(57)【要約】  【課題】  非目的遺伝子群へのクロスハイブリダイゼーションが少なく、多くの目的遺伝子群をシークエンシングすることができるプライマーセットを探索する方法を提供する。  【解決手段】  プライマーセットに含めるプライマーの候補と目的遺伝子および複数の非目的遺伝子とのハイブリダイゼーションの可否を求めてデータベースを生成するステップと、ランダムに初期のプライマーセットを生成するステップと、プライマーセットの一つのプライマーを別の複数のプライマー候補と交換したときに生成される複数のプライマーセットのそれぞれの評価値を、当該プライマーセットがハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔおよび非目的遺伝子の割合Ｃｎに基づいて計算し、計算した評価値に基づいて確率的にプライマーセットを選択し、そのプライマーセットと評価値を記憶部に記憶する処理を繰り返し行う探索ステップとを備える。【選択図】  図７
2011062085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーセットを探索するための方法であって、
複数の目的遺伝子と複数の非目的遺伝子の配列を入力するステップと、
プライマーセットに含めるプライマーの探索条件を入力するステップと、
前記探索条件に合致するプライマー候補が前記複数の目的遺伝子および前記複数の非目的遺伝子のそれぞれにハイブリダイズするか否かを求め、その結果を記憶したデータベースを生成するステップと、
前記プライマーセットに含める個数のプライマーを前記プライマー候補からランダムに選択して初期のプライマーセットを生成するステップと、
（１）プライマーセットに含まれるプライマーから一つのプライマーをランダムに選択し、（２）選択したプライマーを複数のプライマー候補のそれぞれと交換したときに生成される複数のプライマーセットについて、ハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔおよび非目的遺伝子の割合Ｃｎを前記データベースに記憶されたデータに基づいて求め、（３）前記目的遺伝子の割合Ｃｔと前記非目的遺伝子の割合Ｃｎとに基づいて、複数のプライマーセットのそれぞれの評価値を計算し、（４）前記評価値に応じた確率値を与える確率分布と前記複数のプライマーセットのそれぞれの評価値とに基づいて、前記複数のプライマーセットから一つのプライマーセットを選択し、（５）選択したプライマーセットとその評価値を記憶部に記憶する、上記（１）〜（５）の処理を繰り返し行う探索ステップと、
前記記憶部に記憶された複数のプライマーセットの中でその評価値が最も高かったプライマーセットを探索結果として出力するステップと、
を備えるプライマーセット探索方法。
【請求項２】
前記データベースを生成するステップは、前記探索条件に合致するプライマーのうち、いずれの前記目的遺伝子にもハイブリダイズしないプライマーをプライマー候補から除外し、前記データベースに含めない請求項１に記載のプライマーセット探索方法。
【請求項３】
前記プライマーセットの評価値は、目的遺伝子の割合Ｃｔが大きいほど評価値が高く、非目的遺伝子の割合Ｃｎが大きいほど評価値が低い請求項１または２に記載のプライマーセット探索方法。
【請求項４】
前記プライマーセットの評価値Ｓを、
Ｓ＝Ｃｔ-α×Ｃｎ  （ただし、α＞０）
によって計算する請求項３に記載のプライマーセット探索方法。
【請求項５】
前記プライマーセットの評価値Ｓを、
Ｓ＝（Ｃｔ＋α）／（Ｃｎ＋β）  （ただし、β≠０）
によって計算する請求項３に記載のプライマーセット探索方法。
【請求項６】
前記確率分布を、前記記憶部に記憶された評価値の変化に基づいて変更する請求項１〜５のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項７】
前記確率分布を、上記（１）〜（５）の処理の繰り返し回数に基づいて変更する請求項１〜５のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項８】
各プライマー候補のＴｍ値を計算し、Ｔｍ値を前記データベースに記憶するステップと、
温度条件を入力するステップと、
入力された温度条件に合致しないＴｍ値を有する前記プライマー候補を前記データベースから削除するステップと、
を備える請求項１〜７のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項９】
前記探索ステップは、一つのプライマーを交換するプライマー候補として、前記プライマーセットに含まれるプライマーとダイマーを形成しないプライマー候補を選択する請求項１〜８のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項１０】
前記データベースを生成するステップは、プライマー候補の相補的塩基配列と所定の閾値以上の割合で一致する配列部分を有する前記目的遺伝子または前記非目的遺伝子を、前記プライマー候補がハイブリダイズする遺伝子として求める請求項１〜９のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項１１】
