩＧ（商標））に添加した。細胞は、一般的には、インキュベーション緩衝液（１０ｍＭのＣａＣｌ、１０ｍＭのマグネシウム、および１．５ｍＭのＮａＣｌを含むＨＢＳＳ）をウェルにロードすること、その後、ブロッティング紙片上にプレートをさかさまにして置くことによって、穏やかに洗浄した。３回の洗浄の後、蛍光を蛍光分光計でカウントした。蛍光の読取は、ＨＵＶＥＣ細胞に対して付着したままである細胞の数を表している。
【０２９９】
（ノーザンブロット分析）
多組織ノーザンブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、製造業者の推奨にしたがってＡｍｂｉｏｎキットを使用してランダムプライムした全長のＣＲＩｇ  ｃＤＮＡの３２Ｐで標識したプローブでプローブした。ブロットを、２２℃で４時間、ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇスクリーンに感光させた。ブロットを細片にし、ヒトまたはマウスのβ−アクチンに対する市販のプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でプレプローブして、個々のレーンでのＲＮＡのロードと量とを評価し、Ｓｔｏｒｍ（登録商標）ｐｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で分析した。
【０３００】
（実時間ＲｔＰＣＲ分析）
定量的ＰＣＲ分析（ＴＡＱＭＡＮ（商標））のために、ヒト組織または初代細胞に由来する全ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）が、ＣＲＩｇのコード配列に基づくプライマーとともに推奨されている（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０３０１】
（ＦｃおよびＨｉｓ融合タンパク質の生産）
ヒトＣＲＩｇを、バキュロウイルス発現ベクターｐＨＩＦ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にクローニングした。ＨＩＳタグ化ＣＲＩｇ融合タンパク質は、８個のヒスチジンに融合されたＣＲＩｇの細胞外ドメインから構成されている。ＨＩＳタグ化融合タンパク質を、ニッケルアフィニティー樹脂を使用して懸濁液中で増殖させたバキュロウイルス感染昆虫細胞の上清から精製した。
【０３０２】
（モノクローナルおよびポリクローナル抗体の生産）
本実験のために、ＢＡＬＢｃ雌を、Ｇｈｉｌａｒｄｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１６８３１−１６８３６（２００２）に以前に記載されたように、脚パッドへの注射によって、１０μｇのＣＲＩｇ−Ｈｉｓ８で、免疫化と追加免疫とを行った。シングルクローンを、ＥＬＩＳＡによってＣＲＩｇ−Ｈｉｓに対してスクリーニングした。選択したクローンを、ＪＡＭファミリーのメンバーおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃに対して試験した。クローンを、１細胞の密度になるように滴定し、プレスクリーニングした。クローン３Ｃ９（ＩｇＧ１）がＣＲＩｇに対して選択的に反応性であることが明らかになった。複数のクローンを、腹水を生じさせるために使用し、そしてプロテインＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。タンパク質の濃度をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して決定した。
【０３０３】
ポリクローナル抗体を、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｒａｂｂｉｔに１５０μｇのＣＲＩｇ−Ｈｉｓを注射することによって作成した。血清の力価をＥＬＩＳＡによって決定した。血清を、循環ＩｇＧレベルのピークで回収し、プロテインＡカラム上で精製した。
【０３０４】
（インサイチュハイブリダイゼーション）
ＰＣＲプライマー（上流プライマー：
【０３０５】
【化６】
2011246495.tif 000008
（配列番号１８）、および下流プライマー：
【０３０６】
【化７】
2011246495.tif 000009
（配列番号１９））を、ｈｕＪＡＭ４の７００ｂｐの断片を増幅するように設計した。プライマーには、Ｔ７またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ開始部位を含め、これによって、それぞれ、増幅産物からセンスプローブまたはアンチセンスプローブがインビトロで転写されるようにした。正常なヒト組織には、扁桃腺、リンパ節、脾臓、腎臓、肺、および心臓を含めた。慢性的な炎症性疾患を有している組織には、慢性喘息、慢性気管支炎による肺、慢性的なＣ型肝炎感染が原因で慢性的な炎症および肝炎を有している肝臓を含めた。組織を、４％のホルマリン中に固定し、パラフィンで包埋し、切片とし（３〜５μｍの厚み）、脱パラフィン化し、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで徐タンパクし（３７℃で１５分間）、別に記載したようにインサイチュハイブリダイゼーションのために処理した。
【０３０７】
（免疫組織化学）
ヒトの肝臓は、Ａｒｄａｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから入手した。免疫組織化学的染色を、ＤＡＫＯオートスタイナーを使用して５〜６μｍの厚みの凍結した肝臓切片について行った。内因性ペルオキシダーゼの活性を、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙブロッキング溶液（１：１０、２０℃で４分間）でブロックした。ＴＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０中の１０％の正常なヤギ血清（ＮＧＳ）を、希釈およびブロッキングに使用した。Ｍａｂ  ３Ｃ９は１μｇ／ｍｌで使用した。スライドを、金属増強ジアミノベンジジン（ｍｅｔａｌ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して現像した。
【０３０８】
切片の免疫蛍光染色のために、切片を、ＰＢＳ／１０％のＮＧＳでブロックし、ｍＡｂ
３Ｃ９とともに２０℃で１時間インキュベートした。ＦＩＴＳに結合させたウサギ抗マウスＦＩＴＣ標識二次抗体を検出試薬として使用した。続いて、二重染色の手順のために、切片を、ヒトＣＤ６８に対するＰＥ結合モノクローナル抗体で染色した。
【０３０９】
（結果）
実施例１に記載したように，ｈｕＣＲＩｇを、ヒトＪＡＭ１の保存されているＩｇドメインを認識する縮重プライマーを使用してヒト胎児のｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。いくつかのクローンの配列決定によって、３２１アミノ酸のオープンリーディングフレーム（図１、配列番号２）が明らかになった。Ｂｌａｓｔ検索によってＺ３９Ｉｇ（１型膜貫通タンパク質）に対する類似性を確認した（Ｌａｎｇｎａｅｓｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４９２：５２２−５２５（２０００））。この３２１アミノ酸のタンパク質は、いくつかのＣ末端アミノ酸残基を欠失していることが後に明らかになった。全長のｈｕＳＩｇＭＡタンパク質は、図２に示すように、３９９アミノ酸残基を有すると判定されている（配列番号４）。ＣＲＩｇの細胞外領域は、２つのＩｇ様ドメインから成り、Ｎ末端Ｖ−ｓｅｔドメインとＣ末端Ｃ２−ｓｅｔドメインとを含んだ。３’プライマーと５’プライマーとを使用して、ＣＲＩｇのスプライシング改変体であるＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ（３０５アミノ酸、図３、配列番号６）（これは、膜近接ＩｇＧドメインが欠失している）をクローニングした。
【０３１０】
（ヒトＣＲＩｇと比較したマウスＣＲＩｇのクローニングおよび配列）
マウスの発現される配列タグ（ＥＳＴ）データベースを、ｈｕＣＲＩｇの全長のオープンリーディングフレームと、ｔｂｌａｓｔｎアルゴリズムとを使用して検索した。３つのクローンのＤＮＡ配列決定によって、同一の完全な２８０アミノ酸のオープンリーディングフレームを得た。３プライム領域に対するプライマーを使用して、マウスの脾臓ライブラリーから全長の転写物をクローニングした。マウスのクローンは、Ｃ末端Ｉｇ様ドメインを欠失している点で、ｈｕＣＲＩｇのスプライシング形態と似ていた。細胞外ＩｇＶドメインは、ヒトの受容体とマウスの受容体との間でよく保存されており、９３％の同一性を有していた。マウスの細胞質ドメインはあまり保存されておらず、そのヒトの対応物よりも２０アミノ酸短く、そして４０％の同一性であった。マウスＣＲＩｇ（ｍｕＣＲＩｇ）をコードする核酸と推定されるアミノ酸配列とを図４に、それぞれ、配列番号７および８として示す。
【０３１１】
（ＣＲＩｇは、様々な組織中の常在性マクロファージのサブセットで発現し、その発現は炎症において増大している）
ｈｕＣＲＩｇのノーザンブロット分析は、１．５ｋｂと１．８ｋｂとの２種類の転写物（図１７）を示し、副腎、肺、心臓、および胎盤において最も高い発現を有しており、他の臓器（例えば、脊髄、甲状腺、乳腺、およびリンパ節）においては低い発現を有していた。全ての組織において、１．８ｋｂの転写物が最も豊富に発現される転写物であり、これはおそらく、ＣＲＩｇの長い形態をコードする。約１．４ｋｂの１つの転写物は、マウスの肝臓および心臓で検出された。
【０３１２】
（ＴＡＯＭＡＮ（商標）実時間ＰＣＲ分析）
ＣＲＩｇを発現する特異的な細胞株を同定するために、実時間定量的ＰＣＲ、およびＮ末端Ｉｇドメインに特異的なプライマー／プローブを使用した。低いが、検出可能なｍＲＮＡの発現が、ＰＭＡで処理した骨髄性細胞株ＨＬ−６０および単球細胞株ＴＨＰ−１において見られた。発現は、Ｂ細胞株およびＴ細胞株には存在していなかった（図１８Ａ）。
【０３１３】
（分化した単球でのＣＲＩｇの発現）
ＣＲＩｇが分化している単球／マクロファージで発現される際の詳細を確立するために、本発明者らは、ヒトの自己血清の存在下で分化するように誘導した非接着性の単球および接着性の単球の中でのＣＲＩｇ  ｍＲＮＡのレベルを決定した。ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡレベルは時間と共に段階的に上昇し、そしてプレーティング後７日で最大レベルに達した（図１８Ｂ）。この分化段階では、ｍＲＮＡレベルは、未分化の単球の中でのｍＲＮＡのレベルよりも１００倍高かった。
【０３１４】
単球／マクロファージの溶解物のウェスタンブロッティングは、ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現の増加と平行してＣＲＩｇタンパク質の発現の増大を示し（図１８Ｃ）、これは、ＣＲＩｇが、単球がマクロファージを形成するように分化する際に発現することを示している。４８ｋＤａのバンドと４０ｋＤａのバンドとがブロット上で明らかになり、これらはおそらく、ヒトＣＲＩｇの長い形態と短い形態とを示している。
【０３１５】
（ＣＲＩｇの分子の特性決定）
ＣＲＩｇは、還元条件および非還元条件下で同様に移動し、このことは、これが単量体として発現されていることを示している（図１９Ａ）。ＣＲＩｇをＰＮＧａｓｅ  Ｆを使用して脱グリコシル化した場合にも、移動パターンにはごくわずかな変化しか観察されず、これは、Ｎ−グリコシル化が重要ではないことを示している。ＣＲＩｇは、ＣＲＩｇを過剰発現する細胞をパーバナデート（ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）で処理した場合には、リン酸化されていた（図１９Ｂ）。リン酸化されたＣＲＩｇは、わずかに大きいＭｗのタンパク質（５５ｋＤａ）として移動した。ヒトＨＥＫ２９３細胞においては、チロシンリン酸化ＣＲＩｇ細胞質ドメインはＳｙｋキナーゼを動員することはない（結果は示さない）。
【０３１６】
（末梢血単核細胞でのＣＲＩｇの発現のフローサイトメトリー分析）
循環している白血球中のＣＲＩｇの発現パターンを決定するために、フローサイトメトリー分析を、モノクローナル抗ヒトＣＲＩｇ抗体３Ｃ９を使用して健常なドナー由来の血液から単離したリンパ球について行った。抗体は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスをｏｃｔａ−Ｈｉｓタグ化ヒトＣＲＩｇ細胞外ドメインで免疫化することによって作成した。抗体は、ＡＬＥＸＡ（商標）Ａ４８８と直接結合したアセトンで固定した凍結切片中の自然界に存在しているタンパク質を検出するために使用することができる非ブロッキング抗体である。対比染色を、いくつかの免疫細胞表面抗原に対するＰＥ結合抗体を用いて行った。ＣＲＩｇは全ての白血球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、および顆粒球を含む）の表面には存在しなかった（図２０）。しかし、ＣＲＩｇはマクロファージ分化培地で７日間培養した単球で発現していた。
【０３１７】
（単球でのＣＲＩｇの発現の調節）
ＣＲＩｇの発現の調節を研究するために、７日間、マクロファージを、種々のプロ炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの存在下で培養し、ＣＲＩｇの発現レベルを実時間ＰＣＲまたはフロー分析によって決定した。ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βでの２日間のマクロファージでの処理後に増大し、ＩＬ−４、ＩＬ１３、およびＬＰＳによってダウンレギュレートされた（図２１Ａ）。デキサメタゾンでの処理によっては、対照の未処理のマクロファージと比較して発現が５倍に増大した。細胞表面で発現されるＣＲＩｇの調節を決定するために、フローサイトメトリーを、種々のサイトカインとデキサメタゾンで５日間処理した末梢血単球について行った。ＣＲＩｇを、ＡＬＥＸＡ（商標）Ａ４８８に結合されたモノクローナル抗体クローン３Ｃ９を使用して検出した。細胞を、抗ＣＤ１４抗体で同時染色した。ＣＲＩｇの高い表面発現は、ＩＬ−１０およびＬＰＳでの５日間の単球の処理の後で見られた（図２１Ｂ）。表面でのＣＲＩｇの発現の劇的な増大は、デキサメタゾンでの処理後に見られた。
【０３１８】
（ＣＲＩｇの細胞内分布）
ＣＲＩｇの細胞内分布を研究するために、単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を１５日間培養物中で維持し、その後、これらを固定し、そしてモノクローナル抗体（クローン３Ｃ９）またはポリクローナル抗体４Ｆ７で、その後、ＦＩＴＣ結合二次抗体およびＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体で染色した。共焦点顕微鏡は、特定の細胞質の中でのＣＲＩｇの高い発現を示し、これは、リソソーム膜タンパク質ＣＤ６３の発現と重なっていた（図２２）。ＣＲＩｇは、その染色パターンがＣＤ６３の染色パターンとは重複していないマクロファージの先端および末端でも発現していた。
【０３１９】
