(57)【要約】【課題】微生物をもれなく採取するとともに微生物の含まれる標本を平坦化することを目的とする。【解決手段】微生物検出方法は、ろ過によりフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、当該フィルタから微生物を検出する微生物検出方法であって、微生物の捕集面を上にした状態でフィルタを広げて平面板に載せ、親水性かつ揮発性の溶媒を水性マウント剤に混合したマウント液を前記フィルタに塗布し、その後に前記溶媒を揮発させる平坦化工程を具備する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ過によりフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、当該フィルタから微生物を検出する微生物検出方法であって、
微生物の捕集面を上にした状態でフィルタを広げて平面板に載せ、親水性かつ揮発性の溶媒を水性マウント剤に混合したマウント液を前記フィルタに塗布し、その後に前記溶媒を揮発させる平坦化工程を具備することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
前記溶媒は、アルコールであることを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
【請求項３】
前記溶媒は、エタノールまたはイソプロパノールであることを特徴とする請求項２に記載の微生物検出方法。
【請求項４】
前記マウント剤に対して１０倍の容量の溶媒を混合することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項５】
前記溶媒が揮発した後の前記フィルタに、イマージョンオイルを親油性の第２の溶媒で希釈したイマージョンオイル希釈液を塗布する液浸工程を具備することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物検出方法。
【請求項６】
前記第２の溶媒は、キシレンであることを特徴とする請求項５に記載の微生物検出方法。
【請求項７】
前記イマージョンオイルを第２の溶媒で１０倍に希釈することを特徴とする請求項５または６に記載の微生物検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）とは、蛍光標識したプローブを、標的微生物のみに反応させることで、標的微生物のみを蛍光染色する手法であり、自然界の微生物研究の多くに活用されている。しかし、ＦＩＳＨ法において標的微生物の捕集に用いられるメンブレンフィルタ、特にポリカーボネートフィルタは、非常に薄く、波打ちやすい。そのため、メンブレンフィルタは、標本の調整中に平坦性が失われてしまうことがある。そして、ステージの移動が自動化された顕微鏡では、メンブレンフィルタの平坦性が失われると、視野の移動ごとにメンブレンフィルタの起伏に応じてフォーカスを合わせなければならないので、観察に余分な時間がかかる。
そのため、このような課題を解消する発明として、下記特許文献１には、平坦な標本を作製することができる微生物検出方法が開示されている。この微生物検出方法は、平坦な基材上に粘着層が積層された捕集シートで微生物を捕集し、当該捕集シート上の微生物を観察する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２２７７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、上記特許文献１では、平坦な基材上に粘着層が積層された捕集シートで標的微生物を捕集し、顕微鏡で捕集シート上の微生物を観察する。しかしながら、上記特許文献１では、試料中の微生物をもれなく採取するには、試料中の全ての微生物を粘着層に付着させなければならないが、全ての微生物を粘着層に付着させることは極めて困難である。そして、上記特許文献１では、微生物をもれなく捕集することが困難であるので、試料中に含まれる微生物を定量することがむずかしい。
【０００５】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、微生物をもれなく採取するとともに微生物の含まれる標本を平坦化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、ろ過によりフィルタで試料中の微生物を捕集し、当該フィルタから微生物を検出する微生物検出方法であって、微生物の捕集面を上にした状態でフィルタを広げて平面板に載せ、親水性かつ揮発性の溶媒を水性マウント剤に混合したマウント液を前記フィルタに塗布し、その後に前記溶媒を揮発させる平坦化工程を具備するという手段を採用する。
【０００７】
本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記溶媒は、アルコールであるという手段を採用する。
【０００８】
本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、上記第２の解決手段において、前記溶媒は、エタノールまたはイソプロパノールであるという手段を採用する。
【０００９】
本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第１〜第３のいずれかの解決手段において、前記マウント剤に対して１０倍の容量の溶媒を混合するという手段を採用する。
【００１０】
本発明では、微生物検出方法に係る第５の解決手段として、上記第１〜第４のいずれかの解決手段において、前記溶媒が揮発した後の前記フィルタに、イマージョンオイルを親油性の第２の溶媒で希釈したイマージョンオイル希釈液を塗布する液浸工程を具備するという手段を採用する。
【００１１】
本発明では、微生物検出方法に係る第６の解決手段として、上記第５の解決手段において、前記第２の溶媒は、キシレンであるという手段を採用する。
【００１２】
