(57)【要約】【課題】多環芳香族化合物などの石油成分によって汚染された海水や土壌を比較的短時間で効率的に浄化できる技術を提供する。【解決手段】フサリウム属に属するＦ０９２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７９５）を用いて石油中の多環芳香族化合物などを分解する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
石油分解能を有するフサリウム属に属するＦ０９２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７９５）。
【請求項２】
多環芳香族化合物分解能を有するフサリウム属に属するＦ０９２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７９５）。
【請求項３】
請求項１または２に記載の微生物、および基材を含有することを特徴とする石油分解剤組成物。
【請求項４】
請求項１若しくは２に記載の微生物、または請求項３に記載の石油分解剤組成物を石油汚染環境に添加することを特徴とする石油汚染環境の浄化方法。
【請求項５】
前記石油汚染環境は海水または土壌である請求項４に記載の浄化方法。
【請求項６】
さらに、前記微生物の栄養源および／または界面活性剤を添加する請求項４または５に記載の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、石油分解能を有する新規微生物、および当該微生物を用いて石油汚染環境を浄化する方法に関するものである。本発明の新規微生物は、石油に汚染された海洋および土壌のいずれの環境下であっても、石油中の難分解性物質である多環芳香族化合物（ＰＡＨｓ）を分解可能であり、特に、海洋に流出または漏出するなどした多環芳香族化合物の分解に好ましく用いられる。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油の汚染による被害が深刻化しており、原油タンカーの座礁事故などによる海洋汚染；石油の精製工場や備蓄基地、コールタールの製造工場や石炭の処理工場などの敷地内や周辺部における土壌汚染などが挙げられる。石油や原油には低沸点化合物や比較的親水性の高い化合物など、自然に分解され易い成分も含まれているが、多環芳香族化合物（ＰＡＨｓ）など非常に分解され難い成分も含まれている。多環芳香族成分は長く環境に残留して生物に悪影響を与えるので問題となっている。
【０００３】
難分解性の石油成分に汚染された環境浄化方法としては、例えば、活性炭等を用いた吸着方法、加熱による熱分解法、汚染土壌の不溶化処理法など、様々な化学的または物理的な処理方法がある。しかし近年では、より穏和な条件で安価に実施でき、省エネルギーの観点からも優れている微生物による処理方法（バイオレメディエーション）の開発が盛んである。
【０００４】
例えば特許文献１には、液体環境および土壌環境の双方で多環芳香族化合物を効率的に分解できる微生物として、Ｐｏｌｙｐｏｒａｌｅｓ目に属するＴＹ−８株及びＨａｐａｌｏｐｉｌａｃｅａｅ科に属するＴＹ−１６株が開示されている。上記文献には、これらの微生物が液体培地にて多環芳香族化合物を分解できることは開示されているが、海水中に含まれる当該化合物を分解できることまでは実証していない。
【０００５】
また、非特許文献１〜３には、微生物を用いて土壌中の多環芳香族化合物を分解する方法が開示されている。このうち非特許文献１と２には、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属菌やＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ属菌などの細菌によって汚染土壌の抽出物や汚染土壌の懸濁液を処理する方法が開示され、また、非特許文献３には、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属菌等によって石油成分を浄化する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−４６０４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】H.I. ATAGANAら，ウォーター・エアー・アンド・ソイルポリューション（Water, Air, and Soil Pollution），第１４１巻，第２３３〜２４６頁（２００２年）
【非特許文献２】Mikael Erikssonら，アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology），第６９巻、第１号，第２７５〜２８４頁（２００３年）
【非特許文献３】Marc Vinasら，アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology），第７１巻、第１１号，第７００８〜７０１８頁（２００５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように微生物を用いて石油中の多環芳香族化合物を分解し、石油汚染環境を浄化する方法は幾つか開示されている。しかし、例えば非特許文献１〜３は、土壌汚染を主に浄化する方法であり、海洋汚染については特に言及されていない。また、非特許文献１および２は、石油成分の抽出や汚染土壌のスラリー化といった前処理を前提とした浄化処理技術であり、石油成分などにより汚染された土壌の範囲や量が莫大であることを考慮すると、実用性に乏しい。また、非特許文献３は、汚染土壌を固体状態のままでも浄化できる技術であるが、多環芳香族化合物を十分に浄化できるまで約６ヶ月以上の長時間を有するなど、分解効率に劣っている。一方、特許文献１には、海水中の多環芳香族化合物を分解した実施例は開示されていない。
