(57)【要約】      （修正有）【課題】シリンガアルデヒド、パニリン、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド等のリグニン由来の芳香族アルデヒドを効率よく酸化して対応する合成繊維やプラスチックの原料である芳香族カルボン酸に変換する新規遺伝子、新規タンパク質、及び該芳香族カルボン酸の製造法を提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。；該タンパク質をコードする遺伝子；及び、芳香族カルボン酸の製造法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１もしくは３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号２もしくは４に示す塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、該培養物からベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの製造法。
【請求項７】
芳香族アルデヒドに、請求項６に記載の製造法によって得られたベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させることを特徴とする、芳香族カルボン酸の製造法。
【請求項８】
前記芳香族アルデヒドが、ｐ-ヒドロキシベンズアルデヒド、ｍ-アニスアルデヒド、ベラトラアルデヒド、4-ヒドロキシ-3-メトキシ-シンナムアルデヒド及びシリンガアルデヒドからなる群より選ばれる、請求項７に記載の製造法。
【請求項９】
芳香族アルデヒドの存在下、請求項５に記載の形質転換体を培養し、該培養物から芳香族カルボン酸を採取することを特徴とする、芳香族カルボン酸の製造法。
【請求項１０】
前記芳香族アルデヒドが、ｐ-ヒドロキシベンズアルデヒド、ｍ-アニスアルデヒド、ベラトラアルデヒド、4-ヒドロキシ-3-メトキシ-シンナムアルデヒド及びシリンガアルデヒドからなる群より選ばれる、請求項９に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芳香族アルデヒドを酸化し、対応するカルボン酸に変換する新規な酵素、それをコードする遺伝子、この遺伝子を導入した微生物に関する。また、本発明は、この遺伝子が導入された微生物を利用する、芳香族アルデヒドから対応するカルボン酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
芳香族カルボン酸は、合成繊維やプラスチックの原料として有用である。例えば、ヒドロキシエチルバニリン酸は、そのメチルエステルを縮合させることにより合成繊維を製造することができる。
【０００３】
微生物を使って芳香族カルボン酸を生産する方法として、芳香族アルデヒドを連続的に供給しながらシュードモナス属細菌を培養する方法が知られている（特許文献１）。
【０００４】
また、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のTOLプラスミドpWWOにコードされているxyIC遺伝子、アシネトバクター・カルコアセチカアス（Acinetobacter calcoaeticus）NCIB 8250のxyIC遺伝子又はスフィンゴモナス（Sphingomonas）属14DN61株のphnN遺伝子がコードする酵素は、ベンズアルデヒドを安息香酸に変換することが知られている（特許文献２、３）。更に、トルエン資化細菌ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis）PR4株由来の芳香族アルコールデヒドロゲナーゼは、ベンズアルデヒド又はヒドロキシメチルナフタレンを対応するカルボン酸まで変換することが報告されている（特許文献３）。
【０００５】
一方、本発明者らは、リグニン由来の芳香族アルデヒドであるシリンガアルデヒド、バニリン等から、バイオリアクターを用いて、多段階の酵素反応により、2H-ピロン2-オン-4,6-ジカルボン酸（PDC）を製造する方法を報告している（例えば、特許文献４）。この多段階の酵素反応の内、バニリンからバニリン酸への酸化反応、又はシリンガアルデヒドからシリンガ酸への酸化反応には、スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）SYK-6由来の「ligV」と称されるベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が関与している。なお、PDCは、その二官能性から、現在、各種の生分解性ポリマーへの応用や、塗料、接着剤等への適用が検討されている有用な化合物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2000-60586号公報
【０００７】
【特許文献２】WO 2006/016432
【０００８】
【特許文献３】特開2006-345744号公報
【０００９】
【特許文献４】特開2005-278549号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記の酵素は、特定の芳香族アルデヒドを効率よく酸化するが、必ずしもすべての芳香族アルデヒドに対しては十分な酸化能を示さない。特に、リグニン由来の分解物の発酵生産によってPDCを効率良く製造するためには、シリンガアルデヒド、バニリン、p-ヒドロキシベンズアルデヒド等のリグニン由来の芳香族アルデヒドを効率よく酸化する酵素が必要である。
そこで、本発明は、種々の芳香族アルデヒドを効率良く酸化して対応する芳香族カルボン酸に変換する酵素をコードする遺伝子、及び該酵素、並びに該芳香族カルボン酸の製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、斯かる現状に鑑み鋭意検討した結果、スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）SYK-6株由来の新規なベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を見出し、該遺伝子によってコードされるベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼが様々な芳香族アルデヒドを対応するカルボン酸に変換できることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、（１）本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１もしくは３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
（２）本発明は、（１）に記載のタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
（３）本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号２もしくは４に示す塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
（４）本発明は、（２）又は（３）に記載の遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
（５）本発明は、（４）に記載の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。
