(57)【要約】      （修正有）【課題】オーロラカイネースＡ及びＢの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子発現抑制剤、制癌剤を含むオーロラカイネースＡ及びＢ関連疾患の治療剤等を提供する。【解決手段】Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−１００〜−７０の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。【選択図】図２
2011026203.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＡ（以下ｈＡＵＲＫＡとも言う）プロモーターの塩基配列−１００〜−７０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【請求項２】
更にβアラニン単位を含む請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子発現抑制のための請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
ヒトオーロラカイネースＡ関連疾患の治療のための請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項５】
制癌剤として用いるための請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−７９（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項７】
前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−８３（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項８】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１〜７のいずれか一項記載の薬剤。
【化１】
2011026203.tif 000009
【請求項９】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
2011026203.tif 000010
【請求項１０】
Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＢ（以下ｈＡＵＲＫＢとも言う）プロモーターの塩基配列−４４〜−１７（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【請求項１１】
更にβアラニン単位を含む請求項１０に記載の薬剤。
【請求項１２】
ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための請求項１０又は１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子関連疾患の治療のための請求項１０又は１１に記載の薬剤。
【請求項１４】
制癌剤として用いるための請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−３１〜−１７（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−２５〜−１８（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１０〜１６のいずれか一項記載の薬剤。
【化３】
2011026203.tif 000011
【請求項１８】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化４】
2011026203.tif 000012
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤及び請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項９及び請求項１８に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオーロラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ（以下、それぞれＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢとも言う）遺伝子発現抑制剤、オーラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ関連疾患の治療薬及び制癌剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下、ＰＩＰとも言う）を含んでなる薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞分裂は多くのタンパク質のリン酸化によって進行し、サイクリンＢ−ＣＤＫ１をはじめとする“分裂期キナーゼ”と総称される、一群のセリン／スレオニンキナーゼがその主要な役割を担っている。オーロラカイネースは分裂期キナーゼの一つであり、これまでにＡ、Ｂ、Ｃ３つのサブタイプが存在することが明らかにされている。このうちのＡとＢは酵母からヒト等の高等真核生物まで高度に保存されており、分裂期の様々なイベントの分子制御に関連して極めて重要な役割を担っている。加えて、近年、ヒトの多くの悪性腫瘍でオーロラキナーゼの過剰発現が報告されており、発癌あるいは腫瘍性増殖・悪性形質の維持に対する密接な関与が指摘されている。
【０００３】
ヒトオーロラキナーゼＡ（以下ｈＡＵＲＫＡとも言う）及びヒトオーロラキナーゼＢ（以下ｈＡＵＲＫＢとも言う）は細胞周期依存性にその発現量が調節され、分裂期にそれぞれ双極中心体と染色体上に局在し、紡錘糸の形成、相同染色体の中心線への整列、紡錘糸のセントロメアとの付着等の、細胞分裂の主要なイベントの制御に極めて重要な役割を担っている。従って、ＰＩＰのＤＮＡ結合を介してｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢの発現量を制御すれば、特異的にヒト癌細胞の腫瘍性増殖を抑制できる可能性が大きく、分子標的抗癌剤としての効果と臨床応用が期待できる。
【０００４】
また、ＡＵＲＫＡのＲＮＡ干渉（以下ＲＮＡｉとも言う）による阻害作用により、Ｇ２／Ｍでの細胞周期停止がＨｅＬａ癌細胞で報告され（非特許文献１）、ＡＵＲＫＢの阻害作用によって細胞死の誘導が報告されている（非特許文献２）。
【０００５】
これまで、オーロラ遺伝子産物のりん酸化阻害剤として主にＡＵＲＫＢを阻害するＡＺＤ１１５２、ＭＫ０４５７、主にＡＵＲＫＡを阻害するＶＸ−６８０等が開発され、癌患者を対象とする臨床試験が開始されている。しかし、これらの化合物は、タンパク質産物におけるリン酸化酵素活性を示すＡＴＰ結合部位への競争阻害剤であり、転写翻訳には影響しない。低分子干渉ＲＮＡ（以下「ｓｉＲＮＡ」とも言う）による治療法の開発も転写後の翻訳を阻害するものであり、転写を調節するオーロラ遺伝子発現抑制剤の開発は報告されていない（非特許文献３）。
【０００６】
オーロラ遺伝子ファミリーは、その酵素活性部位の化学構造がファミリー間で類似しているため、それぞれの遺伝子産物を特異的に標的とする酵素活性阻害剤の開発が困難である。一方、オーロラ遺伝子自体を阻害することができればこの様な問題は解決できる。更に、癌腫には、ＡＵＲＫＡを主に高発現する癌腫、ＡＵＲＫＢを高発現する癌腫等がある。従って、このような当該オーロラ遺伝子の発現様式の特性を考慮して、種々の癌において癌腫に応じたオーロラ遺伝子を阻害することにより、より高い抗癌効果を生むことが期待される。また、ＡＵＲＫＡの発現によりｐ５３の活性が減少したり、スピンドルチェックポイントの活性化がおこる。このことにより、細胞死が誘導されにくい状態もしくは、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）やｎｏｃｏｄａｚｏｌｅなどの薬剤が効きにくい状態が生じると考えられている。ＡＵＲＫＡの発現抑制により、ＡＵＲＫＢ阻害による細胞死（アポトーシス）の導入や他の細胞死を誘導する薬剤の効果を増強させることが考えられる。また、ＡＵＲＫＡの発現抑制は、Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）やｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ等の薬剤効果の増強を促すことも容易に考えられる。
【０００７】
なお、ＳｉＲＮＡによる治療法は、上記の酵素阻害剤の欠点を補うものであるが、核酸分解酵素の影響を受けやすく生体外および生体内で不安定である。また、薬剤を膜などで包んで患部に到達するまで吸収・分解されないようにする技術、即ち、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の開発が必須であり、標的細胞への薬剤移行にも問題がある。更に、マイクロＲＮＡなどの他の生体制御機構への影響も懸念される。
【０００８】
ピロールイミダゾールポリアミドは抗生物質であるｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ−Ａとｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ−ＡがＤＮＡを塩基特異的に認識する事を基に、Ｄｅｒｖａｎらにより見出された化学合成物質である（特許文献４、非特許文献４、非特許文献５）。ＰＩＰは二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造のマイナーグルーブに結合する事から、標的遺伝子の発現を特異的に制御する事が可能である（非特許文献６）。また、ＰＩＰは、これまでの遺伝子発現制御薬であるアンチセンス・リボザイム・ｓｉＲＮＡ等と異なり、生体内において核酸分解酵素によって分解されず、核酸への結合能が高い事から、新規の分子標的治療薬として、抗癌剤等への臨床応用が期待されるところである。
【０００９】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。
【００１０】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。
【００１１】
ピロールイミダゾールポリアミドは一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（特許文献４、非特許文献４）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献１〜３）。
【００１２】
このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙはＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／ＰｙはＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献４）。最近の研究によればＡ−Ｔ縮合はＰｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果としてＨｐ／Ｐｙが優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている。
【００１３】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモーター領域において特異的な認識配列に結合する転写因子をいくつか必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子が遺伝子発現において重要であれば、転写因子の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの実験で証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモーター中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する。
【００１４】
【特許文献１】特許第３０４５７０６号
【特許文献２】特開２００１−１３６９７４
【特許文献３】ＷＯ０３／０００６８３  Ａ１
【特許文献４】ＷＯ９８／４９１４２  Ａ１
【非特許文献１】Du et al: Proc Natl Acad Sci U S A.2004;101(24):8975-8980.
