(57)【要約】【課題】  細胞毒性が軽減された干渉用二重鎖ＲＮＡおよび干渉用二重鎖ＲＮＡを発現するためのベクターおよび機能遺伝子ノックダウン細胞を生産する。【解決手段】  標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む干渉用二重鎖ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５塩基、２６塩基、２７塩基、又は２８以上の塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする干渉用二重鎖ＲＮＡをＲＮＡｉに用いる。塩基置換及び塩基の挿入を含む二重鎖ＲＮＡを用いることもできる。本発明の干渉用二重鎖ＲＮＡにより、細胞毒性が軽減されたＲＮＡｉを高い効率で誘導することができる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む二重鎖干渉用ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする化学合成により作製した二重鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項２】
標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む二重鎖干渉用ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２６塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする化学合成により作製した二重鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項３】
標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む二重鎖干渉用ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２７塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする化学合成により作製した二重鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項４】
標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む二重鎖干渉用ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２８塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする化学合成により作製した二重鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項５】
センスＲＮＡ鎖の５’側が平滑末端である請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項６】
センスＲＮＡ鎖の５’側が２塩基突出している請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項７】
センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の３’末端が、２塩基突出している請求項１〜４に記載の二本鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項８】
センスＲＮＡ鎖の３’側が平滑末端であり、かつ、アンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端が２塩基突出している請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重鎖干渉用ＲＮＡ。
【請求項９】
標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含み、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５塩基にわたって二重鎖を形成している二重鎖ＲＮＡを、インビトロの哺乳動物細胞に導入するステップを含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項１０】
標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含み、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２６塩基にわたって二重鎖を形成している二重鎖ＲＮＡを、インビトロの哺乳動物細胞に導入するステップを含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項１１】
標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含み、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２７塩基にわたって二重鎖を形成している二重鎖ＲＮＡを、インビトロの哺乳動物細胞に導入するステップを含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項１２】
前記二重鎖ＲＮＡが化学合成により作製されたことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記二重鎖ＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖の５’側が平滑末端である請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記二重鎖ＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖の５’側が２塩基突出している請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記二重鎖ＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の３’末端が、２塩基突出している請求項９〜１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記二重鎖ＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖の３’側が平滑末端であり、かつ、アンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端が２塩基突出している請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記二重鎖ＲＮＡが、最終濃度１０ｎＭ以下でインビトロの哺乳動物細胞に導入される請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記二重鎖ＲＮＡが、最終濃度１ｎＭ以下でインビトロの哺乳動物細胞に導入される請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記二重鎖ＲＮＡが、最終濃度０．１ｎＭ以下でインビトロの哺乳動物細胞に導入される請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡおよび干渉用二重鎖ＲＮＡを発現するためのベクターおよび機能遺伝子ノックダウン細胞の生産方法に関する。より具体的には、二重鎖の部分が、２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８以上の塩基の干渉用二重鎖ＲＮＡ、それらの干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクター、ベクターを含む干渉用二重鎖ＲＮＡ発現システム、およびこれらを保有する細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（RNA interference、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列からなるセンスＲＮＡとこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡとからなる二重鎖ＲＮＡ（以下、「ｄｓＲＮＡ」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現を抑制し得る現象である。このようにＲＮＡｉは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用として注目を集めている。このようなＲＮＡｉは、当初、線虫において発見されたが（非特許文献１）、現在では、線虫のみならず、植物、線形動物、ショウジョウバエ、原生動物などの種々の生物において観察されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。これらの生物では、外来のｄｓＲＮＡを導入することにより、標的遺伝子の発現が抑制されることが実際に確認されており、ノックアウト個体を創生する方法としても利用されつつある。
【０００３】
哺乳動物細胞では、他の生物と同様にｄｓＲＮＡを細胞外から導入することによりＲＮＡｉの誘導が試みられている。しかし、導入されたｄｓＲＮＡによりウイルス感染などに対する宿主細胞の防御機構が作動することにより、タンパク質合成が阻害され、ＲＮＡｉを観察することができなかった。
【０００４】
