(57)【要約】【課題】バイオマスに由来する６炭糖及び５炭糖を含有する糖化液を酵母により発酵させてエタノールを製造するに際し、エタノールの収率を十分に向上させることが可能な方法の提供。【解決手段】タンパク質の含有量がバイオマスの乾燥質量を基準として１．５〜１２質量％であり且つセルロースを含有するバイオマスを、アンモニアにより処理し、得られる改質バイオマスについて加水分解処理を行い、６炭糖類及び５炭糖類を含有する糖化液を得る。該糖化液について、６炭糖類をエタノールに変換可能な酵母を用いてエタノール発酵を行い、１次発酵液を６０℃未満の温度に保持した状態で、エタノール濃度が４％（Ｗ／Ｖ）以下となるように、１次発酵液中のエタノールを除去する。エタノール除去後の１次発酵液について、５炭糖類をエタノールに変換可能な酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、２次発酵液を得る。【選択図】図２
2011087478.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の含有量がバイオマスの乾燥質量を基準として１．５〜１２質量％であり且つセルロースを含有するバイオマスを、アンモニアにより処理し、改質バイオマスを得る第１の工程と、
前記改質バイオマスについて加水分解処理を行い、６炭糖類及び５炭糖類を含有する糖化液を得る第２の工程と、
前記糖化液について、６炭糖類をエタノールに変換可能な第１の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、１次発酵液を得、前記１次発酵液を６０℃未満の温度に保持した状態で、エタノール濃度が４％（Ｗ／Ｖ）以下となるように、前記１次発酵液中のエタノールを除去する第３の工程と、
前記第３の工程後の前記１次発酵液について、５炭糖類をエタノールに変換可能な第２の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、２次発酵液を得る第４の工程と、
を備えることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
前記バイオマスが草本類バイオマスであることを特徴とする請求項１に記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
前記第１の酵母がサッカロマイセス・セレビシエであることを特徴とする請求項１又は２に記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
前記第２の酵母がピキア・スティピティス又はカンジダ・シハタエであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のエタノールの製造方法。
【請求項５】
前記第３の工程において、減圧下での蒸留により前記１次発酵液からエタノールを除去することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のエタノールの製造方法。
【請求項６】
前記第２の工程において、前記改質バイオマスを酵素により加水分解することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマスを原料とするエタノール（以下、場合により「バイオエタノール」という。）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化防止のためのＣＯ２の削減策として、バイオエタノールの輸送用燃料への利用が検討されている。その一方で、従前のバイオエタノールは、糖蜜やデンプン資源から生産されるため、食糧との競合が問題視されている。このような問題を回避するため、木本や草本などのセルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法が検討されている。
【０００３】
セルロース系バイオマスからエタノールを製造する方法としては、バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロース等の多糖類を加水分解して糖化液を得、その糖化液を酵母により発酵させる方法がある。この方法においては、加水分解により、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースが６炭糖であるグルコースに、ヘミセルロースが６炭糖であるグルコース、マンノース、ガラクトース又は５炭糖であるキシロース、アラビノースなどに変換される。そして、これらの６炭糖及び５炭糖を含む糖化液を、酵母を用いてエタノール発酵させることによって、エタノールを得ることができる。
【０００４】
