(57)【要約】【課題】結核菌の薬剤耐性度を迅速・簡便に判定するための新たな手段を提供すること。【解決手段】本発明の、結核菌の薬剤耐性度を判定するための試験片は、少なくとも１つのプローブが固定されており、該少なくとも１つのプローブが、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、該領域が、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、該変異の位置の塩基が、野生型または変異型である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌の薬剤耐性度を判定するための試験片であって、
少なくとも１つのプローブが固定されており、
該少なくとも１つのプローブが、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、
該領域が、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、
該変異の位置の塩基が、野生型である、
試験片。
【請求項２】
さらなるプローブが固定されており、
該さらなるプローブが、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、
該領域が、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、
該変異の位置の塩基が、変異型である、
請求項１に記載の試験片。
【請求項３】
結核菌の薬剤耐性度を判定するための試験片であって、
少なくとも１つのプローブが固定されており、
該少なくとも１つのプローブが、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、
該領域が、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、
該変異の位置の塩基が、変異型である、
試験片。
【請求項４】
さらなるプローブが固定されており、
該さらなるプローブが、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、
該領域が、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、
該変異の位置の塩基が、野生型である、
請求項３に記載の試験片。
【請求項５】
前記薬剤耐性遺伝子が、イソニアジド耐性遺伝子、リファンピシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、エタンブトール耐性遺伝子、ニューキノロン耐性遺伝子およびピラジナミド耐性遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から４のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項６】
前記薬剤耐性遺伝子が、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｅｍｂＡ、ｅｍｂＢ、ｅｍｂＣおよびｐｎｃＡからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から５のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項７】
前記薬剤耐性遺伝子がｋａｔＧであり、前記薬剤耐性遺伝子の変異が、Ｈ９７Ｒ、Ｑ１２７Ｅ、Ｎ１３３Ｔ、Ｍ１７６Ｔ、Ｐ２３２Ｓ、Ｓ３１５Ｒ、Ｓ３１５Ｔ、Ｓ３８３Ｐ、Ｄ４１９Ｈ、Ｍ４２０Ｔ、Ｒ４８９Ｓ、Ｄ５４２Ｈ、Ｒ６３２Ｃ、Δ１９１−１９２、１２４フレームシフトおよび１６０フレームシフトからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項８】
前記薬剤耐性遺伝子がｉｎｈＡであり、前記薬剤耐性遺伝子の変異が、ｔ−８ｃおよびｃ−１５ｔからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項９】
前記薬剤耐性遺伝子がｒｐｏＢであり、前記薬剤耐性遺伝子の変異が、Ｄ５１６Ｖ、Ｓ５２１Ｌ、Ｈ５２６ＤおよびＨ５２６Ｙからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項１０】
前記薬剤耐性遺伝子がｇｙｒＡであり、前記薬剤耐性遺伝子の変異が、Ｇ８８Ｃ、Ａ９０Ｖ、Ｓ９１ＰおよびＤ９４Ｇ／Ａ／Ｈ／Ｎからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項１１】
前記薬剤耐性遺伝子がｇｙｒＢであり、前記薬剤耐性遺伝子の変異が、Ｄ４９５Ｎである、請求項１から６のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項１２】
前記薬剤耐性遺伝子がｅｍｂＢであり、前記薬剤耐性遺伝子の変異が、Ｍ３０６Ｌ／Ｖ／Ｉ、Ｄ３２８Ｇ／Ｙ、Ｇ４０６Ｃ／Ａ／Ｄ／ＳおよびＱ４９７Ｋ／Ｒからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項１３】
前記薬剤耐性遺伝子がｐｎｃＡであり、前記薬剤耐性遺伝子の変異が、Ｍ１Ｉ、Ａ３Ｅ、Ｌ４Ｓ、Ｌ４Ｗ、Ｉ５Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｖ７Ｆ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｇ、Ｖ９Ａ、Ｖ９Ｇ、Ｑ１０Ｐ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０ｓｔｏｐ、Ｄ１２Ａ、Ｃ１４Ｒ、Ｃ１４Ｙ、Ｇ２３Ｖ、Ａ２５Ｅ、Ｒ２６Ｇ、Ａ２８Ｄ、Ｙ３４Ｄ、Ｙ３４ｓｔｏｐ、Ｌ３５Ｐ、Ｖ４５Ｇ、Ａ４６Ｅ、Ｔ４７Ａ、Ｄ４９Ａ、Ｈ５１Ｐ、Ｈ５１Ｑ、Ｈ５７Ｄ、Ｈ５７Ｐ、Ｆ５８Ｌ、Ｔ６１Ｐ、Ｄ６３Ｈ、Ｙ６４Ｄ、Ｓ６７Ｐ、Ｗ６８Ｇ、Ｗ６８Ｒ、Ｗ６８Ｓ、Ｗ６８ｓｔｏｐ、Ｈ７１Ｐ、Ｔ７６Ｉ、Ｔ７６Ｐ、Ｇ７８Ｄ、Ｌ８５Ｐ、Ｌ８５Ｒ、Ｋ９６Ｅ、Ｋ９６Ｑ、Ｇ９７Ｄ、Ｙ９９Ｄ、Ｙ９９Ｓ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｓ、Ｙ１０３ｓｔｏｐ、Ｗ１１９ｓｔｏｐ、Ｒ１２１Ｐ、Ｖ１２８Ｇ、Ｔ１３５Ｐ、Ｄ１３６Ｎ、Ｄ１３６Ｙ、Ｈ１３７Ｐ、Ｃ１３８Ｒ、Ｃ１３８Ｓ、Ｖ１３９Ａ、Ｖ１３９Ｌ、Ｖ１３９Ｍ、Ｑ１４１Ｐ、Ｑ１４１ｓｔｏｐ、Ａ１４６Ｔ、Ｒ１４８Ｓ、Ｖ１５５Ｇ、Ｌ１５６Ｑ、Ｌ１５９Ｒ、Ｌ１７２Ｐ、Ｖ１８０Ｆ、５３フレームシフト、７５フレームシフト、８０フレームシフト、８８フレームシフト、１２３フレームシフト、１４１フレームシフト、１６２フレームシフト、１６４フレームシフトおよび１７７フレームシフトからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１から６のいずれかの項に記載の試験片。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかの項に記載の試験片を含む、結核菌の薬剤耐性度の判定用キット。
