(57)【要約】      （修正有）【課題】分析対象が含む生化学物質の存在または含量を検出するための表面増強ラマン散乱を利用した生化学物質検出方法を提供する【解決手段】単結晶体の貴金属ナノワイヤ表面に物理的に分離された多数個の貴金属ナノ粒子が分析対象物と結合させて形成された多数個のホットスポットより、表面増強ラマン散乱スペクトルを得て、高感度、高再現性、高信頼度、高精密度を有して、マルチプレックス検出が可能な生化学物質を検出する。【選択図】図１０
2011081001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面増強ラマン散乱(SERS；Surface-Enhanced Raman Scattering)を利用して、分析対象が含む生化学物質の存在または含量を検出するための方法であって、
ａ）第１受容体が形成された単結晶体貴金属ナノワイヤ及び第２受容体が形成された貴金属ナノ粒子を分析対象物質と接触させて、前記分析対象物質と前記第１受容体の結合、及び前記分析対象物質と前記第２受容体の結合により、前記分析対象物質を中心に前記貴金属ナノワイヤに前記貴金属ナノ粒子を結合させるステップと、
ｂ）前記貴金属ナノワイヤを焦点に前記貴金属ナノ粒子が結合された貴金属ナノワイヤに、偏光されたレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得るステップと、
を含んで行われる生化学物質検出方法。
【請求項２】
貴金属ナノワイヤまたは貴金属ナノ粒子と分析対象物質間の結合が、酵素−基質、抗原−抗体、蛋白質−蛋白質、ＤＮＡ間の相補的結合、またはビオチン−アビジン結合であることを特徴とする、請求項１に記載の生化学物質検出方法。
【請求項３】
貴金属ナノワイヤの長軸長さが、１μｍ以上であり、貴金属ナノワイヤの長短軸比(aspect ratio、ナノワイヤ長軸長さ/短軸長さ)が、５〜１５０であることを特徴とする、請求項１に記載の生化学物質検出方法。
【請求項４】
貴金属ナノ粒子の平均粒子大きさが、５ｎｍ乃至２０ｎｍであることを特徴とする、請求項３に記載の生化学物質検出方法。
【請求項５】
貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり貴金属ナノワイヤ表面に結合された貴金属ナノ粒子の数である結合密度が、前記貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり存在するホットスポット(hot spot)の数であるホットスポット密度と同一であることを特徴とする、請求項１に記載の生化学物質検出方法。
【請求項６】
分析対象物質がアビジンを含み、第１受容体及び第２受容体がそれぞれビオチンを含み、貴金属ナノ粒子が、貴金属ナノワイヤ及び貴金属ナノ粒子のそれぞれに形成されたビオチンがアビジンを中心に結合したビオチン−アビジン−ビオチンの結合により、貴金属ナノワイヤ表面に自己組織化(self-assembled)されたことを特徴とする、請求項２に記載の生化学物質検出方法。
【請求項７】
アビジンが、検出対象である生化学物質と特異的に結合したアビジンであることを特徴とする、請求項６に記載の生化学物質検出方法。
【請求項８】
分析対象物質がターゲットＤＮＡを含み、第１受容体がプローブＤＮＡを含み、第２受容体がラマンダイ(Raman dye)が付着されたレポーターＤＮＡを含み、
前記ターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡの相補的結合及び前記ターゲットＤＮＡと前記レポーターＤＮＡの相補的結合により、前記貴金属ナノ粒子が前記貴金属ナノワイヤ表面に自己組織化されたことを特徴とする、請求項２に記載の生化学物質検出方法。
【請求項９】
物理的に分離されており、互いに異なる第１受容体が形成された二つ以上の単結晶体貴金属ナノワイヤ及び互いに異なる第２受容体が形成された貴金属ナノ粒子を分析対象物質と接触させて、貴金属ナノワイヤ別に異なる生化学物質が検出されることを特徴とする、請求項１に記載の生化学物質検出方法。
【請求項１０】
物理的に分離されており、互いに異なるプローブＤＮＡが形成されたＮ(Ｎ＞１の自然数)個以上の単結晶体貴金属ナノワイヤ及びラマンダイが付着されたレポーターＤＮＡが形成された単一の種類の貴金属ナノ粒子を、１乃至Ｎ個のターゲットＤＮＡを含有する分析対象物質と接触させ、貴金属ナノワイヤ別に異なるターゲットＤＮＡが検出されることを特徴とする、請求項１に記載の生化学物質検出方法。
【請求項１１】
一つ以上の貴金属ナノワイヤが、基板上位置アドレッシングにより分別されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の生化学物質検出方法。
【請求項１２】
検出対象である生化学物質がＤＮＡであり、検出対象であるＤＮＡの濃度(Ｍ)１０−１１乃至１０−８でＤＮＡ濃度と、ステップｂ）の表面増強ラマン散乱スペクトルの強度が線形的に比例することを特徴とする、請求項１に記載の生化学物質検出方法。
【請求項１３】
貴金属ナノワイヤが、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄナノワイヤであり、貴金属ナノ粒子が、前記貴金属ナノワイヤと同一物質であるＡｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄナノ粒子であることを特徴とする、請求項３に記載の生化学物質検出方法。
【請求項１４】
表面増強ラマン散乱が、貴金属ナノワイヤを焦点として有する偏光されたレーザービームが単一の貴金属ナノワイヤの長軸方向中心に照射されて発生されることを特徴とする、請求項１に記載の生化学物質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析対象が含む生化学物質の存在または含量を検出するための表面増強ラマン散乱を利用した生化学物質検出方法に関し、詳細には、単結晶体のナノワイヤ表面に物理的に分離された多数個のナノ粒子が結合して形成された多数個のホットスポットにより、高感度、高再現性、高信頼度、高精密度を有して、マルチプレックス検出が可能な生化学物質検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子と蛋白質に対する研究は、病の診断を予測できる新しい生物学的マーカー(biomarker)類推に機会を提供した。特に、癌のような疾病は、発病初期に正確な診断を通じて、病の完治が可能であり、再発を防ぐことも可能になる。したがって、このような抗原抗体反応による生物学的標識物の早期検出のための診断用センサー開発に対する研究が活発に進行されている。このようなセンサーは、医療診断の他にも、保健、環境、軍事、食品などの多様な分野に適用が可能であって、非常に多様な形態の研究が進行中である。
【０００３】
微量抗原の検出のためには、光学的な装置を使用して抗原の有無を調べる方法があるが、時間と費用及び努力がかかるといった短所にもかかわらず、現在まで最も広く使用される方法である。最近は、抗原の有無によって吸収される光の波長が変わることを利用した方法(Chou et al., (2004) Biosens. Bioelectron. 19, 999-1005)と、測定しようとする抗原の有無によって、抗原と相補結合できる表面を有したナノ粒子の変化を通じて吸収される光の波長が変わる方法(Alivisatos et al., (2004)  Nat. Biotechnol. 22, 47-52, Namet al., (2003) Science. 301, 1884-1886; 米国特許第6,974,669)などが報告された。
【０００４】
ＳＥＲＳ(Surface-Enhanced Raman Scattering, 以下SERS)分光法は、金、銀などの金属ナノ構造表面に分子が吸着される時、ラマン散乱の強度が急激に１０６〜１０８倍以上増加される現象を利用した分光法である。現在、非常に速い速度で発展しているナノ技術と結合し、たった一つの分子を直接測定可能な高感度の技術に発展可能であり、特にメディカルセンサーとして緊要に使用されると期待を浴びている。
【０００５】
このようなＳＥＲＳセンサーは、分子が吸着した時抵抗が変わる電気的ナノセンサーに比べて大きく技術的優位に立っているが、その理由は、抵抗センサーは、測定値がスカラーであるのに対し、ＳＥＲＳセンサーは、ベクター量のデータである全体のスペクトルを得るため、一回の測定で獲得する情報量が著しく大きいからである。
【０００６】
ＫｎｅｉｐｐとＮｉｅらは、凝集されたナノ粒子を利用し、ナノ粒子に付いている分子を単分子水準でＳＥＲＳ測定が可能であるということを最初に報告した。以後、多様なナノ構造(ナノ粒子、ナノシェル、ナノ線)を利用したＳＥＲＳ増強現象に対する研究が報告された。このような高感度のＳＥＲＳ現象をバイオセンサー開発に利用するために、Ｍｉｒｋｉｎ研究チームは、最近ＤＮＡと結合されたナノ粒子を利用した高感度ＤＮＡ分析に成功した。
【０００７】
高感度ＤＮＡ分析と共に現在ＳＥＲＳセンサーを利用して、アルツハイマー病あるいは糖尿病を始めた多様な疾病の初期診断を行おうとする研究が活発に進行されている。
【０００８】
即ち、ＳＥＲＳ現象は、ラマン分光法が提供した分子の振動状態、あるいは分子構造に対する情報を直接提供するという面で、レーザー蛍光分析法のような既存の測定技術に比べて高選択性及び高情報性を有する測定技術と言えて、超高感度の化学的/生物学的/生化学的分析のための強力な分析方法として認められている。
【０００９】
このような長所にもかかわらず、ＳＥＲＳ現象は、１）メカニズムが完璧に理解されていないばかりか、２）正確に構造的に定義されているナノ物質合成及び制御の困難性と、３）スペクトルを測定する時使用される光の波長、偏光方向による増強効率の変化などにより、再現性及び信頼性側面で解決すべき問題が多く、これは、ナノ−バイオセンサーの開発及び商用化を始めとしたＳＥＲＳ現象の応用に大きい課題として残っている。
【００１０】
このような問題点を解決するために、構造的に正確に定義されているナノ物質(Well-defined nanostructure)の光学的性質に対する理解と、これを利用してＳＥＲＳ現象を正確に制御するための研究の必要性が非常に大きくなっている状況である。
【００１１】
Ｍｏｓｋｏｖｉｔｓ、Ｈａｌａｓ、ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅの研究チームは、最近正確に定義された多様なナノ構造を利用してＳＥＲＳ増強を制御及び最適化できることを報告して、ＭｏｓｋｏｖｉｔｓチームとＹａｎｇチームは、金属ナノ線の群集体を利用してＳＥＲＳ増強を調節できることを報告して、２００６年には、Ｍｏｅｒｎｅｒの研究チームが、電子ビームリソグラフィーを利用して人工的なＳＥＲＳ増強構造であるナノ蝶ネクタイを作るのに成功した。
【００１２】
