(57)【要約】【課題】慢性腎疾患の新たな診断薬の提供。【解決手段】被験体由来の試料中のミンディン又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする慢性腎疾患の判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体由来の試料中のミンディン又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする慢性腎疾患の判定方法。
【請求項２】
慢性腎疾患が、糖尿病性腎症である請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
ミンディン又はその遺伝子の発現量が、正常群に比較して高い場合に慢性腎疾患であると判定する請求項１又は２記載の判定方法。
【請求項４】
ミンディン又はその遺伝子の発現量の測定が、免疫学的手法又は遺伝子検出手法によるものである請求項１〜３のいずれか１項記載の判定方法。
【請求項５】
抗ミンディン抗体、ミンディン遺伝子又はそのフラグメントを含有することを特徴とする慢性腎疾患診断薬。
【請求項６】
慢性腎疾患が、糖尿病性腎症である請求項５記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症等の慢性腎疾患の診断方法及び診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎疾患には、腎不全、原発性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、膠原病腎、糖尿病性腎症、腎アミロイドーシス、遺伝性腎疾患等があるが、腎不全は、各種腎疾患により腎機能が破綻した状態である。これらの慢性腎疾患は、重症化すると透析が必要となり、完全な治癒は困難である。従って、早期に発見し、その原因に対する治療が重要である。
【０００３】
糖尿病性腎症は、米国、日本及びヨーロッパにおける終末期腎疾患の主因であり（非特許文献１）、その早期発見は特に重要である。現在、糖尿病性腎症の診断法としては、尿中微量アルミブン、尿タンパク等の測定が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Science 232:1629-1632(1986)
【非特許文献２】Dev. Biol. 192:211-227(1997)
【非特許文献３】Development 126:3637-3648(1999)
【非特許文献４】Nat. Immunol. 5:88-97(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これらの従来のマーカーが陽性になったときには、既にかなり症状が進行しており、さらに新たなマーカーの開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、慢性腎疾患の新たな診断法を開発すべく種々検討した結果、分泌性細胞外マトリックス蛋白であるミンディン（Ｍｉｎｄｉｎ：別名ｓｐｏｎｄｉｎ２）の発現増強が尿中微量アルミブンの出現時期よりも早期にみられ、ミンディンの発現を検査すれば、従来の診断手段よりも早期に慢性腎疾患の診断が可能になることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、被験体由来の試料中のミンディン又はその遺伝子の発現量を測定することを特徴とする慢性腎疾患の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、抗ミンディン抗体、ミンディン遺伝子又はそのフラグメントを含有することを特徴とする慢性腎疾患診断薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法による尿等の試料中のミンディン発現量が健常者に比べて高くなる時期は、従来用いられているマーカーである微量アルミブンが検出される時期よりも早期であり、従来法よりも早期に腎障害が生じていることを診断できる。従って、従来法よりも、病状が進行する前に慢性腎疾患を発見でき、適正な患者指導、治療計画ひいては、末期腎不全への進行抑制に役立つものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】高脂肪食群（ＨＦＤ）及び通常固形食群（Ｃｈｏｗ）の体重（ａ）、尿アルミブン／クレアチニン比（ｂ）（ＡＣＲ）及び血中ＨｂＡｌｃ（ｃ）の変化を示す。
【図２】高脂肪食群（ＨＦＤ）及び通常固形食群（Ｃｈｏｗ）の糸球体におけるミンディンｍＲＮＡの発現（ａ）及び腎臓全体におけるミンディンｍＲＮＡの発現（ｂ）、さらにミンディンの免疫組織化学染色結果（ｃ）及びウエスタンブロットの結果（ｄ）を示す。
