(57)【要約】【課題】還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖまたはイントラボディーを単離する方法を提供すること。【解決手段】還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワーク内のＣＤＲの単離方法と同様に、そのようにして得られるｓｃＦｖが記載される。そのような規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖから出発して、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が無作為化される一方で、そのフレームワークが保存されるｓｃＦｖライブラリーが産生される。例えば酵母細胞内のそのようなライブラリーは、抗体／ＣＤＲ相互作用のスクリーニングまたは抗体のスクリーニングに好適である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離するための方法であって、
（ａ）既知の抗原に対するｓｃＦｖのＤＮＡ配列の少なくとも１つのフレームワークコード領域の突然変異、および前記突然変異の好適な発現ベクターへの導入により、種々のフレームワークおよび定常的なＣＤＲｓを有するｓｃＦｖライブラリーを産生し、
（ｂ）特異的な既知の抗原を発現可能であり、かつ抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存する宿主細胞を前記ｓｃＦｖライブラリーで形質転換し、
（ｃ）前記形質転換した宿主細胞を、前記抗原および前記ｓｃＦｖを発現するのに好適な条件下で培養して、前記抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ細胞を生存させ、
（ｄ）生存細胞内で発現され、また還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する前記ｓｃＦｖを単離する方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が真核細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が酵母細胞である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
請求項２〜３のいずれか１項に記載の方法により得られる規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
【請求項５】
少なくとも１つのＣＤＲの選択的な交換を可能にする制限酵素認識部位を含む請求項４記載のｓｃＦｖ。
【請求項６】
前記制限酵素認識部位がＣＤＲに隣接する前記フレームワーク内に位置する請求項５に記載のｓｃＦｖ。
【請求項７】
ＣＤＲ領域における選択的な変更に好適なフレームワークを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡの産生方法であって、特異的な制限酵素認識部位を、部位特異的変異誘発により、規定された安定性かつ可溶性であるｓｃＦｖをコードするＤＮＡの配列に導入する方法。
【請求項８】
前記制限酵素認識部位がフレームワーク内に位置し、それによって前記制限酵素認識部位を発生させるための前記ヌクレオチドの置換がアミノ酸配列に影響しない請求項７記載の方法。
【請求項９】
還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖの産生方法であって、還元環境において安定性かつ可溶性である少なくとも２つの異なるフレームワーク、好ましくは請求項４〜６のうちいずれか１項記載のフレームワークまたは請求項１〜３のいずれか１項に従って単離されるフレームワークのうち少なくとも２つの変異が、規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを製造するために組み合わされる方法。
【請求項１０】
請求項９の方法により得られる規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
【請求項１１】
前記変異が前記可変軽鎖のＣＤＲ１の上流に存在する請求項１０記載のｓｃＦｖ。
【請求項１２】
前記変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する請求項１０記載のｓｃＦｖ。
【請求項１３】
少なくとも１つの変異がＣＤＲ１の上流に存在し、かつ少なくとも１つの変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する請求項１０記載のｓｃＦｖ。
【請求項１４】
少なくとも２つの変異がＣＤＲ１の上流に存在し、かつ少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つの変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する請求項１０記載のｓｃＦｖ。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １において規定されたフレームワークを含むｓｃＦｖ。
【請求項１６】
還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するＣＤＲライブラリーの産生方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項記載のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列が、配列当たり少なくとも１つのＣＤＲを修飾されたＣＤＲで置換するために消化される方法。
【請求項１７】
前記修飾されたＣＤＲが無作為な変更により産生される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの無作為化されたＣＤＲおよび、還元環境下において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するイントラボディーのライブラリー。
【請求項１９】
特異的な抗原と相互作用するＣＤＲのスクリーニング方法であって、既知の抗原をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列で形質転換させた宿主細胞をさらに、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化したＣＤＲライブラリーで形質転換し、それによって抗原および／またはｓｃＦｖをマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結させ、したがって選択的な条件下において培養した細胞は抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存し、このように形質転換させた細胞を選択的な条件下において培養し、生存している細胞を培養してイントラボディーを収集する方法。
【請求項２０】
前記フレームワークが請求項１〜１９のいずれか１項において規定されるようなフレームワークである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が真核細胞、特に酵母細胞である請求項１９または２０記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原をコードするＤＮＡ配列および前記ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列がいずれも、生存許容マーカーに連結された転写活性化システムの一部にいずれも連結された、前記抗原またはｓｃＦｖをそれぞれ含むキメラ分子をコードする、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原がＤＮＡ結合ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖが転写活性化因子ドメインに融合されるか、または前記抗原が転写活性化因子ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖがＤＮＡ結合ドメインに融合される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ｓｃＦｖと相互作用している抗原のスクリーニング方法であって、興味のある少なくとも１つの抗原を発現する宿主細胞を、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する少なくとも一つのｓｃＦｖ、または還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化されたＣＤＲライブラリーで形質転換し、それによって抗原および／またはｓｃＦｖをマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結させ、したがって選択的な条件下において培養した細胞は抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存し、このように形質転換させた細胞を選択的な条件下で培養し、生存している細胞を培養してｓｃＦｖを収集する方法。
【請求項２５】
前記フレームワークが請求項１〜２４のいずれか１項において規定されるようなフレームワークである請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が真核細胞、特に酵母細胞である請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原をコードするＤＮＡ配列およびｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列が両者共に、いずれも生存許容マーカーに連結された転写活性化システムの一部に連結された抗原またはｓｃＦｖをそれぞれ含むキメラ分子をコードする、請求項２４〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原がＤＮＡ結合ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖが転写活性化因子ドメインに融合されるか、または前記抗原が転写活性化因子ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖがＤＮＡ結合ドメインに融合される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
治療または診断または予防用薬剤としての、規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
【請求項３０】
細胞内スクリーニングのための、規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖの使用。
【請求項３１】
前記ライブラリーがイントラボディーライブラリーとマーカータンパク質の融合産物である請求項１０記載の方法。
【請求項３２】
特に請求項１記載の方法において使用するための、請求項３１に記載の方法によって得られる規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
