(57)【要約】【課題】本発明は、特定の遺伝子のメチル化頻度を、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法、婦人科がんの判定方法、婦人科がんの判定キット等を提供することを目的とする。【解決手段】ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法。
【請求項２】
以下の工程を備えたことを特徴とする婦人科がんの判定方法。
（Ａ）婦人科検体組織又は被検体の血液からゲノムＤＮＡを抽出する工程：
（Ｂ）抽出したゲノムＤＮＡ中の、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を測定する工程：
（Ｃ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較・評価する工程：
【請求項３】
工程（Ｂ）を、抽出したゲノムＤＮＡにおいてメチル化シトシンと非メチル化シトシンを判別するために、該抽出したゲノムＤＮＡに化学的又は酵素的処理を行うための試薬を添加した後、該ゲノムＤＮＡ中の、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を測定する工程とすることを特徴とする請求項２に記載の婦人科がんの判定方法。
【請求項４】
遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度の測定を、該ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを用いて行うことを特徴とする請求項２又は３に記載の婦人科がんの判定方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチドとして、蛍光標識されたポリヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項４に記載の婦人科がんの判定方法。
【請求項６】
さらに、（Ｄ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度が、コントロールにおける同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較して増加している場合に婦人科がんであると評価する工程を備えたことを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の婦人科がんの判定方法。
【請求項７】
ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位において、該ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを備えたことを特徴とする婦人科がんの判定キット。
【請求項８】
ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに加えて、該ポリヌクレオチドのＣｐＧ部位に相補的な部位におけるシトシンがウラシルとなったポリヌクレオチドをさらに備えたことを特徴とする請求項７に記載の判定キット。
【請求項９】
以下の工程を含むことを特徴とする婦人科がん治療薬のスクリーニング方法。
（Ａ）婦人科がんに罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：
（Ｂ）前記非ヒト動物における婦人科がん組織又は血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を測定する工程：
（Ｃ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、コントロール非ヒト動物における婦人科がん組織又は血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較・評価する工程：
【請求項１０】
さらに、（Ｄ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度が、コントロール非ヒト動物における同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較して低下している場合に、該被検物質を婦人科がん治療薬であると評価する工程を含むことを特徴とする請求項９に記載の婦人科がん治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、婦人科がんにおける遺伝子のメチル化頻度のプロファイルとその用途に関する。より詳細には、特定の遺伝子のメチル化の頻度（以下、単に「メチル化頻度」とも表示する。）を、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法、婦人科がんの判定方法、婦人科がんの判定キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
婦人科がんとは、子宮頸部、子宮体部、卵巣、卵管、腟、外陰部に発生するがんであり、女性の悪性腫瘍の４分の１を超える割合を占める。主なものとして、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がんが挙げられる（特許文献１及び非特許文献１参照）。
【０００３】
近年、がんに関する基礎および臨床的研究が飛躍的に進み、がんは遺伝子の異常に起因する疾患であることが明らかとなった。その結果、がんの病態に関連する様々な遺伝子や蛋白を分子標的にした治療が試みられている。また、子宮がんの早期発見を目的としたがん検診が普及し、早期治療により子宮頸がんの死亡率は低下している。しかし、一方では、初婚年齢の上昇や妊娠回数の減少による女性ホルモン刺激の増大、食事の欧米化といった生活様式の変化、あるいは、性活動の若年化によるパピローマウイルス感染の増大に伴い、子宮体がん、卵巣がんや若年者子宮頸がんについては、その罹患率及び死亡率が上昇している（非特許文献２参照）。特に子宮体がんはその罹患率や死亡率のみならず、疾患の若年齢化も進行している（非特許文献３参照）。
【０００４】
婦人科がんの診断は、一般的に各種画像検査（超音波検査、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ等）を施行し、更に内診や子宮鏡などで進展を評価する。術前に細胞診及び組織診ができない卵巣がんを除く子宮頸がん及び子宮体がんでは、術前の生検で病理組織学的診断を付ける。病期は、病変の進展と病理組織学的診断により決定される。卵巣がんの病期は、開腹手術で摘出された卵巣の病理組織学的診断が得られるまで、決定できない。また、画像検査による病変の進展と病理学的診断が乖離していることがあり（非特許文献４参照）、卵巣腫瘍に際しては、常に悪性の可能性を念頭に置く必要がある。このように、婦人科がんの場合、画像診断では、がんの質的診断が不可能であり、良性疾患との鑑別が困難な場面も多々ある。また、確定診断として用いられる細胞診・組織診による病理学的診断については、基本的なヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色に各種免疫染色を組み合わせて用いたとしても、進行度・進達度の判断に困難な場合がある上、予後の予測まではできないのが現状である。発症・予後の予測に関しては、いくつかの因子が報告されてはいるものの（特許文献２、３、４参照）、現在のところ感度と特異性の双方を十分に持つバイオマーカーは存在しない。
【０００５】
