(57)【要約】【課題】  ＭＶＡにおける発現のために最適化されたプロモーターを提供すること【解決手段】  本発明は、特に改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）のようなワクシニアウイルスにおける遺伝子および／またはコード配列の発現のためのプロモーターに関する。本発明はさらに、前記プロモーター、発現カセットを含むベクターならびに医薬調合物およびワクチンに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれか１つのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１〜６のいずれか１つに記載の配列のサブ配列、および
（ｉｉｉ）  （ｉ）または（ｉｉ）で定義される配列に対して１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を有する配列、
を含む群から選択されるヌクレオチド配列を含むかまたは該ヌクレオチド配列からなるプロモーターであって、ワクシニアウイルスプロモーターとして活性であり、および／またはワクシニアウイルス感染細胞において活性である、前記プロモーター。
【請求項２】
サブ配列がＳＥＱ  ＩＤ：７〜１２を含む群から選択される、請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーターおよびコード配列を含む発現カセットであって、コード配列の発現が前記プロモーターにより制御され、そしてこの発現カセットがワクシニアウイルスのゲノム中に天然に存在する発現カセットではない、前記発現カセット。
【請求項４】
コード配列が治療用タンパク質またはペプチド、抗原、抗原エピトープ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする、請求項３記載の発現カセット。
【請求項５】
請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーターまたは請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセットを含むＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーターまたは請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項７】
プラスミドベクターおよびウイルスベクターから選択される、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
ウイルスベクターがワクシニアウイルスである、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
ワクシニアウイルスが改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、好ましくは欧州細胞カルチャーコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号Ｖ０００８３００８で寄託されているＭＶＡ−ＢＮ株またはその誘導体、ＥＣＡＣＣに寄託番号ＶＡ９４０１２７０７で寄託されているＭＶＡ５７２株または寄託番号Ｖ００１２０７０７で寄託されているＭＶＡ  ５７５株である、請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーター、または請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセットがＭＶＡゲノムの天然に存在する欠失部位に挿入される、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーター、または請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセットが、ウイルスゲノムの非必須部分またはウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項９記載のベクター。
【請求項１２】
ワクチンまたは薬剤としての請求項６〜１１のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項１３】
請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセット、請求項５記載のＤＮＡまたは請求項６〜１１のいずれか１つに記載のベクターを含むワクチンまたは医薬調合物。
【請求項１４】
少なくとも１０２ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量）の請求項８〜１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターを含む、請求項１３記載のワクチンまたは医薬調合物。
【請求項１５】
第一接種（「初回免疫接種」）および第二接種（「追加免疫接種」）において、ウイルスベクターが治療的有効量で投与される、請求項１４記載のワクチンまたは医薬調合物。
【請求項１６】
ワクチンまたは薬剤の製造のために、請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセット、請求項５記載のＤＮＡまたは請求項６〜１１のいずれか１つに記載のベクターを使用する方法。
【請求項１７】
請求項６〜１１のいずれか１つに記載のベクター、請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセット、または請求項５記載のＤＮＡを標的細胞へ導入することを含む、標的細胞へコード配列を導入する方法。
【請求項１８】
請求項７〜１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターを宿主細胞へ感染させること、感染した宿主細胞を適当な条件下において培養すること、および前記宿主細胞により産出されるペプチドおよび／またはタンパク質および／またはウイルスを単離および／または濃縮することを含む、ペプチド、タンパク質および／またはウイルスを製造する方法。
【請求項１９】
請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセット、請求項５記載のＤＮＡまたは請求項７記載のプラスミドベクターを用いる細胞のトランスフェクション、ワクシニアウイルスの細胞への感染、適当な条件下での感染した宿主細胞の培養、および前記宿主細胞により産出されるペプチドおよび／またはタンパク質および／またはウイルスの単離および／または濃縮を含むペプチド、タンパク質および／またはウイルスの製造方法であって、細胞にワクシニアウイルスを感染させる段階が細胞のトランスフェクションの段階の前または後に行われる、前記製造方法。
【請求項２０】
請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーター、請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセット、請求項５記載のＤＮＡまたは請求項７〜１１のいずれか１つに記載のウイルスベクターを含む細胞。
【請求項２１】
コード配列の発現のために請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーターを使用する方法であって、コード配列がワクシニアウイルスにおいて天然にプロモーターと連結している配列ではない、前記使用方法。
【請求項２２】
請求項３または４のいずれか１つに記載の発現カセットをベクターゲノムに挿入する段階を含む、請求項６〜１１のいずれか１つに記載のベクターを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に改変ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）のようなワクシニアウイルスにおける遺伝子および／またはコード配列の発現用プロモーターに関する。本発明はさらに、前記プロモーターを含む発現カセット、前記発現カセットを含むベクター、ならびに医薬調合物およびワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えポックスウイルスは、感染細胞において外来抗原を発現させるために広く使用される。さらに、組換えポックスウイルスは現在、ポックスウイルスベクターから発現する外来抗原に対する免疫応答を誘導するための非常に有望なワクチンとして試験されている。最もよく知られているのは一方ではアビポックスウイルスであり、一方ではワクシニアウイルス、特に改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である。ＭＶＡは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属の一員であるワクシニアウイルスに関連する。ＭＶＡはワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で５１６代にわたって連続継代することによって作出された（概要については非特許文献１を参照されたい）。これらの長期の継代の結果として、得られたＭＶＡウイルスはそのゲノム配列の約３１キロ塩基分を欠失しており、従って宿主細胞がトリ細胞に大きく制限される（非特許文献２）。得られたＭＶＡが有意に無毒性であることが種々の動物モデルにおいて示された（非特許文献３）。さらにこのＭＶＡ株は、ヒト天然痘疾患に対する予防接種のためのワクチンとして、臨床試験において試験されている（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００３】
特許文献１および特許文献２には、ＨＩＶ抗原およびタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス株ワイス（Ｗｙｅｔｈ）が開示されている。特許文献３には、レンチウイルス遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス株ＮＹＣＢＨが開示されている。特許文献４には、ヒトレトロウイルス遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルス株ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）が開示されている。特許文献５には、特に安全で弱毒化されたＭＶＡ株が開示されている。組換えＭＶＡはとりわけ特許文献６および特許文献７に開示されている。
【０００４】
ポックスウイルスにおける異種遺伝子の発現に関しては、３０Ｋおよび４０Ｋプロモーター（例えば特許文献３参照）、強力な合成初期／後期プロモーター（例えば非特許文献６参照）、Ｐ７．５プロモーター（例えば非特許文献７参照）および牛痘ウイルスＡ型封入体（ＡＴＩ：Ａ−ｔｙｐｅ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）遺伝子由来のプロモーター（非特許文献８参照）のような、わずかなプロモーターのみが当業者に公知である。これらのプロモーターは全て、異種遺伝子を発現させるために組換えワクシニアウイルスにおいて使用されており、前記遺伝子を発現させた結果該異種遺伝子によりコードされるタンパク質が産出されることが示されてきた。わずかなプロモーターのみがワクシニアウイルス発現系における遺伝子の発現に利用することができるので、ワクシニアウイルスにおける代替的なプロモータが必要とされている。さらに、これまでに公知のプロモーターはすべて、むしろ強力な後期プロモーターであり、すなわちワクシニアウイルスベクターの複製が起こった後に遺伝子を発現させるのに有用である。いくつかの用途に関しては、細胞の感染後に直ちに遺伝子を発現させるプロモーターを有することが望ましく、すなわちワクシニアウイルス初期プロモーターが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許（ＵＳ）第５，７３６，３６８号明細書