前記データベースを作成するステップは、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）にて生成された専用回路を用いて、プライマー候補が前記目的遺伝子または前記非目的遺伝子にハイブリダイズするか否かを計算する請求項１〜１０のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項１２】
前記探索ステップは、上記（１）〜（５）の処理の繰り返し回数が所定の閾値に達したときに終了する請求項１〜１１のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項１３】
前記探索ステップは、前記記憶部に記憶されるプライマーセットの評価値が所定の閾値に達したときに終了する請求項１〜１１のいずれかに記載のプライマーセット探索方法。
【請求項１４】
目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーセットを探索するためのプログラムであって、コンピュータに、
複数の目的遺伝子と複数の非目的遺伝子の配列を入力するステップと、
プライマーセットに含めるプライマーの探索条件を入力するステップと、
前記探索条件に合致するプライマー候補が前記複数の目的遺伝子および前記複数の非目的遺伝子のそれぞれにハイブリダイズするか否かを求め、その結果を記憶したデータベースを生成するステップと、
前記プライマーセットに含める個数のプライマーを前記プライマー候補からランダムに選択して初期のプライマーセットを生成するステップと、
（１）プライマーセットに含まれるプライマーから一つのプライマーをランダムに選択し、（２）選択したプライマーを複数のプライマー候補のそれぞれと交換したときに生成される複数のプライマーセットについて、ハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔおよび非目的遺伝子の割合Ｃｎを前記データベースに記憶されたデータに基づいて求め、（３）前記目的遺伝子の割合Ｃｔと前記非目的遺伝子の割合Ｃｎとに基づいて、複数のプライマーセットのそれぞれの評価値を計算し、（４）前記評価値に応じた確率値を与える確率分布と前記複数のプライマーセットのそれぞれの評価値とに基づいて、前記複数のプライマーセットから一つのプライマーセットを選択し、（５）選択したプライマーセットとその評価値を記憶部に記憶する、上記（１）〜（５）の処理を繰り返し行うステップと、
前記記憶部に記憶された複数のプライマーセットの中でその評価値が最も高かったプライマーセットを探索結果として出力するステップと、
を実行させるプログラム。
【請求項１５】
目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーセットを探索するための装置であって、
複数の目的遺伝子と複数の非目的遺伝子の配列を入力する手段と、
プライマーセットに含めるプライマーの探索条件を入力する手段と、
前記探索条件に合致するプライマー候補が前記複数の目的遺伝子および前記複数の非目的遺伝子のそれぞれにハイブリダイズするか否かを求め、その結果を記憶したデータベースを生成する手段と、
前記プライマーセットに含める個数のプライマーを前記プライマー候補からランダムに選択して初期のプライマーセットを生成する手段と、
（１）プライマーセットに含まれるプライマーから一つのプライマーをランダムに選択し、（２）選択したプライマーを複数のプライマー候補のそれぞれと交換したときに生成される複数のプライマーセットについて、ハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔおよび非目的遺伝子の割合Ｃｎを前記データベースに記憶されたデータに基づいて求め、（３）前記目的遺伝子の割合Ｃｔと前記非目的遺伝子の割合Ｃｎとに基づいて、複数のプライマーセットのそれぞれの評価値を計算し、（４）前記評価値に応じた確率値を与える確率分布と前記複数のプライマーセットのそれぞれの評価値とに基づいて、前記複数のプライマーセットから一つのプライマーセットを選択し、（５）選択したプライマーセットとその評価値を記憶部に記憶する、上記（１）〜（５）の処理を繰り返し行う手段と、
前記記憶部に記憶された複数のプライマーセットの中でその評価値が最も高かったプライマーセットを探索結果として出力する手段と、
を備えるプライマーセット探索装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマーの探索を行う装置および方法に関し、特に大規模シークエンシングによる遺伝子発現量測定に用いる複数のプライマーの組み合わせ（以下、「プライマーセット」という）の探索に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年ＤＮＡシークエンシングの分野では急速な大規模化が進み、ターゲット遺伝子を特定するために用いるプライマー配列に関しても、計算機を用いた大規模な設計が必要になってきている。
【０００３】
プライマーを用いてターゲットとなる遺伝子群を特定し、配列を決定することにより、遺伝子発現量を絶対定量することが可能である。多数の遺伝子の発現量を一度に測定する実験は、生物学上重要であるが、多数の遺伝子群の発現量を効率よく測定するためには、1つのプライマーで複数の遺伝子を特定できるようなプライマーを、適切な組み合わせで用いる必要がある。
