(57)【要約】【課題】本発明の目的は、肥満を減少する処置を提供することである。【解決手段】データは、腹腔へ移植された子宮内膜組織の増殖が新脈管形成インヒビターによって抑制されることを示す。本パイロット研究において用いられたＴＮＰ−４７０の用量は、確立された腫瘍用量の１／３である。新脈管形成インヒビターが、その血管区画を調節することによって、正常で、形質転換しておらず、血管化した組織の大きさおよび／または増殖を調節するのに有効な量で患者に投与される。制御され得る組織の例は、脂肪組織、腸ポリープ、筋肉（心臓を含む）組織、および子宮内膜組織を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物において正常な血管化した組織の大きさおよび／または増殖を調節するための組成物であって、該血管化した正常な組織の大きさおよび増殖を調節するのに有効な量の新脈管形成インヒビターを含む、方法。
【請求項２】
前記インヒビターがコラゲナーゼインヒビターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記インヒビターがＴＮＰ−４７０、アンギオスタチン、エンドスタチン、およびサリドマイドからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記正常な血管化した組織が脂肪組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記動物またはヒトが肥満を生じる遺伝的欠損を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記インヒビターが食欲を抑制することによる、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記インヒビターがＴＮＰ−４７０であり、前記組成物が食欲を抑制するに有効な量で投与されるものであることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が脂肪組織への血管供給を減少させるに有効な量で投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組織が、心臓組織、腎臓組織、腸組織および生殖組織からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記動物またはヒトがポリープ症（ｐｏｌｙｐｓｉｓ）を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記動物またはヒトが子宮内膜症を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記動物またはヒトが前立腺の拡大を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記動物またはヒトが心肥大または腎肥大を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
ヒトまたは動物において正常な血管化した組織の大きさおよび／または増殖の調節のための組成物であって、薬学的に受容可能なキャリア中に新脈管形成を阻害する化合物の有効量を含み、ここで、その投薬量は、腫瘍の処置についての投薬量未満である、組成物。
【請求項１５】
肥満を減少させるための処方物中の、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
体脂肪を減少させるに有効な量で食欲を減少させる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記化合物が脂肪組織における新脈管形成を阻害する量である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
経口投与について薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
局所投与について薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
徐放性の薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記化合物が、ＴＮＰ−４７０、アンギオスタチン、エンドスタチン、およびサリドマイドからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
前記化合物がＴＮＰ−４７０である、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、有効量の新脈管形成インヒビターを投与することによる、肥満および正常な血管化された組織の増殖によって特徴付けられる他の障害の処置の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
過体重の蔓延は、殆どの先進国において大流行しており、そしてそれとともに動揺させるほどの死亡率および罹病率の統計を伴う。肥満は、多数の潜在的な生命にかかわる疾患（例えば、動脈硬化、高血圧、糖尿病、脳卒中、肺塞栓症、およびガン）について充分に確立された危険因子である（Ｍｅｉｓｌｅｒ、Ｊ．Ｓｔ．Ｊｅｏｒ  Ｓ．１９９６、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．６３：４０９Ｓ−４１１Ｓ）。（Ｂｒａｙ  Ｇ．１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ．２５：９０７−９１９）。さらに、これは、多数の慢性状態（例えば、呼吸器疾患、変形性関節症、骨粗鬆症、胆嚢疾患、および異常脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ））を併発する。この問題の膨大さは、体重の増加につれて死亡率が急上昇するという事実に最も良く反映されている。５０％を超える全死亡原因は、３５００万人の米国人に見られるように一旦ボディマス指数（ＢＭＩ）が３０ｋｇ／ｍ2を超えた場合の肥満関連状態に起因する。（Ｌｅｅ  Ｌ、Ｐａｆｆｅｎｂａｒｇｅｒ  Ｒ．  １９９２、ＪＡＭＡ、２６８：２０４５−２０４９）。年間３００，０００人を超える死亡に寄与することによって、肥満は、喫煙にのみ次いで二番目に、最も一般的な潜在的に予防可能な死亡原因として位置付けられる。（ＭｃＧｉｎｎｉｓ  Ｊ．、Ｆｏｅｇｅ  Ｗ．１９９３、ＭＡ  ２７０：２２０７−２２１２）。
【０００３】
この問題の壊滅的な医学的結果に伴って、米国における保健医療システムにかかる深刻な財政的負担が存在する。肥満およびそれに伴う疾患について、医療費および収入の損失から推定される経済的な影響は、６８０億米ドル／年を超えると報告されている。（Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．１９９２、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．５５、５０３Ｓ−５０７Ｓ）。（Ｗｏｌｆ  Ａ．、Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．１９９６、Ａｍ  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．６３：４６６Ｓ−４６９Ｓ）。（Ｗｏｌｆ  Ａ．、Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．  １９９４、Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，５：３４−３７）。これは、減量用食品、製品およびプログラムにおいて年間に費やされる３００億米ドルを超えるものを含まない。（Ｗｏｌｆ  Ａ．、Ｃｏｌｄｉｔｚ  Ｇ．１９９４、Ｐｈａｒｍａｃｏｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，５：３４−３７）。（Ｅｚｚａｔｉら、１９９２、Ｖｉｔａｌ  ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔａｔ［２］、１１３）。
【０００４】
１９９０年に、米国政府は、この危機に対して、国の主要な保健における目標として、２０００年までに肥満の蔓延を人口の２０％にまで減少させることを確立することによって応答した。（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｈｅａｌｔｈｙ  ｐｅｏｐｌｅ  ２０００：ｎａｔｉｏｎａｌ  ｈｅａｌｔｈ
ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ．１９９０（ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＰＨＳ
９０−５０２１２）。
【０００５】
この目標にもかかわらず、米国における過体重の蔓延は、徐々に増加してきており、最も最近のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ（１９８８−１９９１）において、驚くべきことに３３．０％に達した（Ｋｕｃｚｍａｒｓｋｉら、１９９４、ＪＡＭＡ．２７２：２０５−２１１）。さらに、平均ＢＭＩもまた、この期間に０．９ｋｇ／ｍ2増加した。この警戒すべき傾向は、努力の欠如の結果で生じたのではない。対照的に、推定で，男性の２５％、女性の５０％および若者の４４％が、任意の所定の時機に減量を試みている。（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃ．９３：４４５−４４９）。むしろ、過去１０年間において、３１％の速度の増加および８％の罹患率の増加は、肥満が現在の処置（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）に極めて抵抗性であるという事実の証拠である。（ＮＩＨ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｎｅｌ、１９９３  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１１９：７６４−７７０）。
【０００６】
確立されたアプローチの長期の失敗の主要な原因は、肥満の機構の誤認および貧弱な理解に基づく。従来の知見は、肥満が自己に原因がある暴食癖の疾患であることを維持していた。従って、包括的な処置プログラムは、膨大な数のシステムを用いた、カロリー摂取の低減および身体運動の増加をするための行動改変に焦点が当てられていた。これらの方法は、限定された効力を有し、そして９５％を超える常習性と関連する。
【０００７】