（６）本発明は、（５）に記載の形質転換体を培養し、該培養物からベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの製造法を提供する。
（７）本発明は、芳香族アルデヒドに、（６）に記載の製造法によって得られたベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させることを特徴とする、芳香族カルボン酸の製造法を提供する。
（８）本発明は、前記芳香族アルデヒドが、ｐ-ヒドロキシベンズアルデヒド、ｍ-アニスアルデヒド、ベラトラアルデヒド、4-ヒドロキシ-3-メトキシ-シンナムアルデヒド及びシリンガアルデヒドからなる群より選ばれる、（７）に記載の製造法を提供する。
（９）本発明は、芳香族アルデヒドの存在下、（５）に記載の形質転換体を培養し、該培養物から芳香族カルボン酸を採取することを特徴とする、芳香族カルボン酸の製造法を提供する。
（１０）本発明は、前記芳香族アルデヒドが、ｐ-ヒドロキシベンズアルデヒド、ｍ-アニスアルデヒド、ベラトラアルデヒド、4-ヒドロキシ-3-メトキシ-シンナムアルデヒド及びシリンガアルデヒドからなる群より選ばれる、（９）に記載の製造法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、種々の芳香族アルデヒドを対応するカルボン酸に効率よく変換することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、クローンpKTVH8F及びpKTVH8Rの遺伝子マップ、及び該クローンとアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性との関係を示す図である。
【図２】図２は、ligV2遺伝子及びligV3遺伝子を保有する5.0kb BamHI-ApaIのORFマップを示す。図２において小さな矢印は、lacプロモーターからの転写の方向を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、公知のligV遺伝子がコードするベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼの基質特異性（左縦軸）、及び様々な芳香族アルデヒドに対する該酵素の酸化活性（右縦軸）を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のligV2遺伝子又はligV3遺伝子がそれぞれコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼの基質特異性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のタンパク質は、配列番号１又は３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、特にこれらに限定されず、当該タンパク質の変異体、例えばアレル体、ホモログ、天然の変異体であって、配列番号１又は３に示すアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、更により好ましくは99％以上の同一性を有するタンパク質や、配列番号１又は３に示すアミノ酸配列において、１個もしくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。
【００１６】
ここで、「ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性」とは、芳香族アルデヒドを対応する芳香族カルボン酸に酸化する活性を意味する。
また、「１個もしくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、配列番号１又は２のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、具体的には、好ましくは１〜20個のアミノ酸、より好ましくは１〜10個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を意味し、付加には、両末端への１個〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１７】
配列番号１に示すベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440株、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）HR199株、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）AN103株、及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida） WCS358株の各々のバニリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を比較すると、それぞれ、35%、31%、34%、33%の同一性を示し、公知のベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼLigV（特開2005-278549号公報に、LigVのアミノ酸配列を配列番号22で示す）とは31%の同一性を示した。
また、配列番号３に示すベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440株、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）HR199株、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）AN103株、及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida） WCS358株の各々のバニリンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を比較すると、それぞれ、32%、27%、32%、32%の同一性を示し、LigVとは31%の同一性を示した。従って、配列番号１又は３で表されるベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼは、いずれも新規なタンパク質である。
【００１８】
本発明の遺伝子は、配列番号１又は３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をそれぞれコードするＤＮＡであればよく、後述する一定の改変を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡも包含される。このようなＤＮＡとしては、配列番号２又は４に示す塩基配列からなるＤＮＡが好ましい。また、配列番号２又は４に示す塩基配列と、少なくとも90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上、更に好ましくは99％以上の同一性を有するＤＮＡであって、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号２又は４に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに高ストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
【００１９】
