(57)【要約】      （修正有）【課題】抗腫瘍効果がより改善された改良型センダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）を有効成分とする抗癌剤を提供する。【解決手段】Ｃ末端側に機能性ポリペプチドが連結した融合タンパク質、該融合タンパク質を含む複合体タンパク質、ならびに、該融合タンパク質または該タンパク質複合体をエンベロープに含有する改良型センダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）を有効成分とする抗癌剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が１１１〜２０９アミノ酸の長さを有する、改変ＨＮタンパク質。
【請求項２】
該部分アミノ酸配列が１４０〜１８０アミノ酸の長さを有する、請求項１記載の改変ＨＮタンパク質。
【請求項３】
下記（１）または（２）のポリペプチドである、請求項１記載の改変ＨＮタンパク質：
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変ＨＮタンパク質の残基及び第１の機能性ポリペプチド残基を含む融合タンパク質であって、該改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に該機能性ポリペプチド残基が機能可能に連結されている、融合タンパク質。
【請求項５】
機能性ポリペプチドがＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドである、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが一本鎖ＩＬ−１２である、請求項５記載の融合タンパク質。
【請求項７】
一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドである、請求項６記載の融合タンパク質：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド。
【請求項８】
機能性ポリペプチドが抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインである、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項９】
抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインがＩｇＧ２ａに由来するものである、請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
抗体の定常領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが、下記（１）または（２）のポリペプチドである、請求項９記載の融合タンパク質：
（１）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡとの結合活性を有するポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変ＨＮタンパク質、又は請求項４〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか１に項記載の第１の融合タンパク質、並びにプロテインＡのＺＺドメイン及び第２の機能性ポリペプチド残基を含む第２の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体であって、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが、第１の融合タンパク質に含まれるＣＨ２−ＣＨ３ドメインと第２の融合タンパク質に含まれるＺＺドメインとの間の結合を介して複合体を形成している、タンパク質複合体。
【請求項１３】
第２の機能性ポリペプチドが、一本鎖ＩＬ−１２である、請求項１２記載のタンパク質複合体。
【請求項１４】
一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドであり、且つＺＺドメインが、下記（３）または（４）のポリペプチドである、請求項１３記載のタンパク質複合体：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子の定常領域（Ｆｃ）への結合活性を有するポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変ＨＮタンパク質、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、ＨＶＪ−Ｅ。
【請求項１６】
請求項６もしくは７に記載の融合タンパク質または請求項１３もしくは１４に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、請求項１５記載のＨＶＪ−Ｅ。
【請求項１７】
ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープ外側に提示する形で担持する、ＨＶＪ−Ｅ。
【請求項１８】
ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが、ＩＬ−１２である、請求項１７記載のＨＶＪ−Ｅ。
【請求項１９】
ＩＬ−１２が一本鎖ＩＬ−１２である、請求項１８記載のＨＶＪ−Ｅ。
【請求項２０】
請求項６もしくは７に記載の融合タンパク質または請求項１３もしくは１４に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、請求項１８記載のＨＶＪ−Ｅ。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む、抗癌剤。
【請求項２２】
メラノーマ、前立腺癌、膀胱癌および大腸癌からなる群より選択される癌の治療または予防に用いられる、請求項２１記載の抗癌剤。
【請求項２３】
１回当たりの投与量が、ＨＶＪ−Ｅとして１０００ＨＡＵ以下であり、かつ該ＨＶＪ−Ｅに含まれるＩＬ−１２として１００ｐｇ以下であることを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む抗癌剤。
【請求項２４】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のＨＶＪ−Ｅの治療上有効量を癌患者に投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項２５】
１回当たりの投与量が、ＨＶＪ−Ｅとして１０００ＨＡＵ以下であり、かつ該ＨＶＪ−Ｅに含まれるＩＬ−１２として１００ｐｇ以下であることを特徴とする、請求項２４記載の癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ，以下ＨＶＪと表記することもある）を構成するＨＮタンパク質のＮ末端側部分アミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質、該改変ＨＮタンパク質のＣ末端側に機能性ポリペプチドが連結した融合タンパク質、または、該融合タンパク質を含むタンパク質複合体、さらに、該融合タンパク質または該タンパク質複合体をエンベロープに含有する改良型センダイウイルスエンベロープ（以下ＨＶＪ−Ｅと表記することもある）を有効成分とする抗癌剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
センダイウイルス（ＨＶＪ）のゲノムを不活化して増殖能が喪失された、ＨＶＪエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）は、他の分子をその中に封入することができることから、生体機能分子のベクター（運び屋）として開発されてきた（特許文献１、特許文献２など）。そして、ＨＶＪ−Ｅに抗癌剤を封入して、またはＨＶＪ−Ｅと抗癌剤を併用して投与することで、抗癌効果が増強されることも分かってきた（特許文献３、非特許文献１、非特許文献２）。このように、ＨＶＪ−Ｅは、抗癌剤のためのベクターとして、またそれ自体が抗癌剤の補助剤として研究開発が進められている（非特許文献３）。さらには、ＨＶＪ−Ｅのみを投与した場合でも抗癌作用を示すことが報告されている（特許文献３、非特許文献４）。ＨＶＪ−Ｅは、樹状細胞や腫瘍細胞からＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α、−βやＩＬ−６などのサイトカイン、ＣＣＬ−２、３、４、５、ＣＸＣＬ−１０などのケモカインの分泌を促し、ＮＫ細胞の浸潤の活性化、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌの浸潤と活性化、それによる腫瘍に対するＣＴＬ誘導を引きおこす（非特許文献４）。しかしながら、ＨＶＪ−ＥにはＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ（ＩＦＮ−γ）の産生促進能が認められておらず、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌには直接作用することはできないと考えられる。ＩＦＮ−γ産生を誘導するサイトカインとしては種々の分子が知られているが、代表的な分子としてはＩＬ−１２が挙げられる。ＩＬ−１２がＩＦＮ−γの産生を誘導することで抗腫瘍活性を示すことは、当業者には十分に公知の事実である（例えば、非特許文献５、非特許文献６など）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ０１／５７２０４
【特許文献２】ＷＯ２００４／０３５７７９
【特許文献３】ＷＯ２００５／０９４８７８
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００７  Ｄｅｃ  ２１；３６４（３）：４２３−８．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｏｃｔ  １２
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００８  Ｍａｙ；６１（６）：９７３−８．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｊｕｌ  ２６
【非特許文献３】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  ２００８  Ｆｅｂ；５（２）：２２１−３３．  Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献４】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００９  Ｍａｙ  １５；１２４（１０）：２４７８−８７
【非特許文献５】Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９４，  １５３，  １６９７−  ７０６
【非特許文献６】Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ５５：２８０−２８８；  １９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、ＨＶＪ−Ｅにより、ＩＬ−１２等の抗腫瘍性ポリペプチドの抗腫瘍効果を飛躍的に増大させる新たな技術を開発し、これに基づき優れた抗癌剤を提供することである。また、本発明は、この新たな技術に有用な改変タンパク質や、改良型ＨＶＪ−Ｅを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討の結果、ＨＶＪ−Ｅを構成するＨＮタンパク質の特定の領域のＣ末端側に所望のポリペプチドを連結させることにより改変ＨＮタンパク質と所望のタンパク質との融合タンパク質を作成し、この融合タンパク質を用いてＨＶＪ−Ｅを構成すると、所望のタンパク質がＨＶＪ−Ｅの外側表面に発現することを見出した。この所望のタンパク質として、一本鎖ＩＬ−１２を用いると、一本鎖ＩＬ−１２がＨＶＪ−Ｅ粒子の表面に発現した、改変ＨＶＪ−Ｅを得ることができた。この改変ＨＶＪ−Ｅは、ＨＶＪ−ＥとＩＬ−１２とを単に共投与した場合に比べて、はるかに高い抗腫瘍効果を示したことから、ＨＶＪ−Ｅの粒子表面にＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを結合させると、極めて高い抗腫瘍効果を得ることが出来ることを見出し、本発明を完成させるに到った。すなわち、本発明は、
［１］ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が１１１〜２０９アミノ酸の長さを有する、改変ＨＮタンパク質；
［２］該部分アミノ酸配列が１４０〜１８０アミノ酸の長さを有する、上記［１］記載の改変ＨＮタンパク質；
［３］下記（１）または（２）のポリペプチドである、上記［１］記載の改変ＨＮタンパク質：
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド；
［４］上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の改変ＨＮタンパク質の残基及び第１の機能性ポリペプチド残基を含む融合タンパク質であって、該改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に該機能性ポリペプチド残基が機能可能に連結されている、融合タンパク質；
［５］機能性ポリペプチドがＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドである、上記［４］記載の融合タンパク質；