（正常組織および疾患組織でのＣＲＩｇの発現）
組織常在性マクロファージでのＣＲＩｇの発現および慢性炎症性疾患の組織でのその発現を研究した。インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの発現の変化を、パラホルムアルデヒドで固定したヒト組織のパネルについて決定した。高い発現レベルが、肺炎または慢性喘息を有している患者の肺の剖検によって得られた肺胞マクロファージで見られた（図２３、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）。高いｍＲＮＡの発現は、慢性肝炎の患者の肝臓の中のクップファー細胞の中で見られた（図２３、ＥおよびＦ）。
【０３２０】
以前の研究（Ｗａｌｋｅｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５７４：３８７−３９０（２００２））およびライブラリーの電気的スクリーニングにおいては、ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの高い発現が、関節リウマチの患者の滑膜において見られた。したがって、関節リウマチ、変形性関節症、および変性骨疾患の患者から得られた滑膜でのＣＲＩｇの発現パターンを研究した。ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡの高い発現が、変形性関節症の患者から得られた滑膜細胞の中で見られた（図２４，Ｂ）。表層の滑膜細胞は、最も高いＣＲＩｇの発現を有していた（図２４、Ｄ）。加えて、ポリクローナル抗体６Ｆ１を、関節リウマチの患者から得られたヒトの滑膜の凍結切片の中でのＣＲＩｇの発現を研究するために使用した。ＣＲＩｇは、滑膜細胞のサブセット（２０〜４０％）および滑膜での組織マクロファージにおいて発現していた（図２５、Ａ、Ｂ、Ｃ）。これらの細胞は、Ａ型マクロファージ様滑膜細胞である可能性が最も高かった。染色は、対照の滑膜には存在しなかった（図２５Ｄ）。
【０３２１】
ＣＲＩｇタンパク質の発現は、多数の種々の組織中のマクロファージで見られた。ＣＲＩｇを安定に発現するＣＨＯ細胞から調製した凍結切片は、ＣＲＩｇの膜局在化を示した（図２６Ａ）。ＣＲＩｇタンパク質は、肺胞マクロファージ（図２６、Ｂ）、小腸の固有層中の組織球（図２６、Ｃ）、胎盤のホーフバウワー細胞（図２６、Ｄ）、副腎のマクロファージ（図２６、Ｅ）、および肝臓のクップファー細胞（図２６、Ｆ）中で見られた。
【０３２２】
アテローム性プラークは、多数のマクロファージまたはマクロファージ泡沫細胞を含み、大動脈の内腔壁に堅く接着していた。マクロファージ−内皮の接着におけるＣＲＩｇの役割を考慮して、アテローム性プラークにおけるＣＲＩｇの発現を研究した。プラークの別の切片を、抗ＣＤ６３（図２７、ＡおよびＢ）または抗ＣＲＩｇ（図２７、ＣおよびＤ）で染色した。抗ＣＤ６３とＣＲＩｇとの染色パターンの重複が血管壁と並行している泡沫細胞で見られ、これはアテローム性動脈硬化症におけるＣＲＩｇの役割を示している。
【０３２３】
ＣＲＩｇがマクロファージで選択的に発現するかどうかを決定するために、二重免疫蛍光染色を、心臓の間質マクロファージについて行った（図２８）。重ね合わせ（図２８、３つ目のパネル）に示したように、ＣＲＩｇについてポジティブである間質マクロファージのほとんどは、ＣＤ６８についてもポジティブであった。全てのＣＤ６８ポジティブマクロファージがＣＲＩｇについてもポジティブであるわけではなく、これは、ＣＲＩｇポジティブマクロファージが、組織常在性マクロファージのサブタイプに特異的であることを示している。
【０３２４】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）症候群におけるｍＲＮＡの発現レベルを定量的に決定するために、ｍＲＮＡを、潰瘍性大腸炎の患者、クローン病の患者、またはＩＢＤを発症していない患者から得た結腸組織から抽出した。実時間ＰＣＲを、ＣＲＩｇに特異的なプライマーを使用して行って、相対的な発現レベルを測定した。発現レベルは、対照組織と比較して、潰瘍性大腸炎の患者においては１６倍高く、クローン病の患者においては５倍高かった（図２９、Ａ）。同様に、相対的なＲＮＡ等量を肺組織中で決定し、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の患者に由来する組織中で最も高い（正常な組織の１４倍）ことを明らかにしたが、喘息の患者においては、正常な組織と有意な差はなかった（図２９、Ｂ）。
【０３２５】
Ｉｇスーパーファミリーの分子は、細胞表面認識および細胞−細胞接着を媒介することが周知である。ＣＲＩｇの発現は、血管と平行する間質マクロファージにおいて高かったので、マクロファージ−内皮細胞の接着におけるＣＲＩｇの関与を研究した。全長のＣＲＩｇ−ｌｏｎｇで安定にトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞株（図３０Ａ）を、蛍光色素ＢＣＥＣＦとともにロードし、９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｂプレートのウェルに添加し、ＨＵＶＥＣ細胞の単層を培養した。接着を、３回の穏やかな洗浄の後に保持されている蛍光の量によって測定した。ＣＲＩｇを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、対照プラスミドで安定にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞と比較して、対照の内皮細胞およびＴＮＦαで刺激した内皮細胞の両方に対してより接着性であった（図３０Ｂ）。
【０３２６】
（考察）
本研究では、最初に、新規のＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＣＲＩｇ／Ｚ３９Ｉｇの組織分布、発現の調節、および分子特性決定について記載し、組織常在性マクロファージにおけるその選択的発現を確認した。
【０３２７】
ＣＲＩｇの発現は、完全に分化した表現形を有している常在性マクロファージで見られた。その発現は、関節リウマチおよび炎症性腸疾患のような慢性の炎症を有している組織において増大していた。これらの疾患（多くの場合は、Ｔｈ２型疾患として特徴づけられる）におけるＣＲＩｇの発現の増加は、インビトロでのＴｈ２サイトカインによるその発現の調節と一致している可能性がある。この高い発現がＣＲＩｇポジティブマクロファージの存在の増加が原因であるか、または炎症性マクロファージでの発現の増大が原因であるかは、未だに決定されていない。
【０３２８】
ＣＲＩｇは、ヒトマクロファージのエフェクター機能の１つを媒介することができ、細菌の認識、食作用、抗原提示、およびサイトカインの放出を含む。これらの結果は、血管の内皮細胞壁に対するマクロファージの接着、およびおそらくは、運動性におけるＣＲＩｇの役割を示している。
【０３２９】
ＣＲＩｇの発現は、潰瘍性大腸炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような非微生物性の炎症性疾患においては増大していたが、ＬＰＳ、またはリポタイコ酸もしくは細菌のリポタンパク質のような他の細菌壁成分で処理した場合には、単離したマクロファージでダウンレギュレートされた。ＬＰＳでの２日間の長期にわたる処理によっては、ＣＲＩｇの発現の増加が生じた。これは、ＬＰＳで刺激したマクロファージによって分泌されるＩＬ−１０の自己分泌効果が原因であり得る。ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルとの両方での著しいＣＲＩｇのアップレギュレーションが、デキサメタゾンで単球またはマクロファージを処理した場合に観察された。少数の単球／マクロファージ表面受容体は、デキサメタゾンで処理すると発現が増加することが明らかになっている。一例はＣＤ１６３であるが、デキサメタゾンによるその誘導はそれほど劇的ではない。ＣＲＩｇの抗炎症性サイトカインＩＬ１０およびＴＧＦβによるアップレギュレーションは相当な興味であり、ＣＲＩｇがグルココルチコイドの抗炎症の役割を媒介し得ることを示している。
【０３３０】
本明細書中で記載したように、ＣＲＩｇは、活性化されたマクロファージを提示することができるＣＤ６８ポジティブマクロファージのサブセットで発現された。ＣＲＩｇおよびＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質に対するブロッキング抗体および活性化抗体を使用して、マクロファージエフェクター機能、接着、および移動におけるその役割、ならびに、慢性炎症性疾患におけるその役割を研究し、そして実施例７に記載した。
【０３３１】
わずか数種類の表面マーカーが、ＣＤ６８およびＣＤ１６３などの分化したマクロファージで特異的に発現されていた。ＣＤ６８は全てのヒトマクロファージ集団で明確に発現されたが、抗原もまた他の骨髄細胞で検出することができ、そして特定の非骨髄細胞でも検出できた。したがって、ＣＲＩｇは、間質の成熟マクロファージのサブセットで選択的に発現された第１の細胞表面抗原を提示する。
【０３３２】
（実施例７）
（ＤＢＡ−１Ｊマウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）におけるＣＲＩｇ融合タンパク質）
本実験は、ＣＩＡ（コラーゲン誘導関節炎、関節リウマチの実験用動物モデルシステム）の疾患の発症および進行において、対照マウスＩｇＧ１に対してＣＲＩｇ融合タンパク質を比較することを目的とした。
【０３３３】
実施例４で議論したように、ＣＲＩｇは、マクロファージのサブセットにおいて高度に、そして特異的に発現されており、慢性の炎症を有している組織において増加する。マウスＣＲＩｇは、マクロファージにおいて、およびコラーゲン誘導関節炎のマウスの炎症を起こしている関節の滑膜細胞において高く発現されている。インビトロでの実験は、ＣＲＩｇが内皮細胞に対するマクロファージの接着に関係していることを示していた。ＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質は、組織マクロファージの特性に影響を与えることによって、または他の細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、上皮細胞、内皮細胞）の免疫応答に影響を与えることのいずれかによって、自己免疫疾患（この場合は、マウスのコラーゲン誘導関節炎）の経過に影響を与える。これによって、関節の炎症、腫れ、および長期にわたる骨の目減りの軽減が生じ得る。
【０３３４】
ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質を、マウスＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインをマウスＣＲＩｇの細胞外ドメイン（ａａ１〜２００）に融合させることによって作成した。Ｆｃ受容体の結合を防ぐための二重変異を含む融合体を使用し、Ｆｃ受容体の調節についての対照とした。ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質のヌクレオチド配列を配列番号１７に示す。（類似しているｈｕＣＲＩｇ−ＩｇおよびｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−Ｉｇのコード配列は、それぞれ、配列１５および１６に示す）。タンパク質は、プラスミドＤＮＡの一時的なトランスフェクションによってＣＨＯ細胞中で生産させた。プロテインＡカラムに細胞上清をのせ、その後、イオン交換クロマトグラフィーを行って、凝集物を除去することによって融合タンパク質を精製した。血清半減期は、単回用量の４ｍｇ／ｋｇのＣＲＩｇ−ＦｃのＣ５７Ｂ６マウスへの注射、その後の特定の時間の間隔でのマウスからの血清の採取によって概算した。マウスＣＲＩｇ−Ｆｃの血清レベルを、ＣＲＩｇの細胞外ドメイン上の種々のエピトープを認識する抗ＣＲＩｇ  ｍＡｂを使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。
【０３３５】
動物モデル種：マウス
株（単数または複数）：ＤＢＡ−１Ｊ
供給業者（単数または複数）：ＪＡＣＫＳＯＮ
年齢の範囲：７〜８週齢
コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）が炎症性多発性関節炎であり、ヒトの関節リウマチ（ＲＡ）と類似している臨床的および病理学的特徴を有しているので、マウスを、ＣＩＡを研究するための種として選択した。この動物モデルは多くの研究室で使用されており、ＣＩＡの組織病理学は、パンヌスの形成、軟骨の変性／崩壊、および周辺部分の骨の目減り、その後の関節の変形に進行する滑液の増殖を伴う、ＲＡにおいて見られるものと似ている。また、マウスは、系統発生学的に最も下等な哺乳動物である。加えて、ＲＡの複雑な多元的病因を真似るために利用することができるインビトロモデルは存在していない。
【０３３６】
（実験の設計）
処置グループ：
１）２００μｌの生理食塩水中の６ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ１イソ型を、皮下（ＳＣ）で３回／週を７週間（ｎ＝８）。
【０３３７】
２）１００μｌの生理食塩水中の４ｍｇ／ｋｇのｍｕＣＲＩｇを、ＳＣで３回／週を７週間（ｎ＝８）。
【０３３８】
マウスを、ＣＦＳ（Ｄｉｆｃｏ）中に乳化させたウシＣＩＩ（１００μｇ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ）で、皮内で免疫化した。マウスを、２１日後にＩＦＡ（Ｄｉｆｃｏ）中のＣＩＩで再度チャレンジした。２４日目に開始して、１つのグループのマウス（ｎ＝７）に、１００μｇのｍｕＣＲＩｇ（ＰＲＯ３６２）Ｆｃを１週間に３回、６週間投与した。第２のグループ（ｎ＝８）には、１００μｇのマウスＩｇＧ１を、対照として投与した。マウスを関節の炎症の兆候について毎日試験し、以下のようにスコアした：０、正常；１、踵の関節に限定される紅斑と軽度の腫れ；２、踵から中足骨および中手骨の関節までに広がる紅斑と軽度の腫れ；３、踵から中足骨および中手骨の関節までに広がる紅斑ならびに中度の腫れ；４、踵から指までに広がる紅斑および重症の腫れ。１つの足についての関節炎のスコアの最高は４であり、１匹のマウスについての最高スコアは１６であった（図３１）。
【０３３９】
全てのマウスを、１００μｌの完全なフロイトアジュバント（ＣＦＡ）中の１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンで、０日目に免疫化した。ＣＦＡ中のＩＩ型コラーゲンを、尾の右側の基部に皮内注射した。２１日目に、１００μｌの不完全なフロイトアジュバント中の１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンで２回目の免疫化を、尾の左側にｉ．ｄ．投与した。動物を、研究員に毎日（Ｍ−Ｆ）チェックさせた。Ｎｅｓｔｌｅｔｓを、パワー系統（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｄｅｖｉｃｅ）として使用し、動物にさらなるパッド（ｅｘｔｒａ  ｐａｄｄｉｎｇ）を提供した。必要に応じて、湿らせた餌をケージの底に提供した。衰弱した動物を、獣医であるスタッフとの相談の後で屠殺した。Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ−ＲａｙおよびｍｉｃｒｏＣＴを、実験の終わりに撮影し、関節の病変／目減りを評価した。加えて、動物を、処置前および終了時に体重測定した。