【特許文献２】米国特許（ＵＳ）第６，０５１，４１０号明細書
【特許文献３】米国特許（ＵＳ）第５，７４７，３２４号明細書
【特許文献４】欧州特許（ＥＰ）第０  ２４３  ０２９号明細書
【特許文献５】国際公開（ＷＯ）第０２／４２４８０号パンフレット
【特許文献６】国際公開（ＷＯ）第９８／１３５００号パンフレット
【特許文献７】国際公開（ＷＯ）第０３／０４８１８４号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｙｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，  ６−１４  ［１９７５］
【非特許文献２】Ｍｅｙｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２，  １０３１−１０３８  ［１９９１］
【非特許文献３】Ｍａｙｒ，  Ａ．  ＆  Ｄａｎｎｅｒ，  Ｋ．  ［１９７８］  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．  ４１：  ２２５−３４
【非特許文献４】Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚｂｌ．  Ｂａｋｔ．  Ｈｙｇ．  Ｉ，  Ａｂｔ．  Ｏｒｇ．  Ｂ  １６７，  ３７５−３９０  ［１９８７］
【非特許文献５】Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．  ９９，  ２３８６−２３９２  ［１９７４］
【非特許文献６】Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  （１９９４）  １２，  １０３２−４０）
【非特許文献７】Ｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９１）  ７２，  ６９９−７０３
【非特許文献８】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９８）  ７９，  ６１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
さらに上述のように、ＭＶＡはその改良された安全プロファイルのために、異種遺伝子の発現に非常に有望なウイルスである。しかし、ＭＶＡにおける異種遺伝子の発現のためのこれまでに公知のプロモーターはすべて、その他のワクシニアウイルス由来であるか、またはその他のワクシニアウイルスにおける発現のための合成されたプロモーターである。従って、ＭＶＡにおける発現のために最適化されたプロモーターもまた必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）のゲノムに由来するプロモーターに関する。ＭＶＡプロモーターは本技術分野においてまだ公知ではなかった。
【０００９】
特に本発明は、以下：
（ｉ）  以下のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれか１つのヌクレオチド配列：
５’ＴＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＴＡＡＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＴＴＣＧＡＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＧＴＡＴＴＧＧＡＴＴＧＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＡＧＡＡＴＧＣＴＡＡＴＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＣＣＡＡＴＡＧＡＴＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＣＡ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
５’ＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＧＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＡＣＴＴＴＣＧＧＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＡ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
５’ＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡＴＡＣＴＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＴＡＧＴＴＡＴＴＡＧＴＧＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＧＡＡＴＡＡＧＡＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＡ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
５’ＧＡＴＣＴＡＴＡＡＡＧＧＴＡＧＡＣＣＴＡＡＴＣＧＴＣＴＣＧＧＡＴＧＡＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＧＣＡＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
５’ＧＧＴＡＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＡＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＡＴＴＣＣＡＴＡＧＴＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＡＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＴＣＡＧＴＴ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
５’ＡＴＴＴＣＴＣＧＧＴＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＣＡＴＡＴＴＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＴＡＡＣＧＣＣＣＴＴＡＴＡＧＧＣＴＣＴＡＡＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
（ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ：  Ｎｏ．１〜６のいずれか１つに記載の配列のサブ配列
（ｉｉｉ）  （ｉ）または（ｉｉ）で定義される配列に対して１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を有する配列、
を含む群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ヌクレオチド配列からなるプロモーターに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、異なるプロモーターによる発現後のＧＵＳ活性を示す。
【図２】図２は、初期および初期／後期発現後のＧＵＳ発現を示す。
【図３】図３は、異なるプロモーターによる発現後のＧＵＳ活性を示す。
【００１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６は、ＭＶＡゲノムの天然の部分であり、それぞれリーディングフレームＡ４２Ｒ、Ｊ６Ｒ、Ｆ６Ｒ、Ｉ２Ｒ、Ｃ７ＬおよびＢ９Ｒの上流に位置する。
【００１２】
本発明のプロモーターは、好ましくはワクシニアウイルスプロモーターとして活性であるか、またはワクシニアウイルス感染細胞におけるプロモーターとして活性である。前記ワクシニアウイルスは、好ましくはＭＶＡ、特に以下に記載されるようなＭＶＡ株のうちの１つである。「ワクシニアウイルスプロモーターとして活性」とは、前記プロモーターが、前記ウイルスを用いて細胞を感染させた後に、ワクシニアウイルスにおいて実施可能に連結している遺伝子の発現を誘導することができることを意味する。前記細胞は、好ましくはワクシニアウイルスの後期および／または初期発現が可能な細胞である。「ワクシニアウイルス感染細胞においてプロモーターが活性」には、プロモーターがワクシニアウイルスゲノムの一部分でなく、例えばプラスミドまたは非ワクシニアウイルスのウイルスゲノムの一部分である状態もまた包含され；そのような状態においては、本発明のプロモーターは、該プロモーターを含む細胞がワクシニアウイルスゲノムも含む場合、例えば該細胞がワクシニアウイルスに感染した場合に活性である。このような環境下で、ウイルスＲＮＡポリメラーゼが本発明のプロモーターを認識し、そして該プロモーターに連結する遺伝子／コード配列の発現が活性化される。
【００１３】
本発明においては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載されるプロモーターのうちのいずれか１つを使用することができる。遺伝子／コード配列の発現を誘導するために実際に使用されるプロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のいずれか１つからなることができ、または、実際に使用されるプロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のいずれか１つを含むさらに大きな構造であってもよい。また、これらのプロモーターの誘導体を使用することが本発明の範囲に包含され、これらのプロモーターの誘導体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のいずれか１つに定義される配列のサブ配列であってもよい。「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれか１つに記載の配列のサブ配列」という語句は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれか１つのさらに短い断片を表し、それらはプロモーターとして、特にワクシニアウイルスにおけるまたはワクシニアウイルス感染細胞におけるプロモーターとしてなお活性である。さらに、前記ワクシニアウイルスは、好ましくは以下に記載される株のうちの１つのようなＭＶＡである。典型的なＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のいずれか１つのサブ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列のいずれか１つのうちの少なくとも１５ヌクレオチドの、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの、さらに好ましくは少なくとも２５ヌクレオチドの、最も好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さを有する。
