(57)【要約】【課題】細菌感染、鼻輸送、鼻腔内コロニー形成およびＣＮＳ浸潤を低減または防止するように設計された組成物を提供すること。【解決手段】本明細書では、細菌感染（例えば肺炎球菌感染）、鼻輸送、鼻腔内コロニー形成および中枢神経系侵襲を低減または防止するように設計された組成物を提供する。肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸、またはノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸のいずれかの抗原部分を含む組成物も提供する。さらに、本明細書で開示した組成物を作成および使用する方法も提供する。特に、本明細書で教示した作用因子または組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体内で抗体を産生する方法も提供する。本明細書で教示した組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体における鼻輸送または肺炎球菌感染を低減および防止する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００３年１１月１０日に出願された米国仮出願第６０／５１８，７９９号の利益を主張し、米国仮出願第６０／５１８，７９９号は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０００２】
（謝辞）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの助成金ＤＣ  ０４９７６、ＡＩ  ２１５４８、およびＰ３０  ＤＫ  ５４７８１の下での、そしてＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓとの契約ＮＯ１  ＡＩ  ６５２９９の下での、政府支援によって実施された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ストレプトコッカス・ニューモニエは、肺、中枢神経系（ＣＮＳ）、中耳、および鼻道を含む複数の器官に感染しうる、かなり遍在性のヒト病原体である。これらの組織の感染は、気管支炎、肺炎、髄膜炎、および副鼻腔感染症などの様々な症状を引き起こす。Ｓ．ニューモニエは、ヒトの細菌性髄膜炎の主因であり、抗生剤処置にも関わらず、著しい死亡率および罹患率に関係している。非特許文献１。Ｓ．ニューモニエ髄膜炎は、永続的な神経性続発症を引き起こすことがある。先進国と開発途上国でのＳ．ニューモニエ髄膜炎の発生率は、１００，０００人に付きそれぞれ１〜２人および２０人である。非特許文献２。米国での肺炎球菌性髄膜炎の致死率は、約１８％である。非特許文献３。肺炎球菌性髄膜炎の最高の出現率は、１〜４歳の子供（すべての細菌性髄膜炎の３０％）で、続いて１５〜１９歳（１４％）および１〜１１月齢の乳児（１３％）で発生する。非特許文献２。高齢者も先進国と発展途上国の両方で、連鎖球菌性髄膜炎によって深刻に冒されている。非特許文献４；非特許文献５。
【０００４】
世界での肺炎球菌の主な貯蔵場所は、ヒト鼻輸送（ｎａｓａｌ  ｃａｒｒｉａｇｅ）である。感染の獲得は一般にキャリアからであり、感染は常に鼻輸送が先に起こる。上咽頭のコロニー形成は、肺炎球菌の下気道、副鼻腔、および中耳への蔓延の前提条件と見なされる。それゆえ輸送を防止したいずれの医学的介入も、処置を受けた人々における疾患のリスクを除去するだけではなく、集団免疫ももたらし、コミュニティにおける未処置の構成員の感染リスクすら低下させる。Ｓ．ニューモニエは重要なヒト病原体であるが、Ｓ．ニューモニエが鼻輸送または髄膜炎を引き起こす機構に関しては比較的わずかな事しか知られていない。
【０００５】
ノイラミニダーゼが鼻道に独自の毒性因子であることを示唆する多少のデータが存在する。そのような観察の１つは、その親菌株よりも上咽頭から速く除去される、ＮａｎＡ欠損Ｓ．ニューモニエ菌株Ｄ３９の研究によるものである。非特許文献６。ノイラミニダーゼは、宿主表面および体液中の広範囲に亘る糖脂質、糖タンパク質、およびオリゴ糖から末端シアル酸残基を開裂させる。肺炎球菌性髄膜炎患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中の遊離シアル酸のレベル上昇は、予後不良に関連している。非特許文献７。ヒトにおけるＳ．ニューモニエ毒性に対するこの酵素の重要性は、Ｓ．ニューモニエそれぞれの新たな臨床単離物がノイラミニダーゼ活性を有する、２つの独立した研究の成果によってさらに説明される。非特許文献７；非特許文献８。その上、その毒性を上昇させることの多い肺炎球菌の単離物のマウス継代は、ノイラミニダーゼ活性の２〜５倍の上昇を引き起こすことも報告されている。非特許文献９。肺炎球菌性Ｃポリサッカライドは、テイコ酸としても既知であり、リポテイコ酸としても既知である肺炎球菌性Ｆ抗原のポリサッカライド部分と構造的に同一である。非特許文献１０。これらの分子は、グラム陽性細菌の中でＳ．ニューモニエ独自の特徴である。これらの分子の主要抗原決定基は、ホスホリルコリン（ＰＣ）残基であり、ＰＣに対するＡｂｓは、腹腔内、静脈内、または経鼻肺炎球菌性攻撃に対して防御性である。非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４。しかしながら、これらの研究のすべてが血清によって投薬された全身感染に対する保護を評価したときに、これらのＡｂｓが鼻腔内コロニー形成を防御する能力に関する情報は得られていない。しかしながら表面ホスホコリン残基は、呼吸細菌の表面でよく見られる。非特許文献１５。
Ｓ．ニューモニエが鼻輸送と、それに続く疾患を引き起こす機構は、比較的知られていない。今日までいずれの研究も、鼻輸送を低減または防止する機構を確定していない。上咽頭のコロニー形成は、下気道、副鼻腔、全身、および脳への肺炎球菌の蔓延への前提条件と見なされており、当業界で必要なものは、粘膜免疫を初期肺炎球菌性コロニー形成の部位に供給する手段である。上咽頭での初期肺炎球菌性コロニー形成の防止は、鼻輸送を防止し、個人間でのＳ．ニューモニエの蔓延を低減するであろう。その上、上咽頭の粘膜表面へ免疫を提供することは、Ｓ．ニューモニエによって続いて引き起こされる疾患を防止または低減する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｑｕａｇｌｉａｒｅｌｌｏら，「Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．」１９９２年，第３２７巻：８６９−８７２
【非特許文献２】Ａｎｏｎ，「ＣＤＳＣ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ」ＰＨＬＳ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００年
【非特許文献３】Ｆｅｄｓｏｎら，「Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．」１９９４年，第１５４巻：２５３１−２５３５
【非特許文献４】Ｂｕｔｌｅｒら，「Ｄｒｕｇｓ  Ａｇｉｎｇ」１９９９年，第１５巻（補遺１）：１１−１９
【非特許文献５】Ｆｅｄｓｏｎら，「Ｖａｃｃｉｎｅ」１９９９年，第１７巻補遺１：Ｓ  １１−１８
【非特許文献６】Ｔｏｎｇら，「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」２００２年，第６８巻：９２１−９２４
【非特許文献７】Ｏ’Ｔｏｏｌｅら，「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」１９７１年，第５０巻：９７９−９８５
【非特許文献８】Ｋｅｌｌｙら，「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」１９６７年，第９４巻：２７２−２７３
【非特許文献９】Ｖｉｓｈｎｉａｋｏｖａら，「Ｚｈｕｒｎａｌ  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｉ  ｉ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｉ」１９９２年，９−１０：２６−９
【非特許文献１０】Ｆｉｓｃｈｅｒら，「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ」１９９３年，第２１５巻：８５１−８５７
【非特許文献１１】Ｂｒｉｌｅｓら，「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」１９８４年，第１４巻：１０２７−１０３０
【非特許文献１２】Ｂｒｉｌｅｓら，「Ｎａｔｕｒｅ」１９８１年，第２９４巻：８８−９０
【非特許文献１３】Ｙｏｔｈｅｒら，「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」１９８２年，第３６巻：１８４−１８８
【非特許文献１４】Ｂｒｉｌｅｓら，「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」１９８４年，第１巻：３０５−３０９
【非特許文献１５】Ｌｙｓｅｎｋｏら，「Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．」２０００年，第６８巻：１６６４−７１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本明細書では、細菌感染（たとえば肺炎球菌感染）、鼻輸送、鼻腔内コロニー形成、およびＣＮＳ浸潤を低減または防止するように設計された組成物を提供する。必要に応じて、組成物は、粘膜投与のために設計されている。本明細書では、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、肺炎球菌性リポテイコ酸（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、これらのいずれか１つの抗原部分およびこれらの無毒化作用因子を含有する組成物が提供される。
【０００８】
肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸、またはこれらのいずれか１つの抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物も提供される。必要に応じて組成物は、肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸またはこれらのいずれか１つの抗原部分のいずれかの組合せを含むことができる。無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸、またはこれらのいずれか１つの抗原部分はもちろんのこと、無毒化作用因子を含有する組成物および作用因子を使用する方法も提供される。
【０００９】
被験体に作用因子を含む組成物を投与する工程を含む、被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸、あるいは肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、または肺炎球菌性リポテイコ酸のいずれか１つの抗原部分に対する抗体を産生させる方法も提供される。必要に応じて組成物は、粘膜表面への投与または全身投与に適している。
【００１０】
肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸、またはこれらのいずれか１つの抗原部分に対する抗体を、薬学的に受容可能なキャリアと共に含む組成物もさらに提供される。必要に応じて組成物は、粘膜表面への投与または全身投与に適している。
【００１１】
被験体の鼻粘膜に本明細書で教示した組成物を接触させる工程を含む、被験体において鼻輸送、鼻腔内コロニー形成、または細菌感染（たとえば肺炎球菌感染）を低減または防止する方法がさらに提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目２）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ６０％を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目３）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ７０％を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目４）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ８０％を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目５）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ９０％を有する、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目６）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも７％の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目７）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも７％の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ６０％を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目８）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも７％の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ７０％を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目９）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも７％の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ８０％を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１０）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの天然に存在するアミノ酸の少なくとも７％の欠失を含み、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ９０％を示す、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１１）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの少なくとも５個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１２）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの少なくとも１０個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１３）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼの少なくとも１５個のＮ末端アミノ酸の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１４）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのＣ末端アミノ酸の少なくとも１０％の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１５）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのＣ末端アミノ酸の少なくとも２０％の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１６）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのＣ末端アミノ酸の少なくとも３０％の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１７）
ノイラミニダーゼが、非無毒化ノイラミニダーゼのＣ末端アミノ酸の少なくとも３５％の欠失を含む、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分。
（項目１８）
無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目１９）
アジュバントをさらに含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を投与する工程
を包含する、方法。
（項目２１）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を投与する工程
を包含する、方法。
（項目２２）
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を投与する工程
を包含する、方法。
（項目２３）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減または防止する方法であって、該方法は、
該鼻輸送を低減または防止する条件下で、該被験体に肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原性フラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
（項目２８）
被験体において肺炎球菌感染を低減または防止する方法であって、該方法は、
該感染を低減または防止する条件下で、該被験体に肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原性フラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
（項目２９）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
被験体において肺炎球菌感染を低減または防止する方法であって、該方法は、
該感染を低減または防止する条件下で、該被験体に肺炎球菌ノイラミニダーゼ抗体またはそのフラグメントを投与する工程
を包含し、該投与工程は、
該被験体の粘膜表面に該抗体を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目３４）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
（項目３９）
前記組成物が鼻スプレーである、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記組成物がネブライザ溶液である、項目３８に記載の組成物。
（項目４１）
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目３８に記載の組成物。
（項目４２）
項目３８に記載の組成物を含む、容器。
（項目４３）
前記容器が鼻スプレー器である、項目４２に記載の容器。
（項目４４）
前記容器がネブライザである、項目４２に記載の容器。
（項目４５）
前記容器が吸入器である、項目４２に記載の容器。
（項目４６）
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目４７）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目４８）
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目４９）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目４８に記載の方法。
（項目５３）
肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸からのホスホコリンまたはその抗原部分、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
（項目５４）
前記組成物が鼻スプレーである、項目５３に記載の組成物。
（項目５５）
前記組成物がネブライザ溶液である、項目５３に記載の組成物。
（項目５６）
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目５３に記載の組成物。
（項目５７）
項目５３に記載の組成物を含む、容器。
（項目５８）
前記容器が鼻スプレー器である、項目５７に記載の容器。
（項目５９）
前記容器がネブライザである、項目５７に記載の容器。
（項目６０）
前記容器が吸入器である、項目５７に記載の容器。
（項目６１）
