(57)【要約】【課題】  顕微観察しながら１生細胞など微小域試料をナノスプレーイオン化細管チップで吸引捕捉し、直接質量分析する際、当該チップを微小域の視野しかない顕微視野内の細胞などの目的位置に誘導するのが、もっとも手間と時間と技術の必要な過程であり、測定法の隘路となっている。【解決手段】細胞など顕微下で刺入するナノスプレーイオン化細管チップなどの試料捕捉細管をロボットの先端に保持し、そのチップの先端位置を検出し補正し、当該チップ取り付け毎のチップ先端位置の空間座標を補正し、また顕微鏡での焦点位置の対空間座標を観察する焦点面位置を顕微ステージのＺ軸エンコードで補正し、その両点間をロボットで先端誘導し、高速・高精度に試料捕捉細管を細胞など対象微小試料に誘導する。【選択図】図９
2011120582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞など微小試料からの吸引捕捉または当該試料への注入において、ロボットの先端取り付け部に保持させた試料吸引用細管あるいは成分液体注入細管の先端の絶対空間座標ないしは相対空間座標と、当該試料の観察用顕微鏡での観察焦点面での吸引点あるいは注入点の絶対空間座標ないしは相対空間座標を規定し、計算したロボットアームの変位量により、当該細管を自動的に、所定の位置まで、所定の移動空間の軌跡を、所定の細管の向きなどの姿勢を維持して、細管の保管位置から当該ロボットにより、当該微小試料域に誘導を行う装置およびシステム
【請求項２】
請求項１において、さらに同じ機能の一台以上のロボットを設置し、その複数のロボットには、移動して位置の決まらない細胞などの対象微小試料を空間内に固定したり、微小試料の限られた空間に、光を当てたり、磁場を当てたり、分子を捕捉する先端部を持つ棒状微細器具を近づけたり試料内に挿入したりして、副次的な操作を同時に行えるようにした装置およびシステム
【請求項３】
請求項１において、試料吸引捕捉後、同じロボットか、別のロボットで当該細管に溶媒を添加し、その後、質量分析計のナノスプレーイオン化アタッチメントに当該チップを装着させることまでを自動的に行う装置およびシステム
【請求項４】
請求項１および２および３において、ロボットにより当該細管を対象試料近くまで移動させ、その後の操作は、ジョイスティックなどのインターフェイスを使い、ロボットを微細駆動させるか、ロボットの先端取り付け部に油圧あるいは水圧あるいは電動のマイクロマニュピレーターを保持し、所定の位置から、さらに微細な操作ができるようにした装置およびシステム
【請求項５】
請求項１，２、３および４において、試料吸引用細管チップあるいは成分液体注入チップへの吸引あるいは加圧を、チューブを介して、足で操作するピストンの動きで制御する装置およびシステム
【請求項６】
請求項１，２，３および４において、当該装置あるいはシステムを細胞が成育する炭酸ガス濃度ないしは温度に保ったチェンバー内に置き、かつチャンバー窓に形成した袖を通して、外から内部の雰囲気を最小限にしか変化させず、操作できるようにした装置およびシステム
【請求項７】
ロボット保持具やピストン付シリンダーと空気を漏らさないように容易に結合する様、鞘部を持ったナノスプレーイオン化チップであり、更に、後端から溶媒導入細管が入りやすいように、鞘の上記結合用保持部内面と、当該チップ内径の間をスムースな勾配で繋がれた鞘付ナノスプレーイオン化チップ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、細胞観察などの微小域空間体の観察をともなった細胞内など微小域空間内溶液捕獲と成分分析法および細胞液など微小域空間液の捕獲・分析装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  細胞内での分子メカニズムは生命現象を引き起こす本質的なものであり、生命科学が解明すべき永遠の課題である。しかし、現在までに、リアルタイムで生きた細胞における分子探索をし、そのメカニズムを解明する為の分析手法はなかった。もしそのような手法や装置が開発されれば、生命現象のみならず病態や病態を検知するマーカー分子あるいは医薬品となりうる候補分子の発見は迅速に行えることになり、人類の恩恵は計り知れない。
一般にこの様な分析では、従来は、ある設定された状態に細胞を置き、刺激などの外部因子などの条件設定の前後の多数の細胞を集めてすり潰し、その後感度も不十分なため手間と時間のかかる様々な分子解析を別に行い、その多くの細胞の平均値とも言える分子探索の結果により、生命体の分子メカニズムを推測している。しかし細胞の応答は同じでないことをわれわれは長年の細胞のビデオ顕微鏡観察で認識している。
また、近年ナノテクノロジーの進展とともに、２００μｍ以下の微小域の物質の変化を観察しながら、その分子変化を例えば最終的に質量分析で検出する場合においてもその他の微量分析法であっても、その観察実態とともに捉えることも必要になってきている。更に病気の診断や病変組織などからの病態メカニズムの研究などにも今後質量分析が分子検出や同定の中心となって来る場合においても、超微量の生体試料の採取でこれらの分析が可能になれば、患者への痛みや負担は緩和され、使用される溶媒なども微量ですむなど、様々なメリットが生まれる。本説明では、微小域空間体として、もっとも複雑で、生命体という有機体であり、まだ不明なことの多い細胞を、そのもっとも適用の難しい微小試料の例として取り上げているが、その対象は液体状であればほぼすべてを対象とでき、あるいは固体でもその成分を溶解した液体が僅かに共存すれば、その僅かな量の試料を直接捕捉し、分離法などを付加しないで、そのまま分子検出でき、さらに、その微小域を観察や位置情報で特定しつつ行える特徴を持つ、本発明を説明する。【０００３】  細胞の分子解析には、従来、多数の細胞を、一定時間、一定処理、あるいは一定の刺激をした前後で比較するのが通常である。それを、細胞をリアルタイムに観察し、１細胞の挙動を観察しながら、分子動態を迅速に解析する方法が開発できれば、世界の生命科学を一気に加速させる。いわばこれは生命科学の夢である。またこれはナノテクノロジーや化学、材料化学などあらゆる微小域での分子変化を追跡する有益な手法としても有用で、その手法の実現が望まれている。また、１細胞の体積である１ピコリッター以下の量で分子解析が可能であれば、血液や汗、唾液などを極微量採取するのみで、ほとんど無痛で分子分析し診断なども可能であり、他にも、小動物や昆虫などのごく微量な尿などの体液でも１ピコリッターあれば分析でき、致命的な量で行わずに分析可能で、その用途は無限に広い。
