(57)【要約】【課題】野生株に対してゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた目的遺伝子産物の製造方法の提供。【解決手段】枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から、枯草菌１６８株のゲノム上における以下の領域のうちのいずれか１が欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株：(a)ybbU- ybfI領域；(b)ydjM-cotA領域；(c)yefA-yesX領域；(d)yfiB-yfiX領域；(e)yhcE-yhcU領域；(f)yhaU-yhaL領域；(g)yjbX-yjlB領域；(h)xkdA-ykcC領域；(i)bpr-ylmA領域；(j)flgB-cheD領域；(k)ynfF-ppsA領域；(l)yoxC-yobO領域；(m)spoVAF-spoIIAA領域；(n)spoIIIAH-yqhV領域；(o)ytvB-ytqB領域；(p)yteA-ytaB領域；(q)yuaJ-yugO領域；(r)yusJ-mrgA領域；(s)gerAA-yvrI領域；(t)yvaM-yvbK領域；(u)araE-yveK領域；(v)yvdE-yvcP領域；(w)gerBA-ywsC領域；(x)ywrK-ywqM領域；(y)spoIIID-ywoB領域；(z)slp-ylaF領域；(aa)licH-sigY領域；(ab)yqeF-yrhK領域；(ac)yuzE-yukJ領域；及び(ad)yncM-yndN領域。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から、枯草菌１６８株のゲノム上における以下の(a)〜(ad)で示される領域のうちのいずれか１が欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株：
(a)ybbU- ybfI領域；
(b)ydjM-cotA領域；
(c)yefA-yesX領域；
(d)yfiB-yfiX領域；
(e)yhcE-yhcU領域；
(f)yhaU-yhaL領域；
(g)yjbX-yjlB領域；
(h)xkdA-ykcC領域；
(i)bpr-ylmA領域；
(j)flgB-cheD領域；
(k)ynfF-ppsA領域；
(l)yoxC-yobO領域；
(m)spoVAF-spoIIAA領域；
(n)spoIIIAH-yqhV領域；
(o)ytvB-ytqB領域；
(p)yteA-ytaB領域；
(q)yuaJ-yugO領域；
(r)yusJ-mrgA領域；
(s)gerAA-yvrI領域；
(t)yvaM-yvbK領域；
(u)araE-yveK領域；
(v)yvdE-yvcP領域；
(w)gerBA-ywsC領域；
(x)ywrK-ywqM領域；
(y)spoIIID-ywoB領域；
(z)slp-ylaF領域；
(aa)licH-sigY領域；
(ab)yqeF-yrhK領域；
(ac)yuzE-yukJ領域；及び
(ad)yncM-yndN領域。
【請求項２】
前記(a)〜(ad)で示される領域が、下記の配列番号で示される一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域である、請求項１記載の枯草菌変異株：
(a) 配列番号５１と配列番号５２；
(b) 配列番号５３と配列番号５４；
(c) 配列番号５５と配列番号５６；
(d) 配列番号５７と配列番号５８；
(e) 配列番号５９と配列番号６０；
(f) 配列番号６１と配列番号６２；
(g) 配列番号６３と配列番号６４；
(h) 配列番号６５と配列番号６６；
(i) 配列番号６７と配列番号６８；
(j) 配列番号６９と配列番号７０；
(k) 配列番号７１と配列番号７２；
(l) 配列番号７３と配列番号７４；
(m) 配列番号７５と配列番号７６；
(n) 配列番号７７と配列番号７８；
(o) 配列番号７９と配列番号８０；
(p) 配列番号８１と配列番号８２；
(q) 配列番号８３と配列番号８４；
(r) 配列番号８５と配列番号８６；
(s) 配列番号８７と配列番号８８；
(t) 配列番号８９と配列番号９０；
(u) 配列番号９１と配列番号９２；
(v) 配列番号９３と配列番号９４；
(w) 配列番号９５と配列番号９６；
(x) 配列番号９７と配列番号９８；
(y) 配列番号９９と配列番号１００；
(z) 配列番号１０１と配列番号１０２；
(aa) 配列番号１０３と配列番号１０４；
(ab) 配列番号１０５と配列番号１０６；
(ac) 配列番号１０７と配列番号１０８；
(ad) 配列番号１０９と配列番号１１０。
【請求項３】
枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から、前記(f)、(j)及び(m)で示される３領域が少なくとも欠失したゲノム構造を有する、請求項２に記載の枯草菌変異株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の枯草菌変異株に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が発現可能に導入された組換え枯草菌。
【請求項５】
目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に結合された、請求項４記載の組換え枯草菌。
【請求項６】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合された、請求項５記載の組換え枯草菌。
【請求項７】
分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来のものである、請求項６記載の組換え枯草菌。
【請求項８】
転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列からなるＤＮＡ断片、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントの条件でハイブリダイズするＤＮＡ断片若しくは当該塩基配列のいずれかの一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である、請求項６記載の組換え枯草菌。
【請求項９】
目的遺伝子産物が異種タンパク質又はポリペプチドである、請求項４〜８のいずれか１項記載の組換え枯草菌。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれか１項記載の組換え枯草菌を用いる目的遺伝子産物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた目的遺伝子産物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。
【０００４】
近年、枯草菌については、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が成育に必須であることが指摘されている（非特許文献１）。また、枯草菌等の胞子形成初期に関わる遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞壁或いは細胞膜中のテイコ酸へのＤ−アラニン付加に関わる遺伝子、更にはサーファクチンの生合成或いは分泌に関わる遺伝子を単独に欠失又は不活性化した菌株が構築されている（特許文献１〜８参照）。
【０００５】
枯草菌についてはまた、ゲノムの大領域あるいは遺伝子を欠失させた変異株の網羅的解析により、各種酵素の生産性に優れた変異株が見出されている。この研究で得られた枯草菌変異株の１つであるMGB874株は、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（枯草菌１６８株）に由来し、そのゲノムの合計874 kbが削除された変異株であるが、野生株である１６８株に比較して、タンパク質の分泌生産性が有意に向上している（特許文献９）。
【０００６】
一方、ゲノムの大領域欠失にも係らず野生型と比較して同等以上の遺伝子産物生産性を維持している微生物はロバスト性が低いため、遺伝子産物合成メカニズムの解析において、その解析をより容易にできるという特徴がある。例えば、上記MGB874株は874 kbもの長大な遺伝子の破壊株であり、遺伝子産物合成メカニズム解析のためのモデルとして有望である。
