(57)【要約】【課題】ＶＫＯＲＣ１の同時発現を介する（特に、組換え）ＶＫＤタンパク質発現の生産性を改善するために、新規の系および方法を提供すること。【解決手段】本発明は、ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）をコードする組換え核酸およびビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主生物に関し、ここで、この組換えＶＫＯＲＣ１および組換えＶＫＤタンパク質の両方は、該宿主生物内で発現される。さらに、本発明は、この組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養系、および適切な系で培養されている宿主生物における組換えＶＫＤタンパク質の発現の生産性を改善するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）をコードする組換え核酸およびビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質をコードする組換え核酸を含む宿主生物に関し、ここで、この組換えＶＫＯＲＣ１および組換えＶＫＤタンパク質の両方は、該宿主生物内で発現される。さらに、本発明は、上記組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養系に関し、そして、適切な系で培養されている宿主生物における組換えＶＫＤタンパク質の発現の生産性に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体（ＶＫＯＲＣ）は、ビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質の翻訳後のγ−カルボキシル化に必須の補因子である、還元型ビタミンＫを再循環させる（非特許文献１）。ＶＫＯＲＣ１遺伝子は最近同定され、Ｒｏｓｔら、２００４（非特許文献２）において詳細に記載される。
【０００３】
ＶＫＤタンパク質は、γ−カルボキシル化グルタミン酸（ｇｌａ）残基を含み、この残基は、血液凝固因子の場合、負に帯電したリン脂質膜へのＣａ依存性の結合に類似する、特異的な生化学特性および生理学的特性をこのタンパク質に付与する（非特許文献３）。ＶＫＤタンパク質としては、凝血原因子（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸおよびＸ、ならびに抗凝固タンパク質（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｃ、ＳおよびＺが挙げられる。唯一の公知の酵素反応に限定するが、γ−カルボキシラーゼ活性は、全ての哺乳動物の組織で見出されている（非特許文献４）。γ−カルボキシラーゼは、補因子として還元型ビタミンＫを使用するカルボキシル化反応を触媒する。
【０００４】
グルタミン酸残基のビタミンＫ依存性の（ＶＫＤ）γカルボキシル化は、止血、増殖制御、カルシウムホメオスタシス、およびシグナル変換において役割を担う、生物学的に活性なＶＫＤタンパク質の産生に必要とされる翻訳後タンパク質修飾である（非特許文献５；非特許文献６）。これらのタンパク質のＮ末端Ｇｌａドメインの数個のグルタミン酸残基は、カルボキシル化により改変され、カルシウム依存性のリン脂質膜相互作用を可能にする（非特許文献７；非特許文献８）。これらの複数のγグルタミン酸（Ｇｌａ）残基は、Ｇｌａドメインが、リン脂質膜表面への結合と組み合わせてＶＫＤタンパク質の活性に必要とされるコンフォメーション変化を受けることを可能にする（非特許文献９；非特許文献１０）。
【０００５】
ＶＫＤ血液凝固タンパク質は、カルシウムイオンの存在下で膜表面に結合するために、完全なまたは完全に近いカルボキシル化を必要とする（非特許文献１１）。したがって、ビタミンＫアンタゴニストがγカルボキシル化を阻害する場合、カルボキシル化が不十分なＶＫＤタンパク質は、カルシウム依存性の構造を形成することができず、このことは、リン脂質膜への低い親和性およびより低い活性をもたらす（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。例えば、タンパク質活性の全体的な喪失への寄与は、ＶＫＤタンパク質活性化ヒトプロテインＣの各々１０個のＧｌａ残基が存在しないことに帰せられ得る（非特許文献１５）。血友病Ｂ患者に見られる、カルボキシル化が不十分な因子ＩＸ変異体の凝血原活性の喪失は、カルシウム誘導性コンフォメーション変化の欠陥およびリン脂質小胞に結合する能力の喪失に帰せられ得る（非特許文献１６）。
【０００６】
組換え第ＩＸ因子の場合、より高い産生レベルにおいて、カルボキシル化活性が飽和しているという事実により、チャイニーズハムスター卵巣細胞内での機能的な第ＩＸ因子の発現が制限されることが示されている（非特許文献１７；非特許文献１８）。
【０００７】
ヒト第ＩＸ因子の場合に、γ−カルボキシル化タンパク質の組換え過剰発現は、より速い分泌速度において、ペプチド前駆体（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）の切断およびγ−カルボキシル化の制限をもたらし、それゆえ、培養培地中に余剰にビタミンＫが利用可能である場合でもまた、部分的にしかｇｌａ残基で占められていないタンパク質しか得られないことが示されている。このことは、低減した活性を有するＶＫＤ組換えタンパク質改変体の分泌ををもたらす。培地へのビタミンＫの追加は、高い発現レベルでの第ＩＸ因子の活性を改善しなかった。活性な第ＩＸ因子を誘導するために、細胞培養培地中に存在するビタミンＫの必要量は、５μｇ／ｍｌで飽和に達することが示されている。このレベル以下では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から分泌される活性な第ＩＸ因子の量は、ビタミンＫ濃度に依存した（非特許文献１７）。
ＶＫＤタンパク質を翻訳後に修飾する細胞の能力についてのこれらの制限を克服するために、現在までに、発現レベルの低い細胞株が生成のために選択されてきた。Ｆｕｒｉｎ（ペプチド前駆体切断酵素）の同時発現は、このペプチド前駆体の完全な切断をもたらす（非特許文献１９）が、γ−カルボキシル化の改善を伴わない。別のアプローチ（γ−カルボキシラーゼの過剰発現）は、第ＩＸ因子の場合には、タンパク質の分泌の改善をもたらさなかった（非特許文献２０）。第ＩＸ因子分子は、カルボキシル化反応の間、カルボキシラーゼに結合し、効率よく放出されない。γ−カルボキシル化の部位での還元型ビタミンＫ形態の供給は、この反応の制限工程であることが結論付けられた（非特許文献２１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎ，Ｇ．Ｌ．、Ｚｙｔｋｏｖｉｃｚ，Ｔ．Ｈ．およびＨｏｗａｒｄ，Ｊ．Ｂ．Ｔｈｅ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓ  ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７４）２４９，６３４７−６３５０
【非特許文献２】Ｒｏｓｔ，Ｓ．，Ｆｒｅｇｉｎ，Ａ．，Ｉｖａｓｋｅｖｉｃｉｕｓ，Ｖ．，Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｅ．，Ｈｏｒｔｎａｇｅｌ，Ｋ．，Ｐｅｌｚ，Ｈ．Ｊ．，Ｌａｐｐｅｇａｒｄ，Ｋ．，Ｓｅｉｆｒｉｅｄ，Ｅ．，Ｓｃｈａｒｒｅｒ，Ｉ．，Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ，Ｅ．Ｇ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｍ．およびＯｌｄｅｎｂｕｒｇ，Ｊ．（２００４）Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＶＫＯＲＣ１  ｃａｕｓｅ  ｗａｒｆａｒｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｙｐｅ  ２．Ｎａｔｕｒｅ，４２７，５３７−５４１
【非特許文献３】Ｍａｎｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｊｅｎｎｙ，Ｒ．Ｊ．，およびＫｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ，Ｓ．Ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）５７，９１５−９５６
【非特許文献４】Ｖｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．およびｄｅ  Ｂｏｅｒ−ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＭＡ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ（Ｂｕｄａｐ．）（１９８５）１８，７１−９７
【非特許文献５】Ｆｕｒｉｅ．Ｂ．，Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｂ．Ａ．およびＦｕｒｉｅ．Ｂ．Ｃ．Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ．Ｂｌｏｏｄ（１９９９）９３，１７９８−１８０８
【非特許文献６】Ｂｅｒｋｎｅｒ．Ｋ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．（２０００）１３０，１８７７−１８８０
【非特許文献７】Ｓｔｅｎｆｌｏ．Ｊ．およびＳｕｔｔｉｅ．Ｊ．Ｗ．Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７７）４６，１５７−１７２
【非特許文献８】Ｓｕｔｔｉｅ．Ｊ．Ｗ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ．ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）８，１９１−２２３
【非特許文献９】Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎ．Ｇ．Ｌ，Ｂｒｏｄｅｒｉｕｓ．Ｍ．およびＭａｒｔｉｎ，Ｇ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−  ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ．Ｃａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７６）２５１，６８８６−６８９３
【非特許文献１０】Ｚｗａａｌ．Ｒ．Ｆ．，Ｃｏｍｆｕｒｉｕｓ．Ｐ．およびＢｅｖｅｒｓ．Ｅ．Ｍ．Ｌｉｐｉｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９８）１３７６，４３３−４５３
【非特許文献１１】Ｆｕｒｉｅ．Ｂ．およびＦｕｒｉｅ．Ｂ．Ｃ．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ（１９８８）５３，５０５−５１８
【非特許文献１２】Ｅｓｍｏｎ．Ｃ．Ｔ．，Ｓａｄｏｗｓｋｉ．Ｊ．Ａ．およびＳｕｔｔｉｅ．Ｊ．Ｗ．Ａ  ｎｅｗ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈ−１４−ＣＯ３−  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７５ａ）２５０，４７４４−４７４８
【非特許文献１３】Ｅｓｍｏｎ．Ｃ．Ｔ．，Ｓｕｔｔｉｅ．Ｊ．Ｗ．およびＪａｃｋｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｃｔｉｏｎ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７５ｂ）２５０，４０９５−４０９９
【非特許文献１４】Ｍａｌｈｏｔｒａ．Ｏ．Ｐ．，Ｎｅｓｈｅｉｍ．Ｍ．Ｅ．，およびＭａｎｎ．Ｋ．Ｇ．Ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０，２７９−２８７
