(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫調節ペプチドの同定方法、および、より具体的には、免疫応答の多重分析による抗原ペプチドの同定のための新規方法を提供する。【解決手段】サブセットにおいて目的の免疫反応性を導き出すエピトープが該サブセットのターゲティング剤として同定される、免疫反応性の複数のパラメータについて培養物を同時に分析して最低１個のエピトープを同定することにより、被験体のＨＬＳタイプに依存しないＴ細胞エピトープを同定するための組成物および方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性物質に対し被験体により発現される免疫反応性の型の同定方法であって、
被検体に由来する１種若しくはそれ以上の免疫細胞を準備し、そして１種若しくはそれ以上の抗原フラグメントの存在下で培養する工程；
該免疫細胞により産生されるサイトカインを同定する工程；および
該抗原性物質に応答しての協調的サイトカイン発現に基づき免疫反応性の型を決定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項２】
抗原性物質が、抗原、ペプチド、微生物、細胞、タンパク質のアミノ酸配列が既知であってももしくはなくてもよく、かつ、フラグメントが、該タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーから採取される抗原タンパク質、複数の抗原性物質およびそれらの組合せの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体の免疫状態の評価方法であって、
被験体から免疫細胞を準備する工程；
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で該免疫細胞を培養する工程；
免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を同時に分析し、該被験体について最低１種の免疫調節分子を同定して産生されるサイトカインの同定に基づき該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定する工程を含んでなり、かつ、免疫反応性の型が該被験体の免疫状態の指標となることを特徴とする、上記方法。
【請求項４】
被験体の免疫抑制の程度を評価することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
被験体の免疫状態が、該被験体についての完全なＴ細胞レパートリーを提供するために複数の免疫調節分子について評価されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
免疫調節分子および免疫反応性の型が、感染性疾患、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、癌、慢性炎症およびアレルギーよりなる群から選択される免疫関連疾患の該被験体の危険性の指標であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ワクチン接種、受動免疫療法および養子細胞移入のような免疫療法に対する被験体の応答の予測方法であって、
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーの存在下で、被験体からの免疫細胞を培養する工程；
免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を分析して、該被験体について最低１種の免疫調節分子を同定する工程；および
サイトカインの産生について該培養物を分析し、産生されるサイトカインの同定に基づき免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定して処置の転帰の指標としての処置前の被験体の該エピトープに特異的な免疫状態を決定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項８】
被験体の疾患の経過および臨床転帰の予測方法であって、
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、被験体からの１種若しくはそれ以上の免疫細胞を培養する工程；
細胞増殖およびサイトカイン産生プロファイルについて、該培養物を同時に分析して、該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定する工程であって、かつ、
サイトカイン産生プロファイルが疾患の重症度および疾患の進行若しくは後退の状態のマーカーとする工程を含んでなり、上記方法。
【請求項９】
疾患が、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被験体の治療的介入の調整方法であって、
産生されるサイトカインの同定を包含する免疫反応性の複数のパラメータの分析に基づき、被験体について１種若しくはそれ以上の免疫調節分子を同定する工程；および
該１種若しくはそれ以上の免疫調節分子を含んでなるエピトープ特異的な免疫ワクチンを製造する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項１１】
ワクチンが、被験体における特異的な型の免疫応答を高めるか、被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を低下若しくは高めるか、被験体における抗体産生を高めるか、または被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を高める１種若しくはそれ以上の抗原を含んでなることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験体の免疫モニタリング方法であって、
被験体から免疫細胞を準備し、そして該細胞をペプチドライブラリーから同定される１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにそれらを曝露することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定する工程；
ライブラリーから同定される免疫調節ペプチドの１種若しくはそれ以上で被験体を免疫化する工程；
１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドへの曝露後に被験体から免疫細胞を準備することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定する工程；ならびに
免疫化の前および後の免疫応答の型を比較して、該被験体のエピトープ特異的な免疫状態の変化を決定する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項１３】
免疫療法のための新たな治療薬の同定および特徴付け方法であって、
免疫調節物質、および目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの１種若しくはそれ以上のペプチドの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程；
該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析する工程；ならびに
免疫調節物質が存在する場合の免疫反応性を、免疫調節物質が非存在である場合の免疫反応性と比較する工程であって、かつ、免疫反応性の阻害を免疫抑制性治療薬の指標とし、また、免疫反応性の増強をアジュバントの指標とする工程を含んで成る、上記方法。
【請求項１４】
治療薬が、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｃ１、Ｔｃ２およびそれらの組合せに対する免疫応答の型を駆動する免疫調節ペプチドの組合せであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
免疫調節物質、および感染性疾患、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植よりなる群から選択される目的の抗原からの１種若しくはそれ以上のフラグメントの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程；
該フラグメントに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析する工程；ならびに
免疫反応性の細胞を単離する工程
を含んでなる方法により同定される治療薬。
【請求項１６】
ワクチンエピトープの同定方法であって、
目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの１種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程；
免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、
産生されるサイトカインの同定により該ペプチドに対する免疫反応性の型を決定する工程；ならびに
同一の同定された配列を有する１種若しくはそれ以上のペプチドを伴うワクチンを製造する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
１種若しくはそれ以上のペプチドの配列が単離後に決定されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ワクチンエピトープの特徴付け方法であって、
ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫若しくは蠕虫を含んでなる抗原から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養する工程；
培養物中での免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、該１種若しくはそれ以上のペプチドに対する免疫反応性の型を決定する工程であって、かつ、該ワクチンエピトープが、それらが該抗原に対して導き出す免疫反応性を特徴とする工程を含んでなる、上記方法。
【請求項１９】
細胞培養物が分析され、そして、１種若しくはそれ以上のＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞および赤血球のフロファイルが決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔｈ１およびＴｈ２双方若しくはＴｃ１およびＴｃ２双方のＴ細胞についての反応性ペプチドが同定された特定の個体に対して免疫反応性と同定されたペプチドライブラリーから単離された、免疫応答の型を改変するために選択される１種若しくはそれ以上のペプチドを含んでなる組成物。
【請求項２１】
免疫療法の必要な被検体の処置用医薬の製造するための免疫応答のある型に影響を与える免疫調節ペプチドの使用であって、かつ、
１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドに被検体からの免疫細胞がインビトロで暴露されて該１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにより誘発される免疫応答の型が決定され、そして該免疫応答の型が1種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドの処置後に評価され、また、必要がある場合には、免疫応答の型を変えるように１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチド改変するものである、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、免疫調節ペプチドの同定方法、および、より具体的には、免疫応答の多重分析による抗原ペプチドの同定のための新規方法および系に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は微生物の傷害に対する保護を提供する。それは、その本当に本質により複雑な系である。それは自己組織に対する付随的な損傷を制限しつつ、絶え間なく変わる脅威を認識しかつそれらに適合することが可能でなければならないからである。免疫機能不全（機能亢進および機能低下の双方）が多くのヒト疾患の根源であることは、この複雑さの結果である。養子免疫系（Ｂ細胞およびＴ細胞から構成される）は、特化された分類の抗原提示分子に結合しかつその情況で提示されるペプチド、糖ペプチド、リンペプチドおよび脂質のような分子パターンの形態の抗原を認識する。Ｔ細胞により認識される抗原由来のフラグメント、例えばペプチドはエピトープと称される。その特異的エピトープのＴ細胞による認識が養子免疫機能の中心事象であることが広く受け入れられている。
【０００３】
これらの特化された抗原提示分子は：ｉ）高度に多形性でありかつ２つの主要なクラスすなわちクラスＩおよびクラスＩＩに分離され得る古典的なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質；ｉｉ）ＨＬＡ Ｅ、ＦおよびＧ下位遺伝子座（ｓｕｂｌｏｃｕｓ）によりコードされる古典的でない群（非特許文献１）、ならびにｉｉｉ）抗原提示分子のＣＤ１ファミリー（非特許文献２）を包含する。ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ Ａ、ＢおよびＣ遺伝子座によりコードされ、そしてＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に８〜１０アミノ酸（ＡＡ）のペプチドを提示する（非特許文献３）。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、１２〜１６ＡＡのペプチドをＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に提示し、そしてＨＬＡ ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ遺伝子座によりコードされる（非特許文献４）。Ｔ細胞は、抗原提示分子の状況でのみ、ならびに適切な抗原のプロセシングおよび提示後にのみ抗原を認識する。ＨＬＡ依存性の抗原提示については、抗原プロセシングは通常、タンパク質のタンパク質分解性の断片化よりなり、ＨＬＡ分子の溝にはまるポリペプチドをもたらし、そしてこのペプチド／ＨＬＡ複合体はその後、抗原提示細胞の細胞表面上でＴ細胞に提示される（非特許文献５、非特許文献６）。古典的でない群はＨＬＡ Ｅ、ＦおよびＧ下位遺伝子座によりコードされ、そして、低い程度の多形、および免疫エフェクター細胞に結合しかつ拘束された一組のペプチドを提示する能力を特徴とする。非古典的ＨＬＡ分子により提示されるペプチドの認識は、母体と胎児の界面および／若しくは腫瘍免疫のような領域での免疫寛容の誘導において重要であることが示されている。これらの特化された分子の間での他の重要な群は、免疫系での特化されたエフェクター細胞への細菌の糖脂質のような脂質の提示に関与するＣＤ１ファミリーである。
【０００４】
３つの主要な型のＴ細胞免疫、すなわちタイプ１（Ｔｈ１）、タイプ２（Ｔｈ２）および制御性（制御性Ｔ）が抗原認識の後に続くとみられる。タイプ１の免疫は、細胞内病原体の消失および抗腫瘍免疫に重要であり、そして主としてＩＦＮガンマ（ＩＦＮ−γ）の発現を特徴とする。タイプ２の免疫は細胞外病原体の消失に決定的に重要であり、そして主としてＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３のようなサイトカインの発現を特徴とする。ＩＬ−１０若しくはＴＧＦ−βのようなサイトカインにより媒介される制御性Ｔ型の免疫は、自己寛容の発生および維持に不可欠である。これら３種の型の応答は、古典的なα／β ＴＣＴＲ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞に制限されず、そしてまた、γ／δ ＴＣＲ＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫ Ｔ細胞によっても媒介され得る。従って、これらの細胞型のいずれかによる特異的抗原エピトープの認識は、それらの活性化および独特の特化された応答に至る。免疫応答の質は、従って、サイトカインパターン（タイプ１、タイプ２および制御性Ｔ）の協調発現を観察することにより記述しうる。
【０００５】
免疫反応の経過の間の適切なＴ細胞応答の活性化は、しばしば、１種の特化された応答の他を上回る優性性を伴う。適切な特化されたＴ細胞応答のこの選択的活性化は、疾患の転帰の決定的に重要な決定子である。これの特筆すべき一例は、感染に対するタイプ１応答が保護免疫を特徴としかつタイプ２応答がしばしば致死的な疾患に至る、らいでの患者応答で示される。腫瘍免疫に関する別の劇的な例においては、制御性Ｔ細胞応答への不適切な移動に至る免疫寛容誘発性エピトープが、ヒトで後の腫瘍進行をもたらすことが示された一方、腫瘍抗原エピトープによるタイプ１応答の活性化は腫瘍増殖の阻害を伴う。さらに、制御性Ｔ細胞応答から離れる不適切な移動は、自己抗原が提示される場合に自己免疫疾患の発症に至ることがある。自己免疫疾患の特定の臨床像は優性な応答、すなわち、１型糖尿病の場合でのようなタイプ１、若しくはアレルギーの場合でのようなタイプ２のいずれかに依存するとみられる。
【０００６】
これらの特化されたＴ細胞応答の活性化は、それらへの特異的エピトープの提示に依存するため、従って、これらのペプチドエピトープを同定することが有利であると思われる。これらの特化されたＴ細胞エピトープを疾患状態の早期に同定することにより、適切なＴ細胞応答を高めるか若しくは不適切なＴ細胞応答を排除し、そしてそれにより免疫応答の均衡を疾患の転帰を改善するように移動させる機会が生じる。これらの抗原性Ｔ細胞エピトープの定量的同定および定性的特徴付けのための方法論は、ワクチンの設計、ならびに感染性、自己免疫性および腫瘍性疾患への診断および治療的アプローチの重要な基礎となる。
【非特許文献１】Ｂｒａｕｄ ＶＭ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９ Ｆｅｂ；１１（１）：１００−８
【非特許文献２】Ｂｅｎｄｅｌａｃ Ａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５ Ｊｕｌ １４；２６９（５２２１）：１８５−６
【非特許文献３】Ａｄａｍｓ ＥＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００１ Ｏｃｔ；１８３：４１−６４
【非特許文献４】Ｋｏｒｍａｎ ＡＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１９８５ Ｊｕｌ；８５：４５−８６
【非特許文献５】Ｒｏｃｋ，Ｋ、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；８０：１−７０
【非特許文献６】Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ Ｐ、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．１９９４ Ｊｕｎ １；４（６）：５４１−３
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
本発明は、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの１種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、被験体の免疫細胞を培養すること、ならびに該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析することによる、被験体からの１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドを同定するための組成物および方法を包含し、免疫調節ペプチドは、被験体のＨＬＡタイプに依存しないペプチドに対する免疫反応性の存在により同定される。例えば、反応性エピトープはペプチドのプール中の免疫調節ペプチドから選択されうる。該方法はまた、その特定の個体からのペプチド特異的エフェクター細胞の単離も包含する。
【０００８】
別の例は：被験体から免疫細胞を単離すること；プロセシングされたペプチドライブラリーからの１種若しくはそれ以上のフラグメントの存在下で該免疫細胞を培養すること；ならびに、該フラグメントに対する免疫特異性およびサイトカイン応答の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析することによる、１種若しくはそれ以上の免疫調節フラグメントの同定方法であり、免疫調節フラグメントは、該フラグメントに対する免疫反応性の存在により同定される。この方法を使用して、複数のペプチドフラグメントに特異的なエフェクター細胞を単離することができ、かつ、例えば混合若しくはクローン集団に精製さえしうる。別の例において、本発明は、被験体から１種若しくはそれ以上の免疫細胞を単離しかつ１種若しくはそれ以上の抗原フラグメントの存在下で培養すること；該免疫細胞により産生されるサイトカインを同定すること；および該抗原性物質に応答しての協調的サイトカイン発現に基づき免疫反応性の型を決定することによる、抗原性物質に対し被験体により発現される免疫反応性の型の同定方法を包含する。抗原性物質は、抗原、ペプチド、微生物、細胞、およびそれらの組合せの混合物を包含しうる。抗原タンパク質は、既知若しくは未知のタンパク質および／若しくはタンパク質フラグメント、または、該方法およびその後の特徴付けでの使用の前に大きさにより分画された既知のタンパク質若しくはペプチドから採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからさえの、既知若しくは未知のアミノ酸配列をもつペプチドを包含しうる。何らかの態様において、抗原性物質は、免疫応答の型を駆動するため異なる比で提供される複数の抗原性物質および／若しくはペプチドを包含しうる（例えばＴｈ１対Ｔｈ２若しくはＴｃ１対Ｔｃ２、またはそれらの混合物および組合せ）。
