(57)【要約】【課題】高感度な発光酵素免疫フロースルーデバイスおよびその製造法ならびに高感度光検出法を提供する。【解決手段】生理活性物質を免疫学的に捕捉して酵素による高感度発光で検出するための多孔質膜、前記多孔質膜を通過した液を吸収するための吸収層を備えたフロースルーデバイスであって、前記吸水層が酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とするフロースルーデバイス。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質を免疫学的に捕捉して酵素による高感度発光で検出するための多孔質膜、前記多孔質膜を通過した液を吸収するための吸収層を備えたフロースルーデバイスであって、前記吸水層が酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とするフロースルーデバイス。
【請求項２】
生理活性物質を免疫学的に捕捉して酵素による高感度発光で検出するための多孔質膜と、前記多孔質膜を通過した液を吸収するための吸収層を備えたフロースルーデバイスの製造法であって、前記吸水層を酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む酸性あるいは中性溶液で前処理する工程を含む、フロースルーデバイスの製造法。
【請求項３】
請求項１に記載のフロースルーデバイスにサンプル溶液を供給して多孔質膜にサンプル中の生理活性物質を結合させる工程、次に酵素標識抗体溶液を供給して前記生理活性物質と酵素標識抗体を含む複合体を形成する工程、吸水層において多孔性膜上で捕捉されない余分な発光酵素を失活させたステップ、酵素の基質溶液を供給し、酵素反応に基づく発光を検出する工程を含む、酵素免疫フロースルー検出法
【請求項４】
生理活性物質と結合する酵素標識第二抗体をサンプル溶液と反応させて生理活性物質と酵素標識第二抗体の複合体を形成する工程、前記多孔質膜が生理活性物質を捕捉する第一抗体を備える請求項１に記載のフロースルーデバイスに生理活性物質と酵素標識第二抗体溶液の複合体を含むサンプル溶液を適用して第一抗体・生理活性物質・酵素標識第二抗体の３元複合体を形成する工程、吸水層において多孔性膜上で捕捉されない余分な発光酵素を失活させる工程、酵素の基質溶液を供給し、酵素反応に基づく発光を検出する工程を含む、酵素免疫フロースルー検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明は試料中の核酸、抗原、抗体あるいはホルモンなどの生理活性分子を多孔性膜上で捕捉し、非特異な発光を抑制した高感度な発光酵素免疫フロースルーデバイスおよびその製造法ならびに高感度光検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１と２において、多孔性膜にタンパク成分を非共有結合あるいは共有結合で固定できる方法が開示されているが、発光による高感度検出については言及されていない。
【０００３】
特許文献3において、多孔性膜上で捕捉された生体分子を直接に発光で検出する装置が
開示されているが、多孔性膜の下の吸水層の非特異発光反応を低減させる方法が開示されていない。
【０００４】
特許文献4において、多孔性膜の直下に位置する吸水層の色を白色以外にすることによ
って、吸水層に由来する非特異発光反応を低減させる方法が開示されているが、酵素阻害剤による吸水層非特異発光反応を低減する事例については言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平４-318462
【特許文献２】特開平４-203968
【特許文献３】特開平7−209191
【特許文献４】特開2006−119011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、高感度な発光酵素免疫フロースルーデバイスおよびその製造法ならびに高感度光検出法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、吸水層に酸化防止剤、キレート剤、界面活性剤の少なくとも一種を含めることで、非特異的発光を抑制し、高感度な検出が可能になることを見出した。
【０００８】
本発明は、以下の発光酵素免疫フロースルーデバイスおよびその製造法ならびに高感度光検出法を提供するものである。
項１．  生理活性物質を免疫学的に捕捉して酵素による高感度発光で検出するための多孔質膜、前記多孔質膜を通過した液を吸収するための吸収層を備えたフロースルーデバイスであって、前記吸水層が酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とするフロースルーデバイス。
項２．  生理活性物質を免疫学的に捕捉して酵素による高感度発光で検出するための多孔質膜と、前記多孔質膜を通過した液を吸収するための吸収層を備えたフロースルーデバイスの製造法であって、前記吸水層を酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む酸性あるいは中性溶液で前処理する工程を含む、フロースルーデバイスの製造法。
