(57)【要約】【課題】本発明は、修飾ヒトインシュリン様増殖因子１タンパク質に免疫特異的に結合する抗体の製造および使用を提供すること。【解決手段】本発明の高特異性抗体により上記課題を解決する。当該抗体は、修飾(例えば、ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ)と内因性ヒトＩＧＦ−１タンパク質を区別できる。これらの抗体はｈＩＧＦ−１またはｈＩＧＦ−２とわずかしか、または全く交差反応しない。それらはまた齧歯類ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２とわずかしか、または全く交差反応しない。本抗体はヒトまたは動物に投与されているＩＧＦ−１／Ｅペプチドの薬物動態学的(ＰＫ)／薬力学(ＰＤ)評価に使用できる。本発明の抗体を捕捉抗体として使用するサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、サンプル中の変異ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質を定量できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドＧＰＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号１)に免疫特異的に結合するが、ペプチドＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号２)に免疫特異的に結合しない抗体。
【請求項２】
ペプチドＧＰＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号１)を含むポリペプチドに免疫特異的に結合するが、ペプチドＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号２)を含むポリペプチドに免疫特異的に結合しない抗体。
【請求項３】
ペプチドＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(配列番号６)に免疫特異的に結合するが、ペプチドＰＴＫＡＡＲＳＩＲＡＱＲ(配列番号７)に免疫特異的に結合しない抗体。
【請求項４】
ペプチドＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(配列番号６)を含むポリペプチドに免疫特異的に結合するが、ペプチドＰＴＫＡＡＲＳＩＲＡＱＲ(配列番号７)を含むポリペプチドに免疫特異的に結合しない、抗体。
【請求項５】
ＱＣ１(ハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３０２８により発現)、ＱＣ２(ハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３０２６により発現)、ＱＱ２(ハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３０２７により発現)、ＱＱ５(ハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３０２４により発現)およびＱＱ６(ハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３０２５により発現)から成る群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
(ｉ)ＣＤＲＨ１について配列番号１２、ＣＤＲＨ２について配列番号１３、ＣＤＲＨ３について配列番号１４、ＣＤＲＬ１について配列番号１５、ＣＤＲＬ２について配列番号１６およびＣＤＲＬ３について配列番号１７；
(ii)ＣＤＲＨ１について配列番号１８、ＣＤＲＨ２について配列番号１９、ＣＤＲＨ３について配列番号２０、ＣＤＲＬ１について配列番号２１、ＣＤＲＬ２について配列番号２２およびＣＤＲＬ３について配列番号２３；
(iii)ＣＤＲＨ１について配列番号２４、ＣＤＲＨ２について配列番号２５、ＣＤＲＨ３について配列番号２６、ＣＤＲＬ１について配列番号２７、ＣＤＲＬ２について配列番号２８およびＣＤＲＬ３について配列番号２９；
(iv)ＣＤＲＨ１について配列番号３０、ＣＤＲＨ２について配列番号３１、ＣＤＲＨ３について配列番号３２、ＣＤＲＬ１について配列番号３３、ＣＤＲＬ２について配列番号３４およびＣＤＲＬ３について配列番号３５；または
(ｖ)ＣＤＲＨ１について配列番号３６、ＣＤＲＨ２について配列番号３７、ＣＤＲＨ３について配列番号３８、ＣＤＲＬ１について配列番号３９、ＣＤＲＬ２について配列番号４０およびＣＤＲＬ３について配列番号４１
を含む、請求項１から４のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
(ｉ)配列番号４２を含むＶＨ鎖および配列番号４３を含むＶＬ鎖；
(ii)配列番号４４を含むＶＨ鎖および配列番号４５を含むＶＬ鎖；
(iii)配列番号４６を含むＶＨ鎖および配列番号４７を含むＶＬ鎖；
(iv)配列番号４８を含むＶＨ鎖および配列番号４９を含むＶＬ鎖；または
(ｖ)配列番号５０を含むＶＨ鎖および配列番号５１を含むＶＬ鎖
を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２８、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２６、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２７、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２４およびＤＳＭ  ＡＣＣ３０２５(これら全てＤＳＭＺに寄託)から成る群から選択される、ハイブリドーマ。
【請求項９】
配列ＧＰＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号１)、ＣＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(配列番号５)またはＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(配列番号６)を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項５−７のいずれかに記載の抗体または請求項９に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１−７のいずれかに記載の抗体を含む、修飾インシュリン様増殖因子１／Ｅ(ＩＧＦ−１)の検出のための改善された酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)。
【請求項１４】
溶液から修飾インシュリン様増殖因子１／Ｅ(ＩＧＦ−１)を精製するための改善された親和性クロマトグラフィー方法であって、この改善が、請求項１−７のいずれかに記載の抗体による精製を含む、方法。
【請求項１５】
患者から得た血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを、請求項１−７のいずれかに記載の抗体を使用して検出する工程を含む、患者における修飾ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質のレベルを測定する方法。
【請求項１６】
Ａ  修飾ＩＧＦ−１／Ｅを必要とする患者におけるその最適投与量を維持する方法であって：
(ｉ)請求項１−７のいずれかに記載の抗体を使用して、修飾ＩＧＦ−１／Ｅを投与されている患者からの血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを検出し；そして
(ii)患者血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅのレベルが予定レベルより低いとき、さらに該修飾ＩＧＦ−１／Ｅを該患者に投与する
工程を含む、方法。
【請求項１７】
筋肉障害を有する患者の処置方法であって：
(ｉ)修飾ＩＧＦ−１／Ｅを以前に投与されている患者から得た血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅの血清濃度を請求項１−７のいずれかに記載の抗体を使用して測定し；そして
(ii)ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔの血清濃度が予定した最適レベルより低いならば、さらに修飾ＩＧＦ−１／Ｅを患者に投与する。
【請求項１８】
修飾ＩＧＦ−１／ＥがＷＯ２００７／１４６６８９に記載されているものである、請求項１３に記載のアッセイまたは請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔがＷＯ２００７／１４６６８９の実施例１に記載のもの(そこでは配列番号８と記載され、ここでは修飾ＩＧＦ−１Ｅ  Ｎｏ.１と記載される)、またはＷＯ２００７／１４６６８９の実施例４５に記載のもの(そこでは配列番号５３と記載され、ここでは修飾ＩＧＦ−１／Ｅ  Ｎｏ.２と記載される)である、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫グロブリン、抗体およびそのフラグメントに関する。特に、本発明は、修飾ヒトインシュリン様増殖因子１タンパク質に免疫特異的に結合する抗体の製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インシュリン様増殖因子１(ＩＧＦ−１、ソマトメジン)は、筋肉肥大を誘発し、骨格筋萎縮を阻止する小一本鎖タンパク質である。ＩＧＦ−１は、最初に、ヒト身体でＩＧＦ−１／Ｅ前駆体として合成され、ここで、Ｅは成熟ＩＧＦ−１タンパク質のＣ末端の伸張ペプチドである。成熟ＩＧＦ−１は、最初は既知スプライス変異体ｍＲＮＡの３個のうち１個によりコードされる。各ｍＲＮＡのオープン・リーディング・フレームは、７０アミノ酸ＩＧＦ−１部分および、Ｃ末端に特定のＩＧＦ−１  ｍＲＮＡによってＥａ、ＥｂまたはＥｃであり得る特定の伸張(Ｅ)ペプチドを含む前駆体タンパク質をコードする。このＣ末端ＥペプチドがそのＩＧＦ−１成熟体として開裂される。