【０００９】
本発明はまた、被験体から免疫細胞を単離すること、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で該免疫細胞を培養すること、および免疫反応性の複数のパラメータについて該培養物を同時に分析して、該被験体について最低１種の免疫調節分子を同定して、産生されるサイトカインの同定に基づき該免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定することによる、被験体の免疫状態の評価のための診断方法も包含し、免疫反応性の型が該被験体の免疫状態を暗示する。例えば、該方法は、被験体の免疫抑制の程度、被験体の免疫系の活性化過剰の程度、被験体のＴ細胞レパートリー、およびなお免疫反応性の型さえ評価しうる。これらは該被験体の免疫関連疾患の危険性を暗示しうる。本発明を使用してモニターしうる免疫関連疾患の制限しない例は：感染性疾患、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、癌、慢性炎症およびアレルギーを包含する。
【００１０】
本発明の別の使用は、免疫細胞を、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーの存在下で被験体から培養し、該培養物を免疫反応性の複数のパラメータについて分析して、該被験体のＴ細胞およびＨＬＡのレパートリーについて最低１種の免疫調節分子を同定し、そして該培養物をサイトカイン産生について分析して、産生されるサイトカインの同定に基づき免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定して、処置の転帰の指標として処置の前の該被験体の該エピトープ特異的な免疫状態を決定する、治療に対する被験体の応答の予測方法にある。治療は、ワクチン接種、受動免疫療法および養子細胞移入のような免疫療法でありうる。別の例は、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、被験体からの１種若しくはそれ以上の免疫細胞を培養すること、ならびに細胞増殖およびサイトカイン産生プロファイルについて該培養物を分析して、免疫調節分子に対する免疫反応性の型を決定することによる、被験体の疾患の経過および臨床転帰の予測方法であり、サイトカイン産生プロファイルは疾患の重症度および疾患の進行若しくは後退の状態のマーカーである。
【００１１】
別の例は、産生されるサイトカインの同定を包含する免疫反応性の複数のパラメータの分析に基づき、被験体について１種若しくはそれ以上の免疫調節分子を同定すること；および該１種若しくはそれ以上の免疫調節分子を含んでなるエピトープ特異的な免疫ワクチンを製造することによる、被験体の治療的介入の調整方法である。ワクチンは、例えば：被験体における特異的な型の免疫応答を高める若しくは低下させる１種若しくはそれ以上の抗原；被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を高める若しくは低下させる１種若しくはそれ以上の抗原；被験体におけるエピトープ特異的なサイトカイン産生を高める若しくは低下させる１種若しくはそれ以上の抗原；および／あるいは被験体における抗体産生を高める若しくは低下させる、または細胞媒介性免疫を高める１種若しくはそれ以上の抗原を包含しうる。
【００１２】
被験体のなお別の免疫モニタリング方法は、ライブラリーから同定される免疫調節ペプチドの１種若しくはそれ以上で被験体を免疫化すること；１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドへの曝露後に被験体から免疫細胞を単離することにより、被験体のエピトープ特異的な免疫状態を決定すること；ならびに免疫化の前および後の免疫応答の型を比較して、該被験体のエピトープ特異的な免疫状態の変化を決定することを包含する。
【００１３】
操作において、免疫療法の必要な被験体の処置方法は：被験体からの免疫細胞を、１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドに曝露して、該１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドにより誘発される免疫応答の型を決定すること；免疫応答の型に影響を及ぼす免疫調節ペプチドで被験体を処置すること；ならびに１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドで被験体を処置した後に免疫応答の型を評価すること、および、必要な場合は、該１種若しくはそれ以上の免疫調節ペプチドを改変して免疫応答の型を変えることを包含する。治療的有効性の評価は、ワクチン療法、抗癌治療、抗腫瘍療法、臓器移植、アレルギー、自己免疫疾患の治療および感染性疾患の治療をモニターするのに使用しうる。本発明の別の方法は、免疫調節物質、および目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの１種若しくはそれ以上のペプチドの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養すること；該ペプチド上のエピトープに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析すること；ならびに免疫調節物質が存在する場合の免疫反応性を、免疫調節物質が非存在である場合の免疫反応性と比較することにより、免疫療法のための新たな治療薬を同定および特徴付けすることを包含し、免疫反応性の阻害は免疫抑制性の治療薬を暗示し、また、免疫反応性の増強はアジュバントを暗示し、かつ、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｃ１、Ｔｃ２およびそれらの組合せに対する免疫応答の型を駆動さえしうる。
【００１４】
１種若しくはそれ以上の治療薬は、免疫調節物質および目的の抗原からの１種若しくはそれ以上のフラグメントの存在および非存在下で、単離された免疫細胞を培養すること；該フラグメントに対する特異性およびサイトカイン応答のような免疫反応性の複数のパラメータについて、該培養物を同時に分析すること；ならびに免疫反応性の細胞を単離することにより同定されうる。抗原は、感染性疾患、癌、腫瘍、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、関節炎、糖尿病、アレルギー、臓器移植および骨髄移植でありうる。ワクチンエピトープもまた、目的の抗原タンパク質から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの１種若しくはそれ以上のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養すること；免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、産生されるサイトカインの同定に際して該ペプチドに対する免疫反応性の型を決定すること；ならびに同一の同定された配列を有する１種若しくはそれ以上のペプチドを伴うワクチンを製造することによっても同定されうる。該方法は、１種若しくはそれ以上のペプチドの配列が単離後に決定さえされうるのに十分柔軟性である。ワクチンエピトープもまた、抗原から採取されたオーバーラップペプチドのライブラリーからの一連のペプチドの存在下で、単離された免疫細胞を培養すること；ならびに、免疫反応性の複数のパラメータおよびサイトカイン産生について、該培養物を分析して、１種若しくはそれ以上のペプチドに対する免疫反応性の型を決定することによっても同定されることができ、ワクチンエピトープは、それらが該抗原に対して導き出す免疫反応性を特徴とする。抗原の例は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、寄生虫若しくは蠕虫を包含する。抗原は自己抗原でありうる。細胞培養物もまた分析することができ、そして、１種若しくはそれ以上のＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞および赤血球のプロファイルも決定しうる。
【００１５】
本発明の組成物は、Ｔｈ１およびＴｈ２双方のＴ細胞についての反応性ペプチドが同定された特定の個体に対して免疫反応性と同定されたペプチドライブラリーから単離された、免疫応答の型を改変するために選択される１種若しくはそれ以上のペプチドを包含する。組成物のなお他の例は、Ｔｃ１およびＴｃ２双方のＴ細胞についての反応性ペプチドが同定された特定の個体に対して免疫反応性と同定されたペプチドライブラリーから単離された、免疫応答の型を改変するために選択される１種若しくはそれ以上のペプチドを包含する。これらの組成物は、ワクチンとして、乾燥若しくは液体の形態などに処方しうる。
【００１６】
［発明の詳細な記述］
本発明の多様な態様の作成および使用は下に詳細に論考される一方、本発明は多様な特定の情況で例示され得る多くの応用可能な発明の概念を提供することが認識されるべきである。本明細書で論考される特定の態様は、本発明を作成および使用するための特定の方法を単に具体的に説明し、そして本発明の範囲の範囲を定めない。
【００１７】
本発明の理解を容易にするために多数の用語を下で定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関する領域の当業者により共通に理解されるところの意味するところを有する。１つの（「ａ」「ａｎ」）および該（「ｔｈｅ」）のような用語は単数の実体のみを指すことを意図しておらず、しかしその特定の例が具体的説明に使用されうる一般的分類を包含する。本明細書の用語法は本発明の特定の態様を記述するために使用されるが、しかし、それらの使用は、請求の範囲に概説されたとおりを除き、本発明の範囲を定めない。
【００１８】
本発明は、誘発される応答の型を考慮せずに抗原特異的な免疫応答を評価することが可能である組成物および方法を包含する。本明細書で使用されるところの「誘発される免疫応答の型」若しくは「免疫応答の型」という用語は、ペプチド若しくは抗原を提示する主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）に関係なくＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｃ１、Ｔｃ２およびそれらの組合せ、若しくは他のＴ細胞に基づく養子免疫を介する免疫細胞応答の活性化若しくは調節、それにより、ＭＨＣに関係して特定のペプチド若しくは抗原を認識しかつそれに応答するＴ細胞、および同一の細胞、隣接細胞、若しくはその特定のＴ細胞と相互作用する細胞に対するその効果、またはペプチド若しくは抗原を提示する細胞に対するその効果を記述するのに使用される。熟練した免疫学者は、用語法が重なることがある、すなわち、抗原提示細胞によりプロセシングされかつそれが特定のＭＨＣ糖タンパク質すなわちクラスＩ若しくはクラスＩＩの情況で提示されるペプチド、抗原若しくはエピトープに負荷されたタンパク質を指すことが一般的であることを認識するであろう。
【００１９】
「ペプチド」、「抗原」若しくは「エピトープ」という用語は、抗原提示細胞による提示後のＴ細胞による免疫調節の提示に関して使用されることが、本明細書の文脈で使用されるとおり明らかであろう。本明細書で使用されるところの「ペプチド」という用語はアミノ酸の鎖を記述するのに使用される。
【００２０】
本明細書で使用されるところの「抗原」、「免疫原」、「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、免疫応答を調節するペプチドを記述するのに互換性に使用される。本明細書で使用されるところの「調節する」という用語は、例えば細胞の増殖、サイトカイン若しくはイムノカイン分泌、細胞間の相互作用、アポトーシスなどにより測定されるところの免疫応答の活性化、調節、反応不顕化若しくは抑制さえ記述するのに使用される。例えば、Ｔ細胞応答は、ある種のサイトカイン若しくはイムノカインが、ある型の応答、例えば抗体産生を活性化し；かつ同時に別の型の応答、例えば細胞傷害性Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞の活性化を低下させることが可能であるＴ細胞により放出される場合は「調節され」うる。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「免疫調節性」という用語は、特定の抗原、免疫原、エピトープ若しくは抗原決定基が細胞に影響を及ぼし、すなわちその場で若しくはエフェクターカスケードの下流でさえ活性化される細胞に対する効果を記述するのに使用される。
【００２２】
本発明者は、抗原エピトープの予測および特徴付けのための多くのツールが以前に開発されたことを認識した。例えば、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）とペプチドの複合体のＸ線結晶構造データに主に基づくペプチドとＭＨＣの相互作用のコンピュータモデル化が、タンパク質内の潜在的エピトープを予測するのにしばしば使用される。この方法論は新たな予測アルゴリズムの導入から大きな恩恵を受けたとは言え、それはしかしながら構造データベースの大きさに依存し、そして従ってそのデータ組に表されないＭＨＣ複合体の予測でより少なく効率的でありうる。この方法は、抗原エピトープの同定手段を提供するが、しかしそれらのエピトープにより導き出される特異的応答を特徴づけるのに使用し得ない。（Ｆｌｏｗｅｒ ＤＲ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ．２００３；２５４：１０２−２０；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １２０−５、２１６−２２、２５０−２）。
【００２３】
ＭＨＣからのペプチドの溶出、次いで質量分析配列決定が、抗原エピトープを同定するために成功裏に使用されている（Ｈｕｎｔ ＤＦ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２ Ｍａｒ ６；２５５（５０４９）：１２６１−３）。同定のための強力な方法論とは言え、ペプチド溶出は高価で遅く、そして大きなサンプルサイズを必要とし、それを臨床の設定での使用に非実用的にしている。この方法は抗原エピトープの同定手段もまた提供するが、しかし、それらのエピトープにより導き出される特異的応答を特徴づけるのに使用し得ない。
【００２４】
オーバーラップペプチドのライブラリーが、病原体関連タンパク質中の抗原エピトープを同定するのに使用されている（Ｍａｒｔｉｎ Ｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ｍａｒ；２９（３）：２３６−４７）。ペプチドライブラリースクリーニングは、反応性の読み出しとして生物学的アッセイを使用し、そして従って該エピトープに対する応答の大きさを評価するのに使用し得る。オーバーラップライブラリーを使用することにより、全部の潜在的なクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを同定し得る。今日まで、ペプチドライブラリーを使用して潜在的抗原エピトープを評価するのに使用された生物学的アッセイは、以下の方法論、すなわち、細胞質内サイトカイン、ＥＬＩＳＡおよび細胞増殖を包含する（Ｍａｒｔｉｎ Ｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ｍａｒ；２９（３）：２３６−４７）。これらのアッセイのいずれかにおけるライブラリー内の所定のペプチドに対する反応性は、抗原エピトープが存在することの指標であるが；しかしながらこれらの方法のいずれも、そのエピトープに対する応答の質、例えば抗原性、アレルギー誘発性、免疫寛容誘発性若しくはいずれかの他の特異的応答に関する明確な指標を与えない。
【００２５】
抗原エピトープの予測および特徴付けに有用な既知の技術の組合せもまた報告されている。組合せアッセイの例を下に示す。
【００２６】
ペプチドライブラリーおよびＥＬＩＳＰＯＴ。ＥＬＩＳＰＯＴ技術は、表面結合捕捉抗体を使用して、プレート上で培養した細胞から分泌されるサイトカインを結合する。二次標識抗体を使用して、サイトカイン分泌細胞の数を定量化する。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、およびサイトカイン産生をＥＬＩＳＰＯＴにより評価することにより、抗原エピトープが単離された（Ｇｅｇｉｎａｔ Ｇ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｆｅｂ １；１６６（３）：１８７７−８４）。この方法論は、しかしながら、いずれかの所定のサンプルについてわずか数種のサイトカインの産生を測定し得るために制限される。エピトープ認識に応答して産生されるサイトカインおよびケモカインの完全な範囲を測定することのこの不能は、免疫応答のいかなる特徴付け（すなわちタイプ１、タイプ２若しくは抑制性Ｔ（Ｔ−Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ））も極めて困難にする。
【００２７】
ペプチドライブラリーおよびＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡ技術は、表面結合捕捉抗体を使用して、細胞から分泌された可溶性サイトカインを結合する。二次標識抗体を使用して、標準曲線と比較した場合の分泌されたサイトカインの濃度を定量する。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、およびサイトカイン産生をＥＬＩＳＡにより評価することにより、抗原エピトープが単離された。この方法論は、しかしながら、いずれかの所定のサンプルについてわずか数種のサイトカインの産生を測定し得るために制限される。エピトープ認識に応答して産生されるサイトカインおよびケモカインの完全な範囲を測定することのこの不能は、応答のいかなる特徴付け（すなわちタイプ１、タイプ２若しくは抑制性Ｔ）も極めて困難にする。さらに、ＥＬＩＳＡによる単一サイトカインの評価は、最低１００マイクロリットルの生物学的液体および／若しくは培養物上清という大きな容量を必要とする。
【００２８】
ペプチドライブラリーおよび細胞増殖アッセイ。細胞増殖アッセイは、放射核種の取り込み若しくは蛍光色素の希釈を使用して、刺激に応答しての細胞分裂をモニターする。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、および細胞増殖アッセイにより細胞分裂を評価することにより、抗原エピトープが単離された（Ｍｕｔｃｈ Ｄ、Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ．１９９４ Ｓｅｐ；７（９）：８７９−９０）。この方法論は、しかしながら、細胞分裂は抗原応答の大きさの指標でありうるとは言え、このアッセイが応答の質（すなわちタイプ１、タイプ２若しくは抑制性Ｔ）に関する情報を与えないために制限される。いくつかの抗原特異的応答が、抑制性Ｔ細胞応答のような迅速な細胞増殖と関連しないことにもまた注目すべきである。
【００２９】
ペプチドライブラリーおよび細胞傷害性リンパ球アッセイ（ＣＴＬ）。細胞傷害性リンパ球アッセイは、エピトープ認識および細胞溶解性細胞の機能の尺度として、抗原を負荷した（限定されるものでないが、ｃＤＮＡ、ウイルスおよびファージ発現ライブラリー、全タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド、改変ペプチドならびに脂質を挙げることができる）標的細胞からの放射核種若しくは蛍光色素の遊離をモニターする。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、および細胞傷害性リンパ球アッセイにより細胞の細胞傷害性を評価することにより、抗原エピトープが単離された。細胞の細胞傷害性はタイプ１の抗原応答の大きさの指標でありうるとは言え、この方法論は、タイプ１以外の応答（すなわちタイプ２若しくは抑制性Ｔ）を評価する場合に制限された使用のものである。ＣＴＬアッセイを使用する抗原特異的細胞傷害性の特徴付けは、標的細胞からのレポーター遊離による低感度にしばしば悩まされる。この方法論は高価な細胞培養操作を必要とし、そして従ってハイスループットとみなされ得ないことにもまた注目すべきである。
【００３０】
ペプチドライブラリーおよび細胞質内サイトカイン染色。細胞質内サイトカイン染色技術は、標準的な蛍光染色手順および抗サイトカイン抗体を使用して、抗原刺激に応答して産生された細胞内サイトカインのレベルを測定する。サイトカイン産生の測定およびサイトカイン産生細胞の定量をその後、標準的なサイトメトリー、顕微鏡若しくは分光測光学的技術により達成し得る。細胞をオーバーラップペプチドのライブラリーとともにインキュベートすること、および細胞質内染色によりサイトカイン産生を評価することにより、抗原エピトープが単離された（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ＡＣ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３ Ｄｅｃ；２８３（１−２）：１４１−５３）。この方法論は、しかしながら、いずれかの所定のサンプルについてわずか数種のサイトカインの産生を測定し得るために制限される。エピトープ認識に応答して産生されたサイトカインおよびケモカインの完全な範囲を測定することのこの不能は、応答のいかなる特徴付け（すなわちタイプ１、タイプ２、抑制性Ｔ）も極めて困難にする。この方法論は、それが分析に多数の細胞を必要とし、また、分析される細胞に対し破壊的であるために、さらに制限される。
【００３１】