短期のアプローチの失敗は、肥満の病理生理学を浮き彫りにする最近の進歩とともに、潜在的な長期のアジュバント処置として薬理学的治療の再評価をもたらした。（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ．１９９６、ＪＡＭＡ．２７６：１９０７−１９１５）。（Ｒｙａｎ、Ｄ．１９９６、Ｅｎｄｏ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍｅｒ、２５：９８９−１００４）。この仮定は、体重が血圧に類似する生理学的に制御されたパラメーターであり、そして肥満が高血圧に類似する慢性疾患であることである。長期（おそらく全寿命）医学的治療の目標は、健康的な食餌療法および身体運動とともに体重減少および続く体重の維持の両方を容易にする。このアプローチを評価するために、現在利用可能な薬物の長期の効力を、非薬理学的介入単独の効力に対して判断しなければならない。後者のアプローチは、処置２１週間で平均で８．５ｋｇの体重喪失をもたらし、そして４年目においてその患者の１０〜３０％が体重減少の５０％を維持するのみである。（Ｗａｄｄｅｎ  Ｔ．１９９３、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１１９：６８８−６９３）。（Ｋｒａｍｅｒら、１９８９、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ．１３：１２３−１３６）。長期の（６ヵ月を超える）単一薬物（Ｇｕｙ−Ｇｒａｎら、１９８９、Ｌａｎｃｅｔ  ２：１１４２−１１４４）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９４  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ．１８：１２９−１３５）（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９３：Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．２：９２−９８）または組み合わせ治療（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  Ｍ．１９９２、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．５１：５８１−５８５）を評価した、このわずかな研究は、体重減少においてプラセボと比較して緩和な効力を示す。
【０００８】
肥満を処置または予防するために現在使用される全ての医薬は、エネルギー利用可能性を減少させるかまたはエネルギー出力を増加させるかのいずれかによる、組織および仕事の脂肪細胞区画に関する。これらの薬剤は、機構に基づいて３つのカテゴリーへと分類され得る。（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ
ｏｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  １９９６、ＪＡＭＡ、２７６：１９０７−１９１５）。
【０００９】
エネルギー摂取の減少。このアプローチは、食欲の減少または満腹感の増加によって食餌摂取を減少させることに関する。これらの「食欲抑制」薬物は、カテコールアミン作用系（アンフェタミン、ベンズフェタミン、フェンジメトラジン、フェンテルミン、マジンドール、ジエチルプロピオン、およびフェニルプロパノールアミン）またはセロトニン作用系（フェンフルラミン、デクスフェンフルラミン、フルオキセチン、セルトラリン、または他の抗鬱選択的セロトニン再取り込みインヒビター（ＳＳＲＩ））のいずれかに作用することによって、神経伝達物質の活性に影響を与える。
【００１０】
栄養吸収の減少。このカテゴリーの薬物は、消化酵素の作用または栄養の吸収をブロックする。この型の薬物の例は、オルリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔ）であり、これは、胃および膵臓のリパーゼ活性を阻害する。（非特許文献１）。これらの医薬は、米国において実験段階であり、そして肥満の処置について利用可能ではない。
【００１１】
エネルギー消費の増加。エネルギー消費の増加は、代謝速度の増加（例えば、交感神経系緊張の変化または酸化的リン酸化の脱共役の変化）によって達成され得る。熱産生代謝に影響を与える薬物は、エフェドリン単独ならびにカフェインおよび／またはアスピリン（非特許文献２）、およびＢＲＬ  ２６８３０Ａ（アドレナリン作用性レセプターアゴニスト）（非特許文献３）との組み合わせを包含する。このクラスの医薬は、体重制禦について、ＦＤＡには承認されていない。
【００１２】
現在、単一薬物療法は、体重喪失を促進するかまたは維持するかのいずれかにおいて優れたものとしては出現していない。
【００１３】
外科的処置（例えば、胃分画手順、空腸回腸バイパス、および迷走神経切断）もまた、重症の肥満を処置するために開発されている。（Ｇｒｅｅｎｗａｙ  Ｆ．、１９９６、Ｅｎｄｏ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍｅｒ．２５：１００５−１０２７）。長期的には利点であるが、急性のリスク利益比は、肥満手術についてのＮＩＨコンセンサス会議に従えば、病的肥満患者についてこれらの侵襲的手順を反転する（４０ｋｇ／ｍ2を超えるＢＭＩ）。（ＮＩＨ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、１９９１、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１１５：９５６−９６１）。従って、これは、過体重患者が重度に肥満になり、そして付随の合併症に罹患しない限り、およびそうなるまで、その過体重患者の大部分についての代替手段ではない。
【００１４】
この組織の血管区画に指向される肥満の医薬処置または外科的処置は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄｒｅｎｔ  Ｍ．、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｅｎ  Ｅ．１９９５、Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．３（補遺４）：６２３Ｓ−６２５Ｓ
【非特許文献２】Ｐａｓｓｑｕａｌｉ  Ｒ．、Ｃａｓｉｍｉｒｒｉ  Ｆ．１９９３  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  １７（補遺１）：Ｓ６５−Ｓ６８
【非特許文献３】Ｃｏｎｎａｃｈｅｒら、１９９２、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．５５：２５８Ｓ−２６１Ｓ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、本発明の目的は、肥満を減少する処置を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、肥満の処置のための組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、他の正常で血管化した組織の過剰増殖を阻害または減少させるための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
新脈管形成インヒビターが、その血管区画を調節することによって、正常で、形質転換しておらず、血管化した組織の大きさおよび／または増殖を調節するのに有効な量で患者に投与される。制御され得る組織の例は、脂肪組織、腸ポリープ、筋肉（心臓を含む）組織、および子宮内膜組織を包含する。新脈管形成インヒビターに対するこれらの組織の応答は、肥満、腸ポリープ、心肥大、および子宮内膜症の動物モデルに基づいて、容量依存的であり、可逆的であり、そして種々の異なる新脈管形成インビビターに共通する（例は、ＴＮＰ−４７０、アンギオスタチンおよびエンドスタチンを使用する）。脂肪組織モデル（遺伝子的肥満マウスおよび正常なコントロールマウス）において行われた初期の研究は、脂肪組織の増殖および重量が微細血管内皮の制御下にあることを示した。脂肪組織の拡大は、内皮細胞増殖と関連する。新脈管形成の阻害は、脂肪組織重量の減少をもたらした。新脈管形成インヒビターを受ける動物の体重増加は、対飼育されたマウスにおける体重増加をもたらすに充分な食欲の増加にもかかわらず、有意に制限された。このインヒビターの中止は、脂肪組織の迅速な拡大をもたらした。この効果は、用量依存的であり、反復可能に可逆性であり、そして試験したすべてのインヒビターに応答して生じた。有意な阻害はまた、腫瘍を処置するために使用される用量の３分の２以下の用量を用いて腸ポリープおよび心肥大の両方の動物モデルにおいて観察された。子宮内膜症モデルにおける予備結果もまた、腫瘍を処置するために使用される投薬量の３分の１の投薬量で、新脈管形成インヒビターを用いて処置した動物における子宮内膜症の発症を減少させる性向を明らかに示す。脂肪組織以外の増殖性でない正常組織に対する効果は観察されなかった。
本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）  ヒトまたは動物において正常な血管化した組織の大きさおよび／または増殖を調節する方法であって、有効量の新脈管形成インヒビターを該動物に投与して、該血管化した正常な組織の大きさおよび増殖を調節する工程、を包含する、方法。
（項目２）  上記インヒビターがコラゲナーゼインヒビターである、項目１に記載の方法。
（項目３）  上記インヒビターがＴＮＰ−４７０、アンギオスタチン、エンドスタチン、およびサリドマイドからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）  上記正常な血管化した組織が脂肪組織である、項目１に記載の方法。
（項目５）  上記動物またはヒトが肥満を生じる遺伝的欠損を有する、項目４に記載の方法。
（項目６）  上記インヒビターが食欲を抑制することによる、項目４に記載の方法。
（項目７）  上記インヒビターが食欲を抑制するに有効な量で投与されるＴＮＰ−４７０である、項目６に記載の方法。
（項目８）  上記ＴＮＰ−４７０が脂肪組織への血管供給を減少させるに有効な量で投与される、項目７に記載の方法。
（項目９）  上記組織が、心臓組織、腎臓組織、腸組織および生殖組織からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１０）  上記動物またはヒトがポリープ症（ｐｏｌｙｐｓｉｓ）を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）  上記動物またはヒトが子宮内膜症を有する、項目９に記載の方法。
（項目１２）  上記動物またはヒトが前立腺の拡大を有する、項目９に記載の方法。
（項目１３）  上記動物またはヒトが心肥大または腎肥大を有する、項目９に記載の方法。
（項目１４）  ヒトまたは動物において正常な血管化した組織の大きさおよび／または増殖の調節のための組成物であって、薬学的に受容可能なキャリア中に新脈管形成を阻害する化合物の有効量を含み、ここで、その投薬量は、腫瘍の処置についての投薬量未満である、組成物。
（項目１５）  肥満を減少させるための処方物中の、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）  体脂肪を減少させるに有効な量で食欲を減少させる、項目１５に記載の組成物。
（項目１７）  上記化合物が脂肪組織における新脈管形成を阻害する量である、項目１４に記載の組成物。
（項目１８）  経口投与について薬学的に受容可能なキャリアを含む、項目１４に記載の組成物。
（項目１９）  局所投与について薬学的に受容可能なキャリアを含む、項目１４に記載の組成物。
（項目２０）  徐放性の薬学的に受容可能なキャリアを含む、項目１４に記載の組成物。
（項目２１）  上記化合物が、ＴＮＰ−４７０、アンギオスタチン、エンドスタチン、およびサリドマイドからなる群より選択される、項目１４に記載の組成物。
（項目２２）  上記化合物がＴＮＰ−４７０である、項目１４に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、フェンフルラミン（一日４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）および生理食塩水コントロールで処置したｏｂ／ｏｂマウスと比較した、ＴＮＰ−４７０を、一日５ｍｇ／ｋｇまたは一日１０ｍｇ／ｋｇのいずれかで処置したｏｂ／ｏｂマウスでの経時的な（日数）体重のグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＴＮＰ−４７０（一日１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した対飼育された（説明）ｏｂ／ｏｂマウス、および生理食塩水コントロールでの経時的な（日数）体重のグラフである。
