(57)【要約】【課題】細胞への遺伝子導入効率を改善し、形質転換細胞を安定的かつ高効率に作成するための方法の提供。【解決手段】遺伝子導入処理後の細胞を、コエンザイムＱ１０を含有する培地を用いて培養することを特徴とする遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、前記培地中のコエンザイムＱ１０の濃度が、１０〜１０００ｍｇ／Ｌであることを特徴とする前記記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、及び、前記培地が、さらに、ビタミンＥ、ベタイン、及びプロリンからなる群より選択される１種以上の化合物を含有することを特徴とする前記記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子導入処理後の細胞を、コエンザイムＱ１０を含有する培地を用いて培養することを特徴とする遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項２】
前記培地中のコエンザイムＱ１０の濃度が、１０〜１０００ｍｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記培地が、さらに、ビタミンＥ、ベタイン、及びプロリンからなる群より選択される１種以上の化合物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項４】
前記遺伝子導入処理が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）法、パーティクルガン法、及びエレクトロポレーション法からなる群より選択される１種により行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項５】
前記遺伝子導入処理後の細胞が、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌溶液に浸漬させた後の植物細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項６】
前記細胞が、前記遺伝子導入処理前に、コエンザイムＱ１０を含有する培地を用いて培養されたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項７】
前記細胞が植物細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項８】
前記細胞が、ラテックス産生植物由来の細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【請求項９】
前記細胞が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換細胞を効率よく作製するための、遺伝子導入処理後の細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然ゴムは、弾性を有する高分子であり、ゴム製品の主原料として様々な用途において幅広く、かつ大量に用いられている。天然ゴムは、ゴムノキ等のラテックス産生植物が分泌するラテックスを採取し、これに所望の加工をすることにより製造される。このため、主にタイ・マレーシア・インドネシア等の熱帯諸国において、ラテックスを回収するためのゴムノキ、特にパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が、商業的に植樹されている。
【０００３】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、天然の植物体に、好ましい外来遺伝子を導入することによって、形質を改変することができるようになった。天然ゴムの製造分野においても、ラテックス産生植物を遺伝学的に改良し、より高品質のラテックスを産生し得る植物体や、より大量のラテックスを産生し得る植物体等の所望の形質を有する植物体を作成する方法が研究されている。なかでも、好ましい手法として、遺伝子組み換えによる分子育種があるが、遺伝子組み換えの植物体を得るためには、再分化と遺伝子導入のプロセスを経る必要がある。
【０００４】
植物の遺伝子導入法としては、植物病原菌の１種であるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌を植物細胞に感染させて遺伝子を導入する方法（アグロバクテリウム法）、遺伝子を担持させた金粒子をパーティクルガンにより植物細胞内に撃ち込む方法（パーティクルガン法）、が主として用いられている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００５】
アグロバクテリウム法により、パラゴムノキの形質転換体作成に成功している事例が幾つかある。例えば、パラゴムノキの葯由来カルスに、アグロバクテリウム属細菌のベクター系を用いて所望の遺伝子を導入し、この植物組織から植物を再生することにより、形質転換されたパラゴムノキを作成する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照。）。また、パラゴムノキの珠皮由来カルスからアグロバクテリウム法により形質転換体が得られたという報告もある（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１３０８１５号公報
