(57)【要約】【課題】本発明は、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する方法及び細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化物質のスクリーニング方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害することで、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定化を可能にする。さらに、本発明は、ＳＮＸ２７及びＡＢＣＡ１を細胞膜上に発現している細胞を用いて、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の阻害を介して、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質のスクリーニング方法を提供する。【選択図】図４
2011160744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を調節し、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を制御する方法。
【請求項２】
ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害し、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する方法。
【請求項３】
前記ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の阻害が、細胞に内在するＳＮＸ２７遺伝子全体を破壊することで達成されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の阻害が、細胞に内在するＳＮＸ２７遺伝子に突然変異を導入することで達成されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記突然変異が、ＳＮＸ２７のＰＤＺドメインに導入されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の阻害が、ＲＮＡｉ法によることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかの記載の方法により細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化し、細胞内からのコレステロール排泄量を増大させる方法。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれかに記載の方法により細胞膜上のＡＢＣＡ１が安定化した細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の方法により細胞内からのコレステロール排泄量が増大した細胞。
【請求項１０】
請求項８又は請求項９に記載の細胞から調製したｉＰＳ細胞。
【請求項１１】
請求項８又は請求項９に記載の細胞から、ｉＰＳ細胞を介さずに調製した、該細胞とは異なる細胞型を有する細胞。
【請求項１２】
ＳＮＸ２７又はその一部、ＡＢＣＡ１又はその一部及び試験物質を共存させてインキュベートした後、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１が相互作用しているかどうかを確認することを含む、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
ＳＮＸ２７及びＡＢＣＡ１を細胞膜上に発現している細胞を試験物質の存在下でインキュベートした後、該細胞膜上のＡＢＣＡ１の存在量と、試験物質の非存在下でインキュベートした細胞の細胞膜上のＡＢＣＡ１の存在量とを比較することを含む、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
請求項１２又は請求項１３に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を試験物質として、細胞内からのコレステロールの排泄を増大させる物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求項１２又は請求項１３に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を試験物質として、血中ＨＤＬ濃度を上昇させる物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＢＣＡ１を細胞膜上で安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質異常症や糖尿病、高血圧などの生活習慣病により引き起こされる動脈硬化症は、先進国における死因の上位を占める心臓疾患や脳卒中のリスクファクターとなることから、現代における重要な保健的課題である。これまでの研究より、血液中のＬＤＬ−コレステロール、トリグリセリドなどの脂質濃度の増加が、種々のメカニズムにより動脈硬化を進展させることが明らかにされている。従って、現在の動脈硬化の薬物療法としては、血液中のコレステロールを低下させるスタチン系薬剤、トリグリセリドを低下させるフィブラート系薬剤が用いられているが、これらの薬物療法では、日本動脈硬化学会が定める「動脈硬化性疾患予防ガイドライン」や米国の診断基準であるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ IIIの血液中脂質パラメータの管理目標値に到達しないことも多い。また、スタチン系薬剤では横紋筋融解症、フィブラート系薬剤では肝障害など投与患者における副作用の報告もあることから、新規薬効機序に基づく、動脈硬化症薬の開発が期待されている。
【０００３】
