(57)【要約】      （修正有）【課題】細菌病原体の分泌タンパク質及びそれらの使用法に関し、接着／破壊（Ａ／Ｅ）病変を引き起こすＡ／Ｅ病原体の新規な共通の分泌タンパク質を提供する。【解決手段】組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸を含むＡ／Ｅ病原菌に、該組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現させ、目的のポリペプチド分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、ＩＩＩ型抗原等、目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法。該ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸分子は、Ａ／Ｅ病原体感染に関するワクチン、及び診断または薬剤スクリーニングのツールとして有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、
（ａ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌を提供すること、
（ｂ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子によってコードされた組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現すること、
（ｃ）  目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含まないＡ／Ｅ病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、
を含む方法。
【請求項２】
前記目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件が、ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２０−１００ｍＭのＮａＨＣＯ３が添加された最小培地を含む細胞培養倍地中でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記最小培地に、５−１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１−１．５％のグルコース及び０．０５から０．５％カサミノ酸がさらに添加されていることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２−１０％のＣＯ２の存在中における、３７℃の温度でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、６００ｎｍで０．７−０．８の吸光度（ＯＤ）までＡ／Ｅ病原菌を培養することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２０−１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、５−１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１−１．５％のグルコース及び０．０５−０．５％のカザミノ酸が添加された最小培地を含む細胞培養培地中でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項８】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌の細胞培養上清を単離することをさらに含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、異種の又は非相同のもの（heterologous）であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、異種の又は非相同のものでないことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）に由来することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号８５にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドが、配列番号８６であるか、又は、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号８６にハイブリダイズする核酸分子によってコードされていることを特徴とする請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドが、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号５６をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされることを特徴とする請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記目的のポリペプチドが分泌ポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的のポリペプチドがＩＩＩ型抗原であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
目的のポリペプチドが、配列番号２４〜４３、７３〜７５を含むポリペプチド、Ｔｉｒ、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、及び、Ｍａｐポリペプチドを含む群から１つ以上選択されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ａ／Ｅ病原菌が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）細胞であることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌。
【請求項２０】
前記Ａ／Ｅ病原菌が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする請求項１９に記載のＡ／Ｅ病原菌。
【請求項２１】
目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、
（ａ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子をＡ／Ｅ病原菌に導入すること、
（ｂ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子によってコードされる組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現すること、
（ｃ）目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含まないＡ／Ｅ病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌病原体に関する。より具体的には、本発明は、部分的には、細菌病原体の分泌タンパク質及びそれらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌は極めて多方面的な（versatile）生物体である。正常な腸管内菌叢の一員であることに加えて、大腸菌はまた膀胱感染、髄膜炎、及び、下痢を引き起こす。下痢の大腸菌は、少なくとも５つの型の大腸菌を含み、それらの大腸菌はコレラ様の下痢から極度の大腸炎に及ぶ多様な症状を引き起こす。夫々の型の大腸菌は、付着、浸潤、及び／又は、毒素を含む病原因子の特定のセットを有し、それら特定のセットは特定の型の下痢を引き起こす原因となっている。
【０００３】
腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）は、世界的に、小児性下痢の主な原因となっている。ＥＰＥＣ病は、しばしば体液の喪失に付随する嘔吐及び発熱が生じ、重症度が変化する水下痢によって特徴付けられる。先進国のデイケア施設及び託児所において弧発的に発生するのに加え、ＥＰＥＣは途上国の幼い子供（６ヶ月未満）に対する固有の健康上の脅威を引き起こす主要な原因となっている。世界的に、ＥＰＥＣは、幼い子供における細菌仲介性下痢の第一級の原因であり、そして、ＥＰＥＣは年に数億人の子供達を死亡させていると概算されている。
【０００４】
腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）は、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）又はベロ毒素産生大腸菌（ＶＴＥＣ）とも呼ばれ、ＥＰＥＣ（腸内結腸炎）より更に重度の下痢を引き起こし、そして、凡そ１０％の患者においては、この疾病はしばしば致死的腎臓疾病すなわち溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）に進行する。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７はカナダ及び米国で最も一般的な血清型であり、そして食中毒及び水中毒と関係している（３）。他の血清型のＥＨＥＣもまた、アジア、ヨーロッパ、及び、南アメリカにおいて、並びに、北アメリカのより狭い範囲において、重大な問題を引き起こしている。ＥＨＥＣはウシにおいてコロニー形成（colonizes）しＡ／Ｅ病変を引き起こすが、成熟動物では疾病の原因とはならず、そして、代わりにその環境に生物体（organisms）を流す。しかしながら、これは、比較的少ない量のＥＨＥＣでヒトに感染するため、深刻な健康問題を引き起こす。
【０００５】
腸内毒素原性大腸菌のような他の大腸菌下痢と異なり、ＥＨＥＣ及びＥＰＥＣを原因とする下痢は毒素によって仲介されない。その代わり、ＥＰＥＣ及びＥＨＥＣは腸表面に結合し（ＥＰＥＣ小腸、ＥＨＥＣ大腸）、そして、接着／破壊（attaching and effacing）（Ａ／Ｅ）病変（８）と呼ばれる特徴的な組織学的病変を引き起こす。Ａ／Ｅ病変は、腸の刷子縁表面の溶解及び細菌付着部位における上皮性微絨毛の喪失（破壊）によって特徴付けられる。一旦結合すると、細菌は、カップ様突起又は台座上に位置し続ける。上皮細胞にある潜在的なこの台座は、アクチン及びアクチン関連細胞骨格タンパク質を含む幾つかの細胞骨格成分である。Ａ／Ｅ病変の形成及び付着細菌の下にあるアクチンリッチな台座はＡ／Ｅ病原体の組織病理学的特徴である（１、２）。この病理は、インビトロの培養細胞において再現され得、また、基礎形成は蛍光アクチン染色アッセイによって観察することが可能である（２、１１）。Ａ／Ｅ病変形成は、刷子縁及び微絨毛の破壊、液体分泌、並びに、下痢の原因となっているかもしれない。
【０００６】
ＥＰＥＣ及びＥＨＥＣはＡ／Ｅ病原体ファミリーに属しており、ウサギ（ＲＥＰＥＣ）、ブタ（ＰＥＰＥＣ）、及び、マウス（サイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium））において疾病を引き起こす幾つかのＥＰＥＣ様動物病原体を含んでいる。これらの病原体は、疾病にとって意味のある特定化した分泌システム及び分泌病原因子をコードする病原性島（ＰＡＩｓ）を含む。Ａ／Ｅ病変形成に必要な遺伝子は、腸細胞消失座位（ＬＥＥ）として知られる単一の染色体の病原性島において共にクラスタ形成していると考えられており、それは調節性エレメント、ＩＩＩ型分泌システム（ＴＴＳＳ）、分泌エフェクタータンパク質、及び、それらと同族のシャペロンを含む（４‐８）。
【０００７】
ＬＥＥは４１遺伝子を含み、さらに複雑なＰＡＩｓの１つを形成する。ＬＥＥ ＴＴＳＳの主な機能は、宿主細胞中にエフェクターを送達することであり、そこで、それらは宿主の細胞機能を撹乱しそして疾病を仲介する（９、１０、３４）。５つのＬＥＥコードエフェクター（Ｔｉｒ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＦ、Ｍａｐ、及びＥｓｐＨ）が同定されている（３５‐４０）。Ｔｉｒ（転位置インチミン受容体）は宿主細胞中に転位置し、そこで宿主の細胞骨格及び情報伝達タンパク質と結合し、そして細菌付着部位でアクチン重合を惹起し（３１、４４）、付着細菌下にアクチン基礎構造を形成させ、該細菌は細菌の外膜タンパク質インチミンを介してＴｉｒの細胞外ループと直接相互作用する。ＣｅｓＴはＴｉｒの安定と分泌におけるシャペロンとしての役割を担う（１８、１９）。
【０００８】
４つの他のＬＥＥコードＴＴＳＳ転位置エフェクターはＡ／Ｅ病原において特性付けられる：ＥｓｐＨはアクチン基礎の伸長を増強し（４０）；ＥｓｐＦは腸の上皮細胞間のタイトジャンクションの分解において役割を果たし（３８）；ＥｓｐＧは赤痢菌属微小管結合エフェクターＶｉｒＡと関係があり（３６、５５）；及び、Ｍａｐはミトコンドリアに局在化するが（３７）、アクチン動態における役割も有する（４８）。Ｌｅｒ（ＬＥＥコードレギュレーター）は、同定された唯一のＬＥＥコードレギュレーターである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、部分的には、Ａ／Ｅ病原体の幾つかの新規な共通の（common）分泌タンパク質の同定に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一つの態様において、ポリペプチド又はそれらの断片若しくは変異体を含む組成物、或いは、そのようなポリペプチドを含む細胞培養上清（但し、該実質的に純粋なポリペプチドは、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む）を提供する。本発明はまた、核酸分子を含む組成物（但し、該核酸分子は、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む）；及び、配列番号２２〜４３又はそれらの断片の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組成物をも提供する。前記組成物は、更に生理学的に許容し得る担体を含んでもよく、又は、更に生理学的に許容し得るアジュバントを含んでもよい。前記組成物はまた、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＰ、Ｔｉｒ、志賀毒素１、志賀毒素２、又は、イニチミンのようなポリペプチド又は核酸分子を含んでいてもよい。前記ポリペプチド又は核酸分子は、実質的に純粋で有り得る。
【００１１】
本発明はまた、別の態様において、細菌又はそれらの調製物（但し、該細菌は、ｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ、ｎｌｅＦ、ｎｌｅＧ、ｎｌｅＨ、又は、それらの相同体（ホモログ）のような遺伝子における変異を含むか、或いは、配列番号１〜２１又は６０〜７２と実質的に同一なヌクレオチド配列の細菌ゲノムにおける変異を含む）を提供する。ある実施形態において、前記細菌は、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ；例えば、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ；例えば、 ＥＰＥＣ Ｏ１２７：Ｈ６）、又は、サイトロバクター・ローデンティウムのようなＡ／Ｅ病原体で有り得る。ある実施形態において、前記変異は病原性を減弱させるものであってもよく、或いは、配列番号１〜２１又は６０〜７２から成る群より選択される配列と実質的に同一なＡ／Ｅ病原体ゲノムヌクレオチド配列中に生じるものであってもよい。前記細菌は、アジュバントと組み合わせた組成物として提供されてもよい。ある実施形態においては、前記細菌は生存していてもよい。ある実施形態においては、前記細菌は死滅していてもよい。投与様式は、経口又は非経口的で有り得る。
【００１２】
本発明はまた、別の態様において、試料の用意；並びに、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体から選択される配列と実質的に同一なヌクレオチド配列；配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４から選択される配列と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；又は、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体から選択される配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの検出（但し、該ヌクレオチド配列又は該アミノ酸配列の存在は、試料中、例えば、卵、糞便、血液又は腸におけるＡ／Ｅ病原体の存在を示している）による、試料中のＡ／Ｅ病原体の存在を検出する方法を提供する。前記検出は、配列番号１〜２１又は６０〜７２から成る群より選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの一部から成る群より選択される配列と実質的に同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と実質的に同一のプローブ又はプライマーと前記ヌクレオチド配列との接触を含んでいてもよく、或いは、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４、又は、それらの断片若しくは変異体から成る群より選択される配列と特異的に結合する抗体と前記アミノ酸配列との接触を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明はまた、別の態様において、Ａ／Ｅ病原体感染若しくは感染リスクのある動物を同定し、及び；該動物に有効量の組成物（但し、該組成物は、配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４４３の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４から選択される配列と実質的に同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；１‐２１又は６０‐７２の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を含む核酸分子；或いは、そのようなポリペプチドを含む細胞培養上清を含む）を投与することによる、Ａ／Ｅ病原体又はそれらの構成成分に対する免疫反応を惹起する方法、或いは、動物（例えば、ヒト；ヒツジ（ヒツジの対象）、ヤギ、ウシ（ウシの対象）などのような反芻動物；又は、任意の他の動物、例えばブタ、ウサギ、家禽（例えば、アヒル、ニワトリ、シチメンチョウ）など）におけるＡ／Ｅ病原体のコロニー形成又は脱粒を減少させる方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、別の態様において、Ａ／Ｅ病原体を用意し；及び、Ａ／Ｅ病原体におけるｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ、ｎｌｅＦ、ｎｌｅＧ若しくはｎｌｅＨ又はそれらの相同体のような遺伝子を変異させるか、又は、Ａ／Ｅ病原体のゲノムのヌクレオチド配列（但し、該ヌクレオチド配列は配列番号１〜２１又は６０〜７２から選択される）の１又はそれ以上を変異させることによって病原性を減少させるような、Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、別の態様において、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体から選択される配列と実質的に同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；又は、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つ又はそれ以上の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子、を含むシステム（系）（例えば、ＥＨＥＣ、ＥＰＥＣ若しくはＣ．ローデンティウム細胞のような細胞、動物モデル、又は、試験管内のシステム（系））を用意し；被検化合物を用意し；並びに、該被検化合物が、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌、又は、生物学的活性を調節するか否かを決定することによる、Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる化合物のスクリーニング方法を提供する（但し、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌又は生物学的活性における変化例えば減少は、該Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる化合物を示す）。
【００１６】
本発明はまた、別の態様において、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体から成る群より選択される配列と実質的に同一なポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列；又は、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子、を含む組換え細胞を用意し； 該ポリペプチドの発現及び／又は分泌が許容される条件下で該組換え細胞を増殖させ、及び、任意的に該ポリペプチドを単離することによる、Ａ／Ｅ病原体病原性因子を産生する方法を提供する。ある実施形態においては、前記ポリペプチドは、前記細胞から分泌されてもよい。
【００１７】
本発明はまた、別の態様において、Ａ／Ｅ病原体感染を有する又はそのリスクのある哺乳動物を同定し；及び、該哺乳動物に治療上有効量の該Ａ／Ｅ病原体病原性を減少させる化合物を投与する事（但し、該化合物は、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つと実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの前記発現又は分泌を抑制する）による、Ａ／Ｅ病原体感染を治療又は予防する方法を提供する。ある実施形態において、前記化合物は、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つと実質的に同一なヌクレオチド配列と相補的なアンチセンス核酸分子であってもよく、或いは、ｓｉＲＮＡであってもよい。
【００１８】
本発明はまた、別の態様において、配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む組換え型ポリペプチド、又は、単離された核酸分子、及び／又は、そのようなヌクレオチド配列を含むベクター；並びに、宿主細胞（例えば、そのようなベクターを含む、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウムのようなＡ／Ｅ病原体）を提供する。
【００１９】
別の態様において、本発明はまた、Ａ／Ｅ病原体又はそれらの構成成分に対する免疫反応を惹起させる、又は、動物においてＡ／Ｅ病原体のコロニー形成若しくは脱粒を減少させる医薬品の調製における、本発明に従った、該組成物、細菌、ポリペプチド、又は、該核酸分子の使用を、提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明はまた、試料中のＡ／Ｅ病原体を検出する試薬、及び、試料中の該Ａ／Ｅ病原体の検出に関する使用説明の添付文書とを含むキットを提供する。前記試薬は、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群から選択されるヌクレオチド配列、又は、配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、と実質的に同一なプローブ又はプライマーを含んでもよく、或いは、配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群より選択される配列に特異的に結合する抗体を含んでもよい。
【００２１】
「Ａ／Ｅ病原体」は、例えば、動物（例えば、哺乳動物―例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコなど、又は、トリ―例えばニワトリ、アヒル、シチメンチョウなど）の腸表面に結合する病原性の大腸菌病原であり、及び、接着／破壊（Ａ／Ｅ）病変と呼ばれる特徴的な組織学的病変を誘発する（８）。一般的に、Ａ／Ｅ病原体感染は、下痢、大腸炎、（溶血性尿毒症候群のような）腎臓疾病をもたらし得る。しかしながら、Ａ／Ｅ病原体の感染は、必ずしも疾患症状が明白である必要はない；Ａ／Ｅ病原体に感染した宿主哺乳動物は、該病原体のキャリアであって健康で疾病から免れたままでもよい。それゆえ、Ａ／Ｅ病原体に感染する又は感染リスクのある哺乳動物は、例えば、必ずしも疾病症状が明白ではない家禽動物（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル）若しくは反芻動物（例えばウシ、ヒツジ、ヤギなど）のような農業動物又は他の農業動物（例えばブタなどの動物）、並びに、Ａ／Ｅ病原体感染の結果として重篤な腸内疾病に感受性のあるヒトを含む。
【００２２】
模範的なＡ／Ｅ病原体には、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）（志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）又はベロ毒素産生大腸菌（ＶＴＥＣ）としても知られており、例えば、ＥＨＥＣ血清型０１５７（例えば、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７、それらのゲノム配列はアクセッション番号AE005594、AE005595、AP002566、AE 005174、NC_002695又はNC_002655において記載されている）、又は、０１５８、０５、０８、０１８、０２６、０４５、０４８、０５２、０５５、０７５、０７６、０７８、０８４、９１、０１０３、０１０４、０１１１、０１１３、０１１４、０１１６、０１１８、０１１９、０１２１、０１２５、０２８、０１４５、０１４６、０１６３、０１６５；腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）；並びに、マウス（例えば、サイトロバクター・ローデンティウム）；ウサギ（例えば、Ｏ１５：Ｈ‐のようなＲＤＥＣ‐１系統）；ブタ；ヒツジ；イヌ；及び、他の哺乳動物に感染する病原性大腸菌、を含むがこれらに限定されるものではない。Ａ／Ｅ病原体の多くの系統は、例えば、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（マナサス、バージニア州、米国）を通して、商業的に利用できる。Ａ／Ｅ病原体は、例えば、セフィキシム及びテルライト（tellurite）を添加されたソルビトールマッコンキー寒天上への直接プレーティング、又は、該培地へのプレーティングに続く免疫磁気濃縮によって、感染個体から単離されてもよい（７２、１０７、１０８）。
【００２３】
「タンパク質」、「ペプチド」、又は、「ポリペプチド」は、２又はそれ以上の任意のアミノ酸鎖であり、翻訳後修飾（例えば、糖鎖形成又はリン酸化）に関わりなく、天然又は非天然のアミノ酸又はアミノ酸類似体を含む。本発明の「アミノ酸配列」、「ポリペプチド」、「ペプチド」、又は、「タンパク質」には、異常な連鎖（結合）、クロスリンク及びエンドキャップ、非ペプチジル結合、又は、代替修飾基を有するペプチド又はタンパク質を含む。そのような修飾ペプチドも、本発明の範囲内にある。用語「修飾基」は、前記ペプチド性構造体に直接的に付着する（例えば、共有結合によって）、並びに、前記ペプチド性構造体に間接的に付着する（例えば、安定的な非共有結合性会合によって、又は、前記コアのペプチド性構造体に隣接していてもよい付加的アミノ酸残基又はそれらの模倣体（mimetic）、類似体若しくは誘導体への共有結合性結合によって）構造体を含むことを意図している。例えば、前記修飾基は、前記ペプチド性構造体のアミノ末端若しくはカルボキシ末端に、又は、前記コア領域に隣接したペプチド性若しくはペプチド模倣性領域に、結合し得る。或いは、前記修飾基は、ペプチド性構造体の少なくとも一つのアミノ酸残基の側鎖に、又は、前記コア領域に隣接したペプチド性若しくはペプチド模倣性領域に（例えば、リジル残基のεアミノ基を介して、アスパラギン酸残基若しくはグルタミン酸残基のカルボキシル基を介して、チロシル残基、セリン残基若しくはスレオニン残基のヒドロキシ基を介して、又は、アミノ酸側鎖上の他の好適な反応基を介して）、結合されてもよい。前記ペプチド性構造体へ共有結合された修飾基は、化学構造連結（例えば、アミド、アルキルアミノ、カルバミン酸、又は、尿素結合）のための当業者に周知された方法に従って、付着され得る。
【００２４】
用語「核酸」又は「核酸分子」は、ＲＮＡ（プラス及びマイナス鎖）、並びに、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び、合成（例えば化学合成された）ＤＮＡを含むＤＮＡを包含する。前記核酸は、二本鎖又は一本鎖で有り得る。一本鎖である場合、前記核酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖で有り得る。核酸分子は、２又はそれ以上の共有結合されたヌクレオチド（天然又は非天然のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体若しくは誘導体を含む）の任意の鎖で有り得る。「ＲＮＡ」は、２又はそれ以上の共有結合された、天然又は修飾されたリボヌクレオチドを意味する。本用語の範囲内に含まれる修飾ＲＮＡの一例は、ホスホロチオネートＲＮＡである。「ＤＮＡ」は、２又はそれ以上の共有結合された、天然又は修飾されたデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡ、又は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）の作用によりＲＮＡ鋳型から産生されたコピーＤＮＡを意味する。それゆえ、「ｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクターに保有された目的のＲＮＡ分子に相補的な二重鎖ＤＮＡ配列を意味する。「相補的」とは、二つの核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ、が該二つの核酸間で二重鎖領域を産生するためのワトソン‐クリック塩基対形成を成し得るのに十分な数のヌクレオチドを含む。それゆえ、ＤＮＡ又はＲＮＡの一方の鎖におけるアデニンは、反対側の相補的ＤＮＡ鎖におけるチミンと、又は、反対側の相補的ＲＮＡ鎖におけるウラシルと対をなす。核酸分子における各ヌクレオチドが、二重鎖を形成するために、反対側の相補鎖中のヌクレオチドと、対応した（matched）ワトソン‐クリック塩基対を形成する必要がないことが理解されよう。核酸分子は、高ストリンジェントな条件下で第二の核酸分子とハイブリダイズするのであれば、もう一方の核酸分子と「相補的」である。