【０３４０】
３５日目および実験の終了時には、グループ１から８のマウスを血清ｐＫのために採血し、そして抗ＩＩ型コラーゲン抗体力価を決定した（１００μｌの眼窩の血液）。
【０３４１】
７０日目に、全てのマウスを、最終的に、最後のヘモグラムのために、種々の白血球のカウントのために、および血清ｐＫ（Ｇ３）の評価のために、３％のイソフルラン下で心臓内から採血した。
【０３４２】
マウスを、関節炎の誘導後７０日目に安楽死させた。全ての４本の四肢について、レントゲン写真、５ＣＴ、および組織病理学を集めた。
【０３４３】
（結果）
ＣＲＩｇ融合タンパク質であるｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃの、コラーゲン誘導関節炎のマウス（関節リウマチの動物モデル）への全身的な注射は、ＩｇＧ１を投与したマウスの対照グループ（丸）に対して、ＣＲＩｇ融合タンパク質を投与したマウスの試験グループ（四角）においては、ＣＩＡの進行の有意な（図３１を参照のこと；ｐ値＝０．０００４）減少を示した。コラーゲン誘導関節炎は、完全なフロイトアジュバント中に乳化させたウシＩＩ型コラーゲンの注射によって誘導した。追加免疫を、最初の免疫化の２１日後に投与した。動物を、マウスＣＲＩｇ−ＦＣ融合タンパク質、または抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ１のいずれかで１週間に３回処置した。投与量は、１００μｌのＰＢＳ中で４ｍｇ／ｋｇで、皮下であった。処置は２１日目に開始し、７０日目まで続けた。マウスを、関節炎の兆候としての後肢の腫れについて毎日観察した。関節炎の重篤度は、以下のように１〜１６のスケールで段階付けした：０＝紅斑および腫れの兆候がない、１＝足根骨または踵に限られた紅斑および軽度の腫れ、２＝踵から足根骨までに広がる紅斑と軽度の腫れ、３＝踵から中足関節までに広がる紅斑と中度の腫れ、４＝踵、足、および指を含む紅斑および重症の腫れ。
【０３４４】
（反復実験）
上記のプロトコールを繰り返すように改良し、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける以前の実験の結果を確認した。改良したプロトコールには、疾患および発症の進行についてのインビボでのｍｉｃｒｏＣＴ画像撮影の結果としての放射線照射の潜在的効果の研究を含んだ。
【０３４５】
７０匹のＤＢＡ１／Ｊ７マウス（７〜８週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を５つの処置グループに分け、２つのグループ（Ｇ１とＧ３）には１つのグループについて１５匹のマウスを、２つのグループ（Ｇ４とＧ５）には１つのグループについて１０匹のマウスを、そして１つのグループ（Ｇ２）には２０匹のマウスを含んだ。
【０３４６】
処置グループ
Ｇ１：１００μｌの生理食塩水中の４ｍｇ／ｋｇのＭｕＩｇＧ１イソ型をｓ．ｃ．で１週間に３回、７週間（ｎ＝１５）。
【０３４７】
Ｇ２：１００μｌの生理食塩水中の４ｍｇ／ｋｇのＭｕＣＲＩｇ−ＩｇＧ１をｓ．ｃ．で１週間に３回、７週間（ｎ＝２０）。
【０３４８】
Ｇ３：１００μｌの生理食塩水中の４ｍｇ／ｋｇのＭｕＴＮＦＲＩＩ−ＩｇＧ１イソ型をｓ．ｃ．で１週間に３回、７週間（ｎ＝１５）。
【０３４９】
Ｇ４：１００μｌの生理食塩水中の４ｍｇ／ｋｇのＭｕＩｇＧ１イソ型をｓ．ｃ．で１週間に３回、７週間、インビボｍｉｃｒｏＣＴで麻酔（ｎ＝１０）。
【０３５０】
Ｇ５：１００μｌの生理食塩水中の４ｍｇ／ｋｇのＭｕＴＮＦＲＩＩ−ＩｇＧ１をｓ．ｃ．で１週間に３回、７週間、インビボｍｉｃｒｏＣＴで麻酔（ｎ＝１０）。
【０３５１】
ＴＮＦは、単核食細胞、Ａｇで刺激したＴ細胞、ＮＫ細胞、および肥満細胞によって分泌されるサイトカインである。これは、正常な炎症応答および免疫応答に関係している。ＴＮＦ−αは関節リウマチ（ＲＡ）の病因において重要な役割を担っている。高いレベルのＴＮＦは、ＲＡ患者の滑液で見られた。このプロトコールにおいては、ｍＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃをポジティブ対照として使用して、ＴＮＦとその細胞表面受容体との間での相互作用をブロックした。
【０３５２】
Ｇ１からＧ５までの全てのマウスを、）日目に１００μｌの完全なフロイトアジュバント中の１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンで免疫化した。ＣＦＡ中のＩＩ型コラーゲンを、尾の右側の基部に皮内注射した。２１日目に、１００μｌの不完全なフロイトのアジュバント中の１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンで２回目の免疫化を、尾の左側に皮内投与した。
【０３５３】
動物を毎日チェックした。Ｇ４〜５グループのマウスをイソフルランで麻酔し、インビボｍｉｃｒｏＣＴを毎週行った。Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ−ＲａｙおよびｍｉｃｒｏＣＴを実験の終わりに撮影し、関節の病変／目減りを評価した。加えて、動物を、処置前および終了時に体重測定した。
【０３５４】
３５日目および実験の終了時には、Ｇ１〜５のマウスを血清ｐＫのために採血し、抗ＩＩ型コラーゲン抗体力価を決定した（１００μｌの眼窩の血液）。７０日目に、全てのマウスを、最終的に、最後のヘモグラムのために、種々の白血球のカウントのために、および血清ｐＫ（Ｇ３）の評価のために、３％のイソフルラン下で心臓内から採血した。
【０３５５】
マウスを、関節炎の誘導後７０日目に安楽死させた。全ての４本の四肢について、レントゲン写真、ｍｉｃｒｏＣＴ、および組織病理学を集めた。
【０３５６】
図３３は、ＣＲＩｇ−Ｆｃで処置したマウスにおいて関節の腫れが有意に減少したことを示している。
【０３５７】
７０日目にｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃで処置した動物から得られた、ホルマリンで固定し且つパラフィンに包埋した組織について行った免疫組織化学（Ｈ＆Ｅ染色）は、処置の結果としての関節の炎症の阻害を示している。図３４は、ＩＩ型コラーゲンでの免疫化の７０日後の、ＤＢＡ１／Ｊマウスの、中足骨の関節のＨ＆Ｅ染色切片を示している。Ａ．大量の炎症性細胞の浸潤が、腱鞘周辺の領域および関節腔周辺の領域で見られる；Ｂ．Ａの詳細；Ｃ．ＣＲＩｇ−Ｆｃで処置したマウスの関節の中での低い程度の炎症の浸潤。わずかな炎症性細胞が、腱鞘周辺の領域および関節腔周辺の領域で見られた；Ｄ．Ｂの詳細。
【０３５８】
図３５は、皮質骨の容積が、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃで処置したマウスの関節において保たれたことを示している。対照ＩｇＧ−ＦｃおよびＣＲＩｇ−Ｆｃで処置したグループのマウスを、コラーゲンの注射の７０日後に屠殺し、関節をμＣＴによってスキャンした。ＣＲＩｇ−Ｆｃグループと対照のＩｇＧグループとの典型的なマウスの関節における骨の目減りおよび骨密度の低下を、ｍｕＩｇＧ１で処置した動物と比較して、左側の図に示す。皮質骨の容積の保存は、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃで処置した動物においては有意に大きかった。画像は、Ａｎａｌｙｚｅ画像分析ソフトウェアを使用してμＣＴデータから作成した三次元表面レンダリングである。
【０３５９】
図３６は、ＣＲＩｇ−Ｆｃでの処置が組織常在性マクロファージの数も形態も変化させなかったことを示している。抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ１（左側の図）またはＣＲＩｇ−Ｆｃ（右側の図）のいずれかで処置したマウスに由来する肝臓と肺を取り出し、ホルマリン中で固定し、パラフィンワックスに包埋した。７ミクロンの切片を、Ｆ４／８０に対する抗体を使用して染色した。切片の注意深い試験は、両方の処置グループにおいて等しい数のＦ４／８０ポジティブマクロファージを示している。加えて、マクロファージの形態に差は観察されなかった。
【０３６０】
図３７は、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃでの処置が血清抗コラーゲン抗体力価に影響しなかったことを示している。抗コラーゲン抗体の血清力価を、免疫化の７０日後に決定した。ｇｐ１２０で処置した動物に対して、ＣＲＩｇ−Ｆｃで処置した動物においては、抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＭサブクラスの血清力価に差は見られなかった。これは、ＣＲＩｇ−Ｆｃは、ＩＩ型コラーゲンで免疫化したマウスにおいては抗体応答に影響を与えないことを意味する。図３８は、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃが循環している炎症性マクロファージの数を減少させることを示している。末梢血を、免疫化の７０日後にＣＲＩｇ−Ｆｃおよび抗ｇｐ−１２０で処置した動物から得、炎症性および非炎症性の単球についてのマーカーを使用してフローサイトメトリーによって分析した。ＣＲＩｇ−Ｆｃで処置した動物は、抗ｇｐ１２０で処置したグループと比較して、炎症性単球の数の有意な増加および非炎症性の単球の数の減少を示した。
【０３６１】
結論として、本実施例に記載した実験の結果は、ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質がコラーゲン誘導関節炎を阻害することを示している。具体的には、これらの結果は、ＣＲＩｇ−Ｆｃが関節の腫れを阻害し、炎症を阻害し、関節の皮質骨の容積を保ち、そして循環している炎症性マクロファージの数を減少させることを示している。
【０３６２】
他の実験は、ＣＲＩｇ−Ｆｃは、インビボではＢ細胞応答またはＴ細胞応答に影響を与えないことを示している。
【０３６３】
（実施例８）
（マウスの抗体誘導ＣＩＡにおけるＣＲＩｇ融合タンパク質）
抗体誘導関節炎は、抗原（ウシＩＩ型コラーゲン）の注射の代わりに、ＩＩ型コラーゲンを認識する抗体を注射する点で、コラーゲン誘導関節炎とは異なる。この方法では、順応性のあるＢ細胞応答およびＴ細胞応答が、Ｆｃ受容体および補体によって媒介される活性化によって、マクロファージおよび好中球に対するエフェクター機能を直接誘導するように回避される。
【０３６４】
抗体誘導ＣＩＡは、Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）マウスＢ−ハイブリドーマ細胞株によって作成された４種類のモノクローナル抗体の混合物のｉ．ｖ．注射によって誘導することができる（Ｔｅｒａｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２１０３−８（１９９２））。モノクローナル抗体のうちの３種類は、８４アミノ酸残基の断片であるＣＢ１１のＬｙＣ２（ＩＩ型コラーゲンの最少の関節炎を発症させる断片）内でクラスター形成した自己抗原性エピトープを認識し、４番目のモノクローナル抗体はＬｙＣ１と反応する。４種類の抗体は全て、種々のＩＩ型コラーゲンの種が共有している保存されているエピトープを認識し、同種ＩＩ型コラーゲンおよび異種ＩＩ型コラーゲンと交差反応する（Ｔｅｒａｔｏら、（前出）；Ｔｅｒａｔｏら、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２：１３７−４７（１９９５））。Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ（登録商標）関節炎を誘導するモノクローナル抗体の混合物は市販されている（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，カタログ番号９００３５）。
【０３６５】
（プロトコール）
４〜５週齢の１０匹のＢＡＬＢ−ｃマウス（ＣＲ／Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ）を２つのグループに分け、それぞれのグループに５匹のマウスを含んだ。
【０３６６】
動物を、抗体混合物の注射の前日（−１日目）に開始して、１００μｇのｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃまたは１００μｇの対照−Ｆｃ（抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ１）で毎日処置し、１４日目まで続けた。１４日目に、動物を少なくとも１日に２回チェックし、書面に観察を記録し続けた。疾患の程度を、目視検査によってスコアした。
【０３６７】
目視によるスコアシステム：
０＝紅斑および腫れの兆候がない
１＝足根骨に限られた紅斑および軽度の腫れ
２＝踵から足根骨までに広がる紅斑および軽度の腫れ
３＝踵から中足関節までに広がる紅斑および中度の腫れ
４＝踵、足、および指を含む紅斑および重症の腫れ。
【０３６８】
Ｎｅｓｔｌｅｔｓを、パワー系統（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｄｅｖｉｃｅ）として使用し、動物にさらなるパッド（ｅｘｔｒａ  ｐａｄｄｉｎｇ）を提供した。
【０３６９】
全ての動物を１４日目に屠殺し、関節を免疫組織化学的染色またはヘマトキシリン−エオシン染色のために回収した。血液を、血液学的分析のためにサンプリングした。
【０３７０】
（結果）
図３９は、脱灰していない凍結した関節でのＦ４／８０染色によって作成した、抗体誘導関節炎（ＡＩＡ）後の関節におけるマクロファージの浸潤を示す。雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを、２ｍｇの抗コラーゲン抗体（ａｒｔｈｒｏｇｅｎ）をｉ．ｖ．で注射し、その３日後に、２５μｇのＬＰＳをｉ．ｐ．で注射した。抗体の注射の１４日後、マウスを安楽死させ、足を回収し、ポリビニルアルコールに包埋した。凍結した関節を７μｍの厚みの切片に切り、マウスＣＲＩｇに対する抗体とマクロファージ特異的マーカーであるＦ４／８０に対する抗体とで染色した。
【０３７１】
図４０は、ｍｕＣＲＩｇがＢａｌｂ／ｃマウスの抗体誘導関節炎後の関節の腫れを防ぐことを示している。関節炎は、Ｔｅｒａｔｏおよび共同研究者らの方法（Ｔｅｒａｔｏら、（１９９２），前出；Ｔｅｒａｔｏら、（１９９５），前出）の方法によって、ＩＩ型コラーゲン上の保存されているエピトープを認識する４種類のモノクローナル抗体の混合物（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を使用して誘導した。雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（６週齢）に、２ｍｇの抗ＣＩＩ抗体をｉ．ｖ．で注射し、その３日後、２５μｇのＬＰＳをｉ．ｐ．注射で注射した。動物をマウスＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質または対照−Ｆｃ融合タンパク質でのいずれかで毎日処置した。投与量は、１００μｌのＰＢＳ中４ｍｇ／ｋｇで、皮下であった。処置は抗コラーゲン抗体の注射の前日に開始し、マウスを１４日目に安楽死させるまで続けた。マウスを、関節炎の兆候としての後肢の腫れについてＬＰＳの注射後に毎日観察した。関節炎の重篤度は、以下のように１〜１６のスケールで段階付けした：０＝紅斑および腫れの兆候がない、１＝足根骨または踵に限られた紅斑および軽度の腫れ、２＝踵から足根骨までに広がる紅斑および軽度の腫れ、３＝踵から中足関節までに広がる紅斑および中度の腫れ、４＝踵、足、および指を含む紅斑および重症の腫れ。
