(57)【要約】【課題】シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子を見出す。【解決手段】ショットガンシークエンス法によって、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列を突き止めた。その結果、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子のコードするアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列のＮ末端は、同じシュードモナス属のシュードモナス・フルオレセンスの公知のアセチルコリンエステラーゼの従来公知のＮ末端のアミノ酸配列とは全く異なるものであった。また、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼには、従来報告されていないアセチル−Ｌカルニチンの加水分解活性が認められた。【選択図】図４
2011160730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列がコードするアミノ酸に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列のうち１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列、
のいずれかの塩基配列からなる、アセチルコリンエステラーゼ遺伝子。
【請求項２】
前記遺伝子がシュードモナス・エルギノーザ由来である、請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
ベクターと、前記ベクターに作動可能に連結されてなる請求項１または２記載の遺伝子と、を備える、アセチルコリンエステラーゼ発現ベクター。
【請求項４】
前記遺伝子の上流に作動可能に連結されてなるコールドショックプロモーターをさらに備える、請求項３記載のアセチルコリンエステラーゼ発現ベクター。
【請求項５】
請求項３または４記載のアセチルコリンエステラーゼ発現ベクターを細胞に導入してなる形質転換体。
【請求項６】
前記アセチルコリンエステラーゼ発現ベクターと共発現する分子シャペロン発現ベクターをさらに導入されてなる、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項５又は６記載の形質転換体。
【請求項８】
アセチルコリンエステラーゼを生産する方法であって、
請求項５乃至７いずれかに記載の形質転換体を培養する工程と、
前記形質転換体またはその培地からアセチルコリンエステラーゼを抽出する工程と、
を含む生産方法。
【請求項９】
アセチル−Ｌ−カルニチンの分解に用いるアセチルコリンエステラーゼであって、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列がコードするアミノ酸配列、
のいずれかのアミノ酸配列からなる、アセチルコリンエステラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルコリンエステラーゼ遺伝子、その遺伝子を発現するベクター、その遺伝子を導入してなる形質転換体、その形質転換体を用いるアセチルコリンエステラーゼの生産方法、およびアセチル−Ｌ−カルニチンの分解に用いるアセチルコリンエステラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリンエステラーゼは、動物において神経組織、赤血球などに存在し、コリン作動性神経で神経伝達物質であるアセチルコリンを加水分解し酢酸を生成する加水分解酵素である。
【０００３】
現在市販されているアセチルコリンエステラーゼは、電気ウナギ等の動物由来のエステラーゼであるが、微生物であるシュードモナス・エルギノーザからも微量ではあるが分離されている（非特許文献１）。
【０００４】
アセチルコリンエステラーゼをはじめとするコリンエステラーゼを阻害するコリンエステラーゼ阻害薬は、アルツハイマー改善薬として知られている塩酸ドネペジルなどの医薬品として用いられている。また、コリンエステラーゼ阻害薬は、有機リン系農薬や毒ガスとしても用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】"Purification and Characterization of the Cholinesterase of Pseudomonas aeruginosa A-16", Agr. Biol. Chem., 39, 1287-1294, 1975
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般に、酵素の構造と機能を研究する上では多量の精製酵素が必要となる。しかしながら、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼは多量の精製酵素を取得することが非常に困難であり、非特許文献１にも記載されているように５５０リットルの培養液から９ｍｇというごくわずかな酵素しか精製することができなかった。そのため、多量の精製酵素を取得するためにアセチルコリンエステラーゼの生産効率を高めた形質転換体を作成する必要があったが、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼは、そのアミノ酸配列およびそのアミノ酸に対応する遺伝子の塩基配列は解明されていなかった。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子を見出すことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、アセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号１で表される塩基配列からなる、アセチルコリンエステラーゼ遺伝子が提供される。この塩基配列からなる遺伝子は、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子であり、アセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることが実証されている。
【０００９】
また、本発明によれば、ベクターと、そのベクターに作動可能に連結されてなる上記の遺伝子と、を備える、アセチルコリンエステラーゼ発現ベクターが提供される。このベクターは、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼを好適に発現することが可能である。
【００１０】
さらに、本発明によれば、上記のアセチルコリンエステラーゼ発現ベクターを細胞に導入してなる形質転換体が提供される。この形質転換体は、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼを好適に発現することが可能である。
【００１１】
そして、本発明によれば、アセチルコリンエステラーゼを生産する方法であって、上記の形質転換体を培養する工程と、その形質転換体またはその培地からアセチルコリンエステラーゼを抽出する工程と、を含む生産方法が提供される。この生産方法によれば、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼを好適に生産することが可能である。
【００１２】
なお、上記のいずれの発明においても、（ａ）配列番号１で表される塩基配列は、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列がコードするアミノ酸に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列のうち１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、または（ｄ）配列番号１で表される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列、のいずれかの塩基配列であってもよい。このように、天然のシュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子に対する変異遺伝子であっても、天然の遺伝子に対して高いホモロジーを有していれば、天然の遺伝子と同様の作用効果を有することは当業者には自明のことである。