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目５３に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目６２）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目５３に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目６３）
被験体において肺炎球菌感染を低減または防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目５３に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目６４）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目６３に記載の方法。
（項目６７）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目６３に記載の方法。
（項目６８）
肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分、肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸からのホスホコリンまたはその抗原部分、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
（項目６９）
前記組成物が鼻スプレーである、項目６８の組成物。
（項目７０）
前記組成物がネブライザ溶液である、項目６８の組成物。
（項目７１）
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目６８の組成物。
（項目７２）
項目６８に記載の組成物を含む、容器。
（項目７３）
前記容器が鼻スプレー器である、項目７２に記載の容器。
（項目７４）
前記容器がネブライザである、項目７２に記載の容器。
（項目７５）
前記容器が吸入器である、項目７２に記載の容器。
（項目７６）
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異性な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目６８に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目７７）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目６８に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目７８）
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目６８に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目７９）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目７８に記載の方法。
（項目８３）
肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸の非ホスホコリン抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
（項目８４）
前記組成物が鼻スプレーである、項目８３に記載の組成物。
（項目８５）
前記組成物がネブライザ溶液である、項目８３に記載の組成物。
（項目８６）
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目８３に記載の組成物。
（項目８７）
項目８３に記載の組成物を含む、容器。
（項目８８）
前記容器が鼻スプレー器である、項目８７に記載の容器。
（項目８９）
前記容器がネブライザである、項目８７に記載の容器。
（項目９０）
前記容器が吸入器である、項目８７に記載の容器。
（項目９１）
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目８３に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目９２）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目８３に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目９３）
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目８３に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目９４）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目９３に記載の方法。
（項目９７）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目９３に記載の方法。
（項目９８）
肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはその抗原部分、肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸の非ホスホコリン抗原部分、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、該組成物は、粘膜表面への投与に適切である、組成物。
（項目９９）
前記組成物が鼻スプレーである、項目９８に記載の組成物。
（項目１００）
前記組成物がネブライザ溶液である、項目９８に記載の組成物。
（項目１０１）
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目９８に記載の組成物。
（項目１０２）
項目９８に記載の組成物を含む、容器。
（項目１０３）
前記容器が鼻スプレー器である、項目１０２に記載の容器。
（項目１０４）
前記容器がネブライザである、項目１０２に記載の容器。
（項目１０５）
前記容器が吸入器である、項目１０２に記載の容器。
（項目１０６）
被験体において肺炎球菌ノイラミニダーゼに特異的な抗体を産生する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目９８に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目１０７）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体の鼻粘膜に項目９８に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目１０８）
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体の粘膜表面に項目９８に記載の組成物を接触させる工程
を包含する、方法。
（項目１０９）
前記肺炎球菌感染が髄膜炎である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記肺炎球菌感染が中耳炎である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１１）
前記肺炎球菌感染が肺炎である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１２）
前記肺炎球菌感染が溶血性尿毒症である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１３）
ホスホコリン抗体またはそのフラグメントおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目１１４）
前記組成物が粘膜表面への投与に適切である、項目１１３に記載の組成物。
（項目１１５）
前記組成物が鼻スプレーである、項目１１３に記載の組成物。
（項目１１６）
前記組成物がネブライザ溶液である、項目１１３に記載の組成物。
（項目１１７）
前記組成物がエアゾール吸入薬である、項目１１３に記載の組成物。
（項目１１８）
項目１１３に記載の組成物を含む、容器。
（項目１１９）
前記容器が鼻スプレー器である、項目１１８に記載の容器。
（項目１２０）
前記容器がネブライザである、項目１１８に記載の容器。
（項目１２１）
前記容器が吸入器である、項目１１８に記載の容器。
（項目１２２）
被験体において肺炎球菌の鼻輸送を低減する方法であって、該方法は、
該被験体にホスホコリン抗体またはそのフラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
（項目１２３）
前記投与が、前記被験体の鼻粘膜に前記抗体またはそのフラグメントを接触させる工程を包含する、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
被験体において肺炎球菌感染を防止する方法であって、該方法は、
該被験体にホスホコリン抗体またはそのフラグメントを投与する工程
を包含する、方法。
（項目１２５）
前記投与が、前記被験体の鼻粘膜に前記抗体またはそのフラグメントを接触させる工程を包含する、項目１２４に記載の方法。
【００１２】
さらなる利点は、以下に続く説明で一部が述べられ、一部は説明から明らかになるか、または以下で述べる態様の実施によって知られるであろう。以下で述べる利点は、添付請求項で特に指摘される要素および組合せによって実現および達成されるであろう。上述の一般的な説明および以下の詳細な説明はどちらも例示および説明のためだけであり、制限的でないことが理解されるべきである。
本明細書に含まれ、その一部を構成する添付図面は、以下で述べる複数の態様を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｘｉｄマウスへのＳ．ニューモニエの非カプセル化Ｒ３６Ａ菌株または毒性ＥＦ３０３０菌株のどちらかの３Ｘ１０６ＣＦＵの経鼻送達を示す。神経組織ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、脳組織およびリンパ系組織（ＮＡＬＴ、ＣＬＮおよび肺）を鼻腔内攻撃の第１日〜第４日後に収集して、切り刻み、生肺炎球菌の存在を分析した。論理コロニー形成単位（ＣＦＵ）の平均＋１標準誤差（ＳＥ）が示されている。Ｙ軸の０値は、検出可能なＣＦＵの非存在を表す。１グループ当たり５匹のマウスの平均ＣＦＵ＋ＳＥが示され、３つの異なる実験を表している。
【図２Ａ】鼻腔内攻撃後のＳ．ニューモニエ菌株ＥＦ３０３０  ＣＦＵの器官分布の動力学を示す。ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、脳、血液、ＮＷ、ＮＡＬＴ、ＣＬＮ、および肺組織を４日、１１日、１８日、２５日、および３９日に収集して、Ｓ．ニューモニエの存在を分析した。Ｓ．ニューモニエ３Ｘ１０６ＣＦＵの分割量は、鼻道のコロニー形成と、それに続くＯＢの感染を生じた。Ｙ軸の０値は、検出可能なＣＦＵの非存在を表す。３つの独立した実験の平均ＣＦＵ＋ＳＥを示す。各時点は、マウス５匹を表す第３９日を除いて、マウス１０匹を表す。
【図２Ｂ】鼻腔内攻撃後のＳ．ニューモニエ菌株ＥＦ３０３０  ＣＦＵの器官分布の動力学を示す。ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、脳、血液、ＮＷ、ＮＡＬＴ、ＣＬＮ、および肺組織を４日、１１日、１８日、２５日、および３９日に収集して、Ｓ．ニューモニエの存在を分析した。Ｓ．ニューモニエ３Ｘ１０６ＣＦＵの分割量は、鼻道のコロニー形成と、それに続くＯＢの感染を生じた。Ｙ軸の０値は、検出可能なＣＦＵの非存在を表す。３つの独立した実験の平均ＣＦＵ＋ＳＥを示す。各時点は、マウス５匹を表す第３９日を除いて、マウス１０匹を表す。
【図３Ａ】ＧＬＳによる予備インキュベーション後のＳ．ニューモニエ菌株ＥＦ３０３０の分布を示す。Ｓ．ニューモニエの分割量（３Ｘ１０７ＣＦＵ）を、鼻への利用前に、アシアロ−ＧＭ１（ａ−ＧＭ１）２０μｇまたは混合ＧＬＳ（ＭＧ）１２５μｇを用いて３０分間インキュベートした。ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、脳およびＮＷ、ＮＡＬＴおよび肺を４日後に収集して、Ｓ．ニューモニエの数を分析した。Ｙ軸の０値は、検出可能なＣＦＵの非存在を表す。マウス５匹の平均＋１ＳＥを示し、以下の統計解析からＰ値を得た。データは２つの独立した実験を表している。
【図３Ｂ】ＧＬＳによる予備インキュベーション後のＳ．ニューモニエ菌株ＥＦ３０３０の分布を示す。Ｓ．ニューモニエの分割量（３Ｘ１０７ＣＦＵ）を、鼻への利用前に、アシアロ−ＧＭ１（ａ−ＧＭ１）２０μｇまたは混合ＧＬＳ（ＭＧ）１２５μｇを用いて３０分間インキュベートした。ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、脳およびＮＷ、ＮＡＬＴおよび肺を４日後に収集して、Ｓ．ニューモニエの数を分析した。Ｙ軸の０値は、検出可能なＣＦＵの非存在を表す。マウス５匹の平均＋１ＳＥを示し、以下の統計解析からＰ値を得た。データは２つの独立した実験を表している。
【図４−１】鼻腔内攻撃後のＯＢ中のＳ．ニューモニエのＴＩＧＲ４菌株の検出を示す。５Ｘ１０５ＣＦＵの分割量を鼻腔内投与し、血液、ＮＷ、ＯＮ／Ｅ、ＯＢおよび脳組織を攻撃１週間後にコロニー形成について分析した（パネルＡおよびＢ）。これらの組織（ＤＮＡ  １０μｇ）もニューモリシン遺伝子の存在についてＰＣＲによって分析した（パネルＣ）。加えてコントロール（Ｄ）またはＳ．ニューモニエ攻撃マウスのＯＢ中のＳ．ニューモニエを、ＰｓｐＡ特異性Ａｂｓを用いた免疫蛍光によって描出した（パネルＥおよびＦ）。平均＋１ＳＥを示す。データは３つの独立した実験を表している。
【図４−２】鼻腔内攻撃後のＯＢ中のＳ．ニューモニエのＴＩＧＲ４菌株の検出を示す。５Ｘ１０５ＣＦＵの分割量を鼻腔内投与し、血液、ＮＷ、ＯＮ／Ｅ、ＯＢおよび脳組織を攻撃１週間後にコロニー形成について分析した（パネルＡおよびＢ）。これらの組織（ＤＮＡ  １０μｇ）もニューモリシン遺伝子の存在についてＰＣＲによって分析した（パネルＣ）。加えてコントロール（Ｄ）またはＳ．ニューモニエ攻撃マウスのＯＢ中のＳ．ニューモニエを、ＰｓｐＡ特異性Ａｂｓを用いた免疫蛍光によって描出した（パネルＥおよびＦ）。平均＋１ＳＥを示す。データは３つの独立した実験を表している。
【図５】分泌ＮａｎＡ、ＴＩＧＲ４の、および細胞壁への結合のためのＬＰＸＴＧ（配列番号１４）モチーフを有するＲ６（２型）のモチーフにおける比較を示す。ＴＩＧＲ４遺伝子は、ＬＰＥＴＧ（配列番号１３）モチーフをコード化する配列の前に停止コドンを含む。このモチーフがないと、ＮａｎＡはＴＩＧＲ４によって環境中へ分泌される。
【図６Ａ】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＴＩＧＲ４（黒四角）またはＮａｎＡ同系変異体ＴＩＧＲ４／ｎａｎＡ−（○）によって鼻腔内感染させたＣＢＡ／Ｎマウスの鼻洗浄液中の生肺炎球菌の動力学を示す。各点は、各マウスの鼻洗浄液１ｍｌ当たりの細菌総数を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ＴＩＧＲ４を接種したマウスと比較。
【図６Ｂ】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＴＩＧＲ４（黒四角）またはＮａｎＡ同系変異体ＴＩＧＲ４／ｎａｎＡ−（○）によって鼻腔内感染させたＣＢＡ／Ｎマウスでの鼻腔内コロニー形成動力学を示す。各点は、各マウスの組織１グラム当たりの細菌総数を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ＴＩＧＲ４を接種したマウスと比較。
【図６Ｃ】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＴＩＧＲ４（黒四角）またはＴＩＧＲ４／ｎａｎＡ−（○）によって鼻腔内感染させたＣＢＡ／Ｎマウスの嗅球におけるＣＦＵの動力学を示す。各点は、各マウスの組織１グラム当たりの細菌総数を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ＴＩＧＲ４を接種したマウスと比較。
【図７Ａ】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＥＦ３０３０（黒四角）またはＥＦ３０３０／ｎａｎＡ−（○）によって鼻腔内感染させたＣＢＡ／Ｎマウスの鼻腔内コロニー形成動力学を示す。各点は、各マウスの鼻洗浄液１ｍｌ当たりの細菌総数を表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ＥＦ３０３０を接種したマウスと比較。
【図７Ｂ】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＥＦ３０３０（黒四角）またはＥＦ３０３０／ｎａｎＡ−（○）によって鼻腔内感染させたＣＢＡ／Ｎマウスの鼻腔内コロニー形成動力学を示す。各点は、各マウスの組織１グラム当たりの細菌総数を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ＥＦ３０３０を接種したマウスと比較。
【図７Ｃ】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＥＦ３０３０（黒四角）またはＮａｎＡ同系変異体ＥＦ３０３０／ｎａｎＡ−（○）によって鼻腔内感染させたＣＢＡ／Ｎマウスの鼻腔内コロニー形成動力学を示す。各点は、各マウスの組織１グラム当たりの細菌総数を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ＥＦ３０３０を接種したマウスと比較。野生種および変異体データをすべての時点でプールすると、ＥＦ３０３０とＥＦ３０３０  ＮａｎＢ−との比較はＰ＝０．００１であった。
【図８】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＴＩＧＲ４（黒四角）またはＴＩＧＲ４／ｎａｎＢ−（○）によって鼻腔内感染させた接種４日後のＣＢＡ／Ｎマウスの鼻腔内コロニー形成動力学を示す。各点は、各マウスの鼻洗浄液１ｍｌまたは組織１グラム当たりの細菌の総数を示す。いずれの場合も、ＴＩＧＲ４とＴＩＧＲ４／ｎａｎＢ−との差は統計的に有意でなかった。
【図９】Ｓ．ニューモニエ親菌株ＴＩＧＲ４（黒四角）、ＴＩＧＲ４／ｎａｎＡ−（○）またはＴＩＧＲ４／ＡＢ−によって鼻腔内感染させた接種４日後のＣＢＡ／Ｎマウスの鼻腔内コロニー形成動力学を示す。各点は、各マウスの鼻洗浄液１ｍｌまたは組織１グラム当たりの細菌の総数を示す。いずれの場合も、ＴＩＧＲ４／ｎａｎＡ−とダブル変異体ＴＩＧＲ４／ｎａｎＡＢ−との差は統計的に有意でなかった。
【図１０】鼻腔内攻撃後の、抗ホスホコリン特異性モノクローナル抗体によるＳ．ニューモニエの鼻腔内コロニー形成の阻害を示す。鼻腔内攻撃後の抗ＰＣ特異性ｍＡｂｓによるＳ．ニューモニエの鼻腔内コロニー形成の阻害。総量１Ｘ１０６ＣＦＵのＴＩＧＲ４菌株をＩｇＧ３サブクラスまたはＩｇＭアイソタイプのどちらかの抗ＰＣｍＡｂｓ  ５μｇを用いてインキュベートした。鼻孔ごとに総量５μｇを投与した。利用９および１２時間後の鼻洗浄液５００μｌ中のＣＦＵを示す。１グループ当たりマウス５匹の平均＋ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（詳細な説明）
本化合物，組成物，物品、器具、および／または方法を開示および説明する前に、以下で述べる態様が、具体的な合成方法または具体的な投与方法に制限されず、そのためもちろん変化することが理解されるべきである。本明細書で使用する用語が、特定の態様のみを説明する目的で使用され、制限的でないことも理解されるべきである。
【００１５】
明細書および添付請求項で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途規定しない限り、複数形指示対象も含むことに注意する必要がある。それゆえたとえば、「抗原性フラグメント」への言及は、抗原性フラグメントの混合物を含み、「製薬的キャリア」または「アジュバント」への言及は、２つ以上のそのようなキャリアまたはアジュバントの混合物を含むなどである。
【００１６】
全体を通じて使用するように、「被験体」は個体を意味する。それゆえ「被験体」は、たとえばネコ、イヌなどの飼い慣らされた動物、家畜（たとえば畜牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験用動物（たとえばマウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および鳥類を含むことができる。１つの態様において、被験体は、霊長類またはヒトなどの哺乳類である。
【００１７】
「任意の」または「必要に応じて」は、続いて説明される事象または状況が起こりうる、または起こらないことを、そして説明が事象または状況が起こる例および起こらない例を含むことを意味する。たとえば、「必要に応じて、組成物は組合せを含むことができる」という表現は、説明が組合せおよび組合せの非存在（すなわち組合せの個々の構成要素）を含むように、組成物が異なる分子の組合せを含む、または組合せを含まないことを意味する。