【請求項１５】
さらに、ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬および薬剤耐性遺伝子の増幅用プライマー対を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
結核菌の薬剤耐性度を判定する方法であって、
該結核菌の薬剤耐性遺伝子を増幅する工程、
増幅した薬剤耐性遺伝子を請求項１から１３のいずれかの項に記載の試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブとハイブリダイズさせる工程、
該薬剤耐性遺伝子がハイブリダイズしたプローブを同定する工程、および
同定したプローブの位置から該結核菌の薬剤耐性度を判定する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌の薬剤耐性度を判定するための方法および試験片に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、日本では年間数千人が、地球規模では年間数百万人が結核により死亡しているといわれている。結核の治療では、基本的に化学療法を中心とする内科的療法が用いられ、内科的療法では治療の目的を達成することが不可能な場合に外科的療法が考慮される。
【０００３】
内科的療法で使用される結核治療の薬剤としては、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、エタンブトール（ＥＢ）、ニューキノロン（ＮＱ）、ピラジナミド（ＰＺＡ）などが知られている。これらの薬剤は、結核菌固有の薬剤特異的な遺伝子（薬剤耐性遺伝子）との作用により結核菌の生育を阻害して結核菌を死滅させる。例えば、ＩＮＨは、結核菌に取り込まれた後、ｋａｔＧ遺伝子がコードする結核菌固有のＩＮＨオキシダーゼ（カタラーゼペルオキシダーゼ）により代謝され、結核菌の生育を阻害する代謝産物を生成する。しかし、薬剤を患者に投与した場合、突然変異によって、投与した薬剤に対する耐性を獲得した薬剤耐性菌が生じることが問題となっている。
【０００４】
薬剤耐性菌は、薬剤耐性遺伝子が変異することにより薬剤耐性を獲得する。例えば、ＩＮＨ耐性菌は、ｋａｔＧ遺伝子が変異しているため、ＩＮＨを取り込んでも結核菌の生育を阻害する代謝産物を十分に生成できない。このため、薬剤耐性遺伝子の変異を検出することにより薬剤耐性菌を検出する方法が開発されている。例えば、結核治療用薬剤に感受性である野生型結核菌およびいずれかの薬剤に耐性を有する変異型結核菌における結核菌ゲノム上の薬剤耐性遺伝子の塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドを固定化した基板を含む結核菌診断キットが開示されている（特許文献１）。現在開発されているＤＮＡマイクロアレイキット「Oligo Array」（日清紡績株式会社）は、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＳＭ、カナマイシン（ＫＭ）、またはＥＢの５つの薬剤に特異的な薬剤耐性遺伝子の変異を検出し得るキットである。
【０００５】
ところで、薬剤耐性菌の中には、薬剤に対して高度の耐性を有する菌と中低度の耐性を有する菌とが存在することが明らかになってきた。薬剤に対する耐性が高度か中低度かによって、薬剤耐性菌による結核を治療する方法が異なるため、結核菌の薬剤に対する耐性度を判定することが好ましい。
【０００６】
従来、結核菌の薬剤耐性度を判定する方法として、ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institute）／ＮＣＣＬＳ（National Committee for Clinical Laboratory Standards）が定める方法がある（非特許文献１）。日本では、この方法に従ったキットとして、「薬剤感受性（抗酸菌）キット  “ニチビー”抗酸菌検査用ウェルパック培地Ｓ」（株式会社日本ビーシージーサプライ製）、「薬剤感受性（抗酸菌）キット  極東  結核菌感受性ビットスペクトル−ＳＲ」（極東製薬工業株式会社製）などが市販されている。しかし、これらのキットを用いて結核菌の薬剤耐性度を判定するには４０日程度の長期間を要する。したがって、より迅速・簡便な判定方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１０３９８１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】G. L. Woodsら、「Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardiae, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard」、NCCLS document M24-A (ISBN 1-56238-500-3)、NCCLS、2003年、第23巻、第18号、p.3-19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、結核菌の薬剤耐性度を迅速・簡便に判定するための新たな手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、結核菌の薬剤耐性度と薬剤耐性遺伝子の変異とが対応づけられることを見出した。そこで、本発明者らは、既知の薬剤耐性遺伝子の変異を有する結核菌が示す薬剤耐性度について作成したデータベースに基づいて、結核菌における薬剤耐性遺伝子の変異を同定するだけで結核菌の薬剤耐性度を迅速・簡便に判定できることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、結核菌の薬剤耐性度を判定するための試験片を提供し、該試験片は、少なくとも１つのプローブが固定されており、該少なくとも１つのプローブは、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、該領域は、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、該変異の位置の塩基は、野生型である。
【００１２】
１つの実施態様では、上記試験片は、さらなるプローブが固定されており、該さらなるプローブは、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、該領域は、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、該変異の位置の塩基は、変異型である。
【００１３】
本発明はまた、結核菌の薬剤耐性度を判定するための試験片を提供し、該試験片は、少なくとも１つのプローブが固定されており、該少なくとも１つのプローブは、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、該領域は、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、該変異の位置の塩基は、変異型である。
