(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子増幅法によりピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の目的領域を特異的に増幅するためのプライマー試薬およびその用途を提供する。【解決手段】複数の特定の配列からなる塩基配列の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーを使用して、試料中の被検核酸を鋳型として、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行う。これにより、２１４１位、２１４２位および２１４３位の検出対象領域を含む領域を特異的に増幅できる。そして、得られた増幅産物と検出用プローブとを用いてＴｍ解析を行うことにより、特異的に、前記２１４１位、２１４２位または２１４３位における変異の有無を検出でき、これによってピロリ菌がクラリスロマイシン耐性か否かを判断できる。【選択図】図１
2011062143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子増幅法により、ヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマー試薬であって、下記（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｒ１）および（Ｒ２）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むことを特徴とするプライマー試薬。
（Ｆ１）配列番号１に示すオリゴヌクレオチド
5’-ttcagtgaaattgtagtggaggtgaaaattcctcctaccc-3’
（Ｆ２）配列番号２に示すオリゴヌクレオチド
5’-gcgtaacgagatgggagctgtctcaacc-3’
（Ｒ１）配列番号３に示すオリゴヌクレオチド
5’-gtatctcaaggatgactccataagagccaaagccc-3’
（Ｒ２）配列番号４に示すオリゴヌクレオチド
5’-gtggtatctcaaggatgactccataagagccaaagc-3’
【請求項２】
前記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーと前記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーとのプライマーセットを含む、請求項１記載のプライマー試薬。
【請求項３】
ヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異を検出する方法であって、
前記変異が、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２１４１位、２１４２位および２１４３位の少なくともいずれかの部位における変異であり、
下記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする変異の検出方法。
（Ａ）反応系において、被検核酸を鋳型として、請求項１または２記載のプライマー試薬を用いて、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程で得られた増幅産物と変異の検出用プローブとを含む前記反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記いずれかの部位における変異の有無を決定する工程
【請求項４】
前記（Ａ）工程において、前記検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行う、請求項３記載の検出方法。
【請求項５】
前記検出用プローブが、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における２１４１位、２１４２位および２１４３位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブである、請求項３または４記載の検出方法。
【請求項６】
前記検出用プローブが、オリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなる、請求項３から５のいずれか一項に記載の検出方法。
（ｉ）ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子において、２１４１位、２１４２位および２１４３位の塩基を含む、１０〜３０塩基の長さのオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）前記（ｉ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド
【請求項７】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記２１４１位の塩基がグアニン、前記２１４２位の塩基がアデニン、前記２１４３位の塩基がアデニンである、請求項６記載の検出方法。
【請求項８】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号５に示す塩基配列における、１０〜３０塩基の連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである、請求項６または７記載の検出方法。
5’-cctacccgcggcaagacggaaagaccccgtggacc-3’  （配列番号５）
【請求項９】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号６および７に示す少なくとも一方の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項６から８のいずれか一項に記載の検出方法。
5’-caagacggaaagacccc-3’  （配列番号６）
5’-ggcaagacggaaagacc-3’  （配列番号７）
【請求項１０】
前記（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項６から９のいずれか一項に記載の検出方法。
5’-gagctggcaagacggaaagacc-3’  （配列番号８）
【請求項１１】
前記検出用プローブが、標識物質を有する標識プローブである、請求項３から１０のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１２】
前記標識物質が、蛍光物質であり、前記（Ｂ）工程において、前記シグナル値として蛍光強度を測定する、請求項１１記載の検出方法。
【請求項１３】
前記標識プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さないプローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブである、請求項１１または１２記載の検出方法。
【請求項１４】
前記標識プローブが、蛍光物質で標識化されたプローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブである、請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端が、前記標識物質により標識化され、
前記標識化された末端の塩基が、シトシンまたはグアニンである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記検出用プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項３から１５のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記（Ａ）工程において、コントロール用鋳型核酸の存在下、前記反応系において、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行い、
前記コントロール用鋳型核酸が、前記ヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を含み、請求項１または２記載のプライマー試薬により増幅可能であり、且つ、前記検出用プローブがハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、請求項３から１６のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記被検核酸が、生体試料由来の核酸である、請求項３から１７のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記生体試料が、胃液である、請求項１８記載の検出方法。
【請求項２０】
請求項３から１９のいずれか一項に記載のヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異を検出する方法に使用する検出用プローブであって、
