(57)【要約】      （修正有）【課題】フルクトース残基がα結合した、フルクトースおよびグルコースからなる新規な二糖類を提供。【解決手段】新規な二糖類は、フルクトース残基がグルコースにα結合により２−６結合したα−Ｄ−フルクトフラノシル（２→６）−Ｄ−グルコピラノースである。植物を切断したものに原料重量の１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物抽出エキスを得、該植物抽出エキスを自然発酵させることにより、発酵抽出エキス中にα−Ｄ−フルクトフラノシル（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、得られた発酵エキス中から該α−Ｄ−フルクトフラノシル（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取する。該二糖類は難消化性である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース。
【化１】
2011246371.tif 000003
【請求項２】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物エキス液を得、該植物エキス液を自然発酵させることにより、得られた植物エキス発酵液中に請求項１に記載のα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、生成されたα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取することを特徴とする二糖類の製造方法。
【請求項３】
請求項２に記載の二糖類の製造方法において、α−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取する方法は、植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィーに添加し、水で溶出してα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含むフラクションを得、該フラクションに対してＨＰＬＣによりα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを分離することを特徴とする二糖類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、 α−フルクトシドを持つ新規二糖類及びその製造方法に関し、 詳しくはフルクトースおよびグルコースからなる二糖類であって、α結合したフルクトース残基を有する新規な、α−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フルクトースとグルコースが２−６結合しフルクトース残基がβ結合したもの、即ち、β−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースは、ネオケスト−スの加水分解物から得られることが知られている（非特許文献１）。 
【０００３】
また、植物抽出エキスを自然発酵させ、生成されたオリゴ糖からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取すること、及び糖質を含む溶液に対してβ−フルクトフラノシダーゼを作用させることにより、溶液からβ−Ｄ−フルクトピラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取することは本出願人が既に明らかにしている（特許文献１）。
【０００４】
しかし、 フルクトース残基がα結合した、フルクトースおよびグルコースからなる二糖類は知られていない。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８７１２２２号
【非特許文献１】Journal of Chromatography A, 920 (2001) 299-308.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、フルクトース残基がα結合した、フルクトースおよびグルコースからなる新規な二糖類を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、植物エキス発酵液中の新規オリゴ糖について検索、分離し、 ＴＯＦ−ＭＳ分析、メチル化糖のガスクロマトグラフィ−分析及びＮＭＲ解析を行った結果、いかなる標品とも一致しない未知の二糖類を検出した。この新規二糖類は植物エキス発酵液の発酵中に生成することが見いだされた。この二糖類は、フルクトース残基がグルコースにα結合により２−６結合した下記式（１）で表されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（糖１とも呼ぶ）である。
【０００８】
【化１】
2011246371.tif 000002
【０００９】
本発明の式（１）で表される二糖類の製造方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物エキス液を得、該植物エキス液を自然発酵させることにより、得られた植物エキス発酵液中にα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、生成されたα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取することを特徴とする。
【００１０】
本発明の二糖類の製造方法において、植物エキス発酵液中からα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取する方法は、植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィーに添加し、水で溶出してα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含むフラクションを得、該フラクションに対してＨＰＬＣによりα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを分離することを特徴とする。
