(57)【要約】      （修正有）【課題】好気的条件において、炭素源であるグリセロールから糸状菌を用いた発酵により、コハク酸を製造する方法を提供する。【解決手段】遺伝子工学的手法によりコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）遺伝子の発現量を減少させ、代謝経路を改変した糸状菌を作製し、この糸状菌を用いて好気的条件においてグリセロールを炭素源として発酵を行うことにより、コハク酸を生産する方法。発現量の減少は、例えば、ＳＤＨ遺伝子から転写されるｍＲＮＡに対して相補的な配列を有するＲＮＡを発現するＤＮＡ配列を組み込むことにより行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を減少させるためのＤＮＡ配列を組み込んだ形質転換された糸状菌を用いてグリセロールからコハク酸を製造する方法。
【請求項２】
コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を減少させる方法が、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの全部又は一部に対して相補的な配列を有するＲＮＡを発現するＤＮＡ配列を菌体内に担持させる方法である、請求項１に記載のコハク酸を製造する方法。
【請求項３】
該ＤＮＡ配列が宿主である糸状菌と同一の種由来のもののみからなることを特徴とする、請求項１又は２に記載のコハク酸を製造する方法。
【請求項４】
糸状菌が白色腐朽菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のコハク酸を製造する方法。
【請求項５】
糸状菌がトラメテス（Trametes）属の白色腐朽菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のコハク酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コハク酸を製造する方法に関し、グセロールを原料とし菌体を利用して生物学的にコハク酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸は、カルボン酸の一種である。ＴＣＡ回路の中間物質の一つであり、自然界において様々な生物の体内に存在している。
コハク酸は、広範な産業上の用途を有する。例えば食品や化粧品にｐＨ調整剤として使用されている。
また従来から、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）系プラスチックの原料として利用されている。ＰＢＳは生分解性プラスチックの一つであり、使用後、微生物の働きによって水と二酸化炭素に分解されるため、環境負荷の低いプラスチックとして注目されている。
従来、ＰＢＳの原料となるコハク酸は、石油由来の無水マレイン酸から製造されていた。しかし近年、環境中への二酸化炭素排出量削減の観点から、プラスチックの原料を植物バイオマス由来のものへ転換する技術開発が進められており、コハク酸についても微生物を利用した発酵法による生産方法が報告されている（特許文献１及び２）。
特許文献１では、コハク酸生産性の細菌を利用して嫌気的条件でコハク酸を製造する方法が開示されている。この他にも嫌気的条件でコハク酸を生産する公知の方法があるが、これらの方法を実施するためには、培養時の嫌気状態を維持するために特殊な設備が必要となる。
特許文献２には好気的な条件でコハク酸を製造する方法が開示されている。この方法ではキャンディダ（Candida）属の真菌を利用して、好気的条件で、ｎ-パラフィンを原料としてコハク酸を製造する。
【０００３】
また遺伝子工学により改変された微生物を利用してコハク酸生産性を向上させる方法も報告されている（特許文献３、非特許文献１及び２）。
非特許文献１ではコハク酸生産性細菌である Mannheimia succiniciproducens において、複数の遺伝子を破壊することにより副産物である乳酸、ギ酸、酢酸の生成量を減らし、嫌気的条件でのコハク酸生産量を増加させることができることが報告されている。
非特許文献２では、グラム陰性細菌である大腸菌について、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）をコードする遺伝子及びその他の複数の遺伝子を破壊するとともに、植物（Sorghum vulgare）由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を高発現させることで、副産物である酢酸等の生産量を減らし、好気的条件の培養でコハク酸を生産させることができることが報告されている。なお後述するようにＳＤＨはＴＣＡ回路においてコハク酸をフマル酸に酸化する酵素である。
上記遺伝子工学により改変された微生物を利用する方法は、嫌気的条件である点（非特許文献１）及び組換え体を使用する点（非特許文献２）で、特殊な設備が必要になるという問題がある。
ＳＤＨ遺伝子を改変した微生物を利用する方法としては、非特許文献２の他に、特許文献３において、アンチセンス法等によってＳＤＨ遺伝子の発現量を減少させることによってコハク酸を製造する着想が開示されている。しかし具体的な実施可能性については全く検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平７−３８７９５号公報
【特許文献２】特開昭４８−０５８１９１号公報
