(57)【要約】【課題】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターよりも大きなパッケージング限界及び形質導入効率を有するウイルスベクターを製造する。【解決手段】（ａ）ＡＡＶキャプシド；及び（ｂ）該ＡＡＶキャプシドとは血清型が異なっていることを条件として、該ＡＡＶキャプシド内にパッケージングされるＡＡＶゲノムを含むハイブリッドウイルス粒子を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド；及び
（ｂ）該ＡＡＶキャプシドとは血清型が異なっていることを条件として、該ＡＡＶキャプシド内にパッケージングされるＡＡＶゲノム
を含むハイブリッドウイルス粒子。
【請求項２】
前記ＡＡＶゲノムが少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む、請求項１のウイルス粒子。
【請求項３】
前記ＡＡＶゲノムが少なくとも１つの異種核酸配列を含む、請求項１又は請求項２のウイルス粒子。
【請求項４】
前記少なくとも１つの異種核酸配列がペプチド又はタンパク質をコード化する、請求項３のウイルス粒子。
【請求項５】
前記ペプチド又はタンパク質が治療的タンパク質又はペプチドである、請求項４のウイルス粒子。
【請求項６】
前記少なくとも１つの異種核酸配列が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、ジストロフィン、ミニジストロフィン、ウトロフィン、ＩＸ因子を含む凝固因子、エリトロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子、β−インターフェロンを含むサイトカイン、自殺遺伝子生成物腫瘍抑制遺伝子生成物からなる群より選択される治療的タンパク質又はペプチドをコード化する、請求項５のウイルス粒子。
【請求項７】
前記ペプチド又はタンパク質が免疫原性ペプチド又はタンパク質である、請求項４のウイルス粒子。
【請求項８】
前記少なくとも１つの異種核酸配列が非翻訳ＲＮＡをコード化する、請求項３のウイルス粒子。
【請求項９】
前記ＡＡＶゲノムがＡＡＶ血清型１、２、３、４、５及び６からなる群より選択されるＡＡＶから由来する、請求項１−８のいずれかのウイルス粒子。
【請求項１０】
前記ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ血清型１、２、３、４、５及び６からなる群より選択されるＡＡＶから由来する、請求項１−９のいずれかのウイルス粒子。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体における請求項１−１０のいずれかのウイルス粒子を含む医薬組成物。
【請求項１２】
以下の群：嚢胞性線維症、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン氏病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇、癌、真性糖尿病、筋ジストロフィー、ゴーシュ病、フルラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、糖原貯蔵症、及び網膜変性疾患から選択される疾患の治療のための医薬品の製造のための請求項１−１０のいずれかに記載のウイルス粒子の使用。
【請求項１３】
ワクチン組成物としての請求項７に記載のウイルス粒子。
【請求項１４】
請求項１のハイブリッドウイルス粒子を製造するための分離核酸であって、前記分離核酸が、前記ＡＡＶｃａｐ遺伝子と前記ＡＡＶｒｅｐ遺伝子とは血清型が異なることを条件として、ＡＡＶｃａｐ遺伝子及びＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む、分離核酸。
【請求項１５】
前記ＡＡＶｃａｐ遺伝子が操作可能に標準ＡＡＶポロモーターと随伴している、請求項１４の分離核酸。
【請求項１６】
請求項１４又は請求項１５の分離核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６のベクターを含む細胞。
【請求項１８】
請求項１４又は請求項１５の分離核酸を含む細胞であって、当該分離核酸が当該細胞のゲノムへ安定に組み込まれることを特徴とする細胞。
【請求項１９】
ハイブリッドウイルス粒子を製造する方法であって、
増殖性ＡＡＶ感染を生成するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶｃａｐ遺伝子、ＡＡＶゲノム、及びヘルパー機能を、前記ＡＡＶｒｅｐ遺伝子及び前記ＡＡＶｃａｐ遺伝子の血清型が異なることを条件として、細胞に供給し；
ハイブリッドウイルス粒子の集合を可能にすることを含む方法。
【請求項２０】
細胞に核酸配列を送達するインビトロの方法であって、
請求項３−８のいずれかに記載のハイブリッドウイルス粒子又は請求項１１に記載の医薬組成物を細胞へ導入することを含む方法。
【請求項２１】
細胞が神経細胞、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞、筋細胞、膵細胞、肝細胞、心筋細胞、骨細胞、脾細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、前駆細胞、及び幹細胞からなる群より選択される、請求項２０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願情報）
本出願は、本明細書中でそれらの全体が援用される１９９８年１１月１０日に出願された出願番号第６０／１０７，８４０号及び１９９９年３月１０日に出願された出願番号第６０／１２３，６５１号の各々の仮出願の利益を請求するものである。
【０００２】
（連邦支援陳述）
本発明は、一部は、国立衛生研究所からの第ＤＫ４２７０１号及び第５−３２９３８ ０−１１０号の助成金のもと政府支援によりなされた。合衆国政府は本発明に対する一定の権利を有する。
【０００３】
本発明はウイルスベクターに関し、特に、改変されたパルボウイルスベクターとその製造及び投与の方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
パルボウイルスは、直径が２０乃至３０ナノメートルの小型の一本鎖からなる非エンベロープ型ＤＮＡウイルスである。パルボウイルスのゲノムは約５０００ヌクレオチドの長さであり、２つの開放読み枠を含有する。左側の読み枠は複製（Ｒｅｐ）の原因であるタンパク質をコードするが、右側の開放読み枠はキャプシド（Ｃａｐ）の構造的タンパク質をコード化する。すべてのパルボウイルスは、通常、最小のＣａｐタンパク質である主要Ｃａｐタンパク質、及び１個又は２個の副Ｃａｐタンパク質からなる正二十面体対称のビリオンを有する。Ｃａｐタンパク質は、異なる開始コドンからの翻訳を開始する単一の遺伝子から生成される。これらのタンパク質は同一のＣ−終端を有するが、異なる開始コドンにより独特なＮ−終端を持つ。
【０００５】
ほとんどのパルボウイルスの宿主範囲は狭く、Ｂ１９の向性はヒト赤血球系細胞である（非特許文献１参照）が、イヌパルボウイルスは成体イヌにおけるリンパ球の向性を有する（非特許文献２、非特許文献３参照）。他方、アデノ随伴ウイルスは、イヌ、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、及び適切なヘルパーウイルスが存在するとき、多数のヒト系において十分に複製することができる。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶはこれらの細胞型のすべてにおいて感染して潜伏を確立し、ＡＡＶ受容体が種間で共通であり、保存されることを示す。ＡＡＶのいくつかの血清型は、血清型１、２、３、４、５及び６を含めて確認されている。
【０００６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、別のウイルス（アデノウィルス又は一部のヘルパーウイルス群のいずれか）との共感染を要求し、培養細胞中で増殖性感染を起こす、大きさ２０ナノメートルの依存性パルボウイルスである。ヘルパーウイルスとの共感染の非存在下では、ＡＡＶビリオンは細胞受容体と結合して細胞に入り、核に移動し、宿主染色体内への組み込みにより潜伏を確立しうる一本鎖ＤＮＡゲノム送達する。ベクターとしてのＡＡＶにおける関心が、このウイルスの生物学をめぐって集中している。その独特な生活環のほか、ＡＡＶは感染力の宿主範囲が広く（ヒト、マウス、サル、イヌ、等）、ヒトにおいて偏在性であり、完全に非病原性である。このウイルス（４．５ｋｂ）の有限のパッケージング能は、過去においてこのベクターの使用を小型の遺伝子又はｃＤＮＡに制限していた。ＡＡＶ遺伝子送達の見込みを進歩させるには、大型の遺伝子を保有するのに十分なベクターを開発する必要がある。また、他を形質導入することなく限定された細胞型を特異的かつ効率的に標的にするビリオンが臨床応用には要求される。
【０００７】
ＡＡＶ２のキャプシドタンパク質はＶｐ１、２、および３であり、それぞれ８７、７３、及び６３ｋＤａの分子量を有する。Ｖｐ３は無傷ビリオン中総タンパク質のほぼ８０％を代表し、Ｖｐ１及びＶｐ２は各々１０％である（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６参照）。ＡＡＶ２の初期の研究は、３つのキャプシドユニットのすべてが二本鎖ＤＮＡを複製するプールから一本鎖ゲノムを抽出するために必要であることを裏づけている。
【０００８】
ＡＡＶ２キャプシドのパルボウイルス変異原性研究では、Ｖｐ３ドメインにおける挿入及び欠失が一本鎖ビリオンの蓄積及び感染性粒子の産生を完全に抑制することが示されている（非特許文献７；非特許文献８参照）。Yangら（非特許文献９参照）は、ＡＡＶ２ Ｖｐ１、Ｖｐ２又はＶｐ３コード領域の５’末端でのヒトＣＤ３４に対する一本鎖抗体の可変領域をコード化する配列の挿入を報告している。これらの研究者は、Ｖｐ２融合タンパク質を含有するＡＡＶビリオンによりＫＧ−１を発現するＣＤ３４のきわめて低い形質導入を確認した（１．９形質導入単位／ｍｌ以下、１９３４〜３５にわたる文）。ＫＧ−１細胞は野生型ｒＡＡＶベクターによる感染に対して許容的でないことが報告されている。Ｖｐ２融合ＡＡＶによる結果は、抗ＡＡＶキャプシド抗体に対して本質的に非感受性であったこのウイルスによるＫＧ−１細胞の形質導入と思われるが（４３０ｖｓ．３１０形質導入単位／ｍｌ；表２）、ＨｅＬａ細胞の形質導入はこの抗体により顕著に減少した（６３，２０００ｖｓ．＜２００形質導入単位／ｍｌ；表２）。推定上のビリオンの特徴づけは行われず、粒子がＶｐ２融合タンパク質を含むこと、抗体はキャプシド表面上に発現すること、又は粒子がＣＤ３４タンパク質を結合することを確認した。また、ｒＡＡＶ粒子は３つの野生型キャプシドサブユニットのすべてが、キメラサブユニットのほかに供給された場合のみ生成しえた（１９３４ページ、第２欄、５〜１２行）。まとめると、これらの結果は、キメラサブユニットが生存可能なＡＡＶ粒子に組み込まれず、実際に、標的細胞内で観察された低レベルのキメラタンパク質がキメラキャプシドタンパク質又他のメカニズムより凝集したタンパク質の細胞接種によるものであったことを示している。
【０００９】
いくつかの研究では、パルボウイルスキャプシドタンパク質が変異し、ビリオン集合を試験できることが明らかにされている。一研究において、雌鶏の卵白リゾチームの１４７アミノ酸のコード領域が、Ｂ１９ Ｖｐ１固有コード配列に置換された。この改変により、リゾチーム酵素活性を保持する空の粒子が精製された（非特許文献１０参照）。また、Ｂ１９ Ｖｐ２におけるペプチド（９及び１３残基）の発現より、挿入の表面発現を支持するマウスにおいて免疫原性である空の粒子が得られた（非特許文献１１参照）。さらに最近の研究では、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ヌクレオタンパク質に対するウイルスＣＤ８＋ＣＴＬエピトープ（残基１１８〜１３２）が、ブタパルボウイルス（ｐｐｖ）のＶｐ２キャプシドタンパク質へ挿入された（非特許文献１２参照）。このキャプシドタンパク質は、Ｎ末端でクローンされたエピトープとともに、バキュロウイルス系において発現すると自己組織化した。次いで、このキメラウイルス様粒子を用いて、ＬＣＭＶからの致死惹起に対してマウスを免疫化した。これらの研究ではキャプシドの構造及び集合が評価されたが、改変キャプシド内へのＢ１９ゲノムのパッケージングの問題は扱われなかった。
【００１０】
組換え（ｒ）ＡＡＶベクターは、ウイルスを産生するために４６７９塩基のｃｉｓにおける逆方向末端反復配列のみを必要とする。他のすべてのウイルス配列は不必要であり、ｔｒａｎｓにおいて供給されうる（非特許文献１３参照）。遺伝子治療のためのＡＡＶベクターの魅力的な特徴は、このウイルスの安定性、遺伝子の単純性、及び遺伝子操作の容易さである。これらの因子の各々は根拠が確実であるが、ｒＡＡＶベクターの適用への一部の障壁が最近、明らかにされた。これらは、ベクター系質導入及びパッケージング束縛の非能率が含む。このウイルスの隠れた性質を挙げれば、その生物学への新しい洞察が、野生型ＡＡＶと比較して容易に分析されるｒＡＡＶベクターによる集中的な研究後のみに表面化したことは意外ではない。
【００１１】
ベクター形質導入の効率に関して、いくつかの最近の研究では、in vivo導入遺伝子発現の持続時間の点からきわめて有望であることが示されているが、しかし、in vitroでの以前の結果に基づき予想されなかった形質導入の効率の不足が認められている（非特許文献１４参照）。In vivoでのrＡＡＶの有用性を明らかにするげっは類における最初の実験のひとつはラットにおける脳組織の形質導入が目標とされた（非特許文献１５参照）。脳のほか、筋がＡＡＶによるin vivoで効率的に形質導入されることがわかっており、長期間の遺伝子発現（少なくとも１年半）、免疫応答の欠如、及び非ベクター毒性を示している（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９参照）。有効なベクター送達に影響する主要なステップは、ウイルス侵入及び二次鎖合成の変換である（非特許文献２０参照）。
【００１２】
一般的目的のウイルスベクターとしてのＡＡＶの全体的な成功は、完全長ＡＡＶゲノム（５ｋｂ）よりも大きいゲノムをｒＡＡＶベクターにパッケージングする能力に左右される。Dongらによる研究（非特許文献２１参照）では、ｒＡＡＶベクターを用いたパッケージングの限度が１０４％乃至１０８％と測定された。このパッケージング制限は、ヒトの遺伝子治療用に現在試験されている多数の重要な遺伝子の使用を妨げる（例えば、ジストロフィン遺伝子又は現在のミニジストロフィン作成物）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Munshiら、（1993）J. Virology 67:562
【非特許文献２】Parrishら、（1988）Virology 166:293
【非特許文献３】Changら、（1992）J. Virology 66:6858
【非特許文献４】Muzyczka、（1992）Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97
【非特許文献５】Rollingら、（1995）Molec. Biotech. 3:9
【非特許文献６】Wistubaら（1997）J. Virology 71:1341）
【非特許文献７】Hermonatら、（1984）J. virology 51:329
【非特許文献８】Ruffingら、（1992）J. Virology 66:6922）
【非特許文献９】Yangら、（1988）Human Gene Therapy 9:1929
【非特許文献１０】Miyamuraら、（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8507
【非特許文献１１】Brownら、（1994）Virology 198:477
【非特許文献１２】Sedlikら（1997）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94:7503
【非特許文献１３】Muzyczka、（1992）Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97
【非特許文献１４】Flotteら、（1993）proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:10613
【非特許文献１５】Kaplittら、（1994）Nature Genet. 7:148
【非特許文献１６】Xiaoら、（1996）J. Virol. 70:8098
【非特許文献１７】Clarkら、（1996）Hum. Gene Ther. 8:659
【非特許文献１８】Fisherら、（1997）Nat. Med. 3:306
【非特許文献１９】Monahanら（1998）Gene Ther. 5:40
【非特許文献２０】Ferrariら、（1996）J. Virology 70:3227-34
【非特許文献２１】Dongら（1996）Hum. Gene Ther. 7:2101
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、ＡＡＶベクターよりも大きなパッケージング限界及び形質導入効率を有するウイルスベクターの改良に対する技術上の必要が依然として存在する。また、ＡＡＶベクターと比較して変化した向性を有するウイルスベクターが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の開示）
本発明は、導入（すなわち、送達）及び、好ましくは、細胞へヌクレオチド配列を発現するためのパルボウイルスベクターを提供する。本発明は、一部は、現在のベクターと比較して独特な構造及び特徴を持つパルボウイルスベクターが、外来配列（すなわち、外来性アミノ酸配列）をパルボウイルスキャプシドへ置換又は挿入することで作成しうるという発見に基づく。本発明は、異なるパルボウイルスキャプシド内のパルボウイルスゲノム（好ましくは、ＡＡＶゲノム）を交差パッケージングすることにより生成される新規なベクターをさらに提供する。本発明は、現在のＡＡＶベクターと比較して独特かつ有利な抗原特性、パッケージング能力、及び細胞向性を持ちうる新規なパルボウイルスベクターのレパートリーを提供する。
【００１６】
本発明のこれらの態様及び他の態様は、以下の発明の説明においてさらに詳細に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＡＡＶ２キャプシドに対する挿入性変異原性法を示す図である。ＥｃｏＲＶ及びＮａｅＩ部位によりフランキングされたＫａｎｒ遺伝子を含有するカセットがプラスミドｐＡＶ２Ｃａｐへクローン化された。ＡＡＶ２キャプシドの開放読み枠を含有するｐＡＶ２Ｃａｐは、部分的にＨａｅＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、及びＲｓａＩで別個に消化され、単位長生成物が分離された。これらの酵素の制限部位の４３位置がキャプシド開放読み枠の図の上部に示されている。Ｋａｎｒ挿入の位置は制限酵素の消化によりマッピングされ、ある場合には配列決定された。位置が決定されると、Ｋａｎｒ遺伝子はＥｃｏＲＶにより除去され、キャプシドドメインはｐＡＣＧにサブクローン化された。この方法により、１２塩基対フラグメントが、独特なＥｃｏ ＲＶ部位をフランキングする半ＮａｓｅＩ部位とともに、それぞれＨａｅ ＩＩＩ部位、Ｎｌａ ＶＩ部位、及びＲｓａ Ｉ部位に挿入された。１２塩基対は４個のアミノ酸をコードし、その１個がｐＡＣＧ２の図の上部に示されている。
【図２】ＰＡＣＧ２の野生型及び挿入変異体ヘルパープラスミドを形質移入した細胞内のキャプシドタンパク質の発現を示す図である。１、Ｈ２２８５；２、Ｈ２６３４；３、Ｈ２６９０；４、Ｎ２９４４；５、Ｈ２９４４；６、Ｈ３５９５；７、Ｈ４０４７；８、野生型を形質移入した２９３細胞からの細胞ライセートをアクリルアミドゲル電気泳動及びＢ１モノクローナル抗体による免疫ブロットにより分析し、ペルオキシダーゼ共役二次抗体により検出した。ウエスタンブロットの左側は分子量標準物質の位置であり、右側は主要キャプシドタンパク質、ＶＰ３及び副キャプシドタンパク質ＶＰ２並びにＶＰ１の位置である。
【図３】挿入変異体又は野生型ウイルスを形質移入した細胞内のＬａｃ Ｚ導入遺伝子の発現を示す図である。パネルＡ。Ｌａｃ Ｚ導入遺伝子とのドットブロットハイブリッド形成。挿入変異体又は野生型ヘルパープラスミド及びベクター含有Ｌａｃ Ｚ導入遺伝子を形質移入したアデノウィルス感染２９３細胞の細胞ライセートを塩化セシウム等密度勾配にさらした。勾配からのフラクションをドットブロッティング前にＤＮＡ分解酵素及びＲＮＡ分解酵素で処置し、パッケージングされていない核酸を除去し、フラクション番号がドットブロット上に表示されている。フラクション１の密度は１．３７７〜１．４１であり、フラクション２の密度は１．３９〜１．４３５であり、フラクション３の密度は１．４２〜１．４５である。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を対照テンプレートとして用いて、粒子数を推計した。１μｇの１０００ｂｐ ＤＮＡ仮定して引き出された粒子数の推定値は、９．１×１０１１分子である。パネルＢ。Ｌａｃ Ｚ導入遺伝子を含有する種々の挿入変異体及び野生型キャプシドからの１．７５×１０８粒子とのＨｅＬａ細胞の感染。導入遺伝子を発現する細胞は、Ｘ−ゲルで染色するとブルーに見える。
【図４】電子顕微鏡を用いた挿入変異体の特徴づけを示す図である。勾配のピークフラクションからの各ウイルスの２００ｕＬ試料を１×ＰＢＳ＋１ｍＭ ＭｇＣｌ２に対して透析して高速真空乾燥し、２０ｕＬの蒸留Ｈ２Ｏ中に再懸濁した。試料を２％リンタングステンで陰性染色した。パネルＡ。野生型ビリオンを有するｒＡＡＶ２。感染性挿入ウイルスＨ２６９０（パネルＢ）、及びＨ２５９１（パネルＣ）。非感染性ウイルスＨ２２８５（パネルＤ）、Ｈ２６３４（パネルＢ）及び、Ｈ３５９５（パネルＦ）。黒のバーは１００ｎｍであり、各パネルの倍率は等しい。
【図５】塩化セシウム勾配遠心分離により細胞ライセートから分離された野生型及び種々の挿入変異体からのビリオン成分の分析を示す図である。ウイルスのピークフラクションをドットブロットハイブリッド形成により測定し、１×ＰＢＳ＋１ｍＭ ＭｇＣｌ２に対して透析した。各々について、１．０×１０９粒子と２．５×１０９粒子との間のウイルス粒子を用いた。１．野生型ｒＡＡＶ２；２．Ｈ２２８５；３．Ｒ２３４９；４．Ｈ２５９１；５．Ｈ２６３４；６．Ｈ２６９０；７．Ｈ３７６６；及び８．Ｎ４１６０からのビリオンをアクリルアミドゲル電気泳動及びＢ１モノクロナール抗体による免疫ブロットにより分析するとともに、ペロオキシダーゼ共役二次抗体により検出した。ウエスタンブロットの左側は分子量標準物質の位置であり、右側は主要キャプシドタンパク質、ＶＰ３及び副キャプシドタンパク質ＶＰ２並びにＶＰ１の位置である。
【図６】ドットブロットハイブッリッド形成によるへパリンアガロースとの野生型及び非感染性挿入変体ウイルスバッチの分析を示す図である。キャプシド内の野生型ビリオン及び挿入を有するウイルスを０．５×ＰＢＳと１ｍＭ ＭｇＣｌ２に対して透析した。１００マイクロリットルの各ウイルスを室温で１時間、１００μｌのへパリンアガロースと結合させた。試料を各々５００μｌの洗浄緩衝液で６回洗浄した後、各々１００μｌの０．５、１．０及び１．５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、各洗浄及び溶出ステップからの上清を保存した。各ステップ及び２０μｌのアガロースペレットからの２０マイクロリットルの上清を用いてドットブロットハイブリッド形成用とした。対の洗浄を組み合わせ、各対から総量の１／５０を用いてドットブロットハイブリッド形成用とすると同時に、溶出上清及びアガロース総容積の５分の１を用いた。１００％の結合はへパリンアガロースに添加したウイルスの５分の１に等しい。試料１．野生型ビリオンを有するｒＡＡＶ２；２．Ｈ２２８５：３．Ｈ２４１６；４．Ｈ２６３４；及び５．Ｈ３７６１。
【図７】ＡＡＶ２／４サブユニットキメラを表わす模式図である。
【図８】ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２／Ｂ１９ｐ２Ｃａｐを示す図である。
【図９】ｐＡＡＶ／Ｂ１９ｐ２Ｃａｐにより生成されるキメラウイルス粒子のＥＭ分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、in vitro及びin vivoでの核酸を細胞に送達するためのパルボウイルスベクターを提供する。あるいは、本発明は、例えば、ワクチンとして又は細胞に化合物を送達するための使用に新規なキャプシド構造物を提供する（例えば、Samulskiらに対する米国特許第5,863,541号に記載され、その開示の全体が本明細書中で援用される）。本発明のパルボウイルスベクターはＡＡＶベクターの有利な特性を使用し、これらのベクターで遭遇する問題の一部を軽減することができる。特別な実施例において、パルボウイルスベクターは、抗原特性、パッケージング能力、及び／又は細胞向性を含むがこれらに限定されない、ＡＡＶベクターとは異なる又は変化した特徴を持ちうる。
【００１９】
本明細書中で用いられる「パルボウイルス」という用語は、自律複製性パルボウイルスや依存性ウイルスを含めて、すべてのパルボウイルスを包含する。自律性パルボウイルスには、パルボウイルス（Parvovirus）属、エリスロウイルス（Erythrovirus）属、デンソウイルス（Densovirus）属、イテラウイルス（Iteravirus）属、及びコントラウイルス（Contravirus）属の仲間が含まれる。典型的なパルボウイルスとして、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、及びＢ１９ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。他の自律性パルボウイルスは当業者に周知である。例えば、BERNARD N. FIELDら、VIROLOGY、第２巻、第６９章（第３版、Lippincott-Raven Publishers）を参照。
【００２０】
依存性ウイルス属は、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含むがこれらに限定されないアデノウィルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、例えば、BERNARD N. FIELDら、VIROLOGY、第２巻、第６９章（第３版、Lippincott-Raven Publishers）を参照。
【００２１】
本発明のパルボウイルス粒子、キャプシド及びゲノムはＡＡＶ由来であることが好ましい。
【００２２】
本明細書中で用いられる「向性」という用語は、任意にまた好ましくは、例えば、組換えウイルスのための細胞内のウイルスゲノムにより輸送される配列の発現、異種ヌクレオチド配列の発現後の細胞内へのウイルスの侵入を指す。当業者であれば、ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写が、例えば、誘導性プロモーター又は他の調節核酸配列のためのトランス作用性因子の非存在下に開始しえないことは明らかであろう。ＡＡＶの場合には、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、非組込みエピソームのほか、ウイルスが細胞へ取り込まれる他の形態から安定に組み込まれたプロウイルスによるとみられる。