【００１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の好ましいサブ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の好ましいサブ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の好ましいサブ配列および／または該サブ配列の誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の好ましいサブ配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜１２の配列は、実施例において記載されている。
【００１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６またはそれらのサブ配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含んでなるかまたは該ヌクレオチド配列からなるプロモーターの誘導体、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列の誘導体はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６の配列またはそれらのサブ配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列のいずれか１つに対して１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を有する配列であってもよい。本発明による誘導体は、プロモーターとして、特にワクシニアウイルスにおけるまたはワクシニアウイルス感染細胞におけるワクシニアウイルスプロモーターとして、より好ましくは、ＭＶＡにおけるまたはＭＶＡ感染細胞におけるＭＶＡプロモーターとしてなお活性である。１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換を有する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６またはそれらのサブ配列のいずれか１つの配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜１２のいずれか１つの配列の１つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるヌクレオチドによって置換されている配列である。１つまたはそれ以上のヌクレオチド挿入を有する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６またはそれらのサブ配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列のいずれか１つの１つまたはそれ以上の位置に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドが挿入されている配列である。１つまたはそれ以上のヌクレオチド欠失を有する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６またはそれらのサブ配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のヌクレオチド配列のいずれか１つの配列の１つまたはそれ以上のヌクレオチドが欠失している配列である。本発明の誘導体においては、欠失、置換および挿入が、１つの配列中で組み合わされていてもよい。
【００１６】
本発明におけるサブ配列の誘導体の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３  のサブ配列であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３における対応するヌクレオチド配列に対してさらに１つのヌクレオチドの交換を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である。
【００１７】
前記誘導体は、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列またはそれらのサブ配列のいずれか１つ、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のいずれか１つの配列と比較した場合に、少なくとも４０％の、より好ましくは少なくとも６０％の、さらに好ましくは少なくとも８０％の、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。最も好ましい実施態様においては、多くて１０個のヌクレオチド、より好ましくは多くて５個のヌクレオチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のいずれか１つの配列において置換、欠失および／または挿入される。
【００１８】
当業者であれば本技術分野の先行文献を参照することにより、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１２のいずれか１つの誘導体またはサブ配列のどれが、ワクシニアウイルスプロモーターとして、特にＭＶＡにおけるプロモーターとしてなおも生物学的活性を有するかを予測することができる。これに関しては、「Ｃｈａｋｒａｒｂａｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （１９９７）  ２３，  １０９４−１０９７」および「Ｄａｖｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９８９）  ２１０，  ７７１−７８４」が参照される。さらに、断片がなおワクシニアウイルスプロモーターとして、特にＭＶＡプロモーターとして活性であるかどうかは、当業者であれば容易に評価することができる。特に、前記配列誘導体は、プラスミドコンストラクトにおいてレポーター遺伝子の上流にクローニングすることができる。前記コンストラクトは、ＭＶＡを感染させた真核細胞または細胞株、例えばＣＥＦまたはＢＨＫ細胞にトランスフェクトすることができる。レポーター遺伝子の発現を測定し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれか１つのプロモーターにより制御されているレポーター遺伝子の発現と比較した。本発明の誘導体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれか１つのプロモーター配列の活性と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％の前記試験系におけるプロモーター活性を有する誘導体である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１２のいずれか１つのこれらの誘導体もまた、高いプロモーター活性を有する本発明の範囲に包含される。
【００１９】
本発明のプロモーターは、ＭＶＡにおけるコード配列の発現に特に適している。
【００２０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のプロモーターは、初期プロモーターとして使用することもできるが、特に後期プロモーターとして非常に強力な活性を有する。同一のことが対応するサブ配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列にあてはまるが、それは後期プロモーターとして特に有用である。
【００２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のプロモーターもまた、特に後期プロモーターとしてさらに強力な活性を有する。これはまた初期プロモーターとしても使用することができる。同一のことが対応するサブ配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列にあてはまるが、それは後期プロモーターとして特に有用である。
【００２２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のプロモーターは、特に初期プロモーターとして有用であり、そして試験された全てのプロモーターの中で最も高い初期プロモーター活性を有する。  しかし、それは後期プロモーターとしても使用することができる。同一のことが対応するサブ配列、例えばそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０の配列にあてはまる。これらのサブ配列のうち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９が特に初期プロモーターとして有用であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０が特に後期プロモーターとして有用である。
【００２３】
連結したコード配列を初期および後期に発現させようとする場合に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のプロモーターは特に有用であり、なぜならこのプロモーターは初期ならびに後期の条件下においてより高い活性を有するからである。同一のことが対応するサブ配列、例えばそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２の配列にあてはまる。これらのサブ配列のうち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１が特に初期プロモーターとして有用であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２が特に後期プロモーターとして有用である。  
【００２４】
連結したコード配列をやや低量で発現させようとする場合には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６のプロモーターが特に有用である。これは、連結したコード配列が毒性の遺伝子産物をコードする場合に、および／または高い結合力の免疫応答を誘導させる場合に望ましい場合がある。
【００２５】
「初期プロモーター」という語句は、ウイルスＤＮＡ複製が起こる前にワクシニアウイルスまたはワクシニアウイルス感染細胞において活性であるプロモーターを表す。プロモーターが初期プロモーターであるかを確認することができる方法は、当業者に公知である。特に、興味のプロモーターをレポーター遺伝子の上流に挿入してもよい。前記プロモーターおよび前記レポーター遺伝子を含むコンストラクトは、ワクシニアウイルスを感染させた細胞に導入される。初期プロモーターとしての活性を評価するために、細胞をＡｒａＣのようなＤＮＡ複製を阻害する物質とともにインキュベートする。ＤＮＡ複製は後期プロモーター活性にとって必須条件である。従って、この試験系において測定されるプロモーター活性はいずれも、初期プロモーターとしての活性なエレメントによるものである。よって、「後期プロモーター」という語句は、ＤＮＡ複製が起こった後に活性であるプロモーターを表す。該後期活性は、当業者に公知の方法によって測定することができる。簡潔にするために、本明細書に使用される場合には、「後期プロモーター」という語句は、ＤＮＡ複製を遮断するいずれの物質も加えない場合に測定されるプロモーターの活性を表す。
