(57)【要約】【課題】実用化に結びつく、テヌイウイルス属のウイルスに対して抵抗性植物の作出方法および抵抗性型品種を提供すること。【解決手段】本発明は、テヌイウイルス属のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、テヌイウイルス属のウイルス病に抵抗性を付与するための組成物、ならびに、テヌイウイルス属のウイルス病に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属のウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法であって、Ａ）テヌイウイルス属のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を提供する工程；Ｂ）該発現抑制剤を該植物の細胞に導入する工程；Ｃ）該発現抑制剤が導入された植物の細胞を選択する工程；およびＤ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；を包含する、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
テヌイウイルス属に属するウイルスのゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する抵抗性を付与するための組成物。
【請求項２】
前記組成物は、ほぼ１００％抵抗性集団を与える、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、少なくとも約７０％完全抵抗性集団を与える、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、ほぼ「１００％完全抵抗性集団」を与える、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの遺伝子は、ＲＳＶ−ｐＣ１（配列番号１）、ＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ１（配列番号１５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ５（配列番号１７）およびＲＧＳＶ−ｐＣ６（配列番号１９）これらに対応する遺伝子ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの遺伝子は、ＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、これらに対応する遺伝子ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの遺伝子はＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、これらに対応する遺伝子ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記テヌイウイルスに属するウイルスは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）またはイネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ＲＳＶ−ｐＣ１（配列番号１）、ＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ１（配列番号１５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ５（配列番号１７）、ＲＧＳＶ−ｐＣ６（配列番号１９）これらに対応する遺伝子、およびこれらに対応する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される核酸配列の全部または一部と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および該アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む、発現カセット。
【請求項１６】
前記核酸配列はＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、これらに対応する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項１７】
前記核酸配列はＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、これらに対応する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体である、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項１８】
前記アンチセンス配列は、配列番号３のアンチセンス配列、ならびに配列番号５のいずれか１つに示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体のアンチセンス配列からなる群より選択され、前記トリミング配列は、配列番号９６である、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項１９】
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項２０】
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項２１】
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項２２】
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項２３】
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項２４】
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、請求項１５に記載の発現カセット。
【請求項２５】
請求項１５に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む、植物細胞。
【請求項２７】
請求項２５に記載のベクターを含む、植物体。
【請求項２８】
請求項２５に記載のベクターを含む、種子。
【請求項２９】
テヌイウイルス属に属するウイルスに対する完全抵抗性を示す、請求項２７に記載の植物体。
【請求項３０】
前記テヌイウイルスに属するウイルスは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）またはイネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）である、請求項２９に記載の植物体。
【請求項３１】
テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属に属するウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法であって、
Ａ）請求項２５に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；
を包含する、方法。
【請求項３２】
テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属に属するウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法であって、
Ａ）請求項２５に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程；
を包含する、方法。
【請求項３３】
テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属に属するウイルスに感染し得る植物を再生産する方法であって、
Ａ）請求項２５に記載のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）該種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）該植物体から、種子を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記テヌイウイルスに属するウイルスは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）またはイネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テヌイウイルス属のウイルスに対して抵抗性植物を作出する方法に関する。より具体的には、テヌイウイルス属のウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質、移行タンパク質および複製酵素の遺伝子をコードする核酸分子を用いた、テヌイウイルス属のウイルスに対して抵抗性植物を作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、植物ウイルス病の防除には抵抗性品種の利用が最も有効な方法のひとつであるが、抵抗性遺伝子源には限りがあり、また、特定の遺伝子を長期間使用するとそれを侵すウイルス系統の出現によって導入遺伝子の有効性がやがて失われ、結果的にその抵抗性が崩壊してしまうというケースがしばしば起こる。
【０００３】
テヌイウイルス属のウイルスには、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）、イネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）などの重要ウイルスが分類され、イネのウイルスは、アジア及び南米地域の米の生産に多大な被害を及ぼし、脅威となっている。
【０００４】
このような状況の突破口として、植物自身が生来有するＲＮＡ干渉能に関する知見の集積とその応用を可能にした遺伝子工学技術を駆使して、しばしば大発生して食料安定供給を脅かすテヌイウイルス属のウイルスに対して強力な抵抗性を発揮する品種の開発が望まれている。
【０００５】
テヌイウイルス病の防除には、農薬の使用等によるウイルス媒介昆虫の駆除に依存する化学的防除法により実施されてきた。
【０００６】
また、イネ縞葉枯ウイルスでは、抵抗性遺伝子源を利用した交雑育種法によって抵抗性品種の開発が行われてきた。
【０００７】
テヌイウイルス属のウイルス病が一旦大発生すると、数年間その発生が終焉しないことがあり、ウイルス媒介昆虫の駆除に大量の農薬を使用しなければならず、生産コストの上昇や環境汚染の対策を余儀なくされる。
【０００８】
イネ縞葉枯ウイルスの場合、有効な抵抗性遺伝子源として１種の抵抗性遺伝子が知られているが、交雑育種法により本遺伝子を導入する際、他の優良形質に変化を与えないために戻し交雑を繰り返す必要があり、固定系統を得るまでには多大な労力と長期間の時間を要する。しかしながら、本抵抗性遺伝子を導入したイネは本ウイルスに対して感染率が低下する程度の抵抗性である。
【０００９】
一方、イネ縞葉枯ウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質を過剰発現させる遺伝子組み換えイネが報告されているが、本ウイルスに対して十分な抵抗性を示さないので、実用化の目途は立っていない。
【００１０】
遺伝子組換えウイルス病抵抗性植物の作出について、抵抗性特性の強弱は別にして、多くのウイルス種で外被タンパク質（テヌイウイルスではヌクレオキャプシドタンパク質に相当）遺伝子を導入する方法が報告されており、実際に、パパイアリングスポットウイルス抵抗性パパイアでは実用化に至っている。従来、ウイルス外被タンパク質の過剰発現による抵抗性機構として、ウイルスの脱外被阻害が考えられていたが、現在、その多くは導入遺伝子に対してＲＮＡ干渉が働き、ウイルスの感染初期に起こる外被タンパク質遺伝子の発現が抑制されることにより、ウイルス増殖が阻害されるという考え方が一般的である。
【００１１】
特許文献１では、ウイルス感染初期のウイルス遺伝子を発現抑制すると強度な抵抗性を示すということを示したが、このような概念から、近年、外被タンパク質遺伝子に対してＲＮＡ干渉を誘起するようにデザインされた遺伝子組換え植物の作出例が数多く報告されている。しかし、他のタンパク質遺伝子については、完全な抵抗性はできないと思われる。
【００１２】
テヌイウイルスと分類学的な属は異なるが、同様のゲノム構造（ａｍｂｉｓｅｎｓｅ）をもつトマト黄化えそウイルスにおいて、ヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子（イネ縞葉枯ウイルスではｐＣ３遺伝子に相当）をＲＮＡ干渉で発現抑制することにより「完全に近い抵抗性」が得られたという論文（非特許文献２）が公開されている。
【００１３】
しかし、特許文献１では、バイロプラズマ（ウイルス合成工場）の構成タンパク質遺伝子をＲＮＡ干渉の標的にした場合に完全な抵抗性を示した。今回のテヌイウイルスにおいても同等の機能を発揮するタンパク質が存在するならば、当該遺伝子をＲＮＡ干渉の標的に選ぶことで抵抗性が付与できると考えられるが、現在のところ、テヌイウイルス感染細胞内ではバイロプラズマのような構造物は認められていない。
【００１４】
そこで、イネ縞葉枯ウイルスがコードする全遺伝子について個々の遺伝子をＲＮＡ干渉で発現抑制を試みたところ、ヌクレオキャプシド遺伝子および移行タンパク質遺伝子標的ＲＮＡ干渉イネで完全に抵抗性を示した。本結果は、従来の論文や技術を鑑みても予想を覆すものである。
【００１５】
一方、移行タンパク質遺伝子の導入によるウイルス抵抗性付与に関する報告例は、ウイルス外被タンパク質遺伝子を導入する方法と比較して発明者の知るところではない状況である。なぜなら、植物ウイルスの移行タンパク質は、ウイルス感染後期の細胞内で増殖したウイルスを隣の細胞に輸送する際に重要な働きをするからである。移行タンパク質遺伝子を丸ごと植物に導入して過剰発現させた場合、ウイルス感染が促進されるという報告がある（非特許文献３）。また、変異を施した移行タンパク質遺伝子を植物で発現させて、変異型移行タンパク質が細胞内因子と相互作用してあらかじめブロックすることにより、後から侵入してきたウイルスの移行タンパク質と競合させ、ウイルス細胞間移行の阻害を試みた報告があるが、それらの抵抗性は感染が遅延する程度で実用に供するレベルではない（非特許文献１，３）。
【００１６】
ＲＮＡ干渉を用いたウイルス抵抗性植物を開発する際、従来の植物ウイルス研究の蓄積を鑑みると、移行タンパク質遺伝子を標的にしても完全な抵抗性植物は得られないと考えるのが一般的である。なぜなら、ＲＮＡ干渉はあくまで遺伝子発現を抑制する機構であるので、移行タンパク質遺伝子を標的にしても細胞内で爆発的に増殖したウイルスの移行は阻害しきれないと考えるのが自然であるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０２０２３７号パンフレット
【特許文献２】特開平７−３１３１７３号公報
【特許文献３】特開２００７−８９４０２号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Beck  DL，Van  Dolleweerd  CJ，Lough  TJ，Balmori  E，Voot  DM，Andersen  MT，O'Brien  IE，Forster  RL．(1994)．Disruption  of  virus  movement  confers  broad-spectrum  resistance  against  systemic  infection  by  plant  viruses  with  a  triple  gene  block．Proc．Natl．Acad．Sci．USA．91：10310-10314.
【非特許文献２】Bucher  E，Lohuis  D，van  Poppel  PM，Geerts-Dimitriadou  C，Goldbach  R，Prins  M．(2006)．Multiple  virus  resistance  at  a  high  frequency  using  a  single  transgene  construct．J．Gen．Virol．87：3697-3701.
【非特許文献３】Cooper  B，Lapidot  M，Heick  JA，Dodds  JA，Beachy  RN．(1995)．A  defective  movement  protein  of  TMV  in  transgenic  plants  confers  resistance  to  multiple  viruses  whereas  the  functional  analog  increases  susceptibility．Virology  206：307-13.
【非特許文献４】Hou  YM，Sanders  R，Ursin  VM，Gilbertson  RL．(2000)．Transgenic  plants  expressing  geminivirus  movement  proteins：abnormal  phenotypes  and  delayed  infection  by  Tomato  mottle  virus  in  transgenic  tomatoes  expressing  the  Bean  dwarf  mosaic  virus  BV1  or  BC1  proteins．Mol．Plant  Microbe  Interact．13：297-308.
【非特許文献５】Prins  M，Laimer  M，Noris  E，Schubert  J，Wassenegger  M，Tepfer  M．(2008)．Strategies  for  antiviral  resistance  in  transgenic  plants．Mol．Plant  Pathol．9：73-83．
【非特許文献６】Baulcombe  DC．(1996)．Mechanisms  of  Pathogen-Derived  Resistance  to  Viruses  in  Transgenic  Plants．Plant  Cell  8：1833-1844．Review．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
実用化に結びつく、テヌイウイルス属のウイルスに対して抵抗性植物の作出方法および抵抗性型品種を得ることが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題は、本発明者らが鋭意研究した結果、テヌイウイルス属に属するウイルスのゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する抵抗性を付与するための組成物が、予想外に、完全な抵抗性を付与することを見出したことにより解決した。
【００２１】
一般に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）では遺伝子の発現を完全に抑制することができないという共通認識が存在する（ＲＮＡｉ実験なるほどＱ  ＆  Ａ，羊土社，ｐｐ．４）。
【００２２】
実際に、他のウイルス種において移行タンパク質遺伝子をＲＮＡｉの標的とした報告例が皆無である理由として、単純に十分な抵抗性が付与できていないため、あるいは、移行タンパク質遺伝子は感染後期に働くため、ＲＮＡｉの標的対象として考慮されていないものと推測される。この推測をサポートする情報として、感染後期に機能すると考えられているＰｎｓ４を標的としたイネでは完全な抵抗性は示さない（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２００９）７，ｐｐ．２４−３２）。
【００２３】
本発明のＲＳＶ−ｐＣ３（ヌクレオキャプシドタンパク質）遺伝子標的イネの６系統について接種試験を行ったところ、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）に対して１００％の抵抗性を示した。
【００２４】
一方、非特許文献２（Ｂｕｃｈｅｒら）のＴａｂｌｅ  １（ＩＲ−ＯＵＴ５、ＩＲ−ＯＵＴ７、ＩＲ−ＯＵＴ９、ＩＲ−ＯＵＴ１０、ＩＲ−ＯＵＴ１３、ＩＲ−ＯＵＴ１５、ＩＲ−ＯＵＴ１７、ＩＲ−ＯＵＴ１９、ＩＲ−ＯＵＴ２０、ＩＲ−ＩＮ６、ＩＲ−ＩＮ７、ＩＲ−ＩＮ１１、ＩＲ−ＩＮ１２、ＩＲ−ＩＮ１３、ＩＲ−ＩＮ１４、ＩＲ−ＩＮ１６、ＩＲ−ＩＮ１８、ＩＲ−ＩＮ２１）では、ヌクレオキャプシドタンパク質遺伝子を標的としても全て１００％の抵抗性は示されていない。これらのうち、ＩＲ−ＯＵＴ１０のような９０％前後の抵抗性を示すような系統は、本発明においては得られていない。
【００２５】
また、Ｈａｙａｋａｗａら（ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．９８６５−９８６９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９２）は、ＲＳＶのｐＣ３タンパク質を過剰発現させたイネにおいて、Ｆｉｇ．３に示されるように１００％の抵抗性を示さなかった。すなわち、ＫＶＩＩ５０７１では２３．５％（４個体／１７個体中）が、ＫＶＩＩ５０７２では４２．８％（６個体／１４個体中）で発病している。
【００２６】
次いで、ＲＳＶ−ｐＣ４（移行タンパク質）遺伝子標的イネ４系統では、１００％の抵抗性が示された。移行タンパク質遺伝子を標的にした研究は、発明者の知るところではこれまでに例がない。なぜなら、ＲＮＡ干渉を用いたウイルス抵抗性植物を開発する際、従来の植物ウイルス研究の蓄積を鑑みると、移行タンパク質遺伝子を標的にしても完全な抵抗性植物は得られないと考えるのが一般的である。そのため、ＲＮＡ干渉はあくまで遺伝子発現を抑制する機構であるので、移行タンパク質遺伝子を標的にしても細胞内で爆発的に増殖したウイルスの移行は阻害しきれないと考えるのが自然であるからである。実際に、移行タンパク質遺伝子を標的とし、ＲＮＡ干渉法でそのタンパク質の発現を抑制することによってウイルス抵抗性遺伝子組換え植物の作出を試みた報告は発明者の知るところではない。当初、テヌイウイルスの移行タンパク質を標的にしても、これほど完全な抵抗性が得られるとは予想されない。
【００２７】
特許文献１では、イネ萎縮ウイルス（ＲＤＶ）のバイロプラズマ（ウイルス合成工場）の構成タンパク質遺伝子をＲＮＡ干渉の標的にした場合に完全な抵抗性を示した。今回のテヌイウイルスにおいても同等の機能を発揮するタンパク質が存在するならば、当該遺伝子をＲＮＡ干渉の標的に選択することで抵抗性が付与できると考えたが、現在のところ、テヌイウイルス感染細胞内ではバイロプラズマのような構造物は認められていない。
【００２８】
そこで、イネ縞葉枯ウイルスがコードする全遺伝子について個々の遺伝子をＲＮＡ干渉で発現抑制を試みたところ、ヌクレオキャプシド遺伝子および移行タンパク質遺伝子標的ＲＮＡ干渉イネで完全に抵抗性を示した。この結果は、従来の論文や技術を鑑みても予想を覆すものであった。
【００２９】
本発明は、ＲＮＡ干渉法を用いて抵抗性を付与するためには、ウイルスの種類によって、おそらくはウイルスの複製様式によって、それぞれ標的遺伝子が異なることを明らかにした点が、きわめて新規性が高いと考えられる。
【００３０】
また、ＲＧＳＶについても、ＲＳＶの有効な標的遺伝子とオーソロガスな関係にある遺伝子を標的とすることで、効果的なウイルス抵抗性が付与できると考えられる。
【００３１】
また本発明は、以下の項目を提供する。
（１）
テヌイウイルス属に属するウイルスのゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する抵抗性を付与するための組成物。
（２）
前記組成物は、ほぼ１００％抵抗性集団を与える、項目１に記載の組成物。
（３）
前記組成物は、少なくとも約７０％完全抵抗性集団を与える、項目１に記載の組成物。
（４）
前記組成物は、ほぼ「１００％完全抵抗性集団」を与える、項目３に記載の組成物。
（５）