【００２３】
本発明のパルボウイルスベクターはin vitro及びin vivoで細胞に核酸を送達するために有用である。特に、本発明のベクターは動物細胞に核酸を送達又は導入するために有利に使用できる。関連核酸として、ペプチド及びタンパク質をコード化する核酸、好ましくは治療的（例えば、医療又は獣医用途）又は免疫原性（例えば、ワクチン用）ペプチド又はタンパク質が挙げられる。
【００２４】
「治療的」ペプチド又はタンパク質は、細胞又は対象におけるタンパク質の非存在又は欠損の結果起こる症状を軽減又は除去しうるペプチド又はタンパク質である。あるいは、「治療的」ペプチド又はタンパク質は、他の利点、例えば、抗癌効果を患者に与えるものである。治療的ペプチド又はタンパク質として、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）、ジストロフィン（ジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質生成物を含む、例えば、Vincentら、（1993）Nature Genetics 5:130を参照）、ウトロフィン（Tinsleyら、（1996）Nature 384:349を参照）、凝固因子（ＸＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、等）、エリトロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ホルモン、成長因子（例えば、インスリン様成長因子１及び２、血小板由来成長因子、上皮性成長因子、神経成長因子、向神経性因子−３及び−４、脳由来向神経性因子、グリア由来因子、トランスフォーミング成長因子−α及び−β、等）、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、自殺遺伝子生成物（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロムＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、及び腫瘍壊死因子）、癌治療において使用される薬物に対する耐性を与えるタンパク質、腫瘍抑制遺伝子生成物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、ＶＨＬ、ＡＰＣ、等）、及びその必要のある対象における治療効果を有する他のペプチド又はタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
さらに典型的な治療的ペプチド又はタンパク質として、嚢胞性線維症（及び他の肺疾患）、Ａ型血友病、Ｂ型血友病、地中海貧血症、貧血及び他の血液疾患、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、及び他の神経性疾患、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ、ベッカー）、ゴーシェ病、フルラー病、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、糖原病及び他の代謝欠損症、網膜変性疾患（及び他の眼病）及び固形臓器(例えば、脳、肝、腎、心臓)の疾患が挙げられるがこれらに限定されない疾患状態の治療において使用しうるもの含む。
【００２６】
本発明はワクチンとして有用であるベクターも提供する。ワクチンとしてのパルボウイルスの使用は技術上周知である（例えば、Miyamuraら、（1994）Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507；その開示の全体が本明細書中で援用される、Samulskiらに対する米国特許第5,882,652号、米国特許第5,863,541を参照）。抗原は、キメラ及び改変パルボウイルスベクターについていかに述べるように、パルボウイルスキャプシドにおいて提示される。あるいは、抗原は組換えＡＡＶゲノムに導入され、本発明のパルボウイルスにより輸送される異種核酸から発現される。関連免疫原はパルボウイルスベクターにより提供される。関連免疫原は技術上周知であり、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原、等を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
さらに代わりとして、異種核酸配列はレポーターペプチド又はタンパク質（例えば、抗原）をコード化しうる。レポータータンパク質は技術上周知であり、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、等を含むがこれらに限定されない。
【００２８】
あるいは、本発明の特別な実施例において、関連核酸はアンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第5,877,022号に記載）、スプライセオソーム媒介ｔｒａｎｓ−スプライシングをもたらすＲＮＡ（Puttarajuら、（1999）Nture Biotech. 17:246）、又は「ガイド」ＲＮＡ（Gormanら、（1988）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929；Yuanらに対する米国特許第5,869,248号）など他の非翻訳ＲＮＡをコード化しうる。
【００２９】
別に示されている以外は、ｒＡＡＶゲノム、相補性パッケージングベクター、本発明による一過性及び安定に形質移入されるパッケージング細胞の構成には当業者に周知の標準方法を使用することができる。係る方法は当業者に周知である。例えば、SAMBROOKら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL第２版（Cold Spring Harbor、NY、1989）；F.M.AUSUBELらCuRRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（GREEN PUBLISHING ASSOCIATES, INC. 及びJohn Wiley & Sons, Inc.、ニューヨーク）を参照。
【００３０】
Ｉ． ハイブリッドウイルス。
【００３１】
本発明のハイブリッドパルボウイルスベクターは、細胞への核酸又は他の分子を送達するためのＡＡＶベクターの不利の一部を克服することができる。
【００３２】
本明細書中で使用される「ハイブリッド」パルボウイルスは、異なる（すなわち、別の、異質な、外来性の）パルボウイルスキャプシドへキャプシド形成されるＡＡＶゲノムである。換言すれば、ハイブリッドパルボウイルスは異なるパルボウイルスキャプシドへキャプシド形成されるパルボウイルスゲノムを有する。本明細書中で用いられるように、「異なる」により、ＡＡＶゲノムが別のキャプシドへパッケージングされること、例えば、パルボウイルスキャプシドが別のＡＡＶ血清型又は自律性パルボウイルスに由来することが意図されている。
【００３３】
好ましくは、パルボウイルスゲノムはＡＡＶゲノムである（好ましくは、組換えＡＡＶゲノム）。また、以下に述べるように、ＡＡＶゲノムは１つ又はそれ以上のＡＡＶ逆方向末端反復を含むことが好ましい。典型的に、以下にさらに詳しく述べるように、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、ｔｒａｎｓで供給されるゲノムの残り（例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子）とともに、ｃｉｓにおいて要求される要素（例えば、１つ又はそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲ）のみを保持する。
【００３４】
特に好ましい実施例では、パルボウイルスキャプシドはＡＡＶキャプシド（すなわちハイブリッドＡＡＶベクター）である。この実施例によれば、ＡＡＶキャプシドは異なる血清型（及び好ましくは、１つ又はそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲからの異なる血清型）のＡＡＶゲノムをパッケージングする。例えば、組換えＡＡＶ１、２、３、４、５又は６型ゲノムは、ＡＡＶキャプシド及びゲノム（及び好ましくは、１つ又はそれ以上のＡＡＶ ＩＴＲ）が異なる血清型であることを条件として、ＡＡＶ１、２、３、４、５又は６キャプシドへキャプシド形成することができる。
【００３５】
本発明による例示のハイブリッドパルボウイルスは、ＡＡＶ１、３、４、５又は６型キャプシドへパッケージングされたＡＡＶ２型ゲノムである。特に好ましい実施例では、ハイブリッドパルボウイルスは、ＡＡＶ２型ゲノムをパッケージングするＡＡＶ３型、４型、又は６型キャプシド、さらに好ましくは、２型ゲノムをパッケージングするＡＡＶ３型又は５型キャプシドを含む。
【００３６】
他の好ましい実施例では、ＡＡＶ１、３、４、５又は６型ゲノムが異なるＡＡＶキャプシド（例えば、２、３、４、５、又は６型キャプシド、等における１型ゲノム）へパッケージングされる。
【００３７】
また、ＡＡＶゲノム（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５又は６型ゲノム）がＢ１９キャプシドへパッケージングされるハイブリッドＢ１９／ＡＡＶパルボウイルスが好ましい。さらに、ハイブリッドパルボウイルスがＢ１９キャプシド及びＡＡＶ２型ゲノムを有することが好ましい。
【００３８】
さらに、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、又はガチョウパルボウイルスがＡＡＶゲノム、さらに好ましくはＡＡＶ２型ゲノムをパッケージングすることが好ましい。
【００３９】
特異的なハイブリッドウイルスとして、付録１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド２１３３乃至４３４１）に示したＡＡＶ２／４ヘルパープラスミドによりコード化されるキャプシド配列を有するものが挙げられる。この配列は、ＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーンにおけるＡＡＶ４キャプシドをコード化する。また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１により示されたキャプシド配列を有するハイブリッドパルボウイルスがＡＡＶ２ゲノムであることが好ましい。あるいは、ＡＡＶ４キャプシドのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド２１２３乃至４３４１として示されたヌクレオチド配列と実質的に相同である。さらに代わりとして、ＡＡＶ４キャプシドのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１におけるヌクレオチド２１２３乃至４３４１によりコード化されたアミノ酸配列をコード化する。「実質的に相同」という用語は以下で定義される。
【００４０】
遺伝子送達のための現在のＡＡＶベクターの制約のひとつは、ヒト個体群内のＡＡＶに対する中和抗体の蔓延である。例えば、８０％の成人がＡＡＶ２型に対して血清陽性である。好ましい実施例では、本発明は、治療される対象における免疫応答の縮小（例えば、減少、低下、緩和、等）に有利に使用されうるハイブリッドパルボウイルスベクターを提供する。このため、例えば、１つ又はそれ以上の異種核酸配列を保有するｒＡＡＶ２型ベクターゲノムをＡＡＶ３型キャプシドへパッケージングし、ＡＡＶ２型に対して血清陽性であり、ＡＡＶ３型ウイルスを中和することができない対象に投与することができる。
【００４１】
本発明の本態様によれば、ｒＡＡＶゲノムは、in vitro又はin vivoで細胞に送達するための非相同パルボウイルスキャプシドへパッケージングすることができる。好ましい実施例では、ＡＡＶゲノムは、中和抗体を克服するため、及び／又は免疫応答の進展を予防するために非相同キャプシドのアレイへパッケージングされる。特に好ましい実施例では、ｒＡＡＶは、新しいウイルスベクターで免疫系を絶えず提示するように、一連のハイブリッドウイルス粒子へ送達することができる。この方法は、免疫クリアランスなしに反復投与を可能とする。
【００４２】
ＡＡＶベクターで遭遇する別の制約は、このウイルスの細胞向性の問題である。ＡＡＶの野生型の向性は、ＡＡＶが広範囲の細胞系に感染するという点と関連の他の潜在的な標的細胞（例えば、赤血球系細胞）において感染力を示さないという点で問題となる。これと対照的に、自律性パルボウイルスの細胞向性は狭い。特に自律性パルボウイルスの向性は当業者には周知である。自律性パルボウイルスの例示の細胞向性として、Ｂ１９ウイルス（赤血球系細胞）、イヌパッケージング（腸上皮）、ＭＶＭ（ｐ）（線維芽細胞）；及びガチョウパルボウイルス（心臓の心筋内張り）が挙げられる。さらに、自律性パルボウイルスはＡＡＶよりも広範囲の宿主種を示し、その特徴は、例えば、獣医治療のために、ウシ、イヌ、ネコ、ガチョウ、アヒル、等に投与するＡＡＶベクターの開発に利用することができる。このため、本発明による自律性パルボウイルスキャプシドにおけるＡＡＶゲノムの交差パッケージングを利用し、ＡＡＶとは異なる細胞向性を示すウイルスベクターを生成することができる。
【００４３】
ＡＡＶ／ＡＡＶハイブリッドに関して、ＡＡＶ血清型のすべては細胞の広範囲の宿主に感染する。しかし、ベクター形質移入率には差があり、異なる血清型が異なる細胞受容体を使用することを示している。また、結合実験における血清型間には限定された競合のみが観察され、その所見はさらに異なる血清型が別の受容体を使用するために進化したことを示している（Mizukamiら、（1996）Virology 217:124）。したがって、異なる血清型のＡＡＶキャプシドにおけるＡＡＶゲノムをパッケージングする本発明のハイブリッドパルボウイルスは、現在のＡＡＶベクターよりも広範囲の細胞型にＡＡＶベクターを送達する可能性及び／又は特異的な標的細胞にＡＡＶベクターを方向づける可能性も提供する。
【００４４】
好ましい実施例では、ハイブリッドパルボウイルス粒子はｒＡＡＶゲノムを含有する。本願中で用いられているように、ｒＡＡＶゲノムは細胞に送達されるべき少なくとも１つの異種核酸配列を保有する。当業者であれば、ｒＡＡＶゲノムが１種類以上の異種核酸配列（例えば、２、３種類又はそれ以上の異種核酸配列）をコード化することができ、一般にウイルスキャプシドのパッケージング能によりわずかに制限されることが明らかであろう。本発明による使用の関連異種核酸は上述した通りである。
【００４５】
本願中で用いられるように、組換えハイブリッドパルボウイルス粒子は、以下に述べる通り、ハイブリッド、キメラ、標的及び／又は改変パルボウイルスキャプシドを有するウイルス粒子を包含する。さらに、当業者であれば、パルボウイルスキャプシドが他の改変又は変異（例えば、欠失、挿入、点及び／又はミスセンス変異、等）を含みうることを理解するであろう。同様に、ｒＡＡＶゲノムは改変又は変異（例えば、欠失、挿入、点及び／又はミスセンス変異、等）を含みうる。当業者にはさらに、変異が使用されるクローニング法の結果としてＡＡＶゲノム又はパルボウイルスキャプシドに偶発的に導入されうることが明であろう。
【００４６】
ハイブリッドパルボウイルスのｒＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）、好ましくは２つのＡＡＶ ＩＴＲ、さらに好ましくは、細胞に送達すべき異種核酸配列をフランキングする２つの相同ＡＡＶ ＩＴＲをコード化することが好ましい。ＡＡＶ ＩＴＲはいずれかのＡＡＶ由来であって、１、２、３、４、５又は６型が好ましく、２型が最も好ましい。「逆方向末端反復」という用語は、その開示の全体が本明細書中で援用されるSamulskiらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載された「二重−Ｄ配列」など、ＡＡＶ逆方向末端反復として機能する合成配列を含む。単一の１６５ｂｐ二重−Ｄ配列のみが、ベクター配列の部位特異的な組み込み、複製、及びキャプシド形成のためにｃｉｓにおいて要求されることが明らかにされている。本発明によるＡＡＶ ＩＴＲは、ＩＴＲが機能してウイルスパッケージング、複製、組み込み、及び／又はパルボウイルスの救出、等を仲介する限り、野生型ＩＴＲ配列（例えば、野生型配列は挿入、欠失、切断又はミスセンス変異により変化されうる）を有する必要はない。
【００４７】
本発明によるハイブリッドパルボウイルスでは、ＡＡＶ ＩＴＲはパルボウイルスキャプシドと異なる。さらに、キャプシドがＡＡＶキャプシドである場合は、キャプシド及びＩＴＲはＡＡＶ血清型が異なる。好ましい実施例では、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２型由来であり、パルボウイルスキャプシドはＡＡＶ３、４又は５型キャプシドであり、さらに好ましくはＡＡＶ３又は５型キャプシドである。別の好ましい実施例では、ハイブリッドパルボウイルスはＢ１９キャプシドを有し、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２型由来である。
【００４８】
さらに、本発明のｒＡＡＶゲノムは、細胞に送達すべき異種核酸配列と操作可能に随伴した、転写／翻訳制御シグナル、複製源、ポリアデニル化シグナル、及び内部侵入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサー、等など発現制御要素を含みうる。当業者には、各種のプロモーター／エンハンサー要素を所望のレベル及び組織特異的発現によって使用することができることが明らかであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンによって、構成的又は誘導的でありうる。プロモーター／エンハンサーは未変性又は外来性でよく、天然又は合成の配列であることができる。外来性によって、プロモーター／エンハンサー領域が、プロモーター／エンハンサー領域が導入される野生型宿主において見出せないことが意図されている。
【００４９】
治療すべき標的細胞又は対象に対して未変性であるプロモーター／エンハサーであることが好ましい。また、異種核酸配列に対して未変性であるプロモーター／エンハンサーが好ましい。プロモーター／エンハンサーは、関連の標的細胞において機能するように選択される。哺乳動物プロモーター／エンハンサーであることも好ましい。
【００５０】
誘導性発現制御要素は、異種核酸配列の発現にわたって調節を提供することが望ましい用途において好ましい。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサー要素は好ましくは組織特異的プロモーター／エンハンサー要素であり、筋特異的（心筋、骨格及び／又は平滑筋を含む）、神経組織特異的（脳特異的を含む）、肝特異的、骨髄特異的、膵特異的、脾特異的、網膜特異的、及び肺特異的プロモーター／エンハンサー要素を含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサー要素として、ホルモン誘導性要素及び精神誘導性要素が挙げられる。典型的な誘導性プロモーター／エンハンサーは、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆ要素、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーター含むがこれらに限定されない。
【００５１】
異種核酸配列が転写されて標的細胞に翻訳される本発明の実施例では、配列をコードする挿入タンパク質の効率的な翻訳のために特異的な開始シグナルが一般に必要である。これらの外因性翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドン及び隣接した配列を含みうるが、天然及び合成の各種の源であることができる。
【００５２】
本発明のパルボウイルスベクターのＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ Ｃａｐ及びＲｅｐタンパク質をコード化する遺伝子を任意に含みうる。好ましい実施例では、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の少なくとも１つ又はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の少なくとも１つをコード化する遺伝子はｒＡＡＶゲノムから欠失する。本実施例によれば、Ｃａｐ及びＲｅｐ機能は、in trans、例えば、トランス相補性パッケージングベクターから又は安定に変換されたパッケージング細胞系により提供することができる。さらに好ましい実施例では、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のすべて又はＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のすべてをコード化する遺伝子は、ｒＡＡＶゲノムから欠失する。最後に、最も好ましい実施例では、ＡＡＶｃａｐ遺伝子のすべて及びＡＡＶｒｅｐ遺伝子のすべてがＡＡＶベクターから欠失する。この配置は、ＡＡＶゲノムにより輸送される異種核酸配列のサイズを最大限にし、クローンング手順を簡単にするとともに、in transで提供されるｒＡＡＶゲノムとｒｅｐ／ｃａｐパッケージング配列との組換えを最小限にする。
【００５３】
本発明によるハイブリッドパルボウイルスでは、パルボウイルスキャプシド遺伝子（存在する場合）は、パルボウイルス、好ましくはＡＡＶからのＣａｐタンパク質をコード化しうる。これとは対照的に、ｒｅｐ遺伝子（存在する場合）は典型的にかつ好ましくはＡＡＶｒｅｐ遺伝子となる。さらに、ＡＡＶゲノムにより輸送されるｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ逆方向末端反復は血清型が同じであることが好ましい。さらに、ｃａｐ遺伝子がＡＡＶｃａｐ遺伝子である場合は、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶｃａｐ遺伝子とＡＡＶ血清型が異なることが好ましい。
【００５４】
異なるＡＡＶ血清型のｒｅｐ遺伝子／タンパク質は、過度の実験なしに特定のハイブリッドパルボウイルスと関連して最高力価のベクターを示すものについて評価することができる。特に好ましい実施例では、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、Gavinら、（1999）J. Virology 73:9433（その開示の全体は本明細書中で援用される）により記載された通り、温度感受性Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐタンパク質をコード化する。
【００５５】
上述した通り、ハイブリッドパルボウイルスのＣａｐタンパク質はＡＡＶゲノムとは異なる（すなわち、Ｃａｐタンパク質は異なるＡＡＶ血清型又は自律性パルボウイルスのいずれかである）。また、上述した通り、Ｃａｐタンパク質は典型的にかつ好ましくはｒｅｐ遺伝子（存在する場合）とは異なる。
【００５６】
したがって、特に好ましい実施例では、ハイブリッドパルボウイルスはＡＡＶ３、４、又は５型キャプシドを有し、ＡＡＶ２型ＩＴＲを含むＡＡＶ２型ゲノムを保有する。さらに、ＡＡＶゲノムはＡＡＶｒｅｐ遺伝子（好ましくは２型）及びＡＡＶｃａｐ遺伝子（好ましくは、それぞれＡＡＶ３、４、又は５型）を含みうる。しかし、典型的に、ＡＡＶゲノムはｒＡＡＶゲノムとなり、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子はそこから欠失する。別の好ましい実施例では、ハイブリッドパルボウイルスはＢ１９キャプシドを有し、ＡＡＶゲノム、さらに好ましくは、ＡＡＶ ＩＴＲを含めてＡＡＶ２型ゲノムを保有する。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（好ましくはＡＡＶ２型）及びＢ１９キャプシドタンパク質を任意にコード化することができるが、好ましくはこれらの配列を欠くｒＡＡＶゲノムである。
【００５７】
本発明は、本発明によるハイブリッドパルボウイルスを生成するための本発明によるＡＡＶゲノム及びパルボウイルスｃａｐ遺伝子並びにＡＡＶｒｅｐ遺伝子をコード化するヌクレオチド配列及びベクター（クローニング及びパッケージングベクターを含む）も提供する。上述した通り、好ましい実施例では、少なくともＡＡＶｒｅｐ遺伝子の１つ又はＡＡＶｃａｐ遺伝子の１つ、さらに好ましくはＡＡＶｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶｃａｐ遺伝子のすべてがＡＡＶゲノムから欠失する。Ｒｅｐ及びＣａｐ機能はパッケージングベクターによるin transで提供しうる。複数のパッケージングベクター（例えば、２、３、等）を使用しうるが、典型的にかつ好ましくはＲｅｐ及びＣａｐ機能のすべてが単一のパッケージングベクターにより提供される。
【００５８】
クローニングベクター及びパッケージングベクターは技術上周知のベクターであればどれでもよい。例示のベクターとして、プラスミド、裸のＤＮＡベクター、細菌人工染色体、酵母人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。好ましいウイルスベクターとして、ＡＡＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプシュタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、バキュロウイルス、及びレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクター、さらに好ましくは、アデノウィルスベクター及びヘルペスウイルスベクターである。
【００５９】
本発明は本発明によるベクターを含有する細胞も提供する。細胞は、細菌細胞、原虫細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、及び動物細胞（例えば、昆虫、ニワトリ、哺乳動物）を含めて技術上周知のいずれの細胞であってよい。
【００６０】
さらに、本発明のハイブリッドパルボウイルスを製造するためのパルボウイルスｃａｐ遺伝子及び／又はＡＡＶｒｅｐ遺伝子をコード化する配列を発現する安定に変換されたパッケージング細胞が提供される。技術上周知の適切な細胞が、パルボウイルスｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子を発現するために使用できる。哺乳動物細胞が好ましい（例えば、ＨｅＬａ細胞）。また、複製欠損性ヘルパーウイルス、例えば、２９３細胞又は他のＥ１ａトランス相補性細胞から欠失した機能を提供するトランス相補性パッケージング細胞系も好ましい。
【００６１】
特に好ましい実施例では、少なくとも１つのｒｅｐ遺伝子又は少なくとも１つのｃａｐ遺伝子、さらに好ましくはｃａｐ遺伝子のすべて又はｒｅｐ遺伝子のすべてがパッケージング細胞の遺伝物質に安定に組み込まれ、そこから発現する。典型的に、かつ最も好ましくは、パルボウイルスｃａｐ遺伝子のすべて及びＡＡＶｒｅｐ遺伝のすべてが安定に組み込まれ、パッケージング細胞により発現することである。
