(57)【要約】【課題】本発明が解決すべき課題は、レポータージーンアッセイシステムや特定の酵素を発現している微生物の検出システムなどにおいて酵素の基質となり、酵素反応前後における蛍光強度の差が顕著に大きい集合体を含む蛍光プローブを提供することにある。また、本発明は、当該集合体の製造方法と、当該集合体の原料化合物であるロドール誘導体を提供することも目的とする。【解決手段】本発明に係る蛍光プローブは、下記式（Ｉ）で表されるロドール誘導体からなる集合体を含むことを特徴とする。2011162486.tif 000015［式中、Ａは置換基としてニトロ基等を有するＣ6-12アリール基を示し；Ｘは置換基を有していてもよいＣ6-12アリール基を示し；Ｒ1〜Ｒ2は、独立してＣ1-6アルキル基を示し；Ｒ3〜Ｒ8は置換基を示し；Ｒ9〜Ｒ10は水素原子などを示し；ｎは、０または１を示す］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表されるロドール誘導体からなる集合体を含むことを特徴とする蛍光プローブ。
【化１】
2011162486.tif 000012
［式中、
Ａは、置換基としてニトロ基またはＣ2-7アシルオキシ基を有するＣ6-12アリール基を示し；
Ｘは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいＣ6-12アリール基を示し；
Ｒ1〜Ｒ2は、独立してＣ1-6アルキル基を示し；
Ｒ3〜Ｒ8は、独立して水素原子、または、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基を示し（但し、Ｒ1とＲ3および／またはＲ2とＲ4は、互いに結合してＣ2-3アルキレン基を形成してもよい）；
Ｒ9〜Ｒ10は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し；
ｎは、０または１を示す］
【請求項２】
集合体の体積平均粒子径が１０ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下である請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
さらに水を含む請求項１または２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
下記式（Ｉ）または（Ｉ’）で表されるロドール誘導体を水系溶媒に添加する工程を含むことを特徴とするロドール誘導体の集合体の製造方法。
【化２】
2011162486.tif 000013
［式中、
Ａは、置換基としてニトロ基またはＣ2-7アシルオキシ基を有するＣ6-12アリール基を示し；
Ｘは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいＣ6-12アリール基を示し；
Ｒ1〜Ｒ2は、独立してＣ1-6アルキル基を示し；
Ｒ3〜Ｒ8は、独立して水素原子、または、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基を示し（但し、Ｒ1とＲ3および／またはＲ2とＲ4は、互いに結合してＣ2-3アルキレン基を形成してもよい）；
Ｒ9〜Ｒ10は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し；
ｎは、０または１を示す］
【請求項５】
水系溶媒の塩濃度を調節することにより集合体の体積平均粒子径を調節する請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
下記式（Ｉ）または（Ｉ’）で表されることを特徴とするロドール誘導体。
【化３】
2011162486.tif 000014
［式中、
Ａは、置換基としてニトロ基またはＣ2-7アシルオキシ基を有するＣ6-12アリール基を示し；
Ｘは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいＣ6-12アリール基を示し；
Ｒ1〜Ｒ2は、独立してＣ1-6アルキル基を示し；
Ｒ3〜Ｒ8は、独立して水素原子、または、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基を示し（但し、Ｒ1とＲ3および／またはＲ2とＲ4は、互いに結合してＣ2-3アルキレン基を形成してもよい）；
Ｒ9〜Ｒ10は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し；
ｎは、０または１を示す］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光プローブ、その製造方法、およびその原料化合物であるロドール誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
