(57)【要約】【課題】パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）を臨床適用可能とするための精製技術を提供する。【解決手段】パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）含有溶液を疎水性担体処理し、次いで３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）の存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするＰＯＮの精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラオキソナーゼ（ＰＯＮ）含有溶液を疎水性担体処理し、次いで３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）の存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするＰＯＮの精製方法。
【請求項２】
ＣＨＡＰＳおよびポリオールの存在下に陰イオン交換体処理する請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
ポリオールがグリセロールである請求項２に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパラオキソナーゼ（以下ＰＯＮと称することもある）に関するものである。詳細にはＰＯＮを含有する製剤、精製方法、安定化方法および新規な医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
パラオキソナーゼ（ヒト血清パラオキソナーゼあるいはＰＯＮ１ともいう）は、Ｃａ2+依存性の分子量約４５ｋＤａの糖蛋白質であり、血中で高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）を構成する蛋白成分の一つとして存在している。ＰＯＮはオクソン、有機リン、神経ガスのサリンなどの芳香族カルボン酸を加水分解する血清酵素として知られており、これらの解毒剤として使用することができる。近年、ＰＯＮの生理活性が明らかになりつつあり、例えば、抗動脈硬化作用、抗酸化作用などが報告されている（非特許文献１、同２、特許文献１）。
【０００３】
ＰＯＮの精製に関しては、ブルーアガロース処理とＤＥＡＥ型陰イオン交換体処理を組合せる方法が報告されている（非特許文献３、同４）。該報告例によれば、グリセロールとポリオキシエチレン・アルキルフェニルエーテル型の非イオン系界面活性剤（具体的にはＥｍｕｌｇｅｎ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、共に商品名）の共存下にＰＯＮを精製することが報告されているが、それ以外のもの、例えば、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（以下ＣＨＡＰＳと称することもある）等は開示されていない。また、ＰＯＮを含む血清検体にＣＨＡＰＳを添加し、該酵素活性を維持することが報告されている（特許文献２）が、これは精製ＰＯＮに関するものではない。
【０００４】
ＰＯＮを医薬に応用することを示唆する報告もいくつかなされている。例えば、生体中のＰＯＮ量と狭心症、心筋梗塞、脳梗塞の関係を示唆する報告例がある（特許文献２）。また、特許文献３は、Ａｐｏ−Ａ１に関する虚血再灌流障害に関する報告であるが、この中でＰＯＮもＡｐｏ−Ａ１と同様に虚血再灌流障害に有効であることが示唆されている。しかし、具体的にその効果が示されているわけではない。
【０００５】
このようにＰＯＮは医薬として有用であることが示唆されているにすぎず、またＰＯＮを医薬品として安定的に供給する手段についてはほとんど報告例がないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開パンフレットＷＯ００／３０４２５号
【特許文献２】特開２０００−３３３６７４号公報
【特許文献３】国際公開パンフレットＷＯ０３／９７６９６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、１９９８年、１０１巻、１５８１−１５９０頁
【非特許文献２】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９８年、３９４巻、２８４−２８７頁
【非特許文献３】ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Ｄｒｕｇ Ｍｅｔｈａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、１９９１年、１９巻１号、１００−１０６頁
【非特許文献４】バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９１年、３０巻、１０１３３−１０１４０頁
【非特許文献５】プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９５年、９２巻、７１８７−７１９１頁
