(57)【要約】【課題】色素細胞において、メラニン産生を簡便な操作で誘導することができるメラニン産生誘導剤及び被験物質の美白作用を迅速かつ簡便な操作で評価することができる被験物質の評価方法を提供すること。【解決手段】ＩＬ−８、ＣＴＧＦ及びＩＬ−１Ｆ９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を含有するメラニン産生誘導剤並びに色素細胞含有細胞群に前記因子を接触させてメラニン産生を誘導した細胞群に被験物質を接触させ、メラニンの量を測定し、測定されたメラニンの量に基づき、被験物質の美白作用を評価する被験物質の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
色素細胞におけるメラニン産生を誘導するメラニン産生誘導剤であって、インターロイキン−８、結合組織成長因子およびインターロイキン−１ファミリー  メンバー９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を含有することを特徴とするメラニン産生誘導剤。
【請求項２】
被験物質の美白作用を評価する被験物質の評価方法であって、
（Ａ）色素細胞を含有する細胞群に、インターロイキン−８、結合組織成長因子およびインターロイキン−１ファミリー  メンバー９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を接触させ、前記細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生を誘導するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群に被験物質を接触させ、前記細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量を測定するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量に基づき、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制を調べ、前記被験物質の美白作用を評価するステップ
を含む被験物質の評価方法。
【請求項３】
前記細胞群がヒト細胞からなる細胞群である請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記細胞群がヒト色素細胞からなる細胞群またはヒト色素細胞とヒト表皮角化細胞とからなる細胞群である請求項３に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン産生誘導剤および被験物質の評価方法に関する。さらに詳しくは、皮膚外用剤などの評価や開発、生化学などの分野における基礎研究などの際に有用なメラニン産生誘導剤および被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線による皮膚傷害は、１回の紫外線曝露によって生じる急性傷害と、長期間にわたる紫外線曝露の蓄積によって生じる慢性傷害とに分類される。前記急性傷害としては、例えば、サンタン、紅斑などが挙げられる。また、前記慢性障害としては、例えば、色素沈着、しわなどの光老化などが挙げられる。
【０００３】
前記皮膚傷害のなかで、色素沈着を改善または予防するためには、紫外線による急性障害を緩和させることが重要であると考えられている。かかる色素沈着は、紫外線Ｂ波（ＵＶ−Ｂ）によって誘導され、主に、色素細胞の活性化および増殖、チロシナーゼの活性化（成熟チロシナーゼの生成）、色素細胞中のメラノソーム内への成熟チロシナーゼの移行による当該メラノソーム内でのメラニン産生、色素細胞から角化細胞へのメラノソームの輸送などのプロセスを経て生じていると考えられている。
【０００４】
前記色素細胞は、エンドセリン−１、α−色素細胞刺激ホルモンおよび膜結合型の幹細胞増殖因子それぞれによって活性化される（例えば、非特許文献１、非特許文献２などを参照）。そのため、前記エンドセリン−１、α−色素細胞刺激ホルモンおよび膜結合型の幹細胞増殖因子それぞれの産生やこれらの生理活性を抑制する成分を含む美白剤によって色素細胞の活性化を抑制して色素沈着を改善または予防することが提案されている（例えば、特許文献１などを参照）。かかる美白剤の評価は、前記美白剤による前記エンドセリン−１、α−色素細胞刺激ホルモンおよび膜結合型の幹細胞増殖因子それぞれの産生抑制率に基づいて評価されている。しかしながら、前記成分によっては、色素沈着の改善または予防に対する実効性が低い場合がある。
【０００５】
一方、美白剤などの被験物質の美白作用を評価する方法として、色素沈着部位への被験物質の投与前後における当該色素沈着部位と色素沈着の色の濃さをグレースケールの各ピクセルからなる画像として抽出し、つぎに、色素沈着部位の面積をピクセル数によって数値化し、その後、色素沈着部位への被験物質の投与前後における色素沈着部位の面積の変化を調べることにより、美白作用を評価する方法が提案されている（例えば、特許文献２などを参照）。しかしながら、前記方法は、操作が複雑であるという欠点がある。
【０００６】
これに対して、被験物質によってケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）レセプター３、インターフェロンγ−誘導性１０ｋＤａタンパク質、インターフェロンγ−誘導モノカイン、インターフェロン誘導性Ｔ細胞α化学誘引物質およびＥ−セレクチンそれぞれの遺伝子の発現量が減少するかどうかを調べることによって被験物質の美白作用の評価を行なうことが本発明者らによって提案されている（例えば、特許文献３、特許文献４などを参照）。
【０００７】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、インターロイキン−８、結合組織成長因子およびインターロイキン−１ファミリー  メンバー９それぞれとメラニン産生との関連性や前記関連性を利用して、前記被験物質の美白作用を迅速かつ簡便な操作で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特願２０１０−１３４１３号公報
【特許文献２】特開２００８-２４５６６６号公報
【特許文献３】特開２００９−３５５０２号公報
【特許文献４】特開２００９−３５４９９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ハチヤ・アキラ（Ａｋｉｒａ  Ｈａｃｈｉｙａ）他５名，「紫外線Ｂにより誘導されたヒトのメラニン産生における２つの傍分泌性メラニン形成サイトカイニン、幹細胞因子およびエンドセリン−１の２相性発現（Ｂｉｐｈａｓｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐａｒａｃｒｉｎｅ  Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１，ｉｎ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｂ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）」，アメリカン・ジャーナル・オブ・ペイソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ），２００４年１２月発行，第１６５巻，第６号，ｐ．２０９９−２１０９
【非特許文献２】タダ・アキヒロ（Ａｋｉｈｉｒｏ  Ｔａｄａ）外７名，「エンドセリン−１はヒト色素細胞のメラニン生成を調節し、紫外線照射に対する応答に役割を果たす傍分泌性成長因子である（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ｉｓ  ａ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」，セル・グロース＆ディファレンシエーション（Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ），１９９８年７月発行，第９巻，ｐ．５７５−５８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、色素細胞において、メラニン産生を簡便な操作で誘導することができるメラニン産生誘導剤を提供することを目的とする。また、本発明は、被験物質の美白作用を迅速かつ簡便な操作で評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）  色素細胞におけるメラニン産生を誘導するメラニン産生誘導剤であって、インターロイキン−８、結合組織成長因子およびインターロイキン−１ファミリー  メンバー９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を含有することを特徴とするメラニン産生誘導剤、
