(57)【要約】      （修正有）【課題】幅広い基質スペクトル，高いエナンチオ選択性，及び有機溶媒に対する高い安定性によって特徴とする酸化還元酵素を提供する。【解決手段】ピキア属の酵母，より詳細にはピキア・カプスラータから得られるＮＡＤＨ依存性酸化還元酵素。該酸化還元酵素は，有機ケト化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物へエナンチオ選択的に還元。また，ピキア・カプスラータから単離した組換え過剰発現酸化還元酵素を用いた二相系において（Ｓ）−ヒドロキシ化合物をエナンチオ選択的に調製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、
（ａ）配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードするＤＮＡ、
及び、
（ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列に対し、７０％よりも大きな同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡによってエンコードされることを特徴とする、酸化還元酵素。
【請求項２】
前記ＤＮＡは、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対し、８０％〜９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、請求項１記載の酸化還元酵素。
【請求項３】
前記ＤＮＡは、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対し、９０％〜９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列をエンコードすることを特徴とする、請求項１記載の酸化還元酵素。
【請求項４】
ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、
配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによってエンコードされることを特徴とする、酸化還元酵素。
【請求項５】
ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒する酸化還元酵素をエンコードし、
（ａ）配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖、
及び、
（ｂ）配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
からなる群から選択されることを特徴とする、単離ＤＮＡ。
【請求項６】
ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、
エチル−４−クロロ−３−オキソブタン酸から（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸への還元反応によって見積もられる比活性が１μｍｏｌ／ｍｇタンパク質を超え、
（ａ）配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、
（ｂ）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードするＤＮＡ、
及び、
（ｃ）配列番号９に記載のアミノ酸配列に対し、７０％よりも大きな同一性を有するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡによってエンコードされることを特徴とする、酸化還元酵素。
【請求項７】
ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元する反応を触媒し、エチル−４−クロロ−３−オキソブタン酸から（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸への反応によって見積もられる比活性が１μｍｏｌ／ｍｇタンパク質を超える酸化還元酵素をエンコードし、
（ａ）配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖、
及び、
（ｂ）配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはその相補鎖に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
からなる群から選択されることを特徴とする、単離ＤＮＡ。
【請求項８】
カルボニル化合物を対応するヒドロキシ化合物にエナンチオ選択的に還元する方法であって、
ＮＡＤＨ及び水の存在下で、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酸化還元酵素によってカルボニル化合物を対応するヒドロキシ化合物に還元することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，オキシドレダクターゼと，カルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物へエナンチオ選択的に還元するための方法と，キラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を得るための方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性ヒドロキシ化合物は，薬理活性化合物や芳香族物質，フェロモン，農薬，酵素阻害剤の合成に広く適用できる有用なキラル成分である。
【０００３】
同時に，生体触媒作用への大規模な用途に好適であり，且つ低コストで十分な量が入手可能なカルボニル還元酵素の数は極端に限られている。次のＮＡＤＨ依存性Ｓ特異的カルボニル還元酵素が知られている。ウマ肝臓由来アルコール脱水素酵素（ＨＬＡＤＨ）（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．６，１９８２年，１０７頁），酵母由来アルコール脱水素酵素（ＹＡＤＨ）（Ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，（１９６３年），２５〜８３頁，ニューヨーク：アカデミックプレス），カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）由来カルボニル還元酵素（ＣＰＣＲ）（米国特許第５，５２３，２２３号及び米国特許第５，７６３，２３６号），ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）由来カルボニル還元酵素（ＲＥＣＲ）（米国特許第５，５２３，２２３号）及びノルカディア・フスカ（Norcardia fusca）由来カルボニル還元酵素（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１０）（１９９９年），１７２１〜１７２９頁），カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）由来アルコール脱水素酵素（Ｂｉｏｃｈｉｍ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７１６，（１９８２年），２９８〜３０７頁），又はスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来アルコール脱水素酵素（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１７０（１９９９年），３１〜３９頁）。
【０００４】
従来，上述のカルボニル還元酵素はいずれも大規模には用いられていない。その主な理由としては，基質スペクトルが狭すぎることが多かったり，該酵素のエナンチオ選択性が低かったりすることに加え，何よりも該酵素の入手性が挙げられる。従来，上述の酵素の多くは，十分な量を低コストで供給することができなかった。
【０００５】
上述のカルボニル還元酵素を適用する際に生じる他の問題としては，補因子ＮＡＤＨ或いはＮＡＤＰＨの再生が挙げられる。従来の方法では，例えば，２−プロパノールを用いた基質結合補酵素再生か，或いは，例えば，ギ酸脱水素酵素を用いた酵素結合補酵素再生を用いる。
【０００６】