【非特許文献６】ジャーナル・オブ・リピド・リサーチ（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｃｈ）、２００１年、４２巻、９５１−９５８頁
【非特許文献７】ストローク（Ｓｔｒｏｋｅ）、１９８９年、２０巻、１０３７−１０４３頁
【非特許文献８】ジャーナル・オブ・セレブラル・ブラッド・フロー・アンド・メタボリズム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、２０００年、２０巻、１３１１−１３１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の精製法では高純度のＰＯＮを効率よく回収することが困難であると予想された。また従来より使用されている界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン・アルキルフェニルエーテル型の非イオン系界面活性剤を用いた場合、ＰＯＮの安定化効果は必ずしも良好なものではないことが確認された。さらに、これらの界面活性剤のうち、高分子量のものは透析などにより除去できないため、クロマト処理により精製されたＰＯＮを動物などに投与するための濃縮操作を行うと、これらの界面活性剤も一緒に濃縮されてしまい、生体への悪影響が懸念された。
【０００９】
本発明の目的は、ＰＯＮを臨床適用可能とするための精製および製剤化技術を提供することにある。また、本発明の別の目的はＰＯＮの新規な医薬用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の事情を考慮に入れて研究を行った結果、ＰＯＮの精製時および／または保存時に、ＣＨＡＰＳを添加することにより、純度、活性発現、活性回収率および保存安定性が改善できることを見出した。
【００１１】
また、本発明者らは、虚血再灌流動物モデルにおいてＰＯＮが有用であることを証明した。
【００１２】
すなわち、本発明は下記のとおりである：
（１）ＰＯＮおよびＣＨＡＰＳを含むＰＯＮ含有製剤、
（２）さらにポリオールを含む上記（１）の製剤、
（３）ポリオールがグリセロールである上記（２）の製剤、
（４）ＰＯＮ含有溶液を、疎水性担体処理し、次いでＣＨＡＰＳの存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするＰＯＮの精製方法、
（５）ＣＨＡＰＳおよびポリオールの存在下に陰イオン交換体処理する上記（４）の精製方法、
（６）ポリオールがグリセロールである上記（５）の精製方法、
（７）ＰＯＮにＣＨＡＰＳを添加することを特徴とするＰＯＮの安定化方法、
（８）さらにポリオールを添加する上記（７）の安定化方法、
（９）ポリオールがグリセロールである上記（８）の安定化方法、
（１０）ＰＯＮを有効成分とする、虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞の予防及び／又は治療剤、
（１１）虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善するために使用される上記（１０）の予防及び／又は治療剤、
（１２）ＰＯＮおよびＣＨＡＰＳを含む、虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞の予防及び／又は治療するための薬剤、
（１３）虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善するために使用される上記（１２）の薬剤、
（１４）さらにポリオールを含む上記（１２）または（１３）の薬剤、
（１５）ポリオールがグリセロールである上記（１４）の薬剤、
（１６）有効量のＰＯＮを投与してなる虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善する方法、
（１７）虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能を改善するための薬剤を製造するためのＰＯＮの使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、精製時・保存時の安定性が改善されたＰＯＮ含有製剤の供給が可能である。また、虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞に有用な新規な医薬品の提供が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本図は虚血再灌流モデルにおいて再灌流直後にＰＯＮの初回投与を行ったときの、神経症状の改善度の変化を経時的に示したものである。横軸は観察日、すなわち再灌流後の日数（ｄａｙ）を、縦軸は神経症状スコアーを、各々示す。図中の記号（□、△、○）は各観察日における神経症状スコアーを示す。各々のデータは平均値±ＳＥＭで示される。記号と折れ線の組合せのうち、□と点線の組合せはｓｈａｍ群（正常群）を、△と点線の組合せはビークル群（疾患群）を、○と実線の組合せはＰＯＮ投与群を、各々示す。＊はＷｉｌｃｏｘｏｎ法を用いてビークル群と比較したときに危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図２】本図は虚血再灌流モデルにおいて再灌流直後にＰＯＮの初回投与を行ったときの、運動機能の改善度の変化を経時的に示したものである。横軸、データ表示、記号と折れ線の組合せの定義は図１の説明に同じである。縦軸はＲｏｔａｒｏｄの歩行時間（秒）を示す。図中の記号（□、△、○）は各観察日におけるＲｏｔａｒｏｄの歩行時間を示す。＊＊はｔ−ｔｅｓｔ法を用いてビークル群と比較したときに危険率１％未満で有意差があることを示す。