【０００３】
修飾組み換えヒトＩＧＦ−１／Ｅタンパク質は構築され、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００７／１４６６８９に記載されている。これらの修飾ＩＧＦ−１／Ｅペプチドは野生型ＩＧＦ−１と比較して長い半減期、高い安定性、阻害性インシュリン様増殖因子結合タンパク質(ＩＧＦＢＰ)への低い親和性、および高い効果を有する。例示的修飾ヒトＩＧＦ−１／Ｅタンパク質は、ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔである(図１参照)。“３ｍｕｔ”名は、次の３工程の修飾を有するｈＩＧＦ−１−Ｅ−ペプチド前駆体を意味する：(１)Ｇ１、Ｐ２、およびＥ３の欠失；(２)Ａｒｇ３７からＡｌａへの変異(Ｒ３７Ａ)；および(３)Ｒ７１およびＳ７２の欠失。これらのｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔペプチドは骨格筋萎縮の処置用の新規薬剤の可能性があるとして提案されている。
【０００４】
しかしながら、この候補薬剤の薬物動態学(ＰＫ)および薬力学(ＰＤ)の評価は、野生型と修飾ｈＩＧＦ−１／Ｅペプチドが、互いに全ペプチド鎖長における３個所の離れた位置での１個または２個のアミノ酸しか異ならないため、困難である(図１)。内因性ｈＩＧＦ−１の同時の検出無しにｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔペプチドを認識する抗体は市販されていない。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
本発明は、修飾(例えば、ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ)および内因性ヒトＩＧＦ−１タンパク質を区別できる高特異性抗体提供する。本発明の抗体は、ｈＩＧＦ−１またはｈＩＧＦ−２と交差反応性がわずかしか、または全くない。それらはまた齧歯類ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２と、交差反応性がわずかしか、または全くない。本抗体は、ヒトまたは動物に投与されたＩＧＦ−１／Ｅペプチドの薬物動態学的(ＰＫ)および薬力学(ＰＤ)評価に有用である。
【０００６】
一つの態様において、本発明の抗体は、ペプチドＧＰＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号１)に免疫特異的に結合するが、ペプチドＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号２)には免疫特異的に結合しない。他の態様において、本発明の抗体は、ペプチドＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(配列番号６)と免疫特異的に結合するが、ペプチドＰＴＫＡＡＲＳＩＲＡＱＲ(配列番号７)とは免疫特異的に結合しない。
【０００７】
本発明は、それ故、抗体ＱＣ１、ＱＣ２、ＱＱ２、ＱＱ５およびＱＱ６を提供する。
本抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。それらは、適当な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダまたはサメの免疫化により製造し得る。
【０００８】
さらに本発明の範囲に包含されるのは、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードする核酸配列、かかる核酸配列を含むベクター、例えば発現ベクター、ならびにかかるベクターで形質転換した細胞である。
【０００９】
本発明はまた、ハイブリドーマＤＳＭ  ＡＣＣ３０２８、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２６、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２７、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２４およびＤＳＭ  ＡＣＣ３０２５(２００９年１１月１０日にDSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託)を提供し、これらは各々抗体ＱＣ１、ＱＣ２、ＱＱ２、ＱＱ５およびＱＱ６の発現に使用できる。
【００１０】
本発明はまた、修飾組み換えヒトＩＧＦ−１／Ｅペプチドの薬物動態学的(ＰＫ)／薬力学(ＰＤ)関係を評価するための生化学分析アッセイも提供する。
【００１１】
一つの態様において、本発明の抗体が免疫吸着剤(捕捉抗体)として使用される、本アッセイは放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ前臨床および臨床サンプル中の変異ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質を定量するためのアッセイである。これらの適用において、本抗体を分析により検出できる試薬、例えば放射性同位体、蛍光分子または酵素で標識できる。
【００１２】
加えて、本発明の抗体を、例えば親和性クロマトグラフィーにより、大量のＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔペプチドを精製するために使用する。本発明の抗体は、それ故に、筋肉萎縮処置用医薬の商業規模精製に有用である。
【００１３】
一つの態様において、上記方法に使用する抗体は、ＱＣ１、ＱＣ２、ＱＱ２、ＱＱ５およびＱＱ６から成る群から選択される。
【００１４】
発明の詳細な記載
本発明の抗体
定義。本明細書に使用するいくつかの用語の定義を以下に記載する。他の用語の定義は、Illustrated Dictionary of Immunology, 2nd Edition, Cruse, J.M. and Lewis, R.E., eds. (CRC Press, Boca Raton, Florida, 1995)に見ることができる。
【００１５】
対象への薬剤または医薬の投与は、自己投与および他者による投与を含む。記載の医学的状態の処置または予防の種々のモードは、完全なまたは完全未満の処置または予防を含み、そしてここで、何らかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される、“実質的”を意味することも認識されよう。
【００１６】
用語“抗体”は、あるエピトープ、例えば、修飾ＩＧＦ−１／Ｅペプチドに見られるが、野生型ＩＧＦで見られないエピトープ、例えば両方とも以下に記載するペプチドＡおよびペプチドＣ抗原のエピトープと特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント由来のフレームワーク領域を含む、ポリペプチドを意味する。用語抗体の使用は、一本鎖完全抗体を含む完全抗体、およびその抗原結合フラグメントを意味する。用語“抗体”は、一本鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントを含み、これは、可変領域のみを、またはそれを、次のポリペプチド要素の全てまたは一部と組み合わせて含み得る：抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。また本発明に包含されるのは、可変領域およびヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの何らかの組み合わせである。本発明の結合剤として有用な抗体関連分子は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ(ａｂ’)２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ(ｓｃＦｖ)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ(ｓｄＦｖ)およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントを含み、これに限定されない。例は：(ｉ)Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ’)２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により結合した２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；(iv)抗体の１個のアームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント(Ward et al., Nature 341:544-546, 1989)；および(vi)単離された相補性決定領域(ＣＤＲ)。用語“抗体”は、一ドメイン抗体、マキシボディ(maxibody)、ミニボディ(minibody)、イントラボディ(intrabody)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖを含む(例えば, Hollinger & Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136(2005)参照)。抗体が産生されたら、それをキメラ化またはヒト化し得る。例えば、キメラ抗体を作るために、当分野で既知の方法を使用して、可変領域をヒト定常領域に結合できる(例えば、Cabilly et al.の米国特許４,８１６,５６７参照)。ヒト化抗体を作るために、当分野で既知の方法を使用して、ＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入できる。例えば、Winterの米国特許５２２５５３９、およびQueen et al.の米国特許５５３０１０１；５５８５０８９；５６９３７６２および６１８０３７０参照。この代わり、抗体の抗原結合部分を、フィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドをベースにした骨格にグラフトできる(フィブロネクチンポリペプチドモノボディ(monobody)を記載する米国特許６,７０３,１９９参照)。抗原結合部分を、タンデムＦｖセグメント(ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１)の対を含む一本鎖分子に挿入でき、それは、相補的軽鎖ポリペプチドと一体となって、抗原結合領域の対を作る(Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)；および米国特許５,６４１,８７０)。
