(57)【要約】【課題】ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元酵素を用いて基質濃度を測定するバイオセンサであって、安定かつ十分な感度が得られ、なおかつ安価なバイオセンサを提供する。【解決手段】絶縁性基板および該基板上に少なくとも作用極と対極からなる２つ以上の電極を有し、該電極の１部もしくは全部に少なくともＮＡＤまたはＮＡＤＰ、ＮＡＤ及び／またはＮＡＤＰを補酵素とするデヒドロゲナーゼ、フェナジンメトサルフェート誘導体およびメディエータを含んでなる組成物を接触させてなる、該デヒドロゲナーゼの基質濃度を測定するためのバイオセンサ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板および該基板上に少なくとも作用極と対極からなる２つ以上の電極を有し、該電極の１部もしくは全部に、少なくとも以下の（１）から（４）をすべて含む組成物を接触させてなる、デヒドロゲナーゼの基質濃度を測定するためのバイオセンサ。
（１）ＮＡＤまたはＮＡＤＰ
（２）ＮＡＤ及び／またはＮＡＤＰを補酵素とするデヒドロゲナーゼ
（３）フェナジンメトサルフェート誘導体
（４）メディエータ
【請求項２】
デヒドロゲナーゼの基質がグルコースである、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
メディエータがフェリシアン化物塩である、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
組成物中のフェナジンメトサルフェート誘導体の含量が、フェナジンメトサルフェート誘導体を含まない場合に比して２倍以上の電気化学シグナル感度を得られる範囲である、請求項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項５】
組成物中のフェナジンメトサルフェート誘導体の物質量としての含量が、メディエータの物質量に対して４０００分の１以上２００分の１以下である、請求項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするデヒドロゲナーゼを使用し、該デヒドロゲナーゼの基質濃度を測定するバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種酸化還元酵素を用いて酵素の基質となる物質を定量する方法は従来より種々検討がなされている。その原理は、基質を酵素によって酸化した際に生じる電子を電圧印加状態において最終的に電極に渡すことで電流を検出し、この電流値を元に該基質の濃度を測定するというものである。ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰを補酵素とする酸化還元酵素を用いた場合、還元状態のＮＡＤ（Ｐ）から電極への直接の電子の受け渡しは効率が悪く、これを達成するには高い印加電圧を要する。
より低い電圧で効率よく電流値を検出する方法として、還元状態のＮＡＤ（Ｐ）と電極との間にメディエータを介在させる方法があり、電極上において還元型ＮＡＤ（Ｐ）を直接酸化型に変換する場合に比して電子伝達速度が改良される。しかしながら、この場合においても補酵素−メディエータ間の電子伝達速度は十分とはいえず、ここが一連のセンサ上における電気化学的反応の律速段階となる。
これを解消する方法として、例えば特許文献１には還元型ＮＡＤ（Ｐ）を酸化型ＮＡＤ（Ｐ）に変換させる他の酵素を共存させる方法が開示される。また、特許文献２には、フェナジンメトサルフェートもしくはその誘導体とテトラゾリウム塩とを用いることでホルマザンを生成させ、電圧印加下でホルマザンより電子を電極へ移動させる方法が開示される。
これらの方法は還元型ＮＡＤ（Ｐ）から最終的に電極へ至るまでの電子伝達速度が格段に改善される一方で他の問題を含んでいる。例えば、前者については還元型ＮＡＤ（Ｐ）を酸化型に変換する代表例としてジアホラーゼが挙げられるが、ジアホラーゼ自体の安定性は十分とはいえず、保存中の該酵素の活性低下による基質濃度定量値のみかけの低下が懸念される。また後者についても保存中にテトラゾリウム塩の変質やそれに伴う還元剤としての機能の低下がみられるなど保存安定性上の問題がある。
また、補酵素と電極間を介するメディエータとして、フェナジンメトサルフェートの誘導体である１−メトキシ−５−フェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）を用いることで電子伝達速度と安定性の両方を解消しうる可能性がある。しかしながらこのｍＰＭＳは、汎用的に用いられるメディエータであるフェリシアン化物やフェロセン等に比して顕著に高額であるため、これを満足な電子伝達速度を得るに十分な量を単独で処方することは経済的な観点から現実的ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５５−１３０７２号公報
【特許文献２】ＷＯ００／５７１６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って本発明の目的は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元酵素を用いて基質濃度を測定するバイオセンサであって、安定かつ十分な感度が得られ、なおかつ安価なバイオセンサを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。結果、フェナジンメトサルフェート誘導体は、それ単独では十分な電子伝達速度を得られないごく微量であっても、他の汎用的なメディエータと組合せることで、該メディエータを単独で用いた場合に比して顕著に高い電子伝達速度を達成でき、これにより電気化学的シグナルが増大することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