【００１８】
範囲は本明細書では、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表現される。そのような範囲が表現されるとき、別の態様は、一方の特定の値から、および／または他方の特定の値までを含む。同様に、値が先行する「約」を用いて概数として表現されるとき、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。各範囲の終点は、他方の終点に関連しても、および他方の終点から独立しても重要であることがさらに理解されるであろう。
【００１９】
本明細書では、細菌感染（たとえば肺炎球菌感染）、鼻輸送、鼻腔内コロニー形成、およびＣＮＳ浸潤を低減または防止するように設計された組成物および方法を提供する。Ｓ．ニューモニエは、Ｃポリサッカライド−ガングリオシド相互作用によって上皮バリアを通過して、続いて上皮細胞中へエンドサイトーシスすることによって、一部は鼻道をコロニー形成する。Ｃポリサッカライドは、ガングリオシド中の末端または内部ＧａＩＮＡｃβ１−４Ｇａｌ配列への結合を介して、アシアロ−ＧＭ１、アシアロ−ＧＭ２、およびフコシル−アシアロ−ＧＭ１に結合する。ヒト肺を除いて細胞原形質膜中のこれらのアシアロガングリオシドは通常は少ないが、Ｓ．ニューモニエは、２つのノイラミニダーゼＮａｎＡおよびＮａｎＢを有し（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８５４−４８６０）、これはそれぞれα２，３−およびα２，６結合Ｎ−アセチルノイラミン酸をガラクトースへ、そしてα２，６−結合をＮ−アセチル−ガラクトサミンへ開裂できる。Ｓｃａｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｅｎｚｙｍｅ  ４１：１４３−１５０。ガングリオシドのシアル酸残基は、ガラクトースに結合したα２，３である。Ｓ．ニューモニエのノイラミニダーゼは、すべてのモノシアロガングリオシドに存在する末端シアル酸残基、およびジ−およびトリ−シアロガングリオシドで見られるように、ガラクトース結合した複数のシアル酸残基を除去する。それゆえそれらは、最も一般的な哺乳類細胞表面ガングリオシド中のＧａＩＮＡｃβ１−４Ｇａ１配列を露出できるはずである。これらの残基は、細胞表面上の推定Ｃポリサッカライド結合部位である。通常はさらに細胞壁に結合しているそのＮａｎＡ、および分泌されると考えられるＮａｎＢを使用して、Ｓ．ニューモニエは、気道の上皮細胞上にその独自の結合部位を生成する。それゆえ肺炎球菌性Ｃポリサッカライドは、アシアロガングリオシド、特にアシアロ−ＧＭ１に結合し、かなり豊富なＧＭ１をアシアロ−ＧＭ１に変換できるノイラミニダーゼは、ＣポリサッカライドのためにＯＮ／Ｅ上に豊富な結合部位を作成する。本機構は、鼻輸送を促進し、鼻嗅神経および鼻甲介を被覆する上皮（ＯＮ／Ｅ）、嗅球（ＯＢ）を介してＳ．ニューモニエのＣＮＳへのアクセスを提供する。同様に、中耳炎およびＳ．ニューモニエを含む他の感染症は、中耳に分布する神経を介してＣＮＳへのアクセスを同様に得ることができる。Ｓ．ニューモニエに加えて他の細菌は、匹敵するノイラミニダーゼを有し、それゆえ同じ機構が他の細菌でも同様に発生する。それゆえ本明細書では、各種の細菌におけるこの機構を標的とする組成物および方法を開示する。本明細書で教示される作用因子、組成物、および方法は、輸送を低減させ、ＣＮＳ浸潤を防止するために本機構を妨害することに関する。
【００２０】
必要に応じて組成物は、粘膜投与用に設計される。たとえば本明細書では、肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸またはこれらのいずれか１つの抗原部分および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物であって、粘膜表面への投与に適した組成物が提供される。必要に応じて組成物は、肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸またはこれらのいずれか１つの抗原部分のいずれかの組合せを含むことができる。
【００２１】
必要に応じて組成物は、エアゾール、鼻腔用ミスト、鼻スプレー、点鼻薬、ネブライザ溶液、エアゾール吸入薬、坐剤の形、または粘膜投与（経口投与を含む）に適したいずれかの形である。必要に応じて組成物は、送達のために微小球、またはリポソームに入れることができる。「粘膜表面への投与」とは、呼吸系、胃腸系、または泌尿生殖器系を含むいずれかの粘膜表面への投与を意味する。粘膜表面の例は、これに限定されるわけではないが、鼻腔（嗅覚神経上皮を含む）、上咽頭、直腸、膣、咽頭、口、エウスタキー管、気管、気管支および他の気道、および腸粘膜を含む。
【００２２】
粘膜表面への投与では、粘膜アジュバントが使用できる。アジュバントは、本発明の組成物と同時に、その直前に、またはその後に投与できる。必要に応じて、組成物はさらにアジュバントを含む。粘膜アジュバント処方物はたとえば、粘膜誘導部位を標的とする作用因子を含む。アジュバントは必要に応じて、これに限定されるわけではないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、血管由来因子、アポトーシス阻害物質、およびその組合せを含む群より選択される。サイトカインがアジュバントして選択されるとき、サイトカインはこれに限定されるわけではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−１γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１８を含むインターロイキン；形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）；またはアジュバント活性を有する他のサイトカインを含む群より選択される。サイトカインの部分、あるいはアジュバント活性または他の生物活性を有するサイトカインの変異体またはミミック（またはその組合せ）も、本発明の組成物および方法で使用できる。
【００２３】
ケモカインがアジュバントとして選択されるとき、ケモカインは必要に応じて、これに限定されるわけではないが、リンホタクチン、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＡＲＣ、ＰＡＲＣ、ＭＤＣ、ＴＡＲＣ、ＳＬＣおよびＦＫＮを含む群より選択される。アポトーシス阻害物質がアジュバントとして選択される場合、アポトーシス阻害物質は必要に応じて、これに限定されるわけではないが、カスパーゼ−８の阻害物質、およびその組合せを含む群より選択される。血管由来因子がアジュバントとして選択される場合、血管由来因子は必要に応じて、これに限定されるわけではないが、塩基性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ヒアルロナン（ＨＡ）フラグメント、およびその組合せを含む群より選択される。実際に、プラス（＋）およびマイナス（−）血管由来因子をアジュバントとして選択できる。
【００２４】
本発明の実質的に非毒性の生物活性粘膜アジュバントの他の例は、ホルモン、酵素、成長因子、またはその生物活性部分を含む。そのようなホルモン、酵素、成長因子、またはその生物活性部分は、たとえばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、または鳥類起源であり、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、プロラクチン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、ソマトトロピン（成長ホルモン）またはインスリン、あるいはレセプタが免疫系の細胞上で発現される他のホルモンまたは成長因子でありうる。
【００２５】
粘膜投与のためのアジュバントは、細菌性毒素、たとえばコレラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．コリ易熱性毒素（ＬＴ）、クロストリジウムディフィシル毒素Ａおよび百日咳毒素（ＰＴ）、あるいはその組合せ、サブユニット、トキソイド、キメラ、または変異体も含む。たとえば未変性コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製調製物が使用できる。フラグメント、ホモログ、誘導体、およびこれらの毒素のいずれかへの融合物も、それらがアジュバント活性を保持するという条件ならば適切である。好ましくは低下した毒性を有する変異体が使用される。適切な変異体は、たとえばＷＯ  ９５／１７２１１（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ  ＣＴ変異体）、ＷＯ  ９６／６６２７（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ  ＬＴ変異体）、およびＷＯ  ９５／３４３２３（Ａｒｇ−９−ＬｙｓおよびＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ  ＰＴ変異体）に述べられている。本発明の方法および組成物で使用できる、その他のＬＴ変異体はたとえば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−１１０−Ａｓｐ、およびＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ変異体を含む。他のアジュバント、たとえばＲＨ３−リガンド；ＣｐＧ−モチーフオリゴヌクレオチド；たとえばＥ．コリ、サルモネラ・ミネソタ、サルモネラ・チフィムリウム、またはシゲラ・フレキシネリの細菌性モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬＡ）；サポニン（たとえばＱＳ２１）、またはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）微小球も粘膜投与で使用できる。考えられる他の粘膜アジュバントは、デフェンシンおよびオリゴヌクレオチドを含有するＣｐＧモチーフである。
【００２６】
本明細書を通じて使用するように、「薬学的に受容可能なキャリア」は、生物学的にまたはそれ以外で望ましくないわけではない材料を意味し、すなわち該材料は、望ましくない生物的影響を引き起こすことなく、またはそれが含有される薬学的組成物の他の成分のいずれかと有害な方式で相互作用することなく、選択した化合物と共に個体に投与できる。
【００２７】
本明細書で述べる組成物のいずれも、薬学的に受容可能なキャリア共に治療に使用できる。本明細書で述べる化合物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合せて、１つ以上の化合物より成る薬学的組成物へと好都合に処方できる。たとえば、代表的なキャリアおよび本明細書で述べた化合物の処方物の調製と併せて使用可能である薬学的組成物を調製する通常の方法を開示し、参照により本明細書に組み入れられている、ペンシルベニア州イーストンのＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．によるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版を参照。最も代表的には、これらは、ヒトへの組成物投与のための標準キャリアである。１つの態様においては、ヒトおよび非ヒトであり、滅菌水、食塩水、および生理的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含む。他の化合物は、当業者に使用される標準手順に従って投与されるであろう。
【００２８】
本明細書で述べる薬学的組成物は、これに限定されるわけではないが、選択した分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存料、界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物は、１つ以上の活性成分、たとえば抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤なども含むことができる。
【００２９】
肺炎球菌ノイラミニダーゼは、肺炎球菌性細菌で見られるいずれかのノイラミニダーゼ分子を意味する。表１は、複数の種からのノイラミニダーゼのアライメントを示す。ノイラミニダーゼ分子は、たとえばＳＰ１３２６を含む。ＳＰ１３２６アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ７５４２４によって入手できる。Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：４９８−５０６。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ７５４２４の下でＳＰ１３２６に提供されたアミノ酸および核酸配列を含むすべての情報は、この参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。本明細書を通じて示すように、すべてのアミノ酸配列のアミノ酸残基を、肺炎球菌性菌株Ｒ６のアミノ酸配列に従って表１に示すように番号付けする。
【００３０】
【表１−１】
2011160812.tif 000002
【００３１】
【表１−２】
2011160812.tif 000003
ノイラミニダーゼのいずれの抗原性改変体も、本明細書で教示した組成物または方法で使用できる。それゆえ天然型ノイラミニダーゼは、本発明で教示した方法に従ったアミノ酸残基の置換、欠失、または変更によって修飾できる。必要に応じて、そのような修飾は、ノイラミニダーゼを無毒化するように設計されるであろう。「無毒化」とは、抗原性または免疫原性を維持しながら、酵素活性を低減または除去することを意味する。これは部位特異性突然変異誘発を使用する、ノイラミニダーゼの活性部位におけるアミノ酸の置換、欠失、または変更によって実施される。好ましくは、そのような置換、欠失、または変更は、Ａｓｐボックスの範囲内となるであろう（すなわちアミノ酸残基４６０〜４８０、５３０〜５６０、または６００〜６２０内）。本明細書で教示されたノイラミニダーゼ構造については、その全体が参照により本明細書に組み入れられているＣｒｅｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：９８５２−９８５６を参照。そのような置換、欠失、または変更は、アミノ酸残基３８３〜３８７、４６７〜４７３、５４１〜５４６、または６１０〜６１６内のＡｓｐボックス内で発生しうる。Ａｓｐボックスにおける変更はたとえば、アスパラギン酸の、グルタミン酸またはトレオニンの置換を含むことができる。他の保存的または非保存的アミノ酸置換も、毒性を低下させるために、Ａｓｐボックス内のアスパラギン酸残基または他のいずれかの残基にて使用できる。ノイラミニダーゼの他の領域は必要に応じて、部位特異性突然変異誘発を標的とする。たとえば位置５７２におけるバリンまたはグルタミンの保存的および非保存的アミノ酸置換を含む、たとえば残基５７０〜５８０に該当する領域内での修飾が開示される。残基７５０〜７６０に該当する領域に修飾を、さらに詳細には位置７５４にチロシンを有するノイラミニダーゼも開示される。チロシン残基の保存的アミノ酸置換は、たとえばセリンまたはトレオニンを含む。アミノ酸残基３４０〜３５０、６００〜６１０、または３６０〜３７０該当する領域に修飾を有するノイラミニダーゼも提供される。さらに詳細には、位置３４７、６０５、３６６、または３６７のアルギニンは、リジンまたはグルタミン、あるいは他のいずれかの保存的または非保存的アミノ酸によって置換できる。本明細書で教示した各種の修飾を組み合せて使用できる。それゆえ１つ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換が必要に応じて、同じノイラミニダーゼ中に存在する。
【００３２】
上述のように、無毒化ノイラミニダーゼは、当業界で周知であるＬｏｃｋら（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．４：３３−４３，１９８８）のアッセイで測定されたように、非無毒化ノイラミニダーゼと比較して低下した活性を示すノイラミニダーゼである。Ｌｏｃｋのアッセイを使用して、溶解物、血清、または血液中のＮａｎＡ活性は、酵素アッセイで２’−（４−メチル−ウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ａｃｅｔｌｙｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）を基質として用いて、測定される（Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）。基質１０マイクロリットルを血清１０μｌと合せて、３７℃にて５分間インキュベートする。０．５Ｍ炭酸ナトリウムを使用して反応を停止させる。ノイラミニダーゼ活性を１分間当たりに放出される４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）の量で測定する。ＭＵは、励起波長３６６ｎＭおよび放出波長４４５ｎｍを有する。無毒化ノイラミニダーゼは、免疫組成物を作成するために薬学的に受容可能なキャリアと組合されるように、非無毒化ノイラミニダーゼと匹敵する抗原性または免疫原性を保持することが好ましい。比較の目的で、非無毒化ノイラミニダーゼはこれに限定されるわけではないが、表１に示すＲ６  ＮａｎＡを含む。好ましい実施形態において、無毒化ノイラミニダーゼは、非無毒化ノイラミニダーゼの活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％を示す。
【００３３】
無毒化ノイラミニダーゼは、非無毒化ノイラミニダーゼと比較して、アミノ酸配列内に変更（すなわち置換、修飾、または欠失）を含む。好ましい実施形態において、無毒化ノイラミニダーゼは、非無毒化ノイラミニダーゼ内に見られるアミノ酸のおよそ７％、１０％、１５％または２０％の変更を含む。好ましいアミノ酸欠失は、非無毒化ノイラミニダーゼのＮ末端からのアミノ酸ほぼ５、１０または１５個の欠失を含む。他の好ましい実施形態は、非無毒化ノイラミニダーゼのＣ末端のアミノ酸ほぼ６０、５０、４０、３０、２０、１０または５個の欠失を含む（本出願では、Ｃ末端は表１に示すように、Ｒ６  ＮａｎＡのアミノ酸８００にて始まる）。なお他の好ましい実施形態では無毒化ノイラミニダーゼは、非無毒化ノイラミニダーゼのＣ末端の１７、９、８、７、４または２のアミノ酸の欠失を含む。好ましい欠失のある例を表１に示す（すなわちＴＩＧＲ４  ＮａｎＡアミノ酸配列）。これらの変更のいずれも、１つ以上の他の変更と組み合せることができる。そのような無毒化ノイラミニダーゼ種は、非無毒化ノイラミニダーゼの活性のおよそ６０％、７０％、８０％または９０％を示すことが好ましい。
【００３４】
ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｄｉａｓｅ）の他の保存的および非保存的置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）は、ノイラミニダーゼがその抗原性または免疫原性を維持している限り使用できる。これらの保存的置換は、天然に存在するアミノ酸が同じ特性を有する天然に存在するアミノ酸によって置換されるようになっている。そのような保存的および非保存的置換は必要に応じて、ポリペプチドの酵素機能を変化させる。たとえば保存的置換は、表２に従って行える。
【００３５】
【表２】
2011160812.tif 000004
所望の場合、修飾および変化は、本発明のポリペプチドをコード化する核酸および／または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において行われ、同様のまたは他の所望の特徴（たとえば抗原性または免疫原性）を有するポリペプチドがなお得られることが理解される。そのような変化は、天然単離物で発生するか、または部位特異性突然変異誘発を使用して合成により導入され、ミスマッチポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの手順が当業界で周知である。たとえばあるアミノ酸は、機能活性の認識できる損失なしに、ポリペプチド中の他のアミノ酸と置換される。それゆえ生物有用性または活性の認識できる損失なしに、そしておそらくはそのような有用性または活性の上昇を伴って、様々な変更が本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（または基礎を成す核酸配列）中で行われることが検討される。
【００３６】
