(57)【要約】      （修正有）【課題】世界中で呼吸器感染症に罹患している小児入院患者の約20％を占め、乳児や子供では重症の呼吸器疾患をもたらす伝染性のパラインフルエンザウイルス感染症を予防するためのワクチンの開発。【解決手段】適当な宿主細胞系において異種遺伝子産物を発現させるために、および/または異種遺伝子産物を発現し、パッケージングし、かつ/または提示するネガティブ鎖RNA組換えウイルスをレスキューするために、使用することができる組換えウシ・パラインフルエンザウイルス（bPIV）cDNAもしくはRNAに関する。異種遺伝子産物には、別の種のPIV由来または別のネガティブ鎖RNAウイルス由来の遺伝子産物が含まれる。このキメラウイルスおよび発現産物は、広範な病原体および抗原に対するワクチンを含めたワクチン製剤において有利に使用される。【選択図】図１Ａ
2011167197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列を含んでなる組換えパラインフルエンザウイルス３型であって、該哺乳動物メタニューモウイルスが、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科ニューモウイルス(Pneumovirinae)亜科に属するネガティブセンス一本鎖RNAウイルスであり、かつ該哺乳動物メタニューモウイルスは、系統発生的に、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)との近縁性よりも、CNCM（パリ）にI-2614として寄託されたウイルス分離株との近縁性が高いことを特徴とする、組換えパラインフルエンザウイルス３型。
【請求項２】
哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列が、パラインフルエンザのヌクレオチド配列に取って代わっているか、またはパラインフルエンザウイルスのゲノムに挿入されている、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項３】
哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列が、パラインフルエンザウイルスゲノムの位置1、2、3、4、5または6に挿入されている、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項４】
さらにRSVヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項５】
パラインフルエンザウイルスがウシ・パラインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項６】
さらにヒト・パラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を１つ以上含む、請求項５に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が哺乳動物メタニューモウイルスのポリペプチドをコードしている、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、哺乳動物メタニューモウイルスのFもしくはGタンパク質、またはその断片である、請求項７に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号70もしくはその断片と少なくとも90％同一、配列番号78もしくはその断片と少なくとも70％同一、配列番号62もしくはその断片と少なくとも90％同一、配列番号18もしくはその断片と少なくとも82％同一、配列番号42もしくはその断片と少なくとも85％同一、配列番号50もしくはその断片と少なくとも60％同一、配列番号34もしくはその断片と少なくとも85％同一、配列番号26もしくはその断片と少なくとも20％同一、または配列番号86もしくはその断片と少なくとも30％同一である、請求項７に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号78、配列番号62、配列番号18、配列番号42、配列番号50、配列番号34、配列番号26、配列番号86、配列番号70、配列番号28、配列番号72、配列番号80、配列番号64、配列番号20、配列番号44、配列番号52、配列番号88、配列番号36、配列番号29、配列番号73、配列番号81、配列番号65、配列番号21、配列番号45、配列番号53、配列番号89、配列番号37、配列番号27、配列番号71、配列番号79、配列番号63、配列番号43、配列番号51、配列番号87、配列番号35、またはその断片である、請求項７に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号22〜25、配列番号30〜33、配列番号38〜41、配列番号46〜49、配列番号54〜61、配列番号66〜69、配列番号74〜77、配列番号82〜85、配列番号90〜93、配列番号98〜132、配列番号168〜247、またはその断片からなる群より選択される、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１２】
前記断片が、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、または少なくとも1000アミノ酸長である、請求項９または10に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１３】
前記断片が、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、または少なくとも1000ヌクレオチド長である、請求項11に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１４】
異種ヌクレオチド配列がヒト・メタニューモウイルス由来である、請求項１に記載のウイルス。
【請求項１５】
哺乳動物メタニューモウイルス配列が、Fタンパク質、Gタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、Lタンパク質、またはその断片をコードしている、請求項７に記載のウイルス。
【請求項１６】
請求項１〜14のいずれか1項に記載のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。
【請求項１７】
請求項15に記載のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。
【請求項１８】
請求項１〜14のいずれか1項に記載の組換えウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤。
【請求項１９】
請求項15に記載の組換えウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤。
【請求項２０】
請求項18に記載のワクチンを投与することを含んでなる、哺乳動物における呼吸器感染症の処置方法。
【請求項２１】
請求項19に記載のワクチンを投与することを含んでなる、哺乳動物における呼吸器感染症の処置方法。
【請求項２２】
哺乳動物がヒトである、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物がヒトである、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を、該細胞の増殖に最適な温度より低い温度で培養することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、(i) 該ウイルスを感染させる前に第１の温度で細胞を培養し、(ii) 該細胞にウイルスを感染させ、(iii) 該細胞へのウイルスの感染後に第２の温度で該細胞を培養する、ことを含んでなり、第２の温度が第１の温度より低いことを特徴とする、上記方法。
【請求項２６】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を血清の非存在下で培養することを含んでなる上記方法。
【請求項２７】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、(i) 該ウイルスを感染させる前に血清の存在下で細胞を培養し、(ii) 該細胞にウイルスを感染させ、(iii) 該細胞へのウイルスの感染後に血清の非存在下で該細胞を培養する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項２８】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を、血清の非存在下に、該細胞の増殖に最適な温度より低い温度で培養することを含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  序
本発明は、適当な宿主細胞系において異種遺伝子産物を発現させるために、および/または異種遺伝子産物を発現し、パッケージングし、かつ/または提示するネガティブ鎖RNA組換えウイルスをレスキューするために、使用することができる組換えパラインフルエンザウイルス（PIV）cDNAもしくはRNAに関する。特に、本発明は、異種遺伝子産物（好ましくは、抗原性ペプチドまたはポリペプチドである）を発現するキメラPIVを含むワクチン製剤を包含する。一実施形態において、本発明のPIVベクターは、同じまたは異なるウイルスによりコードされうる1、2または3つの異種遺伝子産物を発現する。好ましい実施形態では、異種配列は、別の種のPIV由来または別のネガティブ鎖RNAウイルス（インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、哺乳動物メタニューモウイルス、およびトリ・ニューモウイルスを含むが、これらに限らない）由来の抗原性ポリペプチドである異種遺伝子産物をコードする。本発明のワクチン製剤には、二価および三価のワクチン製剤をはじめとする多価ワクチンが含まれる。本発明の多価ワクチンは、それぞれの異種抗原配列を発現する1つのPIVベクターの形で、または各ベクターが異なる異種抗原配列をコードする2つ以上のPIVベクターの形で投与することができる。本発明のワクチン製剤は、単独で投与してもよいし、他のワクチン、予防薬または治療薬と組み合わせて投与してもよい。
【背景技術】
【０００２】
2.  発明の背景
パラインフルエンザウイルス感染は、乳児や子供では重症の呼吸器疾患をもたらす (Taoら, 1999, Vaccine 17: 1100-08)。伝染性のパラインフルエンザウイルス感染症は、世界中で呼吸器感染症に罹患している小児入院患者の約20％を占めている（前掲）。有効な抗ウイルス治療法はPIV関連疾患の治療には利用することができず、PIV感染を予防するためのワクチンはまだ認可されていない。
【０００３】
PIVは、パラミクソウイルス科のレスピロウイルス属（PIV1、PIV3）またはルブラウイルス属（PIV2、PIV4）のメンバーである。PIVは2つの構造モジュールから構成されている。すなわち、(1)ウイルスゲノムを含む内部のリボ核タンパク質コア、つまりヌクレオキャプシドと、(2)外側のほぼ球状のリポタンパク質エンベロープである。そのゲノムは一本鎖のネガティブセンスRNAから成り、その長さはおよそ15,456ヌクレオチドで、少なくとも8つのポリペプチドをコードしている。これらのタンパク質には、ヌクレオキャプシド構造タンパク質（その属に応じてNP、NCまたはN）、リンタンパク質（P）、基質タンパク質（M）、融合糖タンパク質（F）、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質（HN）、ラージポリメラーゼタンパク質（L）、機能が不明なCおよびDタンパク質が含まれる（前掲）。
【０００４】
パラインフルエンザ・ヌクレオキャプシドタンパク質（NP、NCまたはN）は、各タンパク質単位内に2つのドメインを含む。これらのドメインには、アミノ末端ドメイン（この分子の3分の2ほどを含み、RNAと直接相互作用する）およびカルボキシ末端ドメイン（集合したヌクレオキャプシドの表面にある）が含まれる。これら2つのドメインの接合部にはヒンジ部が存在しており、それによりこのタンパク質に若干の柔軟性が付与されると考えられている (Fieldsら(編), 1991, FUNDAMENTAL VIROLOGY, 第2版, Raven Press, New Yorkを参照のこと(その全体を参照により本明細書に組み入れる))。基質タンパク質（M）は、明らかにウイルスの組み立てに関与しており、ウイルス膜とヌクレオキャプシドタンパク質のいずれとも相互作用する。リンタンパク質（P）は、リン酸化を受けやすく、転写調節、メチル化、リン酸化およびポリアデニル化に関係している。最初は不活性な前駆物質として産生された融合糖タンパク質（F）は、翻訳時に開裂されて2つのジスルフィド結合ポリペプチドを生じる。活性型のFタンパク質はウイルス膜と相互作用し、そこでFタンパク質は、ウイルスエンベロープと宿主細胞原形質膜との融合を促進することによって、パラインフルエンザウイルス粒子が宿主細胞に侵入しやすくする（前掲）。糖タンパク質であるヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）はエンベロープから突き出ており、ウイルスにヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの活性を賦与する。HNは、脂質二重層にHNタンパク質を固着させるように機能する疎水性の強いアミノ末端を有する（前掲）。最後に、ラージポリメラーゼタンパク質（L）は転写と複製の両方において重要な役割を担っている（前掲）。
【０００５】
ウシ・パラインフルエンザウイルスは、輸送熱（shipping fever）の徴候を示しているウシから1959年に初めて分離された。それ以来、当該ウイルスが正常なウシ、流産した胎児、呼吸器疾患の徴候を示すウシからも分離されている (Breker-Klassenら, 1996, Can. J. Vet. Res. 60: 228-236; さらに、Shibuta, 1977, Microbiol. Immunol. 23(7), 617-628も参照のこと)。ヒトおよびウシPIV3は中和エピトープを共有しているが、明確に区別される抗原特性を示す。ヒトおよびウシのウイルス株間には、HNタンパク質に有意な差が存在する。事実、ウシ株はhPIV感染に対して若干の中和抗体を引き出す一方で、ヒト株はヒトPIV3に対して広範な中和抗体を引き出すようである (Van Wyke Coelinghら, 1990, J. Virol. 64: 3833-3843)。
【０００６】
PIVを含めて、あらゆるネガティブ鎖RNAウイルスの複製は、RNAの複製に必要とされる細胞機構が存在しないため、複雑になっている。さらに、ネガティブ鎖ゲノムは、翻訳が起こる前にポジティブ鎖（mRNA）コピーに転写されねばならない。その結果として、ゲノムRNAだけでは、細胞に侵入したとき、必要とされるRNA依存性RNAポリメラーゼを合成することができない。ゲノムRNAと共にL、PおよびNタンパク質が宿主細胞に侵入しなければならない。
【０００７】
PIV mRNAに転写するウイルスタンパク質のほとんどまたは全部がゲノムの複製をも行なうと仮定される。同じタンパク質の別の用途（すなわち、転写または複製）を調節するメカニズムは明確には確認されていないが、そのプロセスは1以上のヌクレオキャプシドタンパク質の豊富な遊離形態を必要とすると考えられる。ウイルスの侵入後すぐに、ヌクレオキャプシド中のネガティブセンスRNAを鋳型として用いてLタンパク質により転写が開始される。ウイルスRNAの合成は、転写においてモノシストロン性mRNAが生じるように調節されている。
【０００８】
転写後、ウイルスゲノムの複製はネガティブ鎖RNAウイルスによる感染において第2の不可欠な事象となる。他のネガティブ鎖RNAウイルスと同様に、PIVのウイルスゲノムの複製もウイルス特異的タンパク質により媒介されている。複製RNA合成の第1の産物は、PIVゲノムRNAの相補的コピー（すなわち、プラス極性）（cRNA）である。これらのプラス鎖コピー（アンチゲノム）は、その末端構造がプラス鎖mRNA転写産物と相違している。mRNA転写産物とは異なり、アンチゲノムcRNAはその5'末端でキャッピングまたはメチル化されておらず、また、その3'末端でトランケーションもポリアデニル化もされない。cRNAはそれらのネガティブ鎖鋳型とコターミナル（coterminal）であり、遺伝情報のすべてを相補形態で含んでいる。cRNAはPIVネガティブ鎖ウイルスゲノム（vRNA）の合成のための鋳型として作用する。
【０００９】
bPIVネガティブ鎖ゲノム（vRNA）およびアンチゲノム（cRNA）はヌクレオキャプシドタンパク質によってキャプシド形成されており、キャプシド形成されていない唯一のRNA種がウイルスmRNAである。bPIV RNAの複製および転写は宿主細胞の細胞質で起こる。ウイルス構成成分の組み立ては、宿主細胞の原形質膜（ここで成熟ウイルスが出芽により放出される）で起こるようである。
【００１０】
2.1.  パラミクソウイルス
古くから、疾患を引き起こす壊滅的な感染因子としてのパラミクソウイルスが原因で、毎年世界中で数多くの動物およびヒトが死亡している。パラミクソウイルス科は、モノネガウイルス(Mononegavirales)目(ネガティブセンス一本鎖RNAウイルス)に含まれる1つの科を形成しており、パラミクソウイルス亜科とニューモウイルス亜科からなる。後者の亜科は、現在のところ、分類学上ニューモウイルス属とメタニューモウイルス属とに分けられる(Pringle, 1999, Arch. Virol. 144/2, 2065-2070)。ニューモウイルス属の1種であるヒト呼吸器多核体ウイルス(hRSV)は、世界的に乳幼児期における下部気道感染症の最も重要な原因である(Domachowske & Rosenberg, 1999, Clin. Microbio. Rev. 12(2): 298-309)。ニューモウイルス属のその他の種には、ウシおよびヒツジRSウイルスとマウス肺炎ウイルス(PVM)が含まれる。
【００１１】
過去数十年で、哺乳動物の疾患、特にヒトの呼吸器疾患(RTI)のいくつかの病原体が確認されている(Evans: Viral Infetions of Humans, Epidemiology and Control, 第3版(Evans, A.S.編) 22-28 (Plenum Publishing Corporation, New York, 1989))。哺乳動物のRTIの古典的な病原体は、ヒト(hRSV)とウシやヒツジ(bRSVおよび/またはoRSV)などの反芻動物で見られたニューモウイルス属に属する呼吸器多核体ウイルスである。ヒトRSVでは、相互中和アッセイ、イムノアッセイでのGタンパク質の反応性、およびG遺伝子のヌクレオチド配列の差異を使用して、2つのhRSV抗原サブグループを規定している。これらのサブグループ内では、アミノ酸配列が94％(サブグループA)または98％(サブグループB)の同一性を示し、一方サブグループ間では、53％のアミノ酸配列同一性しか見られない。サブグループ内では、モノクローナル抗体、RT-PCRアッセイ、およびRNAseプロテクションアッセイに基づいて、更なるばらつきが観察される。両サブグループからのウイルスは世界中に分布しており、一シーズンの間に発生しうる。感染は既存の免疫の存在下でも生じ、再感染を可能にするのに抗原変異を必ずしも必要としない。例えば、Sullender, 2000, Clinical Microbiology Reviews 13(1):1-15; Collonsら, Fields Virology, B.N. Knipe, Howley, P.M. 編、1996, Philadelphia: Lippencott-Raven. 1313-1351; Johnsonら、1987 (Proc Natl Acad Sci USA, 84(16): 5625-9; Collins, The Paramyxoviruses, D.W. Kingsbury編, 1991, Plenum Press: New York, p.103-153を参照されたい。
【００１２】
別の古典的なニューモウイルスは、一般には実験用マウスでしか見られない、マウス肺炎ウイルス(PVM)である。しかし哺乳類で観察される疾患の一部は、まだ既知の病原体に原因があるとすることができない。
【００１３】
2.2.  RSV感染
呼吸器多核体ウイルス(RSV)は、小児の重篤な下部気道疾患の主な原因である(Feigenら編, 1987, Textbook of Pediatric Infectious Diseases, WB Saunders, Philadelphia, p.1653-1675; New Vaccine Development, Establishing Priorities, Vol.1, 1985, National Academy Press, Washington DC, p.397-409; およびRuuskanenら, 1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79)。RSV感染の毎年の流行は世界中で明らかであるが、ある季節でのRSV疾患の発生率および重症度は地域ごとに様々である(Hall, 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110)。北半球の温暖な地域では、感染が通常晩秋から始まって晩春には静まる。一次RSV感染は、6週目の乳児から2才の小児に最も多く発症し、まれに院内感染で4週目の乳児にも生じる(Hallら, 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)。RSV感染の危険性が高い小児には、早産児(Hallら, 1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)と、気管支肺異形成(Groothuisら, 1988, Pediatrics 82:199-203)、先天性心疾患(MacDonaldら, New Engl. J. Med. 307:397-400)、先天性または後天性免疫不全(Ograら, 1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249; およびPohlら, 1992, J. Infect. Dis. 165:166-169)、嚢胞性線維症(Abmanら, 1988, J. Pediatr. 113:826-830)の小児が含まれるが、これらに限定されない。RSV感染で入院している心疾患または肺疾患の小児における致死率は、3〜4％である(Navasら, 1992, J. Pediatr. 121:348-354)。
【００１４】
RSVは乳幼児だけでなく成人にも感染する。健康な成人では、RSVによって主に上部気道疾患が生じる。一部の成人、特に高齢者は、以前に報告されたよりも頻繁に症候性RSV感染に罹患することが、最近明らかになった(Evans, A.S.編、1989, Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 第3版, Plenum Medical Book, New York, p.525-544)。養護ホームの患者および施設に入所している若年成人の中にはいくつかの伝染病も報告されている(Falsey, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608; およびGarvieら, 1980, Br. Med. J. 281:1253-1254)。最後に、RSVは、免疫抑制状態にあるヒト、特に骨髄移植患者の場合に重篤な疾患を引き起こす可能性がある(Hertzら, 1989, Medicine 68:269-281)。
【００１５】
確立されたRSV疾患に対する治療の選択肢は限られている。下部気道の重篤なRSV疾患は、加湿酸素の投与および呼吸補助も含めたかなりのサポート介護をしばしば必要とする(Fieldsら編、1990, Fields Virology, 第2版, Vol.1, Raven Press, New York, p.1045-1072)。
【００１６】
ワクチンはRSV感染および/またはRSV関連疾患を予防すると考えられるが、この徴候に対して認可されているワクチンはまだない。ワクチン開発の主な障害は安全性である。ホルマリン不活化ワクチンは、免疫原性ではあるが、予期せぬことに、このワクチンで免疫した乳児では、同様に調製した三価パラインフルエンザワクチンで免疫した乳児よりも、RSVが原因の下部気道疾患をより高い発生率でかつより重篤な状態で発症した(Kimら、1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434; およびKapikianら、1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-421)。いくつかの候補RSVワクチンについては断念し、その他については開発中であるが(Murphyら、1994, Virus Res. 32:13-36)、たとえ安全性の問題が解決されたとしても、ワクチンの効力も改善されなければならない。いくつかの問題はまだ未解決のままである。下部気道疾患の発生率のピークは2〜5月齢で生じるので、新生児期直後に免疫する必要があると考えられる。新生児免疫応答の未熟さは、母体から獲得されたRSV抗体の高い力価と一緒になって、新生時期のワクチン免疫原性を低下させることが予想される(Murphyら、1988, J. Virol. 62:3907-3910;およびMurphyら、1991, Vaccine 9:185-189)。最後に、一次RSV感染および疾患は、その後のRSV疾患を十分には予防しない(Hendersonら、1979 New Engl. J. Med. 300:530-534)。
【００１７】
現在、RSV疾患を予防するのに唯一認可されている手法は受動免疫である。IgGの防御役割を示唆する初期証拠が、フェレット(Prince, G.A., Ph.D. diss., University of California, Los Angeles, 1975)およびヒト(Lambrechtら、1976, J. Infect. Dis. 134:211-217; およびGlezenら、1981, J. Pediatr. 98:708-715)において母性抗体に関する観察から得られた。Hemmingら(Morellら編、1986, Clinical Use of Intravenous Immunoglobulines, Academic Press, London, p.285-294)は、新生児敗血症の疑いがある新生児での静脈内免疫グロブリン(IVIG)の薬物動態に関する研究中に、RSV感染の治療または予防におけるRSV抗体の潜在的な有用性を認識した。この研究では、呼吸器分泌物がRSVをもたらした1人の乳児が、IVIGを注入した後に急速に回復したことがわかった。IVIGロットに関するその後の分析では、RSV中和抗体の力価が異常に高いことが明らかになった。次いで、この同じ研究者グループは、RSV中和抗体を富化させた高度免疫血清または免疫グロブリンがコットンラットおよび霊長類をRSV感染から防御する能力について試験した(Princeら、1985, Virus Res. 3:193-206; Princeら、1990, J. Virol. 64:3091-3092; Hemmingら、1985, J. Infect. Dis. 152:1083-1087; Princeら、1983, Infect. Immun. 42:81-87; およびPrinceら、1985, J. Virol. 55:517-520)。これらの研究の結果は、IVIGを使用することによって、RSV関連障害を治療または予防することに加えて、RSV感染を予防できることを示している。
【００１８】
最近の臨床研究では、この受動的に投与されたRSV高度免疫グロブリン(RSV IVIG)が、RSVによる重篤な下部気道感染の危険性のある小児を保護できることが実証されている(Groothiusら、1993, New Engl. J. Med. 329:1524-1530; およびThe PREVENT Study Group, 1997, Pediatrics 99:93-99)。これはRSV感染を予防するうえで大きな進歩であるが、この治療を広範に用いる際、ある特定の制約がある。第一に、効果的な用量を実現するために、RSV IVIGを数時間にわたって静脈から注入しなければならない。第二に、高度免疫グロブリン中の活性物質の濃度は、心肺機能が損なわれる危険性のある成人または心肺機能が損なわれた大部分の小児を治療するには不十分である。第三に、静脈内注入は、RSVシーズン中に病院に毎月通う必要がある。最後に、この製品の需要を満たすため、RSVに対する高度免疫グロブリンを生成するのに十分なドナーを選択することが困難であることがわかる。現在、正常なドナーのわずか8％ほどしか、高度免疫グロブリンの生成に適する十分に高いRSV中和抗体力価を持ち合わせていない。
【００１９】
免疫グロブリンの特異的活性を改善する1つの方法は、1種以上の非常に強力なRSV中和モノクローナル抗体(MAb)を開発することであると考えられる。そのようなMAbは、好ましい薬物動態を維持するために、またヒト抗マウス抗体応答の発生を回避するために、ヒトまたはヒト化したものであるべきであるが、それはRSVシーズンを通して繰り返し投与することが必要だからである。RSV表面の2種の糖タンパク質、FおよびGは、中和抗体の標的であることが示された(Fieldsら、1990, 前掲;およびMurphyら、1994, 前掲)。
【００２０】
RSVのFタンパク質のA抗原部位にあるエピトープに対するヒト化抗体、SYNAGIS(登録商標)は、RSVにより引き起こされる重篤な下部気道疾患を予防するために、RSVシーズン(北半球では11月から4月まで)を通して毎月15mg/kg（体重）の推奨用量で、小児患者に筋肉内投与することが認可されている。SYNAGIS(登録商標)は、ヒトの抗体配列(95％)とマウスの抗体配列(5％)の複合体である。Johnsonら、1997, J. Infect. Diseases 176:1215-1224、および米国特許第5,824,307号を参照されたい（その内容全体を参照により本明細書に組み入れる）。ヒト重鎖配列は、ヒトIgGIの定常ドメインと、Cor(Pressら、1970, Biochem. J. 117:641-660)およびCess(Takashiら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:194-198)のVH遺伝子の可変フレームワーク領域から得られた。ヒト軽鎖配列は、Cκの定常ドメインと、Jκ-4を持つVL遺伝子K104の可変フレームワーク領域から得られた(Bentleyら、1980, Nature 288:5194-5198)。マウス配列は、マウス相補性決定領域のヒト抗体フレームワークへのグラフト化を含むプロセスで、マウスモノクローナル抗体Mab 1129から得られた(Beeleroら、1989, J. Virology 63:2941-2950)。
【００２１】
2.3.  トリ・ニューモウイルス
トリ・ニューモウイルス(APV)によって生じる呼吸器疾患は、まず南アフリカで1970年代後半に記述され(Buysら、1980, Turkey 28:36-46)、シチメンチョウ産業に壊滅的な影響を与えた。このシチメンチョウの疾患は副鼻腔炎および鼻炎を特徴とし、シチメンチョウ鼻気管炎(TRT)と呼ばれた。APVのヨーロッパ分離株も、ニワトリの頭部膨張症候群(SHS)の病原体として大きく関係している(O'Brien, 1985, Vet. Rec. 117:619-620)。当初この疾患は、ニューカッスル病ウイルス(NDV)に感染したブロイラー集団に発生し、ニューカッスル病(ND)に関連した二次的な問題であると考えられていた。SHS発症後の罹患ニワトリにおいてヨーロッパAPVに対する抗体が検出され(Cookら、1988, Avian Pathol. 17:403-410)、したがってAPVが原因として浮かび上がってきた。
【００２２】
トリ・ニューモウイルス(APV)は、シチメンチョウの上部気道感染症であるトリ鼻気管炎の病因となるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)とも呼ばれているもので (Giraudら、1986, Vet. Res. 119:606-607)、最近指定されたメタニューモウイルス属の唯一のメンバーであるが、これは現在まで感染には関係がなく、さらに哺乳類の疾患にも関係がないと言われていたものである。APVの血清学上のサブグループは、G糖タンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と、やはりG糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体を使用した中和試験に基づいて区別することができる。しかし、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のその他の差異を使用して、APVの血清学上のサブグループを区別することもできる。サブグループA、BおよびDの場合、Gタンパク質は、そのサブグループ内で98.5〜99.7％のアミノ酸配列同一性を示し、一方サブグループ間では、わずかに31.2〜38％のアミノ酸配列同一性しか観察されない。例えば、Collinsら、1993, Avian Pathology, 22:p.469-479; Cookら、1993, Avian Pathology, 22:257-273; Bayon-Auboyerら、J. Gen Virol, 81(Pt 11):2723-33; Seal, 1998, Virus Res, 58(1-2):45-52; Bayon-Auboyerら、1999, Arch Virol, 144(6):91-109; Juhaszら、1994, J. Gen Virol, 75(Pt 11):2873-80を参照されたい。
【００２３】
APVの別の血清型がWO00/20600（参照により本明細書に組み入れる）に記載されているが、これはAPVのコロラド分離株について述べており、in vitro血清中和試験により既知のAPVまたはTRT株と比較している。まずコロラド分離株を、認識されたTRT分離株に対する単一特異性ポリクローナル抗血清に対して試験した。コロラド分離株は、TRT株のいずれの単一特異性抗血清によっても中和されなかった。しかしコロラド分離株は、サブグループA株に対して作製された高度免疫抗血清によって中和された。この抗血清は、同種ウイルスを1:400の力価で中和し、コロラド分離株を1:80の力価で中和した。次いで上述の方法を使用して、コロラド分離株をTRTモノクローナル抗体に対して試験した。それぞれの場合に相互中和力価は＜10であった。コロラド分離株に対して作製された単一特異性抗血清も、両サブグループのTRT株に対して試験した。試験をしたTRT株の中で、コロラド分離株に対する抗血清によって中和されたものはなかった。
【００２４】
APVのコロラド株は、TRTウイルスのサブグループA株またはサブグループB株の攻撃からSPFニワトリ雛を保護しない。これらの結果は、コロラド分離株が別の血清型のトリ・ニューモウイルスの最初の例になり得ることを示唆している(Bayon-Auboyerら、2000, J. Gen. Vir. 81:2723-2733参照)。
【００２５】
トリ・ニューモウイルスは、パラミクソウイルス科ニューモウイルス亜科のメタニューモウイルス属に属する一本鎖の非セグメント化RNAウイルスである(CavanaghおよびBarrett, 1988, Virus Res. 11:241-256; Lingら、1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715; Yuら、1992, J. Gen. Virol. 73:1355-1363)。パラミクソウイルス科は、2つの亜科、すなわちパラミクソウイルス亜科とニューモウイルス亜科とに分けられる。パラミクソウイルス亜科には、パラミクソウイルス属、ルブラウイルス属、および麻疹ウイルス属が含まれるが、これらに限定されない。最近、遺伝子の順序および配列相同性に基づいて、ニューモウイルス亜科は2つの属、すなわちニューモウイルス属とメタニューモウイルス属とに分けられた(Naylorら、1998, J. Gen. Virol. 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159)。ニューモウイルス属には、ヒト呼吸器多核体ウイルス(hRSV)、ウシ呼吸器多核体ウイルス(bRSV)、ヒツジ呼吸器多核体ウイルス、およびマウスニューモウイルスが含まれるが、これらに限定されない。メタニューモウイルス属には、ニューモウイルス属の型種であるhRSVとは区別されるヨーロッパトリ・ニューモウイルス(サブグループAおよびB)が含まれるが、これらに限定されない(Naylorら、1998, J. Gen. Virol. 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159)。APVの米国分離株は、ヨーロッパ分離株とは抗原的にも遺伝的にも異なることがわかったので、メタニューモウイルス属の第3のサブグループ(サブグループC)になる(Seal, 1998, Virus Res. 58:45-52; Senneら、1998, Proc. 47th WPDC, California, pp.67-68)。
【００２６】
ネガティブ染色したAPVの電子顕微鏡検査によって、長さ1000〜2000nmの長いフィラメントを有する直径80〜200nmの範囲の多形性の、ときには球形の、ウイルス粒子であることが明らかにされた(CollinsおよびGough, 1988, J. Gen. Virol. 69:909-916)。エンベロープは、長さ13〜15nmのスパイクが散在している膜でできている。ヌクレオキャプシドは直径14nmのらせん状で、そのピッチは7nmである。ヌクレオキャプシドの直径は、通常約18nmの直径を有するパラミクソウイルス属および麻疹ウイルス属の直径よりも小さい。
【００２７】
トリ・ニューモウイルス感染は、長年にわたり家禽類では世界各地に存在しているにもかかわらず、米国で新たに発生した疾患である。1996年5月、非常に伝染性のシチメンチョウの呼吸器疾患がコロラドで発生し、その後アイオワ州Amesの国立獣医学研究所(NVSL)でAPVが単離された(Senneら、1997, Proc. 134th Ann. Mtg., AVMA, p.190)。これより前は、米国およびカナダにはトリ・ニューモウイルスがないものと考えられていた(Pearsonら、1993, Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control, pp.78-83; HeckerおよびMyers、1993, Vet. Rec. 132:172)。1997年の初め、ミネソタ州のシチメンチョウにおいてAPVの存在が血清学的に検出された。最初の確定診断がなされるまでに、APV感染は既に多くの農場に蔓延していた。この疾患は上部気道の臨床的症状、すなわち泡沫眼、鼻漏、および副鼻腔等の腫張を伴う。これは二次感染によって悪化する。感染したトリの罹患率は100％になる可能性がある。死亡率は1〜90％に及ぶ可能性があり、6〜12週齢の雛で最も高い。
【００２８】
トリ・ニューモウイルスは接触により伝染する。鼻漏、感染したトリの移動、汚染水、汚染設備、すなわち汚染された飼料トラックおよび積出し作業が、ウイルスの伝播に寄与する可能性がある。回復したシチメンチョウはキャリアであると考えられる。ウイルスは、産卵するシチメンチョウの卵管上皮に感染することが示されており、またAPVは若い雛で検出されているので、卵による伝播が可能であると考えられる。
【００２９】
ヒト呼吸器疾患の大部分は、パラミクソウイルス亜科およびニューモウイルス亜科というウイルス亜科のメンバーによって引き起こされる。気道感染をもたらす様々なウイルスから保護するのに有効なワクチンが依然として求められている。
【００３０】
本明細書の参考文献の引用または考察は、それらが本発明の先行技術であると認めるものと解釈すべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】米国特許第5,824,307号
【特許文献２】WO00/20600
【非特許文献】
【００３２】
【非特許文献１】Taoら, 1999, Vaccine 17: 1100-08
【非特許文献２】Fieldsら(編), 1991, FUNDAMENTAL VIROLOGY, 第2版, Raven Press, New York
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【非特許文献４】Shibuta, 1977, Microbiol. Immunol. 23(7), 617-628
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【非特許文献１０】Collonsら, Fields Virology, B.N. Knipe, Howley, P.M. 編、1996, Philadelphia: Lippencott-Raven. 1313-1351
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【非特許文献４６】Johnsonら、1997, J. Infect. Diseases 176:1215-1224
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【非特許文献５３】Collinsら、1993, Avian Pathology, 22:p.469-479
【非特許文献５４】Cookら、1993, Avian Pathology, 22:257-273
【非特許文献５５】Bayon-Auboyerら、J. Gen Virol, 81(Pt 11):2723-33
【非特許文献５６】Seal, 1998, Virus Res, 58(1-2):45-52
【非特許文献５７】Bayon-Auboyerら、1999, Arch Virol, 144(6):91-109
【非特許文献５８】Juhaszら、1994, J. Gen Virol, 75(Pt 11):2873-80
【非特許文献５９】Bayon-Auboyerら、2000, J. Gen. Vir. 81:2723-2733
【非特許文献６０】CavanaghおよびBarrett, 1988, Virus Res. 11:241-256
【非特許文献６１】Lingら、1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715
【非特許文献６２】Yuら、1992, J. Gen. Virol. 73:1355-1363
【非特許文献６３】Naylorら、1998, J. Gen. Virol. 79:1393-1398
【非特許文献６４】Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159
【非特許文献６５】Senneら、1998, Proc. 47th WPDC, California, pp.67-68
【非特許文献６６】CollinsおよびGough, 1988, J. Gen. Virol. 69:909-916
【非特許文献６７】Senneら、1997, Proc. 134th Ann. Mtg., AVMA, p.190
【非特許文献６８】Pearsonら、1993, Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control, pp.78-83
【非特許文献６９】HeckerおよびMyers、1993, Vet. Rec. 132:172
【発明の概要】
【００３３】
3.  発明の概要
本発明は、異種のまたは非天然の遺伝子産物を発現するように、特に抗原性ポリペプチドおよびペプチドを発現するように、遺伝子操作されうる組換えパラインフルエンザウイルスcDNAおよびRNAに関する。一つの実施形態において、本発明は、異種抗原または異種抗原の免疫原性および/または抗原性断片を発現するように遺伝子操作されるウシまたはヒトの組換えパラインフルエンザウイルスに関する。別の実施形態では、ウシまたはヒトの組換えパラインフルエンザウイルスが、突然変異型PIVヌクレオチド配列を含めて、PIVゲノムに対して非天然の配列を発現するように遺伝子操作される。特に、本発明は、組換えカンサス(Kansas)株ウシ・パラインフルエンザ３型ならびにそれをコードするcDNAおよびRNA分子に関する。本発明はまた、ワクチン製剤中で使用するのに適した表現型をもつキメラウイルスをもたらす改変を含む組換えPIVに関する。
【００３４】
本発明は、初めて、ワクチンとして製剤化されたキメラPIVを提供するものであり、このワクチンは種々のウイルス感染、特に気道感染をもたらすウイルスに対して防御を賦与することができる。特定の実施形態において、本発明は、パラインフルエンザ、インフルエンザ、または呼吸器多核体ウイルス感染から防御することができるワクチンを提供する。本発明は、初めて、哺乳動物宿主においてメタニューモウイルス感染に対する防御を賦与することができるワクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】ヒト・メタニューモウイルスのFタンパク質と、マガモ（Mallard Duck）から分離されたトリ・ニューモウイルスのFタンパク質とのアライメント（細胞外ドメインでは85.6％の同一性）を示す。
【図１Ｂ】ヒト・メタニューモウイルスのFタンパク質と、シチメンチョウから分離されたトリ・ニューモウイルスのFタンパク質とのアライメント（サブグループB；細胞外ドメインでは75％の同一性）を示す。
【図２】b/h PIV3キメラウイルスの3つの異なる分離株から得られたnt 5255からnt 6255までのPCR断片を増幅した。得られた1 kb DNA断片をヒトPIV3のF遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素ではウシPIV3の対応する断片は切断されない。1％アガロースゲルは、未消化の断片（レーン2、5、6）およびSaclまたはBglII消化断片（それぞれレーン4、6およびレーン9、10、11）を示す。レーン1とレーン8はDNAサイズマーカーを示す。
【図３】b/h PIV3キメラウイルスの3つの異なる分離株から得られたnt 9075からnt 10469までのPCR断片を増幅した。得られた1.4 kb DNA断片をウシPIV3のL遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素ではヒトPIV3の対応する断片は切断されない。1％アガロースゲルにより、未消化の1.4 kb断片（レーン2、5、8）が示される。BamHlおよびPvuII消化により生じたより小さいDNA断片がレーン3、4、6、7、9および10に示される。レーン1はDNAサイズマーカーを示す。
【図４】bPIV3/hPIV3ベクターおよびb/h PIV3ベクター化RSV FまたはG cDNAを含めた、6つの構築物を示す。
【図５Ａ−Ｂ】キメラウシ/ヒトPIV3ベクターからのRSV FおよびGタンパク質(A)およびmRNA(B)の発現を示す。
【図５Ｃ】b/h PIV3ベクター化RSV FまたはGタンパク質を含むキメラウイルスのVero細胞内での増殖曲線を示す。MOI=0.01
【図５Ｄ】b/h PIV3ベクター化RSV FまたはGタンパク質を含むキメラウイルスのVero細胞内での増殖曲線を示す。MOI=0.1
【図６】PIV3ゲノムへの増強型緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescence protein: eGFP)の挿入がウイルス複製に及ぼす位置効果を示す。
【図７Ａ】Vero細胞にb/h PIV3ベクター化eGFP 1、2および3をMOI 0.1とMOI 0.01で20時間感染させた後に生じた緑色細胞の量を示す。
【図７Ｂ】位置1、2および3でのb/hPIV3におけるeGFP発現を示す、感染細胞溶解物のウェスタンブロット分析である。
【図７Ｃ】b/h PIV3ベクター化GFP構築物（位置1、2および3に挿入したもの）のVero細胞内での増殖曲線を示す。
【図８】異なる遺伝子間領域をもつb/h PIV3ベクター化RSV F遺伝子の構築物を示す。
【図９Ａ】挿入したRSV遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよび/または性質がウイルス複製に影響を及ぼすことを示す、キメラウイルスにおけるRSV Fタンパク質発現のウェスタンブロット分析である。
【図９Ｂ】0.1のMOIでVero細胞に感染させたRSV Fl、RSV F1*N-NおよびRSV F2構築物のウイルス複製の速度論を比較したマルチサイクル増殖曲線を示す。
【図１０】三価のb/h PIV3ベクター化RSV FおよびhMPV Fの構築物を示す。
【図１１】b/h PIV3ベクター中に2つのRSV F遺伝子を保有する構築物を示す。
【図１２】キメラb/h PIV3ベクター化hMPV F構築物を示す。
【図１３Ａ】モルモットまたはヒト抗hMPV抗血清を用いたhMPV Fタンパク質の免疫沈降を示す。
【図１３Ｂ】0.1のMOIでVero細胞に感染させたb/h PIV3/hMPV F2、b/h PIV3およびb/h PIV3/RSV F2の増殖曲線の比較を示す。
【図１３Ｃ】0.01のMOIでVero細胞に感染させたb/h PIV3/hMPV Fl、b/hPIV3/hMPV F2およびb/h PIV3の増殖曲線の比較を示す。
【図１３Ｄ】0.1のMOIでVero細胞に感染させたb/h PIV3/hMPV Fl、b/hPIV3/hMPV F2およびb/h PIV3の増殖曲線の比較を示す。
【図１４】b/h PIV3ベクター化RSV Fワクチン候補のウイルスRNAゲノムの模式図を示す。
【図１５】免疫染色されたb/h PIV3/hMPV F1およびb/h PIV3/hMPV F2を示す。
【図１６Ａ】ショ糖密度勾配における遊離RSV Fタンパク質 (バキュロウイルス中で生成させ、C末端でトランケートした) の対照勾配を示す。大部分の遊離RSV Fは画分3、4、5および6に存在した。
【図１６Ｂ】ショ糖密度勾配で最高濃度のRSVビリオンが画分10、11および12に観察されたことを示す。RSV画分はRSV F MAbとRSVポリクローナル抗体を用いて検出した。最大量のRSVビリオンを含んでいた画分はまた、RSV Fについて最も強いシグナルを示し、このことはRSV Fタンパク質がRSVビリオンと共泳動し、RSVビリオンと結合していることを示唆する。(B)に示した最後の図はまた、画分10、11および12がプラークアッセイで最高のウイルス力価を呈示したことを示している。
【図１６Ｃ】b/h PIV3ビリオンはより多形性であり、ショ糖密度勾配でのb/h PIV3ビリオンを含むピーク画分がより広範に広がっていることを示す。
【図１６Ｄ】b/h PIV3/RSV F2のショ糖密度勾配画分は、PIVポリクローナル抗血清とRSV F MAbの両方を用いて分析した。大部分のビリオンを含む画分は、PIV3抗血清を用いたウェスタンブロット分析により示されるように、画分11、12、13および14であった。
【図１６Ｅ】b/h PIV3/RSV G2のビリオンを最も多く含む画分（9、10、11および12）はまた、RSV Gタンパク質について最も強いシグナルを示した。この場合も、これらは最高のウイルス力価を示す画分であった。
【図１７】感染性ウイルス力価に及ぼすMOIの影響を示す。
【図１８】感染性ウイルス力価に及ぼすPOIおよび感染後温度の影響を示す。Vero培養物に(a)播種後3日目（1.1×107個/フラスコ）または(b)播種後5日目（3.3×107個/フラスコ）のいずれかにMOI 0.01でb/h PIV3/RSV F2ウイルスを感染させた。
【図１９】感染性ウイルス力価に及ぼす血清の感染前添加の影響を示す。Vero細胞を以下の条件の一つで感染前に3日間培養した：(a) 4mMグルタミンを添加したOPTI PRO SFM、(b) 4mMグルタミンと0.5% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM、および(c) 4mMグルタミンと2% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM。
【図２０】PIV-3 HNウイルスタンパク質の発現プロファイルを示す。
【図２１】PIV-3 Fウイルスタンパク質の発現プロファイルを示す。
【図２２】RSV Fウイルスタンパク質の発現プロファイルを示す。
【図２３】感染性ウイルス力価に及ぼす血清の感染前添加の影響を示す。Vero細胞を以下の条件の一つで感染前に3日間、2通りのセットのローラーボトルで培養した：(a) 4mMグルタミンを添加したOPTI PRO SFM、(b) 4mMグルタミンと0.5% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM、および(c) 4mMグルタミンと2% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明によれば、組換えウイルスは、内在性つまり天然のゲノム配列または非天然のゲノム配列によりコードされるウシ・パラインフルエンザウイルスまたはヒト・パラインフルエンザウイルスから得られるものである。本発明によれば、非天然配列は、天然のまたは内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点突然変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1以上の突然変異があるためである。
【００３７】
本発明によれば、本発明のキメラウイルスは、1つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているか、あるいはヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置き換わっているヌクレオチド配列によりコードされうる。
【００３８】
本発明はまた、様々なPIV株、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒト・メタニューモウイルス）、トリ・ニューモウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、その他のウイルス、病原菌、細胞遺伝子、腫瘍抗原、またはこれらの組合せに由来する遺伝子を含むがこれらに限定されない遺伝子の産物をコードする異種配列の組合せをコードしている遺伝子操作された組換えパラインフルエンザウイルスおよびウイルスベクターに関する。さらに本発明は、メタニューモウイルス由来のヌクレオチド配列を、呼吸器多核体ウイルス由来のヌクレオチド配列と共に、さらにはヒト・パラインフルエンザウイルス由来のヌクレオチド配列と共に、含む遺伝子操作された組換えパラインフルエンザウイルスに関する。本発明はまた、ヒトPIV3のFおよびHN遺伝子を含めて、様々なパラインフルエンザウイルス種および株由来の遺伝子をコードするように遺伝子操作される組換えパラインフルエンザベクターおよびウイルスを包含する。
【００３９】