特定の酵素に対して応答する基質部分と蛍光発色部分を有する蛍光プローブは、様々な生命現象などを可視化するためのツールとして有用であり、β−ガラクトシダーゼやアルカリホスファターゼなど、様々な酵素に対する蛍光プローブが既に開発されている。
【０００３】
かかる蛍光プローブは、例えば、細胞の形質転換を確認するために用いられる。具体的には、目的遺伝子と共にレポーター遺伝子を細胞へ導入し、レポーター遺伝子に対応する蛍光プローブを作用させ、蛍光発色の有無により形質転換細胞を特定する。かかるレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの遺伝子が知られている。
【０００４】
最近、特定の酵素と蛍光プローブの組み合せを使う技術として、レポータージーンアッセイシステムが開発されている。当該技術は、ある受容体により刺激されるプロモーターの下流にレポーター遺伝子を導入し、レポーター遺伝子の発現による蛍光プローブの発色の有無、蛍光強度や蛍光波長の変化などにより、受容体に対するリガンドの活性を試験するものである。
【０００５】
さらに蛍光プローブは、特定の酵素を発現している微生物の検出システムにも適用されている。
【０００６】
上記技術において、より明確な結果を得るには、レポーター遺伝子から発現する酵素により代謝される化合物の酵素反応前後における蛍光強度が大きく異なることが好ましい。そこで、例えばニトロレダクターゼ遺伝子をレポーター遺伝子として用いるシステムにおいて、酵素反応前後で蛍光強度が変化する蛍光プローブとして、特許文献１〜３に示す化合物が開発されている。これら一連の技術から、下記化合物が、レポータージーンアッセイシステムにおけるニトロレダクターゼの蛍光プローブとして市販されている。
【０００７】
【化１】
2011162486.tif 000002
【０００８】
また、特許文献１には、蛍光化合物であるフルオレセインの水酸基をｐ−ニトロベンジルエーテル化した下記化合物が開示されている。
【０００９】
【化２】
2011162486.tif 000003
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００６／１００４１７号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０３１７６７４号明細書
【特許文献３】特表２００３−５２２３３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述した様に、レポータージーンアッセイシステムなどにおいてニトロレダクターゼの基質となり、酵素反応前後で蛍光強度が変化する蛍光化合物は既に開発されている。
【００１２】
しかし本発明者らによる実験的知見によれば、上記市販化合物の酵素反応前後における蛍光強度の比は１０未満であるなど、公知の蛍光化合物の蛍光強度差は全く満足できるものではない。
【００１３】
そこで本発明が解決すべき課題は、レポータージーンアッセイシステムや特定の酵素を発現している微生物の検出システムなどにおいて酵素の基質となり、酵素反応前後における蛍光強度の差が顕著に大きい集合体を含む蛍光プローブを提供することにある。また、本発明は、当該集合体の製造方法と、当該集合体の原料化合物であるロドール誘導体を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、蛍光化合物であるロドールの誘導体を水に添加したところ集合体を形成し、当該集合体は蛍光性をほとんど示さない一方で、レダクターゼの基質になって解砕されつつ蛍光性のロドール誘導体に還元されるため、代謝前後での蛍光強度差が極めて大きいことを見出して、本発明を完成した。
【００１５】
本発明に係る蛍光プローブは、下記式（Ｉ）で表されるロドール誘導体からなる集合体を含むことを特徴とする。
【００１６】
【化３】
2011162486.tif 000004
【００１７】
［式中、
Ａは、置換基としてニトロ基またはＣ2-7アシルオキシ基を有するＣ6-12アリール基を示し；
Ｘは、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基で置換されていてもよいＣ6-12アリール基を示し；
Ｒ1〜Ｒ2は、独立してＣ1-6アルキル基を示し；
Ｒ3〜Ｒ8は、独立して水素原子、または、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、Ｃ2-7アシルオキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基およびシアノ基からなる群より選択される１以上の置換基を示し（但し、Ｒ1とＲ3および／またはＲ2とＲ4は、互いに結合してＣ2-3アルキレン基を形成してもよい）；
Ｒ9〜Ｒ10は、独立して水素原子またはＣ1-6アルキル基を示し；
ｎは、０または１を示す］
【００１８】