ｎａｎＡ遺伝子またはｎａｎＡ遺伝子のいずれかの部分の欠失は、その中で教示された方法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられているＳｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７：５１９０−５１９６によって述べられている方法を使用して実施される。試薬２，３ブタジオンは、タンパク質のＡｒｇ残基と特異的に反応し、ＮａｎＡ分子の折畳みに対するＡｒｇ残基の重要性を評価するために使用される。部位特異的突然変異誘発は、特異的アミノ酸を変更するために使用される。
【００３７】
ノイラミニダーゼは、たとえば変性を含む化学処理によっても無毒化できる。化学処理は、さらに負の副作用を低減し、抗原性または免疫原性を改善するために、部位特異的突然変異誘発と組み合せることもできる。無毒化ノイラミニダーゼは、無毒化ノイラミニダーゼによる被験体の免疫化の前に、ホルマリン、グルタルアルデヒド、熱などの作用因子によって、または当業者に既知の他の作用因子によって処理できる。
【００３８】
それゆえ本明細書では、無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼあるいはその抗原性または免疫原性部分が提供される。無毒化肺炎球菌ノイラミニダーゼおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物も提供される。必要に応じて組成物は、アジュバント（たとえば粘膜アジュバントを含む）をさらに含む。
【００３９】
さらに、たとえば抗原性または免疫原性を上昇させる部分を含む、部分をノイラミニダーゼに添加できる。そのような部分はたとえば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、血管由来因子、アポトーシス阻害物質、ホルモン、毒素、またはアジュバントとして使用するための本明細書で述べた他の部分を含む。部分は必要に応じて、変更分子中で使用するために修飾または切断できる。それゆえ本明細書では、ノイラミニダーゼあるいはその抗原性または免疫原性フラグメントおよび抗原性または免疫原性を向上させる部分を含む、肺炎球菌ノイラミニダーゼキメラが提供される。肺炎球菌ノイラミニダーゼ誘導体および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物も提供される。必要に応じて組成物は、アジュバント（たとえば粘膜アジュバントを含む）をさらに含む。
【００４０】
必要に応じて、本発明の修飾ノイラミニダーゼフラグメントまたはその部分は、天然型肺炎球菌ノイラミニダーゼまたはそのフラグメントと少なくとも約７０％の相同性を備えたアミノ酸配列を有する。修飾ノイラミニダーゼまたはそのフラグメントをコード化する核酸がさらに提供される。いずれかの既知の改変体および誘導体、あるいは本明細書で開示された核酸およびタンパク質の発生する改変体および誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知配列への相同性に関する改変体および誘導体の定義を通じてであることが理解される。たとえば表１に示すようにＲ６肺炎球菌性菌株のｎａｎＡ遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列は、肺炎球菌ノイラミニダーゼの特定の配列を説明し、タンパク質の特定のアミノ酸配列を説明する。示された配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの相同性を有する、本発明で開示されたこの配列の改変体が特に開示される。当業者は、２つのタンパク質または核酸の相同性を決定する方法をただちに理解するであろう。たとえば相同性は、相同性がその最高レベルとなるように２つの配列を整列させた後に、計算できる。
【００４１】
相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムによって実施できる。比較のための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似度方法の検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，マジソン、ウィスコンシン州）、または検査によって実施される。核酸について同じタイプの相同性が、核酸アラインメントに関する少なくとも物質について、たとえば参照により本明細書に組み入れられている、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：  ２８１−３０６，１９８９で開示されたアルゴリズムによって得られる。
【００４２】
「肺炎球菌性ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸」は、肺炎球菌性細菌中に存在するホスホコリン、テイコ酸、またはリポテイコ酸を意味する。これらの化合物は、ノイラミニダーゼについて上述したように、修飾、無毒化または強化することができる。本明細書では、修飾、無毒化、および強化された化合物を含む組成物が提供される。
【００４３】
「その抗原部分」とは、抗体産生を誘発する分子または化合物（たとえばノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸）のいずれかのエピトープを意味し、該抗体は該分子に向けられている。好ましくは、抗原部分は分子またはＳ．ニューモニエに対する免疫を誘発する。好ましくは、抗体はノイラミニダーゼの活性部位に向けられているか、または活性部位を妨害する。抗原性フラグメントの例は、これに限定されるわけではないが、保存的アミノ酸置換または修飾の存在下または非存在下でのｎａｎＡ−Ｒ６アミノ酸配列の残基６３〜３６１に該当する残基を含む。他の例は、保存的アミノ酸置換または修飾の存在下または非存在下で、ノイラミニダーゼのＡｓｐ領域（ＮａｎＡ−Ｒ６のアミノ酸配列の残基４６０〜４８０、５３０〜５６０、６１０〜６２０に該当する）およびＮａｎＡ−Ｒ６アミノ酸配列の３４０〜３５０、３６０〜３７０、６００〜６１０、５７０〜５８０および７５０〜７６０に該当する領域を含む。必要に応じて、ノイラミニダーゼの活性部位を妨害するように方向付けられた抗体は、配列番号１５の残基３４７、３６７または６０５に位置するＮａｎＡのアルギニン残基に、または配列番号１５の残基３８３〜３８７、４６７〜４７３、５４１〜５４６および６１０〜６１６に位置するＮａｎＡのＡｓｐボックスに結合するか、またはその結合を防止することができる。その上、抗体は、配列番号１５の残基５７５に位置するバリン、または配列番号１５の残基７５２に位置するチロシンに結合するか、またはその結合を防止することもできる。抗体は、配列番号１５の上で示した残基のいずれかの組合せに結合するか、またはその結合を防止することもできる。
【００４４】
ＮａｎＡフラグメントの他の例は、アミノ酸１〜３４０、３３０〜６３０、６２０〜８００、７００〜１０３０および３３０〜８００を含む。これらのフラグメントの２つ以上の融合物であるフラグメントもさらに提供される。融合フラグメントは、これに限定されるわけではないが、領域６２０〜６８０と融合された領域１〜３４０を含む。融合フラグメントは、組換えタンパク質として発現される。これらのフラグメントをコード化するフラグメントは、発現ベクター（ｐＥＴベクター；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）内へクローニングされ、タンパク質が精製される。あるいはフラグメントは、ベンダーからの合成ポリペプチドとして産生される。フラグメントを使用して、動物を免疫化して抗体を産生させて、３次元構造を評価するために結晶化させる。本明細書で述べるように、保存的または非保存的アミノ酸修飾、または置換の存在下または非存在下でのフラグメントをコード化する核酸も提供される。核酸を含むベクターまたは発現系も提供される。
【００４５】
本明細書では、肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、テイコ酸、リポテイコ酸、あるいはこれらの１つまたは両方の抗原部分に特異的に結合する単離抗体を含む組成物も提供される。抗体のいずれかの組合せを含む組成物も提供される。そのような抗体は、Ｓ．ニューモニエに対する受動免疫を発現させるのに有用である。抗体組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む。必要に応じて組成物は、粘膜表面への投与に適切であるが、上述のような全身投与を含む他の投与経路も開示されている。
【００４６】
本明細書では、肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、テイコ酸、リポテイコ酸、あるいは肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、テイコ酸、またはリポテイコ酸のいずれかのエピトープに対して特異性の抗体を産生する方法も開示されている。必要に応じて抗体は、被験体の鼻粘膜に本明細書で開示された組成物の有効量を接触させることによって被験体内で（すなわち、生体内）産生される。被験体の鼻粘膜に標的分子または分子を標的とする抗体の組合せを含む組成物の有効量を接触させることによって、肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、テイコ酸、リポテイコ酸、あるいは肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、テイコ酸、またはリポテイコ酸のいずれかのエピトープのいずれかの組合せに対して特異性である抗体を産生する方法も開示される。
【００４７】
必要に応じて、本明細書で述べる作用因子は、天然型であるか、無毒化または、そうでなければ修飾されたかにかかわらず、必要に応じて、たとえばベクター内の核酸として投与できる。核酸の発現は次に、被験体へのそれによって発現された所望の核酸の接触を引き起こす。それゆえたとえば、肺炎球菌ノイラミニダーゼをコード化する核酸が被験体に被験体内で発現できる形で投与する場合、次に被験体にノイラミニダーゼを接触させる。
【００４８】
被験体の細胞内への外来性ＤＮＡの投与および摂取（すなわち遺伝子形質導入または形質移入）を含む本明細書で述べた方法において、開示された核酸は裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形でありうるか、あるいは核酸は、核酸を細胞に送達するベクターであり、それによって抗体コード化ＤＮＡフラグメントは、当業者によって十分理解されるように、プロモータの転写調節の支配下にある。ベクターは、アデノウィルスベクター（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ラヴァル、ケベック、カナダ）などの市販の調製物でありうる。核酸またはベクターの細胞への送達は、多様な機構を介することができる。一例として、送達は、市販のリポソーム調製物、たとえばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．、ゲティスバーグ、メリーランド州）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．ヒルデン、ドイツ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｉｎｃ．、マジソン、ウィスコンシン州）はもちろんのこと、当業界で標準的な手順に従って開発された他のリポソームを使用して、リポソーム経由で行われる。加えて、開示された核酸またはベクターは、遺伝子銃または他の送達方法、たとえばＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（サンディエゴ、カリフォルニア州）から入手できる技術である電気穿孔法によってはもちろんのこと、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ装置（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、ツーソン、アリゾナ州）によっても生体内送達できる。
【００４９】
一例として、ベクター送達は、ウィルス系、たとえば組換えレトロウィルスゲノムをパッケージできるレトロウィルスベクターを介して行える（たとえばＰａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６，１９８８；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５，１９８６を参照）。次に組換えレトロウィルスを感染させるために使用して、それによってたとえば肺炎球菌ノイラミニダーゼまたは幅広い中和抗体（またはその活性フラグメント）をコード化する感染した細胞核酸に送達する。変化した核酸を哺乳類細胞に導入する正確な方法はもちろん、レトロウィルスベクターの使用に限定されない。この手順では、アデノウィルスベクター（Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８，１９９４）、アデノ結合ウィルス（ＡＡＶ）ベクター（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４９２−１５００，１９９４）、レンチウィルスベクター（Ｎａｉｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，１９９６）、シュードタイプレトロウィルスベクター（Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７，１９９６）を含む他の技法が広範に利用できる。物理的形質導入技法、たとえばリポソーム送達およびレセプタ仲介および他のエンドサイトーシス機構も使用できる（たとえばＳｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８７：４７２−４７８，１９９６を参照）。このように開示された組成物および方法は、これらのまたは他の一般に使用される遺伝子導入方法のいずれかと併せて使用できる。
【００５０】
一例として、抗体コード化核酸がアデノウィルスベクター内の被験体の細胞に送達される場合、ヒトへのアデノウィルス投与の投薬量は、注射１回当たり約１０７〜１０９プラーク形成単位（ｐｆｕ）の範囲でありうるが、注射１回当たり１０１２ｐｆｕにもなりうる（Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１，１９９７；Ａｌｖａｒｅｚ  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３，１９９７）。被験体には１回の注射を投与できるか、または追加の注射が必要な場合は、それらは無期限に亘っておよび／または処置の有効性が確立されるまで、６ヶ月の間隔（または当業者によって決定されるように、他の適切な期間）で反復できる。
【００５１】
核酸またはベクターの非経口投与は使用される場合、一般に注射を特徴とする。注射可能物質は、液体液剤または懸濁剤のどちらかとしての従来形で、注射前の液体への懸濁剤の溶解に適した固体形で、あるいは乳剤として調製できる。非経口投与のより最近修正された手法は、一定の投薬量が維持されるような低速放出または持続放出系の使用を包含する。たとえば参照により本明細書に組み入れられている、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，６１０，７９５を参照。治療化合物の適切な処方および各種の投与経路のさらなる議論については、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，イーストン、ペンシルベニア州、１９９５を参照。
【００５２】
被験体の鼻粘膜への本明細書で開示された組成物の有効量の接触を含む、被験体における肺炎球菌の鼻輸送を低減または防止する方法も開示される。そのような投与は、肺炎球菌感染または鼻輸送に対する能動または受動免疫あるいは防御を生成するのに有用でありうる。
【００５３】
被験体の粘膜表面への本発明で開示した組成物の有効量の接触を含む、被験体における肺炎球菌感染を低減または防止する方法がさらに提供される。たとえば該方法は、肺炎球菌性髄膜炎、中耳炎、肺炎、または溶血性尿毒症を防止できる。防止または低減は、鼻輸送を低減すること、またはＣＮＳ浸潤、全身性浸潤、あるいはエウスタキー管または下気道を防止することによって行える。
【００５４】
化合物の「有効量」とは本明細書で規定されるように、所望の結果を提供するための、化合物の非毒性であるが十分な量を意味する。以下で指摘されるように、正確な必要量は、被験体の種、年齢、および全身状態、処置される疾患の重症度、使用された特定の化合物、その投与方法などによって、被験体ごとに変化するであろう。それゆえ正確な「有効量」を規定することは可能ではない。しかしながら適切な有効量は、日常的な実験のみを使用して、当業者が決定できる。
【００５５】
本明細書で述べる組成物の投薬量または量は、送達が行われる方法で所望の効果を生じるのに十分な多さである。投薬量は、有害な副作用、たとえば望ましくない交叉反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほど多くするべきではない。一般に投薬量は、年齢、状態、性別および被験体における疾患の程度によって変化し、当業者によって決定できる。投薬量は、関与する被験体の臨床状態に基づいて個々の医師が調整することができる。用量、投薬スケジュールおよび投与経路は変化しうる。抗原の鼻腔内投与の好ましい投薬量は、免疫化１回当たり約１〜１０００μｇ、またはたとえば１０〜１００μｇを含む、その間の任意の量を含む。
【００５６】
本明細書で述べた方法による化合物または組成物の特定の用量の投与の有効性は、病歴、徴候、症状、および肺炎球菌感染した被験体または肺炎球菌性キャリアである被験体の状態を評価するのに有用であることが既知である客観的臨床試験の特定の態様を評価することによって判定できる。これらの徴候、症状、および客観的臨床試験は、そのような患者を処置する臨床医またはこの分野で実験を行う研究者に既知となるように、処置または防止される特定の疾患または状態によって変化する。たとえば適切なコントロール群および／または一般個体群または特定の個体における疾患の正常な進行の知識との比較に基づいて：１）被験体の身体的状態の改善が示される（たとえば鼻輸送が低減または除去される）、２）疾患、感染、または鼻輸送の進行が安定、減速、または後退していることが示される、あるいは３）疾患または状態を処置する他の作用因子の必要性が低下または除去される場合、特定の処置計画は有効と見なされるであろう。たとえば被験体または個体群における鼻輸送の低減または防止、ＣＮＳ浸潤または他の２次肺炎球菌感染の発生の回避または低減は、有効性を示す。そのような効果は、単一の被験体（たとえば従来の粘膜表面拭取りによって検出される細菌数を減少させることによって）または個体群（たとえば疫学的研究を使用）にて決定できる。
【００５７】
本明細書で述べる化合物および薬学的組成物は、局所または全身処置が望ましいかどうかによって、そして処置される部位によって多数の方法で被験体に投与することができる。それゆえたとえば、本明細書で述べる化合物または薬学的組成物は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、リポソームまたは微小球でカプセル化して、点眼液および／または軟膏として目の表面へ、鼻スプレーとして、噴霧液として、またはエアゾールとして鼻腔または気道へ投与することができる。その上、化合物または薬学的組成物は、被験体へ経膣的に、経直腸的に、経鼻的に，経口的に、吸入により、経口的に、または挿管によって投与できる。必要に応じて組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内注射によって投与される。組成物は、液体液剤または懸濁剤のどちらかとしての従来形で、液体への懸濁剤または液剤に適した固体形で、あるいは乳剤として調製できる。必要に応じて投与は、一定の投薬量が維持されるような低速放出または持続放出系による。たとえばそこで教示された方法について、参照により本明細書に組み入れられているＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，６１０，７９５を参照。
【００５８】
本明細書で教示した組成物は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加剤も含有できる滅菌水性または非水性液剤、懸濁剤、および乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレアートなどの有機エステルである。水性キャリアは、食塩水および緩衝溶媒を含む、水、アルコール性／水性液剤、乳剤または懸濁剤である。ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油を含む。保存料および他の添加剤、たとえば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなども存在できる。
【００５９】
