(57)【要約】      （修正有）【課題】早期離乳仔ブタが、頻繁に遭遇する問題を防止および／または緩和する。【解決手段】飼料補足物として外因性脂肪分解酵素（エステラーゼまたはリパーゼ）と合せた中鎖脂肪酸（Ｃ４〜Ｃ１２まで）を含有するトリグリセリド（ＴＧ）の使用に関する。これは、伝統的であるが、異議のある飼料添加剤の使用なしに、成長作用の際だった改善を生じる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中鎖脂肪酸を含む少なくとも１種のトリグリセリド、および少なくとも１種の脂肪分解酵素を含有する、飼料補足物または飼料組成物（サプリメント）。
【請求項２】
前記トリグリセリドが、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１および／またはＣ１２の中鎖脂肪酸を含有する、請求項１記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項３】
前記トリグリセリドが、乳脂肪およびココナッツ油のような天然に存在するトリグリセリドである、請求項１または２記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項４】
前記トリグリセリドが、製造されたトリグリセリド組成物である、請求項１または２記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項５】
前記トリグリセリドが、Ｃ４〜Ｃ１２鎖の脂肪酸のインターエステリフィケーションによって製造される、請求項１または２記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項６】
前記脂肪分解酵素が、リパーゼである、請求項１または２記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項７】
前記脂肪分解酵素が、エステラーゼである、請求項１または２記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項８】
前記トリグリセリドが、天然または製造された中鎖脂肪酸を含有するトリグリセリド組成物中に存在し、そして前記脂肪分解酵素が、市販の脂肪分解酵素組成物中に存在する、請求項１〜７のいずれか１項記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項９】
前記トリグリセリド成分が、約０．０５〜約２０％までの、好ましくは約０．２５％〜１０％の濃度で、飼料に添加され、そして前記脂肪分解酵素成分が、約５〜１０，０００ppm、好ましくは約１００〜１０，０００ppmの濃度で、飼料に添加される、請求項１〜８のいずれか１項記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項１０】
医薬品として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項１１】
抗微生物剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項１２】
成長プロモータとして使用するための、請求項１〜９のいずれか１項記載の飼料補足物または飼料組成物。
【請求項１３】
胃腸管微生物叢の安定化、選択的活性化および／または抑制のための胃腸管における制御された脂肪分解のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の動物用飼料補足物または飼料組成物。
【請求項１４】
動物が、早期に離乳された仔ブタである、請求項１〜１３のいずれか１項記載の生産およびペット動物のための飼料補足物または飼料組成物。
【請求項１５】
生産動物が、早期に離乳された仔ブタである、請求項１４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、現在頻繁に遭遇される問題を防止および／または緩和するために、動物、特に早期に離乳された仔ブタ用の飼料補足物として外因性脂質分解酵素（エステラーゼまたはリパーゼ）と組合せて、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ；Ｃ４〜Ｃ１２まで）を含むトリグリセリド（ＴＧ）の使用に関する。これは、伝統的であるが、競合する飼料添加剤の使用なしに、成長作用の際だった改善を生じる。
【背景技術】
【０００２】
早期離乳（３〜４週までの年齢）の仔ブタは、生産性を増大し、そして収益性を維持するために、ブタ管理システムにおける一般的慣例になった。しかし、早期離乳は、子ブタに、多かれ少なかれ、飼料摂取の顕著な抑制および体の蓄えと合せて、主に環境、栄養および免疫起源の多量のストレスを負わせる。消化不良および吸収不良は、しばしば、細菌の過剰成長および／またはウイルス感染による消化不調を生じる状況をさらに悪化させる。これらの現象は、企業の収益性に大いに干渉する。これらの問題を網羅する膨大な量の文献がある（例えば、VAN DER PEET、1992年；PARTRIDGE、1993年）。
【０００３】