ここで、「高ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。高ストリンジェントな条件としては、相同性が高いＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、例えば、Molecular cloning a Laboratory manual 2nd edition（Sambrookら、1989）に記載の条件が挙げられる。具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションにおける洗浄の条件である60℃、1×SSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1％SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２０】
前記の改変のための人為的手段としては、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（BD Bioscience社製Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit）等を用いて変異を導入し調製することができる。
【００２１】
尚、アミノ酸配列又は塩基配列の同一性は、既知の配列分析ソフトウェア、例えばDNASIS（日立ソフトウェアエンジニアリング）のBLASTプログラムを使用した測定（データベースに登録されているアミノ酸配列又はＤＮＡ塩基配列との比較）によって解析できる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、本発明によって明らかにされた本発明の遺伝子の配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することができる。具体的には、本発明遺伝子が発現される微生物、例えばスフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）SYK-6株より、常法に従ってゲノムＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の適当なプローブ等を用いて所望クローンを選択することにより製造することができる。上記において、スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）SYK-6株からの全RNAの分離、mRNAの分離及び精製、ゲノムＤＮＡの取得及びそのクローニングなどは、いずれも常法に従って行うことができる。
【００２３】
本発明の遺伝子をゲノムＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の各種方法に従うことができる。具体的方法としては、例えば、目的の核酸配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法など、及びこれらの組合せを例示することができる。
【００２４】
上記方法において用いられるプローブとしては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できる。また、本発明の遺伝子の塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー及びアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることができる。
【００２５】
本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ法（Science, 230, 1350 (1985)）によるＤＮＡ増幅法が好適に利用できる。増幅させたＤＮＡ断片の単離精製は、常法に従って行うことができる。例えばゲル電気泳動法などが挙げられる。上記方法に従って得られる本発明の遺伝子は、常法、例えばジデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)）、マキサム−ギルバート法（Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)）などに従って、その核酸配列を決定することができる。また、簡便には、市販のシークエンスキットなどを用いて、その核酸配列を決定することができる。
【００２６】
本発明のタンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報に基づいて、通常の遺伝子組換え技術に従って調製することができる。すなわち、本発明の遺伝子を形質転換に用いられる宿主中での発現に適したベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から回収することができる。
【００２７】
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターとしては、宿主内で自立的に増殖し得るファージ又はプラスミドから組換えベクターを目的として構成されたものを用いることができる。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＥＴ２１、ｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられる。
ファージＤＮＡとしてはλファージなどが挙げられる。更に、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２８】
本発明に係る遺伝子を上記のベクターに挿入するには、まず、本発明に係る遺伝子を有する精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、好適なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２９】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込むことができる。すなわち、組換えベクターは、本発明の遺伝子、プロモーター、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列）などを含むように調製することができる。プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの大腸菌由来のものやＴ７プロモーターなどのファージ由来のものが用いられる。更に、ｔａｃプロモーターなどのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを使用することができる。
【００３０】
本発明に係る遺伝子を含む組換えベクターを当該遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより宿主を形質転換することができる。形質転換の方法は、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３１】
宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）などのエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などのバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などのシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）などのリゾビウム属に属する細菌類の他に、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母；シロイヌナズナ、タバコ、トウモロコシ、イネ、ニンジンなどから株化した植物細胞や該植物から調製したプロトプラスト；ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などの動物細胞；及び、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞が挙げられるが、これらの中で細菌類、特に大腸菌が好ましい。
