(57)【要約】【課題】複数種類の色素で染色した試料について、各色素から発生する蛍光を検出して画像化する際に、各画像が互いにずれないようにする。【解決手段】レーザ光源１１１ないし１１３から射出される３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３は、ダイクロイックミラー１３及び１４により混合され、遅延回路１２１及び１２２により超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が順番に等間隔に並ぶように調整される。レーザ走査部１７により超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が、３種類の色素で染色された試料Ｓ上に集光されて走査され、それにより励起された色素から発生する３種類の異なるスペクトルを有する蛍光の強度が、ダイクロイックミラー２１及び２４により分離され、光検出部２３１ないし２３３により同時に検出されることで、１回の励起光焦点走査で、同時に各色素から発生する蛍光に対応する蛍光画像を取得できる。本発明は、２光子励起蛍光顕微鏡に適用できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心波長が互いに異なるに固定されたパルス光を射出する複数のレーザ光源と、
前記複数のレーザ光源からそれぞれ射出される複数のパルス光を２次元的に走査する走査手段と、前記複数のパルス光を複数種類の色素で染色された試料に集光する対物レンズとを有する照明光学系と、
前記走査手段によって走査し、前記対物レンズで集光する前記試料上の各集光位置ごとに、前記中心波長が互いに異なる前記複数のパルス光が順次照射されるように、前記複数のパルス光が前記試料へ向かうタイミングを調整する調整手段と、
前記中心波長が互いに異なる前記複数のパルス光に応じて励起された前記試料の複数種類の色素からそれぞれ発生する複数の蛍光を、前記対物レンズを介して検出する検出手段と
を備えることを特徴とする多光子顕微鏡。
【請求項２】
前記調整手段は、前記複数のレーザ光源からそれぞれ射出される前記複数のパルス光のうちの基準のパルス光に対して他のパルス光を遅延させて、前記複数のパルス光が異なる中心波長ごとに交互に順番に繰り返されるように調整し、
前記検出手段は、前記試料の複数種類の色素から発生した複数の異なるスペクトルを有する蛍光を、異なるスペクトルを有する蛍光ごとに同時に検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の多光子顕微鏡。
【請求項３】
前記調整手段は、前記複数のレーザ光源からそれぞれ射出される複数のパルス光を、所定のタイミングで透過させて、前記複数のパルス光が異なる中心波長ごとに所定の個数を単位として順番に繰り返されるように調整し、
前記検出手段は、前記試料の複数種類の色素から発生した複数の異なるスペクトルを有する蛍光を、前記調整手段による透過のタイミングに同期させて順番に検出する
ことを特徴とする請求項１に記載の多光子顕微鏡。
【請求項４】
前記レーザ光源は、共振器長が短く、超短パルス光を射出する超短パルスレーザ光源である
ことを特徴とする請求項１ないし３の何れか一項に記載の多光子顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多光子顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、２光子励起蛍光顕微鏡では、試料を色素で染色して、近赤外線のパルス状のレーザ（パルス光）で色素を２光子吸収により励起し、発生する蛍光を検出することで、画像化が行われる（例えば、特許文献１参照）。このとき、励起光の焦点近傍からのみ蛍光が発生するため、線形共焦点顕微鏡と異なり、検出器前にピンホールを配置しなくても３次元分解能力をもつという特徴がある。
【０００３】
このような２光子励起蛍光顕微鏡では、しばしば複数種類の色素で試料を染色し、それぞれの色素の２光子吸収効率の高い波長の光で励起することで、各色素から発生する波長の異なる蛍光を検出し、色素ごとに画像化することが行われる。
【０００４】
２光子励起蛍光顕微鏡において、各色素の画像を得る場合には、複数の波長に可変可能な波長可変光源により波長を変えるか、あるいは波長の異なる複数の光源を用意して、順次励起波長を変えてレーザ走査をすることで画像を取得するのが、一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２８４８９５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、画像を取得するに際して、上記の方法によりレーザ走査を行う場合、ガルバノミラーなどの走査手段が要因となり試料の同一の場所を走査しても、走査範囲が例えば、１回目と２回目とで完全には一致せず、多少ずれるのが普通である。そのため、取得した各画像には互いにずれが生じることとなり、この画像のずれを起こさない方法が要求されていた。