【００２５】
本書で使用する場合、「細胞培養上清」とは、一般に、配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む１又はそれ以上のポリペプチド、或いは、それらの免疫原性部分を、細胞培養倍地中に分泌し得る培養中の細菌又は他の生物体（例えば酵母）又は細胞（例えば昆虫細胞）由来の上清を指す。ある実施形態において、前記細胞培養上清は、実質的に純粋すなわち実質的に細菌の細胞又はそれらの細胞の可溶化液からフリーである。ある実施形態において、前記細胞培養上清は、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ、インチミン、志賀毒素１若しくは２、又は、ＥｓｐＰポリペプチド、或いは、それらの断片又は凝集体の１又はそれ以上を含み得る。
【００２６】
前記細菌は、Ａ／Ｅ病原体―例えば、ＥＨＥＣ、ＥＰＥＣ又はサイトロバクター・ローデンティウム（該Ａ／Ｅ病原体は、ある実施形態においては、本書に記載されたタンパク質を優先的に発現又は分泌するように修飾又は変異させられていてもよい）であってよく、或いは、幾つかの他の細菌―例えば、非病原性細菌、例としてＨＢ１０１のような非病原性大腸菌又は非Ａ／Ｅ病原体（該他の細菌は、例えば組換え又は他の技術によって、本書に記載されたタンパク質（例えば、配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド、或いは、それらの免疫原性部分）の１又はそれ以上を、細胞培養培地中に分泌するように修飾又は変異させられている）であってもよい。幾つかの実施形態においては、前記細菌は、ＥＨＥＣ又はＥＰＥＣではない。幾つかの実施形態において、前記細菌がＡ／Ｅ病原体である場合には、ポリペプチド（例えば、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ、イニチミン、志賀毒素１若しくは２又はＥｓｐＰ）を発現又は分泌する能力を損なうような修飾を更に施してもよい（但し、該ポリペプチドは、修飾がなされていない状態で正常に分泌される）。幾つかの実施形態において、前記他の生物体（例えば酵母）又は細胞（例えば昆虫細胞）、例えば組換え又は他の技術によって、本書に記載されたタンパク質（例えば、配列番号２２〜４３の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド、或いは、それらの免疫原性部分）の１又はそれ以上を、細胞培養倍地中に分泌するように修飾又は変異させられている。
【００２７】
天然において化合物に付随する成分から、該化合物が分離された場合に、該化合物は「実質的に純粋」又は「単離されている」。典型的には、試料中の全物質の、重量において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％若しくは６０％、又は、より一般的には、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％である場合、化合物は実質的に純粋である。それゆえ、例えば、化学的に合成された又は組換え技術により産生されたポリペプチドは、一般に、該ポリペプチドが天然において会合する成分から実質的にフリーであろう。ポリペプチドが、遠心分離、沈殿、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、ＨＰＬＣ等のような物理的な技術により該ポリペプチドの天然会合成分から分離された場合、該ポリペプチドはまた一般に実質的に純粋であろう。
【００２８】
核酸分子が、本発明におけるＤＮＡが由来する生物の天然ゲノムにおいて、該核酸分子が通常近接しているコード配列と、すぐ近接（すなわち共有結合性に連結）していない場合、該核酸分子は一般に実質的に純粋又は「単離されている」であろう。それゆえ、「単離された」遺伝子又は核酸分子とは、（ゲノム配列中におけるように）該遺伝子又は核酸分子に通常（現実に）隣接する核酸分子によって隣接されていない、及び／又は、（ｃＤＮＡ又はＲＮＡライブラリ中におけるように）他の転写された配列から完全に又は部分的に精製された遺伝子又は核酸分子を意味することを意図する。例えば、本発明の単離された核酸は、該核酸が天然において存在する前記複合体細胞環境に関して、実質的に単離されていてもよい。幾つかの場合、前記単離された物質は、組成物（例えば、他の物質を含む粗製抽出物）、緩衝液系、又は、混合試薬の一部を形成するであろう。他の場合には、前記物質は、例えば、ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣのようなカラムクロマトグラフィによって決定されるような本質的な均一性へと精製されてもよい。したがって、前記用語は、例えば、自律複製プラスミド若しくはウイルスのようなベクターに、又は、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれた；或いは、他の配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限酵素処理によって産生されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として存在する、組換え核酸を含む。付加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え核酸をも含む。好ましくは、単離された核酸は、存在する全ての巨大分子種の少なくとも凡そ５０、８０、又は、９０％（モルを基礎として）を含む。それゆえ、単離された遺伝子又は核酸分子は、化学的に又は組み換え法により合成された遺伝子又は核酸分子を含み得る。ベクターに含有された組換えＤＮＡは、本書で使用する場合、「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子は、異種性の宿主細胞中に組換えＤＮＡ分子、並びに、溶液中に部分的に又は実質的に精製されたＤＮＡ分子を含む。本発明のＤＮＡ分子の生体内及び試験管内ＲＮＡ転写物も、「単離された」核酸分子に包含される。そのような単離された核酸分子は、前記コードされたポリペプチドの製造において、相同配列を単離するためのプローブとして（例えば、他の哺乳動物種から）、遺伝子地図のために（例えば、染色体との切片上ハイブリッド形成法によって）、又は、ノーザンブロット解析によるような組織（例えば、末梢血のようなヒト組織）における遺伝子発現の検出のために、有用である。
【００２９】
実質的に純粋な化合物は、例えば、天然源からの抽出によって；ポリペプチド化合物をコードする組換え核酸分子の発現によって；又は、化学合成によって、獲得され得る。純度は、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、ＨＰＬＣなどのような適切な方法の何れかを用いて測定し得る。実質的に純粋な細胞（例えば細菌細胞）調製物は、所望の変異遺伝子型を有しない、又は、所望のポリペプチドを十分な量で発現若しくは分泌しない混入細胞が、該調製物における全細胞数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０%より少なく構成される細胞の調製物である。
【００３０】
本発明の種々の遺伝子及び核酸配列は、組換え型配列であってもよい。用語「組換え」は何かが組み換えられていることを意味するが、核酸コンストラクトに言及する場合、該用語は、組み合わされた又は分子生物学的技術の方法によって産生された核酸配列から成る分子を意味する。タンパク質又はポリペプチドに言及する場合に用語「組換え」は、分子生物学的技術の方法によって産生された組換え核酸コンストラクトを用いて発現させられたタンパク質又はポリペプチド分子を意味する。遺伝的組成物に言及する場合に用語「組換え」は、その親のゲノムに無い新しい組み合わせの対立遺伝子を伴った配偶子又は子孫を意味する。組換え核酸コンストラクトは、天然において連結しない又は天然とは異なる位置に連結された核酸配列に、連結された又は連結するように操作されたヌクレオチド配列を含んでもよい。それゆえ、「組換え」の場合の核酸コンストラクトは、該核酸分子が遺伝子工学を用いて操作された、すなわちヒトの介入による核酸コンストラクトを意味する。組換え核酸コンストラクトは、例えば、形質転換により宿主細胞中に導入されてもよい。そのような組換え核酸コンストラクトは、それと同じ宿主細胞の種又は異なる宿主細胞の種由来の配列を含み、該配列は単離され該宿主種の細胞に再導入される。組換え核酸コンストラクト配列は、宿主細胞の最初の形質転換の結果として、又は、引き続く組換え及び／又は修復イベントの結果の何れかにより、該宿主細胞ゲノムに組み込まれることになってもよい。
【００３１】
本書で使用される場合、核酸又はタンパク質に対して「異種の又は非相同の（heterologous）」とは、天然に見出される位置とは異なる位置になるように人的介入によって操作された分子を言う。例えば、ある種からの核酸配列がもう一つの種のゲノム中に導入されてよく、或いは、あるゲノム座位からの核酸配列が同じ種のもう一つのゲノム座位若しくは染色体外座位に移動されてもよい。異種の又は非相同のタンパク質は、例えば、天然にはそのタンパク質を発現しない単一細胞中で、異種の又は非相同のコード配列から発現されたタンパク質又は組換え型遺伝子から発現されたタンパク質を含む。
【００３２】
「実質的に同一の（substantially identical）」配列は、本書で検討されたような１又はそれ以上の保存的な置換によって、或いは、アミノ酸又は核酸分子の生物学的機能を破壊しない配列位置における１又はそれ以上の非保存的置換、欠失又は挿入によって、のみ基準配列と異なるアミノ酸又はヌクレオチド配列である。そのような配列は、例えば、Align Program（９６）又はFASTAを用いて比較のために使用された配列と、アミノ酸又はヌクレオチドレベルで、１０％から９９％の任意の整数、又はより一般的には、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０、５５％若しくは６０％、又は、少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％、又は、９６％、９７％、９８％若しくは９９％と同程度、同一であり得る。ポリペプチドについては、前記比較配列の長さは、少なくとも２、５、１０若しくは１５アミノ酸、又は、少なくとも２０、２５若しくは３０アミノ酸であってよい。別の実施形態においては、前記比較配列の長さは、少なくとも３５、４０若しくは５０アミノ酸、又は、６０、８０若しくは１００アミノ酸以上であってよい。核酸分子については、前記比較配列の長さは、少なくとも５、１０、１５、２０若しくは２５ヌクレオチド、又は、少なくとも３０、４０若しくは５０ヌクレオチドであってよい。別の実施形態においては、前記比較配列の長さは、少なくとも６０、７０、８０若しくは９０ヌクレオチド、又は、１００、２００若しくは５００ヌクレオチド以上であってよい。配列同一性は、公的に入手可能な配列解析ソフトウェア（例えば、ウィスコンシン大学生物工学センター Genetics Computer Group(1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705)のSequence Analysis Software Package、国立医学図書館から入手可能なBLASTソフトウェア、又は、本書に記載されたような）を用いて、容易に測定され得る。有用なソフトウェアの例には、プログラム「Pile-up and PrettyBox」を含む。そのようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、置換及び他の修飾に対し、相同性の度合いを割り当てることにより、似た配列を対応させる。
【００３３】
或いは、又は、更に、二つの核酸配列が高い厳密性条件下でハイブリッド形成する場合、それらは「実質的に同一」であってもよい。ある実施形態において、高い厳密性条件は、例えば、０．５Ｍ ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、少なくとも５００ヌクレオチド長のＤＮＡプローブを用いて起こるハイブリッド形成に匹敵するハイブリッド形成を許容する条件である。（これらは、高い厳密性でのノーザンブロット法又はサザンブロット法のための典型的条件である。）ハイブリッド形成は、凡そ２０から３０分間、又は、凡そ２から６時間、又は、凡そ１０から１５時間にわたって、或いは、２４時間又はそれ以上にわたって、行われる。高厳密性ＰＣＲ、ＤＮＡシークエンス、一本鎖高次構造多型解析、及び、切片上ハイブリッド形成法のような分子生物学者によって日常的に行われている多数の技術の成功も、高厳密性のハイブリッド形成に依存している。ノーザンブロット法及びサザンブロット法とは対照的に、これらの技術は、通常、相対的に短いプローブで行われる（例えば、通常、ＰＣＲ又はシークエンスのためには凡そ１６ヌクレオチド若しくはそれより長く、及び、切片上ハイブリッド形成法のためには凡そ４０ヌクレオチド若しくはそれより長い）。これらの技術で用いられる前記高厳密性条件は、分子生物学分野の当業者に周知されている（６１）。
【００３４】
実質的に同一な配列は、例えば、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列、或いは、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列であってよい。幾つかの実施形態において、実質的に同一な配列は、例えば、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と相補的な又はハイブリッド形成するヌクレオチド配列であってもよい。幾つかの実施形態において、実質的に同一な配列は、Ａ／Ｅ病原体由来のものであってもよい。
【００３５】
「プローブ」又は「プライマー」は、相補的な配列（標的）を含む２番目のＤＮＡ又はＲＮＡ分子と塩基対形成（base pair）し得る限定された配列の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。生じたハイブリッド分子の安定性は、生じた塩基対形成の程度（範囲）に依存し、そして、プローブと標的分子との間の相補性の程度、及び、ハイブリッド形成条件の厳密度のようなパラメータに影響される。ハイブリッド形成厳密性の度合いは、その温度、塩濃度、ホルムアミドのような有機分子の濃度などのパラメータに影響され、当業者既知の方法により決定される。本書に記載された前記核酸配列に対して特異的なプローブ若しくはプライマー又はそれらの一部は、その目的、その条件、及び、使用されるのがプローブかプライマーかに依存して、長さにおいて異なり、少なくとも８ヌクレオチドから５００ヌクレオチドの間の任意の整数によって示される値を取ってよい。例えば、プローブ又はプライマーは、少なくとも８、１０、１５、２０若しくは２５ヌクレオチド長であってよく、又は、少なくとも３０、４０、５０又は６０ヌクレオチド長であってよく、又は、１００、２００、５００若しくは１０００ヌクレオチド長以上であってよい。本書に記載された前記核酸配列に対して特異的なプローブ若しくはプライマーは、本書に記載された前記核酸配列と、例えばAlign program（９６）を用いて、１０％から９９％の任意の整数、又は、より一般的には、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％若しくは６０％、又は、少なくとも６５％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％、又は、９６％、９７％、９８％若しくは９９％程度、同一であり得る。
【００３６】
「プローブ」又は「プライマー」は、当業者既知の方法により、放射能又は非放射能の何れかにより、検出可能なように標識され得る。「プローブ」又は「プライマー」は、核酸シークエンス、ポリメラーゼ連鎖反応法による核酸増幅、一本鎖高次構造上多型（ＳＳＣＰ）解析、制限酵素断片多型（ＲＦＬＰ）解析、サザンブロット法、ノーザンブロット法、切片上ハイブリッド形成法、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）、及び、当業者既知の他の方法のような、核酸ハイブリッド形成法を含む方法のために使用し得る。「プローブ」又は「プライマー」は、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡに（例えば増幅による）、又はクローン化ＤＮＡセグメントに由来してよく、或いは、化学的に合成されてもよい。
【００３７】
「変異」は、生物体のＤＮＡ配列すなわちゲノムにおいて、その親の菌株と比較した場合の、任意の変化を含む。前記変化は、自発的に生じてもいいし、又は、前記生物体を、変異原性化学薬品、エネルギー、放射線、組換え技術、交配、若しくはＤＮＡを改変するために使用される任意の他の技術のような変異原性刺激に曝露することによって生じてもいい。変異は、本書に記載された任意のヌクレオチド配列における変化を含んでよく、又は、本書に記載された任意のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における変化を含んでよい。
【００３８】
変異は、前記変異の結果として、その親の菌株と比較した際に、前記変異体細胞のその病原性レベルが少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％まで減少した場合、「病原性の減弱」を含んでよい。病原性の減弱は、ポリペプチド（例えば、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド）の発現において、その親の菌株と比較した際に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の減少によって測定されてもよい。Ａ／Ｅ病原体の病原性は、本書に記載された又は当業者に知られているように測定されてよい。病原性の減弱は、ポリペプチド（例えば、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド）の前記生物学的活性において、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％の減少によって測定されてもよい。
【００３９】
「調節」又は「調節する」は、減少又は増加の何れかの変化を意味する。増加又は減少は、対照又は参照の試料又は化合物と比較された場合、１０％と９０％の間の任意の整数値の、又は３０％と６０％の間の任意の整数値の変化であってよく、或いは、１００％以上の変化であってよい。
【００４０】
「被検化合物」は、任意の天然の又は人工的に誘導された化合物である。被検化合物は、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然有機物分子、及び、核酸分子を含むがこれらに限定されない。被検化合物は、本書に記載された任意の前記ポリペプチド又は前記核酸分子のような既知化合物と、例えば、病原性を干渉することによって、又は、該既知化合物によって誘発される任意の生物学的応答を干渉することによって、競合し得る。
【００４１】
一般的に、被検化合物は、参照化合物と比較された場合、１０％と２００％の間の任意の値、又は、５００％以上の調節を示し得る。例えば、被検化合物は、少なくとも任意の陽性若しくは陰性の１０％から２００％の整数値での調節、又は、少なくとも任意の陽性若しくは陰性の３０％から１５０％の整数値での調節、又は、少なくとも任意の陽性若しくは陰性の６０％から１００％の整数値での調節、又は、任意の陽性若しくは陰性の１００％以上の整数値での調節を示してもよい。負のモジュレーターである化合物は、通常、既知化合物に関する修飾を減少させるであろうし、正のモジュレーターである化合物は、通常、既知化合物に関する修飾を増加させるであろう。
【００４２】
「ベクター」は、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は、哺乳類若しくは昆虫ウイルス、又は人工染色体に由来するＤＮＡ分子であり、それらの中に核酸分子（例えば、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列）が挿入されてよい。ベクターは１又はそれ以上の独特の制限酵素部位を含んでよく、或いは、前記クローン化された配列が複製可能なように限定された宿主又は媒体生物体の中で自律増殖可能であってもよい。ベクターはＤＮＡ発現ベクターすなわち組換え型ポリペプチドの合成を指揮し得る任意の自律的エレメントであってよく、そして、それゆえ、宿主細胞中でポリペプチド（例えば、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド）を発現させるために使用してもよい。ＤＮＡ発現ベクターは、細菌のプラスミド及びファージ、並びに、哺乳類及び昆虫のプラスミド及びウイルスを含む。ベクターは、ベクターによる前記宿主細胞のゲノム中に導入された任意の修飾が、該宿主細胞のゲノムの一部になるように、前記宿主細胞のゲノム中に組み込み可能であってもよい。ベクターは、前記宿主細胞のゲノム中に組み込み不可能であって、そして、そのため、プラスミドのように自律複製単位として残ってもよい。
【００４３】
抗体は、抗体が抗原（例えば、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド）を認識し結合した場合、抗原に「特異的に結合する」が、試料中の他の分子を実質的に認識し結合することはない。そのような抗体は、前記抗原に対する親和性（例えば、試料中のもう一つの参照分子に対する該抗体の親和性よりも少なくとも１０、１００、１０００又は１００００倍大きい）を有する。
【００４４】
「試料」は、Ａ／Ｅ病原体感染動物或いは本発明の１又はそれ以上の前記ポリペプチド若しくは核酸分子又はそれらの免疫原性断片を投与された動物から単離された試料のような、対象から単離された任意の器官、組織、細胞若しくは細胞抽出物であり得る。例えば、試料は、患者（ヒト又は動物）、被検対象又は実験動物から得られた、組織（例えば組織診又は剖検からの）、細胞、血液、血清、乳、尿、便、唾液、糞便、卵、哺乳類細胞培養若しくは培地、又は、任意の他の検体、或いは、それらの任意の抽出物を含み得るがこれらに限定されない。試料は、正常な又は形質転換された細胞によって細胞培養中に産生された産物（例えば、組換えＤＮＡ又は単クローン抗体技術による）を含んでよいがこれらに限定されない。試料は、実験条件下で創出された細胞又は株化細胞（該細胞は、対象から直接的に単離されていない）であってもよい。試料は、無細胞の、人工由来の、又は、合成されたものでも有り得る。
【００４５】
前記試料は、Ａ／Ｅ病原体由来の遺伝子、ゲノム、ポリペプチド、核酸分子の存在を検出するために、又は、Ａ／Ｅ病原体由来の遺伝子における変異を検出するために、又は、Ａ／Ｅ病原体由来の遺伝子若しくはポリペプチドの発現レベルを検出するために、又は、Ａ／Ｅ病原体由来の遺伝子若しくはポリペプチドの生物学的機能を決定するために、当業者既知及び／又は本書に記載された方法を用いて、分析されてよい。例えば、試料由来ＰＣＲ産物のシークエンス、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析若しくは制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析のような方法が、遺伝子における変異を検出するために使用し得；ＥＬＩＳＡ若しくはウエスタンブロット法はポリペプチドのレベルを測定するために使用し得；ノーザンブロット法は、ｍＲＮＡを測定するために使用し得；又は、ＰＣＲは、核酸分子のレベルを測定するために使用し得る。
【００４６】
「免疫応答」は、以下の１又はそれ以上の哺乳類における応答：組成物又はワクチン投与後の、該組成物又はワクチン中の前記抗原に特異的に方向付けられた抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、γδＴ細胞を含む）の誘導、を含むがこれらに限定されない。組成物又はワクチンへの免疫応答は、それゆえ一般に、目的の該組成物又はワクチンへの宿主哺乳類の細胞性の及び／又は抗体‐仲介性応答における発達を含む。通常、前記免疫応答は、Ａ／Ｅ病原体による感染の予防又は減少をもたらすであろう；該Ａ／Ｅ病原体によるコロニー形成に対する腸の抵抗性；又は、該Ａ／Ｅ病原体の脱粒における減少。
【００４７】
ポリペプチド又は核酸分子の「免疫原性断片」は、免疫応答を誘発するアミノ酸又はヌクレオチド配列を意味する。したがって、免疫原性断片は、本書に記載された任意の配列の任意の部分、又は、それらと実質的に同一の配列であって、１又はそれ以上のエピトープ（Ｔ細胞又はＢ細胞のような特異的免疫系細胞によって認識される前記部位）を含有するもの、を含んでよいがこれらに限定されない。例えば、免疫原性断片は、本書に記載された任意の１又はそれ以上の配列に由来する、６と６０の間の、又は、６０以上の任意の値のアミノ酸長のペプチド、例えば、１０と２０の間の任意の値のアミノ酸長の、又は、２０と４０の間の任意の値のアミノ酸長のペプチド、を含んでよいがこれらに限定されない。そのような断片は、エピトープマッピング法、又は抗原性若しくは疎水性親水性指標プロットのような当業者既知の標準的方法、例えば、Oxford Molecular GroupのOmiga バージョン 1.0 プログラムを用いて、同定されてよい（参照、例えば、米国特許第４，７０８，８７１）（７６、７７、８１、９２、７３）。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＡのアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。
【図１Ｃ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｄ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＡのアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。
【図１Ｅ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図１Ｆ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＡのアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。
【図２Ａ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＢのヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｂ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＢ２のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図２Ｃ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＢのアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図２Ｄ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＢ２のアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
【図２Ｅ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＢのヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。
【図２Ｆ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＢのアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。
【図２Ｇ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＢのヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図２Ｈ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＢのアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図２Ｉ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＢ２のアミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【図２Ｊ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＢのヌクレオチド配列（配列番号６０）を示す。
【図３Ａ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＣのヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。
【図３Ｂ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＣのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。
