(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞のアクアポリン遺伝子発現を促進するアクアポリン遺伝子発現促進剤を提供する。また、アクアポリン遺伝子発現促進剤により、アクアポリン遺伝子産物の増加によって、水チャンネルの正常な働きを補い、アクアポリンの機能低下に伴う症状を改善する薬剤を提供する。【解決手段】式（１）で表されるホスファチジン酸を有効成分とするアクアポリン遺伝子発現促進剤。2011063515.tif 000011（式中Ｒは、炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基を示す。Ｘは、環状ホスファチジン酸、リゾホスファチジン酸およびそれらのアルカリ金属塩、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基からなる塩である。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表されるホスファチジン酸を有効成分とするアクアポリン遺伝子発現促進剤。
【化１】
2011063515.tif 000008
（式中Ｒは、炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基を示す。Ｘは、式（２）または式（３）で表される基を示す。Ｍは水素原子、アルカリ金属原子、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基を表す。）
【化２】
2011063515.tif 000009
【化３】
2011063515.tif 000010
【請求項２】
請求項１に記載のアクアポリン遺伝子発現促進剤を用いたアクアポリン産生促進剤。
【請求項３】
請求項１に記載のアクアポリン遺伝子発現促進剤を用いたアクアポリン機能不全治療剤。
【請求項４】
請求項１に記載のアクアポリン遺伝子発現促進剤を用いた外皮水分代謝異常治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞のアクアポリン（以下、ＡＱＰと省略することがある）の遺伝子発現を亢進することができるアクアポリン遺伝子発現促進剤に関する。より詳しくは、アクアポリンの活性低下に伴う組織の水分補給機能の改善を目的として、イオントフォレシス（イオン導入法）や注射による投与により外皮組織の水分輸送を担うアクアポリン遺伝子の発現増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アクアポリンは、リン脂質二重層からなる細胞膜によって細胞内外に隔てられた水分子を選択的に透過させる機能を担う膜たんぱく質である。１００年以上前からその存在が予想されながら、実際の確認は、ノーベル賞の対象となった１９９２年のＰｅｔｅｒ Ａｇｒｅらによる赤血球からのクローニングによる研究により初めて行われた（非特許文献１）。
【０００３】
アクアポリンは、原核生物から高等動物まで普遍的に存在し、哺乳類では現在までに１０種類以上のアクアポリン遺伝子が報告されている。既に、アクアポリン遺伝子のノックアウト動物を用いた研究で、白内障、腎性尿崩症、難聴、聴力障害など様々な疾病が引き起こされることが判明しており、アクアポリン遺伝子の更に多様な役割が予想されている。既に、赤血球の形態変化能（非特許文献２）やドライアイの発生（非特許文献３）に関与することが知られている。
【０００４】
アクアポリンの一種であるアクアポリン３のノックアウトマウスでは腎機能の低下や、皮膚の乾燥が引き起こされるが、この原因因子としてグリセリンの供給能の低下による保水能低下が指摘されている（非特許文献４）。
このようにアクアポリンは、水に対する選択的なチャンネル（水チャンネル）として発見されたが、グリセリンや尿素等の低分子化合物や、炭酸ガスのチャンネルとしても機能しており、水輸送を担う器官や血流の乏しい外皮などの組織においても重要な役割を果たしていると考えられる。
【０００５】
現在、水分代謝機能の低下した組織機能の回復のため、アクアポリン遺伝子の発現促進や、産生促進を可能にする技術の完成が待たれている。
特許文献１では、過酸化脂質の生成を抑制し、アクアポリンの生成を促進するノウゼンハレン科植物が、皮膚において優れた保湿性、荒れ肌改善、老化防止および美白効果を有することが知られている。
特許文献２ではヒアルロン酸産生を高め、アクアポリンの生成を促進するアヤメ科クロッカス属サフラン（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）から得られる抽出物が、皮膚においてハリや潤いを維持して皺、乾燥肌、日焼け肌、老化肌を改善することが知られている。  
【０００６】
特許文献３では、トコフェリルレチノエートを有効成分とする細胞環境改善剤からなるアクアポリン発現促進剤が知られている。特許文献４では、リポカリンのリガンドからなることを特徴とするアクアポリン水チャンネルオープナー組成物による角膜上皮障害治療剤が知られている。
また、特許文献５では、アクアポリン５水チャンネル開口作用を有するペプチドによる、角結膜上皮障害治療剤が知られている。特許文献６では、水分代謝異常や、呼吸不全を伴う口渇、ドライアイや鼻腔乾燥に伴う出血、皮膚乾燥による掻痒感、気道乾燥による咳及び痰、又は肺水腫など、種々の疾患の治療に用いることができるレチノイン酸又はその塩によるアクアポリン５の発現亢進剤が示されている。
【０００７】
特許文献７には、インターフェロンαの経口、吸引投与でアクアポリンの発現亢進により気道粘膜・肺機能不全を治療する方法が示されている。特許文献８では、Ａｊｕｇａ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ抽出物を用い、外用することでアクアポリンの発現亢進を生じせしめ、基底膜細胞の水分輸送不全による皮膚疾患を改善する方法が開示されている。また、クレソンにもアクアポリン産生増強効果が知られており、化粧料として用いられている。（非特許文献５）
