(57)【要約】【課題】本発明の目的は、フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の安定化方法、及び安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液を提供することにある。【解決手段】（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液に、（Ｂ）界面活性剤、並びに（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸及びそれらの塩から選ばれるキレート剤を含有させることを特徴とするフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の安定化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液に、（Ｂ）界面活性剤、並びに（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸及びそれらの塩から選ばれるキレート剤を含有させることを特徴とするフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の安定化方法。
【請求項２】
（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤、（Ｂ）界面活性剤、並びに（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸及びそれらの塩から選ばれるキレート剤を含有することを特徴とする安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の長期保存安定化方法及び安定化された水溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査試薬に代表される生化学試薬では、酵素反応を利用して、標的成分から直接又は２次的に生成させた過酸化水素と酸化発色剤との反応により形成された色素を比色定量することにより、標的成分を測定する試薬が多く開発され、市販されている。ここで用いられる酸化発色剤としては、４−アミノアンチピリンのようなカップラー試薬とフェノール系やアニリン系のような水素供与体の組み合せからなるものと、カップラー試薬を必要としないロイコ型発色試薬等が知られている。
【０００３】
これらの酸化発色剤のうち、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウムに代表されるフェノチアジン系酸化発色剤は、分子吸光係数が高いことから、高感度の測定が可能である（特許文献１）。
【特許文献１】特開昭６３−２４６３５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、フェノチアジン系酸化発色剤を水溶液の状態で保存した場合、自動的に酸化されて着色してしまい、ブランク値が上昇してしまうという問題がある。臨床検査試薬としては、水溶液で供給することが広く行なわれていることから、フェノチアジン系酸化発色剤の水溶液状態での安定化手段の開発が強く望まれていた。
従って、本発明の目的は、フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の安定化方法、及び安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、フェノチアジン系酸化発色剤の水溶液状態での安定化を図るべく種々検討したところ、界面活性剤の添加に加えて、さらにキレート剤の中でも特定のキレート剤を併用することにより、フェノチアジン系酸化発色剤の自動酸化が顕著に抑制され、長期間安定なフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液試薬が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液に、（Ｂ）界面活性剤、並びに（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸及びそれらの塩から選ばれるキレート剤を含有させることを特徴とするフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の安定化方法を提供するものである。
また、本発明は、（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤、（Ｂ）界面活性剤、並びに（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸及びそれらの塩から選ばれるキレート剤を含有することを特徴とする安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、界面活性剤の添加では十分でなかったフェノチアジン系酸化発色剤の水溶液中での安定性が顕著に改善される。本発明の安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液を用いれば、長期保存後もブランク値の上昇が抑えられる結果、校正の間隔を長くすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、フェノチアジン系酸化発色剤含有水溶液の安定化方法に関する。（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤としては、フェノチアジン骨格を有する一剤式の酸化発色剤が挙げられ、具体的には、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ−６７，和光純薬工業（株）製）、１０−（メチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ、同仁化学研究所（株）製）、１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３−ジメチルアミノ−７−ヒドロキシ−１０Ｈ−フェノチアジン等が挙げられるが、このうちＤＡ−６７及びＭＣＤＰが特に好ましい。
【０００９】
本発明の水溶液中のフェノチアジン系酸化発色剤の濃度は、通常発色試薬として用いる濃度であれば特に限定されないが、５〜１,０００μＭ、特に１０〜１００μＭが好ましい。
【００１０】
本発明に使用する（Ｂ）界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでもよく、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。
【００１１】
これらの非イオン性界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルの具体例としては、例えばテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルアミンの具体例としては、例えばポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられる。脂肪酸アルカノールアミドの具体例としては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられる。ショ糖脂肪酸エステルの具体例としては、例えばショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。これらの非イオン性界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが特に好ましい。
