(57)【要約】【課題】多血小板血漿を利用する再生治療用材料であって、用時調製又は冷凍保存を必要としない再生治療用材料を開発する。【解決手段】本発明は、固体支持体にコーティングされた後に凍結乾燥された多血小板血漿を含み、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも１日間冷蔵保存された後に使用される、再生治療用材料を提供する。本発明の再生治療用材料は、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも３０日間冷蔵保存された後に使用できる場合がある。前記固体支持体は、繊維製品、多孔性基材、粒状体及び発泡体からなるグループから選択される場合がある。前記固体支持体は、生分解性材料でできている場合がある。前記固体支持体は、前記多血小板血漿がコーティングされる前に、細胞−基質間接着レセプターのリガンドがコーティングされる場合がある【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体にコーティングされた後に凍結乾燥された多血小板血漿を含み、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも１日間冷蔵保存された後に使用されることを特徴とする、再生治療用材料。
【請求項２】
前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも３０日間冷蔵保存された後に使用されることを特徴とする、請求項２に記載の再生治療用材料。
【請求項３】
前記固体支持体は、繊維製品、多孔性基材、粒状体及び発泡体からなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の再生治療用材料。
【請求項４】
前記固体支持体は生分解性材料でできていることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の再生治療用材料。
【請求項５】
前記固体支持体は、前記多血小板血漿がコーティングされる前に、細胞−基質間接着レセプターのリガンドがコーティングされることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の再生治療用材料。
【請求項６】
前記リガンドはアテロコラーゲンであることを特徴とする、請求項５に記載の再生治療用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生治療用材料に関し、具体的には、固体支持体にコーティングされた後に凍結乾燥された多血小板血漿を含む再生治療用材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト血液から分画した多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ、以下、「ＰＲＰ」という。）は、フィブリン糊として５０年以上昔から外科手術に頻繁に用いられてきた。また、２１世紀に入ると、口腔外科の分野においてＰＲＰ中に細胞増殖因子が濃縮されて含まれていることが注目され、現在、再生医療のみならず美容外科の分野での応用が進んでいる。しかし、長期保存ができないことからいずれの場合も用時調製が原則である（特許文献１）。１９９０年代から、緊急時への対応や野戦病院での応急手当などへの汎用性を拡大させるために、凍結乾燥によるＰＲＰ保存技術の開発が進んだ。また、肝臓の再生を目的としたＰＲＰの多量保存法のひとつとして凍結乾燥法の研究が進められている。ただし、これらの凍結乾燥ＰＲＰは水溶液に溶解させるのに注意を要するのが課題として残されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００７／０２７１７８号公報パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗｏｌｋｅｒｓ，Ｗ．Ｆ．ら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、４２：７９−８７（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、多血小板血漿を利用する再生治療用材料であって、用時調製又は冷凍保存を必要としない再生治療用材料を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、固体支持体にコーティングされた後に凍結乾燥された多血小板血漿を含み、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも１日間冷蔵保存された後に使用される、再生治療用材料を提供する。