【図３】高脂肪食群（ＨＦＤ）及び通常固形食群（Ｃｈｏｗ）の糸球体顕微鏡観察結果を示す。（ａ）は糸球体光学顕微鏡写真、（ｂ）は糸球体電子顕微鏡写真である。
【図４】高グルコース培地（ＨＧ）と通常培地（ＮＧ）における上皮細胞培養物中のミンディン蛋白発現量を示す。
【図５】高脂肪食群（ＨＦＤ）及び通常固形食群（Ｃｈｏｗ）、並びに高グルコース培地（ＨＧ）及び通常培地（ＮＧ）におけるβ１−インテグリンとβ−アクチンの発現量を示す。
【図６】高脂肪食群（ＨＦＤ）及び通常固形食群（Ｃｈｏｗ）における尿中ミンディン量（ａ）、及び糖尿病性腎症患者の尿中ミンディン蛋白発現レベルを示す。
【図７】尿中ミンディン／クレアチニン比（ＡＣＲ）（ａ）及び尿中ミンディン蛋白（ｂ）の発現の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の慢性腎疾患の新たなマーカーはミンディンである。ミンディンは、分泌性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蛋白である、ミンディン−Ｆスポンディン・ファミリーの一員である。この蛋白は当初ゼブラフィッシュにおいて同定され、基底板に蓄積することが見出された（非特許文献２）。ラットミンディンは、インビトロで胚の海馬ニューロンの生長と接着を測定する分泌性蛋白である（非特許文献３）。最近の研究によると、ミンディンは先天的免疫応答の開始に必須であること、及び細菌性病原体について、ＥＣＭにおけるユニークなパターン認識分子であることが知られている（非特許文献４）。しかし、ミンディンと慢性腎疾患の進行との関係については、全く知られていない。
【００１１】
本発明の判定は診断の対象となる慢性腎疾患としては、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、遺伝性腎疾患等があるが、糖尿病性腎症が特に好ましい。
【００１２】
本発明の診断対象である被験体としては、慢性腎疾患を発症し得る哺乳類であればよいが、ヒトが好ましい。また被験体由来の試料としては、尿、血液、腎組織等が挙げられるが、尿が特に好ましい。
【００１３】
被験体由来試料中のミンディン又はその遺伝子の発現量の測定は、ミンディン又はその遺伝子を検出できる手段であれば特に限定されず、免疫学的手法、遺伝子検出手法のいずれでもよい。免疫学的手法の場合には、抗ミンディン抗体を用いた免疫学的測定法が好ましい。また、遺伝子検出手法としては、各種ハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法等が挙げられる。このうち、尿を試料とし、精度良く測定できる点から、抗ミンディン抗体を用いた免疫学的測定法が特に好ましい。
【００１４】
抗ミンディン抗体としては、精製したミンディンと反応する抗体であれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでも良いが、モノクローナル抗体が好ましく用いられる。当該抗体の作製は周知の方法にて作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体の作製には、免疫する動物としてマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどが用いられる。抗血清は、抗原を動物の皮下、皮内、腹腔などに一回又は複数回投与した後、血清から得ることができる。タンパク質、ペプチドを抗原として用いる時は、免疫賦活効果を有するアジュバントとの混合物の免疫がより好ましい。
また、モノクローナル抗体の作製には、公知のモノクローナル抗体作製方法、例えば、長宗香明、寺田弘共著、「単クローン抗体」廣川書店（１９９０年）や、Ｊａｍｅ  Ｗ．Ｇｏｌｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ”，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６年に従い作製することができる。また、ＤＮＡ免疫法によりモノクローナル抗体を作製することもでき、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２  Ｍａｒ１２；３５６  １５２−１５４やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｒ  １；２４９  １４７−１５４を参考に作製することができる。
【００１５】
当該モノクローナル抗体は、常法に従い作成したハイブリドーマを培養し、培養上清から分離する方法、該ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳類動物に投与し、腹水として回収する方法により製造できる。
