(57)【要約】【課題】複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスを高い特異性及び感度で検出するための網羅的な検出方法、ウイルス検出用プライマーセット、マイクロアレイ及びウイルス検出用キットを提供する。【解決手段】型特異的なプライマーを用いて複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ増幅物をＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイズさせて検出する。ウイルス検出用プライマーセット及びプローブセットを用いることで複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスを高い特異性及び感度で迅速かつ簡易に検出する。【選択図】図２
2011120556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原ウイルスの検出方法であって、
（１）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット１、
（２）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット２、
（３）Ｂ型肝炎ウイルス （ＨＢＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット３、
（４）パルボウイルスＢ１９（ＰｖＢ１９）遺伝子を増幅するための、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット４、
（５）ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット５
から選択される１種またはそれ以上の遺伝子増幅用のプライマーセットを用いて、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶから選択される１種またはそれ以上のウイルス遺伝子を増幅することを特徴とするウイルスの検出方法。
【請求項２】
前記（１）ＨＩＶ遺伝子は、配列番号１１で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_００１８０２の第４１５３番目から第４４６４番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（２）ＨＣＶ遺伝子は、配列番号１２で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ_９０２０８の第５９番目から第３２７番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（３）ＨＢＶ遺伝子は、配列番号１３で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ_７０１８５の第４５０番目から第７１５番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（４）ＰｖＢ１９遺伝子は、配列番号１４で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_０００８８３の第２１４３番目から第２２７８番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（５）ＷＮＶ遺伝子は、配列番号１５で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_００９９４２の第３４４５番目から第３５９９番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド
であることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
ＰＣＲにより前記１種または２種以上のウイルス遺伝子を増幅することを特徴とする、請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
病原ウイルスの検出方法であって、
前記（１）のプライマーセット１で増幅されたＨＩＶ遺伝子を検出するための、
配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１）、
配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２）、
配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３）、
配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ４）、
配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ５）、
配列番号２１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ６）、
配列番号２２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ７）
から構成されるプローブセット１、
前記（２）のプライマーセット２で増幅されたＨＣＶ遺伝子を検出するための、
配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ８）、
配列番号２４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ９）、
配列番号２５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１０）、
配列番号２６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１１）、
配列番号２７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１２）、
配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１３）、
配列番号２９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１４）
から構成されるプローブセット２、
前記（３）のプライマーセット３で増幅されたＨＢＶ遺伝子を検出するための、
配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１５）、
配列番号３１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１６）、
配列番号３２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１７）、
配列番号３３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１８）、
配列番号３４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１９）、
配列番号３５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２０）、
配列番号３６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２１）
から構成されるプローブセット３、
前記（４）のプライマーセット４で増幅されたＰｖＢ１９遺伝子を検出するための、
配列番号３７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２２）、
配列番号３８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２３）、
配列番号３９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２４）、
配列番号４０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２５）、
配列番号４１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２６）、
配列番号４２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２７）
から構成されるプローブセット４、
前記（５）のプライマーセット５で増幅されたＷＮＶ遺伝子を検出するための、
配列番号４３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２８）、
配列番号４４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２９）、
配列番号４５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３０）、
配列番号４６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３１）、
配列番号４７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３２）、
配列番号４８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３３）、
配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３４）、
配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３５）、