それらの問題を取扱う最近使用された方法は、全体または飼料のエネルギー含量の増加と合せて、特定の成分（例えば、ミルク粉末および乳漿およびラクトースのような誘導物、乾燥血液血清、フレーバー）の使用による飼料の許容性を改善することによっておよび／または仔ブタの消化容量に対する飼料の適合を目的とする。エネルギー含量の増加は、中でも、容易に消化できるか、または代謝できる脂肪を含むことによって得られる。この内容における中鎖トリグリセリド（ＭＣＴＧ）の有用性は、新生児（ODLE、1999年）で、および離乳した仔ブタ（CERAら、1989年）での両方で典拠が充分に示されている。ＭＣＴＧの有用性についての理由は、BACHおよびBABAYAN（1982年）により検討されたそれらの特定の消化性および代謝性脂肪である。
【０００４】
消化性不調は、飼料に、医薬上の抗微生物物質（抗生物質、さらに抗生物質と呼ばれる化学療法剤）を補足することによって防止および／または治療される。上に明記された介在の組合せ効果は、主に、成長作用（さらに「成長促進」と呼ばれる）の顕著な改善を生じる。この成長促進は、環境により、主に、よりよい飼料変換（＝飼料kg／増加kg）と二者択一で合せて、飼料摂取が改善されることによる。しかし、動物生産システムにおける成長促進のための抗生物質の使用についての憂慮がつのる。特に、ヒト医薬品で使用されるある種の最後の手段の抗生物質に対する交差耐性の発生の危険について、充分に考慮される恐れがある（CORPET、1996年；WEGENERら、1998年）。したがって、それらの抗生物質（いわゆる成長プロモータ）のほとんどは、代替物についての緊急の必要性を正当化する欧州ではすでに、または近い将来禁止される。
【０００５】
早期離乳ブタにおける消化病理学が、グラム−細菌（特に、大腸菌）により生じるということ、およびグラム＋乳酸細菌（ビフィドバクテリア（Bifidobacteria）ラクトバシリ（Lactobasilli)）が、それらに対する保護的および／または拮抗効果を示すという一般的意見があるので、最近提案された代替物は、それらの抗大腸菌活性：例えば、銅および亜鉛化合物、選択された有機酸（短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ、蟻酸、酢酸、プロピオン酸）、乳酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、ソルビン酸）、プロバイオティックス（主に、乳酸細菌）および／またはプレバイオティックス（主に、ビフィド原性オリゴサッカライド、いわゆるＮＤＯ）について選択される。Ｃｕおよび／またはＺｎ化合物は、有効であるが、しかし、環境におけるそれらの効果（汚染）のために受入られない。プロ−および／またはプレバイオティックスで得られた結果は、予測不可能であり、そして一般的に言って落胆させている（CHESSON、1994年）。
【０００６】
類似の問題が、他の動物種で、そして他の年齢群の動物で存在する。
だたＳＣＦＡおよび「伝統的」有機酸が、当面最も信頼する代替物である（ROTHら、1998年）。しかし、むしろ高用量が必要とされ、その結果それらの有用性は、高コスト、仔ブタの飼料摂取に大いに干渉するそれらの腐食特性およびそれらの嫌いな風味により制限される。
【０００７】
一般に脂肪酸（ＦＡ）およびそれらの塩（ソープ）の抗微生物効果は、数十年間、すでに知られている。選択ＦＡ（および誘導体）の抗微生物効果の再評価は、KABARA（1978年）の検討で示される。それにより、ラウリン酸（Ｃ１２、ＭＣＦＡ−ファミリーの一員）および誘導体に特別の注目が示された。
別の文献のデータは、ある種の動物種（例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ）のミルク−脂肪におけるＭＣＦＡの比較的重要な寄与を結論づけるに至る一方で、他の種では、その濃度は、低いか、または雌ブタのミルクにおけるのと同様に無価値でさえある（DIERICK、1998年、文献編纂物、個人的通信）。ほとんどの哺乳類で、舌または胃の分泌から起因する多かれ少なかれ顕著な前十二指腸（＝膵臓起源のものでない）の脂肪分解活性がある。それらのリパーゼの活性は、コリパーゼおよび胆汁酸に依存し、広範なpHで活性および安定で、そして乳脂肪中でＭＣＦＡについて優先性を示す。前十二指腸のリパーゼ活性は、プレ反芻動物である仔ウシおよびウサギでは高く、仔ブタでは中程度であり、そして家禽ではなしである（MOREAUら、1988年）。過剰のＭＣＦＡは、重要な副作用を示しうる：実際に、それらは、新たに生まれたブタで催眠作用がある可能性があり（ODLE、1999年）、そして飼料摂取に干渉しうる顕著な十二分に満足される活性を示す腸のホルモンであるＣＣＫについての強力な刺激物であるというデータがある（LEPINEら、1989年）。この内容でのデータが、欠乏しているか、または決定的でないが、低い飼料摂取は、遊離ＭＣＦＡの強力な（ヤギの様な）臭いおよび嫌いな風味の結果でもありうる。
【０００８】
本発明は、動物飼料のため、特に一般に使用される（および競争される）抗生物質および他の成長増強剤を置換できる早期離乳ブタのための新たな飼料補足物を提供することに向けられる。
本発明は、飼料補足物が、完全な食品の一部（主として１〜５％まで）として使用するための担体との飼料添加剤（中でも、ビタミン、ミネラル、抗生物質）の予備混合物であり、そして飼料組成物が、完全な飼料中で使用された様々の飼料成分の全体的項目である飼料補足物または飼料組成物に関連する：しばしば使用される他の語句は、「飼料配合物」である。
【０００９】
