(57)【要約】【課題】藍生葉染めにおいて繰り返しの染色を可能とし、染色に要する時間を短縮させる事を可能とする藍染色法を提供することである。【解決手段】βグルコシダーゼを粒子に固定化した固定化酵素を用い、アンモニア蒸気および／または酸素を含む空気に接触させる事で染色を行う染色方法を見出した。本法は通常の環境下で行われ、染色に要する時間も数分以内に短縮され、酵素の繊維中への残留を防ぎ、繰り返しの染色も可能である、極めて効率的な染色方法を提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インジカン水溶液からなる染色液に染色する繊維物を浸漬させて藍染織する藍染織方法において、前記インジカン水溶液を酸性に調整する工程と、前記インジカン水溶液に粗酵素標品から精製した酵素を添加する工程と、前記酵素が添加された前記インジカン水溶液に染色する繊維物を浸漬させる工程と、前記繊維物をアンモニア雰囲気中及び／または空気中に放置する工程とを有する藍染織方法。
【請求項２】
前記酵素は、固定化されたβ-グルコシダーゼを用いる請求項１に記載の藍染織方法。
【請求項３】
前記インジカン水溶液にβ−グルコシダーゼからなる酵素を添加する工程において、窒素ガスを反応液中に通気することを特徴とする。請求項１または請求項２のいずれか１項に記載された藍染織方法
【請求項４】
前記アンモニア雰囲気中のアンモニア濃度を調整することにより染色の程度を調整する請求項１〜３のいずれか１項に記載の藍染織方法。
【請求項５】
前記空気中に室温で放置することで、赤紫色に染色することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の藍染織方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載された藍染織方法によって藍染織された藍染織物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藍生葉染めによる藍染織方法及び藍染織物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、藍染織法としては、藍発酵建てによる染織方法と、化学合成インジゴを用いて行う染織方法と、藍生葉染めによる染織方法が一般的に知られている。
【０００３】
藍発酵建てによる染織方法では、伝統的な染織方法であって、蓼藍という蓼科の植物の葉を乾燥させた後、１００日程度発酵させることによりスクモと呼ばれる堆肥状の粗染料を調製する。このスクモ中には青色色素インジゴが含まれているが、インジゴは水不溶性のために、この状態では染色に用いることはできない。そこで、このスクモに小麦ふすまやアルカリ性の灰汁を加えて１週間程度発酵させることにより、インジゴを水溶性のロイコインジゴに変換させている。得られた水溶性の染色液に染色する繊維物を浸漬させ、染色液から引き上げた後、空気に触れさせることにより、ロイコインジゴは再びインジゴに変換され、その結果、繊維物（枷、布や綿、織物、編み物など）を青色に染色することができる。
【０００４】
また、化学合成インジゴを用いた染織方法は、インジゴを化学合成し、この合成されたインジゴを含有した染色液に染色する繊維物を浸漬させ、インジゴの還元反応を生じさせて染色を行っており、インジゴを化学合成や還元反応の際にハイドロサルファイト(Na2S2O4)や消石灰などの化学薬品が必要となっていた。
【０００５】
一方、藍生葉染めによる染織方法は、蓼藍の葉からインジカンを抽出してインジカン水溶液を調製し、この溶液中に酵素β−グルコシダーゼが含まれている蓼藍の生葉を加えて、染色液中にインドキシルを生じさせる。その後、この溶液中に染色する繊維物を浸漬させることにより、このインドキシルを繊維物に定着させている。そして、繊維物を染色液から引き上げて空気に触れさせることにより、空気中の酸素によってインドキシルを酸化させてインジゴに変換し、青色に染色している（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００６】