ある実施形態では、本発明のPIVベクターは、1つ以上の異種配列を発現するように遺伝子操作されるが、その異種配列は好ましくは抗原性の遺伝子産物である遺伝子産物をコードする。好ましい実施形態においては、本発明のPIVベクターは抗原性のポリペプチドおよびペプチドをコードする1、2または3種の異種配列を発現する。いくつかの実施形態では、その異種配列は同一のウイルスに由来しても、異なるウイルスに由来してもよい。好ましい実施形態では、異種配列は、ヒトPIV、突然変異PIV株のような別の種のPIV由来の、あるいは別のネガティブ鎖RNAウイルス（インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒト・メタニューモウイルス(hMPV)）、およびトリ・ニューモウイルスを含むがこれらに限定されない）由来の、抗原性ポリペプチドである異種遺伝子産物をコードしている。一実施形態において、異種配列は異種遺伝子産物の免疫原性および/または抗原性断片をコードしている。
【００４０】
好ましい実施形態において、組換えPIVは、ウシPIV3型または弱毒化されたヒトPIV3型である。一実施形態では、PIVゲノムの融合(F)タンパク質、ヘマグルチニン(HN)糖タンパク質、または他の非必須遺伝子をコードする配列が欠失されて、異種抗原配列により置換される。さらに別の実施形態では、PIVゲノムが、異種ヌクレオチド配列に加えて、突然変異または改変を含みうるが、こうした突然変異または改変は、ワクチン製剤で使用するのに適した表現型（例えば、弱毒化表現型または抗原性が増強された表現型）をもつキメラウイルスをもたらすものである。
【００４１】
特定の実施形態においては、PIVゲノムに挿入される異種ヌクレオチド配列は、Fタンパク質、Gタンパク質またはHNタンパク質をコードするヌクレオチド配列から得られる。いくつかの実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列は、キメラFタンパク質、キメラGタンパク質またはキメラHNタンパク質をコードする。具体的な実施形態では、Fタンパク質がメタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の内腔ドメイン（luminal domain）を含む。いくつかの実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列が、Fタンパク質の膜貫通ドメインを欠失しているFタンパク質をコードしており、その結果として可溶性のFタンパク質が発現される。
【００４２】
別の特定の実施形態においては、本発明は、メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含むPIVゲノムを含んでなるキメラウイルスを提供する。具体的な実施形態では、PIVウイルスは、カンサス株ウシ・パラインフルエンザ３型ウイルスである。他の実施形態では、PIVウイルスは、弱毒化された表現型をもつヒト・パラインフルエンザウイルスである。さらに別の実施形態では、本発明は、ウシ・パラインフルエンザ骨格中にヒト・パラインフルエンザのFおよびHN遺伝子を含むように遺伝子操作されたキメラなウシ・パラインフルエンザ３型/ヒト・パラインフルエンザウイルスを提供する。このキメラウイルスは、さらにメタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含んでいてもよく、および/または、さらに呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明のウイルスは、メタニューモウイルスの少なくとも2つの異なる遺伝子に由来する異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、異種配列はメタニューモウイルス、例えば、トリ・ニューモウイルスおよびヒト・メタニューモウイルスに由来するものである。さらに特定すると、異種配列はトリ・ニューモウイルス、例えば、トリ・ニューモウイルスA、B、CまたはD型、好ましくはC型に由来するものである。
【００４４】
本発明はまた、1種以上の異種抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチン製剤および免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、二価および三価のワクチンを含めた多価ワクチンを提供する。本発明の多価ワクチンは、それぞれの異種抗原配列を発現する1つのPIVベクターの形で、または各ベクターが異なる異種抗原配列をコードする2つ以上のPIVベクターの形で投与することができる。一実施形態において、本発明のワクチン製剤は、1、2または3種の異種ポリペプチドを発現するキメラPIVを含むが、その場合、異種ポリペプチドは同一ウイルス株由来の、同一ウイルスの異なる株由来の、または異なるウイルス由来の配列によってコードされていてもよい。好ましくは、異種抗原配列は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒト・メタニューモウイルス(hMPV)）、およびトリ・ニューモウイルス(APV)を含むがこれらに限定されないネガティブ鎖RNAウイルスから得られるものである。異種抗原配列としては、限定するものではないが、ヒト・パラインフルエンザウイルスのFまたはHNタンパク質、RSVのFタンパク質、インフルエンザウイルスA、BおよびC型のHAタンパク質、ならびにヒトMPVおよびトリ・ニューモウイルスのFタンパク質をコードする配列が挙げられる。さらに好ましくは、本発明のワクチン製剤は、生存能があって感染性である弱毒化されたキメラウイルスを含む。好適な実施形態では、組換えPIVがウシPIV3型またはヒトPIVの弱毒株である。
【００４５】
ある実施形態においては、ワクチン製剤は、PIVゲノムのF、HNまたは他のいくつかの非必須遺伝子が置換または欠失されている本発明のキメラウイルスを含む。好ましい実施形態では、本発明のワクチン製剤は、意図された宿主内で弱毒化表現型をもつPIV株を遺伝子操作することにより調製される。別の好ましい実施形態では、本発明のワクチン製剤は、PIVの弱毒株を遺伝子操作することにより調製される。
【００４６】
別の実施形態においては、異種ヌクレオチド配列が完全なPIVゲノムに付加される。いくつかの実施形態では、PIVゲノムを遺伝子操作することにより、ウイルスゲノムの位置1、2、3、4、5または6に異種配列を挿入して、異種配列がウイルスゲノムの第1、第2、第3、第4、第5または第6遺伝子として発現されるようにする。特定の実施形態では、ウイルスゲノムの位置1、2または3に異種配列を挿入する。いくつかの実施形態では、挿入された異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を望ましい長さに変更すると、結果的に、異種配列の発現が増大したり、またはキメラウイルスの増殖が向上したりする。あるいはまた、遺伝子間領域を望ましい長さに変更すると、異種配列の発現または組換えもしくはキメラウイルスの増殖が変化する可能性がある（例えば、弱毒化表現型）。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列に隣接する遺伝子間領域の長さと挿入位置の両方を遺伝子操作することにより、異種配列の望ましい発現レベルおよび望ましいウイルス増殖特性を有する組換えまたはキメラウイルスを選別する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の組換えまたはキメラウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤を提供する。特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはトリ種などの被験体の免疫応答をモジュレートするために用いられる。さらに特定の実施形態では、ヒト乳幼児または小児の免疫応答をモジュレートするために前記ワクチンを用いる。別の実施形態では、本発明は、獣医用途のワクチン製剤に関する。本発明のワクチン製剤は、単独で投与してもよいし、他のワクチン、予防薬または治療薬と組み合わせて投与してもよい。
【００４８】
3.1.  慣例および省略形
cDNA：  相補DNA
CPE：  細胞変性効果
L：  ラージタンパク質
M：  基質タンパク質(エンベロープの内側のライニング)
F：  融合糖タンパク質
HN：  ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ糖タンパク質
N、NP、またはNC：  核タンパク質(RNAと結合し、ポリメラーゼ活性に必要とされる)
P：  リンタンパク質
MOI：  感染多重度
NA：  ノイラミニダーゼ(エンベロープ糖タンパク質)
PIV：  パラインフルエンザウイルス
bPIV：  ウシ・パラインフルエンザウイルス
bPIV3：  ウシ・パラインフルエンザウイルス３型
hPIV：  ヒト・パラインフルエンザウイルス
hPIV3：  ヒト・パラインフルエンザウイルス３型
bPIV/hPIVまたはb/hPIV：  hPIV配列をもつ組換えbPIV
b/hPIV3またはbPIV3/hPIV3：  hPIV3型配列をもつ組換えbPIV
nt：  ヌクレオチド
RNP：  リボ核タンパク質
rRNP：  組換えRNP
vRNA：  ゲノムウイルスRNA
cRNA：  アンチゲノムウイルスRNA
hMPV：  ヒト・メタニューモウイルス
APV：  トリ・ニューモウイルス
dpi：  感染後の日数
HAI：  赤血球凝集阻害
hpi：  感染後の時間
POI：  感染時点
RSV：  呼吸器多核体ウイルス
SFM：  無血清培地
TCID50：  50％組織培養感染用量
位置：  ウイルスの遺伝子操作に関して位置を用いる場合、それは転写されるウイルスゲノムの遺伝子の位置をさす。例えば、遺伝子が位置1に存在するとき、それは転写されるウイルスゲノムの第1の遺伝子であり、遺伝子が位置2に存在するとき、それは転写されるウイルスゲノムの第2の遺伝子である；
bPIV3、b/hPIV3およびその誘導体の位置1：  ゲノムのヌクレオチド位置104、あるいは転写されるウイルスゲノムの第1の遺伝子の位置；
bPIV3、b/hPIV3およびその誘導体の位置2：  ゲノムのヌクレオチド位置1774、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第1のオープンリーディングフレームと第2のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第2の遺伝子の位置；
bPIV3、b/hPIV3およびその誘導体の位置3：  ゲノムのヌクレオチド位置3724、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第2のオープンリーディングフレームと第3のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第3の遺伝子の位置；
bPIV3、b/hPIV3およびその誘導体の位置4：  ゲノムのヌクレオチド位置5042、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第3のオープンリーディングフレームと第4のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第4の遺伝子の位置；
bPIV3、b/hPIV3およびその誘導体の位置5：  ゲノムのヌクレオチド位置6790、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第4のオープンリーディングフレームと第5のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第5の遺伝子の位置；
bPIV3、b/hPIV3およびその誘導体の位置6：  ゲノムのヌクレオチド位置8631、あるいは天然パラインフルエンザウイルスの第5のオープンリーディングフレームと第6のオープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第6の遺伝子の位置。
【００４９】
4.  図面の説明
図1.  ヒト・メタニューモウイルスのFタンパク質と、異なるトリ・ニューモウイルスの異なるFタンパク質との、アミノ酸配列のペアワイズアライメント。2つの配列間の同一アミノ酸はアミノ酸の一文字表記で示される。2つのアミノ酸配列間の保存アミノ酸の交換は「＋」記号で示され、空白は非保存アミノ酸の交換を示す。A) ヒト・メタニューモウイルスのFタンパク質と、マガモ（Mallard Duck）から分離されたトリ・ニューモウイルスのFタンパク質とのアライメント（細胞外ドメインでは85.6％の同一性）。B) ヒト・メタニューモウイルスのFタンパク質と、シチメンチョウから分離されたトリ・ニューモウイルスのFタンパク質とのアライメント（サブグループB；細胞外ドメインでは75％の同一性）。
【００５０】
図2.  b/h PIV3キメラウイルスの3つの異なる分離株から得られたnt 5255からnt 6255までのPCR断片を増幅した。得られた1 kb DNA断片をヒトPIV3のF遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素ではウシPIV3の対応する断片は切断されない。1％アガロースゲルは、未消化の断片（レーン2、5、6）およびSaclまたはBglII消化断片（それぞれレーン4、6およびレーン9、10、11）を示す。レーン10のサンプルは消化されないが、BglII消化を繰り返すと、このサンプルは切断された（データは示してない）。レーン1とレーン8はDNAサイズマーカーを示す。
【００５１】
図3.  b/h PIV3キメラウイルスの3つの異なる分離株から得られたnt 9075からnt 10469までのPCR断片を増幅した。得られた1.4 kb DNA断片をウシPIV3のL遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素ではヒトPIV3の対応する断片は切断されない。1％アガロースゲルにより、未消化の1.4 kb断片（レーン2、5、8）が示される。BamHlおよびPvuII消化により生じたより小さいDNA断片がレーン3、4、6、7、9および10に示される。レーン1はDNAサイズマーカーを示す。
【００５２】
図4.  bPIV3/hPIV3ベクターおよびb/h PIV3ベクター化RSV FまたはG cDNAを含めた、6つの構築物を示す。ウシPIV3のF遺伝子およびHN遺伝子を欠失させ、それぞれヒトPIV3のF遺伝子およびHN遺伝子で置き換える。RSVのF遺伝子またはG遺伝子を位置1または位置2のいずれかにクローニングする。全てのRSV遺伝子はbPIV3 N-P遺伝子間領域に連結されるが、ただし、RSV F1* (N-N)はより短いbPIV3のN遺伝子終止配列/N遺伝子開始配列があとに続く。
【００５３】
図5.  b/h PIV3ベクター化RSV FまたはG遺伝子は位置効果を示した。(A)は、キメラウイルス感染細胞の溶解物のウェスタンブロット分析である。RSV Fタンパク質に対するモノクローナル抗体(MAb)を用いてFタンパク質を検出し、RSV Gタンパク質に対するポリクローナル抗体(PAb)を用いてGタンパク質を検出した。F1断片に相当する50 kDaバンドが、野生型RSV感染細胞と同様に全てのキメラウイルス感染細胞においても検出された。キメラウイルス感染細胞の溶解物には、野生型RSV感染細胞と比較して、26 kDa F断片がより多く蓄積していた。この実験は0.1のMOIで実施したが、レーン1ではb/h PIV3ベクター化RSVF1* N-N感染をより高い1.0のMOIで繰り返した。約50 kDaおよび90 kDaで泳動するRSV Gタンパク質の未成熟形態とグリコシル化形態の両方が検出された。(B)は、mRNA転写が図5Aに示したタンパク質発現の結果と相関することを示したノーザンブロット分析である。等量の全RNAを、1％ホルムアルデヒドを含有する1％アガロースゲル上で分離して、ナイロン膜に移行させた。これらのブロットをジゴキシゲニン(DIG)-UTP-標識リボプローブとハイブリダイズさせた。該リボプローブはDIG RNAラベリングキットを用いてin vitro転写により合成したものである。(C)および(D)は、b/h PIV3ベクター化RSV FまたはGタンパク質を含むキメラウイルスのVero細胞内での増殖曲線である。Vero細胞を90％コンフルエンスに増殖させ、0.01または0.1のMOIで感染させた。感染細胞の単層を37℃でインキュベートした。各回収時点でTCID50アッセイによりウイルス力価を測定した。前記アッセイは、37℃で6日間のインキュベーション後にCPEを肉眼で精査することにより行なった。
【００５４】
図6.  b/h PIV3でベクター化された増強緑色蛍光タンパク質(enhanced green fluorescence protein: eGFP)構築物。eGFP遺伝子を、b/h PIV3ベクター中の全てのPIV3遺伝子の間に連続して導入する（ここでは位置1、2、3および4のみを示す）。eGFP遺伝子をbPIV3 N-P遺伝子間領域に連結させた。b/h GFP1構築物は、b/h PIV3ゲノムの3'側に最も近い位置にeGFP遺伝子カセットを保有する。b/h GFP2構築物はN遺伝子とP遺伝子の間にeGFP遺伝子カセットを含有する。b/h GFP3構築物はP遺伝子とM遺伝子の間にeGFP遺伝子カセットを含有し、b/h GFP4構築物はb/h PIV3のM遺伝子とF遺伝子の間にeGFP遺伝子を含有する。
【００５５】
図7.  b/h PIV3ゲノムへの増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)挿入の位置効果。(A)は、Vero細胞にb/h PIV3ベクター化eGFP 1、2および3をMOI 0.1とMOI 0.01で20時間感染させた後に生じた緑色細胞の量を示す。緑色細胞は蛍光顕微鏡を使って可視化した。(B)は、感染細胞溶解物のウェスタンブロット分析である。これらのブロットは、PIV3 PAbだけでなくGFP MAbも用いて検出した。ブロットが同一容量のローディングであることを示すためにPIV3抗体も使用した。(C)は、b/h PIV3ベクター化GFP構築物（位置1、2および3に挿入されたもの）のVero細胞内での増殖曲線である。
【００５６】
図8.  異なる遺伝子間領域をもつb/h PIV3ベクター化RSV F遺伝子の構築物。3つの構築物RSV F1* N-N、RSV F2 N-P、およびRSV F1 N-Pは、それぞれ図4のRSV F* (N-N)、RSV F2、およびRSV F1と同じである。RSV F1* N-N中のN遺伝子開始配列とN遺伝子翻訳開始コドンの間の距離はたつたの10ヌクレオチド(nt)長である。これに対して、RSV F2構築物ではこの距離が86 nt長である。また、RSV F1* N-Nでは、RSV F2構築物で用いられるようなP遺伝子開始配列ではなく、N遺伝子開始配列が用いられる。
【００５７】
図9.  挿入したRSV遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよび/または性質は、ウイルスの複製に影響を及ぼす。(A) キメラウイルスにおけるRSV Fタンパク質発現のウェスタンブロット分析。ブロットは、RSV Fタンパク質に対するモノクローナル抗体で検出した。RSV F1構築物により発現されたF1タンパク質のレベルを、感染の24時間後と48時間後に測定したところ、そのF1タンパク質レベルはRSV F2構築物で観察されたレベルに近似していたが、RSV F1* N-N構築物で観察されたレベルよりもかなり高かった。(B)は、0.1のMOIでVero細胞に感染させたRSV Fl、RSV F1*N-NおよびRSV F2構築物のウイルス複製の速度論を比較したマルチサイクル増殖曲線である。各回収時点でのウイルス力価をプラークアッセイで測定したが、このアッセイは5日間のインキュベーション後に定量用のRSVポリクローナル抗血清を用いて免疫染色することにより行なった。
【００５８】
図10.  三価のb/h PIV3ベクター化RSV FおよびhMPV Fの構築物。2つのウイルスゲノムをここに示すが、各ウイルスゲノムはキメラb/h PIV3ベクターとメタニューモウイルスF遺伝子由来の第1の異種配列および呼吸器多核体ウイルスF遺伝子由来の第2の異種配列を含む。これらの構築物のいずれか一方を含むウイルスをVero細胞内で増幅させた。記載した遺伝子操作ウイルスは、パラインフルエンザウイルス感染、メタニューモウイルス感染および呼吸器多核体ウイルス感染に対する三価ワクチンとして使用することができる。
【００５９】
図11.  2つのRSV F遺伝子を保有する構築物。この構築物はウイルスの増殖速度を測定するため、RSV Fタンパク質の産生のため、ならびにハムスターでの複製および免疫原性を測定するために使用することができる。
【００６０】
図12.  キメラb/h PIV3ベクター化hMPV F構築物。ヒト・メタニューモウイルス(hMPV)のF遺伝子をb/h PIV3ゲノムの位置1または位置2に挿入した。hMPV F遺伝子カセットはbPIV3 N-P遺伝子間領域を保有していた。
【００６１】
図13.  b/h PIV3ベクター化hMPV F遺伝子（位置2または位置1）の免疫沈降および複製アッセイ。(A)は、モルモットまたはヒト抗hMPV抗血清を用いたhMPV Fタンパク質の免疫沈降を示す。b/h PIV3ベクター化hMPV F2およびhMPV F1の溶解物中に約80 kDaで泳動する特異的バンドが観察された。このサイズはF前駆体タンパク質Foに相当する。b/h PIV3および擬似対照レーンにはさまざまなサイズの非特異的バンドも観察された。(B)は、増殖曲線を示すが、これは、b/h PIV3/hMPV F2のウイルス複製の速度論を測定し、それを、0.1のMOIでVero細胞に感染させたb/h PIV3およびb/h PIV3/RSV F2について観察されたものと比較するために行なった。(C)〜(D)は、増殖曲線を示すが、これは、b/h PIV3/hMPV Flのウイルス複製の速度論を測定し、それを、0.01または0.1のMOIでVero細胞に感染させたb/hPIV3/hMPV F2およびb/h PIV3について観察されたものと比較するために行なった。
【００６２】
図14.  (A)および(B)：b/h PIV3ベクター化RSV Fワクチン候補のウイルスRNAゲノムの模式図。b/h PIV3/RSV F2は、PIV3ゲノムの位置2に天然RSV F遺伝子を含み、一方b/h PIV3/sol RSV F2は、膜貫通ドメインと細胞質ドメインを欠失している可溶性RSV Fを発現した。RSV Fタンパク質からの膜貫通ドメインと細胞質テイルの除去は、C末端で50アミノ酸を欠失させることにより行なった。sol RSV F遺伝子カセットのPIV3遺伝子終止配列および遺伝子開始配列は変更されなかったので、RSV F2遺伝子カセットとsol RSV F2遺伝子カセットは、50アミノ酸の欠失を除いて同一であった。sol RSV Fタンパク質はウイルス粒子エンベロープに組み込まれないだろうと予想された。
【００６３】
図15.  免疫染色されたb/h PIV3/hMPV F1およびb/h PIV3/hMPV F2。(A) b/h PIV3/hMPV F1ウイルスを希釈して、サブコンフルエントなVero細胞への感染に用いた。感染細胞をゲンタマイシン含有optiMEM培地でオーバーレイし、35℃で5日間インキュベートした。細胞を固定し、モルモット抗hMPV血清を用いて免疫染色した。AEC基質系の存在下での特異的発色によりhMPV Fの発現を可視化する。(B) b/hPIV3/hMPV F2ウイルスを希釈して、Vero細胞への感染に用いた。感染細胞をEMEM/L-15培地 (JRH Biosciences; Lenexa, KS)中の1％メチルセルロースでオーバーレイした。細胞をインキュベートして固定した後、抗hMPVモルモット血清を用いて免疫染色した。抗hMPVモルモット血清はhMPV 001タンパク質に特異的である。
【００６４】
図16.  ショ糖密度勾配上でのb/h PIV3ベクター化RSV遺伝子のビリオン分画。これらの一連の実験では、RSVタンパク質がb/h PIV3ビリオンに組み込まれたか否かを検討する。(A)は、遊離RSV F (バキュロウイルス中で生成させ、C末端でトランケートした) の対照勾配を示す。大部分の遊離RSV Fは画分3、4、5および6に存在した。(B)は、最高濃度のRSVビリオンが画分10、11および12に観察されたことを示す。RSV画分はRSV F MAbとRSVポリクローナル抗体を用いて検出した。最大量のRSVビリオンを含んでいた画分はまた、RSV Fについて最も強いシグナルを示し、このことはRSV Fタンパク質がRSVビリオンと共泳動し、RSVビリオンと結合していることを示唆する。(B)に示した最後の図はまた、画分10、11および12がプラークアッセイで最高のウイルス力価を呈示したことを示している。(C) b/h PIV3ビリオンはより多形性であり、そのためb/h PIV3ビリオンを含むピーク画分の広がりがより広範であった。(D) b/h PIV3/RSV F2のショ糖密度勾配画分は、PIVポリクローナル抗血清とRSV F MAbの両方を用いて分析した。大部分のビリオンを含む画分は、PIV3抗血清を用いたウェスタンブロット分析により示されるように、画分11、12、13および14であった。対応して、これらは最高量のRSV Fタンパク質を呈示した画分でもあった。若干の遊離RSV Fは画分5および6にも存在していた。画分11、12、13および14はピークウイルス力価を示した。(E) b/h PIV3/RSV G2のビリオンを最も多く含む画分（9、10、11および12）はまた、RSV Gタンパク質について最も強いシグナルを示した。この場合も、これらは最高のウイルス力価を示す画分であった。 
図17.  14日目から56日目までのAGM霊長類研究デザインの概略図。示した時点（矢印）で血清を採取した。1日目の初期ワクチン接種および28日目のRSVチャレンジ投与を示してある。
【００６５】
図18.  感染性ウイルス力価に及ぼすMOIの影響。感染後、培養物を37±1℃および5±1％CO2でインキュベートした。 
図19.  感染性ウイルス力価に及ぼすPOIおよび感染後温度の影響。Vero培養物に(a)播種後3日目（1.1×107個/フラスコ）または(b)播種後5日目（3.3×107個/フラスコ）のいずれかにMOI 0.01でb/h PIV3/RSV F2ウイルスを感染させた。 
図20.  感染性ウイルス力価に及ぼす血清の感染前添加の影響。Vero細胞を以下の条件の一つで感染前に3日間培養した：(a) 4mMグルタミンを添加したOPTI PRO SFM、(b) 4mMグルタミンと0.5% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM、および(c) 4mMグルタミンと2% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM。感染に先だって、使用済み培地を取り除き、細胞をDPBSで洗った。培養物にMOI 0.001でb/h PIV3/RSV F2ウイルスを感染させ、33±1℃および5±1％CO2でインキュベートした。
【００６６】
図21.  PIV-3 HNウイルスタンパク質の発現プロファイル。感染後のさまざまな時点(それぞれ36 hpi、60 hpi、88 hpi、112 hpi、130 hpi、および155 hpi)で細胞を固定し、マウス由来のPIV-3 HNモノクローナル抗体と、続いて蛍光標識ヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートした。
【００６７】
図22.  PIV-3 Fウイルスタンパク質の発現プロファイル。感染後のさまざまな時点(それぞれ36 hpi、60 hpi、88 hpi、112 hpi、130 hpi、および155 hpi)で細胞を固定し、マウス由来のPIV-3 Fモノクローナル抗体と、続いて蛍光標識ヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートした。
【００６８】
図23.  RSV Fウイルスタンパク質の発現プロファイル。感染後のさまざまな時点(それぞれ36 hpi、60 hpi、88 hpi、112 hpi、130 hpi、および155 hpi)で細胞を固定し、ヒト由来のRSV Fモノクローナル抗体と、続いて蛍光標識ヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートした。
【００６９】
図24.  感染性ウイルス力価に及ぼす血清の感染前添加の影響。Vero細胞を以下の条件の一つで感染前に3日間、2通りのセットのローラーボトルで培養した：(a) 4mMグルタミンを添加したOPTI PRO SFM、(b) 4mMグルタミンと0.5% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM、および(c) 4mMグルタミンと2% (v/v)血清を添加したOPTI PRO SFM。
【００７０】
5.  発明の説明
本発明は、異種配列または非天然配列の発現に使用することができる組換えパラインフルエンザcDNAおよびRNA構築物（組換えウシおよびヒトPIV cDNAおよびRNA構築物を含むがこれらに限定されない）に関する。
【００７１】
本発明によれば、組換えウイルスは、内在性つまり天然のゲノム配列または非天然のゲノム配列によりコードされるウシ・パラインフルエンザウイルスまたはヒト・パラインフルエンザウイルスから得られるものである。本発明によれば、非天然配列は、天然のまたは内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点突然変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1以上の突然変異があるためである。
【００７２】
本発明によれば、本発明のキメラウイルスは、1つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているか、あるいはヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置き換わっているヌクレオチド配列によりコードされうる。これらの組換えおよびキメラウイルスならびに発現産物は、ヒトや動物に投与するのに適したワクチンとして使用することができる。例えば、本発明のキメラウイルスは、ニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、またはインフルエンザウイルスによる感染に対する防御を賦与するためのワクチン製剤中で使用される。
【００７３】
一実施形態において、本発明は、ヒトまたはウシPIV変異体に由来し、かつ1、2または3種の異種配列（好ましくは種々の病原体、細胞遺伝子、腫瘍抗原およびウイルス由来の外来抗原および他の産物をコードする異種遺伝子）を発現するように遺伝子操作されるPIV cDNAおよびRNA構築物に関する。特に、異種配列はmorbillivrusまたはネガティブ鎖RNAウイルスに由来するものであり、例えば、インフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒト・メタニューモウイルスのAl、A2、BlおよびB2変異株）、およびトリ・ニューモウイルスのサブグループA、B、CおよびDに由来するが、これらに限定されない。哺乳動物MPVはAl、A2、B1またはB2変異株でありうる。しかし、本発明の哺乳動物MPVは、まだ同定されていない追加のMPV変異株をも包含し、Al、A2、BlおよびB2変異株に限定されない。本発明の別の実施形態では、異種配列は変異型PIV配列を含めた非天然のPIV配列である。ある実施形態では、異種配列が同じウイルスまたは異なるウイルスに由来するものである。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明のウイルスは、ヒト・メタニューモウイルスまたはトリ・ニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列を含む組換えPIVである。PIVゲノムに挿入される異種配列には、ヒト・メタニューモウイルスAl、A2、BlまたはB2変異株のF、GおよびHN遺伝子をコードする配列、トリ・ニューモウイルスA、B、CまたはD型のF、GおよびHN遺伝子をコードする配列、ならびにその免疫原性および/または抗原性断片が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列がウイルスゲノムに付加される。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列が内在性のヌクレオチド配列と置き換わる。異種ヌクレオチド配列は、PIVゲノムの様々な位置（例えば、位置1、2、3、4、5または6）に追加または挿入される。好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列は位置1に追加または挿入される。別の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列は位置2に追加または挿入される。さらに別の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列は位置3に追加または挿入される。ウイルスゲノムのより低い番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入または付加すると、ウイルスゲノム全体に生じる転写勾配が原因となって、より高い番号の位置に挿入した場合に比べて、異種ヌクレオチド配列の発現がより強くなる。しかし、ウイルス複製の効率も考慮しなければならない。例えば、本発明のb/h PIV3キメラウイルスでは、位置1に異種遺伝子を挿入すると、in vitroでの複製速度論が遅くなり、in vivoでもさらに遅くなる (セクション8、実施例3、および図5、ならびにセクション26、実施例21を参照のこと)。したがって、より低い番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入することは、異種ヌクレオチド配列の強い発現が望まれる場合には本発明の好ましい実施形態である。最も好ましくは、異種配列の強い発現が望まれる場合には、異種配列をb/h PIV3ゲノムの位置2に挿入する (セクション5.1.2.およびセクション8、実施例3を参照のこと)。
【００７６】
いくつかの他の実施形態においては、組換えまたはキメラPIVゲノムは、異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させるように遺伝子操作される。さらに他の実施形態では、本発明のウイルスは、位置1、2、3、4、5および6からなる群より選択される位置に異種ヌクレオチド配列を挿入しかつ異種ヌクレオチド配列と次の下流遺伝子との間の遺伝子間領域を変化させるように遺伝子操作された組換えまたはキメラPIVゲノムを含む。適切なアッセイを用いて最良の挿入様式（すなわち、挿入位置および遺伝子間領域の長さ）を決定することにより、適切なレベルの遺伝子発現およびウイルス増殖の特性を達成することができる。詳細については、セクション5.1.2.を参照されたい。
【００７７】
特定の実施形態において、本発明のキメラウイルスは2つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有する。異なる異種ヌクレオチド配列はPIVゲノムの様々な位置に挿入することができる。好ましい実施形態では、1つの異種ヌクレオチド配列が位置1に挿入され、別の異種ヌクレオチド配列が位置2または3に付加または挿入される。本発明の他の実施形態では、追加の異種ヌクレオチド配列がPIVゲノムのより高い番号の位置に挿入される。本発明によれば、異種配列の位置は、その配列がウイルスゲノムから転写される順序をさし、例えば、位置1にある異種配列は、ゲノムから転写される最初の遺伝子配列である。
【００７８】
本発明の特定の実施形態において、本発明のウイルスのゲノムに挿入される異種ヌクレオチド配列はネガティブ鎖RNAウイルスに由来するものであり、例えば、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス、およびトリ・ニューモウイルスに由来するが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がヒト・メタニューモウイルスに由来する。別の特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列がトリ・ニューモウイルスに由来する。さらに特定すると、異種ヌクレオチド配列がヒトまたはトリ・メタニューモウイルスのF、GもしくはSH遺伝子またはその部分をコードする。具体的な実施形態では、異種ヌクレオチド配列が配列番号1〜配列番号5、配列番号14、および配列番号15のいずれか1つでありうる（表16参照）。いくつかの特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号6〜配列番号13、配列番号16、および配列番号17のいずれか1つのタンパク質をコードする（表16参照）。いくつかの特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号314〜配列番号389のいずれか1つのタンパク質をコードする。
【００７９】
本発明の特定の実施形態において、本発明の異種ヌクレオチド配列は、A型トリ・ニューモウイルスに由来する。本発明の他の特定の実施形態では、本発明の異種ヌクレオチド配列は、B型トリ・ニューモウイルスに由来する。本発明のさらに他の特定の実施形態では、本発明の異種ヌクレオチド配列は、C型トリ・ニューモウイルスに由来する。系統発生的分析により、A型とB型は、C型に対してより互いに近縁であることが示されている (Seal, 2000, Animal Health Res. Rev.1(1): 67-72)。A型とB型はヨーロッパに見られ、一方C型は米国で最初に分離された。 
本発明の別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列はキメラポリペプチドをコードするものであり、このキメラポリペプチドにおいて、細胞外ドメインはベクター骨格が誘導されるPIV株以外のウイルスに由来する抗原性配列を含み、膜貫通および内腔ドメインはPIV配列から誘導される。得られるキメラウイルスは、選ばれたネガティブ鎖RNAウイルスの抗原性を賦与し、弱毒化された表現型をもつと考えられる。
【００８０】
本発明の特定の実施形態において、異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードするものである。特に、キメラFタンパク質の細胞外ドメインはヒト・メタニューモウイルスまたはトリ・ニューモウイルスのようなメタニューモウイルスの細胞外ドメインであり、その膜貫通ドメインおよび内腔ドメインはヒトまたはウシ・パラインフルエンザウイルスのようなパラインフルエンザウイルスの膜貫通および内腔ドメインである。いかなる理論によっても拘束されないが、キメラFタンパク質の挿入は、意図した宿主内で該ウイルスをさらに弱毒化するものの、その細胞外ドメインに起因するFタンパク質の抗原性は保持している。
【００８１】
本発明のキメラウイルスは、各種の感染（ニューモウイルス感染、呼吸器多核体ウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、インフルエンザウイルス感染、またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない）から防御することができるワクチン製剤中で使用しうる。本発明は、1種以上の異種抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチン製剤（二価および三価のワクチンを含む）を提供する。本発明の二価および三価ワクチンは、それぞれの異種抗原配列を発現する1つのPIVベクターの形で、または各ベクターが異なる異種抗原配列をコードする2つ以上のPIVベクターの形で投与することができる。好ましくは、異種抗原配列は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス(RSV)、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒト・メタニューモウイルス）、およびトリ・ニューモウイルスを含むがこれらに限定されないネガティブ鎖RNAウイルスに由来する。こうして、本発明のキメラウイルス粒子を遺伝子操作することにより、例えば、抗ヒト・インフルエンザワクチン、抗ヒト・パラインフルエンザワクチン、抗ヒトRSVワクチン、および抗ヒト・メタニューモウイルスワクチンを作ることができる。好ましくは、本発明のワクチン製剤は、生存能があって感染性である弱毒型キメラウイルスを含有する。本発明のワクチン製剤は、単独で投与してもよいし、他のワクチン、他の予防薬または治療薬と組み合わせて投与してもよい。
【００８２】
本発明はまた、広範なウイルスおよび/または抗原（腫瘍抗原を含む）に対するワクチンを製剤化するためのウイルスベクターおよびキメラウイルスの使用に関するものである。本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することによって、または抗原に対する寛容を刺激することによって、被験体の免疫系を調節するために使用される。本明細書中で用いる被験体とは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、またはトリ種のメンバーをさす。腫瘍抗原を送達する場合には、本発明は、非固形腫瘍または小さいサイズの固形腫瘍といった、免疫反応介在拒絶反応をおこしやすい疾患を有する被験者の治療に用いられる。また、本明細書に記載のウイルスベクターおよびキメラウイルスによる腫瘍抗原の送達は、大きな固形腫瘍の摘出後の治療に有用であると考えられる。本発明はまた、癌の存在が疑われる被験者の治療にも使用することができる。
【００８３】
本発明は、限定ではなく説明のために以下のサブセクションに分けることができる：(a) 組換えcDNAおよびRNA鋳型の構築; (b) 組換えcDNAおよびRNA鋳型を用いた異種遺伝子産物の発現; および(c) 組換えウイルス粒子中の異種遺伝子のレスキュー。 
5.1.  組換えcDNAおよびRNA鋳型の構築
本発明は、ウシ・パラインフルエンザウイルスと哺乳動物パラインフルエンザウイルスを含めて、パラインフルエンザウイルスのゲノムから誘導されたウイルスベクターによりコードされる組換えまたはキメラウイルスを包含する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性つまり天然のゲノム配列または非天然のゲノム配列によりコードされるウシ・パラインフルエンザウイルスまたは哺乳動物パラインフルエンザウイルスから誘導されるものである。本発明によれば、非天然配列は天然のまたは内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点突然変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1以上の突然変異があるためである。本発明の組換えウイルスは、ウシおよび哺乳動物のパラインフルエンザウイルスを含めて、パラインフルエンザウイルスのゲノムから誘導されるウイルスベクターによりコードされるウイルスを包含し、ウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよい。本発明によれば、パラインフルエンザウイルスのゲノムから誘導されるウイルスベクターは、パラインフルエンザウイルスの1つのORFの少なくとも一部をコードする核酸配列を含むものである。
【００８４】
本発明はまた、ワクチン製剤中での使用により適した表現型（例えば、弱毒化表現型または増強された抗原性）をもつウイルスをもたらす配列を含むウシおよび/または哺乳動物PIVゲノムから誘導されたウイルスベクターを含む組換えウイルスを包含する。突然変異および改変はコード領域に、遺伝子間領域に、ウイルスのリーダーおよびトレーラー配列に存在しうる。
【００８５】
本発明によれば、本発明のウイルスベクターは、哺乳動物のパラインフルエンザウイルス、特にヒトのパラインフルエンザウイルス（hPIV）のゲノムから誘導される。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターはヒト・パラインフルエンザウイルス３型のゲノムに由来する。本発明によれば、これらのウイルスベクターはウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよい。
【００８６】
本発明によれば、本発明のウイルスベクターは、ウシ・パラインフルエンザウイルス（bPIV）のゲノムから誘導される。本発明の特定の実施形態では、ウイルスベクターはウシ・パラインフルエンザウイルス３型のゲノムに由来する。本発明によれば、これらのウイルスベクターはウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよい。
【００８７】
本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているか、または内在性のまたは天然の配列が異種ヌクレオチド配列で置き換わっているヌクレオチド配列によりコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む本発明のウイルスベクターによりコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、ウイルスゲノムに対して天然ではない核酸を含んでいても含まなくてもよいウイルスベクターによりコードされる。本発明によれば、キメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列が付加された、挿入された、または天然のもしくは非天然の配列の代わりに使用されたウイルスベクターによりコードされる。
【００８８】
キメラウイルスは2種以上のウイルスから防御する組換えワクチンを作るのに特に有用である (Taoら, J. Virol. 72, 2955-2961; Durbinら, 2000, J. Virol. 74, 6821-6831; Skiadopoulosら, 1998, J. Virol. 72, 1762-1768 (1998); Tengら, 2000, J. Virol. 74, 9317-9321)。例えば、別のネガティブ鎖RNAウイルス（例えば、MPV）の1つ以上のタンパク質を発現するhPIVまたはbPIVウイルスベクター、あるいはMPVの1つ以上のタンパク質を発現するRSVベクターは、かかるベクターでワクチン接種された個体を両方のウイルス感染から防御すると想定される。同様の手法が他のパラミクソウイルスにも考えられる。弱毒型および複製欠損ウイルスは、他のウイルスに関して提案されているような、生ワクチンを用いたワクチン接種のために使用することができる(本明細書に参照により組み入れるPCT WO 02/057302、第6および23頁参照)。
【００８９】
本発明によれば、本発明の組換えまたはキメラウイルスをコードするウイルスベクターに組み込まれる異種配列には、種々のメタニューモウイルス株、トリ・ニューモウイルス株、その他のネガティブ鎖RNAウイルス（RSV、PIV、インフルエンザウイルス、その他のウイルス（例えば、麻疹ウイルス）を含むがこれらに限定されない）から得られるまたは誘導される配列が含まれる。
【００９０】
本発明のある実施形態では、本発明のキメラまたは組換えウイルスは、1つ以上の配列、遺伝子間領域、末端配列、あるいは一部または全体のORFが異種配列または非天然配列で置換されているウイルスゲノムから誘導されたウイルスベクターによりコードされる。本発明のある実施形態では、本発明のキメラウイルスは、1つ以上の異種配列がベクターに付加されているウイルスゲノムから誘導されたウイルスベクターによりコードされる。
【００９１】
本発明の特定の実施形態は、パラインフルエンザウイルスのゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。好ましい実施形態では、PIVゲノムがウシPIV（例えば、bPIV3のKansas株）から、またはヒトPIVから誘導される。好ましい実施形態では、PIVゲノムが、ウシ・パラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または異種配列が完全なbPIVゲノムに付加されているbPIV3のKansas株から誘導される。本発明のさらに具体的な実施形態は、ヒト・パラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または異種配列が完全なhPIVゲノムに付加されている、ヒト・パラインフルエンザウイルス３型ゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。本発明のさらに具体的な実施形態は、(a) ウシ・パラインフルエンザウイルスのF遺伝子およびHN遺伝子がヒト・パラインフルエンザウイルスのF遺伝子およびHN遺伝子で置換されており(bPIV/hPIV)、かつ(b) 異種配列が完全なbPIVゲノムに付加されている、bPIV3のKansas株のようなウシ・パラインフルエンザウイルスゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。
【００９２】
本発明はまた、異種配列に加えて、ワクチン製剤中での使用により適した表現型（例えば、弱毒化表現型または増強された抗原性）をもつキメラウイルスをもたらす突然変異または改変を含む、bPIV、hPIV、またはbPIV/hPIVゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスを包含する。本発明のこの特定の実施形態によれば、ウシPIV3骨格の状況下での異種配列は、bPIV3に対して異種であれば、どのような配列でもよい。
【００９３】
本発明の別の特定の実施形態は、hPIVヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または異種配列が完全なhPIVゲノムに付加されている、ヒトPIV 1、2、または3由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスである。ただし、得られるキメラウイルスは、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼおよび融合糖タンパク質がhPIV1のもので置き換わっているキメラhPIV3ではない。本発明はまた、異種配列に加えて、ワクチン製剤中での使用により適した表現型（例えば、弱毒化表現型または増強された抗原性）をもつキメラウイルスをもたらす突然変異または改変を含む、hPIVゲノム由来のヌクレオチド配列によりコードされた骨格を含むキメラウイルスを包含する。
【００９４】
ウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーターの相補体、例えば本発明の3'-PIVウイルス末端の相補体、または3'-および5'-PIVウイルス末端の両方の相補体で挟まれた異種遺伝子コード配列は、当技術分野で公知の技法を用いて構築することができる。得られるRNA鋳型は、ネガティブ極性のものであり、ウイルスRNA合成装置がその鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有しうる。あるいはまた、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有する、ポジティブ極性のRNA鋳型を使用することもできる。これらのハイブリッド配列を含有する組換えDNA分子は、クローニングされ、バクテリオファージT7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼまたは真核生物ポリメラーゼ（例えば、ポリメラーゼI）などの、DNA特異的RNAポリメラーゼによって転写され、それによって、ウイルスポリメラーゼの認識および活性を可能にする適切なウイルス配列をもつ組換えRNA鋳型をin vitroまたはin vivoで生産することができる。
【００９５】
一実施形態において、本発明のPIVベクターは、抗原性ポリペプチドおよびペプチドをコードする1、2または3つの異種配列を発現する。ある実施形態では、異種配列は同一のウイルスまたは異なるウイルスに由来するものである。いくつかの実施形態では、2コピー以上の同一の異種ヌクレオチド配列が、ウシ・パラインフルエンザウイルスのゲノム、ヒト・パラインフルエンザウイルスのゲノム、またはbPIV/hPIVキメラベクターに挿入される。好ましい実施形態では、2コピーの同一の異種ヌクレオチド配列が本発明のウイルスのゲノムに挿入される。ある実施形態では、異種ヌクレオチド配列はヒト・メタニューモウイルスまたはトリ・ニューモウイルスのようなメタニューモウイルスに由来するものである。特定の実施形態では、メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列がメタニューモウイルスのF遺伝子である。他の特定の実施形態では、メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列がメタニューモウイルスのG遺伝子である。いくつかの他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列が呼吸器多核体ウイルスに由来するものである。特定の実施形態では、呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列が呼吸器多核体ウイルスのF遺伝子です。他の特定の実施形態では、呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列が呼吸器多核体ウイルスのG遺伝子です。1つ以上の異種ヌクレオチド配列が挿入される場合には、挿入位置および挿入された各コピーの遺伝子間領域の長さを操作して、以下のセクション5.1.2.に従って様々なアッセイにより決定することができる。
【００９６】
ある実施形態において、キメラウイルスまたは発現産物のレスキューは、宿主細胞がキメラcDNAまたはRNA構築物でトランスフェクトされている宿主細胞系における逆遺伝学的手法により達成することができる。本発明のRNA鋳型は、適当なDNA配列をDNA特異的RNAポリメラーゼにより転写することで調製される。本発明のRNA鋳型は、適当なDNA配列を、バクテリオファージT7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、または真核生物ポリメラーゼ（例えば、ポリメラーゼI）などの、DNA特異的RNAポリメラーゼを用いて転写することにより、in vitroまたはin vivoで調製しうる。ある実施形態では、本発明のRNA鋳型は、適当なDNA配列を、Hoffmannら, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6108-6113に記載されるプラスミドに基づく発現系を用いて、またはHoffmannおよびWebster, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2843-2847に記載される一方向RNAポリメラーゼI-ポリメラーゼII転写系を用いて転写することにより、in vitroまたはin vivoで調製しうる。得られるネガティブ極性のRNA鋳型は、ウイルスRNA合成装置がその鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含むだろう。あるいはまた、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有する、ポジティブ極性のRNA鋳型を使用することもできる。ポジティブ極性のRNA鋳型からの発現は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターをもつプラスミドの転写により達成しうる。例えば、ポジティブRNA鋳型をT7プロモーターの制御下でコードするプラスミドDNAは、ワクシニアウイルスまたは鶏痘T7系と組み合わせて使用される。
