(57)【要約】【課題】反応速度の低下を抑制し、効率よく多糖類から分解糖を製造することのできる方法の提供。【解決手段】多糖類に脂肪酸の存在下、加水分解酵素を作用させる単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類に脂肪酸の存在下、加水分解酵素を作用させる単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
多糖類の乾燥固形分に対する脂肪酸の質量比が０．００５〜２．０である請求項１記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
脂肪酸の融点が６０℃以下である請求項１又は２記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
脂肪酸の炭素数が６〜２４である請求項１〜３のいずれか１項記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
多糖類としてセルロース含有バイオマスを用いる、請求項１〜４のいずれか１項記載の単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類、特にバイオマスから単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖（以下、総称して「分解糖」ともいう）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石資源に代えてセルロース系、デンプン系、或いは糖質系のバイオマスからエタノールや乳酸等の有用物質を製造する技術の開発が望まれている。とりわけ、非食糧資源であるセルロース系バイオマスを有効利用する技術への関心が高まっている。
バイオマスからのエタノール等の製造は、バイオマスを糖化工程において糖に分解した後、これを発酵工程においてエタノール等に変換することにより行うことができる。糖化は、硫酸等を用いる酸糖化と酵素糖化に大別される。
【０００３】
酵素糖化は、酸糖化に比して緩和な条件で加水分解できる等の利点があるが、特にセルロース系バイオマスを利用する場合、反応速度が非常に遅く、糖化率の向上が大きな課題になっている。
糖化率向上のための技術として、糖化工程に先立って予めバイオマスを前処理する方法が検討されている。前処理方法としては、例えば、硫酸法、有機溶媒法、水熱処理法、機械的破砕等が知られている。
【０００４】
また、酵素反応時に第３成分を添加して糖化率を向上させる検討も行われ、例えば、リグノセルロース系植物材料を粉砕処理した後、小麦フスマ及び界面活性剤を添加して糖化酵素により糖化処理する方法（特許文献１）；リグニンと親和性の高い物質、例えばタンパク質を予め添加した後、加水分解酵素により反応を開始するセルロースの糖化方法（特許文献２）；ポリエチレングリコールを添加してセルラーゼによりバイオマスを加水分解する方法（非特許文献１）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−９７５７５号公報
【特許文献２】特開２００９−７２１４４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Enzyme Microb. Tschnol., 40, 754 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、セルロース系バイオマスを機械的破砕等で前処理した後に酵素糖化に供した場合でも、経時的に反応速度が低下し、十分な糖化率が得られない場合があることが判明した。
一方で、従来の酵素反応時に界面活性剤を添加する方法では、加水分解率を高めるため添加量を多くすると酵素が失活してしまい、却って糖化率が低下する場合がある。また、上記いずれの添加成分も水溶性であるため加水分解後の糖溶液からの除去が困難で、操作が煩雑になる。
従って、本発明の課題は、反応速度の低下を抑制し、効率よく多糖類から分解糖を製造することのできる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討したところ、多糖類に脂肪酸の存在下で加水分解酵素を作用させることにより、反応速度の低下が抑制され、糖化率が向上し、効率よく分解糖を製造できることを見出した。
