(57)【要約】【課題】本発明の主な目的は、細胞又は細胞集団から、多能性幹細胞、癌幹細胞等の幹細胞を含む未分化細胞を簡便且つ的確に同定するための技術を提供することである。【解決手段】被験対照の細胞又は細胞集団に、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を導入することによって、未分化細胞において特異的にレポーター遺伝子を発現させることができ、その結果、目的物である未分化細胞を正確に同定、検出することが可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験細胞又は被験細胞集団から、未分化細胞を同定する方法であって、
(1)  Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を、被験細胞又は被験細胞集団に導入する工程、及び
(2)  レポーター遺伝子が発現している細胞を未分化細胞として同定する工程
を含むことを特徴とする、未分化細胞の同定方法。
【請求項２】
レポーター遺伝子が、GFPをコードしている遺伝子である、請求項１に記載の同定方法。
【請求項３】
前記工程(1)において使用される核酸構築物が、Nanogプロモーター作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むプラスミドである、請求項１又は２に記載の同定方法。
【請求項４】
分化細胞を初期化して得られた誘導多能性幹細胞、又は分化した癌細胞を含む癌細胞を初期化して得られた未分化癌細胞を同定する方法である、請求項１乃至３のいずれかに記載の同定方法。
【請求項５】
Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含有する、未分化細胞の同定試薬。
【請求項６】
Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含有する、未分化細胞の同定キット。
【請求項７】
Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含有する、未分化細胞の製造キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞、癌幹細胞等の幹細胞を含む未分化細胞を同定するための方法に関する。また、本発明は、多能性幹細胞、癌幹細胞等の幹細胞を含む未分化細胞を同定するために使用される試薬及びキットに関する。更に、本発明は、誘導多能性幹細胞及び癌幹細胞等の幹細胞を含む未分化細胞を製造するために使用される、未分化細胞の製造キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、様々な組織に分化する能力を備えており、その性質を利用することで、神経、心臓、膵臓β細胞等の様々な細胞を試験管内で得ることができる。更に、幹細胞を利用することによって、従来は治療困難であった神経疾患や心臓疾患の根本的な治療法の開発や、創薬分野における薬効評価、安全性試験等の創薬スクリーニングに応用することができる。
【０００３】
近年、OCT3/4、KLF4、c-MYC及びSOX2をコードする各々の遺伝子を体細胞に導入することにより、体細胞を初期化して誘導多能性幹(iPS)細胞に誘導する技術が報告され、再生医薬の分野で革新的な技術が提供されている（特許文献１参照）。この誘導多能性幹細胞は、皮膚等の組織から作成可能であることから倫理的な障壁が低く、更に自己移植が可能であり免疫拒絶を回避できるため、有用な細胞資源として注目されている。
【０００４】
一方、本発明者等は、従来にない全く新しい発想で、癌細胞から人工的に誘導癌幹(iCS)細胞を作製する技術を開発している（特許文献２参照）。癌幹細胞は、正常幹細胞と同様に未分化な表面形質を示し、自己複製能と分化能を有し、癌組織を構成する多様な分化段階にあるあらゆる癌細胞を生みだす特性を有しており、癌幹細胞の作成技術は、癌の創薬や診断薬の開発を加速させる上で極めて有用なものである。
【０００５】
しかしながら、誘導多能性幹細胞及び誘導癌幹細胞の製造において、産業上応用するのに超えなければならない大きな課題の一つに、その誘導効率が低いことが挙げられる。実際、誘導多能性幹細胞は、誘導処理した細胞の中の0.5〜20％程度しか得られず、また誘導癌幹細胞は処理した細胞の中の0.1〜50％程度しか得られないのが現状である。そのため、誘導多能性幹細胞及び誘導癌幹細胞の製造では、誘導された目的幹細胞を的確に峻別する技術が不可欠とされている。とりわけ、誘導多能性幹細胞及び誘導癌幹細胞の製造において、誘導された目的幹細胞と、単に不死化されているに過ぎない細胞との峻別には、従来法では細胞表面マーカーの有無の確認等を行わざるを得ず、簡便に為し得ることではなかった。
【０００６】
このような従来技術を背景として、細胞又は細胞集団から、多能性幹細胞、癌幹細胞等の幹細胞を含む未分化細胞を簡便且つ的確に同定するための技術の確立が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2007/069666号パンフレット
【特許文献２】特願2009-241322