最近、Tuschlらにより、他の生物で用いられているような長いｄｓＲＮＡに代えて、２もしく３ヌクレオチドの一本鎖の３’末端の突出（オーバーハング）を有する全長２１もしくは２２ヌクレオチド（オーバーハングを含めて数える）の短鎖の干渉用ＲＮＡ二重鎖（short interfering ＲＮＡ、以下、「ｓｉＲＮＡ」と略称する）を哺乳動物細胞に導入することにより、哺乳動物細胞でもＲＮＡｉを誘導し得ることが報告された（非特許文献６、非特許文献７）。
このようにｓｉＲＮＡがリボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチドを越える遺伝子の機能解析や発現制御のための強力なツールとして使用できることがわかり、その改良が日夜続けられている。特に、遺伝子の一次配列がヒトを含む多くの生物種でほぼ決定された現在、生体における遺伝子機能を網羅的かつ高効率に解析するための最も有力なツールとしてｓｉＲＮＡの利用が注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, (1998)
【非特許文献２】Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)
【非特許文献３】Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)
【非特許文献４】Hammond, S. M., Caudy, A. A. & Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)
【非特許文献５】Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750 (2001)
【非特許文献６】Elbashir, S. M et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001)
【非特許文献７】Caplen, N. J. et al. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9742-9747 (2001)
【非特許文献８】Ohkawa, J. & Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Hum Gene Ther. 11, 577-585 (2000)
【非特許文献９】Zanta M.A. et al., Gene delivery: a single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jan 5;96(1):91-6)
【非特許文献１０】Liu F, Huang L. Improving plasmid DNA-mediated liver gene transfer by prolonging its retention in the hepatic vasculature. J. Gene Med. 2001 Nov-Dec;3(6):569-76
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＮＡｉを利用してｍＲＮＡレベルで任意の遺伝子の発現を抑制することによって、その遺伝子の機能を解析することができ、また、医療分野への応用として、前述のような方法により疾患原因遺伝子の解明のほか、ＲＮＡウイルスの増殖抑制、疾患関連遺伝子の発現抑制を行なうことのできる可能性がある。
【０００７】
ＲＮＡの化学合成には、ＤＮＡ合成に比べ、塩基数が長いほど格段に費用がかかること等から、哺乳動物細胞では、Tuschlらが行なった二重鎖ＲＮＡ部分の塩基数が１９〜２１（２塩基のオーバーハングをアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡの３’側に２塩基含むため、オーバーハングを含めて数えると塩基数２１〜２３)のｓｉＲＮＡを用いている。しかし、これらの塩基数だと、標的とする配列により遺伝子発現の抑制効果が異なる。すなわち、発現を抑制させたい標的遺伝子のうちの、どの部位をアンチセンスＲＮＡと相補的な部位にするかにより発現抑制効果は異なり、標的とする部位によっては遺伝子発現を効果的に抑制できるが、部位によってはほとんど抑制されない場合もある。このため、実際の適用には、効果的な標的とする部位を予め検討する必要がある。
一方、長い塩基数のＲＮＡを用いた場合には、ｄｓＲＮＡ依存的タンパク質依存キナーゼ（ＰＫＲ）が活性化し、遺伝子全体の翻訳が阻害される。このため、ＲＮＡ干渉効果の特異性が下がり、またアポトーシスも誘導されるため、細胞毒性が上がる。
【０００８】
そこで、ＲＮＡｉを遺伝子機能解析および遺伝子治療に適用するにあたり、標的とする部位によらず、効果的に遺伝子発現が抑制されるが、細胞毒性が低いｓｉＲＮＡの開発が望まれる。
そこで、本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを発現するためのベクターおよび機能遺伝子ノックダウン細胞の生産方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、上記課題に鑑みて、二重鎖の部分が、２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８以上の塩基のｓｉＲＮＡを用いた場合、部位によらず高い発現抑制効果を有しかつ低毒性であることを見出した。
すなわち、本発明は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む干渉用二重鎖ＲＮＡであって、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８以上の塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする干渉用二重鎖ＲＮＡを提供する。
この干渉用二重鎖ＲＮＡは、化学合成により作製することができる。
【００１０】
この干渉用二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換されていてもよい。この場合、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目の塩基が、他の塩基により置換されているのが望ましい。
【００１１】
あるいは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換されていてもよい。この場合、センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目の塩基が、他の塩基により置換されているのが望ましい。
【００１２】
あるいは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換され、かつ、前記アンチセンスＲＮＡの前記置換された塩基に対応する前記センスＲＮＡの塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記置換された塩基と相補的塩基対を形成する他の塩基に置換されていてもよい。この場合、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目の塩基及びセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目の塩基が他の塩基により置換されているのが望ましい。
【００１３】
上記のようなアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡの塩基の置換は、グアニン（Ｇ）からウラシル（Ｕ）若しくはアデニン（Ａ）への置換、またはシトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）若しくはアデニン（Ａ）への置換が望ましい。
【００１４】
さらに、本発明は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む干渉用二重鎖ＲＮＡであって、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２５塩基、２６塩基または２７塩基又は２８以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入されていることを特徴とする干渉用二重鎖ＲＮＡを提供する。
このような二重鎖ＲＮＡとしては、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されているものが望ましい。
【００１５】
さらに、本発明は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む干渉用二重鎖ＲＮＡであって、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２５塩基、２６塩基または２７塩基又は２８以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入されていることを特徴とする干渉用二重鎖ＲＮＡを提供する。
このような二重鎖ＲＮＡとしては、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されているものが望ましい。
【００１６】
さらに、本発明は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含む干渉用二重鎖ＲＮＡであって、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２４塩基、２５塩基または２６以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入され、前記アンチセンスＲＮＡに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記挿入された塩基に対応する前記センスＲＮＡの位置に挿入されていることを特徴とする干渉用二重鎖ＲＮＡを提供する。
