(57)【要約】【課題】  マイクロ・ナノバブルＭｎｂによる細胞操作効果向上を課題とする。【解決手段】  窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）等の純度９０％以上の単一気体の単独成分ガスを包含したＭｎｂを混合した「Ｐタイプ」Ｍｎｂと、窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）等を混合して成分調整したガスを包含した「Ｃタイプ」Ｍｎｂとを混合した「Ｐ／Ｃ混合タイプ」のＭｎｂで細胞操作の効果を向上させた。包含ガスはこれらに限らず、アルゴン（Ａｒ）など対象細胞の自然生育環境に存在する気体種、および／または、一酸化窒素（ＮＯ）や一酸化炭素（ＣＯ）など対象細胞中の生体反応に寄与する気体種であってもよい。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小気泡を含有する液体の組成物であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、かつ、
該微小気泡の包含気体が少なくとも以下の二種が混在するものである組成物。
１  気体が、純度９０％以上の単一気体である。
２  気体が、複数の気体が混合した混合気体である。
【請求項２】
請求項１の微小気泡を含有する液体の組成物であって、
前記の液体が、以下の物質のうち少なくともひとつを含有した細胞培養液である組成物。
１  遺伝子、
２  酵素・補酵素・助酵素、（「・」は、「または」を示す）
３  遺伝子によって生合成されるリコンビナント蛋白質・アミノ酸・ぺプチド・糖鎖、（「・」は、「または」を示す）
４  ホルモン・フェロモン・植物のアレロパシーを誘発する物質。（「・」は、「または」を示す）
【請求項３】
請求項１または請求項２の微小気泡を含有する液体の組成物であって、
前記の微小気泡の包含気体が下記のいずれかである組成物。
１  窒素（Ｎ2）、
２  酸素（Ｏ2）、
３  二酸化炭素（ＣＯ2）、
４  アルゴン（Ａｒ）、
５  水素（Ｈ2）、
６  一酸化窒素（NO）、
７  一酸化炭素（CO）。
【請求項４】
複数の純度９０％以上の気体供給手段、該複数気体のゼロを含む混合比の設定手段、前記の設定混合比で前記複数気体を混合する気体調整手段、該調整された気体の吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いた、微小気泡を含有する組成物の製造方法であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、かつ、少なくとも以下の二工程を有する方法。
１  前記の混合比の設定手段の設定を複数気体のひとつを除きすべてゼロとして前記気体吸引手段で吸引し、純度９０％以上の単一気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。
２  前記の混合比の設定手段の設定を複数気体についてゼロでない設定として前記気体吸引手段で吸引し、複数気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。
【請求項５】
純度９０％以上の気体供給手段、複数の気体を混合した気体の供給手段、該純度９０％以上の気体または該複数の気体を混合した気体のいずれかを選択的に吸引する手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いた、微小気泡を含有する組成物の製造方法であって、
該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、かつ、少なくとも以下の二工程を有する方法。
１  前記の純度９０％以上の単一気体を前記気体吸引手段で選択吸引し、純度９０％以上の単一気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。
２  前記の複数の気体を混合した気体を前記気体吸引手段で選択吸引し、複数の気体を混合した気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。
【請求項６】
請求項４または請求項５のいずれかの組成物の製造方法であって、
前記の液体が細胞培養液で、該細胞培養液に以下の物質のうち少なくともひとつを混合する工程をさらに含むものである方法。
１  遺伝子、
２  酵素・補酵素・助酵素、（「・」は、「または」を示す）
３  遺伝子によって生合成されるリコンビナント蛋白質・アミノ酸・ぺプチド・糖鎖、（「・」は、「または」を示す）
４  ホルモン・フェロモン・植物のアレロパシーを誘発する物質。（「・」は、「または」を示す）
【請求項７】
請求項４または請求項５のいずれかの組成物の製造方法であって、
前記の気体が下記のいずれかである方法。
１  窒素（Ｎ2）、
２  酸素（Ｏ2）、
３  二酸化炭素（ＣＯ2）、
４  アルゴン（Ａｒ）、
５  水素（Ｈ2）、
６  一酸化窒素（NO）、
７  一酸化炭素（CO）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロバブル、ナノバブル、マイクロ・ナノバブルと呼称される微小気泡を含有する液体の組成物、および、微小気泡を含有する組成物の製造方法に関する。
【０００２】
特に本発明は、後述する特許文献１および特許文献２記載の微小気泡技術の不明確部分を補足し、かつ、特許文献１および特許文献２の微小気泡技術の改良発明である。  
【０００３】
本明細書では、微小気泡をマイクロおよび/またはナノバブルを略した「Ｍｎｂ」と略記する。通常のミリサイズ以上のバブルを「Ｍｍ」と略記する。
【０００４】
ＭｎｂおよびＭｎｂの利用技術については、特許文献１から特許文献４に記載されているし、以下の参考文献０１から２２に記載されているので省略する。
【０００５】
＜参考文献０１から２２＞
０１  特開２００９−１８９３０７号公報「芽胞細菌の殺菌乃至不活化方法」 
０２  特開２００９−１３１７７０号公報「二酸化炭素ナノバブル水の製造方法」 
０３  特開２００９−１３１７６９号公報「窒素ナノバブル水の製造方法」