（２）  被験物質の美白作用を評価する被験物質の評価方法であって、
（Ａ）色素細胞を含有する細胞群に、インターロイキン−８、結合組織成長因子およびインターロイキン−１ファミリー  メンバー９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を接触させ、前記細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生を誘導するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群に被験物質を接触させ、前記細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量を測定するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量に基づき、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制を調べ、前記被験物質の美白作用を評価するステップ
を含む被験物質の評価方法、
（３）  前記細胞群がヒト細胞からなる細胞群である前記（２）に記載の評価方法、ならびに
（４）  前記細胞群がヒト色素細胞からなる細胞群またはヒト色素細胞とヒト表皮角化細胞とからなる細胞群である前記（３）に記載の評価方法
に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のメラニン産生誘導剤は、色素細胞において、メラニン産生を簡便な操作で誘導することができるという優れた効果を奏する。本発明の被験物質の評価方法は、被験物質の美白作用を迅速かつ簡便な操作で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）は試験例１において、ＮＭＭ長期維持培地で培養したＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真、（ｂ）は試験例１において、ＤＭＥＭ／Ｆ１２調整培地で培養したＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真、ならびに（ｃ）は試験例１において、ＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地で培養したＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真である。
【図２】試験例２において、実験番号１〜３それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を示すグラフである。
【図３】（ａ）は試験例３において、ＵＶ−Ｂ非照射の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真、（ｂ）は試験例３において、ＵＶ−Ｂ非照射の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの染色像を示す図面代用写真、（ｃ）は試験例３において、ＵＶ−Ｂ照射後の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真、（ｄ）は試験例４において、ＵＶ−Ｂ照射後の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの染色像を示す図面代用写真である。
【図４】（ａ）は試験例３において、実験番号４および５それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を示すグラフ、（ｂ）は試験例３において、実験番号４および５それぞれの試料と細胞数の相対値との関係を示すグラフ、（ｃ）は試験例３において、実験番号４および５それぞれの試料と１細胞あたりのメラニン量の相対値との関係を示すグラフである。
【図５】試験例５において、実験番号６〜１０それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を示すグラフである。
【図６】（ａ）は実施例１において、実験番号１１および１２それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を示すグラフ、（ｂ）は実施例１において、実験番号１３および１４それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を示すグラフ、（ｃ）は実施例１において、実験番号１５および１６それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．メラニン産生誘導剤
本発明のメラニン産生誘導剤は、色素細胞におけるメラニン産生を誘導するメラニン産生誘導剤であって、インターロイキン−８（以下、「ＩＬ−８」という）、結合組織成長因子（以下、「ＣＴＧＦ」という）およびインターロイキン−１ファミリー  メンバー９（以下、「ＩＬ−１Ｆ９」という）からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を含有することを特徴とする。
【００１５】
本発明者らは、紫外線をヒト角化細胞に照射した場合、前記ヒト角化細胞におけるＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれの遺伝子の発現が誘導され、前記遺伝子の発現量が紫外線非照射のヒト角化細胞における前記遺伝子の発現量と比べて著しく増加することを見出した。また、本発明者らは、色素細胞を含有する細胞群に前記因子を接触させた場合、当該細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生が誘導されることを見出した。さらに、本発明者らは、前記因子を介して誘導されるメラニン産生が美白剤によって抑制されることと美白剤による美白作用の発現とに相関性があることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１６】
前記色素細胞としては、例えば、ヒト色素細胞、マウス色素細胞などが挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「前記因子によるメラニン産生の誘導」とは、前記因子による色素細胞への刺激に応答して、当該色素細胞における単位時間あたりに産生されたメラニンの質量を「メラニン量Ａ」、前記因子非存在下の色素細胞における単位時間あたりに産生されたメラニンの質量を「メラニン量Ｂ」、既知のメラニン産生因子であるαＭＳＨ存在下の色素細胞における単位時間あたりに産生されたメラニンの質量を「メラニン量Ｃ」とした場合、メラニン量Ａが、メラニン量Ｂと比べて有意に多くなっており、かつメラニン量Ａが、メラニン量Ｃよりも有意に多くなっていることをいう。
【００１８】
なお、本明細書において、「有意」とは、ｔ検定のｐ値が０.０５未満、好ましくは０．０１未満であることをいう。
【００１９】
前記因子によるメラニン産生の誘導は、色素細胞を可溶化し、得られた可溶化物からタンパク質を除去して得られた抽出物の４０５ｎｍにおける吸光度を吸光度計で測定して得られた値をメラニン量Ａ〜Ｃそれぞれの指標として用い、式（１）：
【００２０】
（因子と接触させた色素細胞から得られた抽出物の４０５ｎｍにおける吸光度）／（因子と接触させていない色素細胞から得られた抽出物の４０５ｎｍにおける吸光度）                                                                                  （１）
【００２１】
を算出することによって評価することができる。
【００２２】
本発明のメラニン産生誘導剤によれば、本発明のメラニン産生誘導剤を色素細胞に接触させるだけで、色素細胞において、メラニン産生を簡便な操作で誘導することができる。また、本発明のメラニン産生誘導剤に含まれている前記因子は、角化細胞において、紫外線照射によってその遺伝子の発現量が増加する因子であり、かつ色素細胞におけるメラニン産生を誘導する因子である。したがって、本発明のメラニン産生誘導剤を色素細胞に接触させることにより、色素細胞において、紫外線照射によって前記因子を介して誘導されるメラニン産生を再現することができる。また、前記因子を介して誘導されるメラニン産生が美白剤によって抑制されることは、当該美白剤による美白作用の発現と相関性があることから、本発明のメラニン産生誘導剤は、被験物質の美白作用を評価するのに有用である。
【００２３】