【００１４】
１つの実施態様では、上記試験片は、さらなるプローブが固定されており、該さらなるプローブは、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、該領域は、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、該変異の位置の塩基は、野生型である。
【００１５】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子は、イソニアジド耐性遺伝子、リファンピシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、エタンブトール耐性遺伝子、ニューキノロン耐性遺伝子およびピラジナミド耐性遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１６】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子は、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｅｍｂＡ、ｅｍｂＢ、ｅｍｂＣおよびｐｎｃＡからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１７】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子はｋａｔＧであり、上記薬剤耐性遺伝子の変異は、Ｈ９７Ｒ、Ｑ１２７Ｅ、Ｎ１３３Ｔ、Ｍ１７６Ｔ、Ｐ２３２Ｓ、Ｓ３１５Ｒ、Ｓ３１５Ｔ、Ｓ３８３Ｐ、Ｄ４１９Ｈ、Ｍ４２０Ｔ、Ｒ４８９Ｓ、Ｄ５４２Ｈ、Ｒ６３２Ｃ、Δ１９１−１９２、１２４フレームシフトおよび１６０フレームシフトからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１８】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子はｉｎｈＡであり、上記薬剤耐性遺伝子の変異は、ｔ−８ｃおよびｃ−１５ｔからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１９】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子はｒｐｏＢであり、上記薬剤耐性遺伝子の変異は、Ｄ５１６Ｖ、Ｓ５２１Ｌ、Ｈ５２６ＤおよびＨ５２６Ｙからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００２０】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子はｇｙｒＡであり、上記薬剤耐性遺伝子の変異は、Ｇ８８Ｃ、Ａ９０Ｖ、Ｓ９１ＰおよびＤ９４Ｇ／Ａ／Ｈ／Ｎからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００２１】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子はｇｙｒＢであり、上記薬剤耐性遺伝子の変異は、Ｄ４９５Ｎである。
【００２２】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子はｅｍｂＢであり、上記薬剤耐性遺伝子の変異は、Ｍ３０６Ｌ／Ｖ／Ｉ、Ｄ３２８Ｇ／Ｙ、Ｇ４０６Ｃ／Ａ／Ｄ／ＳおよびＱ４９７Ｋ／Ｒからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００２３】
１つの実施態様では、上記薬剤耐性遺伝子はｐｎｃＡであり、上記薬剤耐性遺伝子の変異は、Ｍ１Ｉ、Ａ３Ｅ、Ｌ４Ｓ、Ｌ４Ｗ、Ｉ５Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｖ７Ｆ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｇ、Ｖ９Ａ、Ｖ９Ｇ、Ｑ１０Ｐ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０ｓｔｏｐ、Ｄ１２Ａ、Ｃ１４Ｒ、Ｃ１４Ｙ、Ｇ２３Ｖ、Ａ２５Ｅ、Ｒ２６Ｇ、Ａ２８Ｄ、Ｙ３４Ｄ、Ｙ３４ｓｔｏｐ、Ｌ３５Ｐ、Ｖ４５Ｇ、Ａ４６Ｅ、Ｔ４７Ａ、Ｄ４９Ａ、Ｈ５１Ｐ、Ｈ５１Ｑ、Ｈ５７Ｄ、Ｈ５７Ｐ、Ｆ５８Ｌ、Ｔ６１Ｐ、Ｄ６３Ｈ、Ｙ６４Ｄ、Ｓ６７Ｐ、Ｗ６８Ｇ、Ｗ６８Ｒ、Ｗ６８Ｓ、Ｗ６８ｓｔｏｐ、Ｈ７１Ｐ、Ｔ７６Ｉ、Ｔ７６Ｐ、Ｇ７８Ｄ、Ｌ８５Ｐ、Ｌ８５Ｒ、Ｋ９６Ｅ、Ｋ９６Ｑ、Ｇ９７Ｄ、Ｙ９９Ｄ、Ｙ９９Ｓ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｓ、Ｙ１０３ｓｔｏｐ、Ｗ１１９ｓｔｏｐ、Ｒ１２１Ｐ、Ｖ１２８Ｇ、Ｔ１３５Ｐ、Ｄ１３６Ｎ、Ｄ１３６Ｙ、Ｈ１３７Ｐ、Ｃ１３８Ｒ、Ｃ１３８Ｓ、Ｖ１３９Ａ、Ｖ１３９Ｌ、Ｖ１３９Ｍ、Ｑ１４１Ｐ、Ｑ１４１ｓｔｏｐ、Ａ１４６Ｔ、Ｒ１４８Ｓ、Ｖ１５５Ｇ、Ｌ１５６Ｑ、Ｌ１５９Ｒ、Ｌ１７２Ｐ、Ｖ１８０Ｆ、５３フレームシフト、７５フレームシフト、８０フレームシフト、８８フレームシフト、１２３フレームシフト、１４１フレームシフト、１６２フレームシフト、１６４フレームシフトおよび１７７フレームシフトからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００２４】
本発明はまた、結核菌の薬剤耐性度の判定用キットを提供し、該キットは、上記試験片を含む。
【００２５】
１つの実施態様では、上記キットは、ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬および薬剤耐性遺伝子の増幅用プライマー対を含む。
【００２６】
本発明はさらに、結核菌の薬剤耐性度を判定する方法を提供し、該方法は、該結核菌の薬剤耐性遺伝子を増幅する工程、増幅した薬剤耐性遺伝子を上記試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブとハイブリダイズさせる工程、該薬剤耐性遺伝子がハイブリダイズしたプローブを同定する工程、および同定したプローブの位置から該結核菌の薬剤耐性度を判定する工程を含む。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、結核菌の薬剤耐性度を迅速・簡便に判定することができる。このため、薬剤耐性菌による結核を適切に治療することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】種々の結核菌におけるＩＮＨオキシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明において、結核菌とは、抗酸菌の一種でマイコバクテリウム科マイコバクテリウム属に属する細菌をいう。結核菌としては、例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis；ヒト型結核菌）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis；ウシ型結核菌）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum；アフリカ型結核菌）が挙げられる。