【０００８】
一方で、真性粘菌（Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）培養液から、環状リン酸エステルという物質が真核生物のＤＮＡポリメラーゼα阻害活性を有する物質として見出された（非特許文献６）。この環状リン酸エステルは、構造解析の結果、グリセリン骨格の２位、３位間で自己環状エステルを有するユニークな構造のグリセロリン脂質であることが明らかにされた。
【０００９】
現在、環状リン酸エステルは、哺乳類の血清中にも約１０−７Ｍ程度存在することが明らかにされた（非特許文献７）。更に、ヒト血清やウサギ涙腺液中にも環状リン酸エステルが確認されるなど高等動物体液中に普遍的に存在することが明らかになり、その機能への関心が高まっている。
特許文献９や特許文献１０では、環状リン酸エステルによるがん細胞浸潤の抑制効果に基づく抗がん剤が提案され、また、特許文献１１および特許文献１２では、ニューロンやグリア細胞の生存維持や、神経突起伸展作用を有する薬剤が提案されている。
【００１０】
また、遊離のリン酸残基を有する環状リン酸エステルの構造異性体であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）については、細胞増殖因子の本体の一つであることが明らかにされた（非特許文献８，９）。更に、アクチン細胞骨格の再構築やフォーカルアドヒージョン形成（非特許文献１０）への関与が明らかにされた。
【００１１】
今日、リゾホスファチジン酸は、組織損傷時において即効的に機能することが可能な治癒促進物質、あるいは局所ホルモン（オータコイド）として、細胞の情報伝達物質として機能することが判明している。しかしながら、環状リン酸エステルや、リゾホスファチジン酸によるアクアポリンの活性発現については、これまで全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００４−１６８７３２号公報
【特許文献２】特開２００５−３４３８８２号公報
【特許文献３】特開２００６−２９０８７３号公報
【特許文献４】特開２００１−１１４６９８号公報
【特許文献５】特開平１１−２７９１９４号公報
【特許文献６】特開２００７−３３２０４８号公報
【特許文献７】米国特許第５８６３５３０号明細書
【特許文献８】米国特許第７０６０６９３号明細書
【特許文献９】特開平７−２５８２７８号公報
【特許文献１０】特開平９−２５２３５号公報
【特許文献１１】特開２００２−３０８７７８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６７，２６，１８２６７ （１９９２）
【非特許文献２】Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６，１，６２４（２０００１）
【非特許文献３】（Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ４５，１２，４４２３  （２００４）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７，４８，４６６１６  （２００２）
【非特許文献５】フレグランスジャーナル，１０，１９−２３（２００６）
【非特許文献６】Ｔｈｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，３０，２１５１２−２１５１７（１９９２）
【非特許文献７】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６５，２１，２１８５−２１９１（１９９９）
【非特許文献８】Ｃｅｌｌ． ５９，１，４５-５４（１９８９）
【非特許文献９】Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，４，４，２４７-５５．（１９９３）
【非特許文献１０】ＥＮＢＯ Ｊ．１３，１１，２６００−２６１０（１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の第一の課題は、短時間に細胞のアクアポリン遺伝子発現を促進するアクアポリン遺伝子発現促進剤を提供することにある。また本発明の第二の課題は、アクアポリン遺伝子発現促進剤により、アクアポリン遺伝子産物の増加を促すことにある。本発明の第三の課題は、アクアポリン遺伝子産物の増加によって、水チャンネルの正常な働きを補い、アクアポリンの機能低下に伴う症状を改善することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、次の［イ］、［ロ］である。
［イ］、式（１）で表されるホスファチジン酸を有効成分とするアクアポリン遺伝子発現促進剤。
【００１６】
【化１】
2011063515.tif 000002
（式中Ｒは、炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基を示す。Ｘは、式（２）または式（３）で表される基を示す。Ｍは水素原子、アルカリ金属原子、置換アンモニウム基または無置換アンモニウム基を表す。）
【００１７】
【化２】
2011063515.tif 000003
【００１８】
【化３】
2011063515.tif 000004
［ロ］、前記［イ］項に記載のアクアポリン遺伝子発現促進剤を用いたアクアポリン産生促進剤。
【００１９】
［ハ］、前記［イ］項に記載のアクアポリン遺伝子発現促進剤を用いたアクアポリン機能不全治療剤。
【００２０】
