(57)【要約】【課題】  生体細胞などの培養作業において、高コントラストの顕微鏡観察に好適な培養容器を提供する。【解決手段】  培養容器１０は容器本体１１および蓋体１２を備え、容器本体１１は平板状の底部１１ａと円筒状の側部１１ｂが一体構造に形成される。蓋体１２は容器本体１１を施蓋する蓋天部１２ａと、容器本体１１に嵌め合うように形成される蓋側壁部１２ｂを備える。そして、底部１１ａの中央領域に設けられた本体開口部１１ｃが第１板状ガラス１３により閉塞されている。それに対向して蓋天部１２ａに設けられた蓋体開口部１２ｃが第２板状ガラス１４により閉塞されている。ここで、第２板状ガラス１４には、第１板状ガラス１３の対向面である第２板状ガラス下面１４ｂに親水性ポリマー層が形成されている。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被培養物を収容する培養容器であって、
その底部が平板状でありその側部が筒状になり上方向に開いた容器本体と、
前記容器本体を上方向から閉蓋する蓋体と、を有し、
前記容器本体の底部の前記被培養物が収容される領域は光透過性の第１の平板ガラスにより形成され、前記蓋体のうちで前記第１の平板ガラスに対向する領域は光透過性の第２の平板ガラスにより形成されていることを特徴とする培養容器。
【請求項２】
前記第２の平板ガラスにおいて、前記第１の平板ガラスに対向する面に親水性ポリマー層が形成されていることを特徴とする請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
前記第１の平板ガラスおよび第２の平板ガラスはホウケイ酸ガラス材、石英ガラス材およびソーダライムガラス材のうちのいずれかからなり、前記親水性ポリマーはリン脂質ポリマーであることを特徴とする請求項１又は２に記載の培養容器。
【請求項４】
前記容器本体および前記蓋体は、前記第１の平板ガラスおよび第２の平板ガラスを除いて、それぞれ樹脂材が一体成形された構造になっていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば生体細胞、生物組織片、微生物などの被培養物の顕微鏡観察に適した培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体細胞等の培養は、被培養物が収容された例えばシャーレ等の培養容器を用い、一般にいわゆるインキュベータといわれる所定の温度、雰囲気ガスに制御されたチャンバー内に上記培養容器が載置されて行われる。そして、適宜にインキュベータから培養容器が取り出され、その被培養物の培養状態を検査するために顕微鏡を用いた観察が行われる。
【０００３】
従来、上記培養容器として例えばシャーレのように高い光透過性の平板状の底部と筒状の側部を有する容器本体、この本体を上方から施蓋する蓋体とからなる容器が用いられている。ここで、蓋体はその閉蓋状態において容器本体を密閉しないように隙間を生じ、容器本体の培地がこの隙間を通してインキュベータ内の例えば酸素と所定濃度の二酸化炭素等の雰囲気ガスに通気する構造になっている。このような培養容器には、その他に複数の囲繞部が例えばマトリクス状に配置されてなるマイクロプレートやマルチウェルプレート等といわれる容器がある。以下、このような培養容器を従来型培養容器と呼称する。
【０００４】
従来型培養容器としては、以前は、例えばガラス蓋付きの皿状ガラス容器であるシャーレが用いられてきたが、近年では、その培養容器は例えばポリスチレンのような光透過性を有する合成樹脂材により形成されるようになっている。これは、合成樹脂材が安価でその成形が容易であり、所望の形状の培養容器が低コストに製造できるからである。しかも、この合成樹脂製の培養容器は、生体の細胞や組織片などの付着を容易にする表面処理の作業も円滑に行うことができ、顕微鏡観察に適する平面性の確保も容易である。
【０００５】
また、近年では、培養容器の少なくとも底部を光透過性が高く自己蛍光の低い材料、例えば合成石英で構成し、容器内の被培養物を、高倍率及び高感度に観察または測定できるようにした培養容器が提案されている（例えば特許文献１）。
