(57)【要約】【課題】測定溶液の微量化をしても十分な精度で血中成分を測定することができる参照電極，電位測定系及び電位差測定方法を提供する【解決手段】イオン選択電極，場合によっては陽イオンに対するイオン選択電極もしくは試料中に含まれる量が少ないイオンに対するイオン選択電極を参照電極として用いて，測定溶液に接触した参照電極と測定電極の電位差を計測する。所望の精度を得るために，前記測定溶液中のイオン濃度を規定する。【選択図】図１
2011149878.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物を含む測定溶液が導入される容器又は部位と，
前記測定溶液に接触する測定電極と，
前記測定溶液に接触する参照電極と，
前記測定電極と前記参照電極との間の電位差を測定する電位差計とを備え，
前記参照電極はイオン選択電極であることを特徴とする電位差計測装置。
【請求項２】
前記イオン選択電極は陽イオンに対するイオン選択電極であることを特徴とする請求項１に記載の電位差計測装置。
【請求項３】
前記イオン選択電極はリチウム，カリウム，ナトリウム，マグネシウム，カルシウムもしくはアンモニアに対するイオン選択電極であることを特徴とする請求項１に記載の電位差計測装置。
【請求項４】
前記測定溶液は試料と試薬の混合物であることを特徴とする請求項１に記載の電位差計測装置。
【請求項５】
前記測定溶液中のイオンのうち，
前記イオン選択電極の測定対象のイオンの中で前記試薬由来のイオンの濃度ｃr及び  前記イオン選択電極の妨害イオンｊの中で前記試薬由来のイオンの濃度ｃr,jが，
想定される前記試料中のイオンの最小濃度を，前記イオン選択電極の測定対象のイオンはｃs,min，前記イオン選択電極の妨害イオンｊはｃs,j,minとし，
想定される前記試料中のイオンの最大濃度を，前記イオン選択電極の測定対象のイオンはｃr,max，前記イオン選択電極の妨害イオンｊはｃr,j,maxとし，
前記試料の希釈率をｄとし，
気体定数をＲ，前記測定溶液の絶対温度をＴ，前記イオン選択電極の測定対象のイオンの価数をｚ，ファラデー定数をＦ，前記イオン選択電極の妨害イオンｊの選択係数をＫj，前記イオン選択電極の妨害イオンｊの価数をｚjとしたときに，
【数１】
2011149878.tif 000008
を満たし，かつ，ｃr及びｃr,jが水への溶解度を上まらないことを特徴とする請求項４に記載の電位差計測装置。
【請求項６】
前記試薬は有機物と反応する化学物質もしくは酵素を含むことを特徴とする請求項４に記載の電位差計測装置。
【請求項７】
前記試料は生体物質であることを特徴とする請求項４に記載の電位差計測装置。
【請求項８】
前記試料は全血，血清，血漿，尿，もしくは体液であることを特徴とする請求項４に記載の電位差計測装置。
【請求項９】
前記測定電極により有機物質を測定することを特徴とする請求項１に記載の電位差計測装置。
【請求項１０】
前記測定電極により酸化還元物質を測定することを特徴とする請求項１に記載の電位差計測装置。
【請求項１１】
測定対象物を含む測定溶液を容器又は部位に導入し，
前記測定溶液に測定電極と参照電極を接触させ，
前記測定電極と前記参照電極との間の電位差を電位差計を用いて測定する電位差計測方法において，
前記参照電極はイオン選択電極であることを特徴とする電位差計測方法。
【請求項１２】
前記イオン選択電極は陽イオンに対するイオン選択電極であることを特徴とする請求項１１に記載の電位差計測方法。
【請求項１３】
前記イオン選択電極はリチウム，カリウム，ナトリウム，マグネシウム，カルシウムもしくはアンモニアに対するイオン選択電極であることを特徴とする請求項１１に記載の電位差計測方法。
【請求項１４】
試料と試薬を混合させることで前記測定溶液を調製することを特徴とする請求項１１に記載の電位差計測方法。
【請求項１５】
前記測定溶液中のイオンのうち，
前記イオン選択電極の測定対象のイオンの中で前記試薬由来のイオンの濃度ｃr及び  前記イオン選択電極の妨害イオンｊの中で前記試薬由来のイオンの濃度ｃr,jが，
想定される前記試料中のイオンの最小濃度を，前記イオン選択電極の測定対象のイオンはｃs,min，前記イオン選択電極の妨害イオンｊはｃs,j,minとし，
想定される前記試料中のイオンの最大濃度を，前記イオン選択電極の測定対象のイオンはｃr,max，前記イオン選択電極の妨害イオンｊはｃr,j,maxとし，
前記試料の希釈率をｄとし，
気体定数をＲ，前記測定溶液の絶対温度をＴ，前記イオン選択電極の測定対象のイオンの価数をｚ，ファラデー定数をＦ，前記イオン選択電極の妨害イオンｊの選択係数をＫj，前記イオン選択電極の妨害イオンｊの価数をｚjとしたときに，
【数２】
2011149878.tif 000009
を満たし，かつ，ｃr及びｃr,jが水への溶解度を上まらないことを特徴とする請求項１４に記載の電位差計測方法。
【請求項１６】
前記試薬は有機物と反応する化学物質もしくは酵素を含むことを特徴とする請求項１５に記載の電位差計測方法。
【請求項１７】
