(57)【要約】      （修正有）【課題】生体内での物質動態を高精度かつ定量的に画像化し得る蛍光標識化合物の提供。【解決手段】一般式（１）を有する化合物と蛍光物質とを連結した蛍光標識化合物。2011026283.tif 000024（式中、Ｒ１〜Ｒ９のいずれか１つは、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよく、他の８つは同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。）該蛍光物質としては、フルオレセイン等が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）にて表される構造を備えている化合物と蛍光物質とを連結した蛍光標識化合物であって、
【化１】
2011026283.tif 000022
式中、Ｒ１〜Ｒ９のいずれか１つは、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよく、他の８つは同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である、蛍光標識化合物。
【請求項２】
一般式（１）にて表される構造を備えている上記化合物において、式中、Ｒ１〜Ｒ５は同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ６〜Ｒ９のいずれか１つは、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよく、他の３つは同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である、請求項１に記載の蛍光標識化合物。
【請求項３】
一般式（１）にて表される構造を備えている上記化合物において、式中、Ｒ７は、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよく、Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８〜Ｒ９は同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である、請求項１に記載の蛍光標識化合物。
【請求項４】
上記炭化水素鎖は、炭素数が３〜１２の直鎖である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光標識化合物。
【請求項５】
上記炭化水素鎖が、
【化２】
2011026283.tif 000023
からなる群より選択され、式中、Ｚは蛍光物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光標識化合物。
【請求項６】
上記蛍光物質が、フルオレセイン類、カルボキシナフトフルオレセイン類、ローダミン類、テキサスレッド類、インドシアニン類、蛍光シアニン類、ＮＢＤおよびＳＢＤからなる群より選択される化合物またはその誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光標識化合物。
【請求項７】
脂溶性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光標識化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光標識化合物を含有している、マイクログリアまたはマクロファージを検出するための組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光標識化合物を含有している、網膜疾患を診断するための組成物。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれかに記載の蛍光標識化合物を含有している、神経変性疾患を診断するための組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光標識化合物を用いる工程を包含する、網膜疾患を診断する方法。
【請求項１２】
被験体から分離した生物サンプルを上記蛍光標識化合物ともにインキュベートすることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記蛍光標識化合物を生体に投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物と蛍光物質とをリンカーを介して結合した蛍光標識化合物およびその製造方法、ならびにこれらの利用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体内情報を得るために種々の研究がなされており、とりわけ、目的の分子の挙動を調べることができる「分子イメージング」技術が注目されている。分子イメージングは、種々の疾患の早期発見や、有効かつ副作用の少ない医薬の短期間での開発に有用であると考えられる。
【０００３】
生体内情報を得るための分子イメージングとしては、陽電子放射断層画像撮影法（ＰＥＴ）がよく知られている。ＰＥＴは、陽電子が電子と衝突することによって放射されるγ線を用いて断層画像を撮影する技術であり、標識した目的の分子（いわゆる、分子プローブ）を生体に投与し、標識されている放射性核種が別の原子核に崩壊していく際に放出する陽電子と、その近傍に存在する電子との衝突によって放出されるγ線を検出する。これによって、目的の分子の存在部位を定量的に調べることができる。このようなＰＥＴは、臨床的な分子イメージング技術として広く利用されている。例えば、［１８Ｆ］で標識したフルオロデオキシグルコースを用いたＰＥＴががん検診に利用されている。
【０００４】
ＰＥＴ用の分子プローブとして種々の放射標識プローブが開発されている。末梢型ペンゾジアゼピン受容体と特異的に結合するリガンドである２−（クロロフェニル）−Ｎ−メチル−（１−メチルプロピル）−３−イソキノリンカルボキサミドについても、［１１Ｃ］標識された放射標識プローブが開発されている（例えば、非特許文献１参照）。この放射標識プローブは、以前から、心筋、脳腫瘍などのイメージングに用いられていたが、近年、アルツハイマーなどの疾患の重症度を検討するための、脳の変性部位に集積するマイクログリアの検出に用いられている（非特許文献２参照）。
【０００５】
また、分子イメージング技術としては、蛍光物質を用いるものも知られている。例えば、マイクログリアを生体内にてイメージングする技術として、ＧＦＰを組み込んだトランスジェニックマウスが知られている（非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０３１９７４（２００３（平成１５）年４月１７日国際公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】R. Camsonneら、J. Label. Compd. Radiopharm. 11: 985-991 (1984)
【非特許文献２】Bartels AL and Leenders KL、Movement Disorders 22(13):1852-6 (2007)
【非特許文献３】Wake Hら、J. Neurosci. 29(13): 3974-80 (2009)
【非特許文献４】Suzuki Mら、Chem. Eur. J. 3(12): 2039-42 (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＰＥＴは、医薬品開発および臨床診断に用いられている、優れた分子イメージング技術である。しかし、ＰＥＴでは、放射標識プローブの分解産物を追跡している可能性がある。また、検査部位が頭部（特に脳）の場合、化合物の種類によっては血液脳関門を通過する能力が低下し、脳内での役割を調べるに好ましくない。