【先行技術文献】
【０００４】  我々は、上記の問題を解決する新しい手法をすでに特許申請した。
【特許文献１】特願２００７−２８６２０８
【特許文献２】特願２００８−０９５０９２  その特許は、細胞の様に１ピコリッター程度とその体積は超微量でも、その試料を、ナノスプレーチップという、先端が髭の毛の先の様な口径数ミクロンメーターのマイクロピペットでもあるその先端に試料を捕捉し、その先端試料の濃度を拡散させず留めたままにして初めて可能となった。しかし、多くの生体試料は粘性があり、このままでは、電場印加による液体成分のナノスプレーは起こらない。そこで、さらに、その背後に有機溶媒を含むイオン化溶媒を接合させることで、その溶媒が捕捉した先端にあるごくわずかな試料中を通り抜ける時に、溶媒に溶出する成分を一緒にナノスプレーとして排出させる事が出来ることを初めて発見し、これにより試料中の成分をイオン化させ、質量分析計にダイレクトに導入できる事を世界で初めて実現できた。しかし、その後、本発明を応用する際、習熟しないと時間のかかる過程があることに気づいた。それは試料採取が１細胞レベルのミクロン域であるので、そこに迅速に採取針の先端を持ってゆくことに、時間と技術が必要であることである。この世界で初めての可能性の広い手法を誰でもいつでも迅速に使用できるようにするには、その操作を容易にする必要があることに気づいた。また、細胞に成分液を注入するいままでにある手法（マイクロインジェクション）においても、その操作が迅速化できる。更に、対象分子やイオンを更に広げる事も重要なポイントであり、将来への医療診断法への基礎は申請できたが、様々な応用につながる周辺技術の構築も必須と思えるようになってきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  本発明は、以下に記載する課題をロボットなどの限定空間位置自動移送システムを用いて、微小な試料を採取する際、先端の壊れやすい針などの採取器具を、所定の空間内の位置と向きを連続的に移動させ、高効率に作業を可能とするものである。
今まで殆ど集合体でしか解析されていなかった細胞分子機構の解析手段を１細胞で細胞の個性も含めその挙動を見ながら、細胞１つ、あるいはその細胞内小器官までも成分を捕捉し、その分子解析と定量を可能とする高感度で高速かつ直接的で高い信頼性のある手法を実現したり、あるいは、癌組織の様に細胞集合体の１つである生体組織の中の細胞あるいは細胞間隙のうち、その少なくとも１つの形成空間内成分を直接的に取り出すことを可能とし、可能な限り迅速かつ直接的にその成分を分析する手段を実現することにおける微小域への操作性改善の解決法を提供する。
しかも、細胞は生き物であり、その挙動と細胞内分子動態は連動することが多い。従って、生命現象の分子メカニズムを解明するには、上記の分析手段が、細胞の形態観察と同時に迅速に行われることが望ましい。また、細胞や生体組織中の細胞は、外界からの様々な因子に応答しており、その機能発現のメカニズム解明には、外界から与えられた因子と細胞内分子変動の関連を迅速に調べる方法を提供する事も必要な事である。上記手法の発見の結果、個性のある細胞少なくとも１つ１つについて、その挙動分析と分子動態分析および分子探索分析を同時に可能とし、生命現象の分子メカニズムを迅速かつ直接的に解明する手段を与えることができたが、その操作は煩雑で、微小空間内へ迅速に再現性よく成分捕捉デバイスの先端を持っていくことは手動では簡単ではないことを認識した。また浮遊細胞や卵などは、もう一つのマニュピレーターで軽く吸引捕捉し、それに、ナノスプレーチップなどの細管捕捉器具をつけた本来のマニュピレーターで顕微鏡下、手さぐりで、細管を挿入し、所定の成分を吸引捕捉したり、所定の成分を注入したりして来た。これは２重に困難な作業であった。また、観察する細胞の場と位置を確認しながら、その細胞に一本の光ファイバーでミクロの光照射をしたり、近接場光を先端に出す探査子を細胞に接触させたり、微細な磁石で、磁気ビーズ上に捕捉した細胞内成分を集めることをミクロ域で可能としたり、電極を細胞などにミクロに挿入したり、親和性のある分子を表面に結合した分子捕捉針の様なものを細胞壁から細胞内に挿入したりと、今後は様々なミクロ域の操作が必要とされる時代になってくる。これらを高効率に可能とする必要がある。また、近年ナノテクノロジーの進展とともに、２００μｍ以下の微小域の物質の変化を観察しながら、その分子変化をその観察実態とともに捉えることも必要になってきており、その微小域の変化の可視化と分子機構などの解明をもたらす手段を与えるにも、試料補足および成分液注入におけるミクロ域への成分捕捉・注入デバイスの迅速で正確な移動が不可欠であった。【０００６】  さらに現在、各種疾患や診断に対し、できれば無痛に近い成分捕捉が望ましい。その一つの手段として、採取量が極微量ですめば、血液も耳たぶに痛くない小径の針で刺入するのみで、噴出したわずかな試料や、細針への流入で得た試料で分析でき、他にもまったく痛くない唾液や汗（１汗腺から噴出す量はナノリッター程度）や涙でも診断ができるようになる。その時に、狙った所に採取針を刺入あるいは先端を持っていったりすることを、熟練や手間を要しないで、かつ自動化できれば、その恩恵は計り知れない。更にこの技術によれば、たとえば、皮膚の下の血管の位置を、血液からでる近赤外線や赤外線のイメージと、対物レンズの皮膚表面と当該赤外線の最強深度から、特に女性にわかりにくい血管の位置へ自動的に刺入するシステムを完成することもできる。