【００９７】
2シストロン性（bicistronic）mRNAは、ウイルス配列の翻訳の内部開始が可能になるように、また通常の末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現が可能になるように、構築することができる。あるいはまた、外来タンパク質は、転写単位が開始部位とポリアデニル化部位を有する内部転写単位から発現させることができる。別の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質となるように、外来遺伝子をPIV遺伝子に挿入する。
【００９８】
ある実施形態では、本発明は、本発明のウイルスを含む三価ワクチンに関する。特定の実施形態では、三価ワクチンに使用されるウイルスは、呼吸器多核体ウイルス由来の第1の異種ヌクレオチド配列とメタニューモウイルス（例えば、ヒト・メタニューモウイルスまたはトリ・ニューモウイルス）由来の第2の異種ヌクレオチド配列を含有するキメラなウシ・パラインフルエンザ３型/ヒト・パラインフルエンザ３型である。例示的な実施形態では、そのような三価ワクチンは、(a)ヒト・パラインフルエンザウイルスのF遺伝子およびHN遺伝子の遺伝子産物に、(b)呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、(c)メタニューモウイルス由来の異種ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に、特異的であるだろう。特定の実施形態では、第1の異種ヌクレオチド配列は、呼吸器多核体ウイルスのF遺伝子であって位置1に挿入され、第2の異種ヌクレオチド配列は、ヒト・メタニューモウイルスのF遺伝子であって位置3に挿入される。さらに多くの組合せが本発明に包含され、その一部を例として表１に示す。他の組合せとして、トリ・ニューモウイルスのFまたはG遺伝子を用いることができる。さらに、キメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用することができる(前掲参照)。いくつかのそれほど好ましくはない実施形態では、異種ヌクレオチド配列をウイルスゲノムのより高い番号の位置に挿入することができる。
【表１】
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【００９９】
いくつかの他の実施形態においては、異種配列と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させることができる。例えば、表１に示した各遺伝子は望ましい長さの遺伝子間領域をもっていてよい。代表的な実施形態では、三価ワクチンは、位置1に挿入された呼吸器多核体ウイルスのF遺伝子、177ヌクレオチドの改変された遺伝子間領域（もとの75ヌクレオチドから下流N遺伝子の開始コドンAUGまで）、および天然の遺伝子間領域をもつ位置3に挿入されたヒト・メタニューモウイルスのF遺伝子を含むb/h PIV3ベクターを含有する。もっと多くの組合せが本発明に包含され、異種ヌクレオチド配列のそれぞれの挿入を以下のセクション5.1.2.に従って操作することができる。
【０１００】
より広い実施形態においては、本発明の発現産物およびキメラウイルス粒子は、ウイルス抗原、腫瘍抗原、および自己免疫疾患に関わる自己抗原を含めた広範な病原体に対するワクチンを作るために遺伝子操作されうる。この目標を達成する1つの方法は、既存のPIV遺伝子を、それぞれの外部ドメインに外来配列を含むように、改変させることを含む。異種配列が病原体のエピトープまたは抗原である場合、これらのキメラウイルスは、病原体（これらの決定基はこの病原体に由来する）に対して防御免疫応答を誘発させるのに使用することができる。
【０１０１】
これらのハイブリッド分子を構築するための1つの手法は、異種ヌクレオチド配列を、hPIV、bPIV、またはbPIV/hPIVなどのPIVゲノムのDNA相補体に挿入して、異種配列がウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス配列、すなわちウイルスポリメラーゼ結合部位/プロモーター（以後これをウイルスポリメラーゼ結合部位と呼ぶ）とポリアデニル化部位によって挟まれるようにすることです。好ましい実施形態では、異種コード配列が、5'および3'末端の複製プロモーター、遺伝子開始配列および遺伝子終止配列、5'および/または3'末端に見出されるパッケージングシグナルを含んだウイルス配列によって挟まれる。代替の手法では、ウイルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド、例えばウイルスゲノムセグメントの3'末端あるいは両末端の相補体、を異種コード配列にライゲートして、ハイブリッド分子を構築することができる。外来遺伝子または外来遺伝子のセグメントを標的配列内に配置することは、以前には標的配列内に適切な制限酵素部位を存在させることによって行なわれていた。しかし、分子生物学の近年の進歩により、この問題が大幅に解消されている。制限酵素部位は、部位特異的突然変異誘発を用いることによって、標的配列内のどこにでも容易に配置することができる(例えば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488に記述されている技法を参照)。以下に述べるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術の変法によっても、配列(すなわち制限酵素部位)の特異的な挿入が可能になり、またハイブリッド分子の容易な構築が可能になる。あるいはまた、PCR反応を使用することにより、クローニングの必要なく組換え鋳型を作製することができる。例えばPCR反応を使用して、DNA特異的RNAポリメラーゼプロモーター(例えばバクテリオファージT3、T7、またはSP6)と、異種遺伝子およびPIVポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列とを含有する二本鎖DNA分子を作製することができる。次いでこの組換えDNAからRNA鋳型を直接転写することができる。さらに別の実施形態では、RNAリガーゼを使用して、ネガティブ極性の異種遺伝子を特定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合部位とをライゲートすることにより、組換えRNA鋳型を作製することができる。
【０１０２】
さらに、ウイルスのレスキューを成功させるのに重要と考えられる「6の法則」(Rule of Six)に従って、1つ以上のヌクレオチドを非翻訳領域にあるHN遺伝子の3'末端に付加することができる。「6の法則」は数多くのパラミクソウイルスに適用され、機能性であるためにはRNAゲノムのヌクレオチド数を6の倍数にすることを必要とする。ヌクレオチドの付加は、QuickChange突然変異誘発キット(Stratagene)などの市販の突然変異誘発キットを使用するなど、当技術分野で公知の技法によって実現することができる。適切な数のヌクレオチドを付加した後、適切な制限酵素による消化およびゲル精製によって、正しいDNA断片（例えば、hPIV3 FおよびHN遺伝子のDNA断片）を単離することができる。本発明により使用することができるウイルスポリメラーゼ活性および構築物に関する配列要件については、以下のサブセクションで述べる。
【０１０３】
理論によって拘束されるものではないが、いくつかのパラメータが、組換えウイルスの複製速度および異種配列の発現レベルに影響を与える。特に、bPIV、hPIV、b/hPIV中の異種配列の位置と、この異種配列に隣接する遺伝子間領域の長さは、複製速度と異種配列の発現レベルを決定する。
【０１０４】
ある実施形態においては、ウイルスのリーダー配列および/またはトレーラー配列が野生型ウイルスに対して改変される。いくつかのより具体的な実施形態では、リーダーおよび/またはトレーラーの長さを改変する。他の実施形態では、リーダーおよび/またはトレーラーの配列を野生型ウイルスに対して突然変異させる。
【０１０５】
本発明の組換えウイルスの作製は、ネガティブセンスウイルスRNA(vRNA)ゲノムの部分または完全長コピー、あるいはその相補的コピー(cRNA)の複製を利用する。このvRNAまたはcRNAは、核酸のin vitro転写の際に生成された、または核酸のトランスフェクション後に細胞内で生成された、感染性ウイルスから単離することができる。第二に、組換えネガティブ鎖ウイルスの作製は、機能性ポリメラーゼ複合体を利用する。典型的には、ニューモウイルスのポリメラーゼ複合体は、N、P、LおよびおそらくはM2タンパク質からなるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１０６】
ポリメラーゼ複合体またはその構成要素は、ウイルス粒子から、または1以上の構成要素を発現する細胞から単離することができ、あるいは特定の発現ベクターのトランスフェクションによって生成することができる。
【０１０７】
PIVの感染性コピーは、上記vRNA、cRNA、またはこれらのRNAを発現するベクターが上記ポリメラーゼ複合体16によって複製される場合に得ることができる(Schnellら, 1994, EMBO J 13: 4195-4203; Collinsら, 1995, PNAS 92: 11563-11567; Hoffmannら, 2000、PNAS 97: 6108-6113; Bridgenら, 1996, PNAS 93: 15400-15404; Paleseら, 1996, PNAS 93: 11354-11358; Peetersら, 1999, J. Virol. 73: 5001-5009; Durbinら, 1997, Virology 235: 323-332)。
【０１０８】
本発明は、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。PIVのポリメラーゼ構成要素(おそらくはN、P、LおよびM2であるが、必ずしもこれらに限定されない)を含有するプラスミドまたはウイルスベクターは、適切な細胞型(細菌、昆虫細胞、真核細胞)でのその構成要素の発現のために原核細胞内で生成させる。PIVゲノムの完全長または部分コピーを含有するプラスミドまたはウイルスベクターが、in vitroまたはin vivoでのウイルス核酸の発現のために原核細胞内で生成される。後者のベクターは、キメラウイルスまたはキメラウイルスタンパク質を生成するために他のウイルス配列を含んでいてもよく、複製欠損ウイルスを生成するためにウイルスゲノムの一部を欠失していてもよく、また、弱毒化ウイルスを生成するために突然変異、欠失、または挿入を含んでいてもよい。
【０１０９】
PIVの感染性コピー(野生型、弱毒型、複製欠損、またはキメラ)は、上記の公知技術に従ってポリメラーゼ構成要素の共発現により生成することができる。
【０１１０】
さらに、1つ以上の完全長または部分PIVタンパク質を一過性にまたは安定して発現する真核細胞を使用することができる。そのような細胞は、トランスフェクション(タンパク質または核酸ベクター)、感染(ウイルスベクター)、または形質導入(ウイルスベクター)によって作製することができ、上記野生型ウイルス、弱毒型ウイルス、複製欠損ウイルス、またはキメラウイルスの補完に役立てることができる。
【０１１１】
5.1.1  挿入される異種遺伝子配列
本発明は、1つ以上の異種配列（異種配列は好ましくは抗原性および/または免疫原性である遺伝子産物またはその断片をコードする）を発現させるために組換えウシまたはヒト・パラインフルエンザウイルスを遺伝子操作することを包含する。本明細書中で用いる「抗原性」とは、抗体またはMHC分子と結合する分子の能力をさす。「免疫原性」とは、宿主において免疫応答を引き出す分子の能力をさす。
【０１１２】
好ましい実施形態において、挿入される異種ヌクレオチド配列は、ネガティブ鎖RNAウイルス（インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス(例えば、ヒト・メタニューモウイルス)、およびトリ・ニューモウイルスを含むが、これらに限らない）に由来するものである。好ましい実施形態では、挿入される異種配列には、ヒトPIVのFまたはHN遺伝子、RSVのF遺伝子、インフルエンザウイルスA、BまたはC型のHA遺伝子、ヒトMPVのF遺伝子、トリ・ニューモウイルスのF遺伝子をコードする配列、あるいはそれらの免疫原性および/または抗原性断片が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
ある実施形態においては、挿入される異種ヌクレオチド配列がヒト・メタニューモウイルスまたはトリ・ニューモウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列が、(a) ヒト・メタニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルス、および/または(b) トリ・ニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルスに由来する。
【０１１４】
本発明のある好ましい実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列がヒト・メタニューモウイルスおよび/またはトリ・ニューモウイルス由来のF遺伝子から得られる。いくつかの実施形態では、F遺伝子は、(a) ヒト・メタニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルス、および/または(b) トリ・ニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルスに由来する。
【０１１５】
本発明のある実施形態では、挿入される異種ヌクレオチド配列がヒト・メタニューモウイルスおよび/またはトリ・ニューモウイルス由来のG遺伝子である。いくつかの実施形態では、G遺伝子は、(a) ヒト・メタニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルス、および/または(b) トリ・ニューモウイルスと呼吸器多核体ウイルスに由来する。
【０１１６】
ある実施形態においては、ヒト・メタニューモウイルス、トリ・ニューモウイルス、および呼吸器多核体ウイルス由来の異なるF遺伝子および/または異なるG遺伝子の任意の組合せを本発明のウイルスに挿入することができるが、ただし、全ての実施形態において、ヒト・メタニューモウイルスまたはトリ・ニューモウイルスのいずれかに由来する少なくとも1つの異種配列が本発明の組換えパラインフルエンザウイルス中に存在しなければならない。
【０１１７】
ある実施形態においては、挿入されるヌクレオチド配列はヒト・メタニューモウイルス由来のFタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。他の実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列はヒト・メタニューモウイルス由来のGタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。さらに他の実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列はトリ・ニューモウイルス由来のFタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。さらに他の実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列はトリ・ニューモウイルス由来のGタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。ただし、本発明の全ての実施形態において、少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列はメタニューモウイルスに由来し、挿入される異種ヌクレオチド配列は呼吸器多核体ウイルスのFタンパク質またはGタンパク質をコードする。
【０１１８】
ある実施形態において、挿入されるヌクレオチド配列はキメラFタンパク質またはキメラGタンパク質をコードするものである。キメラFタンパク質は、ヒト・メタニューモウイルス、トリ・ニューモウイルスおよび/または呼吸器多核体ウイルスなどの様々なウイルス由来のFタンパク質の一部を含む。キメラGタンパク質は、ヒト・メタニューモウイルス、トリ・ニューモウイルスおよび/または呼吸器多核体ウイルスなどの様々なウイルス由来のGタンパク質の一部を含む。特定の実施形態では、Fタンパク質はメタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の内腔ドメインを含む。ある実施形態では、挿入される核酸は、可溶性Fタンパク質が発現されるようにFタンパク質の膜貫通ドメインが欠失されているFタンパク質をコードする。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本発明の異種ヌクレオチド配列は、配列番号1〜配列番号5、配列番号14および配列番号15のいずれか1つである（表16参照）。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号6〜配列番号13、配列番号16および配列番号17のいずれか1つのタンパク質をコードする（表16参照）。
【０１２０】
呼吸器多核体ウイルス由来の異種ヌクレオチド配列に関しては、例えば参照によりその全体を本明細書に組み入れるPCT/US98/20230を参照されたい。
【０１２１】
好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルス内で発現させることのできる異種遺伝子配列には、呼吸器疾患をもたらすウイルスの抗原エピトープおよび糖タンパク質、例えばインフルエンザ糖タンパク質、特にヘマグルチニンH5、H7、呼吸器多核体ウイルスのエピトープ、ニューカッスル病ウイルスのエピトープ、センダイウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルス(ILV)などのエピトープをコードするものが含まれるが、これらに限定されない。大部分の好ましい実施形態では、異種ヌクレオチド配列はメタニューモウイルス、例えばヒト・メタニューモウイルスおよび/またはトリ・ニューモウイルスから得られる。本発明のさらに別の実施形態では、本発明のキメラウイルスに遺伝子操作されうる異種遺伝子配列には、ウイルスエピトープおよびウイルス糖タンパク質、例えばB型肝炎表面抗原、AまたはC型肝炎表面糖タンパク質、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質、シミアンウイルス5または流行性耳下腺炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、ヘルペスウイルスの糖タンパク質、ポリオウイルスのVPI、およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)（好ましくは1型または2型）由来の配列をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、本発明のキメラウイルスに遺伝子操作されうる異種遺伝子配列には、マレック病ウイルス(MDV)のエピトープ、感染性バーサル病ウイルス(IBDV)のエピトープ、ニワトリ貧血ウイルスのエピトープ、トリインフルエンザウイルス(AIV)、狂犬病、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および豚痘ウイルスのエピトープが含まれるが、これらに限定されない(参照によりその全体を本明細書に組み入れるFieldsら(編)、1991, Fundamental Virology, 第2版, Raven Press、New York参照)。
【０１２２】
本発明のその他の異種配列は、自己免疫疾患に特有の抗原をコードするものを含む。これらの抗原は、典型的な場合、哺乳動物組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどから得られ、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、悪性貧血、アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、および円板状エリテマトーデスに特有の抗原が含まれる。
【０１２３】
アレルゲンである抗原は、一般にタンパク質または糖タンパク質を含み、花粉、ダスト、カビ、胞子、フケ、昆虫、および食物由来の抗原が含まれる。さらに、腫瘍抗原に特有の抗原は、典型的な場合、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官などから得られる。その例としては、腫瘍タンパク質に特有の抗原、例えば変異した発癌遺伝子によりコードされたタンパク質、腫瘍に関連したウイルスタンパク質、および糖タンパク質が含まれる。腫瘍には、口唇癌、鼻咽頭癌、咽頭および口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、喉頭癌、肺および気管支癌、皮膚黒色腫、乳癌、子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮癌、脳およびその他の神経系部分の腫瘍、甲状腺癌、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病などの癌のタイプから得られたものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本発明の1つの特定の実施形態では、異種配列が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)のゲノム、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型またはヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムから得られる。本発明の別の実施形態では、PIVウイルスタンパク質内に異種ペプチド配列を含有するキメラ遺伝子産物が発現されるように、異種コード配列を、PIV遺伝子コード配列内に挿入することができる。本発明のそのような実施形態では、異種配列を、ヒト免疫不全ウイルス、好ましくはヒト免疫不全ウイルス1型またはヒト免疫不全ウイルス2型のゲノムから得てもよい。
【０１２５】
異種配列がHIV由来のものである場合、そのような配列には、env遺伝子(すなわちgp160、gp120、および/またはgp41の全部または一部をコードする配列)、pol遺伝子(すなわち逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および/またはインテグラーゼの全部または一部をコードする配列)、gag遺伝子(すなわちp7、p6、p55、p17/18、p24/25の全部または一部をコードする配列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、および/またはvpxから得られた配列を含めることができるが、これらに限定されない。
【０１２６】
別の実施形態では、キメラウイルス内に遺伝子操作されうる異種遺伝子配列は、免疫賦活作用を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫賦活タンパク質の例には、サイトカイン、インターフェロン1型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
さらに、キメラウイルス内に遺伝子操作されうるその他の異種遺伝子配列には、細菌の表面糖タンパク質などの細菌由来の抗原、真菌由来の抗原、様々な他の病原体および寄生虫由来の抗原が含まれる。細菌性病原体から得られる異種遺伝子配列の例には、以下の属の種に由来する抗原をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。すなわちSalmonella、Shigella、Chlamydia、Helicobacter、Yersinia、Bordatella、Pseudomonas、Neisseria、Vibrio、Haemophilus、Mycoplasma、Streptomyces、Treponema、Coxiella、Ehrlichia、Brucella、Streptobacillus、Fusospirocheta、Spirillum、Ureaplasma、Spirochaeta、Myocoplasma、Actinomycetes、Borrelia、Bacteroides、Trichomoras、Branhamella、Pasteurella、Clostridium、Corynebacterium、Listeria、Bacillus、Erysipelothrix、Rhodococcus、Escherichia、Klebsiella、Pseudomanas、Enterobacter、Serratia、Staphylococcus、Streptococcus、Legionella、Mycobacterium、Proteus、Campylobacter、Enterococcus、Acinetobacter、Morganella、Moraxella、Citrobacter、Rickettsia、Rochlimeae、ならびにP. aeruginosa、E. coli、P. cepacia、S. epidermis、E. faecalis、S. pneumonias、S. aureus、N. meningitidis、S. pyogenes、Pasteurella multocida、Treponema pallidum、およびP. mirabilisなどの細菌種。
【０１２８】
病原性真菌由来の異種遺伝子配列の例には、Cryptococcus neoformans; Blastomyces dermatitidis; Aiellomyces dermatitidis; Histoplasma capsulatum; Coccidioides immitis; C. albicans、C. tropicalis、C. parapsilosis、C. guilliermondii、およびC. kruseiを含めたCandida種; A. fumigatus、A. flavus、およびA. nigerを含めたAspergillus種; Rhizopus種; Rhizomucor種; Cunninghammella種; A. saksenaea、A. mucor、およびA. absidiaを含めたApophysomyces種; Sporothrix schenckii; Paracoccidioides brasiliensis; Pseudallescheria boydii; Torulopsis glabrata; Trichophyton種; Microsporum種; およびDermatophyres種などの真菌由来の抗原、ならびに病原性であることが現在知られているかまたは後に同定される他の酵母または真菌由来の抗原をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
最後に、寄生虫由来の異種遺伝子配列の例には、例えばBabesia、Toxoplasma、Plasmodium、Eimeria、Isospora、Atoxoplasma、Cystoisospora、Hammondia、Besniotia、Sarcocystis、Frenkelia、Haemoproteus、Leucocytozoon、Theileria、Perkinsus、およびGregarina種などのApicomplexa phylumのメンバー; Pneumocystis carinii; 例えばNosema、Enterocytozoon、Encephalitozoon、Septata、Mrazekia、Amblyospora、Ameson、Glugea、Pleistophora、およびMicrosporidium種などのMicrospora phylumのメンバー; 例えばHaplosporidium種などのAscetospora phylumのメンバー、ならびにPlasmodium falciparum、P. vivax、P. ovale、P. malariaを含めた種; Toxoplasma gondii; Leishmania mexicana、L. tropica、L. major、L. aethiopica、L. donovani、Trypanosoma cruzi、T. brucei、Schistosoma mansoni、S. haematobium、S. japonium; Trichinella spiralis; Wuchereria bancrofti; Brugia malayli; Entamoeba histolytica; Enterobius vermiculoarus; Taenia solium、T. saginata、Trichomonas vaginatis、T. hominis、T. tenax; Giardia lamblia; Cryptosporidium parvum; Pneumocytis carinii、Babesia bovis、B .divergens、B. microti、Isospora belli、L hominis; Dientamoeba fragilis; Onchocerca volvulus; Ascaris lumbricoides; Necator americanis; Ancylostoma duodenale; Strongyloides stercoralis; Capillaria philippinensis; Angiostrongylus cantonensis; Hymenolepis nana; Diphyllobothrium latum; Echinococcus granulosus、E. multilocularis; Paragonimus westermani、P. caliensis; Chlonorchis sinensis; Opisthorchis felineas、G. Viverini、Fasciola hepatica、Sarcoptes scabiei、Pediculus humanus; Phthirlus pubis; およびDermatobia hominis、ならびに病原性であることが現在知られているかまたは後に同定される他の寄生虫由来の抗原をコードするものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
5.1.2  挿入されるメタニューモウイルス配列
本発明は、哺乳動物MPVの核酸配列、哺乳動物MPVのタンパク質、および哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体に関する。本発明はさらに、哺乳動物MPVの核酸配列の相同体、および哺乳動物MPVのタンパク質の相同体に関する。本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列に関し、この融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ以上のペプチドまたはタンパク質を含有するものである。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片とペプチドタグ（ポリヒスチジンタグなどであるが、これに限定されない）を含有する。本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ以上のペプチドまたはタンパク質を含有する融合タンパク質に関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質をコードする核酸の誘導体にも関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質の誘導体にも関する。誘導体は、付加、欠失、トランケーション、置換、および反転などであるがこれらに限定されないタンパク質の変異形態でありうるが、これらに限定されない。誘導体は、さらに、哺乳動物MPVのタンパク質のキメラ形態であってもよく、そのタンパク質の少なくとも1つのドメインが異なるタンパク質に由来するものである。誘導体は、例えば薬物などの別の分子に共有結合または非共有結合で結合された哺乳動物MPVのタンパク質の形態であってもよい。
【０１３１】
NL/1/00(または00-1)と呼ばれるウイルス分離株は、変異型A1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号95に示される。NL/17/00と呼ばれるウイルス分離株は、変異型A2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号96に示される。NL/1/99(または99-1)と呼ばれるウイルス分離株は、変異型B1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号94に示される。NL/1/94と呼ばれるウイルス分離株は、変異型B2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列は配列番号97に示される。本願で開示される配列とそれに対応する配列番号のリストを表16に示す。
【０１３２】
哺乳動物MPVのタンパク質は、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質またはM2-2タンパク質、あるいはその断片でありうる。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その長さが、少なくとも25アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも125アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも175アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも225アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも275アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも325アミノ酸、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも425アミノ酸、少なくとも450アミノ酸、少なくとも475アミノ酸、少なくとも500アミノ酸、少なくとも750アミノ酸、少なくとも1000アミノ酸、少なくとも1250アミノ酸、少なくとも1500アミノ酸、少なくとも1750アミノ酸、少なくとも2000アミノ酸、または少なくとも2250アミノ酸でありうる。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その長さが、多くとも25アミノ酸、多くとも50アミノ酸、多くとも75アミノ酸、多くとも100アミノ酸、多くとも125アミノ酸、多くとも150アミノ酸、多くとも175アミノ酸、多くとも200アミノ酸、多くとも225アミノ酸、多くとも250アミノ酸、多くとも275アミノ酸、多くとも300アミノ酸、多くとも325アミノ酸、多くとも350アミノ酸、多くとも375アミノ酸、多くとも400アミノ酸、多くとも425アミノ酸、多くとも450アミノ酸、多くとも475アミノ酸、多くとも500アミノ酸、多くとも750アミノ酸、多くとも1000アミノ酸、多くとも1250アミノ酸、多くとも1500アミノ酸、多くとも1750アミノ酸、多くとも2000アミノ酸、または多くとも2250アミノ酸でありうる。
【０１３３】
本発明のある実施形態において、哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、このNタンパク質は、系統発生的に、APV C型のNタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97(これらの配列番号の記述に関しては表16も参照のこと)のウイルスゲノムによってコードされたNタンパク質などの、哺乳動物MPVのNタンパク質との近縁性が高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はPタンパク質であり、このPタンパク質は、系統発生的に、APV C型のPタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたPタンパク質などの、哺乳動物MPVのPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はMタンパク質であり、このMタンパク質は、系統発生的に、APV C型のMタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたMタンパク質などの、哺乳動物MPVのMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はFタンパク質であり、このFタンパク質は、系統発生的に、APV C型のFタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたFタンパク質などの、哺乳動物MPVのFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM2-1タンパク質であり、このM2-1タンパク質は、系統発生的に、APV C型のM2-1タンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM2-1タンパク質などの、哺乳動物MPVのM2-1タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM2-2タンパク質であり、このM2-2タンパク質は、系統発生的に、APV C型のM2-2タンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM2-2タンパク質などの、哺乳動物MPVのM2-2タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はGタンパク質であり、このGタンパク質は、系統発生的に、APV C型のいずれのタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたGタンパク質などの、哺乳動物MPVのGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はSHタンパク質であり、このSHタンパク質は、系統発生的に、APV C型のいずれのタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたSHタンパク質などの、哺乳動物MPVのSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はLタンパク質であり、このLタンパク質は、系統発生的に、APV C型のいずれのタンパク質との近縁性よりも、例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたLタンパク質などの、哺乳動物MPVのLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。
【０１３４】
本発明のある実施形態においては、哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、このNタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたNタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのNタンパク質のアミノ酸配列は配列番号366〜369に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はPタンパク質であり、このPタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたPタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのPタンパク質のアミノ酸配列は配列番号78〜85に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はMタンパク質であり、このMタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたMタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのMタンパク質のアミノ酸配列は配列番号358〜361に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はFタンパク質であり、このFタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたFタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95
%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのFタンパク質のアミノ酸配列は配列番号18〜25に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM2-1タンパク質であり、このM2-1タンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM2-1タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのM2-1タンパク質のアミノ酸配列は配列番号42〜49に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はM2-2タンパク質であり、このM2-2タンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたM2-2タンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのM2-2タンパク質のアミノ酸配列は配列番号50〜57に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はGタンパク質であり、このGタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたGタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのGタンパク質のアミノ酸配列は配列番号26〜33に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はSHタンパク質であり、このSHタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号9
7のウイルスゲノムによってコードされたSHタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのSHタンパク質のアミノ酸配列は配列番号86〜93に開示されている; 表16も参照のこと)。本発明のある実施形態では、哺乳動物MPVのタンパク質はLタンパク質であり、このLタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムによってコードされたLタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのLタンパク質のアミノ酸配列は配列番号34〜41に開示されている; 表16も参照のこと)。
【０１３５】
哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、その断片に相同な該タンパク質の部分わたって、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスによってコードされた同種タンパク質に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である。特定の例示的な実施形態では、本発明は、Fタンパク質の細胞外ドメインを含有する哺乳動物MPVのFタンパク質の断片およびその相同体を提供する。細胞外ドメインを含有するFタンパク質の断片の相同体は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスによってコードされたFタンパク質の細胞外ドメインを含有する対応断片に対して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である(それぞれのFタンパク質のアミノ酸配列は配列番号18〜25に開示されている; 表16も参照のこと)。
【０１３６】
ある実施形態において、本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのタンパク質およびその断片を提供する。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、このNタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたNタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、このGタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたGタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、このPタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたPタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、このMタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたMタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのFタンパク質を提供し、このFタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたFタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供し、このM2-1タンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたM2-1タンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたM2-1タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供し、このM2-2タンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたM2-2タンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたM2-2タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、このSHタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたSHタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、このLタンパク質は、系統発生的に、配列番号94または配列番号97によってコードされたウイルスによりコードされたLタンパク質との近縁性よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスによってコードされたLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。
【０１３７】
その他の実施形態においては、本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片を提供する。本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、このNタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたNタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、このGタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたGタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、このPタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたPタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、このMタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたMタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのFタンパク質を提供し、このFタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたFタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供し、このM2-1タンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたM2-1タンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたM2-1タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供し、このM2-2タンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたM2-2タンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたM2-2タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、このSHタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたSHタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、このLタンパク質は、系統発生的に、配列番号95または配列番号96によってコードされたウイルスによりコードされたLタンパク質との近縁性よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスによってコードされたLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。
【０１３８】
本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のGタンパク質(配列番号28)に対して少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。特定の実施形態では、哺乳動物MPVのGタンパク質は配列番号119〜153のアミノ酸配列を有する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のNタンパク質(配列番号72)に対して少なくとも98.5%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプで
ある分離株NL/1/99のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質であって、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のPタンパク質(配列番号80)に対して少なくとも96%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のMタンパク質(配列番号64)と同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のFタンパク質(配列番号20)に対して少なくとも99%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM2-1タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のM2-1タンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2
-1タンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のM2-1タンパク質(配列番号44)に対して少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM2-2タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のM2-2タンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のM2-2タンパク質であって、そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のM2-2タンパク質(配列番号52)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のSHタンパク質(配列番号88)に対して少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質は、系統発生的に、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質との近縁性よりも、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/99に代表される哺乳動物MPV変異型B1のLタンパク質(配列番号36)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。
【０１３９】
本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のGタンパク質(配列番号26)に対して少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のNタンパク質(配列番号70)に対して少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のPタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質であって、そのPタンパ