このような二重鎖ＲＮＡとしては、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入され、かつ、センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されているものが望ましい。
【００１７】
本発明の干渉用二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡの３’側に１〜４個の塩基からなるオーバーハングをさらに有していてもよく、あるいは、アンチセンスＲＮＡの５’末端とセンスＲＮＡの３’末端の間にリンカーＲＮＡをさらに含んでいてもよい。
【００１８】
さらに、本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターであって、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターとを含んでなるベクターであって、前記ベクターから生成される前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５個、２６個、または２７塩基又は２８以上の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とするベクターを提供する。
【００１９】
このベクターから生じる干渉用二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換されていてもよい。この場合、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目の塩基が、他の塩基により置換されているものが望ましい。
【００２０】
あるいは、このベクターから生じる干渉用二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換されていてもよい。この場合、センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目の塩基が、他の塩基により置換されているものが望ましい。
【００２１】
あるいは、このベクターから生じる干渉用二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換され、かつ、前記アンチセンスＲＮＡの前記置換された塩基に対応する前記センスＲＮＡの塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記置換された塩基と相補的塩基対を形成する他の塩基に置換されていてもよい。この場合、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目の塩基及びセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目の塩基が他の塩基により置換されているものが望ましい。
【００２２】
上記のようなアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡの塩基の置換は、グアニン（Ｇ）からウラシル（Ｕ）若しくはアデニン（Ａ）への置換、またはシトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）若しくはアデニン（Ａ）への置換が望ましい。
【００２３】
さらに、本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターであって、 標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターとを含んでなるベクターであって、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２５塩基、２６塩基または２７塩基又は２８以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクターを提供する。
このようなベクターから生じる二重鎖ＲＮＡとしては、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されているものが望ましい。
【００２４】
さらに、本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターであって、 標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターとを含んでなるベクターであって前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２５塩基、２６塩基、または２７塩基又は２８以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入されていることを特徴とするベクターを提供する。
このようなベクターから生じる二重鎖ＲＮＡとしては、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されているものが望ましい。
【００２５】
本発明は、さらに、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるためのベクターであって、 標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターとを含んでなるベクターであって前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２４塩基、２５塩基、または２６以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入され、前記アンチセンスＲＮＡに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記挿入された塩基に対応する前記センスＲＮＡの位置に挿入されていることを特徴とするベクターを提供する。
このようなベクターから生じる二重鎖ＲＮＡとしては、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入され、かつ、センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されているものが望ましい。
【００２６】
本発明のベクターは、アンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡのそれぞれ３’側に１〜４個の塩基からなるオーバーハング部分をコードする配列をさらに有していてもよい。また、本発明のベクターは、リンカーをコードするリンカーＤＮＡを、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの間にさらに含むものであってもよい。
【００２７】
また、本発明のベクターに含まれるプロモーターは、polIII系プロモーターを用いることができる。polIII系プロモーターとしては、U6プロモーター、H1プロモーター、5S rＲＮＡプロモーター、tＲＮＡプロモーター、7SLプロモーター、7SKプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーターからなる群から選択することができる。
【００２８】
また、本発明のベクターに含まれるプロモーターは、polII系プロモーターを用いることもできる。polII系プロモーターとしては、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、ＳＲαプロモーターからなる群から選択することができる。
【００２９】
さらに、本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるための発現システムであって、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターとを含んでなり、前記第一のベクターから生成される前記アンチセンスＲＮＡと前記第二のベクターから生成される前記センスＲＮＡとが連続した２５個、２６個、または２７塩基又は２８以上の塩基にわたって二重鎖を形成することを特徴とする発現システムを提供することができる。
【００３０】
本発明の発現システムから生じる二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換されていてもよい。
【００３１】
あるいは、本発明の発現システムから生じる二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換されていてもよい。
【００３２】
あるいは、本発明から生じる二重鎖ＲＮＡは、前記標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基が他の塩基により置換され、前記アンチセンスＲＮＡの前記置換された塩基に対応する前記センスＲＮＡの塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記置換された塩基と相補的塩基対を形成する他の塩基に置換されていてもよい。
【００３３】
上記のようなアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡの塩基の置換は、グアニン（Ｇ）からウラシル（Ｕ）若しくはアデニン（Ａ）への置換、またはシトシン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）若しくはアデニン（Ａ）への置換が望ましい。
【００３４】
本発明は、さらに、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるための発現システムであって、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターとを含んでなり、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システムを提供する。