６炭糖をエタノールに変換可能な酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がある（特許文献１）。但し、サッカロマイセス・セレビシエは、５炭糖からエタノールへの変換能を有さない。
【０００５】
一方、近年、遺伝子組換え技術により、５炭糖からエタノール生産可能な微生物が生み出されている。かかる微生物としては、例えば、大腸菌やその他の細菌にエタノール変換遺伝子を組み入れ、５炭糖、６炭糖からエタノールを生産できる菌が挙げられる（特許文献２、３）。また、自然界には、キシロースを資化しエタノール生産が可能な酵母、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）やカンジダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｈｉｈａｔａｅ）が存在することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５９−１３５８９６号公報
【特許文献２】特表平５−５０２３６６号公報
【特許文献３】特表平６−５０４４３６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｅｌｇｅｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１９  ２２０−２２５（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、大腸菌等に遺伝子組換え技術を適用することにより生み出される微生物は、安全性の観点からその取り扱いが厳しい規制の対象となる。また、従来のバイオエタノールの製造方法において、６炭糖をエタノールに変換可能な酵母と５炭糖をエタノールに変換可能な酵母とを併用しても、十分な収率でエタノールを製造することができない。
【０００９】
そこで本発明は、バイオマスに由来する６炭糖及び５炭糖を含有する糖化液を酵母により発酵させてエタノールを製造するに際し、エタノールの収率を十分に向上させることが可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
６炭糖をエタノールに変換可能な酵母と５炭糖をエタノールに変換可能な酵母とを併用する従来のバイオエタノールの製造方法においてエタノールの収率が不十分となる原因として、５炭糖をエタノールに変換可能な酵母のエタノール耐性が低いことが考えられる。さらに、本発明者の検討によれば、バイオマスに含まれるタンパク質が前処理工程から５炭糖の発酵工程までの間に変質し、その変質物によって５炭糖をエタノールに変換可能な酵母の機能が阻害されることも判明した。
【００１１】
そこで、本発明者が上記の知見に基づきさらに検討したところ、特定濃度のタンパク質を含むバイオマスについてアンモニア処理による改質を行った後、改質バイオマスの糖化、６炭糖をエタノールに変換する１次発酵、１次発酵液からのエタノールの除去、５炭糖をエタノールに変換する２次発酵を順次行うことによって、上記の問題点を解消してエタノールの収率を飛躍的に向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明のエタノールの製造方法は、
タンパク質の含有量がバイオマスの乾燥質量を基準として１．５〜１２質量％であり且つセルロースを含有するバイオマスを、アンモニアにより処理し、改質バイオマスを得る第１の工程と、
該改質バイオマスについて加水分解処理を行い、６炭糖類及び５炭糖類を含有する糖化液を得る第２の工程と、
該糖化液について、６炭糖類をエタノールに変換可能な第１の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、１次発酵液を得、該１次発酵液を６０℃より低い温度に保持した状態で、エタノール濃度が４％（Ｗ／Ｖ）以下となるように、１次発酵液中のエタノールを除去する第３の工程と、
第３の工程後の１次発酵液について、５炭糖類をエタノールに変換可能な第２の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、２次発酵液を得る第４の工程と、
を備えることを特徴とする。ここで、「Ｗ／Ｖ」は「ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ」の意である。
【００１３】