近年、アメリカ、ヨーロッパにおける大規模な疫学調査から、血液中ＨＤＬ濃度の低下が動脈硬化のリスクファクターとして示されており、血液中ＨＤＬ濃度の調節機構を探ることによって新たな創薬標的を見出せるものと期待される。ＡＢＣトランスポーターファミリーに属するＡＢＣＡ１は、血液中ＨＤＬ濃度が顕著に低下するタンジール病の原因遺伝子にコードされていることなどから、ＨＤＬ合成を担う脂質トランスポーターであることが明らかにされている（非特許文献１及び非特許文献２）。また、遺伝子改変動物を用いた解析からは、その機能亢進が血液中ＨＤＬ濃度を増加させ、動脈硬化の抑制に働くことが報告されている（非特許文献３）。
【０００４】
発明者らは、ＡＢＣＡ１が属するＡＢＣトランスポーターファミリーの機能を明らかにするために、ＡＢＣトランスポーターファミリーと何らかの相互作用を行う因子の検索を行ってきた。その結果、ＡＢＣトランスポーターの１つであるＭＲＰ４のＰＤＺ結合モチーフに相互作用し、その細胞膜発現量を制御するタンパク質として、タンパク質の細胞内ソーティングに関与するＳｏｒｔｉｎｇ  ｎｅｘｉｎ  （ＳＮＸ）ｆａｍｉｌｙに属すＳＮＸ２７を同定した。ＳＮＸ２７は、他のＳＮＸファミリーのメンバーと同様に、ＰＸと呼ばれるドメインを有しており、このドメインを介して早期エンドソームに豊富に存在するイノシトールリン脂質（ＰＩ３Ｐ）と結合し、早期エンドソームに局在すると考えられている（非特許文献４）。ＳＮＸ２７は、ＭＲＰ４以外にも、５−ＨＴ４（ａ）受容体のスプライスバリアント（非特許文献５）、ジアシルグリセロールキナーゼζ（非特許文献６）、Ｋｉｒ３チャネルタンパク質（非特許文献７）、ＣＡＳＰ（非特許文献８）などとも相互作用することが報告されている。
【０００５】
以上のような知見に基づいて、ＡＢＣＡ１が関連する疾患（例えば、動脈硬化など）の治療法や治療剤の開発が精力的に行われている。例えば、ＡＢＣＡ１遺伝子の転写を調節するための方法及び調節物質のスクリーニング方法（特許文献１）、ＡＢＣＡ１遺伝子の発現調節を介した神経系障害等の治療方法（特許文献２）、あるいは、ＡＢＣＡ１の発現制御等を介し脂質代謝などを改善する薬剤のスクリーニング方法（特許文献３）などがこれまでに報告されている。これに対し、ＳＮＸ２７については、現在のところ、疾患等との関連性などに関する詳細は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−８２４４５
【特許文献２】ＷＯ２００２／１０１３９２
【特許文献３】特許第４０１６２８０
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｅｗｉｎｇｔｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  ２００７；３７０：１８２９−１８３９．
【非特許文献２】Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：５６９２−５６９７．
【非特許文献３】Ｓｉｎｇａｒａｊａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：３３９６９−３３９７９．
【非特許文献４】Ｗｏｒｂｙ及びＤｉｘｏｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００２  Ｄｅｃ；３（１２）：９１９−３１
【非特許文献５】Ｊｏｕｂｅｒｔら、Ｊ．Ｃｉｌｌ  Ｓｃｉ．２００４；１１７：５３６７−５３７９．
【非特許文献６】Ｒｉｎｃｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００７；６：１０７３−１０８７．
【非特許文献７】Ｌｕｎｎら、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００７；１０：１２４９−１２５９．
【非特許文献８】ＭａｃＮｅｉｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００７；３５９：８４８−８５３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明者らは、ＡＢＣＡ１の細胞膜上における発現量調節の分子機構解明のため鋭意研究を行ったところ、ＡＢＣＡ１がＳＮＸ２７と相互作用すること、及び、この相互作用を抑制することでＡＢＣＡ１を細胞膜上に安定に存在させることを初めて見出し、本発明を完成させた。
よって、本発明は、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を調節することで、ＡＢＣＡ１の細胞膜上での安定性を制御する方法に関する。
また、本発明は、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を調節することで、ａｐｏＡ−Ｉを介したコレステロールの細胞外への排泄を制御する方法に関する。さらには、本発明は、血中のＨＤＬ濃度を調節する方法に関する。
本発明は、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を調節する物質のスクリーニング方法に関する。さらには、本発明は、血中のＨＤＬ濃度を調節する物質のスクリーニング方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、これまでにＡＢＣトランスポーターの１つであるＭＲＰ４の細胞膜発現量を制御するタンパク質としてＳＮＸ２７を同定している。ＡＢＣＡ１はＭＲＰ４と同様にカルボキシル末端にＰＤＺ結合モチーフを有するＡＢＣトランスポーターであることから、ＳＮＸ２７がＭＲＰ４と同様に、ＡＢＣＡ１の細胞膜発現量も制御している可能性を考え、ＡＢＣＡ１を内因性に発現する肝由来培養細胞であるＨｕｈ７細胞においてＳＮＸ２７をノックダウンし、検討を行った。その結果、ＳＮＸ２７のノックダウンにより、細胞膜上に存在するＡＢＣＡ１の分解速度が遅延され、ＡＢＣＡ１の細胞膜上における発現量が増加することを始めて見出した。さらに、ＡＢＣＡ１の発現量増加に伴う機能亢進により、ａｐｏＡ−Ｉを介したコレステロールの細胞外排泄が増大することを見出した。
すなわち、本発明の以下の（１）〜（１５）である。
（１）ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を調節し、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を制御する方法。
