(57)【要約】【課題】水溶液中のタンパク質の凝集等によるタンパク質の生理活性低下を抑制し、タンパク質の水溶液を長期的に安定化させることができるタンパク質水溶液の安定化剤及びこの安定化剤を用いたタンパク質の安定化方法を提供すること。【解決手段】タンパク質水溶液の安定化剤であって、以下（１）〜（３）の条件を満たす有機化合物（Ａ）を含有するタンパク質水溶液の安定化剤。（１）有機化合物（Ａ）の分子にプロトンが付加した場合に、分子内の少なくとも１つの原子（Ｚ）において、原子（Ｚ）及び原子（Ｚ）に結合している原子（Ｙ）が有するπ電子により形成されているπ結合が共鳴構造をとっており、原子（Ｚ）及び原子（Ｙ）が有する電子であって、この共鳴構造のπ結合に関与しているπ電子が４つ以上であること（２）０．１ｍｏｌ／ｄｍ3溶液のイオン強度が０．１以上であること（３）分子量が３００未満であること【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質水溶液の安定化剤であって、以下（１）〜（３）の条件を満たす有機化合物（Ａ）を含有するタンパク質水溶液の安定化剤；
（１）有機化合物（Ａ）の分子にプロトンが付加した場合に、分子内の少なくとも１つの原子（Ｚ）において、原子（Ｚ）及び原子（Ｚ）に結合している原子（Ｙ）が有するπ電子により形成されているπ結合が共鳴構造をとっており、
原子（Ｚ）及び原子（Ｙ）が有する電子であって、
この共鳴構造のπ結合に関与しているπ電子が４つ以上であること
（２）０．１ｍｏｌ／ｄｍ3溶液のイオン強度が０．１以上であること
（３）分子量が３００未満であること。
【請求項２】
有機化合物（Ａ）が下記一般式（２）で表される化合物（ａ）である請求項１に記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【化１】
2011067202.tif 000012
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【請求項３】
有機化合物（Ａ）が下記一般式（２）で表される化合物（ａ）の塩である請求項１に記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【化２】
2011067202.tif 000013
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【請求項４】
有機化合物（Ａ）がグアニジン塩酸塩である請求項１に記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【請求項５】
タンパク質が酵素である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【請求項６】
さらに下記一般式（３）で表される化合物（Ｂ）を含有する請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【化３】
2011067202.tif 000014
［式中、Ｑは、アルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。］
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤、タンパク質及び水を含有するタンパク質水溶液。
【請求項８】
有機化合物（Ａ）の含有量がタンパク質水溶液の重量に基づいて０．０１〜４０重量％である請求項７に記載のタンパク質水溶液。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤、タンパク質及び水を混合し、１分〜２時間攪拌するタンパク質の安定化方法。
【請求項１０】
タンパク質と安定化剤中の有機化合物（Ａ）との重量比（有機化合物（Ａ）の重量／タンパク質の重量）が２〜６０００である請求項９に記載のタンパク質の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質水溶液の安定化剤、この安定化剤を含有するタンパク質水溶液及びこの安定化剤を用いるタンパク質の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素、抗体、ペプチド等のタンパク質は、洗剤、診断・検査薬、医薬品として広く利用されている。これらの製品においては、製造工程及び保存期間中に生理活性（力価）が損なわれないことが重要である。タンパク質を水溶液とした場合、生理活性が長期間維持できない問題がある。そこで、タンパク質を生理活性を低下させずに供給する方法として、精製したタンパク質製剤を供給する方法が採られている。
安定してタンパク質を取り出し精製するための一つの方法として凍結乾燥が一般的に行われている。タンパク質の多くは熱によって失活しやすい性質を有するが、凍結乾燥法では、熱をかけずにタンパク質を安定化することができる。
しかしながら、凍結乾燥法は、脱水により変性するタンパク質には使用できない、及び凍結乾燥工程中に吸湿や酸化による変質が起こりやすい等の難点がある。また、凍結乾燥製剤は、使用時に水溶液として溶解して用いる場合、タンパク質製剤を必要な濃度に調整した水溶液をその都度に調製しなければならないという煩雑さの問題がある。
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる技術が公開されている。ウレアーゼパーオキシターゼの水溶液の安定化剤として、グリセリン等の多価アルコールを含有させる技術（特許文献１）、コレステロールオキシターゼを含む水溶液に、牛血清アルブミンやグルコース等の糖類あるいはリジン等のアミノ酸を添加する技術（特許文献２）等が挙げられる。
しかし、これらはいずれも特定のタンパク質を安定化させるための方法であり汎用性があるとは言いがたく、タンパク質全般に適用して活性を長期間維持できる汎用的な安定化剤及び安定化方法はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−７０７９８号公報