ギ酸脱水素酵素を用いた酵素結合補酵素再生の不利な点としては，ギ酸脱水素酵素の比活性が低く（４〜１０Ｕ／ｍｇ），従って，組換えギ酸脱水素酵素でさえ比較的高価であることが挙げられる（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．［１９９９年］６４，１８７〜１９３頁）。
【０００７】
イソプロパノールを用いた基質結合補酵素再生の不利な点としては，平衡位置（equilibrium position）が好ましくなく，用いる補基質（イソプロパノール等）に対する酵素安定性が不十分であることが挙げられる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は，幅広い基質スペクトル，高いエナンチオ選択性，及び有機溶媒に対する高い安定性によって特徴とする酸化還元酵素を提供することである。
【０００９】
前記目的は，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元するような酸化還元酵素によって達成される。
【００１０】
先行技術方法における上述の不都合は新規な酸化還元酵素によって未然に防ぐことができることを見出した。
【００１１】
本発明は，好適には，ピキア属或いはカンジダ属の酵母，特にピキア・カプスラータ（Pichia capsulata）から得ることができる酸化還元酵素に関する。
【００１２】
更なる実施形態において，本発明は，配列番号８に記載のＤＮＡ配列及び配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するピキア・カプスラータ由来の酸化還元酵素に関する。これらの配列は添付配列表に記載されている。
【００１３】
一実施形態において，本発明は，アミノ酸の７０％超が配列番号９のアミノ酸配列と同一であり，エチル−４−クロロ−３−オキソブタン酸から（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性が１μｍｏｌ／ｍｇタンパク質を超える酸化還元酵素に関する。アミノ酸の８０％〜９９．５％，特に９０％〜９９．５％，特に９９％〜９９．５％が配列番号９のアミノ酸配列と同一である酸化還元酵素が好ましい。配列番号９に記載の酸化還元酵素或いはその誘導体や類似体（analogon）の比活性の測定は，後述のように，実施例１に記載の試験系によって行う。
【００１４】
本発明に係る酸化還元酵素は，配列番号９のアミノ酸配列を有する酸化還元酵素よりもアミノ酸が１〜４０個多いか或いは１〜４０個少なく，エチル−４−クロロ−３−オキソブタン酸から（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性が１μｍｏｌ／ｍｇタンパク質を超えることを特徴とする。配列番号９のアミノ酸配列を有する酸化還元酵素よりもアミノ酸が１〜２５個，特に２〜２０個，好ましくは３〜１０個多く或いは少なく存在する酸化還元酵素が好ましい。
【００１５】
更に，本発明は，配列番号９のアミノ酸配列を有し，水溶性ポリマーで１回，２回，３回，４回或いは５回修飾（modified）されており，エチル−４−クロロ−３−オキソブタン酸から（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性量が１μｍｏｌ／ｍｇタンパク質を超える酸化還元酵素に関する。水溶性ポリマーとしては，例えば，ポリエチレングリコールが挙げられる。ポリエチレングリコールの結合は，配列番号９に記載のタンパク質のＮ末端で生じるのが好ましい。また，配列番号９に記載の酸化還元酵素は，ポリエチレンやポリスチレン，多糖，セルロース，セルロース誘導体等の固形物に結合することもできる。
【００１６】
更に，本発明は，配列番号９のアミノ酸配列の複数の断片に相当し，一断片当たりのアミノ酸数が５〜３０であるタンパク質断片に関する。６〜２５アミノ酸鎖長，特に８〜２０アミノ酸鎖長或いは１０〜１８アミノ酸鎖長，特に配列番号１０のアミノ酸配列の鎖長を有する配列番号９の複数の断片が好ましい。例えば，前記複数の断片を用いて，ピキア・カプスラータ或いは他の微生物から本発明に係る酸化還元酵素を見出すことができる。
【００１７】
更に，本発明は，配列番号９のアミノ酸配列或いは配列番号９のアミノ酸配列の複数の断片を有する酸化還元酵素に相当し，他のポリペプチドに対してＮ末端或いはカルボキシ末端でペプチド結合により結合しているアミノ酸の数が５〜３０であることを特徴とする融合タンパク質に関する。融合タンパク質は，例えば，他のタンパク質からより容易に分離することができるか，或いは細胞内でより大量に発現される。
【００１８】
更に，本発明は，配列番号９或いは配列番号１０に記載の酸化還元酵素に特異的に結合する抗体に関する。前記抗体の産生は，従来の方法に従い，好適な哺乳動物を免疫した後に該抗体を得ることによって行う。該抗体はモノクローナル抗体であってもよくポリクローナル抗体であってもよい。
【００１９】
また，本発明は，配列番号９及び配列番号１０に記載の酸化還元酵素をコードする単離核酸配列にも関する。
【００２０】
更に，本発明は，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物の対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物への還元を触媒する酸化還元酵素の単離ＤＮＡ配列であって，
ａ）配列番号８，配列番号５，配列番号６或いは配列番号７に記載のヌクレオチド配列或いはその相補鎖を有するＤＮＡ配列，
ｂ）ａ）に記載のＤＮＡ配列の一種以上或いはその相補鎖に対し，ストリンジェントな条件下で行うハイブリダイゼーションによってハイブリダイズするＤＮＡ配列，及び
ｃ）遺伝コードの変性によって，ａ）或いはｂ）に記載のＤＮＡ配列の一種以上でコードされるたんぱく質をコードするＤＮＡ配列
から成る群から選択される単離ＤＮＡ配列に関する。
【００２１】
ハイブリダイゼーション時の一般的な条件については，サンブロック（Sambrok）及びラッセル（Russel），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．１，第１章，プロトコル  ３０〜３２に記載されている。
【００２２】
更に，本発明は，核酸塩基の７０％超が配列番号８に記載のＤＮＡ配列或いはその相補鎖と同一であり，エチル−４−クロロ−３−オキソブタン酸から（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性が１μｍｏｌ／ｍｇタンパク質を超える酸化還元酵素をコードするＤＮＡ配列に関する。核酸塩基の８０％〜９９．５％，特に９０％〜９９．５％，特に９９％〜９９．５％が配列番号８に記載のＤＮＡ配列と同一であるＤＮＡ配列が好ましい。
【００２３】
更に，本発明は，１０〜５０個の核酸塩基を有し，配列番号８に記載のＤＮＡ配列の一以上の部分或いはその相補鎖に対応する配列を有する核酸配列に関する。上述のＤＮＡ配列の内の１５〜４５個の核酸塩基，特に２０〜４０個或いは３０〜４０個の核酸塩基を有する核酸配列が好ましい。上述の核酸配列は，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための分子プローブ或いはプライマーとして好適である。
【００２４】
更に，本発明は，上述の核酸配列或いはＤＮＡ配列の一以上を含むクローニングベクターに関する。更に，本発明は，細菌細胞，昆虫細胞，植物細胞或いは哺乳類細胞内にあり，発現制御配列に対して適切に結合している上述の核酸配列或いはＤＮＡ配列の一以上を含む発現ベクターに関する。更に，本発明は，細菌細胞，酵母細胞，昆虫細胞，植物細胞或いは哺乳類細胞であって，発現ベクターで形質転換或いはトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
【００２５】
上述のＤＮＡ配列或いは上述のアミノ酸配列の同一性については，タンパク質或いはＤＮＡ配列それぞれの部分配列と同一なアミノ酸或いは核酸塩基の数を合計し，その合計をアミノ酸或いは核酸塩基の総数で割り，得られた値に１００を掛けることによって算出する。
【００２６】
好適なクローニングベクターとしては，例えば，ｐｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ，ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）や，ｐＤｒｉｖｅクローニングベクター（キアゲン，ドイツ，ヒルデン），ｐＳ  Ｂｌｕｅ，ｐＥＴ  Ｂｌｕｅ及びｐＥＴ  ＬＩＣベクター（ノバジェン，米国，マディソン），ＴＡ−ＰＣＲクローニングベクター（インビトロジェン，ドイツ，カールスルーエ）が挙げられる。