【０３７２】
治療的処置を、−１日目ではなく４日目で処置を開始したことを除いて予防的処置と同様に行った。ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃでの処置によって、ＡＩＡマウスの足における炎症性サイト系ンのレベルが低下した。関節炎の後脚におけるサイトカイン、Ｃ３ａおよびＣ５ａの濃度の測定は、Ｋａｇａｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｏｌ．１６９：１４５９−６６（２００２）の方法に従って行った。手短に説明すると、抗体誘導関節炎の誘導後の示した時点で、足を回収し、液体窒素で凍結させた。続いて、足を、液体窒素で冷却した金属プレート上で粉砕し、そして０．１％のＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）を含む氷冷したＰＢＳ中に分散させた。試料を、Ｖｉｔａｔｒｏｎ（ＮＬ）ホモジナイザーを用いて氷上でホモジナイズし、不溶性部分を１４０００ｇで１０分間回転させ、上清を回収することによって除去した。上清の中のサイトカインを、ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎによるサイトカインＥＬＩＳＡを使用して測定した。
【０３７３】
ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃでの処置は補体Ｃ３の蓄積を阻害したが、ＡＩＡの軟骨上のＩｇＧ２ａの蓄積は阻害しなかった。雌のＢａｌｂ／Ｃマウスに、２ｍｇの抗コラーゲン抗体（ａｒｔｈｒｏｇｅｎ）をｉ．ｖ．で注射し、その３日後に、２５μｇのＬＰＳをｉ．ｐ．で注射した。抗体の注射の１４日後、マウスを安楽死させ、足を回収し、ポリビニルアルコールに包埋し、ドライアイス上でイソペンタン（ｉｓｐｅｎｔｈａｎｅ）中で凍結させた。凍結した関節を７μｍの厚みの切片に切り、マウスＣ３に対するＦＩＴＣ結合ポリクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびマウスＩｇＧ２ａに対するポリクローナルＡ５９４結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。Ｌｅｉｔｚ蛍光顕微鏡で切片の写真を撮影した。
【０３７４】
Ｈ＆Ｅ染色を用いて行った免疫組織化学の結果を図４１に示す。対照で処置したマウス（ｍｕＩｇＧ１）は、中度から重症の関節炎を有していた（左側のパネル）。ｍｕＣＲＩｇで処置したマウスは、ごくわずかな関節炎を有しているから関節炎を有していないまでであった（右側のパネル）。結果は、ｍｕＣＲＩｇが抗体誘導関節炎における関節の炎症を阻害することを示している。
【０３７５】
結論として、マウスＣＲＩｇ−Ｆｃで処置した動物は、抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ１で処置した動物と比較すると、有意に低下した臨床スコアを有していた。ＣＲＩｇは、この動物モデルにおいては、予防効力と治療効力との両方を示した。関節炎の重篤度の低下はまた、関節の炎症性細胞（特に、好中球）の減少によっても反映されていた。循環においては好中球の数が増加しており、これはおそらく、関節への好中球の移動の減少を反映している。ｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃは、ＲＡの臨床症状と平行して、局所的なＩＬ−１βおよびＩＬ−６の生産を阻害した。ｍｕＣＲＩｇでの処置は、免疫複合体の蓄積には影響を与えなかったが、軟骨上での補体Ｃ３の蓄積を阻害した。エフェクター機能は、Ｆｃ受容体の結合に依存することが明らかになった。ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ−Ｆｃもまた、有意な予防活性を有していることが明らかになった。
【０３７６】
（実施例９）
（マウスＣＲＩｇ−Ｆｃは、Ｃ３オプソニン化ヒツジ赤血球（Ｅ−ＩｇＭ）に結合する）
ＳＲＢＣ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ）を、ラットＩｇＭ（Ｅ−ＩｇＭ）（Ｆｏｒｓｓｍａｎ  Ａｇ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコーティングした。Ｅ−ＩｇＭを、正常なマウスの血清とＣ３ノックアウトマウスに由来する血清とでオプソニン化した。オプソニン化Ｅ−ＩｇＭを、種々の濃度のマウスＣＲＩｇ−Ｆｃとともにインキュベートした。Ｅ−ＩｇＭに対する融合タンパク質の結合を、融合タンパク質のＦｃ部分に対するＦＩＴＣ標識抗体を使用してフローサイトメトリーによってモニターした。
【０３７７】
図４２に示すように、マウスＣＲＩｇは正常なマウスの血清でオプソニン化したＥ−ＩｇＭに対して容量依存的に結合したが、Ｃ３欠損血清でオプソニン化したＥ−ＩｇＭに対しては結合しなかった。これは、マウスＣ３またはＣ３の断片に対するＣＲＩｇの選択的な結合を示している。
【０３７８】
（実施例１０）
（Ｅ−ＩｇＭに対するヒトＣＲＩｇの結合はＣ３依存性である）
ＳＲＢＣ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ）を、ラットＩｇＭ（Ｅ−ＩｇＭ）（Ｆｏｒｓｓｍａｎ  Ａｇ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコーティングした。Ｅ−ＩｇＭを、Ｃ３欠損またはＣ５欠損のヒト血清でオプソニン化した。オプソニン化Ｅ−ＩｇＭを、種々の濃度のヒトＣＲＩｇ−Ｆｃとともにインキュベートした。Ｅ−ＩｇＭに対する融合タンパク質の結合を、融合タンパク質のＦｃ部分に対するＦＩＴＣ標識抗体を使用してフローサイトメトリーによってモニターした。
【０３７９】
図４３に示すように、ヒトＣＲＩｇはＣ５欠損血清でオプソニン化したＥ−ＩｇＭに対して容量依存的に結合したが、Ｃ３欠損血清でオプソニン化したＥ−ＩｇＭに対しては結合しなかった。これは、ヒトＣ３またはＣ３の断片に対するＣＲＩｇの選択的結合を示している。同様の結果が、ヒトＣＲＩｇ  ＥＣＤを用いても得られた。
【０３８０】
（実施例１１）
（ＣＲＩｇを発現するＣＨＯ細胞に対する血清オプソニン化粒子の結合）
５０μｌの新しいＣ５７Ｂ６雌の血清＋２０μｇ／ｍｌのｍＣＲＩｇ−ｍＦｃ（ＰＵＲ５２７０−Ｂ）またはｍＰＩＧＲ−ｍＦｃ（４６９９）を一緒に混合した。Ａ４８８粒子、ザイモサン、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓによる）を、ＰＢＳ／０．２％のゼラチン／０．１８％のグルコース／１ｍＭのＭｇＣｌ２（ＰＢＳｇｇ＋＋）中で３７℃で６０分間かけて添加した。オプソニン化粒子を、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてマウスＣＲＩｇを発現するＣＨＯ細胞（クローン５Ｃ１０）またはヒトＪＡＭ２を発現するＣＨＯ細胞に対して、ＣＲＩｇ−Ｆｃもしくは対照−Ｆｃタンパク質の存在下、またはそれらが存在しない条件下で、３７℃で３０分間かけて添加した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒにおいて細胞表面に対する粒子の結合について分析した。
【０３８１】
図４４に示すように、Ｃ３十分血清でオプソニン化した粒子は、ＣＲＩｇを発現するＣＨＯ細胞に結合したが、ＪＡＭ２を発現するＣＨＯ細胞には結合しなかった。結合は、ＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質の存在下では撤回されたが、対照−Ｆｃ融合タンパク質の存在下ではそうではなかった。これは、Ｃ３ｂに対するＣＲＩｇの結合部位が細胞外ドメインに存在することを示している。
【０３８２】
（実施例１２）
（ｍｕＣＲＩｇ  ＦｃはＣ３ｂに結合する）
実時間でモニターした表面プラズモン共鳴アッセイを、Ｂｉｏｃｏｒｅ（登録商標）−２０００機器を使用して行い、データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析した。カルボキシル化デキストランチップ（センサーチップＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢによる研究用等級）を、全てのアッセイに使用した。ＣＭ５チップのフローセルを、標準的なアミンカップリング手順に使用したか、または工程の間にいずれのタンパク質を添加することもない標準的な活性化−失活手順を使用することによるＣ３ｂの直接の酵素的カップリングのために調製したかのいずれかを行った。活性化工程は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドを含む新しい溶液を用いて行い（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，５μｌ／分の流速での７〜１５分間の注入）、そしてその後、エタノールアミン−ＨＣｌ（１．０Ｍ、ｐＨ８．５）（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、７〜１５分間の注入）で失活させた。Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（Ｂｉａｇｒａｄｅ，Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）またはＶＢＳを、その間中、フロー緩衝液として使用した。これらの最初の工程の後、ＶＢＳまたはＶＢＳを、５μｌ／分の持続的なフロー緩衝液として使用し；脱気しただけの緩衝液を使用した。
【０３８３】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）チップ上へのタンパク質のアミンカップリング−Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、およびＣ３ｄを、製造業者によって推奨されている標準的なアミンカップリング手順を使用してＣＭ５チップ上にカップリングさせた。カップリングさせるタンパク質を、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ  ５．０〜５．７）に対して透析して、アミンカップリングのための正味の負電荷を得た。簡単に説明すると、チップの表面を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドで活性化し（７〜１５分間の注入、５μｌ／分）、そして、いずれかの精製したＣ３ｂ（５０μｇ／ｍｌ、２０μｌ）、Ｃ３ｃ（７０μｇ／ｍｌ、３０μｌ）、またはＣ３ｄ（１３０μｇ／ｍｌ、２０μｌ）を、結合実験のために適しているカップリングのレベル（すなわち、１，０００〜５，０００共鳴単位）（ＲＵ）に達するまで注入した。その後、フロー細胞を、上記のように失活させた。実験の前に、フロー細胞を、ＶＢＳおよび１０ｍＭの酢酸緩衝液中の３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．６）で十分に洗浄した。
【０３８４】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）を使用する結合アッセイ−本発明者らは、アミンをカップリングさせたＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、およびＣ３ｄに対するＣＲＩｇ−Ｆｃの結合を試験した。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の注入のために、試薬をＶＢＳに対して透析し、ＶＢＳで希釈し、そして濾過（０．２０μｍ、Ｍｉｎｉｓａｒｔ（登録商標），Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ
Ｃｏｒｐ．，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ）または遠心分離（１４，０００×ｇで１０分間）した。透析した試薬のタンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。融合タンパク質を、対照のフロー細胞（いずれのカップリングさせたタンパク質を使用することもなく活性化させ、そして失活させたフロー細胞、「ブランクチャンネル」）を通じて、そして２２℃で５μｌ／分の流速を使用して、カップリングさせたタンパク質と共にフロー細胞を介して別々に注入した。結合アッセイは全て、別々に調製したセンサーチップを使用して少なくとも２連で行った。
【０３８５】
図４５に示すように、マウスＣＲＩｇ−Ｆｃは、センサーチップに対するＣ３ｂの特異的結合を示し、計算された２５０ｎＭのＫｄを用いた。
【０３８６】
（実施例１３）
（マウスおよびヒトＣＲＩｇ−Ｆｃは補体Ｃ３ｂに結合する）
Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートに、ＰＢＳ中の３μｇ／ｍｌのＣ１、Ｃ３ａ、ｂ、ｃ、ｄ、Ｃ４、Ｃ６をコーティングした。プレートを、ＰＢＳ＋４％のＢＳＡ中で２時間ブロックし、種々の濃度のマウスまたはヒトＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質と共に、ＰＢＳ＋４％のＢＳＡ＋０．１％のＴｗｅｅｎ中、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗マウスＦｃ抗体またはヤギ抗ヒトＦｃ抗体と共にインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＮＢ基質とともにインキュベートし、プレートリーダーでＯＤを読み取った。
【０３８７】
図４６に示す結果は、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、およびＣ３ｂｉに対するマウスおよびヒトＣＲＩｇの結合の濃度依存性の増加と、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ３ａ、およびＣ３ｄに対する結合の不在とを示している。
【０３８８】
（実施例１４）
（マウスおよびヒトＣＲＩｇ−ＦｃはザイモサンでのＣ３の蓄積を阻害する）
