(57)【要約】【課題】微生物由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを用いた、芳香族アミンの効率的な製造方法を提供すること。【解決手段】シュードモナス属に属する細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの存在下で、芳香族Ｌ−アミノ酸から芳香族アミンを合成することを含む、芳香族アミンの製造方法；当該芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター；当該発現ベクターが導入された形質転換体など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるいずれかのタンパク質の存在下で、芳香族Ｌ−アミノ酸から芳香族アミンを合成することを含む、芳香族アミンの製造方法：
（Ａ）配列番号２により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｃ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有する、タンパク質；ならびに
（Ｄ）配列番号２により表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有する、タンパク質。
【請求項２】
芳香族Ｌ−アミノ酸が、下記（ｉ）あるいは（ｉｉ）のいずれかを芳香環として有する側鎖を含むα−アミノ酸である、請求項１記載の方法：
（ｉ）アリール基；あるいは
（ｉｉ）環構成原子として窒素原子を含有する単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基。
【請求項３】
芳香族Ｌ−アミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、ドーパ、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−メチルドパ、α−メチルチロシンおよび３−メトキシヒドロキシチロシンからなる群より選ばれるいずれかである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
芳香族Ｌ−アミノ酸がドーパである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれるいずれかのポリヌクレオチドを含む、発現ベクター：
（ａ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、欠失、置換、付加および挿入）を含むアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｈ）配列番号２により表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
発現ベクターが大腸菌用発現ベクターである、請求項５記載の発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターがＴ７プロモータを有する、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項９】
形質転換体の宿主が大腸菌である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
大腸菌が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項記載の形質転換体を培地中で培養して、請求項５〜７のいずれか一項記載の発現ベクター中に挿入されているポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を得ることを含む、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芳香族アミンの製造方法、発現ベクター、および形質転換体などに関する。
【背景技術】
【０００２】
芳香族アミノ酸は、脱炭酸反応により各種のアミンに変換される（例、下記参照）。
【０００３】
【化１】
2011130744.tif 000002
【０００４】
これらのアミン類は生体内（特に動物の中枢神経系）で非常に重要な役割を担っていると考えられている。フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、およびチロシン（Ｔｙｒ）が脱炭酸されて生じる各アミン（それぞれ、フェネチルアミン、トリプタミン、およびチラミン）は、神経伝達物質等の生体因子として作用することが知られており、振戦などの症状をもたらすパーキンソン病は、Ｌ−ドーパ（３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン［ＤＯＰＡ］）が脱炭酸されて生じるドパミンの欠乏により引き起こされる。さらに、５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）が脱炭酸されて生じるセロトニンに着目して、うつ病に関する研究・治療薬づくりも進められている。
【０００５】
芳香族アミンから生じる誘導体には数多くの有益な物質が存在する。例えば、アーモンドの香り成分であるベンズアルデヒドや、ヒヤシンスの香り成分であるフェニルアセトアルデヒドなどの芳香族アルデヒド類には、香料成分にとどまらず抗菌・抗ウイルス活性を示す物質も含まれている。また、芳香族アミンから生合成される植物アルカロイドには、鎮痛、抗がん、および抗マラリアなどの効用を示す物質が含まれ、医学的な見地からも重要性が高まっている。
【０００６】
このように、生理活性物質としての作用に限らず、医学・薬学面、さらには日常生活においても身近に存在する物質の合成に芳香族アミンが関与している。そのため、芳香族アミノ酸から各種アミンを効率的に生成する方法を確立することは重要である。
【０００７】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、芳香族アミノ酸からカルボキシル基を脱離させ、アミンの生成を触媒する酵素である。芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、植物や動物など多くの生物が有する酵素であるが、基質特異性は様々に異なる。
【０００８】
植物由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼとしては、チロシンデカルボキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼおよびフェニルアラニンデカルボキシラーゼが知られている（非特許文献１、２）。チロシンデカルボキシラーゼは、ドーパにも作用し得るが、トリプトファンデカルボキシラーゼは、基質特異性が厳密であり、トリプトファンのみに作用し得る（非特許文献１）。フェニルアラニンデカルボキシラーゼもまた、基質特異性が厳密であり、フェニルアラニンのみに作用し得る（非特許文献２）。
【０００９】
動物由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼとしては、ブタ腎臓由来の酵素が知られている。ブタ腎臓由来の酵素は、ドーパおよび５−ヒドロキシトリプトファンを含む広い範囲の基質に作用することが報告されている（非特許文献３、４）。また、ブタ腎臓由来の酵素については、大腸菌を利用した発現系の構築が困難であること、およびプロモータの選択等の創意工夫によりやっとのことで構築した場合でも、得られる組換え酵素の収量が低いこと（４ｍｇ組換え酵素／５リットル培養物）が報告されている（非特許文献５）。
【００１０】
ところで、微生物、特に細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの特性は、植物や動物由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼに比べて、詳細に解析されていない。細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのうち比較的解析されているものとしては、マイクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）に属する細菌由来の酵素が挙げられる（非特許文献６）。本細菌由来の酵素の基質特異性が検討されているが、本酵素は、ドーパが基質である場合、他の基質に比べて、反応性が低いことが報告されている（非特許文献６）。
【００１１】
細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの別の例は、乳酸菌由来の酵素である（非特許文献７〜１０）。乳酸菌由来の酵素は、チロシンのみを基質とする酵素（非特許文献１０）、およびチロシンとフェニルアラニンとを基質とする酵素（非特許文献７）が報告されている。
【００１２】
細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのさらに別の例は、ソランジウム属（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ）に属する細菌由来の酵素である（非特許文献１１）。本細菌由来の酵素は、ドーパに作用し得るものの、ドーパ以外の基質には作用し得ないことが報告されている（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆａｃｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，５４，１２１−１３８
【非特許文献２】Ｋａｍｉｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００６，２８１，２３３５７−２３３６６
【非特許文献３】Ｖｏｌｔａｔｔｏｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８３，２２，２２４９−２２５４
【非特許文献４】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９７０，１４１，３５６−３６７
【非特許文献５】Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９６，３１５，２４９−２５６
【非特許文献６】Ｎａｋａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８１，４５，２５４３−２５５２
【非特許文献７】Ｍａｒｃｏｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００６，２５８，１４４−１４９
【非特許文献８】Ｃｏｎｎｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００２，６８，３５３７−３５４４
【非特許文献９】Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００３，２２９，６５−７１
【非特許文献１０】Ｍｏｒｅｎｏ−Ａｒｒｉｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００１，１９５，１０３−１０７
【非特許文献１１】Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，１７３，３０３−３０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、芳香族アミンを工業的に製造するための有効な選択肢であると考えられる。細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの単離、および単離された芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの詳細な解析により、芳香族アミンの工業的な製造に応用され得る優れた特性を有する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを得ることが可能になる。