【０００７】
しかしながら、目的遺伝子産物の工業的生産における更なる生産性の向上のために、生産性がより向上した枯草菌変異株が求められている。また、生物の遺伝子産物合成メカニズムのより詳細な解析のためには、野生型と同等の遺伝子産物の生産性を有しながら、一方で野生型と比較してできるだけ多くのゲノムを欠失した変異株が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭58-190390号公報
【特許文献２】特開昭61-1381号公報
【特許文献３】国際公開第89/04866号パンフレット
【特許文献４】特表平11-509096号公報
【特許文献５】特許第3210315号公報
【特許文献６】特表2001-527401号公報
【特許文献７】特表2002−520017号公報
【特許文献８】特表2001−503641号公報
【特許文献９】特開2007-130013号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】K. Kobayashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100, 4678-4683, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、野生株に対してゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株、及び当該枯草菌変異株を用いた目的遺伝子産物の製造方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（枯草菌１６８株）に由来し、１６８株のゲノムの大領域が欠失した枯草菌変異株において、さらなるゲノム領域を欠失させることを試みた。その結果、野生株と比較してゲノムの大領域を欠失しているMGB874からさらにゲノムの大領域を欠失させた場合でも、なお生存能を維持し得る変異株を得ることに成功した。さらに本発明者らは、当該変異株に目的産物をコードする遺伝子を組み込むことにより、当該目的産物の生産性により優れた組換え枯草菌変異株を取得することに成功した。
【００１２】
すなわち、本発明は、枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域からさらにゲノム領域を欠失させたゲノム構造を有する枯草菌変異株に係るものである。
本発明はまた、上記枯草菌変異株に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が発現可能に導入された組換え枯草菌に係るものである。
本発明はまた、上記組換え枯草菌を用いる目的遺伝子産物の製造方法に係るものである。
【００１３】
一態様において、本発明は、以下を提供する。
（１）枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から、枯草菌１６８株のゲノム上における以下の(a)〜(ad)で示される領域のうちのいずれか１が欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株：
(a)ybbU-ybfI領域；
(b)ydjM-cotA領域；
(c)yefA-yesX領域；
(d)yfiB-yfiX領域；
(e)yhcE-yhcU領域；
(f)yhaU-yhaL領域；
(g)yjbX-yjlB領域；
(h)xkdA-ykcC領域；
(i)bpr-ylmA領域；
(j)flgB-cheD領域；
(k)ynfF-ppsA領域；
(l)yoxC-yobO領域；
(m)spoVAF-spoIIAA領域；
(n)spoIIIAH-yqhV領域；
(o)ytvB-ytqB領域；
(p)yteA-ytaB領域；
(q)yuaJ-yugO領域；
(r)yusJ-mrgA領域；
(s)gerAA-yvrI領域；
(t)yvaM-yvbK領域；
(u)araE-yveK領域；
(v)yvdE-yvcP領域；
(w)gerBA-ywsC領域；
(x)ywrK-ywqM領域；
(y)spoIIID-ywoB領域；
(z)slp-ylaF領域；
(aa)licH-sigY領域；
(ab)yqeF-yrhK領域；
(ac)yuzE-yukJ領域；及び
(ad)yncM-yndN領域。
（２）前記(a)〜(ad)で示される領域が、下記の配列番号で示される一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域である、（１）記載の枯草菌変異株：
(a) 配列番号５１と配列番号５２；
(b) 配列番号５３と配列番号５４；
(c) 配列番号５５と配列番号５６；
(d) 配列番号５７と配列番号５８；
(e) 配列番号５９と配列番号６０；
(f) 配列番号６１と配列番号６２；
(g) 配列番号６３と配列番号６４；
(h) 配列番号６５と配列番号６６；
(i) 配列番号６７と配列番号６８；
(j) 配列番号６９と配列番号７０；
(k) 配列番号７１と配列番号７２；
(l) 配列番号７３と配列番号７４；
(m) 配列番号７５と配列番号７６；
(n) 配列番号７７と配列番号７８；
(o) 配列番号７９と配列番号８０；
(p) 配列番号８１と配列番号８２；
(q) 配列番号８３と配列番号８４；
(r) 配列番号８５と配列番号８６；
(s) 配列番号８７と配列番号８８；
(t) 配列番号８９と配列番号９０；
(u) 配列番号９１と配列番号９２；
(v) 配列番号９３と配列番号９４；
(w) 配列番号９５と配列番号９６；
(x) 配列番号９７と配列番号９８；
(y) 配列番号９９と配列番号１００；
(z) 配列番号１０１と配列番号１０２；
(aa) 配列番号１０３と配列番号１０４；
(ab) 配列番号１０５と配列番号１０６；
(ac) 配列番号１０７と配列番号１０８；
(ad) 配列番号１０９と配列番号１１０。
（３）枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から、前記(f)、(j)及び(m)で示される３領域が少なくとも欠失したゲノム構造を有する、（２）に記載の枯草菌変異株。
（４）（１）〜（３）のいずれか１に記載の枯草菌変異株に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が発現可能に導入された組換え枯草菌。
（５）目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に結合された、（４）記載の組換え枯草菌。
（６）転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合された、（５）記載の組換え枯草菌。
（７）分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来のものである、（６）記載の組換え枯草菌。
（８）転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列からなるＤＮＡ断片、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントの条件でハイブリダイズするＤＮＡ断片若しくは当該塩基配列のいずれかの一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である、（６）記載の組換え枯草菌。
（９）目的遺伝子産物が異種タンパク質又はポリペプチドである、（４）〜（８）のいずれか１に記載の組換え枯草菌。
（１０）（４）〜（９）のいずれか１に記載の組換え枯草菌を用いる目的遺伝子産物の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、各種遺伝子産物の生産性に優れた枯草菌変異株が提供される。当該枯草菌変異株を用いることによって、生産性に優れた各種酵素やその他の有用物質の工業的生産が実現できる。当該枯草菌変異株はまた、高い遺伝子産物産生能を有する一方、ゲノム量が小さく細胞内機構がより単純化されていることから遺伝子産物合成機構におけるロバスト性がより低いため、各種遺伝子産物の産生メカニズム等の解明に有用な生物材料となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。
【図２】選択マーカー遺伝子カセットＤＮＡ断片の作製手順を示す模式図。