０４  特開２００９−０８４２５８号公報「ナノバブルを含む癌の治療又は予防のための薬剤 」 
０５  特開２００９−０３９６００号公報「超微細気泡生成装置」 
０６  特開２００８−２５９４５６号公報「魚介類の保存方法」
０７  特開２００８−２３７９５０号公報「水酸基ラジカルを含む水の製造方法および水酸基ラジカルを含む水」
０８  特開２００８−０９３６１２号公報「反応活性種を含む水の製造方法および反応活性種を含む水」
０９  特開２００８−０９３６１１号公報「極微小気泡を含む水の製造方法および極微小気泡を含む水」  
１０  特開２００８−０６３２５８号公報「組織保存液」 
１１  特開２００７−２７５０８９号公報「長期持続型オゾン水、長期持続型オゾン水を利用した環境殺菌・脱臭浄化方法 」
１２  特開２００６−２２３２３９号公報「酸素ナノバブルを利用した魚介類焙焼有効成分抽出方法およびその抽出方法によって得られた有効成分を添加した魚肉加工品素材」 
１３  特開２００５−２４６２９４号公報「酸素ナノバブル水およびその製造方法」  
１４  特開２００５−２４６２９３号公報「オゾン水およびその製造方法」
１５  特開２００５−２４５８１７号公報「ナノバブルの製造方法」 
１６  特開２００５−１１０５５２号公報「加圧多層式マイクロオゾン殺菌・浄化・畜養殺菌システム」 
１７  再表２００５／０３０６４９号公報「微小気泡の圧壊」 
１８  長雄一郎、村松憲、佐藤健次「酸素ナノバブル水の組織保存性に関する組織学的検討（第１報）」第１１１回日本解剖学総会・学術集会
１９  平成１７年度  新エネルギー・産業技術総合開発機構委託調査研究  バイオ分野におけるナノバブル水の産業利用に関する調査  成果報告書  ３８−４０「ナノバブル水を利用した生体組織の保存等に関する評価研究」
１０  Ｈｏｊｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．“Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｎａｎｏ−ｂｕｂｂｌｅｓ”  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｖｏｌ．７０，  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉ，ｐ２７６（第７０回  日本循環器学会総会・学術集会）
２１  平成１７年度  新エネルギー・産業技術総合開発機構委託調査研究  バイオ分野におけるナノバブル水の産業利用に関する調査  成果報告書  ４０−４５「細胞の生理機能に対するナノバブル水の影響評価」
２２  日本混相流学会混相流レクチャーシリーズ第３５回「マイクロ・ナノバブルの特性とのその応用」２００９年１２月５日（関西大学にて配布）  
【０００６】
特許文献１および特許文献２の微小気泡技術は、有用な細胞に対する操作または有用な細胞変化の促進を目的とした技術であって、Ｍｎｂが従来のＭｍでは得られない大きな効果を細胞に与えることを利用している。特許文献１および特許文献２の微小気泡技術について以下に説明する。
【０００７】
図１が特許文献１および特許文献２の微小気泡技術を説明する模式図である。すなわち、図１は、細胞に与える影響について、マイクロ・ナノバブルＭｎｂがミリサイズ以上のバブルＭｍのそれよりも大きいことを示す模式図であって、図１（ａ）は、Ｍｍ表面に親水性細胞膜をもつ細胞が集まっているがＭｎは細胞に大きな影響を与えてはいないことを示す。  
【０００８】
これに対して図１（ｂ）は、マイクロ・ナノバブルＭｎｂが細胞Ｃのスケールよりも小さいことを示し、図１（ｃ）は（ｂ）の拡大模式図で、Ｍｎｂが細胞膜表面ＣＳにある物質チャネル構成物質ＣＰ（細胞膜の蛋白など）に接近または親和性等で結合して影響を与える場合があることを示す。
【０００９】
Ｍｎｂをなす気体が溶出して、周囲に高濃度ガス溶存状態を形成すれば、拡散によって細胞膜を透過することもある。
【００１０】
Ｍｎｂをなす気体溶出による拡散現象で細胞膜を透過することを模式的に示す例図が図５および図６である。すなわち、図５が、気孔の二酸化炭素（ＣＯ2）吸収に与えるＭｎｂの影響を示す模式図である。
【００１１】
ここでＭｎｂは、Ｙｏｕｎｇ−Ｌａｐｌａｃｅの式[ P = Pl + 2σ/r (P = gas pressure, Pl = liquid pressure, σ = surface tension, r = radius of the bubble)]により、径が縮小するとともに圧力が上昇する。それで、Ｍｎｂをなす気体の溶存量がＭｎｂと液体の気液界面で局所的に高まり、気体が液体に溶出する。そのため、気孔近傍に二酸化炭素を包含するＭｎｂがあると気孔近傍に二酸化炭素溶存量が極めて高い状態になって拡散による気孔部位の細胞膜透過量が増えて二酸化炭素吸収量が増大すると考えられる。
【００１２】
そして図６が、細胞の酸素（Ｏ2）吸収に与えるＭｎｂの影響を示す模式図である。ここでＭｎｂは、図５同様にＹｏｕｎｇ−Ｌａｐｌａｃｅの式により、径が縮小し、圧力の上昇から包含ガスの溶存量が気液界面で局所的に高まりガス溶出する。そのため、細胞近傍に酸素を包含するＭｎｂがあると細胞近傍に酸素溶存量が極めて高い状態になって拡散による細胞膜透過量が増えて細胞の酸素吸収量が増大すると考えられる。図５・図６に示す「高濃度過飽和ゾーン」が細胞近辺で局所的に高濃度化して細胞膜を透過する気体分子の集合を示す。この気体分子が細胞内に拡散等で取込まれ種々の作用の引き金を引くと考えられる。
【００１３】
特許文献１は、図８（ａ）（ｂ）（ｃ）のタイムチャート模式図で示されるＭｎｂ製法を開示している。
【００１４】
すなわち、図８（ａ）は、気体の選択手段で時間的に順次に選択された複数の気体を気体吸引手段から吸引し、該複数の気体を微小気泡となし、液体吐出手段に時間的に順次連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有組成物を得る製法である。
【００１５】