［ニ］、前記［イ］項に記載のアクアポリン遺伝子発現促進剤を用いた外皮水分代謝異常治療剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤は、ホスファチジン酸を有効成分とするため安全性に優れ、細胞レベルで短時間にアクアポリン遺伝子の発現を引き起こすことができる。
また、本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤を外用することにより、アクアポリン機能不全に起因する、外皮の水分代謝異常を伴う疾患を効果的に治療でき、アクアポリン機能の回復・改善に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤は、式（１）で表されるホスファチジン酸を有効成分として含む。
【００２３】
式（１）においてＲは、炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基を示す。
前記、炭素数８〜２２のアルキル基としては、炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アルキル基、炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アルキル基、炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アルキル基が挙げられる。
【００２４】
前記、炭素数８〜２２のアシル基としては、炭素数８〜２２の直鎖状の飽和アシル基、炭素数８〜２２の分岐鎖状の飽和アシル基、炭素数８〜２２の直鎖状で１〜６個の不飽和結合を有する不飽和アシル基が挙げられる。
【００２５】
これら炭素数８〜２２のアルキル基または炭素数８〜２２のアシル基のうち、好ましい炭素数８〜２２の炭素水素基としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸に由来する炭素水素残基が最も好ましく挙げられる。
【００２６】
式（１）中Ｘは、上記式（２）または式（３）で表される基を示す。
式（２）または式（3）中Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子、置換アンモニウム基もしくは無置換アンモニウム基を表す。
【００２７】
前記アルカリ金属原子としてはナトリウム、カリウムが挙げられる。前記置換アンモニウム基としてはブチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、テトラメチルアンモニウム基が挙げられる。前記無置換アンモニウム基としては、アンモニウム基が挙げられる。これらのうち、Ｍとしては、入手のしやすさの点からナトリウム、カリウムが最も好ましい。
【００２８】
本発明に用いる式（１）のホスファチジン酸には、式（１）のＸが式（２）である環状ホスファチジン酸（以下、ｃＰＡと称することがある）と、式（１）のＸが式（３）であるリゾホスファチジン酸（以下、ＬＰＡと称することがある）がある。
【００２９】
上記式（１）のＸが式（２）であるｃＰＡのうち、Ｒが、炭素数８〜２２のアシル基であるｃＰＡの入手方法としては、市販品を用いることができる他、特開平６−２２８１６９号公報、特開平７−２５８２７号公報、特開平９−２５２３５号公報に示された、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下に脂肪酸と２，３−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールから化学合成して得る方法により得ることができる。
【００３０】
また、上記式（１）のＸが式（２）であるｃＰＡのうち、Ｒが、炭素数８〜２２のアルキル基であるｃＰＡの入手方法としては、市販品を用いることができる他、米国特許第５２３８９６５号明細書に示された、市販の１−Ｏ−アルキル−グリセロールをピリジン溶媒中でオキシ塩化リンと化学反応させる方法で得ることもできる。
【００３１】
上記式（１）のＸが式（３）であるＬＰＡのうち、Ｒが、炭素数８〜２２のアシル基であるＬＰＡの入手方法としては、合成品もしくは市販品を用いることができる。
また、上記式（１）のＸが式（３）であるＬＰＡのうち、Ｒが、炭素数８〜２２のアルキル基であるＬＰＡの入手方法としては、合成品もしくは市販品を用いることができる。
【００３２】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤は、アクアポリン遺伝子の発現を促進する薬剤である。
【００３３】
ここで、アクアポリン遺伝子発現とは、生細胞においてＤＮＡ上のアクアポリンに関する遺伝情報が、アクアポリンｍＲＮＡに転写されることをいう。尚、アクアポリンとは、細菌から哺乳類まで広範な生物の細胞膜にあって水分子の選択的透過を担い、３００前後のアミノ酸で構成されるタンパク質からなるチャンネルをいう。
【００３４】
即ち、前記アクアポリン遺伝子の発現を促進する薬剤とは、ＤＮＡ上のアクアポリンに関する遺伝情報を、アクアポリンｍＲＮＡに転写する過程を促進する薬剤のことである。
【００３５】
ここで、アクアポリン遺伝子発現の促進の確認は、細胞からｍＲＮＡをＩｓｏｇｅｎなどの抽出用試薬を用いてＲＮＡの分解を抑制しながら抽出し、得られたＲＮＡをノーザンブロットやリアルタイムＰＣＲ等の生化学的な方法により評価することで行うことができる。即ち、例えばリアルタイムＰＣＲで評価したときハウスキーピング遺伝子に対して発現量が増大したときに、アクアポリン遺伝子発現の促進が達成できたことを確認できる。
【００３６】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤の使用対象となる細胞やその生体組織としては、例えば、皮膚や口腔、鼻粘膜、眼粘膜等の外皮、胃、食道、気管、肺、腸、腎臓などの消化器、血管や心臓などの循環器、気管や肺などの呼吸器あるいはそれら器官から得られた培養細胞が挙げられる。