本発明において「Ｃ1-6アルキル基」とは、炭素数が１〜６の直鎖状または分枝鎖状の１価脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ヘキシル基などを挙げることができ、Ｃ1-4アルキル基がより好ましく、Ｃ1-2アルキル基がより好ましく、メチル基がより好ましい。
【００１９】
「Ｃ1-6アルコキシ基」とは、炭素数が１〜６の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素オキシ基を意味する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペントキシ基、ｎ−ヘキソキシ基等であり、好ましくはＣ1-4アルコキシであり、より好ましくはＣ1-2アルコキシであり、最も好ましくはメトキシである。
【００２０】
「Ｃ2-7アシルオキシ基」とは、上記Ｃ1-6アルキル基に置換されたカルボニルオキシ基を意味する。例えば、アセチルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基、イソプロピルカルボニルオキシ基、ｔ−ブチルカルボニルオキシ基、イソアミルカルボニルオキシ基、ｎ−ヘキシルカルボニルオキシ基などを挙げることができ、Ｃ2-4アシルオキシ基がより好ましく、Ｃ2-3アシルオキシ基がより好ましく、アセチルオキシ基がより好ましい。
【００２１】
「Ｃ6-12アリール基」は、炭素数が１〜６の芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル基、インデニル基、ナフチル基等であり、好適にはフェニル基である。なお、ＡがＣ6-12アリール基であり且つ置換基を有する場合には、置換基は−（ＣＲ9＝ＣＲ10）n−基に結合している芳香族環に結合していることが好ましく、また、その置換位置はオルト位またはパラ位が好ましく、パラ位がより好ましい。
【００２２】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子を例示することができ、塩素原子または臭素原子が好ましく、塩素原子がより好ましい。
【００２３】
本発明に係るロドール誘導体において、特に−（ＣＲ9＝ＣＲ10）n−Ａ基は、使用する酵素や検出対象である酵素の基質として適するものを選択すればよい。例えば、対象酵素がニトロレダクターゼの場合、Ａとしてはニトロフェニル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル基がより好ましい。対象酵素がエステラーゼの場合、ＡとしてはＣ2-7アシルオキシフェニル基が好ましく、ｐ−Ｃ2-7アシルオキシフェニル基がより好ましく、ｐ−アセチルオキシフェニル基がさらに好ましい。
【００２４】
Ａ上の置換基の置換位置としては、パラ位またはオルト位が好ましく、パラ位がより好ましい。
【００２５】
また、本発明に係るロドール誘導体における置換基の種類や数は特に制限されないが、上述したとおりＡの置換基は対象酵素により適宜選択すればよい。Ａ以外の置換基に関しては、その種類や数により酵素反応前後における蛍光強度比や酵素反応速度などを調節したりすることが可能であり得るが、製造コストなどの問題から、Ａ以外の置換基の数としては１以上、３以下が好ましく、１以上、２以下がより好ましく、さらに好ましくは１とする。
【００２６】
Ｒ3〜Ｒ8としては、より好ましくは、電子吸引性基であるハロゲン原子、ニトロ基およびシアノ基、またはエレクトロンリッチなハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ基およびＣ2-7アシルオキシ基である。
【００２７】
上記集合体の大きさは、体積平均粒子径で１０ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下であることが好ましい。当該体積平均粒子径が１０ｎｍ未満であると、疎水環境が十分に形成されず、蛍光性のロドール誘導体が蛍光性をほとんど示さないラクトン化合物に変換されないおそれがあり得る。一方、当該体積平均粒子径が１０００ｎｍを超えると、集合体が水中で沈降したり、細胞に十分に取り込まれなくなるおそれがあり得る。
【００２８】
上記蛍光プローブは、さらに水系溶媒を含む集合体分散液であることが好ましい。上記集合体は水系溶媒中で安定に存在し、また、当該分散液であれば、そのまま使用することが可能である。
【００２９】
本発明に係るロドール誘導体集合体の製造方法は、下記式（Ｉ）または（Ｉ’）で表されるロドール誘導体を水系溶媒に添加する工程を含むことを特徴とする。
【００３０】
【化４】
2011162486.tif 000005
［式中、各基の定義は上述したものと同様とする］
【００３１】
なお、ロドール誘導体（Ｉ）と（Ｉ’）は互いに平衡の関係にあり、極性環境では（Ｉ’）の構造が主となるが、疎水性環境ではラクトン化し、（Ｉ）の構造が主となる。また、ロドール誘導体（Ｉ’）は、酸性環境においては−ＣＯ2-基が−ＣＯ2Ｈ基に、塩基性環境においてはＲ1Ｒ2Ｎ+＝基がＲ1Ｒ2Ｎ−基となり得るが、これら化合物も本発明範囲に含まれるものとする。