（２）ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害し、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する方法。
（３）前記ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の阻害が、細胞に内在するＳＮＸ２７遺伝子全体を破壊することで達成されることを特徴とする上記（２）に記載の方法。
（４）前記ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の阻害が、細胞に内在するＳＮＸ２７遺伝子に突然変異を導入することで達成されることを特徴とする上記（２）に記載の方法。
（５）前記突然変異が、ＳＮＸ２７のＰＤＺドメインに導入されることを特徴とする上記（４）に記載の方法。
（６）前記ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の阻害が、ＲＮＡｉ法によることを特徴とする上記（２）に記載の方法。
（７）上記（１）乃至（６）のいずれかの記載の方法により細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化し、細胞内からのコレステロール排泄量を増大させる方法。
（８）上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法により細胞膜上のＡＢＣＡ１が安定化した細胞。
（９）上記（７）に記載の方法により細胞内からのコレステロール排泄量が増大した細胞。
（１０）上記（８）又は（９）に記載の細胞から調製したｉＰＳ細胞。
（１１）上記（８）又は（９）に記載の細胞から、ｉＰＳ細胞を介さずに調製した、該細胞とは異なる細胞型を有する細胞。
（１２）ＳＮＸ２７又はその一部、ＡＢＣＡ１又はその一部及び試験物質を共存させてインキュベートした後、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１が相互作用しているかどうかを確認することを含む、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングする方法。
（１３）ＳＮＸ２７及びＡＢＣＡ１を細胞膜上に発現している細胞を試験物質の存在下でインキュベートした後、該細胞膜上のＡＢＣＡ１の存在量と、試験物質の非存在下でインキュベートした細胞の細胞膜上のＡＢＣＡ１の存在量とを比較することを含む、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングする方法。
（１４）上記（１２）又は（１３）に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を試験物質として、細胞内からのコレステロールの排泄を増大させる物質をスクリーニングする方法。
（１５）上記（１２）又は上記（１３）に記載のスクリーニング方法によって得られた物質を試験物質として、血中ＨＤＬ濃度を上昇させる物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を制御することができる。
【００１１】
本発明により、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化することができる。
【００１２】
本発明により、細胞内からのａｐｏＡを介するコレステロール排泄量を増大させることができる。
【００１３】
本発明により、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングすることができる。
【００１４】
本発明により、細胞内からのａｐｏＡを介するコレステロール排泄量を増大させる物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａは、ＡＢＣＡ１とＳＮＸ２７の相互作用を検討した結果を示す。Ｈｕｈ７細胞の細胞可溶液から、ＡＢＣＡ１（左図）、ＳＮＸ２７（右図）抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った。得られた免疫沈降サンプルを、ＡＢＣＡ１検出用は６％、ＳＮＸ２７検出用は８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＡ１、ＳＮＸ２７抗体にてウェスタンブロッティング（ＩＢ）を行った。Ｂは、ＡＢＣＡ１とＳＮＸ２７の相互作用におけるＰＤＺ結合モチーフ依存性について検討した結果を示す。ＡＢＣＡ１をコードするＤＮＡ又はＡＢＣＡ１Δ４をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の細胞可溶液を調製し、ＳＮＸ２７抗体にて免疫沈降を行った。免疫沈降サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗ＡＢＣＡ１抗体又は抗ＳＮＸ２７抗体でウェスタンブロッティングを行った。「Ｉｎｐｕｔ」は、免疫沈降を行わずに調製サンプルをそのままウェスタンブロッティングに用いた結果である。「ＩｇＧ」は抗ＳＮＸ２７抗体の代わりに非特異的なＩｇＧを用いて行ったコントロール実験である。Ｃは、ＳＮＸ２７によるＡＢＣＡ１の細胞膜上における発現量制御に対するＰＤＺ結合モチーフ依存性について検討した結果である。ＨＥＫ２９３細胞にＡＢＣＡ１をコードするＤＮＡ又はＡＢＣＡ１Δ４をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをトランスフェクションし、その２４時間後にＳＮＸ２７遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡ又はコントロールのｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後に細胞可溶液の調製を行い、調製したサンプルについて、抗ＡＢＣＡ１抗体（ＩＢ：ＡＢＣＡ１）、抗ＳＮＸ２７抗体（ＩＢ：ＳＮＸ２７）によるウェスタンブロッティングを行った。