【０００９】
また、上記文献のいずれの微生物も、海水中で成育可能であることは開示されていない。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、難分解性化合物である多環芳香族化合物などの石油成分によって汚染された海洋または土壌を、比較的短時間で効率的に浄化できる新規微生物を用いた浄化技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決し得た本発明の新規微生物は、石油分解能を有するフサリウム属に属するＦ０９２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−７９５）である。上記微生物は、特に多環芳香族化合物の分解能に優れており、石油汚染環境の浄化剤として極めて有用である。
【００１２】
また、上記課題を解決し得た本発明の石油分解剤組成物（石油汚染環境浄化剤組成物）は、上記の微生物、および基材を含有しているところに要旨を有するものである。
【００１３】
また、上記課題を解決し得た本発明に係る石油汚染環境の浄化方法は、上記の微生物または上記の石油分解剤組成物を、石油汚染環境に添加するところに要旨を有するものである。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態において、上記汚染環境は海水または土壌である。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、上記の浄化方法は、上記微生物の栄養源および／または界面活性剤を更に添加するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の新規微生物Ｆ０９２株は、多環芳香族化合物などの石油成分に汚染された海洋や土壌（石油汚染環境）を、スラリー化したり石油成分を抽出したりせずとも比較的短時間で浄化することができる。また、本発明の新規微生物Ｆ０９２株は、海水中で成育可能であるため、海水などに流出または漏出した石油（代表的には原油や重油など）成分をその場で分解・浄化することができる。従って、本発明によれば、原油タンカーの座礁事故などによる海洋汚染や、石油を用いる工場の跡地などの土壌汚染などのように、膨大かつ広大な環境汚染を効率的に浄化処理できるものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、多環芳香族化合物などに代表される石油成分中の難分解性物質を効率的に分解して石油汚染環境を浄化し得る新規微生物を検索してきた。その結果、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（フサリウム）属に属するものであり、石油成分の分解能（すなわち、石油汚染環境の浄化能）に極めて優れる菌株であるＦ０９２株を見出し、本発明を完成した。
【００１８】
この新規微生物は、後記する実施例に示すように、海水中で成育可能であり、しかも短時間で多環芳香族化合物などの難分解性物質を分解できるなど、海洋環境汚染の浄化に特に適している。また、この新規微生物を用いれば、前述した非特許文献に記載された技術のように、石油汚染土壌をスラリー化したり汚染物質を抽出するといった前処理を行なう必要はなく、石油汚染土壌へ当該新規微生物を散布するのみで土壌を浄化することができる。
【００１９】
まず、本発明の新規微生物株Ｆ０９２株について、詳しく説明する。
【００２０】
上記のＦ０９２株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）寄託機関の名称およびあて名
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ）寄託日：２００９年８月１３日
（ｉｉｉ）受領番号：ＮＩＴＥ  ＡＰ−７９５
（ｉｖ）受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−７９５
【００２１】
Ｆ０９２株を馬鈴薯−グルコース（ポテトグルコース）寒天培地（滅菌前のｐＨ５．６、１２１℃で２０分間滅菌）にて２５℃で５〜７日間培養し、光学顕微鏡を用いて観察した形態的特徴は、以下の通りである。即ち、白色系のコロニーを形成し、フィアロ型の多細胞性で紡錘形〜三日月形の大分生子（短径×長径が、おおむね、１〜２μｍ×２０〜２５μｍ程度）および１細胞性の小分生子（短径×直径が、おおむね、１〜２μｍ×３〜４μｍ程度）を形成する。以上の形態的特徴から、下記参考文献に照らし、Ｆ０９２株をＦｕｓａｒｉｕｍ属に属する菌と同定した。
渡邊恒雄著「土壌糸状菌−培養株の探索と形態―」ソフトサイエンス社、第２６〜２７頁、および第２２１〜２２５頁（１９９３年）
【００２２】
Ｆ０９２株の最適成育条件はｐＨ５．５〜８．６、温度２５〜３０℃であり、成育の範囲はｐＨ４〜９、温度１０〜３５℃である。
【００２３】
Ｆ０９２株を上記の馬鈴薯−グルコース液体培地で培養したところ、培地には１，２−ジオキシゲナーゼ活性、２，３−ジオキシゲナーゼ活性、ラッカーゼ（Ｌａｃ）活性、およびマンガンベルオキシダーゼ（ＭｎＰ）活性が認められた。よって、Ｆ０９２株による石油成分の分解能には、これら酵素のうち少なくとも１つが関与している可能性がある。