図８（ｂ）は、複数の微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、複数の気体吸引手段から吸引した複数の気体を微小気泡となし、複数の液体吐出手段に連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物の製法である。
【００１６】
図８（ｃ）は、図８（ｂ）の製法の装置にて図８（ａ）の時間的順次の気体切り替えを組み合わせた製法である。
【００１７】
これら図８（ａ）（ｂ）（ｃ）の製法によるＭｎｂは、図２の（ａ）に示す「Ｐタイプ」Ｍｎｂである。「Ｐタイプ」のＰはピュアガス（純ガス）の意味であって、概ね純度９０％以上の単一気体である。具体的には、純度９０％以上の窒素（Ｎ2）ガス、純度９０％以上の酸素（Ｏ2）ガス、純度９０％以上の二酸化炭素（ＣＯ2）ガス等である。
【００１８】
図２（ａ）は、窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）のそれぞれ該１００％の単独成分ガスを包含した「Ｐタイプ」Ｍｎｂを示す図である。
【００１９】
一方、特許文献２は、図８（ｄ）のタイムチャート模式図で示されるＭｎｂ製法を開示している。
【００２０】
すなわち、図８（ｄ）は、気体吸引手段の上流に吸引気体の成分とその濃度を調整制御する手段、および、前記吸引気体の成分とその濃度を調整制御する手段に、該気体成分とその濃度の調整制御目標指令を出す気体成分・濃度調整制御目標指令の出力手段、を具備した装置による製法である。
【００２１】
この図８（ｄ）の製法によるＭｎｂは、図２の（ｂ）に示す「Ｃタイプ」Ｍｎｂである。「Ｃタイプ」のＣはコンディションドガス（調整ガス）の意味であって、複数のガス（ピュアガス（純ガス）であってもなくともよい）の混合であって大気の成分の成分比、および、この成分比に近く調整したものであってもよい。より具体的には、通常の大気成分の成分比率に対して５％の変化があると細胞への影響が現れるので、各成分の１つ以上を５％以上の成分変化で混合させるのが好適である。図１６が大気成分の比率を示す参考図である。
【００２２】
図２（ｂ）は、窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）を混合して成分調整したガスを包含した「Ｃタイプ」Ｍｎｂを示す図である。
【００２３】
図３と図４で「Ｃタイプ」と「Ｐタイプ」のＭｎｂを補足説明する。図３が、「Ｃタイプ」Ｍｎｂを説明する模式図である。図３第一行のＧａｓ”ＣＡ”とＧａｓ”ＣＢ”とでは、包含ガスの成分比（図３第二行）もバブルの粒度分布（図３第三行）も異なっているので、細胞に与える効果（図３第三行）はＧａｓ”ＣＡ”とＧａｓ”ＣＢ”とで異なる。[ＣＡ≠ＣＢ]
【００２４】
図４が、「Ｐタイプ」Ｍｎｂを説明する模式図である。図４第一行のＧａｓ”ＰＡ”とＧａｓ”ＰＢ”とでは、包含ガスの成分比（図４第二から四行）もバブルの粒度分布（図４第三行）も異なっているが、包含ガスの成分比（図４第二から四行）は、窒素（Ｎ2）単独成分ガス量（図４第二行）、酸素（Ｏ2）単独成分ガスの量（図４第三行）、二酸化炭素（ＣＯ2）単独成分ガス量（図４第四行）の比率を調整すれば、図３のＧａｓ”ＣＡ”あるいはＧａｓ”ＣＢ”と、ほぼ等しくできる。
【００２５】
同様に、バブルの粒度分布（図４第三行）も、図３のＧａｓ”ＣＡ”Ｇａｓ”ＣＢ”とほぼ等しくできる。しかし、それらの効果は等しくはない。（効果ＣＡ≠ＰＡ、効果ＣＢ≠ＰＢ）
【００２６】
また、特許文献３に、以上説明した特許文献１および特許文献２の微小気泡技術と類似の記載が見られる。すなわち、特許文献３［請求項３］に「前記水素発生手段は、発生する気体の種類に応じた供給比率を変更可能な気体分配手段を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のナノバブル液体製造装置。」とあり、また、特許文献３の［００１０］に「（３）前記水素発生手段は、発生する気体の種類に応じた供給比率を変更可能な気体分配手段を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載のナノバブル液体製造装置を提供することができる。」とある。また特許文献３の［００１１］に「・・・また、気体分配手段は、可変バルブの組合せで各種気体の比率を変えてもよく、それぞれの気体の流量を調整する装置（例えば、マスフローコントローラ）を用いて行ってもよい。」とある。さらに特許文献３の図面に「１６ａ  気体分配手段」の記載もある。
【００２７】
しかしながら特許文献３の気体分配や気体比率変更等は、目的や効果について、特許文献１及び特許文献２の記載に比べて不明確である。すなわち特許文献３は、水素を含むナノバブル水と該ナノバブル液体製造装置を開示しているが、水素以外の気体分配手段の説明、水素以外の気体供給手段の記載もなく、微小気泡の包含ガスの調整を具体的に示すものではない。
【００２８】
また同様に、特許文献４および特許文献５にも、特許文献１および特許文献２の微小気泡技術と類似の記載が見られるが、その製法手順等、装置構成要素等は異なっている。（詳述略す）
【００２９】
さらにまた同様に、特許文献６にも、特許文献１および特許文献２の微小気泡技術と類似の記載が見られる。特許文献６の主眼は「気体を過飽和状態として大量に液体中に溶解させる技術」であるが、過飽和で発生する複数の気体による微小気泡（Mnb）の発生が示されている。（特許文献６［請求項２］［請求項１１］参照）  しかし、特許文献６の製法手順等、装置構成要素等も、詳細には特許文献１および特許文献２の微小気泡技術とは異なるものである。（詳述略す）
【００３０】
ここで、図１１から図１５を用いて、特許文献１および特許文献２の微小気泡技術にて追加補足されるべき技術、および特許文献７の組合せ技術について説明する。
【００３１】
図１１は、株式会社協和機設のＭｎｂ発生装置のデータであって、Ｍｎｂ発生後にＭｎｂ粒径が時間経過とともに縮小していくことを示す模式図である。測定器はベックマンコールター社のコールター方式微細粒子測定器である。
【００３２】
この図１１が示すＭｎｂ粒径の縮小変化は、図５および図６を用いて説明したように、Ｙｏｕｎｇ−Ｌａｐｌａｃｅの式[ P = Pl + 2σ/r (P = gas pressure, Pl =
