(57)【要約】【課題】  ＨＣＶの複製を抑制するアンチセンスＲＮＡステム・ループ分子を提供すること。また、Ｃ型肝炎の有効な治療手段を提供すること。【解決手段】  HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸。前記核酸を細胞内で発現することができる発現ベクター、前記核酸及び/又は発現ベクターを含む医薬組成物も提供される。【選択図】図４
2011160674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸。
【請求項２】
アンチセンスRNAステム・ループがHCV
IRESのSL IIIf RNAのループ領域と相補的な２〜８塩基の領域を持つ４〜１２塩基のループを持つ請求項１記載の核酸。
【請求項３】
ループの根元にGAミスマッチ塩基対が挿入された請求項１又は２記載の核酸。
【請求項４】
アンチセンスRNAステム・ループが２〜４８塩基対のステムを持つ請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
アンチセンスRNAステム・ループが下記のいずれかの配列で表される請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
IIIf-a0:5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3'（配列番号１）
IIIf-a1:5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3'（配列番号２）
IIIf-a2:5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3'（配列番号３）
IIIf-a1-s4:5'-GGUGGCUCGCAACACC-3'（配列番号４）
IIIf-a1-s5:5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3'（配列番号５）
IIIf-a1-s6:5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3'（配列番号６）
IIIf-a1-s7:5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3'（配列番号７）
【請求項６】
化学修飾されている請求項１〜５のいずれかに記載の核酸。
【請求項７】
請求項１記載の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクター。
【請求項８】
請求項１記載の核酸及び/又は請求項７記載の発現ベクターを含む、医薬組成物。
【請求項９】
C型肝炎の予防又は治療のために用いられる請求項８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）を標的とする核酸分子に関するものであり、具体的には、ＩＲＥＳドメインIIIのステム・ループIIIｆ（ステム・ループIIIｆ）にループ・ループ相互作用により結合し、翻訳活性を阻害するアンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸分子に関する。本発明はまた、該アンチセンスＲＮＡステム・ループを細胞内で発現することができる発現ベクターに関する。本発明は更に、該アンチセンスＲＮＡステム・ループ、或いは該アンチセンスＲＮＡステム・ループを細胞内で発現することができる発現ベクターを含む医薬組成物に関する。当該医薬組成物は、Ｃ型肝炎の予防又は治療に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、慢性肝炎疾患の主要な原因ウイルスであり、感染者数は世界では１億７千万人と見られている。現在、インターフェロン（及びリハビリンとの併用）が唯一の効果的な治療法であるが、その著効率は５割以下であり、新規治療薬の開発が急務となっている。特に、ウイルスゲノムの変異率が高く、分子標的薬の開発障壁となっている。
【０００３】
ＨＣＶはフラビウイルス科、ヘパシウイルス属に属する（＋）鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。約９．６ｋｂのＲＮＡゲノムは、約３,０００のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする翻訳領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）と、その両末端の非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）から構成される。５末端の約３４１ヌクレオチドからなる非翻訳領域には、内部リボソーム結合領域 (ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ )と呼ばれる構造体が存在し、ウイルスＲＮＡの非キャップ依存性翻訳を仲介する（図１Ａ）。
【０００４】
多くの真核細胞やその感染性ウイルスは、ｍＲＮＡの５’末端に７−メチルグアノシンキャップ構造があり、これにｅＩＦ４、ｅＩＦ４Ｇ、４０Ｓリボソームサブユニットなど多くの翻訳開始因子や細胞性タンパク質が関与して翻訳が開始される。これに対し、ＨＣＶのＩＲＥＳ構造は、４０ＳサブユニットやｅＩＦ３が直接結合し、上記キャップ依存性翻訳と比較してよりわずかな翻訳開始因子で翻訳が可能となる（非特許文献１）。
【０００５】
ＨＣＶ ＩＲＥＳの予測二次構造では、ドメインI、II、III、IVの４つの領域から構成され、翻訳開始複合体を形成する４０ＳリボソームサブユニットやｅＩＦ３翻訳開始因子はドメインIIIの広範にわたって相互作用している（非特許文献２）。ＨＣＶは、変異率の違いから６種のジェノタイプが知られているが、ＩＲＥＳの二次構造はよく保存されている。先行研究では、デコイ実験や変異解析からIIId、e、fの重要性が示唆されている（非特許文献２、非特許文献３）。