この藍生葉染めによる染織方法は、藍発酵建てによる染織方法よりも短期間で染色でき、また、化学合成インジゴを用いた染織方法のように多量の化学薬品を必要としないことから、中小規模の藍染織によく用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】川崎充代、牛田智  「いつでもできる藍の生葉染め−藍の生葉の保存と染色方法」染織と生活社  月刊 染色α  No246,p.69-72(2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、藍生葉染めによる染織方法では、調製したβ−グルコシダーゼは使い捨てにしなければならず、毎回、β−グルコシダーゼが含まれる蓼藍の生葉を必要とするので、作業効率が悪いという問題があった。また、得られる酵素量が一定しないために、染色の程度が、毎回、変動するという問題もあった。さらに、蓼藍の生葉中に含まれるβ−グルコシダーゼの含量は、一般的に微量であるために、藍色の程度を高めることは困難であるという問題もあった。
【０００９】
さらに、染色液中に直接、β−グルコシダーゼを加えてインドキシルを生じさせているため、染色液中でインジゴに変化してしまうインドキシルの量が多く、染色効率が悪いという問題もあった。さらに、溶液中に存在するβ-グルコシダーゼの作用によりセルロース系の繊維が損傷・変質するおそれもあった。
【００１０】
本発明者らはこのような現状に鑑み、藍生葉染めによる染織方法においてより高効率な染織を可能とすべく研究を行って、本発明を成すに至ったものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の藍染織方法では、インジカン水溶液からなる染色液に染色する繊維物を浸漬させて藍染織する藍染織方法において、インジカン水溶液を酸性に調整する工程と、インジカン水溶液に粗酵素標品から精製した酵素を添加する工程と、酵素が添加されたインジカン水溶液に染色する繊維物を浸漬させる工程と、繊維物をアンモニア雰囲気中に放置する工程とを有することとした。この際、使用するβ-グルコシダーゼは、例えば、糸状菌Aspergillus niger由来の酵素のように、pH2.5〜4のような酸性pH条件下で、十分に高い活性と安定性を有する酵素を使用することが必要である。
また、酵素としては、必ずしも精製酵素を使用する必要はなく、染色に影響を及ぼす夾雑物質を含まず、十分に高い活性を有していれば、部分精製酵素を用いてもよい。
【００１２】
さらには、酵素を、たとえば、グルタルアルデヒドを用いて、アミノ基を有する多孔性あるいは非多孔性担体に共有結合法で固定化する、もしくはイオン結合法でイオン交換ゲルやイオン交換樹脂に吸着させるなどの方法を含む、物理吸着法、イオン結合法、共有結合法などを含む担体結合法、包括法、架橋法もしくはこれらの方法を併用した方法を用いて固定化することにも特徴を有し、このような固定化酵素で処理して得られるインドキシル溶液中に繊維物を浸漬させた後に、雰囲気内のアンモニア及び酸素の濃度および／または流量を調節することで、染色の程度を調整することにも特徴を有するものである。また、固定化酵素を利用することにより、β-グルコシダーゼによる繊維の損傷・変質する可能性を除外することが可能となる。
【００１３】
また、本発明の藍染織物は、上記の藍染織方法によって藍染織された藍染織物である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の藍染織方法及び藍染織物では、インジカン水溶液を酸性に調整する工程と、インジカン水溶液に粗酵素標品から精製したβ−グルコシダーゼからなる酵素を添加する工程と、酵素が添加されたインジカン水溶液に染色する繊維物を浸漬させる工程と、繊維物をアンモニア雰囲気中に放置する工程とによって藍染織を行うことにより、粗酵素標品から精製したβ−グルコシダーゼを用いて藍染織できるので、極めて短時間で藍染織でき、作業効率を向上させることができる。