【特許文献２】特許第３２８９０２１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ブラン（Blanc）、外４名、プラント・セル・レポート（Plant cell Report）、２００６年、第２４巻、第７２４〜７３３ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、植物の種類によっては、遺伝子導入効率が十分ではなく、所望の外来遺伝子を導入した形質転換植物の作製は困難である場合が多い。特に、パラゴムノキ等のラテックス産生植物では、他の種類の植物と比較して遺伝子が導入され難く、形質転換体の作製方法にはさらなる改善が求められている。例えば、上述の事例においても、カルスに感染させるときのアグロバクテリウムの菌濃度を調整して効率化を検討しているものの、遺伝子導入の十分な効率化は達成されていない。
【０００９】
本発明は、細胞への遺伝子導入効率を改善し、形質転換細胞を安定的かつ高効率に作成するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、遺伝子導入処理後の細胞を培養する際に、培地中にコエンザイムＱ１０を含有させることにより、遺伝子導入効率を改善し、目的の外来遺伝子が導入された形質転換細胞を効率よく作製し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１）  遺伝子導入処理後の細胞を、コエンザイムＱ１０を含有する培地を用いて培養することを特徴とする遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、
（２）  前記培地中のコエンザイムＱ１０の濃度が、１０〜１０００ｍｇ／Ｌであることを特徴とする前記（１）記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、
（３）  前記培地が、さらに、ビタミンＥ、ベタイン、及びプロリンからなる群より選択される１種以上の化合物を含有することを特徴とする前記（１）又は（２）記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、
（４）  前記遺伝子導入処理が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）法、パーティクルガン法、及びエレクトロポレーション法からなる群より選択される１種により行われることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、  
（５）  前記遺伝子導入処理後の細胞が、標的遺伝子又はそのフラグメントを含むプラスミドを含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌溶液に浸漬させた後の植物細胞であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、  
（６）  前記細胞が、前記遺伝子導入処理前に、コエンザイムＱ１０を含有する培地を用いて培養されたことを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、
（７）  前記細胞が植物細胞であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、
（８）  前記細胞が、ラテックス産生植物由来の細胞であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、
（９）  前記細胞が、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の細胞であることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法、
を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法により、遺伝子導入処理後の細胞を培養することにより、遺伝子導入効率を改善し、所望の遺伝子が導入された形質転換細胞を効率よく作製することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」と略すことがある。）は、遺伝子導入処理後の細胞を、コエンザイムＱ１０を含有する培地を用いて培養することを特徴とする。遺伝子導入処理は、細胞にとって大きなストレスであり、例えば、植物細胞に遺伝子導入処理を行った後に培養すると、褐色に変色し（褐変）、死滅する細胞が多くある。遺伝子導入処理後にコエンザイムＱ１０を含有する培地中で培養することにより、細胞の褐変や細胞死を抑制し、遺伝子導入効率を向上させることができる。
【００１４】
コエンザイムＱ１０は、補酵素Ｑ１０やユビキノン等の別称を持ち、物質代謝からエネルギーを捕獲するミトコンドリアの呼吸鎖において中心的役割を果たす補酵素である。コエンザイムＱ１０は、非常に強い抗酸化作用を有する天然成分である。また、血圧降下、心臓強化、動脈硬化防止、血管保護、抗疲労、運動機能向上、エネルギー代謝効率向上、抗酸化等の諸効果を有することが分かっている。
【００１５】