【００１６】
抗体は、必要に応じてそれをより精製して使用することができる。抗体を精製・単離する手法としては、従来公知の方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによるゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィ法、プロテインＡカラムなどによるアフィニティ精製法などがある。
【００１７】
抗ミンディン抗体を用いた免疫学的測定法としては、例えば免疫染色（ウエスタンブロット）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡやＬＴＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等が挙げられる。
【００１８】
尚、ミンディンの測定において、定量値、もしくは半定量値を得るためには、基準となるミンディン量／濃度と比較することが好ましい。この場合、基準となるミンディン量／濃度としては、既知濃度の尿中ミンディンの使用が好ましい。
【００１９】
次に、得られた測定値を健常者群のミンディン測定値と比較する。
【００２０】
健常者群のミンディン測定値は、前記の被験体由来試料の場合と同様の方法で予め測定しておくのが好ましい。比較には、健常者群のミンディン測定値を統計学的に処理して求めた基準値を使用するのが好ましい。この基準値は、対象疾患毎に統計学的に求めることが好ましい。
【００２１】
慢性腎疾患が存在している場合には、被験体由来試料のミンディン濃度又は量は、後述の実施例に記載の如く、前記基準値よりも有意に高いことが判明した。従って、被験体由来試料のミンディン濃度又は量と、この基準値との対比により、慢性腎疾患の有無を判定することができる。また、治療中の慢性腎疾患患者由来の試料を用いた場合には、治療方法の選択又は効果判定ができる。
【００２２】
また、慢性腎疾患の存在等の判定にあたっては、ミンディンの測定値だけでなく、従来の腎疾患マーカー、例えば尿中微量アルミブン、尿蛋白、尿中ケトン体等の測定値と組み合せて判定してもよい。
【００２３】
本発明の診断薬は、抗ミンディン抗体、ミンディン遺伝子又はそのフラグメントを含有する。当該試薬には、測定に必要な他の要素、例えば反応緩衝液、反応容器、プロトコールが含まれる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（実験方法）
【００２６】
（１）動物
本研究に記載された全てのプロトコルは、順天堂大学の「実験動物委員会」によってレビューされ承認された。雄性ＫＫ／Ｔａ  Ｊｃｌマウス（４週令）は、日本クレア社（日本国、東京）から購入した。マウスは個々にプラスチックのケージに入れ、実験期間中、自由給餌・給水とした。ＫＫ／Ｔａマウスには、４週令からスタートして１６週間、高脂肪食（ＨＦＤ群；脂肪６０％  ｋｃａｌ；Ｄ１２４９２；リサーチ・ダイエット）か、通常の固形食（固形飼料群；脂肪１０％  ｋｃａｌ；Ｄ１２４５０Ｂ；リサーチ・ダイエット）を与えた。これらの食事はカロリーが異なり、高脂肪食は５．２ｋｃａｌ／ｇ、通常食は３．８ｋｃａｌ／ｇであった。全てのマウスは、通常の条件下で同一室内に置き、規則正しい１２時間ずつの明／暗サイクルとし、温度は２４℃±１℃にコントロールした。マウスは２０週令でペントバルビタール麻酔下で犠牲にし、糸球体を単離するための腎臓サンプルを得た。
【００２７】
（２）生化学的検査
４、８、１２、１６及び２０週令において、尿中アルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）、血中ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、及び絶食体重を測定した。絶食血清インスリン、トリグリセリド（ＴＧ）及び総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）の各レベルを２０週令で測定した。尿サンプルは、マウス代謝ケージ（クレアジャパン社）を用いて２４時間採取した。ＨｂＡ１ｃ、尿中アルブミン及びクレアチニンは、イムノアッセイ（ＤＣＡ２０００システム、ジーメンスＡＧ、ドイツ国ミュンヘン）で測定した。絶食血清インスリンは、マウスインスリン酵素結合免疫吸着アッセイキット（森永生科学研究所、日本国東京）で測定した。血漿リポ蛋白は、Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４３：８０５−８１４（２００２）記載のように、スカイライト・バイオテック社（日本国秋田）による高速液体クロマトグラフィーで、コレステロールとトリグリセリド同時定量のためのオンライン・デュアル酵素法によって分析した。