セルロース系バイオマスは、通常、植物を構成する細胞壁や細胞間層にリグニンを多量に含み、これがセルラーゼによる加水分解を阻害していると考えられている。そのため、上記従来技術では、原料に含まれるリグニンをマスキングすることにより、セルラーゼのリグニンへの吸着を抑制し、セルロースにセルラーゼを作用させ易くして糖化率向上を試みている。これに対し、本発明者らは、脂肪酸の存在下で酵素による加水分解反応を行えば、リグニンを含む原料だけでなく、リグニンを含まない原料であっても高い糖化率が得られることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、多糖類に脂肪酸の存在下、加水分解酵素を作用させる単糖類、二糖類、及び／又はオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、糖化率を向上させることができ、分解糖を効率よく製造することが可能になる。本発明方法は、多糖類を含むバイオマスにも適用可能であり、バイオマスからのエタノ−ル等有用物質の製造を高効率化する技術として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、木材パルプの粉砕物にセルラーゼを作用させた時の糖化率に及ぼす脂肪酸の影響を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明で用いられる多糖類としては、例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシログルカン、ペクチン、澱粉、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キチン、キトサン、イヌリン、アルギン酸、寒天、フコイダン、ラミナリン、β−グルカン、プルラン等の天然多糖又はこれらの誘導体が挙げられる。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、安価かつ分解後の発酵生産により有用物質に変換可能である点から、セルロース、ヘミセルロース、キチン、キトサンが好ましく、特にセルロース、ヘミセルロースが好ましい。本発明で用いられる多糖類の分子量は、特に限定されないが、一般的には１，０００以上５，０００，０００以下であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明における多糖類として、前記多糖類を含む原料、例えば、バイオマスを用いることもできる。バイオマスとは、生物由来の有機資源で、化石資源を除いたものである。バイオマスとしては、セルロース系、デンプン系、或いは糖質系のバイオマスが挙げられ、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
なかでも、資源の有効活用の点から、セルロースを含有するセルロース系バイオマスを用いることが好ましい。
【００１４】
セルロース系バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンを主成分とするものであり、例えば、綿、木材系パルプ、ケナフ、麻、小径木、間伐材、おが屑、木屑、古紙、新聞紙、包装紙、ティッシュペーパー、トイレットペーパー、ダンボール等の木質系；バガス、スイッチグラス、エレファントグラス、稲ワラ、ムギワラ等の草木系のバイオマスが挙げられる。また、デンプン系バイオマスとしては、例えば、米、麦、トウモロコシ、イモ等が挙げられ、糖質系バイオマスとしては、サトウキビ、テンサイ、海藻、エビ殻、カニ殻等の糖質系バイオマスが挙げられる。
【００１５】
多糖類としてバイオマスを用いる場合は、加水分解反応に先立って前処理を施してもよい。前処理方法としては、特に制限されず、例えば、硫酸法、有機溶媒法、水熱処理法、機械的破砕等が挙げられる。なかでも、乾燥、粉砕、細断等を行うのが好ましい。
乾燥は通気式バンド乾燥機、棚段式熱風乾燥機等を用いることができる。粉砕、細断は、例えば公知の回転ボールミル、遊星型ボールミル、ディスクミル、ロッドミル等を用いることができる。バイオマスの粉砕、細断は、加水分解酵素との接触表面積を大きくする点から、８００μｍ以下、特に３〜３００μｍのサイズまで行うのが好ましい。
バイオマスは、粉砕等の前処理により非晶化が進行し、非晶化されたバイオマスは酵素糖化に有利である。非晶化の程度は、実施例記載の結晶化度の算出により測定できる。バイオマスの結晶化度は８０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましく、２０％以下がさらに好ましく、ゼロであるものが特に好ましい。
【００１６】
本発明において、多糖類の酵素による加水分解反応は脂肪酸の存在下で行われる。ここで、脂肪酸としては、直鎖又は分岐鎖状の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。脂肪酸の融点は、６０℃以下、更に−１０〜５０℃、特に−５〜３０℃であるのが、加水分解後の糖溶液からの分離・回収が容易である点、取扱が容易である点、分散効率の点、及び糖化率向上の点から好ましい。また、脂肪酸の炭素数に特に制限はないが、同様の理由から、炭素数６〜２４、更に炭素数６〜２２、特に炭素数６〜２０、殊更に炭素数６〜１２であるのが好ましい。具体的には、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が挙げられる。なかでも、カプリル酸が好ましい。