前記ＩＬ−８は、例えば、紫外線照射によって角化細胞を刺激すること、リポ多糖などの刺激物質を用いてマクロファージを刺激することなどによって産生された天然のＩＬ−８であってもよく、遺伝子工学的手法により作製された組換えＩＬ−８であってもよい。また、本発明では、前記ＩＬ−８として、市販のＩＬ−８を用いることができる。
【００２４】
前記ＩＬ−８の供給源となる動物の種類は、本発明のメラニン産生誘導剤の用途に応じて異なるので、一概には決定することができない。例えば、本発明のメラニン産生誘導剤をヒトまたはヒトの色素細胞に適用する場合、前記ＩＬ−８は、ヒトの色素細胞におけるメラニン産生を効率よく誘導する観点から、ヒトのＩＬ−８であることが好ましい。
【００２５】
前記ＣＴＧＦは、ＴＧＦβなどの刺激物質を用いて正常線維芽細胞を刺激することなどによって産生された天然のＣＴＧＦであってもよく、遺伝子工学的手法により作製された組換えＣＴＧＦであってもよい。また、本発明では、前記ＣＴＧＦとして、市販のＣＴＧＦを用いることができる。
【００２６】
前記ＣＴＧＦの供給源となる動物の種類は、本発明のメラニン産生誘導剤の用途に応じて異なるので、一概には決定することができない。例えば、本発明のメラニン産生誘導剤をヒトまたはヒトの色素細胞に適用する場合、前記ＣＴＧＦは、ヒトの色素細胞におけるメラニン産生を効率よく誘導する観点から、ヒトのＣＴＧＦであることが好ましい。
【００２７】
前記ＩＬ−１Ｆ９は、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９などの刺激物質を用いて正常表皮角化細胞を刺激することなどによって産生された天然のＩＬ−１Ｆ９であってもよく、遺伝子工学的手法により作製された組換えＩＬ−１Ｆ９であってもよい。また、本発明では、前記ＩＬ−１Ｆ９として、市販のＩＬ−１Ｆ９を用いることができる。
【００２８】
前記ＩＬ−１Ｆ９の供給源となる動物の種類は、本発明のメラニン産生誘導剤の用途に応じて異なるので、一概には決定することができない。例えば、本発明のメラニン産生誘導剤をヒトまたはヒト色素細胞に適用する場合、前記ＩＬ−１Ｆ９は、ヒトの皮膚などの色素細胞におけるメラニン産生を効率よく誘導する観点から、ヒトのＩＬ−１Ｆ９であることが好ましい。
【００２９】
本発明のメラニン産生誘導剤においては、前記因子として、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９のいずれかを単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３０】
本発明のメラニン産生誘導剤は、前記因子の凍結乾燥物などのように前記因子以外の物質などを含まない剤型であってもよく、緩衝液などの溶媒に前記因子を混合した液剤の剤型であってもよい。
【００３１】
本発明のメラニン産生誘導剤が前記液剤である場合、前記メラニン産生誘導剤中における前記因子の含有量は、当該メラニン産生誘導剤の用途によって異なるので、一概には決定することができないが、通常、前記液剤に用いられる溶媒に対する前記因子の希釈安定性を確保する観点から、１ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、使用時における取り扱いの容易性の観点から、１０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。
【００３２】
本発明のメラニン産生誘導剤は、本発明の目的を妨げない範囲で、前記因子の生理活性を維持するに適した緩衝液、リン酸緩衝化生理的食塩水などをさらに含有していてもよい。前記緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳなどが挙げられる。
【００３３】
本発明のメラニン産生誘導剤によれば、例えば、色素細胞を含む培地、色素細胞を含む細胞懸濁液などに当該メラニン産生誘導剤を添加することなどにより、色素細胞におけるメラニン産生を誘導することができる。
【００３４】
本発明のメラニン産生誘導剤を用いて色素細胞におけるメラニン産生を誘導するに際して、前記因子の量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対する因子の量として換算すると、当該因子の量は、通常、前記因子によるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．００１ｎｇ以上であることが好ましく、０．０１ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、５００ｎｇ以下であることが好ましく、５０ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００３５】
前記因子がＩＬ−８である場合、ＩＬ−８の量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＩＬ−８の量として換算すると、当該ＩＬ−８の量は、通常、ＩＬ−８によるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．００１ｎｇ以上であることが好ましく、０．０１ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、１０ｎｇ以下であることが好ましく、５ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００３６】
前記因子がＣＴＧＦである場合、ＣＴＧＦの量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＣＴＧＦの量として換算すると、当該ＣＴＧＦの量は、通常、ＣＴＧＦによるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．００５ｎｇ以上であることが好ましく、０．０５ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、５０ｎｇ以下であることが好ましく、５ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００３７】
前記因子がＩＬ−１Ｆ９である場合、ＩＬ−１Ｆ９の量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＩＬ−１Ｆ９の量として換算すると、当該ＩＬ−１Ｆ９の量は、通常、ＩＬ−１Ｆ９によるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．５ｎｇ以上であることが好ましく、５ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、５００ｎｇ以下であることが好ましく、５０ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００３８】
前記因子がＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９からなる群より選ばれた２種以上の混合物である場合、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれの量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれの量として換算すると、通常、ＩＬ−８の量が５ｎｇ以下であり、ＣＴＧＦの量が５ｎｇ以下であり、かつＩＬ−１Ｆ９の量が５０ｎｇ以下であることが好ましい。なお、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれの量の下限値は、本発明のメラニン産生誘導剤の用途によって異なるので、一概には決定することができない。
【００３９】
以上説明したように、本発明のメラニン産生誘導剤によれば、当該メラニン産生誘導剤を色素細胞に接触させるだけで、色素細胞におけるメラニン産生を簡便な操作で誘導することができる。しかも、本発明のメラニン産生誘導剤によれば、色素細胞において、紫外線照射によって前記因子を介して誘導されるメラニン産生を再現することができる。したがって、本発明のメラニン産生誘導剤は、被験物質の美白作用の評価などに有用である。
【００４０】
２．被験物質の評価方法
本発明の被験物質の評価方法は、被験物質の美白作用を評価する被験物質の評価方法であって、
（Ａ）色素細胞を含有する細胞群に、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を接触させ、前記細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生を誘導するステップ、
