(57)【要約】【課題】  枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸が配合されたウイルス及び細菌の不活化剤で、且つ免疫賦活効果及び抗酸化効果を有する不活化剤からなる飼料を鳥に与えることにより、不活化剤自体が有する抗ウイルス効果、抗菌効果によりウイルス及び細菌を不活化するとともに、該不活化剤によって鳥自身の免疫を賦活化することにより、鳥のウイルス及び細菌に対する抵抗性を高めて、ウイルス感染及び細菌感染を簡便に防止することを課題とする。【解決手段】  枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤、プロポリス、クエン酸が配合された不活化剤であり、ウイルス及び細菌を不活化することを特徴とする不活化剤を提供する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤、プロポリス、クエン酸が配合された不活化剤であり、ウイルス及び細菌を不活化することを特徴とする不活化剤。
【請求項２】
前記不活化剤が免疫賦活化効果を有することを特徴とする請求項１に記載の不活化剤。
【請求項３】
前記不活化剤が抗酸化効果を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の不活化剤。
【請求項４】
前記ウイルスがＨ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の不活化剤。
【請求項５】
前記細菌がウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）であることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の不活化剤。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載の不活化剤からなることを特徴とする鳥用飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸を配合してなり、ウイルス及び細菌を不活化する不活化剤、及び該不活化剤からなる鳥用飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
鳥インフルエンザは鳥インフルエンザウイルスの感染による家禽類を含む鳥類の疾病であり、病勢から低病原性ウイルスと高病原性ウイルスとに大別される。高病原性ウイルスが発症すると全身症状を起こし、大量死する可能性がある。日本ではＨ５亜型、Ｈ７亜型のウイルスを高病原性鳥インフルエンザとしている。本来ウイルスの宿主域は限定され、哺乳類に感染するウイルスは哺乳類のみ、鳥類に感染するウイルスは鳥類のみというのが通常であるが、鳥インフルエンザウイルスは鳥類のみならず、哺乳類にも感染することができる広い宿主域をもつウイルスである。さらに鳥インフルエンザウイルスは変異することで将来、ヒトからヒトへの感染が起こることが危惧されており、国際的にも監視が強まっている。
【０００３】
鳥インフルエンザウイルスは適切な加熱によって死滅するとされており、ＷＨＯ（世界保健機関）は食品の中心温度を７０度に達するよう加熱することを推奨している。
また、鳥インフルエンザの感染拡大を防止する対策としては、養鶏場における野鳥の侵入防止、スクリーニングの実施などによるウイルス侵入の早期発見、不活化ワクチンの使用、鳥インフルエンザウイルスの浄化を目的とした消毒などがある。
【０００４】
特許文献１には、ヨウ素とシクロデキストリンとを含有する溶液が鳥インフルエンザウイルスの不活化に効果があることが記載されている。しかしながらこの溶液は消毒剤であるため、鳥インフルエンザウイルスが付着し得る場所すべてに該溶液を噴霧等しなければならず費用がかかり効率が悪いものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−３２８０３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸が配合されたウイルス及び細菌の不活化剤で、且つ免疫賦活効果及び抗酸化効果を有する不活化剤からなる飼料を鳥に与えることにより、不活化剤自体が有する抗ウイルス効果、抗菌効果によりウイルス及び細菌を不活化するとともに、該不活化剤によって鳥自身の免疫を賦活化することにより、鳥のウイルス及び細菌に対する抵抗性を高めて、ウイルス感染及び細菌感染を簡便に防止することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に係る発明は、枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤、プロポリス、クエン酸が配合された不活化剤であり、ウイルス及び細菌を不活化することを特徴とする不活化剤に関する。
請求項２に係る発明は、前記不活化剤が免疫賦活化効果を有することを特徴とする請求項１に記載の不活化剤に関する。
請求項３に係る発明は、前記不活化剤が抗酸化効果を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の不活化剤に関する。
