(57)【要約】【課題】大きな規模で培養を行った場合にも一定の品質の高分子ヒアルロン酸を得ることができる方法を提供すること。【解決手段】撹拌翼を備えた培養槽中で乳酸菌を培養することにより多糖類を製造する方法において、撹拌翼の先端とｐＨ電極が最接近したときの、撹拌翼の先端からｐＨ電極までの距離が０．１ｃｍ〜２０ｃｍとなるようにｐＨ電極を設置して培養液のｐＨを測定し、測定したｐＨの値に応じて培養中の培養液のｐＨを調整することを特徴とする方法。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
撹拌翼を備えた培養槽中で乳酸菌を培養することにより多糖類を製造する方法において、
撹拌翼の先端とｐＨ電極が最接近したときの、撹拌翼の先端からｐＨ電極までの距離が０．１ｃｍ〜２０ｃｍとなるようにｐＨ電極を設置して培養液のｐＨを測定し、測定したｐＨの値に応じて培養中の培養液のｐＨを調整することを特徴とする方法。
【請求項２】
撹拌翼径（Ｌ）の培養槽の内径（Ｄ）に対する比（Ｌ／Ｄ）が０．３〜０．８である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培養中の培養液のｐＨが６．５〜８．５である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
攪拌翼が門型翼、マックスブレンド翼又はスーパーミックス翼である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
多糖類を産生する微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物からなる群から選ばれる少なくとも一種の乳酸菌である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
乳酸菌が、ヒアルロン酸生産能を有する微生物である請求項５記載の方法。
【請求項７】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓである請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＭＫ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）である請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は菌の体外に多糖類を生産することが知られており、菌の種類によって多種多様な多糖類を生産する。このような多糖類は、様々な物理化学的性質や生理機能を有していることから、食品、化粧品、医療等幅広い用途で用いられており、生産性を上げるための研究が盛んになされている。なかでも、ヒアルロン酸は、医療用途（例えば、関節炎治療薬）、化粧品用途（例えば、保湿剤等）、食品用途等、幅広く使用され、使用目的によって様々な平均分子量のものが求められている。
【０００３】
ヒアルロン酸は、一定の品質の製品が得られ易いことから、多くの場合、培養法によって製造されている。培養法によってヒアルロン酸を製造する場合には、薬剤等を用いて、使用する微生物が本来有するヒアルロン酸分解酵素（ヒアルロニダーゼ）を発現しないようにした変異株を培養することにより、平均分子量の大きいヒアルロン酸を取得している（特許文献１〜３参照）。
【０００４】
さらに、分子量低下を抑制して高分子量の製品を得る方法として、培養液から速やかに菌体を除去する方法、例えば、培養液を希釈して濾過により菌体を除去する方法（特許文献４参照）、培養液を１０℃以下に冷却し、遠心分離により菌体を除去する方法（特許文献５参照）が知られている。
【０００５】
しかしながら、培養規模の小さい（小さな容器を用いて培養を行う）場合は、容易に一定の品質の高分子ヒアルロン酸を得ることができるが、培養規模が大きい（大きな容器を用いて培養を行う）場合は、培養液の粘度の増加により一定の品質の高分子ヒアルロン酸を得ることは非常に困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公平０４−６３５６号公報
【特許文献２】特公平０４−４３６３７号公報
【特許文献３】特許第２５４７９６５号広報
【特許文献４】特開平０１−６７１９６号広報
【特許文献５】特許第２５７１９０８号広報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、大きな規模で培養を行った場合にも一定品質の高分子量の多糖類を得ることができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、培養中に培養液の特定の場所におけるｐＨを測定して培養液のｐＨを制御（コントロール）することにより上記課題を達成することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、撹拌翼を備えた培養槽中で乳酸菌を培養することにより多糖類を製造する方法において、撹拌翼の先端とｐＨ電極が最接近したときの、撹拌翼の先端からの距離が０．１ｃｍ〜２０ｃｍの位置でｐＨを測定することにより、培養中のｐＨを調整することを特徴とする方法に係る。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、培養規模が大きい場合でも、効率良く高分子量の多糖類を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１における培養中の培地のｐHの経時変化を示す図である。