【非特許文献１５】Ｚｈａｎｇ．Ｌ，Ｊｈｉｎｇａｎ．Ａ．およびＣａｓｔｅｌｌｉｎｏ．Ｆ．Ｊ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  プロテインＣ  ｉｎ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ（１９９２）８０，９４２−９５２
【非特許文献１６】Ｗａｒｅ，Ｊ．，Ｄｉｕｇｕｉｄ．Ｄ．Ｌ，Ｌｉｅｂｍａｎ．Ｈ．Ａ．，Ｒａｂｉｅｔ．Ｍ．Ｊ．，Ｋａｓｐｅｒ．Ｃ．Ｋ．，Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．Ｃ，Ｆｕｒｉｅ．Ｂ．およびＳｔａｆｆｏｒｄ，Ｄ．Ｗ．Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｓａｎ  Ｄｉｍａｓ．Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｆｏｒ  Ａｒｇ−４  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４，１１４０１−１１４０６
【非特許文献１７】Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．，Ｗａｓｌｅｙ．ＬＣ，Ｆｕｒｉｅ．Ｂ．Ｃ、Ｆｕｒｉｅ．Ｂ．およびＳｈｏｅｍａｋｅｒ．Ｃ．Ｂ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６）２６１，９６２２−９６２８
【非特許文献１８】Ｄｅｒｉａｎ．Ｃ．Ｋ．，ＶａｎＤｕｓｅｎ．Ｗ．，Ｐｒｚｙｓｉｅｃｋｉ，Ｃ．Ｔ．，Ｗａｌｓｈ．Ｐ．Ｎ．，Ｂｅｒｋｎｅｒ．Ｋ．Ｌ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．およびＦｒｉｅｄｍａｎ，ＰＡ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ２−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  ｂｌｏｃｋ  ａｓｐａｒｔｙｌ  ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４，６６１５−６６１８
【非特許文献１９】Ｗａｓｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ，Ａ．，Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｊ．Ａ．およびＫａｕｆｍａｎ，ＲＪ．ＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ  ｃａｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏ−ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８，８４５８−８４６５
【非特許文献２０】Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ，Ａ．，Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ａ．，Ｗａｓｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ，Ａ．，Ｗａｌｓｈ，Ｃ．Ｔ．，Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．，Ｆｕｒｉｅ，Ｂ．Ｃ．およびＫａｕｆｍａｎ，ＲＪ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９９３）９０，４６１１−４６１５
【非特許文献２１】Ｈａｌｌｇｒｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｈｏｍｍｅｍａ，Ｅ．Ｌ．，ＭｃＮａｌｌｙ，ＢＡおよびＢｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｆｕｌｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｐｏｏｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１，１５０４５−１５０５５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、改善された分泌速度および／または改善された活性の発現ＶＫＤタンパク質を宿主生物で得ることにおいて、発現（特に、ＶＫＤタンパク質の組換え発現）を安定化させることへの強い需要が存在する。
【００１０】
それゆえ、ＶＫＯＲＣ１の同時発現を介する（特に、組換え）ＶＫＤタンパク質発現の生産性を改善するために、新規の系および方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸およびビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む宿主生物に関し、この組換えＶＫＯＲＣ１および組換えＶＫＤタンパク質の両方は、この宿主生物内で発現される。
【００１２】
さらに、本発明は、ＶＫＯＲＣ１またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸、およびＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養系（ここで、この組換えＶＫＯＲＣ１および組換えＶＫＤタンパク質の両方は、この細胞内で発現される）、組換え的にＶＫＯＲＣ１を同時発現させることによる、宿主生物における組換えＶＫＤタンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法、ならびに、組換えＶＫＤ発現の生産性を改善するための、宿主生物または細胞培養系におけるＶＫＯＲＣ１の組換え発現の使用に関する。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸、およびビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む宿主生物であって、ここで、該組換えＶＫＯＲＣ１および該組換えＶＫＤタンパク質の両方は、該宿主生物内で発現される、宿主生物。
（項目２）
項目１に記載の宿主生物であって、前記組換えＶＫＯＲＣ１をコードする核酸または前記組換えＶＫＤタンパク質をコードする核酸のいずれか、あるいはそれらの両方が、誘導性発現、一過性発現および恒久性発現からなる群より選択される発現様式を介して発現される、宿主生物。
（項目３）
哺乳動物細胞である、項目１または２に記載の宿主生物。
（項目４）
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞株に由来する細胞である、項目３に記載の宿主生物。
（項目５）
前記組換えＶＫＤタンパク質が、凝血原血液因子またはその機能的に活性な誘導体である、項目１〜４のいずれか一項に記載の宿主生物。
（項目６）
前記凝血原血液因子が、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子からなる群より選択される、項目５に記載の宿主生物。
（項目７）
前記凝血原血液因子がヒト第ＩＸ因子である、項目６に記載の宿主生物。
（項目８）
ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸およびビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む細胞を含む細胞培養系であって、該組換えＶＫＯＲＣ１および該ＶＫＤタンパク質の両方が該細胞内で発現される、細胞培養系。
（項目９）
前記培養された細胞が哺乳動物細胞である、項目８に記載の細胞培養系。
（項目１０）
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３細胞からなる群より選択される、項目９に記載の細胞培養系。
（項目１１）
前記組換えＶＫＤタンパク質が凝血原血液因子またはその機能的に活性な誘導体である、項目８〜１０に記載の細胞培養系。
（項目１２）
前記凝血原血液因子が、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子からなる群より選択される、項目１１に記載の細胞培養系。
（項目１３）
前記凝血原血液因子がヒト第ＩＸ因子である、項目１２に記載の細胞培養系。
（項目１４）
宿主生物における組換えビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法であって、
（ａ）宿主生物を提供する工程；
（ｂ）ＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物へ挿入する工程；
（ｃ）ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物へ挿入する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）の組換え核酸を発現させる工程、
を包含する、方法。
（項目１５）
宿主生物における組換えビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法であって、
（ａ）ＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、該組換え核酸は、該宿主生物のゲノムに組み込まれている、工程；
（ｂ）ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物に挿入する工程；ならびに
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の核酸を発現させる工程、
を包含する、方法。
（項目１６）
前記ＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸が安定に発現される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
宿主生物における組換えビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質発現またはその機能的に活性な誘導体の生産性を改善するための方法であって、
（ａ）ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、該組換え核酸は、該宿主生物のゲノムに組み込まれている、工程；
（ｂ）ＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物に挿入する工程；ならびに
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の核酸を発現させる工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
前記ＶＫＯＲＣ１またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸が安定に発現される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
組換えビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質であって、ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸および該組換えＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を宿主生物に挿入する工程、該核酸を発現させる工程、ならびに該組換えＶＫＤタンパク質を回収する工程によって取得可能である、組換えビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ｒＶＫＯＲＣ−１（１）または空ベクター（２）による、ＣＨＯ由来のｒＦＩＸ産生細胞株の一過性トランスフェクション後の、ＥＬＩＳＡ値に基づいて算出されたｒＦＩＸ（ｎｇ／ｍｌ）の濃度（垂直軸）（図１Ａ）、および凝固活性（ＡＰＴＴ）値に基づいて算出されたｒＦＩＸの比活性（ｍＵ／ｍｌ）（垂直軸）（図１Ｂ）を示す。血清を含まない細胞培養上清を２４時間後に収集した。