【００３２】
本発明に係るロドール誘導体集合体の製造方法では、水の塩濃度を調節することにより集合体の体積平均粒子径を容易に調節することが可能である。
【００３３】
本発明に係るロドール誘導体は、上記式（Ｉ）または（Ｉ’）で表されることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３４】
本発明に係る集合体は、水中で安定であり、また、蛍光化合物であるロドールの誘導体から形成されるものでありながら蛍光性をほとんど示さない一方で、酵素の基質となり、解砕されつつ蛍光性のロドール誘導体に還元される。よって、酵素反応前後での蛍光強度差が極めて大きいので、酵素を用いたレポータージーンアッセイや、特定の酵素を発現している微生物の検出システムなどにおける蛍光プローブとして利用できる。また、本発明に係る集合体は、本発明に係るロドール誘導体を水に添加するのみという非常に簡便な方法で製造できる。従って本発明は、従来の蛍光プローブにとって代わり得るものとして、産業上極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、本発明に係る集合体に酵素を作用させた場合における吸収スペクトルの経時的変化を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明に係る集合体に酵素を作用させた場合における蛍光スペクトルの経時的変化を示すグラフである。
【図３】図３は、各蛍光プローブの酵素反応前における蛍光強度（Ｉ0）に対する蛍光強度測定値の比の経時的変化を示すグラフである。図３（２）は、図３（１）中、酵素反応開始から約３０分間の部分を拡大したものである。
【図４】図４は、本発明に係る蛍光プローブの酵素反応前における蛍光強度（Ｉ0）に対する蛍光強度測定値の比の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明に係る集合体の原料であるロドール誘導体は、下記スキームにより製造することができる。
【００３７】
【化５】
2011162486.tif 000006
［式中、Ａ、Ｘ、Ｒ1〜Ｒ10およびｎは、上記と同義を示し、Ｈａｌは脱離基として用い得るクロロ基、ブロモ基またはヨード基を示す］
【００３８】
上記工程では、溶媒中、好適には触媒の存在下、ロドール誘導体（ＩＩ）と−（ＣＲ9＝ＣＲ10）n−Ａ基を含むハロゲン化合物を縮合させる。原料化合物であるロドール誘導体（ＩＩ）は、市販のものがあればそれを用いればよいし、或いは当業者公知の方法により市販化合物から合成することが可能である。また、上記スキーム中ではロドール誘導体（ＩＩ）をカルボキシ体として記載しているが、等価であるラクトン体や、−ＣＯ2-基が−ＣＯ2Ｈ基、Ｒ1Ｒ2Ｎ+＝基がＲ1Ｒ2Ｎ−基である化合物も同様に用いることができる。ハロゲン化合物も同様であり、市販のものがあればそれを用いればよいし、或いは当業者公知の方法により市販化合物から合成することができる。
【００３９】
使用できる溶媒は、原料化合物に対して適度な溶解性を示し、且つ反応を阻害しないものであれば特に制限されない。例えば、ジエチルエーテルやテトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒；アセトニトリルなどのニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒などを用いることができる。また、溶媒の使用量は適宜調整すればよいが、通常、原料化合物と触媒の総量が０．００５ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができ、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上、０．１ｍｇ／ｍＬ以下程度がより好ましい。
【００４０】
反応に用い得る触媒は、原料化合物などに応じて適宜選択すればよいが、例えば、酸化銀（Ｉ）などの金属酸化物；水素化ナトリウムなどの水素化金属；ピリジン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどの有機アミンなどを用いることができる。
【００４１】
ロドール誘導体（ＩＩ）とハロゲン化合物は、ほぼ等モル用いてもよいが、一方が入手し難いような場合には、反応を促進するために他方を過剰に用いてもよい。通常、ロドール誘導体（ＩＩ）に対して、ハロゲン化合物を１．１倍モル以上、５倍モル以下程度用い、より好ましくは１．２倍モル以上、２．５倍モル以下程度用いる。
【００４２】
触媒の使用量は適宜調整すればよいが、例えば、ロドール誘導体（ＩＩ）またはハロゲン化合物のうち少ない方に対して１．１倍モル以上、５倍モル倍以下程度とすることができ、より好ましくは１．５倍モル以上、３倍モル以下程度とすることができる。
【００４３】