【図３】本図は虚血再灌流モデルにおいて再灌流３時間後にＰＯＮの初回投与を行ったときの、神経症状の改善度の変化を経時的に示したものである。横軸、縦軸、記号、データ表示、記号と折れ線の組合せの定義は図１の説明に同じである。＊はｔ−ｔｅｓｔ法を用いてビークル群と比較したときに危険率５％未満で有意差があることを示す。
【図４】本図は虚血再灌流モデルにおいて再灌流３時間後にＰＯＮの初回投与を行ったときの、運動機能の改善度の変化を経時的に示したものである。横軸、データ表示、記号と折れ線の組合せの定義は図１の説明に同じである。縦軸と記号の定義は図２の説明に同じである。＊の定義は図３の説明に同じである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
出発原料
本発明で用いられる出発原料はＰＯＮ含有溶液であれば特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、血漿からフィブリンを除去したもの、血漿からコーンの低温エタノール分画法により得られる上清画分Ｅｆｆ．Ｉなどが例示される。また、遺伝子組換え技術を利用して調製されたものであってもよい。具体的には、組換え技術を用いてＣＨＯ細胞、昆虫細胞等に発現させた組換えＰＯＮを含む溶液（例えば、培養液、培養上清など）を用いることができる（非特許文献５、同６を参照）。
【００１６】
精製
本発明の精製方法は、ＰＯＮ含有溶液を疎水性担体処理し、次いでポリオールおよびＣＨＡＰＳの存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするものである。あるいは本発明の精製方法は、ＰＯＮ含有溶液を疎水性担体処理し、次いでＣＨＡＰＳの存在下に陰イオン交換体処理することを特徴とするものである。
【００１７】
疎水性担体処理
疎水性担体は不溶性担体に疎水性基を結合したものである。不溶性担体としてはアガロース（商品名セファロースなど）、架橋デキストラン（商品名セファデックスなど）、親水性ビニルポリマー（商品名トヨパールなど）等が例示される。また疎水性基としては、アルキル基、好ましくは炭素数４〜１８のアルキル基（例えば、ブチル基、オクチル基、オクタデシル基など）、またはフェニル基等が例示される。不溶性担体に疎水性基を結合する方法は公知の方法に準じて行うことができる。また市販品を入手することもできる。
【００１８】
疎水性担体処理の方法としては、具体的には、ＰＯＮ含有溶液を疎水性担体に接触させてＰＯＮを疎水性担体に吸着させた後に、特定の溶媒を用いてＰＯＮを溶出することにより回収する。吸着条件としては、ｐＨ６〜８程度、塩濃度は０．０１〜０．２Ｍ程度が挙げられる。また、０．１〜２ｍＭ程度のカルシウム塩を添加してもよい。具体的には、１ｍＭ塩化カルシウムを含む生理食塩水（０．１５Ｍ塩化ナトリウム）等が例示される。吸着後に洗浄を行う場合は、吸着と同様の条件により行うことができる。
【００１９】
溶出時には、３０〜７０ｗ／ｖ％、好ましくは４０〜６０ｗ／ｖ％程度の炭素数１〜４のアルキレングリコール類（例えば、エチレングリコールなど）を用いる。また、０．１〜２ｍＭ程度のカルシウム塩を添加してもよい。具体的には、５０ｗ／ｖ％エチレングリコール、１ｍＭ塩化カルシウムを含む水溶液などが例示される。
【００２０】
陰イオン交換体処理
陰イオン交換体は不溶性担体に陰イオン交換基を結合したものである。不溶性担体としてはアガロース（商品名セファロースなど）、架橋デキストラン（商品名セファデックスなど）、親水性ビニルポリマー（商品名トヨパールなど）等が例示される。また陰イオン交換基としては、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ型）、四級アンモニウム基（Ｑ型）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ型）等が例示される。好ましくは、四級アンモミウム基、四級アミノエチル基などの強塩基性のものを用いる。不溶性担体に陰イオン交換基を結合する方法は公知の方法に準じて行うことができる。また市販品を入手することもできる。
【００２１】
陰イオン交換体処理はポリオール（例えば、グリセロールなど）およびＣＨＡＰＳ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−［［（３α，５β，７α，１２α）−３，７，１２−トリヒドロキシ−２４−オキソコラン−２４−イル］−アミノ］−１−プロパナミニウム、または、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）の共存下に行う。ポリオールの添加量としては１０〜４０ｗ／ｖ％、好ましくは２０〜３０ｗ／ｖ％程度が例示される。ＣＨＡＰＳの添加量としては０．０１〜１ｗ／ｖ％程度が例示される。なお、本処理以降も精製を行う場合は全て、ポリオールおよびＣＨＡＰＳの共存下に行う。
【００２２】
