(57)【要約】      （修正有）【課題】バイオマスを用いた燃料やマテリアルの製造・開発等に好適な高濃度糖化液を低コストで容易に製造できる方法を提供する。【解決手段】反応溶媒中に疎水性の炭化水素系溶媒、エーテル、エステル類、石油留分など有機溶媒を存在させ、セルロース系のバイオマス等にセルラーゼ、アミラーゼ等の酵素又はそれらの固定化酵素を作用させて多糖類をより低分子の糖類に加水分解し、燃料やマテリアルの製造・開発等に適した高濃度糖化液を製造する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスから酵素を用いて糖化液を製造する方法であって、
疎水性の有機溶媒が存在する反応溶媒中に、バイオマス及び酵素を添加して攪拌することにより、前記バイオマス中の多糖類をより低分子の糖類に加水分解する分解ステップと、
必要により前記分解ステップの最終段階で前記反応溶媒中に水系溶媒を添加して、前記分解されたより低分子の糖類を水系溶媒に抽出する抽出ステップと、
前記水系溶媒に抽出された糖類を糖化液として回収する回収ステップと、
を含むことを特徴とする、糖化液を製造する製造方法。
【請求項２】
前記分解ステップにおいて、前記反応溶媒は前記有機溶剤と水系溶媒との混合液であり、該混合液中に前記バイオマスは分散されていることを特徴とする請求項１に記載の糖化液の製造方法。
【請求項３】
前記反応溶媒において前記水系溶媒は３５容量％以下であることを特徴とする請求項２に記載の糖化液の製造方法。
【請求項４】
前記分解ステップにおいて、反応開始時は前記反応溶媒として前記有機溶媒を用い、反応の途中で水系溶媒を添加することを特徴とする請求項１に記載の糖化液の製造方法。
【請求項５】
前記酵素は固定化酵素である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の糖化液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスから糖化液を製造する方法に関する。更に詳しくは、疎水性の有機溶媒を用いて、バイオマスを用いた燃料やマテリアルの製造・開発等に適した、高濃度糖化液を低コストで容易に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱石油化学社会の構築には、バイオマスと称される生物由来の資源を活用したエネルギーやマテリアルの生産は不可欠である。中でも太陽エネルギーと二酸化炭素を光合成により有効活用できる植物系のバイオマス（以下、バイオマスという）は、大気中の二酸化炭素濃度増加を招くことのない、所謂カーボンニュートラルな資源として有効活用が望まれている。
【０００３】
一方で、これらバイオマス由来のマテリアルやエネルギーのコスト高が、市場普及への大きな障害となっている。バイオマス由来の製品を製造する場合、多額のコストを要する多くの工程を経る。例えばセルロース系バイオマスからエタノール等のエネルギーを生産する場合、次の工程を経る。
まず、１．木材や草などの原材料を粉砕・加圧・加熱処理等を行った後、セルロースやヘミセルロースと言った多糖類を取り出す。次に、２．多糖類を酸や酵素などの触媒により加水分解すなわち糖化して、グルコースなどの単糖類を回収する。３．得られた単糖類は、酵母などの微生物の発酵によりエタノールに変換する。さらに、４．エタノールと共存する多量の水を除去するために、蒸留や脱水を行う。
また、ポリ乳酸などのマテリアルをバイオマスから生産する場合も、同様の工程を経て、得られたグルコースなどの単糖類を用いる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２８７３８６５号公報
【特許文献２】特開平６−１２１６９３号公報
【特許文献３】特開平７―５９５８５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
粉砕後のバイオマスを上記２の酵素加水分解反応すなわち酵素糖化反応する場合、試料と酵素の接触回数を向上させるために、水（溶媒）を加えて分散させる。例えばセルロース系バイオマス試料の場合、試料の吸水性が良く少量の液体では分散しにくいため、少なくとも試料の１０〜２０倍の水を加える必要がある（試料濃度：５〜１０ｗ／ｖ％程度）。この様に多くの水を加えるため、加水分解（糖化）によって得られる糖液の濃度は低くなり、３の発酵時には糖の１/３が二酸化炭素になり減少するために、エタノール濃度は３〜７％程度と低濃度になる。
【０００６】