ペプチド溶出および質量分析配列決定。ＭＨＣからのペプチドの溶出、次いで質量分析配列決定は、抗原エピトープを同定するために成功裏に使用されている（Ｈｕｎｔ ＤＦ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２ Ｍａｒ ６；２５５（５０４９）：１２６１−３。）。同定のための強力な方法論とは言え、ペプチド溶出は高価で遅く、そして大きなサンプルサイズを必要とし、臨床の設定での使用にそれを非実用的にしている。この方法は抗原エピトープの同定手段を提供するが、しかしそれらのエピトープにより導き出される特異的応答（すなわちタイプ１、タイプ２、抑制性Ｔ）を特徴づけるのに使用し得ない。
【００３２】
ペプチドとＭＨＣの相互作用のコンピュータモデル化。主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）とペプチド複合体のＸ線結晶構造データに主に基づく、ペプチドとＭＨＣの相互作用のコンピュータモデル化は、タンパク質内の潜在的エピトープを予測するのにしばしば使用される。この方法論は新たな予測アルゴリズムの導入から大きな恩恵を受けたとは言え、それは、しかしながら構造データベースの大きさに依存し、そして従ってそのデータ組に表されないＭＨＣ複合体の予測ではより少なく効率的でありうる（Ｋｕｈａｒａ Ｓ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１９９９；：１８２−９。）。この方法は抗原エピトープの同定手段を提供するが、しかしそれらのエピトープにより導き出される特異的応答を特徴づけるのに使用し得ない。
【００３３】
組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定（ＳＥＲＥＸ）。ＳＥＲＥＸ技術は、コンビナトリアル発現ライブラリースクリーニングによる、血清抗体により認識されるエピトープの同定を必要とする。ＳＥＲＥＸ技術は体液性免疫応答の特異性に関して一指標を与えうるとは言え、いかなるこうした指標も細胞性免疫応答の大きさ若しくは性質いずれに関しても示されない（Ｔｕｒｅｃｉ Ｏ、Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ．１９９７ Ａｕｇ；３（８）：３４２−９。）。この技術は時間および労働双方とも集約的であり、そして従って臨床の設定では非実用的である。
【００３４】
複数のサイトカイン分析のためのリアルタイムＰＣＲ。リアルタイムＰＣＲを使用して、複数のサイトカインをコードするＲＮＡの発現を定量的様式で測定し得る（Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００１ Ｄｅｃ；２５（４）：３８６−４０１）。この技術は、しかしながら時間および労働双方とも集約的であり、分析に十分な量のＲＮＡを単離するために多数の細胞を必要とし、そして細胞に対し破壊的である。最後に、ＲＮＡの発現は生物学的に活性のサイトカインの分泌を示さない。
【００３５】
上に示されたとおり、抗原エピトープを予測および特徴付けすることが可能な技術が報告されており、そして、いくつかの場合には、有用な情報の量を最大化するために、蛍光に基づく増殖アッセイおよび細胞内サイトカインアッセイのような多様な技術が組み合わせられた。これらの組合せアッセイのアプローチは、しばしば、上述された細胞内サイトカイン染色に伴う限界のような、その個々の構成要素のアッセイの限界に悩まされる。
【００３６】
自動化の影響を受けやすく、非破壊的で、そしてそれを臨床診断の設定に応用可能にしてヒトでの免疫応答の評価を可能にする小さなサンプルサイズを必要とする、ハイスループットの多パラメータ技術に対する緊急のかつこれまで果たされていない必要性が存在する。この必要性は、出現するおよび再出現する病原体、ならびに、免疫応答の像を提供しかつ／若しくは病原体の性質を同定する迅速なアッセイが必要とされる生体脅威（ｂｉｏｔｈｒｅａｔ）病原体を鑑みればとりわけ重要である。上述された方法論のいずれも、抗原エピトープに対する定性的および定量的免疫応答の明確な特徴付けを提供しない。コンピュータモデル化を除き、これらの方法は高処理量を提供せず、診断若しくは免疫モニタリングの観点からそれらの利用性を制限する。
【００３７】
本発明は免疫調節ペプチドおよびそれらの誘導体の同定を提供し、従って診断、予後および治療的意義をもつ、健康なおよび疾患に罹った個体で誘導される免疫応答の型の評価を可能にする。この方法論はまた、それに対して応答が生成されるエピトープを同時に同定しつつ、その応答の質および大きさの双方の尺度も与える。
【００３８】
一局面において、本発明は、誘導される応答の型に関係しない抗原特異的免疫応答の評価方法であり、従って健康なおよび疾患に罹ったの双方の個体で誘導される免疫応答の型の評価を可能にする。この方法論は、それに対し免疫応答が生成されるエピトープを同時に同定しつつ、その応答の質的および量的双方の尺度を与える。
【００３９】
本発明の方法は３種の技術、すなわちヒト若しくは動物いずれかからの免疫細胞の細胞培養、ＭＨＣに制限されない抗原性物質の提示、ならびに免疫応答の全部の多様性を観察する能力を提供するサイトカインおよび／若しくはケモカインの存在についての分析の組合せである。一態様において、該３種の技術は、ヒト若しくは動物いずれかからの免疫細胞の細胞培養、ＭＨＣに制限されないオーバーラップペプチドのライブラリー、ならびにサイトカインおよび／若しくはケモカインの存在についての多重分析を必要とする。好ましくは、本発明は、第一の相がハイスループットスクリ―ニングであり（第Ｉ相）、および第二の相が特異的抗原エピトープの同定を提供する（第ＩＩ相）、抗原特異的免疫応答の多相評価方法である。
【００４０】
本発明の方法は、ペプチドおよび非ペプチド（例えば糖脂質）双方のエピトープについて多彩な抗原のプロセシング、提示および認識が可能である、存在する複数の細胞型での細胞培養物分析を使用する。本発明の方法に適する細胞は、限定されるものでないがＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、好中球、肥満細胞および赤血球を挙げることができる。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫ−Ｔ細胞を包含する単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本発明での使用のための複数の細胞型の容易に得られる供給源を提供する。さらに、サイトカインの産生もまた支援するヒト若しくは動物細胞を培養するための当該技術分野で既知のいかなる標準化された手順も、本発明での使用に適する。
【００４１】
本発明の方法において、いかなる抗原性物質も免疫応答を導き出すのに使用し得る。本発明に適する抗原性物質の供給源は、抗原、ペプチド、タンパク質、微生物、細胞、組織、腫瘍若しくはそれらのいずれかの組合せを包含する。適する抗原性物質は、限定されるものでないが、ペプチド、糖ペプチド、リンペプチド、脂質、糖脂質およびリン脂質を包含する組成物を挙げることができる。
【００４２】
一態様において、オーバーラップペプチドのライブラリーを、目的のタンパク質上の抗原エピトープを同定しかつ免疫応答を刺激するために本発明で使用する。この技術は、いずれかの所定の抗原についての全部の可能なエピトープクラスＩおよびクラスＩＩの同定を提供し、そしてＣＤ４およびＣＤ８双方のＴ細胞応答に適する。そして、エピトープの同定はＨＬＡハプロタイプにより制限されない。
【００４３】
目的のタンパク質のアミノ酸配列は、小さなオーバーラップペプチド、例えば、例えば３ないし４アミノ酸のオフセット（ｏｆｆｓｅｔ）を伴う一連の８ないし１５−ｍｅｒのオーバーラップペプチドに分割する。本発明によれば、オーバーラップペプチドのライブラリーは、製造し得るか、若しくは商業的に入手可能な供給源から購入し得るかのいずれかである。例えば、２９６アミノ酸を含有するインフルエンザマトリックスタンパク質から、６０種のオーバーラップする１５−ｍｅｒペプチド（４アミノ酸のオフセットを伴う）のオーバーラップペプチドのライブラリーを製造し得る。
【００４４】
オーバーラップペプチドのライブラリーから、１種若しくはそれ以上のペプチドを培養容器に付着させた細胞培養物容器を調製する。一多相法において、マルチウェルの第Ｉ相培養プレートをスクリーニングの目的上使用し、各ウェルは数種のオーバーラップペプチドの１クラスターを含有する。クラスターあたりのオーバーラップペプチドの数、およびスクリーニングに必要とされるクラスターの数は、タンパク質それ自身の大きさに依存する。好ましくは、各クラスターは約５〜１０種のオーバーラップペプチド；より小さいタンパク質については約３〜７種のオーバーラップペプチドを含有する。一多相法において、目的のタンパク質のオーバーラップペプチドのライブラリーを、ウェルあたりのクラスターあたり５〜１０種のペプチドによりコード化し（ｃｏｄｅｄ）、前馴化した９６ウェルの第Ｉ相培養プレートにクラスターごとに分配する。第ＩＩ相のためには、反応性クラスター中のオーバーラップペプチドを、ウェルあたり単一ペプチドとして分配する。第Ｉ相培養プレートは、処理量を最大化しかつアッセイごとの変動性を最小化するように事前に調製し得る。事前に調製しかつ−８０℃で保存したプレートは最低１年の貯蔵寿命を有する。また、特定の第Ｉ相クラスターが反復して抗原性であることが見出される程度まで、第ＩＩ相培養プレートもまた事前に調製し得る。
【００４５】
本発明の免疫応答アッセイを開始するため、目的の免疫細胞を上述された培養容器に添加し、そして培養容器に付着させた抗原ペプチド（１種若しくは複数）に応答してのサイトカインの産生を支援する時間および条件下でインキュベートする。この方法論を使用して評価し得る免疫細胞は、限定されるものでないが、ＰＢＭＣ、リンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＣＲ □□ Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞および顆粒球を挙げることができる。一方法において末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用する。多相法において、例えば、ウェルあたりクラスターあたり５〜１０種のペプチドを含む目的の抗原のオーバーラップペプチドのライブラリーを含有する、上述された１個若しくはそれ以上の暗号化し前馴化した９６ウェルの第Ｉ相培養プレートに、ＰＢＭＣをウェルあたり２×１０５で接種する。免疫細胞をその後、培地、温度およびインキュベーション条件を特定の細胞型について選択された、サイトカインの産生を支援する条件下でインキュベートする。例えば、ＰＢＭＣは、好ましくは実施例１に記述されるところの完全培地中３７℃で１８〜４８時間インキュベートする。インキュベーション後に細胞をペレットにし、そして上清を各ウェルから単離しかつ多様なサイトカインおよびケモカインの存在について分析する。本明細書に記述されるところの本発明に関して、「サイトカイン」という用語はサイトカインおよびケモカイン双方を表すのに使用される。
【００４６】
本発明により、同一サンプル中で数種のサイトカイン、好ましくは２０種若しくはそれ以上のサイトカインの存在について上清を同時に分析することが可能である、当該技術分野で既知のいずれの方法も、本発明で使用し得る。こうした方法は、質量分析、抗体に基づくアレイ、および多重分析ビーズ技術を包含する。サイトカイン多重分析は、それが：ｉ）複数の免疫パラメータの同時測定を見込む、ｉｉ）小容量のサンプルを必要とする、ｉｉｉ）サンプルを破壊しない感受性アッセイを提供する；ｉｖ）特化された免疫応答に特徴的な特異的サイトカインの協調的発現を支援する、およびｖ）免疫エフェクターの直接測定を提供する、ために使用される。適する商業的に入手可能なサイトカイン多重分析機は、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘワークステーション（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、テキサス州オースティン）であり、１００個までの被検体を同時に測定することが可能であり、小容量のサンプルを必要とし、そして１ミリリットルあたり１〜３２，０００ピコグラムのダイナッミックレンジ内でサイトカインの存在を迅速に検出する。サイトカイン多重アレイ技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ）は、小容量中の複数のサイトカインおよびケモカインの同時定量を可能にする（Ｅａｒｌｅｙ ＭＣ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．２００２ Ｏｃｔ １５；５０（５）：２３９−４２）。該アッセイは事実上ハイスループットであり、そして多様な生物学的サンプルの分析に応用され得る。刺激若しくは病原体の傷害に応答しての協調的サイトカイン発現を分析することにより、状態特異的なバイオシグネチャが、特異的免疫応答に対応して記述され得る。
【００４７】
一方法において、５０マイクロリットルの上清を、９６ウェル形式でＬｕｍｉｎｅｘ１００ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘワークステーション（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、テキサス州オースティン）に移し、そして製造元の説明書に従って分析する。上清を、予め調製かつ検証された多重ビーズおよび試薬のマスターミックスを使用して、多様なサイトカインの存在について、二重で迅速にスクリーニングする。
【００４８】
多相法において、第Ｉ相サイトカイン分析により反応性について陽性であることが判明する抗原クラスターを、上述されたところのエピトープフォーカシング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）第ＩＩ相培養プレートでの抗原ペプチドの同定のため、それらの構成要素ペプチド成分に分解する。一方法において、第ＩＩ相培養プレートは、二重の各クラスターの個々の成分ペプチドを含有する暗号化し予め馴化したウェルストリップよりなる。目的の免疫細胞をウェルストリップに添加し、そしてウェルストリップに付着した抗原ペプチド（１種若しくは複数）に応答してのサイトカインの産生を支援する時間および条件下でインキュベートする。例えば、融解したＰＢＭＣを、ウェルストリップにウェルあたり２×１０５細胞で添加し、そして３７℃で１８〜４８時間培養する。インキュベーション後に細胞をペレットにし、上清を単離し、そしてサイトカイン産生について分析する。一方法において、５０マイクロリットルの上清を分析のためＬｕｍｉｎｅｘワークステーションに移す。所定のペプチド鎖についての第ＩＩ相での多重スクリーニングは、第Ｉ相分析の間にその親クラスターに応答して産生されたサイトカイン（１種若しくは複数）よりなる。第ＩＩ相スクリーニングで同定されたペプチドは、該個体により認識される抗原エピトープを表す。同定されたペプチドに応答して産生されたサイトカインおよびケモカインの特徴的なパターンは、そのエピトープにより導き出される特化された応答の型の指標である。
【００４９】
本発明の方法は、ペプチド特異的Ｔ細胞エピトープの迅速な同定および特徴付けのためのハイスループット処置である。本明細書に示されるとおり、アッセイの開発および検証は、選択された一群のサイトカインおよびケモカインの同定につながり、それはタイプ１、タイプ２および抑制性Ｔ細胞の細胞表現型の同定を可能にする。
【００５０】
本発明の方法は：ａ）高感度、すなわち試験した全部のサイトカインについて１ミリリットルあたりピコグラムでの検出；ｂ）ハイスループット、すなわちアッセイは４８時間以内に完了し得る；ｃ）小容量の生物学的液体中の複数の被検体の分析、例えば５０マイクロリットル容量中の最低３０種のサイトカインおよびケモカインの評価；ｄ）非破壊的、すなわち多パラメータ分析のための細胞に基づくアッセイの追加を可能にする；ならびにｅ）ＨＬＡハプロタイプに依存しない様式での抗原エピトープの同定を包含する、既存の技術を上回るいくつかの利点を有する。本発明の方法は、複数の免疫パラメータをモニターするためにサイトカイン多重化（ｍｕｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）を使用し、そして従って、限定されるものでないが抗原性、アレルギー誘発性および免疫寛容誘発性の応答を挙げることができる免疫応答の質を特徴づけることが可能である。複数のサイトカインの協調的応答をモニターすることにより、抗原エピトープの同定および特徴付けもまた、現在の従来技術の技術よりも感受性である。現在の当該技術の技術のいずれも、単独若しくは組合せのいずれかで、本発明の方法が提供し得るサイトカインの多パラメータ評価ならびに抗原エピトープの同定および特徴付けを提供することが可能でない。さらに、本発明の方法はハイスループット技術の利点を包含する。現在の従来技術の技術と対照的に、本発明の方法は分析されている細胞に対し破壊的でないこともまた注目されるべきであり；それは、従って、限定されるものでないが増殖、細胞内サイトカインおよび表面受容体染色、ＣＴＬアッセイおよびＥＬＩＳＰＯＴを挙げることができる、いずれかの数の標準的若しくは通例のイムノアッセイと組合せ得る。最後に、本発明の方法は、いずれかの他の現在利用可能な技術よりも、分析のためにはるかにより小容量の生物学的液体および／若しくは培養上清、ならびにはるかにより少数の細胞を必要とする。従って、本発明の方法は、ハイスループット、低容量、非破壊的技術であり、自動化の影響を受けやすく、そして従って臨床診断、予後および治療的使用に実際的である。
【００５１】
一局面において、本発明は、診断、予後および治療的応用をもつ、免疫調節ペプチドおよびそれらの誘導体の同定を可能にする方法である。（ａ）診断的：この技術は、患者の既存の免疫状態を評価するのに使用し得る。多様な抗原中のエピトープを同定かつ特徴付けることにより、その個体の完全なＴ細胞レパートリーの明確な像を決定し得る。この技術は、ハイスループットで、自動化の影響を受けやすく、非破壊的であり、そして小さなサンプルサイズを必要とし、それを臨床診断の設定に応用可能にする。それは、従って、限定されるものでないが、アレルギー、糖尿病、関節炎、狼瘡および多発性硬化症を挙げることができる、多数の自己反応性疾患および過免疫応答の診断において一ツールとして使用し得る。（ｂ）予後：この技術により評価されるところの処置前の個体のエピトープ特異的な免疫状態は、処置の転帰の予後指標としてはたらき得る。従って、治療的介入の経過を、この免疫状態を高める若しくは排除するように調整し得る。この技術は、抗腫瘍免疫療法、臓器移植、アレルギーおよび自己免疫疾患の処置の予後の評価に使用し得る。（ｃ）治療的：本発明の方法は、処置の経過の間に免疫モニタリングツールとして使用し得る。治療の間のエピトープ特異的免疫応答の特異性、大きさおよび質の明確な像が、進行中の処置の有効性を評価するようにはたらき得る。このアプローチからのデータに基づき、特異的免疫応答を高める、調節する、若しくは阻害するように処置を適合させ得る。この技術は、従って、ワクチン開発、抗腫瘍免疫療法、臓器移植、アレルギーおよび自己免疫疾患の領域での進行中の治療的処置を導くのに使用し得る。
【００５２】
別の局面において、本発明は、限定されるものでないが、ワクチン、生物活性ペプチドおよびターゲッティング試薬を挙げることができる新薬の設計において有用であり得る。（ａ）ワクチン：本発明の方法は、有効なワクチンの開発を大きく助長し得る。この技術を使用して同定される抗原エピトープは、それら自身が、感染性疾患若しくは癌に対する免疫応答を高めるため、または自己免疫疾患、アレルギー若しくは臓器移植の処置のためタンパク質に対する免疫応答を寛容化するための有効なワクチンとしてはたらき得る。（ｂ）生物活性ペプチド：より大きなタンパク質のタンパク質分解により生成される生物活性ペプチドは、顕著な神経調節性および免疫調節性の機能とともに記述されている。この技術を用いて、これらの特性をもつペプチドを迅速に同定し得る。（ｃ）ターゲッティング試薬：細胞上の特異的受容体と相互作用する、この技術を使用して同定される生物活性ペプチドを、特定の細胞集団に薬物を送達するためのターゲッティング試薬として使用し得る。
【００５３】
本発明の方法は、限定されるものでないが、慢性感染、アレルギー、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、アルツハイマー病、急性感染性疾患、臓器移植およびアテローム硬化症を挙げることができるいくつかの医学的応用での使用に適する。これらの応用は代表的であることを意味していること、および当該技術分野で既知のような他の応用を本発明の一部として企図していることが理解されるべきである。
【００５４】
慢性感染。膨大な数のおよび多様なヒト疾患が慢性の病原体感染により引き起こされる。これらの疾患の病因は異なりうるとは言え、それらは全部、該病原体に対するおよびタイプ１若しくはタイプ２いずれかの効果的な応答を開始することの不能を特徴とし得る。応答が一旦開始されれば、病原体関連タンパク質の自己エピトープ模倣は、ライム関節炎およびヘルペス関連脱髄性疾患のような、該感染が消失された後も長く持続する自己免疫応答もまた誘発し得る。病原体の免疫認識後の自己免疫反応の出現は、特異的エピトープの選択を、安全な有効な治療にとって決定的に重要にする。研究は、いくつかの慢性感染における調節的応答の不適切な活性化と関係した。本発明の方法は、慢性感染に関する診断、予後および治療的応用に適する。（ａ）診断的：ＨＢＶについてのＰＣＲに基づく検査のようないくつかの慢性に感染性の病原体の非侵襲的診断検査は、臨床の設定で極端な変動性を示す。本発明の方法は、病原体関連ペプチドに対する特異的応答の迅速な検出および特徴付けによる慢性感染の診断に適用し得る。病原体関連の自己免疫性合併症の診断もまたこの技術の使用により助長され得る。（ｂ）予後：本発明の方法は、特異的な病原体関連エピトープに対するタイプ１、タイプ２若しくは抑制性Ｔいずれかの反応性を検出かつ特徴付けするのに使用し得、それらは順に、疾患の転帰の予後指標としてはたき得、それにより抗生物質治療を導く。本発明の方法は、感染に関連した自己免疫疾患の発症に関する予後指標としてもまたはたらき得る、特定の病原体に関連したエピトープに対する反応性を検出かつ特徴付けするのに適する。（ｃ）治療的：本発明を用いての病原体に関連したタンパク質に対する抗原エピトープの同定および特徴付けは、安全で有効な予防的および治療ワクチンの開発を助長し得る。これらは、自己エピトープ模倣を回避するワクチンの実現を包含すると思われる。ワクチンはまた、病原体プロテオーム内のインバリアントエピトープを標的とする汎バリアント（ｐａｎ−ｖａｒｉａｎｔ）エピトープの同定も包含するとみられ、従って、同一病原体の複数の株に対する保護、ならびにＨＩＶおよびマラリアの場合でのような各病原体の共通の変異体バリアントを提供する。この技術の応用による制御性Ｔエピトープおよび応答細胞の同定および排除は、保護的抗病原体応答の開始においてある役割を演じ得る。
