(57)【要約】【課題】足場材を用いた培養を長期間に亘って行うことのできる細胞培養デバイス、並びにそれを用いた細胞培養システム及び細胞培養方法を提供する。【解決手段】細胞が収容される培養室３００と、前記培養室３００に連通した培地導入流路４００及び培地排出流路５００を備えた細胞培養デバイス１０において、前記培養室３００と培地排出流路５００の間に多孔質フィルタ６００とを設ける。これにより、培養室３００に固定された足場材７００が使用中に剥がれた場合でも、それを多孔質フィルタ６００によって捕捉することができるため、該足場材によって培地排出流路５００が閉塞されるのを防ぎ、長期間の培養を行うことが可能となる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)細胞が収容される培養室と、
b)前記培養室に連通した培地導入流路と、
c)前記培養室に連通した培地排出流路と、
d)前記培養室と培地排出流路の間に設けられた多孔質フィルタと、
を有することを特徴とする細胞培養デバイス。
【請求項２】
本体と、該本体の上部に着脱可能に取り付けられる蓋部とを有し、
前記培養室が前記本体に形成され、且つ該培養室が前記本体の上面に開口部を有するものであり、
前記培地排出流路が前記蓋部に形成され、且つ該培地排出流路が前記開口部と対向する前記蓋部下面の位置に開口部を有するものであって、
前記多孔質フィルタが前記本体と蓋部の間に配置されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項３】
前記本体と蓋部の接触面の少なくとも一方が自己吸着性を有する素材から成ることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養デバイス。
【請求項４】
前記培養室と培地排出流路の接続部に対応する位置に貫通孔を備えた自己吸着性を有するシート材と前記貫通孔を閉塞するように配置された多孔質フィルタとを有するシール部材を、前記本体と蓋部の間に挟持して成る請求項２に記載の細胞培養デバイス。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養デバイスと、該細胞培養デバイスの培地導入流路に培地を送液する送液機構とを有することを特徴とする細胞培養システム。
【請求項６】
請求項５に記載の細胞培養システムを用いた細胞培養方法であって、
前記細胞培養用デバイスの培養室に足場材をコーティングし、該培養室に培地を連続送液しながら該培養室内で内皮細胞と肝実質細胞とを共培養することを特徴とすることを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養デバイス、並びにそれを用いた細胞培養システム及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は、一般的にシャーレ等の容器に細胞及び液体状の培地を収容した状態で行われる。しかし、近年、半導体製造分野での微細加工技術の進歩に伴って医療やバイオテクノロジーの研究分野でも微細加工技術によって製造されたマイクロデバイスの応用が進められており、こうしたマイクロデバイスを用いた細胞培養が行われるようになっている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
細胞培養用のマイクロデバイス（細胞培養デバイス）は平板状基材の内部に培養室と微小流路を形成して成るものであり、該培養室に細胞及び培地を収容して細胞培養を行い、前記微小流路を利用して培地の交換を行うものとなっている。
【０００４】
ところで、近年、人工臓器の開発に期待が寄せられており、その一環である人工肝臓の開発についても数多くの研究がなされている。しかし、肝細胞は長期間の培養が困難であり、更に培養初期には肝機能を発現するものの、その後肝機能が著しく低下してしまうという問題があった。これに関し、本発明者らは適当な足場材（細胞培養担体）を使用することで内皮細胞にネットワークを形成させ、これと肝実質細胞を共培養することによって高い肝機能を発現させることができる旨を報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2008-519598号公報（[0037],図1A）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】藤山陽一、田川陽一、他5名、"管化内皮細胞培養システムを用いた肝実質細胞との共培養における肝機能の解析"、第30回日本分子生物学会年会予稿集、2007年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、細胞培養においては培養する細胞の種類に応じた足場材を用いることが有効である。こうした足場材としては一般にコラーゲン等から成る高分子ゲルがよく用いられる。しかし、上記のような細胞培養デバイスの培養室内面にこのような高分子ゲルをコーティングして足場材を形成した場合、培養中に該ゲルが剥がれて微小流路に目詰まりが生じる場合がある。そのため、従来の細胞培養デバイスではこのような足場材を用いた培養を長期間行うことは困難であった。
