(57)【要約】      （修正有）【課題】水素ガスを生産する方法およびそのために用いられる微生物を提供する。【解決手段】フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産し、ピルピン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を持つタンパク質の生産が増加するように遺伝子操作された微生物を、少なくとも１種の、微生物が吸収可能な炭水化物および吸収可能な窒素源を含む培養培地で培養する、水素ガスを生産する方法。【選択図】図３
2011160673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の微生物を、吸収可能な炭水化物および吸収可能な窒素源を含む培養培地で培養し、それによって水素ガスを生成する工程であって、前記微生物は、フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産し、前記微生物は、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を持つタンパク質の生産が増加するように遺伝子操作され、前記微生物は前記培養培地中の前記炭水化物を吸収すると同時に水素ガスを生成することができる工程、および
生成した水素ガスを回収する工程、
を含む、水素ガスの生産方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、前記微生物のピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列に９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が、前記微生物のピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子操作が、前記微生物に、前記タンパク質をコードする外来性の遺伝子を導入することを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、ｉｓｃＲ遺伝子にコードされる機能的なタンパク質を実質的に生産しない、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、大腸菌属(Escherichia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、サーモトガ属(Thermotoga)、クロストリジウム属(Clostridium)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)からなる群から選択される属に属する少なくともひとつである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記炭水化物がグルコースである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培養が無酸素の雰囲気のもとで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産する微生物であって、前記微生物は、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を持つタンパク質の生産が増加するように遺伝子操作され、前記微生物は、培養培地中の炭水化物を吸収すると同時に水素ガスを生成することができる微生物。
【請求項１１】
前記タンパク質が、フェレドキシンまたはフラボドキシンを還元すると共に同時にピルビン酸を酸化することにより定義される、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を有する、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
前記タンパク質が、前記微生物のピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列に９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
前記タンパク質が、前記微生物のピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
前記の増加した生産が、前記タンパク質をコードする外来性の遺伝子を、前記微生物に導入することによって得られる、請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１５】
前記微生物が、ｉｓｃＲ遺伝子にコードされる機能的なタンパク質を実質的に生産しない、請求項１０ないし１３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１６】
前記微生物が、大腸菌属、エンテロバクター属、サッカロマイセス属、サーモトガ属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属からなる群から選択される属に属する請求項１０に記載の微生物。
【請求項１７】
前記微生物が大腸菌である、請求項１６に記載の微生物。
【請求項１８】
前記炭水化物がグルコースである、請求項１０に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水素ガスを生産する方法およびそのために使用する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素ガス（Ｈ２）は、特にそのＨ２からエネルギーへの変換による環境への影響が極小であるので、移動用及び定置用の両用途において、有望な次世代エネルギー媒体である。現在のＨ２の全世界市場は、１６００億米ドルに値すると見積られている。Ｈ２が移動用の用途（例えば、自動車、飛行機）の燃料として大規模に採用された場合、現市場はより大きくなると見込まれている。Ｈ２生産およびその利用が、環境に影響を及ぼすのに十分な規模で石油代替物として商業的に成熟するためには、石油代替エタノールと比較して数多くの未解決の課題が、更なる研究開発を依然として必要としている。他の代替燃料と比較しての移動距離のコスト効果とともに、生産コストが大きな課題である。Ｈ２は、潜在的に、広い範囲の様々な再生不可能および再生可能な資源から得ることができる。植物由来のバイオマスは、潜在的な再生可能なエネルギー資源のひとつである。微生物による醗酵を通してバイオマスはＨ２に変換され得る。しかし、その初期基質（糖）に対する収量は、エタノールと比較して、非常に悪い。バイオマス生産が、バイオマス由来燃料生産において、大きな経済的、環境的コスト(Hill et al., 2006)であるため、基質あたりの生産物の収量は、経済的、環境的に持続可能なＨ２生産を可能にする重要な可変要因である。従って、微生物によるＨ２生産の向上は、Ｈ２の工業的生産に必要である。
【０００３】
数多くの微生物が、多岐にわたる代謝経路において、様々なかたちでＨ２を生産および消費する能力をもっている。水素を生産する微生物のほとんどは、ピルビン酸依存性Ｈ２生産能力をもっている。典型的に、それは、原生生物または属によって、２つの極めて異なる経路の種類によって行われる。典型的に、クロストリジウム属(Clostridium)および始原細菌のいくつかの菌では、(Wahl et al., 1987; Pieulle et al., 1997; Ma et al., 1999)、ピルビン酸の酸化によって得られた電子は、フェレドキシンに受け渡され、次いで、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼを還元するのに用いられる。
（クロストリジウム属）      ピルビン酸−＞フェレドキシン＋アセチルＣｏＡ（ＰＦＯＲ）、次いで、フェレドキシン−＞Ｈ２（ヒドロゲナーゼＨＹＤＡ）
【０００４】
大腸菌(E.coli)および他のエンテロバクター(Enterobacter)種において、主要なピルビン酸依存性Ｈ２合成経路は、はじめに、ピルビン酸：ギ酸水素リアーゼ（ＰＦＬ）によって触媒され、それが、ギ酸依存性水素リアーゼ（ＦＨＬ）とともに、次の電子移動を効率的に触媒する(Sawers et al., 2005)。
（エンテロバクター）      ピルビン酸−＞ギ酸＋アセチルＣｏＡ（ＰＦＬ、ピルビン酸  ギ酸リアーゼ）、次に、ギ酸−＞Ｈ２（ＦＤＨ）
【０００５】
細胞外のギ酸も、例えば、共生関係におけるメタン生成種と共に、Ｈ２生産または種間電子伝達に直接用いられることができる。