前記少なくとも１つの遺伝子は、ＲＳＶ−ｐＣ１（配列番号１）、ＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ１（配列番号１５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ５（配列番号１７）およびＲＧＳＶ−ｐＣ６（配列番号１９）これらに対応する遺伝子ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（６）
前記少なくとも１つの遺伝子は、ＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、これらに対応する遺伝子ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（７）
前記少なくとも１つの遺伝子はＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、これらに対応する遺伝子ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体である、項目１に記載の組成物。
（８）
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１に記載の組成物。
（９）
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１に記載の組成物。
（１０）
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１に記載の組成物。
（１１）
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１に記載の組成物。
（１２）
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１に記載の組成物。
（１３）
前記発現抑制剤は、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１に記載の組成物。
（１４）
前記テヌイウイルスに属するウイルスは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）またはイネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）である、項目１に記載の組成物。
（１５）
ＲＳＶ−ｐＣ１（配列番号１）、ＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ１（配列番号１５）、ＲＧＳＶ−ｐＣ５（配列番号１７）、ＲＧＳＶ−ｐＣ６（配列番号１９）これらに対応する遺伝子、およびこれらに対応する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される核酸配列の全部または一部と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および該アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む、発現カセット。
（１６）
前記核酸配列はＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）、これらに対応する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体からなる群より選択される、項目１５に記載の発現カセット。
（１７）
前記核酸配列はＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、これらに対応する遺伝子、ならびにこれらの遺伝子をコードする核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体である、項目１５に記載の発現カセット。
（１８）
前記アンチセンス配列は、配列番号３のアンチセンス配列、ならびに配列番号５のいずれか１つに示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体のアンチセンス配列からなる群より選択され、前記トリミング配列は、配列番号９６である、項目１５に記載の発現カセット。
（１９）
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号３９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号３９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１５に記載の発現カセット。
（２０）
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４３に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４３に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１５に記載の発現カセット。
（２１）
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号４５に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号４５に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１５に記載の発現カセット。
（２２）
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１５に記載の発現カセット。
（２３）
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号６９に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号６９に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１５に記載の発現カセット。
（２４）
前記発現カセットは、
（ａ）配列番号９７に示される核酸配列からなるユビキチンプロモーター；
（ｂ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
と相補的なアンチセンス配列；
（ｃ）配列番号９６に示される核酸配列からなるトリミング配列；
（ｄ）（ｉ）配列番号７１に示される核酸配列；あるいは
（ｉｉ）配列番号７１に示される核酸配列において１または数個の置換、付加、挿入、および／または欠失を有する改変体、
からなるセンス配列；ならびに
（ｅ）ターミネーター配列、
を含む、項目１５に記載の発現カセット。
（２５）
項目１５に記載の発現カセットを含む、ベクター。
（２６）
項目２５に記載のベクターを含む、植物細胞。
（２７）
項目２５に記載のベクターを含む、植物体。
（２８）
項目２５に記載のベクターを含む、種子。
（２９）
テヌイウイルス属に属するウイルスに対する完全抵抗性を示す、項目２７に記載の植物体。
（３０）
前記テヌイウイルスに属するウイルスは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）またはイネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）である、項目２９に記載の植物体。
（３１）
テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属に属するウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法であって、
Ａ）項目２５に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；および
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；
を包含する、方法。
（３２）
テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属に属するウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法であって、
Ａ）項目２５に記載のベクターを提供する工程；
Ｂ）該ベクターを該植物の細胞に導入する工程；
Ｃ）該ベクターが導入された植物の細胞を選択する工程；
Ｄ）該選択された細胞を再分化させて、トランスジェニック植物を作出する工程；および
Ｅ）該トランスジェニック植物から種子を得る工程；
を包含する、方法。
（３３）
テヌイウイルス属に属するウイルスまたはテヌイウイルス属に属するウイルスが原因となる疾患に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属に属するウイルスに感染し得る植物を再生産する方法であって、
Ａ）項目２５に記載のベクターを含む、種子を提供する工程；
Ｂ）該種子を生長させて、成熟した植物体を得る工程；
Ｃ）該植物体から、種子を得る工程、
を包含する、方法。
（３４）
前記テヌイウイルスに属するウイルスは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）またはイネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）である、項目３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
上記のように、テヌイウイルス属のウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質、移行タンパク質および複製酵素の遺伝子をコードする分節ゲノムを標的とした発現抑制剤を含む組成物により、より無病徴のレベルの高い、すなわち、１００％抵抗性集団（テヌイウイルス属のウイルス感染植物体の個体数総計に対する完全抵抗性イネと発病遅延型イネの合計の割合がほぼ１００％を示す）、好ましくは、少なくとも約７０％完全抵抗性集団（テヌイウイルス属のウイルス感染植物体の個体数総計に対して少なくとも約７０％が完全抵抗性を示す）か、またはより好ましくは、約１００％完全抵抗性集団（テヌイウイルス属のウイルス感染植物体の個体数総計に対してほぼ１００％が完全抵抗性を示す）が提供され、抑制または安定した抵抗性が付与されたテヌイウイルス属のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
【発明の効果】
【００３３】
本発明により、より無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、抑制または安定した抵抗性が付与されたテヌイウイルス属のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、Ａ）イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）によるウイルス病に感染したイネ（右）と健全なイネ（左）の状態、Ｂ）ＲＳＶを伝搬するヒメトビウンカ、および、Ｃ）ＲＳＶの電子顕微鏡写真を示す。ウイルス病に感染したイネでは、葉がよじれて枯れ（ゆうれい症状）、葉に黄白色の条斑が見られる。
【図２】図２は、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）のゲノム構造（Ａ）および各遺伝子を発現抑制するためのＲＮＡｉ誘起ベクターの構築模式図（Ｂ）を示す。
【図３】図３は、Ａ）イネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）によるグラッシースタント病（褐穂黄化病）に感染したイネ（右）と健全なイネ（左）の状態、Ｂ）ＲＧＳＶを伝搬するトビイロウンカ、および、Ｃ）ＲＧＳＶの電子顕微鏡写真を示す。ウイルス病に感染したイネでは、葉が黄化し、草丈が短縮し、葉に褐色の斑点が見られる。
【図４】図４は、イネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）のゲノム構造（Ａ）および各遺伝子を発現抑制するためのＲＮＡｉ誘起ベクターの構築模式図（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、イネ縞葉枯ウイルスの各遺伝子標的ＲＮＡｉイネにおける導入遺伝子由来ｓｉＲＮＡの検出を示す。ＲＮＡｉが誘導されると、２４、２２および２１塩基のＲＮＡ断片が蓄積される。
【図６】図６は、イネ縞葉枯ウイルスの各遺伝子標的ＲＮＡｉイネ後代Ｔ１におけるウイルス病抵抗性を示す。Ａ）接種４０日後のＲＳＶ各遺伝子ノックダウンイネの様子。下線を付したＲＳＶ−ｐＣ3、ＲＳＶ−ｐＣ４およびＲＳＶ−ｐＣ１が有効標的遺伝子であることがわかる。Ｂ）各種組換えイネ系統における発病率。黒は感染状態、白は無病徴を示す。このグラフからも、ＲＳＶ−ｐＣ３、ＲＳＶ−ｐＣ４およびＲＳＶ−ｐＣ１が有効標的遺伝子であることがわかる。
【図７】図７は、ＲＮＡ干渉によるＲＳＶの各遺伝子ノックダウンイネにおける抵抗性の効果的な遺伝子の順に整列した図である。ＲＳＶ−ｐＣ３、ＲＳＶ−ｐＣ４およびＲＳＶ−ｐＣ１が強度抵抗性を示した標的遺伝子であり、ＲＳＶ−ｐ３およびＲＳＶ−ｐ２が中程度抵抗性を示した標的遺伝子であり、そして、ＲＳＶ−ｐ４およびＲＳＶ−ｐＣ２は抵抗性が全く認められなかった標的遺伝子であることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００３６】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００３７】
本明細書において「イネ縞葉枯ウイルス」とは、ＲＳＶともいわれ、テヌイウイルス属に属するウイルスのメンバーである。このウイルスの形状は、幅が８ｎｍで長さが２００〜２４００ｎｍの糸状粒子である。また、このウイルスのゲノムは、４分節の一本鎖ＲＮＡから成り、アガロースゲルにおける電気泳動易動度によってＲＮＡ１からＲＮＡ４とよばれる。ＲＮＡ１はマイナス鎖に１種、ＲＮＡ２〜４はａｍｂｉｓｅｎｓｅでプラス鎖とマイナス鎖にそれぞれ１種、計７種のタンパク質をウイルスゲノムにコードしている。純化ＲＳＶ粒子は、４分節のＲＮＡゲノムとヌクレオキャプシドタンパク質から成るが、これに微量のＲＮＡ複製酵素が付随している。このウイルスは、イネ科の植物に分布している。ＲＳＶには、多くの亜種系統および変種系統が存在することが確認されている。従って、本明細書において使用される場合、用語「ＲＳＶ」は、当然のことながら、この用語がＲＳＶの亜種系統および変種系統も意図していることは、当業者であれば容易に明らかである。代表的な亜種系統および変種系としては、Ｏ株（中央農業総合研究センターにより分離）、Ｔ株（農業環境技術研究所により分離）、ＨＺ株（中国福建農林大学により分離）、ＪＹ株（中国首都師範大学により分離）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＲＳＶのＯ株のｐＣ３の標的配列とＨｚ株のｐＣ３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０８８６５）内の当該領域を比較したところ、３ヌクレオチドの置換が認められた。この程度の置換があるとしても、最低限発現抑制が起こる塩基長、すなわち、２４ヌクレオチド以上実質的に一致した部分塩基配列が他の亜種株もしくは変異株間に存在していれば、ある１種の亜種株に由来する分節ゲノムを含む本発明の発現抑制剤は、別の１種の亜種株においても、その効果を発揮し得る。他方、ＲＳＶのどの株由来の配列を用いたとしても、当業者は本明細書の記載に基づいて他の株に対しても効果を有するsiＲＮＡなどの発現抑制剤を製造することができることが理解される。
【００３８】
代表的な亜種株のゲノムに関する情報は以下のとおりである。
【００３９】
【表１】
2011067115.tif 000002
【００４０】
本明細書において「イネグラッシースタントウイルス」とは、ＲＧＳＶともいわれ、テヌイウイルス属に属するウイルスのメンバーである。このウイルスの形状は、幅が８ｎｍで長さが２００〜２４００ｎｍの糸状粒子である。また、このウイルスのゲノムは、６分節の一本鎖ＲＮＡから成り、アガロースゲルにおける電気泳動易動度によってＲＮＡ１からＲＮＡ６とよばれる。ＲＮＡ１〜６はａｍｂｉｓｅｎｓｅでプラス鎖とマイナス鎖にそれぞれ１種、計１２種のタンパク質をウイルスゲノムにコードしている。純化ＲＧＳＶ粒子は、６分節のＲＮＡゲノムとヌクレオキャプシドタンパク質から成るが、これに微量のＲＮＡ複製酵素が付随している。このウイルスは、イネ科の植物に分布している。ＲＧＳＶには、多くの亜種系統および変種系統が存在することが確認されている。従って、本明細書において使用される場合、用語「ＲＧＳＶ」は、当然のことながら、この用語がＲＳＶの亜種系統および変種系統も意図していることは、当業者であれば容易に明らかである。代表的な亜種系統および変種系としては、Ｏ株（中央農業総合研究センターにより分離）、Ｌｅｇｕｎａ株（農業環境技術研究所により分離）、Ｓｏｕｔｈ  Ｃｏｔａｂａｔｏ株（東京大学により分離）、Ｓｈａｘｉａｎ株（中国福建農林大学により分離）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＲＧＳＶのＯ株のｐＣ５の標的配列とＳｈａｘｉａｎ株のｐＣ５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９０９４７）内の当該領域を比較したところ、７ヌクレオチドの置換が認められた。この程度の置換があるとしても、最低限発現抑制が起こる塩基長、すなわち、２４ヌクレオチド以上実質的に一致した部分塩基配列が他の亜種株もしくは変異株間に存在していれば、ある１種の亜種株に由来する分節ゲノムを含む本発明の発現抑制剤は、別の１種の亜種株においても、その効果を発揮し得る。他方、ＲＧＳＶのどの株由来の配列を用いたとしても、当業者は本明細書の記載に基づいて他の株に対しても効果を有するsiＲＮＡなどの発現抑制剤を製造することができることが理解される。
【００４１】
代表的な亜種株のゲノムに関する情報は以下のとおりである。
【００４２】
【表２】
2011067115.tif 000003
【００４３】
本明細書においてウイルスの「系統」および「株」は、同じウイルス種内でのバリエーションをいうために使用され得るが、これらの用語は、交換可能に使用され得ることが理解される。
【００４４】
ＲＳＶについて、本明細書において「ＲＳＶ−ｐＣ１」とは、（１）配列番号１に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＳＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するｐＣ１をコードする核酸配列によって示される、４本に分節したＲＳＶ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のゲノムのうちのＲＮＡ１のマイナス鎖に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＳＶ−ｐＣ１によってコードされるタンパク質は、ＲＳＶの粒子に付随されるタンパク質であり、ＲＮＡ複製酵素として機能する。また、ＲＳＶ−ｐＣ１によってコードされるタンパク質は、ＲＳＶのＲＮＡ合成において、その役割を果たす。
【００４５】
本明細書において「ＲＳＶ−ｐＣ３」とは、（１）配列番号３に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＳＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するｐＣ３をコードする核酸配列によって示される、４本に分節したＲＳＶ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のゲノムのうちのＲＮＡ３のマイナス鎖に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＳＶ−ｐＣ３によってコードされるタンパク質は、ＲＳＶの構造タンパク質であり、ヌクレオキャプシドとして機能する。また、ＲＳＶ−ｐＣ３によってコードされる構造タンパク質は、ＲＳＶ粒子の形を形成する役割を果たす。
【００４６】
本明細書において「ＲＳＶ−ｐＣ４」とは、（１）配列番号５に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＳＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するｐＣ４をコードする核酸配列によって示される、４本に分節したＲＳＶ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のゲノムのうちのＲＮＡ４のマイナス鎖に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＳＶ−ｐＣ４によってコードされるタンパク質は、ＲＳＶの移行タンパク質として機能する。また、ＲＳＶ−ｐＣ４によってコードされるタンパク質は、ＲＳＶの感染細胞に隣接する細胞への移行において、その役割を果たす。
【００４７】
一方、ＲＧＳＶについて、本明細書において「ＲＧＳＶ−ｐＣ１」とは、（１）配列番号１５に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＧＳＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するｐＣ１をコードする核酸配列によって示される、６本に分節したＲＳＶ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のゲノムのうちのＲＮＡ１のマイナス鎖に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＧＳＶ−ｐＣ１によってコードされるタンパク質は、ＲＧＳＶの粒子に付随されるタンパク質であり、ＲＮＡ複製酵素として機能する。また、ＲＧＳＶ−ｐＣ１によってコードされるタンパク質は、ＲＧＳＶのＲＮＡ合成において、その役割を果たす。
【００４８】
本明細書において「ＲＧＳＶ−ｐＣ５」とは、（１）配列番号１７に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＧＳＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するｐＣ５をコードする核酸配列によって示される、６本に分節したＲＳＶ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のゲノムのうちのＲＮＡ５のマイナス鎖に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＧＳＶ−ｐＣ５によってコードされるタンパク質は、ＲＳＶの構造タンパク質であり、ヌクレオキャプシドとして機能する。また、ＲＧＳＶ−ｐＣ５によってコードされる構造タンパク質は、ＲＧＳＶ粒子の形を形成する役割を果たす。
【００４９】
本明細書において「ＲＧＳＶ−ｐＣ６」とは、（１）配列番号１９に示される核酸配列；（２）上記核酸配列と中程度または高程度にあるいは任意の程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列と相補的な配列；（３）上記核酸配列において１もしくは数個の置換、付加、挿入および／もしくは欠失を有する改変体；（４）上記核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する改変体；（５）上記核酸配列に対して少なくとも８０％以上の相同性を有する改変体；（６）ＲＧＳＶの他の亜種株もしくは変種株に由来するｐＣ４をコードする核酸配列によって示される、６本に分節したＲＧＳＶ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のゲノムのうちのＲＮＡ６のマイナス鎖に存在する。上記の同一性または相同性は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。ストリンジェントな条件は配列に依存して変化し、このような条件の決定は、当業者の技術範囲内である。ＲＧＳＶ−ｐＣ６によってコードされるタンパク質は、ＲＳＶとの相同性から、おそらくＲＧＳＶの移行タンパク質として機能すると推定される。また、ＲＧＳＶ−ｐＣ６によってコードされるタンパク質は、ＲＧＳＶの感染細胞に隣接する細胞への移行において、その役割を果たすものと思われる。
