(57)【要約】【課題】置換ジ−スルフィド化合物、トリ−スルフィド化合物、テトラ−スルフィド化合物及びペンタ−スルフィド化合物及び組成物、並びに細胞増殖性疾患の処置及び／又は予防のためのその使用方法を提供すること。【解決手段】本発明はまた、トリスルフィド化合物及び組成物の調製方法を提供する。本発明に記載される化合物は、抗腫瘍活性、抗癌活性、抗炎症活性、抗感染活性、及び／又は抗増殖活性を示す。本発明は有機硫黄化合物の製造及び製剤化方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年４月２０日に出願された米国特許仮出願第６０／５６４，１５１号に関する。この文書の内容は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は有機硫黄化合物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は依然として、人類にとって最も重要な、未だかなえられていない医学的課題の一つである。外科手術、放射線療法、化学療法，又はこれらの方法の組み合わせなど、腫瘍を治療するためのいくつかの選択肢が利用可能である。これらの中で、化学療法は全てのタイプの癌、特に、手術不可能な、あるいは転移性の癌に対して広く使用されている。様々な化学療法化合物が臨床において使用されているにもかかわらず、化学療法は概して治癒的でなく、病気の進行を遅らせるにすぎない。通常、腫瘍及びその転移に対して化学療法は効かなくなってくるが、これは、腫瘍細胞が多剤耐性能を発達するからである。いくつかの場合において、腫瘍はあるクラスの化学療法薬に対して本質的に耐性を示す。別の場合では、化学療法による治療中に、その化学療法薬に対し獲得された耐性が発達する。したがって、様々なクラスの腫瘍を治療する際の、利用可能な化学療法化合物の有効性に対する大きな制約が依然として存在する。さらに、腫瘍の化学的治療のために使用される多くの細胞傷害性及び細胞増殖抑制性の薬剤は重篤な副作用を示し、結果的に化学療法を停止する患者もいる。したがって、新規な化学療法薬が依然として必要とされている。
【０００４】
ジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）は、亜熱帯地方の低木Ｐｅｔｉｖｅｒｉａ  ａｌｌｉａｃｅａ  Ｌ．（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｃｅａｅ）から単離された、生物学的に活性なポリスルフィド二次代謝産物である。ＤＢＴＳは免疫調節活性を有することが報告されている（非特許文献１；非特許文献２）。その免疫調節活性におけるＤＢＴＳの細胞的及び分子的メカニズムを研究して、Ｒｏｓｎｅｒとその同僚らは、ＤＢＴＳがウシ血清アルブミンの芳香族領域に優先的に結合し、又、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞においてＭＡＰキナーゼ（ｅｒｋ１／ｅｒｋ２）のチロシン残基の脱リン酸化を低減することを報告した（非特許文献３）。さらに、彼らは、ＤＢＴＳが、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞及びＷｉｓｔａｒ３８ヒト肺線維芽細胞において、微小管の不可逆的な分解を引き起こし、又、アクチンの運動性には影響を与えなかったことを報告した。さらに、彼らは、ＤＢＴＳが神経芽細胞腫細胞の増殖および脊髄外移植片からの神経突起伸長も抑制することを報告した。
【０００５】
別の研究において、Ｍａｔａ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄとその同僚らは、様々な植物由来の多数の抽出物セットにおける抗増殖活性及び分化活性について調べた（非特許文献４）。彼らは、Ｐｅｔｉｖｅｒｉａ  ａｌｌｉａｃｅａ  Ｌ．の根の親油性抽出物、及びこの親油性抽出物からの活性画分が、ＨＬ−６０前骨髄球細胞において抗増殖活性及び抗分化活性を示すことを報告した。この親油性抽出物の活性画分から、彼らは、２つの活性有機硫黄化合物、すなわち、２−［（フェニルメチル）ジチオ］エタノール及びジベンジルトリスルフィドを単離した。彼らはこれら２つの有機硫黄化合物が単球に類似した分化と強い細胞傷害性を誘導することを報告した。さらに、彼らは、これら２つの単離物がいずれもＨＬ−６０細胞において抗増殖活性を示さないことを報告した。
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ａ．Ｄ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ｋ．，Ｎａｒａｖａｎｅ，Ａ．，Ｇｉｂｂｓ，Ｎ．およびＦｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ，Ｒ．“Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｔｉｖｅｒｉａ  ａｌｌｉａｃｅａ．”，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９７，１１，２５１−２５３
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ａ．Ｄ．，Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｅ．，Ｋｌａｉｂｅｒ，Ｉ．，Ｋｒａｕｓ，Ｗ．およびＲｏｓｎｅｒ，Ｈ．“Ａ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｆｒｏｍ  ｄｉｂｅｎｚｙｌ  ｔｒｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａｇｒｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２００３，５１，７０１−７０６
【非特許文献３】Ｒｏｓｎｅｒ，Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｌ．Ａ．Ｄ．，Ｊｕｎｇ，Ａ．およびＫｒａｕｓ，Ｗ“Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ，ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｂｅｎｚｙｌ  ｔｒｉｓｕｌｐｈｉｄｅ”，．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ，２００１，１５４０，１６６−１７７
【非特許文献４】Ｍａｔａ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｅ．，Ｉｔｏ  Ａ．，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｕｒｇ，Ｈ．，Ｃｕｉ，Ｂ．，Ｍｅｈｔａ，Ｒ．Ｇ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ａ．Ｄ．およびＰｅｚｚｕｔｏ，Ｊ．Ｍ．“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＨＬ−６０  ｐｒｏｍｙｅｏｌｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ”Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１，２１，１７６３−１７７０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、有機硫黄化合物、医薬組成物、及びその使用方法に関する。より詳細には、本発明は、置換ジ−スルフィド化合物、トリ−スルフィド化合物、テトラ−スルフィド化合物及びペンタ−スルフィド化合物に関し、この化合物には、その薬学上許容し得る塩及び部分的に酸化されたスルホン誘導体も含まれる。本発明に記載される化合物は、抗腫瘍活性、抗癌活性、抗炎症活性、抗感染活性、及び／又は抗増殖活性を示す。本発明は有機硫黄化合物の製造及び製剤化方法にも関する。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、以下の式で表される化合物
【０００８】
【化１４】
2011162562.tif 000002
式中、Ａ及びＢは、同じであるか又は異なり、且つ、独立して、置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、又は単環式若しくは多環式であってもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい５〜１４員環であり；
各Ｓは酸化物の形態であってもよく；
Ｓ１及びＳ２は、独立して、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ２であり；
各Ｒは、Ｈ、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、アミド、無機置換基、ＳＲ１、ＯＲ１又はＲ１であり、この場合、各Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であり、それらの各々が置換されていてもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０〜３である、化合物；
又は、以下の式（３）若しくは（４）で表される化合物：
【０００９】
【化１５】
2011162562.tif 000003
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りである、化合物；
又は、以下の式（５）で表される化合物：
【００１０】
【化１６】
2011162562.tif 000004
式中、Ａ、Ｂ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りであり；且つ、
Ｚは（ＣＲ１２）ｑ又は（ＣＲ１＝ＣＲ１）ｑ＊であり、この場合、ｑは０〜３であり、且つ、＊は、アルキニル、Ｏ、Ｓ、ＮＲによって置換されていてもよいＣ＝Ｃを表し；又は、Ｚは置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール又は複素環であり；
式中、ＡとＢは一緒に環状環系を形成してもよい、化合物；
但し、前記化合物が、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−クロロベンジル）トリスルフィド、（ｐ−クロロベンジル）ベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−ニトロベンジル）トリスルフィド、ジ（３−フェニル−２−プロペニル）−トリスルフィド、ジフェニルトリスルフィド、又はジ（ｐ−ｔ−ブチルフェニル）トリスルフィドでない、化合物；
及びその薬学上許容し得る塩、エステル、プロドラッグ又は代謝産物；
を提供する。
【００１１】
上記式１〜５において、各Ｚは、
【００１２】
【化１７】
2011162562.tif 000005
であることができ、
式中、各Ｗは、独立して、結合、ＣＲ、Ｎ、ＮＲ、Ｓ、又はＯであり；
各Ｒは、上記定義の通りである。
【００１３】
上記式１〜５において、各Ｒは、Ｈ、ハロ、ＯＲ１、ＳＲ１、ＣＯ２Ｒ１、ＣＯＮＲ１２、Ｃ＝Ｏ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＮＲ１Ｒ１、ＯＣＯＲ１であるか；又は、Ｒは、それぞれがヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０環状アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であることができる。
【００１４】
上記式１〜５において、それぞれＡ及びＢは、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、［１，２，４］オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラゾール、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、ピロール、フラン、チオフェンインドリジン、インドール、イソインドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、プリン、キノキサリン、キノリン、イソキノリン、シノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、ナフチリジン、プテリジン、アクリジン、フェナジン、フェノチアジン、インデン、ナフタレン、ベンゾオキサジアゾール，又はベンゾ［１，２，５］−オキサジアゾールであることができる。
【００１５】
別の態様において、それぞれＡ及びＢは、独立して、
【００１６】
【化１８】
2011162562.tif 000006
であり、
式中、Ｘ及びＷは、独立して、Ｓ、Ｏ、ＮＲ７、ＣＲ７であるか；
又は、６員の単環若しくは二環において１つのＷは結合であってもよく；且つ、
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、アミド、無機置換基、ＳＲ１、ＯＲ１又はＲ１であり、この場合、各Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であって、それらの各々が置換されていてもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよい。例えば、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＲ１、ＳＲ１、ＣＯ２Ｒ１、ＣＯＮＲ１２、Ｃ＝Ｏ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＮＲ１Ｒ１、ＯＣＯＲ１であるか；又は、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それらの各々がヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０環状アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であることができる。
【００１７】
アリール、ヘテロアリール、又は複素環の例は、限定するものではないが、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、フェニル、フラニル、チオフェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノキサリニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、キノリニル、ナフタレニル、ピリダジニル、ピラゾロピリミジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゼン−チオフェン、ピラゾリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、又はキナゾリニルであり、それぞれは、Ｏ、Ｎ、Ｓ及びハロから選択されるヘテロ原子によって置換されていてもよく；又は、それらの各々がヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０環状アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、又は複素環によって置換されていてもよい。
【００１８】
上記式１〜５において、各Ｓは、一酸化物又は二酸化物であることができる。
【００１９】
別の態様において、本化合物は、以下の式（６）
【００２０】
【化１９】
2011162562.tif 000007
で表され、
各ｎは、１〜３であり；且つ、
Ｒは、Ｈ、ハロ、アルキル又はハロゲン化アルキルである。
【００２１】
さらに別の態様において、本化合物は、以下の式（７）
【００２２】
【化２０】
2011162562.tif 000008
で表され、
この場合、Ａｒは、置換されていてもよい、チオフェン、ベンゾチオフェン、ピリジン又はピラジンである。
【００２３】
式１〜５で表される化合物の例は、限定するものではないが、ジ（フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｏ−クロロベンジル）トリスルフィド、ジ（メチルベンジル）トリスルフィド、ジ（トリフルオロメチルベンジル）トリスルフィド、ジ（２−フェニルエチル）トリスルフィド、ジ（２−チオフェン−イル−メチル）トリスルフィド、ジ（４−ピリジン−イル−エチル）トリスルフィド、ジ（２−ピリミジン−イル−エチル）トリスルフィド、又はジ（３−ベンゾチオフェン−イル−メチル）トリスルフィドである。特定の例において、本化合物は、ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｍ−メチルベンジル）トリスルフィド、又はジ−（ｐ−メチルベンジル）トリスルフィドが挙げられる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、上記の式１〜５で表される化合物を含む組成物の製造方法を提供し、その方法に従って調製された組成物も提供する。一態様において、本発明は、ａ）溶液を得るために、請求項１に記載の化合物を、水溶性有機溶媒、非イオン性溶媒、水溶性脂質、シクロデキストリン、ビタミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、又はこれらの組み合わせ中に溶解させる工程；及び、ｂ）生理食塩水又は１〜１０％の炭水化物溶液を含むバッファーを添加する工程；を含む方法を提供する。有機溶媒は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、又はこれらの組み合わせであることができる。
【００２５】
上記方法において、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセロール−トリリシノレート３５、ＰＥＧ−コハク酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール６６０  １２−ヒドロキシステアレート、ソルビタンモノオレエート、ポリオキサマー、エトキシル化杏仁油、カプリル−カプロイルマクロゴール−８−グリセリド、グリセロールエステル、ＰＥＧ６カプリルグリセリド、グリセリン、グリコール−ポリソルベート、又はこれらの組み合わせであることができる。非イオン性界面活性剤の特定の例は、ポリエチレングリコール改変ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）（ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレート３５）、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ、水素化ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＲＨ４０、水素化ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＲＨ６０、ＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標）ＨＳ（ポリエチレングリコール６６０  １２−ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＦＩＬ（登録商標）（エトキシル化杏仁油）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（登録商標）（カプリル−カプロイルマクロゴール−８−グリセリド）、ＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）（グリセロールエステル）、及びＳＯＦＴＩＧＥＮ（登録商標）（ＰＥＧ６カプリリルグリセリド）である。
【００２６】
上記方法において、脂質は、植物性油脂、トリグリセリド、植物油、又はこれらの組み合わせであることができる。例えば、脂質は、ヒマシ油、ポリオキシルヒマシ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ピーナッツ油、ペパーミント油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、硬化植物性油脂、硬化大豆油、ココナッツ油のトリグリセリド、ヤシ種子油、及びこれらの硬化形態、又はこれらの組み合わせであることができる。
【００２７】
上記方法において、ビタミンはトコフェロールであることができ、脂肪酸及び脂肪酸エステルはオレイン酸、モノグリセリド、ジグリセリド、ＰＥＧのモノ−脂肪酸エステル又はジ−脂肪酸エステル、又はこれらの組み合わせであることができる。
【００２８】
上記方法において、シクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、又はスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンであることができる。リン脂質は、大豆ホスファチジルコリン、又はジステアロイルホスファチジルグリセロール、及びこれらの硬化形態、又はこれらの組み合わせであることができる。さらに、炭水化物は、上記方法において、デキストロースを含むことができる。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、ａ）Ｎ−トリメチルシリルイミダゾールを二塩化硫黄のハロゲン化溶媒溶液と接触させてジイミダゾリルスルフィドを得る工程；及びｂ）該ジイミダゾリルスルフィドをメルカプタンと接触させる工程；を含む、上記式１〜２の化合物の調製方法を提供する。一実施例において、ハロゲン化溶媒はジクロロメタンである。
【００３０】
一態様において、Ｎ−トリメチルシリルイミダゾールのヘキサン溶液を二塩化硫黄のジクロロメタン溶液と接触させる。別の態様において、ニート化合物として二塩化硫黄を、Ｎ−トリメチルシリルイミダゾールのヘキサン及びジクロロメタン溶液に接触させる。さらに別の態様において、本方法は、トリスルフィドを再結晶化する工程をさらに含む。一実施例において、トリスルフィドは、ｎ−ヘキサン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル又はこれらの組み合わせ中で再結晶化される。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、上記式１〜５で表される化合物及び薬学上許容し得る賦形剤を含む医薬組成物を提供する。かかる化合物及びその医薬組成物は神経芽細胞腫を改善又は処置するために使用することができる。したがって、本発明は、有効量の式１〜５で表される化合物又はその医薬組成物を、任意で抗増殖性物質と一緒に、それらを必要とする系又は対象に投与する工程を含み、それにより、神経芽細胞腫が改善又は処置される、神経芽細胞腫を改善又は処置する方法も提供する。
【００３２】
本発明は、式１〜５で表されるいずれかの化合物又はその医薬組成物を、それを必要とする対象又は系に投与することを含む、症状を改善又は処置する方法であって、その化合物が、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−クロロベンジル）トリスルフィド、（ｐ−クロロベンジル）ベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−ニトロベンジル）トリスルフィド、ジ（３−フェニル−２−プロペニル）−トリスルフィド、ジフェニルトリスルフィド、又はジ（ｐ−ｔ−ブチルフェニル）トリスルフィドであることができる方法も提供する。対象はヒト又は哺乳動物などの動物であることができる。系は、細胞若しくは組織、又は化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与し得るその他の系であることができる。
【００３３】
一実施形態において、本発明は、式１〜５で表される有効量の化合物又はその医薬組成物を、任意で抗増殖性物質と一緒に、それらを必要とする系又は対象に投与する工程を含み、それにより、その系又は対象における細胞増殖性疾患が改善又は処置される、神経芽細胞腫以外の細胞増殖性疾患を改善又は処置する方法を提供する。本発明は、細胞増殖を低減若しくは抑制するための、又は細胞死を誘導するための方法も提供する。本発明はアポトーシスを誘導するための方法をさらに提供する。特定の例において、本発明の方法で使用される化合物は、任意で抗増殖性物質を伴う、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｐ−メチルベンジル）トリスルフィド又はジ（ｍ−メチルベンジル）トリスルフィドである。
【００３４】
一態様において、細胞増殖が低減されるか、又は細胞死が誘導される。細胞増殖性疾患は、限定するものではないが、白血病、リンパ腫、肺癌、大腸癌、ＣＮＳ癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌，又は腎臓癌などの腫瘍又は癌であることができる。別の態様において、細胞アポトーシスが誘導される。別の態様において、チューブリンの組み立て若しくは分解が妨害されるか、又は細胞周期のＧ２／Ｍの進行、細胞有糸分裂、若しくはこれらの組み合わせが抑制される。さらに別の態様において、内皮細胞増殖、血管新生、又はその組み合わせが抑制される。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、式１〜５で表されるいずれかの化合物又はその医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み、それにより、その対象の再狭窄が改善又は処置される、再狭窄を改善又は処置する方法を提供する。再狭窄は新生内膜過形成に関連し得る。本化合物は、経口投与若しくは非経口投与を介して、又はステントを介して投与することができる。さらに別の実施形態において、本発明は、式１〜５で表される化合物のいずれかと薬学上許容し得る賦形剤を含む、細胞増殖性疾患の治療のための医薬組成物を提供する。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
以下の式で表される化合物：
【化１】
2011162562.tif 000009
式中、Ａ及びＢは、同じであるか又は異なり、且つ、独立して、置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、又は単環式若しくは多環式であってもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよい５〜１４員環であり；
各Ｓは酸化物の形態であってもよく；
Ｓ１及びＳ２は、独立して、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ２であり；
各Ｒは、Ｈ、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、アミド、無機置換基、ＳＲ１、ＯＲ１又はＲ１であり、この場合、各Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であり、それらの各々が置換されていてもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０〜３である、化合物；
又は、以下の式（３）又は（４）で表される化合物：
【化２】
2011162562.tif 000010
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りである、化合物；
又は、以下の式（５）で表される化合物：
【化３】
2011162562.tif 000011
式中、Ａ、Ｂ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りであり；且つ、
Ｚは（ＣＲ１２）ｑ又は（ＣＲ１＝ＣＲ１）ｑ＊であり、この場合、ｑは０〜３であり、且つ、＊は、アルキニル、Ｏ、Ｓ、ＮＲによって置換されていてもよいＣ＝Ｃを表し；又は、Ｚは置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール又は複素環であり；
式中、ＡとＢは一緒に環状環系を形成してもよい、化合物；