項３．  項１に記載のフロースルーデバイスにサンプル溶液を供給して多孔質膜にサンプル中の生理活性物質を結合させる工程、次に酵素標識抗体溶液を供給して前記生理活性物
質と酵素標識抗体を含む複合体を形成する工程、吸水層において多孔性膜上で捕捉されない余分な発光酵素を失活させたステップ、酵素の基質溶液を供給し、酵素反応に基づく発光を検出する工程を含む、酵素免疫フロースルー検出法。
項４．  生理活性物質と結合する酵素標識第二抗体をサンプル溶液と反応させて生理活性物質と酵素標識第二抗体の複合体を形成する工程、前記多孔質膜が生理活性物質を捕捉する第一抗体を備える請求項１に記載のフロースルーデバイスに生理活性物質と酵素標識第二抗体溶液の複合体を含むサンプル溶液を適用して第一抗体・生理活性物質・酵素標識第二抗体の３元複合体を形成する工程、吸水層において多孔性膜上で捕捉されない余分な発光酵素を失活させる工程、酵素の基質溶液を供給し、酵素反応に基づく発光を検出する工程を含む、酵素免疫フロースルー検出法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、吸水層に酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含めることで、発光反応におけるバックグラウンドを抑制でき、高い発光S/N比を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】フロースルーデバイスを構成する、容器、キャップ、多孔性膜、吸水層を示す。
【図２】実施例１の結果を示す。
【図３】実施例２の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、測定対象となる「生理活性物質」は、抗体で認識可能なものであれば特に限定されず、核酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、酵素基質、薬物もしくはその代謝物ないし分解物、糖類(単糖、二糖、多糖)、ムコ多糖、脂質、糖脂質、リン脂質、などが挙げられる。具体的には、タンパク質としては、酵素、受容体、ホルモン、シグナル伝達に関わるタンパク質、抗体、生体を構成するタンパク質（コラーゲン、ケラチン、アクチン、ミオシンなど）、栄養タンパク質(大豆、小麦、乳、卵などの食品由来のタンパ
ク質)、アルブミンなどが挙げられる。ペプチドとしては、ペプチドホルモン、オピオイ
ドペプチド、バソプレシン、オキシトシン、タキキニンペプチド（サブスタンスP、カッ
シニン、ニューロキニンA、エレドイシン、ニューロキニンB、血管作動性腸管ペプチド (VIP)、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド ( PACAP)、成長ホルモン放出ホルモ
ン1-24 (GHRH 1-24)、グルカゴン、セクレチン、膵臓ポリペプチド関連ペプチドなどが挙げられる。
【００１２】
多孔質膜には、生理活性物質を免疫学的に捕捉できる物質が結合もしくは吸着されている。このような物質としては、抗体が好ましく例示されるが、生理活性物質が抗体の場合にはそれに対する抗原を使用することができる。抗原・抗体以外にも、レクチンと糖鎖、シグナル伝達過程で結合するたんぱく質同士、酵素とその基質、受容体とホルモンなどのリガンド、キレートに関与する金属イオンと配位子、その他たんぱく質による特異的結合、、核酸（DNA、RNA）の相補的結合、核酸とたんぱく質の特異的結合など、種々の結合を利用でき、多孔質膜には、これらの複合体を形成し得る組み合わせの一方の物質を結合もしくは吸着させればよい。サンプル中に含まれ、多孔質膜に結合される物質としては、ウイルス粒子、真菌、細菌などの微生物であってもよい。
【００１３】
多孔質膜としては、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維などの無機繊維、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデンなどのフッ素樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどのポリオレフィンのホモポリマーもしくは共重合体、ナイロン、ポリエステル、半合成繊維、再生繊維、発泡ポリマーなどから構成され、織布と不
織布のいずれであってもよい。
【００１４】
多孔質膜へ生理活性物質を免疫学的に捕捉できる物質を結合もしくは吸着させる方法は、公知であり、多孔質膜を前記物質を含む溶液に含浸し、乾燥させる方法、接着剤を用いる方法、多孔質膜と物質の両方に結合可能な２価もしくは多価のリンカーを用いる方法などの常法に従い行うことができる。
【００１５】
吸水層は、水を吸収できる限り特に限定されず、任意の材料を使用でき、例えばセルロースもしくはセルロース誘導体を用いることができる。
【００１６】
サンプルとしては、ヒト又は動物由来のもの(血液、血清、血漿、尿、唾液、涙液、組