【００５５】
アレルギー。アレルギーは、一般には有害でない物質に対する過免疫応答である。タイプ２応答への不適切な移動が、アレルギー性免疫応答の誘発において決定的に重要な役割を演じていることが報告されている。イエダニ、花粉およびカビのような吸入アレルゲン；卵、小麦、大豆およびナッツのような食物アレルゲン；若しくはペニシリンのような若干の薬物を包含する多くのアレルゲンが同定されている。アナフィラキシーと呼ばれる重症のしばしば生命を脅かす反応が生じ得る。アレルギーの情況での抑制性Ｔ細胞応答の活性化が、従って有利であると思われる。（ａ）診断的：皮膚検査およびアレルゲン特異的ＩｇＥレベルのような血液検査が、アレルゲンを同定するのに一般に使用される。しかしながら、皮膚検査はアナフィラキシーを経験しうる若干の患者にとって危険であり得る。本発明の方法は、患者特異的なアレルギー誘発性エピトープを同定するための安全な診断ツールとして適用し得る。（ｂ）予後：本発明の方法は、個々のアレルギー患者についてのアレルゲンエピトープの同定を可能にする。これは、処置若しくは経過観察の間の免疫応答をモニターするのに有用である。免疫寛容誘発性の抑制性Ｔ細胞刺激性エピトープもまた処置後に同定し得、そして成功裏の治療の予後指標としてはたらき得る。（ｃ）治療的：抗原エピトープの同定は、免疫応答を抑制性Ｔに切り替えるか、または不適切なタイプ２細胞を選択的に排除若しくは抑制するために使用し得る、新たなペプチドに基づくワクチンにつながり得る。
【００５６】
腫瘍性疾患。腫瘍性疾患は、正常組織から突然変異した異常な細胞の制御されない増殖と定義される。これらは、癌、充実性腫瘍およびリンパ／造血系の悪性病変を包含し、それらの全部が一般に腫瘍と称される。腫瘍環境が、いくつかの異なる機構により腫瘍抗原に対する免疫寛容を誘発することが報告された。腫瘍細胞に対するタイプ１ Ｔ細胞の発生は腫瘍増殖の後退若しくは抑制に関する一方、免疫寛容に移動した免疫応答は、癌特異的タイプ１ Ｔ細胞の発生を阻害する。しかしながら、若干の癌において、腫瘍抗原特異的なタイプ１ Ｔ応答が、抗原の模倣により自己免疫疾患を誘発する。例えば、乳房および卵巣腫瘍抗原ＣＤＲ２に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が、若干の患者で傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）を誘発することが報告されている。
【００５７】
抗腫瘍免疫の過程での自己免疫反応の出現は、安全で有効な治療に決定的に重要な特異的エピトープの選択を行う。（ａ）診断的：腫瘍関連の自己免疫性合併症の診断が本発明の方法の使用により助長され得る。（ｂ）予後：この技術を使用する、特定の腫瘍関連エピトープに対するタイプ１、タイプ２若しくは抑制性Ｔいずれかの反応性の検出および特徴付けは、疾患の転帰の予後指標としてはたらき得る。本発明の方法は、プレワクチンとポストワクチンの間の腫瘍特異的免疫応答の質および大きさを比較することにより、いかなる種類のワクチン処置の評価も可能にする。この技術を使用する、特定の腫瘍関連エピトープに対する反応性の検出および特徴付けは、腫瘍関連の自己免疫疾患の発症に関する予後指標としてはたらき得る。（ｃ）治療的：本発明を用いての腫瘍関連タンパク質に対する抗原エピトープの同定および特徴付けは、安全で有効な治療ワクチンの開発を助長し得る。これは、自己エピトープ模倣を回避するワクチンの実現を包含するとみられる。
【００５８】
自己免疫性疾患。自己免疫疾患は、身体自身の組織に対する免疫応答により引き起こされる障害と定義し得る。自己抗原提示の情況での制御性Ｔ細胞の機能から離れる不適切な移動が、自己免疫疾患の発症および進行における決定的に重要な因子であると考えられている。生じる疾患の特定の性質は支配的応答に依存する。例えば、１型糖尿病の症例において、膵島を認識するタイプ１細胞が患者で単離された。（Ａｒｉｆ Ｓ、Ｊ Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００４ １１３：４５１）。さらに、多発性硬化症患者では、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）反応性タイプ１分極Ｔ細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏ活性化、および病因において主要な役割を演じていることが報告されているクローン増殖を受けることを示す証拠が存在する。制御性Ｔ細胞の機能の復帰が、正常な免疫恒常性の再構成に決定的に重要であるとみられる。（ａ）診断的：本発明の方法は、所定の型の自己反応性免疫細胞の増殖の原因であるドミナントな自己エピトープの同定を可能にする。（ｂ）予後：本発明の方法は、個々の自己免疫患者についての自己抗原エピトープの同定を可能にする。これは処置若しくは経過観察の間の免疫応答をモニターするのに有用である。免疫寛容誘発性の抑制性Ｔ細胞刺激性エピトープもまた処置後に同定され得、そして成功裏の治療の予後指標としてはたらき得る。（ｃ）治療的：抗原エピトープの同定は、免疫応答を抑制性Ｔに切り替えるか、または不適切なタイプ１若しくはタイプ２細胞を選択的に排除若しくは抑制し得る、新たなペプチドに基づくワクチンにつながり得る。
【００５９】
アルツハイマー病。アルツハイマー病（ＡＤ）は、知的機能の進行性の後天的損傷である、ゆっくりと進行する形態の痴呆である。ＡＤは、脳領域中の４２残基のアミロイドβタンパク質（Ａβ）の進行性沈着を特徴とする。報告は、有意により高比率の健康な高齢被験体およびＡＤを伴う患者が、年齢を一致させた成人に比較した場合に、タイプ１およびタイプ２双方の特徴の強いＡβ反応性Ｔ細胞応答を有したことを示している。（ａ）診断的：多くの症例で、アルツハイマー病と老人性痴呆の間の鑑別診断は死後にのみ確定的に決定し得る。本発明の方法を使用してＡβ反応性Ｔ細胞応答を同定し得、それは従ってＡＤの診断指標としてはたらき得る。（ｂ）予後：本発明を用いての特異的免疫応答の同定は、疾患の臨床経過の予測を可能にし得る。
【００６０】
急性感染症。病原体に対するタイプ１応答の誘導は、細菌およびウイルスのような細胞内微生物の感染からの回復に決定的に重要である。対照的に、蠕虫のような細胞外病原体は、そのサイトカインが病原体のＩｇＥおよび好酸球媒介性の破壊を指図するタイプ２細胞の発生を誘導する。エボラウイルス若しくはデングウイルスのような数種のウイルスは、高死亡率を伴う重篤な疾病を引き起こし、それらの双方について認可されたワクチンは確立されていない。マウスモデルにおいて、エボラウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）およびマトリックスタンパク質（ＶＰ４０）由来のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンがＴ細胞およびＢ細胞双方を活性化することが判明しており、そしてウイルス攻撃から保護する。（ａ）診断的：本発明の方法は、出現および再出現する病原体および生体脅威病原体の存在を診断する新規エピトープの同定に適する。（ｂ）治療的：本発明の方法は、これらの疾患から回復した患者をスクリーニングすることにより、ウイルス抗原に対するＴ細胞エピトープを同定し得る。従って、急性の致死的ウイルス感染症に対して新たなペプチドに基づくワクチンを作成し得る。
【００６１】
臓器移植。臓器移植の拒絶は、移植臓器、若しくは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の場合でのようにレシピエントに対する支配的なタイプ１応答により一般に駆動される過免疫応答である。調節機能が、免疫寛容および長期の移植片認容性の発生において決定的に重要な役割を演じているとみられる。臓器移植の情況での抑制性Ｔの活性化若しくは支配的なタイプ１応答の選択的排除が、従って有利であると思われる。（ａ）診断的：本発明の方法は、急性ＧＶＨＤおよび最も具体的には慢性ＧＶＨＤの発生を予測し得る免疫反応のパターンの決定に指摘する。（ｂ）予後：移植の前若しくは出現後、ドナー若しくはレシピエントいずれかのサンプル中の存在のドミナントなタイプ１エピトープは、移植片拒絶の予後指標であり得、そして、本発明は、ドミナントなタイプ１エピトープの存在を決定するのに適する。免疫寛容誘発性の抑制性Ｔ細胞刺激性エピトープもまた、本発明を用いて処置後に同定され得、そして移植片免疫寛容の予後指標としてはたらき得る。（ｃ）治療的：本発明を用いての抗原エピトープの同定は、免疫応答を抑制性Ｔに切り替え得るか、または不適切なタイプ１細胞を選択的に排除若しくは抑制するための新たなペプチドに基づくワクチンにつながり得る。
【００６２】
アテローム硬化症。アテローム硬化症は動脈の一般的障害である。脂肪、コレステロールおよび他の物質が動脈壁に蓄積し、そして「粥腫」すなわち斑を形成する。慢性の炎症細胞媒介性の免疫応答が、アテローム硬化症の病因に関与していることが現在認識されている。アテローム硬化斑中でのＴ細胞の活性化が、酸化されたＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）のような斑由来抗原により開始されることが報告されている。他者は、頚動脈のヒトアテローム硬化性斑中でのクラミジア ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）反応性Ｔ細胞の検出を報告した。（ａ）診断的：本発明の方法は、免疫反応の初期のパターンの同定に適する。（ｂ）予後：本発明の方法は、Ｔ細胞により認識される、ｏｘＬＤＬ若しくは交差反応性クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）抗原のようなアテローム硬化症の病因に関する抗原のエピトープの定量的測定を見込む。（ｃ）治療的：本発明の方法は、アテローム硬化症の進行を予防するための新たなペプチドに基づくワクチンを開発するのに使用し得る特異的エピトープを決定するのに適する。
【００６３】
下に示される実施例は本発明を代表的し、そして本発明を具体的に説明することを意図しているが、しかし本発明の範囲をいかなる方法でも制限すると解釈されるべきでないことが理解されるべきである。本発明の範囲から離れることなく、本発明の方法の特徴の改変を行いうる。代替の方法もまた、本発明の範囲から離れることなく使用しうることが当業者に容易に明らかであろう。とりわけ、実施例に提示されるサイトカイン産生の測定方法は単に代表的なものであり、そしてサイトカイン濃度を測定するための当該技術分野で既知のいかなる方法も本発明で使用し得る。
［実施例］
【実施例１】
【００６４】
正常ドナーのＰＢＭＣのウイルスペプチドとの単純なインキュベーションにより約４８時間で検出された抗原特異的免疫応答。抗原特異的免疫応答がＰＢＭＣおよび単一ペプチドを使用して本発明の方法により検出され得るかどうかを決定するために、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋正常志願者から新たに調製したＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドとともにインキュベートした。ドナーは、他の方法により、Ｆｌｕ−ＭＰ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有するが、しかしＭａｇｅ ３特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有しないことが既知であった（データは示されない）。
【００６５】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋健康志願者から新たに採取した血液から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣを、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（２００ＵＩ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、１％非必須アミノ酸、２−β−メルカプトエタノール（５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）およびＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４（２５ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地（完全培地すなわちＣＭ）中１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。２×１０５細胞／ウェルを三重で丸底９６ウェルプレートに接種し、そして１μｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチド（ストック濃度１ｍｇ／ｍｌ、培養物濃度１０μｇ／ｍｌ）；Ｆｌｕ−ＭＰ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）若しくはＭＡＧＥ−３２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ、Ｍｕｌｔｉ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）若しくはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のいずれかとともにインキュベートした。培養上清を４８時間後に収集し、そしてサイトカインおよびケモカインをＬｕｍｉｎｅｘで測定した。
【００６６】
Ｆｌｕ−ＭＰペプチドで刺激したＰＢＭＣは、４８時間以内に、ＩＦＮ−γを包含する多数のサイトカインを誘導した（データは示されない）。該結果は、正常ドナーからの新鮮ＰＢＭＣがＦｌｕ−ＭＰペプチドに応答しかつ多数のサイトカインを産生したこと、および、抗原特異的免疫応答がペプチドとのＰＢＭＣの単純なインキュベーションにより約４８時間で検出され得ることを示す。
【実施例２】
【００６７】
腫瘍抗原を包含するＰＢＭＣ中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーについて約４８時間で検出された抗原特異的免疫応答。ウイルス抗原はしばしば、腫瘍抗原より強い想起（ｒｅｃａｌｌ）応答を誘導することが可能である。腫瘍抗原特異的免疫応答が本発明の方法により検出され得るかどうかを決定するため、ＤＣワクチン（黒色腫関連抗原の４種のＨＬＡ−Ａ２ペプチドを負荷した自己ＣＤ３４＋造血前駆細胞由来ＤＣ）の最低８注入を受領した２例の黒色腫患者からの液体窒素中の低温保存ＰＢＭＣを、冷ＰＢＳ中で融解した。ＰＢＳでの第二の洗浄後に、ＰＢＭＣをＣＭ中３７℃で１５分間インキュベートし、そして細胞破片をナイロン細胞フィルターで除去した。細胞をＣＭで再度洗浄しそして１×１０６／ｍｌでＣＭに再懸濁した。その後、２×１０５細胞／ウェルを丸底９６ウェルプレートに三重で接種し、そして、１μｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドすなわち（ストック濃度１ｍｇ／ｍｌ、培養物濃度１０μｇ／ｍｌ）；Ｆｌｕ−ＭＰ ５８−６６、ＣＭＶ ＰＰ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、テキサス州ルイスビル）、ＭＡＧＥ−３ ２７１−２７９、ＭＡＲＴ−１ ２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、ｇｐ１００ｇ２０９−２Ｍ（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ）、チロシナーゼ３６８−３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ、ＮＣＩ）若しくはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のそれぞれとともにインキュベートした。培養上清を４８時間後に収集し、そして産生されたサイトカインをＬｕｍｉｎｅｘ技術で測定した。加えて、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の検出のため、製造元のプロトコル（Ｍａｂｔｅｃｈ）に従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。簡潔には、ＰＢＭＣ（２×１０５細胞／ウェル）を、１０μｇ／ｍｌのペプチドの存在若しくは非存在下に１０μｇ／ｍｌの一次抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン・ストックホルム）で前被覆したプレートに添加した。
【００６８】
直接ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにより、Ｆｌｕ−ＭＰおよびＣＭＶに対するＣＤ８＋  Ｔ細胞を有することが既知であった（データは示されない）患者１は、Ｆｌｕ−ＭＰ若しくはＣＭＶペプチドに応答してＩＬ−１α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＰ−１０の誘導を示したが、しかし４種の黒色腫ペプチドではしなかった（データは示されない）。これは、黒色腫ペプチドが免疫応答を非特異的に調節しないことを示す。ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびにＦｌｕ−ＭＰ若しくはＣＭＶを有することが示された（データは示されない）患者２は、ＭＡＲＴ−１ペプチドに応答してのＩＬ−１αのわずかな増大およびＩＰ−１０の顕著な増大を表したが、しかし他の黒色腫ペプチドではしなかった（データは示されない）。結果は、正常ドナーからの新鮮ＰＢＭＣがＦｌｕ−ＭＰペプチドに応答しかつＩＬ−１αおよびＩＰ−１０を産生することを示す。サイトカイン／ケモカイン産生プロファイルは２例の異なる正常ドナー間で異なり、同一のＦｌｕ−ＭＰペプチドを認識する異なる型のＣＤ８＋ Ｔ細胞がＥＰＩＭＡＸアッセイで同定され得ることを示唆する。ＩＰ−１０がＩＦＮに応答してアップレギュレートされ得るという事実を考えれば、ＤＣとＴの相互作用はＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導することができ、それはＤＣからのＩＰ−１０産生につながる。従って、ＩＰ−１０はタイプ１ Ｔ細胞応答の有用なマーカーであり得る。
【実施例３】
【００６９】
ペプチドを負荷したＣＤ３４−ＤＣをワクチン接種した黒色腫患者におけるＭａｒｔ−１ペプチドに応答してのＩＰ−１０の誘導はＩＦＮ−γに依存する。ＩＰ−１０産生がＩＦＮ−γに依存するかどうかを検査するために、ＨＬＡ−Ａ２黒色腫ペプチドを負荷した自己ＣＤ３４−ＤＣをワクチン接種した黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、ブロッキング抗ＩＦＮ−γＲ１ ｍＡｂの存在下で、ＭＡＲＴ−１ペプチド＃６（１０μＭ）若しくはＦｌｕ−ＭＰ ＨＬＡ−Ａ２ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかで刺激した。ＩＰ−１０産生はＩＦＮ−γＲ１の遮断により完全に無効にされた（データは示されない）。従って、ＩＰ−１０産生はＩＦＮ−γ産生に依存し、ＩＰ−１０がＩＦＮ−γ産生の代理マーカーとなり得ることを示した。
【００７０】
ＤＣワクチン（黒色腫関連抗原の４種のＨＬＡ−Ａ２ペプチドを負荷した自己ＣＤ３４＋造血前駆細胞由来ＤＣ）の最低８注入を受容した２例の黒色腫患者からの液体窒素中の融解された低温保存ＰＢＭＣを、丸底９６ウェルプレートに三重で接種し、そして１０μｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドすなわちＦｌｕ−ＭＰ５８−６６、ＣＭＶ  ＰＰ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）、ＭＡＧＥ−３２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）、ＭＡＲＴ−１２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、ｇｐ１００ｇ２０９−２ Ｍ（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ）、チロシナーゼ３６８−３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）若しくはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のそれぞれとともにインキュベートし；そして培養上清を４８時間後に収集しかつサイトカインおよびケモカインの存在についてＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用して量的に評価した。抗原特異的ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の検出のためＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、ここで、ＰＢＭＣ（２×１０５細胞／ウェル）を、１０μｇ／ｍｌのペプチドの存在若しくは非存在下に１０μｇ／ｍｌの一次抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体で前被覆したプレートに添加した。該結果は、ＰＢＭＣ中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーが本発明の方法により同定されたことを示した。