病気の診断には、現在、血液中に漏出した各組織中に特異的に存在する酵素なども検出されている。この場合、従来の臨床検査では、酵素の基質となるものを加え、酵素反応とカップルする反応をうまく利用して呈色させたりして、その酵素活性を一つ一つ計測している。本手法によれば、血液、唾液、あるいは汗腺からの１ナノリッター以下の汗など、極微量でも測定できることから、あらかじめ、この様な基質をナノスプレーチップ内壁にコーティングなどで存在させておき、酵素基質とその反応物の比から、血中の逸脱酵素などの診断に利用されている蛋白質などの機能を分析できるようにしたく思う。【０００７】  また、飲食品分野では、ワイン、日本酒、ビール、ウイスキー、焼酎等のアルコール性飲料、醤油、味噌などの醗酵食品、漬物、キムチ、ピクルスなどの野菜果実加工品、ヨーグルト、チーズ等の酪農食品には酵母、乳酸菌等の微生物細胞についても遺伝子レベルにおける解析、研究等が進んでいるが、風味、香等微妙な品質を研究したい場合には、それらの遺伝子解析やタンパク質の分析のみでは限度があり、酵母、乳酸菌等の醗酵と関連する微生物の細胞内の低分子動態の解析手段の出現や、発酵などの製造過程でのリアルタイムでの成分解析が望まれており、その結果と遺伝子解析やタンパク質の解析結果との統合が望まれている。もし発酵過程などでの、極微量での解析が簡単に低コストで、かつ自動化して行えれば、その恩恵も計り知れない。
さらに、反応系、例えば合成や誘導体化や分子結合の様な化学反応の進む試料を、ごく僅かナノスプレーチップ先端に捕捉し、すぐに分析して、反応の進行をチェックすることもできる。【０００８】  また植物研究については、一般的な植物生理学・発生学等の各種の研究分野において、動物細胞と比較して一般的に未解明事象が多く、植物の分化、形、色、香をつかさどる分子機構等の解明や、植物の重力や光などの環境応答に対する低分子の動態の研究が望まれている。また近年、食糧事情等の関係から、遺伝子組み換え植物の需要は高まっており、生態的リスク評価のみならず、遺伝子組み換えによる安全性評価や、品種改良の迅速な評価も非常に重要な課題であり、細胞内外の低分子動態の変化を追跡する手段の出現が望まれている。我々は最近植物細胞１ヶでの分子解析にも成功しているが、空間に植物の葉や茎を固定して、そこに３次元的に、細胞採取用ナノスプレーチップを刺入する事は簡単では無く、自動化が望まれている。【０００９】  さらに一般的化学品製造産業等において、例えば、有機半導体、有機導電体、有機光学材料のように高純度が要求される製品の製造過程において、または食品添加物等の健康面での品質保証が重要な製品の製造過程において、微量の因子が、物理化学的性能または安全性等の要求品質に影響を与えるような製造工程では、そのような微量因子のモニタリング、制御など、製造管理、品質管理のために、微小域での迅速な分子動態の自動解析が望まれている。【００１０】  しかし、光学顕微鏡内に観察される細胞などの微小対象は、細胞で１０ミクロンメーター程度ときわめて微小である。対物レンズの倍率にもよるが、その顕微鏡の視野内で見ている範囲はせいぜい１ｍｍからそれ以下である。そこに視野外から、顕微鏡の焦点外の上下（Ｚ軸）方向も含む不確定位置から、先端口径数ミクロンの針の様なナノスプレーイオン化細管チップの先端を細胞近辺に誘導するのは、とても時間と手間のかかる作業で、１細胞成分捕獲など微小域成分捕捉において、この操作が一番難しく、対物レンズの倍率を上げれば上げるほど困難さは増し、チップ先端を間違ってシャーレの底面に当てて先端を折ってしまうなど失敗の多い操作である。この操作の手間と時間が短縮できれば、上記新分析法は世界中で誰でも、色々な分野で利用される方法となると考えられた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  そこで、この１細胞などの微小域試料捕捉用のナノスプレーイオン化細管チップ（以下チップと表記）を多軸ロボットなど、３次元空間位置認識移動体の先端に固定し、かつ、固定時に、チップ装着時にチップの製造時の長さ変動や先端保持の微妙な固定点の違いなどによるチップ先端位置のミクロンメータースケールでのずれを認識し、補正して、再現性良く、チップ先端を１細胞近辺など指定微小域試料位置に、所定の移動空間内を、所定の軌跡とチップの向きなどの姿勢を保ちながら、一気に移動させることができないかと考えた。これによれば、一番時間と手間のかかるチップ先端のミクロ域での対象試料付近への誘導が数秒で再現性良く実現でき、またその後、チップ先端に捕捉した成分に溶媒を入れる操作も、ロボットが試料採取後のチップを一度ラックのようなものに置き、ロボット先端からチップを開放し、その後、ロボットは指定の量の溶媒を入れることのできるマイクロディスペンサーを取り上げ、その先端に溶媒採量用のマイクロピペッティングチップを保持し、一定量の溶媒吸引操作の後、先ほど細胞などの成分を捕捉したナノスプレーチップの後端から、マイクロピペッティングチップの糸の様なプラスティック細管を当該ナノスプレーチップ内に挿入して、イオン化補助溶媒を試料採取チップに添加し、その後、ロボットはマイクロディスペンサーを所定のディスペンサー保持部に戻して離し、もう一度、当該ナノスプレーチップを取り上げ、チップ先端を下向きにしての振動付加や遠心力付加などで、ナノスプレーチップ先端に向かって溶媒を落とし、気泡などを取り除き、その後質量分析計の専用ナノスプレーイオン化アタッチメントに、このチップを置き操作の１サイクルを終え、次の細胞などの微小域成分捕捉の準備に、新しいナノスプレーチップをチップラックから取り上げ入る。これにより、質量分析計側では、同時にナノスプレーイオン化による細胞などの微小域成分の分子分析が平行してスタートすることになる。