【図２】図２は、ＴＮＰ−４７０  ２．５、５．０、７．５、および１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量対コントロールでのマウスの、体重（グラム）対処置の日数のグラフである。各群について、１０ｍｇがｎ＝８である以外はｎ＝４である。
【図３】図３は、生理食塩水で処置したコントロールと比較した場合の、アンギオスタチン（２０ｍｇ／ｋｇ／日）、エンドスタチン（５０ｍｇ／ｋｇ／１２ｈ）、およびアンギオスタチン（５０ｍｇ／ｋｇ／１２ｈ）での、マウスの、体重（グラム）対処置の日数のグラフである。各群ｎ＝３である。
【図４Ａ】図４Ａは、生理食塩水で処置したコントロールｏｂ／ｏｂ（ｎ＝４）、および生理食塩水で処置した正常マウスの９Ｃ５７Ｂ１／６（ｎ＝５）に対する、１０ｍｇ／ＴＮＰ−４７０／ｋｇ／日（ｎ＝６）で処置したｏｂ／ｏｂマウスについての、体重（グラム）対処置の日数のグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、コントロール生理食塩水処置と比較した、１０ｍｇ／ＴＮＰ−４７０／ｋｇ／日で処置したｏｂ／ｏｂマウスについての、体重（グラム）対処置日数のグラフである。各群についてｎ＝６である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、生理食塩水で処置した正常Ｃ５７／Ｂ１／６マウス（ｎ＝５）および生理食塩水で処置したｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝４）に対する、１０ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝１５）の用量でのＴＮＰ−４７０で処置したｏｂ／ｏｂマウスの、体重（グラム）対日数のグラフである。
【図５】図５は、フェンフルラミン（４０ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝４）単独で、次いでＴＮＰ−４７０で処置した（１０ｍｇ／ｋｇ／日、ｎ＝４）ｏｂ／ｏｂマウスの、体重（グラム）対処置の日数のグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、対飼育実験において、ＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇ／日）対生理食塩水コントロールでの、体重（グラム）対処置日数のグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、対飼育実験において、ＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇ／日）対生理食塩水コントロールでの、体重（グラム）対処置日数のグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、成長因子、ＢＣＥ、およびＦＧＦあるいは３Ｔ３およびＦＧＦをその細胞に添加した場合の、細胞数／ウェル（×１０3）対ＴＮＰ−４７０（ｐｇ／ｍｌ）のグラフである。
【図７】図７は、Ｔ３（肥大を誘発する）、１０ｍｇ／ｋｇ  ｑｏｄでのＴ３およびＴＮＰ−４７０、ならびに２０ｍｇ／ｋｇ  ｑｏｄでのＴ３およびＴＮＰ−４７０で処置した、チロニン誘発した心室肥大を有するマウスの体重比率としての心室重量のグラフである。
【図８Ａ】図８Ａは、１および３週間後の、Ｍｉｎ／＋  マウス、生理食塩水コントロール対１０ｍｇ／ｋｇ  ｑｏｄの用量でのＴＮＰ−４７０で処置したマウスにおけるポリープ数のグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇ  ｑｏｄでのＴＮＰ−４７０で処置したマウス対生理食塩水コントロールについて各大きさ（ｍｍ直径）のポリープ数の合計としてグラフ化した、Ｍｉｎ／＋  マウスにおけるポリープの大きさおよび大きさの分布のグラフである。
【図９】図９は、コントロールマウスおよびＴＮＰ−４７０で処置したマウスについての子宮内膜症の動物モデルにおける組織の直径（ｍｍ）のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
新脈管形成は、新たな血管が形成される過程である。これは、生殖、発生および創傷治癒において必須であり、そしてこれらの正常な事象において高度に調節される。しかし、調節されず、そして恒常的な新脈管形成はまた、関節炎、眼新生血管形成および固形腫瘍増殖のような多くの疾患の状態に寄与する。１９８３年以来、新脈管形成の刺激または阻害のいずれかをするいくつかの分子が同定されている。これらの分子は、診断研究分野における臨床的な適用および試行、創傷治癒における新脈管形成の迅速化、ならびに新生物における新脈管形成の阻害をもたらした。
【００２２】
新脈管形成は、固形腫瘍増殖の分野において徹底的に研究されており、そして多くの調節因子がこれらの組織から単離されている。固形腫瘍の大きさおよび増殖が新脈管形成依存的であるという実質的な証拠が存在する。単純に述べると、一旦腫瘍が開始すると、腫瘍細胞集団の各々の増加は、腫瘍に供給するための新たな毛細管の形成の増加によって進行しなければならない。この関連は、新脈管形成と「正常」組織もしくは器官（例えば、脂肪組織）との間では決してなされない。
【００２３】
脂肪組織は、高度に血管化した組織であり、そして、主に影響を受けた組織の血管再生を促進する能力に起因して、数世紀もの間、創傷治癒を容易にするために開発されている（Ｂａｌｌ  Ｊ．１９２８、Ｔｈｅ  ｓａｃｋ−’ｅｍ−ｕｐ
ｍｅｎ：ａｎ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ａｎｄ  ｆａｌｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｒｎ  ｒｅｓｕｒｒｅｃｔｉｏｎｉｓｔｓ、Ｏｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐ７３）。この特徴の結果として、脂肪組織は、腸、心筋および移植肺のような、血管供給が重要である種々の組織を含む外科的手順において利用されつづけている。（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、１９８８、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ。  Ｂｉｏｃｈ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍ．１５３：３４７−３５２）。
【００２４】
脂肪組織の新脈管形成局面への調査は、血管供給の発達への増殖の依存を明らかにした。胚形成の間、血管新生および脂肪細胞分化は、密接に協調された事象である。新たに形成された脂肪組織は、さらなる増殖および発達のために連続的な新脈管形成を必要とする。（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  Ｆ．１９６５．Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第５巻、Ｒｅｎｏｌｄ  Ａ．Ｃａｈｉｌｌ  Ｇ．（編）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、Ａｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｏｃ．第８７〜１００頁）。関連する機構はまた充分明らかになっていないが、脂肪細胞と微細血管性内皮細胞（ＥＣ）との間の二方向性パラクリン相互作用が重要な調節的役割を果たすことは公知である。（Ｌａｕ  Ｄら、１９９６、Ｉｎｔｅｒｎ
Ｊ．Ｏｂｅｓ．２０（補遺３）、Ｓ１６−Ｓ２５）。これは、脂肪組織から単離されたＥＣと３Ｔ３細胞（インビトロでの脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ）の寄与を殆ど維持する脂肪細胞株）との相互作用を評価するインビトロ研究によって支持される。（Ｇｒｅｅｎ  Ｈ．、１９７８、Ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ、１０ｔｈ  Ｍｉａｍｉ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ａｈｅａｄ  Ｆ．Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｊ．、Ｒｕｓｓｅ  Ｔ．、Ｗａｇｎｅｒ  Ｒ．（編）Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１３〜３３頁）。これらの研究は、ＥＣおよび前脂肪細胞の両方が、細胞特異的な様式で互いに増殖を増強する有糸分裂因子を放出することを実証する。この共生的関係は、前脂肪細胞が、ＥＣの群の周りの「島（ｉｓｌｅｔ）」において増殖する同時培養において見られ得る。（Ｌａｕら、１９９６、Ｉｎｔｅｒｎ  Ｊ  Ｏｂｅｓ．２０（補遺３）Ｓ１６−Ｓ２５）。
【００２５】
関連する化合物の多くを同定するにおいて進歩がなされてきた。３Ｔ３脂肪細胞は、インビトロでのＥＣ増殖および移動ならびにニワトリ漿尿膜における新脈管形成を刺激する強力な因子を産生する。（Ｃｙｓｔｏｌｉｔｈら、１９８２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７：６００７−６０１１）。（Ｃｙｓｔｏｌｉｔｈら、１９８２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
ＵＳＡ．７：５５９７−５６０１）。１つのこのような化合物は、そのレベルが脂肪細胞分化の間に少なくとも２００倍に増加する脈管新生因子である１−ブチリル−グリセロールであると同定された。（Ｄｏｂｓｏｎら、１９９０．Ｃｅｌｌ、６１：２２３−２３０）。脂肪細胞はまた、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＴＮＦ−（、ｂＦＧＦ、およびＦＧＦ−９を含む、公知の新脈管形成活性を有する他の因子を産生する。（Ｆｏｒｍ  Ｄ．、Ａｕｅｒｂａｃｈ  Ｒ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１７２：２１４−２１８）。（Ｓｍｉｔｈ  Ｓ．１９９６．Ｅｎｄｏ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍｅｒ．２５：９２１−９４２）。（Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｎｗｓｋａら、１９９２、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１２２５−１２３１）。（Ｓａｍａｇｈら、１９９５、Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．３：３０７Ｓ）。再現性良く、脂肪組織から単離されたＥＣは、マイトジェンを培養培地に放出し、これは、用量依存的な様式で前脂肪細胞複製を刺激した。（Ｌａら、１９９６、Ｉｎｔｅｒｎ  Ｊ  Ｏｂｅｓ．２０（補遺３）Ｓ１６−Ｓ２５）。ＥＣ由来のマイトジェンの部分精製は、分子量が１８〜６７ｋＤａに及ぶいくつかの活性タンパク質を明らかにし、これらのいくつかは、ヘパリン結合性ＦＧＦファミリーに属し得る。（Ｌａｕら、１９９０  Ｉｎｔ．Ｊ  Ｏｂｅｓ．１４：１９３−２０１）。脂肪組織とＥＣとの間の複雑なオートクリン／パラクリン連絡は、活発な研究分野のままである。
【００２６】