【０００９】
また、非特許文献３に記載されるようなトランスジェニックマウスの作製は多くの労力が必要である上に、そもそもこの技術は臨床診断に利用し得るものではない。また、現段階では、遺伝子改変技術をヒトに適用することができない。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体内での物質動態を高精度かつ定量的に画像化し得る、臨床的に利用可能な分子イメージング技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
蛍光標識化合物を用いる分子イメージング技術について、これまでに種々の研究が行われている。しかし、標識に用いられる蛍光物質のサイズが大きいために目的の化合物の本来の機能を阻害しやすいという欠点を有している。蛍光標識を用いた研究のほとんどが、高分子化合物（例えば、タンパク質または核酸）を標識したものであり、しかもそのほとんどが細胞レベル以下の研究である（例えば、特許文献１参照）。実際に、マイクログリアを検出の標的とした動物レベルでの研究としては、ＰＥＴ用プローブを用いたもの（非特許文献２等）、マイクログリアにＧＦＰが集積するように遺伝子改変されたトランスジェニックマウス（非特許文献３等）が挙げられるに過ぎない。
【００１２】
このように、臨床的に利用可能な分子イメージング技術として、分子のサイズにほとんど影響を与えない放射標識プローブを用いるＰＥＴ以外は実現されていない。しかも、蛍光標識プローブを用いた、臨床的に利用可能な分子イメージング技術を完成させるための知見は、全く知られていない。
【００１３】
本発明者らは、独自の観点に基づき、創意工夫を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、生体内での分子イメージングを可能にする蛍光標識化合物を提供する。
【００１４】
本発明にかかる蛍光標識化合物は、一般式（１）にて表される構造を備えている化合物と蛍光物質とを連結した蛍光標識化合物であって、
【００１５】
【化１】
2011026283.tif 000002
【００１６】
式中、Ｒ１〜Ｒ９のいずれか１つは、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、他の８つは同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であることを特徴としており、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明者らはこれまでに、非常に短時間で完了するメチル化反応を開発している（例えば、非特許文献４参照）。また、従来の放射標識プローブと比較して非常に高感度なＰＥＴ画像を提供し得る放射標識プローブおよびその作製キットを完成させている。本発明者らによって完成された放射標識プローブは、従来の放射標識プローブと異なる位置に放射標識を結合させており、これによって非常に優れた性質が付与されている。
【００１８】
本発明は、放射標識プローブとして非常に優れた性質を付与するための知見に対して、独自の観点に基づいてさらなる改良を加えたことによって初めて実現されたものであり、当業者が容易になし得るものでも容易に想到し得るものでもない。
【００１９】
また、上述したように、当該分野において、臨床的に利用可能な、蛍光標識プローブを用いた分子イメージング技術についての知見がない。よって、当業者はこのような技術を容易に完成することができない。本発明の蛍光標識プローブによって、臨床的に利用可能な分子イメージング技術を実現し得たことは、当業者の予測の範囲を大きく超えている。
【００２０】
本発明にかかる蛍光標識化合物において、末端に蛍光物質が結合した上記炭化水素鎖は、Ｒ２〜Ｒ９のいずれか１つであることが好ましく、Ｒ６〜Ｒ９のいずれか１つであることがより好ましく、Ｒ７であることがさらに好ましい。また、上記ヘテロ原子は、ＯまたはＮであることが好ましい。
【００２１】
本発明にかかる蛍光標識化合物において、上記炭化水素鎖の主鎖は、炭素数が３〜２０の直鎖であることが好ましく、
【００２２】
【化２】
2011026283.tif 000003
【００２３】
からなる群より選択されることがより好ましい（式中、Ｚは蛍光物質である。）。
【００２４】
本発明にかかる蛍光標識化合物において、上記蛍光物質は、フルオレセイン類、カルボキシナフトフルオレセイン類、ローダミン類、テキサスレッド類、インドシアニン類、蛍光シアニン類、ＮＢＤおよびＳＢＤからなる群より選択される化合物またはその誘導体であることが好ましい。
【００２５】
本発明にかかる蛍光標識化合物は、脂溶性であることが好ましい。
【００２６】
本発明にかかる蛍光標識化合物は、生体内におけるマイクログリアおよびマクロファージの検出、網膜疾患の診断、および神経変性疾患の診断に利用可能である。すなわち、本発明は、生体内におけるマイクログリアまたはマクロファージの検出、網膜疾患の診断、あるいは神経変性疾患の診断に用いるための、上記蛍光標識化合物を含有している組成物を提供する。さらに、本発明は、生体内におけるマイクログリアまたはマクロファージの検出方法、網膜疾患の診断法、および神経変性疾患の診断法を提供する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明を用いれば、生体内情報を画像化することができるので、放射性核種を用いることなく臨床診断を行うことができる。特に、表面から観察できる部位（眼底、腸管など）において、標的部位の詳細な像を得ることができ、その結果、各種検査の診断的価値を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施形態にかかる化合物またはフルオレセイン単独を投与した後のＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞における蛍光強度を示す図である。
【図２】（ａ）は、本発明の一実施形態にかかる化合物またはフルオレセイン単独を投与した後のＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞における蛍光強度を示す図であり、（ｂ）は、本発明の一実施形態にかかる化合物を投与した後のＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞またはＣＤ３陽性細胞における蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
２−（クロロフェニル）−Ｎ−メチル−（１−メチルプロピル）−３−イソキノリンカルボキサミド（ＰＫ１１１９５）は、末梢型ペンゾジアゼピン受容体と特異的に結合するリガンドである。末梢型ペンゾジアゼピン受容体は、心筋、肺、副腎、唾液腺、血液細胞、グリア細胞などにおいて見られるレセプターであり、主に、ミトコンドリア外膜に存在している。末梢型ペンゾジアゼピン受容体は、虚血、薬物依存、外的要因などによる脳の損傷部位に多く発現していることが報告されているが、まだ詳しくは解明されていない。
【００３０】
【化３】
2011026283.tif 000004
【００３１】
ＰＫ１１１９５のＰＥＴ用分子プローブとして開発された［１１Ｃ］ＰＫ１１１９５は、ＰＫ１１１９５分子中の窒素原子と結合するメチル基の炭素原子が短寿命放射性核種である１１Ｃに置き換えられており、以前から、生体内のイメージングに用いられている。
【００３２】
【化４】
2011026283.tif 000005
【００３３】
本発明は、このような従来技術からは容易に想到し得ない構成を有するものであり、具体的には、臨床的に利用可能な分子イメージング技術に適用可能な蛍光標識プローブを提供するものである。
【００３４】