局所投与の処方物は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液剤、エアゾール、ネブライザ溶液および粉剤を含むことができる。従来の製薬キャリア、水性、粉末または油性ベース、増粘剤などは必要であるか、望ましい。
【００６０】
経口投与用の組成物は、粉剤または顆粒剤、水または非水性溶媒中の懸濁剤または液剤、カプセル、サシェ、あるいは錠剤を含むことができる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい。
【００６１】
本明細書では、被験体にノイラミニダーゼインヒビタの有効量を投与する工程を含む、被験体における鼻輸送または肺炎球菌感染を低減または防止する方法が提供される。ノイラミニダーゼ阻害物質は好ましくは、被験体の内因性ノイラミニダーゼを著しく低減することなく、肺炎球菌ノイラミニダーゼ活性を阻害する。それゆえたとえば、ノイラミニダーゼがヒトに投与される場合、阻害物質は好ましくは、負の副作用がヒトに生じるように、ヒトノイラミニダーゼ活性を低減することなく、またはヒトノイラミニダーゼ活性を低減することなく、肺炎球菌ノイラミニダーゼを阻害する。既知のノイラミニダーゼインヒビタの例は、ＤＡＮＡ、ＮＡＮＡ、ザナミビルおよびオセルタミビルを含む。
【００６２】
本明細書では、被験体に肺炎球菌ノイラミニダーゼ、ホスホコリン、肺炎球菌性テイコ酸、肺炎球菌性リポテイコ酸に対する抗体またはそのフラグメント、あるいはこれらのいずれか１つの部分に対する抗体を含む組成物の有効量を投与する工程を含む、被験体における鼻輸送および肺炎球菌感染を低減または防止する方法である。必要に応じてこの投与は、被験体の粘膜表面に組成物を接触することを含む。組成物および抗体を含有する容器も提供される。
【００６３】
「ホスホコリン抗体」という用語は本明細書で使用するように、ホスホコリンまたはその抗原性フラグメントに優先的に結合する抗体を指す。本発明の抗体は、肺炎球菌性テイコ酸または肺炎球菌性リポテイコ酸またはその抗原部分にも、あるいはノイラミニダーゼまたはそのフラグメントにも優先的に結合できる。
【００６４】
「抗体」という用語は、本明細書で広範な意味で使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。２重または多重抗原またはエピトープ特異性を備えたキメラ抗体、およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッドフラグメントを含む、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどのフラグメントも、組成物および方法で使用できる。それゆえその特異性抗原を結合する能力を維持する抗体のフラグメントが提供される。たとえばノイラミニダーゼ、ホスホコリン、テイコ酸、またはリポテイコ酸結合活性を維持する抗体のフラグメントは、用語「抗体フラグメント」の意味に含まれる。そのような抗体およびフラグメントは、当業界で既知の技法によって作成可能であり、実施例において、ならびに抗体を産生し、抗体を特異性および活性についてスクリーニングする一般的方法において述べられる方法に従って、特異性および活性についてスクリーニングできる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照）。
【００６５】
本発明の組成物では、抗体フラグメントおよび抗原結合タンパク質（単鎖抗体）の結合体を使用することができる。そのような結合体は、その内容が参照により本明細書に組み入れられている、たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７０４，６９２に述べられている。抗体は、その所望の活性について、試験管内アッセイを使用して、または類似の方法によって試験可能であり、その後、その生体内治療および／または予防活性が、既知の臨床試験方法に従って試験される。
【００６６】
「モノクローナル抗体」という用語は本明細書で使用するように、抗体の実質的に均質な個体群から得られた抗体を指し、すなわち個体群内の個々の抗体は、抗体分子の小さいサブセットに存在する考えられる天然型変異を除いて同一である。開示されたモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生するいずれかの手順を使用して作成できる。たとえば開示されたモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって述べられたような、ハイブリドーマ法を使用して調製できる。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物は通例、免疫剤によって免疫化されて、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生または産生できるリンパ球を発現させる。あるいはリンパ球はたとえば、本明細書で述べたＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−ｃｏ−レセプタ複合体を使用して、試験管内で免疫化できる。
【００６７】
モノクローナル抗体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）に述べられている方法などの、組換えＤＮＡ法によっても産生できる。開示されたモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、従来の手順を使用してただちに単離および配列決定できる（たとえばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。抗体または活性抗体フラグメントのライブラリも、たとえばＢｕｒｔｏｎらへのＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８０４，４４０およびＢａｒｂａｓらへのＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，０９６，４４１に述べられているようなファージ提示技法を使用して産生およびスクリーニングできる。
【００６８】
試験管内方法も、１価抗体を調製するのに適切である。そのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを生成するための抗体の消化は、当業界で既知の日常技法を使用して達成できる。たとえば消化は、パパインを使用して実施できる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開されたＷＯ９４／２９３４８およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，３４２，５６６に述べられている。抗体のパパイン消化は通例、１個の抗原結合部位、および残りのＦｃフラグメントをそれぞれ備えたＦａｂフラグメントと呼ばれる２つの同じ抗原結合フラグメントを生成する。ペプシン処置は、２つの抗原結合部位を有するフラグメントを生成し、なお抗原を架橋することができる。
【００６９】
抗体フラグメントは、他の配列に結合しているかいないかにかかわらず、抗体または抗体フラグメントの活性が非修飾抗体または抗体フラグメントと比較して著しく変化または阻害されないという条件で、特定の領域または特異的アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、あるいは他の選択された修飾を含むことができる。これらの修飾は、ジスルフィド結合可能なアミノ酸を除去および／または付加する、その生体寿命を延長する、その分泌特徴を変化させるなどの、一部の追加特性を提供できる。いずれの場合でも、抗体または抗体フラグメントは、その同種抗原への特異的結合などの生物活性特性を所有しなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能または活性領域は、タンパク質の特異的領域の突然変異誘発と、それに続く発現ポリペプチドの発現および試験によって同定できる。そのような方法は、当業者にただちに明らかとなり、抗体または抗体フラグメントをコード化する核酸の部位特異的突然変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４，１９９２）。
【００７０】
本明細書で使用するように、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を指すこともできる。多くの非ヒト抗体（たとえマウス、ラット、またはウサギに由来するもの）は当然、ヒトにおいて抗原性であり、それゆえヒトに投与したときに、望ましくない免疫反応を生じさせる可能性がある。したがって方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫反応を誘起する機会を減少させる役割を果たす。それゆえ抗体を含む組成物は必要に応じて、ヒト化または完全ヒト抗体を含む。抗体ヒト化技法は一般に抗体分子の１つ以上のポリペプチド鎖をコード化するＤＮＡ配列を操作する組換えＤＮＡ技術の使用を含む。したがって非ヒト抗体（またはそのフラグメント）のヒト化形は、キメラ抗体または抗体鎖（またはそのフラグメント、たとえばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、あるいはヒト（レシピエント）抗体の枠組みへ組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体からの抗原結合部位の部分を含有する抗体の他の抗原結合部分）である。
【００７１】
開示されたヒト抗体は、いずれの技法を使用しても産生できる。ヒトモノクローナル抗体産生の例は、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）によって、そしてＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６  ９５，１９９１）によって述べられているものを含む。ヒト抗体（およびそのフラグメント）も、ファージ提示ライブラリを使用して産生できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１，１９９１）。
【００７２】
開示したヒト抗体は、トランスジェニック動物からも得ることができる。たとえば免疫化に反応してヒト抗体の完全レパートリーを産生できるトランスジェニックの変異体マウスが説明されている（たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１  ２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５  ２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照）。特に、これらのキメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子の同型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害を生じ、ヒト生殖細胞系抗体遺伝子アレイの生殖細胞系変異体マウスへの移入の成功は、抗原攻撃時にヒト抗体の産生を引き起こす。所望の活性を有する抗体は、本明細書で述べるようにＥｎｖ−ＣＤ４−ｃｏ−レセプタ複合体を使用して選択される。
【００７３】
ヒト化抗体を産生するためには、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の抗原結合特徴（たとえば標的抗原に対するあるレベルの特異性および親和性）を有することが既知であるドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基によって置換される。ある例において、ヒト抗体のＦｖ枠組み（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたは枠組み配列にも見出されない残基も含む。一般にヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。実際には、ヒト化抗体は通例、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。ヒト化抗体は一般に、抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通例、ヒト抗体のそれを含有する（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２  ５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３  ３２７（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３  ５９６（１９９２））。
【００７４】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当業界で周知である。たとえばヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２  ５２５（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３  ３２７（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４  １５３６（１９８８））の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって産生できる。ヒト化抗体の産生に使用できる方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，８１６，５６７（Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  ）、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５６５，３３２（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７２１，３６７（Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８３７，２４３（Ｄｅｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，９３９，５９８（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１３０，３６４（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．）、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，１８０，３７７（Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）でも説明されている。
【００７５】
抗体の投与は、本明細書で開示するように実施できる。抗体送達のための核酸手法も存在する。抗体および抗体フラグメントも、被験体自体の細胞が核酸を吸収してコード化抗体または抗体フラグメントを産生および分泌するように、患者または被験体に、抗体または抗体フラグメントをコード化する核酸調製物（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）として投与できる。核酸の送達は、当業界で既知のいずれの手段によってもよい。
【００７６】
本明細書では、本明細書で開示した作用因子および組成物を含む容器も開示する。特に容器は、鼻スプレー器、ネブライザ、吸入器、ボトル、または組成物を粘膜表面への投与形で含有する他のいずれかの手段でありうる。必要に応じて容器は、組成物の計量用量を送達できる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、当業者に本明細書で説明および請求する化合物、組成物、物品、器具、および／または方法が作成および評価される方法の完全な開示および説明を提供するために与えられ、純粋な例示であるものとし、発明者がその発明と見なすものの範囲を限定するものではない。数（たとえば量、温度など）に関して正確を期するよう努力がなされたが、多少の誤差および逸脱が説明されるはずである。別途指示しない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその付近である。反応状態、たとえば成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに生成物の純度および説明した工程から得られた収量を最適化するために使用できる他の反応範囲および条件の、多数の変形および組合せがある。そのような工程状態を最適化するためには、合理的かつ日常的な実験のみが必要となるであろう。
【００７８】
（実施例１）
（輸送中に嗅覚組織に浸透する鼻肺炎球菌）
（材料および方法）
（肺炎球菌性菌株）
Ｓ．ニューモニエＥＦ３０３０、血清型１９Ｆ、およびＴＩＧＲ４菌株、血清型４の２つのカプセル化菌株、ならびに親菌株Ｄ３９、血清型２に由来する無毒性の非カプセル状菌株Ｒ３６Ａを利用した。Ａｖｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９４４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．７９：１３７−１５８。ＥＦ３０３０菌株は、菌血の非存在下で気道にただちにコロニー形成し（Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：  １１１−１１６）、静脈内接種後に菌血を持続できないため選択された。ＴＩＧＲ４菌株はさらに毒性であったが、中程度の鼻接種原によって、菌血なしにコロニー形成する。
【００７９】
（マウス）
ＣＢＡ／ＣＡＨＮ／ｘｉｄ（ｘｉｄ）マウス菌株をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から得た。これらマウスのＢｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ遺伝子における変異は、胸腺独立性ＩＩ型抗原への反応をできなくするが（Ａｍｓｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３６：９３１−９４９；Ｂｅｒｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：５０６−５１３）、比較的な正常なＴ細胞依存性免疫反応を可能にする。これらのマウスは、カプセル状ポリサッカライドに反応できず、肺炎球菌感染を高い再現性で受けやすい。ｘｉｄマウスは、病原体のない状態に維持され、７〜１２週齢で使用される。
【００８０】
（組織収集）
血液を後腹膜神経叢からヘパリン処理毛細管内に収集した。鼻洗浄液（ＮＷ）、腎臓、脾臓、および肺の収集前にマウスを７０％エタノールによって消毒した。ＮＷの血液汚染を防止するために、気管への切開を行って、外径０．０７５ｃｍ、２．０ｃｍ長のＴｙｇｏｎ管（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ、バーノンヒルズ、イリノイ州）を上咽頭に挿入し、同時にリンゲル液を充填した注射器に取り付けた。注射器からの液体は鼻を通じて排出して、３滴を収集した。
【００８１】
上咽頭関連リンパ細網組織（ＮＡＬＴ）、ＯＮ／Ｅ、ＯＢおよび脳の残りを上述のように得た。ｖａｎ  Ｇｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４７７８−４７８２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４６：５０６−５１３。脳から三叉神経節を、解剖顕微鏡を用いて慎重に切除した。ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、三叉神経節、ＮＡＬＴおよび頚部リンパ節ＣＬＮそれぞれをリンゲル液０．５ｍｌ中でホモジナイズし、脳および腎臓をそれぞれリンゲル液１．０ｍｌ中でホモジナイズした。
【００８２】
（組織ミンス／血液／外部排出物中の肺炎球菌の量）
組織および体液の連続３倍希釈物８個を滅菌リンゲル液中で作成し、ゲンタマイシンサルフェート４μｇ／ｍｌを含有する血液寒天プレートで平板培養した。ＣＦＵは平板培養およびロウソク瓶内でのインキュベーションの２４時間後に数えた。結果は、ＣＦＵ／器官、ＮＷまたは血液１ｍｌ当たりのＣＦＵとして表した。
【００８３】
（Ｓ．ニューモニエＥＦ３０３０のＧＬＳプレインキュベーション）
ＧＬＳ結合部位を遮断するために、Ｓ．ニューモニエ菌株ＥＦ３０３０  ３Ｘ１０７ＣＦＵを、ヒト脳からのアシアロ−ＧＭ１  ２０μｇまたはウシ脳からの混合ＧＬＳ（１８％  ＧＭ１、５５％  ＧＤ１ａ、１５％  ＧＤ１ｂ、１０％  ＧＴ１ｂ、２％  他のＧＬＳ）１２５μｇのどちらかを用いて、氷上で３０分間インキュベートした（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，ラホーヤ、カリフォルニア州）。ＧＬＳをＰＢＳに溶解させ、使用１日前に完璧に混合した。両親媒性ＧＬＳは、ＰＢＳ中でミセルを形成し、肺炎球菌に炭水化物部分と相互作用させる。インキュベーションの後、さらに洗浄せずに鼻孔ごとに５μｌをｘｉｄマウスに鼻腔内投与した。４日後に組織をＣＦＵについて分析した。