【００３２】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。得られた培養液から一般的な方法によって、タンパク質の採取、精製を行うことができる。
【００３３】
本発明の芳香族カルボン酸を製造するには、上記の培養時に、芳香族アルデヒドを培地に添加する。本明細書において、芳香族アルデヒドとは、ベンズアルデヒド、アルデヒド基がアルキレン基やアルケニレン基を介してベンゼン環に結合されてなるベンズアルデヒド誘導体、又はこれらのベンズアルデヒドもしくはベンズアルデヒド誘導体のベンゼン環の水素が水酸基、低級アルコキシ基等によって更に置換されたものを含む。芳香族アルデヒドの例としては、バニリン、ベンズアルデヒド、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、プロトカテクアルデヒド、m-アニスアルデヒド、ベラトラアルデヒド、4-ヒドロキシ-3-メトキシシンナムアルデヒド、シリンガアルデヒド、イソバニリン等が挙げられる。これらの芳香族アルデヒドのほとんどは、例えばナカライテスク社から市販されている。これらの芳香族アルデヒドの内、バニリン及びシリンガアルデヒドは、リグニンからアルカリ分解等の化学分解によって得ることもできる。芳香族化合物の培地における濃度は、特に限定されないが、例えば0.1〜10 mM、好ましくは0.1〜2 mM、より好ましくは0.1〜0.5 mMである。
【００３４】
基本となる培地としては、上述した形質転換体の宿主に適したものを使用することができる。例えば、宿主として大腸菌を使用した場合、ＬＢ培地を使用することができる。また一般的には、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類などを含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
例えば、炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。更に、培地中には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を添加してもよい。
【００３５】
培養は、形質転換体の宿主にもよるが、通常、振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜37℃で６〜24時間行う。培養期間中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３７】
実施例１  スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）SYK-6株遺伝子ライブラリーからのベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング
Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(10): 2487-2492, 2007に記載の方法に従ってクローンpKTV1〜pKTV6を獲得し、その中のクローンpKTV3を解析して、新規遺伝子ligV2及びligV3を得た。以下に詳細を説明する。
（１）サブクローニング
pKTV3をスフィンゴモナス・パウシモビリス（S. paucimobilis）IAM 12578株（アルデヒド分解能欠損株、Biosci. Biotechnol. Biochem. 71(10): 2487-2492, 2007）に導入して得られた菌体から粗酵素抽出液 (タンパク質濃度500 μg/ml) を調製し、これを用いて0.1 mMのバニリン及びシリンガアルデヒドに対する分解活性を調べたところ、それぞれ13 mU/mg、25 mU/mgの活性を示したことから本クローン中に目的とするアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が含まれる可能性が考えられた。そこで、pKTV3からアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を単離するために、pKTV3をHindIII、EcoRI、NotIで消化して8.0 kb HindIII断片、7.0 kb EcoRI断片、及び5.5 kb NotI断片をpBluescript II KS(+) に挿入した。得られた6つのクローンをそれぞれE．コリ（E. coli）JM 109株に導入し、形質転換体の休止細胞を用いて、バニリン及びシリンガアルデヒド (各々、1 mM) の分解活性をHPLCによって調べた。その結果、8.0 kb HindIII断片を持つクローンにおいてバニリン及びシリンガアルデヒドの分解活性が確認され、8.0 kb HindIII断片中に目的遺伝子が含まれることが示唆された。これらのクローンをそれぞれ、pKTVH8F、pKTVH8Rとした（図１）。
【００３８】
更にアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む領域を特定するために、pKTVH8F又はpKTVH8Rを、pKT230MCベクターのマルチクローニングサイトと挿入断片の両方に存在する制限酵素部位を切断するEcoRI、EcoRV、BamHI、又はPstIを用いて制限酵素消化した後、セルフライゲーションを行って8種類のサブクローン (pYYEIF、pYYEIR、pYYEVF、pYYEVR、pYYBF、pYYBR、pYYPF、及びpYYPR) を得た（図１）。これらのクローンをE. coli JM109株に導入し、形質転換体の休止細胞のバニリン及びシリンガアルデヒド (各々、1 mM) それぞれの分解活性をHPLCによって解析したところ、pYYBRにおいてバニリン及びシリンガアルデヒドをそれぞれバニリン酸、シリンガ酸へと変換する活性が確認された。従って、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子はpYYBRが持つ3.1 kb HindIII-BamHI断片に存在することが示唆された。
【００３９】
（２）塩基配列の決定及び解析
pYYBRの3.1 kb HindIII-BamHI断片の塩基配列を決定した。塩基配列の解析から1つのORF (ORF1) と1つの不完全なORF (ORF2) の存在が示された（図２）。ORF1は、1,416 bpからなり、472アミノ酸、50,241 Daのタンパク質をコードしていることが推定された。配列解析プログラムEMBOSS::needleにより、ORF1は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440株（DDBJ Accession No.：NC00294）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）HR199株、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）AN103株（DDBJ Accession No.：Y13067）、及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida） WCS358株（DDBJ Accession No.：Y14772）のバニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子とアミノ酸レベルでそれぞれ35%、31%、34%、33%の同一性を示し、ligV（特開2005-278549号公報）と31%の同一性を示すことが判った（表１）。