【００１７】
用語“生物学的サンプル”は、生存細胞由来の、またはそれと接触したサンプル材料を意味する。用語“生物学的サンプル”は、対象から単離された組織、細胞および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むことを意図する。
【００１８】
用語“エピトープ”は、抗体に特異的結合できるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性な分子の表面基群(surface grouping)、例えばアミノ酸類または糖側鎖を有し、通常特異的三次元構造的特性、ならびに特異的荷電特性を有する。高次構造および非高次構造エピトープは、変性溶媒存在下で、前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないことにより区別される。
【００１９】
用語“免疫学的反応条件”は、抗原の特定のエピトープに対して産生された抗体が、その抗体が実質的に他の全てのエピトープに結合するようにも検出可能に大きな程度で、一般的にバックグラウンド結合の少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドの少なくとも５倍でそのエピトープに結合することを可能にする条件を意味する。免疫学的反応条件は、抗体結合反応に依存し、そして典型的に免疫アッセイプロトコールにおいて用いられるものである。免疫アッセイ形態および条件の詳細についてHarlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)を参照のこと。
【００２０】
ここで使用する用語“免疫特異的”は、１個だけの抗原性決定因子と反応する個々の抗体結合部位の能力を意味する。本抗体の結合部位は、分子のＦａｂ部分に位置し、重および軽鎖の超可変領域から構築される。抗体の結合親和性は、一抗原性決定因子と抗体上の一結合部位の間の反応の強度である。これは、抗原性決定因子と抗体の結合部位の間に作用する引力および反発力の合計である。ＩｇＧ抗体についてここで使用する用語“高親和性”は、標的抗原に対して１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ、または１０−１１Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。しかしながら、“高親和性”結合は、抗体アイソタイプが違えば異なる。例えば、ＩｇＭアイソタイプの“高親和性”結合は、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を意味する。用語“モノクローナル抗体”は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む一クローン由来の抗体を意味し、それが産生された方法を意味しない。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して一結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ、組み換え、およびファージディスレイ法を含み、これに限定されない種々の方法を使用して製造できる。
【００２１】
用語“ポリクローナル抗体”は、少なくとも２種の異なる抗体産生細胞株に由来する抗体の調製物を意味する。この用語の使用は、抗原の異なるエピトープまたは領域に特異的に結合する抗体を含む、少なくとも２個の抗体の調製物を含む。
【００２２】
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は、互いにペプチド結合または修飾ペプチド結合(すなわち、ペプチドアイソスター)により結合された２個以上のアミノ酸を含むポリマーを意味するために、ここで、交換可能に使用される。ポリペプチドは、一般にペプチド、糖ペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖、および一般的にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、２０種の遺伝子がコードするアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドは、自然の過程で、例えば翻訳後の過程で、または当分野で既知の化学的修飾技術のいずれかで修飾されたアミノ酸配列を含む。かかる修飾は、基礎的教科書におよびより詳細に研究書に、ならびに無数の学術論文に十分に記載されている。特に、修飾ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質は、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００７／１４６６８９に記載の任意の修飾ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質、ならびにその二次的に修飾された(グリコシル化、ペグ化など)タンパク質であり得る。
【００２３】
用語“組み換え”は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して使用したとき、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入により、または、天然核酸またはタンパク質の改変により修飾されているか、またはその物質が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。特に、組み換えＩＧＦ−１／Ｅタンパク質は、公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ２００７／１４６６８９に記載の任意の組み換えＩＧＦ−１／Ｅタンパク質、ならびにその二次的に修飾された(グリコシル化、ペグ化など)タンパク質であり得る。
【００２４】
用語“一本鎖抗体”または“一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)”は、Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨの抗体融合分子を意味する。Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別の遺伝子によりコードされるが、それらを、組み換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる一価分子を形成する、一タンパク質鎖としてそれらを製造できる合成リンカーにより、結合できる。例えば、Bird et al., Science 242: 423-426 (1988);およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)参照。かかる一本鎖抗体は、用語“抗体”フラグメントの中に包含され、組み換え技術によりまたは完全抗体の酵素的または化学的開裂により製造できる。
【００２５】
用語“特異的結合”は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性での、本発明の抗体とエピトープの(ここに記載のペプチド(ペプチドＡ、ペプチドＢまたはペプチドＣ)またはかかるペプチドを含むタンパク質上での)接触を意味する。好ましい結合剤は、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍの親和性で結合する。
【００２６】
上記の通り、本発明の抗体を標識してよい。標識抗体は、種々の標識を用いる、種々のアッセイに使用できる。本発明の抗体と目的のエピトープの間の抗体−抗原複合体の形成の検出は、抗体に検出可能な物質を結合させることにより容易にできる。適当な検出手段は、標識、例えば放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体(fluorescer)、化学発光体(chemiluminescer)、色原体、酵素基質またはコファクター、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素などの使用を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンを含む；発光物質の例はルミノールである；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む；そして適当な放射活性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。
【００２７】
本発明の抗体の例を、下記表ＡおよびＢに開示する。
【表１】