【図３Ｃ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＣのヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図３Ｄ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＣのアミノ酸配列（配列番号３１）を示す。
【図３Ｅ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＣのヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図３Ｆ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＣのアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図４Ａ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＤのヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図４Ｂ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＤのアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。
【図４Ｃ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＤのヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
【図４Ｄ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＤのアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図４Ｅ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＤのヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。
【図４Ｆ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＤのアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。
【図５Ａ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＥのヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図５Ｂ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＥのヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図５Ｃ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＥのアミノ酸配列（配列番号３６）を示す。
【図５Ｄ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＥのアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【図５Ｅ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＥのヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。
【図５Ｆ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＥのアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。
【図５Ｇ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＥのヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
【図５Ｈ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＥのアミノ酸配列（配列番号３９）を示す。
【図６Ａ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＦのヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図６Ｂ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＦのヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。
【図６Ｃ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＦのアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。
【図６Ｄ】Ｃ．ローデンティウムからのＮｌｅＦのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。
【図６Ｅ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＦのヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。
【図６Ｆ】ＥＰＥＣからのＮｌｅＦのアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。
【図６Ｇ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＦのヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。
【図６Ｈ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＦのアミノ酸配列（配列番号４３）を示す。
【図７】Ｃ．ローデンティウムＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ（配列番号５６）の、正の転写制御因子であるＣａｉＦ（配列番号５７）と、及び、特徴付けされていないサルモネラタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号５８）との、アミノ酸配列アライメントを示す。下線は、ＤＮＡ結合タンパク質の予測ヘリックス・ターン・ヘリックス モチーフ特徴である。一致するアミノ酸残基は＊で印され、保存された変異は＋で印を付けられている。
【図８】ローデンティウム（ｐＣＲｏｒｆ１１）、ＥＨＥＣ（ｐＥＨｏｒｆ１１）、又はＥＰＥＣ（ｐＥＰｏｒｆ１１）からのｏｒｆ１１遺伝子によるＣ．ローデンティウムΔｏｒｆ１１の相補性、及びＣ．ローデンティウムｌｅｒ遺伝子又はｏｒｆ１１遺伝子によるＣ．ローデンティウムΔｌｅｒ−Δｏｒｆ１１二重変異体の相補性を示す。
【図９】ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムにおける新規に同定された６つのエフェクター遺伝子を含むＯ‐アイランドの相対位置を示した模式図。その志賀毒素遺伝子（ｓｔｘ）、ＬＥＥ、及び、inv-spa ＴＴＳＳの位置も示してある。溶原ファージ（ＣＰ‐９３３及びＢＰ‐９３３）とこれら遺伝子の関連を記してある。
【図１０】分泌タンパク質のプロテオミクス解析を示す。図Ａは、野生型ＥＨＥＣ（ｗｔ）及びそのタイプＩＩＩ分泌変異体（ｅｓｃＮ‐）からの総分泌タンパク質の一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の移動は、上記ゲルの左に示す。図Ｂは、野生型ＥＨＥＣからの総分泌タンパク質の二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の移動は上記ゲルの左に示し、ｐＩ値は上記ゲルの上に示す。マススペクトルによって解析されたタンパク質スポット（表１を参照）は、丸で囲み番号を付してある。
【図１１】ＮｌｅＡのゲノム構成、分布及び保存を示す。（Ａ）ＥＨＥＣゲノムにおけるｎｌｅＡ遺伝子周辺領域を図示したものである。各ＯＲＦの転写の方向は矢印（矢じり）で示した。ＯＲＦの注釈は（３）から修正した。ＮｌｅＡ遺伝子は太字でハイライトした。（Ｂ）ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ、ＲＥＰＥＣ、サイトロバクター・ローデンティウム（Ｃｉｔｒｏ．）、及び非病原性大腸菌株ＨＢ１０１からのゲノムＤＮＡのサザンブロット解析を示す。各ゲノムＤＮＡサンプルはＢａｍＨＩ（レーン１、４、７、１０、１３）、ＥｃｏＲＩ（レーン２、５、８、１１，１４）及びＰｓｔＩ（レーン３、６、９、１２、１５）で消化した。（Ｃ）ＥＨＥＣからのＮｌｅＡ遺伝子、インチミン陽性、非Ｏ１５７ＥＨＥＣ株（Ｏ８４：Ｈ４）のプロファージ、ＥＰＥＣ、及びサイトロバクター・ローデンティウムのタンパク質のマルチプルシークエンスアライメントを示す。同一の残基はドット（．）で示し、特定の位置でのアミノ酸欠如はダッシュ（−）で示す。推定膜貫通ドメインでありうる２つの疎水性ストレッチはＥＨＥＣ配列において太字で示す。
【図１２】野生型（ｗｔ）ＥＨＥＣ及びそのタイプＩＩＩ分泌変異体（ｅｓｃＮ‐）発現ｐＮｌｅＡ‐ＨＡ及びその非形質移入の対照における、分泌タンパク質（左レーン）及び細菌ペレット（右レーン）のウエスタンブロット解析を示す。ブロットは、（Ａ.）抗ＨＡ、（Ｂ.）抗ＤｎａＫ、（Ｃ.）抗Ｔｉｒにより行った。
【図１３】ΔｎｌｅＡ ＥＨＥＣにおけるタイプＩＩＩ分泌及びtranslocationを示す。（Ａ.）野生型ＥＨＥＣ（ｗｔ）及びそのΔｎｌｅＡ変異体からの総分泌タンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の移動は、上記ゲルの左に示す。（Ｂ.）野生型ＥＨＥＣ（ｗｔ）及びそのΔｎｌｅＡ変異体からの総分泌タンパク質の抗ＮｌｅＡ抗血清でのウエスタンブロット解析を示す。分子量マーカー（ｋＤａ）の移動は、上記ゲルの左に示す。
【図１４】感染宿主細胞画分のウェスタンブロット解析を示す。（Ａ）ＨｅＬａ細胞は野生型（ｗｔ）又はＨＡ付加ＮｌｅＡを発現するｅｓｃＮ−ＥＨＥＣで感染させ、ディファレンシャル遠心分離によって細胞成分分画に供した。分析した画分は：細菌、非破壊細胞及び細胞骨格（低速ペレット）、宿主細胞質（宿主細胞質）及び宿主細胞膜（宿主細胞膜）である。画分は、抗ＨＡ抗体、抗ＤｎａＫ抗体、抗カルネキシン抗体、及び抗チューブリン抗体を用いたウェスタンブロットにより解析した。（Ｂ）ＨＡ付加ＮｌｅＡを発現する野生型ＥＨＥＣで感染した細胞からの膜画分を単離した。膜画分は、次に氷上にて、高塩濃度（１ＭＮａＣｌ）、高ｐＨ（ｐＨ１１．４）、中性ｐＨ及び等張塩溶液（コントロール）、又は中性ｐＨ及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む等張塩溶液（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で抽出し、可溶性画分（Ｓ）及び不溶性画分（Ｐ）を取得するために再遠心分離した。これらの画分を抗ＨＡ抗体（上段パネル）、抗カルネキシン抗体（中央パネル）、及び抗カルレティクリン抗体（下段パネル）を用いたウェスタンブロットにより解析した。
【図１５】マウスにおけるサイトロバクター・ローデンティウムの病原性解析の結果を示す。（Ａ）野生型Ｃ．ローデンティウム（ｗｔ）とΔｎｌｅＡ変異体からの細菌抽出液を抗ＮｌｅＡ抗血清でプローブ（探索）したウェスタンブロットである。分子量マーカーの移動度を（ｋＤａ単位で）ゲルの左側に示した。（Ｂ）野生型Ｃ．ローデンティウム（■）、ΔｎｌｅＡＣ．ローデンティウム（○）及び予めΔｎｌｅＡ変異体で感染させたマウスを引き続いて野生型Ｃ．ローデンティウムに暴露（｜）したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの生存曲線を示す。マウスは感染実験中毎日監視され、瀕死状態になったマウスは直ちに屠殺された。各群において実験開始時のマウスの数に対する各日の元気なマウスの百分率を示す。（Ｃ）感染したＮＩＨスイスマウス結腸からのＣ．ローデンティウムのタイター（力価）を示す。マウスは、野生型Ｃ．ローデンティウム（●）、又はΔｎｌｅＡ株（○）で感染させ、感染後１０日に屠殺した。結腸組織及び糞便ペレットはホモゲナイズし、屠殺時のマウス結腸におけるＣ．ローデンティウム負荷を決定するためにマッコンキー寒天培地に塗布した。実験における各マウスは単一の点で表した。各群の平均値はグラフ上水平線で示した。（Ｄ）感染したＮＩＨスイスマウスの結腸及び脾臓重量を示す。マウスは、野生型Ｃ．ローデンティウム（■及び▼）、又はΔｎｌｅＡ株（□及び▽）で感染させ、感染後１０日に屠殺した。結腸（□及び■）及び脾臓（▽及び▼）を切り裂いて重量を測定した。実験における各マウスは単一の点で表した。各群の平均値はグラフ上水平線で示した。
【図１６Ａ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＧ相同体のヌクレオチド配列（配列番号６１）を示す。
【図１６Ｂ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＧ相同体のアミノ酸配列（配列番号７３）を示す。
【図１７Ａ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＨ１のヌクレオチド配列（配列番号６２）を示す。
【図１７Ｂ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＨ１のアミノ酸配列（配列番号７４）を示す。
【図１８Ａ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＨ２のヌクレオチド配列（配列番号６３）を示す。
【図１８Ｂ】ＥＨＥＣからのＮｌｅＨ２のアミノ酸配列（配列番号７５）を示す。
【図１９Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２０７６のヌクレオチド配列（配列番号６４）を示す。
【図１９Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２０７６のアミノ酸配列（配列番号７６）を示す。
【図２０Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２１４９のヌクレオチド配列（配列番号６５）を示す。
【図２０Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２１４９のアミノ酸配列（配列番号７７）を示す。
【図２１Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２１５０のヌクレオチド配列（配列番号６６）を示す。
【図２１Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２１５０のアミノ酸配列（配列番号７８）を示す。
【図２２Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２１５１のヌクレオチド配列（配列番号６７）を示す。
【図２２Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２１５１のアミノ酸配列（配列番号７９）を示す。
【図２３Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２３３７のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示す。
【図２３Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２３３７のアミノ酸配列（配列番号８０）を示す。
【図２４Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２３３８のヌクレオチド配列（配列番号６９）を示す。
【図２４Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２３３８のアミノ酸配列（配列番号８１）を示す。
【図２５Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２３３９のヌクレオチド配列（配列番号７０）を示す。
【図２５Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２３３９のアミノ酸配列（配列番号８２）を示す。
【図２６Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２５６０のヌクレオチド配列（配列番号７１）を示す。
【図２６Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２５６０のアミノ酸配列（配列番号８３）を示す。
【図２７Ａ】ＥＨＥＣからのＺ２９７６のヌクレオチド配列（配列番号７２）を示す。
【図２７Ｂ】ＥＨＥＣからのＺ２９７６のアミノ酸配列（配列番号８４）を示す。
【図２８Ａ】ＥＨＥＣからのＬ００４３のヌクレオチド配列（配列番号８５）を示す
【図２８Ｂ】ＥＨＥＣからのＬ００４３のアミノ酸配列（配列番号８６）を示す
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明者らは、Ａ／Ｅ病原体（表２）の幾つかの新規な共通の（common）分泌タンパク質を、陽性ＬＥＥレギュレーター（包括的レギュレーターＬＥＥの活性化因子、又は、ＧｒｌＡ）を用いて同定した（該ＧｒｌＡは、分泌を有意に増加させるために使用され得、そしてプロテオミクスに基づくアプローチを用いた前記ＬＥＥコードＴＴＳＳを介した分泌タンパク質の機能的スクリーニングを可能とさせた）。これらの新規タンパク質は、Ｎｌｅ（非ＬＥＥコードエフェクター）Ａ〜Ｈと名付けられ、ＬＥＥ含有病原体において存在し、そして、大腸菌の非病原性系統、及び、前記ＬＥＥ以外の３つの病原性島（ＰＡＩｓ）（該ＰＡＩｓは、Ａ／Ｅ病原体において存在し且つ前記ＬＥＥと共進化した（３、８））によってコードされる非ＬＥＥ病原体では存在していない。これらのタンパク質の同定は、ある場合には、以前には機能未知であったＯＲＦｓに機能を割り当てることを可能にした。典型的なタンパク質、ＮｌｅＡ（ｐ５４）は、Ｃ．ローデンティウム、ＥＰＥＣ及びＥＨＥＣを含むＡ／Ｅ病原体におけるＩＩＩ型エフェクターであり、且つ、病原性において決定的役割を果たす。ＮｌｅＡは、前記ＥＨＥＣゲノム内のＬＥＥとは別のファージ関連病原性島内にコードされている。前記ＬＥＥコードＴＴＳＳは、ＮｌｅＡの宿主細胞内への転位置を方向付ける（宿主細胞においてＮｌｅＡはゴルジ体に局在化する）。ＮｌｅＡは、ＬＥＥ含有病原体において存在し、そして、非病原性系統大腸菌及び非ＬＥＥ病原体では存在していない。
【００５０】
本発明のある実施形態において、これらのポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子、又は、それらの一部は、Ａ／Ｅ病原体感染に対するワクチン、薬物療法、診断、又は、薬物スクリーニング手段として、或いは、試薬として、有用で有り得る。
【００５１】
ポリペプチド及び被検化合物
本発明に従った化合物は、例えば、配列番号１〜５６、５９〜８４、並びに、それらの断片、類似体及び変異体として記載された前記ポリペプチド及び核酸分子を含むがこれらに限定されない。本発明に従った化合物はまた、前記ｏｒｆ１１／ｇｒｌＡ、ｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＢ２、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ、ｎｌｅＦ、ｎｌｅＧ、ｎｌｅＨ（ｎｌｅ Ｈ１及び／又はｎｌｅ Ｈ２）遺伝子、或いは、それらの相同体（ホモログ）の産物を含む。本発明に従った化合物はまた、例えば、番号Ｚ０９８５（ＮｌｅＢ２）、Ｚ０９８６（ＮｌｅＣ）、Ｚ０９９０（ＮｌｅＤ）、Ｚ６０２０（ＮｌｅＦ）、Ｚ６０２４（ＮｌｅＡ）、Ｚ４３２８（ＮｌｅＢ）、Ｚ４３２９（ＮｌｅＥ）、Ｚ６０２５（ＮｌｅＧ相同体）、Ｚ６０２１（ＮｌｅＨ１）、Ｚ０９８９（ＮｌｅＨ２）、Ｚ２０７６、Ｚ２１４９、Ｚ２１５０、Ｚ２１５１、Ｚ２３３７、Ｚ２３３８、Ｚ２３３９、Ｚ２５６０、Ｚ２９７６又はＬ００４３（Ｏｒｆ１１／ＧｒｌＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ０７１０３４、配列番号８５及び８６）のような前記ＥＨＥＣゲノム配列（例えばＡＥ００５１７４）、並びに、それらの断片、類似体及び変異体として記載された前記ポリペプチド及び核酸分子を含む。
【００５２】
化合物は、例えば、本書に記載されたポリペプチドの任意の位置におけるアミノ酸残基を、他の保存されたアミノ酸残基すなわち同様の物理的、生物学的又は化学的性質を有する残基で、置換、欠失又は挿入することにより、並びに、例えば、該化合物が病原性を減弱させる能力についてスクリーニングすることにより、調製され得る。本発明のある実施形態において、本発明の化合物は、本書に記載された前記ポリペプチド、例えば、配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４に特異的に結合する抗体を含む。
【００５３】
生物学的に等価なポリペプチドを得るために、幾つかの修飾及び変化がポリペプチドの生物学的機能を実質的に変化させずに該ペプチドの構造の中で成され得ることが、当業者に周知されている。本発明の一つの態様において、前記本発明のポリペプチドはまた、生物学的に等価なペプチド、又は、本発明の前記ポリペプチドの配列の一部が保存されたアミノ酸置換によって異なる、若しくは、生物学的機能例えば病原性に影響しない非保存的置換によって異なる「変異体」に及ぶ。本書で使用される場合、用語「保存されたアミノ酸置換」は、前記ペプチドの所与の位置におけるあるアミノ酸の別のアミノ酸への置換であって、重要な機能の実質的欠損無しに成され得る置換を意味する。そのような変化の作成において、同様のアミノ酸残基の置換は、側鎖置換基の相対的類似度―例えば、それらのサイズ、電荷、疎水性及び親水性などに基づいて成し得、そして、そのような置換が前記ペプチド機能に及ぼすそれらの効果についてルーチンの試験により調べられてもよい。
【００５４】
本書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、天然タンパク質において一般に見出されるＬ‐アミノ酸、Ｄ‐アミノ酸、及び、それらが修飾された際のアミノ酸を意味する。従って、本発明のアミノ酸は、例えば、２‐アミノアジピン酸；３‐アミノアジピン酸；β−アラニン；β−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸；ピペリジン酸；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソ酪酸；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４−ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリシン；アロ−ヒドロキシリシン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン；サルコシン；Ｎ−メチルイソロイシン；６−Ｎ−メチルリシン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；及び、オルニチンを含む。
【００５５】
幾つかの実施形態において、保存されたアミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の親水性値（例えば、プラス若しくはマイナス２．０、又は、プラス若しくはマイナス１．５、又は、プラス若しくはマイナス１．０、又は、プラス若しくはマイナス０．５の値以内）を有する別のアミノ酸残基に置換される場合に、成されてよい。但し、以下のものは、アミノ酸残基への割り当てがTyr (-1.3)又はPro (-1.6)のような凡そ−１．６の疎水性親水性指標（詳細は米国特許第４，５５４，１０１に記載されており、参照により本書に組み込まれる）を有するアミノ酸残基であってよい：Arg (+3.0)；Lys (+3.0)；Asp (+3.0)；Glu (+3.0)；Ser (+0.3)；Asn (+0.2)；Gln (+0.2)；Gly (0)；Pro (-0.5)；Thr (-0.4)；Ala (-0.5)；His (-0.5)；Cys (-1.0)；Met (-1.3)；Val (-1.5)；Leu (-1.8)；Ile (-1.8)；Tyr (-2.3)；Phe (-2.5);及び、Trp (-3.4)。
【００５６】
別の態様において、保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の疎水性親水性指標（例えば、プラス若しくはマイナス２．０、又は、プラス若しくはマイナス１．５、又は、プラス若しくはマイナス１．０、又は、プラス若しくはマイナス０．５の値以内）を有する別のアミノ酸残基に置換される場合に、成されてよい。そのような実施形態において、各アミノ酸残基は、疎水性親水性指標を、その疎水性及び荷電特性に基づいて、以下の通りに割り当てられてよい：Ile (+4.5)；Val (+4.2)；Leu (+3.8)；Phe (+2.8)；Cys (+2.5)；Met (+1.9)；Ala (+1.8)；Gly (-0.4)；Thr (-0.7)；Ser (-0.8)；Trp (-0.9)；Tyr (-1.3)；Pro (-1.6)；His (-3.2)；Glu (-3.5)；Gln (-3.5)；Asp (-3.5)；Asn (-3.5)；Lys (-3.9);及び、Arg (-4.5)。
【００５７】
別の態様において、保存的なアミノ酸置換は、公的に入手可能な類似度マトリックス ファミリー（６０、７０、１０２、１０３、９４、１０４、８６）を用いて成されてもよい。ＰＡＭマトリックスは、進化モデル由来の計算に基づいているのに対し、Ｂｌｏｓｕｍマトリックスは整列化内部の高度に保存されたブロックに由来する計算を使用する。ＰＡＭ又はＢｌｏｓｕｍマトリックスの何れかにおいてゼロ以上の類似度スコアは、保存的なアミノ酸置換をつくるのに使用されてよい。
【００５８】
別の態様において、保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が同じクラスの別のアミノ酸残基に置換される場合に、成されもよい（但し、アミノ酸が以下のように無極性、酸、塩基、中性及び無極性に分類される：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸：Asp、Glu；塩基：Lys、Arg、His；中性：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr）。
【００５９】
保存的なアミノ酸変化には、Ｌ‐アミノ酸の保存的置換だけでなく、対応するＤ‐アミノ酸による、保存的なＤ‐アミノ酸による、又は、天然の、遺伝的にコードされていない形式のアミノ酸によるＬ‐アミノ酸の置換を含み得る。天然の遺伝的にコードされていないアミノ酸は、β−アラニン、３−アミノ−プロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ−酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２−ナプチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニル アラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボキシリキス酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニン スルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチル リシン、２−アミノ 酪酸、２−アミノ 酪酸、２，４，−ジアミノ 酪酸、ｐ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、ε−アミノ ヘキサン酸、δ−アミノ 吉草酸、又は、２，３−ジアミノ酪酸を含む。
【００６０】
別の実施形態において、保存的なアミノ酸変化は、親水性若しくは疎水性、サイズ若しくは容量、又は、電荷の考慮に基づいた塩基の変化を含む。アミノ酸は、一般に、そのアミノ酸側鎖の性質に主に依存して、疎水性又は親水性として特徴付けられ得る。アイゼンバーグ（Eisenberg）らの標準化されたコンセンサス疎水性スケール（７１）に基づいて、疎水性アミノ酸は、ゼロよりも大きな疎水性を示し、そして、親水性アミノ酸はゼロよりも小さな疎水性を示す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸はGly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Met及びTrpを含み、そして、遺伝的にコードされた親水性アミノ酸はThr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、Ser及びLysを含む。遺伝的にコードされていない疎水性アミノ酸はｔ‐ブチルアラニンを含む一方、遺伝的にコードされていない親水性アミノ酸はシトルリン及びホモシステインを含む。
【００６１】
疎水性又は親水性アミノ酸は、さらに、その側鎖の特性に基づいて再分割され得る。例えば、芳香族アミノ酸は、少なくとも一つの芳香族又は芳香族複素環を含む一つの側鎖を有する疎水性アミノ酸である（但し、該芳香族又は芳香族複素環は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、二酸化窒素、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどのような１又はそれ以上の置換基を含んでよく、ここで、Ｒは、独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、置換された（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリル、置換された（Ｃ６−Ｃ２６）アルカリル、５−２０員へテロアリール、置換された５−２０員へテロアリール、６−２６員アルケテロアリール、又は、置換された６−２６員アルケテロアリールである）。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸はPhe、Tyr及びTrpを含む一方、遺伝的にコードされていない芳香族アミノ酸はフェニルグリシン、２−ナプチルアラニン、β−２−チエニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン及び４−フルオロフェニルアラニンを含む。