【００２６】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明のプロモーターおよびコード配列を含む発現カセットであって、コード配列の発現が前記プロモーターにより制御されている前記発現カセットを表す。前記発現カセットは、好ましくはワクシニアウイルスゲノムに天然に存在する発現カセットではない。従って、本発明プロモーターがワクシニアウイルスのゲノムに天然に存在するプロモーターである場合に、該プロモーターが連結する配列は、好ましくは該プロモーターがワクシニアウイルスにおいて天然に連結している配列とは異なる。すなわち、本発明のプロモーターが天然に存在するプロモーターと一致する場合に、その発現が該プロモーターおよび／または該プロモーターと該コード配列との間に位置する配列に制御されるコード配列は、前記プロモーターが天然に連結している対応する配列とは異なる。本明細書において、「異なる」という語句は、前記配列において少なくとも１つのヌクレオチドの相違を示す配列を表す。好ましくは、それは少なくとも１つのヌクレオチドが相違を有するコード配列である。その他の選択肢においては、該発現カセットにおけるコード配列とプロモーターが天然に連結する配列との間の相同性は、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満または２０％未満である。最も好ましくは、本発明のプロモーターにより制御されるコード配列は、上述のコード配列によりコードされる天然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の相違を有するペプチド／タンパク質をコードする。一例としては、該発現カセットは、天然に存在するＣ７Ｌ遺伝子の発現を誘導する天然に存在するワクシニアウイルスＣ７Ｌプロモーターを含む発現カセットではなく、例えば該発現カセットは、Ｃ７ＬプロモーターおよびＣ７Ｌコード配列を含む国際公開（ＷＯ）第２００４／０１５１１８号パンフレットに開示される発現カセットではない。
【００２７】
一方、発現させるべき配列が天然に存在するワクシニアウイルス配列である場合に、該配列を発現するために使用されるプロモーターは、天然の構造（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてコード配列の発現を誘導するプロモーターとは異なる。この選択肢においては、プロモーターのヌクレオチド配列は、天然に存在するワクシニアウイルスプロモーターの配列と少なくとも１つのヌクレオチドにおいて相違する。その他の選択肢においては、ワクシニアウイルス配列の発現を制御する本発明のプロモーターと、ワクシニアウイルス配列に連結する天然に存在するプロモーターとの間の相同性は、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満または４０％未満である。
【００２８】
好ましくは、コード配列は少なくとも１つの抗原エピトープまたは抗原、治療用ペプチドまたはタンパク質、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードすることができる。該コード配列が抗原エピトープまたは抗原をコードする場合に、発現カセットは、該発現カセットを生物、例えばヒトを含む哺乳類動物における細胞に導入した後、前記抗原を発現させるために使用することができる。前記抗原／エピトープの提示は、生物において免疫応答を誘導することができ、これは該生物における該抗原／エピトープが由来する因子に対しての予防接種となる。さらに具体的には、該エピトープ／抗原は、ポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質のようなより大きなアミノ酸配列の一部分であってもよい。好ましくは、前記コード配列は、ワクシニアウイルスゲノムによってコードされない、少なくとも１つの抗原エピトープまたは抗原、治療用ペプチドまたはタンパク質、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする。
【００２９】
前記ポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質の例としては、（ｉ）ウイルス、特にＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペスウイルス、デングウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルス等のようなワクシニアウイルス以外のウイルス、（ｉｉ）細菌、（ｉｉｉ）真菌、（ｉｖ）腫瘍関連抗原のような腫瘍関連ポリペプチド／タンパク質由来のポリエピトープ、ペプチドまたはタンパク質が挙げられる。
【００３０】
あるいは、前記コード配列は、インターロイキン、インターフェロン、リボザイムまたは酵素のような治療用化合物をコードすることができる。
【００３１】
さらに一般的にいうと、本発明は、本発明のプロモーターおよび／または本発明の発現カセットを含む任意の核酸配列に関する。該核酸は、例えばプロモーターがレトロウイルスゲノムの一部分である場合には、ＲＮＡでもよい。さらに好ましくは、該核酸はＤＮＡである。該ＤＮＡは、直鎖状、環状、一本鎖または二本鎖ＤＮＡのようないずれのタイプのＤＮＡでもよい。
【００３２】
さらなる実施態様において、本発明のプロモーターおよび／または発現カセットは、ベクターの一部分でもよい。「ベクター」という語句は、当業者に公知の任意のベクターを表す。ベクターは、ｐＢＲ３２２またはｐＵＣ系のベクターのようなプラスミドでよい。さらに好ましくは、該ベクターはウイルスベクターである。本明細書においては、「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）」または「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ）」という語句は、ウイルスゲノムを含む感染性ウイルスを表す。この場合に、本発明のＤＮＡは、それぞれのウイルスベクターのウイルスゲノムの一部分である。組換えウイルスゲノムがパッケージングされ、得られた組換えベクターは細胞および細胞株の感染、特にヒトを含む動物の生体の感染に使用することができる。本発明において使用することができる典型的なウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）を基礎とするベクターである。最も好ましいのはポックスウイルスベクターである。該ポックスウイルスは、好ましくはカナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルスまたはワクシニアウイルスである。
【００３３】
さらに好ましいのは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）（Ｓｕｔｔｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  ［１９９４］，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：  １０３２−４０；  Ａｎｔｏｉｎｅ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  ［１９９８］，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４：  ３６５−３９６）である。本出願において使用される場合には、「ＭＶＡ」という語句は、当業者に公知のＭＶＡ株のいずれかを表す。ＭＶＡ株の例としては、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）  （ＡＴＣＣ、マナサス、ＶＡ  ２０１０８、ＵＳＡ）に寄託番号ＶＲ−１５０８で寄託されているものが挙げられる。本発明に使用されるＭＶＡウイルス株のさらなる例としては、欧州細胞カルチャーコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ、ソールズベリー、ＵＫ）にそれぞれ寄託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ９４０１２７０７およびＥＣＡＣＣ  Ｖ００１２０７０７で寄託されているＭＶＡ５７２および５７５株、寄託番号ＥＣＡＣＣ  Ｖ０００８３００８で寄託されいるＭＶＡ−ＢＮが挙げられる。
【００３４】
最も好ましいＭＶＡ株は、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である。ＭＶＡ−ＢＮの特性、ＭＶＡ株がＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体であるかどうかを評価するための生物学的試験についての記載、およびＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を得るための方法は、国際公開（ＷＯ）０２／４２４８０号パンフレットに開示されている。この出願の記載は、参照することにより本明細書に組み込まれる。特に、国際公開（ＷＯ）０２／４２４８０号パンフレットに開示されるような本発明のワクシニアウイルスの特性の定義、例えばＭＶＡの特性、およびＭＶＡ−ＢＮの誘導体の特性および定義が参照される。前記の参照文献にはＭＶＡおよびその他のワクシニアウイルスを増殖させる方法も開示されている。簡単に言うと、真核細胞にウイルスを感染させる。該真核細胞は、各ポックスウイルスによる感染を許容し、感染ウイルスの複製および産出を許容する細胞である。ＭＶＡに関するこのタイプの細胞の例はニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびＢＨＫ細胞である（Ｄｒｅｘｌｅｒ  Ｉ．，  Ｈｅｌｌｅｒ  Ｋ．，  Ｗａｈｒｅｎ  Ｂ．，  Ｅｒｆｌｅ  Ｖ．  ａｎｄ  Ｓｕｔｔｅｒ  Ｇ．  “Ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ  ｉｎ  ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ，  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｏｓｔ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ”  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  （１９９８），  ７９，  ３４７−３５２）。ＣＥＦ細胞は当業者に公知の条件下で培養することができる。好ましくは、ＣＥＦ細胞は静置したフラスコまたはローラーボトルにおいて血清なしの培地中で培養される。インキュベーションは、好ましくは３７℃±２℃で４８〜９６時間行う。感染のために、ＭＶＡは好ましくは０．０５〜１ＴＣＩＤ５０の感染多重度（ＭＯＩ）で使用され、インキュベーションは好ましくは３７℃±２℃で４８〜７２時間行う。
【００３５】