2011160696.tif 000002
【表２】
2011160696.tif 000003
【００２８】
一つの態様において、本発明の抗体は、(ｉ)ＣＤＲＨ１について配列番号１２、ＣＤＲＨ２について配列番号１３およびＣＤＲＨ３について配列番号１４；(ii)ＣＤＲＨ１について配列番号１８、ＣＤＲＨ２について配列番号１９およびＣＤＲＨ３について配列番号２０；(iii)ＣＤＲＨ１について配列番号２４、ＣＤＲＨ２について配列番号２５およびＣＤＲＨ３について配列番号２６；(iv)ＣＤＲＨ１について配列番号３０、ＣＤＲＨ２について配列番号３１およびＣＤＲＨ３について配列番号３２；または(ｖ)ＣＤＲＨ１について配列番号３６、ＣＤＲＨ２について配列番号３７およびＣＤＲＨ３について配列番号３８を含む。
【００２９】
一つの態様において、本発明の抗体は、(ｉ)ＣＤＲＬ１について配列番号１５、ＣＤＲＬ２について配列番号１６およびＣＤＲＬ３について配列番号１７；(ii)ＣＤＲＬ１について配列番号２１、ＣＤＲＬ２について配列番号２２およびＣＤＲＬ３について配列番号２３；(iii)ＣＤＲＬ１について配列番号２７、ＣＤＲＬ２について配列番号２８およびＣＤＲＬ３について配列番号２９；(iv)ＣＤＲＬ１について配列番号３３、ＣＤＲＬ２について配列番号３４およびＣＤＲＬ３について配列番号３５；または(ｖ)ＣＤＲＬ１について配列番号３９、ＣＤＲＬ２について配列番号４０およびＣＤＲＬ３について配列番号４１を含む。
【００３０】
一つの態様において、本発明の抗体は、(ｉ)ＣＤＲＨ１について配列番号１２、ＣＤＲＨ２について配列番号１３、ＣＤＲＨ３について配列番号１４、ＣＤＲＬ１について配列番号１５、ＣＤＲＬ２について配列番号１６およびＣＤＲＬ３について配列番号１７；(ii)ＣＤＲＨ１について配列番号１８、ＣＤＲＨ２について配列番号１９、ＣＤＲＨ３について配列番号２０、ＣＤＲＬ１について配列番号２１、ＣＤＲＬ２について配列番号２２およびＣＤＲＬ３について配列番号２３；(iii)ＣＤＲＨ１について配列番号２４、ＣＤＲＨ２について配列番号２５、ＣＤＲＨ３について配列番号２６、ＣＤＲＬ１について配列番号２７、ＣＤＲＬ２について配列番号２８およびＣＤＲＬ３について配列番号２９；(iv)ＣＤＲＨ１について配列番号３０、ＣＤＲＨ２について配列番号３１、ＣＤＲＨ３について配列番号３２、ＣＤＲＬ１について配列番号３３、ＣＤＲＬ２について配列番号３４およびＣＤＲＬ３について配列番号３５；または(ｖ)ＣＤＲＨ１について配列番号３６、ＣＤＲＨ２について配列番号３７、ＣＤＲＨ３について配列番号３８、ＣＤＲＬ１について配列番号３９、ＣＤＲＬ２について配列番号４０およびＣＤＲＬ３について配列番号４１を含む。
【００３１】
一つの態様において、本発明の抗体は、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８または配列番号５０を含むＶＨ鎖を含む。
一つの態様において、本発明の抗体は、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９または配列番号５１を含むＶＬ鎖を含む。
【００３２】
一つの態様において、本発明の抗体は、(ｉ)配列番号４２を含むＶＨ鎖および配列番号４３を含むＶＬ鎖；(ii)配列番号４４を含むＶＨ鎖および配列番号４５を含むＶＬ鎖；(iii)配列番号４６を含むＶＨ鎖および配列番号４７を含むＶＬ鎖；(iv)配列番号４８を含むＶＨ鎖および配列番号４９を含むＶＬ鎖；または(ｖ)配列番号５０を含むＶＨ鎖および配列番号５１を含むＶＬ鎖を含む。
【００３３】
一つの態様において、本発明の抗体は、配列番号５２、５４、５６、５８または６０によりコードされるＶＨ鎖を含む。一つの態様において、本発明の抗体は、配列番号５３、５５、５７、５９または６１によりコードされるＶＬ鎖を含む。
【００３４】
一つの態様において、本発明の抗体は、(ｉ)配列番号５２によりコードされるＶＨ鎖および配列番号５３によりコードされるＶＬ鎖；(ii)配列番号５４によりコードされるＶＨ鎖および配列番号５５によりコードされるＶＬ鎖；(iii)配列番号５６によりコードされるＶＨ鎖および配列番号５７によりコードされるＶＬ鎖；(iv)配列番号５８によりコードされるＶＨ鎖および配列番号５９によりコードされるＶＬ鎖；または(ｖ)配列番号６０によりコードされるＶＨ鎖および配列番号６１によりコードされるＶＬ鎖を含む。
【００３５】
ポリペプチド
本発明は、配列ＧＰＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号１)、ＣＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(配列番号５)またはＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(配列番号６)を含む、またはそれから成る単離ポリペプチドを提供する。かかるポリペプチドは、本発明の抗体の惹起に有用である。本発明のポリペプチドはまた、より大きなポリペプチドの一部であってもよい。例えば、本発明のポリペプチドの横に、さらにｎ末端および／またはｃ末端アミノ酸があってよい。
【００３６】
一般に、本発明のポリペプチドは、天然に存在しない環境で提供され、すなわちそれらは、天然に存在する環境から分離される。ある態様において、本ポリペプチドは、コントロールと比較して本ポリペプチドが富化された組成物で存在する。本発明のポリペプチドは、それ故に、好ましくは単離されたまたは実質的に単離された形で提供され、すなわち本ポリペプチドは、実質的に他の発現ポリペプチドが存在しない組成物で存在し、ここで、実質的に存在しないは、組成物の７５％(重量)未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは１０％(例えば５％)未満が他の発現ポリペプチドから構成されることを意味する。
【００３７】
核酸分子
本発明の他の局面は、本発明のポリペプチドまたは抗体をコードする核酸分子に関する。例示的核酸は、配列番号１−５１に記載のいずれか一つのポリペプチドをコードするものを含む。さらなる例示的核酸配列は、配列番号５２−６１に記載のものである。本核酸は、全細胞中に、細胞ライセートに存在してよく、または部分的に精製されたまたは実質的に精製された形の核酸でよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で既知のその他を含む、標準法により、他の細胞成分または他の不純物、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質から精製されたときに、“単離された”または“実質的に純粋にされた”。F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。一つの態様において本核酸はｃＤＮＡ分子である。本核酸は、ベクター、例えばファージディスレイベクター、または組み換えプラスミドベクターに存在してよい。本発明の核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ、例えばここに記載のものにより発現させた抗体について、そのハイブリドーマにより産生された抗体の軽および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。
【００３８】
トランスフェクトーマ産生モノクローナル抗体の産生
本発明の抗体をコードする核酸が得られたら、本発明の抗体もまた、例えば、当分野で既知の通りの組み換えＤＮＡ技術および遺伝子導入法を使用して、宿主細胞トランスフェクトーマで産生できる(例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
【００３９】
例えば、抗体、またはその抗体フラグメントを発現させるために、一部または完全長軽および重鎖をコードするＤＮＡを、標準分子生物学技術(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング)により得ることができ、そのＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に動作可能に連結されるように発現ベクターに挿入し得る。この状況で、用語“動作可能に連結される”は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳の制御という意図される機能を遂行するようにベクター内で連結されることを意味する。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合可能なように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別のベクターに入れてよく、または、より典型的に、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに入れる。抗体遺伝子を、標準法(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しないならば、平滑末端ライゲーション)により、発現ベクターに入れる。ここに記載の抗体の軽および重鎖可変領域を使用して、それらを、既に所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントが、ベクター内でＣＨセグメントに動作可能に連結され、そしてＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに動作可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を製造できる。それに加えて、または別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム内で結合するようにベクターにクローン化できる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドでも異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)でもよい。