【００３０】
本発明において、薬剤とは、結核を治療するための薬剤をいう。薬剤としては、例えば、イソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＦＰ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、エタンブトール（ＥＢ）、ニューキノロン（ＮＱ）、ピラジナミド（ＰＺＡ）が挙げられる。
【００３１】
本発明において、結核菌の薬剤耐性遺伝子とは、結核治療用薬剤の作用に関連する遺伝子をいう。結核菌の薬剤耐性遺伝子としては、ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＳＭ、ＥＢ、ＮＱ、ＰＺＡの作用にそれぞれ関連するイソニアジド（ＩＮＨ）耐性遺伝子、リファンピシン（ＲＦＰ）耐性遺伝子、ストレプトマイシン（ＳＭ）耐性遺伝子、エタンブトール（ＥＢ）耐性遺伝子、ニューキノロン（ＮＱ）耐性遺伝子、ピラジナミド（ＰＺＡ）耐性遺伝子が挙げられる。
【００３２】
ＩＮＨ耐性遺伝子としては、例えば、ｋａｔＧ（カタラーゼペルオキシダーゼをコードする）、ｉｎｈＡ（エノイルＣｏＡレダクターゼをコードする）が挙げられる。ＲＦＰ耐性遺伝子としては、例えば、ｒｐｏＢ（ＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットをコードする）が挙げられる。ＳＭ耐性遺伝子としては、例えば、ｒｐｓＬ（リボソームタンパク質Ｓ１２をコードする）、ｒｒｓ（１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする）が挙げられる。ＥＢ耐性遺伝子としては、例えば、ｅｍｂＡ、ｅｍｂＢ、ｅｍｂＣ（いずれもアラビノシルインドリルアセチルイノシトール合成酵素をコードする）が挙げられる。ＮＱ耐性遺伝子としては、例えば、ｇｙｒＡ（ＤＮＡジャイレースＡをコードする）、ｇｙｒＢ（ＤＮＡジャイレースＢをコードする）が挙げられる。ＰＺＡ耐性遺伝子としては、例えば、ｐｎｃＡ（ピラジナミダーゼをコードする）が挙げられる。
【００３３】
結核菌の薬剤耐性遺伝子は酵素や薬剤結合タンパク質をコードしており、これらのタンパク質と薬剤との作用により結核菌は生育が阻害され死滅する。薬剤耐性遺伝子の変異が、コードするタンパク質のアミノ酸配列においてアミノ酸の置換、挿入および／または欠損をもたらすと、これらのタンパク質の酵素活性の低下や薬剤結合部位の構造変化などが生じ得る。このような変化により、薬剤耐性遺伝子をコードするタンパク質と薬剤との作用が阻害されると、死滅を免れる薬剤耐性菌が出現する。
【００３４】
例えば、ｋａｔＧ遺伝子はＩＮＨオキシダーゼ（カタラーゼペルオキシダーゼ）をコードしており、ＩＮＨオキシダーゼにより酸化を受けたＩＮＨ代謝産物により結核菌は細胞壁合成が阻害され死滅するが、ｋａｔＧ遺伝子の変異によりＩＮＨオキシダーゼのＩＮＨに対する酸化活性が失われると、ＩＮＨ耐性菌が出願する。
【００３５】
例えば、ｒｐｏＢ遺伝子はＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットをコードしており、ＲＦＰがＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットに結合することにより結核菌はＲＮＡ合成の開始反応が阻害され死滅するが、ｒｐｏＢ遺伝子の変異によりＲＮＡポリメラーゼＢサブユニットのＲＦＰに対する結合活性が失われると、ＲＦＰ耐性菌が出願する。
【００３６】
例えば、ｇｙｒＡ遺伝子はＤＮＡジャイレースＡをコードしており、ＮＱがＤＮＡジャイレースＡに結合することにより結核菌はＤＮＡ複製が阻害され死滅するが、ｇｙｒＡ遺伝子の変異によりＤＮＡジャイレースＡのＮＱに対する結合活性が失われると、ＮＱ耐性菌が出願する。
【００３７】
本発明において、結核菌の薬剤耐性遺伝子の変異としては、例えば、薬剤耐性遺伝子がｋａｔＧ（アクセッション番号：NC_000962 REGION: 2153889..2156111）の場合、例えば、Ｈ９７Ｒ、Ｑ１２７Ｅ、Ｎ１３３Ｔ、Ｍ１７６Ｔ、Ｐ２３２Ｓ、Ｓ３１５Ｒ、Ｓ３１５Ｔ、Ｓ３８３Ｐ、Ｄ４１９Ｈ、Ｍ４２０Ｔ、Ｒ４８９Ｓ、Ｄ５４２Ｈ、Ｒ６３２Ｃ、Δ１９１−１９２、１２４フレームシフト、１６０フレームシフトが挙げられる。
【００３８】
例えば、薬剤耐性遺伝子がｉｎｈＡ（アクセッション番号：NC_000962 REGION: 1674202..1675011）の場合、例えば、ｔ−８ｃ、ｃ−１５ｔが挙げられる。
【００３９】
例えば、薬剤耐性遺伝子がｒｐｏＢ（アクセッション番号：NC_000962 REGION: 759807..763325）の場合、例えば、Ｄ５１６Ｖ、Ｓ５２１Ｌ、Ｈ５２６Ｄ、Ｈ５２６Ｙが挙げられる。
【００４０】
例えば、薬剤耐性遺伝子がｇｙｒＡ（アクセッション番号：NC_000962 REGION: 7302..9818）の場合、例えば、Ｇ８８Ｃ、Ａ９０Ｖ、Ｓ９１Ｐ、Ｄ９４Ｇ／Ａ／Ｈ／Ｎが挙げられる。
【００４１】
例えば、薬剤耐性遺伝子がｇｙｒＢ（アクセッション番号：NC_000962 REGION: 5123..7267）の場合、例えば、Ｄ４９５Ｎが挙げられる。
【００４２】
例えば、薬剤耐性遺伝子がｅｍｂＢ（アクセッション番号：NC_000962 REGION: 4246514..4249810）の場合、例えば、Ｍ３０６Ｌ／Ｖ／Ｉ、Ｄ３２８Ｇ／Ｙ、Ｇ４０６Ｃ／Ａ／Ｄ／Ｓ、Ｑ４９７Ｋ／Ｒが挙げられる。
【００４３】
例えば、薬剤耐性遺伝子がｐｎｃＡ（アクセッション番号：NC_000962 REGION: 2288681..2289241）の場合、例えば、Ｍ１Ｉ、Ａ３Ｅ、Ｌ４Ｓ、Ｌ４Ｗ、Ｉ５Ｎ、Ｖ７Ｄ、Ｖ７Ｆ、Ｄ８Ｅ、Ｄ８Ｇ、Ｖ９Ａ、Ｖ９Ｇ、Ｑ１０Ｐ、Ｑ１０Ｒ、Ｑ１０ｓｔｏｐ、Ｄ１２Ａ、Ｃ１４Ｒ、Ｃ１４Ｙ、Ｇ２３Ｖ、Ａ２５Ｅ、Ｒ２６Ｇ、Ａ２８Ｄ、Ｙ３４Ｄ、Ｙ３４ｓｔｏｐ、Ｌ３５Ｐ、Ｖ４５Ｇ、Ａ４６Ｅ、Ｔ４７Ａ、Ｄ４９Ａ、Ｈ５１Ｐ、Ｈ５１Ｑ、Ｈ５７Ｄ、Ｈ５７Ｐ、Ｆ５８Ｌ、Ｔ６１Ｐ、Ｄ６３Ｈ、Ｙ６４Ｄ、Ｓ６７Ｐ、Ｗ６８Ｇ、Ｗ６８Ｒ、Ｗ６８Ｓ、Ｗ６８ｓｔｏｐ、Ｈ７１Ｐ、Ｔ７６Ｉ、Ｔ７６Ｐ、Ｇ７８Ｄ、Ｌ８５Ｐ、Ｌ８５Ｒ、Ｋ９６Ｅ、Ｋ９６Ｑ、Ｇ９７Ｄ、Ｙ９９Ｄ、Ｙ９９Ｓ、Ｙ１０３Ｈ、Ｙ１０３Ｓ、Ｙ１０３ｓｔｏｐ、Ｗ１１９ｓｔｏｐ、Ｒ１２１Ｐ、Ｖ１２８Ｇ、Ｔ１３５Ｐ、Ｄ１３６Ｎ、Ｄ１３６Ｙ、Ｈ１３７Ｐ、Ｃ１３８Ｒ、Ｃ１３８Ｓ、Ｖ１３９Ａ、Ｖ１３９Ｌ、Ｖ１３９Ｍ、Ｑ１４１Ｐ、Ｑ１４１ｓｔｏｐ、Ａ１４６Ｔ、Ｒ１４８Ｓ、Ｖ１５５Ｇ、Ｌ１５６Ｑ、Ｌ１５９Ｒ、Ｌ１７２Ｐ、Ｖ１８０Ｆ、５３フレームシフト、７５フレームシフト、８０フレームシフト、８８フレームシフト、１２３フレームシフト、１４１フレームシフト、１６２フレームシフト、１６４フレームシフト、１７７フレームシフトが挙げられる。