【００５０】
本明細書において「イネ縞葉枯病」とは、植物ウイルス病の一種であって、その原因となるイネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）は昆虫によって伝播される（例えば、体内にＲＳＶを保毒した、ヒメトビウンカが、イネの汁液を吸うために口吻をイネに刺すときに、このイネ縞葉枯ウイルスがイネに感染する）。この植物ウイルス病にかかったイネは、葉に黄白色の条斑を生じ、次いで葉がよじれて枯れ、収量が激減する。
【００５１】
本明細書において、「イネグラッシースタント病」とは、植物ウイルスの一種であって、その原因となるイネグラッシースタントウイルス（ＲＧＳＶ）は昆虫によって伝播される（例えば、体内にＲＧＳＶを保毒した、トビイロウンカが、イネの汁液を吸うために口吻をイネに刺すときに、このイネグラッシースタントウイルスがイネに感染する）。この植物ウイルス病にかかったイネは、葉に褐色の小斑点生じ、葉が黄化し、草丈は短縮し、収量が激減する。
【００５２】
本明細書において、ウイルス（例えば、テヌイウイルス属のウイルス）等に対する「抵抗性」または「耐性」とは、ウイルス等が侵入しようとする宿主生体（本明細書では、植物）が、ウイルス等の侵入に対して抵抗力を持つことをいう。本明細書では、抵抗力とは、宿主生体の通常の生存・増殖が維持される程度の性質のほか、その宿主生体の生存が維持されている限り、抵抗力を有するとみなす。
【００５３】
本明細書において、病害（例えば、テヌイウイルス属のウイルス病）に対する「耐性」または「抵抗性」とは、その病害に対して宿主生体（本明細書では、植物）が抵抗力を持つことをいう。従って、ウイルスまたは菌の侵入を許したとしても、そのようなウイルスまたは菌との共存が図られる限り、病害に対する耐性はあるといえる。
【００５４】
本明細書において、病害に対する「完全抵抗性」とは、病害を引き起こす原因因子（例えば、ＲＳＶ）に感染していない植物体（非感染植物体）と比較して、その原因因子に感染した植物体（感染植物体）が、その植物体の生長（例えば、分けつ、伸長）、目的物質の収量において、非感染生物体と何ら変化なく共存が図られることをいう。一般に、目的の植物体の野生型集団にある病原体を感染させたとき、上記野生型集団中の個々の植物体に上記病原体による病徴が出現する時期はほぼ同じである。従って、より狭義には、「完全抵抗性」とは、目的の植物体にある病原体を感染させたとき、この植物体と同じ種の野生型植物体において病徴が出現する時期を超えてさらに終生何ら病徴が出現しない場合をいう。さらに「感受性」とは、上記目的の植物体に上記病原体を感染させたときに、上記野生型の感染植物体において病徴が出現する時期とほぼ同時期に感染した場合をいう。しかし、上記感染植物体において、何らかの「抵抗性」が付与されているために、上記病徴が、野生型感染個体の病徴出現時期から上記一定期間の間に出現する個体がある。この場合、このような個体において現れる抵抗性を「発病遅延型抵抗性」という。「発病遅延型抵抗性」は、ウイルスの侵入に対して抵抗力を持ったために発病が遅延するという点では「抵抗性」であるものの、結局病徴が出現するという点では、「完全抵抗性」とは意味が異なるので、評価する際には、「発病遅延型抵抗性」個体と「完全抵抗性」個体とは厳密に区別して評価すべきことが理解される。従って、本明細書においては、病原体に対する抵抗性を正しく評価するために、病原体に感染した植物体総数は、感染に失敗した個体（すなわち、ツマグロヨコバイが吸汁したにも拘わらず、発病に至らなかったもの）を除いた個体の中で、完全抵抗性個体がＸ％、遅延型抵抗性個体がＹ％、感受性個体がＺ％である場合（ここでＸ＋Ｙ＋Ｚ＝１００（％）であるが、好ましくは、Ｚはほぼ０である）、上記病原体を感染させた植物体の「集団」における完全抵抗性は、Ｘ％として評価することとし、（Ｘ＋Ｙ）％としては評価しない。また、本明細書において、感染植物体の集団に対してＸ％の個体に「完全抵抗性」が付与され、Ｙ％の個体に「発病遅延型抵抗性」が付与された植物体（例えば、イネ）の個体集団を、「（Ｘ＋Ｙ）％抵抗性集団」または「Ｘ％完全抵抗性集団」という。例えば、感染植物体の集団の８０％の個体に「完全抵抗性」が付与され、１５％の個体に「発病遅延型抵抗性」が付与された場合、このような集団は、「８０％完全抵抗性集団」または「９５％抵抗性集団」といい、１００％の個体に「完全抵抗性」が付与された集団は、「１００％完全抵抗性集団」という。
【００５５】
例えば、ＲＳＶまたはＲＧＳＶの場合は、２〜３葉期のイネ植物体野生型集団に感染させた場合、約３週間でほぼ全個体に病徴が出現する。従って、本明細書において、目的のイネ植物体がＲＳＶまたはＲＧＳＶに対して「感受性」であるとは、上記イネ植物体においてＲＳＶまたはＲＧＳＶを感染させてから３週間以内にその病徴が出現した場合をいう。また、２〜３葉期のイネ植物体野生型集団に感染させた場合に、感染から８週間経過しても病徴が出現しない場合、それ以降発病することはないので、少なくともイネ植物体に感染させてから８週間後に病徴が出現しなければ、一般に、上記イネ植物体は完全抵抗性であるとみなされる。従って、目的のイネ植物体がＲＳＶまたはＲＧＳＶに対して「完全抵抗性」であるとは、上記イネ植物体においてＲＳＶまたはＲＧＳＶを感染させてから通常は、８週間にわたって、または終生にわたってその上記イネ感染植物体に病徴が全く出現せず、非感染イネ植物体と何ら変化がない場合をいう。目的のイネ植物体がＲＳＶまたはＲＧＳＶに対して「発病遅延型抵抗性」であるとは、上記イネ植物体にＲＳＶまたはＲＧＳＶを感染させたときに、野生型イネにおいて感染させてから３週間でその病徴がほぼ全個体に出現することから、通常は、感染させてから３〜８週間の間にその病徴が出現する場合をいう。また、目的のイネ植物体の集団においてＲＳＶまたはＲＧＳＶを感染させた場合に、感染に失敗した個体を除いて、ＲＳＶまたはＲＧＳＶ感染個体集団の全個体が完全抵抗性である場合は、「１００％完全抵抗性集団」として言及し、上記集団において病徴を示す感染イネ植物体が１個体も存在しないことをいう。同様に、ＲＳＶまたはＲＧＳＶ感染個体集団の全個体のうち、Ｘ％の個体に「完全抵抗性」が付与され、Ｙ％の個体に「発病遅延型抵抗性」が付与された集団を「（Ｘ＋Ｙ）％抵抗性集団」または「Ｘ％完全抵抗性集団」といい、このような集団を得ることは、非常に困難である。
【００５６】
本明細書において、「安定した抵抗性」とは、複数の世代において保持される抵抗性をいう。複数の世代において保持されるとは、好ましくは３世代、より好ましくは５世代、さらにより好ましくは７世代、最も好ましくは永久に保持されることを意味する。
【００５７】
本明細書では、特に言及するときは、抵抗性は、ウイルスまたは菌に対する性質をいい、耐性は病害に対する性質をいうが、交換可能に使用され得ることが理解される。
【００５８】
本明細書において、「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。通常、本明細書では、ＲＳＶまたはＲＧＳＶが感染する植物を指す。好ましい植物は、イネ科に属する単子葉植物であり、本発明にとって最も好ましい植物は、イネである。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物組織の例としては、維管束組織（篩部組織、木部組織などを含む）、頂端分裂組織、葉肉組織、厚角組織、柔組織などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
【００５９】
本明細書において「野生型」植物とは、形質転換などの人為的手段による遺伝的改変がなされていない天然に存在する植物をいう。
【００６０】
本明細書において生物の「器官」とは、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。例えば、茎、根、葉、花、種子などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００６１】
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、器官の一部であり得る。器官内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
【００６２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine-modified  cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、Nucleic  Acid  Res．19：5081(1991)；Ohtsukaら、J．Biol．Chem．260：2605-2608(1985)；Rossoliniら、Mol．Cell．Probes  8：91-98(1994)）。
【００６３】
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ，ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子などを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。
【００６４】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常ゲノム上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、遺伝子というときは、通常、本発明の遺伝子の構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００６５】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００６６】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。ヌクレオチドの配列は、本明細書において「ヌクレオチド配列」または「塩基配列」という。
【００６７】
本明細書において「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、ヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドと同じ生物学的機能、特にＲＮＡｉの機能を果たす限り、ヌクレオチドの代替として使用され得ることが理解される。
【００６８】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC-IUB  Biochemical  Nomenclature  Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００６９】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST  2．2．9  （2004．5．12  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００７０】
本明細書において、「対応する」ヌクレオチドとは、ある核酸分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となる核酸分子またはポリヌクレオチドにおける所定のヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるヌクレオチドをいい、ＲＮＡｉにあっては、ＲＮＡ干渉作用において、同様の寄与をするヌクレオチドをいう。アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
【００７１】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＲＳＶのｐＣ１、ｐＣ３およびｐＣ４）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ウイルスの遺伝子に対応する遺伝子は、他のウイルス（他のレオウイルス属のウイルスなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、あるウイルスにおける対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてそのウイルス（例えば、他のレオウイルス）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００７２】
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００７３】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な抗体の生成、酵素活性、抵抗性の付与等を挙げることができるがそれらに限定されない。本発明においては、例えば、植物におけるテヌイウイルス属のウイルスの増殖への関与、テヌイウイルス属のウイルスに対する抵抗性または感受性への関与、テヌイウイルス属のウイルス病に対する耐性、これらの具体的な機能について直接的または間接的に関連する機能（例えば、ウイルスタンパク質との結合など）などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。２つの因子が相互作用する場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００７４】
したがって、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。
【００７５】
本明細書において「相互作用」とは、２つの物質についていうとき、一方の物質と他方の物質との間で力（例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性相互作用など）を及ぼしあうこという。通常、相互作用をした２つの物質は、会合または結合している状態にある。
【００７６】
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
【００７７】
本明細書中で使用される用語「調節する（modulate）」または「改変する（modify）」は、特定の活性、因子またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
【００７８】
本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子の核酸配列の全部または一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列を有する分子を本明細書において「アンチセンス分子」、「アンチセンス核酸分子」または「アンチセンス核酸」と称し、これらは互換的に使用される。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、もっとも好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の５’末端の配列に対して相補的であることが好ましい。そのようなアンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、１つまたは数個あるいは１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、挿入および／または欠失を有するものもまた含まれる。本明細書中で開示される核酸配列（例えば、配列番号１）が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対形成の法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の法則に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、シグナル伝達因子のｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０ヌクレオチド長であり得る。１つの好ましい実施形態では、本発明の発現抑制剤において使用されるアンチセンス核酸は、その長さの下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記アンチセンス核酸は、その長さの上限においては、たとえば、約１０５０ヌクレオチドまで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くアンチセンス現象に基づく遺伝子発現抑制効果を誘起させることができると考えられるからである。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の改変ヌクレオチドを用いて（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）化学合成され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（queosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、3−（3−アミノ−3−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７９】
本明細書において「ＲＮＡｉ（RNA  interference）」とは、二本鎖ＲＮＡ（double  stranded  RNA：ｄｓＲＮＡ）によって配列特異的にｍＲＮＡが分解されることによって、タンパク質への翻訳が阻害され、遺伝子発現が抑制される現象をいう。遺伝子発現抑制手法としての植物におけるＲＮＡｉについての総説は、例えば、三木ら、「植物におけるＲＮＡｉの分子機構とその応用」（実験医学  Vol．22  No．4(3月号)2004）（本明細書中で、参考として援用される）などが挙げられる。ＲＮＡｉの利点の一つとして、弱いものから強いものまで様々なレベルの発現抑制が個々の遺伝子によって取得され得ること挙げられる。現在、ＲＮＡｉは、簡便かつ有効な遺伝子発現抑制法として利用されている。好ましい実施形態において、「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【００８０】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部、あるいは上記の核酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【００８１】
本明細書において「トリミング配列」とは、センス配列およびアンチセンス配列に相当する配列とそれら二つの配列の間に位置する配列（スペーサー、ヘアピン、トリミング等と呼ばれている）ものをいう。下記のような構造：
センス配列−トリミング配列−アンチセンス配列；または
アンチセンス配列−トリミング配列−センス配列
を有する核酸分子が導入され得たベクターで細胞が形質転換されると、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成し、それら二つの鎖の間に位置する部分はループまたはヘアピン部分として保持された、その一部にループ又はヘアピン構造の一本鎖部分を含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が形成される。このトリミング配列の長さは、センス配列とアンチセンス配列とが二本鎖ＲＮＡを形成するときに、このトリミング配列の構成する一本鎖部分がループまたはヘアピン構造をとる限りにおいてどのような長さのものであってもよい。上記ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に移動し、その導入された細胞内でＤｉｃｅｒによって切断されてｓｉＲＮＡとなり、ＲＮＡ干渉を引き起こす。
【００８２】
好ましい実施形態では、ＲＮＡｉを引き起こす因子において使用されるセンス配列またはアンチセンス配列の長さは、その下限において少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも約４００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチドの長さであり得るが、これらの長さに限定されず、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチドの間のいずれの長さであってもよい；上記センス配列またはアンチセンス配列の長さは、その上限においては、たとえば、約１０５０まで、約１１００ヌクレオチドまで、約１２００ヌクレオチドまで、約１３００ヌクレオチドまで、約１４００ヌクレオチドまで、約１５００ヌクレオチドまで、約２０００ヌクレオチドまで、または約２５００ヌクレオチドの長さ、あるいは対象となる核酸の全長であり得るが、これらの長さに限定されず、約５００〜全長までの間の何れの長さであってもよい。理論に束縛されることを望まないが、標的遺伝子を上記範囲（たとえば、５００塩基程度）に設計することによって、ウイルス系統間で幅広くRNAiを誘起させることができると考えられるからである。
【００８３】
本明細書において第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して、第２の物質または因子以外の物質または因子（特に、第２の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第１の物質または因子が、第２の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第１の物質または因子が第２の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００８４】
本明細書において「発現抑制剤」とは、広義には、遺伝子の細胞内における発現、すなわち、ゲノムの複製、転写、翻訳を抑制することができるあらゆる因子をいう。
【００８５】
本明細書において「因子」（agent）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などであって、代表的には分子量約１０，０００以下のもの（例えば、約１，０００以下のもの）を指すがそれらに限定されない）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８６】
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、ＲＮＡとＤＮＡとの複合分子、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、配列番号２のアミノ酸を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントであって、テヌイウイルス属のウイルスの増殖に関与する生物学的な活性を有する限り、それぞれの改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子も使用することができる。また、そのような核酸分子を含む複合分子も使用することができる。
【００８７】
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
【００８８】
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、細胞、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
【００８９】
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味し、その対象物を天然物から区別するために用いられる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、形質転換、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「外来」の核酸分子とは、ある対象核酸分子内に含まれるその対象核酸分子以外の起源の核酸分子などをいう。この外来の核酸分子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。