【図２】図２は、ｒＶＫＯＲＣ−１（１）または空ベクター（２）による、ＣＨＯ由来のｒＦＩＸ産生細胞株の一過性トランスフェクション後の、ＥＬＩＳＡ値に基づいて算出されたｒＦＩＸの特異的な生産性（ｎｇ  ｒＦＩＸ／１０６細胞／日）（垂直軸）（図２Ａ）および凝固活性（ＡＰＴＴ）値に基づいて算出されたｒＦＩＸの比活性（ｍＵ  ｒＦＩＸ／１０６細胞／日）（垂直軸）（図２Ｂ）を示す。血清を含まない細胞培養上清を２４時間後に収集した。
【図３】図３は、ｒＶＫＯＲＣ−１（１）または空ベクター（２）による、ＨＥＫ２９３由来のｒＦＩＸ産生細胞株の一過性トランスフェクション後の、ＥＬＩＳＡ値に基づいて算出されたｒＦＩＸの濃度（ｎｇ／ｍｌ）（垂直軸）（図３Ａ）および凝固活性（ＡＰＴＴ）値に基づいて算出されたｒＦＩＸの比活性（ｍＵ／ｍｌ）（垂直軸）（図３Ｂ）を示す。血清を含まない細胞培養上清を２４時間後に収集した。
【図４】図４は、ｒＶＫＯＲＣ−１（１）または空ベクター（２）による、ＨＥＫ２９３由来のｒＦＩＸ産生細胞株の一過性トランスフェクション後の、ＥＬＩＳＡ値に基づいて算出されたｒＦＩＸの特異的な生産性（ｎｇ  ｒＦＩＸ／１０６細胞／日）（垂直軸）（図４Ａ）および凝固活性（ＡＰＴＴ）値に基づいて算出されたｒＦＩＸの比活性（ｍＵ  ｒＦＩＸ／１０６細胞／日）（垂直軸）（図４Ｂ）を示す。血清を含まない細胞培養上清を２４時間後に収集した。
【図５】図５は、ｒＶＫＯＲＣ−１（１）または空ベクター（２）によるＣＨＯ由来のｒＦＩＸ産生細胞株の一過性トランスフェクション後の、ｒＦＩＸの比凝固活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）（％）（図５Ａ）およびｒＶＫＯＲＣ−１（１）または空ベクター（２）による、ＨＥＫ２９３由来のｒＦＩＸ産生細胞株の一過性トランスフェクション後の、ｒＦＩＸの比凝固活性（％）（図５Ｂ）を示す。
【図６】図６は、ｒＦＶＩＩを安定に発現するＣＨＯ由来細胞株におけるｒＶＫＯＲＣ−１の一過性発現を示す。この細胞株を、ＶＫＯＲＣ１をコードするベクターまたはコントロールとしてＶＫＯＲＣ１を含まない同一のベクター（「空ベクター」）で一過的にトランスフェクトさせる。トランスフェクションを二連で実行し、続いて５つの異なるビタミンＫ１濃度を使用する。ビタミンＫ濃度に対して、培養上清中のｒＦＶＩＩ生産性およびｒＦＶＩＩ活性の測定結果を示す。図６Ａ）ＥＬＩＳＡ測定に基づく生産性の値。図６Ｂ）凝固活性測定に基づく生産性の値。図６Ｃ）ＥＬＩＳＡによって決定される、１μｇあたりのＦＶＩＩ凝固単位（ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ）に基づくＦＶＩＩ比活性の算出。
【図７】図７は、ｒＦＶＩＩを安定に発現するＣＨＯ由来細胞株およびＨＥＫ２９３由来細胞株における、ｒＶＫＯＲＣ１の一過性発現を示す。これらの細胞株を、ｒＶＫＯＲＣ１をコードするベクターまたはｒＶＫＯＲＣ１を含まない同一のベクター（「空ベクター」）で一過的にトランスフェクトさせる。トランスフェクションを二連で実行する。ＥＬＩＳＡに基づくｒＦＶＩＩ生産性およびｒＦＶＩＩ活性の測定結果ならびに培養上清中のＦＶＩＩ凝固およびＦＶＩＩａ凝固を示す。Ａ）ＣＨＯ由来細胞株。Ｂ）ＨＥＫ２９３由来細胞株。
【図８】図８は、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ―宿主細胞における、ｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣの安定なバイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）の同時発現を示す。ｒＦＶＩＩ生産性について選択されたクローンは、増加量のＭＴＸによる遺伝子同時増幅（ｇｅｎｅ  ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって生成した。２つの異なるヒトｒＦＶＩＩをコードする発現ベクターを、ＤＨＦＲをコードする選択プラスミドとともに同時トランスフェクトした。図８Ａ）ベクター構築物でトランスフェクトした８３クローンが、ｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣ１のバイシストロン性の同時発現を生じた。図８Ｂ）ｒＦＶＩＩをコードするベクターで同時トランスフェクトした１３３クローン。
【図９】図９は、ｒＶＫＯＲＣ１バイシストロン性同時発現の有無での、ｒＦＶＩＩを産生するＣＨＯ由来クローンの生産性および比活性の値を示す。このクローンは、サブクローニングおよび遺伝子増幅による安定なトランスフェクション後に生成した。同時に発現していない１３３クローンおよびｒＶＫＯＲＣ１を同時発現している８３クローンを、分泌されたｒＦＶＩＩのＥＬＩＳＡ測定およびＦＶＩＩ凝固測定に基づいて、ｒＦＶＩＩ生産性および比凝固活性について比較する。
【図１０】図１０は、ＣＨＯ由来細胞株から単離されたｍＲＮＡレベルにおける遺伝子発現のノーザンブロット分析の一例を示す。レーン１：ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−非トランスフェクション細胞株、レーン２：ｒＦＶＩＩクローン、レーン３および４：実施例４に記載される、ｒＦＶＩＩをコードするプラスミドベクターおよびｒＶＫＯＲＣ−１をコードするプラスミドベクターで連続的にトランスフェクトされた２つのクローン、レーン５〜７：実施例３に記載される、ｒＦＶＩＩ配列とｒＶＫＯＲＣ１配列とがＩＲＥＳを介して連結しているバイシストロン性ｍＲＮＡをコードする単一のベクターでトランスフェクトされたクローン。パネルＡ、ＢおよびＣは、ハイブリダイゼーション後に、３つの異なるプローブで発色させた同一のブロットを示す。Ａ）ヒトＶＫＯＲＣ１に対するプローブ。Ｂ）ヒトＦＶＩＩに対するプローブ。Ｃ）ハムスターＧＡＰＤＨに対するプローブ。同定したｍＲＮＡの名称およびサイズを示す。
【図１１】図１１は、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ由来細胞クローンおよびＨＥＫ２９３由来細胞クローンのｒＦＶＩＩ発現レベルを示す。これらのクローンは、ｒＶＫＯＲＣ１をコードするプラスミドまたはコントロールプラスミドでのｒＦＶＩＩ産生細胞株の２回目のトランスフェクション後に単離した。コントロールは、空の宿主ベクターである。生産性の値は、分泌されたｒＦＶＩＩのＥＬＩＳＡ測定に基づく。図１１Ａ）ＣＨＯ由来細胞クローン。図１１Ｂ）ＨＥＫ２９３由来細胞クローン。
【図１２】図１２は、安定にトランスフェクトしたＣＨＯ由来細胞クローンおよびＨＥＫ２９３由来細胞クローンの比活性値と比較したｒＦＶＩＩ発現レベルを示す。これらのクローンは、ｒＶＫＯＲＣ１をコードするプラスミドまたはコントロールプラスミドでのｒＦＶＩＩ産生細胞株の２回目のトランスフェクション後に単離した。コントロールは、空の宿主ベクターである。生産性の値は、分泌されたｒＦＶＩＩのＥＬＩＳＡ測定に基づく。比活性値は、ＥＬＩＳＡにより決定される、１μｇ  ＦＶＩＩあたりのＦＶＩＩ凝固単位として算出される。図１２Ａ）は、ＣＨＯ由来細胞クローンを示し、図１２Ｂ）は、ＨＥＫ２９３−由来細胞クローンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明の一局面は、ビタミンＫレダクターゼ複合体サブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸およびビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）タンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を含む宿主生物に関し、この組換えＶＫＯＲＣ１タンパク質および組換えＶＫＤタンパク質の両方は、上記宿主生物内で発現される。
本明細書で使用される用語「機能的に活性な誘導体」とは、それぞれＶＫＯＲＣ１タンパク質およびＶＫＤタンパク質と実質的に同一な生物学的機能を有する、任意のポリペプチドを意味する。機能的に活性な誘導体のポリペプチド配列は、アミノ酸の欠失、付加および／または置換を含み得、このアミノ酸の不在、存在および／または置換は、それぞれ、このポリペプチドの活性にいかなる実質的な負の影響も有さない（例えば、タンパク質の生物学的活性に寄与しない、ポリペプチド配列の部分に位置するアミノ酸）。上記ポリペプチドの生物学的活性を変更しない、それぞれのポリペプチド配列の小規模なアミノ酸の欠失、付加および／または置換はまた、機能的に活性な誘導体として本発明の適用に包含される。
【００１５】
以下で、表現「（組換え）ＶＫＯＲＣ１またはその機能的に活性な誘導体」および「（組換え）ＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体」はまた、それぞれ「（ｒ）ＶＫＯＲＣ１」および「（ｒ）ＶＫＤタンパク質」として示される。
【００１６】
本発明の組換え核酸は、組換え核酸の産生に関して当該分野で公知の任意の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、ＲＮＡの逆転写および／またはＤＮＡの増幅を介してか、あるいは細菌の複製（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を介して）によって取得され得る。
【００１７】
本発明の宿主生物は、生物学的に活性なｒＶＫＯＲＣ１タンパク質および生物学的に活性なｒＶＫＤタンパク質を発現することができる、任意の宿主生物（組換え宿主生物を含む）から取得され得る。特に、本発明の宿主生物は、薬理学的に活性なｒＶＫＤタンパク質を産生することによって特徴付けられる、真核生物の宿主生物（多細胞生物を含む）であり得る。
【００１８】
本発明の一実施形態において、上記宿主生物は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、Ｓｐ２０細胞、Ｐｅｒｃ．６細胞、ＳｋＨｅｐ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞およびＣＯＳ細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞株に由来する細胞）である。本発明の具体例において、この宿主生物は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞に由来する細胞である。
【００１９】
本発明の一実施形態において、本発明の宿主生物に含まれるｒＶＫＯＲＣ−１をコードする核酸もしくはｒＶＫＤタンパク質をコードする核酸のいずれか、またはその両方は、誘導性発現、一過性発現および恒久性発現からなる群より選択される発現様式によって発現される。当該分野で公知であるか、または市販されている任意の発現系が、ＶＫＯＲＣ１および／またはＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸の発現に使用され得る（適切かつ好ましく制御可能なプロモーター、エンハンサーなどのような制御系の使用を含む）。
【００２０】
本発明の宿主生物の好ましい実施形態において、ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸もしくはＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸のいずれか、またはその両方は、本発明の宿主生物の遺伝子材料に安定に組み込まれる。
【００２１】
本発明の宿主生物は、ｒＶＫＤタンパク質、例えば、血液因子（ｂｌｏｏｄ  ｆａｃｔｏｒ）またはその機能的に活性な誘導体、好ましくは、ヒト凝血原血液因子（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｆａｃｔｏｒ）または抗凝固血液因子（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｆａｃｔｏｒ）あるいはそれらの機能的に活性な誘導体の改善された発現のために使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、このｒＶＫＤタンパク質は、出血障害の処置に使用され得る、薬理学的に受容可能なヒト凝血原血液因子（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｆａｃｔｏｒ）である。
【００２２】