【特許文献３】特開２００６−２３８８４３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lee SJ et al, Appl. Environmental Microbiol., 72(3), 1939-1948 (2006)
【非特許文献２】Lin H et al, Biotechnol. Bioeng., 90 775-779 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のコハク酸製造方法は、嫌気的条件での培養や組換え体の使用により特殊な設備が必要であり、また培養条件の制御及び管理が煩雑であった。本発明は、特殊な設備が不要な好気的条件下でコハク酸を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決するため鋭意研究した結果、遺伝子工学的手法により代謝経路を改変した糸状菌を作製し、この糸状菌を用いて好気的条件においてグリセロールを炭素源として発酵を行うことにより、コハク酸を生産するができることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下の（１）〜（５）の５つの発明を包含する。
（１）  コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を減少させるためのＤＮＡ配列を組み込んだ形質転換された糸状菌を用いてグリセロールからコハク酸を製造する方法。
（２）  コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を減少させる方法が、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの全部又は一部に対して相補的な配列を有するＲＮＡを発現するＤＮＡ配列を菌体内に担持させる方法である、（１）に記載のコハク酸を製造する方法。
（３）  該ＤＮＡ配列が宿主である糸状菌と同一の種由来のもののみからなることを特徴とする、（１)又は（２）に記載のコハク酸を製造する方法。
（４）  糸状菌が白色腐朽菌であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のコハク酸を製造する方法。
（５）  糸状菌がトラメテス（Trametes）属の白色腐朽菌であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載のコハク酸を製造する方法。
【発明の効果】
【０００８】
代謝経路を改変した糸状菌を好気的条件で使用するため、特殊な設備を用いずに、グリセロールから工業上有用なコハク酸を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】アラゲカワラタケ染色体上の sdh1 遺伝子の推定コード領域、Degenarate ＰＣＲ及びインバースＰＣＲにより増幅した断片の位置関係を示す図である。図中の太線の領域について配列を決定した。
【図２】アラゲカワラタケの形質転換に用いたＤＮＡ断片の構造を示す図である。また、アンチセンス鎖発現用断片上の矢頭は、形質転換確認のＰＣＲに用いたプライマーの位置を示す。
【図３】コロニーＰＣＲによる形質転換体の確認の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、コハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を減少させた糸状菌を用いる。糸状菌とは、子嚢菌、接合菌、担子菌、不完全菌のいずれかに属する微生物を指す。糸状菌は高い耐酸性を持つものが多く、有機酸の製造に適している。例えば三価のカルボン酸であるクエン酸は、糸状菌である Aspergillus niger を利用して工業的に製造されている。
本発明で使用される糸状菌は、好ましくは担子菌に属する白色腐朽菌であり、例えば、コリオラス／トラメテス（Coriolus/Trametes）属、シゾフィラム（Schizophyllum）属、プレウロタス（Pleurotus）属、ファネロカエテ（Phanerochaete）属、ジェルカンデラ（Bjerkandera）属、イルペックス（Irpex）属、マイセリオソラ（Myceliophthora）属、ピクノポラス（Pycnoporus）属、ボツリティス（Botrytis）属、グリフォラ（Grifola）属、ステレウム（Stereum）属等に属する菌を例示することができる。具体的にはコリオラス／トラメテス属のアラゲカワラタケ（Coriolus hirsutus/Trametes hirsuta）を用いることができる。
【００１１】
コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）は、コハク酸の酸化を触媒する酵素である（EC1.3.5.1）。ＳＤＨは、真核生物においてはミトコンドリアに存在し、呼吸鎖複合体を構成する複合体IIとして機能する。ＳＤＨは、フラビンタンパク質と鉄硫黄タンパク質からなるが、前者がコハク酸の酸化反応を触媒するため、本明細書においてはＳＤＨとはフラビンタンパク質を意味する。
上記フラビンタンパク質は、Ｎ末端付近に存在するヒスチジン残基に補酵素ＦＡＤが結合する。
その前後のアミノ酸配列（Ｒ−［ＳＴ］−Ｈ−［ＳＴ］−ｘ（２）−Ａ−ｘ−Ｇ−Ｇ）は生物種を越えてよく保存されており、このタンパク質の配列上の特徴となっている（＊１、下記ウェブサイト参照、以下同様）。
＊１（http://www.expasy.ch/prosite/PDOC00393）。