請求項４に係る発明は、前記ウイルスがＨ５Ｎ１型鳥インフルエンザウイルスであることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の不活化剤に関する。
請求項５に係る発明は、前記細菌がウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）であることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の不活化剤に関する。
請求項６に係る発明は、請求項１乃至５いずれかに記載の不活化剤からなることを特徴とする鳥用飼料に関する。
【発明の効果】
【０００８】
請求項１に係る発明によれば、枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸が配合されたウイルス及び細菌の不活化剤であるため、人体及び鳥類において安全にウイルス及び細菌を不活化することができる。
【０００９】
請求項２及び３に係る発明によれば、枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸が配合されたウイルス及び細菌の不活化剤であり、プロポリス及びクエン酸の配合量が少なくても、ウイルス及び細菌を直接的に不活化することができるとともに、該不活化剤の鳥類の免疫を賦活化する効果及び抗酸化効果により鳥類のウイルスや細菌に対する抵抗性を高めることができるので、体内に侵入したウイルス及び細菌の増殖を抑制し、感染を防ぐことができる。
【００１０】
請求項４に係る発明によれば、高病原性であるＨ５Ｎ１型の鳥インフルエンザを不活化することができるので、家禽類を含む鳥類の高病原性鳥インフルエンザ感染による大量死を防ぐことができる。
【００１１】
請求項５に係る発明によれば、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）を不活化して、増殖を抑制することができるので、ウェルシュ菌によって引き起こされるガス壊疽、出血性腸炎、エンテロトキセミア、食中毒等の症状を抑制することができる。
【００１２】
請求項６に係る発明によれば、枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸を配合したウイルス及び細菌の不活化剤であり且つ免疫賦活効果及び抗酸化効果を有する不活化剤からなる鳥用飼料であることから、該飼料を鳥類に毎日摂取させるという簡便な方法により、ウイルス及び細菌を直接不活化するとともに免疫賦活効果及び抗酸化効果により体内に侵入したウイルスや菌に対する抵抗性を向上させてウイルスや細菌に感染し難くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の飼料を与えた場合の白血球数の変化を表わした図である。
【図２】本発明の飼料を与えた場合のリンパ球数の変化を表わした図である。
【図３】本発明の飼料を与えた場合の単球数の変化を表わした図である。
【図４】本発明の飼料を与えた場合の抗酸化作用の変化を表わした図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸が配合されてなるウイルス及び細菌の不活化剤及び該不活化剤からなる鳥用飼料であり、ウイルス及び細菌を直接的に不活化することができるとともに、該不活化剤を鳥類が飼料として摂取することで免疫を賦活化するとともに抗酸化効果も有しているため家禽類を含む鳥類のウイルスや細菌に対する抵抗性を高めることができる。
つまり、本発明に係るウイルス及び細菌の不活化剤は、毎日摂取させるという簡便な方法でウイルス及び細菌を直接的に不活化し、また、鳥類の免疫を賦活化して体内に侵入したウイルス及び細菌の増殖を抑制するため、家禽類を含む鳥類がウイルスまたは細菌に感染することを防ぐことができる。
【００１５】
本発明に係る枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤について説明する。
本発明に係る枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤の原料比を表１に示す。
製造方法は表１中の１の成分を発酵機に投入し、発酵させた後、２の成分を追加することによって製造することができる。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
本発明に係る枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤として、ＴＯＰ ＢＩＯ（商品名  株式会社トーワ社製）を用いることもできる。
【００１８】
本発明に係るプロポリスとは、セイヨウミツバチの巣の巣壁を構成する樹脂状ないしは蝋状の物質であって、ミツバチが周辺の植物から採取してきた樹脂や植物体とミツバチの分泌物の混合物である。