なお、従来の製造方法においても、多糖類を加水分解して糖化液を得るに際し、加水分解の処理効率を高める観点から、アンモニア処理、希硫酸処理、水熱処理等の前処理が行われることがある。しかし、本発明の製造方法において、アンモニア処理に代えて水熱処理、希硫酸処理等の前処理を行っても、エタノール収率の向上効果は認められない。これらの前処理を行った場合には、処理時に糖の過分解が起こり、これが発酵時の阻害物質となる。このことから、本発明の製造方法におけるアンモニア処理は、単なる加水分解の前処理でなく、第４の工程における第２の酵母の機能の阻害物質の生成を抑制するために必須の要素であると考えられる。そして、かかるアンモニア処理による寄与と、第３の工程におけるエタノール除去による寄与とが相俟って、第４の工程における第２の酵母の機能を最大限に発揮させることができるようになり、エタノール収率を飛躍的に向上させることができるものと考えられる。
【００１４】
さらに、従来の製造方法において、希硫酸処理には廃液処理等の環境問題が大きいという問題がある。また、水熱処理の場合、多量の水を使用するため、得られる糖化液の糖濃度が低下するという問題がある。これに対して、本発明におけるアンモニア処理には上記のような問題がなく、この点においても本発明の製造方法は有用である。
【００１５】
本発明の製造方法においては、上記バイオマスが草本類バイオマスであることを特徴としてもよい。
【００１６】
また、本発明の製造方法においては、第１の酵母としてサッカロマイセス・セレビシエを、第２の酵母としてピキア・スティピティス又はカンジダ・シハタエを、それぞれ好適に用いることができる。
【００１７】
また、上記第３の工程においては、減圧下での蒸留により１次発酵液からエタノールを除去することが好ましい。これにより、１次発酵液を６０℃より低い温度に保持した状態で、エタノールを効率よく且つ確実に除去することができる。
【００１８】
また、上記第２の工程においては、改質バイオマスを酵素により加水分解することが好ましい。これにより、温和な条件でバイオマスを単糖に分解することができる。
【発明の効果】
【００１９】
以上の通り、本発明のエタノールの製造方法によれば、バイオマスに由来する６炭糖及び５炭糖を含有する糖化液を酵母により発酵させてエタノールを製造するに際し、エタノールの収率を十分に向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１及び２で得られた、各糖化液を用いた１次発酵における発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
【図２】実施例１及び２で得られた、各糖化液を用いた２次発酵における発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
【図３】モデル糖液を用いた２次発酵相当の発酵における発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の好適な実施形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。
【００２２】
本実施形態に係るエタノールの製造方法は、
タンパク質の含有量がバイオマスの乾燥質量を基準として１．５〜１２質量％であり且つセルロースを含有するバイオマスを、アンモニアにより処理し、改質バイオマスを得る第１の工程と、
該改質バイオマスについて加水分解処理を行い、６炭糖類及び５炭糖類を含有する糖化液を得る第２の工程と、
該糖化液について、６炭糖類をエタノールに変換可能な第１の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、１次発酵液を得、該１次発酵液を６０℃より低い温度に保持した状態で、エタノール濃度が４％（Ｗ／Ｖ）以下となるように、１次発酵液中のエタノールを除去する第３の工程と、
第３の工程後の１次発酵液について、５炭糖類をエタノールに変換可能な第２の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、２次発酵液を得る第４の工程と、
を備える。
【００２３】
本実施形態においては、原料バイオマスとして、タンパク質の含有量がバイオマスの乾燥質量を基準として１．５〜１２質量％であり且つセルロースを含有するバイオマスが用いられる。タンパク質の含有量としては、好ましくは２〜８質量％である。タンパク質の含有量が前記下限値未満のバイオマスを原料として使用する場合には、当該バイオマス原料をアンモニア処理して得られる改質バイオマスを加水分解処理、中でも酵素を用いた加水分解処理により糖化液を得る工程において、糖化が十分に進行しない傾向にある。一方、セルロース系バイオマスのタンパク質の含有量は、概ね１２質量％以下である。かかる原料バイオマスとしては、草本類バイオマス及び木本類バイオマスのうち当該条件を満たすものを好適に用いることができる。なお、ここでバイオマスのタンパク質の含有量の測定方法としては燃焼法を用いる。すなわち、乾燥した各バイオマス試料を酸素ガス（純度９９．９％）中で熱分解し、生成した窒素酸化物（ＮＯｘ）を窒素ガスに還元し、この窒素ガスをガス・クロマトグラフィー法により定量し、この値とバイオマス試料の質量とから乾燥バイオマス中の全窒素含有量を算出する。次に同一のバイオマス試料中の硝酸態窒素含有量及び亜硝酸態窒素含有量を液体クロマトグラフィー法により測定し、これらの合計量を前述の全窒素含有量から減じることにより、乾燥バイオマス中の有機態窒素含有量を得る。更に、有機態窒素含有量に係数６．２５を乗じて乾燥バイオマス中のタンパク質含有量とする。