一方、婦人科がんの治療方針は、主に病期と病理組織学的所見により決定される。良性腫瘍に対しては、根治可能な一期的摘出術か、小病変で臨床症状がなければ経過観察が行われる。一方、悪性腫瘍に対しては手術、抗がん剤による化学療法、放射線治療を単独もしくは併用して施行する。子宮頸がんと子宮体がんでは、手術で子宮を摘出せざるを得ないこともあるが、これは若年の未産婦においては妊孕力を喪失するため重大な問題となる（非特許文献５参照）。卵巣がんは自覚症状が乏しく、進行が早いため、発見される時にはすでに進行していることが多い。また、有効なスクリーニング法が確立しておらず（非特許文献６参照）、細胞の採取ができないためにがん検診もできないので、早期発見は極めて困難である。さらに、たとえ早期に発見された場合でも、隣接臓器である子宮を合併切除することが原則である。卵巣がんはあらゆる年齢で発症し、特に若年者の治療においては妊孕力を喪失するため、子宮頸がん・子宮体がんと同様に重大な問題となる（非特許文献７参照）。いずれのがんにおいても、進行がんでは術後に化学療法が施行される場合が多いが、骨髄抑制による免疫力の低下、消化器症状による脱水、電解質異常など副作用が強いことが問題となっている。さらに、治療効果と予後に個人差が認められ、これらはがん組織における遺伝子変異とその発現量の異常に起因していると考えられている（非特許文献８参照）。
【０００６】
前述のとおり、生活様式の変化により、婦人科がんの増加が予測されるため、それらの発症予測や発症診断についてのバイオマーカーの開発が期待されている。子宮頸がんの治療後の経過観察で用いられているバイオマーカーとして、Ｃａ１９−９やＣａ１２５などが知られているものの、その陽性率はおよそ３０％と低く、これまで、婦人科がんに関する有用なバイオマーカーの報告はなされていない（特許文献５及び６参照）。
【０００７】
バイオマーカーの候補としては、タンパクあるいはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）があるが、現状では、各々３万近いこれらをスクリーニングすることは、コスト面ならびに労力面で現実的ではない。また、実際、これまでの手法において、がんの診断に感度ならびに特異性を有するものは、未だ見出だされていない。この原因を考えるに、１）現在の臨床検査手法の問題点、２）ｍＲＮＡが病態を反映しない問題点、がある。前者の問題点に関し、現在、臨床検査の場で、腫瘍マーカーを測定する方法は、ＲＩＡ放射性免疫測定法、ＣＬＩＡ化学発光免疫測定法、ＥＩＡ酵素免疫測定法、ＥＬＩＳＡ酵素免疫測定法等、対象タンパクに対して特異的な抗体を用いている。このような状況において、近年、腫瘍タンパクに対する修飾、例えば、糖鎖修飾が知られてきたが、これらの修飾によって、前述の抗体が認識するはずのエピトープ部分の構造が種々変化し、その抗体が腫瘍タンパクを認識できない可能性が生じる。結果として、腫瘍タンパクを対象とした臨床検査の感度が低くなる。後者の問題点に関しては、ヒトにおいて、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）がｍＲＮＡの切断を介さず、翻訳制御をすることでタンパク合成阻害を行っているので、タンパク量に変化を生じるがｍＲＮＡの量的変化が全く認められないことが起こり得る。結果として、ｍＲＮＡの変化量は、病態を正確に表さず、偽陰性を生じることになる。以上から、タンパクならびにｍＲＮＡは、腫瘍の診断マーカーとしては、有用ではないと考える。
【０００８】
ところで、近年、エピジェネティクス（クロマチンへの後天的な修飾により、遺伝子配列の変化を伴わずに遺伝子発現が制御されることに起因する遺伝学又は分子生物学の研究分野）への関心が高まり、がん等の疾患との関連についての研究が進められている。中でも、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子のメチル化が注目されている。高等真核生物のゲノムＤＮＡ配列中に存在する５’−ＣＧ−３’ＤＮＡ（以下、ＣｐＧ）部分では、グアニン（Ｇ）の５’側に位置するシトシン（Ｃ）がメチル化修飾される現象が知られており、このＣｐＧのメチル化修飾は、遺伝子発現に影響を及ぼすと考えられている。特にＣｐＧ部位に富む領域（ＣｐＧアイランド）が遺伝子のプロモーター領域内に存在する場合には、遺伝子発現に対して重要な影響を及ぼす。通常、ゲノム上の多くの遺伝子はこれらのメチル化修飾から保護されているが、何らかの原因により、遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧアイランドがメチル化された場合、遺伝子の転写が抑制されることになる。このため、ＣｐＧアイランドのメチル化異常によって、例えば、ヒト生体内におけるがん抑制遺伝子の転写が不活性化された場合、細胞増殖の制御が効かなくなり、がんなどの細胞増殖性疾患が進行してしまうことになる。実際、いくつかのがんにおいて、特定の遺伝子におけるメチル化頻度が上昇していることが報告されており、最近では、特定の遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化頻度を、特定のがんの診断に利用する試みがいくつか行われている。例えば、特許文献７には、ＢＡＳＰ１等の遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化の程度を検出することによって、肝臓がんを診断する方法が記載されている。また、子宮がん等の婦人科がんにおいては、ｈＭＬＨ−1、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６の各遺伝子におけるメチル化頻度が上昇しているとの報告がなされている（非特許文献９参照）。しかし、がんにおける遺伝子のメチル化頻度の上昇の程度は遺伝子等によって様々であり、実用的な婦人科がんの診断に耐え得る程度のメチル化頻度の上昇が生じる遺伝子はこれまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５２７７２３号公報
【特許文献２】特開２００５−５３２３１４号公報
【特許文献３】米国特許第６８５５３５０号公報
【特許文献４】米国特許第７０４５２９２号公報
【特許文献５】特表２００３−５１２０１０号公報
【特許文献６】特開２００２−２２７４６号公報
【特許文献７】特開２００８−２４５６３５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Whitcomb  BP. Gynecologic Malignancies. Surg Clin North Am. 2008; 88: 301-317.
【非特許文献２】植田政嗣 子宮頸部癌の診断法−最近のトピックス−医学検査 2003;522：179-186.
【非特許文献３】植田政嗣 子宮体部癌の診断法−最近のトピックス−医学検査 2003; 52：691-700.
【非特許文献４】Ayhan A, Guven S, Guven ES, Kucukali T. Is there a correlation between tumor marker panel and tumor size and histopathology in well staged patients with borderline ovarian tumors? Acta Obstet Gynecol Scand.  2007; 86: 484-490.
【非特許文献５】Amant F, Van Calsteren K, Vergote I, Ottevanger N.  Gynecologic oncology in pregnancy. Crit Rev Oncol Hematol. 2008. [Epub ahead of print]
【非特許文献６】Jacobs IJ, Menon U. Progress and challenges in screening forearly detection of ovarian cancer. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 355-366.
【非特許文献７】Chan JK, Tian C, Monk BJ, Herzog T, Kapp DS, Bell J, Young RC; Gynecologic Oncology Group. Prognostic factors for high-risk early-stage epithelial ovarian cancer: a Gynecologic Oncology Group study. Cancer. 2008; 112: 2202-2010.
【非特許文献８】Marsh S. Cancer pharmacogenetics. Methods Mol Biol. 2008; 448: 437-446.