【０００６】
一方、アンチセンスやｓｉＲＮＡを用いることによるＨＣＶの複製阻害も報告されている。Ｔａｌｌｅｔ−Ｌｏｐｅｚらは、IIIｄ領域に結合する２’−ＯＭｅ化アンチセンスＲＮＡが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系において４０Ｓリボソームとの結合を阻害する（IC50 <10 nM）ことを報告している（非特許文献４）。また、Ｋａｎｄａらは、IIId〜IIIeの領域を標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をＪＦＨ１感染細胞（Ｈｕｈ−７）に導入することにより、ウイルス複製および感染性が阻害されることを報告している（非特許文献５）。
【０００７】
また、アプタマーによるＨＣＶの増幅、複製の阻害に関しては、Ａｌｄａｚ−ＣａｒｒｏｌらのドメインIのステム・ループ1に結合するアプタマー（ａｐｉｃａｌ  ｌｏｏｐ−ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｏｏｐ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（Ｋｄ＝７０ｎＭ）（非特許文献６）、Ｄａ  Ｒｏｃｈａ  ＧｏｍｅｓらのドメインIIに結合するアプタマー（ａｐｉｃａｌ  ｌｏｏｐ−ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｏｏｐ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）（Ｋｄ＝３５ｎＭ）（非特許文献７）などの報告がある。また、Ｒｏｍｅｒｏ−ＬｏｐｅｚらによってIIIf領域に結合する８１ｍｅｒアプタマー（ＨＨ３６３−１０）が報告されているが、ウイルス複製阻害活性は示されていない。また、IIIfと結合するステム・ループ領域も弱い翻訳阻害活性しか示さない（非特許文献８）。
【０００８】
一方、西川らは、リボザイムとアプタマーとからなるキメラＲＮＡによりＩＲＥＳ活性とＮＳ３プロテアーゼ活性をともに抑制可能な機能性ＲＮＡ分子を提唱した（特許文献１など）。しかしながら、目的とするキメラＲＮＡは１６０ｎｔからなる巨大分子であり、医薬品としての利用には、分子量の低下など解決すべき課題は多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＨＣＶにおいてジェノタイプを超えて二次構造が保存されているＩＲＥＳドメインIIIのステム・ループIIIｆ領域に結合することにより、ＨＣＶの複製を抑制するアンチセンスＲＮＡステム・ループ分子を提供し、Ｃ型肝炎の有効な治療手段を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＨＣＶ ５’ＵＴＲ  ＩＲＥＳのドメインIIIに存在するステム・ループ IIIe及びf領域はリボソーム４０Ｓサブユニットとの結合に重要であり、高い保存性を示す（図１Ｂ）。この中で、ステム・ループ IIIfは下流の一本鎖領域とｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ構造を形成すると考えられている（非特許文献９）。ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ形成を妨げる変異は著しく翻訳効率低下させ、再びｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ構造をｒｅｓｔｏｒｅする相補的な変異により効率は部分的にしか回復しない（非特許文献２）。このことから、ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ領域の配列と構造がいずれも翻訳活性において重要であることが分かった。また、ドメインIIIe及びf領域に相当するデコイＲＮＡ分子が特異的にＩＲＥＳからの翻訳を阻害することが示されている（非特許文献３）。以上のことから、ＨＣＶゲノムＲＮＡのIIIfに相当するステム・ループ構造への結合により翻訳を阻害することにより、ＨＣＶの増殖を抑制することができる可能性がある。
【００１１】
そこで発明者らは、上記ＲＮＡ-タンパク質相互作用を阻害する方法として、アンチセンスＲＮＡステム・ループの利用に着目し、Ｕ１Ａタンパク質とＵ１ｈｐII ＲＮＡとの相互作用などをモデルとしてその有効性を示した。また、このような方法論を用いて、ＨＣＶ の翻訳に重要なゲノムＲＮＡ５’非翻訳領域に結合し、感染細胞におけるウイルス複製を抑制するアンチセンスＲＮＡステム・ループの発明に想到した。
【００１２】
以上、本発明の理解のため、本発明を想到するに至る経緯を説明したが、本発明の範囲は上記説明に限定されず、請求の範囲の記載によって定められる。
【００１３】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸。
（２）アンチセンスRNAステム・ループが、HCV IRESのSL IIIf RNAのループ領域と相補的な２〜８塩基の領域を持つ４〜１２塩基のループを持つ（１）記載の核酸。
（３）ループの根元にGAミスマッチ塩基対が挿入された（１）又は（２）記載の核酸。
（４）アンチセンスRNAステム・ループが２〜４８塩基対のステムを持つ（１）〜（３）のいずれかに記載の核酸。
（５）アンチセンスRNAステム・ループが下記のいずれかの配列で表される（１）〜（４）のいずれかに記載の核酸。
IIIf-a0:5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3'（配列番号１）
IIIf-a1:5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3'（配列番号２）