【図３】枯草菌ゲノムから外来薬剤耐性遺伝子を除去する手順を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において塩基配列及びアミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
【００１７】
本発明の枯草菌変異株を構築するための親微生物には、枯草菌変異株MGB874株が用いられる。MGB874株は、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（枯草菌１６８株）を野生株とし、そのゲノムの大量域、すなわちprophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域、yeeK-yesX領域、pdp-rocR領域、ycxB-sipU領域、SKIN-Pro7 (spoIVCB-yraK)領域、sbo-ywhH領域、yybP-yyaJ領域及びyncM-fosB領域を欠失させたものである（前記特許文献９）。これらの欠失領域はまた、表１に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域として表すことができる。
【００１８】
【表１】
2011160686.tif 000002
【００１９】
本発明において提供される新規な枯草菌変異株は、上記枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から、さらにゲノム領域を欠失させたゲノム構造を有する。具体的には、本発明の枯草菌変異株は、枯草菌１６８株のゲノム上における表２に示す欠失領域のうちの少なくとも１を、枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から欠失させたゲノム構造を有する。上記欠失領域としては、表２−１〜表２−２に示される遺伝子領域及び当該領域に相当する領域が挙げられる。
【００２０】
【表２−１】
2011160686.tif 000003
【００２１】
【表２−２】
2011160686.tif 000004
【００２２】
枯草菌１６８株の全塩基配列及び遺伝子は既に報告されており、またインターネット公開されている（Nature, 390, 249-256, 1997及びBSORF Bacillus subtilis Genome Database [http://bacillus.genome.jp/], GenBank: AL009126.2 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]）。当業者は、これらの情報源から得た枯草菌１６８株のゲノム情報、例えばGenBank: AL009126.2 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/38680335]に基づいて、MGB874株のゲノムから欠失させるべき上記表２に示した遺伝子領域を見出すことができる。ここで、欠失させるべき遺伝子領域は、公開されている枯草菌１６８株の遺伝子の塩基配列に対して１又は複数個の塩基における天然又は人工的に引き起こされた欠失、置換、挿入、付加等の変異を含み得る塩基配列を有し得る。変異し得る塩基の個数の範囲は、枯草菌１６８株のゲノムとの対応関係が認識できる限り特に限定されないが、例えば、枯草菌１６８株のゲノム領域の塩基配列に対して５０％以上の同一性、好ましくは６０％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の同一性、さらに好ましくは８０％以上の同一性、さらにより好ましくは９０％以上の同一性、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する範囲が挙げられる。上記「付加」には、塩基配列の一末端及び両末端への塩基の付加が含まれる。
【００２３】
あるいは、表２に示す欠失領域としては、表２に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域が挙げられる。すなわち、本発明の枯草菌変異株は、枯草菌変異株MGB874株のゲノム領域から、表２に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域の少なくとも１を欠失させたゲノム構造を有する。上記表２に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域とは、例えば、その領域の一方の端が表２−１〜表２−２に示す第一オリゴヌクレオチドの塩基配列及びその相補配列に隣接し、且つ他方の端が表２−１〜表２−２に示す第二オリゴヌクレオチドの塩基配列及びその相補配列に隣接する領域である。
【００２４】
本発明の枯草菌変異株はまた、枯草菌１６８株から直接、prophage6 (yoaV-yobO)領域、prophage1 (ybbU-ybdE)領域、prophage4 (yjcM-yjdJ)領域、PBSX (ykdA-xlyA)領域、prophage5 (ynxB-dut)領域、prophage3 (ydiM-ydjC)領域、spb (yodU-ypqP)領域、pks (pksA-ymaC)領域、skin (spoIVCB-spoIIIC)領域、pps (ppsE-ppsA)領域、prophage2 (ydcL-ydeJ)領域、ydcL-ydeK-ydhU領域、yisB-yitD領域、yunA-yurT領域、cgeE-ypmQ領域、yeeK-yesX領域、pdp-rocR領域、ycxB-sipU領域、SKIN-Pro7 (spoIVCB-yraK)領域、sbo-ywhH領域、yybP-yyaJ領域及びyncM-fosB領域、ならびに表２−１〜表２−２に示した欠失領域のうちの少なくとも１を欠失させることによって、作製することができる。
【００２５】
本発明の枯草菌変異株の例としては、下記表３−１及び表３−２に示される枯草菌変異株が挙げられる。
【００２６】
【表３−１】
2011160686.tif 000005
【表３−２】
2011160686.tif 000006
【００２７】
上記で定義した枯草菌１６８株のゲノム領域に加えて、その他の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株も、本発明の枯草菌変異株に含まれる。欠失させるべきその他の領域としては、例えば、生育必須遺伝子を除く遺伝子領域及び非コード領域等の、ゲノム上から欠失しても菌の生存能力が維持され、且つ上述した目的遺伝子産物の生産能を低下させない領域が好ましい。
【００２８】
上述の欠失させるべき領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる方法としては、特に限定されないが、例えば図１に示す方法を適用することができる。
すなわち、いわゆるＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene,77,61 (1989))によって調製される欠失用ＤＮＡ断片を挿入した欠失用プラスミドを用いた２重交差法によって、欠失させるべき領域を枯草菌ゲノム上から欠失させる。本方法で用いる欠失用ＤＮＡ断片には、欠失させるべき領域の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片と称する）と、同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ断片が結合したＤＮＡ断片（下流断片と称する）とを連結したＤＮＡ断片を用いることができるが、目的領域の欠失を確認するためには、当該上流断片と下流断片の間にクロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させたＤＮＡ断片が好適に用いられる。
【００２９】