バイオ燃料としてエタノールを用いる場合、得られた低濃度のエタノールを４の蒸留・脱水を行いエタノールの濃度を９０％以上にまで濃縮することになる。これまでの方法では、この工程で消費される熱エネルギーが非常に大きくなるばかりでなく、糖化の後工程となる３及び４の装置が不要な水を入れるために大型化し、製品のコスト高を招いている。このことは、バイオマテリアルを製造する場合も、グルコースから乳酸・コハク酸などへ発酵させることから、エタノールの場合と同様の問題を起こしている。
斯かる状況に鑑み、本発明は工業的に安価かつ容易にバイオマスを酵素により糖化し、共存する水割合が少ない高濃度の糖化液を取得する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために種々研究を重ねた結果、バイオマスの酵素加水分解（糖化）において、反応溶媒中に疎水性の有機溶媒を存在させることにより、高効率に分解（糖化）が起こることを見出し、本発明に至った。従って、本発明は、以上の知見に基づいたものであり、次の構成からなる。
【０００８】
［１］バイオマスから酵素を用いて糖化液を製造する方法であって、
疎水性の有機溶媒が存在する反応溶媒中に、バイオマス及び酵素を添加して攪拌することにより、前記バイオマス中の多糖類をより低分子の糖類に加水分解する分解ステップと、
必要により前記分解ステップの最終段階で前記反応溶媒中に水系溶媒を添加して、前記分解されたより低分子の糖類を水系溶媒に抽出する抽出ステップと、
前記水系溶媒に抽出された糖類を糖化液として回収する回収ステップと、
を含むことを特徴とする糖化液を製造する製造方法である。
【０００９】
本発明における「バイオマス」とは、植物系のバイオマスを意味し、セルロース系バイオマス、澱粉系バイオマス等を含むが、多糖類を含むバイオマスであればこれらに限定されない。本発明における「多糖類」とは、セルロース、ヘミセルロース等を含むが、これらに限定されない。
【００１０】
［２］前記分解ステップにおいて、前記反応溶媒は前記有機溶媒と水系溶媒との混合液であり、該混合液中に前記バイオマスは分散されている、ことを特徴とする［１］に記載の方法である。
本発明における「水系溶媒」とは、水のみ、及び水を含む緩衝液等を含むが、水を含んでいればよい。
【００１１】
本発明における「分散されている」とは、液相の反応溶媒へバイオマスの粉体を混入させた状態を指し、この状態でバイオマスの粉体は反応溶媒中で自由運動が可能である（図１ｂ参照）。
有機溶媒の種類、バイオマスの種類、バイオマスの粒径、有機溶媒と水系溶媒との配合比、反応溶媒とバイオマスとの混合比等の要因によってはバイオマスと反応溶媒との混合物がペースト状（高粘度流体）となる場合があり、このペースト状態ではバイオマスに対する酵素の接触頻度が低下して充分な加水分解速度を得難い（図１ａ）。
従って、これらの要因を適宜調整して、バイオマスを反応溶媒において分散させ、反応溶媒中の酵素がバイオマスに対して自由に接触できるようにする。
【００１２】
バイオマスを分散状態とするには上記要因を適宜調整するものであるが、本発明者の検討によれば、反応溶媒としてその水系溶媒の配合量を３５容量％以下としたもの、を採用することが好ましい（本発明の第[３]局面）。
ここに、「前記水系溶媒は３５容量％以下」とは、前記水系溶媒を含まない場合を含む。
この範囲を超えて水系溶媒を加えることも勿論可能であるが、アルコール回収時の蒸留量を考慮すると３５容量％以下が適当と考えられる。なお、この範囲を大きく超えて水系溶媒を配合量すると、バイオマスと反応溶媒との混合物はペースト状になる可能性が高い。
【００１３】
［４］前記分解ステップにおいて、反応開始時は前記反応溶媒として前記有機溶媒を用い、反応の途中で水系溶媒を添加する、ことを特徴とする［１］に記載の方法である。
［５］前記酵素は固定化酵素であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれかに記載の方法である。
従来、バイオマスの糖化反応には加水するための水を分散溶媒として用いたが、本発明による方法では試料の水分、もしくは反応に最低限必要とされる水分を分散用の疎水性の有機溶媒に投入することにより行うことができる。酵素糖化反応時の水分量が糖類の抽出・回収に十分な量含まれている場合、抽出・回収時に水系溶媒の添加は必要でなくなる。なお、投入する水系溶媒の量は抽出用も含め、最大で前記反応溶媒の３５容量％までが好ましく、１容量％以上〜３０容量％以下がより好ましく、１５容量％以上〜２５容量％以下では、水系溶媒単独よりも酵素活性が顕著に高められるので、特に好ましい。水系溶媒―前記有機溶媒（前記反応溶媒）の１００容量部に対して試料約５〜１０重量部となることが好ましい。
【００１４】
本発明に用いる疎水性の有機溶媒は、水と相溶性の無いものであればいずれも使用可能であるが、具体的には、
鎖状飽和炭化水素系溶媒：  ｎ−ペンタン、２−メチルブタン、ｎ−ヘキサン、へプタン、オクタンなど