前記ｒＲＮＡ遺伝子における２１４１位、２１４２位および２１４３位を含む配列にハイブリダイズ可能であり、
下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする検出用プローブ。
（ｉ）ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子において、２１４１位、２１４２位および２１４３位の塩基を含む、１０〜３０塩基の長さのオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）前記（ｉ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド
【請求項２１】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記２１４１位の塩基がグアニン、前記２１４２位の塩基がアデニン、前記２１４３位の塩基がアデニンである、請求項２０記載の検出用プローブ。
【請求項２２】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号５に示す塩基配列における、１０〜３０塩基の連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである、請求項２０または２１記載の検出用プローブ。
5’-cctacccgcggcaagacggaaagaccccgtggacc-3’  （配列番号５）
【請求項２３】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号６および７に示す少なくとも一方の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
5’-caagacggaaagacccc-3’  （配列番号６）
5’-ggcaagacggaaagacc-3’  （配列番号７）
【請求項２４】
前記（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドが、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
5’-gagctggcaagacggaaagacc-3’  （配列番号８）
【請求項２５】
前記検出用プローブが、標識物質を有する標識プローブである、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
【請求項２６】
前記標識プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブである、請求項２５記載の検出用プローブ。
【請求項２７】
前記標識プローブが、蛍光物質で標識化されたプローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブである、請求項２６記載の検出用プローブ。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端が、前記標識物質により標識化され、
前記標識化された末端の塩基が、シトシンまたはグアニンである、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
【請求項２９】
前記検出用プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項２０から２８のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
【請求項３０】
請求項３から１９のいずれか一項に記載のヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異を検出する方法に使用する検出試薬であって、
請求項１または２記載のプライマー試薬を含むことを特徴とする検出試薬。
【請求項３１】
さらに、請求項２０から２９のいずれか一項に記載の検出用プローブを含む、請求項３０記載の検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における２１４１位、２１４２位および２１４３位を含む領域を増幅するためのプライマー試薬およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、以下「ピロリ菌」ともいう）は、胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等の疾患の原因菌として知られている。このため、これらの疾患の治療方法として、ピロリ菌を取り除く除菌治療が行われている。この除菌治療の一つとして、抗生物質であるクラリスロマイシンを使用する療法がある。しかし、近年、前記クラリスロマイシンに耐性を示すピロリ菌が増加し、これによって、除菌率の低下が問題となっている。
【０００３】
ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性については、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（以下、「ｒＲＮＡ遺伝子」ともいう）における、２１４１位、２１４２位および２１４３位の多型との関連性が報告されている。２１４１位の多型は、グアニンがアデニンに変異（Ｇ２１４１Ａ）しており、２１４２位の多型は、２１４２位のアデニンがグアニンに変異（Ａ２１４２Ｇ）またはシトシンに変異（Ａ２１４２Ｃ）しており、２１４３位の多型は、２１４３位のアデニンがグアニンに変異（Ａ２１４３Ｇ）している。このため、ピロリ菌のｒＲＮＡ遺伝子多型を調べることにより、より効率的なテーラーメイド除菌治療の実現が期待される（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３等）。
【０００４】
他方、あらゆる疾患の原因、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。点突然変異の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象の変異が生じる部位（検出対象部位）を含む領域（増幅対象領域）をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅させ、その全遺伝子配列を解析するＤｉｒｅｃｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（２）試料の標的ＤＮＡについて、前記増幅対象領域をＰＣＲにより増幅させ、前記増幅対象領域における前記変異の有無により切断作用が異なる制限酵素によって、その増幅産物を切断し、電気泳動することでタイピングを行うＲＦＬＰ解析、（３）３’末端領域に検出対象の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。
【０００５】
しかしながら、これらの方法は、例えば、試料から抽出したＤＮＡの精製、電気泳動、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、ＰＣＲを行った後、反応容器を一旦開封する必要があるため、前記増幅産物が次の反応系に混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、自動化が困難であるため、大量のサンプルを解析することができない。また、前記（３）のＡＳＰ−ＰＣＲ法については、特異性が低いという問題もある。
【０００６】
このような問題から、近年、変異の検出方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を解析する方法が実用化されている。このような方法は、例えば、Ｔｍ解析、または、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。これは、以下のような方法である。すなわち、まず、検出対象部位を含む領域に相補的なプローブを用いて、被検試料の一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナルの変動によって検出する。そして、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することにより、変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定する。前記測定値が評価基準値と同程度であれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに変異が存在しないと判断できる。そして、この方法によれば、遺伝子解析の自動化も可能である。
【０００７】
しかしながら、このようなＴｍ解析を利用した検出方法についても、ＰＣＲにおいて、前記増幅対象領域を特異的且つ効率的に増幅できなければならないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−１４８２４５号公報