【０００４】
少数のプライマーでなるべく多くの遺伝子を特定する試みは、これまでにもＰＣＲの分野で行われてきた（例えば非特許文献１）。しかし、これらの研究において想定されているターゲット遺伝子の数は百遺伝子程度であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pesole G.他  著「GeneUp: a program to select short PCR primer pairs that occur in multiple members of sequence lists.」Biotechniques,1998 vol. 25, no1, pp. 112-123
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多数のターゲット遺伝子および非ターゲット遺伝子を対象とした場合、プライマーの候補配列は膨大となる。全ての組み合わせを調べるには非現実的な時間が必要となる。一方で、非特許文献１で用いられているような、発見的なアルゴリズムを用いた探索では、局所最適解に陥る可能性がある。現実的な時間内に、最適なもしくは準最適な組み合わせを計算するアルゴリズムが必要である。
【０００７】
また、シークエンシングにおいて、クロスハイブリダイゼーションが起きると、目的外の遺伝子が増幅されてしまう。従って、限られた種類のプライマーで、多くの目的遺伝子群をシークエンシングするために、クロスハイブリダイゼーションを最小限に抑えることが重要になる。
【０００８】
非特許文献１に記載されたプログラムは、排除したい少数の遺伝子配列リストを指定するオプション機能を有している。このオプション機能を利用して、目的としない遺伝子にハイブリダイズするプライマーを探索の対象から除外することにより、クロスハイブリダイゼーションを防止することができる。しかし、この方法では、排除したい遺伝子が多数となった場合には、探索対象のプライマーが大幅に限定されてしまう。
【０００９】
本発明は、上記背景に鑑み、非目的遺伝子群へのクロスハイブリダイゼーションが少なく、多くの目的遺伝子群をシークエンシングすることができるプライマーセットを、大規模に探索することのできるプライマー探索装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のプライマーセット探索方法は、目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーセットを探索するための方法であって、複数の目的遺伝子と複数の非目的遺伝子の配列を入力するステップと、プライマーセットに含めるプライマーの探索条件を入力するステップと、前記探索条件に合致するプライマー候補が前記複数の目的遺伝子および前記複数の非目的遺伝子のそれぞれにハイブリダイズするか否かを求め、その結果を記憶したデータベースを生成するステップと、前記プライマーセットに含める個数のプライマーを前記プライマー候補からランダムに選択して初期のプライマーセットを生成するステップと、（１）プライマーセットに含まれるプライマーから一つのプライマーをランダムに選択し、（２）選択したプライマーを複数のプライマー候補のそれぞれと交換したときに生成される複数のプライマーセットについて、ハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔおよび非目的遺伝子の割合Ｃｎを前記データベースに記憶されたデータに基づいて求め、（３）前記目的遺伝子の割合Ｃｔと前記非目的遺伝子の割合Ｃｎとに基づいて、複数のプライマーセットのそれぞれの評価値を計算し、（４）前記評価値に応じた確率値を与える確率分布と前記複数のプライマーセットのそれぞれの評価値とに基づいて、前記複数のプライマーセットから一つのプライマーセットを選択し、（５）選択したプライマーセットとその評価値を記憶部に記憶する、上記（１）〜（５）の処理を繰り返し行う探索ステップと、前記記憶部に記憶された複数のプライマーセットの中でその評価値が最も高かったプライマーセットを探索結果として出力するステップとを備える。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔと非目的遺伝子の割合Ｃｎとに基づいて計算した評価値を用いてプライマーセットを探索するので、非目的遺伝子へのクロスハイブリダイゼーションが少なく、かつ、多くの目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーの組み合わせを求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施の形態のプライマーセット探索装置の構成を示す図である。
【図２】配列特異性データベースに記憶されたデータの例を示す図である。
【図３】配列特異性を計算する専用回路について説明する。
【図４】配列特異性の計算に要する時間を示す図である。
【図５】プライマーセット探索装置のハードウェア構成を示す図である。