【００１３】
また、本発明によれば、アセチル−Ｌ−カルニチンの分解に用いるアセチルコリンエステラーゼであって、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる、アセチルコリンエステラーゼが提供される。このアミノ酸配列からなるアセチルコリンエステラーゼは、後述する実施例で示すように、アセチル−Ｌ−カルニチンを分解する活性を有することが実証されている。
【００１４】
なお、上記の発明において、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列は、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、または（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列がコードするアミノ酸配列、のいずれかのアミノ酸配列であってもよい。このように、天然のシュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼに対する変異酵素であっても、天然の酵素に対して高いホモロジーを有していれば、天然の酵素と同様の作用効果を有することは当業者には自明のことである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、シュードモナス・エルギノーザ由来の新規な塩基配列のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子およびその変異遺伝子が得られる。そのため、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼおよびその変異酵素を大量かつ効率的に生産することができる。
【００１６】
また、本発明によれば、アセチル−Ｌ−カルニチンを分解することができるシュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼおよびその変異酵素を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】シュードモナス・エルギノーザＰＡ０１株のアセチルコリンエステラーゼ（ＰＡ０１）での酵素活性、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株からクローニングし大腸菌で発現させたアセチルコリンエステラーゼ（ＡＥＡ）での酵素活性、実施例４で作成した大量発現系で発現したアセチルコリンエステラーゼ（ＥＪ１）の酵素活性を示す表である。
【図２】実施例４で作成した大量発現系で発現したアセチルコリンエステラーゼの酵素活性を示すグラフである。
【図３】シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼをコードする塩基配列（配列番号１）を示す図である。
【図４】シュードモナス・エルギノーゼ由来のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図５】電気ウナギ等の動物由来のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列とシュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列とを比較した結果を示す図である。
【図６】電気ウナギ等の動物由来のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列とシュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列とを比較した結果を示す図の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜発明の経緯＞
アセチルコリンエステラーゼは動物において神経伝達に関わる酵素として知られており、アセチルコリンを加水分解し、コリンと酢酸を生成する加水分解酵素である。一方、微生物もアセチルコリンエステラーゼを生産することが知られており、その生産菌としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌が知られている。本発明者は、新たな研究テーマとしてアセチルコリンエステラーゼを取り上げようとした。
【００１９】
本酵素はすでに１９７０年代にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから精製されていた（非特許文献１）が、その生産量は非常に少ない。酵素の構造と機能を研究する上で多量の精製酵素が必要となるが、アセチルコリンエステラーゼの場合、多量の精製酵素を取得することが非常に困難であった。そこで、本発明者は、本酵素遺伝子をクローニングし、大量発現させることを試みた。
【００２０】
本発明者は、鋭意試行錯誤の末に、すでに全塩基配列が明らかになっているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１を供試菌株とし、活性発現を指標としたショットガンクローニングによりアセチルコリンエステラーゼ遺伝子のクローニングに成功した。本発明者は、さらに本遺伝子を大量発現用ベクターに組換え、融合タンパク質として大量発現に成功した。
【００２１】
本発明者は、本酵素の基質特異性を検討したところ、従来報告がなかったアセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解することが明らかとなった。また、本発明者は、その活性はアセチルコリンの３〜５％程度であることを見出した。
【００２２】
＜用語の説明＞
（ｉ）アセチルコリンエステラーゼ
本明細書において「アセチルコリンエステラーゼ」（ＡＣｈＥ、真性コリンエステラー）とは、アセチルコリンをコリンと酢酸に分解する酵素活性を有する酵素を意味する。なお、本明細書において「アセチルコリンエステラーゼ」は、天然のアミノ酸配列のアセチルコリンエステラーゼのみならず、天然のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列を改変してなる変異アセチルコリンエステラーゼを含む概念であるものとする。また、本明細書において「アセチルコリンエステラーゼ遺伝子」は、天然の塩基配列のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子のみならず、天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列を改変してなる変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子を含む概念であるものとする。
【００２３】
（ｉｉ）シュードモナス・エルギノーザ
本明細書において「シュードモナス・エルギノーザ」（別名：緑膿菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）とは、グラム陰性好気性桿菌に属する真正細菌の一種を意味する。２０００年には、緑膿菌のＰＡＯ１株の全ゲノム解読が完了しているが、２０１０年現在の本願出願時でも未だＰＡＯ１株の全ゲノム上のどのＯＲＦがアセチルコリンエステラーゼ遺伝子であるのはか公知ではなかった。
【００２４】
（ｉｉｉ）相同性
本明細書において「相同性」とは、２つもしくは複数間のアミノ酸配列の同一のアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。また、いかなる保存的置換も同一と考えない。また、最適に整列した状態において、オーバーラップするアミノ酸を含めた全アミノ酸残基に対する、同一のアミノ酸数の割合を意味する。整列のための方法、割合の算定方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られており、一般的な配列分析プログラム（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓなど）を使用して測定することができる。また「相同性」は、２つもしくは複数間のＤＮＡ鎖、または２つもしくは複数間のＲＮＡ鎖において、同一の塩基の割合を、上記と同様に当該技術分野で公知の方法に従って算定したものである。
【００２５】
（ｉｖ）ハイブリダイズ