織液) 、植物(抽出物、植物全体もしくは一部)であってもよく、河川、湖沼、土壌、地下水、排水、上下水道などの環境由来のもの、食品、化粧品などの工業製品の水溶液、懸濁液などが挙げられる。
【００１７】
本発明のフロースルーデバイスは、多孔質膜の下に吸水層を配置し、多孔質膜にサンプル溶液を適用し、サンプル中に含まれる被測定物質は多孔質膜に捕捉され、その他の液は下の吸水層に吸収される。サンプルを適用後、バッファーなどの適当な水ないし水溶液で洗浄する。
【００１８】
次に、多孔質膜に結合された生理活性物質を免疫学的に捕捉できる物質もしくは被測定物質に対する酵素標識抗体溶液を前記多孔質膜に適用し、酵素標識抗体をさらに結合させる。
【００１９】
酵素標識の酵素としては、発光により酵素量(すなわち被測定物質の量)を発光により測定できるものであれば特に限定されず、例えばルシフェラーゼ（ホタル、ウミボタル、ウミシイタケル、ヒオドシエビ、ヒカリコメツキ、発光性渦鞭毛藻、発光ミミズ、ラチア、オワンクラゲ（エクオリン）などに由来するルシフェラーゼ）、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ(GUS)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、イクオリンやオベリンなどのカルシウム結合型発光タンパク質であるなどが挙げられる。
【００２０】
酵素標識抗体を結合させた後、該酵素の基質（必要な場合にはさらに発光に必要な物質）を含む溶液を多孔質膜に適用する。過剰な基質等は多孔質膜を通過して吸水層に吸収される。この吸水層に吸収された過剰な基質等がバックグラウンドの原因となる。
【００２１】
本発明では、吸水層が予め酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むので、過剰な基質等による発光（バックグラウンド）を抑制でき、Ｓ／Ｎ比を向上することができる。
【００２２】
本発明では、アッセイする前の吸水層に酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種が含まれていることが重要であり、アッセイの途中、例えば洗浄液に酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を配合しても、Ｓ／Ｎ比の向上は期待できない。本発明のフロースルーデバイスは、アッセイする前の吸水層に予め酸化防止剤、キレート剤および界面活性剤からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特徴とする。
【００２３】
酸化防止剤としては、アスコルビン酸またはその塩、エリソルビン酸またはその塩、亜硫酸塩、ブチルヒドロキシアニソール、ポリフェノール類、水素化ホウ素アルカリ金属などが挙げられ、これらを1種又は2種以上組み合わせて使用できる。好ましくはアスコルビ
ン酸、エリソルビン酸又はその塩が挙げられる。
【００２４】
キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、シュウ酸、フィチン酸、クエン酸、リン酸、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ジエチレントリアミン、ビピリジン、グリシン、アセチルアセトン、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、アミノトリ（メチルホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、又はその塩などが挙げられ、ＥＤＴＡ又はその塩が好ましい。
【００２５】
界面活性剤としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＮＰ−５、ＰＥＧ ２００〜
８００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Tween 20（Poly（Oxyethylene）sorbitan monolaurate）、Tween40（Poly（Oxyethylene）sorbitan monopalmitate）、Tween60（Poly（Oxyethylene）sorbitan monostearate）、Tween 80（Poly（Oxyethylene）sorbitan monooleate）などのTween類、N-Bis（3-D-gluconamidopropyl）cholamide［BIGCHAP］、N,N-Bis（3-D-gluconamidopropyl）deoxycholamide［Deoxy-BIGCHAP］、Polyoxyethylene