本発明にかかる蛍光標識化合物は、一般式（１）にて表される構造を備えている化合物と蛍光物質とを連結した蛍光標識化合物であって、
【００３５】
【化５】
2011026283.tif 000006
【００３６】
式中、Ｒ１〜Ｒ９のいずれか１つは、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、他の８つは同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であることを特徴としており、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００３７】
一実施形態において、本発明にかかる蛍光標識化合物は、一般式（２）にて表される構造を備えている化合物と蛍光物質とを連結した蛍光標識化合物であり得る。
【００３８】
【化６】
2011026283.tif 000007
【００３９】
上記式中、Ｘ１〜Ｘ３のいずれか２つは同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、他の１つは、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であることを特徴としており、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００４０】
別の実施形態において、本発明にかかる蛍光標識化合物は、一般式（１）にて表される構造を備えている化合物において、式中、Ｒ１〜Ｒ５は同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ６〜Ｒ９のいずれか１つは、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、他の３つは同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である化合物であることが好ましく、この場合も該炭化水素鎖の主鎖は主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００４１】
１つの局面において、本実施形態にかかる蛍光標識化合物において、一般式（２）中、Ｘ１が、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であってもよい。
【００４２】
さらに別の実施形態において、本発明にかかる蛍光標識化合物は、一般式（１）にて表される構造を備えている化合物において、式中、Ｒ７は、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８〜Ｒ９は同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である化合物であることがより好ましく、この場合もまた、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００４３】
１つの局面において、本実施形態にかかる蛍光標識化合物は、一般式（３）にて表される構造を備えている化合物と蛍光物質とを連結した蛍光標識化合物であってもよい。
【００４４】
【化７】
2011026283.tif 000008
【００４５】
この場合、式中、Ｘ４は、末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖であり、該炭化水素鎖の主鎖はヘテロ原子を含んでいてもよく、Ｘ２およびＸ３は同一または異なって、ＨまたはＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。
【００４６】
本明細書中にて使用される場合、本発明の蛍光標識化合物は、所定の一般式にて示される構造を有する化合物およびその塩が意図される。塩としては、好ましくは、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩）、無機塩基との塩（例えば、アンモニウム塩）、有機アミン塩（例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの塩）、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩など）、有機カルボン酸塩（例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩など）、スルホン酸塩（メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩など）、アミノ酸（例えば、アルギニン、アルパラギン酸、グルタミン酸など）との塩が挙げられる。なお、本発明の蛍光標識化合物は、溶媒和物であってもよく、例えば、水和物またはエタノール和物であり得る。
【００４７】
本明細書中にて使用される場合、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基は、炭素数が１〜６個であるアルキル基が意図され、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチル−１−メチルプロピルなどが挙げられる。好ましい実施形態において、上記アルキル基の炭素数は１〜３個である。
【００４８】
本明細書中において、「炭化水素鎖の主鎖」は「末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖」の蛍光物質以外の部分が意図される。炭化水素鎖の主鎖は直鎖の炭化水素構造であることが好ましく、その炭素数は３〜２０個であることが好ましく、４〜１２個であることがより好ましく、６〜１０個であることがさらに好ましい。なお、「末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖」は、蛍光物質に炭素数が３〜２０個の炭化水素構造が結合しているともいえる。なお、炭化水素鎖の主鎖が含んでいるヘテロ原子は、ＯまたはＮであることが好ましい。
【００４９】
本発明に用いられる炭化水素鎖の主鎖は、
【００５０】
【化８】
2011026283.tif 000009
【００５１】
からなる群より選択されることが好ましい。このような構造の化合物を、当業者は公知の合成法に従って容易に調製し得る。
【００５２】
また、「炭化水素鎖の主鎖」に結合している蛍光物質としては、フルオレセイン類、カルボキシナフトフルオレセイン類、ローダミン類、テキサスレッド類、インドシアニン類、蛍光シアニン類、ＮＢＤ、ＳＢＤなどの化合物が挙げられるがこれらに限定されない。なお、これらの蛍光物質が、炭化水素鎖の主鎖に結合する様式は、特に限定されない。また、本発明に用いられる蛍光物質は、上記化合物の誘導体であってもよい。本発明に好適な誘導体としては、蛍光物質中の親水基（例えば、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈなど）にてエステルを形成したものが好ましく、親水基がアセチル基、エチル基、エチニル基などに置換されているものがより好ましい。また、本発明に好適な誘導体としては、蛍光物質中の親水基がアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基など）に置換されているもの、ならびに電子吸引性基に置換されているものも挙げられる。
【００５３】
一実施形態において、「末端に蛍光物質が結合した炭化水素鎖」は、
【００５４】
【化９】
2011026283.tif 000010
【００５５】
にて表される構造を有しており、式中、Ｙが炭化水素鎖の主鎖である。
【００５６】