【０００６】
ピルビン酸は、全てではないにしてもほとんどの微生物の代謝において、鍵となる中間体である。ピルビン酸の源および運命は、種および特定の種のその優勢な条件下における代謝に依存する。特に、酸素の有無は、大腸菌などの通性嫌気性生物におけるピルビン酸の運命に影響する(Causey et al., 2004)。大腸菌Ｋ−１２種では、嫌気醗酵条件下においてピルビン酸生産は、ＮＡＤ＋−再生成の役割が、種々の電子数をもつ還元排出代謝物に分散されている「混合醗酵」と呼ばれるプロセスによって制限される。従って、グルコースで生育した場合、エタノールだけではなく、コハク酸および乳酸も生成される(Alam and Clark, 1989)。しかし、後者２つの化合物の生成は、ピルビン酸形成の前に分岐するので、潜在的なピルビン酸の形成を減じる。
【０００７】
エタノール生産のみが、ピルビン酸分岐点の下流に位置し、ギ酸依存性Ｈ２合成は、ＮＡＤ＋−再生成に関して酸化還元中性である。従って、活性ＰＦＬ／ＦＨＬ経路の有無は、アセチルＣｏＡの形成には影響するであろうが、ＮＡＤ＋再生成には影響しない(Hasona et al., 2004)。ＡｌａｍおよびＣｌａｒｋ（１９８９）は、遺伝子ｌｄｈＡおよびｆｒｄの削除が２つの前ピルビン酸生産物分岐を効果的に取り除き、その結果、乳酸（ｌｄｈＡによってコードされるタンパク質によって触媒される反応）およびコハク酸（ｆｒｄＡＢＣＤによってコードされるタンパク質によって触媒される反応）を取り除くことを示した。しかし、排出されるピルビン酸、エタノールおよびギ酸の量は増加せず、かわりに酢酸の排出が高まった。しかし、Ｃａｕｓｅｙらは（２００３、２００４）、同じ方法を用い、同様の条件下で酢酸形成の責任遺伝子をも削除し、その組み換え大腸菌株を用いて（これらの株は、そのプロセスが好気的条件下で行われるようさらに組み換え操作されたけれども）、ピルビン酸生産を効果的に高めた。従って、ｌｄｈＡおよびｆｒｄの削除は確立されており、大腸菌において、嫌気下でグルコースからピルビン酸への流れを増やすために必要な重要なプロセスである。
【０００８】
グルコース由来のギ酸依存性Ｈ２生産の収量および合成速度は、ピルビン酸生産を高めると、すでに特徴づけられたものと同じ削除、すなわち、遺伝子ｆｒｄおよびｌｄｈＡの削除によって高められることが、近年、見出された(Yoshida et al., 2006)。
【０００９】
Ｈ２生産用の既存の株を用いるにあたって大きな問題点は、最も有望なＨ２生産微生物は、（１）３３％未満（グルコース中の水素原子１モル当たりのモルＨ２）しか生産せず、（２）遺伝学的に扱いやすくない、または遺伝子操作しやすくない、および（３）一定の、限られた基質特異性を持つＨ２経路を発現する。例えば、我々の知る限り、大腸菌Ｋ−１２は、ギ酸依存性Ｈ２合成のみ可能であり、潜在的なＨ２生産は、わずか１６％（グルコース中の水素原子１モル当たりのモルＨ２）に完全に制約される。そのうえ、Ｓａｗｅｒｓ（２００５）およびＹｏｓｈｉｄａら（２００７）に記述されているように、大腸菌Ｋ−１２でのＰＦＬ経路およびＦＨＬ経路の誘導は、特定環境条件に応じた、高度に複雑な制御の対象となっている。従って、大腸菌において、ＰＦＬ／ＦＨＬ経路を、多くのクロストリジウム属菌(Clostridium spp.)に存在するもののように、使用者が完全に制御するピルビン酸依存性Ｈ２合成経路に置き換えることによって、生産コストが減少し、大腸菌によるバイオ水素の生産の全体的なプロセス速度が増加することが期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】US 2004/0152159 A
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Alam et al., J Bacteriol. 1989 November; 171(11): 6213-6217
【非特許文献２】Axley et al, 1990, J Biol Chem. 1990 Oct 25;265(30):18213-8
【非特許文献３】Blaschkowski et al. (1982) Eur. J. Biochem. 123, 563-569
【非特許文献４】Causey et al., Proc Natl Acad Sci USA. February 4, 2003, vol. 100, no. 3, 825-832
【非特許文献５】Causey et al., Proc Natl Acad Sci USA. February 24, 2004 vol. 101 no. 8 2235-2240
【非特許文献６】Hasona et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 186, No. 22, Nov. 2004, p. 7593-7600
【非特許文献７】Ma et al (1997) Ma et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Sep 2;94(18): 9608-13
【非特許文献８】Pieulle et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Oct. 1997, p. 5684-5692
【非特許文献９】Sawers, Biochemical Society Transactions (2005) Volume 33, part 1, 42-46
【非特許文献１０】Wagner et al, 1992; Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Feb 1;89(3):996-1000.
【非特許文献１１】Wahl et al., J Biol Chem. 1987 Aug 5;262(22):10489-96
【非特許文献１２】Yoshida et al. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Nov. 2005, p. 6762-6768
【非特許文献１３】Yoshida et al., Appl Microbiol Biotechnol (2006) 73: 67-72
【非特許文献１４】Yoshida et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74; 754-760
【非特許文献１５】Akhtar, M. K., and Jones, P. R. (In Press) Engineering of a synthetic hydF-hydE-hydG-hydA operon for biohydrogen production, Anal Biochem.
【非特許文献１６】Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., et al. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection, Mol Syst Biol 2: 2006 0008.
【非特許文献１７】Datsenko, K. A., and Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645.
【非特許文献１８】Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
【発明の開示】
【００１２】
従って、本発明の目的は、微生物による、Ｈ２の増加した生産の方法を提供することである。本発明の他の目的は、Ｈ２の増加した生産を有する微生物を提供することである。