【００２８】
（３）糸球体の単離
単離糸球体サンプルは、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６１：７９９−８０５（２００２）記載のように、ダイナビーズ（ダイナルＡ．Ｓ．社、ノルウェー国オスロ）による灌流で２０週令のマウス腎から得た。即ち、マウスを、直径４．５μｍの磁性ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）で心臓を通して灌流した。腎臓は細断し、コラゲナーゼで消化し、濾過してから磁石で収集した。糸球体サンプルの純度を顕微鏡下で調べ、平均純度９７％を超えていることが確認された。
【００２９】
（４）マイクロアレイ遺伝子発現
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ発現分析テクニカルマニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、米国カリフォルニア州、サンタクララ）に詳細に記載された手続きに基本的に従った。即ち、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（キアーゲン社）を用いて、糸球体サンプルから全ＲＮＡを抽出した。およそ１００ｎｇのＲＮＡを２サイクルｃＤＮＡ合成キット（アフィメトリクス社）に付した。ビオチン標識ｃＲＮＡは、ｃＤＮＡのインビトロ・トランスクリプション（ＩＶＴ標識キット）（アフィメトリクス社）によって得た。アフィメトリクスのＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０で、フラグメントｃＲＮＡ（２０μｇ）をＧｅｎｅＣｈｉｐマウスゲノム４３０  ２．０アレイにハイブリダイズした。アレイは、指示プロトコルに従って洗浄し染色した。ＧｅｎｅＣｈｉｐをＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナ３０００（アフィメトリクス社）でスキャンし、データはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ７．３．１ソフトウェア（アジレント・テクノロジーズ）で分析した。ソフトウェアＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ７．３．１によって、準備した各アレイに対し、高脂肪食及び通常固形食のＫＫ／Ｔａマウス間でデータの正規化及び基準化を行った。可能性のあるバイオマーカー候補を特定するため、インジェヌイティ・パスウェイ分析（ＩＰＡ）を行った（インジェヌイティ・システムズ社、ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）。
【００３０】
（５）リアルタイムＰＣＲ
２０週令の糸球体でのミンディンのｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲで評価した。ランダムデカマープライマー（アンビオン社、米国テキサス州オースチン）とＭＭＬＶ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ社、米国カリフォルニア州、カールスバッド）でＲＮＡを逆転写した。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲは、製造業者（アプライド・バイオシステムズ社、米国カリフォルニア州、フォスター・シティ）の指示書に従って行い、解析した。リアルタイムＰＣＲは、アプライド・バイオシステムズ社（Ｍｍ００５１３５９６＿ｍ１）から商業的に入手可能なアッセイと共に提供されたプライマーを用いて各組織フラクションにおけるミンディンの発現を決定するために行った。各データポイントについて測定を３回繰返し行った。サンプル中の相対ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ量について正規化した。
【００３１】
（６）光学顕微鏡観察及び免疫組織化学的染色
光学顕微鏡観察については、切片を３μｍに細断し、パラフィン包埋した後、パス（ＰＡＳ）試薬で染色した。免疫組織化学法は、基本的にＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．８３：１８３−１８９（２００９）記載の方法に従って行った。モノクローナルマウス抗−ＳＰＯＮ２抗体（アブノヴァ・コーポレイション、台湾）を用いた。
【００３２】
（７）ウェスタンブロット分析