プロポリス中の有機成分としてはフラボノイドに含まれるフラボン（アピゲニン、クリシン、アカセチン）、フラボノール（ケムフェロール、ケルセチン、クェルシトリン）、フラバン（イソサクラネチン、ピノストロビン）、フェノール酸類に含まれるカフェ酸、桂皮酸、p−クマル酸、クマリン類に属するスコポレチン、エスケクレチン、芳香性アルデヒド類に含まれるバニリン、イソバニリン、酵素類に含まれるパロチン、抗腫瘍性物質に含まれるアルテピリンC、テルペノイドを挙げることができる。
【００１９】
本発明において使用されるプロポリスの産地は特に限定されないが、ブラジル産、中国産、日本産、オーストラリア産等のプロポリスが好適に用いられる。また、産地の異なるプロポリスを混合して用いることもできる。
【００２０】
本発明において枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とプロポリスとクエン酸の配合率は適宜変更することができるが、枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤：プロポリス：クエン酸＝９８．９：１：０．１の割合で配合することが好ましい。
枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤を配合することによりプロポリスとクエン酸の量を少量にしてもウイルス及び細菌の感染を防ぐことができる。
【００２１】
本発明に係るクエン酸とはＣ６Ｈ８Ｏ７の化合物であり分子量は１９２である。化学式を以下に示す。
【００２２】
【化１】
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【００２３】
クエン酸は未熟のダイダイ、レモンに特に多く（６〜７％）、またスグリ、サトウダイコン、多くの花や植物の種子、果汁中に遊離の状態で含まれる物質である。
【００２４】
本発明が不活化するウイルスはＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス等限定されないが、特にＲＮＡウイルスに属する鳥インフルエンザウイルスに好適に用いることができる。
【００２５】
本発明が有効な鳥インフルエンザウイルスとしては限定がないが、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の抗原サブタイプ１〜１５のいずれか１種と、ＮＡ（ｎｅｕｒａｍｉｎｄｉａｓｅ）の抗原サブタイプ１〜９のいずれか１種とを有するものを例示することができる。特に高病原性鳥インフルエンザウイルスであるＨ５Ｎ１型に好適に用いることができる。
【００２６】
本発明が不活化することができる菌はグラム陽性菌、グラム陰性菌、好気性菌、嫌気性菌など、限定されないが、特にウェルシュ菌及び大腸菌に好適に用いられる。
【００２７】
本発明に係る飼料は通常の飼料と同様の方法にて鳥類に与えることができる。
【実施例】
【００２８】
以下実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本実施例では枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤としてＴＯＰ ＢＩＯ（商品名  株式会社トーワ社製）を用いた。
【００２９】
（実施例１：本発明に係る不活化剤のウイルス及び菌の不活化効果について）
（鳥インフルエンザウイルス不活化効果について）
コントロール群、プロポリス群、クエン酸群、ＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸配合群の４つのグループに分け、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）の消失率を測定した。
【００３０】
鳥インフルエンザウィルス（Ｈ５Ｎ１）はDepartment of Biological Science, Sungkyunkwan University, Koreaから入手した。
鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）の消失率は電子顕微鏡により細胞カウンターを用いて計測した。
【００３１】
結果を表２に示す。
表２より、コントロールでは鳥インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）の消失率が０パーセントであったのに対して、ＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸配合群（ｍｉｘと称する）では、８８．５７％と高い抗ウイルス作用を示すことが確認された。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
（鳥インフルエンザウイルス感染に対する予防効果について）
隔離された養鶏場にて、ニワトリをコントロール群、プロポリス群、クエン酸群、Ｔｏｐ Ｂｉｏ＋プロポリス＋クエン酸配合群の４つのグループに分け、２ヶ月以上それぞれの飼料を摂取させた後、鳥インフルエンザウィルス（Ｈ５Ｎ１）を感染させ、その後感染率を調べた。結果を表３に示す。この結果よりコントロール群に比べてＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸配合群の飼料を摂取したニワトリの感染率は有意に低い値であることが確認された。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