【非特許文献２】Kallio et al: Curr Biol. 2002;12(11):900-905
【非特許文献３】Malumbres et al: Curr Opin Genet Dev. 2007;17(1):60-65.
【非特許文献４】Sugiyama et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:14405-14410
【非特許文献５】Dervan: Bioorg Med Chem.2001;9:2215-35
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
先に述べたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。これまでに、オーロラカイネースＡ及びＢの遺伝子塩基配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子発現抑制剤又はオーロラカイネースＡ及びＢ関連疾患の治療薬についての報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ（ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ）のプロモーターの特定の領域に特異的に結合してヒトオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ヒトオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、オーロラカイネースＡ及びＢプロモーターの様々な断片を標的とするポリアミド類のうち、オーロラカイネースＡについては、プロモーター領域の−１００〜−７０の領域のうち、Ｅ４ＴＦ１結合領域を含む領域、好ましくは、−８９〜−７９の領域、より好ましくは−８９〜−８３の領域に結合する化合物が、ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子プロモーターの活性を有意に阻害し、オーロラカイネースＢについては、プロモーター領域の−４４〜−１７の領域のうち、ＣＣＡＡＴボックス及びＥ２Ｆ／ＤＰファミリータンパク質結合領域を含む領域、好ましくは−３１〜−１７の領域、より好ましくは、−２５〜−１８の領域に結合する化合物が、ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子プロモーターの活性を有意に阻害し、ヒト子宮頸癌由来細胞であるＨｅＬａ細胞においてヒトオーロラカイネースＡ及びＢ遺伝子の発現をダウンレギュレートすることを見出し、本発明をなすに至った。
【００１７】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−１００〜−７０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（２）更にβアラニン単位を含む上記（１）に記載の薬剤。
（３）ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子発現抑制のための上記（１）又は（２）に記載の薬剤。
（４）ヒトオーロラカイネースＡ関連疾患の治療のための上記（１）又は（２）に記載の薬剤。
（５）制癌剤として用いるための上記（４）に記載の薬剤。
（６）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−７９（配列番号３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の薬剤。
（７）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−８９〜−８３（配列番号４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１）〜（６）のいずれか一項に記載の薬剤。
（８）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１）〜（７）のいずれか一項記載の薬剤。
【化１】
2011026203.tif 000003
（９）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
2011026203.tif 000004
（１０）Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−４４〜−１７（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（１１）更にβアラニン単位を含む上記（１０）に記載の薬剤。
（１２）ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための上記（１０）又は（１１）に記載の薬剤。
（１３）ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子関連疾患の治療のための上記（１０）又は（１１）に記載の薬剤。
（１４）制癌剤として用いるための上記（１３）に記載の薬剤。
（１５）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−３１〜−１７（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記（１０）〜（１４）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１６）前記標的領域がヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−２５〜−１８（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である上記
（１０）〜（１５）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１７）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される上記（１０）〜（１６）のいずれか一項記載の薬剤。
【化３】
2011026203.tif 000005
（１８）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化４】
2011026203.tif 000006
（１９）上記（１）〜（８）のいずれか一項に記載の薬剤及び上記（１０）〜（１７）のいずれか一項に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
（２０）上記（９）及び上記（１８）に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
（２１）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１）〜（７）のいずれか一項記載の薬剤。
（２２）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（２１）に記載の薬剤。
（２３）前記ピロールイミダゾールポリアミドの末端のカルボキシル基がアミドを形成している上記（１０）〜（１６）のいずれか一項記載の薬剤。
（２４）前記アミドがメチルアミノプロピルアミン又はＮ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミンとのアミドである上記（２４）に記載のオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に抑制することができるので化学療法剤のような副作用がなく、また化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、オーロラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための薬剤、オーロラカイネースＡ及びオーロラカイネースＢ遺伝子関連疾患の治療のための薬剤及び制癌剤を得ることができる。さらに、本発明によれば、この遺伝子を用いた基礎実験の試薬を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。
【００２０】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２１】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２２】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２３】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００２４】
本発明のオーロラカイネースＡ遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの塩基配列−１００〜−７０（配列番号２）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
本発明のオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトオーロラカイネースＢプロモーターの塩基配列−４４〜−１７（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
【００２５】
通常ＤＮＡの螺旋の骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
【００２６】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００２７】
ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ遺伝子調節領域の塩基配列は図１、３及び配列番号１、５に示す通りである（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２；２７７：１０７１９−１０７２６；及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ２００４；３１６：９３０−９３６）。
本発明のピロールイミダゾールポリアミドＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８（以下それぞれＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂとも言う）は下記に示す通りである。
ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７
【化５】
2011026203.tif 000007
ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８
【００２８】
【化６】
2011026203.tif 000008
ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７は、分子式Ｃ６５Ｈ８４Ｎ２５Ｏ１３、分子量１４２２．６６を有し、その標的配列はヒトオーロラカイネースＡ調節領域の−１００〜−７０（配列番号２）の領域のうち、Ｅ４ＴＦ１結合領域を含む−８９〜−７９（配列番号３）の領域であり、より具体的にはａｃｃａｃｔｔ（−８９〜−８３）（配列番号４）の７塩基に結合することにより、ヒトオーロラカイネースＡ遺伝子の発現を抑制する。