代替補体経路の阻害を、ザイモサンＡ粒子（Ｓｉｇｍａ）でのＣ３の蓄積のフローサイトメトリー分析を利用する方法を使用して研究した（Ｑｕｉｇｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４５５３−４５６０（１９９８））。簡単に説明すると、１０ｍｌの０．１５ＭのＮａＣｌ中の５０ｍｇのザイモサン粒子を、最初に、６０分間沸騰させることによって活性化させ、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。個々の代替補体経路のアッセイ条件において、２×１０７個の粒子を、１０ｍＭのＥＧＴＡおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度を含む反応チューブに添加した。その後、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ネガティブ対照）または漸増量のマウスＣＲＩｇ−Ｆｃのいずれかを含む、テキストに記載されている試料を添加した。１０μｌのＢＡＬＢ／ｃ血清を補体の供給源として添加し、全ての試料を、ＰＢＳにより１００μｌとした。試料を３７℃で２０分間インキュベートし、反応を、１０ｍＭのＥＤＴＡを添加することによって停止させた。粒子を遠心分離し、そして上清を除去し、そして後の分析のために凍結させた。その後、粒子を冷却ＰＢＳ、１％のＢＳＡで２回洗浄し、その後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＣ３（Ｃａｐｐｅｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）と共に氷上で１時間インキュベートした。その後、試料を、冷却ＰＢＳ、１％のＢＳＡで２回洗浄し、ＰＢＳに再度懸濁させ、その後、ＥＰＩＣＳサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を使用してフローサイトメトリーによって分析した。阻害の割合（％）を、式：［１−［試料の平均チャンネル蛍光−バックグラウンド（１０ｍＭのＥＤＴＡの条件）／ポジティブ対照の平均チャンネル蛍光（Ｃｒｒｙ−Ｉｇなし）−バックグラウンド］］×１００を使用して計算した。
【０３８９】
反応物の上清もまたウェスタンブロッティングによって分析して、Ｃ３の切断の程度を決定した。この分析では、５μｌの上清を、１０％の２−ＭＥを含む等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と混合した。試料を、７．５％のアクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、Ｈｙｂｏｎｄ高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）紙（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に、０．１９ＭのＴｒｉｓ、０．０２５Ｍのグリシン、２０％のメタノール緩衝液において一晩かけて移した。この後、膜を、１０％の乳汁を含むＰＢＳ、０．１％のＴｗｅｅｎで１時間ブロックした。その後、予め滴定した抗Ｃ３  ｍＡｂ  ＲｍＣ１１Ｈ９（Ｑｕｉｇｇら、前出）を、１％のＢＳＡを含む同じ緩衝液中のブロットに添加した。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）（マウスＩｇＧに予め吸着させた）を１時間かけて添加し、その後、ブロットを洗浄し、高感度ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して現像した。
【０３９０】
ザイモシン粒子でのＣＲＩｇ−Ｆｃによる補体の活性化の阻害をフローサイトメトリーによって分析して、表面に結合したＣ３（図４７Ａ）を検出し、または、ザイモシン反応上清のアリコートをウェスタンブロッティングによって分析した場合には、抗Ｃ３  ｍＡｂを使用して検出した（図４７Ｂ）。Ｂ中の完全なＣ３およびＣ３’鎖の位置は、右側の矢印で示す。１０ｍＭのＥＤＴＡのレーンはネガティブ対照を示し、そしてレーン２から７の上部には、漸増用量のＣＲＩｇ−Ｆｃを示す。
【０３９１】
（実施例１５）
（ＣＲＩｇはＳＲＢＣの代替補体経路の溶血を阻害する）
代替補体経路について、ウサギ赤血球（ＲＲＢＣ）を、０．１％のゼラチンを含むベローナル緩衝液（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ）で洗浄し、そしてＧＶＢ中に１×１０ｅ９細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。１０μｌの細胞懸濁液を、阻害因子を含む１０μｌのＣ１ｑ枯渇血清に添加した。混合物を、震盪させながら温室で、３７℃で３５分間インキュベートした。１０ｍＭのＥＤＴＡを含む２００μｌのＧＶＢを添加し、細胞を、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして１００μｌのアリコートを、４１２ｎｍの波長で読み取った。
【０３９２】
古典補体経路については、ＩｇＭでオプソニン化したヒツジ赤血球（Ｅ−ＩｇＭ）を、ｆＢ欠損血清と共にインキュベートした。方法は、代替補体経路についての測定と同様である。
【０３９３】
図４８に示す結果は、マウスＣＲＩｇは代替補体経路によって誘導される溶血を阻害するが、古典補体経路の溶血には影響を与えないことを示している。同様の結果が、ヒトＣＲＩｇを用いた場合にも得られた。
【０３９４】
（実施例１６）
（ＣＲＩｇは代替補体経路を選択的に阻害する）
（全血清を使用する溶血アッセイ）
代替補体経路を、Ｋｏｓｔａｖａｓｉｌｉら、（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７６３−７１（１９９７））に記載されているように、ウサギ赤血球（Ｅｒ）を使用して評価した。簡単に説明すると、Ｅｒ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）を、ＧＶＢで３回洗浄し、そして１×１０９／ｍｌになるように再懸濁した。１０μｌのＥｒを１０μｌのＧＶＢ／ＥＧＴＡ（０．１ＭのＥＧＴＡ／０．１ＭのＭｇＣｌ２）、阻害因子、１０μｌのＣ１ｑ枯渇ヒト血清に添加し、ＧＶＢで１００μｌになるように容量を調整し、その後、３７℃で３０分間インキュベートした。２５０μｌのＧＶＢ／１０ｍＭのＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、そして５００×ｇで５分間遠心分離した。溶血を、２００μｇの上清の４１２ｎｍでの吸光度によって決定した。溶解の割合（％）を、阻害因子が存在しない条件で生じる溶解と等しいものを１００％の溶解とみなすことによって正規化した。
【０３９５】
古典補体経路に対するＣＲＩｇの効果を決定するために、ＥｒをＥ−ＩｇＭと置き換え、そしてアッセイを、ＧＶＢ＋＋中のｆＢ欠損ヒト血清で行ったことを除いて、同様の手順を行った。
【０３９６】
（Ｃ３のＣ３転換酵素によって媒介される切断の測定）
Ｃ３転換酵素（Ｃ３ｂ．Ｂｂ）（Ｋｏｓｔａｖａｓｉｌｉら、（前出））による液相でのＣ３の切断に対するＣＲＩｇの効果は、０．４μＭの精製したＣ３を、ＧＶＢ（２０μｌの容量）中のｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ、ｈｕＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ、ｍｕＣＲＩｇ、またはＨ因子と共に、３７℃で１５分間インキュベートすることによって試験した。その後、０．４μＭのＢ因子と０．０４μＭのＤ因子とを、５０ｍＭのＭｇＥＧＴＡの存在下で、３０μｌの全容量中で添加して、経路を活性化させた。３７℃で３０分の後、反応混合物を、２−ＭＥを含む３０μｌのＬａｅｍｍｌｉ’ｓ試料緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）で停止させ、３分間沸騰させ、そして８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。タンパク質を、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でのゲルの染色によって視覚化した。ゲルをデンシトメトリー分析のためにスキャンし、そして切断されたＣ３の割合（％）を計算した。対照は、切断を阻害するためにＧＶＢＥ（１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＧＶＢ）にてインキュベートした。
【０３９７】
代替補体経路ＤＡＡについてのマイクロタイタープレートアッセイを、記載されているように（Ｋｒｙｃｈ−Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３１１６０−８（１９９９））行った。マイクロタイタープレートを、リン酸緩衝化生理食塩水中の５μｇ／ｍｌのＣ３ｂ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で一晩コーティングした。プレートを、１％のウシ血清アルブミンおよび０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水中３７℃で２時間ブロックし、７１ｍＭのＮａＣｌと０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０とを含む２．５ｍＭのベローナル緩衝液（ｐＨ７．４）中の１０ｎｇのＢ因子、１ｎｇのＤ因子、および０．８ｍＭのＮｉＣｌ２とともに、３７℃で１５分間インキュベートした。同じ緩衝液を使用して、０．０１〜１μｇのＣＲＩｇ−Ｆｃ、０．１２９μｇのヤギ抗ヒトＢ因子抗体、および１００μｇの西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ヤギ抗体の１：１５，０００希釈物（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共に、連続する１時間のインキュベーションを行った。Ｏ−フェニレンジアミンで発色させた。このアッセイでは、ＤＡＦとＨ因子は、予想したとおり、デコイ加速活性の媒介因子として働き、そしてＣ３ａ放出をＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｄｅｓ−Ａｒｇ  ＲＩＡキットを使用して検出した。
【０３９８】
（Ｃ５転換酵素アッセイ）
Ｃ３ｂは、１×１０１０のザイモサン粒子を０．２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのＣ３に再度懸濁させ、そして５μｇのトリプシンを添加し、その後、２２℃で１０分間インキュベーションすることによって、ザイモサンに蓄積させた。トリプシンによるＣ３ｂの蓄積を繰り返し、細胞を、５ｍｌのＧＶＢで６回洗浄した。ザイモサン粒子を、１００μｌのＧＶＢ中に再度懸濁させ、そして、Ｂ因子（３５μｇ）とＤ因子（０．５μｇ）とを含む５０μｌのＧＶＢおよび５０μｌの１０ｍＭのＮｉＣｌ２と混合した。２２℃で５分間のインキュベーションの後、５μｌの０．２ＭのＥＤＴＡを添加した。結合したＣ３ｂを、５０μｌのＣ３（５００μｇ）を添加し、そして２２℃で３０分間細胞をインキュベートすることによって増幅させた。Ｃ３ｂを有しているザイモサン粒子を洗浄し、そして増幅手順を、所望の数のＣ３ｂ／ザイモサンが得られるまで繰り返した。
【０３９９】
Ｃ５転換酵素の形成には１分もかからないので、酵素は、アッセイを行った同じ反応混合物中で形成させた。酵素速度を、上記のように、Ｂ因子およびＤ因子、そしてＣ６の飽和濃度下で、０．５ｍｌのシリコン処理をした微量遠心チューブで決定した。アッセイ混合物には、種々の濃度のＣ５（凍結／融解によって生じたバックグラウンドのＣ５ｂ，６様活性を排除するために、３７℃で２０分間プレインキュベートした）、Ｂ因子（１．２μｇ、５１６ｎＭ）、Ｄ因子（０．１μｇ、１６７ｎＭ）、Ｃ６（２．５μｇ、８３３ｎＭ）、および０．５ｍＭのＮｉＣｌ２を含めた。反応を、ＺｙｍＣ３ｂ、ＥＳＣ３ｂ、またはＥＲＣ３ｂの添加によって開始させた。１つの細胞あたりのＣ３ｂの密度に応じて、細胞の濃度を、２５μｇの最終的な容量の中にＧＶＢ中の９〜３５ｎｇの結合したＣ３ｂを有し、結果として、２〜８ｎＭの酵素濃度となるように調整した。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、Ｃ５のさらなる切断を、アッセイチューブを氷浴に移し、そして氷冷したＧＶＢＥを添加することによって防いだ。適切に希釈したアッセイ混合物を、Ｃ５ｂ，６の形成について、ＥＣを使用する溶血アッセイによって迅速に滴定した。Ｃ５ｂ、６は、精製したＣ５ｂ、６を用いて作成した検量線を使用して定量した。低温およびこの希釈が検出不可能なレベルにまで、次の工程の間にＣ５の切断を減少させるためには十分であったことを、対照によって確立した。ウサギ赤血球（ＥＲ）またはヒツジ赤血球（ＥＳ）の溶解は、終点としてＥＣの溶解を使用して、Ｃ５ｂ、６力価に対しては＜２％を導くことが示された。
【０４００】
Ｃ５ｂ、６を、ヒトＣ５ｂ−９による溶血に対するＥＣの感度を使用して溶血活性によって測定した。Ｃ５転換酵素アッセイによる希釈した試料のアリコート（２５μｌ）に対して、１．２×１０７のＥＣと、補体タンパク質Ｃ７〜Ｃ９の供給源としての５μｌのプールした正常なヒト血清（ＮＨＳ）との混合物を、２２５μｌの最終容量のＧＶＢＥ中で添加した。反応混合物を、３７℃で１０分間インキュベートし、その後、溶解していない細胞を、１０，０００×ｇで１分間の遠心分離によって除去した。放出されたヘモグロビンの量を、４１４ｎｍでの分光高度によって定量した。１００％の溶解を、２％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０中に溶解したＥＣとして測定した。Ｃ５およびＣ６を含むが、Ｃ５転換酵素は含まない対照を、バックグラウンドとして引き算した。Ｃ５転換酵素を含むが、精製されたＣ５またはＣ６は含まない対照は、ＥＣの溶解の間にＣ７〜９の供給源として使用したＮＨＳからは有意な量のＣ５ｂ、６が形成されなかったことを示していた。
【０４０１】
（結果）
結果を、図４９（Ａ）〜（Ｅ）に示す。
【０４０２】
図４９（Ａ）は、ＣＲＩｇがＣ１ｑ欠損血清中でのウサギ赤血球の溶血（代替補体経路）を阻害するが、ｆＢ欠損血清中でのＩｇＭオプソニン化ヒツジ赤血球の溶血（古典補体経路）は阻害しないことを示した。これは、ＣＲＩｇが代替補体経路を選択的に阻害することを示している。
【０４０３】
図４９（Ｂ）に示すように、ＣＲＩｇは、液相でＣ３転換酵素活性を阻害する。ゲルは、漸増濃度のヒトＣＲＩｇ−ＥＣＤ（１０〜１００ｎＭ）でのＣ３の１１５ｋＤａのα鎖の切断の阻害を示す。
【０４０４】
図４９（Ｃ）および（Ｄ）はＣＲＩｇがＣ３のＩ因子によって媒介される切断の補因子ンとして機能しないだけではなく、Ｃ３転換酵素の崩壊の促進因子としても機能しないことを示している。
【０４０５】
図４９（Ｅ）に示すデータは、ＣＲＩｇが、ザイモサン粒子上に形成される代替補体経路のＣ５転換酵素を阻害することを示している。
【０４０６】
（実施例１７）
（ＣＲＩｇは組織マクロファージのサブセットで発現される）