【００９４】
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来の核酸分子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、目的（例えば、ＲＮＡ干渉）を果たす核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
【００９５】
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」または「抑制」とは、交換可能に使用され、ある因子（すなわち、発現抑制剤）を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。
【００９６】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
【００９７】
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、動物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、「ジーンサイレンシング」とは、遺伝子発現の抑制現象を意味する。「ジーンサイレンシング」と呼ばれる現象としては、ゲノムインプリンティング、Ｘ染色体の不活性化、ＰＥＶ（position  effect  variegation）、トウモロコシのパラミューテションなどが挙げられる。植物におけるトランスジーン（導入遺伝子）の不活性化の一つとして、相同性依存型ジーンサイレンシング（Homology-dependent  gene  silencing；HDGS）があり、そのＨＤＧＳ様の現象は、植物内在性遺伝子、植物以外のトランスジェニックにおいても見られており、生物のなんらかの遺伝子制御機構であると考えられる。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、「相同性依存型ジーンサイレンシング」または「ＨＤＧＳ」は、複数の遺伝子が、その塩基配列の相同性またはその配列の類似性に依存して起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。特に、特定の導入された遺伝子（導入遺伝子）を過剰発現させると、その導入遺伝子とともに本来ゲノムに存在していた（すなわち、内在的な）同一または相同な遺伝子が抑制される現象をいう。「ＨＤＧＳ」としては、例えば、「ＰＴＧＳ」が挙げられる。
【０１００】
本明細書中で使用される場合、「転写後型ジーンサイレンシング」または「ＰＴＧＳ」は、転写後に起こる遺伝子発現の抑制現象をいう。ＲＮＡｉもＰＴＧＳの一種である。
【０１０１】
本明細書中において使用される場合、「コサプレッション」、「コーサプレッション」および「共抑制」は、同意義語として使用され得る。「コサプレッション」とは、導入遺伝子を含む植物において、その導入遺伝子と相同な配列を有する内在性の遺伝子（その植物において、その植物のゲノム上の存在していた、その導入遺伝子と同一であるかまたは相同である遺伝子）の両方の発現が抑制される現象をいう。この現象は、ペチュニアの花の色素合成にかかる遺伝子の発現機構を研究している過程に発見された（Napoli，C．，Lemieux，C．＆Jprgensen，R．：Plant  Cell  2，291-299(1990)；ならびにvan  der  Krol，R  et  al：Plant  Cell  2，291-299(1990)）。その後、植物のみでなくアカパンカビ、ショウジョウバエ、線虫、哺乳動物細胞などにおいてもそれらの同様の現象が発見されている。このような「コサプレッション」を、育種目的に利用した例は、SCIENCE  Vol．309  29  July  2005  p．741-745などに記載されている。
【０１０２】
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、short  interfering  RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（RNA-induced-silencing-complex）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【０１０３】
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【０１０４】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
【０１０５】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態をとっていてもよい。
【０１０６】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；short  hairpin  RNA）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【０１０７】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【０１０８】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【０１０９】
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の方法および組成物において有用である。
【０１１０】
本明細書において、ＲＳＶについて、配列番号４（ＲＳＶ−ｐＣ３）、配列番号６（ＲＳＶ−ｐＣ４）または配列番号２（ＲＳＶ−ｐＣ１）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号３（ＲＳＶ−ｐＣ３コード領域）、配列番号５（ＲＳＶ−ｐＣ４コード領域）または配列番号１（ＲＳＶ−ｐＣ１コード領域）に示される核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。同様に、本明細書において、ＲＧＳＶについて、配列番号１８（ＲＧＳＶ−ｐＣ５）、配列番号２０（ＲＧＳＶ−ｐＣ６）または配列番号１６（ＲＧＳＶ−ｐＣ１）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１７（ＲＧＳＶ−ｐＣ５コード領域）、配列番号１９（ＲＧＳＶ−ｐＣ６コード領域）または配列番号１５（ＲＧＳＶ−ｐＣ１コード領域）に示される核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。
【０１１１】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Tijssen(Tijssen(1993)、Laboratory  Techniques  In  Biochemistry  And  Molecular  Biology-Hybridization  With  Nucleic  Acid  Probes  Part  I、第２章  「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  probe  assay」、Elsevier，New  York）に見出される。
【０１１２】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【０１１３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline-sodium  citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular  Cloning  2nd  ed．，Current  Protocols  in  Molecular  Biology，Supplement  1〜38、DNA  Cloning  1：Core  Techniques，A  Practical  Approach，Second  Edition，Oxford  University  Press(1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１１４】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Sambrook  et  al．，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、第2版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory(Cold  Spring  Harbor，N，Y．1989)；およびAnderson  et  al．、Nucleic  Acid  Hybridization：a  Practical  approach、IV、IRL  Press  Limited(Oxford，England)．Limited，Oxford，Englandを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Anderson  et  al．，Nucleic  Acid  Hybridization：a  Practical  Approach、第４章、IRL  Press  Limited（Oxford，England）を参照のこと。
【０１１５】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝81.5＋16.6（log[Na+]）＋0.41（％G+C）−600/N-0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【０１１６】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【０１１７】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【０１１８】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Suggsら、Developmental  Biology  Using  Purified  Genes、683頁、BrownおよびFox(編)(1981)を参照のこと)。
【０１１９】
配列番号４（ＲＳＶ−ｐＣ３）または配列番号１８（ＲＧＳＶ−ｐＣ５）のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下で、配列番号３または１７に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【０１２０】
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。
【０１２１】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【０１２２】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、LASERGENE，PrimerSelect，DNAStar）を用いて行ってもよい。
【０１２３】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、挿入改変体、欠失改変体、短縮（truncated）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加、挿入および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加、挿入および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。「オルソログ（ortholog）」とは、オルソロガス遺伝子（orthologous  gene）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。オルソログは、通常別のウイルス株において、もとのウイルス株と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【０１２４】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Mark  Zoller  and  Michael  Smith，Methods  in  Enzymology，100，468-500(1983)）が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
【０１２５】
本明細書において使用される核酸分子は、目的とする遺伝子の発現を抑制する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【０１２６】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【０１２７】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加、挿入および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、挿入されること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加、挿入および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【０１２８】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J．et  al．(1989)．Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed．(2001)；Ausubel，F．M．(1987)．Current  Protocols  in  Molecular  Biology，Greene  Pub．Associates  and  Wiley-Interscience；Ausubel，F．M．(1989)．Short  Protocols  in  Molecular  Biology：A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology，Greene  Pub．Associates  and  Wiley-Interscience;Innis，M．A．(1990)．PCR  Protocols：A  Guide  to  Methods  and  Applications，Academic  Press；Ausubel，F．M．(1992)．Short  Protocols  in  Molecular  Biology：A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology，Greene  Pub．Associates;Ausubel，F．M．(1995)．Short  Protocols  in  Molecular  Biology：A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology，Greene  Pub．Associates;Innis，M．A．et  al．(1995)．PCR  Strategies，Academic  Press;Ausubel，F．M．(1999)．Short  Protocols  in  Molecular  Biology：A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology，Wiley，and  annual  updates;Sninsky，J．J．et  al．(1999)．PCR  Applications：Protocols  for  Functional  Genomics，Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１２９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait，M．J．(1985)．Oligonucleotide  Synthesis：A  Practical  Approach，IRLPress；Gait，M．J．(1990)．Oligonucleotide  Synthesis：A  Practical  Approach，IRL  Press；Eckstein，F．(1991)．Oligonucleotides  and  Analogues：A  Practical  Approac，IRL  Press;Adams，R．L．et  al．(1992)．The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids，Chapman&Hall;Shabarova，Z．et  al．(1994)．Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids，Weinheim;Blackburn，G．M．et  al．(1996)．Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology，Oxford  University  Press;Hermanson，G．T．(I996)．Bioconjugate  Techniques，Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１３０】
（遺伝子工学）
本発明において用いられる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
【０１３１】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
【０１３３】
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、植物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
【０１３４】
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pcDNA3(+)、pBluescript-SK(+/-)、pGEM-T、pEF-BOS、pEGFP、pHAT、pUC18、pFT-DESTTM42GATEWAY、pENTRTM/D-TOPO（Invitrogen）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
【０１３５】
本明細書において用いられ得る植物細胞に対する「組み換えベクター」としては、pANDA（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）、pBE7133-GUS-Hygro（pE7ΩIGUS-Hygro）、pPZP2H-lacを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１３６】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターの例としては、CaMV35Sターミネーター、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
【０１３８】
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
【０１３９】
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、植物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、植物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。部位特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え植物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。部位特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。
【０１４０】
本明細書において、「部位特異的発現プロモーター」とは、器官（例えば、根、茎、葉、果実、種子ならびにそれらの組合せなど）、組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、ならびにそれらの組合せなど）、発達段階（例えば、発芽期、生長期、開花期、登期ならびにそれらの組み合わせなど）などにおいて、特異的なプロモーターである。原理的には、個体において特異的に発現している遺伝子を単離し、そのプロモーター、発現制御シス領域を単離することによって得られる。
【０１４１】
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
【０１４２】
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子  組換え技術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。
【０１４３】
本明細書において「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入の効率を高める。
【０１４４】
本明細書において「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Langridge，1985，Plant  Cell  Rep．4，355)、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Guilley，1982，Cell  30，763）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Odell，1985，Nature  313，810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang，1991，Plant  Cell  3，1155）、トウモロコシユビキチンプロモーター（Cornejo  1993，Plant  Mol．Biol．23，567）、ＲＥＸφプロモ−タ−（Mitsuhara，1996，Plant  Cell  Physiol．37，49）などを用いることができる。
【０１４５】
あるいは、植物プロモーターは、特定組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター（Fluhr，1986，Pro．Natl．Acad．Sci．USA  83，2358）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子のプロモーター（Aguan，1993，Mol．Gen．Genet．240，1）、高温によって誘導されるイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター（Van  Breusegem，1994，Planta  193，57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Nundy，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA  87，1406）、紫外線の照射によって誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert，1989，EMBO  J．8，651）などが挙げられる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【０１４６】
本明細書において「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。これらの薬剤耐性遺伝子は、本発明においてスクリーニング技術などにおいて用いられる。