【００１５】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの単離および解析を行なうことにより、細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼについて、芳香族アミンの工業的な製造に応用され得る優れた特性を明らかにし、ひいては、かかる特性を利用した芳香族アミンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、シュードモナス属に属する細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを単離および解析した結果、この芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼが、芳香族アミンの工業的な製造に応用され得る優れた特性を有することを見出した。本知見により、かかる特性を利用した、芳香族Ｌ−アミノ酸から芳香族アミンの製造方法などを開発することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１７】
〔１〕下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるいずれかのタンパク質の存在下で、芳香族Ｌ−アミノ酸から芳香族アミンを合成することを含む、芳香族アミンの製造方法：
（Ａ）配列番号２により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｃ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有する、タンパク質；ならびに
（Ｄ）配列番号２により表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有する、タンパク質。
〔２〕芳香族Ｌ−アミノ酸が、下記（ｉ）あるいは（ｉｉ）のいずれかを芳香環として有する側鎖を含むα−アミノ酸である、上記〔１〕の方法：
（ｉ）アリール基；あるいは
（ｉｉ）環構成原子として窒素原子を含有する単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基。
〔３〕芳香族Ｌ−アミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、ドーパ、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−メチルドパ、α−メチルチロシンおよび３−メトキシヒドロキシチロシンからなる群より選ばれるいずれかである、上記〔１〕の方法。
〔４〕芳香族Ｌ−アミノ酸がドーパである、上記〔３〕の方法。
〔５〕下記（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれるいずれかのポリヌクレオチドを含む、発現ベクター：
（ａ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、欠失、置換、付加および挿入）を含むアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｈ）配列番号２により表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔６〕発現ベクターが大腸菌用発現ベクターである、上記〔５〕の発現ベクター。
〔７〕発現ベクターがＴ７プロモータを有する、上記〔６〕の発現ベクター。
〔８〕上記〔５〕〜〔７〕のいずれかの発現ベクターが導入された形質転換体。
〔９〕形質転換体の宿主が大腸菌である、上記〔８〕の形質転換体。
〔１０〕大腸菌が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、上記〔９〕の形質転換体。
〔１１〕上記〔８〕〜〔１０〕のいずれかの形質転換体を培地中で培養して、上記〔５〕〜〔７〕のいずれかの発現ベクター中に挿入されているポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を得ることを含む、タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の製造方法によれば、原料として芳香族Ｌ−アミノ酸を用いることにより、芳香族アミンを製造できる。シュードモナス属に属する細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、広い基質特異性を有するため、本発明の製造方法は、汎用性が極めて高いという利点を有する。また、シュードモナス属に属する細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、ドーパの脱カルボキシル化によるドパミン合成能に優れるため、本発明の製造方法は、多量のドパミンを効率的に合成できるという利点を有する。
本発明の発現ベクターおよび形質転換体によれば、シュードモナス属に属する細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを大量かつ効率的に製造できる。本発明はまた、このような発現ベクターおよび／または形質転換体を用いる、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、シュードモナス・プチダ由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼについて、至適ｐＨ分析の結果を示す図である。黒菱形：ｐＨ４．５〜６．５（クエン酸−リン酸）；黒四角：ｐＨ６．０〜８．５（リン酸カリウム緩衝液）；黒三角：ｐＨ８．０〜１１．０（ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ）
【図２】図２は、シュードモナス・プチダ由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼについて、ｐＨ安定性分析の結果を示す図である。使用した各緩衝液のｐＨは、実施例９で用いた緩衝液のｐＨ（図１のｐＨ）に準じている。
【図３】図３は、シュードモナス・プチダ由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼについて、温度安定性分析の結果を示す図である。
【図４】図４は、シュードモナス・プチダ由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼについて、至適温度分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．本発明に係る芳香族アミンの製造方法
本発明は、芳香族アミンの製造方法を提供する。本発明の製造方法は、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの存在下で、芳香族Ｌ−アミノ酸から芳香族アミンを合成することを含む。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、用語「芳香族Ｌ−アミノ酸」とは、芳香環を有する側鎖を含むＬ−アミノ酸をいう。芳香族Ｌ−アミノ酸において、アミノ基と、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼにより除去されるカルボキシル基との間の位置関係は、任意であり、芳香族Ｌ−アミノ酸は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸等であり得る。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、用語「芳香族アミン」とは、上記の芳香族Ｌ−アミノ酸からカルボキシル基が除去された分子構造を有するアミンをいう。
【００２３】
一実施形態では、本発明の製造方法は、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの存在下で、下記式（Ｉ）：
【００２４】
【化２】
2011130744.tif 000003
【００２５】
〔式中、環Ａは、置換されていてもよい芳香環を示し、ｎは、任意の整数であり、Ｘｎ、Ｙｎは、各々独立して、水素原子、あるいは（１）ヒドロキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、スルホニル基、カルボキシル基、またはアミノ基、あるいは（２）上記（１）の置換基で置換されていてもよいＣ１−６炭化水素基を示す。〕により表される芳香族Ｌ−アミノ酸から、
下記式（ＩＩ）：
【００２６】
【化３】
2011130744.tif 000004
【００２７】
〔式中、環Ａ、ｎ、Ｘｎ、Ｙｎは、上記と同義であり得る〕を合成することを含む。
【００２８】
式（Ｉ）における環Ａは、置換されていてもよい芳香環を示す。芳香環は、例えば、Ｃ６−１４アリール基（例、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル）または芳香族複素環基であり得る。
【００２９】
芳香族複素環基は、単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基であり得る。単環式芳香族複素環基は、環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、硫黄原子および窒素原子（好ましくは、窒素原子）から選ばれるヘテロ原子を１ないし４個含有する４ないし７員（好ましくは、５または６員）の基であり得る。縮合芳香族複素環基は、上記の単環式芳香族複素環基（好ましくは、環構成原子として窒素原子を含有する基）に対応する環と、１または２個の窒素原子を含む５または６員の芳香族複素環（例、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリジン、ピリミジン）、１個の硫黄原子を含む５員の芳香族複素環（例、チオフェン）およびベンゼン環から選ばれる１または２個の環とが縮合した環から誘導される基であり得る。
【００３０】
単環式芳香族複素環基としては、例えば、フリル、チエニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルが挙げられる。
【００３１】
縮合芳香族複素環基としては、例えば、キノリル、イソキノリル、キナゾリル、キノキサリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンズオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、インドリル（例、インドール−１−イル、インドール−２−イル、インドール−３−イル、インドール−５−イル）、インダゾリル、ピロロピラジニル、イミダゾピリジニル、イミダゾピラジニル、ピラゾロピリジニル、ピラゾロチエニル、ピラゾロトリアジニルが挙げられる。
【００３２】
環Ａにより示される「置換されていてもよい芳香環」における「置換基」としては、例えば、以下が挙げられる：
（１）ヒドロキシル基、ハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、ニトロ基、シアノ基、スルホニル基、カルボキシル基、およびアミノ基（下記（２）のＣ１−６炭化水素基でモノまたはジ置換されていてもよい）；ならびに
（２）上記（１）の置換基で置換されていてもよいＣ１−６炭化水素基。
置換基が２個以上である場合、各置換基は同一でも異なっていてもよい。
【００３３】
Ｃ１−６炭化水素基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル）、Ｃ２−６アルケニル基（例、ビニル、アリル）、Ｃ２−６アルキニル基（例、エチニル、プロパルギル）、Ｃ３−６シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル）が挙げられる。
【００３４】