【００３７】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤は、経口的もしくは非経口的に投与することができる。その剤形としては、例えば液剤、ドリンク剤、散剤、顆粒剤、注射剤、点滴剤、点眼剤、点鼻薬、吸入剤、座剤、イオン導入剤などのいずれであっても良いが、局所適用が可能であるとの理由から、注射剤、点眼剤、点鼻剤あるいはイオン導入剤が好ましい。
【００３８】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤の製剤化は、例えば有効成分である式（１）で表わされるホスファチジン酸と、公知の薬理的に許容される担体、賦形剤、崩壊剤、増量剤、希釈剤、可溶化剤等とを用いて公知の方法によって行なうことができる。この際、式（１）で表されるホスファチジン酸の製剤中の含有率は、通常０．０１〜３０質量％の範囲、好ましくは０．１〜１０質量％の範囲、より好ましくは１〜５質量％の範囲である。
【００３９】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤の投与量は、投与対象投与経路、症状等によっても著しく異なるが、経口的に投与する場合、式（１）で表されるホスファチジン酸として、通常１〜１０００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１〜３回程度である。また、非経口的に投与する場合は、例えば、皮内注では式（１）であらわされるホスファチジン酸として約０．０１〜１００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１回程度、１週間に１〜７回繰り返して投与することが好ましい。
【００４０】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤は、遺伝子発現促進の目的を達成するための医薬品として用いることができる他、その働きを利用した特殊な使用の方法として細胞試験のための試験試薬や皮膚疾患のための外用薬剤として用いることもできる。
【００４１】
本発明のアクアポリン産生促進剤とは、アクアポリン遺伝子産物を増強する薬剤である。
【００４２】
本発明のアクアポリン産生促進剤は、アクアポリン遺伝子発現により生成するｍＲＮＡが翻訳されて生じるアクアポリン遺伝子産物の量的な増強をする薬剤である。アクアポリン遺伝子産物の量的な増強をするということはアクアポリン遺伝子の発現により遺伝子産物であるアクアポリン遺伝子産物の量が増えるということであり、アクアポリン遺伝子産物産生促進についての評価は、細胞や組織からタンパク質の変性や分解を防ぎながらアクアポリン特異抗体によるＥＬＩＳＡ法や免疫組織法等の生化学的な方法により評価することで達成できる。具体的には、例えば免疫染色法により同一条件で顕微鏡観察した際に、染色強度が増大し、アクアポリン遺伝子産物の量的な増大が確認できたとき、アクアポリン遺伝子産物の産生促進がされたということができる。
【００４３】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤をアクアポリン遺伝子産物産生促進剤として使用するには、本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤をアクアポリン遺伝子産物産生促進剤として、そのまま用いることができる。その際、アクアポリン遺伝子発現促進剤は、製剤化されていても、されていなくても良いが、好ましくは製剤化したものを用いることができる。
【００４４】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤をアクアポリン遺伝子産物産生促進剤として使用する場合の投与量は、投与対象投与経路、症状等によっても著しく異なるが、経口的に投与する場合、式（１）で表されるホスファチジン酸として、通常１〜１０００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１〜３回程度である。また、非経口的に投与する場合は、例えば、皮内注では式（１）であらわされるホスファチジン酸として約０．０１〜１００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１回程度、１週間に１〜７回繰り返して投与することが好ましい。
【００４５】
本発明の外皮のアクアポリン遺伝子産物の機能不全治療剤とは、産生促進剤を有効成分とするアクアポリン遺伝子産物の機能不全の治療剤である。これは即ち、アクアポリン遺伝子産物の機能不全の治療あるいは予防のための薬剤をいう。アクアポリン遺伝子産物の機能不全とはアクアポリン遺伝子発現により生成するｍＲＮＡが翻訳されて生じるアクアポリン遺伝子産物の生体内での分解の促進、高次構造の変化や遺伝子発現量の低下によって生体組織のアクアポリン遺伝子産物の、水あるいはグリセロールのチャンネルとしての機能が低下している状態をいう。このような、アクアポリン遺伝子産物の機能不全が生じているかどうかは、生体組織の水分量を電気伝導度あるいは静電容量を機器測定することで確認できる。
【００４６】
外皮のアクアポリン遺伝子産物の機能不全の測定には、静電容量の測定機器に装備されたプローブにより組織表面に３．５ＭＨｚの高周波電流を流し、組織深度２０μｍ程度の電気伝導度を測定できる装置が用いられ、例えばＳＫＩＣＯＮ（ＩＢＳ社）が水分量を非侵襲的に計測できるため、好ましく用いられる。
【００４７】