現在ナノ粒子を利用したＳＥＲＳセンサーが最も一般的に研究されており、Ｂｉｎｇｅｒ、Ｂａｕｅｒらにより既に提案されたＳＥＲＳ基盤構造は、平坦な金属表面上の金属性フィルム(以下、MIF)からなるオプティカル構造である。ＭＩＦは、ランダム２次元アレイの金属粒子からなり、最大寸法は、それぞれ数ｎｍである。上記の構造では、金属粒子の形状が多様であり、その配列が確率によるランダム構造を有するため、規定された構造を有することができず、ＳＥＲＳセンサーの再現性及び正確性を獲得することが難しく、金属粒子の形状の多様性により、均質な散乱強度が得られない短所がある。
【００１３】
上記のＭＩＦ構造を一例にＳＥＲＳセンサーの問題点を記述したが、これは、金属ナノ粒子を利用したＳＥＲＳセンサーの一般的な問題であって、５ｎｍ未満への金属粒子の大きさの本質的な制限として規定されて確立された、よく定義された構造(Well-defined structure)決定のためには、金属粒子の形状及び金属表面のパラメーターの制御不能等が難題として残っている現実である。
【００１４】
金属粒子ではない金属ナノワイヤ、特にＡｇナノワイヤを利用してＳＥＲＳセンサーを製造しようとする研究も進行されている。
【００１５】
Ｔａｏら(Nano. Lett. 2003, 3, 1229)は、ＡｇナノワイヤをＬａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ法を利用して、Ｓｉウェハー上に多量のＡｇナノワイヤからなる単層(monolayer)を製作して、これを利用してＳＥＲＳ測定をした。たとえ、Ｔａｏらが提案したセンサーの構造及び製作方法がＡｇナノワイヤを利用して、単層を構成するＡｇナノワイヤの長軸がある程度整列された方向を有したのにもかかわらず、再現性のあるＳＥＲＳ結果が得られない限界があった。
【００１６】
Ｊｅｏｎｇら(J. Phys. Chem. B 2004, 108, 12724)は、鋳型体(template)を利用してＡｇナノワイヤのフラットアレイ(flat array, rafts)を合成した。一方向に整列されているＡｇナノワイヤｒａｆｔｓを利用してＳＥＲＳ現象を観察し、ナノワイヤの長さ方向とレーザーの偏光方向の差によってＳＥＲＳ信号が変わることを示している。Ｊｅｏｎｇらは、実験的にレーザーの偏光方向及び二つのナノワイヤ間の作用によるＳＥＲＳ現象を測定したが、フラットアレイ構造により、多量のＡｇナノワイヤがＳＥＲＳに必要となり、前記Ａｇナノワイヤの製造方法上、高形状、高品質のＡｇナノワイヤが得られなくて、前記レーザー偏光方向及び二つのナノワイヤ間の作用によるＳＥＲＳ現象が精密に制御され難い短所がある。
【００１７】
Ａｒｏｃａら(Anal. Chem. 2005, 77, 378)は、液相で合成したＡｇナノワイヤをガラス基板に多量載せて、ＳＥＲＳ基板として活用して測定したが、ナノワイヤの外に多量の粒子が存在して、一定な配列を有していない。
【００１８】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら(J. Appl. Phys. 2005, 97, 024308)とＬｅｅら(J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2200)は、鋳型体を利用してＡｇナノワイヤアレイ(array)を製作して、鋳型体を除去しなかった状態と、エッチングを通じて鋳型体を除去した状態でＳＥＲＳ測定を行って、鋳型体を除去することによって、ＳＥＲＳ信号が増えることを示している。
【００１９】
Ｐｒｏｋｅら(Appl. Phys. Lett., 2007, 90, 093105)は、ＺｎＯとＧａ２Ｏ３ナノワイヤを合成した後、ＡｇをコーティングしてＳＥＲＳ測定した。この際、ＳＥＲＳが発生する部分の構造は、合成されたＺｎＯとＧａ２Ｏ３ナノワイヤの形状によって決定されるが、Ｇａ２Ｏ３ナノワイヤの場合、合成そのものが非常にもつれている状態で合成されて、ＺｎＯは、比較的もつれていない状態で合成され、もつれている構造のＧａ２Ｏ３ナノワイヤを利用した時、さらに大きいＳＥＲＳ信号が得られることを示している。
【００２０】
Ｊｅｏｎｇ、Ｐｒｏｋｅ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｌｅｅ及び金属粒子のｄｉｍｅｒを通じて報告されたことのあるＳＥＲＳ信号の増強は、ＢｒｕｓとＫａｌｌにより提案された、孤立された金属粒子ではない、近接して(１−５ｎｍ)いる二つ以上のナノ粒子間に形成される非常に強い電磁場(hot spot or interstitial field)によるＳＥＲＳ増強理論を支持する結果であり、電磁気的な理論計算によると、前記ホットスポット(Hot spot)により１０１２程度のＳＥＲＳ増強が予測される。
【００２１】
しかしながら、上記のようなナノワイヤを利用したＳＥＲＳ用光センサーの構造も、金属ナノ粒子を利用した光センサーと同様に、ナノワイヤの形状と品質の制御に困難があって、また製造されたナノワイヤの物理的な構造も正確に規定されず、ＳＥＲＳ現象に必須的なホットスポットの発生が正確に制御されないという点で再現性、信頼性が低くて、制御可能な測定が難しい短所があり、これを利用したセンサー開発に問題点があると知られている。特に、ナノ粒子凝集体の場合、凝集される程度によって、ホットスポットが生成される位置とホットスポットの強度が変わる可能性があって、これは、測定されるＳＥＲＳ信号再現性及び制御に大きい問題とされることが知られている。
【００２２】
上述したように、ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ、Ｈａｌａｓらのような先頭研究チームは、固有のナノシステム(nanopattern、nanoshell)を開発して、システムの表面プラズモン(Surface plasmon)特性を利用して、ＳＥＲＳ現象の再現性を向上して制御する研究を進行し、これを利用して、現在バイオセンサー開発のための研究を進行中にあるが、実質的に製造が簡便で、高純度/高品質/高形状のナノワイヤを利用して、基板上のナノワイヤの個別位置及び構造が調節されて、ホットスポットの発生が正確に制御されるＳＥＲＳ光センサーの開発は、本出願人が提案した技術(大韓民国登録特許第0892629)を除いては、全くない実情である。
【００２３】
本出願人は、表面及び結晶状態が正確に定義されている気相合成されたナノワイヤとナノパーティクルのハイブリッド構造を利用して、生体抽出物及び蛋白質、ＤＮＡのようなバイオ分子のＳＥＲＳ信号の増強と測定の再現性、敏感度及び信頼度向上のための研究を進行した結果、本特許を出願するに至った。
【００２４】
ハイブリッド金属−金属ナノ構造は、光学的信号を利用した効率的なバイオ/化学センサー開発において重要な役割をすることができるが、その理由は、それらがナノ構造の隙間で局所表面プラズモン共鳴(LSPR；Localized Surface Plasmon Resonance)カップリングにより集中された電磁場領域である‘ホットスポット’を提供するからである。多様な光学的検出方法の中、表面増強ラマン散乱(SERS)は、単分子検出の高感度を有する魅力的な技術である。さらに、ＳＥＲＳは、他の検出方法に比べ、高選択性を提供するが、これは、ラマンスペクトルが分析物の検出に使用できる特定化学作用基に対する信号を提供するからである。このようなＳＥＲＳの長所により、この現象の発見以後から多様な化学物質の検出とＤＮＡと蛋白質のような生分子の確認のための分析道具として広く研究されてきた。
【００２５】
貴金属ナノパーティクル(ナノ粒子；Nano Particles)とナノ線(ナノワイヤ；Nano Wire)は簡単に合成可能であるため、ＳＥＲＳ−活性構造(SERS-Active  Structure)として大きい関心を引く二つの重要な基本ナノ構造である。
【００２６】
ナノパーティクル(ナノ粒子)二量体、集合体、アセンブリー、そしてナノシェルを含んだナノパーティクルに基づいた数多いナノ構造が提示された。また、ＳＮＯＦ(SNOF；Single-Nanowire-On-a-Film)、ナノワイヤ対、整列されたナノワイヤ束、ナノワイヤの ラングミュア・ブロジェットフィルム(Langmuir-Blodgett film)、そして石板法で製作されたナノワイヤ整列のような高増強性と方向探知性(directional response)を全て有する１次元ＳＥＲＳ−活性構造も研究された。
【００２７】
二つの異なるナノ構造を結合させたハイブリッドナノ構造は、ナノワイヤとナノパーティクルの長所を同時に有する効果的なＳＥＲＳ−活性構造になり得る。たくさんの研究グループは、ナノワイヤ−ナノパーティクル構造がラマン信号の高増強性、偏光依存性、そして、遠隔励起性を有することを報告した。したがって、単一ハイブリッドナノ構造は、将来のＳＥＲＳ検出/イメージング道具として応用できるはずである。
【００２８】
しかし、よく定義されたハイブリッドナノ構造を手安く製作することと、生物学的研究への応用が実際ＳＥＲＳ−活性構造の開発において課題として残っており、ナノワイヤ−ナノパーティクルのＳＥＲＳ−活性構造において、生化学物質を検出した結果は全くない実情である。
【００２９】
一方、低単価で少ないサンプル量から最大の情報が得られるようなマルチプレックスで且つ敏感でありながらも特定のＤＮＡのみを検出する技術は、遺伝子プロファイリング(Gene profiling)、薬物スクリーニング(Drug screening)、疾病診断のようなバイオメディカル研究分野でその必要性が大きく台頭されている。
【００３０】
したがって、簡単且つ信頼度が高くて、多数のＤＮＡｓを一回の分析で速く検出する方法が、蛍光、ＳＰＲ、電気的信号、そして質量変化の測定のような多様な検出方法を利用して開発されてきた。
【００３１】
多様なＤＮＡ検出方法の中でも、蛍光は、マルチプレックスＤＮＡ検出のために一般的に選好する技術である。しかしながら、ＳＥＲＳも無標識マルチプレックスＤＮＡ検出のための魅力的な方法と考えられてきたが、これは、単分子水準の感度、ＳＥＲＳスペクトルの分子特異性、単一励起ソース(excitation source)の有効性、そして、湿度、酸素、または他の物質によるｑｕｅｎｃｈｉｎｇがないからである。
【００３２】
このような注目すべき長所により、数多い独創的なＳＥＲＳセンシングプラットフォーム(sensing platforms)が開発されている。しかしながら、ナノ構造に依存するＳＥＲＳ信号再現性及び一遍に少ない量のサンプル量で多様なターゲットＤＮＡを検出することが、実際マルチプレックスＤＮＡ検出のためのＳＥＲＳセンサーの開発において、依然として超えるべき課題として残っている。
【非特許文献１】Chou et al., (2004) Biosens. Bioelectron. 19, 999-1005
【非特許文献２】Alivisatos et al., (2004)  Nat. Biotechnol. 22, 47-52
【非特許文献３】Nam et al., (2003) Science. 301, 1884-1886
【非特許文献４】Nano. Lett. 2003, 3, 1229
【非特許文献５】J. Phys. Chem. B 2004, 108, 12724
【非特許文献６】Anal. Chem. 2005, 77, 378
【非特許文献７】J. Appl. Phys. 2005, 97, 024308
【非特許文献８】J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 2200