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞又は細胞集団から、多能性幹細胞、癌幹細胞等の未分化細胞を簡便且つ的確に同定するための技術を提供することを目的とする。更に、本発明は、当該技術を利用して、未分化細胞の同定試薬、未分化細胞の同定キット、及び未分化細胞の製造キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行ったところ、被験対照の細胞又は細胞集団に、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を導入することによって、未分化細胞において特異的にレポーター遺伝子を発現させることができ、その結果、目的物である未分化細胞を正確に同定・検出できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  被験細胞又は被験細胞集団から、未分化細胞を同定する方法であって、
(1)  Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を、被験細胞又は被験細胞集団に導入する工程、及び
(2)  レポーター遺伝子が発現している細胞を未分化細胞として同定する工程
を含むことを特徴とする、未分化細胞の同定方法。
項２．  レポーター遺伝子が、GFPをコードしている遺伝子である、項１に記載の同定方法。
項３．  前記工程(1)において使用される核酸構築物が、Nanogプロモーター作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含むプラスミドである、項１又は２に記載の同定方法。
項４．  分化細胞を初期化して得られた誘導多能性幹細胞、又は分化した癌細胞を含む癌細胞を初期化して得られた未分化癌細胞を同定する方法である、項１乃至３のいずれかに記載の同定方法。
項５．  Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含む、未分化細胞の同定試薬。
項６．  Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含む、未分化細胞の同定キット。
項７．  Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含む、未分化細胞の製造キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞又は細胞集団から、多能性幹細胞、癌幹細胞等の幹細胞を含む未分化細胞を簡便且つ的確に同定、検出することが可能になる。それ故、本発明によれば、未分化細胞が僅かにしか存在していない細胞集団に対しても、的確に未分化細胞を識別化でき、産業的に応用する上で有効な高純度の未分化細胞を取得することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１のＡには、ヒト繊維芽細胞から誘導した多能性幹細胞（Nanogプロモーター作動可能に連結されたGFP遺伝子の導入有り）の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｂには、Ａと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果；Ｃにはヒト繊維芽細胞（Nanogプロモーター作動可能に連結されたGFP遺伝子の導入有り）の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｄには、Ｃと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果を、各々示す。なお、図１中のＡ〜Ｄの右下のバーは、200μmを示す。
【図２】図２のＡには、ヒト大腸癌細胞から誘導した未分化癌細胞（Nanogプロモーター作動可能に連結されたGFP遺伝子の導入有り）の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｂには、Ａと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果；Ｃには、ヒト大腸癌細胞（Nanogプロモーター作動可能に連結されたGFP遺伝子の導入有り）の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｄには、Ｃと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果を、各々示す。なお、図２中のＡ〜Ｄの右下のバーは、200μmを示す。
【図３】図２のＡには、ヒト胆管癌細胞から誘導した未分化癌細胞（Nanogプロモーター作動可能に連結されたGFP遺伝子の導入有り）の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｂには、Ａと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果；Ｃには、ヒト胆管癌細胞（Nanogプロモーター作動可能に連結されたGFP遺伝子の導入有り）の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｄには、Ｃと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果を、各々示す。なお、図２中のＡ〜Ｄの右下のバーは、200μmを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．未分化細胞の同定方法
本発明の未分化細胞の同定方法は、被験細胞又は被験細胞集団から未分化細胞を同定する方法であって、
(1)  Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を、被験細胞又は被験細胞集団に導入する工程、及び
(2)  レポーター遺伝子が発現している細胞を未分化細胞として同定する工程
を含むことを特徴とするものである。