実施例に記載される研究は、脂肪生成が新たな血管の増殖に依存するという反駁し得ない証左を提供する。次いで、固形腫瘍増殖への拡張および類似により、抗新脈管形成薬剤を用いた血管新生の予防は、脂肪組織の増殖を予防する。しかし、驚くべきことに、実施例からもまた、脂肪組織の増殖の増加が存在する動物のみならず正常動物において新脈管形成が体重喪失を生じ得ることは明らかである。これらの結果は、新脈管形成の投与が脂肪組織の大きさおよび増殖を調節するために使用し得るという強力な証左を提供する。
【００２７】
これらの動物において記載されるさらなる研究は、新脈管形成の投与を使用して、その組織に該を与えることなく、正常な血管化した組織の大きさおよび／または増殖を調節し得るというさらなる証左を提供する。本明細書において使用される場合、「正常」組織とは、ガン性でない（すなわち、形質転換されていない）組織か、または創傷治癒から生じる瘢痕組織をいう。本明細書において使用される場合、「血管化した組織」とは、筋肉、腸、脂肪組織、および子宮内膜のような組織をいい、これらはその組織を通じて栄養および気体交換を提供する血液供給によって通常特徴付けられる。「血管系」とは、血管化した組織とは対照的に、血管自体をいう。
【００２８】
Ｉ．脂肪組織を減少させるための組成物
Ａ．新脈管形成機構を阻害する化合物
任意の抗新脈管形成化合物を使用して正常な血管化した組織の大きさおよび／または増殖を調節し得る。好ましい例示的な抗新脈管形成化合物は、ＴＮＰ−４７０（米国特許第５，２９０，８０７号に記載される）；アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ；米国特許第５，６３９，７２５号に記載される）；エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）およびサリドマイド（Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）を包含する。他の化合物も、当業者に公知である。以下の新脈管形成インヒビターのリストは、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、１９９８年１０月１日に公開された。
【００２９】
【表１】
2011026332.tif 000002
2011026332.tif 000003
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Ｂ．投与のためのキャリア／経路／手段：
薬物は、非経口または腸内投与され得る。好ましい実施態様では、薬物は、胃への通過の間、薬物を保護するために必要であれば、腸溶性キャリア中で経口投与される。代替的な送達方法は、静脈内、経頬、または他の経膜送達、および徐放性処方を包含する。
【００３０】
Ｃ．投薬量
抗新脈管形成組成物は、血管化組織の大きさおよび／または成長を調節するのに有効な量で投与される。有効な量は、代表的には、組織増殖を制限するか、または組織の大きさを減少させる（特に、組織が脂肪組織である場合）のに有効な量である。本明細書中で用いられるような組成物は、全身毒性を実質的に存在させることなく所望の調節を達成するように患者を処置するために、有効量の新脈管形成インヒビターを含む。
【００３１】
ＩＩ．処置方法
Ａ．提案される処置スケジュール
実施例によって実証されるように、新脈管形成インヒビターは、処置されるべき血管組織の大きさおよび／または成長を調節する血管レベルを生じる量および期間で投与される。肥満症の処置のために好ましい実施態様では、患者は、維持レベルに体重を減少させるのに有効な投薬量で一日に一度、薬物を受容する。
【００３２】
Ｂ．患者のタイプ
処置方法は、通常の超過体重の個体および遺伝的欠陥を有する個体の両方に適用可能であることが実証されている。この方法はまた、ホルモンもしくは代謝の欠陥または薬物副作用に起因する体重増加を伴うほとんどの場合において有用であるはずである。除脂肪体重を維持し、かつ慢性投与の間の体重減少を持続し得ながら体脂肪の減少を促進することに加えて、処置の他の利点は、肥満関連糖尿病において、そしていくつかの薬物（例えば、ＴＮＰ−４７０、食欲減少（すなわち、食欲抑制薬））の場合において、血中グルコースレベルの正常化を包含する。これらの結果は、望ましくない副作用もなく得られ得、乱用または依存性になる可能性がない。
【００３３】
正常な器官の大きさおよび成長の新脈管形成依存性は、過剰または不充分な組織成長が臨床続発症を生じる領域、ならびに組織工学の分野において密接な関係を有する。実施例は、子宮内膜症、ポリープ症、心肥大、ならびに肥満症の動物モデルの効力を実証する。これらの結果は、他のタイプの正常組織の大きさまたは成長の増大を伴う障害（例えば、子宮類腺維、前立腺肥大、およびアミロイド症）の処置のための効力を示している。これらの障害は、代表的には、組織の大きさまたは成長が正常でなく、しかし、組織が悪性形質転換されておらず、もとの組織と完全に異なっているわけではないが、位置（子宮内膜症の場合のような）または成長（器官肥大）が異常である患者を伴う。
【実施例】
【００３４】
ＩＩＩ．実施例
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される・
（実施例１：ＴＮＰ−４７０による遺伝的肥満マウスの処置）
第一のシリーズの実験をｏｂ／ｏｂマウス（レプチン遺伝子における自発性変異の結果として病的肥満を生じるマウス系統）において実施した。（Ｚｈａｎｇら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ．３７２：４２５−４３２）。動物研究は、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｂｏｓｔｏｎの動物施設において施設ガイドラインに従って実施した。７週齢から６ヵ月齢の、そして３５〜７０ｇの体重の雄のｏｂ／ｏｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を実験前に順応させ、個々に収容し、そして研究の間中は自由に水に接近できるようにした。全ての手順（剃毛および写真撮影）の前に、動物を吸入メトキシフルオラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）で麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニタリングした。動物を実験の最後に、メトキシフルオランの連続吸入によって屠殺した。
【００３５】
注射を容易にするために、マウスの背中を剃った。全ての注射および測定を各日午後４時から６時の間に実施した。マウスに、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＰ−４７０（ＡＧＭ−１４７０）または生理食塩水コントロールを、（ここまで）３０日までの処置期間の間、３０Ｇ注射針を用いて皮下注射した。皮下脂肪は、ＴＮＰ−４７０注射の部位で減少することが観察されたので、注射部位を背側に沿って変化させた。比較のために、１つの動物群は、フェンフルラミン（４０（：ｇ／ｋｇ、腹腔内、毎日）を受容した。各動物の体重および残りの食物を各日測定した。１つの動物群には、ＴＮＰ−４７０の体重減少効果の全体または一部が食欲抑制の結果であるか否かを決定するために、ペアで給餌した。これは、未処理マウスを各処理マウスと対にし、未処理マウスに、その処理パートナーが前日食餌した量を食餌させることにより行った。
【００３６】
図１Ａは、ＴＮＰ−４７０で処置したマウスの体重減少応答を示す。処置マウスは、用量依存様式で体重を減少した。ＴＮＰ−４７０処置群における体重減少は、最大用量のフェンフルラミンで達成されたより有意に大きかった。１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＰを受容する群の体重減少は、それらが約２２〜２４ｇの除脂肪体重に達するまで、平均して１日あたり１ｇで続いた。この体重減少は、研究の開始時の動物の体重とは独立して達成された。動物の体重は、継続した薬物投与に関わらず、これらのレベルで安定した。より低い用量のＴＮＰ−４７０を受容した動物は、より高い体重で安定した。動物は、研究を通して健常でかつ活動的なままであった。
【００３７】
図１Ｂに示すように、ＴＮＰ−４７０で処置されたマウスは、単独では体重の減少を生じたコントロールマウスと比較して、食欲の低下を有した。しかし、食物摂取の減少から生じる体重減少は、ＴＮＰ−４７０により達成された体重減少より有意に低かった。これらの結果は、ＴＮＰ−４７０が、体重を減少させるために２つの機構によって作用していることを示唆する。この２つの機構は、中枢食欲抑制および末梢新脈管形成阻害である。ＴＮＰ−４７０の食欲抑制効果は、これまで報告されていない。
【００３８】
（実施例２：ＴＮＰ−４７０の投与による脂肪を減少させるための正常マウスの処置）
ペア給餌実験を、肥満症を発症しなかったレプチン遺伝子変異を有さない正常マウスを用いて繰り返した。これらの動物（それらの除脂肪体重に比較的近くで研究を開始した）では、処置群およびペアの給餌群に類似した少ない体重減少が観察された。このことは、痩せ動物では、緩慢に成長する脂肪組織において生じる新脈管形成が制限されると予期されるが、ＴＮＰ−４７０による体重減少のほとんどが、食欲抑制の結果であることを示唆する。これらの動物はまた、毒性の形跡を示さなかった。
【００３９】
脂肪組織の試料を、ＰＣＮＡおよびＢｒｄｕ染色法を用いて、処置マウスおよび未処置マウスの両方において、新規な血管形成を示す内皮細胞増殖の証拠のために、組織学的に試験した。未処置マウスでは、ＴＮＰ−４７０を受容したマウスと比較して有意に大きい内皮細胞増殖が存在した。このことは、これらのマウスの脂肪組織において新脈管形成が存在すること、およびそれは、ＴＮＰ−４７０によって阻害され得るという仮説を支持する。
【００４０】
結論として、ＴＮＰ−４７０は、肥満症マウスおよび正常マウスの両方において、除脂肪体重のレベルにまで、用量依存性での体重減少を引き起こした。これは、動物の出発体重とは独立した、食欲抑制および新脈管形成の阻害の両方の結果としてである。ＴＮＰ−４７０を用いて達成された体重減少の量は、フェンフルラミンを用いて達成されたよりもはるかに優れている。これらの結果は、肥満症の処置のための新脈管形成阻害の使用を支持する。さらに、ＴＮＰ−４７０の食欲抑制効果もまた確立される。
【００４１】
（実験手順）
（動物研究）
動物研究を、ＢｏｓｔｏｎにあるＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで、施設ガイドラインに従って実施した。雄のｏｂ／ｏｂ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスおよびＣ５７（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスを７週齢で購入し、そして実験前の１週間、順応させた（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウスを、水および標準的な固形飼料に自由に接近できるようにして、個々に収容した。取り扱いは、食餌規則の破壊を最小限にするために、午後４時から６時の間に行った。動物を、不快または苦痛を引き起こす手順の前に吸入メトキシフルオラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）で麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニタリングした。注射を容易にするために、マウスの背中を剃った。ＴＮＰ−４７０は、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｌｔｄ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）の好意により提供していただき、４０℃で乾燥保存した。溶液を正常生理食塩水中で毎日調製し、背面に沿って部位を変えながら皮下投与した。体重および給餌器内に残っている固形飼料を毎日測定した。動物をＣＯ2の連続吸入によって屠殺した。