具体的な反応条件としては、特に制限されないが、例えば、ロドール誘導体（ＩＩ）とハロゲン化合物と触媒を溶媒に添加した上で、攪拌しつつ加熱すればよい。反応温度は適宜調整すればよいが、例えば、常温以上、１５０℃以下程度とすることができ、５０℃以上、９０℃以下がより好ましい。また、使用する溶媒の還流温度で反応させることもできる。反応時間も特に制限されず、例えば、予備実験などで決定したり、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などで、原料化合物のうち少なくとも一方の消失が確認できるまでとすればよいが、通常は１時間以上、３６時間以下程度とすることができる。
【００４４】
反応終了後は、当業者公知の方法により目的化合物であるロドール誘導体（Ｉ）を精製すればよい。例えば、反応液を常温まで放冷し、触媒などの不溶成分を濾別した後、濾液を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィーなどで精製したり、或いは再結晶すればよい。
【００４５】
本発明に係る集合体は、本発明に係るロドール誘導体を水系溶媒に添加することにより簡便に調製することが可能である。本発明に係るロドール誘導体は、水溶性が低いために、水に添加すると凝集して自ら疎水性環境を形成し、ラクトン環を有するロドール誘導体（Ｉ）からなる集合体となる。この際、あくまで推定ではあるが、水と接触可能な表面付近の化合物のみが蛍光性のロドール誘導体（Ｉ’）として存在し、大部分が非蛍光性のロドール誘導体（Ｉ）であるので、集合体全体ではほとんど蛍光性を示さないと考えられる。
【００４６】
ロドール誘導体は、いったん溶媒に溶解した上で、溶液として水系溶媒に添加することが好ましい。かかる溶液の溶媒は、ロドール誘導体を溶解できるものであれば特に制限されないが、例えば、メタノールやエタノールなどのアルコール類；テトラヒドロフランやジオキサンなどのエーテル類；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド類；ジメチルスルホキシド；ピリジンなどのヘテロアリール類などを挙げることができる。
【００４７】
水系溶媒とは、水、または水と水溶性有機溶媒との混合溶媒をいう。即ち、集合体の形成のために用いる水系溶媒は、集合体が形成される範囲で水溶性有機溶媒を含んでいてもよい。水溶性有機溶媒としては、ロドール誘導体の溶解に用いる溶媒として例示したものと同様のものを挙げることができる。
【００４８】
水としては、精製水、純水、超純水、蒸留水など、特に制限なく使用できるが、水道水や井戸水など不純物を比較的多く含むものは使用しないことが好ましい。
【００４９】
本発明に係る集合体は極性環境で形成されるため、水系溶媒における水溶性有機溶媒の割合が過剰になると、集合体が形成されないか、形成されても安定性が低下するおそれがあり得る。よって、ロドール誘導体の溶解に水溶性有機溶媒を使う場合であっても、水系溶媒における最終的な水溶性有機溶媒の割合を０．１容量％以上、１０容量％以下とすることが好ましく、０．５容量％以上、５容量％以下とすることがより好ましく、０．５容量％以上、２容量％以下とすることがさらに好ましい。
【００５０】
また、集合体の形成のために用いる「水系溶媒」は、塩を含むものであってもよい。かかる塩としては、例えば、トリス−塩酸、グリシン塩酸塩、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム、グリシン−水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウムなど、緩衝能を有するものを挙げることができる。その他、ＨＥＰＥＳやＭＯＰＳなどのグッドバッファーを用いてもよい。
【００５１】
集合体の大きさは、体積平均粒子径で１０ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下であることが好ましい。当該体積平均粒子径が１０ｎｍ未満であると、疎水環境が十分に形成されず、蛍光性のロドール誘導体が蛍光性をほとんど示さないラクトン化合物に変換されないおそれがあり得る。一方、当該体積平均粒子径が１０００ｎｍを超えると、集合体が水中で沈降したり、細胞に十分に取り込まれなくなるおそれがあり得る。
【００５２】
集合体の大きさは、溶媒中の塩濃度で調節することが可能である。即ち、塩濃度が高いほど集合体は大きくなる傾向があり、塩濃度が低いほど集合体は小さくなる傾向がある。集合体の大きさと塩濃度との関係は、使用するロドール誘導体の種類や濃度、また、塩の種類などにより異なるため、具体的な塩濃度は予備実験などにより決定することが好ましい。但し、一般的には、集合体の体積平均粒子径で１０ｎｍ以上、１０００ｎｍ以下とするには、塩濃度を１ｍＭ以上、１Ｍ以下程度とすることが好ましく、５ｍＭ以上、２００ｍＭ以下程度とすることがより好ましく、１０ｍＭ以上、１００ｍＭ以下程度とすることがさらに好ましい。
【００５３】