環状飽和炭化水素系溶媒：  シクロペンタン、シクロヘキサンなど
芳香族系炭化水素系溶媒：  ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼンなど
その他（ハロゲン化炭化水素系溶剤、エーテル、エステル類、石油留分など）  ：  クロロホルム、四塩化炭素、酢酸エチル、酢酸メチルなど
が用いられるが、酢酸メチルやトルエンなど水と完全に２層分離する溶媒が望ましい。
【００１５】
本発明に用いる酵素（加水分解酵素）としては、セルロース系バイオマスの場合、セルラーゼ、ヘミセルラーゼが好適なものとして挙げられ、澱粉系バイオマスの場合アミラーゼが好適なものとして挙げられるが、これに縛られるものではない。
中でも、セルラーゼとしては、エンドグルカナーゼ ＥＣ３．２．１．４、エキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ） ＥＣ  ３．２．１．９１及びβ-グルコシダーゼＥＣ３．２．１.２１の混合が望ましい。アミラーゼとしては、α-アミラーゼ  ＥＣ  ３．２．１．１、β-アミラーゼＥＣ  ３．２．１．２、グルコアミラーゼＥＣ  ３．２．１．３の混合が望ましい。
【００１６】
これら酵素は、疎水性の有機溶媒による失活の影響を抑える目的から、不溶性の担体に固定化して固定化酵素として用いることが望ましい。酵素の固定化方法は、イオン結合法、物理吸着法、化学結合法、架橋法及び包括法があるが、本発明では担体の耐久性が高く使用中に酵素が担体外に放出されにくい、シリカゲルの包括固定化剤が望ましい。
【００１７】
本発明の反応温度は４０〜５０℃が最適であるが、これに限るものではなく、酵素の至適温度や耐久性により適切に設定することが可能である。抽出及び反応時に使用する水系溶媒は、ｐＨ５〜７の緩衝液が望ましいが、これに拘るものではない。本発明では、例えば疎水性の有機溶媒中にバイオマス、酵素を投入し攪拌しながら分散・反応させ、バイオマスから低分子の糖類を得る。その後に最低量の緩衝液を投入し攪拌しながら、緩衝液に低分子の糖類を抽出させ高濃度の糖溶液を取得する。反応後、攪拌を停止させると前記有機溶媒と水は比重差により２層に分離し、目的とする低分子の糖化液が容易に回収できる。回収した糖化液のうち単糖などの糖液は、糖液は発酵槽でエタノールに変換される。さらに、蒸留・濃縮行程を経て９０％以上のエタノール燃料となる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、従来の糖化液の製造手法に比べて、高濃度糖化液を、低コストで容易に製造する方法が提供される。これにより、バイオマス由来のマテリアルやエネルギーにおけるコスト高や煩雑さ等の問題を解決することができ、バイオマスを用いた燃料やマテリアルの製造・開発分野において極めて有意義である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】バイオマス（スギ試料）と水系溶媒（MacIlvain緩衝液）(ａ)又は疎水性の有機溶媒（トルエン）（ｂ）との混合状態を示す写真。
【図２】スギ試料を用いて様々な反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収された全糖濃度を示す図。
【図３】スギ試料を用いて様々な反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収された全糖量を示す図。
【図４】トマトの葉茎試料を用いて様々な反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収された全糖濃度を示す図。
【図５】トマトの葉茎試料を用いて様々な反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収された全糖量を示す図。
【図６】結晶性セルロース試料を用いて様々な濃度のトルエンを含む反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収された全糖濃度を示す図。
【図７】結晶性セルロース試料を用いて様々な濃度のトルエンを含む反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収された全糖量を示す図。
【図８】結晶性セルロース試料を用いて様々な濃度のトルエンを含む反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収されたグルコース濃度を示す図。
【図９】結晶性セルロース試料を用いて様々な濃度のトルエンを含む反応溶媒中で反応を行った後の水相に回収されたグルコース量を元に算出したα- セルロース分解率を示す図。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２０】