【０００８】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、足場材を用いた培養を長期間に亘って行うことのできる細胞培養デバイス、並びにそれを用いた細胞培養システム及び細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために成された本発明に係る細胞培養デバイスは、
a)細胞が収容される培養室と、
b)前記培養室に連通した培地導入流路と、
c)前記培養室に連通した培地排出流路と、
d)前記培養室と培地排出流路の間に設けられた多孔質フィルタと、
を有することを特徴としている。
【００１０】
このような構成によれば、培養室に足場材をコーティングして細胞培養を行った場合において、使用中に足場材が剥離したとしても、それが多孔質フィルタによって捕捉されるため、該足場材による培地排出流路の目詰まりを防止することができる。そのため、本発明によれば、従来の細胞培養デバイスでは困難であった足場材を用いた長期培養を行うことが可能となる。なお、前記多孔質フィルタは、剥離した足場材は通過できないが培地は容易に通過できるものとする必要がある。そのため、該多孔質フィルタとしては平均孔径が０．１〜１０μｍのものを用いることが望ましい。このような多孔質フィルタとしては、例えばニトロセルロース等から成るシート状の多孔質膜を好適に用いることができる。
【００１１】
また、上記本発明に係る細胞培養デバイスは、
本体と、該本体の上部に着脱可能に取り付けられる蓋部とを有し、
前記培養室が前記本体に形成され、且つ該培養室が前記本体の上面に開口部を有するものであり、
前記培地排出流路が前記蓋部に形成され、且つ該培地排出流路が前記開口部と対向する前記蓋部下面の位置に開口部を有するものであって、
前記多孔質フィルタが前記本体と蓋部の間に配置されているものとすることが望ましい。
【００１２】
従来の細胞培養デバイスにおいて培養室の内部を足場材でコーティングする際には、一般に、液状化させた足場材を培地導入用（又は培地排出用）の流路から培養室へ流し込む方法がとられている。しかし、この方法では使用する足場材の種類によっては流路の中で足場材が固化して流路を閉塞してしまう場合があり、使用できる足場材の種類に制約があった。これに対し、上記構成から成る本発明の細胞培養デバイスによれば、本体から蓋部を取り外すことにより培養室に足場材を直接導入することができるため、流路を詰まらせることなく、容易に培養室内に足場材をコーティングすることができる。このため、上記本発明に係る細胞培養デバイスは、種々の足場材を用いた培養に使用することが可能である。また、細胞培養デバイスを本体と蓋部とに分割し、両者の間に多孔質フィルタを介在させる構成とすることにより、該多孔質フィルタを培養室と培地排出流路の間に容易に配置することができる。
【００１３】
なお、多孔質フィルタに捕捉された足場材によって培養室と培地排出流路との接続部が完全に塞がれることがないよう、多孔質フィルタと培養室との接触面積はできるだけ広くすることが好ましい。そこで、例えば前記フィルタの培養室と接する領域の面積を、該フィルタと平行な断面における培養室の最大面積の５０％以上とすることが望ましい。
【００１４】
また、本発明に係る細胞培養デバイスは、前記本体と蓋部との接触面の少なくとも一方が自己吸着性を有する素材から成るものとすることが望ましい。
【００１５】
このような構成によれば、ネジや粘着剤などの特別な固定手段を用いることなく蓋部を本体に安定して固定することができ、且つ必要に応じて容易に蓋部を着脱することが可能となる。前記の自己吸着性を有する素材としては、例えば、シリコンゴムやＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
また、本発明に係る細胞培養デバイスは、前記培養室と培地排出流路の接続部に対応する位置に貫通孔を備えた自己吸着性を有するシート材と前記貫通孔を閉塞するように配置された多孔質フィルタとを有するシール部材を、前記本体と蓋部の間に挟持して成るものとすることが望ましい。