まず、１回目のＰＣＲによって、欠失させるべき領域の上流断片Ａ及び下流断片Ｂ、並びに必要に応じて薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの３断片を調製する（図１）。この際、上流及び下流断片の調製のためには、結合対象となるＤＮＡ断片の末端１０〜３０塩基対の配列を付加したプライマーを設計する。例えば、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合させる場合、上流断片Ａの下流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側１０〜３０塩基に相当する配列を付加し（図１、プライマーＤＲ１）、また下流断片Ｂの上流末端に位置する（アニールする）プライマーにおける５’末端に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側１０〜３０塩基に相当する配列を付加する（図１、プライマーＤＦ２）。このように設計したプライマーセットを用いて上流断片Ａ及び下流断片ＢをＰＣＲで増幅した場合、増幅された上流断片Ａ’の下流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの上流側に相当する領域が付加されることとなり、増幅された下流断片Ｂ’の上流側には薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍの下流側に相当する領域が付加されることとなる。
【００３０】
次に１回目のＰＣＲで調製した上流断片Ａ’、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂ’を混合して鋳型とし、上流断片の上流側に位置する（アニールする）プライマー（図１、プライマーＤＦ１）及び下流断片の下流側に位置する（アニールする）プライマー（図１、プライマーＤＲ２）からなる１対のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行う。この２回目のＰＣＲにより、上流断片Ａ、薬剤耐性マーカー遺伝子断片Ｃｍ、及び下流断片Ｂをこの順で結合した欠失用ＤＮＡ断片Ｄを増幅することができる（図１）。
【００３１】
あるいは、上流断片及び下流断片を結合した欠失用ＤＮＡ断片を増幅した後、当該欠失用ＤＮＡ断片を薬剤耐性マーカー遺伝子を含むプラスミドに挿入することで、上流断片及び下流断片に加えて薬剤耐性マーカー遺伝子断片を有する欠失用ＤＮＡ断片を調製することができる。
【００３２】
更に、上述の方法などによって得られる欠失用ＤＮＡ断片を、通常の制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて宿主菌内で増幅されないプラスミドＤＮＡ、又は温度感受性プラスミド等、容易に除去できるプラスミドＤＮＡに挿入することによって、欠失導入用プラスミドを構築する。宿主菌内で増幅されないプラスミドＤＮＡの例としては、例えば枯草菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
次いで、欠失用プラスミドによる宿主菌の形質転換をコンピテントセル形質転換法（J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)）などの通常行われる手法によって行い、プラスミドに挿入された上流断片及び下流断片と、それらのゲノム上の相同領域との間での２重交差の相同組換えによって欠失用プラスミドが宿主菌ゲノムＤＮＡ内に融合することにより、欠失させるべき領域が薬剤耐性マーカー遺伝子に置き換えられた形質転換体が得られる（図１）。形質転換体の選択は、欠失用ＤＮＡ断片中に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子などのマーカー遺伝子による薬剤耐性を指標に行えばよい。例えば、枯草菌をＳＰＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０２％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍｌトリプトファン）において３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が１程度になるまで振盪培養する。振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍｌトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が０．４程度になるまで振盪培養することで、枯草菌のコンピテントセルを調製する。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに上記ＤＮＡ断片を含む溶液（上記ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液）５μＬを添加し、３７℃で１時間振盪培養後、抗生物質（クロラムフェニコール等）を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫する。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離する。形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとしたＰＣＲにより、目的の領域削除が行われていることを確認することができる。ゲノムＤＮＡの抽出は、斉藤と三浦（Saito & Miura）の方法[Saito & Miura Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)]、あるいは、市販のゲノムＤＮＡ抽出キット、例えば、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories, Inc.）を用いて行うことができる。
【００３４】
かくして得られた形質転換体から、さらに、ゲノムＤＮＡに挿入された外来薬剤耐性マーカー遺伝子を除去する。除去の手順としては、特に限定されないが、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene,77,61 (1989))により調製されるＤＮＡ断片を用いた２段階相同組換え法を用いることができる（図３参照）。以下にその手順を説明する。
【００３５】
はじめに、第１相同組換えのためのＤＮＡ断片（供与体ＤＮＡ）を調製する。調製の方法としては、特に限定されないが、上述したＳＯＥ−ＰＣＲ法、及びプラスミド上で所望の断片を結合させる方法等が挙げられる。供与体ＤＮＡとしては、例えば、除去すべき外来薬剤耐性マーカー遺伝子領域（すなわち、欠失された領域）の上流に隣接する約０．１〜３ｋｂ断片（上流断片）及び同じく下流に隣接する約０．１〜３ｋｂ断片が順に結合したＤＮＡ断片（下流断片）と、当該外来薬剤耐性マーカー遺伝子下流領域のＤＮＡ断片とが結合した断片を用いることができる。好適には、当該下流断片とマーカー遺伝子下流領域断片との間に、相同組換えの指標となる別のマーカー遺伝子等が挿入されたＤＮＡ断片が用いられる（図３）。
【００３６】
次いで、調製された供与体ＤＮＡをコンピテントセル形質転換法などの通常行われる手法によって形質転換体に導入し、形質転換体ゲノムＤＮＡの当該上流断片及び外来薬剤耐性マーカー遺伝子下流領域に相当する領域との間に相同組換えを起こさせる（第１相同組換え）。所望の相同組換えが生じた形質転換体は、供与体ＤＮＡ中に挿入した別のマーカー遺伝子による薬剤耐性を指標に選択することができる。第１相同組換えが適切に生じた形質転換体のゲノムＤＮＡでは、上流断片、下流断片、必要に応じて別のマーカー遺伝子、外来薬剤耐性マーカー遺伝子下流領域、及び下流断片が順番に配置している（図３参照）。このような配置を有するゲノムＤＮＡにおいては、上記２つの下流断片同士の間で自然誘発的に相同組換えが起こり得る（ゲノム内相同組換え）。このゲノム内相同組換えによって、当該２つの下流断片の間に位置していた領域が欠失することにより、外来薬剤耐性マーカー遺伝子が形質転換体ゲノムから除去される。目的通りにゲノム内相同組換えを起こした形質転換体は薬剤に対する耐性能を失っているため、薬剤感受性となった菌株を選択することで目的の形質転換体を得ることができる。得られた菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法などによって目的遺伝子の欠失を確認することができる。
【００３７】
目的の欠失株を選択する際、薬剤耐性から感受性に変化した菌株を直接選択することは難しく、またゲノム内での相同組換えは約１０-4以下の低い頻度で生じるものと考えられる。そこで、目的欠失株を効率的に取得するためには薬剤感受性株の存在比率を高める方法やある条件下で致死に働く遺伝子を利用して目的欠失株を選択する方法などの工夫を施すことが望ましい。