（9）Lauryl Ether、Octanoyl-N-methylglucamide［MEGA-8］、Nonanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-9］、Decanoyl-N-methylglucamide ［MEGA-10］、Polyoxyethylene（8）Octylphenyl Ether［Triton X-114］、Polyoxyethylene（9）Octylphenyl Ether［NP-40］、Polyoxyethylene（10）Octylphenyl Ether［Triton X-100］、Polyoxyethylene（20）Sorbitan Trioleate 、Polyoxyethylene（23）Lauryl Ether ［Brij35］、Polyoxyethylene（20）Cethyl Ether ［Brij58］、n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside 、n-Heptyl-β-D-thioglucopyranoside 、n-Octyl-β-D-glucopyranoside、n-Octyl-β-D-thioglucopyranosideなどが挙げられる。
【００２６】
例えば酵素としてルシフェラーゼを用いる場合、ＳＤＳなどの界面活性剤が好ましく、酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いる場合には、アスコルビン酸のような酸化防止剤が好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
実施例、
１．ビオチン化ガラス繊維濾紙
特許文献２で開示された方法で作成したビオチン導入したガラス繊維濾紙を円形にくり抜いた。
２．吸水層の化学処理
円筒形の吸水層を、0.3Mアスコルビン酸ナトリウム塩を含む0.1M リン酸緩衝pH5.4溶液あるいは１０％SDS溶液に５分間漬け、風の良い場所に一晩放置し乾燥させた。１で作成
したビオチン化ガラス繊維濾紙を吸水層の上に置き、図１で示された容器にいれて開口部を有するキャップをし、収納した。
３．ビオチンウミホタルルシフェラーゼの発光検出感度の向上
上記の方法でSDS処理した吸水層あるいは未処理吸水層を挿入した4個の容器のうち、2個は0.02ml のStreptavidin (0.1 mg/ml) /PBS緩衝液/0.5%BSA溶液pH 7.4で処理され、
ビオチン分子を結合するガラスフィルターとした。比較するため、残り2個の容器には、streptavidinを加えないことにした。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
それぞれの容器に、0.05mlのブロック液を加えたのち、0.02mlのビオチン化ウミホタルルシフェラーゼ（0.001mg/ml）を滴化した。容器を0.5％Tweenを含む10mM リン酸塩―生
理食塩水（pH7.0）で連続2回洗浄したのち、0.04 mlのウミホタルルシフェリ(0.001 mM)
を加え、富士フィルムのLAS-4000miniでイメージングを行った（図２）。図２のように、SDSで処理した容器1と容器２とのS/N比（21）はSDSで処理していない容器３と４よりのS/N比（11）よりも約2倍であることがわかった。
４．IgEのHRP発光酵素免疫フロースルー検出法
２で記述した方法で10％SDSで処理した吸水層、0.3Mアスコルビン酸ナトリウム塩を含
有リン酸緩衝液pH5.4で処理した吸水層、あるいは未処理吸水層それぞれ2個ずつを用意し、１の方法で作成したビオチン化ガラス繊維フィルターと一緒に容器に挿入した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
まず、すべての容器に0.02ml のStreptavidin (0.1 mg/ml) /PBS緩衝液pH 7.4/0.5%BSA溶液、ブロック液の順で滴下し、ビオチン分子を結合できるようにした。つぎに、ビオチン化アレルゲンーと特異IgE抗体複合体を形成させるため、0.01mlのビオチン化アレルゲ
ンを0.05mlの特異IgE抗体溶液(3.5 IU/ml)と反応させ、0.05mlのその反応液を容器２，４，６に加えた。比較するため、0.01mlのビオチン化アレルゲンとIgEなしのリン酸緩衝液
と反応させた液を、容器1，3，5に加えた。さらに、すべての容器に0.02mlのペルオキシ
ダーゼ標識抗IgE抗体液、0.5％Tweenを含む10mM リン酸塩―生理食塩水（pH7.0）の洗浄
液の順で滴下した。最後に、0.04 ml のPierce社のSuperSignal(R) ELISA Femto  Chemiluminescent Substrate液を加え、容器を富士フィルム社のLAS4000mini装置に移し、発光
イメージング（図３）を行った。
【００３２】
このように、アスコルビン酸塩で処理した１と２のS/N比（97）はSDS処理した３と４S/N比の14、あるいは未処理５と６のS/N比15より明らかに高いであることがわかった。この
ことから、アレルギー陰性と弱陽性クラス(IgEの濃度範囲0.35~3.5 IU/ml)を区別して検
出できることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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