そして、被験者の組織に対して測定を行い、恒温恒湿条件下に被験者を安静に保った後、ＳＫＩＣＯＮを用いて電気伝導度を測定したとき、電気伝導度の数値が健常者に比較し低下していれば、アクアポリン遺伝子産物に機能不全を生じていると想定され、このアクアポリン遺伝子産物の機能不全に陥った被験者は、アクアポリン遺伝子産物の機能不全治療剤の投与により改善する効果が期待できる。例えば、被験者の組織が皮膚である場合、皮膚の電気伝導度を測定したときその数値が５０μＳ以下であるとき乾燥肌、１００μＳ以上では健常肌といえることからその相対値が２倍近く上昇すれば、皮膚のアクアポリン機能不全が改善したとすることができる。
【００４８】
外皮のアクアポリン遺伝子産物の機能不全による疾病としては、皮膚、鼻粘膜、眼粘膜、口腔粘膜、食道、気管、肺、筋肉、腎臓など生体組織における水代謝の機能低下が挙げられる。即ち、生体組織の水分代謝異常を伴う疾患の治療剤として、乾燥肌，ドライアイ、鼻粘膜、気管粘膜や口腔粘膜の、過度の乾燥の治療ないし予防をするためにアクアポリン遺伝子産物の機能不全治療剤が用いられる。
【００４９】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤をアクアポリン遺伝子産物の機能不全治療剤として使用するには、本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤をアクアポリン遺伝子産物の機能不全治療剤として、そのまま用いることができる。その際、アクアポリン遺伝子発現促進剤は、製剤化されていても、されていなくても良いが、好ましくは製剤化したものを用いることができる。
【００５０】
本発明のアクアポリン遺伝子産物の機能不全治療剤の投与量は、投与対象投与経路、症状等によっても著しく異なるが、経口的に投与する場合、式（１）で表されるホスファチジン酸として、通常１〜１０００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１〜３回程度である。また、非経口的に投与する場合は、例えば、皮内注では式（１）であらわされるホスファチジン酸として約０．０１〜１００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１回程度、１週間に１〜７回繰り返して投与することが好ましい。
【００５１】
本発明の外皮水分代謝異常治療剤とは、アクアポリン遺伝子産物の機能不全に起因する疾患が外皮の水分代謝異常を伴う疾患である治療剤のことである。即ち、外皮の水分代謝異常を治療あるいは予防する薬剤をいう。
【００５２】
ここで、外皮である皮膚の水分代謝の異常とは、生体組織の水分量が減少し生理機能が低下した状態のことをいう。即ち、生体組織の水分量が減少し生理機能が低下した生体組織の水分量を回復できる薬剤は、外皮の水分代謝異常を治療あるいは予防する薬剤であるといえ、外皮水分代謝異常治療剤であるとすることができる。
【００５３】
本発明における、外皮水分代謝異常とは、特に皮膚に生じるアクアポリン遺伝子産物の機能不全のことである。このアクアポリン遺伝子産物の機能不全は、前記したＳＫＩＣＯＮを用いて、アクアポリン遺伝子産物の機能不全と同様に診断することができる。
【００５４】
本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤を外皮水分代謝異常治療剤として使用するには、本発明のアクアポリン遺伝子発現促進剤を外皮水分代謝異常治療剤として、そのまま用いることができる。その際、アクアポリン遺伝子発現促進剤は、製剤化されていても、されていなくても良いが、好ましくは製剤化したものを用いることができる。
【００５５】
本発明の外皮水分代謝異常治療剤の投与量は、投与対象投与経路、症状等によっても著しく異なるが、経口的に投与する場合、式（１）で表されるホスファチジン酸として、通常１〜１０００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１〜３回程度である。また、非経口的に投与する場合は、例えば、皮内注では式（１）であらわされるホスファチジン酸として約０．０１〜１００ｍｇ／Ｋｇ体重を１日１回程度、１週間に１〜７回繰り返して投与することが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する。
尚、例中の３１Ｐ-ＮＭＲの測定は、日本電子社製ＪＮＭ  ＡＬ-４００、溶媒：重クロロホルム−重メタノール−重水（２：５：２  Ｖ／Ｖ／Ｖ）を用い、温度２５℃の条件でおこなった。
【００５７】
合成例１；Ｃ１８：１−ｃＰＡの合成
Ｃ１８：１−リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ、アバンチポーラーリピッド社製）１０ｇに水２５０ｇを加え十分に溶解させた。ｐＨ５．５の酢酸ナトリウム緩衝液１Ｍを１００ｇ、２Ｍ塩化ナトリウム１０ｍｌ、ホスホリパーゼＤ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ．ｓｐ．）１００ｍｇ添加し、５５℃で加温した。１８時間後にクロロホルム６５０ｇとメタノール７００ｇを添加し、激しく混合した。クロロホルム６５０ｇを加えて混合後、静置して下層を回収し溶媒を５５℃で留去し、１−オレオイル−ホスファチジン酸（Ｃ１８：１−ｃＰＡ）を得た。
【００５８】
合成例２；Ｃ１０：０−ｃＰＡの合成
Ｃ１０：０−リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ、アバンチポーラーリピッド社製）を用いた以外合成例１と同様にしてＣ１０：０−ｃＰＡを得た。得られた化合物は、３１Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣを含有しないことを確認した。
【００５９】
合成例３；Ｃ１６：０−ｃＰＡの合成