【００８４】
（ＰＣＲによるＳ．ニューモニエニューモリシン遺伝子の検出）
Ｓ．ニューモニエをＰＣＲによって検出するために、組織を１％  ＳＤＳ中に０．１％デオキシコール酸を用いて凍結−解凍によって溶解させて、３７℃で１時間インキュベートした。タンパク質は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド／ＮａＣｌ沈殿法を使用して除去した（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ：２．４．４、セチルトリメチルアンモニウムブロミド／ＮａＣｌ沈殿法の教示については、参照により本明細書に組み入れられている）。ＤＮＡ  １０μｇをＰＣＲ増幅に使用した。ニューモリシン（ｐｌｙ）特異性プライマーＰｌｙ１  ５’−ＡＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＧＡ−３’（配列番号１）およびＰｌｙ２  ５’−ＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣ−３’（配列番号２）をＰＣＲ混合物に添加して、４００ｂｐフラグメントを増幅した。ＰＣＲ反応は、９４℃での５分間の変性工程と、それに続く増幅サイクル、つまり９４℃（１分）、５５℃（１分）、および７２℃（１分）の３０サイクルを含んでいた。エチジウムブロミド染色ＰＣＲフラグメントの画像をＡｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒ  ＴＭ  ＩＳ−３４００（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，サンリアンドロ、カリフォルニア州）で収集した。
【００８５】
（ＰｓｐＡ特異性Ａｂｓを用いたＯＢの免疫蛍光染色）
マウスをＴＩＧＲ４菌株５Ｘ１０５ＣＦＵで経鼻攻撃した。ＯＢを１０％緩衝ホルマリンで固定した。パラフィン画分４μｍ（ｖａｎ  Ｇｉｎｋｅｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４７７８−４７８２）は、それらを室温にて加湿チャンバ内で４時間インキュベートすることによって、ＰｓｐＡファミリ２Ａｂｓ（１：１００）を染色した。スライドをＰＢＳで洗浄して、ビオチン化ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＩｇＧ（１：２００）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，バーミングハム、アラバマ州）で染色し洗浄して、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（１：１００）（ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，サンディエゴ、カリフォルニア州）で染色した。蛍光画像は、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡によってＤＥＩ−７５０  ＣＥデジタルカラービデオカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ，ゴレータ、カリフォルニア州）を用いて収集し、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，フレデリック、メリーランド州）を用いて処理した。
【００８６】
（統計）
データを平均±１標準誤差として表し、結果を統計解析により独立Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ２標本ランク検定またはＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を使用して比較して、ＣＦＵでの有意差を決定した。
【００８７】
（結果）
（鼻腔内コロニー形成およびＣＮＳ浸潤での肺炎球菌性カプセルの役割）
一次感覚嗅覚ニューロンを通じた肺炎球菌の摂取を調査するために、ＥＦ３０３０および非カプセル化菌株Ｒ３６Ａが鼻道にコロニー形成して、ＣＮＳに侵入する能力を第１〜４日に測定した（図１）。第１日にＯＮ／Ｅでは両方の菌株で高いＣＦＵが観察されたが、Ｒ３６Ａは第４日までにＯＮ／Ｅおよび他のすべての組織にほぼ非存在となり、長期のコロニー形成にはあるカプセルが必要であることを示した以前の結果と一致していた。Ｍａｇｅｅ  ａｎｄ  Ｙｏｔｈｅｒ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３７５５−３７６１。ＥＦ３０３０は、どちらの日でもＯＢおよび脳での明らかな存在を示し、第４日にはＮＷおよびＮＡＬＴに多数が存在していた。これらの調査結果は、鼻腔内攻撃後のＥＦ３０３０肺炎球菌のＯＢおよび脳への軸索輸送と一致していた。
【００８８】
（鼻腔内コロニー形成およびＣＮＳ浸潤の動力学）
ＥＦ３０３０は、観察した３９日間に亘ってすべての時点でＯＮ／Ｅ、ＯＢ、ＮＷ、およびＮＡＬＴにおいて維持された（図２）。脳およびＣＬＮでは、はるかに少ない数のＣＦＵが見られ、存在したこれらのＣＦＵは一般に、第１８および２５日に見られた。興味深いことに、肺は第１日（図１）および第１８、２５および３９日を除いて、肺炎球菌を示さなかった（図２）。使用した経鼻用量では、菌株ＥＦ３０３０を用いて実施したいずれの実験の間にも、ＣＦＵがマウス血流で検出されなかったため、菌血は神経組織分布に寄与しなかった（図２）。鼻腔内投与の１、３、６、１２および２４時間後およびそれに続く１週間にわたって毎日、血液を菌血について監視した。血液中に細菌は検出されなかった。
【００８９】
（三叉神経節のＳ．ニューモニエ感染）
三叉神経細胞は上咽頭を刺激し、それゆえＳ．ニューモニエは、鼻粘膜の感染後の三叉神経節中に予想される。これを試験するために、接種４日後に各種の組織および血液を単離し、新たな実験でのＥＦ３０３０の存在について分析した。ＥＦ３０３０菌株は、ＯＮ／ＥおよびＯＢで、そして三叉神経節で検出された（表３）。この調査はさらに、アシアロ−ＧＭ１がＳ．ニューモニエによる神経標的化のレセプタとして機能することを裏付けた。他のＧＬＳも同様に役割を果たしやすい。
【００９０】
表３は、経鼻送達後の各種組織でのＳ．ニューモニエ菌株ＥＦ３０３０の分布を示す。菌株ＥＦ３０３０  １Ｘ１０７ＣＦＵの鼻腔内投与の４日後に組織を単離した。血液（５０μｌ）、ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、および脳組織ミンスを希釈して、次に血液寒天上で平板培養した。三叉神経節をプールして、ホモジナイズし、次にこの培地上で平板培養した。マウス５匹の平均肺炎球菌ＣＦＵ±ＳＥが示され、３つの独立した実験を表している。脳および血液では、肺炎球菌は検出されなかった。
【００９１】
【表３】
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（肺炎球菌性コロニー形成を阻害するガングリオシド）
ＥＦ３０３０菌株を鼻腔内投与前に、アシアロ−ＧＭ１または混合ＧＬＳミセルを用いてＰＢＳ中でインキュベートした。ＧＬＳ混合物は、最強の阻害効果を示し、鼻腔内投与の４日後に評価したときに、ＮＷにてＣＦＵを１０分の１に減少させた（Ｐ＝０．０３６５）。混合ＧＬＳプレインキュベーションの結果としてのＣＦＵの最大の減少は、ＯＮ／Ｅで見られた（６１７分の１への減少；Ｐ＝０．０１３４）。コントロールでは平均２０４および１６６のＣＦＵが存在する肺（Ｐ＝０．０３２０）（図３Ｂ）およびＣＮＳ組織（Ｐ＝０．００７８）（図３Ａ）の差は、まさに顕著であるが、これに対して肺炎球菌は、ＧＬＳでインキュベートしたときに検出不可能であった（検出限界＝３ＣＦＵ）。アシアロ−ＧＭ１プレインキュベーションは、混合ＧＬＳよりも効率的ではなかったが、それでもＣＮＳ（図３Ａ）および肺（図３Ｂ）においてそれぞれ、コロニー形成を２５分の１および６３分の１に減少させた。肺は吸入した肺炎球菌によって感染し、肺に比較的豊富に存在するアシアロ−ＧＭ１へのその結合はＧＬＳによって明らかに阻害された。このことはＧＬＳが上皮細胞への初期結合で役割を果たすことを示した。ＧＬＳ処置は、肺炎球菌の生存能力を変更させなかった。この実験の間に肺炎球菌は血液中で検出されなかった。それゆえＧＬＳは、鼻道の神経−上皮への肺炎球菌結合ならびに肺およびＣＮＳの感染に関して重要な標的を構成する。
【００９２】
（鼻腔内攻撃後のＯＢへのＳ．ニューモニエ蓄積の検出）
ＯＢ中のＥＦ３０３０の数は一般に少なすぎて、顕微鏡による細菌の描出は実現できなかった。鼻腔内投与後のＯＢ中のＳ．ニューモニエを描出するために、さらに毒性の菌株ＴＩＧＲ４を使用した。攻撃の１、３、６、１２または２４時間後およびその後毎日、代表のマウスからの血液サンプルを試験した。菌血は観察されなかった。攻撃の１週間後にマウスを殺処分して、ＣＦＵについて組織を分析した（図４Ａおよび４Ｂ）。わずか５Ｘ１０５のＴＩＧＲ４  ＣＦＵの用量が、ＯＢに〜３００ＣＦＵを生じた（図３）。ＯＢ中のＰｓｐＡ特異性Ａｂｓを染色することによって、肺炎球菌を描出した（図４Ｄ〜Ｆ）。肺炎球菌は、攻撃されたマウスのＯＢ、すなわち糸球体層（図４Ｆ）および外部網状層（図４Ｅ）で検出された。コントロールマウスのＯＢには、肺炎球菌は存在しなかった（図４Ｄ）。
【００９３】
ＴＩＧＲ４菌株は、鼻腔内投与６日後に、ＮＷ、ＯＮ／ＥおよびＯＢからのニューモリシン遺伝子のＰＣＲ増幅によっても検出された（図４Ｃ）。ＰＣＲ検出可能な肺炎球菌は、この間隔で採取した血流中に、または非感染マウスによるサンプル中に存在していなかった。
【００９４】
（実施例２）
（上咽頭輸送における肺炎球菌−ＮａｎＡの役割およびＣＮＳの標的化）
ＮａｎＡ変異体を、遺伝子的背景およびＮａｎＡの局在化の両方で異なるＳ．ニューモニエの３つの菌株にて産生させた。菌株ＥＦ３０３０（１９Ｆ型）およびＤ３９（２型）はどちらも、細胞壁に共有結合するＮａｎＡを発現するが、ＴＩＧＲ４菌株（４型）は、環境へ分泌される切断ＮａｎＡを発現した。
【００９５】
コロニー形成におけるＮａｎＢの役割も評価した。
【００９６】
（細菌株および増殖条件）
本試験で使用した菌株を表４に挙げる。
【００９７】
【表４】
2011160812.tif 000006
すべての肺炎球菌株は、−８０℃にて１０％グリセロール中で保存して、血液寒天プレートに移して培養し、３７℃にて５％  ＣＯ２雰囲気中で一晩インキュベートした。肺炎球菌の培養物を、０．５％酵素抽出物をＯＤ６６０  ０．５まで含有するＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地中で増殖させて、−８０℃にて滅菌グリセロールを用いた１０％までの同じブロス添加で分割して凍結保存した。変異の安定性を確実にするために、耐抗生物質インサートを持つ変異体を適切な抗生物質中で増殖させた。
【００９８】
（ｎａｎＡ変異体の作成）
親バックグラウンドＴＩＧＲ４、ＥＦ３０３０およびＤＤ３９それぞれのＮａｎＡ変異体菌株ＪＷ００１、ＳＡＭ００１、およびＪＣＰ００１を挿入複製突然変異誘発技法によって得た（そこで教示された技法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｙｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：６１０−６１８）（表４）。菌株ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０は、レシピエントとして、同質遺伝子ｎａｎＡ菌株Ｄ３９から作成したドナー染色体ＤＮＡの形質転換に使用した（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：１３３−１４０）。それぞれの場合で、変異体は、親菌株への戻し交雑を３回行った。Ｄ３９変異体も我々のＤ３９親菌株への戻し交雑を３回行って、それがこれらの試験で使用した親菌株との同質遺伝子であることを確認した。Ｄ３９の変異は、成熟タンパク質のアミノ酸約６５０個のＮ末端フラグメント以外のすべての欠失を可能にする挿入複製突然変異誘発によって作成した（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：１３３−１４０）。ＴＩＧＲ４／ｎａｎＢ同系変異体は、挿入複製突然変異誘発技法を使用して作成した（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：２５３６−２５３４；Ｙｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：６１０−６１８）。ｎａｎＢの４６１ｂｐ内部部分を、プライマー：ｎａｎＢＦおよびｎａｎＢＲ（表１）を使用して増幅し、ＰＣＲは、Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、９５℃にて１分間、４５℃にて１分間、７２℃にて１分間を３０サイクル実施した。フラグメントは、ｐＳＦ１５２内へクローニングした。ＴＩＧＲ４菌株のプラスミドＤＮＡによる形質転換は、前と同様であった（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：２５２６−２５３４）。ｎａｎＡ／ｎａｎＢ−ＴＩＧＲ４ダブル変異体は、ｎａｎＢ／ＴＩＧＲ４変異体の菌株ＪＷ００１から作成した染色体ＤＮＡによる形質転換によって得た。
【００９９】
（マウス毒性アッセイ）
メス６〜１２週齢ＣＢＡ／ＣａＨＮ−ＸＩＤ／Ｊ（ＣＢＡ／Ｎ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、マサチューセッツ州）から得た。これらマウスのＢｒｕｔｏｎのチロシンキナーゼ遺伝子における変異は、胸腺独立性ＩＩ型抗原への反応をできなくするが、比較的な正常なＴ細胞依存性免疫反応を可能にする（Ａｍｓｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．１９７２  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３６：９３１−９４９；Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１０３−１２０；Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１０５９−６４；Ｗｉｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒ  １９８６  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４）。これらのマウスは、カプセル状ポリサッカライドに反応できず、肺炎球菌感染を高い再現性で受けやすい（Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：１０３−１２０；Ｂｒｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８１  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：６９４−７０５）。Ｘ連鎖免疫不全（ｘｉｄ）マウスは、病原体のない状態に維持され、７〜１２週齢で使用した。既知の濃度の生細胞を含有する凍結感染ストックを乳酸リンゲル液で希釈した。次にマウスに体積１０μｌ中のおよそ５Ｘ１０５−１Ｘ１０６細胞を用いて、上述のように経鼻的に（Ｉ．Ｎ．）感染させた（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ  ２３：１２７−１３７）。
【０１００】
（組織収集）
すべてのマウスは、鼻洗浄および組織収集を実施する前に安楽死させた。血液を後腹膜神経叢からヘパリン処理毛細管内に収集した。鼻洗浄液（ＮＷ）、鼻組織（嗅上皮（ＮＴ）、嗅球（ＯＢ）を含む）、および脳の収集前に、マウスを７０％エタノールで消毒した。これらの体液および組織を上述のように得た。ＮＷの血液汚染を防止するために、気管への切開を行って、外径０．０７５ｃｍを有する２．０ｃｍ長のＴｙｇｏｎ管（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を上咽頭に挿入し、同時にリンゲル液を充填した注射器に取り付けた。注射器からの液体は鼻を通じて排出して、３滴を収集した。ＯＮ／ＥおよびＯＢをそれぞれリンゲル液０．５ｍｌ中でホモジナイズし、脳の残りをリンゲル注射液剤１．０ｍｌ中でホモジナイズした。
【０１０１】
（生肺炎球菌の定量）
組織および体液の連続３倍希釈物８個を滅菌リンゲル液中で作成し、ゲンタマイシンサルフェート４μｇ／ｍｌを含有する血液寒天プレートで平板培養した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は平板培養およびロウソク瓶内でのインキュベーションの２４時間後に数えた。ノイラミニダーゼ活性に使用したアッセイは、前に述べられている（アッセイ方法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ  １９８８  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ  ４：３３−４３）。野生種肺炎球菌と変異体肺炎球菌との間の比較を行う２標本Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク検定を用いた解析によって、結果の有意性を評価した。
【０１０２】
（試験管内試験）
ＴＩＧＲ４、ならびにそのｎａｎＡおよびｎａｎＢ変異体が特異性ガングリオシドに結合する能力を測定した。使用したガングリオシドは、混合ガングリオシド、アシアロ−ＧＭ１、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびＧＭ３ガングリオシド（Ｓｉｇｍａ）を含む。ＧＭ３ガングリオシドは、肺炎球菌性結合に関与する末端または内部ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ配列を欠いており、負のコントロールとして使用される。これらのガングリオシドを含有する混合、モノ−、ジ−またはトリ−シアル酸は、ＥＬＩＳＡプレートにただちに結合する。ＴＩＧＲ４菌株を用いた短期インキュベーション後の初期データは、肺炎球菌がアシアロ−ＧＭ１コーティングプレートに結合するが、ＢＳＡ−、ＧＭ−３、またはＧＭ１コーティングプレートには結合しないことを示している。ガングリオシドコーティングプレートを使用して、野生種ＴＩＧＲ４菌株、ＴＩＧＲ４菌株、ｎａｎＡ、ｎａｎＢ、およびｎａｎＡ／ｎａｎＢ変異体菌株の安定不透明および透明相改変体によるこれらのプレートへの結合能力を比較する。これらの解析は、ガングリオシドコーティングプレートへの短期インキュベーション（１時間）および長期インキュベーション（２４時間）を含む。結合した肺炎球菌は、０．５％酵素抽出物を含有するＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔ培地中での短期インキュベーション（１０〜１５分間）によってガングリオシドプレートから除去され、放出された細菌の反復ピペッティングおよび血液寒天プレート上での平板培養が続く。あるいは４１℃の、０．５％酵素抽出物を含有するＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔブロス寒天を結合した肺炎球菌の上に注入して、プレートの底からコロニーをカウントする。コントロールは、肺炎球菌のないプレートおよびガングリオシドはないが、肺炎球菌のあるプレートを含んでいる。
【０１０３】