から構成されるプローブセット５
からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセットを用いて、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶから選択される１種またはそれ以上のウイルスを同時に検出する方法。
【請求項５】
請求項４に記載のプローブ１〜３５からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセットが、マイクロアレイの基板上に固定されていることを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記（１）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット１、
前記（２）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット２、
前記（３）Ｂ型肝炎ウイルス （ＨＢＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット３、
前記（４）パルボウイルスＢ１９（ＰｖＢ１９）遺伝子を増幅するための、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット４、
前記（５）ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット５
から選択される１種またはそれ以上の遺伝子増幅用のプライマーセットを構成する、配列番号１〜配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマー。
【請求項７】
前記プライマーが、蛍光標識で標識されている、請求項６に記載のプライマー。
【請求項８】
蛍光標識が、Ｃｙ３又はＣｙ５によりなされている、請求項６または７に記載のプライマー。
【請求項９】
ＨＩＶ遺伝子を検出するための、
配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１）、
配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２）、
配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３）、
配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ４）、
配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ５）、
配列番号２１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ６）、
配列番号２２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ７）
から構成されるプローブセット１、
ＨＣＶ遺伝子を検出するための、
配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ８）、
配列番号２４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ９）、
配列番号２５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１０）、
配列番号２６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１１）、
配列番号２７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１２）、
配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１３）、
配列番号２９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１４）
から構成されるプローブセット２、
ＨＢＶ遺伝子を検出するための、
配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１５）、
配列番号３１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１６）、
配列番号３２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１７）、
配列番号３３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１８）、
配列番号３４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１９）、
配列番号３５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２０）、
配列番号３６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２１）
から構成されるプローブセット３、
ＰｖＢ１９遺伝子を検出するための、
配列番号３７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２２）、
配列番号３８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２３）、
配列番号３９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２４）、
配列番号４０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２５）、
配列番号４１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２６）、
配列番号４２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２７）
から構成されるプローブセット４、
ＷＮＶ遺伝子を検出するための、
配列番号４３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２８）、
配列番号４４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２９）、
配列番号４５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３０）、
配列番号４６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３１）、
配列番号４７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３２）、
配列番号４８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３３）、
配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３４）、
配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３５）、
から構成されるプローブセット５
からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセット。
【請求項１０】
請求項９に記載のプローブセット１〜５からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセットが、マイクロアレイの基板上に固定されていることを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１１】
ウイルス検出用キットであって、
請求項６〜８に記載のプライマー、請求項９に記載のプローブセット、請求項１０に記載のマイクロアレイのいずれかを備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料中のウイルス検出方法、ウイルス検出用プライマーセット、マイクロアレイ及びウイルス検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、病院等の医療現場において、多くの病原体あるいは病原物質が血液を介して伝播・感染することが知られており、特に血液もしくは血液成分の移入すなわち輸血は、針刺し事故等と比較し、相当量の感染体が血管内に確実に移入されることから、その危険性が最も高い医療行為の１つであると言われている。薬害エイズやＣ型肝炎など、病院内での輸血により大きな惨禍を招いた輸血事故は数え切れず、このような輸血血液の安全性を確保することは、国民の健康・福祉の観点から極めて重要性が高い。
【０００３】
ＨＩＶ（Human Immunodeficiency Virus）は直径約１００ｎｍのＲＮＡウイルスであり、主としてＣＤ４陽性Ｔ細胞とマクロファージに感染する。ＨＩＶはＣＤ４をレセプターとして細胞に侵入すると、ＨＩＶの逆転写酵素の働きでＲＮＡがＤＮＡへと逆転写され、宿主のＤＮＡの中に組み込まれる。組み込まれたＨＩＶ遺伝子は、その後、宿主細胞の代謝経路を利用しウイルス蛋白を生成し、完全なウイルス体となって、ＣＤ４陽性細胞を破壊し、次なる細胞へと感染していく。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、体内の免疫に関する中心的な役割を果たしていることから、ＣＤ４細胞数の減少は、免疫能の低下を意味し、最終的には免疫不全症となり、通常は感染することがない病原体に感染（日和見感染）、発症したり、悪性リンパ腫を起こすことになる。
【０００４】