【００２９】
ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８は、分子式Ｃ７８Ｈ９７Ｎ２８Ｏ１５、分子量１６６５．７６を有し、その標的配列はヒトオーロラカイネースＢ遺伝子調節領域の−４４〜−１７（配列番号６）の領域のうち、Ｅ２Ｆ／ＤＰファミリー結合領域を含む−３１〜−１７（配列番号７）の領域であり、より具体的にはａｇａｔｔｔｇａ（−２５〜−１８）（配列番号８）の８塩基に結合することにより、ヒトオーロラカイネースＢ遺伝子の発現を抑制する。
【００３０】
本発明者らはヒトオーロラカイネースＡ遺伝子及びヒトオーロラカイネースＢ遺伝子プロモーターの特定の領域を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。これらのポリアミドは核内に４８時間以上特に消失することもなく安定に滞留した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムと比較して、ポリアミドはよりすぐれた透過性（低濃度、トランスフェクション媒体不要）とより高い安定性を培養ＨｅＬａ細胞において示した。ポリアミドの高い透過性と安定性は遺伝子治療法のための真核細胞の核への理想的な薬剤アプローチを提供するものである。
【００３１】
最近までＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発はプロモーター配列における転写因子−ＤＮＡ複合体の構造的特性に基づいていた。ＴＡＴＡボックス含有プロモーター中の配列を標的とする効率的な方法は、ＴＡＴＡボックスに隣接する塩基対に結合するよう設計することであろう。ＴＡＴＡボックスはほとんどのタンパク質コード遺伝子において転写開始部位の上流２５〜３５塩基対に位置している。転写介在因子Ｄ（ＴＡＦＩＩＤ）はＴＡＴＡボックスに特異的に結合するＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を含んでおり、コアプロモーターにおける他の転写関与因子を採用してプレ開始コンプレックス（ＰＩＣ）を形成する。ＰＩＣは遺伝子転写を開始してアクチベータ又はサプレッサと相互作用して遺伝子発現を調節する。ＴＢＰも二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合するので（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ２０；６７（６）：１２４１−５０、Ｓｔａｒｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９９１；６７：１２３１−４０、Ｃｏｕｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｅｌｌ．１９８８；５５：８８７−９８）、合成ポリアミドはＴＡＴＡ結合タンパク質の結合部位を競合的に占有し、遺伝子転写に干渉する。様々なプロモーターで設計したポリアミドの成功例のうちで、ＴＡＴＡボックスを標的とするものが常に機能することが知られている。ところが、ＡＵＲＫＡおよびＡＵＲＫＢのプロモータ領域にはＴＡＴＡボックスの特異的配列が無く、その代わりにＣＣＡＡＴボックスとｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）とｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｇｉｏｎ（ＣＨＲ）と呼ばれる細胞周期調節蛋白特にＧ２期特異的に発現する遺伝子に共通の配列を有する。このＣＤＥ−ＣＨＲ領域を有することは、細胞周期Ｇ２期に特異的な発現をすることが予測されたが、この領域に変異を導入する実験により、Ｇ１−Ｓ期の発現抑制をこの領域特にＣＨＲ領域が担当していることが示唆された。この領域においてＤＰ−１、ＤＰ−２、Ｅ２Ｆ−１やＥ２Ｆ−４といった転写因子は二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）に結合することが解っており、これらの転写因子との結合により細胞周期特異的にＡｕｒｏｒａ遺伝子の発現が制御されている。このことよりＴＡＴＡ結合たんぱく質の結合阻害と同様にＣＤＥ−ＣＨＲ領域への転写因子蛋白の結合部位を競合的に占有するＰｙ−Ｉｍポリアミドの開発により、遺伝子転写を干渉する化合物の合成が可能と考えられる。（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ  ２４：２９０５−１０，Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００４  ＢＢＲＣ  ３１６：９３０−３６）
【００３２】
ｈＡＵＲＫＡプロモーター領域にある転写開始部位の上流には、配列ｃｔｔｃｃｇｇ（配列番号９からなる正の調節エレメント（ＰＲＥ）が存在する。このエレメントに、Ｅ４ＴＦ１タンパク質が結合することにより、ｈＡＵＲＫＡの転写を正に制御することが分かっている（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７（１２）：１０７１９−２６）。
一方、ｈＡＵＲＫＢプロモーター領域にある転写開始部位の上流には、細胞周期依存性因子（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ；以下、「ＣＤＲ」とも言う）及び細胞周期遺伝子相同領域（ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ；以下「ＣＨＲ」とも言う）が存在し、ＣＤＲ及びＣＨＲは、細胞周期依存性のプロモーター活性を制御することが分かっている。ＣＤＥには、Ｅ２Ｆ／ＤＦファミリータンパク質が結合する。オーロラＢタンパク質のｍＲＮＡの発現は、ＣＤＲ／ＣＨＲによって制御されている（Ｋｉｍｕｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４；３１９（３）：９３０−９３６）。
【００３３】
Ｅ４ＴＦ１遺伝子は、転写因子であるＧＡ結合タンパク質のβサブユニットを指令する。従って、本発明のＰＩＰ−Ａが二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造の副溝（マイナーグルーブ）に結合することにより、Ｅ４ＴＦ１タンパク質のｈＡＵＲＫＡ遺伝子への結合が阻害されると、結果としてｈＡＵＲＫＡ遺伝子の転写が阻害される。本発明のＰＩＰ−Ａは、当該標的二本鎖ＤＮＡに特異的に結合した。さらに、Ｇ２／Ｍ期において顕著にＡＵＲＫＡｍＲＮＡの発現量は減少した。
【００３４】
ＣＤＲ／ＣＨＲ配列は、ＡＵＲＫＢのｍＲＮＡレベルを調節する調節配列であり、当該配列には、Ｅ２Ｆ／ＤＦファミリータンパク質が結合する。Ｅ２Ｆタンパク質は、細胞周期と腫瘍抑制タンパク質の活動抑制において決定的な役割を果たし、小ＤＮＡ腫瘍ウイルスの形質転換タンパク質の標的でもある。Ｅ２Ｆタンパク質は、このファミリーのほとんどのタンパク質で見られる進化的に保存された領域をいくつか含んでいる。従って、本発明のＰＩＰ−Ｂは、この様な保存領域に非特異的に結合することを防ぐため、ＣＤＥ配列から上流に４塩基ずらしてＰＩＰ−Ｂを設計した。
【００３５】
ＰＩＰ−Ａも、非特異結合を防ぐために上流に４塩基ずらして設計した。４塩基ずらしても上述の通りＰＩＰ−Ａは二本鎖ＤＮＡの標的部位への結合及びＡＵＲＫＡｍＲＮＡの発現量の減少が見られた。
【００３６】
本発明のＰＩＰ−Ｂは、ＰＩＰ−Ａと同様に二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造の副溝（マイナーグルーブ）に結合することにより、Ｅ２Ｆ／ＤＦファミリータンパク質のｈＡＵＲＫＢ遺伝子の結合を阻害し、結果としてｈＡＵＲＫＢ遺伝子の転写が阻害される。本発明のＰＩＰ−Ｂは、当該標的二本鎖ＤＮＡに特異的に結合した。さらに、Ｇ２／Ｍ期において顕著にＡＵＲＫＢｍＲＮＡの発現量は減少した。
【００３７】
プロモーター領域における転写因子の調節以外に、他の因子も遺伝子発現に影響を与えている可能性もある。これらの因子はクロマチンパッキング、ポリアデニレーション、スプライシング、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始等を包含するものである（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１；５：２６３−８、ＭｃＫｅｏｗｎ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１３３−５５、Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１９９４；１９：３３６−４０、Ｋｏｚａｋ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２；８：１９７−２２５）。合成ポリアミドはヌクレオソームの位置関係から標的部位に接近することができ、特異的配列を標的とすることによりクロマチンの縮合・脱縮合構造に影響を与えている可能性がある（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；３２１：２４９−６３；Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６１５−２９。）。ピロールイミダゾールポリアミドがヘテロクロマチン褐色サテライトを開き、ＧＡＦの結合を可能とし、その結果ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおける表現型の変化を引き起こしているということが証明されている。ピロールイミダゾールポリアミドは容易に合成し、興味のある配列を標的とするように設計することができるので、ゲノムの機能研究や最終的にはｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子阻害や活性化のような遺伝子治療に有用である。
本発明に係るＰｙ−Ｉｍポリアミドは転写開始領域からは遠位の上流において設計することができ、これがｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子の発現に対する阻害効果を示す。従って、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−ＢはヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ遺伝子発現抑制のための薬剤として使用することができる。
【００３８】
本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂを同時に用いた場合に互いに干渉作用は示さず、ｈＡＵＲＫＡｍＲＮＡ及びｈＡＵＲＫＢｍＲＮＡの両方の発現阻害を示した。従って、ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子選択的発現抑制剤である本発明の化合物を同時に使用することによって、ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子の両方を阻害することができる点で有利である。
【００３９】