但し、前記化合物が、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−クロロベンジル）トリスルフィド、（ｐ−クロロベンジル）ベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−ニトロベンジル）トリスルフィド、ジ（３−フェニル−２−プロペニル）−トリスルフィド、ジフェニルトリスルフィド、又はジ（ｐ−ｔ−ブチルフェニル）トリスルフィドでない、化合物
及びその薬学上許容し得る塩、エステル、プロドラッグ又は代謝産物。
（項目２）
式中、Ｚが以下の式
【化４】
2011162562.tif 000012
で表され、
式中、各Ｗは、独立して、結合、ＣＲ、Ｎ、ＮＲ、Ｓ、又はＯであり；
各Ｒは、項目１における定義の通りである、
項目１に記載の化合物。
（項目３）
式中、Ｒが、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＲ１、ＳＲ１、ＣＯ２Ｒ１、ＣＯＮＲ１２、Ｃ＝Ｏ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＮＲ１Ｒ１、ＯＣＯＲ１であるか；又は、Ｒが、それぞれがヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０環状アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環である、項目１に記載の化合物。
（項目４）
式中、Ａ及びＢが、独立して、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、［１，２，４］オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラゾール、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、ピロール、フラン、チオフェンインドリジン、インドール、イソインドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、プリン、キノキサリン、キノリン、イソキノリン、シノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、ナフチリジン、プテリジン、アクリジン、フェナジン、フェノチアジン、インデン、ナフタレン、ベンゾオキサジアゾール，又はベンゾ［１，２，５］−オキサジアゾールである、項目１に記載の化合物。
（項目５）
式中、Ａ及びＢが、独立して、
【化５】
2011162562.tif 000013
であり、
式中、Ｘ及びＷは、独立して、Ｓ、Ｏ、ＮＲ７、ＣＲ７であるか；
又は、６員の単環若しくは二環において１つのＷは結合であってもよく；且つ、
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、アミド、無機置換基、ＳＲ１、ＯＲ１又はＲ１であり、この場合、各Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であって、それらの各々が置換されていてもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよい、項目１に記載の化合物。
（項目６）
式中、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７が、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＲ１、ＳＲ１、ＣＯ２Ｒ１、ＣＯＮＲ１２、Ｃ＝Ｏ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＮＲ１Ｒ１、ＯＣＯＲ１であるか；又は、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７が、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０環状アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であって、それらの各々がヘテロ原子を含んでいてもよい、項目５に記載の化合物。
（項目７）
前記アリール、ヘテロアリール、又は複素環が、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、フェニル、フラニル、チオフェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノキサリニル、チアゾリニル、オキサゾリル、イミダゾリル、キノリニル、ナフタレニル、ピリダジニル、ピラゾロピリミジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゼン−チオフェン、ピラゾリル、ピロリル、インドリル、イソインドリル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、又はキナゾリニルであり、それらの各々がＯ、Ｎ、Ｓ及びハロから選択されるヘテロ原子によって置換されていてもよく；又は、それぞれがヘテロ原子を含んでいてもよい、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ３−１０環状アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ２−１０アルキニル、アリール、又は複素環によって置換されていてもよい、項目６に記載の化合物。
（項目８）
式中、各Ｓが、一酸化物又は二酸化物であってもよい、項目１に記載の化合物。
（項目９）
前記化合物が以下の式（６）
【化６】
2011162562.tif 000014
で表され、
各ｎが、１−３であり；且つ、
Ｒが、Ｈ、ハロ、アルキル又はハロゲン化アルキルである、
項目１に記載の化合物。
（項目１０）
前記化合物が以下の式（７）
【化７】
2011162562.tif 000015
で表され、
この場合、Ａｒが、置換されたチオフェン、ベンゾチオフェン、ピリジン又はピラジンであってもよい、項目１に記載の化合物。
（項目１１）
前記化合物が、ジ（フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｏ−クロロベンジル）トリスルフィド、ジ（メチルベンジル）トリスルフィド、ジ（トリフルオロメチルベンジル）トリスルフィド、ジ（２−フェニルエチル）トリスルフィド、ジ（２−チオフェン−イル−メチル）トリスルフィド、ジ（４−ピリジン−イル−エチル）トリスルフィド、ジ（２−ピリミジン−イル−エチル）トリスルフィド、又はジ（３−ベンゾチオフェン−イル−メチル）トリスルフィドである、項目１に記載の化合物。
（項目１２）
前記化合物が、ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｍ−メチルベンジル）トリスルフィド、又はジ−（ｐ−メチルベンジル）トリスルフィドである、項目１に記載の化合物。
（項目１３）
神経芽細胞腫を改善又は処置する方法であって、有効量の項目１に記載される化合物又はその医薬組成物を、任意で抗増殖性物質と一緒に、それらを必要とする系又は対象に投与する工程を含み、それにより、前記神経芽細胞腫が改善又は処置される、方法。
（項目１４）
神経芽細胞腫以外の細胞増殖性疾患を改善又は処置する方法であって、
以下の式を有する化合物：
【化８】
2011162562.tif 000016
式中、Ａ及びＢは、同じであるか又は異なり、且つ、独立して、置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、又は単環式若しくは多環式であってもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい５〜１４員環であり；
各Ｓは酸化物の形態であってもよく；
Ｓ１及びＳ２は、独立して、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ２であり；
各Ｒは、Ｈ、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、アミド、無機置換基、ＳＲ１、ＯＲ１又はＲ１であり、この場合、各Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であり、それらの各々が置換されていてもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０〜３である、化合物；
又は、以下の式（３）若しくは（４）で表される化合物：
【化９】
2011162562.tif 000017
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りである、化合物；
又は、以下の式（５）で表される化合物：
【化１０】
2011162562.tif 000018
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りであり；且つ、
Ｚは（ＣＲ１２）ｑ又は（ＣＲ１＝ＣＲ１）ｑ＊であり、この場合、ｑは０〜３であり、且つ、＊は、アルキニル、Ｏ、Ｓ、ＮＲによって置換されていてもよいＣ＝Ｃを表し；又は、Ｚは置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール又は複素環であり；
式中、ＡとＢは一緒に環状環系を形成してもよい、化合物；
で表される有効量の化合物、又はその医薬組成物を、任意で抗増殖性物質と一緒に、それらを必要とする系又は対象に投与する工程を含み、それにより前記の系又は対象における細胞増殖性疾患が改善又は処置される、方法。
（項目１５）
前記細胞増殖が低減されるか、又は前記細胞死が誘導される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記対象がヒト又は動物であり、且つ、前記系が細胞又は組織である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞増殖性疾患が腫瘍又は癌である、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
前記癌が、白血病、リンパ腫、肺癌、大腸癌、ＣＮＳ癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、頭頸部癌、膵臓癌、又は腎臓癌である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記化合物が、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｐ−メチルベンジル）トリスルフィド又はジ（ｍ−メチルベンジル）トリスルフィドである、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
細胞増殖を低減若しくは抑制するか、又は細胞死を誘導する方法であって、有効量の項目１４に定義される化合物又はその医薬組成物を、任意で抗増殖性物質と一緒に、系又は対象に投与する工程を含み、それにより、前記の系又は対象において細胞増殖を低減若しくは抑制するか、又は前記細胞死が誘導される、方法。
（項目２１）
細胞アポトーシスが誘導される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
チューブリンの組み立て若しくは分解が妨害されるか、又は前記細胞周期におけるＧ２／Ｍの進行、細胞有糸分裂、若しくはこれらの組み合わせが抑制される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
内皮細胞増殖、血管新生、又はその組み合わせが抑制される、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記対象がヒト又は動物であり、且つ、前記系が細胞又は組織である、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記化合物が、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｐ−メチルベンジル）トリスルフィド又はジ（ｍ−メチルベンジル）トリスルフィドである、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
再狭窄を改善又は処置する方法であって、有効量の項目１４に定義される化合物又はその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含み、それにより、前記対象の再狭窄が改善又は処置される、方法。
（項目２７）
前記再狭窄が新生内膜過形成に関連するものである、項目２６に記載される方法。
（項目２８）
前記投与工程が経口投与若しくは非経口投与であるか、ステントを介して投与される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記化合物が、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド、ジ（ｐ−メチルベンジル）トリスルフィド又はジ（ｍ−メチルベンジル）トリスルフィドである、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
項目１に記載される化合物及び薬学上許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。
（項目３１）
以下の式で表される化合物：
【化１１】
2011162562.tif 000019
式中、Ａ及びＢは、同じであるか又は異なり、且つ、独立して、置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、又は単環式若しくは多環式であってもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよい５〜１４員環であり；
各Ｓは酸化物の形態であってもよく；
Ｓ１及びＳ２は、独立して、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ２であり；
各Ｒは、Ｈ、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、アミド、無機置換基、ＳＲ１、ＯＲ１又はＲ１であり、この場合、各Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であり、それぞれが置換されていてもよく、又、ヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０〜３である、化合物；
又は、以下の式（３）又は（４）で表される化合物：
【化１２】
2011162562.tif 000020
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りである、化合物；
又は、以下の式（５）で表される化合物：
【化１３】
2011162562.tif 000021
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りであり；且つ、
Ｚは（ＣＲ１２）ｑ又は（ＣＲ１＝ＣＲ１）ｑ＊であり、この場合、ｑは０〜３であり、且つ、＊は、アルキニル、Ｏ、Ｓ、ＮＲによって置換されていてもよいＣ＝Ｃを表し；又は、Ｚは置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール又は複素環であり；
式中、ＡとＢは一緒に環状環系を形成してもよい、化合物；
及び薬学上許容し得る賦形剤を含む、細胞増殖疾患の処置のための医薬組成物。
（項目３２）
ａ）  Ｎ−トリメチルシリルイミダゾールを二塩化硫黄のハロゲン化溶媒溶液と接触させ、ジイミダゾリルスルフィドを得る工程；及び
ｂ）  前記ジイミダゾリルスルフィドをメルカプタンと接触させる工程；
を含む、項目３１に記載される式１−２で表される化合物の調製方法。
（項目３３）
前記溶媒がジクロロメタンである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
Ｎ−トリメチルシリルイミダゾールのヘキサン溶液を、二塩化硫黄のジクロロメタン溶液と接触させる、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
ニート化合物としての二塩化硫黄を、Ｎ−トリメチルシリルイミダゾールのヘキサン及びジクロロメタン溶液と接触させる、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記トリスルフィドを再結晶化する工程をさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記トリスルフィドを、ｎ−ヘキサン、ヘキサン、ヘプタン、石油エーテル又はこれらの組み合わせの中で再結晶化させる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
ａ）  溶液を得るために、項目１に記載の化合物を、水溶性有機溶媒、非イオン性溶媒、水溶性脂質、シクロデキストリン、ビタミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、又はこれらの組み合わせの中に溶解させる工程；及び
ｂ）  生理食塩水又は１〜１０％の炭水化物溶液を含むバッファーを添加する工程；
を含む、項目１に記載の化合物を含む組成物を調製する方法。
（項目３９）
前記有機溶媒が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、又はこれらの組み合わせである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
非イオン性の界面活性剤が、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレート３５、ＰＥＧ−コハク酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール６６０  １２−ヒドロキシステアレート、ソルビタンモノオレイン酸、ポロキサマー、エトキシル化杏仁油、カプリル−カプロイルマクロゴール−８−グリセリド、グリセロールエステル、ＰＥＧ６カプリルグリセリド、グリセリン、グリコール−ポリソルベート、又はそれらの組み合わせである、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記脂質が、植物性油脂、トリグリセリド、植物油又はそれらの組み合わせである、項目３８に記載の方法。
（項目４２）
前記脂質がヒマシ油、ポリオキシヒマシ油、コーン油、オリーブ油、綿実油、落花生油、ペパーミント油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、硬化植物性油脂、硬化大豆油、ココナツ油のトリグリセリド、ヤシ種子油、及びそれらの硬化形態又はそれらの組み合わせである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ビタミンがトコフェロールである、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
前記脂肪酸がオレイン酸である、項目３８に記載の方法。
（項目４５）
前記脂肪酸エステルが、モノグリセリド、ジグリセリド、ＰＥＧのモノ−脂肪酸エステル若しくはジ−脂肪酸エステル、又はこれらの組み合わせである、項目３８に記載の方法。
（項目４６）
前記シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、又はスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンである、項目３８に記載の方法。
（項目４７）
前記リン脂質が、大豆ホスファチジルコリン、又はジステアロイルホスファチジルグリセロール及びその硬化形態、又はこれらの組み合わせである、項目３８に記載の方法。
（項目４８）
前記炭水化物がデキストロースを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４９）
アポトーシスの促進方法であって、有効量の項目１４に定義される化合物又はその医薬組成物を、任意で抗増殖性物質と一緒に、それらを必要とする系又は対象に投与することを含み、それにより、前記対象又は系中のアポトーシスが促進される、方法。
（項目５０）
細胞のチューブリン又は微小チューブリンが誘導される、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
項目３８に記載の方法に従って調製された組成物。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１Ａ−Ｃは、リアルタイム電子的センシングシステム（ＲＴ−ＣＥＳシステム）で測定された、種々の濃度のＤＢＴＳ、コルセミド、及びパクリタキセルそれぞれに対するＨ４６０細胞（非小細胞肺癌株）の応答を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−Ｃは、リアルタイム電子的センシングシステム（ＲＴ−ＣＥＳシステム）で測定された、種々の濃度のＤＢＴＳ、コルセミド、及びパクリタキセルそれぞれに対するＨ４６０細胞（非小細胞肺癌株）の応答を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ−Ｃは、リアルタイム電子的センシングシステム（ＲＴ−ＣＥＳシステム）で測定された、種々の濃度のＤＢＴＳ、コルセミド、及びパクリタキセルそれぞれに対するＨ４６０細胞（非小細胞肺癌株）の応答を示す。
【図２】図２は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＭＶ５２２細胞（肺癌細胞株）の応答を示す。
【図３】図３は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞株）の応答を示す。
【図４】図４は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＡ５４９細胞（肺癌細胞株）の応答を示す。
【図５】図５は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）（図６Ａ）及び５−フルオロウラシル（図６Ｂ）に対するＰＣ３細胞（前立腺癌細胞株）の応答を示す。
【図６Ａ】図６は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＡ４３１細胞（類表皮癌細胞株）の応答を示す。
【図６Ｂ】図６は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＡ４３１細胞（類表皮癌細胞株）の応答を示す。
【図７】図７は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＨＴ１０８０細胞（線維肉腫細胞株）の応答を示す。
【図８】図８は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＭＤＡ−２３１細胞（乳癌細胞株）の応答を示す。
【図９】図９は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＨＴ−２９細胞（大腸癌細胞株）の応答を示す。
【図１０】図１０は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＨＣ−２９９８細胞（大腸癌細胞株）の応答を示す。
【図１１】図１１は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＯＶＣＡＲ４細胞（卵巣癌細胞株）の応答を示す。
【図１２】図１２は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＡ２７８０細胞（大腸癌細胞株）の応答を示す。
【図１３】図１３は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々の濃度のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）に対するＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓癌細胞株）の応答を示す。
【図１４】図１４は、ジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）を用いて処理されたマウス肉腫Ｓ１８０腫瘍（皮下移植によりマウスに移植）を示す。
【図１５】図１５は、ジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）を用いて処理されたマウスルイス肺癌（皮下移植によりマウスに移植）を示す。
【図１６】図１６は、皮下播種により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植され、化合物ＡＣＥＡ１００１０８を用いて処理されたＢｃａｐ−３７ヒト乳房腫瘍を示す。
【図１７】図１７は、皮下移植により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植されたＢｃａｐ−３７ヒト乳癌に対する化合物ＡＣＥＡ１００１０８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果試験での腫瘍サイズの動的変化を示す。
【図１８】図１８は、皮下移植により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植されたＢｃａｐ−３７ヒト乳癌に対する化合物ＡＣＥＡ１００１０８（１００１０８）のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果試験での担体マウスの体重の動的変化を示す。
【図１９】図１９は、皮下播種により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植され、化合物ＡＣＥＡ１００１０８を用いて処置されたＨＣＴ−８ヒト大腸腫瘍を示す。
【図２０】図２０は、皮下移植により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植されたＨＣＴ−８ヒト大腸癌に対する化合物ＡＣＥＡ１００１０８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果試験での腫瘍の大きさにおける動的変化を示す。
【図２１】図２１は、皮下移植により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植されたＨＣＴ−８ヒト大腸癌に対する化合物ＡＣＥＡ１００１０８（１００１０８）のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果試験での担体マウスの体重の動的変化を示す。
【図２２】図２２は、皮下播種により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植され、化合物ＡＣＥＡ１００１０８を用いて処理されたａｏ１０／１７ヒト卵巣腫瘍を示す。
【図２３】図２３は、皮下移植により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植されたａｏ１０／１７ヒト卵巣癌に対する化合物ＡＣＥＡ１００１０８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果試験での腫瘍の大きさにおける動的変化を示す。
【図２４】図２４は、皮下移植により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植されたａｏ１０／１７ヒト卵巣癌に対する化合物ＡＣＥＡ１００１０８（１００１０８）のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果試験での担体マウスの体重における動的変化を示す。
【図２５】図２５は、皮下移植により免疫欠損ヌードマウスに異種移植片移植され、化合物ＡＣＥＡ１００１０８を用いて処置されたＢｃａｐ−３７ヒト乳房腫瘍を示す。
【図２６−１】図２６は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、ＡＣＥＡ１００１０８に対する各種細胞株の応答を示す。
【図２６−２】図２６は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、ＡＣＥＡ１００１０８に対する各種細胞株の応答を示す。