【００２７】
好適な発現ベクターとしては，例えば，ｐＫＫ２２３−３やｐＴｒｃ９９ａ，ｐＵＣ，ｐＴＺ，ｐＳＫ，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，ｐＧＥＭ，ｐＱＥ，ｐＥＴ，ＰＨＵＢ，ｐＰＬｃ，ｐＫＣ３０，ｐＲＭ１／ｐＲＭ９，ｐＴｒｘＦｕｓ，ｐＡＳ１，ｐＧＥｘ，ｐＭＡＬ，ｐＴｒｘが挙げられる。
【００２８】
好適な発現制御配列としては，例えば，ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）−プロモーターやｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）プロモーター，ｌａｃ−プロモーター，Ｔ７−プロモーター，λｐＬ−プロモーターが挙げられる。
【００２９】
ピキア・カプスラータ由来の酸化還元酵素は，ＳＤＳ−ゲルによって求められる分子量が３４±２ｋＤａ，ゲル浸透クロマトグラフィーによって求められる分子量が１４０±１０ｋＤａのホモ四量体である。酸化還元酵素の最適温度は，４０℃〜４５℃の範囲であり，還元反応における最適ｐＨは６．５〜７．０であり，酸化反応における最適ｐＨは７．８〜８．２である。ピキア・カプスラータ由来の酸化還元酵素は，良好な温度安定性及びｐＨ安定性を示し，ｐＨ範囲５．５〜８．５及び温度範囲１５℃〜４０℃において５時間安定であり，更に，有機溶媒中で高い安定性を示す。
【００３０】
該酵素は，特にピキア属の酵母から単離することができ，分光光度試験にて適切な基質（例えば，エチル−４−クロロ−３−オキソブチラートや２−ブタノン）の存在下で３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨの減少によって検出することができる。
【００３１】
ピキア・カプスラータ由来の本発明に係る酸化還元酵素は，１，０００〜１０，０００Ｕ／ｇ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）湿重量の活性を有する大腸菌でクローン化し，過剰発現させることができた。該酵素は，安価で大量に入手可能である。データベースにおける配列比較から，ピキア・カプスラータ由来の本発明に係る酸化還元酵素は亜鉛依存性カルボニル還元酵素であることが分かる。
【００３２】
また，本発明は，ピキア・カプスラータから酸化還元酵素を得るための方法にも関する。この目的のためには，ピキア・カプスラータ由来の酸化還元酵素をコードするＤＮＡを，例えば，好適な原核微生物或いは真核微生物で発現させる。好ましくは，ピキア・カプスラータ由来の酸化還元酵素を大腸菌株に形質転換し，特に大腸菌ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）細胞で発現させる。
【００３３】
ピキア・カプスラータ由来の酸化還元酵素は，例えば，上述の組換え大腸菌細胞を培養し，酸化還元酵素の発現を誘導した後，約１０〜１８時間（ｈ）後に超音波処理或いはグローブミル（Ｒｅｔｓｃｈ  ＧｍｂＨ，ドイツ，ハーン，１０分，２４Ｈｚ）にてガラスビーズを用いた湿式粉砕により細胞を消化することによって得ることができる。得られた細胞抽出物は直接用いてもよく，或いは更に精製してもよい。この目的のためには，例えば，細胞抽出物を遠沈し，得られた上清をイオン交換クロマトグラフィー，例えば，Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（登録商標）装置（ファルマシア）によるイオン交換クロマトグラフィーに付す。
【００３４】
更に，本発明は，カルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物へエナンチオ選択的に還元するための方法であって，
ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の酸化還元酵素，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元し，
ｂ）生成したキラル（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離する
ことを特徴とする方法に関する。
【００３５】
本発明に係る方法は，高耐用性（high service life）を有し，産生するキラル（Ｓ）−ヒドロキシ化合物のエナンチオマー純度が９５％を超え，カルボニル化合物の供給量に対する収率が高い。
【００３６】
「ＮＡＤＨ」とは，還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味する。「ＮＡＤ」とは，ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味する。
【００３７】
「カルボニル化合物」とは，例えば，式Ｉ
Ｒ１−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２    （Ｉ）
で表される化合物を意味する。
【００３８】
Ｒ１基は，例えば，
１）直鎖或いは分岐鎖の−（Ｃ１−Ｃ２０）−アルキル，
２）直鎖或いは分岐鎖であり，鎖長に応じて１個，２個，３個或いは４個の二重結合を含む−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルケニル，
３）直鎖或いは分岐鎖であり，任意的に１個，２個，３個或いは４個の三重結合を含む−（Ｃ２−Ｃ２０）−アルキニル，
４）−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール，
５）−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル−（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール，
６）非置換であるか，或いはハロゲン，ヒドロキシル，アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−（Ｃ５−Ｃ１４）−複素環，或いは
７）−（Ｃ３−Ｃ７）−シクロアルキルであって，
１）〜７）で記載した各基は非置換であるか，或いは互いに独立して，
ａ）−ＯＨ，
ｂ）フッ素や塩素，臭素，ヨウ素等のハロゲン，
ｃ）−ＮＯ２，或いは
ｄ）−ＮＨ２
で一置換，二置換或いは三置換されている。
【００３９】
Ｒ２基は，例えば，
１）直鎖或いは分岐鎖の−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル，
２）直鎖或いは分岐鎖であり，鎖長に応じて１個，２個或いは３個の二重結合を含む−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニル，
３）直鎖或いは分岐鎖であり，任意的に１個或いは２個の三重結合を含む−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニル，或いは
４）アルキル部分が直鎖或いは分岐鎖であり，非置換であるか，或いはハロゲン，ヒドロキシル，アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−（Ｃ０−Ｃ１０）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルであって，
１）〜４）で記載した各基は非置換であるか，或いは互いに独立して，
ａ）−ＯＨ，
ｂ）フッ素や塩素，臭素，ヨウ素等のハロゲン，
ｃ）−ＮＯ２，或いは
ｄ）−ＮＨ２
で一置換，二置換或いは三置換されている。
【００４０】
キラル「（Ｓ）−ヒドロキシ化合物」とは，例えば，式ＩＩ
Ｒ１−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ２    （ＩＩ）
で表される化合物を意味し，式中，ＯＨ基は通常，それが結合している炭素原子に対して（Ｓ）配置であり，Ｒ１及びＲ２は式Ｉの場合と同様の意味を有する。
【００４１】
しかし，カルボニル基或いはハロゲン原子が該アルコールの近くに位置する場合には，命名が変わり，エナンチオ選択的アルコールを「（Ｒ）−アルコール」と称することもある。しかし，これは単に命名の問題であり，本発明に係る酸化還元酵素によって行われる立体選択的還元方法に変化はない。