【００１２】  ロボットはサーボ制御であるので、サーボ制御によるある一点を維持するための振動的な制御の結果ハンチングなども予測されたが、実験して見ると、顕微鏡で見ても、細胞１ヶでの成分捕捉に問題ない範囲で細胞付近を動かず、非常に再現性良くかつ位置精度高く、一度セットした位置に、位置を維持することがわかった。また何十センチメートルも顕微鏡から離れた位置に戻した後でも、再現性良くチップ先端を細胞近くの所定の位置に誘導できることができることがわかった。その理由として、軽量にチップ保持部分を製作できたことも一因であろう。１０ミクロンメーター程度のメーカー精度保障しか無いロボットでも、軽量に先端部を製作すれば１ミクロン程度での空間精度維持が可能であることを見出したことは、驚きであった。これを達成するために、台にも工夫を施し、顕微鏡とロボットを結ぶ面の台の下部には、高剛性のフレームを溶接して対応した。これもチップ先端の揺れ防止に対しての、対振対策、剛性向上として重要なポイントであった。これで多軸ロボットをミクロ操作にも応用できることを証明した。これにより、一連の操作をかなり複雑でも自動で行う事ができる様になった。
［特許文献２］特願２００８−０９５０９２ですでに詳述したが、従来のマイクロマニュピレーターを電動とし、チップ先端の計測法を加味すれば、小さな稼動範囲に限れば、使用できる（図１）。しかし、質量分析計へのチップの配送には、距離が長く、無理がある。もし、この従来型マイクロマニュピレーターを高精度で直線移動できるリニアーアクチュエーターなどの上に保持すれば、空間移動距離も増え、ロボットに擬した操作を行う事ができる。しかし、溶媒充填などの細かな操作は置き場所をよほど限定しなくては難しい。
さらに、
【発明の効果】
【００１３】  この顕微鏡での観察を伴う微小域試料の採取に対する多軸ロボットの採用の成功で、ナノスプレーチップの先端位置を計測すれば、１細胞内成分捕獲など、顕微鏡内で狙った微小空間内試料の捕捉までの少なくとも細胞などターゲット近辺への高速なチップ先端誘導と、それに引き継いでのジョイスティックなどでの微小移動による細胞などへの狙った位置からの刺入や吸引などが簡単にかつ高速にできる様になった。さらに、細胞内成分など試料吸引後、チップへの溶媒注入や、その後のチップの質量分析計のナノスプレー用専用アタッチメントへの搬送も自動で行う事ができ、本分析手法の高速化・効率化・自動化を図ることができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】  ［特許文献２］特願２００８−０９５０９２で記載した１細胞捕獲の電動マイクロマニュピレーターシステム
【図２】  自動化に対応したナノスプレーイオン化細管チップの迅速交換ホルダー
【図３】  自動化に対応した鞘付きナノスプレーイオン化細管チップと鞘の形状の例
【図４】  図３表記の鞘付きチップの保持ラックの１例
【図５】  鞘をガラス細管上部を高温軟化させ押し広げて形成したナノスプレーイオン化細管チップ
【図６】  多軸ロボットを使ったチップ先端計測モニター補正装置付き自動ナノスプレーイオン化細管チップ細胞誘導システム
【図７】  多軸ロボットを使ったチップ先端簡易型計測モニター補正装置付き自動ナノスプレーイオン化細管チップ細胞誘導システム
【図８】  レーザーなどのビーム中心遮断によるチップ先端計測システム
【図９】  図６のシステムで、チップ保持ラックからチップを取り出し、また細胞成分捕捉後チップを元のラックに戻す機能を付加したシステム
【図１０】  図９のシステムで、更に、チップに溶媒添加後、質量分析計のナノスプレーイオン化システムにチップを搬送する機能を付加したシステム
【図１１】  図９のシステムで、先端のチップ保持部を従来型マイクロマニュピレーターとし、最後の微細操作を容易にしたもの
【図１２】  図１０のシステムに、足ふみペダル操作により細胞など微小空間試料の吸引捕捉と、加圧による培養液の混入防止を可能としたシステムを付加したもの
【図１３】  ロボット化自動細胞捕捉システムを細胞の増殖維持に必要な恒温チェンバー内に配置したもの
【図１４】  ロボット化自動細胞捕捉システムによる細胞捕捉実験の様子
【図１５】  ロボット化自動細胞捕捉システムの細胞付近でのジョイスティックによる微動試験の様子
【図１６】  ロボットを複数台設置し、同じ観察点にある浮遊細胞や卵などの位置の移動を行う試料を、もう一つのマニュピレーターで軽く吸引捕捉し、それに、ナノスプレーイオン化細管チップなどの細管捕捉器具をつけた本来のマニュピレーターで、同じ観察点に向かってロボットで成分採取を行う一例
【図１７】  ロボットを複数台設置し、観察する細胞の場と位置を確認しながら、その細胞に一本の光ファイバーでミクロの光照射をしたり、近接場光を先端に出す探査子を細胞に接触させたりしながら、その条件による細胞の変化を、成分の変化として、もう一つのロボットの先端にある試料採取細管で捕捉する場合の一例
【図１８】  試料捕捉用の図３にある鞘付チップの、先端ナノスプレーイオン化細管チップ内部に、ロボットでも容易に溶液注入用のチップの髭の様な先端部が導入できるよう、鞘の結合部と、ナノスプレーイオン化細管チップ内径の間にスロープを設けた一例
【図１９】  本ロボットをフレーム移動型とした場合の全体操作の一例
【図２０】  本ロボットにより、ヒトの血液を腕から採取できるようにしたシステムの一例
【図２１】  指の指紋領域に見られる汗腺一つから噴き出るナノリッターレベルの汗を、本ロボットでナノスプレーイオン化細管チップ先端に捕捉する時の図の一例
【図２２】  図２１で捕捉した汗から検出された質量スペクトルとその中の同定分子の一例