【００４４】
ここで、例えば、「Ｈ９７Ｒ」とは、薬剤耐性遺伝子がコードするタンパク質の第９７番目のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）に変異したことを意味する。「Ｈ」、「Ｒ」などはアミノ酸の１文字表記である。例えば、「Ｑ１０ｓｔｏｐ」とは、薬剤耐性遺伝子がコードするタンパク質の第１０番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）から終止コドンに変異したことを意味する。例えば、「ｔ−８ｃ」とは、薬剤耐性遺伝子のコード領域を基準にして（開始コドンａｔｇのａを１位として）−８位の塩基がチミン（ｔ）からシトシン（ｃ）に変異したことを意味する。「ｔ」、「ｃ」などは塩基の表記である。例えば、「Δ１９１−１９２」とは、薬剤耐性遺伝子がコードするタンパク質の第１９１〜１９２番目のアミノ酸が欠損したことを意味し、「１２４フレームシフト」とは、薬剤耐性遺伝子のコード領域の第１２４番目のコドンに塩基の挿入または欠損が生じ、その後にコードされているアミノ酸が変化する変異を意味する。
【００４５】
結核菌の薬剤耐性遺伝子の変異は、上記のような既知の変異に制限されず、未知の変異でもよい。未知の変異を同定する方法は特に制限されない。例えば、薬剤耐性菌より薬剤耐性遺伝子をＰＣＲ法などにより単離して遺伝子の塩基配列を解読し、次いで解読した遺伝子の塩基配列と野生型の薬剤耐性遺伝子の塩基配列とを比較することにより変異を同定する方法が挙げられる。
【００４６】
本発明では、結核菌の薬剤耐性度を薬剤耐性遺伝子の変異と対応づける。このために、薬剤耐性遺伝子に変異を有する結核菌の薬剤耐性度を判定する。
【００４７】
本発明において、結核菌の薬剤耐性度とは、結核菌が薬剤存在下で死滅しない程度をいう。薬剤耐性度を区分する方法は、特に制限されないが、簡便な方法が好ましい。簡便な方法としては、例えば、結核菌が耐性を示す薬剤の濃度により薬剤耐性度を区分する方法が挙げられる。例えば、高濃度の薬剤存在下で死滅しない結核菌と、高濃度の薬剤存在下では死滅するが低濃度の薬剤存在下では死滅しない結核菌とを区分する方法が挙げられる。例えば、１．０μｇ／ｍＬの薬剤存在下で死滅しない結核菌と、１．０μｇ／ｍＬの薬剤存在下では死滅するが０．２μｇ／ｍＬの薬剤存在下では死滅しない結核菌とを区分する方法が挙げられる。区分（薬剤濃度）の数は、特に制限されないが、２〜３が好ましい。
【００４８】
本発明において、結核菌の薬剤耐性度を判定する方法は、特に制限されないが、標準的な方法が好ましい。標準的な方法としては、例えば、ＣＬＳＩ（Clinical and Laboratory Standards Institute）／ＮＣＣＬＳ（National Committee for Clinical Laboratory Standards）が定める方法が挙げられる。例えば、日本では、この方法に従ったキットとして、「薬剤感受性（抗酸菌）キット  “ニチビー”抗酸菌検査用ウェルパック培地Ｓ」（株式会社日本ビーシージーサプライ製）、「薬剤感受性（抗酸菌）キット  極東  結核菌感受性ビットスペクトル−ＳＲ」（極東製薬工業株式会社製）が市販されている。これらのキットでは、各種薬剤濃度の存在下または非存在下にて結核菌を培養し、一定期間の培養後に、例えば、目視により結核菌の生死を確認することができる。
【００４９】
（プローブ）
本発明のプローブは、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、該領域は、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、該変異の位置の塩基は、野生型である（以下、「野生型プローブ」という場合がある）。野生型プローブは、変異が起こり得る塩基配列からなる領域が変異を有する場合には、これらの領域にハイブリダイズできない。野生型プローブの長さは、ハイブリダイズさせる条件にもよるが、一般的には１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２６ヌクレオチド長である。
【００５０】
本発明のプローブはまた、薬剤耐性遺伝子の任意の領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなり、該領域は、結核菌の薬剤耐性度と対応づけられた変異の位置を有し、該変異の位置の塩基は、変異型である（以下、「変異型プローブ」という場合がある）。変異型プローブは、変異が起こり得る塩基配列からなる領域が変異を有さない場合には、これらの領域にハイブリダイズできない。変異型プローブの長さは、ハイブリダイズさせる条件にもよるが、一般的には１０〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１２〜２６ヌクレオチド長である。変異型プローブにおける変異の位置は、変異を確実に識別するために、変異型プローブを構成するオリゴヌクレオチドの中央近辺が好ましい。
【００５１】
本発明では、野生型プローブと変異型プローブとを併せて用いてもよい。
【００５２】
上記の各プローブは、標準的なプログラムおよびプライマー解析ソフトウェア、例えば、Primer Express（Perkin Elmer社）を用いることにより設計することができ、自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーなどの標準的な方法を用いて合成することができる。
【００５３】
さらに、各プローブは、以下で詳述するように、試験片に固定するために５’または３’末端のいずれか一方が修飾されていてもよい。
【００５４】
（試験片）
本発明の試験片は、少なくとも１つのプローブが固定されている。少なくとも１つのプローブは野生型プローブであり、好ましくは変異型プローブがさらに固定されている。あるいは、少なくとも１つのプローブは変異型プローブであり、好ましくは野生型プローブがさらに固定されている。
【００５５】
本発明の試験片は、上記プローブを担体表面に一定間隔で固定して作製することができ、複数のプローブを固定する場合は、プローブ毎に担体表面を区切って固定する。担体としては、例えば、ビニル系ポリマー、ナイロン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロースなどの有機材料；ガラス、シリカなどの無機材料；金、銀などの金属材料が挙げられるが、特に限定されない。成形加工性が容易である点で、有機材料が好ましく、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類がより好ましい。担体は、以下の薬剤耐性度を判定する方法において発色法を用いる場合には、発色を視認しやすくするために白色であることが好ましい。
【００５６】