本発明の発現カセットまたはプロモーターをウイルスゲノム、特にワクシニアウイルスのゲノムに、最も好ましくはＭＶＡのゲノムに挿入する方法は、当業者に公知である。一例として、本発明の発現カセットまたはプロモーターまたはその誘導体は、相同組換えによりＭＶＡのゲノムに挿入することができる。この目的のためには、核酸はＣＥＦまたはＢＨＫ細胞のような許容細胞株にトランスフェクトされ、該核酸は、本発明の発現カセットまたはプロモーターまたはその誘導体が挿入されるＭＶＡゲノムの領域と相同であるヌクレオチドストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）に隣接する、本発明の発現カセットまたはプロモーターまたはその誘導体を含む。前記細胞にＭＶＡを感染させると、感染細胞において核酸とウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こる。あるいは、最初に細胞にＭＶＡを感染させ、その後核酸を感染細胞にトランスフェクトすることも可能である。この場合も細胞中で相同組換えが起こる。組換えＭＶＡは当業者に公知の方法によりその後選択される。組換えＭＶＡの構築はこの特定の方法に限定されない。いずれの当業者に公知の適当な方法も代わりにこの目的のために使用することができる。
【００３６】
本発明の発現カセットまたはプロモーターは、ベクター、特にウイルスゲノムの適当な部分のいずれかに導入することができる。ワクシニアウイルスの場合には、ウイルスゲノムの非必須部分に、またはウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される。「遺伝子間領域」という語句は、好ましくはコード配列を含まない、２つの隣接する遺伝子の間に位置するウイルスゲノムの部分を表す。ベクターがＭＶＡの場合には、ウイルスゲノムの天然に存在する欠失部位に挿入することもできる。「天然に存在する欠失部位」という語句は、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のゲノムにおいて欠失しているウイルスゲノムの部分を表す。しかし、発現カセットは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）のような少なくとも１つの細胞培養系において増幅および増殖することができる組換え体が得られる限り、ウイルスゲノム中のどこにでも挿入することができ、本発明の範囲内にあるので、挿入部位はワクシニアウイルスゲノムおよびＭＶＡゲノムにおけるこれらの好ましい挿入部位に限定されない。
【００３７】
本発明のプロモーターは、すでにベクター、例えばＭＶＡのゲノムの一部分である遺伝子を発現させるために使用することができる。このような遺伝子はウイルスゲノムの天然の部分である遺伝子またはすでにベクターに挿入されている外来遺伝子でよい。これらの場合に、本発明のプロモーターはベクターにおいて該遺伝子の上流に挿入され、その発現は該プロモーターにより制御される。本発明の発現カセットを含むＭＶＡベクターは、オープンリーディングフレームＡ４２Ｒ、Ｊ６Ｒ、Ｆ６Ｒ、Ｉ２Ｒ、Ｃ７ＬおよびＢ９Ｒ  のいずれか１つを、その発現が前記オープンリーディングフレームのいずれか１つの発現を天然に制御しているプロモーターにより制御されるコード配列によって置換することにより調製することができる。従って、その一例として、Ａ４２Ｒコード配列またはその部分を、発現させるコード配列によって置換することができる。その結果得られるコンストラクトにおいて、前記コード配列は本発明のプロモーターにより、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のプロモーター配列により制御される。これらの発現カセットもまた本発明の範囲に包含される。
【００３８】
さらなる実施態様において、本発明は、ワクチンまたは薬剤としての本発明のベクターに関する。さらに総括すると、本発明は、本発明の発現カセット、ＤＮＡまたはベクターを含むワクチンまたは医薬調合物に関する。該ワクチンまたは医薬調合物を動物またはヒトの体に投与する方法は当業者に公知である。ＤＮＡおよびプラスミドベクターの場合には、該ＤＮＡおよびベクターは注射により簡単に投与することができる。該ベクターがワクシニアウイルスベクター、特にＭＶＡベクターのようなウイルスベクターの場合には、それは当業者の知識に従って、例えば静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内または皮下投与により動物またはヒトの体に投与することもできる。投与されるウイルスの量に関する詳細は以下に記載する。
【００３９】
前記医薬調合物またはワクチンは、通常、本発明のプロモーター、発現カセットまたはベクターに加えて、１つまたはそれ以上の薬学的に許容されるおよび／または承認されるキャリアー、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤および／または安定剤を含むことができる。補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等でよい。適当なキャリアーは、典型的にはタンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質集合体等のような大きなゆっくりと代謝される分子である。
【００４０】
医薬調合物またはワクチンの製造のために、本発明のＤＮＡ、発現カセットまたはベクター、特に組換えＭＶＡのような組換えワクシニアウイルスを、生理的に許容される形態に変換する。ワクシニアウイルス、特にＭＶＡに関しては、これは天然痘に対する予防接種に使用されるポックスウイルスワクチンの製造における実験に基づいて行うことができる（「Ｓｔｉｃｋｌ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  ［１９７４］  Ｄｔｓｃｈ．  ｍｅｄ．  Ｗｓｃｈｒ．  ９９，  ２３８６−２３９２」により記載されるように）。例えば、精製したウイルスは５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で約１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）されて−８０℃で保存される。ワクチン注射の製造のために、例えば１０１〜１０９個の本発明の組換えウイルス粒子を、アンプル、好ましくはガラスアンプル中で、２％のペプトンおよび１％のヒトアルブミンの存在下でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において凍結乾燥する。あるいは、該ワクチン注射は、調合物におけるウイルスの段階的な凍結−乾燥によって製造することができる。この調合物は、さらにｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適したマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドンのような添加剤、または酸化防止剤または不活性ガス、安定剤または組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）のようなその他の添加剤を含むことができる。凍結−乾燥に適した典型的なウイルス含有調合物は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−緩衝液、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１８．９ｇ／ｌのデキストラン（ＭＷ  ３６０００〜４００００）、４５ｇ／ｌのスクロース、０．１０８ｇ／ｌのＬ−グルタミン酸一カリウム塩一水和物（ｐＨ７．４）を含む。その後ガラスアンプルを密封し、４℃〜室温の間で数ヶ月保存することができる。しかし、必要がない限りは、該アンプルは好ましくは−２０℃以下の温度で保存される。
【００４１】
予防接種または治療を行うために、前記の凍結乾燥物または凍結乾燥生成物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは水、生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、筋肉内投与、または当業者に公知のその他の任意の投与経路によって投与することができる。当業者であれば、投与方法、投与用量および投与回数を、公知の方法で最適化することができる。従って、関連する実施態様において、本発明は、本発明の発現カセット、ＤＮＡ、ベクター、医薬調合物またはワクチンを治療される動物またはヒトに投与することを含む、ヒトを含む動物の生体内における免疫応答に作用する、好ましくはそれを誘導する方法に関する。ワクチンがワクシニアウイルス、特にＭＶＡである場合に、典型的なヒト用のワクチン注射は、少なくとも１０２、好ましくは少なくとも１０４、より好ましくは少なくとも１０６、さらに好ましくは少なくとも１０７または１０８ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量）のウイルスを含む。
【００４２】
前記ワクチンが組換えＭＶＡ、特に組換えＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体である場合には、該ウイルスはプライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）投与に使用することができる。従って、本発明は、ベクターがＭＶＡ、特にＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体であり、そして前記ベクター、または前記ベクターを含む調合物またはワクチンを、第一接種（「初回免疫接種（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）」）および第二接種（「追加免疫接種（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）」）において、それを必要とするヒトを含む動物に治療的有効量で投与する方法に関する。
【００４３】
本発明はさらに、本発明のベクター、発現カセットまたはＤＮＡを標的細胞に導入することを含む、コード配列を標的細胞に導入する方法に関する。ベクターがワクシニアウイルス、特にＭＶＡ−ＢＮのようなＭＶＡの場合には、標的細胞はウイルスが複製できる細胞、例えばＣＥＦまたはＢＨＫ細胞、またはＭＶＡが感染できるが該ウイルスが複製しない細胞（例えばＭＶＡ−ＢＮに関しては全てのタイプのヒト細胞）でよい。
【００４４】
本発明はさらに、宿主細胞への本発明ウイルスベクターの感染、それに続く適当な条件下での感染した宿主細胞の培養、さらにそれに続く前記宿主細胞により産出されたペプチドおよび／またはタンパク質および／ウイルスの単離および／濃縮を含む、ペプチド、タンパク質および／またはウイルスを製造する方法に関する。本発明のウイルスを製造、すなわち増幅しようとする場合には、該細胞はウイルスが複製できる細胞でなければならない。ワクシニアウイルス、特にＭＶＡに適した細胞はＣＥＦまたはＢＨＫ細胞である。本発明のウイルスベクターによりコードされるペプチド／タンパク質を製造しようとする場合には、該細胞は、ウイルスベクターが感染でき、コードされるタンパク質／ペプチドの発現を許容するいずれの細胞でもよい。
【００４５】
本発明はさらに、本発明の発現カセット、ＤＮＡまたはプラスミドベクターを用いる細胞のトランスフェクション、それに続く該細胞へのワクシニアウイルスの感染を含む、ペプチド、タンパク質および／またはウイルスを製造する方法に関する。該感染した宿主細胞は適当な条件下で培養される。さらなる段階は、前記宿主細胞により産出されるペプチドおよび／またはタンパク質および／またはウイルスの単離および／または濃縮を含む。細胞へのワクシニアウイルスの感染段階は、該細胞のトランスフェクション段階の前または後に行われる。