また陰イオン交換体処理は、ＣＨＡＰＳの存在下に行うこともできる。この場合、本処理以降も精製を行うときは全て、ＣＨＡＰＳの存在下に行うこともできる。
【００２３】
陰イオン交換体処理の方法としては、具体的には、ＰＯＮ含有溶液を陰イオン交換体に接触させてＰＯＮを陰イオン交換体に吸着させた後に、高塩濃度の溶媒を用いてＰＯＮを溶出することにより回収する。吸着条件としては、ｐＨ６〜９程度、塩濃度は０．００１〜０．１Ｍ程度が挙げられる。また、０．１〜２ｍＭ程度のカルシウム塩を添加してもよい。具体的には、１ｍＭ塩化カルシウム、２５ｗ／ｖ％グリセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）等が例示される。吸着後に洗浄を行う場合は、吸着と同様の条件により行うことができる。さらに溶出条件としては、ｐＨ６〜９、塩濃度０．１〜２Ｍ程度が挙げられる。また、０．１〜２ｍＭ程度のカルシウム塩を添加してもよい。具体的には、０．１〜１Ｍの塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、２５ｗ／ｖ％グリセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）等が例示される。また、溶出に際しては、塩濃度をステップワイズに上げる方法、連続的に上げる方法（濃度勾配法）のいずれで行ってもよい。
【００２４】
濃縮（限外濾過）
陰イオン交換体処理後にＰＯＮ含有溶液を、分画分子量１０〜３０ｋＤａ程度の限外濾過膜を用いて濃縮することができる。
【００２５】
固定化コンカナバリンＡ（以下ＣｏｎＡと称することもある）処理
固定化ＣｏｎＡは不溶性担体にＣｏｎＡを結合したものである。不溶性担体としてはアガロース（商品名セファロースなど）、架橋デキストラン（商品名セファデックスなど）、親水性ビニルポリマー（商品名トヨパールなど）等が例示される。不溶性担体にＣｏｎＡを結合する方法は公知の方法に準じて行うことができる。また市販品を入手することもできる。
【００２６】
固定化ＣｏｎＡ処理の方法としては、具体的には、ＰＯＮ含有溶液を固定化ＣｏｎＡに接触させてＰＯＮを固定化ＣｏｎＡに吸着させた後に、高塩濃度または特定の溶媒を用いてＰＯＮを溶出することにより回収する。吸着条件としては、ｐＨ６〜９程度、塩濃度は０．１〜０．５Ｍ程度が挙げられる。また、１〜２０ｍＭ程度のカルシウム塩、１〜１０μＭ程度のＥＤＴＡ塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ土類金属塩等）を添加してもよい。具体的には、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、５μＭ ＥＤＴＡ３ナトリウム塩、２５ｗ／ｖ％グリセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）等が例示される。吸着後に洗浄を行う場合は、吸着と同様の条件により行うことができる。
【００２７】
また溶出条件としては、ｐＨ６〜９、塩濃度１〜５Ｍ程度が挙げられる。あるいは、ｐＨ、塩濃度は吸着条件のままで、０．１〜０．５Ｍ程度のα−メチルマンノシドを用いる。また、１〜２０ｍＭ程度のカルシウム塩、１〜１０μＭ程度のＥＤＴＡ塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ土類金属塩等）を添加してもよい。具体的には、１０ｍＭ塩化カルシウム、１〜４Ｍ塩化ナトリウム、５μＭ ＥＤＴＡ３ナトリウム塩、２５ｗ／ｖ％グリセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）あるいは０．１〜０．５Ｍ α−メチルマンノシド、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、５μＭ ＥＤＴＡ３ナトリウム塩、２５ｗ／ｖ％グリセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）等が例示される。また、溶出に際しては、塩濃度あるいはα−メチルマンノシド濃度をステップワイズに上げる方法、連続的に上げる方法（濃度勾配法）のいずれで行ってもよい。固定化ＣｏｎＡ処理は必要に応じて行えばよく、また場合により省略することもできる。
【００２８】
陰イオン交換体処理（２回目）
本処理は最初の陰イオン交換体処理に準じて繰り返すことができる。
【００２９】
さらにＰＯＮの精製度を上げるために公知の手法としてブルーアガロース処理を併用することもできる。その処理条件は公知の方法に準じて行うことができる。ただし、上述のとおり、ポリオールおよびＣＨＡＰＳの共存下に行う。あるいは本処理はＣＨＡＰＳの存在下に行うこともできる。
【００３０】
本発明の精製法として具体的には以下の方法が例示される。
疎水性担体処理→陰イオン交換体処理→固定化ＣｏｎＡ処理→陰イオン交換体処理（２回目）
疎水性担体処理→陰イオン交換体処理→陰イオン交換体処理（２回目）
本精製法により、１００〜２０００Ｕ／Ａ280、好ましくは５００〜１８００Ｕ／Ａ280程度に高度精製されたＰＯＮを調製することができる。なおＰＯＮ活性の１Ｕとは１分間当たり１ｎｍｏｌのパラオキソンから同モル量の４−アミノフェノールを生成できることを意味する。詳細は参考例１に記載のとおりである。