本発明にかかる蛍光標識化合物は、脂溶性であることが好ましい。細胞を標的として本発明の蛍光標識化合物を用いる場合、脂溶性であることによって化合物の細胞透過性が顕著に増大する。上述したような、蛍光物質の誘導体（例えば、親水基にてエステルを形成したもの、親水基を電子吸引性基に置換したもの）を用いれば、首尾よく脂溶性を付与することができる。後述する実施例にて示すように、脂溶性の蛍光標識化合物は、より選択的にマクロファージを描出することができる。
【００５７】
後述する実施例にて示すように、本発明にかかる蛍光標識化合物は、活性型マイクログリアと結合する。活性型マイクログリアは、網膜疾患（例えば、糖尿病性網膜症、高血圧網膜症、加齢黄斑変性、網膜剥離、網膜欠陥閉塞、網膜色素変性、ブドウ膜炎など）において、疾患の初期病変にて観察される。画像診断によって活性型マイクログリアを検出することは、上記疾患の初期段階での診断を可能にする。
【００５８】
眼科領域における画像診断として、静注したフルオレセインの蛍光眼底造影が用いられている。しかし、フルオレセインの検出では、活性型マイクログリアを見落とす危険性がある。解像度が高い新たな検査法の導入が期待されている。
【００５９】
このように、本発明は、眼科領域にこれまで導入されていなかった分子イメージングを実現し得る。本発明の化合物を用いれば、活性型マイクログリアを体外から高解像度にて容易に検出し得る。マイクログリアを首尾よく検出し得る蛍光標識化合物はこれまで全く知られていない。また、検出に必要な蛍光眼底カメラは開業医のほとんどが所有しているので、本発明の普及は極めて容易である。さらに、本発明を用いれば、眼科領域だけでなく、マイクログリアおよびマクロファージの集積を呈する、消化管の種々の疾患についてその初期病変を容易に検出することができる。
【００６０】
すなわち、本発明は、生体内におけるマイクログリアまたはマクロファージの検出、網膜疾患の診断、あるいは神経変性疾患の診断に用いるための組成物を提供する。本発明にかかる組成物は、本発明にかかる蛍光標識化合物を含有していることを特徴としている。本発明にかかる組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの形態にて調製されていても、液体（例えば、緩衝液）に溶解もしくは懸濁するために適切な固体形態として調製されていてもよい。
【００６１】
なお、本発明にかかる組成物は、キットとして提供されてもよい。「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であり、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であるが、本明細書中にて用いられる場合、「有効成分を含有している組成物」は「有効成分を備えているキット」を包含する。キット形態の場合、本発明にかかる蛍光標識化合物を有効成分として備えていればよく、上述した組成物に含まれ得る成分をさらに備えていてもよい。
【００６２】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明にかかるキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得る。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明にかかるキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明にかかるキットは、用途に応じて必要な器具をあわせて備えていてもよい。
【００６３】
さらに、本発明は、マイクログリアまたはマクロファージの検出方法、網膜疾患の診断法、および神経変性疾患の診断法を提供する。本発明にかかる方法は、上述した蛍光標識化合物および組成物を用いる工程を包含することを特徴としている。被験体から分離した生物サンプル中のマイクログリアまたはマクロファージを検出する場合には、上述した蛍光標識化合物および組成物を生物サンプルともにインキュベートする工程を包含すればよく、生体内にてマイクログリアまたはマクロファージを検出する場合には、上述した蛍光標識化合物および組成物を生体に投与する工程を包含すればよい。同様に、網膜疾患または神経変性疾患の診断を、被験体から分離した生物サンプルを用いて行う場合には、上述した蛍光標識化合物および組成物を生物サンプルともにインキュベートする工程を包含すればよく、診断するための情報を生体から直接入手する場合（すなわち、画像診断を行う場合）には、上述した蛍光標識化合物および組成物を生体に投与する工程を包含すればよい。
【００６４】
本発明にかかる蛍光標識化合物および組成物を生体に適用する場合の投与は、種々の経路による注入が好ましいが、これに限定されない。また、投与量も、必要に応じて当業者によって適宜設計され得る。
【００６５】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００６６】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００６７】
本発明について、以下の実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【００６８】
〔実施例１〕
実施例１では以下に示す方法によりＮ−ｓｅｃ−ブチル−１−（２−クロロ−５−  （２−（２−（２−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）エトキシ）  エトキシ）エチルカルボニル）フェニル）−Ｎ−メチルイソキノリン−３−カルボキサミドを合成した。
【００６９】
【化１０】
2011026283.tif 000011
【００７０】
２−（ヒドロキシイミノ）プロピオフェノン（２１．１ｇ，１２９ｍｍｏｌ）、１０％パラジウム炭素（１．１８ｇ）を含むエタノール溶液（３００ｍＬ）を、水素雰囲気下（３ａｔｍ）にて室温で６０時間撹拌した。触媒を、セライ５４５を用いて濾過し、濃縮した濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１：１）］で精製して泊黄色結晶（６．３０ｇ）を得た。
【００７１】
続いて、この泊黄色結晶（４．８３ｇ）と、５−ブロモ−２−クロロベンゼンカルボン酸（７．６５ｇ，３２．５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４．９７ｇ，３６．８ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１２．９ｇ，６７．２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（７．９９ｇ，６５．４ｍｍｏｌ）とを含む無水ジクロロメタン溶液（２００ｍＬ）を、アルゴン雰囲気下にて室温下で４８時間撹拌した。この反応液を減圧下濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製して目的物（９．３１ｇ，２段階２６％）を得た。
【００７２】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.96-1.10 (d×2, 3H, CHCH3, J = 6.6 Hz) , 4.00-4.25 (m×2, 1H, CHCH3) , 4.55-4.70 (dd×2, 1H, J = 5.1, 5.5 Hz) , 5.43-5.48 (d×2, 1H, CHOH, J = 5.1 Hz) , 7.20-7.43 (complex, 7H, aromatic and NH) , 7.60-7.62 (m, 1H, aromatic) , 8.25-8.46 (d×2, 1H, aromatic)。
【００７３】
【化１１】
2011026283.tif 000012
【００７４】