ｎは、繰返し単位の数を示す。ｎは、任意の整数であり得、例えば０〜５の整数、好ましくは０〜２の整数であり得る。ｎが０である場合、上記式（Ｉ）により表されるα−アミノ酸は、側鎖として、置換されていてもよい芳香環を有する。ｎが１である場合、上記式（Ｉ）により表されるα−アミノ酸は、置換されていてもよい芳香環で置換されたメチル基（Ｘ１およびＹ１が水素原子である場合）、置換されていてもよい芳香環およびＸ１またはＹ１で置換されたメチル基（Ｘ１またはＹ１の一方が水素原子であり、他方が水素原子でない場合）、あるいは置換されていてもよい芳香環、ならびにＸ１およびＹ１で置換されたメチル基（Ｘ１およびＹ１が水素原子でない場合）を、側鎖として有する。ｎが２である場合、上記式（Ｉ）により表されるα−アミノ酸は、置換されていてもよい芳香環で置換されたエチル基（Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２が水素原子である場合）を、側鎖として有する。
【００３５】
Ｘｎ、Ｙｎは、各々独立して、水素原子、あるいは上記（１）または（２）に示した置換基であり得る。Ｘｎ、Ｙｎにおける「ｎ」は、Ｘｎ、Ｙｎがそれぞれｎ個存在することを示す。Ｘｎ、Ｙｎにおける「ｎ」は、任意の整数であり得、例えば０〜５の整数、好ましくは０〜２の整数であり得る。例えば、ｎが０である場合、Ｘｎ、Ｙｎは、存在しない。ｎが１である場合、Ｘ１およびＹ１は、各々独立して、水素原子、あるいは上記（１）または（２）の置換基であり得る。ｎが２である場合、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２が存在し、これらは、各々独立して、水素原子、あるいは上記（１）または（２）の置換基であり得る。
【００３６】
理解の容易のため、ｎ、Ｘｎ、Ｙｎの関係をより具体的に示すと、ｎ＝２の場合、本発明の製造方法は、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの存在下で、下記式（Ｉ’）：
【００３７】
【化４】
2011130744.tif 000005
【００３８】
〔式中、環Ａは、置換されていてもよい芳香環を示し、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、各々独立して、水素原子、あるいは（１）ヒドロキシル基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、スルホニル基、カルボキシル基、またはアミノ基、あるいは（２）上記（１）の置換基で置換されていてもよいＣ１−６炭化水素基を示す。〕により表される芳香族Ｌ−アミノ酸から、
下記式（ＩＩ’）：
【００３９】
【化５】
2011130744.tif 000006
【００４０】
〔式中、環Ａ、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２およびＹ２は、上記と同義であり得る〕を合成することを含む。
【００４１】
別の実施形態では、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸は、芳香環として、（ｉ）アリール基、あるいは（ｉｉ）環構成原子として窒素原子を含有する単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基（例、上述の単環式芳香族複素環基または縮合芳香族複素環基）を有する側鎖を含むアミノ酸であり得る。このような芳香族Ｌ−アミノ酸の好ましい例としては、フェニルアラニン、チロシン、ドーパ、トリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−メチルドパ、α−メチルチロシンおよび３−メトキシヒドロキシチロシンが挙げられる。
【００４２】
本発明の製造方法では、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの存在下で、芳香族Ｌ−アミノ酸から芳香族アミンが合成される。
【００４３】
一実施形態では、本発明の製造方法に用いられ得る芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、種々の酵素学的特性を有するタンパク質であり得る。このような酵素学的特性としては、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性、分子量、活性、Ｋｍ値が挙げられる。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、用語「ｐＨ安定性」とは、該当するｐＨ領域において、タンパク質を２４時間インキュベートした場合、初期活性の６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは１００％の活性を保持し得ることをいう。換言すれば、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、初期活性の６０％以上の活性を保持する場合、ｐＨ約５．８〜約１１．０においてｐＨ安定性を示し得、初期活性の８０％以上の活性を保持する場合、ｐＨ約６．０〜約１１．０においてｐＨ安定性を示し得、初期活性の９０％以上の活性を保持する場合、ｐＨ約７．８〜８．２においてｐＨ安定性を示し得、初期活性の１００％以上の活性を保持する場合、ｐＨ約７．０においてｐＨ安定性を示し得る。したがって、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、ｐＨ約５．８〜約１１．０において２４時間インキュベートされた場合、初期活性の少なくとも６０％の活性を保持し得るｐＨ安定性を示す。
【００４５】
本明細書中で用いられる場合、用語「至適ｐＨ」とは、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼが最大活性を示し得るｐＨをいう。芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの至適ｐＨは、ｐＨ約７．３〜約９．５の範囲中の任意のｐＨ値であり得るが、好ましくは、ｐＨ約７．５〜約８．３の範囲中の任意のｐＨ値であり得、より好ましくは、ｐＨ約７．８〜約８．２の範囲中の任意のｐＨ値であり得、さらにより好ましくは、ｐＨ約８．０であり得る。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、用語「温度安定性」とは、該当する温度範囲において、タンパク質を３０分間インキュベートした場合、初期活性の６０％以上、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上の活性を保持し得ることをいう。換言すれば、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、初期活性の６０％以上の活性を保持する場合、約０〜約５２℃の温度安定性を示し得、初期活性の８０％以上の活性を保持する場合、約０〜約５０℃の温度安定性を示し得、初期活性の９０％以上の活性を保持する場合、約０〜約４７℃の温度安定性を示し得る。したがって、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、約０〜約５２℃で１時間インキュベートされた場合、初期活性の少なくとも６０％の活性を保持し得る温度安定性を示す。
【００４７】
本明細書中で用いられる場合、用語「至適温度」とは、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼが最大活性を示し得る温度をいう。芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの至適温度は、約３９〜約６３℃の範囲中の任意の温度であり得るが、好ましくは、約４５〜約６１℃の範囲中の任意の温度であり得、より好ましくは、約４９〜約６０℃の範囲中の任意の温度であり得、さらにより好ましくは、約５５℃であり得る。
【００４８】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの分子量は、単量体としては、例えば約４０〜約６５ｋＤａ、好ましくは約４５ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、より好ましくは約５０〜約５５ｋＤａであり得る。芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの分子量はまた、二量体としては、例えば約８０〜約１３０ｋＤａ、好ましくは約９０ｋＤａ〜約１２０ｋＤａ、より好ましくは約１００〜約１１０ｋＤａであり得る。
【００４９】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼはまた、各基質について優れたＫｍ値を有し得る。具体的には、ドーパに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＫｍ値は、例えば約１．０ｍＭ以下、好ましくは約０．０１〜約１．０ｍＭ、より好ましくは約０．０５〜約０．５ｍＭであり得る。５−ＨＴＰに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＫｍ値は、例えば約５．０ｍＭ以下、好ましくは約０．００５〜約５．０ｍＭ、より好ましくは約０．１〜約１．０ｍＭであり得る。ＰｈｅおよびＴｒｐに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＫｍ値は、それぞれ、例えば約５０ｍＭ以下、好ましくは約１．０〜約５０．０ｍＭ、好ましくは約５．０〜約３０．０ｍＭ、より好ましくは約８．０〜約２５．０ｍＭであり得る。
【００５０】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼはまた、各基質について優れたＶｍａｘ値（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ）を有し得る。具体的には、ドーパに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値は、例えば約５００以上、好ましくは約１０００以上、より好ましくは約１５００以上、さらにより好ましくは約２０００以上であり得る。ドーパに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値はまた、約１００００以下、例えば約５０００以下であり得る。５−ＨＴＰに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値は、例えば約１０以上、好ましくは約２０以上、より好ましくは約５０以上、さらにより好ましくは約８０以上であり得る。５−ＨＴＰに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値はまた、約５００以下、例えば約２００以下であり得る。Ｐｈｅに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値は、例えば約５０以上、好ましくは約１００以上、より好ましくは約２００以上、さらにより好ましくは約４００以上であり得る。Ｐｈｅに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値はまた、約２０００以下、例えば約１０００以下であり得る。Ｔｒｐに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値は、例えば約０．５以上、好ましくは約１．０以上、より好ましくは約２．０以上、さらにより好ましくは約４．０以上であり得る。Ｔｒｐに対する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのＶｍａｘ値はまた、約３０以下、例えば、約１５以下であり得る。