【請求項３３】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、その全体が参照によりここに組み込まれる１９９９年１２月２８日に出願されたＰＣＴ特許出願ＩＢ９９／０２０５４、および２０００年３月１日に出願されたＰＣＴ特許出願ＩＢ００／００２１８の優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の単鎖融合体（ｓｃＦｖ）に関し、特に規定された安定なフレームワークを有しかつ細胞内で発現されたかかるｓｃＦｖ（イントラボディー）に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、その抗原に対する高い親和性および特異性、およびそのインビトロおよびインビボにおける比較的高い安定性のために、生化学および分子生物学研究、診断および医学用途のための好ましい道具である。抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖からなり、そのＮ末端に可変領域を含み、またそれらはジスルフィド架橋により連結されている。単鎖抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のフラグメントを連結することにより設計されている（ｓｃＦｖ）。各可変領域は、フレームワークに包埋された３つの相補性決定部位（ＣＤＲ）を含む。これらのＣＤＲは、抗原との相互作用の原因である。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は領域内ジスルフィド架橋を含み、これは単鎖抗体の安定性に重要であることが報告された（Biocca  et  al.,1995； Derman  et  al., 1993）。
【０００４】
特異的なエピトープに結合する単鎖抗体を同定するために最も一般的に使用される技術は、ファージディスプレイおよびその変形によるものである（概説はHoogenboom  et  al.,1998を参照されたい）。このスクリーニング方法は、免疫感作またはハイブリドーマ技術のような一般的な技術に対する主要な利点を有する。つまり、比較的短時間でモノクローナル単鎖抗体を取り出すことができる。
【０００５】
細胞（たとえば細胞質または核）内で発現される単鎖抗体は、イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）と呼ばれる。細胞内は還元環境であるために、抗体の安定性に重要であると信じられているジスルフィド架橋が形成されない。従って、初めは、イントラボディーの適用は好ましくないと信じられていた。しかしながら、イントラボディーの適用の可能性を示すいくつかのケースが開示されている（Beerli  et  al.,1994; Biocca  et  al., 1994; Duan  et  al., 1994; Gargano  and  Cattaneo, 1997;Greeman  et  al., 1996; Martineau  et  al. 1998; Mhashilkar  et  al., 1995;Tavladoraki  et  al., 1993）。これらのケースにおいては、イントラボディーはたとえば、細胞質内の抗原をブロッキングし、その生物活性を阻害することにより働く。
【０００６】
現在まで、イントラボディーは大抵の場合、初めに古典的な技術（たとえばファージディスプレイ）で選別され、次にその細胞内でのイントラボディーとしての生物活性を試験される（Vinsintin  et  al.,1999）、モノクローナル抗体に由来するものであった。成功したイントラボディー（上述を参照）が記述されているにもかかわらず、今日では、そのようなイントラボディーが細胞内で機能的であるかどうかは全く予測不可能である（概説は、Cattaneo,1998; Cattaneo  and  Biocca, 1999を参照されたい）。その原因はおそらく、異なる環境である。ファージディスプレイおよび他の古典的な技術は酸化条件下で行われ、従ってジスルフィド架橋が形成されるが、一方イントラボディーは還元条件下で機能しなければならない。この還元環境はイントラボディーの不十分な溶解性を導く可能性があり、従ってそれらは非機能的な凝集塊を形成する。イントラボディーの溶解性は、フレームワーク内（Knappik  and  Pluckthun,1995）またはＣＤＲ内（Kipriyanov  et  al., 1997; Ulrich  et  al., 1995）のいずれかにおける変化によって調節できる。
【０００７】
しかしながら、従来知られている方法は、その用途が細胞内の標的を検出することに限定されている。従って、ある抗原に特異的なイントラボディーを直接的にスクリーニングする信頼性のある技術および方法の必要性が増している。
【０００８】
ＷＯ９９／３６５６９においてウィットラップ（Ｗｉｔｔｒｕｐ）らは、酵母内在性の、細胞壁上での局在化のためのＡｇａ２ｐに由来するタンパク質断片を用いて、タンパク質およびｓｃＦｖを酵母の細胞壁上に提示する方法を記載している。他の関連する方法は、ＥＰ０４０７２５９（Boquet  et  al.,1991）において記載されている。これらの方法は、タンパク質またはペプチドライブラリーもまた表面上に提示されるファージディスプレイスクリーニングに匹敵する。しかしながら、これらの技術はイントラボディーを同定するための細胞内スクリーニングには使用できない。
【０００９】
特許明細書ＪＰ１１０００１７４（Kyoko  et  al., 1999）において、抗体のＦａｂフラグメントを高レベルに発現および分泌させるための、酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の使用が記載されている。この酵母は、その分泌レベルが高いために有名であり、したがってこの用途に好適に使用される。分泌された抗体は、上清を精製することにより収集することができる。さらに、ＥＰ０５９００６７、ＷＯ９２／２２３２４、ＪＰ０６０３０７７８、ＵＳ５６９８４３５、ＵＳ５５９５８８９、ＪＰ１０３１３８７６において、酵母は分泌されるタンパク質または抗体の製造に使用されている。ＥＰ０６９８０９７およびＷＯ９４／２５５９１は、さらなる用途のための、重鎖またはその断片のみの製造および分泌の用途を開示している。ＪＰ０９０２０７９８；ＪＰ０５１０５７００；およびＪＰ０５０９７７０４には、一般に人体または生物体に投与した場合の、肝炎ワクチンを得るための酵母分泌の方法が記載されている。
【００１０】
単鎖抗体のスクリーニングに酵母を使用することも、ＷＯ９９／２８５０２によってすでに知られている。前記出願は、単鎖モノクローナル抗体融合試薬用のＤＮＡ構築物ライブラリーの使用を開示する。このｓｃＦｖライブラリー（ここではｓＦｖライブラリーと呼ぶ）は、次にスクリーニングに使用される。しかしながら、規定されていないフレームワークを使用しているために、イントラボディーの安定性と可溶性は劇的に変化する可能性があることが見出されている。さらに、インビボにおける性能とインビトロにおける安定性および可溶性との間に直接的な相関関係が示された。したがって、ＣＤＲは原理的には抗原に対して必要とされる高い親和性を示すにもかかわらず、対応するフレームワークが十分に可溶性でないために凝集し、このモノクローナルｓｃＦｖは検出不可能になるので、種々のｓｃＦｖフラグメントのｍＲＮＡ由来ライブラリーの使用は、その抗原に対する高い親和性を有するＣＤＲを同定する可能性があるという観点に限定される。したがって、未だ改善された抗体、またはイントラボディーがそれぞれ必要とされている。
【００１１】
細胞内の標的に向けられるｓｃＦｖの用途は増大しており、信頼性のあるイントラボディーのスクリーニング方法の必要性が生じている。還元条件下においてｓｃＦｖが不安定であり、かつ抗体安定性が予測できないために、ｓｃＦｖの細胞質内標的は最も困難な用途である。この安定性と可溶性の問題も、細胞内適用のために最適化された、規定されたフレームワークを使用することにより解決され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖまたはイントラボディーを単離する方法を提供することが、本発明の全般的な目的である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖまたはイントラボディーである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＣＤＲ／フレームワーク連結領域内に独特な制限酵素認識部位を備えるように修飾された、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖまたはイントラボディーである。
【００１５】
本発明の他の目的は、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークと、無作為にまたは確定的に変形されたＣＤＲとを有するｓｃＦｖまたはイントラボディーのライブラリーである。
【００１６】
本発明の他の目的は、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークと種々のＣＤＲとを有するｓｃＦｖまたはイントラボディー、またはこのようなｓｃＦｖまたはイントラボディーのライブラリーを用いた、抗原結合性ＣＤＲをスクリーニングする方法である。
【００１７】
本発明の他の目的は、このようなｓｃＦｖまたはイントラボディーまたはライブラリーをそれぞれ用いた、さらなる抗原のスクリーニング方法である。
【００１８】
本発明の他の目的は、還元条件下において可溶性かつ安定性であるフレームワークを有するイントラボディーの同定方法である。
【００１９】
本発明のイントラボディーはさらに、疾病の治療、診断、または予防における薬剤、および特異的なタンパク質活性の機能的ノックアウトのような移植における種々の用途の薬剤として使用され得る。イントラボディーはそれ自体として、またはこのようなｓｃＦｖをコードするＤＮＡとして使用され得る。
【００２０】
本明細書の範囲内において、術語ｓｃＦｖおよびイントラボディーは大部分は同義語として使用されるが、たとえば細胞内のような還元環境における本発明の規定されたフレームワークを有するイントラボディー（ｓｃＦｖ）の安定性および可溶性は本発明にとって必要であるが、そのようなイントラボディー（ｓｃＦｖ）等の用途は、細胞内での用途に制限されるものではないことは理解されなければならない。
【００２１】
ＣＤＲ内にアミノ酸変化を導入することのみによって、本発明に従ったフレームワークが特異的な抗原認識という所望の生物学的機能を示すモノクローナル抗体を識別する可能性が大いに増加する。ｓｃＦｖのＣＤＲにおけるそのような変化は、イントラボディーの細胞質内適用に適する規定されたフレームワークを変化させずに、無作為の変化として行うことができる。
【００２２】
細胞内でモノクローナル単鎖抗体のスクリーニングを行うためには、細胞質の酸化還元環境に適応するフレームワークを使用しなければならない。したがって、フレームワークはジスルフィド架橋の不在下であっても十分に安定性かつ可溶性でなければならない。しかしながらｓｃＦｖの多くは、還元条件下または、ドメイン内ジスルフィド架橋の形成に必要であるシステインの不在下においては、適切な構造に折りたたまれないことが知られている。したがって、本発明の範囲内において、同一のＣＤＲを含有する複数のフレームワークを比較したところ、インビボでの性能における劇的な差異が観察された。本発明の方法によって、抗原認識のための規定されたＣＤＲを含有する最も性能の良いフレームワークが選択できる。この方法は、出発材料として既知の抗原に対するイントラボディーを用いて行われる。重鎖および軽鎖の可変領域を連結するのに用いるリンカーは重要ではない。しかしながらそれは、ＣＤＲと抗原との間の相互作用のために好適な接触およびフォールディングを確実にするために、十分な溶解性および柔軟性を提供しなければならない。好適なリンカーは、約５〜６０アミノ酸の典型的な長さを有し、通常の規則的なグリシンの配列、および溶解性を増強するための１〜３個のセリンを有する。