前記試料は生体物質であることを特徴とする請求項１５に記載の電位差計測方法。
【請求項１８】
前記試料は全血，血清，血漿，尿，もしくは体液であることを特徴とする請求項１５に記載の電位差計測方法。
【請求項１９】
前記測定電極により有機物質を測定することを特徴とする請求項１１に記載の電位差計測方法。
【請求項２０】
前記測定電極により酸化還元物質を測定することを特徴とする請求項１１に記載の電位差計測方法。
【請求項２１】
前記測定溶液は前記測定電極と接触する部位と前記参照電極と接触する部位で概ね同一の組成であることを特徴とする請求項１１に記載の電位差計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，電気的な計測を行い，生体物質を高精度に測定することのできる測定装置，及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液検査は，健康状態の把握と病気の早期発見を目的として広く普及している。血液検査では，要求精度，迅速性，コストなどに応じて，大型の生化学自動分析装置を用いる場合や，小型のポイント・オブ・ケア・テスティング（ＰＯＣＴ）向け装置を用いる場合がある。大型の生化学自動分析装置は総合病院や検査センターに導入されていて，単位時間当たりの検体処理能力が高く測定精度も比較的高く，ランニングコストも比較的低いため，健康診断などの定期的な検査に適している。しかし，検体をパイプライン処理するため検体を装置にセットしてから結果が出るまでにはそれなりの時間がかかり，また，検体の運搬や検査待機の時間や，検査結果集計・送付に要する時間を考慮すると，検体の採取から結果が出るまでには通常数日を要する。一方，ＰＯＣＴ向け装置は，現状では測定精度は大型の生化学自動分析装置には及ばないものの，検体を採取したその場ですぐに検査結果が得られる迅速性を有しているため，術中検査などの緊急検査，外来患者に対する検査，救急車内での検査，診療所での検査，自己血糖測定などの在宅での自己検査に適している。
【０００３】
検査にいずれの装置を用いた場合でも，より少ない液量で測定できると様々な利点が生じる。検体の微量化により検査をより低侵襲にでき，試薬の微量化により検査コストを低減でき，廃液量の低減により環境負荷を低減できる。どれほどの測定液量の微量化が可能であるかは，測定方式に依存する面が大きい。現在検査装置に用いられている測定方式には，大きく分けて，吸光光度法（呈色反応を含む），電流計測法，電位差計測法がある。吸光光度法は，試薬と試料（検体）の反応により生じる吸光度の変化から検体中の測定対象物濃度を求める方法である。得られる信号の大きさは光路長と光照射面積に依るため，一般に測定液量の微量化により感度が低下する。電流計測法は，試薬と試料の反応の生成物を電極で反応させて電流値として測定し，測定対象物濃度を求める電気化学的測定法である。電流値は電極の面積に依存するため，単純なスケールダウンでは測定液量の微量化により感度が低下する。例えば，血糖値を測定するグルコースセンサでは，必要とされる測定感度はそれほど高くないため，数滴の血液量で測定可能である（例えば特許文献１）が，一般的な測定項目を有するＰＯＣＴ向け検査装置では，測定感度を維持するためにより多くの血液量が必要である。ＰＯＣＴ向け検査装置として開発されたi-Stat（非特許文献１）は，６５μｌ程度の血液量を必要としていた。
【０００４】
電位差計測法はこれらの測定方法とは異なり，信号が電極面積に依存しない電気化学的測定法である。電位差計測法は，金や白金などでできた測定電極（作用電極）と参照電極で構成され，測定溶液中に酵素と酸化還元物質が存在する（特許文献２）。また，測定電極と参照電極は，電圧計などの電圧を測定する装置に接続されている。測定溶液中に測定対象物質が添加されると，酵素反応により測定対象物質が酸化され，同時に酸化状態の酸化還元物質が還元される。その際に生じる測定電極の表面電位は，次のネルンストの式に従う。
【０００５】
【数１】
2011149878.tif 000003
【０００６】
上式には電極の面積が含まれず，表面電位は電極面積に依存しない。そのため，信号強度を減少させずに電極面積を小さくし，必要な検体の量を低減することができる。
【０００７】
電流計測法と電位差計測法の違いは，信号の電極面積への依存性だけでなく，信号が酵素反応の反応速度依存か反応量依存かの違いもある。すなわち，電流計測法では酵素反応の反応速度に比例した信号が得られるのに対し，電位差計測法では酵素反応により生成した還元物質（もしくは酸化物質）の量に依存した信号が得られる。そのため，電流計測法では酵素反応の反応速度を測定するレート法しか用いることができないが，電位差計測法ではレート法に加えて反応産物総量を測定するエンドポイント法を用いることができる。酵素はその特性として基質が低濃度の領域では反応速度は基質濃度に比例するが，基質が高濃度になると反応速度が基質濃度に比例しなくなり，更に高濃度になると一定となる。この境界の濃度をミカエリス定数と言うが，血中の測定対象物質濃度がミカエリス定数以上の場合，レート法による測定では試料を希釈して測定しなくてはならず，測定に必要な操作が複雑となる。一方，エンドポイント法では反応産物総量を測定するためこのような制約はなく，無希釈での測定が可能である。このような酵素の一つにコレステロール脱水素酵素があり，電位差計測法は原理的にコレステロールを無希釈で測定できる方法と言える。