【００５１】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼはまた、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性」とは、芳香族Ｌ−アミノ酸からカルボキシル基を除去して、芳香族アミンに変換する触媒活性をいう。
【００５２】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼはまた、広い基質特異性および優れた活性を有し得る。例えば、基質特異性については、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、上記式（Ｉ）により表される化合物を基質として、上記式（ＩＩ）により表される化合物を合成し得る。優れた活性については、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、特にドーパをドパミンに変換する触媒活性に優れる。脊椎動物由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼが、脊椎動物の内因性物質であるドーパを、脊椎動物の神経伝達物質であるドパミンに変換する触媒活性を有している点は理解できるが、シュードモナス属に属する細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼが、脊椎動物の神経伝達物質であって、かつ微生物の内因性物質でないドパミンの合成能に優れているという点は、驚くべきことであり、予想外であった。
【００５３】
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼはまた、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌に由来し得る。より具体的には、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、好ましくは、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株に由来し得る。
【００５４】
別の実施形態では、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選ばれるいずれかであるタンパク質であり得る：
（Ａ）配列番号２により表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（Ｂ）配列番号２により表されるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｃ）配列番号２により表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、欠失、置換、付加および挿入）を含むアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有する、タンパク質；あるいは
（Ｄ）配列番号２により表されるアミノ酸配列に対して所定のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有する、タンパク質。
【００５５】
本発明においては、タンパク質（Ａ）と実質的に同一のタンパク質も用い得る。タンパク質（Ａ）と実質的に同一のタンパク質として、（Ｂ）〜（Ｄ）に示すタンパク質が提供される。アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、用語「１又は数個」は、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や活性を大きく損なわない範囲を示すものである。タンパク質の場合における用語「１又は数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。タンパク質（Ｂ）〜（Ｄ）は、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を保持し得る限り、特に限定されないが、上述の１以上の特性（例、ｐＨ安定性）をさらに保持していてもよい。ただし、タンパク質（Ｂ）〜（Ｄ）の場合、５５℃、ｐＨ８．０の条件下で、タンパク質（Ａ）の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００５６】
タンパク質（Ａ）と実質的に同一である芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、部位特異的変異法等の変異導入法により、または精製用配列等のタグ配列を有する発現ベクターに、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより得られる。また、上記のような改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びタンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡを保持する大腸菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００５７】
また、上記のような変異には、微生物の種あるいは菌株による差等、天然に生じる変異も含まれる。上記のような変異を有するＤＮＡを適当な細胞で発現させ、発現産物の本酵素活性を調べることにより、タンパク質（Ａ）と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００５８】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、及び硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、及びグリシンとアラニンとの間での置換であり得る。
【００５９】
また、タンパク質（Ａ）とそれぞれ実質的に同一のタンパク質として、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するタンパク質が挙げられる。なお、本明細書において、アミノ酸配列の同一性の計算は、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド鎖全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＭａｒｃｈｉｎｇ  ｃｏｕｎｔをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値である。
【００６０】
本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼはまた、精製用タグを含んでいてもよい。精製用タグに親和性を有する物質（例えば、Ｎｉ２＋レジン、タグに特異的な抗体）を用いることで、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを、より簡便に単離、精製することができる。精製用タグとしては、例えば、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡＧが挙げられるが、付加されるアミノ酸配列が短く、多くの場合除去する必要がない、および特異的な抗体や精製用担体も複数の市販品が入手可能であり、安価である等の理由より、ヒスチジンタグが好ましい。
【００６１】
反応液中の芳香族Ｌ−アミノ酸の濃度は、特に制限されず、適宜設定できる。芳香族Ｌ−アミノ酸はまた、反応中に適宜補充されてもよい。さらに、芳香族Ｌ−アミノ酸は、遊離の塩基および塩のいずれの形態でも用いることができる。
【００６２】
反応液中の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの濃度は、反応が進行し得る限り、特に限定されない。芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼはまた、上記のような反応を触媒し得る状態で反応系内に存在すれば、その形態に特に限定はない。すなわち、タンパク質の存在下で反応を行う際の、反応系内におけるタンパク質の具体的な存在形態としては、例えば、タンパク質を生産する微生物を含む培養物、その培養物から分離された微生物菌体、菌体処理物などが含まれる。微生物を含む培養物とは、微生物を培養して得られる物のことであり、より具体的には、微生物菌体、その微生物の培養に用いた培地および培養された微生物により生成された物質、及びこれらの混合物などのことをいう。また、微生物菌体は洗浄し、洗浄菌体として用いてもよい。また、菌体処理物には、菌体を破砕、溶菌、凍結乾燥したものなどが含まれ、さらに菌体などを処理して回収される無細胞抽出物や粗精製タンパク質、これらをさらに精製した精製タンパク質などが含まれる。精製処理されたタンパク質としては、各種精製法によって得られる部分精製タンパク質等を使用してもよいし、これらを共有結合法、吸着法、包括法等によって固定化した固定化タンパク質を使用してもよい。また、使用する微生物によっては、培養中に一部、溶菌するものもあるので、この場合には培養液上清もタンパク質含有物として利用し得る。
【００６３】
本発明の製造方法におけるｐＨは、より多量の芳香族アミンを芳香族Ｌ−アミノ酸から効率的に製造するという観点から、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのｐＨ安定性および至適ｐＨを考慮して、適宜設定できる。本発明の製造方法は、例えばｐＨ約６．０〜約１１．０、好ましくはｐＨ約７．０〜約９．５、より好ましくはｐＨ約７．５〜約８．５、さらにより好ましくはｐＨ約８．０の条件下で行なわれ得る。
【００６４】
本発明の製造方法における温度は、より多量の芳香族アミンを芳香族Ｌ−アミノ酸から効率的に製造するという観点から、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの温度安定性および至適温度を考慮して、適宜設定できる。本発明の製造方法は、例えば約２０℃〜約６５℃、好ましくは約３０℃〜約６０℃、より好ましくは約３５℃〜約５５℃の条件下で行なわれ得る。
【００６５】
本発明の製造方法では、反応液中に、反応の進行に必要な成分（例、ピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ））をさらに含み得る。
【００６６】
本発明の製造方法において、反応時間は、製造されるべき芳香族アミン量に応じて適宜設定できる。反応は、静置または攪拌状態で行われ得る。
【００６７】
本発明の製造方法により製造された芳香族アミンは、公知の方法により容易に反応液から分離精製できる。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより精製後、濃縮し、有機溶媒中で結晶体を得ることができる。
【００６８】
２．本発明に係る発現ベクター、形質転換体、およびこれらの調製
本発明は、芳香族アミンの製造に有用な発現ベクターおよび形質転換体を提供する。
【００６９】
本発明の発現ベクターは、下記（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれるいずれかのポリヌクレオチドを含む。
（ａ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１により表されるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド；あるいは
（ｅ）〜（ｈ）上記〔Ａ〕〜〔Ｄ〕のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００７０】
上記（ａ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらの混合物であってもよい。
【００７１】