本明細書においてポリヌクレオチドに適用される場合の「ハイブリダイズ」とは、ヌクレオチドの塩基間の水素結合等によってヌクレオチド間の対ができる性質のことを表す。塩基対はワトソン・クリック型塩基対、フーグスティーン型塩基対、または任意の他の配列特異的な形で生じうる。塩基対は二本鎖構造を形成する二本鎖、複数本鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含む。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような場合にも起こりうる。ハイブリダイゼーションが２つの１本鎖ポリヌクレオチド間において逆平行配置で生じる場合、それらのポリヌクレオチドは「相補的である」または「相補鎖」と言われる。
【００２６】
（ｖ）ストリンジェントな条件
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、例えば（１）洗浄のための低イオン強度と高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いる、（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、および７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いる、（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸と、４２℃において０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での洗浄および５５℃のホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなるストリンジェントな洗浄を含む条件であっても良い。なお、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に決定でき、一般的にプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する。一般に、長いプローブは適当なアニーリングのために高温を必要とし、短いプローブは低温を必要とする。また一般に、ストリンジェンシーは塩濃度に逆比例する。
【００２７】
（ｖｉ）コールドショックプロモーター
本明細書において「コールドショックプロモーター」とは、通常の培養温度から低温に移すとコールドショックを受け、制御する遺伝子の発現量を安定的に増加させるプロモーターをいう。具体的には、例えば、大腸菌では通常の培養温度（３７℃）から低温（１０〜１５℃）に移すとコールドショックを受け、常温で発現している遺伝子の発現レベルが極端に減少し、コールドショックプロモーターが制御するコールドショックタンパク質の遺伝子の発現が増加する。
（ｖｉｉ）シャペロン
本明細書において「シャペロン」  （ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）とは、他のタンパク質分子が正しい折りたたみ（フォールディング）をして機能を獲得するのを助けるタンパク質の総称を意味する。大腸菌をはじめとする真正細菌で機能するシャペロンにＧｒｏＥＬ（グループＩ型シャペロニン）がある。このシャペロンはコシャペロン（シャペロン補助因子）ＧｒｏＥＳの共存によって正常に機能することができる。ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳはシャペロニンとコシャペロニンと呼ばれることもある（シャペロンとして最初に明らかにされたためこう命名された）。
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜実施形態１：アセチルコリンエステラーゼ遺伝子＞
本実施形態に係るシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子は、配列番号１で表される９２４残基の塩基配列からなる遺伝子である。この塩基配列からなる遺伝子は、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子であり、アセチルコリンエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることが実証されている。
【００２９】
なお、このシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列がコードする配列番号２のアミノ酸配列は、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のアセチルコリンエステラーゼの従来公知のＮ末端のアミノ酸配列（参照文献：Biochimica et Biophysica Acta, 1385, 126-138, 1998）と全く異なるものであった。参考までに、下記にこれら２種の微生物のアセチルコリンエステラーゼのＮ末端のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
シュードモナス・エルギノーザ
ＭＲＴＲＬＰＡＬＬＬＧＶＬＬＡＧＱＡＣＧＨＴＳＰＬ（配列番号５）
シュードモナス・フルオレセンス
ＡＥＰＬＫＡＶＧＡＧＥＧＱＬＤＩＶＡＷＰＧＹＩＥＡ（配列番号６）
【００３１】
このように、本発明者がショットガンシークエンスによって同定したクローンから読み出したシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼのＮ末端のアミノ酸配列は、驚くべきことに、同じシュードモナス属のシュードモナス・フルオレセンスの公知のアセチルコリンエステラーゼの従来公知のＮ末端のアミノ酸配列とは全く異なるものであった。
【００３２】
なお、繰り返しになるが、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼは多量の精製酵素を取得することが非常に困難であり、非特許文献１にも記載されているように５５０リットルの培養液から９ｍｇというごくわずかな酵素しか精製することができなかった。そのため、多量の精製酵素を取得するためにアセチルコリンエステラーゼの生産効率を高めた形質転換体を作成する必要があったが、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼは、そのアミノ酸配列およびそのアミノ酸に対応する遺伝子の塩基配列は解明されていなかった。さらに、同様の理由から、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼのＮ末端のアミノ酸配列も解明されていなかった。
【００３３】
そのため、本発明者も、通常ならば多量の精製酵素を取得してＮ末端のアミノ酸配列を解読し、その解読結果に基づいて既に解読済みのシュードモナス・エルギノーザのゲノムＤＮＡ全体の塩基配列内から対応するＯＲＦの候補を見つけ出し、それらを発現してみて活性を確認するという容易な方法を採用できず、実験上の苦労の多いショットガンシークエンス法を用いて多大な労力をかけてシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子のクローニングを行ったのである。その結果、判明したのは、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、同じシュードモナス属のシュードモナス・フルオレセンスの公知のアセチルコリンエステラーゼの従来公知のＮ末端のアミノ酸配列とは全く異なるものであるという予想外の事実であった。
【００３４】
また、得られたシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列およびその遺伝子のコードするアミノ酸配列は、さらに驚いたことには、電気ウナギ等の動物由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列およびその遺伝子のコードするアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列とも大きく異なっていた（図５および図６参照）。そして、詳しくは後述するが、さらに驚くべきことに、得られたシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼの酵素活性は、電気ウナギ等の動物由来のアセチルコリンエステラーゼの酵素活性と、アセチル−Ｄ−カルニチンおよびアセチル−Ｌカルニチンに対する基質特異性の面で大きく異なっていた。