【図２】比較例１における培養中の培地のｐHの経時変化を示す図である。
【図３】培養槽（培養装置）の一部を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明では、撹拌翼を備えた培養槽中で乳酸菌を培養することにより多糖類を製造する際に、培養液のｐＨを調整するためのｐＨを測定する場所が重要である。
【００１３】
（１）培養槽
本発明で使用する培養槽の大きさは、多糖類が大規模で製造できれば限定されないが、例えば０．１ｍ３（１００Ｌ）〜１００ｍ３の大きさの培養槽を使用する場合に適している。培養槽の大きさは、好ましくは０．２〜８０ｍ３、より好ましくは０．５〜５０ｍ３である。
【００１４】
培養槽の形状も限定されない。例えば、球状、カプセル状、円柱・円筒状の培養槽を挙げることができる。また、必要に応じて、バッフル、攪拌翼、スパージャーが取り付けてあり、さらに、温度調節のために、ジャケット、又は、内部コイルを取り付けたものが好ましいが、高分子量の多糖類が得られれば特に限定されない。
【００１５】
培養槽の材質も、微生物が安定して培養でき、高粘度の多糖類が十分に得られれば限定されない。例えば、ステンレス製のものが好ましく、さらに槽内壁をＳＵＳ３１６、ガラス、テフロン（登録商標）、チタン等でコーティングしたものがより好ましい。
【００１６】
（２）撹拌翼
当該培養槽は撹拌翼が備えられており、乳酸菌を培養する際に撹拌翼で培地を撹拌する。
【００１７】
撹拌翼の形状としては、例えば、門型翼、マックスブレンド翼、スーパーミックス翼等を使用することができが、培養液中の多糖類の濃度が高くなって培養液の粘度が上昇しても、培養液が十分に撹拌されれば、特には限定されない。翼の数も粘度の高い培養液が十分に撹拌できれば限定されず、当業者が適宜選択することができる。
【００１８】
撹拌翼の材質も、微生物が安定して培養でき、高粘度の多糖類が十分に得られれば限定されない。例えば、ステンレス製が好ましく、さらにガラス、テフロン（登録商標）、チタンでコーティングしたものや、ＳＵＳ３１６のステンレス製がより好ましい。
【００１９】
撹拌翼の大きさとしては、撹拌翼径（Ｌ）の培養槽の内径（Ｄ）に対する比（Ｌ／Ｄ）が０．３〜０．８であることが好ましく、より好ましくは０．３５〜０．７、更に好ましくは０．４５〜０．６の大きさである。Ｌ／Ｄを０．３以上とすることにより、多糖類の濃度が高くなって培養液が高い粘性を有するようになっても培養液全体を十分に撹拌することができる。Ｌ／Ｄを０．８以下とすることにより、撹拌軸への負担を軽減することができ、且つ、使用するモーター出力も軽減できる。
【００２０】
「培養槽の内径」とは、培養槽内部の攪拌軸と垂直方向の最も長い直径をいう。例えば、上下の鏡部分（醗酵槽の上下部分の丸い部分）に挟まれた円筒部分から成る培養槽を使用する場合、当該円筒部分の槽内の直径をいう。「撹拌翼径」とは、撹拌軸の中心から撹拌翼の先端までの最も長い距離を２倍した径をいう。「撹拌翼の先端」とは、撹拌軸から垂直に測定した場合に最も遠い部分をいう。
【００２１】
（３）ｐＨの測定
本発明では、培養中の培養液のｐＨをｐＨメーターを用いて制御する。すなわち、ｐＨメーターが培養液のｐＨの上昇を感知した場合は酸を添加してｐＨを下げ、逆に、ｐＨの下降を感知した場合にはアルカリを添加してｐＨを上げるようにすればよい。当該ｐＨの制御は手動で行っても良いが、自動制御が好ましい。制御装置の種類についは限定されず、市販のものを使用することも可能である。
【００２２】
ｐＨメーターの種類や大きさについては限定されず、市販のものを使用することができる。例えば、ｐＨ電極のような培養液に接触する部分（培養液に接触してｐＨを感知する部分）がオートクレーブに耐える材質でできていることが好ましい。
【００２３】
ここで使用する、培養液のｐＨを調整するための酸及びアルカリの種類は、微生物の生育に影響を及ぼさず、また得られる多糖類の製品に悪影響を及ぼさなければ限定されない。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、燐酸、酢酸、クエン酸等を挙げることができる。これらの中でも、安価で、且つ、金属の腐食に影響しない硫酸が好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等を挙げることができる。これらの中でも、安価であることから、水酸化ナトリウムが好ましい。例えば、乳酸菌が産生する乳酸、且つ、多糖類が酸性の物質である場合は、培養を通してｐＨが低下し続けるので、ｐＨ制御はｐＨの下降を防止するために水酸化ナトリウムのみを用いることが可能である。
【００２４】
ｐＨ電極は、撹拌翼の先端とｐＨ電極が最接近したときの、撹拌翼の先端からの距離（攪拌翼先端とｐＨ電極の間隔）が０．１ｃｍ〜２０ｃｍとなる位置にセットする。好ましくは０．２〜１９ｃｍ、更に好ましくは０．５〜１８ｃｍの位置である（例えば、図３参照）。この間隔は（当該位置でｐＨを測定して培養液のｐＨを調整することにより）、粘性の高くなった培養液においてもｐＨのハンティング（ｐＨの値が上下に大きく振れること）を防ぐことができるので、高分子量の多糖類を効率良く製造することができる。
【００２５】