Ｃ１６：０−リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ、アバンチポーラーリピッド社製）を用いた以外合成例１と同様にしてＣ１６：０−ｃＰＡを得た。得られた化合物は、３１Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣを含有しないことを確認した。
【００６０】
合成例４；Ｃ１６：０−Ｏ−ｃＰＡの合成
市販のリゾ血小板活性化因子（リゾＰＡＦ、アバンチポーラーリピッド社製）を用いた以外合成例１と同様にしてＣ１６：０−Ｏ−ｃＰＡを得た。得られた化合物は、３１Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣをほとんど含有しないことを確認した。
【００６１】
合成例５；Ｃ１６：０−ＬＰＡの合成
市販のリゾ血小板活性化因子（リゾＰＡＦ、アバンチポーラーリピッド社製）とキャベツ由来のホスホリパーゼＤを用いた以外合成例１と同様にしてＣ１６：０−ＬＰＡを得た。
【００６２】
合成例６；Ｃ６：０−ｃＰＡの合成
Ｃ６：０−リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ、アバンチポーラーリピッド社製）を用いた以外合成例１と同様にしてＣ６：０−ｃＰＡを得た。得られた化合物は、３１Ｐ−ＮＭＲによりリン酸環状構造を有し、開環したＬＰＡや原料のＬＰＣをほとんど含有しないことを確認した。
【００６３】
Ｉ）ＡＱＰ遺伝子発現促進試験
実施例１−１；合成例１のＣ１８：１−ｃＰＡ［（Ｒ＝１８、アシル）ｃＰＡ］の試験
１．細胞培養
正常ヒト表皮角化細胞として新生児包皮角化細胞ＮＨＥＫ（凍結Ｆ）をクラボウ（株）より入手した。ＮＨＥＫ細胞をウシ脳下垂体抽出液０．４％、インスリン１０μｇ／ｍｌ、ヒト組換え型上皮成長因子０．１ｎｇ／ｍｌ、ハイドロコーチゾン０．５μｇ／ｍｌを含有するＨｕＭｅｄｉａ―ＫＧ２培地（クラボウ）を用いて継代培養した。継代は、基本的にメーカーの手順書に順じて行なった。
【００６４】
２．遺伝子発現促進評価
培養用ディシュ６ｃｍ（ファルコン社製）に細胞を懸濁したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２に４ｍｌを加え、３７℃で３日間培養を行った。その後培地を無血清のＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）４ｍｌで置換し、更に２日間培養を継続した。ホスファチジン酸として合成例１で得たＣ１８：１−ｃＰＡ（式（１）中のＲがＣ１８Ｈ３３Ｏ−であり、Ｘが式（２）で示される基である化合物）２０μＭ（９μｇ/ｍＬ）を添加し、３７℃で培養を行い０，４，１０時間目に培地を吸引除去し、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いて細胞を溶解し全ＲＮＡを回収した。得られたＲＮＡを１×ＴＡＥ緩衝液で０．２〜２０μｇ／μｌとなるように希釈後、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００６５】
β−アクチンのプライマー配列として、５’’-ＧＧＣＣＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＣ-３’および５’-ＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ-３’を用い、ＡＱＰのプライマーとして、５’-ＣＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＣＣＡＣＴＣおよび５’-ＧＣＣＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ-３’を用いた。ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応条件は、逆転写：４２℃、１５分、変性：９５℃、５秒、アニーリング：６０℃、２０秒、鎖長延長：７２℃、１５秒とし、これを４５回反復した。ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンの発現強度に対するＡＱＰの相対発現強度を求めた。被験物質添加からＲＮＡ回収までの培養時間が１０時間である場合のＡＱＰ遺伝子発現増強効果の評価結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】
2011063515.tif 000005
【００６７】
実施例１−２；合成例２のＣ１０：０−ｃＰＡ［（Ｒ＝１０、アシル）ｃＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、合成例２で合成したＣ１０：０−ｃＰＡ（式（１）中のＲがＣ１０Ｈ１９Ｏ−であり、Ｘが式（２）で示される基である化合物）を用いた以外実施例１−１と同様に、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間が１０時間の場合のＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００６８】
実施例１−３；合成例３のＣ１６：０−ｃＰＡ［（Ｒ＝１６、アシル）ｃＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、合成例３で合成したＣ１６：０−ｃＰＡ（式（１）中のＲがＣ１６Ｈ３１Ｏ−であり、Ｘが式（２）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００６９】
