(57)【要約】【課題】プロテインＡに対する抗体の結合性における抗体に修飾する糖鎖の影響には全く注意が払われてこなかった。【解決手段】本発明の抗体の改変方法は、軽鎖に糖鎖が付加された抗体において、糖鎖を酵素処理によって除去することによりプロテインＡに対する結合性を変異させた抗体の改変方法を提供し、前述の抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、あるいはそれらの改変体であり、前述の酵素がグリコシダーゼである抗体の改変方法を提供する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖の可変領域に糖鎖が付加された抗体において、糖鎖を酵素処理によって除去することによりプロテインＡに対する結合性を変異させた抗体の改変方法。
【請求項２】
請求項１記載の抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、あるいはそれらの改変体である抗体の改変方法。
【請求項３】
請求項１記載の酵素がグリコシダーゼである抗体の改変方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体の改変方法に関する。特に、軽鎖に結合している糖鎖を切断することによりプロテインＡに強く結合する抗体等を得る。
【０００２】
抗体の軽鎖に付加された糖鎖を酵素処理、例えばグリコシダーゼ処理することによりプロテインＡに対する結合性を変異させた抗体の改変方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来の技術では、種々の動物種の抗体を精製する際、プロテインAやプロテインGを固定化したアフィニティカラムを用いた方法により行われていた。
【０００４】
しかし、天然由来のプロテインAやプロテインGは、動物種または抗体のサブクラスによっては精製できないといった問題点があった。
【０００５】
この問題に対して、種々の抗体を精製できる程度までプロテインAの結合力を向上させるために、遺伝子変異（ポイントミューテーション、ドメイン化、マルチドメイン化など）を加える取り組みが多くなされてきた(特許文献１)。
【０００６】
一方で、抗体の変異により抗体の抗原特異的結合領域に存在する糖鎖を除去することで抗原結合性を向上させる取り組みもなされてきた（特許文献２、３、４）。
【０００７】
この他、本発明に関連し得る文献として、特許文献５を挙げることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−１１２８２７号公報
【特許文献２】特開平６−９０７８２号公報
【特許文献３】特表２００７−５２５１９４号公報
【特許文献４】特表２００８−５１１２９１号公報
【特許文献５】特許第３４３９７８０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前記の状況において、本発明の発明者は、従来の抗体の開発やその機能についての検討において、プロテインＡに対する抗体の結合性における抗体に修飾する糖鎖の影響には全く注意が払われてこなかったことに注目し、抗体の修飾糖鎖の役割について検討を進めてきた。
【００１０】
その結果、抗体のプロテインA結合性は、抗体の糖鎖構造に依存しているとの知見を得た。そこで、この発明は、上記の通りの従来技術の限界を克服し、この抗体に結合する軽鎖に付加された糖鎖に注目することによって、よりプロテインA結合性の高い抗体を生成させることのできる新しい技術手段を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記従来の課題を解決するために、本発明の抗体の改変方法は、軽鎖に糖鎖が付加された抗体において、糖鎖を酵素処理によって除去することによりプロテインＡに対する結合性を変異させた抗体の改変方法を提供し、前述の抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、あるいはそれらの改変体であり、前述の酵素がグリコシダーゼである抗体の改変方法を提供する。
【００１２】
この発明は、上記の通りの課題を解決するものとして、抗体産生ハイブリドーマにより産生した抗体を酵素処理によって軽鎖の糖鎖の切断をすることを特徴とする抗体の改変方法をも提供するものである。この方法によって、プロテインＡ特異性が認識されつつもその結合性に大きな問題があった抗体について、高効率精製方法が可能となる。