【００１１】
本明細書において、「植物エキス液」とは発酵する前の植物の抽出液の意味で用いる。また、「植物エキス発酵液」とは植物の抽出液を発酵処理したものの意味で用いる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の前記式（１）で表される二糖類は、新規化合物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィーに添加し、水で溶出した画分をさらにＡｍｉｄｅ−８０（商品名、東ソー株式会社製）に添加して溶出した結果について、溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフである。
【図２】図１における溶出時間１９．０〜２２．０分のフラクションをＯＤＳ−８０Ｔｓカラムを用いたＨＰＬＣを行って分離したものについて、溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフである。
【図３】糖１についてのＰｏｓｉｔｉｖｅイオンモードでの質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）のチャートを表す図である。
【図４】糖１についての 1Ｈ−ＮＭＲ解析のチャートを表す図である。
【図５】糖１についての13Ｃ−ＮＭＲ解析のチャートを表す図である。
【図６】糖１についてのＣＯＳＹのチャートを表す図である。
【図７】糖１についてのＥ−ＨＳＱＣのチャートを表す図である。
【図８】糖１についてのＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹのチャートを表す図である。
【図９】糖１についてのＨＭＢＣのチャートを表す図である。
【図１０】糖１の消化性のグラフを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（植物エキス発酵液の製造方法）
植物エキス発酵液は、以下の様に製造される。植物原料としては、リンゴ、バナナ、イチゴ、ミカン、ミカンの皮、ナシ、パイナップル、ブドウ、等の果物、ニンジン、大根、ショウガ、ゴボウ、キャベツ、ホウレン草、タマネギ、トマト、キュウリ、セロリ、ピーマン、ブラックマッペモヤシ、エンドウモヤシ、ナス、レンコン、カボチャ、レタス、ニンニク、三つ葉、ウド、アスパラガス、シソ、カブ、アサツキ、白菜、サラダ菜、シュンギク、セリ、ニラ、等の野菜類、シイタケ、エノキタケ等のきのこ類、及び熊笹、クローバー、フキノトウ、タンポポ、オオバコ、スギ葉、パセリ、イタドリの若芽、ヨモギ、トドマツ葉等の山野草、昆布、ワカメ等の海藻類が挙げられ、これらの植物原料のうち２種以上、好ましくは、多種類が用いられる。
【００１５】
上記植物原料の配合割合として、例えばリンゴでは植物原料総重量の０．１から５０％、ニンジンでは０．１から５０％、大根では０．０５から４０％、キャベツでは０．０５から４０％、セロリやキュウリでは０．０１から３０％、バナナ、タマネギ、ゴボウ、ホウレン草では０．０１から３０％とすることが望ましいが、特に制限されるものではない。
【００１６】
これらの植物原料を１〜５ｃｍ幅、好ましくは１〜４ｃｍ幅、最も好ましくは２〜３ｃｍ幅に切断し、全ての原料を杉樽中に入れ、これに、ショ糖を混合し、圧搾せずに浸透圧を利用して、３日間から３週間抽出して植物エキス液を得る。ショ糖の混合割合については、全体として１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにし、好ましくは、植物原料とほぼ等量のショ糖を添加して混合することが望ましい。同時に、数ｐｐｍ程度の濃度となるように若干量の食塩を添加混合してもよい。
【００１７】
圧搾せずに回収した植物エキス液を３７℃で暗所で保存すると主として酵母（例えば、Saccharomyces 属に属する微生物）および乳酸球菌（例えば、Leuconostoc 属に属する微生物）により自然発酵する。発酵後、さらに３７℃で約半年間以上熟成させると褐色、粘稠性液体の植物エキス発酵液が得られる。
【００１８】
（本発明の二糖類の分画、精製）
得られた植物エキス発酵液を活性炭セライトを充填したカラムクロマトグラフィーに通し、水で溶出することにより本発明の前記式（１）で表されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（糖１）を含む溶出液を得ることができる。得られた溶出液をさらにＨＰＬＣを用いて前記式（１）で表される糖１を分離し、精製する。その後、凍結乾燥して、粉末状の精製された本発明の前記式（１）で表される糖１を得ることができる。
【実施例１】
【００１９】
（植物発酵エキスの調製）
植物抽出エキスの原料として以下の配合の材料を２〜３ｃｍ幅に切断したものを使用した。
【００２０】
リンゴ      植物原料総重量の２０％
ニンジン        同          １６％
大根            同          １２％
キャベツ        同          １０％
セロリ          同            ９％
キュウリ        同            ９％
バナナ          同            ６％
玉ねぎ          同            ６％
ゴボウ          同            ６％
ホウレン草      同            ６％
これらの植物原料全重量に対して、等量のショ糖を加えて一週間抽出し、得られた植物エキス液を自然発酵させた後、３７℃で約半年間熟成させることにより、褐色の粘稠性の液状の植物エキス発酵液を得た。
【００２１】
（未知の糖成分の分画、精製）
前記工程で得られた発酵後の植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィー（４．５ｃｍ×３５ｃｍ）に添加し、順次、水、５％エタノール、１５％エタノールのステップワイズグラジエントで溶出した。
【００２２】