培養液のｐＨは、使用する微生物によって至適ｐＨが異なるので、使用する微生物の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物を使用する場合は、６．５〜８．５のｐＨが好ましく、より好ましくは７〜８．４、更に好ましくは７．２〜８．２の範囲である。当該範囲で微生物を培養することにより、高分子量の多糖類を効率よく得ることができる。
【００２６】
（４）乳酸菌及び乳酸菌由来の多糖類
本発明における乳酸菌とは、通常の培養により菌体外に多糖類を生産することができる乳酸菌のことである。当該乳酸菌は多糖生産能を有していれば種類は限定されない。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物等を挙げることができる。
【００２７】
乳酸菌の生産する乳酸菌由来の多糖類には、単一の糖からなるホモ多糖と、複数の単糖や単糖誘導体からなるヘテロ多糖がある。ホモ多糖には、グルコースからなるデキストリン、βグルカン、ムタン、アルテルナンとフルクトースからなるレバン、イヌリンとガラクトースからなるガラクタン等が知られている。
【００２８】
デキストランを生産する乳酸菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｎｆｕｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、βグルカン生産乳酸菌としてＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｄａｍｎｏｓｕｓ等、ムタン生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｕｓ等、アルテルナン生産菌としてＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、レバン生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ等、イヌリン生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎ等、ガラクタン生産乳酸菌としてＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ等が挙げられる。
【００２９】
ヘテロ多糖は、単糖のグルコース、ガラクトース、ラムノース、フコース、糖誘導体であるN−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸などが少なくとも２種類以上で構成されるユニットが連なったものである。
【００３０】
代表的なヘテロ多糖はN−アセチルグルコサミンとグルクロン酸からなるヒアルロン酸、グルコースとガラクトースからなるケフィランが挙げられる。ヒアルロン酸生産乳酸菌としてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等、ケフィラン生産乳酸菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ等が挙げられる。
【００３１】
ヘテロ多糖生産菌としてはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａ  ｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ等が挙げられる。
【００３２】
本明細書では、これらの多糖類のうち、代表してヒアルロン酸について述べる。
【００３３】
（５）ヒアルロン酸生産能を有する微生物
本発明では、ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が好ましい。ヒアルロン酸生産能を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物は、一般に牛鼻腔粘膜、牛眼球に存在していることが知られている。本発明ではそこから単離された微生物を利用することも出来る。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属しない微生物でも、通常の遺伝子工学的手法を用いてヒアルロン酸生産能を得た微生物も使用することが出来る。
【００３４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｓ等が挙げられる。その中でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓがより好ましい。
【００３５】
さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の属する微生物等のヒアルロン酸生産能を有する微生物を、紫外線、ＮＴＧ(Ｎーメチル-Ｎ´-ニトロ-Ｎーニトロソグアニジン)、メチルメタンスルホン酸等で処理することにより、ヒアルロニダーゼ非生産菌や非溶血性菌に改良することがより好ましい。人体または動物に悪影響を及ぼす可能性が低くなるからである。
【００３６】