【特許文献２】特開平１０−２８６０９９号公報
【特許文献３】特開２００１−３２１１９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、遺伝子増幅法によりピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の目的領域を特異的に増幅するためのプライマー試薬およびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明のプライマー試薬は、遺伝子増幅法により、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマー試薬であって、下記（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｒ１）および（Ｒ２）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むことを特徴とする。
（Ｆ１）配列番号１に示すオリゴヌクレオチド
5’-ttcagtgaaattgtagtggaggtgaaaattcctcctaccc-3’
（Ｆ２）配列番号２に示すオリゴヌクレオチド
5’-gcgtaacgagatgggagctgtctcaacc-3’
（Ｒ１）配列番号３に示すオリゴヌクレオチド
5’-gtatctcaaggatgactccataagagccaaagccc-3’
（Ｒ２）配列番号４に示すオリゴヌクレオチド
5’-gtggtatctcaaggatgactccataagagccaaagc-3’
【００１１】
本発明の変異の検出方法は、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異を検出する方法であって、前記変異が、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２１４１位、２１４２位および２１４３位の少なくともいずれかの部位における変異であり、
下記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）反応系において、被検核酸を鋳型として、前記本発明のプライマー試薬を用いて、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程で得られた増幅産物と変異の検出用プローブとを含む前記反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記いずれかの部位における変異の有無を決定する工程
【００１２】
本発明の検出用プローブは、前記本発明の検出方法に使用する検出用プローブであって、前記ｒＲＮＡ遺伝子における２１４１位、２１４２位および２１４３位を含む配列にハイブリダイズ可能であり、下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ｉ）ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子において、２１４１位、２１４２位および２１４３位の塩基を含む、１０〜３０塩基の長さのオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）前記（ｉ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド
【００１３】
本発明の変異検出試薬は、前記本発明のピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異を検出する方法に使用する検出試薬であって、前記本発明のプライマー試薬を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のプライマー試薬によれば、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における２１４１位、２１４２位および２１４３位を含む目的領域を特異的に増幅できる。このため、前記本発明のプライマー試薬を用いた本発明の変異の検出方法によれば、より特異的に効率よく、前記各部位における変異の検出が可能となる。前述のように、これらの部位における変異は、ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性との関連性が知られていることから、本発明は、医療分野において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例２における、コントロールプラスミド（ＩＣ）のＴｍ解析結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例２における、正常型プラスミド（ｗｔ）およびコントロールプラスミド（ＩＣ）のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２における、変異型プラスミド（ｍｔ１）およびコントロールプラスミド（ＩＣ）のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２における、変異型プラスミド（ｍｔ２）およびコントロールプラスミド（ＩＣ）のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例２における、変異型プラスミド（ｍｔ３）およびコントロールプラスミド（ＩＣ）のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例２における、変異型プラスミド（ｍｔ４）およびコントロールプラスミド（ＩＣ）のＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、検出目的の変異とは、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における、２１４１位、２１４２位および２１４３位のうち少なくとも一カ所の変異である。前記２１４１位の塩基は、野生型はグアニンであり、変異型はアデニン（ＧＡ２１４１Ａ）が知られている。前記２１４２位の塩基は、野生型がアデニンであり、変異型はグアニン（Ａ２１４２Ｇ）とシトシン（Ａ２１４２Ｃ）とが知られている。また、前記２１４３位は、野生型がアデニンであり、変異型はグアニン（Ａ２１４３Ｇ）が知られている。この３カ所の塩基のうちいずれか１カ所が変異型を示す場合、そのピロリ菌は、クラリスロマイシン耐性変異株と判断できる。なお、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｕ２７２７０として登録されている。
【００１７】
本発明において、以下、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を「ｒＲＮＡ遺伝子」といい、前記３カ所のうちいずれか１カ所が変異型である前記ｒＲＮＡ遺伝子を「変異型ｒＲＮＡ遺伝子」、前記３カ所全てが野生型である前記ｒＲＮＡ遺伝子を「野生型ｒＲＮＡ遺伝子または正常型ｒＲＮＡ遺伝子」という。本発明において、前記ｒＲＮＡ遺伝子における、２１４１位、２１４２位および２１４３位のトリヌクレオチド領域を、「検出対象領域」ともいう。また、本発明において、増幅させる目的領域、すなわち、前記ｒＲＮＡ遺伝子における前記検出対象領域を含む領域を、「増幅対象領域」ともいう。前記増幅対象領域は、例えば、前記ｒＲＮＡ遺伝子のセンス鎖における領域でもよいし、それに対応するアンチセンス鎖における領域でもよいし、両方であってもよい。本発明において、被検核酸とは、変異の検出に供される核酸を意味する。本発明において、プローブが一本鎖核酸とハイブリダイズする際、前記一本鎖核酸における前記プローブがハイブリダイズする領域を、以下、「ハイブリダイズ領域」という。
【００１８】
本発明において、末端とは、オリゴヌクレオチドの５’側および３’側の最も端の塩基を意味する。また、末端領域とは、オリゴヌクレオチドの５’末端から数塩基の領域であり、３’末端領域とは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端から数塩基の領域である。前記数塩基とは、例えば、末端から１塩基〜１０塩基である。本発明において、末端からＸ塩基目（Ｘは正の整数）とは、末端の塩基を１塩基目とした順番であり、例えば、末端から１塩基目とは、末端の塩基、末端から２塩基目とは、末端の隣の塩基を意味する。
【００１９】
＜プライマー試薬＞
本発明のプライマー試薬は、遺伝子増幅法により、ピロリ菌のｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマー試薬であって、下記（Ｆ１）、（Ｆ２）、（Ｒ１）および（Ｒ２）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーを含むことを特徴とする。
（Ｆ１）配列番号１に示すオリゴヌクレオチド
5’-ttcagtgaaattgtagtggaggtgaaaattcctcctaccc-3’
（Ｆ２）配列番号２に示すオリゴヌクレオチド
