(57)【要約】【課題】  植物の維管束を構成する組織において機能するプロモーターなどの探索を、形質転換個体の作出を行うことなく短時間で簡易に行うことを可能とする、伴細胞などにおけるＤＮＡの機能解析方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、維管束の摘出単離が可能な植物から摘出単離した維管束に遺伝子銃を用いてＤＮＡを導入し、導入したＤＮＡの維管束を構成する組織における機能解析を行う方法である。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
維管束の摘出単離が可能な植物から摘出単離した維管束に遺伝子銃を用いてＤＮＡを導入し、導入したＤＮＡの維管束を構成する組織における機能解析を行う方法。
【請求項２】
維管束の摘出単離が可能な植物がアブラナ科アブラナ属の植物、セリ科オランダミツバ属の植物、オオバコ科オオバコ属の植物のいずれかである請求項１記載の方法。
【請求項３】
解析対象とするＤＮＡの機能がプロモーター活性である請求項１記載の方法。
【請求項４】
特定の細胞において特異的に機能するプロモーターの下流にレポーター遺伝子と終止配列を連結し、さらにその下流に、解析対象とするＤＮＡと上流に連結したレポーター遺伝子と異なるレポーター遺伝子と終止配列を連結して維管束に導入し、特定の細胞にＤＮＡが導入されたことを上流側のレポーター遺伝子の発現で確認した上で、その細胞におけるＤＮＡのプロモーター活性を下流側のレポーター遺伝子の発現で評価する請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法による機能解析に基づいて植物の維管束を構成する組織において機能するＤＮＡを探索する方法。
【請求項６】
配列表の配列番号１に記載のシロイヌナズナ由来ＭＥＴＡＬＬＯＴＨＩＯＮＥＩＮ２Ｂ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ（翻訳開始点上流１０００−１ｂｐ）に含まれる配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ（翻訳開始点上流１４８−１３９ｂｐ）および配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ（翻訳開始点上流１１５−１０５ｂｐ）を少なくとも含むＤＮＡからなるプロモーターを用いて植物の維管束を構成する組織において遺伝子を発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伴細胞などの植物の維管束を構成する組織におけるＤＮＡの機能解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の維管束は様々な組織から構成され、生命維持のために機能している。近年の研究により、維管束を構成する通道組織である篩管（ｐｈｌｏｅｍ）は、同化産物に加え、植物ホルモンやタンパク質、さらにはＲＮＡのような高分子までも輸送対象としていることが明らかにされている。その際、伴細胞（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｃｅｌｌ）は、輸送物質の選定、篩管への物質輸送、篩管からの物質の荷降ろしといったいわばターミナルとしての機能を担っている他、生細胞でありながら核やリボソームが存在しない篩管細胞を維持する役割も有していることが知られている。一方で、植物種や器官によっては伴細胞を含まない篩部組織も存在することから、伴細胞の存在が植物にとって必須でないことも知られており、その機能や生命活動への貢献度については未だ不明な点が多い。しかしながら、これまでの研究により、伴細胞を特徴付ける遺伝子発現制御機構の存在が示唆されていることなどからすれば、伴細胞は植物の生命維持に対して少なからず貢献していることは間違いがなく、その機能解明は非常に意義深い。
【０００３】
上記のような背景のもと、伴細胞で機能するプロモーターについての研究がこれまでにも行われており、その鍵となるシス配列の同定に関する報告も既に存在する（非特許文献１）。しかしながら、これまでの研究は、形質転換個体の作出を前提としていることから、時間と労力を必要とするものであった。従って、この点が研究の進展に多かれ少なかれ悪影響を与えていることは否めない。よって、形質転換個体の作出を行うことなく、伴細胞における遺伝子発現制御機構などの機能の解析を行うための方法論があれば、研究の進展に大いに寄与するものと考えられる。