本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、各々ＨｅＬａ細胞のｍＲＮＡの発現を顕著に抑制した。また、ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂの細胞の核内への移動が観察された。従って、ドラックデリバリーシステム等の手法を用いなくても、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは細胞の核内に移行するため薬剤として有利である。当該有利な効果は、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−ＢをヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢ関連疾患の治療に用いるために有利である。
【００４０】
また、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、それぞれ細胞増殖に影響を及ぼす。本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、各々ＨｅＬａ細胞の細胞増殖を抑制し、少なくとも周知の抗癌剤であるシスプラチンと同程度又はそれ以上の細胞増殖抑制効果が観察された。また、ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂを併用することによってＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂを別々に用いる場合と比べて更に顕著に協奏的に細胞増殖抑制効果を発揮した。
【００４１】
本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、ＨｅＬａ細胞だけでなく、Ｔ９８Ｇ細胞を含む種々の癌細胞の増殖を阻害した。また、正常細胞の増殖阻害はより高い濃度のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂで処理しなければ阻害されなかった。従って、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂそれぞれによる処理により、正常細胞増殖阻害を導くことなく、癌細胞のみの増殖を阻害することができる。従って、本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、癌に対する治療薬として、正常細胞に影響を与えることなく、癌細胞の増殖を阻害できる点で有利である。
【００４２】
本発明のＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂは、各々アポトーシスを誘導した。
【００４３】
また、癌、非限定的に挙げると、特に甲状腺癌、前立腺癌、乳癌、甲状腺肉腫、上皮卵巣癌、精巣性胚細胞腫瘍、膀胱癌、神経膠腫、結腸癌、肺癌、小細胞肺癌、骨髄性白血病、頭頸部扁平上皮癌、非小細胞肺癌、大腸癌等を始めとするヒトの癌種でＡｕｒｏｒａＡ及びＡｕｒｏｒａＢタンパク質の過剰発現が報告されている。従って、本発明のｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子発現抑制剤は、種々の癌に対する治療薬として有効であると合理的に考えることができる。
【００４４】
更に、本発明のｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子発現抑制剤は、同時に使用した場合であっても、互いに干渉作用は示さず、両遺伝子を同時に抑制することができるという相乗効果を示す。このような効果は、上述したような種々の癌に対する治療薬として更に有効であると合理的に考えることができる。
【実施例】
【００４５】
１．ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢプロモーターに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの合成
【００４６】
（１）ヒトオーロラカイネースＡ及びヒトオーロラカイネースＢプロモーターに対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計
Ｉ．材料及び方法
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの−８９〜−８３又はヒトオーロラカイネースＢプロモーターの−２５〜−１８の塩基対に結合するように、上記のようなＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８を設計した。
【００４７】
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。
【００４８】
ＦＩＴＣカップリング：４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。
【００４９】
カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
アミンとしての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍＬ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
精製：最終精製は、１０ｍＬ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出により行った。ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８のＲＰ−ＨＰＬＣのチャートを図６及び７にそれぞれ示す。
【００５０】
２．ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−ＢのＩｎ  ｖｉｔｒｏでの生物学的機能解析
【００５１】
（１）ゲルシフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ  （ＥＭＳＡ））
Ｉ．材料及び方法
オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングして、ｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢプロモーターの塩基対に対応する４種の二本鎖オリゴヌクレオチドとした。一方の一本鎖オリゴヌクレオチドをＦＩＴＣで標識し、相補的配列の一本鎖オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションして二本鎖ＤＮＡ作成した。具体的な二本鎖ヌクレオチドの塩基配列は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＧＧＴ−３’）（配列番号９）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１０）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴ−３’）（配列番号１１）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１２）、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＧＣＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴ−３’）（配列番号１３）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＧＣＣ−３’）（配列番号１４）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）のセンスプライマー（５’−ＦＩＴＣ−ＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴ−３’）（配列番号１５）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣ−３’）（配列番号１６）を作成した。また、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）としては、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡである配列番号１３及び配列番号１４のオリゴＤＮＡを使用し、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）としては、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡである配列番号９及び配列番号１３を使用した。３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７。９、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中でポリアミド又はミスマッチポリアミドとともにインキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、蛍光標識二本鎖オリゴヌクレオチドの移動度を蛍光イメージ解析機（Ｆｕｊｉ  ＬＡＳ  ３０００等）で解析した。
【００５２】
ＩＩ．結果
合成ポリアミドの二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７及びＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８の標的配列への結合を検討した。それぞれのピロールイミダゾールポリアミドの標的配列を含む２２塩基のセンス、アンチセンスのオリゴヌクレオチドを作成し、これをアニーリングさせて標的部位の二本鎖ＤＮＡを作成し、これとそれぞれのピロールイミダゾールポリアミドとをインキュベートした。これらをポリアクリルアミドゲルで電気泳動してピロールイミダゾールと標的配列との結合性を検討した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂとともに二本鎖ＤＮＡ（ＤＳ）にピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｙ−Ｉｍ）を加えると、ＤＳのみのレーンと比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆され、ＤＳとＰｙ−Ｉｍとの結合が証明された。結果を図８及び９に示す。
【００５３】
（２）ビアコアアッセイ
Ｉ．材料及び方法
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（ＧＥヘルスケア）は、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）を測定原理としており、生体内でのタンパク質、核酸、糖鎖など分子間の相互作用を、ラジオアイソトープや蛍光物質などによる標識無しにｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構成し、リアルタイムで観察できる装置であり、本装置を用いて分子間の相互作用を数値化して評価することが可能である。
【００５４】