ＨＣＶ（Hepatitis C Virus）は、直径約５５ｎｍの球形をしたＲＮＡウイルスである。Ｃ型肝炎を引き起こす原因ウィルスであり、急性肝炎から慢性肝炎、肝硬変及び肝癌に進行する極めて危険な疾病を起こす要因として、主に輸血と体液によって感染する。ＨＣＶ遺伝子は約９６００塩基からなるプラス鎖ＲＮＡである。
【０００５】
ＨＢＶ（Hepatitis B Virus）に感染することで発症するＢ型肝炎は、Ｃ型肝炎と同様にウイルス性感染疾患であり、慢性肝炎、肝硬変など危険な疾病を引き起こす。ＨＢＶは血液や体液を介して感染することが多い。ＨＢＶは、直径４２ｎｍの球形粒子で７ｎｍの外被（エンベロープ）と環状２本鎖（一部一本鎖）ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを包む直径２７ｎｍのヌクレオキャプシドからなるＤＮＡウイルスであり、ＨＢＶ遺伝子は約３２００塩基からなる環状２本鎖ＤＮＡである。
【０００６】
ＰｖＢ１９（Parvovirus B19）は、パルボウイルスＢ１９感染症原因ウイルスであり、免疫が正常な個体では通常軽微な経過をたどるありふれた小児期の疾病であり、伝染性紅斑または第５病として知られる特徴的な発疹を生じる。しかしながら、このウイルスは、肝炎および心筋炎と関係していることが解明されており、母体が妊娠中に感染すると、このウイルスは、胎児に伝染して、水症、自然流産、または子宮内死を引き起こす。ＰｖＢ１９遺伝子は約５５００塩基からなる直鎖ＤＮＡである。
【０００７】
ＷＮＶ（West Nile Virus）は、ウエストナイル脳炎あるいはウエストナイル熱などのウエストナイルウイルス感染症の原因ウイルスである。ＷＮＶは、鳥と蚊の間で感染環が維持され、主に蚊を介してヒトや馬に感染する。ヒトにおけるウエストナイルウイルス感染症の主な臨床症状は発熱、頭痛、背部痛、筋肉痛、筋力低下、食欲不振、皮膚発疹、リンパ節の腫脹で、一部の患者では脳脊髄炎を発症する。ウエストナイルウイルスは直径が約５０ｎｍ、エンベロープを有する球形のプラス鎖ＲＮＡウイルスである。
【０００８】
これら５種類のウイルスは極めて危険な疾病を引き起こす要因として挙げられ、疾患や病害に対する予防・診断・治療法を確立するためには原因ウイルスの早期確認が非常に重要であるが、一般的なウイルス抗原ならびに抗ウイルス抗体の免疫学的測定によるウイルス検査では、感染状態にあるにも関わらず、ウイルス量が測定感度以下であるために抗原検査が診断に利用できない場合が少なくない。
【０００９】
そこで、現在はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるウイルス遺伝子の増幅により、微量のウイルスを検出可能な遺伝子検査が広く行われている。しかしながら、従来のＰＣＲによるウイルス検出法では個別のウイルス株について増幅後、各々測定を行うことにより、多大な労力・時間を費やしていた。また、５種類のウイルスをマイクロアレイにより同時に検出する方法については未だ報告がなされていない。これらの状況から、複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスを、高い特異性及び感度で検出することができる、迅速性、簡易性及び経済性に優れた方法を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平１０−２１０９９０号公報
【特許文献２】特開２００５−５８２３４号公報
【特許文献３】特開２００６−２０６４２号公報
【特許文献４】特開２００４−１８７６８７号公報
【特許文献５】特開２００５−８０５０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、生物学的試料中の複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスを一度の検出作業で高い特異性及び感度で網羅的に検出するための検出方法、また検出に用いるウイルス検出用プライマーセット、マイクロアレイ及びウイルス検出用キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために、特異的なプライマーを用いて複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルス遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ増幅物をマイクロアレイとハイブリダイズさせて検出することを特徴とする遺伝子検出方法に着目し鋭意検討を重ねた結果、上記複数の遺伝子型を有する５種のウイルス遺伝子を増幅することが可能なプライマーセット、５種のウイルス遺伝子を同時に検出することが可能なプローブセット及び検出条件を用いることで、複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルス遺伝子において高い特異性及び感度で迅速かつ簡易に検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、病原ウイルスの検出方法であって、
（１）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット１、
（２）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット２、
（３）Ｂ型肝炎ウイルス （ＨＢＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット３、
（４）パルボウイルスＢ１９（ＰｖＢ１９）遺伝子を増幅するための、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット４、
（５）ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット５
から選択される１種またはそれ以上の遺伝子増幅用のプライマーセットを用いて、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶから選択される１種またはそれ以上のウイルス遺伝子を増幅することを特徴とするウイルスの検出方法を提供する。
【００１４】
本発明の病原ウイルスの検出方法においては、
前記（１）ＨＩＶ遺伝子は、配列番号１１で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_００１８０２の第４１５３番目から第４４６４番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（２）ＨＣＶ遺伝子は、配列番号１２で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ_９０２０８の第５９番目から第３２７番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（３）ＨＢＶ遺伝子は、配列番号１３で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ_７０１８５の第４５０番目から第７１５番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（４）ＰｖＢ１９遺伝子は、配列番号１４で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_０００８８３の第２１４３番目から第２２７８番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、
前記（５）ＷＮＶ遺伝子は、配列番号１５で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_００９９４２の第３４４５番目から第３５９９番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド
であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の病原ウイルスの検出方法においては、ＰＣＲにより前記１種または２種以上のウイルス遺伝子を増幅することを特徴とする。
【００１６】
本発明は、病原ウイルスの検出方法であって、
前記（１）のプライマーセット１で増幅されたＨＩＶ遺伝子を検出するための、
配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１）、
配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２）、
配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３）、
配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ４）、
配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ５）、
配列番号２１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ６）、
配列番号２２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ７）
から構成されるプローブセット１、
前記（２）のプライマーセット２で増幅されたＨＣＶ遺伝子を検出するための、
配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ８）、
配列番号２４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ９）、