【０００７】
本発明の再生治療用材料は、前記多血小板血漿が凍結乾燥されてから少なくとも３０日間冷蔵保存された後に使用される場合がある。
【０００８】
本発明の再生治療用材料において、前記固体支持体は、繊維製品、多孔性基材、粒状体及び発泡体からなるグループから選択される場合がある。
【０００９】
本発明の再生治療用材料において、前記固体支持体は生分解性材料でできている場合がある。
【００１０】
本発明の再生治療用材料において、前記固体支持体は、前記多血小板血漿がコーティングされる前に、細胞−基質間接着レセプターのリガンドがコーティングされる場合がある。
【００１１】
本発明の再生治療用材料において、前記リガンドはアテロコラーゲンの場合がある。
【００１２】
本発明において、固体支持体とは、多血小板血漿をコーティングしてから凍結乾燥されるまでの間、ほぼ一定の形状を保つことができることを条件として、いかなる材質及び形状であってもかまわない。本発明における固体支持体の好ましい材質は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及びこれらの共重合体のような短期吸収性の生分解性ポリマー又は生体吸収性ポリマーと、プロパンジオール、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−イプシロン−カプロラクトン）、ポリカプロラクトン及びこれらの共重合体のような長期分解性の生分解性ポリマー又は生体吸収性ポリマーと、ポリブチレンサクシネート、ポリビニルアルコール、キトサンその他の生分解性ポリマー又は生体吸収性ポリマーと、非生分解性ポリマーの絹とを含むが、これらに限定されない。本発明における固体支持体の好ましい形状は、織物、編物、不織布、ステッチ、綿、布、紙、フィルター等の繊維製品と、粒状体及び発泡体を含む多孔性基材とを含むが、これらに限定されない。好ましい繊維製品には、メッシュ、ガーゼ地のような織物の他、編物、不織布、ステッチ、綿のように、創傷被覆材として慣用されるものを含む。
【００１３】
本発明において用いられる用語「コーティング」とは、ＰＲＰや、アテロコラーゲンのようなリガンドを含む溶液に、固体支持体が覆われることを指す。すなわちコーティングとは、ＰＲＰが前記固体支持体の表面で凝固することの他に、前記溶液が前記固体支持体の繊維間隙や細孔を通って毛細管現象で浸透することや、前記溶液の存在下で前記固体支持体が溶解又は分解するために前記固体支持体の表面に前記溶液の層又は膜が形成されることによって、前記固体支持体に前記溶液が吸収されることを含む広い意味を有する。
【００１４】
本発明においてＰＲＰは、所要の細胞増殖促進活性、創傷治癒促進活性等を有すること、及び、血液製剤としての安全性が確保されることを条件として、いかなる出所のものであってもかまわない。しかし、種特異性を考慮すると、再生治療の対象となる患者と同じ種の個体に由来することが好ましい。また、血液製剤としての安全性を担保するためには、ＰＲＰは、再生治療の対象となる患者自身から採取された血液から精製されることがより好ましい。ＰＲＰの調製は、例えば、Ｏｋｕｄａ，Ｋ．ら（Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．７４：８４９−８５７（２００３））及び特開２００４−２０１７９９号明細書に従って行う。簡潔には、患者から採血した新鮮な全血をクエン酸及びブドウ糖を含む抗凝固剤を添加した１０ｍＬ遠心管に分注し、最短径約５７ｍｍ、最長径約１４０ｍｍのスウィングバケット型ロータで２，４００ｒｐｍ、１０分間遠心する。遠心分離すると、赤血球が沈殿し、上清の血漿との間に血小板が集まる。次に、血小板及び血漿を別の１０ｍＬ遠心管に移して３，６００ｒｐｍ、１５分間遠心して、血小板を沈殿させ、最少量の血漿中に懸濁して回収した分画を多血小板血漿として使用する。本発明の多血小板血漿は患者から採取した新鮮なものを使用する場合もあるが、凍結保存したものを使用する場合もある。また、ＰＲＰの提供者は、患者自身であることが好ましい。しかし、血液製剤としての安全性が確保されることを条件として、献血のように患者以外の人間から採取された血液から調製されたＰＲＰを用いる場合もある。