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１５】  まず細胞成分捕獲を自動化するためには、その際大量に使用するナノスプレーイオン化細管チップ１の迅速な交換を可能にする必要がある。図２では、ナノスプレーイオン化細管チップ１内には安定してナノスプレーが生じるよう先端への毛管現象を維持するためフィラメント３３８が配してある。この金属コーティングを外面に施されたナノスプレーイオン化細管チップ１は、二つのＯ−リング３４１を介して、空気漏れなくチップホルダー３４０中心部に保持され、チップホルダー後端にある二つのＯ−リングで空気漏れなくロボット先端のナノスプレーイオン化細管チップ１のロボット先端取り付け部３６３に保持される。チップ１の交換は、チップをつまんで引き抜く。これで、迅速にチップを交換できる。また、このナノスプレーイオン化細管チップを金属コーティングせずマイクロキャピラリーとして、成分液体の注入用としても使うことができる。以下、説明において、注入に関しては述べないが、同じく可能である。
【実施例２】
【００１６】  ロボットが次々に空気漏れなくチップ１をロボット先端取り付け部３６３に保持するには、注射針の鞘部のように、内部に丸状テーパになったチップ結合用鞘をチップ後端に設けることで解決できる。図３は、さまざまな形状の鞘を持ったナノスプレーイオン化細管チップ１の例を示す。円形の断面を持つものに比べ、角型の断面を持つものは、チップ１をロボット先端に保持する際、チップをチップホルダーに食い込ませる時に少し回転をさせるが、この動きをラック内にチップ１がある場合に、完全に回転運動をチップ１にさせないで食い込ませることが容易であるからである。さらに一部襟が鞘についているのは、ラックから落ちにくくするためである。これらの鞘は、ナノスプレーチップにインジェクションでプラスティックを成型付加するのがもっともやりやすい製造法であろう。ナノスプレーチップをガラス加熱引き伸ばしで作る際は、引き伸ばす前に両端に鞘を形成して後、引き伸ばしても良い。
【実施例３】
【００１７】  図４は、１例として、襟付き角型鞘３４８のあるナノスプレーイオン化細管チップ１を保持するラックを示す。この場合は細胞などの捕捉後のチップや、溶媒添加待ちのチップ、あるいは質量分析待ちや終了後のチップをこの６ヶの穴の中に保持させて、置くことができる。
【実施例４】
【００１８】  図５は、フィラメント３３８付きのナノスプレーイオン化細管チップ１の鞘を、同じチップ素材であるガラスなどの加熱押し出し成型で形成したものである。プラスティック鞘の付加の様に、プラスティックの可塑剤などの分子ピークが質量スペクトルに現れにくく、また回収に際しても、ガラスとコーティング金属のみが原料で、再生性に優れている。鞘押し出し成型時に形成された突起部３５９は、ラックでのチップに回転でチップホルダーに食い込ませたり、はずしたりする際に、回転運動を受け止められるようにしたものである。
【実施例５】
【００１９】  図６は、上記のようなチップ１を使用し、多軸ロボット３６０で細胞などの微小域成分捕捉システムを形成した１例である。この場合は６軸ロボットを使用した例であるが、ロボットは小型ロボット制御部３６１で制御される。まずホルダーへの食いつきの違いやチップ先端長さのばらつきから、微妙にチップ先端位置が異なるので、その先端位置補正を、顕微鏡やそれとは切り離して別に設けられた３次元位置顕微撮影装置３７６（Ｘ−Ｙ平面），３７８（Ｘ−Ｚ平面）でモニター上３７７，３７９に表示される先端点４０２に先端位置をジョイスティック４０５などの微動装置で移動させることで、補正絶対座標値が検出される。このチップ先端位置座標と、この顕微鏡ステージ３７３のＺ軸移動エンコーダー値を顕微鏡Ｘ−Ｚステージ駆動部４０１からもらい、例えば視野中心部である焦点面を、チップ捕捉点・焦点面４０３として誘導座標を決め、あとはロボットを移動させるのみとさせる。この様に、微細空間では、顕微鏡の焦点位置とロボットが操作するチップ１の先端位置を、絶対座標あるいは相対座標の中で共有し、さらに、障害物などのそれらの位置情報をあらかじめコンピューターに記憶させておくことで、目標の微細試料へのチップ１などの、目的ツールを、高精度に、かつ正確に、かつその移動空間内での軌跡と向きなどの姿勢も含めて制御できる様になる。細胞付近にチップ先端が来ると急に細胞モニター画面３７２の色合いが、光をチップ先端がさえぎるので、変わる。ロボットと顕微鏡の間の絶対位置が正確でないと、再現性良くチップ誘導できないので、ロボット化微小域自動試料採取システムの取り付け台３６２の裏打ちとして取り付け台の剛性補強材４００などを介して剛性強化して置くことも重要である。この様にして、簡便にかつ高速高精度で再現性良く細胞などの微小域試料を捕捉することができる様になる。尚、捕捉にあたっての、チップ内への成分吸引のための減圧吸引や、細胞などへのアプローチの際に培養液などをチップ１内に入れないための軽い加圧は、後述図１２で説明する。
【実施例６】
【００２０】  図７は、図６において、チップの先端位置補正を簡略化し、顕微鏡やそれとは切り離して別に設けられた３次元位置顕微撮影装置３７６（Ｘ−Ｙ平面）のみでチップ先端をモニター３７７上に表示する様にしたものである。Ｚ軸方向の補正は、ロボットが９０度回転してチップ位置を見せることでわかるようにして、６軸ロボットの特性を使ってコストダウンを計ったものである。後は、図６と同じである。
【実施例７】
【００２１】  図８は、チップ先端計測の別の手法を示したもので、チップ先端部が、非常に小さく焦点化された点をＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸移動で移動する際、通過光強度が大きく変化することを利用する。先端付近がこの小さな焦点化光経路を横切ると、非常に狭い範囲で大きな通過光強度の変化が生じる。チップ１をＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸ロボットで動かしながら、光強度変化で先端位置を割り出すことができ、その時の絶対座標をチップ１の先端座標とすることができる。また、ロボット３６３の回転軸を回転させることで、チップ１の中心回転軸からのずれにより、補正することもできる。