【０００７】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、複数種類の色素で染色した試料について、各色素から発生する蛍光を検出して画像化する際にして、各画像が互いにずれないようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の多光子顕微鏡は、中心波長が互いに異なるに固定されたパルス光を射出する複数のレーザ光源と、前記複数のレーザ光源からそれぞれ射出される複数のパルス光を２次元的に走査する走査手段と、前記複数のパルス光を複数種類の色素で染色された試料に集光する対物レンズとを有する照明光学系と、前記走査手段によって走査し、前記対物レンズで集光する前記試料上の各集光位置ごとに、前記中心波長が互いに異なる前記複数のパルス光が順次照射されるように、前記複数のパルス光が前記試料へ向かうタイミングを調整する調整手段と、前記中心波長が互いに異なる前記複数のパルス光に応じて励起された前記試料の複数種類の色素からそれぞれ発生する複数の蛍光を、前記対物レンズを介して検出する検出手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、画像のずれを防止できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第１の実施の形態である２光子励起蛍光顕微鏡の構成の例を示すブロック図である。
【図２】本発明の第２の実施の形態である２光子励起蛍光顕微鏡の構成の例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１２】
図１は、本発明の第１の実施の形態である２光子励起蛍光顕微鏡の構成の例を示すブロック図である。
【００１３】
２光子励起蛍光顕微鏡１は、２光子吸収の原理を利用して、試料Ｓに対して単光子励起の場合の励起光の２倍の波長を有する光子を同時に２光子照射することにより、試料Ｓからの蛍光を観察する多光子顕微鏡である。
【００１４】
２光子励起蛍光顕微鏡１は、レーザ光源１１１ないし１１３、遅延回路１２１及び１２２、ダイクロイックミラー１３、１４、１６、２１、及び２４、ミラー１５、レーザ走査部１７、走査レンズ１８、第２対物レンズ１９、対物レンズ２０、結像レンズ２２１ないし２２３、並びに光検出部２３１ないし２３３を含むようにして構成される。
【００１５】
レーザ光源１１１ないし１１３としては、例えば、超小型レーザが用いられる。この超小型レーザは、パルス幅がフェムト秒単位の（例えば100フェムト秒の）超短パルス光を射出する超短パルスレーザにより構成される。より具体的には、超小型レーザは、例えば、多層膜ミラーにより構成される負分散ミラー、レーザ結晶、過飽和吸収ミラー（SESAM）、及び、SESAMと組み合わせたイットリビウム（Yb）ベースの固体レーザなどにより構成され、ソリトンモードロッキング（ソリトン型モード同期）技術を用いることにより、共振器長を数cmと短くしても、モードロッキング状態を安定して維持することが可能な小型の超短パルスレーザにより構成される。このような小型超短パルスレーザの詳細については、例えば、「山添省吾，加藤雅紀，笠松直史、“小型超短パルスレーザ”、富士フイルム研究報告No.54、2009年、P.43-46」（以下、非特許文献１という）などに記載されている。
【００１６】
非特許文献１に記載されている小型超短パルスレーザは、超短パルス光の波長が固定されているため、波長を変更するための可動部を設ける必要がなく、超短パルス光の射出角度が安定しており、さらに上述した技術的特徴により、従来の波長が可変の超短パルスレーザと比較して非常に小さくすることができる。また、この小型超短パルスレーザは、共振器長が短いため、従来の超短パルスレーザと比較して、超短パルス光の繰り返し周波数を大幅に高く設定することができる。例えば、非特許文献１には、共振器長を5cm未満とし、超短パルス光の最大繰り返し周波数を2.9GHzに設定できることが記載されている。
【００１７】
以上のように構成されるレーザ光源１１１，１１２，１１３は、異なる中心波長（波長λ１，λ２，λ３）に固定された超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３をそれぞれ射出する。なお、本実施の形態では、試料Ｓは、３種類の色素で染色されているものとし、それらの色素の２光子吸収効率の高い波長の光として、超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が用いられているものとする。
【００１８】