【００４６】
本発明はさらに、本発明のプロモーター、ＤＮＡ、発現カセットまたはベクターを含む細胞に関する。特に、本発明は、本発明のウイルスベクターを感染させた細胞に関する。
【００４７】
＜図面の簡単な説明＞
図１：異なるプロモーターによる発現後のＧＵＳ活性
細胞にＭＶＡ−ＢＮを感染させ、適当なプラスミドでトランスフェクトした。４８時間後に細胞を抽出し、黄色を発色する酵素反応後の４１５ｎｍにおける吸光度を測定することによりＧＵＳ活性を間接的に測定した。Ｚｅｘ＝ネガティブコントロール（ＭＶＡ−ＢＮ感染細胞）。
【００４８】
図２：初期および初期／後期発現後のＧＵＳ発現
細胞にＭＶＡ−ＢＮを感染させ、適当なプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後に細胞を抽出し、黄色を発色する酵素反応後の４１５ｎｍにおける吸光度を測定することによりＧＵＳ活性を間接的に測定した。Ｚｅｘ＝ネガティブコントロール（ＭＶＡ−ＢＮ感染細胞）。酵素反応に関して、呈色反応を得るために、ＡｒａＣなしのサンプル（初期＋後期発現）は５時間インキュベートしなければならず、ＡｒａＣを添加したサンプル（初期発現）は一晩インキュベートしなければならない。
【００４９】
図３：異なるプロモーターによる発現後のＧＵＳ活性
細胞にＭＶＡ−ＢＮを感染させ、適当なプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後に細胞を抽出し、黄色を発色する酵素反応後の４１５ｎｍにおける吸光度を測定することによりＧＵＳ活性を間接的に測定した。コントロール＝ネガティブコントロール（ＭＶＡ−ＢＮ感染細胞）。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例により本発明をさらに例証する。当業者には、本発明により提供される技術の適用がこの実施例に限定されることがないことは理解される。
【００５１】
＜実施例１：ＭＶＡ−ＢＮゲノムにおいてコード配列を発現するためのプロモーターの解析＞
１．１  実験の目的
この解析の目的は、ＭＶＡゲノムにおけるコード配列、好ましくは天然のＭＶＡゲノムとは異種のコード配列を発現するのに適したプロモーターを同定することである。特に、１つの挿入部位に２つまたはそれ以上の遺伝子を挿入するためには、外来遺伝子の１つの欠失を生じる組換えイベント（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ）のリスクを減少するために、各遺伝子の発現のために異なるプロモーターを使用することが有利である。さらに、組換えＭＶＡ−ＢＮに挿入された外来遺伝子をプロモーターの強さに依存する可変の量で発現する可能性を有するためには、異なる強さのプロモーターを有することが望ましい。全体で１１個の推定プロモーターが単離された。これらの推定プロモーター配列をプラスミド骨格（ｐＢＳＫＳ＋）にクローニングした。これらの潜在的な活性を解析するために、該プロモーターをＧＵＳ（大腸菌β−グルクロニダーゼ）レポーター遺伝子と融合させた。ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞にＭＶＡ−ＢＮを感染させ、ＧＵＳ遺伝子と融合させた推定プロモーターを含むプラスミドでトランスフェクションを行った。プロモーターが機能する場合にはＧＵＳが発現し、ＧＵＳの酵素反応により定量化することができる。ポジティブコントロールとしておよび標準として、よく特性が明らかにされているワクシニアウイルスプロモーターｐ７．５およびＰｓをＧＵＳと融合させ同時に解析した。ＧＵＳ発現の測定により、推定プロモーターについて活性、強さおよび初期／後期発現に関してスクリーニングを行った。該初期／後期発現はＡｒａＣ（シトシンアラビノシド）を培地に添加することにより確認した。機能することが示されているプロモーター、すなわち当業者に公知のＰｓ、ｐ７．５、７．５ＬおよびＡＴＩプロモーター、ならびにＭＶＡ  ＯＲＦ’ｓの発現制御に天然において関与する新しく同定されたプロモーター配列、Ａ４２Ｌ、Ｂ９Ｒ、Ｃ７Ｌ、Ｆ６Ｒ、Ｉ２Ｒ、Ｊ６Ｒは、好ましくは組換えＭＶＡコンストラクト（ｒｅｃＭＶＡ−ＢＮ）中の外来遺伝子の発現に使用することができる。
【００５２】
１．２  材料
細胞：ＢＨＫ細胞
ウイルス：ＭＶＡ−ＢＮの標準的な粗製ストック（７．５×１０７ＴＣＩＤ５０）
ＤＮＡ：ｐＡＢ−ＧＵＳ（Ｐｓプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ７１（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ワクシニアウイルスｐｒ７．５＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ７３（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋牛痘ウイルスＡＴＩプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮ８１（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋改変Ｈ５Ｒプロモーター＋ＧＵＳ１）
ｐＢＮ６１（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｂ１Ｒプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮ６２（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｂ２Ｒプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮ６３（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｂ３Ｒプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮ６０（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ａ３０Ｒプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮ８２（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ワクシニアウイルス７．５Ｌプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮ８３（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｃ７Ｌプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ４９（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ａ４２Ｒプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ６９（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｉ２Ｒプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ７２（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｋ５Ｌプロモーター＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ８３（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｆ６Ｒプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ８４（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｂ９Ｒプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６＋ＧＵＳ）
ｐＢＮＸ８５（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋ＭＶＡ  Ｊ６Ｒプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）＋ＧＵＳ）
トランスフェクションキット：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ社）
培地および添加物質：１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）  
試薬および緩衝液：溶解緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ＋１ｍＭのプロテアーゼ阻害剤）ＡｒａＣ（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｃ１７６８）
ＧＵＳ基質１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニル−ベータ−（Ｄ）−グルクロニド；  Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｎ１６２７）
停止溶液２．５Ｍ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；  Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ａ  ９７５４）。
【００５３】
１．３  方法
細胞の播種
６ウェルプレートのウェルにおけるトランスフェクション反応あたり５×１０５個のＢＨＫ細胞を播種し、３７℃および５％ＣＯ２におけるＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で一晩維持した。
【００５４】
感染／［トランスフェクション］
１ウェルあたり０．５ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにおいて、細胞にＭＶＡ−ＢＮ（ｍｏｉ  ０．１）を感染させ、室温下、振とう器において１時間インキュベートした。トランスフェクションを製造者のプロトコールに記載されるとおりに実施した。２μｇのプラスミドを緩衝液ＥＢ（１００μｌの全容量）に希釈した。３．２μｌのエンハンサー溶液の添加後、該溶液を混合し室温で５分間インキュベートした。その後、１０μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を添加し、懸濁液を混合して室温で１０分間インキュベートした。ウイルス懸濁液を細胞から除去し、１．６ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを添加した。０．６ｍｌのＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳをＤＮＡ  Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ混合物に添加し、培養プレートを回転させながら細胞に滴下した。その後、細胞を解析によって７、２４または４８時間インキュベートした。初期／後期発現の解析のために、感染およびトランスフェクションの間にＡｒａＣを培地に添加した（４０μｇ／ｍｌ）。