【０００６】
一方、微分干渉顕微鏡などを使用し、培養容器内の細胞や組織片などを、より高倍率、高コントラストで観察をする必要が生じてきている。ところが、合成樹脂材からなる上記従来型培養容器を用いてかかる要請に応えようとしても、所望する微分干渉顕微鏡観察は難しい。これは、光路途中に容器の樹脂材料が介在すると、成型上不可避的に生じてしまう樹脂の歪によって、微分干渉顕微鏡にとって重要な照射光の振動面が、撹乱されてしまうためである。
【０００７】
特許文献１の培養容器でも、依然として、蓋については従来の樹脂製であり、かかる問題は解消されない。
【０００８】
蓋体に樹脂ではなく、ガラスを用いる生化学用容器として、蓋体を構成する上部部材の窓部が石英ガラスからなる容器（例えば特許文献２）や、ウェルを備えた容器上面を、板ガラスとその板ガラスを補強するために板ガラス周囲に取り付けられた枠体により構成されている蓋体で覆う容器（例えば特許文献３）が提示されている。
【０００９】
特許文献２では、蓋体を構成する上部部材の窓部が石英ガラスからなり、容器本体を構成するシャーレの窓部がカバーガラスからなる構造の培養容器が開示されている。ここで、上部部材は、その窓部がシャーレの内部に突出して、その内部に収容された培養液と接するようになる。この場合、例えば一部の蒸発した培養液あるいは雰囲気ガス等が結露することから生じる窓部の曇りは、窓部が培養液に接することにより容易に回避される。
【００１０】
また、特許文献３では、蓋体が板ガラスおよびこの板ガラスの周囲に取り付けられた枠体により構成され、容器本体が多数のウェルを備えた光透過性のガラスからなるマイクロプレートになる例が開示されている。ここで、上記蓋体の内面に形成され易い雰囲気ガス等の結露による曇りを防止するため、親水性ポリマーとシリコンアルコキシドの重合物を板ガラスの下面に含浸させたり、板ガラスの下面に表面加工を施して微細な凹凸を形成する。なお、板ガラス表面の凹凸は親水性を高めるように働くものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第３５２９０１４号公報
【特許文献２】特許第３４２７１０５号公報
【特許文献３】特開２００６−１９１８３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ガラス材は、樹脂材と比較してその平面性を確保しながらより薄い肉厚に加工でき、また低蛍光でもあることから、特許文献２，３に提示された培養容器は、顕微鏡の光路が樹脂製のものに較べ高倍率・高感度の顕微鏡観察を容易にする。特に、特許文献２に開示されている培養容器は、被培養物に照明光を投射するためのコンデンサレンズあるいは顕微鏡の対物レンズを培地に近づけることが容易な構造であり、焦点深度が浅い高倍率の場合にも充分に対応できるようになる。しかしながら、この場合、蓋体を構成する上部部材の窓部が突出して培養液に接する構造になるために、インキュベータ内での培養あるいは顕微鏡観察において、培地への雰囲気ガスのガス交換効率が、従来型培養容器と比較して、相対的に低下するという不具合がある。
【００１３】
そして、特許文献３に提示された蓋体を有する培養容器では、例えば微分干渉顕微鏡のような高いコントラストにできる顕微鏡において、観察対象である被培養物の解像度が向上し難いという不具合が生じる。これは、上述したような結露による曇りを防止するために含浸させた親水性ポリマーとシリコンアルコキシドの重合物、板ガラスの下面に施した微細な凹凸によって、微分干渉顕微鏡における直線偏光の振動面が乱され易くなるからである。
【００１４】