【００３５】
このアセチルコリンエステラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を得る場合には、そのＤＮＡ断片は人工的に化学合成されてもよいが、シュードモナス・エルギノーザＰＡ０１株のゲノムから公知の手法を用いてクローニングされたり、そのゲノムからＰＣＲ法などを用いて人工的に増幅されたりしてもよい。あるいは、ベクター中に組み込んだ上で大腸菌などに導入して大腸菌およびベクターごと増幅させ、その後大腸菌の細胞内から抽出して得てもよい。
【００３６】
また、このアセチルコリンエステラーゼ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列の天然の遺伝子である必要はなく、天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列を改変してなる変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子であってもよい。
【００３７】
このような変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子としては、配列番号１で表される塩基配列がコードするアミノ酸に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるアセチルコリンエステラーゼ遺伝子が挙げられる。なお、この相同性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。この相同性が高ければ高いほど、変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子の活性が天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子に近似する可能性が高くなる。
【００３８】
さらに、この変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子は、（ｃ）配列番号１で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列のうち１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよい。なお、この欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数は、２０以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下または１以下であってもよい。この欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数が少なければ少ないほど、変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子の活性が天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子に近似する可能性が高くなる。
【００３９】
なお、この変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列のコードするアミノ酸配列が、配列番号１で表される塩基配列のコードするアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、および、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸同士の置換は保存的置換と総称される。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.）。
【００４０】
また、この変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であってもよい。このハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの説明は、既に用語の説明の欄において行ったので煩雑を避けるために繰り返さない。
【００４１】
本実施形態に係るシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子は、本発明者によるショットガンクローニングによりゲノムからのクローニングが成功しているため、この遺伝子を大量発現用ベクターに組換え、大量発現させることができる。そのため、この天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子またはその変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子を用いれば、多量の精製酵素を取得して酵素の構造および機能を明らかにする上で役立てることができる。さらに、現在市販されているアセチルコリンエステラーゼは、電気ウナギ等の動物から精製されたエステラーゼであるが、この天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子またはその変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子を用いれば、電気ウナギ等の動物から精製する場合に比べて微生物を用いて安価に多量の精製酵素を生産することが可能になる。
【００４２】
＜実施形態２：アセチルコリンエステラーゼ発現ベクター＞
本実施形態に係るアセチルコリンエステラーゼ発現ベクターは、ベクターと、そのベクターに作動可能に連結されてなる上記のアセチルコリンエステラーゼの遺伝子（シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来の天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子およびその変異遺伝子を含む）と、を備える。このベクターは、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼを好適に発現することが可能である。
【００４３】
ここで、このベクターとしては、特に限定されず、一般的な微生物等に導入可能なベクターを利用可能であるが、例えば、後述する実施例で用いられているｐＵＣ１８、ｐＥＴ２４ｂ、ｐＣｏｌｄＩ〜ＩＶなどを好適に用いることができる。通常は、これらのベクターにあらかじめ設けられているマルチクローニングサイトにおいて所定の制限酵素を用いて切断（Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行い、その後切断された箇所に上記のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子を挿入して所定のリガーゼ酵素を用いて連結（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行うことにより、アセチルコリンエステラーゼを発現する組換ベクターを得る。
【００４４】
そして、この組換ベクターは、上記のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の上流において作動可能に連結されてなるコールドショックプロモーターをさらに備えることが好ましい。このように、アセチルコリンエステラーゼ遺伝子の上流にコールドショックプロモーターを設けることによって、コールドショックを与えて下流のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の発現を誘導することが可能になる。すなわち、このようにすれば、アセチルコリンエステラーゼ遺伝子の発現の有無または強弱を自由に調製することができる。
【００４５】
コールドショックプロモーターとしては、低温で発現誘導できるプロモーター出あれば任意のものを用いることができるが、例えば、大腸菌の低温発現遺伝子のプロモーターであるｃｓｐＡプロモーターを好適に用いることができる。例えば、このｃｓｐＡプロモーターをあらかじめマルチクローニングサイトの上流に有するコールドショックベクターであるｐＣｏｌｄＩ〜ＩＶは、ｃｓｐＡ遺伝子の発現を制御するプロモーター配列や５’−ＵＴＲと呼ばれる配列の下流に製造しようとするタンパク質の遺伝子をつなげるようにしたプラスミドベクターであり、大腸菌に導入した後低温下に置くことにより、目的とするタンパク質を大量に発現させることができる。この方法を用いると大腸菌の全タンパク質中の最高６０−７０％を目的タンパク質として製造することができ、効率よく目的タンパク質を生産し回収するタンパク質生産工場として利用することが可能である。