【図２】ＳＮＸ２７が細胞膜上のＡＢＣＡ１の発現量に及ぼす影響について検討した結果を示す。Ｈｕｈ７細胞にＳＮＸ２７遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、その７２時間後に、細胞可溶液の調製（Ａ）と、ビオチン化による細胞膜分画の調製（Ｂ）を行った。調製したサンプルのうち、２５μｇ（Ａ）又は全量（Ｂ）を６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＡ１、ＳＮＸ２７抗体にてウェスタンブロッティングを行った。
【図３】ＡＢＣＡ１の細胞膜からの分解速度に対するＳＮＸ２７の影響を示す。Ｈｕｈ７細胞にＳＮＸ２７遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、その７２時間後に細胞表面をビオチン化した。３７℃で０、２、４、８時間培養後、細胞可溶液を調製し、ストレプタビジンビーズを用いて残存しているビオチン化タンパク質を単離した。単離したサンプルは、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＡＢＣＡ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った（Ａ）。Ａの結果に示されるＡＢＣＡ１のバンドの濃度を、Ｉｍａｇｅ  ｇａｕｇｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅで定量化した。各バーは３回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるｃｏｎｔｒｏｌとの有意差（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０５）。
【図４】ＳＮＸ２７がａｐｏＡ−Ｉをアクセプターとする細胞外へのコレステロール排泄に及ぼす影響を検討した結果を示す。「ｃｏｎｔｒｏｌ」はコントロールのｓｉＲＮＡを用いた結果を示し、「ＳＮＸ２７ＫＤ」はＳＮＸ２７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた結果を示す。「Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ」はＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ  ＝（メディウムのカウント）／（メディウムのカウント＋可溶液のカウント）より算出し、「ａｐｏＡ−Ｉ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｈｏｒｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ」はａｐｏＡ−Ｉ添加時、非添加時のｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｅｆｆｌｕｘ値の差分から評価した。
【図５】ＳＮＸ２７とオルガネラマーカーとの共局在を確認した結果を示す。ＣＯＳ１細胞を固定、可溶化し、オルガネラマーカー抗体（（Ａ）ＥＥＡ１、（Ｂ）ＴＧＮ３８、（Ｃ）ＬＡＭＰ−１）及びＳＮＸ２７抗体（中図）にて免疫染色を行った。左図は、オルガネラマーカー抗体による結果。中図は、ＳＮＸ２７抗体による結果。右図は、左図と中図を併せた図。
【図６】ＳＮＸ２７とＧＦＰ融合Ｒａｂファミリータンパク質との共局在を確認した結果を示す。ＣＯＳ１細胞に、Ｒａｂ４（Ａ）、Ｒａｂ５（Ｂ）、Ｒａｂ７（Ｃ）及びＲａｂ１１（Ｄ）を発現させるＡｃＧＦＰ発現ベクターをトランスフェクションし、その４８時間後に細胞を固定、可溶化し、ＳＮＸ２７抗体にて免疫染色を行った。左図はＡｃＧＦＰ−Ｒａｂタンパク質の局在を、中図はＳＮＸ２７の局在を示した図である。右図は左図と中図を併せた図。
【図７】ＳＮＸ２７と蛍光標識トランスフェリン（Ｔｆ）との共局在を確認した結果を示す。ＣＯＳ１細胞をＡｌｅｘａ５９４−Ｔｆ（０．１ｍｇ／ｍＬ）で、０、２、１０、３０及び６０分間、３７℃で培養した。左図はＳＮＸ２７の局在を、中図は、Ａｌｅｘａ５９４−Ｔｆの局在を示す。右図は左図と中図を併せた図。
【図８】細胞膜分画におけるＳＮＸ２７の発現確認結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜分画をビオチン化により調製した。調製したサンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＳＮＸ２７、ＨＲＳ、ＥＥＡ１及びＭＲＰ４抗体にてウェスタンブロッティングを行った。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態の１つは、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を調節して、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を制御する方法である。
ＳＮＸ２７は、細胞内ソーティングに関与するＳＮＸ（Sorting nexin）ファミリーに属するタンパク質である。ＳＮＸ２７が由来する動物種は特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコなどが好ましく、特に、ヒトが好ましい。ＳＮＸ２７のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１〜配列番号１５で表されるアミノ配列、及びこれらの配列と実質的に同一のアミノ酸配列である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号１〜配列番号１５で表されるアミノ配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸配列からなるタンパク質が細胞内ソーティング活性を有する配列、あるいは、配列番号１〜配列番号１５で表されるアミノ配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、該アミノ酸配列からなるタンパク質が細胞内ソーティング活性を有する配列のことである。
また、ＡＢＣＡ１とは、ＰＤＺ結合モチーフを有し、ＡＢＣトランスポーターファミリーに属するタンパク質のことで、その遺伝子配列、アミノ酸配列等に関する情報は、公開のデータベースなどを検索することで容易に入手することができる。
【００１７】
ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の「相互作用」とは、直接的又は間接的に互いに何らかの影響を与えることであり、例えば、互いに直接的又は間接的に「結合」している状態を意味する。また、「相互作用」を調節するとは、相互作用を強めたり、又は、弱めたりすることで、例えば、「結合」を増強又は阻害（抑制あるいは低下）することである。
細胞膜上のＡＢＣＡ１の「安定性」とは、一般的に理解される意味であって、例えば、ＡＢＣＡ１が細胞膜上で発現している時間の長短のことである。例えば、ＡＢＣＡ１が細胞膜上に発現している時間が長くなれば、細胞膜上のＡＢＣＡ１が「安定化」したということができる。
ＳＮＸ２７は、ＡＢＣＡ１との相互作用を介してＡＢＣＡ１のソーティングに関与していると考えられるため（後述の実施例を参照のこと）、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を調節すれば、ＡＢＣＡ１の細胞内への内在化をコントロールすることができ、その結果、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を制御することができる。
【００１８】
ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用は、例えば、ＡＢＣＡ１と相互作用する能力を保持したＳＮＸ２７の細胞膜上の存在量を変化（増加又は減少）させるか、あるいは、ＡＢＣＡ１と相互作用するＳＮＸ２７の能力を変化（増強又は低下）させることにより調節することができる。
特に、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害（又は抑制、低下）するために、ＳＮＸ２７の細胞膜上の存在量を低下させる場合、例えば、適当なターゲティングベクターを利用して細胞に内在するＳＮＸ２７遺伝子の全体を破壊する方法、ＲＮＡｉ法によりＳＮＸ２７遺伝子の発現阻害を誘導する方法など当該技術分野において公知の方法により容易に行うことができる。ＲＮＡｉ法による場合には、ＳＮＸ２７遺伝子の発現を阻害する核酸等であれば如何なるものを利用してもよいが、例えば、センス鎖：5’-GGUUGGCAUGGACAGUACGtt-3’（配列番号１７）及びアンチセンス鎖：5’-CGUACUGUCCAUGCCAACCtt-3’（配列番号１８）からなるｓｉＲＮＡ、あるいは、センス鎖：5’-GCAAUAAUCUAGGGUAUGUtt-3’（配列番号１９）及びアンチセンス鎖：5’-ACAUACCCUAGAUUAUUGCtg-3’（配列番号２０）からなるｓｉＲＮＡなどを利用することができる。
また、ＡＢＣＡ１と相互作用（又は結合）するＳＮＸ２７の能力を低下させるためには、ＡＢＣＡ１と相互作用するＳＮＸ２７側の領域、例えば、ＰＤＺドメインに突然変異などを導入し、ＡＢＣＡ１との相互作用を喪失又は低下させることにより達成してもよい。ＳＮＸ２７のＰＤＺドメインは、公知のデータベース等により容易に検索することができ、例えば、ヒト由来のＳＮＸ２７の場合、アミノ酸位置４０〜１５０、好ましくはアミノ酸位置４３〜１３４までの領域を挙げることができる。他の動物種においても、ヒトのＳＮＸ２７のアミノ酸配列との相同性を手掛かりにして、ヒトのＰＤＺドメインに相当する領域を該動物種のＰＤＺドメインと予測することは当業者にとって容易である。従って、ＡＢＣＡ１との相互作用に必要なＳＮＸ２７のＰＤＺドメイン（例えば、ヒト由来の場合、アミノ酸位置４３〜１３４）にＣｒｅ−ｌｏｘシステムなどを利用して変異（アミノ酸の置換、挿入又は欠失、あるいは、改変又は修飾）を導入することなどにより、ＳＮＸ２７のＡＢＣＡ１と相互作用する能力を低下させることができる。また、ＳＮＸ２７のＰＤＺドメインを修飾（例えば、リン酸化など）することによってもＡＢＣＡ１との相互作用を調節することが可能である。特に、ＳＮＸ２７のＰＤＺドメイン内のリン酸化部位がＡＢＣＡ１との相互作用に重要であると考えられていることから、このドメインに含まれるアミノ酸のリン酸化・脱リン酸化を介した相互作用の調節が可能である。
【００１９】
さらに、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害（又は抑制、低下）するために、抗体、アプタマー（ペプチド又は核酸）又は化合物を使用してもよい。これらの抗体、アプタマー又は化合物は、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を阻害（又は抑制、低下）するものであれば、ＳＮＸ２７又はＡＢＣＡ１のいずれかに結合しても、両方に結合してもよい。このような抗体、アプタマー又は化合物は、例えば、ＳＮＸ２７のＰＤＺドメイン及び／又はＡＢＣＡ１のＰＤＺ結合モチーフに結合するものなどを例示することができる。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を調節し、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を制御し、細胞内からのコレステロール排泄量を調整することである。特に、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害（又は抑制、低下）し、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を増強し、細胞内からのコレステロール排泄量を増大させることである。ＳＮＸ２７の細胞内発現量を低下させると、細胞膜上にＡＢＣＡ１が安定に維持され、ＡＢＣＡ１を介したａｐｏＡ−Ｉをアクセプターとするコレステロールの細胞外排泄量が増大する。ａｐｏＡ−ＩはＨＤＬの形成に関与することから、本発明により、血中ＨＤＬ濃度の上昇をも達成することができる。
【００２１】