【０１４７】
上記のような植物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクターまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラスト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なものを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉および根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。
【０１４９】
また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われるのに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料としては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Nagelらの方法（Microbiol．Lett．，67，325(1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により植物組織に導入する方法である。これらの方法は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得る。
【０１５０】
植物発現ベクターを導入された細胞は、例えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生され得る。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培することにより植物体とすることができる。再生（再分化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献にイネ（Fujimura，1995，Plant  Tissue  CultureLett．2，74）、トウモロコシ（Shillito，1989，Bio/Technol．7，581、Gorden-Kamm，1990，Plant  Cell  2，603）、ジャガイモ（Visser，1989，Theor．Appl．Genet．78，594）、タバコ（Nagata，1971，Planta  99，12）など各種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。
【０１５２】
再生した植物体においては、当業者に周知の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡを抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを検出し得る。
【０１５３】
本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物をも包含する。
【０１５４】
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【０１５５】
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
【０１５６】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。例えば、エンハンサーとして、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が用いられるが、これらに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
【０１５７】
本発明において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。
【０１５８】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【０１５９】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ausubel  F．A．ら編(1988)、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley、New  York、NY；Sambrook  Jら(1987)Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，2nd  Ed．およびその第三版，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，Cold  Spring  Harbor，NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１６０】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
【０１６１】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
【０１６２】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Escherichia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属などに属する原核生物細胞、例えば、Escherichia  coli  XL1-Blue、Escherichia  coli  XL2-Blue、Escherichia  coli  DH1が例示される。
【０１６３】
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Methods．Enzymol．，194，182(1990)］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84，1929(1978)］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
【０１６４】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Nat  Genet．2002  Dec;32  Suppl：526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１６５】
（抵抗性の評価）
本発明の方法によって作出された遺伝子組換え植物が、病原体に対する抵抗性を有しているか否かは、例えば、Methods  for  Isolation，Cultivation，Inoculation  of  Plant  Pathogens，Japan  Plant  Protection  Associationに記載されている試験方法により容易に確認し得る。例えば、テヌイウイルス属のウイルス病の場合は、特定のイネ品種にヒメトビウンカなどのＲＳＶを媒介する昆虫を温室中で放飼してウイルス感染させた場合の病斑形成やイネの背丈を、原品種または野生型と組換え体とを比較することによって検定することが可能であるが、これに限定されることはない。
【０１６６】
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１６７】
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
【０１６８】
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
【０１６９】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【０１７０】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【０１７１】
ＲＳＶがコードする各タンパク質の感染細胞内での挙動について、ほとんど解析がなされていないことから、全７種の遺伝子について個々に標的遺伝子を設定して発現抑制剤を作製し、ＲＳＶまたはＲＧＳＶ抵抗性イネの作出を試みた。
【０１７２】
一局面において、本発明は、テヌイウイルス属のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子の発現抑制剤を含む、テヌイウイルス属のウイルス病に抵抗性を付与するための組成物を提供する。
【０１７３】
本発明の一実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子は、ＲＳＶ−ｐＣ３（配列番号３）、ＲＳＶ−ｐＣ４（配列番号５）およびＲＳＶ−ｐＣ１（配列番号１）からなる群より選択され得る。一実施形態において、本発明の発現抑制剤は、配列番号４３(Trigger  RSV-pC3）、配列番号４５(Trigger  RSV-pC4）および配列番号３９（Trigger  RSV-pC1）の核酸配列と相補的なアンチセンス配列を用いて作製することができる。
【０１７４】
一実施形態において、好ましいアンチセンス配列は、配列番号４３（Trigger  RSV-pC3）によって示される核酸配列に相補的な配列、配列番号４５（Trigger  RSV-pC4）によって示される核酸配列に相補的な配列、配列番号３９（Trigger  RSV-pC1）によって示される核酸配列に相補的な配列であり得る。
【０１７５】
本発明の一実施形態において、上記少なくとも１つの遺伝子は、ＲＧＳＶ−ｐＣ５（配列番号１７）、ＲＧＳＶ−ｐＣ６（配列番号１９）およびＲＧＳＶ−ｐＣ１（配列番号１５）からなる群より選択され得る。一実施形態において、本発明の発現抑制剤は、配列番号６９(Trigger  RGSV-pC5）、配列番号７１(Trigger  RGSV-pC6）および配列番号６１（Trigger  RGSV-pC1）の核酸配列と相補的なアンチセンス配列を用いて作製することができる。
【０１７６】
一実施形態において、好ましいアンチセンス配列は、配列番号６９（Trigger  RGSV-pC5）によって示される核酸配列に相補的な配列、配列番号７１（Trigger  RGSV-pC6）によって示される核酸配列に相補的な配列、配列番号６１（Trigger  RGSV-pC1）によって示される核酸配列に相補的な配列であり得る。
【０１７７】
一実施形態において、トリミング配列は、５〜３２個またはそれ以上のヌクレオチド配列を有し得る。好ましいトリミング配列としては、ＧＵＳ配列、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ(pyruvate  orthophosphate  dikinase)イントロン、dof  affecting  germination(DAG1)イントロンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明のプロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、好ましいプロモーターとしては、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターとしては、ストレス誘導性プロモーター（例えば、感染誘導性プロモーター）が好ましい。恒常性プロモーターとしては、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。感染誘導性プロモーターとしては、ＷＲＫＹ転写因子プロモーター、ＰＲ１プロモーター、ＰＢＺ１遺伝子プロモーター、ペルオキシダーゼプロモーター、マイトジェン活性化プロモーターなどが挙げられるが、これらには限定されない。
【０１７９】
本発明は、一局面において、テヌイウイルス属のウイルスゲノムに存在する少なくとも１つの遺伝子をコードする核酸配列と相補的なアンチセンス配列、トリミング配列、および該アンチセンス配列と相補的なセンス配列を含む、発現カセットを提供する。
【０１８０】
別の好ましい実施形態において、使用されるアンチセンス配列は、例えば、Invitrogenのウェブサイトにおいて利用可能なrnai_designer（http：//www．invitrogen．co．jp/rnai/rnai_designer．shtml/）、Promegaのウェブサイトにおいて利用可能なsiRNADesigner（http：//www．promega．com．siRNADesigner/）、AmbionのウェブサイトのsiRNA  Target  Finder、DharmaconのsiDESIGN  Center、GenScriptのsiRNA  Target  Finder、およびGene  specific  siRNA  selector（これらの方法に限定されない）を使用することによって容易に設計可能である。
【０１８１】
本発明は、一局面において、上記発現カセットを含むベクターを提供する。本発明において使用されるベクターは、所望の目的（発現、送達、挿入、導入など）を達成する限り、どのようなベクターを用いても良いことが理解される。
【０１８２】
本発明のベクターは、目的の細胞に導入された否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子を含み得る。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、これらに限定されない。
【０１８３】
本発明は、一局面において、上記ベクターを含む植物細胞、植物体、種子を提供する。
【０１８４】
このような植物としては、どのようなものでも良いが、好ましくは、イネ縞葉枯ウイルス（ＲＳＶ）などのテヌイウイルス属のウイルスに罹患する植物であり、さらに好ましくは、イネ科植物（コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ソルガムなど）、さらにより好ましくはイネ属植物、さらにより好ましくは、イネ（例えば、ジャポニカ種またはインディカ種）であり得る。
【０１８５】
一実施形態において、本発明の植物体は、テヌイウイルス属のウイルスに対する完全抵抗性を示す。
【０１８６】
（抵抗性・耐性植物の作出）
本発明は、一局面において、テヌイウイルス属のウイルス病に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属のウイルスに感染し得るイネ科植物を生産する方法；テヌイウイルス属のウイルス病に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属のウイルスに感染し得る植物の種子を生産する方法；およびテヌイウイルス属のウイルス病に対する耐性が付与された、テヌイウイルス属のウイルスに感染し得る植物を再生産する方法を提供する。
【０１８７】
上記に示される方法は、本発明の発現抑制剤を、イネ科植物の細胞に導入する工程を包含する。一般的に、本発明のベクターは、種々の慣用的技術を用いて所望の植物宿主（例えば、イネ科植物の細胞）のゲノムに導入することができる。好ましい導入法としては、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が挙げられるが、これらに限定されない。上記方法はさらに、テヌイウイルス属のウイルスに対して抵抗性を有する植物を選択する工程を包含する。このような選択は、抵抗性を有するトランスジェニック植物を選択することができる限り、どのような方法を用いてもよく、細胞レベルの選択でもよいし、植物体レベルの選択でもよい。
【０１８８】
本発明のベクターが導入されたか否かを確認するために、薬剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子）を含むベクターの場合、上記の導入工程後に得られた細胞は、その薬剤耐性遺伝子が細胞中で発現したか否かを検出するための薬剤（例えば、ハイグロマイシン）を含む選択培地中で増殖させることによって選択される。当然のことながら、このような選択培地中に含まれる薬剤は、上記ベクター中に含まれる薬剤耐性遺伝子に依存して変更され得る。
【０１８９】
上記のようにして選択された細胞を、当該分野で一般的に使用される再生培地中で培養することにより、例えば、根およびシュートが確認できるまで再分化させる。このような再生培地としては、以下の実施例に記載されるような再分化培地（ＭＳＲＥ）などのような（当該分野で周知の）培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
上記のようにして再分化させることによって得られた根およびシュートは、鉢上げされ、試験に適した時期（例えば、９葉期）まで、または成熟期まで生長させられることによって、トランスジェニック植物（Ｔ０）が作出される。
【０１９１】
さらに、このようにして得られたトランスジェニック植物中に本発明のベクターが含まれているか否かについては、上記植物から細胞を採取して全細胞ＤＮＡを得、ゲノムに組み込まれた薬剤耐性遺伝子をサザンブロットなどで、得られたトランスジェニック植物中に実際に本発明のベクターが含まれているか否かを確認できる。また、低分子ＲＮＡを得、Trigger領域をプローブにノザンブロットを行うことで、トランスジェニック植物中で実際にＲＮＡｉを誘起できていることも確認できる。さらには、得られたトランスジェニック植物に、実際にＲＳＶまたはＲＧＳＶを感染させて、感染トランスジェニック植物とコントロール野生型植物とを比較することによって、本発明のベクターが含まれているか否かを検出することもできる。
【０１９２】
さらに、本発明のトランスジェニック植物は、Ｔ０植物から得られた種子、さらに後代のＴ１植物、Ｔ２植物、Ｔ３植物などから得ることもできる。
【０１９３】
（使用）
別の局面において、本発明は、本発明の発現抑制剤の、テヌイウイルス属のウイルスに対する抵抗性、テヌイウイルス属のウイルス病に対する耐性を付与するための、またはその耐性もしくは抵抗性を付与する農薬を製造するための使用を提供する。ここで使用される核酸分子および因子は、本明細書において上記される任意の核酸分子であり得ることが理解される。
【０１９４】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１９５】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１９６】
（材料および方法）
以下に示す実施例において、特段の記載がない場合、一般的に、以下に記載される材料および方法を用いて実験を行った。
【０１９７】
１．イネの生育
実験系統として、イネ（Oryza  sativa  cv．Nipponbare）を使用した。イネ植物を温室（２０℃〜３２℃）において栽培し、９葉期まで生育させてから、以下の実験に使用した。イネへのＲＳＶまたはＲＧＳＶ接種試験においては、各形質転換体系統およびコントロールの野生型イネのいずれも、２〜３葉期まで生育させてから使用した。なぜなら、ＲＳＶまたはＲＧＳＶの病徴は新しく展開した葉において観察される、すなわち、イネの生育期において、２〜３葉期がＲＳＶまたはＲＧＳＶに対する感受性が最も高いからである。
【０１９８】
２．培地および試薬
（０）Ｎ６−ビタミン  １．２Ｌ
グリシン                                                    ２ｇ
ニコチン酸                                              ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ                                      ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ                                              １ｇ
ミオイノシトール                                        １００ｇ  
蒸留水で１．２Ｌにする。
【０１９９】
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
【０２００】
（１）ＭＳ−ビタミン  １．２Ｌ
ニコチン酸                                              ０．５ｇ
ピリドキシンＨＣｌ                                      ０．５ｇ
チアミンＨＣｌ                                          ０．１ｇ
ミオイノシトール                                        １００ｇ  
蒸留水で１．２Ｌにする。
【０２０１】
１．２ｍｌずつ分注し、使用時まで−２０℃で保存する。
【０２０２】
（２）カルス誘導培地（Ｎ６Ｄ）  １Ｌ
スクロース                                                    ３０ｇ
カザミノ酸                                                  ０．３ｇ
Chu(N6)  Basal  Salt  Mixture  Powder  （Sigma社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン                                                    ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン                                              １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ  ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ）                    ２ｍｌ  
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０２０３】
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
【０２０４】
（３）共存培養培地（Ｎ６ＣＯ）  １Ｌ
スクロース                                                    ３０ｇ
グルコース                                                    １０ｇ
カザミノ酸                                                  ０．３ｇ
Chu(N6)  Basal  Salt  Mixture  Powder  (Sigma社から購入)
３．９８１ｇ
Ｎ６−ビタミン                                            １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ  ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ）                  ２ｍｌ  
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．２に調節し、蒸留水で１Ｌにする。
【０２０５】
ゲルライト  ４ｇを加えてオートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、アセトシリンゴン（５０ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ加える。
【０２０６】
（４）選抜培地（Ｎ６ＳＥ）  １Ｌ
スクロース                                                ３０ｇ
カザミノ酸                                              ０．３ｇ
Chu(N6)  Basal  Salt  Mixture  Powder（Sigma社から購入）
３．９８１ｇ
プロリン                                                ２．９ｇ