【００１２】
ＳＤＨをコードする遺伝子であるＳＤＨ遺伝子の配列情報は、文献、データベースを利用することにより様々な生物について入手することができる。それらは公開されたゲノム配列のデータベースを利用して取得することができる。真核微生物では、例えばパン酵母のゲノムデータベース（＊２）を検索すれば、ＳＤＨ遺伝子としてＳＤＨ１の配列を取得することができる。
＊２（Saccharomyces Genome Database  http://www.yeastgenome.org/）
その他にも、Phanerochaete chrysosporium （＊３）、Coprinus cinereus（＊４）、Aspergillus niger（＊５）、Neurospora crassa（＊６）、Cryptococcus neoformans（＊７）等についてゲノム情報を利用してＳＤＨ遺伝子の配列を取得することができる。
＊３（http://genome.jgi-psf.org/whiterot1/whiterot1.home.html）
＊４（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/coprinus_cinereus/MultiHome.html）
＊５（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/aspergillus_group/MultiHome.html）
＊６（http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/neurospora/）
＊７（http://www.tigr.org/tdb/e2k1/cna1/）
【００１３】
また例えば Coccidioides posadasii （DQ674551）のように、ＤＤＢＪ等の公共のデータベースに登録されている配列からＳＤＨ遺伝子やｍＲＮＡの配列を取得することもできる。
さらにゲノム配列が公開されておらず、ＳＤＨ遺伝子が公共のデータベースに登録されていないような生物については、種々の公知の方法でＳＤＨ遺伝子の配列を取得することができる。例えば実施例に記載の方法を用いることができ、アラゲカワラタケｓｄｈ１遺伝子（配列番号１）の配列を取得することができる。
【００１４】
本発明では、ＳＤＨ遺伝子の発現量を減少させるために、特定の配列のＤＮＡを用いて宿主糸状菌を形質転換する。この方法において用いられるＤＮＡ配列は、宿主ゲノム配列中に１コピー以上組み込まれる。またこのＤＮＡ配列には宿主由来の配列だけでなく、他の生物由来の配列、例えば大腸菌ｐＵＣ系ベクターなどの配列を含んでいてもよい。しかし他の生物由来の配列を含む場合、形質転換体は組換え体となるため、工業上の利用には特殊な設備が必要となるため不利である。したがって宿主由来のＤＮＡ配列のみを利用するセルフクローニングによる形質転換が好ましい。
【００１５】
ＳＤＨ遺伝子の発現量を減少させるには、公知の任意の方法を用いることができる。例えば、染色体上のＳＤＨ遺伝子の全部又は一部を他のＤＮＡ配列と置き換えることにより欠失させる方法、ＳＤＨ遺伝子の配列中に他のＤＮＡ配列を挿入することにより正常な遺伝子が発現しないようにする方法、ＳＤＨ遺伝子のプロモーターを他の配列に置換して発現制御を変化させる方法、ＳＤＨ遺伝子の全部又は一部に対応するアンチセンス鎖を発現させる方法、ＳＤＨ遺伝子の全部又は一部に対応する二本鎖ＲＮＡを発現させる方法等がある。
【００１６】
これらの方法のうち、アンチセンス鎖を発現させる方法では、少なくともプロモーター配列及びその下流に連結したアンチセンス鎖を含むＤＮＡを宿主内に移入する。宿主内で発現したアンチセンス鎖は、その相補鎖であるＳＤＨ遺伝子のｍＲＮＡと結合し、それによってタンパク質への翻訳を阻害する。したがってこの方法においてアンチセンス鎖とは、ＳＤＨ遺伝子から転写されるｍＲＮＡと結合する配列を発現するＤＮＡ配列である。上記の機能を有していれば、ＳＤＨ遺伝子のｍＲＮＡと完全に相補的な配列でなくてもよく、欠失、置換、付加等の変異を含んでいてもよい。
【００１７】
プロモーターとしては、プロモーター活性を有するＤＮＡ配列であれば特に限定されない。例えばグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）遺伝子のプロモーター等が使用できる。
宿主に移入するＤＮＡは、プロモーター配列及びその下流に連結されたアンチセンス鎖を含んでいればよく、その他の配列を含んでいてもよい。具体的には、リンカー配列、ターミネーター配列、選択マーカー等が例示される。プロモーター配列とアンチセンス鎖の間にリンカー配列を含んでいてもよい。またアンチセンス鎖の下流において転写を適切に停止させるために、アンチセンス鎖の下流にターミネーター配列が連結されていることが好ましい。
形質転換体の選抜に用いる選択マーカーは、実施例に記載したようにプロモーター配列及びアンチセンス鎖を含むＤＮＡとは連結されていない状態で形質転換に用いることができるが、連結した状態でもよい。
【００１８】
選択マーカーとして用いる遺伝子は、宿主の薬剤感受性や遺伝子型に応じて適切に選択される。例えば糸状菌に対して用いられる薬剤としてはピリチアミン、オーレオバシジン、カルボキシン等が知られているが、これらに対応する選択マーカーとしてピリチアミン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子（変異型コハク酸脱水素酵素Ｉｐサブユニットをコードする遺伝子）等を用いることができる。