（細菌類の不活化効果について）
＜寒天平板反転法による細菌成育抑制作用の測定＞
ウェルシュ菌の遊走能抑制のため寒天濃度を３％に調整し、コントロール、プロポリスのみ、クエン酸のみ、ＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸を夫々配合したＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン社）を作製した。ウェルシュ菌、グラム陽性菌及び大腸菌を夫々の寒天培地に白金耳で画線塗抹して、好気的条件下で３５℃、２４時間培養した。その後、寒天を、スパーテルを用いて無菌的に裏返し、ウェルシュ菌、グラム陽性菌及び大腸菌を画線塗抹して、さらに３５℃で２４時間〜４８時間培養し、ウェルシュ菌、グラム陽性菌及び大腸菌の発育阻止直径を測定した。ここでは便宜的に、夫々の菌との交点付近において菌が寸断なく発育したもの、および菌の発育が1コロニーも認められない部分が１０ｍｍ未満のものを発育抑制作用（−）とし、発育阻止直径が１０ｍｍ以上のものを発育抑制作用（＋）の菌株とした。また、２４時間、４８時間培養での比較も行った。
菌の消失率はバイオ専用顕微鏡を用いて計測した。
【００３６】
結果を表４に示す。この結果よりコントロールに対してＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸を配合した培地に、ウェルシュ菌、グラム陽性菌、大腸菌の全てにおいて抗菌活性があることが示された。
【００３７】
【表４】
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【００３８】
＜寒天平板重層法による細菌類の生育抑制作用の測定＞
直径１５０ｍｍのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン社）の表面にウェルシュ菌をＮＣＣＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、米国臨床検査標準委員会)に準じた菌量（１０８ｃｆｕ／ｍｌ）を塗抹し２４時間３５℃で培養後、直径８５ｍｍの５％ヒツジ脱繊維素血液添加Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地を乗せ、その表面にウェルシュ菌をＮＣＣＬＳに準じた菌量を塗抹し、コントロール群、プロポリス群、クエン酸群、ＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸配合群の感受性ディスクを置いて２４時間３５℃で培養し、阻止円直径を測定した。
コントロールとして、菌類を塗抹していないＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天培地の上に５％ヒツジ脱繊維素血液添加Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ 寒天培地を乗せ、ウェルシュ菌をＮＣＣＬＳに準じた菌量を塗抹し、感受性ディスクを置いて阻止円直径を測定した。
ウェルシュ菌と同様の方法により、グラム陽性菌、大腸菌についても阻止円直径を測定した。
阻止円直径の統計学的有意差の検定は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を用いた。
菌の消失率はバイオ専用顕微鏡を用いて計測した。
【００３９】
結果を表５に示す。この結果よりコントロールに対してＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸を配合した感受性ディスクにウェルシュ菌、グラム陽性菌、大腸菌の全てにおいて抗菌活性があることが示された。
【００４０】
【表５】
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【００４１】
（実施例２：本発明に係る飼料の免疫賦活作用について）
本発明に係るＴＯＰ ＢＩＯにプロポリスとクエン酸を配合した飼料のｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫効果について検討した。
免疫効果を考える上で、指標となるものの一つに血球細胞がある。造血組織や末梢血球細胞のリンパ球は放射線感受性が高くまた、白血球や骨髄細胞の減少によって引き起こされる免疫力の低下は顕著である。従って免疫低下が血球細胞に及ぼす影響を正確に把握することが重要となる。
このことから本研究では、ＴＯＰ ＢＩＯにプロポリスとクエン酸を配合した飼料の抗酸化作用、免疫賦活作用に着目し、末梢血液中の血球数への影響を調べると共にＴリンパ球のサブセットおよび抗酸化作用の測定を行い、免疫増強のメカニズムを検討した。
【００４２】
（実験材料）