【図２７−１】図２７は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々のＤＢＴＳ誘導体に対するＨＴ１０８０細胞の応答を示す。
【図２７−２】図２７は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々のＤＢＴＳ誘導体に対するＨＴ１０８０細胞の応答を示す。
【図２７−３】図２７は、ＲＴ−ＣＥＳシステムで測定された、種々のＤＢＴＳ誘導体に対するＨＴ１０８０細胞の応答を示す。
【図２８】図２８は、いかなる薬物によっても処置されていない対照ＣＯＳ細胞における微小管の画像を示す。
【図２９】図２９は、種々の濃度のパクリタキセルを用いて４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３０】図３０は、種々の濃度のパクリタキセルを用いて２４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３１】図３１は、種々の濃度のビンブラスチンを用いて４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３２】図３２は、種々の濃度のビンブラスチンを用いて２４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３３】図３３は、種々の濃度のＤＢＴＳを用いて４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３４】図３４は、種々の濃度のＤＢＴＳを用いて２４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３５】図３５は、種々の濃度のＡＣＥＡ１００１０８を用いて４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３６】図３６は、種々の濃度のＡＣＥＡ１００１０８を用いて２４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３７】図３７は、種々の濃度のＡＣＥＡ１００１１６を用いて４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３８】図３８は、種々の濃度のＡＣＥＡ１００１１６を用いて２４時間処理されたＣＯＳ細胞の微小管の画像を示す。
【図３９Ａ】図３９ａは、純粋なチューブリン（ＭＡＰ不含）及びＤＢＴＳを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小管組み立てアッセイの結果を示す。
【図３９Ｂ】図３９ｂは、いかなる薬物も存在しない条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられた微小管の電子顕微鏡画像を示す。
【図３９Ｃ】図３９ｃは、３μＭ  ＤＢＴＳの存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられた微小管の電子顕微鏡画像を示す。
【図４０】図４０は、純粋なチューブリン（ＭＡＰ不含）及びＡＣＥＡ１００１０８を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小管組み立てアッセイの結果を示す。
【図４１】図４１は、純粋なチューブリン（ＭＡＰ不含）及びＡＣＥＡ１００１１６を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小管組み立てアッセイの結果を示す。
【図４２】図４２は、１μＭ  ＡＣＥＡ１００１０８、５０ｎＭ  パクリタキセル、１０ｎＭ  ビンブラスチン又はＤＭＳＯを用いて２４時間処理したＡ５４９ヒト肺癌細胞を６−ＣＦＤＡ（上段パネル）及びアネキシンＶ（下段パネル）染色した蛍光顕微鏡画像を示す。
【図４３】図４３は、２５μＭ  ＡＣＥＡ１００１０８、７．８ｎＭ  パクリタキセル、又はＤＭＳＯを用いて２４時間処理された後のＡ５４９ヒト肺癌細胞のフローサイトメトリーで分析された細胞周期分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（発明の実施の形態）
限定のためでなく、開示の明確さのために、本発明の詳細な説明を以下の小節に分けて記載する。
【００３８】
（Ａ．定義）
特に明記しないかぎり、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者により通常理解されているものと同一の意味を有する。本明細書中で参照されている全ての特許、特許出願、公開された出願及びその他の刊行物は、参照によりその全体を組み入れるものとする。本節において示されている定義が、参照によって本明細書中に組み入れられている特許、特許出願、公開された出願及びその他の刊行物において示されている定義と矛盾する、又はさもなければ一致しない場合は、本節において示されている定義が、参照によって本明細書中に組み入れられている定義よりも優先される。
【００３９】
本明細書中で使用する時、「ａ」又は「ａｎ」は「少なくとも一つ」又は「１以上」を意味する。
【００４０】
本明細書中で使用する時、用語「アルキル」とは、直鎖状、分枝鎖状、又は環状構造の飽和炭化水素基を意味し、特に意図されるアルキル基としては、低級アルキル基（すなわち、１０個以下の炭素原子を有するもの）が挙げられる。典型的アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、第２ブチル、第３ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等である。本明細書中で使用する時、用語「アルケニル」とは、上記定義のアルキルであって、少なくとも一つの二重結合を有するものを意味する。このようにして、特に意図されるアルケニル基としては、２〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分枝鎖状、又は環状のアルケニル基（例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル等）が挙げられる。同様に、本明細書中で使用する時、用語「アルキニル」とは、上記定義のアルキル又はアルケニルであって、少なくとも一つの三重結合を有するものを意味する。特に意図されるアルキニルとしては、合計２〜１０個の炭素原子を有する直鎖状、分枝鎖状、又は環状のアルキン（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等）が挙げられる。
【００４１】
本明細書中で使用する時、用語「シクロアルキル」とは、環状アルカン（すなわち、この場合、炭化水素の炭素原子鎖が環を形成している）を意味し、３〜８個の炭素原子を含むものが好ましい。このようにして、典型的シクロアルカンとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。さらに、シクロアルキルは１又は２つの二重結合を含み、「シクロアルケニル」基を形成する。また、シクロアルキル基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ及び他の一般的基によってさらに置換される。
【００４２】
本明細書中で使用する時、用語「アリール」又は「芳香族部分」とは、１以上の非炭素原子をさらに含んでいてもよい芳香族環系を意味する。したがって、意図されるアリール基としては（例えば、フェニル、ナフチル等）及びピリジルが挙げられる。さらに意図されるアリール基は、１個又は２個の５員又は６員のアリール又は複素環基と縮合（すなわち、第１の芳香環上の２原子と共有結合する）していてもよく、したがって、「縮合アリール」又は「縮合芳香族」と称される。
【００４３】
本明細書中でも使用されるように、用語「複素環」、「シクロヘテロアルキル」、及び「複素環部分」は、本明細書中において同義的に使用され、複数の共有結合を介して複数の原子が一つの環を形成しているいずれかの化合物を意味し、この場合、この環は炭素原子以外の少なくとも１つの原子を含む。特に意図される複素環の基部としては、非炭素原子として窒素、硫黄、又は酸素を有する５員及び６員環（例えば、イミダゾール、ピロール、トリアゾール、ジヒドロピリミジン、インドール、ピリジン、チアゾール、テトラゾール等）が挙げられる。さらに意図される複素環は、１個又は２個の環又は複素環と縮合（すなわち、第１の複素環上の２原子と共有結合する）していてもよく、したがって、本明細書中で使用する時、「縮合複素環基部」又は「縮合複素環部分」と呼ばれる。
【００４４】
本明細書中で使用する時、用語「アルコキシ」とは、アルコキシドと呼ばれる酸素原子と結合している直鎖状又は分枝鎖状のアルキルを意味し、この場合、炭化水素部分は任意の数の炭素原子を含んでいてもよく、二重結合又は三重結合をさらに含んでいてもよく、そしてアルキル鎖中に１個又は２個の酸素、硫黄又は窒素原子を含んでいてもよい。例えば、適当なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロポキシ、メトキシエトキシ等が挙げられる。同様に、用語「アルキルチオ」とは、直鎖状又は分枝鎖状のアルキルスルフィドを意味し、この場合、この炭化水素部分は任意の数の炭素原子を含んでいてもよく、二重結合又は三重結合をさらに含んでいてもよく、そしてアルキル鎖中に１個又は２個の酸素、硫黄又は窒素原子を含んでいてもよい。例えば、意図されるアルキルチオ基としては、メチルチオ、エチルチオ、イソプロピルチオ、メトキシエチルチオ等が挙げられる。
【００４５】
同様に、用語「アルキルアミノ」とは、直鎖状又は分枝鎖状のアルキルアミンを意味し、この場合、アミノ窒素「Ｎ」は１個又は２個のアルキルと置換することができ、炭化水素部分は任意の数の炭素原子を含んでいてもよく、二重結合又は三重結合をさらに含んでいてもよい。さらに、アルキルアミノの水素は別のアルキル基によって置換されていてもよい。したがって、典型的なアルキルアミノ基としては、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ等が挙げられる。
【００４６】
本明細書中で使用する時、用語「アリールオキシ」とは、酸素原子と結合しているアリール基を意味し、この場合、このアリール基はさらに置換されていてもよい。例えば、適当なアリールオキシ基としてはフェニルオキシ等が挙げられる。同様に、本明細書中で使用する時、用語「アリールチオ」とは、硫黄原子と結合しているアリール基を意味し、この場合、このアリール基はさらに置換されていてもよい。例えば、適当なアリールチオ基としてはフェニルチオ等が挙げられる。
【００４７】
本明細書中で使用する時、用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を意味する。
【００４８】
本明細書中で使用する時、用語「アミノ酸」とは、Ｄ−若しくはＬ−構造又はその混合状態を伴う置換された天然及び非天然アミノ酸であって、そこにおいてアミノ基及び酸性基が意図される化合物を誘導体化するために使用されるものを意味する。
【００４９】
全ての上記に定義される基は、さらに１以上の置換基により置換されていてもよく、言い換えれば置換されていてもよいことがさらに認識されるべきである。例えば、本明細書中で使用する時、「アルキル」はヘテロ原子で置換されたアルキルを包含する。
【００５０】
本明細書中で使用する時、用語「置換された」は、原子又は化学基（例えば、Ｈ、ＮＨ２、又はＯＨ）の官能基への置き換えを意味し、特に求核基（例えば、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＣ等）、求電子基（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｘ）ＯＨ等）、極性基（例えば、−ＯＨ）、非極性基（例えば、複素環、アリール、アルキル、アルケニル、アルキニル等）、イオン性基（例えば、−ＮＨ３＋）、及びハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ）、ＮＨＣＯＲ、ＮＨＣＯＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＯＯＨ、ＯＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＯＣＨ２ＣＯＮＨＲ、ＮＨＣＨ２ＣＯＯＨ、ＮＨＣＨ２ＣＯＮＨ２、ＮＨＳＯ２Ｒ、ＯＣＨ２−複素環、ＰＯ３Ｈ、ＳＯ３Ｈ、アミノ酸、及び技術的に知られた各種の組み合わせを含む官能基が意図される。さらに、用語「置換された」は、複数の度合の置換をも含み、複数の置換基が開示されるか又は特許請求される場合、その置換化合物は、開示されるか又は特許請求される置換基部分の１以上によって独立して置換され得る。
【００５１】
本明細書中で使用する時、用語「有機硫黄誘導体」は、２以上の「硫黄」原子を含有する有機化合物を意味する。本明細書中で使用する時、用語「ジスルフィド」「トリフルフィド」「テトラスルフィド」「ペンタスルフィド」は、２、３、４又は５個の硫黄原子が直鎖上に連結し（−Ｓ−Ｓ−Ｓ−）、そこにおいて、そのうちの１個又は２個または３個がさらにＳ＝Ｏ又はＳＯ２へと酸化されてよく、ジ−スルフィド誘導体、トリ−スルフィド誘導体、テトラ−スルフィド誘導体及びペンタ−スルフィド誘導体が、ジ−スルフィド、トリ−スルフィド、テトラ−スルフィド及びペンタ−スルフィドの２つの末端において、２個の官能基、アリール、アルケニル、複素環基または置換基で置換されたもの（Ｒ−Ｓ−（Ｓ）０−３−Ｓ−Ｒ）を意味する。２以上のトリスルフィド（−Ｓ−Ｓ−Ｓ−）部分は芳香族又は直鎖により共に連結されることができ、これもまた「トリスルフィド」又は有機硫黄を指す。１つ又は２つのトリスルフィド又は有機硫黄部分は共に連結されて環状系を形成し得る。
【００５２】
（Ｂ．置換有機硫黄誘導体及びその医薬組成物）
本発明の化合物は、以下の式で表される化合物
【００５３】
【化２１】
2011162562.tif 000022
式中、Ａ及びＢは、同じであるか又は異なり、且つ、独立して、置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール、又は単環式若しくは多環式であってもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい５〜１４員環であり；
各Ｓはオキシドの形態であってもよく；
Ｓ１及びＳ２は、独立して、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ２であり；
各Ｒは、Ｈ、ハロゲン、カルボキシル、シアノ、アミノ、アミド、無機置換基、ＳＲ１、ＯＲ１又はＲ１であり、この場合、各Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、炭素環又は複素環であり、そのうちの各々が置換されていてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよく；
ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０〜３である、化合物；
又は、以下の式（３）若しくは（４）で表される化合物：
【００５４】
【化２２】
2011162562.tif 000023
式中、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りである、化合物；
又は、以下の式（５）で表される化合物：
【００５５】
【化２３】
2011162562.tif 000024
式中、Ａ、Ｂ、Ｓ、ｎ及びｐは上記定義の通りであり；且つ、
Ｚは（ＣＲ１２）ｑ又は（ＣＲ１＝ＣＲ１）ｑ＊であり、この場合、ｑは０〜３であり、且つ、＊は、アルキニル、Ｏ、Ｓ、ＮＲによって置換されていてもよいＣ＝Ｃを表し；又は、Ｚは置換されていてもよいアリール、ヘテロアリール又は複素環であり；
式中、ＡとＢは一緒に環状環系を形成してもよい、化合物；
及びその薬学上許容し得る塩、エステル、プロドラッグ又は代謝産物；
但し、前記化合物が、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−クロロベンジル）トリスルフィド、（ｐ−クロロベンジル）ベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−ニトロベンジル）トリスルフィド、ジ（３−フェニル−２−プロペニル）−トリスルフィド、ジフェニルトリスルフィド、又はジ（ｐ−ｔ−ブチルフェニル）トリスルフィドでないもの、を提供する。
【００５６】
他の実施形態において、上記式１〜５中の各Ｒは非干渉性置換基であることができる。一般的に、「非干渉性置換基」とは、その存在により化合物が治療用物質として挙動する能力が無効にならない置換基である。例えば、非干渉性置換基は効力及びＰＫ特性を向上させることができる。別の例では、非干渉性置換基は毒性を低減させることができる。適当な非干渉性置換基としては、ハロ、ニトロ、カルボキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールアルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アリールアルキニル、複素環、アミノ酸が挙げられ、そのうちの各々がさらに１以上の非干渉性置換基によって置換されていてもよい。さらに、非干渉性置換基は、Ｒもまた上記定義の非干渉性置換基であるＣＯＯＲ、ＳＲ、ＯＲを含んでいてもよい。
【００５７】
上記式１〜５において、Ａ及びＢは、独立して、
【００５８】
【化２４】
2011162562.tif 000025
であり、
式中、Ｘ及びＷは、独立して、Ｓ、Ｏ、ＮＲ７、ＣＲ７であるか；
又は、６員の単環若しくは二環において１つのＷは結合であってもよく；且つ、
各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は前記定義の通りである。
【００５９】
他の実施形態において、それぞれＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は極性又は非極性の置換基であることができる。他の例において、それぞれＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は求核性又は求電子性の非干渉性置換基であることができる。
【００６０】
本発明は、式１〜５を有する化合物、並びにそれらの塩及びプロドラッグも包含する。このような塩は、例えば、化合物における正に荷電した置換基（例えば、Ａ及び／又はＢにおけるアミノ基）と薬学的に適切な陰イオンから形成され得る。適切な陰イオンとしては、限定するものではないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。薬学的に受容可能な塩は、化合物における負に荷電した置換基（例えば、Ａ及び／又はＢにおけるカルボキシル基）と陽イオンからも形成され得る。適切な陽イオンの非限定的な例は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、及びテトラメチルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオンなどの有機アンモニウムイオン、並びに、その他の有機カチオンである。
【００６１】
トリスルフィドはスキーム１に示される手順にしたがって合成することができる。例えば、芳香族式又は複素環式メチレンハライド（Ｘ＝Ｉ又はＢｒ又はＣｌ）をチオウレアと反応させる。得られたイソチオウロニウムハライドを水酸化ナトリウムで処理することにより対応するチオール誘導体が得られる（Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｂ．Ｓ．；Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ａ．Ｊ．；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｖ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｗ．Ｇ．；Ｔａｔｃｈｅｌｌ，Ａ．Ｒ．Ｖｏｇｅｌ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９７８，ｐｐ５８２−５８３）。
【００６２】
【化２５】
2011162562.tif 000026
対称トリスルフィド誘導体は方法Ａを使用して合成することができる。方法Ａにおいては、Ｎ−トリメチルシリルイミダゾールを二塩化硫黄と反応させる。得られたジイミダゾリルスルフィドを次にチオールと反応させて対応するトリスルフィドが得られる。方法Ｂを使用することにより、対称及び非対称トリスルフィドを合成することができる。方法Ｂにおいては、第１のチオールを二塩化硫黄と低温で定量的に反応させる。得られた中間体チオスルフェニルクロリドを次に第２のチオールと反応させて、第２の工程で使用されるチオールに応じて、所望の非対称又は対称トリスルフィドが得られる。
【００６３】
代表的な芳香族メチレンチオール１〜６（スキーム２）は、Ｖｏｇｅｌ’ｓ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｐｐ５８２〜５８３に記載されるものと同様の手順を使用して合成することができる。さらに、対称トリスルフィド誘導体７〜３２（スキーム２）は、報告されている手順（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ａ．；Ｋａｌｅｎａ，Ｇ．Ｐ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８０，２１，３００３−３００４）と同様の方法Ａにより合成した。例えば、二塩化硫黄（１４ｍｍｏｌ）の無水ヘキサン又はジクロロメタン溶液を、Ｎ−トリメチルシリルイミダゾール（２８ｍｍｏｌ）を含むヘキサンの攪拌溶液に室温で添加した。３０分間攪拌した後、反応混合物を０℃に冷却し、指定されたチオール（２８ｍｍｏｌ）を含む無水ヘキサンの溶液を３０分間滴下添加した。反応混合物を３０分間攪拌し、沈殿したイミダゾール副生成物を濾過して取り除いた。濾過物を水とブラインを用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、溶出液としてヘキサン−酢酸エチル１００：１〜２０：１を使用するシリカゲルカラム上でのフラッシュクロマトグラフィーにより残渣を精製することにより、所望のトリスルフィド７〜３２を収率６０〜９０％で取得した。芳香族トリスルフィド３３〜３９を同様の手順により収率３０〜７０％で合成した。
【００６４】
ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド（８）。トリスルフィド８を７７％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．４６（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．００（ｓ，４Ｈ）、７．０１（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．２７（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．８，５．４Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５．７ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４２．４、１１５．６、１１５．８、１３１．２、１３１．３、１３２．４、１６２．５（Ｃ−Ｆ、Ｊ＝２５０Ｈｚ）；１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６．５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ−１１４．２；ＥＳ  ＭＳ  ｍ／ｚ３３７／３３８（Ｍ＋Ｎａ）＋；Ｃ１４Ｈ１２Ｆ２Ｓ３に対する解析計算値：Ｃ、５３．４８；Ｈ、３．８５；Ｓ、３０．５９。実測値：Ｃ、５３．１６；Ｈ、４．２２；Ｓ、３０．２４。
【００６５】
ジ（ｐ−クロロベンジル）トリスルフィド（９）。トリスルフィド９を９０％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．４５（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ
ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ３．９８（ｓ，４Ｈ）、７．２２（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．２９（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。
【００６６】
【化２６】
2011162562.tif 000027
ジ（ｍ−トリフルオロメチルベンジル）トリスルフィド（１２）。トリスルフィド１２を９９％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．３３（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．０４（ｓ，４Ｈ）、７．４１−７．４９（ｍ，４Ｈ）、７．５１−７．５８（ｍ，４Ｈ）。
【００６７】
ジ（ベンゾ［Ｂ］チオフェン−３−イル−メタン）トリスルフィド（２２）。トリスルフィド２２を４５％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製により白色の固体が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．４５（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ３．７４（ｓ，４Ｈ）、７．０１（ｓ，２Ｈ）、７．３４−７．４５（ｍ，４Ｈ）、７．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．８５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８，１．１Ｈｚ）。ＥＳ  ＭＳ  ｍ／ｚ３９１（Ｍ＋Ｈ）＋、４１３（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【００６８】
ジ（ｐ−ブロモベンジル）トリスルフィド（２５）。トリスルフィド２５を８４％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．５５（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ３．９６（ｓ，４Ｈ）、７．１７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．４５（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）。
【００６９】
ジ（ｐ−メチルベンジル）トリスルフィド（２６）。トリスルフィド２６を９９％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．６６（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ２．３３（ｓ，６Ｈ）、４．０１（ｓ，４Ｈ）、７．１４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．２１（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）。
【００７０】
ジ（ｐ−ｔ−ブチルベンジル）トリスルフィド（２８）。トリスルフィド２８を９６％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．５０（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ１．３０（ｓ，１８Ｈ）、４．０２（ｓ，４Ｈ）、７．２５（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）、７．３５（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）。
【００７１】
ジ（ｏ−クロロベンジル）トリスルフィド（３０）。トリスルフィド３０を７７％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．４４（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ４．１７（ｓ，４Ｈ）、７．２３−７．２８（ｍ，４Ｈ）、７．３５−７．４３（ｍ，４Ｈ）。