【００６２】
ｃａｐ及びｒｅｐ並びにタンパク質は、ハイブリッドＡＡＶゲノムに関して上述した通りである。このため、パッケージングベクター及び／又はパッケージング細胞は、すべてのパルボウイルスからのｃａｐ遺伝子をコード化しうる。好ましいのは、Ｂ１９、ＡＡＶ３型、ＡＡＶ４型及びＡＡＶ５型ｃａｐ遺伝子である。同様に、パッケージングベクター及び／又はパッケージング細胞は、すべてのパルボウイルスからのｒｅｐ遺伝子をコード化しうる。しかし、ｒｅｐはＡＡＶ遺伝子であることが好ましく、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型、ＡＡＶ４型及びＡＡＶ５型ｒｅｐ遺伝子であることがさらに好ましい。ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２型ｒｅｐ遺伝子であることが最も好ましい。特に好ましい実施例では、ＡＡＶｒｅｐ配列は、Gavinら、（1999）J. Virology 73:9433により記載されているように、温度感受性のＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８タンパク質をコード化する。
【００６３】
ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の発現は、ｒＡＡＶゲノム、パッケージングベクターにより輸送されるか、又はパッケージング細胞のゲノムに組み込まれるかどかに関係なく、詳しく上述したように、技術上周知のプロモーター又はエンハンサーにより駆動されうる。好ましくは、ｃａｐ遺伝子又はｒｅｐ遺伝子（さらに好ましくは両方）がパルボウイルスプロモーターを操作可能に随伴していることである。最も好ましい実施例では、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子はそれらの標準のプロモーター（すなわち、未変性プロモーター）に操作可能に随伴している。
【００６４】
以前の報告では、Ｂ１９／ＡＡＶ２型ハイブリッドベクターからのパルボウイルスｃａｐ遺伝子の発現は、標準のプロモーターを用いて達成不可能であることを示している。Ponnazhagenら、（1998）J. Viroligy 72:5224は、ＡＡＶ２型ゲノムをパッケージングするＢ１９パルボウイルスキャプシドを製造するためのヘルパーベクターの生成を試みた。これらの研究者は、ヘルパーベクター上のｃａｐ遺伝子が標準のＡＡＶ ｐ４０又はＢ１９ ｐ６プロモーターのいずれかによって駆動されると、ウイルスがパッケージングできないことを報告した。ウイルスのパッケージングは、ＣＭＶプロモーター（強力なプロモーター）で標準のプロモーターが置換される場合のみ有効に達成された。ｃａｐ遺伝子の自然の調節が破壊され、ｃａｐ遺伝子の発現はｒｅｐ及びｃａｐコード領域を分裂させ、外来性プロモーターを用いてｃａｐ遺伝子の発現を駆動することによってのみ修復されると思われる。
【００６５】
同様に、Lebkowskiらに対する米国特許第５，６８１，７３１号により提案された、ｒＡＡＶゲノム（ｃｏｌ．１５〜１６）をキャプシド形成する自律性パルボウイルスキャプシドを含むハイブリッドウイルスを生成するためのクローニング法は、パッケージングウイルスにおいて成果は得られない。
【００６６】
これとは対照的に、本発明は、パルボウイルスプロモーター、好ましくは標準のプロモーターを用いてパルボウイルスｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の発現を駆動し、本発明のハイブリッドパルボウイルスを製造するハイブリッドパッケージングベクター及びパッケージング細胞を提供する。標準のプロモーターを用いたハイブリッドパルボウイルスｃａｐ／ｒｅｐ遺伝子作成物を生成する以前の努力は成功しなかったが、少なくとも一部は、以上の研究者がｒｅｐ遺伝子の適切な工程に必要なスプライス部位の完全性を保存できなかったためである。今回の研究では、ｒｅｐ遺伝子内のスプライス部位が保存されているシームレスクローニング法（Stratagene USA）を利用した。あるいは、部位定方向突然変異（又は同様の方法）を用いてハイブリッドウイルス作成物に対するスプライス部位を保存することができる。
【００６７】
本発明はさらに、本発明のハイブリッドパルボウイルスを製造する方法を包含する。本発明によるハイブリッドパルボウイルス粒子は、複製すべきＡＡＶゲノムを導入することで製造し、技術上理解される用語である許容的又はパッケージング細胞にパッケージングすることができる（例えば、「許容的」細胞はウイルスにより感染又は形質導入することができ、「パッケージング」細胞は、ヘルパー機能を提供する安定な形質転換細胞である）。好ましくは、ＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲによりフランキングされる異種核酸配列をコード化するｒＡＡＶゲノムである。ｒＡＡＶゲノム、ＡＡＶ ＩＴＲ、及び異種核酸配列はすべてさらに詳しく上述されている。ＡＡＶゲノムは、上述したように、適切なベクターにより細胞に提供することができる。
【００６８】
ＡＡＶゲノムを保有したベクターを許容的細胞に導入する方法は、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法、微量注入法、陽イオン又は陰イオンリポソーム、及び核局在化シグナルと結合したリポソームを含むがこれらに限定されないものを使用することができる。ＡＡＶゲノムがウイルスベクターにより提供される実施例では、ウイルス感染を得るための標準の方法を使用することができる。
【００６９】
技術上周知の適切な許容的又はパッケージング細胞を使用してＡＡＶベクターを製造することができる。哺乳動物細胞が好ましい。複製血管性ヘルパーウイルス、例えば、２９３細胞又は他のＥ１ａトランス相補性細胞から欠失した機能を提供するトランス相補性パッケージング細胞系も好ましい。
【００７０】
ＡＡＶゲノムは、本願中に記載したように、ＡＡＶｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の一部又はすべてを含有しうる。しかし、好ましくは、ｃａｐ機能及びｒｅｐ機能の一部又はすべてが、上述したように、細胞にパッケージングベクターを導入することでin transで提供されることである。あるいは、細胞は、安定に形質転換されてｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子を発現するパッケージング細胞である。パッケージングベクター及びパッケージング細胞は上述した通りである。
【００７１】
また、新しいウイルス粒子を増殖させるためにエピトープベクターにはヘルパーウイルス機能が提供される。アデノウィルス及び単純ヘルペスウイルスはＡＡＶのヘルパーウイルスとして使用しうる。BERNARD N. FIELDら、VIROLOGY、第２巻、第６９章（第３版、Lippincott-Raven Publishers）を参照。例示のヘルパーウイルスとして、単純ヘルペス（ＨＳＶ）水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、及びエプシュタイン−バールウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。感染効率（ＭＯＩ）及び感染期間は使用されるウイルス型及び使用されるパッケージング細胞系に依存する。適切なヘルパーベクターであればすべて使用しうる。好ましくは、ヘルパーベクターは、例えば、Xiaoら、（1998）J. Virology 72:2224により記載されたプラスミドである。ベクターは、上述した通り、技術上周知の適切な方法によりパッケージング細胞に導入することができる。
【００７２】
ＡＡＶベクターは技術上周知の適切な方法により製造することができる。ＡＡＶベクターの伝統的な製造は、アデノウィルスで感染したヒト細胞へＡＡＶヘルパー及びＡＡＶベクターをコード化するｒｅｐ／ｃａｐベクターの同時形質移入を必要とする（Samulskiら、（1989）J. Virology 63:3822）。最適化された条件下、この手順ではｍｌ当たり１０９感染単位のｒＡＡＶを得ることができる。しかし、この方法の１つの欠点は、ｒＡＡＶ製剤において混入する野生型アデノウィルスの同時生産を生じることである。ヒトにおいて細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）免疫応答を生じるいくつかのアデノウィルスタンパク質（例えば、線維、へクソン、等）が知られているため（YangとWilson、(1995)J. Immunol. 152:2564；Yangら、（1995）J. Virology 69:2004；Yangら、（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:4407）、このことは、これらのｒＡＡＶ製剤を用いる場合の重大な欠点を表わす（Monahanら、（1998）Gene Therapy 5:40）。
【００７３】
混入ヘルパーウイルスのないＡＡＶベクターストックは、技術上周知の方法で得ることができる。例えば、ＡＡＶ及びヘルパーウイルスはサイズに基づき容易に区別しうる。ＡＡＶはヘパリン基質に対する親和性に基づきヘルパーウイルスから分離することもできる（Zolotukhinら、（1999）Gene Therapy 6:973）。
【００７４】
好ましくは、いかなる混入ヘルペスウイルスも複製適格性ではないように欠失型複製欠損性ヘルパーウイルスが用いられる。さらに代わりとして、アデノウィルスの早期遺伝子発現のみがＡＡＶウィルスのパッケージングを仲介するために必要であるため、後期遺伝子発現を欠いたアデノウィルスヘルパーを使用しうる。後期遺伝子発現とって欠損のあるアデノウィルス変異体が技術上周知である（例えば、ｔｓ１００Ｋ及びｔｓ１４９アデノウィルス変異体）。
【００７５】
感染性アデノウィルスによるヘルパー機能を提供する好ましい方法では、効率的なＡＡＶ製造に必要なヘルパー遺伝子のすべてを保有する非感染性アデノウィルスミニプラスミドを使用する（Ferrariら、（1997）Nature Med. 3:1295；Xiaoら、（1998）J. Virology 72:2224）。この方法は、アデノウィルスとの同時形質移入を必要としない（Holscherら、（1994）、J. Virology 68:7169；Clarkら、（1995）Hum. Gene Ther. 6:1329；TrempeとYang、（1993）、第五回パルボウイルスワークショップ、Crystal River、FL）。
【００７６】
ｒＡＡＶストックを製造する他の方法が記載されており、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子を分離発現カセットに分割し、複製適格性ＡＡＶの生成を防ぐ方法（例えば、Allenら、（1997）J. Virol. 71:6816を参照）、パッケージング細胞系（例えば、Gaoら、（1998）Human Gene Therapy 9:2353；Inoueら、（1998）J. Virol. 72:7024を参照）、及び他のヘルパーウイルスを含まない系（例えば、Colosiらに対する米国特許第5,945,335号を参照）使用する方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
したがって、パッケージングすべきＡＡＶゲノム、パルボウイルスｃａｐ遺伝子、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、及びヘルパー機能を細胞（例えば、許容的又はパッケージング細胞）に提供され、ＡＡＶゲノムを保有するＡＡＶ粒子を製造する。ＡＡＶゲノム及び／又はパッケージングベクター及び／又は安定に変換されたパッケージング細胞によりコード化されるｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の発現の組み合わせにより、パルボウイルスキャプシドがＡＡＶゲノムをキャプシド形成するハイブリッドパルボウイルスが製造される。ハイブリッドパルボウイルス粒子は細胞へ集合され、次いで当業者に周知の方法により回収される。
【００７８】
本明細書中で開示される試薬及び方法を使用して高力価ストックの本発明によるパルボウイルスベクターを製造することができる。好ましくは、パルボウイルスストックの力価は少なくとも約１０５形質導入単位（ｔｕ）／ｍｌであり、さらに好ましくは少なくとも約１０６形質導入単位（ｔｕ）／ｍｌであり、さらに好ましくは約１０７ｔｕ／ｍｌであり、なおさらに好ましくは約１０８ｔｕ／ｍｌであり、なおさらに好ましくは約１０１０ｔｕ／ｍｌであり、またなお好ましくは約１０１１ｔｕ／ｍｌ、又はそれ以上である。
【００７９】
別の述べ方をすれば、パルボウイルスの力価は少なくとも約１ｔｕ／細胞が好ましく、さらに好ましくは少なくとも約５ｔｕ／細胞であり、さらに好ましくは少なくとも約２０ｔｕ／細胞であり、さらに好ましくは少なくとも約５０ｔｕ／細胞であり、さらに好ましくは少なくとも約１００ｔｕ／細胞であり、さらに好ましくは少なくとも約２５０ｔｕ／細胞であり、最も好ましくは約５００ｔｕ／細胞、又はそれ以上である。
【００８０】
パルボウイルスは実質的に野生型の力価で製造されることも好ましい。
【００８１】
当業者には、本発明が、キャプシドへのアミノ酸配列の挿入により改変され、各々以下でさらに詳しく述べるように、変化した向性又は他の特徴を与えるハイブリッドパルボウイルスベクターを包含することが明らかであろう。ウイルスキャプシドは他の改変、例えば、欠失、挿入、点及び／又はミスセンス変異、等をも含む。
【００８２】
当業者にはさらに、変異が使用される特定のクローニング法の結果としてｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子に偶発的に導入しうることが明であろう。例えば、上述したハイブリッドパルボウイルスゲノムをコード化する配列の構成により、ｒｅｐ及びｃａｐ配列の重複のためキメラｒｅｐ遺伝子（及びタンパク質）が生じる（例えば、キャプシド遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の３’末端はＡＡＶ３型であり、ｒｅｐ遺伝子の残部はＡＡＶ２型でありうる）。上述したように、３’領域が自律性パルボウイルス由来であるキメラＡＡＶｒｅｐ遺伝子は、部位定方向突然変異誘発、又は同様の方法を用いてハイブリッドウイルス作成物に対するスプライシング部位を修復しない限り、ＡＡＶ及び自律性パルボウイルス間で保存されないスプライシングシグナルとして一般に機能しない。
【００８３】
II. キメラウイルス
本発明はさらに、独特の構造及び特徴をもつキメラパルボウイルスを構成しうる発見を提供する。上述した方法は、異なるパルボウイルス内のＡＡＶゲノムを交差パッケージングすることによるＡＡＶウイルスの構造及び機能を変化させることが焦点であった。ウイルス粒子における別の多様性は、異なる（すなわち別の又は異質の）パルボウイルスからのキャプシドの一部分でパルボウイルスキャプシドの一部分を置換することにより達成しうる。あるいは、一部分の異なるパルボウイルスキャプシドをパルボウイルスキャプシドへ挿入（すなわち置換ではなく）し、キメラパルボウイルスキャプシドを生成することができる。また、キメラパルボウイルス粒子を構成するためのベクター、パッケージング細胞、及び方法も開示される。本明細書中で開示されるキメラパルボウイルスは、新しい抗原特性、パッケージング能力、及び／又は細胞向性を持つ。本発明のキメラキャプシド及びウイルス粒子は、新規なキャプシド構造に対するキメラ特異的抗体を産生するために有用である。
【００８４】
パルボウイルス、ＡＡＶ、及びｒＡＡＶゲノムは、ハイブリッドパルボウイルスに関して上述した通りである。
【００８５】
本明細書中で用いられる「キメラ」パルボウイルスは、異なるパルボウイルスからの異質の（すなわち、外来性）キャプシド領域がパルボウイルスキャプシドへ挿入又は置換されている。好ましくは、異質のキャプシド領域は未変性キャプシド領域のひとつで置換されていることである。特別な実施例では、異質のキャプシド領域はパルボウイルスキャプシド内の相同キャプシド領域で交換されている。パルボウイルスキャプシドがＡＡＶキャプシドであることも好ましい。この実施例によれば、ＡＡＶキャプシドはいずれのＡＡＶ血清型であってもよい（例えば、上述したように、１型、２型、３型、４型、５型、６型、等）。さらに好ましくは、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ２型、３型、４型、又は５型キャプシドであり、ＡＡＶ２型キャプシドであることが最も好ましい。
【００８６】
当業者には、キメラパルボウイルスがさらにハイブリッドパルボウイルス（上述した通り）又は標的、もしくは改変パルボウイルス（以下に述べる通り）でありうることがあきらかであろう。当業者にはさらに、パルボウイルスキャプシドタンパク質をコード化する配列の重複により、単一の挿入又は置換が１つ以上のキャプシドサブユニットに影響を及ぼすことが明らかであろう。
【００８７】
異質のパルボウイルスキャプシド領域は、上述した通り、いずれのパルボウイルス（例えば、自律性パルボウイルス又は依存性ウイルス）であってもよい。好ましくは、異質のキャプシド領域はヒトＢ１９パルボウイルス由来又はＡＡＶ３型、４型、又は５型由来である。
【００８８】
異質のパルボウイルスキャプシド領域はすべて又は実質的にすべてのキャプシドサブユニット（すなわち、領域、例えばＡＡＶのＶｐ１、Ｖｐ２及びＶｐ３サブユニット又はＢ１９ウイルスのＶｐ１及びＶｐ２サブユニット）又は一部分のキャプシドサブユニットを構成しうる。逆に、１つ又はそれ以上の異質のキャプシドユニットは、パルボウイルスキャプシドへ挿入又は置換しうる。同様に、一部分のパルボウイルスキャプシドサブユニット又は１つ又はそれ以上のパルボウイルスキャプシドサブユニットが、１つ又はそれ以上の異質のキャプシドサブユニット、又はその一部分で置換しうる。さらに、キメラパルボウイルスキャプシドは、キャプシド内の１つ以上の部位で挿入及び／又は置換を含有しうる。この実施例によれば、複数の挿入／置換は１つ又はそれ以上のパルボウイルス（例えば、２、３、４、５以上）由来でありうる。一般に、パルボウイルスキャプシド由来の少なくとも１つのサブユニットがキメラキャプシドにおいて保持されることが好ましいが、これは必要というわけではない。
【００８９】
本発明の特別の実施例では、未変性パルボウイルスキャプシドへ挿入又は置換される異質のパルボウイルスキャプシド領域のアミノ酸の長さは少なくとも約２、５、１０、１２、１５、２０、３０、５０、又は１００である。
【００９０】
本発明のキメラパルボウイルスはすべてのパルボウイルスゲノム、好ましくはＡＡＶゲノム、さらに好ましくは組換えＡＡＶゲノムを含有しうる。ＡＡＶが同じ血清型のキメラキャプシド内でパッケージングされる実施例も好ましい。ＡＡＶ２型ゲノムが、キメラパルボウイルスキャプシドの組成に関係なく最も好ましい。
【００９１】
本発明の好ましい実施例では、キメラパルボウイルスはＡＡＶキャプシド、さらに好ましくは、Ｂ１９パルボウイルスからのキャプシド領域がＡＡＶキャプシド領域の１つで置換されているＡＡＶ２型キャプシドを含む。他の好ましい実施例では、キメラパルボウイルスは、ＡＡＶキャプシドのＶｐ３サブユニットがＢ１９ Ｖｐ２サブユニットで置換されているＡＡＶキャプシド（さらに好ましくは、ＡＡＶ２型キャプシド）を含む。
【００９２】
別の好ましい実施例では、キメラパルボウイルスはＶｐ１及びＶｐ２サブユニットがＢ１９パルボウイルスのＶｐ１サブユニットで置換されるＡＡＶキャプシド（好ましくは２型）を含む。
【００９３】
他の好ましくは実施例では、キメラパルボウイルスは２型Ｖｐ１サブユニットがＡＡＶ１、３、４、５、又は６型キャプシド、好ましくは３、４、又は５キャプシドからのＶｐ１サブユニットにより置換されているＡＡＶ２型キャプシドを含む。あるいは、キメラパルボウイルスは、２型Ｖｐ２サブユニットがＡＡＶ１、３、４、５、又は６型キャプシド、好ましくは３、４、又は５キャプシドからのＶｐ２サブユニットにより置換されているＡＡＶ２型キャプシドを含む。同様に、ＡＡＶ１、３、４、５又は６（さらに好ましくは、３、４又は５型）からのＶｐ３サブユニットがＡＡＶ２型キャプシドのＶｐ３サブユニットで置換されているキメラパルボウイルスが好ましい。さらに代わりとして、ＡＡＶ２型サブユニットの２つが異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５又は６型）のＡＡＶからのサブユニットにより置換されうキメラパルボウイルスが好ましい。この実施例による例示のキメラパルボウイルスでは、ＡＡＶ２型キャプシドのＶｐ１及びＶｐ２、又はＶｐ１及びＶｐ２、又はＶｐ２及びＶｐ３サブユニットが異なる血清型のＡＡＶの対応するサブユニット（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５又は６型）により置換される。同様に、他の実施例では、キメラパルボウイルスは、１つ又は２つのサブユニットが、ＡＡＶ２型について上述したように、異なる血清型のＡＡＶからのもので置換されているＡＡＶ１、３、４、５又は６型キャプシド（好ましくは２、３又は５型キャプシド）を有する。
【００９４】
さらに他の好ましくは実施例では、１つのパルボウイルスの副サブユニットが別のパルボウイルスの副サブユニットで置換しうる（例えば、ＡＡＶ２型のＶｐ２はＡＡＶ３型のＶｐ１で置換され、Ｂ１９のＶｐ１はＡＡＶのＶｐ１及び／又はＶｐ２を置換しうる）。同様に、１つのパルボウイルスの主要キャプシドサブユニットは、別のパルボウイルスの主要キャプシドサブユニットで置換しうる。
【００９５】
特異的なキメラキャプシドのヌクレオチド配列は、付録２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のヌクレオチド２１３３乃至４３１５）に示したヘルパープラスミドでコード化されたものを含む。この配列はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーンにおけるＡＡＶ２ｒｅｐコード配列、ほとんんどのＡＡＶ２ Ｖｐ１及びＶｐ３コード配列、及び全体のＡＡＶ４ Ｖｐ２コード配列及び一部のＡＡＶ４ Ｖｐ１及びＶｐ３コード配列を含有する。好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したヘルパーによりコード化されるキャプシドを有するキメラパルボウイルスは、ＡＡＶ２ゲノムを保有する。
【００９６】
あるいは、キメラキャプシドのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド２１３３乃至４３１５として示されたキャプシドコードは配列と実質的に相同性である。さらに代わりとして、キメラキャプシドのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヌクレオチド２１３３乃至４３１５と同じアミノ酸配列をコード化する。「実質的に相同性」という用語は、以下に定義される通りである。
【００９７】
本発明は、キメラパルボウイルスが構成物パルボウイルスキャプシドに似ることのない独特のキャプシド構造物を生成しうる発見も提供する。例えば、今回の研究では、ＡＡＶ２型のＶｐ３サブユニットがヒトＢ１９ウイルスのＶｐ２サブユニットにより置換されるＢ１９／ＡＡＶ２型キメラにより、期待される２３〜２８ｎｍ粒子（ｗｔＡＡＶに典型的）及び新規な３３〜３８ｎｍ粒子が得られることが発見された。大きな粒子が、セシウム等密度の勾配における２３〜２８ｎｍ粒子と同じ密度で存在した。
【００９８】
本発明の特定の理論とするつもりはないが、これらの結果はこの粒子がＴ＝１からＴ＝３への三角数を変更することで形成され、６０の代わりに主要キャプシド成分の１８０コピーを含有する大粒子を産生することを示している。この新規な粒子はそのサイズの増大により野生型ゲノムよりも大きくパッケージングすることができる。特に好ましくは実施例では、Ｂ１９／ＡＡＶ２型キメラパルボウイルスキャプシド（ＡＡＶ２ Ｖｐ３で交換されたＢ１９ Ｖｐ２）がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（付録３）で示された配列を有する。
【００９９】
本発明はさらに、野生型よりも大きなキャプシド構造（例えば、直径が約２８ｎｍ、３０ｎｍ、３２ｎｍ、３４ｎｍ、３６ｎｍ、３８ｎｍ、４０ｎｍ以上）を有するＢ１９／ＡＡＶキメラキャプシド及びパルボウイルスを提供する。別の述べ方をすれば、本発明は野生型よりも多くのキャプシドサブユニット（例えば、約９０以上のキャプシドサブユニット、約１２０以上のキャプシドサブユニット、約１８０以上のキャプシド）を含有するキャプシド構造を有するＢ１９／ＡＡＶキメラキャプシド及びパルボウイルスを提供する。さらに別の述べ方をすれば、本発明は野生型ゲノム以上に効率的にパッケージングする（例えば、約４．８ｋｂ、５．０ｋｂ、５．２ｋｂ、５．４ｋｂ、５．６ｋｂ、５．８ｋｂ、６．０ｋｂ、６．２ｋｂ、６．４ｋｂ、６．８ｋｂ以上）Ｂ１９／ＡＡＶキャプシド及びパルボウイルスを提供する。好ましくは、大型のゲノムが効率的にパッケージングされ、上述した力価を有するウイルスストックを生成することである。
【０１００】
Ｂ１９／ＡＡＶキメラが抗原特性を変化していることも好ましい。特に、Ｂ１９／ＡＡＶキメラが免疫クリアランスなしにＡＡＶの血清型に対する抗体を有する、すなわち、キメラがＡＡＶ血清型特異的抗体抗体により認識されない対象に投与されることが好ましい。
【０１０１】
本発明の他の好ましくは実施例では、Ｂ１９／ＡＡＶキメラキャプシドのヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示した配列と実質的に相同性であり、キメラパルボウイルスキャプシドをコード化する。この定義は、他の血清型のＡＡＶ及び非ヒトＢ１９ウイルスを含むことが意図されている。本明細書中で用いられる、「実質的に相同性」である配列は、少なくとも７５％であり、さらに好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以上の相同性である。
【０１０２】
相同性ヌクレオチド配列のハイブリッド形成を可能にする厳密性の高いハイブリッド形成法の条件は技術上周知である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示した配列にハイブリッド形成する相同性ヌクレオチド配列のハイブリッド形成法は、４２℃下１００μｇの単鎖ＤＮＡ及び５％デキシトラン硫酸とともに、２５％ホルマリン、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘデンハルト液中、４２℃で１５分間、２５％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件で実施し、相同性が約６０％の配列のハイブリッド形成を可能にする。さらに厳密な条件は、標準のin situハイブリッド形成アッセイを用いた６０℃又は７０℃下、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳの洗浄の厳密性により表わされる。（SAMBROOKら、MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL（第２版1989）を参照）。
【０１０３】