（Ａ）試験方法
１．試料及び試薬
セルロース系バイオマス試料には結晶性セルロースのセオラスTG（旭化成（株））、トマトの葉茎の廃材及びスギを用いた。なお、トマトの葉茎及びスギは、乾式粉砕後に篩い分けを行い、45?mから90??mの分画サイズを用いた。セルロース糖化用酵素には、セルラーゼA「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４、及びヘミセルラーゼ「アマノ」90 （全て、天野エンザイム（株）製）を同量混合して用いた。
【００２１】
２．試料の水分測定
試料の水分測定は105℃の乾燥機を用いて行った。105℃で恒量になるまで乾燥した試料の重量を用い、以下の式により試料の水分を算出した。
試料の水分（重量％）＝（乾燥前の試料の重量(g) ― 105℃で乾燥した試料の重量(g)）／（乾燥前の試料の重量(g)）×100％
【００２２】
（Ｂ）酵素糖化反応
疎水性の有機溶媒の入ったガラス製容器に試料及び酵素を投入し、50℃の環境下において180rpmで3日間振とう・反応させた。なお、酵素量は試料1gあたり各20mg、前記有機溶媒は試料0.5gあたり10mLとした。反応時に水を投入する場合は、pH 5.0のMacIlvain緩衝液を用い、投入した前記緩衝液と同量の有機溶媒を除いて、溶液量を10mL に統一して試験に供した。
【００２３】
（Ｃ）糖類の抽出
反応の最終段階でガラス容器にイオン交換水を投入し、密栓後1分間強く攪拌し低分子の糖類を水に抽出させた。抽出に使用した水の量は試料0.5gに対し2ｍLとした。なお、反応時に水を投入した系では、抽出用の水量を減らし、反応時の水と抽出用の水が併せて試料0.5gに対し2mL となるように統一した。
（Ｄ）成分分析
グルコースの定量分析は、グルコースＣIIテストワコー（和光純薬（株）製）を用いて行った。全糖の分析はフェノール硫酸法を用いた。
【００２４】
（Ｅ）実験結果
１−１．スギ混濁液の粘度
密閉容器中のスギにMacIlvain緩衝液又はトルエンを投入したところ、前者は後者に比べ粘度が大きく上昇した。スギ2gに対し前記緩衝液9mLを加えた状態を図１ａに示し、同じくトルエン9mLを加えた状態を図１ｂに示す。各々の粘度をB型粘度計で測定したところ、前記緩衝液を用いた試験区では2,400から3,000cP、トルエンを用いた試験区では625から750cPであった。
【００２５】
前記粘度及び図１から明らかなように、反応溶媒が同量であるにもかかわらず、前記緩衝液を用いた試験区では試料が前記容器を傾けても移動しないほど膨潤するのに対して（ペースト状態：図１ａ）、トルエンを用いた試験区では反応溶媒が2層に分離し試料が前記容器を傾けると試料粒子が移動する程度に分散された（分散状態：図１ｂ）。
【００２６】
１−２．各種有機溶媒中でのスギの糖化試験結果
pH 5.0のMacIlvain緩衝液、酢酸メチル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、及びトルエン中でスギ（0.5ｇ）を酵素糖化反応させた。また、容積比で緩衝液：有機溶媒＝1:9の溶液中でも同様の試験を行った。用いたスギの水分は12.1重量％であった。3日間の酵素糖化により生成した全糖のうち、抽出した水及び未抽出で使用した有機溶媒中に残った糖の割合、すなわち、各種有機溶媒中で糖化した後の水抽出全糖及び有機溶媒残存全糖の割合を表1に示す。全ての系において、90%以上の糖が水に抽出された。反応溶媒に緩衝液：有機溶媒＝1:9の混合液を用いた場合、水中に回収される糖の量が多くなった。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
また、3日間反応後に抽出した水の全糖濃度を図２に示す。図２中、
１  pH 5.0のMacIlvain緩衝液のみ、
２  酢酸エチルのみ、
３  ｎ−ヘキサンのみ、
４  クロロホルムのみ、
５  トルエンのみ、
６  前記緩衝液：酢酸エチル＝１：９（容積比）の混合液、
７  前記緩衝液：ｎ−ヘキサン＝１：９（容積比）の混合液、
８  前記緩衝液：クロロホルム＝１：９（容積比）の混合液、
９  前記緩衝液：トルエン＝１：９（容積比）の混合液である（以下、図３〜５も同様）。
【００２９】
なお、有機溶媒を使用せずpH 5.0のMacIlvain緩衝液のみの試験区（１）は、反応後に水を加えることなく緩衝液の糖濃度を測定した。緩衝液中の糖化に比べ、有機溶媒中で糖化反応して水抽出した試験区は、全て高い濃度の糖液が回収された。中でも、水：有機溶媒＝1:9の溶液中で反応させた回収液の糖液濃度は高く、いずれの場合も、MacIlvain緩衝液のみの試験区（１）の3.0mg/mLに比べ約6倍の18mg/mL以上になった。