ストレプトアビジンを予め固定化したセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ，ＢＲ−１０００−３１）を使用し、ヘアピンビオチン化ＤＮＡプローブ（１本鎖ＤＮＡが相補配列を含み、ハイブリダイゼーションすることで２本鎖部分を含むパリンドロームＤＮＡを形成）１μＭを固定した後、ピロールイミダゾールポリアミド（Ｐｙ−Ｉｍ）を添加して、２本鎖ＤＮＡとの結合性の変化を２分子間の結合・解離に伴うセンサーチップ表面での微量な質量変化をＳＰＲシグナルとして検出し、経時的に測定した。なお、具体的なヘアピンビオチン化ＤＮＡプローブの塩基配列は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＧＧＧＴ−ＴＴＴＴ−ＡＣＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１７）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴ−ＴＴＴＴ−ＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１８）である。また、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）（５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＴ−ＴＴＴＴ−ＡＣＣＣＧＧＡＡＴＣＧＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣ−３’）（配列番号１９）、２塩基変異を有するＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＴ−ＴＴＴＴ−ＡＧＧＡＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＧＣＣ−３’）（配列番号２０）である。ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）は、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）（配列番号１９）を、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）（配列番号１７）を用いた。０ｎＭから１μＭの濃度のＰｙ−Ｉｍを添加し、２０μｌ／ｓｅｃの流量でセンサーグラムと呼ぶグラフとして表示し、レスポンス（ＲＵ）値を経時的に測定することで、平衡状態における２分子間の親和性（解離定数：ＫＤあるいは親和定数：ＫＡ）および結合・解離反応の速さに関する情報、すなわち結合速度定数（ｋａ）、および解離速度定数（ｋｄ）を測定し分子間結合を解析した。得られた濃度依存性センサーグラムをＬａｎｇｍｕｉｒ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔを使用して、解析しセンサーチップに固定されたＤＮＡプローブと添加したピロールイミダゾールポリアミドの結合能、乖離能をＫＤ、ＫＡ、ｋｄ、ｋａ値として算定した。
【００５５】
ＩＩ．結果
本発明のＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（マッチ）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）３．８４Ｅ＋０５、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）５．１１Ｅ−０４、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）７．５１Ｅ＋０８解離定数ＫＤ（Ｍ）１．３３Ｅ−０９、２塩基変異を有するＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）４．４２Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）３．１７Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）１．３９Ｅ＋０６解離定数ＫＤ（Ｍ）７．１７Ｅ−０７が得られ結合特異性に５３９倍の差を認めた。ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８は、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（マッチ）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）５．４７Ｅ＋０５、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）２．６８Ｅ−０４、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）２．０４Ｅ＋０９解離定数ＫＤ（Ｍ）４．９０Ｅ−１０、２塩基変異を有するＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）５．４１Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）２．１９Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１・Ｍ）２．４７Ｅ＋０６解離定数ＫＤ（Ｍ）４．０５Ｅ−０７が得られ結合特異性に８２６倍の差を認めた。以上よりＰＩＰ−ＡおよびＰＩＰ−Ｂは、結合部位と同様の配列を有するオリゴＤＮＡに特異的に結合することが分かった。また、本発明のＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７は、ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）１．７２Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）３．５９Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）４．７９Ｅ＋０５解離定数ＫＤ（Ｍ）２．０９Ｅ−０６であった。ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８は、ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−２）と結合速度定数ｋａ（１／Ｍｓ）３．４０Ｅ＋０３、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）４．６４Ｅ−０３、親和定数ＫＡ（１／Ｍ）７．３３Ｅ＋０５解離定数ＫＤ（Ｍ）１．３６Ｅ−０６であった。結果を図１０〜１５に示す。
【００５６】
３．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布
【００５７】
Ｉ．材料及び方法
イ）外来刺激に対する細胞死の誘導が遅いアポトーシス低感受性のＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を、６ウェルプレートの各ウェルに３００００細胞となるよう播種し、２ｍｌの１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて培養した。
ロ）培養ＨｅＬａにおけるＦＩＴＣ−標識ポリアミド類のインキュベーション
ＨｅＬａ細胞を２４時間培養後、ＦＩＴＣ標識ＰＩＰ（ＰＩＰ−Ａ  及び  ＰＩＰ−Ｂ）を１０μＭの濃度で培地に直接添加した。経時的に観察し、６時間、１２時間、２４時間で核をＦＩＴＣ及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２によって３０分間染色し、ＨｅＬａ細胞を蛍光顕微鏡を用いて、×２００の倍率で観察した。
【００５８】
ＩＩ．結果
ＦＩＴＣ標識をしたＰＩＰは、ＨｅＬａ細胞の核に特異的に取り込まれた。ＦＩＴＣ標識をしたＰＩＰ添加後６時間でほぼ全ての細胞の核が、蛍光強度は不均一であるがＦＩＴＣの蛍光を示し、細胞質での蛍光は、培地同様でバックグランドレベルであった。添加後６時間でＦＩＴＣの蛍光強度はほぼ全ての細胞で均一化していた。また、添加後１２時間で、全ての細胞の核内にＦＩＴＣの蛍光が認められ、その強度の濃縮が認められた。さらに、２４時間でＦＩＴＣの蛍光強度が減弱しない事より、ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂが細胞核内で非常に安定であることが示唆された。結果を図１６〜２４に示す。
【００５９】
４．ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂによるプロモーターに対するノックダウン効果の同定及びランダム培養細胞におけるｍＲＮＡ発現とＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢタンパク質の発現の同定
【００６０】
（１）リアルタイムＰＣＲアッセイ（ｍＲＮＡ発現の測定）
Ｉ．材料及び方法
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を、１０００００細胞となるよう播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて６時間培養後、培地を交換し、１０μＭのＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂおよび５μＭずつのＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ両方を含む１０％子牛血清添加培地もしくはＰＩＰを含まない同様の培地で６時間培養し、細胞を回収し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用し抽出、リアルタイムＰＣＲアッセイに供した。
リアルタイムＰＣＲアッセイは、ＴＡＫＡＲＡ  ＤＩＣＥ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍを利用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  Ｉにより逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑを使用し、ＴＡＫＡＲＡ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｒｉｍｅｒより購入したＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢおよびＧＡＰＤＨプライマーを利用し、（初期変性）９５℃、１０秒（ＰＣＲ反応：４０サイクル）９５℃、５秒  ６０℃、３０秒（融解曲線分析）の反応系によって行った。具体的なプライマーの塩基配列は、ＡＵＲＫＡセンスプライマー（５’−ＧＧＡＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧＴＴＣ−３’）（配列番号２１；タカラバイオ、ＨＡ０３８３１０−Ｆ）、ＡＵＲＫＡアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＴＧＣＴＴＣＡＡＣＡ−３’）（配列番号２２；タカラバイオ、ＨＡ０３８３１０−Ｒ）、ＡＵＲＫＢセンスプライマー（５’−ＴＣＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＣＡＡＴＧＴＣ−３’）（配列番号２３；タカラバイオ、ＨＡ０８９５９６−Ｆ）、ＡＵＲＫＢアンチセンスプライマー（５’−ＡＡＧＡＴＧＴＣＧＧＧＴＧＴＣＣＣＡＣＴＧ−３’）（配列番号２４；タカラバイオ、ＨＡ０８９５９６−Ｒ）、ＧＡＰＤＨセンスプライマー（５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３）（配列番号２５；ＨＡ０６７８１２−Ｆ）及びＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’）（配列番号２６；ＨＡ０６８１２−Ｒ）を用いた。増幅産物の生成量モニターは、インターカレーター法により蛍光強度として検出され、指数関数的にシグナルが上昇する閾値と増幅曲線が交わる点Ｃｔ値を算出した。ＡＵＲＫＡとＡＵＲＫＢのＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値と比較することで相対的なＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢのｍＲＮＡの発現量を算定した。