【００３５】
さらに、本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるための発現システムであって、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターとを含んでなり、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入されていることを特徴とする発現システムを提供する。
【００３６】
さらに、本発明は、干渉用二重鎖ＲＮＡを細胞内で発現させるための発現システムであって、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターとを含んでなり、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域は、連続した２４塩基、２５塩基、または２６以上の塩基の領域であり、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入され、前記アンチセンスＲＮＡに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記挿入された塩基に対応する前記センスＲＮＡの位置に挿入されていることを特徴とする発現システムを提供する。
【００３７】
本発明の発現システムから生じる二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡの３’側にそれぞれ１〜４個の塩基からなるオーバーハング部分をコードする配列をさらに有していてもよい。
【００３８】
また、本発明の発現システムに含まれるプロモーターは、polIII系プロモーターを用いることができる。polIII系プロモーターとしては、U6プロモーター、H1プロモーター、5S rＲＮＡプロモーター、tＲＮＡプロモーター、7SLプロモーター、7SKプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーターからなる群から選択することができる。
【００３９】
また、本発明の発現システムに含まれるプロモーターは、polII系プロモーターを用いることもできる。polII系プロモーターとしては、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、ＳＲαプロモーターからなる群から選択することができる。
【００４０】
さらに、本発明の二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１７から１９番目の塩基、またはセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１７から１９番目の塩基のうちの１個が他の塩基により置換されていてもよい。アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１９番目の塩基またはセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１９番目の塩基の置換が好ましく、より好ましくはＧ又はＣからＡ又はＵへの置換である。
【００４１】
またさらに、本発明の二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１８番目と１９番目の塩基、またはセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１８番目と１９番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されていてもよい。
【００４２】
また、本発明の二重鎖ＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖の５’側が平滑末端であるか、又はオーバーハングとして１〜３塩基突出してもよい。あるいは、センスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の３’末端が、２又は１塩基突出していてもよい。
【００４３】
さらに、本発明は、上記ベクターまたは上記発現システムを保持した細胞を提供する。そのような細胞としては、植物細胞及び動物細胞が好ましく、特に、哺乳動物細胞を例示できる。
また、本発明は上記ベクターまたは上記発現システムを含む組成物を提供する。このような組成物としては、医薬組成物が好ましい。
さらに本発明は、上記ベクターまたは上記発現システムを細胞に導入する工程と、前記ベクター又は前記発現システムが導入された細胞を選択する工程とを含む標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法を提供する。
【００４４】
またさらに、本発明は、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含み、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８塩基にわたって二重鎖を形成している二重鎖ＲＮＡを、インビトロの哺乳動物細胞に導入するステップを含む、標的遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。
この干渉用二重鎖ＲＮＡは、化学合成により作製することができる。
【００４５】
ここで、前記二重鎖ＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖の５’側を平滑末端又は２塩基突出とすることができる。または、前記二重鎖ＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖及びアンチセンスＲＮＡ鎖の両鎖又はいずれか一方の鎖の３’末端を２塩基突出とすることができる。また、前記二重鎖ＲＮＡのセンスＲＮＡ鎖の３’側を平滑末端とし、かつ、アンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端を２塩基突出とすることができる。
【００４６】
上記標的遺伝子の発現を抑制する方法において、二重鎖ＲＮＡを最終濃度１０ｎＭ以下、最終濃度１ｎＭ以下又は最終濃度０．１ｎＭで、インビトロの哺乳動物細胞に導入することができる。
【発明の効果】
【００４７】
上記の通り、本発明のｓｉＲＮＡを用いることにより、特定の標的部位のみに限定されることがなく、かつ低い細胞毒性でＲＮＡｉをもたらすことができる。
また、本発明のベクターまたは発現システムは、化学合成によらずｓｉＲＮＡを細胞内で合成できるため、より短いｓｉＲＮＡを用いたときのように予め発現抑制効果の高い部位を特定することなく、かつ低毒性なｓｉＲＮＡを、安価に作成することができる。このような本発明のベクターまたは発現システムを用いて、標的遺伝子の機能解析や、ウイルスの発現抑制、疾患原因遺伝子の発現抑制などによる遺伝子治療を行なうことができる。さらには、本発明のベクターまたはシステムを用いて、標的遺伝子の機能解析のための研究材料となるノックダウン細胞、ノックダウン動物または植物を作成することができる。植物細胞に本発明のｓｉＲＮＡを導入した場合には、機能解析のみならず、品種改良に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】表１に示すｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性の比較を示すグラフである。
【図２】表２に示すｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性の比較を示すグラフである。
【図３】ｓｈＲＮＡである、Ａ／ＢヘアピンベクターとＢ／Ａベクターの構造と、修飾されたｐＧＬ３コントロールの構造を示す図である。
【図４】ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターとタンデム型ｓｉＲＮＡ、及びＡ／ＢタイプヘアピンベクターとＢ／Ａタイプヘアピンベクターの発現抑制効果の比較を示すグラフである。
【図５】ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターとタンデム型ｓｉＲＮＡ、及びＡ／ＢタイプヘアピンベクターとＢ／Ａタイプヘアピンベクターのノザン解析の比較を示すグラフである。
【図６】様々な長さのｓｉＲＮＡによる発現抑制効果を比較したグラフである。
【図７】様々な長さのｓｉＲＮＡによる発現抑制効果を比較したグラフである。
【図８】様々な長さのｓｉＲＮＡによる発現抑制効果を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の第一の側面は、標的とする配列が限定されることなく、かつ細胞毒性の低い、干渉用二重鎖ＲＮＡに関する。この干渉用二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含み、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５個、２６個、２７個又は２８個以上の塩基にわたって二重鎖を形成していることを特徴とする。
【００５０】
さらに、この干渉用二重鎖ＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの配列に対して、二重鎖を形成しているアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡの少なくとも１個の塩基が他の塩基に置換していてもよい。具体的には、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基、好ましくは５’側から１番目の塩基が他の塩基により置換されているものや、センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１〜４番目の塩基のうちの１塩基、好ましくは、３’側から１番目の塩基が他の塩基により置換されているものが挙げられる。