【００１４】
以下、本発明の同定方法について、具体的に説明する。
【００１５】
本発明の同定方法は、被験細胞又は被験細胞集団から未分化細胞を同定する方法である。ここで、被験細胞とは、未分化細胞であるか否かの判定が求められている細胞であり、また被験細胞集団とは、未分化細胞が含まれているか否かを判定することが求められている細胞集団である。また、未分化細胞とは、未分化の状態であり、様々な細胞に分化可能であって、自己増殖能を備えている細胞であり、具体的には、多能性幹細胞（様々な分化細胞に分化可能な幹細胞）、癌幹細胞（様々な癌細胞に分化可能な幹細胞）及び癌幹細胞に関連する未分化癌細胞（癌幹細胞から発生する未分化癌細胞、癌幹細胞と同様の性質を有している未分化癌細胞）が挙げられる。
【００１６】
また、本発明の同定方法に供される被験細胞又は被験細胞集団の由来については、特に制限されず、脊椎動物や非脊椎動物の別を問わず、また哺乳動物や非哺乳動物の別を問わない。かかる由来の好適な一例としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル等の哺乳動物由来；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類由来が例示される。
のものであればよい。
【００１７】
未分化細胞は、生体内に存在しているものもあり、また分化細胞を初期化（再プログラミング）して未分化状態に誘導することにより得られるものである。本発明において同定対象となる未分化細胞は、生体内に存在しているものもあってもよく、また分化細胞（通常細胞と癌細胞を含む）を初期化（再プログラミング）して未分化状態に誘導されたものであってもよい。なお、分化細胞を初期化する方法としては、例えば、分化細胞に対して、OCT3/4、KLF4、c-MYC及びSOX2をコードする各々の遺伝子を導入する方法が公知である。
【００１８】
同定対象が多能性幹細胞である場合には、本発明の同定方法の一実施形態として、分化細胞を初期化して多能性幹細胞に誘導する処理を行った後に得られた細胞又は細胞集団から、目的物である多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞）の同定を行う方法が例示される。ここで、分化細胞を多能性幹細胞に初期化する技術については、公知であり、例えば、分化細胞（体細胞）に対して、OCT3/4、KLF4、及びSOX2をコードする各々の遺伝子、又はOCT3/4、KLF4、c-MYC及びSOX2をコードする各々の遺伝子を導入する方法が例示されるが、本発明の同定方法は、如何なる手法で作製された多能性幹細胞であっても同定・検出が可能であるため、ここで例示された方法で得られた多能性幹細胞に限定されるものではない。
【００１９】
また、同定対象が癌幹細胞である場合には、本発明の同定方法の一実施形態として、癌細胞（分化している癌幹細胞）に対して初期化する処理を行った後に得られた細胞又は細胞集団から、目的物である癌幹細胞又は未分化癌細胞を同定する方法が例示される。ここで、癌細胞を癌幹細胞に初期化する技術については、前述する特許文献２に示されているが、具体的には、癌細胞に対して、KLFファミリー遺伝子（好ましくはKLF 4遺伝子）、OCTファミリー遺伝子（好ましくはOCT3/4遺伝子）、SOXファミリー遺伝子（好ましくはSOX2遺伝子）と共に、NANOG、LIN28、KRAS、BCL2、BMI1、及びERASよりなる群から選択される少なくとも1種の未分化誘導因子の遺伝子、及び／又はCDKN2A、FHIT、TP53、RB1、PTEN、及びLZTS1よりなる群から選択される少なくとも1種の癌抑制遺伝子の発現抑制因子を導入する方法が例示される。但し、本発明の同定方法は、如何なる手法で作製された癌幹細胞であっても同定・検出が可能であるため、ここで例示された方法で得られた癌幹細胞に限定されるものではない。
【００２０】
更に、同定対象が癌幹細胞又は未分化癌細胞である場合には、本発明の同定方法の一実施形態として、癌組織から得られた癌細胞又は癌細胞集団から、癌幹細胞又は未分化癌細胞を同定する方法が例示される。癌幹細胞又は未分化癌細胞は、癌組織を構成する癌細胞の中で、数％以下という寡少にしか存在していないが、本発明によれば寡少にしか存在しない癌幹細胞又は未分化癌細胞を的確に同定、検出することができる。
【００２１】
本発明の同定方法では、先ず、被験細胞又は被験細胞集団に対して、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を導入する（工程(1)）。
【００２２】
Nanogプロモーターの塩基配列については公知であり、本発明では、Nanogプロモーターの由来や塩基配列については、特に制限されるものではないが、未分化細胞の同定効率をたかめるという観点から、同定対象の未分化細胞と由来が同じNanogプロモーターを使用することが望ましい。具体的には、ヒト未分化細胞の同定を行う場合には、ヒト由来のNanogプロモーターを使用することが好ましい。また、本発明に使用されるNanogプロモーターは、Nanogプロモーターとして機能する限りにおいて、従来公知のNanogプロモーターの塩基配列の一部が改変されていてもよい。特に、本発明の同定方法において、Nanogプロモーターとして配列番号１に示される塩基配列のものを使用すると、未分化細胞（特に、誘導多能性幹細胞、誘導癌幹細胞、及び誘導未分化癌細胞）の同定効率を一層高めることができるので、好適である。
【００２３】