ガングリオシド結合の試験に続いて、各種の細胞系は、肺炎球菌をその細胞表面に結合させて、それらを内部移行させるその能力について試験する。これらの試験は、ラット神経褐色細胞腫細胞系ＰＣ１２（ＡＴＣＣ）およびマクロファージ細胞系Ｐ３８８Ｄ１に焦点を当てる。これらの２つの細胞系は、その特異的属性のために選択された。Ｐ３８８Ｄ１細胞系は、小膠細胞上に存在することが報告されている、高い親和性ＰＡＦ−Ｒ（Ｖａｌｏｎｅ（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：２３８９−２３９４）を発現する。ＰＣ１２細胞系は、検出可能なＰＡＦ−Ｒを発現しない。Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．ＮｅｕｒｏＣｈｅｍ  ８２：１５０２−１５１１。１０２〜１０５個の肺炎球菌性ＣＦＵを６ウェルまたは２４ウェル組織培養プレートで増殖させたこれらの細胞系に添加して、３７℃にて１５分間〜６時間インキュベートし、その後、細胞を完璧に洗浄して、付着性の肺炎球菌を分析する。細胞への内部移行を判定するために、ペニシリンおよびゲンタマイシンを用いた２時間の洗浄を実施してから、血液寒天上で細胞を平板培養するか、またはそれらを４１℃の０．５％酵素抽出物を含有するＴｏｄｄ  Ｈｅｗｉｔｔブロス寒天で被覆する。使用した２つの細胞系は、通常はＣＮＳにて観察されるＰＡＦ−Ｒの生体内発現を反映する。活性化小膠細胞は、Ｐ３８８Ｄ１細胞系と同様にこのレセプタを豊富に発現するが、ＰＡＦ−Ｒレセプタは、神経細胞、たとえばＰＣ１２細胞系上に不在であるか、別個の神経小集団によって低レベルでのみ発現されるかのどちらかである。Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：３５９０−３６００；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｃｅｌｌ  Ｄａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．５：８６７−８７５。肺炎球菌の両方の細胞系への付着は、ＰＡＦ−Ｒが付着にとって必須ではなく、代わりのレセプタが存在することを示す。ＴＩＧＲ４不透明および透明改変体ならびにｎａｎＡ−、ｎａｎＢ−変異体およびｎａｎＡ／ｎａｎＢダブル変異体を、野生種ＴＩＧＲ４菌株によって観察された付着と比較して、これらの細胞系への付着について試験する。肺炎球菌付着におけるＰＡＦ−Ｒ対ガングリオシドの役割をさらに分析するために、ＰＡＦ−Ｒを欠いたＣＯＳ−７細胞系（Ｇｅｒａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｒｄ（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：７９３−８００；Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄ．５：１０５−１０７）を、１０２９ｂｐのヒトＰＡＦＲ読み取り枠で、ｐｃＤＮＡ３．１／ＧＳプラスミドを前に報告したように使用して（そこで教示した方法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｂｒｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏ  Ｃｈｅｍ  ８２：  １５０２−１５１１）形質移入し、Ｔｒａｎｓｆａｓｔ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して形質移入する。プラスミド単独をコントロールとして使用し、肺炎球菌付着に影響を及ぼすパラメータをＰＡＦ−Ｒの存在または非存在下で解析する。本実験は、ＰＡＦ−Ｒの付着での重要性に関する明確なデータを提供する。ＰＡＦ−Ｒを欠いた細胞系での付着は、ガングリオシドによって���介され、続いてガングリオシドを用いたプレインキュベーションによって遮断される。肺炎球菌が上皮細胞に付着して浸透する能力にさらに注目するために、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２ヒト咽頭上皮細胞系（ＡＴＣＣ）およびＡ５４９ヒト肺上皮細胞系（ＡＴＣＣ）を採用し、トランスウェルシステムを使用する。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）−ＰＣＦ培養（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ビルリカ、マサチューセッツ州）プレートインサートを使用して、上皮細胞系をコンフルエントまで培養する。コンフルエントは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）電気抵抗システムを使用して、経上皮耐性を測定することにより決定する。少なくとも５００Ω／ｃｍ２の抵抗は、完全にコンフルエントな上皮単層が達成されたことを意味する。これらの細胞は、それらがこの上皮層に付着し、侵入して、浸透する能力を試験するために、肺炎球菌に暴露させる。結合と内部移行を区別するために、上皮細胞を洗浄して、ペニシリンおよびゲンタマイシンを含有する培地で２時間インキュベートする。最初に、ＴＩＧＲ４菌株、そのｎａｎＡおよびｎａｎＢ変異体、ならびにダブル変異体に焦点を当てる。ＴＩＧＲ４菌株の安定な透明および不透明改変体は、生体内攻撃後に逆行しなかった安定な改変体が得られるまで、連続継代によって産生させた。これらのＴＩＧＲ４改変体は、上皮細胞に付着、侵入、浸透する（ｔｒａｎｖｅｒｓｅ）能力について比較する。ウェルにＥＭＥＭ培地中の１０３〜１０６ＣＦＵ／ウェルを装填する。０．５、１、２、４、８、および２４時間後に培養物を上皮層の上下で収穫して、ＣＦＵについて解析する。細胞層を５〜６回洗浄してから、細胞に０．５％酵素抽出物および０．５％寒天を添加したＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスを重ね、４１℃まで冷却し、単層と結合した肺炎球菌ＣＦＵを決定する。プレートを３７℃および５％  ＣＯ２にて一晩インキュベートし、その後、ＣＦＵをカウントする。細胞系をＰＡＦ−Ｒの発現について解析する。これらの細胞系に由来する全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより、２つのプライマーＰＡＦ−１（５’−ＣＣＧＡＴＡＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＧＡ−３’（配列番号３）；ヌクレオチド１５１〜１７０）およびＰＡＦ−２（５’−ＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号４）；ヌクレオチド９７０〜９５１）を使用して解析し、８３８ｂｐのＰＣＲ生成物を得る（そこで教示された方法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｓｔｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：９５４−９６２）。ＰＡＦレセプタが存在する場合、ＰＡＦレセプタインヒビタ、たとえばオクチルオニウムブロミド（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．プリマスミーティング、ペンシルベニア州）またはＰＡＦ（Ｂｉｏｍｏｌ）を培養物に添加して、ＰＡＦ−Ｒの上皮付着および浸透への寄与を決定する。オクチルオニウムブロミドは、ＰＡＦ−Ｒへ高い親和性で結合する。あるいは上述のＣＯＳ７細胞は、この目的に使用され、ＰＡＦ−Ｒの存在または非存在下で肺炎球菌付着を比較する。
【０１０４】
各種の肺炎球菌株の侵襲性度は、トランスウェルシステムの頂端および基底面コンパートメントの両方での炎症性サイトカインの生成と相関している。培養物上澄みを各種の時点で上下のコンパートメント両方にて収集して、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）によって解析し、炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αの濃度を決定する。上皮単層を酢酸アルコール中で固定して、ＯＢ中での肺炎球菌の描出で以前に使用したように、ＰｓｐＡ特異性免疫蛍光染色を使用して、肺炎球菌の細胞内存在を解析する。蛍光画像は、以前に述べたように（そこで教示された方法について、参照により本明細書に組み入れられている、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３７４８−３７５８）、適切なフィルタキューブを装備したＬｅｉｃａ／Ｌｅｉｔｚ  ＤＭＲＢ顕微鏡（Ｃｈｒｏｍｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，バトルボロ、バージニア州）によって描出する。画像はＣ５８１０デジタルカラーカメラ（Ｍａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて収集し、Ａｄｏｂｅ  ｐｈｏｔｏｓｈｏｐおよびＩＰ  ＬＡＢ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍソフトウェアで処理する。
【０１０５】
（結果）
（ＮａｎＡおよびＮａｎＢ変異体のコロニー形成）
Ｓ．ニューモニエがＣＢＡ／Ｎマウスの上咽頭にコロニー形成する能力に対するＮａｎＡ変異の効果を、鼻腔内（ｉ．ｎ．）感染させたマウスの鼻洗浄から単離された肺炎球菌細胞の数を、ＮａｎＡ変異体菌株で感染させたマウスの肺炎球菌細胞の数と比較することによって評価した。これらの異なる肺炎球菌菌株が含まれ、それゆえカプセル血清型および遺伝的背景が異なる菌株に対するＮａｎＡ変異の効果が調査された。ＴＩＧＲ４／ＮａｎＡ−（ＪＷ００１）、ＥＦ３０３０／ＮａｎＡ−（ＳＡＭ００１）およびＤ３９／ＮａｎＡ−（ＪＣＰ００１）はそれぞれ、カプセル型４、１９Ｆおよび２であった（表４）。カプセル型４臨床アイソレート、ＴＩＧＲ４の場合、ＬＰＥＴＧ（配列番号１３）モチーフをコード化する配列の前に停止コドンがある。このモチーフがないと、ＮａｎＡは、ＴＩＧＲ４によって環境中へ分泌されることが予想される。現在入手できる残りの４つの肺炎球菌−ＮａｎＡ配列、Ｇ５４（１９Ｆ型）、Ｒ６（２型）、Ｓｐａｎｉｓｈ  ２３Ｆおよび６７０（６Ｂ型）の試験（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ７１：２９９−３０５；Ｈｏｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３：５７０９−１７；Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：４９８−５０６）は、細胞壁への共有結合のためのＬＰＸＴＧ（配列番号１４）モチーフを有することを示した（図５）。したがってここに含まれる菌株は、ＮａｎＡが分泌され、表面結合されている菌株における変異の比較を提供した。
【０１０６】
コロニー形成の劇的な減少は、ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０両方のＮａｎＡ変異体で観察された（図６および７）。
【０１０７】
Ｓ．ニューモニエは別のノイラミニダーゼ、ＮａｎＢを発現する。同様の相同性度がＮａｎＢ間でＮａｎＡに対して共有されている。ＮａｎＢは、ＮａｎＡと４３％の相同性を共有する（２４％の同一性）。タンパク質間の共有された残基は、シアリダーゼであることを示唆した（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８５４−４８６０）。ＮａｎＢは、６．５〜７であるＮａｎＡの最適ｐＨと比較して、４．５の最適ｐＨを有することが見出されている。その最適ｐＨにおいてさえ、ＮａｎＢは、ＮａｎＡがその最適ｐＨにあるときのシアリダーゼの約１／１００の活性である。それでも、コロニー形成およびＣＮＳの直接侵襲についてＮａｎＢの要件があるかどうか調べるために、菌株ＴＩＧＲ４／ＮａｎＢ−（ＪＷ００２）、変異体を、ＮａｎＢを欠いたＴＩＧＲ４遺伝的背景にて、ＮａｎＡおよびＮａｎＢ発現の両方を欠いた菌株ＴＩＧＲ４／ＮａｎＡＢ−（ＪＷ００３）と同様に作成した。マウスのＪＷ００２による感染は、ＴＩＧＲ４菌株とほぼ同じコロニー形成のレベルを生じた（図８）。その上、ＮａｎＡ変異体と比較して（図９）、コロニー形成の著しい減少はダブル変異体（ＪＷ００３）では起こらなかった。
【０１０８】
（肺炎球菌のＣＮＳへの侵入）
Ｓ．ニューモニエの鼻組織（嗅神経を含む）への移動を追跡するために、嗅球および脳の残りをＳ．ニューモニエの存在について試験した。ＮａｎＡ変異体は、遺伝的背景とは無関係に、鼻組織および嗅球において、野生種菌株の数と比べて著しい数の減少が見られた。殺処分時に、すべてのマウスから採血したが、いずれも血液中に検出可能な肺炎球菌を示さず（＜１２ＣＦＵ／ｍｌ血液）、肺炎球菌が鼻腔からＣＮＳ組織へ直接移動することを示している。ＮａｎＢ変異体は、肺炎球菌の鼻組織または嗅球内への侵入に対する影響を持たなかった（図８）。
【０１０９】
ＮａｎＡ変異体は、上咽頭およびＣＮＳでコロニー形成および持続するその能力が明らかに弱められた。このことは、カプセル血清型およびＮａｎＡの表面への結合の両方が異なる菌株で見られた。ＮａｎＡは、細菌細胞表面と宿主との間の親密性に影響を及ぼす多くの表面構造の１つに過ぎないが、肺炎球菌のＣＮＳへの標的化と同様に、鼻輸送へのその関与は必須である。ＮａｎＡの破壊は、コロニー形成およびＣＮＳへの標的化を著しく減少させる。この結果は、ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０の両方で観察された。
【０１１０】
菌株ＥＦ３０３０（１９Ｆ型）は、１ヶ月間に亘って高い効率で上咽頭にコロニー形成する。しかしながら、ＥＦ３０３０が持続する能力にかかわらず、ＮａｎＡの変異は、鼻の肺炎球菌細胞の数を著しく減少させた。弱化は、鼻洗浄液から単離された細胞数が１４日後には検出可能限界近くまで低下した、ＴＩＧＲ４／ＮａｎＡ−菌株でなおさらに劇的であった。
【０１１１】
自然の状況では、肺炎球菌は、他の細菌種と共存する。それゆえＮａｎＡの他の機能は、宿主タンパク質の機能を変化させることと、輸送の長期安定性に寄与することとを含む。ＮａｎＡは、肺炎球菌がＮ．メニンギティディスまたはＨ．インフルエンゼを含む他の口内細菌と競合する能力も、宿主糖タンパク質を炭素源として使用できるようにすることによって向上させる。
【０１１２】
これらの試験の主な結果は、ＮａｎＡ発現がマウスの最適輸送に必要であることの証明であったが、これらのデータは、ＮａｎＡを欠く肺炎球菌が嗅球でははるかに少ない数で見出されることも証明した。この時点では、活性ＮａｎＡがＣＮＳ組織中でのＳ．ニューモニエの生存にとって重要であるかどうかを知ることは困難である。これらの組織から回収されたＮａｎＡ変異体の数は親菌株よりはるかに少ないが、肺炎球菌が脳に入ったとたん、神経細胞組織でのその存在すら、ＮａｎＡのさらなる毒性効果を明らかにしている。ＯＢ中のノイラミニダーゼ−変異体のレベル低下はおそらく、減少した輸送の結果であろう。この発見は、輸送がより侵襲性の疾患の前提条件であるという原則を強調し、輸送を低減できる介入、たとえばＮａｎＡを用いた免疫化がニューモニエ、髄膜炎、中耳炎および敗血症からの保護を提供するであろう。
【０１１３】
ｎａｎＡの既知配列のうち、ＴＩＧＲ配列は、表面アンカーを含有しない唯一の配列であろう。本菌株では、フレームシフトがＬＰＥＴＧ（配列番号１３）モチーフの前の、分子の切断を引き起こす（Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：４９８−５０６）。大半の菌株では、ＮａｎＡのかなりの部分がソルターゼによって細胞壁に共有結合されることが予想され（Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７６０−６３）、そこで電子顕微鏡写真によって検出されている（Ｃａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：３６８８−９５）。これらの試験では、ＴＩＧＲ４はＥＦ３０３０と同様に、ＮａｎＡ依存性輸送および嗅球での存在を示した。上澄みまたは細菌ペレットでのＮａｎＡ活性の局在化の試験から、ＴＩＧＲ４とは異なり、ＥＦ３０３０のＮａｎＡ活性は細胞に結合していることがわかった。それゆえＮａｎＡは、表面結合されてもされなくても、または分泌されてもされなくても、コロニー形成を促進できる。
【０１１４】
（実施例３）
（Ｓ．ニューモニエ病原性におけるガングリオシドの役割）
精製ノイラミニダーゼ、ＮａｎＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をＰＢＳ  １０μｌ中１、１０および５０μｇにて、ＯＮ／Ｅ単離の１５、３０、および６０分前に鼻腔内投与する。組織を４％パラホルムアルデヒドで固定して、パラフィン切片を作成した。ＧＭ１はビオチン化ＣＴ−Ｂを使用して、続いてストレプトアビジン−ＦＩＴＣによって染色し、染色強度を解析する。切片はローダミンに結合させたアシアロ−ＧＭ１特異性Ａｂｓによっても染色して、これらの組織においてＧＭ１染色の減少がアシアロ−ＧＭ１染色の増加と同時に起きることを確認する。同じ処置を受けるマウスの並行群をＳ．ニューモニエ菌株ＴＩＧＲ４およびＥＦ３０３０によるコロニー形成について、第１日および第４日に解析して、ノイラミニダーゼ処置が鼻腔内コロニー形成レベルの上昇を引き起こしたことを確認する。マウスに菌株ＥＦ３０３０の高用量（１ｘ１０８ＣＦＵ）を鼻腔内投与して、ＯＮ／Ｅは、鼻腔内攻撃後の第１日および第４日に以下の間隔、すなわち、１、３、６、および１２時間にて単離する。ＯＮ／Ｅを上で概説したように染色し、ＧＭ１およびアシアロ−ＧＭ１発現について解析する。ＧＭ１の減少およびアシアロ−ＧＭ１発現の上昇が鼻組織で観察される場合、ＮａｎＡおよびＮａｎＢ欠損菌株も、それらが鼻道でのＧＭ１発現を変化させることが期待されないため、試験を行う。シアル酸残基の除去は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原の抗原決定基に相当する、次端部ジサッカライド、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−３）Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンを露出させ、そのためにＰＮＡは高い親和性を有する。それゆえＯＮ／Ｅ中のＰＮＡ−結合部位における変化は、ノイラミニダーゼ活性の別の尺度である。これらの組織から作成した凍結切片をＰＮＡ−ＦＩＴＣまたはＰＮＡ−ＨＲＰでただちに染色して（Ｍｅｄａｃ，ハンブルク、ドイツ）、顕微鏡検査に基づいてＰＮＡ−結合部位の増加が生じたかどうかを判定する（そこで教示した方法について、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  Ｊ．１９：１８７−１９５；Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．５６：７６１−７６５）。
【０１１５】
ＧＭ１部位は、菌株ＴＩＧＲ４またはＥＦ３０３０の鼻腔内投与の前に特異的に遮断される。これは：１）ＣＴ−Ｂ対非ガングリオシドコントロールタンパク質、たとえばオボアルブミン、２）ＧＭ１に対するＡｂｓ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）対正常ウサギ免疫グロブリン、または３）ＵＡＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡｎａｌｙｓｉｓおよびＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで合成されたＧＭ１特異性ペプチドを使用して、３つの方法で着手される。ＧＭ１特異性ペプチドによる阻害は、ＣＴ−ＢおよびおそらくＧＭ１に対するＡｂｓが随伴性の炎症を引き起こすことが予想されるため、最良の手法である。これらの実験では、ＯＮ／ＥおよびＯＢは、肺炎球菌性ＣＦＵの投与後、第１日および第４日に解析する。ＧＭ１を遮断する代わりの手法は、ＧＭ１結合ペプチドに対して選択されるファージ提示ペンタデカペプチドライブラリの使用によって発見されたＧＭ１結合ペプチドの使用である。このＧＭ１結合ペプチドＶＷＲＬＬＡＰＰＦＳＮＲＬＬＰ（配列番号５）は、ＧＭ１に対する高い親和性（１０１０Ｍ−１）および１．０μＭのＩＣ５０を有する。Ｍａｔｓｕｂｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５６：２５３−２５６。同じ長さの、ランダムに選択された配列中の同じアミノ酸より成るペプチドをコントロールとして使用する。両方のペプチドのＧＭ１結合能力は、生体内で使用する前にＥＬＩＳＡによって確認する。最初に、リンゲル液またはＰＢＳ  １０μｌ中のこれら２つのペプチド１００μｇを、菌株ＥＦ３０３０  ３Ｘ１０６ＣＦＵの投与の１０分前に鼻腔内投与する。第１日および第４日の投与後に、ＯＮ／ＥをＣＦＵについて、未処置ＣＢＡ／Ｎマウスに対するＣＦＵの数について解析する。
【０１１６】
