(57)【要約】 【課題】  ホスファチド塩錯体の新規な製造方法を提供する。【解決手段】  本発明の製造方法は、基質として少なくとも１つの原料レシチンを使用するステップと、カルボン酸塩錯体水溶液中でホスポリパーゼ−Ｄ（ＰＬＤ）、ラセミ体又は鏡像異性的に純粋なセリン又はアミンにより、少なくとも１つの原料レシチンを酵素的に処理するステップとからなり、少なくとも１つの原料レシチンから誘導された構造的に脂肪酸鎖を有するホスファチド塩錯体を生成するために、前記処理ステップは単相反応環境下で行われる。前記処理ステップは約４．５〜８．０の範囲内のｐＨ及び約２５〜６０℃の範囲内の温度で行われ、前記カルボン酸塩錯体水溶液は、鎖長がＣ２〜Ｃ８のカルボン酸と塩とが約１：２（酸対塩）（ｗ／ｗ）の比率の水溶液から形成される。【選択図】  無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)基質として少なくとも１つの原料レシチンを使用するステップと、
(b)カルボン酸塩錯体水溶液中でホスポリパーゼ−Ｄ（ＰＬＤ）、ラセミ体又は鏡像異性的に純粋なセリン又はアミンにより、少なくとも１つの原料レシチンを酵素的に処理するステップとからなり、
少なくとも１つの原料レシチンから誘導された構造的に脂肪酸鎖を有するホスファチド塩錯体を生成するために、前記処理ステップは単相反応環境下で行われる、
ことを特徴とするホスファチド塩錯体の製造方法。
【請求項２】
(i)前記少なくとも１つの原料レシチンは、植物性レシチン及び非植物性レシチンからなる群から選択され；
(ii)前記植物性レシチンは大豆レシチン、ひまわりレシチン、菜種レシチンからなる群から選択され；
(iii)前記非植物性レシチンは乳燐脂質、卵黄レシチン及び魚類レシチンからなる群から選択され；
(iv)前記ＰＬＤは植物性ＰＬＤ、細菌由来酵素ＰＬＤ、植物性ＰＬＤと細菌由来酵素ＰＬＤの混合物からなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記処理ステップは、約４．５〜８．０の範囲内のｐＨ及び約２５〜６０℃の範囲内の温度で行われる、
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
前記カルボン酸塩錯体水溶液は、鎖長がＣ２〜Ｃ８のカルボン酸と塩とが約１：２（酸対塩）（ｗ／ｗ）の比率の水溶液から形成される、
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
(c)適当な有機溶剤及び熱からなる群から選択される少なくとも１つの成分で処理してＰＬＤを変性させるステップを更に有する、
ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１の製造方法により製造されたホスファチド塩錯体。
【請求項７】
(a)基質として少なくとも１つの原料レシチンを使用するステップと、
(b)カルボン酸塩錯体水溶液中でホスポリパーゼ−Ｄ（ＰＬＤ）、ラセミ体又は鏡像異性的に純粋なセリン又はアミンにより、少なくとも１つの原料レシチンを酵素的に処理するステップとからなり、
少なくとも１つの原料レシチンから誘導された構造的に脂肪酸鎖を有するホスファチド塩錯体を生成するために、前記処理ステップは単相反応環境下で行われる、
ことを特徴とするホスファチジン酸塩（ＰＡ塩）錯体とホスファチジルセリン塩（ＰＳ塩）錯体を含むホスファチド塩錯体混合物を同時に製造する方法。
【請求項８】
(i)前記少なくとも１つの原料レシチンは、植物性レシチン及び非植物性レシチンからなる群から選択され；
(ii)前記植物性レシチンは大豆レシチン、ひまわりレシチン、菜種レシチンからなる群から選択され；
(iii)前記非植物性レシチンは乳燐脂質、卵黄レシチン及び魚類レシチンからなる群から選択され；
(iv)前記ＰＬＤは植物性ＰＬＤ、細菌由来酵素ＰＬＤ、植物性ＰＬＤと細菌由来酵素ＰＬＤの混合物からなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記処理ステップは、約４．５〜８．０の範囲内のｐＨ及び約２５〜６０℃の範囲内の温度で行われる、