【非特許文献９】Appl. Phys. Lett., 2007, 90, 093105
【特許文献１】米国特許第6,974,669号明細書
【特許文献２】大韓民国登録特許第0892629号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
本発明は、ナノワイヤ及びナノワイヤに自己組織化されたナノ粒子を含んで構成された表面増強ラマン散乱(SERS)−活性構造を利用した生化学物質検出方法を提供して、単一の測定を通じて多様な生化学物質の検出が可能なマルチプレックス(multiplex)方法を提供し、よく定義された(well-defined)物理的構造及びよく定義されたホットスポット構造を有し、再現性があって、信頼度の高い結果が得られる生化学物質検出方法を提供して、測定時、よく定義された多数個のホットスポットにより増強された表面増強ラマン散乱スペクトルが得られて、非常に敏感度の高い生化学物質検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明による生化学物質検出方法は、表面増強ラマン散乱(SERS；Surface-Enhanced Raman Scattering)を利用して、分析対象が含む生化学物質の存在または含量を検出するための方法であって、ａ）第１受容体が形成された単結晶体貴金属ナノワイヤ及び第２受容体が形成された貴金属ナノ粒子を分析対象物質と接触させて、前記分析対象物質と前記第１受容体の結合、及び前記分析対象物質と前記第２受容体の結合により、前記分析対象物質を中心に前記貴金属ナノワイヤに前記貴金属ナノ粒子を結合させるステップと、ｂ）前記貴金属ナノワイヤを焦点に前記貴金属ナノ粒子が結合された貴金属ナノワイヤに、偏光されたレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得るステップとを含んで行われる特徴がある。
【００３５】
前記検出対象である前記生化学物質は、細胞構成物質、遺伝物質、炭素化合物、生物体の代謝、物質合成、物質輸送または信号伝達過程に影響を及ぼす有機物を含む。
【００３６】
詳細には前記生化学物質は、高分子有機物、有機金属化合物、ペプチド、炭水化物、蛋白質、蛋白質複合体、脂質、代謝体、抗原、抗体、酵素、基質、アミノ酸、アプタマー(Aptamer)、糖、核酸、核酸断片、ＰＮＡ(Peptide Nucleic Acid)、細胞抽出物、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３７】
前記貴金属ナノワイヤまたは貴金属ナノ粒子と前記分析対象物質間の結合、詳細には前記貴金属ナノワイヤまたは貴金属ナノ粒子と前記分析対象物質に含有された生化学物質間の結合は、酵素−基質、抗原−抗体、蛋白質−蛋白質、ＤＮＡ間の相補的結合、またはビオチン(biotin)−アビジン(avidin)結合として特徴付けられる。
【００３８】
特徴的には、前記貴金属ナノワイヤの長軸長さは、１μｍ以上である特徴があり、前記貴金属ナノワイヤの長短軸比(aspect ratio、ナノワイヤ長軸長さ/短軸長さ)は、５〜５０００である特徴があって、前記貴金属ナノ粒子の平均粒子大きさは、５ｎｍ乃至２０ｎｍである特徴がある。
【００３９】
前記貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり前記貴金属ナノワイヤ表面に結合された前記貴金属ナノ粒子の数である結合密度は、前記貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり存在するホットスポット(hot spot)の数であるホットスポット密度と同一な特徴がある。
【００４０】
詳細には、前記酵素−基質、抗原−抗体、蛋白質−蛋白質、ＤＮＡ間の相補的結合、またはビオチン(biotin)−アビジン(avidin)結合により、検出対象である生化学物質を中心に貴金属ナノワイヤ表面に単一の貴金属ナノ粒子がそれぞれ物理的に分離されて貴金属ナノワイヤに自己組織化される特徴があり、これによって、貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり結合された貴金属ナノ粒子の数が、貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり存在するホットスポット(hot spot)の数であるスポット密度になる特徴がある。
【００４１】
前記分析対象物質は、アビジン(avidin)を含み、前記第１受容体及び前記第２受容体は、それぞれビオチン(biotin)を含み、前記貴金属ナノ粒子は、前記貴金属ナノワイヤ及び前記貴金属ナノ粒子のそれぞれに形成されたビオチン(biotin)がアビジン(avidin)を中心に結合したビオチン−アビジン−ビオチンの結合により、前記貴金属ナノワイヤ表面に自己組織化(self-assembled)された特徴があって、前記アビジンは、検出対象の生化学物質と特異的に結合したアビジンを含む。
【００４２】
好ましくは、前記第１受容体及び前記第２受容体がそれぞれビオチン(biotin)を含む場合、前記貴金属ナノワイヤまたは前記貴金属ナノワイヤがＮ−(６−(ビオチンアミド)ヘキシル)−３’−(２’−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド(N-(6-(Biotinamido)hexyl)−3’-(2’-pyridyldithio)−propionamide、以下、EZ-Link  Biotin-HPDP)で改質されて、貴金属ナノワイヤまたは貴金属ナノ粒子にビオチンが形成された特徴がある。
【００４３】
前記分析対象物質は、ターゲットＤＮＡを含み、前記第１受容体は、プローブＤＮＡを含み、前記第２受容体は、ラマンダイ(Raman dye)が付着されたレポーターＤＮＡを含んで、前記ターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡの相補的結合及び前記ターゲットＤＮＡと前記レポーターＤＮＡの相補的結合により、前記貴金属ナノ粒子が前記貴金属ナノワイヤ表面に自己組織化(self-assembled)された特徴がある。
【００４４】
特徴的には、前記ターゲットＤＮＡは、病原菌のＤＮＡ及び病原菌に感染された生体から抽出分離された病原菌のＤＮＡを含む。
【００４５】
詳細には、前記ターゲットＤＮＡは、前記貴金属ナノワイヤ表面に形成されたプローブＤＮＡと相補的に結合すると同時に、前記貴金属ナノ粒子表面に形成されたレポーターＤＮＡと相補的に結合されて、前記レポーターＤＮＡに付着されてラマン信号の敏感度を増加させる前記ラマンダイは、使用するレーザーの波長を考慮して選択する。一例として、６３３ｎｍ  Ｈｅ−Ｎｅレーザーの場合、ラマンダイは、Ｃｙ５を使用する。
【００４６】
本発明による生化学物質検出方法は、物理的に分離されており、互いに異なる第１受容体が形成された二つ以上の単結晶体貴金属ナノワイヤ及び互いに異なる第２受容体が形成された貴金属ナノ粒子を分析対象物質と接触させて、貴金属ナノワイヤ別に異なる生化学物質が検出される特徴がある。
【００４７】
特徴的には、物理的に分離されており、互いに異なるプローブＤＮＡが形成された二つ以上の単結晶体貴金属ナノワイヤ及び互いに異なるレポーターＤＮＡが形成された貴金属ナノ粒子を分析対象物質と接触させて、貴金属ナノワイヤ別に異なるターゲットＤＮＡが検出される。
【００４８】
特徴的には、物理的に分離されており、互いに異なるプローブＤＮＡが形成されたＮ(Ｎ＞１の自然数)個以上の単結晶体貴金属ナノワイヤ及びラマンダイが付着されたレポーターＤＮＡが形成された単一の種類の貴金属ナノ粒子を、１乃至Ｎ個のターゲットＤＮＡを含有する分析対象物質と接触させ、貴金属ナノワイヤ別に異なるターゲットＤＮＡが検出される。
【００４９】
上述のマルチプレキシング検出において、前記一つ以上の貴金属ナノワイヤは、基板上位置アドレッシングにより分別される特徴がある。
【００５０】
前記貴金属ナノワイヤは、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄナノワイヤであり、前記貴金属ナノ粒子は、貴金属ナノワイヤと同一物質であるＡｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄナノ粒子である特徴がある。
【００５１】
前記表面増強ラマン散乱は、貴金属ナノワイヤを焦点として有する偏光されたレーザービームが単一の貴金属ナノワイヤの長軸方向中心に照射されて発生される特徴があり、前記貴金属ナノワイヤの長軸と前記偏光されたレーザービームの偏光方向とがなす角度θが３０乃至１５０°または２１０乃至３３０°の条件で発生される特徴がある。
【発明の効果】
【００５２】
本発明の生化学物質検出方法は、検出そのもののための生化学物質の前処理が必要なく、生化学物質そのものを直接的に検出可能な特徴があり、検出しようとする生化学物質に他の標識を人為的に付けなくても選択的に検出される無標識選択検出の特徴があって、検出しようとする生化学物質がホット−スポット領域に固定されており、極微量の物質も検出可能な高感度検出である特徴があって、単結晶体で且つ非常に大きい縦横比を有する単一の貴金属ナノワイヤに、互いに物理的に分離されたナノ粒子が均一且つ高密度で貴金属ナノワイヤに自己組織化されたナノワイヤ−ナノ粒子構造により、非常に安定的で再現性のあるＳＥＲＳスペクトルが得られる特徴があり、単一の貴金属ナノワイヤ及び貴金属ナノワイヤに自己組織化されたナノ粒子が単一のセンサーとして作用するため、センサーの非常に高い敏感度、安定性、再現性を有すると同時にセンサーの超小型化が可能な特徴があって、ホットスポットの位置及び密度が制御可能な特徴があり、調節された多数個のホットスポットにより画期的に増進された生化学物質のＳＥＲＳスペクトルが得られる特徴があり、多数個の貴金属ナノワイヤのそれぞれに、互いに異なる生化学物質と結合するように受容体を形成させて、短時間及び単一な測定を通じて高い正確度及び敏感度で多様な検出対象物質の検出(Multiplex platform)が可能な長所がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、添付の図面を参照し、本発明の生化学物質検出方法を詳細に説明する。以下紹介される図面は、当業者に本発明の思想が十分伝えられるようにするために例として提供されるものである。したがって、本発明は、以下提示される図面に限定されず、他の形態で具体化されることもできる。また、本明細書において、同一な参照符号は、同一な構成要素を示す。
【００５４】
ここで使用される技術用語及び科学用語に当たって、他に定義がなければ、この発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が通常的に理解している意味を有し、下記の説明及び添付図面において、本発明の要旨を曖昧にするような公知機能及び構成に対する説明は省く。
【００５５】