【００３１】
製剤化
精製されたＰＯＮを用いて製剤化を行う。精製されたＰＯＮとしては上記の精製法により調製されたものを用いることができる。また、公知の精製法により調製されたものを用いてよい。例えば、ブルーアガロース処理と陰イオン交換体処理を組合せた態様（特許文献２、非特許文献３、同４）などが例示される。
【００３２】
本製剤におけるＰＯＮの濃度としては１〜１００ｍｇ／ｍＬ（１８００〜１８００００Ｕ／ｍＬ）程度が例示される。ｐＨとしては６〜９程度、塩濃度としては１〜１００ｍＭ程度が例示される。添加剤としては、ポリオール、ＣＨＡＰＳが挙げられる。ポリオールとしてはグリセロールなどが例示される。その添加濃度としては、ポリオールが１〜５ｗ／ｖ％程度、ＣＨＡＰＳが０．００１〜０．１ｗ／ｖ％程度、が例示される。さらに、塩化カルシウムなどのカルシウム塩、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、トリスなどの緩衝液を用いてもよい。その添加濃度として、カルシウム塩が０．０１〜１ｍＭ程度、キレート化剤が０．１〜１μＭ程度、緩衝液が１〜１０ｍＭ程度、が各々例示される。
【００３３】
ＰＯＮ含有溶液に必要に応じて各種添加剤を添加し、濾過滅菌、小分け分注、凍結乾燥などの方法を用いてＰＯＮを製剤化することができる。
【００３４】
用法用量
本発明で得られたＰＯＮ含有製剤は公知の医薬用途に用いることができる。例えば、解毒剤、動脈硬化への適用などである。また新規な医薬用途としては虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞の予防及び／又は治療等に適用可能である。投与方法としては経口投与・非経口投与のいずれでもよい。非経口投与の場合は静脈内投与などの注射などの態様が挙げられる。その投与量は患者の症状、性別、年齢、体重などに応じて適宜増減すればよい。具体的には０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度が例示される。
【００３５】
特にＰＯＮを虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞の予防及び／又は治療に適用する場合は、具体的には、虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞における予後、神経症状あるいは運動機能の改善などに適用することができる。また、虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞の意識障害、該疾患に伴う神経症候、動作障害、特に日常生活動作障害、機能障害などの予防及び／又は治療に適用することができる。
【００３６】
ＰＯＮを虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞の予防及び／又は治療に用いる際の投与方法としては、具体的には、虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞の発症後４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、特に好ましくは３時間以内に投与を開始し、１日１回、単回投与あるいは１〜１４日間、好ましくは１〜７日間程度の連日投与が例示される。
【実施例】
【００３７】
本発明をより詳細に説明するために、以下に実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３８】
参考例１
Ａ．ＰＯＮ活性の測定
１）基質の調製
基質原液（パラオキソン、ジエチルｐ−ニトロ−フェニルホスフェートともいう、シグマ社）７μＬを５２μＬのＤＭＳＯで溶解後、０．１Ｍトリス塩酸、２ｍＭ塩化カルシウム（ｐＨ８、２５℃）で１００倍希釈した。但し、必要に応じて本測定系には上記の緩衝液にヘパリンを添加（０．５ｍｇ／ｍＬ）した緩衝液を用いた。
２）測定（室温で行う）
９６ウエルマイクロプレートに試料（ＰＯＮを含む）２０μＬおよび、１）で調製した基質溶液２００μＬを添加、混和した（パラオキソンの終濃度は５ｍＭとなる）。３０分間動力学的モードで波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、その結果をＳｏｆｔｍａｘ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．３５で計算した。なお試料の希釈には基質調製用と同じ緩衝液を用いた。
３）活性算出法
２）で得られたＶｍａｘ ｉｎ ｍＯＤ／ｍｉｎを用いて以下の式より算出した。但し、当該値は、Ｖｍａｘ相関係数が０．９５以上の値を採用した。
【００３９】
【数１】
2011087595.tif 000002
【００４０】
Ｂ．ＰＯＮ抗原量はサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００４１】
実施例１