プローブを担体表面に固定する方法としては、物理的方法および化学的方法が挙げられる。物理的方法は特に制限されない。例えば、担体表面をポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で被覆する方法、担体表面が金などの金属材料である場合には、２−アミノエタンチオールなどのアミノ基を有するチオールまたはジスルフィド化合物などで担体表面を処理する方法が挙げられる。これらの方法は、ポリアニオンであるプローブとの静電相互作用を利用するため、固定効率を上げることができる。さらに、プローブの末端に無関係な塩基配列（ポリチミン鎖など）を付加し、固定されるプローブ自体の分子量を増大させることによって、固定効率を上げることもできる。例えば、ポリチミン付加オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、ディスペンサを用いてニトロセルロース膜上に吐出し、次いでニトロセルロース膜に紫外線を照射することによって、比較的容易にプローブを固定することができる。具体的には、各プローブを含む溶液をそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．５〜１．０μＬ／分の量で吐出させながら、２．５〜８．５ｍｍ／秒の塗布速度で、それぞれ一定の間隔をあけてニトロセルロース膜上に塗布すると、各プローブが一定の間隔で並んだ約１〜２ｍｍの幅のストライプが形成される。このプローブのストライプが形成されたニトロセルロース膜に紫外線を照射することによって、プローブがニトロセルロース膜表面に固定される。さらに、必要に応じて、これらのストライプを横断するように細く切断すると、各プローブが順に固定された多数の試験片を一挙に得ることができる。
【００５７】
化学的方法は特に制限されない。例えば、担体の材料がガラス、シリコンなどの無機材料である場合には、プローブの末端をトリメトキシシラン、トリエトキシシランなどのシランカップリング反応が可能な官能基で修飾し、担体を、修飾プローブを含む溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄する方法が挙げられる。あるいは、担体を、アミノエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤で処理することにより、担体の表面をアミノ化し、次いで末端にカルボン酸を導入したプローブとアミノカップリング反応させる方法が挙げられる。担体の材料が金、銀などの金属材料である場合には、プローブの末端をチオール基、ジスルフィド基などの金属と結合可能な官能基で修飾し、担体を、修飾プローブを含む溶液に２４〜４８時間浸漬し、取り出した後、洗浄する方法が挙げられる。
【００５８】
プローブを担体表面に固定する方法としては、合成したプローブを固定する方法以外に、リソグラフィー技術などを利用して、プローブを担体表面上で合成する方法が挙げられる。
【００５９】
（結核菌の薬剤耐性度を判定する方法）
本発明の、結核菌の薬剤耐性度を判定する方法は、該結核菌の薬剤耐性遺伝子を増幅する工程、増幅した薬剤耐性遺伝子を上記試験片と接触させて、該試験片に固定されたプローブにハイブリダイズさせる工程、該薬剤耐性遺伝子がハイブリダイズしたプローブを同定する工程、および同定したプローブの位置から該結核菌の薬剤耐性度を判定する工程を含む。
【００６０】
１．検体
本発明において、検体とは、薬剤耐性度を判定する対象となる結核菌を含む物質をいう。検体としては、例えば、喀痰、咽頭ぬぐい液、胃液、気管支肺胞洗浄液、気管内吸引物、喉からの拭取物および／または組織生検物などの体液、ならびにこれらから培養して得られた結核菌自体が挙げられる。
【００６１】
２．検体の前処理（ＤＮＡの抽出）
上記検体の前処理として、検体からＤＮＡを抽出する。検体からＤＮＡを抽出方法は特に制限されない。例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシナネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法が挙げられる。
【００６２】
３．薬剤耐性遺伝子の増幅
薬剤耐性遺伝子を増幅する方法は特に制限されない。例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法が挙げられる。各方法において、薬剤耐性遺伝子を増幅するための条件は適宜設定される。例えば、薬剤耐性遺伝子をＰＣＲ法により増幅する場合、対象となる薬剤耐性遺伝子の変異を有する塩基配列からなる領域を増幅できるように、プライマー対を設計すればよい。好ましくは、すべての変異をカバーできる薬剤耐性遺伝子の領域を増幅できるように、より好ましくは、薬剤耐性遺伝子のコーディング領域を増幅できるようにプライマー対を設計すればよい。例えば、ＩＮＨ耐性遺伝子ｋａｔＧをＰＣＲ法により増幅する場合、プライマー対としては、例えば、ｋａｔＧ遺伝子のコーディング領域の上流および下流の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。例えば、以下の実施例に記載の配列番号７および８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６３】
４．結核菌の薬剤耐性度の判定
増幅した薬剤耐性遺伝子を上記試験片と接触させて、試験片に固定されたプローブとハイブリダイズさせる方法は特に制限されない。例えば、増幅した薬剤耐性遺伝子を含む溶液に試験片を一定時間浸漬する方法が挙げられる。浸漬中の温度などの条件は、非特異的なハイブリダゼーションの抑制などを考慮して適宜設定される。
【００６４】
薬剤耐性遺伝子がハイブリダイズしたプローブを同定する方法は特に制限されない。例えば、薬剤耐性遺伝子をＰＣＲ法により増幅する際に、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質で修飾したプライマー対を用い、薬剤耐性遺伝子に付加されたこれらの標識物質を検出する方法が挙げられる。あるいは、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質などの標識物質でプローブを修飾し、これらの標識物質を手がかりに薬剤耐性遺伝子がハイブリダイズしたプローブを検出する方法が挙げられる。標識物質を検出する方法は特に制限されない。例えば、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）発色法が挙げられる。
【００６５】
具体的には、薬剤耐性遺伝子をＰＣＲ法により増幅する際に、３’または５’末端をビオチンで修飾したプライマー対を用いる。次いで、増幅した末端にビオチンを有する遺伝子を含む溶液に試験片を浸漬する。この工程で、薬剤耐性遺伝子は試験片に固定されたプローブとハイブリダイズし得る。次いで、試験片を洗浄し、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを含む溶液に浸漬する。この工程で、試験片に固定されたプローブとハイブリダイズした薬剤耐性遺伝子にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンが結合する。次いで、洗浄した試験片にＮＢＴ／ＢＣＩＰを添加し、アルカリホスファターゼの反応による発色を検出する。この発色は視認可能である。発色の有無をより明確にするために、野生型プローブと変異型プローブとで発色の差異を確認してもよい。