【非特許文献９】Guida M, Sanguedolce F, Bufo P, Di Spiezio Sardo A, Bifulco G, Nappi C, Pannone G. Aberrant DNA hypermethylation of hMLH-1 and CDKN2A/p16 genes in benign, premalignant and malignant endometrial lesions. Eur J Gynaecol Oncol. 2009; 30:267-270.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、特定の遺伝子のメチル化頻度を、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法、婦人科がんの判定方法、婦人科がんの判定キット等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前述したように、婦人科がんにおいて、いくつかの遺伝子のメチル化頻度の上昇が見られるとの報告がなされているが、実用的な婦人科がんの診断に耐え得る程度のメチル化頻度の上昇が生じる遺伝子はこれまで知られていなかった。本発明者らは、子宮体がん組織のゲノムＤＮＡと正常子宮内膜組織のゲノムＤＮＡとを対比し、子宮体がん組織におけるゲノムＤＮＡ上の特定の遺伝子のメチル化頻度が著しく上昇していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（２）（Ａ）婦人科検体組織又は被検体の血液からゲノムＤＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したゲノムＤＮＡ中の、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を測定する工程：及び、（Ｃ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較・評価する工程：を備えたことを特徴とする婦人科がんの判定方法や、（３）工程（Ｂ）を、抽出したゲノムＤＮＡにおいてメチル化シトシンと非メチル化シトシンを判別するために、該抽出したゲノムＤＮＡに化学的又は酵素的処理を行うための試薬を添加した後、該ゲノムＤＮＡ中の、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を測定する工程とすることを特徴とする上記（２）に記載の婦人科がんの判定方法や、（４）遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度の測定を、該ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを用いて行うことを特徴とする上記（２）又は（３）に記載の婦人科がんの判定方法や、（５）ポリヌクレオチドとして、蛍光標識されたポリヌクレオチドを用いることを特徴とする上記（４）に記載の婦人科がんの判定方法や、（６）さらに、（Ｄ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度が、コントロールにおける同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較して増加している場合に婦人科がんであると評価する工程を備えたことを特徴とする上記（２）〜（５）のいずれかに記載の婦人科がんの判定方法に関する。
【００１５】
さらに本発明は、（７）ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位において、該ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを備えたことを特徴とする婦人科がんの判定キットや、（８）ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに加えて、該ポリヌクレオチドのＣｐＧ部位に相補的な部位におけるシトシンがウラシルとなったポリヌクレオチドをさらに備えたことを特徴とする上記（７）に記載の判定キットに関する。
【００１６】
さらにまた本発明は、（９）（Ａ）婦人科がんに罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（Ｂ）前記非ヒト動物における婦人科がん組織又は血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を測定する工程：及び、（Ｃ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、コントロール非ヒト動物における婦人科がん組織又は血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較・評価する工程：を含むことを特徴とする婦人科がん治療薬のスクリーニング方法や、（１０）さらに、（Ｄ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度が、コントロール非ヒト動物における同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較して低下している場合に、該被検物質を婦人科がん治療薬であると評価する工程を含むことを特徴とする上記（９）に記載の婦人科がん治療薬のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明における婦人科がんのバイオマーカーは、簡便に用いることができ、また、感度及び特異性にも優れている。したがって、本発明の婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法や、本発明の婦人科がんの判定方法によると、迅速かつ正確に婦人科がんを判定することができる。また、本発明の婦人科がんの判定キットによると、婦人科がんであるかどうかを迅速かつ正確に判定することができる。その結果、内視鏡検査及び各種画像検査（ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、超音波検査等）を用いた従来の診断方法の欠点（前述の背景技術の記載を参照）を克服することが可能となった。さらに、本発明の婦人科がん治療薬のスクリーニング方法によると、婦人科がん治療薬を効率的にスクリーニングすることができる。
【００１８】
特に、被検体の血液から抽出したゲノムＤＮＡからであっても、メチル化頻度を測定可能な遺伝子の場合は、採取が極めて容易な血液サンプルを利用することができるため、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法や、婦人科がんの判定方法等における迅速性や簡便性が特に優れている。なお、本件遺伝子のメチル化頻度、及び、それらの関連等についてさらに研究が進めば、婦人科がんの発症・進展・予後予測や治療が可能となることで、現在の婦人科がん臨床のさまざまな問題点を解決する突破口となることが期待できる。また、遺伝子のメチル化頻度の上昇は組織特異的であることが知られており、婦人科の原発不明がんの原発部位の特定にも有用となる可能性がある。さらに治療に際しては、薬剤や放射線治療への抵抗性が診断できれば、患者個人ごとに有効な治療法を選択する個別化治療にまで発展させ得る可能性を含んでいる。正確な診断や予後の予測は、余計な検査や患者の必要以上の通院を減らすことが期待でき、医療経済効果も大きいと予想される。
【００１９】