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群に被験物質を接触させ、前記細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量を測定するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量に基づき、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制を調べ、前記被験物質の美白作用を評価するステップ
を含むことを特徴とする。
【００４１】
本発明の評価方法によれば、色素細胞を含有する細胞群に前記因子を接触させて、メラニン産生を誘導した細胞群と、被験物質とを接触させることにより、前記被験物質が、前記因子を介して誘導されるメラニン産生を抑制するかどうかを迅速かつ簡便に調べることができる。また、かかる因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制と美白剤の美白作用とに相関性があることから、本発明の評価方法によれば、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制の有無や前記抑制の程度に基づいて、被験物質の美白作用を迅速かつ簡便に評価することができる。
【００４２】
ステップ（Ａ）では、色素細胞を含有する細胞群に、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を接触させ、前記細胞群中の色素細胞におけるメラニン産生を誘導する。
【００４３】
前記細胞群としては、例えば、ヒト細胞からなる細胞群、マウス細胞からなる細胞群、異種細胞の組み合わせからなる細胞群などが挙げられる。前記細胞は、ヒトの皮膚に適した被験物質を評価する観点から、ヒト細胞からなる細胞群であることが好ましい。
【００４４】
ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９は、それぞれ、前記メラニン産生誘導剤におけるＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９と同様である。
【００４５】
前記色素細胞としては、例えば、ヒト色素細胞、マウス色素細胞などが挙げられる。前記色素細胞は、ヒトの皮膚に適した被験物質を評価する観点から、ヒト色素細胞であることが好ましい。
【００４６】
前記細胞群としては、例えば、前記色素細胞からなる細胞群、前記色素細胞と角化細胞とからなる細胞群などが挙げられる。前記細胞群は、ヒトの皮膚に適した被験物質を評価する観点から、ヒト色素細胞からなる細胞群またはヒト色素細胞とヒト角化細胞とからなる細胞群が好ましい。前記細胞群が、ヒト色素細胞からなる細胞群である場合、かかる細胞群を用いる本発明の評価方法によれば、例えば、ヒト色素細胞中の受容体が直接関与するメラニン産生の誘導に対する被験物質の作用を観察できる。したがって、かかる細胞群を用いる本発明の評価方法によれば、ヒト色素細胞のメラニン産生機構に対する被験物質の直接的な作用を評価することができる。また、前記細胞群が、ヒト色素細胞とヒト角化細胞とからなる細胞群である場合、前記細胞群中では、ヒト色素細胞とヒト角化細胞との相互作用、ヒト角化細胞からヒト色素細胞へのパラクライン的刺激から発生するメラニン産生誘導、ヒト色素細胞からヒト角化細胞へのメラニン輸送などが発生する。したがって、かかる細胞群を用いる本発明の評価方法によれば、ヒト色素細胞と当該ヒト色素細胞がメラノソームを受け渡すヒト表皮角化細胞とにより構成されるヒトのメラニン産生ユニットにおけるメラニン産生の誘導に対する被験物質の作用を評価することができる。
【００４７】
前記ヒト色素細胞は、正常ヒト色素細胞および不死化ヒト色素細胞のいずれであってもよい。
【００４８】
前記ヒト角化細胞は、正常ヒト角化細胞および不死化ヒト角化細胞のいずれであってもよい。前記ヒト角化細胞としては、例えば、正常ヒト表皮角化細胞などが挙げられる。
【００４９】
前記細胞群と前記因子との接触は、例えば、前記細胞群を含む培地に前記因子を添加して当該細胞群を培養すること、前記細胞群を含む細胞懸濁液に前記因子を添加した混合物を当該細胞群の生育に適した温度で保温することなどにより行なうことができる。
【００５０】
前記ステップ（Ａ）においては、前記因子として、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９のいずれかを単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５１】
前記細胞群に前記因子を接触させるに際して、前記細胞群を含む培地または前記細胞群を含む細胞懸濁液中の前記因子の量は、因子の種類、細胞群の種類、細胞群を含む培地または細胞群を含む細胞懸濁液中の細胞数などにより異なるので一概に決定することができない。前記因子の量を、例えば、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対する前記因子の量として換算すると、当該因子の量は、通常、前記因子によるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．００１ｎｇ以上であることが好ましく、０．０１ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、５００ｎｇ以下であることが好ましく、５０ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００５２】
前記因子として、ＩＬ−８を単独で用いる場合、例えば、前記ＩＬ−８の量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＩＬ−８の量として換算すると、当該ＩＬ−８の量は、通常、ＩＬ−８によるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．００１ｎｇ以上であることが好ましく、０．０１ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、１０ｎｇ以下であることが好ましく、５ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００５３】
前記因子として、ＣＴＧＦを単独で用いる場合、前記ＣＴＧＦの量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＣＴＧＦの量として換算すると、当該ＣＴＧＦの量は、通常、ＣＴＧＦによるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．００５ｎｇ以上であることが好ましく、０．０５ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、５０ｎｇ以下であることが好ましく、５ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００５４】
前記因子として、ＩＬ−１Ｆ９を単独で用いる場合、前記ＩＬ−１Ｆ９の量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＩＬ−１Ｆ９の量として換算すると、当該ＩＬ−１Ｆ９の量は、通常、ＩＬ−１Ｆ９によるメラニン産生の誘導を十分に行なう観点から、０．０１ｎｇ以上であることが好ましく、０．１ｎｇ以上であることがより好ましく、細胞の生育や生存に対する負荷を抑制する観点から、５００ｎｇ以下であることが好ましく、５０ｎｇ以下であることがより好ましい。
【００５５】
前記因子として、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９からなる群より選ばれた２種以上を混合して用いる場合、例えば、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれの量を、例えば、３ｍＬの培地が入った６ｃｍディッシュに細胞濃度が１．０×１０4個／ｃｍ2となるように播種された細胞に対するＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれの量として換算すると、通常、ＩＬ−８の量が５ｎｇ以下であり、ＣＴＧＦの量が５ｎｇ以下であり、かつＩＬ−１Ｆ９の量が５０ｎｇ以下であることが好ましい。
【００５６】
前記細胞群と前記因子との接触時間は、被験物質の評価を行なう目的などにより異なるので一概に決定することができない。
【００５７】
つぎに、ステップ（Ｂ）では、前記ステップ（Ａ）で得られた細胞群に被験物質を接触させ、前記細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量を測定する。
【００５８】
