(57)【要約】【課題】分泌タンパク質またはそれらをコードする遺伝子を使用することによって、医学的疾患、障害および／または状態を検出、処置、および予防すること。【解決手段】本発明は、新規なヒト分泌タンパク質、およびそのようなタンパク質をコードする遺伝子のコード領域を含む単離された核酸に関する。ヒト分泌タンパク質を産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、ならびにヒト分泌タンパク質を産生するための組換え方法がまた、提供される。本発明はさらに、これらの新規なヒト分泌タンパク質に関する疾患、障害、および／または状態を、診断および処置するために有用な診断方法および治療方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチド、これらのポリペプチドに結合する抗体、
このようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体の使用、ならびにそれ
らの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
膜によって取り囲まれる単一コンパートメントとして存在する細菌とは異なり
、ヒト細胞および他の真核細胞は、膜によって多くの機能的に異なるコンパート
メントに細分される。各膜で区切られたコンパートメント、すなわちオルガネラ
は、そのオルガネラの機能に不可欠な異なるタンパク質を含む。細胞は、特定の
細胞オルガネラにタンパク質を標的化するために、タンパク質内部に位置するア
ミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用する。
【０００３】
シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列と呼ばれる選別シグナ
ルの１つの型は、小胞体（ＥＲ）と呼ばれるオルガネラに１つのクラスのタンパ
ク質を指向させる。ＥＲは、膜で区切られたタンパク質をすべての他の型のタン
パク質から分離する。一旦、ＥＲに局在すると、両方の群のタンパク質とも、ゴ
ルジ装置と呼ばれる別のオルガネラにさらに指向され得る。ここで、ゴルジは、
タンパク質を、分泌小胞を含む小胞、細胞膜、リソソーム、および他のオルガネ
ラに分布させる。
【０００４】
シグナル配列によってＥＲに標的化されたタンパク質は、分泌タンパク質とし
て細胞外間隙に放出され得る。例えば、分泌タンパク質を含む小胞は、細胞膜と
融合し得、そして細胞外間隙にその内容物を放出し得る（エキソサイトーシスと
呼ばれるプロセスである）。エキソサイトーシスは、構成的に、または誘発シグ
ナルの受け取りの後に生じ得る。後者の場合には、タンパク質は、エキソサイト
ーシスが誘発されるまで、分泌小胞（または分泌顆粒）に貯蔵される。同様に、
細胞膜上に存在するタンパク質はまた、タンパク質を膜に保持する「リンカー」
のタンパク質分解切断によって、細胞外間隙に分泌され得る。
【０００５】
近年大きく進歩したにもかかわらず、ヒトの分泌タンパク質をコードする遺伝
子は少数しか同定されていない。これらの分泌タンパク質としては、商業的価値
のあるヒトインスリン、インターフェロン、第ＶＩＩＩ因子、ヒト成長ホルモン
、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびエリスロポエチンが挙げられる
。したがって、ヒトの生理学における分泌タンパク質の広範な役割を考慮すると
、新規のヒトの分泌タンパク質およびそれらをコードする遺伝子を同定および特
徴付けるための必要性がある。この知見は、分泌タンパク質またはそれらをコー
ドする遺伝子を使用することによって、医学的疾患、障害および／または状態を
検出、処置、および予防することを可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、新規ポリヌクレオチドおよびそのコードされたポリペプチドに関す
る。さらに、本発明は、そのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するた
めのベクター、宿主細胞、抗体、ならびに組換え方法および合成方法に関する。
このポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関連する疾患、障害および／または
状態を検出するための診断方法、ならびにこのような疾患、障害および／または
状態を処置するための治療方法もまた提供される。本発明は、さらに、このポリ
ペプチドの結合パートナーを同定するためのスクリーニング方法に関する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）  単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号Ｘのポリヌクレオチドフラグメント、または配列番号Ｘにハイ
ブリダイズし得るＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列のポリヌクレオチ
ドフラグメント；
（ｂ）配列番号Ｙのポリペプチドフラグメント、または配列番号Ｘにハイブリ
ダイズし得るＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされる
ポリペプチドフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドドメイン、または配列番号Ｘにハイブリダイ
ズし得るＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリ
ペプチドドメインをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、または配列番号Ｘにハイブリダ
イズし得るＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポ
リペプチドエピトープをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｅ）生物学的活性を有する、配列番号Ｙのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド、または配列番号Ｘにハイブリダイズし得るＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含
まれるｃＤＮＡ配列；
（ｆ）配列番号Ｘの改変体であるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号Ｘの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号Ｙの種相同体をコードするポリヌクレオチド；
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
クレオチド、
からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
（項目２）  前記ポリヌクレオチドフラグメントが、分泌タンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目３）  前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｙとして同
定される配列、または配列番号Ｘにハイブリダイズし得るＡＴＣＣ寄託番号Ｚに
含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目４）  前記ポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号Ｘの全体の
ヌクレオチド配列、または配列番号Ｘにハイブリダイズし得るＡＴＣＣ寄託番号
Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列を含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（項目５）  前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかか
らの連続するヌクレオチド欠失を含む、項目２に記載の単離された核酸分子。
（項目６）前記ヌクレオチド配列が、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかから
の連続するヌクレオチド欠失を含む、項目３に記載の単離された核酸分子。
（項目７）  項目１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクタ
ー。
（項目８）  項目１に記載の単離された核酸分子を含む組換え宿主細胞を、作製する方法。
（項目９）  項目８に記載の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
（項目１０）  ベクター配列を含む、項目９に記載の組換え宿主細胞。
（項目１１）  単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
、ポリペプチドフラグメント；
（ｂ）生物学的活性を有する、配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含ま
れるコードされた配列の、ポリペプチドフラグメント；
（ｃ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
、ポリペプチドドメイン；
（ｄ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
、ポリペプチドエピトープ；
（ｅ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
、分泌形態；
（ｆ）配列番号Ｙ、またはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるコードされた配列の
、全長タンパク質；
（ｇ）配列番号Ｙの改変体；
（ｈ）配列番号Ｙの対立遺伝子改変体；または
（ｉ）配列番号Ｙの種相同体、
からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
単離されたポリペプチド。
（項目１２）  前記分泌形態または前記全長タンパク質が、Ｃ末端または
Ｎ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を含む、項目１１に記載の単離
されたポリペプチド。
（項目１３）  項目１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
合する、単離された抗体。
（項目１４）  項目１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
組換え宿主細胞。
（項目１５）  単離されたポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、項目１４に記載の組換
え宿主細胞を培養する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、
を包含する、方法。
（項目１６）  項目１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチド。
（項目１７）  医学的状態を予防、処置、または緩和する方法であって、項目１１に記載のポリペプチドまたは項目１に記載のポリヌクレオチドの治療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１８）  被験体において病理学的状態、または病理学的状態に対す
る感受性を診断する方法であって、
（ａ）項目１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
決定する工程；および
（ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
（項目１９）  被験体において病理学的状態、または病理学的状態に対す
る感受性を診断する方法であって、
（ａ）生物学的サンプルにおいて項目１１に記載のポリペプチドの発現の存
在または量を決定する工程、および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
（項目２０）  項目１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
を同定する方法であって、
（ａ）項目１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
および
（ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすかどうかを決定す
る工程、
を包含する、方法。
（項目２１）  配列番号ＹのｃＤＮＡ配列に対応する、遺伝子。
（項目２２）  生物学的アッセイにおいて活性を同定する方法であって、
ここで該方法が、以下：
（ａ）細胞において配列番号Ｘを発現させる工程；
（ｂ）その上清を単離する工程；
（ｃ）生物学的アッセイにおいて活性を検出する工程；および
（ｄ）該活性を有する該上清においてタンパク質を同定する工程、
を包含する、方法。
（項目２３）  項目２０に記載の方法によって産生される、産物。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
（定義）
以下の定義は、本明細書全体を通して使用される特定の用語の理解を容易にす
るために提供される。
【０００８】
本発明において、「単離された（単離した）」とは、その本来の環境（例えば
、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、した
がって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単
離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは物質の組成物の一部であり得るか
、あるいは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離され」得る。なぜなら、そのベ
クター、物質の組成物、または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境で
はないからである。用語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡ
ライブラリー、丸ごとの細胞全体またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（
電気泳動により分離されたものおよびブロットへのトランスファーされたものを
含む）、せん断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物あるいは、当該分野が本発明の
ポリヌクレオチド／配列の識別する特徴を示せない他の組成物をいわない。
【０００９】
本発明において、「分泌」タンパク質とは、ＥＲ、分泌小胞、または細胞外間
隙にシグナル配列の結果として指向され得るタンパク質、ならびにシグナル配列
を必ずしも含まないが細胞外間隙に放出されるタンパク質をいう。分泌タンパク
質が、細胞外間隙に放出される場合、この分泌タンパク質は、「成熟」タンパク
質を産生するために細胞外プロセシングを受け得る。細胞外間隙への放出は、エ
キソサイトーシスおよびタンパク質分解切断を含む多くの機構によって生じ得る
。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５、少
なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なく
とも５００または少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドであるが、長さ
が３００ｋｂ、２００ｋｂ、１００ｋｂ、５０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．
５ｋｂ、５ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂまたは１ｋｂ以下である。さらなる実
施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において開示される場
合、コード配列の一部を含むが、任意のイントロンの全てまたは一部を含まない
。別の実施形態において、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノム隣接遺
伝子（すなわち、ゲノムにおける目的の遺伝子に対して５’側または３’側）の
コード配列を含まない。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、１０
００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、
２、または１より多いゲノム隣接遺伝子コード配列を含まない。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、配列番号Ｘ（ＳＥ
Ｑ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）に含まれる核酸配列を有する分子、またはＡＴＣＣに寄託
されたクローン内に含まれるｃＤＮＡをいう。例えば、このポリヌクレオチドは
、５’および３’非翻訳配列、シグナル配列を含むかもしくは含まないコード領
域、分泌タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列、な
らびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメイン、および改変体を含
み得る。さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」とは、広く定義
される場合、ポリヌクレオチドから生じた翻訳されたアミノ酸配列を有する分子
をいう。
【００１２】
本発明では、配列番号Ｘとして同定された全長配列は、しばしば、複数のクロ
ーンに含まれる配列を重複させることによって生成された（コンティグ分析）。
配列番号Ｘについての配列のすべてまたはほとんどを含む代表的クローンが、ア
メリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）に寄託された。表１に
示すように、各クローンは、ｃＤＮＡクローンＩＤ（識別子）およびＡＴＣＣ受
託番号によって同定される。ＡＴＣＣは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  
Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２
０９，ＵＳＡに位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続目的のための微生物の寄託
の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に拠って行われた。
【００１３】
本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、その相補体、またはＡＴＣＣに寄
託されたクローン内のｃＤＮＡにハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む
。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミ
ド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５
０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキスト
ランサルフェート、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中
での４２℃での一晩インキュベーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃に
てフィルターを洗浄することをいう。
【００１４】
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌ
クレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた意図される。ハイブリダイゼー
ションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムア
ミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生
じる）；塩条件、または温度の操作を通じて達成される。例えば、より低いスト
リンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．
２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％  ＳＤＳ
、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶
液中、３７℃で一晩のインキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％  Ｓ
ＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、さらにより低いストリンジェンシ
ーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる
洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行われ得る。
【００１５】
上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意のこと。代表的なブロッキング試薬と
しては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、およ
び市販の特許処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性の
問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１６】
もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の
定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ス
トレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオ
リゴｄＴを用いて生成される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイブ
リダイズするからである。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ
、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、一本鎖、またはより代表的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖領域
の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得
る。さらに、このポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよ
びＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた
、安定性のために、または他の理由のために改変された、１つ以上の改変された
塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基としては
、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通でない塩基が挙げ
られる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがって、「
ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態を含む
。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。このポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセ
スによって、または当該技術分野で周知の化学改変技術によってのいずれかで、
改変され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、
ならびに多くの研究文献に十分記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこにで
も生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同じま
たは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多
くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として
分枝状であり得、そしてポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環状で
あり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プ
ロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変としては、
アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、
ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質
または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔ
ｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、
脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成
、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸
化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏ
ｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ
イル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファ
ーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥ
Ｓ，第２版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  
Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩ
ＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩ
ＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙ
ｏｒｋ，１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａ
ｃａｄ  Ｓｃｉ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００１９】
「配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）」とは、ポリヌクレオチド配列をい
うが、「配列番号Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）」とは、ポリペプチド配列をい
い、両方の配列とも、表１に特定された整数によって同定される。
【００２０】
「生物学的活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイで測定
した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても、本発明のポリペプチド（成
熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同一ではない活性を示すポリペ
プチドをいう。用量依存性が存在する場合、このポリペプチドの用量依存性と同
一である必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと比較した場合に、所定の
活性における用量依存性に実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、
本発明のポリペプチドと比較して、より大きな活性を示すか、または約１／２５
以上、そして好ましくは約１／１０以上の活性、そして最も好ましくは約１／３
以上の活性を示す）。
【００２１】
多くのタンパク質（および翻訳されたＤＮＡ配列）は、アミノ酸組成が、利用
可能な残基の小さいサブセットに対して非常に片寄る領域を含む。例えば、膜貫
通ドメインおよびシグナルペプチド（これもまた膜貫通である）は、代表的に、
ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、およびイソロイシン（Ｉ）が
支配する長いストレッチを含む。ｃＤＮＡの末端のポリアデノシン領域（ポリＡ
）は、正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）翻訳においてポリリジン（ポリ−Ｋ）、および
逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が翻訳される場合、ポリフ
ェニルアラニン（ポリ−Ｆ）として現れる。これらの領域は、しばしば「より低
い複雑性」の領域といわれる。
【００２２】
このような領域は、ＢＬＡＳＴのようなデータベース類似性調査プログラムに
、真の相同性を意味しない、高いスコアの配列一致を見出させ得る。ほとんどの
重量（ｗｅｉｇｈｔ）マトリックス（ＢＬＡＳＴによって生じるアライメントを
スコアするために使用される）が、一般的に、特定の低い複雑性の領域において
見出される疎水性アミノ酸（Ｌ、ＶおよびＩ）の群のいずれかの間での一致に、
正確な一致に対しての高いスコアとほとんど同様の高いスコアを与えるという事
実によって、問題が悪化する。
【００２３】
これに対する補正のために、ＢＬＡＳＴＸ．２（バージョン２．０ａ５ＭＰ−
ＷａｓｈＵ）は、特定の配列においてより低い複雑性を「マスクする（ｍａｓｋ
）」２つのフィルター（「ｓｅｇ」および「ｘｎｕ」）を用いる。これらのフィ
ルターは、このような領域についての配列を分析して、そしてより低い複雑性領
域におけるアミノ酸が文字「Ｘ」により置換された新しい配列を作製する。次い
で、これは、ＢＬＡＳＴＸプログラムへの入力配列（ときどき、本明細書中で「
Ｑｕｅｒｙ（問い合わせ）」および／または「Ｑ」といわれる）として使用され
る。このレジメンは、高いスコアの一致が真の相同性を表すことを保証するのを
補助する一方、ＢＬＡＳＴＸプログラムがアライメントを描くためにフィルター
によってマスクされた問い合わせ配列を使用するという点で、ネガティブな結果
が存在する。
【００２４】
従って、以下の適用において示されるアライメントにおける「Ｘ」のストレッ
チは、下線を引かれたＤＮＡ配列または翻訳されたタンパク質配列のいずれかが
、未知または不特定であることを必ずしも示さない。そしてまたこのようなスト
レッチの存在は、この配列が、本発明のアライメントにおいて開示される配列に
対して同一であるか、または同一でないことを示すことを意味されない。このよ
うなストレッチは、上記で定義されるように、このＢＬＡＳＴＸプログラムが、
低い複雑性の領域の検出に起因して、その領域におけるアミノ酸をマスクするこ
とを単に示し得る。全ての場合において、本明細書、配列表（表１）、および／
または寄託されたクローンに示される参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）配列（ときど
き、本明細書中で、「対象（Ｓｕｂｊｅｃｔ）」、「Ｓｂｊｃｔ」、および／ま
たは「Ｓ」という）は、本発明の決定的な実施形態であり、そして本明細書中の
他の箇所で特別に示さない限り、アライメントにおいて示される部分的配列に対
して、本発明を限定するように解釈されるべきでない。
【００２５】
（本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
（遺伝子番号１によってコードされるタンパク質の特徴）
コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＸを使用して、この遺伝子の翻訳産物
が、非限定的な例として、以下のデータベースの受託番号ｇｂ｜ＡＡＤ３３８９
２．１｜ＡＦ１４２７８０＿１（列挙される受託番号を通じて入手可能な全ての
情報が、本明細書中で参考として援用される）を通してアクセス可能な配列（こ
れは、ここでは「（ＡＦ１４２７８０）ブチロフィリン様タンパク質［Ｍｕｓ  
ｍｕｓｃｕｌｕｓ]」として記載される）と配列相同性を共有することを決定し
た。観察される相同性を示す部分的なアライメントをすぐ下に示す。
【００２６】
【化１】
2011087587.tif 000002
上記で「Ｓ」として示されるｇｂ｜ＡＡＤ３３８９２．１｜ＡＦ１４２７８０
＿１のセグメントは、配列番号として配列表中に示される。構造的な類似性に基
づいて、これらの相同なポリペプチドは、少なくともいくつかの生物学的活性を
共有することが予期される。このような活性は、当該分野で公知であり、そして
そのいくつかが本明細書中の他で記載される。このような活性を決定するための
アッセイもまた、当該分野で公知であり、そのいくつかが、本明細書中の他で記
載されている。本発明の好ましいポリペプチドは、上記で示されるアライメント
（コンピューターによって、配列に導入されたギャップは、もちろん除去される
）において、「Ｑ」配列に対応する配列番号として配列表に示されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含む。
【００２７】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｓｏａｒｅｓ＿ｐｒｅｇｎａｎｔ＿ｕｔｅｒｕｓ＿ＮｂＨＰＵ、そしてより少な
い程度で以下において：Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，ｌ
ｉｂ  １；Ｔｈｙｍｕｓ；Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｐｌｅｅｎ；Ａｏｒｔａ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ＋  ＴＮＦ−ａ；Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃ
ｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎ
ｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｆｒａｃ  ２、およびＳｏａｒｅｓ＿ｔｅｓｔｉｓ
＿ＮＨＴ。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００２９】
組織分布、およびブチロフィリンに対する相同性に基づき、この遺伝子に対応
するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、種々の障害の診断および／また
は処置に有用であり得る。子宮における発現の上昇は、生殖障害の診断および／
または処置を研究するための有用性を示唆する。ブチロフィリンに対する相同性
は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、多発性硬
化症に対する感受性について乳製品、ワクチンおよびアッセイにおいて有用であ
り得ることを示唆する。この組織分布はまた、造血組織／免疫組織における富化
を示す。さらに、この遺伝子産物は、Ｔ細胞同時刺激分子のＢ７ファミリーの新
規なメンバーである、Ｂ７−Ｈ１に対して相同性を共有する。したがって、この
遺伝子産物は、免疫障害の処置および／または診断において有用であり得る。
【００３０】
（遺伝子番号２によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子に対応する翻訳産物は、骨形態形成タンパク質の阻害において役割を果たすと考えられる、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）タンパク質と配列番号相同性を共有する（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号  ＡＡＣ４０１１１を参照のこと）。
【００３１】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ、そしてより少ない程度で以下において：Ｓｏａｒｅｓ
＿ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ＿ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ＿ＮｂＨＳＦ；Ｊｉａ  ｂｏｎ
ｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａ；Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  ＩＩ
；Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；Ｓｏａｒｅｓ  ｍ
ｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ２ＮｂＨＭ；ＨＳＡ  １７２  Ｃｅｌｌｓ；Ｈｕｍａｎ  
Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｍａ；Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ＴＦ２７４；Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（＃９３７２１２）；Ｈｕｍａｎ  ｅｎ
ｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ
ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ；Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｒｏ
ｍａｌ  ｃｅｌｌｓ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ；Ｈｕｍ
ａｎ  ａｄｕｌｔ（Ｋ．Ｏｋｕｂｏ）；Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  
ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｇａｓ４；Ｈｕｍａｎ  Ｇａ
ｌｌ  Ｂｌａｄｄｅｒ；Ｃｏｌｏｎ  Ｔｕｍｏｒ；Ｈｕｍａｎ  ８  Ｗｅｅｋ  
Ｗｈｏｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；Ｃｏｌｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  ＩＩ；Ｈｕｍａｎ  Ｂｏ
ｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＵＭＡＮ  Ｓ
ＣＨＷＡＮＯＭＡ；Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ；Ｐｈａｒｙｎｘ  Ｃａｒ
ｃｉｎｏｍａ；Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｆｒａｃｔｉ
ｏｎ  ＩＶ；Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅ−Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ａｄｉｐｏ
ｃｙｔｅｓ；ＨＳＣ１７２  ｃｅｌｌｓ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ１２；ｈｕｍ
ａｎ  ｃｏｒｐｕｓ  ｃｏｌｏｓｕｍ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ９；Ｓｙｎｏｖ
ｉａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ−ＲＳＦ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｏ
ｍａｃｈ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ，ｒｅ−ｅｘｃｉ
ｓｉｏｎ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ａｌｖ１；Ｇｅｓｓｌｅｒ  Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍ
ｏｒ；Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；１２
Ｗｅｅｋ  Ｏｌｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｔａｇｅ  Ｈｕｍａｎ，ＩＩ；Ｈｕｍａｎ
Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｔｕｍｏｒ，Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｓｙｎｏｖｉａｌ  
Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ｃｏｎｔｒｏｌ）；Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｓｔｒ
ｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ，ｕｎｔｒｅａｔｅｄ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ３；ＣＨＭ
Ｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ，ｕｎｔｒｅａｔｅｄ；Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍ
ａ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ８；Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ；Ｐａｎｃｒｅ
ａｓ  ｎｏｒｍａｌ  ＰＣＡ４  Ｎｏ；Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ
；Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｔｕｍｏｒ  ＰＣＡ４  Ｔｕ；Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  
ＩＬ−１  ａｎｄ  ＬＰＳ  ｉｎｄｕｃｅｄ；Ｈ．Ｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅ
ｘ，ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ、およびＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿
Ｌｕ５。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：筋骨格系の疾患およ
び／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試
薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対す
る抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有
用である。上記組織または細胞、特に筋骨格系の多くの障害に関して、標準の遺
伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液
中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝
子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細
胞型（例えば、筋骨格組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リ
ンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの
中で、慣用的に検出され得る。
【００３３】
マウスグレムリンタンパク質に対しての、この遺伝子に対応する翻訳産物の相
同性は、この遺伝子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物および抗体が、増殖
因子のＴＧＦ−βファミリーのメンバーの阻害に有用であり得ることを示す。骨
芽細胞および巨骨細胞腫組織におけるこの遺伝子産物の発現の上昇は、この遺伝
子に対応するポリヌクレオチド、翻訳産物、および抗体が、骨芽細胞の生存、増
殖および／または成長において役割を果たしうることを示唆する。従って、この
遺伝子産物は、骨粗しょう症のような状態において骨量への影響に有用であり得
る。
【００３４】
この分泌タンパク質は、生物学的活性を決定するため、抗体を惹起するため、
組織マーカーとして、同種のリガンドまたはレセプターを単離するために、それ
らの相互作用を調節する薬剤を同定するために、そして栄養補給剤として、使用
され得る。このタンパク質はまた、非常に広範な生物学的活性を有し得る。代表
的な用途は、以下の「走化性」および「結合活性」の節、実施例１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１８、１９および２０、ならびに本明細書中の他の箇所
において記載される。簡潔には、このタンパク質は、以下の活性を有し得る：サ
イトカイン、細胞の増殖／分化調節活性、または他のサイトカインの誘導；免疫
刺激／免疫抑制活性（例えば、ヒトの免疫不全ウイルス感染、癌、自己免疫疾患
、およびアレルギーを処置するため）；造血の調節（例えば、貧血を処置するた
め、または化学療法に対する補助薬として）；骨、軟骨、腱、靭帯、および／ま
たは神経の刺激または増殖（例えば、創傷を処置するため、卵胞刺激ホルモンの
刺激のため（受胎能の制御のため）；走化性およびケモキネシス活性（例えば、
感染、腫瘍を処置するため）；止血または血栓崩壊活性（例えば、血友病、心筋
梗塞などを処置するため）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショック、クローン
病を処置するため）；抗菌薬として；乾癬または他の過剰増殖性疾患を処置する
ため；代謝および挙動の調節のため。遺伝子治療手順における対応する核酸の使
用も意図される。
【００３５】
免疫細胞（例えば、好中球、骨髄）における組織分布は、このクローンのタン
パク質産物が、種々の免疫系障害の診断および処置に有用であることを示す。代
表的な用途は、以下の「免疫活性」および「感染疾患」の節において、実施例１
１、１３、１４、１６、１８、１９、２０および２７において、ならびに本明細
書中の他の箇所に記載される。簡略には、この遺伝子産物の発現は、血液幹細胞
を含む、造血細胞系列の増殖；生存；分化；および／または活性化の調節におけ
る役割を示す。サイトカイン産生、抗原提示、または他のプロセスの調節におけ
る関与は、（例えば、免疫応答をブーストすることによる）ガンの処置における
有用性を示唆する。リンパ系起源の細胞における発現は、この天然の遺伝子産物
が、免疫機能に関与することを示す。従って、それはまた、関節炎、喘息、ＡＩ
ＤＳのような免疫不全疾患、白血病、慢性関節リウマチ、慢性肉芽腫症、炎症性
腸疾患、敗血症、挫創、好中球減少症、好中球増加症、乾癬、過敏症（例えば、
Ｔ細胞媒介細胞障害）；移植器官および組織に対する免疫反応（例えば、宿主対
移植片および移植片対宿主疾患）または自己免疫障害（例えば、自己免疫不妊症
、水晶体組織傷害、脱髄、全身エリテマトーデス、薬物誘導溶血性貧血、慢性関
節リュウマチ、シェ−グレン病、および強皮症）を含む、免疫学的障害のための
薬剤としても有用である。
【００３６】
さらに、このタンパク質は、他の血液細胞の分化または挙動に影響する分泌因
子、または傷害の部位に造血細胞を補充する分泌因子を示し得る。従って、この
遺伝子産物は、様々な血液系列の幹細胞および方向付けられた前駆細胞の拡大に
おいて、ならびに様々な細胞型の分化および／または増殖において有用であると
考えられる。組織分布（例えば、骨芽細胞）は、このクローンのタンパク質産物
が、骨障害の診断および／または処置に有用であることを示唆する。結腸、膵臓
および咽頭起源の腫瘍における組織分布は、このクローンのタンパク質産物が、
これらの腫瘍の診断および阻害のために、ならびに発現が示された他の腫瘍に対
して有用であることを示唆する。さらに、このタンパク質はまた、栄養補給剤と
してのその使用に加えて、生物学的活性を決定するため、抗体を惹起するため、
組織マーカーとして、同種のリガンドまたはレセプターを単離するために、それ
らの相互作用を調節する薬剤を同定するために、使用され得る。タンパク質およ
びこのタンパク質に対して指向される抗体は、上記に列挙された組織の腫瘍マー
カーおよび／または免疫療法の標的としての有用性を示し得る。
【００３７】
（遺伝子番号３によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子に対応する翻訳産物は、マウスＭＰＳ−１タンパク質およびラット
ＭＰＧ−１タンパク質（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ７３９５７お
よびＡＡＤ３８４１７を参照のこと）と配列相同性を共有する。ＭＰＳ−１タン
パク質は、パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）タンパク質の溶解性ファミリーに
対して進化的保存を有するマクロファージ特異的タンパク質である。相同性に基
づいて、この遺伝子に対応する翻訳産物は、溶解能において機能し得、細胞死を
起こすと考えられる。
【００３８】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，ｔｒｅａｔｅｄ、そしてより少ない程度
で以下において：Ｈｕｍａｎ  ｒｅｊｅｃｔｅｄ  ｋｉｄｎｅｙ；Ｈｕｍａｎ  
Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  Ａｄ
ｕｌｔ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ；Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ
ｓ  ＩＩ；Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｌｉｔｉｓ；Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｃｅｎ
ｔａ；ｈｕｍａｎ  ｔｏｎｓｉｌｓ；Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  
ＩＩ、およびＰｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，ｌｉｂ  １。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００４０】
この遺伝子は、マウスおよびラットのマクロファージ特異的遺伝子１のヒトオ
ルソログである。このマウス遺伝子は、ディファレンシャルｃＤＮＡ分析によっ
て同定され、そして、成熟マクロファージにおいては高レベルそして特定の骨髄
単球性細胞株においては中度のレベルで、マクロファージ系列および分化段階特
異的発現を示した。
【００４１】
ヒト骨髄における組織分布および他の造血細胞型は、この遺伝子およびそのタ
ンパク質産物が、ヒト免疫系障害、骨芽細胞腫、関節炎および他の癌の診断およ
び処置に有用であることを示す。この遺伝子に対応する翻訳産物は、細胞死に関
与する溶解性タンパク質として機能し得る。
【００４２】
あるいは、この遺伝子に対応する翻訳産物は、免疫機能および免疫監視機構に
参加し得る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産
物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または
免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【００４３】
（遺伝子番号４によりコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｓｏａｒｅｓ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｓｐｌｅｅｎ  １ＮＦＬＳ、そしてよ
り少ない程度で以下において：ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿ＧＣＢ１；Ｈｕｍａｎ  Ｐｉ
ｔｕｉｔａｒｙ，ｓｕｂｔ  ＩＸ；Ｓｏａｒｅｓ＿ＮＦＬ＿Ｔ＿ＧＢＣ＿Ｓ１；
Ｓｏａｒｅｓ＿ＮｈＨＭＰｕ＿Ｓ１；Ｈｕｍａｎ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ，ｓｕｂ
ｔｒａｃｔｅｄ；Ｓｏａｒｅｓ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ  Ｎ２ｂ４ＨＢ５５Ｙ
；Ｒｅｊｅｃｔｅｄ  Ｋｉｄｎｅｙ，ｌｉｂ  ４；Ｈ．Ｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒ
ｔｅｘ，ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｓｏａｒｅｓ  ｍｅｌ
ａｎｏｃｙｔｅ  ２ＮｂＨＭ；Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ；Ａｃｔｉｖ
ａｔｅｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ，１２  ｈｒｓ，ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ；Ｈｕｍａｎ
Ｃｏｌｏｎ，ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔ；
ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｕｔ４；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＮＴ２  ｎｅｕｒｏｎａｌ
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ９３７２３０；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ６；Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ（＃９３７２０８）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  
ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ  ｓ３  ９３７２１６；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｅｎｄｏｔ
ｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ９３７２２３；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ３；Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ  ｃｏｌｏｎ（＃９３７２０４）；Ｅａｒｌｙ  Ｓｔａｇｅ  Ｈｕ
ｍａｎ  Ｂｒａｉｎ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ，Ｒｅｅｘｃｉｓ
ｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｈｅａｒｔ；ｈｕｍａｎ  ｔｏｎｓｉｌｓ；
ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿ＧＣ６；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ５；ＨＵＭＡＮ  Ｂ  Ｃ
ＥＬＬ  ＬＹＭＰＨＯＭＡ；Ｓｏａｒｅｓ  ｏｖａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ＮｂＨＯ
Ｔ；Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ＩＩ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｔｅｓｔｉ
ｓ＿ＮＨＴ；Ｈ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｃｏｔ  ５０
Ａ３；ＰＲＭＩＸ；Ｎａｍａｌｗａ  Ｃｅｌｌｓ；ＨＬ−６０，ＲＡ  ４ｈ，Ｓ
ｕｂｔｒａｃｔｅｄ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ８；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ９；
Ｈｕｍａｎ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｅ
ｔａｌ  Ｂｒａｉｎ；ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ（ｈｕｍａｎ）；Ｈｕｍａ
ｎ  Ｃｏｌｏｎ；Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａ  ｃＤＮＡ  Ｔｓｐ５０９Ｉ−ｃｌ
ｅａｖｅｄ  ｓｕｂｌｉｂｒａｒｙ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｌｉｐ２；Ｈｕｍａｎ
Ｆｅｔａｌ  Ｓｐｌｅｅｎ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ，ｃｏｎｔｒｏｌ，
ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈ．Ｅｐｉｄｉｄｉｙｍｕｓ，ｃａｐｕｔ  ＆  ｃｏ
ｒｐｕｓ；Ｈ．ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ，Ｅｎｚｙｍｅ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ；
Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ；Ｈ．Ｅｐｉｄｉｄｉｙｍｕｓ，ｃａｕｄａ；Ｈｕｍａｎ
Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｅａｌｉｎｇ  ｇｒｏ
ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  −  ｚｅｒｏ  ｈｒ  ｐｏｓｔ−ｉｎｃｉｓｉｏｎ（ｃｏｎ
ｔｒｏｌ）；Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｉｄｙｍｕｓ；ＳＴＲＯＭＡＬ  −ＯＳＴＥ
ＯＣＬＡＳＴＯＭＡ；Ｓｙｎｏｖｉａｌ  ＩＬ−１／ＴＮＦ  ｓｔｉｍｕｌａｔ
ｅｄ；Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｕｍｏｒ；ｐＢＭＣ  ｓｔｉｍｕｌａ
ｔｅｄ  ｗ／  ｐｏｌｙ  Ｉ／Ｃ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ，ＩＬ１ｂ  ｉ
ｎｄｕｃｅｄ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｓｃｈｉｚｏ  ｂｒａｉｎ  Ｓ１１；Ｓ
ｙｎｏｖｉａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ−ＲＳＦ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ；ＮＣＩ＿Ｃ
ＧＡＰ＿Ｃｏ１４；Ｂ−ｃｅｌｌｓ（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）；ＬＮＣＡＰ
ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ−Ｃｅｌｌ，Ｓ  
ｐｈａｓｅ；Ｈ．Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ；Ｈｕｍ
ａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ；Ｂｒｅａｓｔ，Ｎｏｒｍ
ａｌ：（４００５５２２Ｂ２）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ  ９３７２１８；Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ；Ｂ−Ｃｅｌｌｓ；Ｈ
ｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ，Ｓｔｒｉａｔｕｍ；Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ；Ｈｕ
ｍａｎ  Ｕｔｅｒｉｎｅ  Ｃａｎｃｅｒ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｇａｓ４；Ｈｕｍ
ａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｔｕｍｏｒ，Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｏｖａｒｙ，Ｃ
ａｎｃｅｒ（９８０９Ｃ３３２）：Ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ
ｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｏｖａｒｙ，Ｃａｎｃｅｒ：（４００４５
７６  Ａ８）；Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ；Ｂｏｎｅ  Ｍａｒ
ｒｏｗ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌ，ｕｎｔｒｅａｔｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙ
ｍｕｓ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；Ｓｏａｒｅｓ  ｂｒｅａｓｔ  ２ＮｂＨ
Ｂｓｔ；Ｈｕｍａｎ  Ａｄｒｅｎａｌ  Ｇｌａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ；Ｈｕｍａｎ  
Ｇａｌｌ  Ｂｌａｄｄｅｒ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ，ｓｅｒｕｍ  ｉｎｄ
ｕｃｅｄ，ｒｅ−ｅｘｃ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ，ｓｅｒｕｍ  ｔｒｅａ
ｔｅｄ；ｂｒｅａｓｔ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ＣＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ；Ｈ
ｕｍａｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ；Ｈ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＧＭ−ＣＳＦ  ｔｒ
ｅａｔｅｄ），ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｌｏｎ；ＮＣＩ＿
ＣＧＡＰ＿ＧＣ４；Ｈｕｍａｎ  Ｓｙｎｏｖｉａｌ  Ｓａｒｃｏｍａ；Ｐａｎｃ
ｒｅａｓ  ｎｏｒｍａｌ  ＰＣＡ４  Ｎｏ；１２  Ｗｅｅｋ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｔ
ａｇｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩＩ，Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏｎ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｂｒｎ
２３；Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｐｌａｃｅｎｔ
ａ＿８ｔｏ９ｗｅｅｋｓ＿２ＮｂＨＰ８ｔｏ９Ｗ；Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｓｔｅｓ；
Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（ＲＳ４，１１）；ＮＣＩ＿ＣＧ
ＡＰ＿Ｌｕ５；Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；Ｃｏｌｏｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ＩＩＩ
；Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｈｅａｒｔ＿ＮｂＨＨ１９Ｗ、およびＰｒｉｍａ
ｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，ｌｉｂ  １。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００４５】
観察された組織分布は、この遺伝子産物が、種々の障害の診断および／または
処置に有用であり得ることを示唆する。胎児肝臓および脾臓における発現は、造
血における、そして血液細胞系列の生存、分化、および／または活性化における
潜在的な役割を示唆する。従って、この遺伝子産物は、免疫系機能不全、感染に
対する感受性、自己免疫、白血病／リンパ腫、炎症および免疫調節に関与し得る
。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する
抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の
標的として有用性を示し得る。
【００４６】
（遺伝子番号５によってコードされるタンパク質の特徴）
コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＸを使用して、この遺伝子の翻訳産物
が、非限定的な例として、以下のデータベースの受託番号ｇｂ｜ＡＡＣ１７２１
７．１｜（列挙される受託番号を通じて入手可能な全ての情報が、本明細書中で
参考として援用される）を通してアクセス可能な配列（これは、ここでは「｜（
ＡＦ０１６０３２）ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｌｉｋ
ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ]」として記載される）と配列
相同性を共有することを決定した。観察される相同性を示す部分的なアライメン
トをすぐ下に示す。
【００４７】
【化２】
2011087587.tif 000003
上記で「Ｓ」として示されるｇｂ｜ＡＡＣ１７２１７．１｜のセグメントは、
配列番号：として配列表中に示される。構造的な類似性に基づいて、これらの相
同なポリペプチドは、少なくともいくつかの生物学的活性を共有することが予期
される。このような活性は、当該分野で公知であり、そしてそのいくつかが本明
細書中の他で記載される。このような活性を決定するためのアッセイもまた、当
該分野で公知であり、そのいくつかが、本明細書中の他で記載されている。本発
明の好ましいポリペプチドは、上記で示されるアライメント（コンピューターに
よって、配列に導入されたギャップは、もちろん除去される）において、「Ｑ」
配列に対応する配列番号：として配列表に示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを含む。
【００４８】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｓｏａｒｅｓ  ｉｎｆａｎｔ  ｂｒａｉｎ  １ＮＩＢ、そしてより少ない程度で
以下において：Ｍｅｓｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ，ｆｒａｃ  １；Ｈｕｍａｎ  
Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，ｆｒａ
ｃ  Ｂ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉ
ｏｎ；Ｆｅｔａｌ  Ｈｅａｒｔ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕ
ｓｃｌｅ，ＩＬ１ｂ  ｉｎｄｕｃｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ
；ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿ＣＬＬ１；
ＰＣ３  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ；Ｓｏａｒｅｓ  ｍｅｌａｎｏ
ｃｙｔｅ  ２ＮｂＨＭ、およびＰｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ
ｓ，ｌｉｂ  １。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の障害を含む
がそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬として有用である。
同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または
細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。上記組織ま
たは細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわ
ち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対し
て有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような
障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、癌性組織
および創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、ま
たは別の組織もしくはサンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００５０】
アピラーゼ、ジホスファターゼおよびＣＤ３９（細胞間相互作用および凝集に
関与すると考えられる）に対する相同性に基づいて、このタンパク質は、細胞間
相互作用に類似の役割を有し得る。胎児脳における発現に基づいて、この遺伝子
およびその産物は、認識、学習および他のより高度な神経機能（例えば、記憶）
に必要である、正しい神経相互作用（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の形成に関与し
得る。従ってこの遺伝子は、このような障害ならびに他の神経変性性障害（例え
ば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳおよび多発性硬化症）の診断お
よび処置に有用であり得る。さらに、このタンパク質は、神経再生が有利である
、脊髄損傷を含む神経損傷の治療に有用であり得る。さらに、この遺伝子に対応
する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組
織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る
。
【００５１】
（遺伝子番号６によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子に対応する翻訳産物は、ヒトＨＥＲ２レセプタータンパク質と配列
相同性を共有する（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ７５４９３を参照の
こと）。この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現さ
れる：ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ２８、そしてより少ない程度で以下において：Ｎ
ＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ２３；Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｉ；Ｈｅ
ａｌｉｎｇ  ｇｒｏｉｎ  ｗｏｕｎｄ  −  ｚｅｒｏ  ｈｒ  ｐｏｓｔ−ｉｎｃ
ｉｓｉｏｎ（ｃｏｎｔｒｏｌ）；Ｈｅａｌｉｎｇ  ｇｒｏｉｎ  ｗｏｕｎｄ，６
．５  ｈｏｕｒｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｕｔ２；
ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ２；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ６；Ｓｏａｒｅｓ  ａｄ
ｕｌｔ  ｂｒａｉｎ  Ｎ２ｂ５ＨＢ５５Ｙ；Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏ
ｍａ  ＩＩ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｈｅａｒｔ＿ＮｂＨＨ１９Ｗ、および
Ｓｏａｒｅｓ  ｉｎｆａｎｔ  ｂｒａｉｎ  １ＮＩＢ。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害、ならびに癌を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断
のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプ
チドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブ
の提供に有用である。上記組織または細胞、特に免疫系および癌組織の多くの障
害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来
の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより
低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された
特定の組織もしくは細胞型（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）また
は体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織
もしくはサンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００５３】
ヒトＨｅｒ２レセプターに対する相同性、そして主ヒト前立腺腫瘍およびホジ
キンＩリンパ腫組織におけるこの組織分布は、この遺伝子およびそのタンパク質
産物が、ヒト前立腺がん、ホジキンリンパ腫、および他の免疫系障害の診断およ
び処置に有用であることを示す。
【００５４】
（遺伝子番号７によりコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子に対応する翻訳産物は、ヒトＳｔｅｅｒｉｎ−１タンパク質（例え
ば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ２５１９７３を参照のこと）、およびエクステ
ンシン様タンパク質（ｅｘｔｅｎｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と配列相
同性を共有する。
【００５５】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含
むか、あるいは以下のアミノ酸配列から構成される：ＭＳＤＮＡＰＡＳＬＥＳＧ
ＳＳＳＴＰＴＮＣＳＴＳＳＡＩＰＱＰＧＡＡＴＫＰＷＲＳＫＳＬＳＶＫＨＳＡＴ
ＶＳＭＬＳＶＫＰＰＧＰＥＡＰＲＰＴＰＥＡＭＫＰＡＰＮＮＱＫＳＭＬＥＫＬＫ
ＬＦＮＳＫＧＧＳＫＡＧＥＧＰＧＳＲＤＴＳＣＥＲＬＥＴＬＰＳＦＥＥＳＥＥＬ
ＥＡＡＳＲＭＬＴＴＶＧＰＡＳＳＳＰＫＩＡＬＫＧＩＡＱＲＴＦＳＲＡＬＴＮＫ
ＫＳＳＬＫＧＮＥＫＥＫＥＫＱＱＲＥＫＤＫＥＫＳＫＤＬＡＫＲＡＳＶＴＥＲＬ
ＤＬＫＥＥＰＫＥＤＰＳＧＡＡＶＰＥＭＰＫＫＳＳＫＩＡＳＦＩＰＫＧＧＫＬＮ
ＳＡＫＫＥＰＭＡＰＳＨＳＧＩＰＫＰＧＭＫＳＭＰＧＫＳＰＳＡＰＡＰＳＫＥＧ
ＥＲＳＲＳＧＫＬＳＳＧＬＰＱＱＫＰＱＬＤＧＲＨＳＳＳＳＳＳＬＡＳＳＥＧＫ
ＧＰＧＧＴＴＬＮＨＳＩＳＳＱＴＶＳＧＳＶＧＴＴＱＴＴＧＳＮＴＶＳＶＱＬＰ
ＱＰＱＱＱＹＮＨＰＮＴＡＴＶＡＰＦＬＹＲＳＱＴＤＴＥＧＮＸＴＸＥＳＳＳＴ
ＧＶＳＶＥＰＸＨＦＰＲＬＤＳＬＬＷＫＮＳＬＧＫＩＬＲＬＧＧＣＧＱＳＮＰＨ
ＡＴＭＴＱＱＧＲＲＧＲＥＦ（配列番号１４６）。さらに、これらのポリペプチ
ドのフラグメントおよび改変体（例えば、本明細書に記載のフラグメント、これ
らのポリペプチドに少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％または９９％同一であるポリペプチド、およびこれらのポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドなど）がまた、本発明に
より包含される。本発明のポリペプチドに結合する抗体がまた、本発明により包
含される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明
により包含される。
【００５６】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｓｏａｒｅｓ＿ｐｒｅｇｎａｎｔ＿ｕｔｅｒｕｓ＿ＮｂＨＰＵ、そしてより少な
い程度で以下において：７ＴＭ−ＰＮＭＩＸ；Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓ
ｔｓ  ＩＩ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ，Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏｎお
よびＳｏａｒｅｓ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ２ＮｂＨＭ。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：生殖疾患および／ま
たは障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬とし
て有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体
は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用であ
る。上記組織または細胞、特に生殖系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現
レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の発現
レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の発現
が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型（例
えば、生殖組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清
、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、慣用
的に検出され得る。
【００５８】
ヒトＳｔｅｅｒｉｎ−１タンパク質に対する相同性、およびエクステンシン様
タンパク質に対する相同性、ならびにＺｎフィンガー転写因子に対する相同性は
、この遺伝子が、遺伝子発現、調節、および発生において役割を果たすことを示
唆する。ヒト妊娠子宮における組織分布および骨芽細胞における組織分布は、こ
の遺伝子およびそのタンパク質産物が、雌性生殖障害および異常な胚発達の診断
および処置に有用であることを示す。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、
ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍
マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【００５９】
（遺伝子番号８によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、主にｐｏｏｌｅｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、および
Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓにおいて発現される。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００６１】
ヒト樹状細胞および胸腺間質細胞における組織分布は、この遺伝子およびその
タンパク質産物が、ヒト免疫障害の診断および処置に有用であることを示す。こ
の遺伝子産物は、サイトカイン産生、抗原提示、または他のプロセスの調節にお
いて関与し得、このことは、癌の処置（例えば、免疫応答をブーストすることに
よる）における有用性を示唆し得る。この遺伝子は、リンパ起源の細胞において
発現するので、この遺伝子またはタンパク質、ならびにこのタンパク質に対する
抗体は、上記に列挙する組織の腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標的として
有用性を示し得る。従って、これはまた、関節炎、喘息、免疫不全疾患（例えば
、ＡＩＤＳ）、白血病、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、挫瘡、およ
び乾癬を含む免疫学的障害のための薬剤として用いられ得る。さらに、この遺伝
子産物は、種々の血液系列の幹細胞および方向付けられた前駆体の拡大において
、ならびに種々の細胞型の増殖において商業的有用性を有し得る。さらに、この
遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に
挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用
性を示し得る。
【００６２】
（遺伝子番号９によってコードされるタンパク質の特徴）
開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝子は、第１２染色体に存在すると考えら
れる。従って、本発明に関するポリヌクレオチドは第１２染色体についての連鎖
分析におけるマーカーとして有用である。
【００６３】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｈｅａｒｔ＿ＮｂＨＨ１９Ｗ、そしてより少ない程
度で以下において：Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ，ｎｏｒｍａｌ；Ｅａｒｌｙ  Ｓｔ
ａｇｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ；Ｈ．ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ，ｆｒａｃ  
Ａ；Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ；Ｈｕｍａｎ  Ｔｏｎｓｉｌｓ，Ｌｉ
ｂ  ２；ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｐｕｓ  ｃｏｌｏｓｕｍ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  
ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ９３７２１８；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｆｅｔ
ａｌ  ｓｐｌｅｅｎ（＃９３７２０５）；Ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖ
ｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，ＩＬ−４  ｉｎｄｕｃｅｄ；Ｍ
ａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＧＭ−ＣＳＦ  ｔｒｅａｔｅｄ）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
ｌｉｖｅｒ（＃９３７２２４）；Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ；Ｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ａｍｙｇｄａｌａ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ  ｌｕｎｇ（＃９３７２１０）；Ｓｐｌｅｅｎ，Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，ｔｒ
ｅａｔｅｄ；Ｓｏａｒｅｓ＿ＮｈＨＭＰｕ＿Ｓ１；Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒ
ｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，ｌｉｂ  １、およびＳｏａｒｅｓ  ｉｎｆａｎｔ  ｂｒ
ａｉｎ  １ＮＩＢ。
【００６４】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：発生および免疫系の
障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬として有
用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、
組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。
上記組織または細胞、特に免疫系および発生系の多くの障害に関して、標準の遺
伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液
中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝
子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細
胞型（例えば、免疫組織、発生組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例
えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサ
ンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００６５】
ヒト胎児組織における組織分布は、この遺伝子およびそのタンパク質産物が、
発生の障害および成人免疫障害および癌の診断および処置に有用であることを示
す。この遺伝子産物は、サイトカイン産生、抗原提示、または他のプロセスの調
節において関与し得、このことは、癌の処置（例えば、免疫応答をブーストする
ことによる）における有用性を示唆し得る。この遺伝子は、リンパ起源の細胞に
おいて発現するので、この遺伝子またはタンパク質、ならびにこのタンパク質に
対する抗体は、上記に列挙する組織の腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標的
として有用性を示し得る。従って、これはまた、関節炎、喘息、免疫不全疾患（
例えば、ＡＩＤＳ）、白血病、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、挫瘡
、および乾癬を含む免疫学的障害のための薬剤として用いられ得る。さらに、こ
の遺伝子産物は、種々の血液系列の幹細胞および方向付けられた前駆体の拡大に
おいて、ならびに種々の細胞型の増殖において商業的有用性を有し得る。さらに
、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、
上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的とし
て有用性を示し得る。
【００６６】
（遺伝子番号１０によってコードされるタンパク質の特徴）
開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝子は、第１９染色体に存在すると考えら
れる。従って、本発明に関するポリヌクレオチドは第１９染色体についての連鎖
分析におけるマーカーとして有用である。
【００６７】
この遺伝子は、主にヘルパーＴ細胞（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ）および精
巣において、そしてより少ない程度でｅｘｔｅｎｔ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ
において、発現される。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：精巣および免疫系の
疾患および／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断の
ための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチ
ドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの
提供に有用である。上記組織または細胞、特に精巣および免疫系の多くの障害に
関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健
常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低い
レベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定
の組織もしくは細胞型（例えば、精巣組織、免疫組織、癌性組織および創傷組織
）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別
の組織もしくはサンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００６９】
観察された組織分布は、この遺伝子産物が、種々の障害の診断および／または
処置において有用であり得ることを示唆する。ヘルパーＴ細胞における組織分布
に基づいて、この遺伝子産物は、免疫系機能不全、白血病／リンパ腫、感染に対
する感受性、および循環障害の診断および／または処置に有用であり得る。同様
に、精巣における発現の上昇は、雄性受精における潜在的な役割、および雄性避
妊薬としてのこの遺伝子産物の潜在的な適用を示唆する。分泌されたタンパク質
はまた、生物学的活性を決定するために、抗体を惹起するために、組織マーカー
として、同属のリガンドまたはレセプターを単離するために、それらの相互作用
を調節する薬剤を同定するために、そして栄養補給剤として、使用され得る。こ
の産物はまた、非常に広範な生物学的活性を有する。これらの代表的なものは、
サイトカイン、細胞の増殖／分化調節活性、または他のサイトカインの誘導；免
疫刺激／免疫抑制活性（例えば、ヒトの免疫不全ウイルス感染、癌、自己免疫疾
患、およびアレルギーを処置するため）；造血の調節（例えば、貧血を処置する
ため、または化学療法に対する補助薬として）；骨、軟骨、腱、靭帯、および／
または神経の刺激または増殖（例えば、創傷を処置するため、卵胞刺激ホルモン
の刺激のため（受胎能の制御のため）；走化性およびケモキネシス活性（例えば
、感染、腫瘍を処置するため）；止血または血栓崩壊活性（例えば、血友病、心
筋梗塞などを処置するため）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショック、クロー
ン病を処置するため）；抗菌薬として；乾癬または他の過剰増殖性疾患を処置す
るため；代謝および挙動の調節のためである。遺伝子治療手順における対応する
核酸の使用も意図される。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこ
れらの翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーお
よび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【００７０】
（遺伝子番号１１によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
ｐｒｏｓｔａｔｅ，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｐｏｏｌｅｄ；Ｓｏａｒ
ｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｌｕｎｇ＿ＮｂＨＬ１９Ｗ、そしてより少ない程度で以下に
おいて：Ｈｕｍａｎ  Ｐｉｎｅａｌ  Ｇｌａｎｄ；Ｌ４２８、およびＡｃｔｉｖ
ａｔｅｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ（１２ｈｓ）／Ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ  ｌａｂｅｌｌ
ｅｄＥｃｏ。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害、ならびに癌を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断
のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプ
チドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブ
の提供に有用である。上記組織または細胞、特に免疫系および癌性組織の多くの
障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由
来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはよ
り低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取され
た特定の組織もしくは細胞型（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）ま
たは体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組
織もしくはサンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００７２】
ヒト前立腺および造血細胞系列における組織分布は、この遺伝子およびそのタンパク質産物が、ヒト前立腺癌および免疫系障害の診断および処置に有用であることを示す。この遺伝子産物は、サイトカイン産生、抗原提示、または他のプロセスの調節に関与し得、（例えば、免疫応答をブーストすることによる）ガンの処置における有用性をまた示唆し得る。この遺伝子は、リンパ系起源の細胞において発現するので、この遺伝子またはタンパク質、ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。従って、それはまた、関節炎、喘息、ＡＩＤＳのような免疫不全疾患、白血病、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、挫創、乾癬を含む、免疫学的障害のための薬剤としても有用であり得る。さらに、この遺伝子産物は、様々な血液系列の幹細胞および方向付けられた前駆細胞の拡大において、ならびに様々な細胞型の分化および／または増殖において商業的有用性を有し得る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【００７３】
（遺伝子番号１２によってコードされるタンパク質の特徴）  この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：Ｈｕｍａｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｒａｉｎ  ＃２  −  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ＞  １．５Ｋｂ；Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、そしてより少ない程度で以下において：Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（ＲＳ４，１１）；Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ＩＩ；Ｔｅｓｔｉｓ  １；Ｈｕｍａｎ  ８  Ｗｅｅｋ  Ｗｈｏｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ；Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａ  ｃＤＮＡ  Ｔｓｐ５０９Ｉ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｓｕｂｌｉｂｒａｒｙ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｓｃｈｉｚｏ  ｂｒａｉｎ  Ｓ１１；Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ，Ｅｎｄｏ．ｒｅｍａｋｅ；Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｏｍａｃｈ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈ．Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ；Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆａｎｔ  Ｂｒａｉｎ；Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ；Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ；Ｔ−Ｃｅｌｌ  ＰＨＡ  ２４  ｈｒｓ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｈＮＴ  ｎｅｕｒｏｎ（＃９３７２３３）；Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｓｔｅｓ  Ｔｕｍｏｒ；Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｆｒａｃ  ２；Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  ８  Ｗｅｅｋ  Ｗｈｏｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｌｕｎｇ＿ＮｂＨＬ１９Ｗ、およびＰｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，ｌｉｂ  １。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：神経系および免疫系
の疾患および／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断
のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプ
チドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブ
の提供に有用である。上記組織または細胞、特に神経系および免疫系の多くの障
害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来
の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより
低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された
特定の組織もしくは細胞型（例えば、神経組織、免疫組織、癌性組織および創傷
組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、また
は別の組織もしくはサンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００７５】
この遺伝子の組織分布は、このクローンが、神経発生、神経変性、造血および
免疫の障害および新生物の診断および／または処置に有用であり得ることを示唆
する。この遺伝子産物は、サイトカイン産生、抗原提示、または他のプロセスの
調節において関与し得、このことは、癌の処置（例えば、免疫応答をブーストす
ることによる）における有用性を示唆し得る。この遺伝子は、リンパ起源の細胞
において発現するので、この遺伝子またはタンパク質、ならびにこのタンパク質
に対する抗体は、上記に列挙する組織の腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標
的として有用性を示し得る。従って、これはまた、関節炎、喘息、免疫不全疾患
（例えば、ＡＩＤＳ）、白血病、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、挫
瘡、および乾癬を含む免疫学的障害のための薬剤として用いられ得る。さらに、
この遺伝子産物は、種々の血液系列の幹細胞および方向付けられた前駆体の拡大
において、ならびに種々の細胞型の増殖において商業的有用性を有し得る。さら
に、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は
、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的と
して有用性を示し得る。
【００７６】
（遺伝子番号１３によりコードされるタンパク質の特徴）
Ｕ９３７骨髄細胞株に対して試験した場合、この遺伝子を含む細胞から得られ
た上清は、ＧＡＳアッセイを活性化した。従って、この遺伝子は、Ｊａｋ−ＳＴ
ＡＴシグナル伝達経路を介して、骨髄細胞を活性化するようである。γ活性化配
列（ＧＡＳ）は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路に関与する多くの遺伝子の上流に見出さ
れるプロモーターエレメントである。このＪａｋ−ＳＴＡＴ経路は、細胞の分化
および増殖に関与する大きなシグナル伝達経路である。従って、Ｊａｋ−ＳＴＡ
Ｔ経路の活性化（ＧＡＳエレメントの結合により反映される）を用いて、細胞の
増殖および分化に関与するタンパク質を示し得る。
【００７７】
この遺伝子は、神経／感覚組織において、および初代樹状細胞において、ある
程度富化して偏在的に発現される。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：神経系および免疫系
の疾患および／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断
のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプ
チドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブ
の提供に有用である。上記組織または細胞、特に神経系および免疫系の多くの障
害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来
の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより
低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された
特定の組織もしくは細胞型（例えば、神経組織、免疫組織、癌性組織および創傷
組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、また
は別の組織もしくはサンプルの中で、慣用的に検出され得る。
【００７９】
観察された組織分布は、種々の疾患の研究、診断および／または処置について
の有用性を示唆する。神経／感覚組織における富化発現は、この遺伝子が、アル
ツハイマー病、パーキンソン病、学習障害のような神経変性性障害および行動障
害の処置、検出および／または診断に有用であり得ることを示す。あるいは、樹
状細胞における発現および観察された生物学的活性は、免疫系疾患および／また
は障害、ならびに感染性疾患の研究、診断、および／または処置についての有用
性を示唆する。この遺伝子産物は、サイトカイン産生、抗原提示、または他のプ
ロセスの調節において関与し得、このことは、癌の処置（例えば、免疫応答をブ
ーストすることによる）における有用性を示唆する。この遺伝子は、リンパ起源
の細胞において発現するので、この遺伝子またはタンパク質、ならびにこのタン
パク質に対する抗体は、上記に列挙された組織の腫瘍マーカーおよび／または免
疫療法標的としての有用性を示し得る。従って、この遺伝子はまた、関節炎、喘
息、免疫不全疾患（例えば、ＡＩＤＳ）、白血病、慢性関節リウマチ、炎症性腸
疾患、敗血症、挫瘡、および乾癬を含む免疫学的障害のための薬剤として用いら
れ得る。さらに、この遺伝子産物は、種々の血液系列の幹細胞および方向付けら
れた前駆体の拡大において、ならびに種々の細胞型の分化および／または増殖に
おいて商業的有用性を有し得る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、なら
びにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マー
カーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【００８０】
（遺伝子番号１４によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、主に免疫系／造血系の細胞において、とりわけ、単球および樹
状細胞、ならびに胎児肝臓および脾臓（造血機能を有することが公知）において
発現される。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に造血系および発生系の多くの障害に関して、
標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織ま
たは体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルの
この遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織も
しくは細胞型（例えば、免疫系、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば
、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプ
ルの中で、慣用的に検出され得る。
【００８２】
造血機能を有することが公知である、胎児肝臓および脾臓におけるその発現、
ならびに樹状細胞における発現に基づいて、この遺伝子およびそのコードするポ
リペプチドは、自己免疫障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および慢性関
節リウマチを含む）において観察されるような免疫系の過剰な活性などの免疫機
能に関連する障害の診断および処置に、または特定の免疫細胞血球減少のような
乏しい免疫機能に関連する障害の処置において有用であり得る。この遺伝子産物
はまた、器官移植およびアレルギーにおける免疫応答の調節に有用であり得る。
この遺伝子は、免疫障害の処置に、または腫瘍に対する免疫ベースの治療の開始
に有用であり得る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの
翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／
または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【００８３】
（遺伝子番号１５によってコードされるタンパク質の特徴）
コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＸを使用して、この遺伝子の翻訳産物
が、非限定的な例として、以下のデータベースの受託番号ｇｂ｜ＡＡＢ５７６７
９．１｜（列挙される受託番号を通じて入手可能な全ての情報が、本明細書中で
参考として援用される）を通してアクセス可能な配列（これは、ここでは「｜ｔ
ｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＵＮＣ５Ｈ２［Ｒａｔｔｕｓ  
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ]」として記載される）と配列相同性を共有することを決
定した。観察される相同性を示す部分的なアライメントをすぐ下に示す。
【００８４】
【化３】
2011087587.tif 000004
上記で「Ｓ」として示されるｇｂ｜ＡＡＢ５７６７９．１｜のセグメントは、
配列番号：として配列表中に示される。構造的な類似性に基づいて、これらの相
同なポリペプチドは、少なくともいくつかの生物学的活性を共有することが予期
される。このような活性は、当該分野で公知であり、そしてそのいくつかが本明
細書中の他で記載される。このような活性を決定するためのアッセイもまた、当
該分野で公知であり、そのいくつかが、本明細書中の他で記載されている。本発
明の好ましいポリペプチドは、上記で示されるアライメント（コンピューターに
よって、配列に導入されたギャップは、もちろん除去される）において、「Ｑ」
配列に対応する配列番号：として配列表に示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを含む。
【００８５】
この遺伝子の翻訳産物は、発生中の神経系において重要であると考えられるネ
トリン（ｎｅｔｒｉｎ）レセプターと配列相同性を共有する。このネトリンは、
拡散性誘引物質として、ならびに異なるクラスの細胞および軸索についての忌避
薬として機能し得る、系統学的に保存された指導合図（ガイダンスキュー：ｇｕ
ｉｄａｎｃｅ  ｃｕｅ）のファミリーである。脊椎動物、昆虫および線虫におい
て、免疫グロブリンスーパーファミリーのＤＣＣサブファミリーのメンバーは、
ネトリン供給源に向かう遊走に関与するレセプターとみなされている。ラットネ
トリンレセプターに対するヒト遺伝子産物の配列類似性に基づき、このクローン
の翻訳産物は、ネトリンレセプタータンパク質と少なくともいくつかの生物学的
活性を共有することが期待される。このような活性は、当該分野で公知であり、
そのいくつかが、本明細書のいずれかに記載されている。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：Ｅ
ＧＥＧＱＩＦＱＬＨＴＴＬＡＥＴＰＡＧＳＬＤＴＬＣＳＡＰＧＸＴＶＴＴＱＬＧ
ＰＹＡＦＫＩＰＬＳＩＲＱＫＩＣＮＳＬＤＡＰＮＳＲＧＮＤＷＲＭＬＡＱＫＬＳ
ＭＤＲＹＬＮＹＦＡＴＫＡＳＰＴＧＶＩＬＤＬＷＥＡＬＱＱＤＤＧＤＬＮＳＬＡ
ＳＡＬＥＥＭＧＫＳＥＭＬＶＡＶＡＴＤＧＤＣ（配列番号１５２）、
を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列番号から構成される。さらに、これ
らのポリペプチドのフラグメントおよび改変体（例えば、本明細書に記載のフラ
グメント、これらのポリペプチドに少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチド、およびこれ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドなど）が
、本発明により包含される。本発明のポリペプチドに結合する抗体がまた、本発
明により包含される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはま
た、本発明により包含される。
【００８７】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｉｎｆａｎｔ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ、そしてより少な
い程度で以下において：Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ，ｓｅｒｕｍ  ｔｒｅａｔ
ｅｄ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ５；Ｓｏａｒｅｓ＿ｍｕｌｔｉｐｌｅ＿ｓｃｌ
ｅｒｏｓｉｓ＿２ＮｂＨＭＳＰ；Ｓｏａｒｅｓ  ｏｖａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  Ｎｂ
ＨＯＴ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｐｒｅｇｎａｎｔ＿ｕｔｅｒｕｓ＿ＮｂＨＰＵ；Ｈ．Ｅ
ｐｉｄｉｄｉｙｍｕｓ，ｃａｕｄａ；Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ−  ＨＡＳＴ
Ｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｓｙｎｏｖｉｕｍ；Ｇｅｓｓｌｅｒ  
Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ；Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ；Ｈｕｍ
ａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐａｎ
１；Ｆｅｔａｌ  Ｈｅａｒｔ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿ＧＣ４；Ｏｓｔｅｏｂｌａｓ
ｔｓ；Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ；Ｓｏａｒｅｓ＿ＮＦＬ＿Ｔ＿ＧＢＣ
＿Ｓ１；Ｓｏａｒｅｓ＿ＮｈＨＭＰｕ＿Ｓ１；Ｓｏａｒｅｓ  ｉｎｆａｎｔ  ｂ
ｒａｉｎ  １ＮＩＢ；Ｈｕｍａｎ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ；Ｓｉｎｕｓ  ｐｉｎｉ
ｆｏｒｍｉｓ  Ｔｕｍｏｕｒ；Ｈｕｍａｎ  ＯＢ  ＭＧ６３  ｔｒｅａｔｅｄ（
１０  ｎＭ  Ｅ２）ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉ；Ｂａｒｓｔｅａｄ  ｓｐｌｅｅｎ  
ＨＰＬＲＢ２；Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  Ｂｏｎｅ  
Ｃｅｌｌｓ；Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｓｍｏｏｔｈ  
Ｍｕｓｃｌｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｔｒｅａｔｅｄ，Ｎｏｒｍ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓ
ｃｌｅ−ＩＬｂ  ｉｎｄｕｃｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｂｒｅａｓｔ；
ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿ＡＡ１；Ｐａｌａｔｅ  ｎｏｒｍａｌ；Ｈｕｍａｎ  ａｄｕ
ｌｔ（Ｋ．Ｏｋｕｂｏ）；Ｈ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｃｏｒｔｅｘ，ｓｕｂｔｒａｃｔ
ｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ；Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ＢＰＨ；Ｓ
ｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ
Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ；１２  Ｗｅｅｋ  Ｏｌｄ  Ｅａ
ｒｌｙ  Ｓｔａｇｅ  Ｈｕｍａｎ，ＩＩ；Ｈｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ
ＩＩ；Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｔｕｍｏｒ；Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌ
ｌ  ＴＦ２７４；Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｔｕｍｏｒ，Ｒｅｅｘｃｉｓ
ｉｏｎ；Ｏｖａｒｙ，Ｃａｎｃｅｒ（９８０９Ｃ３３２）：Ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｈｅｍａｎｇｉｏ
ｐｅｒｉｃｙｔｏｍａ；Ｓｏａｒｅｓ  ｂｒｅａｓｔ  ２ＮｂＨＢｓｔ；Ｈｕｍ
ａｎ  Ａｄｒｅｎａｌ  Ｇｌａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ
，ｓｅｒｕｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ，ｒｅ−ｅｘｃ；Ｐａｎｃｒｅａｓ  Ｉｓｌｅｔ
Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ；Ｃｏｌｏｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ＩＩ；Ａｄｉｐｏｃｙｔ
ｅｓ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ８；Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ，Ｒ
ｅｅｘｃｉｓｉｏｎ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ３；Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍ
ａｒｒｏｗ，ｔｒｅａｔｅｄ；Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ＩＩ；
Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｌｕｎｇ＿ＮｂＨＬ１
９Ｗ、およびＣｏｌｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  ＩＩ。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：神経系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に神経系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、神経組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００８９】
脳における組織分布および膜貫通レセプターＵＮＣ５Ｈ２［Ｒａｔｔｕｓ  ｎ
ｏｒｖｅｇｉｃｕｓ］に対する配列番号相同性は、このクローンのタンパク質産
物が、神経変性性疾患状態、行動障害、または炎症性状態の検出、処置および／
または予防に有用であることを示す。代表的な用途は、本明細書中の、以下の「
再生」および「過剰増殖性障害」のセクションにおいて、実施例１１、１５およ
び１８において、ならびに他のいずれかにおいて、記載される。要するに、この
用途としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット
症候群、髄膜炎、脳炎、脱髄疾患、末梢神経障害、新形成、外傷、先天性異常、
脊髄傷害、虚血および梗塞形成、動脈瘤、出血、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執
症、強迫性障害、鬱病、恐慌性障害、学習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉、および
行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、および知覚の障害を含む）の検出、
処置、および／または予防が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、脳の
領域におけるこの遺伝子産物の発現の上昇は、これが正常な神経機能において役
割を果たすことを示す。潜在的に、この遺伝子産物は、シナプス形成、神経伝達
、学習、認識、恒常性、あるいはニューロンの分化または生存に関与する。さら
に、このタンパク質はまた、栄養補給剤としてのその用途に加えて、生物学的活
性を決定するために、抗体を惹起するために、組織マーカーとして、同属のリガ
ンドまたはレセプターを単離するために、それらの相互作用を調節する薬剤を同
定するために使用され得る。タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は
、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的と
して有用性を示し得る。
【００９０】
（遺伝子番号１６によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｐｏｏｌｅｄ；ｈｕｍａｎ  ｔｏｎｓｉｌｓ
。
【００９１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００９２】
扁桃および樹状細胞におけるその発現に基づいて、この遺伝子およびそのコー
ドするポリペプチドは、自己免疫障害（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およ
び慢性関節リウマチを含む）において観察されるような免疫系の過剰な活性など
の免疫機能に関連する障害の診断および処置に、または特定の免疫細胞血球減少
のような乏しい免疫機能に関連する障害の処置において有用であり得る。この遺
伝子産物はまた、器官移植およびアレルギーにおける免疫応答の調節に有用であ
り得る。
【００９３】
（遺伝子番号１７によってコードされるタンパク質の特徴）
本発明の好ましいポリペプチドは、配列表に配列番号１４８として示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを含むか、あるいはこのようなポリペプチドか
らなる。さらに、これらのポリペプチドのフラグメントおよび改変体（例えば、
本明細書に記載のフラグメント、これらのポリペプチドに少なくとも、８０％、
８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリ
ペプチド、およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、など）がまた、本発明により包含される。本発明のポリペプチド
に結合する抗体がまた、本発明により包含される。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【００９４】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
ＫＭＨ２；Ｈｕｍａｎ  Ａｄｒｅｎａｌ  Ｇｌａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ；Ｄｅｎｄｒ
ｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｐｏｏｌｅｄ；Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｌ
ｉｎｅ（ＲＳ４，１１）。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００９６】
骨髄および樹状細胞における発現に基づいて、この遺伝子およびそのコードす
る遺伝子産物は、自己免疫症候群（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節
リウマチ、多発性硬化症、糖尿病、および免疫不全症候群）を含む免疫系の疾患
の診断および処置に有用であり得る。この遺伝子はまた、器官移植またはアレル
ギーのような状態において免疫応答を調節するのに有用であり得る。さらに、こ
の遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記
に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有
用性を示し得る。
【００９７】
（遺伝子番号１８によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて例示されるように
、主に、２つの異なる型の組織、例えば、免疫機能／造血機能の細胞、および精
巣において発現される：Ｈｕｍａｎ  Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ；Ｈｕｍａｎ  Ｔ
ｅｓｔｅｓ，Ｒｅｅｘｃｉｓｉｏｎ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ３；Ｅａｒｌｙ  
Ｓｔａｇｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ；Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｉｎｄｕｃｅ
ｄ；Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ（１２ｈ）／Ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ−
ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ＩＩ；Ｓｏａｒｅｓ＿
ｆｅｔａｌ＿ｈｅａｒｔ＿ＮｂＨＨ１９Ｗ；Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉ
ｃ  Ｃｅｌｌｓ，ｌｉｂ  １；ＨＳＣ１７２  ｃｅｌｌｓ；Ｈ．Ｅｐｉｄｉｄｉ
ｙｍｕｓ，ｃａｐｕｔ  ＆  ｃｏｒｐｕｓ；Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ−  Ｈ
ＡＳＴＥ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ；Ａｍｎｉｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ｐｒｉ
ｍａｒｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ２２；Ｓｏａｒｅｓ＿ｐｉ
ｎｅａｌ＿ｇｌａｎｄ＿Ｎ３ＨＰＧ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ２８；ＮＣＩ＿Ｃ
ＧＡＰ＿ＣＬＬ１；Ｒｅｓｔｉｎｇ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，ＩＩ；Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃｏｌｏｎ（＃９３７２０４）；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃ
ｅｌｌｓ，ｐｏｏｌｅｄ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｐｒｅｇｎａｎｔ＿ｕｔｅｒｕｓ＿Ｎ
ｂＨＰＵ；Ｓｏａｒｅｓ＿ＮｈＨＭＰｕ＿Ｓ１；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ１；Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ７  ＨｅＬａ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ；Ａｔｒｉｕｍ
ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
７  Ｆｅｔａｌ  Ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ；Ｈｕｍａｎ  ＯＢ
ＭＧ６３  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｉ；Ｃｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃ
ｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅ  ｔｒｅａｔｅｄ；Ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ（
ｈｕｍａｎ），ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ
ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔｒａｄｉｏ
ｌ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ，ＩＬ１ｂ  ｉｎｄｕｃｅｄ；Ｓｙｎｏｖｉａ
ｌ  ｈｙｐｏｘｉａ−ＲＳＦ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｗｈｏｌｅ
Ｂｒａｉｎ  ＃２  −  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ＞  １．５Ｋｂ；ＨＬ−６０，Ｐ
ＭＡ  ４Ｈ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；ＬＮＣＡＰ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃｅｌ
ｌ  ｌｉｎｅ；Ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ；Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ−ｃｅｌ
ｌ  Ｇ１  ｐｈａｓｅ；Ｂｒａｉｎ  Ｆｒｏｎｔａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ，ｒｅ−ｅ
ｘｃｉｓｉｏｎ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（＃
９３７２３１）；Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ，Ｒｅｅｘｃｉｓ
ｉｏｎ；Ｇｅｓｓｌｅｒ  Ｗｉｌｍｓ  ｔｕｍｏｒ；ＨＵＭＡＮ  ＪＵＲＫＡＴ
ＭＥＭＢＲＡＮＥ  ＢＯＵＮＤ  ＰＯＬＹＳＯＭＥＳ；Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａ
ｌ  Ｄｕｒａ  Ｍａｔｅｒ；Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ
；Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｐｏｔｈａｌｍｕｓ，Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ；ＮＣＩ