実施例１−４；市販の大豆ｃＰＡ［（Ｒ＝１４〜１８、アシル）大豆ｃＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販の大豆ｃＰＡ（商品名ＣｙＰＡＴＭ溶液の減圧乾燥物、日油株式会社社製、式（１）中のＲが主にＣ１４Ｈ２１Ｏ〜Ｃ１８Ｈ３５Ｏであり、Ｘが式（２）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７０】
実施例１−５；合成例４のＣ１６：０−Ｏ−ｃＰＡ［（Ｒ＝１６、Ｏ−アルキル）ｃＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、合成例４で合成したＣ１６：０−Ｏ−ｃＰＡ（式（１）中のＲがＣ１６Ｈ３３Ｏ−であり、Ｘが式（２）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７１】
実施例１−６；市販のＣ１８：１のリゾホスファチジン酸［（Ｒ＝１８、アシル）ＬＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販のＣ１８：１のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ：Ｓｉｇｍａ社製）（式（１）中のＲがＣ１８Ｈ３３Ｏ−であり、Ｘが式（３）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７２】
実施例１−７；市販のＣ１０：０のリゾホスファチジン酸［（Ｒ＝１０、アシル）ＬＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販のＣ１０：０のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ：Ｓｉｇｍａ社製）（式（１）中のＲがＣ１０Ｈ１９Ｏ−であり、Ｘが式（３）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７３】
実施例１−８；市販のＣ１６：０のリゾホスファチジン酸［（Ｒ＝１６、アシル）ＬＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販のＣ１６：０のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ：Ｓｉｇｍａ社製）（式（１）中のＲがＣ１６Ｈ３１Ｏ−であり、Ｘが式（３）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７４】
実施例１−９；市販の大豆リン脂質由来リゾホスファチジン酸［（Ｒ＝１４〜１８、アシル）大豆ＬＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販の大豆リン脂質由来リゾホスファチジン酸（大豆ＬＰＡ、Ｓｉｇｍａ社製）（式（１）中のＲが主にＣ１４Ｈ２１Ｏ〜Ｃ１８Ｈ３５Ｏであり、Ｘが式（３）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７５】
実施例１−１０；合成例５のＣ１６：０−ＬＰＡ［（Ｒ＝１６、Ｏ−アルキル）ＬＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、合成例５で合成したＣ１６：０−ＬＰＡ（式（１）中のＲがＣ１６Ｈ３３Ｏ−であり、Ｘが式（３）で示される基である化合物）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７６】
比較例１−１；市販の大豆ジアシルホスファチジルコリン［（Ｒ＝１４〜１８、ジアシル）大豆リン脂質］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販の大豆ジアシルホスファチジルコリン（大豆ＰＣ−７０、辻製油社製）を用い被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７７】
比較例１−２；市販の大豆ホスファチジン酸［（Ｒ＝１４〜１８、ジアシル）大豆ＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販の大豆ホスファチジン酸（大豆ＰＡ、Ｓｉｇｍａ社製）を用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７８】
比較例１−３；合成例６のＣ６：０−ｃＰＡ［（Ｃ＝６、アシル）ｃＰＡ］の試験
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、合成例６で合成したＣ６：０−ｃＰＡを用い、被験物質添加から全ＲＮＡ回収までの培養時間を１０時間とした以外、実施例１−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子発現促進効果について評価を行った。結果を表１に示す。
【００７９】
ＩＩ）ＡＱＰ遺伝子産物産生促進試験
実施例２−１
（１）３次元表皮モデル
ヒトの表皮の代替として市販の表皮モデル（ＬａｂＣｙｔｅ、ジャパン・ティシュ・エンジニアリング社）ＥＰＩ−ＭＯＤＥＬ１２を用いた。添付のアッセイ培地を用いメーカーの手順書に従って培養を行った。培養開始直後に合成例１で得たＣ１８：１−ｃＰＡの２ｍＭ（９００μｇ／ｍＬ）水溶液を表皮表面に１００μｌ滴下し、３７℃で２日間培養を行った。培養した表皮モデルを取り出し、ＯＴＣコンパウンドに埋入してから液体窒素を用いて急速凍結し、ＡＱＰ３タンパク質の検出に用いる試料とした。
【００８０】
（２）ＡＱＰ３遺伝子産物の検出  