【００２３】
還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離するための本発明の方法は、以下の工程により規定される。
【００２４】
ａ）既知の抗原に対するｓｃＦｖのＤＮＡ配列の少なくとも１つのフレームワークコード領域を突然変異させ、そのような突然変異を好適な発現ベクターに導入することにより、種々のフレームワークおよび定常のＣＤＲを有するｓｃＦｖライブラリーを作製し、
ｂ）特異的な既知の抗原を発現でき、かつ抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存する宿主細胞を、前記ｓｃＦｖライブラリーで形質転換し、
ｃ）そのようにして形質転換した宿主細胞を、抗原およびｓｃＦｖを発現するのに好適な条件下で培養して、抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ細胞を生存させ、
ｄ）生存している細胞内で発現され、また還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを単離する。
【００２５】
好ましい実施形態において、宿主細胞は真核細胞、特に酵母細胞である。
【００２６】
上述した方法によって、規定したフレームワークを有するｓｃＦｖを入手できる。そのようなフレームワークも本発明の目的である。そのようなフレームワークは、少なくとも１つのＣＤＲの選択的な交換を可能にする特異的な制限酵素認識部位を含むように修飾できる。好ましくは前記制限酵素認識部位は、ＣＤＲに隣接するフレームワーク内に位置する。
【００２７】
本発明はさらに、ＣＤＲ領域内における選択的な変更に好適なフレームワークを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡの産生方法であって、特異的な制限酵素認識部位を、規定された安定性かつ可溶性であるｓｃＦｖをコードするＤＮＡの配列に部位特異的変異誘発によって導入し、それによって制限酵素認識部位が好ましくはフレームワーク内に位置し、かつそれによって制限酵素認識部位を作製するためのヌクレオチドの置換がアミノ酸配列に影響しない方法を提供する。
【００２８】
還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを含む改善されたｓｃＦｖは、本発明の目的でもある方法によっても得ることができ、ここでは還元環境において安定性かつ可溶性である少なくとも２つの異なるフレームワーク（好ましくは本発明のフレームワーク）の少なくとも２つの変異を組合せて、規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを製造する。
【００２９】
上述した方法によって入手できるｓｃＦｖも本発明の目的である。そのようなフレームワーク内においては、少なくとも１つの変異が可変軽鎖のＣＤＲ１の上流に存在し、かつ／または少なくとも１つの変異が可変重鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３の間に位置することが好ましい。
【００３０】
非常に好ましい実施形態においては、本発明のｓｃＦｖは、可変軽鎖のＣＤＲ１の上流に存在する少なくとも２つの変異、および可変重鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３の間に位置する少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つの変異を含む。特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １に規定されるフレームワークを含むｓｃＦｖが好ましい。
【００３１】
そのようなフレームワークにおいてＣＤＲを特異的に無作為化するために、独特な制限酵素認識部位の発生を導く沈黙突然変異（ｓｉｌｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ）（同じアミノ酸配列をコードするが、異なるコドンを使用する）を導入できる（上記も参照）。制限酵素認識部位はＣＤＲ／フレームワーク連結領域内のどこにでも設置できるが、それは独立した各ＣＤＲに隣接するフレームワーク内に位置することが好ましい。これによって、独立した各ＣＤＲは、無作為のまたは規定された配列の導入により置換され得る。これは、抗原に対して高い親和性を示すイントラボディー内の新規なＣＤＲを選択することを可能にする。
【００３２】
局在化シグナルまたは活性化ドメインのような付加的な配列をｓｃＦｖライブラリーに由来する非限定的なフレームワークに導入する場合、この修飾によって、たとえばｓｃＦｖが不溶性になるといったように、生物学的活性が（たとえそれまで存在していても）失われ得る。したがって、既知の抗原に対する本発明の規定されたフレームワークを使用し、次にそのような修飾をイントラボディー内の種々の位置（ＮおよびＣ末端またはｓｃＦｖのコード配列内）に導入し、また本来の機能を維持するために選択することは、利点である。ＷＯ９９／２８５０２には、局在化シグナルを導入するいくつかの可能性が記載されている。ある抗原に対する相互作用スクリーニングに使用される活性化ドメインは、ＷＯ９９／９８５０２において記載されており、ｓｃＦｖライブラリーのＣ末端に導入される。種々の位置、たとえばＮ末端の活性化ドメインにおいて配列の付加を許容するフレームワークも本発明の方法によって選択することができ、それは拮抗的な機能における活性化ドメインを持たない、それらのｓｃＦｖに対応する物と同様に振る舞うことが今般見出された。従って、たとえば以下の実施例においてさらに説明されるフレームワーク内においては、Ｎ末端の活性化ドメインを導入することは抗体の機能を阻害しない。
【００３３】
還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する本発明のイントラボディーから出発して、ＣＤＲライブラリーを含有するｓｃＦｖまたはイントラボディーをそれぞれ作製できる。
【００３４】
還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するＣＤＲライブラリーを作製するための好適な方法は本発明の方法であり、配列につき少なくとも１つのＣＤＲを修飾されたＣＤＲで置換するために、本発明のｓｃＦｖをコードしているＤＮＡ配列を消化させる。好ましくは、修飾されたＣＤＲは無作為変異により作製する。そのような方法により、少なくとも１つの無作為化されたＣＤＲ、および還元条件下において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するイントラボディーのライブラリーを作製できる。
【００３５】
ＣＤＲライブラリーを含有する本発明のイントラボディーは、抗原に対して高い親和性を有するクローンのスクリーニングおよび選択に使用され得る。特定の抗原と相互作用するＣＤＲのスクリーニング方法も本発明の目的であり、またこの方法は、既知の抗原をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列で形質転換し、さらに還元環境下において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化されたＣＤＲライブラリーで形質転換した宿主細胞を含み、それによって抗原および／またはｓｃＦｖはマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結され、したがって選択的条件下で培養された細胞は抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ生存するので、形質転換された細胞を選択的な条件下で培養して残存する細胞を培養し、イントラボディーを収集することを含む。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態においては、このフレームワークは本発明のフレームワークであり、細胞は真核細胞、特に酵母細胞である。
【００３７】
本発明のさらに好ましい実施形態において、抗原をコードするＤＮＡ配列およびｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列はいずれも、生存許容（ａｌｌｏｗｉｎｇ）マーカーに連結された転写活性化システムの一部にいずれも連結された、抗原またはｓｃＦｖをそれぞれ含むキメラ分子をコードし、さらに好ましくは抗原はＤＮＡ結合ドメインに融合されてｓｃＦｖは転写活性化因子ドメインに融合されるか、または抗原は転写活性化因子ドメインに融合されてｓｃＦｖはＤＮＡ結合部位に融合される。
【００３８】
ＣＤＲライブラリーを含有する本発明のイントラボディーは、抗原に対して高い親和性を有するクローンをスクリーニングおよび選択するのに使用され得る。これは、その生物学的機能において細胞内に位置する抗原をブロックすること、または規定されたフレームワーク内に包埋されたＣＤＲの抗原に対する直接的な相互作用を分析することのいずれかにより達成できる。直接的な相互作用は、好ましくは、転写性の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）、好ましくはＨＩＳ３遺伝子の発現によってモニターできる。予め決定した条件下で３−アミノトリアゾール（３ＡＴ）を添加すると、抗原に対してより親和性の高いＣＤＲの選択が可能になる。特異的な既知の抗原を発現し得る宿主細胞は、前記条件下では抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下、好ましくは十分に強い抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ生存する。ここで用いられる術語「十分に強い」は、ＢＩＡｃｏｒｅで測定されたＫＤが、＞１×１０−６Ｍ、好ましくはＫＤ＞１×１０−８Ｍ、そしてより好ましくはＫＤ＞１×１０−１０Ｍであるタンパク質−タンパク質相互作用として定義される。そのような選択工程はさらに、ＣＤＲ（好ましくは軽鎖および重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２）内のアミノ酸を無作為または選択的に変異させ、続いて上昇した３ＡＴの濃度において増殖するものをこのプールから選出することによる親和性熟成を行うのに適用できる。
【００３９】
既に上述したように、今までに知られており使用されているｓｃＦｖライブラリーは、好ましくはＢ細胞が高度に蓄積されることが知られている脾臓からのｍＲＮＡの単離に由来し、再編成された抗体が発現される。そのようなライブラリーは、その生物体内に存在するエピトープに対して反応しないように予備選択（ポジティブおよびネガティブ選択）されているという欠点を有する。これは、自己免疫反応を開始しない抗体のみが熟成され、活性化され得ることを保証する。しかしながら、この選択工程のために、可能性のあるアミノ酸の組み合わせの全てが「天然の（ｎａｔｕｒａｌ）」ｓｃＦｖライブラリー内に存在するわけではない。いくつかのインビトロおよび診断上の用途のためには、抗体は種属間で保存されているタンパク質と相互作用することが必要とされる。そのようなタンパク質またはペプチドにとって、予備選択工程のために、「天然の」ｓｃＦｖライブラリー内で強力に相互作用するモノクローナル抗体を検出することは非常に困難な場合がある。さらに、その「天然の」ライブラリー内に存在するフレームワークは最適化されておらず、したがって不十分かまたは可変性の溶解性および／または安定性はそれぞれ問題を生じる。したがって、本発明のフレームワーク、および／または本発明の方法によって得られるフレームワークを含み、かつこれらの領域内のアミノ酸配列の可能な組み合わせのいくらか、または好ましくは全てをカバーするＣＤＲ無作為ライブラリーのみを使用することは大きな利点である。