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産する微生物のＨ２生産が、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素をコードする外来の遺伝子を導入することによって、増加することを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、少なくとも１種の微生物を、吸収可能な炭水化物および吸収可能な窒素源を含む培養培地で培養し、それによって水素ガスを生成する工程であって、前記微生物は、フェレドキシン／フラボドキシン依存ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産し、前記微生物は、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を持つタンパク質の生産が増加するように遺伝子操作され、前記微生物は前記培養培地中の前記炭水化物を吸収すると同時に水素ガスを生成することができる工程；および生成した水素ガスを回収する工程を含む、水素ガスの生産方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、フェレドキシン／フラボドキシン依存ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産する微生物であって、前記微生物は、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を持つタンパク質の生産が増加するように遺伝子操作され、前記微生物は、培養培地中の炭水化物を吸収すると同時に水素ガスを生成することができる微生物を提供する。
【００１６】
本発明によって、Ｈ２の増加した生産を可能にする微生物によるＨ２生産の新規な方法、およびそのために用いられる新規微生物が提供された。本発明の方法によって、Ｈ２生産が高められるので、本発明は、環境への影響が最小限で、移動用及び定置用の両用途において有望な次世代エネルギー媒体であるＨ２の生産に貢献するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例で用いたｐＣＤＦ−ＦＥＧＡＦｄｘベクターの関連部分の構造を、水素が生産される代謝経路とともに示す。
【図２】図２は、実施例で調製した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体による、培養培地の上部の空間中のＨ２濃度（ｖ／ｖ％）に換算した経時的なＨ２生産を、対照形質転換体によるＨ２生産とともに示す。
【図３】図３は、ｉｓｃＲ遺伝子を欠損したものを含めた様々な微生物によって生産されたＨ２の量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
この明細書および添付の請求項において、単数形「ａ」および「ａｎ」、並びに「ｔｈｅ」は、文脈上、そうでないことが明らかでない限り、複数形の照応も含むということに注意すべきである。従って、例えば、「a microorganism（微生物）」は、複数のそのような微生物を含む。また、「a nitrogen source（窒素源）」は、１つまたはそれ以上の窒素源を含む。
【００１９】
本発明は、フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産する微生物のＨ２生産が、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を有するタンパク質の生産を増加することによって、増加するという知見に基づいている。
【００２０】
従って、本発明の方法で用いられる微生物は、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を有するタンパク質の生産が増加するように遺伝子操作されたものであるということを特徴とする。そのタンパク質は、好ましくは、フェレドキシンまたはフラボドキシンの還元と共に同時に起こるピルビン酸の酸化によって定義される、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素の酵素活性を有する。本発明者らは、フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを天然に生産し、培養培地中の炭水化物を吸収すると同時に水素ガスを生産することができる微生物、例えば、大腸菌(Escherichia coli)のＨ２生産は、ピルビン酸：フラボドキシン／フェレドキシン酸化還元酵素（以下、略して「ＹＢＤＫ」ともいう）の生産を増加することによって高められ得ることを見出した。「ＹＢＤＫの酵素活性を有するタンパク質の生産を増加する」とは、微生物が遺伝子操作を施す以前は、そのタンパク質を生産しない場合、および、微生物が遺伝子操作を施す前から、そのタンパク質を生産し、遺伝子操作後、その生産が増加する場合を含む。
【００２１】
ＹＢＤＫの酵素活性を有するタンパク質の生産を増加するための遺伝子操作は、タンパク質の生産を増加する遺伝子操作のいずれでもよい。好ましくは、遺伝子操作は、そのタンパク質をコードする遺伝子（外来性の遺伝子）を含む組み換えベクターの１個またはそれ以上のコピーを細胞に導入し、外来性の遺伝子を発現することによって実施される。ＹＢＤＫのアミノ酸配列およびＹＢＤＫをコードする塩基配列は周知であるので、そのような遺伝子操作は、当業者ならば容易に実施し得る。
【００２２】
より具体的に、大腸菌のピルビン酸：フラボドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列は、ジェンバンク受託番号(GenBank accession No.)AAC74460に示されている。該アミノ酸配列および塩基配列は、また、配列表の配列番号１に示されている。クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)、デスルホビブリオ・アフリカヌス(Desulfovibrio africanus)のピルビン酸：フラボドキシン・フェレドキシン酸化還元酵素のアミノ酸配列およびその遺伝子の塩基配列は、それぞれ、ジェンバンク受託番号ＣＡＣ２４９９、ＣＡＣ２２２９（同様に、クロストリジウム・アセトブチリクム(C. acetobutylicum)),X13109,X85171,Y09702に示されている。
【００２３】
宿主微生物の種にとって天然のＹＢＤＫをコードする遺伝子を導入することが好ましい。従って、例えば、宿主微生物が、大腸菌の場合、大腸菌のＹＢＤＫをコードする遺伝子、すなわち、配列番号１に示される塩基配列をもつ遺伝子を導入することが好ましい。しかし、ＹＢＤＫの酵素活性を有するタンパク質をコードする（そのようなタンパク質は、便宜上、以下、「修飾ＹＢＤＫ」ともいう）、すなわち、フェレドキシンまたはフラボドキシンのいずれかを還元すると同時にピルビン酸の酸化を触媒することができる、いかなるタンパク質をコードするいかなる遺伝子を用いてもよい。そのようなタンパク質は、好ましくは、ＹＢＤＫのアミノ酸配列に９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものがよく、より好ましくは９５％以上の相同性を、さらに好ましくは９８％以上の相同性をもつものがよい。よって、宿主微生物が大腸菌の場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列に９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性をもつアミノ酸配列をコードする遺伝子を、コードされたタンパク質がＹＢＤＫの酵素活性をもつ限り、大腸菌細胞に好ましくは導入し得る。ここでアミノ酸配列の「相同性」という用語は、一致するアミノ酸残基の数が最大となるように（必要に応じてギャップを挿入する）、２つのアミノ酸配列を並べ、一致したアミノ酸残基の数を完全長の配列のアミノ酸残基（２つの配列間で全アミノ酸残基の数が異なる場合、長い方のアミノ酸残基）の数で除することよって求めた値を意味する。そのような相同性の計算は、ＢＬＡＳＴのような周知のソフトウェアによって容易に入手し得る。
【００２４】
タンパク質が、ピルビン酸：フラボドキシン酸化還元酵素の酵素活性を有するか否かは、例えば、ピルビン酸：フェレドキシン／フラボドキシン酸化還元酵素、ピルビン酸、ＣｏＡ、ＭｇＣｌ２、チアミンピロ燐酸、適切なフェレドキシンまたはフラボドキシン、同一の電子の受容体／供与体（すなわち、フェレドキシンまたはフラボドキシン）に対する特異性をもつヒドロゲナーゼを、適切なバッファー中に、完全な嫌気条件下で含む、酵素アッセイによって決定され得る。最終反応混合物の上部の空間中を、Ｈ２生産についてモニターする。または、ヒドロゲナーゼを除いて、前述と同じ反応混合物を用いて、酸化された電子受容体／供与体に対する還元された電子受容体／供与体の割合を、紫外分光光度法（各タンパク質によって決められた吸光度で）によりモニターしてもよく、レポーター分子であるメトロニダゾールを還元する能力（吸光度３２０ｎｍ）、若しくは、酸化されたメチルビオロゲンまたは酸化されたベンジルビオロゲンを、フェレドキシンおよびフラボドキシンの非存在下で還元することによって（吸光度６０４ｎｍ）モニターしてもよい。この酵素アッセイのより具体的な条件は、例えば、次の通りであり得る。（１〜５μｇのｐＣＤＯＰＦＥＧＡ（後述）をもつＢＬ２１（ＤＥ３）の各粗溶解物、試験対象のタンパク質を発現するプラスミド、組み換えフェレドキシンまたはフラボドキシンを発現することができるプラスミド、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ピルビン酸、０．５ｍＭ  ＣｏＡ、０．５ｍＭ  チアミンピロ燐酸、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む反応混合物を、ブチルゴム栓で密閉した血清瓶に、完全嫌気条件下で、集める。反応を、３７ｏＣ（１５０ｒｐｍ）で１〜４時間インキュベートし、後述のように、上部の空間をＨ２について分析する。