【特許文献２】特開平８−１８７０９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、水溶液中のタンパク質の凝集等によるタンパク質の生理活性低下を抑制し、タンパク質の水溶液を長期的に安定化させることができるタンパク質水溶液の安定化剤及びこの安定化剤を用いたタンパク質の安定化方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記の目的を達成するべく検討を行った結果、本発明に到達した。
すなわち、本発明はタンパク質水溶液の安定化剤であって、以下（１）〜（３）の条件を満たす有機化合物（Ａ）を含有するタンパク質水溶液の安定化剤；
（１）有機化合物（Ａ）の分子にプロトンが付加した場合に、分子内の少なくとも１つの原子（Ｚ）において、原子（Ｚ）及び原子（Ｚ）に結合している原子（Ｙ）が有するπ電子により形成されているπ結合が共鳴構造をとっており、
原子（Ｚ）及び原子（Ｙ）が有する電子であって、この共鳴構造のπ結合に関与しているπ電子が４つ以上であること
（２）０．１ｍｏｌ／ｄｍ3溶液のイオン強度が０．１以上であること
（３）分子量が３００未満であること
である。
また、本発明のタンパク質水溶液は、このタンパク質水溶液の安定化剤、タンパク質及び水を含有することを要旨とする。
また、本発明のタンパク質の安定化方法は、タンパク質水溶液の安定化剤、タンパク質及び水を混合し、１分〜２時間攪拌することを要旨とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のタンパク質水溶液の安定化剤は、水溶液中のタンパク質を安定化し生理活性が低下しない。したがって、本発明のタンパク質水溶液の安定化剤を含有するタンパク質水溶液及び本発明のタンパク質の安定化方法は、生理活性を長期間維持できる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、タンパク質水溶液の安定化剤を単に安定化剤とも表記する。また、有機化合物（Ａ）を単に化合物（Ａ）とも表記する。
本発明は、タンパク質水溶液の安定化剤であって、以下（１）〜（３）の条件を満たす有機化合物（Ａ）を含有するタンパク質水溶液の安定化剤；
（１）有機化合物（Ａ）の分子にプロトンが付加した場合に、分子内の少なくとも１つの原子（Ｚ）において、原子（Ｚ）及び原子（Ｚ）に結合している原子（Ｙ）が有するπ電子により形成されているπ結合が共鳴構造をとっており、
原子（Ｚ）及び原子（Ｙ）が有する電子であって、この共鳴構造のπ結合に関与しているπ電子が４つ以上であること
（２）０．１ｍｏｌ／ｄｍ3溶液のイオン強度が０．１以上であること
（３）分子量が３００未満であること
である。
【０００８】
タンパク質を水溶液として保存する際にそのまま保存すると、これらが凝集や加水分解等を起こし力価が著しく低下するという問題点があるが、本発明では、特定の化学構造を有する上記の化合物（Ａ）をタンパク質水溶液の安定化剤として使用することにより解決できる。
【０００９】
上記（１）の条件について説明する。
例えば、有機化合物（Ａ）が下記一般式（１）で表されるのグアニジン分子である場合、炭素原子（Ｉ）は、窒素原子（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）と結合している。グアニジンの分子にプロトンが付加した場合、炭素原子（Ｉ）はカチオンになり空軌道をもち、窒素原子（ＩＩ）〜（ＩＶ）はそれぞれｓｐ3混成軌道に孤立電子対を有する。これら３つの孤立電子対は、炭素原子（Ｉ）との間にπ結合を形成することができ、共鳴構造をとっている。
すなわち、グアニジンの分子内の炭素原子（Ｉ）を原子（Ｚ）とした場合に、この原子（Ｚ）に結合している原子（Ｙ）は、窒素原子（ＩＩ）〜（ＩＶ）であり、この原子（Ｚ）｛炭素原子（Ｉ）｝および原子（Ｙ）｛窒素原子（ＩＩ）〜（ＩＶ）｝が有する電子であって、この共鳴構造のπ結合に関与しているπ電子は６つである。
なお、グアニジン分子にプロトンが付加した場合、窒素原子（ＩＩ）〜（ＩＶ）は、それぞれ炭素原子（Ｉ）及び２つの水素原子と結合しており、それぞれの孤立電子対がπ結合を形成しているので、窒素原子（ＩＩ）〜（ＩＶ）を原子（Ｚ）とした場合は、それぞれπ結合に関与しているπ電子を２つ有している。
したがって、グアニジンは、炭素原子（Ｉ）が原子（Ｚ）の条件を満たすので、（１）の条件を満たす。
【００１０】
【化１】
2011067202.tif 000002
【００１１】
上記（１）の条件を満たす化合物としては、例えば、グアニジウム塩、グアナジン、グアナミン、ホルムアミジン、複素環化合物（ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、インドール、キノリン、イソキノリン、プリン等）、有機リン酸（炭素数１〜３０のアルコールのリン酸エステル等）等が挙げられる。
【００１２】
上記（２）の条件において、イオン強度Ｉとは、溶液中のイオン種ｉについて、それぞれのイオンのモル濃度ｍと電荷ｚの２乗の積を加え合わせ、さらにそれを１／２にしたものであり、以下の式で表される。
Ｉ＝１／２Σｍiｚi2
つまり、０．１ｍｏｌ／ｄｍ3溶液のイオン強度が０．１以上であるとは、上式で計算されるＩの値が０．１以上であることを示す。
【００１３】
本発明の上記（１）〜（３）の条件を満たす有機化合物（Ａ）としては、複素環化合物（Ａ−１）、有機リン酸（Ａ−２）、炭素数１〜２０の窒素、酸素及び硫黄原子を２つ以上有する化合物（Ａ−３）並びにこれらの塩（Ａ−４）が挙げられる。
複素環化合物（Ａ−１）としては、含窒素複素環化合物、含酸素複素環化合物、含硫黄複素環化合物、含リン複素環化合物が挙げられ、例えば、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、インドール、キノリン、イソキノリン、プリン、インドール、キノリン、イソキノリン、フラン、チオフェン、オキサゾール、チアゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール等が挙げられる。
有機リン酸（Ａ−２）としては、炭素数１〜２０の有機リン酸が挙げられ、例えばメチルリン酸、エチルリン酸、イソプロピルリン酸、ブチルリン酸、ジメチルリン酸、ジエチルリン酸、ジプロピルリン酸、ジブチルリン酸、メチルピロリン酸、エチルピロリン酸等が挙げられる
