(57)【要約】      （修正有）【課題】制御しやすい修飾反応を行う合成法によって、医薬品として体内で最も有効に働く修飾タンパク質を効率的に製造し、このような修飾タンパク質を高比率で占める反応液を提供する。【解決手段】生理活性タンパク質に、修飾試薬を逐次添加し反応させることにより、生理活性タンパク質の修飾反応をより容易に制御しうる、修飾タンパク質の製造法と、得られうる修飾タンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性タンパク質に、修飾試薬を逐次添加し反応させることを特徴とする、修飾タンパク質の製造法。
【請求項２】
生理活性タンパク質に、修飾試薬を３０分〜３時間かけて添加し反応させることを特徴とする、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
生理活性タンパク質に、修飾試薬を１時間〜２時間かけて添加し反応させることを特徴とする、請求項２に記載の製造法。
【請求項４】
修飾試薬がメトキシＰＥＧのスクシンイミジルエステル誘導体であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
生理活性タンパク質が、エリスロポエチンであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項６】
生理活性タンパク質が、ネコエリスロポエチンであることを特徴とする、請求項５に記載の製造法。
【請求項７】
修飾タンパク質が、モノＰＥＧ修飾体を５０％以上含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項８】
モノＰＥＧ修飾体を５０％以上含むことを特徴とする修飾タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は制御しやすい修飾反応を行う合成法によって、医薬品として体内で最も有効に働く修飾タンパク質を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年遺伝子組換え法の発達により、様々な生理活性タンパク質が工業生産されるようになり、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）等が医薬品として実用化されてきた。また免疫グロブリンタンパク質の一種であるＩｇＧモノクローナル抗体は、病因となる抗原を特異的に抑制する薬剤として、注目を集めている。
【０００３】
これら生理活性タンパク質は、生体が本来持っている物質であるため副作用の少ない医薬品として有用であるが、肝臓において代謝されて失活する。例えば赤血球増殖効果をもち、貧血症改善に利用されるエリスロポエチンは、静脈内、皮下等に投与されると投与後３〜５日目に血中量のピークを示し、以後急速に減少する。
【０００４】
このようなタンパク性医薬品の薬物動態を改善するため、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性高分子をタンパク質表面に付加することによる修飾技術が開発された。ＰＥＧは無毒性、非免疫原性の高分子で、肝臓での代謝を阻害するため、付加したタンパク質の血中寿命が延び、薬効持続期間が延長されることが知られている（非特許文献１）。
【０００５】
タンパク質の修飾のさらに進んだ技術として、タンパク質分子や付与している糖鎖に抗体やポリマー分子を付加し、特定組織への滞留性を向上させたり病原分子への標的効率を高めたりして、本来の性質とは異なる薬物動態特性を付与する技術も研究されてきている。
【０００６】
このような修飾分子は、付加の様態によって修飾タンパク質の性質が異なってくる。ＰＥＧの場合、付加する分子量が高いほどタンパク質は代謝されにくくなり、また付加数が多いほど代謝を受けにくくなる傾向がある。従って分子量の高いＰＥＧ分子が多数付加したタンパク質は、体内投与されたときに血中寿命が長くなることが予想される（非特許文献１）。
【０００７】
タンパク質修飾のため、種々の合成法が考案されてきた。一例を挙げればＰＥＧのような水溶性高分子を付加するには、ポリオール、ラクトール、アミン、カルボン酸誘導体との化学反応により、共有結合できるヒドラジド、又はオキシルアミン部分に結合する例が報告されている。この例では１分子のタンパク質に対して、６〜３４個のＰＥＧが結合した異性体が合成されるため、単一成分を得るために反応制御することは難しいと考えられる（特許文献１）。