【００７２】
【化２７】
2011162562.tif 000028
ジ（２，４，６−トリメチルベンジル）トリスルフィド（３２）。トリスルフィド３２を５９％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．６５（４０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ２．２７（ｓ，６Ｈ）、２．４２（ｓ，１２Ｈ）、４．２３（ｓ，４Ｈ）、６．８７（ｓ，４Ｈ）。
【００７３】
ジ（ｐ−メトキシフェニル）トリスルフィド（３３）。トリスルフィド３３を９８％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．３２（２０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ３．８０（ｓ，４Ｈ）、６．８１（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、７．４７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）。
【００７４】
ジ（４−トリフルオロメチルピリジン−２−イル）トリスルフィド（３４）。トリスルフィド３４を５３％の収率で合成した。クロマトグラフィー精製に続くヘキサンからの再結晶化により白色の結晶が得られた。シリカゲルＴＬＣのＲｆ＝０．６１（１０：１  ヘキサン−酢酸エチル）。１Ｈ  ＮＭＲ（４９９．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ７．７０（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．８４（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．４，２．４Ｈｚ）８．７３（ｓ，２Ｈ）。
【００７５】
表１〜８に示される非対称トリスルフィド誘導体は、化合物４１〜６８に対する手順と同様の手順にしたがい、対応するチオールを使用することにより、合成することができる。
【００７６】
【表１】
2011162562.tif 000029
【００７７】
【表２】
2011162562.tif 000030
【００７８】
【表３】
2011162562.tif 000031
【００７９】
【表４】
2011162562.tif 000032
【００８０】
【表５】
2011162562.tif 000033
【００８１】
【表６】
2011162562.tif 000034
【００８２】
【表７】
2011162562.tif 000035
【００８３】
【表８】
2011162562.tif 000036
スキーム４及び５に示される二置換（トリスルフィド）誘導体は同様の手順（方法Ｂ）によって合成することができる。例えば、１，３−ベンゼンジメタンチオール又は２−ブテン−１，４−ジチオール（１０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（２０ｍｍｏｌ）を含む３０ｍＬのジエチルエーテルの溶液を、二塩化硫黄（２０ｍｍｏｌ）を含む８０ｍＬの無水ジエチルエーテルの冷却された（−７８℃）攪拌溶液に３０分間かけて滴下添加する。この反応混合物を３０分間攪拌する。対応する第２のチオール（２０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（２０ｍｍｏｌ）を含む４０ｍＬのジエチルエーテルを−７８℃にて３０分間かけて滴下添加し、反応混合物をさらなる３０分間さらに攪拌する。ｐＨが中性になるまで、反応混合物を水（２回）、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液（２回）、次いで、水（２回）を用いて洗浄する。有機相をＣａＣｌ２又は無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮する。溶出液としてヘキサン−酢酸エチルを用いてシリカゲルの短い詰め物に残渣を通過させることにより二置換トリスルフィドを収率４０〜９０％で取得した。
【００８４】
【化２８】
2011162562.tif 000037
【００８５】
【化２９】
2011162562.tif 000038
トリスルフィド誘導体は、上記方法により、又はスキーム６に示されたアプローチにより合成することができる。テトラ−及びペンタ−スルフィド誘導体は報告されている手順（Ｓｉｎｈａ，Ｐ．；Ｊｕｎｄｕ，Ａ．；Ｒｏｙ，Ｓ．；Ｐｒａｂｈａｋａｒ，Ｓ．；Ｖａｉｒａｍａｎｉ，Ｍ．；Ｓａｎｋａｒ，Ａ．Ｒ．；Ｋｕｎｗａｒ，Ａ．Ｃ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  ２００１，２０，１５７−１６２）に基づく同様のストラテジーにより合成される。
【００８６】
【化３０】
2011162562.tif 000039
対称又は非対称スルフェンスルホンチオ無水物誘導体（スキーム７）は、報告されている手順（Ｋａｒｐｐ，Ｄ．Ｎ．；Ｇｌｅａｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．；Ａｓｈ，Ｄ．Ｋ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７１，３６，３２２−３２６；およびＨａｒｐｐ，Ｄ．Ｎ．；Ａｓｈ，Ｄ．Ｋ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７９，４４，４１３５−４１４０）に基づいて合成することができる。
【００８７】
本発明は、必要に応じて抗増殖性因子と共に、有効量の式１〜５を有する化合物と薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物も提供する。本明細書中で使用する場合、「有効量」とは、処置される被験体に治療的効果を及ぼすために必要とされる化合物の量を意味する。有効量又は用量は、当業者によって理解されるように、処置される腫瘍のタイプ、投与経路、及びその他の抗腫瘍性因子又は放射線療法の使用などのその他の治療的処置とともに可能な同時投与に依存して変動する。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、用語「抗増殖性因子」とは、腫瘍又は癌などの細胞増殖性疾患を処置又は改善するために使用することができる治療用因子を意味する。抗増殖性因子の例としては、限定するものではないが、抗腫瘍薬、アルキル化剤、植物性アルカロイド、抗菌剤、スルホンアミド、抗ウイルス剤、プラチナ剤、及び当該分野で公知のその他の抗癌剤が挙げられる。抗増殖性因子の特定の例としては、限定するものではないが、シスプラチン、カルボプラチン、ブスルファン、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メファラン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、クロラムブシル、パクリタキセル、ゲンシタビン、及び当該分野で公知のその他のものが挙げられる。（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第９版）（Ｇｏｏｄｍａｎら編）（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）（１９９６）；及び１９９９  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９８）を参照のこと）。
【００８９】
本明細書中に記載される化合物のいずれの適切な製剤も調製することができる。安定した非毒性の酸性又は塩基性塩を形成するために化合物が十分塩基性又は酸性である場合、塩としての化合物の投与が適切であり得る。薬学的に受容可能な塩の例は、生理学的に受容可能な陰イオンを形成する酸によって形成される有機酸付加塩、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びα−グリセロリン酸塩である。適切な無機塩も形成することができ、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、及び炭酸塩が挙げられる。薬学的に受容可能な塩は、当該分野において周知の標準的手順を使用して（例えば、適切な酸と共にアミンなどの十分に塩基性の化合物によって）、生理学的に受容可能な陰イオンが得られることにより得られる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム若しくはリチウム）又はアルカリ土類金属（例えば、カルシウム）塩も作られる。
【００９０】
本明細書中に記載される式１〜５を有する化合物は、一般的に、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、グリセロール，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒に可溶性である。一実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリアと共に式１〜５を有する化合物を混合することにより調製される製剤を提供する。一局面において、この製剤は、ａ）溶液を得るために、請求項１に記載の化合物を、水溶性有機溶媒、非イオン性溶媒、水溶性脂質、シクロデキストリン、トコフェロールなどのビタミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、リン脂質、又はこれらの組み合わせの中に溶解させる工程；及びｂ）生理食塩水又は１〜１０％の炭水化物溶液を含むバッファーを添加する工程；を含む方法を使用して調製することができる。一実施例において、この炭水化物はデキストロースを含む。本方法を使用して得られた薬学的組成物は安定であり、動物及び臨床での適用に対して有用である。
【００９１】
本発明の方法において使用するための水溶性有機溶媒の代表的な例としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、アセトニトリル、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、又はこれらの組み合わせである。アルコールの例としては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、又はプロピレングリコールが挙げられる。
【００９２】
本発明の方法において使用するための水溶性非イオン性界面活性剤の具体例は、限定するものではないが、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレート３５、ＰＥＧ−コハク酸、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール６６０  １２−ヒドロキシステアレート、ソルビタンモノオレエート、ポロキサマー、エトキシル化杏仁油、カプリル−カプロイルマクロゴール−８−グリセリド、グリセロールエステル、ＰＥＧ６カプリルグリセリド、グリセリン、グリコール−ポリソルベート、又はこれらの組み合わせである。非イオン性界面活性剤の特定の例は、ポリエチレングリコール改変ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）（ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレート３５）、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ、水素化ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＲＨ４０、水素化ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＲＨ６０、ＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標）ＨＳ（ポリエチレングリコール６６０  １２−ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＦＩＬ（登録商標）（エトキシル化杏仁油）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（登録商標）（カプリル−カプロイルマクロゴール−８−グリセリド）、ＧＥＬＵＣＩＲＥ（登録商標）（グリセロールエステル）、及びＳＯＦＴＩＧＥＮ（登録商標）（ＰＥＧ６カプリリルグリセリド）である。
【００９３】
本発明の方法において使用するための水溶性脂質の代表的な例としては、限定するものではないが、植物性油脂（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌ）、トリグリセリド、植物性油脂（ｐｌａｎｔ  ｏｉｌ）、又はこれらの組み合わせが挙げられる。脂質油の例としては、限定するものではないが、ヒマシ油、ポリオキシルヒマシ油、コーン油、オリーブ油、綿実油、落花生油、ペパーミント油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油、硬化植物油、硬化大豆油、ココナッツ油のトリグリセリド、ヤシ種子油、及びそれらの硬化形態又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９４】
本発明の方法において使用するための脂肪酸及び脂肪酸エステルの代表的な例としては、限定するものではないが、オレイン酸、モノグリセリド、ジグリセリド、ＰＥＧのモノ脂肪酸エステルもしくはジ脂肪酸エステル、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９５】
本発明の方法において使用するためのシクロデキストリンの代表的な例としては、限定するものではないが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、又はスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンが挙げられる。
【００９６】
本発明の方法において使用するためのリン脂質の代表的な例としては、限定するものではないが、大豆ホスファチジルコリン、又はジステアロイルホスファチジルグリセロール及びその硬化形態、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９７】
当業者であれば、特定の投与経路のための多くの製剤を得るために、本明細書の教示内の製剤を改変することができる。特に、水又は他のビヒクル中でより可溶性にするために、この化合物を改変することができる。患者において最大限の有益な効果をもたらすように本発明の化合物の薬物動態を管理するために特定の化合物の投与経路及び投薬レジメンを改変することも十分に当業者の能力の範囲内である。
【００９８】
（Ｃ．置換有機硫黄誘導体及びその薬学的組成物の使用方法）
本明細書中に記載される化合物は、癌又はその他のタイプの増殖性疾患を処置する際の細胞傷害性且つ／又は細胞増殖抑制性因子として使用することができる。これらの化合物は、あらゆるタイプの作用機構を通じて機能することができる。例えば、本化合物は、細胞周期のＧ２／Ｍの進行を抑制することができ、最終的に、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することができる（例えば、Ｗｅｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９７，２６３，３９８−４０４を参照のこと）。ある化合物はチューブリンの組み立てを妨害することができ、又、別の化合物はチューブリンの分解を妨害することができる。これにより、細胞有糸分裂を抑制することができ、又、細胞アポトーシスを誘導することができる（例えば、Ｐａｎｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，１０５６０−１０５６４を参照のこと）。本化合物は内皮細胞増殖及び血管新生の影響も抑制することができる（例えば、Ｗｉｔｔｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１９９８，１７，１５５−１６１を参照のこと）。
【００９９】
本発明は、式１〜５を有するいずれかの化合物、例えば、限定するものではないが、ジベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−クロロベンジル）トリスルフィド、（ｐ−クロロベンジル）ベンジルトリスルフィド、ジ（ｐ−ニトロベンジル）トリスルフィド、ジ（３−フェニル−２−プロペニル）−トリスルフィド、ジフェニルトリスルフィド、又はジ（ｐ−ｔ−ブチルフェニル）トリスルフィドを含む、細胞増殖性疾患の処置のための薬学的組成物も提供する。
【０１００】
本発明の方法を実施するために、式１〜５を有する化合物及びその薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔的に、経膣的に、移植されたリザーバーを介して、又はその他の薬物投与方法により投与することができる。本明細書中で使用する場合、用語「非経口的な」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、及び頭蓋内注射又は注入技法を含む。
【０１０１】
無菌の注射可能な組成物、例えば、無菌の水性又は油性懸濁液は、適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用する当該分野において公知の技法にしたがって製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物は、非毒性の、非経口的に受容可能な希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液であることもできる。使用することができる受容可能なビヒクル及び溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、溶媒又は懸濁媒体として、通常、無菌の不揮発性油が使用される（例えば、合成のモノグリセリド又はジグリセリド）。脂肪酸、例えば、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体は、オリーブ油又はヒマシ油などの薬学的に受容可能な油と同様に、特に、そのポリオキシエチル化された形態において、注射物質の調製に有用である。これらの油性溶液又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、又はカルボキシメチルセルロース若しくは同様の分散剤を含むこともできる。薬学的に受容可能な固体、液体、又はその他の剤形の製造において通常使用されている様々な乳化剤又はバイオアベイラビリティー促進剤も製剤化のために使用することができる。
【０１０２】
経口投与のための組成物は、いずれかの経口的に受容可能な剤形であることができ、例えば、限定するものではないが、錠剤、カプセル剤、エマルジョン及び水性懸濁液、分散液及び溶剤が挙げられる。経口用途のための錠剤の場合、一般的に使用されるキャリアとしてはラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤も添加することができる。カプセル形態での経口投与のために有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。水性懸濁液又はエマルジョンを経口投与するとき、活性成分は、乳化剤又は懸濁化剤と共に油相中に懸濁又は溶解させることができる。必要であれば、特定の甘味剤、矯味矯臭剤、又は着色剤を添加することができる。経鼻エアロゾル又は吸入組成物は医薬製剤の技術分野において周知の技術にしたがって調製することができ、適切な保存剤（例えば、ベンジルアルコール）、バイオアベイラビリティーを増大させるための吸収促進剤、及び／又は、当該分野で公知のその他の可溶化剤若しくは分散剤を使用して、例えば、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【０１０３】
さらに、式１〜５を有する化合物は、様々な癌又は症状の処置のために、単独又はその他の抗癌剤と共に投与することができる。本発明による組み合わせ療法は、少なくとも一つの本発明の化合物又はその機能的誘導体と、少なくとも一つのその他の薬学的に活性な成分との投与を含む。活性成分と薬学的に活性な因子は別々に又は一緒に投与することができる。活性成分と薬学的に活性な因子の量、並びに、投与の相対的なタイミングは、所望の組み合わせ療法の効果を達成するために選択される。
【０１０４】
一実施形態において、本発明は、白血病、リンパ腫、肺癌、大腸癌、ＣＮＳ癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、膵臓癌、腎臓癌、及びその他のタイプの増殖性疾患などが挙げられるが、これらに限定されない組織又は臓器の癌を処置又は改善する方法に関し、この方法は、治療的有効量の式１〜５を有する化合物を投与する工程を包含する。
【０１０５】
別の実施形態において、本発明は、冠動脈疾患を有する患者に対する冠動脈ステント挿入後の再狭窄を、ジベンジルトリスルフィド及びその他のトリスルフィド誘導体などの式１〜５を有する化合物を用いて処置する方法に関する。冠動脈疾患を有する患者に対する冠動脈ステント挿入後の再狭窄の主要な原因の一つは、平滑筋細胞の増殖及び移動と細胞外マトリックス産生から生じ得る新生内膜過形成である（例えば、Ｆａｒｂ，Ａ．，Ｓａｎｇｉｏｒｇｉ，Ｇ．，Ｃｅｒｔｅｒ，Ａ．Ｊ．らによる“Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｔｅｎｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９９，９９，４４−５２を参照のこと）。抗増殖能を有する化合物は、その化合物が適切な手段によって送達される場合、臨床的且つ血管造影的再狭窄のリスク低減に効果を有し得る（例えば、Ｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｗ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｃｏｘ，Ｄ．Ａ．らによる“Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ，ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ
ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２００４，３５０，２２１−２３１を参照のこと）。したがって、ジベンジルトリスルフィド及び式１〜５を有する化合物はまた、新生内膜過形成を伴う細胞増殖を抑制し、それにより、新生内膜過形成及び再狭窄の発生を低減させるのに有用であり得る。
【０１０６】
式１〜５を有する化合物をそれらのターゲット、例えば、細胞に効果的に送達するために様々な方法を使用することができる。例えば、ジベンジルトリスルフィド又は式１〜５を有する別の化合物を含む組成物は、経口的に、非経口的に、又は移植されたリザーバーにより投与することができる。その他の実施例においては、参照により本明細書中に援用される以下の文献に記載される方法を使用することもできる：Ｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｗ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｃｏｘ，Ｄ．Ａ．らによる“Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ，ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ
ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００４，３５０，２２１−２３１；Ｍｏｒｉｃｅ，Ｍ．−Ｃ．，Ｓｅｒｒｕｙｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｓｏｕｓａ，Ｊ．Ｅ．らによる“Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｔｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００２，３４６，１７７３−１７８０；Ｍｏｓｅｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｌｅｏｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｐｏｐｍａ，Ｊ．Ｊ．らによる“Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ−ｅｌｕｔｉｎｇ  ｓｔｅｎｔｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓｔｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｎａｔｉｖｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ”，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００３，３４９，１３１５−１３２３。
【０１０７】
ジベンジルトリスルフィド及び上記の置換有機硫黄アナログにおける前記抗癌効果は、標準的なエンドポイントアッセイ様式（以下の詳細な説明を参照のこと）、又は抗癌剤に曝した後の動的な細胞応答情報を提供するリアルタイム電子的細胞センシング（ＲＴ−ＣＥＳ）システムによって癌細胞株パネルを用いて、インビトロで予備的にスクリーニングされ得る。抗癌剤発見及び検証のために、いくつかのエンドポイント細胞ベースのスクリーニングアッセイ様式を使用することができる。例えば、国立癌研究所（ＮＣＩ）は６０の癌細胞株パネルを用いたエンドポイント細胞傷害性アッセイ系を提供しており、これは抗癌剤の大規模な細胞をべースとするスクリーニングに用いられ得る（例えば、Ｍｏｎｋｓ、Ａら、Ｊ  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９１、８３、７５７−７６６；Ａｌｌｅｙ、Ｍ．Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８８、４８、５８９−６０１；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｒ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．１９８８、２７６、２６５−２８６；及びＳｔｉｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８９、３０、６１３を参照のこと）。
【０１０８】
このスクリーニング方法において、所望の細胞濃度へと稀釈された細胞懸濁液を、各ウェルが１０００個台（例えば、５０００個）から１００００個台（例えば、４０，０００個）の間の数の細胞を含む約１００マイクロリットルの溶液を有するように９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に加える。個々のウェルに添加される細胞の数は、細胞のタイプ、細胞の大きさ、細胞の生育特性に依存する。プレート中の細胞を、標準的な細胞培養インキュベーター中で、３７℃、飽和湿度及び５％のＣＯ２雰囲気下で約２４時間インキュベートする。対象化合物を連続的な希釈濃度で試験溶液へと調製する。１例において、連続希釈溶液における稀釈係数は１０倍（又は２、３、４倍）であり、最高濃度から最低濃度まで１０，０００倍の比率を有する５（又は６〜１０）種類の異なる濃度である。その他の稀釈係数及びその他の各種濃度も使用される。通常、試験化合物の最高濃度は１０−４Ｍである。ウェルへの最初の細胞播種から２４時間後に、約１００マイクロリットルの試験溶液を各ウェル中に添加する。各化合物濃度の試験溶液を、２連で行う目的で、少なくとも２つのウェルに添加する。試験化合物はＤＭＳＯなどの有機溶媒に溶解し得、１００マイクロリットルの試験溶液を、有機溶媒をべースとした溶液又は懸濁液と混合した水性溶液としてもよい。
【０１０９】