＿ＣＧＡＰ＿Ｂｒ２；Ｈｕｍａｎ  Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ；Ｈｕｍ
ａｎ  ａｄｕｌｔ  ｔｅｓｔｉｓ，ｌａｒｇｅ  ｉｎｓｅｒｔｓ；Ｐａｎｃｒｅ
ａｓ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｕｍｏｒ；Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ；
ｂｒｅａｓｔ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ＣＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ；Ａｄｉｐｏ
ｃｙｔｅｓ；ＣＤ３４  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  Ｂｕｆｆｙ  Ｃｏａｔ（Ｃｏｒｄ  
Ｂｌｏｏｄ），ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌ
ａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ｆｒａｃｔ．Ａ；Ｍｏｎｏｃｙｔ
ｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ；ＨＵＭＡＮ  Ｂ  ＣＥＬＬ  ＬＹＭＰＨＯＭＡ；Ｓｐ
ｌｅｅｎ，Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；Ｈｕ
ｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，ｔｒｅａｔｅｄ；Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｓｔｅｓ
；Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｌｉｖｅｒ＿ｓｐｌｅｅｎ＿１ＮＦＬＳ＿Ｓ１、
およびＳｏａｒｅｓ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｓｐｌｅｅｎ  １ＮＦＬＳ。
【００９８】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：免疫系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、免疫組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【００９９】
免疫機能に関連する種々の供給源（例えば、好酸球、リンパ節、Ｔ細胞および
樹状細胞）におけるその発現に基づいて、この遺伝子およびそのコードするポリ
ペプチドは、自己免疫症候群（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および慢性関
節リウマチを含む）において観察されるような、免疫機能に関連する障害（例え
ば、免疫系の過剰な活性が病原となる障害）の診断および処置に、または特定の
免疫細胞減少症のような乏しい免疫機能に関連する障害の処置において、有用で
あり得る。この遺伝子はまた、器官移植またはアレルギーのような状態において
免疫応答を調節するのに有用であり得る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産
物、ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する
腫瘍マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【０１００】
（遺伝子番号１９によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｂｒａｉｎ；ｐＢＭＣ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｗ／
ｐｏｌｙ  Ｉ／Ｃ。
【０１０１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：神経系の疾患および
／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のための試薬
として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する
抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供に有用
である。上記組織または細胞、特に神経系の多くの障害に関して、標準の遺伝子
発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または体液中の
発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの遺伝子の
発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしくは細胞型
（例えば、神経組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、
血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、
慣用的に検出され得る。
【０１０２】
発生中の脳における発現に起因して、この遺伝子およびそのコードするポリペ
プチドは、脳卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症、ＡＬＳ、ならびに認識お
よび学習機能の損失に関連する他の障害の診断および処置に有用であり得る。こ
のタンパク質はまた、神経細胞の再生および再成長が必要である、脊髄および他
の神経損傷の処置に有用であり得る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、
ならびにこれらの翻訳産物に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍
マーカーおよび／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【０１０３】
（遺伝子番号２０によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
Ｓｏａｒｅｓ＿ｐｒｅｇｎａｎｔ＿ｕｔｅｒｕｓ＿ＮｂＨＰＵ、そしてより少な
い程度で以下において：Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ
ｃｅｌｌｓ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ；ＮＣＩ
＿ＣＧＡＰ＿Ｐｒ２８；Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ
ｃｅｌｌｓ；Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；Ｈｕｍａｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｒａｉ
ｎ  ＃２  −  Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ＞  １．５Ｋｂ；Ｓｏａｒｅｓ＿ＮｈＨＭＰ
ｕ＿Ｓ１；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿ＧＣＢ１；Ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ
ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｓｔｒａｄｉｏ
ｌ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ１０；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｕｔ２；ＮＣＩ＿ＣＧＡ
Ｐ＿Ｇａｓ４；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｐａｎ１；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿ＧＣ４；ＮＣ
Ｉ＿ＣＧＡＰ＿ＧＣ６；Ｓｏａｒｅｓ  ｏｖａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ＮｂＨＯＴ；
Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（ＲＳ４，１１）；Ｈｏｄｇｋｉ
ｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ＩＩ；Ｈｕｍａｎ  ８  Ｗｅｅｋ  Ｗｈｏｌｅ  Ｅ
ｍｂｒｙｏ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｌｕｎｇ＿ＮｂＨＬ１９Ｗ；Ｔ  ｃｅ
ｌｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ＩＩ；Ｓｏａｒｅｓ＿ＮＦＬ＿Ｔ＿ＧＢＣ＿Ｓ１；Ｈｅａ
ｌｉｎｇ  Ａｂｄｏｍｅｎ  Ｗｏｕｎｄ，１５  ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｉｎｃｉ
ｓｉｏｎ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｏｖ３５；Ｔｅｓｔｉｓ  １；Ｈｕｍａｎ  ８  
Ｗｅｅｋ  Ｗｈｏｌｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ；Ｈｕｍａｎ  ｒ
ｅｔｉｎａ  ｃＤＮＡ  Ｔｓｐ５０９Ｉ−ｃｌｅａｖｅｄ  ｓｕｂｌｉｂｒａｒ
ｙ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｏｖ２３；Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ；Ｈ．
Ｅｐｉｄｉｄｉｙｍｕｓ，ｃａｕｄａ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｓｃｈｉｚｏ  
ｂｒａｉｎ  Ｓ１１；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｃｏ９；Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃ
ａｌ  Ｖｅｉｎ，Ｅｎｄｏ．ｒｅｍａｋｅ；Ｏｖａｒｙ，Ｃａｎｃｅｒ：（１５
７９９Ａ１Ｆ）Ｐｏｏｒｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃａｒｃｉｎｏ
ｍａ；Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｏｍａｃｈ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；ｗｉｌｍ’ｓ  
ｔｕｍｏｒ；Ｈｕｍａｎ  Ｍａｎｉｃ  Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ；
Ｈ．Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ；Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｆ
ａｎｔ  Ｂｒａｉｎ；Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ａｎ
ｇｉｏｇｅｎｉｃ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｕｔ１；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ６；
Ｈｕｍａｎ  Ｆｅｔａｌ  Ｄｕｒａ  Ｍａｔｅｒ；Ｈｕｍａｎ  Ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌｓ；Ｔ−Ｃｅｌｌ  ＰＨＡ  ２４  ｈｒｓ；ＮＣＩ＿ＣＧＡ
Ｐ＿ＣＬＬ１；Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；ＣＨ
ＭＥ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ，ｔｒｅａｔｅｄ  ５  ｈｒｓ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ  ｈＮＴ  ｎｅｕｒｏｎ（＃９３７２３３）；Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｌ
ｙｍｐｈｏｍａ；Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｃｅｎ
ｔａ；ＮＣＩ＿ＣＧＡＰ＿Ｋｉｄ１１；Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｓｔｅｓ  Ｔｕｍｏｒ
；Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，ｆｒａｃ  ２；Ｐａｎｃ
ｒｅａｓ  ｎｏｒｍａｌ  ＰＣＡ４  Ｎｏ；Ｈｕｍａｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｐｕｌｍ
ｏｎａｒｙ，ｒｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎ；Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ，
ｔｒｅａｔｅｄ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ＿ｔｕｍｏｒ＿ＮｂＨ
ＰＡ；Ｓｏａｒｅｓ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ２ＮｂＨＭ；Ｃｏｌｏｎ  Ｔｕｍ
ｏｒ  ＩＩ；Ｓｏａｒｅｓ＿ｆｅｔａｌ＿ｈｅａｒｔ＿ＮｂＨＨ１９Ｗ、および
Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ，ｌｉｂ  １。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：生殖、免疫、および
造血系の疾患および／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態
の診断のための試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポ
リペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プ
ローブの提供に有用である。上記組織または細胞、特に生殖系、免疫系および造
血系の多くの障害に関して、標準の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有
さない個体由来の健常組織または体液中の発現レベル）に対して有意により高い
か、またはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体
から採取された特定の組織もしくは細胞型（例えば、生殖組織、免疫組織、造血
組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿
、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプルの中で、慣用的に検出さ
れ得る。
【０１０５】
観察された組織分布は、この遺伝子産物が、生殖系、新形成、および他の増殖
障害の疾患の診断および／または処置に有用であり得ることを示唆する。同様に
、造血細胞における発現は、種々の血球細胞系列の増殖、生存、分化および／ま
たは活性化における役割、ならびに免疫機能不全、自己免疫、白血病／リンパ腫
、感染に対する感受性、および循環障害におけるこの遺伝子産物の関与を示し得
る。さらに、この遺伝子に対応する翻訳産物、ならびにこれらの翻訳産物に対す
る抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療
の標的として有用性を示し得る。
【０１０６】
（遺伝子番号２１によってコードされるタンパク質の特徴）
本発明の好ましいポリペプチドは、配列表に配列番号：配列番号：および／ま
たは配列番号１５６として示されるアミノ酸配列：１５７）を有するポリペプチ
ドを含むか、あるいはこのようなポリペプチドからなる。さらに、これらのポリ
ペプチドのフラグメントおよび改変体（例えば、本明細書に記載のフラグメント
、これらのポリペプチドに少なくとも、８０％、８５％、９０％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％同一であるポリペプチド、およびこれらのポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、など）がまた、
本発明により包含される。本発明のポリペプチドに結合する抗体がまた、本発明
により包含される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた
、本発明により包含される。
【０１０７】
この遺伝子に対応する翻訳産物は、ヒトデルマタン（ｄｅｒｍａｔａｎ）／コ
ンドロイチン硫酸２−スルホトランスフェラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録
番号ＡＢ０２０３１６を参照のこと）と配列相同性を共有する。
【０１０８】
この遺伝子は、主に以下の組織／ｃＤＮＡライブラリーにおいて発現される：
ＳＴＲＯＭＡＬ  −ＯＳＴＥＯＣＬＡＳＴＯＭＡ；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌ
ｌｓ，ｐｏｏｌｅｄ；Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ，ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｎｉｎｅ
Ｗｅｅｋ  Ｏｌｄ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｔａｇｅ  Ｈｕｍａｎ。
【０１０９】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的サンプル中に存在
する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下：筋骨格系組織の疾患
および／または障害を含むがそれらに限定されない疾患および状態の診断のため
の試薬として有用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに
対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブの提供
に有用である。上記組織または細胞、特に筋骨格系の多くの障害に関して、標準
の遺伝子発現レベル（すなわち、その障害を有さない個体由来の健常組織または
体液中の発現レベル）に対して有意により高いか、またはより低いレベルのこの
遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織もしく
は細胞型（例えば、筋骨格組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば
、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、または別の組織もしくはサンプ
ルの中で、慣用的に検出され得る。
【０１１０】
この分泌タンパク質は、生物学的活性を決定するため、抗体を惹起するため、
組織マーカーとして、同種のリガンドまたはレセプターを単離するために、それ
らの相互作用を調節する薬剤を同定するために、そして栄養補給剤として、使用
され得る。このタンパク質はまた、非常に広範な生物学的活性を有し得る。代表
的な用途は、以下の「走化性」および「結合活性」の節、実施例１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１８、１９および２０、ならびに本明細書中の他の箇所
において記載される。簡潔には、このタンパク質は、以下の活性を有し得る：サ
イトカイン、細胞の増殖／分化調節活性、または他のサイトカインの誘導；免疫
刺激／免疫抑制活性（例えば、ヒトの免疫不全ウイルス感染、癌、自己免疫疾患
、およびアレルギーを処置するため）；造血の調節（例えば、貧血を処置するた
め、または化学療法に対する補助薬として）；骨、軟骨、腱、靭帯、および／ま
たは神経の刺激または増殖（例えば、創傷を処置するため、卵胞刺激ホルモンの
刺激のため（受胎能の制御のため）；走化性およびケモキネシス活性（例えば、
感染、腫瘍を処置するため）；止血または血栓崩壊活性（例えば、血友病、心筋
梗塞などを処置するため）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショック、クローン
病を処置するため）；抗菌薬として；乾癬または他の過剰増殖性疾患を処置する
ため；代謝および挙動の調節のため。遺伝子治療手順における対応する核酸の使
用も意図される。巨骨細胞腫におけるこの遺伝子産物の発現のレベルの上昇は、
この産物が巨骨細胞腫の生存、増殖および／または成長において役割を果たし得
ることを示唆する。従って、この産物は、骨粗しょう症のような状態において骨
量に影響するのに有用であり得る。さらに、このタンパク質はまた、栄養補給剤
としての使用に加えて、生物学的活性を決定するため、抗体を惹起するため、組
織マーカーとして、同種のリガンドまたはレセプターを単離するために、それら
の相互作用を調節する薬剤を同定するために、使用され得る。タンパク質ならび
にこのタンパク質に対する抗体は、上記に挙げられた組織に対する腫瘍マーカー
および／または免疫治療の標的として有用性を示し得る。
【０１１１】
【表１】
2011087587.tif 000005
2011087587.tif 000006
2011087587.tif 000007
2011087587.tif 000008
2011087587.tif 000009
2011087587.tif 000010
2011087587.tif 000011
表１は、上記の各「遺伝子番号」に対応する情報を要約する。「ヌクレオチド
配列番号Ｘ（ＮＴ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）」として同定されるヌクレオチド
配列は、表１において同定される「ｃＤＮＡクローンＩＤ」から、およびいくつ
かの場合において、さらなる関連のＤＮＡクローンから得られる部分的に相同な
（「重複する」）配列から構築された。重複する配列は、高い重複性の単一の連
続した配列に構築され（通常、各ヌクレオチド部位で３〜５個の重複する配列）
、配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）として同定される最終的な配列を得た
。
【０１１２】
ｃＤＮＡクローンＩＤは、その日付に寄託され、そして「ＡＴＣＣ受託番号Ｚ
および日付」において列挙される対応する受託番号が与えられた。寄託物のいく
つかは、同じ遺伝子に対応する複数の異なるクローンを含む。「ベクター」とは
、ｃＤＮＡクローンＩＤにおいて含まれるベクターの型をいう。
【０１１３】
「総ヌクレオチド配列（Ｔｏｔａｌ  ＮＴ  Ｓｅｑ）」は、「遺伝子番号（Ｇ
ｅｎｅ  Ｎｏ）」によって同定されるコンティグにおけるヌクレオチドの総数を
いう。寄託されたクローンは、これらの配列の全てまたは大半を含み得、これら
は、配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）の「クローン配列の５’ヌクレオチ
ド」および「クローン配列の３’ヌクレオチド」として示されるヌクレオチドの
位置によって反映される。推定開始コドン（メチオニン）の配列番号Ｘ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）のヌクレオチドの位置は、「開始コドンの５’ヌクレオチド
」として同定される。同様に、推定シグナル配列の配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：Ｘ）のヌクレオチドの位置は、「シグナルペプチドの最初のアミノ酸の５
’ヌクレオチド」として同定される。
【０１１４】
翻訳されたアミノ酸配列は、メチオニンで始まり、「アミノ酸配列番号Ｙ（Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）」として同定されるが、他のリーディングフレームもま
た、公知の分子生物学技術を使用して容易に翻訳され得る。これらの代替のオー
プンリーディングフレームによって生成されるポリペプチドは、本発明によって
特に意図される。
【０１１５】
推定シグナルペプチドの配列番号Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）の最初および
最後のアミノ酸の位置は、「シグナルペプチドの最初のアミノ酸」および「シグ
ナルペプチドの最後のアミノ酸」として同定される。分泌部分の配列番号Ｙ（Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）の推定される最初のアミノ酸の位置は、「分泌部分の推
定される最初のアミノ酸」として同定される。最後に、オープンリーディングフ
レームにおける最後のアミノ酸の配列番号Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）のアミ
ノ酸の位置は、「ＯＲＦの最後のアミノ酸」として同定される。
【０１１６】
配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）（ここでＸは、配列表に開示される任
意のポリヌクレオチド配列であり得る）および翻訳された配列番号Ｙ（ＳＥＱ  
ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）（ここでＹは、配列表に開示される任意のポリペプチド配列で
あり得る）は、十分に正確であり、そしてそうでなければ、当該分野において周
知の種々の用途および以下でさらに記載される種々の用途に適切である。例えば
、配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）は、配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ
：Ｘ）において含まれる核酸配列または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ
を検出する核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計するために有用である。
これらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズし、
それによって本発明の種々の法医学的方法、および診断方法を可能にする。同様
に、配列番号Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）から同定されるポリぺプチドは、例
えば、表１において同定されるｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク
質（ポリペプチドおよび分泌タンパク質を含む）に特異的に結合する抗体を作製
するために使用され得る。
【０１１７】
それにもかかわらず、配列決定反応によって生成されるＤＮＡ配列は、配列決
定のエラーを含み得る。このエラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、
または生成されたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存
在する。誤って挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸
配列のリーディングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場
合において、作製されるＤＮＡ配列が、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば
、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入ま
たは欠失）を超えて同一であり得るとしても、推定アミノ酸配列は、実際のアミ
ノ酸配列とは異なる。
【０１１８】
従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）として
同定される作製されたヌクレオチド配列、および配列番号Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：Ｙ）として同定される推定の翻訳されたアミノ酸配列のみならず、表１にお
いて記載されるような、ＡＴＣＣに寄託された本発明のヒトｃＤＮＡを含むプラ
スミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。各々の寄託されたクローンのヌクレオ
チド配列は、公知の方法に従って、寄託されたクローンを配列決定することによ
って容易に決定され得る。次いで、推定アミノ酸配列は、このような寄託物から
証明され得る。さらに、特定のクローンによってコードされるタンパク質のアミ
ノ酸配列はまた、ペプチド配列決定によって、または寄託されたヒトｃＤＮＡを
含む適切な宿主細胞中でタンパク質を発現させ、このタンパク質を収集し、そし
てその配列を決定することによって、直接的に決定され得る。
【０１１９】
本発明はまた、配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）、配列番号Ｙ（ＳＥＱ
ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）、または寄託されたクローンに対応する遺伝子に関する。対
応する遺伝子は、本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従
って単離され得る。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプラ
イマーを調製する工程、およびゲノム物質の適切な供給源から対応する遺伝子を
同定または増幅する工程を包含する。
【０１２０】
本発明においてまた提供されるものは、対立遺伝子改変体、オーソログ（ｏｒ
ｔｈｏｌｏｇ）、および／または種ホモログである。当該分野において公知の手
順を使用し、本明細書中に開示される配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローン
からの情報を用いて、配列番号Ｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘ）、配列番号Ｙ（Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）または寄託されたクローンに対応する遺伝子の全長遺伝
子、対立遺伝子改変体、スプライシング改変体、全長のコード部分、オーソログ
、および／または種ホモログを獲得し得る。例えば、対立遺伝子改変体および／
または種ホモログは、本明細書中に提供される配列から適切なプローブまたはプ
ライマーを作製し、そして対立遺伝子改変体および／または所望のホモログにつ
いて適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって単離および同定され得
る。
【０１２１】
表２は、本発明の特定の実施形態に含まれる好ましいエピトープ、および本発
明の特定の実施形態に従って放棄され得るポリペプチド配列を示す。第１列は、
上記表１に記載される各「遺伝子番号」をいう。第２列は、表１に開示されるポ
リヌクレオチド配列に関する配列識別子「ヌクレオチド配列番号Ｘ」を示す。３
列目は、表１に開示されるポリヌクレオチド配列に関する配列識別子「ＡＡ配列
番号Ｙ」を示す。第４列目は、配列番号Ｘの１と最終ヌクレオチドマイナス１５
との間の任意の整数である、固有の整数「ｎｔＡ」を示す。そして第５列は、固
有の整数「ｎｔＢ」を示すが、この「ｎｔＢ」は、配列番号Ｘの１５と最終ヌク
レオチドとの間の任意の整数である。ここでｎｔＡもｎｔＢも両方とも、配列番
号Ｘに示されるヌクレオチド残基の位置に相当し、そしてｎｔＢは＋１４以上で
ある。配列番号Ｘとして示される各ポリヌクレオチドについて、固有に規定され
た整数は、一般式ａ−ｂに置きかえられ得、そしてこれを用いて、好ましくは本
発明から除外され得るポリヌクレオチドを記載し得る。第６列は、各々の好まし
いＯＲＦによりコードされるポリペプチド（配列番号Ｙ）中に含まれる好ましい
エピトープを含む残基を列挙する。可能性のある免疫原性領域の同定は、Ｊａｍ
ｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ（（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ，４；１８１〜１８６）の
方法に従って実施された；詳細には、このアルゴリズムのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）実施（プログラムＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲ
ＵＣＴＵＲＥ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｖ１０．０，Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ
）に統合された）。この方法は、所定の残基がタンパク質の表面上で見出される
確率の値を戻す。抗原性係数スコアが少なくとも６アミノ酸を超える領域が、表
２に「好ましいエピトープ」として示される。本発明のポリペプチドは、表２に
記載される残基を含む抗原性エピトープの１、２、３、４、５または５以上を有
し得る。用いられる分析基準に依存して抗原性決定基を推測すること、抗原決定
基の正確な位置がわずかに変化し得ることが理解される。
【０１２２】
表３は、表１に開示されるクローンに対応するポリヌクレオチドの発現プロフ
ィールをまとめる。１列目は、表１に開示される各コンティグ配列に関するｃＤ
ＮＡクローンについての、特定のクローン識別子「クローン番号（Ｃｌｏｎｅ  
ＩＤ）」を提供する。２列目の「ライブラリーコード」は、本発明のポリヌクレ
オチドを発現する組織および/または細胞株のライブラリーの発現プロフィール
を示す。第２列の各ライブラリーのコードは、表５に提供されるライブラリーコ
ードおよびライブラリーの詳細（Ｌｉｂｒａｒｙ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）に
対応する組織／細胞供給源の識別子コードを示す。これらのポリヌクレオチドの
発現は、試験した他の組織および／または細胞ライブラリーにおいては観察され
なかった。当業者は、慣用的に、この情報を用いて、本発明の対応するポリヌク
レオチドの優勢な発現パターンを示す組織を同定するか、または優勢なおよび／
または特異的な組織発現を示すポリヌクレオチドを同定し得る。
【０１２３】
表４の第１列は、ヌクレオチド配列識別子「配列番号Ｘ」を提供する。この「
配列番号Ｘ」は、表１の５列目に開示されたヌクレオチド配列番号Ｘに適合する
。表４の２列目は、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドの染色体配置である
「細胞学的バンドすなわち染色体（Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｎｄ  ｏｒ  Ｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅ）」を提供する。染色体配置は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ）ＵｎｉＧｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅに含まれるＥＳＴおよびｃＤＮＡに対す
る正確な適合（マッチ）を見出すことにより決定された。推定染色体配置を考慮
して、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍ
ａｎ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍ
ａｎ，ＯＭＩＭTM．ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  
ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃ
ｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，ＭＤ）２０００）由来のＭｏｒｂｉｄ  Ｍａｐとの比較によって疾患関連遺
伝子座を、決定した。Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／）。Ｑｕｅｒｙの推定
染色体配置が、Ｍｏｒｂｉｄ  Ｍａｐエントリーの染色体配列番号位置と重複し
た場合、ｍｏｒｂｉｄ  ｍａｐエントリーのＯＭＩＭ参照同定数（ＯＭＩＭ  ｒ
ｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）を「ＯＭ
ＩＭ  ＩＤ」と表示して、表４の３列目に示した。ＯＭＩＭ参照同定数に対する
手がかり（ｋｅｙ）を表６に示した。
【０１２４】
表５は、表３に開示されたライブラリーコードに対する手がかりを提供する。
１列目は、表３の２列目に開示されたライブラリーコードを提供する。２列目は
、対応するライブラリーが誘導された組織または細胞の供給源の詳細を提供する
。疾患組織に対応するライブラリーコードは、「疾患」の用語を使って第３列目
に示される。
【０１２５】
表６は、表４の３列目に開示されたＯＭＩＭ参照同定数に対する手がかりを提
供する。ＯＭＩＭ参照同定数（１列目）は、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ
Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ
Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，ＯＭＩＭ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎ
ａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
，ＭＤ）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）２０００）Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄ
ｅ  Ｗｅｂ  ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ
ｖ／ｏｍｉｍ／）から導かれた。２列目は、Ｍｏｒｂｉｄ  Ｍａｐデータベース
を用いて決定されたような、表４の２列目に開示された細胞質バンドと関連した
疾患を提供する。
【０１２６】
【表２】
2011087587.tif 000012
2011087587.tif 000013
2011087587.tif 000014
【０１２７】
【表３】
2011087587.tif 000015
2011087587.tif 000016
【０１２８】
【表４】
2011087587.tif 000017
【０１２９】
【表５】
2011087587.tif 000018
2011087587.tif 000019
2011087587.tif 000020
2011087587.tif 000021
2011087587.tif 000022
2011087587.tif 000023
【０１３０】
【表６】
2011087587.tif 000024
本発明のポリぺプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。このようなポリ
ぺプチドとしては、単離された天然に存在するポリぺプチド、組換え的に生成さ
れたポリぺプチド、合成的に生成されたポリぺプチド、またはこれらの方法の組
合せによって生成されたポリぺプチドが挙げられる。このようなポリぺプチドを
調製するための手段は、当該分野において十分に理解される。
【０１３１】
ポリぺプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であり得るか、ま
たはより大きいタンパク質（例えば、融合タンパク質）の部分であり得る（以下
を参照のこと）。分泌配列もしくはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配
列（例えば、複数のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安定性のための
さらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利である。
【０１３２】
本発明のポリぺプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製される。ポリぺプチド（分泌ポリぺプチドを含む）の組換
え的に生成されたバージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）は、本明細書中に記載される技
術または当該分野で公知のそれ以外の技術（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎ
ｓｏｎ、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８）に記載される１工程の方法に
よるような）を使用して実質的に精製され得る。本発明のポリぺプチドはまた、
例えば、分泌タンパク質に対して惹起される本発明の抗体のように、本明細書中
に記載される技術または当該分野において公知のそれ以外の技術を使用して、天
然供給源、合成供給源または組換え供給源から精製され得る。
【０１３３】
本発明は、配列番号Ｘの核酸配列、および／またはＡＴＣＣ寄託物Ｚ中に含ま
れるｃＤＮＡを含むか、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを提供する。
本発明はまた、配列番号Ｙのポリペプチド配列および／またはＡＴＣＣ寄託物Ｚ
中に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを含むか、あるいはそれ
らからなるポリペプチドを提供する。配列番号Ｙのポリペプチド配列および／ま
たはＡＴＣＣ寄託物Ｚ中に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配
列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本発明に包含される。
【０１３４】
（シグナル配列）
本発明はまた、配列番号Ｙのポリペプチド配列、および／または寄託されたク
ローン中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列を有するポリペプチド
の成熟形態を包含する。成熟形態をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列
番号Ｘのポリヌクレオチド配列、および／または寄託されたクローンのｃＤＮＡ
に含まれるポリヌクレオチド配列のような）もまた、本発明に包含される。シグ
ナル仮説に従うと、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、一旦、粗面小
胞体を横切る伸長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切
断される、シグナル配列または分泌リーダー配列を有する。ほとんどの哺乳動物
細胞および昆虫細胞でさえも、同じ特異性を有する分泌タンパク質を切断する。
しかし、いくつかの場合、分泌タンパク質の切断は、完全には、均一ではなく、
このことは、このタンパク質の２以上の成熟種を生じる。さらに、分泌タンパク
質の切断特異性は、最終的には、完全なタンパク質の一次構造によって決定され
る（すなわち、これは、このポリペプチドのアミノ酸配列に固有である）ことが
長い間公知である。
【０１３５】
タンパク質が、シグナル配列、ならびにその配列についての切断点を有するか
否かを予測するための方法が、利用可能である。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｖｉ
ｒｕｓ  Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５）の方法は、短いＮ末端荷電領
域およびそれに続く完全な（切断されていない）タンパク質の非荷電領域からの
情報を使用する。ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
．１４：４６８３−４６９０（１９８６）の方法は、切断部位の周辺の残基（代
表的に−１３〜＋２残基）からの情報を使用し、ここで、＋１は、分泌タンパク
質のアミノ末端を示す。これらの方法のそれぞれについての、公知の哺乳動物分
泌タンパク質の切断点を予測することの正確さは、７５〜８０％の範囲にある（
ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、前出）。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質につ
いて、同じ推定切断点を必ずしも生成するとは限らない。
【０１３６】
本発明の場合において、分泌ポリぺプチドの推定アミノ酸配列は、Ｓｉｇｎａ
ｌＰと呼ばれるコンピュータープログラム（Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎら、
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６（１９９７））によっ
て分析され、このプログラムは、アミノ酸配列に基づいてタンパク質の細胞での
位置を予測する。この局在化のコンピューター予測の一部として、ＭｃＧｅｏｃ
ｈおよびｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅの方法が援用される。このプログラムによって、
本明細書中に記載される分泌タンパク質のアミノ酸配列の分析は、表１において
示される結果を提供した。
【０１３７】
しかし、当業者に理解されるように、切断部位は、時折、生物に応じて変化し
、そして絶対的な確実性を伴っては予測され得ない。従って、本発明は、配列番
号Ｙにおいて示される配列を有する分泌ポリぺプチドを提供し、これは推定切断
点の５残基（すなわち、＋５または−５残基）内で始まるＮ末端を有する。同様
に、いくつかの場合において、分泌タンパク質からのシグナル配列の切断は、完
全に均一という訳ではなく、１つより多くの分泌される種を生じることもまた認
識される。これらのポリぺプチド、およびこのようなポリぺプチドをコードする
ポリヌクレオチドは、本発明によって意図される。
【０１３８】
さらに、上述の分析によって同定されるシグナル配列は、天然に存在するシグ
ナル配列を必ずしも予測しないかもしれない。例えば、天然に存在するシグナル
配列は、推定シグナル配列からさらに上流にあり得る。しかし、推定シグナル配
列は、分泌タンパク質をＥＲに指向し得る可能性がある。それにもかかわらず、
本発明は、哺乳動物細胞（例えば、下記のようなＣＯＳ細胞）において、配列番
号Ｘのポリヌクレオチド配列および／または寄託されたクローンのｃＤＮＡに含
まれるポリヌクレオチド配列の発現により産生される成熟タンパク質を提供する
。これらのポリぺプチド、およびこのようなポリぺプチドをコードするポリヌク
レオチドは、本発明によって意図される。
【０１３９】
（ポリヌクレオチドおよびポリぺプチド改変体）
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘに開示されたポリヌクレオチド配列、それ
に対する相補鎖、および／または寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡ配列
の改変体に関する。
【０１４０】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙに開示されるポリペプチド配列、およ
び／または寄託されたクローンによりコードされるポリペプチド配列の改変体を
包含する。
【０１４１】
「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドとは異なるが
、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリぺプチドをいう
。一般に、改変体は、全体的に密接に類似し、そして、多くの領域において、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリぺプチドに同一である。
【０１４２】
本発明はまた、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｘのヌクレオチドをコードする
配列またはその相補鎖、寄託されたｃＤＮＡクローンに含まれるヌクレオチドを
コードする配列またはその相補鎖、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙのポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／またはこれらの
核酸分子のいずれかのポリヌクレオチドフラグメント（例えば、本明細書中に記
載されるフラグメント）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか
、あるいはそれらからなる核酸分子に関する。ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件またはより低いストリンジェントな条件の下で、これらの核酸分
子にハイブリダイズするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【０１４３】
本発明はまた、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙに示されるポリペプチド配列
、寄託されたクローン中に含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配
列、および／またはこれらのポリペプチドのいずれかのポリペプチドフラグメン
ト（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）に対して、少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミ
ノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドに関する。
【０１４４】
本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有する核酸によって、核酸のヌクレオチド配列が、ヌクレオ
チド配列がポリぺプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオ
チドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、参照配列に対して同一で
あることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９
５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、参照配列のヌクレオチ
ドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換され得るか、
または参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列
中に挿入され得る。問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）配列は、表１に示される配列全体
、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、または本明細書中で記載されるよ
うに特定される任意のフラグメントであり得る。
【０１４５】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリぺプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来的に決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象
配列との間の最も良好な全体的な適合性（全体的な配列整列としてもまた参照さ
れる）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ
．  Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づく
ＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列にお
いて、問い合わせ配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である。ＲＮＡ
配列は、ＵからＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配列整列
の結果は、同一性パーセント（％）で示される。同一性パーセントを算定するた
めにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは
：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚ
ａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ０．０５、
Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらか
より短い方）である。
【０１４６】
対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠失のためではなく）問い合
わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。こ
れは、同一性パーセントを計算する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列
の５’および３’切断を考慮しないからである。５’末端または３’末端で切断
される対象配列について、問い合わせ配列に対して、同一性パーセントは、問い
合わせ配列の総塩基のパーセントとして一致／整列されない対象配列の５’およ
び３’である問い合わせ配列の塩基の数を計算することによって補正される。ヌ
クレオチドが一致／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって
決定される。次いで、このパーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、特
定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定され、最
終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明
の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示されるように、問
い合わせ配列と一致／整列されない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩
基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【０１４７】
例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’または３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１４８】
本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドとは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は
、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あ
たり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同一
であることを意図する。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも９５
％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列におけ
るアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））また
は別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列
のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末端位
置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列内の
１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
【０１４９】
実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミ
ノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：Ｙ）に対して、または寄託されたクローンに含
まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％
、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である
か否かは、従来的に、公知のコンピュータープログラムを使用して決定され得る
。問い合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との間での最良の全体的な一致（
全体的配列整列としても参照される）を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕ
ｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０
））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して
決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列および対象配列は、両方とも
ヌクレオチド配列であるかまたは両方ともアミノ酸配列であるかのいずれかであ
る。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤ
Ｂアミノ酸整列に用いられる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  
０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉ
ｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅ
ｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ  ＝  
配列の長さ、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ
＝  ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長
さ（どちらかより短い方）である。
【０１５０】
対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で切断されている対象配列について、問い合わせ配列と比較して
、同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する
対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ
配列の残基の総数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されて
いるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、この
パーセントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラ
ムによって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセント
のスコアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的
で使用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ
末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する
目的のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠
いＮ末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【０１５１】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１５２】
改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌク
レオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって
生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて５
〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付加される改変
体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、特定の
宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、Ｅ．
ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のために、
生成され得る。
【０１５３】
天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう（Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、ポ
リヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し得
、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発技
術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【０１５４】
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実質的な欠損を伴わずに、分泌タン
パク質のＮ末端またはＣ末端から欠失され得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１９９３）の著者らは、３、８、または２
７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失させた後でさえもヘパリン結合活性を有
する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した。同様に、インターフェロンγは、この
タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１
０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ  ７：１９９−２１６（１９８８））。
【０１５５】
さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。
【０１５６】
さらに、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失を生じたとしても、他の生物学的
活性はなお保持され得る。例えば、分泌される形態を認識する抗体を誘導および
／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌される形態の大多数より少ない残
基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合に保持されるようである。タンパ
ク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定のポリぺプチドが、このような免
疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、および
そうでなければ当該分野において公知の慣用的な方法によって容易に決定され得
る。
【０１５７】
従って、本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すポリぺプチド改変体を
含む。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さないように
、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、挿入、逆位
、反復、および置換が挙げられる。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置
換を作製する方法に関する指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１
３０６−１３１０（１９９０）において提供され、ここで、著者らは変化に対す
るアミノ酸配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあること
を指摘する。
【０１５８】
第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較して、保存されるアミノ酸
が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機能について重
要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容されたアミノ酸
の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを示す。従って
、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生物学的活性を
なおも維持する。
【０１５９】
第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中のどの残基においても１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−
１０８５（１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試
験され得る。
【０１６０】
著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。
【０１６１】
保存的なアミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存
的なアミノ酸残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードに
よってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい
、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉ
ｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増
加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチ
ドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペ
プチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列のよう
な）とのポリぺプチドの融合、または（ｖ）ポリペプチドと別の化合物（例えば
、アルブミン（限定しないが、組換えアルブミン（例えば、１９９９年３月２日
に発行された米国特許第５，８７６，９６９号、ＥＰ特許０  ４１３  ６２２号
、および１９９８年６月１６日に発行された米国特許第５，７６６，８８３号（
これらは、その全体において本明細書中で参考として援用される）を参照のこと
）を含む））との融合物を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中
の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１６２】
例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特性（例えば、より
少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集
体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもた
らす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１
−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３６：８３８−
８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １０：３０７−３７７（
１９９３））。
【０１６３】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有する本発明のアミノ酸配列を
含むポリペプチドに関する。もちろん、好ましさの増大する順番に、ペプチドま
たはポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、
７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸置換を超えない本発明のアミノ酸配
列を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。特定の実施形態において
、本発明のアミノ酸配列またはそのフラグメント（例えば、本明細書に記載の成
熟形態および／または他のフラグメント）における付加、置換、および／または
欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０
〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【０１６４】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドフラグメント）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメントに
関する。
【０１６５】
本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、以下である核酸配
列を有する短いポリヌクレオチドをいう：寄託されたクローンに含まれるか、も
しくは寄託されたクローン中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコー
ドする核酸配列の一部であるか；配列番号Ｘもしくはそれらの相補鎖に示される
核酸配列の一部であるか、または配列番号Ｙのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列の一部である。本発明のヌクレオチドフラグメントは、好ましく
は、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さら
により好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてなおより好ましくは少なくとも
約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約７５ｎｔ、または少なくとも
約１５０ｎｔの長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」のフラグ
メントは、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列または配列番号Ｘに示さ
れるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続する塩基を含むことが意図される。
この文脈において「約（おおよそ）」は、特に記載された値（いずれかの末端も
しくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌク
レオチドだけ大きいかまたは小さな値）を含む。これらのヌクレオチドフラグメ
ントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとして
の使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きなフ
ラグメント（例えば、５０、１５０、５００、６００、２０００ヌクレオチド）
は好ましい。
【０１６６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいは以下からなるフラグ
メントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２０
０、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４０
１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７０
０、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９０
１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、１
１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１３
００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４５
１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５０
、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１〜
１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、も
しくは２００１から配列番号Ｘの末端、またはそれらの相補鎖、あるいは寄託さ
れたクローンに含まれるｃＤＮＡ。この文脈において、「約（おおよそ）」は、
特に記載された範囲、およびいずれかの末端もしくは両方の末端において、これ
より数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいかまたは小さ
な範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、生物学的活性を有するポ
リペプチドをコードする。より好ましくは、これらのポリヌクレオチドは、本明
細書中で議論されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る。スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシ
ー条件下でこれらの核酸分子にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発
明に含まれ、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも同様
に含まれる。
【０１６７】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号Ｙに含まれる
か、または寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ
酸配列の一部である、アミノ酸配列をいう。タンパク質（ポリペプチド）フラグ
メントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるい
はより大きなポリぺプチド内（そのフラグメントが、部分または領域を（最も好
ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペ
プチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸
数を含むか、あるいは以下のおおよそのアミノ酸数からなるフラグメントが挙げ
られる：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１０
２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、または１６１からコード領域の
末端まで。さらに、ポリペプチドフラグメントは、約２０、３０、４０、５０、
６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１
５０アミノ酸の長さであり得る。この文脈において、「約（おおよそ）」とは、
特に記載された範囲または値、およびいずれかの末端もしくは両方の末端におい
て、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きいかまたは
小さな範囲または値を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本発明に含まれる。
【０１６８】
好ましいポリペプチドフラグメントとしては、分泌タンパク質および成熟形態
が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、アミノ末端
もしくはカルボキシ末端またはその両方から、連続した一連の欠失した残基を有
する分泌タンパク質もしくは成熟形態が挙げられる。例えば、任意の数のアミノ
酸（１〜６０の範囲）は、分泌ポリペプチドもしくは成熟形態のいずれかのアミ
ノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０の範囲）が、
分泌タンパク質もしくは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る。さらに、
上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせは好ましい。
同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもま
た好ましい。
【０１６９】
構造的または機能的ドメインによって特徴付けられるポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチドのフラグメント（例えば、α−へリックスおよびα−へリックス形
成領域、β−シートおよびβ−シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、
コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両
親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高い抗原性指標
領域を含むフラグメント）もまた、好ましい。保存性ドメインの中に含まれる配
列番号Ｙのポリペプチドフラグメントは、本発明によって特に意図される。さら
に、これらのドメインをコードするポリヌクレオチドもまた、意図される。
【０１７０】
他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントは、類似の活性を示すが本発明のポリペプ
チドの活性とは必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラグメントの
生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した所望でない活性を含み得
る。これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、
本発明に含まれる。
【０１７１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、機能的活性を示すポ
リペプチドをコードする。「機能的活性」を示すポリペプチドとは、本発明のタ
ンパク質の全長（完全）ポリペプチドと関連した１つ以上の公知の機能的活性を
示し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活性としては、生物学的活
性、抗原性［本発明のポリペプチドに対する抗体に結合する（または結合するこ
とについて、本発明のポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（本発明のポ
リペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプチドと多量体を
形成する能力、および本発明のポリペプチドについてのレセプターまたはリガン
ドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
本発明のポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、お
よびアナログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【０１７３】
例えば、本発明のポリペプチドの抗体への結合について本発明の全長ポリペプ
チドに結合するかまたはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施
形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このような
アッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッ
セイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降
反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵
素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集ア
ッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、
免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの
ような技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定
されない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出すること
によって検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対す
る二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施
形態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結
合の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１７４】
別の実施形態では、同定された本発明のポリペプチドについてのリガンド、ま
たは本発明のポリペプチドフラグメント、改変体、もしくは誘導体が多量体化す
る能力が評価される場合、結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラ
フィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティ
ーブロッティングのような当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。
一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ
．５９：９４−１２３を参照のこと。別の実施形態では、その基質への本発明の
ポリペプチドの結合の生理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【０１７５】
さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例を参照のこと）および当該分野
で公知の他のアッセイは、本発明のポリペプチドならびにそれらのフラグメント
、改変体、誘導体、およびアナログが、本発明のポリペプチドの生物学的活性に
関連した関連の生物学的活性を（インビトロまたはインビボのいずれかで）惹起
する能力を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知
であり、そして本発明の範囲内である。
【０１７６】
（エピトープおよび抗体）
本発明は、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、ま
たはＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるポリヌクレオチド配列によって、もしくは配
列番号Ｘの配列の相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコード
されるポリペプチド配列のエピトープ、または上記で規定されたようなストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件下もしくはより低いストリンジェンシー
のハイブリダイゼーション条件下でＡＴＣＣ寄託番号Ｚに含まれるポリヌクレオ
チド配列によってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むか、あるい
はそれらからなるポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチド
配列（例えば、配列番号Ｘで開示された配列）のエピトープをコードするポリヌ
クレオチド配列、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補
鎖のポリヌクレオチド配列、および上記で定義されたストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼー
ション条件下で相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１７７】
用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ま
しくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または
免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、
本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用さ
れる場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下
記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘
発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２（１９８３
）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場
合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセ
イによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得
るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外
するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免
疫原性である必要はない。
【０１７８】
エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。これはさらに
、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０１７９】
本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２
、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なく
とも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含
み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む
。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチド
は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５
、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基
の長さである。さらなる非排他的に好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で
開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む。抗原性エピトープは、有用
である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含
む）を惹起するため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される
抗原性エピトープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任
意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子
として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７−７
７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９：６６０−
６６６（１９８３）を参照のこと）。
【０１８０】
同様に、免疫原性のエピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に
従って抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら（前出）；Ｗｉｌｓ
ｏｎら（前出）；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６
６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピト
ープは、本明細書で開示された免疫原性エピトープ、ならびにこれらの免疫原性
エピトープの２つ、３つ、４つ、５つ以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上
の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、ア
ルブミン）とともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を
惹起するために提示され得るか、または、そのポリペプチドが十分に長い場合で
は（少なくとも約２５アミノ酸）、このポリペプチドはキャリアなしで提示され
得る。しかし、８〜１０程度のわずかなアミノ酸を含む免疫原性エピトープが、
変性されたポリペプチドの直鎖エピトープに（少なくとも）結合し得る抗体を惹
起するのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッティングにお
いて）。
【０１８１】
本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。この方法としては、インビボ免疫、インビトロ
免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定されない。
例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およびＢｉｔｔ
ｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：２３４７−２３５４（１９８５）を
参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用いて免疫し
得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（ｈｅｍａｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）または破傷風トキソ
イド）にペプチドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイ
ン残基を含むペプチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その
一方、他のペプチドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を
用いてキャリアに結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は
、遊離のペプチドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エ
マルジョン（約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイン
トアジュバントまたは免疫応答を刺激すると知られる任意の他のアジュバントを
含む）の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブー
スター注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週
間の間隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離の
ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の
血清中の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で
周知の方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出に
よる）により上昇し得る。
【０１８２】
当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、他のポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組み合わせおよびそれらの部分）、あるい
はアルブミン（組換えアルブミン（例えば、１９９９年３月２日発行の米国特許
第５，８７６，９６９号、欧州特許第０  ４１３  ６２２号、および１９９８年
６月１６日発行の米国特許第５，７６６，８８３号（これらは、本明細書によっ
てその全体において参考として援用される）を参照のこと）を含むが、限定はさ
れない）と融合され得、キメラポリペプチドを生じる。このような融合タンパク
質は、精製を容易にし得、そしてインビボでの半減期を増大させ得る。これは、
ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブ
リンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質に
ついて示されている。例えば、ＥＰ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら
、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮の障壁を
横切る抗原の免疫系への増強された送達は、ＩｇＧまたはＦｃフラグメントのよ
うなＦｃＲｎ結合パートナーへ結合された抗原（例えば、インシュリン）につい
て実証された（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２２０２４および同ＷＯ９９／０
４８１３を参照のこと）。ＩｇＧ部分のジスルフィド結合に起因するジスルフィ
ド結合二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドま
たはそれらのフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和においてより
効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。上記
のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球凝集素
（「ＨＡ」）タグまたはフラッグ（ｆｌａｇ）タグ）として目的の遺伝子と組換
えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａ
ｎｋｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株中で発現される非変性融
合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ  ら、１９９１、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７）。
この系において、目的の遺伝子はワクシニア組換えプラスミドへサブクローン化
され、その結果、この遺伝子のオープンリーディングフレームが、６つのヒスチ
ジン残基からなるアミノ末端タグへ翻訳時に融合される。このタグは、融合タン
パク質についての基質結合ドメインとしての機能を果たす。組換えワクシニアウ
イルスを用いて感染された細胞からの抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロ
ースカラム上へロードされ、そしてヒスチジンタグ化タンパク質は、イミダゾー
ル含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０１８３】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
方法を使用することにより、改変された活性を有するポリペプチド、ならびにこ
れらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には
、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３
０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、
ならびにＰａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ
およびＢｌａｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８−１３
（１９９８）（これらの特許および刊行物の各々が本明細書によってその全体に
おいて参考として援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番
号Ｘに対応するポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコー
ドされるポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、ポリヌクレ
オチド配列において変化を生じるように２つ以上のＤＮＡセグメントをアセンブ
ルすることを含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはそ
のコードされるポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏ
ｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法による、ランダム変異
誘発に供されることによって改変され得る。別の実施形態において、本発明のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ以上の成分、モチーフ、セクシ
ョン、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の、１つ以上
の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換えら
れ得る。
【０１８４】
（抗体）
さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号Ｙの改変体、および／
またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原レセプター（Ｔ
ＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、
多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフ
ラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生
されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体
に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメ
ントを含むが、限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、
免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち
、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含む分子をいう。本発明の免疫グ
ロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、Ｉ
ｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）または任意のサブクラ
スであり得る。好ましい実施形態では、本発明の免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ
１である。他の好ましい実施形態では、本発明の免疫グロブリンはＩｇＧ４であ
る。
【０１８５】
最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ  ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのア
ミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまたは
１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内因
性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、およ
び例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号
において記載のような）を含む。
【０１８６】
本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／１７７１５；同ＷＯ  ９
２／０８８０２；同ＷＯ  ９１／００３６０；同ＷＯ  ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１８７】
本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチド
の排除を可能にする抗体を含む。
【０１８８】
本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オーソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク
質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに
対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９
５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６
５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有する
ポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態にお
いて、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原
性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性お
よび／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチドを結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、
本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化さ
れ得る。好ましい結合親和性としては、５×１０-2Ｍ未満、１０-2Ｍ未満、５×
１０-3Ｍ未満、１０-3Ｍ未満、５×１０-4Ｍ未満、１０-4Ｍ未満、５×１０-5Ｍ
未満、１０-5Ｍ未満、５×１０-6Ｍ未満、１０-6Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１
０-7Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未
満、５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、
５×１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×１０-13Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×
１０-14Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０-15Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離
定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられる。
【０１８９】
本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０１９０】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続いてウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を
検出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存
在下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、
少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、
少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が
提供される。
【０１９１】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
いレセプター特異的抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し
、そしてレセプターへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結
合し、それによりレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合す
ることを妨げない抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体
を含む。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例
えば、レセプターの二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性
化の生物学的活性化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性
化し得る。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物
学的活性を含む生物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆ア
ゴニストとして特定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法
を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第
５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ９２（６）：１９８１−１９
８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６
８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４
）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ：５８
（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ
．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０５（２）：１７７−１９０（１９９
７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ９（４）：２３３−２４１（１
９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１
２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ  １４（４
）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６（
９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎ
ｅ  ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記の文献は、全て、その全体が参考
として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１９２】
本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（
Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，
第２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照の
こと。
【０１９３】
以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、Ｎ末端でもし
くはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、あるいはポリペプ
チドまたは他の組成物へ化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され
得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子お
よび異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分
子へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４
９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，
９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１９４】
本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１９５】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホ
ールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメッ
ト−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのよう
な潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。このよう
なアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１９６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、それが生成され
る方法のことではない。
【０１９７】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される（例え
ば、実施例１６）。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチ
ドまたはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応
答が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）
と、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の
技術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株
ＳＰ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択お
よびクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチド
に結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッ
セイする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ
）が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって、産
生され得る。
【０１９８】
従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
【０１９９】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０２００】
例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）か
ら発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結
合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定さ
れ得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉
された抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的
には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク
質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化さ
れたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合
ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）である。
本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例とし
ては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅ
ｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５
８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ  １８７  ９−１８（１９９７）；
Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９
１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０
４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９
８２；ＷＯ  ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同
第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７
号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，
０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５
１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第
５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明
細書中でその全体が参考として援用される）。
【０２０１】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ  ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
【０２０２】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号
を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）
。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合
する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内
のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させるため（好ましくは改善させるた
めに）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置換される。これらフレームワークの
置換は、当該分野で周知の方法によって同定され、例えば、抗原結合に重要なフ
レームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用
のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定す
るための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０
８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を
参照のこと（これらはそれらの全体が参考として本明細書中に援用される）。）
抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化され得る：例え
ば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ  ９１／０９
９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同
第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサー
フェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第
５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４
）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、およ
びチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５
，５６５，３３２号）。
【０２０３】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ  ９８／４６６４５、ＷＯ  ９８／５０４３３、ＷＯ  ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ  ９８／１６６５４、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５、お
よびＷＯ  ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。
【０２０４】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再構成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０  ５９８  ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。
【０２０５】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト化抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを認識する完全ヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓら
、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０２０６】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０２０７】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。
【０２０８】
ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０２０９】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０２１０】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒ
ｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０２１１】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０２１２】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０２１３】
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２１４】
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０２１５】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開  ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開  ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０２１６】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
【０２１７】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要前初期（ｍａｊｏ
ｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントの
ようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ
）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉ
ｎｇら、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０２１８】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ  ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０２１９】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２２０】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２２１】
さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
【０２２２】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択マーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮ
Ａの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させられ得、
次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは
、選択に対する耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色体内に安定に
組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はクローニングし
得、増殖して細胞株になり得ることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現
する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作された細胞
株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリーニングお
よび評価において、特に有用であり得る。
【０２２３】
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず
、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれ
ぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠とし
て使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗ
ｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０
）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：
１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与
える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−
４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４
８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（
１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ
Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７
（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１
５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える（
Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技
術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適
用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ
、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編
）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−
Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらは
その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２２４】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅ
ｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏ
ｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  
ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子
のコピーの数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０２２５】
宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含み得る。あ
るいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリペプチ
ドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、過剰の
毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである（Ｐｒ
ｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））
。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る
。
【０２２６】
一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０２２７】
本発明は、本発明のポリペプチド（もしくはその部分、好ましくはこのポリペ
プチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、
もしくは１００個のアミノ酸）に、組換えにより融合されるかまたは化学的に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによっ
て、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、
抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた
、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法にお
いて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３
／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌ
ｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇ
ｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ  ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこ
と。これらは、その全体が参考として援用される。
【０２２８】
本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。本発明のポリぺプチ
