(57)【要約】【課題】一本鎖抗体部を含む化合物を用いて、病変部位に存在する抗原（病変マーカー）を検出等する際、病変部位以外に存在する抗原と一本鎖抗体部との結合により、病変部位へ到達する化合物の量が低下し、また、病変部位以外で抗原に結合した化合物からの信号（バックグラウンド）が発生する。その結果、高感度、高コントラストな病変部位の検出が困難であり、これを解消する化合物が求められている。【解決手段】一般式（１）で表されるポリマーからなる化合物。Ｌ−Ｙ−Ａ    （１）（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している）【選択図】図１
2011026294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表されるポリマーからなる化合物。
Ｌ−Ｙ−Ａ    （１）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している）
【請求項２】
一般式（２）で表されるポリマーからなる化合物。
Ｘ−Ｌ−Ｙ−Ａ    （２）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している。Ｘはポリエチレングリコール、有機色素、有機ポリマー、粒子のいずれかである）
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールの分子量が２０ｋＤａ以上であることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールの分子量が４０ｋＤａ以下であることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
前記リンカー部が、配列番号２または配列番号３のいずれか一方のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記一本鎖抗体部が、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記一本鎖抗体部に信号発信分子が結合していることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記信号発信分子が酸化鉄微粒子であることを特徴とする請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
病変マーカーの検出方法において、請求項７又は８に記載の化合物を個体に投与、又は個体より得られた試料に添加し、信号を検出することにより、該個体中もしくは個体より得られた試料中の病変マーカーの存否、又は病変マーカーを産生する病変部位の存否を検出する方法。
【請求項１０】
一般式（１）で表されるポリマーからなる化合物の製造方法であって、
一本鎖抗体部Ａをコードする塩基配列と、リンカー部Ｌをコードする塩基配列と、ペプチド部Ｙをコードする塩基配列と、を有する核酸をプラスミドに挿入する工程と、
前記核酸が挿入されたプラスミドを菌に導入する工程と、
前記プラスミドを導入した菌が発現した化合物を回収する工程と、
を有することを特徴とする製造方法。
Ｌ−Ｙ−Ａ    （１）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物および前記化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病変部位に存在する抗原（病変マーカー）を検出するために、病変マーカーに結合する抗体などの病変マーカー結合分子に、放射性核種、ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）信号を発信する分子、超音波信号を発信する分子、蛍光信号を発信する分子などの物理的な信号を発生する分子（以下、信号発信分子と略すことがある）を標識した体内診断用造影剤の開発がなされている。このような化合物を体内へ投与し、その化合物の信号発信分子からの信号を体外から検出することにより、病変部位、及び病変マーカーを検出することが可能である。
【０００３】
上記のような化合物を血中へ投与した場合、病変部位から漏れ出て血中に存在する病変マーカーや正常部位に存在する病変マーカーなど、病変部位以外に存在する病変マーカーとの結合により、病変部位へ到達する化合物の量が低下する場合がある。また、そのような場合は、病変部位以外に結合した化合物からの信号（バックグラウンド）の発生により、病変部位の高コントラストな検出が困難になると考えられる。
【０００４】
上記問題を解決する化合物として、ローファーらは、特定の生物活性の存在下にて、インビボで生物活性化されるプロドラッグ造影剤を報告している（特許文献１）。この文献のプロドラッグ造影は信号発信分子を有する標的化分子に、酵素で開裂可能なリンカーを介して、標的化分子の結合能力を低下させる分子を結合したものである。この造影剤は、アルカリフォスファターゼによる反応を受けてリンカーが開裂し、その結果標的化分子として用いた低分子化合物のヒト血清アルブミンへの結合能力が開裂前と比較して向上する。また、リンカーの開裂により、信号発信分子として用いたＭＲＩ信号を発生する分子の信号が変化し、病変部位のより高コントラストな検出が可能になることもローファーらは報告している。
【０００５】
抗体は抗原を特異的に認識する分子であり、病変部位の検出、あるいは治療に好適に用いられる。しかし、特許文献１は、低分子化合物を用いた造影剤の利用可能性を記載しているのみで、抗体を用いた造影剤の分子設計ならびに調製方法は開示されておらず、抗体を用いたインビボで生物活性化される造影剤の実用性については不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０００‐５０７５７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗体を含む化合物を用いて、病変部位に存在する抗原（病変マーカー）抗体を検出等する際、病変部位以外に存在する抗原と抗体との結合により、病変部位へ到達する抗体化合物の量が低下し、また、病変部位以外で抗原に結合した抗体化合物からの信号（バックグラウンド）が発生する。その結果、高感度、高コントラストな病変部位の検出が困難であり、これを解消する化合物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第一の本発明に係る化合物は、一般式（１）で表されるポリマーからなる。
Ｌ−Ｙ−Ａ    （１）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している）