【０００４】
また、各種の物質が篩管を通じて輸送されることは上記の通りであるが、この現象は接ぎ木を介しても成立することが明らかにされており、本発明者らも、非特許文献２において、伴細胞を含む篩部組織で発現したｍＲＮＡが、接ぎ木を介して植物の表現型を改変し得ることを報告している。このような台木から穂木への接ぎ木を介した形質付与は、農業的応用の可能性が期待され、大いに興味がもたれるところである。しかしながら、篩管を通して輸送される物質の量はごく僅かである。輸送物質の量を増加するための方法としては、輸送物質がＲＮＡの場合、例えば台木の篩部組織においてＲＮＡを大量に発現させる方法が挙げられる。このような方法を確立するためには、篩部組織において強力に機能するプロモーターの情報は不可欠である。けれども、このような情報を入手するためには、これまでは、時間と労力を必要とする形質転換個体の作出を行わなければならなかったことは上記の通りである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Schneidereit A, Imlau A, Sauer N. (2008) Conserved cis-regulatory elements for DNA-binding-with-one-finger and homeo-domain-leucine-zipper transcription factors regulate companion cell-specific expression of the Arabidopsis thaliana SUCROSE TRANSPORTER 2 gene. Planta 228, 651-662.
【非特許文献２】Kudo H, Harada T. (2007) A graft-transmissible RNA from tomato rootstock changes leaf morphology of potato scion. HortScience 42, 225-226.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、植物の維管束を構成する組織において機能するプロモーターなどの探索を、形質転換個体の作出を行うことなく短時間で簡易に行うことを可能とする、伴細胞などにおけるＤＮＡの機能解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、アブラナ科アブラナ属に属するセイヨウナタネの葉柄から維管束の摘出単離が容易に行えることに着目し、摘出単離した維管束に遺伝子銃を用いてＤＮＡを導入すれば、維管束を構成する組織における一過的遺伝子発現が可能となり、伴細胞などの組織において機能するプロモーターなどの解析を容易に行うことができることを知見した。
【０００８】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、維管束の摘出単離が可能な植物から摘出単離した維管束に遺伝子銃を用いてＤＮＡを導入し、導入したＤＮＡの維管束を構成する組織における機能解析を行う方法である。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、維管束の摘出単離が可能な植物がアブラナ科アブラナ属の植物、セリ科オランダミツバ属の植物、オオバコ科オオバコ属の植物のいずれかである方法である。
また、請求項３記載の方法は、請求項１記載の方法において、解析対象とするＤＮＡの機能がプロモーター活性である方法である。
また、請求項４記載の方法は、請求項３記載の方法において、特定の細胞において特異的に機能するプロモーターの下流にレポーター遺伝子と終止配列を連結し、さらにその下流に、解析対象とするＤＮＡと上流に連結したレポーター遺伝子と異なるレポーター遺伝子と終止配列を連結して維管束に導入し、特定の細胞にＤＮＡが導入されたことを上流側のレポーター遺伝子の発現で確認した上で、その細胞におけるＤＮＡのプロモーター活性を下流側のレポーター遺伝子の発現で評価する方法である。
また、本発明は、請求項５記載の通り、請求項１記載の方法による機能解析に基づいて植物の維管束を構成する組織において機能するＤＮＡを探索する方法である。