【００６２】
無極性アミノ酸は、生理的ｐＨで無荷電であり且つ二つの原子により共有されている電子対が一般的に該二つの原子の各々により等しく保持されている結合（複数）を有する側鎖（即ち該側鎖は極性が無い）を伴う疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた無極性アミノ酸はGly、Leu、Val、Ile、Ala及びMetを含む一方、遺伝的にコードされていない無極性アミノ酸はシクロヘキシルアラニンを含む。無極性アミノ酸は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である脂肪族アミノ酸か否かにより、更に再分割され得る。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸はAla、Leu、Val及びIleを含む一方、遺伝的にコードされていない脂肪族アミノ酸はノルロイシンを含む。
【００６３】
極性アミノ酸は、生理的ｐＨで無荷電であるが二つの原子により共有されている電子対が該原子の一つによってより接近して保持されている一つの結合を有する側鎖を伴う疎水性アミノ酸である。遺伝的にコードされた極性アミノ酸はSer、Thr、Asn及びGlnを含む一方、遺伝的にコードされていない極性アミノ酸はシトルリン、Ｎ‐アセチルリジン及び メチオニンスルホキシドを含む。
【００６４】
酸性アミノ酸は、７より低いｐＫａ値の側鎖を伴う親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失のために生理的ｐＨにおいて負に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸は、Asp及びGluを含む。塩基性アミノ酸は、７より高いｐＫａ値の側鎖を伴う親水性アミノ酸である。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合のため、生理的ｐＨにおいて正に荷電した側鎖を有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸はArg、Lys及びHisを含む一方、遺伝的にコードされていない塩基性アミノ酸は非環状アミノ酸オルニチン、２，３，‐ジアミノプロピオン酸、２，４‐ジアミノ酪酸及びホモアルギニンを含む。
【００６５】
上記分類が絶対的なものではなく、一つのアミノ酸が一つ以上のカテゴリーに分類されてもよいことは、当業者に認識されるであろう。さらに、アミノ酸は、特定のアッセイにより又は以前に同定されたアミノ酸との比較により、既知の挙動及び／又は特徴的な化学的、物理的若しくは生物学的性質に基づいて分類され得る。アミノ酸はまた、アミノ酸様側鎖を有する二機能性成分を含み得る。
【００６６】
保存的変化はまた、例えば、アミノ酸の機能的側鎖の反応による、非誘導体化残基に対して化学的誘導体化部分の置換を含み得る。それゆえ、これらの置換は、その遊離型（free）のアミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ‐トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ‐ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又は、ホルミル基へ誘導体化された化合物を含み得る。同様に、遊離（free）のカルボキシル基は、塩、メチル及びエチルエステル、若しくは、他の型のエステル、又は、ヒドラジドを形成するように誘導体化され得、そして、側鎖は、遊離のヒドロキシル基に対してはＯ‐アシル若しくはＯ‐アルキル誘導体を、又は、ヒスチジンのイミダゾール窒素に対してはＮ‐ｉｍ‐ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。ペプチド類似体もまた、例えば、メチル化によって、エチルアミン、エタノールアミン若しくはエチレンジアミンのようなアルキルアミンによるＣ末端アミノ酸のアミド化、又は、アミノ酸側鎖のアシル化若しくはメチル化（リジンのεアミノ基のアシル化のような）によって、化学的に変化させられたアミノ酸を含む。ペプチド類似体は、置換されたアミド（例えば、‐Ｃ（Ｏ）‐ＮＲの基、ここで、Ｒは（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル、置換された（Ｃ１‐Ｃ６）アルキル、置換された（Ｃ１‐Ｃ６）アルケニル、又は、置換された（Ｃ１‐Ｃ６）アルキニル）、又は、アミド結合のアイソスター（例えば、‐ＣＨ２ＮＨ‐、‐ＣＨ２Ｓ、‐ＣＨ２ＣＨ２‐、‐ＣＨ＝ＣＨ‐（シス及びトランス）、‐Ｃ（Ｏ）ＣＨ２‐、‐ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２‐、又は、‐ＣＨ２ＳＯ‐）によるペプチド内のアミド結合の置換をも含み得る。
【００６７】
前記化合物は、同種重合体又はヘテロ重合体を形成するために、例えば、重合又は抱合によって、共有結合性に結合され得る。スペーサ及びリンカー（典型的には、生理的条件下で無電荷なアミノ酸のような中性低分子から構成されるもの）が、使用され得る。結合は、多数の方法により達成され得る。例えば、システイン残基がペプチド終端に付加され、そして、複数ペプチドが管理された酸化により共有結合され得る。あるいは、ジスルフィド／アミド形成剤、又は、チオエーテル／アミド形成剤のようなヘテロ二機能性薬剤が、使用され得る。前記化合物はまた、もう一つの化合物（該もう一つの化合物は、例えば免疫原性応答を調節し得る）と結合され得る。前記化合物はまた、例えば、環状部分を有することによって、制約され（constrained）得る。
【００６８】
ペプチド又はペプチド類似体は、標準的化学技法により、例えば、溶液又は固相合成方法論を用いた自動化合成により、合成し得る。自動化ペプチド合成装置は、商業的に入手可能であり、且つ、当業者によく使用されている。ペプチド及びペプチド類似体はまた、例えば、Sambrookら（１１０）又はAusubelら（１１１）において記載されているような標準的な技術を用いた組換えＤＮＡ技術を用いて調製し得る。通常、候補化合物は、天然物又は合成（若しくは半合成）抽出物の両者の大規模ライブラリ、或いは、当業者既知の方法に従った化学的ライブラリから同定され得る。創薬及び薬剤開発の分野の専門家には、本発明の前記方法にとって、被検抽出物又は化合物の正確な供給源が重要でないことは理解されるであろう。したがって、実質的に、幾つかの化学的抽出物又は化合物がいくらでも、本書に記載された模範的な方法を用いてスクリーニングされ得る。そのような抽出物又は化合物の例には、植物に、真菌に、原核生物に若しくは動物に基づく抽出物、発酵ブロス、及び、合成化合物、並びに、現存する化合物の修飾を含むがこれらに限定されない。また多数の方法が、多数の化合物（糖類、脂質、ペプチド及び核酸に基づく化合物を含むがこれらに限定されない）のランダムな又は方向付けられた合成（例えば、半合成又は全合成）を発生させるのに利用可能である。合成化合物ライブラリは、商業的に入手可能である。或いは、細菌の、真菌の、植物の、及び、動物の抽出物の形の天然化合物ライブラリが、多くの供給源（Biotics (Sussex、英国)、Xenova (Slough、英国)、Harbor Branch Oceanographic Institute (Ft.Pierce、フロリダ州、米国)、及び、PharmaMar（マサチューセッツ州、米国）を含む）から、商業的に入手可能である。さらに、必要に応じて、天然及び合成的に産生された（例えば、Ａ／Ｅ病原体ポリペプチドの）ライブラリが、当業者既知の方法、例えば、標準的抽出及び分画法に従い、産生される。なおそのうえ、必要に応じて、任意のライブラリ又は化合物が、標準的な化学的、物理的又は生化学的方法を用いて容易に修飾される。
【００６９】
粗製抽出物が病原性を調節することが見出された場合、該陽性リード抽出物の更なる分画が、該観察された効果の原因である化学的成分を単離するのに必要である。そのため、その抽出、分画及び精製プロセスのゴールは、病原性修飾特性を有する前記粗製抽出物内の化学的実体の慎重な特徴付け及び同定である。本書に記載された化合物の混合物における活性検出のための同様のアッセイが、その活性成分の精製及びその誘導体の試験に使用し得る。そのような不均一な抽出物の分画及び精製の方法は、当業者において既知である。必要であらば、処置において有用な薬剤であることが示された化合物は、当業者に知られた方法に従って、化学的に修飾される。治療上の、予防的な、診断の、又は、他の価値のあるものとして同定された化合物は、Ａ／Ｅ病原体感染のサイトロバクター若しくはウシのモデル、又は、Ａ／Ｅ病原体感染の任意の他の動物モデルを用いて、引き続いて分析されてもよい。
【００７０】
ワクチン
「ワクチン」は、所望の免疫応答を惹起する物質を含む組成物である。ワクチンは、例えば、Ａ／Ｅ病原体又はその成分のような感染性物質の除去を可能にする免疫系のメモリーＢ及びＴ細胞を、選択、活性化、又は、拡大してもよい。ある実施形態において、ワクチンは、アジュバントのような好適な担体を含む（該アジュバントとは、非特異的様式で特異的抗原又は抗原群に対する免疫応答を増加させる物質であり、任意の所与のワクチン用量における該抗原量の減少、又は、所望の免疫応答を生起させるのに必要とされる用量の頻度の減少を可能とする）。所望の免疫応答は、Ａ／Ｅ病原体の脱粒（感染動物、例えば哺乳動物の糞便における存在）又はＡ／Ｅ病原体によるコロニー形成（感染動物、例えば哺乳動物の腸における存在）に対する完全な又は部分的な防御を含む。例えば、所望の免疫応答は、非ワクチン接種動物と比較した時に、ワクチン接種動物におけるＡ／Ｅ病原体の脱粒又はＡ／Ｅ病原体のコロニー形成に対する防御が、１０%から１００%までの間の任意の値、例えば、１０%、２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、１００%を含んでよい。
【００７１】
本発明に従ったワクチンは、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子、又は、それらの免疫原性断片を含んでもよく、また、当業者に周知の又は本書に記載された投与様式を用いて投与されてよい。本発明の幾つかの実施形態において、前記ワクチンは、生存しているＡ／Ｅ病原体、殺傷されたＡ／Ｅ病原体、又は、それらの成分を含んでもよい。生存しているＡ／Ｅ病原体は、経口ワクチンの形状で投与されてもよいが、該Ａ／Ｅ病原体の病原性には影響するがその免疫応答の誘発には影響しない非可逆的遺伝的改変を含んでよい。生ワクチンは、接種された動物、例えば哺乳動物の腸内でコロニー形成可能であってもよい。
【００７２】
幾つかの実施形態において、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子、又は、それらの免疫原性断片、又は、本書に記載された変異させられた細菌（例えば減弱された細菌）が、家禽、例えばニワトリ、アヒル、シチメンチョウなどに、該家禽における免疫応答を惹起（例えば抗体産生）するように、投与されてもよい。本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子又はそれらの免疫原性断片に対し免疫応答を示すそのような家禽から得られた卵又はその生産物は、動物、例えばヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジなどに、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子又はそれらの免疫原性断片に対し該動物における免疫応答を惹起するように投与されてもよい。家禽における抗体産生方法及びそのような抗体の投与方法は、例えば、１９９８年５月１２日に発行された米国特許５，７５０，１１３（Cook）、２００４年５月４日に発行された米国特許６，７３０，８２２（Ivarieら）、及び、本書で引用された出版物１１３‐１１７において、記載されている。
【００７３】
本発明に従った前記ワクチンは、当業者に周知の技術を用いて、組換え型又は精製されたＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＰ、Ｔｉｒ、志賀毒素１若しくは２及び／又はイニチミンのような抗原の添加によって更に補充されてもよい。ＥｓｐＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＢ、及び、イニチミンのようなＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７タンパク質の組換え生産及び使用が、記載されている（ＰＣＴ公報第ＷＯ９７／４００６３；ＰＣＴ公報第ＷＯ９９／２４５７６；５１）。
【００７４】
細胞培養
Ａ／Ｅ病原体は、当業者に周知された又は本書に記載された任意の方法に従って、育てられてよい。例えば、Ａ／Ｅ病原体は、まず、Luria-Bertani（ＬＢ）培地中で、凡そ８から４８時間、又は、凡そ１２から２４時間増殖させ、それから、凡そ１：５から１：１００例えば１：６７、又は、凡そ１：５から１：２５、又は、凡そ１：１０で、２０‐１００ｍＭ ＮａＨＣＯ２若しくはＮａＨＣＯ３、又は、凡そ３０‐５０ｍＭ若しくは凡そ４４ｍＭ ＮａＨＣＯ２若しくはＮａＨＣＯ３；４‐２０ｍＭ ＭｇＳＯ４若しくは凡そ５‐１０ｍＭ；又は、凡そ０．８ｍＭから８ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１から１．５%グルコース、又は、凡そ０．２から１％若しくは凡そ０．４％グルコース及び０．０５から０．５％カサミノ酸、又は、凡そ０．０７から０．２％若しくは凡そ０．１％カサミノ酸を添加されたＭ−９最少培地中に、希釈されてもよい。培養は、一般に、凡そ３７℃で、任意的には２‐１０％ ＣＯ２、又は、任意的には５％ ＣＯ２に維持し、凡そ６００ｎｍの光学濃度が０．７から０．８まで増殖させる。それから全細胞を適当な手段、例えば、精密濾過法又は遠心分離により除去し、その上清を例えば、１００倍のように１０‐１０００倍又はそれ以上に、透析及び限外濾過などを用いて濃縮する。総タンパク質量は、当業者既知の方法により容易に決定される。
【００７５】
細胞培養上清は、野生型又は変異体Ａ／Ｅ病原体を含む任意のＡ／Ｅ病原体、例えば本書に記載された又は当業者既知のＥＨＥＣ、の培養を用いて産生されてよい。一般に、前記Ａ／Ｅ病原体は、ＩＩＩ型抗原分泌を助ける条件下で、好適な培地中で培養される（米国特許第６，１３６，５５４及び６，１６５，７４３）（５１、７４）。
【００７６】
付加的遺伝子の単離及び同定
本書に記載された前記ヌクレオチド及びアミノ酸配列、例えば配列番号１〜５６又は５９〜８４、に基づいて、付加的遺伝子の単離及び同定が標準的技術を用いて成し得る。任意のＡ／Ｅ病原体が、そのような遺伝子の供給源として役立ち得る。
【００７７】
ある実施形態においては、本書に記載された前記核酸配列は、何れかのＤＮＡ鎖配列に基づいたプローブ又はプライマー（変性オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを含む）を設計するために用いてもよい。それから、前記プローブ又はプライマーは、標準的増幅法又はハイブリッド形成法を用いて、他のＡ／Ｅ病原体からの遺伝子に対するゲノムの又はｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするのに用いてもよい。
【００７８】
ある実施形態においては、本書に記載された前記アミノ酸配列は、Ａ／Ｅ病原体からのポリペプチドのスクリーニングに使用される抗体又はその他の試薬を作成するために使用され得る（但し、Ａ／Ｅ病原体は、これらの抗体に結合する）。
【００７９】
ある実施形態においては、結合パートナーは、エピトープ配列（例えば、ＦＬＡＧ又は２ＨＡ）で、本発明の前記ポリペプチド（例えば、配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４と実質的に同一な配列）を標識化し（tagging）、そして、それを本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む適当なベクターでトランスフェクションすること又は内因性細菌ＩＩＩ型の送達の何れかにより宿主細胞に送達し、続いて免疫沈降及びその結合パートナーの同定を行うことによって、同定されてもよい。ＨｅＬａ細胞が、そのＦＬＡＧ又は２ＨＡ融合を発現する系統で感染させられ、溶解され、そして、抗ＦＬＡＧ又は抗２ＨＡ抗体で免疫沈降されてもよい。結合パートナーは、質量分析で同定されてもよい。本発明のポリペプチドが十分量産生されない場合、そのような方法はその結合パートナーを同定するための標識化された（tagged）タンパク質を送達しなくともよい。補完的なアプローチの一部として、本発明の各ポリペプチドは、哺乳類の形質移入ベクター中に、例えば２ＨＡ、ＧＦＰ及び／又はＦＬＡＧと融合されてクローン化されてもよい。形質移入後、ＨｅＬａ細胞は溶解され、そして、標識化されたポリペプチドが免疫沈降されてもよい。前記結合パートナーは、ＳＤＳ ＰＡＧＥに続く質量分析によって、同定されてもよい。
【００８０】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、標識化され、過剰産生され、そして、同定標的化合物を同定及び／又は確認するためのアフィニティーカラム及び免疫沈降に使用されてもよい。ＦＬＡＧ、ＨＡ、及び／又は、Ｈｉｓで標識されたタンパク質は、細胞抽出物から宿主細胞因子を取り出すアフィニティーカラムなどのために使用され得、そして、任意のヒットしたものは、標準的な結合実験、飽和曲線、及び、本書に記載された又は当業者既知の他の方法によって、確証されてよい。
【００８１】
ある実施形態において、細菌ツーハイブリッドシステムをタンパク質間相互作用を調べるために使用してもよい。本書に記載された前記核酸配列又はそれと実質的に同一な配列は、ツーハイブリッドシステムのｐＢＴベイト プラスミドにクローン化され得、そして、５ｘ１０６個の独立クローンである商業的に入手可能なマウス脾臓ライブラリがベイトに対する標的ライブラリとして使用されてよい。可能性のあるヒットしたものについては、偽陽性（該偽陽性は、クローン ベイト変異体及びレポーター遺伝子をクローン バイトと独立に活性化するライブラリ標的クローンから生じる）を減少させるために前記プラスミドを回収し再形質転換することによって更に特徴付けられてよい。再現性のあるヒットしたものは、本書に記載されたように更に調べられてもよい。
【００８２】
ある実施形態において、ＧｒｌＡを発現するＡ／Ｅ病原体系統、例えばクローン化されたＧｒｌＡを発現するＥＨＥＣ Ｏ１５７系統は、Ａ／Ｅ ＩＩＩ型分泌プロテオームのプロテオミクス解析（例えば、その上清の２次元ゲル解析を用いる）のために使用されてもよい。さらに、完全Ａ／Ｅ病原体（例えばＥＨＥＣアレイ）は、ＧｒｌＡによって制御される遺伝子を限定するために使用されてもよい。病原性は、本書に記載された又は当業者に周知されているように調べられてもよい。
【００８３】
一旦、コード配列が同定されると、それらは標準的クローニング技術を用いて単離され、そして、任意の適当なベクター又はレプリコン（例えばポリペプチド産生のための）に挿入され得る。そのようなベクター及びレプリコンには、バクテリオファージＸ（大腸菌）、pBR322（大腸菌）、pACYC177（大腸菌）、pKT230（グラム陰性細菌）、pGVI 106（グラム陰性細菌）、pLAFRl（グラム陰性細菌）、pME290（非大腸菌グラム陰性細菌）、pHV14(大腸菌及び枯草菌)、pBD9（バシラス）、pIJ61（放線菌類）、pUC6（放線菌類）、YIp5（酵母類）、Ycpl9 （酵母類）、又は、ウシ乳頭腫ウイルス（哺乳類細胞）が、含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００８４】
一般的には、本発明の前記ポリペプチドは、適当なベクターにより形質転換又は形質移入された任意の適当な宿主細胞中で、産生されてよい（６９）。前記形質転換又は形質移入の方法及び前記発現媒体の選択は、選択された宿主システムに依存するであろう。広範な種類の発現系が使用されてよく、そして、使用される正確な宿主細胞は本発明に対して決定的なものではない。例えば、本発明に従ったポリペプチドは、原核生物の宿主（例えば、大腸菌）又は真核生物の宿主（例えば、出芽酵母、昆虫細胞例えばＳｆ２１細胞、又は、哺乳類細胞例えばＮＩＨ ３Ｔ３、ＨｅＬａ若しくはＣＯＳ細胞）において、産生され得る。そのような細胞は、広範囲な供給源（例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、マナサス、バージニア州）から入手可能である。ポリペプチド産生のための細菌発現系には、大腸菌ｐＥＴ発現系（Novagen社、マジソン、ウィスコンシン州）及びｐＧＥＸ発現系（ファルマシア）を含む。
【００８５】
アッセイ
ポリペプチド、核酸分子及び低分子を含む候補化合物は、本書に記載された又は当業者既知の種々の技術を用いて、スクリーニング及び試験され得る。本発明の任意の前記ポリペプチド又は核酸分子の発現量を減少させる化合物は、例えば、Ａ／Ｅ病原体感染に対する治療において、有用で有り得る。
【００８６】
スクリーニングアッセイは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブとして本発明に従った任意の適当な核酸断片を用いた標準的ノーザンブロット解析による遺伝子発現測定（但し、前記候補化合物存在下での前記遺伝子発現レベルが前記候補化合物非存在下での前記遺伝子発現レベルと比較された場合の）によって行われてよい。代わりに、又は、さらに、候補化合物の前記効果は、例えば、免疫沈降又はウエスタンブロット法のアプローチを用いて、前記ポリペプチドの発現又は分泌レベルで判定されてもよい。他のアッセイは、以下の通りに行われてよい
【００８７】
ＩＩＩ型分泌の確認、及び、宿主細胞内への転位置（translocation）
候補化合物のどれが分泌に関しＴＴＳＳを要求するかを決定するために、各遺伝子又はそれらの一部は、その末端をＦＬＡＧに融合させてもよく、そして、ＷＴ及びＴＴＳＳ変異体（例えば、本書に記載された又は当業者に周知されているようなＷＴ ＥＨＥＣ及びその同質遺伝子のｅｓｃＮ ＩＩＩ型変異体）からの上清が収集されてもよい。分泌を決定するための別の方法は、前記変異体系統における分泌産物のロスについての上清検査、又は、前記タンパク質に対する抗体産生及びＷＴとＩＩＩ型上清のウエスタン分析、を含む。目的の前記タンパク質がＴＴＳＳ成分でないことを確認するために、ＩＩＩ型誘導条件下で増殖させた前記候補化合物の各々からの上清をＩＩＩ型分泌について検討してもよい。前記ＬＥＥ ＴＴＳＳは、二つのクラスのタンパク質を分泌する：トランスロコン（ＥｓｐＡ、Ｂ、及び、Ｄ）（細菌の細胞表面に集合させられている）、及び、エフェクター（宿主細胞中に直接的に転位置させられている）。候補化合物は、それらがエフェクター又は輸送体（translocators）であるか否かを判定するために調べられてもよい。例えば、ＥＨＥＣ又は他のＡ／Ｅ病原体におけるＦＬＡＧタグをつけた推定上のエフェクターは、培養ＨｅＬａ上皮細胞を感染させるために使用され、抗ＦＬＡＧ抗体で染色後に免疫蛍光顕微鏡観察により調べられてもよい。そのような可視化は、通常宿主細胞中への細菌の送達を実証し、そして、しばしば前記エフェクターがその標的としている細胞小器官を指し示す（例えば膜へのＴｉｒ、ゴルジへのＮｌｅＡ）。種々の細胞区画に対する抗体は、その局在性を確認するために使用され得る。前記可視化を補完するため、感染させたＨｅＬａ細胞は既知の分画方法（３０）を用いてサイトゾル、不溶性、及び、膜画分に分画され、どの細胞画分がエフェクターの標的なのかを限定するために抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタン分析を行い得る。対照として、細胞は、ＴＴＳＳ欠損系統において発現されるタグ付加エフェクターで感染させられてもよい。前記膜画分を標的としているのであれば、高濃度の塩又はアルカリ性ｐＨの処理が、それが内在性膜タンパク質であるか否かを決定するのに使用され得る。前記候補化合物が低レベルで発現しており且つ免疫蛍光法による転位置ないし移行（translocation）の検出が困難な場合、アデニル酸シクラーゼ、その活性化のために哺乳類の細胞質の補助因子を必要とする（カルモジュリン）酵素（８７）、の遺伝的融合が作成され得る。
【００８８】
台形成（pedestal formation）及び取り込みにおける効果
アクチン凝縮（condensation）及び台形成がＡ／Ｅ病原体の特徴であるとすると、候補化合物は、アクチン蓄積及び台形成について、例えば、培養ＨｅＬａ上皮細胞において、スクリーニングされ得る。
【００８９】
ＥＰＥＣ及びＥＨＥＣ浸潤（invasion）は容易に測定されるもう一つの細胞培養表現型であり、そして、培養上皮細胞との相互作用及び宿主細胞骨格を変化させる能力の徴候を与える（ＩＩＩ型 変異体は浸潤、Ｔｉｒ及びインチミン欠損系統もまた浸潤しない）。種々の候補化合物の浸潤レベルが、ｗｔ及びＩＩＩ型 変異体 Ａ／Ｅ病原体において、例えば、ＷＴ及びＴＴＳＳ 変異体ＥＨＥＣをＨｅＬａ細胞においてゲンタマイシン保護アッセイ（protection assay）を用いて、比較されてもよい。
【００９０】
さらに、ＥＰＥＣ及びＥＨＥＣがＩＩＩ型依存様式で宿主のＰＩ３キナーゼ活性を抑制することによって培養マクロファージにおける食作用を抑制するので、候補化合物が培養マクロファージの食作用を遮断する能力を試験し得る（Celli, J., M. Olivier, and B. B. Finlay. 2001. Enteropathogenic Escherichia coli mediates antiphagocytosis through the inhibition of PI 3-kinase-dependent pathways. Embo J 20:1245-58）。もし任意の候補化合物が食作用の抑制をできなくさせるのであれば、ＰＩ３キナーゼ抑制について第二のアッセイを行い得る。
【００９１】
極性化した上皮性単層（polarized epithelial monolayers）における効果
接合部の完全性は下痢において鍵となる役割を担う。台形成に加えて、Ａ／Ｅ病原体は、極性化した上皮細胞（polarized epithelial monolayers）における他のＬＥＥ ＩＩＩ型効果、微絨毛の喪失（微絨毛消失）及び単層貫通（transmonolayer）電気抵抗の喪失（密着結合の測定）を含む、を及ぼす。Ｃａｃｏ‐２細胞の極性化したヒト腸単層を用いて、高分解能走査型電子顕微鏡観察が、ＷＴ Ａ／Ｅ病原体（例えばＷＴ ＥＨＥＣ）、ＴＴＳＳ変異体Ａ／Ｅ病原体（例えばＥＨＥＣ ｅｓｃＮ）、及び、前記候補化合物の各々で感染させた単層について行われてよい。単層は、種々の時間感染させられ、洗浄され、そして、標準的技術を用いたＳＥＭ（６６）で処理され、そして、感染後の極性化したＣａｃｏ‐２細胞の電気抵抗の喪失についてスクリーニングされ得る。
【００９２】
自然免疫及び炎症における効果
病原体に共通して急速に出現したテーマは、自然免疫及び炎症反応を抑制するその能力である。そのような効果は、ＥＨＥＣ及びＥＰＥＣのようなＡ／Ｅ病原体に関して報告されており、そして、これらのアッセイがＷＴ及びＴＴＳＳ変異体 Ａ／Ｅ病原体株において候補化合物を試験するために用いられてもよい。例えば、ＥＨＥＣは、ＨｅＬａ細胞において、ＮＦ‐κβの抑制を引き起こし、その結果Ｉｌ‐８、Ｉｌ‐６及びＩｌ‐１αのような幾つかのサイトカインの抑制をもたらし（８０）、また、このプロセスは前記ＬＥＥ ＴＴＳＳを必要とする。候補化合物は、これらの因子の抑制について、例えば、ＨｅＬａ細胞の感染後に、ＲＴ‐ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）及び商業的に利用可能なＥＬＩＳＡアッセイのような標準的方法を用いて、アッセイされてよい。
【００９３】
局在性情報に基づいた機能研究
表現型アッセイに加えて、候補化合物は、宿主細胞における局在に基づいてアッセイされてもよい。例えば、候補化合物がゴルジに局在化されているのであれば、ゴルジの機能に影響するかを判定するためのアッセイ（糖鎖形成を検討する生化学的研究及び該候補化合物を発現する酵母における機能的ゴルジアッセイを含む）を行い得る。前記候補化合物がミトコンドリアに局在化されているのであれば、アポトーシス及び他のミトコンドリア機能についてのアッセイを利用し得る。前記候補化合物が小胞体に局在化されているのであれば、タンパク合成及び分泌のアッセイを計画し得る。核へのターゲティングが起こているのであれば、転写研究を行ってもよい。
【００９４】
病原性における役割
競合的指標（ＣＩ）は、微量な病原性因子の役割、並びに、二つの病原性因子が同一の病原性「経路」に属するかどうかを決定するのに広範に使用されている（６３）。簡潔には、異なる抗生物質耐性で特徴付けられる二つの菌株が、動物に同時感染させられ、適当なインキュベーション時間の後、細菌が回収され、該二つの菌株の比が決定される。値が１は、等しい病原性を示している。同定された化合物が病原性への影響を有しているのであれば、ＷＴに比較されてそのＣＩが決定されてもよい。ＣＩはまた、前記候補化合物が属する病原性経路がどれかを決定するために使用されてもよい。例えば、ＣＩは、二つの病原性因子の変異体の比較を、ＷＴに対する各々の変異体を比較するのに加えて、行ってもよい。単一の変異体と二重変異体とを比較した場合に、ＣＩ比が１は、それらが同じ病原性経路に属していることを示し、一方、１以外の値はそれらが異なる病原性「経路」にあることを示している。
【００９５】
顕微鏡観察の研究
顕微鏡観察技術がＡ／Ｅ病原体疾患を特徴付けるために使用されてもよい（Ａ／Ｅ病変形成を確認するためにｒＥＰＥＣを感染させたウサギからの遠位回腸のパイエル板におけるリンパ濾胞を検討するための透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（６３）、マウスの絨毛内への送達を示すための共焦点顕微鏡観察、及び、感染マウスにおける疾患プロセスの組織学的解析を含む）。