【０００９】
第二の本発明に係る化合物は、一般式（２）で表されるポリマーからなる化合物。
Ｘ−Ｌ−Ｙ−Ａ    （２）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している。Ｘはポリエチレングリコール、有機色素、有機ポリマー、粒子のいずれかである。）
【００１０】
第三の本発明に係る化合物の製造方法は、一般式（１）で表されるポリマーからなる化合物の製造方法であって、一本鎖抗体部Ａをコードする塩基配列と、リンカー部Ｌをコードする塩基配列と、ペプチド部Ｙをコードする塩基配列と、を有する核酸をプラスミドに挿入する工程と、前記核酸が挿入されたプラスミドを菌に導入する工程と、前記プラスミドを導入した菌が発現した化合物を回収する工程と、を有することを特徴とする。
Ｌ−Ｙ−Ａ    （１）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している。）
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物は、病変部位以外では、一本鎖抗体部の抗原との結合能力を低下させた状態であり、病変部位においては、抗原との結合能力を向上させた状態となることにより、病変部位以外に存在する抗原との結合による病変部位へ到達する一本鎖抗体部の量の低下と、病変部位以外で抗原に結合した一本鎖抗体部からの信号（バックグラウンド）を抑えることが可能である。これにより、高コントラストな病変部位の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明で提供される化合物の模式図を示す。
【図２】一本鎖抗体部のＮ末端にリンカー部を介してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させた化合物の模式図を示す。
【図３】作製したｓｃＦｖ−ＮＭとｓｃＦｖ−ＷＴについて、ＭＭＰ−２添加、非添加での還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図４】作製したｓｃＦｖ−ＮＭのＭＭＰ−２添加前後における、ＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステムを用いて測定した結果を示す。
【図５】作製したＮ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＮＭのＭＭＰ−２添加前後での分子状態をゲルろ過クロマトグラフィーで検出した結果を示す。
【図６】２  ｋＤａ、５  ｋＤａ、１２  ｋＤａ、２０  ｋＤａ、４０  ｋＤａの  ＰＥＧ−マレイミドを反応させたｓｃＦｖ−ＣＭの還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図７】作製したＣ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭにＭＭＰ−２を添加、非添加、及びＭＭＰ−２活性阻害剤存在下での還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図８】作製したｓｃＦｖ−ＷＴ、ｓｃＦｖ−ＮＭ、ｓｃＦｖ−ＮＰＭについて、ＭＭＰ−２添加、非添加での還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図９】作製したＮ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＮＭ、Ｃ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭのＭＭＰ−２添加、非添加での、ＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステムを用いて測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施形態について説明する。
【００１４】
（第一の実施形態）
本発明の第一の実施形態に係る化合物は、一般式（１）で表されるポリマーからなる。
Ｌ−Ｙ−Ａ    （１）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している）
【００１５】
本実施形態に係る化合物は一本鎖抗体部とリンカー部とペプチド部とを有する。リンカー部はペプチド部のＮ末端に結合し、ペプチド部は一本鎖抗体部のＮ末端に結合している。または、リンカー部は一本鎖抗体部のＮ末端に直接結合している（ペプチド部が０個のアミノ酸からなる場合）。このような構成となっているため、一本鎖抗体部の抗原結合能力が阻害あるいは低減されている。そして、リンカー部がプロテアーゼによって切断されることにより、一本鎖抗体部の抗原結合能力が回復する。
本実施形態において、抗原結合能力が阻害あるいは低減される、とは、一本鎖抗体部が修飾等をされていない状態で抗原と結合する能力が、なんらかの要因により、失われ、あるいは、弱められることを指す。また、抗原結合能力が回復するとは、失われ、あるいは弱められた抗原結合能力が、向上し、修飾等をされていない状態の一本鎖抗体部と、同じ、または近い状態になることをいう。
【００１６】
（一本鎖抗体部）
本発明において、一本鎖抗体部とは、抗体の重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域とをペプチドからなるリンカーで連結した部位（抗原結合部位）からなるポリペプチドである。
ここで、抗体とは、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、鳥、等、由来は問わず、さらにはキメラ体であってもよく、また、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００１７】
また上記抗体は限定なく用いられるが、本発明の目的に照らし合わせれば、例えば、ＥＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＰＳＡ、ＣＥＡ、マトリックスメタロプロテアーゼファミリー、ＥＧＦファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、エンドグリン、又はＭＵＣファミリーからなる群より選ばれた病変マーカーに結合する抗体、さらにはＨＥＲ２に結合する抗体を例としてあげることができる。
【００１８】