【実施例８】
【００２２】  図９は、図６のシステムで、更にチップをラックから取り出したり、ラックに細胞などの捕捉後、チップを置いたりする操作をさせるものである。この試料採取後のチップをラックに置いて、その後、例えば、ロボットは指定の量の溶媒を入れることのできるマイクロディスペンサーを取り上げ、その先端に溶媒採量用のマイクロピペッティングチップを保持し、一定量の溶媒吸引操作の後、先ほど細胞などの成分を捕捉したナノスプレーチップの後端から、マイクロピペッティングチップの糸の様なプラスティック細管を当該ナノスプレーチップ内に挿入して、イオン化補助溶媒を試料採取チップに添加し、その後、ロボットはマイクロディスペンサーを所定のディスペンサー保持部に戻して離すこともできる。
【実施例９】
【００２３】  図１０は、図９に加え、更にロボットに質量分析装置へのチップの搬送をさせ、自動化を更に進めるものである。ロボットは、もう一度、溶媒を添加されたナノスプレーチップ１を取り上げ、チップ先端を下向きにしての振動付加や遠心力付加などで、ナノスプレーチップ先端に向かって溶媒を落とし、気泡などを取り除き、その後質量分析計の専用ナノスプレーイオン化アタッチメントに、このチップを置き去り、操作の１サイクルを終え、次の細胞などの微小域成分捕捉の準備のために、新しいナノスプレーチップをチップラックから取り上げ入る。これにより、質量分析計側では、同時にナノスプレーイオン化による細胞などの微小域成分の分子分析が平行してスタートすることになる。
【実施例１０】
【００２４】  図１１は、上記のロボットのみによる細胞などの微小域試料捕捉において、最後の細胞捕捉などのための微動操作を変えたもので、更に細かく微動操作できる、従来の小型Ｘ−Ｙ−Ｚマイクマニュピレーターをロボット先端部に取り付けた場合を示す。ロボット先端部が重くなり、ロボット自身がハンチングを起こさない範囲の重量で行う必要があるが、微動に関してはよりスムースになる。
【実施例１１】
【００２５】  図１２は、図１１やそれ以前の図で、細胞など微小域試料のナノスプレーチップ１での吸引捕獲のために、手での注射筒を使った吸引操作ではなく、ふさがりがちな手を用いないで、足によるペダル４３７の操作でピストン４３６を動かし、チューブを介して、捕捉にあたってのチップ内への成分吸引のための減圧吸引や、細胞などへのアプローチの際に培養液などをチップ１内に入れないための軽い加圧を可能とするものである。チューブ内には、吸引加圧の操作特性向上のために液体を入れることも可能である。この操作も電動で自動化できるが、操作のスムースさや適切性には欠ける。
【実施例１２】
【００２６】  図１３は、上記システムを細胞観察の適正温度である摂氏３６度付近に維持するためのもので、特に細胞を培養し長時間観察するためには必須の炭酸ガス濃度維持および恒温チェンバーである。正面は、二重ガラスでは無く、有機ガラス１枚で形成され、顕微鏡観察窓４５３、顕微鏡操作窓４５４やチップ取り出し窓４５５などが設けてあり、質量分析計を内部に入れて、全自動化を図ることもできる。その場合は、質量分析計やそのイオン化アタッチメントの維持のために、大きな透明ドア４５７を設ける。
【実施例１３】
【００２７】  図１４は、実際に６軸小型ロボットを用いて、細胞刺入を行っている写真である。
【実施例１４】
【００２８】  図１５は、図１４において、細胞内刺入の最後の段階で、ジョイスティック操作により微動操作を行っているところである。いずれも期待を上回る性能を発揮した。
【実施例１５】
【００２９】  図１６は、６軸小型ロボットを複数台設置して行う例を示しており、左側のロボットで浮遊細胞や卵など、貼り付き細胞と異なり、その位置が移動する試料に対し、先端口径が対象試料の大きさに近く、傷つけないように角が丸くなっている細管で、弱く吸引することで捕捉し、その捕捉位置は、ロボットの座標軸値から割り出せるので、その場所に、もう一つのロボットのチップの先端を誘導する事を可能としたシステムである。この様に複数のロボットを使う場合、絶対座標を共有できるロボットの特性を生かした操作がさらに可能となり、作業の高精度化と高効率化が達成できる。
【実施例１６】
【００３０】  図１７は、ロボットを複数台設置し、観察する細胞の場と位置を確認しながら、その細胞に一本の光ファイバーでミクロの光照射をしたり、近接場光を先端に出す探査子を細胞に接触させたりしながら、その条件による細胞の変化を、もう一つのロボットの先端にある試料採取細管で捕捉する場合の一例である。測定試料（この場合は細胞であるが）に対し、他に微細な磁石で、磁気ビーズ上に細胞内成分を集めることをミクロ域で可能としたり、電極を細胞などにミクロに押し付けたり、挿入したり、親和性のある分子を表面に結合した分子捕捉針の様なものを細胞壁から細胞内に挿入したりと、今後は様々なミクロ域の操作が同時に可能となる。
【実施例１７】
【００３１】  図１８は試料捕捉用の図３にある鞘付チップの、先端ナノスプレーイオン化細管チップ内部に、ロボットでも容易に溶液注入用のチップの髭の様な先端部４８２がチップ後端部から導入できるよう、鞘の結合部と、ナノスプレーイオン化細管チップ内径の間にスロープ４８０を設けた一例であり、ロボットは、当該チップで細胞などの試料成分を捕捉後、一度ラックにこのチップを置き、これに、この様な鞘の形状を生かして、このチップの後端から容易に、溶液添加用細管チップ４８１を使って、この細管内部に溶媒を添加する事ができる。今まで、この重要な溶媒添加作業も、細かな作業で、難しく、効率化の妨げになっていた。
【実施例１８】
【００３２】  図１９は、本ロボットのタイプをフレーム移動型とした場合の全体操作の一例である。フレームを移動軸５０１として動くこのタイプのロボットは、低コストであるが、移動空間に制約が多く、使える場合が上記の６軸回転型のロボットよりは狭い。他にもアーム式や色々なロボットがあるが、その操作の基本は変わらない。