本発明に係る集合体は、例えば、本発明に係るロドール誘導体の溶液を緩衝液などに添加してよく混合するなど、非常に簡便に製造することが可能である。得られた集合体分散液は、そのまま或いはゲルカラムにより溶媒を適切なものに置換した上で酵素反応などに使用することもできるし、いったん遠心分離やゲルカラムなどで集合体を単離した後、酵素反応に用いることもできる。
【００５４】
本発明に係る集合体は、ほとんど蛍光性を示さない。その一方で、酵素により−ＣＨ2−（ＣＲ9＝ＣＲ10）n−Ａ基が脱離し、蛍光性のロドール誘導体が遊離して強い蛍光を発するようになる。例えば、Ａにニトロ基が置換している場合、当該ニトロ基がレダクターゼによりアミノ基に還元され、生じた孤立電子対の電子がアリール基や−（ＣＲ9＝ＣＲ10）−基の共役系を移動し、−ＣＨ2−（ＣＲ9＝ＣＲ10）n−Ａ基を脱離させる。また、Ａにアシルオキシ基が置換している場合には、エステラーゼによりアシル基が除去され、生じた−ＯＨ基または−Ｏ-基上の電子が同じく−ＣＨ2−（ＣＲ9＝ＣＲ10）n−Ａ基を脱離させる。よって本発明の集合体は、その前駆体として対象酵素の基質化合物となるロドール誘導体を選択することにより、レポータージーンアッセイや形質転換の確認、対象酵素を特異的または過剰発現している微生物や組織の検出などにおいて、蛍光プローブとして利用することができる。
【００５５】
本発明の集合体を用いる場合には、対象試料などに本発明の集合体を単に添加するのみでもよいが、事前に分散液としておくと利便性が高い。より詳しくは、水中で集合体を調製した場合には、反応液をそのまま用いてもよい。しかし、溶媒中に水溶性有機溶媒を添加した場合には、レダクターゼが有機溶媒により変性して活性が低下するおそれがあるため、例えば、ゲルカラムにより溶媒を適切なものに置換した上で、分散液とすることが好ましい。当該分散液の濃度としては、０．００１質量％以上、０．５質量％以下程度が好適である。
【００５６】
酵素の還元作用により本発明の集合体から生じた代表的なロドール誘導体は、吸収光波長が５１７ｎｍであり、蛍光波長が５５１ｎｍである。よって、蛍光プローブとして用いる際には、４７０ｎｍ以上、５３０ｎｍ以下程度の波長の光を含む光を照射し、５４０ｎｍ以上、６２０ｎｍ以下程度の光の強度を測定すればよい。
【００５７】
使用する酵素の種類は特に制限されないが、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンレダクターゼ、ＤＴ−ジアフォラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨ：シトクローム  Ｐ４５０  レダクターゼ、フェレドキシン：ＮＡＤＰ+レダクターゼ、ＮＡＤＨ：ユビキノンレダクターゼなどのレダクターゼ；ブタ肝臓由来のエステラーゼやウサギ肝臓由来のエステラーゼなど、ＥＣ３．１．１．１のエステラーゼなどを用いることができる。好適には、ニトロ基の還元能に優れるニトロレダクターゼを用いることが好ましい。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００５９】
実施例１  本発明に係るロドール誘導体の合成
【００６０】
【化６】
2011162486.tif 000007
【００６１】
（１）  Ｎ，Ｎ−ジメチルロドール
２−［４−（ジメチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル］−安息香酸（３０１．８ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）、レゾシノール（１６７．５ｍｇ，１．２倍モル）および塩化亜鉛（ＩＩ）（２５４．８ｍｇ）をトルエン（４ｍＬ）に添加し、オイルバス中、１６０℃で３時間加熱撹拌した。反応液に酢酸エチルを添加し、飽和食塩水で３回洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を乾燥後、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／ジクロロメタン＝１／２→２／：１）により精製し、純水物ではないが、オレンジ色固体であるＮ，Ｎ−ジメチルロドールを得た（収量：５９．５ｍｇ）。
1H-NMR（400MHz，CD3OD）：δ3.08（s，6H），6.60（dd，1H，J=8.78），6.67（s，2H），6.73-6.75（m，3H），7.24（d，1H，J=7.32），7.57-7.77（m，3H），8.06（d，1H，J=7.32）
FAB-MS（m/z)［（M+H）+］  理論値（C22H18NO4）：359.12，実測値：360
【００６２】
（２）  本発明に係るロドール誘導体