【０００８】
電気化学の原理を用いた計測には，一般的に参照電極という溶液中での電位の基準となる電極を用いる。酸化還元電流法においても電位差計測法においても参照電極は必要であるが，酸化還元電流法が電流を測定するのに対して電位差計測法では電位を測定する方法であるため，特に参照電極に高い精度が求められる。参照電極として良く用いられるものの一つに内部液型銀塩化銀参照電極があり，ガラスなどの容器に一定濃度（飽和や３Ｍのものが良く用いられる）の塩化カリウムや塩化ナトリウム溶液と銀塩化銀電極が入っていて，多孔質ガラスやセラミックスの液絡部を介して測定したい溶液と電気的に結合されているものが一般的である。特定の条件下では，銀塩化銀電極単体を疑似参照電極として用いること（特許文献２）や，塩素イオン選択電極を参照電極として用いること（特許文献３）もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平２−２４５６５０号公報
【特許文献２】特表平９−５００７２７号公報
【特許文献３】特開２００６−９０７８５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Clin. Chem. 39/2 (1993) 283-287
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のような優位性を持つ電位差計測法を用いて，微量溶液で高精度に測定可能な酵素センサの研究開発を行ったところ，従来の参照電極を用いた場合，十分な精度が得られない場合があることが明らかとなった。
【００１２】
内部液型銀塩化銀参照電極を用いた場合，内部液の漏出が主原因となり，測定電極の電位が変動してしまう。これを防ぐには，測定溶液の微量化とともに参照電極，特に液絡部を測定溶液の微小化と同じスケールで微小化することが考えられる。しかしながら，単純に液絡部を微小化すると液絡部のつまりが生じやすくなり，やはり測定の精度が低下してしまう。また，内部液の漏出は液絡部と参照電極容器の接合部からも生じているため，液絡部の単純な微小化では防ぐことができない。
【００１３】
内部液を有さない銀塩化銀電極などの疑似参照電極を用いることで，内部液の漏出による測定電位変動を防ぐことができる。しかし，その場合，参照電極電位の精度が低下し，測定の精度が低下する新たな問題が生じる。さらに，参照電極と測定溶液が直接接触するため，試料中に含まれる妨害物質の影響を受け，参照電極電位の精度が低下する。妨害物質としては，臭素，チオシアン酸が代表的である。
【００１４】
参照電極として，特許文献３のように単純に塩素イオン選択電極を用いたとしても，疑似参照電極で生じた課題を解決することは難しい。というのも，特許文献３では，塩素イオン選択電極は内部液に接触しているため，試料を含む測定溶液と接触する際にどのようにして一定の電位を生じさせるか不明である。また，妨害物質に対する考慮がされておらず，妨害物質の影響を取り除き，どれだけの精度が得られるようになるかも不明である。
【００１５】
本発明では，測定溶液を微量化しても十分な精度で血中成分を測定することができる参照電極，電位測定系及び電位測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明では，参照電極として，イオン選択電極を用いた。その際，イオン選択電極の選択係数を考慮し，陽イオンに対するイオン選択電極を参照電極として用いた。所望の精度を得るために，測定溶液中のイオン濃度を規定した。その際，試料中に含まれる量が少ないイオンに対するイオン選択電極を参照電極として用いた。一例では，グルコース，コレステロールなどの有機物に対するセンサを測定電極とし，無機イオンに対するセンサを参照電極とした。他の例では，酸化還元物質に対するセンサを測定電極とし，無機イオンに対するセンサを参照電極とした。
【００１７】
参照電極に用いるイオン選択電極の選択係数を考慮することで，妨害物質に対する応答を抑制でき，十分な測定精度が得られるようになる。その際，妨害物質の多くが陰イオンであることから，参照電極に用いるイオン選択電極を陽イオンに対するイオン選択電極とすることで，妨害物質に対する応答を抑制できる。測定溶液中のイオン濃度を規定することで，試料中の妨害物質やイオン濃度の変動に対する測定電位の変動を抑制できる。試料中に含まれる量が少ないイオンに対するイオン選択電極を参照電極として用いることで，試薬中のイオン濃度が支配的になるようにでき，試料中のイオン濃度の変動に対する測定電位の変動を抑制できる。グルコース，コレステロールなどの有機物に対するセンサを測定電極とし，無機イオンに対するセンサを参照電極とすることで，測定溶液中の無機物濃度をある程度任意に設定することができ，測定電極電位の精度を維持したまま参照電極電位を安定化し，十分な測定精度が得られるようになる。