【００１３】
抗体に結合する糖鎖に着目し、新しい技術手段を切拓いたこの発明は、今後の抗体技術にとって極めて重要な、かつ、画期的な手段を提供すると言ってよい。もちろん、対象とする抗体の種類には限定はない。抗体に結合する糖鎖の認識によって、目的と応用のいかんによって具体的条件、プロセスが適宜に決定される。
【発明の効果】
【００１４】
軽鎖に糖鎖が付加された抗体を種々のグリコシダーゼで処理することにより、抗体のプロテインAによる精製効率を格段に向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施の形態における一般的な抗体を示す図
【図２】本発明の一実験例の結果を示す電気泳動写真
【図３】本発明の実施の形態における抗体において糖鎖負荷されている箇所を示す図
【図４】本発明の一実験例の結果を示すグラフ
【図５】本発明の一実験例の結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１７】
（実施の形態１）
改変を行う抗体には、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞から得られるａｎｔｉ  ｈＳＡ（ヒト血清アルブミン）マウスＩｇＧ１を用いるのがよい。
【００１８】
図１に一般的なマウスIgG1抗体の模式図を示す。
【００１９】
しかし、抗体の軽鎖への糖鎖修飾がなされる方法、例えば、酵母、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞などによる抗体産生方法により得られたモノクローナル抗体、また各種動物により産生されたモノクローナル、ポリクローナル抗体であれば改変を行う抗体として使用可能である。
【００２０】
また、改変に用いる抗体は、いかなる抗原に関わらず、抗体の種類、サブクラスであっても軽鎖への糖鎖修飾がなされておりプロテインＡに結合する抗体であれば使用できる。
【００２１】
抗体は一般的にＮ型グリコシル化によりコンセンサス配列と呼ばれるアミノ酸配列中のアスパラギンに糖鎖が結合している。
【００２２】
この糖鎖を酵素により処理することで抗体への改変を行う。
【００２３】
酵素はＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ＢｉｏＬａｂｓ社）を使用するのがよいが、エンドグリコシダーゼＨやＯ型グリコシル化による糖鎖付加であればその糖鎖を切除するグリコシダーゼであれば使用できる。
【００２４】
酵素処理を行う温度は３７度が最もよいが、抗体の構造が破壊されない温度であればよい。
【００２５】
処理時間は１５時間が最もよいが、抗体量、酵素量、温度により最適値を設定すればよい。
【００２６】
糖鎖切除の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可能である。糖鎖切除の確認であるので、この方法に関わらず、各種クロマトグラフィーやＭＳなど分子量を測定できる方法であればよい。
【００２７】
プロテインＡとの相互作用の測定には速度論的解析も可能であるＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるのがよいが、ＥＬＩＳＡやＩＴＣなど分子間相互作用を測定できる方法であれば使用可能である。
【００２８】
上記の実施の形態により、本発明に係る抗体改変方法を提案する。
【００２９】
以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明の方法と、改変された抗体について説明する。
【００３０】
（実施例１）
本発明の実施に係る、抗体の改変方法について実施例を以下に説明する。
【００３１】
図１に一般的な抗体(IgG1)の構造を示す。抗体は軽鎖（１０１）と重鎖（１０２）がジスルフィド結合することで存在し、これらが対になって一個の抗体を形成している。
【００３２】
さらに、軽鎖および重鎖は可変領域（１０３）と定常領域（１０４）に分かれている。
【００３３】
一般的な抗体の重鎖（１０２）の定常領域（１０４）には糖鎖（１０５）が付加されていることが分かっている。
【００３４】
本発明に用いた抗体には、本発明に係る軽鎖に糖鎖付加がある抗体A(寄託番号：FERM BP-10459)および、比較として軽鎖に糖鎖付加のない一般的な抗体B(寄託番号：FERM BP-10460)を用いた。