【００４２】
「アリール」とは，環内に６〜１４個の炭素原子を含む芳香族炭素基を意味する。−（Ｃ６−Ｃ１４）アリール基としては，例えば，フェニルやナフチル，１−ナフチル，２−ナフチル，ビフェニリル，２−ビフェニリル，３−ビフェニリル，４−ビフェニリル，アントリル，フルオレニルが挙げられる。ビフェニリル基，ナフチル基，特にフェニル基が好ましいアリール基である。「ハロゲン」とは，フッ素，塩素，臭素及びヨウ素から成る族の元素を意味する。「−（Ｃ１−Ｃ２０）アルキル」とは，炭素鎖が直鎖或いは分岐鎖であり，１〜２０個の炭素原子を含んでいる炭化水素基を意味し，例えば，メチルやエチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，第三ブチル，ペンチル，ヘキシル，ヘプチル，オクチル，ノネニル（nonenyl），デカニルが挙げられる。「−Ｃ０アルキル」とは共有結合を意味する。
【００４３】
「−（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル」とは，シクロプロピルやシクロブチル，シクロペンチル，シクロへキシル，シクロヘプチル等の環状炭化水素基を意味する。
【００４４】
「−（Ｃ５−Ｃ１４）複素環」とは，部分的或いは完全に飽和されている単環式或いは二環式の５員〜１４員複素環を意味する。ヘテロ原子の例としては，ＮやＯ，Ｓが挙げられる。「−（Ｃ５−Ｃ１４）複素環」の例としては，ピロ−ルやフラン，チオフェン，イミダゾール，ピラゾール，オキサゾール，イソオキサゾール，チアゾール，イソチアゾール，テトラゾール，１，２，３，５−オキサチアジアゾール−２−オキシド，トリアゾロン，オキサジアゾロン，イソオキサゾロン，オキサジアゾリジンジオン，Ｆ，−ＣＮ，−ＣＦ３或いは−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４）アルキルで置換されたトリアゾール，３−ヒドロキシピロ−２，４−ジオン，５−オキソ−１，２，４−チアジアゾール，ピリジン，ピラジン，ピリミジン，インドール，イソインドール，インダゾール，フタラジン，キノリン，イソキノリン，キノキサリン，キナゾリン，シンノリン，前記複素環のカルボリン及びベンズアネル化（anellated）誘導体，前記複素環のシクロペンタ，シクロヘキサ或いはシクロへプタアネル化（anellated）誘導体に由来する基が挙げられる。２−或いは３−ピロ−ルや，４−或いは５−フェニル−２−ピロ−ル等のフェニルピロ−ル，２−フリル，２−チエニル，４−イミダゾリル，メチルイミダゾリル（例えば，１−メチル−２−，−４−或いは−５−イミダゾリル），１，３−チアゾール−２−イル，２−ピリジル，３−ピリジル，４−ピリジル，２−，３−或いは４−ピリジル−Ｎ−オキシド，２−ピラジニル，２−，４−或いは５−ピリミジニル，２−，３−或いは５−インドリル，置換２−インドリル（例えば，１−メチル，５−メチル，５−メトキシ−，５−ベンジルオキシ−，５−クロロ−或いは４，５−ジメチル−２−インドリル），１−ベンジル−２−或いは−３−インドリル，４，５，６，７−テトラヒドロ−２−インドリル，シクロヘプタ［ｂ］−５−ピロリル，２−，３−或いは４−キノリル，１−，３−或いは４−イソキノリル，１−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−イソキノリル，２−キノキサリニル，２−ベンゾフラニル，２−ベンゾ−チエニル，２−ベンズオキサゾリル，ベンゾチアゾリル，ジヒドロピリニジル（dihydropyrinidyl），ピロリジニル（例えば，２−或いは３−（Ｎ−メチルピロリジニル）），ピペラジニル，モルホリニル，チオモルホリニル，テトラヒドロチエニル，ベンゾジオキソラニルが特に好ましい。
【００４５】
式Ｉで表される化合物で好ましいものとしては，例えば，エチル−４−クロロアセトアセテートやメチルアセトアセテート，エチル−８−クロロ−６−オキソオクタン酸，エチル−３−オキソバレリエート，４−ヒドロキシ−２−ブタノン，エチル−２−オキソバレリエート，エチル−２−オキソ−４−フェニルブタン酸，エチルピルベート，エチルフェニルグリコシレート，１−フェニル−２−プロパノン，２，３−ジクロロアセトフェノン，アセトフェノン，２−オクタノン，３−オクタノン，２−ブタノンが挙げられる。
【００４６】
これに対して生成されるＳ−アルコールとしては，例えば，（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸やエチル−（Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸，（Ｓ）−２−オクタノール，（Ｒ）−エチル−８−クロロ−６−ヒドロキシオクタン酸が挙げられる。
【００４７】
好適な酸化還元酵素は，例えば，ピキア・カプスラータに由来する。本発明に係る方法において，酸化還元酵素は完全に精製した状態で用いてもよく，部分的に精製した状態で用いてもよい。本発明の方法は，本発明に係る酸化還元酵素を用いて行うか，或いは本発明に係る酸化還元酵素を含有する細胞を用いて行う。その際に，用いる細胞は，天然状態，透過状態或いは溶解状態で用意することができる。好ましくは，配列番号９に記載のクローン化酸化還元酵素を用いる。
【００４８】
用いる酸化還元酵素の体積当たりの活性は，１００単位／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）〜５，０００Ｕ／ｍＬ（好ましくは〜約５００Ｕ／ｍＬ）である。
【００４９】
反応対象となる式Ｉで表される化合物１ｋｇ当たり，５，０００〜２，０００，０００Ｕ（好ましくは，約１０，０００〜２００，０００Ｕ）の酸化還元酵素を用いる。これにより，酵素単位１Ｕは，１分（ｍｉｎ）当たり式Ｉで表される化合物１μｍｏｌを反応させるのに必要な酵素量に相当する。
【００５０】
更に，本発明は，カルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物へエナンチオ選択的に還元するための方法であって，
ａ）本発明に係る酸化還元酵素，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元し，
ｂ）該酸化還元酵素によって生成したＮＡＤを補基質を用いてＮＡＤＨに還元し，
ｃ）生成したキラル（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００５１】
用いるカルボニル化合物及び酸化還元酵素の量は，上述の方法に記載した量と同等である。本発明に係る方法における好適な補基質としては，エタノールや２−プロパノール（イソプロパノール），２−ブタノール，２−ペンタノール，２−オクタノール等のアルコールが挙げられる。本発明に係る酸化還元酵素及びＮＡＤにより，このような補基質は反応して対応するケトン及びＮＡＤＨとなる。これにより，ＮＡＤＨは再生する。
【００５２】
ＮＡＤをＮＡＤＨへ再生するための補基質（イソプロパノール等）の量は，総体積に対して５％〜５０％，好ましくは８％〜２０％，特に１０％〜１５％である。
【００５３】
更に，本発明は，（Ｓ）−ヒドロキシ化合物をエナンチオ選択的に回収するための方法であって，
ａ）本発明に係る酸化還元酵素，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元し，
ｂ）該酸化還元酵素によって生成したＮＡＤを脱水素酵素及び補基質を用いてＮＡＤＨに還元し，
ｃ）生成したキラル（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００５４】
好適な脱水素酵素としては，例えば，カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）或いはカンジダ・パラプシローシス（Candida
parapsilosis）由来のパン酵母に由来するＮＡＤＨ依存性アルコール脱水素酵素が挙げられる。用いるアルコール脱水素酵素のための好適な補基質としては，エタノールや２−プロパノール（イソプロパノール），２−ブタノール，２−ペンタノール，２−オクタノール等のアルコールが挙げられる。
【００５５】
更に，ＮＡＤ還元は，ギ酸脱水素酵素（ティシュコフ（Tishkov）ら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．［１９９９年］６４，１８７〜１９３，組換えＮＡＤ及びＮＡＤＰ特異的ギ酸脱水素酵素のパイロット規模産生及び単離）によって行うこともできる。ギ酸脱水素酵素の好適な補基質としては，例えば，ギ酸アンモニウムやギ酸ナトリウム，ギ酸カルシウム等のギ酸塩が挙げられる。