酸化還元物質に対するセンサを測定電極とし，無機イオンに対するセンサを参照電極とすることで，測定溶液中の無機物濃度をある程度任意に設定することができ，測定電極電位の精度を維持したまま参照電極電位を安定化し，十分な測定精度が得られるようになる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると，参照電極としてイオン選択電極を用いることで，従来の内部液型参照電極で問題となった内部液の漏出が抑制でき，測定溶液を微量化しても十分な測定精度が得られるようになる。従来の内部液型参照電極では，液絡部を通じた内部液と測定溶液間のイオンの移動により，内部液と測定溶液間の電位を一定に保っていた。そのため，内部液の漏出を無くすとイオンの移動ができなくなるため，原理的に内部液の漏出を無くすことはできなかった。これに対し，イオン選択電極では，溶液とイオン選択膜の界面でのイオンの平衡により溶液とイオン選択膜の間の電位が定まるため，原理的にイオン選択膜内部をイオンが通り抜ける必要はない。そのため，精度を維持したまま内部液の漏出を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明による電位差測定装置の一例を示す図。
【図２】本発明による電位差測定装置の一例を示す図。
【図３】本発明による血中成分測定装置の一例を示す図。
【図４Ａ】本発明による血中成分測定装置の一例を示す側面模式図。
【図４Ｂ】本発明による血中成分測定装置の一例を示す平面模式図。
【図５】本発明による電位差測定装置の一例を示す図。
【図６】電位差測定装置の回路の一例を示す図。
【図７】従来の内部液型銀塩化銀参照電極と本発明のイオン選択電極の安定性の比較結果を示す図。
【図８】従来の内部液型銀塩化銀参照電極と本発明のイオン選択電極の安定性の溶液量依存性を示す図。
【図９】イオン選択電極の構成例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下，図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００２１】
図１は，本発明による電位差測定装置の一例を示す図である。本装置は，イオン選択電極１０１，測定電極１０２，電圧計１０３，容器１０４，測定溶液１０５を有し，イオン選択電極１０１と測定電極１０２の端子は電圧計１０３に接続されていて，両端子間の電位差が測定できるようになっている。イオン選択電極１０１のイオン感応部と測定電極１０２の電極部は容器１０４内の測定溶液１０５に接触している。イオン選択電極１０１には，ナトリウム選択電極，カリウム選択電極，リチウム選択電極，マグネシウム選択電極，カルシウム選択電極，ルビジウム選択電極，セシウム選択電極，ストロンチウム選択電極，バリウム選択電極，塩素選択電極などを用いる。内部液を有していても有していなくても構わない。例えば，Pure Appl. Chem., 72, 1851-2082 Umezawa et. al., Pure Appl. Chem., 74, 923-994 Umezawa et. al.,に記載のリチウム，カリウム，ナトリウム，マグネシウム，カルシウムもしくはアンモニウムに対するイオン選択膜を用いたイオン選択電極を用いる。
【００２２】
イオン選択電極は，例えば，図９のように，容器９０１，イオン選択膜９０２，内部溶液９０３，銀塩化銀電極９０４，端子９０５からなる構成をしている。内部溶液９０３は，銀塩化銀電極９０４の電位を安定化させるための塩素イオンと，イオン選択膜９０２の電位を安定化させるためのイオン選択膜９０２の測定対象のイオンが含まれている。
【００２３】
測定電極１０２には，金，銀，白金といった貴金属を用いた電極や，カーボン電極，もしくは，それらの電極に酵素の修飾を施した電極を用いる。測定溶液１０５の組成は，イオン選択電極１０１に接触する部位と測定電極１０２に接触する部位で概ね同一とみなせる。
【００２４】
図２は，本発明による電位差測定装置の一例を示す図である。本装置は，基板２０１，イオン選択電極２０２，測定電極２０３，電圧計２０４と，測定溶液２０５の保持部を有している。イオン選択電極２０２と測定電極２０３は基板２０１の同一平面上に有り，それぞれの電極からの配線は電圧計２０４に接続されていて，両電極間の電位差が測定できるようになっている。イオン選択電極２０２のイオン感応部と測定電極２０３の電極部は基板２０１上に配置された測定溶液２０５に接触している。イオン選択電極２０２には，ナトリウム選択電極，カリウム選択電極，リチウム選択電極，マグネシウム選択電極，カルシウム選択電極，ルビジウム選択電極，セシウム選択電極，ストロンチウム選択電極，バリウム選択電極，塩素選択電極などを用いる。イオン選択電極２０２の構造は，金属の電極とイオン選択膜で内部液に相当するゲル化した溶液を挟み込むような形状であっても，いわゆるコーテットワイヤーと言われる金属の電極にイオン選択膜を張り付けたものであっても良い。例えば，Pure Appl. Chem., 72, 1851-2082 Umezawa et. al., Pure Appl. Chem., 74, 923-994 Umezawa et. al.,記載のイオン選択電極を用いる。測定電極１０２には，金，銀，白金といった貴金属を用いた電極や，カーボン電極，もしくは，それらの電極に酵素の修飾を施した電極を用いる。測定溶液２０５の組成は，イオン選択電極２０２に接触する部位と測定電極２０３に接触する部位で概ね同一とみなせる。