本発明は、ただちに、頻繁に適合された飼育問題を防止および／または緩和するために、動物飼料のための、特に早期に離乳されたブタのための飼料補足物として少なくとも一種の外因性脂肪分解酵素（エステラーゼまたはリパーゼ）と組み合わせて、中鎖脂肪酸を含む少なくとも一種のトリグリセリド（ＴＧ）（ＭＣＦＡ：Ｃ４〜Ｃ１２まで）の使用を提供する。飼料に対するＴＧおよび外因性脂肪分解酵素のこの組合せの追加は、驚くべきことに、胃腸の微生物叢を制御および安定化する胃における生理学上の環境を生じる。エネルギーの容易に消化でき、そして代謝できる源が提供されるという事実と組合されたこの効果は、驚くべきことに、動物、飼料工業および消費者についての負の副作用なしに、一般的に使用される（および競争される）抗生物質および他の成長促進剤で得られる成長促進に匹敵する成長の際立った改善を生じる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】実施例１で得られた結果に関し、そして様々の試験されたＴＧ（１ａ、ココナッツ油、１ｂ、ＭＣＴＧ１、１ｃ、ＭＣＴＧ２、１ｄ乳脂肪）および選択酵素についてのインビトロ放出ＭＣＦＡ（ｇ／１００ｇＴＧとして表される）を表す。コードされたＬ１〜Ｌ６までの酵素は、ＴＧに基づいて１０，０００ppmの用量で使用された。ＦＡの放出は、胃中でインビボで行うpH調節についての代表である、pH２、３、４および５の緩衝培地で研究された。
【図１ｂ】実施例１で得られた結果に関し、そして様々の試験されたＴＧ（１ａ、ココナッツ油、１ｂ、ＭＣＴＧ１、１ｃ、ＭＣＴＧ２、１ｄ乳脂肪）および選択酵素についてのインビトロ放出ＭＣＦＡ（ｇ／１００ｇＴＧとして表される）を表す。コードされたＬ１〜Ｌ６までの酵素は、ＴＧに基づいて１０，０００ppmの用量で使用された。ＦＡの放出は、胃中でインビボで行うpH調節についての代表である、pH２、３、４および５の緩衝培地で研究された。
【図１ｃ】実施例１で得られた結果に関し、そして様々の試験されたＴＧ（１ａ、ココナッツ油、１ｂ、ＭＣＴＧ１、１ｃ、ＭＣＴＧ２、１ｄ乳脂肪）および選択酵素についてのインビトロ放出ＭＣＦＡ（ｇ／１００ｇＴＧとして表される）を表す。コードされたＬ１〜Ｌ６までの酵素は、ＴＧに基づいて１０，０００ppmの用量で使用された。ＦＡの放出は、胃中でインビボで行うpH調節についての代表である、pH２、３、４および５の緩衝培地で研究された。
【図１ｄ】実施例１で得られた結果に関し、そして様々の試験されたＴＧ（１ａ、ココナッツ油、１ｂ、ＭＣＴＧ１、１ｃ、ＭＣＴＧ２、１ｄ乳脂肪）および選択酵素についてのインビトロ放出ＭＣＦＡ（ｇ／１００ｇＴＧとして表される）を表す。コードされたＬ１〜Ｌ６までの酵素は、ＴＧに基づいて１０，０００ppmの用量で使用された。ＦＡの放出は、胃中でインビボで行うpH調節についての代表である、pH２、３、４および５の緩衝培地で研究された。
【図２】実施例２で得られた結果に関し、そしてカニューレ挿入されたブタの胃内容物中の総および選択性細菌数（ｌｏｇ10コロニー形成単位、新たな内容物ｇ当たりのＣＦＵとして表される）表す。２ａ、２ｂおよび２ｃは、それぞれ５％ココナッツ油、ＭＣＴＧ１および乳脂肪を用いた飼料についての結果を付与する。各図の第一の成分は、脂肪分解酵素なしに得られた結果を表し、第二および第三のブロックは、それぞれ、Ｌ２およびＬ５（飼料に基づいて１０００ppm）の添加を伴う結果を表す。第一の棒線は、総数であり、次の棒線は、ラクトバシリ、ストレプトコッキ（streptococci）および大腸菌の数である。結果は、各ＴＧを共に、酵素が、総数およびラクトバシリの数の減少を引起すことを示す。
【図３】実施例２で使用されたカニューレ挿入されたブタの胃内容物（ｇ／１００ｇ含量で）での脂質画分の分析の結果に関する。総ＦＡに対する遊離ＦＡの比率は、酵素なし（Ｖ１：ココナッツ油、Ｖ４：：ＭＣＴＧ１；Ｖ７：乳脂肪）に、またはＬ２またはＬ５（飼料に基づいて１０，０００ppm）の補足を伴って使用された様々なＴＧを伴う飼料に付与される。酵素なしに放出された遊離ＦＡは、外因性前十二指腸リパーゼの活性から生じる。結果は、使用された脂肪分解酵素が、試験された各ＴＧからの遊離ＦＡの放出を大いに増強することを示す。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ちょうど今頻繁に遭遇される問題を防止および／または緩和するために、動物飼料用の飼料補足物として少なくとも一種の外因性脂肪分解酵素（エステラーゼまたはリパーゼ）と組み合わせて、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）を含む少なくとも一種のトリグリセリド（ＴＧ）の使用に関する。
【００１２】
したがって、本発明は、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）を含む少なくとも一種のトリグリセリド（ＴＧ）、および少なくとも一種の外因性脂肪分解酵素（エステラーゼまたはリパーゼ）を包含する飼料補助組成物にも関する。
【００１３】
本発明による中鎖脂肪酸としては、Ｃ４（酪酸、ブタン酸）、Ｃ５（吉草酸）、Ｃ６（カプロン酸、ヘキサン酸）、Ｃ７（ヘプタン酸）、Ｃ８（カプリル酸、オクタン酸）、Ｃ９（ペラルゴン酸）、Ｃ１０（カプリン酸、デカン酸）、Ｃ１１（ウンデカン酸）またはＣ１２（ラウリン酸、ドデカン酸）を含む脂肪酸のような偶数および奇数の脂肪酸の両方が挙げられる。本発明によるＭＣＦＡトリグリセリド成分は、乳脂肪およびココナッツ油のような天然に存在するトリグリセリド含有組成物でありうる。または、上記トリグリセリド成分は、一種またはそれ以上の工業的に製造されたトリグリセリド、または天然に生じる、および工業的に製造されるトリグリセリドの混合物を包含しうる。上記トリグリセリドは、Ｃ４〜Ｃ１２までの鎖の脂肪酸のインターエステリフィケーションによって製造されうる。