本発明の一実施例として、ｒＶＫＤタンパク質は、凝血原血液因子（第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子（好ましくは、ヒト第ＩＸ因子）および第Ｘ因子を含む）または抗凝固血液因子（プロテインＣ、プロテインＳおよびプロテインＺを含む）である。
【００２３】
本発明にしたがって、宿主生物は、ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸およびＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸を含み、ｒＶＫＯＲＣ１およびｒＶＫＤタンパク質の両方は、上記宿主生物内で発現され、そして組換えＶＫＤタンパク質発現の生産性が実質的に改善される。
【００２４】
本明細書で使用される用語「組換えＶＫＤタンパク質発現の生産性が実質的に改善される」とは、ｒＶＫＯＲＣ１を同時に発現しない宿主生物内でのｒＶＫＤタンパク質の発現と比較した場合、組換え発現されたＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体の量、分泌速度、活性および／または安定性が実施的に増大されることを意味する。
【００２５】
組換えＶＫＤタンパク質発現の生産性の改善は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、培養培地からの単離、もしくは宿主生物を回収することによる単離、および、例えば、発現されたタンパク質の電気泳動、クロマトグラフィもしくは免疫吸着による分析が挙げられる）によって決定され得る。本発明の好ましい実施形態において、ｒＶＫＤタンパク質の発現は、任意の公知の酵素イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））によって検出される。あるいは、ｒＶＫＤタンパク質の完全性および活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ  ｔｉｍｅ）（ＡＰＴＴ）を測定することにより、評価され得る。
【００２６】
本発明の別の局面は、ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸およびＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸を含む細胞培養系に関し、ｒＶＫＯＲＣ１およびｒＶＫＤタンパク質の両方が、上記細胞内で発現される。
【００２７】
本発明の細胞培養系は、生物学的に活性なｒＶＫＯＲＣ１タンパク質および生物学的に活性なｒＶＫＤタンパク質を発現することができる細胞を含む、任意の細胞培養系を含み得る。適切な細胞の例は、上記に列挙されている。好ましい実施形態において、本発明の細胞培養系は、１つ以上の薬理学的に活性なｒＶＫＤタンパク質を産生することにより特徴付けられる真核細胞系である。
【００２８】
本発明の一実施形態において、本発明の細胞培養系は、上記で定義される宿主生物を含む。
【００２９】
本発明の細胞培養系内の細胞を培養する（連続様式またはバッチ様式で細胞を培養することを含む）ための、培地、試薬および条件に対する具体的な限定は存在しない。本発明の一実施形態において、細胞は、血清を含まない条件または血清およびタンパク質を含まない条件下で培養される。本発明のさらなる実施形態において、ＶＫＯＲＣ１またはＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸を含む細胞が、例えば、選択培地を使用することによって選択的に増殖される条件が使用される。
【００３０】
所望のｒＶＫＤタンパク質（このタンパク質は、選択された宿主生物の細胞により発現され、そして使用されるトランスフェクション／ベクター系に依存して、細胞内に含まれるか、細胞を培養するための培地に分泌される）は、当該分野で公知の方法を使用して、細胞培養系から単離／回収され得る。
【００３１】
本発明のさらなる局面は、宿主生物内で発現される組換えＶＫＤタンパク質の比活性を改善するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）宿主生物を提供する工程；
（ｂ）ＶＫＤタンパク質またはその機能的に活性な誘導体をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物に挿入する工程；
（ｃ）ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物に挿入する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）の組換え核酸を発現させる工程、
を包含する。
【００３２】
本発明の一実施形態において、ＶＫＯＲＣ１またはＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸は、同時トランスフェクションによって宿主生物に同時に挿入される。あるいは、この組換え核酸は、続くトランスフェクションによって宿主生物に続いて挿入される。
【００３３】
本発明にしたがって使用される組換え核酸は、宿主生物へのトランスフェクションに適する任意の形態および系（プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含む）に含まれ得る。それぞれＶＫＯＲＣ１およびＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸は、一つのベクター分子内に両方とも存在しても、それぞれ一つのベクター分子に存在してもよく、この２つの異なるベクター分子は、同一でも異なっていてもよい。組換え核酸のトランスフェクションは、使用されるトランスフェクション系に依存し、宿主生物（例えば、真核細胞）などをトランスフェクトするための、当該分野で公知の任意の方法または市販されている方法（エレクトロポレーション、沈殿またはマイクロインジェクションが挙げられる）によって実行され得る。
【００３４】
本発明の別の局面は、宿主生物における組換えＶＫＤタンパク質発現の生産性を改善するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、この組換え核酸は、その遺伝子材料（好ましくは、そのゲノム）に組み込まれている、工程；
（ｂ）ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物に挿入する工程；ならびに、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の核酸を発現させる工程、
を包含する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、ＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸は、安定に発現される。
【００３６】
本発明のさらなる局面は、宿主生物における組換えＶＫＤタンパク質発現の生産性を改善するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸を有する宿主生物を提供する工程であって、この組換え核酸は、その宿主生物のゲノムに組み込まれている、工程；
（ｂ）ＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸を工程（ａ）の宿主生物に挿入する工程；ならびに
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）の核酸を発現させる工程、
を包含する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸が安定に発現される。
【００３８】
本発明にしたがって、上記で定義した宿主生物または上記で定義した細胞培養系は、ｒＶＫＯＲＣ−１の同時発現によって、組換えＶＫＤタンパク質発現の生産性を驚異的に改善するために使用され得る。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、ｒＶＫＤタンパク質を提供し、このタンパク質は、ＶＫＯＲＣ１をコードする組換え核酸およびこのｒＶＫＤタンパク質をコードする組換え核酸を挿入する工程、この核酸を発現させる工程、そしてこのｒＶＫＤタンパク質を回収する工程によって取得可能である。
【００４０】
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、それに対しいかなる限定もしない。
【実施例】
【００４１】
（実施例１：ｒＦＩＸ産生ＨＥＫ２９３由来細胞株およびＣＨＯ由来細胞株におけるｒＶＫＯＲＣ１の一過性トランスフェクションおよび同時発現）
強力なウイルスプロモーターの制御下にあるヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードするＤＮＡ配列を含む発現プラスミドを、適切なトランスフェクション法により哺乳動物宿主細胞株へ導入し、それらのゲノムへ安定に組み込まれたこの導入された配列を有する細胞を得ることによって、組換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＸ）の発現を達成する。このプラスミドはまた、適切な耐性遺伝子を送達することによって選択可能なマーカー薬物に対する耐性を付与する。ヌクレオチド新規合成経路の酵素の欠陥のために、培地中のヌクレオチド前駆体の存在下でのみ増殖することができるＣＨＯ細胞の場合、この酵素（ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ））の発現が必要とされる。このことは、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を徐々に増大させることによって、ＦＩＸ遺伝子の同時増幅を可能し、細胞のゲノム内でのＤＨＦＲをコードする遺伝子およびｒＦＩＸをコードする遺伝子の両方のコピー数の増大をもたらす。この目的のために、ＣＨＯ由来細胞クローンをまた、ヌクレオチドおよびヌクレオチド前駆体を欠く選択培地により増殖させる必要がある。
【００４２】
ヒトｒＦＩＸ産生細胞を同定するために、トランスフェクションおよび培地への選択薬物の添加の後、単一細胞由来のクローンを単離することを可能にするために、細胞懸濁物を希釈する。単離後、これらの細胞クローンを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）技術により細胞培養上清のｒＦＩＸ含量を測定することを可能にする集密度まで培養する。この目的のために、これらの細胞を、ｒＦＩＸを分泌する細胞の同定を確実にするために、いかなる増殖を促進するウシ胎仔血清もその成分も存在しない条件下で増殖させる必要がある。完全に機能的なｒＦＩＸタンパク質を確実にするために、ビタミンＫを添加する。上清を、２４時間後に回収し、ｒＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡ技術により分析する。さらに、タンパク質の完全性および活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定することにより評価する。
【００４３】
ｒＶＫＯＲＣ１の同時発現は、ｒＦＩＸ発現のために予め選択されている細胞株を使用して、一過性発現技術によって達成される。ｒＶＫＯＲＣ−１  ｃＤＮＡを含む発現プラスミドを、さらなるクローン選択を行わずに、これらの細胞にトランスフェクトする。上清を、トランスフェクトされた細胞のプール全体から収集し、そしてｒＦＩＸ含量および活性を、ネガティブコントロールと比較し、ｒＶＫＯＲＣ−１活性の効果を評価するために、特異的なｒＦＩＸ分泌速度について正規化する。
【００４４】
（材料および方法）
発現ベクター