前記ヒアルロニダーゼ活性及び溶血性を欠損させた菌株としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＮＨ−１３１（ＦＥＲＭ  Ｐ−７５８０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＨＡ−１１６（ＡＴＣＣ３９９２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＭＫ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０５）が好ましく、その中でもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＭＫ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ  ＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３０５）が特に好ましい。
【００３７】
これらのうち、ＦＥＲＭ株については、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより入手可能である。また、ＡＴＣＣ株については、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【００３８】
（６）微生物の培養
培地は、上記微生物がヒアルロン酸を生産できる培地であれば限定されず、微生物の種類に応じた公知の培地を用いることが出来る。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース等の単糖類、乳糖、スクロース、マルトース等の二糖類、オリゴ糖類等；窒素源としてポリペプトン、酵母エキス等の有機窒素源；アルギニン、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸；ビタミン；無機塩類等；タンニン等のフェノール性水酸基を有するヒアルロニダーゼ阻害剤を含む（水に溶解した）培地を使用することが出来る。
【００３９】
当該培地は、加熱処理(加熱殺菌)を行った後に、微生物の培養に用いることが出来る。微生物が完全に殺菌されれば、加熱条件は限定されない。例えば、１００〜１３０℃で５〜３０分間、より好ましくは１２１℃〜１２５℃で１５〜３０分間という条件を挙げることが出来る。または、一部若しくは全部の成分を精密濾過による非加熱滅菌することにより使用することができる。
【００４０】
培養条件も限定されるものではないが、培養液の温度を２５〜４２℃程度、好ましくは３０〜４０℃程度、より好ましくは３２〜３８℃程度に制御すればよい。また、必要に応じて、好気的に培養することも可能である。培養時間も限定されず、培養液の量、所望のヒアルロン酸の量に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
（７）その他
このようにして得られたヒアルロン酸は、公知の方法により精製等を行うことができる。例えば、培地を必要に応じて（好ましくは、ヒアルロン酸濃度が０．１〜５ｇ／Ｌになるように）希釈した後、例えば遠心分離、濾過、カーボン、セライト、パーライト等を用いて菌体を除去し、さらに、菌体を除去した培地を活性炭と接触させればよい。
【００４２】
得られたヒアルロン酸の平均分子量は、公知の方法により求めることができる。例えば、極限粘度測定法、分子量既知のプルランを用いたＧＰＣ液クロ（示差屈折計）による相対分子量測定法、ＧＰＣ液クロ（示差屈折計）と光散乱検出器の組み合わせによる絶対分子量測定法等を使用することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例、比較例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００４４】
＜実施例１＞
工程１．ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）の培養
グルコース６（ｗ／ｖ）％、ポリペプトン−Ｎ（大日本製薬株式会社製）１．５（ｗ／ｖ）％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１（ｗ／ｖ）％、リン酸水素２ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、グルタミン酸ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、アデカプルロニックＬ−６１（旭電化工業製）０．０１（ｗ／ｖ）％の組成の培地を１０００Ｌのジャーファーメンター（培養槽）（株式会社丸菱製）に５００Ｌ入れ、ジャケットにスチームを供給して１２１℃、２０分間滅菌した。尚、グルコースは１２１℃、２０分間別滅菌して、培養開始時に一度に添加した。
【００４５】
前培養した該菌を１（ｖ／ｖ）％接種し、２７（ｗ／ｖ）％水酸化ナトリウムにてｐＨを７．４に連続的に制御しながら温度３７℃、攪拌数５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍで２４時間通気攪拌培養した。攪拌翼は、直径４５０ｍｍの門型攪拌翼（株式会社高杉製作所製）（醗酵槽内径との比Ｌ／Ｄ＝０．５）を使用した。攪拌翼先端とｐＨ電極（メトラートレド社製  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ−２２５：電極の長さ２２５ｍｍ）の間隔は１２０ｍｍであった。培養中のｐＨ経時変化を図−１に示した。
【００４６】
工程２．培養液の処理
前記工程１で培養した培養液（ヒアルロン酸含有液）を、イオン交換水を用いて１０倍に希釈し、その２．５Ｌ水溶液のｐＨを４に調整後、活性炭（武田薬品社製の白鷺ＲＷ５０−Ｔ）を５ｇ、パーライト（三井金属鉱業株式会社のロカヘルプ♯４０９）を３０ｇ添加して、１時間処理し、ヌッチェを用いて濾過した。