【００５６】
基質結合補酵素の再生には，エタノールや２−プロパノール（イソプロパノール），２−ブタノール，２−ペンタノール，２−オクタノール等の第二アルコールを用いることが好ましい。従って，本発明の方法は，更なる脱水素酵素を用いずに行うことが好ましい。
【００５７】
好ましくは，本発明の方法で用いる水にバッファー，例えば，ｐＨ値が５〜１０（好ましくはｐＨ値が６〜９）のリン酸カリウム，ｔｒｉｓ／ＨＣｌ或いはトリエタノールアミンバッファーを添加する。バッファー濃度は１０ｍＭ〜１５０ｍＭである。
【００５８】
また，該バッファーには，酵素を安定化或いは活性化するためのイオン，例えば，亜鉛イオンやマグネシウムイオンを含有させることができる。
【００５９】
温度は，例えば，１０℃〜６０℃，好ましくは，３０℃〜５５℃である。
【００６０】
更に，本発明は，（Ｓ）−ヒドロキシ化合物をエナンチオ選択的に回収するための方法であって，
ａ）本発明の酸化還元酵素，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元し，
ｂ）有機溶媒の存在下で反応を行い，
ｃ）生成したキラル（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００６１】
好ましい有機溶媒としては，例えば，ジエチルエーテルや第三ブチルメチルエーテル，ジイソプロピルエーテル，ジブチルエーテル，酢酸ブチル，へプタン，ヘキサン，シクロヘキサンが挙げられる。
【００６２】
追加溶媒を用いる場合，反応バッチは水相と有機相から成る。有機相は，基質が溶解状態で存在する好適な溶媒によって形成されているか，或いは水不溶性の基質自身によって形成されている。
【００６３】
有機相は総反応物体積の５％〜８０％，好ましくは１０％〜４０％を占める。
【００６４】
本発明に係る二相系においては，水が一液相を形成し，有機溶媒が第二の液相を形成する。更に，例えば，完全に溶解しなかった酸化還元酵素由来及び／又は添加した酵素或いはカルボニル化合物由来の固相或いは他の液相を必要に応じ提供してもよい。しかし，固相のない二液相が好ましい。好ましくは，二液相を機械的に混合して，二液相間に広い界面が形成されるようにする。
【００６５】
補因子ＮＡＤＨの濃度は，水相に対して０．０１ｍＭ〜１ｍＭ，特に０．０５ｍＭ〜０．２ｍＭである。
【００６６】
本発明に係る方法において，用いるカルボニル化合物の量は，総体積に対して３％〜３０％，好ましくは５％〜１５％，特に１０％である。
【００６７】
更に，本発明は，カルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物へエナンチオ選択的に還元するための方法であって，
ａ）本発明の酸化還元酵素，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元し，
ｂ）有機溶媒の存在下で反応を行い，
ｃ）該酸化還元酵素によって生成したＮＡＤを補基質を用いてＮＡＤＨに還元し，
ｄ）生成したキラル（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００６８】
用いるカルボニル化合物及び酸化還元酵素の量は，上述の方法に対応する。本発明の方法における好適な補基質としては，エタノールや２−プロパノール（イソプロパノール），２−ブタノール，２−ペンタノール，２−オクタノール等のアルコールが挙げられる。本発明の酸化還元酵素及びＮＡＤにより，このような補基質は反応して対応するケトン及びＮＡＤＨとなる。これにより，ＮＡＤＨは再生する。
【００６９】
ＮＡＤをＮＡＤＨへ再生するための補基質（イソプロパノール等）の量は，総体積に対して５％〜５０％，好ましくは８％〜２０％，特に１０％〜１５％である。
【００７０】
更に，本発明は，カルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物へエナンチオ選択的に還元するための方法であって，
ａ）本発明の酸化還元酵素，ＮＡＤＨ及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する（Ｓ）−ヒドロキシ化合物に還元し，
ｂ）該酸化還元酵素によって生成したＮＡＤを脱水素酵素及び補基質を用いてＮＡＤＨへ同時に（simultaneously）還元し，
ｃ）有機溶媒の存在下で反応を行い，
ｄ）生成したキラル（Ｓ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００７１】
好ましくは，本発明に係る方法においては，アルコール脱水素酵素のための更なる安定剤を用いる。好適な安定剤としては，例えば，グリセロールやソルビトール，１，４−ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ），ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
【００７２】
本発明に係る方法は，例えば，ガラス或いは金属から成る密閉反応容器内で行う。この目的のためには，各成分を個々に反応容器に投入し，例えば，窒素や空気雰囲気下で撹拌する。反応時間は用いる基質やカルボニル化合物よって異なり，１時間〜４８時間，特に２時間〜２４時間である。
【００７３】
次いで，得られた反応混合物を再処理する。この目的のためには，水相を分離し，有機相をろ過する。必要に応じ水相を再度抽出し，有機相と同様に更に再処理してもよい。その後，ろ過した有機相から溶媒を必要に応じ蒸発させる。このようにして，エナンチオマー純度が９９％を超え，抽出物であるエチル−４−クロロアセトアセテートを実質的に含まない生成物（Ｒ）−エチル−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸を得る。該生成物を蒸留した後，この方法の全収率は，用いた抽出物の量に対し５０％〜９５％となる。
【００７４】
更に，本発明は，式ＩＩ
Ｒ１−Ｃ（ＯＨ）−Ｒ２    （ＩＩ）
で表され，Ｒ１基及びＲ２が上述と同様であるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を回収するための方法に関する。前記方法においては，
ａ）式ＩＩで表されるラセミ化合物を含有する混合物を，本発明に係る酸化還元酵素，ＮＡＤ及び水と共にインキュベートし，
ｂ）残存する式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を単離する。
【００７５】
これにより，式ＩＩで表される（Ｓ）−ヒドロキシ化合物は反応して対応するケトン化合物及びＮＡＤＨとなる。
【００７６】
更に，本発明は，式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を回収するための方法であって，
ａ）式ＩＩで表されるラセミ化合物を含有する混合物を，本発明に係る酸化還元酵素，ＮＡＤ及び水と共にインキュベートし，
ｂ）該酸化還元酵素によって生成したＮＡＤＨを補基質を用いてＮＡＤに酸化し，
ｃ）残存する式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００７７】
更に，本発明は，式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を回収するための方法であって，
ａ）式ＩＩで表されるラセミ化合物を含有する混合物を，本発明に係る酸化還元酵素，ＮＡＤ及び水と共にインキュベートし，
ｂ）該酸化還元酵素によって生成したＮＡＤＨを脱水素酵素及び補基質を用いてＮＡＤに酸化し，
ｃ）残存する式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００７８】
他の実施形態において，本発明は，式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を回収するための方法であって，
ａ）式ＩＩで表されるラセミ化合物を含有する混合物を，本発明に係る酸化還元酵素，ＮＡＤ及び水と共にインキュベートし，
ｂ）有機溶媒の存在下で反応を行い，
ｃ）残存する式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を単離する，方法に関する。
【００７９】