本発明は、上述の事情に鑑みてなされたもので、培養等における雰囲気ガスのガス交換効率を低下させることなく、しかも、特に高コントラストの顕微鏡観察に好適な培養容器を提供することを目的とする。そして、培養操作における作業効率を向上させる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、これまでにガラス材、樹脂材、防曇剤等の種々の材料の可視光における偏光について検討を行ってきた。その中で、非晶質無機材からなり、歪の少ない板状ガラスの場合、高分子からなる樹脂性部材あるいは防曇部材等に較べて偏光が小さく、例えば微分干渉顕微鏡のような高いコントラストの顕微鏡における解像度が向上することを見出した。また、板状ガラスを培養容器に適用する場合に、板状ガラスの平面性を高くしその表面に極薄の親水性ポリマー層を形成することが、結露を防止し、観察像の明度の向上に有効になることを見出した。本発明はこのような知見に基づいてなされている。
【００１６】
すなわち、上記目的を達成するために、本発明にかかる培養容器は、被培養物を収容する培養容器であって、その底部が平板状でありその側部が筒状になり上方向に開いた容器本体と、前記容器本体を上方向から閉蓋する蓋体と、を有し、前記容器本体の底部の前記被培養物が収容される領域は光透過性の第１の平板ガラスにより形成され、前記蓋体のうちで前記第１の平板ガラスに対向する領域は光透過性の第２の平板ガラスにより形成されている、構成になっている。ここで、前記第２の平板ガラスにおいて、前記第１の平板ガラスに対向する面に親水性ポリマー層が形成される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の構成により、被培養物の培養における雰囲気ガスのガス交換効率が低下することなく、例えば微分干渉顕微鏡のような高いコントラストの顕微鏡による被培養物の観察においてその解像度が向上する。そして、本発明にかかる培養容器を用いることにより、培養操作における培養あるいは顕微鏡観察等の作業効率が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施形態にかかる顕微鏡観察に適した培養容器の一例を閉蓋状態のもとに示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ矢視断面図である。
【図２】本発明の実施形態にかかる顕微鏡観察に適した培養容器の本体における他例を示す図１（ａ）のＸ−Ｘ矢視の略断面図である。
【図３】本発明の実施形態にかかる顕微鏡観察に適した培養容器の蓋体における他例を示す図１（ａ）のＸ−Ｘ矢視の略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施形態にかかる顕微鏡観察に適した培養容器について図１を参照して説明する。ここで、図１は本実施形態にかかる培養容器の一例を閉蓋状態のもとに示す図であり、（ａ）はその平面図、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ矢視の断面図である。以下、互いに同一または類似の部分には共通の符号を付して、重複説明は一部省略される。ただし、図面は模式的なものであり、各寸法の比率等は現実のものとは異なる。
【００２０】
図１に示すように、培養容器１０は、通常の細胞培養用シャーレのような従来型培養容器であり、容器本体１１および蓋体１２を備えている。容器本体１１は、上方に開いた有底円筒状の構造であり、例えば中央領域が円形状にくり抜かれた底部１１ａと円筒状の側部１１ｂが、例えばポリスチレンなどの合成樹脂の成形により一体構造に形成されている。そして、上記円形状にくり抜かれて設けられる本体開口部１１ｃは、第１板状ガラス上面１３ａおよび第１板状ガラス下面１３ｂを有する例えば円盤状の非晶質素材からなる第１板状ガラス１３により下方から閉塞されている。
【００２１】
ここで、被培養物（図示せず）は、通常液体培地中で、第１板状ガラス上面１３ａ上に培養されるようになっている。また、底部１１ａの外底面１１１ａは凹陥状になっており、第１板状ガラス１３はその第１板状ガラス下面１３ｂが上記外底面１１１ａにより形成される凹陥部内に位置するように取り付けられる。このようにして、第１板状ガラス１３は上記凹陥状の外底面１１１ａにより培養容器の外部から保護される。
【００２２】