【００２５】
天然のタンパク質を構成する２０種のアミノ酸は、同じ特性をもつグループにグループ分けされ得ることが知られている。すなわち、例えば、極性の低い側鎖をもつ中性アミノ酸（グリシン（Ｇｌｙ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ））、親水性の側鎖をもつ中性アミノ酸（アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシイ（Ｔｙｒ）、システイン（Ｃｙｓ））、酸性アミノ酸（アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ））、塩基性アミノ酸（アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ））および芳香族アミノ酸（フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ））である。アミノ酸を他のアミノ酸に置換するとき、タンパク質の特性は、アミノ酸が同じグループ内のアミノ酸に置換するならば、あまり変化しないことが多い。従って、修飾したＹＢＤＫをコードする遺伝子を微生物に導入する場合、修飾したＹＢＤＫは、好ましくは、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換を有し、各置換が同じグループ内で行われたものがよい。
【００２６】
ｙｂｄＫ遺伝子の塩基配列は公知であり、ｙｂｄＫｋ遺伝子の源は公知で入手可能であり、また、外来の遺伝子を微生物に導入するための発現ベクターは周知で、市販されているので、ＹＢＤＫ（遺伝子は、便宜上、以下「ｙｂｄＫ遺伝子」ともいう）または修飾ＹＢＤＫをコードする遺伝子を含む組み換えベクターの構築は当業者ならば容易に実行し得る。より具体的に、組み換えベクターは、ｙｂｄｋ遺伝子を調製し、ｙｂｄｋ遺伝子を発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することによって、構築され得る。ｙｂｄＫ遺伝子は、ｙｂｄＫ遺伝子を有する微生物のゲノムから単離し得る。必要に応じて、ｙｂｄＫ遺伝子は、ｙｂｄＫ遺伝子を有する微生物のゲノムを鋳型として用いて、ＰＣＲなどにより増幅し、増幅産物を、発現ベクターに挿入し得る。この場合、ｙｂｄＫ遺伝子の塩基配列は公知であるので、ＰＣＲ用のプライマーは容易に調製し得る。
【００２７】
構築されたｙｂｄＫ遺伝子を含む組み換えベクターは、当分野では周知の方法、例えば塩化カルシウム法などによって、微生物細胞に導入し得る。発現ベクターのもつ選択マーカーを利用して選択した後、組み換えベクターが導入された微生物細胞が得られる。こうして得られた形質転換体から、ＹＢＤＫを生産するものを選択し、クローンする。その後、クローンした微生物細胞を培養し、増幅した細胞を、本発明の方法に用い得る。
【００２８】
前述の遺伝子操作により、宿主微生物によるＹＢＤＫまたは修飾したＹＢＤＫの生産が増加し、次いで宿主微生物によるＨ２生産が、向上する。
【００２９】
本発明の方法に用いられる微生物は、フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフェレドキシン／フラボドキシンを生産するものでもある。「フェレドキシン／フラボドキシン」という語は、フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンを意味する。従って、「フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼ」という語は、「フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよび／またはフラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼ」を意味する。
【００３０】
フェレドキシンおよびフラボドキシンは、電子供与体として働く周知のタンパク質であり、そのアミノ酸配列およびそのタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は公知である。例えば、クロストリジウム・パスツリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｕｅｒｉａｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリクム、および大腸菌のフェレドキシンのアミノ酸配列およびフェレドキシンをコードする遺伝子の塩基配列は、ぞれぞれ、ジェンバンク受託番号Ｍ１１２１４、ＣＡＣ００７５、ＣＡＣ３６２１、ＣＡＣ０１０５、ＣＡＣ０３０３、ＣＡＣ３５２７（ＣＡＣが前に付く受託番号はすべてクロストリジウム・アセトブチリクムからである）、ｙｆｈＬ（ＮＰ＿４１７０５７）、ｆｄｘ（ＥＣＫ２５２２）に示されている。クロストリジウム・アセトブチリクム、および大腸菌のフラボドキシンのアミノ酸配列およびフラボドキシンをコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ、ジェンバンク受託番号ＣＡＣ０２０３、ＣＡＣ０５８７、ＣＡＣ２４５２、ＣＡＣ３４１７（ＣＡＣが前に付く受託番号はすべてクロストリジウム・アセトブチリクムからである）、ｆｌｄＡ（Ｂ０６８４）、ｆｌｄＢ  （Ｂ２８９５）（ｆｌｄ前に付く受託番号はすべて大腸菌からである）に示されている。
【００３１】
フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼは、ヒドロゲナーゼとして働くとき、フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンから電子を受け取るヒドロゲナーゼである。フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼも、また周知である。例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・パスツリアヌム、メタノサルシナ・バーケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ）およびサーモアナエロバクター・テングコンゲンシス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）のフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼのアミノ酸配列およびフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、ぞれぞれ、ジェンバンク受託番号Ｕ１５２７７（ＣＡＣ３２３０）、ＡＡＡ２３２４８、Ｙ１６１９１、およびＴＴＥ０１２３とＴＴＥ０１３４の間の全ての遺伝子に示されている。
【００３２】
また、フェレドキシン／フラボドキシンは、天然フェレドキシン／フラボドキシン、組み換えフェレドキシン／フラボドキシンのいずれでもよい。組み換えフェレドキシン／フラボドキシンを生産する、遺伝子操作された微生物を用いる場合、そのような微生物は、それ自身が、当技術分野において周知である従来の遺伝子操作技術によって当業者ならば容易に調製することができる。前述のように、フェレドキシン／フラボドキシン遺伝子の塩基配列およびその遺伝子を天然に含む微生物は公知であり、外来の遺伝子を微生物宿主細胞に発現するための多くの発現ベクターが市販されているので、組み換えフェレドキシン／フラボドキシンは、フェレドキシン／フラボドキシンを発現ベクターに挿入し、得られた組み換えベクターを微生物宿主細胞に導入することによって生産し得る。
【００３３】
フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼもまた、天然のフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼでもよく、または組み換えフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼいずれでもよい。組み換えフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼを生産する、遺伝子操作された微生物を用いる場合、そのような微生物は、それ自身が、当技術分野において周知である従来の遺伝子操作技術によって当業者ならば容易に調製することができる。前述のように、フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列およびその遺伝子を天然に含む微生物は、周知であり、外来の遺伝子を微生物宿主細胞に発現するための多くの発現ベクターが市販されているので、組み換えフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼは、フェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼを発現ベクターに挿入し、得られた組み換えベクターを微生物宿主細胞に導入することによって生産し得る。
【００３４】
フェレドキシン／フラボドキシンおよびフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼに関して、上で説明したＹＢＤＫと同様に、フェレドキシン、フラボドキシン、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼおよびフラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼの活性を有する修飾タンパク質をそれぞれコードする遺伝子を用い得る。そのような修飾タンパク質は、好ましくは、相当する天然のタンパク質のアミノ酸配列に９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有する。「相同性」という語の定義は、修飾ＹＢＤＫを説明するセクションで前述されているのと同様である。同様に、修飾ＹＢＤＫを説明するセクションで前述されている、アミノ酸のグループ化およびアミノ酸の置換についての説明は、フェレドキシン／フラボドキシンおよびフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼの修飾タンパク質にも、等しく適用される。
【００３５】
タンパク質が、フェレドキシンの予期される機能性を有するか否かは、例えば、ヒドロゲナーゼ活性アッセイによって決められ得る。このアッセイでは、嫌気条件下で、適切なバッファー中に、精製フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼ、亜ジチオン酸ナトリウム、フェレドキシンの予期される機能性を有する試験タンパク質を含む反応混合物を反応させ、閉じられた反応容器の気体上部空間を、Ｈ２生産についてガスクロマトグラフィーによりモニターする。但し、亜ジチオン酸塩およびフェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼの還元は、亜ジチオン酸塩によるヒドロゲナーゼの直接還元と同等または大きいものとする。上記のアッセイにおいて、最終反応混合物中にフェレドキシンが含まれているか含まれていないかが、結果としてＨ２の蓄積における統計的な有意差になるはずである。タンパク質が、フラボドキシンの機能性を有するか否かは、例えば、フラボドキシンに特異的なヒドロゲナーゼを用いることを除いて、フェレドキシンと同じ方法によって決められ得る。
【００３６】
このヒドロゲナーゼ活性アッセイのより具体的な条件は、例えば、次の通りである。組み換えヒスチジンタグ付きＨｙｄＡを次のように発現する。一晩培養したスターター培養を使用して、抗生物質を２％（ｖ／ｖ）で添加したＴＢ培地に播種する。ｐＣＤＯＰＦＥＧＨｉｓＡ（後述）をもつＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＯＤ６００が０．５〜１に達するまで、好気的（３７ｏＣ、１９０〜２００ｒｐｍ）にバッチ培養する。培養細胞を、緩くキャップをした遠心管、蓋を閉じた（ｃｌｏｓｅ−ｔｏｐｐｅｄ）血清瓶にそれぞれ移す。無酸素的に発現するためのＯ２の除去は、９９．９９９５％（ｖ／ｖ）Ｎ２を細胞培養に拡散することによって達成された。組み換えタンパク質発現は、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）の添加によって始められる。細胞培養は、１７〜２１時間、３０ｏＣ／１９０−２００ｒｐｍで行った。ＨｙｄＡおよびその成熟タンパク質の発現は、１０−１４％（ｖ／ｖ）変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔｅｆｃｏ、日本）により、製造者の取扱説明書に従ってＳＹＰＲＯ（登録商標）  Orange (Invitrogen、日本）で染色した後、タンパク質のバンドをFujifilm FLA-3000 scannerを用いて可視化し、確認された。
【００３７】
ヒスチジンタグ付きＨｙｄＡは次のように精製する。無酸素状態を、すべての調製を、嫌気性チャンバー内（５％  Ｈ２（ｖ／ｖ）、５％  ＣＯ２（ｖ／ｖ）、９０％（ｖ／ｖ）  Ｎ２）で行うこと、またはチャンバーの外で密閉血清瓶を用いることによって、維持した。採取された細胞は、Ｅａｓｙｌｙｓｅキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて溶解した。得られた溶解物を遠心し（１０、０００ｇ、７分、２５ｏＣ）、１５０〜３００ｍｌの培養細胞から得られた溶解物質を、組み換えタンパク質の精製にために用いた。ＨｙｄＡ精製のために、粗可溶化画分を、０．２ｍｌ  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、日本）を含む１ｍｌのミニカラムに加えた。０．５ｍｌ  洗浄バッファー（０．７ｃｍｘ２ｃｍ）  （２０ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で三回洗った。レジンは、短時間遠心（３５００ｒｐｍ、１０秒、４ｏＣ）し、洗浄バッファーを移した。ＨｙｄＡを５００μＬの溶出バッファー（０．４Ｍ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で溶出した。精製したＨｙｄＡの量を、変性１０％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、測定した。ヒドロゲナーゼアッセイは、次のように行う。５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファーを含む血清管にＮ２を拡散し、ブチルゴムセプタムで封をする。ヒスチジンタグの精製ＨｙｄＡ（０．１〜２．８μｇ）、フェレドキシンまたはフラボドキシン（試験タンパク質）およびメチルビオローゲン（最終濃度  ２ｍＭ）を、ガス拡散したバッファー、および予め３７度に平衡化した溶液に加えた。亜ジチオン酸ナトリウム（最終濃度  ２５ｍＭ）の添加により反応を開始した後、容器上部空間の気体組成を、選択された各時点で後述のように分析した。
【００３８】
タンパク質が、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼの活性を有するか否かは、例えば、ヒドロゲナーゼの有無もまたテストされることを除いて、フェレドキシンの機能性を決定するために用いた方法と同じ方法で決定し得る。タンパク質が、フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼの活性を有するか否かは、例えば、フラボドキシンに特異性をもつヒドロゲナーゼを用いることを除いて、フェレドキシン依存性ヒドロゲナーゼと同じ方法で決定し得る。
【００３９】
ｙｂｄｋ遺伝子およびフェレドキシン／フラボドキシンおよび／またはフェレドキシン／フラボドキシン依存性ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、同じ組み換えベクターに含んでもよいし、または、それら遺伝子を、別々の組み換えベクターに含んで、宿主微生物に、別々の組み換えベクターを共トランスフェクションしてもよい。後者の場合に、３またはそれ以上の遺伝子を宿主に導入するならば、同じベクター中に含まれるべき遺伝子の組み合わせは、特に制限されない。また、３またはそれ以上のベクターも用いられ得る。