化合物の添加後、次いで細胞を、さらに４８時間、３７℃、５％のＣＯ２雰囲気及び飽和湿度下で化合物と共にインキュベートする。この細胞を次いで、例えば、スルホローダミンＢアッセイ（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９０，８２，１１１３−１１１８；及びＳｋｅｈａｎ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９０，８２，１１０７−１１１２に記載するように）等の各種のアッセイにより、その生存細胞数をアッセイする。次いで吸光度を読むためにプレートリーダーを用い、また５０％の生育阻害が起こる薬物濃度であるＩＣ５０の値（又は開始時に計数される細胞に対する補正を重視したＧＩ５０値）を投与量応答曲線に基づいて導き出す。従って、ＧＩ５０値は試験化合物の生育阻害強度を測定するために用いられる。Ｂｏｙｄら，Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ：Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；Ｖｌｅｒｉｏｔｅ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｔ．Ｈ．，Ｂａｋｅｒ  Ｌ．Ｈ．（編）；Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｈｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．，１９９２，ｐｐ１１−３４中の記載を参照されたい。
【０１１０】
その他のアッセイ様式においては、エンドポイントアッセイ法を用いて、試験化合物の細胞傷害性及び／又はある種の癌細胞タイプにおける細胞増殖抑制効果についてアッセイする。ＮＣＩ癌細胞パネルにおける細胞を使用してもよい。一定の長さの時間（例えば、８時間又は２４時間）のプレインキュベーション後に、細胞を連続的に稀釈した濃度（例えば、５つの１０倍稀釈系列）の試験化合物と、２４時間及び／又は４８時間、あるいは及び／又はその他の特定の長さの時間インキュベートする。次いで、試験化合物の投与量依存的な細胞傷害性及び／又は細胞増殖抑制効果を、例えばＢｏｙｄ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｖｉｔａ，Ｊ．Ｔ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｓ．及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．（編），１９８９，Ｖｏｌ，３，ＰＰＯ  Ｕｐｄａｔｅ，Ｎｏ．１０中）により先に記載されたような、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ法を用いて試験し評価することができる。
【０１１１】
その他のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが、細胞周期進行の停止における化合物の効果を評価するために使用され得る。より具体的には、ある種の細胞株の細胞に対し試験化合物を濃度依存的な方法で添加する。細胞を一定の特定時間インキュベートした後に、細胞をヨウ化プロピジウムにより染色し、フローサイトメトリー試験のために使用した。Ｇ０前／Ｇ１、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期における細胞集団を調べる。全ての上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞をベースとした、単回時刻ポイント（又は複数のプレートを用いた複数時刻ポイント）のエンドポイントアッセイである。
【０１１２】
試験化合物はまた、細胞−基質又は細胞−電極インピーダンスの電子的測定に基づく新規なｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞ベースのスクリーニングアッセイ系を用いてスクリーニングしてもよい。全てのエンドポイントアッセイ系とは対照的に、この細胞ベースのスクリーニングアッセイ系は、抗癌剤に対する癌細胞の動的な応答を、細胞を標識することなくリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。このシステムはまた、大規模な、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでの細胞をベースとした抗癌剤のハイスループットスクリーニングに使用することができる。このアプローチはマイクロエレクトロニクスと組み合わせた分子生物学及び細胞生物学の融合を特徴とし、生物学的アッセイプロセスの電子的な検出に基づいている。
【０１１３】
この細胞の電子的な検知技術の詳細は、リアルタイム細胞電子センシング（ＲＴ−ＣＥＳＴＭ）と称され、関連する装置、システム及び使用方法は２００２年７月２０日に提出された米国特許仮出願第６０／３９７，７４９号、；２００２年１２月２０日に提出された米国特許仮出願第６０／４３５，４００号；２００３年５月９日に提出された米国特許仮出願第６０／４６９，５７２号、２００３年７月１８に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２２５５７号；２００３年７月１８日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２２５３７号；２００４年１１月１２日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／３７６９６号；２００５年２月９日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４４８１号；２００３年１１月１０日に提出された米国特許出願第１０／７０５，４４７号；２００３年１１月１０日に提出された米国特許出願第１０／７０５，６１５号；２００４年１１月１２日に提出された米国特許出願第１０／９８７，７３２号；２００５年２月９日に提出された米国特許出願第１１／０５５，６３９号に記載されており、それらの各々は、参考として援用される。さらなるＲＴ−ＣＥＳ技術の詳細はさらに、２００３年１１月１２日に提出された米国特許仮出願第６０／５１９，５６７号、及び２００４年２月９日に提出された米国特許仮出願第６０／５４２，９２７号、２００４年２月２７日に提出された米国特許仮出願第６０／５４８，７１３号、２００４年８月４日に提出された米国特許仮出願第６０／５９８，６０８号；２００４年８月４日に提出された米国特許仮出願第６０／５９８，６０９号；２００４年９月２７日に提出された米国特許仮出願第６０／６１３，７４９号；２００４年９月２７日に提出された米国特許仮出願第６０／６１３，８７２号；２００４年９月２９日に提出された米国特許仮出願第６０／６１４，６０１号；２００４年１１月２２日に提出された米国特許仮出願第６０／６３０，０７１号；２００４年１１月２２日に提出された米国特許仮出願第６０／６３０，１３１号において開示され、それらの各々は、本明細書中で参考として援用される。
【０１１４】
ＲＴ−ＣＥＳ技術を用いた細胞−基質又は細胞−電極インピーダンスの測定のために、適切な形状を備えた微小電極が、マイクロタイタープレート又は類似の装置の底表面上に、ウェルに向かう方向で備えられる。細胞はこの装置のウェルへと導入され、電極表面と接近し、また接触する。細胞の存在、非存在又は特性の変化は電極センサー表面上の電子及びイオンの通過に影響を及ぼす。電極間又は電極の中におけるインピーダンスの測定は、センサー上に存在する細胞の生物学的状態についての重要な情報を提供する。細胞アナログの生物学的状態に変化がある場合、電子的な読み出しシグナルは自動的に且つリアルタイムで測定され、処理及び解析のためにデジタルシグナルに変換される。ＲＴ−ＣＥＳシステムにおいて、細胞指数は、測定される電極インピーダンス値に基づいて自動的に導き出され提供される。所定のウェルについて得られた細胞指数は：１）このウェル中で何個の細胞が電極表面に付着しているか；２）このウェル中で細胞がどの程度良好に電極表面に付着しているか、を反映する。すなわち、類似の生理学的条件において同タイプの細胞がより多く電極表面に付着するほど、細胞指数はより大きくなる。そして、電極表面へと細胞がより良く付着するほど（例えば、細胞がより大きな接触面積を有するように広がる、又は細胞が電極表面に、より強固に付着する）、細胞指数はより大きくなる。
【０１１５】
ＲＴ−ＣＥＳシステムの使用を通じ、ジベンジルトリスルフィドが多様な癌のタイプの増殖を阻害することが示されている。ジベンジルトリスルフィドは従来、標準的なエンドポイントアッセイを用いては見出されていなかった。ジベンジルトリスルフィドは抗増殖活性を有さないというネガティブな結論が先の研究者によってなされていた（“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＨＬ−６０  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ”、Ｍａｔａ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、Ｅ．、Ｉｔｏ、Ａ．、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｕｒｇ、Ｈ．、Ｃｕｉ、Ｂ．、Ｍｅｈｔａ、Ｒ．Ｇ．，Ｋｉｎｇｈｏｒｎ、Ａ．Ｄ．及びＰｅｚｚｕｔｏ、Ｊ．Ｍ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１、２１、１７６３−１７７０）。
【０１１６】
ジベンジルトリスルフィドの抗癌効果を評価し、可能性ある抗癌作用のメカニズムを予測するために、１２種の癌細胞株のパネルを利用し、ジベンジルトリスルフィドを既知の作用メカニズムと並べて、１０種の抗癌化合物を試験した。（ある種の濃度における）ジベンジルトリスルフィドの時間依存的な、細胞応答性のパターンは、パクリタキセル、ビンブラスチン及びコルセミド（ある特定の濃度における）のものといくぶん類似していた。従って、ジベンジルトリスルフィドはパクリタキセル、ビンブラスチン及びコルセミドに類似する抗癌作用メカニズムを有し得る。ジベンジルトリスルフィドはパクリタキセル、ビンブラスチン及びコルセミドとは異なるその他の作用メカニズムを通じて癌細胞に作用し得る。ジベンジルトリスルフィドが、パクリオタキセル、ビンブラスチン及びコルセミドに類似するメカニズムを含む複数の作用メカニズムを通じて癌細胞に作用する可能性もある。
【０１１７】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞モデル及びアッセイ様式に対し、化合物の抗腫瘍活性がさらに調べられ、移植された癌を伴うｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルによって評価され得る。ほとんどのｉｎ  ｖｉｖｏモデルはマウスモデルである。
【０１１８】
（リアルタイム細胞電子センシング（ＲＴ−ＣＥＳ）システムを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞に基づくスクリーニング）
ＲＴ−ＣＥＳシステムは電子的センサー分析装置、デバイスステーション及び１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレートデバイスの３つの要素を含む。微小電極センサーアレイがスライドガラス上にリソグラフ微細加工法を用いて加工され、電極を含むスライドは電極を含むウェルを形成するためにプラスチック製のトレイへと組み立てられる。ＲＴ−ＣＥＳシステムに使用する１６ウェル（又は９６ウェル）の各マイクロタイタープレートデバイスは、１６（又は９６）ウェルまでのこのような電極を含むウェルを含む。デバイスステーションは１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレートデバイスを受け入れ、インピーダンス測定のためウェルの任意のひとつをセンサー分析装置へと電子的に切り替えることができる。操作において、ウェル中で培養された細胞を伴うデバイスは、インキュベーター内部に配置されたデバイスステーションへと配置される。電気的ケーブルがこのデバイスステーションをセンサー分析装置へと連結する。ＲＴ−ＣＥＳソフトウェアの制御下で、センサー分析装置は測定されるウェルを自動的に選択し得、連続的にインピーダンス測定を実施し得る。分析装置から得られたインピーダンスデータはコンピューターへと送られ、統合ソフトウェアにより解析され処理される。
【０１１９】
個々のウェル中の電極間で測定されるインピーダンスは、電極の形状、ウェル中のイオン濃度、及び電極に付着している細胞があるかどうかに依存する。細胞が存在しない場合、電極インピーダンスは主として、電極／溶液インターフェースにおいて、及びバルク溶液中での両方のイオン環境により決定される。細胞が存在する場合、電極センサー表面に付着した細胞は電極／溶液インターフェースにおける局部的なイオン環境を変化させ、インピーダンスの増加を導くであろう。電極上に存在する細胞が増えるほど、細胞−電極インピーダンスは増加する。さらに、インピーダンスの変化は、細胞の形態及び電極に付着した細胞の面積にも依存する。
【０１２０】
測定された細胞−電極インピーダンスに基づく細胞の状態を評価するために、細胞指数と称するパラメーターが以下の式
【０１２１】
【化３１】
2011162562.tif 000040
に従い導き出される。式中、Ｒｂ（ｆ）及びＲｃｅｌｌ（ｆ）はそれぞれ、細胞が存在しない場合又は細胞が存在する場合の周波数依存性電極抵抗（インピーダンスの一要素）である。Ｎはインピーダンスが測定される頻度の点の数である。従って細胞指数は、電極を含むウェル中の細胞における状態の定量的測定である。同一の生理学的条件下で電極に付着した細胞数がより多いことは、より大きいＲｃｅｌｌ（ｆ）値を導き、細胞指数についてのより大きな値を導く。さらに、ウェル中に存在する同数の細胞については、形態のような細胞の状態における変化が細胞指数における変化を導く。例えば、細胞吸着又は細胞拡長における増加は、より大きい細胞−電極接触面積を導き、Ｒｃｅｌｌ（ｆ）の増大を導き、従って、細胞指数について、より大きな値を導く。細胞指数はまた、本明細書中に記載のものと異なる式を用いて計算することもできる。インピーダンス測定に基づいて細胞指数を計算するその他の方法は、２００４年１１月１２日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／３７６９６号、２００５年２月９日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０４４８１号、２００４年１１月１２日に提出された米国特許出願第１０／９８７，７３２号、及び２００５年２月９日に提出された米国特許出願第１１／０５５，６３９号中に見出すことができる。
【０１２２】
ＮＣＩ−Ｈ４６０（非小細胞肺癌細胞）、ＭＶ５２２ＳＷ（非小細胞肺癌細胞）、ＭＣＦ７（乳癌細胞）、Ａ５４９（非小細胞肺癌細胞）、ＰＣ３（前立腺癌細胞）、Ａ４３１（類表皮癌細胞）、ＨＴ１０８０（線維肉腫細胞）、ＭＤＡ．ＭＢ２３２１（乳癌細胞）、ＨＴ２９（結腸癌細胞）、ＨＣＣ２９９８（結腸癌細胞）、ＯＶＣＡＲ４（卵巣癌細胞）、Ａ２７８０（卵巣癌細胞）及びＨｅｐＧ２（ヒト肝臓肉腫）を含む、異なるタイプのヒト癌細胞を、異なる数（ウェルあたり４０００〜２０，０００個）で１６又は９６ウェルマイクロタイタープレートデバイス中に播種し、ＲＴ−ＣＥＳＴＭシステムによりモニタリングした。細胞を、ＤＭＳＯ溶液中に溶解したジベンジルトリスルフィド（最終ＤＭＳＯ濃度：０．２％；最終ジベンジルトリスルフィド濃度：１．５６２５μＭ〜１００μＭ）を添加する前に、約２４時間生育させた。細胞−電極インピーダンスを連続的に測定し、相当する時間依存的な細胞指数を導き出して記録した。
【０１２３】
図１〜５、６Ａ、及び７〜１２は、ジベンジルトリスルフィドを各種濃度で添加する前及び後の、多数の細胞株についての時間依存性の細胞指数を示す。図に示すように、ジベンジルトリスルフィドは多数の癌細胞株における増殖に阻害的影響を呈した。ジベンジルトリスルフィドに対する感受性は癌細胞のタイプにより異なる。いくつかの癌細胞タイプについては、低投与量のジベンジルトリスルフィドで顕著に癌細胞増殖を阻害するために十分であり、他方その他の癌細胞タイプにおいては、類似の阻害の程度を達成するためには、より高投与量が必要とされる。
【０１２４】
一例において、図１Ｂ及び１Ｃは、各種濃度のコルセミド及びパクリタキセルの添加前及び添加後のＨ４６０（非小細胞肺癌細胞株）細胞に関する時間依存性の細胞指数を示す。図１Ｂ及び１Ｃに示すように、コルセミド及びパクリタキセルは、試験された濃度におけるＡ４３１細胞の増殖に対して阻害能力を呈した。さらに、これらの図は、化合物（コルセミド又はパクリタキセル）添加後、Ｈ４６０細胞に関する細胞指数がまず時間と共に減少し、次いで増加して、Ｈ４６０細胞がコルセミド及びパクリタキセルのいずれかに対し複雑な動的応答を有することを示す。図１Ａに示す、２５μＭ以上のジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）濃度の影響下でのＨ４６０細胞に関する細胞指数曲線が図１Ｂ及び１Ｃにおける曲線にいくぶん類似していることは特筆すべきであり、すなわち、ＤＢＴＳ（２５μＭ以上）の添加後に、Ｈ４６０細胞に関する細胞指数がまず時間と共に減少し、次いで増加する。
【０１２５】
その他の例において、図６Ｂは、各濃度の５−フルオロウラシルの添加前及び添加後のＡ４３１（類表皮癌細胞株）細胞に関する時間依存性の細胞指数を示す。図６Ｂに示すように、５−フルオロウラシルは１２．５μＭ以上の濃度においてＡ４３１細胞の増殖に対して阻害能力を呈した。図６Ｂに示す時間依存的な細胞指数曲線は、図６Ａにおけるものと顕著に異なっている。
【０１２６】
その他の例において、図１３はジベンジルトリスルフィドの影響下におけるＨｅｐａＧ−２細胞株の細胞指数データを示す。図１３に示すように、ジベンジルトリスルフィドはＨｅｐａＧ−２細胞において抗増殖能力を示さなかった。
【０１２７】
（抗癌活性に関するｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング）
ＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８（ＤＢＴＳの誘導体、表３３参照）を含む試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌効果を評価するため、マウス肉腫Ｓ１８０モデル、マウスルイス肺癌モデル、Ｐ３８８リンパ性白血病モデル、及び免疫欠損ヌードマウスにおける３種のヒト腫瘍異種移植片モデル（Ｂｃａｐ−３７ヒト乳癌、ＨＣＴ−８ヒト結腸癌、ａｏ１２／１７ヒト卵巣癌）を含む各種マウスモデルを使用した。試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌効果における詳細を以下に示す。
【０１２８】
（ＤＢＴＳ及び化合物ＡＣＥＡ１００１０８の急性毒性試験）
ＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８（ＤＢＴＳの誘導体、表３３参照）の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける急性の、静脈内毒性を評価するために、ＤＢＴＳ又はＡＣＥＡ１００１０８の静脈内注入（ｉ．ｖ．）による単回投与に対するマウスの急性応答をモニタリングすることにより、腫瘍を有さない、正常なＫｕｎｍｉｎｇマウスにおける試験を実施した。処置したマウスに関する死亡数をモニタリングし記録した。これらの化合物に対するＬＤ５０値を計算した。研究の詳細を以下に示す。
【０１２９】
以下の実施例は例示のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３０】
（実施例１）
（マウス肉腫Ｓ１８０及びマウスルイス肺癌に対するＤＢＴＳの抗癌活性）
試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏの抗癌効果を評価するため、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価に関し２つのマウス移植腫瘍モデル：マウス肉腫Ｓ１８０モデル及びマウスルイス肺癌モデルを使用した。試験用のマウスはＳｈａｎｇｈａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの薬理学研究室において維持した。マウスの供給源及び種類は以下のようである。Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから供給されたマウスＣ５７ＢＬ／６及びＫｕｎｍｉｎｇ株、認定番号：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｉｎｉｃａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ、Ｎｏ．５。マウスの体重は１８〜２０ｇであった。オス及びメスの両方のマウスを使用した。しかし、試験毎に同性の動物を使用した。試験された動物の数は以下である：試験化合物群に関し、高投与量群について１０匹、中投与量群について１０匹、及び低投与量群について１０匹を含む３０匹のマウス；陽性化合物群について１０匹のマウス；陰性対照群について、生理食塩水群について１０匹及び溶媒のみの群について１０匹を含む２０匹のマウス。ＤＢＴＳの高、中及び低投与量はそれぞれ、５０、２５及び１２．５ｍｇ／ｋｇ／日であった。
【０１３１】
試験対照  陰性対照として、２つの群：溶媒のみの対照群と生理食塩水対照群を設定した。溶媒のみの対照群において、各マウスには、高投与量ＤＢＴＳ試験で使用された溶媒と、同量かつ同濃度（肉腫Ｓ１８０モデルについて１０％及びルイス肺癌モデルについて５％）の溶媒のみを、連続した７又は１０日間にわたり、１日１回静脈内投与した。生理食塩水群においては、各マウスは０．５ｍｌの生理食塩水を１日１回、７又は１０日間連続投与された。陽性対照群については、抗癌化合物のシクロホスファミド（ＣＴＸ）が、３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、７又は１０日間連続で腹腔内投与された。
【０１３２】
試験化合物の調製及び投与  抗腫瘍効果癌モデルを評価するために、試験化合物溶液を次のように調製した。マウス肉腫Ｓ１８０マウスモデルにおいて、２００ｍｇのＤＢＴＳを１０ｍＬのヒマシ油（ポリオキシエチル化されたもの）中にまず溶解し、次いで９０ｍＬの生理食塩水と混合した。最終的な溶液中のＤＢＴＳ濃度は０．２％であり、最終的な溶媒濃度は１０％であった。各マウスにそれぞれ０．５ｍＬ（高投与量）、０．３ｍＬ（中投与量）及び０．１５ｍＬ（低投与量）の化合物溶液を静脈内投与した。
【０１３３】
マウスルイス肺癌モデルにおいて、２００ｍｇのＤＢＴＳを５ｍＬのヒマシ油（ポリオキシエチル化されたもの）中に溶解した。毎回使用前に、この溶液を生理食塩水で希釈して、最終ＤＢＴＳ濃度をそれぞれ０．２％（高投与量）、０．１％（中投与量）及び０．０５％（低投与量）にした。この場合、各マウス（体重約２０ｇ）に、所定の化合物濃度を有する０．５ｍＬの化合物溶液を静脈内投与した。静脈注入の速度は約０．５ｍＬ／０．５分であった。
【０１３４】
試験化合物の投与量は、薬理学における当業者によく知られた知識の範囲内である。例えば、試験化合物は、ある試験化合物溶液を１日２回、７日間連続で静脈注入することにより投与してもよい。別の方法においては、試験化合物を、ある試験化合物を１日１回、１０日間連続で静脈注入することにより投与してもよい。
【０１３５】
移植用腫瘍細胞の調製及び化合物の効果測定  腫瘍細胞を調製するために、迅速に成長した腫瘍をまず移植腫瘍マウス（肉腫Ｓ１８０モデル又はルイス肺癌モデル）から除去し、この腫瘍組織を切開し、切開された組織から腫瘍細胞濃度が２〜４×１０７個／ｍｌである腫瘍細胞懸濁液を調製した。次いで、０．２ｍＬの腫瘍細胞懸濁液（４００〜８００万個の腫瘍細胞）を皮下注入により試験用マウスに戻して移植した。移植２４時間後、マウスに所定の投与量のＤＢＴＳ、生理食塩水、又は陰性対照として供される溶媒のみを静脈内投与し、あるいは陽性対照として供される５０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを腹腔内投与した。移植２週間後、マウスを屠殺し、移植された腫瘍を試験マウスから除去した。除去された各固形腫瘍の重量を測定し、ＤＢＴＳ処置群とＣＴＸ処置群における腫瘍阻害率を以下の式：
腫瘍阻害率％＝（陰性対照群における腫瘍重量の平均−化合物処置群における腫瘍重量の平均）／陰性対照群における腫瘍重量の平均  ×  １００（２）
に従って計算した。
【０１３６】
マウス肉腫Ｓ１８０モデルについては、Ｓ１８０細胞をマウス１匹あたり約５００万個の細胞数で皮下移植した。移植２４時間後、試験群の各マウスにジベンジルトリスルフィドを、それぞれ１日あたり５０、２５又は１２．５ｍｇ／ｋｇ、連続した７又は１０日間、静脈内投与した。陽性対照群としては、各マウスにシクロホスファミド（サイトキサン、ＣＴＸ）を１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ、７日間連続して腹腔内投与した。陰性対照群としては、各マウスに、生理食塩水又は試験群における１日あたりのジベンジルトリスルフィドに対する濃度と同濃度の溶媒のみのいずれかを、７日間連続して、静脈内投与した。各群について１０匹のマウスを使用した。
【０１３７】
マウスルイス肺癌モデルに関して、ルイス肺癌細胞をマウス１匹あたり約５００万個の細胞数で皮下移植した。移植２４時間後、試験群における各マウスにジベンジルトリスルフィドを、１日あたり５０、２５又は１２．５ｍｇ／ｋｇ、１０日間連続して静脈内投与した。陽性対照としては、各マウスにＣＴＸを１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ、１０日間連続して腹腔内投与した。陰性対照としては、各マウスに、生理食塩水又は試験群における１日あたりのジベンジルトリスルフィドに対する濃度と同濃度の溶媒のみを、１０日間連続して、静脈内投与した。各群について１０匹のマウスを使用した。
【０１３８】
結果  マウス肉腫Ｓ１８０モデルにおいてＤＢＴＳは、５０、２５及び１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ６３．３０％、５４．６８％及び４８．６９％の平均腫瘍阻害率を示した（生理食塩水対照に対して）。詳細な結果を、マウス肉腫Ｓ１８０モデルにおける０．２％ＤＢＴＳのｉｎ  ｖｉｖｏ効果実験を表す表９及び図１４に示す。図１４において、７つの列（それぞれ１−７）は以下の投与化合物（ｉｖ×７ｑｄ）：１）陰性対照；２）生理食塩水対照；３）ＤＢＴＳ（２５ｍｌ／ｋｇ）；４）ＤＢＴＳ（１５ｍｌ／ｋｇ）；５）ＤＢＴＳ（７．５ｍｌ／ｋｇ）；６）溶媒対照（１５ｍｌ／ｋｇ）及び７）陽性対照  ＣＴＸ（３０ｍｇ／ｋｇ）から得られた結果を表す。
【０１３９】
ＤＢＴＳの静脈内注入の直後、マウスが、跳躍、頻呼吸、及び横たわって活動が低下するということを含む一時的な異常な反応を呈することが観察された。このような反応は通常１０〜１５分間持続する。同様な異常な反応はまた、溶媒のみを静脈内注入されたマウスにおいてもみられた。従って、注入速度と、ＤＢＴＳではなく高濃度の溶媒は、マウスにおいて一時的な異常な反応をもたらし得る。
【０１４０】
ルイス肺癌モデルにおいて、ＤＢＴＳは、５０、２５及び１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ６７．０５％、５１．３４％及び４５．２１％の平均腫瘍阻害率を示した（生理食塩水対照に対して）。詳細な結果を、マウスルイス肺癌モデルにおける０．２％ＤＢＴＳの効果研究を表す表１０及び図１５にまとめる。図１５において、７つの列（それぞれ１〜７）は以下の投与化合物：１）陰性対照；２）生理食塩水対照；３）ＤＢＴＳ（２５ｍｌ／ｋｇ）；４）ＤＢＴＳ（１５ｍｌ／ｋｇ）；５）ＤＢＴＳ（７．５ｍｌ／ｋｇ）；６）溶媒対照（１５ｍｌ／ｋｇ）及び７）陽性対照  ＣＴＸ（３０ｍｇ／ｋｇ）から得られた結果を表す。ＤＢＴＳ及び溶媒対照はｉｖ×１０ｑｄにて投与し；陽性対照はｉｐ×７ｑｄにて投与した。マウス肉腫Ｓ１８０の実験に用いられたマウスとは対照的に、この実験でＤＢＴＳ又は溶媒のいずれかを静脈内注入されたマウスは、より軽微な一時的な異常反応を示した。
【０１４１】