ドに融合されたこの抗体の部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分の
任意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融
合または結合され得、多量体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合
されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通してニ量体を形成
し得る。より高度の多量体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に
融合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合
または結合させるための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ  ３０７，４３４；ＥＰ  ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９
６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。
【０２２９】
上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号Ｙの改変体に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半減
期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセイ
において使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに、
配列番号Ｙに対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して、
精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の
２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域
の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ  ３９４，８
２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８
））。ジスルフィド連結ニ量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合ま
たは結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質またはタ
ンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに
効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０
：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分
は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動態
学的な特性を生じ得る（ＥＰ  Ａ  ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパク
質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させることが
望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場合
、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、ｈ
ＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するた
めのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合さ
れてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ
ｎ  ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０２３０】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に
記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を
提供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集
素タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅ
ｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限
定されない。
【０２３１】
本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所定の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカーなど）を介して、連結または結合さ
れ得る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る
金属イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な
酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β
−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補
欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／
ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオ
レセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジ
ニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げら
れ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては
、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切
な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが
挙げられる。
【０２３２】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ）など）に結合され得る。細胞毒
または細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パ
クリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、
臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎ
ｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈ
ｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオ
ン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロ
ン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グル
ココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、
およびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる
。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン
、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（５−ｆ
ｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、
メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、
カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド
（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール
、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン
白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アンスラサイクリン（例えば、ダウノ
ルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば
、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイ
シン、およびアンスラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（ＡＭＣ））、なら
びに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、を含むが、
それらに限定されない。
【０２３３】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス薬（例
えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９
号を参照のこと）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照の
こと）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６
：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１
０５号を参照のこと））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオス
タチンもしくはエンドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカ
イン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ
−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロ
ニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」
）、または他の増殖因子など）、が挙げられ得る。
【０２３４】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２３５】
このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆ
ｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎ
ｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２３６】
あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体の異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得
る。
【０２３７】
単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
【０２３８】
（免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
【０２３９】
これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における微小
残存病変（ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己」
細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にする
。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖およ
び／または分化を受け得る、造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可能
にする。
【０２４０】
（抗体結合アッセイ）
本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によ
ってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的ア
ッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使
用する、少し例を挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降
アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ
、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ
免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である（
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。これはその全体が
本明細書中で参考として援用される）。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単に
記載される（しかし限定として意図されない）。
【０２４１】
免疫沈降プロトコルは、一般に、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒ
ｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０
．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％Ｔｒａ
ｓｙｌｏｌ）のような、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ
インヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナト
リウム）を補充した溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を
細胞溶解物に添加する工程、４℃である時間（例えば１〜４時間）インキュベー
トする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧのセファロースビーズを
細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上、４℃でインキュベートする工程、ビ
ーズを溶解緩衝液で洗浄する工程およびビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再
懸濁する工程、を包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例
えば、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原に対する
抗体の結合を増加し、そしてバックグラウンドを減少する（例えば、セファロー
スビーズとともに細胞溶解物を予め洗浄する）ように改変され得るパラメータに
関して、よく知っている。免役沈降プロトコルに関するさらなる考察については
、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１０．１６．１）を参照のこと。
【０２４２】
ウェスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（例えば抗原の分子量
によって８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリ
ルアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロ
ン）へ移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルク
を含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングする工程、メンブレンを洗浄緩衝
液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液
で希釈された１次抗体（目的の抗体）を用いてメンブレンをブロッキングする工
程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈され
た、酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファタ
ーゼ）または放射性分子（例えば３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した２次抗体（
これは１次抗体（例えば抗ヒト抗体）を認識する）でメンブレンをブロッキング
する工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、および抗原の存在を検出
する工程、を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバック
グランドノイズを減少するように改変され得るパラメータをよく知っている。ウ
ェスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ
ｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１０．８．１）を参照のこと。
【０２４３】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物
に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さら
に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングさ
れ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コーティングさ
れたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出され
るシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野におい
て公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬＩＳＡに関
するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，
第１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，
１１．２．１を参照のこと。
【０２４４】
抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した
抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的
の抗体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含
む。目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキ
ャッチャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合
はまた、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増
量の非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ
）に結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２４５】
（治療用途）
本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ま
しくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それら
のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコード
する核酸（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよ
び誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるがこれらに限定さ
れない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の疾
患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害または予防
するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それらの疾患
、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。
本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載されるよう
に、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２４６】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわ
かる。
【０２４７】
本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２４８】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２４９】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、
１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、
１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ
、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１
０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-
15Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２５０】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２５１】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２５２】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２５３】
好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸
の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）
）。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいは
この核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはその
フラグメントを含む。
【０２５４】
核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２５５】
特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の
多数の方法などのいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの
一部として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例え
ば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国
特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、
裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺
伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質もし
くは細胞表面のレセプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェク
トすることにより、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプ
セル化により、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結
合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリ
ガンドとそれを結合させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）
（レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）達成
され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで
、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ
）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さ
らに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることによ
り、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例え
ば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第
ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２
２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相同組
換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒお
よびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６
：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４
２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２５６】
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にす
る。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法
に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性幹細胞に送達するため
の、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療に
おけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である。
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０２５７】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利
点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ
ｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９
９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。
Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０（１９９４
）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクター
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９
９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ  
Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２５８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案
されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２
０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２５９】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入の方
法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子
を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それら
の細胞は次いで、患者に送達される。
【０２６０】
この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒
介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入につい
ては、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒお
よびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３
）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９
９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８
５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機
能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞
への安定した移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可
能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現
可能である。
【０２６１】
得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
【０２６２】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２６３】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０２６４】
遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与さ
れる。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビト
ロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／または
前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、Ｐ
ＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，
Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ
．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏ
ｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９
８６）を参照のこと）。
【０２６５】
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は
、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能である
。
【０２６６】
（治療活性または予防活性の実証）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証す
るためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する
化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物
または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび
細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得
る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するために
用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げ
られ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして化
合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに
対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２６７】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。
【０２６８】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方物および投
与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方物および投与経路は、本明細書
中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２６９】
種々の送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル化、この
化合物の発現が可能な組み換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例え
ば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（
１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての
核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻
腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物ま
たは組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射に
より、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射を包
含する；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２７０】
特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である）によ
り達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、
タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない
。
【０２７１】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐ
ｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２７２】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅ
ｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８
：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部の
みを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２７３】
他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２７４】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。
【０２７５】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレ
ン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望される
ならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの
組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方
物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドの
ようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級
のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリ
ンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み
得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載され
る。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で
、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供
する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２７６】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２７７】
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２７８】
この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要
に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において
使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さ
に依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきであ
る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線
から外插され得る。
【０２７９】
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２８０】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２８１】
（診断および画像化）
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出を
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０２８２】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生についての素因
を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提
供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させるこ
と、またはより早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生または
さらなる進行を予防する。
【０２８３】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイに使用し得る（例えば、Ｊ
ａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８
５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０
９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用
な、抗体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸
着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。
適切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例
えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、
１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウ
ム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ル
ミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、
ならびにビオチンが挙げられる。
【０２８４】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０２８５】
被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するため
に必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体
部分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、約５〜
２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識された抗体または抗
体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。
インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒ
ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉ
ｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａ
ｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編
、Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０２８６】
用いられる標識の型および投与の様式を含む、いくつかの可変要素に依存して
、標識された分子が被験体の部位に優先的に濃縮し、そして結合されていない標
識された分子がバックグラウンドレベルまで一掃されることを可能にする、投与
後の時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。
別の実施形態においては、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日
間である。
【０２８７】
１つの実施形態においては、疾患または障害のモニタリングは、その疾患また
は障害を診断するための方法を繰り返すこと（例えば、最初の診断後１ヶ月、最
初の診断後６ヶ月、最初の診断後１年など）により行われる。
【０２８８】
標識された分子の存在は、インビボ走査について当該分野において公知の方法
を用いて、患者から検出され得る。これらの方法は、用いられる標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明
の診断方法において用いられ得る方法およびデバイスとしては、限定はされない
が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層撮影
法（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査
法が挙げられる。
【０２８９】
特定の実施形態においては、この分子は放射性同位体で標識され、そして放射
線応答性の外科用機器を用いて患者から検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態においては、この分子は蛍光化合
物で標識され、そして蛍光応答性の走査機器を用いて患者から検出される。別の
実施形態においては、この分子は陽電子射出金属で標識され、そして陽子射出断
層撮影法を用いて患者（ｐａｔｅｎｔ）から検出される。さらに別の実施形態に
おいては、この分子は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
を用いて患者から検出される。
【０２９０】
（キット）
本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０２９１】
本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
【０２９２】
より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０２９３】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血
清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、二次標識化モノクロナール
抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原を
含み得る。
【０２９４】
１つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、およ
び洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポータ
ー標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に
比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合
していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決
定する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質
、発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在
下で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０２９５】
上記アッセイにおいて、固体表面試薬は、固体支持体物質（例えば、ポリマー
ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材料）へタンパク
質物質を付着することについての公知の技術によって調製される。これらの付着
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着またはタンパク質の共有結
合性の付着（代表的に、固体支持体上の化学的反応基に対して遊離のアミン基（
例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、もしくはアルデヒド基）によ
る）を包含する。あるいは、ストレプトアビジンコートプレートが、ビオチン化
抗原と組み合わせて使用され得る。
【０２９６】
従って、本発明は、この診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを
提供する。このキットは、一般に、表面に結合した組換え抗原を有する支持体、
および表面に結合した抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識化抗ヒト抗体
を含む。
【０２９７】
（融合タンパク質）
本発明の任意のポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用され得
る。例えば、本発明のポリペプチドは、第２のタンパク質と融合される場合、抗
原性タグとして使用され得る。本発明のポリペプチドに対して惹起される抗体は
、ポリペプチドに結合することによって、第２のタンパク質を間接的に検出する
ために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞位置を輸送シグナ
ルに基づいて標的化するので、本発明のポリペプチドは、他のタンパク質に一旦
融合されると標的化分子として使用され得る。
【０２９８】
本発明のポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみ
ならず、他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要はな
いが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０２９９】
さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改良するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主
細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改良
するためにポリペプチドのＮ末端へ付加され得る。また、ペプチド部分は精製を
容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、ポリペプチ
ドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするための
ペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られる慣用の技術である。
【０３００】
さらに、本発明のポリペプチド（フラグメント、そして特にエピトープを含む
）は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまた
はそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意の組み合わせ（
ドメイン全体およびそれらの部分の両方を含む））の一部と組み合わせられ、キ
メラポリぺプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そし
てインビボにおける増大した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４
ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖
または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載してい
る（ＥＰ  Ａ  ３９４，８２７；  Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３
３１：  ８４−８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起
因する）を有する融合タンパク質もまた、モノマー分泌タンパク質またはタンパ
ク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効率
的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３
９５８−３９６４（１９９５））。これらの融合タンパク質をコードする核酸を
含むか、あるいはこのような核酸から構成されるポリヌクレオチドもまた本発明
によって包含される。
【０３０１】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４  ５３３（カナダ国対応特許第２０４５８６９
号）は、別のヒトタンパク質またはその部分とともに免疫グロブリン分子の定常
領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ  ０２３２  ２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失させることが望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として
使用される場合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発
見において、ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニス
トを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分
と融合されてきた（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏ
ｇｎｉｔｉｏｎ  ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）
。
【０３０２】
さらに、本発明のポリペプチドはマーカー配列（例えば、融合されたポリペプ
チドの精製を容易にするペプチド）に融合され得る。好ましい実施形態において
、マーカーアミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐ
ＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，
Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、
これらの多くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１
９８９）に記載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の
良い精製を提供する。精製のために有用な別のペプチドタグである「ＨＡ」タグ
は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉ
ｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））。
【０３０３】
従って、任意のこれら上記の融合物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを使用して操作され得る。
【０３０４】
（ベクター、宿主細胞、およびタンパク質産生）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの産生に関連する。例えば、ベクターは、ファー
ジベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベ
クターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント、または複製
欠損であり得る。後者の場合、一般的にウイルス増殖は、補完性（ｃｏｍｐｌｅ
ｍｅｎｔｉｎｇ）宿主細胞にのみ生じる。
【０３０５】
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含むベクター
に連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物のよ
うな沈澱物、または荷電脂質との複合体において導入される。ベクターがウイル
スである場合、ウィルスベクターは、適切なパッケージング細胞株を使用してイ
ンビトロでパッケージングされ、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０３０６】
ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター（いくつか挙げれば、例えば
、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、ｐｈｏＡプロモーターおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プ
ロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲの
プロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは
当業者に公知である。発現構築物はさらに、転写開始、転写終結のための部位、
および転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によ
って発現される転写物のコード部分は、好ましくは、始めに翻訳開始コドン、お
よび翻訳されるためのポリペプチドの末端に適切に位置される終結コドン（ＵＡ
Ａ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０３０７】
示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー
を含む。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクター
ゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他
の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシ
リン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃ
ｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ細胞）；酵母細胞のような真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣ
Ｃ受託番号２０１１７８））；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細
胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞を含
むが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条
件は、当該分野で公知である。
【０３０８】
細菌における使用のために好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６
ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；およびｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３
−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を含む。好ましい真核生物ベクターの中
には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）がある。酵母菌系における
使用のための好ましい発現ベクターは、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚ
ｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌ
ｂａｄ，ＣＡから入手可能）を含むが、これらに限定されない。他の適切なベク
ターは当業者に容易に明らかである。
【０３０９】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によっ
てもたらされ得る。このような方法は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８６）のような多く
の標準的研究室マニュアルに記載される。本発明のポリペプチドは、実際、組換
えベクターを欠損する宿主細胞によって発現され得ることが特に意図される。
【０３１０】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され得、そして
精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）
が精製のために使用される。
【０３１１】
本発明のポリペプチド、および好ましくは分泌形態はまた、以下から回収され
得る：直接単離されるかまたは培養されるかにかかわらず、体液、組織および細
胞を含む天然の供給源から精製された産物；化学的合成手順の産物；ならびに、
例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を
含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生された産物
。組換え産生手順に使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリ
コシル化されてもまたはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明の
ポリペプチドもまた、宿主媒介プロセスの結果として、いくつかの場合において
、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一般に、翻訳開始コド
ンによってコードされるＮ末端メチオニンが、すべての真核生物細胞における翻
訳後の任意のタンパク質から高い効率で除去されることは当該分野において周知
である。ほとんどのタンパク質においてＮ末端メチオニンもまた、ほとんどの原
核生物において効果的に除去されるが、いくつかのタンパク質について、この原
核生物除去プロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存
しており、非効率的である。
【０３１２】
１つの実施形態においては、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓは、真核生
物系において本発明のポリペプチドを発現するために用いられる。Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓは、メタノールをその唯一の炭素源として代謝し得るメチロ
トローフィック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母である。メタノール代謝
経路における主なステップは、Ｏ2を用いてメタノールを酸化し、ホルムアルデ
ヒドにすることである。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼにより触媒さ
れる。メタノールをその唯一の炭素源として代謝するために、Ｐｉｃｈｉａ  ｐ
ａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ2に対するアルコールオキシダーゼの相対的に低い親和性
にいくぶん起因して、高いレベルのアルコールオキシダーゼを産生しなければな
らない。従って、主要な炭素源としてのメタノールによる増殖培地において、２
つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの１つのプロモーター領
域は、非常に活性である。メタノールの存在下において、ＡＯＸ１遺伝子から産
生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中の総可
溶性タンパク質のおよそ３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ．
Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ  ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ
．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８７）を参
照のこと。従って、全体または一部のＡＯＸ１調節塩基配列の転写調節下で、異
種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチド）は、メタノールの存在下で
増殖したＰｉｃｈｉａ酵母において例外的に高いレベルで発現される。
【０３１３】
１つの例においては、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋは、本明細書中に記述されるように、本質的に以下に記載されるようなＰｉｃｈｅａ酵母系において本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するために用いられる：「Ｐｉｃｈｉａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８。この発現ベクターは、多重クローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダーペプチド）に連結した強いＡＯＸ１プロモーターの効力により、本発明のタンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０３１４】
多くの他の酵母ベクターは、当業者が容易に理解するように、提案される発現
構築物が、転写、翻訳、分泌（所望される場合）などのために適切に配置された
シグナル（必要ならばインフレームＡＵＧを含む）を提供する限り、ｐＰＩＣ９
Ｋ（例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、
ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩ
Ｌ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５）の代わり
に用いられ得る。
【０３１５】
別の実施形態においては、異種コード配列（例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドのような）の高レベルの発現は、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクタ
ー（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαのような）にクローニングすること
により達成され得、そしてメタノールの非存在下で酵母培養物を増殖させる。
【０３１６】
本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次（ｐｒｉｍａｒ
ｙ）宿主細胞、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）宿主細胞、および不死化宿主細胞を
含む。これらの宿主細胞は、内因性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失ま
たは置換するように操作されており、そして／または本発明のポリヌクレオチド
と作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含む
ように操作され、そして内因性のポリヌクレオチドを活性化、変更、および／ま
たは増幅する。例えば、当該分野で公知の技術は、相同組換えを介して、異種制
御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）および内因性ポリ
ヌクレオチド配列を作動可能に連結するために使用され得、その結果、新しい転
写ユニットを形成する（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第
５，６４１，６７０号；１９９８年３月３１日に発行された米国特許第５，７３
３，７６１号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開第ＷＯ  ９６／２９
４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第ＷＯ  ９４／１２６５０
；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８
９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３
４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これらの開示の各々は、それ
ら全体において参考として援用される）。
【０３１７】
さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成さ
れ得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．
Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、本発
明のポリペプチド配列のフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成
機の使用により合成され得る。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化
学的アミノ酸アナログが、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入さ
れ得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない
：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４
−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノ
ヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチ
ン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン
、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、
フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸
、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メチルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸
、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ
（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０３１８】
本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質
分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改
変されるポリペプチドを含む。任意の多数の化学的改変は、以下を含むがこれら
に限定されない公知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キ
モトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学的切
断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合
成；など。
【０３１９】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の炭水化物鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロ
セシング）、アミノ酸バックボーンへの化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結
合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末
端メチオニン残基の付加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標
識（例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変
して、このタンパク質の検出および単離が可能にされ得る。
【０３２０】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置で、またはこの
分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を
含み得る。
【０３２１】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状でまたは非
分枝状であり得る。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量は、取
り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（用語
「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分
子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示す）
である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時間、存
在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度ま
たは抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチ
レングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例
えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２
０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５
００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９００
０、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１
２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４
，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，
０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５
００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，００
０、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００
、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、
または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０３２２】
上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有していてもよい。分
枝ポリエチレングリコールは、例えば、以下に記載される：米国特許第５，６４
３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：２７４５−２７５０（１９９９）
；およびＣａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−
６４６（１９９９）（これらの各々の開示は、本明細書中において参考として援
用される）。
【０３２３】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ  ０  ４０１  ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。
【０３２４】
上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、多くのアミノ酸残基の
いずれかへの結合を介してタンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレング
リコールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸
残基、またはシステイン残基への共有結合を介してタンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学系を用いて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リ
ジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン）またはタ
ンパク質の１つより多くの型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、システインおよびそれらの組み合わせ）にポリエ
チレングリコールを結合し得る。
【０３２５】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（
分子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子の
タンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、お
よび選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化
調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から
分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精
製によるものであり得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特
定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジ
ン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る
。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタン
パク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０３２６】
上記のように、本発明のタンパク質のペグ化は、かなり多数の手段によって、
達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的または介在性リンカ
ーによってのいずれかによってタンパク質に接続され得る。タンパク質にポリエ
チレングリコールを接続させるためのリンカーレス（ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）シ
ステムは、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａ
ｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎ
ｔｅｒｎ．Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許
第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０
５８；およびＷＯ９８／３２４６６に記載される。これらの各々の開示は、本明
細書中に参考として援用される。
【０３２７】
介在するリンカーを伴わずに、タンパク質のアミノ酸残基に直接的にポリエチ
レングリコールを結合させる１つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）
ＭＰＥＧ（これは、塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＣｌＳＯ
2ＣＨ2ＣＦ3）を使用して、モノメトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレ
ングリコール（ＭＰＥＧ）を改変することによって生成される）を使用する。ト
レシル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応に際して、ポリエチレングリコールは、
タンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク
質と２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スル
ホニル基を有するポリエチレングリコール分子とを反応させることによって生成
されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む。
【０３２８】
ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介在リンカーを使用して、タン
パク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示全
体が、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質にポリエチレングリ
コールを結合させるためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコー
ルが、リンカーによってタンパク質に結合されるタンパク質−ポリエチレングリ
コール結合体はまた、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１，１'−カルボニルジイミダゾールで活
性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネート
（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロ
フェノールカルボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような
化合物とのタンパク質の反応によって生成され得る。さらなる多くのポリエチレ
ングリコール誘導体、およびタンパク質にポリエチレングリコールを結合させる
ための反応化学が、ＷＯ９８／３２４６６（この開示全体が、本明細書中で参考
として援用される）に記載される。本明細書中に示される反応化学を使用して生
成されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０３２９】
本発明の各タンパク質に結合されたポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）もまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０個またはそれより多いポリエチレングリコール分子を連結し得る。同様に、平
均の置換の程度は、タンパク質１分子あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、
５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２
〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、また
は１８〜２０個のポリエチレングリコール部分のような範囲内である。置換の程
度を決定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ
ａ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）にお
いて考察される。
【０３３０】
本発明のポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、
トリマー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発
明は、モノマーおよびマルチマーの本発明のポリペプチド、それらの調製ならび
にそれらを含む組成物（好ましくは、治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ））に関
する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、モノマー、ダイマー、ト
リマーまたはテトラマーである。さらなる実施形態では、本発明のマルチマーは
、少なくともダイマー、少なくともトリマー、または少なくともテトラマーであ
る。
【０３３１】
本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、配列番号Ｙのアミノ酸配列に
対応するポリペプチドまたは寄託されたｃＤＮＡクローンによって含まれるｃＤ
ＮＡによってコードされるポリペプチド（本明細書中に記載されるポリペプチド
の、フラグメント、改変体、スプライス改変体、および融合タンパク質を含む）
のみを含むマルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマー
は、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含むマルチマーである。別
の特定の実施形態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを含むマルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは
、ホモダイマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含む）あるいはホモトリマー（例えば、同一および／または異なるアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態では、本発明のホモ
マー性マルチマーは、少なくともホモダイマー、少なくともホモトリマーまたは
少なくともホモテトラマーである。
【０３３２】
本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のポリペプチドに
加えて１以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド
）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテ
ロダイマー、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態
では、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なく
ともヘテロトリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。
【０３３３】
本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
的な結合の結果であり得、そして／または例えば、リポソーム形成によって間接
連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例えば、ホ
モダイマーまたはホモトリマーなど）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互い
に接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー（
例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマー）は、本発明のポリペプチドが
、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質におけ
る異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成される。他
の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの、および／
または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような共
有結合は、ポリぺプチド配列（例えば、配列表に記載されるか、または寄託され
たクローンによってコードされるポリペプチドによってコードされるポリペプチ
ドに含まれる）に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、この共
有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチドにおいて相互
作用するポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間での架橋である。別の
例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果である。あるいは
、このような共有結合は、本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に
おいて含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。
【０３３４】
１例では、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある
（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、こ
の共有結合は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＦｃ融合タンパク質
に含まれる異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共
有結合は、共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（例えば、オス
テオプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリ
ペプチド配列間にある（例えば、国際公開番号ＷＯ  ９８／４９３０５号（この
内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の実
施形態では、２以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを通して連結
される。例としては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考とし
て援用される）に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカー
によって隔てられた複数の本発明のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組
換えＤＮＡ技術を用いて産生され得る。
【０３３５】
本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来種々の異なるタンパク質
において見出されている。とりわけ公知のロイシンジッパーは、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体である。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ  ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形成ま
たはトリマー形成をするペプチド配列に融合された本発明のポリペプチドを含む
組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性
マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収
される。
【０３３６】
本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性の利点を提供し得
る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを優先
的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏｐｐ
ｅら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１，（１９９４））および米国
特許出願第０８／４４６，９２２号に記載されるような肺サーファクタントプロ
テインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するトリマ
ータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製にお
いて用いられ得る。
【０３３７】
別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって結合される。さらなる実施形態では、本発明のタンパク
質の結合は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリ
ペプチド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって結合する
。
【０３３８】
本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を使用して生成され得る。
例えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該
分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を使用して、化学的
に架橋され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全体が
本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、本発明のマルチ
マーは、当該分野で公知の技術を使用して生成されて、マルチマー中に含まれる
ことが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に、１つ以
上の分子間架橋を形成し得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これ
は、本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと）。さらに、
本発明のポリペプチドは、このポリぺプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステイ
ンまたはビオチンの付加により慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技
術が、１つ以上のこれらの改変されたポリペプチドを含むマルチマーを生成する
ために適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号（これはその全
体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。さらに、当該分野で
公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれることを所望されるポリペプチド成
分を含むリポソームを生成するために適用され得る（例えば、米国特許第５，４
７８，９２５号（これはその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照
のこと）。
【０３３９】
あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の融合タンパク質技
術を用いて組換え生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態では
、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配
列に連結し、次いでさらに元々のＣ末端からＮ末端の方向とは逆方向でポリペプ
チドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）に連
結することによって生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形態では
、本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野で公知の組換え技術を適用して
、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、そして膜
再構成技術によってリポソームに組み込まれ得る、本発明の組換えポリペプチド
を生成する（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許
第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０３４０】
（ポリヌクレオチドの使用）
本明細書中で同定された各々のポリヌクレオチドは、試薬として多数の方法に
おいて使用され得る。以下の説明は例示的であるとみなされるべきであり、そし
て公知の技術を利用する。
【０３４１】
本発明のポリヌクレオチドは、染色体同定のために有用である。実際の配列デ
ータ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとんど利用可能では
ないため、新しい染色体マーカーを同定する必要性が存在するままである。本発
明の各々のポリヌクレオチドは、染色体マーカーとして使用され得る。
【０３４２】
簡単に言うと、配列は、配列番号Ｘで示される配列からＰＣＲプライマー（好
ましくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって染色体にマッピングされ得る
。プライマーが、ゲノムＤＮＡ中の１つより多くの予測されたエキソンにまたが
らないように、プライマーは、コンピューター分析を使用して選択され得る。次
いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰ
ＣＲスクリーニングのために使用される。配列番号Ｘに対応するヒト遺伝子を含
むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを産生する。
【０３４３】
同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対してポリヌクレオチドをＰ
ＣＲマッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用し
て１日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチ
ドの下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグ
メントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピング戦略
は、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌａｂｅｌｅｄ
ｆｌｏｗ  ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、染色体特異的ｃＤ
ＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択、およ
びコンピューターマッピング技術（例えば、本明細書中にその全体が参考として
援用される、Ｓｈｕｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：４５
６〜４５９（１９９８）を参照のこと）を含む。
【０３４４】
ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッド（ｓｐｒ
ｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して獲
得され得る。この技術は５００または６００塩基ほどの短さのポリヌクレオチド
を使用する；しかし２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい
。この技術の総説に関しては、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，  Ｐ
ｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）を参照のこと
。
【０３４５】
染色体マッピングについては、ポリヌクレオチドは、個々に（単一染色体また
はその染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数部位およ
び／または複数染色体をマークするために）使用され得る。
【０３４６】
本発明のポリヌクレオチドは、放射線（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）ハイブリッドマ
ッピング、ＨＡＰＰＹマッピング、およびロングレンジ制限マッピング（ｌｏｎ
ｇ  ｒａｎｇｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ）において同様に有
用である。これらの技術および当該分野で公知の他の技術の概説については、例
えば、Ｄｅａｒ「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９７）；Ａｙｄｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅ
ｄ．７７：６９１〜６９４（１９９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉ
ａｔｒｙ  ３：４８３〜４９２（１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏ
ｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：４０９〜４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２：２６５〜２８０（２０００）；およ
び/またはＯｔｔ，Ｊ．Ｈｅｒｅｄ．９０：６８〜７０（１９９９）（これらの
それぞれは、その全体が参考として本明細書において援用される）を参照のこと
。
【０３４７】
一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされると、ポリヌクレオ
チドの物理的位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色体位置
と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立す
る。（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌ
ｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通し
てオンラインで利用可能である）において見い出される）。１メガベースマッピ
ング解像度および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連する染色体
領域に正確に位置決定されるｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子の
うちの１つであり得る。
【０３４８】
従って、一旦、同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間でのポ
リヌクレオチドおよび対応する遺伝子における差異が試験され得る。まず、染色
体中の可視的構造変化（例えば、欠失または転座）は染色体スプレッドにおいて
、またはＰＣＲによって試験される。構造的変化が存在しない場合、点変異の存
在が確認される。何人かのまたは全ての罹患個体で観察されたが、正常な個体で
は観察されなかった変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを示す。
しかし、いくつかの正常な個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝子の完全
な配列決定は、変異を多型性と区別するために要求される。新しい多型性が同定
される場合、この多型ポリペプチドはさらなる連鎖分析のために使用され得る。
【０３４９】
さらに、非罹患個体と比較した、罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現
が、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化（
変化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マーカ
ーとして使用され得る。
【０３５０】
従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをポリヌクレオチド発現レベル
の標準レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子
発現レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
【０３５１】
なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／または癌性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキットを
含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと特
異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレ
オチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、このキ
ットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオチ
ドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー末
端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０３５２】
障害の診断が既に従来方法によって行われている場合、本発明は、予後のイン
ジケーター（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）として有用であり、それによって増強または
抑制された本発明のポリヌクレオチド発現を示す患者が、標準レベルにより近い
レベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経験する。
【０３５３】
「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」とは、本発明
のポリペプチドのレベルまたはこのポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベル
を、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク質レベル
またはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対的（例え
ば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対
して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定または評価
することを意図する。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリペプチドレ
ベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリペプチドレ
ベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、障害を有さない個体
から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは障害を有さない個体
の集団由来のレベルを平均することによって決定される。当該分野で認識される
ように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが公知になれば
、これを、比較のための標準として反復して用い得る。
【０３５４】
「生物学的サンプル」とは、本発明のポリペプチドまたはｍＲＮＡを含む、個
体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意の生物学的サ
ンプルを意図する。示されるように、生物学的サンプルは、本発明のポリペプチ
ドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、お
よび本発明のポリペプチドを発現することが見出された他の組織供給源を含む。
哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周知である。
生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。
【０３５５】
上記で提供された方法は好ましくは、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペ
プチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適用され得
る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，８３２号
、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載される、「
遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明のポリヌ
クレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、このポリヌクレオチ
ド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチドとの間の多型性を同定し
得る。このような多型性の知見（すなわち、それらの位置ならびにそれらの存在
）は、癌性の疾患および状態を含む多くの障害についての疾患の遺伝子座を同定
する際に有益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５９号およ
び同第５，８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は、その全
体が本明細書中に参考として援用される。
【０３５６】
本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再
現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、本発明のポリ
ヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、ポリヌクレオチドが固体支持体、す
なわち、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として役立つ。本発明
の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡアナログで
あり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについての単量体単位
が市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｃｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＤＮＡの
特定の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導体）は、ＰＮ
Ａ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅ
ｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７（１９９
１）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅ
ｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄｒｉｖｅｒ
，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．Ｅ．Ｎｉｅ
ｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６５，６６６（１９９３）によって開示されるよう
に、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し、そしてヌク
レアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合するよりも
強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥力が存在せず
、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性が高いことによる。これによって、Ｐ
ＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリンジェンシ
ー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより容易にする。
強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用いられ得る。
さらに、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼー
ションを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マーにおける単
一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４℃〜１６℃で
あるのに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させるからである。
また、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーションが、低い
イオン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を減少させるこ
とを意味する。
【０３５７】
本発明は、哺乳動物における癌の検出のために有用である。特に、本発明は、
以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増殖新形成の診断の間に有用
である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前
骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血病、急性巨核球性白血病、
および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨髄性白血病（慢性骨髄単球
性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好ましい哺乳動物としては、有尾
猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサ
ギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒトである。
【０３５８】
病理学的細胞増殖性の疾患、障害および／または状態はしばしば、癌原遺伝子
の不適切な活性化に関連する（Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ  Ｅｔｉ
ｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉ
ｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、
Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１８２（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の
染色体への挿入、より活性に転写される領域への遺伝子の染色体転座、または何
らかの他の機構による、正常な細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子
発現の定量的改変から生じると考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特
定の遺伝子の変異または変更された発現が、他の組織および他の細胞型の中でも
、いくつかの白血病の病因と関与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
実際、いくつかの動物新形成に関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病
および癌腫のいくつかの症例において増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎ
ｎら、前出）。例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ球性白血病細胞株ＨＬ−６
０において高度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘
導される場合、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出さ
れる（国際公開番号ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−
ｍｙｂの５’末端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ
−ｍｙｃタンパク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートす
る対応するｍＲＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の
停止を引き起こすことが示されている（国際公開番号ＷＯ９１／１５５８０号；
Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２
８（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８６：３３７９（１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公
知である種々の起源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が
造血性の細胞および組織の増殖性の疾患、障害および／または状態の処置に限定
されないことを認識する。
【０３５９】
前記に加えて、ポリヌクレオチドは、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮ
ＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセ
ンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１
９９１），「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，
ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）において考察さ
れる。三重らせん形成は例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  
２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１
：１３６０（１９９１）において考察される。両方の方法は、相補的ＤＮＡまた
は相補的ＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に依存する。これらの技術に関して
、好ましいポリヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドで
あり、そして転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ  ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２
５１：１３６０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス
−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇ
ｏｄｅｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，
Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重ら
せん形成は、最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンス
ＲＮＡハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止
する。両方の技術は、モデル系において効果的であり、そして本明細書に開示さ
れる情報は、疾患を処置または予防するための試みにおいて、アンチセンスまた
は三重らせんポリヌクレオチドを設計するために使用され得る。
【０３６０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物
へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは、
高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標
は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主
細胞中に新しい形質を生成することである。
【０３６１】
ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長
の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノム
ＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するため固有なバン
ドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認識
票（Ｄｏｇ  ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれた
りすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限界を受けない
。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとし
て使用され得る。
【０３６２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物として使
用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして単離
するためにＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選択さ
れたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有する
ので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータベー
スが個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡してい
ようとにかかわらず、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプル
からなされ得る。
【０３６３】
法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ、肺痰（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｐ
ｕｔｕｍ）またはサーファクタント、尿、糞便物質など）のような非常に小さな
生物学的サンプルから得られたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。
ある先行技術において、ＤＱａクラスＩＩ  ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子
座から増幅された遺伝子配列は、個体を同定するための法医学生物学において使
用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が
増幅されると、これらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラ
スＩＩ  ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについ
てのバンドの同定セットを生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医
学的目的のための多型性マーカーとして使用され得る。
【０３６４】
また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、特定の組織に特
異的なＤＮＡプローブまたはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは
、種および／または器官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの
試薬は、夾雑物について組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
【０３６５】
少なくとも、本発明のポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーと
して、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断プローブとして
、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」す
るためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるため
のオリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体
を惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
【０３６６】
（ポリペプチドの使用）
本明細書中に同定される各ポリペプチドは、多くの方法に使用され得る。以下
の説明は、例示としてみなされるべきであり、そして公知の技術を利用する。
【０３６７】
本発明のポリペプチドは、抗体に基づいた技術を使用して生物学的サンプル中
のタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織における
タンパク質発現は、古典的な免疫組織化学法を用いて研究され得る（Ｊａｌｋａ
ｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５
）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−
３０９６（１９８７））。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用である、抗
体に基づいた他の方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが含まれる。適切な抗体ア
ッセイの標識は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、グルコースオキシ
ダーゼのような酵素標識、ならびにヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４
Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およ
びテクネチウム（９９ｍＴｃ）のような放射性同位体、ならびにフルオレセイン
およびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。
【０３６８】
生物学的サンプル中の分泌タンパク質レベルをアッセイすることに加えて、タ
ンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質をインビボ
で画像化するための抗体の標識またはマーカーとしては、Ｘ線ラジオグラフィー
、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能なものが挙げられる。Ｘ線ラジオグラフィ
ーについては、適切な標識は、検出可能な放射線を発するが、被験体に対して明
白には有害ではないバリウムまたはセシウムのような放射性同位体を含む。ＮＭ
ＲおよびＥＳＲに適切なマーカーには、例えば重水素のような検出可能な特徴的
なスピンを有するものが含まれ、これは、関連したハイブリドーマのための栄養
素を標識することにより抗体に取り込まれ得る。
【０３６９】
放射性同位体（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線不透過
性物質、または核磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像
化部分で標識された、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動
物に（例えば、非経口的、皮下、または腹腔内に）導入される。被験体のサイズ
および用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために必要な画像化部
分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、
ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃの約５〜２０
ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは
、特定のタンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像
化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅ
ｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  
Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  
Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒの第１
３章、Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０３７０】
従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、この方法は、（ａ）個体の細胞
または体液中の本発明のポリペプチドの発現をアッセイする工程；（ｂ）この遺
伝子発現レベルを標準の遺伝子発現レベルと比較する工程を包含し、これによっ
て、標準的な発現レベルと比較して、アッセイされたポリペプチドの遺伝子発現
レベルの増加または減少が、障害の指標になる。癌に関しては、個体由来の生検
組織中での比較的多量の転写物の存在は、この疾患の発症の素因を示し得るか、
または実際の臨床症状の出現前にこの疾患を検出するための手段を提供し得る。
この型のより決定的な診断は、保健専門家が、より早期に予防的測定または積極
的処置を用い、それによって癌の発症またはさらなる進行を予防することを可能