前記細胞群と被験物質との接触は、例えば、前記細胞群を含む培地に被験物質を添加して当該細胞群を培養することなどが挙げられる。
【００５９】
前記細胞群に被験物質を接触させるに際して、用いられる被験物質の量は、被験物質の種類などにより異なるので一概に決定することができない。
【００６０】
メラニンの量（質量）の測定は、例えば、細胞群の培養物に含まれる細胞から、エチルアルコール−ジエチルエーテル混合溶液〔エチルアルコール／ジエチルエーテル（体積比）＝１／１〕、２Ｎ水酸化ナトリウム−１０体積％ジメチルスルホキシド混合溶液〔２Ｎ水酸化ナトリウム、１０体積％ジメチルスルホキシド〕などの抽出溶媒を用いてメラニンを含む抽出物を得、得られた抽出物の４０５ｎｍにおける吸光度を吸光度計で測定することなどによって行なうことができる。なお、メラニンの量の測定に際して、メラニンを含む抽出物を得る抽出方法は、上記方法に限定されるものではない。
【００６１】
その後、ステップ（Ｃ）では、前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量に基づき、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制を調べ、前記被験物質の美白作用を評価する。
【００６２】
前記被験物質が、前記因子を介して誘導されるメラニン産生を抑制するかどうかは、例えば、前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量と、被験物質を接触させていない細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量とを比較することにより調べることができる。
【００６３】
ステップ（Ｃ）では、前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量が、例えば、被験物質を接触させていない細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量よりも有意に少なくなっている場合、前記被験物質が、前記因子を介して誘導されるメラニン産生を抑制すると判断することができる。なお、評価結果の精度を高める観点から、前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量は、コウジ酸を接触させた細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量よりも有意に少なくなっていることが好ましい。
【００６４】
前記のように、前記被験物質が、前記因子を介して誘導されるメラニン産生を抑制すると判断した場合、当該被験物質が美白作用を示す物質であると評価することができる。また、前記ステップ（Ｂ）で測定されたメラニンの量と、被験物質を接触させていない細胞群中の色素細胞により産生されたメラニンの量との差が大きくなるほど、当該被験物質がより強い美白作用を有すると評価することができる。
【００６５】
以上説明したように、本発明の評価方法によれば、前記因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制の有無や抑制の程度に基づいて、被験物質の美白作用を簡便に評価することができることから、美白用外用剤などに有用な美白剤のスクリーニングや、美白用外用剤などの美白作用の評価を迅速かつ簡便な操作で行なうことができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００６７】
（製造例１）
ＤＫ−ＳＦＭ〔ライフテクノロジーズ社製〕と色素細胞増殖培地２５４〔倉敷紡績（株）製〕とを、ＤＫ−ＳＦＭと２５４との体積比（ＤＫ−ＳＦＭ／２５４）が１／１となるように添加して、ＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地を得た。なお、前記ＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地中のカルシウム濃度は、０．１５ｍＭ未満であった。
【００６８】
（製造例２）
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕およびα-色素細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕を、ｂ−ＦＧＦ濃度が５ｎｇ／ｍＬおよびαＭＳＨ濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように３次元培養皮膚維持培地〔倉敷紡績（株）製、商品名：ＮＭＭ〕に添加してＮＭＭ長期維持培地を得た。なお、前記ＮＭＭ長期維持培地中のカルシウム濃度は、１．２ｍＭであった。
【００６９】
（製造例３）
ＦＢＳ、アデニン〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、インスリン、イソプロテレノール〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕、トランスフェリンおよびトリヨードチロニン〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕を、ＦＢＳ濃度が１０体積％、アデニン濃度が０．１８ｍＭ、ＥＧＦ濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、ヒドロコルチゾン濃度が０．４μｇ／ｍＬ、インスリン濃度が５μｇ／ｍＬ、イソプロテレノール濃度が１０μＭ、トランスフェリン濃度が５μｇ／ｍＬおよびトリヨードチロニン濃度が２ｎＭとなるようにＤＭＥＭ／Ｆ１２混合培地［ＤＭＥＭ〔ライフテクノロジーズ社製〕とＦ１２〔ライフテクノロジーズ社製〕との混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比＝３／１）］に添加して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２調整培地を得た。なお、前記ＤＭＥＭ／Ｆ１２調整培地中のカルシウム濃度は、０．１５ｍＭ未満であった。
【００７０】
（製造例４）
正常ヒト表皮角化細胞（以下、「ＮＨＫ」という）〔倉敷紡績（株）製〕と正常ヒト色素細胞（以下、「ＮＨＭ」という）〔倉敷紡績（株）製〕とを、ＮＨＫ／ＮＨＭ（細胞数比）が１０／３となるように混合してＮＨＫ／ＮＨＭ混合物を得た。
【００７１】
（試験例１）培地の検討
製造例４で得られたＮＨＫ／ＮＨＭ混合物を、全細胞濃度が１．０×１０4細胞／ｃｍ2となるように６ｃｍディッシュ上の培地に播種し、５体積％二酸化炭素下、３７℃で７日間培養した。なお、培地として、製造例１で得られたＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地、製造例２で得られたＮＭＭ長期維持培地または製造例３で得られたＤＭＥＭ／Ｆ１２調整培地を用いた。また、培養期間中、前記６ｃｍディッシュ上の培地を、１日おきに新鮮な培地に交換した。
【００７２】
ＢｒｄＵ検出キット〔ベクトン・ディッキンソン社製、商品名：ＢｒｄＵ  Ｆｌｏｗ  Ｋｉｔ〕および蛍光顕微鏡システム〔オリンパスフォトアクチベーション蛍光顕微鏡システムＩＸ８１−ＰＡＦＭ〕を用いて培養後の細胞に取り込まれたＢｒｄＵの量を調べることにより、培養後の細胞の細胞増殖活性を測定した。
【００７３】
また、培養後の細胞を位相差顕微鏡〔オリンパス社製、商品名：ＩＸ７０〕で観察した。
【００７４】
試験例１において、ＮＭＭ長期維持培地で培養したＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真を図１（ａ）に、試験例１において、ＤＭＥＭ／Ｆ１２調整培地で培養したＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真を図１（ｂ）に、ならびに試験例１において、ＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地で培養したＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真を図１（ｃ）にそれぞれ示す。なお、図中、スケールバーは、１００μｍを示す。
【００７５】
図１（ａ）に示された結果から、カルシウム濃度が１．２ｍＭであるＮＭＭ長期維持培地でＮＨＫおよびＮＨＭを培養した場合、ＮＨＫの分化が進行し、かつＮＨＫおよびＮＨＭが重層化されていることがわかる。しかしながら、細胞内に取り込まれたＢｒｄＵの量が細胞染色の強度により減少していることから、ＮＨＫおよびＮＨＭの増殖活性が減弱していることがわかる。
【００７６】
また、図１（ｂ）に示された結果から、ＤＭＥＭ／Ｆ１２調製培地でＮＨＫおよびＮＨＭを培養した場合、細胞の形状が扁平状になっており、特に、ＮＨＫが線維芽細胞様に伸長しているが、ＮＨＫおよびＮＨＭが重層化されていないことがわかる。