liquid pressure, σ = surface tension, r = radius of the
bubble)]で説明される。
【００３３】
細胞操作においては、この粒径の時間変化を加味しなければならない。特に、気体の種類によって粒径の時間変化が異なることに注意が必要である。
【００３４】
具体的には、二酸化炭素（ＣＯ2）は溶解度が酸素・窒素に比べて大きいのでＭｎｂ発生後に溶出する量も多い。そのため二酸化炭素（ＣＯ2）を包含したＭｎｂは比較的早期に縮小する（図１２参照）。
【００３５】
図１２（ａ）は、二酸化炭素（ＣＯ2）が時間経過と共により多く溶出して包含量が減少することを示す模式図である。図１２（ｂ）は、各気体の水に対する溶解度の温度変化を示す参考図である。このような気体種による時間的変化の差異を見込んで実験データを採取して、実験と実際の応用との差が生じないようにする工夫を要する。
【００３６】
簡単には、実験でのＭｎｂ発生から細胞近傍へのＭｎｂ供給の時間と実用装置でのそれとを一致させればよい。もちろん液体温度等の付帯環境条件も一致させる必要がある。
【００３７】
実際には、実験でのＭｎｂ発生から細胞近傍へのＭｎｂ供給の時間と実用装置でのそれとを一致させることは困難であるので、発生させるＭｎｂごとに図１１の粒径分布時間変化を実測するとともに、図１２の気体種・適用温度ごとの溶存量変化を加味して実用装置内細胞近傍におけるＭｎｂ粒径分布・溶存量・気体溶出量などを推定し実施するのが好ましい。
【００３８】
図１３は参考図で、特許文献１に例示されたＭｎｂ発生装置の模式図である。（特許文献１［図２］の修正図）  図１３のようなマルチノズルの装置構成で、図８（ａ）や図８（ｂ）に示した複数の異なった気体を包含したＭｎｂを同時に発生させることができる。ここで、１０は、流動体保持容器Ｈ、または、流動体保持容器ＨとＴａｙｌｏｒリアクターＴＲ（図１４を用いて後述）の組合せであって、容器Ｈにて細胞培養する場合にはＨは細胞培養容器（バイオリアクター）である。
【００３９】
図１４も参考図で、特許文献２に例示されたＭｎｂ発生装置の模式図である。（特許文献２［図４］の修正図）  図１４の１７、１８、１８A、３０、３１は以下である。
【００４０】
すなわち、１７は、１０の液体濁度を透過光または散乱光測定方式で測定するセンサー、１８は、１０の温度・圧力・水素イオン濃度・生物学的／化学的酸素要求量等の環境の操作手段、１８Ａは、１０の温度・圧力・水素イオン濃度・生物学的／化学的酸素要求量等の環境の制御手段、３０は、液体槽の環境を調整制御する手段１８Ａに、促進環境の調整制御目標指令を出す液体槽環境調整制御目標指令の出力手段、３１は、対象細胞について、該細胞自身の変化を促進するのに要する複数の物質それぞれ個別の取込み安さに応じた、それぞれ個別の気体成分とその濃度をあらかじめ実験的に決定する工程によって得られたデータのデータベース、および、該細胞が自身の変化を促進するのに要する複数の物質それぞれ個別の取込み安さを促進する液体槽の環境のデータをあらかじめ実験的に決定する工程によって得られたデータのデータベースである。
【００４１】
これら１７、１８、１８A、３０、３１を兼備した構成で細胞培養やｉＰＳ細胞化操作等のバイオリアクター機能が実現される。
【００４２】
図１５も参考図で、特許文献７に記載されたＣＴ（Couette-Taylor）反応装置（Ｔａｙｌｏｒリアクター）ＴＲと微小気泡発生器とを組み合わせたプロセス装置の模式図である。特許文献１および特許文献２の微小気泡技術を実施する場合、ＴａｙｌｏｒリアクターＴＲとの組合せによって、細胞培養やｉＰＳ細胞化操作等のバイオリアクター機能をマクロ的に効率化できる。
【００４３】
ここで「マクロ的」とは、リアクター内部の流れ環境の均一化を意味するものであって、たとえば前述の図１１・図１２で説明した細胞近傍へのＭｎｂ供給の時間と実用装置でのそれとを一致させる「ミクロ的な」細胞近傍での条件、および、液体温度等の付帯環境条件を一致させる「ミクロ的な」細胞近傍での条件こと、について、マクロ的にリアクター内部のどの位置でも同様に実現することができるということである。（特許文献７参照）
【００４４】
以上図１１から図１５を用いて説明した特許文献１・特許文献２の追加補足技術、および特許文献７の技術は、本発明の実施においても組み合わせて実施することができる。
【特許文献１】特願２００９−２３４６８３号「細胞変化を促進する微小気泡含有組成物、およびその微小気泡含有組成物を製造する装置、ならびに微小気泡含有組成物を用いた細胞変化促進方法」丸井智敬
【特許文献２】特願２００９−２８２８４０号「微小気泡を含有する液体組成物で細胞変化を促進する装置、微小気泡を含有する液体組成物で細胞変化を促進する方法」丸井智敬
【特許文献３】特許公開２００８−６３９７号公報「ナノバブル液体製造装置及びナノバブル液体」オプトクリエーション
【特許文献４】特許公開２００９−１９５８８９号公報「微細気泡発生装置」アイシン精機株式会社
【特許文献５】特許公開２００７−７５７８５号公報「水処理方法および水処理装置」シャープ株式会社
【特許文献６】公表特許２００９−１９５８８９号公報（WO２００６/１２７９７９）「気体の液体への溶解と同溶解気体の供給のためのシステム及び方法」ユニバーシティ オブ アーカンソー
【特許文献７】特願２０１０−０１２７２７号「ＣＴ（Couette-Taylor）反応装置を用いたプロセス装置、該装置と微小気泡発生器とを組み合わせたプロセス装置。」丸井智敬
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４５】
本発明は、特許文献１および特許文献２記載の微小気泡技術の不明確部分を補足し、かつ、特許文献１および特許文献２の微小気泡技術を改良した発明を提案するものである。
【課題を解決するための手段】
【００４６】
本発明は、図２の（ｃ）に示す、特許文献１および特許文献２で示された「Ｐタイプ」「Ｃタイプ」Ｍｎｂを混合した「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂである。本発明を、図７（効果）、図９と図１０（本発明タイムチャート）で説明する。