【００４０】
【表１】
2011067142.tif 000002
【００４１】
これらのバニリンデヒドロゲナーゼとの相同性から、ORF1は、新規なアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子であることが示唆され、「ligV2」と命名した。また、ligV2開始コドンの上流7 bpにシャイン・ダルガノ配列と考えられる配列が存在し、開始コドンの約50 bp上流にはE. coliのσ70プロモーターのコンセンサス配列と類似の配列が見られた。終止コドンの14 bp下流にはρ非依存性ターミネーターと考えられる配列が存在した。
相同性検索の結果、ligV2の下流に存在するligV2と逆方向に転写されると推定されるORF2も、HR199株やAN103株のバニリンデヒドロゲナーゼとアミノ酸レベルで約30%の同一性を示し、N末側が40アミノ酸程度欠けていると考えられた。
【００４２】
（３）ORF2の完全長の単離と塩基配列の決定
ORF2の完全長を得るために、pYYBRの500 bp BspHI-HindIII断片をプローブとして、ORF2内部に存在しないSmaI、BglII、又はApaIで消化したpKTV3のサザンハイブリダイゼーション解析を行った。その結果、SmaI消化物では6.5 kb、BglIIでは9.0 kb、ApaIでは4.2 kbで交雑が見られた。4.2 kb ApaI断片をpBluescript II KS(+) のApaIサイトに挿入し、得られたプラスミドpVA42をpBluescript II KS(+) のマルチクローニングサイト内に存在する制限酵素で消化し、4.2 kb ApaI断片の制限酵素地図を作製した。更に、ORF2を含む領域をサブクローニングするために、pVA42の2.5 kb BglII-SalI断片をpBluescript II KS(+) のBamHI-SalIサイトにサブクローニングし、pBSV3を作製した。
【００４３】
pBSV3を用いてORF2の完全長を含む2.5 kb BglII-SalI断片の塩基配列を決定した。その結果、ORF2は、467 bpからなり、489アミノ酸、51,637 Daのタンパク質をコードしていることが推定された。ORF2は、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）AN103株、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）KT2440株、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）HR199株、及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida） WCS358株のバニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子とアミノ酸レベルでそれぞれ32%、27%、32%、32%の同一性を示し、ligVとの同一性は31%、ligV2との同一性は34%であった（表２）。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
従って、ORF2も、新規のバニリン又はシリンガアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子である可能性が考えられ、「ligV3」と命名した。ligV3開始コドンの上流13 bpにはSD配列と考えられる配列が存在し、開始コドンの約80 bp上流にはE. coliのσ70プロモーターのコンセンサス配列と類似の配列が見られた。
【００４６】
ligV2のORF（ORF1）の塩基配列を配列番号２に、LigV2のアミノ酸配列を配列番号１に示す。また、ligV3のORF（ORF2）の塩基配列を配列番号４に、LigV3のアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００４７】
実施例２  芳香族カルボン酸の製造
（１）E. coliにおけるligV2及びligV3遺伝子の発現
ligV2及びligV3の遺伝子産物 (それぞれ、LigV2、LigV3) の解析を行うために、E. coli細胞中での発現を試みた。ligV2を含む最小領域を単離するためにpYYBRの1.7 kb BamHI-PstI断片をpBluescript II SK(+) のBamHI-PstIサイトに挿入したプラスミドpSKL2を作製した。pSKL2をE. coli JM109株に導入し、得られた形質転換体から粗酵素抽出液を調製してSDS-PAGEで解析したところ、45 kDaにLigV2に由来すると考えられるタンパク質の産生が確認された。同様にligV3を含む最小領域の2.5 kb BglII-SalI断片をpBluescript II KS(+) に挿入したプラスミドpBSV3をE. coli JM109株に導入して粗酵素抽出液を調製してSDS-PAGEで解析した結果、48 kDaにLigV3に由来すると考えられるタンパク質の産生が確認された。
【００４８】
（２）LigV2及びLigV3の基質特異性
バニリン、ベンズアルデヒド、p-ヒドロキシベンズアルデヒド、プロトカテクアルデヒド、m-アニスアルデヒド、ベラトルアルデヒド、4-ヒドロキシ-3-メトキシシンナムアルデヒド、又はシリンガアルデヒド (各々、0.1 mM) を基質として、これらの基質各々にLigV2及びLigV3を28℃で30分作用させて、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を調べた。粗酵素抽出液は、LigV2ではタンパク質濃度100 μg/ml、LigV3では500 μg/mlとした。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂにおいて、白抜きのバーは、LigV2の酸化活性を、斜線を付したバーは、LigV3の酸化活性を示す。比較のために、ligV遺伝子の遺伝子産物（LigV）の各芳香族アルデヒドに対する基質特異性（左縦軸）、及び様々な芳香族アルデヒドに対する該酵素の酸化活性（右縦軸）を示す。データは、3つの独立した実験の平均±標準偏差で示す。
【００４９】
図３Ａ及び３Ｂから明らかなように、LigV2は、LigVに比べて、p-ヒドロキシベンズアルデヒド (925 mU/mg) に対して特に強い活性を示した。また、LigV2は、4-ヒドロキシ-3-メトキシシンナムアルデヒド (627 mU/mg)、シリンガアルデヒド (511 mU/mg)、ベンズアルデヒド (473 mU/mg)、ベラトルアルデヒド (301 mU/mg) に対しても活性を示し、広い基質特異性を有する酵素であることが判った。
一方、LigV3は、m-アニスアルデヒドに対して特異的であることが判った(1,150 mU/mg)。なお、ベラトルアルデヒド (188 mU/mg)、4-ヒドロキシ-3-メトキシシンナムアルデヒド (150 mU/mg) 、ベンズアルデヒド (108 mU/mg)、シリンガアルデヒド (69 mU/mg)、及びバニリン (38 mU/mg) に対する活性は、m-アニスアルデヒドに対する活性の約16%以下であった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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