【００５１】
塩基置換の例としては、アンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡにおいて、グアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）若しくはウラシル（Ｕ）に置換しているもの、またはシトシン（Ｃ）がアデニン（Ａ）若しくはウラシル（Ｕ）に置換しているものが挙げられる。この場合、置換された塩基を含むＲＮＡと相補的なＲＮＡ鎖（例えば、アンチセンスＲＮＡが置換された塩基を含む場合には、センスＲＮＡ）における置換された塩基に対応する位置の塩基は、置換せずもとの塩基のままであっても、置換された塩基と相補的な塩基対を形成するように置換しても良い。例えば、アンチセンスＲＮＡにおいてグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に置換した場合、対応するセンスＲＮＡはシトシン（Ｃ）のままでもよいし、置換されたアデニン（Ａ）と相補的な塩基対を形成するようにセンスＲＮＡの対応する塩基をウラシル（Ｕ）に置換してもよい。
【００５２】
または、二重鎖を形成している領域内のアンチセンスＲＮＡの５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれか、またはセンスＲＮＡの３’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入されていてもよい。挿入される塩基は、任意の塩基でよく、修飾された塩基を挿入してもよい。
【００５３】
さらに、本願の干渉用二重鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとの間で形成される二重鎖の部分だけではなく、アンチセンスＲＮＡ及びセンスＲＮＡの３’側に、１〜４個の塩基、好ましくは２〜３個の塩基からなるオーバーハングを有しても良い。オーバーハングは、二重鎖を形成しない一本鎖の突出部分である。このオーバーハングは、標的遺伝子との特異性が低いため、標的遺伝子の配列と相補的（アンチセンス）配列あるいは同じ（センス）配列である必要は必ずしもない。また、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を保持し得る範囲で、例えば一端の突出部分に低分子ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子であってもよく、また人工的なＲＮＡ分子）を備えてもよい。
【００５４】
本発明のさらに別の干渉用二重鎖ＲＮＡとして、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含み、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２４塩基、２５塩基または２６以上の塩基にわたって二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入され、前記アンチセンスＲＮＡに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記挿入された塩基に対応する前記センスＲＮＡの位置に挿入されていることを特徴とする。このばあいには、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入され、かつ、センスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間の位置に１個の塩基が挿入されているものが望ましい。
【００５５】
本発明の別の側面として、標的とする配列が限定されることなく、かつ細胞毒性の低い、干渉用二重鎖ＲＮＡを発現させるためのベクターが提供される。このベクターには、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡおよび前記センスコードＤＮＡから、前記アンチセンスＲＮＡおよび前記センスコードＲＮＡをそれぞれ発現させるための一つ以上のプロモーターとを含んでなり、前記ベクターからは、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８以上の塩基にわたって二重鎖が形成された干渉用二重鎖ＲＮＡが形成される。
【００５６】
本願のベクターから生じる干渉用二重鎖ＲＮＡは、上記に説明したように、二重鎖を形成しているアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡの少なくとも１個の塩基が他の塩基に置換していてもよい。または、アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、若しくは４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置、またはセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の３’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、若しくは４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に、１個の塩基が挿入されていてもよい。
【００５７】
本発明のさらに別のベクターとして、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡとを含み、生じる二重鎖ＲＮＡは、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２４塩基、２５塩基または２６以上の塩基にわたって二重鎖を形成し、前記アンチセンスＲＮＡの二重鎖を形成している領域内の５’側から１番目と２番目の塩基の間、２番目と３番目の塩基の間、３番目と４番目の塩基の間、または４番目と５番目の塩基の間のうちのいずれかの位置に１個の塩基が挿入され、前記アンチセンスＲＮＡに挿入された塩基と相補的塩基対を形成する塩基が、前記アンチセンスＲＮＡの前記挿入された塩基に対応する前記センスＲＮＡの位置に挿入されている。
【００５８】
上記ベクターは、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの間に、リンカーをコードするリンカーＤＮＡをさらに含んでもよい。このリンカーＤＮＡを含むベクターから転写されるＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡの一方の端部がリンカーＲＮＡにより接続されたステムループ型構造となる。また、リンカーＤＮＡの長さ、配列は特に限定されないが、ｓｉＲＮＡの生成を阻害するようなターミネーション配列などでなく、および上述したように二重鎖ＲＮＡまで生成された際にステム部分の対合に支障のないリンカーの長さ、配列であればよい。例えば、ステムの対合の安定化およびステム部分をコードしているＤＮＡ間での組換えを抑制するために、リンカー部分にクローバーリーフｔＲＮＡ構造を用いてもよい。また、リンカーの長さがステムの対合に支障を与える長さであっても、例えば、リンカー部分にイントロンを包含させ、前駆ＲＮＡから成熟ＲＮＡにプロセッシングされる際にイントロンが切り出されて、ステム部分が対合するような構成をとってもよい。また、二重鎖ＲＮＡのループを形成していない側のアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡのいずれかの端部に、低分子ＲＮＡをさらに備えてもよい。この低分子ＲＮＡは、上述したように、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡまたはウイルスＲＮＡのような天然のＲＮＡ分子であってもよく、また人工的なＲＮＡ分子であってもよい。
【００５９】
本発明の別の側面として、標的とする配列が限定されることなく、かつ細胞毒性の低い、干渉用二重鎖ＲＮＡを発現させるための発現システムが提供される。この発現システムには、標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるいずれかの領域と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードしたアンチセンスコードＤＮＡと、前記アンチセンスコードＤＮＡから前記アンチセンスＲＮＡを発現させるための第一のプロモーターとを含む第一のベクターと、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける前記領域と相同なセンスＲＮＡをコードしたセンスコードＤＮＡと、前記センスコードＤＮＡから前記センスＲＮＡを発現させるための第二のプロモーターとを含む第二のベクターとを含んでなり、前記発現システムからは、前記アンチセンスＲＮＡと前記センスＲＮＡとが連続した２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８以上の塩基にわたって二重鎖が形成された干渉用二重鎖ＲＮＡが形成される。
【００６０】
「ｓｉＲＮＡ」は、哺乳動物細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味する。ｓｉＲＮＡの長さは、アンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡとの間で形成される二重鎖部分の長さが、２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８塩基以上である。