【００４０】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を担持する。用語“制御配列”は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図する。かかる制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)に記載されている。発現ベクターの設計は、制御配列の選択を含み、形質転換すべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは、当業者には当然である。哺乳動物宿主細胞発現のための制御配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えばサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、サルウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(ＡｄＭＬＰ))、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス制御配列、例えばユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターを使用してよい。なおさらに、異なる供給源由来の配列から成る制御要素、例えば、ＳＶ４０早期プロモーター由来の配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復を含むＳＲａプロモーターシステムがある(Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【００４１】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列(例えば、複製起点)および選択可能マーカー遺伝子を担持し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、全てAxel et al.の米国特許４,３９９,２１６、４,６３４,６６５および５,１７９,０１７参照)。例えば、典型的に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に薬剤、例えばＧ４１８、ヒグロマイシンまたはメトトレキサートに対する耐性を付与する。選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)遺伝子(メトトレキサート選択／増幅と共にｄｈｆｒ宿主細胞において使用するための)およびｎｅｏ遺伝子(Ｇ４１８選択のため)を含む。
【００４２】
軽および重鎖発現のために、重および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。用語“トランスフェクション”の種々の形態は、外来ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入に一般的に使用される広範な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクションなどを包含することを意図する。本発明の抗体を原核または真核宿主細胞のいずれかで発現させることが理論的に可能である。真核細胞、特に哺乳動物宿主細胞での抗体の発現は、真核細胞、および特に哺乳動物細胞が、適切に折りたたまれたおよび免疫学的に活性な抗体を集合させ、分泌させる可能性が原核細胞よりも高いため、記載する。抗体遺伝子の原核発現での発現は、活性抗体の高収率での産生には無効であると報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13)。
【００４３】
組み換え本発明の抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ細胞)(例えば、R.J. KaufmanおよびP.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621により記載されたＤＨ  ＦＲ選択可能マーカーと共に使用する、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む、UrlaubおよびChasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220記載)、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と使用するための、他の発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８,８４１に示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されたとき、本抗体は、宿主細胞内で抗体を発現させるか、または、抗体を、宿主細胞が増殖している培養培地に分泌させるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体を、標準タンパク質精製法を使用して培養培地から回収できる。
【００４４】
診断法／処置法
上記の通り、本発明の抗体を、サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅの濃度を測定するための種々のアッセイに使用し得る。
【００４５】
それ故、本発明は、患者における修飾ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質のレベルを測定する方法であって：
(ｉ)該修飾ＩＧＦ−１／Ｅを投与された患者から血液サンプルを得て、そして
(ii)本発明の抗体を使用して該サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを検出する
工程を含む、方法を提供する。
【００４６】
修飾ＩＧＦ−１／Ｅのレベルは、標準技術を使用して、例えば既知量の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを使用して較正曲線を設定し、試験サンプルで得られた結果と較正マーカーを使用して得られた結果を比較することにより定量できる(例えば実施例参照)。
【００４７】
患者の修飾ＩＧＦ−１／Ｅのレベルタンパク質の測定が可能になることは、医師が治療効果を達成するために適切な量を決定することを可能する。それ故、本発明はまた修飾ＩＧＦ−１／Ｅを必要とする患者におけるその最適投与量を維持する方法であって：
(ｉ)該修飾ＩＧＦ−１／Ｅを投与された患者から血液サンプルを得て、
(ii)本発明の抗体を使用して該サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを検出し、そして
(iii)患者血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅのレベルが予定したレベルより低いとき、さらに該修飾ＩＧＦ−１／Ｅを該患者に投与する
工程を含む、方法を提供する。
【００４８】
ある場合において、血液サンプルは患者から既に得られているかもしれないことに注意すべきである。それ故、本発明は、患者における修飾ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質のレベルを測定する方法であって、患者から得た血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを、本発明の抗体を使用して検出する工程を含む方法を提供する。
【００４９】
本発明はまた修飾ＩＧＦ−１／Ｅを必要とする患者におけるその最適投与量を維持する方法であって：
(ｉ)修飾ＩＧＦ−１／Ｅを投与されている患者からの血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを本発明の抗体を使用して検出し、そして
(ii)患者血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅのレベルが予定レベルより低いとき、さらに該修飾ＩＧＦ−１／Ｅを該患者に投与する
工程を含む、方法を提供する。
【００５０】
本発明はまた修飾ＩＧＦ−１／Ｅの産生のモニタリングも可能にする。それ故、サンプルを生産プラントから得て、本発明の抗体で検定して、正しい形態の修飾ＩＧＦ−１／Ｅが産生されていることを確認してよい。
【００５１】
本発明はまた筋肉障害を有する患者の処置方法であって：
(ｉ)修飾ＩＧＦ−１／Ｅを以前に投与されている患者から得た血液サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅの血清濃度を本発明の抗体を使用して測定し；そして
(ii)ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔの血清濃度が予定した最適レベルより低いならば、さらに修飾ＩＧＦ−１／Ｅを患者に投与する
ことを含む、方法も提供する。
【００５２】
上記の態様において、修飾ＩＧＦ−１／ＥはｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔでも、ＷＯ２００７／１４６６８９に記載されているものでもよい。例えば、修飾ＩＧＦ−１／Ｅは、ＷＯ２００７／１４６６８９の実施例１に記載のもの(そこでは配列番号８と記載され、ここでは修飾ＩＧＦ−１Ｅ  Ｎｏ.１と記載される)、またはＷＯ２００７／１４６６８９の実施例４５に記載のもの(そこでは配列番号５３と記載され、ここでは修飾ＩＧＦ−１／Ｅ  Ｎｏ.２と記載される)であり得る。
【００５３】
タンパク質精製