ヒトプール血漿から調製された血清を用いてＰＯＮを精製した。ヒト血清を、１ｍＭ塩化カルシウムを含む生理食塩水で平衡化したフェニル−アガロースカラム（フェニル−セファロース、アマシャムファルマシア）にアプライした。同溶媒で洗浄した後に、５０ｗ／ｖ％エチレングリコール、１ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液で吸着したＰＯＮを溶出した。当該溶液を限外濾過膜（３０ｋＤａ）を用いて１ｍＭ塩化カルシウム、２５ｗ／ｖ％グルセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で脱塩濃縮し、同溶媒で平衡化した四級アンモニウム型−アガロースカラム（Ｑ−セファロース、ファルマシア）にアプライした。同溶媒で洗浄した後に、塩化ナトリウム濃度を、０．１Ｍ→０．１５Ｍ→０．２Ｍ→０．２５Ｍ→１Ｍの順にステップワイズに上げて溶出させた。０．２Ｍ〜０．２５Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分を回収して、限外濾過膜（１０ｋＤａ）で濃縮した。
【００４２】
実施例２
実施例１で調製されたＰＯＮ含有溶液を、１０ｍＭ塩化カルシウム、０．２Ｍ塩化ナトリウム、５μＭ ＥＤＴＡ３ナトリウム、２５ｗ／ｖ％グリセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＣｏｎＡアガロースカラム（ＣｏｎＡセファロース、アマシャムファルマシア）にアプライした。同溶媒で洗浄した後に、３Ｍ塩化ナトリウムを含む同溶媒でＰＯＮを溶出した。限外濾過膜（１０ｋＤａ）を用いて濃縮した。当該溶液を実施例１の方法に準じて四級アンモニウム型アガロースカラム（前述）を用いて処理し、０．２５Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分を回収した。当該四級アンモニウム型アガロース処理（２回目）における活性回収率は９５％であった。また精製ＰＯＮをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）で分析したところ、ほぼ１バンド（分子量４５ｋＤａ）として検出された。
【００４３】
実施例３
四級アンモニウム型アガロース（Ｑ−セファロース）処理における溶出時の塩化ナトリウム濃度を、０．１５Ｍ→０．２Ｍ→０．２５Ｍ→１Ｍの順でステップワイズに上げて行う以外は全て実施例１に準じて行った。０．２５Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分を回収して、限外濾過膜（１０ｋＤａ）で濃縮した。
【００４４】
実施例４
実施例３で調製されたＰＯＮ含有溶液を実施例１の方法に準じて再度、四級アンモニウム型アガロースカラムを用いて処理し、０．２Ｍの塩化ナトリウムの溶出画分を回収した。精製ＰＯＮをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）で分析したところ、ほぼ１バンド（分子量４５ｋＤａ）として検出された。
【００４５】
各実施例で調製されたＰＯＮの精製挙動を以下の表に示す。実施例１が表１と２、実施例２が表３、実施例３が表４、実施例４が表５に対応する。
【００４６】
【表１】
2011087595.tif 000003
【００４７】
【表２】
2011087595.tif 000004
【００４８】
【表３】
2011087595.tif 000005
【００４９】
【表４】
2011087595.tif 000006
【００５０】
【表５】
2011087595.tif 000007
【００５１】
実施例５
１０ｍｇ／ｍＬの精製ＰＯＮ（実施例４により調製）、２．５ｗ／ｖ％グリセロール、０．０５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳ、０．１ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５μＭ ＥＤＴＡ・３Ｎａを含む２．５ｍＭトリスの緩衝液（ｐＨ７．５）の組成からなるＰＯＮ製剤を調製した。
【００５２】
実験例１
実施例１の疎水性担体（フェニル−アガロース、以下の実験例および参考例２も全て同様）処理により得られた溶出液について、各界面活性剤［ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（商品名トリトンＸ−１００）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名トウイーン８０）、オクチルチオグリコシド、ＣＨＡＰＳ］と活性残存率の関係を検討した。溶媒は１ｍＭ塩化カルシウム、２５ｗ／ｖ％グリセロールを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）とした。室温で３０分間放置後にＰＯＮ活性を測定した。結果を表６に示す。
【００５３】
【表６】
2011087595.tif 000008
【００５４】
トリトンＸ−１００、トウイーン８０、オクチルチオグルコシドに比較して、ＣＨＡＰＳの方が高い活性残存率を示し、安定化効果に優れていることが判明した。
【００５５】
参考例２