【００６１】
本発明において、「アンチセンスＲＮＡ」は、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部の配列と相補する配列からなるＲＮＡであり、このアンチセンスＲＮＡが標的遺伝子のｍＲＮＡと結合してＲＮＡｉを誘導すると考えられている。アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡにおける特定の領域と完全に相補的な塩基配列を有する必要はなく、センスＲＮＡとともに二重鎖ＲＮＡを形成できる限り、塩基配列の一部に不対合部分が含まれていてもよい。また、「センスＲＮＡ」は、上記アンチセンスＲＮＡと相補する配列、すなわち、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な（同じ）塩基配列を備え、相補的なアンチセンスＲＮＡとアニーリングしてｓｉＲＮＡを生成するＲＮＡである。センスＲＮＡは、前記標的遺伝子のｍＲＮＡにおける特定の領域と完全に相同な（同じ）塩基配列を有する必要はなく、アンチセンスＲＮＡとともに二重鎖ＲＮＡを形成できる限り、塩基配列の一部に不対合部分が含まれていてもよい。これらアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとは、従来では、ＲＮＡ合成機により化学合成されることが多いが、本発明では、化学合成のみならず、ベクター中のアンチセンスＲＮＡをコードしたＤＮＡ（アンチセンスコードＤＮＡ）、センスＲＮＡをコードしたＤＮＡ（センスコードＤＮＡ）より細胞内で発現される。
【００６２】
「標的遺伝子」は、その遺伝子の発現がｓｉＲＮＡより抑制される遺伝子であり、任意に選択することができる。この標的遺伝子は、例えば、配列は判明しているがどのような機能を有するかを解明したい遺伝子や、その発現が疾患の原因と考えられる遺伝子などを好適に選択することができる。標的遺伝子は、そのｍＲＮＡ配列の一部、すなわちｓｉＲＮＡの一方の鎖（アンチセンスＲＮＡ鎖）と結合し得る長さである少なくとも１５塩基以上が判明しているものであれば、ゲノム配列まで判明していない遺伝子であっても選択することができる。したがって、EST（Expressed Sequence Tag）などのｍＲＮＡの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子なども「標的遺伝子」として選択することができる。
【００６３】
上記アンチセンスコードＤＮＡ、センスコードＤＮＡよりアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させるために、本発明のｓｉＲＮＡ発現ベクターおよびｓｉＲＮＡ発現システムには、一つ以上の「プロモーター」が備えられている。このプロモーターは、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを発現し得るものであれば、その種類、数、位置などは任意に定めることができる。プロモーターは、上記各ＤＮＡより対応するＲＮＡを産生し得るものであれば、polII系、polIII系のいずれでもよいが、好ましくはｓｉＲＮＡのような短いＲＮＡの発現に適したpolIII系を用いることができる。このpolIII系のプロモーターとしては、例えば、U6プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーター、５Ｓ ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ ＲＮＡプロモーター、Ｈ１ ＲＮＡプロモーターなどを挙げることができる。
【００６４】
本発明のベクターとしては、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡの５’上流にプロモーターをそれぞれ備えたタンデム型のｓｉＲＮＡ発現ベクターや、アンチセンスＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを同一ＤＮＡ鎖上に逆向きに配置し、これらＤＮＡ間にリンカーを挟んで連結させたユニットを一つのプロモーターの下流に接続させたステムループタイプのｓｉＲＮＡベクターが挙げられる。
【００６５】
タンデム型のｓｉＲＮＡ発現ベクターでは、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをそれぞれ別々のＲＮＡ鎖として発現させた後に、アニーリングさせ、二重鎖ＲＮＡとすることができる。ステムループタイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターから生じるｓｉＲＮＡは、リンカー部分をループとし、その両側のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとが対合（ステム構造）となったステムループ型構造を有する。そして、細胞内の酵素によりプロセッシングを受けてループ部分が切断され、ｓｉＲＮＡを生成させることができる。なお、この場合のステム部分の長さ、リンカーの長さ、種類などは上述した通りの構成とすることができる。
【００６６】
本発明の発現システムでは、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとを別個のベクターに保持させる。この場合には、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡのそれぞれの５’上流にプロモーターを含む。この場合には、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをそれぞれ別々のＲＮＡ鎖として発現させた後に、アニーリングさせ、二重鎖ＲＮＡとすることができる。
【００６７】
センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスＲＮＡコード鎖、センスＲＮＡコード鎖）の３’末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、Ｔ（チミン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。
【００６８】
また、いずれの場合にも、5’端にプロモーターからの転写を促進し得る配列を備えてもよい。具体的にはタンデム型の場合には、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの5’端それぞれに、また、ステムループ型の場合には上記ユニットの5’端に、プロモーターからの転写を促進し得る配列を備えることにより、ｓｉＲＮＡの生成を効率化してもよい。なお、こうした配列からの転写物は、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制に支障がない場合には、ｓｉＲＮＡに付加された状態で用いてもよいが、発現抑制に影響を与える場合には、リボザイムのようなトリミング手段を用いてトリミングを行うことが好ましい。
【００６９】
また、本発明では、ＲＮＡ干渉を誘導するための、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部の配列と相補する部分が２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８塩基以上からなる一本鎖アンチセンスＲＮＡをも意図している。また、本願発明は、標的遺伝子のｍＲＮＡの一部の配列と相補する部分が２５塩基、２６塩基、２７塩基又は２８塩基以上からなる一本鎖アンチセンスＲＮＡを発現させるためのベクター、当該ベクターを保持する細胞、当該細胞を有する生物個体、当該ベクターを細胞に導入して、標的遺伝子の発現が抑制された細胞を生産する方法をも意図している。
【実施例】
【００７０】
（１）ｄｓＲＮＡの作成
ショートヘアピンＲＮＡの転写は、40mMのHepes-KOH(pH7.8)、20mMのMgCl2、5mMのジチオトレイトール、1mMのNTP混合物、2mMスペルミジン、48μg/mlの牛血清アルブミン、100nMのＤＮＡ鋳型 (Hokkaido System Science Inc.)、0.47μg/mlのパン酵母無機ピロホスファターゼ(Sigma)及び5.7μg/mlのT7 ＲＮＡポリメラーゼを含む400μｌの反応混合液中で42℃にて1時間行った。標的遺伝子として、HygEGFP遺伝子を標的とし、転写したショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、トリミングループに結合している表1及び表２に示す二本鎖領域と一本鎖５’−ＧＧＧ配列とを有している。トリミングループは、ループの２番目と最後の位置に２個の特異的なＧ残基を有している。RNase T1 (10,000U/ml)は、 100 mMのMgCl2の存在下で０℃という限定された条件下で、これら２個のＧ残基及び５’−ＧＧＧ配列を特異的に切断する。トリミングしたｓｉＲＮＡをフェノールで抽出し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。精製したｓｉＲＮＡの品質はＰＡＧＥ分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析で確認した
【００７１】
【表１】
2011087601.tif 000002
【表２】
2011087601.tif 000003
【００７２】
表１及び表２は、生じるｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの塩基配列を５’から３’の方向に示したものである。