【実施例４】
【００７１】
本発明の方法は、Ｔ細胞により認識される特異的ペプチド配列の同定を可能にする。Ｔ細胞により認識される抗原エピトープ（１種若しくは複数）およびそのエピトープにより誘導される免疫応答が本発明の方法で同定され得るかどうかを決定するため、１５−ｍｅｒのＭＡＲＴ−１ペプチドライブラリーからの４〜７種のペプチドよりなるペプチドの５クラスターを、ＣＤ３４−ＤＣワクチンを受領したＨＬＡ−Ａ０２０１＋黒色腫患者から得たＰＢＭＣとともにインキュベートした。４アミノ酸のオフセットを伴う１５−ｍｅｒのオーバーラップペプチドは、ＭＡＲＴ−１の全アミノ酸配列を包含するよう設計した（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）。各ペプチドは２ｍＭで５０％アセトニトリルで再構成し、そして使用まで−８０℃に保管した。ＰＭＢＣはＤＣワクチンを受領した黒色腫患者から得た。４〜６種のクラスターを形成した（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）ペプチド（１ペプチドあたり１μｌ）若しくは単一のペプチド（１μｌ）を９６ウェルプレートに三重で接種し、そして室温で乾燥した。その後、２００μｌのＣＭ中の２×１０５ＰＢＭＣを各ウェルに添加し、そして加湿５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で４８時間インキュベートした。培養上清中のサイトカイン若しくはケモカイン濃度をＬｕｍｉｎｅｘで測定した。
【００７２】
有意により多量のＩＰ−１０がクラスター＃１培養物中で検出されたことが見出された。次に、ＭＡＲＴ−１ライブラリーからの単一ペプチドを含むＰＢＭＣの第二の培養物を、クラスター＃１内の原因であるペプチドを同定するために作成した。ペプチド＃６は顕著なＩＰ−１０を誘導し、このペプチドが黒色腫患者のＴ細胞のエピトープであることを示す。興味深いことに、このペプチドはＨＬＡ−Ａ０２０１のドミナントなエピトープ配列（ＭＡＲＴ−１２７−３５；ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）を含有する。ＤＣワクチンを受領した黒色腫患者からＰＢＭＣを得た。この患者はＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｐｏｓであり、そして、四量体結合アッセイで、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のドミナントなエピトープ（ＭＡＲＴ−１２６−３５）を認識するＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を有することが示された（データは示されない）。ＰＢＭＣをこのＨＬＡ−Ａ＊０２０１のドミナントなＭＡＲＴ−１ペプチドと共に培養した場合、２種のサイトカインＩＬ−１αおよびＩＰ−１０が特異的に誘導されたが、しかしＩＦＮ−γのアップレギュレーションは示されなかった（データは示されない）。ＩＰ−１０がタイプＩ若しくはタイプＩＩインターフェロンに応答して多くの細胞型により分泌されることを考え、われわれは、ＩＰ−１０がＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ−γに応答して産生されたと推測した。従って、ＩＰ−１０産生はＩＦＮ−γの機能を阻害することにより完全に無効にされた（図４Ｃ）。該結果は、ペプチドを負荷したＣＤ３４−ＤＣをワクチン接種した黒色腫患者におけるＭＡＲＴ−１ペプチドに応答してのＩＰ−１０の誘導が、ＩＦＮ−γに依存することを示す。
【００７３】
この患者のＰＢＭＣが、このドミナントなエピトープを認識するＣＤ８＋ Ｔ細胞を含有するかどうかを確認するために、ＰＢＭＣを、ＭＡＲＴ−１２７−３５若しくは他のＨＬＡ−０２０１ペプチド（例えばＭａｇｅ−３、チロシナーゼおよびＦｌｕ−ＭＰ）を負荷した自己単球由来ＤＣとともに培養し、そして抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団の誘導について特異的四量体で検査した。図４Ｂ−４Ｅに示されるとおり、ＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は７日以内に容易に増殖し、この患者がＭＡＲＴ−１に対するメモリー若しくはエフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞を有すること、およびこのＣＤ８＋ Ｔ細胞集団が本発明の方法によりＭＡＲＴ−１ライブラリーを用いて認識されたことを示した。
【実施例５】
【００７４】
本発明の方法は多様な型の免疫応答の同定を可能にする。本発明の方法は、免疫応答のためのエピトープならびに誘導される応答の型の同時の同定を可能にする。実施例４に示される一般的方法により、黒色腫患者からのＰＢＭＣプレワクチン若しくはポストワクチンいずれかを、ＭＡＲＴ−１若しくはＮＹ−ＥＳＯ１ペプチドライブラリーからの５〜６種のペプチドクラスターとともに４８時間インキュベートした（ＭＡＲＴ−１は５クラスターと；ＮＹ−ＥＳＯ１は８クラスターと）。典型的な結果は、多様な免疫応答に対応するサイトカインプロファイルのシグネチャを表すことが示された（データは示されない）。各免疫応答のパターンを表した該ペプチドクラスターは灰色の棒で示した。タイプ１応答において、ＩＬ−１０産生は抑制されかつＩＰ−１０が誘導される。対照的に、抑制性Ｔ応答において、タイプ１応答の阻害により、より多くのＩＬ−１０が誘導されかつＩＰ−１０産生が無効にされる。ＩＬ−１３およびエオタキシンは、ＩＰ−１０のレベルに影響を及ぼすことなくタイプ２応答で検出される。従って、本発明は、いかなる種類の抗原によっても約４８時間で誘導される多様な型の免疫応答を同定する。ＨＬＡ−Ａ０２０１＋ドナーからの２×１０５の新鮮ＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性Ｆｌｕ−ＭＰ５８−６６、Ｍａｇｅ３２７１−２７９若しくは希釈剤で、示された時間、三重で刺激した。培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定した。三重のデータからの平均±ＳＤを示す。この結果は、ＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のペプチド特異的産生が、４８時間のペプチド刺激でプラトーに達したことを示す。
【実施例６】
【００７５】
本発明の方法は、非Ｔ細胞により誘導される他の型の免疫応答の同定を可能にする。１５−ｍｅｒペプチドがＢ細胞、ＮＫ細胞若しくはＮＫ−Ｔ細胞のような他の免疫細胞により認識されること、および数種のペプチドは同定されていない受容体に結合して免疫応答の調節に至ることが既知である。本発明の別の例を使用して、ＭＨＣ非拘束性中で調節シグネチャを表したペプチドで非Ｔ細胞により誘導される免疫応答を同定した。黒色腫患者からのＰＢＭＣを、スルビビンライブラリーからのペプチドクラスターとともにインキュベートした。図６Ａ−６Ｈに示されるとおり、スルビビンクラスター＃３からのペプチド＃１５はサイトカイン産生の強い調節パターンを誘導した。すなわち、ＩＬ−１０およびＩＬ−１βが強く誘導され、そして、タイプ１応答のマーカーであるＩＬ−１αおよびＩＰ−１０はひどく無効にされた。
【００７６】
この応答がある型のＭＨＣ分子に制限されるかどうかを決定するため、５名の正常健康志願者から採取したＰＢＭＣ由来新鮮血をスルビビンペプチド＃１５とともに４８時間インキュベートし、そして本発明の方法に従ってサイトカイン濃度を測定した。ペプチド＃１５は全５名の正常志願者でＩＰ−１０産生を阻害し（データは示されない）、このペプチドがあるＨＬＡサブタイプに制限されないことを示した。スルビビンペプチド＃１５は免疫応答を改変する強い能力を有することが示された。ペプチド＃１５の存在下に生インフルエンザウイルスで刺激した黒色腫患者からのＰＢＭＣは、明らかにＩＬ−１０産生によるＩＰ−１０誘導の強い廃止を表したからである（データは示されない）。さらに、ペプチド＃１５はＴＳＳＴ−１誘発性のＴ細胞増殖を部分的に阻害した（データは示されない）。枯渇研究は、ＣＤ５６＋細胞がＩＬ−１０産生およびＩＰ−１０阻害の原因であったことを示し（データは示されない）、スルビビンペプチド＃１５がＮＫ、ＮＫ−Ｔ細胞若しくはγ／δ Ｔ細胞集団に作用することを示した。ペプチド＃１５はまたＣＤ３−ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞の生存を維持することも示された（データは示されない）。従って、本発明の方法は、ある型のペプチドにより誘導されるいかなる種類の免疫調節の同定にも有用である。
【実施例７】
【００７７】
本発明の方法は、ワクチン接種の間の黒色腫患者の免疫モニタリングを見込む。細胞を、暗号化し予め馴化した９６ウェルの第Ｉ相培養プレート中にウェルあたり２×１０５で接種した。第Ｉ相培養プレートは、クラスターあたり長さ各１５アミノ酸の１２種のオーバーラップペプチドとともに四重で腫瘍抗原ＧＰ１００、ＭＡＧＥ３、ＮＹ−ＥＳＯおよびＭＡＲＴ−１のそれぞれ５ペプチドクラスター、ならびにＫＬＨおよび死Ｃｏｌｏ細胞対照を含有する。プレートは、処理量を最大化しかつアッセイ間の変動性を最小限にするために事前に準備してもよい。細胞を３７℃で５日間インキュベートする。同時に、再刺激に指定された細胞を、３０：１のＰＢＭＣ対ＤＣの比の、完全な範囲の抗原ペプチドクラスターを負荷した自己成熟ＤＣの存在下で７日間培養する。第７日にこれらの細胞を徹底的に洗浄し、そして第Ｉ相培養プレートに２４時間移す。インキュベーション後に、これらの再刺激した細胞はペレットにされることができ、そして１５０マイクロリットルの各上清を、ＴＥＣＡＮ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＲＰＳロボットサンプル処理装置（ＴＥＣＡＮ）を装備した完全自動化Ｌｕｍｉｎｅｘ１００ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘワークステーションに９６ウェル形式で移す。
【００７８】
オペレータに依存しないサンプル処理が可能なワークステーションを、バーコード識別および無作為マイクロプレート分析とともに使用しうる。上清を、予め調製しかつ検証した多重ビーズおよび試薬のマスターミックスを使用して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０およびグランザイムＢの存在について二重で迅速にスクリーニングする。残存する上清サンプルは後の分析のため凍結する。共培養物からのＤＣが、第Ｉ相プレートでの２４時間インキュベーションの間のバックグラウンドのサイトカイン産生に寄与しうることが予期される。成熟ＤＣからの上清は、従ってサイトカイン多重分析において対照としてはたらく。一次刺激アッセイからの細胞を回転して落とし（ｓｐｕｎ ｄｏｗｎ）、そしてＨ３チミジンを含有する培地に再懸濁しかつ３７℃をインキュベートする。５日後に、抗原特異的増殖をチミジン取り込みアッセイにより四重で評価する。一次刺激アッセイからの上清は後日での分析のため−８０℃で凍結する。再刺激後のサイトカイン産生について陽性であるペプチドクラスターを、一次刺激の間のサイトカイン産生についてスクリーニングする。
【００７９】
第Ｉ相サイトカイン多重アレイにより反応性について陽性であると判明している腫瘍抗原クラスターを、第ＩＩ相培養プレート上で抗原ペプチド同定のためそれらの構成成分に分解する。第ＩＩ相培養プレートは、各クラスターについて１２種の成分ペプチドを含有するウェルストリップを二重で包含する。第ＩＩ相ペプチドウェルストリップは事前に準備し、そしてバーコードラベルを貼付した枠にセットする。融解したＰＢＭＣを、第Ｉ相で同定された特異的ペプチドクラスターを負荷した自己の成熟ＤＣと３７℃で７日間共培養し、洗浄し、そしてウェルあたり２×１０５で第ＩＩ相培養プレートに２４時間移す。インキュベーション後に細胞をペレットにし、そして１５０マイクロリットルの上清を分析のためＬｕｍｉｎｅｘワークステーションに移す。所定のペプチドストリップについての第ＩＩ相での多重スクリーニングは、第Ｉ相分析の間にその親クラスターに応答して産生されたサイトカイン（１種若しくは複数）よりなる。成熟ＤＣ単独が第ＩＩ相分析のためのバックグラウンド対照としてはたらく。所定のクラスターの抗原ペプチド（１種若しくは複数）が一旦同定されれば、それらを使用して、抗原特異的エフェクター集団を単離する。
【００８０】
第ＩＩＩ相モニタリングはペプチド特異的エフェクター細胞の同定および特徴付けよりなる。この手順において、２×１０６個のＰＢＭＣを融解し、そして、第ＩＩ相で単離された各抗原ペプチドを負荷した自己の成熟ＤＣとともに３７℃で７日間インキュベートする。細胞をその後洗浄しそして２４時間の再刺激にかける。再刺激後に、細胞をブレフェルジンＡ処理し、固定し、浸透化し、そして表面マーカーおよび細胞内サイトカイン発現双方を特徴づけるために一団の抗体で染色する。抗原特異的エフェクター集団の同定は、９色分析および分取が可能なＦＡＣＳａｒｉａフローサイトメーター／ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用する多色サイトメトリー分析により達成される。刺激されたＴ細胞のＣＴＬ機能を、ペプチドを負荷され、ＥＢＶで形質転換された自己Ｂ−ＬＣＬを標的として使用するＣｒ５１遊離アッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する。同定後、抗原特異的エフェクター細胞集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−６の存在下で自己の成熟した抗原ペプチドを負荷したＤＣと７日間共培養すること、次いでＩＬ−２およびＩＬ−７の存在下でのペプチドを負荷した成熟ＤＣでの毎週の再刺激により、サブクローニングする。クローンのエフェクター細胞集団が一旦確立されれば、遺伝子発現パターンおよび細胞傷害性機能の広範囲の特徴付けに着手する。
【実施例８】
【００８１】
本発明の方法は癌におけるワクチンエピトープの選択を可能にする。この技術を使用する特定の腫瘍関連エピトープに対するタイプ１、タイプ２若しくは抑制性Ｔのいずれかの反応性の検出および特徴付けは、ワクチン接種に使用される場合に所望の型の免疫応答を導き出す、腫瘍関連タンパク質に対する抗原エピトープの同定および特徴付けのためのツールとしてはたらき得る。
【００８２】
ワクチンエピトープを選択するため、患者のＰＢＭＣを、腫瘍関連タンパク質からの抗原エピトープを表す一連のペプチドライブラリーに曝露する。４８時間培養後に上清を収集し、そして分泌されたサイトカインを本明細書の教示に従って分析する。タイプ１ Ｔ細胞応答、例えばＩＦＮ−γの産生を誘導するがしかしＩＬ−１０（抑制性Ｔ応答）若しくはタイプ２サイトカインの産生を誘導しないペプチドのクラスターを同定する。次の段階で、所定の患者のＨＬＡタイプに対応するペプチドをさらに選択し得、そしてこの特定の患者のワクチン接種に使用し得る。従って、患者において所望の型の免疫応答を生じさせるよう調整されたワクチン接種のための剤を、本発明を用いて決定し得る。
【実施例９】
【００８３】
本発明の方法は感染性疾患におけるワクチンエピトープの選択を可能にする。微生物病原体に対する現在利用可能なワクチンの多くは保護免疫を賦与しないことが既知である（例えばデングウイルスワクチン）。保護免疫の欠如は不適切な免疫応答の誘導による可能性があり、例えば、現在のワクチンエピトープのいくつかは、タイプ１ Ｔ細胞よりむしろタイプ２若しくは抑制性Ｔ細胞を誘導することができ、従って免疫応答を非保護的応答にゆがませかつ／若しくは阻害する。本実施例にて、本発明の技術は、ワクチン接種に使用される場合に所望の型の免疫応答を導き出す微生物関連抗原の抗原エピトープの同定および特徴付けのためのツールとしてはたらき得る。
【００８４】
ワクチンエピトープを選択するため、患者のＰＢＭＣを、微生物、例えばデングウイルスからの抗原エピトープを表す一連のペプチドライブラリーに曝露する。４８時間培養後に上清を収集し、そして分泌されたサイトカインを本発明の教示に従って分析する。タイプ１ Ｔ細胞応答、例えばＩＦＮ−γの産生を誘導するがしかしＩＬ−１０（抑制性Ｔ応答）若しくはタイプ２サイトカインの産生を誘導しないペプチドのクラスターを同定する。次の段階で、ペプチドをさらに選択しかつワクチン接種に使用する。従って、本発明の方法は、ワクチン接種に際して保護的微生物免疫の誘導を可能にするエピトープの選択を見込む。
【００８５】
図１は、本発明により評価される正常ドナーの免疫応答を描くグラフであり、ここで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨＬＡ−Ａ０２０１＋健康志願者から新たに採取した血液から単離し、２×１０５細胞／ウェルで丸底９６ウェルプレートに三重で接種し、そして１μｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドＦｌｕ−ＭＰ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）若しくはＭＡＧＥ−３２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）、またはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のいずれかとともにインキュベートし；そして培養上清を４８時間後に収集し、そしてＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。結果は、正常ドナーからの新鮮ＰＢＭＣがＦｌｕ−ＭＰペプチドに応答しかつ多数のサイトカインを産生したことを示す。
【００８６】
図２は、本発明による正常ドナー中でのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドＦｌｕ−ＭＰ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）に対する免疫応答の別の例を描くグラフである。ＰＢＭＣを、別のＨＬＡ−Ａ０２０１＋健康志願者から新たに採取した血液から単離し、５×１０５細胞／ウェルで丸底９６ウェルプレートに三重で接種し、そして１０μｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドＦｌｕ−ＭＰ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）若しくはＭＡＲＴ−１２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、またはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のいずれかとともにインキュベートし；そして培養上清を４８時間後に収集し、そしてＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。結果は、正常ドナーからの新鮮ＰＢＭＣがＦｌｕ−ＭＰペプチドに応答しかつＩＬ−１αおよびＩＰ−１０を産生することを示す。該サイトカイン／ケモカイン産生プロファイルは２名の異なる正常ドナー間で異なり、同一のＦｌｕ−ＭＰペプチドを認識する異なる型のＣＤ８＋ Ｔ細胞がＥＰＩＭＡＸアッセイで同定され得ることを示唆する。
【００８７】
図３Ａ−３Ｄは、本発明により評価されるところの２例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。それぞれ患者１および２についての図３Ａおよび３Ｃにおいて、ＤＣワクチン（黒色腫関連抗原の４種のＨＬＡ−Ａ２ペプチドを負荷した、自己のＣＤ３４＋造血前駆細胞由来ＤＣ）の最低８注入を受領した２例の黒色腫患者からの液体窒素中の融解した低温保存ＰＢＭＣを、丸底９６ウェルプレートに三重で接種し、そして１０μｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドすなわちＦｌｕ−ＭＰ５８−６６、ＣＭＶ ＰＰ６５（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）、ＭＡＧＥ−３２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）、ＭＡＲＴ−１２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）、ｇｐ１００ｇ２０９−２Ｍ（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ）、チロシナーゼ３６８−３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）、若しくはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のそれぞれとともにインキュベートし；そして培養上清を４８時間後に収集しそしてＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。それぞれ患者１および２についての図３Ｂおよび３Ｄにおいて、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の検出のためＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施し、ここで、ＰＢＭＣ（２×１０５細胞／ウェル）を、１０μｇ／ｍｌのペプチドの存在若しくは非存在下に１０μｇ／ｍｌの一次抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体で前被覆したプレートに添加した。該結果は、ＰＢＭＣ中のペプチド反応性細胞の広範なレパートリーが本発明の方法により同定されたことを示す。