【００３５】
これらの抗体における定常領域のアミノ酸配列は、NCBI_BLAST(//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi、冒頭にhttp:を付与）にてマウスの抗体の一般的な配列と一致していることを確認した。
【００３６】
また、これらの抗体はヒト血清アルブミン(hSA)を免疫したマウスから獲得したものである。
【００３７】
次に、抗体に付加された糖鎖を切断する処理を示す。
【００３８】
抗体糖鎖の切断は、抗体主鎖に結合する糖鎖、特にN結合型糖鎖を切断する酵素、PNGase F（BioLabs社）を用いて実施した。
【００３９】
抗体濃度が１ｍｇ/ｍｌかつ全量が２０ｕＬとなるように、２ｕｌの１０ｘ  Ｇ７バッファ（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）と２０ｕｇの抗体と脱イオン蒸留水を混合し、最後に２ｕｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆを混合し、よくピペッティングした後、37℃にて15時間インキュベートした。
【００４０】
糖鎖切断処理後、バッファー置換を行うために透析を行った。透析膜ＭｗＣＯ１００，０００（Ｓｐｅｃｔｒａ/Ｐｏｒ）を用いて、リン酸バッファー（０．０５％sodium Azide、８ｇＮａＣｌ、０．２ｇＫＣｌ、１．４４ｇＮａ2ＨＰＯ4、０．２４ｇＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）に置換した。
【００４１】
糖鎖除去を確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００４２】
０．５ｕｇの抗体をサンプルバッファー（１ｍＬ  ０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２ｍｌ  １０％ＳＤＳ、０．６ｍｌ  βメルカプトエタノール、１ｍｌ  グリセロール、数滴  １％  ＢＰＢ、脱イオン蒸留水（１０ｍｌメスアップ））へ混合し、５分間湯せんにて加熱処理した。
【００４３】
処理後、１０％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。得られた結果を図２に示す。２０４および２０５に示すバンドは抗体の軽鎖、２０６に示すバンドは抗体の重鎖である。
【００４４】
２００は蛋白質の分子量を示すマーカーであり、図２中において上が分子量が大きく、下が小さいことを示している。
【００４５】
このことから、抗体（３１０）は軽鎖に糖鎖を持つ抗hＳＡ（ヒト血清アルブミン）のマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体である（図２中２０４）。
【００４６】
比較のため、軽鎖に糖鎖を持たない抗体Ｂ（３１１）（図１中マル４；抗hＳＡ（ヒト血清アルブミン）のマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体）、および非還元処理による糖鎖切断処理後の抗体Ａ（図１中マル３）を同時に電気泳動した。
【００４７】
前記糖鎖処理後の抗体Ａ（３１０）の軽鎖のバンド（Ｉ）が低くなっている（図１中、マル２、マル３）、つまり糖鎖が切断されて抗体Ａ（３１０）の軽鎖の分子量が小さくなっていることが確認された。
【００４８】
以上のことから、本発明に係る抗体は、軽鎖（１０１）の可変領域（１０３）に糖鎖（３０３）を持つ抗体であることが確認された。
【００４９】
次に、軽鎖の糖鎖の有無による抗体（４０１および４０２）とプロテインＡとの結合様式を確認するため、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＳＰＲ評価を実施した。
【００５０】
ＳＰＲ評価に用いた温度は、一貫して２５度で行った。センサーチップ（ＣＭ５；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にプロテインＡ（当方にてクローニングにより作製）をチオールカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ｌａｎｅ２に１０００ＲＵ（約１ｎｇ/ｍｍ2）結合した。
【００５１】