【００１２】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられる。このうち、脂肪族アミン塩としては、モノラウリルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられる。脂肪族４級アンモニウム塩としては、ラウリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等の塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。これらの陽イオン性界面活性剤のうち、脂肪族４級アンモニウム塩が特に好ましい。
【００１３】
陰イオン性界面活性剤としてはカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩等が挙げられる。このうち、カルボン酸塩としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的には例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。スルホン酸塩としては、ラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフチレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等の塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。硫酸エステル塩としては、ラウリル硫酸エステル等の高級アルコール硫酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルと、ナトリウム、アンモニウム等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等の高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。リン酸エステル塩としては、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩等が挙げられ、具体的には例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。
【００１４】
これらの陰イオン性界面活性剤のうち、スルホン酸塩、硫酸エステル塩が好ましい。
【００１５】
両性界面活性剤としては、例えばカルボキシベタイン類、スルホベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類等が挙げられる。このうちカルボキシベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。スルホベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられる。グリシン類の具体例としては、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられる。２−アルキルイミダゾリンの誘導体類の具体例としては、２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。アミンオキサイド類の具体例としては、ラウリルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。これらの両性界面活性剤のうち、ラウリルベタイン類が特に好ましい。
【００１６】
これらの（Ｂ）界面活性剤は１種又は２種以上を用いることができ、本発明水溶液中に、フェノチアジン系酸化発色剤の安定化の点から０.０１〜５（w/v）％、特に０.１〜２（w/v）％含有するのが好ましい。
【００１７】
本発明に使用されるキレート剤の具体例としては、（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＧＥＤＴＡ）、及びそれらの塩から選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、及びそれらの塩から選ばれる１種以上が、フェノチアジン系酸化発色剤の安定効果の点で特に好ましい。
【００１８】
これらの（Ｃ）キレート剤は、フェノチアジン系酸化発色剤安定化効果の点から、本発明水溶液中に０.０１〜１,０００μＭ、さらに０.１〜１００μＭ、特に０．５〜２０μＭ含有するのが好ましい。
【００１９】
本発明の水溶液には、pHを調整するため緩衝剤を配合していてもよい。このような緩衝剤としては、pHを５〜８に維持することができるリン酸、グリシン、トリス、グッド等の緩衝剤を挙げることができる。より好ましくは、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳが挙げられる。これらの緩衝剤の濃度は１〜１,０００ｍＭ、さらに２０〜１００ｍＭが好ましい。
【００２０】
本発明の安定化された水溶液には、さらに目的に応じて、酵素、酵素活性化剤、抗体、防腐剤等を配合することができる。
【００２１】
本発明の水溶液は、フェノチアジン系酸化発色剤の自動酸化が抑制されているので、あらゆる種類の酸化発色系の比色定量試薬として使用できる。好ましくは、酵素反応を利用して、標的成分から直接又は２次的に過酸化水素を生成させる反応系に広く利用することができる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
フェノチアジン系酸化発色剤１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ−６７）を２０μＭ及び後記の界面活性剤１（w/v）％含有する水溶液に、１０μＭになるように各種キレート剤を添加して、４５℃で２日保存後、自動分析装置Ｈ７１７０で６６０nmの吸光度を測定した。ＤＡ−６７水溶液（界面活性剤やキレート剤を添加しない場合）の吸光度を１００とした時の吸光度の割合を図１、２に示す。
【００２４】
図１、２から明らかなように、４５℃で２日保存によるフェノチアジン系酸化発色剤の吸光度の上昇（着色）は、界面活性剤〔ラウリルベタイン（アンヒトール２４Ｂ（花王（株）製））、又はアルカンスルホン酸ナトリウム（ラテムルＰＳ（花王（株）製））〕だけでは十分に抑制されず、またエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）やイミノジ酢酸（ＩＤＡ）の添加によっても十分に抑制できない。
【００２５】
これに対し、界面活性剤にジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、あるいはビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸を併用した場合に、充分に吸光度の上昇（着色）が防止できることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】界面活性剤(アンヒトール２４Ｂ)共存下において、界面活性剤を添加しない場合(対照)の吸光度(６６０ｎｍ)を１００とした時の吸光度の割合を示す。
【図２】界面活性剤(ラテムルＰＳ)共存下において、界面活性剤を添加しない場合(対照)の吸光度(６６０ｎｍ)を１００とした時の吸光度の割合を示す。
【図１】
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【図２】
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