［６］ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが一本鎖ＩＬ−１２である、上記［５］記載の融合タンパク質；
［７］一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドである、上記［６］記載の融合タンパク質：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド；
［８］機能性ポリペプチドが抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインである、上記［４］記載の融合タンパク質；
［９］抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインがＩｇＧ２ａに由来するものである、上記［８］記載の融合タンパク質；
［１０］抗体の定常領域のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが、下記（１）または（２）のポリペプチドである、上記［９］記載の融合タンパク質：
（１）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡとの結合活性を有するポリペプチド；
［１１］上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の改変ＨＮタンパク質、又は上記［４］〜［１０］のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸；
［１２］上記［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の第１の融合タンパク質、並びに
プロテインＡのＺＺドメイン及び第２の機能性ポリペプチド残基を含む第２の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体であって、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが、第１の融合タンパク質に含まれるＣＨ２−ＣＨ３ドメインと第２の融合タンパク質に含まれるＺＺドメインとの間の結合を介して複合体を形成している、タンパク質複合体；
［１３］第２の機能性ポリペプチドが、一本鎖ＩＬ−１２である、上記［１２］記載のタンパク質複合体；
［１４］一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドであり、且つＺＺドメインが、下記（３）または（４）のポリペプチドである、上記［１３］記載のタンパク質複合体：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子の定常領域（Ｆｃ）への結合活性を有するポリペプチド；
［１５］上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載の改変ＨＮタンパク質、上記［４］〜［１０］のいずれか１つに記載の融合タンパク質、または上記［１２］〜［１４］のいずれか１つに記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、ＨＶＪ−Ｅ；
［１６］上記［６］もしくは［７］に記載の融合タンパク質または上記［１３］もしくは［１４］に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、上記［１５］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［１７］ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープ外側に提示する形で担持する、ＨＶＪ−Ｅ；
［１８］ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが、ＩＬ−１２である、上記［１７］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［１９］ＩＬ−１２が一本鎖ＩＬ−１２である、上記［１８］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［２０］上記［６］もしくは［７］に記載の融合タンパク質または上記［１３］もしくは［１４］に記載のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、上記［１８］記載のＨＶＪ−Ｅ；
［２１］上記［１７］〜［２０］のいずれか１つに記載のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む、抗癌剤；
［２２］メラノーマ、前立腺癌、膀胱癌および大腸癌からなる群より選択される癌の治療または予防に用いられる、上記［２１］記載の抗癌剤；
［２３］１回当たりの投与量が、ＨＶＪ−Ｅとして１０００ＨＡＵ以下であり、かつ該ＨＶＪ−Ｅに含まれるＩＬ−１２として１００ｐｇ以下であることを特徴とする、上記［２１］記載のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む抗癌剤；
［２４］上記［２１］記載のＨＶＪ−Ｅの治療上有効量を癌患者に投与することを特徴とする、癌の治療方法；
［２５］１回当たりの投与量が、ＨＶＪ−Ｅとして１０００ＨＡＵ以下であり、かつ該ＨＶＪ−Ｅに含まれるＩＬ−１２として１００ｐｇ以下であることを特徴とする、上記［２４］記載の癌の治療方法；
を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の改変ＨＮタンパク質や融合タンパク質を用いれば、ＨＶＪ−Ｅの表面に所望のポリペプチドを発現させることが可能となる。
例えば、改変ＨＮタンパク質と一本鎖ＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドとの融合タンパク質を用いることにより、エンベロープの外側に該ポリペプチドを提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅを得ることが可能である。
エンベロープの外側にＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅは、高い抗腫瘍効果を有しており、抗腫瘍剤として有用である。
癌の治療においては、外科的切除法、放射線治療法、化学療法などが存在するが、その根治は依然大きな課題である。本発明は、細胞実験および生体内実験を通じて、本発明の改良型ＨＶＪ−Ｅの癌への直接投与で、ＩＦＮ−γの産生を誘導し、癌を著しく退縮させることを示した。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】１本鎖ＩＬ−１２のＺＺドメインがＨＶＪ−Ｅ表面の抗体の定常領域（Ｆｃ）に会合することにより抗腫瘍効果を向上させたＨＶＪ−Ｅの作製スキームを示した図である。
【図２】融合タンパク質を発現させ、細胞膜上に局在させた細胞にネイティブなＨＶＪを感染させることにより、エンベロープに融合タンパク質を組み込んだ組換えＨＶＪの作製の過程を示した図である。
【図３】（ａ）ＨＮタンパク質の細胞外ドメインを段階的に欠失させた各融合タンパク質の構造を示す図である。（ｂ）（ａ）に示した各融合タンパク質の細胞膜での局在を示す免疫染色図である。（ｃ）（ａ）に示した各融合タンパク質の細胞内発現をウエスタンブロットで確認した図である（ｄ）（ａ）に示した各融合タンパク質の細胞膜局在をウエスタンブロットで確認した図である。
【図４】（ａ）ＨＮタンパク質の細胞外ドメインを細胞外ドメインから５０アミノ酸残基、８０アミノ酸残基、１００アミノ酸残基、１２０アミノ酸残基、１５０アミノ酸残基だけ残した各融合タンパク質の構造を示す図である。（ｂ）（ａ）に示した各融合タンパク質の細胞膜での局在を示す免疫染色図である。（ｃ）（ａ）に示した各融合タンパク質の細胞内発現をウエスタンブロットで確認した図である（ｄ）（ａ）に示した各融合タンパク質の細胞膜局在をウエスタンブロットで確認した図である。
【図５】（ａ）ＨＮタンパク質の細胞外ドメインを細胞外ドメインから１００アミノ酸残基、だけ残した融合タンパク質にマウス由来ＩｇＧ２ａのＦｃのＣＨ２−ＣＨ３ドメインを付加したＦｃ−ＨＮタンパク質の構造を示す図である。（ｂ）（ａ）に示したＦｃ−ＨＮタンパク質の細胞内発現をウエスタンブロットで確認した図である。（ｃ）（ａ）に示したＦｃ−ＨＮタンパク質の細胞膜での局在を示す免疫染色図である。（ｄ）（ａ）に示したＦｃ−ＨＮタンパク質の細胞膜局在をウエスタンブロットで確認した図である。（ｅ）（ａ）に示したＦｃ−ＨＮタンパク質のプロテインＡセファロースとの共沈を示す図である。
【図６】（ａ）プロテインＡのＺＺドメインと一本鎖ＩＬ−１２とを融合させて作製したＺＺ−ＩＬ−１２タンパク質の構造を示す図である。（ｂ）各ＺＺ−ＩＬ−１２タンパク質のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌刺激効果を示す図である。
【図７】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪとの結合能を示す図である。
【図８】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪとの２４時間インキュベーション後の結合保持能を示す図である。
【図９】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの樹状細胞（ＤＣ）および脾臓細胞への作用を示す図である。図９左図は、各ＨＶＪ−Ｅの発現を示すウエスタンブロット図である。図９中図は、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの樹状細胞（ＤＣ）からのＩＦＮ−γ分泌促進能を示す図である。図９右図は、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの樹状細胞（ＤＣ）からのＩＬ−６分泌促進能を示す図である。
【図１０】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−ＥとＺＺ−ｓｃＩＬ１２単独投与との脾臓細胞へのＩＦＮ−γ分泌促進作用の比較を示す図である。
【図１１】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍作用を示す図である。
【図１２】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅのｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫活性化能を示す図である。図１２左図は、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−ＥのＩＦＮ−γ分泌誘導能を示すＥＬＩＳＰＯＴアッセイ図である。図１２右図は、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−ＥのＣＴＬ活性を示すＣｒ５１リリーシングＣＴＬアッセイ図である。
【図１３】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅと、非結合ｓｃＩＬ１２およびＨＶＪ−Ｅの併用投与との抗癌作用の比較を示す図である。
【図１４】ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅと、非結合ｓｃＩＬ１２およびＨＶＪ−Ｅの併用との脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進能の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、センダイウイルス（ＨＶＪ）のＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質であって、該部分アミノ酸配列が１１１〜２０９アミノ酸の長さを有する、改変ＨＮタンパク質を提供する。
好ましくは、該部分アミノ酸配列が１４０〜１８０アミノ酸の長さを有する。
さらに好ましくは、本発明の改変タンパク質は、下記（１）または（２）のポリペプチドである：
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。
【００１０】
本発明で用いられるセンダイウイルス（ＨＶＪ）は、例えばＶＲ−１０５、ＶＲ−９０７等をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ：Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８  ＵＳＡ）より購入することができる。
【００１１】
本発明で用いられるＨＮタンパク質とは、センダイウイルス（ＨＶＪ）のエンベロープを構成する公知のコンポーネントの一つであり、宿主細胞への結合に関わる赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子によってコードされる。ＨＮタンパク質のアミノ酸配列も公知である。本明細書においては、ＨＮタンパク質は、例えば配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を意味する。
【００１２】
発明者らは、後述する実施例において確認するように、ＨＮタンパク質の種々の欠失変異体を作成し、ＨＮタンパク質が、細胞膜に局在し、ウイルス粒子形成の際にＨＶＪのエンベロープを構成するためのＨＮタンパク質中の必要領域を検討し、その範囲を見出した。その結果、ＨＮタンパク質の翻訳開始メチオニン残基から始まり、細胞内ドメイン、膜貫通ドメインに加えて細胞外ドメインの一部をコードする部分アミノ酸配列（以下、Ｎ末端部分アミノ酸配列とも表記してもよい）が必須であることを見出した。そして、該部分アミノ酸配列が、１１１アミノ酸以上、好ましくは１４０アミノ酸以上の長さを有していれば、Ｃ末端側の領域を欠失していても、該変異体ＨＮタンパク質は、安定してＨＶＪのエンベロープを構成し得ることを見出した。