標準技法に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット分析を行い、エンハンスト・ケミルミネッセンス・イムノブロット検出キット（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック社、英国バッキンガムシャー、リトルシャルフォント）で可視化した。本研究で用いた第一抗体は次の通りであった：モノクローナルマウス抗−ＳＰＯＮ２（ミンディン）抗体（アブノヴァ・コーポレイション）、モノクローナルマウス抗−β１インテグリン抗体（ＢＤトランスダクションラボラトリーズ、ＢＤバイオサイエンス社、米国カリフォルニア州）、モノクローナルマウス抗−βアクチン抗体（シグマ社）。また、本研究ではＨＲＰ−結合第二抗体（ジャクソン−イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、米国ペンシルバニア州ウェストグローブ）を用いた。
【００３３】
（８）電子顕微鏡観察
０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸バッファー中２％のグルタルアルデヒド（ＧＡ）によって組織を４℃で１２０分間固定して電顕観察に付した。組織片は通常のダイヤモンドナイフで切断し、並の薄さの（ｓｅｍｉ−ｔｈｉｎ）切片とごく薄い切片とを得た。１％トルイジンブルーで染色した並薄の切片（厚さ１μｍ）を光学顕微鏡観察に用いた。極薄の切片は、１００メッシュの銅グリッド上に集め、４％ウラニルアセテートとクエン酸鉛で二重染色した。日立の７１００透過型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ、日本国東京）を７５ｋＶで操作して切片を調べた。
【００３４】
（９）上皮細胞の培養
上皮細胞の培養はＥｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３６：２４８−２５８（１９９７）記載に従って行った。分化を誘導するため、上皮細胞（細胞数：５×１０4個）を、タイプＩコラーゲンでコーティングされたディッシュ（イワキガラス社、日本国、東京）に低密度でγインターフェロンの非存在下、３７℃で播種した。分化した上皮細胞を２４時間、０．１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有のダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で飢餓状態で培養した。次いで細胞を２群に分割した：（１）正常グルコース群（ＮＧ）；コントロールとして５．５ｍＭグルコースを含有させたＤＭＥＭ中でインキュベート、及び（２）高グルコース群（ＨＧ）；２５ｍＭグルコースを含有させたＤＭＥＭ中でインキュベート。全ての実験は、各条件について最低３回行った。全実験において、継代数１５と２０の間の上皮細胞を使用した。
【００３５】
（１０）患者
この研究は順天堂大学医学部の倫理委員会で承認されたものである。すべての患者が実験に参加する前に書面でインフォームド・コンセントを提出した。患者の蛋白尿発現は糖尿病発症が記録されてから５年超経過後であり、尿中の沈澱物には赤血球や細胞円柱は含まれていなかった。尿サンプルは早朝に採集した。コントロールの尿サンプルは健常成人ボランティアから採取した。これらのサンプルは−８０℃で保存し、使用前に遠心操作に付して尿酸塩類を除去した。尿中アルブミン及びミンディンの濃度を尿中クレアチニンに対して補正した。
【００３６】
（１１）統計解析
全てのデータは平均±標準誤差（ＳＥ）で表した。２種のパラメータ間の比較はスチューデント・アンペアｔ検定で解析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとした。
【００３７】
（結果）
（１）高脂肪食ＫＫ／Ｔａマウスの表現型の特徴付け
高脂肪食（ＨＦＤ）或いは通常固形食（Ｃｈｏｗ）を給餌した、週令の異なるＫＫ／Ｔａマウスの表現型値を図１に示す。ＨＦＤ群中、８、１２、１６及び２０週令の体重とＡＣＲは通常固形食群におけるそれらより顕著に高かった（ｐ＜０．０１）。ＨＦＤ群中、１２、１６及び２０週令のＨｂＡ１ｃレベルもまた、通常固形食群におけるそれらより顕著に高かった（ｐ＜０．０１）。血清ＴＧと総コレステロールについては、２０週令で、ＨＦＤ群と通常固形食群との間で顕著な差はなかった（表１）。しかし、ＨＦＤ群の血清低密度リポ蛋白コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）は、固形飼料群におけるデータより顕著に高く（ｐ＜０．０５）、ＨＦＤ群の血清高密度リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、固形飼料群におけるデータより低かった（ｐ＜０．０５）。ＨＦＤ群の絶食血清インスリンレベルは、固形飼料群のレベルと比べ顕著に上昇していた（ｐ＜０．０１）。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