陰性対照として溶媒のみを使用することにより、肉腫Ｓ１８０に対するＤＢＴＳのｉｎ
ｖｉｖｏの腫瘍阻害率の平均値は、表１１に示すように、５０、２５及び１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ５０．２５％、３８．５８％及び３０．４６％であった。ルイス肺癌モデルに対しては、ＤＢＴＳのｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍阻害率の平均値は、表１２に示すように、５０、２５及び１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ６２．２８％、４４．３０％及び３７．３８％であった。
【０１４２】
２つのマウス移植腫瘍モデルから得られた結果は、ＤＢＴＳを静脈内投与されたマウスにおける、移植腫瘍の増殖の特異的阻害を示す。高投与量のＤＢＴＳ（５０ｍｇ／ｋｇ／日、７又は１０日間連続）を静脈内投与された場合、生理食塩水を陰性対照として用いることにより、いずれのマウス移植腫瘍モデルにおいても６５％の腫瘍阻害率が達成された。ＤＢＴＳ溶液の調製に使用した溶媒は、マウス移植腫瘍モデル中での腫瘍の増殖に弱い阻害効果を示し、また静脈内注入後にマウスにおける一時的な異常反応をも引き起こし得る。
【０１４３】
【表９】
2011162562.tif 000041
【０１４４】
【表１０】
2011162562.tif 000042
【０１４５】
【表１１】
2011162562.tif 000043
【０１４６】
【表１２】
2011162562.tif 000044
（実施例２）
（マウスルイス肺癌に対するＤＢＴＳの抗癌活性）
本研究は、実施例１のようなマウスルイス肺癌モデルにおけるジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）のインビボ抗癌効力を評価する。その実験用マウスを、Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの薬理学研究室において維持した。実験用マウスは、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから提供されたマウスＣ５７ＢＬ／６系統（認定番号：ＳＣＸＫ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００３−０００３）であった。マウスの体重は、１８ｇ〜２０ｇであった。メスのマウスのみを使用した。試験した動物の数は以下の通りであった：各投与量群に対し１０匹、陽性対照群について１０匹、および陰性対照群について２０匹（生理的対照群について１０匹および溶媒対照群について１０匹）。
【０１４７】
（試験対照）  陰性対照として、２つの群（溶媒のみの対照群および正常生理食塩水対照群）を設定した。溶媒のみの対照群において、各マウスに、高投与量ＤＢＴＳ試験で使用したものと同量かつ同濃度を有する溶媒（正常生理食塩水中、５％溶媒）のみを、連続７日間または１０日間にわたり、１日１回静脈内投与した。正常生理食塩水群においては、各マウスに、０．５ｍｌの正常生理食塩水を１日１回、１０日間連続投与した。陽性対照群については、抗癌化合物のシクロホスファミド（サイトキサン、ＣＴＸ、腹腔内使用用）を、３０ｍｇ／ｋｇで、１日１回、７日間連続で腹腔内投与した。さらに、参照群として、抗癌化合物のタキソールを、１５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇにて、１日１回、５日間連続で静脈内投与した。
【０１４８】
（試験化合物の調製および投与）  ４００ｍｇのＤＢＴＳを、１０ｍＬのヒマシ油（溶媒）中に溶解し、この溶媒中で４０ｍｇ／ｍｌのＤＢＴＳ濃度を有するようにした。使用前に毎回、この溶液を正常生理食塩水で希釈して、所望のＤＢＴＳ濃度である、０．２％（高投与量）、０．１％（中投与量）および０．０５％（低投与量）をそれぞれ達成した。各マウスに、この化合物溶液０．５ｍＬを、０．５ｍｌ／０．５分という制御された注入速度で静脈内投与した。腫瘍移植の２４時間後に、化合物のキャリアマウスへの静脈内注入を１日１回、７日間または１０日間連続して実行した。
【０１４９】
（移植用腫瘍細胞の調製および化合物の効力測定）  腫瘍細胞を調製するために、迅速に増殖する腫瘍を、まず移植腫瘍マウスから除去し、この腫瘍組織を切開し、濃度２×１０７／ｍｌ〜４×１０７／ｍｌを有する腫瘍細胞懸濁液を、正常生理食塩水中で調製した。０．２ｍＬの細胞懸濁液を皮下注入により各マウスの腋窩部に注入した。移植の２４時間後、マウスに所定の投与量のＤＢＴＳ、生理食塩水、または陰性対照として役立つ溶媒のみを静脈内投与するか、あるいは陽性対照として役立つ３０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを腹腔内投与した。移植の約２週間後に、マウスを屠殺し、移植された腫瘍を実験マウスから取り出した。取り出した各固形腫瘍の重量を測定し、各投与量群における腫瘍阻害率を、実施例１（マウス肉腫Ｓ１８０およびマウスルイス肺癌に対するＤＢＴＳの抗癌活性）中の式（２）に従って計算した。
【０１５０】
マウスルイス肺癌モデルに関して、ルイス肺癌細胞を、マウス１匹あたり約６００万個の細胞数で皮下移植した。移植２４時間後、試験群における各マウスに、ジベンジルトリスルフィドを１日あたり５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇまたは１２．５ｍｇ／ｋｇにて、連続１０日間静脈内投与した。陽性対照としては、各マウスに、ＣＴＸを１日あたり３０ｍｇ／ｋｇ、連続７日間腹腔内投与した。陰性対照としては、各マウスに、正常生理食塩水か、または試験群における１日あたりの濃度と同濃度のジベンジルトリスルフィド用溶媒を、連続１０日間または連続７日間にわたり静脈内投与した。各群について、１０匹のマウスを使用した。タキソール参照群については、試験群における各マウスに、１５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇにて、１日１回、５日間連続してタキソールを静脈内投与した。
【０１５１】
（結果）  ルイス肺癌モデルにおいて、ＤＢＴＳは、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量群について、（正常生理食塩水対照に対して）それぞれ６５．７７％、５１．６１％および４３．１０％の平均腫瘍阻害率を示した。詳細な結果を表１３に示す。陰性対照として溶媒のみを使用することにより、相当する腫瘍阻害率は、それぞれ６１．０２％、４６．９４％および３５．１０％である（表１４）。ＤＢＴＳの静脈内注入直後、マウスが、一時的な異常な反応（跳躍、速い呼吸、および横たわって活動が低下することを含む）を呈することが観察された。このような反応は、代表的には１０分間〜１５分間持続した。同じ異常な反応が、溶媒のみを静脈内注入したマウスにおいても観察された。
【０１５２】
参照試験において、タキソールは、１５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ（正常生理食塩水対照に対して）４８．９４％、３６．９７％および３０．２８％の平均腫瘍阻害率を示した。詳細な結果を表１５に示す。
【０１５３】
マウスルイス肺癌モデルにおいて得られた結果は、ＤＢＴＳを静脈内投与されたマウスにおける、移植腫瘍の増殖の特異的阻害を示す。高投与量のＤＢＴＳ（５０ｍｇ／ｋｇ／日、連続１０日間）を静脈内投与された時、正常生理食塩水を陰性対照として用いることにより、上記マウス移植腫瘍モデルにおいて６５％の腫瘍阻害率が達成された。このようなデータは、再現性を有することが示されている。ＤＢＴＳ溶液の調製に使用した溶媒は、マウス移植腫瘍モデル中での腫瘍増殖に対して弱い阻害効果を示した。この溶媒はまた、静脈内注入後にマウスにおける一時的な異常反応をも引き起こし得る。
【０１５４】
【表１３】
2011162562.tif 000045
【０１５５】
【表１４】
2011162562.tif 000046
【０１５６】
【表１５】
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（実施例３）
（マウスにおけるルイス肺癌およびＰ３８８リンパ性白血病、ならびにヌードマウスにおけるＢｃａｐ−３７ヒト乳癌およびＨＣＴ−８ヒト結腸癌に対する、ＡＣＥＡ１００１０８のインビボ抗癌活性）
化合物ＡＣＥＡ１００１０８（ＤＢＴＳ誘導体、表３３参照）のインビボ抗癌効力を評価するため、移植された癌を有するマウスモデル（ルイス肺癌モデルおよびＰ３８８リンパ性白血病モデル、ならびに免疫不全ヌードマウスにおける２つのヒト腫瘍異種移植片モデル（Ｂｃａｐ−３７ヒト乳癌およびＨＣＴ−８ヒト結腸癌）が挙げられる）を使用した。すべてのマウスモデルは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの薬理学研究室において維持した。ヒト腫瘍異種移植片モデルについては、本研究のためにヌードマウスへと移植する前に、癌細胞を２度、インビボで継代した。フラスコ中の培養ヒト癌細胞を、まず、免疫不全ヌードマウスへと異種移植片移植した。癌細胞がヌードマウス中で一定の大きさの腫瘍にまで増殖した後に、その腫瘍をヌードマウスから取り出し、腫瘍組織を切開した。この切開した腫瘍組織から細胞懸濁液を調製し、免疫不全ヌードマウスへと再び移植し戻した（すなわち、ヒト癌異種移植片移植モデルにおける癌細胞の２度目の継代）。この癌細胞が一定の大きさに増殖した後に、腫瘍をヌードマウスから取り出し、この腫瘍組織を切開した。切開した組織から細胞懸濁液を調製し、本明細書中に記載のヒト癌異種移植片モデルの研究のために使用した。
【０１５７】
実験用のマウスは、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから提供されたマウスＣ５７ＢＬ／６ヌードマウス系統、ＤＢＦ１ヌードマウス系統およびＢＡＬＢ／ｃヌードマウス系統、認定番号：ＳＣＸＫ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００３−０００３であった。マウスの体重は、１８ｇ〜２２ｇであった。オスおよびメスのマウスを使用した。しかし、実験毎に同性の動物を使用した。マウス移植腫瘍モデルについて、試験した動物の数は以下の通りであった：各投与量群に対し１０匹、陽性対照群について１０匹、および陰性対照群について２０匹。ヒト腫瘍異種移植片モデルに関し、試験した動物の数は以下の通りであった：各投与量に対し６匹、陽性対照群について６匹、および陰性対照群について１２匹。
【０１５８】
（試験対照）  陰性対照として、各マウスには、高投与量ＡＣＥＡ１００１０８試験で使用されたものと同量かつ同濃度を有する溶媒のみを連続７日間にわたり１日１回静脈内投与した。陽性対照群については、抗癌化合物のタキソールを、１０ｍｇ／ｋｇにて、１日１回、７日間連続して静脈内投与した。参照群において、ＤＢＴＳを、５０ｍｇ／ｋｇにて、１日１回、７日間連続して静脈内投与した。
【０１５９】
（試験化合物の調製および投与）  化合物ＡＣＥＡ１００１０８を硬化ヒマシ油（溶媒）中に溶解し、この溶媒中２０ｍｇ／ｍｌの化合物ＡＣＥＡ１００１０８濃度を有するようにした。使用前に毎回、この溶液を正常生理食塩水中に希釈して、所望のＡＣＥＡ１００１０８濃度を達成した。各マウス（体重約２０ｇ）に、この化合物溶液０．５ｍＬを、０．５ｍＬ／０．５分という制御された注入速度で静脈内投与した。腫瘍移植２４時間後に、化合物溶液のキャリアマウスへの静脈内注入を、１日１回、連続７日間または連続１０日間実行した。１００ｍｇ／ｋｇ〜６．２５ｍｇ／ｋｇの範囲の種々の投与量の化合物ＡＣＥＡ１００１０８を、本研究において使用した。
【０１６０】
（移植用腫瘍細胞の調製および化合物効力の測定）  マウスルイス肺癌モデル、ヒト乳癌異種移植片モデルおよびヒト結腸癌異種移植片モデルのための腫瘍細胞を調製するために、迅速に増殖する腫瘍を、まず移植腫瘍マウスから取り出した。この腫瘍組織を切開し、濃度×１０７／ｍｌ２〜４×１０７／ｍｌを有するように腫瘍細胞懸濁液の正常生理食塩水中に調製した。０．２ｍＬの細胞懸濁液を、皮下注入により各マウスの腋窩部（右側）に注入した。移植２４時間後、マウスに、所定の投与量のＡＣＥＡ１００１０８、または陰性対照として役割を果たす溶媒のみ、または陽性対照として役立つ１０ｍｇ／ｋｇのタキソール、または参照試験として役立つ５０ｍｇ／ｋｇのＤＢＴＳを投与した。移植２〜４週間後、マウスを屠殺し、移植された腫瘍を実験マウスから取り出した。取り出した各固形腫瘍の重量を測定し、実施例１に記載の式（２）に従って、各投与量群における腫瘍阻害率を計算した。
【０１６１】
ヒト腫瘍異種移植片モデルについては、動物の餌、動物のケージ、動物が接触する支持材および装置を含む、すべての使用物品は高圧滅菌した。ヌードマウスは、ＳＰＦ条件下で、ラミナーフロー形式の棚において維持した。腫瘍移植後に、各化合物投与量群におけるマウスの体重および腫瘍の大きさを動的にモニターし、プロットした。腫瘍の大きさは、腫瘍の長軸（ａ）および短軸（ｂ）を測定することにより測定し、腫瘍の体積は、式
腫瘍体積＝ａ×ｂ２／２      （３）
に従って計算した。
【０１６２】
Ｐ３８８マウスリンパ性白血病モデルのための癌細胞を調製するために、滅菌条件下でＰ３８８白血病保有マウスの腹水を取り出した。この腹水を正常生理食塩水中に（腹水対正常生理食塩水が１：６で）希釈して、細胞懸濁液を調製した。０．２ｍＬの細胞懸濁液を腹腔内に注入した。癌細胞をマウスへと移植した２４時間後に、マウスに、所定の投与量のＡＣＥＡ１００１０８、または陰性対照として役割を果たす溶媒のみ、あるいは陽性対照として役立つ１０ｍｇ／ｋｇのタキソールおよび陽性対照として役立つ２ｍｇ／ｋｇのＭＭＣ（マイトマイシンＣ）、または参照試験として役立つ５０ｍｇ／ｋｇのＤＢＴＳを、投与した。キャリアマウスの寿命は、３０日間以内に判断された。各化合物処置群におけるキャリアマウスの、陰性対照群と比較した寿命比は、式：
寿命比％＝化合物処置群の平均寿命／陰性対照群の平均寿命  ×  １００％（４）
に従って計算した。
【０１６３】
（結果）  ルイス肺癌モデルにおいて、ＡＣＥＡ１００１０８は、１００ｍｇ／ｋｇ（毒性を有するため５回のみ投与した）、２５ｍｇ／ｋｇおよび６．２５ｍｇ／ｋｇの投与量群について、（溶媒のみの対照に対して）それぞれ６０．１５％、５５．３５％および３４．３２％のインビボ平均腫瘍阻害率を示した。同じ試験において、ＤＢＴＳは、１００ｍｇ／ｋｇ（毒性を有するため５回のみ投与した）および２５ｍｇ／ｋｇの投与量群について、それぞれ６３．１０％および５７．９３％のインビボ平均腫瘍阻害率を示し、タキソールは、１０ｍｇ／ｋｇの慣用的投与量群について４３．９１％のインビボ平均腫瘍阻害率を示した。結果を表１６にまとめる。
【０１６４】
マウスリンパ性白血病モデルにおいて、化合物ＡＣＥＡ１００１０８で処置したマウスの寿命における平均増加は、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび１２．５ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ１０６．１８％、１０７．２２％および１０９．２８％であった。同じ実験において、５０ｍｇ／ｋｇの投与量でＤＢＴＳ化合物で処置したマウスについて、マウス寿命における平均増加は、１０９．２８％であり、１０ｍｇ／ｋｇのタキソール化合物で処置したマウスの寿命における平均増加は１０９．２８％であった。詳細を表１７中に示す。
【０１６５】
ヌードマウスにおけるＢｃａｐ−３７ヒト乳癌異種移植片モデルでは、ＡＣＥＡ１００１０８は、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ６４．１３％、５６．１０％および３１．４０％の平均インビボ腫瘍阻害率を示した。同じ実験において、ＤＢＴＳは、５０ｍｇ／ｋｇの投与量群について６６．９８％の平均インビボ腫瘍阻害率を示し、タキソールは、１０ｍｇ／ｋｇの慣用的投与量について４８．８４％の平均インビボ腫瘍阻害率を示した。表１８および図１６に、詳細を示す。これは、ヌードマウスに移植されたＢｃａｐ−３７ヒト乳癌異種移植片に対するＤＢＴＳおよびＡＣＥＡ１００１０８の効力研究を表す。図１６において、７つの列（それぞれ１〜７）は、以下の投与化合物：１）陰性対照；２）溶媒；３）ＡＣＥＡ１００１０８（５０ｍｇ／ｋｇ）；４）ＡＣＥＡ１００１０８（２０ｍｇ／ｋｇ）；５）ＡＣＥＡ１００１０８（８ｍｇ／ｋｇ）；６）ＤＢＴＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）；および７）陽性対照（タキソール、１０ｍｇ／ｋｇ）を表す。試験化合物および対照を、ｉｖ×７ｑｄで投与した。腫瘍の大きさの動的な変化を表１９および図１７に示す。キャリアマウスの体重における動的変化を、表２０および図１８中にまとめる。
【０１６６】
ヌードマウスにおけるＨＣＴ−８ヒト結腸癌異種移植モデルでは、ＡＣＥＡ１００１０８は、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ４５．６２％、２８．１０％および１５．０３％の平均インビボ腫瘍阻害率を示した。同じ実験において、ＤＢＴＳは、５０ｍｇ／ｋｇの投与量について４６．０８％の平均インビボ腫瘍阻害率を示し、タキソールは、１０ｍｇ／ｋｇの慣用的投与量について３３．３３％の平均インビボ腫瘍阻害率を示した。表２１および図１９に、詳細を示す。これらは、ヌードマウスに移植されたＨＣＴ−８ヒト結腸癌異種移植片に対するＤＢＴＳおよびＡＣＥＡ１００１０８の効力研究を表す。図１９において、７つの列（それぞれ１〜７）は、以下の投与化合物：１）陰性対照；２）溶媒；３）ＡＣＥＡ１００１０８（５０ｍｇ／ｋｇ）；４）ＡＣＥＡ１００１０８（２０ｍｇ／ｋｇ）；５）ＡＣＥＡ１００１０８（８ｍｇ／ｋｇ）；６）ＤＢＴＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）；および７）陽性対照（タキソール、１０ｍｇ／ｋｇ）を表す。試験化合物および対照を、静脈内注入を毎日７日間（ｉｖ×７ｑｄ）投与した。腫瘍の大きさの動的な変化を、表２２および図２０に示す。キャリアマウスの体重における動的変化を、表２３および図２１中にまとめる。
【０１６７】
２つのマウス腫瘍モデルおよび２つのヒト腫瘍異種移植片モデルのインビボ評価から得られた結果に基づくと、ＡＣＥＡ１００１０８は、５０ｍｇ／ｋｇで静脈内注入を毎日７日間（ｉｖ×７ｑｄ）にて効果的に投与され得る。さらに、マウスルイス肺癌モデルおよびＢｃａｐ−３７ヒト乳癌モデルに対するＡＣＥＡ１００１０８の抗癌効果はＨＣＴ−８ヒト結腸癌モデルにおける効果よりも強力である。しかし、ＡＣＥＡ１００１０８は、Ｐ３８８マウス白血病モデルに対しては抗癌効果を呈さなかった。さらに、同一投与量かつ同一薬剤の投与手順に関して、化合物ＡＣＥＡ１００１０８の上記モデルに関する抗癌効果は、ＤＢＴＳのものに匹敵し、慣用的な処置の投与条件下でのタキソールの効果よりも優れている。
【０１６８】
【表１６】
2011162562.tif 000048
【０１６９】
【表１７】
2011162562.tif 000049
【０１７０】
【表１８】
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【０１７１】
【表１９】
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【０１７２】
【表２０】
2011162562.tif 000052
【０１７３】
【表２１】
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【０１７４】
【表２２】
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【０１７５】
【表２３】
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（実施例４）
（ヌードマウスにおけるａｏ１０／１７ヒト卵巣癌に対するＡＣＥＡ１００１０８のインビボ抗癌活性）
化合物ＡＣＥＡ１００１０８のインビボ抗癌効力を評価するため、免疫不全ヌードマウスにおけるａｏ１０／１７ヒト卵巣癌異種移植片モデルを使用した。細胞株およびマウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの薬理学研究室において維持した。ａｏ１０／１７ヒト卵巣癌異種移植片モデルについては、本研究のためにヌードマウスへと移植する前に、癌細胞を２度、インビボで継代した。言い換えれば、フラスコ中の培養ヒト卵巣癌ａｏ１０／１７細胞を、まず、免疫不全ヌードマウスへと異種移植片移植した。この癌細胞がこのヌードマウス中で一定の大きさの腫瘍へと増殖した後に、その腫瘍をヌードマウスから取り出し、腫瘍組織を切開した。切開した腫瘍組織から細胞懸濁液を調製し、免疫不全ヌードマウスへと再び移植して戻した（すなわち、ヒト癌異種移植片移植モデルにおける癌細胞の２度目の継代）。その癌細胞が一定の大きさへと増殖した後に、腫瘍をヌードマウスから取り出し、この腫瘍組織を切開した。切開した腫瘍組織から細胞懸濁液を調製し、本明細書中に記載のヒト癌異種移植片移植モデルの研究のために使用した。
【０１７６】
実験用のマウスは、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから提供されたマウスＣ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＦ１系統およびＢＡＬＢ／ｃ（ヌードマウス）系統、認定番号：ＳＣＸＫ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００３−０００３であった。マウスの体重は、１８〜２２ｇであった。メスのマウスのみを本研究において使用した。ヒト腫瘍異種移植モデルについて、試験された動物の数は、以下の通りであった：各投与量群に対し６匹、陽性対照群について６匹、および陰性対照（溶媒のみ）群について１２匹。ＡＣＥＡ１００１０８の高投与量、中投与量および低投与量は、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日および８ｍｇ／ｋｇ／日であった。
【０１７７】
（試験対照）  陰性対照として、各マウスは、高投与量ＡＣＥＡ１００１０８試験で使用されたものと同量かつ同濃度を有する溶媒のみを、連続７日間にわたり、１日１回静脈内投与した。陽性対照群については、抗癌化合物のタキソールを、１０ｍｇ／ｋｇにて、１日１回、７日間連続で静脈内投与した。参照群においては、ＤＢＴＳを、５０ｍｇ／ｋｇにて、１日１回、７日間連続で静脈内投与した。
【０１７８】
（試験化合物の調製および投与）  化合物ＡＣＥＡ１００１０８を、硬化ヒマシ油（溶媒）中に溶解し、その溶媒中２０ｍｇ／ｍｌのＡＣＥＡ１００１０８濃度を有するようにした。使用前に毎回、この溶液を正常生理食塩水で希釈して、所望のＡＣＥＡ１００１０８濃度を達成した。各マウス（体重約２０ｇ）に、この化合物溶液０．５ｍＬを、０．５ｍＬ／０．５分という制御された注入速度で静脈内投与した。腫瘍移植２４時間後に、化合物溶液のキャリアマウスへの静脈内注入を、１日１回、７日間連続して実行した。ＡＣＥＡ１００１０８の高投与量、中投与量および低投与量は、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日および８ｍｇ／ｋｇ／日であった。
【０１７９】
（移植用腫瘍細胞の調製および化合物効力の測定）  ヒト卵巣癌異種移植片のための腫瘍細胞を調製するために、迅速に増殖している腫瘍を、まず、移植腫瘍マウスから取り出した。この腫瘍組織を正常生理食塩水（腫瘍体積  対  生理食塩水が１：６）中で粉砕し、腫瘍細胞懸濁液のこの正常生理食塩水中にて調製した。０．２ｍＬの細胞懸濁液を皮下注入により各マウスの腋窩部（右側）に注入した。移植２４時間後、マウスに、所定の投与量のＡＣＥＡ１００１０８、または陰性対照として役割を果たす溶媒のみ、または陽性対照として役立つ１０ｍｇ／ｋｇのタキソール、または参照試験として役立つ５０ｍｇ／ｋｇのＤＢＴＳを投与した。移植２週間〜４週間後、マウスを屠殺し、移植された腫瘍を実験試験マウスから取り出した。取り出した各固形腫瘍の重量を測定し、実施例１に記載の式（２）に従って、各投与量群における腫瘍阻害率を計算した。
【０１８０】
ヒト卵巣癌異種移植片モデルについては、動物の餌、動物のケージ、動物が接触する支持材および装置を含む、すべての使用物品は高圧滅菌した。ヌードマウスは、ＳＰＦ条件下で、ラミナーフロー形式の棚において維持した。腫瘍移植後に、各化合物投与量群におけるマウスの体重および腫瘍の大きさを動的にモニターし、プロットした。腫瘍の大きさは、腫瘍の長軸（ａ）および短軸（ｂ）を測定することにより決定し、腫瘍の体積は、実施例３に記載の式（３）に従って計算した。
【０１８１】
（結果）  ａｏ１０／１７ヒト卵巣癌異種移植片において、ＡＣＥＡ１００１０８は、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇおよび８ｍｇ／ｋｇの投与量群について、それぞれ５３．４０％、４６．６７％および３３．１９％のインビボ平均腫瘍阻害率を示した。同じ試験において、ＤＢＴＳは、５０ｍｇ／ｋｇの投与量群について５７．３０％のインビボ平均腫瘍阻害率を示し、タキソールは、１０ｍｇ／ｋｇの投与量群について４５．３９％のインビボ平均腫瘍阻害率を示した。表２４および図２２に、詳細を示す。これらは、ヌードマウスに移植されたａｏ１０／１７ヒト卵巣癌異種移植片に対するＤＢＴＳおよびＡＣＥＡ１００１０８の効力研究を表す。図２２において、７つの列（それぞれ１〜７）は、以下の投与化合物：１）陰性対照；２）溶媒；３）ＡＣＥＡ１００１０８（５０ｍｇ／ｋｇ）；４）ＡＣＥＡ１００１０８（２０ｍｇ／ｋｇ）；５）ＡＣＥＡ１００１０８（８ｍｇ／ｋｇ）；６）ＤＢＴＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）；および７）陽性対照（タキソール、１０ｍｇ／ｋｇ）を表す。試験化合物および対照は、１日１回７日間（７ｑｄ）において静脈内（ｉｖ）投与した。
【０１８２】
腫瘍の大きさの動的な変化を、表２５および図２３に示す。キャリアマウスの体重における動的変化を、表２６および図２４中にまとめる。同一投与量かつ同一薬剤の投与手順に関して、化合物ＡＣＥＡ１００１０８のａｏ１０／１７ヒト卵巣癌モデルにおける抗癌効果は、化合物ＡＣＥＡ１００１０１のものに匹敵し、定期的な処置の投与条件下でのタキソールの効果よりも優れている。
【０１８３】
【表２４】
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【０１８４】
【表２５】
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【０１８５】
【表２６】
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（実施例５）
（ヌードマウスにおけるＢｃａｐ−３７ヒト乳癌におけるＡＣＥＡ１００１０８の抗癌活性）
化合物ＡＣＥＡ１００１０８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌効果を評価するため、免疫不全ヌードマウスにおけるＢｃａｐ−３７ヒト乳癌異種移植片モデルを使用した。細胞株及びマウスモデルはＳｈａｎｇｈａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの薬理学研究室において維持した。Ｂｃａｐ−３７ヒト乳癌異種移植片モデルについては、試験のため、ヌードマウスへと移植する前に、癌細胞を２度、ｉｎ  ｖｉｖｏで継代した。言い換えれば、フラスコ中で培養されたヒト乳癌Ｂｃａｐ−３７細胞を、まず免疫不全ヌードマウスへと異種移植片移植した。癌細胞がこのヌードマウス中で一定の大きさの腫瘍に生長した後に、腫瘍をヌードマウスから除去し、腫瘍を切開した。切開された腫瘍組織から細胞懸濁液を調製し、免疫不全ヌードマウスへと再び戻して移植した（すなわち、ヒト癌異種移植片移植モデルにおける癌細胞の２度目の継代）。癌細胞が一定の大きさに生長した後に腫瘍をヌードマウスから除去し、この腫瘍組織を切開した。切開された腫瘍組織から細胞懸濁液を調製し、本明細書中に記載のヒト癌異種移植片移植モデルの試験に使用した。
【０１８６】