【００３８】
薬剤感受性株の濃縮方法としては、例えばアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質が、増殖細胞に対して殺菌的に作用し、一方、非増殖細胞には作用しないことを利用した濃縮法（Methods in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, (1970)）などが挙げられる。アンピシリンなどによる濃縮を行う場合、例えばテトラサイクリンやクロラムフェニコールなどの様に宿主細胞に対して静菌的に作用する薬剤に対する耐性遺伝子の欠失に関して有効である。こうした静菌的作用の薬剤を適量含む適当な培地において、当該薬剤耐性遺伝子を保持する耐性株は増殖可能であり、当該薬剤耐性遺伝子を欠失した感受性株は増殖も死滅もしない。この様な条件下において適当な濃度のアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質を添加して培養を行うと、増殖しようとする耐性株が死滅する一方、感受性株はアンピシリンなどの作用を受けず、結果として感受性株の存在比率が高まることになる。この様な濃縮操作を行った培養液を適当な寒天培地に塗抹、培養し、出現したコロニーのマーカー薬剤に対する耐性の有無をレプリカ法などによって確認することにより、効率的に感受性株を選択することが可能となる。
【００３９】
あるいは、目的欠失株の選択方法として、ある条件下で働く致死遺伝子を利用することもできる。致死遺伝子としては例えば、chpA遺伝子（リボヌクレアーゼをコードする遺伝子）及びccdB遺伝子（ＤＮＡジャイレースの阻害剤をコードする遺伝子）等の細胞増殖阻害タンパク質をコードする遺伝子等を利用することができる。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在下において発現誘導するｓｐａｃプロモーターなどの発現誘導型プロモーターの下流にchpA遺伝子等致死遺伝子を連結し、供与体ＤＮＡ中の２つの下流断片の間に挿入しておくことでchpA遺伝子等致死遺伝子を必要に応じて発現させることができる。したがって、第1相同組換えで生じた形質転換体をＩＰＴＧが含まれる培地で培養することにより、chpA遺伝子等の致死遺伝子が発現する細胞は死滅し、第２相同組み換え工程でchpA遺伝子等の致死遺伝子を脱落した細胞は増殖し生育することができるため、コロニー形成の有無を指標として所望の形質転換体を選択することができる（図３参照）。
【００４０】
以上のようにして、ゲノム上の所定の領域を単独で欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株を作製することができる。複数の領域を欠失したゲノム構造を有する枯草菌変異株は、上記工程を繰り返すことにより得ることができるが、いわゆる、ＬＰ（lysis of protoplasts）形質転換方法によって作製することもできる。ＬＰ形質転換法は、「T. Akamatsu及びJ. Sekiguchi, “Archives of Microbiology”, 1987年, 第146巻, p.353-357」及び「T. Akamatsu及びH. Taguchi, “Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry”, 2001年, 第65巻，第4号, p.823-829」を参照することで利用することができる。
【００４１】
斯くして得られた本発明の枯草菌変異株は、親株である枯草菌変異株MGB874株と比較してゲノムの大領域を欠失しているにもかかわらず、その生存能を維持している。また、本発明の枯草菌変異株は、親株と比較して同等以上の遺伝子産物生産能を有する。従って、本発明の枯草菌変異株は、遺伝子産物産生能を有する一方、ゲノム大領域の欠失によりゲノム量が小さいために細胞内機構がより単純化されているので、各種遺伝子産物の産生メカニズム等の解明に有用な生物材料となり得る。また、本発明の枯草変異株に目的遺伝子産物をコードする遺伝子を発現可能に導入することにより、当該目的遺伝子産物の生産性が向上した本発明の組換え枯草菌を得ることができる。
【００４２】
本明細書において、微生物へ遺伝子を「発現可能に導入する」とは、当該微生物内で当該遺伝子が発現され得るようにその遺伝子を導入することをいう。例えば、適切な位置に目的の遺伝子が組み込まれた発現ベクターや、転写開始制御領域や翻訳開始領域等の制御領域と連結された目的遺伝子を含むベクターを、一般的な形質転換法を用いて微生物に取り込ませることによって、当該微生物へ目的遺伝子を「発現可能に導入する」ことができる。あるいは、微生物ゲノム上の制御領域の下流に、目的遺伝子を含むＤＮＡ断片と当該制御領域下流に相同な領域とを結合させたＤＮＡ断片を直接組み込むことによって、当該遺伝子を本発明の枯草菌変異株へ発現可能に導入することができる。上記に例示したような細胞へ遺伝子を発現可能に導入するための種々の手法は、当業者に周知である。
【００４３】
したがって、一態様において、本発明の枯草菌変異株に導入される目的遺伝子産物をコードする遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域と作動可能に連結されていることが好ましい。より好ましくは、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、更に好ましくは、分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的遺伝子産物をコードする遺伝子の上流に作動可能に連結されている。
【００４４】
本明細書において、転写開始制御領域、翻訳開始領域、又は分泌シグナルと遺伝子との「作動可能な連結」とは、上記制御領域が遺伝子の転写又は翻訳を誘導し得るように、又は遺伝子にコードされたタンパク質又はペプチドが分泌シグナルの働きにより分泌されるように、連結されていることをいう。上記制御領域又は分泌シグナルと遺伝子との「作動可能な連結」の手順は、当業者に周知である。
【００４５】
例えば、本発明の枯草菌変異株に導入される目的遺伝子産物をコードする遺伝子は、その構造遺伝子が、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、又はKSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的遺伝子産物と作動可能に連結されていることが望ましい。より具体的には、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列からなるＤＮＡ断片、当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントの条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなり且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ断片が、目的遺伝子産物の構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部、好ましくは数個（例えば、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）の塩基を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ断片を意味する。また此処で言うストリンジェントな条件とは、例えば[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００４６】
導入する目的遺伝子産物をコードする遺伝子は特に限定されず、内在性の遺伝子であっても、異種遺伝子であってもよい。例えば、導入する遺伝子としては、収縮タンパク質、輸送タンパク質、シグナルタンパク質、生体防御タンパク質、受容体タンパク質、構造タンパク質、遺伝子調節タンパク質、酵素、及び貯蔵タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子、ならびに機能性ＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子が挙げられる。
【００４７】