【００４０】
本発明の方法に用い得る微生物として、例えば、大腸菌属(Escherichia)、エンテロバクター属、サッカロマイセス属(Saccharomyces)、サーモトガ属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)からなる群から選ばれる属に属するものが挙げられる。これら属のひとつに属する種として、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)が挙げられる。
【００４１】
Ｈ２生産をさらに向上する目的で、１つまたはそれ以上の遺伝子の削除または破壊のような、更なる遺伝子操作を、微生物に施してもよい。ＹＢＤＫの生産を増加するための遺伝子操作が微生物に実施される限り、更なる遺伝子操作が施されるいかなる微生物も、本発明の範囲内である。
【００４２】
例えば、本発明者らにより、ｉｓｃＲ遺伝子の削除が本発明の微生物によるＨ２生産を高めることが見出された。従って、上記の微生物ｉｓｃＲ遺伝子の削除が好ましい。ｉｓｃＲ遺伝子は周知であり、大腸菌のその遺伝子は、ジェンバンク受託番号ＥＣＫ２５２８（配列番号３および４）に示されている。ｉｓｃＲ遺伝子の欠損変異体の構築は、従来の方法、例えば、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒにより記載されているプロトコール(Datsenko, K. A., and Wanner, B. L. (2000) One-step inactivation of chromosomal gene in Escherichia coli K-12 using PCR products,Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6640-6645.)を用いてなされ得る。ｉｓｃＲ遺伝子の欠損変異体の構築の詳細は、下記の実施例に述べられている。言うまでもなく、ｉｓｃＲ遺伝子の削除と同じ効果が、例えば、機能するタンパク質が生産されるのを妨げる配列またはナンセンスコドンを挿入することで、ｉｓｃＲ遺伝子を破壊することによって得られうる。代わりに、ｉｓｃＲのプロモーター領域を、その遺伝子の発現を抑制または減少するように、修飾してもよい。つまり、ここで好ましいのは、ｉｓｃＲ遺伝子によってコードされる機能的なタンパク質が、実質的に生産されない状態を得ることである。「実質的に生産されない」とは、機能的なタンパク質が、全く生産されない、または微生物が正常なｉｓｃＲ遺伝子を有する場合と比較して、Ｈ２生産が増加するように、減少した程度に生産されることを意味する。
【００４３】
本発明によるＨ２生産は、遺伝子ｌｄｈＡ（例えば、配列番号５）、大腸菌のピルビン酸：ギ酸リアーゼ複合体の構造メンバーをコードする遺伝子のいずれか、例えばｐｆｌＢ（例えば、配列番号７）、および大腸菌のフマル酸還元酵素複合体の構造メンバーをコードする遺伝子のいずれか、例えば、ｆｒｄＡ（例えば、配列番号９）またはｆｒｄＢ（例えば、配列番号１１）をまた削除または破壊した場合、また更に高められる可能性がある。その根拠は、これら遺伝子の削除が、ピルビン酸を他の代謝物に変換する還元反応によって、大腸菌においてピルビン酸生産を高めることがすでに示されている(Causey et al., 2004)という事実に基づいている。また、ｌｄｈＡおよびｆｒｄＢの削除の大腸菌の醗酵バランスへの影響は、Ａｌａｍらによってすでに示されている(Alam et al., 1989)。従って、そのような反応は、ＹＤＢＫと同じ初期基質、即ち、ピルビン酸を競合し得る。ピルビン酸の競合を減じることによって、より多くの流れがＹＤＢＫ依存性Ｈ２生産経路を経ることが予測され、開始時の基質（糖）あたりのより多くのＨ２の収量が可能となる。更なるｉｓｃＲの削除もまた、前述のように、Ｈ２生産速度および／またはＨ２生産収量を高める可能性がある。よって、この遺伝子もまた削除することが、好ましい。本発明のＨ２を生産する方法において、このようにして調製された微生物細胞は、吸収可能な炭水化物および吸収可能な窒素源を含む培養培地中で培養される。吸収可能な炭水化物として、グルコース、麦芽糖、果糖、キシロース、グリセロールが好ましく、グルコースが最も好ましい。炭水化物がグルコースである場合、培養培地中のグルコースの濃度は、通常、０．１ｗ／ｖ％から２．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは、０．５ｗ／ｖ％から１．０ｗ／ｖ％であり得る。窒素源として、酵母抽出物が好ましいが、窒素源はこれに限定されず、微生物によって吸収される他の窒素源を用いてもよい。酵母抽出物を使用する場合、培養培地中の酵母抽出物の濃度は、通常、０．０５ｗ／ｖ％から１．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．１ｗ／ｖ％から０．３ｗ／ｖ％であり得る。培養培地は、さらに、各微生物用の従来の培養培地に一般に含まれる微量元素およびビタミンを、従来用いられる濃度で含む。大腸菌培養に用いる好ましい培養培地の具体的な組成は、実施例において後述される。
【００４４】
培養が行われる雰囲気は、好ましくは、Ｈ２生産に最適な酸素濃度を有する。通常、雰囲気（空気）は、酸素濃度５％（ｖ／ｖ）またはそれ未満、好ましくは３．０から３．５％（ｖ／ｖ）である。他の培養条件は、従来用いられるものと同じでよい。すなわち、大腸菌の場合、培養は、通常、温度範囲１８ｏＣから４７ｏＣ、好ましくは３０から３７ｏＣ程度で実施され得る。バッチ法、すなわち、微生物が、新鮮な細胞と交換されない方法において、培養は、通常、約２日から１５日間ほど続けられ得る。すべてまたは一部の微生物細胞が、培養のあいだ、新鮮な細胞に、連続的または断続的に交換される、連続した方法において、培養時間は限定されず、培養は、連続的に実施してもよい。培養開始時の培養培地の細胞集団は、通常、培養培地１ｍｌあたり１００個の細胞から10,000,000個の細胞、好ましくは10,000細胞から1,000,000細胞がよい。
【００４５】
微生物の培養によって、水素ガスが生産され、培養培地の雰囲気に放出される。または、その放出は、培養の機械的動作および／またはガス拡散を含むが排除しない、それ自体が当業者に周知の方法によって、補助される。水素ガスは、培養容器内の上部空間に蓄積する。それは、ポンプによって生じる醗酵装置の内側と外側のあいだの負の圧力差によって補助促進してもよいししなくてもよい。二酸化炭素ガス（ＣＯ２ガス）もまた、生産され、上部空間に蓄積する。上部空間の水素ガスは、それ自体が当業者に周知の方法によって、例えば、周知の水素分離膜を利用した方法、または、ＣＯ２の選択的な化学的結合を通して、回収され得る。必要なら、水素ガスを、例えば、Ｈ２ガスおよびＣＯ２ガスの混合物といった、他の１種類またはそれ以上の種類の気体との混合物のかたちで収集してもよい。
【００４６】
本発明を、その実施例を用いて、より具体的に説明する。尚、実施例は、例示の目的だけであって、いかなる限定的な意味でも、限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
１．大腸菌ｙｄｂｋ遺伝子を含む組み換えベクターの構築
大腸菌ピルビン酸：フラボドキシン酸化還元酵素遺伝子（配列番号１）を次のように調製した。遺伝子ｙｄｂＫ（受託番号(accession #)AAC74460)のオープンリーディングフレームを、pET46-Ek/LIC(Novagen, Merck KGaA, ドイツ国Darmstadt)に、プライマー5'-gacgacgacaagatgattactattgacggtaatggcgcggと5'-gaggagaagcccggtttaatcggtgttgcttttttccgcttttccg、大腸菌ＪＭ１０９から、Qiagen DNAeasy kit (Qiagen Sciences, Maryland, USA)およびAccuprime PFX Polymerase(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用い、ＤＮＡ抽出キットの製造者の取扱説明書に従って抽出したゲノムＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、並びにプラスミドベクターを用いクローンし、組み換えベクターｐＥＴ４６−ｙｂｄＫを構築した。リバースプライマーが、終止コドンを含むため、ｐＥＴ４６−ｙｂｄＫベクターは、Ｎ末端にのみヒスチジンタグをコードする融合タンパク質を生成することが予期された。