上記の通り、本発明の抗体はまた修飾ＩＧＦ−１／Ｅの商業規模精製にも使用できる(すなわち筋肉萎縮に使用するための医薬)。例えば、本発明の抗体は、修飾ＩＧＦ−１／Ｅを精製するための親和性クロマトグラフィーに使用し得る。
【００５４】
組み換えポリペプチドの精製は当分野で既知であり、親和性クロマトグラフィー精製技術などを含む(一般的に、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)を参照のこと。またBailon et al., An Overview of Affinity Chromatography, Humana Press (2000)も参照のこと)。バイオセラピューティックタンパク質の商業規模精製のための親和性クロマトグラフィー法(例えば膜ベースの親和性技術)は当分野で既知である。Brandt et al., Bio/Technology 6: 779-782 (1988)参照。
【００５５】
好ましくは、かかる方法で精製した修飾ＩＧＦ−１／ＥはｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ、またはＷＯ２００７／１４６６８９に記載のものである。例えば、修飾ＩＧＦ−１／Ｅは、ＷＯ２００７／１４６６８９の実施例１に記載のもの(そこでは配列番号８と記載され、ここでは修飾ＩＧＦ−１Ｅ  Ｎｏ.１と記載される)、またはＷＯ２００７／１４６６８９の実施例４５に記載のもの(そこでは配列番号５３と記載され、ここでは修飾ＩＧＦ−１／Ｅ  Ｎｏ.２と記載される)であり得る。
【００５６】
均等物
本発明の一つ以上の態様の詳細を上記の文章により明示する。ここに記載のものに類似のまたは均等な何等かの方法および材料を本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本発明の他の特性、目的、および利点は、本明細書および特許請求の範囲から明らかである。一般に、酵素的反応および精製工程は製造者の説明書に従い行う。技術および方法は、一般に当分野で寛容の方法および種々の一般的参考書に従い行う。一般に、本明細書に全体を包含させる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)を参考のこと。
【００５７】
本発明は、本明細書に記載の特定の態様の観点で限定されず、それは、本発明の個々の局面の一つの説明として解釈される。本発明の多くの修飾および改変が、当業者には明らかな通り、その精神および範囲から逸脱することなく成し得る。本発明の範囲内の機能的に同等な方法および装置は、ここに列記されたものに加えて、前記から当業者には明らかである。かかる修飾および改変は、添付の特許請求の範囲内の範囲内に入ると解釈される。本発明は、特許請求の範囲が権利を与える均等物の完全な範囲に沿って、添付の特許請求の範囲の観点でのみ限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ｗｔ、ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ、およびｈＩＧＦ−２のアミノ酸配列アラインメント。ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔとｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔの間のアミノ酸差異を太字で強調する。配列中の点線は欠損残基を示す。下記の動物免疫化のための抗原として選択したｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔからのペプチドに下線を引く。
【図２】ペプチドＡ免疫化により産生されたｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ特異的マウスモノクローナル抗体の活性を示す一連のチャート。細胞培養上清をハイブリドーマクローンＱＣ１(Ａ)およびＱＣ２(Ｂ)から回収し、ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ｗｔ、ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１またはｍＩＧＦ−２でコートしたマイクロタイターウェルで希釈した。プレートに結合した抗体をホースラディシュペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体により検出した。
【図３】ペプチドＢ免疫化により産生されたｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ反応性マウスモノクローナル抗体の活性を示す一連のチャート。モノクローナル抗体をハイブリドーマクローンＢＰ１(Ａ、mg／ml)およびＢＰ２(Ｂ、mg／ml)から産生および精製し、ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１またはｍＩＧＦ−２でコートしたマイクロタイターウェルで１：１０−１：１００,０００希釈した。Ｐプレートに結合した抗体を、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体により検出した。
【図４】ペプチドＣ免疫化により産生されたｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ特異的マウスモノクローナル抗体の活性を示す一連のチャート。細胞培養上清をハイブリドーマクローンＱＱ２(Ａ)、ＱＱ５(Ｂ)、およびＱＱ６(Ｃ)から回収し、ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１またはｍＩＧＦ−２でコートしたマイクロタイターウェルで希釈した。Ｐプレートに結合した抗体を、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体により検出した。
【図５】ペプチドＣ免疫化から産生されたモノクローナル抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ分析を示す一連のチャート。種々の濃度のｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ、ｈＩＧＦ−１／Ｅｃ  ３ｍｕｔ、グリコシル化ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ、およびｈＩＧＦ−１ペプチドをＱＱ２(Ａ)、ＱＱ５(Ｂ)、またはＱＱ６(Ｃ)でコートしたマイクロタイタープレートに添加した。プレートに結合したＩＧＦ−１ペプチドをホースラディシュペルオキシダーゼ結合モノクローナルマウス抗ｈＩＧＦ−１抗体で検出した。
【実施例】
【００５９】
ペプチドＡに対して生じた抗体。２個のモノクローナル抗体を、ペプチドＡ、ＧＰＴＬＣＧＡＥＬＶ(ＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔのａａ  １−１０)(配列番号１)(表１参照)でのマウス免疫化により産生した。ＱＣ１およびＱＣ２により認識されるエピトープは、１個のアミノ酸のみ野生型ｈＩＧＦ−１およびｍＩＧＦ−１配列ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶ(配列番号２)で異なる。このペプチドを、BiobenchおよびAbie Pro 3.0でのタンパク質構造分析が低表面確率および低抗原性指数を有することを示唆したが、動物免疫化のために選択した。
【表３】
2011160696.tif 000004
【００６０】
ハイブリドーマを(１)組み換えｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ(ポジティブクローン用)；(２)組み換えｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔタンパク質(ネガティブクローン用)；(３)組み換えｈＩＧＦ−２(ネガティブクローン用)、および(４)組み換えｍＩＧＦ−２タンパク質(ネガティブクローン用)でスクリーニングした。
【００６１】
５匹のマウスからのペプチドＡ−ＫＬＨコンジュゲートで３回免疫化した後抗血清力価は、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔを用いたＥＬＩＳＡで測定して、１：５００〜１：１６,０００の範囲であった。約１,０００個のハイブリドーマが、最高応答動物であるマウス＃３から産生され、そのうち４個はｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔと強く反応するが、しかしｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ、ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１、およびｍＩＧＦ−２とは反応しないかまたは弱くしか反応しないことが判明した。全４個のｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ反応性ハイブリドーマをサブクローニングの対象とし、各々個別のハイブリドーマ由来の２個の最終サブクローン、ＱＣ１(７Ｂ９Ｃ６)およびＱＣ２(８Ｂ７Ａ２)を選択し、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔに特異的なモノクローナル抗体の産生についてＥＬＩＳＡで確認した(図２、表１)。
【００６２】
２個のｍＡｂｓ、ＱＣ１(７Ｂ９Ｃ６)およびＱＣ２(８Ｂ７Ａ２)はｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔに非常に特異的であり、前臨床および臨床サンプルにおける修飾組み換えヒトＩＧＦ−１／Ｅペプチドの定量のためのサンドイッチＥＬＩＳＡにおける免疫吸着剤(捕捉抗体)として使用できる。２個のｍＡｂｓ  ＱＣ１(７Ｂ９Ｃ６)およびＱＣ２(８Ｂ７Ａ２)を発現するハイブリドーマを、ＤＳＭＺに各々受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２８およびＤＳＭ  ＡＣＣ３０２６の下に寄託する。