Ｎ６−ビタミン                                          １．２ｍｌ
２，４−Ｄ（０．１Ｍ  ＫＯＨ中１ｍｇ／ｍｌ）                ２ｍｌ  
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０２０７】
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ）  ２ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）  ０．５ｍｌを添加する。
【０２０８】
（５）再分化培地（ＭＳＲＥ）  １Ｌ
スクロース                                                    ３０ｇ
Ｄ−ソルビトール                                              ３０ｇ
カザミノ酸                                                      ２ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入）  ４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン                                              １．２ｍｌ
カイネチン（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）                      ０．２ｍｌ
α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ）                                  ０．２ｍｌ  
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０２０９】
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、カルベニシリン（２５０ｍｇ／ｍｌ）  １ｍｌおよびハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）  ０．５ｍｌを添加する。
【０２１０】
（６）ホルモンフリー（ＨＦ）培地  １Ｌ
スクロース                                                      ３０ｇ
ムラシゲ・スクーグ植物培地用混合塩類（和光純薬社から購入）    ４．４ｇ
ＭＳ−ビタミン                                                １．２ｍｌ  
１Ｎ  ＫＯＨでｐＨ５．８に調節して、蒸留水で１Ｌにする。
【０２１１】
ゲルライト  ４ｇを加えて、オートクレーブにかける。
温度が５０℃未満に下がるまで待ってから、
ハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）  ０．５ｍｌを添加する。
【０２１２】
実施例１Ａ：ＲＳＶのｐＣ１遺伝子、ｐ２遺伝子、ｐＣ２遺伝子、ｐ３遺伝子、ｐＣ３遺伝子、ｐ４遺伝子およびｐＣ４遺伝子を用いたＲＮＡｉ誘起ベクターの構築
（１）ＲＳＶのｐＣ１遺伝子、ｐ２遺伝子、ｐＣ２遺伝子、ｐ３遺伝子、ｐＣ３遺伝子、ｐ４遺伝子およびｐＣ４遺伝子を、特異的なプライマーセットを用いて増幅する：
ＲＳＶ感染イネの葉から、定法に従って総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、RNeasyPlantMiniKit（Qiagen）を使用して、添付の説明書に従って行った。総ＲＮＡ  １μｇを用いて、SuperScriptIII（Invitrogen）のマニュアルに従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーセット：
trigger  RSV-pC1についてプライマーセット１：
フォワードプライマー：CACCATGACGACACCACCTCTCGT（配列番号４６）；と
リバースプライマー：TCTTCCACTGGCATTCTCAAG（配列番号４７）、
trigger  RSV-p2についてプライマーセット２：
フォワードプライマー：CACCACGGAGAATCTCGTCTTCA（配列番号４８）；と
リバースプライマー：CTTTGAGATGGGTATTCCATTGG（配列番号４９）、
trigger  RSV-pC2についてプライマーセット３：
フォワードプライマー：CACCACAATCTTTAATATGGCGTG（配列番号５０）；と
リバースプライマー：GGGCTTGATTGCAACACCATG（配列番号５１）、
trigger  RSV-p3についてプライマーセット４：
フォワードプライマー：CACCGACATCATCTAAGTATGAACG（配列番号５２）；と
リバースプライマー：GCCTTTTCTTACTAGGTGATCTA（配列番号５３）、
trigger  RSV-pC3についてプライマーセット５：
フォワードプライマー：CACCACAATGGGCACCAACAAGCCA（配列番号５４）；と
リバースプライマー：TTGTGGAACATAGTCCCACAG（配列番号５５）、
trigger  RSV-p4についてプライマーセット６：
フォワードプライマー：CACCGATGCAAGACGTACAAAGGAC（配列番号５６）；と
リバースプライマー：CTCTTCTGTGTCTGAGCTCTC（配列番号５７）、ならびに
trigger  RSV-pC4についてプライマーセット７：
フォワードプライマー：CACCGCTTTGTCTCGACTTTTGTCC（配列番号５８）；と
リバースプライマー：GCTTATCCTCCAAAGCCAGAAA（配列番号５９）
を用いてそれぞれＰＣＲを行い、trigger  RSV-pC1（配列番号３９）、trigger  RSV-p2（配列番号４０）、trigger  RSV-pC2（配列番号４１）、trigger  RSV-p3（配列番号４２）、trigger  RSV-pC3（配列番号４３）、trigger  RSV-p4（配列番号４４）、およびtrigger  RSV-pC4（配列番号４５）の各増幅産物を得た。
【０２１３】
（２）制限酵素またはGateway（Invitrogen）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する：
上記（１）で得た各増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen  cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/trigger  RSV-pC1、pENTR/trigger  RSV-p2、pENTR/trigger  RSV-pC2、pENTR/trigger  RSV-p3、pENTR/trigger  RSV-pC3、pENTR/trigger  RSV-p4、およびpENTR/trigger  RSV-pC4を得た。
【０２１４】
このクローニングベクターを、キットに付属のE．coli株に形質転換し、同様に、製造業者の説明書に従って、適切な条件下で、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。単一のコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む１〜２ｍｌのＬＢ培地中に接種し、定法に従って、このクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させた。定法に従って、形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認した。
【０２１５】
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を形質転換ベクターにクローニングする：
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化し、pPANDA/trigger  RSV-pC1、pPANDA/trigger  RSV-p2、pPANDA/trigger  RSV-pC2、pPANDA/trigger  RSV-p3、pPANDA/trigger  RSV-pC3、pPANDA/trigger  RSV-p4、およびpPANDA/trigger  RSV-pC4を得た。簡潔にいうと、２μｌ  ＬＲ反応緩衝液（５×）、１００〜３００ｎｇの上記エントリーベクター、３００ｎｇ  pANDAベクター、ＴＥを添加して総容積８μｌにした。２μｌのＬＲクロナーゼ酵素ミックス（Invitrogen  cat．11791-019）を加えて攪拌し、２５℃で一晩インキュベートした。その後、プロテイナーゼＫ溶液を１μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。得られたベクターをE．coli  ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンを含む培地中で増殖させた。
【０２１６】
実施例１Ｂ：ＲＧＳＶのｐ１遺伝子、ｐＣ１遺伝子、ｐ２遺伝子、ｐＣ２遺伝子、ｐ３遺伝子、ｐＣ３遺伝子、ｐ４遺伝子、ｐＣ４遺伝子、ｐ５遺伝子、ｐＣ５遺伝子、ｐ６遺伝子およびｐＣ６遺伝子を用いたＲＮＡｉ誘起ベクターの構築
（１）ＲＧＳＶのｐ１遺伝子、ｐＣ１遺伝子、ｐ２遺伝子、ｐＣ２遺伝子、ｐ３遺伝子、ｐＣ３遺伝子、ｐ４遺伝子、ｐＣ４遺伝子、ｐ５遺伝子、ｐＣ５遺伝子、ｐ６遺伝子およびｐＣ６遺伝子を、特異的プライマーセットを用いて増幅する：
ＲＧＳＶ感染イネの葉から、定法に従って総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡの抽出は、RNeasyPlantMiniKit（Qiagen）を使用して、添付の説明書に従って行った。総ＲＮＡ  １μｇを用いて、SuperScriptIII（Invitrogen）のマニュアルに従って逆転写反応を行い、
ｃＤＮＡを合成し、以下のプライマーセット：
trigger  RGSV-p1についてプライマーセット８：
フォワードプライマー：caccatgggttactatcactccaaga（配列番号７２）；と
リバースプライマー：tagtgatatattaaatcaaaatccag（配列番号７３）、
trigger  RGSV-pC1についてプライマーセット９：
フォワードプライマー：caccatgaatacaaactgtcaattctct（配列番号７４）；と
リバースプライマー：tatgttgggtcatctatggctt（配列番号７５）、
trigger  RGSV-p2についてプライマーセット１０：
フォワードプライマー：caccatgtctatttcaataccagcaag（配列番号７６）；と
リバースプライマー：cctccaatcttcttcagttcat（配列番号７７）、
trigger  RGSV-pC2についてプライマーセット１１：
フォワードプライマー：caccatggggttgcttgtgatcaca（配列番号７８）；と
リバースプライマー：tatcttagaatcatattctccattt（配列番号７９）、
trigger  RGSV-p3についてプライマーセット１２：
フォワードプライマー：caccatgtcacttagttcaagtagtct（配列番号８０）；と
リバースプライマー：ggaaaattaaggtctggtagatc（配列番号８１）、
trigger  RGSV-pC3についてプライマーセット１３：
フォワードプライマー：caccatgttttcactttcagactttctg（配列番号８２）；と
リバースプライマー：ttgatatgattacaatctgaagtg（配列番号８３）、
trigger  RGSV-p4についてプライマーセット１４：
フォワードプライマー：caccatggcaaacttattcttcagtac（配列番号８４）；と
リバースプライマー：tctcattctagaacaccttgga（配列番号８５）、
trigger  RGSV-pC4についてプライマーセット１５：
フォワードプライマー：caccatgtggaattcccaatatgtgaa（配列番号８６）；と
リバースプライマー：cttctaaattcttttaaatcacttc（配列番号８７）
trigger  RGSV-p5についてプライマーセット１６：
フォワードプライマー：caccatgtctggcatgaattcagaag（配列番号８８）；と
リバースプライマー：ggcttatatattgtcataggcaa（配列番号８９）、
trigger  RGSV-pC5についてプライマーセット１７：
フォワードプライマー：caccatgggtaaagtgcaatttggag（配列番号９０）；と
リバースプライマー：tatcaacggtactaatgggtct（配列番号９１）、
trigger  RGSV-p6についてプライマーセット１８：
フォワードプライマー：caccatgtctaaatctcattctgacgt（配列番号９２）；と
リバースプライマー：tattatatacataagcaggaattttg（配列番号９３）、ならびに
trigger  RGSV-pC6についてプライマーセット１９：
フォワードプライマー：caccatggctttactccaaaagctag（配列番号９４）；と
リバースプライマー：tcggacaggtaagacaagtct（配列番号９５）
を用いてそれぞれＰＣＲを行い、trigger  RGSV-p1（配列番号６０）、trigger  RGSV-pC1（配列番号６１）、trigger  RGSV-p2（配列番号６２）、trigger  RGSV-pC2（配列番号６３）、trigger  RGSV-p3（配列番号６４）、trigger  RGSV-pC3（配列番号６５）、trigger  RGSV-p4（配列番号６６）、trigger  RGSV-pC4（配列番号６７）、trigger  RGSV-p5（配列番号６８）、trigger  RGSV-pC5（配列番号６９）、trigger  RGSV-p6（配列番号７０）、およびtrigger  RGSV-pC6（配列番号７１）の各増幅産物を得た。
【０２１７】
（２）制限酵素またはGateway（Invitrogen）システムなどを用いて、形質転換用のＲＮＡｉバイナリーベクターを作製する：
上記（１）で得た各増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen  cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/trigger  RGSV-p1、pENTR/trigger  RGSV-pC1、pENTR/trigger  RGSV-p2、pENTR/trigger  RGSV-pC2、pENTR/trigger  RGSV-p3、pENTR/trigger  RGSV-pC3、pENTR/trigger  RGSV-p4、pENTR/trigger  RGSV-pC4、pENTR/trigger  RGSV-p5、pENTR/trigger  RGSV-pC5、pENTR/trigger  RGSV-p6、およびpENTR/trigger  RGSV-pC6を得た。
【０２１８】
このクローニングベクターを、キットに付属のE．coli株に形質転換し、同様に、製造業者の説明書に従って、適切な条件下で、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択した。単一のコロニーを単離して、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含む１〜２ｍｌのＬＢ培地中に接種し、定法に従って、このクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させた。定法に従って、形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的のトリガー領域がクローニングされていることを確認した。
【０２１９】
（３）ＲＮＡｉを引き起こす因子を形質転換ベクターにクローニングする：
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化し、pPANDA/trigger  RGSV-p1、pPANDA/trigger  RGSV-pC1、pPANDA/trigger  RGSV-p2、pPANDA/trigger  RGSV-pC2、pPANDA/trigger  RGSV-p3、pPANDA/trigger  RGSV-pC3、pPANDA/trigger  RGSV-p4、pPANDA/trigger  RGSV-pC4、pPANDA/trigger  RGSV-p5、pPANDA/trigger  RGSV-pC5、pPANDA/trigger  RGSV-p6、およびpPANDA/trigger  RGSV-pC6を得た。簡潔にいうと、２μｌ  ＬＲ反応緩衝液（５×）、１００〜３００ｎｇの上記エントリーベクター、３００ｎｇ  pANDAベクター、ＴＥを添加して総容積８μｌにする。２μｌのＬＲクロナーゼ酵素ミックス（Invitrogen  cat．11791-019）を加えて攪拌し、２５℃で一晩インキュベートした。その後、プロテイナーゼＫ溶液を１μｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。得られるベクターをE．coli  ＤＨ５αに形質転換し、５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンおよび５０μｇ／ｍｌ  ハイグロマイシンを含む培地中で増殖させた。
【０２２０】
実施例２Ａ：ＲＳＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネの作出
（１）実施例１Ａにおいて作成した上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する：
上記各ベクターを、エレクトロポレーション法によってGenePulser（BioRad）を用いて、製造業者の説明書に従ってアグロバクテリウムへ導入した。アグロバクテリウムの系統は、EHA101（Hood，1986，J．Bacteriol．168，1291）を用いた。実施例１Ａで構築した発現ベクターを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換した。エレクトロポーレーション装置はGENE  PULSER（登録商標）II（BIO-RAD）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養した。この培養液を２０ｍｇ／ｌ  カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ  スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  塩化ナトリウム）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。増殖させた形質転換アグロバクテリウムを、ＹＥＰ培地に播種して、一晩インキュベートし、この培養液と等量のグリセロールを入れてボルテックスミキサーで十分に混合し、−８０℃で使用時までストック溶液として保存した。
【０２２１】
（２）アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する；
アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、アルカリＳＤＳ法（Molecular  Cloning  第３版を参照のこと）によりプラスミドを抽出した後、ＰＣＲにより確認した。
【０２２２】
（３）カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、感染確認後、再分化させ、ＲＳＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出する；
ＲＳＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出するために、カルス化したイネを作製した。簡潔には、イネの完熟種子を小型籾すり機にかけ、籾を除去した種子１００〜１５０粒を５０ｍｌの使い捨て遠心管に入れた。７０％  エタノールを遠心管に入れて、数秒間種子を滅菌し、滅菌水で種子をすすいだ。滅菌水を吸引した後、４０ｍｌの２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を上記遠心管に入れ、振盪機で２０分間、１５０ｒｐｍで振盪して滅菌した。滅菌水を除去して、蒸留水で３回洗浄した。ピンセットで種子をカルス誘導培地（Ｎ６Ｄ培地）に２５種子／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールした。６０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において１８〜２１日間培養することによってカルス誘導した。カルス誘導の間、培地を、７〜１０日毎に新しいＮ６Ｄ培地と交換した。
【０２２３】
誘導して３週間後の種子の胚乳とシュート部分をメスで切り取るか、あるいはピンセットでもぎ取り、胚盤由来カルスのみを新しいカルス誘導培地Ｎ６Ｄ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールして、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において３日間、カルスを前培養した。カルスの前培養を始めるのと並行して、上記（１）において得られたアグロバクテリウムのストック溶液から滅菌した爪楊枝で菌体を採取し、ＡＢ培地に塗布した。塗布した菌体を滅菌した白金耳で培地全体に拡げ、３日間２８℃において遮光して前培養した。
【０２２４】
ＡＢ培地で増殖したアグロバクテリウムを滅菌した小さい薬さじで掻き取り、１０ｍｌの水に１０ｍｇ／ｍｌのアセトシリンゴンを５μｌ入れ、この溶液にアグロバクテリウムをＯＤ６００＝０．０１になるように懸濁した。懸濁液を滅菌シャーレに入れた。１シャーレ分の前培養したカルスを、一方の端をメッシュで覆った筒状のガラス管の中に入れ、ときどき軽く振って、１．５〜２分間メッシュ付きのガラス管ごと、上記懸濁液中に浸漬した。浸漬後、メッシュ付きのガラス管を滅菌ペーパータオルの上に置いて余分な水分を除去した。Ｎ６ＣＯ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレをテープでシールして、２３℃において遮光して３日間培養した。
【０２２５】
培養後、全てのカルスをＮ６ＳＥ培地に、９カルス／シャーレで移植し、３０〜３３℃において２４時間明期の条件下で、１４日間培養した。その間、カルスを、１回だけ新しいシャーレに移した。選択されたカルスをＲＥ培地に移し、３０〜３３℃において再分化してくるまで培養した。その間、７〜１０日間毎に、新しい培地を入れたシャーレにカルスを移した。再分化したイネをＨＦ培地に移し、２〜３週間培養した後、鉢上げした。
【０２２６】
（４）形質転換体当代（Ｔ０）株における導入遺伝子の確認
上記（３）において作出した形質転換体当代（Ｔ０）株において目的の遺伝子が導入されているか否かを確認するために、Ｔ０株からＣＴＡＢ法により調製したＤＮＡを鋳型に形質転換ベクター内のＧｕｓ−ｌｉｎｋｅｒ特異的プライマー及び内在コントロールとしてアクチン特異的プライマーの４種混合プライマーでＰＣＲを行い、アガロース電気泳動にて２本のＤＮＡバンドが増幅されることにより行った。Ｔ０株における導入遺伝子の転写産物の断片化によるｓｉＲＮＡの検出は、低分子ＲＮＡを抽出（基本的に、Hamilton，1999，Science．286，950に従った）した後、trigger  RSV-pC1（配列番号３９)、trigger  RSV-p2（配列番号４０)、trigger  RSV-pC2（配列番号４１)、trigger  RSV-p3（配列番号４２)、trigger  RSV-pC3（配列番号４３)、trigger  RSV-p4（配列番号４４)、およびtrigger  RSV-pC4（配列番号４５)をプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションすることにより行った。図５に示されるように、目的の遺伝子がＴ０株において導入され、かつ導入された配列が切断されたことが明らかになった。