【００２４】
草本類バイオマスは、高いエタノール収率を達成できる点、あるいは更に生育期間が短い点で好ましい。草本類バイオマスとしては、スイッチグラス、エリアンサス、ネピアグラス等が挙げられる。
【００２５】
一方、木本類バイオマスは、一般的にタンパク質の含有量が低く、上記の下限値未満となることが多い。このような木本類バイオマスを用いると、アンモニア処理後の改質バイオマスの酵素糖化が進行しにくい傾向にある。なお、木本類バイオマスのうち、マツ、スギ等の針葉樹は、アンモニア処理後の改質バイオマスの酵素糖化が進行しにくい傾向にある。一方、広葉樹は針葉樹に比較して、相対的にアンモニア処理後の改質バイオマスの酵素糖化が進行し易い傾向にある。特にエゾノキヌヤナギ等のヤナギ由来のバイオマスは、草本類バイオマスと比較するとタンパク質の含有量は低いものの、木本類バイオマスとしては比較的タンパク質の含有量が高いという特徴を有する。このようなヤナギ由来のバイオマスを用いると、草本類バイオマスを用いた場合と比較して、同等以上の効果を得ることができ、特に好ましい。なお、ヤナギ由来のバイオマスを用いた場合に優れた効果が得られる理由は、草本類バイオマスと比較するとタンパク質の含有量が低いため、タンパク質の変質による２次発酵の阻害物質の生成をより確実に抑制できるためであると考えられる。
【００２６】
本実施形態においては、先ず、上記の原料バイオマスをアンモニアにより処理し、改質バイオマスを得る（第１の工程）。かかるアンモニア処理は、アンモニア又はアンモニアと有機アミンとを用いて行うことができる。アンモニア等の使用量は、原料バイオマス１ｇに対して１０ｍｇ〜３００ｇとすることが好ましい。これによって、原料バイオマスの改質が進み、酵素加水分解後の糖の回収率を高めることが可能となる。
【００２７】
次いで、改質バイオマスについて加水分解処理を行い、６炭糖類及び５炭糖類を含有する糖化液を得る（第２の工程）。改質バイオマスの加水分解の方法は特に限定されず、酸触媒、例えば濃硫酸を用いた化学的な方法、酵素を用いた生化学的な方法などを用いることができる。中でも、温和な条件を採用することが可能であり、酵母による発酵に対する阻害物質の生成を抑制する等の観点から、酵素による加水分解が好ましく採用される。この場合に使用する酵素としては、一般的なセルロース分解酵素（セルラーゼ）を用いることができる。
【００２８】
なお、本実施形態においては、前処理工程である第１の工程で、従来の製造方法における水熱処理のように水の使用を必須としないため、酵素による加水分解処理の際の改質バイオマスのスラリーを任意の濃度に調整することが可能である。そのため、酵素による加水分解処理後の糖化液の糖濃度を高く保つことができ、続く発酵工程終了後のエタノール濃度を高めることができるため、省エネルギーなエタノール蒸留プロセスを達成することが可能となる。
【００２９】
次いで、第２の工程で得られた糖化液について、６炭糖類をエタノールに変換可能な第１の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、１次発酵液を得、該１次発酵液を６０℃より低い温度に保持した状態で、エタノール濃度が４％（Ｗ／Ｖ）以下となるように、１次発酵液中のエタノールを除去する（第３の工程）。
【００３０】
第１の酵母としては、６炭糖類をエタノールに変換可能であれば特に制限されず、公知のものを使用できるが、その中でもサッカロマイセス・セルビシエが好ましい。１次発酵はｐＨ５．０〜７．０、温度２０〜３７℃で行うことが好ましい。
【００３１】
また、第３の工程における１次発酵液からのエタノールの除去は、１次発酵と並行して（１次発酵と同時に）行ってもよく、あるいは、１次発酵が完了した後で行ってもよい。エタノールを除去する方法は、１次発酵液を６０℃より低い温度に保持した状態で行うものであれば特に制限されないが、減圧蒸留が好ましい。また、二酸化炭素、窒素等の不活性気体の吹き込みによるストリッピングを行ってもよい。１次発酵液からのエタノールの除去に際して、１次発酵液の温度は６０℃より低い温度であり、好ましくは５０℃以下である。前記温度であればエタノールの除去に際して、２次発酵に使用する酵母の発酵機能を阻害する物質の生成が抑制されると考えられ、２次発酵が効率的に進行する。また、１次発酵液の温度はエタノール除去の効率の観点から、０℃以上であることが好ましい。また、エタノール除去後の１次発酵液中のエタノール濃度は、その後に行なう２次発酵において使用する酵母のエタノール耐性によっても異なるが、４％以下であり、好ましくは３％以下、更に好ましくは２％以下、特に好ましくは１％以下である。エタノール濃度を前記の値とすることで、２次発酵における酵母による５炭糖類からのエタノール生産の効率が向上する。