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
前記カルボン酸塩錯体水溶液は、鎖長がＣ２〜Ｃ８のカルボン酸と塩とが約１：２（酸対塩）（ｗ／ｗ）の比率の水溶液から形成される、
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１１】
前記混合物は、混合物の総燐脂質含量のうち、少なくとも３％（ｗ／ｗ）がＰＡ塩錯体であり、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）がＰＳ塩錯体からなる製品収量を有する、
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１２】
前記混合物は、混合物の総燐脂質含量のうち、約１０％（ｗ／ｗ）以上のＰＡ塩錯体と、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のＰＳ塩錯体からなる製品収量を有する、ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１３】
前記混合物は、混合物の総燐脂質含量のうち、２０〜７０％（ｗ／ｗ）のＰＡ塩錯体と、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のＰＳ塩錯体からなる製品収量を有する、ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１４】
(c)適当な有機溶剤及び熱からなる群から選択される少なくとも１つの成分で処理してＰＬＤを変性させるステップを更に有する、
ことを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１５】
請求項７の製造方法により製造されたホスファチド塩錯体混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスファチド塩錯体の製造方法に関する。更に詳細には、本発明は水系で反応されるカルボン酸塩錯体を用いる、ホスファチジルセリン塩錯体及びホスファチジン酸塩錯体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジルセリン塩及びホスファチジン酸塩は医薬組成物、栄養化合物及び機能性食品において使用される。機能性成分としてのホスファチジルセリン塩の重要性は、米国食品医薬品局の限定的健康強調表示によりサポートされている。この限定的健康強調表示において、ホスファチジルセリンの使用は高齢者における認知機能障害及び痴呆の改善に関するものであった。
【０００３】
特許文献１（米国特許第６４１０５２２号明細書）は、血中コルチゾールレベル及びセロトニン再吸収を低下させる顕著な作用を有する抗うつ剤、ストレス抑制剤及び気分改善薬を開示しており、改善薬を投与された患者のうつ病、精神的、感情的ストレスに付随する症状を緩和する効果を有する。
【０００４】
特許文献２（米国特許第６９４２１４６号明細書）は、ホスホリパーゼ−Ｄ（ＰＬＤ）酵素と、基質１ｇ当たり０．４ｇ以下の量の界面活性剤の存在下でラセミ体又は鏡像異性的に純粋なセリンとからホスファチジルセリン（ＰＳ）を製造する方法を開示している。この製造方法における反応媒体は有機溶剤を含まない水性分散液である。特許文献２に開示された製造方法の主たる利点は、ホスファチジン酸（ＰＡ）副生物量が最小で、高純度のホスファチジルセリンを高収率で得るために、水性媒体中でホスファチジルクロリン及び同様なホスファチジン類のホスファチジル基転移反応を実施できることである。
【０００５】
特許文献３（ドイツ特許第１９９１７２４９号明細書）には、ＰＳ塩の製造方法が開示されている。この方法は、Ｌ−セリンをレシチンの水性分散液（１〜２０％ｗ／ｗ）に添加し、ＰＬＤ及びＣａＣｌ２溶液を前記分散液に添加し、得られた混合物を室温で１０〜２０時間撹拌し、生成したＰＳ−Ｃａ塩を水相から分離し、分離したＣａ塩を水で洗浄してＬ−セリンを除去し、そして生成物をエタノールで抽出することからなる。
【０００６】