結合に際し、プロテインＡをｐＨ４．５の酢酸バッファーに溶解し、流速５ｕｌ/ｍｉｎにてセンサーチップ上に結合させた。ｌａｎｅ１は、リファレンスとするため、プロテインＡを結合せず、センサーチップ上の活性基の不活化のみを行った。
【００５２】
次に、グリコシダーゼ処理により糖鎖を除去した軽鎖に糖鎖付加がある抗体（４０１）および軽鎖に糖鎖付加がない抗体（５０１）、グリコシダーゼ処理を行っていない軽鎖に糖鎖付加がある抗体（４０２）および軽鎖に糖鎖付加がない抗体（５０２）をＲｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（０．００５％  ｔｗｅｅｎ２０  ＰＢＳ、ｐＨ７．４）により１００ｎＭに希釈し、流速１０ｕｌ/ｍｉｎにて３分間、センサーチップ上のｌａｎｅ１およびｌａｎｅ２上へ流し結合挙動を測定し、その後約１０分間Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを流し抗体の解離挙動を測定した。
【００５３】
この測定結果を示すセンサーグラムを図４および５に示す。図４は軽鎖に糖鎖付加がある抗体（３１０）を、図５は軽鎖に糖鎖付加がない抗体（１１０）をそれぞれプロテインＡに結合させたときのセンサーグラムである。
【００５４】
横軸は、時間（秒）、縦軸はプロテインＡに対する抗体の結合量（ＲＵ）、点線はベースライン、ａは抗体を流し始めて１６０秒後を表す。
【００５５】
１６０秒後における軽鎖に糖鎖付加がある抗体（４０１および４０２）の結合量は、それぞれ１２３８．１ＲＵおよび８０８．４ＲＵであった。
【００５６】
一方、抗体（５０１および５０２）の結合量は、２４９．４ＲＵおよび２４８．３ＲＵであった。
【００５７】
このことから、軽鎖に結合した糖鎖を除去することにより約１．９倍強めることが可能であることがわかった。
【００５８】
この結果は、軽鎖の糖鎖付加の違いが抗体特異性に多大な影響を及ぼしていることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明にかかる抗体軽鎖の糖鎖を除去する方法は、プロテインＡ特異性が認識されつつもその結合性に大きな問題があった抗体について、高効率精製方法を可能とする。
【００６０】
抗体に結合する糖鎖に着目し、新しい技術手段を切拓いたこの発明は、今後の抗体技術にとって極めて重要な、かつ、画期的な手段を提供すると言ってよい。
【００６１】
もちろん、対象とする抗体の種類には限定はない。抗体に結合する糖鎖の認識によって、目的と応用のいかんによって具体的条件、プロセスが適宜に決定される。
上記の開示内容から導出される本発明に係る技術的思想は以下の通りである。
１．
抗体をプロテインＡに結合させる方法であって、
前記抗体は軽鎖（１０１）および重鎖（１０２）を具備しており、
前記軽鎖（１０１）は糖鎖（１０５）を具備しており、
前記方法は、
前記抗体を含む溶液にグリコシダーゼを添加し、前記糖鎖を前記軽鎖から切断する第１工程、および
前記溶液をプロテインＡ上に展開する第２工程
を順に有する。
２．
前記抗体は寄託番号：FERM BP-10459により特定される抗体である、前記項目１に記載の方法。
【符号の説明】
【００６２】
１０１  軽鎖
１０２  重鎖
１０３  可変領域
１０４  定常領域
１０５  糖鎖
１１０  一般的なIgG1抗体
２００  分子量マーカー
２０１  糖鎖除去をしていない軽鎖に糖鎖付加された抗体
２０２  糖鎖除去をした軽鎖に糖鎖付加された抗体
２０３  糖鎖除去をした軽鎖に糖鎖付加されていない抗体
２０４  糖鎖付加がある軽鎖のバンド
２０５  糖鎖付加がない軽鎖のバンド
２０６  重鎖のバンド
３０１  軽鎖に付加された糖鎖
３１０  軽鎖に糖鎖付加がある抗体
４０１  糖鎖を除去した軽鎖に糖鎖付加された抗体とプロテインAとの相互作用を示すセンサーグラム
４０２  糖鎖を除去していない軽鎖に糖鎖付加された抗体とプロテインAとの相互作用を示すセンサーグラム
４１０  プロテインAと抗体を相互作用し始めてから１６０秒の時点
５０１  糖鎖を除去した軽鎖に糖鎖付加がない抗体とプロテインAとの相互作用を示すセンサーグラム
５０２  糖鎖を除去していない軽鎖に糖鎖付加がない抗体とプロテインAとの相互作用を示すセンサーグラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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