【００１４】
中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの豊富な天然に生じる物質の例は、それに限定されないが、ココナッツ油、パームケメラ油、ババスーヤシ油、コフネヤシ油、タキューム油、植物種子から由来するキュプヘア油（cuphea oil）、ウマ、ラット、ヤギおよびウサギから得られるミルクのような哺乳類種のミルク、または乳脂肪が挙げられる。
【００１５】
中鎖脂肪酸を含有する化学的に合成された構造または既製のトリグリセリドの市販の源の例としては、それに制限されないが、表１０に示されるもの、または実施例の材料区分で例示されるものが挙げられる。
【００１６】
本発明による脂肪分解酵素成分は、リパーゼまたはエステラーゼ、リパーゼの混合物、またはエステラーゼの混合物、またはリパーゼとエステラーゼとの混合物が挙げられる。上記リパーゼまたはエステラーゼは、天然に生じるか、または工業的に製造されうる。上記脂肪分解酵素は、微生物、哺乳類または植物の起源から得られうる。
【００１７】
市販の植物リパーゼの例としては、それに限定されないが、小麦、ヒマシ油、西洋アブラナ、カラシおよびルピナスから得られるリパーゼが挙げられる。
【００１８】
市販で入手可能な微生物リパーゼの例としては、それに限定されないが、表１１に示されるとおりのリパーゼ、または実施例の材料区分で例示されるものが挙げられる。
【００１９】
市販で入手可能なエステラーゼの例としては、それに限定されないが、ウシ、子供、仔ヒツジの舌下組織の前胃エステラーゼ（ＰＧＥ）、ウシ、子供、仔ヒツジの満腹の第四胃から得られるレンネット、ウサギの肝臓から得られるエステラーゼ、またはブタ肝臓が挙げられる。
【００２０】
好ましくは、上に定義されたときの本発明による上記トリグリセリド成分は、飼料に約０．２５％〜約１０％までの濃度で添加される。
【００２１】
好ましくは、上記脂肪分解酵素成分は、飼料に約１００〜約１０，０００ppmまでの濃度で添加される。
【００２２】
本発明による飼料補足組成物の使用は、好ましくは、動物飼料用の、特に早期に離乳されたブタ用の飼料補足物としてである。しかし、本発明による飼料補足組成物の使用は、他の年齢カテゴリーのブタ用の飼料補足物としての、または他の型の動物についての飼料補足物としてのこのような組成物の使用を除外しない。
【００２３】
本発明は、好ましくは早期に離乳された仔ブタ用の飼料補足物の製造のための、本発明による少なくとも一種のＭＣＦＡ  ＴＧと少なくとも一種の脂肪分解酵素との組合せの使用にも関する。
【００２４】
本発明は、様々のＭＣＦＡ  ＴＧと本発明による脂肪分解酵素成分を一緒に混合する段階を特徴とする本発明による飼料補足物の製造の方法にも関する。
ＳＣＦＡ、ＭＣＦＡおよび他の有機酸が、抗微生物活性を発揮する機構は、文献で典拠を充分に示されている。最近の意見は、未解離の（ＲＣＯＯＨ＝イオン化されていない）酸が、脂質透過性で、そしてこの方法で、微生物細胞膜を通過でき、そして微生物のいっそうアルカリ性の内部で解離（ＲＣＯＯＨ→ＲＣＯＯ−＋Ｈ＋）することである。これは、生存するための透過性レベルより下で細胞内pHの酸性化を引起す。言い換えると、有機酸は、Ｈ＋の内向きの漏れを増大するプロトノホアとして作用し、その結果、流出は、再度細胞質をアルカリ化するために充分迅速でない。有機酸の物理化学的特徴は、プロトノホアとして作用するそれらの能力に大いに影響を及ぼす：（分子量、pKa（解離定数）、可溶性）。それらが存在する生理学上の環境（特に、胃腸管の様々の位置でのpH）は、非常に重要な因子でもある。さらに、微生物のエンベロープの型（主に、グラム＋でのペプチドグリカン、およびグラム−細菌でのリポ多糖）は、膜を通した酸の通過に大いに影響を及ぼす。
【００２５】
第一に、広範な有機酸（ＳＣＦＡ、ＭＣＦＡおよび飼料および食品業界で一般に使用された他の有機酸）が、小さな腸内微生物叢の優勢な細菌に対するそれらの抗細菌活性について予備インビトロ実験で試験された、本発明者らは、ＳＣＦＡおよび一般に使用される有機酸のみが、グラム−叢については高濃度（０．０２〜０．０４Mまで）で（そしてストレプトコッキについてはより少ない含量まで）静菌性であることを予想外に知見した。しかし、ＭＣＦＡを伴い、予想外に高い静菌および殺菌活性が、グラム＋およびグラム−細菌の両方で知見された。抗細菌活性は、pH依存性であり、そして低いpHで最高であり、したがって、比較的高い比率のＦＡが、未解離形態にある。同じ実験で、０．００５〜０．０１Mまでの推奨最小殺菌濃度が、提唱された。
【００２６】
さらに、予想外だったのは、ＭＣＦＡの組合せを使用することによって、集約的な動物生産で使用される抗生物質成長促進剤の抗細菌特性が、完全に模倣できることである。
【００２７】
容易に入手可能なエネルギー源としてのＭＣＴＧの特定の特徴が、典拠を充分に示される。それらの有益な効果は、以下のとおり概略されうる（ＢＡＣＨおよびＢＡＢＡＹＡＮ、１９８２年）：