発現ベクターを、標準的なクローニング技術にしたがってクローニングする。簡潔に述べると、マウスＤＨＦＲを含むベクターｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）−３（Ｓｃａｈｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｄｅｖｏｓ，Ｒ．，Ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｈ．Ｊ．およびＦｉｅｒｓ，Ｗ．（１９８３）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃＤＮＡ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８０，４６５４−４６５８；ベクターは、Ｄｒ．Ｈａｕｓｅｒ，ＧＢＦＧｅｒｍａｎｙにより供与された）のＰｓｔｌ  １．５ｋｂｐフラグメントを、ｐＳＶβベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）（ＳＶ４０エンハンサー、初期プロモーターおよびイントロンを提供する、ＮｏｔＩ消化によりβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を除去し、ポリリンカーを挿入した）に挿入することにより、ｐＳＶ−ＤＨＦＲを作製する。このベクターをまた、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐｈβＡＰｒ−１−βｇａｌ（これもまた、Ｄｒ．Ｈａｕｓｅｒにより供与された）のＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントと交換することによりヒトアクチンプロモーターおよびイントロンを含むｐｈａｃｔを作製するために使用している。ａｌａ１４８多型（ＭｃＧｒａｗ，Ｒ．Ａ．，Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｎｏｙｅｓ，ＣＭ．，Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｈ．Ｒ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｂ．およびＳｔａｆｆｏｒｄ，Ｄ．Ｗ．（１９８５）  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ｄｉｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８２，２８４７−２８５１）を有する野生型ヒトＦＩＸ  ｃＤＮＡを含むｐｈａｃｔ−ＦＩＸを、ｐＦＩＸ−ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（これは、無作為に選択された（ｒａｎｄｏｍｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ）ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリ由来のヒトＦＩＸをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  ＪｏＩＩａ，ＣＡ）に挿入することによって作製した）をＥｃｏＲＩ消化し、生じたフラグメントをＥｃｏＲＩで部分的に消化したｐｈａｃｔに挿入することにより作製する。
【００４５】
ベクターｐＣＭＶ−ＦＩＸ−ｎｅｏを、ベクターｐＦＩＸ−ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（β−ｇａｌ  ｃＤＮＡを除去しておく）に挿入することにより作製する。このベクター内で、ａｌａに対するコドンを、天然に存在する多型ａｌａ１４８をｔｈｒ１４８に変更するＰＣＲを介する部位特異的変異誘発によってｔｈｒに交換する。ＰＣＲ産物を、再度、同一のベクターに再挿入する。このベクターのＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングし、ｐＣＭＶ−ＦＩＸ−ｎｅｏを得る。
【００４６】
ベクターｐＣＭＶ−ＶＫＯＲＣ１−ＥＤＨｐｒｏを、ＰＣＲのための鋳型としてベクターｐＣＥＰ４−ＶＫＯＲＣ１（Ｐｒｏｆ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇにより供与された、説明については、Ｒｏｓｔら、２００４を参照のこと）を使用することによって作製する。ｒＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡを含むＰＣＲ産物を、ｐＣＭＶ−ＥＤＨｐｒｏベクター（Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ，Ｓ．Ｅ．，Ｆａｌｋｎｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｓｃｈｌｏｋａｔ，Ｕ．およびＤｏｒｎｅｒ，Ｆ．（１９９６）  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｉｎ  ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ／ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，８，３５８−３６４）にクローニングする。
【００４７】
細胞培養およびトランスフェクション
ＣＨＯ  ＤＵＫＸ／ＤＸＢ１１細胞を、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から取得し、５％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ，Ｌｉｎｚ，Ａｕｓｔｒｉａ）、デオキシアデノシン（ｄｅｓｏｘｙ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、アデノシンおよびチミジン（全てＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製）およびＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させる。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）を、５％ウシ胎仔血清およびＬ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）混合物中で増殖させる。安定なトランスフェクションのために、リン酸カルシウム共沈殿（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）法を使用する。ＣＨＯｒＦＩＸ細胞を、線状化した（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）プラスミドｐｈａｃｔ−ＦＩＸおよびｐＳＶ−ＤＨＦＲでの同時トランスフェクションならびにヒポキサンチン、グリシンおよびチミジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含まない、５％透析済みＦＢＳ（ＰＡＡ）を補充したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（１：１）混合物での選択によって作製する。遺伝子増幅のために、ＭＴＸ（Ｅｂｅｗｅ，Ｕｎｔｅｒａｃｈ，Ａｕｓｔｒｉａ）を、１０ｎＭから始めて２００ｎＭまでの段階的に増やした濃度で加える。ＨＥＫ２９３細胞を、線状化したプラスミドｐＣＭＶ−ＦＩＸ−ｎｅｏでトランスフェクトし、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地で選択する。細胞クローンを、手動で、またはフローサイトメトリー細胞選別技術を使用してのいずれかで限界希釈クローニング技術により単離する。
【００４８】
細胞培養上清へのＦＩＸ分泌を、増殖培地を、１０μｇ／ｍｌビタミンＫ１（Ｓｉｇｍａ）を補充した血清非含有培地に交換することにより検出する。上清を収集し、ＦＩＸ濃度を、ＥＬＩＳＡおよび凝固アッセイ（活性化部分トロンボプラスチン時間、ＡＰＴＴ）によって決定する。特異的な分泌速度の算出のために、細胞数を、ＣＡＳＹ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｓｃｈａｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して計数する。
【００４９】
一過性の同時発現実験のために、線状化していないプラスミドｐＣＭＶ−ＶＫＯＲＣ１−ＥＤＨＰｒｏを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して処理する。ｒＶＫＯＲＣ−１  ｃＤＮＡを含まない同一のベクターをネガティブコントロールとして使用する。
【００５０】
分析法
ＥＬＩＳＡを、一次抗体として１：４００００希釈のポリクローナルウサギ抗ヒトＦＩＸ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）および検出抗体としてポリクローナルヤギ抗ヒトＦＩＸ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を使用して実行する。標準として、ヒト血漿由来ＦＩＸ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓ．Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を使用する。ＡＰＴＴを、ＦＩＸサンプルをＦＩＸ欠乏血漿（ｐｌａｍａ）に希釈することにより、ＳＴＡ  Ｃｏｍｐａｃｔ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して決定する。凝固に関する全ての試薬を、Ｂａｘｔｅｒ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａから購入する。
【００５１】
（結果）
２つの安定なｒＦＩＸ産生細胞株（１つはＣＨＯ由来および１つはＨＥＫ２９３由来）を、ヒトＶＫＯＲＣ１をコードするｃＤＮＡを保持する発現ベクターｐＣＭＶ−ＶＫＯＲＣ１−ＥＤＨｐｒｏでの一過性トランスフェクションに供する。コントロールとして、空ベクターｐＣＭＶ−ＥＤＨｐｒｏおよび安定なｒＦＩＸ発現細胞株を使用する。一過性トランスフェクションの後、細胞を血清含有培地中で一晩置く。細胞をＰＢＳで洗浄し、血清非含有培地中で２４時間培養し、その後、上清を回収する。ｒＦＩＸ発現および培地へのｒＦＩＸの分泌を、抗原レベルまたは凝固活性を測定する免疫化学診断法および凝固診断法によってモニタリングする。細胞の生産性への効果を推定するために、分泌速度を、細胞数および２４時間あたりの産物濃度に基づいて算出する（図１〜図４）。
【００５２】
ｒＶＫＯＲＣ−１トランスフェクション後に、ｒＦＩＸを発現するＨＥＫ２９３細胞は、空ベクターコントロールと比較して、特異的な分泌速度に平均２．７倍の増大、そしてｒＦＩＸ濃度に２．９倍の増大を示す。これらの値は、ＡＰＴＴ測定に基づく。ＥＬＩＳＡ値は、濃度に２．０倍の増大、そして特異的な生産性に１．８倍の増大を示す。
【００５３】
ＣＨＯ由来ｒＦＩＸ産生細胞株に関して、ＥＬＩＳＡ力価に１．５倍の増大、そしてＥＬＩＳＡに基づく特異的な分泌速度に１．２倍の増大が観察される。ＡＰＴＴから算出した分泌速度は１．４倍高く、ＡＰＴＴから測定したＦＩＸ濃度は１．７倍高い。
【００５４】
これらの値から、異なる細胞型の両方に関し、主に、より高い細胞の特異的なｒＦＩＸ分泌速度に起因して、ｒＶＫＯＲＣ１の存在下で、より高いｒＦＩＸ産物濃度を達成することができると結論付けることができる。完全にγ−カルボキシル化されたｒＦＩＸ分子のより高い分泌速度についての理由は、この翻訳後修飾に対する細胞の品質制御機構であり得る（Ｌｉｎ，ＰＪ．，Ｓｔｒａｉｇｈｔ，Ｄ．Ｌ．およびＳｔａｆｆｏｒｄ，Ｄ．Ｗ．（２００４）Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｅｎｓｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，６５６０−６５６６）。両方の細胞株の場合において、ＥＬＩＳＡ値よりも、ＡＰＴＴ値のより大きな増大は、より良好なＦＩＸ凝固活性を示す。
【００５５】
ＣＨＯ細胞よりも、ＨＥＫ２９３由来細胞における、ｒＦＩＸ同時発現に対するｒＶＫＯＲＣ−１のより強力な効果は、より高い細胞のｒＦＩＸ生産性によって説明され得る。一過性ＶＫＯＲＣ１トランスフェクションの前に、ＡＰＴＴ値に関する生産性において、２９３由来クローンは、ＣＨＯクローンよりも３．５倍高いが、ＥＬＩＳＡ値に関する生産性については５倍高い。このことは、より高い生産性に起因して、２９３由来細胞における、より低い程度の翻訳後プロセシングを示す。したがって、ｒＶＫＯＲＣ−１同時発現によってγ−カルボキシル化能力を修復した場合に、活性なｒＦＩＸアイソフォームのより高い収量が、この細胞株で見出される。
【００５６】