ク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のPタンパク質(配列番号78)に対して少なくとも96%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のMタンパク質(配列番号62)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のFタンパク質(配列番号18)に対して少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM2-1タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のM2-1タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-1タンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のM2-1タンパク質(配列番号42)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM2-2タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のM2-2タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のM2-2タンパク質であって、そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のM2-2タンパク質(配列番号50)に対して少なくとも96%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質、A2のプロトタ���プである分離株NL/17/00のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のSHタンパク質(配列番号86)に対して少なくとも84%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A1のLタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質、A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質との近縁性よりも、変異型A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A1のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/00に代表される哺乳動物MPV変異型A1のウイルスのLタンパク質(配列番号34)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。
【０１４０】
本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のGタンパク質(配列番号27)に対して少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のNタンパク質(配列番号71)に対して少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のPタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質であって、そのPタンパク
質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のPタンパク質(配列番号79)に対して少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のMタンパク質(配列番号63)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のFタンパク質(配列番号19)に対して少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM2-1タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のM2-1タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-1タンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のM2-1タンパク質(配列番号43)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM2-2タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のM2-2タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のM2-2タンパク質であって、そのM2-2タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のM2-2タンパク質(配列番号51)に対して少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質、A1のプロ��タイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のSHタンパク質(配列番号87)に対して少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質、またはB2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質との近縁性よりも、変異型A2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/17/00に代表される哺乳動物MPV変異型A2のLタンパク質(配列番号35)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。
【０１４１】
本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のGタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のGタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のGタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のGタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質であって、そのGタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のGタンパク質(配列番号29)に対して少なくとも66%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のNタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のNタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のNタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のNタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質であって、そのNタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のNタンパク質(配列番号73)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のPタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のPタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のPタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のPタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質であ
って、そのPタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のPタンパク質(配列番号81)に対して少なくとも96%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のMタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のMタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のMタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のMタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質であって、そのMタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のMタンパク質(配列番号65)に対して同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のFタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のFタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のFタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のFタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質であって、そのFタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のFタンパク質(配列番号21)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM2-1タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のM2-1タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-1タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-1タンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-1タンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-1タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM2-1タンパク質であって、そのM2-1タンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のM2-1タンパク質(配列番号45)に対して少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM2-2タンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のM2-2タンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のM2-2タンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のM2-2タンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のM2-2タンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のM2-2タンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のM2-2タンパク質であって、アミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のM2-2タンパク質(配列番号53)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のSHタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のSHタンパク質、またはA2のプロトタイプであ���分離株NL/17/00のSHタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のSHタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質であって、そのSHタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のSHタンパク質(配列番号89)に対して少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質を提供し、この哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質は、系統発生的に、変異型B1のプロトタイプである分離株NL/1/99のLタンパク質、A1のプロトタイプである分離株NL/1/00のLタンパク質、またはA2のプロトタイプである分離株NL/17/00のLタンパク質との近縁性よりも、変異型B2のプロトタイプである分離株NL/1/94のLタンパク質との近縁性のほうが高いものである。本発明は、哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質であって、そのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94に代表される哺乳動物MPV変異型B2のLタンパク質(配列番号37)に対して少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるものを提供する。
【０１４２】
ある実施形態では、配列同一性%は完全長タンパク質のアライメントに基づく。その他の実施形態では、配列同一性%は、タンパク質の連続したアミノ酸配列のアライメントに基づいており、アミノ酸配列は、その長さが25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、または2250アミノ酸でありうる。
【０１４３】
本発明はさらに、哺乳動物MPV由来の核酸配列を提供する。また本発明は、哺乳動物MPV由来の核酸配列の誘導体も提供する。ある特定の実施形態では、核酸が修飾されている。
【０１４４】
ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのサブグループAのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVのサブグループBのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型A1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型A2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型B1のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態では、本発明の核酸は、上記定義した哺乳動物MPVの変異型B2のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。
【０１４５】
ある実施形態では、本発明は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列に対して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列の断片に対して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であり、この断片の長さは少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1,000ヌクレオチド、少なくとも1,250ヌクレオチド、少なくとも1,500ヌクレオチド、少なくとも1,750ヌクレオチド、少なくとも2,000ヌクレオチド、少なくとも2,00ヌクレオチド、少なくとも3,000ヌクレオチド、少なくとも4,000ヌクレオチド、少なくとも5,000ヌクレオチド、少なくとも7,500ヌクレオチド、少なくとも10,000ヌクレオチド、少なくとも12,500ヌクレオチド、または少なくとも15,000ヌクレオチドである。特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号98〜132; 配列番号168〜247; 配列番号22〜25; 配列番号30〜33; 配列番号38〜41; 配列番号46〜49; 配列番号54〜57; 配列番号58〜61; 配列番号66〜69; 配列番号74〜77; 配列番号82〜85; または配列番号90〜93のヌクレオチド配列の1つに対して少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%、または少なくとも100%同一である。
【０１４６】
本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、または中程度のストリンジェンシー条件下、または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97の核酸配列の1つとハイブリダイズすることが可能である。本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー条件下、または中程度のストリンジェンシー条件下、または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号98〜132; 配列番号168〜247; 配列番号22〜25; 配列番号30〜33; 配列番号38〜41; 配列番号46〜49; 配列番号54〜57; 配列番号58〜61; 配列番号66〜69; 配列番号74〜77; 配列番号82〜85; または配列番号90〜93の核酸配列の1つとハイブリダイズすることが可能である。ある実施形態では、核酸は、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1,000ヌクレオチド、少なくとも1,250ヌクレオチド、少なくとも1,500ヌクレオチド、少なくとも1,750ヌクレオチド、少なくとも2,000ヌクレオチド、少なくとも2,00ヌクレオチド、少なくとも3,000ヌクレオチド、少なくとも4,000ヌクレオチド、少なくとも5,000ヌクレオチド、少なくとも7,500ヌクレオチド、少なくとも10,000ヌクレオチド、少なくとも12,500ヌクレオチド、または少なくとも15,000ヌクレオチドの長さ全体にわたり、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【０１４７】
本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質と特異的に結合する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体は、哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループAのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。その他のある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループBのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。より具体的なある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVの変異型A1のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。その他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループA2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。ある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB1のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。その他のある実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質と特異的に結合する。
【０１４８】
5.1.3.  異種遺伝子配列の挿入
本発明のウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、ウイルスコード領域を異種配列で完全置換することによって、または部分置換することによって、またはウイルスゲノムに異種ヌクレオチド配列を付加することによって行うことができる。完全置換は、PCR誘導型の突然変異誘発を使用することにより、おそらく最良に行われると考えられる。簡単に述べると、PCRプライマーAは、5'末端から3'末端へ、クラスIIS制限酵素部位などのユニーク制限酵素部位(すなわち「シフター」(shifter)酵素; 特定の配列を認識するが、その配列の上流または下流でDNAを切断する); PIV遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドのストレッチ; および異種配列のカルボキシ末端コード部分に相補的なヌクレオチドのストレッチを含有すると考えられる。PCRプライマーBは、5'末端から3'末端へ、ユニーク制限酵素部位; PIV遺伝子に相補的なヌクレオチドのストレッチ; および外来遺伝子の5'コード部分に対応するヌクレオチドのストレッチを含有すると考えられる。これらのプライマーを使用して、クローニングした外来遺伝子のコピーについてPCR反応させた後、ユニーク制限部位を使用して生成物を切り出しクローニングすることができる。クラスIIS酵素による消化、および精製したファージポリメラーゼによる転写によって、結果的に外来遺伝子が挿入されたPIV遺伝子の正確な非翻訳末端を含有するRNA分子が生成されると考えられる。別の実施形態では、PCR-primed反応を使用して、バクテリオファージプロモーター配列およびハイブリッド遺伝子配列を含有する二本鎖DNAを調製することができ、その結果、RNA鋳型をクローニングすることなく直接転写できるようになる。
【０１４９】
異種ヌクレオチド配列は、本発明のウイルスの様々な位置に付加または挿入することができる。一実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置1に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置2に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置3に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置4に付加または挿入する。別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置5に付加または挿入する。さらに別の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を位置6に付加または挿入する。本明細書で使用する「位置」という用語は、転写されるウイルスゲノム上の異種ヌクレオチド配列の位置を指し、例えば、位置1は、第1の遺伝子が転写されることを意味し、位置2は、第2の遺伝子が転写されることを意味する。ウイルスのより低い番号の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入すると、一般に、より大きい番号の位置に挿入した場合と比べて、異種ヌクレオチド配列の発現が強くなるが、これはウイルスのゲノム全体にわたって生ずる転写勾配が原因である。しかし、この転写勾配はまた、ウイルスmRNAの特定の比率をもたらす。外来遺伝子を挿入するとこの比率が乱れ、その結果、異なる量のウイルスタンパク質が合成されて、ウイルスの複製に影響を及ぼす可能性がある。このように、挿入部位を選択する場合には、転写勾配と複製速度の両方を考慮しなければならない。例えば、b/h PIV3ベクターの位置2に異種ヌクレオチド配列を挿入すると、最良の複製速度と異種遺伝子発現レベルが得られる。異種ヌクレオチド配列をより低い番号の位置に挿入することは、異種ヌクレオチド配列の強力な発現が望まれる場合、本発明の好ましい実施形態になる。好ましい実施形態では、異種配列を位置1、2、または3に付加または挿入する。
【０１５０】
本発明のウイルスに異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果が実現されるように、異種遺伝子のコード配列の終端と下流遺伝子のコード配列の開始点との間の遺伝子間領域を変化させることができる。本明細書で使用する「遺伝子間領域」という用語は、1つの遺伝子の終止シグナルと、その隣の下流にあるオープンリーディングフレームのコード配列の開始コドン(例えばAUG)との間のヌクレオチド配列を指す。遺伝子間領域は、遺伝子の非コード領域、すなわち遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始点(AUG)との間を含むことができる。この非コード領域は、bPIV3 mRNAおよび他のウイルス遺伝子内にもともと存在しており、それを非限定的な例として表２に示す。
【表２】
2011167197.tif 000004
【０１５１】
様々な実施形態において、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との間の遺伝子間領域は、互いに独立して、少なくとも10nt長に、少なくとも20nt長に、少なくとも30nt長に、少なくとも50nt長に、少なくとも75nt長に、少なくとも100nt長に、少なくとも125nt長に、少なくとも150nt長に、少なくとも175nt長に、または少なくとも200nt長になるように操作することができる。ある実施形態では、異種ヌクレオチド配列とその下流の遺伝子との遺伝子間領域は、互いに独立して、最大でも10nt長に、最大でも20nt長に、最大でも30nt長に、最大でも50nt長に、最大でも75nt長に、最大でも100nt長に、最大でも125nt長に、最大でも150nt長に、最大でも175nt長に、または最大でも200nt長になるように操作することができる。様々な実施形態では、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域を、互いに独立して、少なくとも10nt長に、少なくとも20nt長に、少なくとも30nt長に、少なくとも50nt長に、少なくとも75nt長に、少なくとも100nt長に、少なくとも125nt長に、少なくとも150nt長に、少なくとも175nt長に、または少なくとも200nt長になるように操作することができる。ある実施形態では、ウイルスゲノム内の所望の遺伝子の非コード領域を、互いに独立して、最大でも10nt長に、最大でも20nt長に、最大でも30nt長に、最大でも50nt長に、最大でも75nt長に、最大でも100nt長に、最大でも125nt長に、最大でも150nt長に、最大でも175nt長に、または最大でも200nt長になるように操作することができる。
【０１５２】
異種ヌクレオチド配列を挿入する場合、所望の効果を実現するために、位置効果と遺伝子間領域の操作を組み合わせて用いることができる。例えば異種ヌクレオチド配列を、位置1、2、3、4、5、および6からなる群から選択された位置に付加または挿入し、かつ異種ヌクレオチド配列とこれに隣接する下流遺伝子との遺伝子間領域を変化させることができる(表３参照)。代表的な実施形態では、hRSV F遺伝子をb/h PIV3ベクターの位置1に挿入し、F遺伝子とN遺伝子（すなわち、F遺伝子に隣接する下流遺伝子）との遺伝子間領域を177ヌクレオチドに変化させる。本発明に包含される組合せのいくつかを、例として表３に示す。
【表３】
2011167197.tif 000005
【０１５３】
挿入された異種ヌクレオチド配列の目的（例えば、強力な免疫原性をもたせるなど）に応じて、挿入される異種ヌクレオチド配列の挿入位置と遺伝子間領域の長さとは、以下の非限定的な例のアッセイによって測定される、複製速度およびタンパク質またはmRNAの発現レベルを含むがこれらに限定されない様々な指標によって決定することができる：すなわち、プラークアッセイ、蛍光焦点アッセイ、感染中心アッセイ、形質転換アッセイ、終点希釈アッセイ、平板培養効率、電子顕微鏡法、赤血球凝集、ウイルス酵素活性の測定、ウイルス中和、赤血球凝集阻害、補体結合法、免疫染色、免疫沈降および免疫ブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ、核酸検出(例えばサザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析)、増殖曲線、レポーター遺伝子の使用(例えば、タンパク質発現を観察するために、関心のある異種遺伝子と同じ様式でウイルスゲノムに組み込まれる、緑色蛍光タンパク質(GFP)や増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)などのレポーター遺伝子の使用)、またはこれらの組合せ。これらのアッセイを行う手順は、当技術分野で周知であり(例えば、Flintら、PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press, pp.25-56参照、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる)、非限定的な例を以下の実施例のセクションに示す。
【０１５４】
例えば、発現レベルは、培養中の細胞を本発明のウイルスに感染させ、その後、例えば異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やELISAでタンパク質発現レベルを測定することによって、または例えば異種配列に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でRNA発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に、異種配列の発現レベルは、動物モデルに感染させて、動物モデルにおける本発明の組換えウイルスの異種配列から発現したタンパク質のレベルを測定することによって、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用したELISAまたはウェスタンブロット分析にかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、異種配列の遺伝子産物に対する、動物によって産生された抗体の力価を、ELISAを含むがこれに限定されない当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。
【０１５５】
異種配列は、ウイルスゲノムのヌクレオチド配列と相同である可能性があるので、プローブおよび抗体が異種配列またはその遺伝子産物に対して確かに特異的になるように注意を払うべきである。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、キメラb/h PIV3 RSVまたはb/h PIV3 hMPVまたはb/h PIV3 RSV FおよびhMPV F由来のhMPVのRSVまたはhMPVのFタンパク質の発現レベルは、当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。Fタンパク質の発現レベルは、培養中の細胞に本発明のキメラウイルスを感染させ、例えばhMPVのFタンパク質および/またはGタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析やELISAなどでタンパク質発現レベルを測定することによって、あるいは例えばヒト・メタニューモウイルスのF遺伝子および/またはG遺伝子に特異的なプローブを使用したノーザンブロット分析でRNA発現レベルを測定することによって決定することができる。同様に、異種配列の発現レベルは、動物モデルを使用して、その動物に感染させた後、動物モデルにおけるFタンパク質および/またはGタンパク質のレベルを測定することにより、決定することができる。タンパク質のレベルは、感染した動物から組織サンプルを得、次いでその組織サンプルを、異種配列のFタンパク質および/またはGタンパク質に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析またはELISAにかけることによって、測定することができる。さらに、動物モデルを使用する場合、Fタンパク質および/またはGタンパク質に対する、動物によって産生された抗体の力価を、ELISAを含むがこれに限定されない当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。
【０１５７】
本発明の組換えウイルスの複製速度は、当業者に公知の任意の技法によって決定することができる。
【０１５８】
ある実施形態において、ウイルスゲノムにおける異種配列の最適な位置と遺伝子間領域の最適な長さの特定を容易にするために、異種配列はレポーター遺伝子をコードする。最適なパラメータを決定したら、そのレポーター遺伝子を、所定の抗原をコードする異種ヌクレオチド配列に置き換える。当業者に公知のレポーター遺伝子はどれも、本発明の方法と共に使用することができる。より詳細に関しては、セクション5.5を参照されたい。
【０１５９】
組換えウイルスの複製速度は、当業者に公知の標準的技法により決定することができる。複製速度はウイルスの増殖速度で表され、感染後の時間に対してウイルス力価をプロットすることにより決定することができる。ウイルス力価は、当業者に公知のどのような技法によっても測定することができる。ある実施形態では、ウイルスを含有する懸濁液を、ウイルスに感染し易い細胞と共にインキュベートする。本発明の方法と共に使用することができる細胞型には、Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL)細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF)、またはtMK細胞が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスを細胞と共にインキュベートした後、感染した細胞の数を決定する。ある特定の実施形態では、ウイルスがレポーター遺伝子を含む。したがって、レポーター遺伝子を発現している細胞の数が感染した細胞の数を表す。特定の実施形態では、ウイルスがeGFPをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、eGFPを発現している細胞の数、すなわちウイルスに感染した細胞の数をFACSにより決定する。
【０１６０】
ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、その組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下で最大でもその20％である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、およびその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば、位置1にRSVのF遺伝子を含むb/h PIV3の複製速度は、最大でもbPIV3の複製速度の20％である。
【０１６１】
ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下で多くてもその5％、多くても10％、多くても20％、多くても30％、多くても40％、多くても50％、多くても75％、多くても80％、多くてもその90％である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下で少なくともその5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくともその90％である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスの複製速度は、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスの複製速度に対し、同じ条件下でその5％から20％の間、10％から40％の間、25％から50％の間、40％から75％の間、50％から80％の間、または75％から90％の間である。
【０１６２】
ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下で最大でもその20％である。同じ条件とは、ウイルスの初期力価が同じであり、細胞株が同じであり、インキュベーション温度、増殖培地、細胞数、およびその他の複製速度に影響を及ぼす可能性のある試験条件が同じであることを指す。例えば、bPIV3の位置1にあるMPVのFタンパク質の異種配列の発現レベルは、bPIV3のウシFタンパク質の発現レベルに対して最大でも20％である。
【０１６３】
ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下で多くてもその5％、多くても10％、多くても20％、多くても30％、多くても40％、多くても50％、多くても75％、多くても80％、多くてもその90％である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下で少なくともその5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくともその90％である。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスにおける異種配列の発現レベルは、この組換えウイルスが誘導される野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルに対し、同じ条件下でその5％から20％の間、10％から40％の間、25％から50％の間、40％から75％の間、50％から80％の間、または75％から90％の間である。
【０１６４】
5.1.4.  HN遺伝子への異種遺伝子配列の挿入
PIVのヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ活性をもたらすタンパク質は単一の遺伝子HNによってコードされる。HNタンパク質はこのウイルスの主要な表面糖タンパク質である。パラインフルエンザのような種々のウイルスでは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼタンパク質がいくつかの抗原部位を含むことがわかっている。その結果として、このタンパク質は感染後の体液性免疫応答の標的になる可能性がある。したがって、HNの抗原部位を外来タンパク質の一部で置き換えると、この外来ペプチドに対して強力な体液性応答が生ずるかもしれない。ある配列がHN分子内に挿入されて、それがHNの外表面に発現されるならば、それは免疫原性があると考えられる。例えば、HNタンパク質の抗原部位をHIVのgp160由来のペプチドと置き換えると、gp160とHNタンパク質の両方の体液性免疫応答が引き出されるだろう。別の方法では、外来ペプチド配列を、いかなるウイルス配列をも欠失させることなく、抗原部位に挿入することができる。このような構築物の発現産物は外来抗原に対するワクチンとして有用であり、また、以前に論じられた問題、すなわちワクチンを接種した宿主での組換えウイルスの繁殖の問題を実際に回避しうる。抗原部位にのみ置換を有するインタクトなHN分子は、HN機能を果たすことができ、それゆえに生存能のあるウイルスの構築を可能にする。したがって、このウイルスは追加のヘルパー機能を必要とすることなく増殖することが可能である。また、このウイルスは、不慮の事故による伝播の危険性を避けるために他の方法で弱毒化することもできる。
【０１６５】
その他のハイブリッド構築は、細胞表面にタンパク質が発現するように、またはタンパク質が細胞から遊離するように行なうことができる。表面糖タンパク質として、HNは、細胞表面への輸送に必要なアミノ末端の切断可能なシグナル配列と、膜への固着に必要なカルボキシ末端配列を有する。細胞表面にインタクトな外来タンパク質を発現させるためには、これらのHNシグナルを使用してハイブリッドタンパク質を作製することが必要である。この場合には、この融合タンパク質を追加の内部プロモーターから別個の融合タンパク質として発現させることができる。あるいはまた、輸送シグナルだけが存在して、膜固着ドメインが存在しない場合は、このタンパク質を細胞外に分泌させることができる。
【０１６６】
5.1.5.  2シストロンRNAの構築
2シストロン性mRNAは、ウイルス配列の翻訳の内部開始が可能になるように、また通常の末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現が可能になるように、構築することができる。あるいはまた、2シストロン性mRNA配列は、ウイルス配列が通常の末端オープンリーディングフレームから翻訳されるがその一方で外来配列が内部部位から開始されるように、構築することができる。ある特定の内部リボソームエントリー部位(IRES)配列を利用することができる。選択されるIRES配列は、パラインフルエンザパッケージング制限が妨げられないように、十分短いものにすべきである。したがって、そのような2シストロン的手法を目的として選択されるIRESは、その長さが500ヌクレオチド以下であることが好ましく、250ヌクレオチ未満が理想的な長さである。特定の実施形態では、IRESはピコルナウイルス由来のものであり、いかなる追加のピコルナウイルス配列も含まない。好適なIRESエレメントには、哺乳動物BiP IRESとC型肝炎ウイルスIRESが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６７】
あるいはまた、外来タンパク質を新しい内部転写単位から発現させることができ、この転写単位は開始部位およびポリアデニル化部位を有する。別の実施形態では、得られる発現タンパク質が融合タンパク質になるように、外来遺伝子をPIV遺伝子に挿入する。
【０１６８】
5.2.  組換えcDNAおよびRNA鋳型を使用した異種遺伝子産物の発現
上述のように調製された組換え鋳型は、適切な宿主細胞において異種遺伝子産物を発現させるために、または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作製するために、様々な方法で使用することができる。一実施形態では、組換えcDNAを使用して適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、その結果生じるRNAは異種遺伝子産物の高レベルでの発現を指令することができる。高レベルの発現をもたらす宿主細胞系は、PIVに重感染した細胞系、PIV機能を補完するように遺伝子操作された細胞系など、ウイルス機能を提供する連続した細胞系を含む。
【０１６９】
本発明の代替の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を実現するために、組換え鋳型を使用してウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系にトランスフェクトすることができる。このためには、Lタンパク質などのポリメラーゼタンパク質を発現する形質転換された細胞系が適切な宿主細胞として利用される。宿主細胞は、同様に、その他のウイルス機能またはHN、NPまたはNなどの追加の機能を与えるように遺伝子操作することもできる。
【０１７０】
別の実施形態では、異種遺伝子産物の発現を実現するために、ヘルパーウイルスが細胞によって利用されるRNAポリメラーゼタンパク質を提供することができる。さらに別の実施形態では、細胞に、NまたはNP、P、M2-1およびLタンパク質などのウイルスタンパク質をコードするベクターをトランスフェクトすることができる。
【０１７１】
異種遺伝子産物の発現を検出するために、様々な技法を用いることができる（例えば、Flintら, Principles Of Virology, Molecular Biology, Pathogenesis, And Control, 2000, ASM Press pp 25-56を参照のこと；その全内容を参照により本明細書に組み入れる）。代表的なアッセイでは、ウイルスに感染した細胞をメタノールまたはアセトンで透過性にして、異種遺伝子産物に対する抗体と共にインキュベートする。次いで第1の抗体を認識する第2の抗体を添加する。この第2の抗体は通常指示薬に結合されており、その結果として異種遺伝子産物の発現を可視化または検出することができる。
【０１７２】
5.3.  組換えウイルス粒子のレスキュー
キメラウイルスを調製するために、プラスまたはマイナスセンスでPIVゲノムおよび/または外来タンパク質をコードする改変されたcDNA、ウイルスRNA、またはRNAを使用して、複製およびレスキューに必要なウイルスタンパク質および機能をもたらす細胞にトランスフェクトすることができる。あるいはまた、PIVゲノムおよび/または外来タンパク質をコードするDNAまたはRNA分子によるトランスフェクションの前、間、または後に、細胞にヘルパーウイルスをトランスフェクトすることができる。合成組換えプラスミドPIV DNAおよびRNAは、以下の特許または特許出願に記載されているような、当技術分野で知られている数多くの技法によって、感染性ウイルス粒子に複製またはレスキューすることができる：1992年11月24日発行の米国特許第5,166,057号; 1998年12月29日発行の米国特許第5,854,037号; 1996年2月20日公開の欧州特許公開EP0702085A1; 米国特許出願第09/152,845号; 1997年4月3日公開の国際特許公開PCT WO97/12032; 1996年11月7日公開のWO96/34625; 欧州特許公開EP-A780475; 1999年1月21日公開のWO 99/02657; 1998年11月26日公開のWO 98/53078; 1998年1月22日公開WO 98/02530; 1999年4月1日公開のWO 99/15672; 1998年4月2日公開のWO 98/13501; 1997年2月20日公開のWO 97/06270; および1997年6月25日公開のEPO 780 47SA1（その全体を参照により本明細書に組み入れる）。
【０１７３】
本発明の一実施形態では、ウイルスポリメラーゼによる認識に不可欠でありかつ成熟したウイルス粒子の生成に必要とされるパッケージングシグナルに不可欠な、ネガティブ鎖ウイルスRNAの非コード領域を含有する合成組換えウイルスRNAを調製することができる。逆遺伝学的手法を適用してネガティブ鎖RNAウイルスをレスキューするのに使用することが可能な、いくつかの異なる手法が存在する。まず、組換えRNAを組換えDNA鋳型から合成し、精製ウイルスポリメラーゼ複合体を用いてin vitroで再構成し、それによって、細胞へのトランスフェクションに使用することができる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。別の手法では、in vitroまたはin vivoでの合成RNAの転写中にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションが可能である。この手法によれば、合成RNAをcDNAプラスミドから転写することができるが、これは、ポリメラーゼタンパク質をコードするcDNAプラスミドと共にin vitroで同時転写されるか、またはポリメラーゼタンパク質の存在下にin vivoで、すなわちポリメラーゼタンパク質を一過性にまたは構成的に発現する細胞内で、転写されるかのいずれかである。
【０１７４】
本明細書で述べる追加の手法では、感染性のキメラウイルスの作製は、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系内(例えば、ウイルス/宿主細胞発現系内；ポリメラーゼタンパク質を発現するように遺伝子操作された形質転換細胞系など)で複製され、したがって感染性のキメラウイルスがレスキューされる。この場合には、ヘルパーウイルスを利用する必要がない。なぜなら、この機能は、発現されたウイルスポリメラーゼタンパク質によって提供されるからである。
【０１７５】
本発明によれば、当業者に公知の技法を使用して、組換えおよびキメラウイルスの複製およびレスキューを達成することができる。ある手法では、宿主細胞にトランスフェクトする前にin vitroでの複製に必要なウイルスタンパク質およびウイルス機能を提供することを伴う。そのような実施形態では、ウイルスタンパク質を、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、精製ウイルスタンパク質、または組換えにより発現されるウイルスタンパク質の形で提供することができる。ウイルスタンパク質は、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写前、転写の間、または転写後に提供することができる。宿主細胞にトランスフェクトするには、混合物全体を使用することができる。別の手法では、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルスの機能を、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写前、または転写の間に提供することができる。そのような実施形態では、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルスの機能は、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイルス抽出物、ウイルスタンパク質を発現する合成cDNAまたはRNAの形で提供され、これらが感染またはトランスフェクションによって宿主細胞内に導入される。この感染/トランスフェクションは、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAを導入する前、または導入と同時に行なわれる。
【０１７６】
特に望ましい手法では、本発明の組換えまたはキメラウイルスの全てのウイルス遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞は、所望の遺伝子型を含有する感染性のキメラウイルスの産生をもたらし、したがって選択系を必要としない。理論上、PIVの構造タンパク質をコードする6つの遺伝子のいずれか1つ、またはそのような6つの遺伝子のいずれか1つの一部を、外来配列と置き換えることができる。しかし、このような状況で必要な部分は、欠損ウイルス(正常なウイルス遺伝子産物が失われているかまたは変化しているので欠損である)を増殖させる能力である。この問題を回避するため、いくつかの可能な手法を利用することができる。ある手法では、突然変異タンパク質を有するウイルスを、同じタンパク質の野生型を構成的に発現するように構築された細胞系内で増殖させることができる。この方法により、細胞系は当該ウイルス内の突然変異を補完する。同様の技法を使用して、PIV遺伝子のいずれかを構成的に発現する形質転換細胞系を作製することができる。ウイルスタンパク質を発現するように作製されたこれらの細胞系を使用して、組換えウイルスの欠損を補完し、これによりそれを増殖させることができる。あるいはまた、ある特定の天然の宿主域系を利用して、組換えウイルスを増殖させることができる。
【０１７７】
さらに別の実施形態では、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルスの機能は、合成cDNAまたはRNAの形の遺伝物質として提供することができ、その結果、それらはキメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAと共転写されるようになる。特に望ましい手法では、キメラウイルスおよびウイルスポリメラーゼおよび/またはその他のウイルス機能を発現するプラスミドが、宿主細胞内に同時トランスフェクトされる。例えば、野生型または改変型のいずれかのゲノムまたはアンチゲノムPIV RNAをコードするプラスミドを、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質NPまたはN、P、M2-1もしくはLをコードするプラスミドと共に宿主細胞内に同時トランスフェクトすることができる。あるいはまた、キメラb/h PIV3ウイルスのレスキューは、T7 RNAポリメラーゼをコードする改変型ワクシニアウイルスAnkara(MVA)の使用、またはポリメラーゼタンパク質(N、P、およびL)をコードするプラスミドとMVAの組合せの使用によって達成することができる。例えば、MVA-T7またはFowl Pox-T7を、Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF 1043(HEL)細胞、tMK細胞、LLC-MK2、HUT 292、FRHL-2(アカゲザル)、FCL-1(ミドリザル)、WI-38(ヒト)、MRC-5(ヒト)細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、およびCEF細胞に感染させることができる。MVA-T7またはFowl Pox-T7を感染させた後、完全長アンチゲノムb/h PIV3 cDNAを、NP、P、M2-1およびLをコードする発現プラスミドと共にHeLaまたはVero細胞にトランスフェクトすることができる。あるいはまた、ポリメラーゼをプラスミドのトランスフェクションによって提供してもよい。その後、細胞および細胞上清を回収し、1回の凍結融解サイクルにかける。次いで得られた細胞溶解産物を使用して、ワクシニアウイルスの複製阻害剤である1-β-D-アラビノフラノシルシトシン(ara C)の存在下で新しいHeLaまたはVero細胞の単層に感染させ、それによってウイルスストックを得ることができる。次いでこれらのプレートからの上清および細胞を回収し、一度凍結融解して、bPIV3ウイルス粒子の存在を、P
IV3特異的抗血清を使用するウイルスプラークの免疫染色によって検出することができる。
【０１７８】
組換えウイルスを増殖させる別の手法は、野生型ウイルスと共培養することを伴う。これは、単に組換えウイルスを取得して、このウイルスと別の野生型ウイルスを細胞に共感染させることにより行われる。野生型ウイルスは、欠損ウイルス遺伝子産物を補完して、野生型ウイルスと組換えウイルスの両方の増殖を可能にするだろう。あるいはまた、ヘルパーウイルスを使用して、組換えウイルスの増殖を助けてもよい。
【０１７９】
別の手法では、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する組換えウイルスを共感染させた細胞内で、合成鋳型を複製することができる。実際に、この方法を使用して、本発明による組換え感染性ウイルスをレスキューすることができる。このために、ウイルス発現ベクター(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど)またはポリメラーゼタンパク質を発現する細胞系(例えばKrystalら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709-2713参照)を含むがこれらに限定されない、任意の発現ベクター/宿主細胞系内で、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現させることができる。さらに、6種全てのPIVタンパク質を発現する宿主細胞への感染は、感染性キメラウイルス粒子の作製をもたらす。ウイルスの生存能力を変化させることなく、組換えウイルスを構築することが可能であることに留意すべきである。次いで、これらの変化したウイルスは増殖能力を持ち、複製するのにヘルパー機能を必要としないと考えられる。
【０１８０】