【００４２】
用量応答研究  ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを２．５、５．０、７．５、または１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で２１日間処置した。コントロール群は、０．１ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０を受容した群には８匹のマウスが含まれ、そして他の全ての群にはそれぞれ４匹のマウスが含まれた。
【００４３】
病的肥満症マウスの処置  ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、急速成長期を完了し、そして６０ｇを超える体重になるまで収容した。約５ヶ月齢（ｎ＝６）で、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で処置を開始し、そして６７日間続けた。ｏｂ／ｏｂマウスの年齢適合コントロール群（ｎ＝６）は、０．１ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。
【００４４】
長期処置研究  ８週齢（ｎ＝６）のｏｂ／ｏｂマウスを、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で１３８日間処置した。コントロール群（ｎ＝４）は、０．１ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。正常な年齢適合Ｃ５７マウス（ｎ＝５）の体重を比較のために毎日記録した。
【００４５】
フェンフルラミンを用いる比較  ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、０．１ｍｌの生理食塩水中の４０ｍｇ／ｋｇ／日で４５日間腹腔内注射した（ｎ＝１２）。次いで、マウスを、均等に３群に分割し、そして以下のいずれかを行った：１）治療をとりやめる；２）フェンフルラミンで続ける；または３）１６８日の研究の残りの間、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０に変更した。ｏｂ／ｏｂマウスのコントロール群（ｎ＝４）は、０．１ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。
【００４６】
ペア給餌研究  固形飼料に自由に接近できる８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で処置した（ｎ＝４）。給餌器内に残っている固形飼料を毎日秤量し、各マウスによって１日あたりに消費された量を計算した。次いで、この食物量を、第二の未処置群（ｎ＝４）におけるペアのマウスに給餌した。固形飼料に自由に接近できる未処置マウスのコントロール群の食物消費もまた記録した。体重を毎日測定した。実験を、正常な年齢適合Ｃ５７マウス（ｎ＝５／群）を用いて繰り返した。ペア給餌実験をまた、このプロトコルの後にアンジオスタチンおよびエンドスタチンで処置したマウスを用いて行った。
【００４７】
ＴＮＰ−４７０での循環処置  ８週齢のｏｂ／ｏｂマウスを（ｎ＝１５）を、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０の断続的な周期で処置した。マウスは、４５ｇの体重で出発し、そして年齢適合Ｃ５７マウスの体重にそれらが減少するまで処置した。次いで、処置を中断し、そしてマウスを４５ｇの出発体重に戻るまで体重増加させた。この周期を２回繰り返した。ここでの再現性および６０ｇを超える体重のｏｂ／ｏｂマウスにおける効力を実証すると、次いで、処置群を、処置を再開する前に第三周期（１３５日目）で５９ｇの平均体重にまで増加させた。続いて、マウスを、ｏｂ／ｏｂ群の体重とＣ５７コントロール群の体重との間を循環させた。全てのマウスを毎日、重量測定した。
【００４８】
肥満症マウスのアンジオスタチンおよびエンドスタチン処置  組換えマウスエンドスタチンおよびアンジオスタチンを、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９４  Ｃｅｌｌ．７９：３１５−３２８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９７．Ｃｅｌｌ．８８：２７７−２８５により記載のように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉによって産生した。８週齢のｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝３／群）は、２０ｍｇ／ｋｇ／日でのもしくは１日に２回の５０ｍｇ／ｋｇでのアンジオスタチン、または１日に２回の５０ｍｇ／ｋｇでのエンドスタチンの皮下注射を２２日間受容した。ｏｂ／ｏｂマウスのコントロール群（ｎ＝３）は、０．１ｍｌ／日の生理食塩水を受容した。
【００４９】
体組成アッセイ  マウスの体組成を、トリチウム化水希釈技術（Ｌｏｇｓｄｏｎ、１９７２  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４４：１４６−１４９）を使用して評価した。ＴＮＰ−４７０（９０日目）を用いる長期処置研究からの５ヶ月齢の処置（ｎ＝６）動物およびコントロール（ｎ＝３）動物、および正常年齢適合Ｃ５７マウス（ｎ＝３）をこの研究のために使用した。マウスを、水に自由に接近できるようにして１２時間絶食させた。次いで、それらに２００μｌのトリチウム化水（１００μＣｉ／ｍｌ）を給水し、そしてさらに２時間絶食させ、トリチウムを水区画内で平衡させた。次いで、動物を麻酔し、２分間熱ランプ下に置き、尾部血管拡張を誘導した。０．５ｍｍの深さの切開を、＃１０手術刃を用いて基部から５ｍｍで、尾の腹側の長軸に対して垂直に行った。中枢尾動脈に傷を与えることを避けるために注意を払った。５０μｌの血液試料を尾静脈から血清分離バイアルに採集し、氷上に置いた。出血を切開全面を軽く圧迫することにより停止させた。トリチウム化水比活性を、Ｗａｌｌａｃ  １４０９液体シンチレーションカウンターを用いて、１０μｌの血漿および３ｍｌのＥｃｏｌｕｍｅシンチレーション液（ＩＣＮ；Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）を含有する試料において測定した。反復試料間の変動は、平均して１０％未満であった。所望のパラメーターを計算するために、以下の式を使用した：
【００５０】
【数１】
2011026332.tif 000007
血清の約９４％が水であるという事実のために補正するために、１．０６４の係数を使用した。２，０００の係数は、投与した用量中の総トリチウム化活性を計算するために必要とされる希釈係数である。
【００５１】
【数２】
2011026332.tif 000008
０．７３の係数は、死体の分析から得られるような、除脂肪体重で見出される総身体水分の平均パーセントである（Ｗｉｄｄｏｗｓｏｎら、１９６８）。
【００５２】
【数３】
2011026332.tif 000009
【００５３】
【数４】
2011026332.tif 000010
血清中グルコース測定  ９ヶ月齢の処置（ｎ＝５）および未処置（ｎ＝１３）ｏｂ／ｏｂマウスの血清中グルコースレベルを、体重応答研究の終了時に測定した。血液試料（１００μｌ）を、上述のように、麻酔したマウスの尾静脈から採集した。血清中グルコースレベルを、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｂｏｓｔｏｎの臨床化学実験室によって測定し、そしてｍｇ／ｄｌで表す。
【００５４】
（細胞培養研究）
ウシ毛管内皮細胞（ＢＣＥ）を、Ｆｏｌｋｍａｎら、１９７９  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５２１７−５２２１に以前に記載のようにして得た。ＢＣＥを、１．５％ゼラチンでコーティングした組織培養プレート上にプレートし、そして１０％ウシ胎児血清（ＢＣＳ）、１％グルタミン／抗生物質（ＧＰＳ）、および３ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）を含有するＤＭＥＭ中で培養した。ＢＣＥを、３７℃で１０％ＣＯ2中に維持し、そして０．５％トリプシン溶液を用いてコンフルエントで継代させた。３Ｔ３−Ｌ１細胞を、ＡＴＣＣから得、そして付随の指示書に従って維持した。３Ｔ３−Ｌ１を、抗生物質を含まない１０％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ中で培養し、そして未コーティングの組織培養プレート上にプレートした。細胞を、７０％コンフルエントのとき、脂肪細胞における分化を避けるために、０．５％トリプシン溶液を用いて継代した。
【００５５】
ウシ毛管内皮細胞増殖アッセイ  ＢＣＥを、増殖アッセイにおいて使用する前に５日間コンフルエントに維持した。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして０．０５％トリプシン溶液中に分散した。ＢＣＥを、１０％ＢＣＳおよび１％ＧＰＳを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁し（２５，０００細胞／ｍｌ）、そして１２，５００細胞／ウェル（０．５ｍｌ／ウェル）の密度でゼラチン処理した２４ウェル培養プレート上にプレートした。プレートを２４時間インキュベートした。培地を、最終濃度の２倍で試験試料を含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋５％ＢＣＳ＋１％ＧＰＳ）と置き換えた。インキュベーションの３０分後、２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地を添加した。次いで、ウェルは、１倍濃度の試験試料および１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと共に０．５ｍｌのアッセイ培地を含有した。インキュベーションの７２時間後、細胞をトリプシン中に分散させ、Ｈｅｍａｔａｌｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）中に再懸濁し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計数した。
【００５６】
３Ｔ３−Ｌ１細胞増殖アッセイ  ３Ｔ３―Ｌ１の細胞のサブコンフルエント培養物をＰＢＳで培養し、そして０．０５％トリプシン溶液中に分散させた。細胞を、１０％ＢＣＳを含有するＤＭＥＭ中に再懸濁し（１６，０００細胞／ｍｌ）、８，０００細胞／ウェル（０．５ｍｌ／ウェル）の密度で２４ウェル組織培養プレート上にプレートした。プレートを２４時間インキュベートした。培地を、最終濃度の２倍で試験試料を含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋５％ＢＣＳ）と置き換えた。インキュベーションの３０分後、２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有する０．２５ｍｌのアッセイ培地を添加した。次いで、ウェルは、１倍濃度の試験試料および１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦと共に０．５ｍｌのアッセイ培地を含有した。インキュベーションの７２時間後、細胞をトリプシン中に分散させ、Ｈｅｍａｔａｌｌ中に再懸濁し、そしてＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計数した。