【００４７】
まず図７が、「Ｐタイプ」Ｍｎｂ・「Ｃタイプ」Ｍｎｂ・「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂそれぞれが細胞または生物に与える影響を比較する実験１）から実験６）のまとめ表である。概して「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂが細胞あるいは生物に与える影響が大きいことがわかる。
【００４８】
図７の実験１）＜酵母増殖＞  大気組成よりも酸素の成分を１０％大きくした３通りのＭｎｂ群を常温培養液に加えた培地で酵母（S. cerevisiae）を４８時間増殖させたときのコロニー数の比較である。
【００４９】
図７の実験２）＜大腸菌増殖＞  大気組成よりも酸素の成分を１０％大きくした３通りのＭｎｂ群を常温培養液に加えた培地で大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）を４８時間増殖させたときのコロニー数の比較である。
【００５０】
図７の実験３）＜気孔吸収＞大気組成よりも二酸化炭素の成分を１０％大きくした３通りのＭｎｂ群を常温蒸留水に加えてミスト化してシロイヌナズナに６時間おきに一定量散布。散布前から３０日後の植物体重量変化の比較である。
【００５１】
図７の実験４）＜メタン発酵＞酸素ゼロ、窒素とアルゴン９９％、二酸化炭素１％の３通りのＭｎｂ群を常温培養液に加え常温でメタン菌を４８時間培養したときのメタン発生量の比較である。
【００５２】
図７の実験５）＜人体血流量＞大気組成よりも二酸化炭素の成分を１０％大きくした３通りのＭｎｂ群を３８℃の温浴水に加え、該温浴水に３０分全身浴する人体上腕部の血流上昇値の比較である。
【００５３】
図７の実験６）＜動物細胞増殖＞大気組成よりも酸素の成分を１０％大きくした３通りのＭｎｂ群を常温培養液に加えた培地で標準チャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞を４８時間増殖させたときの細胞数の比較である。
【００５４】
ここで、「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂのほうが「Ｐタイプ」Ｍｎｂ、「Ｃタイプ」Ｍｎｂよりも細胞あるいは生物に与える影響が大きいことの理由は現時点では明確ではなく今後の研究によらねばならない。
【００５５】
仮説として考えられることは、上記の各実験にて細胞または生物が敏感に作用する気体分子は、実験１）、実験２）では酸素、実験３）では二酸化炭素、実験４）では窒素とアルゴン、実験５）では二酸化炭素、実験６）では酸素等であって、これらの作用気体が細胞近辺に局所的に高濃度で存在し、かつまた、他の気体分子は大気等の通常環境での溶存状態にあったほうがよい。そのため、「Ｐタイプ」Ｍｎｂでは、他の悪影響気体分子の濃度が高すぎるので効果の抑制があり、「Ｃタイプ」Ｍｎｂでは局所高濃度化の程度が低い。それで両者の中間的な「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂが、比較的良好な効果が得られる、ということである。（図５・図６の「高濃度過飽和ゾーン」が細胞近辺の局所高濃度化した作用気体分子の集合を示す）
【００５６】
さて、本発明の「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂの製法について、図９と図１０で説明する。
【００５７】
図９は、本発明の「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂの製法のタイムチャート模式図であって、「Ｃタイプ」Ｍｎｂを発生させた後に、同じ液体容器Ｈに「Ｐタイプ」Ｍｎｂを発生して混合し「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂを得るものである。
【００５８】
図１０は、逆に「Ｐタイプ」Ｍｎｂを発生させた後に「Ｃタイプ」Ｍｎｂを発生して混合して「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂを得るものである。このようにすれば「Ｐタイプ」・「Ｃタイプ」Ｍｎｂの混合タイプの製法は容易である。
【００５９】
すなわち、本発明の「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂは、複数の純度９０％以上の気体供給手段、該複数気体個別のゼロを含む混合比の設定手段、前記の設定混合比で前記複数気体を混合する気体調整手段、該調整された気体の吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて製造すればよい。
【００６０】
また、本発明の「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂは、純度９０％以上の気体供給手段、複数の気体を混合した気体（プレミックス調整気体）の供給手段、該純度９０％以上の気体または該複数の気体を混合した気体（プレミックス調整気体）のいずれかを選択的に吸引する手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いて製造すればよい。
【００６１】
ここで「プレミックス調整気体」のプレミックスは、「Ｐｒｅｐａｒｅｄ  Ｍｉｘ＝あらかじめ混合したもの、という意味で、プレミックス調整気体は、とはあらかじめ成分調整された混合気体、または、大気のような容易に入手される既に特定の混合比で混合された気体である。
【００６２】
いずれにせよ本発明の組成物である「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂは（請求項１）、微小気泡を含有する液体の組成物であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、かつ、該微小気泡が包含する気体が少なくとも以下の二種が混在するものである組成物である。  １  気体が、純度９０％以上の単一気体である。  ２  気体が、複数の気体が混合した混合気体である。