【００１７】
このような構成によれば、該シール部材によって本体と蓋部を着脱自在に貼り合わせることができると共に、培養室と培地排出流路の間に多孔質フィルタを配置させることができる。なお、前記シール部材は、本体及び蓋部の両方に対して着脱自在な状態としてもよく、蓋部の下面に固定された状態としてもよい。
【００１８】
また、本発明に係る細胞培養システムは、上記細胞培養デバイスと、該細胞培養デバイスの培地導入流路に培地を送液する送液機構とを有することを特徴とするものである。
【００１９】
このような細胞培養システムは、上述のような肝細胞の培養に好適に使用することができる。
即ち、本発明に係る細胞培養方法は、上記本発明に係る細胞培養システムを用いた細胞培養方法であって、前記細胞培養用デバイスの培養室に足場材をコーティングし、該培養室に培地を連続送液しながら該培養室内で内皮細胞と肝実質細胞とを共培養することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２０】
以上の通り、上記本発明に係る細胞培養デバイス、並びにそれを用いた細胞培養システム及び細胞培養方法によれば、足場材を用いた細胞培養を長期間に亘って行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の一実施例に係る細胞培養デバイスの斜視図。
【図２】図１のＡ−Ａ矢視断面図。
【図３】同実施例におけるカバー部を構成する各部材の平面図であって、（ａ）が蓋部材、（ｂ）が第１シート部材、（ｃ）が第２シート部材を示している。
【図４】同実施例における本体を構成する各部材の平面図であって、（ｄ）が第１周面部材、（ｅ）が第２周面部材、（ｆ）が底面部材を示している。
【図５】同実施例の細胞培養デバイスを含む細胞培養システムの概略構成図。
【図６】同実施例に係る細胞培養デバイスを用いて培養した細胞の写真。
【図７】培養細胞の肝機能評価結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を実施するための形態について実施例を用いて説明する。図１は、本実施例に係る細胞培養デバイスの斜視図であり、図２は、図１のＡ−Ａ矢視断面図である。
【００２３】
本実施例に係る細胞培養デバイス１０は、大きく分けて本体１００とカバー部２００から成る。更に、カバー部２００は、図３に示すような蓋部材２１０、第１シート部材２２０、及び第２シート部材２３０で構成されており、本体１００は、図４に示すような第１周面部材１１０、第２周面部材１２０、及び底面部材１３０で構成されている。
【００２４】
底面部材１３０は合成石英から成り、第１周面部材１１０、第２周面部材１２０、及び蓋部材２１０は、ＰＤＭＳ（東レダウコーニング社製、ＳＩＬＰＯＴ１８４）から成る。第１シート部材２２０及び第２シート部材２３０はシリコンゴムから成る。
【００２５】
これらの部材はいずれも幅２０ｍｍ、長さ２０ｍｍの平板形状を有しており、厚さは、蓋部材２１０が３ｍｍ、第１シート部材２２０及び第２シート部材２３０がそれぞれ０．１ｍｍ、第１周面部材１１０及び第２周面部材１２０がそれぞれ１．５ｍｍ、底面部材１３０が１ｍｍである。
【００２６】
第１周面部材１１０、第２周面部材１２０、及び第２シート部材２３０の中央にはそれぞれ直径１０ｍｍの貫通孔１１１、１２１、２３１が設けられている。また、第１シート部材２２０の中央には直径１３．２ｍｍの貫通孔２２１が設けられている。更に、第１周面部材１１０の隅には直径１．５ｍｍの貫通孔１１２が設けられており、第２シート部材２３０、第１シート部材２２０、及び蓋部材２１０にも前記貫通孔１１２と対応する位置に直径１．５ｍｍの貫通孔２３２、２２２、２１１が設けられている。更に、蓋部材２１０には、前記貫通孔２１１が設けられた隅と対向する隅に直径１．５ｍｍの貫通孔２１２が設けられている。
【００２７】
蓋部材２１０及び第１周面部材１１０の下面側には、それぞれ深さ０．１ｍｍの凹部２１３、１１３が形成されている。前記凹部２１３は、図３（ａ）の点線で示すように、蓋部材２１０の中央部に設けられた直径１１ｍｍの円形の窪み、及び該窪みと前記貫通孔２１２を結ぶ幅２ｍｍの溝で構成されている。また、前記凹部１１３は、図４（ｄ）に示すように、第１周面部材１１０の貫通孔１１１の周縁部に設けられた幅１ｍｍの円周形状の溝、及び該溝と前記貫通孔１１２を結ぶ幅２ｍｍの溝とで構成されている。なお、これらの凹部２１３、１１３はいずれも型取りによって形成することができる。
【００２８】