式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を回収するための本発明に係る更なる方法は，
ａ）式ＩＩで表されるラセミ化合物を含有する混合物を，本発明に係る酸化還元酵素，ＮＡＤ及び水と共にインキュベートし，
ｂ）有機溶媒の存在下で反応を行い，
ｃ）該酸化還元酵素によって生成したＮＡＤＨを脱水素酵素及び補基質を用いてＮＡＤに酸化し，
ｄ）残存する式ＩＩで表されるキラル（Ｒ）−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする。
【００８０】
反応条件は，基本的には，式Ｉで表されるケトン化合物をエナンチオ特異的に還元するための上述の方法と同様である。しかし，式ＩＩで表される化合物のラセミ混合物から式Ｉで表されるケトン化合物をエナンチオ選択的に還元する代わりに，式ＩＩで表される（Ｓ）−ヒドロキシ化合物のみを対応するケトン化合物へエナンチオ選択的に酸化する。こうして，式ＩＩで表される（Ｒ）−ヒドロキシ化合物が残存し，単離することができる。
【００８１】
更に，エタノールや２−プロパノール（イソプロパノール），２−ブタノール，２−ペンタノール，２−オクタノール等のアルコールを補基質として用いる代わりに，それに対応するケトン（アセトン等）をＮＡＤ再生のための方法に用いる。例えば，本発明に係る酸化還元酵素或いは他の脱水素酵素を用いて，アセトン及びＮＡＤＨを反応させてＮＡＤ及びイソプロパノールを得る。用いるケトンの量は，総体積に対して５％〜５０％，好ましくは８％〜２０％，特に１０％〜１５％である。
【００８２】
以下，実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【００８３】
実施例１：Ｓ特異的アルコール脱水素酵素用酵母のスクリーニング
スクリーニングのために，多数の様々な酵母菌株を次の培地：酵母エキス（３），麦芽エキス（３），ペプトン（５）及びグルコース（１０）で培養した（データは全てｇ／Ｌ）。培地を１２１℃で殺菌し，更なるｐＨ調整を行わずに振盪機にて２５℃，１６０回転／分（ｒｐｍ）で酵母を培養した。次いで，１２５ｍｇの細胞を８００μＬの消化バッファー（１００ｍＭ  トリエタノールアミン（ＴＥＡ），ｐＨ＝７．０）で再懸濁させ，１ｇのガラスビーズと混合し，グローブミル（Ｒｅｔｓｃｈ）にて４℃で１０分間（ｍｉｎ）消化させた。１２，０００ｒｐｍで２分間遠沈した後に得た上清（ライセート）を次の活性スクリーニング及びエナンチオマー過剰率（ｅｅ値）の測定に用いた。エチル−４−クロロアセトアセテート及び２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オンを基質として用いた。
【００８４】
活性スクリーニング用バッチ：
８６０μＬ    ０．１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＰＯ４，ｐＨ＝７．０，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２０μＬ      ＮＡＤＰＨ或いはＮＡＤＨ（１０ｍＭ）
２０μＬ      ライセート
１００μＬ    各基質（１００ｍＭ）
【００８５】
反応は波長３４０ｎｍで１分間追跡した。
【００８６】
ｅｅ値測定用バッチ：
２０μＬ      ライセート
１００μＬ    ＮＡＤＨ或いはＮＡＤＰＨ（５０ｍＭ）
６０μＬ      基質（エチル−４−クロロアセトアセテート  １００ｍＭ）
【００８７】
２４時間（ｈ）後，ｅｅ測定用バッチをクロロホルムで抽出し，エナンチオマー過剰率をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって測定した。エナンチオマー過剰率は次のように計算する。
ｅｅ（％）＝（（Ｒ−アルコール  −  Ｓ−アルコール）／（Ｒ−アルコール  ＋  Ｓ−アルコール））×１００
【００８８】
【表１】
2011244829.tif 000002
【００８９】
ＤＳＭＺは，Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇを示す。
酵素単位の定義：１Ｕは，１分当たり基質１μｍｏｌを反応させるのに必要な酵素量に相当する。
【００９０】
実施例２：ピキア・カプスラータからのＮＡＤＨ依存性（Ｓ）特異的酸化還元酵素の単離
ピキア・カプスラータ（Ｐ．カプスラータ）からＮＡＤＨ依存性酸化還元酵素を単離するため，実施例１に記載したように微生物を培養した。定常期に達した時点で，細胞を採取し，遠沈によって培地から分離した。ガラスビーズを用いた湿式粉砕によって酵素の遊離を行ったが，酵素遊離は他の消化方法によって行うこともできる。この目的のために，１００ｇのＰ．カプスラータを４００ｍＬの消化バッファー（１００ｍＭ  トリエタノールアミン，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ＝７．０）で懸濁させ，フレンチプレスによってホモジナイズした。
【００９１】
遠沈（７０００ｒｐｍ）後に得られた粗抽出物を更に精製し，ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）によって再処理した。
【００９２】
本発明に係る酸化還元酵素は，Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｍｅｓｓｒｓ．ファルマシア）及びＵｎｏ  Ｑ（バイオラッド，ドイツ，ミュンヘン）を用いたイオン交換クロマトグラフィーによって２連続工程で精製することができた。この目的のために，５０ｍＭのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ−カラムへ遠沈後に得られたライセートを直接適用し，線形塩勾配を増加させながら溶出させた。その際，該酸化還元酵素は０．２〜０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。酸化還元酵素含有画分を集め，限外ろ過（排除限界：１０ｋＤａ）によって適切な体積まで濃縮した。次いで，濃縮した酸化還元酵素画分を再処理し，更に上述同様のバッファーを用い，Ｕｎｏ  Ｑによって精製した。これにより，該酵素は０．１Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。
【００９３】
その直後，得られた精製酸化還元酵素の分子量をゲル浸透（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ；ファルマシア，１００ｍＭ  トリエタノールアミン，ｐＨ＝７，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）によって測定した。
【００９４】
カタラーゼ（２３２ｋＤａ），アルドラーゼ（１５８ｋＤａ），アルブミン（６９．８ｋＤａ）及びオボアルブミン（４９．４ｋＤａ）を分子量標準品として用いた。
【００９５】
得られた結果を次の表２にまとめる。
【００９６】
【表２】
2011244829.tif 000003
【００９７】
酸化還元酵素の酵素活性は実施例１に記載の試験系（活性スクリーニング用バッチ）にて測定し，タンパク質量の測定については，ローリー（Lowry）ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９３（１９５１年）：２６５〜２７５，或いはピーターソン（Peterson）ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１００（１９７９年）：２０１〜２２０）に従って行った。酵素活性をタンパク質量で割った商によって比活性が得られるが，ここでは１μｍｏｌ／ｍｉｎの転化反応が１単位（Ｕ）に相当する。
【００９８】
ゲル浸透によって測定した本発明に係る酸化還元酵素の分子量は，天然状態で１４０±１０ｋＤａであった。
【００９９】
実施例３：本発明に係る酸化還元酵素のＮ末端配列の決定
ゲル浸透後，実施例２に記載の酵素調製物を１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルに分画し，ポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜）上に移した。約３５〜４５ｋＤａにおける明確なバンドをエドマン分解（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９２（ＰＥ−バイオシステム））によるＮ末端配列決定に付した。次のＮ末端配列が得られた。