他の好ましい実施例では、キメラＢ１９／ＡＡＶキャプシドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（付録４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）に示した配列によりコードかされたアミノ酸配列を有する。
【０１０４】
他の特に好ましい実施例では、パルボウイルスキャプシドの非保存キャプシド領域が、別のパルボウイルスキャプシドへ挿入又は置換、好ましくは置換される。好ましくは、非保存領域は異なるパルボウイルスからの同じ（すなわち、相同性）領域で置換される。パルボウイルス特異的（ＡＡＶ血清型特異的を含む）特徴は、係る非保存領域に随伴する可能性が高い。また、非保存領域は変化に最もよく耐性である可能性も高い。特別な実施例では、パルボウイルスの主要キャプシドサブユニットのループアウト領域を２つのパルボウイルス間、さらに好ましくはＡＡＶとパルボウイルスとの間、なおさらに好ましくは血清型が異なる２つのＡＡＶ間で交換される。
【０１０５】
特にＡＡＶ２型に関して、このウイルスの結晶構造は解明されていないが、構造的相関は配列情報に基づき得られている。その構造的相関は、ＡＡＶ２型のＶｐ３サブユニットが８β−バーレルのモチーフを有し、これらのモチーフがループアウト領域により分離されていることを示している（Chapmanら、Virology 194:419）。最近、ＡＡＶ３型の配列が、Murayamaら、（1996）Viorogy 221:208により確認されている。ＡＡＶ２型とＡＡＶ３型のＶｐ３間のアミノ酸の相同性は８９％であり、領域は７０％の相同性を有するループ３／４と規定されている（同上）。さらに、ＡＡＶ３型はＡＡＶ２型と同じ受容体と結合することはない（Mizukamiら、Virology 217:124）。ループ３及び４の多岐にわたるアミノ酸配列は、ＡＡＶ２型及びＡＡＶ３型により用いられる細胞受容体における差、及び結果としての細胞向性の相違を説明しうる。したがって、本発明の好ましい実施例では、キメラＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２型のループ３/４、又はその一部分がＡＡＶ３型のループ３／４で交換され、又はその逆で同じく交換されて構成されている。
【０１０６】
他の実施例では、キメラパルボウイルスは、Ｖｐ３サブユニットのループ１、２、３、及び／又は４が異なる血清型（例えば、１、３、４、５又は６型）のＡＡＶの対応するループ領域により置換されているＡＡＶ２型キャプシドを含む。例示の実施例では、ＡＡＶ２型Ｖｐ３サブユニットのループ２〜４の血清型が３型又は４型ウイルスのループ２〜４領域により置換されている。
【０１０７】
同様に、他の好ましい実施例では、キメラパルボウイルスは、Ｖｐ３サブユニットのループ１、２、３及び／又は４領域が異なるＡＡＶ血清型の対応する領域により置換される。例示の実施例として、Ｖｐ３サブユニットのループ２〜４領域がＡＡＶ２型ループ２〜４領域により置換されるＡＡＶ３型又は４型キャプシドを含むキメラパルボウイルスが挙げられるがこれに限定されない。
【０１０８】
本発明はさらに、主要Ｖｐ３サブユニットが、自律性パルボウイルスの主要サブユニットからループ領域（好ましくは、対応するループ領域）により置換されるＡＡＶキャプシドを含むキメラパルボウイルスを提供する。特に、ＡＡＶ１、２、３、４、５、又は６型のＶｐ３サブユニットからのループ領域１、２、3及び／又は４が自律性パルボウイルスの主要サブユニットからのループ領域で置換される。
【０１０９】
特異的キメラキャプシドのヌクレオチド配列として、付録５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のヌクレオチド２１３３乃至４３４２）に示したヘルパープラスミドによりコード化されるキャプシド配列を有するものが挙げられる。この配列はＡＡＶ２ｒｅｐコード配列を含有し、ＡＡＶ２ Ｖｐ３サブユニットからのループ２〜４が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーンにおいて、ＡＡＶ３からの対応する領域で置換されたことを除き、ほとんどのＡＡＶ２キャプシドコード配列を含有する。
【０１１０】
あるいは、キメラキャプシドのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のヌクレオチド２１３３乃至４３４２で示した配列と実質的に相同性である。さらに代わりとして、キメラキャプシドのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のヌクレオチド２１３３乃至４３４２によりコード化されるキャプシドと同じアミノ酸配列を有する。「実質的に相同性」という用語は、上で定義した通りである。
【０１１１】
キメラパルボウイルスは、本明細書中で開示された通り、又は技術上周知の他の標準方法により構成することができる。同様に、当業者は、本明細書中で記載されている通り、又は技術上周知の他の標準方法により、過度の実験をせずに、アセンブリ、パッケージング、細胞向性、等のために生成されるキメラパルボウイルスを評価することができる。
【０１１２】
本発明の別の態様は、別のパルボウイルスからの少なくとも１つのキャプシド領域が挿入又は置換（好ましくは、置換）されているキメラパルボウイルスキャプシド（好ましくはＡＡＶ Ｖｐ１、Ｖｐ２又はＶｐ３タンパク質）である。パルボウイルスキャプシドへの異質のキャプシドタンパク質の導入により、キメラパルボウイルスキャプシドタンパク質を組み込むウイルスキャプシド又は粒子（好ましくはパルボウイルスキャプシド又は粒子）に対して変化した特徴（例えば、免疫原性、向性、等）が提供される。あるいは、キメラパルボウイルスキャプシドタンパク質は、キメラパルボウイルスキャプシドタンパク質を組み込むウイルスキャプシド又は粒子（好ましくはパルボウイルスキャプシド又は粒子）の検出又は精製を促進しうる。特に好ましい実施例では、特定の血清型のＡＡＶキャプシド又は粒子の抗原特性が変化（例えば、変更又は改変）され、又は未変性キャプシド領域のキメラパルボウイルスキャプシド領域の組み込みにより減少（例えば、縮小又は軽減）される。この実施例によれば、キメラキャプシドタンパク質を用いて、ＡＡＶキャプシド又は粒子の血清型に対して免疫を有する対象における免疫クリアランスを除去又は減少しうる（例えば、複数のウイルス投与を可能にする）。抗原特性の変化又は縮小は、例えば、キメラパルボウイルスキャプシドタンパク質の存在を除き同一であるＡＡＶキャプシド又は粒子との比較で評価しうる。
【０１１３】
本発明は空のキメラパルボウイルスキャプシド構造物も包含する。空のキャプシドは、ペプチド又はタンパク質（例えば、免疫応答を生じる抗原）、核酸、又は他の化合物の提示又は送達のために使用できる（例えば、Miyamuraら、（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:8507；その開示の全体が本明細書中で援用される、Youngらに対する米国特許第5,916,563号、Mazzaraらに対する第5,905,040号、Samulskiらに対する米国特許第5,882,652号、米国特許第5,863,541号を参照）。空のキャプシドは技術上周知の方法により生成しうる（例えば、同上を参照）。
【０１１４】
本発明のキメラパルボウイルス及びキャプシドはさらに、新規なキャプシド構造物に対する抗体の増大に使用しうる。抗体は当業者に周知である方法により製造しうる。
【０１１５】
本発明は、クローニングベクター、トランス相補性パッケージングベクター、パッケージング細胞、及び本明細書中で開示された本発明のキメラパルボウイルス粒子を製造するための方法も提供する。一般に、ベクター、パッケージング細胞、及びキメラパルボウイルスを製造するための方法は、ハイブリッドパルボウイルスに関して上述した通りである。また、少なくとも１つのｃａｐ遺伝子（ｒＡＡＶゲノム、パッケージングベクター、又はパッケージング細胞によりコード化される）は、非相同性パルボウイルス（上述した通り）からの異質のアミノ酸配列をコード化する少なくとも１つの核酸配列を挿入している。
【０１１６】
ＩＩＩ． 標的パルボウイルス
本発明の別の態様は、外来性ターゲティング配列がパルボウイルスキャプシドへ挿入又は置換されている、パルボウイルスキャプシド及び組換えＡＡＶゲノムを含むパルボウイルスベクターである。パルボウイルスベクターは、パルボウイルスキャプシドへの外来性ターゲティング配列の置換又は挿入によりターゲティングされている（すなわち、特定の細胞型又は複数の細胞型に方向づけられている）ことが好ましい。別の述べ方をすれば、外来性ターゲティング配列はパルボウイルスに対して変化した向性を与えることが好ましい。さらに別の述べ方をすれば、ターゲティング配列は細胞への標的ベクターの送達の効率を増大させる。
【０１１７】
以下でさらに詳しく述べるように、外来性ターゲティング配列は、特定の細胞にパルボウイルスの感染を方向づけるウイルスキャプシド配列（例えば、自律性パルボウイルスキャプシド配列、ＡＡＶキャプシド配列、又は他のウイルスキャプシド配列）でありうる。代わりとして、外来性アミノ酸配列は、細胞へのパルボウイルスベクターの侵入を方向づけるペプチド又はタンパク質をコード化しうる。好ましい実施例では、パルボウイルスキャプシドはＡＡＶキャプシド、さらに好ましくは、ＡＡＶ２型キャプシドである。
【０１１８】
本明細書中で用いられる「変化した」向性は、ターゲティング配列を欠く未変性パルボウイルスと比較して特定の細胞型に関して感染力の縮小又は増強を含む。「変化した」向性は新しい向性の作成も包含する（すなわち、パルボウイルスは特定の細胞型に対して、外来性アミノ酸配列の非存在下には有意な、あるいは検出可能な程度に感染することがない）。あるいは、「変化した向性」は、未変性パルボウイルスと比較して特定の細胞型に対するパルボウイルスベクターのより方向づけられたターゲティングを指しうるが、標的細胞は典型的に未変性パルボウイルスによっても感染しうる（例えば、狭くした向性）。さらに代わりとして、「変化した」向性は、未変性パルボウイルスと比較して標的パルボウイルスのより効率的な送達を指す（例えば、感染効率（ＭＯＩ）の減少）。
【０１１９】
本明細書中で用いられる「感染力の縮小」は、野性型向性の消失及び野生型向性又は特定の細胞型への感染力の減少を包含することが意図されている。感染力の減少は、感染力の野生型レベルに対して感染力の２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％以上の減少でありうる。「感染力の増強」により、特定の細胞型に対する感染力が野生型パルボウイルスで観察される感染力を上回り、例えば、少なくとも２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、又は５００％以上に増大することを意味する。
【０１２０】
外来性ターゲティング配列はキャプシドサブユニットの一部又はすべて、あるいは１つ上のキャプシドサブユニットを交換又は置換しうる。さらに代わりとして、１つ以上のターゲティング配列（例えば、２、３、４、５又はそれ以上の配列）がパルボウイルスキャプシドへ導入しうる。別の実施例では、副キャプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶのＶｐ１及びＶｐ２）内の挿入及び置換が好ましい。ＡＡＶキャプシドについては、Ｖｐ２又はＶｐ３における挿入又は置換も好ましい。
【０１２１】
当業者には、パルボウイルスキャプシドタンパク質をコード化する配列の報復により、単一の挿入又は置換が１つ以上のキャプシドサブユニットに影響を及ぼしうることがあきらかであろう。
【０１２２】
上述したように、特別な実施例では、本発明は独特な構造及び特性を有するキメラパルボウイルス粒子を提供する。別の領域にキメラパルボウイルスキャプシドを作成する1つ又はそれ以上のパルボウイルスキャプシド領域の置換及び／又は挿入により、野生型パルボウイルスの向性の喪失及び／又は外来性キャプシド領域と関連した新しい向性の進展が生じる。したがって、標的パルボウイルスは、詳しく上述した通り、キメラパルボウイルスでありうる。特に、標的キメラパルボウイルスは、主要なキャプシドサブユニットからのキャプシドサブユニット又はループ領域が別のパルボウイルスからのキャプシドサブユニット又はループ領域で置換されているところに提供される。
【０１２３】
したがって、本発明の特別な実施例では、キメラパルボウイルス粒子は、野生型パルボウイルスの向性をコード化するキャプシド領域が異なるパルボウイルス配列からのキャプシド領域又はサブユニットで交換されているところで向性され、それにより野生型の向性を縮小又は完全に消失させる。これらの感染−未変性パルボウイルスは、ターゲティング向性を有するパルボウイルスを作成するテンプレートとして使用しうる。このようにして、新しい又は方向づけられた向性を有するが、野生型の向性を欠いたパルボウイルスを生成することができる。
【０１２４】
別の好ましい実施例では、未変性又は野生型の向性に方向づけられるパルボウイルスキャプシド領域が、別のパルボウイルスの向性に方向づけられるキャプシド領域で交換され、それにより未変性の向性を縮小又は切断すると同時にキメラパルボウイルスに対して新しい向性を与える。他の実施例では、異質のキャプシド領域が、野生型の向性を縮小又は消失させることなくパルボウイルスキャプシドへ置換又は挿入される。さらに代わりとして、１つ以上の異質のパルボウイルスキャプシド領域（例えば、２、３、４、５以上）がパルボウイルスキャプシドへ交換される。例えば、第１のキャプシド領域は野生型の向性に方向づけられる未変性のキャプシド領域を置換しうる。別の異質のキャプシド領域は新しい向性を有するキメラキャプシドを提供する。
【０１２５】
ヘパラン硫酸（ＨＳ）は最近、ＡＡＶの主要な受容体として確認されている（SummerfordとSamulski、（1998）J. Virology 72:1438）。このため、キャプシド構造を改変し、ＡＡＶの細胞受容体との結合を促進又増強し、又はそれとの結合を抑制又は予防することができる。例えば、ＡＡＶの向性は、例えば、ＨＳ結合領域又は他の配列を含有する他のパルボウイルスからの配列により、ＡＡＶキャプシドに対するＨＳ結合を交換することにより変化しうる。
【０１２６】
いくつかのコンセンサス配列が、ＨＳ受容体と結合するリガンドの中で確認されている。一般に、ＨＳは塩基性アミノ酸のクラスターを含む配列と結合するように見える。例示のコンセンサス配列として、ＢＢＸＢ、ＢＢＢＸＸＢ、及びＲＸ７ＦＲＸＫＫＸＸＸＫが挙げられるがこれらに限定されず、ここでＢは塩基性アミノ酸であり、Ｘはいずれかのアミノ酸である。塩基性アミノ酸のクラスターを含有する３つの配列は、以下の通り、ＡＡＶ２型のＶＰ１キャプシドタンパク質の最初の１７０個のアミノ酸残基中に存在する：アミノ酸１１６乃至１２４でのＲＸ５ＲＫＲ、アミノ酸１３７乃至１４４でのＫＸ４ＫＫＲ、及びアミノ酸１６１乃至１７０でのＫＸ６ＲＫＲ（Srivastavaら、（1983）J. Virology 45:555により記載されたＡＡＶ２型配列及び番号、Ruffingら、（1994）J. Gen. Virology 75:3385、Muzycka、（1992）Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97、及びCassinottiら、（1988）Virology 167:176による修正）。また、コンセンサス配列（ＲＸ７ＦＲＰＫＲＬＮＦＫ）が、アミノ酸２９９乃至３１５でのＡＡＶ２型のＶＰ１キャプシドサブユニットにおいて見出されている。
【０１２７】
ＡＡＶ血清型４及び５が細胞性ＨＳ受容体と結合することはなく、又は結合の効率は低いように思われる。したがって、特別の実施例では、ＡＡＶ血清型１、２、３、又は６のＨＳ結合領域はＡＡＶ血清型４又は５の対応する領域で置換され、ＨＳ結合を縮小又は消失するとみられる。同様に、ＨＳ結合は、ＡＡＶ１、２、３又は６からのＨＳ結合領域での挿入又は置換によりＡＡＶ血清型４又は５に対して与えられるとみられる。
【０１２８】
ＨＳコンセンサス配列は大量の塩基性アミノ酸により特徴づけられる。ＡＡＶ２型Ｖｐ１Ｃａｐタンパク質の最初の１７０個の残基へは、３系統の塩基性アミノ酸を含め、正の電荷をもつアミノ酸が高密度で認められ、これは細胞表面とのイオン相互作用に関係しているとみられる。したがって、本発明の１つの特別な実施例では、ＨＳ受容体に対するＡＡＶキャプシドの親和性が、一部又はすべての塩基性配列が他の配列、例えば、ＨＳ結合領域を含有しない別のパルボウイルスからの他の配列により置換される標的パルボウイルスを作成することにより縮小又は除去される。
【０１２９】
あるいは、呼吸器合胞体ウイルスへパリン結合領域を典型的にＨＳ受容体（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、Ｂ１９）と結合することがないウイルスへ挿入又は置換し、結果として生じる変異体にへパリン結合を与えることができる。
【０１３０】
Ｂ１９はその受容体としてグロボサイドを用いて一次赤血球前駆細胞に感染する（Brownら、（1993）Science 262:114）。したがって、Ｂ１９キャプシドのグロボサイド受容体結合領域は他のパルボウイルスキャプシド（好ましくはＡＡＶキャプシド、さらに好ましくは、ＡＡＶ２型キャプシド）へ挿入／置換され、結果として生じるキメラパルボウイルスを赤血球細胞にターゲティングすることができる。
【０１３１】
さらに好ましい実施例では、外来性ターゲティングは、パルボウイルスキャプシドへ挿入又は置換されてパルボウイルスの向性を変化させるペプチド又はタンパク質をコード化するアミノ酸配列であってよい。未変性パルボウイルスの向性はアミノ酸配列の挿入又は置換により縮小又は消失しうる。あるいは、外来性アミノ酸配列の挿入又は置換はパルボウイルスを特定の細胞型にターゲティングする。さらに好ましい実施例では、外来性ターゲティング配列はパルボウイルスキャプシドへ置換又は挿入され、野生型の向性を同時に切断し、新しい向性を導入する。例えば、ターゲティングペプチドをＡＡＶキャプシドのターゲティング領域へ直接挿入し、未変性向性を（例えば、細胞性へパラン硫酸受容体との結合に干渉することにより）同時に破壊し、標的ＡＡＶベクターを特定の細胞に方向づけることができる。
【０１３２】
当業者には、パルボウイルスの未変性向性が、受容体結合の原因となるパルボウイルスキャプシドの領域へ直接、外来性ターゲティング配列を置換又は挿入することなく縮小又は除去しうることが明らかであろう。野生型の向性を喪失した変異体が、本明細書中で開示された新規な向性を有するパルボウイルスを作成するためのテンプレートとして有用である。野生型の向性の喪失を生じる置換又は挿入が受容体結合及び／又は細胞内への侵入のレベルで作用することが好ましい。換言すれば、変化したパルボウイルスは、その他の点で他の手段により、例えば、二重特異性抗体により、本明細書中で開示されたターゲティングペプチド又はタンパク質により、又は技術上周知の他の手段により、細胞内への侵入が提供される場合は、細胞への感染能力があることが好ましい。
【０１３３】
外来性ターゲティング配列は、パルボウイルスの向性を変化させるタンパク質又はペプチドをコード化するアミノ酸配列であってよい。特別の実施例では、ターゲティングペプチド又はタンパク質は天然に発生し、あるいは、完全に又は部分的に合成的でありうる。例示のペプチド及びタンパク質として、ＲＧＢペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド成長因子（例えば、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、シンスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ、等）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、β又はγ）、神経ペプチド及びエンドルフィン、等など細胞受容体及び糖タンパク質と結合するリガンドや他のペプチド、及びそれらの同族受容体に細胞をターゲティングする能力を保持するフラグメントが挙げられる。他の例示のペプチド及びタンパク質として、サブスタンスＰ、ケラチノサイト成長因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、雌鶏の卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β−エンドルフィン、ロイエンケファリン、リモルフィン、α−ネオーエンケファリン、アンジオテンシン、プノイマジン、血管作用性小腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン及び上述したそのフラグメントが挙げられる。さらに代わりとして、ターゲティングペプチド又はタンパク質は、例えば、抗受容体抗体など細胞表面エピトープを認識する抗体又はＦａｂフラグメントであってよい。さらに代わりとして、毒素（例えば、α−ブンガロトキシン、等など破傷風抗毒素又は蛇毒）を用いて、本発明のパルボウイルスベクターを関連の特定の標的細胞にターゲティングすることができる。さらに好ましい実施例では、パルボウイルスベクターを「非古典的な」輸入／輸出シグナルペプチド（例えば、線維芽成長因子−１及び−２、インターロイキン１、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶ２２タンパク質、等）を用いて、Cleves、（1997）Current Biology 7:R318により記載されたように、細胞に送達することができる。また、特異的細胞、例えば、肝細胞により摂取されるＦＶＦＬＰペプチドモチーフトリガーにより摂取を方向づけるペプチドモチーフも包含される。ファージディスプレイ法、及び技術上周知の他の方法を用いて、好ましくは特異的に関連の細胞型を認識するペプチドを確認することができる。
【０１３４】
本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含めてすべての型の免疫グロブリンを指す。抗体はモノクローナル又はポリクローナルであってよく、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、又はヒトを含めてどの種の起源であってもよく、あるいはキメラ抗体であってもよい。「抗体」という用語により、当業者には周知の二重特異性抗体又は「架橋」抗体も包含される。
【０１３５】
本発明の範囲内の抗体フラグメントとして、例えば、Ｆａｂ（ａｂ’）２、及びＦｃフラグメント、及びＩｇＧ以外の抗体から得られる対応するフラグメントが挙げられる。係るフラグメントは周知の方法により製造することができる。
【０１３６】
あるいは、ターゲティング配列は、受容体（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質又はプロテオグリカン）を含めて細胞表面結合部位にパルボウイルス粒子をターゲティングするペプチド又はタンパク質、及び逆に荷電分子（ターゲティング配列又はパルボウイルスキャプシドと比較して）、又はターゲティング配列又は標的パルボウイルスが相互作用して細胞と結合する他の分子をコード化することにより、細胞の侵入を促進する。細胞表面結合部位の例として、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及び他のグリコサミノグリカン、ムチンで見出されるシアル酸成分、糖タンパク質、及びガングリオシド、ＭＨＣ Ｉ糖タンパク質、マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコース、等を含めて膜糖タンパク質で見出される炭水化物成分が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３７】
さらに代わりとして、ターゲティング配列は、細胞へのパルボウイルスの侵入を方向づける別の分子との化学結合（例えば、アルギニン又はリジン残基のアミノ酸側鎖による）のために使用されるペプチド又はタンパク質であってもよい。
【０１３８】
他の実施例では、外来性ターゲティング配列がキャプシドへ置換又は挿入され、細胞受容体（例えば、ＨＳ受容体）結合及び／又は細胞への侵入を乱す。例えば、外来性アミノ酸配列は、細胞受容体と結合及び／又はその他の点でウイルスの細胞への侵入を仲介するＡＡＶキャプシドの領域に置換又は挿入することができる。好ましくは、外来性ターゲティング配列は、細胞ＨＳ受容体（上述した通り）と相互作用するキャプシド領域に挿入されることである。しかし、完全なＡＡＶビリオンを形成する１例としての挿入変異体はへパリンアガロースと結合せず、又は感染Ｈｅｌａ細胞はＡＡＶ２型ゲノム（Ｖｐ３ｃａｐ遺伝子領域）のｂｐ３７６１でのアミノ酸配列の挿入により生成される。
【０１３９】
さらに別の実施例では、パルボウイルスキャプシドへ挿入される外来性アミノ酸配列は、パルボウイルスの精製を促進するものである。本発明のこの態様にによれば、外来性アミノ酸配列が改変パルボウイルスの向性も変化させることは必要ではない。例えば、外来性アミノ酸配列は、当業者には周知であるように、ニッケルカラム上のパルボウイルスを精製するために有用であるポリ−ヒスチジンを含むことができる。あるいは、硫酸をパルボウイルスキャプシドへ置換又は挿入し、パルボウイルスをへパリンとの結合により精製することができるが、これは例えば、Zoloyukhinら、（1999）Gene Therapy 6:973により記載され、その 開示の全体が本明細書中で援用される。
【０１４０】
他の実施例では、アミノ酸配列が、標準の免疫精製法によりＡＡＶを精製するために使用できる抗原性ペプチド又はタンパク質をコード化する。あるいは、アミノ酸配列は、アフィニティー精製又は技術上周知の他の方法（例えば、分化サイズ、密度、電荷、又は等電、イオン交換クロマトグラフィー、又はペプチドクロマトグラフィー）により改変パルボウイルスを精製するために使用できる受容体リガンド又は他のペプチドもしくはタンパク質をコード化しうる。
【０１４１】
本発明のさらに別の実施例では、アミノ酸配列をパルボウイルス粒子へ挿入又は置換され、その検出を促進する（例えば、技術上周知の通り、抗体又は他の検出試薬による）。例えば、「フラッグ」エピトープをパルボウイルスキャプシドへ挿入し、市販の抗体（Eastman-Kodak、Rochester、NY）を用いて検出すうことができる。検出可能なウイルスは、例えば、細胞、組織又は対象中のウイルスの存在及び／又は残留性を追跡するために使用できる。
【０１４２】
さらに別の実施例では、抗原性タンパク質をコード化する外来性アミノ酸配列が改変キャプシドにおいて発現しうる（例えば、ワクチンにおける使用のため）。
【０１４３】
以下及び表１に示したように、今回の研究では、ペプチド挿入に耐性であるキャプシド内の位置を確認するために、ＡＡＶ血清型２のキャプシドコード配列の挿入突然変異を用いた。生存可能な変異体は、各々のキャプシドサブユニット全体にわたる挿入で確認された。これらの挿入変異体は、例えば、ウイルスの精製及び／又は検出、又はキャプシドへの抗原ペプチド又はタンパク質を挿入するために、ＡＡＶキャプシドへペプチド又はタンパク質配列を挿入することが望ましい。表１（実施例を参照）に示したヌクレオチドの位置は、制限部位が作られ、例えば、新しい配列が次のヌクレオチドで開始する位置である。例えば、表１に示した挿入変異体について、ヌクレオチド２２８５で挿入したため、新しい挿入配列はヌクレオチド２２８６で開始することになる。
【０１４４】