配列番号２５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１０）、
配列番号２６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１１）、
配列番号２７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１２）、
配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１３）、
配列番号２９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１４）
から構成されるプローブセット２、
前記（３）のプライマーセット３で増幅されたＨＢＶ遺伝子を検出するための、
配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１５）、
配列番号３１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１６）、
配列番号３２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１７）、
配列番号３３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１８）、
配列番号３４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１９）、
配列番号３５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２０）、
配列番号３６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２１）
から構成されるプローブセット３、
前記（４）のプライマーセット４で増幅されたＰｖＢ１９遺伝子を検出するための、
配列番号３７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２２）、
配列番号３８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２３）、
配列番号３９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２４）、
配列番号４０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２５）、
配列番号４１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２６）、
配列番号４２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２７）
から構成されるプローブセット４、
前記（５）のプライマーセット５で増幅されたＷＮＶ遺伝子を検出するための、
配列番号４３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２８）、
配列番号４４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２９）、
配列番号４５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３０）、
配列番号４６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３１）、
配列番号４７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３２）、
配列番号４８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３３）、
配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３４）、
配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３５）
から構成されるプローブセット５
からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセットを用いて、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶから選択される１種またはそれ以上のウイルスを同時に検出する方法を提供する。
【００１７】
本発明によれば、上記プローブセット１〜５からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセットが、マイクロアレイの基板上に固定されていることを特徴とする。
【００１８】
本発明によれば、
前記（１）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット１、
前記（２）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット２、
前記（３）Ｂ型肝炎ウイルス （ＨＢＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット３、
前記（４）パルボウイルスＢ１９（ＰｖＢ１９）遺伝子を増幅するための、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット４、
前記（５）ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）遺伝子を増幅するための、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット５
から選択される１種またはそれ以上の遺伝子増幅用のプライマーセットを構成する、配列番号１〜配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーを提供する。
【００１９】
本発明によれば、上記プライマーは蛍光標識されており、その蛍光標識は、Ｃｙ３又はＣｙ５によりなされていることを特徴とする。
【００２０】
本発明によれば、
ＨＩＶ遺伝子を検出するための、
配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１）、
配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２）、
配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３）、
配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ４）、
配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ５）、
配列番号２１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ６）、
配列番号２２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ７）
から構成されるプローブセット１、
ＨＣＶ遺伝子を検出するための、
配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ８）、
配列番号２４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ９）、
配列番号２５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１０）、
配列番号２６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１１）、
配列番号２７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１２）、
配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１３）、
配列番号２９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１４）
から構成されるプローブセット２、
ＨＢＶ遺伝子を検出するための、
配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１５）、
配列番号３１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１６）、
配列番号３２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１７）、
配列番号３３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１８）、
配列番号３４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１９）、
配列番号３５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２０）、
配列番号３６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２１）
から構成されるプローブセット３、
ＰｖＢ１９遺伝子を検出するための、
配列番号３７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２２）、
配列番号３８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２３）、
配列番号３９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２４）、