図１は、本発明による生化学物質検出方法を示した一例であって、詳細には、貴金属単結晶ナノワイヤ１００表面に第１受容体１１０が備えられて、貴金属ナノ粒子２００表面にも第２受容体２１０が備えられた特徴があり、前記貴金属単結晶ナノワイヤ１００及び貴金属ナノ粒子２００と検出対象物質である生化学物質３００を含有する分析対象と接して、前記生化学物質３００を挟んで前記貴金属ナノ粒子２００が前記貴金属単結晶ナノワイヤ１００に結合するようになる。
【００５６】
詳細には、前記貴金属単結晶ナノワイヤ１００の表面に備えられた第１受容体１１０及び貴金属ナノ粒子２００表面に備えられた第２受容体２１０が、分析対象に含有された検出対象物質の生化学物質３００とそれぞれ結合し、前記貴金属ナノワイヤ１００表面に貴金属ナノ粒子２００が自己組織化(self-assembled)されて、前記貴金属ナノワイヤ１００と貴金属ナノ粒子２００との間に検出対象物質の生化学物質３００が固定される特徴がある。
【００５７】
ナノ構造に付いている分子(生化学物質)のラマン信号増強を最大化する方法は、分子(生化学物質)を、本発明のように貴金属ナノワイヤ及び貴金属ナノ粒子のような整列されたナノ構造の間に位置させて、大きく増加したＳＥＲＳ信号を得ることができて、このような整列されたナノ構造は、生化学物質とナノワイヤ及びナノ粒子の結合により生成(Turn on)されるＳＥＲＳ−活性(SERS-active)ナノ構造である特徴がある。
【００５８】
前記貴金属単結晶ナノワイヤ１００は、長短軸比(aspect ratio、ナノワイヤ長軸長さ/短軸直径)が、５〜５０００である特徴があって、長軸の長さは、１μｍ以上である特徴があり、前記貴金属単結晶ナノワイヤ１００は、二つ以上のナノワイヤが互いに物理的に凝集しているナノワイヤ凝集体、二つ以上のナノワイヤが互いに物理的に結合しているナノワイヤの結合体、ナノワイヤが同種または異種の物質に付着された複合体ではない、単一のナノワイヤ(free standing single nanowire)である特徴がある。
【００５９】
以後、前記貴金属ナノワイヤ１００を焦点にして、前記貴金属ナノ粒子２００が結合された貴金属ナノワイヤ１００に偏光されたレーザービームを照射して表面増強ラマン散乱スペクトルを得るようになる。この際、レーザービームが照射されて得られる表面増強ラマン散乱スペクトルは、単一の貴金属ナノワイヤ及び多数個の貴金属ナノ粒子により形成された局所電磁場により増強された結果である特徴がある。
【００６０】
前記貴金属ナノ粒子２００は、平均粒子大きさが５ｎｍ乃至２０ｎｍである特徴がある。これは、前記貴金属ナノ粒子２００が貴金属ナノワイヤ１００に結合して局所表面プラズモン共鳴(LSPR)カップリングにより集中された電磁場領域であるホットスポットを形成すると同時に、貴金属ナノワイヤ１００に高密度のホットスポットを形成するためである。
【００６１】
図１に基づいて述べた本発明の検出方法は、貴金属ナノワイヤ表面に備えられた第１受容体−検出対象物質−貴金属ナノ粒子表面に備えられた第２受容体の結合により、貴金属ナノワイヤに貴金属ナノ粒子が自己組織化されて、貴金属ナノワイヤが高純度、高結晶性の単結晶体であり、均一な厚さ(短軸長さ)と大きい縦横比を有する偏平な表面(粗度が非常に小さい表面)を有する単一のナノワイヤであることにより、貴金属ナノワイヤ表面に均一に貴金属ナノ粒子が結合されて、単一の貴金属ナノ粒子と貴金属ナノワイヤにより単一なホットスポットが形成されて、貴金属ナノ粒子の結合密度が非常に高い特徴がある。
【００６２】
一例として、前記第１受容体及び第２受容体がそれぞれビオチンを含み、前記検出対象物質がアビジンを含む場合、貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり結合された貴金属ナノ粒子の数である結合密度は、１５００乃至３５００(個/μｍ２)であり、上述の本発明の特徴により、前記貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり結合された貴金属ナノ粒子の数である結合密度は、前記貴金属ナノワイヤの単位表面積当たり存在するホットスポット(hot spot)の数であるホットスポット密度と同一であることから、１５００乃至３５００(個/μｍ２)のホットスポット密度を有するようになる。
【００６３】
前記貴金属ナノワイヤは、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄナノワイヤである特徴があり、前記貴金属ナノ粒子は、Ａｕ、Ａｇ、ＰｔまたはＰｄナノ粒子である特徴があって、好ましくは、前記貴金属ナノワイヤと前記貴金属ナノ粒子は、同一な貴金属物質である。
【００６４】
詳細には、ＳＥＲＳ不活性基板に前記第１受容体が形成された貴金属ナノワイヤを位置させて、分析対象を含有した液相を利用して前記貴金属ナノワイヤと前記分析対象を接触させた後、第２受容体が形成された貴金属ナノ粒子分散液を、分析対象と接触した貴金属ナノワイヤに塗布するか、第２受容体が形成された貴金属ナノ粒子分散液に、分析対象と接触した貴金属ナノワイヤ(基板含み)を含浸させることができる。
【００６５】
詳細には、前記第１受容体が形成された貴金属ナノワイヤが位置したＳＥＲＳ不活性基板自体が、前記第２受容体が形成された貴金属ナノ粒子分散液に含浸された状態で分析対象が前記分散液に添加され、分析対象と貴金属ナノワイヤ及び貴金属ナノ粒子を接触させることができる。
【００６６】
詳細には、前記第１受容体が形成された貴金属ナノワイヤが位置したＳＥＲＳ不活性基板そのものを液相に含浸させた後、分析対象及び貴金属ナノ粒子分散液を、前記貴金属ナノワイヤが含浸された液相に添加(分析対象の添加後、貴金属ナノ粒子分散液の添加、または貴金属ナノ粒子分散液の添加後、分析対象の添加、を含む)して、分析対象と貴金属ナノワイヤ及び貴金属ナノ粒子を接触させることができる。
【００６７】
この際、前記貴金属ナノワイヤ、貴金属ナノ粒子及び分析対象との接触は、微細流体キャピラリー管(Micro fluidic capillary tube)を含む流体移送のための装置内で行えることはもちろんのことである。
【００６８】
前記液相(貴金属ナノワイヤ含浸液、貴金属ナノ粒子分散液、または分析対象を含有する検出溶液の液相)は、前記貴金属ナノワイヤ１００及び貴金属ナノ粒子２００に備えられた受容体及び生化学物質と化学的に反応せず、前記貴金属ナノ粒子２００を容易に分散させて、貴金属ナノ粒子及び生化学物質の流動を可能にする流体である。
【００６９】
この際、生化学物質が存在しないことを除いては、実際測定時使用された液相と同一な液及び測定条件を利用して得られたＳＥＲＳスペクトルをリファレンス(reference)として、検出対象と接触した後得られたＳＥＲＳスペクトルを分析することができることはもちろんである。
【００７０】
さらに、分析対象に含有された検出対象物質により貴金属ナノ粒子が貴金属ナノワイヤに結合した後、多数個の貴金属ナノ粒子が結合された貴金属ナノワイヤを液相と分離するか洗浄した後、偏光されたレーザービームを照射して表面増強ラマン散乱スペクトルを得ることが好ましい。
【００７１】
この際、前記貴金属ナノ粒子２００が自己組織化される貴金属ナノワイヤ１００の表面に非特異的結合による蛋白質などの吸着防止のための蛋白質吸着防止層が備えられて、一例として、吸着防止層は、グリコール系化合物などの親水性分子を使用することができる。
【００７２】
分析対象に含有された検出対象物質である前記生化学物質は、貴金属ナノワイヤ１００に備えられた第１受容体１１０に特異的に結合すると同時に、前記貴金属ナノ粒子２００に備えられた第２受容体２１０に特異的に結合する物質、即ち、少なくとも二つ以上の結合能を有する物質である。
【００７３】
前記生化学物質と前記受容体(１１０または２１０)の結合は、イオン結合、共有結合、水素結合、配位結合または非共有結合を含み、特徴的には酵素−基質、抗原−抗体、蛋白質−蛋白質、ＤＮＡ間の相補的結合、またはビオチン−アビジン結合である。
【００７４】
特徴的には、前記第１受容体及び第２受容体は、それぞれビオチンを含み、前記生化学物質は、アビジンを含む。
【００７５】
特徴的には、前記第１受容体及び第２受容体の少なくとも一つの受容体は、ラマンダイ(Raman Dye)付着されたＤＮＡである。より特徴的には生化学物質は、ターゲットＤＮＡを含み、前記第１受容体は、プローブＤＮＡを含んで、貴金属ナノ粒子に形成される前記第２受容体は、ラマンダイが付着されたレポーターＤＮＡを含む。
【００７６】
特徴的には、検出対象である前記生化学物質はＤＮＡであり、ＤＮＡの濃度(Ｍ)１０−１１乃至１０−８でＤＮＡ濃度と、ステップｂ）の前記表面増強ラマン散乱スペクトルの強度とは線形的に比例する。
【００７７】
上述のように、本発明による生化学物質検出方法は、検出対象である生化学物質３００を中心に貴金属ナノワイヤ１００と貴金属ナノ粒子２００が結合された特徴を有して、検出対象の生化学物質３００により、貴金属ナノ粒子２００が貴金属ナノワイヤ１００に自己組織化されるようになる。
【００７８】
したがって、検出対象の生化学物質３００の有/無によって、貴金属ナノ粒子２００と貴金属ナノワイヤ１００の結合によるホットスポットの生成有/無が決定されて、生化学物質３００の濃度によって、前記ホットスポットの表面密度が決定されるようになる。
【００７９】
貴金属ナノ粒子２００と貴金属ナノワイヤ１００の結合領域に検出対象の生化学物質３００が固定されて、生化学物質３００の濃度によりホットスポットの表面密度が決定されるため、貴金属ナノワイヤ１００の中心に偏光されたレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得て、これに基づいて検出対象の生化学物質の有/無、生化学物質の種類または生化学物質の濃度を分析する。
【００８０】
前記貴金属ナノワイヤ１００に備えられた第１受容体１１０は、前記生化学物質３００の結合能によって、前記貴金属ナノ粒子２００に備えられた受容体２１０と同種または異種の受容体である。
【００８１】
特徴的には、図２に示した一例のように、前記貴金属ナノワイヤ１００に備えられた第１受容体１２０及び前記貴金属ナノ粒子２００に備えられた第２受容体２２０は、それぞれビオチンを含む特徴があり、前記検出対象である生化学物質は、アビジン４００と生化学物質３００が結合した生化学物質複合体５００である特徴がある。
【００８２】
前記アビジン４００と第１受容体１２０のビオチンが結合して、同一なアビジン４００と第２受容体２２０のビオチンが結合して、前記生化学物質複合体５００を挟んで前記貴金属ナノ粒子２００が貴金属ナノワイヤ１００に結合してホットスポットを形成する。
【００８３】
この際、上述のように生化学物質５００の有/無により、貴金属ナノワイヤ上にホットスポットの生成有/無が決定されて、生化学物質の濃度により、貴金属ナノワイヤ表面に形成されたホットスポットの数が決定されるようになる。
【００８４】
詳細には、図２は、図１に基づいて述べた本発明による生化学物質の検出を示した他の例であって、第１受容体１２０及び第２受容体２２０がそれぞれビオチンを含み、検出対象物質がアビジン４００または生化学物質３００と結合したアビジンである生化学物質複合体５００である場合を示したものである。
【００８５】