【００４０】
本発明をさらに説明するために、酵母細胞内転写因子Ｇｃｎ４ｐに対する規定された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、安定性かつ可溶性であるイントラボディーフレームワークを選択した。この規定されたフレームワークは、無作為の配列によってそのＣＤＲを置換するのに使用した。所望の生物活性（ＣＤＲのインビボ効果）を刺激する新規なＣＤＲを同定するためにこれらのＣＤＲライブラリーをスクリーニングする：
ａ）細胞内（たとえば、ヒト細胞内または他のいかなる細胞内でも）で自然に起こる分子相互作用を好適な細胞（好ましくは酵母）内で再構成させるか、または酵母内在性の相互作用を使用する。次のスクリーニングで、再構成されたかまたは内在性の分子の生物活性によるこれらのＣＤＲの干渉によって、高親和性のＣＤＲを同定する。そのような拮抗性のＣＤＲはたとえば、シグナル伝達経路に含まれる２つのタンパク質をブロックすることにより機能できるであろう。
【００４１】
ｂ）再構成されたかまたは内在性の分子における、所望の生物活性を誘発するアゴニストのＣＤＲを選択する。
【００４２】
安定性であるフレームワーク内に包埋された無作為ＣＤＲをさらに、相互作用スクリーニングに基づいて、ＣＤＲと抗原との相互作用を同定するのに使用することができる：
ａ）選択されたフレームワークは転写活性化ドメインに融合可能であり、しかもその機能を保持することが示されるであろう。このキメライントラボディーを、ＤＮＡ結合活性を有するＤＮＡ結合部位または転写因子に融合されて得られる抗原に対して高親和性であるＣＤＲの選択に使用する。抗原とＣＤＲが相互作用する時には、転写活性化ドメインは選択マーカー遺伝子の遺伝子発現を媒介し、選択条件下でのこの細胞の生存を許容する。
【００４３】
ｂ）ハイブリッド技術（一方のパートナーを活性化ドメインへ融合させ、もし必要であればもう一方をＤＮＡ結合部位へ融合させる）に基づいて再構成させた分子の相互作用は、特異的で高親和性のＣＤＲによってブロックされ得る。
【００４４】
イントラボディーのＣＤＲは一定であるがフレームワーク内の種々の変異は、イントラボディーの安定性および溶解性を変化させることによりそのインビボにおける性能に影響を及ぼすことも明らかとなった。フレームワークは、イントラボディーの安定性および溶解性の主要な部分に寄与する。にもかかわらず、ＣＤＲ内の特定の変異はイントラボディーの溶解性および安定性に影響する場合もある。したがって、機能的品質管理（下記参照）によって、規定されたフレームワーク内に包埋された無作為なＣＤＲを予備選択することは都合が良いだろう。
【００４５】
本発明はさらに、イントラボディーフレームワークまたはイントラボディーの同定方法であって、好適な宿主細胞をライブラリーおよびマーカーシステムにより形質転換し、それによって前記ライブラリーはイントラボディーライブラリーと前記マーカーシステムの少なくとも一部との融合産物となり、前記マーカーシステムは可溶性かつ安定性であるイントラボディーフレームワークをコードする融合タンパク質の存在下においてのみ活性化され、また前記細胞を、可溶性かつ安定性であるイントラボディーフレームワークを発現している細胞の同定および選択を可能にする条件下で培養する方法を提供する。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態において、前記ライブラリーはイントラボディーライブラリーとマーカータンパク質との融合産物である。好ましくは、前記マーカータンパク質は選択可能な活性、特に酵素活性または蛍光活性を有する。そのような方法において使用され得るマーカータンパク質は、たとえばＧＦＰタンパク質またはそのいかなる変異体でもある。
【００４７】
本発明の他の好ましい実施形態においては、前記ライブラリーは、イントラボディーライブラリーと、転写がそのＤＮＡ結合タンパク質により制御されるマーカー遺伝子の転写を活性化できるＤＮＡ結合タンパク質との融合産物である。好適なＤＮＡ結合タンパク質はたとえばｐ５３である。
【００４８】
本発明のさらなる好ましい実施形態においては、前記方法はイントラボディーおよびトランス活性化システムの一部を含むタンパク質をコードするライブラリーで形質転換された好適な宿主細胞を含み、かつ前記細胞はさらに少なくとも前記トランス活性化システムの第２部分を含む第２タンパク質を発現し、それによって前記トランス活性化システムは生存許容マーカーに連結されて前記細胞は前記２つの融合タンパク質間の相互作用の存在下における選択的条件下においてのみ生存する。
【００４９】
さらに好ましい実施形態においては、前記ライブラリーにコードされるタンパク質は転写活性化ドメインを含みかつ前記第２タンパク質はＤＮＡ結合部位を含むか、または前記ライブラリーにコードされるタンパク質はＤＮＡ結合部位を含みかつ前記第２タンパク質は転写活性化ドメインを含む。
さらなる好ましい実施形態においては、前記第２タンパク質はＤＮＡ結合部位またはトランス活性化ドメインと、前記ライブラリーにコードされるタンパク質の定常領域と相互作用するタンパク質とを含む。ここで使用される術語「定常領域」は、ライブラリー構築物によってコードされ、タンパク質相互作用のパートナーとして働くいかなるタンパク質部位、またはいかなる近接するアミノ酸配列をも含み、また前記用語はたとえばイントラボディーまたはＧａｌ１１ｐの一部を含む。
【００５０】
上記方法により得ることが可能な、規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖも本発明の目的であり、特に本発明の方法において使用するための目的である。
【００５１】
同方法は、たとえばｓｃＦｖまたはＣＤＲライブラリー、特に本発明のライブラリーの出発材料として使用され得る、可溶性かつ安定性であるフレームワークを同定するためのいかなるｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングにも適用され得る。
【００５２】
本発明の他の目的は、ｓｃＦｖと相互作用する抗原のスクリーニング方法であって、少なくとも１つの興味のある抗原を発現する宿主細胞を、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する少なくとも１つのｓｃＦｖ、または還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化されたＣＤＲライブラリーで形質転換し、それによって抗原および／またはｓｃＦｖをマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結させ、したがって選択的条件下で培養される細胞が抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ生存し、このように形質転換された細胞を選択的条件下で培養し、残存する細胞を培養してｓｃＦｖを収集する方法を提供することである。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態においては、フレームワークは本発明のフレームワークであり、かつ細胞は真核細胞、特に酵母細胞である。
【００５４】
本発明の非常に好ましい実施形態においては、抗原をコードするＤＮＡ配列およびｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列は、いずれも生存許容マーカーに連結された転写活性化システムの一部に連結された抗原またはｓｃＦｖそれぞれとのキメラ分子の両方をコードし、より好ましくは抗原はＤＮＡ結合ドメインに融合されかつｓｃＦｖは転写活性化因子ドメインに融合されるか、または抗原は転写活性化因子ドメインに融合されかつｓｃＦｖはＤＮＡ結合ドメインに融合される。
【００５５】
本発明はさらに、治療または診断または予防用薬剤として規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ、および細胞内スクリーニングのために規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖの使用方法を提供する。
【００５６】
本発明の全ての目的のためには真核細胞が好ましく、特に、増殖、ポジティブ選択、増殖選択が速くでき、かつ形質転換およびその選択が効率的にできることを含むその特異的な特徴から、酵母細胞が特に好ましい。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）  還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖの単離方法であって、
（ａ）既知の抗原に対するｓｃＦｖのＤＮＡ配列の少なくとも１つのフレームワークコード領域の突然変異、および前記突然変異の好適な発現ベクターへの導入により、種々のフレームワークおよび定常的なＣＤＲを有するｓｃＦｖライブラリーを作製し、
（ｂ）特異的な既知の抗原を発現可能であり、かつ抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存する宿主細胞を前記ｓｃＦｖライブラリーで形質転換し、
（ｃ）前記形質転換した宿主細胞を、前記抗原および前記ｓｃＦｖを発現するのに好適な条件下で培養して、前記抗原−ｓｃＦｖ相互作用の存在下においてのみ生存させ、
（ｄ）生存細胞内で発現され、また還元環境において安定性かつ可溶性である
規定されたフレームワークを有する前記ｓｃＦｖを単離する方法。
（項目２）  前記宿主細胞が真核生物である項目１記載の方法。
（項目３）  前記宿主細胞が酵母細胞である項目１または２記載の方法。
（項目４）  項目１〜３のいずれか１項に記載の方法により得られる規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
（項目５）  少なくとも１つのＣＤＲの選択的な交換を可能にする制限酵素認識部位を含む項目４記載のｓｃＦｖ。
（項目６）  前記制限酵素認識部位がＣＤＲに隣接する前記フレームワーク内に位置する項目５に記載のｓｃＦｖ。
（項目７）  ＣＤＲ領域における選択的な変更に好適なフレームワークを含むｓｃＦｖをコードするＤＮＡの産生方法であって、部位特異的変異誘発により、規定された安定性かつ可溶性であるｓｃＦｖをコードするＤＮＡの配列に特異的な制限酵素認識部位を導入する方法。
（項目８）  前記制限酵素認識部位が前記フレームワーク内に位置し、それによって前記制限酵素認識部位を発生させるための前記ヌクレオチドの置換がアミノ酸配列に影響しない項目７記載の方法。
（項目９）  還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを含むｓｃＦｖの産生方法であって、還元環境において安定性かつ可溶性である少なくとも２つの異なるフレームワーク、好ましくは項目４〜６のうちいずれか１項記載のフレームワークまたは項目１〜３のいずれか１項に従って単離されるフレームワークのうち少なくとも２つの変異が、規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖを製造するために組み合わされる方法。