炭素数１〜２０の窒素、酸素及び硫黄原子を２つ以上有する化合物（Ａ−３）としては、下記一般式（２）で表される化合物（ａ）、アミジノ基含有化合物、アミド基含有化合物等が挙げられ、例えば、グアニジン、尿素、チオ尿素、フォルムアミジン、メチルアミジン、ビグアニド等が挙げられる。
これらの塩（Ａ−４）としては、下記一般式（２）で表される化合物（ａ）の塩が挙げられる。塩としては、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、および炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。
【００１４】
本発明の安定化剤中に含まれる有機化合物（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し１０〜１００が好ましく、さらに好ましくは２０〜９０、次にさらに好ましくは３０〜８０、特に好ましくは３０〜７０である。
本発明の安定化剤中に含まれる化合物（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から、安定化剤を使用する場合のタンパク質の重量に対し、２〜６０００重量％となるように含有することが好ましく、さらに好ましくは５〜５００重量％となるように含有することであり、次にさらに好ましくは１０〜１００重量％となるように含有することである。
【００１５】
本発明のタンパク質水溶液の安定化剤において、活性の持続性の観点から、有機化合物（Ａ）としては、下記一般式（２）で表される化合物（ａ）及び化合物（ａ）の塩が好ましい。
【００１６】
【化２】
2011067202.tif 000003
【００１７】
一般式（２）において、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。
【００１８】
一般式（２）で表される化合物（ａ）として、具体的にはグアニジン、尿素及びチオ尿素が挙げられる。
【００１９】
一般式（２）で表される化合物（ａ）の塩としては、グアニジンの塩が挙げられる。
塩としては塩酸塩、炭酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩及びリン酸塩等が挙げられる。
【００２０】
化合物（ａ）及び化合物（ａ）の塩としては、タンパク質安定化の観点で、グアニジンの塩及び尿素が好ましく、さらに好ましくはグアニジンの塩、次にさらに好ましくはグアニジン塩酸塩である。
【００２１】
本発明の安定化剤は、さらに下記一般式（３）で表される化合物（Ｂ）を含有することができる。
【００２２】
【化３】
2011067202.tif 000004
【００２３】
一般式（３）中、Ｑはアルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。
【００２４】
Ｑのアルキル基としては炭素数１〜２２のアルキル基が挙げられ、具体的にメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、セチル基、ステアリル基及びベヘニル基等が挙げられる。これらのアルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されてもよい。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及び水酸基等が挙げられる。置換基の数は１〜３が好ましく、さらに好ましくは２〜３である。例えばブチル基末端の水素原子２つが１つのアミノ基と１つのカルボキシル基で置換された場合、化合物（Ｂ）はアルギニンをあらわす。
【００２５】
化合物（Ｂ）としては、アルギニン又はその塩（Ｂ−１）及びアルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）が挙げられる。
【００２６】
アルギニン又はその塩（Ｂ−１）として、アルギニン、アルギニンの無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及びアルギニンの有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００２７】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）において、アルギニン誘導体は下記一般式（４）で表されるアルギニンのα−アミノ基若しくはα−カルボキシル基又はこれらの両方の基が置換された誘導体である。
α−アミノ基の置換は、下記一般式（５）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（６）で表されるイミノ基（Ｙ−２）への置換であり、α−カルボキシル基の置換は下記一般式（７）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（８）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）への置換である。
【００２８】
言い換えると、アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）では、α−アミノ基又はα−カルボキシル基の少なくともいずれか一方が置換されている。すなわち、Ｙがアミノ基の場合、Ｚは下記一般式（７）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（８）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）であり、Ｚがカルボキシル基の場合は、Ｙは下記一般式（５）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式で表されるイミノ基（Ｙ−２）である。
【００２９】
【化４】
2011067202.tif 000005
【００３０】
一般式（４）中、Ｙはアミノ基、下記一般式（５）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）又は下記一般式（６）で表されるイミノ基（Ｙ−２）を表す。Ｚは、カルボキシル基、下記一般式（７）で表されるエステル基（Ｚ−１）又は下記一般式（８）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）を表す。