【００６３】
ペプチドＢに対して生じた抗体。２個のモノクローナル抗体を、ペプチドＢ、ＣＧＤＲＧＦＹＦＮ−ＫＰＴＧＹＧＳＳ(ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔのａａ  １７−３３)(配列番号３)(表１参照)でのマウス免疫化により産生した。このペプチドは、高表面確率および高抗原性指数を有するために選択した。しかしながら、ｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔは、この領域で同一配列を有するそれ故に、このペプチドに対して生じた抗体は、次のタンパク質の全てを認識する：ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ、およびｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ。加えて、ｍＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−１は、この領域に１個のアミノ酸の差異しか示さない。
【表４】
2011160696.tif 000005
【００６４】
ハイブリドーマを(１)組み換えｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ(ポジティブクローン用)；(２)組み換えｈＩＧＦ−２(ネガティブクローン用)；(３)組み換えｍＩＧＦ−１(ネガティブクローン用)；および(４)組み換えｍＩＧＦ−２タンパク質(ネガティブクローン用)でスクリーニングした。
【００６５】
ペプチドＢに対するマウス免疫応答は強かった。５匹のマウスからのペプチドＢ−ＫＬＨコンジュゲートで４回免疫化した後抗血清力価は、１：１,０００から＞１：３２,０００の範囲であった。約１,０００個のハイブリドーマが、最高応答動物であるマウス＃５から産生され、そのうち２１個はｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ、およびｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔと強く反応し、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１およびｍＩＧＦ−２に弱い反応性であることが判明した。全１３個のハイブリドーマをサブクローニングの対象とした。各々個別のハイブリドーマ由来の２個の最終サブクローン、ＢＰ１(２Ｆ１１Ｄ８)およびＢＰ２(３Ｃ５Ｄ１０)を選択し、ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔおよびｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔに結合するモノクローナル抗体の産生を確認した(図３、表１)。
【００６６】
２個のｍＡｂｓ、ＢＰ１(２Ｆ１１Ｄ８)およびＢＰ２(３Ｃ５Ｄ１０)はｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔの両方を認識し、ｈＩＧＦ−２およびｍＩＧＦ−１およびｍＩＧＦ−２と交差反応する。それにも関わらず、これらのｍＡｂｓはＩＧＦ−１試験に有用であるはずである。
【００６７】
ペプチドＣに対して生じた抗体：３個のモノクローナル抗体を、ペプチドＣ、ＣＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔのａａ  ６５−７４と、コンジュゲーションのためのＮ末端Ｃ)(配列番号５)(表１参照)でのマウス免疫化により産生した。このｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔのペプチドを、その高表面確率および抗原性指数のために選択した。それは、成熟ｈＩＧＦ−１と変異Ｅペプチドの間の連結領域に伸びる。
【表５】
2011160696.tif 000006
【００６８】
ハイブリドーマを(１)組み換えｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ(ポジティブクローン用)；(２)組み換えｈＩＧＦ−１(ネガティブクローン用)；(３)組み換えｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ(ネガティブクローン用)；(４)組み換えｍＩＧＦ−１(ネガティブクローン用)；および(５)組み換えｍＩＧＦ−２タンパク質(ネガティブクローン用)でスクリーニングした。
【００６９】
５匹のマウスからのペプチドＣ−ＫＬＨコンジュゲートで４回免疫化した後抗血清力価は、１：４００から１：３,２００の範囲であった。約１,０００個のハイブリドーマが、最高応答動物であるマウス＃４、最高応答動物から産生され、そのうち１８８個は標準ＥＬＩＳＡでｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔと反応するが、ｈＩＧＦ−１とは反応しないことが判明した。１８８個のハイブリドーマのうち、２０個をサブクローニングの対象とした。各々個別のハイブリドーマ由来の３個のサブクローン、ＱＱ２(２Ｃ１０Ｂ７)、ＱＱ５(６Ｈ６Ｇ１１)およびＱＱ６(７Ｂ１Ｈ１２)を選択し、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔを認識するが、ｈＩＧＦ−１を認識しないモノクローナル抗体の産生を確認した(図４、表１)。しかしながら、これらのｍＡｂｓはｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔと交差反応した。
【００７０】
ＱＱ２、ＱＱ５およびＱＱ６により認識されるエピトープはＰＡＫＳＡＶＲＡＱＲ(ａａ  ６５−７４)(配列番号６)である。これらの３個のｍＡｂｓ、ＱＱ２(２Ｃ１０Ｂ７)、ＱＱ５(６Ｈ６Ｇ１１)およびＱＱ６(７Ｂ１Ｈ１２)は、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔを認識し、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔと交差反応性であるが、ｈＩＧＦ−１と結合しなかった。これらのｍＡｂｓの各々は、種々の修飾組み換えヒトＩＧＦ−１／Ｅペプチドを定量するためのサンドイッチＥＬＩＳＡにおける免疫吸着剤(捕捉抗体)として使用できるであろう。３個のｍＡｂｓ、ＱＱ２(２Ｃ１０Ｂ７)、ＱＱ５(６Ｈ６Ｇ１１)およびＱＱ６(７Ｂ１Ｈ１２)を発現するハイブリドーマを、ＤＳＭＺに各々受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２７、ＤＳＭ  ＡＣＣ３０２４およびＤＳＭ  ＡＣＣ３０２５の下に寄託する。
【００７１】
【表６】
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【００７２】
本発明の抗体の製造方法
抗体製造の一般法。ある抗原(例えばペプチドＡ、ペプチドＢまたはペプチドＣ)に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造するための多くの方法が当分野で既知である。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)および上記の他の引用文献を参照のこと。
【００７３】
動物免疫化、ハイブリドーマスクリーニング、およびｍＡｂ産生。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループを、ＫＬＨとコンジュゲートした選択したペプチドの各々で免疫化した。ハイブリドーマを、標準ＥＬＩＳＡで(１)組み換えｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ；(２)組み換えｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ；(３)組み換えｈＩＧＦ−１；(４)組み換えｈＩＧＦ−２；(５)組み換えｍＩＧＦ−１；および／または(６)組み換えｍＩＧＦ−２についてスクリーニングし、所望の特異性のハイブリドーマを３回のサブクローニングおよび再スクリーニングのために選択した。モノクローナル抗体を、タンパク質Ａ親和性カラムを使用して、最終選択ハイブリドーマの細胞培養上清から精製した。
【００７４】
３個の抗原ペプチド(ペプチドＡ、ペプチドＢおよびペプチドＣ)をGL Biochem(Shanghai)Ltd., Shanghai, Chinaで化学的に合成し、ＨＰＬＣ精製した。ペプチド純度を質量分析により免疫グレード(約８５％)であることを決定した。これらのペプチドは、Ｃ残基を含み、Pierce(Cat. No. 77605)から購入したキットでマレイミド活性化ＫＬＨとコンジュゲートさせた。
【００７５】
６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを抗体を産生するために使用した。免疫応答を誘発するために、５匹のマウスのグループに、各５０μgの３個の抗原ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートのＣＦＡ溶液(最初の注射)および２５μgの各抗原のＩＦＡ溶液(２回目および３回目の注射)を皮下注射により投与した。２５μgの抗原での最終ブースト免疫化を何のアジュバントも使用せずに腹腔内注射により行った。免疫化スケジュールは下記の通りであった：
０日目：免疫化前採血；１回目の抗原注射
２６日目：２回目の抗原注射
５２日目：３回目の抗原注射
６３日目：試験採血；抗血清力価ＥＬＩＳＡ