配列番号４０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２５）、
配列番号４１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２６）、
配列番号４２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２７）
から構成されるプローブセット４、
ＷＮＶ遺伝子を検出するための、
配列番号４３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２８）、
配列番号４４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２９）、
配列番号４５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３０）、
配列番号４６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３１）、
配列番号４７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３２）、
配列番号４８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３３）、
配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３４）、
配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３５）
からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセット
から構成されるプローブセット５
を提供する。
【００２１】
本発明によれば、前記プローブセット１〜５からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセットが、マイクロアレイの基板上に固定されていることを特徴とするマイクロアレイを提供する。
【００２２】
本発明によれば、ウイルス検出用キットであって、上記プライマー、プローブセット、及びマイクロアレイのいずれかを備える、キットを提供する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は、生物学的試料中、例えば輸血血液中の複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスを一度の検出作業で高い特異性及び感度で検出可能な網羅的検出方法、ウイルス検出用プライマーセット、マイクロアレイ及びウイルス検出用キットを提供する。従来の技術よりも多種のウイルスを迅速に検査・解析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、各ウイルス遺伝子の標的配列を対象としたプライマー設計を説明するフローチャートである。
【図２】図２は、各ウイルスのサブタイプの遺伝子について、プライマーが特異的にウイルス遺伝子を増幅できることを確認したアガロースゲル電気泳動の説明図である。
【図３】図３は、表３に示すプローブ候補とＨＩＶ遺伝子の標的配列との特異性を確認した説明図である。
【図４】図４は、表３に示すプローブ候補とＨＣＶ遺伝子の標的配列との特異性を確認した説明図である。
【図５】図５は、表３に示すプローブ候補とＨＢＶ遺伝子の標的配列との特異性を確認した説明図である。
【図６】図６は、表３に示すプローブ候補とＰｖＢ１９遺伝子の標的配列との特異性を確認した説明図である。
【図７】図７は、表３に示すプローブ候補とＷＮＶ遺伝子の標的配列との特異性を確認した説明図である。
【図８】図８は、表４に示すプローブセットのマイクロアレイの基板上への配置の説明図である。
【図９】図９は、ＰＣＲで増幅させた各ウイルスＤＮＡの増幅物の混合物とマイクロアレイの基板上におけるプローブとのハイブリダイゼ−ションを確認した説明図である。
【図１０】図１０は、各ウイルスＤＮＡの濃度によるマイクロアレイの検出感度を調べた説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（標的配列）
本発明の検出対象としてのウイルスは、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスであり、具体的な検出対象は、これらのウイルス遺伝子である。これらのウイルス遺伝子の標的配列は、ＨＩＶ遺伝子については、配列番号１１で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_００１８０２の第４１５３番目から第４４６４番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、ＨＣＶ遺伝子については、配列番号１２で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ_９０２０８の第５９番目から第３２７番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、ＨＢＶ遺伝子は、配列番号１３で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ_７０１８５の第４５０番目から第７１５番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、ＰｖＢ１９遺伝子は、配列番号１４で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_０００８８３の第２１４３番目から第２２７８番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチド、ＷＮＶ遺伝子は、配列番号１５で示される塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ_００９９４２の第３４４５番目から第３５９９番目）又はその相補的塩基配列を含む１種または２種以上のオリゴヌクレオチドである。これらのウイルスの１種または２種以上のウイルスの任意の組み合わせであっても同時に検出することが可能である。なお、上記標的配列の類似配列、例えば上記標的配列に１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入及び付加のいずれかあるいは２種類以上の変異が発生した塩基配列についても標的とすることが可能である。
【００２６】
（プライマーセット）
標的配列を検出するプライマーセットについては、表１に記載の、ＨＩＶ遺伝子を増幅するための、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号２で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット１、ＨＣＶ遺伝子を増幅するための、配列番号３で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号４で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット２、ＨＢＶ遺伝子を増幅するための、配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット３、ＰｖＢ１９遺伝子を増幅するための、配列番号７で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット４、ＷＮＶ遺伝子を増幅するための、配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０で示される塩基配列からなるプライマーとから構成されるプライマーセット５からなるプライマーセットを用いることにより、上記１種またはそれ以上のウイルスの遺伝子における標的配列を検出することが可能となる。  本発明においては、上記５種類のプライマーセットを各々のウイルス遺伝子を増幅するために用いるが、混合物として用いた場合においても使用することが可能である。
【００２７】
【表１】
2011120556.tif 000003
【００２８】
プライマーセットを構成するプライマーの各ヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知のいずれかの方法を用いて合成しても良い。また、オリゴヌクレオチドは委託合成しても良い。
【００２９】
本発明のプライマーセットを構成するプライマーは、後述のマイクロアレイにおけるウイルス遺伝子の標的配列を検出するため、増幅領域を識別できるように、蛍光標識されたプライマーを用いる。蛍光標識は、Ｃｙ３又はＣｙ５によりなされていることが好ましいが、標識方法については、これに限定されるものではなく、例えば、標識ヌクレオチドを基質としてＰＣＲに用いる方法でもよい。標識方法としては、例えば、ＰＣＲ増幅物を作製する際、基質となるＡＴＣＧ４種のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と標識付きデオキシヌクレオチドをそれぞれ調製して、各ｄＮＴＰの終濃度を揃えることで、作製される増幅物中に標識付きデオキシヌクレオチドを取り込ませる方法が用いられる。
【００３０】
（ＰＣＲ）
本発明で使用するＰＣＲは、従来公知の手法に従って実施する。本発明におけるプライマーセットを使用することで、目的の標的配列を増幅することが可能である。
【００３１】