配列番号１０
ＫＴＱＡＧＹＩＦＫＫＧＡ
【０１００】
実施例４：ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素のクローニング
真核微生物ピキア・カプスラータは，サッカロマイセタセア（Saccaromycetacea）のファミリーに属する。該微生物のゲノム構造は，エキソン−イントロン配列を示す。従って，エナンチオ選択的酸化還元酵素をコードする遺伝子配列を同定するため，ピキア・カプスラータの活性細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製した。
【０１０１】
４．１  ピキア・カプスラータ細胞からの全ＲＮＡの調製
ピキア・カプスラータ由来の新鮮細胞（６００ｍｇ）を２．５ｍＬの氷冷ＬＥＴＳ（１０ｍＭ  ｔｒｉs−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．４，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  ＬｉＣｌ，０．２％ＳＤＳ）バッファーに再懸濁させた。得られた細胞浮遊液に，硝酸で洗浄し３ｍＬのフェノール（ｐＨ  ７．０）で平衡化した５ｍＬ（約２０ｇ）のガラスビーズを添加した。その直後，バッチ全体に対して，１回３０秒間（ｓｅｃ）の振盪（Ｖｏｒｔｅｘ  Ｇｅｎｉｅ  ２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社，米国，ニューヨーク）と３０秒間の氷上冷却とを交互に行い，この処理を合計１０分間行った。次いで，更に氷冷ＬＥＴＳバッファー（５ｍＬ）を添加した。得られた細胞浮遊液を１１，０００ｇ，４℃で５分間遠沈した。水相を除去し，抽出を２回，同体積のフェノール：クロロホルム：３−メチル−１−ブタノール（２４：２４：１）で行った。その後，クロロホルムで抽出を行った。最終抽出を行った後，１／１０ｖｏｌ．の５Ｍ  ＬｉＣｌを添加して，得られた全ＲＮＡを−２０℃で４時間沈殿させた。
【０１０２】
１ｍｇの単離ＲＮＡを用いて，オリゴ−ｄＴセルロース（ｍＲＮＡ  ＰｒｅｐＫｉｔ，キアゲン）によるｍＲＮＡ回収を行った。
【０１０３】
引き続き沈殿を行った後，５μｇのｍＲＮＡを用いて，ｃＤＮＡ合成（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＸＲ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ストラタジーン）を行った。該メーカーの指示に従って構築したライブラリーをＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ大腸菌に形質転換し，（Ｓ）−ＡＤＨ活性について検討した。
【０１０４】
ＮＡＤＨを補因子として用い，エチル−４−クロロアセトアセテートを基質として用いて，吸光度の減少に基づき２種類のクローン（２／１及び２／２）を同定し単離した。プライマーＴ７（配列番号３）及びプライマーＴ３（配列番号４）を用い，該クローンに含まれるプラスミドの多重クローニング部位によって配列決定を行った結果，サイズ１１７５ｂｐの断片（配列番号１）が得られた。前記断片は，３６６個のアミノ酸を含む融合タンパク質（配列番号２）をコードし，β−ガラクトシダーゼのａ断片と本発明に係る酸化還元酵素の配列とから構成される。
【０１０５】
４．２  ピキア・カプスラータ由来（Ｓ）−ＡＤＨをコードする全長転写物のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による合成
配列番号１に基づき，特定のプライマーを構築した後，全長転写物を適切な発現系にクローニングした。その際，ＮｄｅＩ（或いはＳｐｈＩ）の認識配列を有する５’−プライマーとＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を有する３’−プライマーとを修飾した（配列番号５，配列番号６，配列番号７）。
オリゴ１−ＮｄｅＩ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣ−３’
オリゴ２−ＳｐｈＩ：５’−ＣＡＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣ−３’
オリゴ３−ＨｉｎｄＩＩＩ：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＣＣＡＡＴＣＴＴ−３’
【０１０６】
ピキア・カプスラータの発現ライブラリーのクローン２／１から単離したプラスミドＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。増幅については，ＰＣＲバッファー［３０ｐＭｏｌのプライマー及び２．５ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ−ポリメラーゼ（インビトロジェン）当たり，１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）；５０ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４；１ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物（Ｎは塩基Ａ，Ｔ，Ｃ或いはＧを表わす）］において５０ｎｇの鋳型を用い，次の温度サイクルで行った。
サイクル１：        ９４℃，２分間
サイクル２×３０：  ９４℃，１５秒間
５８℃，３０秒間
６８℃，７５秒間
サイクル３：        ６８℃，７分間
４℃，∞
【０１０７】
精製後，得られたＰＣＲ産物を，エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ或いはエンドヌクレアーゼＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（１％アガロースゲル）を用いて消化し，ｐＥＴ２１ａベクター（ノバジェン）或いはｐＱＥ３０ベクター（キアゲン）のバックボーン（同エンドヌクレアーゼで処理済）に連結した。連結バッチの２イル（ｉｌ）を大腸菌Ｔｏｐ  １０Ｆ’細胞（インビトロジェン）に形質転換した後，エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ或いはエンドヌクレアーゼＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限解析によってアンピシリン耐性コロニーのプラスミドＤＮＡを試験し，１，１００ｂｐのサイズを有するインサートの存在について確認した。発現構築物ｐＥＴ２１−ＰＣ＃１０について配列決定を行った。本発明に係る酸化還元酵素をコードするピキア・カプスラータ由来転写物は，全部で１０２６ｂｐのオープンリーディングフレーム（配列番号８）を有するが，これは３４１個のアミノ酸から成るタンパク質（配列番号９）に対応する。
【０１０８】
４．３  Ｐ．カプスラータ由来の本発明に係る酸化還元酵素のＳｔａｒＢＬ２１（Ｄｅ３）大腸菌細胞における発現
コンピテント大腸菌ＳｔａｒＢＬ２１（Ｄｅ３）細胞（インビトロジェン）を本発明に係る酸化還元酵素をコードする発現構築物ｐＥＴ２１−ＰＣ＃１０で形質転換した。５００ｎｍで測定される光学密度が０．５となるまで，形質転換菌株の培養をアンピシリン（５０ｉｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）にて行った。組換え酸化還元酵素タンパク質の産生は，イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加（最終濃度１ｍＭ）によって開始した。誘導バッチを２５℃，２２０ｒｐｍで更に１５時間インキュベートした。得られた酵素活性は約６０００Ｕ／ｇ湿細胞質量となった。
【０１０９】
４．４  Ｐ．カプスラータ由来の本発明に係る酸化還元酵素のＲＢ７９１大腸菌細胞における発現
コンピテント大腸菌ＲＢ７９１細胞を本発明に係る酸化還元酵素をコードする発現構築物ｐＱＥ３０−ＰＣ＃１２で形質転換した。５００ｎｍで測定される光学密度が０．５となるまで，形質転換菌株の培養をアンピシリン（５０ｉｇ／ｍＬ）含有ＬＢ培地（１％トリプトン，０．５％酵母エキス，１％ＮａＣｌ）にて行った。組換え酸化還元酵素タンパク質の産生は，ＩＰＴＧの添加（最終濃度０．１ｍＭ）によって開始した。誘導バッチを２５℃，２２０ｒｐｍで更に１５時間インキュベートした。得られた酵素活性は約１０００Ｕ／ｇ湿細胞質量となった。