IIIf-a2:5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3'（配列番号３）
IIIf-a1-s4:5'-GGUGGCUCGCAACACC-3'（配列番号４）
IIIf-a1-s5:5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3'（配列番号５）
IIIf-a1-s6:5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3'（配列番号６）
IIIf-a1-s7:5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3'（配列番号７）
（６）化学修飾されている（１）〜（５）のいずれかに記載の核酸。
（７）（１）記載の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクター。
（８）（１）記載の核酸及び/又は（７）記載の発現ベクターを含む、医薬組成物。
（９）C型肝炎の予防又は治療のために用いられる（８）記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のアンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸は、一般的な一本鎖ＲＮＡからなるアンチセンス分子やｓｉＲＮＡでは標的とすることが難しいＩＲＥＳの二次構造を標的とする。ＲＮＡ二次構造を標的とすることにより、ＨＣＶの翻訳において重要な役割を果たす宿主やウイルス因子の働きを直接阻害し、効果的な翻訳の抑制が期待される。また、ＩＲＥＳの二次構造は高い配列保存性を有し、耐性変異が生じ難いことが知られており、各種ジェノタイプに対応したＨＶＣ増殖、複製阻害が可能なアンチセンスＲＮＡステム・ループを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】(A) ＨＣＶ ＩＲＥＳの二次構造、(B)ＨＣＶＩＲＥＳドメインIIIe及びf領域の二次構造
【図２】デザイン／合成したアンチセンスＲＮＡステム・ループとその変異体
【図３】デザイン／合成したアンチセンスＲＮＡステム・ループと標的ＲＮＡとの結合のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による解析
【図４】アンチセンスＲＮＡステム・ループによるＨＣＶ ＲＮＡ産生阻害の評価
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１７】
定義
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
【００１８】
アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸
本発明は、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸を提供する。
【００１９】
アンチセンスRNAステム・ループは、HCV IRESのSL IIIf RNAのループ領域と相補的な２〜８塩基の領域を持つ４〜１２塩基のループを持つとよい。また、ループの根元にGAミスマッチ塩基対が挿入されてもよい。さらに、ループには、HIV DISの5'AANNNNNNA3'のようにアデニン３個が挿入されてもよい。これにより、結合の親和性が向上する。アンチセンスRNAステム・ループは、４〜１２塩基のループを持つとよく、好ましくは、５〜１０塩基のループを持ち、より好ましくは、６〜１０塩基のループを持つ。
【００２０】
アンチセンスRNAステム・ループは、２〜４８塩基対のステムを持つとよく、好ましくは、２〜２０塩基対のステムを持ち、より好ましくは、２〜１０塩基対のステムを持つ。
【００２１】
アンチセンスRNAステム・ループは、下記のいずれかの配列で表されるとよい。IIIf-a0:5'-GGGAACCUGCUCGCACAGGUUCCC-3'（配列番号１）
IIIf-a1:5'-GGGAACCUGGCUCGCAACAGGUUCCC-3'（配列番号２）
IIIf-a2:5'-GGGAACCUGGACUCGCAAACAGGUUCCC-3'（配列番号３）
IIIf-a1-s4:5'-GGUGGCUCGCAACACC-3'（配列番号４）
IIIf-a1-s5:5'-GGCUGGCUCGCAACAGCC-3'（配列番号５）
IIIf-a1-s6:5'-GGCCUGGCUCGCAACAGGCC-3'（配列番号６）
IIIf-a1-s7:5'-GGACCUGGCUCGCAACAGGUCC-3'（配列番号７）
【００２２】
本発明の核酸は、バルジ塩基、internalループ、apicalループなどを含んでもよい。本発明の核酸は、８〜１２０塩基の長さであるとよく、好ましくは、９〜６０塩基の長さであり、より好ましくは、１０〜４０塩基の長さである。
【００２３】
本発明の核酸は、鋳型DNAからin vitro転写法により、作製することができる。また、本発明の核酸は、公知のオリゴヌクレオチド合成法で作製することができる。
【００２４】
本発明の核酸は、当業者に公知の手法で化学修飾することにより安定化することができる。具体的には、アンチセンスＲＮＡステム・ループあるいはその他の構成要素の一部或いは全部が、ホスホロチオエート体、ボラノフォスフェート体であってもよく、ＤＮＡ、Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＮＡ）或いはモルフォリノ体、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）体で置換されていてもよい。また、２’−修飾体であってもよく、具体的には、２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ、２’−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ、２’−ｆｌｕｏｒｏ修飾体であってもよい。