【００２５】
図３は，本発明による血中成分測定装置の一例を示す図である。本装置は，測定部３０１，制御部３０２から成り，測定部３０１はイオン選択電極３１１，測定電極３１２，電圧計３１３，測定溶液用容器３１４，測定溶液３１５，試料用分注器３１６，試料用容器３１７，試料液３１８，試薬用分注器３１９，試薬用容器３２０，試薬液３２１から成る。イオン選択電極３１１，測定電極３１２には図１で示したものを用いる。試料液３１８はヒトやその他生物の全血，血清，血漿，尿，体液を用いる。試薬液３２１は試料液３１８に適合しグルコース，コレステロールなどの測定項目に応じたものを用いる。測定前は測定溶液用容器３１４は空であり，試料用分注器３１６，試薬用分注器３１９によってそれぞれ試料液３１８，試薬液３２１を測定溶液用容器３１４中に分注し，良く混ぜ合わせて測定溶液３１５とした後に，イオン選択電極３１１，測定電極３１２を測定溶液３１５に接触させる。イオン選択電極３１１と測定電極３１２の間の電位を電圧計３１３で測定し，測定値とする。
【００２６】
図４Ａ及び図４Ｂは，本発明による血中成分測定装置の一例を示す図であり，図４Ａは側面模式図，図４Ｂは平面模式図である。本装置は，基板４０１，イオン選択電極４０２，測定電極４０３，電圧計４０４，測定溶液保持部としての濾紙４０５を有している。イオン選択電極４０２と測定電極４０３は基板４０１の同一平面上に有り，それぞれの電極からの配線は電圧計４０４に接続されていて，両電極間の電位差が測定できるようになっている。イオン選択電極４０２，測定電極４０３には図２で示したものを用いる。濾紙４０５は試薬を含んでいて，乾燥していても湿潤していてもよい。規定量の試料液が濾紙４０５に添加されると，試料液は濾紙４０５中の試薬を溶解もしくは混合し，反応，測定溶液となる。試料液はヒトやその他生物の全血，血清，血漿，尿，体液を用いる。濾紙４０５中の試薬にはグルコース，コレステロールなどの測定項目に応じたものを用いる。測定溶液はイオン選択電極４０２，測定電極４０３に接触し，イオン選択電極４０２と測定電極４０３の間の電位を電圧計４０４で測定し，測定値とする。
【００２７】
図５は，本発明による電位差測定装置の一例を示す図である。本装置は，基板５０１，イオン選択電極５０２，測定電極５０３，ＦＥＴ（Field-effect Transistor；電界効果トランジスタ）５０４，ソース電極５０５，ドレイン電極５０６，導電性配線５０７，５０８，端子５０９，測定溶液保持部に保持された測定溶液５１０を有している。イオン選択電極５０２と測定電極５０３は基板５０１の同一平面上に有る。導電性配線５０７，５０８は測定溶液５１０に直接触れないよう表面が絶縁処理されている。ＦＥＴ５０４により測定電極５０３の電位をソース電極５０５，ドレイン電極５０６間の電圧−電流特性として測定することができ，これによりイオン選択電極５０２と測定電極５０３間の電位差を測定することができる。イオン選択電極５０２のイオン感応部と測定電極５０３の電極部は基板５０１上に保持された測定溶液５１０に接触している。
【００２８】
イオン選択電極５０２には，ナトリウム選択電極，カリウム選択電極，リチウム選択電極，マグネシウム選択電極，カルシウム選択電極，ルビジウム選択電極，セシウム選択電極，ストロンチウム選択電極，バリウム選択電極，塩素選択電極などを用いる。イオン選択電極５０２の構造は，金属の電極とイオン選択膜で内部液に相当するゲル化した溶液を挟み込むような形状であっても，いわゆるコーテットワイヤーと言われる金属の電極にイオン選択膜を張り付けたものであっても良い。例えば，Pure Appl. Chem., 72, 1851-2082 Umezawa et. al., Pure Appl. Chem., 74, 923-994 Umezawa et. al.,に記載のイオン選択電極を用いる。測定電極５０３には，金，銀，白金といった貴金属を用いた電極や，カーボン電極，もしくは，それらの電極に酵素の修飾を施した電極を用いる。測定溶液５１０の組成は，イオン選択電極５０２に接触する部位と測定電極５０３に接触する部位で概ね同一とみなせる。
【００２９】
図６は，図５に示す電位差測定装置を用いた際の回路の一例を示す図である。基板６０１には，イオン選択電極に接続された端子６０２，ＦＥＴのソースに接続された端子６０３，ＦＥＴのドレインに接続された端子６０４がある。端子６０２と端子６０３はアースに接続され，端子６０３と端子６０４の間には一定の電圧が印加されている。その際の端子６０４の電流値を測定する。別途測定したＦＥＴの電圧−電流特性から，測定電極とイオン選択電極間の電位差を求めることができる。