【００９６】
これらの技術は、候補化合物を適当な動物モデル、例えば、前記候補配列中に変異を含む種々のサイトロバクター菌株で感染させたマウスにおいて、アッセイするために使用されてよい。各候補化合物についての包括的な研究が、この系で病状悪化（又は病状の欠如）を追跡するために行われてもよい。さらに、腸の表面におけるこれら変異体のコロニー形成レベルが決定されてもよい。抗生物質で特徴付けられた菌株が、動物を感染させるために使用され、続いて腸の組織が回収されてもよい。組織はホモジナイズされ、細菌は選択プレート上でプレート計数により定量化されてよい。
【００９７】
Ａ／Ｅ病原体感染、例えばサイトロバクター感染の主要な特徴は、広範な炎症である。細胞の炎症事象は、候補化合物における種々の変異体について、共焦点顕微鏡観察により、追跡されてもよい。組織を抗体又はレクチンで標識した後に共焦点顕微鏡で観察することにより、変異体によって感染部位に集められる前記炎症細胞が、該変異体の親株との比較で明らかにされてもよい。幾つかの生得的応答因子に対する抗体が入手可能であり、そして、生得的応答因子及びマクロファージ、好中球、ｉＮＯＳ産生細胞、樹状細胞などのような細胞を検討して、感染の際の前記変異体の表現型を分析するために用いられてもよい。
【００９８】
組織学的研究
染色された組織の組織学的研究が行われてもよい。例えば、ＲＥＰＥＣ及び候補化合物において欠失のある菌株で感染させられたウサギのヘマトキシリン及びエオシン染色の回腸切片は、その炎症及び組織損傷を比較しＡ／Ｅ病原体感染を特徴付けるために調べられてもよい（５８）。同様の染色が、マウスにおいて、候補化合物を欠いたサイトロバクター菌株でなされてもよい。ギムザ及びトルイジンブルーＯ（一般的な形態学のために）、過ヨウ素酸シッフ（炭水化物を染色し、腸の粘液層及び杯状細胞を調べることが可能）、グラム染色、クロロ酢酸エステラーゼ（炎症細胞の染色）、及び、カスパーゼアッセイ（アポトーシスのために）を含む、利用可能な幾つかの他の組織学的染色により、サイトロバクター及び同質遺伝子的変異体と関連した炎症を更に規定してよい。細菌及び哺乳動物細胞抗原に対する抗体の利用を、免疫組織化学は許容する。
【００９９】
抗体
本発明の化合物は、標準的な調製技術（４５）又は当業者既知の技術を用いて、本発明のポリペプチドに対する抗体を調製するのに使用し得る。
【０１００】
例えば、本発明のポリペプチドのコード配列は、ウサギの免疫化に必要な程度に精製されてよい。低い親和性又は抗血清の特異性といった潜在的な問題を最小化するために、２又は３のポリペプチドコンストラクトが各タンパク質から産生されてよく、そして、各コンストラクトは少なくとも２羽のウサギに注射される。抗血清は連続した注射により高められてよく、好ましくは、少なくとも３回のブースター注射を含む。最初の免疫化はフロイント完全アジュバントで、そして、引き続く免疫化はフロイント不完全アジュバントで行われてよい。抗体価は、前記精製タンパク質を用いたウエスタンブロット及び 免疫沈降解析によりモニターされてよい。免疫血清は、ＣＮＢｒセファロース結合タンパク質を用いて、アフィニティー精製されてよい。抗血清の特異性は、無関係のタンパク質のパネルを用いて測定されてよい。代わりに、又は、更に、本発明のポリペプチドの相対的に独特な免疫原性領域に対応するペプチドが生成され、そして、導入されたＣ末端リジンを介して鍵穴カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）へ結合されてもよい。これらのペプチドに対する抗血清は、ＢＳＡと抱合したペプチドでアフィニティー精製されてよく、そして、特異性は、ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット（ペプチド抱合体を用いウエスタンブロットと免疫沈降による）により試験される。
【０１０１】
或いは、本発明の前記ポリペプチドの何れかと特異的に結合する単クローン抗体が、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製される（９１、９０、８９、７８）。一旦産生されたら、単クローン抗体は、特異的認識についてウエスタンブロット又は免疫沈降によりテストされてよい。本発明の前記ポリペプチドと特異的に結合する抗体は有用で有ると判断される；そのような抗体は、例えば免疫測定法において使用されてよい。或いは、単クローン抗体は、上記の本発明の前記ポリペプチド及びファージディスプレイ ライブラリ（１１２）を用いて調製されてもよい。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、抗体は、（高頻度の荷電残基のような判定基準によって）、免疫原性が有りそうに思われるポリペプチド断片を用いて産生されてもよい。抗体は、例えば、一つの種からの抗原結合領域及びもう一つの種からのＦｃ部分を含むキメラ抗体を用いることによって、又は、適切な種のハイブリドーマから産生された抗体を用いることによって、有害な宿主免疫応答を最小限にするように仕立てられ得る。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、本書に記載された前記ポリペプチドの何れかに対する抗体は、Ａ／Ｅ病原体による感染を治療又は予防するのに使用してもよい。
【０１０４】
動物モデル
化合物は、Ａ／Ｅ病原体感染の種々の動物モデルにおいて迅速にスクリーニングされ得る。
【０１０５】
サイトロバクターマウス感染モデルは天然疾病モデルであり、そして、成体ウシのＥＨＥＣ脱粒モデルは天然の非疾病運搬モデル（ウシは病気にならないが、ＥＨＥＣはその常在菌叢の一部ではない）である。サイトロバクターモデルについて、変異体は、本書に記載されたようにマウスにおける病原性に関してスクリーニングされ得る。ノックアウト（ＫＯ）／変異体マウスは、感染における候補配列の役割を調べるために使用されてもよい。幾つものＫＯマウス株が開発されており、それは、ｉＮＯＳ（２０）、Ｔ及びＢ細胞（１０６）、Ｔｌｒ−４の役割の明確化、及び、一定範囲の宿主感受性の確立（５４）、並びに、Ｎｃｋを含む。
【０１０６】
ウシのモデルについては、前記ＥＨＥＣ変異体は、一年子のウシにおいてスクリーニングされ得る。（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ ０２／０５３１８１を参照されたい）。簡潔には、１０８ＣＦＵの変異体又はＷＴ Ｏ１５７が、経口胃挿管を介してウシに送達される。接種１４日後に、糞便の脱粒を選択的プレーティング によりモニターし、そして、コロニーは、mutiplex ＰＣＲ、脱粒レベル、及び、ＥＨＥＣが集中している肛門周囲の領域の組織学的及び顕微鏡での解析により検証する（９７）。もう一つのモデルは、ウシの腸ループ（intestinal loop）モデルである（該モデルにおいては、腸ループにＥＨＥＣが注入され、そして種々の時点で、組織学的及び顕微鏡的な検討、並びに、プレーティングによる接着性細菌の定量化がなされる。
【０１０７】
ＲＤＥＣ‐１感染の天然ウサギ感染モデルが以下の通りに行われてよい：オーバーナイトで培養された細菌を遠心分離により収集し、そして、１ｍｌのリン酸緩衝食塩水に再懸濁する。ニュージーランド白色ウサギ（体重１．０から１．６ｋｇ）を一晩囲い込み（fasted）、それから、５ｍｌの２．５％無菌炭酸水素ナトリウムと１ｍｌのＲＤＥＣ‐１若しくは候補配列変異体菌株（２：‐５ｘ１０１０）を口腔胃管（orogastric tubes）を用いてその胃内に播種する。次の日に各ウサギに同じ用量の細菌を播種する。各々のウサギの体重が毎日量られ、そして細菌の糞便の脱粒が直腸塗布により便ペレットから収集される。直腸塗布を、ナリジクス酸含有マッコンキー（MacConkey）プレートの表面の２分の１に渡って転がす。５つの便ペレット又は同量の液体便を各々のウサギから収集し、そして、３ｍｌリン酸緩衝食塩水に再懸濁し、そして各々の便懸濁液０．１ｍｌをナリジクス酸含有マッコンキープレート上にプレーティングする。前記ナリジクス酸耐性コロニーの増殖は以下のようにスコアーリングする：０、無増殖；１、広い間隔のコロニー；２、密接な間隔のコロニー；３、集密的に増殖したコロニー。ケタミンと過量のフェノバルビタール ナトリウムの静脈内注射によって絶命させた後、即座に組織を摘出する。腸組織における細菌コロニー形成量は以下の通りにアッセイした：盲腸を除く前記腸のセグメント（１０ｃｍ）は、その近位及び遠位末端で二重に結紮され、二重結紮部分の間で切開され（dissected）、それから、１０ｍｌ氷冷リン酸緩衝食塩水で流す。盲腸からの粘稠性内容物１グラムに９ｍｌのリン酸緩衝食塩水を加える。得られたリン酸緩衝食塩水懸濁液は、希釈され、そして、ナリジクス酸含有マッコンキープレート上にプレーティングする。組織試料を９ｍｍ直径コルク穿孔器を用いて摘出し、リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、２ｍｌの氷冷リン酸緩衝食塩水を、そして、ホモジナイザでホモジナイズし、それから、段階希釈試料をマッコンキープレート上にプレーティングする。平方センチメートル当たりの各組織に接着した細菌の数は以下の通りに計算する：ＣＦＵ／ｃｍ２＝前記細菌数／プレート×希釈因子×２ｍｌ／‐０．４５２。
【０１０８】
治療及び診断
本書に記載された前記ポリペプチド及び核酸分子は、例えば、ワクチン若しくは治療用の組成物の調製、又は、病原性が減弱されたＡ／Ｅ病原体の構築のために、治療に使用されてもよい。そのようなＡ／Ｅ病原体は、例えば、本書に記載された核酸配列に基づくプライマーを設計すること、及び、ｓａｃＢ遺伝子に基づく対立形質交換技術（２９）を用いることにより、本書に記載されたように構築されてよい。前記ポリペプチド及び核酸分子は、単独で使用、或いは、互いに、又は、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＰ、Ｔｉｒ、志賀毒素１、志賀毒素２、又は、インチミン分子のような他の適切な分子と、組み合わせて使用されてもよい。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、本書に記載された前記核酸分子は、アンチセンス技術において使用されてもよい。核酸に関連して本書で「アンチセンス」という場合、核酸分子、例えば、ｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ又はｎｌｅＦ遺伝子のような遺伝子の有意鎖に相補的な、或いは、配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を意味する。幾つかの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、その相補遺伝子によってコードされるポリペプチドのレベルを、一つの細胞中で両者が発現されている際に、低下させられる核酸分子である。幾つかの実施形態において、前記ポリペプチドレベルは、その相補的アンチセンス核酸分子がなくその遺伝子のみが発現している細胞中の前記ポリペプチドレベルと比較した場合に、少なくとも１０％から少なくとも２５％の任意の整数まで、又は、少なくとも２５％から少なくとも５０％の任意の整数まで、又は、少なくとも５０％から少なくとも７５％の任意の整数まで、又は、少なくとも７５％から１００％の任意の整数まで、低下させられる。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術すなわち転写後遺伝子サイレンシング形式を用いて、興味のある遺伝子又は翻訳若しくは非翻訳領域の発現が、抑制又は阻止されてもよい。ＲＮＡｉは、機能的「ノックアウト」すなわち興味のある遺伝子又は翻訳若しくは非翻訳領域の発現が減少するようなシステム（前記コード産物全体の減少がもたらされる）を創生するのに用いられてもよい。そういうものとして、ＲＮＡｉは、興味のある核酸又はその断片若しくは変異体を標的にし、次に、それがコードする産物の発現及び活性レベルを減少させるために実行されてもよい。そのようなシステムは、前記産物の機能研究だけでなくＡ／Ｅ病原体感染の治療のためにも使用されてよい。ＲＮＡｉは、例えば、発行された米国特許出願２００２０１７３４７８（Gewirtz；２００２年１１月２１日に発行）及び２００２０１３２７８８（ルイスら；２００２年１１月７日に発行）（７９、６７）に記載されている。ＲＮＡｉを行うための試薬及びキットが、例えば、Ambion Inc.（Austin、テキサス、米国）及びNew England Biolabs Inc.（Beverly、マサチューセッツ州、米国）からのものが商業的に入手可能である。
【０１１１】
幾つかのシステムにおけるＲＮＡｉのための初期物質は、標的核酸に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であると考えられている。前記二本鎖ＲＮＡは、そして、２１‐２３ヌクレオチド長の低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）（各々２ヌクレオチドが３’突出した１９−２１ｂｐの二本鎖）へと切断されると考えられている。この最初の切断過程に影響すると考えられている酵素は、「Ｄｉｃｅｒ（ダイサー）」と呼ばれ、Ｒｎａｓｅ ＩＩＩファミリーの二本鎖ＲＮＡ特異的ＲＮＡ分解酵素のＲｎａｓｅ ＩＩＩファミリーの一員として分類されている。或いは、ＲＮＡｉは、細胞内への直接的な導入を介して、又は、そのようなｓｉＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡ様分子の適当な前駆物質（例えばベクター等）を細胞内に導入することによる細胞内での生成を介して、効果が発揮されてよい。ｓｉＲＮＡは、それから、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成するために他の細胞内成分と会合してもよい。そのようにして形成されたＲＩＳＣは、引き続いて、そのｓｉＲＮＡ成分と興味のある転写物（標的転写物）との間の相同性による塩基対形成相互作用を介して、該標的転写物を標的とし、該ｓｉＲＮＡの３’末端から凡そ１２ヌクレオチドの該標的転写物の切断をもたらす。そうして、前記標的ｍＲＮＡは切断され、そして、該標的ｍＲＮＡがコードするタンパク質産物レベルが減少させられる。
【０１１２】
ＲＮＡｉは、適切に試験管内合成されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子を細胞内に導入することによって、効果が発揮されてよい。ＲＮＡｉは、例えば、化学的に合成されたＲＮＡを用いて行われてよく（６４）、それに適したＲＮＡ分子は既知の方法を用いて化学的に合成されてよい。或いは、適当な発現ベクターがそのようなＲＮＡを試験管内又は生体内で転写させるために使用されてもよい。センス及びアンチセンス鎖（同じベクター上又は別のベクター上に存在する配列によりコードされる）の試験管内転写は、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われてもよく、この場合、該ベクターは適当なコード配列がＴ７プロモータに作動可能なように連結されたものを含んでよい。前記試験管内転写されたＲＮＡは、具体的には（例えば大腸菌ＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いて）、ＲＮＡｉに適したサイズへと試験管内で加工されてもよい。ＲＮＡ二本鎖（該二本鎖は、興味のある標的細胞内に導入される）を形成するために組み合わされてもよい。低分子ヘアピン型ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）を発現する他のベクターが使用されてもよく、ｓｈＲＮＡｓはｓｉＲＮＡ様分子へと加工され得る。ベクターに基づく多様な方法が当業者に周知されている（６５、９３、９５、９８、９９、１０５、１０９）。そのようなベクターを試験管内で又は生体内で（例えば、遺伝子治療）細胞に導入する多様な方法が、当業者に周知されている。
【０１１３】
したがって、一つの実施形態においては、配列番号２２〜４３の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現が、該ポリペプチド若しくはその断片をコードする核酸分子又はそれらと相同的な核酸分子に対応するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子を細胞内に導入するか又は細胞内で産生させることによって抑制されてもよい。種々の実施形態において、そのような方法は、細胞内へのｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子の直接投与、或いは上述の前記ベクターに基づく方法の使用を必要としてもよい。一つの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、凡そ３０ヌクレオチド長より短い。一つの更なる実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、凡そ２１‐２３ヌクレオチド長である。一つの実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、１９‐２１ｂｐの二本鎖部分を含み、各鎖は３’突出の２ヌクレオチドを有する。複数の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子は、前記ポリペプチド又はその断片若しくは変異体（又は変異体の断片）をコードする核酸と実質的に同一である。そのような変異体は、配列番号２２〜４３によってコードされるポリペプチドの前記活性を有するタンパク質をコードし得る。複数の実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ様分子のセンス鎖は、配列番号１〜２１又はそれらの断片と実質的に同一である（ＲＮＡは、そのＤＮＡ配列のＴ残基の代わりにＵを有する）。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、本発明の前記ポリペプチドに対して産生される抗体は、Ａ／Ｅ病原体による感染に対する治療に使用されてもよい。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、本発明の前記ポリペプチド及び核酸分子は、試料中のＡ／Ｅ病原体の存在を検出するのに使用されてもよい。前記核酸分子は、プローブ又はプライマー（例えば、試料中のＡ／Ｅ病原体の前記ＤＮＡとハイブリッド形成し得る）を設計するのに使用されてもよく、又は、試料中のＡ／Ｅ病原体の前記ＤＮＡを増幅する（例えばポリメラーゼ連鎖反応法を用いて）のに使用されてもよい。前記ポリペプチドは、例えば、Ａ／Ｅ病原体によって発現されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するのに使用され得る。そのようなプローブ又はプライマー又は抗体は、検出可能な程度に標識されてもよい。「検出可能な程度に標識される」とは、分子、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、遺伝子若しくはその断片、又は、ｃＤＮＡ分子、の存在を、標識して同定するための方法を意味する。検出可能な程度に標識化する分子に関する方法は、当該技術分野で周知されており、放射性標識化（例えば３２Ｐ又は３５Ｓのような同位元素での）及び酵素標識化のような非放射性標識化（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼを用いて）、化学発光標識、蛍光標識（例えば、フルオレセンを用いて）、生物発光標識、又は、前記プローブ付着したリガンドの抗体検出を含むがこれらに限定されない。間接的方法により検出可能な程度に標識化された分子、例えば、一番目の成分（ビオチンなど）と結合した分子、該一番目の成分は次に観察又はアッセイされてよい二番目の成分（フルオレセン標識ストレプトアビジンなど）と結合する、も本定義に含まれる。標識には、ジゴキシゲニン、ルシフェラーゼ、及び、エクオリンも含む。
【０１１６】
医薬及び獣医学組成物、薬用量、並びに、投与
化合物には、本書に記載されたポリペプチド及び核酸分子、並びに、本発明の方法を用いて同定された化合物を含む。本発明に従う化合物は、単独で又は他の化合物（例えば、核酸分子、小分子、ポリペプチド、ペプチド又はペプチド類似体）と併用して、リポソーム、アジュバント又は任意の医薬的に許容し得る担体の存在下で、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジなど）への投与に適した形状で、提供され得る。必要であれば、本発明に従った化合物での治療は、Ａ／Ｅ病原体感染の、より伝統的な及び現存する治療と組み合わせてもよい。
【０１１７】
通常の薬務が、Ａ／Ｅ病原体によって感染した対象に前記化合物を投与するのに適した製剤又は組成物を提供するために使用されてよい。任意の適切な投与経路、例えば、非経口的、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼の、脳室内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル又は経口投与が使用されてよい。製剤は、液体溶液又は懸濁液；錠剤又はカプセル；粉末、点鼻薬又はエアロゾルの形状でよい。
【０１１８】
製剤を製造するための方法は、当該技術分野で周知されている（５７）。非経口投与のための製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水若しくは生理食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、野菜起源の油、又は、水素付加ナフタレンを含んでよい。生体適合性、生分解性ラクチド（lactide）高分子, ラクチド／グリコリド（lactide/glycolide）共重合体、又は、ポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレン共重合体は、前記化合物の徐放性放出のために使用されてよい。調節性化合物のための他の潜在的に有用な非経口的送達系は、エチレン‐ビニル酢酸塩共重合体粒子、浸透圧性ポンプ、移植可能な注入システム、及び、リポソームを含む。吸入用の製剤は、賦形剤、例えばラクトースを含んでよく、又は、水溶液（例えば、ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル、グリココール酸及びデオキシコール酸を含む）であってもよく、点鼻薬の形状で若しくはゲルとして投与されるための油性溶液であってもよい。治療用の又は予防用の組成物のためには、前記化合物は、Ａ／Ｅ病原体感染を止めるか遅らせるのに十分な量で個体に投与される。
【０１１９】
本発明に従った化合物の「有効量（effective amount）」は、治療的有効量又は予防的有効量を含む。「治療的有効量（therapeutically effective amount）」とは、Ａ／Ｅ病原体によるコロニー形成又はＡ／Ｅ病原体の脱粒の減少のような所望の治療上の効果を達成するために必要な投薬（複数）及び期間における有効な量を言う。化合物の治療的有効量は、対象の病状、年齢、性及び体重、並びに、対象において所望の応答を惹起させる該化合物の能力のような要因に従って異なってよい。投与計画は、最適な治療上の応答が実現されるように調整されてよい。治療的有効量は、前記化合物の任意の有毒又は有害な効果が、治療的に有利な効果によって上回られるような量でもある。「予防的有効量（prophylactically effective amount）」とは、Ａ／Ｅ病原体によるコロニー形成の阻害のような所望の予防上の効果を達成するために必要な投薬（複数）及び期間における有効な量を言う。典型的には、予防的投薬は、予防的有効量が治療的有効量より少なくてよいように、疾病の前か又は早い段階で、対象において使用される。化合物の治療的又は予防的効果量の好ましい範囲は、０．１ｎＭ‐０．１Ｍ、０．１ｎＭ‐０．０５Ｍ、０．０５ｎＭ‐１５μＭ又は０．０１ｎＭ‐１０μＭの任意の数であってよい。
【０１２０】
薬用量の値は軽減されるべき状態の重症度とともに異なってよいことが、注意されるべきである。任意の特定の対象に対して、特有の投与計画が、個体の必要性及び前記組成物投与を投与又は監督する人の専門的判断に従い、時間経過につれて、調整されてよい。本書で説明される薬用量範囲は、臨床医によって選択されてよい薬用量範囲の模範的なものであってこれを限定するものではない。前記組成物における活性化合物の量は、個体の病状、年齢、性及び体重などの要因に従って異なってよい。投与計画は、最適な治療上の応答を実現するために調整されてよい。例えば、単独の巨丸剤が投与されてよく、幾つかに分割された用量が時間をかけて投与されてもよく、又は、治療上の状況の緊急性によって示される場合には投与量は比例的に減少又は増加させられてもよい。投与の容易性且つ薬用量の均一性のために、単位用量形式で非経口的組成物を製剤化するのも有利であってよい。
【０１２１】
ワクチン製剤の場合、有効量の本発明の化合物は、単独で若しくは他の化合物と併用して、免疫応答を誘発する１又はそれ以上の免疫学的アジュバントと共に、提供され得る。本発明に従ったアジュバントは、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジン（avridine）、水酸化アルミニウムのような水性アジュバント、キトサンベースアジュバント、サポニン、油、アンフィゲン（Amphigen）（登録商標）、ＬＰＳ（リポ多糖）、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、細菌複合体、合成オリゴヌクレオチド、及び、それらの組み合わせを含んでよい（１００）。前記アジュバントは、マイコバクテリウムｐｈｌｅｉ（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）（米国特許第４，７４４，９８４）、Ｍ．ｐｈｌｅｉ ＤＮＡ（Ｍ−ＤＮＡ）、又は、放線菌細胞壁複合体（ＭＣＣ）を含んでいてもよい。乳化剤は、天然及び合成の乳化剤を含む。合成乳化剤は、陰イオン性剤（例えば、ラウリン酸及びオレイン酸のカリウム、ナトリウム及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩、すなわち、金属性セッケン、及び、硫酸ラウリルナトリウムのような有機スルホン酸）、陽イオン性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、及び、非イオン性剤（例えば、モノステアリン酸グリセリルのようなグリセリルエステル、ポリオキシエチレングリコールエステル及びエーテル、並びに、モノパルミチン酸ソルビタン及びそれらのポリオキシエチレン誘導体（例としてモノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン）のようなソルビタン脂肪酸エステル）を含む。天然乳化剤は、アカシア、ゼラチン、レシチン及びコレステロールを含む。他の好適なアジュバントは、単一の油、油（複数）の混合物、水中油エマルジョン（例えば、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ ＰＬＵＳ（商標）又はＶＳＡ３）、又は、非水中油エマルジョン（例えば、油エマルジョン、油中水エマルジョン、又は、水中油中水エマルジョン）のような油を含む。前記油は、ミネラルオイル、野菜油、又は、動物油であってよい。好適な動物油は、例えば、タラ肝油、オヒョウ油、ニシン（menhaden）油、オレンジラッフィー油、又は、サメ肝油を含むが、これらの全ては商業的に入手可能である。好適な野菜油は、アブラナ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油又はダイズ油を含むがこれらに制限されない。或いは、いくつかの脂肪族窒素性塩基（aliphatic nitrogenous bases）の多くがワクチン製剤と共にアジュバントとして使用されてもよい。例えば、既知の免疫原性アジュバントは、アミン、四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン及びチオウロニウムを含む（７５）。特異的アジュバント化合物は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡ）（米国特許第５，９５１，９８８）（８８、５９、８５、６８、８４、８２、８３）、及び、Ｎ，Ｎ‐ジオクタデシル‐Ｎ，Ｎ‐ビス（２‐ヒドロキシエチル）プロパンジアミン （「アブリジン（avridine）」）（米国特許第４，３１０，５５０、米国特許第５，１５１，２６７）（６２）を含む。本発明に従うアジュバントは、例えば、ミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニ���ムブロマイドを含んでもよい。
【０１２２】
ワクチン組成物は、標準的技術（混合、超音波処理及び微小流動化（microfluidation）を含むがこれらに限定されない）を用いて調製されてよい。前記アジュバントは、前記ワクチンの凡そ１０から５０％（ｖ／ｖ）、又は凡そ２０から４０％（ｖ／ｖ）、又は凡そ２０から３０％、又は凡そ３５％（ｖ／ｖ）、或いは、これらの範囲内の任意の値で含まれてよい。前記化合物は、免疫原性を高めるために、ウシ血清アルブミン又は鍵穴カサガイヘモシアニンのような担体分子と会合されていてもよい。
【０１２３】
通常、本発明の化合物は、実質的な毒性を引き起こすこと無しに使用されるべきである。本発明の化合物の毒性は、標準的技術を用いて、例えば、細胞培養又は実験動物において試験し且つ治療係数（すなわち、そのＬＤ５０（その集団の５０％にとって致死的な用量）とそのＬＤ１００（その集団の１００％にとって致死的な用量）との間の比）を決定することにより、判定され得る。しかしながら、幾つかの場合において、重篤な病的状態では、実質的に過剰な前記組成物が投与されてもよい。
なお、本発明は、以下の好ましい実施形態を含む。
（形態１）
配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
（形態２）
配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
（形態３）
配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
（形態４）
配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む細胞培養上清を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