なお、バイオマーカーにおける感度とは、検査を受ける被検体の中で、問題とする疾患に罹患している患者の総数に対する、検査陽性者数の割合を指す。例えば、１００人の集団に婦人科がん検診を行う場合で、１００人中１０人が婦人科がんに罹患しているとする。この際、バイオマーカーＡを利用して検査したところ、罹患しているその１０人中９人が陽性と検出され、バイオマーカーＢを利用して検査したところ、１０人中５人しか検出されなかったとする。この場合、バイオマーカーＡの感度は９０％、バイオマーカーＢの感度は５０％となり、バイオマーカーＡの方が、バイオマーカーＢより感度が高く、婦人科がんの見逃しが少ない、有用なマーカーと判断することができる。また、バイオマーカーにおける特異度とは、検査を受ける被検体の中で、問題とする疾患に罹患していない者（非患者）の総数に対する、検査陰性者数の割合を指す。例えば、１１０人の集団に婦人科がん検診を行う場合で、１１０人中１００人は婦人科がんに罹患していないとする。この際、バイオマーカーＣを利用して検査したところ、罹患していないその１００人中９０人が陰性と判定され、バイオマーカーＤを利用して検査したところ、１００人中７０人が陰性と判定されたとする。この場合、バイオマーカーＣの特異度は９０％、バイオマーカーＤの特異度は７０％となり、バイオマーカーＣの方が、バイオマーカーＤより特異度が高く、非患者を患者として疑い、余計な検査や精神的不安を患者に強いることの少ない、有用なバイオマーカーと判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】９１４９（正常子宮内膜  増殖期）、９１７４（正常子宮内膜  分泌期）、９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）、９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）、９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）、９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）から採取したサンプル組織について測定した各ＣｐＧ部位におけるβ値（平均値）を示す図である。なお、図１〜３における各ＣｐＧ部位には、左から９１４９（正常子宮内膜  増殖期）、９１７４（正常子宮内膜  分泌期）、９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）、９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）、９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）、９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）の結果を棒グラフにて示している。また、図１〜図３のＣｐＧ部位は、実施例２における（１）〜（８）のすべての値が３以上となった計１８箇所のＣｐＧ部位の結果を示す。
【図２】９１４９（正常子宮内膜  増殖期）、９１７４（正常子宮内膜  分泌期）、９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）、９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）、９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）、９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）から採取したサンプル組織について測定した各ＣｐＧ部位におけるβ値（平均値）を示す図である。
【図３】９１４９（正常子宮内膜  増殖期）、９１７４（正常子宮内膜  分泌期）、９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）、９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）、９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）、９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）から採取したサンプル組織について測定した各ＣｐＧ部位におけるβ値（平均値）を示す図である。
【図４】９１４９（正常子宮内膜  増殖期）、９１７４（正常子宮内膜  分泌期）、９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）、９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）、９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）、９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）から採取したサンプル組織について測定した各ＣｐＧ部位におけるβ値（平均値）を示す図である。なお、図４のＣｐＧ部位は、実施例２における（１）〜（８）のすべての値が４以上となった計７箇所のＣｐＧ部位の結果を示す。
【図５】９１４９（正常子宮内膜  増殖期）、９１７４（正常子宮内膜  分泌期）、９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）、９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）、９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）、９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）から採取したサンプル組織について測定した各ＣｐＧ部位におけるβ値（平均値）を示す図である。なお、図５のＣｐＧ部位は、実施例２における（１）〜（８）のすべての値が５以上となった計２箇所のＣｐＧ部位の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法
本発明の婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法としては、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４、ＢＸＤＣ１、ＨＫＲ１、ＤＲＤ４、ＰＥＮＫ、ＦＡＭ１２Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｆ、ＮＥＦ３、ＳＫＩＰ、ＣＸ３６、ＥＯＭＥＳ、及び、ＳＯＲＣＳ３からなる遺伝子群から選ばれる１又は２種以上の遺伝子のＣｐＧ部位（以下、「本件ＣｐＧ部位」とも表示する。）におけるメチル化の頻度（以下、「本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度」とも表示する。）を、子宮体がん等の婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法である限り特に制限はされず、具体的には、後述の本発明の婦人科がんの判定方法や、本発明の婦人科がん治療薬のスクリーニング方法を例示することができる。本件ＣｐＧ部位は、婦人科がん組織のゲノムＤＮＡにおいてメチル化頻度が増加していたため、婦人科がんのバイオマーカーとして使用することができる。なお、本明細書における所定の遺伝子のＣｐＧ部位とは、ゲノムＤＮＡ上で該ＣｐＧ部位に最も近い位置に存在する遺伝子が、その所定の遺伝子であることを意味するが、該遺伝子のプロモーター領域に位置するＣｐＧ部位を好ましく含んでいる。また、本件ＣｐＧ部位が該遺伝子の近傍に複数存在し、ＣｐＧアイランドを形成している場合は、それら複数のＣｐＧ部位を婦人科がんのバイオマーカーとして使用することが好ましいが、近傍のＣｐＧ部位のメチル化頻度は、相関が見られるとされているため、特定の１カ所のＣｐＧ部位のメチル化頻度が増加していれば、該ＣｐＧ部位が形成するＣｐＧアイランドにおけるメチル化頻度も増加していると評価することができる。
【００２２】
上記本件ＣｐＧ部位の中でも、メチル化頻度の増加の程度がより高いことから、ＤＣＣ、ＧＨＳＲ、ＡＪＡＰ１、ＺＮＦ５６０、ＦＥＲＤ３Ｌ、ＦＬＪ２３５１４を好適に例示することができ、中でも、ＤＣＣ、ＧＨＳＲをより好適に例示することができる。
【００２３】
上記の本件ＣｐＧ部位に関する遺伝子のGenBank Accession番号、ＮＣＢＩデータベースに基づく該ＣｐＧアイランドのゲノム上の位置、及び、ＮＣＢＩデータベースに基づく該ＣｐＧ部位中のＣのゲノム上の位置を以下の表１に示す。なお、ＣｐＧアイランドを形成していないＣｐＧ部位については、ＣｐＧアイランドのゲノム上の位置は記載していない。
【００２４】
【表１】
2011160711.tif 000002
【００２５】