【００１５】
本発明において、凍結乾燥は、冷却及び／又は減圧によって乾燥させることを指し、遠心分離を伴う場合がある。例えば、ＰＲＰや、アテロコラーゲンのようなリガンドでコーティングされた織布が、−８０°Ｃのディープフリーザー内で約１時間予備凍結され、その後、凍結乾燥装置で−４５°Ｃ、２０Ｐａで約１０分間処理される場合がある。完全に凍結乾燥させるために、さらに２０ないし５０分間処理される場合もある。
【００１６】
本発明において、冷蔵保存とは、−８０°Ｃないし−２０°Ｃの保存のための冷凍庫を必要としない、室温より低いいずれかの温度で保存することを指し、０°Ｃないし１０°Ｃの範囲の温度での保存が好ましく、４°Ｃないし１０°Ｃの範囲の温度での保存がより好ましい。
【００１７】
本発明において、細胞−基質間接着とは、細胞と細胞外マトリクスとの接着や、細胞と培養容器の表面との接着を指す。本発明における細胞−基質間接着レセプターのリガンドは、コラーゲン及びアテロコラーゲンや、フィブロネクチン、ラミニンを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明の再生治療用材料は、創傷被覆材や、硬組織及び／又は軟組織の欠損部分に包埋するインプラント材として利用できる。また、従来の凍結乾燥ＰＲＰの代替品として、細胞増殖因子の供給源等の目的で利用することができる。
【００１９】
本発明の再生治療用材料は少なくとも１日間冷蔵保存された後に使用されるため、用時調製の必要がない。そこで、遠心機等の設備がない小規模の医療機関での再生治療に特に有用である。また本発明の再生治療用材料は冷蔵保存が可能なので、輸送及び保存にドライアイス、ディープフリーザー等の必要がない。そのため、エネルギー消費の点からも凍結ＰＲＰの代替品として有用である。
【００２０】
（生命倫理）
ヒト由来の培養細胞、ＰＲＰ及びラットを使用するにあたって、新潟大学医歯学総合病院の倫理規定に基づき作成した実験計画を新潟大学歯学部倫理委員会で承認を受けた。さらに、インフォームドコンセントにより、その都度、提供者に対して骨膜細胞及びＰＲＰの採取と実験への供与について説明し、書面による同意を得た。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＰＲＰコーティング織布のヒト骨膜由来培養細胞の増殖への影響を調べる実験結果の棒グラフ。
【図２】生体吸収性織布を用いないで処置された対照実験のラットの創傷組織（Ａ）と、ＰＲＰがコーティングされた生体吸収性織布を用いて処置されたラットの創傷組織（Ｂ）とのヘマトキシリン・エオジン染色された組織の光学顕微鏡写真。
【図３】アテロコラーゲン及びＰＲＰでコーティングされた生体吸収性織布上で培養された骨膜片初代培養の隣接する薄切切片に、それぞれ、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ａ）及びフォン・コッサ染色（Ｂ）を施した組織標本の光学顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【実施例１】
【００２３】
ヒト骨膜由来培養細胞の増殖促進効果
ＰＲＰの調製
患者から採血した新鮮な全血がクエン酸及びブドウ糖を含む抗凝固剤を添加した１０ｍＬ遠心管に分注され、最短径約５７ｍｍ、最長径約１４０ｍｍのスウィングバケット型ロータで２，４００ｒｐｍ、１０分間遠心された。遠心分離により赤血球が沈殿し、上清の血漿との間に血小板が集まった。前記血小板及び血漿が別の１０ｍＬ遠心管に回収され、３，６００ｒｐｍ、１５分間遠心された。沈殿した血小板は最少量の血漿中に懸濁して回収され、これが多血小板血漿として使用された。
【００２４】
