(57)【要約】【課題】G-CSF及びEPOの持つ心筋組織修復再生能を副作用なく最大限に引き出すため、虚血心筋局所に有効量のG-CSFあるいはEPOを作用させることができる心筋組織修復のための薬剤のための組成物を提供する。【解決手段】シアリルルイスＸ型四糖鎖（Neu5Ac.alpha.2-3 Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)GlcNAc）を表面に備える平均粒径が７０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下のリポソームと、前記リポソームに内包されるエリスロポエチン及び／又は顆粒球コロニー刺激因子と、を含有する、静脈投与される心筋梗塞の治療用静脈投与用医薬組成物とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルルイスＸ型四糖鎖（Neu5Ac.alpha.2-3 Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)GlcNAc）を表面に備える平均粒径が７０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下のリポソームと、
前記リポソームに内包されるエリスロポエチン及び／又は顆粒球コロニー刺激因子と、
を含有する、静脈投与される、心筋梗塞の治療用医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の心筋梗塞の治療用医薬組成物を静脈経由で投与する、心筋梗塞の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、梗塞心筋局所部位への非侵襲的であって有効な薬剤送達を実現できるリポソームを使用した心筋梗塞の治療用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、重症大型心筋梗塞などの心筋梗塞では左室リモデリングが進行し心不全に陥るため生命予後は悪いことが知られている。したがって、壊死心筋組織を再生し、左室リモデリングを改善できれば予後は改善する。梗塞心筋組織を再生し左室リモデリングを改善する方法の一つに、サイトカイン治療がある。具体的な再生修復サイトカインとしてはエリスロポエチン（EPO）及び／又は顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）がある。G-CSFとEPO は、心筋梗塞後に全身投与されると心筋組織の修復、血管再生が生じることが明らかとなっている。EPOはすでに腎性貧血に対し、G-CSFは顆粒球減少症に対して臨床応用されている薬剤であり、修復再生サイトカインとしての使用にあたっての倫理的なハードルは低く、静脈注射という極めて低侵襲的で患者負担が少ないため、心筋組織血管再生治療のための臨床応用が可能である。
【０００３】
現在までのところ、このような薬剤の梗塞心筋組織へのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としては、ゼラチンゲルパッチを用いて梗塞心筋局所部位に外科的手法により適用し、該パッチより薬剤を局所部位に除放することが行われている（非特許文献１）。一方、ＤＤＳの一種として表面にＥ−セレクチン等と結合するシアリル酸Ｘ（シアリルルイスＸ型四糖鎖；Neu5Ac.alpha.2-3 Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)GlcNAc）（SLX）を結合させた標的指向性リポソームが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開WO2005/011633号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kobayashi H & Minatoguchi S et al. Cardiovasc Res 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
G-CSFとEPOの全身投与は、白血球数増加、赤血球数増加、ヘマトクリット上昇などが生じ、心筋梗塞、脳卒中などの合併症が起こる可能性があるという問題を有する。また、心筋梗塞に関する有効な薬剤のＤＤＳは未だ確立されていない。
そこで、本発明は、G-CSF及びEPOの持つ心筋組織修復再生能を副作用なく最大限に引き出すため、虚血心筋局所に有効量のG-CSFあるいはEPOを作用させることができる心筋組織修復用の薬剤のための組成物を提供することをその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、G-CSFやEPOの梗塞心筋局所部位へのDDSを種々検討し、E-セレクチン等と結合するSLXを表面に備え、毛細血管を通過可能なリポソームにこれらの薬剤を内包させることで、選択的に梗塞心筋局所へ送達でき、しかも、内包させた薬剤が有効に作用することを初めて見出し、本発明を完成した。梗塞心筋局所では、セレクチン等の発現が増強されていることが知られているものの、SLXを表面に備えるリポソームを静脈投与したときに梗塞心筋局所に到達することは知られておらず、また、当業者といえども予測できなかった。しかも、到達後に有効に薬剤が取り込まれ梗塞心筋局所で作用することも知られていなかった。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
【０００８】
（１）シアリルルイスＸ型四糖鎖（Neu5Ac.alpha.2-3 Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)GlcNAc）を表面に備える平均粒径が７０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下のリポソームと、前記リポソームに内包されるエリスロポエチン及び／又は顆粒球コロニー刺激因子と、を含有する、静脈投与される心筋梗塞の治療用医薬組成物。
（２）（１）に記載の心筋梗塞の治療用医薬組成物を静脈経由で投与する、心筋梗塞の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】SLX-リポソームの梗塞部位への選択的集積を蛍光により示す図である。蛍光部分（赤色）を矢印で示す。