【００２４】
Ｆ０９２株を２０℃、２５℃、３０℃および３５℃で培養したところ、いずれの温度でも成育したが、最も良好に成育したのは３０℃であった。よって、Ｆ０９２株を培養する際の温度やＦ０９２株により石油成分を分解する際の温度は、２０℃以上、３５℃以下程度が好適である。
【００２５】
本発明のＦ０９２株は、石油成分の分解能に優れているが、特に、置換基を有さず極めて分解され難い多環芳香族化合物であるクリセンなどを効率良く分解できることが実験的に確認された（後記する実施例を参照）。また、本発明者らによる知見によれば、Ｆ０９２株は１，２−ジオキシゲナーゼなどを活発に発現する。Ｆ０９２株は、これら酵素によりクリセンを酸化しつつその炭素−炭素結合を切断していき、水酸基やカルボキシル基などの親水性基を有するベンゼン化合物に導き、最終的に二酸化炭素と水まで分解すると推察される。よってＦ０９２株は、クリセンと同様の多環芳香族化合物であるテンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、フルオレン、フェナレン、フェナンスレン、アントラセン、トリフェニレン、ピレン、ベンゾピレン、ナフタセン、ペリレンなども分解できると考えられる。またＦ０９２株は、ベンゼン、アルキルフェノール類、ハロゲン化フェノール類、ビスフェノール類、ダイオキシン類といった化合物も同様に分解し得ると考えられる。
【００２６】
なお、Ｆ０９２株が分解し得る石油成分は、原油や石油に含まれ得るものであれば原油由来のものや石油由来のものに限定されない。例えばクリセンなどの多環芳香族化合物は山火事によっても発生する。その一方で、かかる多環芳香族化合物は自然には分解され難い。よって、本発明で処理すべき石油成分は、原油や石油に含まれる成分であれば、その起源は問わないものとする。なお、一般的に精製前の石油を特に原油というが、本発明では石油と原油を特に区別しないものとする。原油には、原油を用いた石油製品（例えば、重油、ガソリン、灯油、軽油など）も含まれる。後記する実施例ではＣ重油を用いた。Ｃ重油は、動粘度によって分類された３種の重油であり、軽油のほか９０％以上が残渣油である。
【００２７】
本発明のＦ０９２株は、石油成分中の多環芳香族化合物を効率よく分解できるため、海水汚染環境、土壌汚染環境の別を問わず、石油汚染環境の浄化処理に好適に用いられる。
【００２８】
特に本発明のＦ０９２株は、海水中で成育可能であり、海水汚染環境の浄化に好適に用いられる。本発明によれば、上述した種々の石油成分を高濃度に含む汚染海水を効率よく分解することができる。本発明によって処理可能な石油汚染海水の濃度は、Ｆ０９２株を、好ましくは後記する栄養源や界面活性剤などと併用したり、撹拌培養を行ったり、当該菌株の培養期間を長くするなどして高めることができ、おおむね、１５，０００〜５０，０００ｐｐｍ程度の汚染海水を処理することができる。
【００２９】
また、本発明のＦ０９２株は、土壌汚染環境の浄化にも好適に用いられる。本発明によれば、従来のように石油汚染土壌をスラリー化したり汚染土壌中の石油成分を抽出しなくても、石油汚染土壌へＦ０９２株を添加してＦ０９２株と石油汚染土壌を接触させるのみで石油成分を分解することができる（後記する実施例を参照）。
【００３０】
しかも本発明によれば、上述した種々の石油成分を高濃度に含む汚染土壌を効率よく分解することができる。本発明によって処理可能な石油汚染土壌の濃度は、Ｆ０９２株を、好ましくは後記する栄養源や界面活性剤などと併用したり、当該菌株式の培養期間を長くするなどして高めることができ、おおむね、１５，０００〜５０，０００ｐｐｍ程度の汚染土壌を処理することができる。
【００３１】
Ｆ０９２株と石油汚染土壌を接触させる方法は常法に従えばよい。例えば、Ｆ０９２株を液体培地で培養した場合には、その培養液を石油汚染土壌に散布すればよい。
【００３２】
本発明のＦ０９２株は、麦芽エキス培地、ポテトグルコース培地などの液体培地を用いて培養することが好ましい。実施例に用いた麦芽エキス培地およびポテトグルコース培地の組成は、後記する実施例に示すとおりである。なお、実施例に用いたポテトグルコース培地の組成は、通常用いられるポテトグルコース培地とは若干異なり、通常培地に比べ、ポテトの量が２．５倍（２００ｇ／Ｌ→５００ｇ／Ｌ）であり、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）を更に加えている点で、通常組成のものと相違している。また、当該液体培地のｐＨは、Ｆ０９２株の至適ｐＨに合わせて５〜８．５程度に調整することが好ましい。
【００３３】
上述したように、Ｆ０９２株は石油成分を高度且つ短時間に効率よく分解できるため、石油分解剤若しくは石油汚染環境浄化剤として用いることができる。具体的には、Ｆ０９２株をそのまま、石油分解剤として用いても良いし、Ｆ０９２株を含む液体培地を、石油分解剤として用いても良い。あるいは、栄養源や界面活性剤など（後記する。）を含むものであってもよい。あるいは、Ｆ０９２株に、微生物を含む処理剤に通常添加される添加剤（代表的には保存剤など）を添加したものを、石油分解剤として用いることもできる。
【００３４】
上記の石油分解剤は、液体培地などでＦ０９２株を十分に成育させたものであってもよいし、或いは成育させたものを冷蔵保存したものであってもよい。
【００３５】
次に、本発明の石油分解剤組成物について詳しく説明する。本発明の石油分解剤組成物は、上記のＦ０９２株、および基材を含有している。ここで、上記のＦ０９２株は、添加剤を更に含む石油分解剤として含有されていても良い。