パルボウイルス副Ｃａｐサブユニット内、例えばＡＡＶ Ｖｐ１及びＶｐ２サブユニットの外来性アミノ酸配列を挿入することが好ましい。あるいは、Ｖｐ２又はＶｐ３の挿入が好ましい。また、ＡＡＶ２型ｃａｐ内のヌクレオチド２２８５、２３５６、２３６４、２４１６、２５９１、２６３４、２６９０、２７４７、２９４４、３３１７、３３９１、３５６１、３５９５、３７６１、４０４６、４０４７、及び／又は４１６０での挿入変異体が好ましく、好ましくは、本明細書中に記載される向性が変化したＡＡＶ２型ベクターを生成する（本明細書中で用いられるＡＡＶ２型ナンバリングは、Srivastavaら、（1983）J. Virology 45:555により記載され、Ruffingら（1994）J. Gen. Virology 75:3385、Muzycka、（1992）Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97、及びCassinottiら、（1988）Virology 167:176により改変された通りである）。
【０１４５】
ＡＡＶ２のこれらのヌクレオチド位置での挿入は、ＡＡＶ２キャプシドコード領域（アミノ酸１としてＶｐ１の開始メチオニン残基を用いた）、又は当業者には周知の他の血清型のＡＡＶの対応する領域内のアミノ酸２８（ｎｕ２２８５）、５１（ｎｕ２３５６）、５４（ｎｕ２３６４）、７１（ｎｕ２４１６）、１３０（ｎｕ２５９１）、１４４（ｎｕ２６３４）、１６３（ｎｕ２６９０）、１８２（ｎｕ２７４７）、２４７（ｎｕ２９４４）、３７２（ｎｕ３３１７）、３９６（３３９１）、４５２（ｎｕ３５６１）、４６４（ｎｕ３５９５）、５２０（ｎｕ３７６１）、５２１（ｎｕ３７６６）、６１５（ｎｕ４０４６及び４０４７）、及び６５３（ｎｕ４１６０）後のアミノ酸挿入を増大させる。当業者であれば、ＡＡＶキャプシドコード領域における重複により、これらの挿入が１個以上のキャプシドタンパク質内の挿入を増大しうることは明らかであろう。
【０１４６】
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あるいは、外来性アミノ酸配列は、当業者に周知の他の血清型のＡＡＶキャプシドにおける上述した相同部位に挿入する（例えば、Chioriniら、（1999）J. Virology 73:1309を参照）。ＡＡＶキャプシド内のアミノ酸は、ＡＡＶ血清型間に高度に、しかも完全に保存されているように見える。したがって、特別な実施例において、外来性アミノ酸配列は、血清型２以外（例えば、血清型１、３、４、５又は６）のＡＡＶにおける表２（次のアミノ酸で開始する新しい配列）に示したアミノ酸位置で置換される。
【０１４７】
さらに代わりとして、外来性アミノ酸配列は上記の位置でＡＡＶキャプシドに挿入し、上述したように、改変パルボウイルスの精製及び／又は検出を促進し、又は抗原提示を目的としてもよい。
【０１４８】
１つの特別なＡＡＶ２型変異体が、ゲノムのヌクレオチド位置２６３４（Ｖｐ２ｃａｐ遺伝子領域；上述したＡＡＶ２ナンバリング）でアミノ酸配列を挿入することにより製造される。この変異体は、Ｖｐ１及びＶｐ２サブユニットの検出可能発現の非存在下に電子顕微鏡分析により正常な形態を有するＡＡＶ２型を形成する。さらに、この変異体はウイルスゲノムを保護し、へパリンアガロースマトリックスとの結合を保持するが、ＨｅＬａ細胞における感染力は明らかではない。この変異体は、Ｖｐ１及びＶｐ２サブユニットに対する免疫応答を避ける対象に投与するために有用である。さらに、大きなペプチド又はタンパク質をＡＡＶキャプシド構造物へ挿入するために使用できる。１つの実例として、アデノウィルスノブタンパク質をこの変異体へ挿入し、コクサッキーアデノウィルス受容体（ＣＡＲ）に対してウイルスをターゲティングする。
【０１４９】
別の特定のＡＡＶ２型挿入変異体が、ゲノムのｂｐ３７６１（Ｖｐ３キャプシドコード領域内）での外来性アミノ酸配列の挿入により製造される。この変異体はウイルスゲノムを保護し、形態学的に正常なキャプシド構造物を形成するが、へパリン−アガロースと結合することがなく、ＨｅＬａ細胞には感染しない。この変異体は、未変性向性を欠いたＡＡＶベクターを作成するための試薬として有用である。例えば、新しいターゲティング領域がｂｐ３７６１又は別の部位でこの変異体へ導入することができる。表１に示したように、今回の研究では、外来性ペプチドの挿入に耐性であり、感染力を保持するＡＡＶキャプシド内のさまざま位置が発見された（例えば、ＡＡＶ２型ゲノムのｂｐ２３５６、２５９１、２６９０、２９４４、３５９５、及び／又は４１６０）。
【０１５０】
他の好ましい実施例では、複数の挿入及び／又は置換を有するＡＡＶベクターを作成し、所望のパターンの感染力、例えば、非感染性挿入／置換突然変異を示すＡＡＶベクターを提供し、感染性突然変異（例えば、表１に示した通り）を単一ＡＡＶベクターで併用することができる。１つの実例として、ペプチド挿入がＡＡＶ２型ゲノムのｂｐ３７６１（Ｖｐ３サブユニット内）で作られ、非感染性へパリン結合陰性変異体を作成した。第２のペプチド挿入をｂｐ２３５６（あるいは、ｂｐ２５９１、２６９０、２９４４、３５９５又は４１６０）で行い、ベクターにターゲティングした。挿入ペプチドは、ＡＡＶ２型ベクターを関連の標的細胞に対して方向づけるものであってよい。特別な実施例では、ブラジキニンを前述の部位のいずれかで挿入し、肺上皮細胞に対してベクターをターゲティングすることができる（例えば、嚢胞性線維症又は他の肺疾患の治療用）又はアデノウィルスノブタンパク質を前述の部位で挿入しＣＡＲ受容体を発現する細胞に対してベクターをターゲティングすることができる。あるいは、このベクターは免疫応答を得る抗体提示のために使用することができる。
【０１５１】
他の実施例では、置換又は挿入（好ましくは挿入）がＡＡＶ２ゲノムのヌクレオチド３７８９又は３９６１（例えば、新しい配列はそれぞれ、ｎｕ３７９０及び３９６２で開始する）、又は当業者には周知である他のＡＡＶ血清型の対応する部位で行われる。これらの位置はそれぞれ、ＡＡＶキャプシド（アミノ酸としてＶｐ１のＭｅｔ＃１；表２）。特別な実施例では、クローニング法の一環としての制限部位の作成より、ヌクレオチド３７９０〜３７９２（Ｇｌｕ→ｌｌｅ）又はヌクレオチド３９６０〜３９６１（Ｇｌｕ→Ｖａｌ）でそれぞれ、ミスセンス突然変異が認められる。本発明の好ましい実施例では、ｎｕ３７８９又は３９６１でのターゲティング挿入が３７６１突然変異と結合し、これによりへパリン結合の喪失が生じ、標的キャプシド又はパルボウイルスを作成する。
【０１５２】
他の好ましい実施例では、挿入又は置換（好ましくは、挿入）がヌクレオチド３７５３、３８５８、３９６０、又は３９８７（次のヌクレオチドでの新しい配列の開始）、又は他の血清型のＡＡＶにおける対応する部位でのＡＡＶ２キャプシドにおいて行われる。これらの部位は、それぞれＡＡＶキャプシド、又は当業者には周知の他の血清型のＡＡＶキャプシドにおける対応する部位（アミノ酸としてＶｐ１のＭｅｔ＃１；表２）のアミノ酸５１７、５５２、５８６、又は５９５の後の挿入又は置換に対応する。
【０１５３】
他の好ましい実施例では、挿入又は置換は他の血清型、例えば（１、２、３、５又は６）のＡＡＶキャプシドのアミノ酸５１７、５５２、５８６、又は５９５の後に行われる。
【０１５４】
標的又は改変パルボウイルスキャプシドが所望の特性（例えば、アセンブリー、パッケージング、感染力）を保持している限り、ウイルスキャプシドに挿入又は置換しうるアミノ酸配列の長さに対する特別な下限又は上限はない。外来性アミノ酸配列は、長さが１００、５０、２０、１６、１２、８、４又は２アミノ酸という短さであってもよい。同様に、外来性アミノ酸配列はタンパク質全体をコード化する。好ましくは、パルボウイルスキャプシドへ挿入／置換される外来性アミノ酸配列は、改変パルボウイルスキャプシドの外側表面で発現することである。
【０１５５】
本発明はさらに、上述した通り、ターゲティング配列がパルボウイルスキャプシドタンパク質へ挿入又は置換される標的パルボウイルスキャプシドタンパク質を提供する。標的パルボウイルスキャプシドタンパク質は、未変性ウイルスベクター又は標的パルボウイルスキャプシドタンパク質の非存在下のウイルスキャプシドの向性と比較して、その中に標的パルボウイルスキャプシドタンパク質を組み込んだウイルスベクター又はウイルスキャプシド（好ましくは、パルボウイルスベクター又はキャプシド）に対する変化した向性を与える。同様に、改変キャプシドタンパク質（パルボウイルスについて上述した改変）が本発明の別の態様である。改変キャプシドはパルボウイルスキャプシド又は粒子へ組み込まれ、例えば、その精製及び／又は検出を促進し、又は抗原提示を目的とすることができる。
【０１５６】
さらに、キメラパルボウイルスキャプシドと関連して、さらに詳しく上述した通り、標的及び／又は改変パルボウイルスキャプシドが提供される。特別な実施例では、本発明は、ＡＡＶキャプシドについて、米国特許第５，８６３，５４１号などにより記載されている通り、標的パルボウイルス「キャプシド媒体」を提供する。
【０１５７】
本発明によるパルボウイルスキャプシドによりパッケージングされ、細胞へ移入される分子として、その後に標的細胞ゲノムへ有利に組み込まれる組換えＡＡＶゲノム、及び他の異種ＤＮＡ分子、ＲＮＡ、タンパク質及びペプチド、又は小有機分子、又はその組み合わせが挙げられる。異種分子は、パルボウイルス感染においては自然に見出されない分子、すなわちパルボウイルスゲノムによりコード化されない分子と定義される。本発明の好ましい実施例では、キャプシド形成すべきＤＮＡ配列が、ウイルスパッケージングシグナルを含有するＡＡＶ ＩＴＲと結合され、これによりキャプシド形成及び／又はゲノムへの標的組み込みの効率が増大する。
【０１５８】
本発明はさらに、宿主標的細胞への分子の移入するための本発明のパルボウイルスキャプシドの外観と治療的に有用な分子との関連に向けられている。係る関連分子として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂質、タンパク質又はペプチドが挙げられる。本発明の１実施例では、治療的に有用な分子がキャプシドタンパク質と共有結合的に結合される（すなわち、共役又は化学的結合）。共有結合的に分子を結合する方法は当業者には周知である。
【０１５９】
本発明の標的及び／又は改変パルボウイルスのキャプシドタンパク質、キャプシド、及びウイルス粒子は、これらの新規な構造物に対する抗体を増大するために使用できる。あるいは、外来性アミノ酸配列を細胞に対する抗原提示のために、例えば、対象に投与して外来性アミノ酸配列に対する免疫応答を得るために、パルボウイルスキャプシドへ挿入することができる。この後者の実施例によれば、外来性アミノ酸配列もパルボウイルスの向性を変化させることは必要ではない。
【０１６０】
当業者には、上述した改変／標的ウイルス及びキャプシドが前節で述べたキメラ及び／又はハイブリッドパルボウイルスであってもよいことは明らかであろう。当業者にはさらに、本明細書中に記載された挿入変異体が他の改変、例えば、欠失、挿入又はミスセンス突然変異のパルボウイルスを含むことは明であろう。また、その突然変異は使用される特定のクローニング法の結果としてパルボウイルスキャプシド又はｒＡＡＶゲノムへ偶発的に導入される。
【０１６１】
パルボウイルス、ＡＡＶ、およびｒＡＡＶゲノムは、ハイブリッドパルボウイルスに関して上述した通りである。本発明は、クローニングベクター、トランス相補性パッケージングベクター、パッケージング細胞、及び上記の改変及び／又は標的ｒＡＡＶ粒子を製造するための方法も提供する。一般に、ヘルペス、パッケージング細胞、及び標的又は改変パッケージングを製造するための方法は、ハイブリッド及びキメラウイルスに関して上述した通りである。また、少なくとも１つのｃａｐ遺伝子（ｒＡＡＶゲノム、パッケージングベクター、又はパッケージング細胞によりコード化）は外来性ターゲティング配列（上述した通り）又は外来性アミノ酸配列（例えば、精製、検出又は抗原提示について上述した通り）をコード化する少なくとも１つの核酸配列を挿入又は置換している。
【０１６２】
ＩＶ． 遺伝子導入技術
本発明の方法は、細胞の分割と非分割を含め、広範囲の宿主細胞へ異種核酸配列を送達する手段を提供する。本発明のベクターや他の試薬、方法や医薬組成物は、治療又はその他の方法として、それを必要とする対象に対しタンパク質又はペプチドを投与する方法においてさらに有用である。このようにして、タンパク質又はペプチドは対象のin vivoで得ることができる。対象は、その対象がタンパク質又はペプチドの欠損を有しているため、又は対象におけるタンパク質又はペプチドの産生が一部の治療的効果に影響するため、治療又はその他の手段として、またさらに以下で説明されるように、タンパク質又はペプチドの必要がある。
【０１６３】
一般に、本発明を使用し、生物学的効果を有する異質の核酸を送達して遺伝子発現と関連した疾患に伴う症状を治療又は寛解させることができる。例示の疾患状態として、嚢胞性線維症（及び他の肺疾患）、Ａ型血友病、Ｂ型血友病、地中海貧血症、貧血及び他の血液疾患、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、及び他の神経性疾患、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ、ベッカー）、ゴーシェ病、フルラー病、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、糖原病及び他の代謝欠損症、網膜変性疾患（及び他の眼病）及び固形臓器(例えば、脳、肝、腎、心臓)の疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６４】
遺伝子導入は、これらの状態の治療の理解と提供における実質的に有力な用途を有する。欠損性遺伝子が知られ、クローン化されている数多くの先天性疾患がある。ある場合には、これらのクローン化遺伝子の機能は知られている。一般に、上記の疾患状態は２分類化される。すなわち、一般に劣性様式で遺伝性である、通常、酵素の欠損性状態と、優性様式で遺伝性ある、調節又は構造タンパク質を少なくとも時々巻き込む不均衡性状態である。欠損性状態の疾患については、遺伝子導入を用いて補充療法のために疾患組織へ正常な遺伝子を導くほか、アンチセンス突然変異を用いて疾患の動物モデルを作成することができよう。不均衡性疾患状態については、遺伝子導入を用いてモデル系において疾患状態を作成し、次いでこれを疾患状態に対抗する努力において使用できよう。このため、本発明の方法は遺伝子疾患の治療を可能とする。本明細書中で用いられるように、疾患状態は、疾患の原因となり、それをさらに重篤にする欠損又は不均衡を部分的又は全体的に治療することにより治療される。核配列の部位特異的組み込みを用いて突然変異を誘発することや欠損を矯正することも可能である。
【０１６５】
本発明を使用して、in vitro又はin vivoの細胞にアンチセンス核酸を供給することもできる。標的細胞におけるアンチセンス核酸の発現は、細胞による特定タンパク質の発現を減少する。したがって、アンチセンス核酸を投与して、それを必要となる対象における特定タンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をin vitroの細胞に投与して細胞生理を調節すること、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。本発明は他の非翻訳ＲＮＡ、例えば、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載）、スプライセオソーム性トランス−スプライシングをもたらす（Puttarajuら、（1999）Nature Biotech. 17:246）又は「ガイド」ＲＮＡ（例えば、Gormanら、（1988）Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929；Yuanらに対する米国特許第５，８６９，２４８号を参照）ＲＮＡを標的細胞に送達するために有用である。
【０１６６】
最後に、本発明はさらに診断法や検査法における用途があり、これにより関連の遺伝子が一時的に又は安定に細胞培養系、あるいは、遺伝子導入動物モデルにおいて発現される。
【０１６７】
Ｖ． 対象、医薬組成物、ワクチン、及び投与様式
本発明は獣医用及び医療用に使用される。適切な対象として、トリ及び哺乳動物が挙げられ、哺乳動物であることが好ましい。本明細書中で用いられる「トリ」という用語は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ及びキジを含むがこれらに限定されない。本明細書中で用いられる「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、等を含むがこれらに限定されない。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は新生児、乳児、小児、及び成人を含む。
【０１６８】
特別な実施例では、本発明は、薬学的に許容される担体又は他の医療薬剤、医薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、等での本発明のウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。注射のために、担体は典型的に液体となる。他の投与方法のために、担体は、無菌の発熱物質を含まない水又は無菌の発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水など固体又は液体のいずれかであってよい。吸入投与のために、担体は呼吸可能なものとなり、好ましくは固体又は液体の粒子性の形態となる。注射媒体として、滅菌剤、塩又は食塩水、及び／又は緩衝液など注射液に有用な添加剤を含む。
【０１６９】
他の実施例では、本発明は、ＡＡＶプロウイルスが薬学的に許容される担体また他の医薬剤、医薬品、担体、アジュアンント、希釈剤、等でゲノムへ組み込まれる細胞を含む医薬組成物を提供する。
【０１７０】
「薬学的に許容される」により、生物学的又はその他の点で望ましくないものではない物質、すなわち、その物質が望ましくない生物学的作用を引き起こすことなくウイルスベクターとともに対象に投与しうることが意味される。このため、例えば、ex vivo細胞の形質移入又はウイルス粒子の対象への直接投与において、係る医薬組成物を用いることができる。
【０１７１】
本発明のパッケージングウイルスを投与して免疫原性反応（例えば、ワクチンとして）を誘発することができる。典型的に、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と併用して本明細書中で開示されている免疫原性量の感染性ウイルス粒子を含む。「免疫原性量」は、医薬組成物が投与される対象における免疫応答を誘起するのに十分である感染性ウイルス粒子の量である。典型的に、治療される対象の年齢や種よって、１用量につき約１０３乃至約１０１５の量のウイルス粒子、及び好ましくは約１０４乃至１０１０の、さらに好ましく約１０４乃至１０６ウイルス粒子が適切であり、免疫応答がそれに対する免疫原が望ましい。対象及び免疫原は上述した通りである。
【０１７２】
本発明は、細胞へヌクレオチド配列を送達する方法をさらに提供する。インビトロでの方法のために、ウイルスは、技術上周知のように、標準のウイルス形質導入法により細胞に投与することができる。ウイルス粒子は、特定の標的細胞に適切な標準の形質導入法により適切な複数の感染で細胞に添加される。投与するウイルスの力価は、標的細胞型及び特定のウイルスベクターによって変動しうるが、過度の実験なしに当業者により決定できることができる。あるいは、本発明のアデノウィルスベクターは、以下に記載するように、技術上周知の他の手段により達成することができる。
【０１７３】
組換えウイルスベクターは、生物学的に有効な量で細胞に投与されることが好ましい。ウイルスベクターの「生物学的に有効な」量は、細胞において異種核酸配列の感染（又は形質導入）及び発現が生じるのに十分である量である。ウイルスがin vivo細胞に投与される（例えば、ウイルスを以下に着さした対象に投与される）場合は、ウイルスベクターの「生物学的に有効な」量が、標的細胞における異種核酸配列の形質導入及び発現を生じるのみ十分である量である。
【０１７４】
本発明のウイルスベクターが投与される細胞は、神経細胞（末梢又は中枢神経系、特に脳細胞）、肺細胞、網膜細胞、上皮細胞（例えば、腸及び呼吸器上皮）、筋細胞、膵細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、胚細胞、等を含むがこれらに限定されないどの型でもありうる。あるいは、細胞は前駆細胞であってもよい。さらに代わりとして、細胞は幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）。さらに、細胞は、上記したように、どの種の起源でもありうる。
【０１７５】
本発明の特別の実施例において、細胞は対象から除去され、パルボウイルスベクターがその中に導入されて、細胞が対象に戻されて置換される。Ex vivo治療のために対象から細胞を除去し、対象に戻されて導入される方法は技術上周知である。あるいは、ｒＡＡＶベクターを別の対象からの細胞、培養細胞、又は他の適切な源からの細胞へ挿入し、その細胞がそれを必要とする対象に投与される。
【０１７６】
Ex vivo遺伝子療法の適切な細胞として、肝細胞、神経細胞（末梢又は中枢神経系、特に脳細胞）、膵細胞、脾細胞、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽）、ケラチン生成細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋芽細胞、造血細胞、骨髄間質細胞、前駆細胞、及び幹細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７７】
対象に投与される細胞の投与量は、対象の年齢、状態及び種、細胞の型、細胞により発現される核酸、投与様式、等によって変動する。典型的に、少なくとも１用量につき約１０２乃至約１０８、好ましくは約１０３乃至１０１０細胞で投与される。好ましくは、細胞は「治療的に有効な量」で投与されることである。
【０１７８】
本明細書中で用いれる「治療的に有効な」量は、疾患状態と関連した症状の少なくとも１を軽減（例えば、緩和、減少、縮小）するのに十分である量である。別の述べ方をすれば、「治療的に有効な」量は、対象の状態に何らかの改善を与えるのに十分である量である。
【０１７９】
本発明の別の態様は、本発明のウイルス粒子によりin vivoで対象を治療する方法である。本発明のパルボウイルス粒子のそれを必要とする対象又は動物の投与は、ウイルスベクターを投与するための技術上周知の手段により行うことができる。
【０１８０】
実例としての投与様式は、経口、直腸、経粘膜、局所、経皮、吸入、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内、及び関節内）投与、等、及び直接組織（例えば、筋）又は臓器投与（例えば、中枢神経系に送達するための肝内、脳内）、選択的に、くも膜下腔内、直接筋内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含む。注射剤は、液体溶液又は懸濁液としてのいずれかの在来形態で、注射前の液体中の溶液又は懸濁液の適した形態、又は乳濁液として調製することができる。選択的に、全身ではなく局所的に、例えば、デポー又は持効性製剤でウイルスを投与することができる。
【０１８１】
本発明の特に好ましい実施例では、関連のヌクレオチド配列が対象の肝臓に送達される。肝臓への投与は、静脈内投与、門脈内投与、胆道内投与、動脈内投与、及び肝実質内への直接注射を含むが、これらに限定されない、技術上周知の方法により達成することができる。
【０１８２】
好ましくは、細胞（例えば、肝細胞）はペプチド又はタンパク質をコード化する組換えパルボウイルスベクターにより感染し、細胞はコード化ペプチド又はタンパク質を発現するとともに、それを治療的に有効な量で循環系に分泌することである（上述した通り）。あるいは、ベクターは、脳、膵、脾又は筋を含むがこれらに限定されない別の細胞又は組織に送達され、それらにより発現される。
【０１８３】
他の好ましい実施例では、本発明のパルボウイルス粒子は筋内投与され、さらに好ましくは筋内注射又は局所投与により投与される（上述した通り）。他の好ましい実施例では、本発明のパルボウイルス粒子は肺に投与される。
【０１８４】
本明細書中で開示されたパルボウイルスは、適切な手段により対象の肺に投与することができるが、対象が吸引する本発明のパルボウイルスを含む呼吸可能な粒子のエアロゾル懸濁剤を投与することにより投与されることが好ましい。呼吸可能な粒子は液体又は固体であってもよい。本発明のパルボウイルスを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者には周知の通り、圧力推進エアロゾルネブライザー又は超音波ネブライザーなど、適切な手段により生成しうる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照。本発明ウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルは同様に、製薬技術で周知の方法により、固体の粒子性薬物エアロゾル発生装置により生成しうる。
【０１８５】
投与量は、投与様式、疾患又は治療される状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、及び送達される遺伝子によって決まり、ルーチン的に決定することができる。治療効果を達成するための実例としての投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位以上であり、好ましくは約１０８〜１０１４形質導入単位であり、さらに好ましくは１０１２形質導入単位である。
【０１８６】
本発明の特別の実施例では、１回以上の投与（例えば、２、３、４回、又はそれ以上の投与）を行い、遺伝子発現の治療的レベルを達成することができる。この実施例によれば、また上述した通り、各投与で異なる抗原特性を有するパルボウイルスベクターを使用し、中和抗体の影響を除去することが好ましい。上述した通り、本発明の特別な実施例では、本発明のキメラパルボウイルスを治療すべき対象の包囲する中和抗体に投与し、対象における免疫応答の進展を予防する。
【０１８７】
対象はハイブリッドのアレイ内又はキメラパルボウイルスキャプシド内のｒＡＡＶゲノムをパッケージングすることで表面上、新しいウイルスベクターを提示することができる。
【０１８８】
前述の考察は、本発明のパルボウイルスキャプシド及び他の試薬を含有する医薬組成物並びにそれを投与する方法にも関する。
【０１８９】
要約すると、本発明のパルボウイルスベクター、試薬、及び方法を用いて分割又は非分割細胞に核酸を方向づけ、その中に異種核酸を安定に発現させることができる。このベクター系を用いることで、細胞生理に影響を及ぼすタンパク質をコード化する遺伝子を、in vivo又はin vitroで細胞へ導入することがここで可能となる。このため、本発明のベクターは疾患状態のための遺伝子療法及び細胞生理学の実験的改変のためにおいて有用であると言える。
【０１９０】
本発明の特別な実施例において、１回以上の投与（例えば、２、３、４回又はそれ以上の投与）を行って、遺伝子発現の治療レベルを達成することができる。
【０１９１】
実施例１
ＡＡＶベクター
