(57)【要約】【課題】取扱性に優れたアンチセンスRNA含有試料を用いて迅速且つ簡便に大腸癌を診断する手段、及びその診断に用いられる有用なツールを提供すること。【解決手段】本発明は、哺乳動物から採取した血液における内在性アンチセンスRNAの発現を測定することを含む、大腸癌診断のための検査方法を提供する。また本発明は、該内在性アンチセンスRNAを提供し、それとハイブリダイズし得る塩基配列を含む核酸を含有してなる、大腸癌の診断薬を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から採取した血液中の、以下の（１）〜（３０）から選択される内在性アンチセンスRNAを測定することを含む、大腸癌診断のための検査方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のMAPK14遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２）配列番号２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRNF175遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３）配列番号３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のB4GALT5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（４）配列番号４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLRRK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（５）配列番号５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC731208遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（６）配列番号６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPSMF1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（７）配列番号７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のUSP25遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（８）配列番号８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRAB10遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（９）配列番号９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLIN7A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１０）配列番号１０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFN2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１１）配列番号１１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCREB5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１２）配列番号１２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のDSC2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１３）配列番号１３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC432369遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１４）配列番号１４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のANXA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１５）配列番号１５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCENTB2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１６）配列番号１６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFDN5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１７）配列番号１７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のKIAA0241遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１８）配列番号１８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のHINT1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１９）配列番号１９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のAYTL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２０）配列番号２０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のBAZ1A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２１）配列番号２１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPROK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２２）配列番号２２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のTMEM80遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２３）配列番号２３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のC9orf102遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２４）配列番号２４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のSETD6遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２５）配列番号２５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLANCL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２６）配列番号２６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のWNT2B遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２７）配列番号２７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPNPLA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２８）配列番号２８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZNF533遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２９）配列番号２９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZBED4遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３０）配列番号３０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC730966遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
【請求項２】
以下の（１）〜（３０）から選択される内在性アンチセンスRNA。