【実施例１９】
【００３３】  図２０は、本ロボットにより、ヒトの血液を腕５１０から採取できるようにしたシステムの一例である。近赤外あるいは赤外域に感度を持つカメラ３７１をカメラに用いれば、温度の高い血管５１１などの位置を容易に可視化する。その焦点面から、血管の大きさと位置を確認できれば、ヒトの腕５１０を、血液採取する位置を生体試料採取ポイント確定プレート５１４で固定し、そこに注射針などの生体試料採取針５１５を刺入する。その時の血管壁通過などを針の根元に設置した採取時の感触センサー５１８で感知し、血管壁の片側を刺入した所で、ロボットの動きを止め、採血などに入るようにしている。そのセンサーからの信号は、センサー信号線５２０を介し、プリアンプ５２１で増幅されて、ロボット駆動コンピューターに送られる。
【実施例２０】
【００３４】  図２１は指の指紋領域に見られる汗腺一つから噴き出るナノリッターレベルの汗を、本ロボットでナノスプレーイオン化細管チップ先端に捕捉する時の図の一例である。指の指紋領域にある汗腺一つから噴き出た汗５３０は、ナノスプレーイオン化チップ５１５で捕捉され、これに溶媒を後端から添加して、ナノスプレーイオン化質量分析法で直接分子ピークを検出した。その検出に成功した質量スペクトルを図２１に示す。汗一滴から得られた質量スペクトルの中で、汗に特異的な分子ピークは１３０本あり、その中でアミノ酸とともに同定された分子のピークとその分子構造を３例記載した。摂取したカフェインやニコチン、および服用している医薬品分子の検出にも成功し、この成功は、将来診断などが、血液では無く、もっと患者に負荷のない、痛みの無い試料で様々にできる可能性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００３５】  合目的的に動き外部因子に応答している細胞は、その挙動と細胞内分子動態が連動することが多く、細胞の顕微観察と分子検出をリアルタイムに行うことで、生命現象の合目的的分子メカニズムを迅速に解明することができる。本発明は、生命現象とその分子メカニズムの両方を細胞１つまでミクロなスケールで、迅速かつ直接的に解明する手段を与え、その用途は膨大である。何よりも疾患細胞と正常細胞の動態と分子比較による疾患の分子メカニズムの解明が加速する。そして、細胞内分子メカニズムが分かれば、その分子あるいはメカニズムを利用した創薬や診断法、治療法の開発、新しい分子が見つかれば新医薬品への応用あるいはライフサイエンス用の試薬の開発、など実に多彩な応用が考えられる。
また、細胞内や生体組織中の細胞内の様々な分子メカニズムの解明の高速化は、医薬品候補分子も含め新分子の発見、新生命現象の発見の高速化をもたらし、医療や診断あるいはバイオ応用を大きく展開し加速することができる。例えば、再生医療などの万能細胞の細胞分化因子の高速探索、細胞分化制御、細胞増殖因子の発見や制御法、がん細胞など細胞種の分子診断や分子探索、細胞種の同定など様々な分析が高速に展開することとなる。【００３６】  現在、各種疾患について網羅的な解析が進められている多くの遺伝子およびその発現産物であるタンパク質等と関連して、細胞内の低分子動態を明確にすることができ、統合的な生命現象の解明が可能となり、生命現象の統合的理解は、人類の生命、健康の増進に大きく貢献し、付帯的な様々な事業を生み出しうる。【００３７】  また、食品分野では、風味、香等微妙な品質を研究できる細胞内や発酵液などの直接的で迅速な低分子動態の解析手段を与えることができる。
さらに一般的化学品製造産業等において、例えば、ナノテクノロジーの微小域分子機構の解明や、有機半導体、有機導電体、有機光学材料のように高純度が要求される製品の製造管理、あるいは食品添加物等の健康面での品質保証が重要な製品の製造過程において、微量の副生物が、物理化学的性能または安全性等の要求品質に悪影響を与えるような製造工程では、そのような副生物の監視、製造管理、品質管理など、微小域での分子検出と解析が可能となる。
【符号の説明】
【００３８】  １    ナノスプレーイオン化細管チップ
２    質量分析装置
３    試料溶液と添加イオン化溶媒
４    高圧電圧（この場合はポジティブモードの例でありチップ側が＋）
５    ナノスプレー
６    細管表面の金属コーティング部
８    細胞
９    顕微鏡ステージ
１０  捕捉した細胞液
１１  対物レンズ
１２  ビデオカメラ
１３  吸引操作
１５  シャーレ
１６  細胞培養液
１７  モニター
３５  細胞刺入ナノスプレー細管チップを細胞位置まで駆動するホルダーのＸ−Ｙ−Ｚ駆動ステージ（この図では電動型、手動のギア粗動・微動型もあり）
３６  細胞刺入ナノスプレー細管チップを細胞位置まで駆動するホルダーの軸方向アクチュエーター（この図では電動型、他に手動の水圧または油圧ピストン駆動型もあり）
３７  細胞刺入ナノスプレー細管チップを細胞位置まで駆動する軸方向アクチュエータによる細胞刺入および吸引後引き戻し移動方向
３８  細胞刺入ナノスプレー細管チップホルダー駆動制御装置
３９  細胞刺入ナノスプレー細管チップホルダー駆動用端末（この図ではジョイスティック）
４０  細胞成分吸引駆動用チューブ
４１  細胞成分吸引用ピストン（注射器でも代用可）
４２  細胞成分吸引用ピストン駆動装置
３３８  ナノスプレー管内付設フィラメント
３４０  ナノスプレー吸引ホルダー
３４１  ナノスプレー吸引時密封Ｏ−リング
３４２  ホルダー取り付け部Ｏ−リング
３４３  ナノスプレー吸引ホルダー本体
３４４  吸引用鞘付きナノスプレーイオン化細管チップ（表面金属コーティングは細管のみでも、鞘を含んでコーティングしても可）
３４５  同心円状鞘（インジェクション成型などで製作、吸引部との接合部は丸状テーパ）