（２）ＨＦＤ群の糸球体におけるミンディンのｍＲＮＡ発現
表２は、ＩＰＡバイオマーカーによってフィルタリングしＧｅｎｅＣｈｉｐ上に置かれたＨＦＤ群の糸球体において発現量増大を示した上位２０の遺伝子を示す。ミンディンの発現は高脂肪が誘導した遺伝子で最も高い増大倍数を示した。この結果をリアルタイムＰＣＲで確認した（図２ａ）。
ミンディンのｍＲＮＡ発現は、高脂肪食、２０週令の糸球体で顕著に発現量が増加した（ｐ＜０．００５）。しかしながら、全腎臓では、ＨＦＤ群と通常固形食群でミンディンのｍＲＮＡ発現量に大きな差はなかった（図２ｂ）。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
（３）糸球体におけるミンディンの蛋白発現
免疫組織化学染色を行ってみると、ミンディン蛋白は主として上皮細胞に局在している（図２ｃ）。ウェスタンブロット分析の結果、２０週令のＨＦＤ群の糸球体におけるミンディンの蛋白発現レベルも、通常固形飼料群でのレベルより顕著に高いことが判明した（図２ｄ）。
【００４２】
（４）ＨＦＤ群における糸球体傷害
光学顕微鏡観察では、ＨＦＤ群でメサンギウム基質の増生・拡大が見られ、これは通常固形飼料群の場合と比べ僅かに高レベルであった（図３ａ）。電子顕微鏡観察において、上皮細胞の足突起は２０週令のＨＦＤ群においては融合していた（図３ｂ）。
【００４３】
（５）上皮細胞によるミンディン蛋白の産生
高グルコース刺激がミンディン蛋白の産生を増大させるかどうかを決定するため、高グルコース培地でインキュベートした上皮細胞培養物を調べた。ミンディンは分泌性ＥＣＭ蛋白であるため、上清に検出された。高グルコース刺激下での上清におけるミンディン蛋白発現レベルは、通常のグルコース刺激下での発現レベルより顕著に高かった（ｐ＜０．０５、図４）。
【００４４】
（６）糸球体及び培養上皮細胞におけるβ１−インテグリン蛋白発現
糸球体におけるβ１−インテグリン蛋白発現については、ＨＦＤ群と固形飼料群とでそのレベルに統計的に有意な差はなかった（図５ａ）。しかしながら、高グルコース条件での、上皮細胞溶解産物におけるβ１−インテグリンの発現は、通常のグルコース条件下での発現に比べ増大していた（ｐ＜０．０５、図５ｂ）。
【００４５】
（７）マウス及びヒトの糖尿病性腎症から得た尿サンプル中のミンディン
上皮細胞が高グルコース条件でミンディンを分泌するという前提のもと、次にマウス及びヒトの尿中のミンディンの発現を調べた。ＨＦＤ群における尿中ミンディンの発現レベルは固形飼料群におけるそれよりも顕著に高かった（図６ａ）。
糖尿病性腎症の患者における尿中ミンディンの蛋白発現レベルもまた、健常コントロールのレベルと比べと高かった（図６ｂ）。尿中ミンディンレベルは糖尿病性腎症の進行と共に漸増した。
【００４６】
（８）尿中ミンディン発現の早期増加
固形飼料群では、尿中（アルミブン／クレアチニン比）（ＡＣＲ）レベルは１２週令でプラトーに達し平坦化した。１２週令で高脂肪食に変えた群では、尿中ＡＣＲレベルは２０上昇した（図７ａ）。尿中のミンディン発現は１６週令で増強した（図７ｂ）。尿中ミンディンの発現は尿中ＡＣＲより早く増加した。
【００４７】
ミンディンはヒト及びマウスの尿中で検出可能であった。ミンディンの発現は、健常コントロールの場合と比べ糖尿病患者で増加しており、これは糖尿病性腎症の臨床病期を反映していた。ミンディンが免疫組織化学法では主として上皮細胞に検出されることから、尿中ミンディンは上皮細胞から排出されると仮定し、上皮細胞はミンディンを上皮細胞培養物中に産生することを確認した。糸球体傷害の重症度を評価するため、少なくとも２つの観点を検討する必要がある。それらは糸球体傷害の影響（ｒｅｓｕｌｔｓ）と進行中の障害の重篤度である。食事を通常固形食から高脂肪食に変えると、尿中ミンディンは尿中ＡＣＲよりも早期に上昇した。ミンディンの発現は、糸球体傷害の早期マーカー及び／又はアクティブな糸球体傷害のリアルタイムのインジケータであると考えられる。
臨床期によっては糖尿病性腎症患者の尿中に、ミンディンの検出が可能であった。尿中ミンディンは糖尿病性腎症を有する患者における上皮細胞傷害の新しい尿中マーカーとなりうると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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