【００５７】
（免疫組織化学）
脂肪組織切片における増殖細胞（Ｂｒｄｕ）および内皮細胞（フォン  ビルブラント因子；ｖＷＦ）の同時同定を可能にするために、二重蛍光標識化技術を使用した。脂肪組織を、冷Ｃａｒｎｏｙ固定液中に４時間固定し、そして１００％エタノールに移した。組織を、標準的な組織学的手順に従って、パラフィン中に包埋した。切片（５μｍ厚）を１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで、３７℃で２０分間、透過処理し、そしてＰＢＳで洗浄した。増殖細胞を標識化するために、切片を、抗Ｂｒｄｕ／ヌクレアーゼ混合物（Ｂｒｄｕ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、室温で６０分間インキュベートし、そしてＰＢＳで洗浄した。スライドを、フルオレセイン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｎｅ、ＣＡ）中に４℃で一晩インキュベートした。内皮を標識化するために、切片を、３０分間５％ウマ血清を用いてブロックし、次いでＰＢＳ中に５％ヤギ血清中に希釈したヒトフォンビルブラント因子（ＤＡＫＯ）に対するウサギ抗血清と共にインキュベートした。抗体結合を、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって検出した。染色切片を、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）で保存した。スライドを、ＦＩＴＣ励起について４８５ｎｍの青色光（Ｂｒｄｕ）、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ励起について５１０〜５６０ｎｍの緑色光（内皮）を使用してＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ＦＲＧ）を用いて分析した。写真をＥｃｋｔａｃｈｒｏｍｅ  ｐ１６００フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いて４０倍の倍率で撮影した。増殖内皮は、黄色細胞（緑＋赤）としてフィルム上に検出可能であった。
【００５８】
（統計学的分析）
片側スチューデントｔ検定を、処置群と未処置群との間の体重、体重脂肪パーセント、および血清中グルコースレベルの比較のために使用した。処置群とペア給餌群との間の比較を、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。
【００５９】
（結果）
（肥満症マウスおよび非肥満症マウスにおける体重増加）
これらの研究に使用した肥満症（ｏｂ／ｏｂ）マウスおよび非肥満症（Ｃ５７）マウスは共に、生存中の最初の数ヶ月の間に急速成長期および体重増加着を経験した。これは、動物の加齢につれて遅延した。しかし、ｏｂ／ｏｂマウスは、年齢適合コントロールに比較して、ずっとより速い速度で２〜３倍に体重を増加した。この差異は、過剰な脂肪組織の蓄積によって大部分は説明された。これらの研究において、８週齢のｏｂ／ｏｂマウスは、４４．６±０．７ｇの体重であり、０．４ｇ／日の平均速度で増加した（ｎ＝１２）。比較のために、正常な年齢適合Ｃ５７マウスは、２３．０±０．６ｇの体重であり、０．１ｇ／日の平均速度で増加した（ｎ＝５）。肥満症マウスは、３〜４ヶ月齢で３０ｇを超える最大体重を減少させたそれらの正常な対応のマウスと比較して、８〜９ヶ月齢で７０ｇより大きい最大体重に達した。
【００６０】
（新脈管形成インヒビターに対する肥満症マウスの体重応答）
ｏｂ／ｏｂマウスが体重を増加させる能力に対する新脈管形成インヒビターの効果を試験した。ＴＮＰ−４７０（選択的な新脈管形成インヒビター）を、肥満症マウスに、２．５、５．０、７．５、および１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で２１日間投与した。ＴＮＰ−４７０を受容した肥満症マウスは、一定速度で、一定期間の間、かつ用量に依存する程度に、体重を減少させた（図２）。体重減少の速度は、２．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量での０．５ｇ／日から、１０ｍｇ／ｋｇ／日以上の用量での最大１．２ｇ／日までの範囲であった（ｐ＜０．００００１）。比較のために、４日間カロリー摂取のないマウスで生じた体重減少の最大速度は、１．２ｇ／日であった。継続した処置にもかかわらず、マウスは、２．５ｍｇ／ｋｇ／日での１０日後には、４０．５±０．９ｇの範囲の体重で一様になるか、または降下した（ｐ＜０．００００１）。４５ｇの平均出発体重に対して、これは、ＴＮＰ−４７０の用量に依存して、４〜２５ｇの体重減少となった。対して、未処置マウスは、平均して９ｇの体重を増加し、本研究の終了時までに５３．８±０．６ｇの体重に達した。コントロールマウスの最終体重に対して、ＴＮＰ−４７０処置マウスは、１３〜３４ｇ少ない体重であった。
【００６１】
肥満症マウスの体重をまた、特異的新脈管形成インヒビターに応じて評価した。マウスを、２０ｍｇ／ｋｇ／日もしくは１日に２回の５０ｍｇ／ｋｇの用量のアンジオスタチン、または５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量のエンドスタチンで、２１日間処置した（図３）。コントロールマウスは、４５ｇの平均出発体重から０．４ｇ／日で増加し、２２日目までに５４．６±０．２ｇに達した。対して、新脈管形成インヒビターを受容するマウスは、体重を、相対的にわずかに増加したか、または減少した。アンジオスタチンに対する応答は用量依存性であった。２０ｍｇ／ｋｇ／日では、体重増加は、コントロールの３分の１に制限され、そしてマウスは、研究の終了時までに４８．５±１．１ｇに達した（ｐ＜０．０３）。１日２回の５０ｍｇ／ｋｇのアンジオスタチンでは、マウスは、４１．７±０．２ｇに減少し、そして水平に達した（ｐ＜０．０００４）。エンドスタチンで処置したマウスは、まず約２ｇ減少し、次いで２２日目までに、４８．９±０．８ｇまで徐々に増加した（ｐ＜０．００２）。最終コントロール体重に対して、処置マウスは、５〜１３ｇ少ない体重であった。
【００６２】
（ＴＮＰ−４７０での長期処置）
長期研究を、慢性療法に対する体重応答のパターンを決定するために実施した。マウスを、全部で１３８日間、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０で処置し、そして体重を毎日測定した（図４Ａ）。最初に、動物は、１．２ｇ／日の平均速度で体重を減少し、２０日目には２０．２±０．５ｇの最下点まで減少した。この後に、急速体重増加の限定された期間が続いた。体重は、本研究の５４日目までに約３２ｇで一様になり、次いで正常な年齢適合Ｃ５７マウスの成長曲線と平行になった
動物を、トリチウム化水希釈実験を実施するために、本研究の８９〜９０日目に全部で２４時間の期間、絶食させた。これは、全ての群において体重減少を生じた。しかし、処置マウスは、随意食餌に戻したにもかかわらず、この減少した体重を再増加しなかった。これは、曲線が急降下し、続いてより低い体重への傾斜が再確立されていることによって反映される。
【００６３】
本研究の終了時には、処置マウスは、３４．８±１．１ｇの体重であった。これに対して、コントロールｏｂ／ｏｂマウスは、７１．０±０．９ｇ（ｐ＜０．００００１）の体重であり、そして正常な年齢適合Ｃ５７マウスは、３３．１±０．７ｇの体重であった。処置マウスは、未処置マウスｏｂ／ｏｂよりも３６ｇ少ない体重であった。
【００６４】
（５ヶ月齢でのＴＮＰ−４７０に対する肥満症マウスの体重応答）
肥満症マウスが加齢するにつれて、マウスは、正常Ｃ５７マウスの２〜３倍の体重となり、そして体重増加の速度は減少し、ヒトにおける慢性肥満症（ＣｈｌｏｕｖｅｒａｋｉｓおよびＨｏｊｎｉｃｋｉ，１９７４）により類似するようになった。ＴＮＰ−４７０がこれらの条件下で同様に有効であるか否かを決定するために、ｏｂ／ｏｂマウスを急速成長期が完了するまで収容した。これらのマウスは、５ヶ月齢であり、実験開始時には６０ｇより多い体重であった。未処置マウスは、０．１ｇ／日の速度で体重を増加し、本研究の終了時までには７３．０±１．０ｇに達した。対して、処置マウスは、０．２ｇ／日の速度で、処理の４０日目までに３９．０±１．９ｇに減少し、そして本研究の６７日の期間一様であった（ｐ＜０．００００１）（図４）。正常なＣ５７マウスは、この齢で約３４ｇの体重であった。従って、これらのより高齢の、非常に肥満である、そしてより多くの体重の安定した動物は、ＴＮＰ−４７０に対して等しく応答性であった。
【００６５】
（ＴＮＰ−４７０で処置した肥満症マウスの身体組成）
正常動物における唯一の成長中の成体器官および新脈管形成部位として、肥満組織が抗新脈管形成療法に対して選択的に感受性であると仮定された。処置動物の体重が、出発体重または治療期間に関わらず、正常な年齢適合Ｃ５７マウスの近似の体重で一様になったという所見は、この仮説と一致した（図４Ａおよび４Ｂ）。トリチウム化水希釈技術を使用して、マウスの身体組成を評価し、体重減少が体脂肪パーセントにおける減少（Ｌｏｇｓｄｏｎ，１９７２）と関連するかどうかを決定した。ＴＮＰ−７４０（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で９０日間処置したマウス（図４Ａ）ならびに年齢適合ｏｂ／ｏｂマウスおよび正常Ｃ５７Ｂ１／６マウスを使用した。抗新脈管形成療法に応じた体重減少は、３５％から１９％への体脂肪パーセントの４６％減少と関連した（表２；ｐ＜０．００１）。
【００６６】
【表２】
2011026332.tif 000011
（ＴＮＰ−４７０で処置された肥満マウスの血清グルコースレベル）
ｏｂ／ｏｂマウスにおける病的肥満は、インスリン耐性および高血糖症の発達と関連する（ＣｏｌｅｍａｎおよびＨｕｍｍｅｌ，１９７３）。抗血管形成治療から生じる体重減少が、糖尿病の発症に対する保護をしたか否かを決定するために、血清グルコースレベルを、ＴＮＰ−４７０で１１５日間処置したｏｂ／ｏｂマウスおよび非処置コントロールにおいて測定した。非処置マウス（７３ｇ）は、２２４±１６ｍｇ／ｄｌという平均グルコースレベルを有していた。対照的に、ＴＮＰ−４７０で処置したｏｂ／ｏｂマウス（４１ｇ）は、１５８±１２．６ｍｇ／ｄｌ（ｐ＜０．０５）の平均グルコースレベルを有していた。これは、この種について報告された６２〜１７５ｍｇ／ｄｌの正常範囲内にある（ＨａｒｋｎｅｓｓおよびＷａｇｎｅｒ，１９９５  Ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔｓ  ａｎｄ  ｒｏｄｅｎｔｓ．  Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  Ｂｏｏｋｓ．Ｍｅｄｉａ，ＰＡ．９３頁）。
【００６７】
【表３】
2011026332.tif 000012
（肥満マウスのＴＮＰ−４７０での循環処置）
正常組織増殖のこのモデルにおいて抗血管形成治療の可逆性および再現性を実証するために、ｏｂ／ｏｂマウスを、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量でのＴＮＰ−４７０の断続的なサイクルによって処置した（図４Ｃ）。４５ｇの体重で開始したマウスを、それらが齢の一致するＣ５７マウスの体重まで低減するまで処置した。次いで、処置を中止し、そしてそのマウスを４５ｇの開始体重まで戻させた。このサイクルを２回繰り返した。ここで再現性および６０ｇを超える体重のｏｂ／ｏｂマウスにおける効力を実証したので（図４Ｂ）、次いで、処置を再度開始する前に第３のサイクル（１３５日目）において、処置グループに約６０ｇまで体重を増加させた。これは、継続する研究であり、そしてそのマウスは、ｏｂ／ｏｂグループの体重とＣ５７コントロールグループの体重との間の体重を循環する。治療をやめたときの体重増加速度は、コントロールの体重増加速度よりも大きかった。加速された体重増加が、カロリー制限研究後に、通常の肥満体重が確立されるまで、これらの動物において以前に報告されている（Ｃｈｌｏｕｖｅｒａｋｉｓ，１９７０）。処置マウスは、ＴＮＰ−４７０を受けている間同様に、そして繰り返し減少し、そして薬物を中止したときに再び増加した。