【０００８】
また付加するＰＥＧなどの分子の末端に、反応性に富む反応基を結合させた修飾試薬を調製し、タンパク質アミノ酸の特定官能基と反応させて結合する方法もある。この例として、スルホネート活性化ＰＥＧが開示されている（特許文献２）。このスルホネートエステル活性化ＰＥＧもまた、第一級又は第二級アミノ基、チオール基及び芳香族ヒドロキシル基などと様々な官能基と反応するため生成物が多様化し、特定の異性体のみの選択合成を制御するのは難しい。
【０００９】
しかし、一般的な合成反応により思い通りのタンパク質部位を修飾することはもとより、可能性のある異性体のなかからただ一つの構造を選択的に合成することすらも、多大な困難が伴うのが実情である。修飾される生理活性タンパク質の化学反応可能な官能基は一次構造から予測されるが、実際はフォールディングされるタンパク質の立体構造により反応性に違いが出るためである。
【００１０】
従来タンパク質の修飾反応の制御には、ｐＨ、反応温度、反応時間、攪拌速度等のパラメータを調整することにより反応を制御しているが、これだけでは望みの構造をもつタンパク質修飾を行うのは困難であるため、さらに合成反応を調整する指標が望まれている。
【００１１】
また合成反応後に得られる反応液は種々の異性体混合物となるが、単一の化合物であることが医薬品の品質管理の観点からは好ましいため、修飾タンパク質の精製が必要となる。精製には、各種のクロマトグラフィーや分離膜が用いられ、目的化合物が大きな比率を占める反応液を得ることが望ましい。この精製工程が医薬品製造コストに占める割合はタンパク質によって異なるが一般に４０〜６０％であり、医療コスト削減の観点からも、活性の高い異性体比率の高い合成反応が望まれる。例えばヒト由来ＥＰＯの場合、メトキシＰＥＧのスクシンイミジルプロピオン酸エステル付加反応を試みると、血中持続時間が長いとされるモノＰＥＧ体収率は２５〜３５％程度であり、さらに向上する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平７−１９６９２５号公報
【特許文献２】特表平９−５０４５１５号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Polyethylene glycol-conjugated pharmaceutical proteins; PSTT Vol.1, No.8, 1998, 352-356
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
制御しやすい修飾反応を行う合成法によって、医薬品として体内で最も有効に働く修飾タンパク質を効率的に製造する方法を提供することを課題とする。また、このような修飾タンパク質を高比率で占める反応液を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
タンパク質を修飾するには、付加するＰＥＧなどの水溶性高分子末端に反応性に富む反応基を結合させた修飾試薬を調製し、タンパク質アミノ酸の特定官能基と反応させて結合させる方法が有効である。このとき、通常、修飾試薬の添加混和は短時間で一気に行い、攪拌時間（反応時間）により反応を制御する（特開平７−１９６９２５号公報等）。合成反応を制御し最適化するためには、ほかに反応溶液ｐＨ、反応温度、攪拌速度等を変化させて検討するのが一般的である。しかし反応が急激な場合、これらの制御因子だけでは反応、副反応生成物を制御しきれないことが多い。
【００１６】
そこで本発明者は鋭意検討を重ねた結果、修飾試薬を逐次反応溶媒に添加することにより、タンパク質の修飾反応をより容易に制御しうることを見出して本発明に至った。
【００１７】
すなわち本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであり、以下の発明を包含する。
【００１８】
（１）生理活性タンパク質に、修飾試薬を逐次添加し反応させることを特徴とする、修飾タンパク質の製造法。
【００１９】
（２）生理活性タンパク質に、修飾試薬を３０分〜３時間かけて添加し反応させることを特徴とする、（１）に記載の製造法。