上記の婦人科がんとは、子宮頸部、子宮体部、卵巣、膣、外陰部に発生するがんを意味する。これらの婦人科がんの中でも、子宮頸部や子宮体部のがんを好適に例示することができ、中でも子宮体部のがんをより好適に例示することができる。
【００２６】
本発明の婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法の対象となる生物（例えば、検体組織の由来となる生物や、被検体となる生物）の種類としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物を好適に例示することができ、中でもヒト、マウスをより好適に例示することができ、特にヒトを好適に例示することができる。
【００２７】
上記の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度が、婦人科がん組織又は婦人科がん被検体の血液においてコントロールと比較して増加するかどうかは、後述のパイロシークエンス法、メチル化特異的ＰＣＲ（MSP：Methylation-specific PCR）法（Herman JG et al., Proc Natl Acad Sci U S A 93:9821-6, 1996参照）、ＨＭ−ＰＣＲ（HeavyMethyl PCR）法（Cottrell SE et al., Nucleic Acids Res 32:e10, 2004参照）等の従来のＤＮＡメチル化検出方法により確認することができる。
【００２８】
なお、本発明の婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法は、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定することを特徴とする、本件ＣｐＧ部位を子宮体がん等の婦人科がんのバイオマーカーとして使用する方法とも表現することができる。
【００２９】
また、婦人科がんのバイオマーカーとして使用する本件ＣｐＧ部位は、バイオマーカーとしてのより高い精度を得る観点から、２箇所以上であってもよいが、現在の保険診療制度下での遺伝子検査の診療報酬の算定方法を考慮すると、１箇所であることが好ましい。
【００３０】
２．婦人科がんの判定方法
本発明の婦人科がんの判定方法としては、（Ａ）婦人科検体組織又は被検体の血液からゲノムＤＮＡを抽出する工程：（Ｂ）抽出したゲノムＤＮＡ中の、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定する工程：（Ｃ）工程（Ｂ）において測定した本件ＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のメチル化の頻度と比較・評価する工程：を備えている（含んでいる）限り特に制限されないが、さらに、（Ｄ）工程（Ｂ）において測定した遺伝子のメチル化の頻度が、コントロールにおける同遺伝子のメチル化の頻度と比較して増加している場合に婦人科がんであると評価する工程を備えた方法を好適に例示することができる。
【００３１】
上記（Ａ）工程におけるゲノムＤＮＡを抽出する方法としては、婦人科検体組織中又は被検体の血液中から、ゲノムＤＮＡを抽出する方法である限り特に制限されず、例えば、MagNA PureLC DNA Isolation Kit I（ロシュ・ダイアグノスティックス製）やQIAamp DNA Blood Midi Kit（QIAGEN製）などの市販品を添付のプロトコールにしたがって用いる方法の他、後述の実施例に記載されているような、フェノール・クロロホルム処理及びイソプロパノール沈殿等を利用した常法（Molecular Cloning第3版Volume1のプロトコール参照）を例示することができる。
【００３２】
上記（Ｂ）工程中における、抽出したゲノムＤＮＡ中の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定する方法としては、抽出したゲノムＤＮＡ中の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定し得る限り特に制限されないが、該ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを用いて行う方法や、さらに、該ポリヌクレオチドのＣｐＧ部位に相補的な部位におけるシトシンがウラシルとなったポリヌクレオチドを用いて行う方法を好適に例示することができる。これらのポリヌクレオチドは、該ＣｐＧ部位にハイブリダイズし得る限り、そのヌクレオチド数に制限はないが、例えば７個以上を例示することができ、特異性の観点からは、１５個以上、より好ましくは２５個以上を好適に例示することができる。これらのポリヌクレオチドとしては、より容易な検出が可能となることから、蛍光標識したポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００３３】
上記工程（Ｂ）としてより好ましくは、抽出したゲノムＤＮＡにおいてメチル化シトシンと非メチル化シトシンを判別するために、該抽出したゲノムＤＮＡに化学的又は酵素的処理を行うための試薬を添加した後、該ゲノムＤＮＡ中の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定する工程を例示することができる。上記の酵素的処理としては、制限酵素処理を挙げることができ、上記の化学的処理としては、亜硫酸水素塩（バイサルファイト）処理を例示することができる。
【００３４】
制限酵素処理を利用した手法とは、ＤＮＡのメチル化部位の検出を、メチル化感受性制限酵素を用いて行う方法であり、最も古典的な方法である。この方法は、制限酵素の認識配列中のシトシンがメチル化されることで、ＤＮＡを切断できなくなる現象を利用している。必要な反応時間は、制限酵素の種類により異なるが、１〜数時間程度である。また、これまでは、制限酵素を用いていることから検出可能な配列が限られていたが、現在では、入手可能なメチル化感受性制限酵素は１００種類以上あり、認識配列も多彩であるため、標的とするＤＮＡ領域のほとんどを切断することが可能である。メチル化部位の決定は、生じたＤＮＡ断片の鎖長をゲル電気泳動によって判別することによって行う。この手法には、インタクトなＤＮＡを使用できるため、迅速な検出が可能ではあるが、検出できるのは制限酵素の認識配列であるために、認識部位に変異が生じている場合は偽陰性となるなど、精度の点で以下のバイサルファイト法に劣っている。
【００３５】
また、バイサルファイト処理を利用したバイサルファイト法とは、バイサルファイト処理によって、シトシンをウラシルに変換するバイサルファイト反応を利用した方法であり、現在最も一般的に用いられている方法である。このバイサルファイト反応は５−メチルシトシンでは非常に緩徐にしか進まないため、適当な条件下で反応を行うと、メチル化されたシトシンはそのまま変換しないが、メチル化されていなかったシトシンはウラシルに変換されることとなる。メチル化の有無は、バイサルファイト反応後のＤＮＡ配列をテンプレートとしたＰＣＲを行って、得られたＰＣＲ産物をシーケンシングして検出したり、あるいは、バイサルファイト反応後のＤＮＡのうち、シトシンが変換されていないＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るプローブや、ウラシルに変換されたＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るプローブを利用したハイブリダイゼーションを行うことによって検出することができる。バイサルファイト反応の時間は一般的に１６時間（一晩）程度であるが、問題点として、非特異的切断反応によりほとんどのサンプルの断片化が起こる点が挙げられる。このバイサルファイト法を利用したものとして、以下の（i）〜（iv）の４つの方法等を好適に例示することができる。
【００３６】
（i）バイサルファイトシーケンシング法
サンプルであるゲノムＤＮＡに対してバイサルファイト処理を行うことによって、ゲノムＤＮＡにおける、メチル化修飾を受けたシトシンはそのまま変換せず、非メチル化シトシンのみをウラシルに変換させる。このゲノムＤＮＡについてシーケンス反応を行うと、ウラシルはチミンとして表現されることとなる。バイサルファイト処理前後のゲノムＤＮＡの配列データを比較し、バイサルファイト処理前後のいずれもシトシンである部位はメチル化シトシンであることが分かり、バイサルファイト処理前にシトシンでありバイサルファイト処理後にチミンとなった部位は非メチル化シトシンであることが分かる。