（１）で得た試料から、８μｍ厚の凍結切片を作成した後に風乾固定し、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）でブロッキングした。ブロッキングした試料に、１次抗体として抗ヒトＡＱＰ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｕｒｚ社）を室温で１時間試料と反応させた。反応させた試料を、ＴＢＳで十分洗浄し余分な１次抗体を除去後、ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇＧ（カッペル社）を２次抗体として用いて室温で１時間反応させた。このように試料を処理して得られた、染色切片の基底膜近傍を蛍光顕微鏡を用いて無作為に１０回観察し、露出条件を一定に撮影した。撮影画像を目視により評価した。即ち、比較例１のＰＢＳと不処理切片に比較して基底膜周辺が著しく濃染された場合は３、同等の場合は１、それらの中間の場合は２と評価し、その平均値を表２に示した。
【００８１】
【表２】
2011063515.tif 000006
【００８２】
実施例２−２
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、合成例４で合成したＣ１６：０のＯ−アルキルｃＰＡ（式（１）中のＲがＣ１６Ｈ３３Ｏ−であり、Ｘが式（２）で示される基である化合物）を用いた以外、実施例２−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子産物の産生増強効果について評価を行った。結果を表２に合わせて示す。
【００８３】
実施例２−３
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販の大豆リン脂質由来のリゾホスファチジン酸（大豆ＬＰＡ、Ｓｉｇｍａ社製）（式（１）中のＲが主にＣ１４Ｈ２１Ｏ〜Ｃ１８Ｈ３５Ｏであり、Ｘが式（３）で示される基である化合物）を用いた以外、実施例２−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子産物の産生増強効果について評価を行った。結果を表２に合わせて示す。
【００８４】
実施例２−４
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、Ｃ１６：０のＯ−アルキルＬＰＡ（式（１）中のＲがＣ１６Ｈ３３Ｏ−であり、Ｘが式（３）で示される基である化合物）を用いた以外、実施例２−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子産物の産生増強効果について評価を行った。結果を表２に合わせて示す。
【００８５】
参考例１
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、生理食塩水を用いた以外，実施例２−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子産物の産生増強効果について評価を行った。結果を表２に合わせて示す。
【００８６】
比較例２−１
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販の大豆ジアシルホスファチジルコリン（大豆ＰＣ−７０、辻製油社製）を用いた以外、実施例２−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子産物の産生増強効果について評価を行った。結果を表２に合わせて示す。
【００８７】
比較例２−２
Ｃ１８：１−ｃＰＡの換わりに、市販の大豆ホスファチジン酸（大豆ＰＡ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた以外，実施例２−１と同様にしてＡＱＰ遺伝子産物の産生増強効果について評価を行った。結果を表２に合わせて示した。
【００８８】
ＩＩＩ）水分代謝機能改善試験
実施例３−１
ａ．皮膚連用試験
外皮組織の水分代謝機能への効果を検討するため市販の大豆ｃＰＡ（商品名ＣｙＰＡＴＭ溶液の減圧乾燥物、日油株式会社社製、式（１）中のＲが主にＣ１４Ｈ２１Ｏ〜Ｃ１８Ｈ３５Ｏであり、Ｘが式（２）で示される基である化合物）を３％配合するローションを作成し、皮膚に連用して皮内水分量への影響を検討した。用いたローション組成は大豆ｃＰＡ（ＣｙＰＡ溶液、日油社製）３%、フェノキシトール０．２％、メチルパラベン０．１％、エタノール４％とした。これを乾燥肌の被験者１名の上腕内側約２ｃｍ×２ｃｍに２滴滴下し、被１日２回３０日間連用した。尚、ローション滴下面は保護せずそのままとし、被験者は実験中、日常生活を継続する条件で連用試験を行った。
【００８９】
ｂ．表皮水分量の測定
連用開始前と連用終了日にＳＫＩＣＯＮ−２００（ＩＢＳ社）を用いて、湿度％、室温２５℃に被験者を３０分以上安静に保った後に上腕内側皮膚の電気伝導度を測定した。１０回繰り返して測定しその平均値を求め表３に示した。連用後の表皮の電気伝導度は３倍近く上昇し明らかに表皮の水分含量が増加したことから皮膚や口腔鼻粘膜、眼粘膜などの外皮に対して水分代謝能を改善する効果があることも期待できる。
【００９０】
【表３】
2011063515.tif 000007
【００９１】
実施例３−２
市販の大豆ｃＰＡの換わりに、合成例１のＣ１８：１−ｃＰＡを用いた以外は実施例３−１と同様にしてローションを作成して、連用試験を行い表皮水分量を測定した。その結果を表３に示した。連用後の表皮の電気伝導度は２倍近く上昇し表皮の水分含量が増加していることが分かる。
【００９２】
参考例２
市販の大豆ｃＰＡを添加しない以外は、実施例３−１と同様にしてローションを作成して、連用試験を行い表皮水分量を測定した。その結果を表３に示した。
【００９３】
以上の結果から、本発明に用いるホスファチジン酸は、細胞によるＡＱＰの遺伝子発現を著しく亢進し、その遺伝子産物であり特異抗体によって認識されるタンパク質の相対量が増加することで、外皮である表皮や口腔粘膜、鼻粘膜などの水分代謝異常を伴う疾患を軽減することも期待できる。