６９日目：最終ブースト注射
７３日目：脾臓摘出
【００７６】
免疫化後の抗原特異的抗体の発生をＥＬＩＳＡにより試験した。Nunc-Immunoマイクロタイタープレートを１μg／mlのｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔ、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ｗｔ、ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１またはｍＩＧＦ−２の炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウム緩衝液(Pierce, Cat. No. 28382)でコートし、連続的に希釈した免疫化前および抗血清および／またはハイブリドーマ上清サンプルとインキュベートし、抗原結合マウスＩｇＧをホースラディシュペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体(Sigma, Cat. No. A0168)と、続くＢＭ青色ＰＯ基質(Roche Diagnostics, Cat. No. 1.484.281)での発色により検出した。マイクロタイタープレートを、ペルオキシダーゼ反応を２.０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた後に４５０nmで読み、ＥＬＩＳＡデータをソフトウェアSoftMax Pro v5.2(Molecular Devices)で分析した。結果を図２−４に示す。
【００７７】
ハイブリドーマを、免疫化マウスから単離した脾細胞と非分泌性骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞を標準法を使用して融合させることにより産生した。ＥＬＩＳＡアッセイを行い、ｈＩＧＦ−１／Ｅ  ３ｍｕｔペプチドに特異的なハイブリドーマを同定した。
【００７８】
選択したハイブリドーマを無血清増殖培地(Sigma, Cat. No. 24621C-500)に適合させた。モノクローナル抗体を、標準法に従いタンパク質Ａ親和性カラムによりハイブリドーマ上清から精製し、透析を通してＰＢＳと交換した。精製抗体のアイソタイプをSouthern Biotechから購入したマウスＩｇＧアイソタイプ分類キット(Cat. No. 5300-05)で決定した。
【００７９】
抗原特異的ハイブリドーマを、限界希釈により３回のサブクローニング(およびＥＬＩＳＡによる再スクリーニング)の対象とした。
ペプチドＡ、ペプチドＢおよびペプチドＣでの免疫化により生じた抗体の結果は上記の通りである。
【００８０】
本発明の抗体の使用方法
サンプル中の修飾ＩＧＦ−１／Ｅを検出するための免疫アッセイ。本発明は、ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質が投与されている個体からの生物学的サンプル(例えば、血液、血清、細胞、組織)における修飾ＩＧＦ−１／Ｅタンパク質を測定するための診断的アッセイを提供する。診断的アッセイ、例えば競合アッセイは、標識アナログ(“トレーサー”)が、共通結合パートナー上の限られた数の結合部位について、試験サンプル分析物と競合する能力を利用する。結合パートナーは、一般に競合の前または後は不溶性であり、結合パートナーに結合するトレーサーおよび分析物が非結合トレーサーおよび分析物から分離される。この分離はデカント(結合パートナーが前に不溶性であるとき)または遠心分離(結合パートナーが競合反応後に沈殿するとき)により行う。試験サンプル分析物の量は、マーカー物質の量で測定される結合したトレーサーの量と逆比例する。既知量の分析物との用量応答曲線を製造し、試験サンプル中に存在する分析物の量の定量的測定をするために試験結果と比較する。これらのアッセイは、酵素を検出可能マーカーとして使用したとき酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)システムと呼ばれる。特にＥＬＩＳＡ試験の形のかかるアッセイは、臨床環境および日常的な血液スクリーニングに相当な適用がある。免疫アッセイ形態および条件の詳細についてHarlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)参照。
【００８１】
本発明の免疫アッセイは、診断的アッセイ、予後診断的アッセイ、薬理ゲノミクス、およびモニタリング臨床試験が、予後診断的(予測的)目的で使用される予測医学の分野で有用である。
【００８２】
本発明のモノクローナル抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ。ペプチドＣ、ＱＱ２、ＱＱ５、およびＱＱ６に対して産生した３個のｍＡｂｓの各々を捕捉抗体としておよび市販のＩＧＦ−１  ｍＡｂを検出試薬として使用して、ＱＱ２、ＱＱ５およびＱＱ６の特異性を試験するために行った。図５に示す通り、全ての３個のｍＡｂｓはｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔ、ｈＩＧＦ−１／Ｅｃ  ３ｍｕｔおよびグリコシル化ｈＩＧＦ−１／Ｅａ  ３ｍｕｔと結合するが、ｈＩＧＦ−１ペプチドと結合しない。ＱＱ２、ＱＱ５、またはＱＱ６は、ｈＩＧＦ−１へは、ｈＩＧＦ−１濃度が１０nMほど高くても結合しない(図５)。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ分析のために、連続希釈した抗血清およびハイブリドーマ上清サンプルから得たＯＤ値を、同様に処理した免疫前血清および細胞培地の各々のＯＤ値と比較した。抗血清またはハイブリドーマ上清サンプルは、そのＯＤ値がネガティブコントロールよりも少なくとも２倍高いとき、被覆抗原と反応性であると見なす。
【００８４】
“単離”または“精製”ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は実質的に細胞性物質または、本発明の抗体が由来する細胞または組織供給源からの他の汚染物がなく、または化学分析したとき実質的に化学前駆体または他の化学物質がない。例えば、単離ＩＧＦ−１／Ｅには、この薬剤の診断的または治療的使用を妨げるであろう物質がない。かかる妨害物質は、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質様および非タンパク質様溶質を含み得る。
【００８５】
抗体選択性の評価
本抗体のｗｔ  ヒトＩＧＦと比較した修飾ＩＧＦ−１／Ｅに対する選択性を、修飾ＩＧＦ−１／Ｅ  Ｎｏ.１またはＮｏ.２を動物に投与し、続いて本発明の抗体を使用して修飾ＩＧＦ−１／Ｅを回収することにより確認した。動物に投与した基の量を超える修飾ＩＧＦ−１／Ｅが回収されるならば、これは非特異的結合(すなわちｗｔ  ＩＧＦへの結合)を示す。
【００８６】
７匹のサルおよび７匹のイヌからの血清サンプルに、８０ng／ml変異ＩＧＦ  Ｎｏ.１、または２００ng／ml変異ＩＧＦ  Ｎｏ.２を添加し、６匹のラットからの血清に３０ng／ml変異ＩＧＦ  Ｎｏ.１を添加した。変異ＩＧＦの濃度を変異ＩＧＦ  Ｎｏ.１については抗体ＱＱ２をまたは変異ＩＧＦ  Ｎｏ.２についてはＱＱ５を使用して分析した。
【００８７】
両方の抗体について、アッセイを同じ方法で行った。９６ウェルプレートを２.５μg／μlの濃度の１００μl抗体(ＱＱ２またはＱＱ５)でコートし、一夜静置した。次いで、ウェルを３００μl遮断緩衝液で２回、および３００μl洗浄緩衝液で４回洗浄した。血清サンプルをアッセイ緩衝液で１：１０に希釈し、１００μlの各サンプルを、１００μlのコントロール(１０−３０００ng／ml濃度)と共にプレートに添加した。次いで、プレートを４時間、室温で振盪させながらインキュベートした。
【００８８】
次いで１００μlのビオチニル化抗ヒトＩＧＦ−１(アッセイ緩衝液中７５ng／ml濃度)を添加し、プレートをさらに１時間、ＲＴで振盪させながらインキュベートした。次いで、プレートを上記の通り４回洗浄した。
【００８９】
１００μlのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート(１００ng／ml)を添加し、プレートをさらに３０分間、ＲＴで振盪させながらインキュベートした。次いで、プレートを上記の通り４回洗浄した。
【００９０】
次いで１００μlのＴＭＢを各ウェルに添加し、１０分間インキュベートした。次いで１００μlの停止溶液を添加し、光学密度を３０分以内に４５０nmで読んだ。
コントロールを較正曲線のプロットに使用した(示していない)。
【００９１】
抗体ＱＱ２の結果
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【００９２】
抗体ＱＱ５の結果
【表１０】
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【表１１】
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【００９３】
特異性／選択性は、分析方法の、サンプルに存在する他の類似のおよび／または無関連な構成成分の存在下で分析物を測定および区別する能力である。それは、生物学的マトリックスに添加し、そして回収された分析物の量の測定から得られた精度の評価により調べられる。特異性／選択性の標的容認基準は、評価した少なくとも８０％のマトリックスについて許容される回収率が得られることである。許容される回収率は、我々の方法では７５−１２５％と定義した。全ての試験した個々のマトリックスがこの容認基準内にあるため、我々は、この方法は特異的かつ選択的であると見なした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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