−ＭＣＴＧは、消化、吸収され、そして消化および吸収が、最適でない疾患において迅速に輸送される。消化不良および吸収不良は、新たに離乳された仔ブタで頻繁に観察され、そしてほとんどの消化酵素の活性の急落によるものである。離乳直後の脂肪分解酵素の欠乏は、非常に顕著である。
−ＭＣＴＧは、生物で迅速に酸化され、そして大量であり、迅速に利用できるエネルギーの源である。しかし、高い用量が与えられるときに、麻酔性の副作用を示すＭＣＴＧは、ケトン原性である。この副作用は、仔ブタで確かに望ましくない。
【００２８】
さらに、ＣＣＫの活性化による、自発的飼料摂取における抑制的効果は、望まれていない。さらに、望まれていない（生産者および／または動物による）のは、比較的容易に蒸発する遊離ＭＣＦＡの強力な歓迎されない臭いである。
【００２９】
ＭＣＦＡの正の効果を得て、そして負の特徴を避けるために、発明者らは、充分なＭＣＦＡが、滅菌効果を示す胃で放出されるべきで、それにより小腸でより少ない細菌負荷を生じ、そして消化不調を防止するという意図で、飼料補足物として脂肪分解酵素と一緒に、充分なＭＣＦＡを含有するＴＧの組合せを使用する本来の概念を示した。ＭＣＦＡの特別に簡単に利用できるエネルギー、並びに外因性脂肪分解酵素による胃および小腸における天然のリパーゼ活性の補足と組合せたこの効果は、不必要な抗生物質を利用する成長促進で予想外に生じた。予想される遊離ＭＣＦＡの徐放および吸収は、歓迎されない副作用を予想外に避けた。
【００３０】
要約すると、本発明では、動物で使用するための、自然に成長を促進する飼料補足物の組成物が記述されている。
【００３１】
以下の実施例および図面は、単に本発明を示す役割を果すのみであり、そしてあらゆる手段で制限されることは意味されない。
【実施例】
【００３２】
材料
例えば、以下の脂肪（ＴＧ）は、本発明を例示するために選択された：それぞれ、乳脂肪、ココナッツ油、ならびにロンザ・インク．（米国ニュージャージー州０７０４１０、フェアー・ローン）により市販されたＭＣＴＧ：ＭＣＴＧ１（アルド・ＭＣＴコシャー・フード級）およびＭＣＴＧ２（スタビロックス−８６０）の２種の市販で入手可能な源。例えば、以下の脂肪分解酵素は、本発明を例示するために選択された：Ｌ１：リポザイム１０．０００Ｌ．ノボ・ノルディスクＡ／Ｓ、デンマーク国２８８０バッグスブァール；Ｌ２：リパーゼ１０．０００Ｐ、英連邦ウェールズ、ポンティプリッドのバイオカタリスツ・リミテッド．；Ｌ３：ＴＰ５１６Ｐ、英連邦ウェールズ、ＣＦ３７  ５ＵＴポンティプリッドのバイオカタリスツ・リミテッド；Ｌ４：ＬＩＰＯＭＯＤ２２４Ｐ、英連邦ウェールズ、ＣＦ３７  ５ＵＴポンティプリッドのバイオカタリスツ・リミテッド；リパーゼサイケン、日本国東京１０３、中央区のナガセ・アンド・シーオー．；Ｌ６：リパーゼ・イタラーゼＣ、米国ウィスコンシン州５３１８７−１６０９ワウケシャのＳＢＩ、システムズ・バイオ−インダストリーズ，インク．。コードＬ１〜Ｌ６までは、さらに使用される。これらの実施例中のＴＧおよび脂肪分解酵素の選択は、他のＴＧおよび脂肪分解酵素の強力な有用性、および本発明で記述される目的のために、それらの組合せを除外しない。
【００３３】
様々の脂肪化合物の抽出および分析の方法
それらの強い揮発性のため、ＭＣＦＡのあらゆる損失を避けるために、任意の溶媒蒸散工程を避けるヘキサン／イソプロパノール（３／２、ｖ／ｖ）を使用する脂質抽出手段が使用された。
【００３４】
短鎖エステルの損失または多不飽和の高いＦＡの改変なしに、イソプロピルエステル（ＦＡＩＰＥ）の形成と同じ抽出媒体中の酸（Ｈ２ＳＯ４）で触媒されたＦＡのエステリフィケーションが、使用された。ＦＡＩＰＥは、上部ヘキサン相で現れる。
濃度の計算のために、２種の内部標準（Ｃ４〜Ｃ１２までの酸に使用されるＣ９、およびＣ１４〜Ｃ１８：３までの酸に使用されるＣ１７）を使用した個々のＦＡＩＰＥの定量的キャピラリーカラム（ＤＢ−２２５、３０cm、ＩＤ０．２５mm、フィルム０．２５μm）ＧＬＣクロマトグラフィーが使用された。応答因子における変動の係数は、Ｃ９については０．９４％、およびＣ１７については２．５％に達した。
【００３５】
個々の遊離ＦＡは、強力な陰イオン交換樹脂アンバーリスト２６を用いた脂質抽出物から抽出させた後に、同じ媒体中でエステル化し、そしてキャピラリーＧＬＣ手段によって、１０１．９％に達した添加遊離ＦＡの回収物を分析した。
【００３６】
実施例１
様々なpHでの脂肪分解についてのＭＣＦＡ含有ＴＧおよび脂肪分解酵素のインビトロスクリーニング（胃の状態の刺激）
【００３７】
それらの市販の利用性および市販の設定で適した価格に基づいて、Ｌ１〜Ｌ６までにコードされた試験されるべき脂肪分解酵素の選択を行った。ＭＣＦＡ含有ＴＧは、表１で特定されるとおり脂肪中のそれらの特定のＭＣＦＡ含量に基づいて選択された。
【００３８】
【表１】
2011244826.tif 000002
【００３９】
様々のpHで緩衝された環境でインビトロインキュベーションが行われた；グリシン緩衝液が、pH２およびpH３でのインキュベーションのために使用された；酢酸緩衝液が、pH４およびpH５でのインキュベーションのために使用された。インキュベーションは、１８０分間、３７℃で、振盪水浴で行われた。インキュベーションのために使用されたパラメーターは、インキュベート内容物でのインビボ条件を可能な限り密接に刺激するために選択された。インキュベーションのために使用される培地は、以下の成分から製造された：０．２５０ｇの選択ＴＧ＋２．２５０ｇの合成飼料（澱粉、デキストロース、カゼインおよびビタミン−ミネラル予備混合物に基づいた）＋１０ml緩衝剤溶液＋０．５mlペプシン溶液（１００mlアクアデスト（aqua dest）中５０mg）＋１００００mg/kg脂肪（＝ppm）の選択された市販の脂肪分解酵素標品。必要であれば、脂肪は溶解され、さもなければ、特定の製造（分散または乳化）の脂肪はなかった。