またそれだけに留まらず、本発明により、より高濃度の基質に対してもそれに応じて電気化学的シグナルが上昇するため、メディエータを単独で用いた場合に比して測定可能な濃度レンジが広がるという効果もみられた。
【０００７】
すなわち本発明は以下の構成からなる。
［項１］
絶縁性基板および該基板上に少なくとも作用極と対極からなる２つ以上の電極を有し、該電極の１部もしくは全部に、少なくとも以下の（１）から（４）をすべて含む組成物を接触させてなる、デヒドロゲナーゼの基質濃度を測定するためのバイオセンサ。
（１）ＮＡＤまたはＮＡＤＰ
（２）ＮＡＤ及び／またはＮＡＤＰを補酵素とするデヒドロゲナーゼ
（３）フェナジンメトサルフェート誘導体
（４）メディエータ
［項２］
デヒドロゲナーゼの基質がグルコースである、項１に記載のバイオセンサ。
［項３］
メディエータがフェリシアン化物塩である、項１または２に記載のバイオセンサ。
［項４］
組成物中のフェナジンメトサルフェート誘導体の含量が、フェナジンメトサルフェート誘導体を含まない場合に比して２倍以上の電気化学シグナル感度を得られる範囲である、項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ。
［項５］
組成物中のフェナジンメトサルフェート誘導体の物質量としての含量が、メディエータの物質量に対して４０００分の１以上２００分の１以下である、項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元酵素を用いて基質濃度を測定するバイオセンサであって、安定かつ十分な電気化学的シグナルが得られ、なおかつ安価なバイオセンサを提供することができる。
【０００９】
また本発明により、より高濃度の基質に対してもそれに応じて電流値が上昇するため、メディエータを単独で用いた場合に比して測定可能な濃度レンジが広がるという効果もみられた。これは、グルコースから引き抜かれた電子が電極に至るまでの反応経路におけるボトルネックが解消されたことにより、基質濃度依存的に電流値が上昇しうる濃度範囲がより高濃度側に広がったものと理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のバイオセンサに用いる電極の一例を示す。
【図２】ｍＰＭＳ濃度と電気化学シグナル強度との関係を示す。
【図３】本発明のバイオセンサにおける、基質濃度と電気化学シグナル強度の相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明について以下に詳細に説明する。
本発明のバイオセンサは、絶縁性基盤上に少なくとも作用極と対極とからなる電極を形成し、該電極のうち少なくとも作用極の全域を、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、デヒドロゲナーゼ、フェナジンメトサルフェート誘導体およびメディエータを少なくとも含んでなる組成物に接触させてなるバイオセンサである。作用電極にはカーボン電極を用いてもよいし、白金、金、銀、ニッケル、パラジウムなどの金属電極を用いてもよい。金属電極の場合、金が特に好ましい。絶縁性基板上に電極を形成する方法としては、具体的にはフォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成することが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、ガラスエポキシ、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリイミドなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
ＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、デヒドロゲナーゼ、フェナジンメトサルフェート誘導体およびメディエータを少なくとも含んでなる組成物は、通常は作用電極上に担持されてなるが、対極上及び参照極を有する場合であれば参照極上に及んでもよい。
酵素等を含む組成物を電極に接触する方法としては、組成物の水溶液を電極上に滴下する方法、また滴下後に風乾する方法、また電極上に組成物を固定化する方法が挙げられる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマーを利用する方法などが挙げられる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて、酵素等を含む組成物をカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする方法が例示される。
参照電極としては、特に限定されるものではなく、電気化学実験において一般的なものを適用することができるが、例えば飽和カロメル電極、銀−塩化銀などが挙げられる。
【００１２】
本発明に述べるデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ及び／又はＮＡＤＰを補酵素として基質を酸化及び／または還元する反応を触媒するものであれば特に限定しないが、例えばホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．４６）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４７）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．４９）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２もしくはＥＣ  １．４．１．４）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．