また、本発明の実施形態には、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を調節し、細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定性を制御した細胞、及び、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を調節し、細胞内からのコレステロール排泄量を制御した細胞が含まれる。好ましくは、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害（又は抑制、低下）し、細胞膜上のＡＢＣＡ１が安定化した細胞、及び、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を阻害（又は抑制、低下）し、細胞膜上のＡＢＣＡ１が安定化し、細胞内からのコレステロール排泄量が増大した細胞である。
本発明により、細胞膜上のＡＢＣＡ１が安定化した、あるいは、コレステロール排泄量が増大した、分化多能性細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）を調製することもできる。このような分化多能性細胞は、所望の分化状態を有し、所望の細胞型を有する細胞へ分化誘導することができるため、種々の疾患の治療などに利用することができる。
【００２２】
また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの分化多能性細胞を介さずに直接所望の細胞型を有する細胞を調製することも可能である。このよう方法として、例えば、特定の転写因子を細胞中で発現させ、該細胞を所望の細胞型に変換する方法が報告されている（Zhou et al., Nature 455, 627-633, 2008）。本報告においては、３種の遺伝子（Ｎｇｎ３，Ｐｄｘ１，Ｍａｆａ）を膵外分泌細胞中で発現させ、β細胞に変換する方法が開示されている。また、任意の浸透化した細胞を、所望の細胞型を有する細胞から調製した間期細胞抽出物又は有糸分列細胞抽出物と共にインキュベートし、該任意の細胞を所望の細胞型の細胞へ変換する方法が報告されている（特開２００９−１４２２７８）。このような方法を利用することで、細胞膜上のＡＢＣＡ１が安定化した細胞、又は、コレステロール排泄量が増大した細胞を所望の細胞型の細胞に直接変換することができる。
【００２３】
本発明のさらなる実施形態は、ＳＮＸ２７又はその一部、ＡＢＣＡ１又はその一部及び試験物質を共存させ、適当な条件で（例えば、少なくとも、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１が相互作用する温度、塩濃度、ｐＨなどの条件）インキュベートすることで、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用に影響（例えば、阻害又は増強）を与えるような物質をスクリーニングする方法である。本発明のスクリーニングは、単離したＳＮＸ２７及びＡＢＣＡ１を使用した無細胞系を利用して行ってもよく、あるいは、両タンパク質を細胞膜上に発現している細胞を使用して行ってもよい。単離したＳＮＸ２７及びＡＢＣＡ１を使用してスクリーニングを行う場合には、ＳＮＸ２７及びＡＢＣＡ１の全長を使用してもよいが、その一部、例えば、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１が相互作用している領域（例えば、ＳＮＸ２７のＰＤＺドメイン、又は、ＡＢＣＡ１のＰＤＺ結合モチーフを含む領域など）のみを使用して、実施してもよい。試験物質が、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用に影響を与えているか否かの判断は、ＳＮＸ２７（又はその一部）、ＡＢＣＡ１（又はその一部）及び試験物質を混合した状態でインキュベートした後、ＳＮＸ２７（又はその一部）又はＡＢＣＡ１（又はその一部）のいずれか一方を特異的に単離したときに、他方が共に単離されてくるか否かを確認することにより行うことができる。例えば、ＳＮＸ２７（又はその一部）に対する特異的な抗体により、免疫沈降を行ったときに、ＡＢＣＡ１（又はその一部）が共沈した場合には、試験物質は、ＳＮＸ２７（又はその一部）とＡＢＣＡ１（又はその一部）との相互作用に影響を与えない（又は、相互作用を増強する）と判断することができ、ＡＢＣＡ１（又はその一部）が共沈しなかった場合には、試験物質は、ＳＮＸ２７（又はその一部）とＡＢＣＡ１（又はその一部）との相互作用を阻害（又は抑制、低下）すると判断することができる。
ここで得られたＳＮＸ２７（又はその一部）とＡＢＣＡ１（又はその一部）との相互作用を阻害する物質は、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質の試験物質として使用してもよい。
【００２４】
本発明には、さらに、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングする方法が含まれる。ＳＮＸ２７（又はその一部）及びＡＢＣＡ１（又はその一部）を細胞膜上に発現している細胞を試験物質の存在下でインキュベートした後、該細胞膜上のＡＢＣＡ１の存在量と、試験物質の非存在下でインキュベートした細胞の細胞膜上のＡＢＣＡ１の存在量とを比較し、試験物質の存在下でインキュベートした細胞の細胞膜上のＡＢＣＡ１の存在量が多い場合、該試験物質を細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質の候補とすることができる。本スクリーニングの過程で行うインキュベーションは、試験物質が細胞表面（より具体的には、細胞膜上に存在するＳＮＸ２７及び／又はＡＢＣＡ１）と接触して、ＳＮＸ２７（又はその一部）とＡＢＣＡ１（又はその一部）との相互作用に影響を与えるような条件であればいかなる条件であってもよく、例えば、本スクリーニングに使用する細胞の培養条件等を参考にして適宜決定することができる。例えば、３７℃前後の温度で、試験物質の存在下で、１０〜６０分程度インキュベートしてもよい。
細胞膜上に存在するＡＢＣＡ１量の測定は、細胞表面のタンパク質をビオチン化し、細胞を可溶化し、該調製液からストレプトアビジンなどでビオチン化されたタンパク質を調製し、該調製物中のＡＢＣＡ１を抗ＡＢＣＡ１抗体などで定量することで実施できる。その他、当該技術分野において公知の方法であればいずれの方法を使用してもよい。
ここに記載の細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングする方法に用いる試験物質として、上述のＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を阻害する物質をスクリーニングする方法により得られた物質を使用してもよい。