また宿主が特定の遺伝子の欠損により栄養要求性となっているような場合には、正常な遺伝子を選択マーカーとして用いることができる。具体的には、例えば本発明の実施例ではオルニチンカルボキシトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）遺伝子の欠損によりアルギニン要求性を示す宿主に対して、正常なＯＣＴ遺伝子を選択マーカーとして用いている。
形質転換に用いるＤＮＡに含まれる配列は、宿主ゲノム、プラスミド、その他の単離されたＤＮＡ試料からＰＣＲ法により増幅し取得することができる。ＰＣＲは市販の酵素等を用いて、公知の方法で実施することができる。
【００１９】
ＤＮＡ断片同士を連結する場合には、制限酵素による切断、必要であれば平滑末端化、及びライゲーションによって行うことができる。またフュージョンＰＣＲのような方法を用いてＤＮＡ断片同士を連結することもできる。これらの方法を含む遺伝子工学的技術については、例えばJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) に記載の方法を用いることができる。
【００２０】
糸状菌の形質転換は、公知の任意の方法で行うことができる。例えばアグロバクテリウム法や、本発明の実施例に記載のプロトプラスト法等を用いることができる。
形質転換体においてＳＤＨ遺伝子の発現量が減少したことは、公知の方法で確認することができる。例えばノーザン解析、定量ＲＴ−ＰＣＲ等の方法を利用できる。形質転換体のＳＤＨ遺伝子の発現量は、宿主又は野生型株と比較して、少なくとも５分の１以下に減少していることが好ましい。
宿主微生物及び形質転換体を生育させるための培養は、公知の培地及び培養条件で実施することができる。窒素源としては酵母エキス、ペプトン、各種アミノ酸、大豆粕、コーンスティープリカー、尿素、硫酸アンモニウム、各種無機窒素を用いることができる。炭素源としては、菌株を生育させるためであれば、菌株の資化性に応じて、グルコース等の糖類、オリゴ糖、デンプンやセルロースなどの多糖類、エタノールやグリセロール等のアルコール類を用いることができる。
本発明においてＳＤＨ遺伝子の発現量を減少させた形質転換体を用いてコハク酸を生産させる場合には、主な炭素源としてグリセロールを用いる。グリセロールは、天然物由来の油脂を原料とするバイオマスエネルギーのひとつであるバイオディーゼル燃料の製造において副産物として生成し、その有効利用法の開発が求められている。本発明で用いるグリセロールはそのようにして生成したものであってもよい。発酵時のグリセロール濃度は特に限定されないが、通常１〜３０％で用いられる。グリセロールを他の炭素源とともに用いることもできる。
培養によって製造されたコハク酸は培地中に溶解した状態又は塩として析出した状態で得られる。コハク酸の精製は公知の方法で行うことができ、精製されたコハク酸は各種工業製品の原料とすることができる。
【実施例】
【００２１】
＜試験例１＞  アラゲカワラタケのコハク酸デヒドロゲナーゼ遺伝子配列の決定
コハク酸デヒドロゲナーゼは４つのサブユニットからなる。それらは出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae においては、ＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、及びＳＤＨ４の各遺伝子にコードされたタンパク質である。
それらのうちＳＤＨ１は触媒サブユニットをコードしている。この触媒サブユニットに着目し、遺伝子工学的手法による発現制御を行い、代謝経路を改変することを目的として、アラゲカワラタケの染色体上に存在する相同遺伝子（以下ｓｄｈ１とする）の配列決定を行った。
【００２２】
既に他のいくつかの微生物のＳＤＨ１ホモログの配列情報が公知となっている（Phanerochaete chrysosporium、Coprinus cinereus、Aspergillus niger、Neurospora crassa、Coccidioides posadasii、Cryptococcus neoformans）。これらについて塩基配列を比較したところ、６種全ての配列で比較的良く保存された領域を複数見出した。この領域の配列をもとに degenerate ＰＣＲ法によりアラゲカワラタケのＳＤＨ１ホモログの部分配列情報を得るために、以下のフォワード及びリバースのオリゴＤＮＡプライマー（１）〜（５）をそれぞれデザインした。なお配列中、ＢはＣ、Ｇ、又はＴのいずれかを、ＨはＡ、Ｃ、又はＴのいずれかを、ＲはＡ又はＧのいずれかを、ＶはＡ、Ｃ、又はＧのいずれかを、ＷはＡ又はＴのいずれかを、ＹはＣ又はＴのいずれかを示す。
（１）ＴｈＳＤＨ−１Ｆ（フォワード）  ５’― CAGCGWGCBTTCGGTGG ―３’
（２）ＴｈＳＤＨ−２Ｆ（フォワード）  ５’― CTCCACACHYTBTACGG ―３’
（３）ＴｈＳＤＨ−３Ｆ（フォワード）  ５’― ARTTYGTBCARTTCCAYCC ―３’
（４）ＴｈＳＤＨ−４Ｒ（リバース）    ５’― ATCGACRCCRGCRAARAT ―３’
（５）ＴｈＳＤＨ−５Ｒ（リバース）    ５’― CGGTTVGCACCRTGGAC ―３’
【００２３】
アラゲカワラタケ野生型株の培養菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出は以下の方法で行った。