（１）配列番号１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のMAPK14遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２）配列番号２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRNF175遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３）配列番号３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のB4GALT5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（４）配列番号４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLRRK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（５）配列番号５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC731208遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（６）配列番号６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPSMF1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（７）配列番号７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のUSP25遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（８）配列番号８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRAB10遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（９）配列番号９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLIN7A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１０）配列番号１０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFN2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１１）配列番号１１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCREB5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１２）配列番号１２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のDSC2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１３）配列番号１３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC432369遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１４）配列番号１４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のANXA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１５）配列番号１５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCENTB2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１６）配列番号１６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFDN5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１７）配列番号１７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のKIAA0241遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１８）配列番号１８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のHINT1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１９）配列番号１９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のAYTL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２０）配列番号２０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のBAZ1A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２１）配列番号２１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPROK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２２）配列番号２２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のTMEM80遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２３）配列番号２３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のC9orf102遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２４）配列番号２４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のSETD6遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２５）配列番号２５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLANCL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２６）配列番号２６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のWNT2B遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２７）配列番号２７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPNPLA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２８）配列番号２８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZNF533遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２９）配列番号２９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZBED4遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３０）配列番号３０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC730966遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
【請求項３】
請求項２に記載の内在性アンチセンスRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含む核酸を含有してなる、大腸癌の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌特異的な発現様式を示す血液中の内在性アンチセンスRNAに関し、また、該アンチセンスRNAを利用した大腸癌診断のための検査方法及び大腸癌の診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
今までの遺伝学におけるセントラルドグマは、DNAからRNAが転写され、それがタンパク質に翻訳されるというものであり、RNAに関しては、タンパク質をコードするゲノムDNAを鋳型に作製されるメッセンジャーRNA（センスRNA）を中心として解析が進められてきた。ところが、近年、ゲノム・トランスクリプトーム解析の結果から、同じ遺伝子座でありながらDNAの両鎖からセンスRNAと反対方向に転写されるアンチセンスRNAが多く存在することが報告された（非特許文献１）。
【０００３】
アンチセンスRNAとは、メッセンジャーRNAに対して相補的な塩基配列を持ったRNAであり、具体的には、センス遺伝子をコードするDNA鎖の逆鎖から読まれるRNAである。センス−アンチセンスRNA間には二本鎖形成能があり、例えば、二本鎖RNAはRNA干渉が働く際に必要であること、及びマイクロRNAと呼ばれる小さなRNAによるタンパク質の翻訳制御に関与すること等が知られている。
【０００４】
マウスでは、約2,500対のセンス−アンチセンス遺伝子が同定されており、それらにはタンパク質をコードしない非翻訳性の遺伝子が多く含まれている（非特許文献２）。そのセンス−アンチセンス遺伝子対の約半数が、翻訳性−非翻訳性の遺伝子対であると考えられている。またヒトでも、約2,600対のセンス−アンチセンスRNAペアが存在することが示唆されている（非特許文献３）。
【０００５】
本発明者らの一人及びその共同研究者らは、このアンチセンスRNAの生理的な役割を解明すべく研究を行ったところ、特定の内在性アンチセンスRNA（特に非翻訳性のアンチセンスRNA）とその対応するセンスRNAとの発現バランスが、癌の組織において特異的に変動することを見出し、これを報告している（特許文献１）。また別のグループからは、一つのアンチセンスRNAがヒトの癌化をエピジェネティックに制御していることが報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
このように、アンチセンスRNAの発現は癌の発生に関与していることが明らかになりつつあり、このアンチセンスRNAの解析が癌の診断等に重要な役割を果たすと考えられている。しかしながら、そのような癌の診断について迅速且つ簡便に行う方法は未だ開発されておらず、特に、その診断において取り扱いやすい試料を対象としたアンチセンスRNA発現の網羅的解析や、その結果に基づく癌の診断法については、具体的な報告は為されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2008-295392号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Rosok O et al., Nat Biotechnol. 22, 104-108. (2004)
【非特許文献２】Kiyosawa H et al., Genome Res. 13, 1324-1334. (2003)