６）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．８）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２７）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．９）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．３７）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１もしくはＥＣ  １．１．１．２）等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば測定対象がグルコースである場合、グルコースヒドロゲナーゼが選択される。
【００１３】
フェナジンメトサルフェート誘導体として具体的に例示されるのは１−メトキシ‐５−フェナジンメトサルフェート（ｍＰＭＳ）である。広義には、このｍＰＭＳもメディエータの範疇に入るが、本発明に述べるメディエータとは、ＰＭＳ誘導体以外の物質であって電子を還元型ＰＭＳ誘導体から受容し電極に供与しうる物質として定義される。
【００１４】
ｍＰＭＳ以外のメディエータとして具体的に例示されるものとしてはキノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、フェレドキシン類、フェロセンおよびその誘導体等が挙げられ、より具体的には、ベンゾキノン／ハイドロキノン、フェリシアン化物（カリウムもしくはナトリウム塩）、フェリシニウム／フェロセン、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどが挙げられる他、オスミウム、コバルト、ルテニウムなどの金属錯体を用いることも可能である。この中で、好適にはフェリシアン化カリウムが用いられる。
【００１５】
水溶性の低い化合物をメディエータとして用いる場合、有機溶媒を用いると、酵素自体の安定性を損なったり、酵素活性を失活させたりする可能性がある。そこで、水溶性を高めるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子により修飾された酵素を用いてもよい。
【００１６】
試料添加時の反応系におけるメディエータ濃度は、１ｍＭ〜１Ｍ程度の範囲が好ましく、５〜５００ｍＭがより好ましく、１０〜３００ｍＭが更に好ましい。
【００１７】
また、ＰＭＳ誘導体の添加量としては、少量かつ還元型ＮＡＤからメディエータまでの電子の伝達速度を促進するに十分な量であることが好ましい。
還元型ＮＡＤからメディエータまでの電子の伝達速度を促進するに十分なＰＭＳ誘導体添加量の目安としては、該メディエータを単独で用いた場合と比して２倍以上の電気化学的シグナルを得られる添加濃度であり、より好ましくは該メディエータを単独で用いた場合と比して３倍以上の電気化学的シグナルを得られる添加濃度である。また別の観点からの還元型ＮＡＤからメディエータまでの電子の伝達速度を促進するに十分なＰＭＳ誘導体添加量の目安は、好ましくは物質量としてメディエータの４０００分の１以上であり、より好ましくは４０００分の１以上２００分の１以下であり、さらに好ましくは８００分の１以上２００分の１以下である。ここで物質量とはすなわち分子数と換言することができ、組成中のＰＭＳ誘導体の物質量としての含量がメディエータの４０００分の１というとき、ＰＭＳ誘導体１分子あたり４０００個のメディエータ分子が存在することを意味する。また、ＮＡＤ（Ｐ）の組成中の含量としては、測定対象となるデヒドロゲナーゼ基質の濃度に依存的な強度の電気化学的シグナルを安定的に検出しうる量であれば特に限定しないが、好ましい目安は、基質とデヒドロゲナーゼが反応する際の溶液中の濃度として該デヒドロゲナーゼのＮＡＤ（Ｐ）に対するミカエリス定数（Ｋｍ）以上であり、より好ましくは該デヒドロゲナーゼのＮＡＤ（Ｐ）に対するミカエリス定数（Ｋｍ）の５倍以上であり、最も好ましくは該デヒドロゲナーゼのＮＡＤ（Ｐ）に対するミカエリス定数（Ｋｍ）の１０倍以上である。
【００１８】
電極上の組成物中には、ＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、デヒドロゲナーゼ、フェナジンメトサルフェート誘導体およびメディエータに加えて、各種緩衝剤を含んでいてもよい。緩衝剤としては好ましくはｐＨ５．０〜９．０の範囲で設定される好適なｐＨ条件において緩衝能を有する物質であればよく、リン酸塩の他、フマル酸・マレイン酸・グルタル酸・フタル酸・クエン酸等の各種有機酸、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳなどのＧＯＯＤの緩衝剤が例示されうるが、これらに限定されない。さらに、デヒドロゲナーゼの保存安定性を高める目的でウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、セリシン等のタンパク質、該デヒドロゲナーゼの基質となりえない糖類やアミノ酸、またカルシウム・マグネシウム・亜鉛・マンガン等の金属塩、あるいはＥＤＴＡに代表されるキレート剤、さらにはＴｒｉｔｏｎＸ−１００・デオキシコール酸・コール酸・Ｔｗｅｅｎ２０・Ｂｒｉｊ３５・エマルゲン等の各種界面活性剤等を適宜含んでもよい。
【００１９】
電極の形状は特に限定されるものではなく、円形、楕円形、四角形などの形状が挙げられる。例えば、円形の形状である場合、その半径は３ｍｍ以下であることが好ましく、２．５ｍｍ以下がより好ましく、２ｍｍ以下が更に好ましい。
【００２０】
本発明に示すバイオセンサを用いて興味の物質の濃度を測定する方法は、以下のように行う。