（形態５）
前記ポリペプチドが、前記組成物中に存在する前記細胞のタンパク質の２０％を構成することを特徴とする形態４に記載の組成物。
（形態６）
さらにＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＰ、Ｔｉｒ、志賀毒素１、志賀毒素２、又は、インチミンポリペプチドを含むことを特徴とする形態１〜５の何れか一項に記載の組成物。
（形態７）
さらにアジュバントを含むことを特徴とする形態１〜６の何れか一項に記載の組成物。
（形態８）
細菌又はそれらの調製物であって、該細菌が、配列番号１〜２１又は６０〜７２と実質的に同一なヌクレオチド配列の該細菌ゲノムにおける変異を含むことを特徴とする細菌又はそれらの調製物。
（形態９）
細菌又はそれらの調製物であって、該細菌が、ｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ、ｎｌｅＦ、ｎｌｅＧ若しくはｎｌｅＨ、又は、それらの相同体と実質的に同一な遺伝子における変異を含むことを特徴とする細菌又はそれらの調製物。
（形態１０）
前記細菌が、Ａ／Ｅ病原体であることを特徴とする形態８又は９に記載の細菌。
（形態１１）
前記細菌が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム(Citrobacter rodentium)であることを特徴とする形態８〜１０の何れか一項に記載の細菌。
（形態１２）
前記ＥＨＥＣが、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７、又は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭであることを特徴とする形態１１に記載の細菌。
（形態１３）
前記ＥＰＥＣが、ＥＰＥＣ Ｏ１２７：Ｈ６であることを特徴とする形態１１に記載の細菌。
（形態１４）
前記変異が、病原性を減弱させることを特徴とする形態８〜１３の何れか一項に記載の細菌。
（形態１５）
形態８〜１４の何れか一項に記載の前記細菌を、生理的に許容可能な担体と併せて含む組成物。
（形態１６）
前記細菌が生きていることを特徴とする形態１５に記載の組成物。
（形態１７）
前記細菌が経口投与されることを特徴とする形態１６に記載の組成物。
（形態１８）
前記細菌が死滅していることを特徴とする形態１５に記載の組成物。
（形態１９）
前記細菌が非経口投与されることを特徴とする形態１８に記載の組成物。
（形態２０）
さらにアジュバントを含むことを特徴とする形態１５〜１９の何れか一項に記載の組成物。
（形態２１）
前記アジュバントが、水中油型エマルジョン、又は、非水中油型エマルジョンであることを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態２２）
前記アジュバントが、ミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドを含むことを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態２３）
前記アジュバントが、乳化剤、ムラミルジペプチド、水性剤、キトサンベース剤、サポニン、油、リポ多糖（ＬＰＳ）、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、細菌複合体、合成オリゴヌクレオチド、及び、脂肪族窒素性塩基（aliphatic nitrogenous base）から成る群より選択される１又はそれ以上の薬剤を含むことを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態２４）
前記乳化剤が、１又はそれ以上の天然乳化剤、合成乳化剤、陰イオン性乳化剤、陽イオン性乳化剤、及び非イオン性剤から成る群より選択されることを特徴とする形態２３に記載の組成物。
（形態２５）
前記天然乳化剤が、１又はそれ以上のアカシア、ゼラチン、レシチン、及び、コレステロールから成る群より選択されることを特徴とする形態２４に記載の組成物。
（形態２６）
前記陰イオン性乳化剤が、ラウリン酸のカリウム塩、オレイン酸のカリウム塩、ラウリン酸のナトリウム塩、オレイン酸のナトリウム塩、ラウリン酸のアンモニウム塩、オレイン酸のアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム塩、脂肪酸のマグネシウム塩、脂肪酸のアルミニウム塩、金属性セッケン、及び、有機スルホン酸塩から成る群の１又はそれ以上より選択されることを特徴とする形態２４に記載の組成物。
（形態２７）
前記有機スルホン酸塩が、硫酸ラウリルナトリウムであることを特徴とする形態２６に記載の組成物。
（形態２８）
前記陽イオン性乳化剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする形態２４に記載の組成物。
（形態２９）
前記合成乳化剤が、１又はそれ以上のグリセリルエステル、ポリオキシエチレングリコールエステル、ポリオキシエチレングリコールエーテル、及びソルビタン脂肪酸エステルから成る群より選択されることを特徴とする形態２４に記載の組成物。
（形態３０）
前記グリセリルエステルが、モノステアリン酸グリセリルであることを特徴とする形態２８に記載の組成物。
（形態３１）
前記ソルビタン脂肪酸エステルが、モノパルミチン酸ソルビタン、及び、それらのポリオキシエチレン誘導体から成る群の１又はそれ以上より選択されることを特徴とする形態２８に記載の組成物。
（形態３２）
前記ポリオキシエチレン誘導体が、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンであることを特徴とする形態３１に記載の組成物。
（形態３３）
前記水性剤が、水酸化アルミニウムであることを特徴とする形態２３に記載の組成物。
（形態３４）
前記油が、１又はそれ以上のミネラルオイル、野菜油、及び動物油から成る群より選択されることを特徴とする形態２３に記載の組成物。
（形態３５）
前記野菜油が、１又はそれ以上のアブラナ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、及びダイズ油から成る群より選択されることを特徴とする形態３４に記載の組成物。
（形態３６）
前記動物油が、１又はそれ以上のタラ肝油、オヒョウ油、ニシン（menhaden）油、オレンジラッフィー油、及びサメ肝油から成る群より選択されることを特徴とする形態３４に記載の組成物。
（形態３７）
前記アジュバントが、油成分を含むことを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態３８）
前記油成分が、１又はそれ以上の単一の油、及び油（複数）の混合物から成る群より選択されることを特徴とする形態３７に記載の組成物。
（形態３９）
前記非水中油型エマルジョンが、１又はそれ以上の油エマルジョン、油中水型エマルジョン、及び水中油中水型エマルジョンから成る群より選択されることを特徴とする形態２１に記載の組成物。
（形態４０）
前記水中油型エマルジョンが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（商標）、又はＥＭＵＬＳＩＧＥＮ ＰＬＵＳ（商標）であることを特徴とする形態２１に記載の組成物。
（形態４１）
前記油が、アンフィゲン（Amphigen）（登録商標）であることを特徴とする形態２３に記載の組成物。
（形態４２）
前記アジュバントが、放線菌の細胞壁抽出物を含むことを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態４３）
前記アジュバントが、放線菌のＤＮＡを含むことを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態４４）
前記アジュバントが、放線菌の細胞壁複合体を含むことを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態４５）
前記脂肪族窒素性塩基（aliphatic nitrogenous bases）が、１又はそれ以上の、アミン、四級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンズアミジン、及び、チオウロニウムから成る群より選択されることを特徴とする形態２３に記載の組成物。
（形態４６）
前記脂肪族窒素性塩基が、Ｎ，Ｎ‐ジオクタデシル‐Ｎ，Ｎ‐ビス（２‐ヒドロキシエチル）プロパンジアミンであることを特徴とする形態２３に記載の組成物。
（形態４７）
前記アジュバントが、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドを含むことを特徴とする形態７又は２０に記載の組成物。
（形態４８）
前記アジュバントが、２０％から４０％（ｖ／ｖ）の濃度で前記組成物中に存在することを特徴とする形態２１〜４７の何れか一項に記載の組成物。
（形態４９）
試料中のＡ／Ｅ病原体の存在を検出する方法であって、
（ａ）試料を用意し、そして、
（ｂ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の１又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子の存在を検出するか、又は、
（ｃ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の１又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出するか、又は、
（ｄ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体から成る群の１又はそれ以上より選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドの存在を検出する
ことを含み、該核酸分子又は該ポリペプチドの存在が、該試料中におけるＡ／Ｅ病原体の存在を示すことを特徴とする方法。
（形態５０）
前記試料が、糞便又は血液であることを特徴とする形態４９に記載の方法。
（形態５１）
前記検出が、
ａ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群から選択されるヌクレオチド配列、或いは、
ｂ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
と実質的に同一なプローブ又はプライマーと、前記ヌクレオチド配列との接触を含むことを特徴とする形態４９又は５０に記載の方法。
（形態５２）
前記検出が、前記アミノ酸配列と、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群より選択される配列と特異的に結合する抗体との接触を含むことを特徴とする形態４９又は５０に記載の方法。
（形態５３）
Ａ／Ｅ病原体又はそれらの構成成分に対する免疫反応を動物において惹起する方法であって、形態１〜７又は１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、形態８〜１４の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物に免疫応答を惹起させることを特徴とする方法。
（形態５４）
動物において、Ａ／Ｅ病原体のコロニー形成（colonization）を減少させる方法であって、形態１〜７又は１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、形態８‐１４の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物におけるＡ／Ｅ病原体のコロニー形成を減少させることを特徴とする方法。
（形態５５）
動物において、Ａ／Ｅ病原体の脱粒（shedding）を減少させる方法であって、形態１〜７又は１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物の有効量を該動物に投与することを含むか、或いは、形態８‐１４の何れか一項に記載の前記細菌の有効量を該動物に投与することを含み、それによって該動物におけるＡ／Ｅ病原体の脱粒を減少させることを特徴とする方法。
（形態５６）
前記動物が、反芻動物であることを特徴とする形態５３〜５５の何れか一項に記載の方法。
（形態５７）
前記反芻動物が、ウシ又はヒツジ被検体であることを特徴とする形態５６に記載の方法。
（形態５８）
前記動物が、ヒトであることを特徴とする形態５３〜５５の何れか一項に記載の方法。
（形態５９）
Ａ／Ｅ病原体による感染を治療又は予防する方法であって、
ａ）Ａ／Ｅ病原体感染を有するか、又はそのリスクのある哺乳動物を同定すること；及び、
ｂ）該哺乳動物に有効量の該Ａ／Ｅ病原体病原性を減少させる化合物を投与すること（但し、該化合物は、配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４の何れか一つの配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現、分泌又は生物学的活性を抑制する）
を含む方法。
（形態６０）
前記化合物が、配列番号１〜２１、５９若しくは７３〜８４の何れか一つの配列と実質的に同一なヌクレオチド配列と相補的なアンチセンス核酸分子であることを特徴とする形態５９に記載の方法。
（形態６１）
前記化合物が、ｓｉＲＮＡであることを特徴とする形態５９に記載の方法。
（形態６２）
Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる方法であって、
Ａ／Ｅ病原体におけるｎｌｅＡ、ｎｌｅＢ、ｎｌｅＣ、ｎｌｅＤ、ｎｌｅＥ、ｎｌｅＦ、ｎｌｅＧ及びｎｌｅＨから成る群より選択される遺伝子又はそれらの相同体遺伝子の１又はそれ以上を変異させるか、或いは、Ａ／Ｅ病原体のゲノムのヌクレオチド配列（但し、該ヌクレオチド配列は配列番号１‐２１又は６０‐７２から選択される）の１又はそれ以上を変異させることを含み、
それによって病原性を減少させることを特徴とする方法。
（形態６３）
Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる化合物のスクリーニング方法であって、
ａ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の何れかを含むシステム（系）を用意すること：
（ｉ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子
（ｉｉ）配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
（ｉｉｉ）配列番号２２〜４３、５９若しくは７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチド
ｂ）被検化合物を用意すること；並びに、
ｃ）該被検化合物が、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌、又は、生物学的活性を調節するか否かを決定すること（但し、該ポリペプチド若しくは該核酸分子の発現、分泌又は生物学的活性における変化は、前記Ａ／Ｅ病原体の病原性を減少させる化合物を示す）
を含むことを特徴とする方法。
（形態６４）
前記システムが、細胞であることを特徴とする形態６３に記載の方法。
（形態６５）
前記細胞が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする形態６３又は６４に記載の方法。
（形態６６）
前記システムが、試験管内のシステムであることを特徴とする形態６３に記載の方法。
（形態６７）
Ａ／Ｅ病原体ポリペプチドを産生する方法であって、
ａ）以下の（ｉ）又は（ｉｉ）を含む組換え細胞を用意すること、並びに、
（ｉ）配列番号１〜２１又は６０〜７２と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む核酸分子
（ｉｉ）配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４と実質的に同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子
ｂ）該ポリペプチドの分泌が許容される条件下で該組換え細胞を増殖させること
を含むことを特徴とする方法。
（形態６８）
前記ポリペプチドの分泌が許容される条件下で前記組換え型細胞を増殖させることを更に含むことを特徴とする形態６７に記載の方法。
（形態６９）
前記ポリペプチドが前記細胞から分泌されることを特徴とする形態６７又は６８に記載の方法。
（形態７０）
前記ポリペプチドの単離を更に含むことを特徴とする形態６７〜６９の何れか一項に記載の方法。
（形態７１）
前記Ａ／Ｅ病原体が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする形態４９〜７０の何れか一項に記載の方法。
（形態７２）
前記ＥＨＥＣが、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７、又は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭであることを特徴とする形態７１に記載の方法。
（形態７３）
前記ＥＰＥＣが、ＥＰＥＣ Ｏ１２７：Ｈ６であることを特徴とする形態７１に記載の方法。
（形態７４）
配列番号２２〜４３、５９又は７３〜８４の配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む組換え型ポリペプチド。
（形態７５）
配列番号１〜２１又は６０〜７２の配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
（形態７６）
形態７５に記載の前記ヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
（形態７７）
前記ベクターが、Ａ／Ｅ病原体のゲノム中に組み込み可能であることを特徴とする形態７６に記載のベクター。
（形態７８）
前記ベクターが、Ａ／Ｅ病原体のゲノム中に組み込み不能であることを特徴とする形態７６に記載のベクター。
（形態７９）
形態７６〜７８の何れか一項に記載の前記ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
（形態８０）
前記宿主細胞が、Ａ／Ｅ病原体であることを特徴とする形態７９に記載の宿主細胞。
（形態８１）
前記Ａ／Ｅ病原体が、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又は、サイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする形態８０に記載の宿主細胞。
（形態８２）
Ａ／Ｅ病原体若しくはその成分に対する免疫応答を惹起するための、又は、動物におけるＡ／Ｅ病原体の脱粒若しくはコロニー形成を減少させるための、又は、Ａ／Ｅ病原体による感染を治療若しくは予防するための、薬物調製における、形態１〜７若しくは１５〜４８の何れか一項に記載の前記組成物、形態８〜１４の何れか一項に記載の前記細菌、形態７４に記載の前記ポリペプチド、又は、形態７５に記載の前記核酸分子の使用。
（形態８３）
試料中のＡ／Ｅ病原体を検出する試薬、及び試料中の該Ａ／Ｅ病原体の検出に関する使用説明の添付文書と、を含むキット。
（形態８４）
前記試薬が、
ａ）配列番号１〜２１若しくは６０〜７２又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群より選択されるヌクレオチド配列、或いは、
ｂ）配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上と実質的に同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
と実質的に同一なプローブ又はプライマーを含むことを特徴とする形態８３に記載のキット。
（形態８５）
前記試薬が、配列番号２２〜４３、５９、７３〜８４又はそれらの断片若しくは変異体の１又はそれ以上から成る群より選択される配列に特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする形態８３に記載のキット。
（形態１０１）
目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、
（ａ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌を提供すること、
（ｂ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子によってコードされた組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現すること、
（ｃ）  目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含まないＡ／Ｅ病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、
を含む方法。
（形態１０２）
前記目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件が、ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件であることを特徴とする形態１０１に記載の方法。
（形態１０３）
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２０−１００ｍＭのＮａＨＣＯ３が添加された最小培地を含む細胞培養倍地中でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする形態１０２に記載の方法。
（形態１０４）
前記最小培地に、５−１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１−１．５％のグルコース及び０．０５から０．５％カサミノ酸がさらに添加されていることを特徴とする形態１０２に記載の方法。
（形態１０５）
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２−１０％のＣＯ２の存在中における、３７℃の温度でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする形態１０２に記載の方法。
（形態１０６）
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、６００ｎｍで０．７−０．８の吸光度（ＯＤ）までＡ／Ｅ病原菌を培養することを含む形態１０２に記載の方法。
（形態１０７）
前記ＩＩＩ型抗原の分泌に好ましい条件が、２０−１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、５−１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１−１．５％のグルコース及び０．０５−０．５％のカザミノ酸が添加された最小培地を含む細胞培養培地中でのＡ／Ｅ病原菌の培養を含むことを特徴とする形態１０２に記載の方法。
（形態１０８）
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌の細胞培養上清を単離することをさらに含む形態１０１〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
（形態１０９）
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、異種の又は非相同のもの（heterologous）であることを特徴とする形態１０１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
（形態１１０）
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、異種の又は非相同のものでないことを特徴とする形態１０１〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
（形態１１１）
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）に由来することを特徴とする形態１０１〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（形態１１２）
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子が、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号８５にハイブリダイズすることを特徴とする形態１０１〜１１０に記載の方法。
（形態１１３）
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドが、配列番号８６であるか、又は、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号８６にハイブリダイズする核酸分子によってコードされていることを特徴とする形態１０１〜１１０に記載の方法。
（形態１１４）
前記組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドが、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１％ＢＳＡ（フラクションＶ）を含む緩衝液中で温度６５℃で、又は、４８％ホルムアミド、４．８ｘＳＳＣ、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、１ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸及び０．１％ＳＤＳを緩衝液中で温度４２℃で、配列番号５６をコードする核酸分子にハイブリダイズする核酸分子によってコードされることを特徴とする形態１０１〜１１０に記載の方法。
（形態１１５）
前記目的のポリペプチドが分泌ポリペプチドであることを特徴とする形態１０１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（形態１１６）
前記目的のポリペプチドがＩＩＩ型抗原であることを特徴とする形態１０１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（形態１１７）
目的のポリペプチドが、配列番号２４〜４３、７３〜７５を含むポリペプチド、Ｔｉｒ、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、及び、Ｍａｐポリペプチドを含む群から１つ以上選択されることを特徴とする形態１０１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（形態１１８）
Ａ／Ｅ病原菌が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）細胞であることを特徴とする形態１０１〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
（形態１１９）
組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含むＡ／Ｅ病原菌。
（形態１２０）
前記Ａ／Ｅ病原菌が腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）又はサイトロバクター・ローデンティウム（Citrobacter rodentium）であることを特徴とする形態１１９に記載のＡ／Ｅ病原菌。
（形態１２１）
目的のポリペプチドの分泌を促進させる方法であって、
（ａ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子をＡ／Ｅ病原菌に導入すること、
（ｂ）  組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子によってコードされる組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡポリペプチドを発現すること、
（ｃ）目的のポリペプチドの分泌に好ましい条件下でＡ／Ｅ病原菌を成長させて、組換えＯｒｆ１１／ＧｒｌＡ核酸分子を含まないＡ／Ｅ病原菌に比べて目的のポリペプチドの分泌を促進させること、
を含む方法。
【実施例】
【０１２４】
以下の実施例は本発明の実施形態を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【０１２５】
［実施例１］
変異体の作製
用いた細菌の菌株は以下のとおりである：ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７株８６／／２４（３２）、ＥＨＥＣ ＥＤＬ９３３（野生型大腸菌Ｏ１２７：Ｈ７単離株；３）；ＥＨＥＣ ｅｓｃＮ−（４７）、野生型ＥＰＥＣ Ｅ２３４８／６９（野生型大腸菌Ｏ１２７：Ｈ６単離株；５０）、サイトロバクター・ローデンティウム（C. rodentium）ＤＢＳ１００（ＡＴＣＣ５１４５９；５３）、ＲＥＰＥＣ０１０３：Ｋ−：Ｈ２ ８５／１５０（５２）、大腸菌ＨＢ１０１。
【０１２６】
用いたプラスミドは以下のとおりである：
2011250790.tif 000002
【０１２７】
ＰＣＲ及びインバースＰＣＲを行うために、校正ＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム (GIBCO BRL/Life Technologies)を日常的に用いてＰＣＲによる誤差を最小限にした。ＰＣＲ産物は、インビトロジェンのＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットを用い、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ又はｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯの何れかにクローン化した。ＤＮＡの塩基配列は、Ｔａｑダイターミネータ法と自動化３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ）を用いて決定した。日常的なクローニング、形質転換、及び感染操作を行うために、細菌は、適当な抗生物質を添加したＬＢ寒天培地、又はＬＢブロス（液体培地）にて３７℃で生育させた。種々の抗生物質を以下の濃度で使用した、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びクロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ。ＬＥＥ遺伝子発現及びＩＩＩ型タンパク質分泌は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて生育させて行った。