【００１３】
更にこのＨＮタンパク質のＮ末端部分ポリペプチドのＣ末端側に任意の機能性ポリペプチドを連結した融合タンパク質を調製し、この機能性ポリペプチドがＨＶＪのエンベロープの外側に提示されるように、該融合タンパク質を安定してＨＶＪ−Ｅ上に発現させる方法について検討する過程で、該融合タンパク質に含まれるＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列の長さが、２０９アミノ酸（好ましくは１８０アミノ酸）よりも長いと、かえって該融合タンパク質が安定してＨＶＪ−Ｅ上に発現され難いことを見出した。
【００１４】
即ち、ＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列の長さは、通常、１１１〜２０９アミノ酸、好ましくは、１４０〜１８０アミノ酸、最も好ましくは、１６０アミノ酸である。
【００１５】
尚、ＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列における、第１のアミノ酸は、ＨＮタンパク質のＮ末端の第１メチオニン（翻訳開始メチオニン残基）である。
【００１６】
本発明の改変ＨＮタンパク質は、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）において発現したときに、該細胞の細胞膜上に局在する（これを、細胞膜へ局在する活性という）。「局在」とは、細胞内の他の領域よりも細胞膜における発現量が高いことを意味する。改変ＨＮタンパク質が細胞膜上へ局在するか否かは、該改変ＨＮタンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントの細胞膜や各オルガネラにおける改変ＨＮタンパク質の発現を、改変ＨＮタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。
【００１７】
また、本発明の改変ＨＮタンパク質は、ＨＶＪのウイルス粒子形成の際に、エンベロープへ取り込まれることにより、該エンベロープを構成し得る（これを、ＨＶＪ−Ｅを構成する活性という）。即ち、本発明の改変ＨＮタンパク質を哺乳動物細胞において発現させ、該哺乳動物細胞にＨＶＪを感染させると、ＨＶＪ感染細胞から生じるＨＶＪのエンベロープに、該改変タンパク質が取り込まれ、該エンベロープを構成する。改変ＨＮタンパク質が、かかる特徴を有するか否かは、該改変ＨＮタンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントにＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離し、該エンベロープにおける改変ＨＮタンパク質の発現を、改変ＨＮタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。
【００１８】
ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１１１番のアミノ酸乃至アミノ酸番号２０９番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（好ましくは配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１４０番のアミノ酸乃至アミノ酸番号１８０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、より好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１６０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列）と完全同一のアミノ酸配列が挙げられる。
【００１９】
ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸同士が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４７：  １３０６−１３１０  （１９９０）を参照）。アミノ酸（配列）が置換、欠失または挿入されている場合、その置換、欠失または挿入の位置は、上述の、細胞膜へ局在する活性、及びＨＶＪ−Ｅを構成する活性が実質的に保持される限り、特に限定されない。「実質的に保持される」とは、少なくともネイティブなＨＮタンパク質（全長ＨＮタンパク質）と比較して、有意に高い細胞膜へ局在する活性を保持していることを意味する。
【００２０】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：  ５８７３−５８７７  （１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：  ３３８９−３４０２  （１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４４−４５３  （１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，  ＣＡＢＩＯＳ，  ４：  １１−１７  （１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：  ２４４４−２４４８  （１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００２１】
より好ましくは、ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２２】
ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなる改変ＨＮタンパク質は、前記の配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１１１番のアミノ酸乃至アミノ酸番号２０９番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列（好ましくは配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１４０番のアミノ酸乃至アミノ酸番号１８０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列、より好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１番のメチオニンから始まり、アミノ酸番号１６０番のアミノ酸で終了する、配列番号６に示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列）と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性を有する蛋白質を意味する。
「実質的に同質の活性」における「活性」は、上述の「細胞膜へ局在する活性」、及び「ＨＶＪ−Ｅを構成する活性」を意味する。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に同じであることを意味する。したがって、上記の各活性は同等（例えば、約０．５〜約２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度などの量的要素は異なっていてもよい。
【００２３】
また、ＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列には、例えば、（１）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）上述のＨＶＪのＨＮタンパク質のＮ末端部分アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
【００２４】
本発明の最も好ましい改変ＨＮタンパク質は、下記（１）または（２）のポリペプチドである：
（１）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号６の第１〜１６０アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＨＶＪに発現された場合に粒子表面に局在しうる特徴を有するポリペプチド。
【００２５】
本発明の改変ＨＮタンパク質は、例えば下記の融合タンパク質の構築や、下記の融合タンパク質の機能評価におけるネガティブコントロール等として有用である。
【００２６】
本発明はさらに、前記改変ＨＮタンパク質の残基及び第１の機能性分子を含む改変ＨＮタンパク質であって、該改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に該機能性分子が機能可能に連結されている、改変ＨＮタンパク質を提供する。ここで、「連結」とは、機能性分子が、改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に繋がっている状態を達成するものであれば、いかなる結合様式であっても特に限定されないが、好ましくはペプチド結合によって、改変ＨＮタンパク質残基と機能性分子とが連結している。また、「機能可能に連結されている」とは、機能性分子がその機能を発揮できるように連結されていることを意味する。従って、機能性分子がその機能を発揮できる限りは、例えば、連結部位にリンカーやタグを介して改変ＨＮタンパク質の残基と機能性分子が連結されていてもよい。本明細書における機能性分子とは、何らかの生物学的機能または活性を有している、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチド）、低分子化合物も含む、あらゆる分子を包含しうる。好ましくは、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチド）またはその類似体である。従って好ましくは、本発明は、前記改変ＨＮタンパク質の残基及び第１の機能性ポリペプチド残基を含む融合タンパク質であって、該改変ＨＮタンパク質残基のＣ末端側に該機能性ポリペプチド残基が機能可能に連結されている、融合タンパク質を提供する。該融合タンパク質においては、前記改変ＨＮタンパク質の残基と第１の機能性ポリペプチド残基とが、結合手又はペプチドリンカーを介してペプチド結合により結合し、１本のポリペプチドを構成している。
【００２７】
ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、改変ＨＮタンパク質の残基と第１の機能性ポリペプチド残基との機能的な連結を可能にする限り特に限定されない。ペプチドリンカーの長さは、改変ＨＮタンパク質の残基と第１の機能性ポリペプチド残基との機能的な連結を可能にする限り特に限定されないが、通常１〜３０アミノ酸、好ましくは１〜１０アミノ酸である。
【００２８】
本発明の融合タンパク質は、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）において発現したときに、該細胞の細胞膜上に局在する（これを、細胞膜へ局在する活性という）。「局在」とは、細胞内の他の領域よりも細胞膜における発現量が高いことを意味する。融合タンパク質が細胞膜上へ局在するか否かは、該融合タンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントの細胞膜や各オルガネラにおける融合タンパク質の発現を、融合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。
【００２９】
更に、本発明の融合タンパク質を哺乳動物細胞において発現すると、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域が、細胞の外側に提示する形で、該哺乳動物細胞の細胞膜上に局在する。機能性ポリペプチド領域が、細胞の外側に提示されているか否かは、該機能性ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、フローサイトメーターや免疫組織染色により確認することが出来る。
【００３０】
また、本発明の融合タンパク質は、ＨＶＪのウイルス粒子形成の際に、エンベロープへ取り込まれることにより、該エンベロープを構成し得る（これを、ＨＶＪ−Ｅを構成する活性という）。即ち、本発明の融合タンパク質を哺乳動物細胞において発現させ、該哺乳動物細胞にＨＶＪを感染させると、ＨＶＪ感染細胞から生じるＨＶＪのエンベロープに、該融合タンパク質が取り込まれ、該エンベロープを構成する。融合タンパク質が、かかる特徴を有するか否かは、該融合タンパク質を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントにＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離し、該エンベロープにおける融合タンパク質の発現を、融合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットにより解析することにより、確認することが出来る。
【００３１】
更に、本発明の融合タンパク質が、ＨＶＪ−Ｅへ取り込まれると、該ＨＶＪ−Ｅは、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域を、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示する形で、該融合タンパク質を担持することとなる。機能性ポリペプチド領域が、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示されているか否かは、該機能性ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いて、フローサイトメーターや免疫組織染色により確認することが出来る。