【００３２】
次いで、エタノールが除去された１次発酵液について、５炭糖類をエタノールに変換可能な第２の酵母を用いてエタノール発酵を行うことにより、２次発酵液を得る（第４の工程）。
【００３３】
第２の酵母としては、５炭糖類をエタノールに変換可能なものであれば特に制限されず、公知のペントース資化酵母を用いることができるが、その中でもピキア・スティピティス又はカンジダ・シハタエが好ましい。２次発酵はｐＨ５．０〜７．０、温度２０〜３７℃で行うことが好ましい。
【００３４】
２次発酵液からのエタノールの分離・回収は、第３の工程におけるエタノール除去と同様にして行うこともできるが、常圧下に加熱して蒸留すること等によっても行うことができる。
【００３５】
このようにして、特定の原料バイオマスを用い、第１〜第４工程を経てエタノールを製造することによって、バイオマスに由来する６炭糖及び５炭糖を含有する糖化液を酵母により発酵させてエタノールを製造する際に従来の製造方法では達成が困難であった、高いエタノール収率を達成することが可能となる。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例及び比較例に基づき本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００３７】
［参考例；バイオマス原料中のタンパク質の含有量の測定］
乾燥した各バイオマス試料を酸素ガス（純度９９．９％）中で熱分解し、生成したＮＯｘを窒素ガスに還元して変換し、この窒素ガスをガス・クロマトグラフィー法により定量し、この値とバイオマス試料の質量とから、乾燥バイオマス中の全窒素含有量を算出した。次に同一のバイオマス試料中の硝酸態窒素含有量及び亜硝酸態窒素含有量を液体クロマトグラフィー法により測定し、これらの合計値を前述の全窒素含有量から減じることにより、乾燥バイオマス中の有機態窒素含有量を得た。この値に係数６．２５を乗じ、各乾燥バイオマス中のタンパク質の含有量とした。結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
[参考例；各種バイオマスを用いた糖化液の製造（予備試験）]
各種バイオマスについてアンモニア処理後に酵素による加水分解処理を行い、糖化の進行状況を調べた。
エリアンサス、スイッチグラス（以上草本類）、エゾノキヌヤナギ、スギ（以上木本類）をカッターミル及びハンマーミルにて平均粒径約２００μｍとなるように粉砕した。
次に、それぞれの粉砕したバイオマス約１０ｇを内容積２５０ｍｌの高圧容器に入れ、この容器を−４０℃に冷却した後、液体アンモニア約２５ｇを導入し、８０℃、４．３ＭＰａ又は１００℃、６．３ＭＰａに到達した後、２時間処理を行った。
アンモニア処理後の各バイオマスを０．０５Ｍ−酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁し、スラリー濃度を２．５％とした。糖化用酵素として、Celluclast 1.5 L及びNovozyme188（共に登録商標、ノボザイムズ社製）を各々タンパク質量として０．１％となるよう前記バイオマス懸濁液に添加し、３７℃で７２時間、振とう（２００ｒｐｍ）した。
酵素糖化後の液を９５℃にて１５分間加熱処理して酵素を失活させた後、懸濁液のろ過により得られた液のグルコース濃度を、ＨＰＬＣ（カラムShodex SUGAR 0810、検出器RI）により測定し、酵素糖化率（グルコース）を算出した。  なお、原料バイオマスの持つグルコース量は、硫酸加水分解法により測定した。そして、このグルコース量を１００％として、酵素糖化率を算出した。結果を表２に示す。
【００４０】
表２において、タンパク質の含有量が１．５質量％以上であるスイッチグラス、エリアンサス（以上、草本類。）及びエゾノキヌヤナギ（木本類）においては、いずれもアンモニア処理を行うことにより７０％以上の糖化率となったのに対して、タンパク質含有量が１．５質量％未満である木本類のスギにおいては、アンモニア処理を行なっても糖化率が極めて低い値となった。このことから、タンパク質の含有量が１．５質量％未満であるバイオマスを用いる場合には、アンモニア処理による改質効果が極めて小さく、酵素を用いた加水分解処理による糖化が進行し難いことが明らかとなった。この結果から、以後の実験は、スギを除くバイオマスについて行なった。
【００４１】
【表２】
2011087478.tif 000004
【００４２】