試験用のマウスはＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから提供されるＢＡＬＢ／ｃ（ヌードマウス）株、認定番号：ＳＣＸＫ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）２００３−０００３であった。マウスの体重は１８〜２２ｇであった。メスのマウスのみをこの試験のために使用した。ヒト腫瘍異種移植モデルについて、試験された動物の数は以下の通りである：各投与量群に対し６匹、陽性対照群について６匹、及び陰性対照（溶媒のみ）群について１２匹。ＡＣＥＡ１００１０８の高投与量、中高投与量及び低投与量はそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日及び８ｍｇ／ｋｇ／日であった。
【０１８７】
（試験対照）
陰性対照として、各マウスは、高投与量ＡＣＥＡ１００１０８試験で使用されたものと同様に、同量かつ同濃度の溶媒のみを、１日１回、７日間連続で静脈内投与した。陽性対照群については、抗癌化合物のタキソールが１０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、７日間連続で静脈内投与された。
【０１８８】
（試験化合物の調製及び投与）
化合物ＡＣＥＡ１００１０８を硬化ヒマシ油（溶媒）中に溶解し、溶媒中２０ｍｇ／ｍｌのＡＣＥＡ１００１０８濃度となるようにした。毎回使用前に、この溶液を生理食塩水で希釈して、所望のＡＣＥＡ１００１０８濃度を達成した。各マウス（体重約２０ｇ）に、この化合物溶液０．５ｍＬを、０．５ｍＬ／０．５分に制御された注入速度で静脈内投与した。腫瘍の移植７日後、移植された腫瘍は、その動物に手で触れた時に感じることができる程度に十分に大きく生長した。その時点から化合物溶液の担体マウスへの静脈内注入を１日１回、７日間又は１０日間連続して実行した。ＡＣＥＡ１００１０８の高投与量、中高投与量及び低投与量はそれぞれ５０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日及び８ｍｇ／ｋｇ／日であった。
【０１８９】
（移植用腫瘍細胞の調製及び化合物の効果測定）
ヒト乳癌異種移植片についての腫瘍細胞を調製するために、迅速に成長している腫瘍をまず移植腫瘍マウスから除去した。この腫瘍組織を生理食塩水（腫瘍体積と生理食塩水が１：６）中ですり潰し、細胞濃度が２〜４×１０７個／ｍｌである腫瘍細胞懸濁液の生理食塩水溶液を調製した。０．２ｍＬの細胞懸濁液を皮下注入により各マウスの腋窩部（右側）に注入した。移植７日後、マウスにおける腫瘍は、その動物に手で触れた時に感じることができる程度に十分に大きく生長した。その時点からマウスに所定の投与量のＡＣＥＡ１００１０８、又は陰性対照として役割を果たす溶媒のみ、あるいは陽性対照として機能する１０ｍｇ／ｋｇのタキソールを投与した。移植から３〜４週間後、マウスを屠殺し、移植された腫瘍を試験マウスから除去した。除去された各固形腫瘍の重量を測定し、実施例１に記載の式（２）に従って、各投与量群における腫瘍阻害率を計算した。腫瘍の体積に基づき、その他のパラメーター、すなわち腫瘍体積阻害率も、以下の式：
Ｔ／Ｃ（％）＝化合物処置群における平均腫瘍体積／陰性対照群における平均腫瘍重量  ×  １００％      （５）
に従って計算した。
【０１９０】
ヒト乳癌異種移植片モデルについては、動物が接触する動物の餌、動物のケージ、支持材及び装置を含む全ての使用された物品は高圧滅菌した。ヌードマウスはＳＰＦ条件下で、層流の棚（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｓｈｅｌｖｅ）において維持した。腫瘍移植後に、各化合物投与量群におけるマウスの体重と腫瘍の大きさを動的にモニターし、プロットした。腫瘍の大きさは腫瘍の長軸（ａ）及び短軸（ｂ）を測定することにより測定し、腫瘍の体積は実施例３に記載の式（３）に従って計算した。
【０１９１】
（結果）
ヌードマウスにおけるＢｃａｐ−３７ヒト乳癌異種移植片モデルにおいて、ＡＣＥＡ１００１０８は、ｉｖ×７ｑｄの手順に従い投与した場合、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ及び８ｍｇ／ｋｇの投与量群についてそれぞれ５２．２４％、４７．３１％及び２８．２１％のｉｎ  ｖｉｖｏ平均腫瘍阻害率を示した。さらに、１０ｑｄの手順に従い投与した場合、５０ｍｇ／ｋｇの投与量群について５６．９２％のｉｎ  ｖｉｖｏ平均腫瘍阻害率を示した。同様の試験において、タキソールは１０ｍｇ／ｋｇの投与量群について４４．３３％のｉｎ  ｖｉｖｏ平均腫瘍阻害率を示した。ヌードマウスに移植されたＢｃａｐ−３７ヒト乳癌異種移植片に対するＡＣＥＡ１００１０８の効果試験を表す表２７及び図２５に、詳細を示す。図２５中、７つの列（それぞれ１−７）は、以下の投与化合物：１）陰性対照；２）溶媒；３）ＡＣＥＡ１００１０８（５０ｍｇ／ｋｇ）；４）ＡＣＥＡ１００１０８（２０ｍｇ／ｋｇ）；５）ＡＣＥＡ１００１０８（８ｍｇ／ｋｇ）；６）ＡＣＥＡ１００１０８（５０ｍｇ／ｋｇ）；及び７）陽性対照（タキソール、１０ｍｇ／ｋｇ）を表す。試験化合物及び対照は、ＡＣＥＡ１００１０８を５０ｍｇ／ｋｇで、ｉｖ×１０ｑｄで投与したもの以外は、７ｑｄにおいてｉｖで投与した。腫瘍体積阻害率を表２８に示す。腫瘍の大きさの動的な変化を表２６にまとめる。担体マウスの体重における動的変化は表２７にまとめる。
【０１９２】
ヌードマウスにおけるＢｃａｐ−３７ヒト乳癌異種移植片モデルにおいて、ＡＣＥＡ１００１０８は、手で触れることにより感じることができるほど腫瘍が十分に大きく生長した後でこの化合物を投与するという投与手順について、５０％を超える腫瘍体積阻害率を示した。さらに、ヌードマウスにおける投与回数を増加させた場合、マウスに対する毒性効果は明白には増加せず、一方で腫瘍阻害は増大した。加えて、ここでヌードマウスに投与された中投与量のＡＣＥＡ１００１０８は、定期的な処置の投与条件下でのタキソールの効果よりも優れた抗癌効果を示した。
【０１９３】
【表２７】
2011162562.tif 000059
【０１９４】
【表２８】
2011162562.tif 000060
【０１９５】
【表２９】
2011162562.tif 000061
【０１９６】
【表３０】
2011162562.tif 000062
（実施例６）
（ＤＢＴＳ及び化合物ＡＣＥＡ１００１０８の急性毒性試験：マウスにおける静脈内注入のＬＤ５０の測定）
ＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８の急性毒性を試験するための実験をマウスにおいて行った。試験マウスはランダムに６つの群に分けられた（５つの投与量群及び１つの対照群）。各群は２０匹のＫｕｎｍｉｎｇ株マウスを含み、それらの中で５０％はオス、５０％はメスであった。静脈内注入（ｉ．ｖ．）によるＤＢＴＳ又はＡＣＥＡ１００１０８の単回投与後、ＤＢＴＳ又はＡＣＥＡ１００１０８化合物に対する急性応答、及び、処置されたマウスの最初の２週間での死亡をモニターし、記録した。ＬＤ５０値はＢｌｉｓｓ法を用いて計算した。ＤＢＴＳのマウス単回静脈内投与におけるＬＤ５０値は２５８．５３ｍｇ／ｋｇ（２３４．９６〜２８４．４６ｍｇ／ｋｇ）であり、ＡＣＥＡ１００１０８のマウス単回静脈内投与におけるＬＤ５０値は３１６ｍｇ／ｋｇ（２８４．２６〜３５１．２８ｍｇ／ｋｇ）であった。
【０１９７】
（材料及び方法）
試験化学化合物はＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８であり、予め加温した湯浴中で硬化ヒマシ油中に溶解し、２０ｍｇ／ｍｌの溶液とした。この溶液をさらに希釈して、所望の試験濃度にした。マウスあたり０．５ｍＬの静脈内投与量及び注入速度は０．５ｍＬ／０．５分であった。
【０１９８】
試験用マウスはＳｈａｎｇｈａｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔから供給されたＫｕｎｍｉｎｇ株であった。その施設の認定番号はＡｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１０７であった。マウスの体重は１８〜２０ｇであった。各試験群は２０匹のＫｕｎｍｉｎｇ株マウスを含み、それらのうち、１０匹のマウスはオス、１０匹はメスであった。４００ｍｇ／ｋｇ、３２０ｍｇ／ｋｇ、２５６ｍｇ／ｋｇ、２０４．８ｍｇ／ｋｇ及び１６３．８ｍｇ／ｋｇの５種類の試験投与量を使用した。対照群におけるマウスは、希釈された硬化ヒマシ油である同量の溶媒のみを投与された。全ての試験用マウスに、ＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８、又は対照として役割を果たす溶媒を、０．５ｍｌ／０．５分の注入速度で単回静脈内投与した。投与後に迅速に起こるＤＢＴＳ、ＡＣＥＡ１００１０８又は溶媒に対する急性応答ならびに体重変化、及び投与２週間以内での死亡をモニターし、記録した。マウスにおける静脈内注入のＬＤ５０値はＢｌｉｓｓ法を用いて計算した。
【０１９９】
（結果）
静脈内注入直後、マウスは、跳躍する、走る、けいれん、息切れ（呼吸亢進）を含む異常な反応を示した。高投与量群において、数匹のマウスは、けいれん発作により注入３分以内に死亡した。死亡は投与後１時間以内に起こり、そのピークは投与後１２時間目であった。病理解剖により、死亡したマウスの臓器における生理学的異常は見出されなかった。生き残ったマウスは、早期に活動が低下し脱毛する以外の深刻な中毒症状を示さず、それらは徐々に回復し、その後１４日の観察の間に遅れて起こる中毒の兆候は見られなかった。生き残ったマウスは健康で、正常な挙動をしたものの、それらのマウスの体重はいくぶん減少した。試験データに基づくと、ＤＢＴＳのマウス単回静脈内投与のＬＤ５０値は２５８．５３ｍｇ／ｋｇ（２３４．９６〜２８４．５６ｍｇ／ｋｇ）であり、ＡＣＥＡ１００１０８のマウス単回静脈内投与のＬＤ５０値は３１６ｍｇ／ｋｇ（２８４．２６〜３５１．２８ｍｇ／ｋｇ）であった。オスのマウスとメスのマウスの間でＬＤ５０値の顕著な差異はみられなかった（ｐ値＞０．０５）。ＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８の急性毒性の結果を表３１及び３２にまとめる。マウスにおける、溶媒の陽性の中毒効果を評価するため、対照群のマウスに同量の溶媒を投与した。溶媒を投与されたマウスは、ＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８を投与されたマウスよりも軽度の、早期における異常な兆候及び体重減少を示した。このことは、投与マウスにおいてみられる急性毒性は、ＤＢＴＳ又はＡＣＥＡ１００１０８に関連することを示す。
【０２００】
【表３１】
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【０２０１】
【表３２】
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（実施例７）
（ＤＢＴＳ、コルセミド及びパクリタキセルによる細胞増殖の阻害）
Ｈ４６０細胞（ヒト肺癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり８，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２２時間プレインキュベートした。ＤＭＳＯ中で各種濃度にしたジベンジルトリスルフィド（ＤＢＴＳ）、コルセミド及びパクリタキセルをウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物添加直前のＤＢＴＳ及びコルセミド溶液に対する様々なウェルにおける細胞指数は１．７〜１．９であり、パクリタキセルに対しては１．４〜１．９であった。図１Ａ〜Ｃは、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２３時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０２】
（実施例８）
（ＭＶ５２２細胞におけるＤＢＴＳによる細胞増殖の阻害）
ＭＶ５２２細胞（ヒト肺癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２２時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は１．０〜１．６であった。図２は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２３時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０３】
（実施例９）
（ＭＣＦ−７細胞におけるジベンジルトリスルフィドによる細胞増殖の阻害）
ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約４４時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は１．２〜１．５であった。図３は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約４４．５時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０４】
（実施例１０）
（Ａ５４９細胞におけるジベンジルトリスルフィドによる細胞増殖の阻害）
Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり８，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約１７時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は０．７２〜１．２６であった。図４は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約１８時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０５】
（実施例１１）
（ＰＣ３細胞におけるジベンジルトリスルフィドによる細胞増殖の阻害）
ＰＣ３細胞（ヒト前立腺癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２２．５時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は０．３４〜０．５４であった。図５は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２３．５時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０６】
（実施例１２）
（Ａ４３１細胞におけるＤＢＴＳ及び５−フルオロウラシルによる細胞増殖の阻害）
Ａ４３１細胞（ヒト扁平上皮癌細胞）をマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２２．３時間プレインキュベートした。各種濃度のＤＢＴＳ及び５−フルオロウラシル溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物の添加直前のＤＢＴＳに対する様々なウェルにおける細胞指数は０．６〜１．２であり、５−フルオロウラシルに対しては０．６〜１．２であった。図６Ａ〜Ｂは、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２２．６時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０７】
（実施例１３）
（ＨＴ１０８０細胞におけるＤＢＴＳによる細胞増殖の阻害）
ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり４，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約１８．６時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物の添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は０．７２〜１．４５であった。図７は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２０時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０８】
（実施例１４）
（ＭＤＡ−２３１細胞におけるＤＢＴＳによる細胞増殖の阻害）
ＭＤＡ−２３１細胞（ヒト乳癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり５，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約１８．７時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物の添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は０．６５〜０．８２であった。図８は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約１９．６時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２０９】
（実施例１５）
（Ｈ−２９細胞におけるＤＢＴＳによる細胞増殖の阻害）
Ｈ−２９細胞（ヒト結腸癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度がウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２５時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物の添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は０．９５〜１．１３であった。図９は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２６時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２１０】
（実施例１６）
（ＨＣ−２９９８細胞におけるＤＢＴＳによる細胞増殖の阻害）
ＨＣ−２９９８細胞（ヒト結腸癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２４．７時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物の添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は０．３３〜０．６８であった。図１０は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２５．７時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２１１】
（実施例１７）
（ＯＶＣＡＲ４細胞におけるＤＢＴＳによる細胞増殖の阻害）
ＯＶＣＡＲ４細胞（ヒト卵巣癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２７時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物の添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は１．４〜１．７であった。図１１は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２８時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２１２】
（実施例１８）
（Ａ２７８０細胞におけるＤＢＴＳによる細胞増殖の阻害）
Ａ２７８０細胞（ヒト結腸癌細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり２０，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約１６．４時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は２．２〜３．７であった。図１２は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約１７．５時間）における細胞指数値に対し正規化した。
【０２１３】
（実施例１９）
（ＤＢＴＳに対するＨｅｐＧ２細胞の応答）
ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝臓肉腫細胞）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度が１ウェルあたり１５，０００個の細胞数となるように播種し、標準的な細胞培養条件下でインキュベーター中で約２２時間プレインキュベートした。ジベンジルトリスルフィドのＤＭＳＯ溶液をウェル中に添加し、次いでインキュベートした。ＲＴ−ＣＥＳシステムを用いて、化合物添加前後の細胞の状態をモニターした。化合物添加直前の様々なウェルにおける細胞指数は０．７〜０．９７であった。図１３は、化合物添加前及び添加後の時刻の関数としての正規化した細胞指数を示す。細胞指数は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約２２．７時間）における細胞指数値に対し標準化した。本明細書中に示された細胞指数からは、ジベンジルトリスルフィドがＨｅｐＧ２細胞の増殖に阻害効果を示さず、曝した投与量範囲内においてはＨｅｐＧ２細胞に何ら細胞傷害性の影響を示さないようである。
【０２１４】
（実施例２０）
（ＤＢＴＳ及びその誘導体による細胞増殖の阻害）
ＲＴ−ＣＥＳシステム及びＭＴＴアッセイを使用し、８つの異なるタイプのヒト癌細胞株においてＤＢＴＳ及びその誘導体の抗癌効果を試験した。この８つの癌細胞株はＨＴ１０８０（ヒト繊維肉腫細胞株）、Ｈ４６０（ヒト非小細胞肺癌細胞株）、ＯＶＣＡＲ４（ヒト卵巣癌細胞株）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌細胞株）ＭＤＡ−ＭＢ２３１（Ｍ２３１、ヒト乳癌細胞株）Ａ２７８０（ヒト結腸癌細胞株）Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞白血病細胞株）であった。試験用ＤＢＴＳ誘導体としては、ＡＣＥＡ１００１０７、ＡＣＥＡ１００１０８、ＡＣＥＡ１００１０９、ＡＣＥＡ１００１１１、ＡＣＥＡ１００１１５、ＡＣＥＡ１００１１６、ＡＣＥＡ１００１１７、ＡＣＥＡ１００１１８、ＡＣＥＡ１００１１９、およびＡＣＥＡ１００１２０が挙げられる。ＡＣＥＡ１００１２９はＨＴ１０８０、ＨＥＬＡ及びＭＣＦ７細胞中でも試験され、それぞれ０．８２μＭ、０．４２μＭ及び２．３μＭのＩＣ５０値を有していた。誘導体の化学構造を表３３及び３４に示す。
【０２１５】
ＲＴ−ＣＥＳシステムにおいて実行されるアッセイのために、細胞を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート、すなわち、プレートのウェル中に電極センサーを有するプレート）のウェル中に、開始時の播種密度範囲が１ウェルあたり５，０００〜１５，０００個の細胞数となるように播種した。この細胞を、細胞指数が増殖期（細胞指数が０．８〜１．２）に到達するまで、５％のＣＯ２及び３７℃において一晩インキュベートした。連続的に希釈した化合物を次いでこの細胞に添加し、細胞増殖及び細胞毒性に及ぼす影響を動的にモニターした。各誘導体についての時間依存的なＩＣ５０値を、化合物処置後の様々な時点の細胞指数における投与量応答に基づいて計算した。処置後、化合物が最大の阻害を示す時点に相当するＩＣ５０値を表３５に示す。
【０２１６】
ＭＴＴアッセイのために、細胞を通常の９６ウェルプレートに播種密度範囲が１ウェルあたり５，０００〜１５，０００個の細胞数となるように播いた。この細胞を５％のＣＯ２及び３７℃において一晩インキュベートした。誘導体を連続的に希釈し、この細胞へと添加した。この処理を、４８時間のインキュベーション後に、ＭＴＴ染色試薬の添加によって終了させた。４時間後、停止バッファーの添加によって染色を停止し、次いでマイクロタイタープレートリーダー上で、２つの波長、６５０ｎｍ及び５５０ｎｍにおいて、比色測定を実行した。試験誘導体についてのＩＣ５０値を、比色読取り機を用いて計算し、表３６に列挙した。
【０２１７】
【表３３】
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【０２１８】
【表３４】
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【０２１９】
【表３５】
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【０２２０】
【表３６】
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（実施例２１）
（ＡＣＥＡ１００１０８による癌細胞増殖の動力学的阻害）
ＲＴ−ＣＥＳシステムにおいて、７つの癌細胞株におけるＤＢＴＳ誘導体、ＡＣＥＡ１００１０８の抗癌効果を試験した。細胞株はＨＴ１０８０、Ｈ４６０、ＯＶＣＡＲ４、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＨｅｐＧ２、及びＡ２７８０であった。癌細胞を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（すなわち、電子プレート）のウェル中に、開始時の播種密度がウェルあたり５，０００個〜１５，０００個の細胞数の範囲となるように播き、播かれた細胞を次いで３７℃及び５％のＣＯ２においてインキュベートした。癌細胞の増殖を、ＲＴ−ＣＥＳシステム上で、細胞が増殖期にいたるまでの約２０時間リアルタイムでモニターした。次いで、細胞を５０μＭ〜０．３８μＭの濃度範囲で連続的に稀釈したＡＣＥＡ１００１０８で処理した。ＡＣＥＡ１００１０８の癌増殖阻害及びＡＣＥＡ１００１０８に対する各種細胞株の細胞傷害性の応答を、ＲＴ−ＣＥＳシステムにおいてリアルタイムでモニターした。次いで細胞−化合物相互作用の動力学的曲線を記録し、図２６に示す。細胞指標曲線は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約１８〜２４時間）における細胞指数値に対し標準化した。
【０２２１】
（実施例２２）
（ＤＢＴＳ誘導体による癌細胞増殖の動力学的阻害）
ＨＴ１０８０癌細胞の動力学的増殖阻害及びＨＴ１０８０癌細胞におけるＤＢＴＳ誘導体の細胞傷害性の影響を、ＲＴ−ＣＥＳシステムにおいて測定した。ＤＢＴＳ誘導体は、ＡＣＥＡ１００１０７、ＡＣＥＡ１００１０９、ＡＣＥＡ１００１１１、ＡＣＥＡ１００１１４、ＡＣＥＡ１００１１５、ＡＣＥＡ１００１１６、ＡＣＥＡ１００１１７、ＡＣＥＡ１００１１８、ＡＣＥＡ１００１１９及びＡＣＥＡ１００１２０であった。ＨＴ１０８０細胞（ヒト繊維肉腫）を１６又は９６ウェルのマイクロタイタープレート装置（電子プレート）のウェル中に、播種密度がウェルあたり５，０００個の細胞数となるように播いた。この細胞を増殖期にいたるまでの約２０時間、３７℃及び５％のＣＯ２においてインキュベートした後、５０μＭ〜０．３８μＭの濃度範囲で連続的に稀釈したＤＢＴＳ誘導体を細胞に添加し、ＤＢＴＳ誘導体の細胞応答をＲＴ−ＣＥＳシステムにおいてリアルタイムで４８時間モニターした。図２７は異なる濃度における細胞とＤＢＴＳ誘導体の相互作用の動力学的曲線を示す。細胞指標曲線は、化合物添加直後の時点（細胞播種後約１８〜２４時間）における細胞指数値に対し標準化した。
【０２２２】
（実施例２３）
（ＤＢＴＳ及びその誘導体化合物であるＡＣＥＡ１００１０８及びＡＣＥＡ１００１１６による微小管動力学抑制の概要）
微小管は、細胞が２個の娘細胞へと分裂する前に、複製された染色体が２つの同一のセットへと分離するときの有糸分裂を含む多数の細胞プロセスにおいて重要である。有糸分裂及び細胞分裂における微小管の重要な役割及びその動態により、微小管は抗癌薬の重要な標的となっている。間期の細胞において微小管は、そのチューブリンを、半減期が３分以内から数時間である細胞質プール中に可溶性のチューブリンに変化させる。有糸分裂の開始に伴い、間期の微小管ネットワークは再組み立てされて、紡錘体を形成し染色体を動かす高度に動的な微小管の集合に置き換えられる。紡錘体微小管は間期細胞中の微小管よりも２０〜５０倍動的であり、紡錘体微小管には１５秒という迅速な半減期を伴ってそのチューブリンを可溶性チューブリンに変化させるものもある。
【０２２３】