【００３１】
【化５】
2011067202.tif 000006
【００３２】
一般式（５）中、Ｒ1は、水素原子又は炭素数１〜３６の１価の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００３３】
一般式（５）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）におけるＲ1の炭化水素基としては、炭素数１〜３６の１価の炭化水素基であり、直鎖又は分岐の脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基が含まれる。
直鎖の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基及びベヘニル基等が挙げられる。
分岐の脂肪族炭化水素基としては、イソプロピル基及びｔ−ブチル基等が挙げられる。
脂環式炭化水素基としては、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基及びシクロヘキシルメチル基等が挙げられる。
芳香族炭化水素基としては、フェニル基、メチルフェニル基、ベンジル基、フェニルエチル基及びメチルベンジル基等が挙げられる。
これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液の安定化の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
水素原子以外の置換基としては、アミノ基、カルボキシル基、アミド基、エステル基、イミノ基及び水酸基等が挙げられる。
【００３４】
一般式（５）で表されるＮ−アルキルカルボニル−アミド基（Ｙ−１）として具体的には、ホルムアミド基、アセチルアミド基、プロピオン酸アミド基、ブチル酸アミド基、ヘキシル酸アミド基、シクロヘキシル酸アミド基、オクチル酸アミド基及びベンゾイルアミド基等が挙げられる。
【００３５】
【化６】
2011067202.tif 000007
【００３６】
一般式（６）中、Ｒ2とＲ3はそれぞれ独立に、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、これらの炭化水素基はその水素原子の一部が水素原意以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００３７】
一般式（６）で表されるイミノ基（Ｙ−２）において、Ｒ2とＲ3は、Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
【００３８】
一般式（６）で表されるイミノ基（Ｙ−２）としては、メチルイミノ基等が挙げられる。
【００３９】
【化７】
2011067202.tif 000008
【００４０】
一般式（７）中、Ｒ4は、炭素数１〜３６の炭化水素基又は多価アルコール若しくは糖から１つの水酸基を除いた残基を表す。
この炭化水素基はその水素原子一部が他の官能基、例えば、水酸基、メトキシル基、エトキシル基、ニトロ基、ヒドロキシフェニル基等で置換されていてもよい。
【００４１】
一般式（７）で表されるエステル基（Ｚ−１）において、Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基は、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれる。
Ｒ4が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液の安定化の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはエチル基である。
【００４２】
多価アルコールとしては、２価〜３価のアルコールが含まれ、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール及びグリセリン等が挙げられる。
糖としては、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール及びトレハロース等が挙げられる。
【００４３】
【化８】
2011067202.tif 000009
【００４４】
一般式（８）中、Ｒ5は、水素原子又は炭素数１〜３６の炭化水素基を表し、この炭化水素基はその水素原子の一部が水素原子以外の他の官能基に置換されていてもよい。
【００４５】
一般式（８）で表されるＮ−アルキルアミド基（Ｚ−２）において、Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、その炭化水素基としては、前記Ｒ1と同様の炭化水素基が含まれ、これらの炭化水素基はＲ1と同様に、その一部が他の官能基に置換されていてもよい。
Ｒ5が炭素数１〜３６の炭化水素基の場合、これらの炭化水素基のうち、タンパク質含有水溶液の安定化の観点から、直鎖の脂肪族炭化水素基が好ましく、さらに好ましくはメチル基及びエチル基、最も好ましくはメチル基である。
【００４６】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）がアルギニン誘導体の塩の場合、塩としては無機酸塩（塩酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、硫酸塩及びケイ酸塩等）及び有機酸塩（ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、トリメリット酸塩及びピロメリット酸塩等）が挙げられる。
【００４７】
アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）の化合物として具体的に、Ｎ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩が挙げられる。
【００４８】
本願発明の安定化剤中に含まれる化合物（Ｂ）としては、活性の持続性の観点から、アルギニン誘導体又はその塩（Ｂ−２）が好ましく、さらに好ましくはアルギニンのα−アミノ基及びα−カルボキシル基の両方の基が置換された誘導体であり、特に好ましくはＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩である。