【００４７】
工程３．ヒアルロン酸ナトリウム結晶の取得
前記工程２で調整したヒアルロン酸含有液１Ｌに、食塩３ｇを溶解、ｐＨ７に調整後、２−プロパノール６Ｌで析出を行い、４０℃で真空乾燥し、ヒアルロン酸ナトリウム結晶を得た。
【００４８】
ヒアルロン酸平均分子量の測定
ヒアルロン酸ナトリウム結晶約４ｍｇを純水５ｍＬに溶解し、分析用サンプルとしてＧＰＣカラムを用いた液体クロマトグラフィ−（島津製作所社製）により相対平均分子量を算出した。
（i）使用機器
島津高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅＧＰＣシステム
システムコントローラ：ＣＢＭ−２０Ａ
液送ユニット：ＬＣ−２０ＡＤ
オンラインデガッサ：ＤＧＵ−２０Ａ３
オートサンプラ：ＳＩＬ−２０ＡＣ
カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ
示差屈折率検出器：ＲＩＤ−１０Ａ
ＬＣワークステーション：ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖｅｒ.１．２４ＳＰ１＋
（ii）分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｏｈｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ｏｈｐａｋ  ＳＰ−Ｇ
溶離液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム水溶液
流量：１．００ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０．０℃
（iii）検量線作成用多糖類
平均分子量５９００、９６００、２１１００、４７１００、１０７０００、２０００００、  ３７５０００、７０８０００、のプルラン（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２  Ｌｏｔ  Ｎｏ８１００１）を用いて検量線を作成した。
結果を表−１に示した。
【００４９】
＜実施例２＞
直径４５０ｍｍのマックスブレンド攪拌翼（株式会社高杉製作所製）（醗酵槽内径との比Ｌ／Ｄ＝０．５）を使用した以外は、実施例１と同様の操作を実施した。攪拌翼先端とｐＨ電極（メトラートレド社製  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ−２２５：電極の長さ２２５ｍｍ）の間隔は１２０ｍｍであった。結果を表−１に示した。
【００５０】
＜実施例３＞
直径４５０ｍｍのスーパーミックスＭＲ２０３翼（佐竹化学機械工業株式会社製）（醗酵槽内径との比Ｌ／Ｄ＝０．５）を使用した以外は、実施例１と同様の操作を実施した。攪拌翼先端とｐＨ電極（メトラートレド社製  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ−２２５：電極の長さ２２５ｍｍ）の間隔は１２０ｍｍであった。結果を表−１に示した。
【００５１】
＜実施例４＞
１５０００Ｌジャーファーメンター（培養槽）（小松川加工機株式会社製）に、直径１４００ｍｍの門型攪拌翼（株式会社高杉製作所製）（醗酵槽内径との比Ｌ／Ｄ＝０．５８）を取り付け、ｐＨ電極を、図−１に示したような鞘付きフランジ（深さ２００ｍｍ）に取り付けた以外は、実施例１と同様の操作を実施した。攪拌翼先端とｐＨ電極（メトラートレド社製  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ−３２５：電極の長さ４２５ｍｍ）の間隔は１５０ｍｍであった。結果を表−１に示した。
【００５２】
＜比較例１＞
ｐＨ電極を、メトラートレド社製の４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ−１２０（電極の長さ１２０ｍｍ）を使用した以外は、実施例１と同様の操作を実施した。攪拌翼先端とｐＨ電極の間隔は２２０ｍｍであった。培養中のｐＨ経時変化を図−１に示した。結果を表−１に示した。
【００５３】
＜比較例２＞
ｐＨ電極を、メトラートレド社製の４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ−１２０（電極の長さ１２０ｍｍ）を使用した以外は、実施例２と同様の操作を実施した。攪拌翼先端とｐＨ電極の間隔は２２０ｍｍであった。結果を表−１に示した。
【００５４】
＜比較例３＞
ｐＨ電極を、メトラートレド社製の４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ−１２０（電極の長さ１２０ｍｍ）を使用した以外は、実施例３と同様の操作を実施した。攪拌翼先端とｐＨ電極の間隔は２２０ｍｍであった。結果を表−１に示した。
【００５５】
＜比較例４＞
鞘付きフランジを使用しなかった以外は、実施例４と同様の操作を実施した。攪拌翼先端とｐＨ電極の間隔は４００ｍｍであった。ｐＨは最大１１まで上昇し、ヒアルロン酸の生産は培養１４時間目に停止した。結果を表−１に示した。
【００５６】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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