ヒトＣＲＩｇおよびマウスＣＲＩｇに特異的なモノクローナル抗体を作成し、実施例３に記載したように、ＣＲＩｇの発現を定義するために利用した。ＣＲＩｇは末梢血Ｃ１４＋単球には存在していなかったが、これは、フローサイトメトリーによって、単球由来マクロファージで容易に検出された（図５０Ｂ）。ｈｕＣＲＩｇは、末梢血ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ１５＋顆粒球には存在しなかった（図５１Ａ）。ｈｕＣＲＩｇと同様に、ｍｕＣＲＩｇは、末梢血および脾臓の白血球（ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞を含む）には存在しなかったが、肝臓のクップファー細胞で検出された（ＫＣ、図５０Ｂ）。ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）および（Ｓ）タンパク質の発現は、マクロファージに分化した単球として、５５Ｋおよび４８ＫのＭｒのタンパク質として確認された（図５０Ｃ）。同様に、マウスＣＲＩｇは、末梢マクロファージ（ＰＭ）中で４８ＫのＭｒの糖タンパク質として検出された。ｍｕＣＲＩｇは、推定されるＮ結合グリコシル化部位を有していて、これはグリコシル化されており、ゲルにおける約５ｋＤａの移動シフトの原因となる。
【０４０７】
ＣＲＩｇ  ｍＲＮＡは肝臓において高度に検出されるので、肝臓でのＣＲＩｇの発現を免疫組織化学によってさらに分析した。ＣＲＩｇは、ヒトおよびマウスの肝臓の中のＣＤ６８＋ＫＣで発現されていたが、副腎、胎盤、滑膜、腸、および腹膜のマクロファージでも検出された（データは示さない）。ＣＲＩｇは、ヒトの脾臓マクロファージ、ランゲルハンス細胞、ミクログリア細胞、および骨髄由来マクロファージ、ならびに、種々のヒトおよびマウスのマクロファージ細胞株（ＴＨＰ−１、ＲＡＷ２７５、ＰＵ１．１、Ｊ７７４；結果は示さない）には存在しなかった。まとめると、これらの結果は、ＣＲＩｇが種々の組織の常在性マクロファージの集団において高度に発現されることを示している。
【０４０８】
（実施例１８）
（ＣＲＩｇはＣ３ｂおよびｉＣ３ｂに結合する）
（材料および方法）
（補体タンパク質）
ヒトおよびマウスのＣ３を、Ｈａｍｍｅｒら、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（８）：３９９５−４００６（１９８１））の方法にしたがって、混入しているＩｇＧを除去するために別のプロテインＡカラムを用いて単離した。ｈＣ３ｂを得るために、ｈＣ３を、ＣＶＦ、ｈｆＢ、ｕｇ、ｈｆＤと共に１０：１０：１のモル比で３７℃で１時間、１０ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下でインキュベートした。ｈＣ３ｂ断片を、続いて、強アニオン交換モノＱ  ５／５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、クマシーブルー染色したゲルによって＞９５％の純度で単離した。Ｃ３ｂ二量体を作成するために、上記のように調製したＣ３ｂを、メタノール中のビスマレイミドへキサン（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに、２．２：１のモル比で、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）中で４℃で３日間反応させた。架橋を、チオエーテル結合を切断することにより遊離スルフヒドリル基を介して作成した。この手順を用いた場合には、収量は、５０％を上回った。二量体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって精製した。二量体は、クマシーブルー染色したゲルによれば９５％の純度であった。加水分解したＣ３を、反応容量のなかで５０ｍＭの最終濃度のなるように、１０ｍＭのＥＤＴＡでＰＢＳ中のＣ３に対して２Ｍのメチルアミン（ｐＨ  ７．０）を添加することによって生じさせた。反応は、３７℃で４時間行い、その後、これをＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００  １０／３００
ＧＬゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｃ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００  １０／３００  ＧＬゲル濾過カラム上で精製し、二量体から単量体を分離した。Ｃ３ｄ、Ｂ因子、Ｄ因子、およびＰ因子、補体成分Ｃ１〜９、抗体で感作したヒツジ赤血球およびコブラ毒因子は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。
【０４０９】
（結果）
高度な食細胞の集団上でのＣＲＩｇの発現によって、本発明者らは、ＣＲＩｇがオプソニン化粒子の結合に関与しているかどうかを詳しく研究するように駆り立てられた。補体およびＦｃ受容体は、食作用を媒介することが明らかにされている（Ａｄｅｒｅｍ  ａｎｄ  Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：５９３−６２３（１９９９），Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｏｚｉｎｓｋｙ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：８２５−８５２（２００２）にまとめられている）。ＣＲＩｇが補体Ｃ３に結合するかどうかを決定するために、ウサギＩｇＧ（Ｅ−ＩｇＧ）またはマウスＩｇＭ（Ｅ−ＩｇＭ）のいずれかでコーティングしたヒツジ赤血球を、Ｃ３またはＣ５欠損ヒト血清の存在下でＣＲＩｇＬを発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株とともにロゼット形成するそれらの能力について分析した。ＣＲＩｇ（Ｌ）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（しかし、対照Ｊｕｒｋａｔ細胞はそうではない）はＣ３の存在下（Ｃ３＋）でＥ−ＩｇＭとともにロゼットを形成したが、Ｃ３が存在しない条件（Ｃ３−）では形成しなかった（図５２Ａ）。ＩｇＧでオプソニン化したＥｓは、Ｊｕｒｋａｔ  ＣＲＩｇ細胞と共にロゼットを形成することはなかったので、ＣＲＩｇは、Ｆｃ受容体によって媒介される結合には関係していないようであった（結果は示さない）。
【０４１０】
ＣＲＩｇが細胞表面上の補体成分に直接結合できるかどうかを試験するために、ＣＲＩｇのＥＣＤがヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたヒトＣＲＩｇの可溶性形態を作成した。ｈｕＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ−Ｆｃ融合タンパク質（しかし、対照Ｆｃ融合タンパク質はそうではない）は、Ｃ３の存在下ではオプソニン化されたＥ−ＩｇＭに結合したが、Ｃ３が存在しない条件では結合しなかった（図５２Ｂ）。結合は、Ｃ３欠損血清を精製したヒトＣ３で再構成すると回復した。Ｖ型Ｉｇドメインが結合に十分であった。なぜなら、ｈｕＣＲＩｇ（Ｓ）−ＦｃとｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃはいずれも、Ｅ−Ｉｇｍに結合できたからである（結果は示さない）。
【０４１１】
酵素反応のカスケードを誘導する補体活性化の結果として、Ｃ３は、その複数の崩壊産物Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄｇ、およびＣ３ｄ（これらのそれぞれがＣＲＩｇの結合パートナーとしての役割を担うことができる）に切断される。プレートに結合させたＥＬＩＳＡを使用した場合には、ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）およびｈｕＣＲＩｇ（Ｓ）−Ｆｃは（しかし、対照Ｆｃはそうではない）Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂに対する飽和性結合を示した（図５２Ｃ）が、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｃ、またはＣ３ｄに対する結合は示さなかった（データは示さない）。同様の結合が、ｈｕＣＲＩｇＬ−ＥＣＤ（Ｆｃ部分が欠失している）およびｍｕＣＲＩｇ−Ｆｃについても観察され、ｉＣ３ｂに対する結合はＣ３ｂに対する結合よりも大きかった（結果は示さない）。逆に、可溶性Ｃ３ｂはまた、プレートをコーティングしたｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−Ｆｃにも結合し、ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）−ＥＣＤと競合した（結果は示さない）。したがって、ＣＲＩｇは、溶液中で、または、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂが基質に結合している場合には、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂに結合することができる。Ｃ３ｂは、細胞表面に蓄積した場合には多量体形態として存在するので、人工的にアセンブリされたＣ３ｂ二量体（Ｃ３ｂ２）に対するＣＲＩｇの結合をさらに評価した。Ｃ３ｂ２は、表面プラズモン共鳴によって測定すると、ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）に対しては１３１ｎＭのＫｄで（図５２Ｄ）、そしてｈｕＣＲＩｇ（Ｓ）に対しては４４ｎＭのＫｄで結合した（図５２Ｄ）。
【０４１２】
これらの生化学的研究を補うために、本発明者らは、Ｃ３に由来する産物に対する細胞表面ＣＲＩｇの結合特異性を評価した。Ａ４８８標識のＣ３ｂ２の二量体形態は、ＣＲＩｇ＋の表面に結合したが、ＣＲＩｇ−、ＴＨＰ−１細胞には結合しなかった（図５２Ｅ）。結合は特異的であった。なぜなら、これは、可溶性の未標識のＣ３ｂ２、Ｃ３ｂ単量体、およびｈｕＣＲＩＧ（Ｌ）−ＥＣＤの添加によって競合されたが、自然界に存在しているＣ３によっては競合されなかったからである。可溶性の補体断片に対する結合に加えて、ＣＨＯ細胞株の表面で発現されたｍｕＣＩｇはまた、Ｃ３十分血清中の（しかし、Ｃ３欠損血清ではそうではなかった）オプソニン化された種々の粒子にも結合した（図５１Ｂ）。まとめると、これらの実験は、ＣＲＩｇが細胞表面で発現されること、さらに、可溶性ＣＲＩｇ（ＣＲＩｇ−ＦＣ）がｉＣ３ｂおよびＣ３ｂの受容体であることを示している。
【０４１３】
（実施例１９）
（クップファー細胞でのＣＲＩｇの発現は粒子に結合したＣ３断片の結合に不可欠である）
（材料および方法）
（１．ＣＲＩｇノックアウト（ｋｏ）マウスの生成）
全ての動物を、滅菌した病原体を含まない条件で飼育し、そして動物実験は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの研究機関の動物管理使用委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。ＣＲＩ  ｇｋｏの胚性幹細胞を、ネイマイシン耐性遺伝子でエキソン１が置き換えられている直鎖状の標的化ベクター（図５３Ａ）の、Ｃ２Ｂ６胚性幹（ＥＳ）細胞へのエレクトロポレーションによって生成した。ネオマイシン耐性クローンを選択し、相同組換えをサザンブロッティングによって確認した。スクリーニングした１００個のクローンのうちの７個が相同組換えについてポジティブであった。２つの標的化クローンを、Ｃ５７ＶＬ／６胚盤胞に注入し、偽妊娠させた里親に移し、そして得られた雄のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌と交配させて、＋／−マウスを得た。生殖細胞系伝達を、Ｆ１子孫に由来する尾ＤＮＡのサザンブロット分析によって、クローニングした２ＥＳについて確認した（図４２Ｂ）。＋／−マウスの異種交配を、−／−ＣＲＩｇマウスを作成するために行った。２つのクローンの表現形は同じであった。ＰＣＲ法による日常的に行われる遺伝子型分類のために、共通のセンスプライマー５’−ＣＣＡＣＴＧＧＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴ−３’（配列番号２２）および野生型特異的アンチセンスプライマー（５’−ＣＡＣＴＡＴＴＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡ−３’）（配列番号２３）およびノックアウト特異的アンチセンスプライマー（５’−ＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴ−３’）（配列番号２４）を使用して、野生型対立遺伝子についての３０６ｂｐの断片と、変異体対立遺伝子についての４０６ｂｐの断片を増幅した。Ｃ３  ｋｏマウスの作成は以前に記載されている（Ｎａｕｇｈｔｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３０５１−３０５６（１９９６））。ＣＲＩｇ／Ｃ３二重ノックアウトマウスを作成するために、混合ｓ１２９／Ｂ６バックグラウンドを有しているＣ３  ｋｏマウス（Ｆ２）を、ＣＲＩｇ  ｋｏマウスと交配させた。いずれの対立遺伝子についてもヘテロ接合型であるＦ１雌を、その後、ＣＲＩｇ対立遺伝子について半接合型のＣ３ヘテロ接合型の雄と交配させた。この交配による子孫を実験に使用した。フローサイトメトリーによるＣＲＩｇの発現の分析に使用したＣ５７Ｂ６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入した。
【０４１４】
（２．ウェスタンブロッティングと脱グリコシル化）
ヒトおよびマウスのマクロファージを、１％のＳＤＳ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびプロテアーゼ阻害因子混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含むＰＢＳ中で溶解させた。１０，０００ｇでの遠心分離の後、可溶性画分をＳＤＳゲル上で泳動し、そしてニトロセルロース膜に移動させた。ＣＲＩｇタンパク質を、抗ＣＲＩｇ抗体およびＨＲＰＯ結合二次抗体を使用して視覚化し、その後、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって結合した抗体の化学発光の検出を行った。ＣＲＩｇのグリコシル化状態の決定のために、ＣＲＩｇ−ｇＤを発現する細胞を、抗ｇＤ抗体で免疫沈降させ、製造業者の説明書（Ｂｉｏｌａｂｓ，ＮＥ）にしたがってＰＮＧａｓｅ、Ｏ−グリコシダーゼ、およびノイラミニダーゼで処理し、そしてビオチニル化抗ｇＤ抗体を使用してウェスタンブロット分析を行った。
【０４１５】
（結果）