【００４０】
インキュベーションの結果は、図１ａ〜１ｄで示され、それは、様々の試験ＴＧについて、ｇ／１００ｇＴＧでの放出されたＭＣＦＡを表す。加水分解活性は、酵素の各々を用いて、pH３〜５で最高であったが、そしてそれは、ブタの胃でインビボで正常に起るpHと充分に適合する。放出された遊離ＭＣＦＡの量は、ＴＧの当初の源に存在する量に依存するようである。放出されるＭＣＦＡの量は、ココナッツ油で±３．５％、２種のＭＣＴＧで１０〜１５％、そして乳脂肪で±０．５％であった。
【００４１】
実施例２
内因性および外因性脂肪分解酵素によるインサイチューＭＣＦＡでの放出の研究についての、胃のカニューレ挿入されたブタを用いたインビボ実験
【００４２】
±８．５kgの当初の体重を示す３種のブタ（ベルギー・ランドレース、ストレス陰性、メス）を、DECUYPEREら（1977年）の技術を使用して、胃のカニューレを用いて作成した。カニューレを、底部領域中の主要な湾曲の中ほどに置いた。
三種のＴＧ（各々、ココナッツ油、ＭＣＴＧ１および乳脂肪）および二種のリパーゼ（Ｌ２およびＬ５）は、本実験について選択された。
選択リパーゼで完全に、または完全ではなく補足された５％の選択された（結局溶解した）ＴＧと共に、仔ブタ用の９５％の市販飼料を使用して、９種の飼料が製造された（さらに使用されるコードについては表２参照）。脂肪は、ミールに単に注がれ、そして水平混合機で充分に混合された。リパーゼの濃度は、飼料中の１０００ppmの市販標品であった。
【００４３】
【表２】
2011244826.tif 000003
【００４４】
仔ブタ飼料の消費は、トウモロコシ、大麦、乾燥酸乳漿、カッサバ、ニシンの肉、大豆油に基づき、そしてビタミン−ミネラル予備混合物を補足した。飼料は、成長促進補足物を含有しなかった。示されるとおり％での飼料の直前分析（Ｖ１、Ｖ４およびＶ７）は、ＤＭ：９０．６、９０．７および９０．８；総灰分：７．８、７．９および８．５；粗タンパク質：１５．１、１５．４および１４．８；粗脂質：８．５、８．３および８．３であった。
【００４５】
飼料は、３回の等しい食事（９、１３および１７時間）で、匹敵する体重を示すブタの８５％の任意の摂取で、乾燥で与えられた。
実験は、３×３ラテン方挌法を示した。
【００４６】
実験は、首尾のよい経過を示した。健康問題も、飼料拒絶もなかった。統計学が、ＡＮＯＶＡ（1997年）を使用して行われ、差異は、ｐ＜０．０１〜ｐ＜０．０５（＊＊）またはｐ＜０．１（＊）であった。
【００４７】
化学分析のための胃内容物のサンプル採取を、継続した２日間で、毎日２回、９時間および１３時間の食事の後３０分に行った。pHは、直接測定され、その後、サンプルを、さらなる分析まで−２０℃で保存した。
【００４８】
細菌学上の分析のために胃内容物のサンプル採取は、１日じゅう、９時間および１３時間の食事の後９０分に行った。細菌計数は、VAN DER HEYDEら（1964年）の技術を用いて行った。使用された培地（全て、英連邦のOXOIDから得た）は、総計数（４８時間、嫌気性微生物）についてはＲＣＭ寒天＋ヘミン、ラクトバシリ（４８時間、嫌気性微生物）についてはロゴサ寒天、表面ストレプトコッキ（２４時間、好気性微生物）についてはスラネッツ・アンド・バートレイの寒天、および大腸菌（２４時間、好気性微生物）についてはＥＭＡ寒天であった。全てのインキュベーションは、３７℃であった。結果は、log10 CFU/g新鮮含量（コロニー形成単位）として表される。
【００４９】
実験の結果は、以下のとおり要約されうる：
給餌の３０分および９０分後に測定された胃内容物のpHは、処置（飼料）で異ならず、そして４．２および５．０１の間の範囲に入った。これは、最初の実験で見られたとおり、Ｌ２およびＬ５の脂肪分解についての最適な範囲内であった。
細菌学上の計数の結果は、表３および図２に表される。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
最も重要な結果は、
−ココナッツ油を用い、Ｌ２およびＬ５の両方が、１０倍、総数およびラクトバシリの数を減少させた。
−ＭＣＴＧ１を用い、両方の酵素は、非常に際立った（主に、ｐ＜０．００１）効果を示し、そして因子１００〜１０００までの総数およびラクトバシリを減少させた；ストレプトコッキおよび大腸菌は、非検出レベルに主に減少した。
−乳脂肪を用い、総数およびストレプトコッキの数で１０倍の減少があった。
【００５２】
結果は、飼料中のＭＣＦＡ含有ＴＧおよび脂肪分解酵素の組合せが、総細菌数および優勢なフローラを抑制する能力があるという結論を可能にする。この効果は、最も、使用されたＴＧからの遊離ＭＣＦＡの放出によるようである。
【００５３】
本実験中に収集された胃内容物における様々な脂肪分画の化学的分析によって、この主張が確認された。分析の結果は、１００ｇ新鮮胃内容物での総および遊離ＦＡの量が表された図３に示される。
【００５４】