【００２０】
（３）生理活性タンパク質に、修飾試薬を１時間〜２時間かけて添加し反応させることを特徴とする、（２）に記載の製造法。
【００２１】
（４）修飾試薬がメトキシＰＥＧのスクシンイミジルエステル誘導体であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の製造法。
【００２２】
（５）生理活性タンパク質が、エリスロポエチンであることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の製造法。
【００２３】
（６）生理活性タンパク質が、ネコエリスロポエチンであることを特徴とする、（５）に記載の製造法。
【００２４】
（７）修飾タンパク質が、モノＰＥＧ修飾体を５０％以上含むことを特徴とする、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の製造法。
【００２５】
（８）モノＰＥＧ修飾体を５０％以上含むことを特徴とする修飾タンパク質。
【発明の効果】
【００２６】
本発明により、制御しやすい修飾反応を行う合成法によって、医薬品として体内で最も有効に働く修飾タンパク質を効率的に製造する手段が提供される。修飾される生理活性タンパク質の化学反応可能な官能基は一次構造から予測されるが、実際はフォールディングされるタンパクの立体構造により反応性（修飾されやすさ）に違いが出るため、特定の付加数でタンパク質の修飾を制御するのは従来困難であった。
【００２７】
しかし、修飾試薬を逐次添加反応させる合成法により、目的タンパク質への修飾体付加数を制御し、最も好適な異性体の一種をより高収率に得ることが可能となった。この方法により、最も好適な異性体の一種を高比率に含む組成物が得られる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明に使用される生理活性タンパク質は、一般的に入手可能な動物細胞を宿主として製造される組換えタンパク質のほか、天然物由来のもの、組換え動物由来のもの等が利用できる。タンパク質は精製品であっても、未精製状態でも良いが、目的タンパク質の反応効率から精製品が好ましい。またこの生理活性タンパク質を構成するアミノ酸配列は、１又は２以上のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入、又は、付加した改変体でもよい。
【００２９】
生理活性タンパク質としては、インターフェロン、成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）などのホルモンやサイトカイン類があり、これらは医薬品として実用化されている。このような生理活性タンパク質を本発明に好適に使用することができる。なかでもＥＰＯは、分子量３４ｋＤａ、１６５個のアミノ酸からなり、腎臓で産生されて赤血球前駆細胞を赤血球に分化・増殖させる作用をもつホルモンであるが、各種の貧血症に対する治療薬として普及しており、修飾により得られる血漿中寿命延長効果が患者負担の軽減につながる観点から好ましい。特に、ネコエリスロポエチンを好適に用いることができる。
【００３０】
ＥＰＯのｃＤＮＡクローニングは、マウス、ラット、イヌ、ネコなどで行われており（ヴェンら：「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、８２巻、ｐ１５０７（１９９３））それぞれの配列が解明されている。例えばネコのＥＰＯはヒトのＥＰＯと相同性が８３．４％であり、ＣＨＯ細胞で発現させたネコ由来ＥＰＯはネコに対して造血活性がある（Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．２００３  Ｄｅｃ；６４（１２）：１４６５−７１）。
【００３１】
慢性腎不全は愛玩動物として普及しているイヌ、ネコ、あるいは家畜であるウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、観賞用動物であるライオン、トラ、カンガルー、ゾウ、キリン、シマウマ、コアラ、パンダ等でも発症する。近年これらコンパニオン・アニマルの高齢化に伴う腎臓病発症率の上昇が問題となっており、特にネコ（国内）では、９６年からの１０年間で慢性腎不全は、０．６４％から３．９５％と大幅に増加し、疾病順位も２８位から４位へ増加している。また輸血用血液の備蓄がないコンパニオン・アニマルでは、手術等による出血の治療にＥＰＯによる自己血液の増加が輸血代替措置として有効である。こうした愛玩動物の貧血治療にＥＰＯは有効であるが、注射による体内投与が必要な事から通院加療のため、少しでも薬効持続期間の長い製剤が望まれている。