本発明の発現ベクターの調製方法を説明する。上記ポリヌクレオチドは、定法により単離できる。例えば、配列番号１により表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａの染色体ＤＮＡ、もしくはＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションによって取得することができる。また、配列番号１に記載されたヌクレオチド配列に基づいてプライマーまたはハイブリダイゼーション用のプローブを設計することもでき、あるいはプローブを使って単離することもできる。
【００７２】
本発明の発現ベクターはまた、上記ポリヌクレオチド（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドをコードしていてもよい。ポリヌクレオチド（ａ）と実質的に同一のポリヌクレオチドとして、例えば、上記ポリヌクレオチド（ｂ）〜（ｈ）が挙げられる。
【００７３】
上記の上記ポリヌクレオチド（ｄ）では、ポリヌクレオチド（ａ）に対するヌクレオチド配列同一性が、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であり得る。なお、本明細書において、ヌクレオチド配列同一性は、ＯＲＦ全体（終止コドンを含む）において、株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ  ＝  ６、ｐｉｃｋ  ｕｐ  ｌｏｃａｔｉｏｎ＝１の設定でｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた数値により判定され得る。
【００７４】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このような条件は、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄であり得る。このような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の発現ベクターにつなぎ、適当な宿主で発現させて、発現産物の酵素活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００７５】
なお、上記ポリヌクレオチド（ｂ）〜（ｈ）は、それらによりコードされるタンパク質が芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を保持し得る限り、特に限定されないが、上述の１以上の特性をさらに保持するタンパク質をコードしていてもよい。ただし、上記ポリヌクレオチド（ｂ）〜（ｈ）の場合、５５℃、ｐＨ８．０の条件下で、タンパク質（Ａ）の半分程度以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ活性を保持しているタンパク質をコードすることが望ましい。
【００７６】
次に本発明の製造方法に用いられる発現ベクターおよび形質転換体の作製方法について、上記（Ａ）のタンパク質を一例として説明する。他の変異型タンパク質についても同様に実施し得る。
【００７７】
上記（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体は、上記のいずれかのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを作製し、これを用いて作製することができる。例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを作製して適切な宿主に導入することにより、（Ａ）のタンパク質を発現する形質転換体を得ることができる。配列番号１により表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡにより特定されるタンパク質を発現させるための宿主としては、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム属細菌、及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）をはじめとする種々の真核細胞を用い得る。多量のタンパク質を効率的に製造するという観点からは、宿主としては、大腸菌が好ましい。
【００７８】
配列番号１により表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを宿主に導入するために用いる発現ベクターは、発現させようとする宿主の種類に応じたベクターに、これらのＤＮＡを、ＤＮＡがコードするタンパク質が発現可能な形態で挿入することで調製し得る。
【００７９】
形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、ＢＬ２１株またはその亜株（例、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株）、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株などから選択することができる。多量のタンパク質を効率的に製造するという観点からは、宿主としては、ＢＬ２１株またはその亜株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｒｅｓｓ  （２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
【００８０】
本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモータは、通常、大腸菌における異種タンパク質生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ラムダファージのＰＲプロモータ、ＰＬプロモータ、Ｔ５プロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。大量の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの効率的な製造という観点からは、Ｔ７プロモータの使用もまた好ましい。この場合、宿主としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌を用いることもまた、好ましい。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌としては、例えば、ＢＬ２１株またはその亜株（例、ＢＬ２１（ＤＥ３）株）が挙げられる。
【００８１】
生産量を増大させるためには、融合タンパク質遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネータを連結することが好ましい場合がある。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータが挙げられる。大量の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの効率的な製造という観点からは、Ｔ７ターミネータの使用もまた好ましい。
【００８２】
発現ベクターはまた、転写開始および転写終結のための部位、および翻訳に必要とされ得るリボソーム結合部位、複製起点、選択マーカー遺伝子、精製用タグ（例、ヒスチジンタグ）のコーディング領域などを含み得る。選択マーカー遺伝子としては、宿主として大腸菌を用いた場合に、形質転換された大腸菌を選別できるものである限り特に限定されないが、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン等の抗生物質に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００８３】
ベクターとしては、例えば、ｐＥＴ、ｐＵＣ、ｐＢＲ、ｐＨＳＧ、ＲＳＦ、ｐＡＣＹＣ、ｐＭＷ、ｐＱＥおよびその誘導体を用いてもよい。大量の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの効率的な製造という観点からは、ｐＥＴの使用もまた好ましい。この場合、宿主としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌の使用もまた好ましい。
【００８４】
所定の活性を有する目的タンパク質をコードするＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して発現ベクターを得る。得られた発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、所定のタンパク質が製造される。
【００８５】
上記精製用タグとの融合タンパク質として発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、目的タンパク質内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いて目的タンパク質を切り出せるようにしてもよい。
【００８６】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００８７】
目的タンパク質を回収するには、以下の方法などがある。目的タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法により、目的タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、目的タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００８８】
本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、形質転換体を用いて、大量に効率的に製造できる。例えば、従来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（例、ブタ由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ）の収量は、大腸菌で発現させた場合、少量である（非特許文献５）。一方、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの収量は、大腸菌で発現させた場合、多量である。したがって、本発明の製造方法で用いられる芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの発現系は、従来の発現系に比し、大量の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを効率的に製造できるという利点を有する。より多量の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを効率的に製造するという観点からは、宿主として大腸菌（例、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌）および大腸菌用発現ベクター（例、Ｔ７プロモータを有する発現ベクター）の組合せを用いることもまた好ましい。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００９０】
［実施例１］Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのクローニング
微生物、特に細菌に由来する芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼに関しては未だ詳細な性状解析が行われていない。芳香族アミンおよびその誘導体の効率的生産において微生物を用いた発酵・酵素合成法は極めて有効な選択肢であり，微生物、特に細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼについて詳細な知見を得ることは重要である。そこで、細菌由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを解析した。
【００９１】