【００１７】
脂肪酸の使用量は、糖化率向上の点から、基質である多糖類の乾燥固形分に対する質量比として０．００５〜２．０が好ましく、更に０．００８〜１．０、特に０．００９〜０．８、殊更０．０１〜０．２９が好ましい。
【００１８】
多糖類はスラリー状にして用いるのが好ましく、スラリー中の多糖類の含有量は、流動性の点から、１〜２００ｇ／Ｌ、更に５〜１５０ｇ／Ｌ、特に８〜１００ｇ／Ｌとするのが好ましい。スラリーとしては、水、各種緩衝液等が挙げられる。水としては、水道水、蒸留水、イオン交換水、精製水が例示される。緩衝液としては、ｐＨ３〜８の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等が例示される。
脂肪酸は、この多糖類を含むスラリーへ添加するのが好ましく、添加のタイミングは、加水分解酵素を添加する前でも後でもよい。
【００１９】
本発明で用いられる加水分解酵素としては、多糖類に対して加水分解活性を有する酵素であれば特に制限はないが、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、グルカナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、アガラーゼ、ラクトーゼ、ムタナーゼ、キチナーゼ、キトサナーゼ等が挙げられる。
加水分解酵素は、その起源に限定はなく、さらに、遺伝子組み換え技術、部分加水分解等による人工酵素であってもよい。
また、加水分解酵素の形態は特に限定されず、酵素蛋白質の乾燥物、酵素蛋白質を含む粒子、及び酵素蛋白質を含む液体等を用いることができる。
【００２０】
加水分解酵素の使用量は、加水分解反応の条件、多糖類の種類等によって異なるが、例えば、セルラーゼの場合、多糖類１ｇあたり１〜２００ＦＰＵが好ましく、特に５〜５０ＦＰＵが好ましい。ここでＦＰＵ活性は以下に示すＩＵＰＡＣ法により測定される。まず、濾紙（ワットマンＮｏ．１）５０ｍｇを基質とし、これに酵素液０．５ｍＬと０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）１．０ｍＬを加え、５０℃で１．０時間酵素反応を行った後、ジニトロサリチル酸試薬３．０ｍＬを加え、１００℃で５．０分間加熱し発色させる。冷却後、これにイオン交換水２０ｍＬを加え５４０ｎｍの波長で比色定量する。１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１ユニット（ＦＰＵ）とする。
【００２１】
多糖類と加水分解酵素との反応は、使用する酵素の特性に合わせて温度やｐＨを選択することが可能であるが、例えば、セルラーゼを用いる場合、ｐＨ３〜８、特にｐＨ４〜７とすることが好ましく、温度は１０〜８０℃、特に２０〜６０℃とすることが好ましい。また、反応温度は、脂肪酸が液体で存在する条件であることが好ましい。
【００２２】
反応時間は、多糖類の種類等によって異なるが、糖化率及び生産効率の点から、例えば、１〜２４０時間が好ましく、更に２〜２００時間、特に３〜１４０時間が好ましい。
【００２３】
加水分解反応終了後、反応液を分解糖を含む糖溶液と脂肪酸とに分離してもよい。分解糖を含む糖溶液と脂肪酸とを分離する方法としては、特に制限されず、例えば遠心分離やデカンテーションにより行うことができる。回収した脂肪酸は、再利用してもよい。
【００２４】
かくして、加水分解反応により得られる単糖類としては、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、アラビノース等が挙げられる。また、二糖類としては、セロビオース、マルトース、ジ−Ｎ−アセチルキトビオース等が挙げられ、オリゴ糖としては３〜１０の単糖単位を有するものをいい、例えば、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、トリ−Ｎ−アセチルキトトリオース、テトラ−Ｎ−アセチルキトテトラオース、ペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオース、ヘキサ−Ｎ−アセチルキトヘキサオース等が挙げられる。
【００２５】
本発明方法によれば、１０〜１００％、更に１５〜１００％、特に２０〜１００％の糖化率で多糖類から分解糖を製造することができる。なお、糖化率とは、加水分解反応により生成した水溶性糖（グルコースに代表される単糖類、二糖類とオリゴ糖）の合計質量を、原料多糖類の質量で割った値を云い、後記記載の方法で求めることができる。
【００２６】