単結晶体の単一の貴金属ナノワイヤ１００及び貴金属ナノ粒子２００のそれぞれに形成されたビオチンがアビジンを中心に結合したビオチン−アビジン−ビオチンの結合により、前記貴金属ナノ粒子２００が生化学物質複合体５００を中心にホットスポットが生成されて、以後、前記貴金属ナノワイヤ１００を焦点に偏光されたレーザービームを照射してＳＥＲＳスペクトルを得て、これに基づいて生化学物質の有/無、生化学物質の種類または生化学物質の濃度を分析する。
【００８６】
この際、生化学物質複合体５００を中心に前記貴金属ナノ粒子２００が貴金属ナノワイヤ１００に結合されたナノ構造体(及び貴金属ナノワイヤ)は、物理的支持のための基板上に位置することができて、ナノ構造体(及び貴金属ナノワイヤ)と基板のファンデルワールス力または重力により基板上に固定できる。
【００８７】
前記ナノ構造体にレーザービームを照射すると、前記ナノ構造体のホットスポットにより増強された前記生化学物質５００のＳＥＲＳ信号を得るようになる。
【００８８】
前記貴金属ナノ粒子(または貴金属ナノワイヤ)表面に備えられるビオチンは、貴金属ナノ粒子(または貴金属ナノワイヤ)の表面改質を通じて形成できて、一例として、前記貴金属ナノ粒子(または貴金属ナノワイヤ)がＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰで改質されて形成されることが好ましい。
【００８９】
図３は、本発明による生化学物質検出方法において、物理的に分離されており、互いに異なる第１受容体１１０Ａ、１１０Ｂが形成された二つ以上の単結晶体貴金属ナノワイヤ１００Ａ、１００Ｂ及び互いに異なる第２受容体２１０Ａ、２１０Ｂが形成された貴金属ナノ粒子２００Ａ、２００Ｂを分析対象物質と接触させて、物理的に分離されてＳＥＲＳ基板上に位置する貴金属ナノワイヤ別に異なる生化学物質３１０、３２０が検出されるマルチプレックス検出の一例を示したものである。
【００９０】
図３に示したように、前記マルチプレックス検出のために、第１生化学物質３１０と特異的に結合する第１受容体１１０Ａが形成された貴金属ナノワイヤ及び第１生化学物質３１０と特異的に結合する第２受容体２１０Ａが形成された貴金属ナノ粒子を利用して第１生化学物質を検出して、第２生化学物質３２０と特異的に結合する第１受容体１１０Ｂが形成された貴金属ナノワイヤ及び第２生化学物質３２０と特異的に結合する第２受容体２１０Ｂが形成された貴金属ナノ粒子を利用して第２生化学物質をそれぞれ検出する。この際、図３には、２種類の生化学物質を一遍に独立的に検出できる例を示したが、Ｎ(Ｎ＞１の自然数)個の相異なる生化学物質を単一のテストで検出するために、ＳＥＲＳ不活性基板上のそれぞれの生化学物質と特異的に結合する第１受容体が形成されたＮ個の貴金属ナノワイヤ及びそれぞれの生化学物質と特異的に結合する第２受容体が形成されたＮ種類(同一な受容体が形成された貴金属ナノ粒子を１種類とする)の貴金属ナノ粒子を利用して、Ｎ個の生化学物質に対してマルチプレックス検出が可能である。
【００９１】
より重要には、無標識ＤＮＡマルチプレックス検出のために、前記物理的に分離された二つ以上の単結晶体貴金属ナノワイヤの第１受容体１１０Ａ、１１０Ｂは、それぞれ異なるプローブＤＮＡであり、前記貴金属ナノ粒子の第２受容体２１０Ａ、２１０Ｂは、互いに異なるレポーターＤＮＡであって、分析対象物質は、互いに異なるターゲットＤＮＡを含有し、これを通じて貴金属ナノワイヤ別に異なるターゲットＤＮＡが検出される。
【００９２】
貴金属ナノワイヤ−貴金属ナノ粒子の結合を利用した無標識生化学物質検出
以下提示される例は、単結晶の単一の貴金属ナノワイヤ−貴金属ナノ粒子の結合を利用した無標識生化学物質検出としては最初の結果である。測定時、ＳＥＲＳ活性金属としてＡｕナノワイヤ及びＡｕナノ粒子を使用したが、本発明がこれに限定されるものではない。
【００９３】
本発明による貴金属ナノワイヤは、本出願人の特許出願２００７−００６５０３０、２００８−００３６３６０、２００９−００３５５２２に公知された方法を使用して製造することが好ましい。
【００９４】
詳細には、前記貴金属ナノワイヤは、反応炉の前端部に位置させた貴金属酸化物、貴金属物質またはハロゲン化貴金属(Noble metal halide)を含む前駆物質と、反応炉の後端部に位置させた半導体または不導体単結晶基板を、不活性気体が流れる雰囲気で熱処理して前記単結晶基板上に製造された貴金属単結晶ナノワイヤである特徴がある。
【００９５】
前記製造方法による貴金属単結晶ナノワイヤは、触媒を使用せず、単に金属酸化物、貴金属物質またはハロゲン化貴金属を前駆物質として使用して単結晶基板上に貴金属ナノワイヤが形成されて、気相の物質移動経路を通じて貴金属単結晶ナノワイヤが形成されるため、不純物を含まない高純度、高品質のナノワイヤである長所がある。
【００９６】
また、前記反応炉前端部及び反応炉後端部の温度をそれぞれ調節して、前記不活性気体の流れ程度と前記熱処理時利用される熱処理管内圧力を調節して、最終的に単結晶基板上部で金属物質の核生成駆動力、成長駆動力、核生成速度及び成長速度を調節する方法であるため、貴金属単結晶ナノワイヤの大きさ及び基板上の密度などが制御可能で、再現可能であり、欠陥がなくて結晶性のよい高品質の貴金属単結晶ナノワイヤを製造することができるようになる。
【００９７】
上述の気相移送法を利用して製造されて、本発明のバイオセンサーに備えられる前記貴金属単結晶ナノワイヤは、ツイン、積層欠陥などの面欠陥がない単結晶体である特徴があり、長短軸比(aspect ratio、ナノワイヤ長軸長さ/短軸直径)が、５〜５０００である特徴があって、長軸の長さは、１μｍ以上である特徴があり、前記貴金属単結晶ナノワイヤは、二つ以上のナノワイヤが互いに物理的に凝集しているナノワイヤ凝集体、二つ以上のナノワイヤが互いに物理的に結合しているナノワイヤの結合体、ナノワイヤが同種または異種の物質に付着された複合体ではない、単一のナノワイヤ(free standing single nanowire)である特徴があって、厚さが均一で、原子水準で滑らかな表面を有する高形状のナノワイヤである特徴がある。
【００９８】
Ａｕナノワイヤ
反応炉で、気相輸送法を利用し、Ａｕ単結晶ナノワイヤを合成した。
【００９９】
前記反応炉は、前端部と後端部に区別されて、独立的に加熱体(heating element)及び温度調節装置を備えている。反応炉内の管は、直径１インチ、長さ６０ｃｍ大きさの石英(Quzrtz)材質からなるものを使用した。
【０１００】
反応炉の前端部の中央に、前駆物質のＡｕ２Ｏ３(Sigma-Aldrich,334057)０．０５ｇを入れた高純度アルミナ材質のボート状容器を位置させて、反応炉の後端部の中央には、表面が（０００１）面であるサファイア単結晶基板を位置させた。アルゴン気体は、反応炉の前端部に投入され、反応炉の後端部に排気されて、反応炉の後端部には真空ポンプが備えられている。前記真空ポンプを利用して石英管内の圧力を１５ｔｏｒｒに維持して、ＭＦＣ(Mass Flow Controller)を利用して５００ｓｃｃｍのＡｒが流れるようにした。
【０１０１】
反応炉の前端部(前駆物質を入れたアルミナボート)の温度は１１００℃に維持して、反応炉の後端部(サファイア基板)の温度は９００℃に維持した状態で３０分間熱処理し、Ａｕ単結晶ナノワイヤを製造した。
【０１０２】
Ａｕ単結晶ナノワイヤの短軸の直径が５０〜１５０ｎｍであり、長軸の長さは、５０μｍ以上であって、表面が原子的に滑らかな単結晶体のＡｕナノワイヤが製造された。
【０１０３】
アビジン検出
表面改質を通じて製造されたＡｕ単結晶ナノワイヤの表面にビオチンを形成させた。詳細に、製造されたＡｕ単結晶ナノワイヤを１ｍＬの０．４ｍＭ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰ(Pierce、21341)ジメチルホルムアミド(DMF)溶液に含浸させて、ビオチンが備えられるように表面改質した後、ＤＭＦ溶媒を利用して洗浄した後、１ｍＬリン酸緩衝食塩水(PBS；Phosphate Buffered Saline solution、以下PBS)水溶液に保管した。同様に、平均粒径が１０ｎｍであるＡｕナノ粒子(Sigma-Aldrich, G1527)を２μｌの０．４ｍＭ ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰ(Pierce、21341)ＤＭＦ溶液に含浸させて、ビオチンが備えられるように表面改質した。
【０１０４】
以後、ビオチンが備えられたＡｕナノワイヤにアビジン(Sigma-Aldrich,  A9275)ＰＢＳ溶液５ｍＬを添加して、ＰＢＳ溶液で洗浄した後、１ｍＬビオチンが備えられたＡｕナノ粒子水溶液１ｍＬを添加した。
【０１０５】
上記の過程を常温で１８０分間維持した後、非特異的に結合されたＡｕナノ粒子を除去するために、ＰＢＳ溶液を利用して洗浄した後、Ａｕナノワイヤを分離して物理的光学的特性を調べた。
【０１０６】
図４(ａ)は、ＡｕナノワイヤにＡｕナノ粒子及びアビジンを添加した後得られたＡｕナノワイヤの走査電子顕微鏡(SEM；Scanning Electron Microscopy)写真であって、Ａｕナノワイヤに備えられたビオチン及びＡｕナノ粒子に備えられたビオチンがアビジンと結合した、ビオチン−アビジン−ビオチン結合により、アビジンを挟んで単一のＡｕナノワイヤにＡｕナノ粒子が自己組織化されたことを確認することができる。
【０１０７】
Ａｕナノワイヤに自己組織化されたＡｕナノ粒子は、明確に識別することができて、Ａｕナノ粒子が凝集体を形成せず、それぞれが物理的に分離されて、単一のＡｕナノ粒子がＡｕナノワイヤに自己組織化されることが分かり、また、Ａｕナノ粒子がＡｕナノワイヤ表面に全体的に均一に高密度で自己組織化されていることが分かる。
【０１０８】
このような生化学物質により、単一の貴金属ナノワイヤに貴金属ナノ粒子が自己組織化されて、貴金属ナノ粒子と貴金属ナノワイヤ結合領域(Hot spot)に生化学物質が存在することによって、生化学物質のラマン信号は大きく増加するようになり、この現象を利用して生化学物質を容易に検出することが可能である。
【０１０９】
このような検出対象の生化学物質によるナノワイヤ−ナノ粒子構造は、単一構造が、生化学物質を検出できる一つのセンサーとして作用できるため、多数のナノワイヤの表面を多様な物質で改質して一つの基板に移して置くことにより、多様な生化学物質を同時に検出できるようなマルチプレックス検出方法への応用が非常に容易である。
【０１１０】
一方、図４(ｂ)から観察できるように、Ａｕナノワイヤ及びＡｕナノ粒子分散液にアビジンを添加せず、純粋なＰＢＳ溶液のみをもってＡｕナノ粒子とナノワイヤの自己組織化を行った時は、Ａｕナノ粒子がＡｕナノワイヤに自己組織化されないことを確認することができた。
【０１１１】
アビジンが添加された場合に得られたＡｕナノワイヤ及びアビジンが添加されなかった場合に得られたＡｕナノワイヤ(比較例)をＳｉ単結晶基板上部に位置させた後、ＳＥＲＳスペクトルを測定した。ＳＥＲＳスペクトルを測定するために、貴金属ナノワイヤを焦点に６３３ｎｍ波長を有するレーザービームを照射して、共焦点ラマン分光検出器で検出し、レーザービームの強度を０．５ｍＷとして６０秒間測定された結果である。
【０１１２】