5’-gcgtaacgagatgggagctgtctcaacc-3’
（Ｒ１）配列番号３に示すオリゴヌクレオチド
5’-gtatctcaaggatgactccataagagccaaagccc-3’
（Ｒ２）配列番号４に示すオリゴヌクレオチド
5’-gtggtatctcaaggatgactccataagagccaaagc-3’
【００２０】
前記（Ｆ１）および（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、それぞれ、ピロリ菌の前記ｒＲＮＡ遺伝子のセンス鎖を増幅するためのフォワードプライマーであり、前記（Ｒ１）および（Ｒ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーは、それぞれ、前記ｒＲＮＡ遺伝子のアンチセンス鎖を増幅するためのリバースプライマーである。なお、前記各オリゴヌクレオチドからなるプライマーを、以下、本発明のプライマーともいう。
【００２１】
本発明のプライマー試薬は、前記オリゴヌクレオチドからなる本発明のプライマーのうちいずれか一種類を含んでいればよいが、少なくとも二種類の本発明のプライマーを含むことが好ましい。具体的には、例えば、増幅効率が優れることから、一対の前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーとを含むことが好ましい。フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは、特に制限されないが、例えば、前記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと前記（Ｒ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせが好ましい。本発明のプライマー試薬が、二種類以上の本発明のプライマーを含む場合、本発明のプライマー試薬は、例えば、本発明のプライマーセットということもできる。なお、本発明のプライマー試薬が、二種類以上の本発明のプライマーを含む場合、例えば、各プライマーは、例えば、別個の容器に収容される等、使用時まで独立した状態であってもよいし、混合された状態であってもよい。
【００２２】
本発明のプライマー試薬がフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む場合、そのモル比は、特に制限されず、核酸増幅反応時における前記両者のモル比も、特に制限されない。具体例として、フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）とのモル比（Ｆ：Ｒ）は、１：０．５〜１：４であることが好ましく、より好ましくは１：１〜１：３であり、特に好ましくは１：２である。
【００２３】
＜検出用プローブ＞
本発明の検出用プローブは、前述のように、本発明のピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異の検出方法に使用する検出用プローブであり、前記ｒＲＮＡ遺伝子の増幅対象領域における前記検出対象領域を含む配列にハイブリダイズ可能であればよい。
【００２４】
本発明の検出用プローブは、その長さは特に制限されないが、例えば、５〜５０塩基であり、好ましくは１０〜３０塩基であり、より好ましくは１０〜２５塩基、さらに好ましくは１５〜２５塩基、特に好ましくは１７〜２２塩基である。本発明の検出用プローブは、例えば、前記ｒＲＮＡ遺伝子のセンス鎖にハイブリダイズ可能であってもよいし、アンチセンス鎖にハイブリダイズ可能であってもよい。
【００２５】
本発明の検出用プローブの具体例としては、例えば、下記（ｉ）および（ｉｉ）の少なくとも一方のオリゴヌクレオチドからなるプローブがあげられる。
（ｉ）ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子において、２１４１位、２１４２位および２１４３位の塩基を含む、１０〜３０塩基の長さのオリゴヌクレオチド
（ｉｉ）前記（ｉ）において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド
【００２６】
前記（ｉ）および（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドからなる検出用プローブは、前記ｒＲＮＡ遺伝子のアンチセンス鎖に相補的であり、前記アンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションにより、変異を確認できる。
【００２７】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドにおいて、前記２１４１位の塩基は野生型のグアニン、前記２１４２位の塩基は野生型のアデニン、前記２１４３位の塩基は野生型のアデニンであることが好ましい。この場合、前記（ｉ）および（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、野生型ｒＲＮＡ遺伝子のアンチセンス鎖における検出対象領域（ｔｔｃ）に、パーフェクトマッチする。
【００２８】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドは、配列番号５に示す塩基配列における、１０〜３０塩基の連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは１０〜２５塩基の連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである。また、３’末端がシトシンであるオリゴヌクレオチドが好ましく、より好ましくは、配列番号５において、５’末端から２６塩基目または２８塩基目のシトシンが３’末端となるオリゴヌクレオチドであり、特に好ましくは、５’末端から２６塩基目のシトシンが３’末端となるオリゴヌクレオチドが好ましい。下記配列番号５に示すオリゴヌクレオチドにおいて、下線部のｇａａは、２１４１位、２１４２位および２１４３位の野生型の塩基を示す。
5’-cctacccgcggcaagacggaaagaccccgtggacc-3’  （配列番号５）
【００２９】
前記（ｉ）のオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号６および７に示す少なくとも一方の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましく、中でも、配列番号７に示すオリゴヌクレオチドが好ましい。下記配列番号６および７において、下線部のｇａａは、２１４１位、２１４２位および２１４３位の野生型の塩基を示す。
5’-caagacggaaagacccc-3’  （配列番号６）
5’-ggcaagacggaaagacc-3’  （配列番号７）
【００３０】
前記（ｉｉ）のオリゴヌクレオチドにおいて、塩基が欠失、置換、挿入または付加される部位は、前記検出対象領域以外であることが好ましい。前記（ｉｉ）の具体例としては、例えば、配列番号８に示すオリゴヌクレオチドが好ましい。下記配列において、５’側のｇａｇｃｔが、付加配列であり、下線部のｇａａは、２１４１位、２１４２位および２１４３位の野生型の塩基を示す。
5’-gagctggcaagacggaaagacc-3’  （配列番号８）
【００３１】
本発明の検出用プローブは、標識物質を有する標識プローブであることが好ましく、例えば、前述のオリゴヌクレオチドが、前記標識物質で標識化（修飾）されていることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されないが、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。また、後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシンまたはグアニンであることが好ましい。なお、前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。前記配列番号５、６、７および８に示すオリゴヌクレオチドは、例えば、３’末端のシトシンが、前記標識物質で標識化されていることが好ましい。
【００３２】
前記標識物質は、特に制限されないが、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色等があげられる。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値としては、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色の場合、前記シグナル値としては、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。また、前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。
【００３３】