【００４９】
本発明の安定化剤中に含まれる化合物（Ｂ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し１０〜９０が好ましく、さらに好ましくは２０〜８０、次にさらに好ましくは３０〜７０である。
本発明の安定化剤中に含まれる化合物（Ｂ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から、安定化剤を使用する場合のタンパク質の重量に対し、２〜５００重量％となるように含有することが好ましく、さらに好ましくは５〜２００重量％となるように含有することであり、次にさらに好ましくは１０〜１００重量％となるように含有することである。
【００５０】
本発明の安定化剤は有機化合物（Ａ）のみを含有すればよいが、タンパク質の安定化の観点から、有機化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）を含有することが好ましい。
【００５１】
本発明の安定化剤が有機化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）を含有する場合、（Ａ）と（Ｂ）との重量比（有機化合物（Ａ）の重量／化合物（Ｂ）の重量）は０．１〜９が好ましく、さらに好ましくは０．２〜８であり、特に好ましくは０．５〜５である。
【００５２】
本発明の安定化剤は上記有機化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）以外に、界面活性剤（Ｅ）、無機塩（Ｆ）、多価アルコール（Ｇ）、糖（Ｈ）、アルギニン以外のアミノ酸（Ｉ）及びその他の有機化合物（Ｊ）を併用することができる。
【００５３】
界面活性剤（Ｅ）として、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が含まれ、ポリエチレングリコール、ポリオキシプロピレン／ポリオキシエチレン共重合物、ソルビタンアルキルエステルエチレンオキシド付加物、脂肪族アルコールエチレンオキシド付加物、脂肪酸エチレンオキシド付加物及びアルキルアミンエチレンオキシド付加物等が挙げられる。
【００５４】
無機塩（Ｆ）として、塩化ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、ギ酸ナトリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸アンモニウム等が挙げられる。
【００５５】
多価アルコール（Ｇ）として、エチレングリコール、プロピレングリコール及びグリセリン等が挙げられる。
【００５６】
糖（Ｈ）として、トレハロース、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトース、フルクトース、ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸等が挙げられる。
【００５７】
アルギニン以外のアミノ酸（Ｉ）として、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、リシン、ヒスチジン及びそれらの塩等が挙げられる。
【００５８】
その他の有機化合物（Ｊ）としては特に限定するものではないが、血清アルブミン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン及びシルクペプチドが挙げられる。
【００５９】
本発明の安定化剤中に含まれる界面活性剤（Ｅ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、次にさらに好ましくは０〜２０である。
本発明の安定化剤中に含まれる無機塩（Ｆ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し０〜２０が好ましく、さらに好ましくは０〜１５、次にさらに好ましくは０〜１０である。
本発明の安定化剤中に含まれる多価アルコール（Ｇ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し０〜７０が好ましく、さらに好ましくは０〜６０、次にさらに好ましくは０〜５０である。
本発明の安定化剤中に含まれる糖（Ｈ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し０〜５０が好ましく、さらに好ましくは０〜３０、次にさらに好ましくは０〜２０である。
本発明の安定化剤中に含まれるアルギニン以外のアミノ酸（Ｉ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し０〜３０が好ましく、さらに好ましくは０〜２０、次にさらに好ましくは０〜１０である。
本発明の安定化剤中に含まれるその他の有機化合物（Ｊ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から安定化剤の重量に対し０〜１０が好ましく、さらに好ましくは０〜５、次にさらに好ましくは０〜３である。
【００６０】
本発明の別の実施態様は、上記タンパク質の安定化剤、タンパク質及び水を含有するタンパク質水溶液である。
タンパク質水溶液において、安定化剤の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から、タンパク質の水溶液の重量に基づいて０．１〜５０が好ましい。
タンパク質水溶液において、タンパク質の含有量（重量％）は、長期安定性の観点から、タンパク質の水溶液の重量に基づいて０．０１〜２が好ましい。
タンパク質水溶液において、水の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から、タンパク質の水溶液の重量に基づいて４８〜９９．８が好ましい。
【００６１】
本発明のタンパク質水溶液において、（Ａ）の含有量（重量％）は、タンパク質安定化の観点から、タンパク質の水溶液の重量に基づいて０．０１〜４０が好ましい。
タンパク質水溶液において、タンパク質水溶液中のタンパク質と（Ａ）の重量比（（Ａ）の重量／タンパク質の重量）は、タンパク質安定化の観点から、２〜６０００が好ましく、さらに好ましくは５〜５００であり、次にさらに好ましくは１０〜１００である。