【００３２】
本明細書における機能性ポリペプチドとは、何らかの生物学的機能または活性を有しているポリペプチドを言う。好ましくは、タンパク質、ペプチドまたはその類似体である。例えば、何らかの抗体またはその抗原結合部位、各種のサイトカイン、増殖因子、ホルモン、受容体または細胞膜タンパク質に対するリガンドなどが挙げられる。例えば、この機能性ポリペプチドとして細胞特異的表面抗原に対する抗体を用いた場合、本発明の融合タンパク質をＨＶＪ−Ｅに取り込ませると、該ＨＶＪ−Ｅの外側に、該抗体が提示されるので、その抗原を表面に発現する細胞に選択的にＨＶＪ−Ｅをターゲティングさせることが可能となる。また、機能性ポリペプチドとして何らかのサイトカインを用いた場合は、本発明の融合タンパク質をＨＶＪ−Ｅに取り込ませると、該ＨＶＪ−Ｅの外側に、該サイトカインが提示されるので、そのサイトカイン受容体を細胞表面に発現する細胞特異的にＨＶＪ−Ｅを選択的に作用させるとともに、該サイトカインで該細胞を刺激することも可能である。例えば、抗腫瘍活性を有するタンパク質（例えば、ＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド）を機能性ポリペプチドとして用いた場合、本発明の融合タンパク質をＨＶＪ−Ｅに取り込ませると、該ＨＶＪ−Ｅの外側に、抗腫瘍活性を有するタンパク質が提示されるので、ＨＶＪ−Ｅによる抗腫瘍活性に加えて、この機能性ポリペプチドの有する抗腫瘍活性も発揮されることで、より強力な抗腫瘍効果を得ることが可能である。
【００３３】
本発明で用いる機能性ポリペプチドの好ましい一実施態様としては、ＩＦＮ−γ分泌促進能を有する分子が挙げられる。このＩＦＮ−γ分泌促進能は、当業者に公知の方法および実施例に記載の方法で測定することが可能であるとともに、これらの方法に当業者が日常的な活動の範囲内にある改変を加えて測定してもよい。ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドとしては、哺乳動物（例、ヒト）の脾細胞または樹状細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進能を有していればどのような分子であってもよいが、例えば、哺乳動物のＩＬ−１２が挙げられる。ＩＬ−１２は、２つの異なるサブユニット（ｐ３５およびｐ４５）から構成されるヘテロダイマーであってもよく、該２つのサブユニットが機能可能に連結された一本鎖ＩＬ−１２であってもよい。好ましくは、一本鎖ＩＬ−１２である。一本鎖ＩＬ−１２を構築する技術は、例えばＧｒａｈａｍ  Ｊ．  Ｌｉｅｓｃｈｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  １５．  ３５−４０  （１９９７）等に記載されており、当業者であればこれを容易に製造することが出来る。本発明において用いられる一本鎖ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２の２つのサブユニットｐ３５およびｐ４０を一本のポリペプチドとして連結させたもので、好ましくはｐ４０のＣ末端側にｐ３５が機能可能に連結されている。ｐ３５とｐ４０との間にはペプチドリンカーを含んでいても良く、好ましくは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒからなるリンカーを１〜５単位、より好ましくは３単位含んでいる。そのような一本鎖ＩＬ−１２としては、具体的には、下記（１）または（２）のポリペプチド：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドがあげられる。
【００３４】
（２）の一本鎖ＩＬ−１２のポリペプチドには、（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含み、且つ哺乳動物（例、ヒト）の脾細胞または樹状細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドが含まれる。
【００３５】
尚、本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列は、アミノ酸番号１〜２４：シグナルペプチド（ｐ４０）、アミノ酸番号２５〜４１：Ｆｌａｇ−ｔａｇ  ＨＡ−ｔａｇ、アミノ酸番号４２〜９９：ＺＺ−ドメイン、アミノ酸番号１００〜１０２：リンカー、アミノ酸番号１０３〜４１７：ＩＬ−１２−ｐ４０サブユニット、アミノ酸番号４１８〜４３２：リンカー、アミノ酸番号４３３〜６２５：ＩＬ−１２−ｐ３５サブユニットで構成されている。
【００３６】
本発明で用いる機能性ポリペプチドの別の好ましい一実施態様としては、抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが挙げられる。このＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、プロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有する限り、どのイムノグロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）のものに由来してもよく、さらにどのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）のものに由来してもよく、また各ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列に１又は複数個のアミノ酸が欠失・置換・付加されたものであってよい。また、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインがプロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有する限り、当該イムノグロブリンはどの動物種（マウス、ラット、ヒト等の哺乳動物、鳥類等）に由来してもよい。好ましい例としては、ＩｇＧ２（たとえば、マウスＩｇＧ２）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが挙げられる。そのような抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインとしては、具体的には、下記（１）または（２）のポリペプチドが挙げられる：
（１）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有するポリペプチド。
【００３７】
（２）の一本鎖ＩＬ−１２のポリペプチドには、（１）  配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）  配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）  配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）  配列番号４の第１７１〜３８９アミノ酸に該当するアミノ酸配列のうち１または２個以上（好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、いっそう好ましくは１〜数（２、３、４もしくは５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含み、且つプロテインＡのＺＺドメインとの結合活性を有するポリペプチドが含まれる。
【００３８】
尚、本発明の配列番号４で表されるアミノ酸配列は、アミノ酸番号１〜１６０：配列番号６の第１〜１６０アミノ酸配列、アミノ酸番号１６１〜１７０：Ｍｙｃ  ｔａｇ、アミノ酸番号１７１〜３８９：ＩｇＧ２ａ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインで構成されている。
【００３９】
ここで、上記の抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、プロテインＡのＺＺドメインと結合することができる。従って、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む本発明の融合タンパク質（「第１の融合タンパク質」と表記することもある）を発現することが出来る発現ベクターにより、哺乳動物細胞（例えばサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２）をトランスフェクトし、得られたトランスフェクタントにＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離することにより、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをＨＶＪのエンベロープの外側に提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅを得ることが出来る。更に、ＺＺドメインと機能可能に連結された前記の機能性ポリペプチドを含む融合タンパク質（「第２の融合タンパク質」と表記することもある）を、ＨＶＪ−Ｅ上の第１の融合タンパク質へＺＺドメインを介して結合することにより、所望の機能性ポリペプチドをＨＶＪのエンベロープの外側に提示する形で担持するＨＶＪ−Ｅを提供することができる。ＩｇＧ２由来のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを用いた場合、第２の融合タンパク質が結合したＨＶＪ−Ｅの血中安定性が高いため、体内に投与した場合でも血中に第２の融合タンパク質が結合したＨＶＪ−Ｅが長時間存在し、第２の融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチドの機能を発揮するのに有利である。ただし、この他のサブクラスのイムノグロブリンに由来するＣＨ２−ＣＨ３ドメインもまた、ＨＶＪ−Ｅと機能性ポリペプチドとの複合体の使用目的に応じて、当業者が選択することができる。
【００４０】
従って、本発明は、上記の第１の融合タンパク質、及びプロテインＡのＺＺドメイン及び第２の機能性ポリペプチド残基を含む第２の融合タンパク質を含む、タンパク質複合体であって、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質とが、第１の融合タンパク質に含まれるＣＨ２−ＣＨ３ドメインと第２の融合タンパク質に含まれるＺＺドメインとの間の結合を介して複合体を形成している、タンパク質複合体を提供する。
【００４１】
本発明の第２の融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチドの好ましい一実施態様としては、前記のＩＦＮ−γ分泌促進能を有する分子が挙げられる。従って、そのような分子としては、ＩＬ−１２が挙げられ、好ましくは、一本鎖ＩＬ−１２が挙げられる。本発明のタンパク質複合体としては、具体的には、一本鎖ＩＬ−１２が、下記（１）または（２）のポリペプチドであり、且つＺＺドメインが、下記（３）または（４）のポリペプチドである、タンパク質複合体を挙げることができる：
（１）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（４）配列番号２の第４２〜９９アミノ酸に該当するアミノ酸配列において１または複数の残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、且つ抗体分子のＦｃ領域への結合活性を有するポリペプチド。
【００４２】
さらに、本発明は上記の本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸を提供する。該核酸は、本発明の改変ＨＮタンパク質や融合タンパク質を遺伝子工学的手法により製造するために有用である。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。また、核酸は１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。
【００４３】
好ましい一実施態様としては、本発明の改変ＨＮタンパク質をコードする核酸として、配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜３３３番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜６２７番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜３３３番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜６２７番目の塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。より好ましくは、本発明の改変ＨＮタンパク質をコードする核酸として、配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜４２０番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜５４０番目の塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の最も短い範囲で１番目〜４２０番目の塩基配列であって、最も長い範囲で１番目〜５４０番目の塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、最も好ましくは、配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡである。
【００４４】