【００４６】
例えば、ｃｓｐＡのプロモーターに目的の遺伝子をつないだ場合、３７℃では目的の遺伝子はまったく発現しない状態であっても、１５℃では新たに合成されるタンパク質の大部分が目的の遺伝子にコードされるタンパク質となるように高効率で発現させることも可能である。これはプロモーター領域などを含むタンパク質の発現領域のｍＲＮＡが３７℃では不安定であるが、１５℃では安定化するだけでなく、細胞内の他のタンパク質を造るのに必要なリボソームを全て奪ってしまうためだと考えられる（ＬＡＣＥ効果）。すなわち、コールドショック発現系では、可溶性発現の向上を期待できるだけでなく、低温発現により大部分の大腸菌タンパク質の発現が減少するため、目的タンパク質のみを効率よく回収することができることが期待される。
【００４７】
本実施形態に係るシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子またはその変異遺伝子の発現ベクターは、これらのアセチルコリンエステラーゼを大量発現させることができる。また、この発現ベクターにコールドショックプロモーターを設けることによって、さらに大量発現させたアセチルコリンエステラーゼを可溶化して活性を維持することができる。そのため、このアセチルコリンエステラーゼ発現ベクターを用いれば、多量の精製酵素を取得して酵素の構造および機能を明らかにする上で役立てることができる。さらに、現在市販されているアセチルコリンエステラーゼは、電気ウナギ等の動物から精製されたエステラーゼであるが、このアセチルコリンエステラーゼ発現ベクターを用いれば、電気ウナギ等の動物から精製する場合に比べて微生物を用いて安価に多量の精製酵素を生産することが可能になる。
【００４８】
＜実施形態３：形質転換体＞
本実施形態の形質転換体は、上記のアセチルコリンエステラーゼ発現ベクター（シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来の天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の発現ベクターおよびその変異遺伝子の発現ベクターを含む）を細胞に導入してなる形質転換体である。この形質転換体は、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼを好適に発現することが可能である。
【００４９】
ここで、この形質転換される細胞の種類は、特に限定されるものでなく、動物細胞および植物細胞などを排除する趣旨ではないが、取扱容易性および増殖性の面からは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの真菌細菌をはじめとする微生物細胞であることが好ましい。大腸菌の菌株は任意であるが、後述する実施例で大量発現の実績があるため、例えばＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株を用いることが特に好ましい。
【００５０】
また、この形質転換体には、アセチルコリンエステラーゼ発現ベクターと共発現する分子シャペロン発現ベクターをさらに導入してもよい。このようにシャペロンを共発現させることによって、アセチルコリンエステラーゼのタンパク質分子（シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来の天然のアセチルコリンエステラーゼおよびその変異アセチルコリンエステラーゼを含む）が正しい折りたたみ（フォールディング）をして機能を獲得するのを助けるので、大量発現した場合にもアセチルコリンエステラーゼのタンパク質分子が可溶化して機能を維持しやすくなる。
【００５１】
大腸菌をはじめとする真正細菌を形質転換する場合には、真菌細菌で機能するシャペロンであれば任意のものを利用できるが、このように真菌細菌で機能するシャペロンの中でも入手容易性、取扱容易性および優れたフォールディング活性の面からＧｒｏＥＬ（グループＩ型シャペロニン）を用いることが好ましい。このシャペロンはコシャペロン（シャペロン補助因子）ＧｒｏＥＳの共存によって正常に機能することができるため、さらに小シャペロンも共発現させてもよい。
【００５２】
上述のように、大腸菌コールドショック遺伝子ｃｓｐＡのプロモーターを利用したタンパク質発現系によれば、目的タンパク質の発現量は、最大で菌体タンパク質の６０％、新生タンパク質の９０％に達する場合がある。そのため、従来から汎用されている通常のｐＵＣ１８、ｐＥＴ２４ｂなどの発現系では発現できなかったタンパク質、あるいは発現しても可溶化が難しいタンパク質でも、ｐＣｏｌｄＩ〜ＩＶなどのコールドショック発現系を用いることで発現が可能となる場合や可溶化率が向上する場合がしばしば見られる。しかし、目的タンパク質によっては、ｐＣｏｌｄＩ〜ＩＶをはじめとするｃｓｐＡプロモーターを利用したタンパク質発現系を用いても十分な発現や可溶化が困難な場合もある。そのような際には、ｐＣｏｌｄＩ〜ＩＶとシャペロンベクターの共発現により、目的タンパク質の発現および可溶化率が著しく改善する場合がある。
【００５３】
シャペロンベクターは、タンパク質の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）に協同して働くことが知られている大腸菌の分子シャペロンを、大腸菌をはじめとする真菌内で発現するように構築したベクターを好適に使用できる。なお、このシャペロンベクターは、大腸菌内でｐＣｏｌｄＩ〜ＩＶとの共存が可能であるように複製開始点および薬剤耐性などを工夫しておくことが好ましい。このようなシャペロンベクターの共発現により、目的タンパ
ク質の発現量や可溶化率の向上が期待できる。シャペロンベクターとしては、例えば、ｔｉｇ配列、ｇｒｏＥＳおよびｇｒｏＥＬがシャペロンチームとして働くように構築されており、シャペロンチームの発現はＰｚｔ１プロモーター（テトラサイクリンで誘導）で制御されており、ｐＡＣＹＣの複製開始点とクロラムフェニコール耐性遺伝子を利用しているため、大腸菌内でｐＣｏｌｄベクターとの共存が可能である、プラスミドｐＧ−Ｔｆ２などを好適に使用できる。
【００５４】
本実施形態に係る形質転換体は、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子またはその変異遺伝子の発現ベクターを大腸菌細胞などに導入してなるため、これらのアセチルコリンエステラーゼを大腸菌細胞などで大量発現させることができる。また、この形質転換体でシャペロンを共発現させることによって、さらに大量発現させたアセチルコリンエステラーゼを可溶化して活性を維持することができる。そのため、この形質転換体を用いれば、多量の精製酵素を取得して酵素の構造および機能を明らかにする上で役立てることができる。さらに、現在市販されているアセチルコリンエステラーゼは、電気ウナギ等の動物から精製されたエステラーゼであるが、この形質転換体を用いれば、電気ウナギ等の動物から精製する場合に比べて微生物を用いて安価に多量の精製酵素を生産することが可能になる。
【００５５】
＜実施形態４：アセチルコリンエステラーゼの生産方法＞
本実施の形態のアセチルコリンエステラーゼの生産方法は、上記の形質転換体を培養する工程と、その形質転換体またはその培地からアセチルコリンエステラーゼ（シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来の天然のアセチルコリンエステラーゼおよび変異アセチルコリンエステラーゼを含む）を抽出する工程と、を含む。この生産方法によれば、後述する実施例で示すように、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来の天然のアセチルコリンエステラーゼまたはその変異アセチルコリンエステラーゼを好適に生産することが可能である。
【００５６】