前記標識物質は、特に制限されないが、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光物質としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（商標名、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（商標名、モレキュラープローブ社製）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００３４】
前記標識プローブは、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブであることが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブとしては、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシンまたはグアニンであることが好ましい。前記末端の塩基がシトシンの場合、前記プローブは、例えば、被検核酸とハイブリッドを形成した際、標識化された末端のシトシンと対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニンとなるように、塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から１塩基離れた塩基とは、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが被検核酸にハイブリダイズすると、例えば、蛍光物質で標識化された末端のシトシンが、前記被検核酸におけるグアニンに近づくことによって、前記蛍光物質の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。同様に、前記末端の塩基がグアニンの場合、前記プローブは、例えば、被検核酸とハイブリッドを形成した際、標識化された末端のグアニンと対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がシトシンとなるように、塩基配列を設計することが好ましい。
【００３５】
本発明の検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸は、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製でき、この際、本発明の検出用プローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、前記プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、前記プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００３６】
＜変異検出方法＞
本発明の変異の検出方法は、前述のように、ヘリコバクター・ピロリの２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異を検出する方法であって、前記変異が、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２１４１位、２１４２位および２１４３位の少なくともいずれかの部位における変異であり、下記（Ａ）工程〜（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）反応系において、被検核酸を鋳型として、前記本発明のプライマー試薬を用いて、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる工程
（Ｂ）前記（Ａ）工程で得られた増幅産物と変異の検出用プローブとを含む前記反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
（Ｃ）温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記いずれかの部位における変異の有無を決定する工程
【００３７】
本発明の検出方法によれば、ピロリ菌の前記ｒＲＮＡ遺伝子における前記検出対象領域を含む増幅対象領域を、優れた特異性で効率よく増幅することができる。このため、例えば、変異の検出の特異性も高く、擬陰性の問題も回避可能である。なお、本発明においては、前記本発明のプライマー試薬を使用することが特徴であって、その他の条件や工程は、何ら制限されない。本発明の検出方法において、前記プライマー試薬は、前述の通りである。前記反応系としては、例えば、反応液があげられる。
【００３８】
本発明の検出方法において、前記本発明のプライマー試薬に含まれるプライマーは、例えば、一種類でもよいし、二種類以上でもよいが、二種類以上が好ましい。中でも、前述のように、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一対のプライマーセットを少なくとも含むことが好ましい。前記フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせとしては、例えば、前記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーと前記（Ｆ２）のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせがあげられる。
【００３９】
前記（Ａ）工程において、遺伝子の増幅法としては、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。なお、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４０】
前記反応系において、本発明のプライマー試薬の添加割合は、特に制限されないが、例えば、一種類のプライマーについて、例えば、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、本発明のプライマー試薬として、一対のフォワードプライマーとリバースプライマーとを使用する場合、前記フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されないが、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは、１：０．５〜１：２である。
【００４１】
前記被検核酸は、例えば、試料由来の被検核酸であり、前記試料としては、例えば、生体試料、培養試料等があげられる。前記生体試料としては、例えば、胃液、胃組織、胃洗浄液等があげられ、また、培養試料としては、例えば、ピロリ菌の培養物、胃液または胃組織等の培養物等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、前記試料からの被検核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００４２】
本発明において、前記被検核酸は、例えば、ＤＮＡがあげられる。前記ＤＮＡは、例えば、前記試料に元来含まれるＤＮＡでもよいし、前記試料に元来含まれるＲＮＡから生成させたｃＤＮＡであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれている、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡを鋳型として、逆転写反応により、ｃＤＮＡを得ることができる。前記逆転写反応を利用したｃＤＮＡの生成方法としては、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）があげられる。
【００４３】
前記反応系における前記被検核酸の添加割合は、特に制限されない。具体例として、胃液由来の被検核酸の場合、例えば、前記反応系の全量を１００μＬとして、胃液０．１〜１０μＬから得られる被検核酸を添加することが好ましい。
【００４４】
前記（Ｂ）工程における検出用プローブは、前述のように特に制限されないが、例えば、前記本発明の検出用プローブを使用できる。
【００４５】
前記検出用プローブは、前記（Ａ）工程の後、すなわち、前記ｒＲＮＡ遺伝子の増幅対象領域について、増幅反応を行った後、前記反応系に添加してもよいし、増幅反応の途中で、前記反応系に添加してもよいし、前記（Ａ）工程の増幅反応に先立って、予め、前記反応系に添加してもよい。中でも、例えば、容易且つ迅速に解析を行えることから、予め、前記反応系に添加することが好ましい。すなわち、前記（Ａ）工程は、例えば、前記検出用プローブの存在下、前記反応系において、前記ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行うことが好ましい。また、増幅反応前に前記検出用プローブを添加する場合、前述のように、その３’末端に、蛍光物質を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００４６】