培養培地にコエンザイムＱ１０を含有させることにより、このような褐変抑制効果や遺伝子導入効率改善効果が得られる理由は明らかではないが、コエンザイムＱ１０は強い抗酸化作用を有することから、遺伝子導入処理によるストレスから産生された活性酸素を除去し、その細胞毒性を緩和しているためではないかと推察される。
【００１６】
なお、例えばブドウにおいては、遺伝子導入処理後の細胞の褐変を防止するために、遺伝子導入処理後の細胞を培養する培地にＤＴＴ（ジチオスレイトール）やＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）等の還元剤を添加して細胞内で発生した活性酸素を除去する方法が開示されている（例えば、Avihai Perl et. al., Nature Biotechnology, vol.14, p624-628 (1996)参照。）。しかしながら、後記参考例１に示すように、パラゴムノキにおいては、ＤＴＴやＰＶＰを添加した場合には、コエンザイムＱ１０において得られるような褐変抑制効果や遺伝子導入効率改善効果は奏されなかった。このことから、コエンザイムＱ１０には、ＤＴＴ等の他の還元剤とは異なる効果がある可能性も示唆される。
【００１７】
培地に含有させるコエンザイムＱ１０量は、褐変抑制効果や遺伝子導入効率改善効果を得るために十分な濃度であれば、特に限定されるものではなく、細胞の種類や遺伝子導入処理方法の種類等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、１０ｍｇ／Ｌ以上であることが好ましい。また、コエンザイムＱ１０は天然成分であり、高濃度となっても細胞に対する毒性は非常に小さいものの、コストが過大となってしまう。このため、例えば、１０〜１０００ｍｇ／Ｌであることが好ましく、５０〜５００ｍｇ／Ｌであることがより好ましく、１００〜２５０ｍｇ／Ｌであることがさらに好ましい。
【００１８】
コエンザイムＱ１０を含有させる培地は、遺伝子導入処理後の細胞を培養する際に通常用いられる公知の培地の中から、細胞の種類や遺伝子導入処理方法の種類等を考慮して、適宜選択して用いることができる。また、公知の培地を、必要に応じて改変等したものを用いてもよい。例えば、遺伝子導入処理の対象となる細胞が植物細胞の場合には、一般的に植物細胞の培養に用いられるホルモンフリーの植物細胞培養培地を用いることができる。該植物細胞培養培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地、Ｈｅｌｌｅｒの培地、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）、Ｇａｍｂｏｒｇ、Ｂ５、ＭＢ培地、ＷＰＭ培地（ＬＬＯＹＤ  ＡＮＤ  ＭｃＣＯＷＮ‘Ｓ  Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ）等がある。また、これらの培地に、スクロースやマルトース等の糖、スペルミジン等のポリアミン、ココナッツウォーター、バナナパウダー、カゼイン等の栄養源等や、ホルモン、スクロースやマルトース等の糖、活性炭等を適宜添加してもよい。さらに、遺伝子導入処理後の細胞を培養するコエンザイムＱ１０を含有させる培地は、液体培地であってもよく、支持体としてゲルライトや寒天等を用いた培地であってもよい。
【００１９】
また、培地には、コエンザイムＱ１０に加えて、ビタミンＥ等の抗酸化剤、ベタイン等の界面活性剤、プロリン等のアミノ酸類等を添加してもよい。中でも、コエンザイムＱ１０、ビタミンＥ、ベタイン、及びプロリンを組み合わせて添加することが好ましい。
【００２０】
本発明の培養方法に供される細胞に施される遺伝子導入処理は、特に限定されるものではなく、細胞に遺伝子を導入する際に用いられる公知のいずれの手法を用いてもよい。このような遺伝子導入処理方法として、例えば、目的の遺伝子（標的遺伝子）を構成するＤＮＡを含むプラスミド等のベクターを導入したアグロバクテリウム属菌を植物細胞に感染させて遺伝子を導入する方法（アグロバクテリウム法）、標的遺伝子を構成するＤＮＡを担持させた金粒子をパーティクルガンにより細胞内に撃ち込む方法（パーティクルガン法）、標的遺伝子を組み込んだベクターを含む溶液中で電圧により細胞膜に孔を開け、そこから当該ベクターを導入する方法〔エレクトロポレーション（電気穿孔）法〕等が挙げられる。植物細胞へ標的遺伝子を導入する場合には、アグロバクテリウム法又はパーティクルガン法により遺伝子導入処理を行うことが好ましく、アグロバクテリウム法により行うことがより好ましい。なお、これらの方法は、常法により行うことができる。
【００２１】
細胞に対する遺伝子導入処理を、アグロバクテリウム法により行う場合には、具体的には、標的遺伝子を組み込んだベクターを導入したアグロバクテリウム属菌の溶液中に、脱分化誘導等により得られたカルスを浸漬させることにより、遺伝子導入処理を行う。そこで、このアグロバクテリウム属菌溶液に浸漬させた後のカルスを、コエンザイムＱ１０を含有する培地中で培養することにより、本発明の培養方法を行うことができる。なお、感染に用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有するプラスミド等のベクターを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
【００２２】