ここで、上記の形質転換体を培養する工程において用いる培地は、形質転換体が増殖可能な培地であれば任意のものを用いることができるが、例えば大腸菌を形質転換した場合には、ＬＢ培地（１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１％  ＮａＣｌ）などを好適に使用できる。また、培地の形状は、液体培地であってもよく、寒天培地であってもよいが、取扱容易性および増殖速度の面からは液体培地が好ましい。また、大腸菌の場合には、例えば、好気性条件下で３７℃で一晩振盪培養すれば容易に大量増殖させることが可能である。
【００５７】
次いで、上記の形質転換体またはその培地からアセチルコリンエステラーゼを抽出する工程において、もしもアセチルコリンエステラーゼ発現ベクターにコールドショックプロモーターが設けられている場合には、大腸菌の含まれる培地を３７℃から１５℃まで冷却し、さらに一晩培養した上でアセチルコリンエステラーゼを抽出することが好ましい。このように大量培養後に冷却した上で培養を継続することによって、コールドショックプロモーターの下流のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の発現が誘導され、大腸菌細胞内で
アセチルコリンエステラーゼが大量生産されることになるためである。このとき、大量生産しすぎると大腸菌細胞内でアセチルコリンエステラーゼがインクルージョンボディーを形成することがあるが、シャペロンベクターを共発現させておけば、このようなインクルージョンボディーの発生を抑制し、アセチルコリンエステラーゼを可溶化して活性を維持した状態で大量生産が可能になる。
【００５８】
その後、アセチルコリンエステラーゼを分離・精製するために、通常の細胞からのタンパク質の分離・精製に用いられる方法を用いることができる。具体的には、アセチルコリンエステラーゼを大量生産した大腸菌細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。大腸菌細胞の破壊には、例えば、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法などが好適に用いられる。アセチルコリンエステラーゼの分離精製手段には、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いることができる。
【００５９】
本実施形態に係るアセチルコリンエステラーゼの生産方法は、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子またはその変異遺伝子の発現ベクターを導入してなる形質転換体などを培養して、その形質転換体またはその培地からアセチルコリンエステラーゼを抽出するため、これらのアセチルコリンエステラーゼを容易かつ安価に大量発現させて回収できる。また、この発現ベクターにコールドショックプロモーターを設け、この形質転換体でシャペロンを共発現させることによって、さらに大量発現させたアセチルコリンエステラーゼがインクルージョンボディーを形成することを抑制して、アセチルコリンエステラーゼを可溶化して活性を維持した状態で回収することが可能になる。そのため、この生産方法を用いれば、多量の精製酵素を取得して酵素の構造および機能を明らかにする上で役立てることができる。さらに、現在市販されているアセチルコリンエステラーゼは、電気ウナギ等の動物から精製されたエステラーゼであるが、この生産方法を用いれば、電気ウナギ等の動物から精製する場合に比べて微生物を用いて安価に多量の精製酵素を生産することが可能になる。
【００６０】
＜実施形態４：アセチル−Ｌ−カルニチン分解性アセチルコリンエステラーゼ＞
本実施形態に係るアセチル−Ｌ−カルニチンの分解に用いるアセチルコリンエステラーゼは、配列番号２で表される３０７個のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、分子量は３０ｋＤａ、等電点は、８．１である。このアミノ酸配列からなるアセチルコリンエステラーゼは、後述する実施例で示すように、アセチル−Ｌ−カルニチンを分解する活性を有することが実証されている。
【００６１】
このアセチル−Ｌ−カルニチン分解性のアセチルコリンエステラーゼを得る場合には、そのタンパク質は人工的に化学合成されてもよいが、上記のアセチルコリンエステラーゼの生産方法によって得ることが安価かつ大量に生産可能であるため好ましい。
【００６２】
また、このアセチル−Ｌ−カルニチン分解性のアセチルコリンエステラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の天然のタンパク質である必要はなく、天然のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列を改変してなる変異アセチルコリンエステラーゼであってもよい。
【００６３】
このような変異アセチルコリンエステラーゼタンパク質としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。なお、この相同性は、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。この相同性が高ければ高いほど、変異アセチルコリンエステラーゼの活性が天然のアセチルコリンエステラーゼに近似する可能性が高くなる。
【００６４】
さらに、この変異アセチルコリンエステラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。なお、この欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数は、２０以下、１０以下、５以下、４以下、３以下、２以下または１以下であってもよい。この欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数が少なければ少ないほど、変異アセチルコリンエステラーゼの活性が天然のアセチルコリンエステラーゼに近似する可能性が高くなる。
【００６５】
なお、この変異アセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して１または数個の置換がある場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換していることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、および、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸同士の置換は保存的置換と総称される。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加、または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９８４  Ｓｅｐ；８１（１８）：５６６２−５６６６．、Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９８２  Ｏｃｔ  ２５；１０（２０）：６４８７−６５００．、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９８４  Ｊｕｎ  ２９；２２４（４６５６）：１４３１−１４３３．）。
【００６６】
また、この変異アセチルコリンエステラーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列がコードするアミノ酸配列であってもよい。このハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの説明は、既に用語の説明の欄において行ったので煩雑を避けるために繰り返さない。
【００６７】
本実施形態に係るシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼは、当然のことながら、通常のアセチルコリンエステラーゼの活性を有しており、アセチルコリン、アセチルチオコリン、プロピオニルコリン、プロピオニルチオコリン、アセチルメチルコリン、ニトロフェニルアセテート、フェニルアセテート、アミルアセテート、イソアミルアセテートなどを加水分解できる。それに加えて、本実施形態に係るシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼは、驚いたことに、アセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解することができる。