胃内容物中、または言い換えればＴＧの加水分解の程度（％）は、１００ｇ総ＦＡ当たりｇ遊離ＦＡとして表され結果は、表４に示される。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
個々のＦＡ（ここには示されず）についての結果は、特定のＦＡの優先放出はないことを示した；言い換えると、個々のＦＡの放出は、使用されるＴＧでのそれらの含量におよそ比例している。図３および表１に示される結果以外に、仔ブタの胃における内因性脂肪分解活性が、±１６−１９％のＴＧを加水分解すると結論されうる。外因性脂肪分解酵素の添加は、約三倍加水分解を増大させる。
【００５７】
ＭＣＦＡの放出が、胃の中の細菌負荷の抑制の程度と平行して起ることは、強烈で、そして予想外である：最も有効な抑制は、ＭＣＴＧ１＋Ｌ５の組合せで観察され、そしてそれは、胃の中のＴＧの６０．９％加水分解（±１％の遊離ＦＡおよび０．６％のＭＣＦＡの濃度に対応する）、続いてココナッツ油＋Ｌ５（０．８％ＦＡ酸および０．３％ＭＣＦＡ）および乳脂肪＋Ｌ５（０．８％遊離ＦＡおよび０．０５％ＭＣＦＡ）を引起した。
【００５８】
実施例３
市販の設定での畜産学の実験：胃内容物でのエキソビボ観察と組合せた成長作用
この実験の目的は、上に明記した概念が、市販の設定で使用可能で、適切であるかどうかを調べること、および成長促進が得られたときに、これが、抗生物質、または保証された効力を示す有機酸の組合せを用いて、早期に離乳された仔ブタで得られた成長促進に匹敵するかどうかを調べることである。
【００５９】
この実験について、２４４匹の新たに離乳した仔ブタ（セグハーのハイブリッドＦ１、当初の体重±６．５kg）を、一腹、性別および体重によって４つのグループに分割された；Ａ：６８；Ｂ＝６１；Ｃ＝６０およびＤ＝５５頭の仔ブタ。実験は、温度制御設備において市販の設定で行われた。
【００６０】
使用された飼料の組成物は、大麦、小麦、トウモロコシ、フレーク、押出しトウモロコシ、押出し大豆、大豆粉、ニシンの身、２．５％ＴＧおよび早期に離乳された仔ブタ（１２．５％）についての市販の予備混合物（主に、ミルク製品、ビタミン＋ミネラルに基づいて）に基づいた。処置（Ａ〜Ｄまで）は、使用したＴＧおよび使用した添加剤で異なった（表５参照）。飼料は、成長促進抗生物質を含まない。飼料Ａは、負の対照で、飼料Ｄは、一般に使用される有機酸の混合物を含む正の対照であった。使用された飼料の計算された直前の分析は、均等化された。処方された内容は、（新たな％）：ＤＭ：９０．０〜８８．８、粗タンパク質：１８．７〜１８．９、粗脂質６．９、総灰分：５．１−５．３であった。エネルギー内容は、（Ｎｅｆ９７）：２４６３−２４７５kcal/kgであり、回腸の消化性アミノ酸は、Ｌｙｓ：１．０７％、Ｍｅｔ＋Ｃｙｓ：０．６５、Ｔｈｒｅ：０．６６、Ｔｒｙ０．１９で設定された。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
飼料は、脂肪および他の液体補足物のためのスプレー装置を使用する市販の飼料会社によって製造された。飼料は、任意に乾燥に供された；水は、ニップルを介して継続的に利用できた。
実験は３週間続いた。仔ブタは、実験の開始時およびその後毎週秤量した；飼料摂取は、２つの畜舎（±１５の各仔ブタに２つの畜舎についての結合供給ホッパー）当たり毎日記録された。したがって、統計学のみが、秤量のために役立ち得た。畜舎当たりのブタの目視の健康状態は、毎日調べられ、そして０（非常に悪い）〜１０（素晴らしい）までのスケールでコード付けされた。
毎週ベーズでの畜産学の結果は、表６に表される。
【００６３】
【表６】
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【００６４】
目視の健康スコアー（詳細には示されず）は、処置Ａで４と９の間の範囲にある；他方の処置については、範囲は、明確な差異なしに８〜９であった。
毎日成長は、処置ＡおよびＤの間、並びにＢおよびＣの間で異ならなかった。最も顕著な差異は、最高の成長作用（対照より±３０％を加える）が、処置ＢおよびＣで得られる離乳の後の最初の２週で得られた。飼料ＢおよびＣ（リパーゼなし、またはと共にＭＣＴＧ２）で得られたよい結果は、飼料摂取の増加による。しかし、最高の飼料変換は、ＭＣＴＧ２＋リパーゼを含有する飼料で得られた。ＭＣＦＡ  ＴＧ（ＭＣＴＧ２）およびリパーゼの組合せを用いた成長の改善は、キノキサリン（グラム＋およびグラム−特性の両方を有する添加剤）で得られたのと同じ範囲にあった（デキュペレ（Decuypere）、文献データのメタ分析、未公表結果）。
離乳の２週間後に、各実験群の５頭の去勢した雄ブタを、安楽死させた。ブタが、任意に給餌されたので、飼料摂取の制御はなかった。胃腸管の切断の後、サンプルを、胃および上部（十二指腸）小腸から取り出した。サンプルを、先の実験で説明されたのと同じ方法で、化学的に、そして細菌学的に分析した。ただ、総嫌気性生物数のみが、ここで報告される。
【００６５】
胃腸内容物のpHは、±３．５であり、十二指腸で±５．７であった；処置の間で差異はなかった。総嫌気性生物数は、表７に報告される。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