紡錘体微小管の動態は、モジュレーターによる調節及び微小管活性化薬物による破壊に対し極めて敏感に反応する。微小管を標的とする薬物は、微小管のポリマー化及び動態を広範な方法により変化させ得る。（１）培養細胞における微小管ネットワークに影響を及ぼす能力、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの微小管組み立てに影響を及ぼす能力、及び（３）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの微小管動態に影響を及ぼす能力、に関するＤＢＴＳ、ＡＣＥＡ１００１０８及びＡＣＥＡ１００１１６として設計された３種のＡＣＥＡ化合物の作用メカニズムを以下に記す。
【０２２４】
（方法）
細胞培養及び免疫細胞化学  ＣＯＳ細胞を非必須アミノ酸、１０％のＦＢＳ、抗生物質−抗カビ剤（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加したＤＭＥＭ培地中で３７℃、５．５％  ＣＯ２において生育させた。免疫蛍光顕微鏡観察のために細胞をポリリジン被覆したカバースリップ上に載せ、各種濃度の３種のＡＣＥＡ化合物、パクリタキセル又はビンブラスチンを用いて４又は２４時間処理した（任意の所定の試験で使用される濃度については各図を参照されたい）。細胞を次いで温かいＰＢＳで一度洗浄し、冷エタノールで固定し、再度ＰＢＳで洗浄してＰＢＴ（ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中、１晩４℃でブロックした。全てのその後の染色および洗浄は、別に記載のない限りＰＢＴ中で室温において行った。細胞を抗チューブリンマウス抗体ＤＭ−１を用いて１：１０００にて１時間染色し、各１５分間、４回洗浄し、Ｃｙ−３コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を用いて１：１００にて１時間、暗所で染色した。次に、サンプルを各１５分間、ＰＢＴ中で暗所にて４回洗浄し、次いで最後に１５分間、ＰＢＴ中で暗所にて洗浄した。サンプルを次いでレーザー走査共焦点顕微鏡により観察した。
【０２２５】
微小管組み立てアッセイ  精製ウシ脳チューブリンを、１ｍＭのＧＴＰ、１０％のグリセロール及び１０％のＤＭＳＯと共に３５℃、３０分間インキュベートして微小管の種を合成し、次いで２７ゲージの針を通し、組み立てた微小管を６回通過させることにより剪断した。微小管組み立ては、２７．５μｌの微小管の種を、１ｍＭのＧＴＰ（及び適用可能な薬物）を添加した２４７．５μｌの精製ウシ脳チューブリンのＰＥＭ−１００バッファー（１００ｍＭのＰｉｐｅｓ  ｐＨ＝６．８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）を含む分光光度計キュベット（３５℃に維持されている）に加え、ＯＤ４００を２時間モニターすることによりアッセイした。化合物がＤＭＳＯ中に溶解され、ＤＭＳＯは微小管組み立てにおいて顕著な効果を有し得ることから、ＤＭＳＯは、反応に対し加えられた最大量の薬物と同量となるよう全てのキュベット中に添加された。微小管組み立て反応の初発速度は非常に速く、サンプルを準備している間にそれが起こるために、光散乱プロファイルの初発の上昇を常に捕らえることはできないということは留意されるべきである。しかし、導入される薬物以外は全て同一であるから、全てのサンプルは同じ吸光度から開始される。
【０２２６】
チューブリンの精製及び微小管動態アッセイ  チューブリンは文献に記載されるように精製した（”Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ”、Ｔｏｓｏ、Ｒ．Ｊ．、Ｊｏｒｄａｎ、Ｍ．Ａ．、Ｆａｒｒｅｌｌ、Ｋ．Ｗ．、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｂ．及びＷｉｌｓｏｎ、Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３、３２、１２８５−１２９３）。手短に言えば、微小管に関連した蛋白質に富むウシ脳微小管蛋白質を３サイクルの組み立て及び分解によって調製した。チューブリンを、ＰＥＭ５０（５０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  ＧＴＰ）中に平衡化したＷｈａｔｍａｎ  Ｐ−１１ホスホセルロースカラムを通して溶出することにより、その他の微小管蛋白質から精製した。精製されたチューブリン（純度  ＞９９％）を液体窒素中に滴下して凍結し、−７０℃に保存した。精製チューブリン（１５Ｍ  チューブリンダイマー）を、キタムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）軸糸の種の末端部において、ＰＭＥＭバッファー（８７ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ、３６ｍＭ  ＭＥＳ、１．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８）及び２ｍＭ  ＧＴＰ中のＡＣＥＡ０１、０８又は１６の存在又は非存在下で、３７℃においてポリマー化した。個々の微小管の動態を、微分干渉コントラスト増強ビデオ顕微鏡を用いて３７℃で記録した。結果は、生育速度、種の向かい合う末端において成長する微小管の数、及びその微小管の相対的な長さを基準にして、プラス又はマイナスとして指定された（Ｐａｎｄａ、Ｄ．、Ｇｏｏｄｅ、Ｂ．Ｌ．、Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｓ．Ｃ．及びＷｉｌｓｏｎ、Ｌ．、Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｔ  ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ｂｙ  ｔａｕ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔａｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、１１１１７−１１１２７；Ｗａｌｋｅｒ、Ｒ．Ａ．、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ、Ｅ．Ｔ．、Ｐｒｙｅｒ、Ｎ．Ｋ．、Ｓｏｂｏｅｉｒｏ、Ｍ．Ｆ．、Ｖｏｔｅｒ、Ｗ．Ａ．、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、Ｈ．Ｐ．及びＳａｌｍｏｎ、Ｅ．Ｄ．、Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｖｉｄｅｏ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８８、１０７、１４３７−１４４８）。プラスの末端は、ポリマー化の定常状態（ポリマー化開始後４５分まで）の間、スライドごとに１０分間解析された。個々の微小管の生育史は、Ｐａｎｄａらにより改変とともに１９９５年に記述されたものとして集められている（Ｐａｎｄａ、Ｄ．、Ｇｏｏｄｅ、Ｂ．Ｌ．、Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｓ．Ｃ．及びＷｉｌｓｏｎ、Ｌ．、Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｔ  ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ  ｂｙ  ｔａｕ  ａｎｄ  ｍ��ｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔａｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、１１１１７−１１１２７）。データポイントは１〜３秒の間隔で収集した。
【０２２７】
微小管は、＞０．５μｍ／分の速度で長さが増加又は減少する場合に、成長している又は短縮されているとみなした。３０秒間以上成長速度が０．５μｍ／分を下回る微小管は減衰期にあるとみなした。平均の速度、長さ及び持続は独立した事象の平均である。危険頻度は短縮事象の数を生育及びその後の減衰の合計時間で割ることにより計算し、レスキュー頻度はレスキュー事象の数をその後の短縮の合計時間で割ることにより計算した。実験誤差を制御するために、少なくとも２つの異なるチューブリン／ＧＴＰ混合物を使用し（各２−３枚のスライド）、各条件は複数日にわたり固定した。所定の条件における混合物又はスライドの間で、微小管の動態における全体的な変化は観察されなかった。動態の不安定性アッセイに使用された薬物の濃度は、微小管組み立てアッセイに用いられたものの半量を用いて安定化された微小管を最初に観察することにより選択した。スライド上のほとんどの微小管は安定であり、薬物の濃度は、追跡された任意の所定の微小管が１０分間に少なくとも２つの生育又は短縮事象を有するまで低減されるものとした。
【０２２８】
図２８〜３８は、ＤＢＴＳ及び有機硫黄化合物ＡＣＥＡ１００１０８及びＡＣＥＡ１００１１６の、培養細胞における微小管ネットワークに及ぼす影響を示す。図２８は、薬物にさらされていない調節された細胞における微小管の画像を示す。微小管ネットワークは予測されたとおりにみえる。図２９は、タキソールに４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。微小管はいくつかの位置で束ねられている；濃度が増加すると、束ねられたところがより広範になるが、微小管はしばしば、対照細胞中のものよりも短い。図３０は、タキソールに２４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。投与量が増加すると微小管の異常は増加する。この図は、束ねられ短くなった微小管の増加が存続していることを示す。さらに、大きな細胞の異常が明らかになっている。
【０２２９】
図３１は、ビンブラスチンに４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。投与量が増加すると微小管ネットワークは崩壊し、微小管はより短くなる。図３２は、ビンブラスチンに２４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。この図が示すように、大きな細胞の異常は微小管ネットワーク中に広がっている。
【０２３０】
図３３は、ＤＢＴＳに４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。微小管ネットワークは完全に崩壊している；非常に短い微小管のみが存在し、微小管中のチューブリンの全体的なレベルは顕著に減少している。この影響は非イオン性の界面活性剤抽出及びイムノブロッティングによって生物化学的に定量し得る。図３４は、ＤＢＴＳに２４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。最も低い投与量において、いくらかの微小管が存在し、薬物にわずか４時間曝した細胞と比較して、細胞が部分的に回復しているように見える。；６μＭ又は１８μＭのいずれかのＤＢＴＳで２４時間処置した後に生存する細胞は無かった。
【０２３１】
図３５は、ＡＣＥＡ１００１０８に４時間曝した細胞における微小管の画像を示し、微小管ネットワークは試験した全ての濃度において顕著に変化している。微小管は非常に短く、微小管中内容物の全体的なレベルは減少しているようにみえる。最も高い濃度において、細胞はしばしば寄り集まっている。図３６は、ＡＣＥＡ１００１０８に２４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。１μＭ及び３μＭの両方において、細胞は４〜２４時間の間でいくぶん回復しているように見える。両方の場合における微小管ネットワークは比較的正常に見える。しかし、９μＭにおいては、微小管は短く、そのネットワークは異常であるように見える。
【０２３２】
図３７は、ＡＣＥＡ１００１１６に４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。微小管ネットワークの残留が１μＭにおいては残っているが、２つのより高い濃度において微小管は非常に短く、異常である。細胞は伸長していないが、むしろ投与量依存的に寄り集まっているように見える。図３８は、ＡＣＥＡ１００１１６に２４時間曝した細胞における微小管の画像を示す。わずか１μＭ  ＡＣＥＡ１００１１６で処理された細胞は比較的正常である；３μＭ又は９μＭで処理された本質的に全ての細胞は、ＡＣＥＡ１００１１６に曝して２４時間後に死滅した。
【０２３３】
図３９〜４１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの微小管組み立てにおけるＤＢＴＳ及び有機硫黄化合物ＡＣＥＡ１００１０８及びＡＣＥＡ１００１１６の効果を示す。図３９ａに示すように、ＤＢＴＳの全ての投与量は微小管組み立ての程度を顕著に阻害する。効果は特に９μＭにおいて顕著である。対照（図３９ｂ）及び薬物処理された（図３９ｃ）サンプルの両方の微小管構造を電子顕微鏡により視覚化した。図４０に示すように、より低い投与量のＡＣＥＡ１００１０８は、微小管組み立てに与える影響が最も小さかった。対照的に、２７μＭのＡＣＥＡ１００１０８は微小管組み立ての程度に顕著な阻害効果を与えた。
【０２３４】
図４１に示すように、ＡＣＥＡ１００１１６はＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１０８とは非常に異なっている。その他の２つの薬物が微小管組み立てを阻害するのに対して、ＡＣＥＡ１００１１６は微小管組み立てを促進する。このことは、９μＭ及び２７μＭの両方において明白である。このプロットは、一般的であるがよく理解されていない“オーバーシュート”として知られる現象を呈してもおり、そこにおいて光散乱のパターンはプラトーに達しておらずむしろ徐々に低下する。にもかかわらず、ＡＣＥＡ１００１１６がｉｎ  ｖｉｔｒｏで微小管組み立てを阻害するよりもむしろ促進することは明らかである。
【０２３５】
さらに、ＤＢＴＳ、ＡＣＥＡ１００１０８及びＡＣＥＡ１００１１６がｉｎ  ｖｉｔｒｏの微小管の挙動に影響することが示された。表３７に示すように、全ての３つの薬物は微小管動態のパターンを変化させた。ＤＢＴＳは微小管の生育速度に影響を及ぼさなかったが、生育事象の平均的な持続を増加させ、結果的に生育事象における平均的な生育の長さを増加させた。このことがまた生育にかかる時間の割合を増加させた。短縮事象の平均的な長さも減少した。
【０２３６】
ＡＣＥＡ１００１０８もまた、生育事象の持続を増加させ、生育事象の平均的な長さを増加させた；これもまた、短縮事象の長さにおいて強い効果を有した；この効果は、その他の２薬物のいずれかとも顕著に異なる効果を呈したＤＢＴＳ及びＡＣＥＡ１００１１６の効果よりも、なお顕著であった。ＡＣＥＡ１００１１６は生育速度を増加させたが、生育事象の長さにはほとんど影響しなかった。それは短縮事象の速度には影響を及ぼさなかったが、短縮事象の長さには強い影響を及ぼした。細胞イメージングデータがチューブリン又は微小管関連蛋白質へ結合している薬物を識別できないときには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小管組み立て及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小管動態アッセイの両者は、精製されたＭＡＰを含まないチューブリンのみを使用した。これらの観察は、全ての３つの薬物が直接的にチューブリンと相互作用することを示す。
【０２３７】
【表３７】
2011162562.tif 000069
（実施例２４）
（ＡＣＥＡ１００１０８が癌細胞においてアポトーシスを誘導する）
ＡＣＥＡ１００１０８化合物が癌細胞におけるアポトーシスを誘導するか否かを試験するために、Ａ５４９ヒト肺癌細胞を１μＭのＡＣＥＡ１００１０８及び５０ｎＭのパクリタキセル又は１０ｎＭのビンブラスチンで処理した。パクリタキセル及びビンブラスチンという２つの微小管動態抑制剤は陽性対照として使用した。Ａ５４９細胞をチャンバースライド中にウェルあたり１０，０００個の細胞数となるように撒き、１８時間後に指定された濃度の抗有糸分裂化合物ＡＣＥＡ１００１０８、パクリタキセル及びビンブラスチンによって処理した。細胞を薬物とともに２４時インキュベートし、次いでＰＢＳで２回、及び結合バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で３回洗浄した。細胞を、１μｇ／ｍＬのアネキシンＶ−Ｃｙ３コンジュゲート（赤色、アポトーシスの段階を開始した細胞を染色する）及び５００μＭの６−ＣＦＤＡ（緑色、生存している細胞を染色する）の１×結合バッファー中で２０分間染色した。この細胞を１×結合バッファー中で緩やかに３回洗浄し、マウントして、免疫蛍光顕微鏡下で取り付けられたＣＣＤカメラを用いて観察した。生存する細胞が６−ＣＦＤＡのみで染色され（緑色）、一方壊死している細胞がアネキシンＶ−Ｃｙ３のみで染色される（赤色）ことに留意されたい。アポトーシスの段階を開始した細胞はアネキシンＶ−Ｃｙ３と６−ＣＦＤＡの両方で染まるであろう。
【０２３８】
図４２に示すように、ＡＣＥＡ１００１０８、パクリタキセル及びビンブラスチンで処理された細胞はアネキシンＶでの強い染色を示し、一方ＤＭＳＯのみで処理された対照細胞はアネキシンＶで染まらなかった。このことは、ＡＣＥＡ１００１０８がＡ５４９ヒト肺癌細胞におけるアポトーシスを誘導することを示す。
【０２３９】
（実施例２５）
（ＡＣＥＡ１００１０８は癌細胞においてＧ２／Ｍ細胞周期停止を誘導する）
微小管は、細胞が２個の娘細胞へと分裂する前に、複製された染色体が２つの同一のセットへと分離するときの有糸分裂において極めて重要である。微小管を標的とするパクリタキセル及びビンブラスチン等の化合物は、微小管の動態を抑制し、有糸分裂のプロセスをブロックする。結果として、細胞はＧ２／Ｍ期において停止される。ＡＣＥＡ１００１０８が癌細胞の分裂における有糸分裂のプロセスに影響を及ぼすか否かを試験するために、Ａ５４９ヒト肺癌細胞を２５μＭのＡＣＥＡ１００１０８及び７．８ｎＭのパクリタキセルで処理し、この化合物の細胞周期への影響をフローサイトメトリーにより検出した。
【０２４０】
手短に言えば、Ａ５４９細胞を、６０ｍｍ組織培養ディッシュ中に５００，０００個の細胞数となる密度で撒いた。約１８時間後に細胞を指定された濃度の抗有糸分裂化合物により処理し、さらに２４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン処理し、計数して、氷冷７０％のメタノール中で固定化し、４℃で保存した。細胞をＰＢＳで洗浄し、プロピジウムアイオダイドで染色し、フローサイトメトリー分析まで氷中に保存した。図４３に示すように、Ｇ２／Ｍ期にある細胞の数は、ＡＣＥＡ１００１０８及びパクリタキセルの両方で処理した細胞中では、ＤＭＳＯのみで処理された細胞と比較して顕著に増加した。
【０２４１】
（実施例２６）
（ジ（ｐ−クロロベンジル）トリスルフィド（９）の大規模合成）
Ｎ−トリメチルシリルイミダゾール（１０．６７ｍＬ、９７％、ｄ＝０．９５６、実重量＝９．８９ｇ、７０．５４ｍｍｏｌ）を、乾燥した２５０ｍＬ容丸底フラスコ中で７０ｍＬの無水ヘキサン中に溶解した。この攪拌溶液に対してゆっくりと（４０〜５０分）二塩化硫黄のジクロロメタン溶液（３５．３ｍＬ、１．０Ｍ、３５．３ｍｍｏｌ）を窒素下、室温にて添加した。白色の沈殿が形成された。この反応混合物を５０分間攪拌し、次いで窒素下、０℃まで冷却した。４−クロロベンジルメルカプタン（９．５ｍＬ、９６％、実重量＝１１．１９ｇ、７０．５３ｍｍｏｌ）の無水ヘキサン溶液５０ｍＬを、攪拌しながら窒素下で４０〜５０分間かけて滴下した。得られた反応混合物を０℃、１時間攪拌し、次いで室温にて３時間攪拌した。セライトの詰め物を通過させ、少量のヘキサンで洗浄することにより、白色から淡い黄色の固体を濾過除去した。濾液を、水（２００ｍＬ、１００ｍＬ）で洗浄し、次いで飽和塩化ナトリウム溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。
【０２４２】
白色の固体残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（６０：１）を溶出液としたシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。画分を、ヘキサン−酢酸エチル（４０：１）を展開溶媒とするシリカゲルＴＬＣでモニターした（Ｒｆ＝０．４５）。所望の画分を回収し、溶媒をエバポレーションした。得られた白色の個体生成物をヘキサンから再結晶し、１１．０６ｇ（９０％）の所望の生成物９を白色の針状結晶として得た。
【０２４３】
【化３２】
2011162562.tif 000070
（実施例２７）
（ジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド（８）の大規模合成）
Ｎ−トリメチルシリルイミダゾール（２１．４２ｍＬ、９７％、ｄ＝０．９５６、実重量＝１９．８６ｇ、１４１．６ｍｍｏｌ）を、乾燥した５００ｍＬ容丸底フラスコ中で１４０ｍＬの無水ヘキサン中に溶解した。この攪拌溶液に対してゆっくりと（４０〜５０分）二塩化硫黄のジクロロメタン溶液（７０．８ｍＬ、１．０Ｍ、７０．８ｍｍｏｌ）を窒素下、室温にて添加した。白色の沈殿が形成された。この反応混合物を５０分間攪拌し、次いで窒素下、０℃まで冷却した。４−フルオロベンジルメルカプタン（１８．０４ｍＬ、２０．８６ｇ、９６％、実重量＝２０．０ｇ、１４０．８ｍｍｏｌ）の無水ヘキサン溶液１００ｍＬを、攪拌しながら窒素下で４０〜５０分間かけて滴下した。得られた反応混合物を０℃、１時間攪拌し、次いで室温にて３時間攪拌した。セライトの詰め物を通過させ、少量のヘキサンで洗浄することにより、白色から淡い黄色の固体を濾過除去した。濾液を、水（４００ｍＬ、３００ｍＬ）で洗浄し、次いで飽和塩化ナトリウム溶液（４００ｍＬ）で洗浄した。有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。
【０２４４】
白色の固体残留物を、ヘキサン−酢酸エチル（６０：１）を溶出液としたシリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。画分を、ヘキサン−酢酸エチル（４０：１）を展開溶媒とするシリカゲルＴＬＣでモニターした（Ｒｆ＝０．４６）。所望の画分を回収し、溶媒をエバポレーションした。得られた白色の固体生成物をヘキサンから再結晶し、１４．７ｇ（６７％）の白色の針状結晶として所望の生成物を得た。母液を濃縮した。さらなる再結晶は１０〜１５％多い結晶生成物を提供した。
【０２４５】
【化３３】
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（実施例２８）
（純粋な二塩化硫黄を用いたジ（ｐ−フルオロベンジル）トリスルフィド（８）の大規模合成）
Ｎ−トリメチルシリルイミダゾール（２２６．６ｍＬ、９７％、ｄ＝０．９５６、実重量＝２０５．７ｇ、１４６７ｍｍｏｌ）を、乾燥した３０００ｍＬ容三つ首フラスコ中で１２００ｍＬの無水ヘキサン及び５６０ｍＬの無水ジクロロメタン（分子ふるいタイプ３Ａで乾燥）中に溶解した。この攪拌溶液に対してゆっくりと（４０〜５０分）二塩化硫黄のジクロロメタン溶液（５５．９ｍＬ、９０．６３ｇ、８８０ｍｍｏｌ、０．６ｅｑ）を窒素下、室温にて添加した。反応は沈殿を伴って迅速に起こった。反応混合物を５０分間攪拌し、次いで窒素下で０℃まで冷却した。４−フルオロベンジルメルカプタン（１７６ｍＬ、９６％、実重量＝２００．１７ｇ、１４０８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液２５０ｍＬ及び１００ｍＬの無水ヘキサンを、攪拌しながら窒素下で４０〜５０分間かけて滴下した。得られた反応混合物を０℃、１時間攪拌し、次いで室温にて３時間攪拌した。反応物をヘキサン−酢酸エチル（４０：１）を展開溶媒とするシリカゲルＴＬＣでモニターし、その結果反応が正常に完了したことが示された。セライトの詰め物を通過させ、少量のヘキサンで洗浄することにより、白色から淡い黄色の固体を濾過除去した。濾液を、水で２回（１０００ｍＬ×２）洗浄し、次いで飽和塩化ナトリウム溶液（１０００ｍＬ）で１回洗浄した。有機溶媒相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤を濾過除去し、濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物を、石油エーテル（６０〜９０℃画分）−酢酸エチル（８０：１、６０：１、４０：１及び次いで２０：１）をグラジェント溶出液としたシリカゲルカラム（８×３６ｃｍ）上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。画分を、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（４０：１）を展開溶媒とするシリカゲルＴＬＣでモニターした（Ｒｆ＝０．４６）。所望の画分を回収し、溶媒をエバポレーションした。得られた白色の固体生成物を１０００ｍＬのヘキサンから再結晶し、１３１．０ｇの所望の生成物８を、収率５９．２％の白色針状結晶として得た（Ｔ収量２２１．１６ｇ）。
【０２４６】
【化３４】
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【化３５】
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非対称トリスルフィド４１〜６８（スキーム３）は、報告されている手法（Ｄｅｒｂｅｓｙ、Ｇ．；Ｈａｒｐｐ、Ｄ．Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９４、３５、５３８１−５３８４）と類似の方法Ｂにより合成することができる。例えば、フェニルチオール（Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＳＨ）（１０ｍｍｏｌ）溶液及び無水ピリジン（１０ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液２５ｍＬを、３０分間かけて、冷却され（−７８℃）攪拌された二塩化硫黄（１０ｍｍｏｌ）の無水ジエチルエーテル溶液５０ｍＬへと滴下する。反応混合物を３０分間攪拌する。対応する第２のチオール（１０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（１０ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液２５ｍＬを、−７８℃で３０分間かけて滴下し、反応混合物をさらに３０分間攪拌する。ｐＨが中性になるまで、反応混合物を水（２回）、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液（２回）、及び次いで水（２回）で洗浄する。有機溶媒相をＣａＣｌ２、又は無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して濃縮する。残ったものを、ヘキサン−酢酸エチルを溶出液として用いたシリカゲルの短い詰め物に通過させ、高純度の生成物４１〜６８を４０〜１００％の収率で得る。
【０２４７】
上述の詳細な説明及びそれに伴う実施例は説明的なものにすぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。開示される実施形態に対する各種の変更及び改変は当業者にとって明らかであろう。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、製剤及び／又はその使用方法に関する限定を伴わないこのような変更及び改変は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなくなされ得る。本明細書中に参照される米国特許及び出版物は参照として援用される。
【図１Ａ】
2011162562.tif 000074
【図１Ｂ】
2011162562.tif 000075
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2011162562.tif 000082
【図７】
2011162562.tif 000083
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【外国語明細書】
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