ブタ腎臓由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を用いて細菌の全ゲノム配列データベースよりホモログを探索したところ、入手可能であった菌株群のうちＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株ならびにＭｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ  ＳＩＯ−８株において高い相同性を示す機能未知ＯＲＦの存在が明らかとなった（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０，相同性３９％［ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ：ＰＰ＿２５５２］；Ｍ．ｍａｒｉｎａ  ＳＩＯ−８，相同性４０％［ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ：Ｍ２３１３４＿００４８３］）。
【００９２】
１．１  ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ反応
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０のゲノムＤＮＡから、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼホモログをＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ用酵素には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を使用した。ＰＣＲ条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１０秒間を３０サイクルであった。ＰＣＲに用いた各プライマーの詳細は、以下のとおりであった。
【００９３】
プライマー１：ＡＡＡＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＣＣＣＧＡＡＣＡＡＴＴＣＣＧ（配列番号３：ＮｄｅＩ切断部位を含む）
プライマー２：ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧ（配列番号４：ＢａｍＨＩ切断部位を含む）
プライマー３：ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧ（配列番号５：ＢａｍＨＩ切断部位を含む）
【００９４】
プライマー１およびプライマー２によるＰＣＲ産物は、制限酵素処理後、ｐＥＴ−１６ｂプラスミドに対するライゲーションに使用した。プライマー１およびプライマー３によるＰＣＲ産物は、ｐＥＴ−３ａに対するライゲーションに使用した。ｐＥＴ−３ａはヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列を有しないため、プライマー３中に、ヒスチジンタグをコードするヌクレオチド配列ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ（配列番号６）を付加した。
【００９５】
１．２  制限酵素処理
増幅した芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼホモログを含む各種ＰＣＲ断片およびベクター（ｐＥＴ−３ａ，ｐＥＴ−１６ｂ；Ｍｅｒｃｋ）を制限酵素で切断した。切断には、ＢａｍＨＩ（ＴＯＹＯＢＯ）およびＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。
【００９６】
１．３  ライゲーションおよび大腸菌ＤＨ５αの形質転換
ライゲーションには、タカラバイオ社のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞を使用した。ライゲーション反応は、各溶液を１６℃で３０分以上インキュベートすることで行った。ＤＨ５αの形質転換および形質転換体の培養は、定法により行った。
【００９７】
１．４  プラスミドの抽出およびインサートの確認
プラスミドの抽出は、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。
【００９８】
抽出後のプラスミドについて、ライゲーションが適切に行われたことを確認する目的で、制限酵素処理（ＢａｍＨＩ，ＮｄｅＩ）後に、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果、目的遺伝子が、ｐＥＴ−１６ｂ（Ｎ末端側にヒスチジンタグが付加）、ｐＥＴ−３ａ（Ｃ末端側にヒスチジンタグが付加）に正確に導入されたことが示唆された。
【００９９】
次いで、抽出後のプラスミドの残りを、シーケンス解析に使用した。シーケンス解析のサーマルサイクル反応には、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。シーケンス解析では、ＰＣＲにより増幅したインサートのＤＮＡ配列をゲノムデータベース上のＤＮＡ配列と比較し，相違がないことを確認した。芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼホモログのＤＮＡ配列およびその推定アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および配列番号２により示す。
【０１００】
［実施例２］Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの酵素活性の確認
２．１  大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および培養
実施例１で得られたプラスミドを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換を行い，芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼホモログの発現株を構築した。培養は、定法により行い、ＩＰＴＧを用いて、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼホモログの発現を誘導した。１８℃で一晩培養後、菌体を回収した。
【０１０１】
２．２  ＴＬＣによるアミン生成確認
各プラスミド導入後のＢＬ２１（ＤＥ３）の無細胞抽出液について、芳香族アミン生成活性を、ＴＬＣにより確認した。酵素反応における基質として、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびチロシン（Ｔｙｒ）を用いた。
【０１０２】
ＴＬＣによるアミン生成活性の確認は、以下のとおり行った。先ず、上記２．１で回収された菌体を、菌体破砕用緩衝液〔５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ピリドキサール−５’−ホスフェート（ＰＬＰ）および０．０２ｍＭ  ＥＤＴＡ〕中に懸濁した。Ｖｉｂｒａ  ｃｅｌｌ（マイクロテック・ニチオン）を用いて、超音波により菌体を破砕した。菌体の破砕は、４０Ａ（１０Ｗ）、４分、４秒間隔で行った。次いで、各基質を含む酵素反応液〔５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＰＬＰ〕を調製した。酵素反応液中、基質濃度は、２．５ｍＭ（ＤＯＰＡ、ＰｈｅおよびＴｒｐ）、または１ｍＭ（Ｔｒｐ）であった。菌体破砕後の酵素溶液を、総容量の１／５量添加し、反応を開始した。１時間または２０時間の反応後、反応溶液を、ＴＬＣプレート（Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０；ＭＥＲＣＫ）に１μｌスポットした。プレートの乾燥後、展開溶媒（１−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１）を用いて、反応溶液を展開した。展開後のプレートに、０．２％ニンヒドリン溶液（エタノール中に溶解）を噴霧し、プレートの乾燥後、１００℃のホットプレート上で加熱し、各アミノ酸およびアミンを検出した。
【０１０３】
その結果、Ｃ末端ヒスチジンタグ融合型酵素発現株（ｐＥＴ−３ａ／ＢＬ２１（ＤＥ３））の無細胞抽出液について、１時間反応させた場合、ＤＯＰＡおよびＰｈｅにおいてアミンの生成が確認された。一方、１時間反応させた場合、ＴｒｐおよびＴｙｒでは対応するアミンの生成が確認されなかった。２０時間反応させた場合、Ｔｙｒにおいてチラミンに相当するスポットが確認されたが、Ｔｒｐについては、トリプタミンのスポットを確認できなかった。
【０１０４】
続いて、Ｎ末端ヒスチジンタグ融合型酵素発現株（ｐＥＴ−１６ｂ／ＢＬ２１（ＤＥ３））の無細胞抽出液を用いて、ＴＬＣによる酵素反応の確認を行った。上述したように、本酵素のＴｙｒへの反応性が低いことを考慮し、本株については２０時間反応後の溶液のみをスポットした。
【０１０５】
その結果、Ｎ末端ヒスチジンタグ融合型酵素発現株（ｐＥＴ−１６ｂ／ＢＬ２１（ＤＥ３））の無細胞抽出液について、ＤＯＰＡおよびＰｈｅにおいてアミンの生成が確認された。一方、Ｔｙｒではアミンの生成がわずかに確認され、Ｔｒｐではアミンの生成が確認できなかった。ＤＯＰＡについては全てドパミンに変換されていたことから、本酵素のＤＯＰＡに対する高い反応性が示唆された。
【０１０６】
なお、Ｃ末端ヒスチジンタグ融合型酵素発現株およびＮ末端ヒスチジンタグ融合型酵素発現株の無細胞抽出液では、同一基質からのアミンの生成に顕著な差は見出されなかったことから、ヒスチジンタグ付加部位による酵素活性への影響は小さいと考えられた。
【０１０７】
以上より、クローニングされたＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来遺伝子が芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼをコードしていることが実証された。
【０１０８】
［実施例３］ヒスチジンタグ付加部位による発現量の比較
ヒスチジンタグを付加した部位によって発現の程度が異なるかどうかを検証した。上記２．１で回収された菌体を、比較に用いた。具体的には、菌体を含む溶液を遠心分離し、上清を除去した。得られた菌体を、上述した菌体破砕用緩衝液中に懸濁し、再度、遠心分離した。上清を除去後、菌体を、上述した菌体破砕用緩衝液中に再懸濁した。次いで、超音波により、菌体を破砕した（４０Ａ［１０Ｗ］、４分、４秒間隔）。破砕後の菌体残渣を遠心分離し、可溶画分および不溶画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、両画分中の量を比較した。
【０１０９】
その結果、ヒスチジンタグをＣ末端側（ｐＥＴ−３ａ）およびＮ末端側（ｐＥＴ−１６ｂ）に付加したいずれの場合においても、菌体破砕後の可溶性画分では同程度の酵素量を示した。一方、不溶性画分では、Ｎ末端側にヒスチジンタグを付加した場合に、酵素量がやや多かった。
【０１１０】
ＳＤＡ−ＰＡＧＥを利用した本実験およびＴＬＣを利用した実施例２の実験の結果より、ヒスチジンタグ付加部位による、可溶体の量および活性の顕著な差が確認されなかったことから、いずれの発現系を用いても、タグ部位が酵素機能に影響を及ぼす可能性は少ないものと考えられた。したがって、ヒスチジンタグを除去する可能性を考慮し、ヒスチジンタグ付加部位近傍にＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断部位を有するＮ末端ヒスチジンタグ付加型酵素を、以降で使用した。
【０１１１】
［実施例４］大腸菌を用いた、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの大量発現系の構築