【００３７】
（ii）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ、methylation-specific PCR)法
サンプルであるゲノムＤＮＡに対してバイサルファイト処理を行うと、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとはＣｐＧ部位が異なる塩基配列を持つこととなる。このことを利用して、各々において異なる塩基配列の部位に特異的なＰＣＲプライマーを設計して、ＰＣＲ産物の有無でメチル化状態を検出する方法である。このＭＳＰ法では、バイサルファイト処理をしたＤＮＡをそのまま解析に使うことができるため、短時間で結果を確認することが可能である。
【００３８】
（iii）ＣＯＢＲＡ（combined bisulfite restriction analysis）法
バイサルファイト処理による変化により、制限酵素認識塩基配列が生じることを利用し、酵素処理後のＰＣＲ産物を電気泳動することによりメチル化を検出する方法である。認識部位のメチル化状態の有無の比を、切断の有無の量比にて定量的に検出できる。
【００３９】
（iv）HumanMethylation27 BeadChip（イルミナ株式会社製）を用いた方法
この方法は、バイサルファイトシーケンシング法の１種であるバイサルファイトピロシーケンシング法に類似した方法であり、後述の実施例で用いている方法でもある。サンプルから抽出したゲノムＤＮＡについてバイサルファイト処理を行った後、制限酵素によってＤＮＡを断片化し、該ＤＮＡ断片上の各ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度（メチル化レベル）を、付属のBeadChipを用いて検出する。このBeadChipには、各ＣｐＧ部位のシトシンがウラシルに変換したＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（非メチル検出用プローブ）と、変換していないＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（メチル検出用プローブ）が各種の遺伝子についてそれぞれ固定されている。それぞれのプローブにハイブリダイズしたＤＮＡ断片の量を蛍光で簡便に検出することによって、ゲノムＤＮＡ上の該ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定することができる。ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度の好適な指標として、β値を挙げることができる。β値とは、測定によって得られた、各ＣｐＧ部位に対応する非メチル検出用プローブの蛍光値（signal A）、及び、メチル検出用プローブの蛍光値（signal B）について、以下の計算式により算出される値である。
β＝（該ＣｐＧ部位におけるsignal Bの最大値）／（該ＣｐＧ部位におけるsignal Aの最大値＋該ＣｐＧ部位におけるsignal Bの最大値＋１００）；
この計算式によると、各ＣｐＧ部位のメチル化頻度が、０（完全非メチル化）〜１（完全メチル化）の範囲で算出されることとなる。
【００４０】
上記（Ｃ）工程は、「工程（Ｂ）において測定した本件ＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度を、コントロールとしての、検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のメチル化の頻度と比較・評価する工程」である。ここで、上記工程（Ａ）において婦人科検体組織を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、該検体組織と同種の非がん組織（好ましくは正常組織）を用い、上記工程（Ａ）において被検体の血液を用いた場合は、上記工程（Ｃ）におけるコントロールとして、該被検体と同種の非がん被検体（好ましくは正常被検体又は異形成被検体）の血液を用いる。また、婦人科検体組織を用いた場合は、より正確な評価が可能となることから、該検体組織と同一個体における同種の非がん組織（好ましくは正常組織）をコントロールとして用いることがより好ましい。なお、コントロールとしての検体組織と同種の非がん組織又は被検体と同種の非がん被検体の血液は、検体組織又は被検体の血液を採取する際に必ずしも採取する必要はなく、非がん組織又は非がん被検体の血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度についてあらかじめ検量線を作成し、それとの比較・評価を行なってもよい。また、コントロールには、被検体と同じ生物種のもの（被検体がヒトである場合にはヒトのもの）を用いることが好ましいことは言うまでもない。
【００４１】
このように検体組織又は被検体の血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度に基づいて、該検体組織又は該被検体が婦人科がんであるかどうかを判定することができる。より具体的には、工程（Ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度が、コントロールにおける同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較して増加している場合に、婦人科がんであると評価する（工程（Ｄ））こととなり、結果として、婦人科がんであると判定することができる。
【００４２】
婦人科がんであると判定する場合のメチル化頻度（好ましくは前述のβ値）の増加の程度としては、例えば、コントロールに対する相対頻度（コントロールにおけるメチル化頻度を１としたときの相対頻度）として好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上、さらにより好ましくは７以上、より好ましくは９以上、さらに好ましくは１１以上となる場合を挙げることができ、また、別の指標としては、コントロールにおける前述のβ値と比較して好ましくは０．２以上、より好ましくは０．３以上、さらに好ましくは０．４以上、さらにより好ましくは０．５以上高いβ値となる場合を挙げることができる。
【００４３】
なお、本発明の婦人科がんの判定方法に使用する本件ＣｐＧ部位は、婦人科がんについてのより高い精度を得る観点から、２箇所以上であってもよいが、現在の保険診療制度下での遺伝子検査の診療報酬の算定方法を考慮すると、１箇所であることが好ましい。
【００４４】
３．婦人科がんの判定キット
本発明における婦人科がんの判定キットとしては、本件ＣｐＧ部位のうち、いずれかのＣｐＧ部位において、該ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド（以下、「ポリヌクレオチドＡ」と表示する。）を備えている限り特に制限されないが、ＣｐＧ部位のポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし得る上記ポリヌクレオチドに加えて、該ポリヌクレオチドのＣｐＧ部位に相補的な部位におけるシトシンがウラシルとなったポリヌクレオチド（以下、「ポリヌクレオチドＢ」と表示する。）をさらに備えていることが、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度をより正確に測定することが可能となる点で好ましい。これらのポリヌクレオチドの配列は、ＮＣＢＩのデータベース等を参照して、本件ＣｐＧ部位近辺のポリヌクレオチド配列を調べることによって、適宜決定することができる。かかるポリヌクレオチドの具体例として、HumanMethylation27 BeadChip（イルミナ株式会社製）のBeadChipに固定されたポリヌクレオチドを好適に挙げることができる。本発明における判定キットの使用方法としては、HumanMethylation27 BeadChip（イルミナ株式会社製）に添付のプロトコールに記載された方法を例示することができる。
【００４５】