【００７７】
これに対して、図１（ｃ）に示された結果から、カルシウム濃度が０．１５ｍＭ未満であるＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地でＮＨＫおよびＮＨＭを培養した場合、細胞が共に本来の形状を維持しながら増殖していることがわかる。
【００７８】
したがって、これらの結果から、細胞が共に本来の形状を維持しながら増殖し、長期間培養することができたため、ＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地がＮＨＫとＮＨＭとの共培養に適していることが示唆される。
【００７９】
（試験例２）
ＮＨＫ（実験番号１）、ＮＨＭ（実験番号２）、または製造例１で得られたＮＨＫとＮＨＭとの混合物（実験番号３）を、細胞濃度が１．０×１０4細胞／ｃｍ2となるように６ｃｍディッシュ上のＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に播種し、５体積％二酸化炭素下、３７℃で７日間培養した。なお、培養期間中、前記６ｃｍディッシュ上の培地を、１日おきに新鮮な培地に交換した。
【００８０】
つぎに、得られた培養物を１０００×ｇで５分間での遠心分離に供して細胞を回収した。つぎに、リン酸緩衝生理食塩水で２回細胞を洗浄した。洗浄後の細胞を１０００×ｇで５分間での遠心分離に供して上清を除去した。得られた細胞を蒸留水２００ｍＬに懸濁して細胞懸濁液を得た。
【００８１】
得られた細胞懸濁液にエチルアルコール−ジエチルエーテル混合溶液〔エチルアルコール／ジエチルエーテル（体積比）＝１／１〕１ｍＬを添加した。得られた混合物を室温で１５分間保温した後、３０００×ｇで５分間の遠心分離に供して上清を除去して沈殿物を得た。得られた沈殿物に、２Ｎ水酸化ナトリウム−１０体積％ジメチルスルホキシド混合溶液〔２Ｎ水酸化ナトリウム、１０体積％ジメチルスルホキシド〕２５０μＬを添加した。その後、得られた混合物を８０℃で３０分間保温した。保温後の混合物に、メチルアルコール−クロロホルム混合溶液〔メチルアルコール／クロロホルム（体積比）＝１／２〕５０μＬを加えて懸濁した。得られた懸濁物を、３０００×ｇで１０分間での遠心分離に供し、上清を得た。
【００８２】
得られた上清の４０５ｎｍにおける吸光度を吸光度計〔バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社製、商品名：マイクロプレートリーダー〕で測定した。得られた測定値からメラニンの質量（以下、「メラニン量」という）を算出した。
【００８３】
試験例２において、実験番号１〜３それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を図２に示す。図中、実験番号１はＮＨＫの培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号２はＮＨＭの培養物におけるメラニン量の相対値および実験番号３はＮＨＫとＮＨＭとの混合物の培養物におけるメラニン量の相対値をそれぞれ示す。
【００８４】
図２に示された結果から、ＮＨＭの培養物におけるメラニン量を１００とした場合、ＮＨＫとＮＨＭとの混合物の培養物におけるメラニン量は、ＮＨＭの培養物におけるメラニン量の約１９０％に増加していることがわかる。
【００８５】
したがって、これらの結果から、表皮角化細胞と色素細胞との相互作用があると考えられるため、色素細胞で産生されたメラニンが色素細胞から角化細胞に輸送されていることが示唆される。
【００８６】
（試験例３）
製造例１で得られたＮＨＫとＮＨＭとの混合物を、細胞濃度が１．０×１０4細胞／ｃｍ2となるように６ｃｍディッシュ上のＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に播種し、５体積％二酸化炭素下、３７℃で培養した。なお、培養期間中、前記６ｃｍディッシュ上の培地を、１日おきに新鮮な培地に交換した。
【００８７】
培養開始から１日間経過後において、紫外線照射量が５ｍＪ／ｃｍ2となるように紫外線Ｂ波〔ＵＶ−Ｂ（波長：２８０〜３１５ｎｍ）〕を前記ＮＨＫおよびＮＨＭに照射した。ＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物を、５体積％二酸化炭素下、３７℃で７日間さらに培養した（実験番号５）。
【００８８】
また、ＮＨＫとＮＨＭとの混合物にＵＶ−Ｂを照射する代わりに、当該混合物にＵＶ−Ｂを照射しないことを除き、前記と同様にして前記混合物を培養した（実験番号４）。
【００８９】
培養後の細胞を位相差顕微鏡で観察した。また、ＢｒｄＵ検出キットを用いて前記混合物の培養物に含まれる細胞にＢｒｄＵを取り込ませるとともに、前記細胞に取り込まれたＢｒｄＵを染色した。その後、蛍光顕微鏡システムを用いて染色後の細胞を観察した。
【００９０】
試験例３において、ＵＶ−Ｂ非照射の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真を図３（ａ）に、試験例３において、ＵＶ−Ｂ非照射の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの染色像を示す図面代用写真を図３（ｂ）、試験例３において、ＵＶ−Ｂ照射後の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの観察結果を示す図面代用写真を図３（ｃ）に、試験例３において、ＵＶ−Ｂ照射後の混合物の培養物に含まれるＮＨＫおよびＮＨＭの染色像を示す図面代用写真を図３（ｄ）にそれぞれ示す。図中、スケールバーは、１００μｍである。
【００９１】
さらに、ＵＶ−Ｂ非照射の混合物の培養物およびＵＶ−Ｂ照射後の混合物の培養物それぞれにおけるメラニン量を、前記試験例２と同様の操作を行なって測定した。つぎに、ＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物におけるメラニン量を１００として、前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値を算出した。
【００９２】
また、ＵＶ−Ｂ非照射の混合物の培養物およびＵＶ−Ｂ照射後の混合物の培養物それぞれの細胞数を、血球計算板によって算出した。つぎに、ＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物における細胞数を１００として、前記混合物の培養物における細胞数の相対値を算出した。
【００９３】
試験例３において、実験番号４および５それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を図４（ａ）に、試験例３において、実験番号４および５それぞれの試料と細胞数の相対値との関係を図４（ｂ）に、試験例３において、実験番号４および５それぞれの試料と１細胞あたりのメラニン量の相対値との関係を図４（ｃ）にそれぞれ示す。図４（ａ）において、実験番号４はＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号５はＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値をそれぞれ示す。図４（ｂ）において、実験番号４はＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物における細胞数の相対値、実験番号５はＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物の培養物における細胞数の相対値をそれぞれ示す。図４（ｃ）において、実験番号４はＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物における１細胞あたりのメラニン量の相対値、実験番号５はＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物の培養物における１細胞あたりのメラニン量の相対値をそれぞれ示す。
【００９４】
図３（ａ）〜（ｄ）に示された結果から、ＵＶ−Ｂ非照射の場合、ＮＨＭおよびＮＨＫのいずれも存在している〔図３（ａ）および（ｂ）参照〕のに対して、ＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物の培養物では、ＮＨＭが樹状に伸びた形状を示して生存しているが、ＮＨＫが生存していないことがわかる〔図３（ｃ）および（ｄ）参照〕。図４（ｂ）に示された結果から、ＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物の培養物の細胞数が、ＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物の細胞数の約５０％であることから、ＮＨＫは、ＵＶ−Ｂによって特異的にアポトーシスを起こしていることが示唆される。