【図６】実施の形態のプライマーセット探索装置の動作を示す図である。
【図７】プライマーの組み合わせ探索の動作を示す図である。
【図８】評価値について説明するための図である。
【図９】プライマーセットを選択するための確率分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態のプライマーセット探索装置およびプライマーセット探索方法について図面を参照しながら説明する。
【００１４】
（第１の実施の形態）
図１は、第１の実施の形態のプライマーセット探索装置１０の構成を示す図である。プライマーセット探索装置１０は、ｃＤＮＡライブラリ３０に接続されている。ｃＤＮＡライブラリ３０には、ｃＤＮＡの配列と、そのｃＤＮＡによって発現されるタンパク質の特徴（ヒト転写遺伝子、ハウスキーピング遺伝子等）が関連付けて記憶されている。ｃＤＮＡライブラリ３０には、例えば、数万個のｃＤＮＡのデータが記憶されている。
【００１５】
プライマーセット探索装置１０は、ｃＤＮＡライブラリ３０から目的遺伝子を入力する目的遺伝子入力部１１と、非目的遺伝子を入力する非目的遺伝子入力部１２とを有している。目的遺伝子入力部１１は、オペレータが目的遺伝子として取得したいｃＤＮＡの特徴のデータを入力すると、その特徴に関連付けられたｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリ３０から読み出す。同様に、非目的遺伝子入力部１２は、オペレータが非目的遺伝子としたいｃＤＮＡの特徴のデータを入力すると、その特徴に関連付けられたｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラリ３０から読み出す。
【００１６】
プライマーセット探索装置１０は、探索条件入力部１３を有している。探索条件入力部１３は、プライマーセットに含めるプライマーの個数と、プライマーの塩基長のデータの入力を受け付ける。探索条件の例としては、例えば、塩基長：１０ｎｔ、プライマー数：２０個である。この探索条件により、目的遺伝子をなるべくカバーして、非目的遺伝子をなるべくカバーしないような、例えば１０ｎｔのプライマー２０個の組み合わせ（プライマーセット）を探索する。
【００１７】
プライマーセット探索装置１０は、配列特異性計算部１４を備えている。配列特異性計算部１４は、探索条件として入力された塩基長のすべてのプライマー候補について、目的遺伝子および非目的遺伝子にハイブリダイズするか否かを求める機能を有している。例えば、１０ｎｔのプライマーであれば、４１０個のプライマー候補が存在する。このすべてのプライマー候補と、目的遺伝子および非目的遺伝子とのハイブリダイゼーションの可否を総当たりで計算し、その結果を配列特異性データベース（以下、「配列特異性ＤＢ」という）１５に記憶する。
【００１８】
プライマー候補が遺伝子（目的遺伝子、非目的遺伝子）にハイブリダイズするか否かは、遺伝子にプライマー候補の配列と相補的な配列が含まれているか否かによって判定する。遺伝子にプライマー候補の配列と相補的な配列を含む場合には、プライマー候補はその遺伝子にハイブリダイズすると判定する。プライマー候補の配列の全塩基に対して相補的でない場合にも、相補的な塩基を所定の割合（例えば、８割）以上含む配列が存在する場合には、その遺伝子にハイブリダイズすると判定してもよい。どの程度のマッチング率によってハイブリダイズすると判定するかの閾値は、当業者が適切に設定することが可能である。
【００１９】
図２は、配列特異性ＤＢ１５に記憶されたデータの例を示している。ここでは簡単のため、目的遺伝子Ｔ１〜Ｔ６、非目的遺伝子Ｎ１〜Ｎ６に対して、プライマー候補Ｐ１〜Ｐ６がハイブリダイズするか否かのデータを示している。図中に「○」が記載してある組み合わせは、ハイブリダイズすることを示している。例えば、プライマー候補Ｐ１は、目的遺伝子Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４と非目的遺伝子Ｎ１に対してハイブリダイズし、それ以外の遺伝子に対してはハイブリダイズしない。なお、配列特異性ＤＢ１５には、目的遺伝子Ｔ１〜Ｔ６のいずれにもハイブリダイズしないプライマー候補は記憶しなくてもよい。すなわち、目的遺伝子Ｔ１〜Ｔ６のいずれにもハイブリダイズしないプライマーはプライマー候補から除外する。
【００２０】
配列特異性計算部１４は、プライマー候補と遺伝子との膨大な数の組み合わせについて配列特異性計算を行う必要があるので、計算を高速に行うため、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）等により専用回路を構成してもよい。専用回路については、後述する。
【００２１】
プライマーセット探索装置１０は、プライマー候補のＴｍ値を計算する熱力学特性計算部１６を備えている。Ｔｍ値は、プライマーのうち半数がターゲットの遺伝子にハイブリダイズする温度である。熱力学特性計算部１６は、まず、プライマー配列とターゲット配列から、最近接塩基対法（Nearest Neighbor法）を用いて、ハイブリダイゼーション反応におけるギブス自由エネルギー変化ΔＧを計算する。この際、熱力学特性計算部１６は、Ｍｇ２＋やＮａ＋などのイオン濃度を考慮してもよい。