上記ポリヌクレオチドＡやポリヌクレオチドＢは、より容易な検出が可能となることから、蛍光標識したポリヌクレオチドであることが好ましい。上記ポリヌクレオチドＡやポリヌクレオチドＢは、該ＣｐＧ部位にハイブリダイズし得る限り、そのヌクレオチド数に制限はないが、例えば７個以上を例示することができ、特異性の観点からは、１５個以上、より好ましくは２５個以上を好適に例示することができる。
【００４６】
また、上記ポリヌクレオチドＡは、本発明の判定キットに１つ備えられていてもよいし、２つ以上備えられていてもよい。また、上記ポリヌクレオチドＢが備えられている場合は、該ポリヌクレオチドＢは１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。さらに、上記ポリヌクレオチドＡやポリヌクレオチドＢがハイブリダイズし得る本件ＣｐＧ部位は、ポリヌクレオチド１つにつき、それぞれ１箇所ずつでもよいし、それぞれ２箇所ずつ以上であってもよい。本発明の婦人科がんの判定キットに使用する本件ＣｐＧ部位は、婦人科がんについてのより高い精度を得る観点から、２箇所以上であってもよいが、現在の保険診療制度下での遺伝子検査の診療報酬の算定方法を考慮すると、１箇所であることが好ましい。
【００４７】
本発明の婦人科がんの判定方法や、本発明の婦人科がんの判定キットの判定対象（判定目的）としては、婦人科がんであるかどうかの発症判定の他、がんの進展(病期)や予後の予測などの、疾患者に対する判定も含まれる。この場合、判定目的に応じて、メチル化頻度を測定するＣｐＧ部位を適宜選択することができる。なお、がんの進展(病期)や予後の予測の判定は、治療中や手術後の罹患者の組織検体や、血液検体のメチル化頻度を測定することにより行うことができる。
【００４８】
４．婦人科がん治療薬のスクリーニング方法
本発明の婦人科がん治療薬のスクリーニング方法としては、（ａ）婦人科がんに罹患した非ヒト動物に被検物質を投与する工程：（ｂ）前記非ヒト動物における婦人科がん組織又は血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定する工程：（ｃ）工程（ｂ）において測定した遺伝子のメチル化の頻度を、コントロール非ヒト動物における婦人科がん組織又は血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較・評価する工程：を含んでいる限り特に制限されないが、さらに、（ｄ）工程（ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度が、コントロール非ヒト動物における同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較して低下している場合に、該被検物質を婦人科がん治療薬であると評価する工程：を含んでいることが好ましい。上記非ヒト動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物を好適に例示することができ、中でもマウス、ラットをより好適に例示することができる。また、婦人科がんに罹患した非ヒト動物としては、婦人科がんを自然に罹患した非ヒト動物であってもよいし、発がん物質で婦人科がんを誘導した非ヒト動物であってもよい。
【００４９】
上記（ｂ）工程における本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定する方法としては、上記（Ｂ）工程中における、抽出したゲノムＤＮＡ中の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定する方法と同様の方法を用いることができる。上記（ｃ）工程におけるコントロール非ヒト動物としては、上記工程（ａ）に用いた婦人科がんに罹患した非ヒト動物に、被検物質を投与しなかったものを好適に例示することができる。上記（ｄ）工程にあるように、工程（ｂ）において測定した遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度が、コントロール非ヒト動物における同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較して低下している場合に、該被検物質を婦人科がん治療薬であると評価することなり、結果として、そのような被検物質を婦人科がん治療薬とすることができる。婦人科がん組織又は血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度の過度の増加を正常化方向にシフトさせるような被検物質は、婦人科がん治療薬として用いうる可能性が高いと考えられる。
【００５０】
なお、（ｃ）工程に代えて、（ｅ）コントロールとしての、婦人科がん組織と同種の非がん組織（好ましくは正常組織）又は被検体と同種の非がん被検体（好ましくは正常被検体）の血液から抽出したゲノムＤＮＡ中の同遺伝子のＣｐＧ部位におけるメチル化の頻度と比較・評価する工程：を採用することができる。（ｅ）工程における比較・評価する方法としては、本件ＣｐＧ部位におけるメチル化頻度が、コントロールと比較して有意差がない場合に、該被検物質が婦人科がん治療薬である可能性が高いと判定することができる。
【００５１】
なお、本件ＣｐＧ部位を２種類以上、婦人科がんのバイオマーカーとして併用すると、婦人科がんの判定や、婦人科がん治療薬である可能性をより正確に判定することが可能となる点で好ましい。
【００５２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５３】
［サンプル組織の採取及びＤＮＡの抽出］
慶應義塾大学医学部の倫理委員会の承認のもと、慶應義塾大学病院の婦人科外来を受診した患者を選定し、サンプル提供の依頼対象者とした。その上で、その対象者からインフォームド・コンセントを得た後、６人の各対象者として９１４９（正常子宮内膜  増殖期）、９１７４（正常子宮内膜  分泌期）、９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）、９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）、９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）、９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）から、６種類のサンプル組織を採取した。
【００５４】
採取したこれらの組織のそれぞれの一部から、常法（Molecular Cloning第3版Volume1のプロトコール参照）によりゲノムＤＮＡの抽出を行った。具体的には以下のような方法で行った。採取した組織１０〜２０ｍｇ程度を１．５ｍＬチューブに入れた。そのチューブに１００μＬの抽出バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）を加え、ハサミで組織を刻んだ。次いで、１５０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを含む、４００μＬの前述の抽出バッファを添加して、５５℃で１時間インキュベートした。そして、フェノール・クロロホルムを添加して混合し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を分取して別のチューブに入れた。そこに、クロロホルムを添加して混合し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を分取して別のチューブに入れた。次に、QIAGEN社製のＲＮａｓｅＡを１μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートして、ＲＮａｓｅ処理を行った。次いで、フェノール・クロロホルムを添加して混合し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を分取して別のチューブに入れた。そこに、クロロホルムを添加して混合し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を分取して別のチューブに入れた。１０分の１容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加したイソプロパノールを添加して、１５０００ｒｐｍで５分間遠心してイソプロパノール沈殿を行った。沈殿（ゲノムＤＮＡ）を２回洗浄した後、溶解バッファを添加し、３７℃で一晩放置して沈殿を溶解させて、ゲノムＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液を用いるまでは、４℃で保存を行った。