レーザ光源１１１から射出された超短パルス光Ｌ１（波長λ１）は、ダイクロイックミラー１３及び１４を透過して、ミラー１５に到達する。
【００１９】
レーザ光源１１２から射出された超短パルス光Ｌ２（波長λ２）は、遅延回路１２１により所定の時間だけ遅延された後、ダイクロイックミラー１３によりダイクロイックミラー１４の方向に反射され、ダイクロイックミラー１４を透過して、ミラー１５に到達する。
【００２０】
レーザ光源１１３から射出された超短パルス光Ｌ３（波長λ３）は、遅延回路１２２により所定の時間だけ遅延された後、ダイクロイックミラー１３によりミラー１５の方向に反射され、ミラー１５に到達する。
【００２１】
すなわち、遅延回路１２１及び１２２によって、超短パルス光Ｌ１に対して超短パルス光Ｌ２，Ｌ３をそれぞれ所定の時間だけ遅延させて、ダイクロイックミラー１３及び１４により混合することで、図中の励起パルス列Ａに示すように、３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が等間隔で順番に繰り返されるようにタイミングを調整する。例えば、励起パルス列Ａでは、図中右側から左側を時間の方向として、超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，・・・が異なる中心波長ごとに順番に繰り返されている。以下、調整された超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３を、超短パルス光Ｌとも称して説明する。
【００２２】
超短パルス光Ｌは、ミラー１５によりダイクロイックミラー１６の方向に反射された後、ダイクロイックミラー１６を透過して、例えばガルバノミラーにより構成されるレーザ走査部１７に入射する。
【００２３】
レーザ走査部１７は、ダイクロイックミラー１６からの超短パルス光Ｌを、３種類の色素で染色されている試料ＳのＸ−Ｙ平面（試料Ｓに照射される超短パルス光Ｌの光軸に対し直交する平面）で走査させる。すなわち、レーザ走査部１７による２次元的な走査によって、超短パルス光Ｌは、走査レンズ１８及び第２対物レンズ１９を経て対物レンズ２０により集光され、試料Ｓ上にスポットを形成する。
【００２４】
これにより、３種類の色素で染色された試料Ｓでは、超短パルス光Ｌのスポットが形成された領域（集光位置）ごとに、中心波長が異なる３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３により順番に励起されて、各色素からスペクトル（波長）の異なる蛍光が発せられることになる。すなわち、レーザ走査部１７によって、試料Ｓ上のある一点（集光位置）に対して、中心波長が異なる３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が順番に照射され、ある一点についての照射が終了すると、次の点以降の点についても同様に照射が繰り返される。
【００２５】
このようにして励起された色素から発生する蛍光（３種類の異なるスペクトルを有する蛍光）は、観察光となって、対物レンズ２０、第２対物レンズ１９、及び走査レンズ１８を経てレーザ走査部１７に入射する。レーザ走査部１７は、試料Ｓに照射した超短パルス光Ｌを走査したときと同様の角度で試料Ｓからの蛍光を反射することで、その蛍光をデスキャンしてダイクロイックミラー１６に入射する。
【００２６】
ダイクロイックミラー１６は、レーザ走査部１７から入射した、試料Ｓの励起された色素から発生する３種類の異なるスペクトルを有する蛍光を、ダイクロイックミラー２１の方向に反射させて、ダイクロイックミラー２１及び２４により、その蛍光の強度を分離させる。すなわち、ダイクロイックミラー２１は、ダイクロイックミラー１６から入射された蛍光のうち、超短パルス光Ｌ１により励起されて発生した蛍光を透過し、それ以外の蛍光をダイクロイックミラー２４の方向に反射させる。
【００２７】
ダイクロイックミラー２１により透過された蛍光は、結像レンズ２２１を通過して、光検出部２３１に入射する。光検出部２３１は、例えばPMT（photo mltiplier tube：光電子増倍管）などにより構成され、結像レンズ２２１により光検出部２３１の受光面において結像した蛍光を受光し、その蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。
【００２８】
ダイクロイックミラー２４は、ダイクロイックミラー２１により反射された蛍光のうち、超短パルス光Ｌ２により励起されて発生した蛍光を結像レンズ２２２の方向に反射し、それ以外の超短パルス光Ｌ３により励起されて発生した蛍光を透過する。
【００２９】
ダイクロイックミラー２４により反射された蛍光は、結像レンズ２２２を通過して、例えばPMTなどにより構成される光検出部２３２に入射され、その蛍光の強度に応じた電気信号として出力される。一方、ダイクロイックミラー２４により透過された蛍光は、結像レンズ２２３を通過して、例えばPMTなどにより構成される光検出部２３３に入射され、その蛍光の強度に応じた電気信号として出力される。