ある実施形態においては、活発で高収率性の細胞培養（例えば、本発明のウイルスワクチン候補を製造するのに有益であると考えられる）を得ることを目的として、ウイルスの増殖条件を最適化することができる。重要なパラメーターを確認し、まず、小規模実験で生産プロセスを最適化してスケーラビリティ、頑健性、および再現性を調べ（この最適化プロセスの例はセクション36に提示される）、その後ウイルスの大規模生産に適合させることができる。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスがPIVである。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスが組換えまたはキメラPIVである。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスが以下のウイルス科のひとつに属するウイルスである： Adenoviridae、Arenaviridae、Astroviridae、Baculoviridae、Bunyaviridae、Caliciviridae、Caulimovirus、Coronaviridae、Cystoviridae、Filoviridae、Flaviviridae、Hepadnaviridae、Herpesviridae、Hypoviridae、Idaeovirus、Inoviridae、Iridoviridae、Leviviridae、Lipothrixviridae、Luteovirus、Machlomovirus、Marafivirus、Microviridae、Myoviridae、Necrovirus、Nodaviridae、Orthomyxoviridae、Papovaviridae、Paramyxoviridae、Partitiviridae、Parvoviridae、Phycodnaviridae、Picornaviridae、Plasmaviridae、Podoviridae、Polydnaviridae、Potyviridae、Poxviridae、Reoviridae、Retroviridae、Rhabdoviridae、Sequiviridae、Siphoviridae、Sobemovirus、Tectiviridae、Tenuivirus、Tetraviridae、Tobamovirus、Tobravirus、Togaviridae、Tombusviridae、Totiviridae、Trichovirus、Mononegavirales。ある実施形態では、本発明の方法を用いて増殖されるウイルスがRNAウイルスである。ある実施形態では、ウイルスがヘルペスウイルス科（Herpesviridae）のウイルスではない。ある実施形態では、ウイルスがHSVではない。
【０１８１】
ある実施形態においては、対象のウイルスまたはウイルス構築物を感染させた細胞培養物を、細胞培養のための標準的なインキュベーション温度より低い感染後インキュベーション温度でインキュベートする。特定の実施形態では、対象のウイルス構築物を感染させた細胞培養物を33℃または約33℃（例えば、33±1℃）でインキュベートする。特定の実施形態では、感染後インキュベーション温度を約25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、または37℃とする。
【０１８２】
ある実施形態においては、ウイルスを増やすために、ウイルスを感染させる前の細胞を細胞増殖に最適な温度でインキュベートし、その細胞にウイルスを感染させた後、すなわち感染後に、温度をより低い温度に変える。ある実施形態では、温度変化が少なくとも1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、または少なくとも12℃である。ある実施形態では、温度変化が多くても1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、または多くても12℃である。特定の実施形態では、温度変化が4℃である。
【０１８３】
ある実施形態においては、対象のウイルスまたはウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地で培養し、ウイルスまたはウイルス構築物を感染させた後では細胞を無血清培地で培養する。感染細胞を血清の不在下で増殖させることについてのより詳細な説明は、「無血清培地でのウイルスのプラスミドのみの再生」と題するセクションを参照されたい。特定の実施形態では、血清はウシ胎児血清であり、培養物体積の5％、培養物体積の2％、または培養物体積の0.5％の濃度で存在する。
【０１８４】
ある実施形態においては、ウイルスを増やすために、ウイルスを感染させた細胞を血清の不在下でインキュベートする。ある実施形態では、ウイルスを増やすために、ウイルスを感染させた細胞を、5％未満の血清、2.5％未満の血清、1％未満の血清、0.1％未満の血清、0.01％未満の血清、または0.001％未満の血清を含む培地でインキュベートする。
【０１８５】
ある実施形態においては、ウイルスを感染させる前に細胞を血清含有培地でインキュベートする。ある実施形態では、細胞にウイルスを感染させた後で、その細胞を血清の不在下でインキュベートする。他の実施形態では、最初に、細胞を血清含有培地でインキュベートしてから、その細胞を無血清培地に移し、続いてその細胞にウイルスを感染させて、血清の不在下でさらにインキュベートする。
【０１８６】
ある実施形態においては、細胞から血清含有培地を取り出し、血清を含まない培地を添加することによって、細胞を血清含有培地から血清不含培地に移す。他の実施形態では、細胞を遠心分離して、血清含有培地を取り出し、血清不含培地を加える。ある実施形態では、細胞を血清不含培地で洗浄して、ウイルスに一度感染した細胞が確実に血清の不在下でインキュベートされるようにする。ある、より具体的な実施形態では、細胞を血清不含培地で少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、または少なくとも10回洗浄する。
【０１８７】
さらに他の実施形態において、ウイルスまたはウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で細胞増殖に最適な温度にて培養し、対象のウイルス構築物を感染させた後では（対応するウイルスまたはウイルスベクターの標準的なインキュベーション温度と比べて）より低い温度で細胞培養物をインキュベートする。具体的な実施形態では、対象のウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で37℃にて細胞を培養し、その細胞培養物を、対象のウイルス構築物を感染させた後には33℃または約33℃（例えば、33±1℃）でインキュベートする。
【０１８８】
さらに他の実施形態において、ウイルスまたはウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で細胞増殖に最適な温度にて培養し、その細胞培養物を、対象のウイルス構築物を感染させた後では（対応するウイルスまたはウイルスベクターの標準的なインキュベーション温度と比べて）より低い温度で血清の不在下にインキュベートする。具体的な実施形態では、対象のウイルス構築物を感染させる前には細胞を血清含有培地中で37℃にて細胞を培養し、その細胞培養物を、対象のウイルス構築物を感染させた後には33℃または約33℃（例えば、33±1℃）で血清の不在下にインキュベートする。
【０１８９】
本発明のウイルス構築物および方法は、商業上のウイルス生産のために、例えばワクチンの製造のために使用することができる。商業上のワクチン製造の場合、ワクチンは、不活化ウイルスまたはウイルスタンパク質（感染性のウイルスまたはウイルス核酸混入物をまったく含まない）のみを含有するか、あるいはまた、有毒なものに復帰しない弱毒化生ワクチンを含有することが好適である。製造中に導入される外因性物質によるワクチンの汚染も回避すべきである。本発明のワクチンの商業上の製造には、ウイルスまたはウイルスタンパク質の大規模生産のための当技術分野で公知の方法を使用することができる。ある実施形態においては、本発明のワクチンの商業上の製造のために、細胞をバイオリアクターまたはファーメンター内で培養する。バイオリアクターは1リットル以下から100リットルを越える容量まで利用可能であり、例えば、Cyto3バイオリアクター(Osmonics, Minnetonka, MN); NBSバイオリアクター(New Brunswick Scientific, Edison, N.J.); およびB. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)製の実験室用および商業スケールのバイオリアクターなどがある。別の実施形態では、ウイルスの商業生産の前に、小規模工程最適化実験（例えば、実施例31（セクション36）を参照）を行い、最適化された条件をウイルスの商業生産のために選択して使用する。
【０１９０】
本発明の特定の実施形態では、ウイルスをヘルパーウイルスの不在下で再生することができる。さらに特定すると、ウイルスゲノムをコードするプラスミドと、複製およびレスキューに必要なウイルスタンパク質をコードするプラスミドとを細胞に導入することによって、ウイルスを再生することが可能である。ある実施形態では、細胞を無血清培地で増殖させて、その培地に維持する。ある実施形態では、プラスミドをエレクトロポレーションによって細胞に導入する。具体的な実施形態では、T7プロモーターの制御下でウイルスのアンチゲノムcDNAをコードするプラスミド、T7 RNAポリメラーゼをコードするプラスミド、ならびにそれぞれT7プロモーターの制御下でNタンパク質、Pタンパク質およびLタンパク質をコードするプラスミドをエレクトロポレーションによってSF Vero細胞に導入する。Vero細胞をATCCから入手して、以下のステップ（Mike Berry's研究所によって開発された）に従って無血清培地で増殖するように適合させた。
【０１９１】
1. T-25フラスコP121に入れたDMEM + 5%v/v FBS中でATCC CCL-81バイアルを解凍する; 
2. DMEM + 5%v/v FBS P126中で5回継代して増やす; 
3. FBS増殖細胞をT-225フラスコ中のOptiPRO (Invitrogen Corporation)に直接移す; 
4. OptiPRO中で7回継代して増やす; 
5. 継代133-7でプレ-マスター細胞バンクストックを凍結させる; 
6. OptiPRO中で4回継代して増やす; 
7. 継代137でマスター細胞バンクストックを凍結させる; 
8. OptiPRO中で4回継代して増やす; 
9. 継代141でワーキング細胞バンクストックを凍結させる; 
10. エレクトロポレーションおよびウイルス増幅のために解凍して増やす。
【０１９２】
ウイルス粒子のレスキュー法については、このセクションにおいて上述されている。 
特定の実施形態において、ウイルスレスキューのために用いる細胞は、動物またはヒト由来の成分を添加しないで増殖および/または維持することができる細胞である。ある実施形態では、ウイルスレスキューのために用いる細胞は、血清を用いない増殖に適応している細胞である。具体的な実施形態では、SF Vero細胞をウイルスのレスキューに用いる。特定の実施形態では、4mM L-グルタミンを補充したOptiPRO SFM (Invitrogen Corporation)中で細胞を増殖させ、および/または維持する。特定の実施形態では、血清を補充した培地で細胞を増殖させるが、ウイルス粒子のレスキューのため細胞を無血清培地に移す。具体的な実施形態では、細胞を無血清培地で洗浄して、ウイルスのレスキューが血清フリーの環境で確実に起こるようにする。
【０１９３】
プラスミドは、細胞に対して使用しうる当業者に公知の方法で細胞に導入されるが、かかる方法として、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在トランスフェクションがある（Short Protocols in Molecular Biology, Ausubelら(編集), John Wiley & Sons, Inc., 1999、第9章を参照のこと）。具体的な実施形態では、エレクトロポレーションを用いてプラスミドDNAを細胞に導入する。SF Vero細胞はリポフェクション抵抗性である。必要なプラスミドでトランスフェクトされた細胞を選択するために、プラスミドは特定のマーカーを担持しうる。そのようなマーカーとしては、限定するものではないが、ある種の抗生物質（例えば、カナマイシン、ブラスチシジン、アンピシリン、ハイグロマイシンB、ピューロマイシンおよびゼオシン）に対する耐性、ある種の独立栄養特性を細胞（マーカーの不在下ではこの特性を失っている）に賦与するマーカーなどが含まれ、あるいはまた、細胞の増殖にとつて必要であるがプラスミドが導入される細胞においては突然変異を起こしている遺伝子をマーカーとしてもよい。
【０１９４】
ウイルスゲノムおよび/またはウイルス遺伝子の転写は、プロモーターの転写制御下におく。かくして、ウイルスゲノムまたはウイルスタンパク質をコードする配列は、プロモーター配列と機能的に連結させる。当業者に公知のプロモーター/RNAポリメラーゼ系はどれも本発明の方法において使用することができる。ある実施形態では、プロモーターは細胞に対して内因性のRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーターであり、例えばRNAポリメラーゼI (Pol I)またはRNAポリメラーゼII (Pol II)などの細胞性DNA依存性RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列であってよい。ある実施形態では、プロモーターが誘導性のプロモーターでありうる。ある実施形態では、細胞に対して内在性でないRNAポリメラーゼによる転写を可能にするプロモーターとすることができる。ある具体的な実施形態では、プロモーターがT3プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、またはCMVプロモーターである。用いるプロモーターのタイプに応じて、そのプロモーターを認識するRNAポリメラーゼをコードするプラスミドも細胞に導入して、適切なRNAポリメラーゼを供給する。具体的な実施形態では、RNAポリメラーゼをがT3 RNAポリメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、またはCMV RNAポリメラーゼである。具体的な実施形態では、ウイルス遺伝子とウイルスゲノムがT7プロモーターの制御下で転写され、T7 RNAポリメラーゼを与えるためにT7 RNAポリメラーゼをコードするプラスミドが導入される。ポリメラーゼの転写は、用いる細胞型内で機能するのであれば、どのようなプロモーターの制御下にあってもよい。具体的な実施形態では、CMVプロモーターを使用する。
【０１９５】
ウイルスゲノムはプラスまたはマイナス方向でありうる。したがって、ウイルスゲノムは遺伝物質から転写されて、ウイルスゲノムのポジティブセンスコピー（アンチゲノムコピー）またはウイルスゲノムのネガティブセンスコピー（ゲノムコピー）のいずれかをもたらすことができる。ある実施形態では、ウイルスゲノムが本発明の組換え、キメラおよび/または弱毒化ウイルスである。ある実施形態において、ウイルスゲノムがヘキサマーの長さのものである場合、ウイルスの複製およびレスキューの効率が増大されうる。ウイルスゲノムが確実に適切な長さとなるように、リボザイム配列、例えばデルタ肝炎ウイルス(HDV)リボザイム配列、ハンマーヘッド型リボザイム配列、またはリボザイム触媒活性を保持するその断片を用いて5'または3'末端を規定することができる。
【０１９６】
ある実施形態において、複製およびレスキューに必要とされるウイルスタンパク質にはN、PおよびL遺伝子が含まれる。より具体的な実施形態では、複製およびレスキューに必要とされるウイルスタンパク質にはN、P、M2-1およびL遺伝子が含まれる。
【０１９７】
5.4.  組換えウイルスの弱毒化
本発明の組換えウイルスはさらに、弱毒表現型を示すように遺伝子操作することができる。特に本発明の組換えウイルスは、ウイルスがワクチンとして投与される被験者において弱毒表現型を示す。弱毒化は、当業者に知られている任意の方法によって実現することができる。理論に拘束されるものではないが、組換えウイルスの弱毒表現型は、例えば以下のようにして引き起こすことができる。すにわち、意図される宿主内では自然な状態で十分に複製されないウイルスを使用する(例えばヒトにおけるウシPIV3を使用する)か、または、野生型のウイルス株に比べ、ウイルスゲノムの複製を減少させるか、ウイルスが宿主細胞に感染する能力を低下させるか、ウイルスタンパク質が感染性ウイルス粒子へと構成される能力を低下させる。リーダー配列やトレーラー配列など、ウイルスの特定配列の生存能をミニゲノムアッセイにより試験してもよい(セクション5.5.1参照)。
【０１９８】
本発明の組換えウイルスの弱毒表現型は、当業者に公知の任意の方法によって試験することができる(例えばセクション5.5参照)。候補ウイルスは、例えば、それが宿主に感染する能力について、または細胞培養系での複製速度について試験される。ある実施形態では、変化した遺伝子がN、P、L、M2またはこれらの組合せである場合、ミニゲノム系を使用して弱毒化ウイルスを試験する。ある実施形態では、種々の温度での増殖曲線を使用して、ウイルスの弱毒表現型について試験する。例えば弱毒化ウイルスは35℃で増殖することができるが、39℃または40℃では増殖することができない。ある実施形態では、種々の細胞系を使用して、ウイルスの弱毒表現型を評価することができる。例えば弱毒化ウイルスはサル細胞系でのみ増殖して、ヒト細胞系では増殖することができないか、または様々な細胞系で達成されるウイルス力価が弱毒化ウイルスごとに異なっている。ある実施形態では、ハムスター、コットンラット、マウス、およびモルモットを含むがこれらに限定されない小動物モデルの気道におけるウイルス複製が、ウイルスの弱毒表現型を評価するのに使用される。その他の実施形態では、抗体力価(例えばプラーク減少中和アッセイまたはELISAによってアッセイされる)を含むがこれに限定されない、ウイルスによって誘発される免疫応答が、ウイルスの弱毒表現型を評価するのに使用される。具体的な実施形態では、プラーク減少中和アッセイまたはELISAを低用量で実施する。ある実施形態では、組換えウイルスが動物モデルにおいて病理学的症状を誘発させる能力について試験することができる。動物モデルでウイルスが病理学的症状を誘発させる能力の低下は、弱毒表現型であることを示している。特定の実施形態では、候補ウイルスが、粘液産生によって示される鼻感染について、サルのモデルで試験される。
【０１９９】
本発明のウイルスは、ウイルスの1つ以上の機能的特徴が損なわれるように弱毒化される。ある実施形態では、弱毒化は、弱毒化ウイルスが得られる野生型のウイルス株と比較して測定される。他の実施形態では、弱毒化は、異なる宿主系での弱毒化ウイルスの増殖を比較することによって決定される。したがって、非限定的な例として、ヒト宿主におけるウシPIV3の増殖がウシ宿主におけるウシPIV3の増殖に比べて減少している場合、そのウシPIV3はヒト宿主で増殖させたとき弱毒化されていると言える。
【０２００】
ある実施形態においては、本発明の弱毒化ウイルスは宿主に感染することができ、感染性ウイルス粒子が産生されるように宿主内で複製することができる。しかし野生型の株と比較すると、弱毒化した株はより低い力価へと増殖するか、またはよりゆっくりと増殖する。弱毒化ウイルスの増殖曲線を決定し、それを野生型ウイルスの増殖曲線と比較するには、当業者に公知の任意の技法を使用することができる。代表的な方法については、以下の実施例セクションを参照されたい。特定の実施形態では、弱毒化ウイルスは、記載されるような条件下で、Vero細胞内で105pfu/ml未満、104pfu/ml未満、103pfu/ml未満、または102pfu/ml未満の力価にまで増殖する。
【０２０１】
ある実施形態では、本発明の弱毒化ウイルス(例えばキメラPIV3)はヒト細胞内で複製することができないが、野生型ウイルス(例えば野生型PIV3)は複製することができる。しかし弱毒化ウイルスは、Vero細胞のようなインターフェロン機能を欠いている細胞系内では十分に複製することができる。
【０２０２】
その他の実施形態においては、本発明の弱毒化ウイルスは、宿主に感染することができ、宿主内で複製することができ、本発明のウイルスのタンパク質を細胞質膜に挿入することができるが、この弱毒化ウイルスは、宿主に新たな感染性ウイルス粒子を産生させることができない。ある実施形態では、弱毒化ウイルスは、野生型哺乳動物ウイルスと同じ効率で、宿主に感染し、宿主内で複製し、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入することができる。その他の実施形態では、弱毒化ウイルスがウイルスタンパク質を宿主細胞内の細胞質膜に挿入する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。ある実施形態では、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主内で複製する能力は、野生型ウイルスに比べて低下している。当業者に知られる任意の技法を使用して、ウイルスが哺乳動物細胞に感染できるかどうか、宿主内で複製できるかどうか、ウイルスタンパク質を宿主の細胞質膜に挿入できるかどうかを調べることができる。例示的な方法に関してはセクション5.5を参照されたい。
【０２０３】
ある実施形態においては、本発明の弱毒化ウイルスは宿主に感染することができる。しかし野生型PIVとは対照的に、弱毒化PIVは宿主内で複製することができない。特定の実施形態では、弱毒化ウイルスは宿主に感染することができ、その宿主によってウイルスタンパク質をその細胞質膜に挿入することができるが、弱毒化ウイルスは宿主内で複製する能力がない。弱毒化ウイルスが宿主に感染したかどうか、さらにその宿主によってウイルスタンパク質がその細胞質膜に挿入されたかどうか、当業者に知られている任意の方法を使用して試験することができる。
【０２０４】
ある実施形態においては、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主に感染する能力は、同じ宿主に野生型ウイルスが感染する能力に比べて低下している。当業者に知られている任意の技法を使用して、ウイルスが宿主に感染可能かどうかを調べることができる。例示的な方法に関してはセクション5.5を参照されたい。
【０２０５】
ある実施形態では、突然変異(例えばミスセンス突然変異)をウイルスゲノムに導入して、弱毒化表現型を持つウイルスを作製する。突然変異(例えばミスセンス突然変異)は、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子に導入することができる。突然変異は、付加、置換、欠失、またはこれらの組合せでありうる。特定の実施形態では、N、P、L、またはM2タンパク質に対して単一アミノ酸欠失変異を導入し、これを、ミニゲノムアッセイ系で機能性に関してスクリーニングして、ウイルス内で予測される機能性に関して評価することができる。より具体的な実施形態では、ミスセンス突然変異は低温感受性突然変異である。その他の実施形態では、ミスセンス突然変異は熱感受性突然変異である。一実施形態では、ウイルスのPタンパク質の主なリン酸化部位が除去される。別の実施形態では、1つまたは複数の突然変異がウイルスのL遺伝子に導入されると、温度感受性株が生じる。さらに別の実施形態では、F遺伝子の切断部位が、切断が生じないようにまたは切断が非常に低い頻度で生じるように突然変異される。
【０２０６】
その他の実施形態では、組換えウイルスのゲノムに欠失を導入する。さらに具体的な実施形態では、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子に欠失を導入することができる。特定の実施形態では、欠失は、本発明の組換えウイルスのM2遺伝子にある。その他の具体的な実施形態では、欠失は、本発明の組換えウイルスのSH遺伝子にある。さらに別の具体的な実施形態では、M2遺伝子とSH遺伝子の両方が欠失している。
【０２０７】
ある実施形態では、組換えウイルスの遺伝子間領域が変化している。一実施形態では、遺伝子間領域の長さが変化している。代表的な例に関してはセクション5.1.2.を参照されたい。別の実施形態では、遺伝子間領域がウイルスゲノムの5'末端から3'末端へシャッフルされる。
【０２０８】
その他の実施形態では、組換えウイルスの1つまたは複数の遺伝子のゲノム位置が変化している。一実施形態では、FまたはG遺伝子がゲノムの3'末端に移動している。別の実施形態では、N遺伝子がゲノムの5'末端に移動している。
【０２０９】
ある実施形態では、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスの遺伝子を異なる種のウイルスの遺伝子と置き換えることによって実現される。例示的な実施形態では、bPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子を、それぞれhPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子と置き換える。その他の例示的な実施形態では、hPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子を、それぞれbPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子と置き換える。好ましい実施形態では、ウイルスの弱毒化は、1つまたは複数のポリメラーゼ関連遺伝子(例えばN、P、L、またはM2)を異なる種のウイルスの遺伝子と置き換えることで実現される。
【０２１０】
ある実施形態においては、ウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスのタンパク質の1つまたは複数の特定のドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質に由来のドメインと置き換えることによって実現される。例示的な実施形態では、bPIV3のFタンパク質の細胞外ドメインを、メタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメインと置き換える。好ましい実施形態では、L、N、またはPタンパク質の1つまたは複数の特定ドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質に由来のドメインと置き換える。別の例示的な実施形態では、Fタンパク質の膜貫通ドメインを欠失させて、可溶性のFタンパク質が発現されるようにする。
【０２１１】
本発明のある実施形態では、本発明の組換えウイルスのリーダー配列および/またはトレーラー配列を修飾することによって、弱毒化表現型を実現することができる。より具体的な実施形態では、リーダーおよび/またはトレーラー配列の長さを、野生型ウイルスよりも少なくとも1ヌクレオチド、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、または少なくとも6ヌクレオチドだけ短くする。その他のより具体的な実施形態では、組換えウイルスのリーダーおよび/またはトレーラーの配列を突然変異させる。特定の実施形態では、リーダー配列とトレーラー配列は、互いに100％相補的である。その他の実施形態では、1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、または10ヌクレオチドは互いに相補的ではなく、リーダーおよびトレーラー配列の残りのヌクレオチドは互いに相補的である。ある実施形態では、非相補的ヌクレオチドが互いに同一である。その他のある実施形態では、非相補的ヌクレオチドが互いに異なっている。その他の実施形態では、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがプリンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。その他の実施形態では、トレーラー内の非相補的ヌクレオチドがピリミジンである場合、リーダー配列内の対応するヌクレオチドもプリンである。
【０２１２】
弱毒化生ワクチンを使用する場合は、その安全性についても考慮しなければならない。ワクチンは疾患を引き起こしてはならない。本発明では、ワクチンを安全なものにすることができる当技術分野で知られている任意の技法を使用することができる。弱毒化技法に加えて、その他の技法を使用することができる。1つの非限定的な例は、ビリオン膜に組み込むことができない可溶性の異種遺伝子を使用することである。例えば、膜貫通ドメインとサイトゾルドメインを欠いているRSV遺伝子の変異型である、可溶性RSV F遺伝子の単一コピーを使用することができる。それはビリオン膜に組み込まれないので、ウイルスの向性(tropism)が変化するとは予想されない。
【０２１３】
ワクチンの安全性について試験をするには、様々なアッセイを使用することができる。以下のセクション5.5.を参照されたい。特に、ショ糖密度勾配アッセイと中和アッセイを使用することができる。異種タンパク質がウイルス粒子に挿入されるかどうかを決定するには、ショ糖密度勾配アッセイを使用することができる。異種タンパク質がビリオンに挿入される場合、そのビリオンは、たとえ親株が症状を引き起こさない場合であっても、症状を引き起こすその能力について試験すべきである。理論に拘束されるものではないが、異種タンパク質がビリオンに組み込まれる場合には、そのウイルスは新しい（おそらくは病理学的な）性質を獲得している可能性がある。
【０２１４】
5.5.  キメラウイルスのウイルス力価、抗原性配列の発現、免疫原性およびその他の特徴の測定
細胞培養系、動物モデル系、または被験者におけるキメラまたは組換えウイルスの増殖速度を測定するために、本発明に従っていくつかのアッセイを用いることができる。ビリオンの感染、複製、またはパッケージングを実現するのに要するキメラおよび組換えウイルスの要件を決定するためにも、本発明に従っていくつかのアッセイを用いることができる。
【０２１５】
本明細書で述べるアッセイは、経時的にウイルス力価をアッセイしてウイルスの増殖特性を決定するのに使用することができる。特定の実施形態では、ウイルス力価を測定するにあたって、感染した細胞または感染した被験者からサンプルを取得し、そのサンプルの連続希釈液を調製し、単一のプラークを出現させるウイルスの希釈度でウイルスに感染しやすい細胞の単層に感染させる。次いでこのプラークをカウントし、ウイルス力価を、サンプル1ミリリットル当たりのプラーク形成単位として表す。本発明の特定の実施形態では、被験者における本発明のウイルスの増殖速度は、被験者内のウイルスに対する抗体の力価によって評価される。理論によって拘束されるものではないが、被験者の抗体力価は、被験者におけるウイルス力価だけでなく抗原性をも反映している。ウイルスの抗原性が一定である場合、被験者内での抗体力価の増加を使用して、被験者におけるウイルスの増殖曲線を求めることができる。好ましい実施形態において、動物またはヒトにおけるウイルスの増殖速度を最良に試験するには、感染後の複数の時点で宿主の生物学的液体をサンプリングして、ウイルス力価を測定する。
【０２１６】
細胞培養系または被験者での異種遺伝子配列の発現は、当業者に公知の技法によって確認することができる。ある実施形態では、異種遺伝子の発現を、転写物のレベルを定量することにより測定する。転写物のレベルは、転写物に特異的なプローブまたはプライマーをそれぞれ使用するノーザンブロット分析またはRT-PCRによって、測定することができる。ウイルスはアンチセンス方向にあり、一方、転写物はセンス方向にあるので、転写物はウイルスのゲノムと区別することができる。ある実施形態では、異種遺伝子の発現を、異種遺伝子のタンパク質産物のレベルを定量することによって測定する。タンパク質のレベルは、タンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット分析によって、測定することができる。
【０２１７】
特定の実施形態では、異種遺伝子にペプチドタグを付ける。ペプチドタグは、このペプチドタグに対する抗体を使用して検出することができる。検出されたペプチドタグのレベルは、異種遺伝子から発現されたタンパク質のレベルを表している。あるいはまた、異種遺伝子から発現されたタンパク質をペプチドダグによって単離することができる。精製したタンパク質の量は、異種遺伝子の発現レベルと相関している。そのようなペプチドタグと、そのようなペプチドタグに融合されたタンパク質の単離方法は、当技術分野で周知である。異種遺伝子の修飾には、以下に挙げるような当技術分野で公知の様々なペプチドタグを使用することができる：例えば、免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列(Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, Current Protocols in Molecular Biology, 第1〜3巻(1994-1998)、Ausubel, F.M., Brent, R., Kunston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., および Struhl, K.編, John Wiley and Sons, Inc., USA, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience発行)、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229)、大腸菌マルトース結合タンパク質(Guanら, 1987, Gene 67:21-30)、様々なセルロース結合ドメイン(米国特許第5,496,934号; 第5,202,247号; 第5,137,819号; Tommeら, 1994, Protein Eng. 7:117-123)、およびFLAGエピトープ(Short Protocols in Molecuar Biology, 1999, Ausubelら編, John Wiley & Sons, Inc., Unit 10.11)などであるが、これらに限定されない。その他のエピトープタグは、特異的な結合パートナーによって認識されるものであり、それゆえ、結合パートナー（好ましくは固定化されかつ/または固相支持体上にある）への親和性結合による単離を容易にする。当業者に理解されるように、上記ペプチドダグのコード領域を得るために、DNAクローニング、DNA増幅、および合成方法を含むがこれらに限定されることのない数多くの方法を使用することができる。いくつかのペプチドタグおよびそれらを検出し単離するための試薬は市販されている。
【０２１８】
被験者由来のサンプルは、当業者に知られている任意の方法によって得ることができる。ある実施形態では、サンプルは、鼻吸引液、咽頭スワブ、痰、または気管支肺胞洗浄液からなる。
【０２１９】
5.5.1.  ミニゲノム構築物
ミニレプリコン構築物は、アンチセンスレポーター遺伝子を含有するように作製することができる。当業者に公知のレポーター遺伝子はどれも本発明で使用することができる。特定の実施形態では、レポーター遺伝子がCATである。ある実施形態では、レポーター遺伝子は、肝炎デルタリボザイム(Hep-d Ribo)およびT7ポリメラーゼ終結(T-T7)シグナルに連結されたネガティブセンスbPIVまたはhPIVリーダーと、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの後に続くbPIVまたはhPIVトレーラー配列によって挟まれていてもよい。
【０２２０】
ある実施形態では、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。宿主細胞は、T7 RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM2.1遺伝子を発現する。ある実施形態では、T7 RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM2.1遺伝子をコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする。その他の実施形態では、ミニレプリコンをコードするプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし、その宿主細胞にヘルパーウイルスを感染させる。
【０２２１】
レポーター遺伝子の発現レベルおよび/またはその活性は、セクション5.5.6に記載される方法などであるがこれらに限定されない、当業者に公知の方法によってアッセイすることができる。
【０２２２】
より具体的なある実施形態では、ミニレプリコンは以下のエレメントを、列挙した順番で含む：T7 RNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼI、リーダー配列、遺伝子開始点、GFP、トレーラー配列、肝炎デルタリボザイム配列またはRNAポリメラーゼI終結配列。T7をRNAポリメラーゼとして使用する場合は、肝炎デルタリボザイム配列を終結配列として使用すべきである。RNAポリメラーゼIを使用する場合は、RNAポリメラーゼI終結配列を終結シグナルとして使用することができる。レスキュー系に応じて、ミニレプリコンの配列をセンス方向またはアンチセンス方向にすることができる。ある実施形態では、リーダー配列を本発明のウイルスの野生型リーダー配列に対して変化させることができる。リーダー配列の前には、場合によりACを置いてもよい。T7プロモーター配列は、Gダブレットまたはトリプレットがあってもなくてもよく、このGダブレットまたはトリプレットは転写の増加を与える。
【０２２３】
特定の実施形態では、T0で細胞に本発明のウイルスを感染させる。24時間後、T24で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。T0後48時間およびT0後72時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合(例えばGFP)、レポーター遺伝子の発現はFACSを使用して調べることができる。
【０２２４】
別の実施形態では、細胞に、T=0時間で6個のプラスミドをトランスフェクトする。次いで細胞をT=40時間およびT=60時間で回収し、CATまたはGFP発現に関して分析する。
【０２２５】
別の特定の実施形態では、細胞に、T0でMVA-T7を感染させる。1時間後、T1で、細胞にミニレプリコン構築物をトランスフェクトする。T0後24時間で、細胞に本発明のウイルスを感染させる。T0後72時間で、細胞を、レポーター遺伝子の発現に関して試験する。蛍光レポーター遺伝子産物を使用する場合(例えばGFP)、レポーター遺伝子の発現はFACSを使用して調べることができる。
【０２２６】
5.5.2.  感染率の測定
感染率は、例えば感染の存在についての臨床サンプル(例えば鼻腔スワブ)の検査を含むがこれに限定されない、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。例えば、hMPV、RSV、hPIV、間bPIV/hPIV成分は、抗hMPV抗原抗体、抗RSV抗原抗体、抗hPIV抗原抗体、および/または異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用する免疫蛍光アッセイ(IFA)によってそれぞれ検出することができる。
【０２２７】
ある実施形態では、無傷の細胞を含有するサンプルを直接処理することができるが、無傷の細胞を持たない分離株は、許容細胞系(例えばHEp-2細胞)の上でまず培養すべきである。例示的な実施形態では、培養細胞懸濁液を、例えば室温で300×gの遠心分離に5分間かけ、その後、同じ条件下でPBS、pH7.4(Ca++とMg++を含まず)で洗浄することによって、清澄にする。細胞ペレットを、少量のPBSに再懸濁して分析にかける。無傷の細胞を含有する一次臨床分離株をPBSと混合し、室温で5分間、300×gの遠心分離にかける。粘液を、滅菌ピペットの先端を用いて境界面から除去し、細胞ペレットを同じ条件下でもう一度PBSで洗浄する。次いでペレットを少量のPBSに再懸濁し、分析にかける。アセトン洗浄した12ウェルHTCスーパーキュアガラススライド上の5mmウェル当たり、5〜10マイクロリットルの各細胞懸濁液をスポッティングし、空気乾燥させる。スライドを冷(-20℃)アセトン中で10分間固定する。各ウェルにPBS-1％BSAを添加し、その後室温で10分間インキュベートすることによって、反応を遮断する。スライドをPBS-0.1％Tween-20で3回洗浄し、空気乾燥させる。ブロッキング緩衝液中で250ng/mlに希釈した各一次抗体試薬10マイクロリットルをウェルごとにスポッティングし、反応物を、加湿した37℃の環境下で30分間インキュベートする。次いでスライドを、PBS-0.1％Tween-20を3回交換して十分に洗浄し、空気乾燥させる。ブロッキング緩衝液中で250ng/mlに希釈した適切な二次コンジュゲート抗体試薬10マイクロリットルを各ウェルにスポッティングし、反応物を、加湿した37℃の環境下でさらに30分間インキュベートする。次いでスライドを、PBS-0.1％Tween-20を3回交換して洗浄する。5マイクロリットルのPBS-50％グリセロール-10mM Tris pH8.0-1mM EDTAを各反応ウェルにスポッティングし、スライドにカバーガラスを取り付ける。その後、各反応ウェルを、B-2Aフィルタ(EX 450-490nm)を使用して倍率200×で蛍光顕微鏡法により分析する。陽性反応を、染色していない細胞または二次試薬のみで染色した細胞から得られた自己蛍光バックグラウンドに対して評価する
。RSV陽性反応は、感染細胞の細胞質内にある小封入体で中断された、明るい蛍光により特徴づけられる。
【０２２８】
5.5.3.  血清力価の測定
抗体血清力価は、当技術分野で周知の方法によって測定することができ、例えば、血清サンプル中の抗体または抗体フラグメントの量をサンドイッチELISAで定量することができるが、これに限定されるものではない。簡単に言うと、ELISAは、血清中の抗体または抗体フラグメントを認識する抗体で、マイクロタイタープレートを4℃で一晩被覆することからなる。次いでこのプレートを、室温で約30分間、PBS-Tween-0.5％BSAでブロックする。PBS-BSA-BSA中に希釈した精製済みの抗体または抗体フラグメントを使用して標準曲線を作成し、サンプルをPBS-BSA中に希釈する。サンプルおよび標準品を、アッセイプレートの重複するウェルに加え、室温で約1時間インキュベートする。次に未結合抗体をPBS-TWEENで洗い落とし、結合抗体については、室温で約1時間、標識二次抗体(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG)で処理する。標識に特異的な色素産生基質を添加し、例えば分光光度計によって、基質の代謝回転速度を測定することにより、標識抗体の結合を検出する。血清中の抗体または抗体フラグメントレベルの濃度は、サンプルについての基質の代謝回転速度と標準曲線についての基質の代謝回転速度とを比較することによって決定する。
【０２２９】
5.5.4.  チャレンジ研究
このアッセイを使用して、本発明の組換えウイルスおよび本発明のワクチンが、コットンラット、Syrian Goldenハムスター、およびBalb/cマウスなどを含むがこれらに限定されない動物モデル系での下部気道ウイルス感染を予防できるかどうかを検討する。組換えウイルスおよび/またはワクチンは、静脈内(IV)経路によって、筋肉内(IM)経路によって、または鼻腔内(IN)経路によって投与することができる。組換えウイルスおよび/またはワクチンは、当業者に周知の技法によって投与することができる。このアッセイはまた、抗体の血清濃度を、抗体が結合するウイルスの肺力価の減少に相関させるために使用される。
【０２３０】
0日目に、コットンラット(Sigmodon hispidis、平均体重100g)、カニクイザル(平均体重2.0kg)、およびハムスター（例えばSyrian Goldenハムスター）を含むがこれらに限定されない動物群に、筋肉内注射によって、または静脈内注射によって、または鼻腔内経路によって、問題となっている組換えウイルスもしくはワクチンまたはBSAを接種する。本発明の組換えウイルスまたはワクチンを投与する前に、あるいは投与と同時に、あるいは投与した後に、野生型ウイルス（このウイルスに対してワクチンが生成された）を動物に感染させる。ある実施形態では、本発明の組換えウイルスおよび/またはワクチンを投与した後、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、または少なくとも4週間経てから、動物に野生型ウイルスを感染させる。好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルスおよび/またはワクチンを投与した後、21日経てから動物に野生型ウイルスを感染させる。別の好ましい実施形態では、本発明の組換えウイルスおよび/またはワクチンを投与した後、28日経てから動物に野生型ウイルスを感染させる。
【０２３１】
感染後、動物を犠牲にし、その鼻甲介組織および/または肺組織を採取し、プラークアッセイおよびTCID50アッセイなどの適切なアッセイによってウイルス力価を測定する。ウシ血清アルブミン(BSA)10mg/kgを陰性対照として使用する。チャレンジ時の血清中の抗体濃度をサンドイッチELISAを使用して測定することができる。
【０２３２】
5.5.5.  臨床試験
in vitroアッセイおよび動物モデルで試験した本発明のワクチンまたはそのフラグメントは、さらに、あらゆる年齢層を含む健常なヒトボランティア群において、安全性、許容性、免疫原性、感染性、および薬物動態について調べることができる。好ましい実施形態では、健常なヒトボランティアは約6週以上の乳児、子供および成人である。これらのボランティアに、鼻腔内、筋肉内、静脈内経路で、または肺送達系によって、1回用量の本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与する。年齢が6〜60ヵ月の血清陰性の子供では複数回用量の本発明のウイルスおよび/またはワクチンが必要になるかもしれない。また、誕生後最初の6ヵ月では、局所および全身の免疫を刺激しかつ母親由来の抗体による中和を避けるために、複数回用量の本発明のウイルスおよび/またはワクチンが必要になるかもしれない。好ましい実施形態では、2、4および6ヵ月齢で一次投薬を行い、2才の初めに追加免疫を行なう。本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンは単独で投与してもよいし、対応する年齢で推奨される小児用ワクチンと同時に投与してもよい。
【０２３３】
好ましい実施形態では、二重盲検ランダム化、プラセボ対照臨床試験を使用する。特定の実施形態では、コンピュータ作成ランダム化スケジュールを採用する。例えば、試験に参加している各被験者を１つの単位として登録し、独自のケース番号を割り当てる。１家族に含まれる複数の被験者は登録目的のために個体として取り扱う。親/保護者、被験者、および研究者は、試験期間中、被験者がどの処置群に割り当てられたかを知らされていない。血清学的およびウイルス学的試験は、処置群の割り当てを知らされていない研究室の職員によって行なうこととする。しかしながら、ウイルス学研究室の職員は、ワクチン接種後に得られた鼻洗浄液からのワクチンウイルスの分離によって、おそらくワクチン接種者を識別できると予想される。血清学的試験とウイルス学的試験の職員は分離されており、血清学的試験群には培養結果のいかなる情報も入らないようにする。
【０２３４】
好ましくは、本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与する前、少なくとも12時間にわたり各ボランティアをモニターし、また、臨床サイトでその用量を受け取った後少なくとも15分間は各ボランティアをモニターする。その後は、投与後1〜14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日目に外来患者として各ボランティアをモニターする。好ましい実施形態では、それぞれのワクチン接種後最初の1月間は外来患者としてボランティアをモニターする。ワクチンに関係した重大な有害事象はすべて、全試験期間を通して記録される。重大な有害事象は、以下のような事象として定義される：1)死に至る、2)ただちに生命を脅かす、3)永久的なまたは重症の身体障害をもたらす、4)入院するようになるか、またはすでに入院している患者の入院を長引かせる、5)先天性の異常をもたらす、6)癌である、または、7)研究中のワクチンの過剰投与の結果である。ワクチンとは無関係の重大な有害事象は、最初のワクチン接種日（0日目）に開始して、最後のワクチン接種後30日間続けて記録する。ワクチンとは無関係の重大な有害事象については、最後のワクチン接種につづく30日の記録期間後、5〜8ヶ月間は記録されないだろう。子供が投薬後にワクチンに関係した重大な有害事象を示す場合には、ワクチン/プラセボを投与しないようにする。ワクチンに関係するとは考えられないものの、関心がもてる有害事象については、別の用量を投与する決定がなされる前に、臨床試験従事者と医療従事者によって論議されるだろう。
【０２３５】
血液サンプルは、留置カテーテルまたは直接静脈穿刺（例えば、先端が赤い10ml Vacutainerチューブ（採血管）を使用）により、以下の間隔で採血する。すなわち、(1)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与する前、(2)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与している間、(3)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与してから5分、10分、15分、20分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間、および48時間後、(4)本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与してから3日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日後に採血する。特定の実施形態では、全部で5回の採血（それぞれ3〜5ml）を行なうが、それぞれ初回、3回目および追加免疫の直前、ワクチンまたはプラセボの3回目および追加免疫を行なってから約1ヶ月後である。サンプルを室温で凝固させ、遠心分離後に血清を回収する。
【０２３６】
本発明のウイルスに対する株特異的血清赤血球凝集阻害(HAI)抗体レベルについて血清を試験する。IgG、IgA、または中和抗体のような他の免疫原性の指標も試験する。同時に投与した1種以上の他のワクチンの血清抗体応答を測定してもよい。患者由来のサンプル中の、本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンに対して生成された抗体の量は、ELISAによって定量することができる。PBMC中、および肺と鼻の洗浄液中のT細胞免疫性(細胞傷害性およびヘルパー応答)もモニターすることができる。
【０２３７】
ボランティアの血清中の抗体レベルの濃度は、本発明の組換えウイルスおよび/または本発明のワクチンを投与した後それぞれの採血間隔での血清レベルから、投与前の血清レベル(バックグラウンドレベル)を差し引くことによって、補正する。各ボランティアごとに、補正された血清抗体または抗体フラグメント濃度から、モデル非依存型手法(Gibaldiら編, 1982, Pharmacokinetics, 第2版, Marcel Dekker, New York)に従って薬物動態パラメータを算出する。
【０２３８】
ワクチン/プラセボをそれぞれ投与してから約2、3、4、5、6、7または8日後に得られた鼻腔洗浄液を培養して、本発明のワクチンウイルスの消失を検出することができよう。好ましい実施形態では、ワクチン/プラセボをそれぞれ投与してから7日後に得られた鼻腔洗浄液を培養する。さらに、試験のいずれかの時点で、鼻咽頭スワブ、喉スワブ、または鼻腔洗浄液を使用して、発熱性疾患（直腸温度が102°F以上）および/またはクループ、細気管支炎、または肺炎に罹っているボランティアに他のウイルスが存在するかを調べる。サンプルはドライアイスで冷やしながら指定された研究サイトに輸送する。本発明のワクチンウイルスの分離および定量のためのアッセイ、ならびに本発明のワクチンウイルスを同定するためのMAbを用いる免疫染色アッセイが用いられる（このようなアッセイの例は以下の実施例セクションに示す）。鼻腔洗浄液検体を、他のウイルスや免疫応答（IgG、IgA、および中和抗体を含む）について試験することができる。
【０２３９】
5.5.6. レポーター遺伝子
特定の実施形態では、組織培養物または動物モデルにおけるレポーター遺伝子発現を測定するためのアッセイが、本発明の方法とともに使用され得る。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列はbPIV、hPIV、またはb/hPIV3などのウイルスにクローニングされ、そこでの（i）レポーター遺伝子の位置は変化し、（ii）レポーター遺伝子に隣接している遺伝子間領域の長さは様々である。レポーター遺伝子の最適な発現率およびレポーター遺伝子を含むウイルスの最適な複製率を決定するために、様々な組み合わせが検査される。
【０２４０】
特定の実施形態では、レポーター遺伝子を含むようにミニゲノム構築物が作製される。ミニゲノム構築物の構築はセクション5.5.1.に記載される。
【０２４１】
レポーター遺伝子産物の存在量は、当業者にとって既知の任意の技術によって測定され得る。このような技術は、それぞれレポーター遺伝子に特異的なプローブもしくは抗体を用いたノーザンブロット分析またはウェスタンブロット分析を含むが、それらに限定されない。
【０２４２】
特定の実施形態では、レポーター遺伝子はFACSで検出され得る蛍光シグナルを発する。FACSはレポーター遺伝子を発現する細胞を検出するために使用され得る。
【０２４３】
本発明の特定の態様を実施するための技術には、他に指示されない限り、当業者のよって通常実施されている、分子生物学、微生物学、ならびに組換えDNA操作および作製の従来の技術を用いる（例えば、Sambrook, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第二版; DNA Cloning, IおよびII巻（Glover編1985）; ならびにTranscription and Translation（HamesおよびHiggins編1984）を参照されたい）。
【０２４４】
レポーター遺伝子産物の生化学的活性は、レポーター遺伝子の発現レベルを表す。レポーター遺伝子活性の総レベルはまた、本発明の組換えウイルスの複製速度に依存する。従って、組換えウイルス由来のレポーター遺伝子の真の発現レベルを測定するために、総発現レベルを細胞培養物または動物モデルにおける組換えウイルスの力価で割るべきである。
【０２４５】
本発明の方法とともに使用され得るレポーター遺伝子は、下記の表４に記載される遺伝子を含むが、それらに限定されない。
【表４】
2011167197.tif 000006
【０２４６】
レポーター遺伝子の存在量は、特に、ウェスタンブロット分析もしくはノーザンブロット分析、またはヌクレオチド配列の転写の定量化、そのmRNA、そのタンパク質の存在量の定量化のために用いられる他の任意の技術によって測定され得る（Short Protocols in Molecular Biology, Ausubelら（編）、Jolm Wiley & Sons, Inc., 第四版, 1999を参照されたい）。特定の実施形態では、レポーター遺伝子産物の活性が、組換えウイルス由来のレポーター遺伝子発現の読取値として測定される。レポーター遺伝子産物の活性の定量化のために、レポーター遺伝子産物の生化学的特性を調べることができる（表１参照）。レポーター遺伝子産物の生化学的活性を測定する方法は、当業者によく知られている。本発明の方法とともに使用され得る例示的なレポーター遺伝子の更に詳細な記述を以下に示す。