前記反応系における前記検出用プローブの添加割合は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系に、例えば、前記検出用プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。また、例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応系において、前記被検核酸に対する前記検出用プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。
【００４７】
また、前記検出用プローブが標識プローブであり、標識物質として蛍光物質を用いている場合、例えば、検出する蛍光強度を調整するために、標識プローブと同じ配列である非標識プローブを併用してもよい。また、前記非標識プローブは、その３’末端にリン酸が付加されてもよい。この場合、標識プローブと非標識プローブとのモル比は、例えば、１：１０〜１０：１が好ましい。
【００４８】
本発明の検出方法は、前述のような、いわゆるＴｍ解析に利用できる。ここで、Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００４９】
前記（Ｂ）工程において、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナルの測定は、前述した、２６０ｎｍにおける吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記検出用プローブとして、前述したように、標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅産物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記標識物質のシグナルを検出することによって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッド形成体の融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件としては、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。なお、前記標識プローブならびに前記標識物質については、前述のとおりである。
【００５０】
つぎに、本発明の検出方法について、一例をあげて説明する。本例は、前記プライマー試薬として、一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用し、前記検出用プローブとして、標識プローブを使用し、胃液試料由来の被検核酸を使用し、核酸増幅法としてＰＣＲ法を採用し、ピロリ菌の前記ｒＲＮＡ遺伝子の変異の検出する例である。なお、本例は、あくまでも一例であり、本発明は本例には制限されない。
【００５１】
まず、反応系として、ＰＣＲ反応液を調製する。前記ＰＣＲ反応液は、例えば、前記被検核酸および本発明のプライマー試薬を含み、さらに、ＰＣＲに必要な成分を適宜含んでもよい。また、後述するように、前記ＰＣＲ反応液は、増幅反応に先立って、さらに、前記検出用プローブを含んでもよい。
【００５２】
前記反応液において、本発明のプライマー試薬の添加割合は、特に制限されない。前述のように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの添加割合は、それぞれ、例えば、０．１〜２μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、前記フォワードプライマー（Ｆ）とリバースプライマー（Ｒ）との添加割合（モル比Ｆ：Ｒ）は、特に制限されないが、例えば、１：０．２５〜１：４が好ましく、より好ましくは、１：０．５〜１：２である。前記反応液における被検核酸の添加割合は、特に制限されず、前述と同様である。
【００５３】
前記反応液における他の成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸）、溶媒等があげられる。なお、前記反応液の調製において、各成分の添加順序は何ら制限されない。
【００５４】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０（商標Ｖｅｎｔ）：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来の耐熱性ポリメラーゼが好ましい。
【００５５】
前記反応液におけるＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは、５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは、２０〜３０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【００５６】
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００５７】
前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【００５８】
また、前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【００５９】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、サーマルサイクラー等の使用する機器等に応じて適宜設定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
【００６０】
つぎに、ＰＣＲを行う。ＰＣＲのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（１）被検核酸である二本鎖ＤＮＡの一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）前記一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ポリメラーゼ反応による前記プライマーの伸長は、それぞれ下記表１の条件が例示できる。また、サイクル数も特に制限されないが、下記（１）〜（３）の３ステップを１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。前記サイクル数の合計の上限は、特に制限されないが、例えば、１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは、５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。本発明のプライマー試薬として、一対のプライマーセットを使用した場合、前述のように、増幅効率に優れるため、従来の方法によれば、５０サイクルに３時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、約１時間程度（好ましくは１時間以内）で５０サイクルを完了することも可能である。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
前記標識プローブは、前述のように、例えば、増幅反応の前、反応途中および反応後のいずれにおいて、前記反応液に添加してもよい。中でも、例えば、添加のために前記反応液を外部環境に露出する必要がなく、また、増幅反応とシグナル値の測定とを、連続的に行うことが可能であるため、増幅反応前に前記反応液に添加することが好ましい。この場合、前記標識プローブは、前述のように、その３’末端が標識物質またはリン酸基で修飾されていることが好ましい。
【００６３】
前記反応液における標識プローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記プローブを１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌの範囲となるように添加することが好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌである。また、例えば、十分なシグナル値を確保できることから、前記反応液において、前記被検核酸に対する前記標識プローブのモル比は、例えば、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。前記被検核酸に対する前記標識プローブの添加割合は、例えば、二本鎖核酸に対するモル比でもよいし、一本鎖核酸に対するモル比でもよい。
【００６４】
次に、得られた増幅産物（二本鎖ＤＮＡ）の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記標識プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め標識プローブを添加した反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【００６５】