【００６８】
（ＴＮＰ−４７０のフェンフルラミンに対する比較）
ＴＮＰ−４７０に応答しての体重減少を、食欲不振効果を有するセロトニン取込み阻害剤であるフェンフルラミンの体重減少と比較した（図５）。高治療用量（４０ｍｇ／ｋｇ／日）のフェンフルラミンで処置した肥満マウスは、治療の最初の５日間で４〜５ｇ減少した（ｐ＜０．００５）。その後、それらは継続的な処置にもかかわらず徐々に体重を再び増加し始めた。研究の４５日目に、そのフェンフルラミン処置マウスを、３つのグループに分割し、そして１）治療から外すか、２）フェンフルラミンで継続するか、または３）１０ｍｇ／ｋｇ／日のＴＮＰ−４７０に変更するかのいずれかとした。９４日目までに、コントロールマウスは、体重６５．８±１．４ｇであった；フェンフルラミンから外したマウスは、体重６５．６±１．４ｇであった；そして、フェンフルラミンで継続したマウスは、体重６２．４±１．９ｇであった。これらのグループのいずれの間においても有意な差異は存在しなかった。対照的に、マウスのサブグループにおいてＴＮＰ−４７０でフェンフルラミンを置換することによって、正常Ｃ５７マウスの体重である３８．５±０．７ｇまで減少させた（ｐ＜０．０００００１）。これは、マウスの外観によりさらに説明された。非処置ｏｂ／ｏｂマウスは、フェンフルラミンで処置したマウスとは容易に区別できないのに対し、ＴＮＰ−４７０を受けているマウスは、それらのＣ５７対応物と同じ大きさである。
【００６９】
（肥満マウスにおけるＴＮＰ−４７０での長期処置の耐性）
ＴＮＰ−４７０での処置は、これまでのところ、１３８日までの期間、１０ｍｇ／ｋｇ／日までの用量に非常によく耐性であった。これは、その動物の寿命の約１／５である。注目された唯一の有害な効果は、薬物の繰り返し注射の部位での中等度の表面的な瘢痕である。食欲は、処置の最初の１０〜２０日間中等度に抑制され、次いで徐々に正常化した。処置マウスの活動レベルは、Ｃ５７マウスの活動レベルと同様であり、そしてコントロールｏｂ／ｏｂマウス（これらは体重が増加するにつれて不活発になった）とは対照的であった。
【００７０】
結論として、これらの研究は、抗血管形成治療が、３つの異なる血管形成インヒビターを用いて、遺伝的に肥満のマウスにおいて有意な体重減少および体脂肪の減少をもたらすことを実証した。これは、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）およびエンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）の不活性な調製物が、体重に影響を及ぼさなかった実例によりさらに実証された。以下の一連の実験は、そのメカニズムを決定することに関した。食欲および末梢組織に対する効果が調査されている。その結果を以下に要約する。
【００７１】
（血管形成インヒビターで処置された肥満マウスを用いた対の給餌研究）
ＴＮＰ−４７０処置マウスの体重に対する食欲の効果を、対の給餌実験において単離した。各処置マウスによって毎日消費される正確な量の餌を、非処置グループの対のマウスに与えた（図６Ａおよび６Ｂ）。対のマウスの体重を使用して、処置動物における食欲の変化の効果を単離しそして測定した。ＴＮＰ−４７０を受けている肥満マウスは、処置の最初のおよそ１８日間は、より少なく食べた。これは、最初の体重減少の５６％を説明した。その後、食欲は、処置を続けた（１３８日まで）にも関わらず、対のマウスのコントロール体重に近づくまでの着実な増加に反映されるように、徐々に正常になった。食欲不振効果が同じ動物において可逆的であり、そして再現性があるか否かを決定するために、マウスの１グループを、ＴＮＰ−４７０の断続的なサイクルで処置し、対の給餌グループを用いて、食欲の変化の影響を追跡した（図６Ａ）。ＴＮＰ−４７０を２０日間受けたマウスを、１５日間治療から外し、次いで２回目に３６日間処置した。食欲不振効果は、ＴＮＰ−４７０への最初の曝露の間にのみ存在した。治療の２回目のサイクルの間に、処置された動物は、体重を減少させたが、対で給餌したマウスの体重の着実な増加によって反映されるように、食欲は維持した。食欲は、２回目のサイクルの間の、処置マウスと非処置マウスとの間のわずか１７％の体重の差を説明するに過ぎなかった。食欲不振のメカニズムは、未だ決定されていない。
【００７２】
２０ｍｇ／ｋｇ／日で、エンドスタチンまたはアンジオスタチンと関連する食欲不振効果は存在しない。１日２回、５０ｍｇ／ｋｇでのアンジオスタチンは、全体重減少の２０％未満を占める、食欲のわずかな減少と関連した。
【００７３】
（ＴＮＰ−４７０で処置した正常Ｃ５７マウスでの対の給餌研究）
ＴＮＰ−４７０で処置した正常Ｃ５７マウスもまた、体重を減少させた（図６Ｂ）。この場合、ほとんど全ての最初の体重の減少は、対で給餌したマウスによって反映されるように、食欲の減少に起因した。食欲不振効果は、約８日続き、その後処置マウスの食欲は、徐々に増加し、そして対のマウスは体重を増加させた。処置マウスは、コントロール体重の平均８５％まで減少した（ｐ＜０．００００１）。これは、同じ用量のＴＮＰ−４７０でのｏｂ／ｏｂマウスにおいて観察されたもの（コントロール体重の５６％）よりも有意に少ない。これは、これらの正常動物がずっと低い体脂肪パーセントを有する事実を反映し得、これはこの治療の選択的な標的であるようである。
【００７４】
食欲によって説明されない処置動物における体重の減少は、組織レベルでの周辺効果の結果である可能性が最も高い。この結論は、ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７の両方のマウスの体重増加が、血管形成インヒビターによって制限されるという観察によってさらに支持される。処置マウスは、対で給餌されたグループにおいて体重の増加を引き起こすのに十分な増加した食料消費にもかかわらず、比較的わずかに増加した。
【００７５】
（肥満マウスおよび正常マウスの脂肪組織における内皮細胞増殖）
脂肪組織の増殖が内皮細胞増殖と関連しているか否かを決定するために、処置および非処置のｏｂ／ｏｂマウスおよび正常Ｃ５７マウス由来の皮下脂肪組織切片を試験した。二重蛍光染色手順を使用して、内皮細胞および任意の増殖細胞の両方を同時に同定した。内皮細胞マーカーであるフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）を赤色蛍光タグで染色し、そして増殖細胞中のＢｒｄｕを緑色蛍光タグで染色した。増殖する内皮細胞を、両方のタグで染色し、そして黄色に呈色させた。
【００７６】
正常Ｃ５７マウスの脂肪組織は、赤に染まった細胞が多量にあることから示されるように、細胞比較的小さな脂肪細胞および高密度の内皮細胞を含んでいた。増殖する内皮細胞はまた、時々観察された（黄色の細胞）。非処置の肥満マウスの脂肪組織は、多数の増殖する内皮細胞を含有していた。内皮細胞の密度は、肥満マウスにおける大きなサイズの介在脂肪細胞によって希釈された。処置ｏｂ／ｏｂマウスの脂肪組織は、血管形成の阻害と一致して、内皮細胞の百分率は低く、そして増殖している細胞は稀である拡張された蛇行微細血管を含んでいた。ＴＮＰ−４７０を１週間止めた肥満マウス由来の組織切片もまた試験した。これらの動物は、コントロールよりも速い速度で体重を増加させた。内皮細胞の密度は、正常脂肪組織の密度よりも顕著に低かった。しかし、増殖細胞は豊富に存在する。増殖する内皮細胞（黄色）および非内皮細胞（緑）が存在する。処置動物にて観察されたものと同様に、拡張された微細血管もまた観察された。
【００７７】
（ＴＮＰ−４７０に応答した内皮細胞および３Ｔ３−Ｌ１細胞の増殖）
ＴＮＰ−４７０が前肥満細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｏ）に対して直接的効果を有し得るか否かを決定するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を使用して増殖アッセイを行った。この細胞株は、インビボで脂肪細胞の寄与のほとんどを有する（Ｇｒｅｅｎ  １９７８．Ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ．１０ｔｈ  Ｍｉａｍｉ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ．  Ａｈｍａｄ  Ｆ，  Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｊ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｔ，Ｗｅｒｎｅｒ  Ｒ（編）。Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１３頁）。細胞を、ＴＮＰ−４７０濃度の範囲で７２時間インキュベートし、続いて計数した。ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥ）と比較した。内皮細胞増殖の細胞増殖抑制阻害の最大半値は、約１００ｐｇ／ｍｌであった。対照的に、１０μｇ／ｍｌのＴＮＰ−４７０が、３Ｔ３−Ｌ１培養において、同程度の阻害のために必要とされた。
【００７８】
（結論）
これらの研究は、脂肪組織の増殖および質量が、血管形成依存的であること；血管形成インヒビターが体重および脂肪組織質量を減少させること；抗血管形成剤での体重の減少が用量依存的であり、可逆的であり、そして開始体重にかかわらず起きること；体重減少が、試験された全ての血管形成インヒビターで達成されたこと；ＴＮＰ−４７０が食欲の一過性の減少を生じること；血管形成インヒビターでの長期処置が十分に耐性であること；血管形成インヒビターでの病的な肥満の処置が高血糖を予防することを実証した。
【００７９】
（実施例３：血管形成インヒビターを使用しての心肥大を有する動物の処置）
（モデル）
慢性的に上昇した甲状腺ホルモンレベルは、心臓の容量過剰負荷をもたらし、これは動物およびヒトの両方において遠心性心肥大を導く（Ｏｓｌｅｒ  Ｗ．１８９２．Ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｄ．Ａｐｐｅｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７１２−７１４頁）。心筋肥大は、通常、冠状血管系の異常および最終的な心室機能の損失と関連する（ＴｏｍａｎｅｋおよびＨｏｖａｎｅｃ，１９８１  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１３：４７１−４８８；Ｆｒｉｂｅｒｇ，１９８８  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２２：３２９−３３９）。しかし、甲状腺ホルモン誘導性の心肥大は、増強された心室機能および支持している微細血管系の増殖が、頻繁に存在する点で独特である（Ｔｏｍａｎｅｋら、１９９８  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．８２：５８７−５９３）。心筋肥大のこのモデルにおける心臓組織の増殖は、血管内皮によって媒介され得、そして血管形成インヒビターの使用によって抑制され得ることが仮定された。このような知見の意味は、正常な心臓質量および機能の調節因子としての血管内皮の役割に関連する。
【００８０】
（方法）