【０１２８】
ｓａｃＢ遺伝子に基づく対立遺伝子変換（１４）及びラムダＲｅｄ組換え酵素系を用いて変異体を作製した。通常、それぞれの遺伝子の内部配列の７５％以上を欠失させて当該遺伝子の機能を確実に破壊した。ｌｅｒ遺伝子はラムダＲｅｄ組換え酵素系により、 また、ｌｅｒ、ｏｒｆ１１／ｇｒｌＡ及びｃｅｓＴ遺伝子はｓａｃＢ遺伝子に基づく対立遺伝子変換法により変異を導入した。ｌｅｒ／ｏｒｆ１１二重変異体もまたｓａｃＢに基づく方法で作製した。ｔｉｒ及びｅｓｃＤ変異体の作製についてはすでに報告した（２０、５６）。これらの変異体はインフレームの欠失変異体であり、（ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ又はＳａｌＩの何れかの）制限酵素切断部位が以下の欠失部位に導入されたものである。 
2011250790.tif 000003
【０１２９】
これらの変異体は複数のＰＣＲ反応により検証された。Δｔｉｒ、Δｌｅｒ及びΔｏｒｆ１１変異体は、それぞれの遺伝子をプラスミドで供給することにより相補性試験を行った。これらすべての変異体は補完され、両方の対立遺伝子変換法で作製された変異体は下流の遺伝子機能に影響を及ぼさず、従って非極性であることが確認された。
【０１３０】
ＥＨＥＣ−ｐＮｌｅＡ−ＨＡを作製するため、ｎｌｅＡ遺伝子を校正ＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（インビトロジェン）及び以下のプライマーを用いて増幅した：
Ｚ６０２４Ｆ：5'AGATCTGAAGGAGATATTATGAACATTCAACCGACCATAC （配列番号４４）；
Ｚ６０２４Ｒ：5'CTCGAGGACTCTTGTTTCTTCGATTATATCAAAG （配列番号４５）
ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローン化し、ＤＮＡ塩基配列はＴａｑダイターミネータ法と自動化３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ）を用いて検証した。該産物は、次に、サイトロバクター・ローデンティウムＥｓｐＧプロモータからタンパク発現を駆動するように操作され、発現されたタンパク質のＣ末端にインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）を付加したｐＡＣＹＣ由来のプラスミドｐＣＲｅｓｐＧ−２ＨＡ／ＢｇｌＩＩにサブクローン化した。このプラスミド構築物は、続いてエレクトロポレーション法により野生型ＥＨＥＣ及びＥＨＥＣ ｅｓｃＮ−に導入した。
【０１３１】
ＥＨＥＣのナリジキシン酸耐性株におけるｎｌｅＡ遺伝子の欠失変異体は、ｓａｃＢ遺伝子に基づく対立遺伝子変換法により作製した（２９）。ｎｌｅＡ遺伝子に隣接する２つのＤＮＡ断片を、ＥＨＥＣ染色体ＤＮＡを鋳型として用い、ＰＣＲにより増幅した。
【０１３２】
断片Ａは、プライマーＮＴ１０：5'CCGGTACCTCTAACCATTGACGCACTCG （配列番号４６）と、プライマーＮＴ１１：5'AACCTGCAGAACTAGGTATCTCTAATGCC （配列番号４７）とを用いてＰＣＲ増幅し、１．３ｋｂの産物を産生した。
【０１３３】
断片Ｂは、プライマーＮＴ１２：5'AACCTGCAGCTGACTATCCTCGTATATGG（配列番号４８）と、プライマーＮＴ１３：5'CCGAGCTCAGGTAATGAGACTGTCAGC（配列番号４９）とを用いてＰＣＲ増幅し、１．３ｋｂの産物を産生した。
【０１３４】
断片Ａ及びＢは続いてＰｓｔＩにより１時間消化し、その後酵素を６５℃で２０分間熱不活化した。各消化断片およそ５０ｎｇをＴ４ＤＮＡリガーゼにより室温で１時間連結した。連結反応液を１／１０に希釈し、その１μｌを、プライマーＮＴ１０とＮＴ１３とを用いるＰＣＲに添加した。生じた２．３ｋｂのＰＣＲ産物は続いてＳａｃＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＲＥ１１２（１４）の対応部位と連結し、ＤＨ５αλｐｉｒに形質転換してｐＮＴ２２５を作製した。ｐＮＴ２２５は、野生型ＥＨＥＣとの接合においてドナー株として働く接合性株ＳＭ１０λｐｉｒに形質転換した。ナリジキシン酸及びクロラムフェニコール耐性エキソ接合体は、ＬＢ寒天培地で選択した。続いてこのエキソ接合体を５％（ｗ／ｖ）スクロースを含み、且つＮａＣｌを含まないＬＢ寒天培地にプレーティングした。生じたコロニーはクロラムフェニコールに対する感受性によりスクリーニングし、続いてＰＣＲによりｎｌｅＡ遺伝子を欠失し、プラスミド配列を失った単離物を同定した。ｎｌｅＡ遺伝子を欠失した１つの変異体を単離し、以下の実験に使用した。 サイトロバクター・ローデンティウム(C. rodentium) のｎｌｅＡ欠失変異体は、ＰＣＲによりｎｌｅＡ遺伝子の内部欠失を有する自殺ベクターを、ｐＲＥ１１８（１４）を用いて作製することにより生成した。
【０１３５】
以下のプライマーを用いた： del1F: 5'GGTACCACCACACAGAATAATC (配列番号５０); del1R: 5'CGCTAGCCTATATACTGCTGTTGGTT (配列番号５１); del2F: 5'GCTAGCTGACAGGCAACTCTTGGACTGG (配列番号５２); del2R: 5'GAGCTCAACATAATTTGATGGATTATGAT (配列番号５３)。作製したプラスミドはエレクトロポレーション法によりサイトロバクター・ローデンティウムへ導入し、抗生物質耐性部分二倍体株を創生した。第二の組み換え段階においてプラスミド配列を失った変異体株は上述した方法により選択した。抗生物質感受性、且つスクロース耐性コロニーは、欠失領域に隣接するプライマーを用いたＰＣＲにより適切な組み換えが起こっていることを検証した。ＮｌｅＡタンパク質が存在しないことを、ポリクローナル抗ＮｌｅＡ抗血清を用いた細胞全体ライセート（溶菌液）のウェスタンブロッティングにより確認した。
【０１３６】
総タンパク質及び分泌タンパク質の解析／プロテオミクス
分泌タンパク質は既述のようにして調製した（５１）。Ｃ．ローデンティウム株は、４ｍｌのルリアブロス（ＬＢ）の入ったシェーカー中で３７℃にて一晩増殖させた。培養液は１／５０に希釈して、組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）で一晩あらかじめ保温しておいた４ｍｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に継代し、同じインキュベーター内で６時間静置して生育させ、ＬＥＥ遺伝子の発現を誘導した。培養液は、１３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を２回行って細菌を除去した。培地中に分泌されたタンパク質を濃縮するために、上清を１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させた。細菌のペレットは２倍濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液に溶解し、総細菌タンパク質と名づけた。上清から沈殿させた分泌タンパク質もまた２倍濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液に溶解し、残存ＴＣＡを１μｌの飽和Ｔｒｉｓ溶液を用いて中和した。細菌ペレット及び分泌タンパク質を再懸濁するために用いた緩衝液の容量は培養液の濁度について標準化し、試料負荷量を均一にした。分泌タンパク質は、１２％又は１７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、０．１％クーマシーブルーＧ２５０で染色した。ウェスタンブロット解析は、総タンパク質又は分泌タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜（バイオラッド）上に移行させた。抗体は、ヒスチジンタグを付加したサイトロバクターＴｉｒに対するラットのポリクローナル抗体、及びＥＰＥＣ ＥｓｐＢに対するマウスのモノクローナル抗体を用い、標準的なＥＣＬウェスタンブロッティングプロトコル（アマシャムライフサイエンス）に従った。
【０１３７】
野生型ＥＨＥＣ及びＥＨＥＣ ＣＶＤ４５１は、ＬＢ培養液中にて一晩生育させた。続いて培養液を、４４ｍＭのＮａＨＣＯ３、８ｍＭのＭｇＳＯ４、０．４％グルコース及び０．１％カザミノ酸を含むＭ−９最小培地で１００倍に希釈し、３７℃、５％炭酸ガス中にて静置してＯＤ６００が０．６から０．８になるまで増殖させた。
【０１３８】
分泌タンパク質は、培養液を８０００ｇで３０分間遠心分離して回収し、ペレットから上清を分離した。上清は、０．４５ミクロンのフィルターを通してろ過し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ法（シグマ社）にて決定した。電気泳動用のタンパク質は１／９容量の１００％ＴＣＡを加えて、氷上、４５〜１２０分間沈殿させ、続いて１７６００ｇで３０分間遠心分離することにより調製した。沈殿は１００％冷アセトンでリンスし、１×レムリー緩衝液（一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル）又は二次元ゲルのための２Ｄサンプルバッファー（８Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、４％ＣＨＡＰＳ、２０ｍＭトリス、０．００２％ブロモフェノールブルー）に溶解した。二次元ゲルのためには、ＤＴＴを６ｍｇ／ｍｌ、サンプル負荷前にＩＰＧバッファー（ｐＨ３〜１０、アマシャムバイオサイエンス）を０．５％添加した。１８ｃｍのイモービラインドライストリップ(Immobiline Dry Strips)（ｐＨ３〜１０、アマシャムバイオサイエンス）は、サンプル中で２０℃、一晩再水和された。その後、サンプルは１５℃にて６５０００Ｖｈ泳動（フォーカス）した。泳動後、ストリップ（条片）を１０ｍｇ／ｍｌのＤＴＴを添加したＥＢ中、１５分間平衡化し、続いて２５ｍｇ／ｍｌヨードアセタミドで１５分間平衡化した（ＥＢは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、６Ｍ尿素、３０％グリセリン、２％ＳＤＳ、ｐＨ８．８である）。平衡化したストリップを、０．００２％ブロモフェノールブルーを添加したＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファーで調製した０．５％アガローズを用いて大型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％又は１４％アクリルアミド）の上に封着し、色素の先端がゲルを流れきるまで泳動した。
【０１３９】
ゲルはＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙを用いて使用説明書（ＢｉｏＲａｄ）に従って染色し、紫外線ライトボックス上で、又はナノフロー液体クロマトグラフィーシステム(LC Packings-Dionex)を備えたＬＣＱ Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計(Thermo Finnigan)によるＭＳ／ＭＳにより視覚化した。紫外線ライトボックス上で視覚化されたゲルに対して、目的のスポットを手動で切り取った。タンパク質のゲル内消化は、Investigator ProGestロボット(Genomic Solutions, Ann Arbor, MI)により記述された方法（２３）で実施した。高濃度でタンパク質が存在するサンプルは、ＦＡＭＯＳオートサンプラーを備えたナノフロー液体クロマトグラフィーシステム(LC Packings -Dionex,、サンフランシスコ、ＣＡ)及びＬＣＱＤｅｃａイオントラップ質量分析計(Thermo Finnigan、サンジョゼ、ＣＡ)（２４）からなるＬＣ−ＭＳシステムにより分析した。
【０１４０】
逆相PicoFritカラムPFC7515-PP18-5 (New Objective, Woburn, MA, USA)は、ペプチド分離のために使用し、カラムからの溶出液を直接質量分析装置に噴霧注入した。２００ｎＬ／分の流速で、総データ採取時間はサンプル当たりほぼ４５分であった。
【０１４１】
低濃度でタンパク質が存在するサンプルは、ナノスプレーイオン源(Proxeon, Odense, Denmark)を備えたＡＰＩ ＱＳＴＡＲ ＰｕｌｓａｒハイブリッドＭＳ／ＭＳ質量分析計（アプライドバイオシステムズ／ＭＤＳ ＳＣＩＥＸ、コンコード、カナダ）（１２）で分析した。分析に先立って、サンプルはＺｉｐＴｉｐｓ（ミリポア、ビルリカ、ＭＡ）で精製及び濃縮した。このＡＰＩ ＱＳＴＡＲ Ｐｕｌｓａｒは、デノボペプチドシーケンシングにも用いた。
【０１４２】
測定されたスペクトルは、Ｍａｓｃｏｔ(Matrixscience)又はＳｏｎａｒ(Proteometrics Canada Ltd.)検索エンジンを用いてＮＣＢＩデータベースに対して検索を行った。
【０１４３】
ｃａｔ転写融合体の構築とＣＡＴアッセイ
サイトロバクターｌｅｒ遺伝子（ＬＥＥ１）及びｔｉｒ遺伝子（ＬＥＥ５）のプロモーター及び全ての上流制御要素を有するＰＣＲ断片は、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化され、プロモーターを持たないｃａｔ遺伝子を含むプラスミドｐＫＫ２３２−８にクローン化された。クローン化された断片にわたる位置はここに示される。異なるサイトロバクター株におけるこれらの融合物によって示されるＣＡＴ活性は、既述の方法（２１、２２）により決定した。サンプルは、上述したようにＤＭＥＭ中で増殖する細菌培養液から異なる時刻に回収した。
【０１４４】
配列解析とバイオインフォマティクス手段
ＤＮＡ及びタンパク質の配列解析、並びにＢＬＡＳＴＮ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰによる相同性検索は、ＮＣＢＩウェブサイト(http://www.ncbi.nih.org/)から入手可能なプログラムを用いて行った。使用したデータベースは、ＮＣＢＩサイト、サンガーゲノムセンター(http://www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes)、及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ(http://www.expasy.org/sprot/)からのものを含む。ＬＥＥ  ＰＡＩ及びＥＨＥＣゲノム中のプロファージの位置は、IslandPathプログラム(http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandpath/)（１３）によって作成されたデータより入手した。
【０１４５】
サザンブロット解析
サザンブロット解析のためのゲノムＤＮＡサンプルは、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅキット（キアゲン社）を用いて調製した。プローブは、ｐＮｌｅＡ−ＨＡをＳａｌＩとＢｇｌＩＩ酵素で消化することにより５００塩基対の断片を取得し、BrightStar Psoralen-Biotin Nonisotopic Labeling Kit (Ambion)を用いて標識した。
【０１４６】
それぞれ５μｇのゲノムＤＮＡサンプルは、２５ユニットのＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＰｓｔＩで一晩消化した。このサンプルを１％アガロースゲル電気泳動により分離し、受動的なわずかにアルカリ性の下方溶出流によってBrightStar-Plusナイロン膜（アンビオン社）に一晩移行させた。ＤＮＡは、当該膜を紫外線に２分間露光し、続いて８０℃でベーキングすることにより膜に架橋した。
【０１４７】
膜は、１０ｍｌのULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer (Ambion)中で４２℃、３０分間洗浄してプレハイブリダイズした。続いて、上記で調製したプローブ１０μｌを同バッファー中のプレハイブリダイゼーション膜に添加し、プローブと膜とを４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。膜は室温にて、厳密性の低い洗浄バッファー（アンビオン）中で５分間２回洗浄し、厳密性の高い洗浄バッファー（アンビオン）中で１５分間２回洗浄した。ハイブリダイズしたプローブは、BrightStar BioDetect Nonisotopic Detection Kit (Ambion)とコダックフィルムへの露光により検出した。
【０１４８】
抗ＮｌｅＡ抗血清の調製
ｎｌｅＡ遺伝子のコード部分は、ＥＨＥＣゲノムＤＮＡから増幅し、ヒスチジンタグ付き発現ベクター（ｐＥＴ２８ａ、ノバジェン）にクローン化した。用いたプライマーは次のとおりである：5'TTCCATATGAACATTCAACCGACC（配列番号５４）及び5'GGAATTCAATAATAGCTGCCATCC （配列番号５４）。このプラスミドＢＬ２１（λＤＥ３）に導入し、吸光度（Ａ６００）が０．８まで生育させ、０．５ｍＭＩＰＴＧを添加して２０℃にて１６時間発現を誘導した。ヒスチジンタグ付加タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにより取扱説明書に従って精製した。ＮｌｅＡタンパク質を含有する画分をプールし、トロンビンを添加し（５００：１）、そしてタンパク質を２０ｍＭトリスｐＨ８．２、５０ｍＭのＮａＣｌに対して一晩透析した。次の日、タンパク質をモノＱＦＰＬＣカラムに負荷し、カラムを５０〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線的な濃度勾配で展開した。ＮｌｅＡタンパク質を含有する画分をプールした。この段階の後、タンパク質は９０％以上の純度であった。精製したタンパク質により、２匹のＳＤ(Sprague Dawley)ラットを一匹当たり３００μｇのタンパク質とフロイントの完全アジュバント（シグマ社）を用いて免疫し、生成した抗血清を、活性化した免疫担体Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５を用いて取扱説明書（バイオラッド）に従ってアフィニティー精製した。免疫蛍光実験のため、抗血清はＨｅＬａ細胞及びＥＨＥＣ．ＮｌｅＡから調製したアセトンパウダーへの吸着により、（４５）に記載されたようにさらに精製した。抗血清の特異性は、野生型ＥＨＥＣ及びＥＨＥＣ．ＮｌｅＡからの細胞抽出液のウェスタンブロットにより確認した。
【０１４９】
イムノブロット解析
ウェスタンブロット解析のためのサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９％〜１２％ポリアクリルアミド）で分離した。タンパク質をニトロセルロースへ移行させ、イムノブロットを、０．１％ツイーン２０と５％脱脂乾燥乳（ＮＦＤＭ）を含むＴＢＳバッファー、ｐＨ７．２（ＴＢＳＴ）で４℃にて一晩ブロックした。そしてその後、１％ＮＦＤＭを含むＴＢＳＴ中、室温にて１時間、第一抗体とインキュベートした。膜をＴＢＳＴで６回洗浄した後、１：５０００に希釈したワサビパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス（Ｈ＋Ｌ）抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)と共に、室温で１時間インキュベートした。膜はその後上述したように洗浄した。抗原−抗体複合体は、活性化化学発光検出キット（enhanced chemiluminescence detection kit（アマシャム））を用い、続いてコダックフィルム（パーキンエルマー）に露光することによって視覚化した。以下の第一抗体を用いた：抗ＨＡ．１１（Ｃｏｖａｎｃｅ）、抗ＤｎａＫ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）、抗ＥＨＥＣ Ｔｉｒ、抗ＮｌｅＡ（本研究）、抗カルネキシン（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）、抗カルレティキュリン（アフィニティー・バイオリージェンツ）、抗チューブリン（シグマ）。
【０１５０】
免疫蛍光法
ＨｅＬａ細胞を２４ウェル組織培養プレートにてカバーガラス上で生育させ、ＯＤ約０．４の一晩静置培養液（ＥＨＥＣ）１μｌで６時間感染させた。感染後６時間に細胞をＣａ２＋及びＭｇ２＋含有ＰＢＳで３回洗浄し、２．５％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中、室温にて１５分間固定した。細胞を、０．１％サポニンを含むＰＢＳで透過処理し、５％ヤギ血清又は５％ＢＳＡを含むＰＢＳ＋０．１％サポニンでブロックし、ブロッキング溶液で希釈した以下の第一抗体と共に室温にて１時間インキュベートした：抗ＥＨＥＣ Ｔｉｒ、１：１０００；抗大腸菌Ｏ１５７（ディフコ）、１：２００；アフィニティー精製ラットポリクローナル抗ＮｌｅＡ（本研究）、１：１００；抗マンノシダーゼＩＩ（マリアン、ファークハー博士ＵＳＣＤから提供）、１：１０００。ＰＢＳ／サポニンにて３回洗浄後、細胞を二次抗体（Ａｌｅｘａ−４８８又は−５６８結合抗マウス、ウサギ、ラット(Molecular Probes)１：４００）で、室温にて３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／サポニンで３回、ＰＢＳで１回洗浄し、モビオール＋ＤＡＢＣＯを用いてスライドガラス上にのせた。重合したアクチンを可視化するために、Ａｌｅｘａ−４８８−結合ファロイジン(Molecular Probes)を１：１００希釈にて第二抗体と共にインキュベートした。表示した場合には、細胞を５μｇ／ｍｌのブレフェルディンＡ(brefeldin A) （ベーリンガーマンハイム）で固定前に３０分間インキュベートした。画像は、ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡を用いて検出し、ＥｍｐｉｘＤＶＣ１３００デジタルカメラで取り込み、ノーザンエクリプスイメージングソフトウェアを用いて解析するか、又はＬａｓｅｒｓｈａｒｐソフトウェアを用いてバイオラッドラジアンスプラス共焦点顕微鏡で検出した。
【０１５１】
感染宿主細胞の分画
それぞれのサンプルごとに、１００ｍｍシャーレ２枚に密集したＨｅＬａ細胞を、初期感染効率（ＭＯＩ）１：１０にて野生型ＥＨＥＣ−ｐＮｌｅＡ−ＨＡ又はＥＨＥＣｅｓｃＮ−ｐＮｌｅＡ−ＨＡに感染させた。感染６時間後に細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、既述の方法（３０、４９）にて生化学的に分画した。簡単に説明すると、細胞を３００μｌの完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロッシュ）を添加した均一化バッファー（３ｍＭイミダゾール、２５０ｍＭスクロース、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、２２ゲージの注射針を通して機械的に破壊した。ホモジネートを低速（３０００ｇ）で１５分間、４℃にて遠心分離し、非破壊細胞、細菌、核及び細胞骨格成分（低速ペレット）を沈殿させた。上清を、ＴＬ１００遠心分離機（ベックマン）のＴＬＳ５５ローターを用いて４℃で２０分間高速超遠心分離（４１０００ｇ）を行い、宿主膜（ペレット）と細胞質（上清）に分離した。ペレットは３００μｌの１×レムリーバッファーに再懸濁し、上清は５×の保存液を用いて１×レムリーバッファーに調製した。すべての画分の等容量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９％ポリアクリルアミド）で分離し、ニトロセルロースに移行させ、ウェスタンブロット解析した。
【０１５２】
膜に相互作用したＮｌｅＡの抽出実験のため、１００ｍｍシャーレ２枚分の感染したＨｅＬａ細胞をそれぞれの抽出条件ごとに上述と同様に分画した。高速ペレット（宿主膜画分）は３００μｌの以下の抽出バッファーの１つに再懸濁した：(i)１０ｍＭトリス、５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．４；(ii)１０ｍＭトリス、５ｍＭ塩化マグネシウム、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４；(iii)０．２ＭＮａＨＣＯ３、５ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ１１．４；(iv) １０ｍＭトリス、５ｍＭ塩化マグネシウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．４。抽出は、氷上にて３０秒間、５秒ごとにサンプルをピペット吸入及び排出することによって行い、サンプルは１０００００ｇで３０分間再遠心分離した。ペレット（不溶性画分）は１×レムリーバッファーに再懸濁し、上清（可溶性画分は、１０％トルクロロ酢酸で氷上３０分間沈殿させ１００％アセトンで洗浄し、３００μｌの１×レムリーバッファーに再懸濁した。等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（９％ポリアクリルアミド）で分離し、ニトロセルロースへ移行させ、ウェウスタンブロッティングで解析した。 
【０１５３】
マウスでのＣ．ローデンティウム感染解析
５週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅｊマウス（ジャクソンラボラトリー）と非近交系のＮＩＨスイスマウス(Harlan Sprague-Dawley) は、ブリティッシュコロンビア大学動物管理委員会及び実験動物の使用に関するカナダ会議によって作成されたガイドラインに従ってブリティッシュコロンビア大学動物施設に収容した。野性型Ｃ．ローデンティウム及びｎｌｅＡ欠失変異体をＬＢ培地中シェーカーにて２００ｒｐｍ一晩増殖させ、１００μｌの培養液を用いて経口的胃管栄養法によりマウスに感染させた。接種菌液は段階的希釈及びプレーティングにより力価を測定し、両方のグループにおいて４×１０８ｃｆｕ／マウスとなるように計算した。Ｃ．ローデンティウムに感受性の高いＣ３Ｈ／Ｈｅｊマウスの感染については、感染実験の期間中毎日感染したマウスの生存を評価した。マウスが瀕死の状態になったときは直ちに屠殺した。ＮＩＨスイスマウスを用いた細菌病原性アッセイのために、感染後１０日目に動物を屠殺した。結腸の過形成を計測するために、肛門の端から始まって遠位結腸の最初の４ｃｍを回収し、糞便のペレットを取り除いた後で秤量した。細菌のコロニー形成をアッセイするために結腸組織及び糞便ペレットをＰＢＳ中ポリトロン組織ホモジナイザーを用いて均質化し、マッコンキー寒天培地（ディフコラボラトリー）上にプレーティングする前に段階的に希釈した。結腸組織と糞便ペレットは併せて屠殺時のマウス結腸における全細菌負担を決定した。マッコンキー寒天培地はグラム陰性細菌に対して選択的であり、その上でＣ．ローデンティウムの形成するコロニーは、高度に特徴的かつ同定可能な大腸菌とは異なる形態を示す（２６）。組織学的な解析のために、感染マウス結腸の最後の０．５ｃｍを１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、処理し、３μｍ切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオジン染色した。組織学的解析は、ブリティッシュコロンビア大学病理学実験医学教室における形態学的サービスによって行われた。
【０１５４】
[実施例２]
ＬＥＥ遺伝子発現調節解析
ＬＥＥ遺伝子座の如何なる遺伝子が、Ｃ．ローデンティウムのＬＥＥ遺伝子発現を制御しているのかを調べるために、ＬＥＥ４遺伝子及びＬＥＥ５（Ｔｉｒ）遺伝子にそれぞれコードされているＥｓｐＢ及びＴｉｒタンパク質発現のための種々のＬＥＥ変異体を解析した。ＤＭＥＭ培地で増殖した細菌の細胞ライセート全体を、抗Ｔｉｒ及び抗ＥｓｐＢ抗血清を用いたウェスタンブロットにより解析した。その結果、Δｌｅｒ株ではＴｉｒ及びＥｓｐＢタンパク質の何れも産生されなかったことからＬＥＥ発現におけるＬｅｒのきわめて重要な役割が確認された。予想されるように、Δｔｉｒ及びΔｅｓｐＢ株ではそれぞれＴｉｒ及びＥｓｐＢタンパク質は産生しなかった。ΔｃｅｓＴ株ではＴｉｒタンパク質は検出されず、この結果は、Ｔｉｒタンパク質の安定性と分泌のためのシャペロンとしてのＣｅｓＴタンパク質の役割（１８、１９）から妥当である。意外にも、別のＬＥＥコードタンパク質であるＯｒｆ１１もまたＴｉｒ及びＥｓｐＢの発現に要求された。ΔＯｒｆ１１株におけるＴｉｒ及びＥｓｐＢの発現は、サイトロバクターｏｒｆ１１遺伝子のみを有するプラスミドによって相補された（図８）。ｏｒｆ１１遺伝子は、Ａ／Ｅ病原体の間で高度に保存され、ＥＨＥＣ及びＥＰＥＣのｏｒｆ１１遺伝子は共にサイトロバクターΔＯｒｆ１１株を相補した（図８）。このことは、Ｏｒｆ１１タンパク質がＡ／Ｅ病原体におけるＬＥＥ遺伝子発現の正の制御における機能的な等価物であることを示す。
【０１５５】
配列解析の結果、Ｏｒｆ１１／ＧｒｌＡは、腸内細菌科のｃａｉ及びｆｉｘオペロンの転写活性因子であるＣａｉＦ（１５）に対して２３％の同一性を示し、性質不明のサルモネラ菌産物（１６）で、ｓｔｄ海馬采オペロン下流に位置する１つの遺伝子によってコードされる推定されたアミノ酸配列と３７％の同一性を示した（図７）。このサルモネラ菌ホモログは、図の中でＳＧＨ（サルモネラＧｒｌＡホモログ）として示される。３つのタンパク質はすべてＤＮＡ結合タンパク質に特徴的な予測されたヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを含む。
【０１５６】