にし得る。
【０３７１】
さらに、本発明のポリペプチドを用いて疾患を処置、予防および／または診断
し得る。例えば、患者には、ポリペプチド（例えば、インスリン）の非存在また
はレベルの減少を置換すること、異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢ
に対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）の非存
在またはレベルの減少を補充すること、ポリペプチド（例えば、癌遺伝子または
腫瘍サプレッサー）の活性を阻害すること、ポリペプチドの活性を（例えば、レ
セプターに結合することによって）活性化すること、遊離リガンド（例えば、炎
症を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）について、膜結合レセ
プターと競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること、ま
たは所望の応答（例えば、血管の増殖阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応
答の増強）をもたらすことに取り組む際に、本発明のポリペプチドが投与され得
る。
【０３７２】
同様に、本発明のポリペプチドに対する抗体もまた使用されて疾患を処置、予
防および／または診断し得る。例えば、本発明のポリペプチドに対する抗体の投
与によって、そのポリペプチドに結合して、そしてそのポリペプチドの過剰産生
を低減し得る。同様に、抗体の投与によって、例えば、膜に結合したポリペプチ
ド（レセプター）へ結合することにより、そのポリペプチドを活性化し得る。
【０３７３】
少なくとも本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され得
る。ポリペプチドを用いてもまた、抗体を惹起し得、次いで、この抗体を使用し
て、宿主細胞の形質転換を評価する方法として、組換え細胞からのタンパク質発
現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドを使用して、以下の生物学的活性
を試験し得る。
【０３７４】
（遺伝子治療方法）
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置または予防するための遺
伝子治療方法に関する。この遺伝子治療法は、本発明のポリペプチドの発現を達
成するために、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ
）配列を動物へ導入することに関する。この方法は、プロモーター、および標的
組織によるこのポリペプチドの発現のために必要な任意の他の遺伝的エレメント
に作動可能に連結された、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を必要とする。このような遺伝子治療および送達の技術は、当該分野で公知であ
り、例えば、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９０／１１０９２を参照の
こと。
【０３７５】
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のポリヌクレオチド
に作動可能に連結されたプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）を用いて操作され得、この操作された細胞は次いで、このポリペプチドで
処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野で周知である。
例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，
８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉら，Ｃａｎｃｅｒ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎ
ｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３：４６０４−４６１５（１９９４）；
Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６０：２２１−２２９（１９
９５）；Ｏｇｕｒａら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：５１０２−５
１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈ
ｅｒａｐｙ  ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇら
，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：３１−３８（１９９６）を参
照のこと。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形
態では、操作される細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈周囲
の組織への直接注射によって、またはカテーテル注射によって患者に再度導入さ
れ得る。
【０３７６】
以下でより詳細に考察するように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可能
な物質を動物の細胞へ送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、
肺、肝臓など）の間隙空間への注射）によって送達され得る。このポリヌクレオ
チド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性キャリアにて送達され得る。
【０３７７】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドと
して送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞
への侵入を補助、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（
ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈殿
剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはま
た、リポソーム処方物中で送達され得、そしてリポフェクチン処方物などは、当
業者に周知の方法によって調製され得る。このような方法は、例えば、本明細書
中に参考として援用される、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９
，４６６号および同第５，５８０，８５９号に記載される。
【０３７８】
遺伝子治療方法において使用される本発明のポリヌクレオチドベクター構築物
は好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含まない、
構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能な
ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；な
らびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１
、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易
に明白である。
【０３７９】
当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、本発明のポリヌクレオチド配列
の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウ
イルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または
異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アル
ブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウ
イルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ
プロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒ
ト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明の
ポリヌクレオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３８０】
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３８１】
本発明のポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）
の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、
細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織
のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔ
ｉｓｓｕｅ  ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌ）内または骨の
裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャン
ネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、
以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、
これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポ
リヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され
、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または
完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）に
おいて達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、
そして発現する能力において、特に適格である。
【０３８２】
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識
するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切
かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態
および投与経路に依存し得る。
【０３８３】
好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられる
カテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３８４】
裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
【０３８５】
この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０３８６】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調
製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カ
チオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を
包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で
強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カ
チオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で
参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７））；ｍＲＮＡ（本明細書
中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：６０７７〜６０８１（１９８９））；および精製された
転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２６５：１０１８９〜１０１９２（１９９０））の細胞内送達を媒介
することが示されている。
【０３８７】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７）をもまた参照のこと、）よ
り入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３８８】
当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ  ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。類
似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
【０３８９】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、
ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得
る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知であ
る。
【０３９０】
例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの
各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、浴が、１５ＥＣで循環している間、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。
【０３９１】
このリポソームとしては、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソー
ム（ＳＵＶ）または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好
ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調
製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅ
ｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０１：５１２〜５２７
（１９８３）を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブ
の壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質
の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理
により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を
、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン
性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質膜を、滅菌水または１０
ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸
濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合す
る。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソー
ムおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメン
トを用いての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製
される。一般に使用される方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐ
ａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、３
９４：４８３（１９７５）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、１７：７７（１９７９
））；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ、４４３：６２９（１９７６）；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．、７６：８３６（１９７７）；Ｆｒａｌｅｙら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８（１９７９
））；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ、７６：１４５（１９７９））；および逆相エバポレーション（ＲＥＶ
）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：１０４３１（１９８
０）；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：
１４５（１９７８）；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
１５：１６６（１９８２））が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考とし
て援用される。
【０３９２】
一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３９３】
米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０３９４】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＲＮ
Ａを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操
作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとして
は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０３９５】
このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９
０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１
２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに
限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケー
ジング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限定さ
れない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポ
ソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【０３９６】
このプロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのよう
なレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちら
かにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞
は、本発明のポリペプチドを発現する。
【０３９７】
特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれる本発明の
ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデ
ノウイルスは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そして発現し、それと
同時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化され
るように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞
染色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配
が軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして
優れた安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔら、Ａｍ．Ｒｅ
ｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８（１９７４））。最終的
に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトンラットの肺へのα−１−アンチ
トリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証されている（Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３１〜４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１５５（１９９２））。さらに
、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを確立しようとする広範な研究
は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６（１９７９））。
【０３９８】
本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ  Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。
【０３９９】
好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的
のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠
損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたは
Ｌ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０４００】
特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、非分裂細胞の中に
そのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基対程
度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得るが、
外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡＶの
生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１３９
，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第５，
４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号およ
び同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０４０１】
例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベク
ターに挿入する。次いで、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸
カルシウム沈殿などを含む、任意の標準的技術を使用して、この組換えＡＡＶベ
クターを、ヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞にトランスフェ
クトする。適切なヘルパーウイルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウ
イルス、ワクシニアウイルス、またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッ
ケージング細胞がトランスフェクトおよび感染されると、それらは本発明のポリ
ヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキ
ソビボまたはインビボのいずれかで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物
細胞を形質導入する。この形質導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌク
レオチド構築物を含み、そして所望される遺伝子産物を発現する。
【０４０２】
遺伝子治療の別の方法は、相同組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７
０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９９
６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４日
公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６
：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ
、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領域
および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、目的のポリペプチド配列をコード
している配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存
在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベ
ルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０４０３】
当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プ
ロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０４０４】
このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０４０５】
裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０４０６】
プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列は、このプロモ
ーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在性配列の発現
を駆動する。
【０４０７】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の新脈管形成タン
パク質をコードする他のポリヌクレオチドと一緒に投与され得る。新脈管形成タ
ンパク質としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、Ｖ
ＥＧＦ−２（ＶＥＧＦ−Ｃ）、ＶＥＧＦ−３（ＶＥＧＦ−Ｂ）、上皮増殖因子α
およびβ、血小板由来の内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子
α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファー
ジコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、および一酸化
窒素シンターゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０８】
好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、そのタ
ンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配
列は、ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で
発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列
は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランス
フェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公
知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０４０９】
その投与形態によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子
が発現される限り、上記のポリヌクレオチド構築物のうちのいずれかの任意の投
与形態が使用され得る。これは、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイ
オリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝
子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅ
ｐｏｔ）物質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐
剤用の固形（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングま
たは局所適用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウ
ム沈澱した裸のプラスミドの直接注射、または門脈へのタンパク質被覆プラスミ
ド直接注射は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａ
ｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０４１０】
局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域内部に直接注射によ
り投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成
物の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリ
メートルで注射することを言う。
【０４１１】
局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０４１２】
全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０４１３】
全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１
１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐え
る能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成
することにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、
当該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げら
れる。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌク
レオチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０４１４】
送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。本発明の治療的組成物は、
任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投与され得る。好ましい哺乳動
物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ
およびブタが挙げられ、特にヒトである。
【０４１５】
（生物学的活性）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをアッセイに使用し、１つ以上の生物学的活性について試験し得
る。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドが特定のアッセイにおいて活
性を示す場合、これらの分子はその生物学的活性に関連した疾患に関与し得るよ
うである。従って、このポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニ
ストもしくはアンタゴニストを使用し、関連した疾患を処置し得る。
【０４１６】
（免疫活性）
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、例えば、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走
化性）を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患、障害および／または
状態を、処置、予防、および／または診断するのに有用であり得る。免疫細胞は
、造血と呼ばれるプロセスを介して発達し、多能性幹細胞から骨髄性細胞（血小
板、赤血球、好中球およびマクロファージ）およびリンパ系細胞（Ｂリンパ球お
よびＴリンパ球）を生成する。これら免疫疾患、障害および／または状態の病因
は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌またはいくつかの自己免疫
性障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であり
得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマー
カーまたは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０４１７】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、造血細胞の疾患、障害および／または状態の処置、
予防および／または診断において有用であり得る。本発明のポリヌクレオチド、
ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、特
定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連した疾患、障害および／または
状態を処置または予防する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化お
よび増殖を増加させるために用いられ得る。免疫不全症候群の例としては、血液
タンパク質の疾患、障害および／または状態（例えば、無ガンマグロブリン血症
、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、
ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症
候群、リンパ球減少、食細胞殺細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）
、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン
尿症が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４１８】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストをまた使用して、止血性活性（出血を止めるこ
と）または血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血
栓崩壊活性を増大させることにより、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、血液凝固
の疾患、障害および／または状態（例えば、無線維素原血症、因子欠損症）、血
液血小板の疾患、障害および／または状態（例えば、血小板減少症）、あるいは
外傷、手術または他の原因から生じる創傷を処置または予防し得る。あるいは、
止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る本発明のポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用し、凝血
を阻害または溶解し得る。心臓発作（梗塞）、発作（ｓｔｒｏｋｅ）または瘢痕
の処置または予防において、これらの分子は重要であり得る。
【０４１９】
自己免疫障害の処置、予防および／または診断において、本発明のポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
はまた、有用であり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって外来性物質
として不適切に自己認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の
破壊をもたらす免疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、
分化または走化性を阻害し得る本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
投与は、自己免疫障害の防止において効果的な治療であり得る。
【０４２０】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストによって処置、予防および／または診断され得る自己免
疫疾患および障害の例としては、以下の１つ以上が挙げられるがこれらに限定さ
れない：自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少
性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、ア
レルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体
腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎
、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、ヘノッホ−シェーンライン（Ｈｅｎｌｏｃ
ｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ）紫斑病）、ライター病、Ｓｔｉｆｆ−Ｍａｎ症候群、
自己免疫肺炎症、自閉症、ギヤン−バレー症候群、インシュリン依存性糖尿病（
ｍｅｌｌｉｔｉｓ）、および自己免疫炎症性眼、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能
低下症（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャ
ー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）
重症筋無力症、および（ｃ）インシュリン耐性など）、自己免疫溶血性貧血、自
己免疫血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症
（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性
貧血、特発性アディソン病、不妊症、糸球体腎炎（原発性糸球体腎炎およびＩｇ
Ａネフロパシーなど）、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病およびア
ドレナリン作用性薬剤耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性
薬剤耐性を含む）、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、
白斑、脈管炎、心筋梗塞後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）、心臓切開症候群、じんま疹、ア
トピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシーならびに他の炎症性障害、肉芽腫性障
害、変性障害および萎縮性障害。
【０４２１】
本発明の組成物によって処置、予防および／または診断され得る、さらなる、
自己免疫障害（起こり得る）としては、以下が挙げられるがこれらに限定されな
い：慢性関節リウマチ（例えば、関節における免疫複合体によってしばしば特徴
付けられる）、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）（
例えば、核小体抗体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられる）、混合
結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に対する抗体
によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋炎（例えば、非ヒストンＡＮＡに
よってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗壁細胞、ミクロソーム
、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、特発性アジソン病（例
えば、体液および細胞媒介性副腎細胞傷害性によってしばしば特徴付けられる）
、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付けられる）、糸球体腎炎
（例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる
）、水疱性類天疱瘡（例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特
徴付けられる）、シェーグレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または
特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿
病（例えば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられ
る）、ならびにアドレナリン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴う
アドレナリン作動性薬剤抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗
体によってしばしば特徴付けられる）。
【０４２２】
本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特
徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗
体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体
ならびに／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例え
ば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心
筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対する
ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮
膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特
徴付けられる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体に
よってしばしば特徴付けられる）、ならびに多くの他の炎症性障害、肉芽種性障
害、変性障害、および萎縮性障害。
【０４２３】
好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、例えば、本発明のアンタゴニ
スト、またはアゴニスト、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは抗体を用
いて、処置、予防、および／または診断される。
【０４２４】
特定の好ましい実施形態においては、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストが、Ｂ細胞および／また
はＴ細胞の免疫不全個体の中で免疫反応性をブーストするための薬剤として用い
られ得る。
【０４２５】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはそのアゴニス
トを投与することにより回復されるかまたは処置され得るＢ細胞免疫不全として
は、以下が挙げられるがこれらに限定されない：重篤な複合型免疫欠損（ＳＣＩ
Ｄ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損
）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ病、先天性無
ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグ
ロブリン血症、成人発症無ガンマグロブリン血症、後期発症無ガンマグロブリン
血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性乳児低ガン
マグロブリン血症、非特異的低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症
、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症
候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖
免疫欠損、選択的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ欠損を伴うかまた
は伴わない）、正常なＩｇまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免
疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選
択的ＩｇＭ免疫欠損、退縮無ガンマグロブリン血症（Ｓｗｉｓｓ型）、網様発育
不全、新生児好中球減少症、重篤な先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う胸腺リ
ンパ形成不全症−発育不全症または形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短肢
（ｓｈｏｒｔ  ｌｉｍｂｅｄ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ）、
Ｉｇを伴うネゼロフ症候群複合免疫欠損、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠
損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠失（不全リンパ球症候群）および重症複合型
免疫不全。
【０４２６】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および／またはそのアゴニス
トを投与することによって、緩和または処置され得るＴ細胞不全としては、以下
が挙げられるがこれらに限定されない：例えば、ディジョージ奇形、胸腺発育不
全、第３および第４咽頭嚢症候群、２２ｑ１１．２欠損、慢性粘膜皮膚カンジダ
症、ナチュラルキラー細胞欠損（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋  Ｔリンパ球減少、顕
著なＴ細胞欠損を伴う免疫欠損（不特定）、および細胞媒介免疫の不特定の免疫
欠損が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ディジョ
ージ奇形またはディジョージ奇形に関連する状態は、例えば、本発明のポリペプ
チドもしくはポリヌクレオチド、またはそのアンタゴニストもしくはアゴニスト
を投与することによって、緩和されるか処置される。
【０４２７】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、および／またはそれらのア
ゴニストもしくはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得
る他の免疫不全症としては、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ；例えば、Ｘ連鎖Ｓ
ＣＩＤ、常染色体ＳＣＩＤ、およびアデノシンデアミナーゼ不全症）、毛細血管
拡張性運動失調、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、短肢性（ｓｈｏｒｔ−
ｌｉｍｂｅｒ）小人症、Ｘ連鎖リンパ球増多症症候群（ＸＬＰ）、ネゼロフ症候
群（例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ不全症）、ＭＨＣクラスＩＩ不
全症が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、毛細血
管拡張性運動失調または毛細血管拡張性運動失調に関連する状態が、本発明のポ
リペプチドもしくはポリヌクレオチド、および／またはそれらのアゴニストを投
与することによって寛解または処置され得る。
【０４２８】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド
、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、慢性関節リ
ウマチが処置、予防、および／または診断される。別の特定の実施形態において
、全身性エリテマトーデスが、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置、予防および／
または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
を用いて、特発性血小板減少性紫斑病が処置、予防および／または診断される。
別の特定の好ましい実施形態において、ＩｇＡネフロパシーは、本発明のポリヌ
クレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストを用いて、処置、予防および／または診断される。好ましい実施形態にお
いて、自己免疫疾患および自己免疫障害ならびに／または上記の疾患および障害
と関連する状態は、本発明タンパク質に対する抗体を用いて、処置、予防、およ
び／または診断される。
【０４２９】
同様に、アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）
または他の呼吸障害）はまた、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド
、および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、処置、
予防および／または診断され得る。さらに、これらの分子は、アナフィラキシー
、抗原性分子に対する過敏性、または血液型不適合を処置、予防および／または
診断するために用いられ得る。
【０４３０】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストをまた用いて、炎症状態を処置、診断、および
／または予防し得る。このような炎症性状態としては、以下が挙げられるがこれ
らに限定されない：例えば、呼吸器障害（例えば、喘息およびアレルギーなど）
；胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患など）；癌（例えば、胃癌、卵巣癌、肺癌、
膀胱癌、肝臓癌、および乳癌など）；ＣＮＳ障害（例えば、多発性硬化症、血液
脳関門透過性、虚血性脳損傷、および／または脳梗塞、外傷性脳損傷、神経変性
性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病など）、ＡＩＤＳ関連
痴呆、およびプリオン病）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、心
筋炎、心血管疾患、および心肺バイパス合併症など）；ならびに炎症によって特
徴付けられる多くのさらなる疾患、状態、および障害（例えば、慢性肝炎（Ｂお
よびＣ）、慢性関節リウマチ、痛風、外傷、敗血性ショック、膵炎、サルコイド
ーシス、皮膚炎、腎虚血再還流障害、グレーヴス病、全身性エリテマトーデス、
真性糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）、および同種異系移植拒絶など）。
【０４３１】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、
および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、移植拒絶、対宿
主性移植片病、自己免疫および炎症性疾患（例えば、免疫複合体誘導血管炎、糸
球体腎炎、溶血性貧血、重症筋無力症、ＩＩ型コラーゲン誘導動脈炎、実験アレ
ルギー性および超急性異種移植変拒絶、慢性関節リウマチ、および全身性エリテ
マトーデス（ＳＬＥ）を処置、診断、および／または予防するのに有用である。
器官拒絶は、免疫反応による、移植された組織の宿主免疫細胞破壊によって生じ
る。同様に、免疫反応はまた、ＧＶＨＤに関するが、この場合、外来の移植され
た免疫細胞が、宿主組織を破壊する。本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポ
リヌクレオチドおよび／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニスト（免疫応
答、特にＴ細胞の活性化、増殖、分化、または走化性を阻害する）は、器官拒絶
またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であり得る。
【０４３２】
同様に、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストをまた使用し、炎症を調節および／または診断し
得る。例えば、本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレオチド、およ
び／または本発明のアゴニストもしくはアンタゴニストは、炎症応答に関与する
細胞の活性化、増殖および／または分化を阻害し得る。これらの分子を使用して
、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身炎症応
答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連す
る炎症、関節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に
関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症
、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病に関連する炎症またはサイトカイン
（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含むがこれらに
限定されない、慢性および急性の両方の状態の炎症状態を処置、診断、および予
後を判断し得る。
【０４３３】
本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、感染性因子を処置、検出、および／または予防するた
めに用いられ得る。例えば、免疫応答を増大することによって、特にＢ細胞およ
び／またはＴ細胞の増殖、活性化および／または分化を増大することによって、
感染性疾患は、処置、検出、および／または予防され得る。免疫応答は、既存の
免疫応答を増大するか、または新しい免疫応答を惹起するかのいずれかによって
、増大され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、免疫応答の必然的な惹
起なしに、感染性因子（感染性因子の適用列挙の節などで述べる）を直接阻害し
得る。
【０４３４】
本発明のさらなる好ましい実施形態としては、以下の適用におけるポリペプチ
ド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
の使用が挙げられるがこれらに限定されない：
免疫系をブーストし、１つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、お
よびＩｇＥ）の量の増大を生じ、高い親和性の抗体産生（例えば、ＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導し、および／または免疫応答を増大するための
動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニ
ブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長
類、およびヒト、最も好ましくはヒト）への投与。
【０４３５】
機能的な内因性抗体分子を産生できないか、さもなければ易感染性の内因性免
疫系を有するが、別の動物由来の再構成されたか、または部分的に再構成された
免疫系の手段によってヒト免疫グロブリン分子を産生し得る、動物（上記に列挙
した動物を含むがこれに限定されず、またトランスジェニック動物も含む）への
投与（例えば、ＰＣＴ公開番号、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６
、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１を参照のこと）。
【０４３６】
特定の抗原に対する免疫応答性を増強するワクチンアジュバント。
【０４３７】
腫瘍特異的免疫応答を増強するためのアジュバント。
【０４３８】
抗ウイルス免疫応答を増強するアジュバント。アジュバントとして本発明の組
成物を用いて増強され得る抗ウイルス免疫応答としては、ウイルスおよび本明細
書において記載されるかさもなければ当該分野で公知のウイルス関連疾患および
症状が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下：ＡＩＤ
Ｓ、髄膜炎、デング、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より
選択される、ウイルス、疾患または症状に対する免疫応答を増強するためのアジ
ュバントとして用いられる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、
以下：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＲＳウイルス、デング、ロタウイルス、日本脳炎、イ
ンフルエンザＡおよびＢ、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、
狂犬病、Ｊｕｎｉｎウイルス、チクングニヤウイルス、リフトバレー熱、単純疱
疹、および黄熱病からなる群より選択されるウイルス、疾患または症状に対する
免疫応答を増強するアジュバントとして用いられる。
【０４３９】
抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答を増大するためのアジュバント。アジュ
バントとして本発明の組成物を使用して増大され得る抗細菌免疫応答または抗真
菌免疫応答としては、細菌または真菌、および本明細書中に記載されるか、また
はさもなくば当該分野で公知の疾患または症状に関連する細菌または真菌が挙げ
られる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌または真菌、疾患、
または症状（これは、破傷風、ジフテリア、ボツリスム、およびＢ型髄膜炎から
なる群から選択される）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして
使用される。特定の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、細菌または
真菌、疾患、または症状（これは、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｇｒｏｕｐ
Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒ
ｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅ
ｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｉ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）からなる群から選択される）に対
する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
【０４４０】
抗寄生生物免疫応答を増大するためのアジュバント。アジュバントとして本発
明の組成物を使用して増大され得る抗寄生生物免疫応答としては、寄生生物、お
よび本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の疾患または症
状に関連する寄生生物が挙げられる。特定の実施形態において、本発明の組成物
は、寄生生物に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される
。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マ
ラリア）に対する免疫応答を増大するためのアジュバントとして使用される。
【０４４１】
病原に対するＢ細胞応答性の刺激物質として。
【０４４２】
Ｔ細胞のアクチベーターとして。
【０４４３】
免疫抑制性治療を受ける前の、個体の免疫状態を増大させる薬剤として。
【０４４４】
より高い親和性抗体を誘導するための薬剤として。
【０４４５】
血清免疫グロブリン濃度を増加するための薬剤として。
【０４４６】
免疫無防備状態の個体の回復を促進するための薬剤として。
【０４４７】
高齢の集団の間の免疫応答性をブーストするための薬剤として。
【０４４８】
骨髄移植および／または他の移植（例えば、同種異系または外因性の器官移植
）の前、間、または後の免疫系エンハンサーとして。移植に関して、本発明の組
成物は、移植の前、同時、および／または後に投与され得る。特定の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回復の開始前に投与される
。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回
復の開始後であるが、Ｂ細胞集団の完全な回復の前に最初に投与される。
【０４４９】
Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬
剤として。ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはそれらのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得る
、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄
移植、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０４５０】
一時的な免疫不全を有する個体間で免疫応答性をブーストするための薬剤とし
て。ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよび／またはそれらのアゴニスト
もしくはアンタゴニストを投与することによって寛解または処置され得る、一時
的な免疫不全を生じる状態としては、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）
からの回復、栄養失調に関連する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはス
トレスに関連する状態、麻疹からの回復、輸血からの回復、手術からの回復が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０４５１】
単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原提示のレギュレーターとして
。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、インビトロまたはインビ
ボで抗原提示を増強するかまたは抗原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連
する実施形態において、この抗原提示の増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処
置としてかまたは免疫系を調節するために有用であり得る。
【０４５２】
個体の免疫系を、ＴＨ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（すなわち、ＴＨ
２）の発生に指向するための薬剤として。
【０４５３】
腫瘍増殖を誘導し、従って、腫瘍を抗腫瘍性薬剤に対してより感受性にするた
めの手段として。例えば、多発性骨髄腫は、緩慢な細胞分裂（ｄｉｖｉｄｉｎｇ
）の疾患であり、従って、実質的に全ての抗腫瘍性レジメンに対して不応性であ
る。これらの細胞は、より迅速に増殖させた場合、これらの感受性プロフィール
は、おそらく変化するであろう。
【０４５４】
ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能性免疫不全症（Ｃｏｍｍ
ｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような病理に
おけるＢ細胞の産生の刺激因子として。
【０４５５】
手術、外傷または遺伝的欠陥後のリンパ組織の生成および／または再生のため
の治療として。
【０４５６】
ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全を生じる遺伝性の障害のための
遺伝子ベースの治療として。
【０４５７】
本発明のポリペプチドに対する免疫媒介応答を阻害または増強するための抗体
を生成するための抗原として。
【０４５８】
Ｔ細胞を活性化する手段として。
【０４５９】
単球に影響を及ぼす寄生生物疾患（リーシュマニア属（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）
）に対して防御するために単球／マクロファージを活性化する手段として。
【０４６０】
移植前の骨髄サンプルの前処理として。このような処理は、Ｂ細胞提示を増加
し、従って回復を加速する。
【０４６１】
本発明のポリペプチドによって誘発される分泌サイトカインを調節する手段と
して。
【０４６２】
さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および／またはその
アゴニストは、ＩｇＥ媒介アレルギー応答を処置または予防するために使用され
得る。このようなアレルギー反応としては、ぜん息、鼻炎および湿疹が挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０４６３】
上記の適用の全ては、獣医学的医療に適用され得る。
【０４６４】
本発明のアンタゴニストとしては、例えば、結合および／または阻害性の抗体
、アンチセンス核酸、リボザイムが挙げられる。これらは、上記のリガンドの活
性の多くを無効にし、そして以下のような臨床的または実用的な適用を見い出す
ことが予測される。
【０４６５】
外来因子または自己に対する種々の局面の免疫応答をブロックする手段として
。例としては、狼瘡および関節炎のような自己免疫障害、ならびに皮膚アレルギ
ー、炎症、腸疾患、損傷および病原体に対する免疫応答が挙げられる。
【０４６６】
自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス
およびＭＳ）に関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を妨げるための治療として。
【０４６７】
内皮細胞におけるＢ細胞および／またはＴ細胞の遊走のインヒビターとして。
この活性は、組織構造または同属の応答を破壊し、そして例えば、免疫応答の破
壊および敗血症のブロックにおいて有用である。
【０４６８】
対宿主性移植片病または移植片拒絶のインヒビターとして。
【０４６９】
ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、プラスマ
細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫およびＥＢＶ変換性（ＥＢＶ−ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍｅｄ）疾患のようなＢ細胞および／またはＴ細胞の悪性疾患のた
めの治療。
【０４７０】
未定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃ
ａｎｃｅ）（ＭＧＵＳ）、ヴァルデンストレーム疾患、関連する特発性単一クロ
ーン性高ガンマグロブリン血症、およびプラスマ細胞腫のような疾患における、
慢性の高ガンマグロブリン血症事象のための治療。
【０４７１】
ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少するための治療。
【０４７２】
慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少する手段。
【０４７３】
免疫抑制剤。
【０４７４】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、インビトロまたはインビボでのＩｇＥ濃度を調節する
ために使用され得る。
【０４７５】
別の実施形態において、本発明のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドおよ
び／またはアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、ぜん息、鼻炎および湿
疹を含むがこれらに限定されない、ＩｇＥ媒介アレルギー反応を処置または予防
するために使用され得る。
【０４７６】
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、上記のような、薬学的に受容可
能なキャリアを含む組成物において使用され得る。
【０４７７】
アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば、特定の自己免疫疾患および慢性
炎症疾患および感染性疾患における、マクロファージおよびその前駆体、ならび
に好中球、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、
活性化Ｔ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー細胞）の
、ポリペプチド走化性および活性化を阻害するために使用され得る。自己免疫疾
患の例は、本明細書中に記載され、その自己免疫疾患の例としては、多発性硬化
症およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニストまたはアゴニス
トはまた、例えば、単核食細胞の補充および活性化を妨げることによって、珪肺
症、サルコイドーシス、特発性肺線維症を含む、感染性疾患を処置するために使
用され得る。これらはまた、例えば、好酸球の産生および遊走を妨げることによ
って、特発性好酸球増多症候群を処置するために使用され得る。アンタゴニスト
またはアゴニストはまた、例えば、動脈壁における単球浸潤を妨げることによっ
て、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。
【０４７８】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、ＡＲＤＳを処置するために使用され得
る。
【０４７９】
本発明のアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、創傷および組織の
修復の刺激、新脈管形成の刺激、血管またはリンパの疾患または障害の修復の刺
激における用途を有する。さらに、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストは
、粘膜表面の再生を刺激するために使用され得る。
【０４８０】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／
またはそれらのアゴニストは、原発性または後天性の免疫不全、欠損性の血清免
疫グロブリン産生、再発性の感染および／または免疫系機能不全によって特徴付
けられる障害を処置または予防するために使用される。さらに、ポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、および／またはそれらのアゴニストは、関節、骨、皮
膚および／または耳下腺の感染、血液由来の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗
血症性関節炎および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開
示されるような自己免疫疾患）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／ある
いはこれらの感染、疾患および／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障
害または状態（ＣＶＩＤ、他の原発性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気
管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状ヘルペス（例え
ば、重篤な帯状ヘルペス）および／またはニューモシスティスを含むが、これら
に限定されない）を処置または予防するために使用され得る。
【０４８１】
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、分類不能性免疫不全症（Ｃ
ｏｍｍｏｎ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｉｃｉｅｎｃｙ）（「ＣＶ
ＩＤ」；「後天性無ガンマグロブリン血症」および「後天性低ガンマグロブリン
血症」としても公知である）またはこの疾患のサブセットを有する個体を、処置
および／または診断するために使用される。
【０４８２】
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体お
よび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、（１）癌または新生物、お
よび（２）自己免疫細胞または組織関連癌または新生物を処置、診断、および／
または予防するために用いられ得る。好ましい実施形態において、本明細書中に
記載されるように、毒素または放射性同位体に結合体化された本発明のポリヌク
レオチド、ポリペプチド、抗体および／またはアゴニストもしくはアンタゴニス
トは、急性骨髄性白血病を処置、診断、および／または予防するために用いられ
得る。さらに好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるように、毒素
または放射活性同位体に結合体化された本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、抗体、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、慢性骨髄性白
血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、および／またはホジキン病を処置、
診断、診断、および／または予防するために用いられ得る。
【０４８３】
別の特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、選択的Ｉｇ
Ａ欠損、ミエロペルオキシダーゼ欠損、Ｃ２欠損、毛細管拡張性運動失調、Ｄｉ
Ｇｅｏｒｇｅ奇形、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン
血、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、およびＷｉｓｋ
ｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群を処置、診断、予測、および／または予防し得る
。
【０４８４】
処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧
血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸
球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力
症、神経炎、眼炎痛、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ラ
イター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデ
ス、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、
および自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４８５】
好ましい実施形態において、自己免疫疾患および障害ならびに／または上記の
疾患および障害に関連する状態は、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて
、処置、予測、予防、および／または診断される。
【０４８６】
Ｂ細胞免疫不全個体（例えば、部分的または完全な脾臓摘出術をうけた個体な
ど）の間で免疫応答性をブーストするための因子として用いられる。
【０４８７】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストは、アポトーシスに影響し得、従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストは、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する多くの疾患を処置するのに有用である。例えば、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストによって処置または検出され得る、細胞生存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、およびホルモン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｔｉｓｉｓ）を阻害するために使用される。
【０４８８】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアンタゴニストによ
って処置または検出され得る細胞生存に関連したさらなる疾患または状態として
は、以下のような悪性腫瘍および関連する障害の増殖および／または転移が挙げ
られるがこれらに限定されない：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性
白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性
白血病、単球性白血病、および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば
、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性
赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨
髄腫、ヴァルデンストレームマクロ大グロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍
（肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性
肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫
、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、
卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状
癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管
癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、
小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫
、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜
腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。
【０４８９】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストに
よって処置または検出され得る、増加したアポトーシスに関連する疾患としては
、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パ
ーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍また
は以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン
症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫
関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再
生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作および再灌流
傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓傷害、虚血
／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）および肝臓
癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるようなもの）、
敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０４９０】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはアンタゴニストに
よって検出および／または処置され得る過剰増殖性の疾患および／または障害と
しては、以下に位置する新生物が挙げられるがこれらに限定されない：肝臓、腹
部、乳房、消化器系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、
卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ
系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、ならびに泌尿生殖器。
【０４９１】
同様に、他の過剰増殖性障害もまた、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、および／またはアンタゴニストによって処置または検出され得る。このよう
な過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：高
ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑、サル
コイドーシス、セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、
ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過剰増殖性疾患、加えて上記に列挙
した器官系に見出される新生物。
【０４９２】
（過剰増殖障害）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、新生物を含む過剰増殖性疾患、障害を処置、予防お
よび／または診断し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ま
たはアゴニストもしくはアンタゴニストは、直接的または間接的な相互作用を介
してこの障害の増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、過剰増殖障害を
阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。
【０４９３】
例えば、免疫応答を増大させること、特に過剰増殖障害の抗原性の質を増大さ
せることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって
、過剰増殖性の疾患、障害および／または状態を処置、予防および／または診断
し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫応答を開始するかのい
ずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、免疫応答を減少させ
ることもまた、化学療法剤のような、過剰増殖性の疾患、障害および／または状
態を処置、予防および／または診断する方法であり得る。
【０４９４】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置、予防および／または診断され得る過剰増殖性の疾
患、障害および／または状態の例としては、結腸、腹部、骨、胸、消化系、肝臓
、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺
）、眼、頭および首、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織
、脾臓、胸郭、ならびに尿生殖器に位置する新生物が挙げられるが、これらに限
定されない。
【０４９５】
同様に、他の過剰増殖性の疾患、障害および／または状態もまた、本発明のポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニス
トにより処置、予防および／または診断され得る。そのような過剰増殖性の疾患
、障害および／または状態の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖
性の疾患、障害および／または状態、パラプロテイン血症、紫斑病、類肉腫症、
セザリー症候群、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織
球増殖症、ならびに任意の他の過剰増殖疾患、さらに上記に収載されている器官
系に位置している新生物が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４９６】
１つの好ましい実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを利用して、本発明、
および／またはタンパク質融合物もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療
により、異常な細胞分裂を阻害する。
【０４９７】
従って、本発明は、異常に増殖している細胞に、本発明のポリヌクレオチドを
挿入することにより細胞増殖性の疾患、障害および／または状態を処置または予
防するための方法を提供する。ここで、上記のポリヌクレオチドは、上記の発現
を抑制する。
【０４９８】
本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖性の疾患、障害および／また
は状態を処置または予防する方法を提供し、この方法は、異常に増殖している細
胞に本発明の１つ以上の活性な遺伝子コピーを投与する工程を包含する。好まし
い実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドを
コードするＤＮＡ配列を発現する際に有効な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構
築物である。本発明の別の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチ
ドをコードするＤＮＡ構築物を細胞に挿入して、レトロウイルス（または、より
好ましくは、アデノウイルスベクター）を利用して処置する（参考として本明細
書中に援用される、Ｇ  Ｊ．Ｎａｂｅｌら、ＰＮＡＳ  １９９９  ９６：３２４
−３２６を参照のこと）。最も好ましい実施形態において、このウイルスベクタ
ーは欠損性であり、そして非増殖細胞を形質転換せず、増殖細胞のみを形質転換
する。さらに、好ましい実施形態において、増殖している細胞に、単独で、また
は他のポリヌクレオチドとともに、もしくは他のポリヌクレオチドと融合して挿
入される本発明のポリヌクレオチドは、次いで、外部刺激（すなわち、磁性、特
定の低分子、化学物質、または薬物投与など）により調節され得る。この刺激は
、上記のポリヌクレオチドの上流にあるプロモーターに作用して、コードされた
タンパク質産物の発現を誘導する。このようにして、本発明の有益な治療効果は
、上記の外部刺激に基づいて、明らかに調節され得る（すなわち、本発明のポリ
ヌクレオチドの発現を増加、減少、または阻害するために）。
【０４９９】
本発明のポリヌクレオチドは、発癌性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に
有用であり得る。「発癌性遺伝子の発現を抑制する」とは、遺伝子の転写の抑制
、遺伝子転写物（前メッセンジャー（ｐｒｅ−ｍａｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）の分解
、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後修
飾の妨げ、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を意図する。
【０５００】
異常に増殖する細胞に対する局所的な投与に関しては、本発明のポリヌクレオ
チドは、当業者に公知の任意の方法により投与され得、この方法としては、トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション
、例えば、リポソームのようなビヒクルにおいて、リポフェクチン、または裸の
ポリヌクレオチド、または本明細書中全体を通して記載される任意の他の方法が
挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺
伝子送達系（例えば、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ
３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：３０１４）；ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａ
ｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５））また
は他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１２（
１９８５））に限定されない）により送達され得る。これらの参考文献は、例示
にすぎず、そして本明細書中に参考として援用される。異常に増殖している細胞
に特異的に送達するか、またはそれをトランスフェクトし、そして非分裂細胞を
残す（ｓｐａｒｅ）ために、当業者に公知のレトロウイルスまたはアデノウイル
ス（例えば、当該分野または本明細書中で記載される）送達系を利用することが
好ましい。宿主ＤＮＡ複製は組み込むためにレトロウイルスＤＮＡが必要である
ので、このレトロウイルスは、その生活環についての必要とされるレトロウイル
ス遺伝子の欠如に起因して自己複製できない。本発明のポリヌクレオチドのため
に、このようなレトロウイルス送達系を利用して、上記の遺伝子および構築物を
、異常に増殖している細胞に標的化し、そして非分裂性の正常細胞を残す。
【０５０１】
本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接注射針を導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位に直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、手術介入時に
疾患部位に投与され得る。
【０５０２】
「細胞増殖性疾患」とは、任意のヒトもしくは動物の疾患または障害が、器官
、腔、または身体部分のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを冒してい
ることを意味する。この疾患は、良性または悪性に拘わらず、細胞、細胞群、も
しくは組織の単一または複数の局所的な異常な増殖により特徴づけられる。
【０５０３】
本発明のポリヌクレオチドの任意の量は、この量が、処置細胞の増殖に対して
生物学的に阻害性の効果を有する限り、投与され得る。さらに、本発明の１つよ
り多くのポリヌクレオチドを、同時に同じ部位に投与することが可能である。「
生物学的に阻害性の」とは、部分的または全体的な成長阻害ならびに細胞の増殖
または成長の速度における減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、標的の
悪性または組織培養において異常に増殖している細胞の成長、動物および細胞培
養物における腫瘍成長に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価すること
、あるいは当業者に公知の任意の他の方法により決定され得る。
【０５０４】
本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この方法は、記載される疾患、障
害および／または状態の１つ以上を処置、予防および／または診断するために、
哺乳動物（好ましくはヒト）の患者に抗ポリペプチド抗体および抗ポリヌクレオ
チド抗体を投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗体および抗ポリヌクレオ
チド抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）を生成するための方
法は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載される。このような抗体は、当該分野
で公知のように、または本明細書中に記載されるように薬学的に受容可能な組成
物中に提供され得る。
【０５０５】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の概要は、本発明のポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドを、身体において局所的もしくは全身的に、または抗体の
直接的な細胞傷害性（例えば、補体による媒介（ＣＤＣ）もしくはエフェクター
細胞による媒介（ＡＤＣＣ））により結合させる工程を包含する。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教
示があれば、当業者は、本発明の抗体を、過度の実験なくして、診断、モニタリ
ングまたは治療の目的のために使用する方法を知る。
【０５０６】
詳細には、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載さ
れるように、細胞増殖および／または分化の疾患、障害および／または状態を有
するか、または発症している被験体を処置、予防および／または診断するために
有用である。このような処置は、単一用量または複数用量の抗体、あるいはその
フラグメント、誘導体、または結合体を投与する工程を包含する。
【０５０７】
本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせ
て、有利に利用され得る。
【０５０８】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、そのフラグメントもしくは
領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または
中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に関する疾患、障害および／または状態に関するイム
ノアッセイおよびその治療の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメ
ント、または領域は、好ましくは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そ
のフラグメントを含む）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×
１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×
１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、
５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-
14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親
和性を含む。
【０５０９】
さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載されるように
、単独で、融合タンパク質として、または直接的にもしくは間接的に他のポリペ
プチドとの組み合わせでかのいずれかで、増殖性細胞もしくは組織の脈管形成を
阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態において、上記の抗脈管形成効
果は、例えば、造血性の腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の
阻害を通じて、間接的に達成され得る（本明細書中に参考として援用される、Ｊ
ｏｓｅｐｈ  ＩＢら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，９０（２１）：
１６４８−５３（１９９８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドに対する抗体はまた、脈管形成の直接的または間接的な阻害を生じ
得る（本明細書中に参考として援用される、Ｗｉｔｔｅ  Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）を参
照のこと）。
【０５１０】
本発明のポリペプチド（タンパク質融合物を含む）、またはそのフラグメント
は、アポトーシスの誘導を通じて増殖性細胞または組織を阻害する際に有用であ
り得る。上記のポリペプチドは、直接的または間接的のいずれかで、増殖性の細
胞および組織のアポトーシスを誘導するように、例えば、死ドメインレセプター
（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）ならび
にＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１および２（
本明細書中に参考として援用されるＳｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ  Ｋ，ら、
Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参照
のこと））の活性化において作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形
態において、上記のポリペプチドは、他の機構を通じて（例えば、アポトーシス
を活性化する他のタンパク質の活性化において）あるいは上記タンパク質の発現
を単独でまたは低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン、ガレ
クチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質）と組み合わせてかのいずれかで
刺激することを通じて、アポトーシスを誘導し得る（例えば、本明細書中に参考
として援用される、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ４００（１−２）：４４７−５５（１
９９８），Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９
８），Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ  ２４；１１１−１１２
；２３−３４（１９９８））、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２
（１９９８），Ｉｎｔ  Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５
（１９９８）を参照のこと）。
【０５１１】
本発明のポリペプチド（それに対するタンパク質融合物を含む）、またはその
フラグメントは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害
は、本明細書中他の箇所に記載されるように、ポリペプチドまたは上記ポリペプ
チドに対する抗体を投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば
、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒ
ｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；２３１：１２５
−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分
子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０５１２】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、ポリペプ
チドまたは異種ポリペプチドに関連するポリペプチド抗体、異種核酸、毒素、ま
たはプロドラッグを含む組成物）を含む組成物を、本発明のポリペプチドを発現
する、標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまた
はポリペプチド抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッ
グと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて
結合され得る。
【０５１３】
本発明のポリペプチド、それに対するタンパク質融合物、またはそのフラグメ
ントは、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のポリペプ
チドが「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対して応答する
ように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公
知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のい
ずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強
する際に有用である。
【０５１４】
（心臓血管障害）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管の
疾患、障害および／または状態を処置、予防および／または診断し得る。
【０５１５】
心臓血管の疾患、障害および／または状態としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉ
ｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ  ｆｉｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先
天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁
閉鎖症、およびシミター症候群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠
陥としては、大動脈縮窄、三房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｖｅｓｓ
ｅｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ）、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ  
ｄｕｃｔｕｓ  ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー
複合体、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大
血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ
ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒ
ｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リ
ュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕ
ｌａｒ  ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０５１６】
心臓血管の疾患、障害および／または状態としてはまた、不整脈、カルチノイ
ド心臓病、高心拍出量（ｈｉｇｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出
量（ｌｏｗ  ｃａｒｄｉａｃ  ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ、心内膜炎（細
菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性
呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞
後心破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｈｅａｒｔ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、
心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗
塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ
性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕ
ｌａｒ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、シミター症候群
、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｂｅｒ
ｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられる。
【０５１７】
不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群（ｌｏｎｇ
ＱＴ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−レヴァイン症候群
、マヘーム型早期興奮症候群（Ｍａｈａｉｍ−ｔｙｐｅ  ｐｒｅ−ｅｘｃｉｔａ
ｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞不
全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げられる。頻拍としては、発作性頻拍、
上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性再入頻拍（ａｔｒｉｏｖｅｎｔｒｉ
ｃｕｌａｒ  ｎｏｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、異所心
房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節性再入頻拍（ｓｉｎｏａｔｒｉａｌ  ｎｏ
ｄａｌ  ｒｅｅｎｔｒｙ  ｔａｃｈｙｃａｒｄｉａ）、洞性頻拍、トルサード・
ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０５１８】
心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ  ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０５１９】
心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。
【０５２０】
心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０５２１】
心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症状、ヒッペル−リンダラ疾患（Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  Ｄｉｓｅａｓｅ
）、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、
血管運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、
動脈閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性
動脈炎、脳血管の疾患、障害および／もしくは状態、糖尿病性血管障害、糖尿病
性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞障害、高血圧、低血圧
、虚血、末梢血管障害、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、高血圧、低血圧、虚血、末梢
血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞疾患、レーノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈
閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、毛細血管拡張性運動
失調（ａｔａｃｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性出血性毛細管拡
張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全
のような血管疾患が挙げられる。
【０５２２】
動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０５２３】
動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０５２４】
脳血管の疾患、障害および／または状態としては、頸動脈疾患、脳アミロイド
脈管障害、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大
脳動脈疾患、大脳の塞栓症および血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベ
ルク症候群、大脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａ
ｘｈｎｏｉｄ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）
、鎖骨下動脈盗血症候群、室周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌ
ｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部
（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０５２５】
塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０５２６】
虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群（ｃｏｍｐａｒｔｍｅ
ｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前仕切り症候群（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｏｍｐａｒ
ｔｍｅｎｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、心筋虚血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血
が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅ
ｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群、粘膜皮膚リンパ節症候群、閉塞性血
栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライン−ヘーノホ紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌ
ｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ  ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェ
ーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０５２７】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効
である。
【０５２８】
ポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、こ
れらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、
カテーテル注入、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器、ゲルフォ
ームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口または坐剤の固
形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾル送達が挙
げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公知である。
本発明のポリペプチドは、下記でより詳細に記載される、治療剤（Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃ）の一部として投与され得る。本発明のポリヌクレオチドを送達する
方法は本明細書中でより詳細に記載される。
【０５２９】
（抗新脈管形成活性）
新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響を支配する平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ  ５６
：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が通常の生理学的条件下において
生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロ
セス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に
定められる。病理学的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける
）下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ  ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０５３０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、本発明のアゴニストお
よび／またはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する疾患、障害お
よび／あるいは状態の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態
および転移性状態には、本明細書に記載の悪性腫瘍、固形腫瘍、および癌、なら
びに当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍ
ａｎら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これら
に限定されない。従って、本発明は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド
、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、必要な個体に投
与する工程を包含する、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置、予防お
よび／あるいは診断の方法を提供する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に予防
するために、種々のさらなる方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストで処置、予防および／あるいは
診断され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭
癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子
宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍およ
び転移；黒色腫；グリア芽細胞腫；カポージ肉腫；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；
結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；および血液から生じる腫瘍
（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ポリヌク
レオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、皮膚癌
、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような癌を処置するために、局所
送達され得る。
【０５３１】
なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
、予防および／あるいは診断するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストは、注射もしくはカテーテ
ルを介して、腫瘍に直接的に、または腫瘍部位付近に送達され得る。当然のこと
ながら、当業者が理解するように、適切な投与様式は、処置されるべき癌によっ
て変化する。他の送達様式は本明細書中において議論される。
【０５３２】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
は、癌に加えて、他の疾患、障害および／あるいは状態（新脈管形成を含む）を
処置、予防および／あるいは診断する際に有用であり得る。これらの障害、疾患
および／あるいは状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性
肉芽腫）；動脈硬化斑；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜
症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシ
ス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒ
ｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；
子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮
症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ
ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成
；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生
血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創
傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０５３３】
例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置、予防および／
あるいは診断するための方法が提供される。
【０５３４】
本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）を経た後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に
開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角
膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖およ
び黄斑変性を含む）を処置、予防および／または診断するための方法を提供する
。
【０５３５】
さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の疾患、障害および／あるいは状態としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：血管新生緑内障、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖
症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他
の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連す
る疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４
〜７１０（１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２
２：２９１〜３１２（１９７８）による総説を参照のこと。
【０５３６】
従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織で
ある。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から
角膜に伸長し得る。角膜が血管化される場合、角膜はまた混濁され、患者の視力
の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃｉｔａｔｅ）場合に、完
全に視力喪失になり得る。広範な種々の疾患、障害および／あるいは状態は、例
えば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ
、単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プ
ロセス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アル
カリやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、なら
びにコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０５３７】
本発明の特に好ましい実施形態において、生理食塩水（眼科用調製物において
一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与のために
調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、純粋な形
態で調製され、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調製さ
れる抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態にお
いて、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調製さ
れる。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物は、
従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた、脈
管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが公知
の角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置（お
そらくステロイドと組み合わされる）は、その後の合併症を予防するのを補助す
るために直ちに開始され得る。
【０５３８】
他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡下での誘導
のもとで眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態
で変化し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと
（すなわち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合に
おいて、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅ
ｒｉｌｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防
的に防ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質
は、角膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲
角膜に注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の
毛細血管侵入を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年
に２〜３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その
注射自体から生じる炎症を低減し得る。
【０５３９】
本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効
量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供
される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置
するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前眼房
角（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ  ａｎｇｌｅ）の領域への注入によって
移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的
に放出されるように、任意の位置に配置され得る。本発明の別の局面において、
患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含
する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０５４０】
本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜にお
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。
【０５４１】
本発明の別の局面において、患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有
効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニ
ストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法
が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を
介して局所投与され得る。
【０５４２】
さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置、予防および／あるいは疾患され得る障害としては、以下が挙げ
られるが、それらに限定されない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテロ
ーム性動脈硬化症斑、遅延型創傷治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、
偽関節骨折、オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿
性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管接着。
【０５４３】
さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ  ｂｏｒｎ）腫瘍
（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、
乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、
角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細
胞腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、
脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコー
マ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｃｏｌｌａ
ｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー
−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、
血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬
化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防
することによる）、病原性の結果（例えば、引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉ
ｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏ
ｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する疾
患。
【０５４４】
出産制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物
の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、このようにして出
産制限の有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ  ａｆｔｅｒ）」方法
を提供する。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴ
ニストはまた、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症
の処置における腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与さ
れ得る。
【０５４５】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
【０５４６】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織
から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広
がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするた
めに利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形
態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成
を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面に
おいて、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メ
ッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メッシュレーデン（ｌａｄ
ｅｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子
を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得
る。
【０５４７】
本発明のさらなる局面において、腫瘍切除部位を処置するための方法が提供さ
れる。この方法は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニスト、および
／またはアゴニストを、切除後に腫瘍の切除縁に投与して、その部位での、癌の
局所的再発および新血管形成を阻害するようにする工程を包含する。本発明の１
つの実施形態において、この抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与され
る（例えば、この抗脈管形成化合物を用いて、腫瘍の切除縁に綿棒で塗るか、ブ
ラシで塗るか、または他の方法でコーティングすることによって塗布される）。
あるいは、この抗脈管形成化合物は、投与の前に、公知の手術用ペーストに組み
込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態において、この抗脈管形成化合物は
、悪性疾患の肝切除の後、および神経外科的手術の後に塗布される。
【０５４８】
本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストは、広範な種類の腫瘍（例えば、胸部腫
瘍、結腸腫瘍、脳腫瘍、および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば
、本発明１つの実施形態において、抗脈管形成化合物が、神経学的腫瘍の部位に
、切除の後に投与され得、その結果、その部位での新規な血管の形成が阻害され
る。
【０５４９】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因
子の代表例としては、以下が挙げられる：抗侵襲性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）因子、
レチン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ
−１の組織インヒビター、メタロプロテイナーゼ２の組織インヒビター、プラス
ミノゲン活性化因子インヒビター１、プラスミノゲン活性化因子インヒビター２
、および種々の形態の軽い方の（ｌｉｇｈｔｅｒ）「ｄ群」遷移金属。
【０５５０】
軽い方の「ｄ群」遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タン
グステン、チタン、ニオブ、およびタンタル種が、挙げられる。このような遷移
金属種は、遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体は、オキ
ソ遷移金属錯体を含む。
【０５５１】
バナジウム錯体の代表的例は、オキソバナジウム錯体（例えば、バナジン酸塩
錯体およびバナジル錯体）を含む。適切なバナジン酸塩錯体は、メタバナジン酸
塩錯体およびオルトバナジウム酸塩錯体（例えば、メタバナジン酸アンモニウム
、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン酸ナトリウム）を含む。適
切なバナジル錯体は、例えば、バナジルアセチルアセトネートおよび硫酸バナジ
ル（硫酸バナジル水和物（例えば、硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三
水和物）を含む）を含む。
【０５５２】
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的例もまた、オキソ錯体を含む
。適切なオキソタングステン錯体は、タングステン酸塩錯体および酸化タングス
テン錯体を含む。適切なタングステン酸塩錯体は、タングステン酸アンモニウム
、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物、およびタン
グステン酸を含む。適切な酸化タングステンは、酸化タングステン（ＩＶ）およ
び酸化タングステン（ＶＩ）を含む。適切なオキソモリブデン錯体は、モリブデ
ン酸塩錯体、酸化モリブデン錯体、およびモリブデニル錯体を含む。適切なモリ
ブデン酸塩錯体は、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸
ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物
を含む。適切な酸化モリブデンは、酸化モリブデン（ＶＩ）、酸化モリブデン（
ＶＩ）、およびモリブデン酸を含む。適切なモリブデニル錯体は、例えば、モリ
ブデニルアセチルアセトネートを含む。他の適切なタングステン錯体およびモリ
ブデン錯体は、例えば、グリセロール、酒石酸および糖から誘導された、ヒドロ
キソ誘導体を含む。
【０５５３】
広範な種類の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的例は、以下を含む：血小板第４因子；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘
導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ  ｃｒａｂ）の殻から調製される）（Ｍｕｒ
ａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）；硫酸化多糖
ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ステロイド（例
えば、エストロゲンおよびクエン酸タモキシフェン）の存在によって、増強され
得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリンアナログ、
シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、
α，α−ジピリジル、アミノプロピオニトリルフマレートを含む）；４−プロピ
ル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；
ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；Ｃ
ｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１
〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ  Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキストリンテトラデ
カサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒ
ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリンゴ酸金ナト
リウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲナーゼ−血清
；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（４
）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａ
ｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−
カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａｎｔｈｒｏｎ
ｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）二ナトリウム、または「ＣＣＡ」；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、
Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３６：３１２〜３１６、１９９２）；サリドマ
イド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノ
イミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメ
タロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０５５４】
（細胞レベルでの疾患）
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはアンタゴニス
トまたはアゴニストによって、処置、予防および／または診断され得る、細胞生
存の増大またはアポトーシスの阻害に関連する疾患には、以下が挙げられる：癌
（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍
。これらは以下を含むが、これらに限定されない：結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、
黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、神経芽
細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、破骨細胞腫、骨肉腫、
軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌）；自己免疫疾患
、障害および／または状態（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本
甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エ
リテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、ならび
にウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウ
イルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶
。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドお
よび／またはアゴニストまたはアンタゴニストは、特に上記に列挙されたものに
おいて、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するた
めに使用される。
【０５５５】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストによって処置、予防および／あるいは診断され得る、細胞生存の増
大に関連するさらなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移
ならびに以下のような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白
血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球
性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに
慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血
病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病
）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、なら
びに固形腫瘍（以下を含むが、これらに限定されない：肉腫および癌腫（例えば
、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、
内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内
皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、
膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮
脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、
肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌
、精巣の腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞
腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神
経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞
腫、および網膜芽細胞腫））。
【０５５６】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および／またはアゴニストま
たはアンタゴニストによって処置、予防および／あるいは診断され得る、アポト
ーシスの増大に関連する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性疾患
、障害および／または状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎
縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および脳腫瘍または先の関連した疾患
）；自己免疫疾患、障害および／または状態（例えば、多発性硬化症、シェーグ
レン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発
性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リ
ウマチ）、脊髄形成異常症候群（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病
、虚血性損傷（心筋梗塞、発作および再灌流損傷によって生じるようなもの）、
肝臓損傷（例えば、肝炎関連肝臓損傷、虚血／再灌流損傷、胆汁うっ滞（ｃｈｏ
ｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管損傷）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコ
ールによって生じるようなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振
。
【０５５７】
（創傷治癒および上皮細胞増殖）
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、および／またはアゴニストまたはアンタゴニストを、治療目的のため、
例えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激
するため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用する
ためのプロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
およびアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激すること
において臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮お
よび表皮の損傷を含む）、眼の組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿
病性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露
または化学物質から生ずる熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒
症、栄養失調、ビタミン欠乏、および／またはステロイド、放射能療法および抗
腫瘍性薬物および代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症。本発明の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニス
トは、皮膚の損失の後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０５５８】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび／またはアゴニストまた
はアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ  ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増
大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以
下は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストが創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の型である：
自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己
表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ  ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕ
ｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移
植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異
種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇ
ｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片
、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大
網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ  ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層
移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｓｐｌｉｔ  ｓ
ｋｉｎ  ｇｒａｆｔ）、分層植皮片（ｔｈｉｃｋ  ｓｐｌｉｔ  ｇｒａｆｔ）。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび／またはアゴニストまたは
アンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善
するために使用され得る。
【０５５９】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（
ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖における
変化を生じると考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂
細胞（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ
ＩＩ  ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、な
らびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進
し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストおよび／
またはアンタゴニストは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイ
トの増殖を促進し得る。
【０５６０】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生じ
る腸の毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、小
腸粘膜上で細胞保護的な効果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、化学療法
およびウイルス感染から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒
を刺激し得る。
【０５６１】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損に
おける皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾
癬のような他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌク
レオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストおよび／またはアンタゴニ
ストは、表皮水疱症、これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開
放性かつ疼痛性の水疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置
するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、な
らびにアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を
処置し、そして粘膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指
腸の粘膜の内層の再生による治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（
例えば、クーロン病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の
粘膜表面の崩壊を生じる疾患である。従って、本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、粘膜表面
の再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるた
め、および炎症性腸疾患の進行を予防するために、使用され得る。本発明のポリ
ヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタゴニスト
を用いる処置は、胃腸管全体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予
測され、そして腸粘膜を、摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護
するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよ
び／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドの
発現下に関連する疾患を処置するために使用され得る。
【０５６２】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防
および治癒するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストのような成長因子は
、急性または慢性の肺損傷を予防または処置するために、増殖および分化を刺激
し得、そして肺胞および気管支（ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得
る。例えば、気管支上皮および肺胞（ａｌｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（こ
れは、肺胞の進行性の損失を生じる）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入およ
び熱傷から生じる）は、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび
／またはアゴニストまたはアンタゴニストを使用して効果的に処置され得る。ま
た、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増殖および分化を刺激するた
めに使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮
迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処置または予防することを助
け得る。
【０５６３】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従っ
て、肝臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイル
スおよび毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ
ｔｅｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）によ
り生じる肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され得る。
【０５６４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するため
に使用され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者におい
て、いくつかの島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、その疾患
の持続性の発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するため
に使用され得る。また、本発明のポリヌクレオチドもしくポリペプチド、ならび
にアゴニストまたはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための
島細胞移植における補助として使用され得る。
【０５６５】
（神経学的疾患）
本発明の組成物（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニスト）を用いて処置、予防および／または診断され
得る神経系の疾患、障害および／または状態には、軸索の切断、ニューロンの減
少もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系損傷および疾患、
障害および／または状態が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従っ
て、患者（ヒト患者および非ヒト哺乳動物患者を含む）において処置、予防およ
び／または診断され得る神経系病変には、以下の中枢神経系（脊髄、脳を含む）
または末梢神経系のいずれかの病変が挙げられるが、これらに限定されない：（
１）虚血病変（ここで、神経系の一部における酸素不足により、ニューロンの損
傷または死が生じ、これには大脳梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚
血が挙げられる）；（２）外傷病変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関
連する病変、例えば、神経系の一部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）
；（３）悪性病変（ここで、神経系の一部分は、神経系関連悪性疾患もしくは非
神経系組織由来の悪性疾患のいずれかである悪性組織により破壊または損傷され
る）；（４）感染性病変（ここで、神経系の一部分は、例えば、膿瘍による感染
の結果として、破壊または損傷されるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状
ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染と関連するか、ライム病、結
核、梅毒に関連する）；（５）変性病変（ここで、神経系の一部分は、変性プロ
セスの結果として破壊または損傷され、これには、パーキンソン病、アルツハイ
マー病、ハンティングトン病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変
性が挙げられるが、これらに限定されない）；（６）栄養性の疾患、障害および
／または状態に関連する病変（ここで、神経系の一部分は、栄養障害または代謝
障害によって破壊または損傷され、これには、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏
症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコール弱視、マルキアファーヴァ−ビニャー
ミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール小脳変性が挙げられるが、これらに限
定されない）；（７）全身性疾患に関連する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニュ
ーロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌または類肉腫症が挙げら
れるが、これらに限定されない）；（８）毒性物質（アルコール、鉛または特定
の神経毒を含む）により生じる病変；ならびに（９）脱髄性病変（ここで、神経
系の一部分は、脱髄性執権によって破壊または損傷され、これには、多発性硬化
症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断脊髄障害または種々の病因、進行
性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解が挙げられるが、これらに限
定されない）。
【０５６６】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、また
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳底酸素症の損傷効果から神経細胞
を保護するために用いられる。この実施形態によると、本発明の組成物は、大脳
底酸素症に関連する神経細胞損傷を処置、予防および／または診断するために用
いられる。この実施形態の１つの局面において、本発明のポリペプチド、ポリヌ
クレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳虚血と関連する
神経細胞損傷を処置、予防および／または診断するために用いられる。この実施
形態の別の局面において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳梗塞に関連する神経細胞損傷を処置、
予防および／または診断するために用いられる。この実施形態の別の局面におい
て本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタ
ゴニストは、発作に関連する神経細胞損傷を処置、予防および／または診断もし
くは予防するために用いられる。この実施形態のさらなる局面において、本発明
のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト
は、心臓発作に関連する神経細胞損傷を処置、予防および／または診断するため
に用いられる。
【０５６７】
神経系障害を処置または予防するのに有用な本発明の組成物は、ニューロンの
生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって、選
択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のいずれかを誘発す
る本発明の組成物は、本発明によると有用であり得る：（１）培地におけるニュ
ーロンの増加した生存時間；（２）培地またはインビボにおけるニューロンの増
加した出芽；（３）培地またはインビボにおけるニューロン関連分子（例えば、
運動ニューロンに関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコ
リンステラーゼ）の増加した産生；あるいは（４）インビボにおけるニューロン
機能障害の軽減した症状。このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によ
って測定され得る。好ましくは、非制限的な実施形態において、ニューロンの増
加した生存時間は、本明細書中に記載される方法、またはそうでなければ当該分
野で公知の方法（例えば、Ａｒａｋａｗａら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３
５０７〜３５１５（１９９０））に記載される方法）を使用して慣用的に測定さ
れ得；ニューロンの増加した出芽は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｓｔ
ｒｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５〜８２（１９８０））またはＢ
ｒｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２（１９８１）
）に記載される方法）によって検出され得；ニューロン関連分子の増加した産生
は、当該分野で公知の技術を使用し、測定されるべき分子に基づいて、バイオア
ッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノザンブロットアッセイなどによって、測定
され得；そして運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現
（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価すること
によって、測定され得る。
【０５６８】
特定の実施形態において、本発明に従って処置、予防および／または診断され
得る運動ニューロンの疾患、障害および／または状態には、運動ニューロンおよ
び神経系の他の成分に影響を与え得る疾患、障害および／または状態（例えば、
梗塞、感染、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、
ならびにニューロンに選択的に影響する疾患、障害および／または状態（例えば
、筋萎縮性側索硬化症）が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれには
、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮お
よび若年性筋萎縮、小児期の進行性球麻痺（ファチオ−ロンデ病）、ポリオおよ
びポリオ後症状、ならびに遺伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−ト
ゥース病）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６９】
さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ニューロン生存、
シナプス形成；伝達；神経分化などにおいて役割を果たし得る。従って、本発明
の組成物（ポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴ
ニストを含む）は、学習および/または認識の障害を含むがこれに限定されない
、これらの役割に関連する疾患または障害を、診断、および/または処置または
予防するのに用いられ得る。本発明の組成物は、神経変性性疾患状態および/ま
たは行動障害の処置または予防において有用であり得る。このような神経変性性
疾患状態および/または行動障害としては以下が挙げられるがこれらに限定され
ない：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツレット症候群、
精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫性障害、鬱病、恐慌性障害、学習障害、
ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平衡、およ
び知覚の障害を含む）。さらに、本発明の組成物は、発生中の胚、または伴性障
害に関連する発生の障害の処置、予防および/または検出において役割を果たし
得る。
【０５７０】
さらに、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/またはアゴニス
トまたはアンタゴニストは、以下を含むが挙げられるがこれらに限定されない脳
血管障害に関連する、疾患、傷害、障害または、損傷から、神経細胞を防御する
のに有用であり得る：脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄またはモ
ヤモヤ病）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、脳低酸素症、大脳動
脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、脳塞栓症および血栓（例えば、頸動
脈血栓症、洞血栓症およびヴァレンベルク症候群）、硬膜上血腫（例えば、硬膜
外血腫または硬膜下血腫およびクモ膜下出血）、脳亀裂骨折、脳虚血（例えば、
一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、または椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏ
ｂａｓｉｌａｒ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ））、血管性痴呆（たとえば、多
発脳梗塞性痴呆）、脳室周囲白質軟化症、ならびに血管性頭痛（例えば、群発性
頭痛）。
【０５７１】
本発明のなおさらなる局面によれば、治療目的で、例えば神経学的細胞増殖お
よび/または分化を刺激するために、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを利用するためのプロセスが提
供される。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよ
び/またはアンタゴニストは、神経学的疾患を処置、および/または検出するため
に用いられ得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ま
たはアゴニストもしくはアンタゴニストは、特定の神経系疾患または傷害のマー
カーまたは検出因子として用いられ得る。
【０５７２】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙
げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿
症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒ
ａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新
生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病
、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のよう
な小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ
病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周
囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎の
ようなびまん性脳硬化。
【０５７３】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストは、を用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、
以下が挙げられる：脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびモヤ
モヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳
動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およびヴ
ァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血腫お
よびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血
症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ  ｉｎｓｕｆｆｉ
ｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、脳室周
囲白質軟化症、群発性頭痛のような血管性頭痛。
【０５７４】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては以下が
挙げられる：エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アルツハイマー病およびクロイ
ツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツハイマー病および進行性核
上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、びまん性軸
周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、マダニ媒
介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、急性播種性脳脊髄炎、ブド
ウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球性硬化性汎脳炎のような髄
膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣を含む全身てんかんのよう
なてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥ
ＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・間代てんかん、複雑部分て
んかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのような部分てんかん、外傷後て
んかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持続状態、ハレルフォルデン
−シュパッツ症候群。
【０５７５】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症のような水頭症
、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、大脳マラリア、脱力発作を含むナ
ルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳
偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内
結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ痴呆複合症のような中枢神経系感
染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎のような脳脊髄炎、ベネズエラウマ
脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、ならびに大脳マラリア。
【０５７６】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアン
タゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以
下が挙げられる：クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイル
ス性髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リ
ステリア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎
菌性脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎の
ような真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、
横行脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄
ろうのような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオ
ン病（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコ
ン−シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）、ならびに大脳トキソプ
ラスマ症。
【０５７７】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：テント下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中
枢神経系新生物、脈絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のよう
な脳室新生物、髄膜新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病の
ような脱髄疾患、副腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆ
ｆｕｓｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球
様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性
脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、
橋中央ミエリン溶解、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢
性疲労症候群、ビスナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｎｅ
ｒｖｏｕｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患
、筋萎縮性側索硬化症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧
搾、硬膜外新生物のような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン
症候群、母親由来１５  ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、
ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガ
ングリオシドーシス、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモ
シスチン尿症、ローレンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候
群、カエデシロップ病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロン
セロイド脂褐素沈着症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニル
ケトン尿症、プラーダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テ
ービ症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無
能症（ｈｙｄｒａｎｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、
アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎
および潜在性二分脊椎のような脊髄癒合不全。
【０５７８】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感覚ニューロ
ン障害、視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ−ホフマ
ン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感覚および自
律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候群を含む失
認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発作、難聴、
部分聴覚欠失、大声（ｌｏｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび耳鳴を含む聴覚
障害のような情報伝達障害、失書症、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニ
ッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語発
達障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症のよ
うな発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発語
障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状態
、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５  ｑ‐１３微少欠損、運
動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオクロ
ーヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群の
ような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経麻
痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエーン
症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、球
麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻痺
および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全のよ
うな味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視覚
（ｓｕｂｎｏｒｍａｌ  ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィン
症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のような
痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天性
筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋
無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェル
ドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、重
症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性期
性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐａｒａｍｙｌ
ｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端肢
端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、Ｂ
ａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性交
感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系疾
患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患、
顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱視
を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋麻
痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視お
よび外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のよう
な眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫、
三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖尿
病性足のような糖尿病性ニューロパシー。
【０５７９】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび/またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得るさらなる神経学的疾患としては、以下
が挙げられる：手根管症候群のような神経圧搾症候群、足根管症候群、頸肋症候
群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、カウザルギー、頸腕神経痛、
顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験的アレルギー性神経炎、眼神
経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神経根炎（例えば、多発性神経
根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例えば、シャルコー−マリエ疾患
、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺およびヴェルドニッヒ‐ホフ
マン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー（先天性痛覚脱失および．家
族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐骨神経痛、味覚性発汗症候群
およびテタニー））のような神経炎。
【０５８０】
（感染性疾患）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、感染因子を処置、予防および／または診断するため
に用いられ得る。例えば、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞およ
び／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させることによって、感染性疾患が処
置、予防および／または診断され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上昇させ
るか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得る。あ
るいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発することなく、
感染因子を直接阻害し得る。
【０５８１】
ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、予防および／または診断され
得る疾患または症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例とし
ては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこ
れらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、
アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、
サルコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱
、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペス
ウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹
）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウ
イルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例え
ば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピ
ローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、
ポックスウイルス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例え
ば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レン
チウイルス）、およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科
内に入るウイルスは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状
を引き起こし得る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼
吸性シンシチウムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢
性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳
炎Ｂ型、アルゼンチン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、
日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱
、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病
、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患が処置、予防および／ま
たは診断され得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下の処置、予防およ
び／または診断に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎
（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態において、本発明のポリヌク
レオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、１以上
の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために使用される。さら
に具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、また
はアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを処置、予防および／または
診断するために使用される。
【０５８２】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって
処置、予防および／または診断され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下
のグラム陰性およびグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに
限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａ
ｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂ
ａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌ
ｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ
）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃ
ｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉ
ｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏ
ｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  Ｅ
．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ
、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、および
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉ
ｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇ
ｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙ
ｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｖ
ｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉ
ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍ
ｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ
の感染症（例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（
例えば、ＨｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ型）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａ
ｌならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細
菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き
起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉
炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテー
ゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血
症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎
、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテ
リア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹
、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅ
ｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポ
リペプチドもしくはポリヌクレオチド、アゴニストもしくはアンタゴニストを用
いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置、予防および／または診断し得る
。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニ
ストまたはアンタゴニストは、以下を処置、予防および／または診断するために
使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヅム、および／またはＢ型髄膜炎。
【０５８３】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置、予防および／または診断され得る
、寄生生物性因子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたは
クラスが挙げられるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシ
ジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉ
ａｓｉｓ）、交疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマ
ニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモ
ナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）
（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌ
ｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍ
ｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定さ
れない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染
症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見
感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラス
マ症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもし
くはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置、予防およ
び／または診断し得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、
ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、マラリアを処置、
予防および／または診断するために使用される。
【０５８４】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／また
はアゴニストもしくはアンタゴニストを用いた治療または予防は、患者に有効量
のポリペプチドを投与するか、または患者から細胞を取り出して、本発明のポリ
ヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操作した細胞を患者に戻す（エキソビ
ボ治療）かのいずれかによるものであり得る。さらに、本発明のポリペプチドま
たはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原として用いられて、感染性疾患に対す
る免疫応答を惹起し得る。
【０５８５】
（再生）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して
、組織の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：５９−８７（１９９７）を
参照のこと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、ま
たは潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒ
ｔｈｒｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌
流傷害、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換
、または保護し得る。
【０５８６】
本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０５８７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ
得る。例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が
早まる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使
用され得る。処置、予防および／または診断され得る特定の疾患は、腱炎、手根
管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさ
らなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不全、外科的創傷、および外傷性創傷に関
連する潰瘍が挙げられる。
【０５８８】
同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストもしく
はアンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置、
予防および／または診断され得る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経
系疾患、神経障害、または機械的および外傷性の疾患、障害および／または状態
（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏｋｅ））が挙
げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例えば、化
学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神経系疾
患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側
索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストを
用いて処置、予防および／または診断され得る。
【０５８９】
（走化性）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば
、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／ま
たは内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖
の部位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または
異常性を撃退および／または治癒し得る。
【０５９０】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これ
らの走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加さ
せることによって、炎症、感染、過剰増殖性の疾患、障害および／もしくは状態
、または任意の免疫系障害を処置、予防および／または診断し得る。例えば、走
化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引することによって、組
織に対する創傷および他の外傷を処置、予防および／または診断し得る。本発明
の走化性分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置、予防および／
または診断するために使用され得る。
【０５９１】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これら
の分子はまた、疾患、障害および／または状態を処置、予防および／または診断
するために使用され得る。従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、走化性のインヒビタ
ーとして使用され得る。
【０５９２】
（結合活性）
本発明のポリペプチドは、このポリペプチドに結合する分子、またはこのポリ
ペプチドが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。この
ポリペプチドとこの分子との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を
活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。
そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば
、レセプター）、または低分子が挙げられる。
【０５９３】
好ましくは、この分子は、このポリペプチドの天然のリガンド（例えば、リガ
ンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは
機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（２）：第５章（１９９１）を参
照のこと）。同様に、この分子は、このポリペプチドが結合する天然のレセプタ
ー、または少なくとも、このポリペプチドによって結合され得るレセプターのフ
ラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても
、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【０５９４】
好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、分泌タンパク質とし
てかまたは細胞膜上のいずれかでこのポリペプチドを発現する適切な細胞を産生
する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次いで、このポリペプチ
ドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細胞膜）を、好まし
くは、このポリペプチドまたはこの分子のいずれかの結合、活性の刺激、または
活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物と接触させる。
【０５９５】
アッセイは、このポリペプチドへの候補化合物の結合を単純に試験し得、ここ
で結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイに
おいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこのポリペプチドへの結
合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０５９６】
あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、ポリペプチドを含む溶液と混合する工程、ポリペ
プチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分子の活
性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０５９７】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的のいずれかの結合、または基質についてのポリペプチドとの競合によって、
ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【０５９８】
さらに、本発明のポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多く
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、
第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポ
リアデニル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場合に用
いられ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に対
する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、および
このＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そして
このポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェクト
するために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトされ
た細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。この
ポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部位
のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０５９９】
固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０６００】
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、レセ
プター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出
し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィル
ムに曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、
ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微量配列決定に供され
得る。微量配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌ
クレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定
レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０６０１】
さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、それ
によって本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生
成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号
、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３
７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，
Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８
）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７
６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これら
の特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照
のこと。１つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポ
リペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャ
ッフリングは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡ
セグメントの、本発明の分子の所望のポリヌクレオチド配列への構築を含む。別
の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは
、組換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌク
レオチド挿入または他の方法によるランダム変異誘発に供することによって、変
更され得る。別の実施態様において、本発明のポリペプチドの１つ以上の成分、
モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の
１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグメントなどと組換え
られ得る。好ましい実施態様において、この異種分子は、ファミリーのメンバー
である。さらに好ましい実施態様において、この異種分子は、例えば、血小板由
来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホー
ミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子
（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭ
Ｐ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびアクチビンＢ、デカペン
タプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−
２、ドーサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄ
ａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３
、ＴＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子
である。
【０６０２】
他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラ
グメントである。生物学的に活性なフラグメントは、このポリぺプチドの活性に
類似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラグメ
ントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されない活
性を含み得る。
【０６０３】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および3[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における3[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、3[Ｈ
]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
って測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この
手順により同定され得る。
【０６０４】
別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
レセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターに結合し、そしてセ
カンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメ
ッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホ
スホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６０５】
これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド／分子
を活性化または阻害することによって、疾患を処置、予防および／または診断す
るか、あるいは患者に特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用さ
れ得る。さらに、アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明の
ポリペプチドの産生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。従って、本発明
は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を
包含する：（ａ）候補結合化合物をポリペプチドとともにインキュベートする工
程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程。さらに、本発明は、以下
の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する方法を包含する：（ａ）候
補化合物をポリペプチドとともにインキュベートする工程、（ｂ）生物学的活性
をアッセイする工程、および（ｂ）ポリペプチドの生物学的活性が改変されてい
るか否かを決定する工程。
【０６０６】
また、タンパク質のポリペプチド配列に含まれるβプリーツシート領域を使用
することによって、実験的に本発明のポリペプチドを結合する分子を同定し得る
。従って、本発明の特定の実施形態は、開示されたポリペプチド配列中の各々の
βプリーツシート領域のアミノ酸配列を含むか、あるいは開示されたポリペプチ
ド配列中の各々のβプリーツシート領域のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、本発明
のポリペプチド配列中に含まれる任意の組合せもしくは全てを含むか、または本
発明のポリペプチド配列中に含まれる任意の組合せまたは全てからなる、ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる好ましい実施
形態は、本発明のポリペプチド配列の１つにおけるβプリーツシート領域の各々
のアミノ酸配列を含むか、あるいは本発明のポリペプチド配列の１つにおけるβ
プリーツシート領域の各々のアミノ酸配列からなる、ポリペプチドに関する。本
発明のさらなる実施形態は、本発明のポリペプチド配列の１つにおけるβプリー
ツシート領域の任意の組合せもしくは全てを含むか、または本発明のポリペプチ
ド配列の１つにおけるβプリーツシート領域の任意の組合せもしくは全てからな
る、ポリペプチドに関する。
【０６０７】
（標的化された送達）
別の実施形態において、本発明は、組成物を、本発明のポリペプチドについて
のレセプターを発現する標的化細胞、または本発明のポリペプチドの細胞結合形
態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
【０６０８】
本明細書中で議論される場合、本発明のポリペプチドまたは抗体は、異種ポリ
ペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性お
よび／または共有結合性の相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態におい
て、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明のポリペプチド（
抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達の
ための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化
細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核
酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）あるいは二本鎖核酸（例えば、細
胞のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写さ
れ得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０６０９】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体
）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための
方法を提供する。
【０６１０】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素
（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の
条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の
分子もしくは酵素を、結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に
従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない
：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性
エフェクター系を結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固
定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、
アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモ
ルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボ
ウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「
細胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害
性化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用
され得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤の
グルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシ
ンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトア
ミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０６１１】
（薬物スクリーニング）
本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするため
の、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチ
ドを、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択さ
れた化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性
をアッセイする工程を包含する。
【０６１２】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のポリ
ペプチド、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合
物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポ
リペプチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発
現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリ
ーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核
酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利
用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対して
スクリーニングされる。例えば、試験されている薬剤と本発明のポリペプチドと
の間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
【０６１３】
従って、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及
ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これ
らの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペ
プチドもしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのポリ
ペプチドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする
工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる
薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結
合形態中に存在する薬剤から分離され、そして遊離または複合体化されていない
標識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０６１４】
薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適
切な結合親和性を有する化合物に対するハイスループットスクリーニングを提供
し、そして欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これ
は、本明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にい
うと、大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチ
ックピンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、
本発明のポリペプチドと反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したポリペプ
チドは、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは
、前述の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディン
グされる。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固
体支持体上にそれを固定し得る。
【０６１５】
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本
発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、
抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有す
る任意のペプチドの存在を検出する。
【０６１６】
（本発明のポリペプチドに結合するペプチドおよび他の分子）
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合するポリペプチドおよび非ポリペ
プチドを同定するためのスクリーニング方法、ならびにそれによって同定された
本発明のポリペプチドに結合する分子を含む。これらの結合分子は、例えば、本
発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。その
ようなアゴニストおよびアンタゴニストは、本発明に従って、以下に詳細に記載
される治療実施形態において使用され得る。
【０６１７】
この方法は、以下の工程を包含する：
ａ．本発明のポリペプチドを多数の分子と接触させる工程；および
ｂ．本発明のポリペプチドに結合する分子を同定する工程。
【０６１８】
本発明のポリペプチドを多数の分子と接触させる工程は、多数の方法によって
もたらされ得る。例えば、当業者は、本発明のポリペプチドを固体支持体上に固
定化させ、そして多数の分子の溶液を固定した本発明のポリペプチドと接触させ
ることを考え得る。このような手順は、固定した本発明のポリペプチドから構成
される親和性マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィープロセス
に類似している。次いで、本発明のポリペプチドに対して選択的な親和性を有す
る分子が、親和性選択によって精製され得る。固体支持体の性質、本発明のポリ
ペプチドのこの固体支持体への付着に関するプロセス、溶媒、および親和性単離
または親和性選択の条件は、大部分が慣用的であり、そして当業者に周知である
。
【０６１９】
あるいは、多数のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブセットまたは個々
のポリペプチドを含む実質的に別々の分画へ分離され得る。例えば、多数のポリ
ペプチドは、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィーなどポリペプチドの分離
に関して当業者に公知の方法によって、分離され得る。個々のポリペプチドはま
た、宿主細胞の外部表面上またはほぼ外部表面に発現されるような様式で、形質
転換された宿主細胞（例えば、組換えファージ）によって産生され得る。次いで
、個々の単離物は、本発明のポリペプチドによって「プローブ化」され得、必要
に応じて発現に必要とされるであろうインデューサーの存在下で、本発明のポリ
ペプチドと個々のクローンとの間で任意の選択的親和性相互作用が起こったか否
かが決定される。本発明のポリペプチドを個々のポリペプチドを含む各分画と接
触させる前に、これらのポリペプチドはまず、さらなる簡便性のために固体支持
体に移され得る。そのような固体支持体は、単に、例えばニトロセルロースまた
はナイロンでできたフィルター膜の断片であり得る。この様式において、陽性ク
ローンは、形質転換宿主細胞の発現ライブラリーの集団（これらは、本発明のポ
リペプチドに対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築
物を持つ）から同定され得る。さらに、本発明のポリペプチドに対して選択的親
和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が、従来の手段によって直接決定され
得るか、またはこのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列が、頻繁によ
り簡便に決定され得る。次いで、一次配列が、対応するＤＮＡ配列から推定され
得る。アミノ酸配列がポリペプチド自身から決定されるものである場合、微小配
列決定技術を使用し得る。この配列決定技術は、質量分析法を含み得る。
【０６２０】
特定の状況において、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出しようと
試みる前に、未結合の本発明のポリペプチドあるいは未結合ポリペプチドのいず
れかを、本発明のポリペプチドおよび多数のポリペプチドの混合物から洗浄除去
することが望ましくあり得る。このような洗浄工程は、本発明のポリペプチドま
たは多数のポリペプチドが固体支持体に結合している場合に、特に望ましくあり
得る。
【０６２１】
本方法に従って提供される多数の分子は、多様性ライブラリー（例えば、本発
明のポリペプチドへ特異的に結合する分子をスクリーニングし得る無作為または
コンビナトリアルの、ペプチドライブラリーまたは非ペプチドライブラリー）と
して提供され得る。使用され得る多くのライブラリー（例えば、化学合成ライブ
ラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、
およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー）が、当該分野で公知である。化学
合成ライブラリーの例は、以下に記載される：Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１、Ｎａｔｕ
ｒｅ  ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２
−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ、１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：
７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１９９
３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０
９２６；Ｅｒｂら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２，Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、１９９４、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；Ｓ
ａｌｍｏｎら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９
０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２；ならびに
ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３。
【０６２２】
ファージディスプレイライブラリーの例は、以下に記載される：Ｓｃｏｔｔお
よびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖ
ｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔ
ｉａｎ，Ｒ．Ｂ．ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１
８）；Ｌｅｎｓｔｒａ、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１
４９−１５７；Ｋａｙら、１９９３、Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５；ならびに
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８（１９９４年８月１８日）。
【０６２３】
インビトロ翻訳ベースのライブラリーとしては、以下：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９
１／０５０５８（１９９１年４月１８日）；およびＭａｔｔｈｅａｋｉｓら、１
９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９
０２６に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６２４】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば
、Ｂｕｎｉｎら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  
９１：４７０８−４７１２を参照のこと）が、使用のために適応され得る。ペプ
トイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１）がまた使用され得る。使用され
得るライブラリーの別の例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２）によって記載
され、ここでは、ペプチド中のアミド官能基が、過剰にメチル化（ｐｅｒｍｅｔ
ｈｙｌａｔｅ）されて、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリー
を生成する。
【０６２５】
本発明において有用である種々の非ペプチドライブラリーは、大きい。例えば
、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（１９９５，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  
１３：３５１−３６０）は、種々のライブラリーの基礎を形成する化学種の間と
して、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖ア
ナログ、β−メルカプトケトン、アリール酢酸、アシルピペラジン、ベンゾピラ
ン、キューバン（ｃｕｂａｎｅ）、キサンチン、アミンイミドおよびオキサゾロ
ンを列挙している。
【０６２６】
非ペプチドライブラリーは、２つの型に大きく分類され得る：修飾されたモノ
マーおよびオリゴマー。修飾モノマーライブラリーは、比較的単純な骨格構造を
使用し、この上に種々の官能基が付加される。しばしば、骨格は、既知の有用な
薬理学的活性を有する分子である。例えば、骨格は、ベンゾジアゼピン構造であ
り得る。
【０６２７】
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、モノマーの順序に依存して新規な形状
を作製する様式で共にアセンブルされる、多数のモノマーを使用する。使用され
るモノマー単位の間には、カルバメート、ピロリノン（ｐｙｒｒｏｌｉｎｏｎｅ
）およびモルホリノがある。ペプトイド（側鎖がα炭素よりもαアミノ基に結合
するペプチド様オリゴマー）は、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別のバー
ジョンの基礎を形成する。最初の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単一型
のモノマーを使用し、従って、反復骨格を含む。近年のライブラリーは、１つよ
り多くのモノマーを使用し、自由度が添加されたライブラリーを与える。
【０６２８】
ライブラリーをスクリーニングすることは、多様な一般的に公知の方法のいず
れかによって達成され得る。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを
開示する以下の参考文献：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、１９８９、Ａｄｖ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍ
ｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓ
ら、１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅ
ｎｂｕｒｇら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８
９：５３９３−５３９７；Ｙｕら、１９９４、Ｃｅｌｌ  ７６：９３３−９４５
；Ｓｔａｕｄｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５７７−５８０；Ｂｏ
ｃｋら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら、１
９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６９８８−６
９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−８
５２；米国特許第５，０９６，８１５号、米国特許第５，２２３，４０９号、お
よび米国特許第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒらに対して）；Ｒｅｂ
ａｒおよびＰａｂｏ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３；な
らびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１８を参照のこと。
【０６２９】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドを結合する分子を同定するた
めのスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固相に固定化された本発明の
ポリペプチドと接触させ、そして本発明のポリペプチドに結合するこれらのライ
ブラリーを収集することによって実行され得る。そのようなスクリーニング方法
の例の、「パニング」と呼ばれる技術は、例として、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍ
ｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら、１９
９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ９４／１８３１８；ならびにその中に引用される参考文献に記載される。
【０６３０】
別の実施形態において、酵母中の相互作用タンパク質を選択するためのツーハ
イブリッドシステム（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  
３４０：２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９５７８−９５８２）が、本発明のポリペプチド
に特異的に結合する分子を同定するために使用され得る。
【０６３１】
分子に結合している本発明のポリペプチドがポリペプチドである場合、このポ
リペプチドは、任意のペプチドライブラリー（ランダムペプチドライブラリー、
コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチドライブラリー
を含む）から簡便に選択され得る。用語「バイアス（ｂｉａｓｅｄ）」は、この
場合のペプチドにおいて、ライブラリーを作製する方法が、生じる分子収集の多
様性を支配する１つ以上のパラメーターを制限するように操作されることを意味
するために本明細書中に使用される。
【０６３２】
従って、本当にランダムなペプチドライブラリーは、ペプチドの所定の位置に
特定のアミノ酸を見出す可能性が全て２０のアミノ酸に関して同じである、ペプ
チドの収集物を作製する。しかし、例えば、リジンが５番目のアミノ酸毎に生じ
ることを特定するかまたはデカペプチドライブラリーの４位、８位および９位が
アルギニンのみを含むように固定して特定することによって、バイアスがライブ
ラリーに導入され得る。明らかに、バイアスの多くの型は、意図され得、そして
本発明は、任意の特定のバイアスに制限されない。さらに、本発明は、特定の型
のペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイペプチドライブラリー
およびＤＮＡ挿入物と共にλファージベクターを含むＤＮＡ構築物を使用するラ
イブラリー）を意図する。
【０６３３】
上記のように、本発明のポリペプチドに結合する分子（ポリペプチドである）
の場合、このポリペプチドは、約６から約６０より少ないアミノ酸残基を有し、
好ましくは約６〜約１０アミノ酸残基、そしてより好ましくは約６〜約２２アミ
ノ酸であり得る。別の実施形態において、本発明のポリペプチドに結合するポリ
ペプチドは、１５〜１００の範囲のアミノ酸、または２０〜５０の範囲のアミノ
酸を有する。
【０６３４】
分子に結合している選択された本発明のポリペプチドは、化学合成または組換
え発現によって得られ得る。
【０６３５】
（アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト））
特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号Ｘに含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／または寄託されるクローンに
含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実施形態において、ア
ンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、別の実施形態において、アン
チセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｎｅｕｒｏｃｈ
ｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  
Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ
，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用して、アンチセンスＤＮＡもしく
はＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成を通して遺伝子発現を制御し得る
。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６
０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される
。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ  ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：
１３００（１９９１）において考察される。これらの方法は、相補的なＤＮＡま
たはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
【０６３６】
例えば、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の増殖を阻害す
るためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前
に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８
９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーション
することによってインビトロで行われた。インビボ用途のための類似の手順は、
ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡにつ
いてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディ
ングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位およ
び３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は
、９０℃で１分間加熱され、次いで２×連結緩衝液（２０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ＨＣ
ｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）および０．２ｍＭ  ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レトロウイル
スベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される（ＷＯ９１
／１５５８０）。
【０６３７】
例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害
する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブ
リダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロック
する。
【０６３８】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、外来の配列からの転
写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写され、本
発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、本発明
のアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが転
写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保持し得る
か、または染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において標
準的な組換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞に
おいて複製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラスミド、ウイ
ルスなどであり得る。本発明のポリペプチドをコードする配列またはそのフラグ
メントの発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当該分野で
公知の任意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導性また
は構成性であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領
域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３
１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモー
ター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８０））、
ヘルペスチミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチ
オネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９
−４２（１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６３９】
本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも目的の遺伝子のＲＮＡ転写物の一部
に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、必要で
はない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列は
、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成す
る配列を意味し；従って、本発明の二本鎖アンチセンス核酸の場合において、二
重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。
ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方
に依存する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、本発明のＲＮＡ配
列とのより多くの塩基ミスマッチを含み得、これは、安定な二重鎖（または三重
鎖の場合もあり得る）を含み得、そしてなお形成し得る。当業者は、ハイブリダ
イズ複合体の融点を決定するために標準的な手順を使用することによりミスマッ
チの許容の程度を確認し得る。
【０６４０】
メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働くべきである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的
な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一
般的に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５（１９９
４）を参照のこと。従って、本発明のポリヌクレオチド配列の５’−または３’
−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍ
ＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍＲＮＡの５
’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含
むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従って使用され
得る。ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするよ
うに設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレ
オチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわた
るオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは
、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５
ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０６４１】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改
変されて、例えば、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。
このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボに
おいて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を
促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔ
ｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９
８７）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）
を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１
３４（１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘
引切断剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｃｌｅａｖａｇ
ｅ  ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９
５８−９７６（１９８８）を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば
、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）を参照のこと
）を含み得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、
ペプチド、ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーショ
ン誘引切断剤など）に結合体化され得る。
【０６４２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０６４３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０６４４】
さらなる別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を
含むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン
酸骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチ
オエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロ
ジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホル
ムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０６４５】
さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のｂ−ユニットとは反対に
、その鎖は互いに平行にする（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅ
ｓ．、１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、
２−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ  Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７
−３３０（１９８７））。
【０６４６】
本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）合成され得る。例えば、
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））により合成され得、メチル
ホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏ
ｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１（１９
８８））などの使用により調製され得る。
【０６４７】
一方、本発明のコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが、使用
され得、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ま
しい。
【０６４８】
本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。一方、部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザ
イムを使用して、本発明のポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡを破壊し得るが
、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム
は、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域により決定される位置で
、ｍＲＮＡを切断する。たった１つの必要条件は、標的ｍＲＮＡが以下の２つの
塩基配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイム
の構築および生成は当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅ
ｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）により十分に
記載される。配列表に開示された各ヌクレオチド配列内に多くの潜在的なハンマ
ーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、このリボザイムは、切
断認識部位が本発明のポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡの５’末端付近に位
置するように；すなわち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞
内蓄積を最小化するように、操作される。
【０６４９】
アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改良された）から構成され得
、そしてインビボにおいて本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞に送達され
るべきである。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするア
ンチセンスの導入のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達
の好ましい方法は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩまたは
ｐｏｌ  ＩＩプロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」
ＤＮＡ構築物を使用することを含み、その結果トランスフェクトした細胞が内因
性メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成す
る。リボザイムはアンチセンス分子と異なり触媒性であるので、より低い細胞内
濃度が効率のために必要とされる。
【０６５０】
アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍の新脈管形成を刺激し、
それにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍形成または増殖において