蓋体１２は、容器本体１１の上方から着脱自在に施蓋する略円板状の部材からなる蓋天部１２ａと、容器本体１１の側部１１ｂの段差１１１ｂの部分に嵌め合うように形成された円環状の蓋側壁部１２ｂとを備えている。蓋天部１２ａは、例えばその中央領域が円形状にくり抜かれて、上記本体開口部１１ｃにほぼ対向する領域に蓋体開口部１２ｃが設けられた構造になっている。ここで、図１（ａ）に示すように、蓋体開口部１２ｃの口径は本体開口部１１ｃのそれより大きくなるように形成されるとよい。また、蓋天部１２ａの下面の例えば３箇所に突起部１２ｄが形設される。このような蓋体１２は例えばポリスチレンなどの合成樹脂の成形により一体構造に形成される。
【００２３】
そして、上記蓋体開口部１１ｃは、第２板状ガラス上面１４ａおよび第２板状ガラス下面１４ｂを有する例えば円盤状の非晶質素材からなる第２板状ガラス１４により上方から閉塞されている。ここで、第２板状ガラス下面１４ｂには１ｎｍ程度以下の例えば原子層レベルの薄い親水性ポリマー層１５が形成される。
【００２４】
なお、上記突起部１２ｄは、容器本体１１の側部１１ｂの先端面１１２ｂに当接して隙間を生じさせ、閉蓋状態において容器本体１１を密閉しないようになっている。このようにして、容器本体１１の培地の被培養物がその培養下あるいは顕微鏡観察下において培養雰囲気ガスに通気する構造になり、その雰囲気ガスのガス交換効率は高く維持される。
【００２５】
上記培養容器１０において、底部１１ａおよび側部１１ｂの一体成形、並びに蓋天部１２ａ、蓋側壁部１２ｂおよび突起部１２ｄの一体成形には、それ等の軽量化、成形容易性等を考慮して樹脂を用いることが好ましい。このような樹脂としては、ポリスチレンの他にアクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂あるいは脂環式構造を有する樹脂等が挙げられる。そして、培養容器１０に要請される機械的強度、平坦性、均一性あるいは光学特性を良好に実現できる樹脂材を用いることが好ましい。ここで、この樹脂材は光透過性、光非透過性のどちらであっても構わない。
【００２６】
第１板状ガラス１３および第２板状ガラス１４の素材としては、光透過性に優れたホウケイ酸ガラス材が好適である。その他に、石英ガラス材、ソーダライムガラス材、合成ガラス材等の光透過性のガラス材を使用することができる。ここで、合成ガラス材は、例えば酸化珪素、酸化ホウ素、アルミナ、酸化亜鉛、酸化チタン等を適宜に含んでいる。このような板状ガラスの肉厚は例えば０．０８ｍｍ〜０．５ｍｍ程度に薄くすることが容易である。
【００２７】
上記第１板状ガラス１３および第２板状ガラス１４は、その平面形状が円形の他に楕円形、三角形、矩形、多角形等の所望の形状に作製される。ここで、これ等の平板ガラスは、本体開口部１１ｃあるいは蓋体開口部１２ｃの形状に合わせて形成され、互いに同じあるいは異なるガラス材から加工製造される。
【００２８】
そして、第１板状ガラス１３および第２板状ガラス１４は高い平面性を有している。例えば、それ等の両面は、その平均面粗さ（Ｒａ）が１５０ｎｍ以下になるようにダウンドローあるいはフロート法による成形、または、ラッピング加工、ポリッシング加工されると好適である。Ｒａ値が１５０ｎｍを超えてくると、例えば微分干渉顕微鏡を用いた被培養物の観察において、その解像度の低下により培養状態の検査、判定等が難しくなり、その操作性および作業性が悪くなる。
【００２９】
また、第２板状ガラス１４の下面１４ｂすなわち第１板状ガラス１３の対向面に形成される親水性ポリマー層１５としては、リン脂質ポリマーが好適である。リン脂質ポリマーは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー（ＭＰＣポリマー）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド重合体および２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・ブチルメタリレート共重合体から適宜に選択されたものである。
【００３０】