また、本発明は、請求項６記載の通り、配列表の配列番号１に記載のシロイヌナズナ由来ＭＥＴＡＬＬＯＴＨＩＯＮＥＩＮ２Ｂ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡ（翻訳開始点上流１０００−１ｂｐ）に含まれる配列表の配列番号２に記載のＤＮＡ（翻訳開始点上流１４８−１３９ｂｐ）および配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ（翻訳開始点上流１１５−１０５ｂｐ）を少なくとも含むＤＮＡからなるプロモーターを用いて植物の維管束を構成する組織において遺伝子を発現させる方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、植物の維管束を構成する組織において機能するプロモーターなどの探索を、形質転換個体の作出を行うことなく短時間で簡易に行うことを可能とする、伴細胞などにおけるＤＮＡの機能解析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例におけるセイヨウナタネの成葉から維管束を摘出単離するための工程図である。
【図２】同、ＭＴ２ＢプロモーターのプロモーターＧＵＳ解析の結果である。
【図３】同、構築したベクターの構造図である（伴細胞マーカーであるＣｏＹＭＶｐ−ＤｓＲｅｄ２−ＮｏｓＴと、ＭＴ２Ｂｐｒｏの欠失シリーズ−ｓＧＦＰ−ＮｏｓＴのｐＴＨ２の制限酵素サイトへの挿入方法である）。
【図４】同、欠失実験によるＭＴ２Ｂプロモーターに座乗するシス配列の同定の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、維管束の摘出単離が可能な植物から摘出単離した維管束に遺伝子銃を用いてＤＮＡを導入し、導入したＤＮＡの維管束を構成する組織における機能解析を行う方法であり、植物体の内部に位置する伴細胞などに対して確実かつ効率よくＤＮＡの導入ができ、そして遺伝子の一過的発現が行えることから、導入したＤＮＡの機能解析を容易に行うことができる。本発明において利用することができる維管束の摘出単離が可能な植物は、いずれかの部位から維管束の摘出単離が可能な植物であれば特段制限されるものではない。具体例としては、セイヨウナタネなどのアブラナ科アブラナ属の植物、セロリなどのセリ科オランダミツバ属の植物、オオバコなどのオオバコ科オオバコ属の植物などが挙げられる。セイヨウナタネの維管束は、例えば葉柄から容易に摘出単離することができる。
【００１２】
本発明において摘出単離した維管束に導入するＤＮＡは、例えば、維管束を構成する組織における機能の有無や程度などの解析を行いたいＤＮＡである。具体的には、伴細胞などにおいてプロモーター活性を有するか否かや活性の程度を知りたいＤＮＡなどが好適な対象となる。この場合、解析対象とするＤＮＡは、例えば、適当なレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子やＤｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＤｓＲｅｄ）遺伝子など）と終止配列（ＮｏｓＴなど）を下流に連結し、ベクターの形態で維管束に導入する。プロモーター活性は組織におけるレポーター遺伝子の発現の有無や程度によって評価することができる。特定の細胞におけるプロモーター活性を評価したい場合、その細胞において特異的に機能するプロモーター（例えば伴細胞で特異的に機能するプロモーターとしてはＣｏｍｍｅｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ（ＣｏＹＭＶ）プロモーターがある）の下流にレポーター遺伝子と終止配列を連結し、さらにその下流に、解析対象とするＤＮＡと上流に連結したレポーター遺伝子と異なるレポーター遺伝子と終止配列を連結し、ベクターの形態で維管束に導入する。例えば、レポーター遺伝子として上流側にＤｓＲｅｄ遺伝子を連結し、下流側にＧＦＰ遺伝子を連結することで、特定の細胞に目的とするＤＮＡが導入されたことをＤｓＲｅｄ遺伝子の発現による赤色の蛍光で確認した上で、その細胞におけるＤＮＡのプロモーター活性をＧＦＰ遺伝子の発現による緑色の蛍光で評価することができる。
【００１３】
摘出単離した維管束への遺伝子銃を用いたＤＮＡの導入は、例えば、維管束に対して自体公知の方法で行えばよい。具体的には、金やタングステンなどの微粒子の表面に解析対象とするＤＮＡを担持させ、市販の遺伝子銃を用いて行うことができる。
【００１４】