【００３６】
本発明に用いられる基材は特に限定されず、微生物の担持に通常用いられるものであって、石油成分を吸収できるものなどが好適に用いられる。具体的には、例えば、紙、繊維、布帛、フィルター、合成繊維などの紙・繊維製品類；木材チップなどの建材製品；フィルム、プラスチックなどの素材などが挙げられる。例えばプラスチックとして、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、メラミン樹脂などの熱硬化性樹脂などが代表的に例示される。上記基材のなかでも、微生物によって分解される生分解性プラスチックや生分解性繊維などの生分解性基材が好ましく用いられる。生分解性基材は、多環芳香族化合物などの石油成分を吸収できるだけでなく、石油成分の浄化処理後は、当該生分解性基材自体も分解されるからである。生分解性基材には、原料により、生物資源（バイオマス）由来のバイオ基材と、石油由来の石油基材とに大別されるが、本発明では、いずれも使用可能である。バイオ基材の代表例としては、例えば、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、変性ポリビニルアルコール、カゼインなどが挙げられ、石油基材の代表例としては、例えば、ＰＥＴ共重合体などが挙げられる。
【００３７】
本発明のＦ０９２株を上記基材に担持し、成形物（製品）を得る方法は特に限定されず、基材の種類に応じて、通常用いられる方法を適宜採用すれば良い。例えば、基材を製品に加工した後、Ｆ０９２株含有溶液を当該製品の表面に被覆したり、当該製品に浸漬するなどの方法が挙げられる。あるいは、製品に加工する前に、基材とＦ０９２株含有溶液などを混合するなどの方法を採用しても良い。
【００３８】
基材に担持するＦ０９２株（培養物）の配合量は、使用する基材の種類などに応じ、適宜適切に制御すればよい。例えば、ポリプロピレンなどのプラスチック素材やポリ乳酸などの生分解性基材を用いる場合、基材全体１００質量部に対し、Ｆ０９２株を培養した培養物、例えば木粉などで培養した培養物を、おおむね、５〜１５質量部の比率で配合することが好ましい。
【００３９】
次に、本発明に係る石油汚染環境の浄化方法について詳しく説明する。本発明の浄化方法は、上記のＦ０９２株または上記の石油分解剤組成物を、石油に汚染された海水または土壌の石油汚染環境に添加するところに特徴がある。
【００４０】
Ｆ０９２株を石油に汚染された海水や土壌などの石油汚染環境に添加する場合には、Ｆ０９２株の栄養源若しくは界面活性剤、またはこれらの混合物を添加することが好ましい。栄養源はＦ０９２株の成育を活発化し、ひいては石油成分の分解能を活性化することができる。また、界面活性剤は、脂溶性が高く親水性の低い石油成分を固体状の土壌などから脱離し易くしてＦ０９２株による分解を促進することによって、より効率的な浄化処理が可能になると考えられる。
【００４１】
Ｆ０９２株の栄養源としては、例えばディフコ製の麦芽エキスなどのようにフサリウム属の栄養源として市販されているものを用いることができる。あるいは、グルコースなどの炭素源；ポリペプトンなどの窒素源；マグネシウム塩やマンガン塩などの微量元素源；クエン酸などのｐＨ調整剤などを適宜選択して用いてもよい。
【００４２】
栄養源の添加量は、Ｆ０９２株の量などに応じて適宜調整すればよいが、一般的には栄養源の量は多いほどＦ０９２株の成育は良好であり、石油成分の分解効率は向上する。その一方で、炭素源や窒素源などの栄養源が多過ぎると環境への悪影響が懸念される。以上を考慮して、添加する栄養源の量は、処理対象である石油汚染海水や石油汚染土壌１００質量部に対して、おおむね、５〜１５質量部の比率にすることが好ましい。
【００４３】
使用する界面活性剤としては、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤など特に制限されないが、Ｆ０９２株への悪影響が少ないことから非イオン界面活性剤が好適である。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。より具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０を用いることができる。
【００４４】
界面活性剤は、Ｆ０９２株の成育環境に対する石油成分の分散性を向上させる他、炭素源となるなどＦ０９２株の成育を促進する可能性もある。しかし、界面活性剤の量が多過ぎるとかえってＦ０９２株の成育に悪影響を与え得る。そこで、界面活性剤の添加量は、処理すべき石油汚染環境１００質量部に対し、おおむね、０．０５質量部以上、１．０質量部以下であることが好ましく、０．１質量部以上、０．７５質量部以下であることがより好ましい。
【００４５】
培養に当たり、撹拌の有無は特に限定されず、静置培養および撹拌培養のいずれも採用することができる。撹拌培養時の撹拌速度は、処理対象である原油の種類や濃度、量などによっても相違するが、Ｆ０９２株の分解能を有効に発揮させるためには、おおむね、５０〜１５０ｒｐｍの範囲内に制御して行なうことが好ましい。
【００４６】
処理対象である石油汚染海水や石油汚染土壌は、採水または採掘した上で容器に挿入し、Ｆ０９２株や栄養源などを添加し、Ｆ０９２株が良好に成育できるように温度や湿度を調整してもよい。しかし、海水汚染や土壌汚染は広範囲に及ぶことが多く、処理すべき海水や土壌を逐一採水または採掘すると、かえって処理効率が低下し得る。よって、石油汚染海水または石油汚染土壌に、そのままＦ０９２株を添加してもよい。なお、Ｆ０９２株は、おおむね、２５℃で十分に成育することから、日本国内であれば、Ｆ０９２株は温度調節せずとも常温で石油成分を分解できると考えられる。但し、湿度は比較的高く保つべきであるので、適時水を散布することなどが好ましい。