【００６８】
ここで、現在市販されているアセチルコリンエステラーゼである電気ウナギのエステラーゼについては、アセチル−Ｄ−カルニチンを加水分解する活性はあるが、アセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解する活性は無いことが知られている（参照文献：Biotechnology and Bioengineering, 24, 911-915, 1984）。そのため、これまでアセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解できるアセチルコリンエステラーゼの開発が、アセチル−Ｄ−カルニチンおよびアセチル−Ｌ−カルニチンの光学分割のために求められていた。
【００６９】
しかしながら、シュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼは多量の精製酵素を取得することが非常に困難であり、非特許文献１にも記載されているように５５０リットルの培養液から９ｍｇというごくわずかな酵素しか精製することができなかったため、これまでシュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼのアセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解する活性は測定されたことが無かった。そして、本発明者も、研究開始当初は、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼも同様にアセチル−Ｄ−カルニチンを加水分解する活性はあるが、アセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解する活性は無いだろうと予測していた。
【００７０】
ところが、本発明者が、大量生産に成功したシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼを用いてアセチル−Ｌ−カルニチンの加水分解活性を測定してみたところ、驚いたことに研究開発当初の予想を裏切ってアセチル−Ｌ−カルニチンの加水分解活性の存在が認められた。本実施形態のアセチル−Ｌ−カルニチン分解性のアセチルコリンエステラーゼは、まさにこれまでの産業界のアセチル−Ｄ−カルニチンおよびアセチル−Ｌ−カルニチンの光学分割の要望に応えるものであり、産業上大きな利用価値があると考えられる。
【００７１】
また、繰り返しにはなるが、このように驚くべき結果を得ることができたのは、本発明者によるショットガンクローニングによりゲノムからのシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子のクローニングが成功したためである。このように遺伝子のクローニングに成功したため、この遺伝子を大量発現用ベクターに組換え、大量発現させることができた。そのため、この天然のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子またはその変異アセチルコリンエステラーゼ遺伝子を用いて、多量の精製酵素を取得して酵素の構造および機能を明らかにするための実験を行うことができ、シュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼも同様にアセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解する活性があることを見出したのである。繰り返しにはなるが、現在市販されている電気ウナギから精製されたアセチルコリンエステラーゼには、アセチル−Ｄ−カルニチンを加水分解する活性はあるが、アセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解する活性は無いことが知られている（参照文献：Biotechnology and Bioengineering, 24, 911-915, 1984）。
【００７２】
現在、電気ウナギ等の動物から精製された動物由来のアセチルコリンエステラーゼは残留農薬（有機リン系農薬）の簡易分析に利用されている。また、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤の幾つかは医薬品として試用されている。しかしながら、電気ウナギ等の動物からアセチルコリンエステラーゼを大量かつ安価に精製することは困難であった。これに対して、本実施形態のようにシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼを簡便に大量に調製することができれば残留農薬分析やコリンエステラーゼ阻害剤のスクリーニングに利用できる。すなわち、こうして得られたアセチルコリンエステラーゼの活性を測定することによって、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬のスクリーニングを行うことができ、残留農薬分析キット、農薬センサーにも用いることができる。
【００７３】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００７４】
例えば、上記実施の形態では形質転換される微生物細胞を大腸菌細胞としたが、特に限定する趣旨でなく、枯草菌，酵母などを用いてもよい。このようにしても、大腸菌の場合と同様にシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼを簡便に大量に調製することができる。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７６】
＜実施例１：目的遺伝子のクローニング＞
（１）ショットガンクローニング
ＰＡ０１株を培養し、集菌し、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ、プラスミドｐＵＣ１８（タカラ製）を、それぞれ制限酵素（ｃｆｒＩ）で処理した。反応処理の後、それぞれの反応液を混合しライゲーションを行った。ライゲーションの結果、得られたＤＮＡを、大腸菌へと組み込み形質転換体を作成した。
【００７７】
（２）スクリーニング
ＬＢ培地に、カルベニシリン・Ｎａ及び０．１Ｍ  ＩＰＴＧ  ２３．８ｍｇ／１ｍｌを加えて、ＬＢＣＩ培地を調製した。０．５％リゾチームと１０ｍＭ  ＥＤＴＡを１００ｍＭ  Ｋ−Ｐ  ｂｕｆｆｅｒに加え、ｐＨ  ８．０に調製し、溶解液を調製した。ＬＢＣＩ培地を分注器にて、約１．２ｍｌずつ１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注し、爪楊枝をあて、形質転換体の大腸菌をＬＣＢＩ培地に植菌した。３０℃、２４時間で培養し、集菌した。集菌したエッペンドルフチューブに準備した溶解液を２００μｌ加えボルテックスにかけた後、３７℃の恒温槽で３０分反応させた。
【００７８】
再度、ボルテックスにかけた後、遠心分離にかけ、上清を回収した。マイクロプレートに表１に記載の反応液を入れたものに回収した上清を２０μｌいれ、反応を見て、アセチルコリンエステラーゼ活性を有する株を取得した。
【００７９】
【表１】
2011160730.tif 000003
【００８０】
（３）無細胞調製液の作成
ＩＰＴＧとカルベニシリンを入れたＬＢスラント培地を調製した。調製したＬＢスラント培地に作成した形質転換体である大腸菌を植菌し、２５℃・２４時間の条件で培養した。つぎに培養したＬＢスラント培地からＬＢ液体培地に植菌し、２５℃・２４時間の条件で培養した。液体培養した菌体を集菌し凍結させた。菌体に０．３Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）を約１０ｍｌ加えて、菌体を超音波破砕器により１０℃以下の液温を保ちながら１５分間破砕した。破砕物のｐＨを測定し、低い場合には１Ｍ水酸化ナトリウムで調製した。破砕物を遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
【００８１】
（４）アセチルコリンエステラーゼ活性の測定
表１に記載するアセチルコリンエステラーゼ活性測定反応液を調製した。無細胞抽出液をアセチルコリンエステラーゼ活性測定反応液に加え反応させた。反応後のアセチルコリンエステラーゼ活性測定反応液を４１２ｎｍ波長での吸光度変化を測定した。得られた吸光度変化を基に、下記の反応式で、アセチルコリンエステラーゼ活性を計算した。