３４６  角状鞘（インジェクション成型などで製作、吸引部との接合部は丸状テーパ）
３４７  一部襟付き角状鞘（インジェクション成型などで製作、吸引部との接合部は丸状テーパ）
３４８  周囲襟付き角状鞘（インジェクション成型などで製作、吸引部との接合部は丸状テーパ）
３４９  鞘付きナノスプレーイオン化細管チップ収納ラック
３５０  鞘付きナノスプレーイオン化細管チップ収納用の穴（角型）
３５２  加熱フィラメント
３５３  ナノスプレーイオン化細管チップ開口後端部押し広げ用受け金型
３５４  ナノスプレーイオン化細管チップ開口後端部押し広げ用押し込み金型
３５５  出来上がった後端部鞘構造をした一体型ナノスプレーイオン化細管チップ（金属コーティングは、押し広げ前後のどちらで行っても良いが、後の方がより良い）
３５９  後端部鞘構造をした一体型ナノスプレーイオン化細管チップに金型形状の変化により形成した位置決め突起部
３６０  小型ロボット（一例として６軸制御ロボットを示す）
３６１  小型ロボット制御部
３６２  ロボット化微小域自動試料採取システムの取り付け台
３６３  ナノスプレーイオン化細管チップのロボット先端取り付け部
３７０  自動微小域試料採取用顕微鏡システム
３７１  顕微解析用ビデオカメラと対物レンズ
３７２  ３７１で捉えた細胞のモニター図
３７３  顕微ステージ
３７４  顕微鏡Ｘ−Ｙステージ駆動部
３７５  細胞培養シャーレ
３７６  ナノスプレーイオン化細管チップの先端計測用対物レンズ付きビデオカメラ（Ｘ−Ｙ平面）
３７７  ３７６で捉えられたチップ先端図
３７８  ナノスプレーイオン化細管チップの先端計測用対物レンズ付きビデオカメラ（Ｘ−Ｚ平面）
３７９  ３７８で捉えられたチップ先端部
４００  ロボット化微小域自動試料採取システムの取り付け台の剛性補強材
４０１  顕微鏡Ｘ−Ｚステージ駆動部
４０２  ナノスプレーイオン化細管チップの先端点
４０３  チップ捕捉点・焦点面
４０４  顕微鏡焦点面Ｚ軸変動エンコード通信線
４０５  ロボット微動用アタッチメント（この場合はジョイスティック）
４１０  チップ先端検出用光源（この場合はレーザーなど）
４１１  光源用丸穴スリット
４１２  光源角度変更ミラー
４１３  集光レンズ
４１４  集光ポイント・ピンホールスリット
４１５  光検出器
４２０  チップ内捕捉試料ナノスプレーイオン化装置
４２１  ナノスプレーイオン化細管チップ固定・電圧印加部
４２５  質量分析計アタッチメントとしてのチップ内捕捉試料ナノスプレーイオン化装置
４３０  Ｘ−Ｙ−Ｚマイクロマニュピレーター駆動部（水圧、油圧、電動など各種ある）
４３１  Ｘ−Ｙ−Ｚマイクロマニュピレーター駆動用チューブ（水圧、油圧式の場合）または電線（電動式の場合）
４３２  Ｘ−Ｙ−Ｚマイクロマニュピレーター微細駆動用回転式ハンドル
４３５  試料吸引用チューブ
４３６  試料吸引用ピストンシリンジ
４３７  ペダル
４３８  ペダル回転軸
４３９  ペダル回転時のスイングアーム
４４０  ペダル式試料吸引圧力調節機
４５０  細胞捕捉用または細胞捕捉分子解析統合システム用恒温チェンバー
４５１  細胞補足用恒温チェンバー台
４５２  二重ガラスまたは２重有機ガラス
４５３  顕微観察用窓
４５４  顕微鏡操作用窓
４５５  試料捕捉チップ取り出し窓
４５６  熱源（オイルヒーターなど）
４５７  質量分析計操作用ドア
４６０  浮遊細胞または卵などの浮遊性微小試料
４６１  細胞保持用ロボット
４６２  細胞保持用ピペット
４６３  細胞など微小試料保持・吸引・注入用ピストンシリンジ
４７０  光ファイバー
４７１  光源
４７２  光ファイバー保持ロッド
４７３  照射された光
４８０  溶液添加用細管導入スロープ
４８１  溶液添加用細管チップ
４８２  溶液添加用細管チップ先端部
４８３  細管内に添加された溶液
５００  フレーム移動ロボット用フレーム支え
５０１  ロボット移動水平フレーム
５０５  ロボット回転部
５０６  ロボットのフレーム移動部
５１０  ヒトの腕（生体の一例）
５１１  血管
５１４  生体試料採取ポイント確定プレート
５１５  生体試料採取針
５１６  生体試料採取吸引ピストンシリンジ
５１７  生体試料採取ピストン駆動部
５１８  採取時の感触センサー
５２０  センサー信号線
５２１  センサー信号プリアンプ
５３０  指の指紋領域にある汗腺一つから噴き出た汗
５４０  汗一滴から得られた質量スペクトルと同定された分子
【図１】
2011120582.tif 000003
【図２】
2011120582.tif 000004
【図３】
2011120582.tif 000005
【図４】
2011120582.tif 000006
【図５】
2011120582.tif 000007
【図６】
2011120582.tif 000008
【図７】
2011120582.tif 000009
【図８】
2011120582.tif 000010
【図９】
2011120582.tif 000011
【図１０】
2011120582.tif 000012
【図１１】
2011120582.tif 000013
【図１２】
2011120582.tif 000014
【図１３】
2011120582.tif 000015
【図１４】
2011120582.tif 000016
【図１５】
2011120582.tif 000017
【図１６】
2011120582.tif 000018
【図１７】
2011120582.tif 000019
【図１８】
2011120582.tif 000020
【図１９】
2011120582.tif 000021
【図２０】
2011120582.tif 000022
【図２１】
2011120582.tif 000023
【図２２】
2011120582.tif 000024