【００２２】
次に、下記の式（１）を用いて、温度Ｔにおけるハイブリダイゼーションの割合ｆを求める。
【数１】
2011062085.tif 000003
【００２３】
ここで、プライマー濃度Ｃｐ、気体定数Ｒには、実際にプライマーを用いてシークエンシングするときの条件を設定する。例えば、プライマー濃度Ｃｐを０．５（μmol/l）、気体定数Ｒを１．９８７２（cal/mol K）とすることができる。熱力学特性計算部１６は、ｆ＝０．５となるＴを求め、Ｔｍ値とする。
【００２４】
プライマーセット探索装置１０は、プライマーセットを用いる温度条件として温度Ｔｃを入力する温度条件入力部１７を有している。温度条件入力部１７は、温度条件Ｔｃの上限値と下限値の入力を受け付ける。また、プライマーセット探索装置１０は、温度条件Ｔｃに合致しないＴｍ値を有するプライマー候補を除外して配列特異性ＤＢ１５を更新するデータベース更新部（以下、「ＤＢ更新部」という）１８を備えている。
【００２５】
プライマーセット探索装置１０は、配列特異性ＤＢ１５に記憶されたデータを用いて、目的遺伝子になるべく多くハイブリダイズすると共に、非目的遺伝子に対するクロスハイブリダイゼーションがなるべく少ないプライマーセットを探索するプライマーセット探索部１９を有している。プライマーセットの探索アルゴリズムについては後述する。
【００２６】
プライマーセット探索装置１０は、プライマーセット探索部１９にて探索されたプライマーセットを出力する出力部２０を有している。出力部２０は、探索されたプライマーセットを表示してもよいし、探索結果を他の装置に対して送信することにより、他の装置から出力させてもよい。
【００２７】
図３を参照して、配列特異性計算部１４を構成する専用回路について説明する。図３では、ｂ塩基長のプライマー候補と、目的遺伝子および非目的遺伝子とを比較する例を示している。図３では、プライマー候補の相補配列を「クエリー配列」、目的遺伝子及び非目的遺伝子を「データベース配列」と記載している。
【００２８】
専用回路は、塩基長ｂ（ｎｔ）の配列どうしがマッチするかどうかを比較する配列比較ユニット４０を有している。比較対象の配列に含まれる塩基を並列的に比較する。図３では、比較対象として塩基長ｂ（ｎｔ）の２つの配列が入力され、配列に含まれるｂ個の塩基が同時に比較される。
【００２９】
配列比較ユニット４０には、閾値が入力される。配列比較ユニット４０は、配列のマッチング率が閾値より高い場合に、ヒットすると判定する。例えば、閾値として「１０」が入力された場合には、配列中の塩基のうちの１０塩基以上が一致すれば、ヒットと判定する。なお、配列比較ユニット４０に入力される閾値は、探索条件として入力された塩基長とマッチング率から計算される。配列比較ユニット４０は、比較結果に基づいて「ｈｉｔ」情報を出力する。「ｈｉｔ」情報の値は、例えば、マッチした塩基数が閾値以上の場合に「１」、閾値未満の場合に「０」とする。
【００３０】
専用回路は、上記した配列比較ユニット４０が３２個集まって、３２並列配列比較回路４１を構成している。３２並列配列比較回路４１は、ｂ塩基長の配列を（ｂ＋３１）塩基長の配列を比較して３２ビットの情報（「ｈｉｔ」）を出力する。専用回路は、さらに、３２並列比較回路４１を２並列化している。以上の構成により、専用回路は、スループットの高い配列特異性計算を行うことができる。
【００３１】
また、配列特異性計算のスループットをさらに高めるために、ターゲット遺伝子の配列を、1クロックで２塩基分シフトするシフト型のレジスタに収納し、計算対象であるレジスタの下位ビットのみを比較回路につないでもよい。通常は、比較回路への入力として、レジスタに収めたプライマー候補配列を用いるが、多数のプライマー候補について計算を行うには、レジスタの内容を入れ替えなければならない。上記した構造によって、比較回路への入力を、少ない論理リソースで高速に入れ替えることができ、下流に接続された３２並列配列比較回路４１のスループットを最大限に引き出すことができる。
【００３２】
図４は、配列特異性（アラインメント）の計算時間を示す図である。実験条件は、ヒトＥＲＢＢ遺伝子３’端のプライマー候補配列（２５ｎｔ）４８８個と、ヒトｍＲＮＡデータベースとのギャップなしアラインメントを行い、ヒットの閾値を８０％として計算するのに要する時間を測定した（ＣＰＵ：ＩｎｔｅｌＸｅｏｎ３．８ＧＨｚ,ＯＳ：Ｌｉｎｕｘ）。Ｃ言語で実装したＮａｉｖｅでは１００００秒以上かかり、高速アライメントソフトウェアＬＡＳＴを用いても１０００秒近くかかった。ＦＰＧＡに、上記専用回路を構成したシステムでは、１０秒強でアライメントが可能であった。以上、配列特異性計算部１４を構成する専用回路について説明した。
【００３３】
図５は、上記に説明したプライマーセット探索装置１０のハードウェア構成を示す図である。プライマーセット探索装置１０は、ＣＰＵ５０、ＲＡＭ５１、ＲＯＭ５２、通信インターフェース５４、ハードディスク５５、操作部５６、ディスプレイ５７がデータバス５９によって接続されたコンピュータによって構成される。また、上記した配列特異性を計算する専用回路を有するＦＰＧＡボード５８がコンピュータに装着される。ＣＰＵ５０が、ＲＯＭ５２に書き込まれたプログラム５３に従って演算処理を実行することにより、上記したプライマーセット探索装置１０の機能が実現される。このようなプログラム５３は、本発明の範囲に含まれる。ハードディスク５５には、配列特異性ＤＢ１５のデータが記憶される。