少なくとも作用極と対極からなる電極系はポテンショスタット／ガルバノスタットに例示される装置に接続し、電極に接触するＮＡＤもしくはＮＡＤＰ、興味の物質を基質とするデヒドロゲナーゼ、フェナジンメトサルフェート誘導体およびメディエータを含む組成物に、測定対象となるデヒドロゲナーゼ基質を含有する試料を添加する。測定対象となる基質溶液の添加方法は、電極上の組成物にマイクロピペット等を用いて滴下してもよく、あるいは開口部から電極系にいたる液体流路を具備し該流路を通して試料を電極上に送液してもよい。電極上の組成物と試料とを接触させた状態で電圧を印加して得られる電気化学的シグナルとしての電流値を計測する。この電流値は試料中に含まれる基質濃度に依存しており、あらかじめ該基質の標準液を用いて作成した検量線を基に電流値から基質濃度を算出することができる。印加する電圧の強度は好ましくは５０〜１０００ｍＶであり、より好ましくは１００〜５００ｍＶである。測定に供する試料の種類は特に制約されるものではなく、酵素の基質を成分として含有する可能性のある水溶液はもとより、血液、体液、尿などの生体試料であってもよい。また、測定に際しては、可能な範囲で反応温度を一定にして行ってもよく、また測定環境温度を計測し、あらかじめ作成した温度と電気化学的シグナルとの相関式から温度依存的な反応速度の変化分を補正することも可能である。
【００２１】
なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００２２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。以下に述べる実施例はいうまでもなく本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２３】
サーモプロテウス属超好熱性始原菌由来改変型グルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと称する）を以下の要領で得た。
配列番号１に示すＧＤＨ遺伝子が大腸菌用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＮ（＋）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに挿入された発現プラスミドｐＢＳＧＤＨ−２を鋳型に、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （ストラタジーン製）を用いてＧＤＨ遺伝子内の特定部位に変異を導入することにより、発現プラスミドｐＢＳＴＧＤＨ−３を得た。ｐＢＳＴＧＤＨ−３は配列番号３に相当するＤＮＡ分子をｌａｃプロモーター下に接続してなるプラスミドである。このプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルに形質転換し、生産菌株とした。形質転換株は、５００ｍｌ容坂口フラスコに入った２００ｍｌ前培養培地（０．５％酵母エキス、０．２５％ペプトン、０．５％塩化ナトリウム、０．５％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．４）に植菌し、３０℃１８０ｒｐｍで１６時間振とう培養した。得られた前培養液を、１０Ｌ容ジャーファーメンター中の６ＬのＧＤＨ生産培地（２．４％コウボエキス、２．４％ペプトン、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．４％グリセロール、０．１％消泡剤、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム、ｐＨ７．０）に全量投入し、通気量２Ｌ／分、攪拌速度３１０ｒｐｍ、槽内圧０．０２ＭＰａ、温度３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。得られた培養液を遠心分離することにより菌体を得、これを１Ｌの２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に懸濁してフレンチプレス菌体破砕装置を用いて平均圧力８０ＭＰａで菌体を破砕した。さらにこの破砕液に１Ｌあたり１５２ｇの硫酸アンモニウムを加えて溶解し、６０℃１時間の加温を行い、さらに遠心分離によって沈殿を除いた。この溶液を、１５．２％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で緩衝化させたＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）にアプライしてＧＤＨを樹脂に吸着させ、さらに７．６％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄した。そして硫酸アンモニウム濃度を７．６％から０％へ、同時にエチレングリコール濃度を０％から０．２％へ、それぞれグラジエントをかけながらバッファーを通液することでＧＤＨを溶出させた。次に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）により緩衝化したＧ−２５  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いて脱塩・バッファー置換を行った。最後に、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅにＧＤＨ溶液を通液することで夾雑タンパク質を樹脂に吸着させ、透過液を精製ＧＤＨとした。このように作製したサーモプロテウス属由来変異型ＧＤＨは配列番号４に示すアミノ酸配列を有している。
【実施例２】
【００２４】
絶縁性基板に作用電極、対向電極、および参照電極を配した電極センサを、有限会社バイオデバイステクノロジー社（石川県能美市）より入手した。本電極センサは、４．０ｍｍ×１７ｍｍの基板に電極が印刷されている。図１に、このセンサの構造を図示する。このセンサの作用電極（面積約１．３ｍｍ２）上に試薬層となる水溶液を１０μＬ分注した。試薬層となる水溶液には、下記の組成が含まれる。