本発明では、微生物検出方法に係る第７の解決手段として、上記第５または第６の解決手段において、前記イマージョンオイルを第２の溶媒で１０倍に希釈するという手段を採用する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、エタノールの混合されたマウント液は液状になるので、マウント液が塗布されたフィルタは、平面板に均一に広がった状態で貼り付く。その後にエタノールが揮発すると、フィルタは、平面板に完全に密着する。そして、フィルタは、平面板に完全に密着することで、平坦化される。このように、本発明は、ろ過により微生物を捕集したフィルタを平坦化することで、微生物をもれなく採取するとともに微生物の含まれる標本を平坦化することができる。これにより、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がないので、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法のフローチャートである。
【図２】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の第９の工程の効果を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係るレジオネラ菌検出方法の第１２の工程の観察環境を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
本実施形態に係るレジオネラ菌検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて試料からレジオネラ菌を検出する方法であり、以下に説明するように第１〜第１２の工程を有するものである。また、これら第１〜第１２の工程のうち、第９の工程は、本実施形態における平坦化工程である。また、第１０の工程は、本実施形態における液浸工程である。
【００１６】
レジオネラ菌検出方法について、図１を参照して、説明する。
〔第１の工程〕
まず、第１の工程において、レジオネラ菌を含む液体試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することでレジオネラ菌の固定標本を作製する（ステップＳ１）。
〔第２の工程〕
上記第１の工程が終了すると、次に第２の工程において、上記液体試料をろ過装置によってろ過することで、レジオネラ菌の固定標本をメンブレンフィルタ上に捕集する（ステップＳ２）。なお、上記メンブレンフィルタは、直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。そして、このメンブレンフィルタの中心部の直径１６ｍｍの円形領域が、ろ過に使用される。
〔第３の工程〕
上記第２の工程が終了すると、次に第３の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることで脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ３）。
【００１７】
〔第４の工程〕
上記第３の工程が終了すると、次に第４の工程において、上記メンブレンフィルタを約４０℃の０．１％の寒天溶液に浸し、その後に当該メンブレンフィルタを気泡の入らないようにスライドガラス上に貼り付け、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ４）。このようにすることで、レジオネラ菌の固定標本がメンブレンフィルからはがれないようにすることができる。
〔第５の工程〕                          
上記第４の工程が終了すると、次に第５の工程において、上記メンブレンフィルタをスライドガラスからはがし、その後に当該メンブレンフィルタの全面にハイブリダイゼーションバッファを塗布する（ステップＳ５）。なお、上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。
【００１８】
〔第６の工程〕                          
上記第５の工程が終了すると、次に第６の工程において、上記メンブレンフィルタ上のレジオネラ菌にプローブを結合させる（ステップＳ６）。第６の工程を具体的に説明すると、まずレジオネラ菌用プローブ溶液の入ったマイクロチューブに上記メンブレンフィルタを入れる。そして、振とう機を使ってマイクロチューブを４６℃の温度下で、約２時間振とうさせる。これにより、レジオネラ菌に対するプローブの結合が促進され、時間の経過とともにレジオネラ菌とプローブとが結合する。なお、プローブとは、標的微生物であるレジオネラ菌の核酸（多くの場合においてリボソームＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid））に対して相補的なポリヌクレオチドに蛍光色素を共有結合したものである。
【００１９】
〔第７の工程〕
上記第６の工程が終了すると、次に第７の工程において、上記メンブレンフィルタをウォッシングバッファに浸し、メンブレンフィルタ上の未反応のプローブを洗浄する。（ステップＳ７）。
〔第８の工程〕
上記第７の工程が終了すると、次に第８の工程において、上記メンブレンフィルタを９９．５％のエタノールに１分間入れることでメンブレンフィルタを脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる（ステップＳ８）。
【００２０】
〔第９の工程（平坦化工程）〕
上記第８の工程が終了すると、次に第９の工程において、微生物の捕集面を上にした状態でメンブレンフィルタを広げて平行平面基板（平面板）に載せ、水性マウント剤に対して１０倍の容量のエタノールを混合したマウント液をマイクロピペットで滴下することで上記メンブレンフィルタに塗布し、その後に常温の空気中で乾燥させることでエタノールを揮発させる（ステップＳ９）。例えば、上記水性マウント剤として、ＣｉｔｉＦｌｕｏｒ、ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ、グリセロール液などがある。また、マウント液の溶媒としてエタノールを使用したのは、親水性、揮発性、観察の邪魔になる影響をメンブレンフィルタ及びレジオネア菌に与えないという特徴を持っているからである。
【００２１】