タンパク質水溶液において、（Ｂ）の含有量（重量％）はタンパク質安定化の観点から、タンパク質の水溶液の重量に基づいて０．０１〜２０が好ましい。
タンパク質水溶液において、タンパク質水溶液中のタンパク質と（Ｂ）の重量比（（Ｂ）の重量／タンパク質の重量）は、タンパク質安定化の観点から、２〜５００が好ましく、さらに好ましくは５〜２００であり、次にさらに好ましくは１０〜１００である。
【００６２】
本発明のタンパク質水溶液の安定化剤が適用できるタンパク質としては特に限定されないが、酵素、組み換えタンパク質、抗体及びペプチド等が挙げられる。
【００６３】
酵素としては、酸化還元酵素｛コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等｝、加水分解酵素｛リゾチーム、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ及びグルコアミラーゼ等｝、異性化酵素｛グルコースイソメラーゼ等｝、転移酵素｛アシルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼ等｝、合成酵素｛脂肪酸シンターゼ、リン酸シンターゼ及びクエン酸シンターゼ等｝及び脱離酵素｛ペクチンリアーゼ等｝等が挙げられる。
【００６４】
組み換えタンパク質としては、タンパク製剤｛インターフェロンα、インターフェロンβ、インターロイキン１〜１２、成長ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ナトリウム利尿ペプチド、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ソマトメジン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、血清アルブミン及びカルシトニン等｝及びワクチン｛Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン及びＣ型肝炎ワクチン等｝等が挙げられる。
【００６５】
抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が挙げられる。
【００６６】
ペプチドとしては、特にアミノ酸組成を限定するものではなく、ジペプチド及びトリペプチド等が挙げられる。
これらのタンパク質のうち、活性の長期安定化の観点から、酵素が好ましい。
【００６７】
本発明のタンパク質水溶液に含まれる水は、特に限定されるものではなく、例えば、水道水、イオン交換水、蒸留水及び逆浸透水等が挙げられる。
【００６８】
本発明のタンパク質含有水溶液には、安定化効果を損なわない範囲で、緩衝剤が添加されていてもよい。
緩衝剤としては、公知の緩衝液が挙げられ、具体的には、トリスバッファー（トリス緩衝液）、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー等が挙げられる。これらのうち、アルカリ性の緩衝液が好ましく、入手しやすさの観点で、特に好ましくは、トリスバッファーである。
【００６９】
本発明の安定化剤を用いたタンパク質水溶液の製造方法の例を以下に説明するが、タンパク質水溶液の製造は、安定化剤をそのまま、あるいは水に溶かしてタンパク質水溶液に加えてもよいし、タンパク質を安定化剤の水溶液に加えてもよいし、タンパク質と安定化剤と水を一緒に混ぜてもよい。
【００７０】
本発明の安定化剤を用いたタンパク質水溶液の製造方法の例として、分離精製工程で分離された酵素の安定化水溶液を作製する場合の一例を以下に挙げる。
（１）安定化剤を水に加え、水溶液を作製する。
（２）分離精製後の酵素水溶液を上記水溶液に加える。
（３）２５℃又は冷蔵庫で密封保存する。
【００７１】
本発明のタンパク質の安定化方法は、上記のタンパク質の安定化剤、上記のタンパク質及び水を混合し、１分〜２時間攪拌してタンパク質を安定化させる、タンパク質の安定化方法である。
【００７２】
本発明のタンパク質の安定化方法において、添加する安定化剤の量、タンパク質の量、水の量、タンパク質と安定化剤中の有機化合物（Ａ）との重量比及びタンパク質と安定化剤中の化合物（Ｂ）の重量比は上記タンパク質水溶液における記載と同様であり、好ましい範囲も同様である。
【００７３】
本発明のタンパク質の安定化方法において、安定化剤、タンパク質及び水を混合する場合、安定化剤をそのまま、あるいは水に溶かしてタンパク質水溶液に加えてもよいし、タンパク質を安定化剤の水溶液に加えてもよいし、タンパク質と安定化剤と水を一緒に混ぜてもよい。
【００７４】
本発明のタンパク質の安定化方法において、タンパク質の安定化剤、タンパク質及び水を混合する際の溶液の温度（℃）は、タンパク質の安定性の観点から、好ましくは４℃〜４０℃であり、更に好ましくは４℃〜２５℃である。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７６】
＜製造例１＞
Ｎ−α−アセチルアルギニン｛アルギニンアセトアミド、株式会社エムピーバイオジャパン｝１２．６重量部（０．０５モル部）、メタンスルホン酸１部及びエタノール９２重量部（２モル部）を均一混合し、８０℃で５時間加熱攪拌し、エバポレーターで濃縮後、塩酸（３５重量％）５．２重量部（０．０５モル部）を加え中和した。その後、水から再結晶し、減圧乾燥｛６０℃、２０Ｐａ｝して、化合物（Ｂ）であるＮ−α−アセチルアルギニンエチルエステル塩酸塩を得た。
【００７７】
＜実施例１＞
塩酸グアニジン１００ｍｇを安定化剤（Ｎ−１）として用いた。
【００７８】
＜実施例２〜１５＞
実施例１において、有機化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）を表１に記載の組成及び量にすること以外は実施例１と同様に、安定化剤（Ｎ−２）〜（Ｎ−１５）として用いた。
【００７９】
＜比較例１＞
従来の安定化剤であるプロピレングリコール１００ｍｇを安定化剤（ＨＮ−１）として用いた。
【００８０】
＜比較例２〜４＞
比較例１において、プロピレングリコールを表２に記載の組成及び量にすること以外は比較例１と同様に、安定化剤（ＨＮ−２）〜（ＨＮ−４）として用いた。
なお、比較例４では、安定化剤として何も用いなかった（０ｍｇ）が、便宜上、安定化剤（ＨＮ−４）とした。
【００８１】
【表１】