【００２５】
アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸を発現するベクター
また、本発明は、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸を発現することができる発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステム・ループを含む核酸をコードするDNA又はRNAがベクターに組み込まれたものである。当該ベクターは非ウイルスベクターであってもよいし、ウイルスベクターであってもよい。
【００２６】
非ウイルスベクターとしては、pUC19（宝酒造、京都）、pGREENLANTERN（ライフテックオリエンタル（株）、東京）、pHaMDR (HUMAN GENE THERAPY 6:905-915 (July 1995))など、当業者が周知のプラスミドベクターを用いることができる。
【００２７】
ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、又はワクシニアウイルスであってもよい。
【００２８】
上記発現ベクターは、当該アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸をコードするＤＮＡを作製し、これを転写因子結合部位（プロモーター領域）を含むベクターに組み込むことによって調製できる。当該アンチセンスＲＮＡステム・ループを含む核酸をコードするＤＮＡは、当業者に周知の核酸の化学的合成法により、ＤＮＡ合成機を用いて製造することができる。また、合成されたＤＮＡを鋳型にしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、あるいは当該ＤＮＡを含むベクターによって形質転換された培養宿主細胞中で増幅することができる。
【００２９】
医薬品組成物
さらに、本発明は、HCV IRESのSL IIIfを標的とするアンチセンスRNAステムループを含む核酸及び/又は当該核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、C型肝炎の予防又は治療のために用いることができる。
【００３０】
ＨＣＶに感染した被験者の組織または細胞（例えば、肝臓）に、本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを導入することによって、細胞中のＨＣＶタンパク質の合成を抑制および／またはＨＣＶの複製を抑制することができる。本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターの導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（”Ｌｉｐｉｄｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ”（１９９７）
Ｒ．Ｊ． Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌ． Ｈｕａｎｇ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １４， １７３−２０６；中西守ら、蛋白質 核酸
酵素 Ｖｏｌ．４４， Ｎｏ．１１， １５９０−１５９６ （１９９９））、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接あるいは静脈、筋肉、腹腔、皮下、皮内投与などの投与経路で本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターを導入することもできる。本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターの投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。例えば、通常、成人一人当たり１〜１００mg、好ましくは、１〜１０mgの投与量で、少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。ベクターがウイルスの場合には、例えば、成人一人当たり１０９〜１０１２pfu、好ましくは１０１１〜１０１２pfuの投与量で少なくとも１回、所望の効果が持続する頻度で投与するとよい。
【００３１】
本発明の核酸又は本発明の核酸を細胞内で発現することができる発現ベクターは、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）とともに製剤化した医薬組成物として、投与されるとよい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本発明の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
試薬・溶媒・使用機器など
【００３３】
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）、尿素、アクリルアミド、エタノール、ＥＤＴＡ、エチジウム・ブロマイド、リン酸ナトリウム、グアノシン5’三リン酸（ＧＴＰ）、シトシン5’三リン酸（ＣＴＰ）は、和光純薬より購入した。ＨＥＰＥＳは、シグマより購入した。ウリジン5’三リン酸（ＵＴＰ）は、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社より購入した。アデノシン5’三リン酸（ＡＴＰ）はロッシュより購入した。トリス（Ｔｒｉｓ）、ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔは、インビトロジェンより購入した。ホウ酸は、アマシャム・バイオサイエンスより購入した。Ｔ７
ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、大腸菌で発現し、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  ＳＰ樹脂（シグマ）を用いて精製した。ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔは、ＭｉｒｕｓＢｉｏ社より購入した。ＵＶトランスイルミネーターはフナコシ、スラブゲル電気泳動層はバイオクラフト、ＴａｑＭａｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ
はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のものを用いた。
【００３４】
実施例１：アンチセンスＲＮＡステム・ループのデザイン
図２に示したアンチセンスＲＮＡステム・ループをデザインした。すなわち、アンチセンスＲＮＡステム・ループ分子IIIｆ−ａ０は、ＨＣＶゲノムＲＮＡ IIIfのループに相補的な6塩基をループにもつようにデザインした。IIIf-a1はIIIf-a0のループ根元にＧＡミスマッチ塩基対を挿入した。IIIf-a2はIIIf-a1より２塩基多い８塩基の相補的な塩基をループに持つようにデザインした。IIIf-a1mは、IIIf-a1のループ先端の塩基ＣＧをＧＣに置換した変異体で、IIIf-a1の陰性コントロールとして作成した。同様にIIIf-a2mは、IIIf-a2のループ先端の塩基ＣＧをＧＣに置換した変異体で、IIIf-a2の陰性コントロールを目的として作成した。このようにデザインした当該アンチセンスＲＮＡ ステム・ループ分子は、ＲＮＡ二次構造予測プログラム（ＭｕｌＦｏｌｄ）によってステム・ループ構造をとるか確認した。
【００３５】
実施例２：アンチセンスＲＮＡステム・ループの合成
アンチセンスＲＮＡ ステム・ループ分子は、Ｔ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法によって合成した。当該アンチセンスＲＮＡ
ステム・ループ分子と相補的なＤＮＡ配列にＴ７プロモーターの相補鎖の配列を連結した鋳型ＤＮＡを作製した。転写反応に用いた鋳型ＤＮＡ配列を表１に示した。当該一本鎖鋳型ＤＮＡ(５μＭ)は、Ｔ７  プロモーターＤＮＡ(７．５μＭ)、ＮａＣｌ(１００ｎＭ),Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (１０ｎＭ)を含む溶液を９５℃で５分間熱変性させ室温まで戻すことでＴ７  プロモーターＤＮＡをアニーリングさせた。これを鋳型としてＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより転写し、当該アンチセンスＲＮＡ
ステム・ループ分子を含む転写反応溶液を得た。転写反応溶液[ＨＥＰＥＳ(1×), ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００, ８０ｍｇ／ｍｌ）, ＧＴＰ (８ｍＭ), ＵＴＰ(８ｍＭ), ＡＴＰ(４ｍＭ), ＣＴＰ(４ｍＭ) 、ＭｇＣｌ２(４２ｍＭ), ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ
(３００ｍＭ)]を調製し、Ｔ７ポリメラーゼを加えて３７℃で２時間インキュベーションした。転写反応溶液はＥＤＴＡを加え反応を停止させ、エタノール沈殿をして８Ｍ尿素／１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。
表１に使用したＲＮＡの鋳型オリゴＤＮＡ配列を示した。
【００３６】
【表１】
2011160674.tif 000003
IIIf、IIIf-a0、IIIf-a1、IIIf-a2、IIIf-a1m及びIIIf-a2mのDNA配列を、それぞれ、配列番号８、９、１０、１１、１２及び１３に示す。
【００３７】
実施例３：アンチセンスＲＮＡステム・ループと標的ＲＮＡとの相互作用の解析
各ＲＮＡ基質が６μＭになるように標的ＲＮＡ：アンチセンスＲＮＡステム・ループ＝１：１のモル比になるようＲＮＡ基質溶液を調製した。９５℃で５分間熱変性させ氷上で５分間急冷した。反応溶液に４×ＰＮバッファー[リン酸ナトリウム、 ｐＨ７．０(４０ｍＭ)、塩化ナトリウム(２００ｍＭ)]を1×になるように加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。グリセロールを終濃度の１０％となるように添加し、ゲルＴＢＥ（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、ＴＢＭ（８９ｍＭトリス、８９ｍＭホウ酸、０．１ｍＭ塩化マグネシウム）の各ゲルに等分してアプライした。電気泳動は、一定温度（特記以外４℃）、２００Ｖで行った。電気泳動後のゲルはエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶトランスイルミネーターでバンドを可視化した。
ＴＢＥゲルはマグネシウムイオンを含まないためループ・ループ相互作用はみられず、２本のバンドとして検出される。ＴＢＭゲルでは、マグネシウムイオンの存在により、ループ・ループ相互作用可能な条件になっている。
【００３８】
標的ＲＮＡIIIfとアンチセンスＲＮＡを組み合わせてゲルシフトを行った。IIIf-a0, IIIf-a1, IIIf-a2すべてにおいてバンドのシフトがみられたことから、デザインしたアンチセンスＲＮＡステム・ループは標的に結合した。また、IIIf-a1, IIIf-a2については、バンドのシフトの度合いが大きいことから、ＧＡミスマッチ塩基対の効果が得られ、IIIf-a0よりも強く結合した。特に、IIIf-a1はIIIf-a2より大きなシフトが確認された。シフトの度合いが大きかったこれら２つのアンチセンスＲＮＡステム・ループIIIf-a1, IIIf-a2に関して、ループ先端の２配列を変えた変異体IIIf-a1m,