（項目１０）  項目９の方法により得られる前記規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
（項目１１）  前記変異が前記可変軽鎖のＣＤＲ１の上流に存在する項目１０記載のｓｃＦｖ。
（項目１２）  前記変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する項目１０記載のｓｃＦｖ。
（項目１３）  少なくとも１つの変異がＣＤＲ１の上流に存在し、かつ少なくとも１つの変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する項目１０記載のｓｃＦｖ。
（項目１４）  少なくとも２つの変異がＣＤＲ１の上流に存在し、かつ少なくとも２つ、好ましくは少なくとも４つの変異が前記可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に位置する項目１０記載のｓｃＦｖ。
（項目１５）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １において規定されたフレームワークを含むｓｃＦｖ。
（項目１６）  還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを含むＣＤＲライブラリーの産生方法であって、項目１〜１５のいずれか１項記載のｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列が、配列当たり少なくとも１つのＣＤＲを修飾されたＣＤＲで置換するために消化される方法。
（項目１７）  前記修飾されたＣＤＲが無作為な変更により産生される項目１６記載の方法。
（項目１８）  少なくとも１つの無作為化されたＣＤＲおよび、還元環境下において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有するイントラボディーのライブラリー。
（項目１９）  特異的な抗原と相互作用するＣＤＲのスクリーニング方法であって、既知の抗原をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列で形質転換させた宿主細胞をさらに、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化したＣＤＲライブラリーで形質転換し、それによって抗原および／またはｓｃＦｖをマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結させ、したがって選択的な条件下において培養した細胞は抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存し、このように形質転換させた細胞を選択的な条件下において培養し、残存している細胞を培養してイントラボディーを収集する方法。
（項目２０）  前記フレームワークが項目１〜１９のいずれか１項において規定されるようなフレームワークである、項目１９記載の方法。
（項目２１）  前記細胞が真核細胞、特に酵母細胞である項目１９または２０記載の方法。
（項目２２）  前記抗原をコードするＤＮＡ配列および前記ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列がいずれも、生存許容マーカーに連結された転写活性化システムの一部にいずれも連結された前記抗原またはｓｃＦｖをそれぞれ含むキメラ分子をコードする、項目１９〜２１のいずれか１項記載の方法。
（項目２３）  前記抗原がＤＮＡ結合ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖが転写活性化因子ドメインに融合されるか、または前記抗原が転写活性化因子ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖがＤＮＡ結合ドメインに融合される、項目２２記載の方法。
（項目２４）  ｓｃＦｖと相互作用している抗原のスクリーニング方法であって、興味のある少なくとも１つの抗原を発現する宿主細胞を、還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する少なくとも一つのｓｃＦｖ、または還元環境において安定性かつ可溶性である規定されたフレームワークを有する無作為化されたＣＤＲライブラリーで形質転換し、それによって抗原および／またはｓｃＦｖをマーカーシステムまたはマーカーシステムの一部に連結させ、したがって選択的な条件下において培養した細胞は抗原／ｓｃＦｖ相互作用の存在下でのみ生存し、このように形質転換させた細胞を選択的な条件下で培養し、残存している細胞を培養してｓｃＦｖを収集する方法。
（項目２５）  前記フレームワークが項目１〜２３のいずれか１項において規定されるようなフレームワークである項目２４記載の方法。
（項目２６）  前記細胞が真核細胞、特に酵母細胞である項目２４または２５記載の方法。
（項目２７）  前記抗原をコードするＤＮＡ配列およびｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列が両者共に、いずれも生存許容マーカーに連結された転写活性化システムの一部に連結された抗原またはｓｃＦｖをそれぞれ含むキメラ分子をコードする、項目２４〜２６のいずれか１項記載の方法。
（項目２８）  前記抗原がＤＮＡ結合ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖが転写活性化因子ドメインに融合されるか、または前記抗原が転写活性化因子ドメインに融合され、かつ前記ｓｃＦｖがＤＮＡ結合ドメインに融合される、項目２７記載の方法。
（項目２９）  治療または診断または予防用薬剤としての規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖ。
（項目３０）  細胞内スクリーニングのための規定されたフレームワークを有するｓｃＦｖの使用。
（項目３１）  イントラボディーフレームワークまたはイントラボディーの同定方法であって、好適な宿主細胞をライブラリーおよびマーカーシステムで形質転換し、それによって前記ライブラリーはイントラボディーライブラリーと前記マーカーシステムの少なくとも一部の融合産物となり、前記マーカーシステムは可溶性かつ安定性であるイントラボディーフレームワークをコードする融合タンパク質の存在下においてのみ活性化され、また、可溶性かつ安定性であるイントラボディーフレームワークを発現する細胞の同定および選択を可能にする条件下において前記細胞を培養する方法。
（項目３２）  前記ライブラリーが、イントラボディーライブラリーとマーカータンパク質の融合産物である項目３１記載の方法。
（項目３３）  前記マーカータンパク質が選択可能な活性、特に酵素活性または蛍光活性を有する項目３２記載の方法。
（項目３４）  前記ライブラリーが、イントラボディーライブラリーと転写を活性し得るＤＮＡ結合タンパク質との融合産物である項目３１記載の方法。
（項目３５）  前記好適な宿主細胞を、イントラボディーおよびトランス活性化システムの一部分を含むタンパク質をコードするライブラリーで形質転換し、前記細胞はさらに前記トランス活性化システムの第２部分を含む第２タンパク質を発現し、それによって前記トランス活性化システムを生存許容マーカーに連結させ、前記細胞が前記２つのタンパク質間の相互作用が存在する選択的な条件下においてのみ生存する、項目３１記載の方法。
（項目３６）  前記ライブラリーにコードされるタンパク質が転写活性化ドメインを含み、かつ前記第２のタンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含むか、または前記ライブラリーにコードされるタンパク質がＤＮＡ結合ドメインを含み、かつ前記第２のタンパク質が転写活性化ドメインを含む項目３５記載の方法。
（項目３７）  前記第２タンパク質が、ＤＮＡ結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのそれぞれと、前記第１のライブラリーにコードされたタンパク質の定常領域と相互作用するタンパク質とを含む、項目３５または３６記載の方法。
（項目３８）  特に項目１記載の方法において使用するための、項目３１〜３７のいずれか１項に記載の方法によって得られる規定されたフレームワークを含むｓｃＦｖ。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】ｓｃＦｖまたはＣＤＲライブラリーの品質管理を行いうる方法を示す図。
【図１Ｂ】レポーター遺伝子活性と関連するｓｃＦｖ融合タンパク質の溶解性を示す図。
【図２】λグラフトと呼ばれる別の変異体と比較した、最適化したＧａｌ４  ＡＤ−ΩグラフトｓｃＦｖのインビボにおけるより良好な性能を示す図。
【図３Ａ】Ｇｃｎ４ｐ依存性ＬａｃＺレポーター遺伝子の遺伝子発現における、種々のｓｃＦｖフラグメントのインビボにおける性能を示す図。
【図３Ｂ】ツーハイブリッドアッセイにおける、酵母内での種々のｓｃＦｖフラグメントの発現のインビボにおける性能を示す図。
【図４】種々のｓｃＦｖフラグメントを発現している細胞の、ツーハイブリッドアッセイにおける増殖選択を示す図。
【図５Ａ】Ｇｃｎ４ｐ依存性ＬａｃＺリポーターの遺伝子発現において、定常ドメイン（Ｇａｌ１１Ｐ−Ｇａｌ４ＡＤ）の単鎖抗体に対するＮ末端融合は、有意にはこのｓｃＦｖフラグメントの性質を変化させないことを示す図。
【図５Ｂ】ＬａｃＺリポーターの遺伝子発現において、２つの独特な制限酵素認識部位の単鎖抗体への導入は、このｓｃＦｖフラグメントの性質を変化させないことを示す図。
【図６】酵母内に発現した種々のＧｃｎ４ｐ結合ｓｃＦｖフラグメントの溶解性のウェスタンブロット解析を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（本発明を実行するための方法）
ｓｃＦｖおよびＣＤＲライブラリーの品質管理
術語「品質管理」は、ｓｃＦｖライブラリーからの安定性かつ可溶性であるイントラボディーの選択を可能にするアッセイを定義する。
この目的のために、ｓｃＦｖライブラリーを、転写活性化ドメイン（この場合Ｇａｌ４ＡＤ）および定常領域（この場合Ｇａｌ１１Ｐ  ａａ２６３−３５２）へ融合させる。融合タンパク質の安定性は、ｓｃＦｖ部分の安定性および溶解性に依存する。定常Ｇａｌ１１Ｐドメインは、Ｇａｌ４の二量体化ドメイン（Ｇａｌ４ＤＮＡ結合部位（ＤＢＤ）の一部である５８−９７残基（Barberis  et  al.,1995））と相互作用する。
【００５９】
このライブラリーを、選択マーカー遺伝子（たとえばＨＩＳ３／ＬａｃＺ）のプロモーターに結合するＧａｌ４  ＤＢＤ（１−１００残基）を発現する酵母細胞に形質転換する。この宿主細胞の増殖は、試験されるイントラボディーが所望の溶解性および安定性を示し、Ｇａｌ１１ＰとＧａｌ４  ＤＢＤを介して十分に相互作用できる場合にのみ媒介される（図１Ａを参照）。
【００６０】
遺伝子活性化に関連する溶解性
本発明において記述される品質管理システムの原理は、よく特徴付けられた多数のｓｃＦｖを用いて実証された。これらは、本質的に同一の抗原結合特性を有するが、インビトロでの安定性は異なる。種々のｓｃＦｖフラグメントをＧａｌ１１Ｐ−Ｇａｌ４ＡＤ融合タンパク質として発現させた。Ｇａｌ４二量体化ドメイン（５８−９７残基）をＬｅｘＡのＣ末端に融合させ、６ｘ  ＬｅｘＡ結合部位の制御下におけるレポーター遺伝子を含有するレポーター株ＹＤＥ１７３に転換した（下記参照）。
【００６１】