2011067202.tif 000010
【００８２】
なお、上記実施例及び比較例において、化合物（Ａ）及び化合物（Ｂ）は下記の試薬を使用した。
グアニジン塩酸塩：和光純薬工業（株）製
尿素：和光純薬工業（株）製
ピリジン：和光純薬工業（株）製
アルギニン塩酸塩：和光純薬工業（株）製
アルギニンエチルエステル：和光純薬工業（株）製
アセチルアルギニン塩酸塩：和光純薬工業（株）製
【００８３】
【表２】
2011067202.tif 000011
【００８４】
なお、上記実施例及び比較例において、従来の安定化剤は下記の試薬を使用した。
プロピレングリコール：和光純薬工業（株）製
グリセリン：和光純薬工業（株）製
トレハロース：和光純薬工業（株）製
【００８５】
＜セルラーゼの酵素活性の測定＞
実施例１〜１５及び比較例１〜４の安定化剤（Ｎ−１）〜（Ｎ−１５）及び比較例１〜４の安定化剤（ＨＮ−１）〜（ＨＮ−４）をそれぞれ２５℃の５０ミリモル／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ＝７）１．０ｍＬに加えて均一混合し、さらに各々セルラーゼ｛和光純薬工業株式会社｝５．０ｍｇを加えて１分間均一混合し、セルラーゼ水溶液（Ｓ−１）〜（Ｓ−１５）及び（ＨＳ−１）〜（ＨＳ−４）をそれぞれ得た。得られたセルラーゼ水溶液を、２５℃の恒温機内で２日間、５日間、２週間及び１ヶ月間密栓保存した後の酵素活性を下記の方法で測定した。
セルラーゼ水溶液各々２００μＬを、５重量％セルロース研濁液（和光純薬社製セルロース５ｇをｐＨ＝７のトリス緩衝液９５ｇに加え、懸濁させたもの）８００μＬに加えて、３７℃で２時間転倒混和した。上澄み１００μＬをグルコース定量キット液（和光純薬製「テストワコー」）１００μＬに加えた。直ちに、この測定液について、２５℃で、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ社製、機種：サンライズサーモ）で４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ0）を測定し、さらに測定液を２５℃で１５分間放置後にもう一度、２５℃で吸光度（Ａ15）を測定し、これらの差（Ａ15−Ａ0）（ΔＡ）を算出した。
一方、セルラーゼ水溶液（ＨＳ−４）を調製した直後に上記と同様にして、吸光度の差（Ａ15−Ａ0）（ΔＡb）を算出し、次式から、「酵素活性残存率」を算出した。
酵素活性残存率（％）＝（ΔＡ／ΔＡb）×１００
その結果を表１及び２に示す。
【００８６】
＜プロテアーゼの酵素活性の測定＞
実施例１〜１５及び比較例１〜４の安定化剤（Ｎ−１）〜（Ｎ−１５）及び比較例１〜４の安定化剤（ＨＮ−１）〜（ＨＮ−４）をそれぞれ２５℃の５０ミリモル／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ＝７）１．０ｍＬに加えて均一混合し、さらに各々プロテアーゼ｛和光純薬工業株式会社｝５．０ｍｇを加えて１分間均一混合し、プロテアーゼ水溶液（Ｐ−１）〜（Ｐ−１５）及び（ＨＰ−１）〜（ＨＰ−４）をそれぞれ得た。得られたプロテアーゼ水溶液を、２５℃の恒温機内で２日間、５日間、２週間及び１ヶ月間密栓保存した後の酵素活性を下記の方法で測定した。
プロテアーゼ水溶液各々１ｍＬを１５ｍＬ容の試験管にはかりとり、０．５重量％カゼイン溶液（和光純薬工業製カゼイン０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解したもの）５ｍＬを加え、２５℃で１０分間放置した。その後、５％ＴＣＡ溶液[トリクロロ酢酸（和光純薬社製）をイオン交換水に溶解させたもの]を５ｍＬを加え、２５℃で２０分間放置した。遠心分離機（ＫＵＢＯＴＡ社製、機種：冷却遠心機３９２２）で２５００ｒｐｍ、２０分間処理し、残った上澄み２ｍＬを別の１５ｍＬ容の試験管に測り取った。この試験管に、０．５Ｍの炭酸ナトリウム水溶液５ｍＬ、イオン交換水で３倍希釈したフォーリン試薬（和光純薬工業製）１ｍＬを加え、２０分間放置した。
この溶液の６６０ｎｍにおける２５℃での吸光度（Ａ）を、分光光度計（島津製作所社製、機種：ＵＶ−１７００）を用いて測定し、プロテアーゼの酵素活性を算出した。
ブランクには、作成した直後の（ＨＰ−４）のプロテアーゼ水溶液を用いて上記と同様にして測定溶液を調製し、吸光度（Ａb）を測定した。次式から「酵素活性残存率」を算出した。
酵素活性残存率（％）＝（Ａ／Ａb）×１００
その結果を表１及び２に示す。
【００８７】
＜リパーゼの酵素活性の測定＞
実施例１〜１５及び比較例１〜４の安定化剤（Ｎ−１）〜（Ｎ−１５）及び比較例１〜４の安定化剤（ＨＮ−１）〜（ＨＮ−４）をそれぞれ２５℃の５０ミリモル／Ｌトリス緩衝液（和光純薬社製）（ｐＨ＝７）１．０ｍＬに加えて均一混合し、さらに各々リパーゼ｛和光純薬工業株式会社｝５．０ｍｇを加えて１分間均一混合し、リパーゼ水溶液（Ｌ−１）〜（Ｌ−１５）及び（ＨＬ−１）〜（ＨＬ−４）をそれぞれ得た。得られたリパーゼ水溶液を、２５℃の恒温機内で２日間、５日間、２週間及び１ヶ月間密栓保存した後の酵素活性を下記の方法で測定した。
リパーゼ水溶液各々１００μＬを５ｍＬ容の試験管にはかりとり、５０ミリモル／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ＝７．０）２ｍＬを加え、さらに５μＭのｐ−ニトロフェニルアセテート（和光純薬社製）１ｍＬを加えた。
この測定溶液調製直後と２５℃で１０分放置後の４００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡ）（トリニトロフェニルアセテートが酵素で分解された生成物の吸収）を分光光度計（島津製作所社製、機種：ＵＶ−１７００）で測定した。
ブランクとして、作成した直後の（ＨＬ−４）のリパーゼ水溶液を用いて上記と同様にして測定溶液を調製し、吸光度変化（ΔＡb）を測定した。
リパーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれて、ｐ−ニトリフェニルアセテートが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
次式から「酵素活性残存率」を算出した。
酵素活性残存率（％）＝（ΔＡ／ΔＡb）×１００