一本鎖抗体部は、各種抗原に対応して安価に簡便に作製することができ、なおかつ、通常の抗体（全抗体など）と比べて分子量が小さいため、体外へ速やかに排泄されやすく、又病変部位に到達しやすい。そのため、一本鎖抗体部は病変部位の検出、又は治療に好適に用いられる。
【００１９】
一本鎖抗体部としては、例えば以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号１）
なお、一本鎖抗体部のＣ末端には、任意のアミノ酸が結合していてもよい。
【００２０】
（リンカー部）
本発明において、リンカー部とは、プロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。ここで、プロテアーゼ切断部位とは、プロテアーゼに特異的に認識されるアミノ酸配列を有しており、そのアミノ酸配列が活性状態のプロテアーゼに認識され、特異的に加水分解されて切断される部位を意味する。
プロテアーゼとしては、特に限定はなく用いられるが、マトリックスメタロプロテアーゼファミリーまたはセリンプロテアーゼファミリーが好ましく、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼー２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテアーゼー９（ＭＭＰ−９）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、プラスミン、カテプシン、カスパーゼなどが標的プロテアーゼとして挙げられる。
プロテアーゼ切断部位については、それぞれのプロテアーゼが特異的に認識するアミノ酸配列であり、たとえば、ＭＭＰ−２の切断部位としてアミノ酸配列ＰＬＧＶＲ（配列番号２）を含むポリペプチドなどを利用できる。また、ＰＳＡの切断部位としてアミノ酸配列ＳＳＩＹＳＱＴＥＥＱ（配列番号３）を含むポリペプチドなどを利用することができる。
リンカー部のＮ末端には任意のアミノ酸が結合していてもよい。
【００２１】
（ペプチド部）
本発明において、ペプチド部とは、一本鎖抗体部とリンカー部とを連結する０個以上のアミノ酸からなる。そのアミノ酸の数は２０個以下であることが好ましく、１０個以下であることがさらに好ましい。アミノ酸の数が２０個以上であると、そのアミノ酸配列が立体構造をとる可能性がある。その結果、プロテアーゼ切断部位がプロテアーゼによって切断された場合でも、一本鎖抗体部の抗原結合能力が阻害あるいは低減されたままとなってしまうおそれがあるためである。
【００２２】
図１を用いて本実施形態をより詳細に説明する。図１は、本実施形態に係る化合物の模式図である。ただし、図１ではペプチド部は図示していない。
抗原結合能力を阻害あるいは低減する機構については、種々の機構が考えられる。第一に、ペプチド部または一本鎖抗体部のＮ末端に結合したリンカー部が一本鎖抗体部の抗原結合部位と抗原の間に存在することにより立体的障害を生じさせることが考えられる。この場合、リンカー部が一本鎖抗体部の抗原結合部位を覆うため、他の抗体が抗原に結合できなくなることなどが考えられる。
【００２３】
リンカー部を一本鎖抗体部のＮ末端に結合させている理由は以下のとおりである。まず第一に、一本鎖抗体部における重鎖可変（ＶＨ）領域と軽鎖可変（ＶＬ）領域とを連結するリンカーにリンカー部を結合させると、一本鎖抗体部の構造自体が変わり、リンカー部切断後にも構造が戻らず、結果として、リンカー部切断後も抗原結合能力が回復しないおそれがある。一方、一本鎖抗体部のいずれかの末端にリンカー部を結合させた場合、構造自体には影響が少なく、リンカー部が切断された後に一本鎖抗体部がリンカー部を導入する前の構造に戻りやすく、リンカー部を切断後に抗原結合能力が回復しやすいと考えられる。そのため、まず、一本鎖抗体部のいずれかの末端にリンカー部を導入すれば、リンカー部が切断された後の抗原結合能力がリンカー部の導入前と同等までに回復することが可能であるという点で有効であると考えられる。次に、一本鎖抗体部のＮ末端はＣ末端よりも、抗原結合部位に近い。そのため、一本鎖抗体部のＮ末端にリンカー部を結合する場合は、Ｃ末端に結合するよりも、結合するリンカー部の長さが短くても、一本鎖抗体部の抗原結合部位への立体的障害作用などの効果をより効率よく生じさせられると考えられ、すなわち、より、強く抗原結合能力を低下させることが可能である。これにより、化合物の分子量を過剰に増大させることなく、抗原結合能力を阻害あるいは低減することが可能になると考えられる。化合物の分子量を過剰に増大させることを抑えることは、体外へ速やかに排泄されやすく、又病変部位に到達しやすいという一本鎖抗体部のみの性質に近い性質を化合物が維持できるため、有効である。さらに、一本鎖抗体部のＮ末端は抗原結合部位と近接しているため、一本鎖抗体部のＮ末端にリンカー部を導入すれば、Ｃ末端に導入するのに比べ抗原結合能力をより強く低下させることが可能であるという点で有効である。また、一本鎖抗体部のＮ末端にリンカー部を結合させることで、抗原結合部位から離れたＣ末端には他の分子を結合することができ、例えば、信号発信分子や治療用薬剤などを、抗原結合能力を低下させることなく結合させることが可能である。以上より、一本鎖抗体部のＮ末端にリンカー部を結合させることが最も有効であると考えられる。
以上のことは、リンカー部がペプチド部のＮ末端に結合し、ペプチド部が一本鎖抗体部のＮ末端に結合している場合についても同様のことが言える。
【００２４】
（信号発信分子）
本実施形態に係る化合物には、一本鎖抗体部に信号発信分子を結合させることが可能である。
信号発信分子として、放射性核種、ＭＲＩ信号を発信する分子、超音波信号を発信する分子、蛍光信号を発信する分子などの種々の分子を用いることができる。例えば、光を吸収し超音波信号や発光信号を発する信号発信分子としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌａｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０（以上商標、インビトロジェン株式会社）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上商標、ＧＥヘルスケア）、ＨｉＬｙｔｅ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  ６８０、ＨｉＬｙｔｅ  ７５０（以上商標、ＡｎａＳｐｅｃ，  Ｉｎｃ）、ＤＹ−６８０、ＤＹ−７００、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７８２  （以上商標、Ｄｙｏｍｉｃｓ，  Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）などを利用することが可能である。また、光を吸収し超音波信号や発光信号を発する分子としては、生体透過性の優れた約６００  ｎｍ以上約１０００  ｎｍ以下の近赤外波長領域の光を吸収する近赤外光吸収色素を選択することが有効である。その他、微粒子としては、酸化鉄微粒子、金微粒子、金ナノロッド、白金、銀などの金属や金属酸化物の微粒子など種々の微粒子を利用することが可能であろう。また、本実施形態の一本鎖抗体部に抗癌剤などの治療用薬剤を結合し、病変部位へ治療用薬剤を送達することも可能であり、病変部位以外への治療用薬剤の送達を低減することによる副作用の低減が期待できる。