上述したように、Ｇａｌ１１Ｐ−Ｇａｌ４ＡＤ−ｓｃＦｖ融合タンパク質の細胞内安定性および溶解性は、ｓｃＦｖ部分に依存する。したがって、ＬｅｘＡ−Ｇａｌ４（５８−９７）と十分に相互作用する安定性かつ可溶性ｓｃＦｖ融合タンパク質のみが、リポーター遺伝子発現（たとえば、β−ガラクトシダーゼ）を活性化できる。
【００６２】
Ｇａｌ１１の野生型（ｗｔ）対立遺伝子は、Ｇａｌ４二量体化ドメイン（５８−９７残基）とは相互作用しない。したがって、いかなる単鎖のＧａｌ１１ｗｔ対立遺伝子との融合体もレポーター遺伝子を活性化できないので、ネガティブコントロールとして働く。これは、Ｇａｌ１１ｗｔ−Ｇａｌ４ＡＤ−λグラフト融合構築物を用いて実証された（図１Ｂ参照）。
【００６３】
ベイト（ｂａｉｔ）（ＬｅｘＡ−Ｇａｌ４（５８−９７））のみおよびｓｃＦｖ融合タンパク質のみのいずれも、レポーター遺伝子を活性化しなかった。
【００６４】
この品質管理システムにおいては、試験した６つのｓｃＦｖフラグメントのうち２つだけが、レポーター遺伝子発現を活性化させるのに十分に可溶性かつ安定性であった。フレームワークに安定化されたλグラフトおよびκグラフトは、最も安定な変異体である。この結果は分画分析と完全に一致しており、そこではλ−およびκグラフトのみが可溶性画分に検出された（図６参照）。
【００６５】
酵母内で細胞質に発現されるｓｃＦｖフラグメント
好適なｓｃＦｖフラグメントは、たとえば、免疫したマウスから作製されたライブラリーからのリボソームディスプレイによって最初に得られた抗ＧＣＮ４野生型ｓｃＦｖである（Hanes  et  al.,1998）。抗原は、７Ｐ１４Ｐ（ジッパードメインの７および１４の位置がプロリン残基に変異されていることを示唆する）と呼ばれるＧｃｎ４ｐロイシンジッパーの二重プロリン変異体であり、これは溶液中でランダムコイルを形成する（Leder  et  al.,1995）。ｓｃＦｖフラグメントは、ランダムコイル高次構造内でモノマーとして野生型ペプチドにも結合するので、インビトロにおいて野生型Ｇｃｎ４ｐコイルドコイルペプチドの二量体化を阻止する（Berger  et  al.,1999）。本発明と関連して「野生型」と呼ばれる抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖフラグメントは、ロイシンジッパーペプチドからの解離定数が４×１０−１１Ｍであることが測定されている（Hanes  et  al.,1998）。
【００６６】
本発明の範囲内において、このｓｃＦｖの多くの異なる変異体が調査された。抗ＧＣＮ４野生型に加えて、Ｈ−Ｒ６６Ｋ変異を保有する不安定化された抗ＧＣＮ４野生型の変異体［抗ＧＣＮ４（Ｈ−Ｒ６６Ｋ）と名付けた］は、本質的に同じ抗原結合特性を有するがインビトロにおける安定性がわずかに減少したＧｃｎ４ｐ結合ｓｃＦｖフラグメントの例として働いた（下記参照）。Ｈ−６６の位置（Kabat  et  al.,1991 に従って番号付けした）にあるアルギニン残基（Ａｒｇ）は、抗原結合ポケットから離れており、一般にＡｓｐ  Ｈ−８６に対して二重水素結合を形成する。Ｈ−６６の位置にあるＡｒｇは以前に、レバン結合Ａ４８ｓｃＦｖフラグメント内のＬｙｓよりも高いタンパク質安定性を導くことが示された（Proba  et  al.,1998; Woern  and  Plueckthun, 1998a）。さらに、抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖフラグメントのＶａｌ−Ａｌａ変異体［抗ＧＣＮ４（ＳＳ――）と名付けた］を調べたところ、いずれのドメイン内ジスルフィドもＶａｌ−Ａｌａペア（Ｌ−Ｃ２３Ｖ、Ｌ−Ｃ８８Ａ、Ｈ−Ｃ２２Ｖ、Ｈ−Ｃ９２Ａ）によって置換された。これらの変異は以前に、ｐ１８５ＨＥＲ２結合４Ｄ５  ｓｃＦｖフラグメントの還元ジチオール型と比較してわずかに安定して作用することが示されており、またイントラボディーの性能を向上させるであろうことが推測されている（Woern  and  Plueckthun,1998b）。
【００６７】
抗ＧＣＮ４  ＣＤＲ（相補性決定領域）ループを別のフレームワークにグラフトすることにより（Jones  et  al., 1986）、さらに２つの変異体を設計した。アクセプターフレームワークとして、「ハイブリッド」と呼ばれるｓｃＦｖを選択した（Woern  and  Plueckthun,1999）。このアクセプターフレームワークは４Ｄ５  ｓｃＦｖフラグメントのＶＬドメインとＡ４８＋＋（Ｈ２）ｓｃＦｖフラグメントのＶＨドメインとから構成されている。それは、一連の安定化ドメインから合理的に設計されており、変性剤誘導性の平衡変性（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）によって実証され、また発現率が高い（Woern  and  Plueckthun,1999）というように、その驚くべき安定性が目立っている。抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖ  ＣＤＲおよび「ハイブリッド」ｓｃＦｖフレームワークを含む２つのＣＤＲ−グラフト変異体を、全遺伝子合成により調製した。抗ＧＣＮ４野生型ループドナーはλ軽鎖を保有し、一方アクセプター「ハイブリッド」フレームワークはκ軽鎖を保有していたので、ループのグラフトは直接的でなかった。したがって、２つの異なる変異体を設計し、一方はさらなる「κ様」（κグラフトと名付けた）、もう一方はさらなる「λ様」（λグラフトと名付けた）とした。これら２つの変異体は、ＶＨ−ＶＬ界面領域内の７残基のみが異なり、互いに２つのドメインの配向を強力に影響しあう。アンピシリン結合ｓｃＦｖフラグメントＡＬ５（A.Krebber  et  al., 未発表）は、Ｇｃｎ４ｐに結合していないｓｃＦｖフラグメントのネガティブコントロールとして働いた。
【００６８】
抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖイントラボディーはＧｃｎ４ｐのトランス活性化能を阻害する
抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖについて初めに、ＧＡＬ１およびＡＤＨ−駆動（ｄｒｉｖｅｎ）プロモーターを含む複数の酵母ベクターから発現されるその生物活性を調べた。さらに、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来の核移行シグナル（ＮＬＳ）を抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖのＮ末端に融合させた。試験した組み合わせのうち、ＴＲＰ１選択マーカーを含むｐＥＳＢＡ−Ａｃｔ発現ベクター（実施例を参照）、および２μオリジン（ｏｒｉｇｉｎ）（データ示さず）を用いて、いかなるＮＬＳをも伴わないアクチン１プロモーターから発現させた場合に、抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖが最も強い生物学的効果を示した。このベクターを引き続き、全てのさらなる実験において使用した。
【００６９】
ＧＣＮ４依存性ＬａｃＺ発現において種々のｓｃＦｖフラグメントを発現させるインビボ効果を図３Ａに示す。レポーター構築物（ＹＡｄＭ２ｘＧＣＮ４−１５０）は、ＴＡＴＡボックスから相対的に−１５０の位置に２つのＧｃｎ４ｐ結合サイトを含有し、酵母遺伝子に組み込まれた。内在性のＧｃｎ４ｐによって駆動されるβ−ガラクトシダーゼ活性比（Ｒｅｌ．β−ｇａｌ．ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、任意に１００％に設定した。ＡＬ５はアンピシリン結合ｓｃＦｖフラグメントであり、ネガティブコントロールとして働く。抗ＧＣＮ４野生型（ｗｔ）に加えて、不安定化させた点変異体［抗ＧＣＮ４（Ｈ−Ｒ６６Ｋ）］、抗ＧＣＮ４野生型のシステインフリー変異体［抗ＧＣＮ４（ＳＳ――）］、および抗ＧＣＮ４の２つのフレームワーク安定化された変異体（κグラフトおよびλグラフト）を試験した。安定化されたλグラフトは最も活性のあるイントラボディーであり、一方、抗ＧＣＮ４の不安定化されたＨ−Ｒ６６Ｋ点変異体およびシステインフリー変異体は、抗ＧＣＮ４野生型と比較すると、活性が減少したことが示された。κグラフトの活性の減少は、その低い親和性のためであると考えられる（表１参照）。不安定化された点変異体である抗ＧＣＮ４（Ｈ−Ｒ６６Ｋ）は、野生型ｓｃＦｖと比較して、ＧＣＮ４依存性レポーター遺伝子活性の阻害において効果的でなかった。Ｇｃｎ４ｐトランス活性化阻害のパターンは再現性が高く、別の分析方法を用いた場合でも確認された。そこでは、溶解させるためにガラスビーズまたは凍結融解サイクルにより細胞を分裂させ、タンパク質濃度に対するβ−ガラクトシダーゼ活性を基準化させた後、β−ガラクトシダーゼレポーター活性を測定した（Escher  and  Schaffner,1997）（データ示さず）。
【００７０】
【表１】
2011062205.tif 000002
Ｇａｌ４  ＡＤ−ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイにおいて、インビトロでの安定性およびインビボにおける性能に従って振舞う
レポーター遺伝子としてのＬａｃＺの発現をモニターするツーハイブリッドアッセイにおける、抗原と相補性決定領域（ＣＤＲ）との間の好結果の相互作用を図３Ｂに示す。レポーター株ＹＤＥ１７３を使用した。ＹＤＥ１７３株は、２０００年２月１１日に、ドイツ、ブラウンシュヴァイク所在のＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓｕｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＤＳＺＭに、番号ＤＳＭ１３３３３として寄託された。ＹＤＥ１７３は、ゲノムのｈｉｓ３遺伝子座に、互いに異なる方向に向き付けられたレポーター遺伝子ＨＩＳ３およびＬａｃＺを制御する６つのＬｅｘＡ結合サイトを含有するレポータープラスミドｐＤＥ２００が組み込まれている、酵母株ＪＰＹ５（Ｍａｔα  ｕｒａ３−５２  ｈｉｓ３Δ２００  ｌｅｕ２Δ１  ｔｒｐ１Δ６３  ｌｙｓ２Δ３８５）に由来するものである。
【００７１】
図３Ａにおいて使用したものと同じであるが、Ｇａｌ４の転写活性化ドメインに融合されたｓｃＦｖフラグメントを、ツーハイブリッドアッセイのベイトとして働く、Ｃ末端をＬｅｘＡに融合させたＧＣＮ４ロイシンジッパー（ａａ２４５−２８５）と共発現させた。非特異的なＡＬ５制御ｓｃＦｖ融合構築物はＬｅｘＡ−ＧＣＮ４ロイシンジッパーと相互作用できず、したがってＬａｃＺレポーター遺伝子を活性化しなかった。フレームワーク安定化されたλグラフト変異体に融合されたＧａｌ４活性化ドメインは、活性化イントラボディーとして最も強い効果を示し、次は抗ＧＣＮ４野生型、および不安定化点変異体抗ＧＣＮ４（Ｈ−Ｒ６６Ｋ）であった。対照的に、安定性は高いが結合の弱いκグラフトおよびシステインフリー抗ＧＣＮ４（ＳＳ――）は、ツーハイブリッドの型式においては明らかなレポーター遺伝子の発現を生じなかった。Ｘ−Ｇａｌプレートアッセイにおいても同じ結果が得られた（データ示さず）。要約すると、種々のＧａｌ４  ＡＤ−ｓｃＦｖ融合変異体の、ツーハイブリッド型式におけるＬａｃＺレポーター遺伝子の活性化についてのインビボにおける性能は、Ｇｃｎ４ｐ依存性ＬａｃＺ発現の阻害パターンと相互に関連する（図３Ａを３Ｂと比較せよ）。
【００７２】
抗原と転写活性化ドメインに融合された種々のｓｃＦｖとの間の相互作用は、ツーハイブリッドアッセイにおいて増殖選択を可能にする