（実施例２：組換えヒト凝固因子ＶＩＩ（ｒＦＶＩＩ）を安定に発現するＣＨＯ由来哺乳動物細胞株およびＨＥＫ２９３由来哺乳動物細胞株における、組換えヒトＶＫＯＲＣ１の一過性の同時発現）
ｒＦＶＩＩの活性および／または分泌速度に対するｒＶＫＯＲＣ−１のあらゆる影響を、ヒト組換え凝固因子ＶＩＩ（ｒＦＶＩＩ）産生細胞における一過性の同時発現によって研究することができる。したがって、ｒＦＶＩＩを産生する細胞集団の大部分はまた、短期間、ＶＫＯＲＣ１を同時発現する。この期間の間、分泌されたｒＦＶＩＩをサンプリングし、特徴付け、空ベクターコントロールで並行してトランスフェクトした同一の細胞株により分泌されたｒＦＶＩＩと比較することができる。
【００５７】
哺乳動物細胞におけるｒＦＶＩＩの安定な発現を、ヒトｒＦＶＩＩ  ｃＤＮＡおよび選択耐性遺伝子を含むプラスミドベクターをトランスフェクトし、続いて産生クローンを選択することにより、達成することができる。実施例１に列挙された同一の宿主細胞株を、ｒＦＶＩＩの安定な発現に使用することができる。遺伝子選択および遺伝子増幅手順、ならびに産生クローンのスクリーニングは、同様に実施すべきである。
【００５８】
その後、ヒトＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡを保持する発現ベクターを、実施例１に記載されるものと同様な方法で、一過的にトランスフェクトし、組換えＶＫＯＲＣ１（ｒＶＫＯＲＣ１）の同時発現を達成することができる。
【００５９】
（材料および方法）
発現ベクター
ヒトｒＦＶＩＩ遺伝子情報を含む発現ベクターを、鋳型としてのワクシニア発現ベクターｐｓｅｌｐ／ｈｕＦＶＩＩ（Ｈｉｍｌｙら、１９９８）のような適切な供給源からＰＣＲによりヒトＦＶＩＩ  ｃＤＮＡを単離することによって、構築することができる。このＰＣＲ産物を、制限部位を介して、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するような強力なウイルスプロモーターおよびネオマイシン耐性遺伝子またはハイグロマイシン耐性遺伝子のようなさらなる抗生物質選択マーカーを提供する哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ＋またはｐｃＤＮＡ３．１／ｎｅｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に挿入することができる。
【００６０】
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−発現系での安定な遺伝子発現のために、実施例１に記載されるｐＳＶ−ＤＨＦＲのようなさらなるプラスミドを使用して、ＤＨＦＲ含有細胞クローンの選択およびＭＴＸ遺伝子増幅を可能にする。
【００６１】
実施例１に記載されるベクターｐＣＭＶ−ＶＫＯＲＣ１−ＥＤＨｐｒｏを、ｒＶＫＯＲＣ１の一過性発現に使用することができる。
【００６２】
細胞培養およびトランスフェクション
実施例１に記載されるものと同一の、細胞株および培養プロトコールを使用することができる。安定なトランスフェクト体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を作製するために、リン酸カルシウム共沈殿法を使用することができる。トランスフェクション前に、プラスミドを、制限酵素消化によって線状化しなければならない。ＦＶＩＩ  ｃＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクターを、ＣＨＯ宿主細胞株またはＨＥＫ２９３宿主細胞株の安定なトランスフェクションに使用することができる。ＣＨＯ  ＤＵＫＸ  ＤＸＢ１１細胞は、ｐＳＶ−ＤＨＦＲで同時トランスフェクトしなければならない。ハイグロマイシンＢを、選択薬剤として使用する場合、ＨＥＫ２９３由来トランスフェクト体を選択するためにその濃度は、培地中１００μｇ／ｍＬでなければならず、ＣＨＯトランスフェクト体の場合には、２５０μｇ／ｍＬでなければならない。ネオマイシン耐性を選択マーカーとして使用する場合、Ｇ４１８の濃度は、各々の細胞型に対して実施例１に記載されるように調整しなければならない。
【００６３】
一過性トランスフェクションのプロトコールは、実施例１に記載されるように、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００試薬の使用を包含する。適切なネガティブコントロールとｒＶＫＯＲＣ−１を一過的に発現する細胞との比較を可能にするために、ベクターｐＣＭＶ−ＶＫＯＲＣ１−ＥＤＨｐｒｏおよびＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡ配列を含まない同一のベクターを、数回の重複試験（好ましくは、６ウェルプレート）において、並行してトランスフェクトしなければならない。同一の集団から取得された細胞を、１ウェルあたり等量の細胞密度で分配する。集密になったら、全てのトランスフェクションを同時に行う。
【００６４】
細胞培養上清へのｒＦＶＩＩの分泌は、増殖培地を、０．１〜１０μｇ／ｍＬに及ぶ種々のビタミンＫ１濃度で補充した血清非含有培地に交換することにより検出することができる。上清を２４時間後に収集することができ、ｒＦＶＩＩ濃度を、以下に記載される適切な方法によって決定することができる。特異的なｒＦＶＩＩ分泌速度の算出のために、例えば、ＣＡＳＹ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｓｃｈａｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはトリパンブルー排除法を使用することによって、細胞を計数しなければならない。
【００６５】
分析アッセイ
ｒＦＶＩＩ産生クローンをスクリーニングするために、そしてＦＶＩＩ活性と抗原レベルとを関連付けるために、以下のアッセイが適切である。
【００６６】
ＦＶＩＩ活性を、プロトロンビン凝固時間（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｔｉｍｅ）（ＰＴ）として凝固アッセイによってか。または色素形成性ＦＸａ基質の変換によって定量される凝固因子Ｘａ（ＦＸａ）の生成量として色素形成アッセイ（欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ５，２００５）に従う）によって測定することができる。ＦＶＩＩ抗原レベルは、適切な抗体の対（例えば、捕捉のための、１：３０００希釈したアフィニティ精製ポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩ抗血清（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ａｎｃａｓｔｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、および検出のための、ポリクローナルヒツジ抗ヒトＦＶＩＩ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ；１：２０００希釈））を使用し、続いて、光度測定（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）検出のための適切な色素形成試薬を添加する、ＥＬＩＳＡを使用して決定することができる。
【００６７】
全てのアッセイに対して、血漿由来のＦＶＩＩ調製物（国際ＦＶＩＩ標準９７／５９２と比較してアッセイする）を、標準物質として使用しなければならない。相対的な比凝固活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、活性値に対して測定した抗原の比を算出し、これらを内部でか、または血漿由来のＦＶＩＩ調製物の値と比較することによって推定することができる。
【００６８】
分泌された総ｒＦＶＩＩの一部としてＦＶＩＩａレベルを推定するために、以下のアッセイを使用することができる：Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ，Ａｓｎｉｅｒｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）は、選択的にＦＶＩＩａのプロトロンビン凝固時間を測定するのに適している（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、１９９３）。ＦＶＩＩａレベルは、国際ＦＶＩＩａ標準８９／６８８と比較してアッセイしなければならない。
【００６９】
（結果）
安定なｒＦＶＩＩ産生ＣＨＯ由来細胞株を、ＶＫＯＲＣ１をコードする発現ベクターｐＣＭＶ−ＶＫＯＲＣ１−ＥＤＨｐｒｏでの一過性トランスフェクションに供する。コントロールとして、ＶＫＯＲＣ１をコードするｃＤＮＡを含まない空ベクターｐＣＭＶ−ＥＤＨｐｒｏを使用することができる。１ウェルあたり１×１０６細胞の細胞濃度で、細胞を６ウェルプレートに播種する。集密になったら、一過性トランスフェクション手順を二連で実行する。一晩のインキュベーション後、細胞を、いかなるビタミンＫ１も含まない血清非含有培地でインキュベートし、ＦＢＳ供給由来の細胞内部のビタミンＫ１レザバを枯渇させる。２４時間後、培地を、０μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬの範囲に及ぶ種々の濃度のビタミンＫ１を含む血清非含有培地に交換する。さらなる分析のために、上清を収集する。２４時間あたりの生産性を、ＥＬＩＳＡおよび一段階の凝固アッセイによって測定されるｒＦＶＩＩ抗原および活性の濃度値から決定する。ＦＶＩＩ比凝固活性を、１μｇ抗原あたりのＦＶＩＩ凝固単位（ｃｌｏｔｔｉｎｇ−ｕｎｉｔ）として算出する。ｒＦＶＩＩａ〜ｒＦＶＩＩａの自己賦活の程度を推定するために、Ｓｔａｃｌｏｔ（登録商標）アッセイを使用することができる。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに、これらの実験の結果を示す。
【００７０】
両方のベクター構築物での一過性トランスフェクションの後、ｒＦＶＩＩ発現レベルを、ＥＬＩＳＡ（図６Ａ）およびＦＶＩＩ凝固（図６Ｂ）によって決定する。この細胞株によって産生されるｒＦＶＩＩａは、著しい量ではないので、ｒＦＶＩＩ活性は、ｒＦＶＩＩ生産性と相関し得る。
【００７１】
培地中にビタミンＫ１が存在しない場合、細胞の生産性および産生されたｒＦＶＩＩの比活性は、ｒＶＫＯＲＣ１を同時発現させてもさせなくても著しく低い。ｒＶＫＯＲＣ１の同時発現の場合、ｒＦＶＩＩの生産性は、凝固およびＥＬＩＳＡの両方で測定される場合、０．１μｇ／ｍＬ〜空ベクターでのコントロールトランスフェクションの４倍の値で回復する。ｒＶＫＯＲＣ１同時発現は、ビタミンＫ１濃度に拘らず、細胞培養培地に添加されるビタミンＫ１の使用法を改善する。概して、ｒＦＶＩＩ−生産性（２つの異なる方法によって決定される）は、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現を伴う全てのビタミンＫ１濃度において、コントロールの最大４倍である。産生された１μｇ  ｒＦＶＩＩあたりの凝固単位として表現される比活性は、０μｇ／ｍＬのビタミンＫ１において、著しくより低い値を示し、ｒＶＫＯＲＣ１の有無で有意な違いを示さない。
【００７２】
同様な実験において、一過性のｒＶＫＯＲＣ−１同時発現後にｒＦＶＩＩを安定に発現するＣＨＯ由来細胞株とＨＥＫ２９３由来細胞株とを比較した場合、両方の場合におけるコントロールトランスフェクションのように、有意により高い生産性が見出され得る（図７）。この実験において、０．５μｇ／ｍＬのビタミンＫ１を使用する。凝固およびＥＬＩＳＡの両方で測定されるように、ＣＨＯ−ｒＦＶＩＩ細胞に関して、ｒＶＫＯＲＣ−１を同時発現させたｒＦＶＩＩ発現レベルは、コントロールよりも２．５倍高いことが見出され得る。
【００７３】
γ−カルボキシル化は、この反応に必要とされる還元型ビタミンＫ形態が十分な量で利用可能ではない場合、ｒＦＶＩＩの生産性に対する律速工程（ｒａｔｅ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｓｔｅｐ）であることが結論付けられ得る。推定上の細胞制御機構は、細胞内の不完全なγ−カルボキシル化を伴うｒＦＶＩＩ分子を保持する（Ｌｉｎら、２００４）。一過性のｒＶＫＯＲＣ−１同時発現は、完全なγ−カルボキシル化を確実にする還元型ビタミンＫ形態のより良好な供給を提供することにより、広範囲のビタミンＫ１濃度でｒＦＶＩＩ生産性を改善する。