実施例３までの手法で作製したＮ末端ヒスチジンタグ融合型芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ発現株を大量培養した。具体的には、ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換株を、２５ｍｌの液体ＬＢ培地（アンピシリン含有）に植菌し、２５℃で一晩前培養した。得られた培養液を、６６０ｍｌまたは１０００ｍｌの液体ＬＢ培地（アンピシリン含有）に接種した。１８℃で振盪培養し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．３〜０．５の時点で、ＩＰＴＧを、終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。１８℃で約２０時間振盪培養した後、菌体を、遠心分離により回収した。
【０１１２】
［実施例５］Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの精製
本酵素を、３段階のクロマトグラフィーを経て精製した。具体的には、Ｎｉ−ＮＴＡ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ４．６／１００  ＰＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、本酵素を精製した。
【０１１３】
５．１  アフィニティークロマトグラフィーによる精製
以下の操作は、４℃で行った。先ず、実施例４に記載される方法による大量培養後に回収した菌体を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＰＬＰ（ｐＨ８．０））２００ｍｌ中に懸濁した。超音波により、菌体を破砕した（４０Ａ［１０Ｗ］、４分、４秒間隔）。破砕した菌体を、遠心分離し、上清をＮｉ−ＮＴＡ担体にアプライした。非吸着画分を、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに、さらに２回アプライした。洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＰＬＰ（ｐＨ８．０））でカラムを洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭ  イミダゾール、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＰＬＰ（ｐＨ８．０））で、酵素を溶出させ、チューブに分取した。酵素を含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより判別し、酵素を含む画分を合わせた。最後に、透析用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＰＬＰ）中で、合わせた画分を透析した。
【０１１４】
５．２  陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製
以下の操作は、４℃で行った。先ず、透析後のサンプルを回収し、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ  ＰＬＰ）、および緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＰＬＰ）を用いてＭｏｎｏＱカラムでクロマトグラフィーを行った。本クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行い、流速を０．４ｍｌ／分とし、ＮａＣｌ終濃度が、０．５Ｍの直線勾配となるように設定した。次いで、ＭｏｎｏＱ溶出後の各画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。酵素を含む各画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより判別し、酵素を含む画分を合わせた。最後に、合わせた画分を濃縮した。濃縮には、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０Ｋ  Ｎｏｍｉｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｌｉｍｉｔ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用した。分子量１０，０００の限外濾過により濃縮した。
【０１１５】
５．３  ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製
以下の操作は、４℃で行った。先ず、濃縮後のサンプル約１ｍｌを、ゲル濾過用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＰＬＰ）を用いてゲル濾過処理に付した（流速０．４ｍｌ／分にて溶出）。酵素を含む各画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより判別し、酵素を含む画分を合わせた。
【０１１６】
上記５．３で得られた画分を合わせた溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、単一の明確なバンドが確認された（約５０〜５５ｋＤａの分子量）。したがって、酵素が均一に精製されたことが確認された。
【０１１７】
ブタ由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの収量は、大腸菌で発現させた場合、５リットルの培養物から約４ｍｇであった（約０．８ｍｇタンパク質／１リットル培養物）と報告されている（非特許文献５）。一方、本酵素の収量は、大腸菌で発現させた場合、１リットルの培養物から約２０ｍｇであった（約２０ｍｇタンパク質／１リットル培養物）。したがって、本発現系が、大量の本酵素を効率的に製造するための系として非常に優れていることが示された。
【０１１８】
［実施例６］サブユニット数の決定
ゲル濾過クロマトグラフィーにより、本酵素のサブユニット数を決定した。ゲル濾過には、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。溶出液には、上記ゲル濾過用緩衝液を使用した。サブユニット数の決定のための標準タンパク質として、オブアルブミン、コンカナバリン、フェリチンを用いた。
【０１１９】
ゲル濾過クロマトグラフィーの結果によると、本酵素の分子量は、約１２１ｋＤａであった。一方、本酵素のアミノ酸組成およびＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果に基づくと、本酵素のサブユニットの分子量は、約５３ｋＤａであった。したがって、本酵素が２量体を形成していることが示唆された。動植物由来芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼもまた、２量体を形成することが報告されており（Ｂｕｒｋｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，８，９６３−９６７；Ｆａｃｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，５４，１２１−１３８）、本酵素もまた、類似する４次構造を有することが示唆された。
【０１２０】
［実施例７］ＰＬＰコンテンツの評価
芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、一般的に、ＰＬＰを補酵素とするビタミンＢ６酵素であること、およびリジン残基のε位のアミノ基を介してＰＬＰと結合することが知られている。本酵素と高い相同性を持つブタ腎臓由来芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼの大腸菌組み換え体では、酵素サブユニットあたり１分子のＰＬＰが結合することが報告されている（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６，３１５，２４９−２５６）。本酵素のアミノ酸配列をブタ由来酵素のものと比較したところ、配列番号２により表されるアミノ酸配列において２９５番目のリジン残基がＰＬＰと結合すると予想された。そこで、本酵素のサブユニットとＰＬＰとの結合比（ＰＬＰコンテンツ）を確認した。
【０１２１】
先ず、アポ酵素の取得（硫酸アンモニウムを用いる方法およびヒドロキシルアミンを用いる方法）ならびにＰＬＰ連続滴下によるＴｉｔｒａｔｉｏｎを試みたが、本法では適切なＰＬＰ結合比が算出されなかった。そのため、以下に記載される、酵素をアルカリ変性させる手法により、ＰＬＰコンテンツを評価した。
【０１２２】
アルカリ条件下において酵素を変性させてＰＬＰを遊離させた。先ず、酵素緩衝液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２００μＭ  ＰＬＰ）を、ＰＤ−１０脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］）にアプライした。次いで、ＰＬＰを含まない緩衝液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を用いて酵素を溶出させた。溶出後の酵素濃度が１００μＭとなるように同じ緩衝液を用いて溶液量を調整し、終濃度０．１Ｎとなるように１Ｎ  ＮａＯＨを添加してＰＬＰを遊離させた。最後に、遊離ＰＬＰを、ＨＰＬＣにて検出した。遊離ＰＬＰのＨＰＬＣ検出条件は、以下のとおりであった。
【０１２３】
＜遊離ＰＬＰのＨＰＬＣ検出条件＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）
緩衝液Ａ：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）
緩衝液Ｂ：１００％メタノール
温度：４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
波長：３８８ｎｍ
【０１２４】
その結果、２回の測定において、１００μＭの酵素試料から９５μＭおよび１１５μＭのＰＬＰが遊離し、酵素とＰＬＰとの結合比が１対１であることが強く示唆された。したがって、大腸菌の形質転換体から得られた組換え酵素がＰＬＰと正常に結合していると考えられた。
【０１２５】
［実施例８］酵素を用いた反応系における基質および生成物の検出法の確立
酵素の性状解析に先立ち、ＨＰＬＣによる、各基質に最適な生成物の検出法を確立した。早い溶出時間に現れる高ピークが、基質であるアミノ酸に対応しており、２番目に高いピークが、生成物であるアミンに対応していた。基質と生成物との間で、保持時間にも十分な開きがあった。
【０１２６】
本実験により定められたＨＰＬＣ分離条件は、以下のとおりである。５−ＨＴＰ、ＤＯＰＡ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒについては、いずれも２８０ｎｍにおける吸収を測定した。一方、Ｐｈｅは同波長での吸収を示さないため、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル・カルバメート（ＡｃｃＱ−ｔａｇ）による誘導体化を行った後、蛍光による検出を行った。Ｐｈｅの誘導体化は、ＡｃｃＱ・ＦｌｕｏｒＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。
【０１２７】
（５−ＨＴＰ、ＤＯＰＡ、およびＴｙｒのＨＰＬＣ分離条件）
カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｆ５（ＳＵＰＥＬＣＯ）
緩衝液Ａ：１０ｍＭ  硫酸アンモニウム（ｐＨ３．０）
緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル
温度：３５℃
流速：０．５ｍｌ／分
波長：２８０ｎｍ
【０１２８】
（ＴｒｐのＨＰＬＣ分離条件）
カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー）
緩衝液Ａ：０．２％トリエチルアミン（ｐＨ８．５）
緩衝液Ｂ：１００％アセトニトリル
温度：５０℃
流速：０．４ｍｌ／分
波長：２８０ｎｍ
【０１２９】
（ＰｈｅのＨＰＬＣ分離条件）