疎水性担体処理により得られた溶出液を、１ｍＭ塩化カルシウム、２５ｗ／ｖ％エチレングリコール、各種界面活性剤［ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（商品名トリトンＸ−１００）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（商品名トウイーン８０）、オクチルグリコシド］を含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換体（ＤＥＡＥ型アガロース）カラムにアプライし、０．１５Ｍ塩化ナトリウムで溶出した場合のＰＯＮの溶出挙動を確認した。トリトンＸ−１００とトウイーン８０の添加濃度は０．１ｗ／ｖ％、オクチルグルコシドの添加濃度は０．５ｗ／ｖ％とした。結果を表７に示す。
【００５６】
【表７】
2011087595.tif 000009
【００５７】
トウイーン８０について、精製度（比活性）はトリトンＸ−１００と同等になったものの活性回収率は半減した。オクチルグルコシドでは精製度・回収率ともトリトンＸ−１００、トウイーン８０よりやや劣った。オクチルチオグルコシドを用いた場合、精製度・回収率ともオクチルグルコシドと同等であった（データを示さず）。
【００５８】
実験例２
疎水性担体処理により得られた溶出液を、１ｍＭ塩化カルシウム、２５ｗ／ｖ％グリセロール、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換体（四級アンモニウム型アガロース）カラムにアプライし、０．２〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムで溶出した場合のＰＯＮの溶出挙動を確認した。結果を表８に示す。
【００５９】
【表８】
2011087595.tif 000010
【００６０】
ＣＨＡＰＳを用いた場合の精製度および活性回収率は参考例２のトリトンＸ−１００とほぼ同等の結果であった。またこの組成物は４℃で１ヶ月間保存しても活性は維持されていた。
【００６１】
実験例３
疎水性担体処理により得られた溶出液を、１ｍＭ塩化カルシウム、５μＭ ＥＤＴＡ・３Ｎａ、０．５ｗ／ｖ％ＣＨＡＰＳ、２５ｗ／ｖ％グリセロールを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰イオン交換体（四級アンモニウム−アガロース）カラムにアプライし、０．２〜０．２５Ｍ塩化ナトリウムで溶出した場合のＰＯＮの溶出挙動を確認した。対照としてグリセロールを添加しないものを用いた。結果を表９に示す。
【００６２】
【表９】
2011087595.tif 000011
【００６３】
グリセロール無添加の場合は、活性回収率はより低い値を示した。またアプライサンプル、得られた画分の安定性についても、１週間保存後で約５０％の活性低下が観察された。
【００６４】
実験例４
精製したＰＯＮのラット脳梗塞（虚血再灌流）モデルに対する作用を、梗塞巣の体積を指標に評価した。
【００６５】
実験方法
１．被験物質および調製法
ＰＯＮは実施例５に準じて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶媒に溶解したものを用いた。溶媒は被験物質に用いたもののみを用いた。
２．動物は、ＣＤ（ＳＤ）系雄性ラット（体重３００ｇ前後、８週齢）を用いた。
３．評価項目は、梗塞巣の体積とした。
４．群構成および投与量
対照群は虚血直後に溶媒をラットに尾静脈内投与した（例数は６）。ＰＯＮ投与群は虚血直後に１０ｍｇ／ｋｇ体重をラットに尾静脈内投与した（例数は５）。
５．方法
虚血再灌流モデルの作製
脳虚血再灌流は、非特許文献７で開示された方法に従い作製した。すなわち、動物をハロタン麻酔下で背位に固定し、頚部を除毛後、頚部皮膚を正中切開した。総頚動脈を周囲組織より剥離し、右外頚動脈及び総頚動脈を絹糸にて結紮して、内頚動脈に糸をかけた後、内頚動脈と外頚動脈の分岐部より、先端約２ｃｍを直径０．４５ｍｍにシリコンコーティングした栓子（４−０ナイロン糸、協和時計工業）を１８ｍｍ挿入し、絹糸にて内頚動脈とともに結紮、固定することにより右中大脳動脈（ＭＣＡ）灌流領域を虚血にした。切開部を縫合し麻酔より覚醒させた。虚血負荷２時間後に再び切開部を開けて、栓子を約１ｃｍ引き抜くことにより、右ＭＣＡ灌流領域の再灌流を行い、再び切開部を縫合した。
【００６６】
梗塞巣体積の測定
再灌流２４時間後に動物を断頭し、頭蓋骨の縫合に沿って開頭し、脳組織を摘出して、ブレインスライサー（ＲＢＭ−４０００Ｃ、Ｂｒａｉｎ Ｍａｔｒｉｘ）を用いて、脳組織をｂｒｅｇｍａより前方（＋）３ｍｍ、１ｍｍ及び後方（−）１ｍｍ、３ｍｍ、５ｍｍで輪切りにして冠状切片を作製した。引き続き２％ ２，３，５−ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＴＣ；ナカライ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液中で脳切片を約１０分間インキュベートした。脳切片を取り出し、水分を軽く除いた後、写真撮影し、ＴＴＣ染色陽性領域と陰性領域を区別した。これより画像解析装置（Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩ、Ｃ−ＩＭＡＧＩＮＧ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて梗塞巣面積を測定し、梗塞巣体積を算出した。
６．結果を表１０に示す。
【００６７】
【表１０】
2011087595.tif 000012
【００６８】
＊は危険率５％未満で有意差が認められることを示す。