本発明のプライマーセットを用いて、生物学的試料中における５種類のウイルス遺伝子の標的配列検出にあたり、生物学的試料からＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、各ウイルス遺伝子の標的配列を増幅させる。生物学的試料としては、例えば輸血血液を用いることができる。ＤＮＡの抽出方法としては、当技術分野において公知の技術を用いることができる。例えば、フェノール・クロロホルムによる抽出や、市販のＤＮＡ抽出試薬を用いる抽出により行うことが可能である。
【００３２】
また、本発明のプライマーセットは、５種類のウイルス遺伝子の標的配列を増幅するよう設計されているため、生物学的試料における各ウイルス遺伝子の発現を検出するために用いることができる。各遺伝子の発現を検出するためには、試料からＲＮＡを抽出して鋳型ｃＤＮＡを作製し、これを鋳型ＤＮＡとして本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、生物学的試料中に発現している各遺伝子の標的配列を増幅させる。ＲＮＡの抽出方法としては、当技術分野において公知の技術を用いることができる。例えば、グアニジン−イソチオシアネートおよびフェノール・クロロホルム抽出や、市販のＲＮＡ抽出試薬を用いる抽出により行うことが可能である。さらに、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを作製する方法も当技術分野において公知の技術を用いることができる。プライマーとしては市販のランダムプライマーを用い、ｄＮＴＰｓの存在下で、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製することができる。逆転写酵素としては、例えばSuperScript III（登録商標）を用いることができる。
【００３３】
上述の通り調整したＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、本発明のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばGoTaq DNA Polymerase（登録商標）等を用いて、増幅物を得ることができる。ＰＣＲの方法については、当技術分野において周知であり、センス鎖にハイブリダイズするプライマー（リバースプライマー）とアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマー（フォワードプライマー）とを用い、これらのプライマー、鋳型ＤＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼの存在下で、アニーリング、伸長、変性の工程から成るサイクルを３０〜５０回程度繰り返すことにより行うことができる。プライマーのＴｍ値に基づいて適当なＰＣＲ反応条件を選択する方法は当技術分野において公知であり、当業者は、プライマーの長さやＧＣ含量、目的とする特異性や感度、用いるポリメラーゼの特性等に基づいて、最適な条件を選択することができる。例えば、下記実施例においては、９５℃で２分間、次に９５℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で３０秒間を５０サイクル、最後に７２℃で７分間の反応でＰＣＲを実施した。また、所定の検出感度を達成し、かつ、各ウイルスによる検出感度のばらつきが少なくなるように、ＰＣＲ溶液中のプライマー量を適宜調整することが可能である。
【００３４】
（プローブセット）
上記プライマーセットによって増幅された標的配列を検出するプローブについては、表４に記載の、
ＨＩＶ遺伝子を検出するための、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１）、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２）、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３）、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ４）、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ５）、配列番号２１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ６）、配列番号２２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ７）から構成されるプローブセット１、
ＨＣＶ遺伝子を検出するための、配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ８）、配列番号２４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ９）、配列番号２５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１０）、配列番号２６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１１）、配列番号２７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１２）、配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１３）、配列番号２９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１４）から構成されるプローブセット２、
ＨＢＶ遺伝子を検出するための、配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１５）、配列番号３１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１６）、配列番号３２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１７）、配列番号３３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１８）、配列番号３４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１９）、配列番号３５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２０）、配列番号３６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２１）から構成されるプローブセット３、
ＰｖＢ１９遺伝子を検出するための、配列番号３７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２２）、配列番号３８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２３）、配列番号３９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２４）、配列番号４０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２５）、配列番号４１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２６）、配列番号４２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２７）から構成されるプローブセット４、
ＷＮＶ遺伝子を検出するための、配列番号４３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２８）、配列番号４４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２９）、配列番号４５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３０）、配列番号４６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３１）、配列番号４７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３２）、配列番号４８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３３）、配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３４）、配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３５）から構成されるプローブセット５、
からなる群より選択される１種またはそれ以上のプローブセットを用いることにより、上記１種またはそれ以上のウイルス遺伝子における標的配列を同時に検出することが可能となる。つまり、本発明においては、上記５種類のプローブセットを上記プライマーセットにより増幅された標的配列を検出するためのプローブセットとして用いた場合においても、５種類のウイルス遺伝子の標的配列を同時に、特異的に検出することができる。プローブセットを構成するプローブは、長さが３０〜４０ｂｐ程度と比較的短く、かつ、他のウイルスＤＮＡと相同性の高い配列を有さないように設計されているため、各ＰＣＲ増幅物と非常に高い特異性でハイブリダイズすることが可能であり、ＰＣＲ増幅物を各ウイルスＤＮＡに特異的なプローブが基板上に固定されているマイクロアレイとハイブリダイズさせることにより、試料中における各ウイルスのの存在又は非存在を検出することができる。
【００３５】