組み込まれたレポーター構築物はＬａｃＺレポーター遺伝子だけでなくＨＩＳ３遺伝子をも含有するので、ヒスチジンを欠如することはプレート上での増殖選択にとって好ましい。さらに、ＨＩＳ３遺伝子産物の競合的な阻害剤である種々の濃度の３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）を添加することにより、ベイト／抗原とＧａｌ４  ＡＤ−ｓｃＦｖ間の相互作用の強さに依存する酵母細胞の増殖を阻害（抑制）することが可能である。
【００７３】
図４に示される結果を導いた実験手順は次のようであった。ＬｅｘＡに融合させたＧＣＮ４ロイシンジッパー（ａａ２４５−２８５）とＧａｌ４−ＡＤ  ｓｃＦｖ融合タンパク質とを共発現する約１０，０００の酵母細胞から始めて系列５倍希釈したものを、種々の濃度の３−ＡＴを含むドロップアウト（ｄｒｏｐ  ｏｕｔ）プレート（−Ｔｒｐ／−Ｌｅｕ／−Ｈｉｓ）上にスポットした。４８時間後、７２時間後、および１２０時間後に増殖をモニターした。
【００７４】
図４におけるレーンは次のようである。１．Ｇａｌ４−ＡＤ  λグラフト、２．Ｇａｌ４−ＡＤ  ＡＬ５、３．Ｇａｌ４−ＡＤ  κグラフト、４．Ｇａｌ４−ＡＤ  抗ＧＣＮ４（ＳＳ――）、５．Ｇａｌ４−ＡＤ抗ＧＣＮ４野生型、６．Ｇａｌ４−ＡＤ  抗ＧＣＮ４（Ｈ−Ｒ６６Ｋ）、７．ポジティブコントロールとして働くＬｅｘＡ−Ｇａｌ１１融合タンパク質、８．空ベクター。
【００７５】
ベイト／抗原（ｌｅｘＡ―ＧＣＮ４ロイシンジッパー）をＧａｌ４  ＡＤ−ｓｃＦｖ融合体と共に発現する酵母株の増殖を５日間に渡ってモニターした。プレート上のコントロールは３−ＡＴを含まないので、種々のＧａｌ４  ＡＤ−ｓｃＦｖ融合変異体の明らかな増殖の違いは観察されなかった。ネガティブコントロールのｓｃＦｖ（Ｇａｌ４  ＡＤ−ＡＬ５）で形質転換した細胞の増殖を抑制するためには、２０ｍＭの３−ＡＴで十分であった。β−ガラクトシダーゼの発現をモニターする結果との関連において、κグラフト変異体、抗ＧＣＮ４（ＳＳ――）、および抗ＧＣＮ４（Ｈ−Ｒ６６Ｋ）とのＧａｌ４  ＡＤ融合体は、２０ｍＭ３−ＡＴの存在下において増殖を許容しなかった。抗ＧＣＮ４野生型だけでなくλグラフト変異体を発現する細胞は、その間フレームワーク安定化されたλグラフトにとって明らかな利点によって、８０ｍＭまでの３−ＡＴの存在下で５日間増殖できた。３−ＡＴの濃度１００ｍＭは、Ｇａｌ４  ＡＤ−抗ＧＣＮ４野生型を発現する細胞の増殖を阻止するのに十分であった。５日後にのみ、最も濃縮されたスポット上にわずかに現れ、一方λグラフトＧａｌ４  ＡＤ−ｓｃＦｖ融合変異体を発現する細胞は明らかに増殖した。
【００７６】
定常ドメインのλグラフトｓｃＦｖへのＮ末端融合は、その生物活性を妨げない
Ｇａｌ１１Ｐ（２６３−３５２残基）およびＧａｌ４活性化ドメインを、λグラフトｓｃＦｖ（Ｇａｌ１１Ｐ−Ｇａｌ４ＡＤ  λグラフト）のＮ末端に融合させた。Ｇｃｎ４ｐ依存性遺伝子活性化を阻害するその生物活性は、λグラフトのみに匹敵する。図５Ａに示すように、定常ドメインのｓｃＦｖへの融合は、Ｇｃｎ４ｐ依存性遺伝子活性化に対する阻害活性を妨げなかった。
【００７７】
特異的な制限酵素認識部位の導入
ＣＤＲ３  ＶＨ（ＧＬＦＤＹ）を無作為ペプチドライブラリーと交換するために、この超可変領域に隣接する２つの独特の制限酵素認識部位（ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ）を、沈黙突然変異誘発（ｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により導入した。これらの沈黙交換は、抗体のアミノ酸配列に影響せず、したがって、λグラフト変異体のインビボでの性能を変化させなかった（図５Ｂ参照）。
【００７８】
抗原（ＧＣＮ４ロイシンジッパー）の特異的認識に対するＣＤＲ３超可変領域（de  Wildt  et  al., 1997; Hemminki  et  al.,1998）の重要性は、付加的なアラニンを可変重鎖のＣＤＲ３（ＡＧＬＦＤＹ）のＮ末端に導入することによって示された。このλグラフト＋Ａｌａ変異体は、酵母株ＹＡｄＭ  ２ｘＧＣＮ４−１５０内におけるＧｃｎ４ｐ依存性レポーター遺伝子の発現を阻害できず、またＹＤＥ１７３株を用いたツーハイブリッド型式におけるレポーター遺伝子の発現の活性化もできなかった（データ示さず）。
【００７９】
グラフト変異体は両方とも、酵母細胞質内で可溶性である
酵母内の種々のＧｃｎ４ｐ結合ｓｃＦｖフラグメントの溶解性を、ウェスタンブロット解析により調べた。λおよびκグラフト変異体の場合のみ、明らかな量の可溶性タンパク質が細胞粗抽出液中に検出された（図６）。
【００８０】
他の全ての抗ＧＣＮ４ｓｃＦｖフラグメントは、インビトロにおける安定性が低下するにつれて不溶性ｓｃＦｖの量がわずかに増加したことから、基本的に完全に不溶性であることが明らかとなった。しかしながら、異なるｓｃＦｖ変異体にとって、可溶性タンパク質の不溶性タンパクに対する正確な割合が必ずしもインビボにおける割合を反映しているのではないことに注意しなければならない。種々の抗ＧＣＮ４変異体の一部分は、たとえピアス社製のＹ−ＰＥＲＴＭ酵母タンパク質抽出剤を使用することにより穏やかな破壊方法を使用したとしても、試料調製の間に沈殿してしまうかもしれないことを排除することはできない。
【００８１】
フレームワークの改善
好ましくは本発明に従った方法により単離されるフレームワーク内の変異は、還元環境において安定性かつ可溶性であるさらなるフレームワークを作製するために組み合わせることができる。そのようにして得られるフレームワークは、１つだけの変異を有するフレームワークに比べて、インビボにおける性能が増強される。６つの変異を組み合わせたフレームワークを、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と規定する。
【００８２】
実施例
ＣＤＲ−グラフトされた抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖフラグメントの設計
ｓｃＦｖフラグメントのクローニング、発現、および精製
全てのｓｃＦｖフラグメントは、２０−ｍｅｒのリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＧＧＧＳ）およびＣ末端のｈｉｓ５−ｔａｇによってＶＬ−ＶＨに配向している。
【００８３】
酵母内に発現させたｓｃＦｖフラグメントを、ｐＥＳＢＡ−Ａｃｔ発現ベクターにクローン化した。ｐＥＳＢＡ−Ａｃｔベクターは、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のシャトルベクターである。それは、細菌の複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子を含有する。さらにそれは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での形質転換選択のための酵母ＴＲＰ１遺伝子を含有する。それは酵母内で高度にタンパク質発現するように設計され、したがって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で高コピー数を確実にする２μ複製開始点を有する。さらにそれは、ＮｃｏＩ（翻訳開始コドンＡＴＧをカバーしている）、ＡｐａＩ、およびＳｔｕＩに対する制限酵素認識部位、３つ全てのフレーム内に３つの翻訳停止コドン、およびＳａｌＩサイトを含有する多クローニングサイトで分離された、強力で恒常的なアクチンプロモーターおよびＧＡＬ１１転写終結配列を含有する。
【００８４】
全てのｓｃＦｖフラグメントをＢｓｐ１２０ＩおよびＳｔｕＩ制限酵素認識部位を用いてクローン化し、Ｃ末端Ｈｉｓ５−ｔａｇを保有させた。Ｂｓｐ１２０Ｉサイトをコードする２つのアミノ酸（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）は、開始のＭｅｔ残基の後のＮ末端に含まれていなければならなかった。
【００８５】
Ｇａｌ４  ＡＤのＮ末端の種々の抗体変異体への融合
Ｇａｌ４活性化ドメインを、テンプレートとしてｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応法により増幅させた。両プライマー［上流プライマー：５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧ−３’（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．２）、下流プライマー：５’−ＴＴＴＧＧＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．３）］は、ｐＥＳＢＡ  Ａｃｔと関連して、種々のｓｃＦｖに対するＳＶ４０Ｔ−抗原核局在化シグナルＮ末端を含むＧａｌ４活性化ドメイン（ＡＤ）ポリペプチドのクローニングに好適なＡｐａＩサイトを含有する。活性化ドメインと単鎖抗体とは、下流プライマーによってコードされる（ＧＧＧＳ）３リンカーによって分離される。
【００８６】
Ｇａｌ１１ｗｔおよびＧａｌ１１Ｐの、Ｇａｌ４活性化ドメイン（ＡＤ）−ｓｃＦｖ融合体へのＮ末端融合
Ｇａｌ１１ｗｔおよびＧａｌ１１ｐはいすれも、以下のプライマーを用いて増幅させた。上流プライマー：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣ−３’（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．４）、下流プライマー：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＴＣＴＣＡＧＧ−３’（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．５）であり、いずれもＮｃｏＩサイトを含有している。アミノ酸２６３−３５２をコードしているＰＣＲ産物を、ｐＥＳＢＡ−Ａｃｔ２  Ｇａｌ４（ＡＤ）−ｓｃＦｖ融合構築物（上述した）のＮｃｏＩサイトに挿入した。これは、それぞれのＧａｌ１１対立遺伝子の、Ｇａｌ４（ＡＤ）−ｓｃＦｖとのインフレーム融合体を産生した。Ｇａｌ１１インサートの正確な配向性を、独特な酵素ＮｈｅＩで消化することにより確認した。
【００８７】
ＬｅｘＡ融合
ＧＣＮ４ロイシンジッパー（ａａ２４５−２８５）を、ＬｅｘＡ（ａａ１−２０２）の下流をクローニングするのに便利なＥｃｏＲＩサイトを含有するプライマーを用いてＰＣＲ増幅させた。これを、ＡＤＨプロモーターの制御下で融合タンパク質を発現する、ＬＥＵ２選択マーカーを含むＡｒｓ  ＣｅｎプラスミドｐＡｄＭ０１８とする。
【００８８】
ＶＨのＣＤＲ３に隣接するＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩサイトの導入
可変重鎖のＣＤＲ３の交換を容易にするために、部位特異的変異誘発によって、Ｇａｌ４  ＡＤ−λグラフトｓｃＦｖの初めの構造を変えることなく、ＣＤＲ３  ＶＨに隣接させて２つの独特な制限酵素認識部位を導入した。これらの沈黙点変異を、テンプレートとしてλグラフトを用いたＰＣＲにより導入した。第１ラウンドにおいては、２つの別々のＰＣＲ反応を、２つの重複したＰＣＲ産物を導くプライマーである、＃２４２１と＃２４８７、および＃２４８６と＃２４８８を用いて行った。これらの２つの産物は、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩサイトを含有する外側のプライマー、＃２４２１および＃２４８８を用いたＰＣＲの第２ラウンド用のテンプレートとして働く。最終産物を、ＳｐｅＩおよびＳａｌＩを用いてＧａｌ４  ＡＤ−λグラフトにサブクローニングした。