【０２４７】
ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼは酸素および基質（ルシフェリン）の存在下で光を発する酵素であり、細胞培養物、個々の細胞、生物全体、およびトランスジェニック生物における遺伝子発現のリアルタイム低光量イメージングに使用されている（GreerおよびSzalay, 2002, Luminescence 17(1) : 43-74に概説される）。
【０２４８】
本明細書において用いられる「ルシフェラーゼ」という用語は、すべてのルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼから派生したルシフェラーゼ活性を有する組換え酵素を包含するものである。ホタル由来の、例えばPhotinus種およびLuciola種由来のルシフェラーゼ遺伝子はよく特徴づけられている（例えば、Photinus pyralisについては国際特許公開番号WO95/25798、Luciola cruciataおよびLuciola lateralisについては欧州特許出願番号EP 0 524 448、ならびにLuciola mingrelicaについてはDevineら、1993, Biochim. Biophys. Acta 1173 (2):121-132を参照されたい）。他の真核生物のルシフェラーゼ遺伝子は、ウミシイタケ（Renilla reniformis, 例えば、Lorenzら、1991, Proc Natl Acad Sci USA 88 (10): 4438-4442参照）およびツチボタル（Lampyris noctiluca, 例えばSula-Newbyら、1996, Biochem J. 313: 761-767参照）を含むが、それらに限定されない。細菌のルシフェリン・ルシフェラーゼ系は、陸生Photorhabdus luminescens（例えば、Manukhovら、2000, Genetika 36 (3): 322-30参照）ならびに海洋細菌Vibrio fischeriおよびVibrio harveyi（例えば、それぞれMiyamotoら、1988, J Biol Chem. 263 (26): 13393-9、およびCohnら、1983, Proc Natl Acad Sci USA., 80(1) : 120-3参照）の細菌性lux遺伝子を含むが、それらに限定されない。本発明に含まれるルシフェラーゼはまた、Squirrellらの米国特許第6,265,177号に記載される突然変異ルシフェラーゼを含み、それは参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４９】
緑色蛍光タンパク質
緑色蛍光タンパク質（「GFP」）は、蛍光を発するために更なる基質または補因子を必要としない発色団の形成に関与するアミノ酸65〜67を含む238アミノ酸のタンパク質である（例えば、Prasherら、1992, Gene 111: 229-233; Yangら、1996, Nature Biotechnol. 14: 1252-1256; およびCodyら、1993, Biochemistry 32:1212-1218を参照されたい）。
【０２５０】
本明細書において用いられる「緑色蛍光タンパク質」もしくは「GFP」という用語は、（緑色以外の色を呈する様々なGFPを含む）すべてのGFP、またはGFPから派生したGFP活性を有する組換え酵素を包含するものである。天然のGFPの遺伝子は、生物発光クラゲAequorea victoriaからクローニングされた（例えば、Morinら、1972, J.Cell Physiol. 77: 313-318を参照されたい）。野生型GFPは、395 nmでの主要な励起ピークおよび470 nmでの小さな励起ピークを有する。470 nmでの吸収ピークは、標準的なフルオレセインイソチオシアネート（FITC）フィルターセットを用いたGFPレベルのモニタリングを可能にする。発現を向上させるため、ならびに励起および蛍光発光を改変するために有用な、GFP遺伝子の突然変異体が見いだされている。例えば、65位にセリンの代わりにアラニン、グリシン、イソロイシン、またはトレオニンを有する突然変異GFPは、最大励起のシフトを伴い、488 nmで励起した場合、野生型タンパク質より大きい蛍光発光を有する突然変異GFPを生じる（例えば、Heimら、1995, Nature 373:663-664）; 米国特許第5,625,048号; Delagrave ら、1995, Biotechnology 13:151-154; Cormackら、1996, Gene 173:33-38; および Cramerら、1996, Nature Biotechnol. 14:315-319を参照されたい）。GFPを488 nmで励起する能力は、標準的な蛍光活性化セルソーティング（「FACS」）装置によるGFPの使用を可能にする。別の実施形態では、GFPは、限定はされないがウミシイタケRenilla reriformisなどのクラゲ以外の生物から単離される。
【０２５１】
EGFPは、野生型GFP（3-5）の赤色にシフトした変異型であり、より明るい蛍光発光および哺乳動物細胞におけるより高い発現のために最適化されている（最大励起= 488 nm; 最大発光= 507 nm）。EGFPは、Phe-64 からLeuおよびSer-65 からThrへの二重アミノ酸置換を含むGFPmut1変異型をコードする。EGFP遺伝子のコード配列は、ヒトのコドン使用頻度の選好性に対応した190以上のサイレント塩基変化を有する。
【０２５２】
βガラクトシダーゼ
βガラクトシダーゼ（「β-gal」）は、ラクトースを含むβ-ガラクトシド、ならびにガラクトシド類似体o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（「ONPG」）およびクロロフェノールレッド-β-D-ガラクトピラノシド（「CPRG」）の加水分解を触媒する酵素である（例えば、Nielsenら、1983 Proc Natl Acad Sci USA80 (17): 5198-5202; Eusticeら、1991, Biotechniques 11: 739-742; およびHendersonら、1986, Clin. Chem. 32: 1637-1641を参照されたい）。そのタンパク質産物は非常に安定であり、細胞溶解液中でのタンパク質分解に耐性があり、容易にアッセイされるので、β-gal遺伝子はレポーター遺伝子としてよく機能する。基質としてONPGを用いる場合、β-gal活性は分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて定量され得る。
【０２５３】
本明細書において用いられる「βガラクトシダーゼ」もしくは「β-gal」という用語は、lacZ遺伝子産物を含むすべてのβ-gal、またはβ-galから派生したβ-gal活性を有する組換え酵素を包含するものである。そのタンパク質産物は非常に安定であり、細胞溶解液中でのタンパク質分解に耐性があり、容易にアッセイされるので、β-gal遺伝子はレポーター遺伝子としてよく機能する。ONPGがその基質である実施形態では、β-gal活性は分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて定量でき、変換されたONPGの量を420 nmで測定する。CPRGがその基質である実施形態では、β-gal活性は分光光度計またはマイクロプレートリーダーを用いて定量でき、変換されたCPRGの量を570〜595 nmで測定する。
【０２５４】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
哺乳動物細胞は検出可能なレベルのCAT活性を持たないため、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）は哺乳動物細胞系におけるレポーター遺伝子として一般に使用される。CATのためのアッセイは、細胞抽出物を放射性標識したクロラムフェニコールおよび適切な補因子とともにインキュベートすること、例えば薄層クロマトグラフィー（「TLC」）によって出発物質を生成物から分離すること、続いてシンチレーション計測を行うことを含む（例えば、参照により本明細書に完全に組み入れられる、米国特許第5,726,041号を参照されたい）。
【０２５５】
本明細書において用いられる「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」もしくは「CAT」という用語は、すべてのCAT、またはCATから派生したCAT活性を有する組換え酵素を包含するものである。レポーター系は、細胞の処理、放射性同位体、およびクロマトグラフ分離を必要とせず、ハイスループットスクリーニングにより適していることが好ましいが、レポーター遺伝子としてのCATは、レポーター遺伝子の安定性が重要である状況において好ましいと思われる。例えば、CATレポータータンパク質はin vivoにおいて約50時間の半減期を持ち、結果の動的な変化に比べて結果の蓄積が望ましい場合に有利である。
【０２５６】
分泌型アルカリホスファターゼ
分泌型アルカリホスファターゼ（「SEAP」）酵素は、アルカリホスファターゼのトランケート型であり、そのタンパク質の膜貫通ドメインの切断が、細胞から周囲の培地中へのその分泌を可能にする。
【０２５７】
本明細書において用いられる「分泌型アルカリホスファターゼ」もしくは「SEAP」という用語は、すべてのSEAP、またはSEAPから派生したアルカリホスファターゼ活性を有する組換え酵素を包含するものである。SEAP活性は、蛍光基質の触媒反応の測定、免疫沈降、HPLC、および放射分析検出を含むがそれらに限定されない様々な方法によって検出され得る。発光法は、その感度の増加のために熱量検出法より好まれる。SEAPを使用することの利点は、SEAPタンパク質が細胞外に分泌されるため、細胞溶解のステップを必要とせず、サンプリングおよびアッセイ法の自動化を容易にすることである。C型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害剤の細胞に基づいた評価において使用するためのSEAPを用いた細胞系アッセイは、Pottsらの米国特許第6,280,940号に記載され、それは参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５８】
5.5.7. 細胞培養系、孵化卵、および動物モデル
当技術分野において既知の細胞培養系は、本発明のウイルスを増殖させるため、または本発明のウイルスの活性を検査するために使用され得る（例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられるFlintら、PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp25-29を参照されたい）。このような細胞培養系の例は、動物組織から調製される初代培養細胞（例えば、サルの腎臓、ヒト胎児の羊膜、腎臓、および包皮、ならびにニワトリまたはマウスの胚に由来する細胞培養物）; 単一の種類の均質集団から成り、死ぬ前に最大100回まで分裂できる２倍体細胞株（例えば、ヒト胎児の肺に由来するWI-38株のような、ヒト胎児に由来する細胞培養物）; ならびに培養液中で無限に増殖できる単一の細胞型から成る連続継代細胞系（例えば、HEp-2細胞、Hela細胞、Vero細胞、Lおよび3T3細胞、ならびにBHK-21細胞）を含むが、それらに限定されない。
【０２５９】
本発明のウイルスはまた、ニワトリの孵化卵でも増殖され得る。受精後5〜14日目に、殻に穴を開けて、ウイルスをその複製に適した部位に注入する。
【０２６０】
例えば、本発明のワクチンの有効性および安全性を決定するなどの、様々な目的を達成するために、当技術分野において既知の任意の動物モデルが本発明に使用され得る。このような動物モデルの例は、コットンラット（Sigmodon hispidis）、ハムスター、マウス、サル、およびチンパンジーを含むがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、Syrian Goldenハムスターが用いられる。
【０２６１】
5.5.8. 中和アッセイ
中和アッセイは、異種表面糖タンパク質がビリオンに取り込まれ、ウイルストロピズム表現型の変化を引き起こしうるかどうかという重要な安全性の問題に対処するために実施され得る。本明細書において用いられる場合、「トロピズム」という用語は、特定の細胞型に対するウイルスの親和性を表す。トロピズムは通常、ウイルスがその特定の細胞型のみに侵入することを可能にする、特定の細胞上の細胞受容体の存在によって決定される。中和アッセイは、異種表面糖タンパク質（非限定的な例はネガティブ鎖RNAウイルスのFタンパク質である）のMAbまたは異種表面糖タンパク質に対する抗体を含むポリクローナル抗血清のいずれかを用いることによって行われる。本発明のキメラウイルスが中和され得るかどうかを調べるために、抗体の様々な希釈が検査される。異種表面糖タンパク質は、抗体結合および中和を引き起こすために十分な量でビリオン表面に存在すべきではない。
【０２６２】
5.5.9. ショ糖密度勾配アッセイ
異種タンパク質がビリオンに取り込まれるかどうかの問題は、生化学的アッセイの使用によって更に研究され得る。感染細胞溶解液は20〜60％ショ糖密度勾配で分画することができ、様々な画分が回収され、異種タンパク質およびベクタータンパク質の存在ならびに分布についてウェスタンブロットにより分析される。その画分およびウイルスタンパク質はまた、プラークアッセイによってピークウイルス力価についてもアッセイされ得る。ショ糖密度勾配アッセイの実施例は、下記のセクション23に示される。異種タンパク質がビリオンに付随している場合、それらはビリオンとともに移動するであろう。
【０２６３】
5.6. キメラウイルスを用いたワクチン製剤
本発明は、本発明の組換えネガティブ鎖RNAウイルスを含むワクチン製剤を包含する。本発明の組換えPIVウイルスは、任意の様々な病原体に対する防御応答を誘導する外来エピトープを発現するためのビヒクルとして使用されうる。特定の実施形態では、本発明は、hPIV感染に対する防御を賦与するためのワクチン製剤における、改変された組換えbPIVウイルスまたは弱毒化hPIVの使用を包含する。
【０２６４】
本発明のワクチン製剤は、二価および三価のワクチン製剤を含む多価ワクチンを含む。本発明の二価および三価のワクチンは、それぞれの異種抗原配列を発現する１つのPIVベクターの形で、またはそれぞれ異なる異種抗原配列をコードする２つ以上のPIVベクターの形で投与されうる。例えば、１つ以上の異種抗原配列を発現する第一のキメラPIVは、１つ以上の異種抗原配列を発現する第二のキメラPIVとともに投与でき、そこでの第二のキメラPIVの異種抗原配列は、第一のキメラPIVの異種抗原配列とは異なる。第一および第二のキメラPIVの異種抗原配列は、同一のウイルスに由来し得るが異なるタンパク質をコードするか、または異なるウイルスに由来する。好ましい実施形態では、第一のキメラPIVの異種抗原配列は呼吸器多核体ウイルスに由来し、第二のキメラPIVの異種抗原配列はヒト・メタニューモウイルスに由来する。別の好ましい実施形態では、第一のキメラPIVの異種抗原配列は呼吸器多核体ウイルスに由来し、第二のキメラPIVの異種抗原配列はトリ・ニューモウイルスに由来する。
【０２６５】
特定の好ましい実施形態では、本発明のワクチン製剤は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、および哺乳動物メタニューモウイルス（例えばヒト・メタニューモウイルス）を含むがそれらに限定されないネガティブ鎖RNAウイルスによる感染を防御するために使用される。より具体的には、本発明のワクチン製剤は、ヒト・メタニューモウイルスおよび/またはトリ・ニューモウイルスによる感染を防御するために使用される。特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、（a）ヒト・メタニューモウイルスおよび呼吸器多核体ウイルス; ならびに/または（b）トリ・ニューモウイルスおよび呼吸器多核体ウイルスによる感染を防御するために使用される。
【０２６６】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の核酸によってコードされるタンパク質性分子またはメタニューモウイルス特異的なウイルスタンパク質もしくはその機能的断片を提供する。有用なタンパク質性分子は、例えば、本発明のウイルスから誘導できる任意の遺伝子またはゲノム断片に由来する。特に有用なものは、抗原もしくはサブユニット免疫原として含有させるためのF、SHおよび/またはGタンパク質あるいはその抗原性断片であるが、不活化された全ウイルスもまた使用しうる。特に有用なものはまた、系統発生分析のために同定される組換え核酸断片によってコードされるタンパク質性物質であり、当然、in vivo（例えば予防目的のため、もしくは診断用抗体を提供するために）であろうとin vitro（例えばファージディスプレイ法もしくは合成抗体を作製するために有用な別の技術による）であろうと、特にMPV特異的抗体またはT細胞応答を誘導するための、系統発生分析において有用なORFの好ましい外延内にあるものは好適である。
【０２６７】
本発明のウイルス、核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、抗原および/または抗体を含む医薬組成物は、例えば個体に本発明の医薬組成物を与えることを含む、MPV感染および/または呼吸器疾患の治療あるいは予防のための方法に使用され得る。これは、前記個体がヒトである場合、特に前記ヒトが5歳未満である場合に最も有用であるが、このような幼児および小児は本明細書に記載されるようなヒトMPVに感染する可能性が最も高いからである。通常、急性期では、患者は上部気道症状を患い、他の呼吸器疾患および他の疾患に罹りやすくなる。下部気道疾患も生じる可能性があり、更に他の重篤な症状に罹りやすくなる。本発明の組成物は、癌患者、移植レシピエントおよび高齢者を含む免疫不全個体の治療のために使用することができる。
【０２６８】
本発明はまた、本発明のウイルスを含む細胞培養物または実験動物を樹立すること、前記培養物または動物を抗ウイルス薬候補で処理すること、および前記薬剤が前記ウイルスに及ぼす効果または前記培養物もしくは動物へのその感染に及ぼす効果を測定することを含む、気道疾患の治療に有用な抗ウイルス薬を得るための方法を提供する。本発明はまた、医薬組成物の調製、特に、MPV感染または関連疾患に起因する場合、特に気道疾患の治療のための医薬組成物の調製のための本発明の抗ウイルス薬の使用を提供し、ならびにMPV感染もしくは呼吸器疾患の治療または予防のための方法に有用な、本発明の抗ウイルス薬を含む医薬組成物を提供し、前記方法は個体にこのような医薬組成物を与えることを含む。
【０２６９】
本発明の特定の実施形態では、本発明のワクチンは哺乳動物メタニューモウイルスを含む。特定の、より特異的な実施形態では、哺乳動物メタニューモウイルスはヒト・メタニューモウイルスである。好ましい実施形態では、ワクチン製剤に使用される哺乳動物メタニューモウイルスは弱毒化表現型を有する。弱毒化表現型を得るための方法については、セクション5.4を参照されたい。
【０２７０】
本発明は、PIV、RSV、APV、および/またはhMPVによる感染の予防ならびに治療のためのワクチン製剤を提供する。特定の実施形態では、本発明のワクチンは、本発明の組換えおよびキメラウイルスを含む。特定の実施形態では、ウイルスは弱毒化される。
【０２７１】
特定の実施形態では、ワクチンはAPVを含み、そのワクチンはヒトにおけるhMPV感染の予防および治療のために使用される。理論に拘束されるものではないが、hMPVのFタンパク質とAPVのFタンパク質の高度の相同性のために、APVによる感染は、宿主にhMPVと交差反応する抗体の産生を引き起こし、hMPVによる感染および関連疾患から宿主を防御するであろう。
【０２７２】
別の特定の実施形態では、ワクチンはhMPVを含み、ワクチンは限定されないがシチメンチョウなどのトリ類におけるAPV感染の予防および治療のために使用される。理論に拘束されるものではないが、hMPVのFタンパク質とAPVのFタンパク質の高度の相同性のために、hMPVによる感染は、宿主にAPVと交差反応する抗体の産生を引き起こし、APVによる感染および関連疾患から宿主を防御するであろう。
【０２７３】
特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、（a）ヒト・メタニューモウイルスおよびヒト・パラインフルエンザウイルスによる感染; ならびに/または（b）トリ・ニューモウイルスおよびヒト・パラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連疾患から防御するために使用される。
【０２７４】
特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、（a）ヒト・メタニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒト・パラインフルエンザウイルスによる感染; ならびに/または（b）トリ・ニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒト・パラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連疾患から防御するために使用される。
【０２７５】
特定の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、ヒト・メタニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒト・パラインフルエンザウイルスによる感染から防御するために使用される。特定の他の実施形態では、本発明のワクチン製剤は、トリ・ニューモウイルス、呼吸器多核体ウイルスおよびヒト・パラインフルエンザウイルスによる感染、ならびに関連疾患から防御するために使用される。
【０２７６】
異なるウイルス種のFタンパク質間の高度の相同性のために（典型的なアミノ酸配列比較については図１を参照されたい）、本発明のワクチン製剤は、Fタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が得られるウイルスとは異なるウイルスから防御するために使用され得る。特定の例示的な実施形態では、ワクチン製剤は、トリ・ニューモウイルスA型に由来する異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含有し、そのワクチン製剤はトリ・ニューモウイルスA型およびトリ・ニューモウイルスB型による感染から防御するために使用される。別の特定の例示的な実施形態では、ワクチン製剤は、トリ・ニューモウイルスのサブグループCに由来する異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含有し、そのワクチン製剤はトリ・ニューモウイルスのサブグループCおよびトリ・ニューモウイルスのサブグループDによる感染から防御するために使用される。
【０２７７】
本発明は、ヒトおよび動物に投与されるべき、PIV、hMPV、APV（APV CおよびAPV Dを含む）、インフルエンザ、RSV、センダイウイルス、ムンプスウイルス、喉頭気管炎ウイルス、シミアンウイルス5、ヒト・パピローマウイルス、ならびに他のウイルス、病原体および関連疾患から防御するために有用なワクチン製剤を包含する。本発明は更に、ヒトおよび動物に投与されるべき、ヒト・メタニューモウイルス感染、トリ・ニューモウイルス感染、および関連疾患から防御するために有用なワクチン製剤を包含する。
【０２７８】
１つの実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス（FLV）およびイヌ・ジステンパーウイルスを含む家畜の病原体に対して有用なワクチン製剤を包含する。更に別の実施形態では、本発明は、家畜を水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスから防御するため、更にまた、野生動物を狂犬病ウイルスから保護するために有用なワクチン製剤を包含する。
【０２７９】
逆遺伝学的アプローチによって作製された弱毒化ウイルスは、本明細書に記載されるワクチンおよび医薬製剤に使用され得る。逆遺伝学的技法はまた、ワクチン製造のために重要な他のウイルス遺伝子に付加的な突然変異を導入するためにも使用され得る。例えば、5’非コード領域における突然変異はmRNAの翻訳に影響を与えるかもしれず、キャプシドタンパク質における突然変異はウイルスの組み立てに影響を与えると考えられ、温度感受性および寒冷適応突然変異体は、親ウイルスほど病原性が強くないことが多い（例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられる、Flintら、PRINCIPLES OF VIROLOGY, MOLECULAR BIOLOGY, PATHOGENESIS, AND CONTROL, 2000, ASM Press pp670-683を参照されたい）。有用なワクチン変異株のエピトープを弱毒化ウイルス内に遺伝子操作することができる。あるいはまた、他のウイルスまたは非ウイルス病原体に由来する抗原を含めて、完全な外来エピトープを弱毒化ウイルス内に遺伝子操作することもできる。例えば、HIV（gp160、gp120、gp41）のような非関連ウイルスの抗原、寄生虫抗原（例えば、マラリア）、細菌もしくは真菌の抗原、または腫瘍抗原を弱毒化株内に遺伝子操作してもよい。あるいは、in vivoでウイルスの向性を変化させるエピトープを、本発明のキメラ弱毒化株内に遺伝子操作することができる。
【０２８０】
事実上どのような異種遺伝子配列も、ワクチンとして使用するために本発明のキメラウイルスへと構築することができる。好ましくは、生物学的応答改変物質として作用する成分およびペプチドが、ワクチンとして使用するために本発明のキメラウイルス内に構築される。好ましくは、様々な病原体のいずれかに対する防御免疫応答を誘導するエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、キメラウイルスによって、またはキメラウイルスの一部として発現されうる。例えば、本発明のキメラウイルス内に構築され得る異種遺伝子配列は、インフルエンザおよびパラインフルエンザのヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、ならびにヒトPIV 3のHN遺伝子およびF遺伝子などの融合糖タンパク質を含むが、それらに限定されない。更に別の実施形態では、キメラウイルス内に遺伝子操作されうる異種遺伝子配列は、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものを含む。免疫調節タンパク質の例は、サイトカイン、インターフェロン１型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン1、2、4、5、6、12およびそれらの物質のアンタゴニストを含むが、それらに限定されない。
【０２８１】
更に、ワクチンでの使用のために本発明のキメラウイルス内に構築され得る異種遺伝子配列は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、好ましくは1型または2型に由来する配列を含むがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、抗原の起源となりうる免疫原性HIV由来ペプチドが、キメラPIV内に構築され、その後、脊椎動物の免疫応答を誘導するために使用されうる。このようなHIV由来ペプチドは、env遺伝子（すなわち、gpl60、gpl20、および/またはgp41の全体または一部をコードする配列）、pol遺伝子（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および/またはインテグラーゼの全体または一部をコードする配列）、gag遺伝子（すなわち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25の全体または一部をコードする配列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、および/またはvpxに由来する配列を含むが、それらに限定されない。
【０２８２】
他の異種配列は、いくつかを挙げると、B型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）; A型肝炎ウイルスまたはC型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタイン・バーウイルスの糖タンパク質; ヒト・パピローマウイルスの糖タンパク質; 呼吸器多核体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス5またはムンプスウイルスの糖タンパク質; インフルエンザウイルスの糖タンパク質; ヘルペスウイルスの糖タンパク質; ポリオウイルスのVP1; 細菌および寄生虫などの非ウイルス病原体の抗原決定基に由来しうる。別の実施形態では、免疫グロブリン遺伝子の全体または一部が発現されうる。例えば、このようなエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域は、本発明のキメラウイルス内に構築されうる。
【０２８３】
他の異種配列は腫瘍抗原に由来してもよく、その結果生じるキメラウイルスは腫瘍細胞に対する免疫応答を起こすために使用され、in vivoにおいて腫瘍の緩解をもたらす。これらのワクチンは、腫瘍の治療のために、化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植等を含むがそれらに限定されない他の治療計画と併せて使用されうる。本発明に従って、組換えウイルスは、以下のものを含むがそれらに限らない腫瘍関連抗原（TAA）を発現するように操作されうる：T細胞によって認識されるヒト腫瘍抗原（参照により本明細書に完全に組み入れられる、RobbinsおよびKawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8 : 628-636）、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1（gp75）、チロシナーゼを含むメラニン細胞系タンパク質; 腫瘍特異的な広く共有される抗原、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15; 腫瘍特異的な変異型抗原、β-カテニン、MUM-1、CDK4; 乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、および膵臓癌に対する非メラノーマ抗原、HER-2/neu、ヒト・パピローマウイルス-E6、-E7、MUC-1。
【０２８４】
更に他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ヒト・メタニューモウイルスおよび/またはトリ・ニューモウイルスなどのメタニューモウイルスに由来する。更に他の実施形態では、本発明のウイルスは２つの異なる異種ヌクレオチド配列を含み、その１つはヒト・メタニューモウイルスおよび/またはトリ・ニューモウイルスなどのメタニューモウイルスに由来し、他の１つは呼吸器多核体ウイルスに由来する。異種ヌクレオチド配列は、それぞれのウイルスのFタンパク質またはGタンパク質をコードする。特定の実施形態では、異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードし、そのキメラFタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質の細胞外ドメインとパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメインならびに内腔ドメインを有する。
【０２８５】
組換えウイルス生ワクチンまたは組換えウイルス不活化ワクチンのいずれかが処方され得る。生ワクチンは、宿主内での増殖が天然の感染において生じるものと同様の種類および規模の持続した刺激を誘導し、従ってかなり長期性の免疫をもたらすので、好まれる。このような組換えウイルス生ワクチン製剤の製造は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜でのウイルスの増殖とそれに続く精製を含む、従来の方法を用いて達成されうる。別法として、bPIVはヒトにおいて非病原性であることが実証されているので、このウイルスは生ワクチンとしての使用に非常に適している。
【０２８６】
これに関して、ワクチンのための遺伝子操作PIV（ベクター）の使用には、これらの株での弱毒化特性の存在が要求されうる。トランスフェクションに用いられる鋳型内への適切な突然変異（例えば、欠失）の導入は、弱毒化特性を有する新規ウイルスを提供しうる。例えば、温度感受性または寒冷適応に関連する特異的なミスセンス突然変異を行って欠失突然変異としうる。これらの突然変異は、寒冷または温度感受性突然変異体に関連する点突然変異より安定であり、復帰頻度が非常に低いはずである。
【０２８７】
別法として、「自殺」特性を有するキメラウイルスが構築されうる。このようなウイルスは、宿主内でわずか１回または２〜３回の複製しか行わない。ワクチンとして使用される場合、組換えウイルスは限定された複製サイクルを行い、十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主内では更には複製を行わず、疾患を引き起こさないだろう。１つ以上のPIV遺伝子を欠損している組換えウイルスまたは突然変異PIV遺伝子を有する組換えウイルスは、連続的な複製を行うことができないだろう。欠損ウイルスは、このような遺伝子を恒常的に発現する細胞株において産生され得る。必須遺伝子を欠損しているウイルスは、これらの細胞株において複製されるが、ヒト宿主に投与された場合、それらは一連の複製を完了することができないだろう。これらの調製物は、免疫応答を誘導するのに十分な数の遺伝子を（この不完全な周期において）転写し、翻訳しうる。あるいは、これらの調製物が不活化された（死滅した）ウイルスワクチンとして機能するように、大量の株が投与されうる。不活化ワクチンに関しては、遺伝子産物がビリオンに組み込まれるように、異種遺伝子産物はウイルスの構成要素として発現されることが好ましい。このような調製物の利点は、それらが天然のタンパク質を含み、死滅ウイルスワクチンの作製において使用されるホルマリンまたは他の薬剤での処理による不活化を受けていないことである。あるいは、cDNAから作製された突然変異PIVは、わずか２〜３回しか複製しないように、高度に弱毒化されうる。
【０２８８】
特定の実施形態では、本発明のワクチンは弱毒化ウイルスを含む。理論にとらわれないが、弱毒化ウイルスが細胞に新しい感染性ウイルス粒子を生成させることができなかったとしても、ウイルスタンパク質が宿主の細胞膜に挿入され、免疫応答を活性化するので、弱毒化ウイルスはワクチンとして有効であり得る。
【０２８９】
本発明のこの態様の別の実施形態では、不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させる」ための従来の技術を用いて調製されうる。不活化ワクチンは、それらの感染性が破壊されているという意味において「死滅」している。理想的には、ウイルスの感染性はその免疫原性に影響を与えることなく破壊される。不活化ワクチンを調製するために、キメラウイルスは細胞培養物またはニワトリ胚の尿膜で培養され、ゾーン超遠心分離法によって精製され、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンによって不活化され、プールされうる。その結果生じるワクチンは通常、筋肉内に接種される。
【０２９０】
不活化ウイルスは、免疫応答を強化するために適切なアジュバントとともに処方されうる。このようなアジュバントは、例えば水酸化アルミニウムのような無機ゲル; リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質; ペプチド; 油性エマルジョン; ならびにBCG、Corynebacterium parvum、ISCOMS、および人工ウイルス粒子(virosome)などの潜在的に有用なヒトアジュバントを含みうるが、それらに限定されない。
【０２９１】
上述のワクチン製剤を導入するために多数の方法が使用され、これらは経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、鼻腔内および吸入経路を含むがそれらに限定されない。病原体（ワクチンはこれに対して設計される）の天然の感染経路を介して、キメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましいと思われる。
【０２９２】
特定の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物に関する。その免疫原性組成物はキメラPIVを含む。特定の実施形態では、その免疫原性組成物は弱毒化されたキメラPIVを含む。特定の実施形態では、その免疫原性組成物は更に製薬上許容されうる担体を含む。
【０２９３】
本発明のワクチンの有効性および安全性を評価するために、様々な技法が使用されうる。有効なワクチンとは、最小限の副作用で、適切な自然免疫応答、細胞性応答および体液性応答を引き起こすことによって、病原体による疾患からワクチン接種個体を防御するワクチンである。ワクチンは疾患を引き起こしてはならない。ウイルスの複製およびワクチンを接種された被験体の免疫応答を測定できる任意の技術は、ワクチンを評価するために使用されうる。例えば、チャレンジ試験および臨床試験が用いられる（セクション5.5.4および5.5.5を参照されたい）。非限定的な例はまた、下記の実施例セクションにも示される。
【０２９４】
5.6.1. 本発明のワクチンまたは免疫原性製剤の用量計画および投与
本発明は、１つ以上の異種抗原配列または非天然抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチンおよび免疫原性製剤を提供する。本発明のワクチンおよび免疫原性製剤は、一価のワクチンまたは、二価および三価のワクチンを含む多価ワクチンを包含する。本発明のワクチンおよび免疫原性製剤は、様々なウイルス感染に対する防御を提供するのに有用である。特に、本発明のワクチンおよび免疫原性製剤は、宿主に呼吸器感染症に対する防御を提供する。
【０２９５】
本発明の組換えウイルスおよび/またはワクチンもしくは免疫原性製剤は、単独であるいは他のワクチンと組み合わせて投与することができる。好ましくは、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、限定はされないが、呼吸器多核体ウイルスワクチン、インフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、風疹ワクチン、肺炎球菌ワクチン、リケッチアワクチン、ブドウ球菌ワクチン、百日咳ワクチンもしくは気道癌に対するワクチンなどの、気道疾患に対する防御を提供する他のワクチンまたは免疫原性製剤と組み合わせて投与される。好ましい実施形態では、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、対応する年齢で推奨されている小児用ワクチンとともに投与される。例えば、2、4もしくは6ヶ月齢では、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、DtaP（IM）、Hib（IM）、ポリオ（IPVもしくはOPV）およびB型肝炎（IM）とともに投与される。12もしくは15ヶ月齢では、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、Hib（IM）、ポリオ（IPVもしくはOPV）、MMRII（登録商標）（SubQ）; Varivax（登録商標）（SubQ）、およびB型肝炎（IM）とともに投与される。本発明の方法とともに使用され得るワクチンは、例えば、The Jordan Report 2000, Division of Microbiology and Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, United States（その内容は参照により本明細書に完全に組み入れられる）のような様々な出版物に概説される。
【０２９６】
本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、それ自体または医薬組成物もしくは治療用組成物の形で被験体に投与されうる。アジュバントおよび本発明の免疫原性抗原（例えば、ウイルス、キメラウイルス、突然変異ウイルス）を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥方法によって製造されうる。医薬組成物は、従来の方法で、本発明の免疫原性抗原の製薬上使用され得る製剤への加工を容易にする、１つ以上の生理的に許容されうる担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて処方されうる。適切な製剤化は、特に、選択された投与経路に依存する。
【０２９７】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物がアジュバントを含む場合、あるいは１つ以上のアジュバントとともに投与される場合、使用され得るアジュバントは、無機塩アジュバントもしくは無機塩ゲルアジュバント、粒子状アジュバント、微粒子状アジュバント、粘膜アジュバント、および免疫賦活アジュバントを含むがそれらに限定されない。アジュバントの例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、スクアレンまたはスクアラン水中油型アジュバント製剤、生分解性および生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイド配糖体またはサポニン（例えば、商標STIMULON, ISCOPREPとしても販売される、QuilAおよびQS-21）、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン（商標TERMURTIDEとしても販売される、トレオニル-MDP）、LPS、モノホスホリル・リピドA（商標MPL として販売される3D-MLA）を含むがそれらに限定されない。
【０２９８】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物が投与される被験体は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトであるが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよび齧歯類を含むヒト以外の動物であってもよい。
【０２９９】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を導入するために、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経皮、鼻腔内および吸入経路を含むがそれらに限定されず、ならびに乱刺法（例えば、二股針を用いて皮膚の最上層に傷をつけること）による、多数の方法が使用されうる。
【０３００】
局所投与のために、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、当技術分野においてよく知られているような、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液等として処方されうる。
【０３０１】
鼻腔内投与あるいは吸入による投与のために、本発明に従って使用される製剤は、加圧容器または噴霧器から、適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガスを用いて、エアゾールスプレーの形で有利に送達され得る。加圧エアゾールの場合には、投与単位は、計量用のバルブを備えることによって測定されうる。吸入剤または吸入器での使用のためには、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との混合粉末を含む、例えばゼラチンの、カプセルならびにカートリッジが処方されうる。
【０３０２】
注射のために、ワクチンまたは免疫原性製剤は、水溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水バッファーなどの生理的に適合したバッファー中に処方されうる。その溶液は、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの処方剤を含みうる。あるいは、そのタンパク質は、使用前に、例えば滅菌した発熱物質フリーの水のような適切なビヒクルで再調製される粉末状でありうる。
【０３０３】
投与のためのワクチンまたは免疫原性製剤の有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示を踏まえた場合、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３０４】
有効な用量は、最初はin vitroアッセイから評価される。例えば、用量は、動物モデルにおいて免疫応答の誘導を達成するように、当技術分野においてよく知られている技術を用いて、処方され得る。当業者は、本明細書に記載される結果に基づいて、すべての動物種に対して投与を容易に最適化することができるであろう。投与量および投与間隔は個々に調整されうる。例えば、免疫原性組成物として使用される場合、適切な用量は、上述のように投与される場合、抗体応答を誘導することができる組成物の量である。ワクチンとして使用される場合、本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、1〜36週間の期間に約1〜3回投与されうる。好ましくは、約2週間から約4ヶ月の間隔で、1または2回分が投与され、その後周期的に、追加ワクチン接種が与えられる。代わりの方法が、個々の動物に適しているかもしれない。適切な用量は、上述のように投与された場合、免疫された動物に、その動物を少なくとも4〜12ヶ月間感染から防御するのに十分な免疫応答を引き起こすことができるワクチン製剤の量である。通常、1回分の用量中に存在する抗原の量は、約1 pg〜約100 mg/kg(宿主)であり、一般的には約10 pg〜約1 mg/kg、好ましくは約100 pg〜約1μg/kgである。適切な用量範囲は注入経路および患者の体重によって異なるが、一般的に約0.1 mL〜約5 mLの範囲であろう。
【０３０５】
特定の実施形態では、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、少なくとも103 TCID50、少なくとも104 TCID50、少なくとも105 TCID50、少なくとも106 TCID50の開始１回量で投与される。別の特定の実施形態では、本発明のウイルスおよび/またはワクチンは、反復投与で投与される。好ましい実施形態では、2、4、および6ヶ月齢での初回投与ならびに2歳の初めでの追加投与が用いられる。より好ましくは、少なくとも105 TCID50、または少なくとも106 TCID50の各用量が、反復投与で与えられる。ウイルスの複製速度は、臨床試験におけるワクチンの投与量を調節するための指標として使用される。例えば、ウイルスの複製速度を検査するためのアッセイ（例えば、増殖曲線など、利用可能なアッセイについてはセクション5.5を参照）は、本発明のウイルスおよび/またはワクチンの複製速度を、以前の研究で証明された（Clementsら、J. Clin. Microbiol. 29: 1175-82 (1991); Karronら、J. Infect. Dis. 171:1107-14 (1995); Karronら、Ped. Inf. Dis. J. 5: 650-654 (1996)を参照）bPIV3のそれと比較するために使用され得る。これらの研究は、ウシPIV3ワクチンが通常安全であり、成人、6〜60ヶ月齢の子供、および2〜6ヶ月齢の幼児を含む健康なヒトボランティアにおいて許容性良好であることを示した。これらの研究において、被験者は少なくとも１回の103 TCID50〜106 TCID50のbPIV3ワクチンの投与を受けた。12人の子供は、有害な影響なく、１回投与の代わりに105 TCID50のPIV3ワクチンの２回投与を受けた。bPIV3と同程度の複製速度は、臨床試験において同程度の投与量を使用しうることを示唆する。bPIV3と比較してより低い複製速度は、より高い投与量を使用できることを示唆する。
【０３０６】
5.6.2. 標的集団
本発明の特定の実施形態では、本発明の治療方法および診断方法のための標的集団は、年齢によって規定される。本発明の特定の実施形態では、本発明の治療方法および診断方法のための標的集団は、呼吸器感染症に加えて疾患または障害によって特徴付けられる。
【０３０７】
特定の実施形態では、標的集団は2歳以下の幼児を含む。より特定的な実施形態では、その2歳以下の幼児は呼吸器感染症以外の疾患に罹患していない。
【０３０８】
他の実施形態では、標的集団は5歳以上の患者を含む。より特定的な実施形態では、その5歳以上の患者は、嚢胞性線維症、白血病、および非ホジキンリンパ腫、または最近受けた骨髄移植もしくは腎臓移植を含む、更なる疾患または障害を患ってる。
【０３０９】
本発明の特定の実施形態では、標的集団はhMPV感染が宿主の免疫抑制と関連している被験者を含む。特定の実施形態では、被験者は免疫無防備状態の個体である。
【０３１０】
特定の実施形態では、本発明の方法のための標的集団は高齢者を含む。
【０３１１】
特定の実施形態では、本発明の方法で治療されるべき被験者は、冬期にhMPVに感染したものである。
【０３１２】
以下の実施例は、本発明の例示となるが、それらに限定されない。実施例において使用される細胞およびウイルスは、以下のように維持する。すなわち、RSV A2株、ウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型（b/h PIV3）ウイルス、ヒト・メタニューモウイルスNL/1/00株（hMPV）、ウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ウイルスベクター化RSVウイルス（b/h PIV3/RSV ウイルス）、およびウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ型ベクター化ヒト・メタニューモウイルス（b/hPIV3/hMPV）は、ゲンタマイシンの存在下にOpti-MEM（Gibco/BRL ）中でVero細胞において増殖させた。ファージT7 RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkara（MVA-T7）またはFowlpox-T7（FP-T7）は、ニワトリ胚の腎臓細胞（SPAFAS）で増殖させた。Vero、HeLaおよびHep-2細胞は、10％ウシ胎仔血清（FCS）、2 mM L-グルタミン、非必須アミノ酸、および抗生物質を補給したMEM（JRH Biosciences）中で維持した。
【実施例】
【０３１３】
6. 実施例１：キメラなウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3 cDNAの構築およびクローニング
bPIV3のFおよびHN遺伝子をhPIV3のそれらと置換するために、付加的な制限酵素部位を感染性のbPIV3 cDNAに導入した。部位特異的突然変異誘発を用いて、固有のNhe I 部位をbPIV3 cDNAのヌクレオチド位置5041に導入し、SalI部位をnt 8529に導入した。改変した完全長bPIV3 cDNAをNhe IおよびSal I制限酵素で処理し、FおよびHN遺伝子を除くすべてのウイルスbPIV3配列を含む約14 kb DNA断片をゲル精製によって単離した。
【０３１４】
hPIV3のFおよびHN遺伝子配列を得るために、10 cmディッシュのコンフルエントなVero細胞にhPIV3株（hPIV3/Tex/12084/1983）を感染させた。37℃で3日間の培養後、細胞を回収し、全RNAをRNA STAT-LS 50（Tel-Test Inc.）を用いて単離した。hPIV3ゲノムの位置4828にアニーリングするhPIV3特異的オリゴを用いた逆転写によって、ウイルスcDNAを生成させた。hPIV3 のFおよびHN遺伝子はTaqポリメラーゼを用いたPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）によって増幅した。PCR産物をpT/A TOPOクローニングベクター（Invitrogen）にクローニングし、2つのクローン（＃11および＃14）からhPIV3のFおよびHN遺伝子を配列決定した。配列解析により、クローン＃11については、F遺伝子は正確であるが、HN遺伝子は異常な配列を含み、クローン＃14については、HN遺伝子は正確であるが、F遺伝子は異常な終止コドンを含むことが明らかにされた。従って、以下の方法で＃11の正確なF遺伝子を＃14の正確なHN遺伝子と連結することによって、機能的なhPIV3 のFおよびHN遺伝子を含むプラスミドを構築した。両方のhPIV3プラスミド（＃11および＃14）をNhelおよびEcoR1によって消化した。正確なF遺伝子を含む1.6 kb断片をクローン＃11から単離し、正確なHN遺伝子を含む8.5kb断片およびプラスミド配列をクローン＃14から単離した。２つの断片をライゲーションし、完全なhPIV3 FおよびHN遺伝子含有プラスミドを作製した。正確な配列をDNA配列解析によって確認した。最後に、「6の法則」を満たすために、非翻訳領域においてHN遺伝子の3'末端に１ヌクレオチドを付加した。１ヌクレオチドの付加は、QuikChange突然変異誘発キット（Stratagene）を用いることによって達成され、DNA配列決定によって確認された。その後、正確なhPIV3 FおよびHN遺伝子のDNA断片をNhe1およびSal1での消化によって単離し、3.5kb DNA断片をゲル精製した。
【０３１５】
上述のbPIV3配列を含む14.5kb DNA断片とhPIV3 FおよびHN遺伝子を含む3.5kb DNA断片をライゲーションすることによって、完全長b/h PIV3キメラcDNAを構築した（図3参照)。広範な制限酵素マッピングによって完全長キメラプラスミドDNAを確認した。更に、キメラ構築物のM/F遺伝子およびHN/L遺伝子の連結部は、それぞれ、両方ともbPIV3およびhPIV3配列ならびにNhe1およびSal1制限酵素部位を含むことをDNA配列決定によって確認した。
【０３１６】
7. 実施例２：キメラなウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスFまたはG cDNAの構築およびクローニング
b/h PIV3ゲノムの位置1または2へのRSV抗原の挿入がウイルスの複製に及ぼす影響を調べるために、呼吸器多核体ウイルス（RSV）のF遺伝子およびG遺伝子を、キメラウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター（b/h PIV3ベクター）の異なる位置にクローニングした（図4参照）。
【０３１７】