ＣＲＩｇの生物学的機能を研究するために、ＣＲＩｇ遺伝子にヌル変異を有しているマウスを、上記および図４２Ａに示したように、相同組換えによって作成した。欠失をサザンブロッティング（図５３Ｂ）、抹消浸出細胞溶解物のウェスタンブロッティング（図５４Ａ）、およびフローサイトメトリー（図５４Ｂ）によって確認した。マウスは予想されたメンデル比で生まれ、そして全体的な表現形または組織病理学的異常は示さなかった。種々のリンパ区画での免疫細胞の絶対数は、ｗｔ動物およびｋｏ動物に由来する血液、脾臓、およびリンパ節において同様であった（図５３Ｃ）。加えて、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学によってそれぞれ分析した場合にも、Ｆ４／８０＋ＫＣおよび心臓マクロファージの数には差は見られなかった（結果は示さない）。ＣＲ３のα鎖およびβ鎖、ならびに、ＫＣでの補体受容体関連遺伝子ｙ（Ｃｒｒｙ）を含むタンパク質を含む他の成分の発現レベルは変わらなかった（図５４Ｃ）。同様に、ＣＲ１、ＣＲ２、またはＣＤ１１ｃ、ＣＲ４のβ鎖の低い発現または検出不可能な発現は、ｗｔ  ＫＣとｋｏ  ＫＣとの間では同等であった（図５３Ｄ）。
【０４１６】
次に、Ｃ３分解産物に対するＣＲＩｇ  ｗｔ  ＫＣおよびＣＲＩｇ  ｋｏ  ＫＣの結合能力を試験した。Ｃ３断片（Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂ２、およびｉＣ３ｂ）は、ＣＲＩｇ  ｗｔ  ＫＣの表面に容易に蓄積した（図５４Ｂ）。対照的に、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂ２、ｉＣ３ｂ、またはｉＣ３ｂ２の結合はＣＲＩｇ  ｋｏ  ＫＣでは検出されなかった。ｗｔ  ＫＣまたはｋｏ  ＫＣのいずれかに対するＣ３およびＣ３ｃのわずかな結合または結合がないことが検出された（図５３Ｅ）。
【０４１７】
可溶性Ｃ３断片の結合から細胞表面に結合したＣ３断片の結合までに分析を広げるために、Ｃ３オプソニン化ＩｇＭでコーティングした赤血球に結合するためのＫＣでのＣＲＩｇの役割を試験した。ＣＲＩｇ  ｋｏ  ＫＣは、ＣＲＩｇ  ｗｔ  ＫＣと比較すると、Ｅ−ＩｇＭのロゼット形成において約６０％の減少を示した（図５４Ｄ）。ＣＲ３は、ロゼットの形成におけるさらなる減少（＜２０％）が、ＣＲ３ブロッキング抗体を添加した場合に観察されたので、結合活性全体に対して小さい関与があった。したがって、ＣＲＩｇの発現は、クップファー細胞に対するＣ３オプソニン化粒子およびＣ３分解産物の結合に不可欠である。
【０４１８】
（実施例２０）
（ＣＲＩｇは再利用されているエンドソームにてインターナライズし且つ発現される）
その受容体に対するＣ３オプソニン化粒子の結合によって、それらのその後のエンドサイトーシスを誘発することができるので（Ｆｅａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：１６１５−１６２８（１９８１）；Ｓｅｎｇｅｌｏｖ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１０７−１３１（１９９５））、Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素を抑えるポリクローナル抗体（Ａｕｓｔｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５：５２６８−５２８２（２００４））を使用して、ＣＲＩｇおよびＣ３ｂがＫＣ中にインターナライズするかどうかを分析した。Ａ４８８結合抗ＣＲＩｇ  ｍＡｂを、ＫＣとともに４℃でプレインキュベートした。４℃での抗Ａ４８８抗体の添加によって、図４７Ａ、パネル１に示すように、表面に結合した抗ＣＲＩｇ抗体の蛍光が抑えられた。Ａ４８８結合抗ＣＲＩｇ  ｍＡｂをＫＣと共に３７℃で３０分間インキュベートし、その後、抗Ａ４８８抗体とともにインキュベーションした場合には、蛍光は抑えられず（図５５Ａ、パネル４）、これは、４℃から３７℃に細胞が移動すると抗ＣＲＩｇ抗体がインターナライズし、したがって、抑えられている抗Ａ４８８抗体に接近することができなかったことを示している。同様の結果が、Ｃ３ｂについても見られた（図５５Ａ、パネル３および６）。抗ＣＲＩｇ抗体のインターナライゼーションは、Ｃ３の存在とは無関係であった。なぜなら、抗体の取り込みは、Ｃ３  ｋｏマウスから単離したＫＣで（図５５Ａ、パネル２および５）、および血清が存在しない条件下で（結果は示さない）起こったからである。免疫組織化学によって、さらに、ＣＲＩｇ  ｗｔマウス（しかし、ｋｏマウスはそうではない）に由来するＫＣの細胞質中での抗ＣＲＩｇ抗体およびＣ３ｂの存在を確認した（図５５Ｂ）。長い時間をかけて、Ａ４８８結合抗ＣＲＩｇ抗体でコーティングしたＫＣを、細胞外抗Ａ４８８抗体の存在下でインキュベートし、経時的な蛍光の減少を観察した。これは、抗ＣＲＩｇ抗体が、細胞表面に再利用されて戻されることを示唆している（図５５Ｃ）。再利用の時間経過もまた、Ｃ３とは無関係であった。なぜなら、抑制の速度論は、Ｃ３の存在下およびＣ３が存在しない条件と同様であったからである（データは示さない）。対照的に、リソソームタンパク質Ｌａｍｐ１に対する抗体は細胞内に留まったままであり、時間とともに減少することはなかった。これらの結果は、ＣＲＩｇが、構造的に再利用されている膜のプール上に存在するＣ３ｂについての受容体としての役割を担っていることを示している。
【０４１９】
ＣＲＩｇが再利用される細胞内区画をさらに決定するために、ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を、再利用されているエンドソームのマーカーとしてトランスフェリンを、そしてエンドソームのマーカーとしてＬａｍ１を使用して、デコンボリューション顕微鏡を使用して視覚化した。７日間培養したＭＤＭは、ｈｕＣＲＩｇ（Ｌ）の細胞外ドメインと競合することができるＣ３ｂの飽和結合を示す（図５５Ａ）細胞の６０％の上でＣＲＩｇを発現していた（データは示さない）。４℃で抗ＣＲＩｇ抗体でコーティングしたマクロファージは、Ｆアクチンを多く含むｆｉｌｏｐｏｄｉａｌの伸張において局所的なＣＲＩｇの発現を示した（矢印の先、図５６Ａ、パネル１〜３）。加えて、ＣＲＩｇ抗体は、細胞表面にＣ３ｂと一緒に局在化していた（結果は示さない）。４℃から３７℃への細胞の移動、その後の３７℃で１０分間のインキュベーション（図５６Ｂ）によっては、ＣＲＩｇ抗体およびＣ３ｂの、細胞の周辺に存在しているトランスフェリン＋エンドソーム区画へ（図５６Ｂ、パネル１〜４、矢印）、そして、Ｌａｍｐ１＋区画の縁（矢印、図５７Ｄ，パネル１〜４）の迅速なインターナライゼーションが生じた。ＣＲＩｇは、エンドソーム区画に局在化したままであり、２４時間までの追跡時間の間にリソソーム中では分解されなかった（結果は示さない）。抗ＣＲＩｇ抗体とのマクロファージのインキュベーションによっては、ＣＲＩｇの分布には影響はなかった。なぜなら、インターナライズしたＣＲＩｇ抗体は、ポリクローナル抗体での固定後に検出されたＣＲＩｇの全てのプールと完全に重複しており（図５７Ｃ、パネル１〜３）、そして、媒体中のＣ３の存在とは無関係であるからである（図５７Ｃ、パネル４）。まとめると、これらの結果は、ＣＲＩｇが再利用されている初期のエンドソームに存在していること、そしてＣＲＩｇのインターナライゼーションがリガンドまたは架橋抗体が存在しない条件下で起こることを示している。
【０４２０】
Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂの大部分は血清に曝された粒子上に蓄積したので（Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７６−８２（１９９１））、次に、本発明者らは、Ｃ３オプソニン化粒子の食作用の間の、マクロファージでのＣＲＩｇポジティブエンドソームの局在化を研究した。ｉＣ３ｂオプソニン化ヒツジ赤血球（Ｅ−ＩｇＭ）と遭遇すると、ＣＲＩｇは迅速に（１０分）、トランスフェリンポジティブベシクルから、飲み込まれた赤血球の周囲の環として見ることができるファゴソームを形成するように再分布する（図５６Ｃ、パネル１および４、矢印）。Ｃ３オプソニン化粒子とのマクロファージのインキュベーションの２時間後、ファゴソームは、リソソーム区画へのそれらの移動によって示されるように十分に成長した（図５６Ｃ、パネル５〜８）。ＣＲＩｇは、Ｃ３オプソニン化粒子を取り囲むファゴソーム膜で高度に発現されており（図５６Ｃ、パネル５および８、矢印）、そしてほとんどのマクロファージにおいては、もはや、トランスフェリン＋エンドソーム区画にはなかった。ＣＲＩｇはリソソーム区画のファゴソームのサブセットに存在したままであったが、その発現は、ＬＡＭＰ−１と重複してはいなかった（図５６Ｃ、パネル７および８、矢印の先）。ＬＡＭＰ−１＋膜にＣＲＩｇが存在しないことは、ＣＲＩｇのリソソームの分解の結果の結果ではないようであった。なぜなら、プロテアーゼ阻害因子は、インキュベーションの間継続して存在していたからである。Ｅ−ＩｇＭを取り込んでいるが、ＣＲＩｇ＋ファゴソームを欠失しているマクロファージのいくつかにおいては、ＣＲＩｇ＋はトランスフェリン＋区画と一緒に局在化しており（太い矢印、図５６Ｃ５、パネル５および８、太い矢印）、これは、ＣＲＩｇ＋がリソソーム区画へのＥ−ＩｇＭの移動後に再利用される区画に戻ることを示唆している。
【０４２１】
まとめると、これらの結果は、ＣＲＩｇがエンドソームから粒子の飲み込み部位に動員され、そしてファゴソームの形成の最初の段階に関与していることを示しているが、ファゴソーム−リソソーム融合が生じるとファゴソームから脱出してエンドソーム区画に戻ることを示している。
【０４２２】
（実施例２１）
（ＣＲＩｇを欠失しているマウスは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に感染しやすい）
（材料および方法）
（１．マウスの微生物感染、およびＣＦＵ数の決定によるリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）増殖の評価）
感染性リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ））（ＡＴＣＣ４３２５１株）を全ての実験に使用した。細菌の病原性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの連続継代によって維持した。新しい単離物は感染させた脾臓から得、ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ（液体）またはｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎプレート（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で増殖させた。細菌を繰り返し洗浄し、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁し、その後、４０％のグリセロールを含むＰＢＳ中の小さいアリコートで−８０℃で保存した。マウスには、種々の用量のリステリア・モノサイトゲネスを尾静脈に静脈内接種した。種々の臓器での細菌増殖の観察のために、本発明者らは、致死量ではない１×１０４のコロニー形成単位（ＣＦＵ）のリステリアを、ＣＲＩｇ  ｋｏマウスまたはＣＲＩｇ  ｗｔマウスのいずれかに静脈内注射した。接種材料において、肝臓および脾臓のホモジネートにおいて、ならびに感染させた細胞において生存している細菌の数を、ｂｒａｉｎ−ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）プレート上に１０倍段階稀釈物をプレーティングすることによって決定した。ＣＦＵの数を、３７℃で２４時間のインキュベーションの後でカウントした。
【０４２３】
（２．クップファー細胞でのリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）−Ａ４８８の取り込みの決定）
生存しているリステリア・モノサイトゲネスを、製造業者の説明書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）にしたがってＡ−４８８標識キットで標識した。標識手順の後で生存しているリステリアの数を、コロニーカウントによって評価した。ＣＲＩｇ  ｗｔまたはＣＲＩｇ  ｋｏマウスに、１０００万ＣＦＵ  ＬＭを静脈内注射した。１時間後、肝臓を潅流させ、クップファー細胞を上記の方法にしたがって単離した。細胞を、Ｆ４／８０に対するＰＥ標識抗体で染色し、ポジティブ細胞を、抗ＰＥビーズ（Ｍｉｌｅｔｎｙｉ）を使用し、その後、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）を用いて選別することによって単離した。Ｆ４／８０ポジティブ細胞をカバースライドにて回収し、インターナライズした標識細菌の数を、共焦点光学顕微鏡を使用して概算した。細胞あたりの細菌の数を、１枚のスライドについて４つの視野に由来する４００個の細胞でカウントした。食作用指数を、少なくとも１つの細菌を含むクップファー細胞の割合と細胞あたりの細菌の平均数とを掛け算することによって計算した。結果は、４種類の動物から得た食作用指数の平均および標準偏差を示す。
【０４２４】
（結果）
Ｃ３ｂ／ｉＣ３ｂオプソニン化粒子に対するＣＲＩｇの結合に基づいて、インビボでの補体オプソニン化粒子の食作用におけるＣＲＩｇの役割を研究するために、ＣＲＩｇ  ｗｔマウスおよびＣＲＩｇ  ＫＯマウスを、グラム陽性通性細菌である種々の用量のリステリア・モノサイトゲネス（ＬＭ）（これは、血清に曝されると、細菌表面上にＣ３ｂおよびｉＣ３ｂを優先的に蓄積させる代替補体経路を活性化させる（Ｃｒｏｉｚｅら、Ｉｎｆｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：５１３４−５１３９（１９９３）））に感染させた。ＣＲＩｇ  ＫＯマウスは、高い致死率に示されるように、明らかにＬＭに感染しやすかった（図５８Ａ）。逆に、ＣＲＩｇ−Ｉｇ融合タンパク質での事前の処置によっては、ＣＲＩｇ
ｗｔマウスの感度が高くなったが、ＣＲＩｇ  ｋｏマウスはそうではなかった（図６２）。
【０４２５】
補体Ｃ３オプソニン化粒子の結合および食作用におけるＣＲＩｇの役割と一致して、ＣＲＩｇ  ｋｏマウスは、脾臓および肺での高いＬＭ負荷を生じる、血液からのＬＭのクリアランスが減少していた（図５８Ｂ）。感染したマウスの肝臓および心臓でのＬＭ負荷もまた減少しており、これはおそらく、これらの組織でのＣＲＩｇを発現するマクロファージの存在を反映している（図５８Ｂ）。炎症応答はＣＲＩｇ  ｋｏマウスにおいて上昇しており、これは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６の血清濃度の増加によって反映されていた（図５８Ｃ）。Ｏ３オプソニン化粒子のクリアランスにおけるＣＲＩｇの必要性と一致して、ＣＲＩｇ  ｋｏ  ＫＣは、ＣＲＩｇ  ｗｔ  ＫＣと比較すると、ＬＭの結合および食作用の有意な減少を示した（図５８Ｄ）。最後に、ＣＲＩｇ  ｋｏマウスの血液中で検出された高いリステリア負荷量は、Ｃ３  ｋｏマウスの感染によってＣＲＩｇ
ｗｔマウスに対するＣＲＩｇ  ｋｏマウスにおける細菌力価の差が撤回されるので、Ｃ３に依存していた（図５８Ｅ）。興味深いことに、細菌の循環レベルは、Ｃ３十分マウスと比較するとＣ３  ｋｏマウスにおいては有意に低く、これはおそらく、Ｃ３  ｋｏマウスにおけるリステリアのクリアランスを担っているＣ３依存性機構の関与の増大を反映している。しかし、Ｃ３が存在しない条件下での迅速なクリアランスは、Ｃ３欠損マウスがグラム陽性細菌による感染後２日以内に死亡するので、長期間にわたる十分な病原体の排除は生じなかった（Ｃｕｎｎｉｏｎら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１４３：３５８−３６５（２００４））。これらの結果は、肝臓のクップファー細胞で発現されたＣＲＩｇが、循環からの補体Ｃ３オプソニン化病原体の迅速なクリアランスにおいて重要な役割を担っていることを強く示している。