【００８９】
抗原と反応する新規なＣＤＲのための、直接的細胞内スクリーニング
フレームワークで安定化された、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合させたλグラフトｓｃＦｖ（λグラフトｓｃＦｖ−Ｇａｌ４  ＡＤ）の可変重鎖からのＣＤＲ３の初めの３アミノ酸（ＧＬＦ）は、ロイター（Ｒｅｉｔｅｒ）らによって記載された方法に基づいたＰＣＲによって無作為化させた。ＣＤＲ３の最後の２残基（ＤおよびＹ）は、その保存および構造上の重要性のために（Chothia  and  Lesk,1987）、無作為化させなかった。可変重鎖の８０００の異なるＣＤＲ３変異体を潜在的にコードするλグラフトｓｃＦｖ−Ｇａｌ４  ＡＤライブラリーを得た。無作為に選んだ６つのライブラリークローンの配列解析により、予想した位置に無作為なＣＤＲ３配列の存在が明らかとなった。
【００９０】
６つのＬｅｘＡ結合部位（上記参照）の制御下においてＨＩＳ３およびＬａｃＺレポーター遺伝子を含有する酵母株ＹＤＥ１７３を、ＬｅｘＡおよびライブラリーに融合されたＧＣＮロイシンジッパー（ａａ２４５−２８５）を発現するベクターに同時形質転換させ、増殖選択のために６０ｍＭの３−ＡＴを含有する選択用ドロップアウトプレート（−Ｔｒｐ／−Ｌｅｕ／−Ｈｉｓ）上に蒔いて培養した。もし、好適なＣＤＲ３配列を含むＣＤＲ３ライブラリーからのｓｃＦｖフラグメントが、ＬｅｘＡに融合されたロイシンジッパー抗原に結合すれば、ＨＩＳ３レポーター遺伝子の転写を活性化させ、酵母細胞のヒスチジン依存性の増殖を回復させる複合体が形成される。３日後、増殖しているコロニーを選び取り、同じ選択用ドロップアウトプレートに再び蒔いた。２次選択後でもまた増殖する細胞の、Ｘ−ｇａｌプレート上におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。β−ｇａｌ陽性クローンからライブラリープラスミドＤＮＡを抽出し、可変重鎖のＣＤＲ３の領域をシークエンスした：本発明者らは本来のλグラフトＣＤＲ３アミノ酸配列を４回見出し、ＧＣＮ４ロイシンジッパーに特異的な３つの完全に新しいＣＤＲ３配列を見出した。本来のＣＤＲ３の配列を含有する４つの同定されたｓｃＦｖフラグメントはλグラフトとして識別不能に振舞い、一方変化したＣＤＲ３配列を含む３つのクローンは、ＬａｃＺレポーター遺伝子の活性化において効果が弱かった。
【００９１】
これらの結果は、還元条件下において安定性かつ可溶性である規定されたｓｃＦｖフレームワーク内に包埋された新規なＣＤＲの、直接的細胞内スクリーニングの可能性を示す。
【００９２】
規定されたイントラボディーのインビボにおける性能は、無作為突然変異誘発により最適化され得る
フレームワークで安定化されたλグラフト変異体を、イントラボディーのフレームワークに沿って統計的にアミノ酸変化を導入するために、Sambrook  et  al.によって説明されるようにＰＣＲにより無作為に突然変異誘発させた。酵母株ＹＤＥ１７３を、このＧａｌ４の活性化ドメインに融合させて無作為突然変異誘発させたｓｃＦｖライブラリー、およびＬｅｘＡに融合させた特異的な抗原（ＧＣＮ４ロイシンジッパーのａａ２４５−２５８）を発現するプラスミドで同時形質転換し、８０ｍＭの３ＡＴを含有するドロップアウトプレート上で培養した。６つの候補となるクローンを選択し、それぞれはフレームワーク内に１つの単独のアミノ酸変化を有していた。これら６つの変異体フレームワークは全て、λグラフト変異体と比べて向上したインビボにおける性能を示し、これはβ−ガラクトシダーゼ活性の測定により確認され、定量化された。イントラボディーの性能を向上させる種々のアミノ酸変化は相加的に振る舞うという仮定をもとに、本発明者らは、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合させた１つのフレームワーク内の６つ全ての変異を組み合わせ、ＬａｃＺレポーター遺伝子の活性化について、フレームワークで安定化させたλグラフト変異体と比較した。図２は、６つの点変異を全て含む混合性のこの新規なフレームワーク（Ωグラフト）は、本来のλグラフト変異体と比較してインビボにおける性能がほぼ３０％優れていることを示すことを示す。驚くべきことに、これら６アミノ酸の置換はクラスター形成されており、そのうち２つ（Ｅ→ＫおよびＬ→Ｒ）は可変軽鎖のＣＤＲ１の上流に存在し、残りの４つ（Ｎ→Ｄ、Ｇ→Ｃ、Ｋ→Ｅ、Ｔ→Ｓ）は可変重鎖のＣＤＲ２とＣＤＲ３の間に位置する。
【００９３】
レポーター遺伝子のＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの染色体への組み込み
組み込み用レポータープラスミドｐＡＢ１８３は、ＧＡＬ１プロモーターのＴＡＴＡボックスの上流１５０の位置で２つのＧｃｎ４ｐ結合サイトをクローニングした、ｐＪＰ１６１（Barberis  et  al.,1995）に由来する。Ｇｃｎ４ｐ結合サイトは、５’ＳｐｈＩおよび３’ＳａｌＩ適合性のオーバーハング配列を有する２つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより発生させた。このオリゴヌクレオチドは次のようである：５’−ＣＣＴＡＴＧＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴＡＴＧＡＣＴＣＡＴＣＧ−３’（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．６）；５’−ＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＡＴＡＡＣＴＧＧＡＴ  ＧＡＧＴＣＡＴＡＧＧＣＡＴＧ−３’（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．７）。このレポータープラスミドをＡｐａＩサイトで直線化し、ＪＰＹ５株（Barberis  et  al.,1995）の酵母ゲノム遺伝子座ｕｒａ３へ組み込み、ＹＡｄＭ２ｘＧＣＮ４−１５０とした。ＹＡｄＭ２ｘＧＣＮ４−１５０株は、２０００年２月１１日に、ドイツ、ブラウンシュヴァイク所在のＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓｕｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ  ＤＳＺＭに、番号ＤＳＭ１３３３２として寄託された。４つの独立した酵母形質転換を機能解析において試験し、全てが同じＧＣＮ４−依存性のレポーター遺伝子活性を示した。クローンのうち１つ（ＹＡｄＭ２ｘＧＣＮ４−１５０）を後の実験のために選択し、これを酵母野生型と呼ぶ。
【００９４】
ツーハイブリッド実験に用いたレポーター株は、ＬａｃＺおよびＨＩＳ３の発現を駆動する６つのＬｅｘＡ結合サイトを含む双方向性プロモーターを含有する、組み込まれたレポーター構築物を有する。
【００９５】
酵母細胞の系列希釈およびスポッティング
酵母細胞を、次の標準的な手順に従った酢酸リチウム法を用いて形質転換した。形質転換体をドロップアウト培地（−Ｔｒｐ／−Ｌｅｕ）中で一晩３０℃で培養した。飽和になった培養液を、ドロップアウト培地でＯＤ６００＝０．７になるまで希釈し、少なくとも２倍の時間再びインキュベートした。各培養液を、およその濃度が１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌから始めて、水で系列希釈し（希釈係数（ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）５）、各希釈溶液から１０μｌずつ、０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、または１００ｍＭの３−アミノトリアゾールを含むドロップアウトプレート（−Ｔｒｐ／−Ｌｅｕ／−Ｈｉｓ）上にスポットした。各形質転換体の６つの異なる希釈溶液をドロップアウトプレート上にスポットした。プレートを３０℃でインキュベートし、４８時間、７２時間、および１２０時間後に調査した。
【００９６】
ｓｃＦｖフラグメントのインビボにおける分析：酵母内におけるｓｃＦｖフラグメントの発現およびβ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイ
溶液中のβ−ガラクトシダーゼアッセイを、記述されているように（Kaiser  et  al., 1994, Escher  and  Schaffner  1997）透過化処理した細胞を用いて行った。活性は、アッセイした細胞数に対して規準化した。
【００９７】
抗ＧＣＮ４  ｓｃＦｖフラグメントのウェスタンブロット解析
種々の抗ＧＣＮ４ｓｃＦｖフラグメントの溶解性をウェスタンブロットにより解析した。５ｍｌの培養液を３０℃で光学密度が約２〜３になるまで培養した。細胞を同じ細胞密度になるように規準化し、沈殿させ、可溶性タンパク質のやさしい単離を促進させる穏やかな界面活性剤調合物であるピアス社製のＹ−ＰＥＲＴＭ酵母タンパク質抽出剤で全細胞タンパク質を抽出した。可溶性および不溶性の画分を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により分離した。可溶性および不溶性の粗抽出物のサンプルを標準的な手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。Ｈｉｓ５−ｔａｇの付いたｓｃＦｖフラグメントを、抗Ｈｉｓ５ｓｃＦｖ−ＡＰ融合体を用いた既知の方法（Lindner  et  al.,1997）に従って、ベーリンガーマンハイム社製の化学発光ホスファターゼ基質（ｃｈｅｍｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ＣＳＰＤを用いて検出した。ウェスタンブロットにおいて適切な強度を得るために、可溶性画分においては不溶性画分において用いるよりも約５倍高いタンパク質濃度を用いなければならず、またブロット時間も異なった。したがって、直接的な比較は、それぞれ全て可溶性の試料の間、または全て不溶性の試料の間でのみ意味のあることである。
【００９８】
本発明の好ましい実施形態が現在示され、記載されているが、本発明はそれに限定されず、請求項の範囲内において他の種々の具体化および実施が可能であることは明瞭に理解されるべきである。
【００９９】
【表２】
2011062205.tif 000003
2011062205.tif 000004
2011062205.tif 000005
2011062205.tif 000006
2011062205.tif 000007
［配列表］
【０１００】
【表３】
2011062205.tif 000008
2011062205.tif 000009
2011062205.tif 000010
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【図１Ａ】
2011062205.tif 000013
【図１Ｂ】
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【図２】
2011062205.tif 000015
【図３Ａ】
2011062205.tif 000016
【図３Ｂ】
2011062205.tif 000017
【図４】
2011062205.tif 000018
【図５Ａ】
2011062205.tif 000019
【図５Ｂ】
2011062205.tif 000020
【図６】
2011062205.tif 000021