【００９５】
また、図４（ａ）に示された結果から、ＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物の培養物の全メラニン量は、ＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物における全メラニン量とほぼ同程度であることがわかる〔図４（ａ）参照〕。しかしながら、図４（ｃ）に示された結果から、ＵＶ−Ｂ照射後の前記混合物の培養物における１細胞あたりのメラニン量は、ＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物における１細胞あたりのメラニン量の約１８０％まで増加していることがわかる。
【００９６】
これらの結果から、ＮＨＫとＮＨＭとの混合物の培養物では、ＵＶ−Ｂ照射によってＮＨＭが樹状形状となって、ＮＨＫにメラニンを輸送しようとしているが、ＮＨＫのアポトーシスによって、ＮＨＫが存在していないため、ＮＨＭからＮＨＫへのメラニン輸送は行なわれていないと考えられる。しかしながら、図４（ｃ）に示されるように、ＵＶ−Ｂ照射によって１細胞あたりのメラニン量が増加していることから、ＮＨＫがアポトーシスを起こす前に、ＮＨＫがＵＶ−Ｂによる刺激によって、ＮＨＭにおけるメラニン産生を誘導する何らかの因子を分泌することが示唆される。
【００９７】
（試験例４）
細胞濃度が１．０×１０4個/ｃｍ2となるように播種された６ｃｍディッシュ上のＮＨＫ細胞に対して、ＵＶ−Ｂ照射量が７．５ｍＪ／ｃｍ2となるようにＵＶ−Ｂを照射した。つぎに、ＵＶ−Ｂ照射後のＮＨＫを、細胞濃度が１．０×１０4細胞／ｃｍ2となるように６ｃｍディッシュ上のＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に播種し、５体積％二酸化炭素下、３７℃で培養した。なお、培養期間中、前記６ｃｍディッシュ上の培地を、１日おきに新鮮な培地に交換した。
【００９８】
ＵＶ−Ｂ照射時から６時間または２４時間経過後の細胞を回収し、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡとＤＮＡマイクロアレイ〔アフィメトリックス社製、商品名：ＧｅｎｅＣｈｉｐ〕とを用いてＤＮＡマイクロアレイ解析を行なった。また、ＵＶ−Ｂを非照射としたことを除き、前記と同様にしてＤＮＡマイクロアレイ解析を行なった。
【００９９】
ＤＮＡマイクロアレイ解析によって得られた各遺伝子のシグナル強度のデータと式（２）：
ＩＦ（Ｕ／Ｎ≧３，ＩＦ（Ｎ  ａｎｄ  Ｕ≧２０，抽出，ＩＦ（Ｕ≧１００，抽出，除外），除外）              （２）
（式中、Ｎは、ＵＶ−Ｂ未照射の細胞における遺伝子のシグナル強度、Ｕは、ＵＶ−Ｂ照射後の細胞における遺伝子のシグナル強度を示す）
で表される条件式に基づいて、ＵＶ−Ｂ照射後のＮＨＫにおける発現量がＵＶ−Ｂ非照射のＮＨＫにおける発現量と比べて３倍以上となっている遺伝子を選抜した。つぎに、選抜された遺伝子によりコードされる因子を、メラニン産生を誘導する候補因子として選抜した。
【０１００】
選抜された候補因子を表１に示す。
【０１０１】
【表１】
2011208964.tif 000002
【０１０２】
（試験例５）
（１）候補分子の使用濃度の検討
製造例１で得られたＮＨＫとＮＨＭとの混合物を、細胞濃度が１．０×１０4細胞／ｃｍ2となるように６ｃｍディッシュ上のＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に播種した。その後、播種後の前記培地に、表１に示される候補因子のいずれかを、前記候補因子の濃度が各種濃度となるように添加した。その後、前記混合物を５体積％二酸化炭素下、３７℃で培養した。なお、培養期間中、前記６ｃｍディッシュ上の培地を、１日おきに新鮮な培地に交換した。
【０１０３】
前記混合物の培養物におけるメラニン量を、前記試験例２と同様にして測定した。また、前記混合物の培養物の細胞数を、血球計算版によって測定した。そして、各候補分子について、候補因子を含まないＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地で前記と同様に培養して得られたＮＨＫとＮＨＭとの混合物の培養物の細胞数以上の細胞数となり、かつ産生されるメラニン量が最大となる至適濃度を決定した。
【０１０４】
（２）メラニン産生を誘導する因子の選抜
製造例２で得られたＮＨＫとＮＨＭとの混合物を、細胞濃度が１．０×１０4細胞／ｃｍ2となるように６ｃｍディッシュ上のＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に播種した。つぎに、播種後の前記培地に、表１に示される候補因子のいずれかを、前記候補因子の濃度が前記至適濃度となるように添加した。その後、前記混合物を５体積％二酸化炭素下、３７℃で培養した。なお、培養期間中、前記６ｃｍディッシュ上の培地を、１日おきに新鮮な培地に交換した。
【０１０５】
また、ＮＨＫとＮＨＭとの混合物にＵＶ−Ｂを照射する代わりに、当該混合物にＵＶ−Ｂを照射しないことを除き、前記と同様にしてＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物におけるメラニン量を測定した。つぎに、ＵＶ−Ｂ非照射の前記混合物の培養物におけるメラニン量を１００として、前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値を算出した。
【０１０６】
前記因子の代わりに、陽性対照としてα-色素細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）〔シグマ・アルドリッチ・コーポレーション製〕を用い、前記と同様にして、メラニン量の相対値を算出した。また、前記因子を添加せずに、前記と同様にして、メラニン量の相対値を算出した。
【０１０７】
その後、前記表１に示される候補因子のなかから、前記メラニン量の相対値が１００を超える値となる因子を選抜した。
【０１０８】
その結果、前記メラニン量の相対値が１００を超える値となる因子として、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９が得られた。なお、前記混合物を播種したＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地中のＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれの至適濃度は、順に、５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬおよび５０ｎｇ／ｍＬであった。
【０１０９】
（３）ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９それぞれによるメラニン産生誘導効果の検討
前記（２）において、前記因子を添加する代わりに、前記因子を培地に添加しないこと（実験番号６）、陽性対照であるαＭＳＨを培地に添加したこと（実験番号７）、ＩＬ−８を培地に添加したこと（実験番号８）、ＣＴＧＦを培地に添加したこと（実験番号９）またはＩＬ−１Ｆ９を培地に添加したこと（実験番号１０）を除き、前記（２）と同様にして、メラニン量の相対値を算出した。
【０１１０】
試験例５において、実験番号６〜１０それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を図５に示す。図中、実験番号６は前記因子を添加していない培地で培養したＨａＣａＴ細胞とＮＨＭとの混合物の培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号７は陽性対照（５ｎｇ／ｍＬαＭＳＨ）を含む培地で培養したＨａＣａＴ細胞とＮＨＭとの混合物の培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号８は５ｎｇ／ｍＬＩＬ−８を含む培地で培養したＨａＣａＴ細胞とＮＨＭとの混合物の培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号９は５ｎｇ／ｍＬＣＴＧＦを含む培地で培養したＨａＣａＴ細胞とＮＨＭとの混合物の培養物におけるメラニン量の相対値および実験番号１０は５０ｎｇ／ｍＬＩＬ−１Ｆ９を含む培地で培養したＨａＣａＴ細胞とＮＨＭとの混合物の培養物におけるメラニン量の相対値をそれぞれ示す。