【００２５】
また、本発明の化合物のうち、信号発信分子が結合したものは、病変マーカーの検出に用いることが可能である。すなわち、本発明は病変マーカーの検出方法において、信号発信分子が結合した本発明の化合物を個体に投与、又は個体より得られた試料に添加し、信号を検出することにより、該個体中もしくは個体より得られた試料中の病変マーカーの存否、又は病変マーカーを産生する病変部位の存否を検出する方法を提供する。病変マーカーの検出方法は以下の通りである。すなわち、信号発信分子が結合した本発明の化合物を個体に投与し、あるいは個体より得られた臓器等の試料に添加する。なお、個体とは、ヒト、実験動物やペット等の哺乳類、その他、特に限定されることなく、あらゆる生物を指し、個体中もしくは個体より得られた試料としては、臓器、組織、組織切片などを挙げることができる。投与あるいは添加後、信号発信分子を検出できる測定機器等を用いて、個体あるいは試料に含まれる信号発信分子の信号を検出する。その結果、信号が基準とする閾値以上で検出されれば、その個体に病変マーカー、あるいは、病変マーカーを産生する病変部位が存在すると推定され、または、試料に病変マーカーが存在する、あるいは、試料の由来となる個体に病変マーカーを産生する病変部位が存在すると推定することができる。
【００２６】
（イメージング）
また、同様に、本発明の化合物のうち、信号発信分子が結合したものは、病変マーカーのイメージングに用いることが可能である。病変マーカーのイメージング方法は、以下の通りである。すなわち、本発明の化合物を個体に投与し、又は個体より得られた試料に添加し、信号を検出することにより、該個体中もしくは個体より得られた試料中の病変マーカーの存否、又は病変マーカーを産生する病変部位の存否をイメージングすることができる。
【００２７】
（第二の実施形態）
以下、本発明の第二の実施形態に係る化合物の説明をするが、第一の実施形態と共通のことに関しては説明を省略する。
本発明の第二の実施形態に係る化合物は、一般式（２）で表されるポリマーからなる化合物。
Ｘ−Ｌ−Ｙ−Ａ    （２）
（式中、Ａは一本鎖抗体部であって、抗原結合部位からなるポリペプチドである。Ｌはリンカー部であってプロテアーゼ切断部位からなるポリペプチドである。Ｙはペプチド部であって、一本鎖抗体部Ａとリンカー部Ｌとを連結する０個以上のアミノ酸からなる。リンカー部Ｌはペプチド部ＹのＮ末端または一本鎖抗体部ＡのＮ末端に結合している。Ｘはポリエチレングリコール、有機色素、有機ポリマー、粒子のいずれかである）
【００２８】
本実施形態に係る化合物は、一本鎖抗体部と、リンカー部と、ペプチド部と、一本鎖抗体部の抗原結合部位を覆うことができる部位（一般式（２）のＸに相当する）とを有する。リンカー部はペプチド部のＮ末端に結合し、ペプチド部は、一本鎖抗体部のＮ末端に結合している。または、リンカー部は一本鎖抗体部のＮ末端に直接結合している（ペプチド部が０個のアミノ酸からなる場合）。このような構成となっているため、一本鎖抗体部の抗原結合能力が阻害あるいは低減されている。そして、リンカ部が切断されることにより、前記一本鎖抗体部の抗原結合能力が回復する。
【００２９】
抗原結合部位を覆うことができる部位としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略すことがある）、有機色素、有機ポリマー、粒子のいずれかである。有機色素としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌａｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０（以上商標、インビトロジェン株式会社）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上商標、ＧＥヘルスケア）、ＨｉＬｙｔｅ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  ６８０、ＨｉＬｙｔｅ  ７５０（以上商標、ＡｎａＳｐｅｃ，  Ｉｎｃ）、ＤＹ−６８０、ＤＹ−７００、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７５０、ＤＹ−７８２  （以上商標、Ｄｙｏｍｉｃｓ，  Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）などを利用することが可能である。有機ポリマーとしては、ポリ乳酸（Ｐｏｌｙ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（Ｐｏｌｙ  （ＤＬ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＧＡ）などを利用することが可能である。
【００３０】
図２にＰＥＧを導入した場合の模式図を示す。ただし、図２ではペプチド部は図示していない。これらの分子を用いる場合であっても、リンカー部及び連結された抗原結合部位を覆うことができる部位は一本鎖抗体部のＮ末端に結合されていることが効果的と考えられる。例えば、ＰＥＧは抗原結合部位を覆うことができる部位として特に好ましく用いられるが、ＰＥＧは水溶液中で、立体的に広がりを持った状態で存在すると考えられる。そのため、一本鎖抗体部のＮ末端にリンカー部及び連結されたＰＥＧを導入した場合、一本鎖抗体部の抗原結合部位と抗原の間にＰＥＧが存在するため、例えば、Ｃ末端などのＮ末端部位以外に導入した場合と比較して、より大きな立体障害となり、抗原結合能力を阻害あるいは低減する作用が大きくなると考えられ、一本鎖抗体部の抗原結合能力をより強く低下させることが可能である。
【００３１】