得られる分解糖は、これら分解糖を糖源として、微生物発酵を行ったり、化学変換したりすることにより、エタノール、ポリ乳酸、アミノ酸、キシリトールやエリスリトール等の有用物質を製造することができる。
【実施例】
【００２７】
＜水溶性糖濃度（単糖類濃度、二糖類濃度、オリゴ糖濃度）の測定＞
日立製作所製高速液体クロマトグラフを用い、昭和電工製カラムＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ  （４．５ｍｍφ×２５０ｍ）を装着し、カラム温度２０℃でグラジエント法により行った。移動相Ａ液はアセトニトリル、Ｂ液は３０％メタノール水とし、１．００ｍＬ／分で送液した。グラジエント条件は以下のとおりである。
時間（分）    Ａ液（％）      Ｂ液（％）
０            ２０          ８０
４５            ５０          ５０
４５．１        ２０          ８０
５５            ２０          ８０
試料注入量は５μＬ、検出はＥＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製コロナＣＡＤ検出器を用いた。
【００２８】
＜糖化率の算出＞
糖化率は次式（１）により算出した。
糖化率（％）＝｛（反応後の水溶性糖質量）−（反応前の水溶性糖質量）｝／原料多糖類の質量×１００      （１）
【００２９】
＜結晶化度の算出＞
セルロースＩ型結晶化度は、Ｘ線回折法による回折強度値からＳｅｇａｌ法により算出したもので、次式（２）により定義される。
セルロースＩ型結晶化度（％）＝〔（Ｉ22.6−Ｉ18.5）／Ｉ22.6〕×１００    （２）
〔Ｉ22.6は、Ｘ線回折における格子面（００２面）（回折角２θ＝２２．６°）の回折強度、Ｉ18.5は、アモルファス部（回折角２θ＝１８．５°）の回折強度を示す〕
なお、上記式（２）で定義されたセルロースＩ型結晶化度では計算上マイナスの値になる場合があるが、マイナスの値の場合はセルロースＩ型結晶化度は０％とする。
【００３０】
実施例１
微結晶粉末セルロース（シグマアルドリッチ製、含水率５％、結晶化度７０％）１．０５ｇをｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸緩衝溶液１９．９５ｇに分散させた。これにカプリル酸０．２９ｇとセルラーゼ（ノボザイムズ製セルクラスト１．５Ｌ）１２５μＬを添加した（基質１ｇあたりの添加は８．７５ＦＰＵ）。加水分解は５０℃の恒温槽中、１１０ｒ／ｍｉｎで振とうしながら７２時間行った。反応終了後、反応液をフィルターでろ過し、水溶性糖濃度を測定した。水溶性糖としては、グルコース、セロビオース、キシロースが測定された。反応条件と結果を表１に示す。
【００３１】
実施例２
カプリル酸の代わりにオレイン酸０．１８ｇを使用した以外は実施例１と同様に反応を行った。反応条件と結果を表１に示す。
【００３２】
比較例１
脂肪酸を添加しない以外は実施例１と同様に反応を行った。反応条件と結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2011120578.tif 000002
【００３４】
実施例３
シート状木材パルプ（Ｂｏｒｒｅｇａｒｄ社製Ｂｌｕｅ  Ｂｅａｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｅｔｈｅｒ、セルロース含有量９６質量％）を振動ロッドミル（φ３０ｍｍ×１３本）を用いて３０分乾式粉砕した。処理後のセルロースの結晶化度はゼロであった。この非晶化セルロース（含水率１４％）１．１４ｇをｐＨ５．０の０．１Ｍクエン酸緩衝溶液１９．８６ｇに分散させた。これにカプリル酸０．０１ｇとセルラーゼ（ノボザイムズ製セルクラスト１．５Ｌ）を１２５μＬ添加した（基質１ｇあたりの添加は８．７５ＦＰＵ）。加水分解は５０℃の恒温槽中で１１０ｒ／ｍｉｎで振とうしながら２４０時間反応を行った。反応中、随時反応液のサンプリングを行い、各反応液をフィルターでろ過し、水溶性糖濃度を測定した。水溶性糖としては、グルコース、セロビオース、キシロースが測定された。反応条件と１２０時間反応させた時の結果を表２に示す。また、糖化率の経時変化を図１に示す。
【００３５】
比較例２
脂肪酸を添加しない以外は実施例３と同様に反応を行った。反応条件と結果を表２に示す。また、糖化率の経時変化を図１に示す。
【００３６】
【表２】
2011120578.tif 000003
【００３７】
表１及び２から明らかなように、多糖類を脂肪酸の存在下で酵素加水分解した実施例１〜３では、脂肪酸無添加の比較例１及び２に比べていずれも糖化率が向上した。特に、表２及び図１から明らかなように、非晶化された多糖類を用いることでより高い糖化率が得られた。
【図１】
2011120578.tif 000004