【非特許文献３】Yelin R et al., Nat Biotechnol. 21, 379-386. (2003)
【非特許文献４】Yu W et al., Nature. 451, 202-206. (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の解決しようとする課題は、取扱性に優れたアンチセンスRNA含有試料を用いて迅速且つ簡便に大腸癌を診断する手段、及びその診断に用いられる有用なツールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、既知cDNAの配列から推認されるアンチセンス鎖配列を仮想アンチセンスRNAとして人工的に想定し、該アンチセンス鎖配列（Artificial Antisense Sequence：AFAS）に対してプローブを設計し、該プローブ（AFASプローブ）をcDNA配列（センス鎖配列）に対するプローブとともに搭載したマイクロアレイを構築した。さらに本発明者らは、取扱性に優れたアンチセンスRNA含有試料として癌患者及び健常者より血液を採取し、該血液からRNA含有試料を調製した。
【００１１】
そして本発明者らは、各試料をランダムプライミングによってラベルし、該マイクロアレイを用いて各試料中のアンチセンスRNA及びセンスRNAの発現を網羅的に解析した結果、特定のアンチセンスRNAが大腸癌特異的な発現様式を有していることを見出した。それから本発明者らはさらに検討を重ねた結果、上記特定のアンチセンスRNAが大腸癌の診断に有用であることを実証し、本願発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］哺乳動物から採取した血液中の、以下の（１）〜（３０）から選択される内在性アンチセンスRNAを測定することを含む、大腸癌診断のための検査方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のMAPK14遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２）配列番号２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRNF175遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３）配列番号３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のB4GALT5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（４）配列番号４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLRRK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（５）配列番号５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC731208遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（６）配列番号６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPSMF1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（７）配列番号７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のUSP25遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（８）配列番号８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRAB10遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（９）配列番号９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLIN7A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１０）配列番号１０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFN2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１１）配列番号１１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCREB5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１２）配列番号１２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のDSC2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１３）配列番号１３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC432369遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１４）配列番号１４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のANXA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１５）配列番号１５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCENTB2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１６）配列番号１６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFDN5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１７）配列番号１７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のKIAA0241遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１８）配列番号１８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のHINT1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１９）配列番号１９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のAYTL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２０）配列番号２０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のBAZ1A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２１）配列番号２１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPROK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２２）配列番号２２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のTMEM80遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２３）配列番号２３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のC9orf102遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２４）配列番号２４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のSETD6遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２５）配列番号２５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLANCL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２６）配列番号２６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のWNT2B遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２７）配列番号２７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPNPLA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２８）配列番号２８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZNF533遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２９）配列番号２９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZBED4遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３０）配列番号３０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC730966遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
［２］以下の（１）〜（３０）から選択される内在性アンチセンスRNA。