一般的に、溶剤はレシチンをホスファチジル基転移反応中に完全に溶解させるために使用される。懸濁液と異なり、溶液は製造方法を一層管理し易くする。別法として、水性媒体中では、レシチン基質の溶液／分散液を扱い易くするために界面活性剤が使用される。
【０００７】
ホスファチジル基転移反応が溶剤不含有水性媒体中で実施され、反応混合物から溶剤で界面活性剤を更に抽出する高コスト工程を必要とすること無く、ホスファチド塩錯体の製造及び分離を可能にする、ホスファチド塩錯体の新規な製造方法の開発が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６４１０５２２号明細書
【特許文献２】米国特許第６９４２１４６号明細書
【特許文献３】ドイツ特許第１９９１７２４９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ホスファチド塩錯体の新規な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明は、ラセミ体又は鏡像異性的に純粋なセリンの水溶液中で酵素的変換により、好ましくは、界面活性剤の不存在下で水性カルボン酸塩錯体溶液（Ｃ２−Ｃ８）とＰＬＤを用いて（Ｌ）−セリン水溶液中で酵素的変換によりレシチンからＰＡ塩錯体又はＰＳ塩錯体を製造する方法を提供する。
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明は更に、ダイエット食品及び機能性食品用成分として安定なＰＡ塩錯体又はＰＳ塩錯体を低コストな商業生産規模で同時に製造する方法及び反応混合物から界面活性剤を事後的に抽出する高コスト工程を有しない安全な製造方法を提供する。
【００１２】
従って、本発明によりホスファチド塩錯体の新規な製造方法が初めて提供される。この製造方法は、(a)基質として少なくとも１つの原料レシチンを使用するステップと、(b)カルボン酸塩錯体水溶液中でホスポリパーゼ−Ｄ（ＰＬＤ）、ラセミ体又は鏡像異性的に純粋なセリン又はアミンにより少なくとも１つの原料レシチンを酵素的に処理するステップとを含む。この処理ステップは単相反応環境下で行われ、少なくとも１つの原料レシチンから誘導された構造的に脂肪酸鎖を有するホスファチド塩錯体が生成される。
【００１３】
好ましくは、(i)少なくとも１つの原料レシチンは、植物性レシチン及び非植物性レシチンからなる群から選択され；(ii)植物性レシチンは大豆レシチン、ひまわりレシチン、菜種レシチンからなる群から選択され；(iii)非植物性レシチンは乳燐脂質、卵黄レシチン及び魚類レシチンからなる群から選択され；(iv)ＰＬＤは植物性ＰＬＤ、細菌由来酵素ＰＬＤ、植物性ＰＬＤと細菌由来酵素ＰＬＤの混合物からなる群から選択される。
【００１４】
好ましくは、本発明の処理ステップは、約４．５〜８．０の範囲内のｐＨ及び約２５〜６０℃の範囲内の温度で行われる。
【００１５】
好ましくは、カルボン酸塩錯体水溶液は、鎖長がＣ２〜Ｃ８のカルボン酸と塩とが約１：２（酸対塩）（ｗ／ｗ）の比率の水溶液から形成される。
【００１６】
好ましくは、本発明の方法は、(c)適当な有機溶剤及び熱からなる群から選択される少なくとも１つの成分で処理してＰＬＤを変性させるステップを更に有する。
【００１７】
本発明により、前記の製造方法により製造されるホスファチド塩錯体が初めて提供される。
【００１８】
本発明により、ホスファチジン酸塩（ＰＡ塩）錯体とホスファチジルセリン塩（ＰＳ塩）錯体を含むホスファチド塩錯体混合物を同時に製造する方法が初めて提供される。この製造方法は、(a)基質として少なくとも１つの原料レシチンを使用するステップと、(b)カルボン酸塩錯体水溶液中でホスポリパーゼ−Ｄ（ＰＬＤ）、ラセミ体又は鏡像異性的に純粋なセリン又はアミンにより少なくとも１つの原料レシチンを酵素的に処理するステップとを含む。この処理ステップは単相反応環境下で行われ、少なくとも１つの原料レシチンから誘導された構造的に脂肪酸鎖を有する、ＰＡ塩錯体とＰＳ塩錯体を含むホスファチド塩錯体混合物が生成される。
【００１９】