その結果を表１及び２に示す。
【００８８】
＜アミラーゼの酵素活性の測定＞
実施例１〜１５及び比較例１〜４の安定化剤（Ｎ−１）〜（Ｎ−１５）及び比較例１〜４の安定化剤（ＨＮ−１）〜（ＨＮ−４）をそれぞれ２５℃の５０ミリモル／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ＝７）１．０ｍＬに加えて均一混合し、さらに各々リパーゼ｛和光純薬工業株式会社｝５．０ｍｇを加えて１分間均一混合し、アミラーゼ水溶液（ＡＭ−１）〜（ＡＭ−１５）及び（ＨＡＭ−１）〜（ＨＡＭ−４）を得た。得られたアミラーゼ水溶液を、２５℃の恒温機内で２日間、５日間、２週間及び１ヶ月間密栓保存した後の酵素活性を下記の方法で測定した。
アミラーゼ水溶液各々１０μＬに、０．５重量％のデンプン懸濁液（和光純薬工業製デンプン０．５ｇを０．０５モル／Ｌのトリス緩衝液１００ｍＬに溶解したもの）５ｍＬを加え、６０℃で２０分間振とうした。
振とう後、ワットマン社製ろ紙（グレードＮｏ．１、９ｃｍ）でろ過し、ろ液を得た。９６穴のマイクロプレートにろ液１００μＬと、グルコース定量試薬（和光純薬製「テストワコー」）１００μＬを加え、２５℃で１０分間静置した。マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ａｕｓｔｒｉａ  ＧｍｂＨ社製、機種：サンライズサーモ）で４９２ｎｍにおける吸光度（Ａ20）を測定した。
また、ブランクとして作成した直後の（ＨＡＭ−４）のアミラーゼ水溶液を用いて上記と同様にして測定溶液を調整し、吸光度（Ａ20b）を測定した。
アミラーゼ（酵素）が変性されずに、活性が保たれ、デンプンが効率よく分解されている場合は、吸光度が大きくなる（ブランクに近い吸光度になる）。
次式から「酵素活性残存率」を算出した。
酵素活性残存率（％）＝（Ａ20）／（Ａ20b）×１００
結果を表１及び２に示す。
【００８９】
表１及び２の結果から、本発明の実施例１〜１５の安定化剤（Ｎ−１）〜（Ｎ−１５）を用いた場合は、安定化剤の入っていない比較例４（ＨＮ−４）と比較して、１ヶ月間保存後の酵素活性残存率が極めて大きいことが分かる。さらに、比較例１〜３の従来の安定化剤（ＨＮ−１）〜（ＨＮ−４）と比較しても、１ヶ月間保存後の酵素活性残存率が極めて大きく、タンパク質の生理活性を長期間維持できることが分かる。
また、化合物（Ａ）が塩酸グアニジンであり、同量の化合物（Ａ）を用いている実施例１、４〜７、１４及び１５を比較した場合、化合物（Ａ）だけを使用した実施例１よりも、化合物（Ａ）及び（Ｂ）を併用した実施例４〜７、１４及び１５の方が、１ヶ月間保存後の酵素活性残存率がさらに大きく、タンパク質の生理活性を長期間高く維持できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のタンパク質水溶液のの安定化剤は、タンパク質を安定化し活性を長期間低下させないので、医薬品、食品、洗剤及び生化学の分野において有効に使用することができる。たとえば、タンパク医薬品液体製剤、酵素液体製剤、工業用酵素水溶液、液体洗剤、飲料、診断薬用の測定試薬、タンパク質の標準液等に使用できる。
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月31日(2010.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質水溶液の安定化剤であって、以下（１）〜（３）の条件を満たす有機化合物（Ａ）を含有するタンパク質水溶液の安定化剤；
（１）有機化合物（Ａ）の分子にプロトンが付加した場合に、分子内の少なくとも１つの原子（Ｚ）において、原子（Ｚ）及び原子（Ｚ）に結合している原子（Ｙ）が有するπ電子により形成されているπ結合が共鳴構造をとっており、
原子（Ｚ）及び原子（Ｙ）が有する電子であって、
この共鳴構造のπ結合に関与しているπ電子が４つ以上であること
（２）０．１ｍｏｌ／ｄｍ3溶液のイオン強度が０．１以上であること
（３）分子量が３００未満であること。
【請求項２】
有機化合物（Ａ）が下記一般式（２）で表される化合物（ａ）の塩である請求項１に記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【化１】
2011067202.tif 000015
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【請求項３】
有機化合物（Ａ）がグアニジン塩酸塩である請求項１又は２に記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【請求項４】
有機化合物（Ａ）が下記一般式（２）で表される化合物（ａ）である請求項１に記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【化２】
2011067202.tif 000016
［式中、Ｘはイミノ基、酸素原子又は硫黄原子を表す。］
【請求項５】
タンパク質が酵素である請求項１〜４のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【請求項６】
さらに下記一般式（３）で表される化合物（Ｂ）を含有する請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤。
【化３】
2011067202.tif 000017
［式中、Ｑは、アルキル基を表し、アルキル基中の水素原子の一部が水素原子以外の基に置換されていてもよい。］
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤、タンパク質及び水を含有するタンパク質水溶液。
【請求項８】
有機化合物（Ａ）の含有量がタンパク質水溶液の重量に基づいて０．０１〜４０重量％である請求項７に記載のタンパク質水溶液。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質水溶液の安定化剤、タンパク質及び水を混合し、１分〜２時間攪拌するタンパク質の安定化方法。
【請求項１０】
タンパク質と安定化剤中の有機化合物（Ａ）との重量比（有機化合物（Ａ）の重量／タンパク質の重量）が２〜６０００である請求項９に記載のタンパク質の安定化方法。