【００６１】
ＩＩ．結果
相対的ＡＵＲＫＡｍＲＮＡ発現量は、通常の１２時間の培養では１．９であったが、ＰＩＰ−Ａ１０μＭ添加で０．９に低下し、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂをそれぞれ５μＭ添加すると０．８、ミスマッチとしてのＰＩＰ−Ｂ１０μＭ添加では１．７であった。相対的ＡＵＲＫＢｍＲＮＡ発現量は、通常の１２時間の培養で２．１であったが、ＰＩＰ−Ｂ１０μＭ添加で１．０に低下し、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂをそれぞれ５μＭ添加すると１．１、ミスマッチとしてのＰＩＰ−Ａ１０μＭ添加では１．９であった。このことより、ＰＩＰ−Ａは単独でもＰＩＰ−Ｂと同時に投与してもＡＵＲＫＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を抑制したが、ＰＩＰ−ＢはＡＵＲＫＡ遺伝子のｍＲＮＡ発現量に影響を及ぼさなかった。同様にＰＩＰ−Ｂは単独でもＰＩＰ−Ａと同時に投与してもＡＵＲＫＢ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を抑制したが、ＰＩＰ−ＡはＡＵＲＫＢ遺伝子のｍＲＮＡ発現量に影響を及ぼさなかった。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−ＢがそれぞれＡＵＲＫＡとＡＵＲＫＢのｍＲＮＡ発現量を特異的に且つ独立して抑制することが示された。また、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの併用投与によっても発現抑制効果が保たれる事が示された。各群においてＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定の結果は、危険率Ｐ＜０．０５で有意差ありと判定した。結果を図２５及び２６に示す。
【００６２】
（２）ルシフェラーゼアッセイ（プロモーター活性の測定）
Ｉ．材料及び方法
【００６３】
ヒトＡＵＲＫＡ遺伝子上流のプロモータ領域１．８Ｋｂ（配列番号２７）とヒトＡＵＲＫＢ遺伝子上流のプロモータ領域約２．４Ｋｂ（配列番号２８）を含むＤＮＡフラグメントをｐＧＬ３ベクター（プロメガ）にそれぞれ挿入した。それぞれのｐＧＬ３挿入ベクターをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、プロモータアクティビティを相対的ルシフェラーゼによる発光強度として検出した、測定はＴＫ  ｖｅｃｔｏｒとのデュアルルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ）を利用し、データの補正を行った。それぞれのアッセイを６回測定し、平均値とＳＤ値で示した。通常の培養系での発光とＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂを１０μｍ  １μＭ添加後の発光強度を比較した。各群においてＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定を行った。
ＩＩ．結果
ヒトＡＵＲＫＡ遺伝子上流のプロモータ領域１．８Ｋｂ（配列番号２７）を含むＤＮＡフラグメントを挿入したｐＧＬ３ベクターによるＨｅＬａ細胞での発光活性は、ＰＩＰ−Ａの添加により濃度依存性に有意に低下した。このことによりＰＩＰ−Ａの添加により、ＡＵＲＫＡプロモーターの調整下での発現ベクターからのルシフェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低下が起こったと確認された。
ヒトＡＵＲＫＡＢ遺伝子上流のプロモータ領域２．４Ｋｂ（配列番号２８）を含むＤＮＡフラグメントを挿入したｐＧＬ３ベクターによるＨｅＬａ細胞での発光活性は、ＰＩＰ−Ｂの添加により濃度依存性に有意に低下した。このことによりＰＩＰ−Ｂの添加により、ＡＵＲＫＢプロモーターの調整下での発現ベクターからのルシフェラーゼ発現が抑制され、発光強度の低下が起こったと確認された。
各群においてＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定の結果は、危険率Ｐ＜０．０５で有意差ありと判定した。結果を図２７及び２８に示す。
【００６４】
（３）ウエスタンブロッティング（タンパク質の測定）
Ｉ．材料及び方法  
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を、１０００００細胞となるよう播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて６時間培養後、培地を交換し、１０μＭのＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂおよび５μＭずつのＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ両方を含む１０％子牛血清添加培地もしくはＰＩＰを含まない同様の培地（１％ＤＭＳＯ含有）で１２時間培養し、細胞を蛋白分解酵素阻害剤を含む、細胞溶解液内に回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、質量で分離後、通常のウェスタンブロットを行った。抗ＡＵＲＫＡ、抗ＡＵＲＫＢマウスモノクローナル抗体（ＡＢＣＡＭ社）を使用した。
コントロールとしてＡｎｔｉ  ｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎ（Ｒａｂｂｉｔ）ＥＬＩＳＡ／ＷＢ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｉｎｃ．）ベータアクチンに対する抗体を用いた。ウェスタン・ブロッティングでのバンドの濃淡をＬＡＳ４０００にて測定し、各Ｐｏｌｙａｍｉｄｅのノックダウン効果を評価した。
【００６５】
ＩＩ．結果
ＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの蛋白合成を、トータル１２時間のランダム（非同調）培養にて検討した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂで処理した細胞群では、ＰＩＰ化合物で非処理の対照細胞群（１％  ＤＭＳＯ含有）に比べて、ＰＩＰ化合物の濃度依存性に、ＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢの蛋白合成が有意に低下している事が示された。また、両ＰＩＰ化合物のＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢの蛋白合成に対するノックダウン効果は、特に（終濃度で）１０μＭのＰＩＰ化合物で処理した際に最も著しい事が示された。加えて、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂを合計１０μＭで併用処理（各５μＭ）した際には、何れもＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの蛋白合成の有意な低下を認めた。一方、ミスマッチとしてのＰＩＰ−Ｂ及びＰＩＰ−Ａは、それぞれＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢの蛋白合成量に何らの影響を及ぼさなかった。
また、コントロールとして用いたｂｅｔａ−Ａｃｔｉｎの蛋白合成量は、ＰＩＰ非処理群／処理群で変化がなく、常に一定していた。これらの結果は、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙによるｍＲＮＡの発現量解析の結果と完全に一致している。また、以上の結果は、両ＰＩＰ化合物が、ＡＵＲＫＡ或いはＡＵＲＫＢのプロモーター活性を抑制し、その結果、それぞれのｍＲＮＡの発現量と蛋白合成量を、特異的に且つ互いに独立して抑制する事を示している。結果を図２９に示す。
【００６６】
５．細胞増殖阻害アッセイ
【００６７】
（１）ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を用いた増殖阻害アッセイ
Ｉ．材料及び方法
細胞を用いて細胞増殖抑制試験を行った。ＨｅＬａ細胞を、３０００細胞となるよう９６穴マイクロタイタープレートに播種し、１００μｌの培地、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて６時間培養後、培地を交換し、０μＭから２０μＭ（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ）のＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂおよび等量のＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ混合物を含む１０％子牛血清添加培地で４８時間培養し、生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を１０μｌずつ添加し、１時間呈色反応を行い、ＡＲＶＯマイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、当該実験は水溶性ホルマザンを用いたｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（ＷＳＴ−８ＴＭ：Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）で施行した。
【００６８】
ＩＩ．結果
ＰＩＰ−Ａ単独では、濃度依存性に生細胞数の減少が見られた。２０μＭではＩＣ−５０に達しなかったが、生細胞数は６０％以下であった。ＰＩＰ−Ｂ単独では、濃度依存性に生細胞数の減少が見られ、そのＩＣ−５０値は１２．４１μＭであった。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物でも、同様に濃度依存性の生細胞数の減少が認められ、そのＩＣ−５０値は６．４５μＭであった。このことより、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ｂ単独、ＰＩＰ−Ａ単独の順に細胞増殖抑制が強く、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの両方を同時に発現抑制することが相乗的に腫瘍細胞増殖を抑制することが示唆された。結果を図３０に示す。