遮断実験は、ＰＡＦ（Ｂｉｏｍｏｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．プリマスミーティング、ペンシルベニア州）およびＰＡＦ−Ｒアンタゴニストオクチルオニウムブロミド（Ｂｉｏｍｏｌ）を用いて実施する。本化合物は、高い親和性でＰＡＦ−Ｒに結合する。各ガングリオシドは個別に試験を行う。混合ガングリオシド以外に、アシアロ−ＧＭ１、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびＧＭ３（Ｓｉｇｍａ）を、攻撃後、第１日および第４日に評価するように鼻腔内コロニー形成を阻害するその能力について試験を行う。各種のガングリオシドは、これらのプロセスを遮断できる。ＧＭ３ガングリオシドは、公開されているＣポリサッカライド結合モチーフを欠いているため、負のコントロールとして機能する。ガングリオシドプレインキュベーション後にＥＦ３０３０によるコロニー形成に対して示されたデータに基づき、混合ガングリオシドは、コロニー形成の遮断ではアシアロ−ＧＭ１よりも有効である。これは、アシアロ−ＧＭ１以外の他のガングリオシドが、鼻道、肺および脳の肺炎球菌性コロニー形成のプロセスに関与することを示している。これらのガングリオシド阻害試験は、ＴＩＧＲ４菌株およびそのノイラミニダーゼ変異体に焦点を当てている。ＴＩＧＲ４菌株を用いたガングリオシドコーティングＥＬＩＳＡプレートでの短期試験管内インキュベーションは、ＴＩＧＲ４菌株のアシアロ−ＧＭ１への結合を証明した。エンテロトキシンは、鼻道での肺炎球菌−ガングリオシド相互作用を異なるふうに遮断する別の手段を提供する。ＣＴおよびＬＴｈ−１はどちらも、両方の血清型Ｉ易熱性エンテロトキシン（Ｐｉｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６５：３４８−３５２）であり、わずかに異なるが、同様のガングリオシド結合特異性を示す。Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．５６：１７４８−１７５３．ＣＴ（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，キャンベル、カリフォルニア州）はＧＭ１に、そしてより低い程度でＧＤ１ｂに結合する。ＬＴｈ−１は、ＧＭ１およびＧＤ１ｂに優先的結合を示し、ＧＭ２およびアシアロ−ＧＭ１に弱く結合する。Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．５６：１７４８−１７５３。Ｓ．ニューモニエと相互作用する主なガングリオシドである場合、ＬＴｈ−１の使用は  ＧＭ１ガングリオシドを遮断するだけでなく、アシアロ−ＧＭ１も遮断し、このことはノイラミニダーゼ活性を必要としない、天然の頻度の低い結合を示す。血清型ＩＩによる易熱性エンテロトキシンは、異なるガングリオシド結合特異性、特に易熱性エンテロトキシンＬＴ−ＩＩｂを示す。この毒素は、ＧＤ１ａに、より低い程度でＧＴ１ｂに結合して、ＧＭ１への親和性は示さなかった。Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．５６：１７４８−１７５３。ＬＴ−ＩＩａは、高い親和性でＧＤ１ｂに、より低い親和性でＧＭ１、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＤ２、ＧＤ１ａ、およびＧＭ２に結合する。Ｆｕｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ��５６：１７４８−１７５３。ＬＴ−ＩＩ毒素は、Ｔ．Ｄ．Ｃｏｎｎｅｌｌ博士のご厚意により提供された。鼻用量および最適期間を最適化してＯＮ／Ｅへの肺炎球菌の結合の阻害を観察するために、最初に用量反応試験（１．０または１０μｇ）を、Ｓ．ニューモニエの鼻腔内投与に与えられる選択したエンテロトキシンに対して実施する。鼻腔内コロニー形成の阻害が第４日に観察された場合、観察は第１１日まで延長され、その間にエンテロトキシンを１日おきに与える。ＣＢＡ／ＮマウスのＯＮ／ＥおよびＯＢにおけるＣＦＵを測定する。
【０１１７】
（実施例４）
（肺炎球菌性病原性におけるＣポリサッカライド特異性抗体の役割）
テイコ酸としても既知の肺炎球菌性Ｃポリサッカライドは、リポテイコ酸としても既知の肺炎球菌Ｆ抗原と構造的に同じである。Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１５：８５１−８５７。これはグラム陽性細菌の中でＳ．ニューモニエ独自の特徴である。これらの分子の主要抗原決定基は、ホスホリルコリン（ＰＣ）残基であり、ＰＣに対するＡｂｓは、ｉ．ｐ．または経鼻肺炎球菌攻撃に対して保護的である。Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１０２７−１０３０；Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：８８−９０；Ｙｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３６：１８４−１８８；Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：３０５−３０９。それゆえ受動伝達または能動鼻腔内免疫化のどちらかによって得られたＰＣ特異性Ａｂｓの役割が調査される。保護性ＰＣ特異性Ａｂｓの受動伝達では、すなわちＩｇＧ３（５９．６Ｃ５）およびＩｇＭ（２２．１Ａ４）アイソタイプの両方のＴ１５イディオタイプモノクローナルＡｂｓ（ｍＡｂｓ）が使用される。Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：８８−９０。Ｔ１５イディオタイプは、おそらくＣポリサッカライドをより効率的に結合することによって、マウスの肺炎球菌感染に対してＭ６０３またはＭ５１１イディオタイプよりも保護性であることが示されている（Ｂｒｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１０２７−１０３０）。受動Ａｂｓ伝達は、鼻腔内投与された肺炎球菌を用いたＴ１５  Ａｂｓ（１００μｇ）の直接投与を含み、鼻腔内コロニー形成を低減するためのｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与されたＡｂｓと比較する。コロニー形成は経時的に監視し（第４日、第１１日、第１８日）、これらの実験の異なる群の間で著しい相違が観察されない場合、ｍＡｂｓ（２０μｇ）を１日おきに鼻腔内投与する。ＣＢＡ／Ｎマウスは、Ｔ１５イディオタイプ抗ＰＣ  Ａｂｓを生成しない。抗ＰＣ特異性Ａｂｓの受動伝達が、鼻道中で粘膜ＩｇＡまたはＰＣ特異性Ａｂｓの他のアイソタイプを誘発することは予想されない。鼻Ａｂｓを誘発するために、２つの異なる手法を取る。１つは、Ｃポリサッカライドに対するＡｂ反応を誘発することが既知である、プロテアーゼ処置Ｒ３６Ａ菌株の直接鼻腔内投与である。抗ＰＣ  Ａｂｓの保護免疫が試験されてきたが、鼻道などの粘膜表面でのその役割に関するデータは入手できない。ＣＢＡ／ＮマウスＸ染色体関連免疫不全は、Ｔ１５イディオタイプの抗ＰＣ  Ａｂｓの産生不能を引き起こす。この不能の重要性を判定するために、ＣＢＡ／Ｎマウスをその野生種対応物のＣＢＡ／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と比較する。抗ＰＣ  Ａｂｓ誘発のための菌株Ｒ３６Ａによる免疫化は、表面タンパク質のタンパク質分解除去を含む。Ｋｒａｕｓｅ（１９７０）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１−５６。鼻腔内免疫化の代わりの手法は、上述したようなＰＣのタンパク質キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）へのカップリングである���そこで教示した方法について、参照により本明細書に組み入れられている、Ｋｒａｕｓｅ（１９７０）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２：１−５６；Ｃｈｅｓｅｂｒｏ  ａｎｄ  Ｍｅｔｚｇｅｒ（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：７６６−７７１）。ＰＣ−ＫＬＨを用いた鼻腔内免疫化は、粘膜免疫反応を最適化するために、粘膜アジュバントＣＴを用いて実施される。マウスは、コロニー形成に対するＣＴの効果を防止するために、最後の免疫化の２〜３週間後に攻撃される。１週間間隔で３回の鼻腔内免疫化を実施する。当業者によって通常実施される通りにＣポリサッカライドおよびＰＣ特異性ＥＬＩＳＡを使用して、血清Ａｂ力価を監視する。ＰＣ特異性ＥＬＩＳＡでは、ＰＣは上述のようにＢＳＡに結合される（そこで教示した方法について、参照により本明細書に組み入れられている、Ｃｈｅｓｅｂｒｏ  ａｎｄ  Ｍｅｔｚｇｅｒ（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：７６６−７７１）。血清に加えて、鼻洗浄液、唾液、および気管支洗浄液中のＡｂ力価を測定する。これらの解析は、粘膜分泌物および血清の両方でのＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＧ−サブクラス分布を含む。最適な粘膜Ａｂ力価を誘起するプロトコルを使用して、第４日および第１１日にコロニー形成が監視された後にマウスに〜５ｘ１０６ＣＦＵで投与される、ＴＩＧＲ４菌株による粘膜攻撃試験を実施する。免疫化試験では、正常な完全免疫適格性マウス（ＣＢＡ／Ｊ菌株）はもちろんのこと、ＣＢＡ／Ｎマウスも以前の試験と同様に使用する。Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：２８７１−２８７５。
【０１１８】
（実施例５）
（Ｓ．ニューモニエ病原性におけるノイラミニダーゼ特異性抗体の役割）
鼻腔内攻撃前にマウスを鼻腔内免疫化するために、市販のＳ．ニューモニエ由来ノイラミニダーゼを使用する（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）。しかしながら、提案された試験に十分な量のタンパク質を得るために、ＮａｎＡ遺伝子はヒスチジンタグ含有発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＥ．コリ内でクローニングおよび発現させる。粘膜免疫反応を最適化するために、３．４％ホルムアルデヒド処置ノイラミニダーゼの鼻腔内免疫化を対の未処置ノイラミニダーゼと、ＣＴの存在下または非存在下で比較する。これらの免疫化は、ＣＢＡ／ＮおよびＣＢＡ／Ｊマウスの両方で実施する。３回の鼻腔内免疫化を１週間おきに与え、その間に血清および唾液Ａｂｓ力価をＥＬＩＳＡによって監視する。免疫マウスをＴＩＧＲ４菌株によって攻撃して、ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、脳、血液、脾臓、および肺のコロニー形成を第４日および第１１日に比較する。宿主の相互作用を遮断するために、ノイラミニダーゼおよびＣポリサッカライド特異性Ａｂｓの両方を同時に誘発させる。鼻腔内免疫化をノイラミニダーゼおよびＴ１５イディオタイプｍＡｂｓの伝達による受動免疫保護と組み合せた計画を使用する。
【０１１９】
（実施例６）
（Ｓ．ニューモニエを用いた鼻腔内攻撃に対して保護するためのノイラミニダーゼ−ＰＣ結合体の有効性）
保護の向上を評価し、単独で使用された各抗原と比較して第１１日のＥＦ３０３０およびＴＩＧＲ４菌株による鼻腔内コロニー形成を低下させるために、マウスを鼻腔内アジュバントとしてのＣＴと組み合せたノイラミニダーゼおよびＰＣ−ＫＬＨによって免疫化する。加えて、鼻洗浄液、唾液、および血清のＡｂ力価を上述のように解析して、免疫パラメータを鼻道内での肺炎球菌に対する保護度と関連付ける。さらに最適な免疫反応を発生させるために、ホスホコリンをノイラミニダーゼに直接結合させる。この作成物を、ＣＢＡ／ＮおよびＣＢＡ／Ｊマウスの両方における鼻腔内および全身免疫化の後に、アジュバントとしてのＣＴを用いて、またはＣＴなしに送達したときに免疫原性について試験を行う。鼻洗浄液、唾液、および血漿のＡｂ力価をＥＬＩＳＡによって測定する。攻撃試験は、菌株ＥＦ３０３０  １０７ＣＦＵまたはＴＩＧＲ４  １０６ＣＦＵを用いて実施する。マウスを攻撃後、第１１日に殺処分して、血液、鼻洗浄液、ＯＮ／Ｅ、ＯＢ、および脳で観察されたＣＦＵについて解析した。ＰＣに結合させたノイラミニダーゼによる免疫化は、粘膜および全身Ａｂレベルを上昇させることによって、これらの２つの毒性成分に対する保護を向上させる。抗原特異性ＩｇＧサブクラスの分布は、他の粘膜アジュバントを使用することによって変更される。ＣＴは、Ｔｈ２−、ＬＴ混合Ｔｈ２／Ｔｈ１−、およびＣｐＧモチーフ、たとえばＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６  ａ  Ｔｈ１型反応をＩｇＧサブクラス分布の関連する変化と共に引き起こす。各種のアジュバントは、ノイラミニダーゼ−Ｃポリサッカライド特異性免疫がＳ．ニューモニエによる鼻腔内コロニー形成から保護する能力をさらに向上させ、新たな肺炎球菌性ワクチン手法の考案をもたらす。
【０１２０】
（実施例７）
（鼻腔内攻撃後のＳ．ニューモニエの鼻腔内コロニー形成の、抗ホスホコリン特異性モノクローナル抗体による阻害）
合計１Ｘ１０６ＣＦＵのＴＩＧＲ４菌株を、ＩｇＧ３サブクラスまたはＩｇＭアイソタイプのどちらかの抗ホスホコリンモノクローナル抗体５μｌでインキュベートした。合計５μｌを鼻孔ごとに投与した。投与９時間および１２時間後の鼻洗浄液５００ｍｌ中のＣＦＵをそれぞれ示す。どちらのモノクローナル抗体でも、重大な８０％超の減少が見られた。１グループ当たりマウス５匹の平均＋ＳＤを示す。データを図１０に示す。
【０１２１】
（実施例８）
（Ｓ．ニューモニエ鼻腔内投与後の神経細胞損傷および炎症）
Ｓ．ニューモニエ菌株ＥＦ３０３０の鼻腔内投与後、第１日、第３日、第７日および第１４日に処置マウスからＯＮ／Ｅ、ＯＢ、および脳を単離して、炎症性反応について組織学的に解析する。Ｄ３９またはＴＩＧＲ４菌株をそのｎａｎＡ変異体菌株と、炎症性反応を発生させるその能力について比較する。殺処分時に、マウスを２５℃のＰＢＳを用いて潅流して、Ｚａｍｂｏｎｉ固定液１０ｍｌ（０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド、１５％ピクリン酸による潅流を続ける。ＯＢおよびＯＮ／Ｅを除去し、次に４℃の新しい４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に一晩置いた。次に、切断前に凍結を防止するために、組織を４℃の３０％スクロース溶液に移して４８時間置いた。次に組織をＯＣＴ中で凍結させ、切片（６μｍ）を事前にコーティングした顕微鏡スライド上に置いた（生理的食塩水中１０％ＢＳＡ）。最初にヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を実施して、この期間中にＯＢ、三叉神経節およびＯＮ／Ｅに浸透する（ｉｎｆｉｔｒａｔｅ）炎症性細胞を検出する。神経細胞損傷を評価するために、神経成長因子β１（ＮＧＦ−β１）を染色する。ＮＧＦ−β１は、神経細胞損傷の後に生成され、アポトーシスを防止し、神経細胞の新たな成長を刺激するように機能する。三叉神経節およびＯＢ切片をビオチン化ウサギ抗ヒトＮＧＦ−β１Ａｂによって０．２μｇ／ｍｌの濃度で染色する。Ａｂ染色切片を４℃にて一晩インキュベートする。スライドをＰＢＳですすぎ、次にアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）のＶｅｃｔａｓｔａｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，バーリンゲーム、カリフォルニア州）によって２５℃にて３０分間反応させた。組織をＰＢＳで３回すすぎ、次に以前に報告したようにジアミノベンジデン（ＤＡＢ）と５〜１０分間反応させる。スライドをさらに３回すすぎ、切片をＣ．Ｓ．ヘマトキシリンによって３０秒間対比染色する。Ｈ２Ｏでの洗浄後、スライドを１００％アルコールおよびキシレン中で脱水する。ＮＧＦ−β１の増加は、神経細胞組織の損傷度の指標を与える。神経細胞関与の別の指標は、小膠細胞の活性化である。活性化された小膠細胞は、アメーバ様球状形状を示し、これに対して静止細胞（Ｇ０／Ｇ１）は、樹枝状の分裂した外観を有する。活性化時のこのような変化によって、静止および活性化小膠細胞を区別できる。小膠細胞では、Ｓ．ニューモニエ攻撃後の活性化状態に対処するために、Ｆ４／８０抗体または抗ＭＡＣ−１（ＭＩ／７０）が使用される。神経細胞損傷および小膠細胞活性化に加えて、ＯＢのアポトーシスの誘発が評価される。このために、活性カスパーゼ３である、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ特異性プロテアーゼの誘発がアポトーシス経路の開始において重要であるため、それが解析される。活性カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ビバリー、マサチューセッツ州）に対して特異性のＡｂは、アポトーシスの検出のために免疫組織化学で使用できる。カスパーゼ３活性が免疫組織化学によって神経細胞組織で検出されると、活性は、基質のタンパク質分解後の蛍光信号に基づくカスパーゼ−３アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，��ージーン、オレゴン州）を用いて定量される。
【０１２２】
（実施例９）
（逆行性軸索輸送による、Ｓ．ニューモニエが嗅球を標的化する能力）
第一に、鼻腔内またはｉ．ｖ．接種後の処置マウスの神経細胞組織、ＯＢおよび脳への肺炎球菌の蓄積を評価する。ｉ．ｖ．接種後、神経細胞組織のどの肺炎球菌も血液を通じて侵入する。鼻腔内攻撃後の第１日、第４日、第１１日および第１８日の組織を収集する。その場合、脳およびＯＢ１グラム当たりの細菌数は、注射後のすべての時点で同様なはずである。これに対して、鼻腔内接種後の鼻道を通じて侵入する細菌では、ＯＢへの蓄積（組織重量当たりで表される）が先に起こり、一般に脳で観察される蓄積が待ち構えている。
【０１２３】
第二に、鼻腔内投与後の肺炎球菌の生体内撮像が実施される。テクネチウム−９９（Ｔｃ−９９ｍ）標識ＴＩＧＲ４、安定不透明および透明改変体、ＥＦ３０３０、ならびにｎａｎＡおよび／またはｎａｎＢを欠いたＴＩＧＲ４変異体を使用して、Ｗａｉｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８９７−  ９０１によって最初に述べられた方法を使用して、アデノウィルスで以前に実施されたようにガンマカメラ撮像を使用して、マウスにおけるその存在を描出する。これは、このアイソトープの短い半減期（６時間）のために、鼻腔内投与後、最初のほぼ２４時間の撮像を可能にし、鼻道で発生する早期の事象の解析を可能にする。肺炎球菌の長期撮像では、ルシフェラーゼ−またはＧＦＰ−発現肺炎球菌性ＥＦ３０３０（またはＴＩＧＲ４）菌株を使用して、生体内での生体発光を描出する。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（アラメダ、カリフォルニア州）から市販されているルシフェラーゼ発現肺炎球菌菌株ＥＦ３０３０を使用する。この肺炎球菌性菌株を用いた生体内撮像の成功が以前に報告されている。マウスは生体発光撮像システム（ＩＶＩＳ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して撮像して、ルシフェラーゼ発現を検出する。同じ位置に向けたマウスで、常にルシフェリン２．５ｍｇのｉ．ｐ．注射の１０分後に画像を収集する。撮像の間、マウスを３７℃にてエンフルレン麻酔状態に維持する。撮像は各マウスに対して、ルシフェラーゼ−発現肺炎球菌を用いた鼻腔内攻撃後の第２日から開始して第１８日まで、複数回実施する。撮像の画像取込時間は、２０秒〜１０分間の範囲である。データ取込ソフトウェアは、画像収集中にいずれの画素も飽和しないようにする。興味のある領域からの発光（相対光子／秒）を、Ｘｅｎｏｇｅｎ提供のソフトウェアを使用して定量する。発光の強度は、生体発光画像の擬似カラースケーリングを用いて表す。生体発光画像は通例、同時に収集されたマウスの白黒写真にオーバーレイされる。この生体内撮像は、肺炎球菌が鼻道からＯＢへ侵入する能力を分析することに焦点を当てている。この生体発光試験は、ルシフェラーゼ遺伝子の伝達成功後に、ｎａｎＡ  ＴＩＧＲ４変異体へと拡張される。
【０１２４】
本出願を通じて、各種の公報が参照されている。これらの公報のその全体の開示は、本明細書で説明する化合物、組成物および方法をさらに十分に説明するために、この出願内への参照により本明細書に組み入れられている。
【０１２５】
各種の改良および変形を、本明細書で説明する化合物、組成物および方法に行うことができる。本明細書で説明する化合物、組成物および方法の他の態様は、本明細書で開示された化合物、組成物および方法の明細書および慣行の検討から明らかになるであろう。明細書および実施例は一例として考慮されるものとする。
【０１２６】
（参考文献）
【０１２７】
【化１】
2011160812.tif 000007
【０１２８】
【化２】
2011160812.tif 000008
【０１２９】
【化３】
2011160812.tif 000009
【０１３０】
【化４】
2011160812.tif 000010
【０１３１】
【化５】
2011160812.tif 000011
【０１３２】
【化６】
2011160812.tif 000012
【０１３３】
【化７】
2011160812.tif 000013
【０１３４】
【化８】
2011160812.tif 000014
【０１３５】
【化９】
2011160812.tif 000015
【０１３６】
【化１０】
2011160812.tif 000016
【０１３７】
2011160812.tif 000017
2011160812.tif 000018
2011160812.tif 000019
2011160812.tif 000020
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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