窒素雰囲気下、上記（１）で得られたＮ，Ｎ−ジメチルロドール（５９．５ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）、酸化銀（Ｉ）（７７．６ｍｇ，２．０倍モル）、４−ニトロ臭化ベンジル（５３．６ｍｇ，１．５倍モル）を含むテトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）を、撹拌しながら１７時間加熱還流した。次いで、反応液を空冷した後、濾過した。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／ジクロロメタン＝０／１→１／５０）により精製し、目的化合物を得た（収量：５．７ｍｇ（０．０１２ｍｍｏｌ），収率：６．８％）を得た。なお、「ＰＮＢ」は、ｐ−ニトロベンジル基を示す。
1H-NMR（400MHz，CDCl3）：δ2.98（s，6H），5.19（s，2H），6.41（dd，1H，J=2.72，6.34，2.26Hz），6.47（d，1H，J=2.26Hz），6.60（d，1H，J=9.05Hz），6.64（dd，1H，J=2.26，6.34，2.72Hz），6.70（d，1H，J=8.60Hz），6.79（d，1H，J=2.26Hz），7.16（d，1H，J=7.24Hz），7.58-7.65（m，4H），8.00（d，1H，J=7.24Hz），8.25（d，2H，J=8.60Hz）
FT-IR（KBr）：3446，3082，2896，2816，1764，1635，1616，1522，1506，1428，1347，1286，1247，862，822，761，737，693，520cm-1
FAB-MS（m/z)［（M+H）+］  理論値（C29H22N2O6）：495.1542，実測値：495.1549
元素分析（C29H22N2O6）  C：70.44，H：4.48，N：5.67（理論値）  C：70.17，H：4.66，N：5.63（実測値）
【００６３】
比較例１〜４
【００６４】
【化７】
2011162486.tif 000008
【００６５】
特許文献１（国際公開第２００６／１００４１７号パンフレット）に記載の実施例に従って、フルオレセインのモノｐ−ニトロベンジルエーテル（比較例１）、フルオレセインのジｐ−ニトロベンジルエーテル（比較例２）、ロドールのｐ−ニトロベンジルエステル（比較例３）を合成した。
【００６６】
また、上記実施例１と同様にして、一般的な蛍光色素であるＳＮＡＲＦのｐ−ニトロベンジルエーテル（比較例４）を合成した。
【００６７】
実施例２  集合体の製造
上記実施例１で合成したロドール誘導体をジメチルスルホキシドに溶解し、２ｍＭ溶液とした。当該ロドール誘導体の終濃度が５μＭとなるように、当該溶液を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（３ｍＬ，ｐＨ７．０）に加え、ピペットマンを用いてよく攪拌した。ダイナミック光散乱光度計（大塚電子社製，ＤＬＳ）を用い、得られた集合体の体積基準の粒度分布を測定したところ、体積平均粒子径は１２３．４±２９．３ｎｍであった。
【００６８】
また、上記比較例１〜４のフルオレセイン誘導体、ロドール誘導体およびＳＮＡＲＦ誘導体も同様に処理した。その結果、比較例１〜３のフルオレセイン誘導体とロドール誘導体は緩衝液に完全に溶解してしまい、集合体は全く観察されなかった。一方、比較例４のＳＮＡＲＦ誘導体では、集合体の形成が確認できた。その体積平均粒子径を上記と同様に測定したところ、２７６．８±６０．４ｎｍであった。
【００６９】
実施例３  酵素反応前後における蛍光強度変化の測定
上記実施例２と同様に、各化合物の５μＭトリス塩酸緩衝液溶液を調製し、さらに濃度５００μＭとなるようにＮＡＤＰＨを添加した。当該液に、大腸菌由来のニトロレダクターゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，Ｎ９２８４）を終濃度が２Ｕ／ｍＬとなるように添加し、１分または１０分ごとに吸収スペクトルと蛍光スペクトルを測定した。本発明集合体を基質とした場合の吸収スペクトルの経時的変化を図１に、蛍光スペクトルの経時的変化を図２に示す。また、酵素反応前における蛍光強度（Ｉ0）に対する蛍光強度測定値（Ｉ）の比を表１と図３に示す。なお、図３（２）は、図３（１）中、酵素反応開始から約３０分間の部分を拡大したものである。
【００７０】
【表１】
2011162486.tif 000009
【００７１】
上記結果のとおり、本発明に係る集合体をレダクターゼの基質にしたところ、その他の蛍光色素誘導体に比して、代謝前後の蛍光強度比が飛び抜けて大きい。特に、実施例１の本発明集合体と比較例１の公知化合物の構造は、置換基が水酸基かジメチルアミノ基であるという違いのみであるにも関わらず、その蛍光強度比の違いは約９倍にも及んでいる。また、比較例４のＳＮＡＲＦ誘導体は集合体を形成したものの、酵素反応前後における蛍光強度差は大きいものではなかった。その理由としては、本発明に係るロドール誘導体は水系溶媒中で蛍光性をほとんど示さない集合体を形成でき、且つ形成された集合体の表面付近のロドール誘導体から速やかにレダクターゼの基質となり、集合体は解砕されつつ蛍光性のロドール誘導体が遊離することが考えられる。また、比較例４のＳＮＡＲＦ誘導体の集合体を基質とした場合の酵素反応速度は遅かったが、本発明集合体を基質とした場合の酵素反応速度は、十分に速かった。