（１）配列番号１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のMAPK14遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２）配列番号２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRNF175遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３）配列番号３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のB4GALT5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（４）配列番号４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLRRK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（５）配列番号５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC731208遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（６）配列番号６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPSMF1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（７）配列番号７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のUSP25遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（８）配列番号８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRAB10遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（９）配列番号９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLIN7A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１０）配列番号１０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFN2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１１）配列番号１１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCREB5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１２）配列番号１２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のDSC2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１３）配列番号１３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC432369遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１４）配列番号１４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のANXA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１５）配列番号１５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCENTB2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１６）配列番号１６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFDN5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１７）配列番号１７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のKIAA0241遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１８）配列番号１８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のHINT1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１９）配列番号１９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のAYTL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２０）配列番号２０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のBAZ1A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２１）配列番号２１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPROK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２２）配列番号２２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のTMEM80遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２３）配列番号２３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のC9orf102遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２４）配列番号２４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のSETD6遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２５）配列番号２５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLANCL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２６）配列番号２６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のWNT2B遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２７）配列番号２７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPNPLA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２８）配列番号２８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZNF533遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２９）配列番号２９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZBED4遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３０）配列番号３０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC730966遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
［３］［２］に記載の内在性アンチセンスRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含む核酸を含有してなる、大腸癌の診断薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の内在性アンチセンスRNAは大腸癌患者において癌特異的な発現様式を有するので、該アンチセンスの発現量を測定することにより大腸癌を効率よく診断することができる。また、本発明ではRNA含有試料として哺乳動物より採取される血液を採用しており、大腸癌の診断における取扱性が優れていることから、迅速且つ簡便な大腸癌の診断を行うことができ、臨床現場においても有用な大腸癌の検査方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】健常人及び大腸癌患者より採取した血液試料における、（A）MAPK14、（B）RNF175、（C）B4GALT5、（D）LRRK2、（E）LOC731208、（F）PSMF1、（G）USP25、（H）RAB10の遺伝子に対する内在性アンチセンスRNAの発現量を示す図である。それぞれ、グラフの縦軸はRNA発現量を表している。
【図２】健常人及び大腸癌患者より採取した血液試料における、（A）LIN7A、（B）PFN2、（C）CREB5、（D）DSC2、（E）LOC432369、（F）ANXA3、（G）CENTB2、（H）PFDN5の遺伝子に対する内在性アンチセンスRNAの発現量を示す図である。それぞれ、グラフの縦軸はRNA発現量を表している。
【図３】健常人及び大腸癌患者より採取した血液試料における、（A）KIAA0241、（B）HINT1、（C）AYTL1、（D）BAZ1A、（E）PROK2、（F）TMEM80、（G）C9orf102、（H）SETD6の遺伝子に対する内在性アンチセンスRNAの発現量を示す図である。それぞれ、グラフの縦軸はRNA発現量を表している。
【図４】健常人及び大腸癌患者より採取した血液試料における、（A）LANCL1、（B）WNT2B、（C）PNPLA3、（D）ZNF533、（E）ZBED4、（F）LOC730966の遺伝子に対する内在性アンチセンスRNAの発現量を示す図である。それぞれ、グラフの縦軸はRNA発現量を表している。