［比較例１；ピキア・スティピティス、１段発酵による各種バイオマス糖化液からのエタノール生産］
（各種バイオマスからの酵素糖化液の製造）
エリアンサス、スイッチグラス、ネピアグラス（以上草本類）及びエゾノキヌヤナギ（木本類）をカッターミル及びハンマーミルを用い、平均粒径約２００μｍとなるように粉砕した。
次に、それぞれの粉砕したバイオマス約２００ｇを内容積５Ｌの高圧容器に入れ、ここに別の容器中にて約８０℃に予熱した液体アンモニア約５００ｇを導入し、１００℃、６．３ＭＰａの条件下に液相のアンモニアにて２時間処理を行った。
アンモニア処理後の改質バイオマスを０．０１Ｍ−酢酸緩衝液に懸濁し、１％−塩酸でｐＨを４．５に調整した後、スラリー濃度を５％とした。糖化用酵素としてCelluclast 1.5 L及びNovozyme 188（共に登録商標、ノボザイムズ社製）を各々タンパク質濃度として０．２％となるように前記バイオマス懸濁液に添加し、３７℃で７２時間、振とう（２００ｒｐｍ）し、改質バイオマスの糖化を行った。
酵素糖化後の懸濁液は、遠心分離及びろ過により固液分離し、得られた溶液をロータリーエバポレーターによりキシロース濃度が３％以上になるように濃縮した。得られた各糖化液中のグルコース及びキシロースの含有量を表３に示す。また、バイオマスの前処理段階において糖及びリグニンの過分解により生成し、酵母全般に対してその発酵機能を阻害すると考えられる物質についての分析を行い、その結果を表３に併せて記載した。いずれの糖化液についても、これらの阻害物質はほとんど検出されなかった。
また、比較対象（コントロール）として、試薬のグルコース（５．６％）とキシロース（３．０％）に試薬の酵母エキス（１％）及びペプトン（２％）を加えた水溶液からなる合成培地も併せて評価を行った。
（エタノール発酵）
各糖化液の発酵は、ピキア・スティピティスによる１段階発酵法で行った。２５ｍｌの糖化液の入った１００ｍｌ三角フラスコにピキア・スティピティスを植菌し、２８℃、８０ｒｐｍで振盪しながら発酵を行った。表４に糖化液中のグルコース及びキシロースが全てエタノールに変換された場合を１００％としたエタノール収率を示す。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
［実施例１；サッカロマイセス・セルビシエとピキア・スティピティスを用いたヤナギ由来の糖化液からの２段階発酵によるエタノール生産（減圧蒸留）］
エゾノキヌヤナギ由来の糖化液を原料として、サッカロマイセス・セルビシエとピキア・スティピティスによる２段階発酵法によるエタノールの製造を行った。糖化液として、比較例１において使用したものと同様にして得たエゾノキヌヤナギ由来の糖化液を用いた。また、比較例１で用いたコントロールの合成培地も併せて評価を行った。
各糖化液の発酵は、まず、１次発酵として、１００ｍｌ三角フラスコ中にて糖化液にサッカロマイセス・セルビシエを植菌し、２８℃、８０ｒｐｍで振盪しながら発酵を行った。発酵液中のグルコースが消費された後、発酵液を減圧蒸留（加熱湯浴温度４０℃）に供し、発酵液中のエタノールを濃度が０．５％以下になるまでエタノールを除去した。次に、蒸留残液を無菌濾過し、得られた液の２５ｍｌを１００ｍｌ三角フラスコに採取し、２次発酵として、ここへピキア・スティピティスを植菌し、２８℃、８０ｒｐｍで振盪しながら発酵を行った。
図１に、１次発酵における発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示す。また、図２に２次発酵における発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示す。更に表４に、各糖化液中のグルコース及びキシロースが全てエタノールに変換された場合を１００％としたエタノール収率を示す。
【００４５】
［実施例２；サッカロマイセス・セルビシエとピキア・スティピティスを用いた各種草本類バイオマス由来の糖化液からの２段階発酵によるエタノール生産（減圧蒸留）］
各種草本類バイオマス由来の糖化液を原料として、実施例１と同様の操作により、サッカロマイセス・セルビシエとピキア・スティピティスによる２段階発酵法によるエタノールの製造生産を行った。糖化液として比較例１において使用したものと同様にして得た、エリアンサス、スイッチグラス、ネピアグラス由来の糖化液３種を用いた。
図１に、各糖化液を用いた１次発酵における、発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示す。また、図２に２次発酵における発酵液中のエタノール濃度の経時変化を示す。更に表４に、各糖化液中のグルコース及びキシロースが全てエタノールに変換された場合を１００％としたエタノール収率を示す。
【００４６】