【００３２】
医療用途に用いられる他のタンパク質として、免疫グロブリンがある。なかでも単一の抗体産生細胞に由来するＩｇＧモノクローナル抗体は質が均一であり、病因となる抗原に特異的に結合することでその機能を失活させる機能から、副作用の少ない優れた治療薬となる。現在ではマウスで作られたモノクローナル抗体の一部をヒトの構造に変換する技術が開発され、副作用を低減する技術が実用化されている。さらに直接ヒト抗体を得る方法も研究され、より副作用が少ない抗体医薬品が市場を席巻すると考えられる。
【００３３】
このような抗体の、結合に働く一部分のみを使った低分子化抗体と呼ばれる一群の化合物は、次世代の抗体医薬として注目されている。従来抗体医薬品はその複雑な構造からコストのかかる細胞培養リアクター方式でしか生産できなかったが、低分子化抗体は安価な微生物培養法で生産できる、とのメリットがある。しかし微生物培養法で生産された低分子化抗体は、糖鎖修飾を受けないため迅速に代謝されて血中寿命が短い、との欠点があった。このような低分子化抗体に水溶性長鎖分子を合成的に結合し、血漿中滞留性を向上する技術の進展は安価な抗体医薬品の実用化にとって重要である。近年ではＰＥＧ修飾された抗ＴＮＦ抗体の低分子化抗体であるＦａｂ断片が、重度のクローン病で寛解誘導後の維持に有効であると臨床試験で証明されている。
【００３４】
タンパク質に付加することで代謝を阻害し、血中動態を改善する修飾試薬としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が例示できる。ＰＥＧの分子量としては、５〜４０ｋＤａ、好ましくは１０〜３０ｋＤａ、より好ましくは２０ｋＤａが使用できる。また構造としては直鎖型が好ましいが、分岐鎖をもつＰＥＧも使用可能である（特表平９−５０４２９９号公報）。
【００３５】
修飾試薬は、反応性の点から活性化して用いることが好ましい。例えば、ＰＥＧをタンパク質に共有結合させる時には、タンパク質、又は糖鎖の酸化を可能とする官能基であるポリオール基、ラクトール基、アミノ基、カルボニル基を付加したり、カルボン酸誘導体として用いたりすることができる。また、スルホネートエステル活性化ＰＥＧ、例えばスルホネートエステル活性化ＰＥＧを用いることができる。
【００３６】
さらにＰＥＧ化するために用いる修飾試薬としては、ＰＥＧ分子の片末端をメトキシ化したものが使用できる。さらにメトキシ化されていない末端をスクシンイミジル脂肪酸エステル化したＰＥＧが開発されており、なかでも脂肪酸がプロピオン酸もしくは酪酸であるものが反応性の点から好ましい。メトキシＰＥＧのスクシンイミジルプロピオン酸エステル（ＳＰＡ−ＰＥＧと称する）をヒト由来ＥＰＯと反応させると、リジン残基に選択的に付加することが知られており、メトキシＰＥＧのスクシンイミジルエステル誘導体は本発明に好適に用いることができる。ＥＰＯには複数のリジン残基が存在するため、反応が進むにつれＰＥＧの付加数は増え、付加数の異なる異性体混合物となる。そのため、単一種のＰＥＧ修飾ＥＰＯの収率を最も高くするように合成反応を制御することが必要である。
【００３７】
医薬品としてタンパク質を利用するには単一であることが品質管理の点から好ましく、そのため修飾反応後の精製が必要である。精製には各種のクロマトグラフィーや分離膜が使用される。このとき反応後の目的化合物の精製収率が３０％以上であることが効率の点から好ましく、より好ましくは４０％以上、さらには５０％以上の精製収率があることが好ましい。
【００３８】
修飾試薬として、ＰＥＧ以外にも、構造的に類似したポリグリシン、ポリリジン等も本発明に使用できる。ポリグリシン等は合成法により、あるいは遺伝子組換え法により生産したものが使用可能である。これらはＰＥＧと同様の修飾試薬を作製し、合成反応によりタンパク質に付加することもできるし、遺伝子組換え法でタンパク質に結合することもできる。
【００３９】