【図５】健常人と大腸癌患者との間で統計学的有意差（p<0.001、Fold change>2.0）が見られた12個のセンスRNAについてのクラスタリング解析の結果を示す図である。
【図６】健常人と大腸癌患者との間で統計学的有意差（p<0.001、Fold change>2.0）が見られた30個のアンチセンスRNAについてのクラスタリング解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の大腸癌診断に用いられる内在性アンチセンスRNAは、下記（１）〜（３０）から選ばれるいずれかである。
（１）配列番号１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のMAPK14遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２）配列番号２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRNF175遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３）配列番号３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のB4GALT5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（４）配列番号４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLRRK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（５）配列番号５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC731208遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（６）配列番号６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPSMF1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（７）配列番号７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のUSP25遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（８）配列番号８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のRAB10遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（９）配列番号９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLIN7A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１０）配列番号１０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFN2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１１）配列番号１１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCREB5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１２）配列番号１２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のDSC2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１３）配列番号１３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC432369遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１４）配列番号１４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のANXA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１５）配列番号１５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のCENTB2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１６）配列番号１６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPFDN5遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１７）配列番号１７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のKIAA0241遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１８）配列番号１８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のHINT1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（１９）配列番号１９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のAYTL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２０）配列番号２０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のBAZ1A遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２１）配列番号２１に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPROK2遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２２）配列番号２２に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のTMEM80遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２３）配列番号２３に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のC9orf102遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２４）配列番号２４に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のSETD6遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２５）配列番号２５に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLANCL1遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２６）配列番号２６に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のWNT2B遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２７）配列番号２７に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のPNPLA3遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２８）配列番号２８に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZNF533遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（２９）配列番号２９に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のZBED4遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
（３０）配列番号３０に示される塩基配列と同一若しくは実質的に同一の塩基配列を含む、哺乳動物のLOC730966遺伝子に対する内在性アンチセンスRNA
【００１６】
本発明の大腸癌診断においては、上記内在性アンチセンスRNAは1種のみを単独で用いても良く、あるいは2種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。2種以上を組み合わせて用いた場合であれば、診断又は検査における疑陽性又は疑陰性の程度を抑えることが可能となり、大腸癌の診断を精度良く行うことができる。
【００１７】
本発明の内在性アンチセンスRNAにより大腸癌の診断が可能な動物は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター等）であれば特に制限はないが、好ましくはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ等であり、より好ましくはヒト又はマウスである。
【００１８】
配列番号１に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_001315として登録されているヒトMAPK14（mitogen-activated protein kinase 14）遺伝子のcDNA配列の691〜750番目の塩基配列のアンチセンス鎖配列である。後記実施例に示される通り、本発明のヒトアンチセンスMAPK14（MAPK14遺伝子に対するアンチセンスRNA；以下、他の遺伝子に対するアンチセンスRNAについても同様の略称を用いる場合がある）は、配列番号１に示される塩基配列に相補的な60merの塩基配列とハイブリダイズし得るものである。従って、該ヒトアンチセンスMAPK14は配列番号１に示される塩基配列の全部若しくは一部を少なくとも含む塩基配列を有するRNAである。