【００７４】
これらの知見は、また、哺乳動物細胞において、γ−カルボキシラーゼの同時発現が組み替えヒト第ＩＸ因子の生産性の低下をもたらすという以前の研究（Ｈａｌｌｇｒｅｎら、２００２）に従う。細胞代謝内での、ＶＫＯＲＣ１について現在までに既知の唯一の機能は、ビタミンＫ−２，３エポキシドの、γ−カルボキシル化反応に必要とされるそのヒドロキノン形態への還元である。たとえ哺乳動物細胞株それ自体が良好に機能するγ−カルボキシル化機構を保持しているとしても、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現が完全なγ−カルボキシル化された品質の所望のｒＦＶＩＩタンパク質を保証することが結論付けられ得る。
【００７５】
（実施例３：非ウイルス性遺伝子トランスフェクション後の、ＣＨＯ由来細胞株内でのｒＶＫＯＲＣ１およびｒＦＶＩＩの安定なバイシストロン性同時発現）
ｒＦＶＩＩ産生のための安定な哺乳動物細胞株を作製することの範囲内の、γ−カルボキシル化に対するｒＶＫＯＲＣ１同時発現のあらゆる効果を利用するために、バイシストロン性発現系を使用することができる。このような系を使用して、単一の発現ベクターの送達後に、真核細胞における２つのタンパク質の同時発現を達成することができる。さらに、２つのタンパク質を、同時に同一のｍＲＮＡ分子から翻訳させる。このことは、発現ベクター構築物の、２つの導入遺伝子をコードするｃＤＮＡの間にウイルス性遺伝子エレメント（これは、内部リボソームエントリー配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）と呼ばれる）を導入することによって可能になる（ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ、１９９５）。このＤＮＡベクター構築物（これは、宿主細胞の染色体に安定に組み込まれている）からのｍＲＮＡの転写後、２つのリボソームが、プロセシングされたｍＲＮＡに結合することができ、両方のポリペプチド鎖を同時に伸長させることができる。
【００７６】
哺乳動物発現のためのエレメント（例えば、強力なウイルスプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびクローン選択を可能にする耐性遺伝子）を提供するように、ベクターを構築しなければならない。所望のタンパク質をコードする両方のｃＤＮＡを、それらの間にＩＲＥＳ配列を有するように、ベクターにクローニングする。
【００７７】
ｒＦＶＩＩ発現とバイシストロン性のｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣ１の同時発現とを比較するために、ｒＦＶＩＩ  ｃＤＮＡのみを保持する同一の宿主ベクターに厳密に由来するコントロール発現ベクターを構築することができる。これらの２つのベクターを、同一の宿主細胞株（例えば、ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞株であるＣＨＯ  ＤＵＸＫ  ＤＸＢ１１）に並行してトランスフェクトすることができる。この細胞株は、遺伝子増幅によりタンパク質発現レベルを増大させる機会を提供する。このことは、ＤＨＦＲ遺伝子を保持するプラスミドの同時トランスフェクションおよび実施例１に記載される継代培養（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）の間に薬物ＭＴＸのレベルを増大させることによって達成することができる。この発現および同時増幅（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）系において、同時発現ベクターとモノシストロン性（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｒＦＶＩＩベクターとを比較することにより、ヘルパータンパク質（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としてのｒＶＫＯＲＣ−１の存在の有無で、ｒＦＶＩＩ発現レベルおよび活性に対する遺伝子増幅の効果を観察することができる。ｒＦＶＩＩ産生クローンの選択および産生されたｒＦＶＩＩの特徴付けは、実施例２で説明したように達成することができる。２つの発現系を比較する場合にクローン特異的な偏りを回避するために、同一の方法論でスクリーニングした多数のクローンを特徴付けなければならない。
【００７８】
（材料および方法）
発現ベクター
プラスミドベクター構築物（これらは、実施例２で説明される同一の宿主ベクターに由来する）を標準的なクローニング技術によって構築することができる。ベクターｐＣＭＶ−ｒＦＶＩＩの構築を実施例２に記載されるようにして達成することができ、類似のベクターｐＣＭＶ−ｒＦＶＩＩ−ｌＲＥＳ−ＶＫＯＲＣ１を、以下のようにして構築することができる：ヒトＦＶＩＩ  ｃＤＮＡを、実施例２で使用したものと同一の供給源からＰＣＲによって増幅することができる。ＩＲＥＳエレメントを、供給源ベクターｐｌＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から単離することができ、そしてＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡを、実施例１に記載されるものと同一の供給源ベクター（ｐＣＥＰ４−ＶＫＯＲＣ１）からクローニングすることができる。これら３つのエレメント全てを、ｐＣＭＶ−ｒＦＶＩＩの構築（実施例２を参照のこと）に使用したものと同一の宿主ベクターにクローニングすることができる。詳細には、付加されたＫｏｚａｋ配列およびＥｃｏＲＩ制限部位を有するＦＶＩＩ  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、適切な制限部位を介した切断を可能にするために中間体ベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏＩＩａ，ＣＡ）にクローニングすることができる。ＦＶＩＩ  ｃＤＮＡを含むこの中間体のＨｉｎｄｌｌｌ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングすることができる。この中間体構築物は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌで消化することができ、一回のライゲーション反応で、ＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡ（鋳型ｐＣＥＰ４−ＶＫＯＲＣ１から得る）ならびに５’端および３’端にＢｓｔＸＩとＸｈｏＩ部位とを有するＰＣＲ産物とともに、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ由来のＢａｍＨＩ／ＢｓｔＸＩフラグメント（ＩＲＥＳを含む）を同時に挿入することを可能にし、ｐＣＭＶ−ｒＦＶＩＩ−ＩＲＥＳ−ＶＫＯＲＣ１を取得することができる。
【００７９】
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−発現系での遺伝子発現および増幅を可能にするために、実施例１に記載される第二の選択プラスミドｐＳＶ−ＤＨＦＲを使用することができる。
【００８０】
細胞培養およびトランスフェクション
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−宿主細胞株、ならびに、実施例１に記載されるものと同一の材料およびトランスフェクションプロトコールおよび培養プロトコールを、所望のｒＦＶＩＩ産生クローンを作製および選択するために使用することができる。ＭＴＸによる遺伝子増幅を同様に達成することができる。
【００８１】
分析アッセイ
ｒＦＶＩＩまたは活性および濃度についてクローンおよび上清を特徴付け、細胞特異的な生産性を決定するために、実施例２に記載されるものと同一のアッセイを使用することができる。ＦＶＩＩａ活性を同様にモニタリングする必要がある。
【００８２】
ノーザンブロット
この技術を使用して、導入した遺伝子の転写をｍＲＮＡレベルで特異的に検出し、正確なｍＲＮＡサイズを確認することができる。細胞集団から単離および調製された細胞の総ＲＮＡを、アガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレンにブロットすることができる。ＤＩＧ標識プローブのハイブリダイゼーション、そしてハイブリダイズしたプローブへ結合した後のアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるＸ線フィルムへの化学発光を現像することにより、特異的なＲＮＡ配列を検出することができる。標的ｍＲＮＡレベル（ｒＶＫＯＲＣ１およびｒＦＶＩＩ）は、ハウスキーピング遺伝子（例えば、ハムスターグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ））と比較しなければならない。
【００８３】
（結果）
ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−発現系に由来する安定な細胞クローンを作製し、そして、ＥＬＩＳＡ技術およびプロトロンビン時間（ＰＴ）凝固技術によってｒＦＶＩＩ生産性をアッセイすることができる。発現プラスミドｐＣＭＶ−ｒＦＶＩＩ−ＩＲＥＳ−ＶＫＯＲＣ１またはｐＣＭＶ−ｒＦＶＩＩを、リン酸カルシウム共沈殿技術によって選択プラスミドｐＳＶ−ＤＨＦＲと同時にトランスフェクトすることができ、クローンを、ヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択培地への曝露（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）および抗生物質による選択への曝露によって取得することができる。単一の細胞由来のクローンを、限界希釈クローニングの後にスクリーニングし、ＭＴＸ濃度を増加させながら数回継代培養して、遺伝子増幅を達成する。サブクローニング工程毎に、クローンを最大３２０ｎＭのＭＴＸ濃度へ曝す。サブクローニングの全ラウンド（ｒｏｕｎｄ）から、全部でｐＣＭＶ−ｒＦＶＩＩトランスフェクション由来の１３３クローンおよびｒＶＫＯＲＣ−１同時発現構築物でのトランスフェクション由来の８３クローンを、増殖させ、詳細に特徴付ける。細胞培養上清に関して、ｒＦＶＩＩ濃度をＥＬＩＳＡによって決定することができ、ｒＦＶＩＩおよびｒＦＶＩＩａ活性をＰＴ凝固アッセイによって並行して測定する。不自然に高い特異的なＦＶＩＩ凝固値（ＦＶＩＩ−ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｖａｌｕｅ）を避けるために、ｒＦＶＩＩのうち１０％未満がＦＶＩＩａに活性化されたクローンのみを特徴付けに関して考慮する（データは示していない）。発現レベルを、２４時間、１０６細胞あたりのｎｇとしてＥＬＩＳＡ濃度の値から算出する。ＦＶＩＩ比凝固活性を、１μｇあたりの凝固単位として算出する。
【００８４】
図８において、ＥＬＩＳＡを基にした特異的な生産性の値を、ｒＦＶＩＩのみを発現するクローン（図８Ａ）、およびｒＦＶＩＩ−ｒＶＫＯＲＣ１同時発現クローン（図８Ｂ）に関してそれぞれＭＴＸ濃度に対してプロットする。両方の株において、ＭＴＸレベルと発現レベルとの間の関連性を見ることができる。ｒＦＶＩＩのみのクローンについて、ＭＴＸ無しでの初期クローンは、匹敵するか、または幾分より高いレベルで始まる。特に、ＭＴＸが２０ｎＭの低い開始レベルから４０ｎＭに増加する場合、ｒＦＶＩＩ−ｒＶＫＯＲＣ１同時発現クローンについて、より急激な共動性の発現レベルの増大を明確に見ることができる（図８Ｂに対して、図８Ａ）。８０ｎＭのＭＴＸにおいて、全てのｒＦＶＩＩ−ｒＶＫＯＲＣ１同時発現クローンは、初期クローンの２〜８０倍のｒＦＶＩＩを発現するのに対し、ｒＦＶＩＩのみのクローンに関して、依然として、一部のクローンが、初期クローンと同様な発現レベルを有することが見出される。２０ｎＭより上では、全てのＭＴＸレベルにおいて、ｒＦＶＩＩのみのクローンよりもｒＦＶＩＩ−ｒＶＫＯＲＣ１内でより良好な産生クローンが見出される。遺伝子増幅後のより良好なｒＦＶＩＩ産生クローンの発現レベルは、特にＭＴＸ増大の最初のラウンドにおいて、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現により２倍になることが見出され得る。