ＰＲＰコーティング織布の調製
５、ｍｍ×５ｍｍ及び５ｍｍ×１０ｍｍの生体吸収性織布（バイクリルメッシュ、カタログ番号：ＶＩＣＲＹＬ  ＷＯＶＥＮ  ＭＥＳＨ  （Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０）  ＶＷＭＭ、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社）が、それぞれ、前記ＰＲＰ３０μＬ及び６０μＬで室温、３−５分間コーティングされた。前記織布は、−８０°Ｃのディープフリーザー内で約１時間予備凍結され、その後、凍結乾燥装置で−４５°Ｃ、２０Ｐａで３０ないし６０分間処理された。（以下、それぞれ「ＰＲＰ×１」及び「ＰＲＰ×２」という。）。前記ＰＲＰコーティング織布は、使用まで冷蔵庫で貯蔵及び保存された。
【００２５】
細胞
患者から採取された骨膜片由来の培養細胞（以下、「ヒト骨膜由来培養細胞」という。）が用いられた。ウシ胎児血清が１０％添加されたダルベッコ変法イーグル培地での継代６回目の前記ヒト骨膜由来培養細胞は、セルインサート（ベクトン・ディキンソン、＃３５３０９０）付きの６ウェルプレート（ベクトン・ディキンソン、＃３５３５０２又は＃５５４６７）にウェルあたり１×１０５個となるように播種された。培養は、ウシ胎児血清が１％添加されたダルベッコ変法イーグル培地（以下、「分化用培地」という。）をウェルに２ｍＬ、セルインサートに１ｍＬ添加して、３７°Ｃ、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で２日間行なわれた。前記セルインサートには、前記骨膜片を採取したのと同一の患者由来のＰＲＰ×１又はＰＲＰ×２が１枚浸漬された。対照実験は、ＰＲＰをコーティングしない織布を使用した培養と、ＰＲＰ×１及びＰＲＰ×２を使用せず分化用培地のみの培養とであった。
【００２６】
細胞増殖の定量
２日間の培養後、細胞は解離され、粒子数計測分析装置（ＣＤＡ−１００Ｘ、シスメックス社）で細胞数が測定された。
【００２７】
結果
図１は、ＰＲＰコーティング織布のヒト骨膜由来培養細胞の増殖への影響を調べる実験結果の棒グラフである。図１に示すとおり、ウェルあたりの細胞数は、対照実験では１．０×１０５個、ＰＲＰ×１を用いた場合には１．２×１０５個、ＰＲＰ×２を用いた場合には１．４×１０５個であった。この結果は、ＰＲＰコーティングバイクリルメッシュのサイズが大きいほど、細胞増殖を促進する活性が高いことを示唆する。なお、ＰＲＰをコーティングしない生体吸収性織布は、細胞増殖促進活性を示さなかった（図示されない）。また、本実施例では冷蔵庫での貯蔵期間が１日のＰＲＰコーティング織布を用いたが、貯蔵期間が３０日のＰＲＰコーティング織布でも、同様の細胞増殖促進活性が認められた。
【実施例２】
【００２８】
ラット皮膚創傷の治癒促進効果
創傷及び処置
局部麻酔されたラット（Ｆ３３４、オス、６週齢）背部の表皮が、１０ｍｍ×１０ｍｍ切開除去された。ＰＲＰをコーティングした１０ｍｍ×１０ｍｍの生体吸収性織布（バイクリルメッシュ、カタログ番号：ＶＩＣＲＹＬ  ＷＯＶＥＮ  ＭＥＳＨ  （Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０）  ＶＷＭＭ、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社）が創傷部位に留置され、その上から外科用ポリウレタンフィルム（サージット、ニプロ）が貼付された。対照実験は、生体吸収性織布を留置せず外科用ポリウレタンフィルムだけを創傷部位に貼付したラットであった。
【００２９】
組織学的観察
創傷処置の５日後に創傷組織が摘出され、光学顕微鏡観察用組織標本が作製された。薄切切片の作製及びヘマトキシリン・エオジン染色は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。
【００３０】
結果