【００７２】
よって、本発明に係る集合体は、レダクターゼを用いたレポータージーンアッセイなどの蛍光プローブとして非常に有用であることが明らかにされた。
【００７３】
実施例４  本発明に係るロドール誘導体の合成
【００７４】
【化８】
2011162486.tif 000010
【００７５】
（１）  ７’−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルロドール
２−［４−（ジメチルアミノ）−２−ヒドロキシベンゾイル］−安息香酸（３０３．４ｍｇ，１．２４ｍｍｏｌ）、４−クロロレゾシノール（２６９．２ｍｇ，１．５倍モル）および塩化亜鉛（２４２．３ｍｇ，１．５倍モル）をトルエン（４ｍＬ）に加え、オイルバス中、１６５℃で５時間撹拌した。反応液に酢酸エチルを加え、飽和食塩水で洗浄した後に、水層を酢酸エチルで４回抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／ジクロメタン＝０／１→１／５）で精製し、赤色固体である７’−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルロドールを得た（収量：２６．５ｍｇ，収率：３％）。
FAB-HRMS（m/z)［（M+H）+］  理論値（C22H17NO4Cl）：394.0847，実測値：394.0843
【００７６】
（２）  本発明に係るロドール誘導体
窒素雰囲気下、上記（１）で得られた７’−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジメチルロドール（１５．２ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）、酸化銀（Ｉ）（１７．９ｍｇ，２．０倍モル）、４−ニトロ臭化ベンジル（１３．０ｍｇ，１．５倍モル）を含むテトラヒドロフラン溶液（５ｍＬ）を、撹拌しながら２０時間加熱還流した。次いで、反応液を空冷した後、濾過した。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：メタノール／ジクロロメタン＝０／１→１／２０）により精製した。目的化合物が含まれている画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン）により精製し、目的化合物が含まれている画分を再度シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン＝２／１）により精製し、目的化合物を得た（収量：１．１ｍｇ，収率：５％）。
1H-NMR（400MHz，CDCl3）：δ2.99（s，6H），5.30（s，2H），6.41-6.46（m，2H），6.59（d，1H，J=9.06Hz），6.78（s，1H），6.80（s，1H），7.17（d，1H，J=7.25Hz），7.52-7.71（m，4H），8.04（d，1H，J=7.70Hz），8.29（d，2H，J=8.61Hz）
FT-IR（KBr）：2923，1759，1633，1613，1526，1412，1349，1284，1252，1182，1109，1086，1061，989，860，814，734，704cm-1
FAB-HRMS（m/z)［（M+H）+］  理論値（C29H22ClN2O6）：3529.1166，実測値：529.1170
【００７７】
実施例５  
上記実施例４で製造した本発明に係るロドール誘導体を用い、上記実施例２と同様にして集合体を調製した。得られた集合体の体積基準の粒度分布を測定したところ、体積平均粒子径は３１６．６±６４．３ｎｍであった。得られた集合体分散液を用い、上記実施例３と同様の条件で酵素反応を行った。実施例１に係る集合体の結果と共に、結果を表２と図４に示す。
【００７８】
【表２】
2011162486.tif 000011
【００７９】
上記結果のとおり、実施例４のロドール誘導体からなる集合体は、実施例１の集合体に比べ、酵素反応速度こそ劣るものの、酵素反応前後における蛍光強度比はさらに向上した。このように、適切な置換基を適切な位置に導入することによって、より優れた効果が得られる可能性があることが明らかとなった。
【図３】
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【図４】
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【図１】
2011162486.tif 000018
【図２】
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