【００３４】
図６は、本実施の形態のプライマーセット探索装置１０の動作を示す図である。まず、プライマーセット探索装置１０は、目的遺伝子配列および非目的遺伝子配列の入力を受け付ける（Ｓ１０）。具体的には、オペレータが、目的遺伝子の特徴および非目的遺伝子の特徴を指定すると、プライマーセット探索装置１０は、その特徴に合致する目的遺伝子配列および非目的遺伝子配列をｃＤＮＡライブラリ３０から読み出す。
【００３５】
次に、プライマーセット探索装置１０は、探索条件として、プライマーセットに含めるプライマーの塩基長と、プライマーセットに含めるプライマーの数と、温度条件Ｔｃの入力を受け付ける（Ｓ１２）。プライマーセット探索装置１０は、入力された塩基長のすべてのプライマーをプライマーセットに含めるプライマーの候補として扱う。
【００３６】
続いて、プライマーセット探索装置１０は、それぞれのプライマー候補が、目的遺伝子および非目的遺伝子にハイブリダイズするか否かを計算し、計算結果に基づいて、図２に示すような配列特異性ＤＢ１５を生成する（Ｓ１４）。ここでは、ターゲットの遺伝子配列が、プライマーの配列に対して所定の閾値以上の割合でマッチングする相補的な配列を含んでいる場合に、ハイブリダイズすると判定する。この閾値は、システムの設計により適切に設定することができる。配列特異性ＤＢ１５の生成に際して、いずれの目的遺伝子にもハイブリダイズしないプライマーは、プライマー候補から除外し、配列特異性ＤＢ１５には含めないこととしてもよい。
【００３７】
プライマーセット探索装置１０は、最近接塩基対法（Nearest Neighbor法）を用いて、配列特異性ＤＢ１５に記憶されたプライマー候補のＴｍ値を求める。続いて、求めたＴｍ値と入力された温度条件Ｔｃとに基づいて、配列特異性ＤＢ１５のデータを更新する（Ｓ１６）。具体的には、温度条件Ｔｃに合致しないＴｍ値を有するプライマー候補を配列特異性ＤＢ１５から削除する。このようなプライマー候補をあらかじめ配列特異性ＤＢ１５から除外しておくことにより、プライマーセット探索のための計算の負荷を軽減できる。
【００３８】
次に、プライマーセット探索装置１０は、配列特異性ＤＢ１５に記憶されたデータに基づいて、プライマー候補の中からプライマーセットに採用するプライマーの組み合わせを探索する（Ｓ１８）。
【００３９】
図７は、プライマーの組み合わせ探索の動作を示す図である。プライマーセット探索部１９は、探索条件として入力されたプライマー数と同数のプライマー候補をランダムに選択し、初期プライマーセットを生成する（Ｓ３０）。ここで、プライマー候補を選択する際には、同じプライマー候補を重複して選択することを許容してもよい。
【００４０】
次に、初期プライマーセットの評価値Ｓ０を求める（Ｓ３２）。以下、プライマーセットを特定しないで評価値に言及するときは「評価値Ｓ」という。評価値Ｓは、ハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔが大きくなるほど高い値をとり、クロスハイブリダイズする非目的遺伝子の割合Ｃｎが大きくなるほど低い値をとる。
【００４１】
図８は、評価値Ｓについて説明するための図である。図８では、プライマー候補Ｐ１〜Ｐ６のうちの、プライマーＰ１、Ｐ３、Ｐ４の組み合わせからなるプライマーセットについて評価値Ｓを求める例を示している。
【００４２】
図８に示すプライマーセットは、目的遺伝子Ｔ１〜Ｔ６のうちのＴ１〜Ｔ５をカバーしている。すなわち、プライマーＰ１が目的遺伝子Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４にハイブリダイズし、プライマーＰ３が目的遺伝子Ｔ２、Ｔ４にハイブリダイズし、プライマーＰ４が目的遺伝子Ｔ１、Ｔ５にハイブリダイズする。従って、プライマーセットがカバーする目的遺伝子の割合Ｃｔは５／６である。また、図８に示すプライマーセットは、非目的遺伝子Ｎ１、Ｎ３、Ｎ４にクロスハイブリダイズするので、クロスハイブリダイズする非目的遺伝子の割合Ｃｎは３／６である。このように配列特異性ＤＢ１５に記憶されたデータを用いて、プライマーセットがハイブリダイズする目的遺伝子の割合Ｃｔおよび非目的遺伝子の割合Ｃｎを求める。
【００４３】
評価値Ｓは、目的遺伝子の割合Ｃｔおよび非目的遺伝子の割合Ｃｎを用いて、例えば、以下の式（２）または式（３）によって求める。
【数２】
2011062085.tif 000004
【数３】
2011062085.tif 000005
なお、上記算式は例示であり、別の算式を用いて評価値Ｓを決定することもできる。
【００４４】
次に、プライマーセット探索部１９は、プライマーセットの中から、１つのプライマーをランダムに選択する（Ｓ３４）。説明の便宜上、選択されたプライマーをプライマーＡという。プライマーセット探索部１９は、プライマーＡと交換する対象となるプライマーをプライマー候補の中から選択する（Ｓ３６）。
【００４５】