）遅延または防止する。
【０６５１】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を阻害し得、そ
して水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ  ｃａｔａｒａｃｔ）手術
後の上皮レンズ細胞の増殖を防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活
性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求さ
れ得る。
【０６５２】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
防止し得る。
【０６５３】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置、予防および／または診断し得る。
【０６５４】
従って、本発明は、疾患、障害および／または状態（本発明のポリヌクレオチ
ドの過剰発現に関連する、本願の全体に渡って列挙される疾患、障害および／ま
たは状態が含まれるが、これらに限定されない）を処置または予防する方法であ
って、（ａ）本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子、および／ま
たは（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに対するリボザイムを、患者に投与するこ
とによって処置または予防する方法を提供する。発明、および／または（ｂ）本
発明のポリヌクレオチドに関するリボザイム。
【０６５５】
（他の活性）
本発明のポリペプチドは、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種
々の疾患状態（例えば、血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因
する虚血組織の血管再生を刺激するための処置において利用され得る。これらの
ポリペプチドをまた利用して、上記で議論されるように新脈管形成および肢の再
形成を刺激し得る。
【０６５６】
このポリペプチドを、傷害、火傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創
傷の処置にもまた利用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例
えば、線維芽細胞および骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ
ダメージを受けた組織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０６５７】
本発明のポリペプチドはまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニュ
ーロンの障害または神経変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病
、およびＡＩＤＳ関連合併症）において生じるニューロンの損傷を処置、予防お
よび／または診断するために用いられ得る。本発明のポリペプチドは、軟骨細胞
増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、骨および歯周の再形成を増強し、そし
て組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され得る。
【０６５８】
本発明のポリペプチドをまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することに
より、日焼けに起因する皮膚の老化を予防し得る。
【０６５９】
本発明のポリペプチドをまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら
、ＦＧＦファミリーのメンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト
増殖を促進するからである。同じ系列にそって、本発明のポリペプチドを利用し
て、他のサイトカインと組み合わせて使用した場合、造血細胞および骨髄細胞の
増殖および分化を刺激し得る。
【０６６０】
本発明のポリペプチドをまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または
始原組織の細胞培養を支持するために使用し得る。
【０６６１】
本発明のポリペプチドはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するために利用され得る。
【０６６２】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹
細胞の分化もしくは増殖を増加または減少し得る。
【０６６３】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、
眼の色、皮膚、脂肪組織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外
科））を調節するために使用され得る。同様に、本発明のポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、異化作
用、同化作用、プロセシング、利用、およびエネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺
乳動物の代謝を調節するために使用され得る。
【０６６４】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストは、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ
）リズム、うつ病（抑うつ性の疾患、障害および／または状態を含む）、暴力の
傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまたはインヒビン様活
性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、性欲、記憶、スト
レス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳動物の精神状態ま
たは身体状態を変更するために使用され得る。
【０６６５】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストも
しくはアンタゴニストはまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク
質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または
減少させるような食品添加物または保存剤として使用され得る。
【０６６６】
（他の好ましい実施形態）
本願発明の他の好ましい実施形態は、配列番号Ｘのヌクレオチド配列中の少な
くとも約５０の連続したヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含み、ここで、Ｘは表１に規定さ
れるような任意の整数である。
【０６６７】
上記連続したヌクレオチドの配列が、表１中の配列番号Ｘについて規定される
ような、クローン配列のほぼ５’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始まり、
そしてクローン配列のほぼ３’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わる位置
の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好ましい
。
【０６６８】
上記連続したヌクレオチドの配列が、表１中の配列番号Ｘについて規定される
ような、開始コドンのほぼ５’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで始まり、そ
してクローン配列のほぼ３’ヌクレオチドの位置のヌクレオチドで終わる位置の
範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる、核酸分子もまた好ましい。
【０６６９】
上記連続したヌクレオチドの配列が、表１中の配列番号Ｘについて規定される
ような、ほぼシグナルペプチドの第１のアミノ酸の５’ヌクレオチドの位置のヌ
クレオチドで始まり、そしてほぼクローン配列の３’ヌクレオチドの位置のヌク
レオチドで終わる位置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に含まれる、核
酸分子も同様に好ましい。
【０６７０】
配列番号Ｘのヌクレオチド配列中の少なくとも約１５０の連続したヌクレオチ
ドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子もまた好ましい。
【０６７１】
配列番号Ｘのヌクレオチド配列中の少なくとも約５００の連続したヌクレオチ
ドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子はさらに好ましい。
【０６７２】
さらに好ましい実施形態は、表１中の配列番号Ｘについて規定されるような、
ほぼシグナルペプチドの第１のアミノ酸の５’ヌクレオチドの位置のヌクレオチ
ドで始まり、そしてほぼクローン配列の３’ヌクレオチドの位置のヌクレオチド
で終わる配列番号Ｘのヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオ
チド配列を含む核酸分子である。
【０６７３】
さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘの完全なヌクレオチド配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０６７４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸分子にハイブリダイ
ズする単離された核酸分子もまた好ましく、ここで上記のハイブリダイズする核
酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基のみま
たはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズし
ない。
【０６７５】
表１におけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定されるヒトｃＤＮＡクローン
を含むＤＮＡ分子を含む物質の組成物もまた好ましく、このＤＮＡ分子は、アメ
リカンタイプカルチャーコレクションに寄託された物質中に含まれ、そして上記
のｃＤＮＡクローンＩＤについて表１中に示されるＡＴＣＣ受託番号を与えられ
ている。
【０６７６】
表１中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同定されるヒトｃＤＮＡクローンのヌ
クレオチド配列中の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも
９５％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子もまた好ましく、
このＤＮＡ分子は表１において示されるＡＴＣＣ受託番号を付与された寄託物中
に含まれる。
【０６７７】
上記の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列が、上記ヒトｃＤＮＡク
ローンによってコードされる完全なオープンリーディングフレームの配列のヌク
レオチド配列中に含まれる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０６７８】
上記ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるヌクレオチド配列中の少なく
とも１５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレ
オチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０６７９】
さらに好ましい実施形態は、上記ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる
ヌクレオチド配列中の少なくとも５００の連続したヌクレオチドの配列に少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０６８０】
さらに好ましい実施形態は、上記ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる
完全なヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子である。
【０６８１】
さらに好ましい実施形態は、以下からなる群から選択される配列中の少なくと
も５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプルにおいて検出するための方法である
：配列番号Ｘのヌクレオチド配列であって、ここでＸは表１において規定される
ような任意の整数である；および表１中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同定さ
れ、そして表１において上記ｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番
号を有する寄託物中に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるヌク
レオチド配列；上記の方法は、上記の群から選択される配列と、上記のサンプル
中の少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配列とを比較する工程、および上
記サンプル中の上記核酸分子の配列が、上記の選択された配列に対して少なくと
も９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する。
【０６８２】
上記の配列を比較する工程が、上記サンプル中の核酸分子と、上記の群から選
択される上記の配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度
を決定する工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、上記の配列を比
較する工程が、上記サンプル中の核酸分子から決定されるヌクレオチド配列と、
上記の群から選択される上記配列とを比較する工程によって実施される、上記方
法もまた好ましい。核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０６８３】
さらに好ましい実施形態は、生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同
定するための方法であって、この方法は、以下からなる群から選択される配列中
の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を含む上記サンプル中の核酸分子を（もしあれば）検出する工
程を包含する：配列番号Ｘのヌクレオチド配列であって、ここでＸは表１におい
て規定されるような任意の整数である；および表１中のｃＤＮＡクローンＩＤに
よって同定され、そして表１において上記ｃＤＮＡクローンについて示されるＡ
ＴＣＣ受託番号を有する寄託物中に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコー
ドされるヌクレオチド配列。
【０６８４】
生物学的サンプルの種、組織、または細胞型を同定するための方法は、少なく
とも２つのヌクレオチド配列のパネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得、ここで上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記の
群から選択される配列中の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少な
くとも９５％同一である。
【０６８５】
表１において同定される分泌タンパク質をコードする遺伝子の異常な構造また
は発現と関連する病理学的状態を、被験体において診断するための方法もまた好
ましく、この方法は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも５０の
連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を
含む、核酸分子を、（もしあれば）上記被験体から得られる生物学的サンプルに
おいて検出する工程を包含する：配列番号Ｘのヌクレオチド配列、ここでＸは表
１において規定されるような任意の整数である；および表１中のｃＤＮＡクロー
ンＩＤによって同定され、かつ表１中の上記のｃＤＮＡクローンについて示され
るＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコ
ードされるヌクレオチド配列。
【０６８６】
病理学的状態を診断するための方法は、少なくとも２つのヌクレオチド配列の
パネル中のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得、ここで
、上記パネル中の少なくとも１つの配列は、上記群から選択される配列中の少な
くとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である。
【０６８７】
上記の核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも２つのヌクレオチド配列の
パネルを含む、単離された核酸分子を含む物質の組成物もまた好ましく、ここで
上記のパネル中の少なくとも１つの配列は、以下からなる群から選択される配列
中の少なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であ
る：配列番号Ｘのヌクレオチド配列、ここでＸは表１において規定されるような
任意の整数である；および表１中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、か
つ表１中の上記のｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する
寄託物に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるヌクレオチド配列
。核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０６８８】
配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に
、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
好ましく、ここでＹは、表１において規定されるような任意の整数である。
【０６８９】
上記連続したアミノ酸の配列が、表１中の配列番号Ｙについて示されるような
、分泌部分のほぼ第１のアミノ酸の位置の残基で始まり、そしてオープンリーデ
ィングフレームのほぼ最後のアミノ酸の残基で終わる位置の範囲で、配列番号Ｙ
のアミノ酸配列中に含まれる、ポリペプチドもまた好ましい。
【０６９０】
配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約３０の連続したアミノ酸の配列に
少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好
ましい。
【０６９１】
配列番号Ｙのアミノ酸配列中の少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列
に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさら
に好ましい。
【０６９２】
配列番号Ｙの完全なアミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含
む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０６９３】
表１中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表１中の上記のｃＤＮ
Ａクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれるヒトｃ
ＤＮＡクローンによってコードされる分泌タンパク質の完全なアミノ酸配列にお
いて、少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一のア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０６９４】
上記の連続したアミノ酸の配列が、表１中のｃＤＮＡクローンＩＤによって同
定され、かつ表１中の上記のｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番
号を有する寄託物に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる分泌タ
ンパク質の分泌部分のアミノ酸配列に含まれる、ポリペプチドもまた好ましい。
【０６９５】
表１におけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表１中の上記のｃ
ＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、
ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配
列中の少なくとも約３０の連続的なアミノ酸の配列に少なくとも９５％同一であ
るアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
【０６９６】
表１におけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表１中の上記のｃ
ＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、
ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配
列中の少なくとも約１００の連続的なアミノ酸の配列に少なくとも９５％同一で
あるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた、好ましい。
【０６９７】
表１におけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表１中の上記のｃ
ＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれるヒ
トｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ酸配列
に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドも
また、好ましい。
【０６９８】
以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも１０個の連続的なアミノ
酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対し
て特異的に結合する単離された抗体は、さらに好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸
配列（ここで、Ｙは表１で規定される任意の整数である）；および表１における
ｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表１のこのｃＤＮＡクローンにつ
いて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクロー
ンによってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列。
【０６９９】
以下からなる群から選択された配列中の、少なくとも１０個の連続的なアミノ
酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生
物学的サンプルにおいて検出する方法はさらに好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸
配列（ここで、Ｙは表１で規定される任意の整数である）；および表１における
ｃＤＮＡクローンＩＤによって同定され、かつ表１のこのｃＤＮＡクローンにつ
いて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクロー
ンによってコードされるタンパク質の完全アミノ酸配列；この方法は、このサン
プル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列をこの群から
選択された配列と比較する工程およびこのサンプル中におけるこのポリペプチド
分子の配列が、少なくとも１０個の連続的なアミノ酸のこの配列と少なくとも９
０％同一であるかどうかを決定する工程を包含する。
【０７００】
このサンプル中における少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を
、この群から選択された配列と比較するこの工程は、このサンプル中のポリペプ
チドの、以下からなる群から選択された配列中の少なくとも１０個の連続的なア
ミノ酸の配列に対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチドと特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を包
含する、上記の方法もまた、好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙ
は表１に規定される任意の整数である）；および表１におけるｃＤＮＡクローン
ＩＤによって同定されかつ表１のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣ
Ｃ受託番号を有する寄託物に含まれるヒトｃＤＮＡクローンによってコードされ
るタンパク質の完全アミノ酸配列。
【０７０１】
配列を比較する上記工程が、このサンプル中のポリペプチド分子から決定され
たアミノ酸配列を、この群から選択されたこの配列と比較することによって行わ
れる、上記の方法もまた好ましい。
【０７０２】
生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する方法もまた好ましく、こ
こでこの方法は、このサンプル中のポリペプチド分子（このポリペプチドは、も
し存在するならば、以下からなる群から選択される配列における少なくとも１０
の連続的なアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む）
を検出する工程を包含する：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは表１に規
定される任意の整数である）；および表１におけるｃＤＮＡクローンＩＤによっ
て同定されかつ表１のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号
を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる、分泌
タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０７０３】
生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定する上記の方法もまた好まし
く、ここでこの方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を包含する、ここでこのパネル中
の少なくとも１つの配列は、上記の群から選択された配列における少なくとも１
０の連続的なアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である。
【０７０４】
被験体において、表１において同定された分泌タンパク質をコードする遺伝子
の異常な構造または発現に関連する病的状態を診断する方法もまた、好ましい。
ここで、この方法は、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて、少な
くとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポリペプチド分
子を検出する工程を包含し、ここでこのパネル中の少なくとも１つの配列は、以
下からなる群から選択される配列における少なくとも１０の連続的なアミノ酸の
配列と少なくとも９０％同一である：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは
表１に規定される任意の整数である）；および表１におけるｃＤＮＡクローンＩ
Ｄによって同定されかつ表１のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ
受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされ
る分泌タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０７０５】
これらの方法のいずれかにおいて、このポリペプチド分子を検出する工程は、
抗体を使用する工程を包含する。
【０７０６】
以下からなる群から選択された配列中の、少なくとも１０の連続的なアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子もまた、好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、
Ｙは表１に規定される任意の整数である）；および表１におけるｃＤＮＡクロー
ンＩＤによって同定されかつ表１のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴ
ＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによってコード
される分泌タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０７０７】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、原核生物宿主でのこのポリペ
プチドの発現について最適化されている、単離された核酸分子もまた、好ましい
。
【０７０８】
ポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離され
た核酸分子もまた、好ましい：配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは表１に
規定される任意の整数である）；および表１におけるｃＤＮＡクローンＩＤによ
って同定されかつ表１のこのｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番
号を有する寄託物に含まれる、ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされる分泌
タンパク質の完全アミノ酸配列。
【０７０９】
上記の単離された核酸分子のいずれかをベクター中に挿入する工程を含む、組
換えベクターの作製方法はさらに好ましい。この方法によって生成された組換え
ベクターも、好ましい。宿主細胞中にベクターを導入する工程を含む、組換え宿
主細胞を作製する方法、ならびにこの方法によって生成された組換え宿主細胞も
また、好ましい。
【０７１０】
このポリペプチドが発現されるような条件下でこの組換え宿主細胞を培養する
工程、およびこのポリペプチドを回収する工程を包含する、単離されたポリペプ
チドを作製する方法もまた好ましい。この組換え宿主細胞は真核生物細胞であり
、そしてこのポリペプチドは、以下からなる群から選択されたアミノ酸配列を含
む、ヒト分泌タンパク質の分泌部分である、単離されたポリペプチドを作製する
この方法もまた好ましい：配列番号Ｙの分泌部分の第１のアミノ酸の位置の残基
で始まる、配列番号Ｙのアミノ酸配列（ここで、Ｙは表１に記載される整数であ
り、そして配列番号Ｙの分泌部分の第１のアミノ酸のこの位置は表１に規定され
る）；および表１におけるｃＤＮＡクローンＩＤによって同定されかつ表１のこ
のｃＤＮＡクローンについて示されるＡＴＣＣ受託番号を有する寄託物に含まれ
る、ヒトｃＤＮＡクローンによってコードされるタンパク質の分泌部分のアミノ
酸配列。この方法によって生成された単離されたポリペプチドもまた、好ましい
。
【０７１１】
増加したレベルの分泌タンパク質活性を必要とする個体を処置する方法もまた
、好ましい。ここで、この方法は、このような個体に、この個体においてこのタ
ンパク質の活性のレベルを増加させるのに有効な本願発明の単離されたポリペプ
チド、ポリヌクレオチド、または抗体の一定量を含む薬学的組成物を投与する工
程を包含する。
【０７１２】
上記で引用される適用は、広範な種々の宿主において使用されている。そのよ
うな宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ  ｐｉｇ）、ニワト
リ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられる
が、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ま
しい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０７１３】
本発明の特定の実施形態では、表７の４番目の列に列挙される各「コンティグ
ＩＤ」について、好ましくは、表７の５番目の列で参照されるヌクレオチド配列
、および一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここでａおよびｂは
、表７の列３で参照される対応する配列番号Ｘについて独自に決定される）を含
むか、またはからなる、１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。さらに特定
の実施形態は、表７の５番目の列において参照される特定のポリヌクレオチド配
列の１、２、３、４、またはそれ以上を除外するポリヌクレオチド配列に指向さ
れる。この表は、一般式により除外され得る配列の全てを含むことを決して意味
せず、それは、単に例示的な例である。これらの登録を通じて利用可能な全ての
文献は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０７１４】
【表７】
2011087587.tif 000025
2011087587.tif 000026
2011087587.tif 000027
2011087587.tif 000028
2011087587.tif 000029
2011087587.tif 000030
2011087587.tif 000031
2011087587.tif 000032
2011087587.tif 000033
2011087587.tif 000034
2011087587.tif 000035
2011087587.tif 000036
2011087587.tif 000037
2011087587.tif 000038
2011087587.tif 000039
2011087587.tif 000040
2011087587.tif 000041
2011087587.tif 000042
2011087587.tif 000043
2011087587.tif 000044
概して、本発明を記載してきたが、例示の目的のために提供され、そして限定
を意図しない、以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解
される。
【０７１５】
（実施例）
（実施例１：選択されたｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離）
引用されるＡＴＣＣ寄託物中の各ｃＤＮＡクローンは、プラスミドベクター中
に含まれる。表１は、各クローンが単離されたｃＤＮＡライブラリーを構築する
ために用いられたベクターを同定する。多くの場合において、ライブラリーを構
築するために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクタ
ーである。すぐ下の表は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各フ
ァージベクターについて関連するプラスミドを相関づける。例えば、特定のクロ
ーンがベクター「Ｌａｍｂｄａ  Ｚａｐ」中に単離されていると表１に同定され
る場合、対応する寄託クローンは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」である。
【０７１６】
【表８】
2011087587.tif 000045
ベクターＬａｍｂｄａ  Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ  ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅ
ｓ．１６：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ
．およびＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７
：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．
ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１  Ｎ．Ｔｏｒ
ｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販
されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマ
イシン耐性遺伝子を含む。両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（これ
もまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形質転換され得る。ｐＢ
Ｓは、ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳの４形態で入荷する。ＳおよびＫとは
、ポリリンカー領域（「Ｓ」とはＳａｃＩであり、そして「Ｋ」とは、ＫｐｎＩ
のことであり、これらは、リンカーのそれぞれの各末端での最初の部位である）
に隣接するＴ７およびＴ３プライマー配列に対するポリリンカーの配向をいう。
「＋」または「−」とは  、ある方向においてｆ１  ｏｒｉから開始される一本
鎖レスキューがセンス鎖ＤＮＡを生成し、そして他方においてアンチセンスであ
るようなｆ１複製起点（「ｏｒｉ」）の配向をいう。
【０７１７】
ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ  ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏ
ｒｔ３．０をＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  ２０８９７から入手した。全ての
Ｓｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株Ｄ
Ｈ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であ
る）に形質転換され得る。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ  
１５：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ  ＢＡ（Ｂｅｎ
ｔｏ  Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、ア
ンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１  Ｂｌｕｅに形質
転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ、１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ  ９２
００８から入手可能である）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃ
ｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である
）に形質転換され得る（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  
Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：（１９９１）を参照のこと）。好ましくは、本
発明のポリヌクレオチドは、表１における特定のクローンについて同定されたフ
ァージベクター配列、ならびに上記に示された対応するプラスミドベクター配列
を含まない。
【０７１８】
表１に引用される、任意の所定のｃＤＮＡクローンについてＡＴＣＣ受託番号
を与えられたサンプルにおける寄託された物質はまた、１つ以上のさらなるプラ
スミド（これは各々、その所定のクローンとは異なるｃＤＮＡクローンを含む）
を含み得る。従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託物は、表１に同定さ
れる各ｃＤＮＡクローンのためのプラスミドを少なくとも含む。代表的には、表
１に引用される各ＡＴＣＣ寄託物のサンプルは、ほぼ等量（重量で）の約５０個
のプラスミドＤＮＡ（これは各々、異なるｃＤＮＡクローンを含む）の混合物を
含む；しかし、このような寄託サンプルは、５０個よりも多いかまたは少ないｃ
ＤＮＡクローン（約５００個までのｃＤＮＡクローン）のためのプラスミドを含
み得る。
【０７１９】
表１における特定のクローンについて引用されるプラスミドＤＮＡの寄託サン
プルからそのクローンを単離するために２つのアプローチが使用され得る。第一
に、プラスミドを、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して
、クローンをスクリーニングすることによって直接単離する。
【０７２０】
特に、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを、報告され
ている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識し、そして慣用的な方法に従って精製
する。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ
ｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））。プラスミド
混合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される技
術または上記で引用された関連の刊行物もしくは特許において提供される技術）
を用いて、上記のような適切な宿主（例えば、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を１．５％寒天プレート（適切な選
択薬剤、例えば、アンピシリンを含む）に、１プレートあたり約１５０の形質転
換体（コロニー）の密度でプレーティングする。これらのプレートを、細菌コロ
ニースクリーニングについての慣用的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ
、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の
技術に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０７２１】
あるいは、配列番号Ｘの両端（すなわち、表１に規定されるクローンの５’Ｎ
Ｔおよび３’ＮＴによって囲まれる配列番号Ｘの領域内）に由来する、１７〜２
０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託さ
れたｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、所望のｃＤＮＡを増幅
する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用的な条件下で、例えば、０．５μｇの上記
ｃＤＮＡテンプレートとの反応混合物の２５μｌ中で実施する。便利な反応混合
物は、１．５〜５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞれ
２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プライ
マーおよび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰＣ
Ｒ（９４℃での変性を１分間；５５℃でのアニールを１分間；７２℃での伸長を
１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイクラー
を用いて実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そして予
想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物を、Ｄ
ＮＡ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって、選択された配列
であることを確認する。
【０７２２】
寄託されたクローンに存在しないかもしれない遺伝子の５’非コード部分また
は３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これら
の方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異
的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３
’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’
ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の欠けている５’末端を生成する
ために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａ
ｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０７２３】
簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ
増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全
長遺伝子を生成し得る。
【０７２４】
この上記の方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡをも使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮ
Ａの５’リン酸基を排除し得る。次いで、ホスファターゼを不活化するべきであ
り、そしてＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を
除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理するべきである。
この反応は、次いでＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに
連結され得る、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。
【０７２５】
この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のた
めのテンプレートとして使用する。次いで、得られた生成物を配列決定し、そし
て分析して５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【０７２６】
（実施例２：ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離）
ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０７２７】
（実施例３：ポリペプチドの組織分布）
本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋらによって記載されるノーザンブロット分析についてのプロトコルを用
いて決定する。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるｃＤＮＡ
プローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造者の指示に従
って、Ｐ32で標識する。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ−１００
TMカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用し
て、製造者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製
した標識プローブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する
。
【０７２８】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造者のプロトコル番号Ｐ
Ｔ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄後、ブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに露出し
、そしてフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０７２９】
（実施例４：ポリヌクレオチドの染色体マッピング）
オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０７３０】
（実施例５：ポリペプチドの細菌性発現）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例１に概説する
ように、ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅して挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿入物を
増幅するために使用されるプライマーは、発現ベクターに増幅産物をクローニン
グするために、プライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限
部位を好ましくは含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌
性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，
ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（
Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可能なプロモーター／
オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ
（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードする。
【０７３１】
ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながらｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミドｐＲ
ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、ＬＢプレート上で生
育するそれらの能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認す
る。
【０７３２】
所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養物に接種
するために使用する。細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．Ｄ
．600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩ
リプレッサーの不活化により誘導され、Ｐ／Ｏの障害物を除去し、遺伝子発現の
増加を導く。
【０７３３】
細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
ＭグアニジンＨＣｌ中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって溶解させる。
細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニッ
ケル−ニトリロ三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡ
ＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタ
ンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手順
で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（１９
９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。
【０７３４】
手短に言えば、上清を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８のカラムにロードし
、そのカラムを、最初に１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ８で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ６で洗浄し、最後にポリペプチ
ドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ５で溶出する。
【０７３５】
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５
０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ  ＮａＣｌに対して
透析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに
固定化している間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロー
ル、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４中の６Ｍ〜１Ｍ尿素の直線勾配を
使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生後、
タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出させる。イミダゾール
を、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ６の緩衝液および２００ｍＭ  
ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質を、４
℃で保存するか、または−８０℃で冷凍する。
【０７３６】
上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに
作動可能に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含
み、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５
、１９９８年２月２５日に寄託）。このベクターは以下を含む：１）選択マーカ
ーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複
製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配
列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサ
ー遺伝子（ｌａｑＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレータ
ー配列を合成的に作製する。
【０７３７】
ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限生成物をゲルで泳動し、そしてより大きな方のフ
ラグメント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対で
あるべきである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。Ｄ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲ
プライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコルに従って生成する。
ＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿入物およ
びベクターを標準的なプロトコルに従って連結する。
【０７３８】
操作されたベクターは、上記のプロトコルにおいて、細菌系でタンパク質を発
現させるために容易に置換され得る。
【０７３９】
（実施例６：封入体からのポリペプチドの精製）
以下の別の方法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定され
ない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０７４０】
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸濁
液に分散させる。
【０７４１】
次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ  Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉで溶液を通すことによって溶解させる。
次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ溶液
と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレットを
、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．
４を使用して再度洗浄する。
【０７４２】
得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ  塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄し
、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧｕ
ＨＣｌ抽出を可能にする。
【０７４３】
不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、Ｇｕ
ＨＣｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ  ナトリウム、ｐＨ
４．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを
、激しい攪拌で迅速に混合することによって、再折畳みさせる。再折畳みした希
釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合しないで４℃で保
つ。
【０７４４】
再折畳みされたポリペプチド溶液を清澄にするために、４０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．０で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメンブレンフ
ィルターを備えるあらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆｉｌｔｒｏ
ｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ
ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上にロードする
。このカラムを４０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で洗浄し、そして同じ緩
衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ  ＮａＣ
ｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を連続的に
モニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析する
。
【０７４５】
次いでポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合する。次
いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン（Ｐｏｒｏｓ  ＨＱ
−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）交換樹脂および弱アニ
オン（Ｐｏｒｏｓ  ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）交換樹脂の直列カラムのセットにロードする。カラムを４０ｍＭ  酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ６．０で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ  酢酸ナトリウム、
ｐＨ６．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２０カラムを１０
カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．０から１．０Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、ｐＨ６．５の範囲
）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタリング下で収集する
。次いで、（例えば、１６％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判明した）ポリペプチ
ドを含む画分をプールする。
【０７４６】
得られたポリペプチドは、上記の再折畳みおよび精製工程の後で９５％より高
い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場合、いかな
る主たる混在バンドも、クマシーブルー染色した１６％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
から観察されないはずである。精製タンパク質はまた、エンドトキシン／ＬＰＳ
混在について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬアッセイに従
って、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０７４７】
（実施例７：バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニングお
よび発現）
この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、ポリヌ
クレオチドをバキュロウイルスに挿入し、ポリペプチドを発現する。この発現ベ
クターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（
ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、Ｘｂａ
Ｉ、およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。シミアンウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使
用する。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同方向の弱
いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含
む。挿入された遺伝子は、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存可能
なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのた
めのウイルス配列と両方の側で隣接する。
【０７４８】
他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０７４９】
具体的には、ＡＵＧ開始コドンを含み、そして表１に同定されたリーダー配列
に天然に結合した寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列を、実施例１に記
載されるＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグナル配列
を使用して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシグナルペ
プチドを必要としない。あるいは、Ｓｕｍｍｅｒｓら、「Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏ
ｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎ
ｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅ
ｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏ
ｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＮＯ．：１５５５（１９８７）に記載される標準的な方
法を用いて、このベクターを、バキュロウイルスリーダー配列を含むように改変
し得る（ｐＡ２ＧＰ）。
【０７５０】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロース
ゲルから単離する。次いで、このフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そし
て再び１％アガロースゲル上で精製する。
【０７５１】
このプラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野
で公知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る
。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ  １０
１  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。
【０７５２】
このフラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを
用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１  Ｂｌｕ
ｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換
し、そして培養プレート上に拡げる。このプラスミドを含む細菌を、個々のコロ
ニー由来のＤＮＡを消化し、そしてゲル電気泳動によって消化産物を分析するこ
とにより同定する。クローニングしたフラグメントの配列を、ＤＮＡシーケンス
によって確認する。
【０７５３】
このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM  ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ  ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同時
トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM  ウイルスＤＮＡおよ
び５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、マイ
クロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清のグレー
ス培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（Ａ
ＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に滴下する。次いで、このプレートを２７℃で５時
間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をこのプレートから
除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加
する。次いで、培養を２７℃で４日間継続する。
【０７５４】
４日後上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によっ
て記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ  Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを使用して、ｇａｌが発現しているクローン（青色に染色したプラ
ークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にする（この型の「プラークアッ
セイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養およ
びバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイン
キュベーションの後、青色に染色したプラークを、マイクロピペッターのチップ
（例えば、エッペンドルフ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２
００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そして組
換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播種した
Ｓｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し、次
いで４℃に貯蔵する。
【０７５５】
ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染効率（「ＭＯ
Ｉ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる。
放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００  ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤから入手可
能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの
35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに
１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパ
ク質ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオートラ
ジオグラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。
【０７５６】
精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０７５７】
（実施例８：哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現）
本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞において発現させ得る。代表的な哺乳
動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント
、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必
要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック（Ｋｏｚ
ａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の
初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、Ｈ
ＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
の初期プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、
ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。
【０７５８】
本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ  ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ  ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａ
ｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ  １細胞、Ｃｏ
ｓ  ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、およ
びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０７５９】
あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、
安定な細胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンのような選択マーカーを用いる同時トランスフェクションは、トランスフ
ェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０７６０】
トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７
−１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９
０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択
マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ  Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５（１９９２））。こ
れらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっ
とも高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれ
た、増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳ
Ｏ細胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０７６１】
プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０  （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロ
インスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終結シグナル、ならびに、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０７６２】
具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６を、適切な制限酵素を用いて消化し、
次いで当該分野で公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リ
ン酸する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。
【０７６３】
本発明のポリヌクレオチドは、実施例１に概説するプロトコルに従って増幅さ
れる。分泌タンパク質の産生のために天然に存在するシグナル配列が用いられる
場合、このベクターは、第２のシグナルペプチドを含む必要はない。あるいは、
天然に存在するシグナル配列が用いられない場合、このベクターは、異種シグナ
ル配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと
）。
【０７６４】
増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ  １０
１  Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。次いで、このフラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再
び１％アガロースゲルで精製する。
【０７６５】
次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化したベクター
を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１また
はＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入された
フラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０７６６】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６  ａ  ｐＣ４を、リ
ポフェクチン（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐ
ＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは
、優性選択マーカーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与す
る酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌの
Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処
理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍ
ｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニン
グプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日
後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いでメトトレキサートの異なる濃度
（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、
６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、メトトレキ
サートの最高濃度で増殖するクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５
μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレート
に移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られる
まで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウ
エスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０７６７】
（実施例９：タンパク質融合物）
本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、本発明のポリぺプチ
ドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトー
ス結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと；ＥＰ
Ａ  ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３３１：８４−８６（１９８８））。同様に、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、お
よびアルブミンへの融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明のポリぺ
プチドに融合した核局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に標的化
し得る。一方、共有結合ヘテロニ量体またはホモニ量体は、融合タンパク質の活
性を増大または減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有す
るキメラ分子を作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比
較して、融合タンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の
融合タンパク質の全ての型は、ＩｇＧ分子へのポリぺプチドの融合を概説する以
下のプロトコル、または実施例５に記載されるプロトコルを改変することによっ
て作製され得る。
【０７６８】
簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位を有するべきである。
【０７６９】
例えば、ｐＣ４（受託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は
、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊され
るべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが、Ｂ
ａｍＨＩを用いて再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載さ
れるＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、このＢ
ａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニン
グされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。
【０７７０】
天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ  ９６／３４８９１を参照のこと）。
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域：
ＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡ
ＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＧＴＧ
ＣＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧ
ＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴ
ＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧ
ＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣ
ＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡ
ＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣ
ＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴ
ＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧ
ＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧ
ＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧ
ＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧ
ＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴ
ＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡ
ＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴ
ＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴ
ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣ
ＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣ
ＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣ
ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号１）
（実施例１０：ポリペプチドからの抗体の産生）
本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本
発明のポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、分泌されたタンパク
質の調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよ
うにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するため
に、このような調製物は、動物に導入される。
【０７７１】
最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそ
のタンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗体は、ハ
イブリドーマ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５
６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：
５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９
２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂ
ｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
，Ｎ．Ｙ．、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、このような手順は、動
物（好ましくはマウス）を、ポリペプチドで、またはより好ましくは分泌ポリペ
プチド発現細胞で免疫する工程を包含する。このような細胞は、任意の適切な組
織培養培地において培養され得る；しかし、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約
５６℃で非働化した）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，
０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン
を補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地において培養される。
【０７７２】
このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞を、このポリぺプチド
に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイする。
【０７７３】
あるいは、このポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイプ
抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗体
それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能で
あるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用し
て、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細胞
を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細胞
は、抗体のタンパク質特異的抗体に結合する能力がこのポリペプチドによってブ
ロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる
。このような抗体は、タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含
み、そして動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の形成を誘導するため
に使用される。
【０７７４】
本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本
明細書において記載される方法に従って用いられ得ることが明白である。このよ
うなフラグメントは代表的に、（Ｆａｂフラグメントを生成するために）パパイ
ンまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために）ペプシンのような酵
素を使用して、タンパク質分解性切断により生成される。あるいは、分泌された
タンパク質−結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によ
り生成され得る。
【０７７５】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、「ヒト化」キメラモノクローナル
抗体を使用することが好適であり得る。このような抗体は、上記のモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を使用することに
よって産生され得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該分野で公知であ
る。（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２
（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）
；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら
、ＥＰ  １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ  ８７０２６７
１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅ
ｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）
。
【０７７６】
（実施例１１：ハイスループットスクリーニングアッセイのための分泌タンパ
ク質の産生）
以下のプロトコルは、試験されるべきポリぺプチドを含有する上清を産生する
。この上清は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにおいて使用され
得る。
【０７７７】
第一に、ポリ−Ｄ−リジン（６４４  ５８７  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ）ストック溶液（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ（カルシウム
もマグネシウムも含まない１７−５１６Ｆ  Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１
：２０に希釈して、作業溶液５０μｇ／ｍｌにする。２００μｌのこの溶液を、
各ウェル（２４ウェルプレート）に添加し、そして室温で２０分間インキュベー
トする。溶液を各ウェルにわたって分配させることを確実にする（注：１２チャ
ンネルピペッターは、１つおきのチャンネルにチップをつけて使用され得る）。
ポリ−Ｄ−リジン溶液を吸引除去し、そして１ｍｌ  ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理
食塩水）でリンスする。ＰＢＳは、細胞をプレートする直前までウェル中に残す
べきであり、そしてプレートは２週間前までに予めポリリジンでコーティングし
得る。
【０７７８】
２９３Ｔ細胞（Ｐ＋２０を過ぎて細胞を保有しない）を、２×１０5細胞／ウ
ェルで、０．５ｍｌのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）（４．
５Ｇ／ＬのグルコースおよびＬ−グルタミン（１２−６０４Ｆ  Ｂｉｏｗｈｉｔ
ｔａｋｅｒ）を含む）／１０％熱非働化ＦＢＳ（１４−５０３Ｆ  Ｂｉｏｗｈｉ
ｔｔａｋｅｒ）／１×Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１７−６０２Ｅ  Ｂｉｏｗｈｉｔｔａ
ｋｅｒ）中にプレートする。細胞を一晩増殖させる。
【０７７９】
翌日、滅菌溶液容器（ｂａｓｉｎ）中で、３００μｌリポフェクトアミン（１
８３２４−０１２  Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）および５ｍｌ  Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ（
３１９８５０７０  Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）／９６ウェルプレートを、一緒に混合
する。小容量のマルチチャンネルピペッターを用いて、実施例８または９に記載
する方法によって産生されたポリヌクレオチド挿入物を含有する約２μｇの発現
ベクターを、適切に標識された９６ウェルの丸底プレート中にアリコートする。
マルチチャンネルピペッターを用いて、５０μｌのリポフェクトアミン／Ｏｐｔ
ｉｍｅｍ  Ｉ混合物を各ウェルに添加する。ピペットで緩やかに吸い上げたり下
げたりして混合する。室温で１５〜４５分間インキュベートする。約２０分後、
マルチチャンネルピペッターを使用して１５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ  Ｉを各ウ
ェルに添加する。コントロールとして、挿入物を欠失するベクターＤＮＡの１つ
のプレートは、トランスフェクションの各セットでトランスフェクトされるべき
である。
【０７８０】
好ましくは、トランスフェクションは、以下の作業をタッグチームを組んで（
ｔａｇ−ｔｅａｍｉｎｇ）行うべきである。タッグチームを組むことによって、
時間に関する労力は半減され、そして細胞にはＰＢＳ上であまり多くの時間を過
ごさせない。まず、Ａさんは、培地を細胞の４つの２４ウェルプレートから吸引
除去し、次いでＢさんが０．５〜１ｍｌのＰＢＳで各ウェルをリンスする。次い
で、Ａさんは、ＰＢＳリンスを吸引除去し、そしてＢさんは、チャンネル１つお
きにチップのついた１２チャンネルピペッターを使用して、２００μｌのＤＮＡ
／リポフェクトアミン／Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ複合体を、まず奇数のウェルに、次
いで偶数のウェルにと、２４ウェルプレート上の各列に添加する。３７℃で６時
間インキュベートする。
【０７８１】
細胞をインキュベートする間に、１×ペンストレップ（ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を
有するＤＭＥＭ中の１％ＢＳＡか、またはＣＨＯ−５培地（１１６．６ｍｇ／Ｌ
のＣａＣｌ2（無水物）；０．００１３０ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ4−５Ｈ2Ｏ；０．
０５０ｍｇ／ＬのＦｅ（ＮＯ3）3−９Ｈ2Ｏ；０．４１７ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ4−
７Ｈ2Ｏ；３１１．８０ｍｇ／ＬのＫＣｌ；２８．６４ｍｇ／ＬのＭｇＣｌ2；４
８．８４ｍｇ／ＬのＭｇＳＯ4；６９９５．５０ｍｇ／ＬのＮａＣｌ；２４００
．０ｍｇ／ＬのＮａＨＣＯ3；６２．５０ｍｇ／ＬのＮａＨ2ＰＯ4−Ｈ2Ｏ；７１
．０２ｍｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4；０．４３２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ4−７Ｈ2Ｏ；
０．００２ｍｇ／Ｌのアラキドン酸；１．０２２ｍｇ／Ｌのコレステロール；０
．０７０ｍｇ／ＬのＤＬ−α−酢酸トコフェロール；０．０５２０ｍｇ／Ｌのリ
ノール酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのリノレン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのミリスチン
酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのオレイン酸；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミトオレイン
酸（ｐａｌｍｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）；０．０１０ｍｇ／Ｌのパルミチン酸；１
００ｍｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８；０．０１０ｍｇ／Ｌのステアリン
酸；２．２０ｍｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０；４５５１ｍｇ／ＬのＤ−グルコース；
１３０．８５ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１４７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アルギ
ニン−ＨＣｌ；７．５０ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン−Ｈ2Ｏ；６．６５ｍｇ
／ｍｌのＬ−アスパラギン酸；２９．５６ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン２ＨＣｌ−
Ｈ2Ｏ；３１．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−シスチン−２ＨＣｌ；７．３５ｍｇ／ｍｌ
のＬ−グルタミン酸；３６５．０ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン；１８．７５ｍｇ
／ｍｌのグリシン；５２．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌ−Ｈ2Ｏ；
１０６．９７ｍｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン；１１１．４５ｍｇ／ｍｌのＬ−ロ
イシン；１６３．７５ｍｇ／ｍｌのＬ−リジンＨＣｌ；３２．３４ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−メチオニン；６８．４８ｍｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン；４０．０ｍｇ
／ｍｌのＬ−プロリン；２６．２５ｍｇ／ｍｌのＬ−セリン；１０１．０５ｍｇ
／ｍｌのＬ−スレオニン；１９．２２ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファン；９１．
７９ｍｇ／ｍｌのＬ−チロシン（Ｔｒｙｒｏｓｉｎｅ）−２Ｎａ−２Ｈ2Ｏ；９
９．６５ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン；０．００３５ｍｇ／Ｌのビオチン；３．２４
ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテン酸；１１．７８ｍｇ／Ｌの塩化コリン；４．６５
ｍｇ／Ｌの葉酸；１５．６０ｍｇ／Ｌのｉ−イノシトール；３．０２ｍｇ／Ｌの
ナイアシンアミド；３．００ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ；０．０３１ｍｇ
／ＬのピリドキシンＨＣｌ；０．３１９ｍｇ／Ｌのリボフラビン；３．１７ｍｇ
／ＬのチアミンＨＣｌ；０．３６５ｍｇ／Ｌのチミジン；および０．６８０ｍｇ
／ＬのビタミンＢ12；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝剤；２．３９ｍｇ／ＬのＮａヒ
ポキサンチン；０．１０５ｍｇ／Ｌのリポ酸；０．０８１ｍｇ／Ｌのプトレシン
ナトリウム−２ＨＣｌ；５５．０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム；０．００６
７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム；２０μＭのエタノールアミン；０．１２２
ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄；４１．７０ｍｇ／Ｌのリノール酸と複合体化したメ
チル−Ｂ−シクロデキストリン；３３．３３ｍｇ／Ｌのオレイン酸と複合体化し
たメチル−Ｂ−シクロデキストリン；ならびに１０ｍｇ／Ｌのレチナールと複合
体化したメチル−Ｂ−シクロデキストリン）のいずれかの適切な培地を調製する
。（１０％ＢＳＡストック溶液のために、１Ｌ  ＤＭＥＭ中にＢＳＡ（８１−０
６８−３  Ｂａｙｅｒ）１００ｇを溶解した）。培地を濾過し、そして５０μｌ
を内毒素アッセイのために１５ｍｌポリスチレンコニカル中に収集する。
【０７８２】
トランスフェクション反応を、好ましくはタッグチームを組んでインキュベー
ション時間の終わりに終結させる。Ａさんは、トランスフェクション培地を吸引
除去し、その間Ｂさんは、１．５ｍｌの適切な培地を各ウェルに添加する。使用
された培地に依存して４５時間または７２時間、３７℃でインキュベートする：
１％ＢＳＡは４５時間、またはＣＨＯ−５は７２時間。
【０７８３】
４日目に、３００μｌのマルチチャンネルピペッターを使用して、６００μｌ
を１ｍｌの深底ウェルプレート１枚にアリコートし、そして残りの上清を２ｍｌ
の深底ウェルにアリコートする。次いで、各ウェルからの上清を実施例１３〜２
０に記載するアッセイにおいて使用し得る。
【０７８４】
活性が、上清を使用して以下に記載する任意のアッセイにおいて得られる場合
、この活性は、ポリぺプチドから直接に（例えば、分泌タンパク質として）か、
または他のタンパク質の発現を誘導するポリぺプチドによって（このタンパク質
は、次いで上清中に分泌される）のいずれかに由来することが特に理解される。
従って、本発明はさらに、特定のアッセイにおける活性によって特徴づけられる
上清中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【０７８５】
（実施例１２：ＧＡＳレポーター構築物の構築）
細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋｓ−ＳＴ
ＡＴ経路と呼ばれる。Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴ経路において活性化されたタンパク質
は、多くの遺伝子のプロモーターに位置する、γ活性化部位「ＧＡＳ」エレメン
トまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。
これらのエレメントに対するタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化
させる。
【０７８６】
ＧＡＳエレメントおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデュ
ーサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因
子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓ
ｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に（ＩＦＮαに対する応答が広
範であるように）、多くの細胞型において存在する。Ｓｔａｔ４は、より限定さ
れており、そして多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２での処理後のＴヘ
ルパークラスＩ細胞に見出されている。Ｓｔａｔ５は、元々は乳房成長因子と呼
ばれたが、骨髄細胞を含む他の細胞においてより高い濃度で見出されている。そ
れは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化され得る。
【０７８７】
ＳＴＡＴは活性化されて、Ｊａｎｕｓ  Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋｓ」）ファミ
リーとして知られる１セットのキナーゼによるチロシンリン酸化に際して細胞質
から核へ移動する。Ｊａｋｓは、可溶性のチロシンキナーゼの独特のファミリー
の代表であり、そしてＴｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。
これらのキナーゼは、有意な配列類似性を示し、そして一般には休止細胞におい
て触媒的に不活性である。
【０７８８】
Ｊａｋｓは、以下の表によって要約されるように広範なレセプターによって活
性化される。（ＳｃｈｉｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．６４：６２１−５１（１９９５）による総説から改変）。Ｊａｋｓ
を活性化し得るサイトカインレセプターファミリーは、２つの群に分けられる：
（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳ
Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対するレセプ
ターを含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−
１０を含む。クラス１レセプターは、保存されたシステインモチーフ（４つの保
存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）、およびＷＳＸＷＳ
モチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘｘｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号２）をコードす
る膜近接領域）を共有する。
【０７８９】
従って、リガンドのレセプターへの結合の際に、Ｊａｋｓは活性化され、これ
は次いでＳＴＡＴを活性化し、これは、次いで移動し、そしてＧＡＳエレメント
に結合する。この全プロセスは、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含さ
れる。
【０７９０】
それゆえ、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によって反映されるＪａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を示
すために使用され得る。例えば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴ経路を活性化することが知られている。（以下の表を参照のこと）。従っ
て、レポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ
ｓ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターが同定され得る。
【０７９１】
【表９】
2011087587.tif 000046
実施例１３〜１４に記載される生物学的アッセイにおいて使用されるプロモー
ターエレメントを含む合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテ
ジーを用いてＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を生成する。５’プライマーは
、ＩＲＦ１プロモーターにおいて見出され、そして一定の範囲のサイトカインで
の誘導の際にＳＴＡＴに結合することが以前に実証されたＧＡＳ結合部位の４つ
の直列のコピーを含むが（Ｒｏｔｈｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：４５７−
４６８（１９９４））、他のＧＡＳエレメントまたはＩＳＲＥエレメントを代わ
りに使用し得る。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に対し
て相補的な１８ｂｐの配列も含み、そしてＸｈｏＩ部位に隣接する。５’プライ
マーの配列は以下である：
５’：ＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣ
ＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡ
ＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧ：３’（配列番号３）。
【０７９２】
下流プライマーはＳＶ４０プロモーターに対して相補的であり、そしてＨｉｎ
ｄ  ＩＩＩ部位に隣接する：５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧ
ＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列番号４）。
【０７９３】
ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラ
スミド中に存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを用いて実施する。得
られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを用いて消化し、そし
てＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。正方向およ
び逆方向のプライマーを用いる配列決定により、挿入物が以下の配列を含むこと
を確認する：
５’：ＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡ
ＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧ
ＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴ
ＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣ
ＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡ
ＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧ
ＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴ：３’（配列番号５）。
【０７９４】
このＧＡＳプロモーターエレメントがＳＶ４０プロモーターに結合されると、
次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２レポーター構築物を操作する。ここで、レポーター分
子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかし、明
らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のレポーター分
子が、ＳＥＡＰの代わりとなり得る。ＳＥＡＰの代わりに使用され得る周知のレ
ポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク
質が挙げられる。
【０７９５】
上記の配列により確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントを
、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ
を用いて、増幅したＧＡＳ：ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモ
ーターを有効に置換し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモータ
ーベクターにサブクローニングする。しかし、このベクターはネオマイシン耐性
遺伝子を含まず、それゆえ、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【０７９６】
従って、ＧＡＳ−ＳＥＡＰレポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作
製するために、ＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットを、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから取り出し、そしてＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベク
ターを作製するために、マルチクローニング部位におけるこれらの制限部位を用
いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含む骨格ベクター（例えば、ｐＧＦＰ−１（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ））に挿入する。一旦、このベクターを哺乳動物細胞にトランス
フェクトすれば、次いでこのベクターは、実施例１３〜１４に記載されるように
ＧＡＳ結合についてのレポーター分子として使用され得る。
【０７９７】
他の構築物を、上記の説明を使用し、そしてＧＡＳを異なるプロモーター配列
で置換して、作製し得る。例えば、ＮＦＫ−ＢおよびＥＧＲプロモーター配列を
含むレポーター分子の構築を、実施例１５および１６に記載する。しかし、多く
の他のプロモーターを、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して置換し得
る。例えば、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンのプロモー
ターを単独で、または組み合わせて（例えば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、Ｇ
ＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換し得
る。同様に、他の細胞株（例えば、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細
胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞
）、または心筋細胞）を、レポーター構築物の活性を試験するために使用し得る
。
【０７９８】
（実施例１３：Ｔ細胞の活性についてのハイスループットスクリーニングアッ
セイ）
以下のプロトコルを使用して、因子を同定すること、および本発明のポリペプ
チドを含有する上清がＴ細胞を増殖および／または分化するか否かを決定するこ
とによって、Ｔ細胞活性を評価する。Ｔ細胞の活性を実施例１２で作製したＧＡ
Ｓ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加さ
せる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。
このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号Ｔ
ＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５
２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞もまた
使用し得る。
【０７９９】
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、リンパ芽球性ＣＤ４＋  Ｔｈ１ヘルパー細胞である
。安定な細胞株を作製するために、およそ２００万のＪｕｒｋａｔ細胞をＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ
／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション
手順）。トランスフェクトした細胞を、およそ２０，０００細胞／ウェルの密度
で播種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して
耐性であるトランスフェクト体を選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、
漸増する濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選
択したクローンの用量応答を示す。
【０８００】
詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５のウェルに
ついて十分な細胞を得る。従って、複数の９６ウェルプレートについて十分な細
胞を産生するために、これをスケールアップするか、または複数で実施するかの
いずれかを行う。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ＋１０％血清および１％のＰｅｎ
−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ
（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０μｇのプラスミドＤＮＡとを組
み合わせる。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを
添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【０８０１】
インキュベート時間の間、細胞濃度をカウントし、必要な細胞数（トランスフ
ェクションあたり１０7個）をスピンダウンし、そして最終濃度が１０7細胞／ｍ
ｌとなるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で再懸濁する。次いで、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中
の１×１０7個の細胞の１ｍｌをＴ２５フラスコに加え、そして３７℃で６時間
インキュベートする。インキュベーションの後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％の
血清を添加する。
【０８０２】
Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定レポーター株をＲＰＭＩ＋１０％血清、
１ｍｇ／ｍｌジェネティシン、および１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で維持する。
これらの細胞は、本発明のポリペプチドを含む上清で処理されるか、および／ま
たは実施例１１に記載のプロトコールにより産生されるよう本発明のポリペプチ
ドを誘導される。
【０８０３】
上清での処理日に細胞を洗浄すべきであり、そして１ｍｌあたり５００，００
０個の細胞の密度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁するべき
である。必要な細胞の正確な数は、スクリーニングされる上清の数に依存する。
１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレ
ートについて１億個の細胞）を必要とする。
【０８０４】
１２チャンネルのピペットを用いて９６ウェルのディッシュに細胞を分与する
ために、三角のリザーバーボートに細胞を移す。２００μｌの細胞を、１２チャ
ンネルのピペットを用いて、それぞれのウェルに移す（従って、ウェル当たり１
００，０００個の細胞を添加する）。
【０８０５】
全てのプレートに播種した後、５０μｌの上清を、１２チャンネルピペットを
用いて、上清を含む９６ウェルプレートから各ウェルに直接的に移す。さらに、
外来性のインターフェロンγの用量（０．１、１．０、１０ｎｇ）を、ウェルＨ
９、ウェルＨ１０、およびウェルＨ１１に添加し、アッセイについてのさらなる
陽性コントロールとして使用する。
【０８０６】
上清で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含む９６ウェルディッシュをインキュベー
ターに４８時間置く（注記：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）
。次いで、各ウェルから３５μｌのサンプルを１２チャンネルのピペットを用い
て、不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートを（セロファン（登
録商標）のカバーを用いて）覆うべきであり、そして実施例１７に記載のＳＥＡ
Ｐアッセイを実施するまで、−２０℃で保存するべきである。残存する処理した
細胞を含むプレートを４℃に置き、そして、所望するならば、特定のウェル上で
のアッセイを繰り返すための物質の供給源として供する。
【０８０７】
陽性コントロールとして、１００ユニット／ｍｌのインターフェロンγを使用
し得、これは、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を活性化することが公知である。代表的に
は、３０倍を超える誘導が、陽性コントロールのウェルにおいて観察される。
【０８０８】
上述のプロトコルは、一過性および安定性の両方のトランスフェクト細胞の作
製に用いられ得、このことは当業者に明らかである。
【０８０９】
（実施例１４：骨髄性活性を同定するハイスループットスクリーニングアッセ
イ）
以下のプロトコルを使用して、本発明のポリペプチドが骨髄性細胞を増殖およ
び／または分化させるか否かを決定することにより骨髄性の活性を評価する。骨
髄性細胞の活性を実施例１２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築
物を用いて評価する。従って、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−Ｓ
ＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用した骨
髄性細胞としては、Ｕ９３７（前単球（ｐｒｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ）細胞株であ
る）が、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１が使用され得る。
【０８１０】
Ｕ９３７細胞を、実施例１２において産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構
築物で、一過的にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（
Ｋｈａｒｂａｎｄａら、１９９４，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５：２５９−２６５）を用いる。最初に、２×１０ｅ7個
のＵ９３７細胞を回収し、そしてＰＢＳで洗浄する。Ｕ９３７細胞を、通常、１
００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補
充した１０％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中
で増殖させる。
【０８１１】
次に、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇのＧＡＳ−ＳＥ
ＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、３７５μＭ
Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および６７５μＭ  ＣａＣｌ2
を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液１ｍｌ中に細胞を懸
濁する。３７℃で４５分間インキュベートする。
【０８１２】
１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０
ｍｌの完全培地に再懸濁し、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【０８１３】
ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細
胞を増殖させることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を使用して、慣用的に
増殖させるが、１〜２ヶ月毎に細胞を二継代の間、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８
中で再増殖させるべきである。
【０８１４】
これらの細胞を１×１０8個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートアッ
セイのために十分である）を回収することにより試験し、そしてＰＢＳで洗浄す
る。上記の２００ｍｌの増殖培地中に、５×１０5細胞／ｍｌの最終密度で細胞
を懸濁する。９６ウェルプレートにおいてウェルあたり２００μｌの細胞（すな
わち、１×１０5細胞／ウェル）をプレートする。
【０８１５】
実施例１１に記載されるプロトコルにより調製された上清の５０μｌを添加す
る。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性コントロールとして、１
００単位／ｍｌのインターフェロンγを使用し得、これはＵ９３７細胞を活性化
することが公知である。代表的には、３０倍を超える誘導が、陽性コントロール
ウェルにおいて観察される。実施例１７に記載のプロトコルに従って上清をＳＥ
ＡＰアッセイする。
【０８１６】
（実施例１５：ニューロン活性を同定するハイスループットスクリーニングア
ッセイ）
細胞が分化および増殖を経る場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達
経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応
答遺伝子１）は、活性化時に種々の組織および細胞型において誘導される。ＥＧ
Ｒ１のプロモーターはこのような誘導を担う。レポーター分子に結合したＥＧＲ
１プロモーターを使用して、細胞の活性化を評価し得る。
【０８１７】
詳細には、以下のプロトコルをＰＣ１２細胞株におけるニューロン活性を評価
するために使用する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍ
ｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、多くのマイトジェン（例えば、ＴＰＡ（テトラデカ
ノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経成長因子）、およびＥＧＦ（上皮
成長因子））での活性化により、増殖および／または分化することが公知である
。この処理の間にＥＧＲ１遺伝子発現を活性化する。従って、ＳＥＡＰレポータ
ーに結合したＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランス
フェクトすることにより、ＰＣ１２細胞の活性化を評価し得る。
【０８１８】
ＥＧＲ／ＳＥＡＰレポーター構築物を以下のプロトコルにより組み立て得る。
ＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｋら、Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ  ６：８６７−８７１（１９９１））を以下のプライマーを用い
て、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し得る：
５’ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧ−
３’（配列番号６）
５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＴＣ−３
’（配列番号７）。
【０８１９】
次いで、実施例１２において作製したＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを使
用して、ＥＧＲ１増幅産物をこのベクターに挿入し得る。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩを使用してＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを直鎖状化し、ＧＡ
Ｓ／ＳＶ４０スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を取り除く。これらと同じ酵素を
用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限処理する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターと
を連結する。
【０８２０】
細胞培養のための９６ウェルプレートを調製するために、コーティング溶液（
コラーゲンＩ型（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．カタログ番号０８
−１１５）を３０％エタノール（滅菌濾過）で１：３０希釈）を１つの１０ｃｍ
プレートあたり２ｍｌ、または９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｍｌ添加
し、そして２時間風乾させる。
【０８２１】
ＰＣ１２細胞を、予めコートした１０ｃｍ組織培養ディッシュ上で、ペニシリ
ン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充
した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４
４９−７８Ｐ）、５％熱非働化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４
０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で慣用的に増殖させる。１つから４つ
への分割を３〜４日毎に行う。細胞を掻き取ることによりプレートからはがし、