前記解離工程における加熱温度は、二本鎖の前記増幅産物を一本鎖に解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００６６】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【００６７】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、グアニン消光プローブ、すなわち、末端のシトシン塩基が標識化されたプローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６８】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、開始温度は、例えば、室温〜８５℃であり、好ましくは、２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは、０．３〜５℃／秒である。
【００６９】
次に、前記シグナル値の変動を解析してＴｍ値を決定する。具体的には、得られた蛍光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（ｄ蛍光強度増加量／ｔ）の最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００７０】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）等により算出でき、また、最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもできる。
【００７１】
そして、これらのＴｍ値から、検出対象領域において、２１４１位、２１４２位および２１４３位の３カ所全てが野生型であるか、前記３カ所のいずれかにおいて変異を有するかを決定する。Ｔｍ解析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、１塩基が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記標識プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、１塩基が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、検出対象領域の３カ所の塩基が、全て野生型であるか、変異型を含むかを決定できる。
【００７２】
また、本発明においては、前述のように、前記検出用プローブを含む反応系の温度を上昇させて（ハイブリッド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記検出用プローブを含む反応系の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００７３】
具体例として、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブを使用した場合、前記一本鎖ＤＮＡと前記標識プローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７４】
また、本発明の変異検出方法においては、例えば、前記（Ａ）工程において、コントロール用鋳型核酸の存在下、前記反応系において、前記２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行うことが好ましい。例えば、前記被検核酸について増幅反応を行っても、前記被検核酸が正常に増幅しないために、前記シグナル値の変動が確認されない場合ある。そこで、前記コントロール用鋳型核酸の存在下で増幅反応を行えば、前記コントロール用鋳型核酸の増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成の有無から、前記試料中において前記被検核酸が正常に増幅されているか否かを確認することができる。以下、前記検出用プローブがハイブリダイズする、前記コントロール鋳型核酸の増幅産物を、前記コントロール鋳型核酸の標的核酸配列といい、前記検出用プローブがハイブリダイズする、前記ｒＲＮＡ遺伝子の増幅産物を、前記ｒＲＮＡ遺伝子の標的核酸配列という。
【００７５】
前記コントロール用鋳型核酸としては、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。すなわち、前記コントロール鋳型核酸は、（１）前記本発明のプライマー試薬により増幅可能であり、（２）前記プライマー試薬により増幅される標的核酸配列に、前記本発明の検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、（３）前記コントロール鋳型核酸の標的核酸配列と前記プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）が、前記ｒＲＮＡ遺伝子の標的核酸配列と前記プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と異なる値となる、オリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００７６】
前記（１）および（２）の条件は、例えば、３’側に前記本発明のプライマーと相補的な配列を有し、且つ、前記配列よりも５’側に前記検出用プローブの全体または部分領域と相補的な配列を有する塩基配列を設計することで達成できる。「プライマーと相補的な配列」とは、例えば、前記プライマーがアニーリングして伸長が開始できればよく、例えば、相補性の程度は、特に制限されないが、例えば、５０％以上であり、８０％以上が好ましく、より好ましくは１００％である。また、「プローブの全体または部分領域と相補的な配列」とは、例えば、プローブがハイブリダイズできればよく、相補性の程度は特に制限されず、後述するＴｍ値との関係に応じて適宜設定できる。
【００７７】
前記（３）の条件は、例えば、前記コントロール用鋳型核酸の標的核酸配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域と、前記ｒＲＮＡ遺伝子の標的核酸配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域とを、異なる条件にすることで達成できる。具体的には、例えば、ハイブリダイズ領域の長さを変える方法、ハイブリダイズ領域の相同性を変える方法があげられる。なお、前記コントロール用鋳型核酸の標的核酸配列と、前記ｒＲＮＡ遺伝子の標的核酸配列とは、例えば、前記検出用プローブのハイブリダイズ領域の一部を除き、同じ配列であることが好ましい。
【００７８】
このように、Ｔｍ値（ＴｍＣ）がＴｍ値（ＴｍＡ）と異なれば、同一反応系において、前記コントロール用鋳型核酸の増幅と、前記被検核酸の増幅とを同時に行っても、Ｔｍ解析において、両者のシグナルは、異なるＴｍ値でピークを示すこととなる。このため、コントール用鋳型核酸のＴｍＣにおけるピークの有無で、正常な増幅の有無を確認し、且つ、ＴｍＣとは異なるＴｍＡでのピークによって、変異の有無を確認することが可能となる。
【００７９】
前記コントロール用鋳型核酸の一例を、配列番号９に示すが、これには制限されない。下記配列において、下線部のｔｔｃは、野生型ｒＲＮＡ遺伝子のセンス鎖における２１４１位（ｇ）、２１４２位（ａ）および２１４３位（ａ）に対応する塩基を示す。
5’-tccacggggtctttccgtcttgccagctcatcctgcgggtaggaggaatt-3’（配列番号９）
【００８０】
＜変異検出試薬＞
本発明の検出試薬は、前記本発明の変異の検出方法に使用する検出試薬であって、前記本発明のプライマー試薬を含むことを特徴とする。本発明は、前述の本発明のプライマー試薬を使用することが特徴であって、その他の構成等は何ら制限されない。また、本発明の検出試薬は、本発明の検出方法にしたがって使用することができる。
【００８１】
本発明の検出試薬は、さらに、前記本発明の検出用プローブを含んでもよい。本発明の検出試薬は、さらに、核酸増幅に必要な試薬等を適宜含んでもよい。また、本発明の検出試薬は、例えば、構成成分のうち、２種類以上が混合して容器に収容されてもよいし、２種類以上の構成成分が、それぞれ別個に容器に収容されてもよい。後者の場合、本発明の検出試薬は、例えば、検出キットということもでき、さらに使用説明書等を含んでもよい。
【００８２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。
【実施例１】
【００８３】
ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２１４１位、２１４２位および２１４３位の塩基における変異を、Ｔｍ解析により検出した。
【００８４】