ＰＥＧの導入は、抗原結合能力を阻害等することに加えて、種々の効果が期待できる。例えば、ＰＥＧを導入することによる化合物の分子量の調節や化合物のタンパク質吸着能の調節が挙げられる。ＰＥＧを導入した化合物は病変部位へ到達する前の血中ではリンカー部が切断されずＰＥＧが遊離しないため、化合物の分子量が大きく保たれ、かつ化合物のタンパク質吸着能が抑えられる。それにより、腎臓から排泄させる大きさより化合物の大きさを大きく保つことができ、腎臓からの排泄による化合物の損失を抑えることができる。また、タンパク質が化合物に吸着することに伴い働く化合物の体外への排泄による化合物の損失を抑えることができる。一方、病変部位では、リンカー部が切断され、ＰＥＧが遊離することにより、化合物の分子量が減少する。それにより、又病変部位では、それ以外の部位と比較して、化合物の浸透性が向上し、病変深部にまで化合物が浸透することで、化合物の病変部位への集積性を向上させることが可能であろう。それに対して、正常部位においては、リンカー部が切断されずＰＥＧが遊離しないため、化合物は正常部位の深部にまで浸透しない。そのため、正常部位への化合物の集積により発生する信号（バックグラウンド）を低減させることが可能であろう。
ＰＥＧの分子量は２０ｋＤａ以上であることが好ましい。また、ＰＥＧの分子量が４０ｋＤａ以下であることが好ましい。
【００３２】
リンカー部を切断する酵素と一本鎖抗体部が結合する病変マーカーが同一の場合、該酵素の存在とその活性を同時に検出することが可能であろう。また、リンカー部を切断する酵素が病変部位特異的であり、かつその酵素が、一本鎖抗体部が結合する病変マーカーと異なる場合には、病変部位の二つの病変マーカーが存在する場合にのみ、病変部位へ集積するため、位置精度を向上させること、および詳細な病変部位の情報を検出することが可能であろう。例えば、ＨＥＲ２に結合する一本鎖抗体部とＭＭＰ−２の切断部位を含むリンカー部を組み合わせた場合、癌の予後不良因子としてのＨＥＲ２陽性であるということと、転移、浸潤などの性質を示すという指標としてのＭＭＰ−２活性が高いということの二つの性状を同時に示す腫瘍、つまり悪性度の高いと考えられる腫瘍を高い位置精度で検出することが可能になるであろう。また、この場合、血中等に存在する可溶性ＨＥＲ２やＨＥＲ２陽性／ＭＭＰ−２陰性の腫瘍部位は当該造影剤では検出されにくいため、バックグラウンドを低減させる事が可能になるであろう。また、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦに結合する一本鎖抗体部とＭＭＰ−２の切断部位を含むリンカー部を組み合わせた場合、血中へ漏れ出たＶＥＧＦには結合し難く、活性化したＭＭＰ−２が存在する病変部位で、高濃度に存在するＶＥＧＦに結合し易くなることで、ＶＥＧＦを高濃度に存在する血管新生の盛んな病変部位を高い位置精度で検出することが可能になるであろう。
【００３３】
（第三の実施形態）
本発明の第三の実施形態について説明する。本実施形態は、上記一般式（１）で表されるポリマーからなる化合物の製造方法に関する。具体的には以下の工程を有する。
（ｉ）一本鎖抗体部Ａをコードする塩基配列と、リンカー部Ｌをコードする塩基配列と、ペプチド部Ｙをコードする塩基配列と、を有する核酸をプラスミドに挿入する工程
（ｉｉ）前記核酸が挿入されたプラスミドを菌に導入する工程
（ｉｉｉ）前記プラスミドを導入した菌が発現した化合物を回収する工程
なお、本実施形態に係る化合物の製造方法は上記（ｉ）から（ｉｉｉ）以外の工程を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３４】
以下に、本発明の特徴をさらに明らかにするために実施例に沿って本発明を説明するが、本発明に用いる一本鎖抗体部、リンカー部、抗原結合部位を覆うことができる部位の組合せは他の組合せを用いることも可能であり、本発明はこの実施例によって制限されるものではない。
【００３５】
（実施例１  ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖの調製）
始めに、ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）部をコードする遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子は発現産物のＮ末端に、ＭＭＰ−２により特異的に切断されるアミノ酸配列ＰＬＧＶＲ、Ｃ末端にはタンパク精製のためのヒスチジンが６残基連続した６  ｘ  Ｈｉｓタグ、またそのさらに下流にスペーサーとしてグリシンを２残基挟み信号発信分子を導入するためのシステインが配置される様に設計した。比較として、Ｎ末端にＭＭＰ−２により特異的に切断されるアミノ酸配列ＰＬＧＶＲを含まない遺伝子についても同様に作製した。上記遺伝子断片をＴ７プロモーターの下流に挿入したプラスミドｐＥＴ−２２ｂ  （＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３））に導入し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４  ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０  ｍｌの２  ｘ  ＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０  ｒｐｍで８  時間振とう培養した。その後、終濃度１  ｍＭでＩＰＴＧを添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００ｘ  ｇ、３０  分、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０  ｍｉｎ、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ／  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１  Ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）  Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したＮ末端ＭＭＰ−２基質導入ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖ  （ｓｃＦｖ−ＮＭ）と、Ｎ末端ＭＭＰ−２基質未導入ｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖ  （ｓｃＦｖ−ＷＴ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８  ｋＤａであることを確認した。
【００３６】