レポーター遺伝子としては、検出マーカーとして機能し得るレポータータンパク質をコードしているものであれば、特に制限されるものではないが、具体的には、緑色蛍光蛋白質（GFP）、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ等のタンパク質をコードしている遺伝子が例示される。これらのレポーター遺伝子の塩基配列も公知である。これらのレポーター遺伝子の中でも、GFPをコードしている遺伝子は、蛍光の有無という簡便な手法で未分化細胞の同定、検出が可能になるので、本発明において好適である。また、GFPが発現している未分化細胞は、生きたまま回収でき、生物学的応用や医療応用が可能である点からも、本発明で使用されるレポーター遺伝子としてGFPをコードしている遺伝子は好ましいといえる。
【００２４】
また、レポーター遺伝子をNanogプロモーターに作動可能に連結する手法についても、従来公知である。具体的には、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を得るには、Nanogプロモーターの3'末端に直接レポーター遺伝子の5'末端を連結してもよく、また、Nanogプロモーターの転写制御が可能であることを限度として、Nanogプロモーターの3'末端に、連結領域（リンカーとなる塩基配列）を介してレポーター遺伝子の5'末端を連結してもよい。
【００２５】
また、被験細胞又は被験細胞集団に対して導入される核酸構築物は、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子からなるものであってもよいが、本発明の効果を妨げない範囲で、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子以外に、エンハンサー等の他の塩基配列からなる領域を含んでいてもよい。
【００２６】
上記核酸構築物の被験細胞又は被験細胞集団への導入は、公知の手法によって行うことができる。具体的には、上記核酸構築物を被験細胞又は被験細胞集団へ導入する方法として、ベクターを使用する方法；リン酸カルシウム法；リポフェクション法；エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法等が例示される。これらの中でも、導入効率が高め、結果として未分化細胞の同定効率を向上させるという観点から、ベクターを使用する方法が好ましい。ベクターを使用して上記核酸構築物を被験細胞又は被験細胞集団に導入する場合には、ベクターとして、ウイルスベクター、プラスミドベクター、非ウイルスベクター、人工ウイルス等を用いることができるが、アデノウイルス及びレトロウイルス等のウイルスベクター及びプラスミドベクターが好適である。
【００２７】
上記核酸構築物を導入した被験細胞又は被験細胞集団を、レポーター遺伝子が発現するのに必要とされる期間、例えば６〜７２時間、好ましくは２４〜３６時間インキュベートすることにより、未分化細胞においてのみ、当該レポーター遺伝子が発現する。
【００２８】
また、分化細胞（正常体細胞又は癌細胞）に対して、未分化細胞（多能性幹細胞、癌幹細胞、未分化癌細胞）に初期化（再プログラム化）する遺伝子を導入することによって未分化細胞に誘導する処理を行った後に得られた細胞又は細胞集団から、目的物である未分化細胞の同定する場合には、上記核酸構築物は、未分化細胞に初期化（再プログラム化）するための遺伝子と共に分化細胞に対して導入してもよい。このように上記核酸構築物と初期化（再プログラム化）するための遺伝子を共に分化細胞に導入することによって、未分化細胞への誘導と未分化細胞の同定・検出が一工程で実施することが可能になり、未分化細胞の製造及び精製を一層容易ならしめることができる。
【００２９】
次いで、上記工程(1)を実施した後に、レポーター遺伝子が発現している細胞を未分化細胞として同定する（工程(2)）。レポーター遺伝子が発現しているか否かを確認する方法についても、当該技術分野で公知であり、レポーター遺伝子の種類に応じて適宜設定される。例えば、レポーター遺伝子がGFPをコードする遺伝子である場合には、緑色蛍光の発色の有無を検出すればよい。
【００３０】
斯くしてレポーター遺伝子の発現が確認された細胞が、未分化細胞として同定される。
【００３１】
斯くして同定された未分化細胞は、必要に応じて単離してもよく、単離された未分化細胞は、その種類に応じて、再生医療、創薬スクリーニングのツール等として利用することができる。
【００３２】
２．未分化細胞を同定するための試薬及びキット
前述するように、Nanogプロモーター作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を使用することによって、被験細胞又は被験細胞集団から未分化細胞を同定することが可能になる。
【００３３】
そこで、本発明は、Nanogプロモーター作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含有する、未分化細胞の同定試薬を提供する。更に、本発明は、Nanogプロモーター作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含有する、未分化細胞の同定キットをも提供する。本同定試薬及び同定キットにおいて、上記核酸構築物は、被験細胞又は被験細胞集団に対して導入されるのに適した形態、例えばベクターに組み込まれた形態であってもよい。また、本同定キットには、必要に応じて、上記核酸構築物を細胞内に導入するためのトランスフェクション試薬、上記未分化細胞の同定方法を実施するための実験指南書が示された説明書面等が含まれていてもよい。
【００３４】
３．未分化細胞の製造キット