・２０ｍＭ  酸化型ＮＡＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（実施例１で作製したもの）
・８０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
・０〜０．４ｍＭ  １−メトキシ−５−フェナジンメトサルフェート
・２０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  （ｐＨ７．０）
上記組成の溶液に等量の２０ｍＭ  Ｄ−グルコース溶液（３６０ｍｇ／ｄｌ）をマイクロピペットで添加・混合し、１分後にポテンショスタットにて＋３００ｍＶの電圧を印加した。すなわち、試料添加後の電極上の溶液（２０μｌ）中における組成は以下のとおりである。
・１０ｍＭ  酸化型ＮＡＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（実施例１で作製したもの）
・４０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
・０〜０．２ｍＭ  １−メトキシ−５−フェナジンメトサルフェート
・１０ｍＭ  Ｄ−グルコース
・１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  （ｐＨ７．０）
各ｍＰＭＳ濃度において得られた電気化学シグナル（電圧印加後１秒〜６秒の５秒間の平均電流値）を表１および図２に示す。ｍＰＭＳ濃度が０．０１ｍＭ、すなわち物質量としてのｍＰＭＳ量がメディエータであるフェリシアン化カリウムの１／４０００の場合、シグナル強度はｍＰＭＳを含まない場合の３．５倍に達し、ｍＰＭＳ濃度が０．０５ｍＭ、すなわち物質量としてのｍＰＭＳ量がメディエータであるフェリシアン化カリウムの１／８００の場合、シグナル強度はｍＰＭＳを含まない場合の５．９倍に達した。
【００２５】
【表１】
2011053052.tif 000003
【比較例１】
【００２６】
実施例２と同様の操作を、フェリシアン化カリウムを含まない組成を用いて実施した。すなわち、Ｄ−グルコース溶液を添加後の電極上の溶液（２０μｌ）中における組成は以下のとおりである。
・１０ｍＭ  酸化型ＮＡＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（実施例１で作製したもの）
・０〜０．２ｍＭ  １−メトキシ−５−フェナジンメトサルフェート
・１０ｍＭ  Ｄ−グルコース
・１０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  （ｐＨ７．０）
各ｍＰＭＳ濃度において得られた電気化学シグナルを表１および図３に示す。この範囲において、ｍＰＭＳを単独で電子伝達物質として用いた場合の電気化学シグナル感度は、メディエータと組み合わせた場合と比較して０．０５３倍〜０．５５倍であった。単独では十分な感度を得られないｍＰＭＳ量であっても、メディエータと組み合わせることで電極における一連の電気化学反応を顕著に促進しうることがわかる。また、実施例１との比較から、ｍＰＭＳを添加することによるシグナル感度の上昇は、添加したｍＰＭＳによる単なる相加的な効果ではなく、メディエータとの組合せによる相乗効果であることが理解される。
【実施例３】
【００２７】
実施例２で用いたものと同様のセンサの作用極上に、試薬層となる水溶液を５μＬ分注した。試薬層となる水溶液には、下記の組成が含まれる。
・４０ｍＭ  酸化型ＮＡＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（実施例１で作製したもの）
・１６０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
・０．４ｍＭ  １−メトキシ−５−フェナジンメトサルフェート
・４０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー  （ｐＨ７．０）
上記組成の溶液に様々な濃度のＤ−グルコース溶液１５μｌをマイクロピペットで添加・混合し、１分後にポテンショスタットにて＋３００ｍＶの電圧を印加し、応答電流を測定した。すなわち、試料添加後の電極上の溶液（２０μｌ）中における組成は以下のとおりである。
・１０ｍＭ  酸化型ＮＡＤ
・ＮＡＤ（Ｐ）依存型グルコースデヒドロゲナーゼ（実施例１で作製したもの）
・４０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
・０．１ｍＭ  １−メトキシ−５−フェナジンメトサルフェート
・５〜３０ｍＭ  Ｄ−グルコース
また、上記試薬層からｍＰＭＳまたはフェリシアン化カリウムを除いた組成の溶液を用いて応答電流を測定した。図３は、各試薬組成を用いた際のグルコース濃度とそれに対する応答電流値をプロットしたグラフである。上記のグルコース濃度範囲において、ＰＭＳ誘導体とメディエータを適量組み合わせた組成においてはＰＭＳ誘導体を欠いた場合と比較して顕著に高い電気化学シグナルを得られることが理解される。また、特に基質濃度が１０ｍＭを超える領域について、濃度依存的なシグナル強度の伸びがＰＭＳ誘導体を欠いた場合に比して改善され、定量可能な基質濃度範囲がより広がったことが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする酸化還元酵素を用いて基質濃度を測定するバイオセンサとして利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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