【００６９】
（２）種々の細胞を用いた細胞増殖アッセイ
Ｉ．材料及び方法
【００７０】
上記５．（１）ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞）を用いた増殖阻害アッセイに記載されている実験方法によって、ＨｅＬａ、Ｔ９８Ｇ、Ａ５４９、Ａ２７８０、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＲＣ５、ＨＵＶＥＣ細胞を用いて、増殖抑制効果が最も高かったＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、０μＭから１００μＭ（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ）を用いて実施した。
【００７１】
ＩＩ．結果
全ての細胞でＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物の添加により、濃度依存性に増殖抑制効果が得られた。Ａ２７８０、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＭＲＣ５、ＨＵＶＥＣの順で、増殖抑制効果が高くみとめられ、ＩＣ−５０値は、Ａ２７８０、ＨｅＬａ、Ａ５４９では５〜１０μＭの間、Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７では１０〜２０μＭの間、Ｔ４７Ｄ、ＭＲＣ５は、２０〜１００μＭの間、ＨＵＶＥＣは１００μＭ以上であった。このことより、癌細胞由来の腫瘍細胞株Ａ２７８０、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｔ９８Ｇ、ＨＣＴ１１６、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄで強い増殖抑制が認められ、正常細胞由来のＭＲＣ５、ＨＵＶＥＣでは増殖抑制が弱い傾向が認められた。結果を図３１に示す。
【００７２】
６．アポトーシス検出アッセイ
【００７３】
アポトーシスの初期段階では、細胞膜の完全性は保たれているが、膜のリン脂質の非対称性が失われる。それに伴い、細胞膜の内側に局在する陰性荷電リン脂質のフォスファチジルセリン（ＰＳ）が細胞表面に露出し、Ｃａ２＋依存性のリン脂質結合タンパクであるＡｎｎｅｘｉｎＶはＰＳに選択的に結合する。このことより、蛍光標識したＡｎｎｅｘｉｎＶを用いることでアポトーシスに陥った細胞を検出することができる。この際、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）などのＤＮＡ特異的な細胞生死判定用の色素で染色すると、細胞膜構造が破壊される後期のアポトーシス細胞に取り込まれ、この色素がＤＮＡと結合することより、前期および後期のアポトーシスを区別して検出することが出来る。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物を培地に添加し、ＨｅＬａ細胞を用いてアポトーシスの誘導の有無をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩによるアポトーシスの検出キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用い確認した。ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣによるアポトーシスの検出は蛍光顕微鏡による形態的評価とフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）：Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ））を用いた定量的評価の両方を行った．
【００７４】
Ｉ．材料及び方法
（１）ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ
ＨｅＬａ細胞を用い、非処理群として１％ＤＭＳＯ、ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）およびＰＩＰ−Ａ（５μＭ）とＰＩＰ−Ｂ（５μＭ）の等量混合物を添加後４８時間の培養細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで処理し、蛍光顕微鏡で観察した。
（２）フローサイトメトリーによるアポトーシス検出アッセイ投与後
ＨｅＬａ細胞を用い、非処理群として１％ＤＭＳＯ、ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）およびＰＩＰ−Ａ（５μＭ）とＰＩＰ−Ｂ（５μＭ）の等量混合物を添加後４８時間の培養細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで処理し、４００００個の細胞をフローサイトメトリーにより解析した。
【００７５】
ＩＩ．結果
（１）ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ
視野中に、非処理群では、ＦＩＴＣおよびＰＩの蛍光色を発する細胞はほとんど認められなかった。ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）およびＰＩＰ−Ａ（５μＭ）とＰＩＰ−Ｂ（５μＭ）の等量混合物でＦＩＴＣおよびＰＩの発色が認められたことより、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−Ａの順でアポトーシスが強く誘導されると考えられた。（２）にフローサイトメトリーによる定量的解析を示す。
（２）フローサイトメトリーによるアポトーシス検出アッセイ投与後
非処理群では前期アポトーシス１．４０％、後期アポトーシス４．７６％が認められた。ＰＩＰ−Ａでは、前期アポトーシス３．８３％、後期アポトーシス４．９１％が認められた。ＰＩＰ−Ｂでは、前期アポトーシス１４．３２％、後期アポトーシス９．０７％が認められた。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物（５μＭ）では、前期アポトーシス３３．６６％、後期アポトーシス５．６５％が認められた。前記アポトーシスの誘導は、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−Ａの順で強く誘導された。前記アポトーシスの誘導は、ＰＩＰ−Ｂ、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物、ＰＩＰ−Ａの順で強く誘導されたが、ＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物と非処理群に差は認めず、ＰＩＰ−Ｂで誘導が亢進する傾向が見られた。
このことより、ＰＩＰ−Ｂによるものに比べＰＩＰ−Ａ単独でのアポトーシス誘導は顕著でなかった。このことは、ＡＵＲＫＡの阻害ではアポトーシスの誘導は見られずＡＵＲＫＢ阻害では強くアポトーシスが認められるとする複数の報告と合致した。また、ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物でアポトーシスの誘導が、ＡＵＲＫＢ単独より、より強く誘導されたことより、ＡＵＲＫＡの阻害によるアポトーシスの誘導増強の現象と同様の所見が得られた。つまり、本発明のＡＵＲＫＡおよびＡＵＲＫＢの併用による抗癌効果の増強および本発明の化合物を使用することで他の薬剤との併用による抗腫瘍効果の増強、もしくはその判定に使用できるものと考えられた。結果を図３２に示す。
【００７６】
７．統計解析
結果は平均値±標準偏差（ＳＤ）で表現した。平均値間の差の有意性は、ＡＮＯＶＡ  及びＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定により評価した。少なくとも０．０５未満のｐ値を有意であると判定した。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明のｈＡＵＲＫＡ遺伝子発現抑制剤及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子発現抑制剤はそれぞれｈＡＵＲＫＡ及びｈＡＵＲＫＢ遺伝子関連疾患の治療薬及び制癌剤として利用可能である。またこの遺伝子を用いた基礎実験の試薬としての利用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ヒトオーロラカイネースＡプロモーターの構造を示す。
【図２】本発明のピロールイミダゾールポリアミド−Ａ（ＰＩＰ−Ａ：Ｎｏ．４７）とその結合部位を示す。
【図３】ヒトオーロラカイネースＢプロモーターの構造を示す。
【図４】細胞周期依存性因子（ＣＤＲ）及び細胞周期遺伝子相同領域（ＣＨＲ）の構造を示す。ＣＤＲ及びＣＨＲともに他の酵素に同じ塩基配列を有することがわかる。
【図５】本発明のピロールイミダゾールポリアミド−Ｂ（ＰＩＰ−Ｂ：Ｎｏ．４８）とその結合部位を示す。
【図６】ＰＩＰ−ＡのＨＰＬＣの結果を示す。
【図７】ＰＩＰ−ＢのＨＰＬＣの結果を示す。
【図８】ＰＩＰ−Ａのゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す。レーン−１：一本鎖オリゴＤＮＡ、レーン−２：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ）、レーン−３：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡ（２塩基変異ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ）、レーン−４：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ａ、レーン−５：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ａ、レーン−６：「ミスマッチ−２」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ）とＰＩＰ−Ａの結果を示す。
【図９】ＰＩＰ−Ｂのゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン１：一本鎖オリゴＤＮＡ、レーン−２：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ）、レーン−３：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡ（２塩基変異ＡＵＲＫＢオリゴＤＮＡ）、レーン４：「マッチ」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ｂ、レーン−５：「ミスマッチ−１」二本鎖オリゴＤＮＡとＰＩＰ−Ｂ、レーン−６：「ミスマッチ−２」二本鎖オリゴＤＮＡ（ＡＵＲＫＡオリゴＤＮＡ）とＰＩＰ−Ｂの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂともに特異的に標的塩基配列と結合することを示す。