これらの研究で使用されるＡＡＶベクターのすべての製造では、Ferrariら、（1997）Nature Med. 3:1295及びXiaoら、（1998）J. Virology 72:2224に記載されたベクター製造スキームが利用される。一過性形質移入法を利用することにより、アデノウィルスを欠くｒＡＡＶが生成されている。同上。このプロトコールでは、ウイルス複製及び後期遺伝子発現のために無能力化されているアデノウィルスＤＮＡゲノムを利用する。複製及び子孫の産生が不可能であるミニＡｄプラスミドは、２９３細胞におけるアデノウィルス遺伝子発現では生存可能である。この作生物を用いて、新しいＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＡＡＶ／Ａｄ ＡＣＧ）及びＡＡＶベクターＤＮＡ（ｓｕｂ２０１）に関与したＡＡＶパッケージング法が有効に補完されている（Samulskiら、（1989）J of Virology 63:3822）。この新しい作成物は典型的に２９３細胞の１０７〜１０９／１０ｃｍ皿のｒＡＡＶを生成する（Xiaoら、（1998）J.Virology 72:2224）。Ａｄの完全非存在下のこれらのベクターについて効率的な遺伝子送達が筋、脳及び肝において観察された。
【０１９２】
実施例２
細胞及びウイルス
ヒト２９３細胞及びＨｅＬａ細胞をストレプトマイシン及びペニシリン（Lieneberger包括的癌センター、Capel Hill、NC）とともに、Dulbeccoの改変Ragles培地（Gibco BRL）中に１０％ウシ血清（Hyclone）中５％ＣＯ２飽和で３７℃下に維持した。４ｘ１０６２９３細胞を形質移入の前日に１０ｃｍプレート上にプレーティングした。製造元の規格に従い、細胞をリン酸カルシウム（Gibco BRL）又はSuperfection（Qiagene）の両方で形質移入した。以下に述べる挿入変異体パッケージングプラスミドを核局在化シグナルによりＣＭＶ駆動Ｌａｃ Ｚ遺伝子を含有するぱＢ１１とともに形質移入した。各々の形質移入について、同じ量のパッケージングプラスミド（１２μｇ）及びぱｐＡＢ１１（８μｇ）を各々の１０ｃｍプレートに用いた。各々の形質移入について、変換効率を評価するためのみの導入遺伝子プラスミドを含有する追加のプレートを用いた。形質移入後、細胞を５のＭＯｌでヘルパーウイルスＡｄ５ ｄｌ３０９を感染させ、４８時間後に細胞を溶解し、ウイルスを精製した。
【０１９３】
組換えウイルスを塩化セシウム等密度又はイオジキサノール勾配を用いて精製した。両方の場合に細胞を１５００ｒｐｍｓ（Sorvall RT 6000B）で４℃下１０分間遠心分離した。硫酸アンモニア（３０％ｗ／ｖ）を用いて上清からタンパク質を沈降し、１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４７Ｈ２Ｏ、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）中に再懸濁した。細胞ペレットを３サイクルの凍結融解で溶解した０．１ｍｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ（Boehringer Mannheim）含有１ｘＰＢＳ中に再懸濁し、上清のタンパク質部分と結合し、３７℃下３０分間インキュべートした。この材料を５０％ｄｕｔｙで２５バースト、出力コントロール２の超音波処理（Branson Sonifier 250、VWR Scientific）にかけた。細胞片を遠心分離（Sorvall RT 6000B）により除去した。各々のミリリットルの上清に塩化カルシウム（ＣｓＣｌ）０．６ｇを添加し、溶液を１２〜１８時間、５５，０００ｒｐｍｓ下、ＴＬＳ５５ローターで遠心分離した（Beckman Optima TLX超遠心機）。あるいは、上清を６０％、４５％、３０％及び１５％のlodixanol（OptiPre-Nycomed Pharma As、ノルウェー、オスロ）の上部で溶解した。この勾配を１時間１００，０００ｒｐｍでＴＬＮ１００ローターを用いてＢｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＴＬＸ超遠心機で遠心分離した。これらの勾配からフラクションを回収し、各々のフラクションの１０μｌを用いてドットブロットハイブリッド形成を行い、どちらのフラクションが最高保護ビリオンを含有したかを判定した（実施例５を参照）。
【０１９４】
実施例３
ＡＡＶパッケージングプラスミドの構成
Ｈｉｎｄ ＩＩＩを用いてｐＡＡＶ／Ａｄのキャプシド領域をＰＢＳ＋（Stratagene）へクローン化し、ｐＡＶ２Ｃａｐを得た。制限酵素Ｈａｅ ＩＩＩ、Ｎｌａ、ＩＶ、及びＲｓａ Iを用いたｐＡＶ２Ｃａｐの部分消化及び単位長ＤＮＡ断片のゲル精製により、クローン化の開始材料を得た。ＳａＩＩで消化したｐＵＣ４Ｋ（Pharmacia）のカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与したアミノグリコシド３’−ホスホとランスフェラーゼ遺伝子をＮａｅＩ及びＥｃｏ ＲＶ部位、一端でオーバーハングしたＳａＩＩ、他の一端でオーバーハングしたＥｃｏ ＲＩ（上部５’− ＡＡＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣ−３’、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、下部５’− ＴＣＧＡＧＡＴＡＴＣＧＣＣＧＧＣ−３’、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含有するリンカーでフランキングした。この断片をｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Stratagene）のＥｃｏ Ｒｌ部位へクローン化した。Ｎａｅによる消化はＫａｎｒ遺伝子を放出し、この断片をｐＡＶ２Ｃａｐ部分へ結合した。こうして得られたプラスミドをキャプシド領域への挿入についてスクリーニングし、次いでＥｃｏ ＲＶで消化し、キャプシド領域へ１２塩基対の挿入５’−ＧＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）を残したＫａｎｒ遺伝子を除去した。複数の酵素消化及びＤＮＡ塩基配列決定法を用いて、キャプシドコード領域内の１２ｂｐ挿入の位置を判定した。酵素消化としてＥｃｏ ＲＶＩＢａｎＩＩ、Ｅｃｏ ＲＶＩＢｓｔ ＮＩ、Ｅｃｏ ＲＶＩＰｓｔＩＩ及びＥｃｏ ＲＶＩＨｉｎｄ ＩＩＩが挙げられる。得られたプラスミドのキャプシド領域はＡｓｐ７１８で消化し、３’−Ａｓｐ７１８部位を重複した１つのＮＩａＩＶを除き、ｐＡＣＧ２パッケージングプラスミド（Liら、1997 J. Virology 71:5236）へサブクローン化した。この挿入変異体をＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｎｓｉ Ｉ消化を用いてｐＡＡＶ／Ａｄへクローン化した。
【０１９５】
実施例４
ウエスタンブロット分析
凍結溶解及び超音波処理後の細胞ライセートを遠心分離し、大きな細胞片を除去した。２０マイクロリットルの上清を直ちにジチオスレイトール含有２ｘＳＤＳゲル添加液２０μｌに添加し、５分間煮沸した。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、電気泳動によりニトロセルロースへ移した。ニトロセルロース膜を抗Ｖｐ３モノクロナール抗体Ｂ１（Jurgen A. Kleinschmidtより寄贈）を用いて免疫ブロットした。各々の挿入変異体を少なくとも２回、ウエスタンブロット分析で試験した。二次抗マウス西洋わさびペルオキシダーゼＩｇＧを用いて強化化学発光（ECL-Amersham）によりタンパク質を間接的に視覚化した。ウエスタンブロットを強化化学発光から走査露光BioMaxフィルム（Kodak）からAdobe PhotoShopへ、ImageQuaNTソフトウエア（Molecular Dynamics Inc.）により分析した。
【０１９６】
ウイルスタンパク質をウエスタンブロット分析による視覚化後、上述した通りに免疫ブロットを行った。各々試料に１．０ｘ１０９及び２．５ｘ１０９ウイルス粒子を用いた。ウイルスをドットブロットで測定したピークセシウム勾配フラクションから分離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有０．５ｘＰＢＳに対して透析した。
【０１９７】
実施例５
組換えウイルスの力価
ＣｓＣｌ勾配からのフラクションを針吸引により得た。屈折計（Leica MarkII）を用いて屈折率を得、その屈折率を用いてフラクションの密度を測定した。１．３６ｇ／ｍｌ〜１．４５ｇ／ｍｌのフラクションから１０μｌのアリコートをドットブロットハイブリッド形成による保護粒子の存在について試験した。アリコートをウイルス希釈緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２ １０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｅ）中に１：４０で希釈し、３７℃下３０分間インキュべートした。サルコシン（最終濃度０．５％）及びＥＤＴＡ（最終１０ｍＭ）を試料に添加し、７０℃下１０分間インキュべートした。プロテイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）を最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるまで添加し、試料を３７℃下２時間インキュべートした。このインキュべションの後、ＮａＯＨ（３５０ｍＭ最終）及びＥＤＴＡ（２５ｍＭ最終）中で試料を変性させた。ドットブロットマニフォールド（Manifold Ｉ、schleicher and Schuell）を用いて平衡nytran（Gene Screen Plus、NEN Life Science Products）に試料をかけた。膜をランダム開始（Boehringer Mannheim）３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識Ｌａｃ Ｚ ＤＮＡ断片でプローブした。膜をフィルム（BioMax MR、Kodak）又は蛍光体イメージングスクリーン（Molecular Dynamics）に露光し、密度推計をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いて行った。次いでウイルスのピークフラクションを形質導入の力価のために１ｘＰＢＳ中で透析した。
【０１９８】
Ｌａｃ Ｚ活性に対する組織化学染色により形質導入の力価を測定した。ＨｅＬａ細胞は感染効率５で１時間、Ａｄ ｄｌ３０９に感染させていた。次いで細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、新鮮培地を添加した。１．７５ｘ１０８粒子に相当するピークフラクションからのウイルスアリコートを用いてＨｅＬａ細胞に感染させた。２０乃至２４時間後に細胞を１ｘＰＢＳで洗浄、固定（１ｘＰＢＳ中２％ホルムアルデヒド０．２％グルタルアルデヒド）、洗浄し、１ｘＰＢＳ ｐＨ７．８、５ｍＭフェリシアン化カリウム、５ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２中１ｍｇ／ｍｌに希釈したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Sigma）中に溶解した５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Gold Bio Technology）で３７℃下１２〜２４時間染色した。染色ＨｅＬａ細胞を１０箇所の４００Ｘ顕微鏡野でカウントした。１０野の染色細胞の数を平均し、プレート上の数で掛け、その数を保護テンプレートのナノグラム数で割ることにより形質導入数を判定した。
【０１９９】
実施例６
電子顕微鏡観察
野生型ビリオン又は変異誘発ビリオンを有するｒＡＡＶのピークフラクションを０．５ｘ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ中で透析した。１０μｌ滴のウイルスを反転させることにより４００メッシュのグロー放電した炭素グリッド上にウイルスを室温で１０分間配置した。その後、各１分間３回１ｘＰＢＳ洗浄した。ウイルスを１％リンタングステン酸中で１分間染色した。Ｚｅｉｓｓ ＥＭ９１０電子顕微鏡を用いて試料を視覚化した。
【０２００】
実施例７
へパリンアガロース結合アッセイ
野生型キャプシド又はキャプシドへ挿入を含有する組換えウイルスを０．５ｘ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳに対して透析した。１００マイクロリットルの各ウイルスを１００μｌのへパリンアガロース１型（０．５ｘ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ２０容積中に前平衡したＨ−６５０８ Ｓｉｇｍａ）に１．５ｍｌミクロチューブ中に室温下１時間、結合した。各ステップ後、結合洗浄及び溶出試料を２０００ｒｐｍ（Sorvall MC 12V）で２分間遠心分離し、上清を採集した。試料を０．５ｘ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ０．５ｍｌで６回洗浄し、上清を採集した。０．５ｘ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳ中に０．５、１．０及び１．５Ｍ ＮａＣｌを含有する１００μｌ容積の３つのステップ中に溶出して上清を採集した。各ステップからの上清２０μｌの各サンプルを用いてドットブロットハイブリッド形成を行った。１００％結合対照をドットブロットで使用した各入力ウイルスの５分の１に相当する内規準とした。へパリンアガロースウイルス混合液を容積０．５ｘ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＰＢＳで６回洗浄し、１：１５６２５の希釈を得た。
【０２０１】
実施例８
ｒＡＡＶにおける挿入突然変異の構成
アセンブリー及び感染力におけるＡＡＶ構造タンパク質の役割を評価するために、われわれはキャプシドリンカー挿入変異体を生成した。ＡＡＶ２のキャプシド領域の配列コードを含有するｐＡＡＶ／Ａｄの２．８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片（Samulskiら、（1989）J. Virology 63: 3822）をｐＢＳ＋へサブクローニングした。このプラスミド、ｐＡＶ２ＣａｐをＨａｅ ＩＩＩ、Ｎａ ＩＶ、及びＲｓａ Ｉで部分消化し、キャプシド特異的挿入の基質を生成した（図１）。これら３つのＤＮＡ制限酵素は、４つのみが重複するＡＡＶ−２キャプシドコード配列上にまたがる４３の部位を構成する。挿入を含有するクローンを効率的に確認するために、新規のオリゴ（Ｎａｅ ＩＩＥｃｏＲ Ｖ）によりフランキングされたカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）を部分消化、全長、直線化したｐＡＶ２Ｃａｐと結合した（実施例３及び図１を参照）。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン及びカナマイシン選択を用いて、挿入変異体を確認し、Ｋａｎｒ遺伝子をＥｃｏ ＲＶ部位の入れ子状の対で消化及び再結合することでキャプシドコード領域から移動させた（実施例３を参照）。これにより、キャプシドコード配列における独特なＥｃｏ ＲＶ部位の単一コピーを保有する１２の塩基対（ｂｐ）の特異的なリンカー挿入が得られた。リンカー挿入の正確な位置をさらに制限酵素消化により、及び６カセット配列決定で精製した（データは示さず）。挿入変異体の位置は、部分消化で用いた酵素の最初の文字で確認され、その後にＡＡＶ２ゲノムにおける制限部位のヌクレオチド位置が確認され、例えばＮｌａ ＩＶ４１６０はＮ４１６０となる。
【０２０２】
これらの位置づけられた挿入変異体からのキャプシドコード配列を、in vivoの生物学的特徴づけのためにヘルパーベクターｐＡＣＧ２又はｐＡＡＶ／Ａｄへサブクローニングした(図１)（Liら、（1997）J. Virology 71:5326；Samulskiら、（1989）J. Virology 63:3822）。配列分析は、この１２の塩基対により４３の挿入部位のいずれの終止コドンも得られないことを示している（表１）。コドン枠の使用及びＮｌａ ＩＶ認識配列の縮重に関して酵素（Ｈａｅ ＩＩＩ、Ｎｌａ ＩＶ、及びＲｓａ Ｉ）の切断部位のコドンの性質のため、１２ｂｐリンカーは枠１のアミノ酸ＧＤＩＡ及び３つすべての酵素の枠３におけるＡＩＳＰの挿入が得られたが、枠２の挿入はＲｓａ ＩのＷＲＹＲＨ、Ｈａｅ ＩＩＩのＧＲＹＲＰ、及びＮｌａ ＩＶのＧＲＹＲＨの両方が得られた。これらの実施例における大型アミノ酸はミスセンス突然変異を表わす（表１）。変異体ヘルパー作成物、ｐＡＣＧ２ＩＮは、アデノウィルスｄ／３０９（ＭＯＩ＝５）感染細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する、ＡＡＶ受容体ベクターとともに２９３細胞へ個別に形質移入された（Liら、（1997）J. Virology 71:5236）。次いで、形質移入細胞はキャプシド発現及び組換えウイルス産生について検定された（実施例５；Liら、（1997）J. Virology 71:5236を参照）。
【０２０３】
2011067212.tif 000003
実施例９
キャプシドタンパク質の分析
相補性アッセイにおいて変異体キャプシド作成物を用いたベクター産生の検定のために、各挿入変異体の形質移入後の２９３細胞におけるキャプシドサブユニットの発現について試験した。正常な化学量論でのＶｐ１、Ｖｐ２、及びＶｐ３産生能は、リンカー挿入がキャプシドタンパク質発現、又は安定性を変化させなかったことを示すであろう。リンカーは終止コドンを導入しなかった、各挿入は３つのすべてのキャプシドを精製すると予想された。形質移入の４８時間後、細胞ライセートをＡＡＶについてウエスタンブロット分析で分析した。図２のウエスタンブロット分析は、細胞ライセートにおける挿入変異体キャプシド発現を表わす。Ｈ２６３４（図２レーン２）を除き、３つのキャプシドサブユニットの化学量論は野生型の対照と大きな違いはないように思われる（図２のレーン１、３〜７乃至８を比較）。このアッセイにより、挿入変異体Ｈ２６３４はＶｐ３サブユニットを生成するのみであると思われる（図２；レーン２）。長い曝露では、図４レーン５及び６の副キャプシドサブユニットが明らかであった（データは示さず）。
【０２０４】
実施例１０
変異体キャプシドの安定なビリオンの産生能
ＤＮａｓｅ消化からベクターゲノムを保護する安定なビリオンの産生について試験するために、われわれは細胞ライセートを塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離にかけた。ウイルス密度を屈折計により測定し、適切なフラクションからのアクリオートをドットブロットハイブリッド形成にかけた（図３ａ）。この分析に基づき、完全な組換えゲノムをパッケージングする粒子は、野生型と同様の浮遊密度を示し、野生型よりもわずかに高い浮遊密度を有するＨ２９４４を除き、ＮＮａｓｅ処置に対して耐性であるはずである。このアッセイの結果、挿入変異体が２つのクラスに分けられた。クラスＩ変異体はウイルスゲノムの保護に対して陰性であったが、クラスＩＩ変異体はベクター基質のパッケージング及び保護に対して正常であるように思われた（表Ｉ）。
【０２０５】
クラスＩＩ変異体のすべては野生型ＡＡＶ２キャプシドの範囲内で浮遊道度を示した（図３ａ）。ドットブロット分析により、Ｎ２９４４は組換えゲノムをパッケージングしたが、等密度勾配における野生型よりもわずかに高い密度の位置に移動した（図３ａ、Ｎ２９４４レーン３）。挿入変異体の数（７）は、＜１ｘ１０５粒子／μｌの感受性を示したこのアッセイによりＤＮＡをパッケージングすることはなかった（定量の方法を参照）（表Ｉ）。これらの変異体がパッケージングに欠陥があるか、又は精製時に不安定であるかどうかは判定されないままである。
【０２０６】
実施例１１
クラスＩＩ挿入変異体の感染力
相補性アッセイにおける挿入変異体により生成されるビリオンの感受性について、ヒト細胞におけるＬａｃ受容体遺伝子の形質導入をモニタリングすることで試験した。ドットブロッドハイブリッド形成から得られたウイルス力価を用いて、ＨｅＬａ細胞を同じ粒子数での変異体ウイルスストックに感染させた。
【０２０７】
感染の２４時間後、導入遺伝子の発現をＸ−ｇａｌ染色により検出した。この分析の代表図を示し（図３ｂ）、分析したすべての変異体を表１に示す。このアッセイにおいて、野性型ビリオンは５．６ｘ１０５ＨｅＬａ細胞／１．７５ｘ１０８保護粒子を形質導入した（図３ｂ）。このアッセイの感受性に基づき、クラスＩＩの挿入変異体の感染効率は０乃至１．６ｘ１０６形質導入単位／１．７５ｘ１０８保護粒子であった。この分析の結果によりさらにキャプシド挿入変異体がクラスＩＩ（ベクター基質のパッケージング及び保護が正常）からクラスＩＩＩ表現型（ベクター基質及び感染ビリオンのパッケージング及び保護が正常）に細分された。感染力に対して陰性であり、ＣｓＣｌ生成及びＤＮａｓｅ保護クラスＩＩ変異体に基づきクラスＩＩ変異体と最初に確認された２つの挿入変異体（Ｎ２９４４、Ｈ３５９５）は、イオジキサノール段階勾配を用いた精製後の試験ではウイルス形質導入に対して陽性であった（表１）。ウイルス精製法はＣｓＣｌほど厳しくはなく、ウイルスの回復が１０倍増大することが示されている（Zolotukhinら、（1999）Gene Therapy 6:973）。しかし、他のクラスＩＩ変異体はイオジキサノール段階勾配を用いた精製後に非感染性のままであった（データは示さず）。われわれは挿入変異体ウイルスＮ２９４４及びＨ３５９５がＬａｃ Ｚ形質導入アッセイを用いて感染性であると判定したが、これらの変異体から生じる感染力価は低く（１ｘ１０２形質導入単位／ｎｇ）、以前に発表された（Hemonatら、（1984）J. Virology 51:329）ｌｉｐ変異体とほぼ同じであることに注意すべきである。
【０２０８】
実施例１２
クラスＩＩ及びクラスＩＩＩ変異体の電子顕微鏡観察
生物学的な違いについてクラスＩＩ及びＩＩＩのｒＡＡＶ２挿入変異体をさらに特徴づけるために、われわれは電子顕微鏡観察（ＥＭ）により変異体粒子を視覚化した。ＥＭ分析は感染性クラスＩＩＩウイルスの全体の形態のみを示し、これらは野性型ビリオンと区別不可能であった（図４ａと４ｂ、ｃを比較）。しかし、野生型ビリオン（図４ａ及び４ｆ−下の４パネル）と比較するとクラスＩＩ／ＩＩＩ変異体ウイルスＨ３５９５間に明確な違いが観察された。Ｈ３５９５のＥＭ像はわずかに大きな粗い五角形の輪郭を示したが、野性型ウイルスはサイズが不均一であり、六角形であった。興味深いことに、クラスＩＩ変異体Ｈ２６３４は、ウエスタンブロットではＶｐ１又はＶｐ２に対して陰性であったが（図２レーン２）、ＥＭ分析（図４ｄ）による形態は正常に見えた。この分析に基づき、ビリオンの形態のみがクラスＩＩ変異体をクラスＩＩＩと区別するのに不十分であり、それはキャプシド内の小さな挿入により非検出可能である（図４ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）か、ビリオン構造（図４ｆ−下の４パネル）の変化が注目すべきあったかのいずれかのためである。しかし、この方法ではこれらのリンカー挿入変異体のわれわれの特徴づけに追加のデータを提供することはできなかった（図４、ａ乃至ｆを比較）。
【０２０９】
実施例１３
クラスＩＩとクラスＩＩＩのビリオンのキャプシド比
Ｒｏｓｅら（１９７１）は、ＡＡＶ２粒子が１：１：２０の比でＶｐ１、Ｖｐ２、Ｖｐ３からなることを証明した（Roseら、（1971）J. Virology 8:766）。クラスＩＩとクラスＩＩＩの変異体ビリオンがこの比を維持したかどうかを判定する努力において、塩化セシウム精製ウイルスでウエスタンブロット分析を実施した。ウエスタンブロット分析により分析された精製ウイルスは、サンプリングしたすべての変異体でほぼ同じ量のＶｐ３を示し、１ｘ１０９〜２．５ｘ１０９ウイルス粒子を各試料に用いた。Ｖｐ２とＶｐ１の量も、副キャプシド成分が確認されなかったＨ２６３４を除くすべての被験試料でほぼ同じであった（図５レーン５）。Ｈ２６３４の副キャプシド成分の欠如は、細胞ライセートからのウエスタンの結果と一致している（図２）。この分析における検出限界では、クラスＩＩの挿入変異体Ｈ２６３４は、Ｖｐ１及びＶｐ２のないＡＡＶビリオンを構築するように見えるが、ＥＭ分析では、この変異体は正常な形態を有することを示している（図４ｄ）。
【０２１０】
実施例１４
クラスＩとクラスＩＩＩの変異体のへパリン結合
最近われわれの実験室では、ＡＡＶ−２は感染力の一次受容体としてへパラン硫酸プロテオグリカンを使用することを証明した（SummerfordとSamulski、（1998）J. Virology 72:1438）。へパリン結合がクラスＩＩ粒子の細胞感染能がない点、及びクラスＩＩＩウイルスのへパリンアガロースとの結合能の点でどのような役割があるかを判定するために、へパリンバッチ結合実験を実施した。クラスＩＩＩのすべての変異体がへパリンに対して陽性であり、大多数のウイルスが１Ｍ Ｎａｃｌ２段階に溶出した（データは示さず）ことは意外ではない。クラスＩＩ変異体ウイルスの感染力の喪失がへパリン結合の欠如と関連があったかどうかを判定するために、バッチ結合実験をドットブロットハイブリッド形成により分析した（図６）。試験した各々のウィルス試料について、１００％結合を判定する内部対照をへパリン結合とは無関係にフィルター上にスポットした（図６；１００％結合）。これにより、われわれは、へパリン精製の各段階で保持されたウイルスのパーセントを判定することができた。へパリンアガロースとの結合後、試料を洗浄し、塩濃度を増大させることで溶出した（実施例７を参照）。野性型ビリオンのシェルを有する組換えＡＡＶ２は９０％の結合を示し、洗浄で１０％放出後、溶出液中で６０％回復し、へパリンアガロースとの結合して２０％残った（図６、レーン１）。クラスＩＩ変異体Ｈ２２８５、Ｈ２４２６、及びＨ２６３４は同様の結合及び溶出プロフィールを示した（図６、レーン２〜４）。しかし、クラスＩＩ変異体Ｈ３７６１は、そのへパリンアガロース結合プロフィールが異なり、大多数のビリオンが結合緩衝液及び洗浄に認められた（図６、レーン５）。このバッチアッセイにおけるへパリン結合の欠如の理由を判定するには、さらに分析が必要である。
【０２１１】
興味深いことに、Ｈ２６３４は以上の条件下にへパリンアガロースと結合することであるが、これはウエスタンブロットにより検出可能なＶｐ１又はＶｐ２サブユニットを保有することはない（図５、レーン４）。へパリンアガロースとの結合能とともにＨ２６３４におけるＶｐ１及びＶｐ２の欠如は、へパリン結合領域がＶｐ３キャプシドタンパク質に位置していることを示す。
【０２１２】
実施例１５
リンカー挿入変異体
ポリ−リシン、ポリ−ヒスチジン、ＲＧＤモチーフ、又はブラジキニンをコード化する挿入配列を表1に記載したリンカー変異体に挿入した。われわれは、ＡＡＶ２キャプシド遺伝子のコード領域への異なるリンカーの挿入を確認するＰＣＲベースの方法を開発した。簡単に言えば、キャプシドコード領域の外側及びリンカーに正確に対応するリンカーをそれぞれ１つ用いた。リンカーが正しい配向にある場合は、ＰＣＲ産物の大きさは挿入変異体の位置によって決まる。
【０２１３】