【０４２６】
（実施例２２）
（ｈｕＣＲＩｇ分子での補体媒介性免疫溶血反応の阻害）
ウサギ赤血球が代替補体経路を特異的に活性化し、これによってＣ５ｂ−９複合体による細胞の溶解を生じることは十分に確立されている（Ｐｏｌｈｉｌｌ，ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１（１）、３６３−３７０（１９７８））。具体的には、ウサギ赤血球は、代替補体経路のカスケードを開始させ、そしてそれによって生じるＭＡＣの形成によってこれらの細胞の溶解を引き起こす。試験化合物が代替補体経路を阻害できる場合は、血清中でバッチ処理したウサギ赤血球に対する試薬の添加（この場合は、カニクイザルの血清中、またはヒトＣ１ｑ枯渇血清中）は、細胞の溶解を妨げるはずである。これは、溶解された赤血球からのヘモグロビンの放出によって生じる４１２ｎｍの波長での光の吸光度の変化をモニターすることによってアッセイすることができる。ｃｙｎｏ血清実験では、血液をカニクイザルの大体静脈から回収した。抗凝固剤は使用しなかった。試料を室温で凝固させた。試料を遠心分離し、血清を回収し、そして−６０〜−８０℃を維持するうように設定した冷凍庫で保存した。ウサギ赤血球（ＲＲＢＣ）を、ＧＶＢ（１×ベローナル緩衝液（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、０．１％のゼラチン）で３回洗浄し、そしてＧＶＢ中に１×１０９／ｍｌとなるように再度懸濁させた。ＧＶＢ、ｈｕＣＲＩｇ（ｓｈｏｒｔ、ｌｏｎｇ、またはｌｏｎｇ  ＥＣＤ）を添加し、その後、１０μｌのＧＶＢ＋／ＥＧＴＡ（ＧＶＢ、０．１ＭのＥＧＴＡ、０．１ＭのＭｇＣｌ２）を添加した。１０μｌのｃｙｎｏまたはＣ１ｑ枯渇血清（Ｑｕｉｄｅｌ）を添加し、その後、１０μｌのＲＲＢＣを添加し、混合物を指ではじくことによって混合した。震盪させながら温室にて３７℃で４５分間のインキュベーションの後、２５０μｌのＧＶＢ／１０ｍＭのＥＤＴＡを添加し、混合物を２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。２５０μｌのアリコートを使用して４１２ｎｍで読み取った。図６３ＡおよびＢ（ｃｙｎｏ血清）、ならびに図６４〜６６（ヒト血清）に示す結果は、試験したＣＲＩｇ化合物が補体ｈＳＴ−Ｌ：ヒトＣＲＩＧ−ｌｏｎｇを阻害したことを示している
ｈＳＴ−Ｓ：ヒトＣＲＩｇ−ｓｈｏｒｔ
ｈＳＴ−Ｌ  ＥＣＤ：ヒトＣＲＩｇ−ｌｏｎｇ  ＥＣＤ
ｈＰＩＧＲ：ヒト多量体免疫グロブリン受容体
ｆＨ：補体因子Ｈ
（実施例２３）
（脈絡膜血管新生のマウスモデルでのマウスＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質の試験）
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、網膜にレーザーによる火傷を生じさせることによって、実験的に誘導することができる。本実験では、４０匹のＣ５７ＢＬ−６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を２つの処置アームに分けた。
【０４２７】
グループ１（対照）：−１日目、１日目、３日目、および５日目に、１２ｍｇ／ｋｇのｇｐ１２０  ｍＩｇＧ１をｉ．ｐ．注射。
【０４２８】
グループ２：−１日目、１日目、３日目、および５日目に、１２ｍｇ／ｍｌのマウスＣＩＲｇ（ｍＣＲＩｇ）をｉ．ｐ．注射。
【０４２９】
それぞれのアームにおいて、動物を、ケタミン（２５ｍｇ／ｇ）とキシラジン（１．２８ｍｇ／ｇ）との混合物の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって麻酔した。瞳孔を、１滴の１％のトロピカミドを使用して広げた。その後、動物をプラスチック製の型に固定した。ダイオードレーザー（１００μｍの孔の大きさ）を使用して、ＯｃｕＬｉｇｈｔ  ＧＬ  Ｄｉｏｄｅ  Ｌａｓｅｒ（５３２ｎｍ）、Ｚｅｉｓｓ  ３０Ｗスリットランプ、およびマイクロマニピュレーターを使用して、視神経の周囲に、眼の中に３個のレーザーをあてるスポットを作った。右目には、１２０ｍＷ、０．１秒、および１００μｍのスリットの大きさでレーザーを照射した。レーザースポットに生じた泡は、ブルーフ膜（Ｂｒａｃｈ’ｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）の破裂を示している。
【０４３０】
レーザースポットを、レーザー処置の７日後に、共焦点顕微鏡を使用して評価した。この時点で、動物をイソフルランで麻酔し、５０ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン標識デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を含む０．５ｍｌのＰＢＳで心臓から潅流させた。眼を取り出し、１０％のリン酸緩衝化ホルマリンに固定し、網膜を廃棄し、そして残ったアイカップ（ｅｙｅ  ｃｕｐ）を、スライド上に平坦になるように固定した。組織病理学的試験には、補体断片およびエラスチンについての脈絡膜の平坦に固定したものの免疫組織化学染色と、共焦点顕微鏡によって眼のＦＩＴＣ−デキストラン染色された血管をモニターすることによるＣＮＶ複合体の大きさの分析とを含めた。
【０４３１】
結果を、図７１ＡおよびＢに示す。ここでは、右目の火傷の孔を、それぞれ、０〜３および０〜５の目盛りでスコアした。
【０４３２】
（実施例２４）
（レーザーで誘導した網膜の損傷を受けたカニクイザルでのＣＲＩｇ  ＥＣＤおよびＣＲＩｇ−Ｆｃ融合タンパク質の試験）
２４匹のカニクイザル（雄または雌のいずれかであり、１２匹の雄と１２匹の雌）を、この実験で使用した。動物は、２〜７歳齢であり、２〜５ｋｇであった。
【０４３３】
【化８】
2011246495.tif 000010
投与は、橈側皮静脈からの静脈内注射である。動物に、レーザー処理の前に少なくとも１回投与し、残りの実験の間には、１週間に３回投与した。用量は最近に記録された体重に基づき、１０〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０４３４】
４日目に、全ての動物のそれぞれの眼の斑点に、スリットランプ送達システムとＫａｕｆｍａｎｎ−Ｗａｌｌｏｗ（Ｏｃｕｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ，Ｂｅｌｌｅｖｕｅ，Ｗａｓｈ）ｐｌａｎ  ｆｕｎｄｕｓコンタクトレンズとを使用して、５３２ｎｍのダイオードグリーンレーザーバーン（ｄｉｏｄｅ  ｇｒｅｅｎ  ｌａｓｅｒ  ｂｕｒｎｓ）（ＯｃｕＬｉｇｈｔ  ＧＬ，ＩＲＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐ  Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ
Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、ＣＯＲＬによってレーザー処理を行った。レーザーおよび支持装置はＣＯＲＬより供給された。動物を、ケタミンとキシラジンとで麻酔した。９個の領域を、それぞれの眼の斑点にて対称に配置した。レーザーのパラメーターには、７５ミクロンの孔の大きさ、および０．１秒の持続期間を含めた。使用した電力（ｐｏｗｅｒ）を、水疱および小さい出血を生じるそれらの能力によって評価した。出血が最初のレーザー処理によっては観察されない場合には、第２のレーザースポットを、同じレーザー手順にしたがって（ワット量を調整したことを除く）最初のスポットの近くに置いた。小さなくぼみに隣接していない領域については、最初の電力の設定を５００ｍＷとし、第２のスポットを置く場合には、電力を６５０ｍＷに設定した。小さなくぼみに隣接している領域については、電力の設定を４００ｍＷ（最初）および５５０ｍＷ（２回目）とした。網膜の外科的判断時に、電力の設定を、レーザー処置の時点での観察に基づいて調整した。
【０４３５】
（臨床的な眼科的試験）
臨床的な眼科的試験を、処置の開始前に１回、そして８日目、１５日目、２２日目、および２９日目に、それぞれの動物について行った。動物をケタミンで麻酔し、眼を散瞳薬で開かせた。両方の眼の付属器および前方部分を、スリットランプ生体顕微鏡（ｂｉｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して試験した。両方の眼の眼底を、間接検眼鏡を使用して試験した。眼科医の判断で、眼を、他の適切な装置を使用して試験することができ、そして写真を撮影することができた。
【０４３６】
（眼の写真）
眼の写真（ＯＰ）を、レーザーでの処理の１日目（レーザー処置の後）、投与期１については１０日目、１７日目、２４日目、および３１日目、ならびに、投与期２については６日目（死体解剖の日）に撮影した。投与期１の間にフルオレセイン血管造影を同時に行った際に、ＯＰを初めに行った。
【０４３７】
フルオレセイン血管造影と同時に行った場合は、動物をケタミンで麻酔し、イソフルラン麻酔で維持し、そして単独で行う場合には、ケタミンとキシラジンとで麻酔した（すなわち、以下のレーザー処置）。眼を散瞳剤で開かせた。カラー写真をそれぞれの眼について撮影し、これには、網膜と関連する眼の異常、後極の立体写真、および２つの中央の周辺視野の非立体写真を含めた（側頭部と鼻）。
【０４３８】
（フルオレセイン血管造影法）
フルオレセイン血管造影法は、全ての動物について処置の開始前に１回、投与期１については、１０日目、１７日目、２４日目、および３１日目（レーザー照射後６日目、１３日目、２０日目、および２７日目）に行った。
【０４３９】
動物を、フルオレセイン血管造影の前に絶食させた。動物をケタミンで麻酔してイソフルランで維持し、そして眼を散瞳剤で開かせた。動物には、フルオレセインの注入後の嘔吐の可能性の理由から挿管した。動物に、フルオレセインの静脈内注射を投与した。フルオレセインの注射の開始時および終了時に写真を撮影した。フルオレセインの注射後、右眼の後極の一連の立体写真を迅速に撮影し、その後、１分以内に左目の後極の立体写真の対を撮影した。その後、それぞれの眼を、約１分から２分、および５分で撮影した。約２分から５分の間に、非立体写真を、それぞれの眼の２つの中央の周辺視野（側頭部と鼻）について撮影した。フルオレセインの漏れが５分の時点で観察された場合には、立体写真の対を約１０分で撮影した。
【０４４０】
フルオレセイン血管造影の評価を、過度の透過性（フルオレセインの漏れ）または任意の他の異常の証拠について以下の評点方式にしたがって行った。
【０４４１】
【化９】
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（材料の寄託）
以下の材料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），１０８０１，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｎ，ＶＡ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【０４４２】
【化１０】
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この寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約とその規制（ブダペスト条約）の規定のもとで行った。これによって、寄託日から３０年間の間、寄託した生存している培養物の維持が確実となる。寄託物は、ブダペスト条約の条項にしたがってＡＴＣＣによって入手することができ、そしてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＡＴＣＣの合意が得られる。これにより、該当する米国特許が発行されると、または任意の米国出願もしくは外国出願が出願公開されると、どれでも、まずそのような状態となりさえすれば、一般の人々が寄託された培養物の子孫を永久的に制限なく入手できることが確実となり、そして３５  ＵＳＣ’１２２とそれに続く委員会の規則（３７  ＣＦＲ（米国特許法施行規則）§１．１４を含む、特に、８８６  ＯＧ  ６３８を参照のこと）にしたがってそれらに与えられる、米国特許庁長官によって決定されるものの子孫を確実に入手できるようになる。
【０４４３】
本出願の指定代理人は、寄託された材料の培養物が、適切な条件下で培養されていても死滅してしまう、または失われてしまう、または破壊されてしまった場合には、通知されると速やかに、材料を同じ別のもので置き換えることに同意する。寄託された材料を利用できることは、その特許権にしたがっていずれかの関係官庁の当局のもとで、与えられた権利に違反して本発明を実施する許可とは解釈されない。
【０４４４】
本明細書中に記載した上の内容は、当業者が本発明を実施できるために十分であると考えられる。本発明は、寄託した構築物によって範囲が限定されることはない。なぜなら、寄託した実施形態は、本発明の特定の態様の１つの説明と意図され、機能的に同等である任意の構築物が本発明の範囲に含まれるからである。本明細書中の材料の寄託は、本明細書中に含まれる記載がその最良の態様を含む本発明の任意の態様の実施を可能にするには不十分であり、そしてまた、それが示す特定の説明に対して特許請求の範囲の範囲を限定するようにも解釈されないことの了解を構成するものでもない。
【０４４５】
実際、本明細書中に示され記載されるものに加えて、本発明の種々の改良が、上の記載から当業者に明らかとなり、添付される特許請求の範囲に含まれるであろう。
（配列表）
【数１】
2011246495.tif 000013
【数２】
2011246495.tif 000014
【数３】
2011246495.tif 000015
【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
2011246495.tif 000029
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
2011246495.tif 000080
【図４６】
2011246495.tif 000081
【図４７】
2011246495.tif 000082
【図４８Ａ】
2011246495.tif 000083
【図４８Ｂ】
2011246495.tif 000084
【図４９】
2011246495.tif 000085
【図５０】
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【図５１】
2011246495.tif 000087
【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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