前述するように、Nanogプロモーター作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を使用することによって、体細胞又は癌細胞から誘導された未分化細胞（誘導多能性幹細胞、誘導癌幹細胞又は誘導未分化癌細胞）を検出することが可能になる。
【００３５】
そこで、本発明は、更に、Nanogプロモーター作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸構築物を含有する、未分化細胞の製造キットをも提供する。本製造キットによれば、分化細胞（正常体細胞又は癌細胞）から未分化細胞（誘導多能性幹細胞、誘導癌幹細胞又は誘導未分化癌細胞）を誘導した際に、未分化細胞を的確に検出して単離することができる。本製造キットにおいて、上記核酸構築物は、被験細胞又は被験細胞集団に対して導入されるのに適した形態、例えばベクターに組み込まれた形態であってもよい。また、本製造キットには、必要に応じて、上記核酸構築物を細胞内に導入するためのトランスフェクション試薬；分化細胞（正常体細胞又は癌細胞）から未分化細胞（誘導多能性幹細胞、誘導癌幹細胞又は誘導未分化癌細胞）を誘導するための試薬；分化細胞から未分化細胞を誘導し、誘導された未分化細胞を同定するための実験指南書が示された説明書面等が含まれていてもよい。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１：誘導多能性幹（iPS）細胞の同定
ヒト繊維芽細胞（HDF、Toyobo,Japan）に対して、リプログラミングすると共に、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたGFP遺伝子を導入して、誘導多能性幹（iPS）細胞の作製と同定・検出を行った。
【００３７】
＜実験方法＞
まず、30mmディッシュに1×106個のヒト繊維芽細胞を2mlの10%FBS含有DMEM培地（2μg/ml puromycin含有）中に接種し、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬10μlとレトロウイルスレセプターを発現に組み込んだレンチウイルスベクター3-5μgを添加して、室温で20分インキュベートした。次いで、上清を除去し、10%FBS含有DMEM培地で細胞を洗浄した後に、2mlの10%FBS含有DMEM培地を入れ、更にLipofectamine 2000トランスフェクション試薬10μlと下記に示す遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター（計5種）各5μgを添加して、37℃で24時間インキュベートすることにより、各遺伝子をヒト繊維芽細胞にトランスフェクトした。
（導入したレトロウイルスベクター）
・OCT3/4をコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・KLF4をコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・c-MYCをコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・SOX2をコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・Nanogプロモーター（配列番号１）の3'末端に、直接GFPをコードする遺伝子を連結させた核酸構築物を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
トランスフェクション後の細胞を10%FBS含有DMEM培地で一日おきに培地を交換しながら２〜４週間程度培養し、多能性幹細胞の誘導を行った。
【００３８】
培養後、細胞の形態の観察と共に、蛍光顕微鏡によってGFPの発現の有無を観察した。
【００３９】
また、コントロールとして、ヒト繊維芽細胞に対して、Nanogプロモーター（配列番号１）の3'末端に、直接GFPをコードする遺伝子を連結させた核酸構築物を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクターのみを導入する以外は、上記と同様に実験を行った場合についても、細胞の形態の観察と共に、蛍光顕微鏡によってGFPの発現の有無を観察した。
＜実験結果＞
得られた結果を図１に示す。図１のＡには、ヒト繊維芽細胞から誘導した多能性幹細胞の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｂには、Ａと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果；ＣにはGFP遺伝子のみを導入したヒト繊維芽細胞の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｄには、Ｃと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果を、各々示す。図１のＡから明らかなように、細胞形態から、本実験によって、ヒト線維芽細胞から多能性幹細胞に誘導されていることが明らかとなった。なお、図１のＡに示す細胞は、その細胞増殖特性及び分化能の点からも、多能性幹細胞であることが確認されている。また、図１のＢから、ヒト線維芽細胞から誘導された多能性幹細胞では、GFPが発現していることも確認された。一方、図１のＤから分かるように、ヒト線維芽細胞に対してNanogプロモーターの制御下でGFPを導入しても、GFPの発現は観察されなかった。
【００４０】