【００１５】
しかも、β−グルコシダーゼからなる酵素を添加したインジカン水溶液に染色する繊維物を浸漬させることにより、インジカンを高効率でインドキシルとし、染色効率を向上させることができる。
【００１６】
さらに、酵素を、グルタルアルデヒドを用いて、アミノ基を有する多孔性あるいは非多孔性担体に共有結合法で固定化する、もしくはイオン結合法でイオン交換ゲルやイオン交換樹脂に吸着させるなどの方法を含む担体結合法、包括法、架橋法もしくはこれらの方法を併用した方法を用いて調製した固定化β−グルコシダーゼを用いることにより、インジカン水溶液からのインドキシルの調製において、酵素の使い回し・繰り返し使用あるいは、固定化酵素が充填されたカラム型反応器や固定化酵素を懸濁した撹拌槽型反応器を用いることにより連続的にインドキシルの調製をも可能にせしめ、酵素の利用効率を著しく向上させることができる。
【００１７】
また、本発明は、また、本発明は、pH2.5〜4のような酸性pH条件下で反応を行うことを特徴とするが、好ましくは窒素ガスを反応液中に通気しながら反応を行うことにより、繰り返しの反応や連続反応を行った場合に、高い活性を維持することが可能である。なお、窒素ガスの代わりに、ヘリウムやアルゴンガスなど不活性な気体を用いてもよいことは、当然である。
【００１８】
しかも、上記段落番号００１６で得られた反応液に、アンモニア蒸気処理を行わないで、少なくとも１−３日間、室温あるいは、より高い温度で空気中に放置することで、繊維物を赤紫色に染色させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】陰イオン交換クロマトグラフィーにおける各画文のSDS-PAGEの結果。
【図２】各種繊維の染色の結果。
【図３】固定化β-グルコシダーゼ活性のpH依存性。
【図４】固定化β-グルコシダーゼ活性の温度安定性(pH=3)。
【図５】固定化β-グルコシダーゼを用いた10mMインジカン水溶液(pH3.0)の繰り返し反応反応液中のグルコース濃度を定量した。反応１回目、３回目及び６回目の反応液を染色に使用した。
【図６】固定化β-グルコシダーゼにより調整されたインドキシル水溶液に浸漬された布を、アンモニア蒸気を利用して染色する方法のスキーム。
【図７】繰り返し反応１回目（Ａ）、３回目（Ｂ）および７回目の酵素反応液を用いた、絹の染色（アンモニア蒸気処理）、およびアンモニア処理をしない絹の染色の結果（Ｄ）。
【図８】固定化酵素を充填したカラム型バイオリアクターによる連続反応（３０℃）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の藍染織方法及び藍染織物では、インジカン水溶液を酸性に調整する工程と、インジカン水溶液に粗酵素標品から精製したβ−グルコシダーゼからなる酵素を添加する工程と、酵素が添加されたインジカン水溶液に染色する繊維物を浸漬させる工程と、浸漬された繊維物をアンモニア蒸気雰囲気中に放置する工程とによって藍染織を行うものである。
【００２１】
すなわち、蓼藍の葉に含まれている酵素のβ−グルコシダーゼでなく、粗酵素標品から精製したβ−グルコシダーゼを用いることにより、効率よくインドキシルを得ることができ、染色効率を著しく向上させることができる。しかも、pH2.5〜4のような酸性pH条件下で反応を行うことにより、反応液中で生成したインドキシルからインジゴへの変換を抑制することを可能とする。
【００２２】
また、粗酵素標品からβ−グルコシダーゼを精製することにより、β−グルコシダーゼを手軽に入手でき、作業効率を向上させることができる。
【００２３】
しかも、β−グルコシダーゼを、グルタルアルデヒドを用いて、アミノ基を有する多孔性あるいは非多孔性担体に共有結合法で固定化する、もしくはイオン結合法でイオン交換ゲルやイオン交換樹脂に吸着させる方法など物理吸着法、イオン結合法、共有結合法などを含む担体結合法、包括法、架橋法もしくはこれらの方法を併用した方法を用いた固定化β−グルコシダーゼを用いることにより、インジカン水溶液からのインドキシルの調製において、酵素の使い回し・繰り返し使用あるいは、固定化酵素が充填されたカラム型反応器や固定化酵素を懸濁した撹拌槽型反応器を用いることにより連続的にインドキシルを調製することも可能となって、酵素の利用効率を、著しき向上させることができる。