【図２】梗塞領域を決定するための染色組織を、乳頭筋レベルの心臓の横断図として示す。黒紫色の部分が非危険領域、赤の部分及び白色の部分が危険領域であり、赤色の部分は、虚血したがその後回復した領域であり、白色の部分が、虚血後に梗塞（壊死）した領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書の開示は、心筋梗塞の治療用医薬組成物に関する。本明細書に開示の医薬組成物によれば、E-セレクチン又はP-セレクチンに結合することがわかっているリポソームを用いることで、予想を超えて梗塞心筋局所にリポソームが到達させることができ、しかも、薬剤の放出により梗塞心筋局所の組織を再生し、修復できることがわかった。
【００１１】
（心筋梗塞の治療用医薬組成物）
本明細書に開示の医薬組成物は、EPOを含有することができる。本明細書において、EPOとは、EPO又はEPOの誘導体様の生理活性を持つアミノ酸組成の異なる生理活性物質を包含している。また、本明細書に開示の医薬組成物は、G-CSFを含有することができる。なお、本明細書においてG-CSFは、G-CSF 又はG-CSFの誘導体様の生理活性を有するアミノ酸組成の異なる生理活性物質を包含している。
【００１２】
本明細書に開示の医薬組成物は、シアリル酸Ｘを表面に備える平均粒径が７０ｎｍ以上１００ｎｍ以下のリポソームを含有している。リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。本明細書において、リポソームは、例えば、その表面すなわち脂質層に糖鎖が、ヒト血清アルブミンのようなリンカー蛋白質を介して、共有結合したものが挙げられる。糖鎖としては、シアリルルイスＸ型四糖鎖（Neu5Ac.alpha.2-3 Gal.beta.1-4(Fuc.alpha.1-3)GlcNAc）が挙げられる。また、リンカー蛋白質としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられる。
【００１３】
本発明のリポソームを構成する脂質としては、例えば、フォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類、コレステロール等が挙げられ、フォスファチジルコリン類としては、ジミリストイルフォスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジステアロイルフォスファチジルコリン等が、また、フォスファチジルエタノールアミン類としては、ジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等が、フォスファチジン酸類としては、ジミリストイルフォスファチジン酸、ジパルミトイルフォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジン酸、ジセチルリン酸等が、ガングリオシド類としては、ガングリオシドＧＭ１、ガングリオシドＧＤ１a、ガングリオシドＧＴ１ｂ等が、糖脂質類としては、ガラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、フォスファチド、グロボシド等が、フォスファチジルグリセロール類としては、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロール、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール等が好ましい。
【００１４】
本発明において使用するリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることがこのましい。リポソーム自体は、周知の方法に従い製造することができるが、これには、薄膜法、逆層蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法等を挙げることができる。また、超音波照射法、エクストルージョン法、フレンチプレス法、ホモジナイゼーション法等を用いて、リポソームの粒子径を調節ことも可能である。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。
【００１５】
なかでも、フォスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類の配合はリンカー蛋白質の結合部位として必須のものである。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。続いて、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。
【００１６】
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作成する方法（特開２００１−３０２６８６号）等も用いることが可能ではあるが、本発明においては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することができる。
【００１７】
本発明において用いるリポソームに、さらに、糖鎖をリンカー蛋白質を介して結合させるが、この手段としては、まず、リポソームを、ＮａＩＯ４、Ｐｂ(Ｏ２ＣＣＨ３)４、ＮａＢｉＯ３等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ４等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白も、親水性化するのが好ましく、これには リンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3'-ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
【００１８】
本発明において用いるリポソームにおいては、糖鎖は、リポソーム上のリンカー蛋白質に結合させるが、これには、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ４ＨＣＯ３、ＮＨ２ＣＯＯＮＨ４等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、3,3'-ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、糖鎖を表面に有するリポソームを得る。なお、これらの糖鎖は市販されている。
【００１９】
本発明においては、シアリルルイスX型四糖鎖（SLX）は、E-セレクチンと結合することが知られているほか、特にリンパ節、脳、肝臓、脾臓に対する指向性が強いことが知られている。しかしながら、本発明者によれば、梗塞心筋局所を有効な標的にできることがわかっている。