【００４８】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞および大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、このようにして得られたｐＥＴ４６−ｙｂｄｋおよび組み換えプラスミドベクターｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘを、共に形質転換した。ｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘベクターは、市販のプラスミドベクターｐＣＤＦ中に、クロストリジウム・アセトブチリクムＨｙｄＡおよびクロストリジウム・パスツリアヌム［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシンの合成に必要な遺伝子を含んでいる。より具体的に、ｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘベクターは、クロストリジウム・アセトブチリクムｈｙｄＦ（ヒドロゲナーゼ成熟因子ＨｙｄＦをコードする、ジェンバンク受託番号NP_348277)、クロストリジウム・アセトブチリクムＨｙｄＥ（ヒドロゲナーゼ成熟因子ＨｙｄＥをコードする、ジェンバンク受託番号NP_348258)、クロストリジウム・アセトブチリクムｈｙｄＧ（ヒドロゲナーゼ成熟因子ＨｙｄＧをコードする、ジェンバンク受託番号NP_347984)、クロストリジウム・アセトブチリクムｈｙｄＡ（ヒドロゲナーゼＨｙｄＡをコードする、ジェンバンク受託番号U15277）およびクロストリジウム・パスツリアヌムｃｌｏｆｄｘ（［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシンをコードする、ジェンバンク受託番号M11214）の遺伝子を上流からこの順番に含む。ｐＣＤＦ−ＦＥＧＡＦｄｘベクターの関連部分の構造を、Ｈ２が生産される代謝経路とともに図１に示す。図１において、「Ｇ６Ｐ」は、グルコース−６−リン酸を、「ＧＡＰ」は、グリセルアルデヒド−３−リン酸を、「ＰＹＲ」は、ピルビン酸を表す。
【００４９】
ｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘベクターを、次のように構築した。ＣｐＦｄをコードする遺伝子（クロストリジウム・パスツリアヌム［４Ｆｅ４Ｓ］フェレドキシンをコードする（受託番号(accession number)M11214)を、プライマーFEGAFdx-for(ATAGGATCCGAATTTAAATAAAATGGCATATAAAATCGCTGATTCATG)およびFEGAFdx-rev(TACCTAGGAGGCCTCCTTTATTCTTGTACTGGTGCTCCAACTGGAC)のプライマーを用いて、ｐＣＤＯＰＦＥＧＡに加えることによって、プラスミドｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘを構築した。ｐＣＤＯＰＦＥＧＡベクターおよびｐＣＤＯＰＦＥＧＨｉｓＡベクターを、次のように構築した。ＨｙｄＥ（受託番号ＣＡＣ１６３１）、ＨｙｄＦ（受託番号ＣＡＣ１６５１）、ＨｙｄＧ（受託番号ＣＡＣ１３５６）およびＨｙｄＡ（受託番号Ｕ１５２７７）をコードする遺伝子を、６つのヒスチジンをコードするＮ末端コドン付きまたはそれらヒスチジンコドン無しで、クロストリジウム・アセトブチリクムゲノムＤＮＡから増幅した。クローニング工程（ｃ）から（ｅ）のために生成されたすべてのＰＣＲ産物（フォワードおよびリバースプライマーは角括弧に示す）は、内部にＳｔｕＩ制限酵素部位(AGGCCT)および６塩基のリボソーム結合部位配列(AGGAGG)を３末端に含んでいた。リボソーム結合部位は、上流の遺伝子終止コドン(TAA)の末端塩基対とTAAGGAGGのように重なるか、または、終止コドンから２塩基対下流にTAATCAGGAGGとして置かれるかのいずれかであった。さらに、工程（ｃ）から（ｅ）によるＰＣＲ産物は、また、８塩基対の任意の配列AAAATAAAを含み、リボソーム結合部位と挿入された遺伝子の最初の開始コドンとの間に十分なスペースを付与した。図１に示されている各々の工程；（ａ）最初に、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１ベクター(Novagen, Carlsbad,USA)を制限酵素NcoI(CCATGG)およびEcoRV(GATATC、平滑末端を作る）で消化し、（ｂ）ＮｃｏＩで消化したｈｙｄＦＰＣＲ産物と結合(5'-aatataccATGGATGAACTTAACTCAACACCCAAAGG-3'および5'-aggcctcctgaTTAGTTCCTACTCGATTGATTAAATATTCTATCAGC-3')して、プラスミドｐＦを生成する。（ｃ）ｈｙｄＥＰＣＲ産物(5'-atataatatttaaataaaATGGATAATATAATAAAGTTAATTAATAAAGC-3'および5'-tacctaggaggcctcctgaTTAACCAATAGATTCTTTGTAGC-3')をSwaI(ATTTAAAT)およびAvrII(CCTAGG)で消化し、StuI/AvrII制限酵素処理したｐＦに結合して、プラスミドｐＦＥを作成する。同様にして、hydG(5'-atataatatttaaataaaATGTATAATGTTAAATCTAAAGTTGCAACTG-3'および5'-tacctaggaggcctcctgaTTAGAATCTAAAATCTCTTTGTCCC-3')およびhydA(5'-atataatatttaaataaaATGAAAACAATAATCTTAAATGGCAATGAAG-3'および5'-tacctaggaggcctccTTATTCATGTTTTGAAACATTTTTATCTTTTGTG-3'）を順にクローンして、ｄ）ｐＦＥＧプラスミドおよびｅ）ｐＦＥＧＡプラスミドをそれぞれ作成した。各段階で、個々の新しいインサートは、シーケンスにより確認した。
【００５０】
ＹＢＤＫ、クロストリジウム・アセトブチリクムＨｙｄＡおよびクロストリジウム・パスツリアヌム［４Ｆｅ４Ｓ］−フェレドキシンを生産する形質転換体は、抗生物質アンピシリンおよびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）に対する抗生質耐性により選択された。対照形質転換体も、プラスミドｐＥＴ４６−ｙｂｄｋの代わりに、ピルビン酸：フラボドキシン酸化還元酵素遺伝子およびピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素遺伝子が挿入されていないことを除いてｐＥＴ４６−ｙｂｄｋと同じ構造をもつプラスミドｐＥＴ−Ｄｕｅｔを用い、前述と同様の方法で調製した。
【００５１】
２．Ｈ２生産
培養は、唯一の炭素源として１．５％  グルコースを含み、カナマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加したＭＯＰＳ最少培地(Teknova, Hollister, CA)（５〜１０ｍｌ）中で行った。前培養は、新鮮なＬＢプレートから播種し、３０ｏＣでＯＤ６００が０．１〜０．５になるまで増殖させた。次に、前培養を用い、ＯＤ６００約０．０２で播種し、本培養（同じ培地に、０．０５ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加）を行った。培養はすべて２４から４８時間増殖し、３０ｏＣで、ブチルゴムセプタムでキャップし、播種後９９．９９９５％Ｎ２を５分間より長く拡散した１２０ｍＬ容の血清瓶で行った。気体試料は、Ｃａｒｂｏｘｅｎ（商標）１０１０  ＰＬＯＴキャピラリーカラム(30m x 0.32mm)(Supelco, Bellefonte, USA)を取り付けた６８９０Ｎガスクロマトグラフィー(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を用いて分析した。２００μＬガス試料は、血清瓶培養の上部空間からサンプルロック注射器(Hamilton, Reno, NV)を用いて取り出し、スプリット／スプリットレス試料導入口（室温、５：１プリット比）に直接注入した。試料は、均一濃度（３５ｏＣ、４〜５分）で溶出した。キャリアガスはＮ２（１７．６ｍＬ／分）とし、熱伝導度検出器（２３０ｏＣ、２．０ｍＬ／ｍｉｎ）を用いて、試料を検出した。〜３．３分で溶出したＨ２および上部空間のＨ２分圧（ｐＨ２）を、０．２５％および５％  標準Ｈ２ガス試料(Kamimaru、横浜、日本）並びに１００％  Ｈ２（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、東京、日本）を用いて作成した検量線に対比することによって定量した。グルコースあたりのＨ２の収量を推定するためには、液体培地中の残留グルコースの量もまた、Ｈ２が定量される最低でも２つのサンプルポイントで測定される必要がある。培地上清中のグルコース濃度は、Roche-Biopharm(ドイツ国Darmstadt)によるＤ−グルコースキットを用い、製造者の取扱説明書に従って測定した。