【００４７】
Ｆ０９２株の添加量は、汚染海水や汚染土壌の汚染状態などに応じて適宜調整すればよい。
【００４８】
本発明者らによる知見によれば、Ｆ０９２株による石油汚染海水や石油汚染土壌の処理中は、遮光した方が効率が良い。よって、石油汚染海水や石油汚染土壌にＦ０９２株を添加した後は、ブルーシート等で被覆するなどして照射光量を抑えることが好ましい。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例によって制限されず、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適切に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００５０】
実施例１：Ｆ０９２株の単離およびスクリーニング試験
まず、下記組成の麦芽エキス（ＭＥ）寒天培地１０ｍＬを用意する。本実施例では、蒸留水の代わりに人工海水（ＮａＣｌ濃度３．５質量％、ｐＨ８．２）を用いてＭＥ寒天培地を作製した。
ＭＥ寒天培地：麦芽エキス（２０ｇ／Ｌ）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、
ポリペプトン（１ｇ／Ｌ）、寒天（２０ｇ／Ｌ）
【００５１】
次に、上記のＭＥ寒天培地１０ｍＬに、ＰＡＨｓの一種であるクリセン溶液（０．２５％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドの１％クリセン溶液）を０．１ｍＬ加え、スクリーニング用培地とした。
【００５２】
このスクリーニング培地に、愛媛大学農学部構内で採取された土壌とキノコ４２種；松山市内で採取された土壌とキノコ５７種；松山市郊外で採取された土壌とキノコ１２種の合計１１１種の試料を接種し、暗所にて、２５℃で７日間静置培養した。当該培地で成育する菌のなかから、成育速度が最も速い（クリセンの分解率が最も高い）菌として、本発明の新規微生物Ｆ０９２菌株を選択した。この新規微生物Ｆ０９２株は、愛媛大学農学部構内で採取された土壌から選抜されたものであった。なお、成育速度（分解率）は、上記のクリセン含有ＭＥ培地で培養した菌の成育直径（Ｂ）と、クリセンを含有しないＭＥ寒天培地で上記と同様にして培養した菌の成育直径（Ａ）を測定し、Ａに対するＢの比率（Ｂ／Ａ×１００）を算出したものであり、Ｆ０９２株の成育速度は約９６％であった。
【００５３】
なお、Ｆ０９２株による高いクリセン分解能は、上記のクリセン含有ＭＥ寒天培地において、人工海水の代わりに蒸留水を加えて作製したＭＥ寒天培地（ｐＨ４．７）を用いて上記と同様にして培養を行なっても認められ、試料中、最も高い分解率（約９６％）を有していた。
【００５４】
以上の実験結果により、Ｆ０９２株は、海水で作製したＭＥ寒天培地、および蒸留水で作製したＭＥ寒天培地のいずれの条件下においても極めて高い成育速度で成育し、クリセンを高度に分解できることが分かった。すなわち、Ｆ０９２株は、海水中の多環芳香族化合物を高度に分解できる微生物として極めて有用であることが実証された。
【００５５】
実施例２
本実施例では、下記組成のクリセン含有ＭＥ液体培地でＦ０９２株を１５日および３０日間培養した後、培養液中に残存しているクリセンを定量し、Ｆ０９２株による、ＭＥ液体培地中のクリセンの分解率を測定した。
【００５６】
詳細には、まず、下記組成の麦芽エキス（ＭＥ）液体培地２０ｍＬを用意する。本実施例では、蒸留水の代わりに人工海水（ＮａＣｌ濃度３．５質量％、ｐＨ８．２）を用いてＭＥ液体培地を作製した。
ＭＥ液体培地：麦芽エキス（２０ｇ／Ｌ）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、
ポリペプトン（１ｇ／Ｌ）
【００５７】
次に、上記のＭＥ液体培地２０ｍＬに、クリセン溶液（０．２５％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドの１．１４％クリセン溶液）を０．４ｍＬ添加し、クリセン含有ＭＥ液体培地を得た。
【００５８】
比較のため、上記のクリセン含有ＭＥ液体培地に対し、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ８０を表１に記載の比率（体積比率）で添加した界面活性剤入りクリセン含有ＭＥ液体培地を用意した。同様に、上記のクリセン含有ＭＥ液体培地に対し、窒素栄養源であるポリペプトンを表１に記載の比率（体積比率）で添加したポリペプトン入りクリセン含有ＭＥ液体培地を用意した。
【００５９】
また、参考のため、上記のそれぞれのＭＥ液体培地について、人工海水の代わりに蒸留水を加えたクリセン含有ＭＥ液体培地（ｐＨ４．７）を用意した。
【００６０】
次いで、上記のようにして作製した合計６種類のクリセン含有ＭＥ液体培地中に、Ｆ０９２株を接種し、暗所にて、２５℃で１５日間または３０日間静置培養した後、後記する方法でクリセンの分解率を測定した。
【００６１】
更に培養条件の比較のため、上記のようにして作製したクリセン含有ＭＥ液体培地（界面活性剤およびポリペプトンの添加なし）にて撹拌培養（撹拌速度８０ｒｐｍ）を行ない、後記する方法クリセン分解率を測定した。
【００６２】