動物研究を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎにおいて施設のガイドラインにしたがって行った。雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、６週齢で購入し、実験の前に１週間環境に順応させた（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウスを一緒にかごの中に入れ、そして水および標準的な餌へのアクセスを自由にした。動物を、不快感または苦痛を引き起こす手順の前に、メトキシフルラン（ｍｅｔｈｏｘｙｆｌｕｏｒａｎｅ）を吸入させて麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニターした。毛を剃って、注射を容易にした。マウスをサイロニン（０．２ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）で１２日間処置し、心肥大を引き起こした。さらに、マウスは、生理食塩水またはＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのいずれか）の皮下注射を一日おきに同時に受けた（ｎ＝３／グループ）。結果を生理食塩水単独（サイロニンなし）で処置したコントロールと比較した。研究の最後に動物の体重を計り、そして頸椎脱臼により屠殺した。心臓を迅速に取り出し、そして未だ脈打っている間に、残存する血液を出してその臓器を空にするために暖かい緩衝液中に置いた。心室から、大動脈（ｇｒｅａｔ  ｖｅｓｓｅｌ）、房、および結合組織をきれいに切開して除き、そして室を開口した。組織をふきとって乾かし、そして計量した。心室の重量を体重に対して正規化し、そして体重のパーセントとして表した。
【００８１】
（結果）
サイロニン処置は、心肥大をもたらし、心室重量を体重の０．３８％から０．５８％まで増大させた。この効果は、ＴＮＰ−４７０によって、用量依存的様式で鈍らされた（図７）。２０ｍｇ／ｋｇのＴＮＰ−４７０用量で、サイロニン処置で達成された心室重量は、体重の０．５１％で、コントロールよりも顕著に少なかった（Ｐ＜０．０５）。さらに、これらの数値は、１２日の研究の間に、ＴＮＰ−４７０を受けているマウスにおいて１〜２ｇの体重減少があったことを考慮すると、ＴＮＰ−４７０の効果を過小評価している可能性がある。重量の減少は、脂肪組織質量の減少から生じる。しかし、処置動物の心臓サイズは、それらのより高い開始重量について適切であることが期待される。これを証明するための研究が進行中である。試験された用量は、これまでのところ、マウスの癌を処置するために代表的に使用される用量よりも２／３少ない。肥大のより大きな減少が、より高い用量で予想される。
【００８２】
（実施例４：腸管ポリポーシスの血管形成インヒビターでの処置）
（モデル）
ＡｐｃMinマウスは、腸管腺腫様ポリープのモデルとして役立つ。Ｍｉｎ（多発性腸腫瘍症）は、ネズミＡｐｃ（腺腫様結腸ポリポーシス）遺伝子におけるエチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）誘導性変異である（Ｍｏｓｅｒら、１９９０）。これは、家族性腺腫様ポリープまたはガードナー症候群を有するヒトのＡＰＣ遺伝子における生殖系列変異に類似する（Ｊｏｓｌｙｎら、１９９１  Ｃｅｌｌ．６６：６０１−６１３）。これらは、腸管ポリープによって特徴付けられる遺伝性の状態であり、最終的に癌に形質転換する。ＡＰＣは散発性のヒト結腸癌においてもまた最も頻繁に変異した遺伝子である（Ｎｉｓｈｉｓｈｏら、１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３：６６５−６６８）。
【００８３】
異型接合性のＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｍｉｎ／＋マウスは、その寿命の間の経過にわたって、腸管全体を通して３０〜６０の腺腫を自然に発達させる（Ｍｏｓｅｒら、１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４７：３２２−３２４）。ポリープはサイズが増大し続け、最終的には、約１２０日齢までにその動物は死に至る。
【００８４】
これらの前新生物病変の増殖は、血管内皮に依存し、そして血管形成インヒビターの使用によって抑制され得ると仮定された。
【００８５】
（方法）
動物研究を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎにおいて施設のガイドラインにしたがって行った。雄のＭｉｎ／＋（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスを、６週齢で購入し、そして実験の前に１週間環境に順応させた（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウスを一緒にかごの中に入れ、そして水および標準的な餌へのアクセスを自由にした。動物を、不快感または苦痛を引き起こす手順の前に、メトキシフルラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）を吸入させて麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニターした。毛を剃って、注射を容易にした。
【００８６】
ＴＮＰ−４７０を乾燥状態で４０℃で保存した。溶液を通常の生理食塩水中に新たに調製し、そして背中に沿って回転する部位に皮下投与した。マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＰ−４７０で一日おきに１または３週間処置した（ｎ＝３／グループ）。コントロールグループは、一日おきに０．１ｍｌの生理食塩水を受けた（ｎ＝３）。
【００８７】
餌を、各研究を終える前の１２時間差し控え、腸管をきれいにした。動物をＣＯ2の連続的な吸入によって屠殺した。腸管の全てを取り出し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水で流した。腸を長軸方向に切り開き、そして管腔表面を、解剖顕微鏡を使用して（倍率１８×）、ポリープの数、サイズ、および位置について試験した。組織サンプルを緩衝化ホルマリン（ｆｏｒｍａｌｙｎ）中で固定し、そしてパラフィン中に包埋した。切片を、組織学的評価のためにＨ＆Ｅで染色した。
【００８８】
（結果）
腸管ポリープの数およびサイズは、血管形成インヒビターで処置されたＭｉｎ／＋マウスにおいて有意に減少した。３週間の処置の後、コントロールマウスは、２３±１．５のポリープを有していたが、一方ＴＮＰ−４７０処置マウスは、８±１．７のポリープを有していた（図８Ａ）。これは、６６％の減少である（ｐ＜０．０５）。コントロールマウスにおけるポリープの直径は、平均で１．９０±０．８６ｍｍ（０．０７５〜０．４２５ｍｍの範囲）であった（図８Ｂ）。対照的に、処置マウスにおけるポリープの直径は、平均で１．０２±０．４０ｍｍ（０．０５〜０．１７５ｍｍの範囲）であった。
【００８９】
コントロールマウス由来のポリープの組織学的検査は、顕著な細胞異形成および多数の海綿状血管を示した。病変は、倍数体であり、粘膜から管腔へと、そして場合によっては臓側面を通って外側へと広がっていた。対照的に、処置マウス由来のポリープは、周囲の粘膜との形態学的な類似性を保持しており、形成異常の細胞がより少なく、そして血管はより少なく、より小さかった。
【００９０】
（結論）
腸管腺腫様ポリープの発生、増殖、そしておそらく形質転換は、血管形成に依存し、そして血管内皮によって調節されている。
【００９１】
（実施例５：子宮内膜症を有する動物の処置。血管形成インヒビターを使用する。）
（モデル）
全ての月経のある女性の５０％までが、子宮内膜症に罹患し得る（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰｒａｔｔ、１９７７  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  １２９：２４５）。ヒト子宮内膜症は、齧歯類モデルにおいて外科的に模倣され得る（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＭｅｔｃａｌｆ，１９９６  ＰＳＥＢＭ．２１２：３３２）。研究を、これらの組織インプラントの増殖が、血管内皮に依存するか否か、および血管形成インヒビターの使用により抑制され得るか否かを試験するために設計した。
【００９２】
（方法）
動物研究を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡにおいて施設のガイドラインにしたがって行った。雌のマウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１）を、８週齢で購入し、実験の前に１週間環境に順応させた（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。マウスを一緒にかごの中に入れ、そして水および標準的な餌へのアクセスを自由にした。動物を、不快感または苦痛を引き起こす手順の前に、メトキシフルラン（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ）を吸入させて麻酔し、そして完全に目覚めるまでモニターした。毛を剃って、注射を容易にした。
【００９３】
ＴＮＰ−４７０を乾燥状態で４０℃で保存した。溶液を通常の生理食塩水中に新たに調製し、そして背中に沿って回転する部位に皮下投与した。マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＴＮＰ−４７０で一日おきに３週間処置した（ｎ＝４／グループ）。コントロールグループは、一日おきに０．１ｍｌの生理食塩水を受けた（ｎ＝３）。
【００９４】
無菌技術を使用して、マウスを麻酔し、そして腹部の毛を剃った。腹部中央で切開し、そして左の子宮角を露出させ、そして両方の末端を結紮した。子宮角を切り出し、暖かい培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２）に置き、そして長軸方向に沿って切り開いた。組織切片を、皮膚パンチ生検（ｄｅｒｍａｌ  ｐｕｎｃｈ  ｂｉｏｐｓｙ）を使用して２ｍｍの直径に切った。その組織切片を腸間膜（４切片／動物）上に置いた。インプラントをフィブリングルー調製物で適所に固定した。腹部の切開を閉じ、そしてそのマウスを４８時間回復させた。その後、そのマウスを各々４匹のマウスからなる２つのグループに分割した。コントロールグループを生理食塩水で処置した。処置グループは、ＴＮＰ−４７０（１０ｍｇ／ｋｇ、一日おき）を受けた。動物を、手術の３週間後、ＣＯ2の連続的な吸入により屠殺した。腹膜腔を子宮内膜組織について検査した。組織を計数し、そして直径をカリパスを使用してｘおよびｙ次元において測定し、平均化した。
【００９５】
（結果）
子宮内膜組織のサイズは、血管形成インヒビターで処置したマウスにおいて減少していた。処置の３週間後、図９に示すように、コントロールマウスの子宮内膜組織は２．９±０．４ｍｍと測定され、一方ＴＮＰ−４７０で処置したマウスの子宮内膜組織は、１．９±０．５ｍｍと測定された。組織インプラントの数は、２つのグループの間で類似していた。
【００９６】
（結論）
データは、腹膜腔中に移植された子宮内膜組織の増殖が、血管形成インヒビターによって抑制されることを示す。このパイロット研究で使用されたＴＮＰ−４７０の用量は、確立された腫瘍用量の１／３である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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