一態様において、導入する遺伝子は、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である。異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子としては、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断、研究などの各種分野において有用なあらゆるタンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素、生理活性ペプチド、マーカー、シグナル伝達物質、構造タンパク質、各種調節などをコードする遺伝子が挙げられる。また、上記酵素としては、機能別に列挙すると、酸化還元酵素（Oxidoreductase）、転移酵素（Transferase）、加水分解酵素（Hydrolase）、脱離酵素（Lyase）、異性化酵素（Isomerase）、合成酵素（Ligase/Synthetase）等が挙げられるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００４８】
セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309, 1991）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来のセルラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ、又は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、又は配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。
【００４９】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、好ましくはBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼ、或いは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、又は配列番号５で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼが挙げられる。
【００５０】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-KP43株(FERM BP-6532)由来のアルカリプロテアーゼ、或いは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００５１】
本明細書において、「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列」には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、上記「付加」には、アミノ酸配列の一末端及び両末端へのアミノ酸の付加が含まれる。
【００５２】
別の一態様において、導入する遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子である。ノンコーディングＲＮＡは、ＤＮＡから転写された後タンパク質に翻訳されないＲＮＡである。ノンコーディングＲＮＡとしては、機能性ＲＮＡ，例えば、制御配列を含む非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｌｉｋｅ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等が挙げられる。これらのノンコーディングＲＮＡは、細胞の発現制御、発生、分化、その他生命活動に関わる多種多様なメカニズムを担っており、研究、医療、診断、創薬、品種改良や農薬生産等の農業、水産及び畜産分野、化学品製造等において利用可能である。
【００５３】
本発明の組換え枯草菌を用いた目的遺伝子産物の生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、当該目的遺伝子産物を採取、及び必要に応じて精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的遺伝子産物の生産性は、親株である枯草菌変異株MGB874株を用いた場合と比較して、その向上が達成されている。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００５５】
実施例で使用したプライマーを表４に記載し、その塩基配列を表５−１〜表５−７に記載する。
【００５６】
【表４】
2011160686.tif 000007
【００５７】
【表５−１】
2011160686.tif 000008
【００５８】
【表５−２】
2011160686.tif 000009
【００５９】
【表５−３】
2011160686.tif 000010
【００６０】
【表５−４】
2011160686.tif 000011
【００６１】
【表５−５】
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【００６２】
【表５−６】
2011160686.tif 000013
【００６３】
【表５−７】
2011160686.tif 000014
【００６４】
〔実施例１〕ゲノム領域の単独欠失株の作製
本実施例では、枯草菌MGB874株のゲノム上の様々な領域を欠失させた変異株を製造した。またそのフローを図１に示した。
【００６５】
＜R25領域の単独欠失株の作製＞
枯草菌変異株MGB874株ゲノム上の表２に示したR25領域を欠失対象領域として、当該領域をMGB874株ゲノムから欠失させた。
【００６６】
図１に示すように、MGB874株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、25-DF1（配列番号１５５）と25-DR1（配列番号１５７）、及び、25-DF2（配列番号１５６）と25-DR2（配列番号１５８）の各プライマーセットを用いて、ゲノム上のR25領域の上流に隣接する０．５ｋｂ断片（Ａ）、及び下流に隣接する０．５ｋｂ断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。また、プラスミドpDLT3（Morimoto et al., 2002）を鋳型として、rPCR-CmF（配列番号３５１）とrPCR-CmR（配列番号３５２）のプライマーのセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１．０ｋｂ断片（Ｃｍ）を、ＰＣＲによって調製した。得られた３つの増幅ＤＮＡ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法（例えば、Gene, 77, 61 (1989)参照）によって結合し、結合欠失用ＤＮＡ断片を作製した。
【００６７】
上述のように取得された欠失用ＤＮＡ断片供与体ＤＮＡを用いて、MGB874株を形質転換した。形質転換の条件は、コンピテントセル形質転換方法（例えば、J. Bacteriol. 93, 192 (1967)参照）に従い、１μｇ以上のＰＣＲ産物（欠失用ＤＮＡ断片供与体ＤＮＡ）を４００μｌのコンピテントセルに加え、更に１．５時間培養した。１０ｐｐｍのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育したコロニーを相同組み換え（図１参照）による形質転換体として分離した。取得した株を、MGB874-R25::cm株とした。
【００６８】
＜その他の各単独欠失株の作製＞
上述したR25領域の単独欠失株の作製手順に準じて、R02領域、R07領域、R08領域、R10N領域、R12領域、R13領域、R15領域、R16領域、R20N領域、R21領域、R22領域、R23領域、R25領域、R26領域、R30領域、R31領域、R32領域、R33領域、R34領域、R35領域、R36領域、R37領域、R39領域、R40領域、R41領域、R45領域、R49A領域、R50N領域、R53領域、Rd22領域（まとめてR*領域と称する）の各単独欠失株を作製した。上記のR*領域の単独欠失株を構築する場合、R25領域単独欠失株の作製と同様の方法により、表４および表５−１〜５−７に記載の各領域単独欠失株作製用プライマーセットを用いて欠失用ＤＮＡ断片を作製し、R*領域の単独欠失株を作製した。