５−ブロモ−２−クロロ−Ｎ−（１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）ベンズアミド（５．９７ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）、五酸化二燐（４０．３ｇ，２８４ｍｍｏｌ）を含むｏ−ジクロロベンゼン溶液（７０ｍＬ）を。１６０℃で４８時間撹拌した。この反応液を氷水（３００ｍＬ）に加え、ジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホル）で精製して目的物（４．８１ｇ，８９％）を得た。
【００７５】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.73-2.77 (s, 3H, CH3) , 7.38-7.42 (d, 1H, aromatic, J = 8.4 Hz) , 7.43-7.49 (dd, 1H, aromatic, J = 7.5, 7.7 Hz) , 7.53-7.58 (complec, 3H, aromatic) , 7.60-7.62 (s, 1H, aromatic) , 7.63-7.69 (dd, 1H, aromatic, J = 7.5, 7.8 Hz) , 7.79-7.83 (d, 1H, aromatic, J = 8.4 Hz)
【００７６】
【化１２】
2011026283.tif 000013
【００７７】
１−（５−ブロモ−２−クロロフェニル）−３−メチルイソキノリン（４．６４ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（２．５６ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）、過酸化ベンゾイル（７４１ｍｇ，３．０６ｍｍｏｌ）、を含む四塩化炭素溶液（４０ｍＬ）を、８０℃で３６時間撹拌した。冷却した後に、この反応液に飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５０ｍＬ）を加え、クロロホルムで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃縮して褐色油状物を得た。この油状物をエタノール（６０ｍＬ）、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）で溶解した後、硝酸銀（９．８９ｇ，５８．２ｍｍｏｌ）を加えて、７０℃で１４時間撹拌した。冷却した後、沈殿物を濾過し、濃縮した濾液をエタノール（１００ｍＬ）に溶解させた。この溶液に硝酸銀（１０．０ｇ，５８．９ｍｍｏｌ）を含む水溶液（１０ｍＬ）を加え、続いて水酸化ナトリウム（７．２０ｇ，１８０ｍｍｏｌ）を含む水溶液（９０ｍＬ）を加え、室温で１４時間撹拌した。冷却した後、沈殿物を濾過し、濃縮した濾液に水（２００ｍＬ）を加え、３Ｍ塩酸でｐＨ２に調整した後、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後に、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製して目的物（１．７６ｇ，３段階３５％）を得た。
【００７８】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.22-7.26 (d, 1H, aromatic, J = 8.2 Hz) , 7.27-7.40 (d, 1H, aromatic, J = 8.2 Hz) , 7.40-7.48 (complex, 3H, aromatic) , 7.52-7.58 (dd, 1H, aromatic, J = 8.2, 7.6 Hz) , 7.92-7.98 (d, 1H, aromatic, J = 8.2 Hz) , 8.36-8.38 (s, 1H, aromatic) , 12.7-13.1 (br, 1H, COOH)
【００７９】
【化１３】
2011026283.tif 000014
【００８０】
アルゴン雰囲気下にて、１−（５−ブロモ−２−クロロフェニルル）イソキノリン−３−カルボン酸（１．２４ｇ，３．４１ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．４３ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．４３ｇ，７．４７ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１．４０ｇ，１１．５ｍｍｏｌ）を含む無水ジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）を室温下で４８時間撹拌した。この反応液を減圧下にて濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（９：１）］で精製して目的物（１．４２ｇ，９９％）を得た。
【００８１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.94-1.01 (t×2 for rotamers, 3H, CH2CH3, J = 7.3 Hz), 1.25-1.30 (d×2 for rotamers, CHCH3, J = 4.8 Hz) , 1.56-1.69 (m, 2H, CH2CH3) , 4.09-4.24 (m, 1H, CHCH3) , 7.44-7.49 (d, 1H, aromatic, J = 9.1 Hz) , 7.60-7.70 (complex, 4H, aromatic) , 7.74-7.80 (dd, 1H, aromatic, J = 7.4, 7.4 Hz) , 7.94-8.01 (br, 1H, NH) , 8.04-8.09 (d, 1H, aromatic, J = 8.4 Hz) , 8.68-8.71 (s, 1H, aromatic).
【００８２】
【化１４】
2011026283.tif 000015
【００８３】
アルゴン雰囲気下にて、１−（５−ブロモ−２−クロロフェニル）−Ｎ−ｓｅｃ−ブチル−Ｎ−イソキノリン−３−カルボキシアミド（１．４０ｇ，３．３６ｍｍｏｌ）を含む無水ジメチルホルムアミド溶液（２０ｍＬ）に、氷浴下にて水素化ナトリウム［２３５ｍｇ（６０％），５．８８ｍｍｏｌ］を加え、１時間撹拌した。この溶液にヨウ化メチル（７３５ｍｇ，５．１８ｍｍｏｌ）を加え、さらに１８時間撹拌させた。この溶液を１Ｍ塩酸で中和し、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（５：１）］で精製して目的物（１．３２ｇ，９１％）を得た。
【００８４】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.75-0.85 and 0.96-1.05 (t×2 for rotamers, 3H, J = 7.4 Hz, CH2CH3) , 1.19-1.25 (m×2 for rotamers, 3H, CHCH3) , 1.37-1.70 (m×2 for rotamers, 2H, CH2CH3) , 2.88-2.90 and 2.96-3.00 (d×2 for rotamers, 3H, NCH3, J = 3.9 Hz) , 3.80-3.90 and 4.75-4.85 (m×2 for rotamers, 1H, CHCH3) , 7.40-7.46 (m, 1H, aromatic) , 7.54-7.66 (complex, 4H, aromatic) , 7.77-7.78 (m, 1H, aromatic) , 7.94-7.99 (d, 1H, aromatic, J = 8.2 Hz) , 8.00-8.09 (m, 1H, aromatic) .