具体的には、プライマーセット探索部１９は、プライマーセットに含まれるプライマーＡ以外のプライマー（例えば、プライマー数がｃ個であれば、プライマーＡ以外の（ｃ−１）個のプライマー）と、ダイマーを形成しないプライマーを交換可能なプライマー候補として選択する。ここでは、説明の便宜上、交換する対象として、ｍ個のプライマー候補が存在するとする。
【００４６】
プライマーＡを交換する前のプライマーセットの評価値Ｓｔとする。ｔは、プライマーセットに含まれるプライマーＡを別のプライマー候補で交換する繰り返し処理を行なった回数を示す。初期プライマーセットの場合には、ｔ＝０である。プライマーセット探索装置１０は、ｍ個のプライマー候補のそれぞれで置き換えた後のｍ個のプライマーセットのそれぞれの評価値Ｓｔ＋１，１，Ｓｔ＋１，２，・・・Ｓｔ＋１，ｍを計算する（Ｓ３８）。
【００４７】
次に、プライマーセット探索部１９は、評価値Ｓｔ＋１，１，Ｓｔ＋１，２，・・・Ｓｔ＋１，ｍに基づいて、プライマーＡと交換するプライマー候補を決定し、プライマーセットを決定する。具体的には、まず、評価値Ｓが大きいほど大きい確率値をとる確率分布と、計算されたプライマーセットの評価値Ｓｔ＋１，１，Ｓｔ＋１，２，・・・Ｓｔ＋１，ｍとに基づいて、各プライマーセットを選択する確率値を決定する（Ｓ４０）。
【００４８】
図９は、確率分布を示す図である。図９に示す確率分布は、
【数４】
2011062085.tif 000006
をグラフ化したものである。式（４）において、ｍｉｎ［ａ，ｂ］は、ａとｂのうち小さい方を選択する関数である。このように、ｍｉｎ関数を用いて１とexp{k (Ｓt+1,i−Ｓt)}とを比較して小さい方の値を採用する構成により、現在より評価値が高くなる場合は、全て１となり、等確率で選択されることになる。なお、ｍｉｎ関数を用いないで、例えば、下記式（５）によって、確率分布を求めてもよい。
【数５】
2011062085.tif 000007
【００４９】
プライマーセット探索部１９は、常に評価値Ｓが最大のプライマーセットを選択するのではなく、確率分布を用いてプライマーセットを選択する。図９に示す例では、評価値Ｓt+1,1のプライマーセットが選択される確率値はＰ１、評価値Ｓt+1,2のプライマーセットが選択される確率値はＰ２、評価値Ｓt+1,3のプライマーセットが選択される確率値はＰ３である。プライマーセット探索部１９は、評価値Ｓによって決まる確率値に従って、プライマーセットを決定し、プライマーセットの評価値Ｓを記憶部に記憶する（Ｓ４２）。
【００５０】
プライマーセット探索部１９は、プライマーセット探索の終了条件を満たすか否かを判定する（Ｓ４４）。終了条件としては、例えば、プライマーセットの探索回数、すなわち、プライマーを交換した回数が所定の閾値ｎに達したこととすることができる。閾値ｎとしては、例えば、１００００回のオーダーの値を設定することができる。与えられた探索条件においてハイブリダイズする目的遺伝子の数を最大とし、クロスハイブリダイゼーションを最小とする理想的な解に近いプライマーセットを求めることができる。
【００５１】
プライマーセット探索部１９は、終了条件を満たした場合には、記憶部に記憶された評価値Ｓが最大のプライマーセットを、探索結果として決定する（Ｓ４６）。
【００５２】
図６に戻って、プライマーセット探索装置１０は、プライマーセット探索部１９にて探索されたプライマーセットを探索結果として出力する（Ｓ２０）。以上、第１の実施の形態のプライマーセット探索装置１０の構成および動作について説明した。
【００５３】
本実施の形態のプライマーセット探索装置１０およびプライマーセット探索方法は、目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーの割合Ｃｔと非目的遺伝子にクロスハイブリダイズするプライマーの割合Ｃｎとに基づいて求めたプライマーセットの評価値Ｓを用いて、プライマーセットを探索するので、クロスハイブリダイゼーションをできるだけ少なくし、かつ、できるだけ多くの目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーセットを求めることができる。
【００５４】
また、プライマーセット探索装置１０およびプライマーセット探索方法は、評価値が高くなるほど高い確率値をとる確率分布とプライマーセットの評価値とに基づいて、交換するプライマー候補を選択するので、局所最大に陥ることなく、適切なプライマーセットを探索することができる。
【００５５】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態のプライマーセット探索装置１０およびプライマーセット探索方法について説明する。第２の実施の形態のプライマーセット探索装置１０の基本的な構成は、第１の実施の形態と同じであるが（図１参照）、第２の実施の形態のプライマーセット探索装置１０は、プライマーセットの探索を行う際に、プライマーセットを選択するための確率分布を変化させる点が異なる。
【００５６】
第２の実施の形態では、評価値Ｓとして、
【数６】
2011062085.tif 000008
を用い、プライマー候補Ａを別のプライマー候補と入れ替えたときの確率Ｐｉを、
【数７】
2011062085.tif 000009
によって求める。
【００５７】