実験動物には、ＩＣＲマウス雄５週齢（日本クレア株式会社、東京）を用いた。１１日の予備飼育後、実験を開始した。その後、コントロール群、Ｘ線２Ｇｙ照射群、ＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス＋クエン酸配合群投与群(以下ｍｉｘ群と称する)、ＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス+クエン酸配合群投与＋Ｘ線２Ｇｙ照射群(以下ｍｉｘ+２Ｇｙ照射群と称する)の計４群に分類した。
【００４３】
（投与方法）
ＴＯＰ ＢＩＯ＋プロポリス+クエン酸の混合比が、９８．９：１：０．１の混合物を濃度５００ｍｇ/ｋｇで、ｍｉｘ群、ｍｉｘ＋２Ｇｙ照射群に毎日胃ゾンデ法により強制経口投与した。
コントロール群、２Ｇｙ単独照射群には同量の蒸留水をｍｉｘ群、ｍｉｘ＋２Ｇｙ照射群と同様に投与を行った。
投与量は体重変化により、変化するので３日おきに体重測定を行い、体重に適した量のＴＯＰ ＢＩＯにプロポリスとクエン酸を混合した混合物または蒸留水を投与した。
【００４４】
（照射方法）
投与開始２週間後、照射群に、フィリップスＸ線照射装置(２２５ｋＶ)を用いて、２Ｇｙ線量率(０．３５Ｇｙ/ｍｉｎ)で、全身照射を行った。
【００４５】
（血球数測定）
尾静脈採血については、スピッツメスを用いて固定したマウスの尾静脈を切開して１０μｌ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｐｉｐｅｔｓ （Ｄｏｒａｍｏｎｄ製)にて採血を行い、自動血球測定器（Ｃｅｌｌｔａｃ−α  ＭＥＫ−６３１８、日本光電社製）を用い、血球数の測定を行った。測定は、経時的変化を観測するために、非照射群については、投与前、投与開始２，４，６，８週後に行い、照射群については照射前日、照射３，１２，２４時間後、３，７，１４，３０日後に行った。
【００４６】
（結果）
＜白血球数の変化＞
白血球数の変化を図１に示した。この結果より、コントロール群と比べてｍｉｘ群は４週目に白血球が有意な差をもって増加することが確認された。
【００４７】
＜リンパ球数の変化＞
リンパ球数の変化を図２に示した。この結果より、コントロール群と比べてｍｉｘ群は４週目にリンパ球が有意な差を持って増加することが確認された。
【００４８】
＜単球数の変化＞
単球数の変化を図３に示した。この結果よりコントロール群と比べて、ｍｉｘ群は６週目に単球数が上昇することが確認された。
【００４９】
＜ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞（ＣＤ１６）数の変化＞
非照射群のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞（ＣＤ１６）数の投与４週間後の測定結果を表６に示した。この結果より、コントロール群に比べてｍｉｘ群のＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞（ＣＤ１６）数の上昇が確認された。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
（実施例３：本発明に係る飼料の抗酸化作用について）
＜ＳＯＤ様活性測定＞
スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）は活性酸素を除去する酵素であり、本発明に係るＴＯＰ ＢＩＯにクエン酸とプロポリスを混合した混合物のＳＯＤ様活性を測定した。ＳＯＤ様活性測定には、ＳＯＤテストワコー（和光純薬工業株式会社製）を用いた。測定原理としては、キサンチン（ＸＡ）にキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）が作用するとＯ２−ラジカルが生成する。生成したＯ２−ラジカルは共存するＮＯ２−ＴＢとの反応に基づくジホルマザン形成の減少の程度を、阻害率として求めることにより、試料中のＳＯＤ活性値を求める。
【００５２】
マウスの眼底よりヘマトクリット毛細管を用いて採血した血液を、キャピタリー遠心分離機にかけて血清を分離した。得られた血清８μＬに発光試薬８０μＬと酵素液８０μＬを加え３７℃で２０分間加温した。その後、反応停止液１．６ｍＬを加えＭＵＬＴＩＳＫＡＮ ＪＸ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）により吸光度を測定し、ＳＯＤ活性値（阻害率％）を求めた。
【００５３】
結果を図４に示す。この結果よりコントロールに比べてｍｉｘ群の方がＳＯＤ様活性が高く、抗酸化作用があることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は枯草菌の発酵成分を含む生菌製剤とクエン酸とプロポリスとが配合されたウイルス及び細菌の不活化剤からなる飼料を鳥に与えることにより、該飼料自体の抗ウイルス及び抗菌効果によりウイルス及び細菌を不活化するとともに、該飼料を与えた鳥の免疫力を賦活化することによって鳥のウイルス及び細菌に対する抵抗性を高めることにより、家禽類を含む鳥類のウイルス感染及び細菌感染を簡便に防止することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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