【００６９】
ＰＯＮの投与により、動物実験において虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞を有意に抑制することが今回、初めて確認された。
【００７０】
実験例５
１）神経症状
中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血再灌流モデルの作製
動物をセボフルレンにより呼気麻酔した後、保温マット（ＳＭＳ−２０００Ｊ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．、３７℃設定）上に背位固定した。頸部中央を切開後、右外頚動脈および右総頚動脈を結紮した。内頚動脈と外頚動脈の分岐部より、先端約２ｃｍを直径０．１９〜０．２０ｍｍにシリコンコーティングした栓子（０．２号渓流用釣り糸、ＯＷＮＥＲ ＣＯ．，ＬＴＤ）を右内頚動脈に沿って約０．９ｃｍ挿入することによりＭＣＡを虚血状態とした。頸部切開部を縫合し麻酔より覚醒させ、虚血１時間後に上記同様に麻酔し、栓子を抜去してＭＣＡを再灌流させた。モデル作製の可否は、再灌流直前の神経症状により判断した。即ち、動物の尻尾をもって吊るすとき、左前肢を屈曲し、胴を左に屈曲するか否かで判定した。また、右外頚動脈および右総頚動脈を結紮するのみで、栓子を挿入しない個体を作製し、ｓｈａｍ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ群とした。
【００７１】
神経症状スコアー（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ；ＮＳＳ）
非特許文献８に記載された方法に従い、スコアー付けを行った。即ち以下に示す症状が観察される時、項目毎に１ポイントとして加算し、合計ポイントをスコアーとした。
【００７２】
観察は、再灌流１、３、５、７、９、１４、１９および２３日後に実施した。
【００７３】
１ポイントとなる症状：
尻尾をもって吊るすとき、左前肢を屈曲する。
尻尾をもって吊るすとき、左後肢を屈曲する。
尻尾をもって吊るすとき、胴を左に屈曲する。
床に置いた時、真直ぐ歩けない。
床に置いた時、左に回る。
床に置いた時、左に傾く。
動かない。
震える。
発作を起こす。
【００７４】
薬剤の投与
ＰＯＮ（実施例５により調製）は、再灌流直後及び再灌流１、２、３、４、５、６日後に１日１回投与した。１回の投与量は１０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ体重とした。対照として、ＰＯＮを含有しない溶媒のみを同投与液量投与した（ビークル群）。
【００７５】
例数はＳｈａｍ群５、ビークル群３、ＰＯＮ投与群４とした。結果を図１に示す。
２）運動機能
市販のＲｏｔａ−ｒｏｄ ｔｒｅｄｍｉｌｌ ｆｏｒ ｍｉｃｅ（ＭＫ−６００、室町機械株式会社）を用いて測定した。すなわち、再灌流１、３、５、７、９、１４、１９、２３日後に、一定スピード（設定１）で回転する棒上を回転方向とは逆向きに歩かせ、歩き始めた時間から棒から落下するまでの時間を測定した。歩行時間は、上限２００秒とした。マウスは予め試験前５日間歩行練習させ、試験前日に２００秒間を歩けた個体のみを、中大脳動脈（ＭＣＡ）虚血再灌流モデルの作製に供した。その他は１）と同様である。結果を図２に示す。
【００７６】
これらの結果より、ＭＣＡ虚血再灌流モデルにおいてＰＯＮを再灌流直後に投与することにより神経症状および運動機能が改善されることが判明した。すなわち、ＰＯＮのＭＣＡ虚血再灌流モデルにおける予後改善効果が確認された。
【００７７】
実験例６
再灌流３時間後にＰＯＮを初回投与する以外は全て実験例５に準じて実験を行い、神経症状を観察した。例数はＳｈａｍ群５、ビークル群３、ＰＯＮ投与群４とした。結果を図３に示す。
【００７８】
また同様に運動機能も観察した。例数はＳｈａｍ群４、ビークル群５、ＰＯＮ投与群４とした。結果を図４に示す。
【００７９】
これらの結果より、ＭＣＡ虚血再灌流モデルにおいてＰＯＮを再灌流３時間後に投与することによっても神経症状および運動機能が改善されることが判明した。すなわち、ＰＯＮのＭＣＡ虚血再灌流モデルにおける予後改善効果は、ＰＯＮの初期投与が再灌流３時間後の場合においても確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によると、精製時・保存時の安定性が改善されたＰＯＮ含有製剤の供給が可能である。また、虚血再灌流に伴う障害および／または脳梗塞に有用な新規な医薬品の提供が可能である。
【００８１】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく、様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。
【００８２】
なお、本出願は、日本で出願された特願２００４−２７７２７号（出願日：２００４年２月４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2011087595.tif 000013
【図２】
2011087595.tif 000014
【図３】
2011087595.tif 000015
【図４】
2011087595.tif 000016