【００３０】
図３に、上記試験の際に回収された全糖量を示す。MacIlvain緩衝液のみ中で酵素糖化した場合、30.2mgの糖が回収された。容積比で前記緩衝液：有機溶媒＝1:9の溶液中で試験を行った全ての場合において、酵素糖化で得られた糖の量が増加した。中でも、前記緩衝液：トルエン＝1:9の試験区（９）では、37.3mgと糖の量が最も多く、MacIlvain緩衝液中の1.1倍となった。
【００３１】
２．各種有機溶媒中でのトマト葉茎の糖化試験結果
上記スギの試験と同様の試験方法で、トマトの葉茎（0.5ｇ）を酵素糖化した。使用したトマトの葉茎に含まれる水分は8.7重量％であった。3日間反応後に抽出した水の全糖濃度を図４に示す。なお、有機溶媒を使用せずpH 5.0のMacIlvain緩衝液のみの試験区（１）は、反応後に水を加えることなく緩衝液の糖濃度を測定した。スギの場合と同様に、前記緩衝液中の糖化に比べ、有機溶媒中で糖化反応して水で抽出した試験区は、全て高い濃度の糖液が回収された。中でも、水：有機溶媒＝1:9の溶液中で反応させた回収液の糖液濃度は高く、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、及びトルエンを用いた場合、MacIlvain緩衝液のみの試験区（１）の3.４mg/mLに比べ約6倍の20mg/mL以上になった。
【００３２】
図５に、上記試験の際に回収された全糖量を示す。MacIlvain緩衝液のみ中で酵素糖化した場合、33.8mgの糖が回収された。容積比で緩衝液：有機溶媒＝1:9の溶液中で試験を行った全ての場合において、酵素糖化で得られた糖の量が増加した。中でも、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、及びトルエンを用いた場合では、MacIlvain緩衝液の1.18倍を超える40mg以上の糖が得られた。
【００３３】
３．様々な水分量での結晶性セルロースの糖化試験結果
60℃の恒温器中でセオラスTGを58時間減圧乾燥し、水分値を4.11重量％とした。乾燥後のセオラスTG（0.5ｇ）をMacIlvain緩衝液とトルエンの比率を変えた様々な水分割合の溶液中で酵素糖化した。上記スギの試験と同様の試験方法で、3日間反応後に抽出した水中の全糖濃度を図６に、分解率を図７に示す。図６及び７中、
１  pH 5.0のMacIlvain緩衝液のみ、
２  トルエンのみ、
３  前記緩衝液：トルエン＝０．４：９．６の混合液、
４  前記緩衝液：トルエン＝０．６：９．４の混合液、
５  前記緩衝液：トルエン＝０．８：９．２の混合液、
６  前記緩衝液：トルエン＝１．０：９．０の混合液、
７  前記緩衝液：トルエン＝１．５：８．５の混合液、
８  前記緩衝液：トルエン＝２．０：８．０の混合液、
９  前記緩衝液：トルエン＝２．２：７．８の混合液、
１０  前記緩衝液：トルエン＝２．５：７．５の混合液、
１１  前記緩衝液：トルエン＝３．０：７．０の混合液
であり、前記混合液は全て容積比で表す（以下、図８及び９も同様）。
【００３４】
有機溶媒を用いた試験区の全糖濃度は、MacIlvain緩衝液のみの試験区（１）より全て高くなった。特にMacIlvain緩衝液：トルエン＝1.5：8.5の試験区（７）では最大値30.1mgを示した。また、トルエンのみの場合（２）を除き、MacIlvain緩衝液を添加した試験区では、分解率が大きく向上した。
【００３５】
さらに、同一の試験において全糖に含まれるグルコースについて分析を行った。グルコース濃度を図８に、グルコース量を元に算出したα- セルロース分解率を図９に示す。抽出水のグルコース濃度はトルエンのみで反応を行った系以外は全てMacIlvain緩衝液のみの試験区より高くなった。また、α- セルロース分解率は全糖に比べ低くなったもののMacIlvain緩衝液：トルエン＝1.5：8.5から2.5：7.5の割合で前記緩衝液を追加した試験区では分解率がMacIlvain緩衝液のみの試験区より高くなった。低分子の糖ほど親水性になる傾向があることから、単糖のグルコース生産には水分の量が大きく影響したものと考えられた。また、水の分子量18に対し、グルコースの分子量は180と10倍大きい。今回の試験の様に数容量％の水分があれば、およそその10倍のグルコースが得られることになる。通常の植物系のバイオマスは10重量％程度の水分を保有していることから、疎水性の有機溶媒に添加する水分は特に必要とすることなく酵素糖化を行うことが出来る。
【００３６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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