また、細胞に対する遺伝子導入処理を、パーティクルガン法やエレクトロポレーション法により行う場合には、金粒子を打ち込んだ細胞や電圧処理後の細胞を、コエンザイムＱ１０を含有する培地中で培養することにより、本発明の培養方法を行うことができる。
【００２３】
本発明の培養方法に供される細胞に導入される遺伝子（標的遺伝子）としては、特に限定されるものではなく、導入される細胞が本来有している遺伝子であってもよく、当該細胞以外の生物種由来の遺伝子であってもよく、人工的に作製した遺伝子であってもよい。人工的に作製した遺伝子としては、例えば、２種類以上の遺伝子をつなぎ合わせたキメラ遺伝子であってもよく、いずれかの生物が有する遺伝子を変異させた変異遺伝子であってもよい。変異遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列のうちの一部の塩基を欠損させたものであってもよく、置換させたものであってもよい。また、該塩基配列の途中に部分塩基配列を挿入したものであってもよい。
【００２４】
また、標的遺伝子は、構造遺伝子であってもよく、調節領域であってもよい。例えば、プロモーターやターミネーター等の転写や翻訳の制御領域を含む構造遺伝子であってもよい。なお、制御領域の遺伝子は、遺伝子が導入される細胞中で機能し得るものであればよく、遺伝子が導入される細胞と同種の生物由来の遺伝子であってもよく、異種の生物由来の遺伝子であってもよいことは言うまでもない。植物細胞に導入される標的遺伝子に含まれるこのような異種プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターを使用することができる。
【００２５】
さらに、細胞に導入される標的遺伝子は、遺伝子の全長であってもよく、フラグメントであってもよい。例えば、構造遺伝子の機能ドメインのみからなるフラグメントを導入するものであってもよい。
【００２６】
また、本発明の培養方法に供される細胞は、遺伝子導入処理前に、コエンザイムＱ１０を含有する培地中で培養してもよい。コエンザイムＱ１０は、植物細胞等の細胞に対するストレスを緩和させる効果が期待できるため、遺伝子導入処理前に予めコエンザイムＱ１０を含有する培地中で培養しておくことにより、より効果的に遺伝子導入処理によるストレスを軽減し、さらに褐変を抑制し、遺伝子導入効率を高めることができる。
【００２７】
本発明の培養方法に供される細胞は、特に限定されるものではなく、植物細胞であってもよく、動物細胞であってもよく、酵母や大腸菌等の微生物の細胞であってもよい。本発明においては、植物細胞であることが好ましく、ラテックス産生植物であることがより好ましい。
【００２８】
本発明において、ラテックス産生植物とは、乳管または細胞間隙にラテックス（主にポリイソプレン）が含まれている植物であれば、特に限定されるものではなく、例えば、トウダイグサ科のパラゴムノキ、セアラゴムノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｇｌａｚｉｏｖｉｉ）、クワ科のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、パナゴムノキ（Ｃａｓｔｉｌｌｏａ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、ラゴスゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｌｕｔｅａ  Ｖａｈｌ）、マメ科のアラビアゴムノキ（Ａｃｃａｃｉａ  ｓｅｎｅｇａｌ）、トラガントゴムノキ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｇｕｍｍｉｆｅｒ）、キョウチクトウ科のクワガタノキ（Ｄｙｅｒａ  ｃｏｓｔｕｌａｔａ）、ザンジバルツルゴム（Ｌａｎｄｏｌｐｈｉａ  ｋｉｒｋｉｉ）、フンツミアエラスチカ（Ｆｕｎｔｕｍｉａ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、ウルセオラ（Ｕｒｃｅｏｌａ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、キク科のグアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、ゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｋｏｋ−ｓａｇｈｙｚ）、アカテツ科のガタパーチャノキ（ｐａｌａｇｕｉｕｍ  ｇａｔｔａ）、バラタゴムノキ（Ｍｉｍｕｓｏｐｓ  ｂａｌａｔａ）、サポジラ（Ａｃｈｒａｓ  ｚａｐｏｔａ）、ガガイモ科のオオバナアサガオ（Ｃｒｙｐｔｏｓｔｅｇｉａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、トチュウ科のトチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａ  ｕｌｍｏｉｄｅｓ）等が挙げられる。中でも、パラゴムノキ、セアラゴムノキ、インドゴムノキ等であることが好ましく、工業用天然ゴム原料として汎用されているパラゴムノキであることがより好ましい。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明の遺伝子導入処理後の細胞の培養方法により、天然ゴム等の遺伝子導入効率の低い植物から、形質転換細胞を効率よく作製することができるため、特に植物の新品種作製の分野で有用である。