【０１１０】
実施例５：Ｐ．カプスラータ由来組換え酸化還元酵素の特徴付け
５．１  最適ｐＨ値
表３に示すバッファーを調製した。各バッファーにおいて各バッファー成分の濃度は５０ｍＭとなった。
【０１１１】
【表３】
2011244829.tif 000004
【０１１２】
測定用バッチ（３０℃）：
８７０μＬ    表３に記載の各バッファー系
２０μＬ      ＮＡＤＨ  １０ｍＭ（８．６ｍｇ／ｍＬ水）
１０μＬ      希釈酵素
【０１１３】
インキュベーションを約２〜３分間続け，その直後，１００μＬの基質溶液（１００ｍＭ  エチル−４−クロロ−３−オキソブタン酸）を添加した。
【０１１４】
最適ｐＨ値を求めるため，表３に示した各バッファーにおいて酵素反応を確認した。酸化反応における最適ｐＨ値を求めるため，ＮＡＤＨを補因子として用い，（Ｓ）−メチル−３−ヒドロキシブタン酸を基質として用いた。本発明に係る酵素の場合，還元反応における最適ｐＨ値は６．５〜７であり，酸化反応における最適ｐＨ値は７．８〜８．２であることが確認できた。
【０１１５】
５．２  ｐＨ安定性
組換え酸化還元酵素の活性については，表３に記載のバッファー系へ中における保存性によって確認した。この目的のために，各種バッファー（５０ｍＭ）をｐＨ領域４〜１１で調製し，実施例４で産生した酸化還元酵素を該バッファーで希釈した。インキュベーションを３０分間，６０分間及び３００分間行った後，各バッチから１０μＬを採取し，実施例１に記載の活性試験に用いた。
【０１１６】
これにより，該酵素をリン酸カリウムバッファー５０ｍＭ（ｐＨ＝７．０）に希釈（１：２０）した直後に得られた測定値が初期値となる。上述の条件下で，前記初期値は約０．７０／分の吸光度変化量に相当し，これを１００％値として設定し，以降の測定値は全て初期値に対して求めた。
【０１１７】
その際，Ｐ．カプスラータ由来組換え酸化還元酵素はｐＨ５．５〜８．５で安定であり，実質的に活性を失うことなく少なくとも５時間インキュベート可能であることが認められた。ｐＨ９．０超又は５．０未満でインキュベーションを行った場合，該酵素は直ちに失活した。
【０１１８】
５．３  最適温度
最適試験温度を求めるため，標準的な測定用バッチにて温度範囲１５℃〜７０℃で酵素活性を測定した。表４から分かるように，４５℃で酵素活性は最大となり，その後，活性は急速に低下する。
【０１１９】
【表４】
2011244829.tif 000005
【０１２０】
５．４  温度安定性
温度安定性については，実施例５．２で記載した方法と同様に１５℃〜７０℃の範囲で確認した。この目的のために，精製酸化還元酵素の１：２０希釈物を各温度で６０分間及び１８０分間インキュベートした後，上述の試験用バッチを用いて３０℃で測定を行った。本例においても，精製酸化還元酵素をリン酸カリウムバッファー５０ｍＭ（ｐＨ＝７．０）に希釈した直後に得られた測定値を初期値として用いた。本例においても，前記初期値を１００％値として設定した。
【０１２１】
ここで，該酵素は温度範囲１５℃〜４０℃では完全に安定であり，３時間のインキュベーション後，如何なる活性損失も見られない。５５℃においては，３０分後には既に酵素活性が検出できない。
【０１２２】
５．５  基質スペクトル／エナンチオマー過剰率
本発明に係る酸化還元酵素の基質スペクトルについては，多数のケトンやオキソ酸及びそのエステルを用いて酵素活性を測定することによって確認した。この目的のために，実施例５．１に記載の標準的な測定用バッチを様々な基質と共に用いた。エチル−４−クロロアセトアセテートの場合の活性を１００％とし，これに対して他の基質全ての場合の活性を求めた。ｅｅ値を測定するため，選択した基質に対して次の反応バッチを用いた。
【０１２３】
１００μＬ    ＮＡＤＨ（５０ｍＭ）
６０μＬ      基質（１００ｍＭ）
＋１〜２Ｕの本発明に係る酸化還元酵素
【０１２４】
２４時間後，ｅｅ測定用バッチをクロロホルムで抽出し，得られたアルコールのエナンチオマー過剰率をＧＣによって測定した。
【０１２５】
【表５】
2011244829.tif 000006
【０１２６】
表５から分かるように，広範囲の２−及び３−オキソ酸エステルや芳香族ケトン及び脂肪族ケトンが，本発明に係る酸化還元酵素によって立体選択的に還元される。
【０１２７】
５．５  溶媒安定性
Ｐ．カプスラータ由来酸化還元酵素の酵素安定性については有機溶媒の存在下で検討した。この目的のために，該酸化還元酵素を後述の各溶媒混合物（水混和性有機溶媒の場合）で１：２０希釈し，室温（２０℃〜２４℃；ＲＴ）でインキュベートした。次いで，１０μＬの酵素溶液を標準的な試験バッチに用いた。本例においても，バッファー（リン酸カリウムバッファー（ＫＰＰ）１００ｍＭ，ｐＨ＝７．０）で希釈後の初期値を１００％とし，他の値全てを前記初期値に対して求めた。
【０１２８】
水不混和性有機溶媒の場合も同様にリン酸カリウムバッファーで希釈を行い，同体積の有機溶媒をバッチに添加し，このバッチをサーモミキサーにて１７０ｒｐｍ，ＲＴでインキュベートした。活性については水相で測定した。結果を表６に示す。
【０１２９】
【表６】
2011244829.tif 000007
【０１３０】
表６から分かるように，Ｐ．カプスラータ由来酸化還元酵素は，有機溶媒に対して驚くべき安定性を示す。確立された学説とは対照的に，本発明に係る酸化還元酵素は，純粋なバッファーでのインキュベーションと比べて，水混和性有機溶媒及び水不混和性有機溶媒においても安定している。従って，本発明に係る酸化還元酵素は，ＤＥ  １０１  １９２７４  Ａ１に記載の二相系に用いることができる。
【０１３１】
５．７  調製における転化反応（Preparative conversions）
５．７．１  エチル−４−クロロアセトアセテートからエチル−（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸への還元
調製用バッチとして，３４Ｌのバッファー（１００ｍＭ  ＴＥＡ，ｐＨ＝７，１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，１０％グリセロール），４Ｌのイソプロパノール，４Ｌの４−クロロアセトアセテート，４ｇのＮＡＤ及び３６０万Ｕのピキア・カプスラータ由来組換え酸化還元酵素の混合物を絶えず混合しながら，室温で２４時間インキュベートした。２４時間後，用いた４−クロロアセトアセテートの９９％が還元された。次いで，得られた反応混合物を酢酸エチルで抽出し，溶媒をロータリーエバポレータによって除去し，粗生成物を蒸留した。このようにして，エナンチオマー過剰率が９９％のエチル−（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸を２．８Ｌ（３．４ｋｇ）回収した。この場合，用いた抽出物量に対する収率は７０％となる。
【０１３２】
５．７．２  ２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オンから（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールへの還元
調製用バッチとして，１６４ｍＬのバッファー（１００ｍＭ  ＴＥＡ，ｐＨ＝７，１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，２０％グリセロール），１６ｍＬのイソプロパノール，メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）（２０ｍＬ）に溶解した２０ｇの２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オン，１０ｍｇのＮＡＤ及び２０，０００Ｕのピキア・カプスラータ由来組換え酸化還元酵素の混合物を絶えず混合しながら，室温で２４時間インキュベートした。２４時間後，用いた２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オンの９６％が還元された。次いで，得られた反応混合物を酢酸エチルで抽出し，溶媒をロータリーエバポレータによって除去した。このようにして，エナンチオマー過剰率が１００％の（Ｒ）−２−クロロ−１−（３−クロロフェニル）エタン−１−オールを１５ｇ回収した。この場合，用いた抽出物量に対する収率は７７％となる。