ここで、親水性ポリマー層１５は、リン脂質ポリマーの吸着による方法で形成される。すなわち、先ず第２板状ガラス下面１４ｂをリン脂質ポリマー塗液に浸し室温で一定時間保持する。その後に上記下面１４ｂを洗い流して室温において乾燥させる。このようにして、ｎｍオーダーあるいは原子層レベルの薄い親水性ポリマー層１５を第２板状ガラス下面１４ｂへの吸着により形成することができる。
【００３１】
そして、第１板状ガラス１３は、第１板状ガラス上面１３ａの周縁部が底部１１ａの外底面１１１ａに接着剤を介して接合し、本体開口部１１ｃを下方から覆うように取り付けられる。同様に、第２板状ガラス１４は、第２板状ガラス下面１４ｂの周縁部が蓋天部１２ａの蓋上面１２１ａに接着剤を介して接合し、蓋体１２を上方から覆う。ここで、接着剤は培養容器に収容される培養液に溶け込まない樹脂組成物からなる。
【００３２】
次に、図２および図３を参照して本実施形態の他例について説明を加える。図２（ａ）〜（ｄ）は本実施形態にかかる顕微鏡観察に適した培養容器の本体における４種類の他例を示す断面図である。図３（ａ）〜（ｃ）は本実施形態にかかる顕微鏡観察に適した培養容器の蓋体における３種類の他例を示す断面図である。ここで、図２および図３は、図１（ａ）に示した培養容器のＸ−Ｘ矢視の略断面図になっている。以下、図１で説明した培養容器１０の場合の構造と異なるところを主に説明する。
【００３３】
容器本体の場合の図２（ａ）に示す他例では、円盤状の第１板状ガラス１３が円筒状の側部１１ｂに第１板状ガラス上面１３ａの周縁部で接合し、容器本体１１の底部になるように取り付けられている。この場合、第１板状ガラス１３の肉厚は、容器本体１１の大きさに合わせてその強度が確保できる程度に設定される。例えば０．１２ｍｍ〜１ｍｍ程度の範囲で設定される。
【００３４】
図２（ｂ）に示す他例では、容器本体１１の底部１１ａに複数の孔１６が形成され、その外底面１１１ａに第１板状ガラス１３の第１板状ガラス上面１３ａが接合されている。そして、この底部１１ａおよび第１板状ガラス１３は、マトリクス状に配置された複数の透孔を有するマルチウェルプレートを構成する。この場合の第１板状ガラス１３は、その素材あるいは肉厚が図２（ａ）の場合と同様になるように作製される。
【００３５】
図２（ｃ）に示す他例では、容器本体１１において、底部１１ａに本体開口部１１ｃが形成され、例えば０．０８ｍｍ〜０．５ｍｍ程度の肉厚の第１板状ガラス１３が本体開口部１１ｃを上方から覆うように取り付けられている。ここで、第１板状ガラス１３の第１板状ガラス下面１３ｂの周縁部が底部１１ａの内底面１１２ａに接合される。
【００３６】
そして、図２（ｄ）に示す他例では、第１板状ガラス１３は本体開口部１１ｃに嵌合するように取り付けられている。ここで、第１板状ガラス１３は、その肉厚が容器本体１１の底部１１ａの厚さより小さくなるように設定され、作製される。
【００３７】
次に、蓋体の場合の図３（ａ）に示す他例では、円盤状の第２板状ガラス１４が第２板状ガラス下面１４ｂの周縁部において円環状の蓋側壁部１２に接合し取り付けられ、蓋体１２の蓋天部になっている。この場合、第２板状ガラス１４の肉厚は、容器本体１１の大きさに合わせてその強度が確保できるような程度になるが、例えば０．１２ｍｍ〜１ｍｍ程度の範囲で設定される。ここで、蓋側壁部１２は例えば３つの突起部１２ｄを有している。
【００３８】
図３（ｂ）に示す他例では、蓋体１２において、蓋天部１２ａに蓋体開口部１２ｃが形成され、第２板状ガラス１４が蓋体開口部１２ｃを下方から塞ぐように取り付けられている。ここで、例えば０．０８ｍｍ〜０．５ｍｍ程度の肉厚の第２板状ガラス１４が、第２板ガラス上面１４ａの周縁部において蓋天部１２ａの蓋下面１２２ａに接合している。
【００３９】
そして、図３（ｃ）に示す他例では、第２板状ガラス１４は蓋体開口部１２ｃに嵌合するように取り付けられている。ここで、第２板状ガラス１４は、その肉厚が例えば蓋体１２の蓋天部１２ａの厚さとほぼ同程度になるように設定され、作製される。
【００４０】