【０２２７】
実施例２Ｂ：ＲＧＳＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネの作出
（１）実施例１Ｂにおいて作成した上記ベクターをエレクトロポレーション法などによってアグロバクテリウムへ導入する：
上記各ベクターを、エレクトロポレーション法によってGenePulser（BioRad）を用いて、製造業者の説明書に従ってアグロバクテリウムへ導入した。アグロバクテリウムの系統は、EHA101（Hood，1986，J．Bacteriol．168，1291）を用いた。実施例１Ｂで構築した発現ベクターを、エレクトロポーレーション法でアグロバクテリウムＥＨＡ１０１に形質転換する。エレクトロポーレーション装置はGENE  PULSER（登録商標）II（BIO-RAD）を用い、導入条件を２００Ω、２５μＦ、２．５ｋＶ、０．２ｃｍキュベットに設定した。エレクトロポーレーションを行ったアグロバクテリウムをＳＯＣ培地に懸濁し、２８℃で２時間振盪培養する。この培養液を２０ｍｇ／ｌ  カナマイシン、１００ｍｇ／ｌ  スペクチノマイシンを含むＬＢプレート培地（１０ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母エキス、１０ｇ／ｌ  塩化ナトリウム）上に拡散し、増殖した形質転換個体を選抜した。増殖させた形質転換アグロバクテリウムを、ＹＥＰ培地に播種して、一晩インキュベートし、この培養液と等量のグリセロールを入れてボルテックスミキサーで十分に混合し、−８０℃で使用時までストック溶液として保存した。
【０２２８】
（２）アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、ＰＣＲなどにより確認する；
アグロバクテリウムにベクターが導入されていることを、アルカリＳＤＳ法（Molecular  Cloning  第３版を参照のこと）によりプラスミドを抽出した後、ＰＣＲにより確認した。
【０２２９】
（３）カルス化したイネにアグロバクテリウムを感染させ、感染確認後、再分化させ、ＲＧＳＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出する；
ＲＧＳＶ各遺伝子のＲＮＡ干渉イネを作出するために、カルス化したイネを作製した。簡潔には、イネの完熟種子を小型籾すり機にかけ、籾を除去した種子１００〜１５０粒を５０ｍｌの使い捨て遠心管に入れた。７０％  エタノールを遠心管に入れて、数秒間種子を滅菌し、滅菌水で種子をすすいだ。滅菌水を吸引した後、４０ｍｌの２．５％次亜塩素酸ナトリウム溶液を上記遠心管に入れ、振盪機で２０分間、１５０ｒｐｍで振盪して滅菌した。滅菌水を除去して、蒸留水で３回洗浄する。ピンセットで種子をカルス誘導培地（Ｎ６Ｄ培地）に２５種子／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールした。６０μｍｏｌ／ｍ２ｓ、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において１８〜２１日間培養することによってカルス誘導した。カルス誘導の間、培地を、７〜１０日毎に新しいＮ６Ｄ培地と交換する。
【０２３０】
誘導して３週間後の種子の胚乳とシュート部分をメスで切り取るか、あるいはピンセットでもぎ取り、胚盤由来カルスのみを新しいカルス誘導培地Ｎ６Ｄ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレの周りをテープでシールして、２４時間明期の条件下で、３０〜３３℃において３日間、カルスを前培養した。カルスの前培養を始めるのと並行して、上記（１）において得られたアグロバクテリウムのストック溶液から滅菌した爪楊枝で菌体を採取し、ＡＢ培地に塗布する。塗布した菌体を滅菌した白金耳で培地全体に拡げ、３日間２８℃において遮光して前培養した。
【０２３１】
ＡＢ培地で増殖したアグロバクテリウムを滅菌した小さい薬さじで掻き取り、１０ｍｌの水に１０ｍｇ／ｍｌのアセトシリンゴンを５μｌ入れ、この溶液にアグロバクテリウムをＯＤ６００＝０．０１になるように懸濁した。懸濁液を滅菌シャーレに入れた。１シャーレ分の前培養したカルスを、一方の端をメッシュで覆った筒状のガラス管の中に入れ、ときどき軽く振って、１．５〜２分間メッシュ付きのガラス管ごと、上記懸濁液中に浸漬する。浸漬後、メッシュ付きのガラス管を滅菌ペーパータオルの上に置いて余分な水分を除去する。Ｎ６ＣＯ培地に１６カルス／シャーレで置床し、シャーレをテープでシールして、２３℃において遮光して３日間培養した。
【０２３２】
培養後、全てのカルスをＮ６ＳＥ培地に、９カルス／シャーレで移植し、３０〜３３℃において２４時間明期の条件下で、１４日間培養した。その間、カルスを、１回だけ新しいシャーレに移した。選択されたカルスをＲＥ培地に移し、３０〜３３℃において再分化してくるまで培養した。その間、７〜１０日間毎に、新しい培地を入れたシャーレにカルスを移した。再分化したシュートおよび根をＨＦ培地に移し、２〜３週間培養した後、鉢上げした。
【０２３３】
（４）形質転換体当代（Ｔ０）株における導入遺伝子の確認
上記（３）において作出した形質転換体当代（Ｔ０）株において目的の遺伝子が導入されているか否かを確認するために、Ｔ０株からＣＴＡＢ法により調製したＤＮＡを鋳型に形質転換ベクター内のＧｕｓ−ｌｉｎｋｅｒ特異的プライマー及び内在コントロールとしてアクチン特異的プライマーの４種混合プライマーでＰＣＲを行い、アガロース電気泳動で２本のＤＮＡバンドが増幅されることにより行った。Ｔ０株における導入遺伝子の転写産物の断片化によるｓｉＲＮＡの検出は、低分子ＲＮＡを抽出（基本的に、Hamilton，1999，Science．286，950に従った）した後、trigger  RGSV-ｐ１（配列番号６０)、trigger  RGSV-ｐＣ１（配列番号６１)、trigger  RGSV-ｐ２（配列番号６２)、trigger  RGSV-ｐＣ２（配列番号６３)、trigger  RGSV-ｐ３（配列番号６４)、trigger  RGSV-ｐＣ３（配列番号６５)、trigger  RGSV-ｐ４（配列番号６６)、trigger  RGSV-ｐＣ４（配列番号６７)、trigger  RGSV-ｐ５（配列番号６８)、trigger  RGSV-ｐＣ５（配列番号６９)、trigger  RGSV-ｐ６（配列番号７０)、およびtrigger  RGSV-ｐＣ６（配列番号７１)のセンス鎖ＲＮＡをプローブとしてノーザンハイブリダイゼーションすることにより行った。
【０２３４】
実施例３Ａ：形質転換体Ｔ１におけるＲＳＶ抵抗性検定
（１）実施例１Ａで作製したpPANDA/trigger  RSV-pC1、pPANDA/trigger  RSV-p2、pPANDA/trigger  RSV-pC2、pPANDA/trigger  RSV-p3、pPANDA/trigger  RSV-pC3、pPANDA/trigger  RSV-p4、およびpPANDA/trigger  RSV-pC4で形質転換したＴ１植物へのＲＳＶ感染；
得られたＴ０イネの各々を１株とし、それぞれの株から全てのＴ１種子を回収した。イネへのＲＳＶの接種は、２〜３葉期まで生育させた各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１５株に対して、約８０％がＲＳＶを保毒したヒメトビウンカの成虫を健全イネ１株当たり１０頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行った。図６および図７は、ＲＳＶ接種してから４０日後の比較である。図６においては、左側の鉢から順に、野生型株、Trigger  RSV-ｐＣ１、Trigger  RSV-ｐ２、Trigger  RSV-ｐＣ２、Trigger  RSV-ｐ３、Trigger  RSV-ｐＣ３、Trigger  RSV-ｐ４、およびTrigger  RSV-ｐＣ４導入イネを示している。図６は、Trigger  RSV-ｐＣ１、Trigger  RSV-ｐＣ３、Trigger  RSV-ｐＣ４の導入形質転換体がＲＳＶに対して抵抗性を有しており、ＲＳＶに対して耐性が付与されたことを明らかに示す。図７においては、左側の鉢から順に、健全の野生型株、以下ＲＳＶを接種した野生株、Trigger  RSV-ｐＣ２、Trigger  RSV-ｐ４、Trigger  RSV-ｐ２、Trigger  RSV-ｐ３、Trigger  RSV-ｐＣ１、Trigger  RSV-ｐＣ４、およびTrigger  RSV-ｐＣ３導入イネを示し、抵抗性強度の順に整列している。図７は、Trigger  RSV-ｐＣ３、Trigger  RSV-ｐＣ４、およびTrigger  RSV-ｐＣ１導入形質転換体がＲＳＶに対して抵抗性を有しており、ＲＳＶに対して耐性が付与されたことを明らかに示す。
【０２３５】
（２）感染後のtrigger  RSV-pC1（配列番号３９)、trigger  RSV-p2（配列番号４０)、trigger  RSV-pC2（配列番号４１)、trigger  RSV-p3（配列番号４２)、trigger  RSV-pC3（配列番号４３)、trigger  RSV-p4（配列番号４４)、およびtrigger  RSV-pC4（配列番号４５)を導入したＴ１植物の抵抗性検定；
trigger  RSV-pC1、trigger  RSV-p2、trigger  RSV-pC2、trigger  RSV-p3、trigger  RSV-pC3、trigger  RSV-p4、およびtrigger  RSV-pC4のいずれかで形質転換したＴ１植物の抵抗性検定は、（１）で接種した植物全ての株に対して、接種後３週以内に発病した個体を感受性、接種３〜８週後に発病した個体を発病遅延型抵抗性、接種８週以後、さらには終生に渡って病徴が認められない個体を完全型抵抗性としてスコアリングを行った。なお、ＣＴＡＢ法によりＴ１植物から調製したＤＮＡを鋳型にして、植物形質転換ベクター内のＧＵＳ配列をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、導入遺伝子が後代Ｔ１に受け継がれなかった個体はスコアリングから除外した。接種試験の結果を以下の表３および図６Ｂに示す。
【０２３６】
【表３】
2011067115.tif 000004
【０２３７】
ＲＳＶ−ｐＣ３およびＲＳＶ−ｐＣ４を標的とした形質転換イネは、全てＲＳＶ抵抗性であった（すなわち、「１００％完全抵抗性集団」を得た）。コントロールとして供した野生型イネ（日本晴）においては、全９６株のうち９株が感染に失敗したが、残りの８７株は全てＲＳＶに感染し、病徴の発現は一定（通常、３週間までには病徴が出揃う）で、遅延することはなかった。それに対して、ＲＳＶ−ｐＣ１を標的とした形質転換イネは、発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られた。一方、ＲＳＶ−ｐ２を標的としたイネは、発病遅延型抵抗性が得られたが、中程度の抵抗性であり、実用レベルではなかった。ＲＳＶ−ｐ３を標的としたイネは、感受性（すなわち、ほぼ全て感染するもの）が得られたが、見かけは中程度の抵抗性を示した。次いで、ＲＳＶ−ｐＣ２およびＲＳＶ−ｐ４を標的とした形質転換イネは、感受性（すなわち、ほぼ全て感染するもの）が得られた。
【０２３８】
ＲＳＶ−ｐＣ３を標的とした形質転換イネは、感染個体集団の１００％が完全抵抗性を示した。ＲＳＶ−ｐＣ３は、ウイルスのヌクレオキャプシド（外被）タンパク質であることから、おそらくＲＳＶ−ｐＣ３の発現を抑制すると、ウイルス粒子の形成が阻害され、結果的にウイルスの活動を静止することができ、完全型抵抗性を示す株が得られたと考えられる。
【０２３９】
ＲＳＶ−ｐＣ４を標的とした形質転換イネは、感染個体集団の１００％が完全抵抗性を示した。ＲＳＶ−ｐＣ４は、ウイルスの細胞間移行タンパク質であることから、おそらくＲＳＶ−ｐＣ４の発現を抑制すると、感染細胞から隣り合った未感染細胞へのウイルスの拡がりが効果的に阻害され、結果的にウイルスの活動を静止することができ、完全型抵抗性を示す株が得られたと考えられる。
【０２４０】
ＲＳＶ−ｐＣ１を標的とした形質転換イネは、約８３％程度が完全型抵抗性を示し、約１２％程度が発病遅延型抵抗性を示した（すなわち、９５％「抵抗性集団」または「８３％完全抵抗性集団」を得た）。ＲＳＶ−ｐＣ１は、ウイルスの複製に関与するタンパク質で、初期の段階ではＲＮＡｉの効果からＲＮＡ複製酵素の発現量が抑制され見かけ上抵抗性を示すが、ＲＮＡｉは完全な発現抑制は不可能なことであり、少しずつでもウイルス増殖が進むにつれてＲＳＶ−ｐＣ１の発現量が増加し、結果的に、ＲＳＶ−ｐＣ１の発現抑制効果が薄れ、遅延型抵抗性を示す株が得られたと考えられる。
【０２４１】
ＲＳＶ−ｐ２を標的とした形質転換イネは、約２５％程度が完全型抵抗性を示し、約６０％程度が発病遅延型抵抗性を示した（すなわち、８５％「抵抗性集団」または「２５％完全抵抗性集団」を得た）が、ＲＳＶ−ｐＣ１と比較して実用レベルではなかった。ｐ２は、機能未知のタンパク質であるが、６０％程度の発病遅延型抵抗性を示したことから、おそらくはウイルス感染には必要であるが、アクセサリー的な働きをすると想定され、ウイルスの複製が進むにつれ、結果的に、ＲＳＶ−ｐ２の発現抑制効果が薄れ、遅延型抵抗性を示す株が得られたと考えられる。
【０２４２】
ＲＳＶ−ｐ３を標的とした形質転換イネは、見かけ上は中程度の抵抗性に見受けられるが、発病カウントから感受性（すなわち、ほぼ全て感染するもの）と考えられた。ＲＳＶ−ｐ３タンパク質は、遺伝子サイレンシングサプレッサーとして機能すると考えられているが、この機能以外に、おそらくは植物での感染には不要であるが病徴決定因子としての機能を果たすことから、ＲＳＶ−ｐ３タンパク質の発現が抑制されることにより、見かけ上中程度の抵抗性の表現型を示したと考えられる。
【０２４３】
ＲＳＶ−ｐ４およびＲＳＶ−ｐＣ２を標的とした形質転換イネは感受性（すなわち、ほぼ全て感染するもの）が得られた。ＲＳＶ−ｐＣ２およびＲＳＶ−ｐ４は、現段階で機能未知であるが、本結果から、両タンパク質は、おそらく植物での感染に不要なタンパク質であることから、これらの発現抑制効果はウイルス複製に影響を与えず、結果的に、抵抗性を示す株は全く得られないと考えられる。
【０２４４】
上記の結果から、本発明の形質転換イネ、すなわちＲＳＶ−ｐＣ３、ＲＳＶ−ｐＣ４およびＲＳＶ−ｐＣ１を発現抑制させたイネは、ＲＳＶに対する発病遅延型抵抗性ないし抵抗性を示すことが明らかになった。
【０２４５】
（３）作出されたＲＳＶ抵抗性イネの後代Ｔ３植物における接種検定；
後代植物においてもＲＳＶ抵抗性が受け継がれているか否かを確認するために、Ｔ１植物からＴ２種子を取得して、Ｔ２植物を生育させる。このＴ２植物からＴ３種子を得、９葉期まで生育させて、試験用Ｔ３植物を得る。得られたＴ３植物において、上記（２）と同様に、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＳＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ1株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。上記（２）と同様に接種検定を行うと、Ｔ３植物においても、ＲＳＶ抵抗性ないし発病遅延型抵抗性が受け継がれていることが確認できる。
【０２４６】
上記の結果から、本発明の形質転換イネが、ＲＳＶに対する発病遅延型抵抗性ないし抵抗性を示すことが明らかになる。
【０２４７】
実施例３Ｂ：形質転換体Ｔ１におけるＲＧＳＶ抵抗性検定
（１）実施例１Ｂで作製したpPANDA/trigger  RGSV-pC1、pPANDA/trigger  RGSV-p2、pPANDA/trigger  RGSV-pC2、pPANDA/trigger  RGSV-p3、pPANDA/trigger  RGSV-pC3、pPANDA/trigger  RGSV-p4、pPANDA/trigger  RGSV-pC4、pPANDA/trigger  RGSV-p5、pPANDA/trigger  RGSV-pC5、pPANDA/trigger  RGSV-p6およびpPANDA/trigger  RGSV-pC6で形質転換したＴ１植物へのＲＧＳＶ感染；
得られたＴ０イネの各々を１株とし、それぞれの株から全てのＴ１種子を回収した。イネへのＲＧＳＶの接種は、２〜３葉期まで生育させた各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１５株に対して、約３０％がＲＧＳＶを保毒したトビイロウンカの成虫を健全イネ１株当たり１０頭程度になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。
【０２４８】
（２）感染後のtrigger  RGSV-p1（配列番号６０)、trigger  RGSV-pC1（配列番号６１)、trigger  RGSV-p2（配列番号６２)、trigger  RGSV-pC2（配列番号６３)、trigger  RGSV-p3（配列番号６４)、trigger  RGSV-pC3（配列番号６５)、trigger  RGSV-p4（配列番号６６)、trigger  RGSV-pC4（配列番号６７)、trigger  RGSV-p5（配列番号６８)、trigger  RGSV-pC5（配列番号６９)、trigger  RGSV-p6（配列番号７０)およびtrigger  RGSV-pC6（配列番号７１)を導入したＴ１植物の抵抗性検定；
trigger  RGSV-p1、trigger  RGSV-pC1、trigger  RGSV-p2、trigger  RGSV-pC2、trigger  RGSV-p3、trigger  RGSV-pC3、trigger  RGSV-p4、trigger  RGSV-pC4、trigger  RGSV-p5、trigger  RGSV-pC5、trigger  RGSV-p6およびtrigger  RGSV-pC6のいずれかで形質転換したＴ１植物の抵抗性検定は、（１）で接種した植物全ての株に対して、接種後３週以内に発病した個体を感受性、接種３〜８週後に発病した個体を発病遅延型抵抗性、接種８週以後、さらには終生に渡って病徴が認められない個体を完全型抵抗性としてスコアリングを行う。
【０２４９】
ＲＧＳＶの結果はＲＳＶとの遺伝子関係から予想でき、ＲＳＶで抵抗性が認められたｐＣ３およびｐＣ４（ＲＳＶ−ｐＣ３およびＲＳＶ−ｐＣ４）とオーソロガスな関係にある遺伝子、すなわち、ＲＧＳＶのｐＣ５およびｐＣ６（ＲＧＳＶ−ｐＣ５およびＲＧＳＶ−ｐＣ６）を標的とした形質転換イネは、全てＲＧＳＶ抵抗性が得られる（すなわち、「１００％完全抵抗性集団」が得られる）と予想される。
【０２５０】
また、ＲＳＶで発病遅延型抵抗性（すなわち、感染が遅延するもの）が得られたｐＣ１（ＲＳＶ−ｐＣ１）とオーソロガスな関係にある遺伝子、すなわち、ＲＧＳＶのｐＣ１（ＲＧＳＶ−ｐＣ１）を標的とした形質転換イネは、約８０％程度が完全型抵抗性を示し、約１５％程度が発病遅延型抵抗性を示す（すなわち、９５％「抵抗性集団」または「８０％完全抵抗性集団」が得られる）と予想される。
【０２５１】
（３）作出されたＲＧＳＶ抵抗性イネの後代Ｔ３植物における接種検定；
後代植物においてもＲＧＳＶ抵抗性が受け継がれているか否かを確認するために、Ｔ１植物からＴ２種子を取得して、Ｔ２植物を生育させる。このＴ２植物からＴ３種子を得、９葉期まで生育させて、試験用Ｔ３植物を得る。得られたＴ３植物において、上記（２）と同様に、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約３０％がＲＧＳＶを保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ1株当たり５頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。上記（２）と同様に接種検定を行うと、Ｔ３植物においても、ＲＧＳＶ抵抗性ないし発病遅延型抵抗性が受け継がれていることが確認できる。
【０２５２】
上記の結果から、本発明の形質転換イネ、すなわちＲＧＳＶ−ｐＣ５、ＲＧＳＶ−ｐＣ６およびＲＧＳＶ−ｐＣ１を発現抑制させたイネは、ＲＧＳＶに対する発病遅延型抵抗性ないし抵抗性を示すことが明らかになる。
【０２５３】
実施例４Ａ：形質転換体Ｔ１における他のＲＳＶ株感染とＲＮＡｉ誘導の確認
（１）Ｔ１植物への他のＲＳＶ株感染；
実施例１Ａにおいて得られたベクターを使用して、実施例２Ａに記載されるようにＲＳＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＳＶのＴ株、ＨＺ株およびＪＹ株の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＳＶ各株を保毒したヒメトビウンカの成虫を健全イネ１株当たり１０頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、Ｏ株に基づく発現抑制剤がＲＳＶのＯ株感染に対する抵抗性のみならず、Ｏ株以外のＲＳＶ株の感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２５４】
実施例４Ｂ：形質転換体Ｔ１における他のＲＧＳＶ株感染とＲＮＡｉ誘導の確認
（１）Ｔ１植物への他のＲＧＳＶ株感染；
実施例１Ｂにおいて得られたベクターを使用して、実施例２Ｂに記載されるようにＲＧＳＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＧＳＶのLaguna株、South  Cotabato株およびShaxian株の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約３０％がＲＧＳＶ各株を保毒したトビイロウンカの成虫を健全イネ1株当たり１０頭程度になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、Ｏ株に基づく発現抑制剤がＲＧＳＶのＯ株感染に対する抵抗性のみならず、Ｏ株以外のＲＧＳＶ株の感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２５５】
実施例５Ａ：Ｏ株以外のＲＳＶのタンパク質（ＲＳＶ−ｐＣ３、ＲＳＶ−ｐＣ４あるいはＲＳＶ−ｐＣ１）の発現抑制イネの作出およびＲＮＡｉ誘導の確認
（ＨＺ株）
ＲＳＶのＨＺ株感染イネの葉から、実施例１Ａに記載されるように、配列情報としては、アクセッション番号AF508865（配列番号９８）、AF513505（配列番号９９）あるいはAY186788（配列番号１００）を用いて、定法に従って総ＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、目的の領域（Trigger  RSV-pC3(HZ)、Trigger  RSV-pC4 (HZ)あるいはTrigger  RSV-pC1 (HZ)）に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、目的の領域の増幅産物を得る。
【０２５６】
上記実施例１（２）に記載されるように、上記で得た増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen  cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/Trigger  RSV-pC3(HZ)、pENTR/Trigger  RSV-pC4 (HZ)あるいはpENTR/Trigger  RSV-pC1 (HZ)を得る。
【０２５７】