別の好ましい一実施態様としては、配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドに一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドが機能可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を提供する。配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号５に示される塩基配列の１〜４８０までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＨＮタンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。また、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列の３０７〜１８７５までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１に示される塩基配列の３０７〜１８７５までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＩＬ−１２タンパク質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
別の好ましい一実施態様としては、配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドにＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドが機能可能に連結されたタンパク質をコードする核酸を提供する。配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては前記の通りである。また、ＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列の５１１〜１１６７までの塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号３に示される塩基配列の５１１〜１１６７までの塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したＣＨ２−ＣＨ３ドメインと実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
前記の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号５（または配列番号１または３）に示される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
【００４５】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００４６】
配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチド、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドおよびＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドをコードするＤＮＡは、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドおよび一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドの全長をコードするＤＮＡまたは配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドおよびＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。
【００４７】
上記のようにしてクローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチドをコードするＤＮＡ、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドをコードするＤＮＡ、ＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドをコードするＤＮＡを、別個にクローン化した場合には、適当な制限酵素、リンカー、リガーゼ等を用いて、それらを配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチド、一本鎖ＩＬ−１２ポリペプチドの順序または配列番号６に表されるアミノ酸配列の配列番号１〜１６０のポリペプチド、ＩｇＧ２ａのＣＨ２−ＣＨ３ドメインのポリペプチドの順序で連結する。
【００４８】
次いで、得られた前記ＤＮＡは、必要に応じて、その５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧをそれぞれ導入し、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結される。翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００４９】
本発明の核酸を、発現ベクター内のプロモーターの制御下に組み込むことにより、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質を発現し得る発現ベクター（本発明の発現ベクター）を製造することが出来る。
【００５０】
発現ベクターとしては、動物細胞発現プラスミド（例：ｐＣＡＧＧＳ  、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主の細胞内で機能可能なプロモーターであれば、いかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＣＡＧプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。
【００５１】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、ＳＶ４０  ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
【００５２】
本発明の発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、本発明の改変タンパク質又は本発明の融合タンパク質を製造することができる。
宿主としては、例えば、動物細胞、動物などの分泌発現に適したものが用いられる。
【００５３】
動物細胞としては、例えば、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｌ、ＡｔＴ−２０、ＧＨ３、ＦＬ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、Ｐ３８８、ＬＬＣＭＫ２などの細胞が用いられる。
動物としては、トランスジェニック系の確立した哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ）もしくはニワトリなどが挙げられる。
【００５４】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７  （１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６  （１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
動物は、例えば、トランスジェニック動物の開発（シーエムシー出版），（２００１）に記載の方法に従って形質転換することができる。
【００５５】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜約２０％の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ），ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ），ＲＰＭＩ  １６４０培地，１９９培地などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜約８である。培養は、通常約３０〜約４０℃で、約１５〜約６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物である場合、遺伝子導入した受精卵から、常法に従ってトランスジェニック動物を得、通常の飼育条件下で飼育、哺乳動物の乳やニワトリの卵を採取すればよい。
【００５６】
このようにして得られた本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を発現する細胞から、適切なタンパク質精製法（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィ等）を用いて、本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を精製することにより、単離又は精製された本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を得ることが出来る。単離又は精製とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作がなされていることを意味する。哺乳動物細胞中では、本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質は、細胞膜へ局在するので、該細胞を界面活性剤で処理し、この溶解液を精製操作に付すことにより、単離又は精製された本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質を得ることが出来る。単離又は精製された本発明の改変タンパク質又は融合タンパク質の純度は、タンパク質純度として、通常５０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは８０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは９０％（ｗ／ｗ）以上、最も好ましくは実質的に１００％である。
【００５７】
上記のようにして得られた、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質を発現するトランスフェクタントへＨＶＪを感染させ、感染したトランスフェクタントから生じたＨＶＪを回収し、該ＨＶＪからエンベロープを単離することにより、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質をエンベロープに含有する、ＨＶＪを製造することが出来る。ここで、本発明の融合タンパク質が、ＨＶＪのエンベロープへ取り込まれると、該ＨＶＪは、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域を、ＨＶＪのエンベロープの外側に提示する形で、該融合タンパク質を担持する。更に、該ＨＶＪを紫外線等に曝露することによってゲノムＲＮＡで不活性化することで、ＨＶＪ−Ｅを製造することが出来る。従って、本発明は、本発明の改変ＨＮタンパク質又は融合タンパク質をエンベロープに含有する、ＨＶＪ−Ｅを提供する。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「ＨＶＪ−Ｅ」とは、ＨＶＪの最も外側に位置する膜状の構造物を意味する。ＨＶＪにおいては、エンベロープは、通常、ウイルスゲノム及びカプシドタンパク質を覆っている。ＨＶＪ−Ｅは、通常、その内腔に種々の物質を担持することが可能であり、且つ細胞膜へ融合し、その内腔に含まれる物質を細胞内へ移入する活性を有する。そのため、ＨＶＪ−Ｅの内腔に、所望の物質（遺伝子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、タンパク質（またはペプチド）、化合物（抗癌剤、抗菌剤、免疫促進剤など）を封入し、これを個体へ投与することにより、種々の組織や細胞の内部へ、所望の物質を送達することが可能である。すなわち、ＨＶＪ−Ｅは種々の物質のベクターとして使用可能である。本発明において使用されるＨＶＪ−Ｅは、その内腔に、生体内や細胞内への導入が意図される物資を封入していても、封入していなくてもよい。
【００５９】
ＨＶＪ−Ｅについてより詳しくは、例えば、特開２００１−２８６２８２号公報（ＷＯ０１／５７２０４号公報）、特開２００２−０６５２７８号公報、ＷＯ０３／０１４３３８号公報等に記載されており、具体的には例えば特開２００１−２８６２８２号公報の実施例８などに従って調製することができる。
【００６０】
本発明に用いられるＨＶＪ−Ｅは、好ましくは、単離且つ精製されたものである。「単離且つ精製」とは、目的物以外の成分（ウイルスゲノム、カプシドタンパク質等）を除去する操作がなされていることを意味する。
【００６１】
本発明は、また、本発明のタンパク質複合体をエンベロープに含有する、ＨＶＪ−Ｅを提供する。ここで、本発明のタンパク質複合体に含有される、本発明の融合タンパク質（第１の融合タンパク質）は、ＨＶＪ−Ｅへ取り込まれており、該融合タンパク質に含まれる機能性ポリペプチド領域（ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン）が、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示されている。ここへ、本発明のタンパク質複合体に含有される第２の融合タンパク質が結合することより、結果として、第２の融合タンパク質に含まれる第２の機能性ポリペプチドが、ＨＶＪ−Ｅの外側に提示されることとなる。
【００６２】