【００８５】
【化１５】
2011026283.tif 000016
【００８６】
１−（５−ブロモ−２−クロロフェニル）−Ｎ−ｓｅｃ−ブチル−Ｎ−メチルイソキノリン−３−カルボキシアミド（３３９ｍｇ，０．７８４ｍｍｏｌ）、テトラキス−トリフェニルホスフィンパラジウム（１６８ｍｇ，０．１４６ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（２１４ｍｇ，２．１８ｍｍｏｌ）を含む無水ジメチルホルムアミド溶液（８．０ｍＬ）に無水メタノール（１．０ｍＬ）を加え、一気圧の一酸化炭素雰囲気下にて６５℃で４２時間撹拌した。反応液に水を加え、この溶液を酢酸エチル−ジエチルエーテル（２：１）で抽出し、飽和食塩水で洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した濾液をシリカゲル薄層クロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（２：１）］で精製して目的物（３２１ｍｇ，１００％）を得た。
【００８７】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.79 and 0.99 (dt×2 for rotamers, 3H, J = 2.7, 7.3 and 2.4, 7.6 Hz, CH2CH3) , 1.20-1.24 (m×2 for rotamers, 3H, CHCH3) , 1.36-1.68 (m×2 for rotamers, 2H, CH2CH3) , 2.90 and 2.98 (d×2 for rotamers, 3H, NCH3, J = 3.2 and 1.5 Hz), 3.85-3.95 and 4.75-4.86 (m×2 for rotamers, 1H, CHCH3) , 3.90 and 3.92 (s, 3H, COOCH3), 7.54-7.66 (complex, 3H, aromatic) , 7.72-7.77 (m, 1H, aromatic) , 7.97 (br d, 1H, aromatic, J = 8.3 Hz) , 8.04-8.16 (m, 3H, aromatic) .
【００８８】
【化１６】
2011026283.tif 000017
【００８９】
メチル  ３−（３−（ｓｅｃ−ブチル（メチル）カルバモイル）イソキノリン−１−イル）−４−クロロベンゾエート（２１１ｍｇ，０．５１４ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（１２０ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）を含むメタノール溶液（６．０ｍＬ）に水（１．０ｍＬ）を加え、５５℃で１２時間撹拌した。反応液を１Ｍ塩酸で中和し、ジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃縮して粗生成物（２３１  ｍｇ）を得た。
【００９０】
続いて、アルゴン雰囲気下にて、得られた粗成生物（１２４ｍｇ）にｔｅｒｔ−ブチル２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチルカルバメート（２８６ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１８７ｍｇ，０．９７５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（２２７ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。この反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製して目的物（１８２ｍｇ，２段階１００％）を得た。
【００９１】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.78 and 0.99 (dt×2 for rotamers, 3 H, CH2CH3, J = 1.2, 7.3 and 5.4, 7.3 Hz), 1.19-1.25 (m×2 for rotamers, 3 H, CHCH3), 1.32-1.70 (m×2 for rotamers, 2 H, CH2CH3), 1.40 (s, 9 H, Ot-Bu), 2.89 and 2.97 (d×2 for rotamers, 3 H, NCH3, J = 2.4 and 3.4 Hz), 3.15-3.25 (m, 2 H, BocNHCH2), 3.45-3.51 (m, 2 H, CH2NH), 3.55-3.70 (m, 8 H, NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH),  3.80-3.89 and 4.75-4.85 (m, 1 H, CHCH3), 5.08 (br s, 1 H, NH), 6.85-7.00 (m, 1 H, NH), 7.55-8.05 (m, 8H, aromatic).