上記の蓋部材２１０、第１シート部材２２０、及び第２シート部材２３０をこの順に貼り合わせることによりカバー部２００が形成される。また、上記の第１周面部材１１０、第２周面部材１２０、及び底面部材１３０をこの順に貼り合わせることにより本体１００が形成される。なお、各部材を接合させる際には、強固な接着性を得るために、各部材の接合面を酸素プラズマや紫外線により活性化して接合させることが望ましい。
【００２９】
なお、第１シート部材２２０に設けられた貫通孔２２１には、直径１３ｍｍの円形に打ち抜かれた多孔質膜から成るフィルタ６００が嵌め込まれる。本実施例では、フィルタ６００として市販のニトロセルロース系多孔質膜（ミリポア社製、ＡＡＷＰ、ポアサイズ０．８μｍ）を使用した。第２シート部材２３０に設けられた貫通孔２３１及び蓋部材２１０に設けられた凹部２１３の直径は、第１シート部材２２０に設けられた貫通孔２２１の直径よりも小さいため、上記のように蓋部材２１０、第１シート部材２２０、及び第２シート部材２３０を貼り合わせることにより、フィルタ６００の周縁部が蓋部材２１０と第２シート部材２３０によって挟まれた状態となり安定に保持される。
【００３０】
以上により形成された本体１００の上部にカバー部２００を重ね合わせることにより本実施例に係る細胞培養デバイス１０が形成される。このとき、上記の貫通孔１１１、１２１によって培養室３００が形成され、貫通孔２１１、２２２、２３２、１１２及び凹部１１３によって培地導入流路４００が形成される。また、凹部２１３及び貫通孔２１２によって培地排出流路５００が形成される。第２シート部材２３０を構成するシリコンゴムが自己吸着性を有するため、カバー部２００は本体１００に対して容易に着脱することができる。なお、本実施例における本体１００及び蓋部材２１０がそれぞれ本発明における本体及び蓋部に相当し、第１シート部材２２０、第２シート部材２３０、及びフィルタ６００が本発明におけるシール部材に相当する。
【００３１】
以上により形成された本体１００及びカバー部２００をオートクレーブやアルコール等によって滅菌処理した後、カバー部２００を外した状態で培養室３００の底面に足場材７００をコーティングする。足場材７００としては、例えばＥＨＳ−ｇｅｌ（Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma-derived matrix）を好適に用いることができる。ＥＨＳ-ｇｅｌは、ＥＨＳマウス肉腫細胞から単離した基底膜調製物であり、ラミニン、IV型コラーゲン及びプロテオグリカンを豊富に含んでいる。このＥＨＳ-ｇｅｌは低温で液状化し、常温で固体状となるため、冷却した状態で培養室３００に流し込み、常温で静置することにより培養室３００の底面に固定させることができる。なお、このような足場材によるコーティングは、細胞培養デバイスの製造段階で行ってもよく、細胞培養デバイスを購入したユーザが行うようにしてもよい。
【００３２】
上記のように本実施例の細胞培養デバイス１０によれば、カバー部２００を外した状態で培養室３００に直接足場材７００を流し込むことができ、従来の細胞培養デバイスのように培地導入用（又は培地排出用）の流路から足場材を導入する必要がないため、流路を詰まらせることなく培養室３００にコーティングを施すことができる。
【００３３】
上記の細胞培養デバイス１０によって細胞培養を行う際には、カバー部２００を外した状態で培養室３００に培地及び細胞８００を収容し、その後、カバー部２００を本体１００に取り付ける。このとき、第１シート部材２２０を構成するシリコンゴムの自己吸着性によりカバー部２００が本体１００に密着するため、培地導入流路４００又は培地排出流路５００以外の部分から培地が外部に漏れ出すことはない。なお、細胞８００は組織片の形で培養室３００に収容してもよく、個々の細胞に分離させた状態で収容してもよい。
【００３４】
図５に本実施例に係る細胞培養デバイス１０を用いた細胞培養システムの概略を示す。これは、上記の細胞培養デバイス１０と、該細胞培養デバイス１０に培地を連続送液する送液機構を組み合わせたものである。該送液機構は、培地貯留部９１０、培地供給管９２０、培地排出管９３０、廃液収容部９４０、送液ポンプ９５０、及び送液ポンプ９５０の動作を制御する制御部９６０を備えている。培地供給管９２０の一端は培地貯留部９１０に挿入され、他端は細胞培養デバイス１０の培地導入流路４００に挿入される。培地排出管９３０の一端は細胞培養デバイス１０の培地排出流路５００に挿入され、他端は廃液収容部９４０に挿入される。
【００３５】