【００２４】
さらに、インジカン水溶液に染色する繊維物を浸漬させる前にインジカン水溶液にβ−グルコシダーゼを添加しておくことにより、インジカンを高効率でインドキシルとし、染色効率を向上させることができるとともに、極めて短時間で藍染織可能とすることができる。
【００２５】
以下において、実施例を示しながら本発明を詳説する。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例によって本発明を説明するが、この実施例に限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１）
本手法は、まず、糸状菌Aspergillus oryzae由来の粗酵素標品（Novozym188, NOVO NordiskA/S社製）から酵素β−グルコシダーゼを精製した。そうして得られた精製酵素を用いて、１）Biodyne A（表面がアミノ基とカルボキシル基で修飾されているナイロンシート；日本ポール製）、２）麻１００％、３）綿１００％（ガーゼ）、４）綿１００％（ブロード）、５）レーヨン５０％／テンセル５０％、６）レーヨン５０％、７）絹の７種の布への染色を試みた。
【００２８】
本発明で用いる精製酵素をえるための精製手順は、たとえば、下記の実施例で記載するように、粗酵素標品（溶液）に硫安を加え、溶液の飽和度が４０％になるまで添加し放置することにより、本発明の酵素を含む沈殿物が得られる。この沈殿物を10mM MES緩衝液pH6.0に溶解させ、DEAE Sephadex陰イオン交換クロマトグラフィー(pH6.0, 0-0.4M NaCl勾配溶出)にかけ、その後、phenyl Sepharose疎水性クロマトグラフィー(pH6.0, 0.4M 0M NaCl勾配溶出)にかけ、さらに、DEAE Sephadex陰イオン交換クロマトグラフィー(pH7.0, 0-0.4M NaCL勾配溶出)にかけることで、得ることができる。図１に各画文のSDS-PAGEの結果を示す。
【００２９】
まず１０ｍＭのインジカン水溶液（ｐH３．０）中に終濃度２０Ｕ／ｍLの精製酵素を添加し、３７℃で２５分間反応させた後。その後、前述の布の断片を３分間、浸漬した。その後、底に２５％アンモニア溶液を入れた蓋付きガラス製の容器中（ＴＬＣ展開槽）上部に布を吊るす。吊るされた布は、アンモニア蒸気と接触することにより、数分以内に青く染色される。
【００３０】
図２は、未染色の場合、２５％アンモニア溶液を入れた蓋付きガラス容器にて揮発したアンモニア蒸気接触させた場合、５％アンモニア水を入れた蓋付きガラス容器にて揮発したアンモニア蒸気接触させた場合、及びアンモニア蒸気処理を行わない場合における染色結果である。なお、図２においてアンモニア蒸気処理を行わない場合の結果は、風乾後、約２日間経過後の写真である。
【００３１】
（実施例２）
精製酵素溶液を20mM MES-NaOH緩衝液（pH6.0）に対して透析後に、終濃度0.7mg/mL程度に調整する。一方、固定化担体の多孔性粒子である各種キトパール（Fujibo社製）200 mg（湿潤重量）を、20mM MES-NaOH緩衝液（pH6.0）で洗浄後に、終濃度２．５％のグルタルアルデヒド水溶液2 ml中、４℃で３時間処理した。その後、このグルタルアルデヒドで処理したキトパールを再び20mM MES-NaOH（pH6.0）の緩衝液で十分に洗浄した後に、前述の酵素溶液を加え、４℃で一晩、緩やかに振盪した。このようにして調製した固定化酵素粒子を、反応に使用する20 mM酢酸ナトリウムーHCl緩衝液（pH3.0）で洗浄した。なお、キトパールとしては、BCW-3001、BCW-3003、BCW-3010、BCW-3501、BCW-3503、BCW-3510を使用した。