そして、このようなマウント剤及びエタノールからなるマウント液は、純粋なマウント剤よりも粘度が緩和され、液状である。すなわち、マウント液は、純粋なマウント剤よりもメンブレンフィルタへの浸透性が高い。そして、このような液状のマウント液が塗布されたメンブレンフィルタは、平行平面基板に均一に広がった状態で貼り付く。その後にエタノールが揮発すると、図２の（ａ）に示すように、メンブレンフィルタＦｌは、その表面が均一にマウント剤Ｍｎに覆われるとともに平行平面基板Ｆｂに完全に密着する。そして、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着することで、平坦化される。また、エタノールにはメンブレンフィルタを緩める働きがあるので、メンブレンフィルタは、エタノールが揮発した際に縮まって平行平面基板Ｆｂへの密着性が高まる。
【００２２】
しかし、従来のように純粋なマウント剤をメンブレンフィルタに塗布すると、粘度の高いマウント剤がメンブレンフィルタに十分に浸透しない。このため、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着することができないので、平坦性が失われる。例えば、図２の（ｂ）に示すように、マウント剤Ｍｎが塗布されたメンブレンフィルタＦｌは、平行平面基板Ｆｂ上で波打った状態になる。
【００２３】
〔第１０の工程（液浸工程）〕
上記第９の工程が終了すると、次に第１０の工程において、イマージョンオイルをキシレンで１０倍に希釈したイマージョンオイル希釈液をマイクロピペットで上記メンブレンフィルタ上に滴下し、平行平面板を傾けて広げることでメンブレンフィルタ上にイマージョンオイル希釈液を塗布し、その後に常温の空気中で乾燥させる。（ステップＳ１０）。なお、イマージョンオイル希釈液は、キシレンで希釈されているので、イマージョンオイルよりも粘度が緩和され、液状である。そのため、イマージョンオイル希釈液は、メンブレンフィルタ上に均一に広がる。
〔第１１の工程〕
上記第１０の工程が終了すると、次に第１１の工程において、メンブレンフィルタ上にカバーガラスを載せ、カバーガラスのメンブレンフィルタの反対側、すなわち顕微鏡の対物レンズに接する側の面にイマージョンオイルを付着させる（ステップＳ１１）。
【００２４】
〔第１２の工程〕
上記第１１の工程が終了すると、次に第１２の工程において、蛍光顕微鏡でメンブレンフィルタ上のレジオネラ菌を検出する（ステップＳ１２）。つまり、蛍光顕微鏡に平行平面基板を取り付け、対物レンズをカバーガラスのイマージョンオイルに接するように配置する。そして、蛍光顕微鏡が波長４９５ｎｍの青色の励起光をメンブレンフィルタに照射すると、レジオネラ菌に結合したプローブが波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発するので、その蛍光を基にレジオネラ菌を検出する。この際、図３に示すように、平行平面基板Fｂ上には、下からメンブレンフィルタFｌ、マウント液Ｍｎ、イマージョンオイル希釈液Ｉｏ１、カバーガラスＣｇ、イマージョンオイルＩｏ２という順番で積み重なっている。そして、顕微鏡の対物レンズＯｌが、図３に示すように、イマージョンオイルＩｏ２に接している。
【００２５】
そして、メンブレンフィルタが平坦であるので、蛍光顕微鏡の視野が移動しても、オートフォーカスによる焦点の再調整がほとんど行われることがない。そして、蛍光顕微鏡によって画像を撮影したところ、通常の方法では画像全体にフォーカスの合う写真は１０枚に１枚程度であったが、本実施形態に係る微生物検出方法を使うことで多数の画像において良好なフォーカスの画像が得られた。
【００２６】
以上のように、本実施形態では、液状のマウント液が塗布されたメンブレンフィルタは、平行平面基板に均一に広がった状態で貼り付く。そして、その後にエタノールが揮発すると、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着する。そして、メンブレンフィルタは、平行平面基板に完全に密着することで、平坦化される。このように、本実施形態は、ろ過によりレジオネラ菌を捕集したメンブレンフィルタを平坦化することで、レジオネア菌をもれなく採取するとともにレジオネア菌の含まれる標本を平坦化することができる。これにより、蛍光顕微鏡の視野の移動毎に、フォーカスを合わせる必要がないので、観察時に生じる余分な時間を低減することができる。
【００２７】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
（１）上記実施形態では、ＦＩＳＨ法を用いてレジオネラ菌を検出する際の標本を平坦化したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、ＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法などのＦＩＳＨ法以外の蛍光染色法、また蛍光染色法以外の微生物検出方法であっても、ろ過によりポリカーボネート製のメンブレンフィルタ上に試料中の微生物を捕集し、当該メンブレンフィルタから微生物を検出する方法であれば、本発明を適用することができる。
【００２８】
（２）上記実施形態では、平面板として平行平面基板を用いたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、平行平面基板の代わりに、スライドガラスを用いてもよい。しかし、より平面度を増すためには平行平面基板など平面度の高い物を用いた方がよい。また、ＦＩＳＨ法などの蛍光染色法では、標本を載せる平面板が透明である必要がないので、シリコンウェハーを用いてもよい。
【００２９】
（３）上記実施形態では、マウント剤にエタノールを混合したが、本発明はこれに限定されない。マウント剤に混合する溶媒は、親水性、揮発性及び観察の邪魔になる影響をメンブレンフィルタ及びレジオネア菌に与えないという条件を備える必要がある。このようなものとして、アルコール（エタノールを含む）がある。そして、エタノール以外のアルコールとして、イソプロパノールがある。
【００３０】
（４）上記実施形態では、第１０の工程においてイマージョンオイル希釈液をメンブレンフィルタに塗布し、第１１の工程においてそのメンブレンフィルタにカバーガラスを載せたが、本発明はこれに限定されない。
例えば、第９の工程の後に、第１０の工程を行わずに、第１１の工程においてマウント剤の載ったメンブレンフィルタ上に直接カバーガラスを載せるようにしてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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