【００３０】
図１から図６に記載の装置を用いて測定する際の測定溶液中のイオン濃度を次のように規定することで，測定精度を向上させることができる。イオン選択電極の電位Ｅは，次のニコルスキー−アイゼンマン式から，求まる。
【００３１】
【数２】
2011149878.tif 000004
【００３２】
測定溶液は試薬と試料の混合物であり，試薬中のイオン濃度が一定であっても，試料中のイオン濃度が変動すると，測定溶液中のイオン濃度は変動する。その結果，イオン選択電極の電位は変動し，測定精度の低下を招く。試料中のイオン濃度が全くの未知であれば，この変動を取り除くことは困難である。しかし，試料が全血もしくは血清，血漿，尿であることに着目すると，生命を維持するのに必要なイオン濃度範囲は限られてくるので，試料中のイオン濃度はある程度予測が可能である。すなわち，上式を用いてイオン選択電極の電位変動幅を見積もり，その変動幅が求める精度以下になるように試薬の組成や試薬と試料の混合比を工夫すればよい。
【００３３】
試薬由来の測定溶液中のイオン濃度をｃr及びｃr,j，試料中のイオン濃度の最小値をｃs,min及びｃs,j,min，試料中のイオン濃度の最大値をｃs,max及びｃs,j,max，試料の希釈率をｄ（例えば，９μｌの試薬と１μｌの試料を混合する時の希釈率は１０，乾燥状態の試薬と１０μｌの試料を混合する時の希釈率は１とする）とし，簡単のため活量係数を１とすると，イオン選択電極の取り得る電位の最小値（Ｅmin）と最大値（Ｅmax）は，ニコルスキー−アイゼンマン式から，
【００３４】
【数３】
2011149878.tif 000005
である。すなわち，イオン選択電極の電位変動幅(Ｅは，
【００３５】
【数４】
2011149878.tif 000006
から求まる。(Ｅが必要な精度以下に収まるように，試薬由来の測定溶液中のイオン濃度ｃr及びｃr,jを設定する。また，上式から分かるように，試薬由来の測定溶液中のイオン濃度を高くすれば試料由来のイオン濃度変動が相対的に小さくなり，(Ｅも小さくなる。そのため，試薬由来の測定溶液中のイオン濃度をなるべく大きくしたいが，溶解度や酵素に至適なイオン濃度範囲があるため，これらの濃度を超えないようにする。
【００３６】
試料中のイオン濃度の変動幅の一例を以下に示す。
【００３７】
【表１】
2011149878.tif 000007
【００３８】
イオン選択電極の電位を安定させる観点からは，試料中のイオン濃度の低いイオンに対するイオン選択電極を用いることが望ましい。なぜならば，(1)試料中のイオン濃度が低いイオンは変動幅が小さく，試薬中に一定量のイオンを含ませることでイオンの変動率を小さくできる（イオン選択電極の電位はイオン濃度の対数に比例）ため，(2)試薬中に含ませることのできるイオンには上限があるため，である。
【００３９】
Pure Appl. Chem., 72, 1851-2082 Umezawa et. al., Pure Appl. Chem., 74, 923-994 Umezawa et. al.にあるように，陽イオンのイオン選択電極は陰イオンのイオン選択電極に比べて選択性が良く，例えば塩素イオン電極の臭素やチオシアンに対する応答のように選択性を著しく低くするようなイオン種が少ない。そのため，参照電極として用いるイオン選択電極は陽イオンのイオン選択電極であることが望ましい。
【００４０】
一例として，血清中グルコースを測定したときの条件を以下に記す。
【００４１】
イオン選択電極：ナトリウム選択電極（選択係数（log）：Ｋ+，−２．４；Ｌｉ+，−３．０；ＮＨ4+，−４．２；Ｃａ2+，−３．８；Ｍｇ2+，−４．０）
測定電極：１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール修飾金電極
電圧計：入力インピーダンス１０ＧΩ以上
試薬１：
フェリシアン化カリウム（９．９ｍＭ）
フェロシアン化カリウム（０．１ｍＭ）
塩化ナトリウム（１３７ｍＭ）
塩化カリウム（３ｍＭ）
塩化マグネシウム（１０ｍＭ）
リン酸水素二ナトリウム（１０ｍＭ）
リン酸二水素カリウム（１．８ｍＭ）
アデノシン３リン酸（４ｍＭ）
ヘキソキナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）
グルコース６リン酸脱水素酵素（４０Ｕ／ｍｌ）
ジアホラーゼ（３．７５Ｕ／ｍｌ）
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（０．５ｍｇ／ｍｌ）
試薬２：
フェリシアン化カリウム（９．９ｍＭ）
フェロシアン化カリウム（０．１ｍＭ）
塩化カリウム（１４０ｍＭ）
塩化マグネシウム（１０ｍＭ）
リン酸水素二カリウム（１０ｍＭ）
リン酸二水素カリウム（１．８ｍＭ）
アデノシン３リン酸（４ｍＭ）
ヘキソキナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）
グルコース６リン酸脱水素酵素（４０Ｕ／ｍｌ）