第２の実施の形態では、プライマーを交換する繰り返し処理ごとに、ｔ＋１回の繰り返し処理後に求めたプライマーセットの評価値Ｓｔ＋１とｔ回の繰り返し処理後に求めたプライマーセットの評価値Ｓｔとを比較して、Ｓｔ＋１＜Ｓｔの場合には、ｋiを1.05倍し、確率分布を変更する。このように確率分布を変更することにより、評価値Ｓｉ＋１が前回の評価値Ｓｉより大きくなった場合には、ｋiを大きくすることにより、評価値Ｓが高いプライマーセットが選ばれる確率を高くする。これにより、与えられた探索条件においてハイブリダイズする目的遺伝子の数を最大とし、クロスハイブリダイゼーションを最小とする理想的な解に近いプライマーセットに早く辿り着くことができる。
【００５８】
本実施の形態では、プライマーセットの評価値Ｓｔ、Ｓｔ＋１の大小関係に基づいて確率分布を変更する例を挙げたが、別の基準に従って確率分布を変更してもよい。例えば、プライマーＡを交換する繰り返し処理を行なった回数に基づいて、確率分布を変更してもよい。
【実施例】
【００５９】
次に、本発明の実施例について説明する。
最初に実験条件について説明する。１０００個の目的遺伝子配列をランダムに選択し、１０００個の非目的遺伝子配列をハウスキーピング遺伝子からランダムに選択した。探索条件は、以下の表１に示すとおりである。
【表１】
2011062085.tif 000010
【００６０】
この探索条件で、２万回の繰り返し探索を行った。また、比較のため、Ｇｒｅｅｄｙアルゴリズムにより、プライマーセットの探索を行った。以下の表２に、探索されたプライマーセットによる目的遺伝子のカバー数と非目的遺伝子へのクロスハイブリダイゼーション数を示す。下記表において、括弧内は、目的遺伝子数から非目的遺伝子数を減算した値である。この数値が大きいほど、クロスハイブリダイゼーションが少なく、かつ、多くの目的遺伝子にハイブリダイズするプライマーセットであると評価できる。
【表２】
2011062085.tif 000011
【００６１】
上記表２に示した結果によれば、目的遺伝子カバー数から非目的遺伝子へのクロスハイブリダイゼーション数を減算して、各実験結果を評価してみると、いずれの探索条件においても、本発明はＧｒｅｅｄｙアルゴリズムより適切な探索結果が得られたことが分かる。
【００６２】
以上、本発明のプライマーセット探索装置およびプライマーセット探索方法について、図面を参照して詳細に説明したが、本発明は上記した実施の形態に限定されるものではない。
【００６３】
上記した実施の形態では、プライマーセット探索の終了条件を、探索回数が予め設定された閾値に達したこととしたが、プライマーセット探索の終了条件はこれに限定されない。例えば、終了条件として、繰り返し処理ごとの評価値の振れ幅が一定の範囲内に収束したことや、評価値が所定の閾値を超えたことなどを終了条件としてもよい。
【００６４】
上記した実施の形態では、熱力学特性計算部１６にてプライマー候補のＴｍ値を計算する例について説明したが、プライマー候補のＴｍ値をあらかじめ記憶しておいてもよい。あるいは、一度求めたＴｍ値を次回以降の探索のために蓄積していくこととしてもよい。これにより、プライマー候補のＴｍ値を計算する時間を割愛、あるいは短縮することができ、より短時間で適切なプライマーセットの探索を行うことができる。
【００６５】
上記した実施の形態では、配列特異性の計算を行った後に熱力学特性の計算を行ってプライマー候補の絞り込みを行う例について説明したが、先に熱力学特性の計算を行って、温度条件Ｔｃに基づいてプライマー候補の絞り込みを行なってもよい。特に、プライマー候補の熱力学特性があらかじめ求めてある場合には、先に温度条件Ｔｃによる絞り込みを行うことが有効である。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、非目的遺伝子群へのクロスハイブリダイゼーションが少なく、かつ、多くの目的遺伝子群にハイブリダイズするプライマーセットを探索でき、シークエンシングに用いるプライマーセットを探索するプライマー探索装置等として有用である。
【符号の説明】
【００６７】
１０  プライマーセット探索装置
１１  目的遺伝子入力部
１２  非目的遺伝子入力部
１３  探索条件入力部
１４  配列特異性計算部
１５  配列特異性ＤＢ
１６  熱力学特性計算部
１７  温度条件入力部
１８  ＤＢ更新部
１９  プライマーセット探索部
２０  出力部
３０  ｃＤＮＡライブラリ
４０  配列比較ユニット
４１  ３２並列配列比較回路
５０  ＣＰＵ
５１  ＲＡＭ
５２  ＲＯＭ
５３  プログラム
５４  通信インターフェース
５５  ハードディスク
５６  操作部
５７  ディスプレイ
５８  ＦＰＧＡボード
５９  データバス
【図１】
2011062085.tif 000012
【図２】
2011062085.tif 000013
【図３】
2011062085.tif 000014
【図４】
2011062085.tif 000015
【図５】
2011062085.tif 000016
【図６】
2011062085.tif 000017
【図７】
2011062085.tif 000018
【図８】
2011062085.tif 000019
【図９】
2011062085.tif 000020