【００６３】
そして、本発明の組成物の製法は（請求項４）、複数の純度９０％以上の気体供給手段、該複数気体のゼロを含む混合比の設定手段、前記の設定混合比で前記複数気体を混合する気体調整手段、該調整された気体の吸引手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いた、微小気泡を含有する組成物の製造方法であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、かつ、少なくとも以下の二工程を有する方法である。  １  前記の混合比の設定手段の設定を複数気体のひとつを除きすべてゼロとして前記気体吸引手段で吸引し、純度９０％以上の単一気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。  ２  前記の混合比の設定手段の設定を複数気体についてゼロでない設定として前記気体吸引手段で吸引し、複数気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。
【００６４】
また、前記プレミックス調整気体を用いた本発明の組成物の製法は（請求項５）、純度９０％以上の気体供給手段、複数の気体を混合した気体（プレミックス調整気体）の供給手段、該純度９０％以上の気体または該複数の気体を混合した気体のいずれかを選択的に吸引する手段、液体吸引手段、液体吐出手段、および、微小気体を生成する本体を具備した微小気泡発生器を用いた、微小気泡を含有する組成物の製造方法であって、該微小気泡は、少なくともその粒径が３０μｍ以下のマイクロバブルを含み、かつ、少なくとも以下の二工程を有する方法である。  １  前記の純度９０％以上の単一気体を前記気体吸引手段で選択吸引し、純度９０％以上の単一気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。  ２  前記の複数の気体を混合した気体を前記気体吸引手段で選択吸引し、複数の気体を混合した気体を包含した気泡を前記液体吸引手段で吸引した液体内に前記液体吐出手段で吐出して発生する工程。
【００６５】
また、本発明の組成物の液体に、特許文献１の［請求項１３］ならびにその説明である特許文献１の[００４８]から[００５０]に記載された細胞変化促進物質を混ぜることで効果を増大することができる。
【００６６】
すなわち（請求項２）、請求項１の微小気泡を含有する液体の組成物であって、前記の液体が細胞培養液で、該細胞培養液に対象細胞の自然生育環境に存在する物質、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する物質、および／または、生体物質である以下の１から４の物質が少なくともひとつ混合されているものである組成物が好適である。  １  遺伝子、  ２  酵素・補酵素・助酵素、（「・」は、「または」を示す）  ３  遺伝子によって生合成されるリコンビナント蛋白質およびアミノ酸・ぺプチド・糖鎖、（「・」は、「または」を示す）  ４  ホルモン・フェロモン・植物のアレロパシーを誘発する物質。（「・」は、「または」を示す）
【００６７】
細胞変化促進物質を混ぜる工程を付加した製法は（請求項６）、請求項４または請求項５のいずれかの組成物の製造方法であって、前記の液体が細胞培養液で、該細胞培養液に（対象細胞の自然生育環境に存在する物質、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する物質、および／または、生体物質である）以下の１から４の物質を少なくともひとつ混合する工程をさらに含めればよい。  １  遺伝子、  ２  酵素・補酵素・助酵素、（「・」は、「または」を示す）  ３  遺伝子によって生合成されるリコンビナント蛋白質およびアミノ酸・ぺプチド・糖鎖、（「・」は、「または」を示す）  ４  ホルモン・フェロモン・植物のアレロパシーを誘発する物質。（「・」は、「または」を示す）
【００６８】
ここで、「アレロパシー（Ａｌｌｅｌｏｐａｔｈｙ）」とは、ある植物が他の植物の生長を抑える物質（アレロケミカル）を放出したり、あるいは動物や微生物を防いだり、あるいは引き寄せたりする効果の総称で邦訳では「他感作用」である。
【００６９】
また、本発明の気体は、より具体的には、特許文献１の［請求項１４］、ならびにその説明である特許文献１の[００５１][００５２]に記載された、「対象細胞の自然生育環境に存在する気体種、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する気体種である」ことが好適である。当然ながら、自然生育環境に存在する気体とは大気であるので、アルゴン（Ａｒ）も含まれる。また、細胞中の生体反応に寄与する気体種には、各種の細胞影響が注目される一酸化窒素（NO）や、有害気体である一酸化炭素（CO）も含まれる。
【００７０】
すなわち、組成物としては（請求項３）、請求項１または請求項２の微小気泡を含有する液体の組成物であって、前記の気体が対象細胞の自然生育環境に存在する気体種、および／または、対象細胞中の生体反応に寄与する以下の１から７の気体のいずれかであることが好適である。  １  窒素（Ｎ2）、２  酸素（Ｏ2）、３  二酸化炭素（ＣＯ2）、４  アルゴン（Ａｒ）、５  水素（Ｈ2）、６  一酸化窒素（NO）、７  一酸化炭素（CO）。
【００７１】
同様にかかる組成物の製法は（請求項７）、請求項４または請求項５のいずれかの組成物の製造方法であって、気体が以下の１から７の気体のいずれかであることが好適である。  １  窒素（Ｎ2）、２  酸素（Ｏ2）、３  二酸化炭素（ＣＯ2）、４  アルゴン（Ａｒ）、５  水素（Ｈ2）、６  一酸化窒素（NO）、７  一酸化炭素（CO）。
【００７２】
以上説明した本発明の実施に当たって、図１１から図１４を用いて説明した特許文献１・特許文献２の追加補足技術、および、図１５の特許文献７によるＴａｙｌｏｒリアクターの利用技術を組み合わせて実施することができる。すなわち、図１１と図１２に示すようなＭｎｂの粒径分布の時間変化、それに伴う気体分子種ごとの溶出データを実験的に把握して、たとえば、二酸化炭素のような溶出しやすい気体については量を多くしたり、ガス投入を遅らせたりする操作を実施すること、図１３の複数の吐出手段による構成を用いること、図１４のセンサーとデータベースをもつ制御システムの構成を用いること、図１５のＣＴ（Couette-Taylor）反応装置（Ｔａｙｌｏｒリアクター）との組み合わせた構成で細胞操作等のマクロ的均一化効果を得ること、等である。