水で溶出した画分をさらにＡｍｉｄｅ−８０（商品名、東ソー株式会社製、カラムサイズ：７．８ｍｍ×３０ｃｍ、溶出：８０％アセトニトリル、カラム温度：８０℃、流速：２ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）に添加して溶出した。その結果を図１に溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフとして表す。
【００２３】
次いで、図１における溶出時間１９．０〜２２．０分のフラクション（図１において矢印で示すピークの部分）を分取し、該分取したフラクションをＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（商品名、東ソー株式会社製；カラムサイズ：４．６ｍｍ×２５ｃｍを４本つないだもの、溶出：蒸留水、カラム温度：室温、流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計）を用いたＨＰＬＣを行った。その結果を、図２に溶出時間とシグナル強度の関係を示すグラフとして表す。図２における溶出時間５３．５〜５４．５分のフラクション（図２において矢印で示すピークの部分）を分取し、精製し、凍結乾燥粉末を得た。
【００２４】
（化学構造の決定）
前記工程で得られた凍結乾燥粉末について、以下に示す機器分析を行い、その化学構造を以下のように決定した。
【００２５】
前記工程で得られた単一の成分として単離された凍結乾燥粉末をPositiveイオンモードで質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）した結果、そのチャートを図３に示す。図３によれば、未知の成分は３６５の［Ｍ＋Ｎａ］+ イオンピークを与えた。よって未知成分はヘキソース二糖類であることが確かめられた。該未知ヘキソース二糖類を糖１と呼ぶ。
【００２６】
糖１を酸加水分解後、ＨＰＡＥＣ分析し、構成糖を調査したところ、糖１はグルコースとフルクトースの比が１：１で遊離した。糖１を箱守の方法でメチル化しメタノール分解した試料をガスクロマトグラフィー分析した結果、メチル１，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−Ｄ−フルクトフラノシド、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコシドが検出された。
【００２７】
次に糖１を重水に溶解して次の１次元ＮＭＲ解析を行った。 1Ｈ−ＮＭＲ解析のチャートを図４に示し、13Ｃ−ＮＭＲ解析のチャートを図５に示す。
【００２８】
次に糖１を重水に溶解して以下の２次元ＮＭＲ解析を行った。ＣＯＳＹのチャートを図６に、Ｅ−ＨＳＱＣのチャートを図７に、ＨＳＱＣ−ＴＯＣＳＹのチャートを図８に、ＨＭＢＣのチャートを図９に示す。
【００２９】
以上の結果から糖１は、α−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースであると決定した。
【実施例２】
【００３０】
（糖１の消化性）
ラット小腸アセトン粉末による本発明の糖１の分解性について下記のように試験した。      
【００３１】
ラット小腸アセトン粉末３００ｍｇに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．７ｍＬを加えてガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズし、１０，０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心分離し、得られた上澄みを酵素液とした。該酵素液をマルターゼ活性として１ｍＬあたり２．５ユニットとなるように希釈した。得られた希釈酵素液０．２ｍＬと、前記実施例１で得られた糖１の１％水溶液１ｍＬを混合し３７℃で一定時間反応させて１００℃で５分間加熱し、反応を停止した。
【００３２】
図１０に縦軸に糖の残存率（％）、横軸に反応時間をとった糖１（△で示す）の消化性の表すグラフを示す。比較のためマルトース（◆で示す）とショ糖（■で示す）の消化性を併せて表した。
【００３３】
この試験の結果、本発明の糖１はほとんど分解されなかった。したがって、本発明の糖１は難消化性糖質であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の新規なα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースは、二糖類のオリゴ糖であることから食品素材、医薬品素材の用途としての利用が期待できる。
【００３５】
本発明の新規な二糖類は、難消化性糖質であるので、腸内環境の改善、および高血糖症状の改善や、高血糖を起因とする肥満症、糖尿病疾患の改善のための食品素材、医薬品素材の用途としての利用が期待できる。
【図１】
2011246371.tif 000004
【図２】
2011246371.tif 000005
【図３】
2011246371.tif 000006
【図４】
2011246371.tif 000007
【図５】
2011246371.tif 000008
【図６】
2011246371.tif 000009
【図７】
2011246371.tif 000010
【図８】
2011246371.tif 000011
【図９】
2011246371.tif 000012
【図１０】
2011246371.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月20日(2010.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物エキス液を得、該植物エキス液を自然発酵させることにより、得られた植物エキス発酵液中に下記式（１）で表されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、生成されたα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取することを特徴とする二糖類の製造方法。
【化１】
2011246371.tif 000014