ライゲーション反応の変換後、細菌コロニーをピペットの先端で採集し、抗生物質とともにＬＢ培地を含有する９６穴プレートのウェルに４〜５回浸漬した。次いでピペットの先端をＰＣＲ反応緩衝液を含有する９６穴プレートのウェルへ配置した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上に取り出し、陽性クローンを確認した。この情報は外部プライマーに関して挿入変異体の配向及び位置を指示した。
【０２１４】
対応するウェルにあるＬＢ培地をＰＣＲ陰性として用いて、この物質を大（５ｍＬ）容積で増殖させた。一晩の増殖期後、プラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ１５回（Ｂｓｔ ＮＩ）を制限する酵素で消化した。これらの消化産物を５〜６％アクリルアミドゲルで分離した。リンカー挿入のサイズ及び対応する非挿入フラグメントのサイズによって、挿入の数を測定した。このため、挿入部位にリンカーを結合した２日以へ、われわれはリンカー挿入の配向がわかり、われわれは十分なＤＮＡをウイルス産生用の１０ｃｍプレートに形質導入した。
【０２１５】
Ｂｓｔ ＮＩで消化したときの挿入のないｐＡＣＧ２（Liら、1997 J. Virology 71:5236）は以下のフラグメントを産生する：
３９００ｂｐ
１１２１ｂｐ
１１１２ｂｐ
４４５ｂｐ −Ｈ２９４４シフト
３４７ｂｂ −Ｈ２６３４、Ｈ２６９０シフト
２５３ｂｐ −Ｈ３５９５シフト
２１５ｂｐ −Ｒ２２３５６、Ｈ２４１６シフト
１２１ｂｐ
１１１ｂｐ
６４ｂｐ
６３ｂｐ −Ｈ２２８５シフト
３３ｂｐ −Ｈ２５９１シフト
１３ｂｐ
９ｂｐ
異なる挿入変異体によるバンドシフトも指示される。
【０２１６】
Ｂａｎ Ｉで消化したときの挿入のないｐＡＣＧ２は以下のフラグメントを産生する。
【０２１７】
２００９ｂｐ
１４２１ｂｐ
１６８ｂｐ
８４３ｂｐ −Ｈ４０４７シフト
８３５ｂｐ
７３４ｂｐ −Ｈ２６３４シフト
４６４ｂｐ
２２３ｂｐ
２１８ｂｐ
２１１ｂｐ
５０ｂｐ
各々の挿入は最初の１２塩基対のＥｃｏ ＲＶ部位を含有する。また、各々のリンカーは以下の塚の塩基対を付加する：
・ＲＧＢ＝３６ｂｐ＋１２＝単一挿入で４８ｂｐ。
【０２１８】
・ブラジキニン（ＢＲＤＹ）＝６９ｂｐ＋１２＝単一挿入で８１ｂｐ。注：ＢＲＤＹ挿入はＢｓｔＮＩ部位を含有する。
【０２１９】
・ヒスチジン（８ＨＩＳ）＝５１ｂｐ＋１２＝単一挿入で６３ｂｐ。
【０２２０】
・ポリリシン（ＰＬＹ）＝６３ｂｐ＋１２＝単一挿入で７５ｂｐ。
【０２２１】
外部プライマーはＨｉｎｄ ＩＩＩ部位の近くにあり、ＡＡＶ２／４ ５’と呼ばれる。このプライマーを用いてＡＡＶ血清型２及び４を増幅することができる。
【０２２２】
最初の挿入変異体にエピトープリンカーを生成するために使用したプライマー配列を以下に示す。注：挿入変異体に対して３つの枠があるため、各プライマーセットに対して３つのプライマーがある。
【０２２３】
ヒスチジンのプライマー対：
枠１：
上部プライマー４８ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）：
５’−ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＧＣ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＣＴ−３’
下部プライマー４８ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）：
５’−ＡＧＣ ＧＣＴ ＧＣＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＣＴ ＡＧＣ−３’
枠２：
上部プライマー５１ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）：
５’−ＡＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＧＣ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＣＴ Ｔ−３’
下部プライマー５１ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）：
５’−Ａ ＡＧＣ ＧＣＴ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＴ−３’
枠３：
上部プライマー５１ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）：
５’−Ｇ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＧＡ−３’
下部プライマー５１ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）：
５’−ＴＣ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧＡＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＧＡ ＡＣＣ Ｃ−３’
ブラジキニンプライマー対：
枠１：
上部プライマー６０ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）：
５’−ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＣＣＣ ＣＣＣ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＣＣ−３’
下部プライマー６０ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）：
５’−ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＧＧ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＣ−３’
フレーム２：
上部プライマー６９ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）：
５’−ＧＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＣＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣＴＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＧＧＣ Ｇ−３’
下部プライマー６９ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）
５’−Ｃ ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＧＧ ＴＣＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＴＧＡ ＡＣＣ ＴＣ−３’
枠３：
上部プライマー６０ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）：
５’−Ａ ＧＧＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＣＡ ＴＴＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＧＧＣ ＧＧ−３’
下部プライマー６０ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）：
５’−ＣＣ ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＡＧＧ ＧＧＧ ＴＣＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＴＧＡ ＡＣＣ Ｔ−３’
ＲＧＤプライマー対：
枠１：
上部プライマー３６ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）：
５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＧＡＴ ＴＧＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＧＧＣ−３’
下部プライマー３６ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）：
５’−ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＣＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ−３’
枠２：
上部プライマー３６ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）：
５’−ＧＡ ＴＣＣ ＴＣＧ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＧＡＴ ＴＧＴＴＴＣ ＴＧＣ ＧＧＣ Ｇ−３’
下部プライマー３６ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）：
５’−Ｃ ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＣＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＧＣＡ ＧＧＡ ＴＣ−３’
枠３：
上部プライマー３６ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）：
５’−Ａ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＧＣ ＧＡＣ ＴＧＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＧＡＴ ＴＧＴ ＴＴＣ ＴＧＣ ＧＧ−３’
下部プライマー３６ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）：
５’−ＣＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＣＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣＧＣＡ ＧＧＡ ＴＣＣ Ｔ−３’
ポリリシンプライマー対：
注：３プライマー対の枠のみが作成された。
【０２２４】
枠３：上部プライマー６３ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）：
５’−Ａ ＧＧＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＧＡＣ ＴＧＣ ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＧＧＣ ＧＧ−３’
下部プライマー６３ｍｅｒ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）：
５’−ＣＣ ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＣＡ ＴＧＡ ＡＣＣ Ｔ−３’
外部プライマーＡＡＶ２／４ ５’上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）：
５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＣＧＣ Ｇ−３’
ＲＧＤリンカーは、表１のＨ２２８５、Ｒ２３５６、Ｈ２５９１、Ｈ２６３４、Ｈ２６９０、Ｈ／Ｎ３７６１、及びＨ／Ｎ４９４７変異体に挿入された。
【０２２５】
ブラジキニンリンカーは、表1のＨ２２８５、Ｈ２４１６、Ｈ２５９１、Ｈ２６３４、Ｈ２６９０、Ｈ／Ｎ２９４４、及びＨ／Ｎ３７６１変異体に挿入された。
【０２２６】
ポリ−Ｌｙｓリンカーは、表１のＨ２２８５、Ｈ２５９１、Ｈ２６９０、及びＨ／Ｎ３７６１変異体に挿入された。
【０２２７】
ポリ−Ｈｉｓリンカーは、表１のＨ２２８５、Ｈ２４１６、Ｈ２５９１、Ｈ２６３４、Ｈ２６９０、Ｈ／Ｎ２９４４、Ｎ３５６１、Ｈ３７６６、及びＨ／Ｎ４０４７変異体に挿入された。
【０２２８】
実施例１６
挿入変異体の特徴づけ
部位Ｈ２６９０での挿入変異体はすべて最初の１２ｂｐ挿入と力価がほぼ同じである。ＥＬＩＳＡアッセイ及び抗ヒスチジン抗体を用いて、この部位へのポリＨｉｓ挿入がビリオンの表面上に表示されることが示された。
【０２２９】
ポリＨｉｓエピトープも部位Ｈ２６３４に挿入すると表面上にあることが示された。興味深いことに、Ｈ２６３４での１２ｂｐ挿入のウエスタンブロット分析では、形成されているいかなるＶＰ１又はＶＰ２サブユニットは示されなかった。ＶＰ２におけるこの挿入はＶＰ１及びＶＰ２サブユニットの核局在化シグナルに近いことが明らかにされている。この領域は最初の挿入により破壊され、８−ヒスチジンの添加により領域が修復されたと考えられる。この８Ｈｉｓウイルスのドットブロットはウイルス粒子の存在を示したが、これらの粒子は感染性ではなかった。
【０２３０】
挿入部位Ｈ２５９１はＶＰ１にある。この部位へのリンカーエピトープの挿入は、この部位での最初の１２ｂｐ挿入以上に力価に対する影響はなかった（表１）。
【０２３１】
部位Ｎ４１６０での挿入は、カルボシキ終端近くのＶＰ３にある。この挿入変異体は、最初の１２ｂｐ挿入が野生型と等しいレベルで細胞に感染するという点で興味深い（表１）。
【０２３２】
以前に表１に記載されている変異体Ｒ３３１７は、ドットブロット分析によりビリオンを保護することはないように見えた。Ｌａｃ導入遺伝子でこの実験を繰り返すことにより、同じ結果が確認され、すなわち保護された粒子は確認されなかった。しかし、独立性クローン及びＧＦＰ導入遺伝子（Ｌａｃよりも〜１０００ｂｐ小さい）を用いたところ、保護された粒子が確認された。また、ＧＦＰ発現ビリオンは、野生型と同じ高レベルでＨｅＬａ細胞を形質導入した。この異なる結果がなぜ異なる導入遺伝子で観察されるのかは明らかではない。
【０２３３】
また、呼吸器合胞体ウイルスへパリン結合領域をコード化するリンカーが、生存力を失うことなく挿入に耐容性を示す部位でＨ２６９０変異体に挿入され、この変異体に対するへパリン結合を修復した。
【０２３４】
実施例１７
独特の制限部位の変異体
ＡＡＶ２型のキャプシド内の独特の制限部位を作成し、挿入変異体の生成を促進した。部位は、キャプシドのヌクレオチド配列に導入される変異体が保存的であるよう、すなわち、ミスセンス変異体ではなく、又は終止コドンを来たさないように選択した。アミノ酸位置５８６、５２９、５９５、及び５１７（アミノ酸＃１としてＶＰ１メチオニン）を選択した。５２９を除き、これらの位置すべてについて、独特のＨｐａＩ部位を操作した。アミノ酸５２９での位置では、独特のＥｃｏ ＲＶ部位を操作した。これらの制限部位の各々により、インフレームの平滑断端した消化産物が得られる。そこで枠１リンカーを用いてこれらの部位に挿入した。重複プライマーを用いて独特の部位を生成し、外部プライマーを用いて挿入の右及び左のフラグメントを生成した。
【０２３５】
次いで右フラグメントをＮｓｉ Ｉ及びＥｃｏ ＲＶ又はＨｐａ Iのいずれかで消化し、左フラグメントをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｏ ＲＶ又はＨｐａ Ｉのいずれかで消化した。われわれはこれらの消化産物を、すでにＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｓｉ Ｉで消化したぱＣＧベクターにクローン化した。次いで、得られたプラスミドをＸｃｍ Ｉ及びＢｓｉ ＷＩで消化した。これらの酵素にょり、操作した独特の制限部位の周囲に〜７５０ｂｐフラグメントが得られる。この方法の結果として、ＰＣＲ生成配列は小さいため誤りの蓄積はほとんどない。
【０２３６】
プライマー： 
５９５上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）：
５’−ＧＣＡ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＣＡ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＣＡ−３’
５９５下部プライマー(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１)：
５’−ＴＴＧ ＴＧＴ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＴＧ−３’
５８６上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）：
５’−ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＧＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣＴ ＡＣＣ ＧＣ−３’
５８６下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）：
５’−ＧＴＣ ＴＧＴ ＴＡＡ ＣＴＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＧ ＴＡＧ ＡＴＡ−３’
注：この構成物によりグリシンのバリンへのミスセンス変異が生じる。
【０２３７】
５５２上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）：
５’−ＡＣＡ ＡＡＴ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＡＡＧ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＴＴ−３’
５５２下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）：
５’−ＴＴＣ ＡＡＴ ＧＴＴ ＡＡＣ ＡＴＴ ＴＧＴ ＴＴＴ ＣＴＣ ＴＧＡ ＧＣＣ−３’
５２９上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）：
５’−ＧＧＡ ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＧＡ ＡＡＡ ＧＴＴ ＴＴＴ ＴＣＣ ＴＣＡ Ｇ−３’
５２９下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）：５’−ＡＣＴ ＴＴＴ ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＧＴ ＣＣＴ ＴＧＴ ＧＧＣ ＴＴＧＣ−３’
注：この構成物によりグルタミン酸からイソロイシンへのミスセンス変異が生じる。
【０２３８】
５１７上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）：
５’−ＴＣＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＡＡＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＡ−３’
５１７下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）：
５’−ＧＣＣ ＣＧＧ ＧＴＴ ＡＡＣ ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＣＣ ＡＴＴ−３’
外部プライマーは以下の通りであった：
５’−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）：
５’−ＴＧＣ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＣＧＣ  Ｇ−３’
３’プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）：
５’−ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＴＧＡ  ＡＡＣ  ＧＡＡ  Ｔ−３’
５２９Ｅｃｏ ＲＶ部位に挿入されたＲＧＤ及び８Ｈｉｓリンカー（実施例１５）によって４つのクローンも生成された。５つの８Ｈｉｓリンカー及び１つのＲＧＤリンカー挿入変異体が５８６Ｈｐａ Ｉ部位に生成された。
【０２３９】
３７９０〜３７９２（アミノ酸５２９；ＥｃｏＲＶ）での独特の制限部位ミスセンス変異はＨｅＬａ細胞に感染したが、効率は比較的低かった（野生型の〜１／１００乃至〜１／１０００）。８Ｈｉｓエピトープ挿入をこの部位に挿入すると、得られるウイルスはｌｉｐ表現型（すなわち、低感染性粒子）を有した。
【０２４０】
８Ｈｉｓ及びＲＧＤの３９６０〜３９６１（アミノ酸５８６；Ｈｐａ Ｉ）での独特のミスセンス制限部位への挿入は両方ともきわめて感染性であり、少なくとも野生型ウイルスと同じくＨｅＬａ細胞を形質導入した。
【０２４１】
実施例１８
二重変異体
単一変異体Ｈ３７６１（表１）をテンプレートとして用いて二重変異体を生成した。Ｈ３７６１挿入変異体は、バッチ及びカラム結合実験の両方で評価されたようにへパリン硫酸と結合することはない。この変異体は、試験した限りではどの細胞系にも感染しないが、電子顕微鏡観察ではこのウイルスが正常なパルボウイルスシェルを形成し、ドットブロットによりこのウイルスがウィルスゲノムを効率的にパッケージングすることを示しているという点で興味深い。
【０２４２】
Ｈ３７６１挿入を含有する配列をコードするキャプシドの領域は他の挿入変異体へサブクローン化され、二重変異体を生成した。Ｈ２６９０（ＡＡ＃１６３）挿入変異体を選択したのは、これがウイルス表面でポリ−Ｈｉｓ挿入エピトープを示すことがわかっているためである（配座特異的抗体を用いてウイルスをＥＬＩＳＡプレートに結合し、西洋わさびペルオキシダーゼに抱合した抗ヒスチジン抗体を用いてヒスチジン含有ウイルスを検出することで評価された）。
【０２４３】
ブラジキニン挿入（実施例１５）を含有するＨ２６９０挿入変異体ヘルパープラスミド（ｐＡＣＧ Ｈ２６９０ ＢＲＤＹ）及びｐＡＣＧ Ｈ３７６１挿入変異体をＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＢｓｉ Ｗｌで消化した。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位はｒｅｐ遺伝子にあるが、Ｂｓｉ Ｗｌ部位は２６９０と３７６１との間にある。小さな断片はｐＡＣＧ Ｈ２６９０ ＢＲＤＹを含有するが、大きい断片はｐＡＣＧ Ｈ３７６１を含有する。
【０２４４】
ブラジキニン挿入がＨ２６９０部位に挿入されている二重変異体ｐＡＣＧ Ｈ２６９０ ＢＲＤＹは、親のＡ９細胞のみと比較してブラジキニン受容体を発現するＡ９細胞の感染力が５倍増大することを示した。これらの結果は、（１）Ｈ３７６１の結合における欠陥が細胞性ＨＳ受容体との結合点である可能性が高いが、このウイルスは別の経路で細胞へ方向づけられた場合は感染力を保持すること、及び（２）ブラジキニン二重変異体は細胞を発現するブラジキニン受容体へウイルスの侵入をターゲティングしたことを示している。
【０２４５】
Ｈ３７６１挿入変異体は独特な制限部位ミスセンス突然変異（実施例１７）、ＡＡ＃５８６（Ｈｐａ Ｉ）及びＡＡ＃５２９（ＥｃｏＲＶ）へもクローン化されている。制限酵素ＮｃｏｌはＨ３７６１と５２６（Ｇｌｕ→ｌｌｅ）及び５８６（Ｇｌｙ→Ｖａｌ）ミスセンス突然変異との間にあり、この酵素がｒｅｐ遺伝子内で切断する。消化によりｐＡＣＧ２ヘルパープラスミドはＨ３７６１とＮｃｏ Ｉを有する５８６と５２９の独特な部位を含有し、Ｈ３７６１挿入突然変異を含有する小さなＮｃｏ Ｉ断片（３１４２ｂｐｓ）及び５８６と５２９の独得な部位を含有する大きなＮｃｏ Ｉ断片（５０３４ｂｐｓ）を分離した。連結後、正しい配向を有する作成物が確立され、これらのクローンを用いてウイルスを作成した。
【０２４６】
ＲＧＤモチーフ（実施例１５）を含有する独得な制限部位ミスセンス突然変異もこのクローニング法に用いた。このため、独得な部位での挿入を含有しない二重変異体と同位置でＲＧＤエピトープを含有する二重変異体がある。
【０２４７】
Ｈ３７６１変異体はＨｅＬａ又はＣＨＯ−Ｋ１細胞を形質導入することはない。これとは対照的に、５８６−ＲＧＤ二重変異体はこれらの細胞型の両方の形質導入を示した。これらの結果は、形質導入は５８６の独得な制限部位へ導入されたＲＧＤモチーフにより仲介されたことを強くしめしている。
【０２４８】
独得な制限部位を有するが、挿入がない二重変異体、及び５２９−ＲＧＤ二重変異体はＨｅＬａ又はＣＨＯ−Ｋ１細胞の効率的な形質導入を示すことはなかった。
【０２４９】
実施例１９
ＭＳＨ−ターゲティングＡＡＶベクター
本発明の１実施例では、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）が、ＭＳＨ受容体を発現する細胞にＡＡＶベクターをターゲティングするために使用される。研究によって、このペプチドがリガンド随伴複合体が特異的にメラニン細胞ＮＥＬ−Ｍ１細胞へ方向づけ（Murphyら、（986）Proc. Nat. Acad. Sci USA 82:8258）、便利な試験系を提供することがわかっている。例えば、ＭＳＨリガンドをコード化する１２残基ペプチドに繋がれたジフテリア毒素が、ＭＳＨ受容体発現細胞のみを殺傷することにおいて効率的であった（Morandiniら、（1994）Internat. J. Ca. 56:129）。細胞死は特異的リガンド送達の受容体介在性エンドサイトーシスに起因した。
【０２５０】
ＭＳＨはＡＡＶ２型キャプシドのループ３へ挿入される。第１のステップでは、Ｂｇｌ ＩＩ−ＳｐＨ Ｉ断片がループ３をコード化する配列から除去されると、ＡＡＶ２型欠失変異体が１２アミノ酸欠失により作成される。次いでＭＳＨペプチドをコード化する配列を欠失領域へ挿入する。
【０２５１】
ループ３及びループ４挿入突然変異を作成するためのプライマー配列は以下の通りである：
ループ３ ５’上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）：
５−’ＧＡＴＡＣＴＴＡＡＧＡＴＣＴＡＧＴＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＴＴ−３’
ｃｔｔａａｇはＡｆｌ ＩＩ部位であり、ａｇａｔｃｔはＢｇｌ ＩＩ部位である。これら２つの部位は２つの塩基対により重複する。ＡＡＶ配列との相同性は位置３５５６で開始、３５８３で終わる。
【０２５２】
ループ３ ３’下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）：
５−’ＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＣＡＴＧＣＡＴＡＣＡＣＡＧＧＴＡＣＴＧＧＴＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＴ−３’
ｇｃａｔｇｃはＳｐｈｌ部位であり、ｃｔｔａａｇはＡｆｌ ＩＩ部位である。これら２つの部位は１つの塩基対により重複する。ＡＡＶ配列との相同性は位置３５０５で開始、３５３１で終わる（これは下部鎖であることに注意）。
【０２５３】
これらのプライマーは３５３２乃至３５５５のＡＡＶ２型配列の２４ｂｐ（すなわち、８個のアミノ酸）を除去する。欠失アミノ酸配列は、アミノ酸４４４乃至４５１のＴｙｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏである（Ｖｐ１−Ｍｅｔがアミノ酸＃１）。