【００３２】
このようにして調製した固定化酵素の比活性は、担体がBCW-3001、BCW-3003、BCW-3010、BCW-3501、BCW-3503、BCW-3510に対して、それぞれおおよそ53、42、22、56、38、18 U/mgであった。ここで、酵素活性1 Uは、5 mMインジカンを基質とした場合に、pH3.0,３０℃の条件で１分間にグルコース1 μmolを生成する酵素量と定義した。また、キトパールBCW-3001に固定化された酵素の、反応の至適pHは、図３に示すように３〜４程度であり、pH３における温度安定性は、図４に示すように１時間のインキュベーションでは５０〜6６０℃程度まで安定であり、高温度領域では遊離酵素よりも安定性は高かった。
【００３３】
次に、5 mlの20 mM酢酸ナトリウムーHCl緩衝液 (pH3.0)中に溶解した10 mMインジカン水溶液中に、100 mgの固定化酵素（担体；BCW-3010）を、窒素ガスを反応液中に通気しながら、懸濁し３０℃で反応を行ったところ、約２０分でインジカンが、ほぼ１００％加水分解された。図５の縦軸には、インジカンが酵素により加水分解された際に、インドキシルと等モル生成するグルコース濃度を示した。そこで、２０分の回分反応を６回繰り返して反応を行ったところ、図５に示すように６回目の反応においても活性の低下は殆ど認められなかった。
【００３４】
１回目、３回目及び６回目の反応により得られた反応液に絹布を、３分間浸漬した後に、液を十分に絞り出し、その後、床に２５％アンモニア溶液を入れた容器中により布を染色した。図６に染色法のスキームを示す。その後、実施例１と同様に、底に２５％アンモニア溶液を入れた蓋付きガラス製の容器中（ＴＬＣ展開槽）上部に布を吊るす。吊るされた布は、アンモニア蒸気と接触することにより、数分以内に青く染色された。
また、図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）に示すように、肉眼で見る限り、１回目、３回目及び６回目の反応液で染色されたガーゼの染色の程度には差が認められなかった。
【００３５】
一方、窒素ガスを通気しない場合、上記段落番号００３２に示した方法と同様な繰り返し反応を行ったところ、６回目反応での固定化酵素の活性は、初期の活性の６０％程度に低下した。これは、窒素を通気しない場合には，反応液中の溶存酸素により反応により生じたインドキシルが水不溶性のインジゴに変換され、生成したインジゴが多孔性担体内に蓄積したためであると考えられた。
【００３６】
上記段落番号００３１で示した、６回目の反応液の一部に絹布を３分間浸し、アンモニア蒸気処理を行わないで、室温あるいは４０℃に１〜２日間程度放置することにより、図７（Ｄ）に示すように絹布を赤紫色に染色することができた。
【００３７】
上記段落番号００２９で調製した固定化β-グルコシダーゼをカラムに充填し、連続反応を行った。担体としてBCW-3010に固定化した酵素130 mgを内径約8 mmのプラスチック製のカラムに充填した。ガラス容器の中に、20 mM酢酸ナトリウムーHCl緩衝液 (pH3.0)に溶解した10 mMインジカン溶液を満たし、予め、窒素ガスで十分に脱気した。その後、このガラス容器から、インジカン水溶液を、ペリスターポンプを用いて、流量0.2 ml/minで、固定化酵素が充填されているカラムに供給し、出口から排出される反応液中のグルコース濃度を定量した。その結果を図８に示す。図８から、少なくとも２５時間にわたり、固定化酵素は安定であり、10 mMインジカン溶液は、ほぼ１００％加水分解されていることがわかった。なお、連続反応中、反応液の温度は３０℃にコントールし、また、ガラス容器中のインジカン水溶液に、窒素ガスを30〜150 ml/min程度の流量で供給し続けた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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