【００８５】
ＦＶＩＩ比凝固活性に関して、全てのこれらのクローンについて計算した値を生産性に対してプロットし、タンパク質の機能性を比較することができる。図９において、両方の株を比較することにより、同様な生産性の範囲においておよそ等しい活性値であり、より高い生産性において両方とも全体的に減少することが示される。ｒＦＶＩＩ−ｒＶＫＯＲＣ１同時発現クローンは、２倍超の生産性を有することが見出されるので、一日、１０６細胞あたり、４μｇより高い範囲の活性値を比較することができない。ｒＦＶＩＩ−ｒＶＫＯＲＣ１クローンにおけるこの発現レベルより高く、血漿由来のＦＶＩＩに類似する一定の活性値（１μｇあたり２Ｕ）を維持し得る（Ｍｏｏｒら、１９９５）。
【００８６】
単一のバイシストロン性ｍＲＮＡ（ｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣ１をコードする配列を含む）の転写をもたらす、ＩＲＥＳエレメントを含むベクター構築物の機能性および機能的なゲノム組み込みを、特にＶＫＯＲＣ１特異的なアッセイを利用することができない場合には、ノーザンブロット技術により実証することができる。
【００８７】
図１０は、ノーザンブロットを示し、ここでは、ＣＨＯ由来のトランスフェクト体またはコントロール細胞の全ｍＲＮＡを細胞溶解後に単離し、そして電気泳動で分離した後にナイロンメンブレン上にブロットした。このメンブレンを、ヒトＶＫＯＲＣ１、ヒトＦＶＩＩ、および参照遺伝子（ハムスターＧＡＰＤＨ）に特異的なＤＩＧ標識ＤＮＡプローブで３回連続してハイブリダイズさせた。プローブを、ＤＩＧ特異的標識抗体で検出する。サンプルは、：トランスフェクトさせていないＣＨＯ−ＤＨＦＲ−細胞、ｒＦＶＩＩのみを発現する１つのＣＨＯ由来クローン、実施例３に記載される、ｒＦＶＩＩをコードするベクターおよびｒＶＫＯＲＣ１をコードするベクターで連続的にトランスフェクトした２つのクローン、ならびに、バイシストロン性ｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣ１の同時発現を有する３つのクローンである。ｒＦＶＩＩ−ＩＲＥＳ−ｒＶＫＯＲＣ１構築物についての約２．４ｋｂのサイズ、ｒＦＶＩＩ構築物についての１．４ｋｂのサイズ、ｒＶＫＯＲＣ１  ｍＲＮＡについての０．５ｋｂのサイズ、およびＧＡＰＤＨコントロールｍＲＮＡについての１．０ｋｂのサイズを有するｍＲＮＡ転写物は、全３つのプローブを用いて検出することができる。ＧＡＰＤＨは、全てのクローンで見出されるが、ｒＶＫＯＲＣ１およびｒＦＶＩＩは、それぞれの細胞株において、トランスフェクトされたプラスミドベクターにしたがって存在する。
【００８８】
まとめると、ｒＶＫＯＲＣ１の安定なバイシストロン性同時発現は、特に、遺伝子増幅を適用する場合に、哺乳動物細胞においてｒＦＶＩＩの生産性を増大させる効果を有する。遺伝子導入後のｒＦＶＩＩ高生産クローンの収量は、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現によってより高い。スクリーニングしたクローンの半数において、２倍超の発現レベルを、同じＭＴＸ濃度レベルにおいて達成することができる。タンパク質活性を、高い細胞タンパク質分泌レベルにおいて維持することができる。両方の効果は、γ−カルボキシル化反応に必要とされる還元型ビタミンＫ形態の十分な供給（これは、完全にカルボキシル化されたタンパク質を適時に放出することを確実にするために、高いタンパク質分泌レベルにおいて、高い代謝回転速で生じる必要がある）によって説明され得る。  
【００８９】
（実施例４：ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３哺乳動物細胞における２つの連続的な非ウイルス性トランスフェクション後の、ｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣ１の安定な同時発現）
哺乳動物細胞培養物におけるｒＦＶＩＩ組換え発現に対する、ヘルパータンパク質としてのｒＶＫＯＲＣ１の効果を確認するために、別のアプローチを使用して、ｒＦＶＩＩととものｒＶＫＯＲＣ−１の同時発現を達成することができる。二回目のトランスフェクション後に、安定なｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣ−１同時発現を示すクローンを選択するためのストラテジーを使用することができる。安定なトランスフェクション後に、ｒＦＶＩＩ発現に関して選択されているクローンに対し、ヒトＶＫＯＲＣ１をコードする別のプラスミドベクターで二回目のトランスフェクションを行うことができる。第二の耐性マーカーを導入して、別の抗生物質への耐性によって選択工程を確実にすることができる。適切なコントロールとして、ＶＫＯＲＣ１  ｃＤＮＡを含まない同一のベクターを、同一の細胞集団に並行してトランスフェクトすることができる。これらのトランスフェクションから、安定なクローンを、クローニング工程内で２種類の抗生物質を用いての同時選択後に単離することができ、実施例２および３に記載されるように特徴付けることができる。これらの新規に単離されたクローンの比較は、ｒＶＫＯＲＣ−１同時発現がｒＦＶＩＩ生産性および活性に与える効果について結論付けることを可能にするはずである。
【００９０】
（材料および方法）
発現ベクター
ｒＦＶＩＩを産生するクローンを作製するために、実施例２に列挙されるものと同一の発現ベクターおよびｒＦＶＩＩ  ｃＤＮＡの供給源を使用することができる。ＣＨＯ−ＤＨＦＲ−系のために、さらなる選択プラスミドｐＳＶ−ＤＨＦＲを使用することができる。
【００９１】
二回目のトランスフェクション後に、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現を達成するために、ヒトＶＫＯＲＣ１および一回目のトランスフェクションで使用したものとは異なる抗生物質選択マーカーをコードするベクターを採用することができる。このベクターを、実施例１に記載されるものと同一の鋳型から生成されたＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１ベースのベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって構築することができる。この場合において、挿入しなかった同一のｐｃＤＮＡ３．１ベクターを、二回目のコントロールトランスフェクションに使用すべきである。あるいは、実施例１に記載されるベクターｐＣＭＶ−ＶＫＯＲＣ１−ＥＤＨｐｒｏを、同一のトランスフェクションのための発現ベクターとして使用することができる。コントロールプラスミドとして、空ベクターｐＣＭＶ−ＥＤＨｐｒｏ（出典は、実施例１を参照のこと）を使用することができる。
【００９２】
細胞培養およびトランスフェクション
実施例１で使用したものと同一の細胞株（ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３）を使用して、ｒＦＶＩＩを産生する安定な細胞株を生成することができる。それにしたがって、全ての細胞培養培地、トランスフェクションプロトコールおよび培養プロトコールを使用することができる。これらの細胞株において、ｒＶＫＯＲＣ−１の安定な同時発現を達成するために、リン酸カルシウム共沈殿を使用する二回目のトランスフェクションを使用することができる。ｒＦＶＩＩおよびｒＶＫＯＲＣ−１を同時発現するクローンを取得するために、さらなる抗生物質性選択薬物を使用する別のクローニング工程が必要とされる。
【００９３】
分析アッセイ
濃度および活性の測定について、実施例２および３に記載されるものと同一のアッセイを使用して、ｒＦＶＩＩ発現を確認することができる。ｍＲＮＡレベルでのｒＶＫＯＲＣ１の転写は、実施例３に記載されるように、ノーザンブロット技術により示すことができる。
【００９４】
（結果）
ｒＦＶＩＩの発現に対するｒＶＫＯＲＣ−１ヘルパータンパク質の効果を示すために、２つの引き続くトランスフェクションおよびクローニングのラウンドのアプローチを使用することができる。最初のラウンドにおいて、ｒＦＶＩＩを発現する細胞クローンを、安定なトランスフェクションおよび抗生物質選択の後に、適切なスクリーニング技術によって単離することができる。これらのクローンのうちの１つを増殖させ、ヒトＶＫＯＲＣ１をコードするプラスミドまたは空のコントロールプラスミドでの二回目のトランスフェクションに使用することができる。別の選択マーカーを導入することができる。再度、第二の抗生物質性選択薬物を培地に添加した（これによりトランスフェクトされていない細胞を枯渇することを確実にする）後、適切な技術によって、クローンをｒＦＶＩＩ発現についてスクリーニングすることができる。ｒＶＫＯＲＣ−１トランスフェクションまたはコントロールトランスフェクションに由来するクローンを、ｒＦＶＩＩ生産性または活性に関して比較することができる。空のコントロールベクターは、ｒＦＶＩＩ発現に影響する同一の培養条件（特に、二重の抗生物質選択）に曝されているクローンの比較を確実にする。
【００９５】
代表的に、首尾よくトランスフェクトされた細胞に由来する全てのクローンから、それらのｒＦＶＩＩ生産性にしたがって、少数のクローンを選択し、さらなる特徴付けのために増殖される。この特徴付けは、抗原ＥＬＩＳＡ技術ならびにｒＦＶＩＩおよびｒＦＶＩＩａ凝固活性の測定による分泌されたｒＦＶＩＩ濃度の決定を含む。ｒＶＫＯＲＣ−１およびｒＦＶＩＩの同時発現を、図１０、レーン３および４において、２つのＣＨＯ由来クローンについて示されるように、ノーザンブロット技術によってｍＲＮＡレベルで確認することができる。
【００９６】
図１１において、培養上清のＥＬＩＳＡ力価に基づく特異的な生産性の値を、一連の選択されたクローン（これらは、ＣＨＯ由来ｒＦＶＩＩ産生細胞株（図１１Ａ）およびＨＥＫ２９３由来ｒＦＶＩＩ産生細胞株（図１１Ｂ）のｒＶＫＯＲＣ１の二回目のトランスフェクションまたはコントロールトランスフェクションに由来する）について示す。両方の細胞型において、ｒＶＫＯＲＣ１  トランスフェクションに由来するクローンが、コントロールトランスフェクションに由来するクローンよりも多くのｒＦＶＩＩを産生することが示され得る。全ての生産性のメジアン値は、両方の場合において、ｒＶＫＯＲＣ１  クローンについて約２倍高い。
【００９７】
図１２Ａおよび１２Ｂにおいて、１マイクログラムＥＬＩＳＡあたりのＦＶＩＩ凝固単位として示されるｒＦＶＩＩ比凝固活性を、二回目のトランスフェクションの後の両方の細胞型に由来するクローンについて示す。比活性算出のために、ｒＦＶＩＩａへの大量のｒＦＶＩＩ活性化を有するクローン（これはＦＶＩＩａ特異的凝固アッセイにより測定することができる）は考慮すべきではない。ＦＶＩＩ凝固単位あたり、１０％のＦＶＩＩａ凝固単位の値は、ｒＦＶＩＩａへ活性化される顕著な量のｒＦＶＩＩを産生するクローンを排除するために選択され得る。したがって、図１１に比べ図１２にはより少ないクローンが示される。
【００９８】
ＦＶＩＩ比凝固活性における差は、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現ではなく、発現レベルと相関し得る。しかしながら、ＣＨＯ由来クローンの場合に、同様な発現レベルを有するクローンは、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現の存在下でより高い活性を示す。ＣＨＯ由来細胞クローンおよびＨＥＫ２９３由来細胞クローンの両方の生産性に関して、ｒＶＫＯＲＣ１同時発現が、コントロールと比較して２倍の平均値の改善をもたらすことが結論付けられ得る。さらに、ｒＦＶＩＩ活性はまた、γ−カルボキシル化に加えて、細胞の代謝性タンパク質分泌および修飾能力によって影響される他の要因によって影響されることが結論付けられ得る。生産性および活性の値は、実施例２および３に記載されるｒＦＶＩＩ／ｒＶＫＯＲＣ１同時発現実験の結果と一致する。
【００９９】
（参考文献のリスト）
【０１００】
【化１】
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【図１】
2011142923.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【外国語明細書】
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