培地貯留部９１０に貯留された培地は、送液ポンプ９５０によって吸引され、培地供給管９２０を通って細胞培養デバイス１０に送られる。細胞培養デバイス１０に供給された培地は、図２中の矢印で示すように培地導入流路４００を通過して培養室３００の周面から培養室３００内に導入される。また、培養室３００への培地の導入に伴い、培養室３００内の培地の一部が培養室３００から外部へ排出される。このとき、培地は図２中の矢印で示すように培養室３００の上方に配置されたフィルタ６００を通過して培地排出流路５００に到達し、該培地排出流路５００に接続された培地排出管９３０を介して廃液収容部９４０に排出される。
【００３６】
このように、本実施例に係る細胞培養デバイス１０では、培養室３００内の培地を培地排出流路５００から排出する際にフィルタ６００を通過させることにより、剥離した足場材７００が培地排出流路５００に進入するのを阻止して流路の目詰まりを防止することができる。また、図２に示すように、培地の導入を培養室３００の周面から行い、培地の排出を培養室３００の上部から行う構成とし、培養室３００と各流路４００、５００との接続部を広くデザインしたことにより、局所的に強い流れが発生するのを防止して足場材７００の剥離を抑制する効果も得られる。更に、培養室３００の上部開口全体をフィルタ６００で覆う構成としたことにより、フィルタ６００の面積を広くすることができるため、フィルタ６００に捕捉された足場材７００によって培地排出流路５００の入口が完全に塞がれる可能性を低減することができる。以上により、本実施例に係る細胞培養デバイスによれば、従来の細胞培養デバイスでは困難であった足場材を用いた長期培養を行うことが可能となる。
【００３７】
以下、本実施例に係る細胞培養デバイスを用いた細胞培養実験について説明する。図６は、本実施例に係る細胞培養デバイスを用いて肝細胞の培養を行った結果を示す写真である。なお、ここでは足場材としてＥＨＳ−ｇｅｌを使用しており、まず該ＥＨＳ-ｇｅｌをコーティングした培養室内に類胴内皮細胞を播種して内皮細胞ネットワークを形成させ、その後、該内皮細胞上に肝実質細胞を播種して細胞培養を行った。図６の写真から明らかなように、内皮細胞のネットワーク中に肝実質細胞が組み込まれており、生体内の肝組織に近い構造を持った共培養系が形成されている。
【００３８】
上記肝細胞を用いた肝機能評価試験の結果を図７に示す。これは、本実施例の細胞培養デバイス又は一般的な細胞培養用シャーレを使用し、上記の類胴内皮細胞（図中の「ＧＨ７」）と肝実質細胞（図中の「肝細胞」）をそれぞれ単独又は両者の共培養系で培養して各培養細胞の尿素合成能（アンモニアを分解して尿素を合成する肝機能）を評価したものである。同図から明らかなように、肝実質細胞単独で培養した場合に比べて共培養系の方が高い肝機能を示している。特に、本発明の細胞デバイスで培養した細胞の方がシャーレで培養したものに比べて高い肝機能を示している。これは、シャーレを用いた培養では一定時間おきに培地交換を行ったのに対し、細胞培養デバイスを用いた培養では培地の連続供給（流速４０μＬ／ｍｉｎで２４時間連続送液）を行ったために組織にシェアストレス（ずり応力）が掛かり、より生体内に近い環境での培養が行われたためと考えられる。
【００３９】
また、本実施例に係る細胞培養デバイスによれば、上述のように足場材の剥離による流路の詰まりを防止することができるため、こうした生体内に近い環境での肝細胞の培養を長期間に亘り安定して行うことが可能である。このため、薬物代謝試験等の様々な系における研究に利用可能であると共に、人工肝臓への展開も期待できる。
【００４０】
以上、実施例を用いて本発明に係る細胞培養デバイス、細胞培養システム、及び細胞培養方法について説明を行ったが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容されるものである。例えば、上記細胞培養デバイスを構成する各部材の素材や寸法としては、上記に限らず種々の素材や寸法を採用することができる。
【符号の説明】
【００４１】
１０…細胞培養デバイス
１００…本体
１１０…第１周面部材
１１１、１１２、２１１、２１２、２２１、２３１、２３２…貫通孔
１１３、２１３…凹部
１２０…第２周面部材
１３０…底面部材
２００…カバー部
２１０…蓋部材
２２０…第１シート部材
２３０…第２シート部材
３００…培養室
４００…培地導入流路
５００…培地排出流路
６００…フィルタ
７００…足場材
８００…細胞
９１０…培地貯留部
９２０…培地供給管
９３０…培地排出管
９４０…廃液収容部
９５０…送液ポンプ
９６０…制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図６】
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