【００８２】
酵素活性（ｕｎｉｔ／ｍｌ）＝吸光度変化（ａｂｓ／ｍｉｎ）×１．５８５×希釈倍率／１３．６／酵素量（ｍｌ）
【００８３】
その結果、アセチルコリンエステラーゼ活性を有する形質転換体（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＥＡ株）を取得した。このようにして測定したアセチルコリンエステラーゼ活性を以下の表２に示す。
【００８４】
【表２】
2011160730.tif 000004
【００８５】
＜比較例１：アセチルコリンエステラーゼの活性測定＞
（１）シュードモナスＰＡ０１の培養
肉汁培地を、傾斜をつけスラント培地にし、一晩インキュベートした後にシュードモナスＰＡ０１をクリーンベンチ内で植菌して、３０℃で２日間培養した。その後、スラント培地からコリン培養培地に植菌し、２５℃で一晩培養した。さらに培養液を坂口フラスコに十倍希釈して２５℃１２０回転／ｍｉｎで２４時間培養した。ここで用いた肉汁培地とコリン培地の組成を表３に示す。
【００８６】
【表３】
2011160730.tif 000005
【００８７】
培養した培養液から、１２０００ｒｐｍ、５℃、２０分で遠心分離機を用いて集菌し、菌体を凍結保存した。凍結保存した菌体に、０．３Ｍリン酸カリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）を約１０ｍｌ加えて、菌体を超音波破砕機により１０℃以下の液温を保ちながら１５分間破砕した。破砕物のｐＨを測定し、低い場合は１Ｍ  ＮａＯＨで調製した。破砕物を遠心チューブに移して、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。得られた上清を無細胞抽出液とする。実施例１と同様にアセチルコリンエステラーゼ活性を測定した。
【００８８】
＜実施例２：目的遺伝子のシークエンス解析＞
（１）シークエンス解析
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＥＡ株からプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片（７ｋｂ）をＰＣＲで反応させた。増幅させた塩基配列のシークエンス解析を行い、塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号２に示す。決定した塩基配列は、シュードモナスＰＡ０１のＯＲＦであるＰＡ４９２１と一致した。ＰＡ４９２１の塩基配列を配列番号１に示す。
【００８９】
（２）ホモロジー
配列を決定したシュードモナス・エルギノーザ由来のアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列と、電気ウナギのアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列とホモロジーを解析した。その結果を図５に示す。図５を見ればわかるように、ホモロジーはアライメントが可能な領域でも３０％以下と非常に低かった。
【００９０】
＜実施例３：大量発現系の構築＞
（１）大腸菌への形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＥＡ株からプラスミドＤＮＡを抽出し、挿入断片を切り出した。構築したプライマー（ｐＡｃｈＥ−Ｕ  ５’ＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＧＴＣＴ  ３’（配列番号３），  ｐＡｃｈＥ−Ｌ  ５’ＴＴＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＧＣＧＣＧＴＡ  ３’ （配列番号４））を用いて、ＰＣＲ法によりＰＡ４９２１を増幅した。増幅したＰＡ４９２１を、ベクターｐ−ｃｏｌｄ（製品番号  タカラ製）とライゲーションし、大腸菌に形質転換を行った。
【００９１】
（２）ｐ−ｃｏｌｄ保有大腸菌の培養
アンピシリンで形質転換大腸菌を選択し、ＬＢＡ液体培地で３７℃の条件にて振とう培養し、ＯＤ６００が０．５程度になったら、培養液を１５℃に冷却し、３０分放置した。０．１から１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、１５℃で２４時間培養を行った。
【００９２】
（３）アセチルコリンエステラーゼ活性測定
培養した培養液から集菌し、菌体を超音波破砕機によって１０℃以下の液温を保ちながら１５分間破砕した。破砕物を遠心し上清を用いて、実施例１の反応系を用いてアセチルコリンエステラーゼ活性を測定した。アセチルコリンエステラーゼ活性の測定結果から、Ｖｍａｘ，Ｋｍ値を計算した。Ｋｍ値は、０．０３６２ｍＭであり、Ｖｍａｘ値は、０．０１０５ｍｍｏｌ／ｍｉｎであった。
【００９３】
＜実施例４：アセチルコリンエステラーゼの酵素活性の分析＞
以下の表４の組成のアセチルカルニチン加水分解反応液及び表５のカルニチン定量反応液を調製した。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
【表５】
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【００９６】
アセチルカルニチン加水分解反応液にて、アセチル−Ｌ−カルニチンの加水分解反応を、３０℃で３０分間の条件で反応させた。
反応後のアセチルカルニチン加水分解反応液５０μｌを、カルニチン定量反応液に添加した。カルニチン定量反応液を１時間、３０℃の条件で反応させた。
カルニチン定量のために、アセチルカルニチン加水分解反応液の他に、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭのカルニチン基質濃度の溶液を、カルニチン定量反応液にそれぞれ反応させた。反応させたカルニチン基質濃度の溶液を基に検量線を作成し、加水分解活性を計算した。なお、アセチル−Ｌ−カルニチンの加水分解反応は、酵素を入れなくても反応が進む場合があるため酵素なしの組成のものも用意した。酵素なしをブランクとして酵素ありの吸光度から引いて加水分解活性を求めた。このようにして測定した加水分解活性を以下の表６に示す。
【００９７】
【表６】
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【００９８】
＜結果の考察＞
本発明者は、上述のように、すでに全塩基配列が明らかになっているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡ０１を供試菌株とし、活性発現を指標としたショットガンクローニングによりアセチルコリンエステラーゼ遺伝子のクローニングに成功した。本発明者は、さらに本遺伝子を大量発現用ベクターに組換え、融合タンパク質として大量発現に成功した。
【００９９】
その結果、このシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列がコードする配列番号２のアミノ酸配列は、驚くべきことに、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のアセチルコリンエステラーゼの従来公知のＮ末端のアミノ酸配列（参照文献：Biochimica et Biophysica Acta, 1385, 126-138, 1998）と全く異なるものであった。
【０１００】
さらに、得られたシュードモナス・エルギノーザのＰＡ０１株由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列およびその遺伝子のコードするアミノ酸配列は、予想外なことに、電気ウナギ等の動物由来のアセチルコリンエステラーゼ遺伝子の塩基配列およびその遺伝子のコードするアセチルコリンエステラーゼのアミノ酸配列とも大きく異なっていた（図５参照）。
【０１０１】
また、本発明者は、本酵素の基質特異性を検討したところ、従来報告がなかったアセチル−Ｌ−カルニチンを加水分解することが明らかとなった。また、本発明者は、その活性はアセチルチオコリンの０．０３％程度であることを見出した。
【０１０２】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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