【００３０】
光検出部２３１ないし２３３から出力された電気信号は、パーソナルコンピュータ２Ａに入力される。これらの電気信号は、それぞれ超短パルス光Ｌ１ないしＬ３により励起されて発生した蛍光の強度に応じたものとなるので、光検出部２３１ないし２３３から同時に出力される電気信号は、同一の集光位置における色素から発生した蛍光の強度となる。従って、パーソナルコンピュータ２Ａは、光検出部２３１ないし２３３から同時に出力される電気信号に対して所定の画像処理を施すことで、観察画像として、各色素から発生する蛍光画像を生成することができる。パーソナルコンピュータ２Ａは、生成した蛍光画像をモニタ２Ｂに表示したり、蛍光画像のデータを記録したりする。なお、この蛍光画像であるが、試料Ｓ上のある一点において、３種類の超短パルス光Ｌにより色素が励起されれば３種類の色素から発生する蛍光が検出され、３種類のうちの２種類の超短パルス光Ｌにより色素が励起されれば２種類の色素から発生する蛍光が検出され、３種類のうちの１種類の超短パルス光Ｌにより色素が励起されれば１種類の色素から発生する蛍光が検出されるので、それらの検出された電気信号に対応する画像となる。また、３種類の超短パルス光Ｌをあてても発現しない試料Ｓ上の点からは、蛍光が検出されないことになる。
【００３１】
そして、この蛍光画像は、試料Ｓ上のある一点に対する走査を複数回行わずに、１回の走査により取得したものであるため、複数回の走査により走査範囲が一致しないといったことは起こらない。これにより、３種類の色素で染色した試料Ｓについて、各色素から発生する蛍光を検出して画像化するに際して、各画像が互いにずれることを防止できる。
【００３２】
以上のように、図１の２光子励起蛍光顕微鏡１においては、レーザ光源１１１ないし１１３から射出された異なる中心波長（波長λ１，λ２，λ３）を有する同一繰り返しの３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が、ダイクロイックミラー１３及び１４により混合され、遅延回路１２１及び１２２により３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が順番に等間隔に並ぶように調整される。そして、超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が、３種類の色素で染色された試料Ｓ上に集光されて２次元的に走査され、それにより励起された色素から発生する３種類の異なるスペクトルを有する蛍光の強度が、ダイクロイックミラー２１及び２４により分離され、スペクトルが異なる蛍光ごとに、３つの光検出部２３１ないし２３３により同時に検出される。これにより、１回の励起光焦点走査で、同時に各色素から発生する蛍光に対応する蛍光画像が取得される。
【００３３】
このように、第１の実施の形態である２光子励起蛍光顕微鏡１では、複数種類の色素で染色した試料Ｓを超短パルス光Ｌで励起して、各色素から発生する蛍光を検出して画像化するに際して、各画像の測定範囲が一致するので、画像のずれを防止することができる。
【００３４】
また、２光子励起蛍光顕微鏡１では、レーザ光源１１１ないし１１３として、従来と比べて共振器長が短く、超短パルス光の繰り返し周波数を大幅に高く設定することが可能な小型超短パルスレーザを用いるため、波長が固定された小型超短パルスレーザを複数用意する必要があるが、高価な波長可変光源を用いる場合と比べて、安価に構成することができる。
【００３５】
なお、レーザ光源１１１ないし１１３から射出される超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３であるが、図１の励起パルス列に示したように、完全に等間隔である必要はなく、それらのパルス列が重ならない程度に遅延回路１２１及び１２２により遅延量を調整すればよい。この場合、試料Ｓ上の一点あたり、３種類のパルスが同数入射するように、レーザ走査部１７を構成するガルバノミラーと光検出部２３１ないし２３３を同期させる制御を行うことになる。ただし、超短パルス光Ｌは、高繰り返しのパルスレーザであるため、仮に同期をとらず連続的にガルバノミラーでレーザ走査したとしても、たかだかパルス１つ分の誤差しかのらないので、大きな問題にはならない。
【００３６】