以上の結果から、多能性幹細胞に対して、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたGFP遺伝子を導入することによって、多能性幹細胞を特異的に同定、検出できることが確認された。
【００４１】
実施例２：癌幹（iCS）細胞の同定
ヒト大腸癌細胞（DLD-1、John Hopkins大学（米国）のB. Vogelsteinより供与）及びヒト胆管癌細胞（HuCCT-1）に対して、リプログラミングすると共に、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたGFP遺伝子を導入して、未分化癌細胞の作製と同定・検出を行った。
【００４２】
＜実験方法＞
まず、30mmディッシュに1×106個の各癌細胞を2mlの10%FBS含有DMEM培地（2μg/ml puromycin含有）中に接種し、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬10μlとレトロウイルスレセプターを発現に組み込んだレンチウイルスベクター3-5μgを添加して、室温で20分インキュベートした。次いで、上清を除去し、10%FBS含有DMEM培地で細胞を洗浄した後に、2mlの10%FBS含有DMEM培地を入れ、更にLipofectamine 2000トランスフェクション試薬10μlと下記に示す遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター（計5種）各5μgを添加して、37℃で24時間インキュベートすることにより、各遺伝子を各癌細胞にトランスフェクトした。
（導入したレトロウイルスベクター）
・OCT3/4をコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・KLF4をコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・SOX2をコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・c-MYCをコードする遺伝子を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
・Nanogプロモーター（配列番号１）の3'末端に、直接GFPをコードする遺伝子を連結させた核酸構築物を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクター
トランスフェクション後の各癌細胞を10%FBS含有DMEM培地で一日おきに培地を交換しながら７日間培養し、トランスフェクションから７日目以降はmTeSRTM1とBDヒトES細胞用マトリゲル（StemCellTechnologies Inc）を用いて一日おきに培地を交換しながら培養を行った。
【００４３】
培養後、細胞の形態の観察と共に、蛍光顕微鏡によってGFPの発現の有無を観察した。
【００４４】
また、コントロールとして、上記各癌細胞に対して、Nanogプロモーター（配列番号１）の3'末端に、直接GFPをコードする遺伝子を連結させた核酸構築物を組み込んだpMXsベースのレトロウイルスベクターのみを導入する以外は、上記と同様に実験を行った場合についても、細胞の形態の観察と共に、蛍光顕微鏡によってGFPの発現の有無を観察した。
＜実験結果＞
得られた結果を図２及び３に示す。図２のＡには、ヒト大腸癌細胞から誘導した未分化癌細胞の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｂには、Ａと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果；Ｃには、GFP遺伝子のみを導入したヒト大腸癌細胞の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｄには、Ｃと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果を、各々示す。また、図３のＡには、ヒト胆管癌細胞から誘導した未分化癌細胞の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｂには、Ａと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果；Ｃには、GFP遺伝子のみを導入したヒト胆管癌細胞胞の形態を顕微鏡で観察した結果；Ｄには、Ｃと同一の像を蛍光顕微鏡で観察した結果を、各々示す。
【００４５】
図２及び３のＡに示されるように、細胞形態から、本実験によって、ヒト大腸癌細胞及びヒト胆管癌細胞胞から未分化癌細胞に誘導されていることが明らかとなった。なお、図２及び３のＡに示す細胞は、その細胞増殖特性及び分化能の点からも、未分化癌細胞であることが確認されている。また、図２及び３のＢから、ヒト大腸癌細胞及びヒト胆管癌細胞胞から誘導された未分化癌細胞では、GFPが発現していることも確認された。一方、図２及び３のＤに示されているように、ヒト大腸癌細胞及びヒト胆管癌細胞胞に対してNanogプロモーターの制御下でGFPを導入しても、GFPの発現は認められなかった。
【００４６】
以上の結果から、未分化癌細胞に対して、Nanogプロモーターに作動可能に連結されたGFP遺伝子を導入することによって、未分化癌細胞を特異的に同定、検出できることが確認された。
【図１】
2011087475.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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