ＬＥＥ遺伝子発現の調節におけるＯｒｆ１１及びＬｅｒ遺伝子の階層性と取り組むために、サイトロバクター・ローデンティウムにおいてｌｅｒ及びｏｒｆ１１遺伝子の二重変異体を作製した。ΔｌｅｒΔｏｒｆ１１株におけるＴｉｒ及びＥｓｐＢの発現は、Ｌｅｒをトランスに発現させることによって部分的に回復するが、同様に発現されたＯｒｆ１１はそのような効果を持たなかった（図８）。このことは、Ｏｒｆ１１遺伝子が調節カスケードにおけるＬｅｒ遺伝子の上流で作用することを示す。プライマー伸長解析は、サイトロバクターｌｅｒプロモーターがＥＰＥＣｌｅｒのそれと同様であり、その発現がΔｏｒｆ１１株において減少することを示すことによって、この調節的階層を確認した。
【０１５７】
ｌｅｒ遺伝子の発現調節におけるＯｒｆ１１の役割は、ＬＥＥ１（Ｌｅｒ）又はＬＥＥ５（Ｔｉｒ）オペロンの調節領域とｃａｔレポーター遺伝子との転写融合物（ｐＬＥＥ１−ＣＡＴ又はｐＬＥＥ５−ＣＡＴ）の活性を、ダルベッコ改変最小培地（ＤＭＥＭ）中で６時間増殖させたサイトロバクターの野生型、Δｌｅｒ及びΔＯｒｆ１１株においてモニターすることによりさらに証明された。ＬＥＥ１−ｃａｔ融合物の活性はΔＯｒｆ１１株において減少し、ＬＥＥ５−ｃａｔ融合物の活性はΔｌｅｒ及びΔＯｒｆ１１株において劇的に減少した。これらの結果は、Ｏｒｆ１１がＬｅｒ発現の新規な正の調節因子であり、続いてＬｅｒが他のＬＥＥオペロンの発現を促進することを示す。Ｏｒｆ１１は、調節カスケードにおいてＬｅｒの上流で作用するから、ＧｒｌＡ（ＬＥＥ−活性化因子の包括的調節因子）と名づけられた。
【０１５８】
[実施例３]
ＬＥＥ遺伝子座にコード化されたＴＴＳＳにより分泌されるエフェクターの同定
Ａ／Ｅ病原体は組織培養液又は最小培地中に種々のタンパク質を分泌するが、それらは主にＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ及びＥｓｐＤなどの輸送体である。ＤＭＥＭで増殖した細菌培養液の上清からＴＣＡ沈殿によって分泌タンパク質を濃縮し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシーブルー染色により分析した。ｏｒｆ１１／ｇｒｌａ遺伝子を含むプラスミドをもったサイトロバクター・ローデンティウムは、野生株に比べて少なくとも３００％以上のＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、及びＥｓｐＤを分泌した。
【０１５９】
サイトロバクターＬＥＥによってコードされるエフェクターを規定するために、ＴＴＳ及び宿主細胞接着に関与しない種々のＬＥＥ遺伝子座にコードされたタンパク質をそのカルボキシ末端にて二重ヘマグルチニン（２ＨＡ）エピトープと結合させ、野生型及び変異体Ｃ．ローデンティウムにおけるそれらの分泌を解析した。Ｔｉｒ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＨ、及びＭａｐのみがＣ．ローデンティウムにおいてＬＥＥにコードされたＴＴＳＳによって分泌された。このことは、ＬＥＥ遺伝子座が５つのエフェクターのみをコードすることを示唆する。これまで認められなかった５４ｋダルトンのタンパク質（ｐ５４）が、Ｔｉｒを過剰分泌する１つの変異体においてクーマシー染色により容易に検出された。このことは、これがＬＥＥ意外にコードされる新規な推定エフェクターを意味することを示唆する。
【０１６０】
ｐ５４を同定し、さらなるエフェクターがＣ．ローデンティウムのＬＥＥ領域外でコードされているか否かを決定するために、ＧｒｌＡがＬＥＥ遺伝子発現及び／又はＩＩＩ型分泌を促進する能力を利用して、ｇｒｌＡプラスミドを、エフェクターは分泌するが輸送体を分泌しない変異体に導入した。ＧｒｌＡの過剰発現は、これらの変異体におけるＴｉｒの分泌を大いに促進（４００％以上も）したが輸送体は発現しなかった。少なくとも６種類の更なる分泌タンパク質が認められ、ＬＥＥにコードされたＴＴＳＳが種々の付加的な非ＬＥＥコードタンパク質を分泌することを示した。
【０１６１】
これらのタンパク質を同定するために、分泌タンパク質を２次元ゲルで分析した。いくつかのＬＥＥコードエフェクター（ＲｓｐＦ、ＥｓｐＨ及びＭａｐ）は、推定される塩基性ｐＩ値、例えば、ＥｓｐＦの極端なｐＩ値１１．００を有することから、これらの分泌タンパク質は、最初に酸性（ｐＨ３〜１０）及び塩基性（ｐＨ６〜１１）グラジエントの両方のImmobiline Dry Stripsで泳動し、続いて１２％及び１４％のそれぞれのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。 ゲルをSypro Rubyで染色し、選択したタンパク質のスポットを手作業で切り出し、質量分析及びde novoペプチドシークエンシングにより解析した。
【０１６２】
この解析により、ＬＥＥにコードされたＴｉｒ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、及びＭａｐはＩＩＩ型分泌機構により分泌されることが確認された。
［表２］Ｃ．ローデンティウムのＬＥＥコード化ＴＴＳＳによって分泌されるエフェクター及び推定エフェクター
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【０１６３】
ＬＥＥ遺伝子座にコードされた５つのエフェクターに加え、ＬＥＥ遺伝子座にコードされていない７つのエフェクターと思われる分泌タンパク質を同定した。ＬＥＥ以外にコードされたこれらの分泌タンパク質は、従って、ＬＥＥコード化分泌タンパク質／エフェクター（Ｅｓｐ）から区別するために、ＮｌｅＡ（ｐ５４）、ＮｌｅＢ、ＮｌｅＣ、ＮｌｅＤ、ＮｌｅＥ、ＮｌｅＦ、及びＮｌｅＧ（ＱＱＥＮＡＰＳＳ（Ｉ／Ｌ）ＱＴＲ；配列番号５９）（非ＬＥＥコード化エフェクター)と称する（表２）。同定された７つのタンパク質の中で、ＮｌｅＧだけがＣ．ローデンティウムに独特のものであり、他の６つのタンパク質はＥＨＥＣ Ｏ１５７における高度に保存されたホモログを有する（表２）。ＥＨＥＣのホモログは、ゲノム中の３つの異なる領域に密集する遺伝子にコードされ、それぞれの領域は少なくともＣ．ローデンティウムが分泌するタンパク質と相同性を示す２つのタンパク質をコードしている（表２）。ＮｌｅＡ及びＮｌｅＦのホモログをコードしている遺伝子Ｚ６０２４及びＺ６０２０は、プロファージＣＰ−９３３Ｐを相互作用するＥＨＥＣのＯアイランド７１に局在する。同様に、ＮｌｅＢ及びＮｌｅＥホモログをコードする遺伝子Ｚ４３２８及びＺ４３２９はＯアイランド１２２に局在し、ＮｌｅＣ及びＮｌｅＤホモログをコードする遺伝子（Ｚ０９８６及びＺ０９９０）はＯアイランド３６に局在する（表２、図９）。さらに、Ｚ４３２８（Ｏアイランド１２２）は、Ｏアイランド３６のＺ０９８６の次に局在する１つの遺伝子であるＺ０９８５に強い相同性を有する。
【０１６４】
６つの新規ＥＨＥエフェクター遺伝子のすべてのホモログは、そのゲノム塩基配列が決定されたＥＰＥＣにおいても存在し同様に構成されている(http://www.sanger.ac. uk/Projects/Microbes/)。ＥＰＥＣ遺伝子と８９％の塩基配列同一性を示したＺ６０２４を除き、他の５つのＥＨＥＣ遺伝子はＥＰＥＣにおけるそれらのホモログと９５％以上の同一性を示した。さらに、これらのエフェクターのいくつかは、他の病原性細菌においても高度に保存されている。ＮｌｅＤ／Ｚ０９９０は、Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｔｏｍａｔｏのＩＩＩ型エフェクターであるＨｏｐＰｔｏＨと類似性を有する（４１、４２）。ＮｌｅＥ／Ｚ４３２９は、ウサギＥＰＥＣ（ＲＥＰＥＣ）のＲｏｒｆＤ及びＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉのＯｒｆ２１２と有意な相同性を有し（８、３３）、一方、ＮｌｅＢ／Ｚ４３２８はＲＥＰＥＣのＲｏｒｆＥ、及び２つの仮想Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍタンパク質と強い相同性を有する。Ｚ４３２８及びＺ４３２９の遺伝子は、ＥＨＥＣでは隣接して局在し、これはＲＥＰＥＣにおけるｒｏｒｆＤ及びｒｏｒｆＥ遺伝子の配置と同様である（８）。しかしながら、ｒｏｒｆＤ及びｒｏｒｆＥ遺伝子はＲＥＰＥＣではＬＥＥの隣に局在するが、ＥＨＥＣにおけるそれらの対応遺伝子はＬＥＥから遠く離れた１つの領域（Ｏ−アイランド１２２）に存在する。Ｚ４３２８及びＺ４３２９を有するＥＨＥＣのＯ−アイランド１２２は、２つの細胞毒素と共に、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａにおける重要なＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ調節病原性因子であるＰａｇＣのホモログをコードする遺伝子もまた含む（３、４３）。これらの新規エフェクターをコードするＥＨＥＣの３つのＯ−アイランドは、ＰＡＩｓの特徴であるジヌクレオチド偏向と低ＧＣ％含量を有する。さらに、それらはプロファージと関連しているか、又は可動挿入配列によって隣接されており、非病原性大腸菌のゲノムには存在しない。このことは、これらの遺伝子の水平伝達を意味する。まとめると、以上のことはこれらのアイランド及び新規に同定されたサイトロバクター及びＥＨＥＣの病原性エフェクターの重要性を示唆する。これらの菌は互いに分岐したため、細菌染色体におけるＰＡＩｓの異なる位置にもかかわらず、関連する病原体は驚くべきことに保存された一連のＰＡＩｓを維持することも示唆する。
【０１６５】
［実施例４］
ＮｌｅＡの同定
ＩＩＩ型分泌機構は一般的に接触依存性であると思われているが、所定のインビトロ培養条件において、ＥＨＥＣは液体培養液中で増殖する間にＩＩＩ型エフェクターを細胞外培地に分泌させることができる（２８、５１）。野生型ＥＨＥＣ（ｗｔ）及びＩＩＩ型分泌変異体（ｅｓｃＮ−）から培養上清を調製し、ＩＩＩ型分泌誘導条件において増殖させた。分泌タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析によって、野生型及びｅｓｃＮ−サンプルの両方からの分泌タンパク質に共通の１つの大量の高分子量タンパク質、及び野生型サンプルに特有の種々の他の大量のタンパク質が見出された（図１０Ａ）。これらの分泌タンパク質は、２次元ゲル電気泳動によって分離され、大量の分離されたタンパク質のスポットはゲルから切り出され、質量分析法により分析された（図１０Ｂ、表１）。
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【０１６６】
スポット番号１は野生型及びｅｓｃＮ−培養上清の両方に存在し、ＥｓｐＰと同定された。ＥｓｐＰは、ＥＨＥＣのプラスミドにコードされ、ＩＩＩ型分泌とは独立して自動輸送機構によって分泌される１つのタンパク質である（２５）。４つの主要なスポット（番号２、３、４、５）は野生型の上清に特有である。これらのうちの３つは、ＬＥＥ内の既知のＩＩＩ型分泌タンパク質として同定され：Ｔｉｒ（スポット番号２）、ＥｓｐＢ（スポット番号４）及びＥｓｐＡ（スポット番号５）である（図１０Ｂ、表１）。スポット番号３はＥＨＥＣゲノム内のＬｅｅ領域外の翻訳領域にコードされる推定分子量が４８ｋダルトンのタンパク質として同定された（図１０Ｃ）。このタンパク質はＮｌｅＡ（非ＬＥＥコード化エフェクターＡ）と称する。
【０１６７】
［実施例５］
ｎｌｅＡを含む遺伝子座の特徴づけ
ｎｌｅＡ遺伝子はＯ−アイランドにコードされている。Ｏ−アイランドとは、ＥＨＥＣゲノムの１つの領域であって、非病原性大腸菌Ｋ−１２株には存在しない領域である（３）。大腸菌Ｋ１２株バックボーンに保存された最後の遺伝子（ＹｃｉＥ）とファージの構造タンパク質をコードする遺伝子の間の領域は、いくつかの推定トランスポザーゼ（転移酵素）と１つの推定部位特異的組換え酵素断片を有した（図１１Ａ）。この領域をＰＡＩｓを同定するためのプログラムであるアイランドパス(Islandpath)で解析した結果、この領域内の全ての翻訳領域（ＯＲＦ）は、ジヌクレオチド偏向とＥＨＥＣゲノムの平均とは異なるＧＣ含量を有することが分かった。この領域内の１０個のＯＲＦは、ＥＨＥＣゲノムの平均値よりも少なくとも１標準偏差低いＧＣ含量を有し、一方、６個のＯＲＦの２つはＥＨＥＣゲノムの平均値よりも少なくとも１標準偏差高いＧＣ含量を有した。これらの結果をまとめると、ｎｌｅＡ遺伝子はＰＡＩを含む水平伝達遺伝子群に局在していることが示唆される。この領域内のいくつかの他のＯＲＦは病原性における役割を示唆する特徴を有し、これらは推定シャペロン（Ｚ２５６５）及び他の病原体のＩＩＩ型分泌タンパク質との相同性を有する２つのタンパク質（Ｚ６０２１、Ｚ６０２０）を含む。
【０１６８】
ｎｌｅＡ遺伝子の性質と分布をさらに調べるために、ｎｌｅＡプローブを調製し、Ａ／Ｅ病原体及び非病原性大腸菌株からのゲノムＤＮＡパネルを用いてサザンブロットを行った。図１１Ｂに示したように、ｎｌｅＡ遺伝子は調べた全てのＡ／Ｅ病原体に存在したが、非病原性大腸菌には存在しなかった。現在進行中のＥＰＥＣゲノムシクエンシング解析によれば、ｎｌｅＡ遺伝子はＥＰＥＣゲノムのファージ挿入部位に近接して存在することが分かった。ｎｌｅＡ遺伝子はインチミン陽性、非Ｏ１５７ＥＨＥＣ株Ｏ８４：Ｈ４のプロファージ内にも存在するが、非病原性大腸菌株、ＬＥＥを含まない尿路感染性大腸菌には存在しない。ｎｌｅＡ遺伝子は、サルモネラ種や赤痢菌種のような他のＴＴＳＳを含む病原体にも存在しない。従って、ｎｌｅＡ遺伝子は、Ａ／Ｅ病原体に特異的に獲得され維持されていると思われる。Ｃ．ローデンティウム、ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ及びＯ８４：Ｈ４のｎｌｅＡ遺伝子配列の複数配列整列（マルチプルシークエンスアライメント）によれば、これら４種類のＡ／Ｅ病原体において高度な配列保存性が分かった（図１１Ｃ）。
【０１６９】
［実施例６］
ＮｌｅＡはＬＥＥにコードされるＩＩＩ型分泌機構により分泌される
現在報告されているＬＥＥにコードされたＴＴＳＳのＥＨＥＣ及びＥＰＥＣエフェクターは、ＬＥＥ内において、分泌装置そのものをコードする遺伝子に近接してコードされている。ＮｌｅＡの分泌がＬＥＥにコードされたＴＴＳＳに依存的かどうかを決定するために、ＮｌｅＡのエピトープ付加物を、野生型ＥＨＥＣ、及びＩＩＩ型分泌を欠損するｅｓｃＮ−ＥＨＥＣ株でプラスミドから発現させた。図１２Ａに示したように、ＨＡ付加ＮｌｅＡは野生型及びｅｓｃＮ−ＥＨＥＣ株で同程度のレベルで発現されたけれども、当該タンパク質はＮｌｅＡ−ＨＡで形質転換された野生型細菌によってのみ細胞外培地に分泌された。非分泌型細菌タンパク質であるＤｎａＫは分泌タンパク質サンプルにおいて非分泌タンパク質の不存在のための対照として用いた（図１２Ｂ）。Ｔｉｒは非形質転換及びＮｌｅＡ−ＨＡで形質転換された野生株で分泌されたが、ｅｓｃＮ−株では分泌されず、予想されたＴＴＳＳ表現形が検証された。同様の結果は、野生型ＥＰＥＣ及びＥＰＥＣのいくつかのＩＩＩ型分泌変異体におけるエピトープ付加ＮｌｅＡの発現について得られ、ＮｌｅＡがＥＰＥＣのＴＴＳＳによってもまた分泌されることが示された。
【０１７０】
［実施例７］
ＮｌｅＡは宿主細胞内に移行する
ＥＨＥＣがＩＩＩ型分泌誘導条件下で増殖するとき、２種類のタンパク質が細胞外の培養液へ分泌される。ＮｌｅＡが輸送体であるか、又は移行エフェクターであるかを決定するために、欠失変異体株を作製してＮｌｅＡ非存在下におけるＩＩＩ型分泌及び移行を調べた。野生型及びΔｎｌｅＡ変異体ＥＨＥＣ株からの分泌タンパク質プロフィールを解析した。野生型のサンプルは、ΔｎｌｅＡから分泌されたタンパク質には存在しない約５０ｋＤａの多量のタンパク質を含んでいた（図１３Ａ）。ＮｌｅＡに対する抗血清を用いて行ったウェスタンブロット解析は、５０ｋＤａのＮｌｅＡタンパク質が野生型分泌タンパク質には存在するがΔｎｌｅＡサンプルに存在しないことを示した（図１３Ｂ）。しかしながら、ＮｌｅＡの存在又は不存在の他は野生型及びΔｎｌｅＡ株の分泌タンパク質プロフィールは同一であった（図１３Ａ）。このように、ＮｌｅＡは他のＩＩＩ型分泌エフェクターの分泌には必要ではない。ＮｌｅＡが他のＩＩＩ型エフェクターの宿主細胞への移行に必要かどうかを調べるために、ＨｅＬａ細胞を野生型ＥＨＥＣ及びＥＨＥＣΔｎｌｅＡで感染させ、Ｔｉｒの移行及び機能を感染細胞の免疫蛍光染色法によりモニターした。野生型ＥＨＥＣ及びΔｎｌｅＡ変異体による台座形成(pedestal formation)を調べるために、感染細胞を抗ＥＨＥＣ及び抗Ｔｉｒ抗体による免疫蛍光法に供し、ファロイジンを用いて糸状のアクチンを可視化した。その結果、ＥＨＥＣΔｎｌｅＡは野生型ＥＨＥＣと同等のレベルでＨｅＬａ細胞に接着することを示した。免疫蛍光染色法により、Ｔｉｒは宿主細胞内に移行し、野生型及びΔｎｌｅＡＥＨＥＣ株の両方の感染細菌下に集中することが分かった。機能的なＴｉｒ移行を確認すために、感染細胞を蛍光ファロイジンで染色し、接着した細菌の下で台座形成に関与する重合したアクチンを視覚化した。アクチンの台座は、野生型又はΔｎｌｅＡＥＨＥＣの何れで感染した細胞にも顕著であり、このことは他のＩＩＩ型エフェクターの移行及び機能がＮｌｅＡ非存在下において進行しうることを示す。これらの結果は、ＮｌｅＡが台座形成に必要でないことも示す。
【０１７１】
ＮｌｅＡが他のエフェクターの分泌と移行に役割を果たさないと思われたので、ＮｌｅＡが自分自身を移行させるかどうかを調べた。ＨｅＬａ細胞を、野生型又はＨＡ付加ＮｌｅＡを発現するｅｓｃＮ−ＥＨＥＣで６時間感染させ、細胞成分分画と抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。図１４Ａに示したように、ＮｌｅＡは宿主細胞に移行し、そこで宿主細胞の膜画分と相互作用した。ＮｌｅＡの移行は、ＨＡ付加ＮｌｅＡを発現するＩＩＩ型分泌変異体で細胞が感染する間は観察されず、ＮｌｅＡの移行と宿主膜との相互作用はＴＴＳＳ依存的であることを示す。それぞれの画分に特異的なタンパク質に対する抗体で画分のウェスタンブロットを行ったところ、画分の相互汚染がないことが確認された。宿主細胞の膜内臓タンパク質であるカルネキシンは、宿主細胞質画分には存在せず、宿主細胞の細胞質タンパク質であるチューブリンは宿主膜画分には存在しなかった。非分泌型細菌タンパク質であるＤｎａＫは、低速ペレットにのみ存在し、宿主膜及び細胞質画分への細菌汚染のないことを示した。ＮｌｅＡ及びＤｎａＫは、ＥＨＥＣの接着がＩＩＩ型依存的であるため、ＩＩＩ型変異感染細胞の低速ペレットには存在しなかった。ＥＨＥＣの接着がＩＩＩ型依存的であるためＩＩＩ型変異体感染サンプルにおける人為的なＮｌｅＡの不存在を抑えるために、ＮｌｅＡを発現し送達する同様の実験を野生型及びＩＩＩ型変異体ＥＰＥＣによってもまた行った。何故なら、ＥＰＥＣのＨｅＬａ細胞への接着はＩＩＩ型分泌とは独立しているからである。ＮｌｅＡは野生型ＥＰＥＣ感染した細胞の膜画分には存在したが、ＩＩＩ型変異ＥＰＥＣ株では存在しなかった。ＮｌｅＡ及びＤｎａＫのいずれも野生型及びＩＩＩ型変異ＥＰＥＣ感染細胞の両方の低速ペレット画分に存在した。
【０１７２】
ＮｌｅＡと宿主細胞膜との相互作用の性質を調べるため、ＨＡ付加ＮｌｅＡを含む宿主細胞膜画分を氷上で種々の条件下に抽出し、可溶性及び不溶性膜画分を得るために再遠心した（図１４Ｂ）。これらの画分は、ＨＡ付加ＮｌｅＡを検出するため抗ＨＡ抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。高塩濃度（１Ｍ塩化ナトリウム）又はアルカリ性ｐＨ（０．２ＭのＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１１．４）処理によって、それぞれ静電的又は親水性相互作用を介して膜と表面的に相互作用していたタンパク質は除かれた。ＮｌｅＡと宿主細胞膜との相互作用は、膜内在性タンパク質であるカルネキシンのように（図１４Ｂ中央パネル）これらの処理による破壊に抵抗を示した（図１４Ｂトップパネル）。反対に、 表在性膜タンパク質であるカルレティキュリンの大部分は、高塩濃度及びアルカリ性ｐＨ処理の両方の処理の間に膜画分から抽出された（図１４Ｂ、下のパネル）。カルネキシンのような膜内在性タンパク質を可溶化する（図１４Ｂ、中央パネル）非イオン性界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００による膜画分の処理は、ほぼ完全にＮｌｅＡを可溶化し、ＨＡ付加ＮｌｅＡタンパク質の不溶性画分から可溶性画分への移動を起こした（図１４Ｂ、上部パネル）。これらの結果は、ＮｌｅＡが宿主細胞へ移行し、そこで膜内在性タンパク質のようにふるまうことが示された。実際、種々の膜貫通ドメイン推測プログラムによるＮｌｅＡタンパク質の配列解析は、その配列内に１つ又は２つの推定膜貫通ドメインの存在を予想する（図１１Ｃ）。
【０１７３】
［実施例８］
ＮｌｅＡは宿主のゴルジ体へ局在する
宿主細胞内におけるＮｌｅＡの細胞内局在性について次に決定した。ＨｅＬａ細胞を野生型ＥＨＥＣ又はＥＨＥＣΔｎｌｅＡで感染させ、ＮｌｅＡ及びマンノシダーゼＩＩに対する抗体で免疫蛍光法を行った。いくつかのサンプルは固定する前に３０分間ブレフェルディンＡで処理した。ＮｌｅＡ及びマンノシダーゼＩＩによる二重染色を行った。ＨｅＬａ細胞は、ＧＦＰ−ＮｌｅＡ融合タンパク質をコードする発現構築物で形質転換し、マンノシダーゼＩＩに対する抗体で免疫蛍光法を行った。
【０１７４】
野生型ＥＨＥＣで感染させたＨｅＬａ細胞の抗ＮｌｅＡ抗体による免疫蛍光染色は、核周囲の染色パターンを示し、これはＥＨＥＣΔｎｌｅＡで感染させた細胞や非感染細胞には見られなかった。このパターンは、後期エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）ミトコンドリア又は核に対するマーカーで得られた染色とは似ていなかった。しかし、非常によく似た染色パターンが、細胞を抗ＮｌｅＡ抗体とマンノシダーゼＩＩを含むゴルジ体のマーカーに対する抗体で共染色したときに観察され、２つのタンパク質は広範に共存した。ＮｌｅＡのゴルジ体への局在を確認するために、固定前の感染細胞を、ゴルジ体の構造を破壊するカビの代謝産物であるブレフェルディンＡ（２７）と共にインキュベートし、免疫蛍光染色した。ブレフェルディンＡはマンノシダーゼＩＩ及びＮｌｅＡ染色の両者の拡散を引き起こし、ゴルジ体局在タンパク質であることが推定された。ＮｌｅＡは種々の他のゴルジ体マーカーと共存することが観察され、ゴルジ体への局在は、また、ＨＡ及びＦＬＡＧエピトープタグを用いた抗タグ抗体で染色されたエピトープタグ付加ＮｌｅＡを調べた実験でも認められた。ＮｌｅＡのゴルジ局在が他の細菌ファクターを必要とするか、又はＮｌｅＡの固有的な性質であるのかを決定するために、細胞をＧＦＰ−ＮｌｅＡ融合タンパク質をコードする発現構築物で形質転換した。形質転換されたＮｌｅＡＧＦＰもまたゴルジに局在し、マンノシダーゼＩＩ染色部位と重なった。
【０１７５】
このように、我々の実験はＮｌｅＡがゴルジに局在することを示した。形質転換されたＮｌｅＡ−ＧＦＰ融合タンパク質がゴルジに局在するという知見は、ＮｌｅＡタンパク質がゴルジ標的化情報を含み、この目的地へ到着するための他の細菌ファクターを必要としないことを示唆する。細菌によって送達されるＮｌｅＡもまたゴルジ局在性である。
【０１７６】
［実施例９］
ＮｌｅＡは病原性に必須である
Ａ／Ｅ病原体における高度な配列保存性（図１１Ｃ）は、ＮｌｅＡが感染における類似した役割を果たしていることを示唆する。Ｃ．ローデンティウムはマウスの天然の病原体であり（５３）、Ａ／Ｅ病原性の研究のモデルシステムとして用いられてきた。感受性系統では、Ｃ．ローデンティウム感染は致死性であり、典型的には感染後６〜１０日の間に感染したマウスの死亡を引き起こす。より耐性を有するマウス系統は、Ｃ．ローデンティウム感染によって死亡しないが、コロニー形成を起こし、腸管炎症や結腸の過形成を引き起こす（５４）。
【０１７７】
病原性におけるＮｌｅＡの役割を調べるために、我々はｎｌｅＡ欠失Ｃ．ローデンティウム株を作製し、全細菌抽出物をＮｌｅＡ抗血清でウェスタンブロッティングしてＮｌｅＡの不存在を検証した（図１６Ａ）。マウスを等量数の野生型又はΔｎｌｅＡ細菌で経口的胃管栄養法により感染させた。Ｃ．ローデンティウム感受性Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウスでは、ＮｌｅＡは病原性にとって絶対的に要求された。野生型Ｃ．ローデンティウムに感染した全てのＣ３Ｈ／Ｈｅｊマウスは感染後６〜１０日の間に死亡した（ｎ＝９）が、ΔｎｌｅＡ感染マウス（ｎ＝１３）は、軟便等の緩和な疾患症状を示したがそれでも体重は増加し感染期間中活発であり、不確定期間生存した（図１６Ｂ）。さらに、ΔｎｌｅＡ感染マウスは野生型Ｃ．ローデンティウムによる後の暴露に抵抗性を示した（ｎ＝５、図１６Ｂ）。このように、ΔｎｌｅＡ株は感受性マウスにおいて非病原性である一方、宿主に対し十分に保護免疫を刺激する作用を示した。
【０１７８】
Ｃ３Ｈ／Ｈｅｊマウスとは反対に、Ｃ．ローデンティウム感染は非近交系のＮＩＨスイスマウスに対して致死性ではない。これらのマウスにおいて、大腸におけるＣ．ローデンティウムのコロニー形成は腸管炎症、結腸の過形成及び緩和な下痢症状に導く。ＮＩＨスイスマウスを野生型又はΔｎｌｅＡ株で感染させ、感染後１０日目に屠殺した。ΔｎｌｅＡ株に感染したマウスは、１０日目の結腸におけるＣ．ローデンティウム力価が平均して２０倍低かった（図１６Ｃ）。
【０１７９】
感染したＮＩＨスイスマウス結腸の組織学的解析は、マウスを野生型又はΔｎｌｅＡ株で感染させ、それらを感染後１０日目に屠殺することにより行った。感染マウス結腸の最後の０．５ｃｍを１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、処理し、３μｍ切片に切断し、ヘマトキシリン及びエオジン染色した。すべてのマウスの組織切片を観察し、５倍及び６３倍の対物レンズで写真撮影した。感染したマウスの肛門の端から取得した生検の組織学的解析の結果、多くの細菌が野生型感染組織に認められたが、ΔｎｌｅＡ感染サンプルの細菌数は、わずかであった。野生型Ｃ．ローデンティウムに感染した全ての動物は、結腸過形成の病理学的徴候を示したが、全てのΔｎｌｅＡ感染マウスは過形成の徴候を示さなかった。野生型感染サンプルは激しい炎症を示し、腸管内腔がもはやはっきりせず、増大した上皮に適応するため外部の筋肉層が見かけ上拡張している程度まで過形成していた。反対に、ΔｎｌｅＡ感染サンプルでは、比較的正常な組織像を示した。腸管炎症と過形成の相対的程度は、マウスの２つのグループにおける屠殺時の結腸重量違いでも明らかである（図１６Ｄ）。野生型感染マウスは、ΔｎｌｅＡ感染よりも大きな脾臓を有することが脾臓重量に反映されている（図１６Ｄ）。
【０１８０】
このように、疾患のマウスモデルにおける病原性に対してＮｌｅＡの著しい効果が示された。感受性マウスにおいて、Ｃ．ローデンティウムの機能的ＮｌｅＡの存在は１０日以内の致死的な感染を引き起こした。ＮｌｅＡ欠失株に感染したマウスはほとんど症状を示さず、不確定に感染から生き残った。Ｃ．ローデンティウムの感染が致死性でないより耐性のマウス系統では、ＮｌｅＡは結腸の過形成の進展に必要であり、感染後１０日目において宿主腸管内のｎｌｅＡ変異体の数はより少なかった。これらの研究は、Ｃ．ローデンティウムにおけるＮｌｅＡの明確な効果を示す。ＨｅＬａ細胞のＥＨＥＣ感染から得られた結果は、インビトロにおいてＮｌｅＡは細菌の宿主細胞への接着又は他のエフェクターの移行に影響せず、ＮｌｅＡが細菌接着を増強するよりも宿主クリアランスへの抵抗性レベルで作用し手いるかもしれないことを示唆した。さらに、ΔｎｌｅＡ感染マウスのその後の野生型Ｃ．ローデンティウムへの暴露は、ｎｌｅＡ変異体株がコロニーを形成し、宿主免疫を刺激するために十分な程度宿主と相互作用するという証拠を提供する。これは、Ｃ．ローデンティウムのＩＩＩ型変異体が宿主にコロニー形成せず、引き続く暴露から保護しないこととは対照的である。従って、ｎｌｅＡ変異体株は弱毒化ワクチン株として使用できるであろう。
【０１８１】
［引用文献］
下記の刊行物は引例により組み込まれる。
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【０１８２】
他の実施形態
本発明の種々の実施形態が本書において開示されているが、当業者が共有する一般的な知識に従って、本発明の範囲内において改変及び修飾が多くなされてもよい。そのような修飾は、実質的に同じ方法において同じ結果を達成するために、既知の等価な形態との置換を含む。本書で使用される場合、受入番号（Accession numbers）は、ヌクレオチド配列に関しては、ＧｅｎＢａｎｋ、ヨーロッパ分子生物学研究室（ＥＭＢＬ）、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）、若しくは、ゲノム配列データベース（ＧＳＤＢ）を含み、並びに、ポリペプチド配列に関しては、タンパク質情報資源（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、タンパク質研究財団（ＰＲＦ）、及び、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）（解析された構造からの配列）、及び、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ若しくはＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列からのアノテートされた翻訳領域からの翻訳を含む、複数のデータベースからの受入番号を含む。数字の範囲は、範囲を限定された包括的な数である。本明細書においては、単語「含んでいる（comprising）」は、言い回し「を含むがこれらに限定されない（including, but not limited to）」と実質的に等価な、制限の無い用語として使用され、また、単語「含む（comprises）」も一致する意味を有する。本書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であるとの承認として解釈されるべきではない。各個別刊行物が、本書に参照により組み込まれるべく且つ本書で十分にかのように説明されるべく、具体的且つ個々に指し示された場合、全ての刊行物は参照により本書に組み込まれる。本発明は、本書の前に記載され、そして、実施例及び図面に対して参照されるような、実質的な全ての実施形態及び変形形態を含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
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