図５(ａ)は、ビオチン−アビジン結合によりＡｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤのＳＥＲＳスペクトル(以下、ナノ構造体ＳＥＲＳスペクトル)である。アビジンが存在してハイブリッドナノ構造が形成された後は、強いＳＥＲＳ信号が観察されることが分かり(図５ａの青色スペクトル)、アビジン無しに、アビジンが添加されずビオチンが備えられたＡｕナノ粒子と接触したＡｕナノワイヤの場合、Ｓｉ信号の他には、特色のないスペクトルが得られることが分かる(図５ａの紫朱色スペクトル)。
【０１１３】
これは、図４の光学的結果と一致するもので、貴金属ナノワイヤと貴金属ナノ粒子が結合することによりホットスポットが生成されたことを立証する結果であって、このようなホットスポットにより非常に高い強度のＳＥＲＳスペクトルが得られることが分かる。しかしながら、ホットスポットが生成されていない単一の貴金属ナノワイヤのみの場合、表面プラズモンの励起が非常に小さくて、Ｓｉスペクトルが得られるだけである。
【０１１４】
Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造形成によるＳＥＲＳ強度増加率(EF)は、下記の数式１で計算できる。
(数式１)
ＥＦ＝(Ｉｓｅｒｓ×Ｎｂｕｌｋ)/(Ｉｂｕｌｋ×Ｎｓｅｒｓ)
【０１１５】
Ｉｓｅｒｓ とＩｂｕｌｋ は、ナノ構造体ＳＥＲＳスペクトルと固体状態のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰのバルクスペクトルにおいて同じピークの大きさ(特定バンドにおいてそれぞれの強度)であり、Ｎｂｕｌｋは、バルクスペクトルに寄与した分子数であって、Ｎｓｅｒｓは、ナノ構造体ＳＥＲＳスペクトルに寄与した分子数である。
【０１１６】
図５(ａ)の青色で示したナノ構造体ＳＥＲＳスペクトルから分かるように、１００５ｃｍ−１バンドの大きさがスペクトルで最も大きいため、これをＩｓｅｒｓとＩｂｕｌｋとして選択した。Ｎｂｕｌｋは、固体状態のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰ(０．５ｇ/ｃｍ３)ラマンスペクトルとラマンシステムの焦点容量(0.5femtoL)に基づいて決定される。
【０１１７】
ホットスポット領域におけるＮｓｅｒｓを求める時、 ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＨＰＤＰがＡｕナノワイヤとＡｕナノ粒子に０．４ｎｍ２の分子当たり面積を有して、単層として吸着されると仮定し、３ｎｍの間の分子のみを選択した。レーザービームが照射されるＡｕナノ粒子の数(即ち、SERS信号増強に寄与するホットスポットの数)が約２５０個であることが、図４(ａ)の走査電子顕微鏡写真から分かるため、Ｎｔｒａｐは、約２．２×１０５になる。
【０１１８】
図５(ａ)のナノ構造体ＳＥＲＳスペクトルにおいて、分子が６３３ｎｍ周辺に吸収バンドを示さないため、共鳴ラマン効果が除かれたことに注目すべきである。共鳴効果を有する探針分子を使用して、レーザーの波長を最適化すると、さらに増加されたＳＥＲＳ効果が得られることを予想することができる。
【０１１９】
図５(ｂ)及び図５(ｃ)に示したように、ビオチン−アビジン結合によりＡｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤのナノ構造体に照射されるレーザービームの偏光特性及びレーザービームが照射される位置によってナノ構造体ＳＥＲＳスペクトルの強度が変わることが分かる。図５(ｂ)は、Ａｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤの長軸中心(図５(ａ)に示されたナノワイヤの(ｂ)位置)にレーザービームが照射される場合であり、図５(ｃ)は、Ａｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤの長軸チップ(tip)(図５(ａ)に示されたナノワイヤの(ｃ)位置)にレーザービーム照射される場合であって、ナノワイヤの長軸方向とレーザービームの偏光方向とがなす角度θによる１１２０ｃｍ−１ラマンバンド積分値に対する極線を示したものである。
【０１２０】
Ａｕナノワイヤ長軸中心領域にレーザービームが照射された場合、レーザービームの偏光がナノワイヤの長軸と垂直である場合、ＳＥＲＳ強度は最高となり、偏光が水平である場合、最小に落ちる。このような偏光依存性は、光反応による減少を補正したｃｏｓ２θ関数でフィッティング(fitting)される。
【０１２１】
一方、ＡｕナノワイヤチップにおけるＳＥＲＳ信号偏光異方性は、中心領域でより著しく小さくなる。チップにおける極線は、指数減少関数でフィッティングされる。
【０１２２】
このような結果は、Ａｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤのチップと中心における表面プラズモン励起の差によって説明できる。単一のナノ粒子がナノワイヤの中間(ナノワイヤ長軸方向の中心)に付いていると、強い偏光異方性が表れる。本発明による貴金属ナノワイヤには、多数個の物理的に分離された貴金属ナノ粒子が自己組織化されているため、観察された偏光依存性は、多数のホットスポットで生成された電磁場の集合により説明される。
【０１２３】
一方、ナノワイヤのチップでは、部分的構造が円柱を覆っている半球に近い。小さいナノ粒子が均一に覆っている大きい球から偏光異方性が消えることが明らかである。したがって、信頼性と再現性があって、高敏感度で生化学物質を検出するために、ナノワイヤ長軸方向の中心にレーザービームが照射されることが好ましいことが分かる。
【０１２４】
図６(ａ)は、ビオチンが形成されたＡｕナノ粒子とビオチンが形成されたＡｕナノワイヤが分散されたＰＢＳ溶液に添加されたアビジンの濃度によるナノ構造体ＳＥＲＳスペクトル変化を示したものである。Ａｕナノ粒子及びＡｕナノワイヤが分散されたＰＢＳ溶液内アビジンの濃度が１０−１３Ｍ乃至１０−５Ｍ濃度になるようにアビジンを添加した後、Ａｕ−ナノワイヤを分離回収してＳＥＲＳスペクトルを得た。
【０１２５】
図６(ａ)に示したように、１０−８Ｍ以上のアビジン濃度では、非常に明らかなＳＥＲＳスペクトルが観察された。１０−９Ｍでは、ＳＥＲＳ強度が低下したが、これは、Ａｕナノワイヤに付着されたナノ粒子の数が減少したからである。１０−１０Ｍ以下では、ラマン信号を観察することが難しかった。ビオチン−アビジン結合は、熱力学的親和常数が非常に大きい非可逆的反応であるため、図６(ａ)に示された各スペクトルは、互いに異なるサンプルから独立的に測定した結果である。これは、ビオチン−アビジン結合により、Ａｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤであるナノ構造体からのＳＥＲＳ信号がＡｕナノワイヤ表面に沿って均一に形成されたホットスポットにより、再現性のあるように具現及び観察されることを意味する。
【０１２６】
ＳＥＲＳ活性の構造からのＳＥＲＳ信号の再現性と安定性は、よいセンサーのために非常に重要な性質である。Ａｕナノワイヤは、非常に均一な表面を有しており、Ａｕナノ粒子も固まることなくナノワイヤ全体に均一に分布されているため、本発明のナノ構造体は、信頼性のあるＳＥＲＳ信号の再現性を示す。
【０１２７】
ＳＥＲＳ増強が、アビジンのみの特定な認知に依存したものであるかどうかを確認するために、ビオチンが形成されたＡｕナノ粒子とビオチンが形成されたＡｕナノワイヤが分散されたＰＢＳ溶液に、アビジンではない、非特異的結合蛋白質の牛血清アルブミン(Bovine Serum Albumin, 以下BSA)を添加した。
【０１２８】
図６(ｂ)は、走査電子顕微鏡写真に基づいてＢＳＡとアビジンのそれぞれの濃度によってＡｕナノワイヤに付着されたＡｕナノ粒子の数を示したものであって、この際、観察したＡｕナノワイヤの面積は、１×１０４ｎｍ２である。
【０１２９】
図６(ｂ)のＢＳＡで示したグラフから分かるように、ビオチンが結合されたＡｕナノワイヤ及びビオチンが結合されたＡｕナノ粒子分散ＰＢＳ溶液にＢＳＡ濃度を上げながら反応しても、自己組織化されたＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造を観察することができなかった。これは、貴金属ナノ粒子−貴金属ナノワイヤのナノ構造体の形成が、ビオチン−アビジン結合に非常に選択的であることを意味する。
【０１３０】
図６(ｂ)のアビジンで示したグラフから分かるように、貴金属ナノ粒子の自己組織化構造によるホットスポットの密度が、アビジン濃度により制御されることが分かる。
【０１３１】
ターゲットＤＮＡ検出
アビジン検出と類似したＡｕナノワイヤ及びＡｕナノ粒子、アビジン検出と類似したＳＥＲＳ測定条件を利用してＤＮＡを検出した一例を詳述する。
【０１３２】
表１は、ＤＮＡ検出に使用されたプローブＤＮＡ(Efm003-20、Sau001-20、Smal03-20、Vvul02-20)、ターゲットＤＮＡ(T1〜T6)、及びレポーターＤＮＡ(R1〜R3)の配列を整理したものである。
【０１３３】
表１に示したように、感度増進のために、レポーターＤＮＡの５’−ｔｅｒｍｉｎｉにＣｙ５またはＴＡＭＲＡラマンダイを付着した。
【０１３４】
表１  使用されたＤＮＡ配列(Genotech、Daejeon、Korea)
【表１】
2011081001.tif 000003
【０１３５】
実験に使用したＤＮＡ(プローブ、ターゲット、レポーターＤＮＡ)は、１Ｍ  ＤＴＴ(dithiothreitol)及びＮＡＰ−５  ｃｏｌｕｍｎ(GE healthcare Co.)を利用して精製した後使用した。Ａｕナノワイヤは、５μＭプローブＤＮＡを含有した１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４バッファ(pH  6.75)に常温で２４時間インキュベーションさせた後、０．２％(w/v)のＳＤＳ溶液で洗浄して、Ｎ２が流れる雰囲気で乾燥した。
【０１３６】
プローブＤＮＡが形成されたＡｕナノワイヤは、ナノマニピュレータ (nanomanipulator)を利用して、Ｍ−ＰＥＧシラン(methoxy-polyethylene glycol Silane)が形成されたＳｉ単結晶基板に移された。
【０１３７】
Ａｕナノ粒子は、ラマンダイが形成されたレポーターＤＮＡで改質して、詳細には、５μＭレポーターＤＮＡ及び０．０１％(w/v)ＳＤＳを含有した０．０１Ｍ  ＰＢ(phosphate buffer)溶液とＡｕナノ粒子を混合して、常温で１２時間インキュベーションして、以後、ＰＢ溶液のＮａＣｌの濃度が漸次的に０．７Ｍになるように、２Ｍ  ＮａＣｌ溶液を添加した(salt aging方法)。ｓａｌｔ  ａｇｉｎｇ以後、遠心分離を利用してＡｕナノ粒子を回収し、０．０１％(w/v)ＳＤＳで２回洗浄した後、ＰＢＳ溶液に分散させた。
【０１３８】
ターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションバッファに添加されて、前記ハイブリダイゼーションバッファとして、６×ＳＳＰＥ(0.9M NaCl, 10mM NaH2PO4H2O, 1mM EDTA, pH 7.4)、２０％(v/v)ホルムアミド溶液(formamide solution, Sigma-Aldrich)、及び０．１％(w/v)ＳＤＳの混合溶液を使用した。