まず、２１４１位、２１４２位および２１４３位の塩基に変異を有さない野生型ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を挿入した野生型プラスミド（以下、「ｗｔ」という）と、２１４３位の塩基ＡがＧに変異した変異型ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を挿入した変異型プラスミド（以下、「ｍｔ１またはＡ２１４３Ｇ」という）、２１４２位の塩基ＡがＧに変異した変異型ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を挿入した変異型プラスミド（以下、「ｍｔ２またはＡ２１４２Ｇ」という）、２１４１位の塩基ＧがＡに変異した変異型ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を挿入した変異型プラスミド（以下、「ｍｔ３またはＧ２１４１Ａ」という）、および、２１４２位の塩基ＡがＣに変異した変異型ｒＲＮＡ遺伝子の部分配列を挿入した変異型プラスミド（以下、「ｍｔ４またはＡ２１４２Ｃ」という）を準備した。前記野生型プラスミドおよび変異型プラスミドを、試料プラスミドという。また、コントロール用鋳型核酸として配列番号９に示すオリゴヌクレオチドを挿入した、コントロールプラスミド（以下、「ＩＣ」という）を準備した。配列番号９のオリゴヌクレオチドは、ｒＲＮＡ遺伝子のアンチセンス鎖の部分配列に相当する。配列番号９に示すオリゴヌクレオチドにおいて、下線部のｔｔｃは、野生型センス鎖の２１４１位、２１４２位および２１４３位に対応する塩基を示す。
コントロール用鋳型核酸（配列番号９）
5’-tccacggggtctttccgtcttgccagctcatcctgcgggtaggaggaatt-3’
【００８５】
チューブ内に、前記試料プラスミドまたはコントロールプラスミドを含む下記表２のＰＣＲ反応液５０μＬを添加し、サーマルサイクラー（商品名Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｓ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒および６２℃で１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。ＰＣＲ終了後、前記チューブを９５℃に加熱し、１０重量％ＳＤＳ溶液２．５μＬを添加し、反応を停止させた。さらに、前記ＰＣＲ反応液が入った前記チューブを、ｉ−ｄｅｎｓｙ（商品名、アークレイ社製）に移し、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、温度を１℃／３秒の速度で上昇させて、４０℃から９５℃に加熱した。この加熱の間、４０℃から８０℃までの各温度における蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。蛍光強度の測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。
【００８６】
【表２】
2011062143.tif 000004
【００８７】
前記表２における、Ｆ１プライマー（フォワードプライマー）、Ｒ１プライマー（リバースプライマー）、および、検出用プローブの配列を以下に示す。下記検出用プローブの配列において、下線部は、前記ｒＲＮＡ遺伝子における検出対象領域である。また、プローブにおける蛍光物質は、ＴＡＭＲＡとした。
Ｆ１プライマー（配列番号１）
5'-ttcagtgaaattgtagtggaggtgaaaattcctcctaccc-3'
Ｒ１プライマー（配列番号３）
5'-gtatctcaaggatgactccataagagccaaagccc-3'
検出用プローブ（配列番号７）
5’-ggcaagacggaaagacc-(蛍光物質)-3'
【００８８】
各反応液の検出結果を、図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。横軸は測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は、「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」とした。図１において、黒丸（●）はｗｔ、黒四角（■）はＩＣ、白丸（○）はｍｔ１（Ａ２１４３Ｇ）、白三角（△）はｍｔ２（Ａ２１４２Ｇ）であり、白四角（□）はｍｔ３（Ｇ２１４１Ａ）、白菱形（◇）はｍｔ４（Ａ２１４２Ｃ）の検出結果である。図１に示すように、ｍｔ１のピーク（Ｔｍ）は５１℃であり、ｍｔ２のピーク（Ｔｍ）は５１℃であり、ｍｔ３のピーク（Ｔｍ）は５６℃であり、ｍｔ４のピーク（Ｔｍ）は５６℃であり、ｗｔのピーク（Ｔｍ）は６１℃であり、ＩＣのピーク（Ｔｍ）は６７℃であった。このように、野生型プラスミドｗｔと、変異型プラスミドｍｔ１およびｍｔ２と、変異型プラスミドｍｔ３およびｍｔ４とが、異なるＴｍ値を示したことから、これらを区別して検出可能であることがわかった。
【実施例２】
【００８９】
本例では、前記野生型プラスミド（ｗｔ）または変異型プラスミド（ｍｔ１、ｍｔ２、ｍｔ３およびｍｔ４）と、コントロールプラスミド（ＩＣ）との共存下で、Ｔｍ解析を行った。
【００９０】
チューブ内に、前記試料プラスミドおよびコントロールプラスミドを含む下記表３のＰＣＲ反応液５０μＬを添加し、実施例１と同じサーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃で１秒および６５℃で１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。ＰＣＲ終了後、前記チューブを９５℃に加熱し、１０重量％ＳＤＳ溶液２．５μＬを添加し、反応を停止させた。さらに、前記ＰＣＲ反応液が入った前記チューブを、ｉ−ｄｅｎｓｙ（商品名、アークレイ社製）に移し、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、温度を１℃／３秒の速度で上昇させて、４０℃から９５℃に加熱した。この加熱の間、４０℃から８０℃までの各温度における蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。蛍光強度の測定波長は、５８５〜７００ｎｍとした。
【００９１】
【表３】
2011062143.tif 000005
【００９２】
前記表３における、Ｆ１プライマー（フォワードプライマー）、Ｒ１プライマー（リバースプライマー）は、前記実施例１と同じものを使用した。また、検出用プローブの配列を以下に示す。下記検出用プローブの配列において、下線部は、前記ｒＲＮＡ遺伝子における検出対象領域である。また、プローブにおける蛍光物質は、ＴＡＭＲＡとした。
検出用プローブ（配列番号８）
5’-gagctggcaagacggaaagacc-(蛍光物質)-3'
【００９３】
各反応液の検出結果を、図２〜図７に示す。図２〜図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。横軸は測定時の温度（℃）を示し、縦軸は蛍光強度の変化（以下、「蛍光変化量」ともいう）を示し、単位は、「ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」とした。図２はＩＣ、図３はｗｔとＩＣとの共存下（ｗｔ／ＩＣ）、図４はｍｔ１とＩＣとの共存下（ｍｔ１／ＩＣ）、図５はｍｔ２とＩＣとの共存下（ｍｔ２／ＩＣ）、図６はｍｔ３とＩＣとの共存下（ｍｔ３／ＩＣ）、図７はｍｔ４とＩＣとの共存下（ｍｔ４／ＩＣ）の結果である。図３〜図７において、ＩＣの結果を示す図２と同じ温度６７℃にピークが見られたことから、各ＰＣＲ反応液において、正常に核酸増幅が起こっていることが確認できた。そして、前記図３〜図７において、全て、ＩＣのＴｍ値（６７℃）とは異なる温度にピークが確認された。具体的には、図３は６２℃、図４は５４℃、図５は５４℃、図６は５８℃、図７は５８℃にピークが見られた。この結果から、内部コントロールと併用することによって、正常な増幅を確認でき、且つ、野生型と変異型とを区別して検出できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
以上のように、本発明のプライマー試薬によれば、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子における２１４１位、２１４２位および２１４３位を含む目的領域を特異的に増幅できる。このため、前記本発明のプライマー試薬を用いた本発明の変異の検出方法によれば、より特異的に効率よく、前記各部位における変異の検出が可能となる。前述のように、これらの部位における変異は、ピロリ菌のクラリスロマイシン耐性との関連性が知られていることから、本発明は、医療分野において極めて有用である。
【図１】
2011062143.tif 000006
【図２】
2011062143.tif 000007
【図３】
2011062143.tif 000008
【図４】
2011062143.tif 000009
【図５】
2011062143.tif 000010
【図６】
2011062143.tif 000011
【図７】
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【配列表】
2011062143000001.app