本発明のタンパク質複合体をＨＶＪのエンベロープに含有させるためには、抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを機能性ポリペプチドとして含有する本発明の融合タンパク質（第一の融合タンパク質）をＨＶＪのエンベロープに組み込ませたＨＶＪ−Ｅを作製し、その後、該ＨＶＪ−Ｅと別途調製したＺＺドメインに機能可能に連結された機能性ポリペプチドを含む第２の融合タンパク質とを結合させて複合体を形成させる。複合体形成のためには、両分子を含む溶液を調製し、５分以上、好ましくは１５分以上、例えば３０分または１時間、ゆるやかに攪拌または静置するとよい。この溶液は、生理的緩衝液および生理的食塩水など、タンパク質の変性をもたらさない緩衝液中で行うことが好ましい。複合体の形成は、常法の免疫学的手法で確認することもでき、例えば機能性ポリペプチドが一本鎖ＩＬ−１２である場合は、ショ糖密度勾配遠心に供してＨＶＪ−ＥとＺＺドメインに連結された一本鎖ＩＬ−１２が同じショ糖密度の画分に回収されることを、免疫学的手法またはＩＬ−１２活性の測定により確認することもできる。
【００６３】
本発明は、またＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持する、ＨＶＪ−Ｅを提供する。ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドの定義は上述の通りであり、該ポリペプチドとしては、哺乳動物のＩＬ−１２を挙げることができる。ＩＬ−１２は、２つの異なるサブユニット（ｐ３５およびｐ４５）から構成されるヘテロダイマーであってもよく、該２つのサブユニットが機能可能に連結された一本鎖ＩＬ−１２であってもよい。好ましくは、一本鎖ＩＬ−１２である。一本鎖ＩＬ−１２としては、配列番号１の第１０３〜６２５アミノ酸に該当するアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることが出来る。
【００６４】
ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持させる方法としては、上述のように、機能性ポリペプチドとしてＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを含む本発明の融合ポリペプチドや、第２の機能性ポリペプチドとしてＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを含む本発明のタンパク質複合体を、エンベロープに含有させる方法が好適なものとして挙げられる。但し、これらの方法に特に限定されるものではなく、当業者に公知の方法でＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持させることができる。例えば、ＨＶＪ−Ｅの外側をビオチン化し、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドを、ビオチン化したＨＶＪ−Ｅへ結合させる方法等を挙げることができる。
【００６５】
本態様のＨＶＪ−Ｅに含有されるＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドの量は、特に限定されないが、ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドとしてＩＬ−１２を用いる場合には、その含有量は、ＨＶＪ−Ｅ  １００ＨＡＵあたり、１〜１００００ｐｇ、好ましくは１０〜１０００ｐｇ、より好ましくは１００〜５００ｐｇ（例えば、２５０ｐｇ）である。本明細書においてＨＡＵ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ）とは赤血球を凝集させる活性の単位であり、ＨＶＪ−Ｅの１ＨＡＵとはニワトリの赤血球と混合した場合に凝集を起こす最小単位のことをいう。例えば１０００ＨＡＵとは、目的の検体の１０００分の１量をニワトリの赤血球と混合した場合には凝集を起こすが、それ未満では凝集を起こさない量をいう。実際の測定は、公知の方法で行うことが可能であるが、例えば、９６ウェルの試験プレートのウェルに２倍希釈系列でＨＶＪ−Ｅを５０μｌずつ入れ、そこにニワトリの赤血球懸濁液を５０μＬ添加して計１００μＬとし、溶液の凝集の有無を目視で確認し、その希釈率を基に計算することができる。
【００６６】
ＩＬ−１２等のＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチド自体は抗腫瘍活性を有しており、また、ＨＶＪ−Ｅも抗腫瘍活性を有しているが、ＩＦＮ−γ分泌促進能を有するポリペプチドをエンベロープの外側に提示する形で担持させることにより、抗腫瘍活性が飛躍的に上昇する。
【００６７】
ＨＶＪ−Ｅは、化学療法剤、治療用外来遺伝子等の治療物質をその中に含有することで、標的となる細胞に高効率で治療物質を導入することができることは当業者にとっては公知である。また、本発明者らは、ＨＶＪ−Ｅ自体に抗腫瘍活性があることを見出している。本発明のＨＶＪ−Ｅにおいては、機能性分子をその粒子表面に露出されることが可能であり、この機能性分子の作用により、従来公知であった抗腫瘍活性を増強させたり、ＨＶＪ−Ｅを特定の腫瘍へ標的化し得ることを見出した。従って、本発明は、前記本発明のＨＶＪ−Ｅを有効成分として含む抗癌剤と提供する。本発明の抗癌剤は、あらゆる種類の癌（固形癌、細胞癌など）に有効である。消化器系、泌尿器科系、神経系、結合組織における癌、皮膚癌等あらゆる種類の癌に適用可能であるが、一例として、メラノーマ、前立腺癌、大腸癌などが挙げられる。本発明のＨＶＪ−Ｅは低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の哺乳動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【００６８】
本発明のＨＶＪ−Ｅを癌の治療剤などの医薬として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。本発明のＨＶＪ−Ｅは常套手段に従って製剤化することができる。該ＨＶＪ−Ｅは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
【００６９】
本発明のＨＶＪ−Ｅは、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明のＨＶＪ−Ｅと薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【００７０】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のＨＶＪ−Ｅを通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記ＨＶＪ−Ｅを通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００７１】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００７２】
本発明のＨＶＪ−Ｅを注射により投与する場合、腫瘍部位、またはその周辺部に、ＨＶＪ−Ｅを直接注射により投与することができる。投与量は、腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。腫瘍体積が１０００ｍｍ３以下（例えば、２００ｍｍ３程度など）の場合、１腫瘍部位あたり１回当たりのＨＶＪ−Ｅの投与量を１０〜１００００ＨＡＵ、好ましくは１０〜５０００ＨＡＵ、さらに好ましくは５０〜１０００ＨＡＵ、例えば１００ＨＡＵとすることができる。あるいはまた、体重１ｋｇあたり、３０００００ＨＡＵ以下であることが好ましい。
【００７３】
本発明のＨＶＪ−Ｅとして、ＩＬ−１２をエンベロープの外側に提示する形で担持する、ＨＶＪ−Ｅを用いた場合における、ＩＬ−１２としての投与量は、腫瘍体積が１０００ｍｍ３以下（例えば、２００ｍｍ３程度など）の場合、１腫瘍部位あたりの１回あたりのＩＬ−１２の投与量を０．１ｐｇ〜１０００ｐｇ、１〜５００ｐｇ、さらに好ましくは１０〜５０ｐｇ（例えば２５ｐｇ）とすることができる。ＨＶＪ−Ｅ自体の抗腫瘍効果とＩＬ−１２の抗腫瘍効果とが相まって、極めて強力な抗腫瘍活性を達成することが可能であるため、ＨＶＪ−ＥやＩＬ−１２を、それぞれ単独で投与する場合や、ＨＶＪ−ＥとＩＬ−１２とを単に混合して投与する場合と比較して、ＨＶＪ−Ｅ及びＩＬ−１２それぞれの投与量を減らすことが可能であり、安全性の観点から有利である。例えば、１腫瘍部位あたり１回当たりの投与量を、ＨＶＪ−Ｅとして、１０００ＨＡＵ以下、好ましくは５０〜１０００ＨＡＵ、より好ましくは１００ＨＡＵとすることができる。また、同じ場合、該投与量を、ＩＬ−１２として、１腫瘍部位あたり１００ｐｇ以下、例えば１０〜１００ｐｇ、好ましくは１０〜５０ｐｇ（例えば２５ｐｇ）とすることができる。このような低い投与量は、特に、腫瘍体積が１０００ｍｍ３以下の場合に、有効である。また、ＨＶＪ−ＥとＩＬ−１２  がそれぞれ所望の量含まれるように、抗体の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインが機能可能に連結された第１の融合タンパク質をエンベロープに含むＨＶＪ−Ｅと第２の融合タンパク質とを混合する際にその比率を適宜変更することができる。また腫瘍体積が１０００ｍｍ３以上の場合であっても、例えばＨＶＪ−Ｅが１腫瘍部位あたりの１回投与量として１０〜１０００００ＨＡＵ、ＩＬ−１２が１ｐｇ〜１００００ｐｇの範囲から、患者の状態に応じて投与量を決定することができる。同様に投与回数も腫瘍の大きさ、患者の年齢、体重、状態等を考慮して、医者または医療従事者が適宜決定することができる。
【００７４】
なお、前記した各組成物は、本発明のＨＶＪ−Ｅとの配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【実施例】
【００７５】
改変ＨＶＪ−Ｅの作製スキーム
本実施例に用いる１本鎖ＩＬ−１２（以下、ｓｃＩＬ−１２とも表す）との会合により抗腫瘍効果を向上させた改変ＨＶＪ−Ｅの作製スキームを図１に示す。図１では、この機能性分子がＩＬ−１２の場合を例として記載しているが、細胞表面の受容体に結合する各種の分子等、所望の機能性分子をこの方法でＨＶＪ−Ｅの表面に提示させることができることは、当業者であれば容易に理解可能である。
すなわち、機能性ポリペプチドを提示するＨＶＪ−Ｅには、イムノグロブリン（Ｉｇ）分子の定常領域（Ｆｃ）のＣＨ２−ＣＨ３ドメインをウイルス表面に提示するＦｃ−ＨＮタンパク質と、所望の機能性ポリペプチドとプロテインＡのＺＺドメインとを融合させたＺＺ融合タンパク質との、２種の融合タンパク質が用いられた。
まず、天然型ＨＶＪ−Ｅのウイルス粒子表面に提示されたＨＮタンパク質の粒子外ドメインを抗体の定常領域（Ｆｃ）に置換したＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を作製し、これをＨＶＪ−ＥのＨＮタンパク質の代わりにウイルス粒子に提示するＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅを作製した（図１ａ）。
より詳細には、ＨＮタンパク質の粒子外ドメインを抗体の定常領域（Ｆｃ）に置換したＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入して該細胞でＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。この細胞に天然型ＨＮタンパク質を持つ天然型ＨＶＪ−Ｅを感染させて増幅させた。すると、このウイルス増幅の過程で、細胞内で発現され細胞外にＦｃを提示していたＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を粒子外被に取り込んでＦｃ部を粒子表面に提示したウイルス（Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅ）が細胞外に放出された（図２）。
次いで、一本鎖ＩＬ−１２にプロテインＡのＺＺドメイン（該ドメインがＦｃと結合する）を付加したｓｃＩＬ−１２−ＺＺ融合タンパク質（ＺＺ−ＩＬ１２）を作製した（図１ｂ）。
Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥとＺＺ−ＩＬ１２とを混合することで、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅの粒子表面のＦｃにＺＺ−ＩＬ１２のＺＺドメインが結合して、ＺＺ−ＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅとが会合し、ＨＶＪ−Ｅの粒子表面にＩＬ−１２が提示されたＺＺ−ＩＬ１２−Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅが得られた（図１ａ＋ｂ）。
より具体的に本実施例に用いたＺＺ−ＩＬ１２−Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅの作製方法を以下に記載するが、この記載により本発明の態様がこれに限定されるものではない。
【００７６】
１．Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪの作製
（１）ウイルス粒子に取り込まれるために必要なＨＮタンパク質内の領域の特定
まず、ウイルス粒子に取り込まれ得るＨＮ−Ｆｃ融合タンパク質を作製するにあたり、ＨＮタンパク質のどの領域がウイルス粒子に取り込まれるために必須であるのかを特定した。