IIIf-a2mを作製し、同法によるバンドのシフトを調べた。その結果、変異体では、標的ＲＮＡとの結合がみられなかったことから、IIIf-a1, IIIf-a2は標的に対し特異的に結合することが示された。
【００３９】
実施例４：アンチセンスＲＮＡステム・ループ分子によるＨＣＶ複製阻害効果の確認
ＨＣＶ感染ヒト肝癌細胞Ｈｕｈ−７を２４-ｗｅｌｌ培養プレートに１ｘ１０５cells/well播種し、１日後、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ (ＭｉｒｕｓＢｉｏ社)を利用してアンチセンスＲＮＡを細胞へ導入した。アンチセンスＲＮＡ
１または５μｇを、ＴｒａｎｓＩＴ−ｍＲＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ／ｍＲＮＡ Ｂｏｏｓｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ／Ｏｐｔｉ−ＭＥＭと混和し、４分間静億後、細胞へ添加した。３日間培養後、細胞の全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ  ｒｅａｇｅｎｔにより調製した。全ＲＮＡ量を測定し、ＴａｑＭａｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶ
ＲＮＡを定量測定した。その結果、IIIf-a1の場合、ＨＣＶ ＲＮＡ量の７０％程度の低下が、IIIf-a2の場合は３０％程度の低下が見られ、試験管内アッセイでの標的ＲＮＡとの結合活性に対応する結果が見られた。また、IIIf-a1およびIIIf-a2のループ変異を導入したIIIf-a1mおよびIIIf-a2mの場合は、予想される通り阻害活性は見られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の核酸は、ＨＶＣ増殖、複製阻害が可能であり、C型肝炎の予防又は治療のための医薬品として利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
＜配列番号１＞
配列番号１は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a0のRNA配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1のRNA配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a2のRNA配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s4のRNA配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s5のRNA配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s6のRNA配列を示す。
＜配列番号７＞
配列番号７は、アンチセンスRNAステム・ループIIIf-a1-s7のRNA配列を示す。
＜配列番号８＞
配列番号８は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIfのDNA配列を示す。
＜配列番号９＞
配列番号９は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a0のDNA配列を示す。
＜配列番号１０＞
配列番号１０は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a1のDNA配列を示す。
＜配列番号１１＞
配列番号１１は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a2のDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a1mのDNA配列を示す。
＜配列番号１２＞
配列番号１２は、RNAの鋳型オリゴＤＮＡ配列IIIf-a2mのDNA配列を示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００４２】
【特許文献１】特開２００２−１６５５９４
【非特許文献】
【００４３】
【非特許文献１】Rijnbrand RC et al., Curr Top MicrobiolImmunol.242:85-116, 2000
【非特許文献２】Kieft et al., ＲＮＡ, Feb;7(2):194-206, 2001
【非特許文献３】Ray & Das, Nucleic Acids Res.,32:1678-1687, 2004
【非特許文献４】Tallet-Lopez et al., Nucleic Acids Res.,31:734-742, 2003
【非特許文献５】Kanda et al., J. Virol., 81:669-676, 2007
【非特許文献６】Aldaz-Carrol et al., Biochem., 41:5883-5893, 2002
【非特許文献７】Da Rocha Gomes et al., BBRC, 322:820-826, 2004
【非特許文献８】Romero-Lopez et al., Cell Mol. Life Sci., 64:2994-3006, 2007
【非特許文献９】Wang et al., ＲＮＡ, Jul;1(5):526-37.:526-537, 1995
【図１】
2011160674.tif 000004
【図２】
2011160674.tif 000005
【図３】
2011160674.tif 000006
【図４】
2011160674.tif 000007
【配列表】
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