本発明によれば、例えば、伴細胞を含む篩部組織において機能する新規なプロモーターの探索などを短時間で簡易に行うことができる。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１６】
実施例：
（Ａ）セイヨウナタネの成葉からの維管束の摘出単離
メスを用いてセイヨウナタネの成葉を茎から分離し、その上部を切除し、葉柄下部に切れ目を入れた後、維管束を含む組織片を縦方向に剥離した。続いて剥離組織より維管束のみを摘出し、表層に残る周辺組織に由来する残渣をメスとピンセットを用いて除去することで行った（図１）。
【００１７】
（Ｂ）遺伝子銃を用いた維管束へのＤＮＡの導入による伴細胞で機能するプロモーターの探索と解析
セイヨウナタネの維管束組織において特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを構築し、このライブラリーから高頻度に出現する遺伝子について、シロイヌナズナにおける相同遺伝子を検索し、ＭＥＴＡＬＬＯＴＨＩＯＮＥＩＮ２Ｂ（ＭＴ２Ｂ：Ａｔ５ｇ０２３８０）遺伝子を見出した。そのプロモーターＧＵＳ解析を実施した結果、ＭＴ２Ｂプロモーターは、実生の子葉、根、本葉、がく片、花弁、莢を含むほぼ全身の篩部組織で機能することがわかった（図２）。ＭＴ２Ｂプロモーターを含むＤＮＡ（翻訳開始点上流１０００−１ｂｐ）の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
次に、ＭＴ２Ｂプロモーターに座乗するシス配列を同定するため、プロモーターの欠失シリーズを作製した。その作製は、伴細胞において特異的に機能するプロモーターであるＣｏＹＭＶｐの下流にレポーター遺伝子としてＤｓＲｅｄ２遺伝子と終止配列としてＮｏｓＴを連結し、さらにその下流に、プロモーター活性の検定対象とするＤＮＡとレポーター遺伝子としてｓＧＦＰ遺伝子と終止配列としてＮｏｓＴを連結したベクター（Ｔｗｉｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）を構築することにより行った（図３：ｐＴＨ２を使用し、その制限酵素サイトを利用して自体公知の遺伝子工学技術により構築。必要であればNiwa Y, Hirano T, Yoshimoto K, Shimizu M, Kobayashi H. (1999) Non-invasive quantitative detection and applications of non-toxic, S65T-type green fluorescent protein in living plants. The Plant Journal 18, 455-463.を参照のこと）。このようにして構築したベクターを、直径１．６μｍの金微粒子を分散させた滅菌水懸濁液に混和した後、さらにスペルミジンと塩化カルシウムを添加し、３０分間静置することで、ベクターを表面に担持した金微粒子を得た。このようにして得たベクターを表面に担持した金微粒子を、遺伝子銃（ＢＩＯ−ＲＡＤ社：ＰＤＳ１０００Ｈｅ）を用いて（Ａ）で摘出単離したセイヨウナタネの維管束に打ち込み、伴細胞における遺伝子の一過的発現を誘導し、伴細胞にベクターが導入されたことをＤｓＲｅｄ２遺伝子の発現による赤色の蛍光で確認した上で、伴細胞における検定対象とするＤＮＡのプロモーター活性をｓＧＦＰ遺伝子の発現による緑色の蛍光で評価した。
上記の方法による欠失実験によってシス配列の座乗領域を同定した結果、ＭＴ２Ｂプロモーターは、その翻訳開始点上流１４８−１３９ｂｐ（配列番号２）および１１５−１０５ｂｐ（配列番号３）の２つの領域に伴細胞における遺伝子発現を制御するシス配列が存在することがわかった（図４）。以上の結果から、ＭＴ２Ｂプロモーターに含まれる上記の２つの領域に存在するシス配列を少なくとも含むＤＮＡ（例えば５０〜１００ｂｐのＤＮＡ）は、植物体の様々な部位の伴細胞おいて機能するプロモーターとして利用できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明は、植物の維管束を構成する組織において機能するプロモーターなどの探索を、形質転換個体の作出を行うことなく短時間で簡易に行うことを可能とする、伴細胞などにおけるＤＮＡの機能解析方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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