【００６６】
同定した薬剤耐性遺伝子がハイブリダイズしたプローブの位置から、いずれのプローブにハイブリダイズしたかがわかる。各プローブは結核菌の薬剤耐性度と対応づけられているため、検体中の結核菌の薬剤耐性度を判定することができる。
【００６７】
（結核菌の薬剤耐性度の判定用キット）
本発明のキットは、上記の試験片を含む。好ましくは、結核菌の薬剤耐性度を判定するために適切な任意の試薬類を含み得る。試薬類としては、例えば、ＤＮＡ抽出用試薬、遺伝子増幅用試薬、ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬が挙げられる。遺伝子増幅用試薬は、薬剤耐性遺伝子の増幅用プライマー対も含み得る。ハイブリダイズしたプローブの検出用試薬としては、例えば、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色法の場合、ビオチン、ストレプトアビジン修飾アルカリホスファターゼ、ＮＢＴおよびＢＣＩＰが挙げられる。
【実施例】
【００６８】
以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６９】
（実施例１：結核菌のＩＮＨ耐性度の判定）
表１に示す結核菌の野性菌株およびＩＮＨ耐性遺伝子ｋａｔＧに変異を有する変異菌株を国立国際医療センターより入手した。
【００７０】
【表１】
2011087465.tif 000002
【００７１】
ＣＬＳＩ／ＮＣＣＬＳ法として汎用されている極東製薬工業株式会社製「薬剤感受性（抗酸菌）キット  極東  結核菌感受性ビットスペクトル−ＳＲ」を用いて、キットに添付の方法に従って、入手した菌株のＩＮＨに対する耐性度を判定した。
【００７２】
１．前培養
極東１％小川培地（リン酸二水素カリウム１ｇ、グルタミン酸ナトリウム１ｇ、蒸留水１００ｍＬ、全卵液２００ｍＬ、グリセリン６ｍＬ、２％マラカイトグリーン６ｍＬ、ｐＨ６．５）上に発育した菌コロニーを白金耳にて採取し、１２ｍＬ容量の滅菌試験管内に含有される４ｍＬの前培養用液体培地（極東製薬工業株式会社製「マイコブロス」）に懸濁させた。この試験管を３７℃にて静置し、試験管内の菌を増殖させた。５３０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ（５３０ｎｍ））が０．１（菌体濃度１ｍｇ／ｍＬ相当）以上に達するまで菌を培養した。
【００７３】
２．菌液の調製
前培養後の試験管内の菌液を撹拌し、菌塊が沈むまで約１５分間試験管を静置した。次いで、試験管内の菌液の上層を滅菌蒸留水により希釈して、ＯＤ（５３０ｎｍ）が０．１となる菌液を調製した。この菌液０．５ｍＬを、５０ｍＬ容量の滅菌試験管内に含有される４．５ｍＬの滅菌蒸留水に添加し、混合して１０倍希釈菌液とした。さらに、１０倍希釈菌液０．１ｍＬを、５０ｍＬ容量の滅菌試験管内に含有される１０ｍＬの滅菌蒸留水に添加し、混合して１０００倍希釈菌液とした。
【００７４】
３．本培養
キットのマイクロタイタープレートの培地密封用テープを剥がし、蓋を取り外した。次いで、キットに付属の専用ドロッパーを用いて、上記１０倍希釈液を「Ｃ＋」のウェルおよびＩＮＨを０．２μｇ／ｍＬまたは１．０μｇ／ｍＬの濃度で含有するウェルに１滴（約０．０２ｍＬ）ずつ添加し、上記１０００倍希釈液を「Ｃ１／１００」のウェルに１滴（約０．０２ｍＬ）ずつ添加し、そして滅菌蒸留水を「Ｃ−」のウェルに１滴（約０．０２ｍＬ）ずつ添加した。次いで、マイクロタイタープレート上のウェル周辺部に配置された濾紙に１〜２ｍＬの滅菌蒸留水を添加した後、マイクロタイタープレートに蓋をし、蓋の縁とマイクロタイタープレートとの隙間をテープで密封した。このマイクロタイタープレートを３７℃にて静置して本培養を開始した。
【００７５】
４．判定
本培養開始後７日目、１０日目および１４日目にマイクロタイタープレートを観察し、「Ｃ＋」のウェルの３／４以上でウェル内の液体が赤く呈色している時点で判定を行った。判定では、「Ｃ−」、「Ｃ＋」および「Ｃ１／１００」の呈色をそれぞれ「０」、「４＋」および「１＋」とし、ＩＮＨを０．２μｇ／ｍＬまたは１．０μｇ／ｍＬの濃度で含有するウェルの呈色を「Ｃ−」、「Ｃ＋」および「Ｃ１／１００」のウェルの呈色と比較して「０」〜「４＋」でスコア化した。スコアが「０」または「１＋」の場合を感受性とし、「２＋」〜「４＋」の場合を耐性とした。そして、ＩＮＨを１．０μｇ／ｍＬの濃度で含有するウェルが耐性を示す１．０μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度、およびＩＮＨを１．０μｇ／ｍＬの濃度で含有するウェルは感受性を示すがＩＮＨを０．２μｇ／ｍＬの濃度で含有するウェルは耐性を示す０．２μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度とした。判定の結果を表２に示す。判定した菌株は、１．０μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度および０．２μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度に分類できた。
【００７６】
【表２】
2011087465.tif 000003
【００７７】
（参考例：ＩＮＨ耐性遺伝子がコードするＩＮＨオキシダーゼの活性測定）
ＩＮＨ耐性遺伝子ｋａｔＧがコードするＩＮＨオキシダーゼの活性が、ｋａｔＧの変異によってどのように影響を受けるかを検討した。野生型ｋａｔＧおよび変異型ｋａｔＧを上記表１に示す結核菌の野生菌株および変異菌株から、以下に示すプライマー対を用いて、それぞれＰＣＲ法により単離し、発現ベクターpTrcHis2-TOPO（インビトロジェン社製）のマルチクローニングサイトにＴＡライゲーションを介して挿入した。
【００７８】
プライマー１：CCCGAGCAACACCCACCCATTACAGAAAC（配列番号１）
プライマー２：TCAGCGCACGTCGAACC（配列番号２）
【００７９】
pTrcHis2-TOPOは、マルチクローニングサイトに挿入されるＤＮＡによりコードされるタンパク質のＣ末端にｃ−ｍｙｃタグおよび６×Ｈｉｓタグを付加できるベクターであるが、挿入したｋａｔＧは終止コドンを有するので、ｋａｔＧがコードするＩＮＨオキシダーゼにこれらのタグは付加されない。次いで、生成したプラスミドにより、常法に従って大腸菌ΔｋａｔＧ株（国立国際医療センター研究所・感染症制御研究部所有）を形質転換した。形質転換大腸菌を培養し、培養開始から３時間後に培地にＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を添加することにより大腸菌内でｋａｔＧを過剰発現させ、培養開始から５時間後に大腸菌を回収した。回収した大腸菌を超音波（株式会社トミー精工製超音波発生機ＵＲ−２０Ｐを用いて、ｐｏｗｅｒ９にて３０秒間超音波処理および６０秒間冷却のサイクルを５回繰り返した）により破砕した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間、４℃：エッペンドルフ社製Centrifuge5415R）に供し、上清を以下の測定に用いた。