（クリセン分解率の測定）
培養開始から１５日および３０日間経過後にろ過により、ろ液と残渣（菌体）に分けた。ろ液は酢酸エチルで抽出した。残渣は酢酸エチルで１６時間ソックスレー抽出した。それぞれの抽出液を減圧濃縮後、合併して内部標準である４−クロロビフェニールを加え、シリカゲルカラムで精製した。ジクロロメタンで溶出する画分を濃縮後、ＧＣ−ＭＳにより残留クリセンを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は、以下の通りである。
カラム：ジーエルサイエンス社製のＴＣ−１（長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）
キャリヤーガス：ヘリウム
昇温条件：８０℃で２分間保持後→１５０℃まで２０℃／分で昇温→３００℃まで
２５℃／分で昇温→３００℃で１０分間保持
カラム流速：  １．５ｍＬ／分
注入口温度：  ２６０℃
イオン化電圧：  ７０ｅＶ
【００６３】
これらの結果を表１（人工海水）および表２（蒸留水）に示す。
【００６４】
【表１】
2011067199.tif 000002
【００６５】
【表２】
2011067199.tif 000003
【００６６】
これらの表より、Ｆ０９２株は、人工海水または蒸留水で作製したＭＥ液体培地のいずれにおいても高い成育速度で成育し、クリセンを高度に分解できることが分かった。また、Ｆ０９２株によるクリセン分解作用は、ＭＥ液体培地中栄養源であるポリペプトンや界面活性剤を添加したり、撹拌下で培養することにより、一層促進されることも分かった。
【００６７】
実施例３
本実施例では、原油含有ポテトグルコース(ＰＧ)寒天培地中にＦ０９２株を接種し、培養後の菌糸の成育直径（ｃｍ）を測定した。
【００６８】
詳細には、まず、人工海水または蒸留水を用いて、下記組成のＰＧ寒天培地を作製した。
ＰＧ寒天培地：ポテト（５００ｇ／Ｌ）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、
酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、寒天（２０ｇ／Ｌ）
【００６９】
上記の各ＰＧ寒天培地中（１０ｍＬ）に、溶媒（ヘキサン１ｍＬ）に溶解した原油を濃度が５０００〜１５０００ｐｐｍになるように加えた後、Ｆ０９２株を接種し、暗所にて２５℃で培養した。Ｆ０９２株は同心円状に成育するので、培養後の菌糸の直径（ｃｍ）を２日毎に測定した。本実施例で用いた原油は、インドネシアから輸入した原油（太陽石油から提供）であり、その組成は、以下のとおりである。
炭化水素（ａｌｋａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）６２％
芳香族化合物６％
窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）７％
アスファルト（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）２５％
【００７０】
これらの結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
2011067199.tif 000004
【００７２】
表３より、Ｆ０９２株は、原油中および海水を含む原油中のいずれにおいても成育可能であり、且つ、５０００〜１５０００ｐｐｍの広範囲の濃度域において成育することが分かった。よって、本発明のＦ０９２株は、海水中で成育可能であり、石油で汚染された海水中の多環芳香族化合物を高度に分解できる微生物として極めて有用であることが分かった。
【００７３】
実施例４
本実施例では、Ｆ０９２株と基材（生分解性を有するポリプロピレン繊維を使用）を用いて海水中の石油を分解浄化することを模擬して、以下の実験を行なった。本実施例では、石油成分としてＣ重油を用いた。
【００７４】
まず、人工海水（ＮａＣｌ濃度３．５質量％、ｐＨ８．２）を用いて作製した実施例３に記載のＰＧ寒天培地２０ｍＬを、三角フラスコに加えた。
【００７５】
次に、ポリプロピレン繊維（東レ・ファインケミカル社製のポリプロピレン繊維シートを使用）を２ｃｍ×２ｃｍのサイズにカットし、Ｃ重油を吸収させた。クリーンベンチ内で一晩放置し、溶媒を除去した。Ｃ重油の濃度は１０００ｐｐｍである。本実施例では、Ｃ重油として、重油規格（ＪＩＳＫ２２０５）の３種１号に相当するＣ重油であり、太陽石油株式会社製のＣ重油を用いた。上記Ｃ重油の組成は、以下のとおりである。
炭化水素（ａｌｋａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）４４％
芳香族化合物４１％
窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）８％
アスファルト（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）７％
【００７６】
このようにしてＣ重油含浸ポリ乳酸繊維を、上記のＰＧ液体培地２０ｍＬに浮かべ、暗所にて、２５℃で０〜６０日間静置培養した後、Ｃ重油の分解率を以下のようにして測定した。比較のため、上記のＰＧ液体培地にＣ重油のみ（ポリプロピレン繊維を使用せず）を加え、同様に培養を行い、Ｃ重油の分解率を測定した。
【００７７】