そして１５回より多く上下にピペッティングして再懸濁する。
【０８２２】
ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を、実施例１１に記載のＬｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅプロトコルを使用して、ＰＣ１２にトランスフェクトする。ＥＧＲ−Ｓ
ＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を増殖させ
ることにより得る。Ｇ４１８を含まない培地を慣用的な増殖のために使用するが
、１〜２ヶ月毎に、細胞を２継代の間、３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で再増殖
させるべきである。
【０８２３】
ニューロン活性をアッセイするために、およそ７０〜８０％コンフルエントな
細胞を有する１０ｃｍプレートを、古い培地を除去することによりスクリーニン
グする。ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）を用いて１回洗浄する。次いで、細胞を低血
清培地（抗生物質とともに１％ウマ血清および０．５％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ
−１６４０）中で一晩、細胞を飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させる。
【０８２４】
翌朝、培地を除去し、そしてＰＢＳで細胞を洗浄する。プレートから細胞を掻
き取り、細胞を２ｍｌの低血清培地中で懸濁する。細胞数をカウントし、そして
低血清の培地をさらに添加し、５×１０5細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達させ
る。
【０８２５】
２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１
０5細胞／ウェルに等しい）。実施例１１により産生された５０μｌの上清を、
３７℃で４８〜７２時間添加する。陽性コントロールとして、ＥＧＲを介してＰ
Ｃ１２細胞を活性化することが公知の成長因子（例えば、５０ｎｇ／μｌの神経
成長因子（ＮＧＦ））を使用し得る。代表的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導
が陽性コントロールウェルにおいて見られる。実施例１７に従って、上清をＳＥ
ＡＰアッセイする。
【０８２６】
（実施例１６：Ｔ細胞の活性についてのハイスループットスクリーニングアッ
セイ）
ＮＦ−κＢ（核因子κＢ）は、広範な種々の薬剤（炎症性サイトカインである
ＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリ
ンホトキシン−βを含む）により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、な
らびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される転写因子である。転
写因子として、ＮＦ−κＢは免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポト
ーシスの制御（ＮＦ−κＢは、アポトーシスから細胞を保護するために現われる
）、Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗菌応答、ならびに複数
のストレス応答を調節する。
【０８２７】
刺激されない条件において、ＮＦ−κＢは、Ｉ−κＢ（インヒビターκＢ）を
有する細胞質に保持される。しかし、刺激の際に、Ｉ−κＢはリン酸化され、そ
して分解され、ＮＦ−κＢの核シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）を引き起こし、これ
により標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢにより活性化される標的遺伝
子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびＭＨＣク
ラス１が挙げられる。
【０８２８】
その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力に起因して、ＮＦ−
κＢプロモーターエレメントを利用するレポーター構築物を、実施例１１におい
て産生された上清をスクリーニングするために使用する。ＮＦ−κＢのアクチベ
ーターまたはインヒビターは、疾患の処置に有用である。例えば、ＮＦ−κＢの
インヒビターを、急性または慢性的なＮＦ−κＢの活性化に関連する疾患（例え
ば、慢性関節リウマチ）を処置するために使用し得る。
【０８２９】
ＮＦ−κＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲ
に基づいたストラテジーを用いる。上流のプライマーは、ＮＦ−κＢ結合部位（
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号８）の４つの直列のコピー、ＳＶ４０初
期プロモーター配列の５’末端に対して相補的な１８ｂｐの配列を含み、そして
ＸｈｏＩ部位に隣接する：
５’：ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ
ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡ
ＴＴＡＧ：３’（配列番号９）。
【０８３０】
下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に対して相補的であり、
そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接する：
５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’（配列
番号４）。
【０８３１】
ＰＣＲ増幅を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープ
ラスミドに存在するＳＶ４０プロモーターのテンプレートを使用して実施する。
得られたＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして
ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングする。Ｔ７およびＴ
３プライマーを用いるシークエンスにより、挿入物が以下の配列を含むことを確
認する：
５’：ＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＧＧＧＡ
ＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＣ
ＡＧＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣ
ＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣ
ＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣ
ＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡ
ＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡ
ＡＡＡＧＣＴＴ：３’（配列番号１０）。
【０８３２】
次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータ
ープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメ
ントをこのＮＦ−κＢ／ＳＶ４０フラグメントで置換する。しかし、このベクタ
ーはネオマイシン耐性遺伝子を含まず、そしてそれゆえ、哺乳動物の発現系には
好ましくない。
【０８３３】
安定な哺乳動物細胞株を作製するために、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカ
セットを制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して上記のＮＦ−κＢ／ＳＥＡ
Ｐベクターから取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。
詳細には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限処理した後に、ＮＦ−
κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入
し、ＧＦＰ遺伝子を置換した。
【０８３４】
一旦、ＮＦ−κＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後は、実
施例１３に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を作製し、
そして維持する。同様に、これらの安定なＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を含む上清をア
ッセイするための方法はまた、実施例１３に記載される。陽性コントロールとし
て、外因性のＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、および
Ｈ１１（代表的には、５〜１０倍の活性化が観察されるウェル）に添加する。
【０８３５】
（実施例１７：ＳＥＡＰ活性についてのアッセイ）
実施例１３〜１６に記載されるアッセイのためのレポーター分子として、ＳＥ
ＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉ
ｇｈｔ  Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐ
ｉｘ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ  Ｋｉｔは、以下で使用される希釈緩衝液、
アッセイ緩衝液、および反応緩衝液を提供する。
【０８３６】
ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして１５μｌの２．５×希
釈緩衝液を３５μｌの上清を含むオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）に分
与する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間
インキュベートする。一様でない加温を避けるためにオプティプレートを離して
おく。
【０８３７】
サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にし、そしてアッ
セイ緩衝液を満たす。５０μｌのアッセイ緩衝液を添加し、そして室温で５分間
インキュベートする。ディスペンサーを空にし、そして反応緩衝液を満たす（以
下の表を参照のこと）。５０μｌの反応緩衝液を添加し、そして室温で２０分間
インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、そしてルミ
ノメーターで５つのプレートを読み取るために約１０分間を費やすので、１回毎
に５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始するべきである。
【０８３８】
ルミノメーターにおける相対的な光の単位（ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）を読み取
る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印字する。化学発光の増加
は、レポーター活性を示す。
【０８３９】
【表１０】
2011087587.tif 000047
（実施例１８：低分子の濃度および膜透過性における変化を同定するハイスル
ープットスクリーニングアッセイ）
レセプターへのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのよう
な低分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させ、ならびに膜電位を変化させるこ
とは公知である。これらの変化を特定細胞のレセプターに結合する上清の同定を
行うアッセイで測定し得る。以下のプロトコルは、カルシウムについてのアッセ
イを記載するが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、ま
たは蛍光プローブにより検出可能な任意の他の低分子における変化を検出するよ
うに容易に改変され得る。
【０８４０】
以下のアッセイは、蛍光測定画像化プレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を使
用して低分子を結合する蛍光分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）におけ
る変化を測定する。明らかに、低分子を検出する任意の蛍光分子を、本明細書で
用いるカルシウム蛍光分子、ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ
，Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｆ−１４２０２）の代わりに使用し得る。
【０８４１】
接着細胞については、細胞を１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで、底
が透明なＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに播種する。プレートをＣＯ2
インキュベーター内で２０時間インキュベートする。接着細胞をＢｉｏｔｅｋ洗
浄器内で２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で２回洗浄し、最後の洗浄後、緩衝液１００μｌを残す。
【０８４２】
１ｍｇ／ｍｌ  ｆｌｕｏ−４のストック溶液を１０％プルロン酸（ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ  ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで作製する。細胞にｆｌｕｏ−４を負荷するため、
１２μｇ／ｍｌ  ｆｌｕｏ−４（５０μｌ）を各ウェルに添加する。このプレー
トをＣＯ2インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートする。プレー
トをＢｉｏｔｅｋ洗浄器で、ＨＢＳＳにより４回洗浄し、緩衝液１００μｌを残
す。
【０８４３】
非接着細胞については、細胞を培養培地からスピンダウンする。細胞を、５０
ｍｌのコニカルチューブ内でＨＢＳＳを用いて２〜５×１０6細胞／ｍｌに再懸
濁する。細胞懸濁液１ｍｌに対して、１０％プルロン酸ＤＭＳＯ溶液を含んだｆ
ｌｕｏ−４（１ｍｇ／ｍｌ）を４μｌを加える。次に、チューブを３７℃の水浴
中に３０〜６０分間置く。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、１×１０6細胞／ｍｌ
に再懸濁し、そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分配する。プレ
ートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。次に、プレートをＤｅｎｌｅｙ  
ＣｅｌｌＷａｓｈ中で２００μｌで１回洗浄した後、吸引工程により最終容量を
１００μｌにする。
【０８４４】
非細胞ベースのアッセイについては、各ウェルは、ｆｌｕｏ−４のような蛍光
分子を含有する。上清をウェルに添加し、そして蛍光変化を検出する。
【０８４５】
細胞内カルシウムの蛍光を測定するため、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに
ついて設定する：（１）システムゲインは、３００〜８００ｍＷであり；（２）
曝露時間は、０．４秒間であり；（３）カメラＦ／ストップは、Ｆ／２であり；
（４）励起は４８８ｎｍであり；（５）蛍光は５３０ｎｍであり；そして（６）
サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける蛍光の増加は、細胞内Ｃａ
++濃度の増加を生じる、細胞外シグナリング事象を示す。
【０８４６】
（実施例１９：チロシンキナーゼ活性を同定するハイスループットスクリーニ
ングアッセイ）
プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、多様な群の膜貫通キナーゼおよび
細胞質キナーゼを意味する。レセプタープロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ
）群内に、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリンレセプ
ターサブファミリーを含む、一定の範囲のマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ）
および代謝性成長因子のレセプターがある。さらに、対応するリガンドが未知で
ある大きなＲＰＴＫファミリーがある。ＲＰＴＫのリガンドは、主として分泌さ
れる低分子量タンパク質を含むが、膜結合型および細胞外マトリックスタンパク
質も含む。
【０８４７】
リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、リガンド媒介レセプター二量体化を含み
、これはレセプターサブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナ
ーゼの活性化を生じる。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（
例えば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）のレセプター関連チロシン
キナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非レセプター結合型および細胞基
質プロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、サイトカイ
ンスーパーファミリー（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−
ＣＳＦおよびレプチン）のレセプターによって誘発されるシグナル伝達を媒介す
る。
【０８４８】
チロシンキナーゼ活性を刺激し得る公知の因子は広範であるため、チロシンキ
ナーゼシグナル伝達経路を活性化し得るこれらの新規なヒト分泌タンパク質の同
定は興味深い。従って、以下のプロトコルを設計して、チロシンキナーゼシグナ
ル伝達経路を活性化し得る新規なヒト分泌タンパク質を同定する。
【０８４９】
標的細胞（例えば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの密
度で、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から購入した９６
ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ  Ｓｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌａｔｅに播種す
る。プレートを１００％エタノールで３０分間、２回リンスして滅菌し、水でリ
ンスした後、一晩乾燥させる。幾つかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養グレ
ードＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリジン（
５０ｍｇ／ｍｌ）（これらは全て、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し得る）で、またはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した１０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔
ウシ血清で２時間コートし、ＰＢＳでリンスした後、４℃で保存する。増殖培地
を含む５，０００細胞／ウェルを播種し、製造業者のＡｌａｍａｒ  Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）が記載するように、ａ
ｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して４８時間後に細胞数を間接定量することにより、
これらのプレート上の細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用
し、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ  Ｓｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌａｔｅを覆う。Ｆ
ａｌｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  ＩＩＩ細胞培養プレートもまた、いくつかの
増殖実験において使用し得る。
【０８５０】
抽出物を調製するため、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロ
ン膜上に播種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一
晩培養する。細胞を無血清基本培地中で２４時間インキュベートして静止させる
。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）または実施例１１で生成した上清５０μｌで５〜２
０分間処理した後、培地を除去し、１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰ
ＥＳ  ｐＨ７．５、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．
１％ＳＤＳ、２ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、２ｍＭ  Ｎａ4Ｐ2Ｏ7およびＢｏｅｈｅｒｉ
ｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手した
プロテアーゼインヒビターの混合物（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加し
、そしてプレートを回転振盪器上、４℃で５分間振盪する。次に、プレートを真
空トランスファーマニホールド（ｖａｃｕｕｍ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍａｎｉｆ
ｏｌｄ）に設置し、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの底の
０．４５ｍｍ膜で濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェル
捕獲／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により明澄
化した抽出物を得るため、界面活性剤で５分間可溶化した後、各ウェルの含有物
を取り出し、４℃、１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【０８５１】
濾過抽出物をチロシンキナーゼ活性のレベルについて試験する。チロシンキナ
ーゼ活性を検出する多数の方法が公知であるが、本明細書においては方法の一つ
を記載する。
【０８５２】
一般的に、特定の基質（ビオチン化ペプチド）上のチロシン残基をリン酸化す
る能力を決定することにより、上清のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目
的に使用し得るビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄ
ｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ
酸１〜１７に相当）が挙げられる。両ペプチドは、一連のチロシンキナーゼの基
質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。
【０８５３】
以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を設定する。ま
ず、５μＭビオチン化ペプチド１０μｌを添加した後、順に、ＡＴＰ／Ｍｇ2+（
５ｍＭ  ＡＴＰ／５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2）１０μｌ、５×アッセイ緩衝液（４０
ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ
ＥＧＴＡ、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ＭｎＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍｌ  
ＢＳＡ）１０μｌ、バナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）５μｌ、最後に水５μｌを
加える。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベー
トする。コントロール酵素または濾過上清１０μｌを加えて反応を開始させる。
【０８５４】
次に、１２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  １０μｌを添加することによりチロシンキナー
ゼアッセイ反応を停止し、反応物を氷上に置く。
【０８５５】
反応混合物の５０μｌのアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モ
ジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、チロシンキ
ナーゼ活性を測定する。これにより、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａ
ｄｉｎ）コーティング９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させる。
ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワ
サビペルオキシダーゼに結合体化した抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを、各ウ
ェルに添加した後、３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように
洗浄する。
【０８５６】
次に、ペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）１００μｌを加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベート
する。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を
測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用
して定量し、これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【０８５７】
（実施例２０：リン酸化活性を同定するハイスループットスクリーニングアッ
セイ）
実施例１９に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性アッセイの可能性のある
代替物および／または補完物（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）として、主要な細胞内シ
グナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイもまた使用し得る。
例えば、下記のように、１つの特定のアッセイは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２
キナーゼのチロシンリン酸化を検出し得る。しかし、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８  
ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特
異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分
子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシンまたはホスホスレオニン
分子のリン酸化を、以下のアッセイにおいてこれらの分子でＥｒｋ−１またはＥ
ｒｋ−２を置き換えることにより検出し得る。
【０８５８】
詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルをプロテインＧ（１μｇ／
ｍｌ）０．１ｍｌにより室温（ＲＴ）で２時間コーティングしてアッセイプレー
トを作製する。次に、プレートをＰＢＳでリンスし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳにより
ＲＴで１時間ブロックする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓ
ａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理（ＲＴで１時間）す
る。（他の分子を検出するために、上記の任意の分子を検出するモノクローナル
抗体を交換することにより、この工程を容易に改変し得る）。ＰＢＳで３〜５回
リンスした後、使用時まで、プレートを４℃で保管する。
【０８５９】
Ａ４３１細胞を２０，０００／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィル
タープレートに播種し、増殖培地中で一晩培養する。次に、細胞を基本培地（Ｄ
ＭＥＭ）中で４８時間飢餓させた後、ＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）または実施例１
１で得た上清５０μｌで５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、抽出物
を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。
【０８６０】
抽出物とともにＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再度リンスする
。陽性コントロールとして、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）
をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、プレートを、Ｅｒｋ−１およびＥ
ｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナ
ル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）で処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標
準的な手順によりビオチン化する。次に、結合ポリクローナル抗体をユーロピウ
ムストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤とともにＷａｌｌａｃ  Ｄ
ＥＬＦＩＡ装置内で連続的にインキュベートする（時間分解性蛍光）ことによっ
て定量する。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、リン酸化を示す
。
【０８６１】
（実施例２１：ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化の決定方法）
目的の表現型（例えば、疾患）を提示する家族全員または個々の患者から単離
されるＲＮＡを単離する。次に、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡサンプルから当該分
野で公知のプロトコルを使用して生成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
次に、このｃＤＮＡを、配列番号Ｘにおける目的の領域を取り囲むプライマーを
用いる、ＰＣＲのテンプレートとして使用する。示唆されるＰＣＲ条件は、Ｓｉ
ｄｒａｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：７０６（１９９１）に記載
の緩衝溶液を使用し、９５℃で３０秒間；５２〜５８℃で６０〜１２０秒間；お
よび７０℃で６０〜１２０秒間の３５サイクルからなる。
【０８６２】
次に、ＰＣＲ産物を、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、その５’末端にＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて標識したプライマーを使用してシークエンスする。
選択したエキソンのイントロン−エキソン境界もまた決定し、ゲノムＰＣＲ産物
を分析してその結果を確認する。次に、疑わしい変異を有するＰＣＲ産物のクロ
ーン化およびシークエンスを行い、直接シークエンスの結果を確認する。
【０８６３】
ＰＣＲ産物を、Ｈｏｌｔｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，１９：１１５６（１９９１）に記載のようにＴテールベクターにクローン
化し、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ）を用いてシークエンスする。罹患個体を、非罹患個体には存在しない変異に
より同定する。
【０８６４】
ゲノム再配列もまた、ポリヌクレオチドに対応する遺伝子における変化を決定
する方法として観察される。実施例２に従って単離したゲノムクローンを、ジゴ
キシゲニンデオキシ−ウリジン５’−三リン酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎ
ｈｅｉｍ）を用いてニックトランスレーションし、そしてＪｏｈｎｓｏｎら、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３５：  ７３−９９（１９９１）に記載
のようにＦＩＳＨを行う。対応するゲノムの遺伝子座への特異的ハイブリダイゼ
ーションのために、大過剰のヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡを用いて標識プローブとの
ハイブリダイゼーションを行う。
【０８６５】
染色体を、４，６−ジアミノ−２−フェニリドールおよびヨウ化プロピジウム
で対比染色し、ＣバンドおよびＲバンドの組み合わせを生成する。正確なマッピ
ングのための整列画像を、三重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）と冷却電荷結合素子カメラ（
Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）および可変励起波長フィルタ
ー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．，８：７
５（１９９１））とを組み合わせて用いて得る。ＩＳｅｅ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｏｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ
ｏｎ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して、画像収集、分析および染色体画分（ｆ
ｒａｃｔｉｏｎａｌ）長測定を行う。プローブがハイブリダイズしたゲノム領域
の染色体変化を、挿入、欠失および転座として同定する。これらの変化を関連疾
患の診断マーカーとして使用する。
【０８６６】
（実施例２２：生物学的サンプル中のポリペプチドの異常レベルを検出する方
法）
本発明のポリペプチドは生物学的サンプル中で検出され得、そしてこのポリペ
プチドレベルの上昇または低下が検出されるなら、このポリペプチドは、特定表
現型のマーカーである。検出方法は数多くあり、そしてそれ故、当業者は以下の
アッセイをそれらの特定の必要性に適合するように改変し得ることが理解される
。
【０８６７】
例えば、抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを使用し、サンプル中（好ましくは、生
物学的サンプル中）のポリペプチドを検出する。マイクロタイタープレートのウ
ェルを、最終濃度０．２〜１０μｇ／ｍｌの特異的抗体でコーティングする。こ
の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであって、実施例１
０に記載の方法により産生される。ウェルへのこのポリペプチドの非特異的結合
が減少するように、このウェルをブロックする。
【０８６８】
次に、コーティングしたウェルを、このポリペプチドを含有するサンプルと共
にＲＴで２時間を超えてインキュベートする。好ましくは、サンプルの系列希釈
を使用して結果を確認すべきである。次に、このプレートを脱イオン水または蒸
留水で３回洗浄し、非結合ポリペプチドを除去する。
【０８６９】
次に、特異的抗体−アルカリホスファターゼ結合体５０μｌを２５〜４００ｎ
ｇの濃度で加え、室温で２時間インキュベートする。このプレートを再び脱イオ
ン水または蒸留水で３回洗浄し、未結合の結合体を除去する。
【０８７０】
４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）またはｐ−ニトロフェニルリン
酸（ＮＰＰ）基質溶液７５μｌを各ウェルに添加し、そして室温で１時間インキ
ュベートする。この反応をマイクロタイタープレートリーダーにより測定する。
コントロールサンプルの系列希釈を使用して標準曲線を作成し、そしてＸ軸（対
数目盛）にポリペプチド濃度を、そしてＹ軸（一様目盛）に蛍光または吸光度を
プロットする。標準曲線を用いてサンプル中のポリペプチド濃度を補間する。
【０８７１】
（実施例２３：処方）
本発明はまた、被験体に有効量の治療剤を投与することにより疾患または障害
（例えば、本明細書中に開示される疾患または障害の任意の１つ以上のような）
を処置および／または予防する方法を提供する。治療剤により、薬学的に受容可
能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合わせた、本発明のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチド（フラグメントおよび改変体を含む）、そのアゴニス
トまたはアンタゴニスト、および／またはそれらに対する抗体が意味される。
【０８７２】
治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部
位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施
基準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方お
よび投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような
考慮を行って決定される。
【０８７３】
一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効
量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、
上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、このホルモン
について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒ
トに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続
投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ
／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポ
ンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得
る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、
所望の効果に応じて変化するようである。
【０８７４】
治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌ
ｙ）、膣内、腹腔内、局所的（散剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチに
よるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的
に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈
剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう。本明細書で用いる場合、用語「
非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射お
よび注入を含む投与の様式をいう。
【０８７５】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内、膣内、腹腔内、局所的（散
剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口ま
たは鼻腔スプレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒
性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補
助剤をいう。本明細書で用いる場合、用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、
腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０８７６】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療
剤の適切な例は、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半
透過性ポリマーマトリックスのような適切なポリマー材料、適切な疎水性材料（
例えば、受容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、および貧可溶
性誘導体（例えば、貧可溶性塩のような）を包含する。
【０８７７】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５
５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９
８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９
８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ
−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０８７８】
徐放性治療剤はまた、リポソームに封入された本発明の治療剤を包含する（一
般には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９
０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏ
ｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅ
ｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒ
ｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）。治
療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される：Ｄ
Ｅ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１
９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４
３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米
国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ
第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニ
ラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも
多く、選択された割合が、最適な治療剤のために調整される。
【０８７９】
なおさらなる実施形態において、本発明の治療剤は、ポンプによって送達され
る（Ｌａｎｇｅｒ，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍ
ｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒ
ｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．
３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０８８０】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５
３３（１９９０））による総説において議論される。
【０８８１】
非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、治療剤は、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するもの
と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合すること
により処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および治療剤
に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０８８２】
一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０８８３】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。
【０８８４】
治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１
〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方さ
れる。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、ポ
リペプチド塩が形成されることが理解される。
【０８８５】
治療的投与に用いられる任意の医薬品は無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例
えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成さ
れる。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注
射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置され
る。
【０８８６】
治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたは
バイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾
燥した治療剤を注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０８８７】
本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を
備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造
、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に
付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政
府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使
用し得る。
【０８８８】
本発明の治療剤は、単独で、またはアジュバントと組み合わせて投与され得る
。本発明の治療剤とともに投与され得るアジュバントとしては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：ミョウバン、ミョウバン＋デオキシコール酸（Ｉ
ｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ  Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬ。特定の実施形態にお
いて、本発明の治療剤は、ミョウバンと組み合わせて投与される。別の特定の実
施形態において、本発明の治療剤は、ＱＳ−２１と組み合わせて投与される。本
発明の治療剤とともに投与され得るさらなるアジュバントとしては、以下が挙げ
られるが、これらに限定されない：モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶ
ａｘ  １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、
ＭＦ−５９、およびＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術。本発明の治療剤とと
もに投与され得るワクチンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎，風疹）、ポリオ（ｐｏｌｉｏ）、水痘、破
傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ、百日咳（ｗｈｏ
ｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、
コレラ、黄熱病、日本脳炎、ポリオ（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、狂犬病、
腸チフス、および百日咳（ｐｅｒｔｕｓｉｓ）に対する防御に指向するワクチン
。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並
行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた
薬剤が治療混合物としてともに投与される説明を含み、そして組み合わせた薬剤
が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合
）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与
えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【０８８９】
本発明の治療剤は、単独で、または他の治療的薬剤と組み合わせて投与され得
る。本発明の治療剤とともに投与され得る治療的薬剤としては、以下が挙げられ
るが、それらに限定されない：ＴＮＦファミリーの他のメンバー、化学療法剤、
抗生物質、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤、従来の免疫療法剤、
サイトカインならびに／または増殖因子。組み合わせは、例えば、混合物として
同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで
投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与さ
れる説明を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同
じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み
合わせ」投与は、第１に、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１
つを別々に投与することをさらに含む。
【０８９０】
１つの実施形態において、本発明の治療剤は、ＴＮＦファミリーのメンバーと
組み合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得るＴＮＦ、ＴＮＦ
関連、またはＴＮＦ様の分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α、（ＬＴ−α、ＴＮＦ−β
としても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロトリマーＬＴ−α２−βにおいて見出さ
れた）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１Ｂ
ＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８
）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン（ｅｎｄ
ｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＴＲ６（国際公開番
号ＷＯ９８／３０６９４）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋ
ｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経増
殖因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４
０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（
国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開番号ＷＯ９８／３２８
５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲ６（国際公開番号
ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号ＷＯ９８／４１６２９）、ＴＲ
ＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開番
号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開番号ＷＯ９８／０６８４２）
、およびＴＲ１２、ならびに可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１
５３。
【０８９１】
特定の実施形態において、本発明の治療剤は、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレ
オシド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、およ
び／またはプロテアーゼインヒビターと組み合わせて投与される。本発明の治療
剤と組み合わせて投与され得るヌクレオシド逆転写酵素インヒビターとしては、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン
／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビ
ン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブ
ジン／３ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）。本発
明の治療剤と組み合わせて投与され得る非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（
ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲTM（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶ
ＡTM（エファビレンズ）。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得るプロテア
ーゼインヒビターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＲ
ＩＸＩＶＡＮTM（インディナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲTM（
リトナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル（ｓａ
ｑｕｉｎａｖｉｒ））、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆ
ｉｎａｖｉｒ））。特定の実施形態において、抗レトロウイルス薬剤、ヌクレオ
シド逆転写酵素インヒビター、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター、および
／またはプロテアーゼインヒビターは、ＡＩＤＳを処置するため、および／また
はＨＩＶ感染を予防もしくは処置するために、本発明の治療剤との任意の組み合
わせで使用され得る。
【０８９２】
他の実施形態において、本発明の治療剤は、抗日和見感染症薬剤と組み合わせ
て投与され得る。本発明の治療剤と組み合わせて投与され得る抗日和見感染症薬
剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰ
ＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡ
ＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭ
ＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、
ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲTM、Ｆ
ＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯ
ＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹＲＩＭＥＴＨ
ＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フィルグラスチ
ム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サルグ
ラモスチン（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、日和見Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ
肺炎感染を予防的に処置または予防するために、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−Ｓ
ＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮ
ＥTM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTMとの任意の組み合わせで使用され
る。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ複合感染を予防的に処置または予防するために、ＩＳＯ
ＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、および／
またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の
実施形態において、本発明の治療剤は、日和見Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置または予防するために、ＲＩＦＡＢ
ＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／またはＡＺＩＴＨＲＯ
ＭＹＣＩＮTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施形態において
、本発明の治療剤は、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に処置または予
防するために、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／ま
たはＣＩＤＯＦＯＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特定の実施
形態において、本発明の治療剤は、日和見真菌感染を予防的に処置または予防す
るために、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、および／
またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMとの任意の組み合わせで使用される。別の特
定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見単純ヘルペスウイルスＩ型お
よび／またはＩＩ型感染を予防的に処置または予防するために、ＡＣＹＣＬＯＶ
ＩＲTMおよび／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMとの任意の組み合わせで使用さ
れる。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見Ｔｏｘｏｐｌａ
ｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置または予防するために、ＰＹＲＩＭＥ
ＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMとの任意の組み合わせ
で使用される。別の特定の実施形態において、本発明の治療剤は、日和見細菌感
染を予防的に処置または予防するために、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／また
はＮＥＵＰＯＧＥＮTMとの任意の組み合わせで使用される。
【０８９３】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗ウイルス薬剤との組み合わ
せで投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗ウイルス薬剤としては
、アシクロビル、リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎ
ｔｉｄｉｎｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９４】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、抗生物質とともに投与される
。本発明の治療剤とともに投与され得る抗生物質としては、アモキシシリン、β
−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタ
マーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロ
フロキサシン、シプロフロキサシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マ
クロライド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、リファンピン、ストレ
プトマイシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメト
プリム−スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、および
バンコマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９５】
本発明の治療剤とともに投与され得る従来の非特異的免疫抑制剤としては、ス
テロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミドメチ
ルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキ
シスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、およびＴ細胞応
答の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤が挙げられるが、これ
らに限定されない。
【０８９６】
特定の実施形態において、本発明の治療剤は、免疫抑制剤と組み合わせて投与
され得る。本発明の治療剤と共に投与され得る免疫抑制剤調製物は、ＯＲＴＨＯ
ＣＬＯＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮ
ＧＤＹＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥＬＬ
ＣＥＰＴTM（ミクロフェノレート）、アザチオプリン、グリコチコステロイド、
およびＲＡＰＡＭＵＮＥTM（シロリムス）が挙げられるが、これらに限定されな
い。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄移植の拒絶を予防
するために使用され得る。
【０８９７】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独または１以上の静脈内免
疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の治療剤と組み合わせて
投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶＥＥ
ＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ  Ｓ／ＤTMおよ
びＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態
において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈内免
疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０８９８】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、単独または抗炎症剤と組合わ
せて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては、グル
ココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体
、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプ
ロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカル
ボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−ア
ミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダ
ザック、ベンジドアミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモル
ファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセ
プロール、パラニリン、ペリゾキサル、ピフオキシム、プロキアゾン、プロキサ
ゾール、およびテニダップが挙げられるが、これらに限定されない。
【０８９９】
別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組合わせて投与され
る。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導体
（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノ
マイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば、
フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロックスウリジン（ｆｌｏ
ｘｕｒｉｄｉｎｅ）、インターフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシ
ン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カル
ムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホ
スファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマ
イシン、ブスルファン、シス−プラチン、およびビンクリスチンスルフェート）
；ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナト
リウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、メゲストロールアセテ
ート、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストールジホスフェート、クロ
ロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロージェンマスタード誘導体
（例えば、メファレン、クロランブシル、メクロレタミン（ナイトロージェンマ
スタード）およびチオテパ）；ステロイドおよび組合わせ（例えば、ベタメタゾ
ンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（例えば、ジカルバジン、アスパラギナ
ーゼ、ミトタン、ビンクリスチンスルフェート、ビンブラスチンスルフェート、
およびエトポシド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９００】
特定の実施形態において、本発明の治療剤は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレジニゾン）と組み合わせて投
与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の治療剤は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さ
らなる実施形態において、本発明の治療剤は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ
と共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共
に投与される。
【０９０１】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、サイトカインと組合わせて投
与される。本発明の治療剤とともに投与され得るサイトカインとしては、ＩＬ２
、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、
ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられる
が、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意の
インターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、
ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１
、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７
、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０およびＩＬ−２１を含むが、これらに限
定されない）と共に投与され得る。
【０９０２】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、新脈管形成タンパク質と組合
わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る新脈管形成タンパク質
としては、欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されるようなグリオーム誘導増殖
因子（Ｇｉｌｉｏｍａ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤ
ＧＦ）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されるような血小板誘導増殖因子−
Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されるような血小板誘
導増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開番号ＷＯ９２／０６１９４号に開示
されるような胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｏｒｗｔｈ  Ｆａ
ｃｔｏｒｓ、４：２５９−２６８（１９９３）に開示されるような胎盤増殖因子
−２（ＰＩＧＦ−２）；国際公開番号ＷＯ９０／１３６４９号に開示されるよう
な血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されるよ
うな血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開番号ＷＯ９６／３９５１
５号に開示されるような血管内皮増殖因子−２（ＶＥＧＦ−２）；血管内皮増殖
因子−Ｂ（ＶＥＧＦ−３）；国際公開番号ＷＯ９６／２６７３６号に開示される
ような血管内皮増殖因子Ｂ−１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）；国際公開番号ＷＯ
９８／０２５４３号に開示されるような血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）
；国際公開番号ＷＯ９８／０７８３２号に開示されるような血管内皮増殖因子−
Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）；およびドイツ国特許ＤＥ１９６３９６０１に開示されるよ
うな血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）が挙げられるが、これらに限定され
ない。上記の参考文献は、本明細書で参考として援用される。
【０９０３】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、造血増殖因子と組み合わせて
投与される。本発明の治療剤と共に投与され得る造血増殖因子としては、ＬＥＵ
ＫＩＮＥTM（ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬ
ＧＲＡＳＴＩＭTM）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０９０４】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、線維芽細胞増殖因子と組合わ
せて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る線維芽細胞増殖因子とし
ては、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ
−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、Ｆ
ＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられるが
、これらに限定されない。
【０９０５】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レ
ジメ（例えば、放射線治療）と組合わせて投与される。
【０９０６】
（実施例２４：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法）
本発明は、体内における本発明のポリペプチドのレベルを増大させる必要のあ
る個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の本発明のアゴニ
スト（本発明のポリペプチドを含む）を含む組成物をそのような個体に投与する
工程を包含する。さらに、個体における分泌タンパク質の標準または正常発現レ
ベルの低下により引き起こされる状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは
分泌形態で投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明は
また、ポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方
法は、このような個体に、このような個体でポリペプチドの活性レベルを増加さ
せる量のポリペプチドを含む治療剤を投与する工程を包含する。
【０９０７】
例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、１日用量
０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペプチドは
分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例２
３に提供されている。
【０９０８】
（実施例２５：ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法）
本発明はまた、体内における本発明のポリペプチドのレベルを減少させる必要
のある個体を処置するための方法に関し、その方法は、治療有効量の本発明のア
ンタゴニスト（本発明のポリペプチドおよび抗体を含む）を含む組成物をそのよ
うな個体に投与する工程を包含する。
【０９０９】
１つの例において、アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生
を阻害する。この技術は、ガンのような様々な病因に起因するポリペプチド、好
ましくは分泌形態のポリペプチドのレべルを低下させる方法の１つの例である。
例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチセ
ンスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ／
ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、
７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチドの
処方は、実施例２３に提供されている。
【０９１０】
（実施例２６：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ）
遺伝子治療の１つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移
植する方法である。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる
。得られた組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。小塊の組織を組織
培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。このフラスコ
を倒置し、しっかりと閉めた後、室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラ
スコを反転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地
（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａ
ｍのＦ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベー
トする。
【０９１１】
この時点で、新鮮な培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週
間培養した後に、単層の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、
さらに大きなフラスコにスケールアップする。
【０９１２】
モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃ
ｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。
線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラスビーズを使用して精製
する。
【０９１３】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、必要な場合、プライマーを用
いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に記載のそ
れぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用して
増幅し得る。好ましくは、この５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして
この３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、モロニーマウス肉腫
ウイルスの線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を、この
２つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合物
を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含む
寒天上にプレーティングし、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有する
ことを確認する。
【０９１４】
アンホトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、１
０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな密度まで増殖
させる。次に、その目的の遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そしてパ
ッケージング細胞をこのベクターで形質導入する。このとき、このパッケージン
グ細胞は、その遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパッ
ケージング細胞をプロデューサー細胞という）。
【０９１５】
形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、次いでこの培地を
１０ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性
ウイルス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、は
がれたプロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感
染させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そし
てプロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そ
して新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線
維芽細胞が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまた
はｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用すること
が必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、その線維芽細胞を分
析し、タンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０９１６】
次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植する
。
【０９１７】
（実施例２７：本発明のポリヌクレオチドに対応する内因性遺伝子を使用する
遺伝子治療）
本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性ポリヌクレオチド配列
を、例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行）；
国際公開番号ＷＯ  ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開
番号ＷＯ  ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１
９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８
（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能
に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細
胞中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝
子の活性化を包含する。
【０９１８】
プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ポリヌクレオチド配列の５’非
コード配列に相同である。この標的化配列は、このポリヌクレオチド配列の５’
末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因
性配列に作動可能に連結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲ
を使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端お
よび３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の
３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そし
て第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限
部位を含む。
【０９１９】
この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。
【０９２０】
この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。
【０９２１】
一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモータ
ーがこの内因性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結される。これは、この細
胞中におけるこのポリヌクレオチドに対応するポリヌクレオチドの発現を生じる
。発現は、免疫学的染色または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出さ
れ得る。
【０９２２】
線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．３、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。
【０９２３】
プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、本発明のポリヌ
クレオチドに対応する遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために
、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ
）をＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部
位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つの非コ
ード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方の非コード配列（フラグメント１）を
、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａＩ部位を備えて増幅す
る；他方の非コード配列（フラグメント２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位およ
び３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶプロモーターお
よびこれらのフラグメント（１および２）を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター
−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；フラグメント１−ＸｂａＩ；フラグメント２−Ｂ
ａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する
。
【０９２４】
プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０９２５】
エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【０９２６】
次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。
【０９２７】
（実施例２８：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ）
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、ポリペプチドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）配列の導入に関する。本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるそのポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）；Ｃｈａｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（５）：４０５−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０９２８】
ポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方
法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間への注入
）によって送達され得る。このポリヌクレオチド構築物は、薬学的に受容可能な
液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０９２９】
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌクレオチドはまた、当業者に
周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  
Ｐ．Ｌ．ら（１９９５）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１
３９およびＡｂｄａｌｌａｈ  Ｂ．ら（１９９５）Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８５（
１）：１−７で教示されたもの）中で送達され得る。
【０９３０】
この遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、
好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も含まない構築
物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの発現を駆動す
るために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細
胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一
過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ
月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０９３１】
このポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、
脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸
、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間
隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（器官
組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における弾性線維、線維
性組織のコラーゲン線維に間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または
骨の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチ
ャンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達
は、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織
への注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持
続性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達およ
び発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細
胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポ
リヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、特に適格で
ある。
【０９３２】
裸のポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約
０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、こ
の投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより
好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業
者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する。核酸配
列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置さ
れる状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間へ
の非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、
これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜への送達の
ためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のポリヌクレオチド構
築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテーテルによって動
脈に送達され得る。
【０９３３】
インビボでの筋肉における注入ポリヌクレオチドの用量応答効果を、以下のよ
うにして決定する。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成のための
適切な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調製する。鋳型ＤＮ
Ａ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮＡとして使用する
か、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次いで、マウスの四
頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【０９３４】
５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌのキャ
リアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、筋肉の
遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで注入する
。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上で行い、そしてその皮膚をステ
ンレス鋼クリップで閉じる。
【０９３５】
適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、タ
ンパク質発現について組織化学的に染色する。タンパク質発現についてのタイム
コースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取すること以外は、同様な
様式で行い得る。注入後の筋肉中のＤＮＡの持続性を、注入したマウスおよびコ
ントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザ
ンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験の結果を、裸のＤ
ＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投薬量および他の処置パラメ
ーターを外挿するために使用し得る。
【０９３６】
（実施例２９：トランスジェニック動物）
本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物において発現され得る
。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ、
ヒツジ、ウシおよびヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー
）を含むがこれらに限定されない任意の種の動物は、トランスジェニック動物を
作製するために用いられ得る。特定の実施形態において、本明細書に記載される
かまたはさもなければ当該分野で公知の技術が、遺伝子治療プロトコルの一部と
して、ヒトにおける本発明のポリペプチドの発現のために用いられる。
【０９３７】
当該分野で公知の任意の技術を、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）の動物への導入に用いて、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕ
ｎｄｅｒ  ｌｉｎｅ）を生成し得る。このような技術は、前核マイクロインジェ
クション（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；お
よびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖細胞
系へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：６１４８−６１５２（１９
８５））、胚盤胞または胚；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏ
ｎら、Ｃｅｌｌ  ５６：３１３−３２１（１９８９））；細胞または胚のエレク
トロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０
３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導
入（例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５（１９９３）を
参照のこと）；胚性多能性（ｐｌｅｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞への核酸構築物
の導入および胚盤胞へのこの幹細胞の移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａ
ｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ  ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含
むがこれらに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にそ
の全体が参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎ
ｉｍａｌｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９
８９）を参照のこと。
【０９３８】
当該分野で公知の任意の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトラ
ンスジェニッククローンを生成し得る（例えば、培養された、静止状態に誘導さ
れた胚細胞、胎児細胞または成体の細胞由来の除核した卵母細胞の核への核移入
（Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６（１９９６）；Ｗｉｌ
ｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）））。
【０９３９】
本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイク動物またはキメラ）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手
短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ない
くつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介
して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機
能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に
選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６
５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型において
のみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされ
る調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかで
ある。
【０９４０】
一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析および逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない技術を用いて評価され得る
。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異
的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価され得る。
【０９４１】
一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがそれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；ならびに目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導
入遺伝子を配置するための交配。
【０９４２】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドの生物学的機能の
詳述、異常な発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのよう
な状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに有
用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。
【０９４３】
（実施例３０：ノックアウト動物）
内因性遺伝子発現もまた、標的化された相同組換えを使用して遺伝子および／
またはそのプロモーターを不活性化あるいは「ノックアウトする」ことによって
減少し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１７：２３０−２
３４（１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ  ５１：５
０３−５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５：３１３−３２
１（１９８９）を参照のこと；これらの各々は、本明細書中でその全体が参考と
して援用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（この遺伝子のコード
領域または調節領域のいずれか）と相同性のＤＮＡに隣接される、本発明の改変
体、非機能的なポリヌクレオチド（または完全に関連のないＤＮＡ配列）を、選
択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーを用いてまたは用いずに使用
し、インビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞をトランスフェクトし得る
。別の実施形態において、当該分野で公知の技術を、目的の遺伝子を含むが、発
現しない細胞中でノックアウトを作製するために使用する。標的化された相同組
換えを介した、このＤＮＡ構築物の挿入は、標的化された遺伝子の不活性化を生
じる。このようなアプローチは、胚性幹細胞に対する改変が不活性な標的化され
た遺伝子を有する動物の子孫を作製するために使用され得る研究および農業分野
に特に適する（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ  １９８７および
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  １９８９、前出を参照のこと）。しかし、このアプローチは
、当業者に明白な適切なウイルスベクターを使用して、組換えＤＮＡ構築物がイ
ンビボで要求された部位に直接投与されるか、または標的化される場合、ヒトに
おける使用に慣用的に適合され得る。
【０９４４】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現お
よび好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましく
は分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ
全身的に導入し得る。
【０９４５】
あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０９４６】
投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
【０９４７】
本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、本発明のポリペ
プチドの生物学的機能の詳述、異常な発現に関連する疾患、障害および／または
状態の研究、ならびにこのような疾患、障害および／または状態を寛解させるに
有効な化合物のスクリーニングにおいて有用な動物モデル系を含むが、それらに
限定されない用途を有する。
【０９４８】
（実施例３１：抗体の産生）
（ａ．ハイブリドーマ技術）
本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、本
発明のポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、本発明のポリペプチ
ドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよ
うにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するため
に、このような調製物は、動物に導入される。
【０９４９】
本発明のポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５
（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１
９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７
６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．
、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は、本
発明のポリペプチドで、またはより好ましくは分泌ポリペプチド発現細胞で免疫
される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織培養培地におい
て、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し、そして
約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イーグル培地
において培養される。
【０９５０】
このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択によって得られるハイブリドーマ細胞は、本発明のポリペプ
チドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０９５１】
あるいは、本発明のポリペプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可
能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使
用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾
細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ
細胞は、本発明のタンパク質に特異的な抗体のポリペプチドに結合する能力が本
発明のポリペプチドによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定す
るためにスクリーニングされる。このような抗体は、本発明のタンパク質に特異
的な抗体のポリペプチドに対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免
疫してさらなる本発明のタンパク質に特異的な抗体のポリペプチドの形成を誘導
するために使用される。
【０９５２】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中に議論
される（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０
２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６
）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら、ＥＰ  １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ  １７３４９４；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、ＷＯ  ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ  ８７０２６
７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３（１９８４）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと
）。
【０９５３】
（ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのポリペプチドに対して指向される抗体
フラグメントの単離）
ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかま
たは曝され得なかった本発明のポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメ
ントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（そ
の全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０９５４】
ライブラリーのレスキュー。  ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０１０４７に記載のよ
うに、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラ
グメントを提示するファージをレスキューするため、ファージミドを保有する約
１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を
接種し、そして振盪しながらＯ．Ｄ．  ０．８まで増殖させる。この培養物の５
ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵの
Δ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７
を参照のこと）を添加し、そして培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュ
ベートし、次いで振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートする。この培養
物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットル
の２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン
を含有する）中に再懸濁し、そして一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ
９２／０１０４７に記載のように調製する。
【０９５５】
Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ  ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13
形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０９５６】
ライブラリーのパニング。Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明の
ポリペプチドの１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用
いてＰＢＳ中で一晩被膜する。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３
７℃で２時間ブロックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファ
ージをチューブに適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温
で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブ
をＰＢＳ  ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。
１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下
に回転させることによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．
０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファ
ージを細菌とともに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージ
を用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１に感染させる。次い
で、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有
するＴＹＥプレート上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、
上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のため
のファージを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回
について反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ−２０で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
【０９５７】
結合剤の特徴付け。第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用い
て、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ  ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセ
イのために単一コロニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭
酸水素塩、ｐＨ９．６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで
被膜したマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ
中の陽性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ
９２／０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付け
る。これらのＥＬＩＳＡ陽性クローンはまた、当該分野において公知の技術（例
えば、エピトープマッピング、結合親和性、レセプターシグナル形質導入、抗体
／抗原結合をブロックするかまたは競合的に阻害する能力、および競合的アゴニ
スト活性または競合的アンタゴニスト活性など）によりさらに特徴付けられ得る
。
【０９５８】
（実施例３２：Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ）
機能的体液性免疫応答の生成は、Ｂ系列の細胞とそれらの微小環境との間に、
可溶性のシグナル伝達および同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナル
は、陽性の刺激（Ｂ系列の細胞がプログラムされた発生を持続するようにさせる
）、または陰性の刺激（細胞が電流発生経路を阻止するように指示する）を伝え
得る。現在までに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ
−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含む、多数の刺激シグナル
および阻害シグナルがＢ細胞応答性に影響することが見出されている。興味深い
ことに、これらのシグナルはそれ自体は弱いエフェクターであるが、種々の同時
刺激タンパク質と組み合わせて、Ｂ細胞集団中の活性化、増殖、分化、ホーミン
グ、耐性、および死を誘導し得る。
【０９５９】
Ｂ細胞同時刺激タンパク質の最も研究されたクラスの１つがＴＮＦスーパーフ
ァミリーである。このファミリー内で、ＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
そのそれぞれのリガンドである、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３と共に
種々の免疫応答を調節することが見出されている。これらのＢ細胞集団およびそ
れらの前駆細胞の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセ
イは、種々のタンパク質がこれらのＢ細胞集団上に、増殖および分化の点で有し
得る効果を決定する際に価値のあるツールである。以下に列挙するのは、Ｂ細胞
集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするように
設計された２つのアッセイである。
【０９６０】
（インビトロアッセイ）−本発明の精製されたポリペプチド、またはそれらの短縮化形態を、Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体において活性化、増殖、分化もしくは阻害および／または死を誘導する能力について評価する。精製したヒト扁桃腺Ｂ細胞への本発明のポリペプチドの活性（定性的に０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範囲にわたって測定した）を、標準的なＢリンパ球同時刺激アッセイにおいて評価する。このアッセイでは、精製した扁桃腺Ｂ細胞を、プライミング因子として、ホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃｏｗａｎ  Ｉ（ＳＡＣ）、または固定した抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２のシグナルは、トリチウム化チミジン取り込みにより測定した場合、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と協同作用してＢ細胞増殖を誘発する。新規な協同因子を、このアッセイを用いて容易に同定し得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性作用細胞の磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇によりヒト扁桃腺Ｂ細胞を単離する工程を包含する。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価する場合、９５％よりも多いＢ細胞である。
【０９６１】
種々の希釈のそれぞれのサンプルを９６ウェルプレートの個々のウェルに配置
し、ここへ、培養培地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ  ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌ
ペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のＳＡＣを
含有するＲＰＭＩ  １６４０）中で懸濁した、総量１５０μｌ中の、１０5Ｂ細
胞を添加する。増殖または阻害を、因子の添加後７２時間から開始して、３Ｈ−
チミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）で２０ｈパルス（１μＣｉ／ウェル）により定量
する。陽性コントロールおよび陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地
である。
【０９６２】
（インビボアッセイ）−ＢＡＬＢ／ｃマウスに、緩衝液のみ、または本発明の
２ｍｇ／ｋｇのポリペプチド、またはそれらの短縮形態を、１日２回注射（腹腔
内）する。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを屠殺し
、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。正常な脾臓および本発
明のポリペプチドで処理した脾臓由来のＨ＆Ｅ切片の比較により、脾臓細胞での
このポリペプチドの活性の結果、例えば、動脈周囲リンパ性鞘の拡散および／ま
たは赤色脾髄領域の有核の細胞充実性の有意な増加（これは、Ｂ細胞集団の分化
および増殖の活性化を示し得る）が確認される。Ｂ細胞マーカーである、抗ＣＤ
４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いる免疫組織化学的研究を用いて、脾臓細胞への任意の
生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）が、樹立されたＴ細胞領域に浸潤する漠
然と規定されたＢ細胞区画内のＢ細胞提示の増加に起因するか否かを決定する。
【０９６３】
ポリペプチドで処置したマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析を用い
て、このポリペプチドが、ＴｈＢ＋であるＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ  Ｂ
細胞の比を、コントロールマウスで観察される比よりも特異的に増加するか否か
を示す。
【０９６４】
同様に、増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の推定される結果は、血清Ｉｇ力価の相対的な増加である。従って、血清ＩｇＭレベルおよび血清ＩｇＡレベルを緩衝液処置マウスとポリペプチド処置マウスとの間で比較する。
【０９６５】
本実施例において記載する試験は、本発明のポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニスト、および／または
アンタゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９６６】
（実施例３３：Ｔ細胞増殖アッセイ）
（休止ＰＢＬに対する増殖アッセイ）
ＣＤ３誘導性の増殖アッセイをＰＢＭＣで実行し、そして3Ｈ−チミジンの取
り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する。９６ウェルプレ
ートを、ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の１００
μｌ／ウェル、またはアイソタイプ適合のコントロールｍＡｂ（Ｂ３３．１）（
０．０５Ｍ  炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）で４℃で１晩、
コートし、次いでＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾
配遠心分離により単離し、そして種々の濃度のＴＮＦδおよび／またはＴＮＦ  
εタンパク質の存在下で、１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中、ｍ
Ａｂでコートしたプレートの４通りのウェル（５×１０4／ウェル）に添加する
（総量２００μｌ）。関連するタンパク質緩衝液および培地単独がコントロール
である。３７℃での培養の４８時間後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間回転
させ、そして１００μｌの上清を除去し、そして、増殖への効果が観察される場
合、ＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で貯蔵した。
ウェルに０．５μＣｉの3Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培地を補充し、
そして３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルを収集し、そして3Ｈ−チミジ
ンの取り込みを増殖の指標として用いた。抗ＣＤ３単独が増殖の陽性コントロー
ルである。ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をまた、増殖を増強するコントロールと
して用いる。Ｔ細胞の増殖を誘導しないコントロール抗体を、ＴＮＦδおよび／
またはＴＮＦεタンパク質の効果についての陰性コントロールとして用いる。
【０９６７】
あるいは、休止しているＰＢＬ（末梢血リンパ球）上での増殖アッセイを、3
Ｈ−チミジンの取り込みにより測定する。このアッセイを以下のように実行する
。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ（ＬＳＭ，ＩＣＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏ）勾配遠心分離により単離し、そし
て１０％（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ，Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ，ＭＤ）／ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒ
ｇ，ＭＤ）中で一晩、培養する。この一晩のインキュベーション期間によって、
接着性細胞をプラスチックに接着させる。これは、アッセイにおいてより低いバ
ックグラウンドとなる。なぜなら、抗原提示細胞として作用し得るか、または増
殖因子を産生し得る細胞の存在が少ないからである。翌日非接着性細胞を回収し
て、洗浄し、増殖アッセイ中で用いる。このアッセイを、最終容量２００μｌ中
に２×１０4細胞／ウェルを用いて９６ウェルプレート中で実施する。目的のタ
ンパク質を発現する上清（例えば、ＣＨＯまたは２９３Ｔ上清）を、３０％の最
終稀釈で試験し、従って、６０μｌを、細胞を含有する１４０μｌの１０％  Ｆ
ＣＳ／ＲＰＭＩに添加する。コントロール上清を同じ最終稀釈で用い、そして以
下のタンパク質を発現する：ベクター（陰性コントロール）、ＩＬ−２（*）、
ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０およびＴＲ２。コントロール上清に加えて、組
換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）
をまた最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで用いる。培養の２４時間後、各ウェルを１μ
Ｃｉの3Ｈチミジン（Ｎｅｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でパルスする。次いで、細
胞をパルス２０時間後に回収し、そして3Ｈチミジンの取り込みを増殖の指標と
して用いる。結果を３連のサンプルの平均±標準誤差として表す。
（*）各トランスフェクションにおいて産生されたコントロールサイトカインＩ
Ｌ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０の量は、３００ｐｇ〜５ｎｇ／ｍ
ｌの間で変化する。
【０９６８】
（同時刺激アッセイ）