【０１３９】
プローブＤＮＡが形成されたＡｕナノワイヤは、ターゲットＤＮＡを含有するハイブリダイゼーションバッファに含浸されて、３０℃、６時間ハイブリダイゼーションされた後、２×ＳＳＰＥで洗浄された。
【０１４０】
プローブＤＮＡが形成されたＡｕナノワイヤとターゲットＤＮＡのハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションされたＡｕナノワイヤは、０．１％(w/v)ＳＤＳを含有してレポーターＤＮＡが形成されたＡｕナノ粒子が分散されたＰＢＳ溶液に含浸され、６時間ハイブリダイゼーションされた。
【０１４１】
ハイブリダイゼーションされたＡｕナノワイヤとＡｕナノ粒子のハイブリダイゼーション後、０．１％(w/v)ＳＤＳを含有するＰＢＳ溶液及び脱イオン水でそれぞれ洗浄し、Ｎ２が流れる雰囲気で乾燥して、ターゲットＤＮＡを挟んでＡｕナノ粒子がＡｕナノワイヤに自己組織化されたＤＮＡ検出サンプルを製造した。
【０１４２】
図７(ａ)は、ターゲットＤＮＡ、レポーターＤＮＡ、プローブＤＮＡを利用したＤＮＡ検出サンプルの一例を示した概念図であり、図７(ａ)に示したように、ホットスポット及びＳＥＲＳ信号は、ＤＮＡ相補的結合の分子認識が起こらなければ得られない。
【０１４３】
図７(ｂ)及び図７(ｃ)の結果は、Ｅｆｍ００３−２０プローブＤＮＡ、Ｔ１ターゲットＤＮＡ、Ｔ２非特異的ターゲットＤＮＡ、Ｒ１レポーターＤＮＡを利用したＤＮＡ検出サンプルの測定結果である。
【０１４４】
図７(ｂ)の青色ラマンスペクトルは、相補的結合するターゲットＤＮＡを利用してハイブリダイゼーションさせた場合のＤＮＡ検出サンプル測定結果を示したもので、図７(ｂ)の紫朱色ラマンスペクトルは、ターゲットＤＮＡの代わりに、非相補的ＤＮＡで類似にハイブリダイゼーションした場合に測定された結果を示したものである。図７(ｂ)から分かるように、ターゲットＤＮＡが存在する場合にのみ、Ｃｙ５の強いＳＥＲＳ信号が得られて、非相補的ＤＮＡを使用した時は、弱いＳｉバンドのみが観察されることを示している。
【０１４５】
たとえ単一のナノワイヤそのものがＳＥＲＳ−活性化物質になってもよいが、表面に付着されたナノ粒子がある時、著しく強いＳＥＲＳ信号を得ることができる。単一ナノワイヤに比べ、ターゲットを挟んで形成されたＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造の実験的ＳＥＲＳ増強ファクター(SERS enhancement factor)は、２．６×１０３であった。
【０１４６】
図７(ｃ)は、このようなＤＮＡ相補的結合によるＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造形成の直接的な観察のためのＳＥＭ写真であって、相補的ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーションによっては、アビジンと類似に典型的なＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造を示して(図7(c)の上)、非特異的ＤＮＡに対しては、ナノ粒子が形成されず、ナノワイヤのみが存在することが分かる(図7(c)の下)。
【０１４７】
図７(ｃ)は、図７(ｂ)のＳＥＲＳスペクトルと相応するＳＥＭ写真であって、ナノ粒子−ナノワイヤ間のギャップ形成、及びこのようなギャップに検出対象の生化学物質が固定された構造が、ＳＥＲＳ増強に非常に重要であることを確実に証明している。また、アビジンと同様に、ナノ粒子が固まることなくナノワイヤに均一に分布されていることに注目すべきである。このような均一なナノ粒子−ナノワイヤ構造は、極めてよく定義されたナノ構造であるため、再現性のあるＳＥＲＳ信号を提供することができる。
【０１４８】
マルチプレックスＤＮＡ検出のために、互いに異なるプローブＤＮＡｓ(Efm003-20とSau001-20)で改質された二つのＡｕナノワイヤを利用した。Ｅｆｍ００３−２０とＳａｕ００１−２０で改質された二つのＡｕナノワイヤは、同じＳｉ基板に位置した。
【０１４９】
図８(ａ)に示したように、プローブＤＮＡで改質されたＡｕナノワイヤを含んだこの基板は、ターゲットＤＮＡｓ(T1とT2)の混合物とレポーターＤＮＡｓ(R1とR2)で改質したＡｕナノ粒子の混合物溶液と順次的に反応させた。
【０１５０】
その結果で得られた二つのＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造は、それぞれのＳＥＲＳスペクトルが測定されるが、これは、一つのターゲットＤＮＡ(T1)はＥｆｍ００３−２０とＣｙ５レポーター分子(R1)に相補的であり、他の一つのターゲットＤＮＡ(T2)は、Ｓａｕ００１−２０とＴＡＭＲＡレポーター分子(R2)に対して相補的にデザインしたからである。
【０１５１】
図８(ｂ)は、それぞれのＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造から測定したＳＥＲＳスペクトルを示したもので、上のＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造から、Ｃｙ５のラマンバンドが見られて、これは、専らＴ１とＲ１のみがこのシステムに存在することを証明する。同様に、下のＡｕナノ粒子−Ａｕナノワイヤ構造からは、ＴＡＭＲＡのＳＥＲＳ信号が得られて、Ｔ２とＲ２のみが存在していることを示す。
【０１５２】
このような結果は、他のターゲットＤＮＡｓ間のクロスハイブリダイゼーション(cross hybridization)が発生しないことを示すもので、一つのナノワイヤを一つのターゲットＤＮＡ検出システムとして使用し、マルチプレックスＤＮＡ検出が可能であることを証明する結果である。
【０１５３】
図９は、マルチプレックスＤＮＡ検出の他の例であって、四つのＡｕナノワイヤを利用した一例である。図９(ａ)に示したように、異なるプローブＤＮＡｓ(Efm003-20、Sau001-20、Smal03-20、及びVvul02-20)を付着した四つのＡｕナノワイヤを、一つのＳｉ基板の特定な位置にＭ字形状で位置させて、Ｍ字形状に基づいた位置住所(address)により各ナノワイヤを区分した。
【０１５４】
ナノワイヤを個別的に正確な位置に置くことは、ナノワイヤ基盤マルチプレックス検出において重要である。本発明による単一Ａｕナノワイヤは、ナノマニピュレータで移動させることができて、また光学顕微鏡で簡便に観察することができるため、容易に位置が制御されて、これによって、ナノワイヤ別区分のために、いかなるパターニング過程も必要なくなる。
【０１５５】
基板上の４種類のナノワイヤは、多数のターゲットＤＮＡｓ(T3、T4、T5、そしてT6)の混合物と結合させた後、５’−ｔｅｒｍｉｎｉにはＣｙ５を、３’−ｔｅｒｍｉｎｉにはＡｕナノ粒子を有しているレポーターＤＮＡ(R3)とインキュベーションさせた。
【０１５６】
この実験において、検査の精密性を高めるために、レポーターＤＮＡの長さを１５−ｍｅｒに縮めた。短いオリゴヌクレオチドが他のＤＮＡとのクロス反応を排除することができて、差別化(discriminatory power)を高めることができることがよく知られている。
【０１５７】
図９(ｂ)乃至９(ｄ)は、四つのＡｕナノワイヤから構成された４プラットフォームサンプルのＳＥＲＳを利用したマルチプレックスＤＮＡ検出を示している。四つの異なるプローブＤＮＡを付けたＡｕナノワイヤは、Ｓｉ基板上、図９(ｂ)の光学顕微鏡写真に示されたように、アルファベット文字Ｍを形成している。Ａｕナノワイヤの固定された位置からナノワイヤを区分することができて、一遍の分析で多数のターゲットＤＮＡを検出することができる。
【０１５８】
二つのターゲットＤＮＡ(T3とT5)混合物で実験した後、四つのナノワイヤから得たＳＥＲＳスペクトルを図９(ｂ)に示している。専らＥｆｍ００３−２０とＳｍａｌ０３−２０が付着されたナノワイヤのみが、Ｃｙ５のＳＥＲＳスペクトルを示している。
【０１５９】
この方法の詳しい評価が図９(ｃ)及び図９(ｄ)に示されている。これらは、多様なターゲットＤＮＡの混合物で実験を終了した後、基板上の各Ａｕナノワイヤから得た１５８０ｃｍ−１ラマンバンドの大きさを示している。図９(ｃ)において、四つのターゲットＤＮＡの中、一つのみを使用したため、ターゲットＤＮＡと相補的なプローブＤＮＡを有している一種類のＡｕナノワイヤからのみＳＥＲＳ信号が観察された。図９(ｄ)では、マルチプレックスＤＮＡ検出のためのセンシング能力が明確に検証された。Ｔ３とＴ６の混合物が基板に適用された時、ＳＥＲＳ信号は、Ｅｆｍ００３−２０とＶｖｕｌ０２−２０が付着されたＡｕナノワイヤからのみ得られた。Ｔ４とＴ５の混合物を使用した時は、Ｓａｕ００１−２０とＳｍａｌ０３−２０が付着されたナノワイヤのみが強いＣｙ５のＳＥＲＳスペクトルを示して、Ｔ３、Ｔ４、そしてＴ５の混合物と反応させた後は、Ｖｖｕｌ０２−２０で改質されたナノワイヤを除いた全てのナノワイヤが強いＳＥＲＳ信号を提供した。最後に、四つのターゲットＤＮＡｓ混合物を使用して、チップ上の全てのＡｕナノワイヤが類似したＳＥＲＳスペクトルを示すことを観察した。この結果は、Ａｕナノワイヤ−ナノ粒子システムがｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ結合を検出することができることを明らかに示している。
【０１６０】
上述のプラットフォームのマルチプレキシング能力が、他のラマンダイによる結果ではないことに注目する必要がある。この実験において、他のナノ粒子基盤検出方法と比べ、マルチプレックスＤＮＡ検出のために一つのレポーターＤＮＡのみを使用した。
【０１６１】
たとえ狭いラマンバンドにより、互いに異なるダイ(dye)のＳＥＲＳスペクトルは区分できるとしても、定量的なマルチプレックス検出のためには、同じラマンダイを使用することがさらに有利である。マルチプレックスＤＮＡ検出のために、多数のダイ(dyes)を使用する場合、ダイ別にＳＥＲＳ増強は異なってくる。
【０１６２】
また、単一ナノワイヤの容易な移動及び観察が可能であるため、バーコードパターンのような物理的に表示されたラベルのない単結晶Ａｕナノワイヤを使用することができた。光学的に互いに区分されないＡｕナノワイヤは、基板における特定な位置によって区分できる。しかも、非常にきれいな表面を有している単結晶Ａｕナノワイヤを、マルチプレックス検出可能なＳＥＲＳプラットフォームのビルディングブロック(building block)として使用することにより、ＳＥＲＳを利用した検出時、最も重要な性質の一つである再現性のあるＳＥＲＳスペクトルを得ることができると期待した。
【０１６３】
図１０は、多様なターゲットＤＮＡ濃度(モル濃度)におけるＡｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造の感度及び濃度との関係を測定した結果であって、図１０(ａ)は、ターゲットＤＮＡの濃度を変えることによるＣｙ５の１５８０ｃｍ−１ラマンバンド大きさの変化を示している。ＳＥＲＳ信号は、ターゲットＤＮＡの濃度に比例して減少して、１０ｐＭの低い濃度でも観察される。