【００９２】
【化１７】
2011026283.tif 000018
【００９３】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−（２−（３−（３−（ｓｅｃ−ブチル（メチル）カルバモイル）イソキノリン−１−イル）−４−クロロベンズアミド）エトキシ）エトキシ）エチルカルバメート（１９６ｍｇ，０．３１３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２．０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、アルゴン雰囲気下にて、５−カルボキシフルオレセイン（１００ｍｇ，０．２６６ｍｍｏｌ）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１９３ｍｇ，１．０１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（２４５ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）、無水ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）を加え、室温で７２時間撹拌した。反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（１０：１）］で精製して目的物（５５．８ｍｇ，２段階２５％）を得た。
【００９４】
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 0.76 and 0.97 (dt×2 for rotamers, 3 H, CH2CH3, J = 3.9, 7.3 and 4.9, 7.3 Hz), 1.15-1.24 (m×2 for rotamers, 3 H, CHCH3), 1.36-1.48 and 1.55-1.70 (m×2 for rotamers, 2 H, CH2CH3), 2.85 and 2.96 (br s and d for rotamers, 3 H, NCH3, J = 2.2 Hz), 3.55 (br, 4 H, CH2NH), 3.65 (br, 8 H, NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH),  3.78-3.87 and 4.65-4.73 (m, 1 H, CHCH3), 6.57 (d, 2 H, aromatic, J = 9.3 Hz), 6.60 (s, 2 H, aromatic), 6.99 (d, 2 H, aromatic, J = 9.3 Hz), 7.24-7.27 (complex, 1 H, aromatic), 7.58-7.70 (complex, 3 H, aromatic), 7.80-7.83 (m, 1 H, aromatic), 7.95-8.09 (complex, 5 H, aromatic), 8.44 (s, 1 H, aromatic); ESI-MS (m/z) 885 [M+H]+。
【００９５】
〔実施例２〕
実施例２では以下に示す方法によりＮ−ｓｅｃ−ブチル−１−（２−クロロ−５−（５−（フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド）ペンチルカルバモイル）フェニル）−Ｎ−メチルイソキノリン−３−カルボキサミドを合成した。
【００９６】
【化１８】
2011026283.tif 000019
【００９７】
メチル  ３−（３−（ｓｅｃ−ブチル（メチル）カルバモイル）イソキノリン−１−イル）−４−クロロベンゾエート（４６．１ｍｇ，０．１１２ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（２０ｍｇ，０．５００ｍｍｏｌ）を含むメタノール溶液（２．０ｍＬ）に水（０．２０ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応液を１Ｍ塩酸で中和し、ジクロロメタンで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液を濃縮して粗生成物（４９．４ｍｇ）を得た。
【００９８】
続いて、アルゴン雰囲気下にて、得られた粗成生物（４９．４ｍｇ）に、ｔｅｒｔ−ブチル５−アミノペンチルカルバメート（４３．０ｍｇ，０．２１３ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２５．８ｍｇ，０．１３５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１６．１ｍｇ，０．１３２ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）を加え、室温下で１２時間撹拌した。この反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ヘキサン−酢酸エチル（１：２）］で精製して目的物（５８．２ｍｇ，２段階８９％）を得た。
【００９９】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.76-0.80 and 0.92-1.02 (m×2 for rotamers, 3 H, CH2CH3), 1.19-1.25 (m×2 for rotamers, 3 H, CHCH3), 1.36-1.65 (m×2 for rotamers, 8 H, CH2CH3 and NHCH2CH2CH2CH2CH2NH), 1.40 (s, 9 H, Ot-Bu), 2.88 and 2.97 (d×2 for rotamers, 3 H, NCH3, J = 2.4 and 2.7 Hz), 3.05-3.12 (m, 2 H, BocNHCH2), 3.37-3.45 (m, 2 H, CH2NH), 3.80-3.89 and 4.74-4.83 (m, 1 H, CHCH3), 4.59 (br s, 1 H, NH), 6.42-6.54 (m, 1 H, NH), 7.44-7.69 (complex, 4 H, aromatic) , 7.71-8.03 (m, 4H, aromatic).
【０１００】
【化１９】
2011026283.tif 000020
【０１０１】
ｔｅｒｔ−ブチル５−（３−（３−（ｓｅｃ−ブチル（メチル）カルバモイル）イソキノリン−１−イル）−４−クロロベンズアミドペンチルカルバメート（１２０ｍｇ，０．２０７ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加え、室温下で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、アルゴン雰囲気下にて、５（６）−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５６．８ｍｇ，０．４１１ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１５２ｍｇ，０．７９３ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１０２ｍｇ，０．８３６ｍｍｏｌ）、無水ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）を加え、室温下で２時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄した後に無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ベンゼン−アセトン（２：１）］で精製して目的物（９６．０ｍｇ，２段階５５％）を得た。
【０１０２】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.73 and 0.94 (t×2 for rotamers, 3 H, CH2CH3, J = 7.3 and 7.3 Hz), 1.14-1.19 (m×2 for rotamers, 3 H, CHCH3), 1.20-1.72 (m×2 for rotamers, 8 H, CH2CH3 and NHCH2CH2CH2CH2CH2NH), 2.83 and 2.93 (s and d for rotamers, 3 H, NCH3, J = 2.7 Hz), 3.22-3.49 (complex, 4 H, NHCH2), 3.75-3.94 and 4.66-4.75 (m, 1 H, CHCH3), 6.47-6.60 (complex, 4 H, aromatic), 6.65-6.70 (complex, 2 H, aromatic), 7.17-7.20 (m, 1 H, aromatic), 7.55-7.66 (complex, 3 H, aromatic), 7.75-7.85 (m, 1 H, aromatic), 7.89-8.12 (complex, 5 H, aromatic), 8.39 (s, 1 H, aromatic); ESI-MS (m/z) 839 [M+H]+。
【０１０３】
〔実施例３〕