アラゲカワラタケの平板寒天培養から直径５ｍｍの寒天片をコルクボーラーで打ち抜き、グルコース・ペプトン培地（３％グルコース、１％ポリペプトン、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、２ｐｐｍチアミン塩酸塩、リン酸でｐＨ５．０に調整）１００ｍｌに植菌し、２８℃で３日間回転振盪培養（１３０ｒｐｍ）を行った。菌体を濾過により集菌後、５００ｍｌの滅菌水で菌体を洗浄し、液体窒素で凍結した。
凍結した菌体２．５ｇを乳鉢で粉砕した後、抽出緩衝液（２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１０ｍｌに懸濁した。フェノール・クロロホルム抽出を二度行い、水層に氷冷したエタノール８ｍｌを加えた。４℃で遠心し、上清を除去し、沈殿に７０％エタノール８ｍｌを加えた。遠心した後、上清を除去し、５５℃で５分間保温し、エタノールを除去した。沈殿をＲＮＡａｓｅ  Ａ  １０μｇ／ｍｌを含むＴＥ緩衝液０．５ｍｌに溶解し、ゲノムＤＮＡ溶液とした。
【００２４】
上記ゲノムＤＮＡを鋳型として上記プライマーを用いて degenerate ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を用いた。反応条件は、（９４℃  ２分）ｘ１サイクル、（９８℃  １０秒、６１℃  ３０秒、６８℃  ５５秒）ｘ４サイクル、（９８℃  １０秒、５８℃  ３０秒、６８℃  ５５秒）ｘ４サイクル、（９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、６８℃  ５５秒）ｘ４サイクル、（９８℃  １０秒、５２℃  ３０秒、６８℃  ５５秒）ｘ４サイクル、（９８℃  １０秒、４９℃  ３０秒、６８℃  ５５秒）ｘ１９サイクルとした。ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲル電気泳動した。その結果プライマー３Ｆと４Ｒの組み合わせで０．３４ｋｂのＤＮＡ断片が、３Ｆと５Ｒの組み合わせで０．５９ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅したことが確認された。
【００２５】
増幅した約０．５９ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出した後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ｄＧＴＰ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖｅｒ．３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン社製）及びＰＣＲ反応に用いたプライマーを用いて反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズジャパン社製）により配列を解読した。その結果上記ＤＮＡ断片の配列（配列番号１の１６１６から２２０４までの塩基配列）は他の生物のＳＤＨ１ホモログと高い相同性を示すことが判明した。したがってアラゲカワラタケのｓｄｈ１遺伝子の一部が増幅されたと結論した。
【００２６】
さらに上記配列の染色体上の周辺配列の決定を行った。
まず制限酵素サイトを調べるために、上記ＤＮＡ断片をプローブとして、アラゲカワラタケ野生型株のゲノムＤＮＡに対してサザン解析を行った。サザン解析にはＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を用いた。ゲノムＤＮＡは数種の制限酵素で消化した。使用した制限酵素は、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩである。
サザン解析の結果、ゲノムＤＮＡをＰｓｔＩで消化したときに約５ｋｂのバンドが、ＳａｌＩで消化したときに約３ｋｂのバンドが、それぞれ検出された。またＸｈｏＩで約６．５ｋｂのバンドが、ＥｃｏＲＶで約８ｋｂのバンドがそれぞれ検出された。その他の制限酵素ではバンドのサイズが１０ｋｂ以上であるか、又はシグナルが弱く検出不能だった。
【００２７】
次にＰｓｔＩ及びＳａｌＩを使用してインバースＰＣＲを行った。インバースＰＣＲ法は、ゲノムＤＮＡを制限酵素で切断した後、ライゲーション反応により環状化し、これを鋳型として内部の既知配列から未知配列へ向かってＰＣＲ反応を行うことで、未知配列部分を増幅する方法である。同法は Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition), Chapter8, Protocol 14, pp. 8.81-8.85 の記載に従って行った。いずれの制限酵素を使用した場合も、ＰＣＲ反応には以下のプライマー（６）（７）を用いた。
（６）ＴｈＳＤＨ−８Ｆ  ５’― CGATGTCACCAAGGAGCC ―３’
（７）ＴｈＳＤＨ−１０Ｒ  ５’― ACGCTCGTGGAGGATCTC ―３’
ＰＣＲ反応の結果、予想されたサイズ、すなわちＰｓｔＩを使用した場合には約５ｋｂの、ＳａｌＩを使用した場合には約３ｋｂのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅された。
またＸｈｏＩを使用してインバースＰＣＲを行い、ｓｄｈ１遺伝子のプロモーター領域を含むと考えられる約６．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動した後、アガロースゲルから切り出し、精製し、配列解読に用いた。ＤＮＡの精製には QIAquick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。各制限酵素サイト、ｓｄｈ１コード領域、及び配列が決定された領域の位置関係を図１に示す。また決定された配列のうち、最長部分の配列を配列番号１に示す。