【００２０】
リポソームの平均粒子径は、毛細血管を通過させることを考慮すると１５０ｎｍ以下であることが好ましい。より好ましくは１４０ｎｍ以下であり、さらに好ましくは、１２０ｎｍ以下であり、一層好ましくは１００ｎｍ以下である。また、平均粒子径は、３０ｎｍ以上であることが好ましく、より好ましくは、５０ｎｍ以上であり、さらに好ましくは７０ｎｍ以上である。リポソームのゼータ電位は、−１００〜１０ｍＶ、好ましくは−７０〜０ｍＶ、さらに好ましくは−６０〜−１０ｍＶである。本明細書に開示される医薬組成物に含まれるリポソーム製造の過程において、表面に何も結合していないリポソーム、親水性化されておらず糖鎖が結合したリポソーム、糖鎖が結合しておらず親水性化されたリポソームおよび親水性化され糖鎖が結合したリポソームの４つの態様のリポソームが存在し得るが、これらの４つの態様のリポソームが生理食塩水などの等張液において前記粒径の範囲およびゼータ電位の範囲に包含される。
【００２１】
リポソームには、EPO及び／又はG-CSFが内包されている。リポソームへこれらの薬剤を封入するには、周知の方法を用いればよく、例えば、薬剤等の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類の脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
【００２２】
本発明の医薬組成物は、シアリルルイスＸ型糖鎖表面に結合したリポソームの他、糖鎖の結合していないリポソームの他に薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤等を含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、静脈投与されることが好ましい。すなわち、静脈経由の注射剤、点滴剤として用いられうる。かかる組成物は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、注射剤は、本発明の糖鎖結合リポソームを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用しても良い。
【００２３】
本明細書に開示の医薬組成物の投与量は、心筋梗塞の重篤度等により適宜決定できるが、本発明の組成物の医薬的に有効量を患者に投与する。ここで、「医薬的に有効量を投与する」とは、梗塞心筋局所の少なくとも一部を再生修復するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与することをいう。本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じて選択される。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。なお、以下の実施例は本発明を拘束するものではない。
【実施例１】
【００２５】
（SLX-リポソームの梗塞部位への選択的集積）
SLX-リポソームが梗塞領域に選択的に集積するか否かを検討するために、日本白色種ウサギを用いて冠動脈３０分間虚血・１日、２日、７日間再灌流の心筋梗塞モデルを作製し、蛍光物質Cy5.5により標識されたヒト血清アルブミンをリポソームに内包し、表面にSialyl Lewis X (SLX)を結合させたSLX- Cy5.5-リポソームを心筋梗塞発症直後に耳静脈から静注し、梗塞１日、２日、７日後の心筋梗塞部に蛍光物質が集積しているかどうかについて、蛍光顕微鏡にて観察した。なお、リポソームは、脂質濃度として２．６ｍｇ／ｍｌのものを1 ｍｌ投与した。結果を図１に示す。なお、図１において、緑色部分は心筋細胞を示し、青色部分は細胞核を示し、赤色部分はSLX- Cy5.5-リポソームを示す。
【００２６】
図１に示すように、非梗塞心筋部位には赤で示されるCy5.5が全く集積していないのに対し、梗塞部位では梗塞１、２、７日後いずれの時点においても赤で示されるCy5.5が認められ、この結果は、SLX- Cy5.5-リポソームは選択的に梗塞心筋部位に集積することを示している。
【実施例２】
【００２７】
（心筋梗塞サイズの評価）
日本白色種ウサギ（約２ｋg）を用いて冠動脈３０分間虚血・１日、２日、７日間再灌流の心筋梗塞モデルを作製しし、何も投与しないコントロール群、EPO全身投与群、SLX-(EPO)-リポソーム群、G-CSF全身投与群、SLX-(G-CSF)-リポソーム群を準備した。これらの各群について、梗塞１４日後に心臓を摘出し、Evans blue dyeによって虚血領域と非虚血領域を決定し、ＴＴＣ染色によって梗塞領域を決定した。図２にその染色組織を示す。梗塞サイズは、心臓全体の危険領域に対する梗塞領域をパーセントで求めた。なお、各群における有効成分の投与量は以下の通りであった。
EPO全身投与群：EPO 1500 IU/kg/day × 5 day＝ 7500 IU/kg（約15000 IU/羽）
SLX-(EPO)-リポソーム群： EPO 2000 IU/ml × 1 ml ＝2000 IU/羽
G-CSF全身投与群：10μｇ/kg/day × 5 day= 50 μｇ/kg（約100μｇ/羽）
SLX-(G-CSF)-リポソーム群：G-CSF 20μｇ/ml ×１ ml＝ 20 μｇ/羽
【００２８】
各群での梗塞サイズは、以下のとおりであった。
コントロール群（n=10）： 26.8±1.4％
EPO-全身投与(n=10)： 24.4±1.5％
SLX-EPO-リポソーム群(n=10)： 17.0±0.8％
G-CSF全身投与群(n=10)：10.0±2.0％ 
SLX-G-CSF-リポソーム群(n=10)： 18.0±0.8％
【００２９】
図２に示すように、SLX-(EPO)-リポソーム、SLX-(G-CSF)-リポソーム投与はコントロールに比較して梗塞サイズ縮小をもたらすことを確認した。なお、G-CSF全身大量投与（10μg/kg/day x 5日間）は梗塞サイズ縮小をもたらすが、EPO少量全身投与（1500 IU/kg x 5日間）は梗塞サイズに変化を与えていないことを確認している。
【００３０】
以上説明したように、本発明によれば、薬剤を特定のリポソームに内包することで予想を超えた心筋梗塞の梗塞心筋局所の治療効果を得ることができた。
【図１】
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【図２】
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