【００５２】
結果を図２に示す。図２は、培養培地の上部の空間中の％Ｈ２（ｖ／ｖ）濃度に換算にした経時的な大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体の水素の生産を示している。図２から明らかにわかるように、外来のピルビン酸：フラボドキシン酸化還元酵素遺伝子およびピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素遺伝子を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体によるＨ２生産は、対照形質転換体より約１５倍多かった。大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）形質転換体を用いた場合にも、同様の結果が得られた。従って、本発明の方法が、微生物によるＨ２生産を高めることが証明された。
【実施例２】
【００５３】
１．ｉｓｃＲ遺伝子欠損変異体の構築
ｉｓｃＲ遺伝子欠損変異体を、次のように構築した。大腸菌ＭＧ１６５５におけるｉｓｃＲ遺伝子の削除は、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒの方法(Datsenko and Wanner, 2000)に従って、実施した。ｐＫＤ１３のカナマイシン耐性カセットに隣接するＦＲＴを、プライマーｉｓｃＲ−ｆｏｒおよびｉｓｃＲ−ｒｅｖを用いて、ＰＣＲで増幅した。ＤｐｎＩで処理および精製した後、削除カセット(deletion cassette)ｐＫＤ４６をもつＭＧ１６５５ＷＴに形質転換した。カナマイシン耐性クローンを選択し、その削除は、プライマーiscRDWF(CACTCCGGCCTGATTCTGAATTCTTTTTATTAAGCGCGTAACTTAACGTCATTCCGGGGATCCGTCGACC)およびiscRDWR(TACAATAAAAAACCCCGGGCAGGGGCGAGTTTGAGGTGAAGTAAGACATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG)を用いて、ＰＣＲで検証した。得られた株を、ＭＧ１６５５ΔｙｄｂＫ：：ｋａｎとし、BL21(DE3)(Novagen, Merck KGaA, ドイツ国Darmstadt)を受け手として、Ｐ１トランスダクションによりＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｙｄｂＫを生成する供与株として用いた(Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。Ｐ１トランスダクションの後、カナマイシン耐性遺伝子を、酵母リコンビナーゼをコードするpCP20(Datsenko and Wanner, 2000)を用いて取り除いた。代わりに、ＢＬ２１（ＤＥ３）のΔｉｓｃＲ変異体を、ＭＧ１６５５ΔｉｓｃＲ株(University of Wisconsin, USA)およびBL21(DE3)(Novagen, Merck KGaA, ドイツ国Darmstadt)をそれぞれ供与株および受容株として用いＰ１トランスダクション(Miller, 1972)によって得た。
【００５４】
２．Ｈ２生産
このように調製した変異体およびｉｓｃＲ遺伝子を含む元の微生物によるＨ２生産を、前述と同じ方法で調べた。結果を図３に示す。図３に示されるように、本発明の実施例１で調製した微生物からｉｓｃＲ遺伝子を削除することにより、Ｈ２生産は、約３倍増加した。従って、ｉｓｃＲ遺伝子の削除により、本発明の微生物によるＨ２生産が増加することが証明された。
【実施例３】
【００５５】
前述のように、本発明によるＨ２生産は、遺伝子ｌｄｈＡ（配列番号５）、大腸菌のピルビン酸：ギ酸リアーゼ複合体の構造メンバーをコードする遺伝子のいずれか、例えばｐｆｌＢ（配列番号７）、および大腸菌のフマル酸還元酵素複合体の構造メンバーをコードする遺伝子のいずれか、例えばｆｒｄＡ（配列番号９）またはｆｒｄＢ（配列番号１１）をも削除した場合、さらに高まる可能性がある。その根拠は、これらの遺伝子の削除が、ピルビン酸を他の代謝物に変換する反応を減じることによって大腸菌におけるピルビン酸生産を高める(Causey et al., 2004)ことが、すでに示されていることに基づいている。ｌｄｈＡおよびｆｒｄＢ欠損の大腸菌の醗酵バランスへの影響もまた、Ａｌａｍらによってすでに示されている（Ａｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．、  １９８９）。従って、そのような反応は、同じ初期基質すなわちピルビン酸を、ＹＤＢＫと競合し得る。ピルビン酸のＹＤＢＫとの競合を減じることで、より多くの流れがＹＤＢＫ依存性Ｈ２生産経路を通ることが予期され、開始時の基質（糖）あたり、より多くの水素の収量が可能になる。ｉｓｃＲの更なる削除もまた、上に示したように、Ｈ２生産速度および／または収量を高める可能性もある。従って、この遺伝子を削除することもまた好ましい。
【００５６】
遺伝子ｌｄｈＡ、ｐｆｌＢ、ｆｒｄＡＢ、およびｉｓｃＲの削除のピルビン酸依存性Ｈ２生産への影響の実験的な証明は、次のように得ることができる。はじめに、遺伝子ｌｄｈＡ、ｐｆｌＢおよびｆｒｄＡＢを、ＭＧ１６５５において、削除する。これは、既報のように((Baba et al., 2006))遺伝子ｌｄｈＡ、ｐｆｌＢ、およびｆｒｄＡＢに対して、それぞれ、プライマーldhADWF ctcccctggaatgcaggggagcggcaagattaaaccagttcgttcgggcaattccggggatccgtcgacc、ldhADWR tatttttagtagcttaaatgtgattcaacatcactggagaaagtcttatgtgtaggctggagctgcttcg、pflBDWF ttttactgtacgatttcagtcaaatctaattacatagattgagtgaaggtattccggggatccgtcgacc、pflBDWR cgaagtacgcagtaaataaaaaatccacttaagaaggtaggtgttacatgtgtaggctggagctgcttcg、frdBDWF gtttacgtttagtcgtcatgttgcactccttagcgtggtttcagggtcgcattccggggatccgtcgacc、frdADWR accctgaagtacgtggctgtgggataaaaacaatctggaggaatgtcgtgtgtaggctggagctgcttcg、を用いること除いて、前述のように行う。削除を、前述のようにＰ１トランスダクションより、ひとつずつＢＬ２１に移し、それぞれ前述のように抽出したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲによって確認される導入の成功後、次の削除を導入する前に、カナマイシン耐性遺伝子を、ｐＣＰ２０を用いて前述のように取り除く。ｉｓｃＲ欠損を構築し、前述のように導入する。最終的に、これによって、ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｌｄｈＡΔｐｆｌＢΔｆｒｄＡＢΔｉｓｃＲ株が生成されるであろう。この株に、プラスミドｐＣＤＯＰＦＥＧＡＦｄｘおよびｐｙｄｂＫを電気穿孔法で形質転換し、前述のようにＨ２生産およびグルコース消費を調べる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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