また、第１の実施の形態では、３つのレーザ光源１１１ないし１１３により、中心波長の異なる３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３を試料Ｓに照射して、それにより得られる蛍光を、３つの光検出部２３１ないし２３３により検出する例について説明したが、超短パルス光Ｌの数は３種類に限られるものではない。すなわち、３種類の超短パルス光Ｌは一例であって、中心波長の異なる複数種類の超短パルス光Ｌを試料Ｓに照射できればよく、２光子励起蛍光顕微鏡１では、超短パルス光Ｌの種類に応じたレーザ光源１１、遅延回路１２、及び光検出部２３、並びにその他の光学部材が配置されることになる。その場合、試料Ｓは、複数種類の超短パルス光Ｌに対応した複数種類の色素で染色されることになる。
【００３７】
図２は、本発明の第２の実施の形態である２光子励起蛍光顕微鏡の構成の例を示すブロック図である。なお、図中、図１と対応する部分については同一の符号を付してあり、その説明は適宜省略する。
【００３８】
図２の２光子励起蛍光顕微鏡５１は、図１の２光子励起蛍光顕微鏡１と比較して、遅延回路１２１及び１２２の代わりに、レーザ光源１１１ないし１１３から射出される超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３の順番を調整するためのシャッタ６２１ないし６２３と、それらのシャッタ６２１ないし６２３を制御するためのコントローラ６１が設けられる点が異なる。また、光検出部２３の数が、３つから１つに減少し、それに伴って結像レンズ２２も１つになり、さらに、光検出部２３だけに蛍光を結像させればよいため、ダイクロイックミラー２１，２４が取り除かれている点も異なる。
【００３９】
シャッタ６２１ないし６２３は、例えば、AOM(音響光学素子)やAOFT（音響光学可変フィルタ）等の高速シャッタ素子であり、コントローラ６１の制御にしたがって、レーザ光源１１１ないし１１３から射出された超短パルス光Ｌ１ないしＬ３による試料Ｓの照射を、それぞれオン／オフにより調整する。
【００４０】
すなわち、シャッタ６２１ないし６２３は、レーザ光源１１１ないし１１３から射出される超短パルス光Ｌ１ないしＬ３をそれぞれ順番に透過させることで、ダイクロイックミラー１３及び１４で混合させたとき、図中の励起パルス列Ｂに示すように、３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が、所定の個数ずつ順番に繰り返されるようにタイミングを調整する。例えば、励起パルス列Ｂでは、図中右側から左側を時間の方向として、超短パルス光Ｌ１，Ｌ１，Ｌ２，Ｌ２，Ｌ３，Ｌ３，・・・のように、超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が２個ずつ順番に繰り返されている。なお、各超短パルス光Ｌの繰り返し個数の単位は任意であり、さらにその単位が各超短パルス光ごとに必ずしも一致することを要しない。なぜなら、例えば、超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３がそれぞれ、10個、10個、11個ずつの単位で繰り返されたとしても、たかだかパルス１つ分の誤差しかのらないため、特に観察には影響は及ぼさないからである。
【００４１】
レーザ走査部１７には、図中の励起パルス列Ｂに示す順番で３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が入射される。レーザ走査部１７は、それらの超短パルス光Ｌを、３種類の色素で染色された試料Ｓに集光し、２次元的に走査を行う。すなわち、試料Ｓ上のある一点（集光位置）に対して、中心波長が異なる３種類の超短パルス光Ｌが所定の単位で繰り返し照射され、ある一点についての３種類の超短パルス光Ｌの照射が終了すると、次の点以降についても同様の照射が繰り返される。そうすると、先に述べたように、試料Ｓでは励起された色素から蛍光が発せられ、その蛍光は、レーザ走査部１７によりデスキャンされた後、ダイクロイックミラー１６に入射される。
【００４２】
ダイクロイックミラー１６は、レーザ走査部１７から入射した蛍光を、結像レンズ２２の方向に反射させることで、光検出部２３の受光面には、結像レンズ２２において結像した蛍光が受光される。この蛍光は、３種類の超短パルス光Ｌが所定の単位で繰り返し照射されることで、励起された色素から発生する蛍光であり、照射された各超短パルス光Ｌに応じて３種類の異なるスペクトル（波長）を有するものとなる。光検出部２３は、受光した蛍光の強度に応じた電気信号をパーソナルコンピュータ２Ａに出力する。
【００４３】
パーソナルコンピュータ２Ａには、光検出部２３からの電気信号とともに、コントローラ６１から、超短パルス光Ｌをどの順番で照射しているかを通知するための信号（以下、通知信号という）が入力される。すなわち、コントローラ６１は、シャッタ６２１ないし６２３を制御することで、レーザ光源１１１ないし１１３から射出される超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３の順番の調整を行っており、この順番を示す通知信号をパーソナルコンピュータ２Ａに出力することで、パーソナルコンピュータ２Ａは、光検出部２３から時系列で出力される電気信号の示す蛍光の強度を、シャッタ６２１ないし６２３の制御、つまり、試料Ｓに照射している超短パルス光Ｌに関する情報である通知信号に同期させて順番に取得することができる。