【００１９】
同様に、配列番号２に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_173662として登録されているヒトRNF175（ring finger protein 175）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号３に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_004776として登録されているヒトB4GALT5（UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- galactosyltransferase, polypeptide 5）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号４に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_198578として登録されているヒトLRRK2（leucine-rich repeat kinase 2）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号５に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. XM_001132091として登録されているヒトLOC731208遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号６に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_006814として登録されているヒトPSMF1（proteasome (prosome, macropain) inhibitor subunit 1）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号７に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_013396として登録されているヒトUSP25（ubiquitin specific peptidase 25）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号８に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_016131として登録されているヒトRAB10遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号９に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_004664として登録されているヒトLIN7A（lin-7 homolog A）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１０に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_002628として登録されているヒトPFN2（profilin 2）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１１に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_004904として登録されているヒトCREB5（cAMP responsive element binding protein 5）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１２に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_024422として登録されているヒトDSC2（desmocollin 2）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１３に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NR_002162として登録されているヒトLOC432369遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１４に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_005139として登録されているヒトANXA3（annexin A3）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１５に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_012287として登録されているヒトCENTB2（centaurin, beta 2）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１６に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_145897として登録されているヒトPFDN5（prefoldin subunit 5）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１７に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_015060として登録されているヒトKIAA0241遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１８に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_005340として登録されているヒトHINT1（histidine triad nucleotide binding protein 1）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号１９に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_017839として登録されているヒトAYTL1（acyltransferase like 1）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２０に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_182648として登録されているヒトBAZ1A（bromodomain adjacent to zinc finger domain, 1A）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２１に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_021935として登録されているヒトPROK2（prokineticin 2）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２２に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. XM_001129808として登録されているヒトTMEM80（transmembrane protein 80）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２３に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_020207として登録されているヒトC9orf102（chromosome 9 open reading frame 102）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２４に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_024860として登録されているヒトSETD6（SET domain containing 6）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２５に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_006055として登録されているヒトLANCL1（LanC lantibiotic synthetase component C-like 1）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２６に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_024494として登録されているヒトWNT2B（wingless-type MMTV integration site family, member 2B）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２７に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_025225として登録されているヒトPNPLA3（patatin-like phospholipase domain containing 3）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２８に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_152520として登録されているヒトZNF533（zinc finger protein 533）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号２９に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. NM_014838として登録されているヒトZBED4（zinc finger, BED-type containing 4）遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