【００２８】
＜試験例２＞  アラゲカワラタケ形質転換用ＤＮＡ断片の作製
アラゲカワラタケ菌体内でｓｄｈ１遺伝子のコード領域のアンチセンス鎖を大量に発現させることで、元々のｓｄｈ１遺伝子の発現量を減少させることができると予想された。そこで図２に示すように、形質転換に用いるアンチセンス鎖発現用ＤＮＡ断片を、以下のように Double-joint PCR 法（Yu. J. H. et al., Fungal Genet Biol. 2004 Nov;41(11):973-81）により作製した。
【００２９】
（１）ＰＣＲによる部分断片の増幅
アンチセンス鎖発現用のプロモーターには、アラゲカワラタケ由来ＧＰＤ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子のプロモーターを、ゲノムＤＮＡよりＰＣＲにより増幅して用いた。ＰＣＲには以下のプライマー（８）（９）を用いた。
（８）ＧＰＤ−Ｆ１  ５’― GAATTCAGAGGCGAGAGCGGACG ―３’
（９）ＧＰＤ−Ｒ１  ５’― TGTGTGGTGGATGGGGATGAGAGG ―３’
ＰＣＲ反応後、反応液を電気泳動し、アガロースゲルから増幅した０．９２ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、精製した。
ｓｄｈ１遺伝子のコード領域のアンチセンス鎖は、ゲノムＤＮＡよりＰＣＲにより増幅して用いた。ＰＣＲには以下のプライマー（１０）（１１）を用いた。
（１０）ｓｄｈ１−ＡＳ１−Ｆ１  ５’― TCATCCCCATCCACCACACAGGGGATACCACCCACTGCATAC ―３’
（１１）ｓｄｈ１−ＡＳ１−Ｒ１  ５’― AAAACGCGCGACCGCGTCTACGGTGTGCCCTTCTCAAGAACC ―３’
なお、ｓｄｈ１−ＡＳ１−Ｆ１の５’末端側２０残基は、ＧＰＤ遺伝子プロモーターの３’末端の配列である。またｓｄｈ１−ＡＳ１−Ｒ１の５’末端側２０残基は、ｓｄｈ１遺伝子ターミネーターの５’末端の配列である。
ＰＣＲ反応後、反応液を電気泳動し、アガロースゲルから増幅した０．８７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、精製した。
ターミネーターには、ｓｄｈ１遺伝子のターミネーターを、ゲノムＤＮＡよりＰＣＲにより増幅して用いた。ＰＣＲには以下のプライマー（１２）（１３）を用いた。
（１２）ｓｄｈ１（ｔ）−Ｆ１  ５’― TAGACGCGGTCGCGCGTTTTGTC ―３’
（１３）ｓｄｈ１（ｔ）−Ｒ２  ５’― CTGAGTCCTCGAAGAAGTGAGCCG ―３’
ＰＣＲ反応後、反応液を電気泳動し、アガロースゲルから増幅した０．９５ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、精製した。
またアラゲカワラタケ形質転換におけるマーカー遺伝子として、プラスミドｐＵＣＲ１（特許第３３７９１３３号）上のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＣＴ）遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには以下のプライマー（１４）（１５）を用いた。
（１４）ＯＣＴ−Ｆ１  ５’― GAATTCTGAAGCTCTCCGGCAGCCG ―３’
（１５）ＯＣＴ−Ｒ１  ５’― GACGTCATGCGCGGCACGTGGCC ―３’
ＰＣＲ反応後、反応液を電気泳動し、アガロースゲルから増幅した２．５ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、精製した。
【００３０】
（２）部分断片の連結及び増幅
まず上記のＤＮＡ断片のうち、ＧＰＤプロモーター、ｓｄｈ１遺伝子アンチセンス鎖、ｓｄｈ１ターミネーターを、１対３対１の割合で混合し、プライマーを加えずにＰＣＲ反応を行った。反応条件は（９４℃  ２分）ｘ１サイクル、（９８℃  １０秒、５５℃  ２分、６８℃  ５分）ｘ１０サイクル、（６８℃  １０分）ｘ１サイクルとした。
次に上記ＰＣＲ反応液を一部とり、プライマーとしてＧＰＤ−Ｆ１及びｓｄｈ１（ｔ）−Ｒ２を加え、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は（９４℃  ２分）ｘ１サイクル、（９８℃  １０秒、６８℃  ３分）ｘ３０サイクルとした。
ＰＣＲ反応液を電気泳動し、アガロースゲルから増幅した２．７４ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、精製した。このＤＮＡ断片と上記ＯＣＴ遺伝子（２．５ｋｂ）とをアラゲカワラタケの形質転換に用いた。
【００３１】
＜試験例３＞  アラゲカワラタケの形質転換
（１）一核菌糸体培養
３００ｍｌ容三角フラスコに、カザミノ酸１％を加えたＭＹＧ培地（２％グルコース、０．１５％リン酸水素二アンモニウム、０．０５％リン酸二水素カリウム、０．１％リン酸水素二カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物、０．１２ｐｐｍチアミン塩酸塩、０．６７％  Yeast nitrogen base without amino acid、リン酸でｐＨを５．６に調整）１００ｍｌを分注して滅菌した。アラゲカワラタケ（アルギニン要求性株）の平板寒天培地から直径５ｍｍの寒天片を打ち抜き、無菌容器内ですりつぶし、上記培地に加えた。１２０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で３日間培養した。