プローブセットを構成するプライマーの各ヌクレオチドは、例えば汎用のＤＮＡ合成装置を用いて化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知のいずれかの方法を用いて合成しても良い。また、オリゴヌクレオチドは委託合成しても良い。
【００３６】
（マイクロアレイ）
本発明の上記プローブセットは、基板上に固定することにより、マイクロアレイの形態で用いることが好ましい。マイクロアレイの作製方法としては、予め調製したオリゴヌクレオチドを基板表面に固定する方法を用いる。プローブは、一般的には、表面処理した基板にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。基板としては、例えば、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ガラス、シリコンチップ等が挙げられる。また、プローブの固定は、当技術分野で利用される任意の方法に従ってなされ得るが、例えば、スポッター等を用いて基板上にＤＮＡを固定してもよい。基板上に固定されたプローブと増幅物のハイブリダイゼーション反応により、各プローブにハイブリダイズした増幅物の量を、蛍光標識を検出することにより測定することができる。ハイブリダイゼーションは、蛍光標識されたＤＮＡ水溶液を、マイクロアレイ上に滴下することによって実施することができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、０．５〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ＤＮＡを除去する。蛍光標識の検出は、例えば蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル強度を測定することで、増幅物の存在を検出することができる。本実施例では、マイクロアレイの基板は３ｍｍ角のシリコン基板からなるジーンシリコン（登録商標）を用いているが、これに限定されるものではない。
【００３７】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３８】
プライマー及びマイクロアレイが、標準検体から調整した各ウイルス遺伝子の標的配列を特異的かつ高感度で検出できるかを確認した。本実施例では、まず各ウイルスのサブタイプの遺伝子について、プライマーの特異性を確認した。その後に、各ウイルスのサブタイプ遺伝子中の1種類を個別にＰＣＲにより増幅し、その後各ウイルス遺伝子増幅物の混合物を用いてマイクロアレイによる検出を確認した。
【００３９】
（プライマーの設計および特異性の確認）
生物学的試料における遺伝子検査は、大量のウイルス、微生物のＤＮＡが混在している中から目的のウイルスＤＮＡを検出するため、標的配列とプライマーとの特異性が高い必要がある。各ウイルスに特異的なプライマー候補の内、表１に示すプライマーセットを選択し、表１に示されるプライマーセットの配列に基づいて、委託合成によりプライマーを得た。
【００４０】
プライマーの設計については、図１に示す通り、プライマー設計アルゴリズムを用いた複数のウイルス遺伝子に共通のプライマーを設計するプログラムCo-ordination of Common Motif (CoCoMo; http://www.geneknot.jp/cocomo)を使用して行った。図１は、各ウイルス遺伝子の標的配列を対象とした、対象塩基配列共通degenerateプライマーの設計を説明するフローチャートである。ここで、対象塩基配列共通degenerateプライマーとは、各ウイルスのサブタイプの標的配列について、特異的に増幅可能なプライマーをいう。まず、各ウイルスのサブタイプの標的配列である複数の設計対象塩基配列情報を参照し、対象塩基配列の相同性に基づく整列（アライメント）を行う（Ｓ１）。次に、対象塩基配列中、１塩基のギャップを間に挟む、２種類の２塩基パターン（Gapped Tetra-Nucleotide Motif：GTNM）に配列名を付け、その配列名及び位置をデータベース上にてデータベース化する（Ｓ２）。各ウイルスのサブタイプの標的配列である複数の設計対象塩基配列間において、共通するGTNMを探索し（Ｓ３）、それぞれの配列上において共通するGTNMを同定する（Ｓ４）。その後、対象塩基配列の共通GTNMの５’末端側における23塩基を抜き出し、共通degenerateプライマーとしての配列を決定（Ｓ５）、そのdegenerateプライマー配列とGTNMを連結させ、鋳型ＤＮＡとの結合温度に応じて適宜プライマー毎に配列長を調整し、一次プライマー候補として認定する（Ｓ６）。一次プライマー候補として認定された塩基配列の立体構造の予測を行い、セルフダイマー及びヘアピン構造を形成する塩基配列のプライマー候補を除き、残りを二次プライマー候補とする（Ｓ７）。さらに、二次プライマー候補からプライマーダイマーを形成する塩基配列を除き（Ｓ８）、対象塩基配列共通degenerateプライマーの配列を得る。
【００４１】
プライマーの選択においては、各ウイルスの標的配列との特異性を確認する必要がある。ＨＩＶについてはサブタイプの１４種類（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｕ５１１９０、ＡＦ２８６２３７、Ｕ８８８２６、Ｕ４６０１６、Ｋ０３４５４、ＡＦ００５４９４、ＡＪ２４９２３６、Ｋ０３４５５、ＡＦ００５４９６、ＡＦ０８２３９４、ＡＪ２４９２３５、ＡＪ００６０２２、Ｌ２０５８７、ＥＦ０２９０６９）、ＨＣＶについては９種類（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＦ００９６０６、Ｄ００９４４、Ｄ１７７６３、Ｙ１１６０４、Ｄ８４２６２、Ｄ８４２６４、ＥＦ４２４６２６、ＥＦ６３２０７０、ＥＦ１０８３０６）、ＨＢＶについては８種類（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｘ０２７６３、Ｄ００３２９、Ｘ０４６１５、Ｘ６５２５９、Ｘ７５６５７、Ｘ６９７９８、ＡＦ１６０５０１、ＡＹ０９０４５４）、ＰｖＢ１９については６種類（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＦＪ５９１１５８、ＧＭ７０３９６４、ＧＭ７０３９６２、ＧＭ７０３８３２、ＤＱ３３３４２７、ＤＱ３５７０６５）、ＷＮＶについては１０種類（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＦＪ４８３５４９、ＮＣ_００１５６３、ＦＪ４２５７２１、ＦＪ１５９１３１、ＦＪ１５９１３０、ＤＱ２５６３７６、ＤＱ１７６６３６、ＡＹ７６５２６４、ＡＹ６８８９４８、ＡＹ６０３６５４）それぞれのＤＮＡを抽出して、鋳型として使用し、選択プライマーを使用したＰＣＲによる増幅を確認した。ＤＮＡの抽出にあたっては、High Pure Viral Nucleic Acid Kit（Roche社）を使用して行った。なお、各ウイルスのサブタイプのＤＮＡは委託合成して得たものを使用した。図２は、各ウイルスのサブタイプについて、プライマーが特異的にウイルス遺伝子を増幅できることを確認したものである。３％アガロースゲルによる電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色し、目的バンドの増幅の有無を確認することにより、いずれのプライマーセットについても、予測される長さの増幅物が得られ、非特異的なハイブリダイズに起因する夾雑増幅物がないことを確認した。アガロースゲルの各レーンは、上述の各ウイルスのサブタイプの遺伝子を示したものであり、その順序は、左からＤＮＡ分子量マーカーに続き、上記の順序のサブタイプの遺伝子を示すものである。この結果から、各ウイルスのサブタイプの遺伝子について、プライマーが特異的にウイルス遺伝子を増幅できることを確認した。
【００４２】
次に、各ウイルス遺伝子増幅物の混合物を用いてマイクロアレイによる検出を確認した。
（試料の調製）
ＨＩＶ−ＲＮＡ
ACCURUN 315 HIV-RNA positive Quality control (Subtype B, 2.1×105 Copies/ml, SeraCare社) 47.62 μlを脱線維素処理済み血漿 (Basematrix 53, SeraCare社)で調整し、1.0×104 cp/Reactionとした。
ＨＣＶ−ＲＮＡ
ACCURUN 306 HCV-RNA positive Quality control (Subtype 1b, 9.1×105 IU/ml, SeraCare社) 10.99 μlを脱線維素処理済み血漿 (Basematrix 53, SeraCare社)で調整し、1.0×104 IU/Reactionとした。
ＨＢＶ−ＤＮＡ
ACCURUN 325 HBV-DNA positive Quality control (Subtype A, 8.1×106 Copies/ml, SeraCare社) 12.35 μlを脱線維素処理済み血漿 (Basematrix 53, SeraCare社)で調整し、1.0×105 cp/Reactionとした。
ＰｖＢ１９−ＤＮＡ
Parvovirus B19 NATtrrol controls (Strain B19, 1.0×105 IU/ml, ZeptoMetrix社) を生理食塩水(大塚製薬)で調整し、2.0×104 IU/Reactionとした。
ＷＮＶ−ＲＮＡ
West Nile virus NATtrrol controls (Strain NY 2001-6263, 5.0×104 Copies/ml, ZeptoMetrix社)を生理食塩水(大塚製薬)で調整し、1.0×104 cp/Reactionとした。