生理活性タンパク質に、修飾試薬を反応させて修飾タンパク質を得る際には、修飾試薬を逐次添加して反応させることが望ましい。ここで、逐次添加とは、修飾試薬を一時に合理的に短時間で添加する態様を除くあらゆる添加方法を含む。連続添加することもできるし、断続的に添加することもできる。修飾試薬の添加時間としては、３０分ないし３時間が好ましく、１時間ないし２時間がより好ましい。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例として、ネコ由来エリスロポエチン（ＥＰＯ）のＰＥＧ修飾により本発明を詳述するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。
【００４１】
細胞培養について特に記述のないものに関しては、代表的な方法に従った。商品名を記載している場合は、特に記述のない限り添付の説明書の指示に従った。
【００４２】
（実施例１）ＰＥＧ化修飾試薬による合成反応
本実施例のネコ由来エリスロポエチン（ネコＥＰＯ）は、特開第２００７−８９５７８号公報に記載の方法によってニワトリ受精卵にネコ由来エリスロポエチン発現遺伝子を導入し、孵化成長させて産卵した卵の白身から、カラム法によって精製したネコ由来ＥＰＯ（ＨＰＬＣによる定量で精製純度９９％）を使用した。
【００４３】
１容のネコ由来ＥＰＯ溶液（２ｍｇ／ｍｌでｐＨ８．５のリン酸あるいはホウ酸バッファーに溶解）に、ＰＥＧの分子量が約２０ｋＤａのｍｅｔｈｏｘｙＰＥＧ−ＳＰＡ（スクシンイミジルプロピオン酸エステル  ＮＥＫＴＡＲ社製）溶液（２ｍｇ／ｍｌ  ｐＨ８．５のリン酸あるいはホウ酸バッファーに溶解）２容を、後述の各実験例における時間を掛けて均一に添加し、４℃で攪拌混和した。各実験例では全体の反応時間を一定にし、添加する時間を変化させてＰＥＧ化異性体の生成比率を比較した。反応後１００ｍＭグリシン溶液を１／１０容加え、室温でさらに０．５時間混和し、活性エステルを失活させた。その後ｐＨ４．５に調製して４℃で一晩透析を行った。
【００４４】
（実験例１）
ネコ由来ＥＰＯ溶解液とＰＥＧ化修飾試薬溶液を一気に混和し、３時間攪拌、静置後反応停止した。
【００４５】
（実験例２）
ネコ由来ＥＰＯ溶解液とＰＥＧ化修飾試薬溶液を０．５時間掛けて均一に混和し、２．５時間攪拌、静置後反応停止した。
【００４６】
（実験例３）
ネコ由来ＥＰＯ溶解液とＰＥＧ化修飾試薬溶液を１時間掛けて均一に混和し、２時間攪拌、静置後反応停止した。
【００４７】
（実験例４）
ネコ由来ＥＰＯ溶解液とＰＥＧ化修飾試薬溶液を２時間掛けて均一に混和し、１時間攪拌、静置後反応停止した。
【００４８】
（実施例２）ＨＰＬＣによる分析
逆相高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＳＣＬ−１０Ａ）により未反応ＥＰＯ、モノＰＥＧ体、ＰＥＧが２以上付加した多ＰＥＧ体の比率を解析した。使用したカラムはＹＭＣ−ＰａｃｋＰｒｏ  Ｃ１８(２５０×４．６ｍｍ，ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ５μｍ)、流速１ｍｌ／分で０．０５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）添加蒸留水から０．０５％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）添加アセトニトリルへグラジエントを掛けた（６０分）。カラム温度は４０℃、検出は２２６ｎｍ吸光波長で行った。この条件でモノＰＥＧ体は３８分のリテンションタイムに、多ＰＥＧ体は４９分のリテンションタイムにピークが現れた。
【００４９】
単一種のＰＥＧ体（本実施例の場合モノＰＥＧ体）の生成収率を最も高くする合成手法として、通常検討されるｐＨ、反応温度、反応時間だけでなく、本発明による修飾試薬の添加に掛ける時間を調整することにより、モノＰＥＧ体生成比率が４８％（実験例１）から５４％（実験例３）に向上した。このことから合成反応に用いる修飾試薬を逐次反応溶媒に添加することにより、タンパク質の修飾反応を容易に制御しうることが明らかである。またモノＰＥＧ体を５０％以上含む反応溶液は、モノＰＥＧ修飾ＥＰＯの精製に際して有利である。
【００５０】
【表１】
2011063521.tif 000002