【００２５】
さらに本発明には、細胞内からのコレステロールの排泄を増大させる物質をスクリーニングする方法が含まれる。本スクリーニングの試験物質として、上述のＡＢＣＡ１を安定化する物質をスクリーニングする方法によって得られた物質を使用することができる。細胞膜上のＡＢＣＡ１が安定化すると、ａｐｏＡ（−Ｉ又は−ＩＩ）を介したコレステロールの細胞外への排泄量が増大する。従って、細胞膜上のＡＢＣＡ１を安定化する物質を試験物質とすれば、細胞内からのコレステロールの排泄を増大させる物質のスクリーニングを効率的に行うことが可能となる。細胞内からのコレステロールの排泄を増大させる物質のスクリーニングは、例えば、細胞膜上にＳＮＸ２７及びＡＢＣＡ１を発現している細胞に、該細胞にａｐｏＡ（−Ｉ又は−ＩＩ）を添加してインキュベートし、試験物質の存在下でさらにインキュベートした後、培養液に排泄されたコレステロールの量を試験物質非存在下の場合と比較することで、スクリーニングを実施することができる。コレステロールの排泄量は、例えば、放射性物質又は蛍光物質などで標識したコレステロールを予め細胞に取り込ませておき、標識の活性（放射活性や蛍光強度）を測定することで、評価することができる。
ａｐｏＡ（−Ｉ又は−ＩＩ）を介した細胞外へのコレステロールの排泄は、血中のＨＤＬ濃度を上昇させると考えられるので、本スクリーニング方法は、血中のＨＤＬ濃度を上昇させる物質のスクリーニングとしても使用することができる。
【００２６】
本発明において、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用を調節する対象となる細胞としては特に限定はされないが、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用の調節によって、他の細胞内現象（つまり、ＡＢＣＡ１の細胞膜上における安定性の変化、あるいは、コレステロールの細胞外排泄量の変化以外の細胞内現象）に影響が及ばない細胞が好ましい。このような細胞として、肝臓・マクロファージ・膵臓β細胞などを例示することができる。
【００２７】
以下に本発明を具体例によって説明するが、本発明の範囲はこれらの例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
１．ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の相互作用
ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用の有無について検討を行った。ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１を発現するＨｕｈ７細胞から細胞可溶液を調製し、この細胞可溶液に対し、抗ＡＢＣＡ１抗体（図１Ａ、左図）及び抗ＳＮＸ２７抗体（図１Ａ、右図）を用いて免疫沈降を行った。沈降産物を、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＡＢＣＡ１検出用）又は８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＮＸ２７検出用）にかけ、抗ＡＢＣＡ１抗体と抗ＳＮＸ２７抗体にてウェスタンブロッティングを行った。その結果、抗ＡＢＣＡ１抗体及び抗ＳＮＸ２７抗体による免疫沈降物中に、各々、ＡＢＣＡ１とＳＮＸ２７の存在がみとめられ、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１の結合が確認された。
次に、ＡＢＣＡ１とＳＮＸ２７の相互作用が、ＰＤＺ結合モチーフに依存しているかどうかを検討した。ＡＢＣＡ１をコードするＤＮＡ又はＰＤＺ結合モチーフを欠失させたＡＢＣＡ１Δ４（カルボキシル末端の４つのアミノ酸ＥＳＹＶが欠失）をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞から、細胞可溶液を調製し、この細胞可溶液に対しＳＮＸ２７抗体を用いて免疫沈降を行った。得られた免疫沈降産物はのうち、ＡＢＣＡ１検出用は６％、ＳＮＸ２７検出用は８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＡＢＣＡ１抗体、ＳＮＸ２７抗体にてウェスタンブロッティングを行った（図１Ｂ）。その結果、抗ＳＮＸ２７抗体で免疫沈降を行った沈降物中に、ＡＢＣＡ１の存在は確認されたが、ＡＢＣＡ１Δ４は確認されなかった。従って、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１は、ＡＢＣＡ１のＰＤＺ結合モチーフを介して相互作用すると考えられる。
さらに、ＳＮＸ２７によるＡＢＣＡ１発現量制御が、ＰＤＺ結合モチーフを介して行われているかどうかについて検討を行った。ＡＢＣＡ１をコードするＤＮＡ又はＰＤＺ結合モチーフを欠失させたＡＢＣＡ１Δ４をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、その２４時間後にＳＮＸ２７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後に細胞可溶液の調製を行った。調製したサンプルのうち、１５μｇを６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＡＢＣＡ１、抗ＳＮＸ２７抗体にてウェスタンブロッティングを行った。その結果、ＳＮＸ２７をノックダウンしてもＡＢＣＡ１の細胞内での総発現量は、ＰＤＺ結合モチーフの有無に関わらず影響を受けなかった（図１Ｃ）。
【００２９】
２．ＳＮＸ２７が細胞膜上のＡＢＣＡ１の発現に及ぼす影響