【０１１１】
図５に示された結果から、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−ＩＦ９は、それぞれ、メラニン産生を誘導する因子であることがわかる。
【０１１２】
（実施例１）
（１）ＩＬ−８を用いたコウジ酸の評価
製造例２で得られたＨａＣａＴ細胞とＮＨＭとの混合物を、細胞濃度が１．０×１０4細胞／ｃｍ2となるように６ｃｍディッシュ上のＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に播種した。その後、ＩＬ−８を、前記混合物を播種したＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に、ＩＬ−８濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。さらに、得られた培地に、美白作用を有することが知られているコウジ酸を、コウジ酸濃度が１ｍＭとなるように添加した。
【０１１３】
その後、前記混合物を５体積％二酸化炭素下、３７℃で培養した。なお、培養期間中、前記６ｃｍディッシュ上の培地を、１日おきに新鮮な培地に交換した（実験番号１２）。また、コウジ酸を培地に添加しないことを除き、前記と同様にして、前記混合物を培養した（実験番号１１）。
【０１１４】
得られた混合物の培養物におけるメラニン量を、前記試験例２と同様にして測定した。つぎに、コウジ酸を含まない培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量を１００として、前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値を算出した。
【０１１５】
実施例１において、実験番号１１および１２それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を図６（ａ）に示す。図６（ａ）において、実験番号１１はＩＬ−８を含むがコウジ酸を含まない培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号１２はＩＬ−８とコウジ酸とを含む培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値をそれぞれ示す。
【０１１６】
図６（ａ）に示された結果から、ＩＬ−８とコウジ酸とを含む培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値は、ＩＬ−８を含むがコウジ酸を含まない培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値と比べて著しく低くなっていることがわかる。これらの結果から、コウジ酸は、ＩＬ−８を介して誘導されるメラニン産生を抑制することがわかる。また、これらの結果から、コウジ酸による美白作用は、ＩＬ−８を介して誘導されるメラニン産生の抑制と相関性があることが示唆される。
【０１１７】
したがって、以上の結果から、ＩＬ−８を介して誘導されるメラニン産生が被験物質によって抑制されるかどうかや、メラニン産生に対する被験物質による抑制の程度を調べることにより、被験物質の美白作用の有無やその強さの程度を評価することができることが示唆される。
【０１１８】
（２）ＣＴＧＦを用いたコウジ酸の評価
前記（１）において、ＩＬ−８を、前記混合物を播種したＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に、ＩＬ−８濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように添加する代わりに、ＣＴＧＦを、前記混合物を播種したＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に、ＣＴＧＦ濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように添加したことを除き、前記（１）と同様にして、前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値を算出した。
【０１１９】
実施例１において、実験番号１３および１４それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を図６（ｂ）に示す。図６（ｂ）において、実験番号１３はＣＴＧＦを含むがコウジ酸を含まない培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号１４はＣＴＧＦとコウジ酸とを含む培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値をそれぞれ示す。
【０１２０】
図６（ｂ）に示された結果から、ＣＴＧＦとコウジ酸とを含む培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値は、ＣＴＧＦを含むがコウジ酸を含まない培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値と比べて著しく低くなっていることがわかる。これらの結果から、コウジ酸は、ＣＴＧＦを介して誘導されるメラニン産生を抑制することがわかる。また、これらの結果から、コウジ酸による美白作用は、ＣＴＧＦを介して誘導されるメラニン産生の抑制と相関性があることが示唆される。
【０１２１】
したがって、以上の結果から、ＣＴＧＦを介して誘導されるメラニン産生が被験物質によって抑制されるかどうかや、メラニン産生に対する被験物質による抑制の程度を調べることにより、被験物質の美白作用の有無やその強さの程度を評価することができることが示唆される。
【０１２２】
（３）ＩＬ−１Ｆ９を用いたコウジ酸の評価
前記（１）において、ＩＬ−１Ｆ９を、前記混合物を播種したＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に、ＩＬ−１Ｆ９濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように添加する代わりに、ＩＬ−１Ｆ９を、前記混合物を播種したＤＫ−ＳＦＭ／２５４培地に、ＩＬ−１Ｆ９濃度が５ｎｇ／ｍＬとなるように添加したことを除き、前記（１）と同様にして、前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値を算出した。
【０１２３】
実施例１において、実験番号１５および１６それぞれの試料とメラニン量の相対値との関係を図６（ｃ）に示す。図６（ｃ）において、実験番号１５はＩＬ−１Ｆ９を含むがコウジ酸を含まない培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値、実験番号１６はＩＬ−１Ｆ９とコウジ酸とを含む培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値をそれぞれ示す。
【０１２４】
図６（ｃ）に示された結果から、ＩＬ−１Ｆ９とコウジ酸とを含む培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値は、ＩＬ−１Ｆ９を含むがコウジ酸を含まない培地で培養した前記混合物の培養物におけるメラニン量の相対値と比べて著しく低くなっていることがわかる。これらの結果から、コウジ酸は、ＩＬ−１Ｆ９を介して誘導されるメラニン産生を抑制することがわかる。また、これらの結果から、コウジ酸による美白作用は、ＩＬ−１Ｆ９を介して誘導されるメラニン産生の抑制と相関性があることが示唆される。
【０１２５】
したがって、以上の結果から、ＩＬ−１Ｆ９を介して誘導されるメラニン産生が被験物質によって抑制されるかどうかや、メラニン産生に対する被験物質による抑制の程度を調べることにより、被験物質の美白作用の有無やその強さの程度を評価することができることが示唆される。
【０１２６】
以上の結果から、被験物質が、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９からなる群より選ばれた少なくとも１種の因子を介して誘導されるメラニン産生の抑制の有無や抑制の程度を調べることにより、被験物質の美白作用の有無やその強さの程度を迅速かつ簡便な操作で評価することができることが示唆される。
【０１２７】
また、ＩＬ−８、ＣＴＧＦおよびＩＬ−１Ｆ９は、それぞれ、細胞におけるメラニン産生を誘導するメラニン産生誘導剤として用いることができることが示唆される。
【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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