表１において、EGFP483-18〜EGFP483-28で示されるｓｉＲＮＡは、そのアンチセンスＲＮＡの３’末端の塩基がＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの４８３番目の塩基に対応するよう設定され、二重鎖ＲＮＡの部分の長さが、それぞれ１６〜２６塩基のものである。480〜490により示されるｓｉＲＮＡは、そのアンチセンスＲＮＡの３’末端の塩基が、それぞれＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの４８０〜４９０番目の塩基に対応するよう設定されている。
表２において、EGFP638-18〜EGFP638-28で示されるｓｉＲＮＡは、そのアンチセンスＲＮＡの３’末端の塩基がＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの６３８番目の塩基に対応するよう設定され、二重鎖ＲＮＡの部分の長さが、それぞれ１６〜２６塩基のものである。635〜645により示されるｓｉＲＮＡは、そのアンチセンスＲＮＡの３’末端の塩基が、それぞれＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの６３５〜６４５番目の塩基に対応するよう設定されている。
【００７３】
（２）細胞培養及びトランスフェクション
Hyg/EGFP を安定に発現しているHeLa細胞（HeLaS3/HygEGFP細胞）を、トランスフェクションに用い、ＲＮＡｉ活性の測定にはHygEGFP遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを使用した。Hyg/EGFP 遺伝子は、ＥＧＦＰとハイグロマイシン耐性遺伝子との融合タンパク質を発現するpHygEGFP (Clontech)に由来するものである。細胞は、10％牛胎児血清（ＦＢＳ）、100unit/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び100μg/mlのハイグロマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で培養した。7.5×104個の細胞を６穴プレートに接種し、４８時間培養した。培地を、ハイグロマイシンを含まない1mlのOPTI-MEM I (Gibco)に交換した。10μｌのオリゴフェクタミン(Invitrogen)を用いて、（１）で作成した10μmolのＥＧＦＰ用ｓｉＲＮＡ(最終濃度10 nM) を細胞にトランスフェクションし、4時間インキュベートした後、30% FBS を含む500μlのダルベッコ改変イーグル培地を添加した。
【００７４】
（３）フローサイトメトリー及び免疫蛍光分析
トランスフェクションの７２時間後に、細胞をトリプシンで処理し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％アジ化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡを含むHanks緩衝液に再懸濁した。EGFPの蛍光をFACScalibur (Becton Dickinson)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。結果を図１及び図２に示す。
【００７５】
図１及び図２では、棒グラフで示した結果は、アンチセンスＲＮＡの３’末端の塩基がＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの４８３番目及び６３８番目の塩基に対応するように設定されたｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を示す。このｓｉＲＮＡは二重鎖ＲＮＡ部分の長さが、１６〜２６塩基のものであり、二重鎖ＲＮＡ部分の長さはグラフ上部に示された１６〜２６の数字に対応する。
【００７６】
折れ線グラフで示された結果は、アンチセンスＲＮＡの３’末端の塩基がＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの４８０〜４９０番目及び６３５〜６４５番目の塩基に対応するように設定されたｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を示す。このｓｉＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡの長さが１９塩基のものであり、アンチセンスＲＮＡの３’末端の塩基が対応する、ＥＧＦＰ遺伝子のｍＲＮＡの塩基の位置がグラフ下部に示された４８０〜４９０及び６３５〜６４５の数字に対応する。
【００７７】
二重鎖部分が２５、２６、２７塩基又は２８塩基（オーバーハングを入れて数えた場合には２７、２８、２９、３０塩基）のｓｉＲＮＡは、従来使用されている二重鎖部分が１９塩基（オーバーハングを入れて数えた場合、２１塩基）のものと比べて、標的とする配列によらず高い活性を示すことがわかる。
【００７８】
（４）細胞の培養及びトランスフェクション、並びにレポーター遺伝子の発現アッセイ
ｓｈＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が同様に活性を阻害するかどうか解析するために、図３に示すような２種のヘアピン型ＲＮＡを設計した。Ａ／Ｂタイプヘアピンは、「Ａ配列」をセンス鎖として、「Ｂ配列」をアンチセンス鎖として有するのに対して、Ｂ／Ａタイプヘアピンは、「Ａ配列」をアンチセンス鎖として、「Ｂ配列」をセンス鎖として有する。「Ａ配列」と「Ｂ配列」は、それぞれ相補的である。また、比較のため、タンデム型のベクターを作成した。また、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターであるｐＧＬ３コントロールベクターに、Ａ配列及びＢ配列の標的を挿入したものを作成した。
【００７９】
ＨｅＬａ Ｓ３細胞をｐＧＬ３コントロールベクターとβｇａｌ発現ベクターとにより共トランスフェクションした。ＨｅＬａ Ｓ３細胞は、１０％胎児牛血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地において培養された。トランスフェクションは、３００ｎｇのタンデム型または３０ｎｇのヘアピン型のｓｉＲＮＡの発現プラスミド、３０ｎｇのホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（pGL3; Promega, Madison, WI）、１０ｎｇのRenillaルシフェラーゼ発現プラスミド（pRL-RSV）を用いて、指示書に従い、リポフェクトアミン２０００(インビトロジェン社)により行なった。ルシフェラーゼ活性は、Dual Luciferase System (Promega)２４時間後測定された。相当するＤＮＡ量を確認するため、インサートの入っていないプラスミドが各トランスフェクションの適当なレベルに加えられた。
【００８０】
内部コントロールとしてβｇａｌ発現ベクターを用いた。タンデム型とヘアピン型とを比較した結果を図４の左のグラフに示す。ヘアピン型ではアンチセンス鎖のみが抑制効果を保っていたのに対して、タンデム型は、センス及びアンチセンスの両方とも抑制効果があった。
【００８１】
この活性の差が配列自体に依存するのか、ヘアピンの構造自体に依存するのか確認するため、図３に示すＡ／ＢとＢ／Ａのヘアピンベクターを用いて抑制効果を測定した。両ベクターのアンチセンス鎖は、センス鎖に比べてより発現を抑制することが示された（図４の右のグラフ）。このことから、ヘアピン型のベクターの発現抑制効果は、配列自体だけではなく、ヘアピンにおけるアンチセンス鎖とセンス鎖の位置が重要であることが示された。
【００８２】
ヘアピンベクターにおけるセンス又はアンチセンスの位置の重要性をさらに解明するために、図３に示すＡ／Ｂベクター、Ｂ／Ａベクター及びタンデムベクターについてノザン解析を行なった。１μｇのｓｉＲＮＡ発現プラスミド、又はホタルルシフェラーゼに対する１０ｎＭのｓｉＲＮＡによりＨｅＬａ Ｓ３細胞をトランスフェクションし、２４時間後、全ＲＮＡをIsogen Reagent （和光純薬株式会社）により抽出した。抽出された全ＲＮＡ（１５μｇ）を１８％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリアクリルアミド−ウレアゲルによりサイズ分画し、Hybond N+ membrane（アマシャム）に転写した。転写されたHybond N+ membraneを室温で乾燥し、紫外線により固定した。３０％のホルマリン、１０％の硫酸デキストラン、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１×デンハード溶液及び０．１ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ（シグマ）中で、Hybond N+ membraneをプレハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子又はウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の配列と相補的な、以下に示す合成オリゴヌクレオチドプローブにより、３６℃で３時間行なった。
【００８３】
ホタルルシフェラーゼ サイトB; (センス) 5’-AAG CTA TGA AAC GAT ATG GG-3’, 
ウミシイタケルシフェラーゼ サイトC; (センス) 5’-AAG TAG TGT GGT GTA TTA TA-3’, 
(アンチセンス) 5’-TAT AAT ACA CCG CGC TAC TT-3’.
【００８４】
コントロールとして用いられたバリンのｔＲＮＡのプローブの配列は次の通りである。
5’-GAA CGT GAT AAC CAC TAC ACT ACG GAA ACC CTA TAG TGA GTC GTA TTA GGC GGG AAC CGC CTA ATA CGA CTC ACT ATA GG-3’. 