実施例３では以下に示す方法によりＮ−ｓｅｃ−ブチル−１−（２−クロロ−５−（２−（２−（２−（Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセイン−５−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチルカルボニル）フェニル）−Ｎ−メチルイソキノリン−３−カルボキサミドを合成した。
【０１０４】
【化２０】
2011026283.tif 000021
【０１０５】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（２−（２−（３−（３−（ｓｅｃ−ブチル（メチル）カルバモイル）イソキノリン−１−イル）−４−クロロベンズアミド）エトキシ）エトキシ）エチルカルバメート（１１９ｍｇ，０．１９０ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２．０ｍＬ）にトリフルオロ酢酸（０．２ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、アルゴン雰囲気下にて、Ｏ，Ｏ’−ジアセチル−５−カルボキシフルオレセイン（８６．２ｍｇ，０．１９０ｍｍｏｌ）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１９３ｍｇ，０．９８２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（１４９ｍｇ，１．２１ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４．９７ｇ，０．４９８ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン（３．０ｍＬ）を加え、室温で６３時間撹拌した。反応液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム−メタノール（２０：１）］で精製して目的物（５２．６ｍｇ，２段階２９％）を得た。
【０１０６】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.72, 0.80 and 0.93 - 0.99 (t, t and m for rotamers, 3 H, CH2CH3, J = 7.3 and 7.1 Hz), 1.17-1.26 (m×2 for rotamers, 3 H, CHCH3), 1.35-1.45 and 1.52-1.70 (m×2 for rotamers, 2 H, CH2CH3), 2.32 (s, 6 H, CH3COO), 2.86 and 3.00 (d and br s for rotamers, 3 H, NCH3, J = 4.2 Hz), 3.28 - 3.70 (m, 12 H, NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH),  3.72-3.81 and 4.73-4.81 (m, 1 H, NCHCH3), 6.74 - 6.82 (m, 4 H, aromatic), 7.10 - 7.18 (m, 1 H, aromatic), 7.11 (s, 2 H, aromatic), 7.53 -7.61 (complex, 3 H, aromatic), 7.68-7.83 (complex, 2 H, aromatic), 7.89-8.14 (complex, 3 H, aromatic), 8.17 - 8.23 (m, 1 H, aromatic), 8.48 - 8.53 (m, 1 H, aromatic); ESI-MS (m/z) 969 [M+H]+。
【０１０７】
〔実施例４〕
本発明の化合物が、ラットの活性マクロファージへin vivoにて結合することを確認した。
【０１０８】
（方法）
ＤＡラットの腹腔にＬＰＳ（４００μｇ／２００μｌ生食／匹）を投与して、炎症反応を活性化させた。実施例２または３の化合物を含む溶液（４ｍｇ＋１００％エタノール１００μｌ＋プロピレングリコール４００μｌ）を調製し、６０℃に温めながらＰＢＳ１５００μｌを徐々に添加した（計４ｍｇ／２ｍｌ）。さらに５時間後に、実施例２または３の化合物４ｍｇ、またはコントロールとしてのフルオレセインＮａ（Ｆｌｕｏ）２ｍｇ（２ｍｇ／０．０２ｍｌ＋ＰＢＳ０．４８ｍｌ）をそれぞれ尾静脈より投与した。この用量は、ヒトに換算すると５０ｋｇ体重あたり１バイアル（５００ｍｇ）に相当する。化合物の投与の１時間後および３時間後に尾静脈から採血した。採血した血液（各５００μｌ）をすぐにヘパリンと混合した。これらの血液に、蒸留水で１０倍希釈したｐｈａｒｍｌｙｓｅを血液量の１０倍量加え、穏やかに攪拌し、暗所にて室温（２０〜２５℃）で１５分間反応させた（溶血処理）。続いて、２００×ｇにて５分間遠心分離し、上清を除去した。４％ＰＦＡでの固定後に、ＣＤ１１ｂ／ｃ、ＣＤ３で免疫染色ラベルし、ＦＡＣＳにて観察した。
【０１０９】
（結果）
図１は、実施例２の化合物またはフルオレセイン単独を投与した後のＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞についてのＦＡＣＳの結果を示す。図中、１はフルオレセイン単独投与の１時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示し、２はフルオレセイン単独投与の３時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示し、３は実施例２の化合物の投与１時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示す。
【０１１０】
投与１時間後における実施例２の化合物の取り込み量（蛍光強度）は、フルオレセインの単独投与による取り込み量よりも多かった。ただし、実施例２の化合物の投与１時間後の取り込み量を、フルオレセインの単独投与３時間後の取り込み量と比較した場合は、両者の差異が小さかった。
【０１１１】
図２（ａ）は、実施例３の化合物またはフルオレセイン単独を投与した後のＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞についてのＦＡＣＳの結果を示す。図中、１はフルオレセイン単独投与の１時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示し、２はフルオレセイン単独投与の３時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示し、３は実施例３の化合物の投与１時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示し、４は実施例３の化合物の投与３時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示す。
【０１１２】
図１と比較して、実施例３の化合物が、実施例２の化合物またはフルオレセイン単独よりも多く、血中のＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞に多く取り込まれていることがわかった。また、実施例３の化合物の投与１時間後から３時間後にかけて化合物の取り込み量が減少していくことがわかったが、３時間後の段階であってもその取り込み量はフルオレセイン単独の取り込み量よりも明らかに多かった。
【０１１３】
図２（ｂ）は、実施例３の化合物を投与した後のＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞およびＣＤ３陽性細胞についてのＦＡＣＳの結果を示す。図中、１は実施例３の化合物の投与１時間後に得た血液における、ＣＤ３陽性細胞の蛍光強度を示し、２は実施例３の化合物の投与３時間後に得た血液における、ＣＤ３陽性細胞の蛍光強度を示す。また、３は実施例３の化合物の投与１時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示し、４は実施例３の化合物の投与３時間後に得た血液における、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞の蛍光強度を示す。
【０１１４】
実施例３の化合物の取り込みは、ＣＤ３陽性細胞よりもＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞において多く観察された。
【０１１５】
以上のことより、本発明の化合物が、ＣＤ１１ｂ／ｃ陽性細胞へ選択に取り込まれること、その取り込みはフルオレセイン単独よりも効率がよいこと、その取り込み効率は水溶性の化合物（実施例２）よりも脂溶性の化合物（実施例３）の方が高いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、疾患の診断、判定および治療に有用であり、医薬分野に大いに貢献する。
【図１】
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【図２】
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