（２）プロトプラストの調製
上記液体培養菌糸をナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で濾集し、浸透圧調節溶液（０．５Ｍ硫酸マグネシウム七水和物、５０ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．６））で洗浄した。
洗浄した湿菌体１００ｍｇに対して１ｍｌの割合で細胞壁分解酵素液を加え、穏やかに振盪しながら２８℃で３時間インキュベートしてプロトプラストを遊離させた。細胞壁分解酵素液は、セルラーゼ“オノズカ”ＲＳ（ヤクルト薬品工業株式会社製）５ｍｇ及びヤタラーゼ（タカラバイオ株式会社製）１０ｍｇを上記浸透圧調節溶液１ｍｌに溶解して調製した。
（３）プロトプラストの精製
上記酵素反応液からナイロンメッシュ（孔径３０μｍ）で菌糸断片を除いた後、プロトプラストの回収率を高めるため、ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片とプロトプラストを上記浸透圧調節溶液で1回洗浄した。得られたプロトプラスト懸濁液を遠心分離（１，０００×ｇ、５分間）し、上清を除去した。沈殿物に、１Ｍスクロースを含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．３）を加えて懸濁し、遠心分離し、上清を除去した。この沈殿物の洗浄操作を再度繰り返した。沈殿物を、１Ｍソルビトールを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）に４０ｍＭ塩化カルシウムを加えた溶液５００μｌに懸濁し、プロトプラスト懸濁液とした。この懸濁液を４℃で保存した。プロトプラスト濃度は血球計算盤を用いて、直接検鏡により求めた。全ての遠心操作はスウィングローターで１，０００Ｘｇ、５分間、室温で行った。
（４）形質転換
約１０７個／ｍｌのプロトプラスト懸濁液１００μｌに対して、試験例２で調製したアンチセンス鎖発現用断片（２．７４ｋｂ）２μｇとＯＣＴ遺伝子（２．５ｋｂ）０．２μｇとを添加し、３０分間氷冷した。次に、プロトプラスト・ＤＮＡ混合液に対して等量のＰＥＧ溶液（５０％ＰＥＧ３，４００を含む２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．４））を加え、さらに３０分間氷冷した。混合液の３分の１を、０．５Ｍスクロースを含む選抜用寒天培地（０．０５％ロイシン、及び１．５％寒天を含むＭＹＧ培地）のプレートの中央に移し、溶解し５０℃に保温しておいた０．５Ｍスクロースを含む選抜用軟寒天培地（０．０５％ロイシン、及び０．７％寒天を含むＭＹＧ培地）５ｍｌを加えて均一になるよう混合した。軟寒天培地が固化した後、プレートを２８℃で数日間インキュベートした。生育してきた形質転換体を選抜用寒天培地に移し、コロニーを形成させた。
またアンチセンス鎖を発現する形質転換体に対する対照株として使用するアルギニン非要求性菌株は、ＤＮＡとしてＯＣＴ遺伝子（２．５ｋｂ）２μｇのみを形質転換に使用することで作製した。
なおＤＮＡを全く加えない対照実験では、菌の生育は認められなかった。
【００３２】
＜試験例４＞  ｓｄｈ１遺伝子アンチセンス鎖発現用ＤＮＡ断片が形質転換体に保持されていることの確認
試験例３で得られた形質転換体について、以下に記載するコロニーＰＣＲ法により、ｓｄｈ１遺伝子アンチセンス鎖発現用ＤＮＡ断片が保持されていることを確認した。
（１）形質転換体の培養とゲノムＤＮＡの抽出
０．０５％ロイシンを含むＭＹＧ培地２００μｌを滅菌した１．５ｍｌ容チューブに分注し、試験例３で得られた形質転換体のコロニーの一部を植菌し、２８℃で５日間インキュベートした。
菌体を細胞溶解溶液（０．８Ｍ塩化カリウム、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．２）、１０ｍｇ／ｍｌヤタラーゼ、５ｍｇ／ｍｌセルラーゼ“オノズカ”Ｒ−１０）５０μｌに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。そこに希釈液（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））１５０μｌを加え、９５℃で３分間加熱し、氷上で５分間急冷した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１分間）し、上清を新しい容器に移し、ＤＮＡ抽出液とした。
（２）ＰＣＲ
上記ＤＮＡ抽出液２．５μｌを使用して、５０μｌの反応スケールでＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を用い、プライマーには以下のオリゴＤＮＡ（１６）〜（１９）を用いた。
５’末端側の確認
（１６）ＧＰＤ−Ｆ２  ５’― AGAGGCGAGAGCGGACGAGGTCGGCCGGAG ―３’
（１７）ＴｈＳＤＨ−９Ｆ  ５’― GTATGCAGTGGGTGGTATC ―３’
３’末端側の確認
（１８）ＴｈＳＤＨ−１２Ｒ  ５’― CGACACATTCGCCATCTTGC ―３’
（１９）ｓｄｈ１（ｔ）−Ｒ１  ５’― AGATTGGTAACTTACGATTACATACAGG ―３’