配列番号３０に示される塩基配列は、GenBankデータベースにAccession No. XM_001127909として登録されているヒトLOC730966遺伝子のcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の一部である。
【００２０】
本発明のアンチセンスRNAは、各配列番号に示される塩基配列に相補的な60merの塩基配列とハイブリダイズし得るものである。従って、該アンチセンスRNAは各配列番号に示される塩基配列の全部若しくは一部を少なくとも含む塩基配列を有するRNAである。
【００２１】
「配列番号ｎ（ｎ＝１〜３０；以下同様）に示される塩基配列と実質的に同一な塩基配列」とは、配列番号ｎに示される塩基配列のフラグメントであるか、あるいはヒト以外の哺乳動物における各遺伝子オルソログのcDNA配列に対するアンチセンス鎖配列の、配列番号ｎに対応する領域の塩基配列、あるいはそれらの天然のアレル変異体若しくは多型を意味する。
【００２２】
本発明のアンチセンスRNAは、それらとハイブリダイズし得る塩基配列を含む核酸をプローブ若しくはプライマーとして用いて、自体公知のRNA検出法により検出することができる。従って、該アンチセンスRNAは大腸癌の診断又は検出用マーカーとして用いることができ、本発明はまた、このような該アンチセンスRNAとハイブリダイズし得る塩基配列を含む核酸を含有してなる大腸癌の診断薬を提供する。
【００２３】
本発明のアンチセンスRNAの検出用核酸は、通常の遺伝子発現解析において使用され得るハイブリダイゼーション条件の下で、標的アンチセンスRNA配列とハイブリダイズし得る塩基配列を含む核酸であれば、特に制限されない。好ましくは、該プローブは、標的アンチセンスRNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含む核酸である。「ストリンジェントな条件」とは、目的とする核酸配列に対して完全相補的な塩基配列と95%以上、好ましくは96%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列のみがハイブリダイズし得る条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダイゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００２４】
本発明のアンチセンスRNAの検出用核酸としては、検出対象であるアンチセンスRNAと特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブや、該アンチセンスRNAの一部若しくは全部を増幅するプライマーとして機能し得る一対のオリゴヌクレオチド（プライマー）等が挙げられる。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。
【００２５】
プローブとして用いられる核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNA又はDNA:RNAのハイブリッドでもよい。該核酸の長さは標的アンチセンスRNAと特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約30塩基以上である。該核酸は、標的核酸の検出又は定量を可能とするために、標識剤により標識されていることが好ましい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔32P〕、〔3H〕、〔14C〕等が用いられる。酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が用いられる。さらに、プローブと標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジンを用いることもできる。一方、プローブとなる核酸を固相上に固定化する場合には、試料中の核酸を上記と同様の標識剤を用いて標識することができる。
【００２６】
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのセットとしては、配列番号ｎに示される塩基配列を含むアンチセンスRNAから、自体公知の方法を用いて合成される二本鎖DNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖とそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができ、それらに挟まれるDNA断片を増幅し得るものであれば特に制限はなく、例えば、各々約15〜約100塩基、好ましくは各々約15〜約50塩基の長さを有し、約100bp〜数kbpのDNA断片を増幅するようにデザインされたオリゴDNAのセットが挙げられる。
【００２７】
本発明のアンチセンスRNAを検出し得るプローブとして機能する核酸は、該アンチセンスRNAの一部若しくは全部を増幅し得るプライマーセットを用い、哺乳動物の任意の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくはガン細胞等）若しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織（例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、血液（例、末梢血、臍帯血等）、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋等）由来の全RNAを鋳型として、RT-PCR法を用いて所望の長さの核酸を増幅することにより取得することができる。あるいは、該核酸は、本発明のアンチセンスRNAに対応するセンスRNA（cDNA）の各塩基配列情報（例えば、ヒトMAPK14の場合、GenBankデータベースにそれぞれAccession No. NM_001315として登録されている）に基づいて、該塩基配列及び／又はその相補鎖配列の一部若しくは全部を市販のDNA/RNA自動合成機等を用いて化学的に合成することによっても得ることができる。また、シリコンやガラス等の固相上で該核酸を直接in situ（on chip）合成することにより、該核酸が固相化されたチップ（アレイ）を作製することもできる。
【００２８】
これらの核酸は、乾燥した状態若しくはアルコール沈澱の状態で、固体として提供することもできるし、水若しくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で提供することもできる。標識プローブとして用いられる場合、該核酸は予め上記のいずれかの標識物質で標識した状態で提供することもできるし、標識物質とそれぞれ別個に提供され、用時標識して用いることもできる。あるいは、該核酸は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチン等の官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例、アルデヒド基、アミノ基、SH基、ストレプトアビジン等）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用して核酸を固定化する等の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
核酸プローブが固相に固定化された状態で提供される好ましい一例として、DNAマイクロアレイが挙げられる。DNAマイクロアレイの作製法としては、フォトリソグラフィー法を用いて核酸プローブを基板（ガラス、シリコン等）上で1ヌクレオチドずつ合成するAffymetrix方式と、マイクロスポッティング法、インクジェット法、バブルジェット（登録商標）法等を用いて、予め調製された核酸プローブを基板上にスポッティングするStanford方式とが挙げられるが、30mer以上のプローブを用いる場合にはStanford方式、あるいは両者を組み合わせた手法を用いるのが好ましい。
【００２９】
本発明はまた、本発明のアンチセンスRNAを検出し得る核酸を用いて、被験哺乳動物から採取したRNA含有試料中の該アンチセンスRNA量を測定することを含む、大腸癌診断のための検査方法を提供する。
【００３０】
被験哺乳動物から採取されるRNA含有試料としては血液が採用される。血液であれば特に制限されないが、迅速且つ簡便に採取することができ、採取する動物への侵襲が少ない等の点から、好ましくは末梢血が採用される。末梢血の採取方法としては、特に制限はなく、常法により採取することができ、例えば、静脈採血や動脈採血が挙げられる。また、末梢血が採取される部位としても、特に制限はなく、体のどの部位から採取された末梢血であっても好適に利用できる。その他、本発明におけるRNA含有試料には、血漿、血清、又は血液を構成する細胞等も含まれ、該細胞としては、例えば、赤血球、白血球、血小板等が挙げられる。また、該白血球には、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球等が含まれる。
【００３１】
被験哺乳動物から採取した血液試料におけるアンチセンスRNAの発現は、該試料から全RNA画分を調製し、該画分中に含まれる該アンチセンスRNAを検出することにより調べることができる。RNA画分の調製は、グアニジン−CsCl超遠心法、AGPC法等公知の手法を用いて行うことができるが、市販のRNA抽出用キット（例：RNeasy Mini Kit、PAXgene Blood RNA Kit；QIAGEN社製等）を用いて、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全RNAを調製することができる。RNA画分中の遺伝子転写産物を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、DNAチップ（マイクロアレイ）解析等）を用いる方法、あるいはPCR（RT-PCR、競合RT-PCR、リアルタイムRT-PCR等）を用いる方法等が挙げられる。
【００３２】