ＨＮタンパク質中のウイルス粒子の外に提示される領域（細胞外ドメイン）のＣ末端側から欠失させて、６種類のリコンビナントＨＮ発現ベクター（Ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＨＮ、ｅｃｔｏ−４００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−３００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−２００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−０ａａ−ＨＮ）を作製した（図３（ａ））。これらのリコンビナントＨＮは、免疫学的検出を可能とするために、便宜上、Ｃ末端側にＭｙｃタグを融合させた。このリコンビナントＨＮ発現ベクターをサル腎臓細胞ＬＬＣＭＫ２に導入し、その発現をウエスタンブロットにより確認したところ、所望の分子量の位置に各リコンビナントＨＮが発現されていた（図３（ｃ））。このウエスタンブロットで検出される発現量がかなり少なかったｅｃｔｏ−０ａａ−ＨＮ以外のリコンビナントＨＮについて、細胞内局在を免疫染色法で確認した。Ｔｒｉｔｏｎ存在下では、いずれも細胞質に検出されたが、Ｔｏｒｉｔｏｎ非存在下で本来の細胞内局を見たところ、Ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ＨＮ  及びｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮのみが細胞膜表面に局在している事が明らかとなった（図３（ｂ））。さらに、これらのリコンビナント  ＨＮ  発現細胞に  ＨＶＪ  を感染させると、ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ  のみが感染細胞由来  ＨＶＪ  に取り込まれていることが確認された（図３（ｄ））。
また、上記と同様に、ｅｃｔｏ−５０ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−８０ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−１２０ａａ−ＨＮおよびｅｃｔｏ−１５０ａａ−ＨＮを作製して（図４（ａ））、同様に細胞内発現（図４（ｃ））、細胞内局在（図４（ｂ））およびウイルス粒子への取り込み（図４（ｄ））を確認したところ、ｅｃｔｏ−５０ａａ−ＨＮは、細胞内発現が低く、細胞膜表面への局在も確認できなかったが、ｅｃｔｏ−８０ａａ−ＨＮ、ｅｃｔｏ−１２０ａａ−ＨＮおよびｅｃｔｏ−１５０ａａ−ＨＮについては、十分に発現され細胞膜表面に局在することが確認された。ウイルス粒子への取り込みについては、ｅｃｔｏ−８０ａａ−ＨＮおよびｅｃｔｏ−１２０ａａ−ＨＮにおいて、認められた（図４（ｄ））。
以上より、Ｃ末端切断型のＨＮタンパク質がウイルス粒子に取り込まれるためには、ＨＮタンパク質の細胞外ドメインのＮ末端側の少なくとも５１残基以上、好ましくは８０残基以上（Ｎ末端から１１１残基以上、好ましくは１４０残基以上）が必要であることがわかった。また、Ｎ末端部分アミノ酸配列の長さが２０９アミノ酸（好ましくは１８０アミノ酸）よりも長いと、かえってＣ末端切断型のＨＮタンパク質はウイルス粒子に取り込まれなくなることが分かった。
（２）Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪの作製
次いで、上記ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮを利用してＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪを作製した。まず、ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮのＭｙｃタグのＣ末端側にマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインのＣＨ２−ＣＨ３ドメインをさらに付加したＦｃ融合ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ（ＨＮ−Ｆｃ）を作製した（図５（ａ））。このＨＮ−Ｆｃについても、上記と同様の方法で、細胞内発現（図５（ｂ））、細胞内局在（図５（ｃ））、ウイルス粒子への取り込み（図５（ｄ））を確認できた。さらに、このｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮのプロテインＡ結合能を調べるために、Ｆｃ−ＨＮとプロテインＡセファロースとの共沈実験を行った。ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮ発現ＬＬＣＭＫ２およびＦｃ−ＨＮ発現ＬＬＣＭＫ２をそれぞれに溶解させてプロテインＡセファロースと混合後、プロテインＡセファロースを沈殿させた。ｅｃｔｏ−１００ａａ−ＨＮはプロテインＡセファロースと共沈せず、全て細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）中に残ったが、Ｆｃ−ＨＮはプロテインＡセファロースと共沈し、プロテインＡとの結合が可能である事が確認された（図５（ｅ））。
【００７７】
２．ＺＺドメイン融合型機能性ポリペプチドの作製（機能性ポリペプチドが一本鎖ＩＬ−１２である場合）
プロテインＡのＺＺドメインと一本鎖ＩＬ−１２とを融合させて、ＺＺ−ＩＬ−１２を作製した。まず、Ｌｉｅｓｃｈｋｅらの報告（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １５，  ３５−４０  （１９９７））にならって一本鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ１２）を作製した。具体的には、ＩＬ−１２の第一のサブユニットｐ４０と第二のサブユニットｐ３５との間にＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒからなるリンカーが３つ連結して挟まれ、さらにｐ４０のＮ末端側にシグナルペプチドを連結したものである（図６（ａ））。本実施例においては、免疫学的検出の便宜のために、シグナルペプチドＣ端とｐ４０サブユニットのＮ端との間にＦｌａｇおよびヘマグルチニン（ＨＡ）のタグを挿入し（Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２）、さらに、ＨＡタグのＣ端とｐ４０サブユニットの間にプロテインＡのＺＺドメインを挿入したものを遺伝子工学的常法により作製した（ＺＺ−ｓｃＩＬ１２）。また、ネガティブコントロールとしてｐ３５サブユニットを欠損したものも作製した（ＺＺ−ｐ４０）。なお、このシグナルペプチドはタンパク質生成後切断される。これらが、ＩＬ−１２として機能しうるかどうかを確認するために、Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２およびＺＺ−ｐ４０について、脾細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌刺激効果を測定した。マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、ＤＣ−Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、４ｎｌ／ｍｌ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌｅ））で６日間培養後、浮遊細胞を樹状細胞（ＤＣ）として回収し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまいた。
Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２およびＺＺ−ｐ４０のそれぞれを、１０  ｎｇ／ｍｌの濃度となるよう各ｗｅｌｌに加え（ｔｏｔａｌ  ２００  μｌ）、２４ｈ  ３７℃でインキュベーションし、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを遠心（４４０×ｇ、５  ｍｉｎ）することで、上清を回収し、上清中のＩＦＮγをＥＬＩＳＡで測定した。その結果、ＺＺ−ｐ４０はＩＦＮγ分泌誘導を示さなかったが、Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２およびＺＺ−ｓｃＩＬ１２は共に、ＩＦＮγ分泌誘導を示し（図６（ｂ））、ここで作製したＺＺ−ｓｃＩＬ１２がＩＬ−１２として作用することが確認された。
【００７８】
３．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪとの結合能
ＺＺ−ｓｃＩＬ１２が、Ｆｃ−ＨＮを粒子表面に提示したＨＶＪ（Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ）と結合して複合体を形成しうるかどうかを調べた。
上記Ｆｃ−ＨＮの発現ベクターをＬＬＣＭＫ２に導入後、ＨＶＪを該細胞に１．５ＭＯＩにて感染させて増幅させたＨＶＪを回収することにより、Ｆｃ−ＨＮを粒子表面に提示したＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪを得た。このＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ液（ＴＦＢバッファー：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２に懸濁）とＺＺ−ｓｃＩＬ−１２液（ＺＺ−ｓｃＩＬ１２発現ベクター導入ＣＨＯ−Ｋ１培養上清（血清不含ＨＡＭ’Ｓ  Ｆ−１２培地））とを、体積比１：２０で混合し（４℃、一晩、転倒混和）、その後、ショ糖密度勾配による遠心分離（２５−５０％スクロース、１００，０００×ｇ、１１ｈ）後、ｓｃＩＬ１２をＨＡタグに対する抗体で、ＨＶＪはＨＶＪに発現しているＭタンパク質に対する抗体で、それぞれショ糖濃度画分のウェスタンブロットにより検出した。Ｆｃ−ＨＮを提示していないＨＶＪとＺＺ−ｓｃＩＬ１２とを混合した場合は、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２は低ショ糖濃度の画分に、ＨＶＪは高ショ糖濃度の画分に、それぞれ分離される（図７右上図）のに対し、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪと混合した場合には、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２はＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪと同じ高ショ糖濃度の画分にも検出され、混合液中のＺＺ−ｓｃＩＬ１２はＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪと複合体を形成していることが確認された。なお、ＺＺドメインを有さないｓｃＩＬ−１２（Ｔａｇ−ｓｃＩＬ１２）はＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪと混合した場合でも、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪと同じ高ショ糖濃度の画分には検出されなかった（図７左下図）。したがって、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪとＺＺ−ｓｃＩＬ−１２とは、Ｆｃ部とＺＺドメインの結合を介して会合し複合体を形成するものと考える。
【００７９】
４．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＨＶＪ−Ｅとの複合体の血清中での結合安定性
前述のようにして得られたＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪを、公知の方法（ＷＯ２００６／０１１５８０など参照のこと）に従って精製し、Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを得た。このＦｃ−ＨＶＪ−ＥとＺＺ−ｓｃＩＬ１２とを上記と同様に混合し、血清中で３７℃で０〜２４時間インキュベートした後、上記同様にウエスタンブロットに供した。その結果、２４時間のインキュベーションにおいても、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＶＪ−Ｅの結合が維持されている事が確認された（図８）。
【００８０】
５．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの樹状細胞（ＤＣ）および脾臓細胞への作用
Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを樹状細胞（ＤＣ）に対するＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの作用を検討した。ＤＣの調製は、マウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、ＤＣ−Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ、４ｎｌ／ｍｌ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌｅ））で６日間培養した後、浮遊細胞（ＤＣ）を回収し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまいた。その後、天然型ＨＶＪ−Ｅ、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥおよびＺＺｓｃＩＬ１２と複合体を形成したＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥＨＶＪ−Ｅを、それぞれ１０、５０または１００ＨＡＵ（１００μｌ培地中）を各ウェルに加え、２４時間、３７℃でインキュベーションした。この９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを４４０×ｇ、５ｍｉｎで遠心し、上清を回収し、上清中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図９に示す。ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、ＤＣからのＩＦＮ−γ分泌を促進した（図９中図）。天然型ＨＶＪ−ＥおよびＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥもＩＦＮ−γ分泌促進を誘導したが、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅが最もＩＦＮ−γ分泌促進能に優れていた。また、ＤＣからのＩＬ−６分泌促進能については、天然型ＨＶＪ−Ｅよりは低いものの、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥおよびＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅとも、ＩＬ−６の分泌も促進させることが確認された（図９右図）。
さらにまた、脾臓細胞におけるＩＦＮ−γ分泌促進についても検討した。脾臓細胞は、マウス脾臓から脾細胞を回収後、塩化アンモニウム−トリス緩衝液を加えて赤血球を溶血させた後、細胞をｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ−Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、４ｎｌ／ｍｌ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌｅ））に懸濁し、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまいた。これに上記と同様に、天然型ＨＶＪ−Ｅ、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥおよびＺＺ−ｓｃＩＬ１２  結合型Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−ＥＨＶＪ−Ｅを、それぞれ１０、５０または１００ＨＡＵ（１００μｌ培地中）を、ならびにＩＬ−１２を２５ｐｇ、５０ｐｇおよび２５０ｐｇ（１００μｌ培地中）をそれぞれ、各ウェルに加え２４ｈ  ３７℃でインキュベーションした。この９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを４４０×ｇ、５ｍｉｎで遠心し、上清を回収し、上清中のＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡで測定した。その結果を図１０に示す。天然型ＨＶＪ−ＥおよびＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅは、脾臓細胞のＩＦＮ−γ分泌を誘導せず、ＩＬ−１２も殆どＩＦＮ−γ分泌を誘導しなかったが、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−ＥはＩＦＮ−γ分泌を誘導した（図１０）。すなわち、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進に関しては、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅとの相加効果を上回るものである。
【００８１】
６．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍作用
マウスの背にＦ１０メラノーマをの皮内注入し、その腫瘍径が２〜４ｍｍになったところでＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ：１００ＨＡＵ、ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）を２日おきに３回腫瘍内注射をし、その後の腫瘍径や免疫系活性化能を測定した。
ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ投与後の腫瘍体積の増大はほとんど認められず、天然型ＨＶＪ−Ｅと比較しても明らかに強い腫瘍増殖抑制が認められた（図１１左図）。なお、本発明者らは、同様の方法で、通常のＨＶＪ−Ｅが前立腺癌の腫瘍体積の増加をほぼ９０％以上抑制するという事実を発表しているが（ＷＯ２００５／０９４８７８）、これに用いたＨＶＪ−Ｅは５０００ＨＡＵという高用量であり、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅ＋ＺＺ−ｓｃＩＬ１２が、ＨＶＪ−Ｅの力価として１００ＨＡＵという低用量でメラノーマに対して同レベルの効果を呈するということは驚くべき事実であった。また、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ投与群の４個体中、２個体は完全に寛解した。このことから、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、１００ＨＡＵという低容量でも強力な抗腫瘍作用を示すことがわかった。
【００８２】
７．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅのｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫活性化能の検討
マウス背部の皮内に５×１０５  ｃｅｌｌｓのＦ１０メラノーマを注入し、腫瘍が約３〜５ｍｍになった時点で、天然型ＨＶＪ−Ｅ１００ＨＡＵまたはＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ：１００ＨＡＵ、ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）を腫瘍内に２日おきに３回投与した。最終投与から１０日後に各マウスの脾細胞を採取した。
マイトマイシンＣで処理（１５μｇ／ｍｌ、４５ｍｉｎ、３７℃）したＦ１０メラノーマを、採取した脾細胞に１０：１の割合で混合し（脾細胞：Ｆ１０＝２×１０７：２×１０６（５ｍｌ））、３７℃で４８ｈ  インキュベートした後、脾細胞を回収し、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｒ＆Ｄ）のプロトコールに従ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。なお、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいては、メンブレン上での脾細胞とマイトマイシンＣ処理Ｆ１０メラノーマとの比は、脾細胞：Ｆ１０＝３×１０５：０．２×１０４（１００μｌ／ｗｅｌｌ）で行い、インキュベーションの時間は２４時間とした。
天然型ＨＶＪ−Ｅに比べてＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、約５倍以上のＩＦＮ−γ分泌誘導効果を示した（図１２左図）。
また、Ｃｒ５１リリーシングＣＴＬアッセイにより、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ刺激脾細胞による免疫系活性化を調べた。Ｃｒ５１リリーシングＣＴＬアッセイは、常法にしたがい、下記の要領で実施した。Ｆ１０メラノーマをマイトマイシンＣで処理（１５μｇ／ｍｌ、４５ｍｉｎ、３７℃）後、上記採取した脾細胞とメラノーマを１０：１割合で混合し（脾細胞：Ｆ１０＝５×１０７：５×１０６（２０ｍｌ））、３７℃で７日間インキュベーションした。この際、培地にはＩＬ−２（ｆｉｎａｌ  １０ｎｇ／ｍｌ）を添加しておき、インキュベーション４日後には１０ｍｌの培地（５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２含有）を再度添加した。脾細胞を回収し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０６、１×１０６、５×１０５、２．５×１０５、１．２５×１０５、０．６２５×１０５  ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌの２倍希釈系列を作製する。また、ポジティブコントロールとして１％ＮＰ−４０溶液、ネガティブコントロールとしてＲＰＭＩ培地を使用した。Ｆ１０メラノーマを５×１０６  ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌに調整し、１．８５ＭＢｑの５１Ｃｒを加え、３７℃、４５ｍｉｎインキュベーションし、Ｆ１０メラノーマを洗浄して２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌで脾細胞をまいたプレートに加え、４ｈインキュベーションした。そのプレートを１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心後、各ｗｅｌｌの上清を１００μｌ回収し、５１Ｃｒを測定した。
その結果、やはりＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅは、天然型ＨＶＪ−Ｅに比べてかなり強いＣＴＬ活性を示した（図１２右図）。
【００８３】
８．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅと、非結合ｓｃＩＬ１２およびＨＶＪ−Ｅの併用投与との抗癌作用の比較
ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ：１００ＨＡＵ、ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）、またはＺＺドメインを有していないためＦｃ−ＨＶＪ−Ｅとは結合しないＴａｇ−ｓｃＩＬ１２（ＩＬ−１２：２５０ｐｇ）とＨＶＪ−Ｅ１００ＨＡＵとの混合液とを、上記同様Ｆ１０メラノーマを注入し腫瘍が約２〜４ｍｍになったマウスに腫瘍内に２日おきに３回投与した。回投与から１４日目において、各マウスの腫瘍を観察し、完全に腫瘍が消失したマウスの割合を図１３に示す。ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを投与した群では３０％以上で腫瘍が全く消失し、それ以後再発することなく９０日後でも生存していた。一方、Ｆｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅと結合しないＴａｇ−ｓｃＩＬ１２とＦｃ−ＨＮ−ＨＶＪ−Ｅとを共投与した群では、５％程度しか腫瘍寛解が認められなかった（図１３）。このことから、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅとが結合して複合体を形成することで強い抗腫瘍活性を示すことがわかった。
このことは、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅの抗癌作用は、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅとが結合して複合体を形成した状態で癌細胞に作用することによって、ＩＬ−１２とＨＶＪ−Ｅというそれぞれに抗癌作用を奏するものの単なる組合せによる効果の増大を大きく上回るということを示している。
【００８４】
９．ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅと、非結合ｓｃＩＬ１２およびＨＶＪ−Ｅの併用との脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進能の比較
上記と同様、ＺＺ−ｓｃＩＬ１２結合型Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅを投与した場合と、同量のｓｃＩＬ１２とＨＶＪ−Ｅとを結合していない状態で併用投与した場合とにおける、脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌促進刺激を調べた。Ｆ１０メラノーマを注入し腫瘍が約３〜５ｍｍになったマウスに腫瘍内に、ＨＶＪ−Ｅ単独、Ｆｃ−ＨＶＪ−Ｅ＋ＺＺｓｃＩＬ１２複合体（２５０ｐｇ  ｓｃＩＬ１２／１００ＨＡＵ  ＨＶＪ−Ｅ、またはＦｃ−ＨＶＪ−ＥとＴａｇｓｃＩＬ−１２との混合液（２５０ｐｇ  ｓｃＩＬ１２／１００ＨＡＵ  ＨＶＪ−Ｅ）を、１０、５０または１００ＨＡＵ  ＨＶＪ−Ｅを、２日おきに３回投与した。最終投与から１０日後に各マウスの脾細胞を採取し、脾細胞から分泌されたＩＦＮ−γを定量した（図１４）。その結果、高濃度投与時においては結合型、非結合型共に同程度に高いＩＦＮ−γ分泌を誘導するが、低濃度投与時においては結合型の方が非結合型と比較して高いＩＦＮ−γ分泌誘導を引き起こすことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の一本鎖ＩＬ−１２がＨＶＪ−Ｅの表面に連結した改良型ＨＶＪ−Ｅ、さらに該改良型ＨＶＪ−Ｅを有効成分とする抗癌剤は、従来公知のＨＶＪ−Ｅ単独の抗癌剤よりも低用量かつ著しい抗腫瘍効果を発揮し、新規な癌治療剤として有用である。
【図２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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