好ましくは、(i)少なくとも１つの原料レシチンは、植物性レシチン及び非植物性レシチンからなる群から選択され；(ii)植物性レシチンは大豆レシチン、ひまわりレシチン、菜種レシチンからなる群から選択され；(iii)非植物性レシチンは乳燐脂質、卵黄レシチン及び魚類レシチンからなる群から選択され；(iv)ＰＬＤは植物性ＰＬＤ、細菌由来酵素ＰＬＤ、植物性ＰＬＤと細菌由来酵素ＰＬＤの混合物からなる群から選択される。
【００２０】
好ましくは、本発明の処理ステップは、約４．５〜８．０の範囲内のｐＨ及び約２５〜６０℃の範囲内の温度で行われる。
【００２１】
好ましくは、カルボン酸塩錯体水溶液は、鎖長がＣ２〜Ｃ８のカルボン酸と塩とが約１：２（酸対塩）（ｗ／ｗ）の比率の水溶液から形成される。
【００２２】
好ましくは、前記混合物は、混合物の総燐脂質含量のうち、少なくとも３％（ｗ／ｗ）がＰＡ塩錯体であり、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）がＰＳ塩錯体からなる製品収量を有する。
【００２３】
好ましくは、前記混合物は、混合物の総燐脂質含量のうち、約１０％（ｗ／ｗ）以上のＰＡ塩錯体と、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のＰＳ塩錯体からなる製品収量を有する。
【００２４】
好ましくは、前記混合物は、混合物の総燐脂質含量のうち、２０〜７０％（ｗ／ｗ）のＰＡ塩錯体と、少なくとも２０％（ｗ／ｗ）のＰＳ塩錯体からなる製品収量を有する。      
【００２５】
好ましくは、本発明の方法は、(c)適当な有機溶剤及び熱からなる群から選択される少なくとも１つの成分で処理してＰＬＤを変性させるステップを更に有する。
【００２６】
本発明により、前記の製造方法により製造されるホスファチド塩錯体混合物が初めて提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について詳述する。
【００２８】
本発明はホスファチド塩錯体の製造方法に関する。本発明によるホスファチド塩錯体の製造原理及び操作について下記の実施例により詳細かつ具体的に例証する。
【実施例１】
【００２９】
原料として大豆レシチンを使用し、ＰＳ塩錯体とＰＡ塩錯体の混合物を下記の方法により同時に製造した。
【００３０】
塩化カルシウム４ｇとカプロン酸４ｍｌを容量５００ｍｌの小瓶内に入れ、一緒に混合した。次いで、水１５０ｍｌを添加し、一般的なカルボン酸塩錯体水溶液に相当するカプロン酸カルシウム塩錯体を製造した。この方法において、その他の塩類も同様に使用できる。カルシウム塩が使用されない場合、カルシウムを添加し酵素反応を促進する。更に、カルボン酸塩錯体を製造するために、その他のカルボン酸（例えば、Ｃ２〜Ｃ８）もこの方法において同様に使用できる。大豆レシチン（商品名Epikuron130P粉末，Cargill Europe BVBA社製）５０ｇとアミノ酸Ｌ−セリン７５ｇを前記小瓶に添加し、４５℃まで３０分間加熱した。
【００３１】
キャベツ由来のＰＬＤ（Sigma社製のP8398ホスホリパーゼ−Ｄ）５００単位（Ｕ）を前記混合物に添加し、４５℃で攪拌機で撹拌しながら１．５時間反応させた。反応溶液中の酵素を変性及び失活させるために、反応溶液を含有する小瓶にアセトン１５ｍｌを添加し、次いで、この小瓶を６５℃の温水中に浸けた。この変性のために、その他の適当な有機溶剤又は熱も同様に使用できる。続いて、反応溶液を氷中で冷却した。燐脂質を抽出するために、変性反応混合物に蒸留水７５ｍｌを添加し、３０分間撹拌した。次いで、この溶液を３０分間遠心分離し、混合物を２層に分離させた。燐脂質層を取り除き、次いで、３０℃の一定温度で減圧下で乾燥させた。高性能薄層クロマトグラフィ（ＨＰＴＬＣ）により測定されたＰＡ塩錯体とＰＳ塩錯体の最終組成は、ＰＡ塩錯体２１．６％、ＰＳ塩錯体１２．３％であった。
【００３２】
並行作業として、カプロン酸以外の前記成分を用いて同様な反応を行った。ＨＰＴＬＣにより測定されたＰＡ塩錯体とＰＳ塩錯体の最終組成は、ＰＡ塩錯体１８．１％、ＰＳ塩錯体６．３％であった。
【００３３】
これらの結果から、カルボン酸塩錯体を含有する本発明の反応に比べて、後の反応はＰＡ塩錯体及びＰＳ塩錯体の製造について非常に低効率であることが明確に示された。
【実施例２】
【００３４】
原料として大豆レシチンを使用し、ＰＳ塩錯体を下記の方法により製造した。