【００８０】
上清の総タンパク質をＢＣＡアッセイ（BCA Protein Assay Kit：Thermo Scientific社製）で定量し、上清のＩＮＨオキシダーゼ活性をWeiら、Antimicrob. Agents Chemother.、2003年、第47巻、p. 670-675を参考にして測定した。ＩＮＨオキシダーゼ活性は、Ｈ２Ｏ２存在下でのＩＮＨの酸化によるフリーラジカル発生に伴うＮＢＴ（Nitroblue Tetrazolium）の還元を５６０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ（５６０ｎｍ））により分光学的に測定することができる。
【００８１】
具体的には、全量が１ｍＬとなるように、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、２００μｇの総タンパク質に相当する上清、最終濃度が０．２ｍＭとなるＮＢＴ（シグマ社製）、５ｍｇのグルコースオキシダーゼ（シグマ社製）、最終濃度が４ｍＭとなるグルコース、および最終濃度が９ｍＭとなるＩＮＨ（シグマ社製）を添加し、室温にて混合した。この混合液のＯＤ（５６０ｎｍ）を分光光度計により２００秒間測定した。各上清につき測定を３回実施し、平均値±標準偏差を算出した。ＯＤ（５６０ｎｍ）の経時変化を図１に示す。
【００８２】
図１より、ｋａｔＧがコードするＩＮＨオキシダーゼの活性は、ｋａｔＧの変異に応じて、「野生型と同程度の活性」、「野生型より低い活性」および「ほとんど活性なし」の３つの区分に分けることができ、これらの区分はそれぞれ、表２に示すｋａｔＧの変異に応じた結核菌のＩＮＨに対する耐性度の「耐性なし」、「０．２μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度」および「１．０μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度」の区分に完全に対応することがわかった。
【００８３】
（実施例２：結核菌のＩＮＨ耐性度を判定するための試験片の作製）
１．プローブの合成
以下に示す、ＩＮＨ耐性遺伝子ｋａｔＧの１．０μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度と対応づけられたＳ３１５Ｔ変異、および０．２μｇ／ｍＬのＩＮＨ耐性度と対応づけられたＨ９７Ｒ変異をそれぞれ検出し得る野生型プローブ１および２とそれぞれに対応する変異型プローブ１および２を作製する。
【００８４】
野生型プローブ１：GCGATCACCAGCGGCATCGA（配列番号３）
野生型プローブ２：GACTACGGCCACTACGGGCC（配列番号４）
変異型プローブ１：GCGATCACCACCGGCATCGA（配列番号５）
変異型プローブ２：GACTACGGCCGCTACGGGCC（配列番号６）
【００８５】
２．プローブの固定
上記各プローブの５’末端にターミナルトランスフェラーゼ（Promega社製）を用いて、ポリチミンの付加を行う。具体的には、ターミナルトランスフェラーゼ（３０ｕｎｉｔ／μＬ）を０．４μＬ、チミジン三リン酸（１０ｐｍｏｌ／μＬ）を２μＬ、オリゴヌクレオチドプローブ（５０ｍＭ）を２μＬ、製品添付の反応緩衝液を２μＬ、および精製水３．６μＬを混合して反応溶液を調製し、３７℃で４時間反応させた後、反応溶液に１０×ＳＳＣ緩衝液９０μＬを添加することにより、ポリチミンが付加されたオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液（１ｐｍｏｌ／μＬ）を得る。
【００８６】
次いで、ポリチミンが付加された各プローブを含む溶液をそれぞれ２４ゲージの針を備えたディスペンサに入れ、０．７μＬ／分の量で吐出させながら、２．５ｍｍ／秒の塗布速度で、２ｍｍの幅のストライプになるようにニトロセルロース膜（縦７５ｍｍ×横１５０ｍｍ：Whatman社製）上に２ｍｍ間隔で縦方向に塗布する。次いで、これらのニトロセルロース膜に３１２ｎｍの紫外線を２分間照射して、プローブをニトロセルロース膜に固定する。次いで、ニトロセルロース膜を、すべてのストライプを含むように切断して、５ｍｍ×１５０ｍｍの試験片を作製する。
【００８７】
（実施例３：ＩＮＨ耐性度判定用試験片を用いた結核菌のＩＮＨ耐性度の判定）
１．ｋａｔＧ遺伝子の増幅
本実施例では、野生菌株、１．０μｇ／ｍＬのＩＮＨに耐性を有するＳ３１５Ｔ変異菌株、および０．２μｇ／ｍＬのＩＮＨに耐性を有するＨ９７Ｒ変異菌株を検体として用い、これらの菌株のＩＮＨ耐性度を実施例２で作製した試験片を用いて判定する。
【００８８】
検体のＩＮＨ耐性遺伝子ｋａｔＧを、配列番号７に記載の塩基配列からなるプライマー３、配列番号８に記載の塩基配列からなりかつ５’末端にビオチンを結合させたプライマー４、およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いるＰＣＲ法により増幅する。
【００８９】
プライマー３：CAACTCCTGGAAGGAATGCT（配列番号７）
プライマー４：GCAGGGCCGATCAACCCGAA（配列番号８）
【００９０】
ＰＣＲの反応条件は、変性工程を９４℃、３０秒、アニール工程を５５℃、２０秒、鎖伸長工程を７２℃、２０秒とし、これらの工程を３０サイクル行って、ｋａｔＧ遺伝子を増幅する。増幅した遺伝子の末端にはビオチンが結合している。
【００９１】
２．ハイブリダイズしたプローブの検出
増幅した遺伝子を含む溶液１０μＬに、水酸化ナトリウム（５Ｍ）、エチレンジアミン四酢酸（０．０５Ｍ）の溶液（１０μＬ）を添加してよく攪拌し、５分間放置して、増幅した遺伝子を１本鎖に変性する。この溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（０．０１ｗ／ｖ％）、塩化ナトリウム（１．８ｗ／ｖ％）、クエン酸ナトリウム（１．０ｗ／ｖ％）の溶液（１ｍＬ）、および実施例２で作製した試験片を添加し、混合液を６２℃にて３０分間振盪させる。次いで、混合液から試験片を取り出し、洗浄後、試験片にアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを添加し、さらにニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼｐ−トルイジニル塩（ＢＣＩＰ）を添加して、試験片を発色させる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、結核菌の薬剤耐性度を迅速・簡便に判定することができる。このため、薬剤耐性菌による結核を適切に治療することが可能となる。結核治療の適切な実施は、患者や医者の負担を軽減するだけでなく、社会全体の医療費の抑制に貢献する。
【図１】
2011087465.tif 000004
【配列表】
2011087465000001.app