本実施形態の顕微鏡観察に適した培養容器は、図１乃至図３で説明した容器本体１１および蓋体１２のうちのそれぞれいずれか１つを選択し組み合わせることにより、図１で説明した以外の種々の構造にできる。ここで、蓋体開口部１２ｃは、その平面形状の大きさが本体開口部１１ｃのそれと同じあるいはそれ以上になるように形成されると好適である。
【００４１】
本実施形態では、いずれの構造の培養容器であっても、容器本体１１の底部１１ａの被培養物が収容される領域は、光透過性の平板ガラスである第１板状ガラス１３により作製される。そして、その蓋体１２の蓋天部１２ａにおいては、第１板状ガラス１３に対向するように光透過性の第２板状ガラス１４が配置され取り付けられている。また、第１板状ガラス１３の対向面となる第２板状ガラス１４の下面１４ｂには、薄い親水性ポリマー層１５が形成される。
【００４２】
そして、第１板状ガラス１３および第２板状ガラス１４は、好ましくは平面性が高くなるように、その平均面粗さが例えば１５０ｎｍ以下と小さく加工製造される。また、特に倒立顕微鏡の対物レンズ側になる第１板状ガラス１３は、好ましくは０．２ｍｍ以下の肉厚になるように薄く作製される。更に、親水性に優れた親水性ポリマー層１５は、例えばリン脂質ポリマーからなり、その厚さがｎｍオーダー以下あるいは原子層レベルになると好適である。
【００４３】
本実施形態の培養容器では、被培養物の高コントラストの光学顕微鏡観察において、従来の有機高分子からなる樹脂材あるいは防曇剤を用いた培養容器の場合に較べて、光透過における直線偏光の振動面の乱れが格段に低減する。このために、高コントラストの顕微鏡、その中でも特に微分干渉顕微鏡における解像度が大きく向上する。そして、培養のための雰囲気ガスのガス交換効率が低下することなく、培養操作における作業効率が向上する。
【００４４】
また、培養容器の載置されるインキュベータでは、その内部における雰囲気ガスの温度が例えば３７℃程度であり、その湿度が例えば９５％以上に高く設定される場合がある。そして、顕微鏡観察においてインキュベータから室温に取り出される際に、培養容器の蓋体１２の内面にその結露による水滴が形成されて曇り易くなる。しかし、本実施形態の培養容器では、上述した親水性に優れた薄い親水性ポリマー層は、充分な防曇効果を有すると共に、顕微鏡の透過光の明度の低下をほとんど生じさせない。
【００４５】
また、第１板状ガラス１３および第２板状ガラス１４以外の容器本体および蓋体は安価で所望の形状に容易に一体成形できる合成樹脂材により作製できことから、本実施形態の培養容器は低コストに製造できるようになる。
【００４６】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、上述した実施形態は本発明を限定するものでない。当業者にあっては、具体的な実施態様において本発明の技術思想および技術範囲から逸脱せずに種々の変形・変更を加えることが可能である。
【００４７】
本実施形態の培養容器は、培養容器内の被培養物の観察を下方から行う倒立顕微鏡の他に、被培養物を上方から観察する正立顕微鏡で使用される場合であっても効果的になる。
【００４８】
また、容器本体および蓋体は、前記第１板状ガラス１３および第２板状ガラス１４を除いて、それぞれ樹脂材による一体成形あるいは部分成形により形成されてもよいし、樹脂材と無機材の複合体により形成されても構わない。
【符号の説明】
【００４９】
１０…培養容器，１１…容器本体，１１ａ…底部，１１１ａ…外底面，１１２ａ…内底面，１１ｂ…側部，１１１ｂ…段差，１１２ｂ…先端面，１１ｃ…本体開口部，１２…蓋体，１２ａ…蓋天部，１２１ａ…蓋上面，１２２ａ…蓋下面，１２ｂ…蓋側壁部，１２ｃ…蓋体開口部，１２ｄ…突起部，１３…第１板状ガラス，１３ａ…第１板状ガラス上面，１３ｂ…第１板状ガラス下面，１４…第２板状ガラス，１４ａ…第２板状ガラス上面，１４ｂ…第２板状ガラス下面，１５…親水性ポリマー層，１６…孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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