（実施例２  ｓｃＦｖ−ＮＭのＭＭＰ−２添加によるリンカー部の切断の確認）
上記で調製したｓｃＦｖ−ＮＭにＭＭＰ−２を添加することにより、ペプチドが切断されて生じる分子量の変化を測定した。ＴＣＮＢ  ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  １０  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．０５％  Ｂｒｉｊ３５，  ｐＨ７．５）に透析したＰＥＧ化ｓｃＦｖ  約４  μＭに、活性型ＭＭＰ−２（コスモ・バイオ株式会社）０．１０  ｍｇ／ｍｌを約１５  ｎＭ添加し、約２０時間反応を行い、分子量の変化を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。その結果、図３に示すように、ＭＭＰ−２を添加することにより、ｓｃＦｖ−ＮＭでは分子量の低下が検出された。一方、ｓｃＦｖ−ＷＴでは分子量の低下は検出されなかった。以上より、ｓｃＦｖ−ＮＭのペプチドがＭＭＰ−２により切断されることを確認した。
【００３７】
（実施例３  ｓｃＦｖ−ＮＭのＭＭＰ−２添加による抗原結合能力の向上の確認）
上記で作製したｓｃＦｖ−ＮＭ、ｓｃＦｖ−ＷＴと抗原であるＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いて測定し、ＭＭＰ−２添加前と添加後でのｓｃＦｖの結合能力の変化を測定した。抗原としては、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２  ／  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、メーカーの推奨に従って、ＣＭ−５チップ表面のカルボキシメチルデキストラン鎖へのアミンカップリングにより固定した。固定化量は、約１０００  ＲＵであった。ランニングバッファーとしてはＰＢＳ−Ｔ（２．６８  ｍＭ  ＫＣｌ  ／  １３７  ｍＭ  ＮａＣｌ  ／  １．４７  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ／  １ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ／  ０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，  ｐＨ７．４）を用いて、５０  ｎＭのｓｃＦｖを流速２０  μｌ／ｍｉｎの条件下でインジェクトし結合能力を評価した。その結果、図４に示すように、ＭＭＰ−２添加前後でセンサーグラムの変化を確認でき、ｓｃＦｖ−ＮＭの抗原結合能力が向上することがわかった。一方、ｓｃＦｖ−ＷＴの抗原結合能力は、ＭＭＰ−２添加前後ではほとんど変化しないことを確認した。
【００３８】
（実施例４  Ｎ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＮＭの作製）
実施例１で調製したｓｃＦｖ−ＮＭを１００  ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ  ５．０）にバッファー置換後、ｓｃＦｖ−ＮＭに対して４０倍モル量の５  ｋＤａ、２０  ｋＤａ、又は４０  ｋＤａの  ＰＥＧ−アルデヒド（日油株式会社）を添加し、終濃度２０  ｍＭで２−ピコリンボランを添加し、４℃で約３日間反応させた。反応後、ＴＣＮＢ  ｂｕｆｆｅｒ（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  １０  ｍＭ  ＣａＣｌ２，  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．０５％  Ｂｒｉｊ３５，  ｐＨ７．５）にバッファー交換し、  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＧＬ  １０／３００カラム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、ＰＥＧが１分子結合したと考えられる画分を分取することで、Ｎ末端にＰＥＧ化されたと考えられるｓｃＦｖ−ＮＭを得た。
【００３９】
（実施例５    Ｎ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＮＭのＭＭＰ−２添加によるＰＥＧの遊離の確認）
上記で調製したＮ末端がＰＥＧ化されたと考えられるｓｃＦｖ−ＮＭについて、ＭＭＰ−２を添加することにより、分子量の変化を評価した。ＴＣＮＢ  ｂｕｆｆｅｒに溶解したＮ末端にＰＥＧ化されたと考えられるｓｃＦｖ−ＮＭに、活性型ＭＭＰ−２（コスモ・バイオ株式会社）０．１０  ｍｇ／ｍｌを終濃度約１０  ｎＭ添加し、約２０  ｈ反応を行い、  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＧＬ  １０／３００カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、分子量の変化を評価した。２０  ｋＤａのＰＥＧを修飾したｓｃＦｖ−ＮＭのＭＭＰ−２添加前後でのゲルろ過クロマトグラフィー（２８０  ｎｍの吸収をモニタリング）の結果を図５に示す。図５に示すようにＭＭＰ−２を添加することにより、切断前にはなかった２つのピークが検出された。これらは、ＰＥＧ未修飾のｓｃＦｖ−ＮＭのモノマーとダイマーと考えられる。すなわち、この結果はＮ末端に導入したＭＭＰ−２基質をＭＭＰ−２が切断することにより、Ｎ末端に修飾されたＰＥＧがｓｃＦｖ−ＮＭより遊離したことを示している。つまり、Ｎ末端にＰＥＧが修飾されていることを確認できた。また、ＭＭＰ−２の添加により現れた、ＰＥＧが遊離したｓｃＦｖ−ＮＭに相当すると考えられるピーク面積と、全体のピーク面積の割合を比較した結果、  ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＮＭ全体のうちＮ末端がＰＥＧ化されていた割合は約５０％程度であった。残りの５０％はｓｃＦｖ−ＮＭ分子内のリジン残基のアミノ基に対してＰＥＧが修飾されていたと考えられる。また、５  ｋＤａ、４０  ｋＤａのＰＥＧ−アルデヒドを用いた場合も同様に約５０％程度がＮ末端にＰＥＧ化されていることを確認した。以上より、Ｎ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＮＭの取得を確認した。
【００４０】
（実施例６    Ｃ末端にＭＭＰ−２基質を導入したｓｃＦｖの作製）
ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）部をコードする遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子のカルボキシ末端には、ＭＭＰ−２により特異的に切断されるアミノ酸配列ＰＬＧＶＲ、抗原結合能を低下させる分子を連結するためのシステイン残基、及びタンパク精製のためのヒスチジンが６残基連続した６  ｘ  Ｈｉｓ  タグを配置した。上記遺伝子断片をＴ７プロモーターの下流に挿入したプラスミドｐＥＴ−２２ｂ  （＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３））に導入し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４  ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０  ｍｌの２  ｘ  ＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０  ｒｐｍで８時間振とう培養した。その後、終濃度１  ｍＭでＩＰＴＧを添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００  ｘ  ｇ、３０  ｍｉｎ、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００ｘｇ、３０  ｍｉｎ、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ／  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１  Ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  （登録商標）Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したＣ末端ＭＭＰ−２基質導入ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ−ＣＭ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８  ｋＤａであることを確認した。  
【００４１】
（実施例７    Ｃ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭの作製）
上記で調製したｓｃＦｖ−ＣＭを５  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸バッファー（２．６８  ｍＭ  ＫＣｌ  ／  １３７  ｍＭ  ＮａＣｌ  ／  １．４７  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ／  １ｍ  Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ／  ５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ７．４）にバッファー置換後、１０〜２０倍モル量のトリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）によって、２５℃で２〜４時間、還元処理した。この還元処理したｓｃＦｖ−ＣＭを、２５℃で２〜４時間、１０倍モル量の２  ｋＤａ、５  ｋＤａ、１２  ｋＤａ、２０  ｋＤａ、又は４０  ｋＤａの  ＰＥＧ−マレイミド（日油株式会社）と反応させた。ＰＥＧ化されていることは、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図６）。また、反応後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＧＬ  １０／３００カラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応のＰＥＧ−マレイミドを除去し、Ｃ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭを得た。
【００４２】
（実施例８    Ｃ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭのＭＭＰ−２添加によるＰＥＧの遊離の確認）
上記で調製したＣ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭのうち、２０  ｋＤａ  ＰＥＧ−マレイミドを付加したものについて、ＭＭＰ−２を添加することにより、分子量の変化を評価した。ＴＣＮＢ  ｂｕｆｆｅｒに透析したＣ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭに、活性型ＭＭＰ−２  （０．１０  ｍｇ／ｍｌ）を終濃度約１０  ｎＭ添加し、２時間、２０時間と反応を行い、各時間での分子量の変化を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。また、ＭＭＰ−２活性阻害剤である１，  １０−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）を１  ｍＭで添加し、同様に２０時間反応させた実験について行った。その結果、図７に示すように、ＭＭＰ−２添加２時間でｓｃＦｖ−ＣＭの分子量である２８  ｋＤａ付近にバンドが検出され、２０  時間でほぼｓｃＦｖ−ＣＭがメインバンドとして検出された。また、このｓｃＦｖ−ＣＭのバンドの検出は、１，  １０−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ添加により抑えられた。以上より、Ｃ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭのＰＥＧがＭＭＰ−２特異的に切断されることにより、ｓｃＦｖ−ＣＭより遊離することを確認した。
【００４３】
（実施例９  Ｎ末端にペプチドとＭＭＰ−２基質を導入したｓｃＦｖの作製）
始めに、ＨＥＲ２へ結合するＩｇＧの可変領域の遺伝子配列を基に、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）部をコードする遺伝子断片を作製した。作製した遺伝子のＮ末端には、ペプチドＧＧＳＧＧＧＳ、その下流に