ジアホラーゼ（３．７５Ｕ／ｍｌ）
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（０．５ｍｇ／ｍｌ）
試料：ヒト血清
試薬１，試薬２のどちらを用いた場合も，以下の反応式に従い，ヒト血清中のグルコース濃度に応じたフェロシアン化カリウムが生成する。
【００４２】
グルコース＋アデノシン３リン酸→グルコース６リン酸＋アデノシン２リン酸（ヘキソキナーゼにより触媒）
グルコース６リン酸＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）→グルコース１，５ラクトン６リン酸＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）（グルコース６リン酸脱水素酵素により触媒）
２フェリシアン化カリウム＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）→２フェロシアン化カリウム＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）（ジアホラーゼにより触媒）
【００４３】
フェリシアン化カリウムとフェロシアン化カリウムの量比は，ネルンストの式に従う測定電極とイオン選択電極の電位差として計測できる。試薬１ではナトリウムイオンが支配的になるように，試薬２ではカリウムイオンが支配的になるように電解質を調節した。酵素反応はこの電解質の違いにほとんど影響を受けず，特に電位差計測で用いることのできるエンドポイント計測においてはその影響はほとんどない。
【００４４】
ヒト血清中の各イオンの変動幅は，前記の表のように見積もった。試薬１と試料を９：１で混合した場合，式によるとイオン選択電極の電位変動幅は０．２３ｍＶである。ここで，簡便のため，活量係数は全て１として計算した。一方，試薬２と試料を９：１で混合した場合，ニコルスキー−アイゼンマン式によるとイオン選択電極の電位変動幅は２．４５ｍＶである。ネルンストの式によると，０．２３ｍＶの電位変動は０．９％の濃度変動に，２．４５ｍＶの電位変動は１０％の濃度変動に相当するため，試薬中のイオン濃度を最適化する前（試薬２）と最適化した後（試薬１）とでは測定精度が１０倍以上も変わることが分かる。また，通常血中成分の測定では１〜３％程度の精度，すなわち０．２５〜０．７５ｍＶ程度の精度が要求されるため，最適化前の精度では実用に耐えられないことが分かる。
【００４５】
このような試薬の最適化は，イオンを測定対象としていないために用いることができる。イオンの測定において試薬に測定対象のイオンが含まれていたとしたら，イオン選択電極の原理からして，測定精度を低下させてしまう。一方，グルコースやコレステロールなどの有機物を測定する場合，参照電極として用いるイオン選択電極の電位を安定化させる目的で試薬中にイオンが含まれていたとしても，測定に直接的な影響を及ぼさない。
【００４６】
同様の測定系でコレステロール，中性脂肪を測定した際の最適化した試薬の組成の例を以下に記す。
【００４７】
イオン選択電極：カリウム選択電極（選択係数（log）：Ｎａ+，−４．０；Ｌｉ+，−４．０；ＮＨ4+，−１．５；Ｃａ2+，−４．２；Ｍｇ2+，−６．０）
測定電極：１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール修飾金電極
電圧計：入力インピーダンス１０ＧΩ以上
コレステロール測定試薬：
フェリシアン化カリウム（９．９ｍＭ）
フェロシアン化カリウム（０．１ｍＭ）
塩化カリウム（１００ｍＭ）
トリス塩酸（０．２Ｍ）
コレステロール脱水素酵素（４０Ｕ／ｍｌ）
ジアホラーゼ（３．７５Ｕ／ｍｌ）
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（０．５ｍｇ／ｍｌ）
中性脂肪測定試薬：
フェリシアン化カリウム（９．９ｍＭ）
フェロシアン化カリウム（０．１ｍＭ）
塩化カリウム（１４０ｍＭ）
塩化マグネシウム（１０ｍＭ）
リン酸水素二ナトリウム（１０ｍＭ）
リン酸二水素カリウム（１．８ｍＭ）
アデノシン３リン酸（４ｍＭ）
リパーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）
グリセロールキナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）
グリセロール３リン酸酸化酵素（４０Ｕ／ｍｌ）
【００４８】
これらの試薬においては，カリウム選択電極を参照電極として用いる際の精度向上のため，カリウムイオンが支配的な電解質となるようにした。また，それぞれの反応式を以下に記す。
【００４９】
コレステロール：
コレステロール＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）→コレステノン＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）（コレステロール脱水素酵素により触媒）