【００５５】
細胞の回収
培地を細胞から除去し、０．５ｍｌの溶解緩衝液を添加した。室温で１５分間振とうした後、細胞を溶解緩衝液中で破砕し、１．５ｍｌの反応チューブに移して、激しく撹拌した。溶解した細胞につき４℃、５００ｒｃｆで１分間遠心分離を行い、透明な上清を新しいバイアルに移して使用するまで−２０℃で保存した。
【００５６】
ＧＵＳ活性の測定
１０μｌの細胞抽出液（＝２×１０４個の細胞からのタンパク質）を１ｍｌの予め温めた基質溶液（３７℃）に添加し、黄色が呈色するまで３７℃でインキュベートした。サンプルをその後直ちに氷上に置き、０．４ｍｌの停止溶液を添加した。４１５ｎｍの吸光度を測定し、ＧＵＳ活性を直線範囲にある０．０５〜２．０の吸光度の値として扱った。基質溶液を基準として使用し、ＭＶＡ−ＢＮ感染細胞の細胞抽出液をネガティブコントロールとして使用した。
【００５７】
１．４  実施例および結果
実施例１：推定プロモーターの機能の測定
第一の実験において、ＧＵＳ遺伝子と融合した推定ＭＶＡプロモーター、またはよく特性が確認されているプロモーターを含む全てのプラスミドを解析した。細胞にＭＶＡ−ＢＮ（ｍｏｉ  ０．１）を感染させ、対応するプラスミドでトランスフェクションを行った。４８時間後に細胞を回収し、溶解させてＧＵＳ活性を測定した。この実施例は、各プロモーターが機能的であるかどうかを測定するために実施した。結果を図１に示す。
【００５８】
ネガティブコントロール（ＭＶＡ−ＢＮ感染細胞からの抽出物）は、明確なＧＵＳ活性を示さなかった（Ｚｅｘ；吸光度０．００１）。特性がよく確認されている強力な合成Ｐｓプロモーターは、発現の４８時間後に高量のＧＵＳが検出されたので、非常に効率的であることが示された（Ｐｓ；吸光度０．８７）。また、公知の天然に存在するワクシニアウイルスｐｒ７．５プロモーターもまた非常に高い活性を示した（ｐ７．５；吸光度０．４１）。ｐｒ７．５の後期部分もまた明確に検出可能な活性を示す（７．５Ｌ；吸光度０．２５）。牛痘ＡＴＩプロモーターは、ＭＶＡ−ＢＮによる外来遺伝子の発現に非常に効率的であることが明確に示される（ＡＴＩ；吸光度０．７６）。ＭＶＡ−ＢＮゲノムの推定プロモーター領域に関して、Ａ４２Ｒ（Ａ４２；吸光度０．４８）、Ｂ９Ｒ（Ｂ９；吸光度０．０６）、Ｃ７Ｌ（Ｃ７；吸光度０．０５５）、Ｆ６Ｒ（Ｆ６；吸光度０．２０８）、Ｉ２Ｒ（Ｉ２；吸光度０．１３０）およびＪ６Ｒ（Ｊ６；吸光度０．２９０）が機能的なプロモーターであることが示された。第一の予備実験において活性（吸光度＞０．０５）であることが明確に示されたプロモーターについて、さらに詳
細に特性を明らかにした（実施例２）。
【００５９】
実施例２：プロモーターの発現特性
実施例１において活性を示したプロモーターを、それらの発現パターンに関して特性を明らかにした。前記の目的のために、ＭＶＡ−ＢＮを感染させ、対応するプラスミドでトランスフェクションを行った細胞をＡｒａＣとともにインキュベートした。ＡｒａＣは、ＭＶＡの複製サイクル間での遺伝子の後期発現のために必須な必要条件であるＤＮＡ複製を阻害する。同時に、同一の実験をＡｒａＣの添加なしで実施した。感染させた、およびトランスフェクションを行った細胞を２４時間後に回収し、ＧＵＳ活性の測定を三重に行った。図２は、各サンプルの平均吸光度を示す。
【００６０】
ＡｒａＣなし（−ＡｒａＣ）で２４時間インキュベーションした後に、全体のＧＵＳ発現（初期＋後期）がすべてのプロモーターについて明確に検出された（図２：右列）。新しく同定したプロモーターの強さは、Ｉ２Ｒ（Ｉ２）＞Ａ４２Ｒ（Ａ４２）＞Ｆ６Ｒ（Ｆ６）＞Ｊ６Ｒ（Ｊ６）＞Ｂ９Ｒ（Ｂ９）＝Ｃ７Ｌ（Ｃ７）の順に減少していく。
【００６１】
後期発現を阻害するＡｒａＣを添加してのインキュベーション（＋ＡｒａＣ）の結果、ネガティブコントロール（Ｚｅｘ）の発現レベルに匹敵するＧＵＳの発現レベルが得られたので、プロモーターＢ９、Ｃ７およびＪ６は、ＭＶＡのライフサイクルの間において主に後期発現に関連することが示された。Ｃ７Ｌプロモーターはある程度弱いことが明らかになったが、それは初期発現の間において重要な役割を果たすことが示唆される。
【００６２】
プロモーターＡ４２Ｒ、Ｉ２ＲおよびＦ６Ｒは非常に効率的な初期発現を明確に示した。初期発現の測定に関しては、検出可能な呈色反応を得るためにサンプルを一晩インキュベートしなければならなかった。これらの結果は、初期＋後期発現（図２：−ＡｒａＣ）が５時間しかインキュベートされていないため、これらの値と直接比較することはできない。初期発現を示さなかったプロモーターを発現の７時間後に再び解析し、２４時間後の結果を確認することができた（データは示さず）。
【００６３】
１．５  結論
異なる強さのプロモーターを得ることができ、インキュベーション時間およびＭＶＡ−ＢＮの複製可能性に依存して異なる発現パターンを示す多種多様な異なるプロモーターを利用できることが明確に示された。初期＋後期発現が好ましい場合には、プロモーターＡ４２Ｒ、Ｉ２ＲおよびＦ６Ｒを使用するのが好ましい。初期発現を避けなければならない場合（例えば、初期発現に対する終結シグナルＴＴＴＴＴＮＴを含む外来遺伝子）には、プロモーターＢ９Ｒ、Ｊ６ＲまたはＣ７Ｌを使用するのが好ましい。
【００６４】
＜実施例２：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４に由来する最小プロモーターエレメントの解析＞
実施例１では、ＭＶＡゲノムにおいて外来遺伝子を発現するのに特に適している配列がいくつか同定された。さらに短い断片が同一の目的を満たすかどうかを確認するために、さらに実験を実施した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４のさらに短い断片をＰＣＲにより単離し、プラスミド骨格（ｐＢＳＫＳ＋）にクローニングした。全部で６個の推定最小プロモーターについて試験を行った。これらの活性の可能性を解析するために、該プロモーターをＧＵＳレポーター遺伝子に融合させた。ＢＨＫ細胞にＭＶＡ−ＢＮを感染させ、ＧＵＳ遺伝子に融合させた推定最小プロモーターを含むプラスミドでトランスフェクションを行った。ＧＵＳの発現を測定することにより、活性および発現の強さに関して、推定プロモーターのスクリーニングを行った（実施例１参照）。ポジティブコントロールとしておよび参照として、よく特性が明らかにされているワクシニアウイルスプロモーターＰｓをＧＵＳと融合させ同時に解析した。約３０ｂｐの最小プロモーターエレメントは、元々の相同的な配列と追加的にクローニングしたプロモーターとの間の相同組換えの危険性なしに、組換えＭＶＡコンストラクト（ｒｅｃＭＶＡ−ＢＮ）中の外来遺伝子の発現に使用することができる。
【００６５】
２．１  材料および方法
特に言及しない限り、実施例２において用いる材料および方法は実施例１における方法と一致する。ＰＣＲは標準的方法により実施した。
【００６６】
２．２  実験および結果
ＰＣＲによるプロモーターのＧＵＳへの融合
ＰＣＲ反応により以下の最小プロモーター配列をＧＵＳ遺伝子へ融合させた：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（「Ａ４２ショートレート（Ａ４２  ｓｈｏｒｔ  ｌａｔｅ）」）ＴＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＴＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＣＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８（「Ｊ６Ｒショートレート」）ＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴＡＴ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（「Ｆ６Ｒショートアーリー（Ｆ６Ｒ  ｓｈｏｒｔ  ｅａｒｌｙ）」）ＡＧＡＧＴＧＴＡＧＴＡＴＣＡＴＡＧＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（「Ｆ６Ｒショートレート」）ＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＡＧＴＡＴＡＡＡＴ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（「Ｉ２Ｒショートアーリー」）ＡＧＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＴＴＡＧＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（「Ｉ２Ｒショートレート」）  ＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＧＣＡＴＡＡＡＴ。
【００６７】
ＧＵＳ遺伝子と融合させた推定最小プロモーターを全て、ｐＢＳＫＳ＋にクローニングし、塩基配列の決定を行った。
【００６８】
推定最小プロモーターの機能の測定
推定最小プロモーターエレメントの機能性を解析するために、ＢＨＫ細胞にＭＶＡ−ＢＮ（ｍｏｉ  １．０）を感染させ、対応するプラスミドでトランスフェクションを行った。２４時間後に細胞を回収し、溶解して、ＧＵＳ活性を測定した（図３）。
【００６９】
ネガティブコントロール（ＭＶＡ−ＢＮ感染細胞から抽出）は明らかにＧＵＳ活性を示さなかった（コントロール；平均吸光度０．００１６７）。よく特性が明らかにされている強力な合成Ｐｓプロモーターは、発現の２４時間後に高量のＧＵＳが検出可能であったので、非常に効率的（Ｐｓ；平均吸光度２．０５２６７）であることが示された。ＭＶＡ−ＢＮゲノムの推定最小プロモーターエレメントに関して、Ｆ６Ｒショートアーリー、Ｆ６Ｒショートレート、Ｉ２Ｒショートアーリー、Ｉ２Ｒショートレート、Ａ４２ＲショートレートおよびＪ６Ｒショートレートの全てが機能的なプロモーターであることが示された。
【００７０】
全部で６個の機能的な最小プロモーターエレメントを単離した。２つは弱い初期転写に適しており（Ｉ２Ｒショートアーリー：平均吸光度０．０６９３３；Ｆ６Ｒショートアーリー：平均吸光度０．１８９）、４つは異なるレベルの後期発現に適している（Ｆ６Ｒショートレート：平均吸光度：０．０９８３３；Ｉ２Ｒショートレート：平均吸光度０．３９１；Ｊ６Ｒショートレート：平均吸光度：０．８０１６７およびＡ４２Ｒショートレート：平均吸光度２．０７）。
【００７１】
２．３  結論
異なる強さのプロモーターを単離することができ、多種多様な異なるプロモーターを利用できることが明確に示された。初期発現が好ましい場合には、最小プロモーターＦ６ＲショートアーリーまたはＩ２Ｒショートアーリーを使用するのが好ましい。後期発現が好ましい場合および初期発現を避けなければならない場合（例えば、初期発現に対する終結シグナルＴＴＴＴＴＮＴを含む外来遺伝子）には、最小プロモーターエレメントＦ６Ｒショートレート、Ｉ２Ｒショートレート、Ｊ６ＲショートレートおよびＡ４２Ｒショートレートを使用するのが好ましい。
【図１】
2011067219.tif 000002
【図２】
2011067219.tif 000003
【図３】
2011067219.tif 000004
【配列表】