カラム：ＡｃｃＱ  Ｔａｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ）
緩衝液Ａ：ＡｃｃＱ  Ｔａｇ  Ｅｌｕｅｎｔ  Ａ
緩衝液Ｂ：６０％アセトニトリル
温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／分
波長：励起（２５０ｎｍ）、発光（３９５ｎｍ）
【０１３０】
以下に記載される、酵素の性状解析（至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、温度安定性）においては、各種緩衝液に対する安定性を考慮し、５−ＨＴＰを共通の基質として用いた。ｐＨ安定性の分析を除き、酵素の希釈には、酵素希釈用緩衝液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＰＬＰ）を用いた。
【０１３１】
［実施例９］至適ｐＨの分析
先ず、酵素反応溶液（５０ｍＭ  種々のｐＨの緩衝液、１ｍＭ  ５−ＨＴＰ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、０．５μＭ  酵素）を調製した（酵素のみ後に添加）。酵素反応溶液中、種々のｐＨの緩衝液の詳細は、ｐＨ４．５〜６．５（クエン酸−リン酸）、ｐＨ６．０〜８．５（リン酸カリウム緩衝液）、ｐＨ８．０〜１１．０（ＮＨ４Ｃｌ−ＮＨ４ＯＨ）であった。各ｐＨの緩衝液において、ｐＨを、０．５間隔で調整した。酵素反応溶液を、３０℃、３分間プレインキュベートした後、酵素反応溶液に酵素を添加し、３０℃で反応を開始した。反応開始０、１０、２０、３０分後でサンプリング（終濃度０．１Ｍ  ＨＣｌで反応停止）し、ＨＰＬＣにアプライした。生成アミンの検出には、実施例８に記載される方法を用いた。本酵素は、後述のようにＤＯＰＡに対して最も高い反応性を有するが、ＤＯＰＡは、高ｐＨで不安定であるため、性状解析には、５−ＨＴＰを使用した。結果を、表１、図１に示す。なお、本実験では、酵素がリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解しており、酵素添加後に反応溶液のｐＨが変動することが想定された。そこで、各反応溶液に酵素を添加した際のｐＨ変化についても調べ、表１には実測したｐＨ値を記載している。
【０１３２】
【表１】
2011130744.tif 000007
【０１３３】
その結果、本酵素は、ｐＨ８．０で最も高い活性を示した。ｐＨ５．５以下ではアミン生成が全く確認されず，アルカリ条件下ではｐＨ１０．７まで活性が認められた。
【０１３４】
［実施例１０］ｐＨ安定性の分析
先ず、ｐＨの異なる複数の酵素インキュベート用溶液（５０ｍＭ  種々のｐＨの緩衝液、４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ＰＬＰ、１０μＭ  酵素）を調製し、各酵素インキュベート用溶液で酵素を希釈した。酵素インキュベート用溶液中、使用した各緩衝液は、実施例９で用いた緩衝液に準じた。次いで、ｐＨの異なる各希釈液を、４℃で一晩静置した。ｐＨ安定性分析用溶液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ５−ＨＴＰ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、０．５μＭ  酵素）を用いて、酵素反応溶液を調製した（酵素のみ後に添加）。本実験では、実施例９の結果より、酵素反応は、ｐＨ８．０で行った。反応液を３０℃、３分間プレインキュベートした後、希釈した酵素を添加して、３０℃で反応を開始した。反応開始３０分後でサンプリング（終濃度０．１Ｍ  ＨＣｌで反応を停止）し、ＨＰＬＣにアプライした。生成アミンの検出には、実施例８に記載される方法を用いた。ｐＨ安定性分析で使用した基質は、実施例９における至適ｐＨ分析と同様に５−ＨＴＰであった。結果を、表２、図２に示す。本実験においても、実施例９と同様に、酵素の添加に伴う反応溶液のｐＨ変化を調べ、表２には実測したｐＨ値を記載した。
【０１３５】
【表２】
2011130744.tif 000008
【０１３６】
その結果、本酵素は、ｐＨ７．０で最も高い安定性を示した。本酵素は、酸性条件下で不安定であったが、ｐＨ６．０以上では、約８０％の相対活性を示した。本酵素は、ｐＨ６．０〜１０．８１で安定であった。
【０１３７】
［実施例１１］温度安定性の分析
実施例８に記載される酵素希釈用緩衝液を用いて、酵素を希釈した。２０〜６０℃（５℃間隔）ごとに希釈酵素液を３０分間静置した。温度安定性分析用溶液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ５−ＨＴＰ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、３μＭ  酵素）を用いて、酵素反応溶液を調製した（酵素のみ後に添加）。反応溶液を３０℃、３分間プレインキュベートした後、各温度条件下に置いた酵素を添加し、３０℃で反応を開始した。１０、２０分後にサンプリング（終濃度０．１Ｍ  ＨＣｌで反応を停止）し、ＨＰＬＣにアプライした。結果を、表３、図３に示す。
【０１３８】
【表３】
2011130744.tif 000009
【０１３９】
その結果、本酵素は、２０〜４５℃の範囲にわたって高い安定性を示し、５０℃付近から活性が低下しはじめ、５０〜５５℃にかけて安定性が著しく低下した。本酵素は、６０℃でインキュベートした場合、完全に失活した。
【０１４０】
［実施例１２］至適温度の分析
温度安定性分析用溶液と同様の組成である温度安定性分析用溶液を用いて、酵素反応溶液を調製した（酵素のみ後に添加）。反応溶液を各温度条件（２０〜６０℃；５℃間隔）で３分間プレインキュベートした後、酵素を添加して各温度で反応を開始した。１分後に終濃度０．１ＭとなるようにＨＣｌを添加し、反応を停止した。各サンプルをＨＰＬＣにアプライした。結果を、表４、図４に示す。
【０１４１】
【表４】
2011130744.tif 000010
【０１４２】
その結果、本酵素は、５５℃で最も高い活性を示した。
【０１４３】
［実施例１３］酵素学的パラメータの決定
酵素学的パラメータの決定は、５−ＨＴＰ、ＤＯＰＡ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒに対して行った。各基質濃度における反応速度を測定し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔに従いＫｍおよびｋｃａｔを算出した（ｎ＝２）。
【０１４４】
［酵素反応］
酵素反応溶液（５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、種々の濃度の各基質、酵素）を調製した（酵素のみ後に添加）。各反応溶液を３０℃、３分間プレインキュベートした後、酵素を添加して反応を開始した。終濃度０．１Ｍ  ＨＣｌで反応を停止し、各サンプルをＨＰＬＣにアプライした。各基質濃度における反応速度を、表５に示す。表５のデータを利用してＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋ  ｐｌｏｔにより算出された酵素学的パラメータを、表６に示す。
【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
【表６】
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【０１４７】
その結果、ＤＯＰＡにおけるｋｃａｔ／Ｋｍ値は、他の基質に比して高く、本酵素のＤＯＰＡに対する高い反応性が明らかとなった。ＴｒｐおよびＴｙｒに対する酵素の反応性は低かった。なお、Ｔｙｒは溶解度が低いため、調製可能な基質終濃度が最高で１．５ｍＭであった。一方、予備実験から概算されたＴｙｒのＫｍ値は、数十ｍＭであった（データ示さず）。したがって、本実験では、Ｔｙｒについて、Ｋｍ値をその範囲に含む濃度の条件を設定できなかったことから、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、およびｋｃａｔの各酵素学的パラメータを算出せず、ｋｃａｔ／Ｋｍのみを記載した。
【０１４８】
先行研究から、植物由来の芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼについては、ＤＯＰＡに対して作用するタイプ、およびＴｒｐのみに作用するタイプが報告されている（非特許文献１）。一方、ブタ腎臓由来芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼは、ＤＯＰＡ、５−ＨＴＰ、およびＴｙｒなど複数の基質に対して反応することが確認されており、ＤＯＰＡについて、Ｋｍ＝０．１８（ｍＭ）、Ｖｍａｘ＝２３８６（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）が報告されている（非特許文献３）。本実験で用いたＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来酵素は、複数の基質に作用し、さらにＤＯＰＡに対する各パラメータ（Ｋｍ、Ｖｍａｘ）は、非特許文献３の報告に類似する傾向があった。これらの結果より、本酵素は、ブタ腎臓由来酵素（即ち、動物型酵素）に類似した性質を有することが示唆された。
【０１４９】
［実施例１４］類似基質に対する作用
酵素学的パラメータ算出実験で用いた５種のアミノ酸に加え、類似基質に対する本酵素の作用について調べた。
本実験の基質には、α−メチルドパ、α−メチルチロシン、および３−メトキシヒドロキシチロシンを使用した。なお、α−メチルドパおよびα−メチルチロシンについては、生成物であるアミン（α−メチルドパミンおよびα−メチルチラミン）が標品として入手不能であった。そのため、これらについては、酵素反応条件と対照条件の溶出ピークとを観察し、両結果を比較して反応の有無を確認した。ＨＰＬＣにおける溶出条件は、ＤＯＰＡおよびＴｙｒと同様であった。いずれの基質とも、対照条件においては６０℃で１時間処理した不活性化酵素を添加した。酵素反応液の組成は、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、５ｍＭ  種々の基質（α−メチルチロシンのみ２ｍＭ）、１０μＭ  酵素であった。α−メチルチロシンについては、溶解度が低いため、最終濃度を２ｍＭとした。
【０１５０】
［酵素反応］
上記の酵素反応溶液を調製した（酵素のみ後に添加）。酵素もしくは不活性化酵素を添加し、３０℃で反応を開始した。一晩反応させた後、終濃度０．１ＭとなるようＨＣｌを添加し、反応を停止した。各サンプルをＨＰＬＣにアプライした。
【０１５１】
その結果、α−メチルドパ、α−メチルチロシン、および３−メトキシヒドロキシチロシンの全てについて、酵素の作用が確認された。具体的には、５ｍＭの３−メトキシチロシンの存在下で２０時間の反応を行ったところ、３４．２μＭの３−メトキシチラミンが生成した（反応速度０．０５３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ）。今回の３−メトキシチロシンに関する実験結果から算出された反応速度は、実施例１３で用いられた５つの基質で算出された反応速度（表６）と比べ、低い値を示した。
【０１５２】
一方、α−メチルドパおよびα−メチルチロシンについても、基質標品とは異なる位置にピークが検出された。質量分析を行なったところ、これらの基質に対応するアミン（α−メチルドパミンおよびα−メチルチロシン）が生成したことを示すマススペクトルデータが得られた。これらの結果は、α−メチルドパおよびα−メチルチロシンを基質として用いた酵素反応により、α−メチルドパミンおよびα−メチルチロシンが生成したことを示す。以上より、本酵素は、５種のアミノ酸の類似化合物を基質とし得ることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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