【０２５４】
以下の配列における５’Ｓｐｈ Ｉ Ａｆｌ ＩＩ Ｂｇｌ ＩＩ３’部位：５−’ＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＡＴＣＴ−３’は５個のアミノ酸Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒが追加される。
【０２５５】
ウイルスは標準のパッケージング法により生成される。ＭＳＨ−標的ＡＡＶ２型ベクターは、ＨｅＬａ細胞及びＭＳＨ受容体を有する細胞（例えば、メラニン細胞）について評価される。
【０２５６】
実施例２０
キメラＡＡＶ２／４ウイルス−キャプシドタンパク質置換
ＡＡＶ血清型のビリオンが、３つのタンパク質サブユニットＶＰ１ＶＰ２及びＶｐ３で作り上げられる。ＶＰ３は最も豊富なサブユニットであり、ビリオンを作り上げる６０のサブユニットの８０から９０％を代表し、ＶＰ１及びＶＰ２は各々５〜１０％のビリオンを作り上げる。これらのサブユニットは重複転写から翻訳され、ＶＰ３配列はＶＰ２とＶＰ１の両方の内部にあり、ＶＰ２配列はＶＰ１内部にある。
【０２５７】
われわれは、完全なサブユニットが置換できるプライマー及びＡＡＶ２とＡＡＶ４のと間のサブユニットの独得な領域をデザインした。ＡＡＶ４はＡＡＶ２と大きく異なる特性を有する。このため、これらの異なる特性の原因となる領域を規定することは、例えば、遺伝子療法用ベクターをデザインするために価値がある。
【０２５８】
われわれは、シームレスのクローニング法を選び、サブユニット又はこれら２つの血清型間のサブユニットの独得な領域をクローン化した。
【０２５９】
ＡＡＶ２及びＡＡＶ４上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）： 
５’−ＴＧＣ ＣＧＡ ＧＣＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＧＡ ＣＧＣ Ｇ−３
ＡＡＶ２及びＡＡＶ４下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）： 
５’−ＣＡＴ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＣＡ ＡＡＧ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ Ｔ−３’ 
ＡＡＶ２ ＶＰ３上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）： 
５’−ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＴＧ ＧＣＧ ＣＡＣ−３’
ＡＡＶ２ ＶＰ３下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）： 
５’−ＡＧＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣＣ ＡＴＣ ＧＴＡ ＴＴＡ ＧＴＴ ＣＣＣ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＡＧ−３’
ＡＡＶ２ ＶＰ２上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）： 
５’−ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＧＡ ＧＧＣ−３’ 
ＡＡＶ２ ＶＰ２下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）： 
５’−ＡＧＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＴＡ ＡＣＡ ＧＧＴ ＴＣＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＧＧ−３’ 
ＡＡＶ４ ＶＰ３上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）： 
５’−ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＡ ＴＧＣ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＴＧ−３’ 
ＡＡＶ４ ＶＰ３下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）： 
５’−ＡＧＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＣ ＡＴＣ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ＧＡＣ ＧＡＧ ＴＣＧ−３’ 
ＡＡＶ４ ＶＰ２上部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２）： 
５’−ＣＧＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＡＣ−３’
ＡＡＶ４ ＶＰ２下部プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３）：
５’−ＡＧＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＧＡ−３’ 
これらのプライマーにより図７に示されているサブユニットの交換が生じる。ＡＡＶ Ｖｐ２が置換されたキメラＡＡＶ２キャプシドの代表的な配列を付録２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示す。この配列はＡＡＶｒｅｐコード配列を含有し、ほとんどのＡＡＶ Ｖｐ１及びＶｐ３コード配列、及び全体のＡＡＶ Ｖｐ２コード配列及び一部のＡＡＶ Ｖｐ１とＶｐ３コード配列がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーンにある。
【０２６０】
Ｒｅｐ６８／７８コード配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のｎｕ２５１で開始し、Ｒｅｐ５２／４０コード配列はｎｕ９２３で開始する。Ｒｅｐ７８／５２終止シグナルはｎｕ２１１４で終わり、Ｒｅｐ６８／４０の終止はｎｕ２１８０である。キャプシドコード配列はｎｕ２１３３で開始し、終末はｎｕ４３１５（Ｖｐ１はｎｕ２１３３で開始し、Ｖｐ２はｎｕ２５４４で開始し、Ｖｐ３は２７４４で開始する）。
【０２６１】
ＡＡＶ２キャプシド遺伝子におけるＶｐ１のｂｐ２２４０での第２のＸｈｏｌ部位からＶｐ３のｂｐ３２５５でのＢｓｉ Ｗｌ部位までのＡＡＶ２配列は、対応するＡＡＶ４からの領域（プラスミド配列におけるｎｕ２３５０〜３１４９に対応）で置換された。簡単に言えば、ＡＡＶ２ヘルパープラスミドｐＡＣＧ２は、８３５ｂｐ断片を放出するＸｈｏｌ及びＢｓｉ Ｗｌで部分的に消化された。ＡＡＶ４における同じ消化により、欠失ＡＡＶ２配列へ連結された７９９ｂｐ断片が生じ、キメラＡＡＶ２／４キャプシドをコード化するヘルパーウイルスを生成した。
【０２６２】
組換えＡＡＶゲノム、好ましくは、典型的にレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を発現する組換えＡＡＶ２ゲノムを保有するビリオンが生成される。これらの変異体ウイルスベクターは、実施例１５に記載した通り、ビリオン形成、形態、遺伝子保護、へパリン結合、及び感染力について特徴づけられる。
【０２６３】
実施例２１
Ｂ１９／ＡＡＶ−２キメラベクターの構成
Ｄｏｎｇら、（１９９６）Human Gene Therapy 7:2101による研究では、ｒＡＡＶを用いてパッケージングの限界が明らかにされている。stufferＤＮＡの挿入を増大した組換えＡＡＶ ＤＮＡを用いることにより、ＤｏｎｇらはｒＡＡＶベクターのパッケージング能が、１０４％乃至１０８％ｗｔ（それぞれ４８８３に対して５０８３ヌクレオチド）で劇的に低下することを測定した。このパッケージング制限は、ミニ筋ジストロフィー遺伝子及びプロモーター制御嚢胞性線維症配列を含め、重要な遺伝の使用を妨げる。
【０２６４】
したがって、本発明は、Ｂ１９のパッケージング能、ＡＡＶ−２の向性、及びターゲティングベクター用の基質としての機能を維持するＢ１９／ＡＡＶ−２由来遺伝子療法用ベクターの開発を提示している。ヒトパルボウイルスＢ１９（パッケージング能５．６ｋｂ）を選び、大きなベクターゲノムをパッケージングするためのキメラＡＡＶベクターの生成において主要な構造タンパク質Ｖｐ２を利用した。Ｂ１９は２つの重複構造タンパク質（Ｖｐ１＆２）のみで構成されている。Ｂ１９はその受容体としてグロボサイドを用いて主要な赤血球前駆細胞に感染する（Brownら、（1993）Science 292:114）。Ｂ１９の構造は、分解能が８Åであると測定されている（Agbandje-Mckennaら、（1994）Virology 203:106）。
【０２６５】
キメラＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの主要構造タンパク質Ｖｐ３をＢ１９のＶｐ２で交換することで構成された。シームレスクローニング（Strategen USA）を利用して、Ｖｐ３主要Ｃａｐタンパク質（図８；付録３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のヌクレオチド配列；付録４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列）で置換したＢ１９によりＡＡＶタンパク質（Ｒｅｐ ７８、６８、５２、４０及びＶｐ１とＶｐ２）のすべてを発現することになるＡＡＶヘルパー作成物を生成した。
【０２６６】
キメラベクターの開始材料はｐＡＡＶ−Ａｄ及びｐＹＴ１０３ｃであった。ｐＹＴ１０３ｃは末端反復なしにＢ１９コード領域を含有する。ｐＡＡＶ−ＡｄのＨｉｎｄＩＩＩ消化は、ＡＡＶ２キャプシドコード領域全体及び一部の不ランキング領域を含む２７２７ｂｌ断片を放出した。この断片をＨｉｎｄ ＩＩＩ消化ｐＢＳ＋（Stragene）へサブクローン化し、ｐＢＳ＋ＡＡＶＣａｐを得た。ポリメラーゼ鎖反応を用いてｐＹＴ１０３ｃからＶｐ２コード領域を増幅した。プライマーは、５’方向において５’−ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＡＴＧＡＣＴＴＣＡＧＴＴＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４）であり、３’方向において５’−ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＴＡＣＡＡＴＧＧＧＴＧＣＡＣＡＣＧＧＣＴＴＴＴ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５）であった。ｐＢＳ＋ＡＡＶＣａｐへのプライマーを用いてＡＡＶ２のＶｐ３周囲を増幅した。プライマーは５’方向において５’− ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＡＡＴＣＧＴＧＧＡＣＴＴＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６）であり、３’方向において５’−ＡＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７）であった。各プライマーの５’末端からの６つのヌクレオチドはＥａｍ１１０４ Ｉ部位であり、この部位はこの場合にその認識部位から下流を消化し、重複部位はＡＴＧとそのコンプリメント及びＴＡＡとそのコンプリメントである。このサイズはシームレスクローニング法（Stratgene）時に利用された。Ｅａｍ１１０４−Ｉ及びクローニングによるＢ１９−Ｖｐ２及びＡＡＶ２ＰＣＲの消化により、ＡＡＶ２ Ｖｐ３で置換されたＢ１９のＶｐ２を有するｐＢＳ＋ＡＡＶＣａｐのサブクローンが得られた。このベクターをＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、クローン化してｐＡＡＶ−Ａｄへ戻し、配向を測定してｐＡＡＶ／Ｂ１９−Ａｄを得た（付録３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。この配列はＡＡＶ Ｖｐ１領域をコード化（ｎｔ１で開始）した後、ＡＡＶ２ ｖｐ２領域（ｎｔ４１２で開始）、及びＢ１９ Ｖｐ２領域（ｎｔ６０７で開始）をコード化した。
【０２６７】
実施例２２
キメラウイルスの製造
ｐＡＡＶ／Ｂ１９ヘルパー作成物を実施例１に記載した一時的なパッケージング系において用いた。簡単に言えば、ヘルパープラスミドＡｄ及びぱＢ１１（ＣＭＶ早期プロモーターの制御下ＡＡＶ末端反復及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有）をリン酸カリウムにより２９３細胞へ同時形質移入した。形質移入の２４時間後、培地を変更し、アデノウィルスｄｌ３０９（ＭＯＩ−５）を添加した。４８時間後に細胞を遠心分離して上清を捨てた。細胞ペレットのフラクションをＨＩＲＴアッセイで用いた。細胞ペレットを塩化セシウム（１．３９ｇ／ｍｌ）中で溶解し、超音波処理し、４１，０００ｒｐｍ下７２時間遠心分離した。セシウム勾配からのフラクションを回収し、各々の試料をドットブロットハイブリッド形成に用いてウイルスの粒子数を試験した。ドットブロットをβ−ガラクトシダーゼ遺伝子でプローブし、対照量のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子により粒子数を測定した。ウイルスを含有するピークフラクションをＰＢＳ、２０％グリセロールに対して透析した。
【０２６８】
実施例２３
キメラウイルスとの細胞の感染
形質移入後４８時間に、細胞ライセートを生成し、各種標的細胞への形質移入について試験した。２ｘ１０６の形質移入力価を生成した。各種量のウイルスを少量の倍地中の２９３、ＲＴ−２ラット神経膠腫、Ｕ８７神経膠腫のほか、２つの原発性ヒトグリア芽細胞腫細胞系に添加した。エリスロポエチン（ＥＰＯ）の存在下数種間インキュべートしてあったＵＴ７巨核球にもウイルスを添加した。ＥＰＯへのＵＴ７細胞の曝露は、これらの細胞にＢ１９感染に対して許容的にさせることが知られている。
【０２６９】
アデノウィルスも５のＭＯＩで細胞に添加した。感染の２時間後、ウイルスを洗浄して新鮮培地を添加した。感染後２４時間に細胞をＰＢＳで洗浄し、ホルムアルデヒド／グルタルアルデヒド中に固定し、Ｘ−ｇａｌで染色した。１２乃至２４時間後にブルーの細胞数を１０野をカウントすることで測定した。
【０２７０】
形質導入を神経膠腫及び原発性ヒトグリア芽細胞腫細胞系において得られた。効率的な形質導入は２９３細胞（典型的にＡＡＶで感染した細胞）では観察されなかった。興味深いことに、ＵＴ７細胞で形質導入が確認された。これらの結果は、キメラが未変性のＡＡＶ向性を失い、赤血球に対するＢ１９向性を獲得したことを示している。このウイルスを特徴づけ、ＡＡＶ血清型と関連した抗原特性を保持しているかどうかを判定した。
【０２７１】
このキメラウイルスのＢ１９グロボサイド結合領域（Ｖｐ２ユニットのアミノ酸３３９〜４０６のループ４：Brownら（1993）Science 262:114）は欠失し、改変され、又は交換されて赤血球に対するＢ１９向性を縮小又は完全に除去する。
【０２７２】
実施例２４
Ｂ１９／ＡＡＶキメラの特徴づけ
実施例２３の結果は、形質移入キメラウイルスが有効に生成されたことを示している。キメラウイルスをさらに総粒子収量及び完全性について評価した。ベクター標本の残りを勾配精製し、キメラウイルスをドットブロット分析で分析し、１ｘ１０８の粒子力価を測定、ＥＭ分析（実施例６を参照）で正確な正二十面体の構造が形成されているかどうかを判定した（図９）。この分析より、生成されたキメラウイルスが典型的なパルボウイルス構造を保持し、超音波処理やＣｓＣｌ２勾配遠心分離など物理的な精製ステップに対して安定であることが確認された。これはほとんどのパルボウイルスが熱安定（６５度まで耐性）であり、洗剤（０．５％ＳＤＳ）に対して耐性であり、極度なｐＨ変化（ｐＨ２．０〜１１で変動）に耐えることができるため重要な所見である。
【０２７３】
また、ＥＭ分析では意外な結果が得られた（図９）。２種類のサイズのビリオン粒子が観察された（２３〜２８ｎｍ粒子、ｗｔＡＡＶに典型的、３３〜３８ｎｍ粒子、これまで確認されず）。さらなる分析では、粒子が３３〜３８ｎｍのＡＡＶがＴ＝１からＴ＝３への三角数を変更することで形成され、６０の代わりに主要キャプシド成分の１８０コピーを含有する大粒子を産生することを示している。このような驚くべき結果は、ｗｔＡＡＶより大きな構造のビリオンが生成されたことを示している。このビリオンはｗｔベクターよりも大きなテンプレートを保有する可能性があるとみられる。大きな３３〜３８ｎｍ粒子は６ｋｂ範囲を上回るパッケージング限界の増大に有用であろう（Ｂ１９の２５ｎｍ粒子は６ｋｂのＤＮＡをパッケージングする）。
【０２７４】
実施例２５
Ｂ１９／ＡＡＶ−キメラのパッケージング能
実施例２１からのキメラウイルスのパッケージング能を定量化するために、Ｄｏｎｇと共同研究者（１９９６）Human Gene Therapy 7:2101により開発された一連のベクターを、７４５乃至１８１１塩基（最大総ゲノムサイズ６．４ｋｂ）に挿入を有するサイズを連続的に増大したゲノムが利用される。小規模生産のキメラ組換えウイルスを用いて、Ｈｉｒｔアッセイを用いたウイルスのＤＮＡ含量を試験するとともに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーターアッセイによりパッケージング効率を検定した。
【０２７５】
実施例２６
他のＢ１９／ＡＡＶキメラの構成
他のキメラＢ１９／ＡＡＶキャプシドが実施例２１におけるように生成され（例えば、ＡＡＶ Ｖｐ１又はＶｐ２をＢ１９ Ｖｐ１で交換）、上記の実施例２２〜２５の通り特徴づけられる。特に、Ｂ１９ Ｖｐ１とＶｐ２はＡＡＶ Ｖｐ１キメラへ置換され、ＡＡＶ Ｖｐ１及びＢ１９ Ｖｐ１とＶｐ２を含有する新規なキメラキャプシドを生成する。
【０２７６】
これらのキメラは２９３（典型的にＡＡＶにより感染）及び赤血球（典型的にＢ１９により感染される細胞型）において形質導入の効率について検定され、上述した通りサイズを増大した挿入を有する組換えＡＡＶベクターのパッケージングについて検定される。
【０２７７】
必要に応じて、これらのベクターのＢ１９グロボサイド結合領域（アミノ酸３９９〜４０６のＶｐ２のループ４；Brownら、（1993）Science 262:114）を欠失し、改変又は交換してＢ１９向性を除去することができる。
【０２７８】
実施例２７
ＡＡＶ血清型間のループ交換
ヘルパーベクターｐＡＣＧ２におけるＡＡＶ２のキャプシド遺伝子ｗｐ酵素Ａｓｐ７１８及びＢｓｉ Ｗｌで消化した。Ｂｓｉ Ｗｌは位置３２５４ｂｐでのＡＡＶ２ゲノムの独得な部位を有し、Ａｓｐ７１８は１９０６及び４１５８ｂｐｓ（ＡＡＶ配列数）で２回消化する。ＡＡＶ２のキャプシドコード領域は部分的にＡｓｐ７１８で消化され、全長（単一切断）断片を分離した。次いでこの断片をＢｓｉ Ｗｌで消化し、７２７２ｂｐ断片を分離した。この断片は、ＶＰ３ループ２、３、及び４領域のコード領域を含む９０４ｂｐ断片を除去した。
【０２７９】
ＡＡＶ４のキャプシドをＡｓｐ７１８及びＢｓｉ Ｗｌで消化して完了し、３２８４ｂｐ（ＢｓｉＷｌ）乃至４２１２ｂｐｓ（Ａｓｐ７１８）の９２８ｂｐｗｐ分離した（ＡＡＶ４配列数）。このＡＡＶ４断片はループ２、３及び４を含むＶＰ３における領域をコードする。９２８ｂｐのＡＡＶ４断片及びｐＡＣＧ２からの７２７ｂｐ断片を連結し、クローンを確認した。
【０２８０】
これらのクローンを用いて、大部分はＡＡＶ２及びＡＡＶ４のＶ３領域の部分を含むキメラウイルスを作成した。このウイルスはブルー染色細胞（ＬａｃＺマーカー遺伝子を発現するウイルス感染細胞）により判定されるＨｅＬａ細胞に感染することはなかった。しかし、ＡＡＶ４のように、これらの細胞は、１ｘ１０５形質移入単位／ｍｌの低力価でＣＯＳ７細胞に感染した。これらのビリオンは、ＡＡＶ２モノクロナール抗体Ｂ１により認識されなかった。
【０２８１】
ＡＡＶ２のＶｐ３ループ２〜４がＡＡＶ４キャプシドの相同性領域へ置換されたキメラウイルスも作成された。
【０２８２】
ＶＰ３ループ２〜４領域を含有するＡＡＶ３キャプシドコード領域を、ＡＡＶ２／４ループ交換について上述した同じやり方でｐＡＣＧ２へクローン化した。これらのキメラＡＡＶ２／３ビリオンはへパリンアガロースと結合し、ＨｅＬａ及び２９３細胞に感染する。さらに、これらのビリオンはＢ１モノクロナール抗体により認識される。
【０２８３】
同様に、上で開示した方法を用いて、ＡＡＶ５のＶｐ３ループ２〜４をＡＡＶ２のループ２〜４で置換した。
【０２８４】
さらに、単一ループ（例えば、ループ２、３又は４、もしくはループ２〜３又は３〜４）をＡＡＶ３、４又は５からＡＡＶ２又はその逆に置換した。
【０２８５】
これらの変異体ウイルスベクターは、実施例４〜７に記載したように、ビリオン形成、形態、ゲノム保護、へパリン結合、及び感染力について特徴づけられる。
【０２８６】
キメラＡＡＶ２／３キャプシドをコード化する代表的なヘルパープラスミドを付録５（ＳＥＱ ＩＤ：５）に示す。この配列はＡＡＶ２ｒｅｐコード配列を含有し、ＡＡＶ２キャプシドコード配列のほとんどは、ＡＡＶ２／Ｖｐ３からのループ２〜４が対応するＡＡＶ３からの領域で置換されたことを除き、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーンにある。Ｒｅｐ６８／７８コード配列はｎｕ２５１で開始し、Ｒｅｐ５２／４０コード配列はｎｕ９２３で開始する。Ｒｅｐ７８／５２の終止シグナルはｎｕ２１１４で終わり、Ｒｅｐ６８／４０の終止はｎｕ２１８０である。キャプシドコード配列はｎｕ２１３３で開始し、終末はｎｕ４３１５（Ｖｐ１はｎｕ２１３３で開始し、Ｖｐ２はｎｕ２５４４で開始し、Ｖｐ３は２７３９で開始する）。
【０２８７】
簡単に言えば、ＡＡＶ２（ｐＡＣＧ２）及びＡＡＶヘルパープラスミドは、Ｂｓｉ Ｗｌ及びＡｓｐ７１８で消化される。ＡＡＶ３ゲノムでは、同じ消化がｎｕ３２６１〜４１６８からの９０７ｂｐを除去する。この９０４ｂｐ断片は欠失ＡＡＶ２ヘルパーに連結され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（プラスミドのｎｕ３１８４〜４０９２でのＡＡＶ３配列）に示したヘルパーとなる。
【０２８８】
実施例２８
ハイブリッドウイルス
プライマーを作り、ＡＡＶ２におけるＨｉｎｄ III部位を重複するＡＡＶ４ｒｅｐ遺伝子における独得なＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を作成した。また、ｒｅｐコード配列の３’末端で、独得なＮｏｔＩ部位がポリアデニル化部位の３’末端で作成された。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入したウイルスをＰＣＲのテンプレートとした。
【０２８９】
Ｘｂａ Ｉ部位からＨｉｎｄ ＩＩＩ部位へのＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子の５’部分をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへサブクローニングした。次いでＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｎｏｔ Ｉ ＰＣＲ消化産物をＮｏｔ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した５’ｒｅｐ遺伝子を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローン化した。
【０２９０】
プライマー：
ＡＡＶ ３’Ｎｏｔ Ｉプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８）：
５’−ＡＡＧ ＣＧＣ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＴＴＡ ＴＧＴ ＡＣＧ ＣＡ−３’
ＡＡＶ ５’Ｈｉｎｄ ＩＩＩプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）：
５’−ＧＡＣ ＧＣＧ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＣＧ ＧＴＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＧ −３’
このクローニング法により、ＡＡＶ２及びＡＡＶ４ｒｅｐ遺伝子のハイブリッドであり、ＡＡＶ４ｃａｐ遺伝子を含有するヘルパープラスミドが得られる。このヘルパーはＨｉｎｄ ＩＩＩ部位までＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子及びここから配列がＡＡＶ４から由来するポリアデニル化部位を含む。
【０２９１】
このウイルスはＡＡＶ２ＩＴＲとともに組換えＡＡＶ２ゲノムをパッケージングした。このハイブリッドＡＡＶ２／４ウイルスはＡＡＶ４の結合特性を示し、例えば、これはＨＳとは結合せず、ＡＡＶ２形質導入に対して典型的に許容的ではないＡＡＶ４標的細胞を形質導入する。
【０２９２】
ハイブリッドＡＡＶ２／４ヘルパープラスミドを付録１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に示す。この配列はＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子をコード化し、ＡＡＶ４キャプシドはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーンにある。Ｒｅｐ６８／７８コード配列はｎｕ２５１で開始し、Ｒｅｐ５２／４０コード配列はｎｕ９２３で開始する。ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ７８／５２ではｎｕ２１２０で終わり、Ｒｅｐ６８／４０ではｎｕ２１８３で終わる。Ｃａｐコード領域はｎｕ２１２３で開始し、ｎｕ４３４１で終わる（Ｖｐ１はｎｕ２１３３で開始し、Ｖｐ２はｎｕ２５４７で開始し、Ｖｐ３は２７２７で開始する）。
【０２９３】
同じ方法を用いて、組換えＡＡＶ２ゲノム（ＡＡＶ２ ＩＴＲとともに）がパッケージングされているハイブリッドＡＡＶ２／３。こうして得られるハイブリッドウイルスは生存可能であり、ＡＡＶ３許容的細胞を効率的に形質導入する。
【０２９４】
また、最近の報告（Chioroniら、1999）J. Virology 73:1309）とは対照的に、上述した方法を用いて、組換えＡＡＶ２ゲノム（ＡＡＶ２ ＩＴＲとともに）ＡＡＶ５型キャプシドへパッケージングされているハイブリッドＡＡＶ２／５を生成した。このウイルスは比較的非効率的にパッケージングされるが、結果として得られる粒子は細胞の形質導入を示した。
【０２９５】
上述の発明は、明快さ及び理解を目的とした説明及び実施例によりかなり詳細に述べられているが、一部の変更や修正が付属のクレーム及びその等価物の範囲内で実施されうることはあきらかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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