【図１０】ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａが特異的にＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴ）と結合したことを示す。
【図１１】ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａが２塩基変異を有するミスマッチ−１オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）との結合と比べて結合が有意に低下したことを示す。
【図１２】ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａが互い違いのＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ＝ミスマッチ−２オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）及びミスマッチ−１オリゴＤＮＡとの結合と比べて結合が更に低下したことを示す。
【図１３】ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ｂが特異的にＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）と結合することを示す。
【図１４】ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ｂが２塩基変異を有するミスマッチ−１オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）との結合と比べて結合が有意に低下したことを示す。
【図１５】ビアコアアッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ｂが互い違いのＡＵＲＫＡ標的オリゴＤＮＡ＝ミスマッチ−２オリゴＤＮＡとは、ＡＵＲＫＢ標的オリゴＤＮＡ（マッチオリゴＤＮＡ）及びミスマッチ−１オリゴＤＮＡとの結合と比べて結合が更に低下したことを示す。
【図１６】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａを１０μＭ添加し、６時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図１７】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを１０μＭ添加し、６時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図１８】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａ及びＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを各々５μＭ添加し、６時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図１９】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａを１０μＭ添加し、１２時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図２０】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを１０μＭ添加し、１２時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図２１】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａ及びＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを各々５μＭ添加し、１２時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図２２】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａを１０μＭ添加し、２４時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図２３】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを１０μＭ添加し、２４時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図２４】ＦＩＴＣ−標識ＰＩＰの分布を示す。ＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ａ及びＦＩＴＣ−ＰＩＰ−Ｂを各々５μＭ添加し、２４時間培養した際の細胞内での分布を図に示す。それぞれ、（ａ）明視野（ｂ）ＦＩＴＣ、（ｃ）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、（ｄ）Ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）の結果を示す。
【図２５】リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＡｍＲＮＡ発現量を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＡｍＲＮＡ発現量に比べて、ＰＩＰ−Ａは濃度依存性にその発現量を抑制する事が示された。各相対的ｍＲＮＡ値は、内部標準として用いたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。
【図２６】リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＢｍＲＮＡ発現量を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＢｍＲＮＡ発現量に比べて、ＰＩＰ−Ｂは濃度依存性にその発現量を抑制する事が示された。各相対的ｍＲＮＡ値は、内部標準として用いたＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。
【図２７】ルシフェラーゼアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＡプロモーター活性を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＡプロモーター活性に比べて、ＰＩＰ−Ａは濃度依存性にその活性を抑制する事が示された。各相対的プロモーター活性値は、内部標準として用いたＴＫｖｅｃｔｏｒの発光量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。
【図２８】ルシフェラーゼアッセイによって測定した相対的ＡＵＲＫＢプロモーター活性を示す。通常の１２時間培養時のＡＵＲＫＢプロモーター活性に比べて、ＰＩＰ−Ｂは濃度依存性にその活性を抑制する事が示された。各相対的プロモーター活性値は、内部標準として用いたＴＫｖｅｃｔｏｒの発光量で補正した値であり、平均値±標準偏差（ＳＤ）：ｎ＝６で表現した。また、Ｔｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較解析を行った。
【図２９】ＡＵＲＫＡ抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す。ＨｅＬａ細胞（１０００００個／ウェル）におけるＰＩＰ−Ａ（１０μＭ、１μＭ及び０．１μＭ）がＡＵＲＫＡタンパク質発現に及ぼす効果を観察した結果である。ＰＩＰ−Ａの添加によりＡＵＲＫＡタンパク質の発現は濃度依存性に低下した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ各々５μｌずつを同時に添加した場合にも、ＡＵＲＫＡタンパク質の発現は低下した。ＡＵＲＫＢ抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す。ＨｅＬａ細胞（１０００００個／ウェル）におけるＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ、１μＭ及び０．１μＭ）がＡＵＲＫＢタンパク質発現に及ぼす効果を観察した結果である。ＰＩＰ−Ｂの添加によりＡＵＲＫＢタンパク質の発現は濃度依存性に低下した。ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ各々５μｌずつを同時に添加した場合にも、ＡＵＲＫＢタンパク質の発現は低下した。
【図３０】ＨｅＬａ細胞を用いた細胞増殖阻害アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ、ＰＩＰ−Ｂ並びにＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ等量混合物はＨｅＬａ細胞の増殖をそれぞれ濃度依存性に阻害した。特にＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量併用処理は、単独処理よりも強い増殖抑制効果を示した。
【図３１】種々の細胞におけるＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ等量併用処理の効果についての細胞増殖アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂ等量併用処理は、広いスペクトラムで多種類のヒト腫瘍細胞由来のセルラインの増殖を抑制した。一方、この併用処理に対して、ヒト正常細胞由来のセルラインは著明な抵抗性を示した。この結果はＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの併用処理の腫瘍細胞株に対する選択性を示唆する結果と考えられる。
【図３２−１】アポトーシス検出アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ（各５μＭ）の添加により細胞は様々な程度でアポトーシスを起こした。特にＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物で処理した細胞群にて、著明な早期アポトーシスの惹起が認められた。
【図３２−２】アポトーシス検出アッセイの結果を示す。ＰＩＰ−Ａ（１０μＭ）、ＰＩＰ−Ｂ（１０μＭ）ＰＩＰ−Ａ及びＰＩＰ−Ｂ（各５μＭ）の添加により細胞は様々な程度でアポトーシスを起こした。特にＰＩＰ−ＡとＰＩＰ−Ｂの等量混合物で処理した細胞群にて、著明な早期アポトーシスの惹起が認められた。
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【００７９】
配列番号９    センスプライマー
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配列番号２５  プライマー
配列番号２６  プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【配列表】
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