【０１６４】
ＳＥＲＳ大きさとＤＮＡ濃度のさらに詳しい結果を図１０(ｂ)に示した。図１０(ｂ)の青色線が示すように、Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造のＳＥＲＳ大きさは、ターゲットＤＮＡの濃度と関連がある。この方法の検出限界(limit of detection)を一般的なアッセイ(assay)容量の３０μｌで３００ａｍｏｌ(1.8×108molecules)と同一な、１０ｐＭと推定した。また、ＳＥＲＳ信号は、１０ｎＭで飽和(saturation)されて、３オーダーのダイナミックレンジ(dynamic range)を有することが分かる。
【０１６５】
また、１０−１１乃至１０−８の３オーダーのダイナミックレンジ範囲でＳＥＲＳ大きさと濃度が直線関係(correlation coefficient: 0.987)を有することが分かり、この結果は、Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造を利用してターゲットＤＮＡの定量的検出が可能であることを提案している。非特異的ＤＮＡを利用して行った比較実験では、区分できるＳＥＲＳ信号を観察することができなかった(図１０(ｂ)の紫朱色線)。
【０１６６】
病原菌ＤＮＡの検出
病原菌を検出することは医学的に重要である。なぜなら、これらが相当な疾病率と高い死亡率を有した様々な伝染病を誘発するからである。Enterococcus faecium(E. faecium)とStaphylococcus aureus(S. aureus)は、高い発生率と死亡率を有した血流疾患の最も有力な病原菌である。Stenotrophomonas maltophilia(S. maltophilia)は、免疫体系が正常に作用しない患者、臓器移植者、嚢胞性線維症(CF)を有した人々に重要な病原菌である。Vibrio vulnificus(V. vulnificus)は、数日内に速く進行されて、５０％以上の高い死亡率を示す敗血症と胃腸炎の原因となる。
【０１６７】
表２は、ＤＮＡ検出に使用された菌の種類を整理したものである。
【０１６８】
表２
【表２】
2011081001.tif 000004
【０１６９】
リファレンス菌のＤＮＡは、表２の菌からDNA mini kit(QIAGEN, Hilden, Germany)を利用して、キット供給社のプロトコール(protocol)によって分離された。
【０１７０】
クリニカルサンプルとして、クリニック菌のＤＮＡは、菌に感染された患者の脳脊髄液、便、うみ、そして痰を含んだ様々な臨床標本から、QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)を利用して、キット供給社のプロトコール(protocol)によって分離された。
【０１７１】
分離されたＤＮＡからＰＣＲ(Polymerase chain reaction)増幅を利用して種特異的ＤＮＡのみを選択的に増幅して、ターゲットＤＮＡｓとして使用した。詳細にＰＣＲ増幅は、1×Taq buffer, 0.2mM dNTPs, 2units of Taqpolymerase(Takara Shuzo Co., Shiga, Japan)、 5ng genomic DNA, 5pmol forward primer、及び25pmol reverse primerを含有した反応液を利用して行われた。
【０１７２】
ＰＣＲ増幅時、種特異的なプライマーは、Efm003-20(for E. faecium)、Sau001-20(S. aureus)、Smal03-20(S. maltophilia)またはVvul02-20(V. vulnificus)を使用して、ユニバーサルプライマーは、23BR(5’-TTCGCCTTTCCCTCACGGTACT-3’)を使用した。
【０１７３】
増幅されたＰＣＲ反応物は、PCR  purification kit(iNtRON Co., Ltd, Gyeongido, Korea)を利用して、キット供給社のプロトコール(protocol)によって精製分離された。
【０１７４】
図１１は、Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造を利用したマルチプレックス病原菌バクテリアＤＮＡ(リファレンス菌のＤＮＡ)のＳＥＲＳ検出結果である。
【０１７５】
ＳＥＲＳ信号は、バクテリアＤＮＡと相補的なプローブＤＮＡを有しているＡｕナノワイヤでのみ増幅された。このターゲットＤＮＡは、モデルシステムに使用した合成された３５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドより著しく長いが(S. maltophiliaは119bp, V.vulnificusは131bp, S. aureus は194bp、そしてE. faeciumは347bp)、モデルシステムとほぼ等しいＳＥＲＳ結果を得ることができた。Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造を利用したラベル−フリーＤＮＡ検出は、ターゲットＤＮＡの長さに関係ないが、その理由は、乾燥した状況でＤＮＡが崩れて、ナノワイヤとナノ粒子間の距離がＳＥＲＳ増幅のために充分小さく縮まるからである。
【０１７６】
図１２は、クリニック菌のＤＮＡをＰＣＲ増幅してターゲットＤＮＡとして使用し、これをＡｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造を利用したＳＥＲＳ検出結果である。図１２のクリニック菌ＤＮＡ検出結果と図１１のリファレンス菌ＤＮＡの検出結果が類似していることが分かり、これは、感染された患者の病原菌をＳＥＲＳ信号から検出可能であることを提案している。
【０１７７】
Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造を利用して、７個の臨床検体から四つの病原菌を成功的に検出して(E. faecium; 2, S. aureus : 2, S. maltophilia : 2, そしてV. vulnificus : 1)、ＳＥＲＳを利用した検出結果は、伝統的な培養基盤アッセイ(culture-based assays)結果とよく一致した。
【０１７８】
以上のように、本発明では、具体的な検出対象物質のように、特定な事項と限定された実施例及び図面を参照して説明したが、これらは、本発明のより全般的な理解を助けるために提供されたもので、本発明がこれらに限定されるものではなく、本発明の属する分野で通常の知識を有する者なら、このような記載から多様な修正及び変形が可能である。
【０１７９】
したがって、本発明の思想は、説明された実施例に局限して定められてはならず、添付の特許請求の範囲だけではなく、この特許請求の範囲と均等なあるいは等価的な変形のあるあらゆるものは、本発明の思想の範疇に属すると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】本発明による生化学物質検出方法を示した一例である。
【図２】本発明による生化学物質検出方法を示した他の例である。
【図３】本発明による生化学物質マルチプレックス検出方法を示した一例である。
【図４】ビオチン−アビジン−ビオチンの結合によりＡｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤの走査電子顕微鏡写真(図１２(ａ))、及びアビジンが添加されていない場合のＡｕナノワイヤの走査電子顕微鏡写真(図１２(ｂ))である。
【図５】ビオチン−アビジン−ビオチンの結合によりＡｕナノ粒子が自己組織化されたＡｕナノワイヤのＳＥＲＳスペクトル(図５(ａ)青色)、アビジンが添加されていない場合のＡｕナノワイヤのＳＥＲＳスペクトル(図５(ａ)紫朱色)、図５(ａ)に示されたナノワイヤの(ｂ)領域で測定されたナノワイヤの長軸方向とレーザービームの偏光方向とがなす角度θによる１１２０ｃｍ−１ラマンバンド積分値(図５(ｂ))、及び図５(ａ)に示されたナノワイヤの(ｃ)領域で測定されたナノワイヤの長軸方向とレーザービームの偏光方向とがなす角度θによる１１２０ｃｍ−１ラマンバンド積分値(図５(ｃ))である。
【図６】ビオチンが形成されたＡｕナノ粒子とビオチンが形成されたＡｕナノワイヤが分散されたＰＢＳ溶液に添加されたアビジンの濃度によるＳＥＲＳスペクトル(図６(ａ))、アビジンの濃度によるＡｕナノワイヤ１×１０４ｎｍ２面積においてＡｕナノワイヤに付着されたＡｕナノ粒子の数(図６(ｂ)の青色)、及び非特異的結合蛋白質の濃度によるＡｕナノワイヤ１×１０４ｎｍ２面積においてＡｕナノワイヤに付着されたＡｕナノ粒子の数(図６の紫朱色)である。
【図７】ＤＮＡを検出対象とした検出方法を示した一模式図(図７(ａ))、特異的ＤＮＡとの接触(青色)と非特異的ＤＮＡとの接触(紫朱色)によるＳＥＲＳスペクトル結果(図７(ｂ))、及び特異的ＤＮＡ及び非特異的ＤＮＡとの接触時の走査電子顕微鏡写真(図７(ｃ))である。
【図８】互いに異なるプローブＤＮＡがそれぞれ形成された二つのナノワイヤを含んだマルチプレックスプラットフォームを利用した検出方法を示した一模式図(図８(ａ))、及びマルチプレックス検出によるＳＥＲＳスペクトル結果(図８(ｂ)である。
【図９】互いに異なるプローブＤＮＡがそれぞれ形成された四つのナノワイヤを含んだマルチプレックスプラットフォームを利用した検出方法を示した一模式図(図９(ａ))、マルチプレックス検出によるＳＥＲＳスペクトル結果(図９(ｂ))、接触するターゲットＤＮＡの種類別検出結果を示したＳＥＲＳスペクトル結果(図９(ｃ))、及び順次的マルチプレックス検出結果を示したＳＥＲＳスペクトル結果(図９(ｄ))である。
【図１０】検出対象であるＤＮＡモル濃度によるＳＥＲＳスペクトルの変化(図１０(ａ))、及び検出対象であるＤＮＡのモル濃度とＳＥＲＳスペクトルの強度との関係を整理して示したもの(図１０(ｂ))である。
【図１１】Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造を利用したマルチプレックス病原菌バクテリアＤＮＡ(リファレンス菌のＤＮＡ)のＳＥＲＳ検出結果である。
【図１２】Ａｕナノワイヤ−Ａｕナノ粒子構造を利用したクリニック菌ＤＮＡのＳＥＲＳ検出結果である。
【符号の説明】
【０１８１】
１００    貴金属ナノワイヤ
２００    貴金属ナノ粒子
１１０    第１受容体
２１０    第２受容体
３００    生化学物質
【図１】
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【図２】
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【図３】
2011081001.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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