枯草菌変異株MGB874株ゲノムから、R*領域を単独で欠失した株を、MGB874-R*::cm株とした。
【００６９】
〔実施例２〕選択マーカー遺伝子カセットの作製
先ず、枯草菌１６８株aprE遺伝子領域にスペクチノマイシン耐性遺伝子、lacI遺伝子、Pspac-chpA遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した枯草菌１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA, cm）株を以下のように作製した。
【００７０】
図２に示すように、枯草菌発現ベクターpO2HCを鋳型として、ベクター中のlacIからspacプロモーターを含む該プロモーター下流のＳＤ配列までの領域を、pO2HC-lacF（配列番号３５５）及びpO2HC-lacR（配列番号３５６）のプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅した。また、大腸菌Ｗ３１１０株のゲノムを鋳型として、chpA-F（配列番号３５８）及びchpA-R（配列番号３５９）のプライマーセットを用いて、ゲノム中のchpA遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの領域をＰＣＲ法により増幅した。得られた二つの増幅ＤＮＡ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法（例えば、Gene, 77, 61 (1989)参照）によって結合し、結合ＤＮＡ断片を作製した。
次に、上記で作製したＤＮＡ断片を制限酵素ApaI及びBamHIで消化し、制限酵素処理断片を得た。同様に、ベクターpAPNC213（スペクチノマイシン耐性遺伝子含有）を制限酵素ApaI及びBamHIで消化し、制限酵素処理断片を得た。こうして得られた制限酵素処理断片を、ＤＮＡライゲースを用いて結合した。
得られた環状ＤＮＡを用いて枯草菌１６８株を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で培養して、目的の形質転換体を選択し、１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA）株を構築した。
次に、得られた１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、APNC-Fプライマー（配列番号３５７）とchpA-Rプライマー（配列番号３５９）を用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した（図２参照）。増幅したＤＮＡ断片を選択マーカー遺伝子カセットと称する。
【００７１】
〔実施例３〕単独領域欠失株のゲノムへの外来配列除去用ＤＮＡコンストラクトの挿入
本実施例では、上記で構築した単独領域欠失株MGB874-R25::cm株、および、MGB874-R*::cm株の各ゲノムへ外来配列除去用DNAコンストラクトを挿入した変異株を製造した。本実施例のフローを図３に示した。
【００７２】
＜R25領域単独欠失株のゲノムへの外来配列除去用ＤＮＡコンストラクトの挿入＞
R25領域単独欠失株であるMGB874-R25::cm株のゲノムへ外来配列除去用ＤＮＡコンストラクトを挿入した変異株を以下のように製造した。図３に示した供与体ＤＮＡを表４および表５−１〜５−７に示すプライマーを用いて以下のように構築した。
【００７３】
＜供与体ＤＮＡの作製＞
また、枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、欠失対象領域の５’外側領域（断片Ａ）、欠失対象領域の３’外側領域（断片Ｂ）の２断片を、それぞれ25-DF1（配列番号１５５）と25-DR1.2（配列番号３１６）、及び25-DF2.2（配列番号３１５）と25-DR2（配列番号１５８）のプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅した（図３）。また、プラスミドpSM5022 (Mol. Microbiol. 6, 309 ,1992)を鋳型としてCm-F(del)（配列番号３５３）とCm-R(del)（配列番号３５４）のプライマーセットを用いてＰＣＲによりクロラムフェニコール耐性遺伝子（断片Ｃｍ）を増幅した（図３）。
【００７４】
これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子の内部配列（断片‘Ｃｍ’）の４断片、並びに、25-DF1（配列番号１５５）とCm-R(del) （配列番号３５４）のプライマーセットを用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene, 77, 61 (1989)）を行った。これにより、図３に示すように、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及びクロラムフェニコール耐性遺伝子上流欠失配列（断片‘Ｃｍ’）がこの順で配置したＤＮＡ断片を取得することができた。本実施例では、このＤＮＡ断片を供与体ＤＮＡとして使用した。
【００７５】
＜形質転換＞
上述のように取得された供与体ＤＮＡを用いて、R25領域単独欠失株（MGB874-R25::cm株）を形質転換した。形質転換の条件は、コンピテントセル形質転換方法（例えば、J. Bacteriol. 93, 192 (1967)参照）に従い、１μｇ以上のＰＣＲ産物（供与体ＤＮＡ）を４００μｌのコンピテントセルに加え、更に１．５時間培養し第１相同組み換え（図３）を行った。
【００７６】
形質転換体を、組み換えにより導入されたスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。具体的には、上記形質転換処理後の細胞を１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地にて、３７℃で一晩培養し、コロニーを形成し、生存可能な菌株を取得した。この培養によって、相同組み換えによって供与体ＤＮＡが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を獲得した枯草菌のみが生育し、コロニーを形成することとなる。
取得した株を、MGB874(R25::R25B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm')株とした。
【００７７】
＜R*領域単独欠失株のゲノムへの外来配列除去用DNAコンストラクトの挿入＞
上述したR25領域単独欠失株のゲノムへの外来配列除去用ＤＮＡコンストラクトの挿入手順に準じて、図３で説明した方法により表４および表５−１〜５−７に記載のプライマーを使用し、R*領域の単独欠失株であるMGB874-R*::cm株の各ゲノムへ外来配列除去用ＤＮＡコンストラクトを挿入した。供与体ＤＮＡの作製のための欠失対象領域の５’外側領域（断片Ａ）及び３’外側領域（断片Ｂ）の断片の増幅には、各R*領域に対し、それぞれ*-DF1と*-DR1.2、及び*-DF2.2と*-DR2のプライマーセットを用いた（例えば、R21領域の場合、それぞれ21-DF1と21-DR1.2、及び21-DF2.2と21-DR2のプライマーセットを用いた）。
取得した株をMGB874(R*::R*B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)株とした。
【００７８】
〔実施例３〕多重領域欠失株の構築
本実施例では、上記で構築した各単独欠失株ゲノムへの外来配列除去用ＤＮＡコンストラクト挿入株を利用して、多重領域欠失株を構築した。
【００７９】
＜MGB874(R25::R25B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)株のゲノム内相同組換え＞