結果は、ＭＣＦＡ  ＴＧ（ＭＣＴＧ２）およびリパーゼ（Ｌ５）を組合せた飼料が、胃および上部腸の両方で、微生物学上の負荷の有意な±１０倍抑制を引起したことを示す。その効果が、胃のカニューレ挿入ブタを用いた先の実験でよりもある程度低かったことは、本実験で使用したＭＣＴＧの量が低いこと（２．５％対５％）および／または給餌およびサンプル採取手段の違いに起因しうる。それにもかかわらず、本実験では、実施例３で報告されたカニューレ挿入したブタで得られた結果が確認された。胃内容物における様々の脂肪分画（ｇ／１００ｇ新鮮内容物）の分析の結果、および加水分解の程度（ｇ遊離ＦＡ／１００ｇ総ＦＡ）についても同様にいうことができ、それは表８で示される。
【００６８】
【表８】
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【００６９】
加水分解率（％）についての結果以外に、飼料Ｂ（ＭＣＴＧ２）およびＣ（ＭＣＴＧ２＋Ｌ５）について、それぞれ、０．３および０．４％遊離ＭＣＦＡが、胃に存在すると計算されうる。カニューレ挿入されたブタを用いた実験では、最も高濃度の遊離ＭＣＦＡ（および細菌負荷の最強の阻害、±１００倍）が、ＭＣＴＧ１＋Ｌ５およびココナッツ油＋Ｌ５を用いて、それぞれ０．６０および０．３０％で得られた。
実施例２および３の組合せた結果は、放出された遊離ＭＣＦＡの量と、胃叢における阻害効果の間に相関関係があることを明かに示す。
実施例４
様々な用量の選択された脂肪分解酵素と、様々な濃度のＭＣＴＧの最適な組合せのインビトロ評価
成長促進が、小腸での総細菌負荷の阻害に関連し、そして比例するというのが、我々の意見であるので、以下のインビトロ実験では、ＭＣＦＡ含有ＴＧ（ＭＣＴＧ１、ＭＣＴＧ２およびココナッツ油）の含有量と保証された有効なリパーゼ（Ｌ５）との±最適な組合せが設定された。
４つの濃度のＴＧが用いられた：０．２５、５および１０％；各濃度のＴＧについて、リパーゼ（Ｌ５）は、１０，０００、１０００、１００ppmで組込まれた。培地はまた、実験１で使用されたものと、同じ合成飼料をインキュベーションフラスコ当たり２．５ｇ（澱粉、デキストロース、カゼインおよびビタミン−ミネラル予備混合物に基づいて）で含んだ。しかし、本実験では、ＴＧは、培地に添加する前に分散された（アラビアゴムおよびトラカントゴムを使用した）。インキュベーションは、適切な酢酸緩衝剤を使用してpH５で行われた。最終的に、培地（１５ml）に、成長促進添加剤なしの食餌を給餌した２頭のカニューレ挿入ブタの回腸内容物に由来する細菌の１mlの懸濁液を接種した。インキュベーションは、１８０分間、３７℃で、振盪水浴で行われた。全てのインキュベーションは、二重に行われた。
脂肪および細菌数を分析する方法は、先の実験で使用されたものと同じであった。総嫌気性生物数のみが、ここに報告される。抗細菌活性とＦＡの分子量との関係が、予測されるので、遊離脂肪酸についての結果は、モルベースでも表わされた。結果は、表９に示される。
【００７０】
【表９】
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【００７１】
結果は、以下のとおり要約されうる：
放出されたＦＡの量が、ＴＧの濃度にほぼ比例した一方で、使用された脂肪分解酵素の用量の１０倍増加は、遊離ＦＡの濃度を倍にしたのみである。ＴＧ含有率（％）と所定ppmの脂肪分解酵素との各組み合わせについて、ＦＡの放出は、ＭＣＴＧ１＞ＭＣＴＧ２＞ココナッツ油の順に従った。
遊離ＦＡの濃度が高いほど、細菌の数の抑制はいっそう顕著になった。±０．３５ｇ％ＦＡの最小濃度を培地は、叢の明らかな抑制のために必要としたようである；これは、０．０２５M／リットルに対応する。ＭＣＴＧ１＞ＭＣＴＧ２＞ココナッツ油の順は、ＴＧ中の定量的に最も重要なＭＣＦＡの分子量の増加に対応した：ＭＣＴＧ１＝Ｃ８、ＭＣＴＧ２＝Ｃ１０、ココナッツ油＝Ｃ１２。
使用されたインビトロプロトコールは、胃腸の微生物叢における安定化または抑制効果を有する飼料補足物としての、有用性についての、ＭＣＦＡ含有ＴＧおよび利用できる脂肪分解酵素の膨大な組合せのスクリーニングのための優れた道具を供与する。この効果は、一般に、成長促進を得るための基本として受入られる。
【００７２】
【表１０】
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【００７３】
【表１１】
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【００７４】
【表１２】
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【００７５】
【表１３】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
1. Title of the Invention
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2. Detailed Description of the Invention
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1. Claims
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1. Abstract
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2. Representative Drawing
None
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