図２は、生体吸収性織布を用いないで処置された対照実験のラットの創傷組織（Ａ）と、ＰＲＰがコーティングされた生体吸収性織布を用いて処置されたラットの創傷組織（Ｂ）とのヘマトキシリン・エオジン染色された組織の光学顕微鏡写真である。図２（Ａ）のアステリク（＊）で示される部分は、皮下に形成された肉芽組織である。対照実験の創傷組織（Ａ）では、創傷部分の皮下の一部にしか肉芽組織が形成されなかったのに対し、ＰＲＰがコーティングされた生体吸収性織布で処置された創傷組織（Ｂ）では、創傷部分の皮下全体に肉芽組織が形成された。この結果は、ＰＲＰをコーティングした生体吸収性織布に創傷治癒促進作用があることを示す。また、本実施例では冷蔵庫での貯蔵期間が１日のＰＲＰコーティング織布を用いたが、貯蔵期間が３０日のＰＲＰコーティング織布でも、同様の創傷治癒促進作用が認められた。
【実施例３】
【００３１】
ヒト骨膜片初代培養での細胞遊走及び細胞分化促進効果
ヒト骨膜片培養用ＰＲＰコーティング織布の調製
実施例１で用いた生体吸収性織布（バイクリルメッシュ）は、予めステアリン酸カルシウムでコーティングされており、ＰＲＰをコーティングしただけではヒト細胞が付着し難いので、ヒト骨膜片細胞の培養基材としては適さない。そこで、本実施例のヒト骨膜片の初代培養のための生体吸収性織布は、ＰＲＰのコーティングに先立って、アテロコラーゲンでコーティングされた。具体的には、７−１０ｍｍ×７−１０ｍｍの生体吸収性織布（バイクリルメッシュ、カタログ番号：ＶＩＣＲＹＬ  ＷＯＶＥＮ  ＭＥＳＨ  （Ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０）  ＶＷＭＭ、ジョンソン・エンド・ジョンソン株式会社）が、３ｍｇ／ｍＬのウシ真皮由来アテロコラーゲン（高研、ＩＰＣ−３０）溶液５０μＬで１５−３０分間コーティングされてから、滅菌蒸留水で３回軽くリンスされ、ガーゼ上で乾燥された後、実施例１で調製されたＰＲＰ１２０μＬで室温、３−５分間コーティングされた。
【００３２】
ヒト骨膜片の処理
ＰＲＰを提供した患者から採取された骨膜片は、培地で湿したガーゼの上に戴せて無菌的に培養室に運ばれ、クリーンベンチ内で以下の作業に供された。前記骨膜片は、ＰＢＳで３回洗浄されてから、アテロコラーゲン及びＰＲＰをコーティングした織布の上に中央に戴置された。前記織布上の骨膜片は、プラスチックディッシュ中で、２５μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０％ウシ胎児血清が含まれるメディウム１９９培養液を用いて合計２６日間培養された。
【００３３】
骨芽細胞への分化
前記骨膜片の初代培養は、１９日後に培地を、１０ｎＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、２５μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０％ウシ胎児血清が含まれるメディウム１９９培養液に切り替えて、さらに７日間培養された。
【００３４】
骨膜片初代培養の組織学的観察
初代培養開始から２６日後、前記織布上の骨膜片培養の組織標本が作製された。薄切切片の作製、ヘマトキシリン・エオジン染色及びフォン・コッサ染色は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。
【００３５】
図３は、アテロコラーゲン及びＰＲＰでコーティングされた生体吸収性織布上で培養された骨膜片初代培養の隣接する薄切切片に、それぞれ、ヘマトキシリン・エオジン染色（Ａ）及びフォン・コッサ染色（Ｂ）を施した組織標本の光学顕微鏡写真である。ヘマトキシリン・エオジン染色標本（Ａ）では、骨膜片からの活発な細胞遊走が観察された。フォン・コッサ染色標本（Ｂ）では、骨膜片の中心に黒く染色された部分が観察され、骨膜片内部での石灰化物の沈着が認められた。この結果から、アテロコラーゲン及びＰＲＰでコーティングされた織布は、骨膜片からの細胞遊走及び骨膜片での石灰化を促進することが示された。また本実施例では、アテロコラーゲン及びＰＲＰでコーティングされた織布は冷蔵庫で１日貯蔵後実験に供された。しかし、貯蔵期間が３０日のコーティング織布でも、同様の創傷治癒促進作用が認められた。
【図１】
2011120763.tif 000002
【図２】
2011120763.tif 000003
【図３】
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