【００８８】
図４Ａ−４Ｃは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。図４Ａについて、ＤＣワクチンを受領したＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｐｏｓ黒色腫患者からＰＢＭＣを得、そしてＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のドミナントなＭＡＲＴ−１ペプチド（ＭＡＲＴ−１２６−３５）を負荷した自己ＤＣで刺激した。患者は、四量体結合アッセイで、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のドミナントなエピトープ（ＭＡＲＴ−１２６−３５）を認識するＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有することが示された（図４Ａ）。ＰＢＭＣをこのＨＬＡ−Ａ＊０２０１のドミナントなＭＡＲＴ−１ペプチドと直接培養した場合、２種のサイトカインＩＬ−１αおよびＩＰ−１０が特異的に誘導されたが、しかしＩＦＮ−γのアップレギュレーションは示されなかった（図４Ｂ）。ＩＰ−１０がタイプＩ若しくはタイプＩＩのインターフェロンに応答して多くの細胞型により分泌されることを考え、われわれは、ＩＰ−１０がＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮ−γに応答して産生されたと推測した。従って、ＩＰ−１０産生は、ＩＦＮγＲブロッキングｍＡｂを使用してＩＦＮ−γの機能を阻害することにより完全に無効にされた（図４Ｃ）。該結果は、ペプチドを負荷したＣＤ３４−ＤＣでワクチン接種した黒色腫患者におけるＭＡＲＴ−１ペプチドに応答してのＩＰ−１０の誘導がＩＦＮ−γに依存することを示す。
【００８９】
図５は、本発明により評価した正常ドナーの免疫応答のキネティクスを描くグラフである。ＨＬＡ−Ａ０２０１＋ドナーからの２×１０５新鮮ＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドＦｌｕ−ＭＰ５８−６６若しくはＭａｇｅ３２７１−２７９または希釈剤で、指定された時間、三重で刺激した。培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定した。三重のデータからの平均±ＳＤを示す。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸアッセイでのＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のペプチド特異的産生が、４８時間のペプチド刺激でプラトーに達したことを示す。
【００９０】
図６は本発明のエピトープフォーカシングのスキームを描く。最初に、抗原タンパク質をコードする１５−ｍｅｒのオーバーラップペプチドのライブラリーを、ペプチドのクラスター（５〜１０種のペプチド／クラスター）に二重で分割する。５×１０５のＰＢＭＣを、ペプチドの各クラスターで最初に刺激する（クラスター分析）。培養上清の複数のサイトカインを多重ビーズに基づくサイトカインアッセイで測定し、そして「ヒット」クラスターを決定した。第二の培養物中、すなわちエピトープフォーカシングで、ＰＢＭＣを「ヒット」クラスターからの個別のペプチドとともに４８時間培養し、そしてその後抗原ペプチドを多サイトカイン分析で測定した。
【００９１】
図７は、特異的Ｔ細胞により認識されるエピトープの同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。ＰＢＭＣはＤＣワクチンを受領した黒色腫患者から得た。この患者はＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｐｏｓであり、そして四量体結合アッセイで、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のドミナントなエピトープ（ＭＡＲＴ−１２６−３５）を認識するＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有することが示された（図４Ａ）。４〜６種のクラスター形成したペプチド（ペプチドあたり１０μＭ）若しくは単一ペプチド（１０μＭ）のいずれかとしてＭＡＲＴ−１の全アミノ酸配列を包括する、４アミノ酸のオフセットを伴う１５−ｍｅｒのオーバーラップペプチドを、９６ウェルプレートに三重で接種し；そして、２００μｌのＣＭ中の２×１０５細胞のＰＢＭＣを各ウェルに添加し、そして加湿５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で４８時間インキュベートし；そして培養上清中のサイトカイン若しくはケモカイン濃度をＬｕｍｉｎｅｘで測定した。図７に示されるとおり、ＭＡＲＴ−１の＃６ペプチドは、ワクチン接種した黒色腫患者から得たＰＢＭＣでのＩＰ−１０の強い産生を誘導する。ＭＡＲＴ−１ペプチド＃６は、図４Ａに描かれるところの１０−ｍｅｒのＨＬＡ−Ａ２のドミナントなエピトープを含有する。従って、本発明の方法は、ペプチド特異的Ｔ細胞応答の同定を可能にする。
【００９２】
図８は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。ＰＢＭＣはＤＣワクチンを受領した黒色腫患者から得た。この患者はＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｐｏｓであり、そして、四量体結合アッセイで、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性のドミナントなエピトープ（ＭＡＲＴ−１２６−３５）を認識するＭＡＲＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を有することが示された（図４Ａ）。ＰＢＭＣを、ブロッキングＩＦＮ γＲ ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）若しくは対照ｍＡｂの存在下で、Ａ２−ＭＡＲＴ−１ペプチド若しくは１５−ｍｅｒのＭＡＲＴ−１ペプチド＃６で４８時間刺激した。Ａ２−ＨＩＶｐｏｌペプチドおよび１５−ｍｅｒのＭＡＲＴ−１ペプチド＃１５を対照ペプチドとして使用した。培養上清中のＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度を示す。この結果は、ＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の双方の産生が、ペプチド特異的Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生に依存することを示し、ＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０がタイプ１ Ｔ細胞応答、すなわちＴｈ１およびＴｃ１細胞の代理マーカーであることを示す。
【００９３】
図９は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、黒色腫抗原をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドのいずれかで４８時間刺激した。４８時間培養物での培養上清中のサイトカイン／ケモカインの濃度をＬｕｍｉｎｅｘで測定した。この結果は、エピトープフォーカシングの概念を、本発明の方法においていかなる抗原およびいかなるサイトカインにも応用し得ることを示す。
【００９４】
図１０は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。一連のＤＣワクチン接種を受領した黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、黒色腫分化抗原ＭＡＲＴ−１をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドのいずれかで刺激した。培養４８時間での培養上清中のＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度を示す。クラスター分析（上）で、クラスター＃２および＃３はＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のアップレギュレーションを誘導した。エピトープフォーカシング（下）で、クラスター＃２からのペプチド＃６およびクラスター＃３からのペプチド＃１３が、特異的Ｔ細胞のエピトープとして同定された。この結果は、本発明の方法が、ＩＦＮ−γを作成することが可能な特異的Ｔ細胞のエピトープを同定することを可能にすることを示す。
【００９５】
図１１は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。ＰＢＭＣは、白血球分離（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）を用いて図１０と同一の患者から得、クライオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）中のアリコートを作成し、そして使用まで液体窒素中に保管した。融解したＰＢＭＣを、ＭＡＲＴ−１の１５−ｍｅｒペプチド＃６、ペプチド＃１３若しくは希釈剤で刺激した。この実験を別個に３回反復した。培養４８時間での培養上清中のＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度を示す。３回の実験のうち３回が、ペプチド＃６若しくはペプチド＃１３での刺激に際してのＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のアップレギュレーションを示し、このＥＰＩＭＡＸアッセイの高再現性を示す。
【００９６】
図１２Ａは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者（図１０と同一）からＤＣワクチン接種前および８回のＤＣワクチン接種後に得たＰＢＭＣを、単一の１５−ｍｅｒのＭＡＲＴ−１ペプチド若しくは希釈剤で刺激した。培養４８時間での培養上清中のＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度を示す。後ＰＢＭＣは、同定された２種の１５−ｍｅｒペプチドすなわちペプチド＃６および＃１３に応答してのＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のアップレギュレーションを示した一方、前ＰＢＭＣはペプチド＃１３に応答してのＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のアップレギュレーションに失敗した。ペプチド＃６に応答しての前ＰＢＭＣからのＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０産生は後ＰＢＭＣからのものより少なかった。これらの結果は、ＤＣワクチン接種がペプチド＃１３特異的Ｔ細胞応答を誘導しかつペプチド＃６特異的Ｔ細胞応答を高めたことを示唆する。この仮説を検査するため、われわれは異なる十分に確立された方法論、細胞内サイトカイン検出アッセイを使用した。同一のＰＢＭＣを、抗ＤＣ２８／ＣＤ４９ｄ ｍＡｂおよびモネンシンの存在下で、ＭＡＲＴ−１の１５−ｍｅｒの単一ペプチドで８時間刺激した。細胞膜の浸透化後に、細胞を抗ＩＦＮ−γ ｍＡｂで染色し、そしてＩＦＮ−γ＋集団をフローサイトメーターで分析した（図１２Ｂ）。約０．１５％のＣＤ８＋ Ｔ細胞が、後ＰＢＭＣ中でペプチド＃６若しくは＃１３いずれかに応答してＩＦＮ−ｇを産生した一方、ＩＦＮ−ｇ産生は前ＰＢＭＣで検出されなかった。これらの結果は、癌患者において抗原特異的Ｔ細胞応答をモニターするのにＥＰＩＭＡＸを使用し得ることを示し、また、各特異的Ｔ細胞応答の大きさが、ＥＰＩＭＡＸでのサイトカイン／ケモカイン調節の大きさを見ることにより予測可能であることを示唆する。
【００９７】
図１３は本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。ＣＦＳＥ（５，６−カルボキシフルオレセイン二酢酸塩スクシンイミジルエステル）は、フローサイトメーターを用いて細胞分裂の数を同定することを可能にするトレーサー色素である。ＥＰＩＭＡＸは非破壊的アッセイであるため、われわれは、抗原特異的Ｔ細胞の増殖能力を測定するため、ＥＰＩＭＡＸおよびＣＦＳＥ技術と組み合わせた。ＣＦＳＥ染色はＥＰＩＭＡＸでのサイトカイン産生を変えないことが確認された。同一の黒色腫患者（図１０と同一）から得たＰＢＭＣを最初に１μＭのＣＦＳＥで染色し、そしてＭＡＲＴ−１をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドのいずれかで刺激した。培養第８日に、細胞をＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ４−ＡＰＣで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのＴ細胞増殖を分析した。該図はＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の分析を示す。ＭＡＲＴ−１クラスター＃２および＃３、ならびにペプチド＃６および＃１３は、いくつかのＣＤ８＋ Ｔ細胞集団においてＣＦＳＥ強度の希釈を誘導し、ペプチド刺激が抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を誘導したことを示す。この結果は、他の方法論との組合せが、抗原特異的Ｔ細胞のより表現型的および／若しくは機能的特徴付けを得ることを可能にすることを示す。
【００９８】
図１４は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。同一の黒色腫患者（図１０と同一）から得たＰＢＭＣを、最初に１μＭのＣＦＳＥで染色し、そしてＭＡＲＴ−１をコードする個々のペプチドで三重で刺激した。培養第８日に、細胞をＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ４−ＡＰＣで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのＴ細胞増殖を分析した。該図は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内のＣＦＳＥが希釈されたＣＤ８＋ Ｔ細胞集団の％を示す。ＭＡＲＴ−１ペプチド＃６および＃１３は、いくつかのＣＤ８＋ Ｔ細胞集団においてＣＦＳＥ強度の希釈を誘導し、ペプチド刺激が抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を誘導したことを示す。
【００９９】
図１５は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、抗原提示細胞上で発現されるＭＨＣクラスＩ分子の情況で８〜１０ｍｅｒのペプチドを認識する。同定されたＣＤ８＋Ｔ細胞の正確なエピトープを決定するため、オーバーラップする１０ｍｅｒのペプチドを、１５ｍｅｒのＭＡＲＴ−１ペプチド＃１３内で遅れる（ｌａｇｇｉｎｇ）１アミノ酸を伴い生成し、そして同一患者のＰＢＭＣを刺激するのに使用した。４８時間での培養上清中のＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度、ならびに培養第８日のＣＦＳＥ希釈アッセイを示す。これらの結果は、ＭＡＲＴ−１５４−６２が、ＩＦＮ−γの産生および特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を可能にするＣＤ８＋ Ｔ細胞のエピトープであることを示す。従って、ＥＰＩＭＡＸはＣＤ８＋ Ｔ細胞の正確なエピトープを同定することを可能にする。
【０１００】
図１６Ａ−Ｄは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、黒色腫細胞の大部分で広範に発現されている癌精巣抗原ＮＹ−ＥＳＯ１をコードするオーバーラップペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドのいずれかで刺激した。クラスター＃５内のＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド＃２４は４８時間にＩＰ−１０のアップレギュレーションを誘導した（図１６Ａ）。これらの結果は、ＮＹ−ＥＳＯ１９３−１０７が特異的Ｔ細胞によりエピトープとして認識されることを示す。どのＴ細胞サブセットがこのエピトープを認識するかを検査するため、該患者のＰＢＭＣを、抗ＭＨＣクラスＩブロッキングｍＡｂ（Ｗ６／３２）若しくはアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下に、ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド＃２４で刺激した。図１６Ｂに示されるとおり、ペプチド＃２４に応答してのＩＰ−１０産生はＷ６／３２により完全に無効にされ、ＩＰ−１０の産生がＭＨＣクラスＩ分子に依存していること、従ってＣＤ８＋  Ｔ細胞がペプチド＃２４を認識することを示す。
【０１０１】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞の正確なエピトープを同定するため、ペプチド＃２４内の９ｍｅｒのオーバーラップペプチドを生成し、そして患者のＰＢＭＣを刺激するのに使用した。図１６Ｃに示されるとおり、ＮＹ−ＥＳＯ１９４−１０２はＩＰ−１０の強いアップレギュレーションを誘導し、これがＣＤ８＋ Ｔ細胞のエピトープであることを示す。ＨＬＡ拘束要素を同定するため、ＰＢＭＣを、ＩＬ−２（１０ＩＵ／ｍｌ）の存在下に、ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド＃２４でパルスした自己単球由来ＤＣで刺激した。培養第９日に、細胞を、ＮＹ−ＥＳＯ１９４−１０２ペプチドでパルスしたか若しくはパルスしていない各ＨＬＡをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした、ＭＨＣクラスＩ分子を欠くＬＣＬで再刺激した。８時間の刺激の間のＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。図１６Ｄに示されるとおり、ＮＹ−ＥＳＯ１９４−１０２ペプチドでパルスしたＨＬＡ−Ｂ＊３５０１トランスフェクタントはＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘導し、この新規ペプチドがＨＬＡ−Ｂ＊３５０１分子により提示されることを示す。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸが、ＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ患者においてＣＤ８＋ Ｔ細胞の新規エピトープを同定することを可能にすることを示し、そして、他の方法論との組合せが、われわれがそれらのＨＬＡ拘束要素を同定することを可能にする。
【０１０２】
図１７は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者（図１０と同一）から得たＰＢＭＣを、ＭＡＲＴ−１の１５−ｍｅｒペプチド＃６および＃１３内の１０ｍｅｒのオーバーラップペプチドで４８時間刺激した。図１７は、４８時間での培養上清中のＩＰ−１０の濃度を示す。ＭＡＲＴ−１２６−３５（既知エピトープ）およびＭＡＲＴ−１５３−６２（新規エピトープ）がエピトープである。
【０１０３】
図１８は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。２例のＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、ＭＡＲＴ−１の１５−ｍｅｒペプチド＃６内の１０ｍｅｒのオーバーラップペプチドで４８時間刺激した。４８時間での培養上清中のＩＰ−１０の濃度を示す。ＭＡＲＴ−１２６−３５（既知エピトープ）は双方の患者についてエピトープである。このエピトープはＨＬＡ−Ａ２に拘束されるとして既知である。これらの患者はＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇであり、かつ、ＨＬＡクラスＩのサブタイプはこれら２例の患者間で完全に異なるため、このエピトープは最低３種の異なるＭＨＣクラスＩ分子により提示される。これは、ＥＰＩＭＡＸを用いるＣＤ８＋ Ｔ細胞のエピトープの同定の別の例である。
【０１０４】
図１９は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者（図１０と同一）から得たＰＢＭＣを、＃６から＃１５までの個別のＭＡＲＴ−１の１５−ｍｅｒペプチドで三重で４８時間刺激した。４８時間での培養上清中のＩＬ−２の濃度を示す。ＭＡＲＴ−１ペプチド＃１０および＃１１はＩＬ−２のアップレギュレーションを誘導した。この結果は、ＥＰＩＭＡＸでのエピトープ同定の別の例を示す。
【０１０５】
図２０は、図１９に示されるところの同定された１５−ｍｅｒペプチドでの刺激に際してのＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２産生を描く。同一患者のＰＢＭＣを、抗ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ ｍＡｂおよびモネンシンの存在下にＭＡＲＴ−１の１５−ｍｅｒペプチド＃１０で８時間刺激した。ＩＬ−２の産生を、特異的ｍＡｂで染色することにより分析した。該図は、ＭＡＲＴ−１ペプチド＃１０に応答してＩＬ−２を産生するＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を示す。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸがＣＤ４＋ Ｔ細胞のエピトープもまた同定し得ることを示す。