ノーザンブロット又はドットブロットハイブリダイゼーションによる場合、アンチセンスRNA発現の検出は、標識プローブとして用いられる核酸を含有する上記本発明の診断用試薬を用いて行うことができる。すなわち、ノーザンハイブリダイゼーションによる場合は、上記のようにして調製したRNA画分をゲル電気泳動にて分離した後、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等のメンブレンに転写し、本発明の試薬を含むハイブリダイゼーション緩衝液中、好ましくは上記「ストリンジェントな条件下で」ハイブリダイゼーションさせた後、適当な方法でメンブレンに結合した標識量をバンド毎に測定することにより、各遺伝子の発現量を測定することができる。ドットブロットの場合も、RNA画分をスポットしたメンブレンを同様にハイブリダイゼーション反応に付し（各アンチセンスRNAについてそれぞれ行う）、スポットの標識量を測定することにより、各アンチセンスRNAの発現量を測定することができる。
【００３３】
DNAチップ（マイクロアレイ）解析による場合、例えば、上記のようにして調製したRNA画分から、逆転写反応によりT7プロモーター等の適当なプロモーターを導入したcDNAを合成し、さらにRNAポリメラーゼを用いてcRNAを合成する（この時ビオチン等で標識したモノヌクレオチドを基質として用いることにより、標識されたcRNAが得られる）。この標識cRNAを上記固相化プローブと接触させてハイブリダイゼーション反応させ、固相上の各プローブに結合した標識量を測定することにより、各アンチセンスRNAの発現量を測定することができる。複数のマーカー遺伝子の発現変動を一括検出することができ、検出方法の選択によって定量性も向上させ得る等の点では、DNAチップ（マイクロアレイ）解析が好ましい。
【００３４】
微量RNA試料を用いて本発明のアンチセンスRNAの発現を定量的に解析する場合は、競合RT-PCR又はリアルタイムRT-PCRを用いることが好ましい。競合RT-PCRとは、目的のDNAを増幅し得るプライマーのセットにより増幅され得る既知量の他の鋳型核酸をcompetitorとして反応液中に共存させて競合的に増幅反応を起こさせ、増幅産物の量を比較することにより、目的DNAの量を算出する方法をいう。従って、競合RT-PCRを用いる場合、本発明の試薬は、上記プライマーセットに加えて、該プライマーセットにより増幅され、目的DNAと区別することができる増幅産物（例えば、目的のDNAとはサイズの異なる増幅産物、制限酵素処理により異なる泳動パターンを示す増幅産物等）を生じる核酸をさらに含有することができる。このcompetitor核酸はDNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合、RNA試料から逆転写反応によりcDNAを合成した後にcompetitorを添加してPCRを行えばよく、RNAの場合は、RNA試料に最初から添加してRT-PCRを行うことができる。後者の場合、逆転写反応の効率も考慮に入れているので、元のmRNAの絶対量を推定することができる。
一方、リアルタイムRT-PCRは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要であり、より迅速に本発明のアンチセンスRNAの発現を解析可能である。通常、モニタリングは種々の蛍光試薬を用いて行われる。これらの中には、SYBR Green I、エチジウムブロマイド等の二本鎖DNAに結合することにより蛍光を発する試薬（インターカレーター）の他、上記プローブとして用いることができる核酸（但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする）の両端をそれぞれ蛍光物質（例：FAM、HEX、TET、FITC等）及び消光物質（例：TAMRA、DABCYL等）で修飾したもの等が含まれる。
【００３５】
本発明の方法において、被験哺乳動物が大腸癌を発症している（若しくは将来発症する可能性が高い）か否かの判定は、例えば、健常な対照哺乳動物から採取したRNA含有試料中の本発明のアンチセンスRNAの発現量を同様にして測定し、被験動物と対照動物との間で該アンチセンスRNAの発現を比較することにより行うことができる。その結果、被験動物と対照動物との間で該アンチセンスRNAの発現が有意に変動（増加又は減少）していた場合に、該被験動物は大腸癌を発症している（若しくは将来発症する可能性が高い）と判定することができる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００３７】
［実施例１］マイクロアレイの作製
ヒト遺伝子の転写配列について、全ての遺伝子からプロープ用のポリヌクレオチド（120mer）を得る作業を行った。また、transcript variantが存在する遺伝子については、該variantを識別できるような設計とした。さらに、転写の可能性のない領域に対しても、相互に相同性を持たないようにプロ−ブ領域を設定した。このようにして選んだポリヌクレオチド（120mer）の中から、アレイ用のプロ−ブとして60merのポリヌクレオチドを選び、センスプローブとした。アンチセンスプローブには、センスプローブと相補な配列を用いた。そして、各種プローブをアジレント社のシステムを利用してマイクロアレイ上に搭載し、マイクロアレイチップを作製した。
【００３８】
［実施例２］RNAの抽出及びRIN（RNA Integrity Number）の測定
手術前の大腸癌患者17名及び健常人6名を被験者対象とし、各被験者から同意を得た後、抹消血液を5mLずつ採取した。採取した血液から、QIAGEN社製RNA抽出キット（PAXgene Blood RNA Kit及びPAXgene Blood RNA Tubes）を使用して、製品説明書に記載のプロトコールに従い、全血中のTotal RNAを抽出した。抽出したRNAについて、血液採取時からのRNA分解等の劣化が生じていないかどうかを確認するため、Agilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies社製）を用いてRINを測定した。なお、RINの測定は機器に指定されたプロトコールに従って行った。
【００３９】
その結果、全ての被検試料（RNA含有試料）がRINとして6.70〜9.20の範囲内の数値を示していた。これにより、全ての被検試料についてRNAの分解はほとんど発生しておらず、RNAの品質は高い状態で保持されていることがわかり、マイクロアレイへの実験に十分使用できるものであることが確認できた。
【００４０】
［実施例３］RNA含有試料の発現解析
実施例２により抽出したTotal RNAを5μg用いて、Cy3蛍光色素にて標識されたターゲットcDNAを作製した。該ターゲットcDNAは、LabelStar Array kit（QIAGEN社製）及びCy3蛍光色素（GE Healthcare社製）を使用し、製品説明書に記載のプロトコールに従って作製した。得られたターゲットcDNAを、実施例１で作製したマイクロアレイチップにハイブリダイズさせ、Agilent DNAマイクロアレイスキャナ（Agilent Technologies社製）を用いて蛍光強度を測定した。ハイブリダイゼーション及び洗浄並びに蛍光強度の測定は、Agilent Technologies社の推奨するプロトコールに従って行った。各種測定値について、Feature Extractionソフトウェア（Agilent Technologies社製）によりデータの補正を行い、シグナル値（processed signal）を算出した。
【００４１】
以上のデータに基づき、被検試料におけるセンスRNA及びアンチセンスRNAの発現量を調べ、大腸癌患者と健常人との間で比較を行い、統計学的に有意な差が見られたRNAを同定した。その結果、統計学的有意差の条件をp<0.05（T-test）及びFold change>2.0とした場合には、121個のセンスRNA及び197個のアンチセンスRNAが同定された。そのうち、大腸癌患者の方が健常人よりも多い発現量を示したものは、センスRNAについては57個であり、アンチセンスRNAについては162個であった。大腸癌患者と健常人との間の比較においてさらに精度を高めるべく、統計学的有意差の条件をp<0.01（T-test）及びFold change>2.0としたところ、68個のセンスRNA及び128個のアンチセンスRNAが同定された。これらのうち、大腸癌患者の方が健常人よりも多い発現量を示したものは、センスRNAは27個であり、アンチセンスRNAは111個であった。これよりもさらに精度を高めるために、統計学的有意差の条件をp<0.001（T-test）及びFold change>2.0としたところ、12個のセンスRNA及び30個のアンチセンスRNAが同定された。同様に、大腸癌患者の方が健常人よりも多い発現量を示したRNAを調べると、センスRNAは7個であり、アンチセンスRNAは24個であった。
【００４２】
［実施例４］クラスタリング解析
実施例３により最も精度が高い条件で同定された12個のセンスRNA及び30個のアンチセンスRNAについて、それぞれGene Spring GX10ソフトウェア（Agilent Technologies社製）を用いてクラスタリング解析を行った。その結果、図５に示されたとおり、12個のセンスRNAについては、色分布による識別から大腸癌患者と健常人との間でクラスター分類をすることができなかった。これに対して、30個のアンチセンスRNAについては、図６に示されたように色分布が明確になっており、クラスター分類をすることができた。以上の結果から、血液中におけるこれら30個のアンチセンスRNAは大腸癌の診断又は検査に利用することができ、新規の大腸癌診断法のバイオマーカーとなる可能性があると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、健常者と比較して大腸癌患者に有意に発現量が相違する内在性アンチセンスRNAを提供することができる。これにより、診断又は検査において有用な大腸癌マーカーを提供することが可能となる。また、本発明では、診断又は検査において取り扱いやすい血液をRNA含有試料として採用することから、臨床現場における実用的な大腸癌の診断又は検査方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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