反応液のうち２μｌを電気泳動した。その結果、図３に示すように５’末端側の０．９ｋｂの断片の増幅は実験に供した６菌株全てにおいて検出され、３’末端側の０．７ｋｂの断片の増幅は４菌株において検出された。野生型株について行った対照実験では５’末端、３’末端のいずれの断片の増幅も検出されなかった。
以上の結果から、試験例３で得られた形質転換体には、ｓｄｈ１遺伝子アンチセンス鎖発現用ＤＮＡ断片が保持されていることが確認された。
【００３３】
＜試験例５＞  ｓｄｈ１遺伝子の発現量の確認
試験例３で得られた形質転換体におけるｓｄｈ１遺伝子の発現量を、以下のように定量ＲＴ−ＰＣＲ法により定量した。
（１）トータルＲＮＡの抽出
試験管に、０．０５％ロイシンを加えたＭＹＧ培地３ｍｌを分注した。形質転換体のコロニーを形成させた平板寒天培地から直径５ｍｍの寒天片を打ち抜き、無菌容器内ですりつぶし、上記培地に加えた。菌株は、アンチセンス鎖発現株として、ＡＳ１−１２、１３、２８、２９、３５、３７、対照株として、ａｒｇ１−１、２、３を使用した。２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で３日間培養した。
菌体を１．５ｍｌ容チューブに移し、直ちに液体窒素で凍結した後、一晩凍結乾燥した。乾燥した菌体を楊枝で粉砕し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ１０μｇをＤＮａｓｅ（ＲＴ  Ｇｒａｄｅ）  ｆｏｒ  Ｈｅａｔ  ｓｔｏｐ（ニッポンジーン社製）で処理し、残存するＤＮＡを除去した。
（２）定量ＲＴ−ＰＣＲ
上記ＲＮＡ試料について、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ＩＩ（タカラバイオ株式会社製）を使用して反応を行い、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により検出した。リファレンス遺伝子としてはアラゲカワラタケのＧＰＤ遺伝子を用いた。プライマーには以下のオリゴＤＮＡ（２０）〜（２３）を用いた。
ｓｄｈ１遺伝子の検出
（２０）ＴｈＳＤＨ−１３Ｆ  ５’― CTTCCCACTGCAAAGATCC ―３’
（２１）ＴｈＳＤＨ−３４Ｒ  ５’― CTGGTCGTACGTCTTGTAG ―３’
ＧＰＤ遺伝子の検出
（２２）ＴｈＧＰＤ１−１Ｆ  ５’― TGTTCAAGTACGACTCCGTC ―３’
（２３）ＴｈＧＰＤ１−２Ｒ  ５’― GGTGGACTCGACGATGTAG ―３’
なおｓｄｈ１遺伝子を検出するためのプライマーセットで増幅される領域は、形質転換に使用したアンチセンス鎖として発現される領域とは重複しない。
ｓｄｈ１遺伝子の相対発現量は△△Ｃｔ法によって計算した。
表１に示したように、６株のアンチセンス鎖発現株のうち、ＡＳ１−２９株ではｓｄｈ１遺伝子の発現量が対照株の１２％程度にまで減少していることが確認された。
【００３４】
【表１】
2011120508.tif 000002
【００３５】
＜実施例１＞  グリセロールを炭素源としたコハク酸生産試験
アンチセンス鎖発現株ＡＳ１−２９及び対照株ａｒｇ１−１について、以下のように液体培養によりコハク酸生産試験を行った。
３００ｍｌ容三角フラスコにＧｌｙＰ培地（３％グリセロール、１％ペプトン、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物、２ｐｐｍチアミン塩酸塩、リン酸でｐＨ５．０に調整）５０ｍｌを分注し、コロニーを形成させた平板寒天培地から直径５ｍｍの寒天片を打ち抜き、無菌容器内ですりつぶし、上記培地に加えた。１３０ｒｐｍで振盪しながら２８℃で培養し、経時的に培養上清をサンプリングした。サンプルは、菌体を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）した後、フィルター濾過（孔径０．２０μｍ）し、コハク酸の定量に供した。
コハク酸の定量にはＦ−キット  コハク酸（Ｒ−バイオファーム社製）を使用した。
表２に示したように、コハク酸生産量は、対照株ａｒｇ１−１では最大で３８ｍｇ／Ｌだったのに対し、アンチセンス鎖発現株ＡＳ１−２９は最大で２３１ｍｇ／Ｌだった。
【００３６】
【表２】
2011120508.tif 000003
【００３７】
＜比較例１＞  グルコースを炭素源としたコハク酸生産試験
ＧＰ培地（（３％グルコース、１％ペプトン、０．１５％リン酸二水素カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム七水和物、２ｐｐｍチアミン塩酸塩、リン酸でｐＨ５．０に調整）を使用して、実施例１と同様にしてコハク酸生産試験を行った。
その結果、表２に示したように、アンチセンス鎖発現株、対照株のいずれも顕著なコハク酸生産はみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の方法により、遺伝子工学により代謝系を改変した糸状菌を用いて、グリセロールから生分解性プラスチック等の原料となるコハク酸を製造することができる。
【図１】
2011120508.tif 000004
【図２】
2011120508.tif 000005
【図３】
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【配列表】
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