ＳＮＸ２７が細胞膜上のＡＢＣＡ１の安定化にどのような影響を及ぼしているのか検討を行った。まず、細胞に内在するＳＮＸ２７の発現を阻害するために、ＡＢＣＡ１を内因性に発現する肝由来培養細胞であるＨｕｈ７細胞に、ＳＮＸ２７遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡ（センス; 5’-GGUUGGCAUGGACAGUACGtt（配列番号１７）、アンチセンス; 5’-CGUACUGUCCAUGCCAACCtt（配列番号１８））をトランスフェクションし、ＳＮＸ２７のノックダウンを行った。細胞から細胞可溶液を調製しＳＮＸ２７のノックダウンを抗ＳＮＸ２７抗体によるウェスタンブロッティングで確認したところ、ほぼ完全にＳＮＸ２７の発現が阻害されていた（図２Ａ）。また、ＳＮＸ２７をノックダウンした細胞表面をビオチン化し、細胞可溶液を調製し、ストレプタビジンビーズでビオチン化タンパク質を単離したのち、この単離サンプルに対して抗ＡＢＣＡ１抗体でウェスタンブロッティングを行った。その結果、コントロールのｓｉＲＮＡで処理したサンプルについては、ＡＢＣＡ１をほとんど検出できなかったのに対し（図２Ｂ、ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＳＮＸ２７遺伝子に対するｓｉＲＮＡで処理したサンプルについては、ＡＢＣＡ１の存在を確認することができた（図２Ｂ、ＳＮＸ２７）。
【００３０】
３．ＡＢＣＡ１の細胞膜からの分解速度に対するＳＮＸ２７の影響
Ｈｕｈ７細胞にＳＮＸ２７遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、その７２時間後に細胞表面をビオチン化した。３７℃で０、２、４、８時間培養した後、細胞可溶液を調製し、ストレプタビジンビーズを用いて残存しているビオチン化タンパク質を単離した。単離したサンプルは、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＡＢＣＡ１抗体にてウェスタンブロッティングを行った（図３Ａ）。また、ウェスタンブロッティングの結果を定量化した結果を図３Ｂに示す。実験の結果、ＳＮＸ２７をノックダウンすると、ＡＢＣＡ１の細胞膜上からの消失速度が遅延することが明らかとなった。
【００３１】
４．ＳＮＸ２７がａｐｏＡ−Ｉをアクセプターとした細胞外へのコレステロール排泄に及ぼす影響
Ｈｕｈ７細胞にＡＢＣＡ１遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、２４時間後にＳＮＸ２７遺伝子を標的としたｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。さらに、その２４時間後、［３Ｈ］Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を加え２４時間培養した。その後、ａｐｏＡ−Ｉ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むメディウムで４時間培養し、メディウムの回収と可溶液の調製を行った。ａｐｏＡ−Ｉを介してメディウムに排泄されたコレステロールの量を評価したところ、ＳＮＸ２７遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた場合のコレステロール排泄量は、コントロールに比べて約２倍程度増加することが明らかとなった（図４）。この結果は、ＳＮＸ２７のノックダウンにより、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を阻害すると、ａｐｏＡ−Ｉを介したコレステロールの細胞外排泄が促進されることを示す。従って、ＳＮＸ２７のノックダウンなどにより、ＳＮＸ２７とＡＢＣＡ１との相互作用を阻害すれば、ＨＤＬの血中濃度を上昇させることも可能となる。
【００３２】
５．ＳＮＸ２７とオルガネラマーカーとの共染色
ＣＯＳ１細胞を固定、可溶化し、オルガネラマーカー抗体（図５Ａ：ＥＥＡ１、図５Ｂ：ＴＧＮ３８、図５Ｃ：ＬＡＭＰ−１）、ＳＮＸ２７（図５Ａ，Ｂ及びＣ、ＳＮＸ２７（中図））抗体にて免疫染色を行った。その結果、ＳＮＸ２７と前記オルガネラが細胞内において、一部、共局在していることが確認された（図５Ａ、Ｂ及びＣ、Ｍｅｒｇｅ（右図））。
【００３３】
６．ＳＮＸ２７とＧＦＰ融合Ｒａｂファミリータンパク質との共局在
ＣＯＳ１細胞にＲａｂ４（図６Ａ）、Ｒａｂ５（図６Ｂ）、Ｒａｂ７（図６Ｃ）及びＲａｂ１１（図６Ｄ）を組み込だＡｃＧＦＰ発現ベクターをトランスフェクションし、その４８時間後に細胞を固定、可溶化し、ＳＮＸ２７抗体にて免疫染色を行った。その結果、ＳＮＸ２７とＲａｂファミリータンパク質が細胞内において、一部、共局在していることが確認された（図６Ａ〜Ｄ、Ｍｅｒｇｅ（右図））。
【００３４】
７．ＳＮＸ２７と蛍光標識トランスフェリン（Ｔｆ）との共局在
ＣＯＳ１細胞をＡｌｅｘａ５９４−Ｔｆ（０．１ｍｇ／ｍＬ）で、０、２、１０、３０及び６０分間、３７℃で培養した（図７）。その後、抗ＳＮＸ２７抗体による免疫染色像（図７、ＳＮＸ２７（左図））、トランスフェリン（図７、Ｔｆ（中図））の局在を観察した。その結果、ＳＮＸ２７とトランスフェリンは、細胞内において、一部、共局在していることが確認された（図７、Ｍｅｒｇｅ（右図））。
【００３５】
８．細胞膜分画におけるＳＮＸ２７の発現の確認
ＳＮＸ２７が細胞膜上に発現していることを確認するために、ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜分画を、ビオチン化法を用いて調製した。調製した細胞膜画分サンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、抗ＳＮＸ２７、抗ＨＲＳ、抗ＥＥＡ１、抗ＭＲＰ４抗体にてウェスタンブロッティングを行ったところ、エンドソーム膜上に存在するＥＦＡ１とＨＲＳは検出されず、ＳＮＸ２７とＡＢＣトランスポーターであるＭＲＰ４が検出された。従って、ＳＮＸ２７は細胞膜上に存在することが確認された（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明は、ＡＢＣＡ１の細胞膜上における安定化方法、及びＡＢＣＡ１を細胞膜上に安定化する物質をスクリーニングする方法を提供し、コレステロールの代謝を調節し、血中ＨＤＬ濃度の上昇に有用な方法及び薬剤の開発に貢献するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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