上記の各ウイルス遺伝子の標準検体（約200μl）からHigh Pure Viral Nucleic Acid Kit （ＤＮＡ抽出用）、またはHigh Pure Viral RNA Kit （ＲＮＡ抽出用）を用いて50μl Elution bufferに各ウイルス遺伝子を回収した。
【００４３】
（ｃＤＮＡの作製）
試料からＲＮＡを抽出して鋳型ｃＤＮＡを作製するため、SuperScript III RT cDNA synthesis kit（invitrogen社）を用いて行った。ＲＮＡの抽出にあたっては、上記の通り、High Pure Viral RNA Kitを用いて行った。ｃＤＮＡの作製条件は以下の通りである。
【００４４】
【表２】
2011120556.tif 000004
【００４５】
（ＰＣＲ）
上記で調製を行った各ウイルスの鋳型ＤＮＡを用いて行ったＰＣＲの反応条件は、９５℃で２分間、次に９５℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、７２℃で３０秒間を５０サイクル、最後に７２℃で７分間の反応でＰＣＲを実施した。
【００４６】
（プローブの作製および特異性の確認）
次に、各ウイルスにおける標的配列と、プローブ候補との特異性を確認した。プローブの作製にあたっては、他のウイルスＤＮＡと相同性の高い配列を含まないことに注意した。表３に示すプローブ候補を用いて、各ウイルスにおける標的配列との特異性を確認した結果を図３〜図７に示す。蛍光検出ができたスポットを基に、表４に示すプローブセット、すなわちＨＩＶ遺伝子を検出するための、配列番号１６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１）、配列番号１７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２）、配列番号１８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３）、配列番号１９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ４）、配列番号２０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ５）、配列番号２１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ６）、配列番号２２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ７）から構成されるプローブセット１、
ＨＣＶ遺伝子を検出するための、配列番号２３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ８）、配列番号２４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ９）、配列番号２５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１０）、配列番号２６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１１）、配列番号２７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１２）、配列番号２８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１３）、配列番号２９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１４）から構成されるプローブセット２、
ＨＢＶ遺伝子を検出するための、配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１５）、配列番号３１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１６）、配列番号３２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１７）、配列番号３３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１８）、配列番号３４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ１９）、配列番号３５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２０）、配列番号３６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２１）から構成されるプローブセット３、
ＰｖＢ１９遺伝子を検出するための、配列番号３７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２２）、配列番号３８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２３）、配列番号３９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２４）、配列番号４０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２５）、配列番号４１で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２６）、配列番号４２で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２７）から構成されるプローブセット４、
ＷＮＶ遺伝子を検出するための、配列番号４３で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２８）、配列番号４４で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ２９）、配列番号４５で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３０）、配列番号４６で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３１）、配列番号４７で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３２）、配列番号４８で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３３）、配列番号４９で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３４）、配列番号５０で示される塩基配列からなるプローブ（プローブ３５）から構成されるプローブセット５を選択し、表４に示されるプローブの配列に基づいて、委託合成によりプローブを得た。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
【表４】
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【００４９】
（マイクロアレイ）
上記で作製したプローブセットを、図８Ａに示す通り、マイクロアレイ上に配置した。配置にあたっては、スポッターを用いてシリコン基板に、プローブを図８Ｂの通り固定し、マイクロアレイを得た。マイクロアレイの基板は３ｍｍ角のシリコン基板からなるジーンシリコン（登録商標）を用いた。
【００５０】
標準検体から調整した各ウイルスＤＮＡを特異的なプライマーを用いて増幅物を得た後に、混合し、マイクロアレイ上に滴下し、８０℃で１時間ベーキング後、2×SSC/0.2%SDS溶液（９５℃）中で５分間洗浄した。超純水で３回リンスし、遠心機で水分を飛ばし乾燥させることにより、プローブをマイクロアレイ上に固定した。マイクロアレイスキャナ−を用いてスポットの蛍光強度（ハイブリダイゼ−ションシグナル）を測定した。各スポットについて、得られたハイブリダイゼ−ションシグナルの測定結果を図９Ａに示す。これにより各ウイルス遺伝子の標的配列が、混合物中においても特異的かつ高い感度で検出されることが示された。
【００５１】
図９Ｂ〜Ｆは、増幅物を混合する際に、各ウイルスＤＮＡを除いた混合物をマイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイゼーションを行ったものである。この結果からも、各ウイルス遺伝子の標的配列が特異的かつ高い感度で検出されることが示された。
【００５２】
図１０は、各ウイルスＤＮＡの濃度によるマイクロアレイの検出感度を調べたものである。ＨＩＶについては10 cp/Reaction、ＨＣＶは5 IU/Reaction、ＨＢＶは2 cp/Reaction、ＰｖＢ１９は2 IU/ Reaction、ＷＮＶは5 cp/Reactionにおいて検出することが可能であった。以上より、低濃度でも高い感度で検出可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、生物学的試料中、例えば輸血血液中の複数の遺伝子型を有するＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＰｖＢ１９及びＷＮＶの５種類のウイルスを一度の検出作業で高い特異性及び感度で網羅的な検出方法、ウイルス検出用プライマーセット、マイクロアレイ及びウイルス検出用キットを提供することで、従来の技術よりも多種のウイルスを迅速に検査・解析が可能となるため、極めて高い産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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