【００８５】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）により、３２Ｐ-ATP（アマシャム）で合成プローブを標識した。このHybond N+ membraneを、３６℃で２×ＳＳＣで２回洗浄し、Fujix Bio-Image Analyzer BAS1000（富士写真フィルム株式会社）により解析した。結果を図５に示す。マーカー（ＭＫ）は２１塩基の長さである。Ｂ配列の検出のため、Ａ配列をプローブとして用いてハイブリッドさせたものを左側、Ａ配列の検出のためＢ配列をプローブとして用いたものを右側に示す。Ｂ配列の検出では（図５左）、Ａ／Ｂベクター及びタンデムベクターを用いた場合、Ｂ配列を明らかに検出できたが、Ｂ／Ａベクターは検出されなかった。さらに、Ａ配列はＢ／Ａベクターの場合とタンデムベクターの場合のみ検出された（図５右）
これらのことから、ヘアピン型のｓｉＲＮＡ発現ベクターはセンス鎖の非特異的な作用を抑制できるため、より望ましいことがわかった。
【００８６】
（５）平滑末端又は２塩基突出末端を有する１９塩基、２５塩基及び２７塩基の二本鎖RNAの発現抑制効果の比較
HeLaS3細胞にリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、10ngのウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター（ｐRL-CMV)（プロメガ社）と30ngのホタルルシフェラーゼ発現ベクター（ｐGL3）および、様々なウミシイタケルシフェラーゼに対する2本鎖RNA（終濃度１ｎM)を導入した。使用した２本鎖ＲＮＡは、次の通りである。
【００８７】
19塩基２本鎖RNA（両端2塩基突出）
5’-UUCACGCUGAAAGUGUAGUUU-3’
5’-ACUACACUUUCAGCGUGAAUU-3’
25塩基２本鎖RNA（両端平滑）
5’-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUA-3’
5’-UACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCU-3’
25塩基２本鎖RNA（両端2塩基突出）
5’-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUAGU-3’
5’-UACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCUUU-3’
27塩基２本鎖RNA（両端平滑）
5’-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUAGU-3’
5’-ACUACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCU-3’
25塩基２本鎖RNA（片端2塩基突出）
5’-AGCAAUAGUUCACGCUGAAAGUGUAGU-3’
5’-UACACUUUCAGCGUGAACUAUUGCU-3’
【００８８】
12時間後に細胞を回収し、デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイキット（プロメガ社）を用いて、ホタルルシフェラーゼ・ウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定した。測定データーは、トランスフェクション効率などを補正するために、ウミシイタケルシフェラーゼをホタルルシフェラーゼで規格化したものを用いた。
【００８９】
結果を図６に示す。図６において、１は、二本鎖RNAなし、２は、19塩基２本鎖RNA（両端2塩基突出）、３は25塩基２本鎖RNA（両端平滑）、４は25塩基２本鎖RNA（両端2塩基突出）、５は27塩基２本鎖RNA（両端平滑）、６は25塩基２本鎖RNA（片端2塩基突出）を示す。図６に示すように、19塩基2本鎖RNAに比較して、25塩基、27塩基2本鎖RNAが高い抑制活性を示した。
【００９０】
（６）EGFPに対する異なる長さのsiRNAのRNAi活性の比較
センス鎖の2本鎖部分の配列が、１９、２１、２３、２５又は２７塩基のｓｉＲＮＡを合成した（オーバーハングを含めると、２１、２３、２５、２９塩基）。センス鎖の５’末端の位置は、EGFPのORFのポジション４３８に相当する。オーバーハングは、センス鎖AG、アンチセンス鎖AUである。用いた配列を以下に記す。
【００９１】
19塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAU-3’（2本鎖RNA領域）
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAU-AG-3’
アンチセンス 5’-AUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3’
21塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAU-3’（2本鎖RNA領域）
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAU-AG-3’
アンチセンス 5’-AUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3’
23塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCA-3’（2本鎖RNA領域）
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCA-AG-3’
アンチセンス 5’-UGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3’
25塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUG-3’（2本鎖RNA領域）
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUG-AG-3’
アンチセンス 5’-CAUGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3’
27塩基 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGC-3’（2本鎖RNA領域）
センス 5’-CAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGC-AG-3’
アンチセンス 5’-GCCAUGAUAUAGACGUUGUGGCUGUUG-AU-3’
【００９２】
実験条件は以下のとおりである。EGFP遺伝子を導入したHeLa細胞を３７℃、５％CO2条件下にて２４ｗｅｌｌプレートで２４時間前培養し、５０％コンフルエントの状態にした。培地はDulbecco’s modified Eagle培地に１０％Fetal Bovine serum(FBS)を加えたものを使用した。細胞をPBSで洗浄後、培地をOpti-MEM I (GIBCO)に交換し、siRNAを終濃度 0.1 nMでトランスフェクションした。
トランスフェクション試薬はオリゴフェクトアミン（インビトロジェン社）を使用し、トランスフェクションボリュームは２５０μlとした。４時間後、３０％FBSを含む培地（Dulbecco’s modified Eagle培地）を１２５μl加え、引き続き培養した。siRNA導入から48時間後にフローサイトメトリーによって、EGFPの蛍光強度を測定した。結果を図７に示す。二本鎖部分が２５塩基及び２７塩基の二本鎖ＲＮＡについて、19塩基の二本鎖RNAより、ＲＮＡｉの活性が高いことが確認された。
【００９３】
（７）１９塩基、２５塩基及び２６塩基のｓｉＲＮＡにおけるタンデム型及びヘアピン型の発現抑制の比較
ＨｅＬａ Ｓ３細胞を、１０％胎児牛血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地において培養した。３００ｎｇのタンデム型または３０ｎｇのヘアピン型のｓｉＲＮＡの発現プラスミド、３０ｎｇのホタルルシフェラーゼ発現プラスミド（pGL3; Promega, Madison, WI）、及び１０ｎｇのウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド（pRL-RSV）により、Promegaの指示書に従い、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いてトランスフェクションを行なった。Dual Luciferase System (Promega)により２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。相当するＤＮＡ量を確認するため、インサートの入っていないプラスミドを各トランスフェクションの適当なレベルに加えた。
Ｕ６プロモーターのすぐ下流に挿入された配列は、以下の通りである（センス配列のみ記載）。
【００９４】
pU6tandem19及びpU6hairpin19, GTG CGC TGC TGG TGC CAA C;
pU6tandem26, GTG CGC TGC TGG TGC CAA CCC TAT TC;
pU6hairpin25, GTG CGC TGC TGG TGC CAA CCC TAT T
【００９５】
結果を図８に示す。タンデム型とヘアピン型いずれにおいても、１９塩基と２６塩基または２５塩基とで比較すると、２６塩基又は２５塩基のほうが１９塩基より効果的にルシフェラーゼの発現を抑制することがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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