MGB874(R25::R25B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)株を、ＬＢ液体培地で一晩培養した。培養液を希釈後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加したＬＢ寒天プレートに塗布した結果、コロニー形成が確認された。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上で生存し、コロニー形成が確認されたこれらの形質転換枯草菌は、ゲノム内相同組み換えによって外来配列除去用ＤＮＡコンストラクト及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（断片‘Ｃｍ’）がゲノムＤＮＡから欠失したものである（図３参照）。
さらに、本実施例では、以上の実験により得られた形質転換枯草菌の単コロニーについて、欠失対象領域（R25領域）の欠失を、表４および表５−１〜５−７に示す25-checkFプライマー（配列番号２５５）と25-checkRプライマー（配列番号２５６）を用いて確認した（図３）。本実験で取得された株をRGF880株と命名した。
【００８０】
＜RGF880株ゲノムからのR21領域の欠失＞
RGF880株ゲノムから、表２に示したR21領域を欠失させる実験を行った。
MGB874-R21::cm株のゲノムへ外来配列除去用ＤＮＡコンストラクトを挿入して構築した株MGB874(R21::R21B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)のゲノムＤＮＡを抽出し、RGF880株に対して形質転換実験を行った。形質転換の条件は、コンピテントセル形質転換方法（例えば、J. Bacteriol. 93, 192 (1967)参照）に従い、１μｇ以上のＰＣＲ産物（供与体ＤＮＡ）を４００μｌのコンピテントセルに加え、更に１．５時間培養した。１０ｐｐｍのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育したコロニーを相同組み換え（図３参照）による形質転換体として分離した。取得した株を、RGF880(R21::R21B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)とした。
【００８１】
RGF880(R21::R21B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)株を、ＬＢ液体培地で一晩培養した。培養液を希釈後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加したＬＢ寒天プレートに塗布した結果、コロニー形成が確認された。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上で生存し、コロニー形成が確認されたこれらの形質転換枯草菌は、ゲノム内相同組み換えによって外来配列除去用ＤＮＡコンストラクト及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（断片‘Ｃｍ’）がゲノムＤＮＡから欠失したものである（図３参照）。
さらに、本実施例では、以上の実験により得られた形質転換枯草菌の単コロニーについて、欠失対象領域（R21領域）の欠失を、表４および表５−１〜５−７に示す21-checkFプライマー（配列番号２４９）と21-checkRプライマー（配列番号２５０）を用いて確認した（図３）。本実験で取得された株をRGF905株と命名した。
【００８２】
＜各領域削除株ゲノムからのR*領域の欠失＞
RGF880株ゲノムから、R21領域を欠失させる実験と同様の方法により、更に多重欠失株の構築を行った。対象とする領域削除株をRGFx株として、RGFx株ゲノムからR*領域を欠失させる実験を以下のように行った。
【００８３】
MGB874-R*::cm株のゲノムへ外来配列除去用ＤＮＡコンストラクトを挿入して構築した株MGB874(R*::R*B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)のゲノムＤＮＡを抽出し、領域削除株RGFx株に対して形質転換実験を行った。形質転換の条件は、コンピテントセル形質転換方法（例えば、J. Bacteriol. 93, 192 (1967)参照）に従い、１μｇ以上のＰＣＲ産物（供与体ＤＮＡ）を４００μｌのコンピテントセルに加え、更に１．５時間培養した。１０ｐｐｍのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地に塗布し、生育したコロニーを相同組み換え（図３参照）による形質転換体として分離した。取得した株を、RGFx(R*::R*B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)とした。
【００８４】
RGFx (R*::R*B, spec, lacI, Pspac-chpA,‘cm’)株を、ＬＢ液体培地で一晩培養した。培養液を希釈後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加したＬＢ寒天プレートに塗布した結果、コロニー形成が確認された。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上で生存し、コロニー形成が確認されたこれらの形質転換枯草菌は、ゲノム内相同組み換えによって外来配列除去用ＤＮＡコンストラクト及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（断片‘Ｃｍ’）がゲノムＤＮＡから欠失したものである（図３参照）。
さらに、本実施例では、以上の実験により得られた形質転換枯草菌の単コロニーについて、欠失対象領域（R*領域）の欠失を、表４および表５−１〜５−７に示す*-checkFプライマーと*-checkRプライマーを用いて確認した（図３）。
以上の実験を繰り返し、表２に示す本発明の枯草菌変異株を構築した。
【００８５】
〔実施例４〕組換え枯草菌の作製および目的遺伝子産物生産性評価
実施例１〜３により作製した本発明の枯草菌変異株RGF916株、RGF933株、RGF1042株、RGF1323株、RGF1334株、RGF1351株、GF1368株、及び、RGF1370に、目的遺伝子産物コードする遺伝子を導入した組換え枯草菌株を作製し、目的遺伝子産物の生産能を評価した。本例では、枯草菌変異株に導入する目的遺伝子産物として、アルカリセルラーゼを使用した。
【００８６】
＜アルカリセルラーゼ分泌生産評価＞
アルカリセルラーゼ分泌生産性評価は以下の様に行った。即ち、バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報）断片（3.1 kb）がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３７℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。
【００８７】
セルラーゼ活性測定については、１／７．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬)で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ p-nitrophenyl-β-D-cellotrioside(生化学工業)を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとした。
【００８８】
＜結果＞
アルカリセルラーゼについて、分泌生産能を表６にまとめた。なお、表６において、各種酵素の分泌生産能は、親株であるMGB874株に各遺伝子を同様に導入した場合の酵素生産量を１００としたときの相対値で示している。
【００８９】
【表６】
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【００９０】
表６に示したように、本発明の組換え枯草菌である、RGF916株、RGF933株、RGF1042株、RGF1334株、RGF1351株、RGF1368株、RGF1370株では、MGB874株よりアルカリセルラーゼの分泌生産性が向上していることが明らかとなった。
【図２】
2011160686.tif 000016
【図１】
2011160686.tif 000017
【図３】
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【配列表】
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