Ｃ重油の分解率は、Ｍｉｓｈｒａらの方法（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｉｌｙ  Ｓｌｕｄｇｅ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓａｎｊｅｅｔ  Ｍｉｓｈｒａ，Ｊｅｅｖａｎ  Ｊｙｏｔ，Ｒａｍｅｓｈ  Ｃｈａｎｄｅｒ  Ｋｕｈａｄ，Ｂａｎｗａｒｉ，  Ｌａｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，３２８−３３５（２００１））を参考にして測定した。ここでは、Ｃ重油量［全石油炭化水素（ｔｏｔａｌ  ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、ＴＰＨ）の量］およびＣ重油を構成する炭化水素（ａｌｋａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）：芳香族化合物；窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）；およびアスファルト（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）の両方を測定した。
【００７８】
測定方法の概要は以下のとおりである。まず、培養開始（０日）からそれぞれ１５日間、３０日間および６０日間経過後の培養物を採取した。培養物にヘキサンを加えて抽出した。ヘキサン抽出後の溶液をさらにジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した。それぞれの抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。一方、菌株を添加せずに同様にして培養を行った培養物を採取し、上記と同様にして、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した各抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。このようにして得られた各抽出物の重量を比較し、全石油炭化水素部（ＴＰＨ）の分解率を算出した。
【００７９】
さらに、各抽出物にヘキサンを加え、ヘキサン可溶部と不溶部に分けた。このうちヘキサン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン、トルエン、およびクロロホルム：メタノール（１：１）で順次溶出した。このようにして得られたヘキサン溶出部は炭化水素を、トルエン溶出部は芳香族化合物を、クロロホルム：メタノール（１：１）溶出部は窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）並びにアスファルトを、それぞれ含む。このうち炭化水素および芳香族化合物の分解率は、ヘキサン溶出部およびトルエン溶出部をガスクロマトグライー（ＧＣ）で分析し、処理前後のそれぞれの溶出物のピーク面積を比較して算出した。ＧＣ条件は、以下の通りである。また、ＮＳＯおよびアスファルトの分解率は、クロロホルム：メタノール（１：１）可溶部およびアスファルトからなるヘキサン不溶部を合わせたものの重量を測定し、処理前後の重量を比較して算出した。
カラム：ジーエルサイエンス社製のＴＣ−５（長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）
キャリヤーガス：ヘリウム
昇温条件：６０℃〜２８０℃まで１０℃／分で昇温→２８０℃で１０分間保持
カラム流速：１．５ｍＬ／分
注入口温度：３００℃
【００８０】
ＴＰＨ、炭化水素、芳香族化合物、並びにＮＳＯおよびアスファルトの分解率を、表４（基材添加あり）および表５（基材の添加なし）に、それぞれ示す。
【００８１】
【表４】
2011067199.tif 000005
【００８２】
【表５】
2011067199.tif 000006
【００８３】
まず、全石油炭化水素部（ＴＰＨ）に着目すると、Ｆ０９２株を用いると、ポリプロピレン繊維の有無にかかわらず培養後約２ヶ月程度で、１０００ｐｐｍのＣ重油の半分以上を分解することができた。表４と表５を対比すると、ポリプロピレン繊維を使用しない場合は分解率が一層促進され、培養後２ヶ月程度で約８０％程度のＣ重油を分解することができた（表５を参照）。
【００８４】
同様の傾向は、Ｃ重油を構成する各成分についても認められた。すなわち、表４に示すように、Ｆ０９２株とポリプロピレン繊維を用いた場合は、培養後約１ヶ月程度でＣ重油中の炭化水素および芳香族化合物の半分以上を分解することができた。また、表５に示すように、ポリプロピレン繊維を使用しない場合は分解率が一層促進され、培養後約１ヶ月程度でＣ重油中の炭化水素および芳香族化合物の２／３以上を分解することができ、培養後約２ヶ月程度で約７０〜８０％にまで分解能が促進された。
【００８５】
以上の結果より、本発明法は、Ｃ重油で汚染された汚染海水を十分に浄化できる技術として極めて有用であることが十分実証された。
【００８６】
実施例５
本実施例では、前述した実施例４において、Ｃ重油の代わりに原油を用いたこと以外は実施例４と同様にして実験を行なった。原油は、実施例３で用いた原油を使用し、添加した原油濃度はＣ重油と同様、１０００ｐｐｍである。
【００８７】
ＴＰＨ、炭化水素、芳香族化合物、並びにＮＳＯおよびアスファルトの分解率を、表６（基材添加あり）および表７（基材の添加なし）に、それぞれ示す。
【００８８】
【表６】
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【００８９】
【表７】
2011067199.tif 000008