ウシ/ヒト（b/h）PIV3 cDNAに外来遺伝子を挿入するために、QuickChangeキット（Stratagene）を用いた部位特異的突然変異誘発によって、b/h PIV3 cDNAプラスミド（Hallerら、2000; 2001, これは実施例6と同一の構築物である）にAvrII制限酵素部位を導入した。次のオリゴ 5'GAA ATC CTA AGA CCC TAG GCA TGT TGA GTC3'およびその相補体を用いて4個のヌクレオチドを変化させて、１つのAvrII部位をb/h PIV3ゲノムのヌクレオチド（nt）104に導入した。この制限酵素部位を用いて、ウイルスゲノムの第一（最も3'側）の位置にRSV遺伝子を挿入した。次のオリゴ 5'CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCATGGAAGACAATG3'およびその相補体を用いて2個のヌクレオチドを変化させて、もう1つのAvrII部位をnt 1774のN-P遺伝子間領域に導入した。この制限酵素部位を用いて、b/h PIV3のN遺伝子とP遺伝子との間の第二の位置にRSV遺伝子を挿入した（図４）。nt 104および1774にAvrII部位を含む完全長b/h PIV3 cDNAは、逆遺伝学によりウイルスを再生させることによって、機能性について検査した。
【０３１８】
RSV Gカセット（N-P遺伝子終止/開始）の構築: PCR鋳型としてb/h PIV3 cDNAを用いて、bPIV3 N-P遺伝子間領域ならびにRSV G遺伝子の3'末端配列を含むDNA断片を作製した。この断片は以下のオリゴを用いたPCRによって生成された。すなわち、5'CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3'および 5'CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3'を用いた。その後、この断片を用いてオーバーラッピングPCRを実施し、bPIV3 N-P遺伝子間領域をRSV G遺伝子に付加した。第二PCR反応のために、RSV GおよびF遺伝子を含むプラスミドをDNA鋳型として用い、オリゴ 5'CAGCGGATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3'および上記の短いPCR断片から生じるオリゴをプライマーとして用いた。その結果生じる、bPIV3 N-P遺伝子間領域に連結されたRSV G遺伝子を含み、かつAvrII制限酵素部位により挟まれているPCR断片を、pGEM3にクローニングした。RSV G遺伝子を配列決定し、完全なオープンリーディングフレームの存在および推定されるアミノ酸配列を確認した。RSV G遺伝子を含むDNA断片を、AvrII制限酵素部位を用いて、AvrIIで直鎖状にしたbPIV3（1-5 bPIV3）ゲノムの最初の5200ヌクレオチドのみを有するサブクローンの第一位置または第二位置に挿入した。本明細書および他の実施例において用いられる場合、1-5 bPIV3とは、ウシPIV3ゲノムのヌクレオチド1から5196（または5200）を指す。この位置にはBstBl部位が存在する。
【０３１９】
RSV Fカセット（N-P遺伝子開始/終止）の構築: RSV F遺伝子断片を、完全長bPIV3/RSV F+G cDNAプラスミドから、RSV F遺伝子の5'末端および3'末端にAvrII部位を付加したオリゴを用いたPCRによって単離し、bPIV3ゲノムの最初の5200ヌクレオチドを含みnt1774にAvrII部位を有する1-5 bPIV3プラスミド（AvrIIで直鎖状にした）に導入した。bPIV3 N-P遺伝子間領域を、鋳型として1-5 bPIV3/RSV G2を用いたPCRによって単離した。オリゴ 5'GACGCGTCGACCACAAAGAGATGACCACTATCACC3'および bPIV3 F オープンリーディングフレームにアニーリングするオリゴを用いて、bPIV3 N-P遺伝子間領域、AvrII部位、およびnt 5200までのbPIV3配列を含むPCR断片を作製した。PCR断片をSalIおよびNheIによって消化し、SalIおよびNheIで消化された位置2にRSV F遺伝子を含む1-5 bPIV3プラスミドに付加した。N-P遺伝子間領域を含むRSV F遺伝子を位置1に導入するために、1.8 kb RSV FカセットをAvrIIにより切り出し、AvrIIで直鎖状にした、nt 104にAvrII部位を含む1-5 bPIV3にライゲーションした。
【０３２０】
短い遺伝子間領域を有するRSV Fカセット（N終止/N開始）の構築: 短いN-N遺伝子間領域を有するRSV F遺伝子の作製は、鋳型として1-5 bPIV3/RSV F2を用い、オリゴ 5'GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAACCCTAGGACTGTA3'およびAvrII制限酵素部位を含むRSV F遺伝子の5'末端の上流にアニーリングするオリゴを用いたPCR反応を行うことによって達成された。RSV F遺伝子および短いN-N遺伝子間領域を含むPCR産物をAvrIIによって消化し、AvrIIで直鎖状にした1-5 bPIV3のnt 104 に導入した。
【０３２１】
RSV GおよびRSV F遺伝子カセットを配列決定し、完全なオープンリーディングフレームの存在、推定上のアミノ酸配列を確認し、６の法則を検証した。RSV GおよびRSV Fの転写単位を、AvrII制限酵素部位を用いて、AvrIIで直鎖状にしたサブクローン1-5 bPIV3の第一位置または第二位置に挿入した。制限酵素マッピングにより適切な方向性を確認した後、RSV遺伝子を第一位置に含むプラスミドをSphIおよびBssHIIによって消化し、4 kb（1-5 bPIV3/RSV G1）または4.8 kb（1-5 bPIV3/RSV F1）DNA断片を単離した。クローニングの第2段階では、残りのb/h PIV3ゲノムをSphI-BssHII 15.1 kb DNA断片として付加し、完全長cDNAを作製した。RSV遺伝子を第二位置に含むbPIV3 サブクローンをSphIおよびNheIで切断し、5.8 kb（bPIV3/RSV G2）および6.5 kb（bPIV3/RSV F2）DNA断片を単離した。クローニングの第2段階では、残りのb/h PIV3ゲノムを14 kbのサイズのNheI-SphI DNA断片としてライゲーションした。完全長のキメラb/h PIV3/RSVプラスミドを、高収量の完全長ウイルスcDNAプラスミドをもたらすSTBL-2細胞（Gibco/BRL）において増殖させた。
【０３２２】
8. 実施例３：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスFまたはGは、mRNA産生およびタンパク質発現ならびにin vitroでのウイルス複製に関して位置効果を示した
3つの実験を行い、実施例2の構築物におけるRSV FまたはG遺伝子の効果的な発現を確認し、PIV3ゲノムにおける遺伝子挿入の位置効果を測定した。
【０３２３】
最初に、キメラウイルスによるRSVタンパク質発現を証明するために、キメラウイルス感染細胞溶解液のウェスタンブロットを行い、RSV特異的抗血清を用いてプローブした（図５A参照）。以下のようにウェスタンブロットを行った。すなわち、キメラウイルスを用いて、サブコンフルエント（70〜80％）のVero細胞に0.1 MOIまたは1.0 MOIで感染させた。感染48時間後、培地オーバーレイを除去し、感染した単層を1 mlのPBSで一度洗浄した。その後、細胞を0.05％β-メルカプトエタノール（Sigma）を含む400μlのLaemmliバッファー（Bio-Rad）中で溶解した。15μ1の各サンプルを12％Tris-HCl Ready Gel（Bio-Rad）で分離し、半乾式転写装置（Bio-Rad）を用いてナイロンメンブレンに転写した。ナイロンメンブレンを0.5％（v/v）Tween-20（Sigma）を含むPBS [pH7.6] （PBST）で洗浄し、5%（w/v）粉乳を含むPBST（PBST-M）で20〜30分間室温でブロッキングした。メンブレンを、PBST-Mで1:1000希釈したRSV Fモノクローナル抗体の混合物（WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107、参照により本明細書に組み込まれるBeelerおよびCoelingh, J. Virol. (1989) 63 (7): 2941-50を参照)または、PBST-M で1: 2000希釈したRSV G 10181ポリクローナル抗体（Orbigen）のいずれかとともに室温で1時間インキュベートした。PBSTで4回洗浄した後、メンブレンをPBST-Mで1:2000希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗マウス抗体（Dako）とともに室温で1時間インキュベートした。メンブレンをPBSTで4回洗浄し、化学発光基質（Amersham Pharmacia）を用いて発光させ、タンパク質バンドの可視化のためにBiomax Light Film（Kodak）に感光させた。
【０３２４】
Vero細胞でのb/h/RSV F1*N-Nの複製効率の減少と一致して（図５C、下記参照）、感染後48時間に検出されるRSV F1の量はb/h PIV3/RSV F2または野生型RSV A2感染細胞に存在するそれより約10倍少なかった（図５Aのレーン2、3および4を比較されたい）。RSV F1断片に相当する約50 kDaバンドは、野生型RSVと同様にb/h PIV3/RSV F1およびb/h PIV3/RSV F2に感染した細胞において検出された。b/h PIV3/RSV F1 は、感染後（hpi）48時間では、b/h PIV3/RSV F2で観察されるものと同様のRSV F1 タンパク質レベルを発現した。ほんの低レベルのF0がb/h PIV3/RSV F1およびb/h PIV3/RSV F2に感染した細胞で検出され、野生型RSV感染においても観察されるようにF0前駆体は感染の間に効果的にプロセッシングされることを示した。予想されるように、b/hPIV3感染細胞およびmock（ウイルスなし）感染細胞の溶解液は、RSV Fタンパク質のシグナルを生じなかった。約26 kDaのより小さいバンドが、b/h PIV3/RSV F1およびF2溶解液において観察され、野生型RSV溶解液には存在しなかった。このバンドは、野生型RSV感染細胞では産生されないRSV Fタンパク質のタンパク質分解性断片を意味する。RSV感染細胞においてタンパク質分解性断片が存在しないのは、完全なセットのRSVタンパク質が存在するためかもしれない。より高い1.0 MOIでb/h PIV3/RSV F1 *N-N感染をくり返した場合（図５A、レーン1）、b/h PIV3/RSV F1感染細胞中のF1断片は感染後48時間で野生型RSVレベルにまで蓄積した。b/h PIV3/RSV F1またはb/h PIV3/RSV F2感染細胞での50 kDaおよび26 kDa F1断片の相対量は、約1:5であった。
【０３２５】
0.1 MOIで48時間感染後のb/h PIV3/RSV G1、b/h PIV3/RSV G2および野生型RSV感染細胞におけるRSV Gの相対発現は図５Aに示される。それぞれ、約50 kDaおよび90 kDaで移動するRSV Gの未成熟型およびグリコシル化型の両方が検出された。b/h PIV3/RSV G1感染細胞は野生型RSV感染細胞において見られるものと同様のRSV G発現のレベルを示した（図５A、レーン1および3）。しかし、b/h PIV3/RSV G2感染細胞では、RSV Gの蓄積は、野生型RSV感染細胞に存在するものより約2〜3倍多かった（図５A、レーン2および3）。より高レベルのRSV G発現は、RSVゲノムでのその位置と比較して、PIV3ゲノムではRSV G遺伝子がより3'末端に近接した位置にあるためかもしれない。より高いレベルの発現は、位置1でのRSV Gについては観察されず、それは減衰したウイルス複製表現型のためかもしれない。RSV G特異的バンドはb/h PIV3感染細胞またはmock感染細胞に由来する細胞溶解液では観察されなかった。総合的に、これらのデータは、キメラb/h PIV3/RSVがRSVタンパク質を位置1または2のいずれかにおいて効果的に発現することを示した。位置2はわずかに高いレベルのRSV Gタンパク質を発現すると思われるが、位置1または2のいずれが用いられたかに関わらず、b/h PIV3による同等のRSVタンパク質の発現レベルが観察された。PIV3ゲノムの位置1または位置２での抗原発現レベルは同様であったので、いずれの位置も遺伝子挿入に使用され得る。
【０３２６】
次に、ノーザンブロット分析は、mRNA転写がウェスタンブロットによって証明されたタンパク質発現の結果と相関することを示した（図５B参照）。以下のようにノーザンブロットを行った。すなわち、全細胞RNAをウイルス感染細胞からTrizol LS（Life Techonologies）を用いて調製した。RNAを１回のフェノール-クロロホルム抽出によって更に精製し、エタノールで沈澱させた。RNAペレットをピロ炭酸ジエチルで処理した水に再懸濁し、-80℃で保存した。等量の全RNAを、1％ホルムアルデヒドを含む1％アガロースゲルで分離し、Turboblotter装置（Schleicher & Schuell）を用いてナイロンメンブレン（Amersham Pharmacia Biotech）に転写した。DIG RNA標識化キット（Roche Molecular Biochemicals）を用いたin vitro転写によって合成されたジゴキシゲニン(DIG)-UTP-標識リボプローブによって、ブロットをハイブリダイズした。Express Hyb溶液（Clontech）中で12時間68℃で、ハイブリダイゼーションを行った。ブロットを2X SSC（1X SSCは0.015 Mクエン酸ナトリウムを含む0.015 M NaClを含有する）-0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）によって68℃で2回洗浄し、続いて0.5X SSC-0.1％SDSによって1回洗浄し、最後に0.1X SSC-0.1％SDSによって洗浄した。ハイブリダイズしたプローブからのシグナルを、DIG-ルミネッセント検出キット（Roche Molecular Biochemicals）を用いて検出し、BioMax MLフィルム（Kodak）に感光させることによって可視化した。
【０３２７】
b/h PIC3/RSV F1*N-N、b/h PIV3/RSV F2、b/h PIV3/RSV G1およびb/h PIV3/RSV G2のノーザン分析は、RSV Fまたは RSV GについてのウイルスmRNAレベルが観察されたRSVタンパク質レベルとよく相関することを示した（図５B）。最も低いレベルのRSV F mRNAはb/h PIV3/RSV F1 *N-Nで観察され、それはまた最も少量のRSV Fタンパク質産生を示した。b/h PIV3/RSV G1はより少ないRSV G mRNAを産生し、その結果b/h PIV3/RSV G2で観察されたものよりも低いRSV Gタンパク質レベルを生じた。
【０３２８】
最後に、（位置1または位置2のいずれかにRSV F または G遺伝子を有する）様々なウイルスの増殖は、タンパク質発現およびRNA転写の結果と相関した。図５Cに示した増殖曲線は以下のように得られた。すなわち、Vero細胞を90％コンフルエントまで増殖させ、0.01または0.1 MOIのb/h PIV3、b/h PIV3 RSV F1、b/h PIV3 RSV G1、b/h PIV3 RSV F2、およびb/h PIV3 RSV G2に感染させた。感染した単層を37℃で培養した。感染0、24、48、72、96および120時間後、細胞および培地をともに回収し、-70℃で保存した。それぞれの回収時点でのウイルス力価をVero細胞でのTCID50アッセイまたはプラークアッセイによって測定した。TCID50アッセイでは、37℃で6日間培養した後のCPEについて視覚的に検査し、一方、プラークアッセイでは、定量のために培養５日後にRSVポリクローナル抗血清を用いて免疫染色した。
【０３２９】
Vero細胞において0.01 MOIでは、第一位置にRSV GまたはF遺伝子を含むキメラウイルス（b/h PIV3 RSV G1およびb/h PIV3 RSV F1 *N-N）は、RSV遺伝子を第二位置に含むウイルスより遅い速度で複製し、より低いピーク力価をもたらし、より大きな遅滞期を示した。感染後96時間でのb/h PIV3/RSV F1 *N-Nならびにb/h PIV3/RSV G1のピーク力価は、それぞれ106.7および105.5 TCID50/mlであった（図５C）。一方、b/h PIV3/RSV F2ならびにb/h PIV3/RSV G2のピーク力価は、感染後72時間および96時間でそれぞれ108.0および107.4であった（図５C）。b/h PIV3対照ウイルスは、それぞれ108.0 TCID50/mlのピーク力価を示した（図５C）。b/h PIV3/RSV F2はb/h PIV3/RSV F1 *N-Nより1.3 log10高い力価をもたらした。b/h PIV3/RSV G2はb/h PIV3/RSV G1より1.9 log10高い力価で複製した。総合的に、データは、ゲノム位置1または2でRSVタンパク質を発現するb/h PIV 3 がVero細胞において106〜108 PFU/mlのピーク力価で複製することを示した。位置2に抗原挿入を含むウイルスは、組織培養において位置1に外来遺伝子を含むものよりも効率的に複製した。
【０３３０】
b/h PIV3/RSV F1 *N-Nおよびb/h PIV3/RSV G1のより高い力価がそもそも達成されるのかどうかを決定するために、より高い0.1 MOIで増殖曲線をくり返した。0.1 MOIでは、b/h PIV3/RSV F1 *N-Nおよびb/h PIV3/RSV G1のピーク力価は0.5〜1.3 log10ほど増加した（データは示さない）。これらのウイルスの遅滞期は減少し、ピーク力価は増殖サイクルの間により早く達成された。
【０３３１】
9. 実施例４：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3 ゲノムへのeGFP挿入がウイルス複製に及ぼす位置効果
ウシ/ヒトPIV3 ベクター骨格への遺伝子挿入の影響は、eGFP遺伝子を順次PIV3のすべての遺伝子間に導入し、ウイルス複製およびeGFP発現への影響を観察することによって体系的に評価された（図６）。この種のアッセイは、特定の比率のウイルスmRNAを生じるパラミクソウイルスで観察される転写勾配の重要性を研究する。外来遺伝子の挿入は、これらの比率を撹乱し、異なる量のウイルスタンパク質の合成を引き起こし、ウイルス複製に影響を及ぼすかもしれない。eGFP遺伝子は、ビリオン膜に組み込まれず、従ってパッケージング、出芽、侵入などのウイルス過程を妨害しないと思われるので、このアッセイのために選択された。eGFP遺伝子をb/h PIV3ゲノムの４つの位置に挿入し、それらのうち３つについてeGFP発現およびウイルス複製を分析した。eGFP遺伝子カセットをbPIV3 N-P遺伝子間領域に連結した。b/h GFP1はeGFP遺伝子カセットをb/h PIV3ゲノムの最も3'末端に近接した位置に含有した。b/h PIV3/GFP2はeGFP遺伝子カセットをb/h PIV3ゲノムのN遺伝子とP遺伝子との間に含有した。b/h PIV3/GFP3はPとMとの間に配置され、b/h PIV3/GFP4はeGFP遺伝子をb/h PIV3のMとFとの間に保持した（図６）。
【０３３２】
eGFP遺伝子カセットの構築: eGFP遺伝子の鋳型は市販されており、例えば、BD Biosciences（pIRES2-EGFP）またはClontech（pEGFP-N1）から購入できる（Hoffmannら、Virology 267:310-317 (2000)を参照されたい）。eGFP遺伝子をPCRによって単離し、bPIV3 N-P遺伝子間領域を以下のオリゴ、すなわち、5'ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3'、5'GGACGAGCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCATG3'、および 5'CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3'を用いて、オーバーラッピングPCR法を利用して付加した。eGFPカセットをpCR2.1に挿入し、配列決定し、６の法則の順守を確認した。その後、eGFPカセットをAvrIIによって消化し、ゲル精製し、下記に記載されるようにb/h PIV3の位置1、2、3、および4に挿入した。
【０３３３】
位置1および2にeGFP遺伝子を含む完全長cDNAの作製: eGFP遺伝子カセットを、nts 1-5200までのbPIV3配列を含み、nt104（位置1）またはnt1774（位置2）のいずれかにAvrII制限酵素部位を含む1-5 bPIV3プラスミドに挿入した。制限酵素マッピングによる適切な方向性の確認後、第一位置にeGFP遺伝子を含むプラスミドをSphIおよびBssHIIによって消化し、4 kbの（1-5eGFP）DNA断片を単離した。次に、残りのb/h PIV3ゲノムをSphI-BssHII 15.1 kb DNA断片として付加し、完全長cDNAを作製した。位置2にeGFPを含む完全長cDNAの作製については、第二位置にeGFP遺伝子を含むbPIV3サブクローンをSphIおよびNheIによって切断し、5.8 kbの（1-5 eGFP2）DNA断片を単離した。次に、残りのb/h PIV3ゲノムを14kbのサイズのNheI-SphI DNA断片として付加した。完全長キメラb/h PIV3/eGFPプラスミドを、高収量の完全長ウイルスcDNAプラスミドをもたらすSTBL-2細胞（Gibco/BRL）で増殖させた。
【０３３４】
位置3および4にeGFP遺伝子を含む完全長cDNAの作製: eGFPカセットをb/h PIV3ゲノムの位置3に挿入するために、AvrII制限酵素部位をbPIV3のnts 1-5200を含むサブクローンのP-M遺伝子間領域中のnt 3730に導入し、２つのヌクレオチドを変化させた。次のオリゴ、すなわち、5'GGACTAATCAATCCTAGGAAACAATGAGCATCACC3'およびその相補体を、AvrII部位を導入するためのQuickChange PCR反応に使用した。eGFPカセットをAvrIIによって消化し、nt 3730にAvrII部位を含むAvrIIで直鎖状にした1-5 bPIV3サブクローンにライゲーションした。SphIからNhelまでの5.5 kb DNA断片をGFP含有サブクローンから単離し、SphIおよびNheIによって消化したb/h PIV3 cDNAに導入して、完全長プラスミドを作製した。eGFP遺伝子カセットをb/h PIV3ゲノムの位置4に付加するために、nts 1-8500のb/h PIV3配列を含むサブクローンを作製した。このサブクローンをNheI（nt 5042）で直鎖状にし、適合性のあるAvrII末端を含むeGFPカセットを挿入した。その後、eGFPカセットを含むサブクローンをSphIおよびXhoIによって消化し、7.1 kb DNA断片を単離した。b/h PIV3プラスミドをSphIおよびXhoIで処理し、11 kb断片を生成した。これら二つのDNA断片をライゲーションし、b/h PIV3/GFP4を作製した。
【０３３５】
b/h PIV3/GFP1、2および3によって産生されたeGFP量を、２つの方法で評価した。第一に、b/h PIV3 GFP1、2、および3を用いて0.1および0.01 MOIで20時間感染させたVero細胞において生じた緑色細胞の量を、蛍光顕微鏡を用いて測定した（図７A）。b/h PIV3/GFP3はb/h PIV3/GFP1または2より著しく少ない緑色細胞を生じた。
【０３３６】
第二に、感染細胞についてウェスタン分析を行い、ブロットをGFP MAbならびにPIV3 PAbを用いてプローブした。b/h PIV3/GFP3は著しく少ないeGFPタンパク質を産生するという初めの観察が確認された（図７B）。b/h PIV3 GFP1およびGFP2は同様の量のeGFPタンパク質を産生した。ウエスタンブロット法は、PIV3抗体を用いてプローブすることによって、同量の装填について調整した（図７B）。興味深いことに、３つのウイルスはすべて、同様の量のPIV3タンパク質（HNタンパク質は最も顕著なバンドである）の産生を示した。これらの結果は、b/h PIV3/GFP3が、位置3において位置1および2と比較してより少ないGFP mRNAを転写することを示唆した。このデータは、パラミクソウイルスにおけるウイルスmRNAの転写勾配の存在を支持した。PIV3 HNタンパク質の産生レベルは、eGFP遺伝子挿入による影響を受けなかった(図７B)。
【０３３７】
GFP遺伝子挿入がb/h PIV3/GFP1、2、および3のウイルス複製の動態に影響を及ぼすかどうかを決定するために、Vero細胞において複数回の増殖曲線を実施した（図７C）。増殖曲線は、b/h PIV3/GFP1が、感染後24時間および48時間でb/h PIV3/GFP2またはGFP3よりウイルス複製の開始の遅れを有することを示した。しかし、得られた最終的なピーク力価は３つのウイルスすべてについて同様であった。b/h PIV3/GFP2およびGFP3についての複製の動態はほぼ同一であった（図７C）。興味深いことに、ウイルスmRNAの比率の変化は、ウイルス複製に有意には影響を与えないように思われた。
【０３３８】
10. 実施例５：異なる遺伝子間領域を有する、キメラウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスFの構築およびクローニング
遺伝子間領域（各mRNA間のヌクレオチド、例えば、F遺伝子とN遺伝子との間のヌクレオチド）がタンパク質発現およびウイルス複製に及ぼす影響を調べるために、３つの異なる構築物を使用した（図8を参照されたい）。第一の構築物は、位置1でのb/h PIV3ベクター化RSV F1 * N-Nであり、より短いbPIV N遺伝子終止/N遺伝子開始配列を持ち（図４におけるRSV F1* N-N）、第二の構築物は、位置1でのb/h PIV3ベクター化RSV Fであり（図４におけるRSV F2）、最後の構築物は、位置1でのb/h PIV3ベクター化RSVであった（図４におけるRSV F1）。3つの構築物はすべて、セクション7の実施例２に記載されたクローニング戦略に従って作製された。
【０３３９】
２つのカセット間の最も劇的な差異は、わずか10 ntsの長さであるb/h PIV3/RSV F1 *N-N中のN遺伝子開始配列とN翻訳開始コドンとの間の距離である。対照的に、この距離はb/h PIV3/RSV F2においては86 ntsの長さである。その他の差異は、b/h PIV3/RSV F2において用いられるようなP遺伝子開始配列よりむしろb/h PIV3/RSV F1 *N-NにおけるN遺伝子開始配列の使用である。ウイルス転写単位の遺伝子転写開始と翻訳開始との間の距離がウイルス複製に影響を及ぼすかどうかを決定するために、b/h PIV3/RSV F2のために使用されるものと同一のRSV F遺伝子カセットを含むb/h PIV3/RSV F1構築物を作製した。
【０３４０】
11. 実施例６：呼吸器多核体ウイルス遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよび/または性質は、ウイルス複製に影響を及ぼす
ウイルスタンパク質発現およびウイルス複製に対する遺伝子間領域の影響を決定するために、実施例５の３つの構築物を以下の実験において使用した（図９を参照されたい）。
【０３４１】
最初に、b/h PIV3/RSV F1、b/h PIV3/RSV F1 * N-N、およびb/h PIV3/RSV F2でのRSV Fタンパク質発現を、Vero細胞における0.1 MOIでの感染後24時間および48時間でウェスタンブロットを用いて比較した。ウェスタンブロットを以下のように行った。すなわち、キメラウイルスを用いて、（70〜80％）サブコンフルエントのVero細胞に0.1 MOIで感染させた。感染24時間および48時間後に、培地オーバーレイを除去し、感染した単層を1 mlのPBSで一度洗浄した。その後、細胞を0.05％β-メルカプトエタノール（Sigma）を含む400 mlのLaemmliバッファー（Bio-Rad）中で溶解した。15 m1の各サンプルを12％Tris-HCl Ready Gel（Bio-Rad）で分離し、半乾式転写装置（Bio-Rad）を用いてナイロンメンブレンに転写した。ナイロンメンブレンを0.5％（v/v）Tween-20（Sigma）を含むPBS（pH7.6）（PBST）で洗浄し、5%（w/v）粉乳を含むPBST（PBST-M）で20〜30分間室温でブロッキングした。メンブレンを、PBST-Mで1:1000希釈したRSV Fモノクローナル抗体の混合物（WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107)とともに室温で1時間インキュベートした。PBSTで4回洗浄した後、メンブレンをPBST-Mで1:2000希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次ヤギ抗マウス抗体（Dako）とともに室温で1時間インキュベートした。メンブレンをPBSTで4回洗浄し、化学発光基質（Amersham Pharmacia）を用いて発光させ、タンパク質バンドの可視化のためにBiomax Light Film（Kodak）に感光させた。
【０３４２】
b/h PIV3/RSV F1は、感染24時間および48時間後、b/h PIV3/RSV F2で観察されるレベルに近いが、b/h PIV3/RSV F1 *N-Nのそれよりずっと高いRSV F1タンパク質レベルを発現した。従って、遺伝子の開始エレメントと翻訳開始コドンとの間の間隔は、ウイルス複製にとって重要でありうる。N遺伝子開始配列をP遺伝子開始配列に変化させたが、この変化はたった１つのヌクレオチドの変更を受けただけであった。これらの要因のいずれかが、RSV Fタンパク質の発現表現型のレスキューに関与しうる。
【０３４３】
次に、Vero細胞において0.1 MOIでのb/h PIV3/RSV F1、b/h PIV3/RSV F1* N-N、およびb/h PIV3/RSV F2のウイルス複製の動態を比較するために、複数回の増殖曲線を実施した（図９B）が、それは以下のように行われた。すなわち、Vero細胞を90％コンフルエントまで増殖させ、0.1 MOIのb/h PIV3、b/h PIV3/RSV F1 * N-N、b/h PIV3/RSV F1、およびb/h PIV3/RSV F2に感染させた。感染した単層を37℃で培養した。感染0、24、48、72、および96時間後、細胞および培地をともに回収し、-70℃で保存した。それぞれの回収時点でのウイルス力価をVero細胞でのプラークアッセイによって測定した。プラークアッセイでは、定量のために培養５日後にRSVポリクローナル抗血清を用いて免疫染色した。
【０３４４】
図９Bに示されるように、b/h PIV3/RSV F1 *N-Nの複製の開始は遅延し、ピーク力価はb/h PIV3/RSV F2のそれらより低かった。一方、b/h PIV3/RSV F1はb/h PIV3/RSV F2で観察されたものとほぼ同一の増殖曲線を示した。
【０３４５】
12. 実施例７：三価のウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化構築物のクローニング
以下の実施例は、単一の弱毒化ウイルス生ワクチンを用いて、子供をRSV、hMPVおよびhPIV3に起因する疾患から防御するための、hPIV3の表面糖タンパク質（FおよびHN）、RSV F、ならびにhMPV Fを含む三価のワクチンの作製に関する。これらの三価のウイルスは逆遺伝学によって再生される。
【０３４６】
それぞれが２つの付加的な異種配列挿入を有するキメラb/h PIV3骨格を含み、１つの異種ヌクレオチド配列はメタニューモウイルス F遺伝子に由来し、もう１つの異種ヌクレオチド配列は呼吸器多核体ウイルスF遺伝子に由来する、２つのウイルスゲノムの構築を以下のように行った（図１０参照）。すなわち、プラスミドb/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/hMPV F2をSphIおよびNheIによって消化し、6.5 kb 断片を単離した。b/h PIV3 RSV F1またはb/h PIV3/hMPV F1に対する完全長cDNAをSphIおよびNheIによって消化し、14.8 kb DNA断片を単離して、完全長ウイルスcDNAを作製するためにプラスミドb/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/hMPV F2由来の6.5 kb DNA断片にライゲーションした。
【０３４７】
上述の構築物（すなわち、位置1にFRSVを、位置3にFhMPVを有するもの、および位置1にFhMPVを、位置3にFRSVを有するもの）から作製したウイルスを、Vero細胞において複製し、パッケージングした。レスキューされたウイルス、好ましくは本明細書に記載される第一の構築物を含むウイルスは、パラインフルエンザウイルス感染、メタニューモウイルス感染、および呼吸器多核体ウイルス感染に対する三価のワクチンとして使用され得る。
【０３４８】
13. 実施例８：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクターへの２つの呼吸器多核体ウイルスFのクローニング
キメラウイルスによって産生されるより多くのRSVタンパク質が免疫原性の改善をもたらすかどうかを決定するために、２コピーのRSV F遺伝子を有するキメラウイルスを設計した。このウイルスを逆遺伝学によってレスキューし、生物学的にクローニングし、Vero細胞において増幅して、1 x 106 pfu/mlの力価を有するウイルスストックを生じた。このウイルス、b/h PIV3/RSV F1F2は、ウイルスの増殖動態、RSV Fタンパク質の産生、ならびに、ハムスターにおける複製および免疫原性について評価するために使用され得る。
【０３４９】
以下の方法で構築物を作製した（図１１参照）。すなわち、1-5 RSV F2 プラスミドをSphIおよびNheIによって消化し、6.5 kb 断片を単離した。b/h PIV3 RSV F1の完全長cDNAをSphIおよびNheIによって消化し、14.8 kb DNA断片を単離して、完全長ウイルスcDNAを作製するために1-5 bPIV3/RSV F2由来の6.5 kb DNA断片にライゲーションした。
【０３５０】
14. 実施例９：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化ヒト・メタニューモウイルス F cDNAの構築およびクローニング
ヒト・メタニューモウイルス（hMPV）のF遺伝子をb/h PIV3ゲノムの位置1および2に挿入した（図１２）。hMPV F遺伝子カセットはbPIV3 N-P遺伝子間領域を含有した。hMPV F遺伝子（NL/1/00）を含むプラスミド（pRF515）を使用し、hMPV F遺伝子における単一のヌクレオチド突然変異を修正して（すなわち、ヌクレオチド3352をCからT（野生型）に修正して）、pRF515-M4を作製した。オーバーラッピングPCRを用いて、bPIV3 N-P遺伝子間領域をhMPV F遺伝子の3'末端に付加した。hMPV Fのための、オーバーラッピングPCRオリゴは5'GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGCACCTAATCATGTTCTTACAATGGTCGACC 3'であった。このクローニングステップの際、AvrII制限酵素部位を含むオリゴを、hMPV F遺伝子カセットの5'末端（5'GCAGCCTAGGCCGCAATAACAATGTCTTGGAAAGTGGTGATC3'）および3'末端（5'CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3'）でPCR反応に用いた。６の法則に合わせるため、QuickChange突然変異誘発キットおよび以下のオリゴ（5'CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3'、 5'CCAAGACATTGTCTATTGCGGCCTAGG3'）を用いて、hMPV F遺伝子カセットを調整した。完全長b/h PIV3/hMPV F1（位置1）およびF2（位置2）cDNAプラスミドを、上述のセクション9、実施例４でb/h PIV3/eGFP1およびeGFP2について記載したものと同様の方法で作製した。
【０３５１】
hMPV F遺伝子カセットを配列決定し、完全なオープンリーディングフレーム、推定アミノ酸配列の存在を確認し、６の法則を確認した。hMPV F 転写単位を、AvrII制限酵素部位を用いて、AvrIIで直鎖状にしたサブクローン1-5 bPIV3の第一位置または第二位置に挿入した。制限酵素マッピングにより適切な方向性を確認した後、hMPV遺伝子を第一位置に含むプラスミドをSphIおよびBssHIIによって消化し、4.8 kb（1-5 hMPV F1）DNA断片を単離した。残りのb/h PIV3ゲノムをSphI-BssHII 15.1 kb DNA断片としてライゲーションし、完全長cDNAを作製した。第二位置にhMPV遺伝子を含むbPIV3サブクローンをSphIおよびNheIによって切断し、6.5 kb（bPIV3/hMPV F2）DNA断片を単離した。残りのb/h PIV3ゲノムを14 kbのサイズのNheI-SphI DNA断片としてライゲーションし、完全長cDNAプラスミドを作製した。
【０３５２】
15. 実施例１０：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化ヒト・メタニューモウイルス Fの免疫沈降および複製アッセイ
位置2でのb/h PIV3ベクター化ヒト・メタニューモウイルスF（hMPV F2）においてFタンパク質が発現することを確認するために、モルモットまたはヒト抗血清を用いて、hMPV Fタンパク質を免疫沈降した（図１３A参照）。b/h PIV3/hMPVによって発現されるhMPV Fタンパク質の免疫沈降のために、Vero細胞を0.1もしくは0.05 MOIでb/h PIV3あるいはb/h PIV3/hMPV F1またはF2に感染させた。感染24時間後、システインおよびメチオニンを含まないDME（ICN）で細胞を１回洗浄し、同培地で30分間培養した。培地を除去し、100μCiの[35S]-Pro-Mix（Amersham）を含むシステインおよびメチオニンを含まない0.5 mlのDMEを細胞に添加した。感染細胞を35S-アイソトープの存在下で5時間37℃にて培養した。培地を除去し、プロテアーゼ阻害剤を含む0.3 M RIPAバッファーに感染細胞を溶解した。細胞溶解液をhMPVに対するモルモットまたはヒトポリクローナル抗血清とともにインキュベートし、IgG-アガロース（Sigma）に結合させた。0.5 M RIPAバッファーで３回洗浄した後、サンプルを10％タンパク質ゲルで分画した。ゲルを乾燥させ、X線フィルムに感光させた。
【０３５３】
b/h PIV3/hMPV F1およびF2によるhMPV Fタンパク質の発現は、モルモットhMPV抗血清を用いた免疫沈降によって示された（図１３A）。興味深いことに、約80 kDaに移動した特異的バンドが、b/h PIV3/hMPV F1およびF2の溶解液において観察された。このサイズはF前駆体タンパク質F0に相当した。異なるサイズの非特異的バンドはまた、b/h PIV3およびmock（ウイルスなし）対照レーンにおいても観察された（図１３）。このデータは、b/h PIV3/hMPV F1およびF2がhMPV Fタンパク質を発現することを示唆した。F0前駆体のF1 切断産物は観察されなかった。Fタンパク質切断部位の解析は、hMPV Fタンパク質切断部位が非荷電アミノ酸残基（RQSRFVL）から成るのに対して、RSVまたはAPV Aのような関連ウイルスはFタンパク質プロセシング部位、それぞれRKRRFLGおよびRRRRFVLに荷電アミノ酸を持つことを示した。切断部位に荷電アミノ酸を有するFタンパク質は効果的にFタンパク質をプロセシングすることができ、有害な表現型を示すことがインフルエンザウイルスから知られている（Hattaら、Science (2001) 293 (5536) : 1840-22001）。F1およびF2断片は適用した方法では検出不可能な低いレベルでしか存在しないと思われるため、hMPV Fタンパク質の「弱い」切断部位がF0タンパク質のみを検出した原因でありうる。非効率的なFタンパク質切断は組織培養におけるhMPV複製の遅い増殖を引き起こす過程の１つであり、いくつかのhMPV株のトリプシン要求性を説明しうる（van den Hoogen, 2001）。しかし、利用可能なhMPV抗体試薬は限定され、これらの抗血清はhMPV Fタンパク質の前駆体にのみ相互作用する。また、切断されたF1が不安定であり、そのためにこの方法によって容易には可視化されないという可能性もある。
【０３５４】
増殖曲線を実施し、b/h PIV3/hMPV F2のウイルス複製の動態を測定して、それらをVero細胞における0.1 MOIのb/h PIV3およびb/h PIV3/RSV F2で観察されたものと比較した（図１３B）。データは、b/h PIV3/hMPV F2がb/h PIV3/RSV F2と比較して感染24時間後に複製開始の遅れを呈することを示した。しかし、感染後48時間以降では、複製における差異はもはや観察されなかった。
【０３５５】
また、増殖曲線を実施し、b/h PIV3/hMPV F1のウイルス複製の動態を測定して、それらをVero細胞における0.01 MOIのb/h PIV3/ hMPV F2およびb/h PIV3で観察されたものと比較した（図１３C）。セクション8においてb/h PIV3/RSVキメラウイルスについて記載されたのと同様の方法を用いて、増殖曲線を得た。データは、b/h PIV/hMPV F1が複製開始の遅れを有し、b/h PIV3/hMPV F2またはb/h PIV3と比較してより低いピーク力価を生じることを示した。b/h hMPV F1のプラークの大きさもまた、b/h hMPV F2と比較してより小さい。
【０３５６】
b/h PIV3ゲノムの位置2にhMPV F遺伝子を含むキメラウイルスは、b/h PIV3で観察されるレベルまで複製した。感染96時間後のb/h PIV/hMPV F2で観察されるピーク力価は、8.1 log10 PFG/mlであった。対照的に、位置1からhMPV Fタンパク質を発現するPIV3はウイルス複製開始の遅れを示し、ピーク力価は感染96時間後 b/h PIV3/hMPV F2と比較して1.8 log10まで減少した。わずか6.3 log10 PFU/mlの力価しか、b/h PIV3/hMPV F1に感染したVero細胞からは得られなかった。b/h PIV3/hMPV F1によって示されたウイルス複製の欠陥は、b/h PIV3/RSV G1またはb/h PIV3/RSV F1のそれより重度であり、挿入物の性質はウイルス複製に影響を及ぼしうることを示唆した。
【０３５７】
総合的に、データは、ゲノム位置1または位置2においてhMPV タンパク質を発現するb/h PIV3 がVero細胞において106〜108 PFU/mlのピーク力価で複製することを示した。位置2に抗原の挿入を含むウイルスは、組織培養において位置1に外来遺伝子を含むものより効果的に複製した。
【０３５８】
また、キメラウイルス、b/h PIV3/hMPV F1およびF2を、Syrian Goldenハムスターにおけるそれらの感染および複製能力について評価した（表５）。そのために、キメラウイルス、b/h PIV3/hMPV F1およびF2を用いて、Syrian Goldenハムスターの鼻腔内に感染させ、気道でのそれらの複製能力を分析した（表１５）。5週齡のSyrian Goldenハムスター（1群6匹）を、100μl容量中1 x 106 pfuもしくは1 x 104 PFUのb/h PIV3、b/h PIV3/hMPV F1またはF2、あるいはhMPV/NL1/00 を用いて鼻腔内から感染させた。異なる群を、別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。感染4日後に、動物の鼻甲介および肺を採取し、ホモジェナイズして、-70℃で保存した。組織に存在するウイルスの力価を、Vero細胞におけるTCID50アッセイによって測定した。チャレンジ試験のため、28日目に動物に1 x 106 pfu/mlのhPIV3またはhMPV/NL/1/00を鼻腔内接種した。チャレンジ4日後に、動物の鼻甲介および肺を摘出し、定量のために免疫染色したVero細胞でのプラークアッセイによってチャレンジウイルスの複製についてアッセイした。
【表５】
2011167197.tif 000007
【０３５９】
結果は、b/h PIV3/hMPV F1およびF2は、ハムスターの鼻甲介においてそれぞれ5.3および5.7 log10 TCID50/g組織の高いレベルで複製することを示した。これらの力価はb/h PIV3で観察された値（4.8 log10 TCID50/g組織）と同様であった。それと比較して、野生型hMPVはハムスターの上気道において5.3 log10 TCID50/g組織の力価を示した（表５）。b/h PIV3/hMPV F1およびF2は、ハムスターの肺では、5.7および4.6 log10 TCID50/g組織で複製した（表５）。これらの力価はb/h PIV3で観察された値（5.6 log10 TCID50/g組織）と同様であった。野生型hMPVはハムスターの下気道において3.6 log10 TCID50/g組織の減少した力価を示した（表５）。これらのデータは、b/h PIV3/hMPV F1およびF2がSyrian Goldenハムスターの上気道および下気道において効率よく感染することができ、複製できることを証明した。これらの結果は、ハムスターがhMPVならびにhMPVワクチン候補の免疫原性を研究するために適切な小動物モデルであることを示唆した。
【０３６０】
16. 実施例１１：可溶性の呼吸器多核体ウイルスF遺伝子構築物のクローニング
また、単一コピーの可溶性RSV F遺伝子、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損したRSV F遺伝子型を含む構築物（すなわち、b/h PIV3/sol RSV F2）を作製した（図１４）。免疫原性について検査するためにこの構築物を使用することができる（可溶性RSV FもやはりRSV特異的免疫応答を誘導すると期待される）。その利点は、可溶性RSV Fをビリオン膜に組み込むことができないことであろう。従って、このウイルスは、そのウイルストロピズムの変化が期待されないため、より安全なキメラウイルスと考えられうる。b/h PIV3/sol RSV FのcDNAプラスミドは、逆遺伝学によってレスキューされ得る。b/h PIV3/sol RSV F2を以下のように構築した。
【０３６１】
ウシ/ヒト（b/h）PIV3/sol RSV F2 cDNAは、ヒトPIV3に由来する融合（F）遺伝子およびヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ（HN）遺伝子を含み、一方、残りのウイルスゲノムはbPIV3に由来した。前述のプラスミド1-5 bPIV3/RSV F2をPCRのためのDNA鋳型として使用した。このプラスミドは、ヌクレオチド（nt）1-5200のbPIV3配列およびnt 1774に挿入されたRSV F遺伝子を含有した。RSV A2 ゲノムの（F遺伝子中の）nt 5946にアニーリングするオリゴおよびオリゴ5'CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATTAGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3'を、RSV Fの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを除去するために用い、150ヌクレオチドを欠失させた。その結果生じたPCR断片をHpaIおよびSalIによって消化し、プラスミド1-5 bPIV3/sol RSV F2を作製するためにHpaIおよびSalIで処理した1-5 bPIV3/RSV F2に導入した。第二位置にsol RSV F 遺伝子を含むbPIV3サブクローンをSphIおよびNheIによって切断し、6.3 kb DNA断片を単離した。残りのウシ/ヒトPIV3ゲノムを14kbのサイズのNheI-SphI DNA断片としてライゲーションし、完全長b/h PIV3/sol RSV F2 cDNAプラスミドを作製した。組換えウイルスを逆遺伝学によって再生した。高力価のウイルスストックを作製し、RSVヤギポリクローナル抗血清を用いて免疫ペルオキシダーゼ染色したVero細胞におけるプラークアッセイによって定量した。ウイルスストックを-70℃で保存した。
【０３６２】
17. 実施例１２：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化ヒト・メタニューモウイルスFに感染した細胞におけるヒト・メタニューモウイルスFの発現
b/h 104 hMPV Fウイルスストックを連続的に10倍希釈し、サブコンフルエントのVero細胞に感染させるために用いた。感染細胞にゲンタマイシンを含むoptiMEM培地をオーバーレイし、35℃で5日間培養した。細胞を100％メタノールで固定し、1:1000希釈した抗hMPV001モルモット血清に続いて1:1000希釈した抗モルモットHRP結合抗体を用いて免疫染色した。hMPV Fの発現をAEC基質システム（DAKO corporation）の存在下での特異的発色によって可視化する（図１５A参照）。
【０３６３】
b/h NP-P hMPV Fウイルスストックを連続的に10倍希釈し、サブコンフルエントのVero細胞に感染させるために用いた。感染細胞に、ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミンおよびウシ胎仔血清を含む1 x L15/MEM培地を補給したEMEM/L-15培地（JRH Biosciences; Lenexa, KS）中の1％メチルセルロースをオーバーレイした。感染細胞を35℃で5日間培養し、100％メタノールで固定し、1:1000希釈した抗hMPV001モルモット血清に続いて1:1000希釈した抗モルモットHRP結合抗体を用いて免疫染色した（図１５B参照）。抗hMPV001モルモット血清はhMPV001タンパク質に特異的であり、b/h PIV3タンパク質には結合しない。
【０３６４】
18. 実施例１３：HeLa細胞およびVero細胞におけるキメラウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ウイルスのレスキュー
bPIV3のレスキューと同様の方法を用いて、キメラb/h PIV3ウイルスのレスキューを行った。HeLa細胞においてLipofecTACE（Gibco/BRL）を用いて、逆遺伝学によるb/h PIV3キメラウイルスのレスキューを行った。80％コンフルエントのHeLa細胞、Hep-2細胞、またはVero細胞を4 MOIのMVAに感染させた。感染1時間後、完全長アンチゲノムb/h PIV3 cDNA（4μg）を、NP（0.4μg）、P（0.4μg）、およびL/pCITE（0.2μg）発現プラスミドとともに感染HeLa細胞またはVero細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの40時間後、細胞および細胞上清を回収し（P0）、１回の凍結融解サイクルを行った。その結果生じた細胞溶解液を、その後、ワクシニアウイルスの複製阻害剤である1-β-D-アラビノフラノシルシトシン（ara C）の存在下で新たなVero細胞単層に感染させるために使用し、P1ウイルスストックを作製した。これらのプレートからの上清および細胞を回収し、一回凍結融解し、bPIV3ウイルス粒子の存在をPIV3特異的抗血清によるウイルスプラークの免疫染色によってアッセイした。P1回収の細胞溶解液はVero細胞単層の完全なCPEを引き起こし、免疫染色は広範なウイルス感染の存在を示した。
【０３６５】
19. 実施例１４：ウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ベクター化ヒト・メタニューモウイルスFウイルスのレスキュー
位置1（b/h 104 hMPV F）または位置2（b/h NP-P hMPV F）でhMPV Fを発現するb/h PIV3ウイルスは以下のように得られた。6 ウェルディッシュにおいて80〜90％コンフルエントのHEp-2またはVero細胞を、0.1〜0.3の感染多重度（m.o.i）でFowlpox-T7に感染させた。Fowlpox-T7による感染後、細胞をPBSで一回洗浄し、以下の量のプラスミドDNA、すなわち、完全長b/h 104 hMPV Fまたはb/h NP-P hMPV F cDNA 2.0μg、pCite N 0.4μg、pCite P 0.4μg、pCite L 0.2μgをトランスフェクトした（pCiteプラスミドは、T7プロモーターに続いて脳心筋炎ウイルス（EMCV）由来のIRESエレメントを有する）。リポフェクタミン2000（Invitrogen）の存在下でメーカーの使用説明書に従って、トランスフェクションを行った。トランスフェクション反応物を33℃で5〜12時間培養し、続いてリポフェクタミン2000を含む培地を、ゲンタマイシンを含む2mlの新しいOptiMEMに交換した。トランスフェクト細胞を更に33℃で2日間培養した。細胞をSPGで安定化させ、-80℃で１回の凍結融解サイクルによって溶解した。粗細胞溶解液を用いて、レスキューされたウイルスを増幅するために新たなVero細胞単層に感染させた。キメラウイルスをVero細胞での限界希釈法によって精製し、106〜108 PFU/mlの高力価のウイルスストックを作製した。hMPV Fタンパク質の発現を、ポリクローナルhMPVモルモット抗血清を用いた免疫染色によって確認した。
【０３６６】
20. 実施例１５：ウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルス遺伝子の逆遺伝学によるレスキュー
前述のトランスフェクション法を用いて、逆遺伝学によりHeLaまたはHEp-2細胞において感染性ウイルスを再生した（実施例１３参照）。簡潔には、6ウェルの組織培養ディッシュにおいて80〜90％コンフルエントのHEp-2あるいはVero細胞を、それぞれ0.1〜0.3もしくは1〜5の感染多重度（m.o.i）でFP-T7またはMVA-T7に感染させた。FP-T7またはMVA-T7による感染後、細胞をPBSで一回洗浄し、以下の量のプラスミドDNA（2.0μgの完全長b/h PIV3 RSV FまたはG cDNA、0.4μgのpCITE/N、0.4μgのpCITE/P、0.2μgのpCITE/L）をトランスフェクトした。リポフェクタミン2000（Invitrogen）の存在下でメーカーの使用説明書に従って、トランスフェクションを行った。トランスフェクション反応物を33℃で5〜12時間培養し、続いてリポフェクタミン2000を含む培地を、ゲンタマイシンを含む2mlの新しいOptiMEMに交換した。トランスフェクト細胞を更に33℃で2日間培養した。細胞をSPGで安定化させ、-80℃で１回の凍結融解サイクルによって溶解した。粗細胞溶解液を用いて、レスキューされたウイルスを増幅するために新たなVero細胞単層を感染させた。キメラウイルスをVero細胞での限界希釈法によって精製し、106〜108 PFU/mlの高力価のウイルスストックを作製した。キメラウイルスのRSV遺伝子をRT-PCRによって単離し、配列を確認した。RSVタンパク質の発現を、RSVヤギポリクローナル抗血清（Biogenesis)を用いた、感染Vero細胞単層の免疫染色によって確認した。
【０３６７】
21. 実施例１６：キメラウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ウイルスレスキューのRT-PCRによる確認