【００４４】
具体的には、コントローラ６１によるシャッタ６２１ないし６２３の制御により、例えば、図中の励起パルス列Ｂに示すように、超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が２個ずつ順番に繰り返される場合、パーソナルコンピュータ２Ａには、それらの超短パルス光Ｌの順番を示す通知信号と、それらの超短パルス光Ｌにより順番に励起されて発生した蛍光の強度に応じた電気信号が同期して入力されることになる。パーソナルコンピュータ２Ａは、コントローラ６１からの通知信号に基づいて、光検出部２３から入力された電気信号に対して所定の画像処理を施すことで、各色素から発生する蛍光に応じた蛍光画像を生成できる。
【００４５】
そして、この蛍光画像は、試料Ｓ上のある一点に対する走査を複数回行わずに、１回の走査により取得したものであるため、複数回の走査により走査範囲が一致しないといったことは起こらない。これにより、３種類の色素で染色した試料Ｓについて、各色素から発生する蛍光を検出して画像化するに際して、各画像が互いにずれることを防止できる。
【００４６】
以上のように、図２の２光子励起蛍光顕微鏡５１においては、レーザ光源１１１ないし１１３から射出された異なる中心波長（波長λ１，λ２，λ３）を有する同一繰り返しの３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が、シャッタ６２１ないし６２３を順番に透過するように、コントローラ６１により調整され、ダイクロイックミラー１３及び１４により混合される。そして、所定の個数ずつ順番に繰り返される超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３が、３種類の色素で染色された試料Ｓ上に集光されて２次元的に走査され、それにより励起された色素から発生する３種類の異なるスペクトルを有する蛍光の強度が、コントローラ６１によるシャッタ６２１ないし６２３の制御、つまり、試料Ｓに照射している超短パルス光Ｌに関する情報である通知信号（超短パルス光Ｌの透過のタイミング）に同期して順番に検出される。これにより、１回の励起光焦点走査で、測定範囲の一致した３種類の色素から発生する蛍光に対応する蛍光画像が同時に取得される。
【００４７】
このように、第２の実施の形態である２光子励起蛍光顕微鏡５１では、複数種類の色素で染色した試料Ｓを超短パルス光Ｌで励起して、各色素から発生する蛍光を検出して画像化するに際して、各画像の測定範囲が一致するので、画像のずれを防止することができる。
【００４８】
なお、第２の実施の形態では、３つのレーザ光源１１１ないし１１３により、中心波長の異なる３種類の超短パルス光Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３を試料Ｓに照射して、それにより得られる蛍光を、１つの光検出部２３により検出する例について説明したが、超短パルス光Ｌの数は３種類に限られるものではない。すなわち、３種類の超短パルス光Ｌは一例であって、中心波長の異なる複数種類の超短パルス光Ｌが試料Ｓに照射できればよく、２光子励起蛍光顕微鏡５１では、コントローラ６１により試料Ｓに照射している超短パルス光Ｌに関する情報を取得して光検出部２３から出力される電気信号と同期させることができるので、光検出部２３は１つのまま、超短パルス光Ｌの種類に応じたレーザ光源１１及びシャッタ６２、並びにその他の光学部材が配置されることになる。その場合、試料Ｓは、複数種類の超短パルス光Ｌに対応する複数種類の色素で染色されることになる。
【００４９】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００５０】
１，５１  ２光子励起蛍光顕微鏡，  ２Ａ  パーソナルコンピュータ，  ２Ｂ  モニタ，  １１１，１１２，１１３  レーザ光源，  １２１，１２２  遅延回路，  １３，１４，１６，２１，２４  ダイクロイックミラー，  １５  ミラー，  １７  レーザ走査部，  １８  走査レンズ，  １９  第２対物レンズ，  ２０  対物レンズ，  ２２，２２１，２２２，２２３  結像レンズ，  ２３，２３１，２３２，２３３  光検出部，  ６１  コントローラ，  ６２１，６２２，６２３  シャッタ，  Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３  超短パルス光
【図１】
2011141311.tif 000003
【図２】
2011141311.tif 000004