表４の結果より、ピキア・スティピティスを用いた１段発酵においては、エタノール収率が低いのに対して、サッカロマイセス・セルビシエとピキア・スティピティスを用いた２段階発酵であって、１次発酵と２次発酵の間に減圧蒸留により加熱することなくエタノールの除去を行った場合、エタノール収率が大きく向上することが判る。
また、図２の結果より、２次発酵において、エゾノキヌヤナギはコントロールと同等のエタノール生産速度を与えたが、その外のバイオマス由来の糖化液は、エタノール生産速度がコントロールに比較してやや低下する傾向にある。これは、糖化液製造の過程で、ピキア・スティピティスによるキシロースからのエタノール生産に対して弱い阻害を与える物質の生成が生じていることを示唆している。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
［１次発酵後をモデルした糖化液を用いたピキア・スティピティスによる発酵−加熱の影響評価］
１次発酵終了後の発酵液のモデルとして、１００ｍｌのＹＰＸ（酵母エキス０．５質量％，ポリペプトン１．０質量％，  キシロース  ５．０質量％）を含む５％（Ｗ／Ｖ）エタノール水溶液を用意し、これを実施例２と同様に減圧蒸留に供した。減圧蒸留は４０℃の温水浴で加温し、６０〜１００ＨＰａの減圧下に５０分間行い、容量７２ｍｌ、エタノール濃度０．５５％（Ｗ／Ｖ）の残液を得た。
一方、前記と同一のＹＰＸを含む５％（Ｗ／Ｖ）エタノール水溶液１００ｍｌを常圧蒸留に供した。加熱はマントルヒーターにより行い、約１００℃の液温で２４分間蒸留を行い、容量８３ｍｌ、エタノール濃度０．５％（Ｗ／Ｖ）の残液を得た。
減圧蒸留、常圧蒸留それぞれの蒸留残液を蒸留水で１００ｍｌにメスアップし、孔径０．４５μｍのポリエーテルサルフォン製フィルターにてろ過した。得られたそれぞれの液に前培養したピキア・スティピティス酵母を植菌し、２８℃、８０ｒｐｍで振とう培養を３０〜４３時間行い、発酵液中のエタノール濃度を経時的に測定した。結果を図３に示す。
常圧蒸留によりエタノールを除去した残液は、減圧蒸留によりエタノールを除去した残液に比較して、エタノールの濃度上昇速度が小さい。これは、発酵液中に含まれる酵母エキス及び／又はペプトン由来のタンパク質、ペプチド、あるいはアミノ酸が、エタノール除去の際の加熱により糖と反応することにより生じたメラノイジン等による発酵阻害に起因すると推定される。一方、減圧蒸留により、加熱することなくエタノールを除去した残液においては、相対的に阻害作用が起こりにくいことが判る。
【００４９】
［参考例；メラノイジンの測定］
各種バイオマスをアンモニア処理し、酵素糖化処理により得た糖化液及び模擬糖化液（ＹＰＸ培地、酵母エキス０．５％、ポリペプトン１．０％にキシロースを５．０％（Ｗ／Ｖ）となるよう加えたもの）について、実施例における減圧蒸留（４０℃、５０分）及び比較例における常圧蒸留（１００℃、２４分）と同様の温度履歴となるように、それぞれインキュベートした。これらの糖化液について、可視光（波長４３０ｎｍ）の吸光度を測定することにより、相対的なメラノイジン生成濃度の比較を行った。各糖化液の未処理及び各温度でのインキュベート後の吸光度を表５に示す。
なお、メラノイジンは特定の構造で規定される単一の物質ではなく、糖類とタンパク質、ポリペプチド、アミノ酸等が反応して生成する着色物質の総称である。
【００５０】
１次発酵液からエタノールを除去する際の常圧蒸留条件に相当する１００℃での加熱処理を行なった場合には、各糖化液の吸光度が未処理の場合に比較して増加し、着色成分であるメラノイジンが生成していることが推定される。一方、減圧蒸留条件に相当する４０℃での処理においては、吸光度の増加は見られず、メラノイジンの生成は抑制されていることが判る。
【００５１】
【表５】
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【００５２】
以上の結果から、１．５〜１２質量％のタンパク質の含有量をもつバイオマスをアンモニア処理、酵素による加水分解処理して得た糖化液について、６炭糖をエタノールに変換可能な酵母を用いた１次発酵、５炭糖をエタノールに変換可能な酵母を用いた２次発酵を行なうエタノールの製造において、１次発酵液を６０℃より低い温度に保持した状態でエタノール濃度を４％（Ｗ／Ｖ）以下とすることにより、高い収率でエタノールを得ることができることが明らかとなった。また、１次発酵液を６０℃以上の温度とすることにより２次発酵の効率が低下する原因は、加熱により、糖化液中に含まれるタンパク質由来の物質がメラノイジンに変質し、これが５炭糖をエタノールに変換可能な酵母の発酵機能を阻害することにあると推定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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