このクローニングベクターを、同様に上記実施例１（２）に記載されるようにE．coli株に形質転換し、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択する。定法に従って、単一のコロニーを単離してこのクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させる。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認する。
【０２５８】
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、上記実施例１に記載されるように、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化する。
【０２５９】
実施例２Ａに記載されるようにＲＳＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＳＶのＯ株、Ｔ株、ＨＺ株およびＪＹ株の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約８０％がＲＳＶ各株を保毒したツマグロヨコバイの成虫を健全イネ1株当たり１０頭以上になるように放飼、２６℃程度の温室で約２日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、ＨＺ株の情報に基づいて設計したTrigger  RSV-pC3(HZ)、Trigger  RSV-pC4 (HZ)あるいはTrigger  RSV-pC1 (HZ) を含む発現抑制剤は、ＲＳＶの秋田株感染に対する抵抗性のみならず、ＲＳＶの秋田株以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２６０】
（他の株）
ＨＺ株に基づく上記実験と同様の実験をＴ株およびＪＹ株についても行う（Ｔ株については、アクセッション番号NC_003776、NC_003753およびアクセッション番号NC_003755、ＪＹ株についてアクセッション番号EF141329、EF141330およびアクセッション番号EF141327を参照して作製することができる。）。これらの実験を行うことによって、Ｔ株およびＪＹ株の情報に基づいて設計したTrigger  RSV-pC3、Trigger  RSV-pC4あるいはTrigger  RSV-pC1を含む発現抑制剤は、ＲＳＶのそれぞれが由来する株感染に対する抵抗性のみならず、ＲＳＶのそれぞれが由来する株以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２６１】
実施例５Ｂ：Ｏ株以外のＲＧＳＶのタンパク質（ＲＧＳＶ−ｐＣ５、ＲＧＳＶ−ｐＣ６あるいはＲＧＳＶ−ｐＣ１）の発現抑制イネの作出およびＲＮＡｉ誘導の確認
（Shaxian株）
ＲＧＳＶのShaxian株感染イネの葉から、実施例１Ｂに記載されるように、配列情報としては、アクセッション番号AF290947（配列番号１０１）、AF287949（配列番号１０２）あるいはAF509470（配列番号１０３）を用いて、定法に従って総ＲＮＡを抽出して、逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成し、目的の領域（Trigger  RGSV-pC5(Shaxian)、Trigger  RGSV-pC6 (Shaxian)あるいはTrigger  RGSV-pC1 (Shaxian) ）に特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、目的の領域の増幅産物を得る。
【０２６２】
上記実施例１（２）に記載されるように、上記で得た増幅産物を、pENTRTM/D-TOPO（登録商標）クローニングキット（Invitrogen  cat．K2435-20）を用いて、製造業者の説明書に従ってpENTR/D-TOPO（Invitrogen）にクローン化し、エントリーベクターpENTR/Trigger  RGSV-pC5 (Shaxian)、pENTR/ Trigger  RGSV-pC6 (Shaxian)あるいはpENTR/ Trigger  RGSV-pC1(Shaxian)を得る。
【０２６３】
このクローニングベクターを、同様に上記実施例１（２）に記載されるようにE．coli株に形質転換し、形質転換E．coliを５０μｇ／ｍｌ  カナマイシンを含むＬＢプレート上で選択する。定法に従って、単一のコロニーを単離してこのクローニングベクターを含む形質転換E．coliを増殖させる。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定することによって、目的の領域がクローニングされていることを確認する。
【０２６４】
上記のようにして得られたプラスミドＤＮＡを、上記実施例１に記載されるように、Gateway（Invitrogen）システムのＬＲクロナーゼ反応系を用いて、pANDAベクター（奈良先端大学院大学島本教授より分譲）へクローン化する。
【０２６５】
実施例２Ｂに記載されるようにＲＧＳＶ抵抗性イネを作出し、Ｔ０イネの各々を１株とする。それぞれの株から全てのＴ１種子を回収する。イネへのＲＧＳＶのＯ株、Laguna株、South  Cotabato株およびShaxian株の接種は、各形質転換体系統につきＴ１イネおよそ１０株に対して、約３０％がＲＧＳＶのShaxian株を保毒したトビイロウンカの成虫を健全イネ1株当たり１０頭程度になるように放飼、２６℃程度の温室で約１日間イネを吸汁させて行う。これらの実験を行うことによって、Shaxian株の情報に基づいて設計したTrigger  RGSV-pC5(Shaxian)、Trigger  RGSV-pC6 (Shaxian)あるいはTrigger  RGSV-pC1 (Shaxian) を含む発現抑制剤は、ＲＧＳＶの秋田株感染に対する抵抗性のみならず、ＲＧＳＶの秋田株以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２６６】
（他の株）
Shaxian株に基づく上記実験と同様の実験をLaguna株およびSouth  Cotabato株についても行う（Laguna株については、アクセッション番号NC_002327、NC_002328およびアクセッション番号NC_002323、South  Cotabato株についてアクセッション番号AB023779、AB023780およびアクセッション番号AB023770を参照して作製することができる。）。これらの実験を行うことによって、Laguna株およびSouth  Cotabato株の情報に基づいて設計したTrigger  RGSV-pC5、Trigger  RGSV-pC6あるいはTrigger  RGSV-pC1を含む発現抑制剤は、ＲＧＳＶのそれぞれが由来する株感染に対する抵抗性のみならず、ＲＧＳＶのそれぞれが由来する株以外の株感染に対する抵抗性も付与することを確認することができる。
【０２６７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０２６８】
本発明により、より無病徴のレベルの高い抵抗性を示し、抑制または安定した抵抗性が付与されたテヌイウイルス属のウイルス抵抗型イネの作出方法および抵抗型品種が提供され、テヌイウイルス病の防除対策手段のひとつとして活用される。
【配列表フリーテキスト】
【０２６９】
配列番号１は、ＲＳＶのｐＣ１遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ１）をコードする核酸配列である。
配列番号２は、ＲＳＶのｐＣ１遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ１）のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＲＳＶのｐＣ３遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ３）をコードする核酸配列である。
配列番号４は、ＲＳＶのｐＣ３遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ３）のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＲＳＶのｐＣ４遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ４）をコードする核酸配列である。
配列番号６は、ＲＳＶのｐＣ４遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ４）のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＲＳＶのｐ２遺伝子（ＲＳＶ−ｐ２）をコードする核酸配列である。
配列番号８は、ＲＳＶのｐ２遺伝子（ＲＳＶ−ｐ２）のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＲＳＶのｐＣ２遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ２）をコードする核酸配列である。
配列番号１０は、ＲＳＶのｐＣ２遺伝子（ＲＳＶ−ｐＣ２）のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＲＳＶのｐ３遺伝子（ＲＳＶ−ｐ３）をコードする核酸配列である。
配列番号１２は、ＲＳＶのｐ３遺伝子（ＲＳＶ−ｐ３）のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ＲＳＶのｐ４遺伝子（ＲＳＶ−ｐ４）をコードする核酸配列である。
配列番号１４は、ＲＳＶのｐ４遺伝子（ＲＳＶ−ｐ４）のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ＲＧＳＶのｐＣ１遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ１）をコードする核酸配列である。
配列番号１６は、ＲＧＳＶのｐＣ１遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ１）のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ＲＧＳＶのｐＣ５遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ５）をコードする核酸配列である。
配列番号１８は、ＲＧＳＶのｐＣ５遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ５）のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ＲＧＳＶのｐＣ６遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ６）をコードする核酸配列である。
配列番号２０は、ＲＧＳＶのｐＣ６遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ６）のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ＲＧＳＶのｐ１遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ１）をコードする核酸配列である。
配列番号２２は、ＲＧＳＶのｐ１遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ１）のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ＲＧＳＶのｐ２遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ２）をコードする核酸配列である。
配列番号２４は、ＲＧＳＶのｐ２遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ２）のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ＲＧＳＶのｐＣ２遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ２）をコードする核酸配列である。
配列番号２６は、ＲＧＳＶのｐＣ２遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ２）のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ＲＧＳＶのｐ３遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ３）をコードする核酸配列である。
配列番号２８は、ＲＧＳＶのｐ３遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ３）のアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ＲＧＳＶのｐＣ３遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ３）をコードする核酸配列である。
配列番号３０は、ＲＧＳＶのｐＣ３遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ３）のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ＲＧＳＶのｐ４遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ４）をコードする核酸配列である。
配列番号３２は、ＲＧＳＶのｐ４遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ４）のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＲＧＳＶのｐＣ４遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ４）をコードする核酸配列である。
配列番号３４は、ＲＧＳＶのｐＣ４遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐＣ４）のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ＲＧＳＶのｐ５遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ５）をコードする核酸配列である。
配列番号３６は、ＲＧＳＶのｐ５遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ５）のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＲＧＳＶのｐ６遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ６）をコードする核酸配列である。
配列番号３８は、ＲＧＳＶのｐ６遺伝子（ＲＧＳＶ−ｐ６）のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、trigger  RSV-pC1の核酸配列である。
配列番号４０は、trigger  RSV-p2の核酸配列である。
配列番号４１は、trigger  RSV-pC2の核酸配列である。
配列番号４２は、trigger  RSV-p3の核酸配列である。
配列番号４３は、trigger  RSV-pC3の核酸配列である。
配列番号４４は、trigger  RSV-p4の核酸配列である。
配列番号４５は、trigger  RSV-pC4の核酸配列である。
配列番号４６は、trigger  RSV-pC1についてのフォワードプライマー（CACCATGACGACACCACCTCTCGT）の配列である。
配列番号４７は、trigger  RSV-pC1についてのリバースプライマー（TCTTCCACTGGCATTCTCAAG）の配列である。
配列番号４８は、trigger  RSV-p2についてのフォワードプライマー（CACCACGGAGAATCTCGTCTTCA）の配列である。
配列番号４９は、trigger  RSV-p2についてのリバースプライマー（CTTTGAGATGGGTATTCCATTGG）の配列である。
配列番号５０は、trigger  RSV-pC2についてのフォワードプライマー（CACCACAATCTTTAATATGGCGTG）の配列である。
配列番号５１は、trigger  RSV-pC2についてのリバースプライマー（GGGCTTGATTGCAACACCATG）の配列である。
配列番号５２は、trigger  RSV-p3についてのフォワードプライマー（CACCGACATCATCTAAGTATGAACG）の配列である。
配列番号５３は、trigger  RSV-p3についてのリバースプライマー（GCCTTTTCTTACTAGGTGATCTA）の配列である。
配列番号５４は、trigger  RSV-pC3についてのフォワードプライマー（CACCACAATGGGCACCAACAAGCCA）の配列である。
配列番号５５は、trigger  RSV-pC3についてのリバースプライマー（TTGTGGAACATAGTCCCACAG）の配列である。
配列番号５６は、trigger  RSV-p4についてのフォワードプライマー（CACCGATGCAAGACGTACAAAGGAC）の配列である。
配列番号５７は、trigger  RSV-p4についてのリバースプライマー（CTCTTCTGTGTCTGAGCTCTC）の配列である。
配列番号５８は、trigger  RSV-pC4についてのフォワードプライマー（CACCGCTTTGTCTCGACTTTTGTCC）の配列である。
配列番号５９は、trigger  RSV-pC4についてのリバースプライマー（GCTTATCCTCCAAAGCCAGAAA）の配列である。
配列番号６０は、trigger  RGSV-p1の核酸配列である。
配列番号６１は、trigger  RGSV-pC1の核酸配列である。
配列番号６２は、trigger  RGSV-p2の核酸配列である。
配列番号６３は、trigger  RGSV-pC2の核酸配列である。
配列番号６４は、trigger  RGSV-p3の核酸配列である。
配列番号６５は、trigger  RGSV-pC3の核酸配列である。
配列番号６６は、trigger  RGSV-p4の核酸配列である。
配列番号６７は、trigger  RGSV-pC4の核酸配列である。
配列番号６８は、trigger  RGSV-p5の核酸配列である。
配列番号６９は、trigger  RGSV-pC5の核酸配列である。
配列番号７０は、trigger  RGSV-p6の核酸配列である。
配列番号７１は、trigger  RGSV-pC6の核酸配列である。
配列番号７２は、trigger  RGSV-p1についてのフォワードプライマー（caccatgggttactatcactccaaga）の配列である。
配列番号７３は、trigger  RGSV-p1についてのリバースプライマー（tagtgatatattaaatcaaaatccag）の配列である。
配列番号７４は、trigger  RGSV-pC1についてのフォワードプライマー（caccatgaatacaaactgtcaattctct）の配列である。
配列番号７５は、trigger  RGSV-pC1についてのリバースプライマー（tatgttgggtcatctatggctt）の配列である。
配列番号７６は、trigger  RGSV-p2についてのフォワードプライマー（caccatgtctatttcaataccagcaag）の配列である。
配列番号７７は、trigger  RGSV-p2についてのリバースプライマー（cctccaatcttcttcagttcat）の配列である。
配列番号７８は、trigger  RGSV-pC2についてのフォワードプライマー（caccatggggttgcttgtgatcaca）の配列である。
配列番号７９は、trigger  RGSV-pC2についてのリバースプライマー（tatcttagaatcatattctccattt）の配列である。
配列番号８０は、trigger  RGSV-p3についてのフォワードプライマー（caccatgtcacttagttcaagtagtct）の配列である。
配列番号８１は、trigger  RGSV-p3についてのリバースプライマー（ggaaaattaaggtctggtagatc）の配列である。
配列番号８２は、trigger  RGSV-pC3についてのフォワードプライマー（caccatgttttcactttcagactttctg）の配列である。
配列番号８３は、trigger  RGSV-pC3についてのリバースプライマー（ttgatatgattacaatctgaagtg）の配列である。
配列番号８４は、trigger  RGSV-p4についてのフォワードプライマー（caccatggcaaacttattcttcagtac）の配列である。
配列番号８５は、trigger  RGSV-p4についてのリバースプライマー（tctcattctagaacaccttgga）の配列である。
配列番号８６は、trigger  RGSV-pC4についてのフォワードプライマー（caccatgtggaattcccaatatgtgaa）の配列である。
配列番号８７は、trigger  RGSV-pC4についてのリバースプライマー（cttctaaattcttttaaatcacttc）の配列である。
配列番号８８は、trigger  RGSV-p5についてのフォワードプライマー（caccatgtctggcatgaattcagaag）の配列である。
配列番号８９は、trigger  RGSV-p5についてのリバースプライマー（ggcttatatattgtcataggcaa）の配列である。
配列番号９０は、trigger  RGSV-pC5についてのフォワードプライマー（caccatgggtaaagtgcaatttggag）の配列である。
配列番号９１は、trigger  RGSV-pC5についてのリバースプライマー（tatcaacggtactaatgggtct）の配列である。
配列番号９２は、trigger  RGSV-p6についてのフォワードプライマー（caccatgtctaaatctcattctgacgt）の配列である。
配列番号９３は、trigger  RGSV-p6についてのリバースプライマー（tattatatacataagcaggaattttg）の配列である。
配列番号９４は、trigger  RGSV-pC6についてのフォワードプライマー（caccatggctttactccaaaagctag）の配列である。
配列番号９５は、trigger  RGSV-pC6についてのリバースプライマー（tcggacaggtaagacaagtct）の配列である。
配列番号９６は、トリミング配列である。
配列番号９７は、ユビキチンプロモーター配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ４５２７３６由来）である。
配列番号９８は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０８８６５の配列である。
配列番号９９は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ５１３５０５の配列である。
配列番号１００は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ１８６７８８の配列である。
配列番号１０１は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９０９４７の配列である。
配列番号１０２は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２８７９４９の配列である。
配列番号１０３は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ５０９４７０の配列である。
【図１】
2011067115.tif 000005
【図２】
2011067115.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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