【０１０６】
図２１Ａ−Ｂは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。同一の黒色腫患者（図１９と同一）から得たＰＢＭＣを、最初に１μＭのＣＦＳＥで染色し、そしてＭＡＲＴ−１をコードする個別のペプチドで三重で刺激した。培養第８日に、細胞をＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ４−ＡＰＣで染色し、そしてペプチド刺激に応答してのＴ細胞増殖を分析した。図２１Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＣＦＳＥが希釈されたＣＤ４＋ Ｔ細胞集団の％を示す。ＭＡＲＴ−１ペプチド＃１０および＃１１は、ペプチドなしより多いＣＦＳＥが希釈されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を誘導し、これらのペプチドが抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を誘導したことを示す。図２１Ｂは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内の各ＭＡＲＴ−１の１５−ｍｅｒペプチドに応答してのＣＦＳＥが希釈されたＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を描く。ＭＡＲＴ−１ペプチド＃１０および＃１１は、他の１５−ｍｅｒペプチドよりもＣＤ４＋ Ｔ細胞の有意により多い増殖を誘導した。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸがＣＤ４＋Ｔ細胞のエピトープの同定を可能にし、そしてＣＦＳＥ技術と組み合わせることにより特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖能力を決定することを可能にすることを強く示す。
【０１０７】
図２２Ａ−Ｃは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。ＣＤワクチン接種を受領したＨＬＡ−Ａ２ｎｅｇ黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、最初に１μＭのＣＦＳＥで染色し、そしてＮＹ−ＥＳＯ１をコードするペプチドのクラスターで刺激した。培養第８日に、細胞を、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰおよびＣＤ４−ＡＰＣで染色し、そしてペプチド刺激に応答しての分析されたＴ細胞増殖を、フローサイトメーターを用いてＣＦＳＥ希釈に基づき分析した。図２２Ａは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団内のＣＦＳＥが希釈されたＣＤ４＋ Ｔ細胞のパーセント（％）を示す。ＮＹ−ＥＳＯ１クラスター＃８は他のクラスターよりも多くのＣＦＳＥが希釈されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団を誘導し、これらのペプチドが抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を誘導したことを示す。図２２Ｂは、培養４８時間での培養上清中のＩＬ−２濃度を描く。ＩＬ−２はＮＹ−ＥＳＯ１のクラスター＃８を含む培養物で産生された。ＣＤ４＋ Ｔ細胞のエピトープを同定するため、ＣＦＳＥで染色したＰＢＭＣを、ＮＹ−ＥＳＯ１クラスター＃８内の個別のペプチドで刺激した。増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞を、フローサイトメーターを用いてＣＦＳＥ希釈に基づき第８日に分析した。図２２Ｃに示されるとおり、ＮＹ−ＥＳＯ１１４９−１６７およびＮＹ−ＥＳＯ１１６５−１８０はＣＤ４＋Ｔ細胞のより多い増殖を誘導し、これらがエピトープであることを示す。この結果は、黒色腫抗原中のＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープの同定の別の例を示す。
【０１０８】
図２３は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。黒色腫患者（図１０と同一）から得たＰＢＭＣを、＃６から＃１５までの個別のＭＡＲＴ−１ １５−ｍｅｒペプチドで三重で４８時間刺激した。４８時間での培養上清中のＩＬ−５の濃度を示す。ＭＡＲＴ−１ペプチド＃１０および＃１１はＩＬ−５のアップレギュレーションを誘導した。この結果は、ＥＰＩＭＡＸでのエピトープ同定の別の例を示す。
【０１０９】
図２４は、図２３に示されるところの同定された１５−ｍｅｒペプチドでの刺激に際してのＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−５産生を描く。同一患者のＰＢＭＣを、抗ＣＤ２８／ＣＤ４９ｂ ｍＡｂおよびモネンシンの存在下でＭＡＲＴ−１ １５−ｍｅｒペプチド＃１１で８時間刺激した。ＩＬ−５の産生を、特異的ｍＡｂで染色することにより分析した。該図は、ＭＡＲＴ−１ペプチド＃１１に応答してＩＬ−５を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞集団を示す。この結果は、ＥＰＩＭＡＸがエピトープならびに特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞により産生されるサイトカインの型を同定し得ることを示す。
【０１１０】
図２５は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。２例の黒色腫患者から得たＣＦＳＥ染色したＰＢＭＣを、ＴＲＰ−１クラスター＃２５若しくはｇｐ１００クラスター＃１５いずれかからの個別の１５−ｍｅｒペプチドで刺激した。培養上清中のサイトカインを４８時間に測定し、そして、Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ希釈アッセイに基づき培養第８日に分析した。該結果は、ＴＲＰ−１ペプチド＃１２４およびｇｐ１００ペプチド＃１５２がＣＤ４＋Ｔ細胞のエピトープであり、それらの双方がＣＤ４＋ Ｔ細胞の新規エピトープであることを示す。ペプチド刺激は、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＰ−１０（ＩＦＮ−γ）のような多様なエフェクターサイトカインの産生、ならびに特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を誘導した。これらの結果は、黒色腫抗原中のＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの同定の別の例を示し、また、ＥＰＩＭＡＸを使用して多様な型のＴ細胞応答を同定し得ることを示唆する。
【０１１１】
図２６は、本発明により評価されるところの３例の黒色腫患者の免疫応答を描く。ＥＰＩＭＡＸは、タイプ１（Ｔｈ１およびＴｃ１）、タイプ２（Ｔｈ２およびＴｃ２）細胞のような異なるＴ細胞サブセットを同定することを可能にする。転移性黒色腫を伴う患者から得たＰＢＭＣを、新たに同定された黒色腫ペプチド（１５−ｍｅｒ）で４８時間刺激し、そして培養上清中のサイトカインを多重ビーズに基づくアッセイで測定した。色を付けた行は示されたペプチドでのサイトカインの濃度を表し（下）、また、白色の行は希釈剤での濃度を表す。３種の異なるＴ細胞サブセットすなわちタイプ１、２およびタイプＩＬ−１０の代表的なサイトカイン産生を示す。タイプ１応答はＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のアップレギュレーションにより同定される一方、タイプ２応答は、ＩＰ−１０のアップレギュレーションを伴わない、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３のようなタイプ２サイトカインのアップレギュレーションにより同定される。ＥＰＩＭＡＸを使用して、ＩＬ−１０のアップレギュレーションを特徴とする新規Ｔ細胞応答（タイプＩＬ−１０）を同定した。
【０１１２】
図２７は、ＥＰＩＭＡＸ方法論で同定される４種の黒色腫抗原すなわちｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ１およびＴＲＰ−１内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の新たなエピトープの要約を描く。これらの新たなエピトープは、１３例の黒色腫患者のＰＢＭＣをＥＰＩＭＡＸでスクリーニングすることにより同定された。
【０１１３】
表１は、ＥＰＩＭＡＸを用いて同定したＣＤ８＋ Ｔ細胞のエピトープの要約を描く。同定された１５−ｍｅｒペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す。数種の１５−ｍｅｒペプチドは、９−ｍｅｒ若しくは１０−ｍｅｒいずれかのオーバーラップペプチドでフォーカシングされ、そして表中に示される。
【０１１４】
【表１】
2011250787.tif 000002
【０１１５】
表２は、ＥＰＩＭＡＸで同定されたＴｈ０、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞のエピトープの要約を描く。同定された１５−ｍｅｒペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す。
【０１１６】
【表２】
2011250787.tif 000003
【０１１７】
表３は、ＥＰＩＭＡＸで同定されたタイプＩＬ−１０のＣＤ４＋ Ｔ細胞のエピトープの要約を描く。同定された１５−ｍｅｒペプチドおよびそれらのアミノ酸配列番号を示す
。
【０１１８】
【表３】
2011250787.tif 000004
【０１１９】
図２８は、本発明により評価されるところの３例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ＮＹ−ＥＳＯ１およびＴＲＰ−１のオーバーラップペプチドでの、転移性黒色腫を伴う患者（１３例の患者）から得たＰＢＭＣのＥＰＩＭＡＸ分析は、タイプ１応答を誘導する１６種のペプチド、タイプ０／２応答を誘導する１５種のペプチド、およびタイプＩＬ−１０を誘導する９種のペプチドを生じた。サイトカインは培養第２日に測定した。各Ｔ細胞サブセットでのＩＬ−１αおよびＩＰ−１０の濃度をそれぞれ示す。各点は、同定された単一ペプチドで刺激したこれらの患者のＰＢＭＣ培養物からのそれぞれ別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。この結果は、ＩＬ−１αおよびＩＰ−１０がタイプ１応答で完全に相関することを明確に示す。
【０１２０】
図２９Ａ−Ｄは、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、ＮＹ−ＥＳＯ１をコードするペプチドのクラスター若しくは個々のペプチドで刺激した。培養４８時間での培養上清中のＩＬ−１０濃度を示す（図２９Ａ）。ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド＃３９および＃４０はエピトープである。ＩＬ−１０産生の起源を探求するため、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ ｍＡｂおよびモネンシンの存在下でペプチド＃３９で８時間刺激し、そしてＩＬ−１０特異的ｍＡｂで染色した。図２９Ｂに示されるとおり、約０．１１％のＣＤ４＋ Ｔ細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド＃３９に応答してＩＬ−１０を産生した。この結果は、ＥＰＩＭＡＸが黒色腫患者においてＩＬ−１０を産生する黒色腫抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を可能にすることを示す。次に、このＩＬ−１０産生Ｔ細胞が調節特性を有したかどうか評価するため、ペプチド＃３９若しくは無関係な１５−ｍｅｒペプチドで刺激したＰＢＭＣをトランスウェル中で「第三者」ＭＬＲに添加して、可溶性媒介物質の放出によるＴ細胞増殖の抑制を試験した。ＭＬＲは、ペプチド特異的Ｔ細胞応答の影響を回避するため、ＣＦＳＥ標識したＣＤ４＋Ｔ細胞および同種異系の成熟ＤＣ（双方とも健康志願者から）を使用した。ＮＹ−ＥＳＯ１ペプチド＃３９で刺激したがしかし対照ペプチドでしなかった患者のＰＢＭＣは、ＭＬＲでの増殖を有意に抑制した（図２９Ｃ、２９Ｄ）。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸのアプローチが腫瘍抗原特異的抑制性Ｔ細胞を同定し得ることを示す。
【０１２１】
図３０は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。図２９Ａ−Ｄでと同一の黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、２つの異なる時間点、すなわちＤＣワクチン接種前および８回のワクチン接種後に、ＮＹ−ＥＳＯ１をコードする個別のペプチドで刺激した。培養４８時間での培養上清中のサイトカイン／ケモカインの濃度を示す。この結果は、タイプＩＬ−１０のシグネチャがワクチン後に消失したことを示し、ＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能がワクチン後に喪失されたことを示唆する。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸアッセイを用いる、ＤＣワクチンによるＴ細胞応答の調節の別の例を示す。
【０１２２】
図３１は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。われわれは、タイプＩＬ−１０応答を誘導する黒色腫抗原中の９種の異なるエピトープを７例の黒色腫患者で同定した。黒色腫を伴う患者から得たＰＢＭＣを、各患者に特異的な同定された１５−ｍｅｒペプチドとともに４８時間インキュベートした。該図は、同定されたタイプＩＬ−１０ペプチドとのインキュベーションによる自発的ＩＰ−１０産生の阻害を示す。これは、ＥＰＩＭＡＸで同定されたＩＬ−１０産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の抑制機能の別の立証である。
【０１２３】
図３２は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。同定されたＩＬ−１０を誘導する１５−ｍｅｒペプチドを含む各ＰＢＭＣ培養物中のＩＬ−１βおよびＩＰ−１０濃度を示す。各点は、同定された独特の単一の１５−ｍｅｒペプチドを含むＰＢＭＣ培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。この結果は、ＩＬ−１βおよびＩＰ−１０が同定されたタイプＩＬ−１０応答で相関し、従って双方のサイトカインがＥＰＩＭＡＸでタイプＩＬ−１０細胞を同定するための良好なマーカーであり得ることを示す。
【０１２４】
図３３は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。３名の正常健康志願者から得た新鮮ＰＢＭＣを３バッチに分割した。各バッチからのＰＢＭＣを、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質（Ｆｌｕ−ＭＰ）をコードする１５−ｍｅｒのオーバーラップペプチドのクラスターで二重で刺激し（２×１０５細胞／ウェル、ペプチドあたり１０μＭ）、従って六重のサンプルを創製した。培養４８時間でのＩＰ−１０の濃度を示す。黒棒および陰は、ペプチドを伴わない培養物中のＩＰ−１０の平均±３ＳＤ値を表す。ＩＰ−１０の濃度が、このバックグラウンドの平均＋３ＳＤの上で測定されたことは、ペプチドクラスターに応答してのＩＰ−１０の陽性の誘導である。正常ドナー＃１において、１２種のペプチドクラスターのうち９種が六重のサンプルのうち４以上で陽性を記録し、このドナーがＦｌｕ−ＭＰに特異的なＴ細胞の非常に広範なレパートリーを有したことを示した。対照的に、正常ドナー＃３では、どのクラスターもＩＰ−１０のアップレギュレーションを誘導しなかった。ＥＰＩＭＡＸは所定の抗原タンパク質に対するＴ細胞応答の完全な幅の同定を可能にする。さらに、この研究はＥＰＩＭＡＸが高度に再現可能なアッセイであることを示す。
【０１２５】
図３４は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図３３に示される同一の試験でのＩＬ−６およびＩＰ−１０の濃度を示した。際立って、正常ドナー＃３において、いかなるヒットもＩＰ−１０産生で同定されなかったが、しかし、ペプチドの多くのクラスターがＩＬ−６産生で陽性を記録した。この結果は、サイトカインの多様な組の測定がＥＰＩＭＡＸにおいてＴ細胞の多様なサブセットを同定し得ることを示す一例を示す。
【０１２６】
図３５は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図３３に示される試験でのＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度を示した。各点は、ペプチドクラスターを含むＰＢＭＣ培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。全部のドナーにおいて、ＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度はＥＰＩＭＡＸで非常に良好に相関し、これら２種のマーカーがタイプ１応答で完全に相関することを確認する。
【０１２７】
図３６は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー＃１から得た凍結ＰＢＭＣを融解し、そしてＦｌｕ−ＭＰをコードする１５−ｍｅｒペプチドのクラスター若しくは単一ペプチドのいずれかで刺激した。ＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度を示す。各点は、ペプチドクラスター若しくは単一ペプチドを含むＰＢＭＣ培養物中の各別個のウェル中のサイトカイン濃度を表す。凍結ＰＢＭＣででさえ、ＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度は非常に良好に相関し（Ｐ＜０．０００１、ｒ＝０．９１２１）、これら２種のマーカーが、ＰＢＭＣがどんなに新鮮若しくは凍結で得られようと、ＥＰＩＭＡＸでタイプ１応答を同定するのに使用し得ることを示す。
【０１２８】
図３７は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー＃１から得た新鮮若しくは凍結ＰＢＭＣを、Ｆｌｕ−ＭＰをコードする１５−ｍｅｒペプチドのクラスターで刺激した。ＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０の濃度を示す。図３７に示されるとおり、クラスター＃６および＃１２双方が、新鮮および凍結ＰＢＭＣでのＩＬ−１ａおよびＩＰ−１０のアップレギュレーションを誘導した。この試験は、ＥＰＩＭＡＸで抗原特異的Ｔ細胞応答をモニターするのに凍結ＰＢＭＣを使用し得ることを示す。
【０１２９】
図３８Ａ、３８Ｂは、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ドナー＃１から得た凍結ＰＢＭＣを融解し、そしてＦｌｕ−ＭＰをコードするペプチドのクラスター若しくは個別のペプチドで六重で刺激した（２×１０５細胞／ウェル、ペプチドあたり１０μＭ）。培養４８時間でのＩＰ−１０の濃度を示す（図３７Ａ）。別の試験において、より多数のＰＢＭＣ（２×１０６細胞／ウェル）を、同一濃度の１５−ｍｅｒペプチドで三重で刺激した。図３７Ｂに示されるとおり、ペプチド＃５８および＃５９が双方の試験でＩＰ−１０産生のスイッチを入れた一方、サンプルと対照培養物の間の対比は、ウェルあたりより多くのＰＢＭＣをＥＰＩＭＡＸアッセイで使用した場合により大きい。従って、ウェルあたりより多数のＰＢＭＣが、ＥＰＩＭＡＸアッセイにおける変動性および感受性を低下させるのに役立つ。ＰＢＭＣ中の抗原特異的Ｔ細胞の低頻度（通常１０５ＰＢＭＣから１個）を考慮すれば、Ｔ細胞応答は、ペプチド刺激に細胞がほとんど応答しなかった場合はＥＰＩＭＡＸ（若しくは事実上いかなる種類のアッセイ）で（も）検出されないことがあることがもっともらしい。従って、正規のＥＰＩＭＡＸアッセイにおいて、われわれは５×１０５ＰＢＭＣ／ウェルを使用している。
【０１３０】
図３９Ａおよび３９Ｂは、ＥＰＩＭＡＸアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ＰＢＭＣを１×１０６細胞／ｍｌでＣＭに再懸濁し、そして１ｍｌの細胞懸濁液を培養管に入れ、そしてＦｌｕ−ＭＰライブラリーからの示された単一ペプチドで７日間刺激した。培養したＰＢＭＣを収集し、そしてモネンシンの存在下に示されたペプチドで５時間パルスしたＤＣで再刺激した。細胞質のサイトカインを、細胞浸透化後に特異的ｍＡｂで検査した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のサイトカイン産生細胞の割合を示した（図３９Ａ）。ドミナントなペプチドでの刺激は特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を誘導した。ドナーのＰＢＭＣを１ｍＭのＣＦＳＥで最初に染色した。ＰＢＭＣを１×１０６細胞／ｍｌでＣＭに再懸濁し、そして１ｍｌの細胞懸濁液を培養管に入れ、そしてＦｌｕ−ＭＰライブラリーからの示された単一ペプチドで６日間刺激した。刺激した細胞を抗ＣＤ３およびＣＤ４ ｍＡｂで染色し、そして増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ希釈に基づきフローサイトメーターを用いて分析した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団中のＣＦＳＥ細胞の割合を示した（図３９Ｂ）。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸが、機能的なＦｌｕ−ＭＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のエピトープの同定を可能にしたことの証明を示す。