【発明の効果】
【００７３】
本発明は、窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）等の純度９０％以上の単一気体の単独成分ガスを包含したＭｎｂを混合した「Ｐタイプ」Ｍｎｂと窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）等を混合して成分調整したガスを包含した「Ｃタイプ」Ｍｎｂとを混合した「Ｐ／Ｃ混合タイプ」のＭｎｂで細胞操作の効果を向上させた。
【００７４】
「Ｐタイプ」Ｍｎｂは特許文献１に、「Ｃタイプ」Ｍｎｂは特許文献２に記載されているが、本案はこれらの組合せを明示した。もちろん、包含ガスは窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）に限らず、アルゴン（Ａｒ）など対象細胞の自然生育環境に存在する気体種、および／または、一酸化窒素（ＮＯ）や一酸化炭素（ＣＯ）など対象細胞中の生体反応に寄与する（影響を与える）気体種であってもよい。（このことは特許文献１[請求項１４]にも記載されている。）
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】細胞に与える影響は、Ｍｎｂがミリサイズ以上のバブルＭｍのそれよりも大きいことを示す模式図。（ａ）は、Ｍｍ表面に親水性細胞膜をもつ細胞が集まっているがＭｎは細胞に大きな影響を与えてはいないことを示す。  これに対して（ｂ）は、Ｍｎｂが細胞Ｃのスケールよりも小さいことを示し、（ｃ）は（ｂ）の拡大模式図で、Ｍｎｂが細胞膜表面ＣＳにある物質チャネル構成物質ＣＰ（細胞膜の蛋白など）に接近または親和性等で結合して影響を与える場合があることを示す。
【図２】Ｍｎｂの包含ガスの違いを示す模式図。（ａ）は、窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）のそれぞれ純度９０％以上の単一気体の単独成分ガスを包含した「Ｐタイプ」Ｍｎｂを示す図。（ｂ）は、窒素（Ｎ2）、酸素（Ｏ2）、二酸化炭素（ＣＯ2）を混合して成分調整したガスを包含した「Ｃタイプ」Ｍｎｂを示す図。（ｃ）は、「Ｐタイプ」「Ｃタイプ」Ｍｎｂを混合した「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂを示す図。
【図３】「Ｃタイプ」Ｍｎｂを説明する模式図。Ｇａｓ”ＣＡ”とＧａｓ”ＣＢ”は包含ガスの成分比（図３第二行）もバブルの粒度分布（図３第三行）も異なっているので、細胞に与える効果（図３第三行）はＧａｓ”ＣＡ”とＧａｓ”ＣＢ”とで異なる。[ＣＡ≠ＣＢ]
【図４】「Ｐタイプ」Ｍｎｂを説明する模式図。Ｇａｓ”ＰＡ”とＧａｓ”ＰＢ”は包含したガスの成分比（図４第二から四行）もバブルの粒度分布（図４第三行）も異なっているが、包含ガスの成分比（図４第二から四行）は、窒素（Ｎ2）単独成分ガス量（図４第二行）、酸素（Ｏ2）単独成分ガスの量（図４第三行）、二酸化炭素（ＣＯ2）単独成分ガス量（図４第四行）の比率を調整すれば、Ｇａｓ”ＣＡ”・Ｇａｓ”ＣＢ”と、ほぼ等しくできる。同様に、バブルの粒度分布（図４第三行）も、Ｇａｓ”ＣＡ”Ｇａｓ”ＣＢ”とほぼ等しくできる。しかし、それらの効果は等しくはない。（効果ＣＡ≠ＰＡ、効果ＣＢ≠ＰＢ）
【図５】気孔の二酸化炭素（ＣＯ2）吸収に与えるＭｎｂの影響を示す模式図。Ｍｎｂは、Ｙｏｕｎｇ−Ｌａｐｌａｃｅの式[ P = Pl + 2σ/r (P = gas pressure, Pl =liquid pressure, σ = surface tension, r = radius of thebubble)]により、径が縮小し、圧力の上昇から包含ガスの溶存量が気液界面で局所的に高まりガス溶出する。そのため、気孔近傍に二酸化炭素を包含するＭｎｂがあると気孔近傍に二酸化炭素溶存量が極めて高い状態になって拡散による気孔部位の細胞膜透過量が増えて二酸化炭素吸収量が増大すると考えられる。
【図６】細胞の酸素（Ｏ2）吸収に与えるＭｎｂの影響を示す模式図。Ｍｎｂは、Ｙｏｕｎｇ−Ｌａｐｌａｃｅの式[ P = Pl + 2σ/r (P = gas pressure, Pl =liquid pressure, σ = surface tension, r = radius of thebubble)]により、径が縮小し、圧力の上昇から包含ガスの溶存量が気液界面で局所的に高まりガス溶出する。そのため、細胞近傍に酸素を包含したＭｎｂがあると細胞近傍に酸素溶存量が極めて高い状態になって拡散による細胞膜透過量が増えて細胞の酸素吸収量が増大すると考えられる。
【図７】「Ｐタイプ」Ｍｎｂ、「Ｃタイプ」Ｍｎｂ、および、「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂのそれぞれが細胞（生物）に与える影響を比較する実験１）から６）のまとめ表。概して「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂが細胞（生物）に与える影響が大きい。
【図８】特許文献１と特許文献２に記載されたＭｎｂ含有液体（微小気泡を含有する液体組成物）の製法のタイムチャート模式図。（ａ）は、気体の選択手段で時間的に順次に選択された複数の気体を気体吸引手段から吸引し、該複数の気体を微小気泡となし、液体吐出手段に時間的に順次連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有組成物を得る製法を示す。（ｂ）は、複数の微小気泡発生器へ細胞培養液が吸引されるとともに、複数の気体吸引手段から吸引した複数の気体を微小気泡となし、複数の液体吐出手段に連続的に吐出される操作で得た複数の気体の微小気泡含有の細胞培養用組成物の製法を示す。（ｃ）は、（ｂ）製法装置にて（ａ）の時間的順次の気体切り替えを組み合わせた製法を示す。（ｄ）は、気体吸引手段の上流に吸引気体の成分とその濃度を調整制御する手段、および、前記吸引気体の成分とその濃度を調整制御する手段に、該気体成分とその濃度の調整制御目標指令を出す気体成分・濃度調整制御目標指令の出力手段、を具備した装置による製法を示す。これら製法によるＭｎｂのタイプを図中に記載した。