休止しているＰＢＬ（末梢血リンパ球）での同時刺激アッセイを、ＣＤ３およ
びＣＤ２８に対して固定された抗体の存在下で実施する。ＣＤ３の不変領域に特
異的な抗体の使用は、抗原によりＴ細胞レセプターの刺激を通じて生じるＴ細胞
活性の誘導を模倣する。同時刺激シグナル（第２シグナル）の非存在下でのＴＣ
Ｒ（第１シグナル）の架橋は、増殖の非常に低い誘導を生じ、そして最終的には
「アネルギー」の状態（この状態は、増殖がないことおよびサイトカイン産生を
できないことによって特徴付けられる）を生じる。同時刺激分子の作用を模倣す
る、ＣＤ２８に対する抗体のような同時刺激シグナルの追加。活性化ＡＰＣ上で
発現されたＢ７−１は、細胞生存およびＩＬ−２の産生を含むＴ細胞応答の増強
を生じる。従って、この型のアッセイにより、目的のタンパク質を発現する上清
の添加によって生じる、Ｔ細胞増殖に対する正の影響および負の影響の両方を検
出できる。
【０９６９】
このアッセイを以下のように実行する。最終容量１００μｌで１００ｎｇ／ｍ
ｌ抗ＣＤ３および５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄ
ｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、９６ウェルプレートをコートし、そして４℃で一晩
インキュベートする。使用前にプレートをＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＭＣをヒ
ト末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ（ＬＳＭ，ＩＣＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏ）勾配遠心分離により単離し、そして１０％ＦＣＳ
（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ，Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ）／ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ
）中で一晩、培養する。この一晩のインキュベーション期間によって、接着性細
胞をプラスチックに接着させる。これは、アッセイにおいてより低いバックグラ
ウンドとなる。なぜなら、抗原提示細胞として作用し得るか、または増殖因子を
産生し得る細胞の存在が少ないからである。翌日非接着性細胞を回収して、洗浄
し、増殖アッセイ中で用いる。このアッセイを、最終容量２００μｌ中に２×１
０4細胞／ウェルを用いて９６ウェルプレート中で実施する。目的のタンパク質
を発現する上清（例えば、ＣＨＯまたは２９３Ｔ上清）を、３０％の最終稀釈で
試験し、従って、６０μｌを、細胞を含有する１４０μｌの１０％  ＦＣＳ／Ｒ
ＰＭＩに添加する。コントロール上清を同じ最終稀釈で用い、そして以下のタン
パク質を発現する：ベクターのみ（陰性コントロール）、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、
ＴＮＦα、ＩＬ−１０およびＴＲ２。コントロール上清に加えて、組換えヒトＩ
Ｌ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をまた最終
濃度１０ｎｇ／ｍｌで用いる。培養の２４時間後、各ウェルを１μＣｉの3Ｈチ
ミジン（Ｎｅｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でパルスする。次いで、細胞をパルス２
０時間後に回収し、そして3Ｈチミジンの取り込みを増殖の指標として用いる。
結果を３連のサンプルの平均±標準誤差として表す。
【０９７０】
（同時刺激アッセイ：ＩＦＮγおよびＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ）
このアッセイを以下のように実行する。最終容量５００μｌで３００ｎｇ／ｍ
ｌもしくは６００ｎｇ／ｍｌのどちらかの抗ＣＤ３および５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２
８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、２４ウェル
プレートをコートし、そして４℃で一晩インキュベートする。使用前にプレート
をＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ（ＬＳＭ，
ＩＣＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏ）勾配遠心
分離により単離し、そして１０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ，
Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）／ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ  Ｂ
ＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）中で一晩、培養する。この一晩のイン
キュベーション期間によって、接着性細胞をプラスチックに接着させる。これは
、アッセイにおいてより低いバックグラウンドとなる。なぜなら、抗原提示細胞
として作用し得るか、または増殖因子を産生し得る細胞の存在が少ないからであ
る。翌日非接着性細胞を回収して、洗浄し、同時刺激アッセイ中で用いる。この
アッセイを、最終容量９００μｌ中に１×１０5細胞／ウェルを用いて前もって
コートした２４ウェルプレート中で実施する。目的のタンパク質を発現する上清
（２９３Ｔ上清）を、３０％の最終稀釈で試験し、従って、３００μｌを、細胞
を含有する６００μｌの１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩに添加する。コントロール上
清を同じ最終稀釈で用い、そして以下のタンパク質を発現する：ベクターのみ（
陰性コントロール）、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８。コン
トロール上清に加えて、組換えヒトＩＬ−２（全てのサイトカインは、Ｒ＆Ｄ  
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入した）をまた最終濃度
１０ｎｇ／ｍｌで、ＩＬ−１２を最終濃度１ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−１８を最終
濃度５０ｎｇ／ｍｌで用いる。コントロールおよび未知のサンプルを、二連で試
験する。上清サンプル（２５０μｌ）をアッセイ開始後２日目および５日目で回
収する。ＩＦＮγおよびＩＬ−２の分泌に対しての試験のためのＥＬＩＳＡをＲ
＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入したキットを
使用して行う。結果を２連のサンプルの平均±標準誤差として表す。
【０９７１】
（プレ活性化した休止しているＴ細胞の増殖アッセイ）
レクチンフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）を用いて事前に活性化した細胞上
で、プレ活性化した休止しているＴ細胞での増殖アッセイを実施する。レクチン
は、ＴＣＲを含むＴ細胞表面糖タンパク質上の残基に結合し得るポリマー性植物
タンパク質であり、そしてポリクローナルアクチベータとして作用する。ＰＢＬ
をＰＨＡで処理し、次いで低用量のＩＬ−２類似エフェクターＴ細胞の存在下で
培養する。これらの細胞は一般に、ＩＬ−２のような増殖因子によって誘導され
たさらなる活性化に対してより感受性である。これは、高親和性ＩＬ−２レセプ
ターの発現に起因する。このレセプターは、この集団をＩＬ−２の量に応答させ
る（ナイーブなＴ細胞上で有する効果の１００分の１である）。従ってこの型の
細胞の使用は、休止している（ナイーブな）Ｔ細胞での増殖を誘導するのに十分
でない、非常に低用量の未知の増殖因子の効果を検出し得る。
【０９７２】
このアッセイを以下のように実行する。ＰＢＭＣをヒト末梢血から、Ｆ／Ｈ勾配遠心分離により単離し、そして２μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で、１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ中で３日間、培養する。次いでこの細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そして５ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の存在下で、１０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ，Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）／ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で、３日間培養する。この細胞を洗浄して、飢餓培地（１％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ）中で１６時間休息させ、その後増殖アッセイを開始した。細胞のアリコートをＦＡＣＳによって分析して、Ｔ細胞（ＣＤ３陽性細胞）存在のパーセンテージを決定する；これは通常ドナーに依存して９３〜９７％の間にわたる。このアッセイを、最終容量２００μｌ中に２×１０4細胞／ウェルを用いて９６ウェルプレート中で実施する。目的のタンパク質を発現する上清（例えば、ＣＨＯまたは２９３Ｔ上清）を、３０％の最終稀釈で試験し、従って、６０μｌを、細胞を含有する１４０μｌの１０％  ＦＣＳ／ＲＰＭＩに添加する。コントロール上清を同じ最終稀釈で用い、そして以下のタンパク質を発現する：ベクター（陰性コントロール）、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−１０およびＴＲ２。コントロール上清に加えて、組換えヒトＩＬ−２をまた最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで用いる。培養の２４時間後、各ウェルを１μＣｉの3Ｈチミジン（Ｎｅｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でパルスする。次いで、細胞をパルス２０時間後に回収し、そして3Ｈチミジンの取り込みを増殖の指標として用いる。結果を３連のサンプルの平均±標準誤差として表す。
【０９７３】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのアゴニスト、および／また
はアンタゴニストを試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９７４】
（実施例３４：ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現、なら
びに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化への本発明のポリペプチドの効
果）
樹状細胞を末梢血において見出される増殖前駆体の増殖により生成する：接着
性ＰＢＭＣまたは清浄化単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩ
Ｌ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）とともに７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は
、非成熟細胞の特徴的表現型（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭ
ＨＣクラスＩＩ抗原の発現）を有する。ＴＮＦ−αのような活性化因子での処理
は、表面表現形に迅速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、同時刺激分子および
接着分子の発現の増加、ＦＣγＲＩＩの下方制御、ＣＤ８３の上方制御）を生じ
る。これらの変化は抗原提示能力の増加、および樹状細胞の機能的成熟と関連す
る。
【０９７５】
表面抗原のＦＡＣＳ分析を以下の様に実施する。細胞を、本発明のポリペプチ
ドまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１〜３日処理し、１％Ｂ
ＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１
：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体またはＰＥ標識モノクロー
ナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄後、標識
した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサ
イトメトリーにより分析する。
【０９７６】
（サイトカインの生成への効果）樹状細胞により生成されるサイトカイン、特
にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始において重要である。ＩＬ−１２
は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の発生に強力に影響し、そして細胞傷害性Ｔ
細胞機能およびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて以下のようにＩＬ
−１２放出を測定する。樹状細胞（１０6／ｍｌ）を、本発明のポリペプチドの
漸増する濃度で２４時間処理する。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コント
ロールとして細胞培養に添加する。次いで、細胞培養からの上清を収集し、そし
て市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐ
ｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供さ
れる標準的プロトコールを用いる。
【０９７７】
ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子および接着分子の発現への効果。細胞表面抗
原の３つの主なファミリー：接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃレ
セプター、が、単球上で同定され得る。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の同時刺
激分子（例えば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１）の発現の調節は、単球の抗原提示能
力、およびＴ細胞活性化を誘導する能力に変化を生じ得る。Ｆｃレセプターの発
現増加は、単球細胞傷害性活性、サイトカイン放出および食菌作用の改善と相関
し得る。
【０９７８】
ＦＡＣＳ分析は、以下のように表面抗原を試験するために用いられる。単球を
、本発明のポリペプチドまたはＬＰＳ（陽性コントロール）の漸増する濃度で１
〜５日処理し、１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢ
Ｓで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体また
はＰＥ標識モノクローナル抗体とともに、４℃で３０分間インキュベートする。
さらなる洗浄後、標識した細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０９７９】
（単球活性化および／または生存の増加）単球を活性化する（あるいは、不活
化する）および／または単球の生存を増加する（あるいは、単球生存を低下させ
る）分子についてのアッセイは、当該分野で公知であり、そして本発明の分子が
単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するか否かを決定するため
に慣用的に適用され得る。本発明のポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニ
ストは、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングされ得る。これら
のアッセイのそれぞれについて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐ
ａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通じた遠心分離により、単一のドナーｌｅｕｋｏ
ｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｄ  Ｃｒｏｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ
）から精製する。単球を向流遠心性エルトリエーション（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏ
ｗ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によりＰＢＭＣから単
離する。
【０９８０】
（単球生存アッセイ）ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激の非存在下で培
養した場合、次第に生存度を失う。それらの死は、内部調節されたプロセス（ア
ポトーシス）から生じる。活性化因子、例えばＴＮＦαの培養への添加は、劇的
に、細胞生存を改善し、そしてＤＮＡの断片化を妨げる。プロピジウムヨード（
ＰＩ）染色を用いて、以下のようにアポトーシスを測定する。単球を、１００ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（陰性コントロール）の存在下、および試験される種々の
濃度の化合物の存在下で、ポリプロピレンチューブ中の無血清培地（陽性コント
ロール）中で、４８時間培養する。細胞を、最終濃度５μｇ／ｍｌでＰＩを含有
するＰＢＳ中で２×１０6／ｍｌの濃度に懸濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎ分析の
前に５分間室温でインキュベートする。ＰＩ取り込みは、この試験パラダイムに
おけるＤＮＡの断片化と相関することを示している。
【０９８１】
（サイトカイン放出への影響）単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカインの放出を通じた免疫系の他の細胞集団へのそれらの調節活性である。サイトカイン放出を測定するためのＥＬＩＳＡは、以下のように実施する。ヒト単球を、５×１０5細胞／ｍｌの密度で、本発明のポリペプチドの漸増する濃度とともに、および同じ条件下であるが、このポリペプチドの非存在下で、インキュベートする。ＩＬ−１２の生成については、この細胞を、本発明のポリペプチドの存在下でＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）で１晩プライムする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。馴化培地を２４時間後に収集し、そして使用するまで凍結保存する。次いで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用い、そしてキットに提供される標準的プロトコールを適用して実施する。
【０９８２】
（酸化的バースト（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｂｕｒｓｔ））精製した単球を９６
ウェルプレートに２〜１×１０5細胞／ウェルでプレートする。本発明のポリペ
プチドの漸増濃度をウェルの総量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋
１０％ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）に添加する。３日間のインキュベー
ション後、このプレートを遠心分離し、そして培地をウェルから除く。マクロフ
ァージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍ
Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキス
トロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を、
刺激物質（２００ｎＭ  ＰＭＡ）とともに添加する。このプレートを３７℃で２
時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを添加
して反応を停止する。吸収を６１０ｎｍで読む。マクロファージにより生成され
るＨ2Ｏ2の量を算出するため、既知のモル濃度のＨ2Ｏ2溶液の標準曲線をそれぞ
れの実験について実施する。
【０９８３】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリペプチドの活性、ポリヌクレオチドの活性（
例えば、遺伝子治療）、アゴニストの活性、および／またはアンタゴニストの活
性を試験するために、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９８４】
（実施例３５：本発明のポリペプチドの生物学的効果）
（星状細胞および神経アッセイ）
上記のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで発現され、そして精製さ
れた本発明の組換えポリペプチドを、皮質ニューロン細胞の生存、神経突起成長
または表現形分化を促進する活性について、およびグリア線維性酸性タンパク質
免疫陽性細胞、星状細胞の増殖の誘導について試験し得る。バイオアッセイのた
めの皮質細胞の選択は、皮質構造中のＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の広く行き渡
っている発現、ならびにＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の以前に
報告された増強に基づく。チミジン取り込みアッセイを用いて、例えば、これら
の細胞への本発明のポリペプチドの活性を解明し得る。
【０９８５】
さらに、インビトロにおける皮質ニューロンまたは海馬ニューロンへのＦＧＦ
−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載する以前のレポートは、ニューロン
生存および神経突起成長の両方における増大を実証している（Ｗａｌｉｃｋｅら
、「Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  
ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  
ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎｅｕｒｉｔｅ  ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３０１２〜３０
１６（１９８６）、アッセイは、本明細書でその全体が参考として援用される）
。しかし、ＰＣ−１２細胞で実行される実験からの報告は、これらの２つの応答
が必ずしも同義でないこと、そしてどのＦＧＦを試験しいるかだけでなく、どの
レセプターが標的細胞で発現されているかにも依存し得ることを示唆する。神経
突起成長を誘導する本発明のポリペプチドの能力を、一次の皮質ニューロン培養
パラダイムを用いて、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いてＦＧＦ−２で
得られた応答と比較し得る。
【０９８６】
（線維芽細胞および内皮細胞アッセイ）
ヒト肺線維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入
手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓからの増殖培地で維持する。真皮性微小血管内
皮細胞をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）か
ら得る。増殖アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞および真皮性微小血管内皮
細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中で１日間、５，０００細胞／ウェルで
培養し得る。次いでこの細胞を０．１％ＢＳＡ基礎培地中で１日間インキュベー
トする。新鮮な０．１％ＢＳＡ培地で培地を置換した後、細胞を試験タンパク質
と３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ａｌｍａｒ  Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）を１０％の最終濃度になるよう
に各ウェルに添加する。この細胞を４時間インキュベートする。細胞生存度をＣ
ｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーでの読取りにより測定する。ＰＧＥ2アッセイに
ついては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中で１日間、５，０００細
胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地を変換した後、細胞をＩ
Ｌ−１αとともに、またはそれをともなわずに、ＦＧＦ−２または本発明のポリ
ペプチドと２４時間インキュベートする。上清を収集し、そしてＥＩＡキット（
Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によりＰＧＥ2についてアッセイす
る。ＩＬ−６アッセイについては、ヒト肺線維芽細胞を、９６ウェルプレート中
で１日間、５，０００細胞／ウェルで培養する。０．１％ＢＳＡ基礎培地に培地
を変換した後、細胞を本発明のポリペプチドＩＬ−１αとともに、またはそれを
ともなわずに、ＦＧＦ−２と２４時間インキュベートする。上清を収集し、そし
てＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によりＩＬ
−６についてアッセイする。
【０９８７】
ヒト肺線維芽細胞をＦＧＦ−２または本発明のポリペプチドとともに基礎培地
中で３日間培養し、その後、線維芽細胞の増殖への効果を評価するためＡｌａｍ
ａｒ  Ｂｌｕｅを添加する。ＦＧＦ−２は、本発明のポリペプチドでの刺激に匹
敵して用いられ得る１０〜２５００ｎｇ／ｍｌの刺激を示すはずである。
【０９８８】
（パーキンソンモデル）
パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特徴付けされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身投与を含む。ＣＮＳにおいて、ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ+）に異化され、そして放出される。引き続き、ＭＰＰ+は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによりドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積する。次いで、ＭＰＰ+は、電気化学勾配によりミトコンドリア中で濃縮され、そしてニコチン酸アミドアデニン二リン酸：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害し、これにより電子伝達を妨害し、そして最終的に活性酸素を生成する。
【０９８９】
ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）が黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活
性を有することが組織培養パラダイムにおいて実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ
ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９８９）。近年、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは
、線条体のゲル型インプラントでのＦＧＦ−２投与がＭＰＴＰ曝露と関連する毒
性から黒質のドーパミン作動性ニューロンのほぼ完全な防御を生じることを実証
している（ＯｔｔｏおよびＵｎｓｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９０）。
【０９９０】
ＦＧＦ−２を用いたデータに基づいて、本発明のポリペプチドは、インビトロ
におけるドーパミン作動性ニューロン生存を増強する際において、本発明のポリ
ペプチドがＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するか否かを決定するために評価
され得、そして、本発明のポリペプチドはまた、線条体におけるドーパミン作動
性ニューロンを、ＭＰＴＰ処理と関連する損傷からの防御についてインビボで試
験され得る。本発明のポリペプチドの潜在的効果を、まずドーパミン作動性ニュ
ーロン細胞培養パラダイムにおいてインビトロで試験する。妊娠１４日のＷｉｓ
ｔａｒラット胚由来の中脳底板を解剖することにより、培養物を調製する。組織
をトリプシンで分離し、そしてポリオルチニン−ラミニンでコートしたカバーガ
ラスに２００，０００細胞／ｃｍ2の密度で播いた。この細胞をダルベッコ改変
イーグル培地およびホルモン補充物（Ｎ１）を含有するＦ１２培地中で維持する
。インビトロで８日後、培養物をパラホルムアミドで固定し、そしてチロシンヒ
ドロキシラーゼ（ドーパミン作動性ニューロンについての特異的マーカー）での
免疫組織化学染色のために処理する。分離した細胞培養物を胚性ラットから調製
する。培養培地を３日ごとに変化させ、そしてこの因子をまたその時点ごとに添
加する。
【０９９１】
ドーパミン作動性ニューロンを妊娠１４日（この発生時間は、ドーパミン作動
性前駆細胞が増殖する段階を過ぎる）で動物から単離するので、チロシンヒドロ
キシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、インビトロで生存しているドーパ
ミン作動性ニューロンの数の増加を示す。従って、もし本発明のポリペプチドが
ドーパミン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、このポリ
ペプチドがパーキンソン病に関与し得ることを示唆する。
【０９９２】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために
、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９９３】
（実施例３６：血管内皮細胞の増殖への本発明のポリペプチドの効果）
１日目に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ
）、１６ユニット／ｍｌ  ヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ  内皮細胞増殖
補充物（ＥＣＧＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９
培地中で、３５ｍｍシャーレあたり２〜５×１０4細胞の密度で播種する。２日
目、この培地を、１０％ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９
で置換する。配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび陽性コント
ロール（例えば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））を種々の濃度で添
加する。４日目および６日目に、培地を交換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃ
ｏｕｎｔｅｒを用いて細胞数を決定する。
【０９９４】
ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、本発明のポリペプチドが血管内皮細胞を増殖し得
ることを示す。
【０９９５】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために
、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９９６】
（実施例３７：血管内皮細胞の増殖への本発明のポリペプチドの刺激効果）
増殖因子の分裂促進活性の評価のために、電子共役試薬ＰＭＳ（フェナジンメ
トサルフェート）を用いる、比色分析ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾー
ル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルフ
ォフェニル）２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイを実行した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ
９６  ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ）。細胞を０．１ｍＬの血清補充培地中で９６ウ
ェルプレートに播種し（５，０００細胞／ウェル）、そして一晩付着させる。０
．５％ＦＢＳ中、１２時間の血清飢餓後、Ｈｅｐａｒｉｎ（８Ｕ／ｍｌ）を伴う
かまたは伴わない、条件（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ165または０．５％ＦＢＳ中の本
発明のポリペプチド）をウェルに４８時間添加する。２０ｍｇのＭＴＳ／ＰＭＳ
混合物（１：０．０５）を１ウェルあたりに添加し、そして３７℃で１時間イン
キュベートさせ、その後ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を測
定する。コントロールウェル（培地あり、細胞なし）のバックグラウンドの吸光
度を差し引きし、そしてそれぞれの条件について７つのウェルを並行して実施す
る。Ｌｅａｋら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０Ａ：５
１２〜５１８（１９９４）を参照のこと。
【０９９７】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）
、本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために
、例示する研究を容易に改変し得る。
【０９９８】
（実施例３８：ＰＤＧＦ誘導性血管平滑筋細胞増殖刺激効果の阻害）
ＨＡｏＳＭＣ増殖を、例えば、ＢｒｄＵｒｄ組み込みにより測定し得る。手短
には、４チャンバスライド上で増殖するコンフルエント未満の静止期細胞を、Ｃ
ＲＰまたはＦＩＴＣ標識化ＡＴ２−３ＬＰでトランスフェクトする。次いで、こ
の細胞に１０％ウシ血清および６ｍｇ／ｍｌのＢｒｄＵｒｄをパルスする。２４
時間後、ＢｒｄＵｒｄ染色キット（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を
用いることにより免疫細胞化学を実施する。簡略には、この細胞を、変性溶液へ
の曝露後、ビオチン化マウス抗−ＢｒｄＵｒｄ抗体と４℃で２時間インキュベー
トし、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン
とともにインキュベートする。ヘマトキシリンでの対比染色後、この細胞を顕微
鏡試験のために標本にし、そしてＢｒｄ  Ｕｒｄ−陽性細胞を計数する。Ｂｒｄ
Ｕｒｄ係数は、総細胞数に対するＢｒｄＵｒｄ−陽性細胞の割合として計算され
る。さらに、個々の細胞について、明野照明および暗野ＵＶ蛍光照明の同時使用
により、ＢｒｄＵｒｄ染色（核）およびＦＩＴＣ取り込み（細胞質）の同時検出
を実行する。（Ｈａｙａｓｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６：２７１（
３６）：２１９８５〜２１９９２（１９９６）を参照のこと）。
【０９９９】
本実施例において記載した研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、
例示する研究を容易に改変し得る。
【１０００】
（実施例３９：内皮遊走の刺激）
本実施例は、本発明のポリペプチドがリンパ性の内皮細胞遊走を刺激し得る可
能性を探索するために用いられ得る。
【１００１】
内皮細胞遊走アッセイは、４８ウェルの微小走化性チャンバを用いて実行され
る（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ，ＭＤ；Ｆａｌｋ
，Ｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８０；３３：
２３９〜２４７）。ポリビニルピロリドンを含まないポリカーボネートフィルタ
ー（これは８μｍの孔径を備える）（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を室温で少なくとも６時間０．１％ゼラチンでコートし、
そして滅菌空気のもとで乾燥する。０．２５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
補充したＭ１９９中で試験物質を適切な濃度に希釈し、そして２５μｌの最終希
釈を改変Ｂｏｙｄｅｎ装置の底部チャンバに置く。コンフルエント未満の、早期
継代（２〜６）のＨＵＶＥＣまたはＢＭＥＣ培養物を洗浄し、そして細胞の脱離
に必要な最小の時間トリプシン処理する。底部チャンバと上部チャンバとの間の
フィルターを配置した後、１％ＦＢＳを含有する５０μｌ  Ｍ１９９中に懸濁し
た２．５×１０5細胞を上部コンパートメントに播種する。次いでこの装置を、
５％ＣＯ２を用いて湿潤にしたチャンバ中で３７℃で５時間インキュベートして
細胞を遊走させた。インキュベーション期間後、このフィルターを取り出し、そ
して非遊走細胞を有するフィルターの上部側をゴム性のポリスマン（ｐｏｌｉｃ
ｅｍａｎ）でかきとる。このフィルターをメタノールで固定し、そしてＧｉｅｍ
ｓａ溶液で染色する（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ，Ｂａｘｔｅｒ，ＭｃＧｒａｗ  Ｐ
ａｒｋ，ＩＬ）。遊走は、それぞれのウェルにおいて、３つの無作為の高出力視
野（４０×）の細胞を計数することにより定量する。そしてすべての群を４連で
実行する。
【１００２】
本実施例において記載した研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した。
しかし、当業者は、本発明のポリヌクレオチドの活性（例えば、遺伝子治療）、
本発明のアゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を試験するために、
例示する研究を容易に改変し得る。
【１００３】
（実施例４０：内皮細胞による一酸化窒素生成の刺激）
血管内皮による一酸化窒素の放出は、血管内皮弛緩の介在物質であると考えら
れてる。従って、本発明のポリペプチドの活性は、このポリペプチドに応答する
内皮細胞による一酸化窒素産生を測定することによってアッセイされ得る。
【１００４】
一酸化窒素を、２４時間の飢餓、次いで、様々なレベルの陽性コントロール（
例えば、ＶＥＧＦ−１）および本発明のポリペプチドへの４時間の曝露の後のコ
ンフルエントな微小血管内皮細胞の９６ウェルプレート中で測定する。培地中の
一酸化窒素を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬の使用により定量して、硝酸還元酵素による一
酸化硝酸由来の硝酸塩の還元後の亜硝酸の総量を測定する。一酸化窒素放出に対する
本発明のポリペプチドの効果を、ＨＵＶＥＣにおいて試験する。
【１００５】
簡単には、培養したＨＵＶＥＣ単層からのＮＯ放出は、ＮＯメーター（Ｉｓｏ
−ＮＯ，Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．
）（１０４９）に接続したＮＯ特異的なポーラログラフ電極を用いて測定する。
ＮＯエレメントの較正を、以下の式に従って行う：
２ＫＮＯ2＋２ＫＩ＋２Ｈ2ＳＯ4６２ＮＯ＋Ｉ2＋２Ｈ2Ｏ＋２Ｋ2ＳＯ4
検量線を、ＫＩおよびＨ2ＳＯ4を含む較正溶液中に段階的な濃度のＫＮＯ2（
０、５、１０、２５、５０、１００、２５０、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添
加することによって得る。ＮＯに対するＩｓｏ−ＮＯ電極の特異性を、オーセン
ティックなＮＯ気体からのＮＯを測定することにより、事前に決定する（１０５
０）。この培養培地を取り除き、そしてＨＵＶＥＣを、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸
緩衝化生理食塩水で２回洗浄する。次いで、細胞を、６ウェルプレート中で５ｍ
ｌのろ過したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ溶液に浸し、そしてこの細胞プレ
ートを、３７℃に温度を維持するために、スライドウォーマー（Ｌａｂ  Ｌｉｎ
ｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）で保持する。ＮＯセンサープローブを
ウェルに垂直に挿入して、異なる条件の追加の前に、電極の先端を溶液の表面の
２ｍｍ下で保持する。Ｓ−ニトロソアセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）を、陽性
コントロールとして用いる。放出したＮＯの量を、１×１０6内皮細胞あたりの
ピコモル濃度として表す。全ての報告した値は、各群（細胞培養ウェルの数）に
おける４〜６の測定値の平均である。Ｌｅａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１７：９６−１０５（１９９５）を参照の
こと。
【１００６】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１００７】
（実施例４１：新脈管形成における索形成に対する本発明のポリペプチドの効
果）
新脈管形成における別の工程は、内皮細胞の分化により特徴付けられる索（ｃ
ｏｒｄ）形成である。このバイオアッセイは、インビトロで培養した場合の微小
血管内皮細胞の毛細管様構造（中空構造）を形成する能力を測定する。
【１００８】
ＣＡＤＭＥＣ（微小血管内皮細胞）を、増殖細胞（２継代）としてＣｅｌｌ  
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ,Ｉｎｃ．から購入し、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ’ＣＡＤＭＥＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ中で培養し、そして５継
代で使用する。インビトロ新脈管形成アッセイのために、４８ウェル細胞培養プ
レートのウェルをＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ
Ｆａｃｔｏｒ  Ｍｅｄｉｕｍ（２００ｍｌ／ウェル）を用いて、３７℃にて３
０分間コートする。ＣＡＤＭＥＣを、７，５００細胞／ウェルでコートしたウェ
ルに播種し、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ中で一晩培養する。次いで、このＧｒ
ｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍを、コントロール緩衝液または本発明のポリペプチド（
０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）を含む３００ｍｇのＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ’Ｃｈｏｒｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍと交換し、そしてこの
細胞をさらに４８時間培養する。毛細管様索の数および長さを、Ｂｏｅｃｋｅｌ
ｅｒ  ＶＩＡ−１７０ビデオ画像分析装置の使用を通じて定量する。全てのアッ
セイを三連で行った。
【１００９】
市販の（Ｒ＆Ｄ）ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性コントロールとして用
いる。ｂ−エストラジオール（１ｎｇ／ｍｌ）を、陰性コントロールとして用い
る。適切な緩衝液（タンパク質なし）もまた、コントロールとして利用する。
【１０１０】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチドの活性を試験した
。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチ
ドの活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト
の活性を試験し得る。
【１０１１】
（実施例４２：ニワトリ漿尿膜に対する脈管形成効果）
ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）は、新脈管形成を試験するために十分に確立した系
である。ＣＡＭにおける血管形成は、容易に可視化および定量可能である。本発
明のポリペプチドのＣＡＭにおける新脈管形成を刺激する能力を試験し得る。
【１０１２】
ニワトリ白色レグホン（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）および日本ウ
ズラ（ｑｕａｌ）（Ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ）の受精卵を、３７．８℃およ
び湿度８０％でインキュベートする。１６日齢のニワトリおよび１３日齢のウズラの胚の分化したＣＡＭを以下の方法で研究する。
【１０１３】
発生の４日目に、ニワトリ卵の卵殻に窓を作る。この胚を正常な発生について
調べ、そしてこの卵をセロテープ（登録商標）で封着する。これらを、さらに１
３日目までインキュベートする。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバーガラス（Ｎｕｎｃ，
Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を、直径約５ｍｍのディスクに切る。滅菌かつ無
塩成長因子を滅菌水に溶解し、そして約３．３ｍｇ／５ｍｌをディスクにピペッ
トで移す。風乾後、逆さにしたディスクをＣＡＭに適用する。３日後、標本を３
％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中に固定し、そして０．１２
Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液ですすぐ。これらを実体顕微鏡［Ｗｉｌｄ  Ｍ８
］を用いて写真撮影し、上記のように半薄層切片化および超薄層切片化のために
包埋する。コントロールを、キャリアディスクのみを用いて行う。
【１０１４】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０１５】
（実施例４３：マウスにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ移植片を用いる新脈管形成ア
ッセイ）
本発明のポリペプチドのインビボ新脈管形成アッセイは、既存の毛細管網様構
造の、マウス細胞外マトリックス物質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の移植したカプセル
中に新しい脈管を形成する能力を測定する。このタンパク質を、４℃で液体Ｍａ
ｔｒｉｇｅｌと混合し、次いでこの混合物を、マウスに皮下（ここで、この混合
物は凝固する）注射する。７日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌの固体「プラグ」を取り除
き、そして新しい血管の存在について試験する。Ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｂｅｃｔ
ｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ／Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから購入する。
【１０１６】
４℃で解凍した時、Ｍａｔｒｉｇｅｌ物質は液体である。このＭａｔｒｉｇｅ
ｌを、４℃にて１５０ｎｇ／ｍｌで本発明のポリペプチドと混合し、冷３ｍｌシ
リンジ中に引き抜く。約８週齢の雌性Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、腹部の中腹側面
の２つの部位にＭａｔｒｉｇｅｌおよび実験タンパク質の混合物を注射する（０
．５ｍｌ／部位）。７日後、このマウスを頚椎脱臼により屠殺し、Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌプラグを取り除きそして洗浄する（すなわち、全ての付着する膜および腺維
組織を取り除く）。同じ全プラグを中性緩衝化１０％ホルムアミド中に固定し、
パラフィン中に包埋し、そしてＭａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色後
、組織学的試験のために切片を作製するために使用する。各プラグの３つの異な
る領域由来の断面を処理する。選択した切片をｖＷＦの存在について染色す
る。このアッセイについての陽性コントロールは、ウシ塩基性ＦＧＦ（１５０ｎ
ｇ／ｍｌ）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ単独を用いて、新脈管形成の基礎レベルを
決定する。
【１０１７】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０１８】
（実施例４４：ウサギ下肢モデルにおける虚血の救出）
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの虚血に対するインビボでの効
果を研究するため、ウサギ後肢虚血モデルを、以前に記載される（Ｔａｋｅｓｈ
ｉｔａら、Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １４７：１６４９−１６６０（１９９５）
）ように１つの大腿動脈の外科的除去により作製する。大腿動脈の切除は、血栓
の逆行性伝播および外腸骨動脈の閉塞を生じる。結果として、虚血肢への血流は
、内腸骨動脈から生じる側副血管に依存する（Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｍ  Ｊ
．Ｐａｔｈｏｌ  １４７：１６４９−１６６０（１９９５））。１０日の間隔で
、ウサギの手術後の回復および内因性の側副血管の発達を可能にする。手術（０
日）後１０日目に、ベースライン血管造影を行った後、虚血肢の内腸骨動脈を、
本発明のポリヌクレオチドを含む５００ｍｇの裸の発現プラスミドを用いて、（
Ｒｉｅｓｓｅｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：７４９−７５８（１９９
３）；Ｌｅｃｌｅｒｃら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：９３６−９４４
（１９９２））に記載されるように、ヒドロゲル被覆バルーンカテーテルを用い
る動脈遺伝子移入技術により、トランスフェクトする。本発明のポリペプチドを
処置に用いる場合、５００ｍｇの本発明のポリペプチドまたはコントロールの単
回ボーラスを、注入カテーテルを通じて１分間にわたり、虚血肢の内腸骨動脈中
に送達する。３０日目に、種々のパラメーターを、これらのウサギで測定する：
（ａ）ＢＰ比−虚血肢の収縮期血圧  対  正常肢の収縮期血圧の比；（ｂ）血流
および逆流−安静時ＦＬ：非拡張性状態の間の血流、および最大ＦＬ：完全に拡張
した状態の間の血流（これはまた、血管量の間接的指標）、そして逆流は、最大Ｆ
Ｌ：安静時ＦＬの比に反映される；（ｃ）血管造影スコア（ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ
Ｓｃｏｒｅ）−これを側副血管の血管造影により測定する。スコアを、オーバ
ーレイグリッド（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ  ｇｒｉｄ）内の円の百分率（ウサギ大
腿の総数ｍで割った横断不透明化動脈を用いる）により決定する；（ｄ）毛細管
（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）密度−側副毛細血管の数は、後肢から得た光学顕微鏡用
切片において決定した。
【１０１９】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペ
プチド活性を試験した。しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本
発明のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを試験し得る。
【１０２０】
（実施例４５：本発明のポリペプチドの血管拡張に対する効果）
血管内皮の拡張は、血圧の低下に重要であるので、自然発症高血圧ラット（Ｓ
ＨＲ）における、本発明のポリヌクレオチドの血圧に影響する能力を、試験する
。漸増用量（０、１０、３０、１００、３００、および９００ｍｇ／ｋｇ）の本
発明のポリペプチドを、１３〜１４週齢の自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）に投
与する。データを、平均＋／−ＳＥＭで表す。統計学的分析を、両側ｔ検定を用
いて行い、そして統計的な有意性を、ｐ＜０．０５  対  緩衝液単独への応答と
して定義する。
【１０２１】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０２２】
（実施例４６：ラット虚血皮膚弁モデル）
評価パラメーターとして、皮膚の血流、皮膚温度、および第ＶＩＩＩ因子の免
疫組織化学または内皮アルカリホスファターゼ反応が挙げられる。皮膚虚血の間
の本発明のポリペプチドの発現を、インサイチュハイブリダーゼーションを用い
て研究する。
【１０２３】
このモデルにおける研究を、以下の３つの部分に分ける：
ａ）虚血皮膚
ｂ）虚血皮膚創傷
ｃ）通常の創傷。
【１０２４】
実験プロトコルは以下を含む：
ａ）３×４ｃｍの単一茎全層無作為皮膚弁（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｅｄｉｃｌｅ  
ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｒａｎｄｏｍ  ｓｋｉｎ  ｆｌａｐ）（動物の
下背部にわたる筋皮弁）を生じさせる。
【１０２５】
ｂ）虚血皮膚（皮膚弁）に切除創傷をつくる（直径４〜６ｍｍ）
ｃ）次の種々の投薬範囲の本発明のポリペプチドによる、切除創傷（創傷後の
０、１、２、３、４日目）の局所的な処置：１ｍｇ〜１００ｍｇ
ｄ）組織学的研究、免疫組織化学的研究、およびインサイチュ研究のために、
創傷後の３、５、７、１０、１４、および２１日目に創傷組織を収集する。
【１０２６】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０２７】
（実施例４７：末梢動脈疾患モデル）
本発明のポリペプチドを用いる脈管形成治療は、末梢動脈疾患の場合の虚血の
周囲の血流の回復を得る新規の治療的ストラテジーである。実験プロトコルは以
下を含む：
ａ）一方の片側の大腿動脈を、後肢の虚血筋肉を作製するために結紮し、他方
の片側の後肢は、コントロールの役割をする。
【１０２８】
ｂ）本発明のポリペプチドを、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あ
たり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜３週間
、送達する。
【１０２９】
ｃ）この虚血筋肉組織を、大腿動脈の結紮後、本発明のポリペプチドの発現の
分析ならびに組織学のために、１、２、および３週間目に収集する。生検はまた
、他方の片側の対側後肢の正常な筋肉においても行う。
【１０３０】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０３１】
（実施例４８：虚血性心筋疾患モデル）
本発明のポリペプチドを、側副血管の発達を刺激し得、かつ冠状動脈閉塞後に
新しい血管を再構成し得る強力なマイトジェンとして評価する。ポリペプチドの
発現の変化を、インサイチュで調査する。実験プロトコルは、以下を含む：
ａ）心臓を、ラットの左側開胸術を介して露出する。直ちに、左冠状動脈を、
細い縫合糸（６−０）を用いて咬合し、そして胸郭を閉じる。
【１０３２】
ｂ）本発明のポリペプチドを、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲で、一週間あ
たり静脈内および／または筋肉内に３回（おそらくそれより多く）で２〜４週間
、送達する。
【１０３３】
ｃ）手術の３０日後、この心臓を、形態測定およびインサイチュ分析のために取り出しそして横断切片
化する。
【１０３４】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０３５】
（実施例４９：ラット角膜創傷治癒モデル）
この動物モデルは、本発明のポリペプチドの、新生血管形成に対する効果を示
す。実験プロトコルは、以下を含む：
ａ）角膜の中心から間質層へと１〜１．５ｍｍの長い切開を作る
ｂ）目の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する
ｃ）ポケットを作る（その基底は、目の縁から（ｆｏｒｍ）１〜１．５ｍｍで
ある）
ｄ）５０ｎｇ〜５μｇ（ｕｇ）の本発明のポリペプチドを含む小丸剤を、ポケ
ット内に配置する
ｅ）本発明のポリペプチドでの処置をまた、２０ｍｇ〜５００ｍｇの投薬範囲
内で（毎日の処置を５日間）角膜創傷に局所的に適用し得る。
【１０３６】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
の活性（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの
活性を試験し得る。
【１０３７】
（実施例５０：糖尿病マウスおよび糖質コルチコイド障害性創傷治癒モデル）
（Ａ．糖尿病ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル）
本発明のポリペプチドが治癒プロセスを促進することを実証するために、創傷
治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを、使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける
全層（ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）創傷治癒モデルは、障害性の創傷治癒の
十分に特徴付けられた、臨床的に関連性のある、そして再現可能なモデルである
。糖尿病性創傷の治癒は、収縮よりむしろ肉芽組織の形成および再上皮形成に依
存する（Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．５２：３８９（
１９９２）；Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１
３６：１２３５（１９９０））。
【１０３８】
この糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病において観察される特徴的な特性の多く
を有する。ホモ接合（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合（
ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）
マウスは、第４染色体上の単一の常染色体性の劣性変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃ
ｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２８
３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。変
異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したま
たは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介性免疫を有する（Ｍａ
ｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５（１９７８）；Ｄｅｂｒａ
ｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１
−７（１９８３）；Ｌｅｉｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ．１１４：
４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管損傷、
基底膜肥厚および糸球体濾過異常は、これらの動物において記載されている（Ｎ
ｏｒｉｄｏ，Ｆ．ら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．８３（２）：２２１−２３２（１
９８４）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２９（１）：６０−６７
（１９８０）；Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．４０（４）：
４６０−４７３（１９７９）；Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３
１（補遺）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合糖尿病マウスは、高血糖
症を発症し、そしてこれは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似してインスリンに対して耐
性である（Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１３７５−１３７７
（１９７８））。
【１０３９】
これらの動物において観察した特徴は、このモデルにおける治癒が、ヒト糖尿
病において観察される治癒に類似し得ることを示す（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈら、
Ａｍ．Ｊ．ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５−１２４６（１９９０））。
【１０４０】
遺伝的糖尿病の雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウス、およびそ
れらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究に用いた（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物を６週齢で購入する
。研究の開始時は８週齢である。動物を個別に飼育し、そして自由に食物と水を
与える。全ての操作を、無菌操作を用いて行う。この実験を、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅ
ｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉ
ｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従って行う。
【１０４１】
創傷プロトコルを、以前に報告された方法（Ｔｓｕｂｏｉ，Ｒ．およびＲｉｆ
ｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：２４５−２５１（１９９０）
）に従って行う。簡単には、創傷させる日に、動物を、脱イオン水に溶解したＡ
ｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよ
び２−メチル−２−ブタノールの腹腔内注射で麻酔する。この動物の背面領域を
剃毛し、そして皮膚を７０％エタノール溶液およびヨウ素で洗浄する。手術範囲
を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。次いで、８ｍｍの全層の創傷を、
Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。創傷させた直後に、周囲の皮膚を、創
傷の拡大を取り除くために穏やかに伸ばす。実験の間、この創傷を開放しておく
。処置の適用は、創傷させた日から５日間連続で、局所的に受ける。処置の前に
、創傷を、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【１０４２】
創傷を視覚的に検査し、そして手術の日およびその後２日間隔で、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目および８日目の日々の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎ測径器（ｃ
ａｌｉｐｅｒ）を用いて水平および垂直に測定する。肉芽組織がもはや目に見え
ず、そして創傷を連続した上皮が覆う場合に、創傷を治癒したとみなす。
【１０４３】
本発明のポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、異なる投薬範囲（１日あたり
創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群に
、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【１０４４】
動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学および免疫組
織化学のために収集する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの
間の組織カセット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１０４５】
各々１０匹の動物（５匹の糖尿病および５匹の非糖尿病コントロール）の３つ
の群：１）ビヒクルプラシーボコントロール、２）非処置群、および３）処置群
を、評価する。
【１０４６】
創傷閉鎖を、水平軸および垂直軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、収縮を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う：
［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］
標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミ
クロトームを用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染
色を、二等分した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験を用いて、修復し
た皮膚の治癒プロセスおよび形態的な外見を、本発明のポリペプチドを用いる処
置によって改変したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛
細管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含む（Ｇｒｅｅ
ｎｈａｌｇｈ，Ｄ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：１２３５（１９
９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ  
ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いる。
【１０４７】
組織切片をまた、ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナル
ウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色する。ヒト皮膚を陽性組織コ
ントロールとして用いる一方、非免疫ＩｇＧを陰性コントロールとして用いる。
ケラチノサイト増殖を、目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上
皮形成の程度を評価することによって決定する。
【１０４８】
皮膚標本における増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を、ＡＢＣ  Ｅｌ
ｉｔｅ検出システムを用いて抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより
実証する。ヒト結腸癌は、陽性組織コントロールとして役割を果たし得、そして
ヒト脳組織を、陰性組織コントロールとして用い得る。各標本は、１次抗体の脱
落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含む。これらの切片の順位
は、０〜８のスケール（わずかな増殖を反映するより低い側のスケール〜激しい
増殖を反映するより高い側）の増殖の程度に基づく。
【１０４９】
実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【１０５０】
（Ｂ．ステロイド障害性ラットモデル）
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のインビトロおよびインビボ系にお
いて十分に実証されている（Ｗａｈｌ，Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎ
ｄ  Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔ
ｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅ
ｃｔｓ．２８０−３０２（１９８９）；  Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
１５：４７６−４８１（１９７５）；Ｗｅｒｂら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７
：１６８４−１６９４（１９７８））。糖質コルチコイドは、新脈管形成を阻害
すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔら、Ａｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．３７：７
０１−７０５（１９５２））、線維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃ
ｋら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；Ｈａ
ｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）
）を低下させること、ならびに循環する単球の一過性の減少を生じること（Ｈａ
ｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）
；Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａ
ｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏ
ｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９））によって
創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身性投与は、ラ
ットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃ
ｔｏｒｓ．５：２９５−３０４（１９９１）；  Ｈａｙｎｅｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｉｎｖｅｓｔ．６１：７０３−７９７（１９７８）  ；Ｗａｈｌ，「Ｇｌｕｃ
ｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ」：Ａｎｔｉｉ
ｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ａｃｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，２８０−３０２頁（１９８９）；Ｐｉｅｒｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２２２９−２２３３（１９８９））。
【１０５１】
本発明のポリペプチドが治癒プロセスを促進し得ることを実証するために、治
癒が、メチルプレドニゾロンの全身性投与により損なわれる、ラットの全層切除
皮膚創傷に対するポリペプチドの複数の局所適用の効果を評価する。
【１０５２】
若年成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ
）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの実験に用
いる。この動物を、８週齢で購入する。そして研究の開始時は９週齢である。ラ
ットの治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身性投与（１７ｍ
ｇ／ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に飼育し、そして自
由に食物と水を与える。全ての操作を、無菌技術を用いて行う。この研究を、Ｈ
ｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＩｎｃのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
ａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｎｄ
ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ
ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの規則およびガイドラインに従
って行う。
【１０５３】
創傷プロトコルは、上記Ａ節に従う。創傷させる日に、動物をケタミン（５０
ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔する。この
動物の背面領域を剃毛し、そして皮膚を７０％エタノールおよびヨウ素溶液で洗
浄する。手術範囲を、創傷させる前に滅菌ガーゼで乾燥させる。８ｍｍの全層創
傷をＫｅｙｅｓ組織パンチを用いて作製する。実験の間、この創傷を開放しておく。
試験物質の適用を、創傷させ、次いでメチルメチルプレドニゾロン投与した
日から開始して、７日間連続で、１日１回、局所的に与える。処置の前に、創傷
を滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに洗浄する。
【１０５４】
創傷を視覚的に検査し、そして創傷させた日および処置の終りに、固定した距
離で写真撮影する。創傷閉鎖を、１〜５日目の毎日および８日目の測定により決
定する。創傷を目盛り付き（Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）Ｊａｍｅｓｏｎノギスを用
いて水平および垂直に測定する。創傷を、肉芽組織がもはや目に見えずかつ創傷
を連続した上皮が覆う場合に、治癒したとみなす。
【１０５５】
本発明のポリペプチドを、ビヒクル中で８日間、異なる用量の範囲（１日あた
り創傷あたり４ｍｇ〜５００ｍｇ）を用いて投与する。ビヒクルコントロール群
は、５０ｍＬのビヒクル溶液を受けた。
【１０５６】
動物を、８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔
内注射で安楽死させる。次いで、創傷および周囲の皮膚を、組織学のために収集
する。組織標本を、さらなる処理のために、生検スポンジの間の組織カ
セット内で１０％中性緩衝化ホルマリン中に置く。
【１０５７】
各々１０匹の動物（メチルプレドニゾロンを用いる５匹および糖質コルチコイ
ドを用いない５匹）の４つの群を評価する：１）非処置群、２）ビヒクルプラシ
ーボコントロール、３）処置群。
【１０５８】
創傷閉鎖を、垂直軸および水平軸で面積を測定すること、および創傷の面積の
合計を得ることにより分析する。次いで、閉鎖を、最初の創傷の面積（０日）と
処置後（８日）の面積との間の差異を確立することにより評価する。１日目のこ
の創傷面積は、６４ｍｍ2（皮膚パンチに対応するサイズ）である。計算を以下
の式を用いて行う：
［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］
標本を１０％緩衝化ホルマリン中に固定し、そしてパラフィン包埋塊を、創傷
表面に対して垂直に切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを
用いて切断する。慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、二等分
した創傷の横断切片で行う。創傷の組織学的試験は、修復した皮膚の治癒プロセ
スおよび形態的な外見を、本発明のポリペプチドを用いる処置によって改善した
かどうかを評価することを可能にする。目盛り付きレンズマイクロメーターを盲
検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ）が用いて、創傷の隙間の距離を
決定する。
【１０５９】
実験データを、片側ｔ検定を用いて分析する。＜０．０５のｐ値を有意とみな
す。
【１０６０】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１０６１】
（実施例５１：リンパ水腫（ｌｙｍｐｈａｄｅｍａ）動物モデル）
この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成およびリンパ
の循環系の再確立における本発明のポリペプチドの治療的効果を試験するための
、適切かつ一貫したリンパ水腫モデルを作製することである。有効性は、罹患し
た肢の腫脹体積、リンパの脈管の量の定量、総血漿タンパク質の量、および組織
病理学により測定される。急性リンパ水腫は、７〜１０日間観察される。恐らく
より重要なことは、水腫の慢性進行は、３〜４週間まで続く。
【１０６２】
手術を始める前に、血液サンプルを、タンパク質濃度分析のために採血する。
雄性ラット（体重約３５０ｇ）に、ペントバルビタールを投薬する。次いで、右
肢を膝から股関節部まで剃毛する。この剃毛した範囲を７０％ＥｔＯＨに浸した
ガーゼで拭く。血液を、血清総タンパク質試験のために採血する。周径測定およ
び体積測定を行った後に、２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点
）に印をつけた後、足へ色素を注射する。右足背および左足背の両方の内皮に、
０．０５ｍｌの１％Ｅｖａｎ’ｓ  Ｂｌｕｅを注射する。次いで、足への色素の
注射の後、周径測定および体積測定を行う。
【１０６３】
目印として膝関節を用いて、中肢鼡径部切開を、大腿血管の位置を確認できる
ように環状に行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開し、そして分離す
る。大腿血管の位置確認後、血管の横に沿ってかつ血管の下に走るリンパ管を位
置確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を、電気凝固縫合結紮する。
【１０６４】
顕微鏡を用いて、肢の背の筋肉（半腱様筋（ｓｅｍｉｔｅｎｄｉｎｏｓｉｓ）
および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認す
る。次いで、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管、ならびに膝窩節の
遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、膝窩リンパ節および任意の付
随する脂肪組織を、結合組織を切断することによって取り除く。
【１０６５】
この手順で生じるいかなる軽度の出血をも管理するように注意すること。リン
パ管を咬合した後、皮膚弁を、液体皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ  Ｂｕｃｋ）
を使用することによって密封する。別々の皮膚縁を、その下の筋肉組織に、脚の
周囲に約０．５ｃｍのギャップを残しながら密封する。皮膚はまた、必要なとき
にその下の筋肉に縫合することによって係留してもよい。
【１０６６】
感染を回避するために、動物を、メッシュを用いて個別に収容する（床敷きな
し）。回復した動物を、最適な水腫ピークを通して毎日チェックする。このピー
クは、代表的には５〜７日までに生じる。次いで、プラトーの水腫ピークを観察す
る。リンパ水腫の強度を評価するために、各肢上の２つの指定した場所の周径お
よび体積を、操作の前および７日間毎日測定する。リンパ水腫に対する血漿タン
パク質の効果を決定し、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるか否かも
また調査する。コントロール肢および水腫肢の両方の重量を、２箇所で評価する
。分析を盲目様式（ｂｌｉｎｄ  ｍａｎｎｅｒ）で行う。
【１０６７】
周径測定：肢の動きを防止するための短期気体麻酔のもとで、布巻尺を使用し
て、肢の周径を測定する。測定を、距骨および背面の足にて、２人の異なる人物
によって行い、次いで、これらの２つの読み取りを平均する。読み取りを、コン
トロールおよび水腫肢の両方から得る。
【１０６８】
体積測定：手術の日に、動物をペントバルビタールで麻酔し、そして手術の前
に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短期ハロタン麻酔（迅速な固定化
およびすばやい回復）のもとにおき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカー
を用いて脚に等しく印をつける。脚を、最初に水に漬け、次いで各々印をしたレ
ベルまで装置に漬け、次いでＢｕｘｃｏ水腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔ
ｏｒ）によって測定する。データを１人の人物によって記録し、一方他者は、脚
をしるしを付けた領域まで漬ける。
【１０６９】
血液−血漿タンパク質測定：手術の前に血液を取り出し、遠心分離し、そして
血清を分離し、次いで、全タンパク質およびＣａ２＋比較について結論付ける。
【１０７０】
肢重量比較：血液を取り出した後、この動物を、組織収集のために調製する。
この肢を、キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて切断し、次いで、実験用
脚とコントロール脚の両方を、結紮して切断し、そして秤量する。２回目の秤量
を、脛踵（ｔｉｂｉｏ−ｃａｃａｎｅａｌ）関節を外し、そして足を秤量して行
う。
【１０７１】
組織学的調製：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金属
型に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷メチルブタンに漬け、標識したサ
ンプルバッグに切断するまで−８０ＥＣにて配置する。切断の際に、筋肉を、蛍
光顕微鏡のもとで、リンパ管について観察する。
【１０７２】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１０７３】
（実施例５２：ＴＮＦα誘導性接着分子発現の本発明のポリペプチドによる抑
制）
炎症および新脈管形成の領域に対するリンパ球の漸増は、リンパ球上の細胞表
面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互作
用に関する。この接着プロセスは、通常の設定および病理学的設定の両方におい
て、内皮細胞（ＥＣ）における細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチ
ン）の発現を含む、多段階カスケードに続く。これらの分子および他の分子の血管
内皮における発現は、白血球が局所血管系に接着し得、そして炎症応答の発生の
間に局所組織に溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所
濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１０７４】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（強力な炎症誘発性サイトカイン）は、内皮細
胞における３つ全てのＣＡＭの刺激因子であり、そして広範な種々の炎症応答に
関与し得、しばしば病理学的結果をもたらす。
【１０７５】
ＴＮＦ−α誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する本発明のポリペプチドの潜在能
力を試験し得る。改変型ＥＬＩＳＡアッセイ（これは、固相吸着剤としてＥＣを
使用する）を使用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用いて同時
刺激した場合に、ＴＮＦ−α処理ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定
する。
【１０７６】
この実験を行うために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を、プール
した索採取物から得、そして１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマ
イシンを補充した増殖培地（ＥＧＭ−２；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅ
ｇｏ，ＣＡ）中で、５％ＣＯ2を含む３７℃の加湿インキュベーターにおいて維
持する。ＨＵＶＥＣを、ＥＧＭ培地中１×１０4細胞／ウェルの濃度で、９６ウ
ェルプレート中に、３７℃で１８〜２４時間またはコンフルエントになるまで播
種する。続いて、単層を、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌス
トレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で３回洗浄し、そ
して所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて、２４時間３７℃にて
処理した。インキュベーション後、次いで、この細胞を、ＣＡＭ発現について評
価する。
【１０７７】
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、標準的な９６ウェルプレートにおいて
コンフルエントになるまで増殖させる。増殖培地を、細胞から取り除き、そして
９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験のためのサンプルお
よびポジティブまたはネガティブコントロールを、このプレートに三連で添加す
る（１０μｌ容量）。プレートを、３７℃にて、５時間（セレクチンおよびイン
テグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュ
ベートする。プレートを吸引して、培地を除去し、そして１００μｌの０．１％
パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を有する）を各ウェル
に添加する。プレートを、４℃にて３０分間保持する。
【１０７８】
次いで、固定液をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）
＋０．５％ＢＳＡを用いて１回洗浄し、そして排水する。このウェルを乾燥させ
ないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェ
ルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ、抗ＶＣＡＭ−１−Ｂｉｏｔｉｎ
および抗Ｅ−セレクチン−Ｂｉｏｔｉｎを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ
／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。細胞を、加湿した環境におい
て、３７℃にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ
）＋０．５％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。
【１０７９】
次いで、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈ
ｏｓｐｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈）を各ウェルに添加し、そして３７℃
にて３０分間インキュベートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５
％ＢＳＡを用いて３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐ
ＮＰＰ）を、５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。グリシン
緩衝液中のｐＮＰＰ基質１００μｌを、各試験ウェルに添加する。三連の標準ウ
ェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏ
ｓｐｈｏｔａｓｅの操作希釈（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（１：５，
０００（１０0）＞１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5）から調製する。５μｌの各希
釈物を、三連のウェルに添加し、そして各ウェル中の得られたＡＰ含量は、５．
５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇである。次いで、１００
μｌのｐＮＰＰ試薬を、標準ウェルの各々に添加しなければならない。このプレ
ートを、３７℃にて４時間インキューベートしなければならない。３Ｍ  ＮａＯ
Ｈの５０μｌの容量を全てのウェルに添加する。この結果を、プレートリーダー
において４０５ｎｍにて定量する。バックグラウンド減算オプションを、グリシ
ン緩衝液のみで満たしたブランクウェルにおいて使用する。このテンプレートを
、各々の標準ウェルにおけるＡＰ結合体の濃度［５．５０ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］を示すように設定する。結果を、各サンプル中の
結合したＡＰ結合体の量として示す。
【１０８０】
本実施例において記載される研究は、本発明のポリペプチド活性を試験した。
しかし、当業者は、例証した研究を容易に改変して、本発明のポリヌクレオチド
（例えば、遺伝子治療）、アゴニスト、および／またはアンタゴニストの活性を
試験し得る。
【１０８１】
（実施例５３：骨髄ＣＤ４３＋細胞増殖の刺激についてのアッセイ）
このアッセイは、ヒトＣＤ３４＋が、造血増殖因子の存在下で増殖する能力に
基づき、そしてこのアッセイは、哺乳動物細胞において発現された単離ポリペプ
チドが、ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する能力を評価する。
【１０８２】
最も熟成した前駆体は、単一シグナルのみに応答することが以前に示されてい
る。より未熟な前駆体は、応答するために少なくとも２つのシグナルを必要とす
る。従って、ポリペプチドの広範な先祖細胞の造血活性に対する効果を試験する
ために、このアッセイは、他の造血増殖因子の存在下または非存在下において、
所定のポリペプチドを含む。単離された細胞を、試験サンプルと組み合わせて、
幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、５日間培養する。ＳＣＦのみは、骨髄（ＢＭ
）細胞の増殖に対して、非常に制限された効果を有し、「生存」因子としてのみ
、このような条件下で作用する。しかし、これらの細胞（例えば、ＩＬ−３）に
対する刺激効果を示す任意の因子と組み合わせると、ＳＣＦは、相乗効果を生じ
る。従って、試験されたポリペプチドが、造血祖先に対する刺激効果を有する場
合、このような活性は、容易に検出され得る。正常なＢＭ細胞は、低レベルの細
胞周期（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ）を有するので、所望のポリペプチド、ある
いはそのアゴニストまたはアンタゴニストのいかなる阻害効果も検出されないよ
うである。従って、先祖に対する阻害効果のためのアッセイが、好ましくは、Ｓ
ＣＦ＋ＩＬ＋３でのインビトロ刺激に最初に供され、次いで、このような誘起増
殖の阻害のために評価される化合物と接触させられる細胞において試験される。
【１０８３】
簡潔には、ＣＤ３４＋細胞は、当該分野で公知の方法を使用して単離される。
これらの細胞は、解凍され、そして、培地（１％  Ｌ−グルタミンを有するＱＢ
ＳＦ  ６０  血清のない培地（５００ｍｌ）（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ  Ｃａｔ＃  １６０−２０
４−１０１））に再懸濁される。２００×ｇでのいくらか穏やかな遠心分離の後
、細胞は、１時間静置される。細胞数を２．５×１０5細胞／ｍｌに調節する。
この時間の間、１００μｌの滅菌水を９６ウェルプレートの周辺ウェルに添加す
る。このアッセイにおいて、所定のポリペプチドで試験され得るサイトカインは
、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ
ｉｓ，ＭＮ，Ｃａｔ＃  ２５５−ＳＣ）のみであり、そして３０ｎｇ／ｍｌのｒ
ｈＳＣＦとｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，
ＭＮ，Ｃａｔ＃  ２０３−ＭＬ）との組み合わせである。１時間後、１０μｌの
調製されたサイトカイン、５０μｌの上清（１：２希釈での上清＝５０μｌ）お
よび２０μｌの希釈された細胞を、培地に添加し、この培地は、１００μｌの最
終全体積にするためにすでにウェル中に存在する。次いで、このプレートを３７
℃／５％  ＣＯ2インキュベータに５日間置く。
【１０８４】
アッセイを行う（ｈａｒｖｅｓｔ）１８時間前に、０．５μＣｉ／ウェルの［
３Ｈ］チミジンを、各ウェルに１０μｌの体積で添加し、増殖率を決定する。こ
の実験は、Ｔｏｍｔｅｃ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ  ９６を使用して、細胞を、各９
６ウェルプレートからフィルターマットに収集することによって終結される。収
集後、フィルターマットを乾燥し、トリムし、そして１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅ
ｒプレートおよび１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒトレイからなるＯｍｎｉＦｉｌｔ
ｅｒアセンブリに置く。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを各ウェルに添加し、
そしてプレートをＴｏｐＳｅａｌ-Ａプレスオンシーリングフィルムで密閉する。バーコー
ド１５ステッカーを計数のために、第１のプレートに固定する。次いで、密閉さ
れたプレートを充填し、そして放射能のレベルを、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃ
ｏｕｎｔを介して決定し、プリントされたデータを分析のために収集する。放射
能レベルは、細胞増殖の量を反映する。
【１０８５】
本実施例に記載される研究は、骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖を刺激する、所定のポ
リペプチドの活性を試験する。当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治
療）、抗体、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト、ならびにそれらのフ
ラグメントおよび改変体の活性を試験するために、例示された実施例を容易に改
変し得る。非限定的な実施例として、このアッセイで試験される可能性のあるア
ンタゴニストは、サイトカインの存在下で細胞増殖を阻害すること、および／ま
たはサイトカインおよび所定のポリペプチドの存在下で細胞増殖の阻害を増加さ
せることが期待される。対照的に、このアッセイで試験される可能性のあるアゴ
ニストは、細胞増殖を増強し、そして／またはサイトカインおよび所定のポリペ
プチドの存在下で、細胞増殖の阻害を減少させることが期待される。
【１０８６】
骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する遺伝子の能力は、この遺伝子に対応する
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが、免疫系および造血に影響す
る障害の診断および処置に有用であることを示す。代表的な用途は、上記の「免疫活性」お
よび「感染疾患」の節、ならびに本明細書中の他の箇所に記載される。
【１０８７】
（実施例５４：細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）についてのア
ッセイ）
細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）アッセイの目的は、細胞外マ
トリックス（ＥＣＭ）誘導シグナルに関連して、造血幹細胞に作用する遺伝子産
物（例えば、単離されたポリペプチド）を同定することである。
【１０８８】
周囲のミクロ環境から受けるシグナルに関連して、細胞は、調節因子に応答す
る。例えば、線維芽細胞、ならびに内皮幹細胞および上皮幹細胞は、ＥＣＭから
のシグナルの非存在下で、複製することができない。造血幹細胞は、骨髄中で自
己再生を起こし得るが、インビトロ懸濁液培養ではそうではない。インビトロで
自己再生を起こす幹細胞の能力は、間質（ｓｔｒｏｍａｌ）細胞およびＥＣＭタ
ンパク質フィブロネクチン（ｆｎ）とのそれらの相互作用に依存する。細胞のｆ
ｎへの吸着は、α5．β1およびα4．β1インテグリンレセプターによって媒介さ
れ、これらのレセプターは、ヒトおよびマウス造血幹細胞によって発現される。
ＥＣＭ環境で組み込み、そして幹細胞の自己再生の刺激の原因である因子は未だ
同定されていない。このような因子の発見は、遺伝子治療および骨髄移植適用に
おける重要な目的である。
【１０８９】
簡潔には、ポリスチレンの組織培養処理されていない９６ウェルプレートは、
０．２μｇ／ｃｍ2のコーティング濃度でｆｎフラグメントでコートされる。マ
ウス骨髄細胞を、０．２ｍｌの血清のない培地にプレートする（１，０００細胞／
ウェル）。ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で
培養された細胞は、幹細胞の自己再生が期待されず、明確な分化が期待される条
件で、ポジティブコントロールとして作用する。遺伝子産物は、ＳＣＦ（５．０
ｎｇ／ｍｌ）の存在下、または非存在下で適切なネガティブコントロールととも
に試験され、ここで、試験因子の上清は、全アッセイ体積の１０％を示す。次い
で、プレートされた細胞を、低酸素環境（５％ＣＯ2、７％Ｏ2および８８％Ｎ2
）の組織培養インキュベータで７日間インキュベートすることによって増殖させ
る。次いで、ウェル内の増殖細胞の数を、細胞ＤＮＡへのチミジン組込みを測定
することによって定量する。アッセイにおけるポジティブヒットの確認は、細胞
の表現型の特徴付けを必要とし、この特徴付けは、培養系をスケールアップし、
そして細胞表面抗原およびＦＡＣＳｃａｎに対する適切な抗体試薬を使用するこ
とによって達成されうる。
【１０９０】
当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、抗体、アゴニスト、お
よび／またはアンタゴニストならびにそのフラグメントおよび改変体の活性を試
験するための例示的な研究を容易に改変し得る。
【１０９１】
特定の遺伝子産物は、造血祖先の刺激薬であることが見出される場合、この遺
伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、免疫系および造血に影
響する障害の診断、ならびに処置に有用であり得る。代表的な用途は、上記の「
免疫活性」および「感染疾患」の節、ならびに本明細書の他の箇所に記載される
。遺伝子産物はまた、種々の血液系統（系列）の幹細胞および先駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｅ
ｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）の拡張において、そして種々の細胞の型の分化およ
び／または増殖において有用であり得る。
【１０９２】
さらに、目的の遺伝子のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、なら
びに／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストはまた、造血細胞の
増殖および分化を阻害するために使用され、そしてそれによって、化学療法の間
に、化学療法薬剤から骨髄幹細胞を保護するために使用され得る。この抗増殖効
果は、より高い用量の化学療法薬剤の投与、従って、より有効な化学治療処置を
可能にし得る。
【１０９３】
さらに、目的の遺伝子に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチドもまた
、造血関連障害（例えば、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、
または白血病）の処置および診断に有用であり得る。なぜなら、間質細胞は、造
血系列の細胞の生成において重要であるからである。これらの用途としては、骨
髄細胞エキソビボ培養、骨髄移植、骨髄再形成、新形成の放射線療法または化学
療法が、挙げられる。
【１０９４】
（実施例５５：ヒト皮膚線維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の増殖）
目的のポリペプチドを、正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびヒト大
動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の培養物に添加し、そして２つの同時アッセイを
各サンプルを用いて実施する。第１のアッセイは、正常なヒト線維芽細胞（ＮＨ
ＤＦ）または大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の増殖に対する、目的のポリペプ
チドの効果を試験する。線維芽細胞または平滑筋細胞の異常な増殖は、いくつか
の病理学的プロセス（繊維症および再狭窄を含む）の一部である。第２のアッセ
イは、ＮＨＤＦおよびＳＭＣの両方によるＩＬ６産生を試験する。ＩＬ６産生は
、機能的活性化の指標である、活性化細胞は、多数のサイトカインおよび他の因
子の産生の増加を有し、これは、炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
）または免疫調節性の結果を生じ得る。アッセイは、同時刺激活性または阻害活
性をチェックするために、同時ＴＮＦａ刺激とともに、そして同時ＴＮＦａ
刺激なしで行う。
【１０９５】
簡単に述べると、１日目に、９６ウェルの黒いプレートに、１００μｌ培養培
地中に１０００細胞／ウェル（ＮＨＤＦ）または２０００細胞／ウェル（ＡｏＳ
ＭＣ）を配置する。ＮＨＤＦ培養培地は、以下：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＦＢ基礎
培地、１ｍｇ／ｍｌ  ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、５０ｍｇ／ｍｌゲン
タマイシン、２％  ＦＢＳを含み、一方ＡｏＳＭＣ培養培地は、Ｃｌｏｎｅｔｉ
ｃｓ  ＳＭ基礎培地、０．５μｇ／ｍｌ  ｈＥＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、
１μｇ／ｍｌ  ｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ  Ａ
ｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ、５％  ＦＢＳを含む。３７℃で少なくとも４〜５
時間のインキュベーション後、培養培地を吸引し、増殖停止培地で置換する。Ｎ
ＨＦＤ用の増殖停止培地は、線維芽細胞基礎培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシ
ン、２％  ＦＢＳを含み、一方ＡｐＳＭＣ用の増殖停止培地は、ＳＭ基礎培地、
５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  
Ｂ、０．４％  ＦＢＳを含む。３７℃で２日目までインキュベートする。
【１０９６】
２日目、目的のポリペプチドの系列希釈物およびテンプレートを、それらが常
に、培地コントロールおよび既知のタンパク質コントロールを含むように、設計
する。刺激実験および阻害実験の両方について、タンパク質を増殖停止培地で希
釈する。阻害実験について、ＴＮＦａを、最終濃度２ｎｇ／ｍｌ（ＮＨＤＦ）ま
たは５ｎｇ／ｍｌ（ＡｏＳＭＣ）まで添加する。コントロールまたは上清を含む
１／３容量の培地を添加し、そして５日目まで、３７℃／５％  ＣＯ2にてインキ
ュベートする。
【１０９７】
各ウェルから６０μｌを別の標識９６ウェルプレートに移し、プレートシーラ
ーで覆い、そして６日目まで４℃で（ＩＬ６  ＥＬＩＳＡのために）保存する。
細胞培養プレート中の残りの１００μｌに、その培養物容量の１０％に等しい量
（１０μｌ）のＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを無菌的に添加する。プレートを３〜４
時間の間インキュベーターに戻す。次いで、５３０ｎｍでの励起および５９０ｎ
ｍでの放射を伴う蛍光を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒを使用して測定する。これにより
、増殖刺激／阻害のデータを得る。
【１０９８】
５日目、ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈した５０〜１
００μｌ／ウェルの抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体で９６ウェルプレートを
コーティングすることによって実施し、室温で一晩インキュベートする。
【１０９９】
６日目、プレートの中身を流しに空け、そしてペーパータオル上で吸い取る。
４％  ＢＳＡを含むＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を調製する。プレートを、ＰＢ
Ｓ中の２００μｌ／ウェルのＰｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋブロッキン
グ緩衝液で１〜２時間ブロックし、次いで、洗浄緩衝液（ＰＢＳ，０．０５％  
Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。プレートをペーパータオル上で吸い
取る。次いで、０．５０ｍｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＩＬ−６モノクローナルビ
オチン標識抗体５０μｌ／ウェルを添加する。ＩＬ−６ストックの培地中の希釈
物を作製する（３０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ
、０．３ｎｇ／ｍｌ、０ｎｇ／ｍｌ）。二連のサンプルをプレートの最上列に添
加する。プレートを覆い、そして振盪機上で室温で２時間インキュベートする。
【１１００】
プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオル上で吸い取る。ＥＵ標識スト
レプトアビジンをアッセイ緩衝液中に１：１０００希釈し、そして１００μｌ／
ウェルを添加する。プレートを覆い、そして室温で１時間インキュベートする。
プレートを洗浄緩衝液で洗浄する。ペーパータオル上で吸い取る。
【１１０１】
１００μｌ／ウェルの増強溶液を添加し、そして５分間振盪する。Ｗａｌｌａ
ｃ  ＤＥＬＦＩＡ蛍光測定器でプレートを読み取る。各アッセイでの三連のサン
プルからの読み取りを、表にして平均をとる。
【１１０２】
このアッセイにおける陽性の結果は、ＡｏＳＭＣ細胞増殖を示唆し、そして目
的の遺伝子産物が皮膚線維芽細胞増殖および／または平滑筋細胞増殖に関与し得
ることを示唆する。陽性の結果はまた、目的の遺伝子／遺伝子産物のポリペプチ
ド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド／ポリペプチドのアゴニストおよび／
またはアンタゴニストの多くの潜在的な使用を示唆する。例えば、本明細書の全
体にわたって記載されるように、炎症および免疫応答、創傷の治癒、ならびに新
脈管形成。特に、この遺伝子産物のポリペプチドおよびこの遺伝子のポリヌクレ
オチドは、創傷の治癒および皮膚の再生、ならびに脈管形成（血管およびリンパ
管の両方）の促進に使用され得る。脈管の成長は、例えば、心臓血管疾患の処置
において使用され得る。さらに、この遺伝子産物のポリペプチドおよびこの遺伝
子のポリヌクレオチドのアンタゴニストは、抗脈管（例えば、抗新脈管形成）と
して作用することによって、新脈管形成を含む、疾患、障害、および／または状
態を処置する際に有用であり得る。これらの疾患、障害、および／または状態、
例えば以下：悪性腫瘍、固形腫瘍、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経
線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）；関節硬化性斑（ａｒｔｈｅｒｏｓ
ｃｌｅｒｉｃ  ｐｌａｑｕｅ）；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜障害
、未熟児の網膜障害、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維
増殖症、皮膚潮紅、網膜芽細胞腫、ぶどう膜炎、および眼の翼状片（異常な血管
の成長））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延性の創傷の治癒；子宮内膜症；脈管
形成；顆粒形成；過形成性瘢痕（ケロイド）；非結合性骨折（ｎｏｎｕｎｉｏｎ
ｆｒａｃｔｕｒｅ）；強皮症；トラコーマ；脈管接着；心筋新脈管形成；冠状
側副枝；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性の肢の新脈管形成；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅ
ｂｂｅｒ症候群；斑の新生血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維
腫；線維性筋性形成異常症；創傷肉芽化；クローン病；およびアテローム性硬化
症などは、当該分野において公知でありそして／または本明細書中で記載される
。さらに、この遺伝子産物のポリペプチドおよびこの遺伝子のポリヌクレオチド
のアンタゴニストは、当該分野において公知でありそして／または本明細書中で
記載される、抗過剰増殖性疾患および／または抗炎症性疾患を処置する際に有用
であり得る。
【１１０３】
当業者は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子治療）、抗体、アゴニスト、お
よび／またはアンタゴニスト、ならびにそのフラグメントおよび改変体の活性を
試験するために例示された研究を容易に改変し得る。
【１１０４】
（実施例５６：内皮細胞上での細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現）
リンパ球の、炎症および新脈管形成の領域に対する漸増は、リンパ球上の細胞
表面接着分子（ＣＡＭ）と脈管内皮との間の特異的なレセプター−リガンド相互
作用を含む。接着プロセスは、通常の環境および病的な環境の両方において、多
段階のカスケードに続き、このカスケードは、内皮細胞（ＥＣ）上での細胞内接
着分子１（ＩＣＡＭ−１）、脈管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮
性白血球接着分子１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む。脈管内皮上でのこれらの
分子などの発現は、白血球が局所的な脈環構造と接着し、そして炎症性応答の進
行の間に局所的な組織へと溢出し得る効率を決定する。サイトカインおよび増殖
因子の局所的濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１１０５】
簡単には、内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））は、標準
９６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖する。増殖培地を、細胞から除
去し、そして１００μｌの１９９  Ｍｅｄｉｕｍ（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ
））で置き換える。試験のためのサンプルおよび陽性または陰性のコントロール
を、３部構成（１０μｌの容量ずつ）のプレートに添加する。次いで、プレート
を、３７℃で、５時間（セレクチンおよびインテグリンの発現）かまたは２４時
間（インテグリンの発現のみ）のいずれかの間インキュベートする。プレートを
、培地を除去するために吸引し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデ
ヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋含有）を各ウェルに添加する。プレート
を４℃で３０分間保持する。固定剤をウェルから除去し、そしてウェルをＰＢＳ
（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで１回洗浄し、そして水気を切る。１０μｌ
の希釈した１次抗体を、試験ウェルおよびコントロールウェルに添加する。抗Ｉ
ＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチン、および抗Ｅ−セレクチン−
ビオチンを、１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌの貯蔵抗体の１：１０希
釈）で使用する。細胞を３７℃で３０分間、加湿された環境においてインキュベ
ートする。ウェルを、ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する
。２０μｌの希釈されたＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｔａｓｅ（１：５，０００希釈、本明細書中で実用的な希釈液といわれる）
を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ウェルを、
ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）＋０．５％ＢＳＡで３回洗浄する。５ｍｌのグリシン緩
衝液（ｐＨ１０．４）につき１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェート（ｐＮＰ
Ｐ）を溶解する。グリシン緩衝液中の１００μｌのｐＮＰＰ基質を各試験ウェル
に添加する。３部構成の標準ウェルを、グリシン緩衝液中のＥｘｔｒＡｖｉｄｉ
ｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ；１：５，０００（１０0）＞
１０-0.5＞１０-1＞１０-1.5の実用的な希釈液から調製する。各希釈液の５μｌ
を３部構成のウェルに添加すると、各ウェル中の得られるＡＰ含有量は、５．５
ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇ、である。次いで、１００μ
ｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルの各々に添加する。このプレートを、３７℃で４
時間インキュベートする。５０μｌの容量の３Ｍ  ＮａＯＨを、全てのウェルに
添加する。このプレートを、グリシン緩衝液のみを充填したブランクウェルでの
バックグラウンド除去オプションを使用して、４０５ｎｍのプレートリーダーで
読む。さらに、テンプレートを、各標準ウェル中のＡＰ共重合体の濃度［５．５
０ｎｇ；１．７４ｎｇ；０．５５ｎｇ；０．１８ｎｇ］を示すようにセットアッ
プする。結果を、各サンプル中の結合したＡＰ共重合体の量として示す。
【１１０６】
（実施例５７：Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ内皮細胞増殖アッセイ）
このアッセイを使用して、ウシリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）、ウシ大動脈内皮細
胞（ＢＡＥＣ）、またはヒト微小血管子宮筋細胞（ＵＴＭＥＣ）のｂＦＧＦ誘導
増殖のタンパク質媒介性阻害を定量的に決定し得る。このアッセイは、代謝活性
の検出に基づいて、蛍光定量的な増殖インジケーターを組み込む。標準Ａｌａｍ
ａｒ  Ｂｌｕｅ増殖アッセイを、内皮細胞刺激の供給源として添加した１０ｎｇ
／ｍｌのｂＦＧＦを含むＥＧＭ−２ＭＶ中で調製する。このアッセイは、増殖培
地および細胞濃度がわずかに変化した様々な内皮細胞と共に使用され得る。試験
されるべきタンパク質バッチの希釈物を、適切に希釈する。ｂＦＧＦなしの血清
を含有しない培地（ＧＩＢＣＯ  ＳＦＭ）を、非刺激コントロールとして使用し
、そしてＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎまたはＴＳＰ−１は、既知の阻害コントロール
として含まれる。
【１１０７】
簡単には、ＬＥＣ、ＢＡＥＣまたはＵＴＭＥＣを、９６ウェルプレートに、５
０００〜２０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地に播種し、そして３７℃で一
晩放置する。この細胞の一晩のインキュベーションの後、増殖培地を除去し、そ
してＧＩＢＣＯ  ＥＣ−ＳＦＭで置き換える。この細胞を、追加のｂＦＧＦを含
む３つのウェル中で、目的のタンパク質またはコントロールタンパク質サンプル
の適切な希釈物（ＳＦＭ中で調製）で、１０ｎｇ／ｍｌの濃度まで処理する。一
旦、細胞をサンプルで処理すると、プレート（単数または複数）を、３７℃のイ
ンキュベーターに３日間戻す。３日後、１０ｍｌのストックＡｌａｍａｒ  Ｂｌ
ｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｃａｔ＃  ＤＡＬ１１００）を、各ウェルに添加し
、そしてプレート（単数または複数）を、３７℃のインキュベーターに４時間戻
す。次いで、このプレート（単数または複数）を、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リー
ダーを使用して、５３０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光で読みとる。直接出力を
、相対蛍光単位で記録する。
【１１０８】
Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応答
して、蛍光を発しかつ色を変化する、酸化−還元指示薬である。培地中で細胞が
増殖するにつれて、生得代謝活性によりすぐ周辺の環境の化学的還元が生じる。
増殖に関する還元により、この指示薬は、酸化（非蛍光性の青色）形態から還元
（蛍光性赤色）形態に変化し得る。すなわち、刺激された増殖は、より強いシグ
ナルを生成し、そして阻害された増殖は、より弱いシグナルを生成し、そして全
シグナルは細胞の総数ならびにそれらの代謝活性に比例する。活性のバックグラ
ウンドレベルは、飢餓性培地のみを用いて観察される。これを陽性コントロール
サンプル（増殖培地中のｂＦＧＦ）およびタンパク質希釈物から観察される出力
と比較する。
【１１０９】
（実施例５８：混合リンパ球反応の阻害の検出）
このアッセイを使用して、遺伝子産物（例えば、単離されたポリペプチド）に
よる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害を検出および評価し得る。ＭＬＲの阻害
は、細胞増殖および生存度、相互作用する細胞における同時刺激分子の変調、リ
ンパ球と副細胞との間の接着の変調、または副細胞によるサイトカイン産生の変
調に対する直接効果に起因し得る。複数の細胞は、これらのポリペプチドによっ
て標的化され得る。なぜなら、このアッセイで使用される末梢血液単核画分は、
Ｔ、Ｂおよびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球および樹状細胞を含むた
めである。
【１１１０】
ＭＬＲを阻害することが見出された目的のポリペプチドは、リンパ球および単
球の活性化または増殖に関する疾患における用途を見出し得る。これには、喘息
、関節炎、糖尿病、炎症性の皮膚状態、乾癬、湿疹、全身性エリテマトーデス、
多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、動脈硬
化症、肝硬変、対宿主性移植片病、対移植片性宿主病、肝炎、白血病およびリン
パ腫のような疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【１１１１】
簡単には、ヒトドナー由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＳＭ（登録商標）、密度  １．０７７０ｇ／ｍｌ
、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈ
ｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を使用する密度勾配遠心分離によって精製する。２つのドナ
ー由来のＰＢＭＣを、１０％  ＦＣＳおよび２ｍＭ  グルタミンを補ったＲＰＭ
Ｉ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎ
ｄ、ＮＹ）中、２×１０6細胞／ｍｌに調整する。第３のドナー由来のＰＢＭＣ
を、２×１０5細胞／ｍｌに調整する。各ドナー由来の５０μｌのＰＢＭＣを、
９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。試験材料の希釈
物（５０μｌ）を、三連でマイクロタイターウェルに添加する。（目的のタンパ
ク質の）試験サンプルを１：４の最終希釈になるまで添加し；ｒｈｕＩＬ−２（Ｒ
＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号  ２０２
−ＩＬ）を、１μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加し；抗−ＣＤ４  ｍＡｂ（
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、クローン  ３４９３０．１１、カタログ番号  ＭＡＢ
３７９）を１０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで添加する。細胞を、５％  ＣＯ
2中、３７℃で７〜８日間培養し、そして１μＣの［3Ｈ］チミジンを、培養の最
後の１６時間でウェルに添加する。細胞を収集し、そしてチミジンの取込みを、
Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔを使用して決定する。データを、３つの測定
値の平均および標準偏差として表す。
【１１１２】
目的のタンパク質のサンプルを、別個の実験でスクリーンし、そして陰性コン
トロール処理、抗−ＤＣ４  ｍＡＢ（これはリンパ球の増殖を阻害する）、およ
び陽性コントロール処理、ＩＬ−２（組換え物質または上清として）（これは、
リンパ球の増殖を促進する）と比較する。
【１１１３】
当業者は、例示の研究を容易に改変して、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子
治療）、抗体、アゴニスト、および／またはアンタゴニスト、ならびにそれらの
フラグメントおよび改変体の活性を試験し得る。
【１１１４】
本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【１１１５】
発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本明細書にとともに提出され
た配列表のハードコピーおよび対応するコンピュ−ター読み出し形態は、両方と
も本明細書中にその全体が参考として援用される。さらに、米国仮出願第６０／
１６４，８３５号および同第６０／２２１，１４２号の内容は、それらの全体が
参考として本明細書に援用される。
【１１１６】
【表１１】
2011087587.tif 000048
ＰＴＡ−８６７
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【１１１７】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１１１８】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【１１１９】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  
Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【１１２０】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。
【１１２１】
（デンマーク）
出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ  ｏｆ  
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１１２２】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ  Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ  Ｉのａｎｎｅｘ  Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ  ｏｆ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【１１２３】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【数１】
2011087587.tif 000049
【数２】
2011087587.tif 000050
【数３】
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【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１】
2011087587.tif 000059
【数１２】
2011087587.tif 000060
【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
2011087587.tif 000063
【数１６】
2011087587.tif 000064
【数１７】
2011087587.tif 000065
【数１８】
2011087587.tif 000066
【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【数２２】
2011087587.tif 000070
【数２３】
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【数２４】
2011087587.tif 000072
【数２５】
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【数２６】
2011087587.tif 000074
【数２７】
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【数２８】
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【数２９】
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【数３０】
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【数３１】
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【数３２】
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【数３３】
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【数３４】
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【数３５】
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【数３６】
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【数３７】
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【数３８】
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【数３９】
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【数４０】
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【数４１】
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【数４２】
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【数４３】
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【数４４】
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【数４５】
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【数４６】
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【数４７】
2011087587.tif 000095
【数４８】
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【数４９】
2011087587.tif 000097
【数５０】
2011087587.tif 000098
【数５１】
2011087587.tif 000099
【数５２】
2011087587.tif 000100
【数５３】
2011087587.tif 000101
【数５４】
2011087587.tif 000102
【数５５】
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