ＭＭＰ−２により特異的に切断されるアミノ酸配列ＰＬＧＶＲ、Ｃ末端にはタンパク精製のためのヒスチジンが６残基連続した６  ｘ  Ｈｉｓタグ、またそのさらに下流にスペーサーとしてグリシンを２残基挟み信号発信分子を導入するためのシステインを配置した。上記遺伝子断片をＴ７プロモーターの下流に挿入したプラスミドｐＥＴ−２２ｂ  （＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３））に導入し、発現用菌株を得た。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地４  ｍｌで一晩前培養後、全量を２５０  ｍｌの２  ｘ  ＹＴ培地に添加し、２８℃、１２０  ｒｐｍで８  時間振とう培養した。その後、終濃度１  ｍＭでＩＰＴＧを添加し、２８℃で一晩培養した。培養した大腸菌を８０００  ｘ  ｇ、３０  分、４℃で遠心分離し、その上清の培養液を回収した。得られた培養液の６０％重量の硫酸アンモニウムを添加し、塩析によりタンパク質を沈殿させた。塩析操作した溶液を一晩４℃で静置後、８０００  ｘ  ｇ、３０  ｍｉｎ、４℃で遠心分離することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ／  ５００  ｍＭ  ＮａＣｌバッファーに溶解し、１  Ｌの同バッファーへ透析した。透析後のタンパク質溶液を、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（商標）  Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を充填したカラムへ添加し、Ｎｉイオンを介した金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製したＮ末端ペプチドとＭＭＰ−２基質を導入したｈｕ４Ｄ５−８  ｓｃＦｖ  （ｓｃＦｖ−ＮＰＭ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示し分子量は約２８  ｋＤａであることを確認した。
【００４４】
（実施例１０  ｓｃＦｖ−ＮＰＭのＭＭＰ−２添加によるリンカー部の切断の確認）
上記で調製したｓｃＦｖ−ＮＰＭにＭＭＰ−２を添加することにより、ペプチドが切断されて生じる分子量の変化を測定した。ＴＣＮＢ  ｂｕｆｆｅｒに透析したＰＥＧ化ｓｃＦｖ  約４  μＭに、活性型ＭＭＰ−２  ０．１０  ｍｇ／ｍｌを約１０  ｎＭ添加し、約２０時間反応を行い、分子量の変化を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。その結果、図８に示すように、ＭＭＰ−２を添加することにより、ｓｃＦｖ−ＮＰＭでは分子量の低下が検出された。また、ｓｃＦｖ−ＮＭ、ｓｃＦｖ−ＣＭも比較として示した。一方、ｓｃＦｖ−ＷＴでは分子量の低下は検出されなかった。以上より、ｓｃＦｖ−ＮＰＭのペプチドがＭＭＰ−２により切断されることを確認した。
【００４５】
（実施例１１    ｓｃＦｖのＭＭＰ−２添加による結合能力の変化の確認）
上記で作製した種々のｓｃＦｖと抗原であるＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステム（ＧＥヘルスケア株式会社）を用いて測定し、ＭＭＰ−２添加前と添加後２０時間での種々のｓｃＦｖの結合能力の変化を測定した。抗原としては、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２  ／  Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、メーカーの推奨に従って、ＣＭ−５チップ表面のカルボキシメチルデキストラン鎖へのアミンカップリングにより固定した。固定化量は、約１０００〜１３００  ＲＵ程度であった。ランニングバッファーとしてはＰＢＳ−Ｔ（２．６８  ｍＭ  ＫＣｌ  ／  １３７  ｍＭ  ＮａＣｌ  ／  １．４７  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ／  １ｍ  Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ／  ０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，  ｐＨ７．４）を用いて、５〜１００  ｎＭに調製したサンプルを流速２０  ｕｌ／ｍｉｎの条件下でインジェクトし結合能力を評価した。結合能力を評価したサンプルとしては、ＭＭＰ−２非添加でのｓｃＦｖ−ＣＭ、ＭＭＰ−２非添加でのｓｃＦｖ−ＣＭのＣ末端に２、５、１２、２０、４０  ｋＤａのＰＥＧ−マレイミドを導入したサンプル、ＭＭＰ−２添加後のｓｃＦｖ−ＣＭのＣ末端に４０  ｋＤａのＰＥＧ−マレイミドを導入したサンプル、ＭＭＰ−２を添加、非添加でのｓｃＦＶ−ＮＭ、ＭＭＰ−２を添加、非添加でのｓｃＦｖ−ＮＰＭ、ＭＭＰ−２添加、非添加でのｓｃＦｖ−ＮＭのＮ末端に５、２０、４０  ｋＤａのＰＥＧ−アルデヒドを導入したサンプルについて結合能を評価した。図９には、作製したＮ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＮＭ、Ｃ末端ＰＥＧ化ｓｃＦｖ−ＣＭのＭＭＰ−２添加、非添加での、ＨＥＲ２との相互作用をＢｉａｃｏｒｅ  Ｘシステムを用いて測定して得られた結合速度定数ｋｏｎの対数を縦軸にＰＥＧの分子量を横軸にとった結果を示す。図９に示すように、Ｃ末端に比べ、Ｎ末端にＰＥＧを導入する方が、より大きくｋｏｎを低下させることが可能であり、ＭＭＰ−２を添加することにより、ｋｏｎを大きく変化させることが可能であることを確認した。具体的には、Ｎ末端にＰＥＧ  ５  ｋＤａを導入したｓｃＦｖ−ＮＭでは、Ｃ末端にＰＥＧ  １２  ｋＤａを導入したｓｃＦｖ−ＣＭと同等のｋｏｎの値を示しており、Ｃ末端に比べＮ末端の方が、より低分子量のＰＥＧで大きくｋｏｎを低下させることが可能であることを確認した。また、ＭＭＰ−２添加によるｋｏｎの変化度はＣ末端にＰＥＧ  ４０  ｋＤａを導入したｓｃＦｖ−ＣＭでは約５倍程度であるのに対して、Ｎ末端にＰＥＧ  ２０  ｋＤａを導入したｓｃＦｖ−ＮＭでは約１５倍であり、Ｃ末端に比べＮ末端の方が、より大きく結合能力を変化させることが可能であることを確認した。また、ｓｃＦｖ−ＮＭとｓｃＦｖ−ＮＰＭのＭＭＰ−２添加前後でのｋｏｎの変化についても比較したところ、ほぼ同等のｋｏｎの変化であることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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