【図９】本発明のＭｎｂ含有液体（微小気泡を含有する液体組成物）の製法のタイムチャート模式図。「Ｃタイプ」Ｍｎｂを発生させた後に「Ｐタイプ」Ｍｎｂを発生して混合した「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂを得る。
【図１０】本発明のＭｎｂ含有液体（微小気泡を含有する液体組成物）の製法のタイムチャート模式図。「Ｐタイプ」Ｍｎｂを発生させた後に「Ｃタイプ」Ｍｎｂを発生して混合した「Ｐ／Ｃ混合タイプ」Ｍｎｂを得る。
【図１１】株式会社協和機設のＭｎｂ発生装置のデータであって、Ｍｎｂ発生後にＭｎｂ粒径が時間経過とともに縮小していくことを示す模式図。測定器はベックマンコールター社のコールター方式微細粒子測定器。
【図１２】二酸化炭素（ＣＯ2）は溶解度が酸素・窒素に比べて大きいのでＭｎｂ発生後に溶出する量も多い。（ａ）は、二酸化炭素（ＣＯ2）が時間経過と共により多く溶出して包含量が減少することを示す模式図。（ｂ）は、各気体の水に対する溶解度の温度変化を示す参考図。
【図１３】特許文献１のＭｎｂ発生装置の模式図。特許文献１［図２］の修正図である。
【図１４】特許文献２のＭｎｂ発生装置の模式図。特許文献２［図４］の修正図である。
【図１５】特許文献７のＣＴ（Couette-Taylor）反応装置と微小気泡発生器とを組み合わせたプロセス装置の模式図。
【図１６】参考図  乾燥空気の主要成分
【符号の説明】
【００７６】
１  固定中空円筒体、またはこれを包含する中空回転対称体
２  １の内壁と間隙４を保ちつつ同軸回転する内包円筒体、またはこれを包含する内包回転対称体
３  ２の回転手段
４  １の内壁と２の側外壁との間隙
１０  流動体保持容器Ｈ、または、流動体保持容器ＨとＴａｙｌｏｒリアクターＴＲ。容器Ｈにて細胞培養する場合にはＨは細胞培養容器（バイオリアクター）である。
１１  複数の気体供給手段（のひとつ）
１２  吸引気体の成分とその濃度を調整制御する手段
１２Ａ  吸引気体の成分とその濃度を調整制御する手段１２に、気体成分とその濃度の調整制御目標指令を出す気体成分・濃度調整制御目標指令の出力手段
１３  成分・濃度を調整制御された吸引気体の供給手段
１７  １０の液体濁度を透過光または散乱光測定方式で測定するセンサー
１８  １０の温度・圧力・水素イオン濃度・生物学的／化学的酸素要求量等の環境の操作手段
１８Ａ  １０の温度・圧力・水素イオン濃度・生物学的／化学的酸素要求量等の環境の制御手段
３０  液体槽の環境を調整制御する手段１８Ａに、促進環境の調整制御目標指令を出す液体槽環境調整制御目標指令の出力手段
３１  対象細胞について、該細胞自身の変化を促進するのに要する複数の物質それぞれ個別の取込み安さに応じた、それぞれ個別の気体成分とその濃度をあらかじめ実験的に決定する工程によって得られたデータのデータベース、および、該細胞が自身の変化を促進するのに要する複数の物質それぞれ個別の取込み安さを促進する液体槽の環境のデータをあらかじめ実験的に決定する工程によって得られたデータのデータベース
Ｃ１  間隙４の一部に被プロセス材を供給する手段
Ｃ２  間隙４の他部から被プロセス材を抽出する手段
Ｃ  細胞
ＣＡ  Ｃタイプのバブル包含ガスＣＡの効果
ＣＢ  Ｃタイプのバブル包含ガスＣＢの効果
ＣＳ  細胞膜
ＣＴ  細胞膜の蛋白などで物質チャネルを構成する物質
Ｄ１  微小気泡を含有した気・液混相の流動体を吐出供給する手段
Ｄ２  流動体を吸引排出する手段
Ｈ  流動体保持容器。容器Ｈにて細胞培養する場合にはＨは細胞培養容器（バイオリアクター）である。
Ｍ    微小気泡の発生手段
Ｍ４    気体吸引手段
Ｍ１０  渦流ポンプ
Ｍ１１  渦流ポンプの内蔵インペラ
Ｍｎｂ  マイクロ・ナノバブル
Ｍｍ  ミリサイズ以上のバブル
ＰＡ  Ｐタイプのバブル包含ガスＰＡの効果
ＰＢ  Ｐタイプのバブル包含ガスＰＢの効果
ＴＲ  Ｔａｙｌｏｒリアクター
【図１】
2011244779.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2011244779.tif 000012
【図１１】
2011244779.tif 000013
【図１２】
2011244779.tif 000014
【図１３】
2011244779.tif 000015
【図１４】
2011244779.tif 000016
【図１５】
2011244779.tif 000017
【図１６】
2011244779.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月28日(2011.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
以上図１１から図１５を用いて説明した特許文献１・特許文献２の追加補足技術、および特許文献７の技術は、本発明の実施においても組み合わせて実施することができる。
【特許文献１】特願２００９−２３４６８３号「細胞変化を促進する・・・細胞変化促進方法」
【特許文献２】特願２００９−２８２８４０号「微小気泡を・・・細胞変化を促進する方法」
【特許文献３】特許公開２００９−１９５８８９号公報「ナノバブル液体製造装置及びナノバブル液体」オプトクリエーション
【特許文献４】特許公開２００８−６３９７号公報「微細気泡発生装置」アイシン精機株式会社
【特許文献５】特許公開２００７−７５７８５号公報「水処理方法および水処理装置」シャープ株式会社
【特許文献６】特許公表２００９−５０７６１８号公報（WO２００６/１２７９７９）「気体の液体への溶解・・・及び方法」ユニバーシティオブアーカンソー
【特許文献７】特願２０１０−０１２７２７号「ＣＴ（Couette-Taylor）反応装置を用いた・・・プロセス装置」