【請求項２】
請求項１に記載の二糖類の製造方法において、α−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取する方法は、植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィーに添加し、水で溶出してα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含むフラクションを得、該フラクションに対してＨＰＬＣによりα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを分離することを特徴とする二糖類の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、 α−フルクトシドを持つ二糖類の製造方法に関し、 詳しくはフルクトースおよびグルコースからなる二糖類であって、α結合したフルクトース残基を有するα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースの製造方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
しかし、 フルクトース残基がα結合した、フルクトースおよびグルコースからなる二糖類は天然では知られていない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は、フルクトース残基がα結合した、フルクトースおよびグルコースからなる二糖類を提供することを目的とする。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明者らは、植物エキス発酵液中のオリゴ糖について検索、分離し、 ＴＯＦ−ＭＳ分析、メチル化糖のガスクロマトグラフィ−分析及びＮＭＲ解析を行った結果、二糖類を検出した。この二糖類は植物エキス発酵液の発酵中に生成することが見いだされた。この二糖類は、フルクトース残基がグルコースにα結合により２−６結合した下記式（１）で表されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（糖１とも呼ぶ）である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明は前記式（１）で表される二糖類の製造方法を提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
（二糖類の分画、精製）
得られた植物エキス発酵液を活性炭セライトを充填したカラムクロマトグラフィーに通し、水で溶出することにより前記式（１）で表されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノース（糖１）を含む溶出液を得ることができる。得られた溶出液をさらにＨＰＬＣを用いて前記式（１）で表される糖１を分離し、精製する。その後、凍結乾燥して、粉末状の精製された前記式（１）で表される糖１を得ることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
この試験の結果、本発明により製造される糖１はほとんど分解されなかった。したがって、本発明により製造される糖１は難消化性糖質であることがわかる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明により製造されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースは、二糖類のオリゴ糖であることから食品素材、医薬品素材の用途としての利用が期待できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本発明により製造される二糖類は、難消化性糖質であるので、腸内環境の改善、および高血糖症状の改善や、高血糖を起因とする肥満症、糖尿病疾患の改善のための食品素材、医薬品素材の用途としての利用が期待できる。
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月14日(2010.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物エキス液を得、該植物エキス液を自然発酵させることにより、得られた植物エキス発酵液中に下記式（１）で表されるα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、該発酵液をクロマトグラフィーに付し水で溶出することによりα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取することを特徴とする二糖類の製造方法。
【化１】
2011246371.tif 000015
【請求項２】
請求項１に記載の二糖類の製造方法において、α−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取する方法は、植物エキス発酵液を活性炭セライトカラムクロマトグラフィーに添加し、水で溶出してα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを含むフラクションを得、該フラクションに対してＨＰＬＣによりα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを分離することを特徴とする二糖類の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の式（１）で表される二糖類の製造方法は、植物を切断したものに１／１０量以上２倍量以下の糖質を含むようにショ糖を添加し、ショ糖の浸透圧を利用して抽出して植物エキス液を得、該植物エキス液を自然発酵させることにより、得られた植物エキス発酵液中にα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを生成させ、該発酵液をクロマトグラフィーに付し水で溶出することによりα−Ｄ−フルクトフラノシル−（２→６）−Ｄ−グルコピラノースを採取することを特徴とする。