2011067219000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年12月22日(2010.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列、および（ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の配列のうちの少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチド配列から選択される配列のうちの１つと比較した場合に、少なくとも６０％の相同性を有する配列を含むかまたは該配列からなるプロモーターであって、ワクシニアウイルスプロモーターとして活性であり、および／またはワクシニアウイルス感染細胞において活性である、前記プロモーター。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の配列のうちの少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６のヌクレオチド配列と比較した場合に少なくとも９０％の相同性を有する配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１または２のいずれか１つに記載のプロモーター。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１〜３のいずれか１つに記載のプロモーター。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の誘導体を含むかまたは該誘導体からなり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６と比較した場合に、前記誘導体において多くとも１０個のヌクレオチドが置換され、欠失しおよび／または挿入される、請求項１記載のプロモーター。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の誘導体を含むかまたは該誘導体からなり、ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の対応する配列と比較した場合に、前記誘導体において多くとも５個のヌクレオチドが置換され、欠失しおよび／または挿入される、請求項１記載のプロモーター。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の誘導体を含むかまたは該誘導体からなり、前記誘導体がＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６と比較した場合に少なくとも９０％の相同性を有する、請求項１記載のプロモーター。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６の配列を含むかまたは該配列からなる、請求項１または５〜７のいずれか１つに記載のプロモーター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のプロモーターおよびコード配列を含む発現カセットであって、コード配列の発現が前記プロモーターにより制御され、そしてこの発現カセットがワクシニアウイルスのゲノム中に天然に存在する発現カセットではない、前記発現カセット。
【請求項１０】
コード配列が治療用タンパク質またはペプチド、抗原、抗原エピトープ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムをコードする、請求項９記載の発現カセット。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のプロモーターまたは請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセットを含むＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のプロモーターまたは請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項１３】
プラスミドベクターおよびウイルスベクターから選択される、請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
ウイルスベクターがワクシニアウイルスである、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
ワクシニアウイルスが改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）である、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
ベクターの生成のために使用される改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）が、欧州細胞カルチャーコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ）に寄託番号Ｖ０００８３００８で寄託されたＭＶＡ−ＢＮ株であるか、または以下の特性：
（ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）において増殖的に複製する能力を有するが、ヒト表皮ケラチノ細胞系ＨａＣａｔ、ヒト胚腎細胞系２９３、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂおよびヒト頸部腺癌細胞系ＨｅＬａにおいて増殖的に複製する能力は有さないこと、および
（ｉｉ）成熟ＢおよびＴ細胞を生成できないマウスモデルにおいて複製することができないこと、
を有するＭＶＡ−ＢＮ変異体である、請求項１５記載のベクター。
【請求項１７】
ベクターの生成のために使用される改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）が、ＥＣＡＣＣに寄託番号ＶＡ９４０１２７０７で寄託されたＭＶＡ５７２株または寄託番号Ｖ００１２０７０７で寄託されたＭＶＡ  ５７５株である、請求項１５記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のプロモーター、または請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセットがＭＶＡゲノムの天然に存在する欠失部位に挿入される、請求項１５〜１７のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のプロモーター、または請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセットが、ウイルスゲノムの非必須部分またはウイルスゲノムの遺伝子間領域に挿入される、請求項１５〜１７のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項２０】
ワクチンまたは薬剤としての請求項１２〜１９のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項２１】
請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセット、請求項１１記載のＤＮＡまたは請求項１２〜１９のいずれか１つに記載のベクターを含むワクチンまたは医薬調合物。
【請求項２２】
少なくとも１０２ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量）の請求項１４〜１９のいずれか１つに記載のウイルスベクターを含む、請求項２１記載のワクチンまたは医薬調合物。
【請求項２３】
ワクチンまたは薬剤の製造のための、請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセット、請求項１１記載のＤＮＡまたは請求項１２〜１９のいずれか１つに記載のベクターの使用。
【請求項２４】
薬剤またはワクチンが請求項２２記載のウイルスベクターを含み、第一接種（「初回免疫接種」）および第二接種（「追加免疫接種」）において、薬剤が治療的有効量のベクターとともに投与されるためのものである、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
標的細胞へコード配列を導入するための、請求項１２〜１９のいずれか１つに記載のベクター。
【請求項２６】
標的細胞へコード配列を導入するための、請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセット。
【請求項２７】
標的細胞へコード配列を導入するための、請求項１１記載のＤＮＡ。
【請求項２８】
ペプチド、タンパク質および／またはウイルスを製造するための請求項１３〜１９のいずれか１つに記載のウイルスベクターであって、前記ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが前記ウイルスベクターの宿主細胞への感染、および感染した宿主細胞の適当な条件下における培養により産出され、そして該ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが単離および／または濃縮される、ウイルスベクター。
【請求項２９】
ペプチド、タンパク質および／またはウイルスの製造のための請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセットであって、前記ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが前記発現カセットを用いる細胞のトランスフェクション、ワクシニアウイルスの細胞への感染、および適当な条件下での感染した宿主細胞の培養により産出され、そして、該ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが単離および／または濃縮される、発現カセット。
【請求項３０】
ペプチド、タンパク質および／またはウイルスの製造のための請求項１１記載のＤＮＡであって、前記ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが前記ＤＮＡを用いる細胞のトランスフェクション、ワクシニアウイルスの細胞への感染、および適当な条件下での感染した宿主細胞の培養により産出され、そして、該ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが単離および／または濃縮される、ＤＮＡ。
【請求項３１】
ペプチド、タンパク質および／またはウイルスの製造のための請求項１３記載のプラスミドベクターであって、前記ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが前記プラスミドベクターを用いる細胞のトランスフェクション、ワクシニアウイルスの細胞への感染、および適当な条件下での感染した宿主細胞の培養により産出され、そして、該ペプチド、タンパク質および／またはウイルスが単離および／または濃縮される、プラスミドベクター。
【請求項３２】
請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセットまたは請求項１３〜１９のいずれか１つに記載のウイルスベクターを含む細胞。
【請求項３３】
コード配列の発現のための請求項１〜８のいずれか１つに記載のプロモーターであって、コード配列がワクシニアウイルスにおいて天然にプロモーターと連結している配列ではない、プロモーター。
【請求項３４】
請求項９または１０のいずれか１つに記載の発現カセットをベクターゲノムに挿入する段階を含む、請求項１２〜１９のいずれか１つに記載のベクターを製造する方法。
【外国語明細書】
2011067219000001.pdf