【００９０】
まず、全石油炭化水素部（ＴＰＨ）に着目すると、Ｆ０９２株を用いると、ポリプロピレン繊維の有無にかかわらず培養後約２ヶ月程度で、１０００ｐｐｍの原油の約２／３程度を分解することができた。表６と表７を対比すると、ポリプロピレン繊維を使用した場合は分解速度が促進され、培養後約１ヶ月程度で半分以上の原油を分解することができた（表６を参照）。
【００９１】
同様に、原油を構成する各成分についても、Ｆ０９２株を用いると、ポリプロピレン繊維の有無にかかわらず培養後約２ヶ月程度で、１０００ｐｐｍの原油の約２／３程度を分解することができた。表６と表７を対比すると、ポリプロピレン繊維を使用した場合は分解速度が促進され、培養後１ヶ月程度で、原油中の炭化水素の半分以上を分解することができた。
【００９２】
以上の結果より、本発明法は、原油で汚染された海水を十分に浄化できる技術として極めて有用であることが十分実証された。
【００９３】
実施例６
本実施例では、Ｆ０９２株によるクリセン汚染土壌中のクリセン分解率を測定した。
【００９４】
まず、クリセン汚染土壌を以下のように調製した。愛媛大学農学部附属農場から採取した土壌（弱酸性のｐＨ６．２）を３ｍｍのメッシュで篩い分けし、１２０℃で２時間滅菌した。別途、０．２５％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドに０．０１％のクリセンを添加した溶液を作製した。上記滅菌土壌（乾燥重量で１００ｇ）にこのクリセン溶液（１ｍＬ）を加えた。また、比較のために、滅菌処理を行っていない土壌に対して、同様に上記クリセン溶液を添加した。いずれも土壌中のクリセン濃度は１０ｐｐｍである。
【００９５】
上記のようにして調製したクリセン汚染土壌にＦ０９２株を接種した。詳細には、Ｆ０９２株の生菌ペレットは、前述したＭＥ寒天培地上で成育させたＦ０９２菌をコルクボーラー（直径５ｍｍ）で寒天ごと打ち抜いて作製し、上記のクリセン汚染土壌１００ｇ中にこの生菌ペレット８個を加えた。この方法によれば、土壌全体中のペレット全体の重さ（生重）は約２質量％となり、本実施例では、これをＦ０９２株の添加量とした。
【００９６】
更に、上記のクリセン汚染土壌に対し、栄養源としてグルコースまたはポリペプトンを、表９（グルコース添加）または表１０（ポリペプトン添加）に記載の比率で添加し、暗所にて、２５℃にて１５日間または３０日間培養した。比較のために、上記の栄養源を添加しないクリセン添加土壌にて、同様に培養した。
【００９７】
培養開始から１５日間または３０日間経過後に土壌の一部を採取し、ジクロロメタンで１６時間ソックスレー抽出した。抽出液を減圧濃縮後、内部標準液である４−クロロビフェニールを加え、シリカゲルカラムで精製した。ジクロロメタンで溶出する画分を濃縮後、ＧＣ−ＭＳにより残留クリセンを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は、以下の通りである。
カラム：ジーエルサイエンス社製のＴＣ−１（長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）
キャリヤーガス：ヘリウム
昇温条件：８０℃→１５０℃まで２０℃／分で昇温→３００℃まで２５℃／分で
昇温→３００℃で１０分間保持
カラム流速：１．５ｍＬ／分
注入口温度：２６０℃
イオン化電圧：７０ｅＶ
【００９８】
処理前のクリセン量から、分解率を算出した。結果を表８（コントロール）、表９（グルコース添加）および表１０（ポリペプトン添加）に、それぞれ示す。
【００９９】
【表８】
2011067199.tif 000009
【０１００】
【表９】
2011067199.tif 000010
【０１０１】
【表１０】
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【０１０２】
表８〜１０より、Ｆ０９２株を用いれば、栄養源を添加しなくても、土壌中のクリセンを分解できることが分かる（表８を参照）。Ｆ０９２株のクリセン分解率は、グルコースやポリペプトンの添加によって一層促進され、培養後３０日で、グルコース添加群ではクリセンの半分以上を、ポリペプトン添加群ではクリセンの約２／３程度を、分解することができた。
【０１０３】
上記の実験結果により、Ｆ０９２株を用いれば、海水および土壌を問わず、クリセンなどの石油中多環芳香族化合物を効率よく分解できることが実証された。
【０１０４】
実施例７
本実施例では、前述した実施例５において、原油の濃度を１５，０００ｐｐｍとしたこと以外は実施例５と同様にして実験を行なった。
【０１０５】
ＴＰＨ、炭化水素、芳香族化合物、並びにＮＳＯおよびアスファルトの分解率を、表１１（基材添加あり）および表１２（基材の添加なし）に、それぞれ示す。
【０１０６】
【表１１】
2011067199.tif 000012
【０１０７】
【表１２】
2011067199.tif 000013
【０１０８】
これらの表より、Ｆ０９２株を用いると、１５，０００ｐｐｍと高濃度の原油であっても、ポリプロピレン繊維の有無にかかわらず培養後約２ヶ月程度で、原油中の炭化水素の約４割程度を分解することができた。なお、培養後約１ヶ月程度までの炭化水素の分解率については、ポリプロピレン繊維を使用しない方が分解速度が促進される傾向が見られた（表１１と表１２をご参照）。
【０１０９】
以上の結果より、本発明法は、１５，０００〜５０，０００ｐｐｍ程度の高濃度の原油で汚染された海水を浄化できる技術としても極めて有用であることが実証された。