【０１３１】
図４０は、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ＰＢＭＣを図３３中のドナー＃２から得た。凍結ＰＢＭＣを融解し、そしてＦｌｕ−ＭＰのクラスター＃１１若しくはクラスター＃１１内の単一の１５−ｍｅｒペプチドのいずれかで刺激した（５×１０５細胞／ウェル、ペプチドあたり２０μＭ）。培養４８時間でのサイトカインの濃度を示す。これらの結果は、ペプチド＃５２および＃５３がＦｌｕ−ＭＰ特異的Ｔ細胞のエピトープであることを示し、特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の新規エピトープの同定の別の例を示す。
【０１３２】
図４１Ａ、４１Ｂは、ＥＰＩＭＡＸアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。図４０の試験で使用したＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、そしてＦｌｕ−Ｍｐクラスター＃１１内の単一ペプチドで刺激した。ＣＦＳＥが希釈されたＣＤ４＋Ｔ細胞を培養第８日に分析した（図４１Ａ）。別の試験において、ＣＦＳＥが希釈されたＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を、培養第６、７、８、および１０日に分析した（図４１Ｂ）。これらの試験は、ＥＰＩＭＡＸを用いて同定されたペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰペプチド＃５２および＃５３）が、ペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘導し、また、増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞の集団がペプチド刺激第７若しくは８日にピークに達したことを示す。この試験は、特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の新規エピトープの同定の別の例を示し、そして増殖するＣＤ４＋ Ｔ細胞集団の分析を培養第８日に実施することを正当化する。
【０１３３】
図４２は、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。ＰＢＭＣはＤＣワクチン接種を受けた黒色腫患者から得た。該患者は、殺した同種異系黒色腫細胞株を負荷した自己ＤＣワクチンを受領した。ＤＣワクチンが、ＤＣワクチンに使用した同種異系黒色腫細胞株上で発現される同種異系抗原に特異的なこの患者でＴ細胞を誘導したことが可能である。この可能性を検査するため、患者ＰＢＭＣを、黒色腫細胞株上で発現されるがしかし該患者細胞上でされない、ＨＬＡ−Ｂ＊４００１をコードする１５−ｍｅｒのオーバーラップペプチドで刺激した。図４２に示されるとおり、クラスター＃１内のペプチド＃５およびペプチド＃７はＰＢＭＣ培養物中でＩＰ−１０産生を誘導した。期待されたとおり、これら２種のエピトープは、双方のペプチドがアミノ酸ミスマッチを含有するため、該患者の抗原エピトープであり得る。これらの結果は、ＥＰＩＭＡＸが同種異系抗原特異的Ｔ細胞応答を同定し得ることを示す。従って、この方法論は、臓器移植の設定で同種異系抗原特異的Ｔ細胞を同定するのに有用であり得る。
【０１３４】
図４３は、本発明により評価されるところの１型糖尿病患者の免疫応答を描くグラフである。ＰＢＭＣは、セルセプトおよびプレドニゾロンのような免疫抑制薬を服用している１型糖尿病を伴う患者から得た。新鮮ＰＢＭＣ（５×１０５細胞／ウェル）を、ＩＡ−２（膵β島細胞上で特異的に発現される自己抗原の１種）をコードする単一の１５−ｍｅｒペプチドで刺激した。培養４８時間でのＩＰ−１０の濃度を示す。１５−ｍｅｒペプチド＃４７、６０、６１、６２、６４および６６は、ＰＢＭＣ培養物中でのＩＰ−１０産生のアップレギュレーションを誘導した。
【０１３５】
この試験は、この患者がＩＡ−２特異的タイプ１細胞の広範なレパートリーを有することを示す。さらに、６種のうち５種（ペプチド＃４７、６０、６１、６２および６６、配列は表４に示す）がＴ細胞の新規エピトープである。従って、この試験は、ＥＰＩＭＡＸが、免疫抑制薬の投薬下でさえ、われわれが自己免疫疾患モデルでエピトープおよびＴ細胞応答の型を同定することを可能にする。
【０１３６】
【表４】
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【０１３７】
図４４Ａおよび４４Ｂは、多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。前ワクチン黒色腫患者から得たＰＢＭＣを、スルビビンペプチドライブラリーの５種のペプチドクラスター（７〜８種のペプチド／クラスター）とともにインキュベートした。スルビビンのクラスター＃３はＩＰ−１０のダウンレギュレーションおよびＩＬ−１０のアップレギュレーションを誘導した。ＰＢＭＣをその後、クラスター＃３からの単一のペプチドとともにインキュベートして、原因となるペプチドすなわちペプチド＃１５を同定した。ＩＬ−１０のアップレギュレーションはＩＬ−１ｂと相関した。データは、ＩＰ−１０について図４４Ａおよび４４Ｃ、ＩＬ−１０について図４４Ｂおよび４４Ｄ、ＩＬ−１αについて図４４Ｅおよび４４Ｇ、ならびにＩＬ−１βについて図４４Ｆおよび４４Ｈに示す。
【０１３８】
図４５は、非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。ＰＢＭＣを５名の健康志願者の新鮮血から単離し、スルビビンペプチド＃１５とともに４８時間インキュベートし、そして本発明の方法により評価した。培養上清中の産生されたＩＰ−１０を測定し、そして、図４５のデータは、ペプチドが添加されない場合の培養物に対する相対値（％）を示す。スルビビンペプチド＃１５は、全５名の志願者でのＩＰ−１０産生をＭＨＣ非拘束性の様式で阻害することが示された。
【０１３９】
図４６Ａおよび４６Ｂは、非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのＰＢＭＣを、スルビビンペプチド＃１５および／若しくは生インフルエンザウイルス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、コネチカット州）の存在若しくは非存在下で１８時間培養した。ＩＰ−１０（図４６Ａ）およびＩＬ−１０（図４６Ｂ）濃度をＬｕｍｉｎｅｘで測定した。スルビビンペプチド＃１５は、生インフルエンザウイルスで刺激したＰＢＭＣからのＩＰ−１０産生を阻害することが示された。
【０１４０】
図４７は、非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのＰＢＭＣを、スルビビンペプチド＃１５若しくはペプチド＃１６（１１アミノ酸がペプチド＃１５に同一である）の存在下で、滴定した濃度のＴＳＳＴ−１で５日間刺激した。５日後にトリチウム化チミジン（１μＣｉ／ウェル）を添加した。プレートを１６時間後に収集し、そして取り込まれた放射活性をＷａｌｌａｃシンチレーションカウンターにより測定した。スルビビンペプチド＃１５は、ＴＳＳＴ−１で刺激されたＴ細胞増殖を阻害することが示された。
【０１４１】
図４８Ａ−４８Ｄは、非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ５６＋、ＢＤＣＡ−４＋またはＢＤＣＡ−１若しくは３＋細胞を、各ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と複合させたマイクロビーズを使用することにより、黒色腫患者のＰＢＭＣから枯渇させた。陰性対照として、ＰＢＭＣを、いかなるビーズも含まないカラムを通過させた（枯渇なし）。枯渇させた細胞を１Ｍ／ｍｌでＣＭに再懸濁し、そしてスルビビンペプチド＃１５の存在若しくは非存在下で生インフルエンザウイルスで刺激した。上清を４８時間に収集し、そしてＩＬ−１０およびＩＰ−１０濃度をＬｕｍｉｎｅｘで分析した。該データは、ＣＤ１４＋若しくはＣＤ５６＋細胞が、ペプチド＃１５がＩＬ−１０分泌を誘導するのに必要であることを示す。
【０１４２】
図４９Ａおよび４９Ｂは、非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。黒色腫患者からのＰＢＭＣを５μＭ ＣＦＳＥで染色し、そして１０μＭのスルビビンペプチド＃１５（図４９Ｂ）若しくは対照ペプチド＃６（図４９Ａ）とともに４日間培養した。ＮＫ集団をＦＡＣＳで分析した。それらのＣＤ５６＋細胞はＣＦＳＥの強度を低下させず、それらが増殖していないことを示す（示されない）。従って、ペプチド＃１５はＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の生存を維持することが示された。
【０１４３】
本明細書に記述される特定の態様は本発明の具体的説明として示されかつその制限として示されないことが理解されるであろう。本発明の原則的特徴は、本発明の範囲から離れることなく多様な態様で使用し得る。当業者は、本明細書に記述される特定の手順に対する多数の同等物を認識するであろうか、若しくは、わずかに慣例の実験を使用して確認することが可能であろう。こうした同等物は本発明の範囲内にあると考えられ、そして請求の範囲により包括される。
【０１４４】
本明細で挙げられた全部の刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の熟練の水準を暗示する。全部の刊行物および特許出願は、各個々の刊行物若しくは特許出願が引用することにより組み込まれることをとりわけかつ個々に示された場合と同一の程度まで、引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
本明細書に開示かつ特許請求される組成物および／若しくは方法の全部は、本開示に照らして過度の実験を伴わずに作成かつ実施し得る。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記述された一方、本明細書に記述される組成物および／または方法に対し、ならびに該方法の段階若しくは段階の順序において、本発明の概念、技術思想および範囲から離れることなく、変形が適用されうることが、当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的の双方で関係するある剤を、同一若しくは類似の結果が達成されるとみられる一方で、本明細書に記述される剤の代わりに用いうることが明らかであろう。当業者に明らかな全部のこうした類似の代替および改変は、付随する請求の範囲により定義されるところの本発明の技術思想、範囲および概念内にあると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
本発明の特徴および利点のより完全な理解のため、付随する図面と一緒に本発明の詳細な記述に今や言及がなされ、そして、ここで：
【図１】本発明により評価される正常ドナーの免疫応答を描くグラフであり、ここで、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨＬＡ−Ａ０２０１＋健康志願者から新たに採取した血液から単離し、２×１０５細胞／ウェルで丸底９６ウェルプレートに三重で接種し、そして１μｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドＦｌｕ−ＭＰ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）若しくはＭＡＧＥ−３２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）またはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のいずれかとともにインキュベートし；そして培養上清を４８時間後に収集し、そしてＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。
【図２】本発明による正常ドナー中でのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドＦｌｕ−ＭＰ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）に対する免疫応答の別の例を描くグラフである。ＰＢＭＣを、別のＨＬＡ−Ａ０２０１＋健康志願者から新たに採取した血液から単離し、５×１０５細胞／ウェルで丸底９６ウェルプレートに三重で接種し、そして１０μｇ／ｍｌのＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ペプチドＦｌｕ−ＭＰ５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）若しくはＭＡＲＴ−１２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）またはペプチド希釈剤（Ｈ２Ｏ中５％ＤＭＳＯ）のいずれかとともにインキュベートし；そして培養上清を４８時間後に収集し、そしてＬｕｍｉｎｅｘ技術を使用してサイトカインおよびケモカインの存在について量的に評価した。
【図３Ａ−３Ｄ】本発明により評価されるところの２例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図４Ａ−４Ｃ】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図５】本発明により評価されるところの正常ドナーの免疫応答のキネティクスを描くグラフである。
【図６】オーバーラップペプチドのライブラリーをペプチドのクラスターに分割し（５〜１０ペプチド／クラスター）クラスター分析、次いでエピトープフォーカシングを実施した、本発明のエピトープフォーカシングのスキームを描く。
【図７】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図８】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図９】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１０】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１１】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１２Ａ−１２Ｂ】黒色腫患者（図１０と同一）からＤＣワクチン接種前および８回のＤＣワクチン接種後に得たＰＢＭＣを、単一の１５−ｍｅｒのＭＡＲＴ−１ペプチド若しくは希釈剤で刺激した、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１３】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１４】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１５】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１６Ａ−Ｄ】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１７】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１８】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図１９】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図２０】図１９に示されるところの同定された１５−ｍｅｒペプチドでの刺激に際してのＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−２産生を描くグラフである。
【図２１Ａ−Ｂ】図１９に示される同一の黒色腫患者から得たＰＢＭＣを用いる、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図２２Ａ−Ｃ】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図２３】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図２４】図２３に示されるところの同定された１５−ｍｅｒペプチドでの刺激に際してのＣＤ４＋ Ｔ細胞からのＩＬ−５産生を描くグラフである。
【図２５】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図２６】本発明により評価されるところの３例の黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図２７】ＥＰＩＭＡＸ方法論で同定される、４種の黒色腫抗原すなわちｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＥＳＯ１およびＴＲＰ−１内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の新たなエピトープの要約を描く。
【図２８】本発明により評価されるところの３例の黒色腫患者の免疫応答を描く。
【図２９Ａ−Ｄ】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図３０】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフを包含する。
【図３１】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図３２】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描くグラフである。
【図３３】本発明により評価されるところの３名の正常健康志願者の免疫応答を描くグラフを包含する。
【図３４】本発明により評価されるところの３名の正常健康志願者の免疫応答を描くグラフを包含する。
【図３５】本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフを包含する。
【図３６】凍結および融解したＰＢＭＣからの、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
【図３７】凍結および融解したＰＢＭＣからの、本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
【図３８Ａ−３８Ｂ】本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
【図３９Ａ−３９Ｂ】ＥＰＩＭＡＸアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフであり、そしてＥＰＩＭＡＸが機能的なＦｌｕ−ＭＰ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞のエピトープの同定を見込むことを示す。
【図４０】本発明により評価されるところの正常健康志願者の免疫応答を描きかつ特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞の新規エピトープの同定を示すグラフである。
【図４１Ａ−Ｂ】ＥＰＩＭＡＸアッセイで同定されたペプチドに対する正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
【図４２】本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答および該患者についての抗原エピトープを描き（双方のペプチドがアミノ酸ミスマッチを含有するように）、そして臓器移植の設定で同種異系抗原特異的Ｔ細胞を同定する能力を示すグラフである。
【図４３】本発明により評価されるところの１型糖尿病患者の免疫応答を描くグラフである。
【図４４Ａ−４４Ｂ】多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者の免疫応答を描く。
【図４５】非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの５名の正常健康志願者の免疫応答を描くグラフである。
【図４６】非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描く２個のグラフを包含する。
【図４７】非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描くグラフである。
【図４８】非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を可能にする、本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描く４個のグラフを包含する。
【図４９】本発明により評価されるところの黒色腫患者における免疫応答を描く２個のグラフを包含し、そして、非Ｔ細胞による多様な型の免疫応答の同定を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011250787.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ−Ｂ】
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【図２９Ｃ−Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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