２フェリシアン化カリウム＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元型）→２フェロシアン化カリウム＋ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型）（ジアホラーゼにより触媒）
【００５０】
中性脂肪：
トリグリセライド＋３Ｈ2Ｏ→グリセロール＋３ＲＣＯＯＨ（リパーゼにより触媒）
グリセロール＋アデノシン３リン酸→グリセロール３リン酸＋アデノシン２リン酸（グリセロールキナーゼにより触媒）
グリセロール３リン酸＋２フェリシアン化カリウム→ジヒドロキシアセトンリン酸＋２フェロシアン化カリウム（グリセロール３リン酸酸化酵素により触媒）
【００５１】
それぞれの反応式に示すようにして生成したフェロシアン化カリウムを，測定電極とイオン選択電極の電位差の変化として計測する。
【００５２】
図７は，図１の測定系を用いて，従来の内部液型銀塩化銀参照電極と本発明のイオン選択電極の安定性の比較を行った結果を示している。図中に銀塩化銀で示した線が内部液型銀塩化銀参照電極のもの，ＩＳＥで示したのがイオン選択電極を用いた結果である。測定は，次の条件で行った。
参照電極：内部液型銀塩化銀参照電極（内部液：飽和塩化カリウム，液絡部：多孔質ガラス）もしくはナトリウムイオン選択電極
測定電極：１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール修飾金電極
測定溶液：１０μｌ
硫酸ナトリウム（０．１Ｍ）
フェリシアン化カリウム（５ｍＭ）
フェロシアン化カリウム（５ｍＭ）
【００５３】
５０秒間の測定中に，内部液型銀塩化銀参照電極を用いた場合は０．５ｍＶ程度の電位ドリフトが観測されたが，イオン選択電極を用いた場合は０．１ｍＶ程度の電位ドリフトであった。
【００５４】
図８は，図１の測定系を用いて，従来の内部液型銀塩化銀参照電極と本発明のイオン選択電極（ＩＳＥ）の安定性（電位ドリフト）の溶液量依存性を測定した結果を示している。測定条件は，
銀塩化銀：内部液型銀塩化銀参照電極（内部液：飽和塩化カリウム，液絡部：多孔質ガラス）
ＩＳＥ：ナトリウム選択電極
測定電極：１１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール修飾金電極
測定溶液：
硫酸ナトリウム（０．１Ｍ）
フェリシアン化カリウム（５ｍＭ）
フェロシアン化カリウム（５ｍＭ）
とした。内部液型銀塩化銀参照電極では溶液量に反比例して電位ドリフト量が増大しているのに対し，イオン選択電極では電位ドリフト量が溶液量に依存しないのが分かる。
【００５５】
図７と図８に示すように，従来の内部液型銀塩化銀参照電極を用いた場合，測定溶液量の減少に伴い電位ドリフト量が増加した。その原因として，内部液の漏出が考えられる。イオン選択電極を参照電極に用いることで，少なくとも１０μｌ程度の測定液量では顕著な電位ドリフトは観測されなかった。従来の内部液型参照電極では，液絡部を通じた内部液と測定溶液間のイオンの移動により，内部液と測定溶液間の電位を一定に保っていた。従って，内部液の漏出を無くすとイオンの移動ができなくなるため，原理的に内部液の漏出を無くすことはできなかった。これに対し，イオン選択電極では，溶液とイオン選択膜の界面でのイオンの平衡により溶液とイオン選択膜の間の電位が定まるため，原理的にイオン選択膜内部をイオンが通り抜ける必要はない。そのため，精度を維持したまま内部液の漏出を抑制することができたと考えられる。
【符号の説明】
【００５６】
１０１ イオン選択電極
１０２ 測定電極
１０３ 電圧計
１０４ 容器
１０５ 測定溶液
２０１ 基板
２０２ イオン選択電極
２０３ 測定電極
２０４ 電圧計
２０５ 測定溶液
３０１ 測定部
３０２ 制御装置
３１１ イオン選択電極
３１２ 測定電極
３１３ 電圧計
３１４ 容器
３１５ 測定溶液
３１６ 分注装置
３１７ 容器
３１８ 試薬液
３１９ 分注装置
３２０ 容器
３２１ 試薬液
４０１ 基板
４０２ イオン選択電極
４０３ 測定電極
４０４ 電圧計
４０５ 測定溶液
５０１ 基板
５０２ イオン選択電極
５０３ 測定電極
５０４ 電界効果トランジスタ
５０５ ソース
５０６ ドレイン
５０７ 導電性配線
５０８ 導電性配線
５０９ 端子
５１０ 測定溶液
６０１ 基板
６０２ イオン選択電極に接続された端子
６０３ ＦＥＴのソースに接続された端子
６０４ ＦＥＴのドレインに接続された端子
【図１】
2011149878.tif 000010
【図２】
2011149878.tif 000011
【図３】
2011149878.tif 000012
【図４Ａ】
2011149878.tif 000013
【図４Ｂ】
2011149878.tif 000014
【図５】
2011149878.tif 000015
【図６】
2011149878.tif 000016
【図７】
2011149878.tif 000017
【図８】
2011149878.tif 000018
【図９】
2011149878.tif 000019