【００３５】
塩化カルシウム４ｇとカプリル酸４ｍｌを容量５００ｍｌの小瓶内に入れ、一緒に混合した。次いで、水１５０ｍｌを添加し、一般的なカルボン酸塩錯体水溶液に相当するカプリル酸カルシウム塩錯体を製造した。大豆レシチン（商品名Epikuron130P粉末，Cargill Europe BVBA社製）５０ｇとアミノ酸Ｌ−セリン７５ｇを前記小瓶に添加し、４５℃まで３０分間加熱した。
【００３６】
Streptomyces sp.由来のＰＬＤ（Sigma-Aldrich社製のP4912）５００単位（Ｕ）を前記混合物に添加し、４５℃で攪拌機で撹拌しながら１．５時間反応させた。反応溶液中の酵素を変性及び失活させるために、反応溶液を含有する小瓶にアセトン１５ｍｌを添加し、次いで、この小瓶を６５℃の温水中に浸けた。続いて、反応溶液を氷中で冷却した。燐脂質を抽出するために、変性反応混合物に蒸留水７５ｍｌを添加し、３０分間撹拌した。次いで、この溶液を３０分間遠心分離し、混合物を２層に分離させた。燐脂質錯体層を取り除き、次いで、３０℃の一定温度で減圧下で乾燥させた。ＨＰＴＬＣにより測定されたＰＡ塩錯体とＰＳ塩錯体の最終組成は、ＰＳ塩錯体２７．３％、ＰＡ塩錯体６．６％であった。
【００３７】
並行作業として、カプリル酸以外の前記成分を用いて同様な反応を行った。ＨＰＴＬＣにより測定されたＰＡ塩錯体とＰＳ塩錯体の最終組成は、ＰＳ塩錯体９．１％、ＰＡ塩錯体６．６％であった。
【００３８】
これらの結果から、カルボン酸塩錯体を含有する本発明の反応に比べて、後の反応はＰＡ塩錯体及びＰＳ塩錯体の製造について非常に低効率であることが明確に示された。
【実施例３】
【００３９】
原料として卵黄レシチンを使用し、ＰＳ塩錯体とＰＡ塩錯体の混合物を下記の方法により同時に製造した。
【００４０】
塩化カルシウム４ｇとカプリル酸４ｍｌを容量５００ｍｌの小瓶内に入れ、一緒に混合した。次いで、水１５０ｍｌを添加し、一般的なカルボン酸塩錯体水溶液に相当するカプロン酸カルシウム塩錯体を製造した。卵黄レシチン（商品名DS-PL95E; Doosan Corp.社製, Venture BG Biotech BU, Korea）５０ｇとアミノ酸Ｌ−セリン７５ｇを前記小瓶に添加し、激しく撹拌し、４５℃まで３０分間加熱した。
【００４１】
Streptomyces sp.由来のＰＬＤ（Sigma-Aldrich社製のP4912）２５０単位（Ｕ）とキャベツ由来のＰＬＤ（Sigma社製のP8398ホスホリパーゼ−Ｄ）２５０単位（Ｕ）を前記混合物に添加し、４５℃で攪拌機で撹拌しながら５．５時間反応させた。
【００４２】
反応溶液中の酵素を変性及び失活させるために、反応溶液を含有する小瓶にアセトン１５ｍｌを添加し、次いで、この小瓶を６５℃の温水中に浸けた。続いて、反応溶液を氷中で冷却した。燐脂質を抽出するために、変性反応混合物に蒸留水７５ｍｌを添加し、３０分間撹拌した。次いで、この溶液を３０分間遠心分離し、混合物を２層に分離させた。燐脂質錯体層を取り除き、次いで、３０℃の一定温度で減圧下で乾燥させた。ＨＰＴＬＣにより測定されたＰＳ塩錯体とＰＡ塩錯体の最終組成は、ＰＳ塩錯体３６．６％、ＰＡ塩錯体３８．３％であった。
【００４３】
並行作業として、カプリル酸以外の前記成分を用いて同様な反応を行った。ＨＰＴＬＣ）により測定されたＰＳ塩錯体とＰＡ塩錯体の最終組成は、ＰＳ塩錯体２２．１％、ＰＡ塩錯体２４．３％であった。
【００４４】
これらの結果から、カルボン酸塩錯体を含有する本発明の反応に比べて、後の反応はＰＡ塩錯体及びＰＳ塩錯体の製造について非常に低効率であることが明確に示された。
【００４５】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するために用いてはならない。また、同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。用語「又は」に関して、例えば「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」、「Ｂのみ」ならず、「ＡとＢの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。