【実施例２】
【００５５】
［抽出したゲノムＤＮＡ上の遺伝子のメチル化頻度の測定］
実施例１で抽出したゲノムＤＮＡにおける遺伝子のメチル化頻度を網羅的に測定するべく、バイサルファイト・パイロシークエンス法の変法であるHumanMethylation27 BeadChip（イルミナ株式会社製）を用いた解析を行った。この解析により、１４４９５種類のヒト遺伝子の２７５７８箇所のＣｐＧ部位におけるメチル化頻度を測定することが可能である。この解析の方法は、HumanMethylation27 BeadChip（イルミナ株式会社製）に添付のプロトコールの方法にしたがったものであるが、以下に概要を説明する。
【００５６】
抽出したゲノムＤＮＡの濃度を前述のPicoGreen dsDNA Quantitation Kitにて測定し、また、ゲノムＤＮＡの断片化の有無を電気泳動法によって確認することによって、ゲノムＤＮＡの品質を確認した。次に、このゲノムＤＮＡに対して、Zymo EZ DNA Methylation Kit（ZYMO RESEARCH社製）を使用して、バイサルファイト（亜硫酸水素塩）処理を行い、ゲノムＤＮＡ上でメチル化されていないシトシンをウラシルへ変換させた。バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡについて全ゲノム増幅によって１０００倍以上に増幅した後、酵素処理によって３００〜６００ｂｐ程度に断片化した。得られたＤＮＡ断片を抽出し、変性させて１本鎖とした後、前述のHumanMethylation27 BeadChip上の各オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーション反応させた。このBeadChip上には、各ＣｐＧ部位のシトシンがウラシルに変換したＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（非メチル検出用プローブ）と、変換していないＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ（メチル検出用プローブ）が各種の遺伝子についてそれぞれ固定されている。ハイブリダイゼーション反応させたBeadChipに対して、ビオチンラベルしたｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰと、ＤＮＰラベルしたｄｄＡＴＰ及びｄｄＵＴＰを用いた１塩基伸長反応を行った。次に、このBeadChipについて、Ｃｙ３ラベルしたストレプトアビジン及びＣｙ５ラベルした抗ＤＮＰ一次抗体で染色し、次いで、ビオチン化抗ストレプトアビジン二次抗体及びビオチン化抗ＤＮＰ二次抗体で対比染色して、免疫組織化学的分析を行った。このBeadChip上の蛍光をBeadXpress（登録商標）Reader（イルミナ株式会社製）で読み取り、各ＣｐＧ部位に対応する非メチル検出用プローブの蛍光値（signal A）、及び、メチル検出用プローブの蛍光値（signal B）を測定した。測定して得られた生データ（Raw Data）について、以下の計算式によって、該ＣｐＧ部位のメチル化頻度（β）を算出した。
β＝（該ＣｐＧ部位におけるsignal Bの最大値）／（該ＣｐＧ部位におけるsignal Aの最大値＋該ＣｐＧ部位におけるsignal Bの最大値＋１００）；
この計算式によると、各ＣｐＧ部位のメチル化頻度が、０（完全非メチル化）〜１（完全メチル化）（メチル化しているＣｐＧ部位の割合がほぼ０％〜１００％に相当）の範囲で算出されることとなる。
【００５７】
以上の解析の結果、ヒト遺伝子の２７５７８箇所のＣｐＧ部位におけるメチル化頻度が明らかとなった。次に、これらのメチル化頻度を利用して、子宮体がん特異的なメチル化部位のスクリーニングを以下のような手法により行った。
【００５８】
子宮体がんの４サンプル（９００３、９０１５、９０３０、９０２５）中のメチル化頻度（β値）の最低値が、正常子宮内膜の２サンプル（９１４９、９１７４）中のメチル化頻度（β値）の最大値の３倍以上となるＣｐＧ部位を選択した。具体的には、まず、以下の（１）〜（８）の値のすべてが３以上という条件を満たすＣｐＧ部位を選択した。
（１）９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）のβ値／９１４９（正常子宮内膜  増殖期）のβ値
（２）９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）のβ値／９１４９（正常子宮内膜  増殖期）のβ値
（３）９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）のβ値／９１４９（正常子宮内膜  増殖期）のβ値
（４）９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）のβ値／９１４９（正常子宮内膜  増殖期）のβ値
（５）９００３（子宮体がん  Iｂ  Ｇ２）のβ値／９１７４（正常子宮内膜  分泌期）のβ値
（６）９０１５（子宮体がん  Iｃ  Ｇ１）のβ値／９１７４（正常子宮内膜  分泌期）のβ値
（７）９０３０（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ１）のβ値／９１７４（正常子宮内膜  分泌期）のβ値
（８）９０２５（子宮体がん  IIIｃ  Ｇ２）のβ値／９１７４（正常子宮内膜  分泌期）のβ値
【００５９】
その結果、上記の（１）〜（８）のすべての値が３以上となったＣｐＧ部位が１８箇所見いだされ、その中の７箇所はすべての値が４以上となり、その中の２箇所はすべての値が５以上となった。上記の（１）〜（８）のすべての値が３以上となったＣｐＧ部位について、各サンプルのβ値を図１〜３に示す。また、上記の（１）〜（８）のすべての値が４以上となったＣｐＧ部位について、各サンプルのβ値を図４に示す。さらに、上記の（１）〜（８）のすべての値が５以上となったＣｐＧ部位について、各サンプルのβ値を図５に示す。
【００６０】
次に、上記の１８箇所のＣｐＧ部位について、以下の相対値（早期がん／正常）を算出した。
相対値（早期がん／正常）＝（９００３のβ値と９０１５のβ値の平均値）／（９１４９のβ値と９１７４のβ値の平均値）
なお、この相対値（早期がん／正常）は、コントロールにおけるメチル化頻度を１としたときの、早期がんにおけるメチル化の相対頻度を実質的に意味することとなる。
【００６１】
前述の１８箇所のＣｐＧ部位を、上記の相対値（早期がん／正常）の高い順に並べ替えたものを以下の表２に示す。
【００６２】
【表２】
2011160711.tif 000003
【００６３】
なお、上記の表２中のcg04272086（DCC）、cg11812218（GHSR）、cg20959866（AJAP1）、cg04062391（ZNF560）、cg25691167（FERD3L）、cg05221167（ZNF560）、cg25500444（FLJ23514）は、上記の（１）〜（８）のすべての値が４以上となったＣｐＧであり、cg04272086（DCC）、cg11812218（GHSR）は、上記（１）〜（８）のすべての値が５以上となったＣｐＧ部位である。
【００６４】
このように、前述の１８箇所のＣｐＧ部位は、婦人科正常組織と比較して、婦人科がん組織においてメチル化頻度が増加していた。したがって、これらのＣｐＧ部位のメチル化頻度は、婦人科がんのバイオマーカーとして好適に使用できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、婦人科がんのバイオマーカーの分野や、婦人科がんの判定の分野や、婦人科がん治療薬のスクリーニングの分野に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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