レスキューされたウイルスが実際にキメラであること、すなわち、そのウイルスがbPIV3骨格中にhPIV3 のF遺伝子およびHN遺伝子配列を含むことを確認するために、ウイルスRNAゲノムをRT-PCRによって更に分析した。3つの独立に由来するb/h PIV3の分離株のP1ウイルスストックに感染させたVero細胞を回収し、全RNAを単離した。bPIV3の位置4754にアニーリングするオリゴを用いて、ウイルスRNAを増幅した。nt 5255〜6255のウイルス領域をPCRによって増幅した。その結果生じる1 kb PCR断片はhPIV3配列を含むはずである。これは、hPIV3に特異的で、bPIV3の補完的な領域では切断しない酵素（Sac1およびBgl II）による消化によって確認された（図２参照）。予想されたように、Sac1およびBgl IIはPCR断片をより小さい断片に切断し、単離した配列がhPIV3に由来することを確認した（レーン3、5、7参照）。更に、ポリメラーゼL遺伝子中のnt 9075〜nt 10469の領域をPCRによって増幅した。この領域はbPIV3配列を含むはずである。先と同様に、その結果生じる1.4 kb PCR断片を、bPIV3に特異的で、hPVI3の同等領域では切断しない酵素（PvullおよびBamH1）によって消化した（図３）。1.4 kb断片は実際にPvullおよびBamH1の両方によって消化され、ポリメラーゼ遺伝子がbPIV3由来であることを確認した（図３のレーン3、4、6、7、9および10参照）。要約すると、RT-PCR分析は、レスキューされたb/h PIV3ウイルスが実際にキメラであることを示した。それはbPIV3の遺伝子骨格中にhPIV3 のF遺伝子およびHN遺伝子を含む。
【０３６８】
22. 実施例１７：ウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルスおよびヒト・メタニューモウイルス遺伝子の遺伝的安定性
b/h PIV3/RSVおよびb/h PIV3/hMPVキメラウイルスが遺伝的に安定であり、導入したRSVまたはhMPV遺伝子カセットを維持することを証明するために、感染細胞溶解液をVero細胞中で10回連続的に盲目継代した。T25フラスコ中のサブコンフルエントVero細胞を0.1 MOIのb/h PIV3/RSVまたはb/h PIV3/hMPVに感染させ、33℃で4日間またはCPEが見られるまで培養した。培養期間の最後に感染細胞および培地を回収し、2回凍結融解し、その結果生じた細胞溶解液を新たなT25フラスコのVero細胞に感染させるために使用した。このサイクルを10回くり返した。P1からP10までのすべての細胞溶解液を、RSVまたはhMPVタンパク質の発現およびウイルス力価のためのプラークアッセイならびに免疫染色によって解析した。継代10代目に、RSV F、RSV G、またはhMPV F遺伝子カセットをRT-PCRによってP10溶解液から単離し、（起こり得るヌクレオチド変化を同定するために）DNA配列解析によって検証した。すべての分離株は、解析された10継代に渡って、RSVまたはhMPV遺伝子カセットおよびRSVまたはhMPVタンパク質発現を維持していた。PIV3ゲノムにおける遺伝子挿入の位置、位置1もしくは2に依存する、RSVまたはhMPV遺伝子を発現するPIV3の挿入安定性の増加は観察されなかった。
【０３６９】
23. 実施例１８：ウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルス遺伝子のショ糖密度勾配でのビリオン分画
RSVタンパク質がb/h PIV3ビリオンに組み込まれるかどうかという問題を、生化学的アッセイの利用によって更に調査した。Vero細胞に0.1 MOIのそれぞれのキメラb/h PIV3/RSVウイルスを接種した。最大のCPEが見られた時、感染単層細胞を凍結融解し、2000 rpmで10分間遠心分離した。上清を20％ショ糖クッションを通して100,000 x gで90分間遠心した。その後、ペレットをPBSに再懸濁し、20-66％ショ糖密度勾配の上部に静かに重層した。その勾配を、平衡に達するように100,000 x gで20時間遠心分離した。勾配の上端から始めて、18個の 2ml画分を回収した。各画分の0.4 mlをウイルス力価の測定のために分取した。各画分を2倍容量の20％PBSに再懸濁し、100,000 x gで1時間の遠心分離によって濃縮した。次に、ペレットを0.05 ml のLaemmliバッファー（Bio-Rad）に再懸濁し、RSV F MAb（NuMax LIFR-S28R）、RSV（Biogenesis）およびbPIV3（VMRD）ポリクローナル抗血清を用いたウエスタンブロットによって、RSVおよびPIV3タンパク質について解析した。バキュロウイルスで発現され、均一に精製したC末端切断型RSV Fタンパク質もまたショ糖密度勾配において分析された。
【０３７０】
それらの画分はまた、ピークウイルス力価についてプラークアッセイによって解析された。（バキュロウイルスで産生されたC末端切断型の）遊離RSV F、RSV A2、およびb/h PIV3の対照勾配を初めに実施した。遊離RSV Fの大部分は、勾配の上部の画分3、4、5、および6に存在した（図１６A)。最大濃度のRSVビリオンは、画分10、11および12において観察された（図１６B) 。RSV画分は、RSV F MAbだけでなくRSVポリクローナル抗血清によってプローブされた。最大量のRSVビリオンを含む画分はまた、RSV Fに対する最も強いシグナルを示し、RSV F タンパク質がRSVビリオンとともに移動し、RSVビリオンに関連していることを示唆した（図１６B)。これらの画分はまた、最も高いウイルス力価を示した（図１６B)。b/h PIV3ビリオンはより多形性であるのかもしれず、従ってb/h PIV3ビリオンを含むピーク画分の広がりはより広範囲であった。b/h PIV3ビリオンは画分9、10、11、12、および13に存在した（図１６C)。先と同様に、ほとんどの量のビリオンを含む画分はまた、プラークアッセイによって最も高いウイルス力価を示した（図１６C)。b/h PIV3/RSV F2のショ糖密度勾配画分を、PIV3ポリクローナル抗血清とRSV F MAbとの両方で解析した（図１６D)。ビリオンの大部分を含む画分は、PIV3抗血清を用いたウエスタンによって示されるように、画分11、12、13、および14であった。それに相当して、これらはまた最大量のRSV Fタンパク質を示す画分であった。しかし、いくらかの遊離RSV Fはまた画分5および6に存在した。画分11、12、13および14はピークウイルス力価を示した（図１６D)。同様に、b/h PIV3/RSV G2のビリオンの大部分を含む画分（画分9、10、11、および12）はまた、RSV Gタンパク質に対する最も強いシグナルを示した（図１６E)。先と同様に、これらは最も高いウイルス力価を有する画分であった（図１６E)。全体として、これらのデータは、RSV FおよびGタンパク質の大部分がb/h PIV3ビリオンととともに移動し、b/h PIV3ビリオンに関連していることを示唆した。しかし、いくらかの遊離RSVタンパク質はまた、勾配
の上部の画分に存在した。
【０３７１】
24. 実施例１９：キメラウシ・パラインフルエンザ3型/ヒト・パラインフルエンザ3型ベクター化呼吸器多核体ウイルス（RSV）はRSV抗血清によって中和できなかった
b/h PIV3 ビリオンに組み込まれたRSV表面糖タンパク質がウイルストロピズム表現型の変化を引き起こすかどうかという重要な安全性の問題に対処するために、中和アッセイを行った（表６および７）。b/h PIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルスまたはRSVについてVero細胞を用いて中和アッセイを行った。連続的に2倍希釈したRSVポリクローナル抗血清（Biogenesis; Poole, England）、Dr. Judy Beeler およびWHO 試薬バンクから得られたRSV F Mab（1200 MAb）（Beeler および Coelingh, J. Virol. (1989) 63 (7): 2941-50）、ならびにhPIV3 F（C191/9）MAbおよびHN（68/2）Mab（van Wyke CoelinghおよびTierny, J Virol. 1989 63 (9): 3755-60; van Wyke Coelinghら、1985）を、約100 PFUのb/h PIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルスまたはRSVのいずれかとともに0.5 mlのOptiMEM中で室温において60分間インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、35℃で1時間培養し、EMEM/L-15培地（JRH Biosciences; Lenexa, KS）中の1％メチルセルロースをオーバーレイし、35℃で培養した。接種6日後、感染細胞単層を免疫染色した。中和力価は、ウイルスプラークの50％を阻害する最高血清希釈の逆数として表された。RSV F MAb（WHO 1200 MAb）は、野生型RSV A2の50％を1:2000希釈で中和した（表６）。対照的に、1:25希釈であっても、いずれのキメラb/h PIV3/RSVも中和しなかった。同様に、1:400希釈のポリクローナルRSV抗血清（Biogenesis）はRSV A2の50％を中和したが、1:15.6希釈であっても、b/h PIV3 RSVを中和しなかった（表６）。
【表６】
2011167197.tif 000008
【０３７２】
hPIV3 F MAb C191/9は、b/hPIV3ならびにb/h PIV3/RSVの50％を1:500希釈で中和した（表７）。hPIV3 HN MAb 68/2は、b/h PIV3を1:16,000希釈で、b/h PIV3/RSVを1:32,000希釈で中和した（表７）。
【表７】
2011167197.tif 000009
【０３７３】
また、モルモットの補体が存在する以外同一の条件を用いてこれらのアッセイを行ったが、b/h PIV3/RSVの中和は依然として観察されなかった。RSVポリクローナル抗体ならびにRSV Fモノクローナル抗体を用いて得られた結果は、b/h PIV3によって発現されるRSV Fタンパク質がビリオンエンベロープに組み込まれないことを示唆した。使用したアッセイが、ビリオン表面の少量のRSV Fタンパク質を検出するのに十分な感度ではなかったのかもしれない。しかし、たとえ低レベルのRSV Fがb/h PIV3/RSV F2ビリオン表面に存在したとしても、RSV Fタンパク質はPIV3 Fタンパク質を機能的に置換することができなかった。この問題を更に研究するために、RSV Fタンパク質をビリオン膜に挿入できなくさせる、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損した可溶型のRSV Fタンパク質を発現するb/h PIV3を作製した（図１４）。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの除去は、RSV Fタンパク質のC末端の50アミノ酸を削除することによって達成された。sol RSV F遺伝子カセットのbPIV3遺伝子末端配列および遺伝子開始配列は、完全長RSV F遺伝子カセットのそれと同一のままであった（図１４）。両キメラb/h PIV3は、天然型および可溶性のRSV Fタンパク質を効率的に発現し、組織培養において107〜108 PFU/mlの高い力価で複製した。これらのデータは更に、RSVタンパク質は機能的ではなかった、すなわち、RSV Fタンパク質はhPIV3 F 抗体によって遮断されるhPIV3 Fタンパク質を機能的に置換できなかったことを示した。従って、RSVおよびhMPVに由来する外来抗原を発現するb/h PIV3のウイルストロピズムの変化は、考えにくい。
【０３７４】
25. 実施例２０：キメラウシPIVは、in vivo投与した場合、弱毒化表現型を示し、強い防御反応を誘導する
5週齡のSyrian Goldenハムスターを5 x 105 pfuの野生型bPIV3、組換えbPIV3、hPIV3、ヒト/ウシPIV3およびプラセボに感染させた。5つの異なる動物群を別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。感染4日後に、動物を屠殺した。動物の鼻甲介および肺をホモジェナイズし、-80℃で保存した。組織中に存在するウイルスをMDBK細胞における37℃でのTCID50アッセイによって測定した。ウイルス感染をモルモット赤血球による赤血球吸着によって確認した。表８は、ハムスターの肺および鼻甲介における様々なPIV3株の複製力価を示す。組換えbPIV3およびb/h PIV3キメラウイルスがハムスターの肺において弱毒化していることに注目されたい。
【表８】
2011167197.tif 000010
【０３７５】
更に、感染前および感染21日後にハムスターから採取した血清サンプルを赤血球凝集阻害アッセイで解析した。血清サンプルをレセプター破壊酵素（RDE, DENKA Seiken Co.）で処置し、非特異的な凝集素をモルモット赤血球とともに氷上で1時間インキュベーションすることによって除去した。野生型のbPIV3およびhPIV3を、連続的に２倍希釈したハムスター血清サンプルに添加した。最後に、モルモット赤血球（0.5％）を添加し、室温で赤血球凝集を起こさせた。表９は、様々なPIV3株に感染した際にハムスターで生じた抗体応答を示す。b/h PIV3キメラウイルスは野生型hPIV3と同様の強さでhPIV3に対する抗体応答を生じ、組換えbPIV3または野生型bPIV3によって生じる応答をはるかに上回ることに注目されたい。
【表９】
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【０３７６】
これらの結果は、これらの組換え体をワクチン製剤での使用に適切にする本発明のb/h PIV3キメラウイルスの特性を実証する。b/h PIV3キメラウイルスがin vivo投与された場合、弱毒化表現型を示すだけでなく、それらはまた野生型hPIV3と同様の強い抗体応答を生じる。このように、本発明のキメラウイルスは弱毒化表現型を持ち、野生型hPIVと同様の強い免疫応答を誘導するという独特の組合せを有するため、これらのキメラウイルスは、PIVへの感染を阻害するおよび/またはそれに対して防御するためのヒトでの使用の成功に必要な特性を有する。
【０３７７】
26. 実施例２１：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスGまたはFタンパク質の、ハムスターの上気道および下気道での複製
5週齡のSyrian Goldenハムスター（１群あたり６匹）を、100μlの容量中1 x 106 PFUまたは1 x 104 PFUのb/h PIV3、b/h PIV3/RSV、RSV A2、またはプラセボ培地によって鼻腔内に感染させた。異なる群を、別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。感染4日後に、動物の鼻甲介および肺を採取し、ホモジェナイズして、-70℃で保存した。組織に存在するウイルスの力価を、Vero細胞におけるTCID50アッセイによって測定した。チャレンジ試験のため、28日目に動物に1 x 106 pfu/mlのhPIV3またはRSV A2を鼻腔内接種した。チャレンジ4日後に、動物の鼻甲介および肺を単離し、定量のために免疫染色したVero細胞でのプラークアッセイによってチャレンジウイルスの複製についてアッセイした。表１０は、ハムスターの肺および鼻甲介における様々な株の複製力価を示す。
【表１０】
2011167197.tif 000012
【０３７８】
Syrian Goldenハムスターは、組換えbPIV3およびhPIV3遺伝子組換えウイルスの複製および免疫原性の評価に適切な小動物モデルにあたる。外来抗原はビリオンに組み込まれないので（表６および表７）、RSV抗原の導入は、キメラb/h PIV3のハムスターに感染し複製する能力を変化させないだろうと期待された。動物を鼻腔内免疫した場合、その結果は、すべてのキメラb/h PIV3/RSVがハムスターの鼻甲介において4.2〜4.6 log10 TCID50/g組織で複製することを示した（表１０）。これらの複製レベルは4.8 log10 TCID50/g組織を示すb/h PIV3で観察されたものと同様であった（表１０）。Syrian GoldenハムスターはRSVの感染に対して半許容性なだけである。ハムスターの上気道で観察されるRSVの力価は、b/h PIV3のそれらと比較して1.4 log10 TCID50/g組織ほど減少した（表１０）。位置1にRSV遺伝子を含むb/h PIV3/RSVは、ハムスターの肺においてb/h PIV3と比較して0.9〜1.5 log10 減少した力価を示した（表１０）。対照的に、位置2に遺伝子挿入を含むb/h PIV3/RSVは、ハムスターの下気道においてb/h PIV3で観察された力価の0.1 log10以内で複製した（表１０）。位置1または位置2に外来遺伝子を含むキメラPIV3は、ハムスターの下気道および上気道においてb/h PIV3と同様のレベルまで効率的に複製する能力を有した。b/h PIV3ゲノムの位置1または2への付加的な遺伝子の導入は、in vivoでのウイルス複製についてウイルスを著しく弱毒化しなかった。
【０３７９】
27. 実施例２２：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスで免疫したハムスターは、ヒト・パラインフルエンザ3および呼吸器多核体ウイルスA2によるチャレンジから防御された
b/h PIV3/RSVで観察される複製レベルがハムスターにおいて防御免疫応答を誘導するのに十分であるかどうかを評価するために、ワクチン接種後28日目に、動物の鼻腔内に動物あたり106 PFUのRSVまたはhPIV3をチャレンジした。b/h PIV3/RSVで免疫した動物はhPIV3およびRSVから完全に防御された（表１１）。ハムスターの上気道および下気道において、RSVチャレンジウイルスは非常に低いレベルで検出され、hPIV3チャレンジウイルスはまったく観察されなかった。プラセボ培地を受けた動物のみが、上気道ならびに下気道において、4.4および4.1 logl0 TCID50/g組織のhPIV3、ならびに3.6および3.1 log10 pfu/g組織のRSVを示した（表１１）。この研究はまた、RSVで免疫された動物がhPIV3によるチャレンジから防御されなかったことを示した。同様に、hPIV3をワクチン接種した動物は、高い力価のRSVチャレンジウイルスを示した（表１１）。
【表１１】
2011167197.tif 000013
【０３８０】
28. 実施例２３：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスによるハムスターのワクチン接種は、血清HAI抗体および中和抗体を誘導する
チャレンジ用量を投与する前、28日目にb/h PIV3/RSVで免疫した動物から血清サンプルを採取した。RSV中和抗体の存在については50％プラーク減少アッセイを用いて、PIV3 HAI血清抗体については赤血球凝集阻害（HAI）アッセイを実施することによって、ハムスター血清を分析した（表１２）。以下のように50％プラーク減少アッセイ（中和アッセイ）を行った。すなわち、ハムスター血清を連続的に２倍希釈し、100 PFUのRSV A2とともに1時間インキュベートした。その後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、メチルセルロースをオーバーレイした。35℃で5日間培養した後、定量のためにRSVポリクローナル抗血清を用いて単層を免疫染色した。赤血球凝集阻害（HAI）アッセイは、連続的に２倍希釈した28日目のハムスター血清を25℃で30分間hPIV3とともにV底の96ウェルプレート中でインキュベートすることによって行われた。その後、モルモット赤血球を各ウェルに添加し、更に90分間のインキュベーションを続けて、各ウェルにおける赤血球凝集の有無を記録した。力価は赤血球凝集を阻害する最高血清希釈の逆数のlog2の平均として表された。
【表１２】
2011167197.tif 000014
【０３８１】
その結果は、ゲノムの位置1または位置2においてRSV Fタンパク質を発現するウイルスがそれぞれ5.5および6.9 log2のRSV中和抗体力価を示すことを示した。これらの力価は、野生型RSVをワクチン接種した動物から得られた血清で観察される抗体力価よりわずかに低かった（表１２）。一方、RSV Gタンパク質を発現するウイルスは、約50％まで減少したRSV中和抗体力価を示した（表１２）。すべてのキメラb/h PIV3/RSVハムスター血清は、b/h PIV3で観察されるレベルと比較して0.5〜2.0 log2ほど減少したHAI血清抗体のレベルを示した（表１２）。結果は、キメラb/hPIV3/RSVがハムスターに感染して効率的に複製することができ、hPIV3およびRSVへの防御免疫応答を誘導できることを示した。
【０３８２】
29. 実施例２４：低用量のウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化呼吸器多核体ウイルスによるハムスターのワクチン接種は、呼吸器多核体ウイルスA2によるチャレンジからハムスターを防御し、血清HAI抗体および中和抗体を誘導する
最良のワクチン候補を同定するために、異なる構築物を含む（実施例２参照）低用量のウイルスを用いてハムスターを免疫した。チャレンジ試験の結果を表１３に要約する。
【表１３】
2011167197.tif 000015
【０３８３】
次に、中和抗体の力価を50％プラーク減少アッセイ（中和アッセイ）によって測定した。b/h PIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルスまたはRSVについてVero細胞を用いて中和アッセイを行った。連続的に２倍希釈したRSVポリクローナル抗血清（Biogenesis; Poole, England）、MedImmuneから得られたRSV F MAb（WHO 1200 MAb）、またはhPIV3 F（C191/9）MAbおよびHN（68/2）MAbを、b/h PIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルスもしくはRSVのいずれか約100 PFUとともに0.5 ml OptiMEM中で60分間室温でインキュベートした。インキュベーション後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、35℃で1時間培養し、EMEM/L-15培地（JRH Biosciences; Lenexa, KS）中の1％メチルセルロースをオーバーレイし、35℃で培養した。接種6日後、感染細胞単層を免疫染色した。中和力価は、ウイルスプラークの50％を阻害する最高血清希釈の逆数として表された。また、感染28日後にb/hPIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルスまたはRSV A2で免疫したハムスターから得られた血清についても、中和アッセイを実施した。ハムスター血清を連続的に２倍希釈し、100 PFUのRSV A2とともに1時間インキュベートした。その後、ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、メチルセルロースをオーバーレイした。35℃で5日間のインキュベーション後、定量のためにRSVポリクローナル抗血清を用いて単層を免疫染色した。ハムスターの前血清の中和抗体の力価は< 1.0であり、HAI抗体の力価は< 4.0であった。
【０３８４】
赤血球凝集阻害（HAI）アッセイは、連続的に２倍希釈した28日目のハムスター血清を25℃で30分間hPIV3とともにV底の96ウェルプレート中でインキュベートすることによって行われた。その後、モルモット赤血球を各ウェルに添加し、更に90分間のインキュベーションを続けて、各ウェルにおける赤血球凝集の有無を記録した。表１４はその結果を要約する。
【表１４】
2011167197.tif 000016
【０３８５】
接種用量を動物あたり1 x 104 pfuに減少させた場合、第一位置にRSV遺伝子を有するキメラウイルスの制限された複製表現型を悪化させた。b/h PIV3/RSV F1およびG1はハムスターの上気道においてb/h PIV3の力価と比較して1.0〜2.0 log10ほど減少した力価で複製した（表１３）。一方、位置2にRSV遺伝子を有するb/h PIV3/RSVは、上気道においてb/hPIV3で観察されるレベルで複製した。ハムスターの肺での複製もまた、第一位置にRSV遺伝子を含むb/h PIV3/RSVにおいて、より制限されていた（表１３）。一方、b/h PIV3/RSV F2は依然として、鼻甲介および肺においてそれぞれ、105.2 および103.9の高い力価で複製した（表１３）。ワクチン接種したハムスターに28日目に1 x 106 pfuのRSV A2をチャレンジした（表１３）。ハムスターの気道で観察された低レベルの複製にも関わらず、動物は下気道と上気道の両方においてRSVによるチャレンジから防御された（表１３）。防御の程度は、wt RSVを用いてワクチン接種した動物で観察されたものと同様に良好であった。プラセボ培地を受けた動物のみが、鼻甲介および肺において高いウイルス力価を示した（表１３）。免疫したハムスターから28日目に血清を採取し、RSV中和抗体およびPIV3 HAI血清抗体の存在について分析した（表１４）。b/h PIV3/RSVを用いて免疫したハムスターから得られた血清では、wt RSV血清で観察される力価と比較して、RSV中和抗体力価の約50％の低下が観察された（表１４）。しかし、位置2にRSV遺伝子を含むb/h PIV3を受けた動物から得られた血清は、依然として、位置1にRSV遺伝子を有するb/h PIV3/RSVからの血清で観察されるよりも高いRSV中和抗体力価を示した。PIV3 HAI血清抗体の力価もまた、b/h PIV3血清と比較してわずかに減少していた（表１４）。
【０３８６】
30. 実施例２５：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化ヒト・メタニューモウイルスFで免疫したハムスターは、ヒト・パラインフルエンザウイルス3またはヒト・メタニューモウイルスNL/001によるチャレンジから防御された
5群のSyrian Goldenハムスター（各群は６匹のハムスターを有した）を、それぞれb/hPIV3、b/h hMPVF1、b/h hMPV F2、hMPVまたはプラセボによって免疫した。５つの異なる動物群を、別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。免疫後28日目に、ハムスターに1 x 106 PFUのhPIV3 またはhMPV（NL/001株）のいずれかをチャレンジして、b/h PIV3/hMPV Fによって誘導される免疫原性を評価した。チャレンジ4日後、動物を屠殺した。動物の鼻甲介および肺をホモジェナイズし、-80℃で保存した。組織中に存在するウイルスをMDBK細胞における37℃でのTCID50アッセイによって測定した。ウイルス感染をモルモット赤血球による赤血球吸着によって確認した。表１５は、ハムスターの肺および鼻甲介におけるPIV3株ならびにMPV株の複製力価を示す。
【表１５】
2011167197.tif 000017
【０３８７】
結果は、b/h PIV3/hMPV F2（位置2にF）を受けた動物が完全にhMPVならびにhPIV3から防御されることを示した（表１５）。しかし、b/h PIV3/hMPV F1（位置1にF）は上気道（例えば鼻甲介）において感染したhMPVの力価を2.5 logsほどしか減少させなかったが、一方、それは下気道（例えば肺）においてhMPVおよびhPIV3の両方の感染から完全に防御した（表１５）。プラセボ培地を投与された動物は、下気道および上気道において高力価のチャレンジウイルスを示した（表１５）。
【０３８８】
31. 実施例２６：ウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化ヒト・メタニューモウイルスをワクチン接種したハムスターは、hMPV中和抗体およびPIV3 HAI血清抗体を産生した
チャレンジウイルスを投与する前に28日目のハムスターから血清サンプルを採取し、hMPV中和抗体およびHAI血清抗体の存在について分析した（表１６）。wt hMPVを感染させた動物由来の血清では、7.36 log2の高レベルのhMPV中和抗体が観察された。b/h PIV3/hMPV F1またはF2をワクチン接種したハムスターから得られた血清は、それぞれ7.77および7.38 log2の中和抗体力価を示し、それは野生型hMPV血清で観察されたものと同等であった（表１６）。HAI抗体レベルもまた、ウイルスベクターであるb/hPIV3で観察されたものと同様であった。キメラb/hPIV3/hMPV F1ならびにF2は、それぞれ5.78および6.33 log2のHAI力価を示し、それはb/h PIV3感染ハムスター血清から得られたHAI力価と比較して1.2および0.7 log2ほど減少した（表１６）。
【表１６】
2011167197.tif 000018
【０３８９】
要約すると、結果は、b/h PIV3ゲノムの位置1または位置２においてhMPV Fを発現するb/h PIV3がSyrian Goldenハムスターに効率よく感染、複製することができ、防御免疫応答を誘導し、hPIV3およびhMPVによるチャレンジから防御することができることを示した。これらのキメラウイルスによるハムスターの免疫はまた、それぞれwt hMPVまたはb/hPIV3で観察されるものと同様のレベルのhMPV中和抗体およびHAI血清抗体の産生を誘導した。
【０３９０】
32. 実施例２７：三価のウシ・パラインフルエンザ3/ヒト・パラインフルエンザ3ベクター化構築物はハムスターにおいて複製し、ハムスターをhMPV/NLl/00、hPIV3およびRSV A2 から防御する
5週齡のSyrian Goldenハムスター（群あたり6匹）を、それぞれ0.1 ml容量中1.0 x 106 PFUのb/h PIV3ウイルスおよび1.0 x 105 PFUの三価ウイルスb/h PIV3/RSV Fl/hMPV F3を用いて鼻腔内から感染させた。異なる群を、別々にマイクロアイソレーターケージで維持した。感染4日後に、動物の鼻甲介および肺を採取し、ホモジェナイズして、-70℃で保存した。組織に存在するウイルスの力価を、Vero細胞におけるTCID50アッセイによって測定した。表１７は、ハムスターの肺および鼻甲介における異なる株の複製力価を示す。
【表１７】
2011167197.tif 000019
【０３９１】
b/h PIV3/RSV F1/hMPV F3で観察される複製のレベルがハムスターにおいて防御免疫応答を誘導するのに十分であるかどうか評価するために、28日目に動物に1 x 106 PFUのhPIV3、1 x 106 PFUのRSV、および1.0 x 105 PFUのhMPV/NL/1/00を鼻腔内チャレンジ（接種）した。チャレンジ4日後、動物の鼻甲介および肺を単離し、チャレンジウイルスの複製について、定量のために免疫染色したVero細胞におけるプラークアッセイによってアッセイした。この研究は、ワクチン接種の28日後、b/h PIV3/RSV Fl/hMPV F3で免疫した動物が３つのウイルスすべてから防御される、すなわち、hPIV3、RSVおよびhMPV（hMPV/NL/1/00）ウイルスから防御されることを示した（表１８）。
【表１８】
2011167197.tif 000020
【０３９２】
33. 実施例２８：RSVの天然型また可溶性の融合タンパク質を発現するb/h PIV3は、アフリカミドリザルにおいてRSV感染からの完全な防御を賦与する
２つの見込みのあるRSVワクチン候補、b/h PIV3/RSV F2（実施例２参照）およびb/h PIV3/sol RSV F2（実施例１１参照）を、非ヒト霊長類モデルにおける有効性および免疫原性について、本研究で評価した。b/h PIV3ベクターを用いて、天然型および可溶型のRSV Fタンパク質を、NとPの間に近接したPIV3ゲノムの位置2から発現させた。以前のb/h PIV3/RSV F2の解析は、高レベルのRSV Fタンパク質がキメラb/h PIV3によってこのゲノム位置から発現されること、ならびに、このワクチンによってワクチン接種されたハムスターがRSVチャレンジおよびhPIV3チャレンジの両方から防御されることを示した。ビリオンエンベロープに挿入され得る天然のRSV F、またはビリオンに組み込まれることができない可溶性RSV Fタンパク質のいずれかを発現する、２つのb/h PIV3ワクチンの有効性を比較した。可溶性RSV Fタンパク質は、膜貫通ドメインの欠如のためにビリオンエンベロープに固定されることができない。
【０３９３】
RSV F遺伝子はRSVのサブグループAとBとの間で高度に保存されているので、b/h PIV3によるRSV Fタンパク質の発現に応答して産生される抗体は、RSVのすべての株による感染に対して交差中和および交差防御をもたらすと期待される。b/h PIV3/RSV F2 およびb/hPIV3/sol RSV F2の両方は、PIV3ゲノムの位置2から効率的にRSV Fタンパク質を発現した。アフリカミドリザル（AGM）の気道における複製のレベルについて、および野生型RSVチャレンジからの防御免疫応答を誘導する能力について、これらのRSVワクチンを解析した。
【０３９４】
この実施例に記載される研究は、両RSVワクチン候補、b/hPIV3/RSV F2およびb/h PIV3/sol RSV F2が有効であり、非ヒト霊長類を完全にRSVチャレンジから防御することを示した。両方のPIV3ベクター化RSVキメラは、更にヒトの臨床試験で評価されるべき魅力的なワクチンであることを意味する。今のところ、誘導された防御免疫応答ならびに産生されたRSVおよびhPIV3抗体力価に基づいて、b/hPIV3/RSV F2およびb/h PIV3/sol RSV F2は同等の応答を示した。両PIV3/RSVワクチン候補について更に詳細な安全性プロファイルを確立するために、コットンラットモデルにおける亢進したRSV疾患についての更なる安全性評価ならびにハムスターにおける組織トロピズムの研究が実施され得る。最良の安全性プロファイルを示すPIV3/RSVワクチンは、有効かつ安全なRSVワクチンを作製するために、臨床試験において成人および子供で更に評価されるであろう。
【０３９５】
1. 材料および方法
細胞およびウイルス
2 mM L-グルタミン、非必須アミノ酸（NEAA）、抗生物質、および10％FCSを補給したModified Eagle's Medium（MEM）（JRH Biosciences）中で、Vero細胞を維持した。b/h PIV3/RSV F2、b/h PIV3/sol RSV F2、RSV A2、RSV B 9320、hMPV/NL/1/00をVero細胞で増殖させた。細胞に0.1 PFU/細胞の感染の多重度（MOI）でウイルスを感染させた。感染3〜5日後、細胞および上清を回収し、1 xの最終濃度になるよう10 x SPG（10 x SPGは2.18 Mショ糖、0.038 M KH2PO4、0.072 M K2HP04、0.054 M L-グルタミン酸）を添加することによって安定化した。ウイルスストックを-70℃で保存した。ウイルス力価をVero細胞でのプラークアッセイによって測定した。プラークを、PIV3（VMRD）またはRSVヤギポリクローナル抗血清（Biogenesis）を用いた免疫ペルオキシダーゼ染色後に定量した。
【０３９６】
霊長類での研究
研究開始日の14日前に採取した霊長類の前血清について、RSV F IgG ELISA（Immuno- Biological Laboratories）および赤血球凝集阻害（HAI）アッセイ（下記に記載される）を用いて、RSVおよびPIV3に対する血清反応陰性のアフリカミドリザル（Cercopithecus aethiops）（3.5〜6.5歳、2.6〜5.8 kg）を同定した。 その霊長類を個別のマイクロアイソレーターケージで飼育した。それらのサルをケタミン-バリウム混合物で麻酔し、鼻腔内および気管内にb/h PIV3/RSV F2、b/h PIV3/sol RSV F2、RSV A2、およびhMPV/NL/1/00を感染させた。経鼻投与容量は鼻孔あたり0.5 mlであり、気管内投与容量は1 mlであった。1日目に、各動物は2〜3 x 105 PFUのウイルスを含む2 mlの投与を受けた。プラセボ動物群は同一の投与容量のOpti-MEMを受けた。28日目に、すべての動物に7 x 105 PFUのRSV A2（各部位に1 ml）を気管内および鼻腔内チャレンジした。鼻咽頭（NP）スワブを毎日11日間採取し、気管洗浄（TL）検体を免疫後およびチャレンジ後1、3、5、7および9日目に採取した。大腿静脈から得られる血液サンプルを血清学的解析のために0、7、14、21、28、35、42、49および56日目に採取した。発熱を示す体温変化、風邪の徴候、鼻水、くしゃみ、食欲不振、および体重について、動物を観察した。霊長類のNPおよびTL検体に存在するウイルスを、RSV ヤギポリクローナル抗血清で免疫染色したVero細胞を用いたプラークアッセイによって定量した。平均ピークウイルス力価は、各動物に対して免疫後またはチャレンジ後11日のうちのいずれかにおいて測定されたピークウイルス力価の平均を表す。
【０３９７】
プラーク減少中和アッセイ（PRNA）:
投与1、28、および56日後に、それぞれb/h PIV3/RSV F2およびb/h PIV3/sol RSV F2を感染させた霊長類から採取した血清について、PRNAを行った。霊長類の血清を連続的に２倍希釈し、モルモットの補体の存在下で100 PFUのRSV A2とともに4℃で1時間インキュベートした。ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、2％FBSおよび1％抗生物質を含むEMEM/L-15培地（JRH Biosciences; Lenexa, KS）中の1％メチルセルロースをオーバーレイした。35℃で6日間培養した後、単層を、定量のためにRSVヤギポリクローナル抗血清を用いて免疫染色した。中和力価はウイルスプラークの50％を阻害する最高血清希釈の逆数のlog2として表された。
【０３９８】
RSV F IgG Elisa :
ワクチン接種した動物からの1、28、および56日目の霊長類の血清を、ELISA kit（Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Germany）を用い、メーカーの使用説明書に従って、RSV F IgGの存在について分析した。サルの二次抗血清（Rockland Inc.）を1: 1000希釈で使用した。RSV F IgG抗体力価はlog2 IgG U/mlとして表された。
【０３９９】
hPIV3 マイクロ中和アッセイ:
Vero細胞でマイクロ中和アッセイを行った。1:4から開始し、連続的に２倍希釈した霊長類血清を、100 TCID50のhPIV3とともに37℃で60分間インキュベートした。次に、ウイルス血清混合物を96ウェルプレート中の細胞単層に移し、37℃で6日間培養し、その後すべてのウェルをCPEについて観察した。中和力価はCPEを阻害する最高血清希釈の逆数として表された。<1:4の中和抗体力価（検査される最低血清希釈）を、逆数のlog2の力価2とする。
【０４００】
PIV3赤血球凝集阻害（HAD）アッセイ:
連続的に２倍希釈した霊長類血清を8 HA units/0.05 mlのbPIV3またはhPIV3のいずれかとともに25℃で30分間インキュベートすることによって、HAIアッセイを行った。続いて、モルモット赤血球を各ウェルに加え、90分間インキュベーションを続け、各ウェルを赤血球凝集について観察した。HAI力価は、ウイルスを介した赤血球の凝集を阻害する抗血清の最高希釈の逆数として表された。
【０４０１】
2. 結果
b/h PIV3/RSV F2およびb/h PIV3/sol RSV F2はAGMの気道において効率的に複製した
AGMは下気道および上気道における高レベルのRSV AならびにRSV Bの複製を支持することを示した。b/h PIV3/RSV F2およびb/h PIV3/sol RSV F2ワクチンの複製効率を研究するために、以下のように実験を計画した（図１７）。簡潔には、1日目に、RSVおよびPIV3に対する血清反応陰性のAGM、群あたり4匹の動物を、2〜3 x 105 PFUの用量でのb/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/sol RSV F2によって鼻腔内および気管内免疫した。陽性対照群には野生型RSV A2を感染させ、陰性対照群にはプラセボ培地を投与した。28日目に、すべての動物に7 x 105 PFUの野生型RSV A2を鼻腔内および気管内チャレンジした。この研究期間中、動物をマイクロアイソレーターケージで飼育した。鼻咽頭スワブを免疫後およびチャレンジ後毎日11日間採取し、気管洗浄サンプルを免疫後およびチャレンジ後2、4、6、8および10日目に採取した。抗体解析のための血清サンプルを、研究の期間中7日毎に採取した（図１７）。
【０４０２】
表１９に示したように、b/h PIV3/RSV F2によるワクチン接種後、サルは、鼻咽頭では5.6 log10 PFU/mlの平均ピーク力価を示して7日間ウイルスを排泄し、気管では7.0 log10 PFU/mlの平均ピーク力価で9日間ウイルスを排泄した。可溶型のRSV F タンパク質を発現するワクチンウイルス、b/hPIV3/sol RSV F2によるAGMの免疫は、鼻咽頭では5.6 log10 PFU/mlの平均ピーク力価を示す8日間の、気管では6.8 log10 PFU/mlの平均ピーク力価で7日間のウイルス排泄（virus shedding）を引き起こした（表１９）。一方、霊長類のwt RSV A2への感染は、鼻咽頭では3.3 log10 PFU/mlの平均ピーク力価に達する6日間のウイルス排泄、および気管では5.0 log10 PFU/mlのピーク力価を示す8日間のウイルス排泄を引き起こした。プラセボ培地を投与された動物は、ウイルスを排泄しなかった（表１９）。このように、b/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/sol RSV F2による非ヒト霊長類の免疫は、検査された両ワクチン候補に対して、同様に高レベルのウイルスの複製および同様のウイルス排泄の期間をもたらした。実際、b/h PIV3/RSVワクチン候補でのウイルス複製は、野生型RSV A2と比較してURTにおいて200倍高く、LRTにおいて63〜100倍高かった。
【表１９】
2011167197.tif 000021
【０４０３】
ワクチン接種後11日間、鼻漏、鼻水、風邪、または発熱などのRSV疾患の徴候について動物を観察した。この急性ウイルス複製の期間中、疾患の徴候は見られなかった。
【０４０４】
この研究では、両ワクチン候補、b/h PIV3/RSV F2ならびにb/hPIV3/sol RSV F2はそれぞれ、AGMのURTおよびLRTにおいて5.6および7.0 log10 PFU/mlの高い力価で複製した。AGMの気道において２つのRSVワクチン候補で観察された複製力価は、野生型RSV A2のものより高かった。見込みのあるRSV候補ワクチンで観察された複製のレベルは、投与後28日目のwt RSVチャレンジから完全に防御することができた。RSV A2チャレンジウイルスの高い複製力価は、プラセボ培地を投与された動物、または関連パラミクソウイルスであるhMPVをワクチン接種された動物のみで観察され、免疫学的交差防御を引き起こさなかった。
【０４０５】
b/h PIV3/RSV F2またはb/hPIV3/sol RSV F2で免疫したAGMは野生型RSV A2チャレンジから完全に防御された
RSV感染からの免疫防御を評価するために、ワクチン接種された霊長類に高用量の野生型RSV A2を免疫4週間後にチャレンジした。有効性を、感染した動物のURTおよびLRTにおいて排泄されるRSVチャレンジウイルス力価の減少として測定した。b/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/sol RSV F2で免疫された霊長類はwt RSV A2チャレンジから効果的に防御された（表１９）。b/h PIV3/RSV F2をワクチン接種された１匹の動物だけは、鼻咽頭において１日間（1.8 log10 PFU/ml）および気管において１日間（1.6 log10 PFU/ml）、低レベルのチャレンジウイルスを排泄した。この処理群の平均ピーク力価は、URTにおいて1.2 log10 PFU/mlであり、LRTにおいて1.2 log10 PFU/mlであった。b/hPIV3/sol RSV F2を投与された動物もまた、wt RSVチャレンジから完全に防御された（表１９）。１匹の動物は鼻咽頭において３日間低レベルのチャレンジウイルス排泄（1.3 log10 PFU/ml）を示したが、この動物は気管ではRSVを排泄しなかった。b/h PIV3/sol RSV F2で免疫した霊長類で観察される平均ピーク力価は、鼻咽頭において1.1 log10 PFU/mlであり、気管において1.0 log10 PFU/mlであった。同様のレベルの免疫防御は、wt RSV A2に感染したAGMで観察された（表１９）。この群は、鼻咽頭および気管においてそれぞれ、1.2 log10 PFU/mlおよび1.0 log10 PFU/mlの排泄RSVチャレンジウイルスのレベルを示した。RSVに感染した１匹の動物は、１日目に鼻咽頭において１日間低レベルのRSVチャレンジウイルス（1.3 log10 PFU/ml）を排泄した。対照的に、プラセボ培地を受けた処理群は、鼻咽頭において4.3 log10 PFU/mlおよび気管において5.7 log10 PFU/mlの高レベルのRSVチャレンジウイルスの複製を示し、その霊長類はURTとLRTとの両方において８日間、チャレンジウイルスを排泄した。関連パラミクソウイルスであるhMPVを投与されたAGMは、１日目にRSVチャレンジから防御されず、URTおよびLRTにおいて８日間、RSVチャレンジウイルスを排泄した。AGMのURTおよびLRTにおいて、4.0 log10 PFU/mlおよび5.0 log10 PFU/mlの平均ピーク力価が観察された（表１９）。これらの結果は、いずれのRSVワクチン候補によるワクチン接種も、その後の野生型RSV感染から非ヒト霊長類を効果的に防御できることを示した。
【０４０６】
b/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/sol RSV F2 で免疫したAGMは防御RSV血清抗体を産生した
b/h PIV3ベクター化RSVワクチン候補の有効性を、免疫4週間後に産生されたRSV中和抗体力価およびRSV F IgG血清抗体力価のレベルによって、更に評価した。RSV中和抗体力価を、50％プラーク減少中和アッセイ（PRNA）を用いて測定した（表２０）。 
【表２０】
2011167197.tif 000022
【０４０７】
野生型RSV A2に感染したAGMは、感染4週間後、PRNAにおける抗原としてRSVサブグループAを用いた場合、9 log2の高いRSV中和抗体力価を示した。PRNAにおいてRSVサブグループBを用いた場合、RSV中和抗体力価の5 log2の減少が観察された。ワクチン候補、b/h PIV3/RSV F2およびb/h PIV3/sol RSV F2は、投与28日後、RSVサブグループAまたはBを抗原として用いた場合、〜4 log2のRSV中和抗体力価を示した。一方、プラセボ培地を投与された動物由来の血清は、RSVサブグループAまたはBのいずれに対してもRSV中和抗体力価を示さなかった。また56日目、RSVチャレンジの4週間後に採取された血清を、RSV中和抗体の存在について検査した（表２０）。野生型RSV A2に感染したAGM由来の56日目血清は、RSVサブグループAを検査した場合、RSV中和抗体力価の1.7 log2の増加を示したが、RSV中和抗体力価はサブグループBでは増加しなかった。b/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/sol RSV F2で免疫された霊長類由来の56日目血清での中和抗体力価の有意な上昇は、サブグループAまたはB抗原のいずれに対しても観察されなかった。プラセボ動物血清サンプルは、サブグループA RSVに対しては56日目でのRSV中和抗体力価の7 log2の増加を示したが、サブグループBに対しては低レベルの中和抗体のみを示した。
【０４０８】
ベクターされたPIV3/RSVによって誘導される免疫応答を更に測定するために、RSV Fタンパク質特異的IgGレベルを、投与前（1日目）、投与4週間後（28日目）、およびチャレンジ4週間後（56日目）に解析した（表２０）。すべての処理群からの投与前の霊長類血清は、3.6 log2 IgG U/mlより低い値を示し、RSV F特異的IgGの欠如を示した。一方、ワクチン接種の4週間後、b/h PIV3/RSV F2またはb/hPIV3/sol RSV F2由来の血清でのRSV F特異的IgGレベルは、それぞれ8.2および8.0 log2の力価を示した。同様のレベルの8.6 log2 RSV F IgG力価が、RSV A2感染動物由来の28日目血清において観察された。プラセボ動物の28日目血清だけがRSV F IgGを含まなかった。RSV A2、b/h PIV3/RSV F2、およびb/h PIV3/sol RSV F2で免疫された動物由来の56日目血清でのRSV F IgG力価は、28日目血清で観察されるレベルから0.5〜1.4 log2上昇した。対照的に、wt RSV A2 をチャレンジしたプラセボ動物から採取された56日目血清は、RSV F特異的IgG力価において7 log2の上昇を示した。PIV3/RSV Fワクチンによってワクチン接種された非ヒト霊長類は、明らかに、RSVチャレンジから完全に動物を防御するのに十分なRSV特異的中和抗体力価およびIgG抗体力価を産生した。
【０４０９】
キメラb/h PIV3/RSV Fワクチンは、RSVサブグループAおよびBの両方に特異的なRSV中和抗体を産生させた。サブグループAおよびBのRSV Fタンパク質間のアミノ酸配列の高度の保存が、共通の中和エピトープをもたらした。RSV中和抗体力価のレベルは、b/h PIV3/RSV Fでは、RSV A2に感染したAGMから得られた霊長類血清で観察されるものより5 log2ほど低かった。b/hPIV3/RSVワクチンでは、RSV中和抗体はRSVウイルス粒子全体よりむしろRSV Fタンパク質のみに応答して産生された。野生型RSV A2に感染したAGMから得られた血清でのRSV B交差中和抗体のレベルは、同種RSV A2抗原を検査した際に観察された抗体レベルと比較して、5 log2ほど減少した。対照的に、b/h PIV3/RSV F2およびb/h PIV3/sol RSV F2によって産生されたRSV B特異的中和抗体力価の減少は観察されなかった。
【０４１０】
これらの結果は、RSV Fタンパク質によって誘導される血清中和抗体レベルが、霊長類をRSVチャレンジから完全に防御するのに十分であることを示唆した。RSV中和抗体力価はb/h PIV3/RSV F霊長類血清ではより低かったが、サブグループAおよびB RSV株に対する中和抗体は同等であった。野生型RSV感染に由来する霊長類血清は、同種RSV A2抗原に対する高いRSV中和力価、およびRSV B抗原に対するより低いレベルを示し、RSV B抗原に対するレベルはベクターされたPIV3/RSV Fワクチンで観察されたそれらに対する力価と同様であった。RSV F IgG抗体力価の有意な増加（> 6 log2）は、RSV A2に感染した霊長類、またはb/h PIV3/RSV Fワクチンによって免疫された霊長類で観察された。RSVチャレンジに応答したRSV中和力価またはIgG抗体力価のいずれの更なる増加も、b/h PIV3/RSV Fまたはb/h PIV3/sol RSV Fによってワクチン接種された動物において観察されなかった。PIV3/RSV F ワクチンに対して測定されたRSV中和抗体力価はwt RSVに感染した霊長類から得られた血清で観察されたものより低かったので、細胞性免疫応答がこのように効果的なRSVチャレンジからの防御をもたらす役割を担っているのかもしれない。弱毒化PIV3/RSV生ワクチンの有効性への細胞免疫系の寄与に取り組むために、更なる研究が行われうる。
【０４１１】
b/h PIV3ベクターは、ウイルスゲノムの大部分が子供において安全であることが証明されているbPIV3に由来するので、ヒトにおいて弱毒化されていることが予想される（Karronら、Pediatr. Infect. Dis. J. 15: 650-654 (1996)を参照されたい）。Skiadopoulosらは、アカゲザル弱毒化モデルを用いて、bPIV3の弱毒化表現型が多遺伝子性の性質であることを明白に示した（Skiadopoulosら、J. Virol. 77:1141-1148 (2003); Van Wyke Coelinghら、J. Infect. Dis. 157: 655-662(1988)を参照されたい）。bPIV3 FおよびHN遺伝子は弱毒化を指定するいくつかの遺伝的決定基を含みうるが、弱毒化表現型への最大の寄与はbPIV3 NおよびPタンパク質であるとされた。Schmidtらは、異なるPIV3ゲノム位置からRSV抗原を発現する多数のb/h PIV3を、アカゲザルの気道での複製について評価した（Schmidtら、J. Virol. 76:1089-1099 (2002); Van Wyke Coelinghら、J. Infect. Dis. 157: 655-662 (1988)を参照されたい）。RSVタンパク質を発現するすべてのキメラb/h PIV3はURTにおいてb/h PIV3より低い効率で複製し、アカゲザルのLRTではベクターb/h PIV3と比較してごくわずかに高い力価（〜0.5 log10 TCID50/ml）が観察された。これらのデータは、b/h PIV3/RSVがヒトにおいて弱毒化されているという予想の正当性を更に立証する。
【０４１２】
幼児は十分に発達した免疫系を持たず、そのため、長期間持続し防御作用のあるRSVに対する免疫を発達させるために、複数回のワクチン投与が必要でありうる。生後2、4、および6ヶ月の想定ワクチン接種計画が考えられ、理想的には他の通常の幼児期ワクチン接種と同時に計画される。PIV3は高度に免疫原性があり、最初のPIV/RSVワクチン接種は高レベルのPIV3抗体を誘導する。これはベクター免疫を誘導して、その後のPIV/RSVによる免疫付与が更なる抗体力価の上昇を引き起こさないかもしれない。Karronらによる最近の研究は、投与間隔が十分に離れていれば、PIV3の反復投与はベクター免疫を誘導しないであろうことを示すデータを提示した（Karronら、Pediatr. Infect. Dis. J. 22: 394-405 (2003)を参照されたい）。低温で継代した温度感受性ウイルスであるcp-45 PIV3ワクチンの単回投与は、2回目の投与後のワクチン複製の規模を制限した。しかし、２回目のワクチンの投与による感染の頻度は明らかに投与間隔に影響された。2回目のワクチンの投与が1ヶ月後に行われた場合、幼児のわずか24％しかウイルスを排泄しなかった。一方、2回目の投与が１回目の投与の3ヶ月後に行われた場合、幼児の62％がウイルスを排泄した。これらの結果は、PIV3ベクター免疫の影響を最小限にするために、ワクチン接種の間隔は1ヶ月以上だが3ヶ月以下にすべきであることを示唆した。
【０４１３】
AGMのPIV3/RSV免疫はhPIV3中和抗体およびHAI血清抗体の産生を引き起こした
b/h PIV3/RSVワクチンがRSV感染およびhPIV3感染から防御できたかどうかを評価するために、hPIV3中和抗体およびHAI血清抗体の存在について霊長類血清を分析した（表２１）。
【表２１】
2011167197.tif 000023
【０４１４】
b/h PIV3/RSV F2ならびにb/h PIV3/sol RSV F2で免疫した動物からの28および56日目の霊長類血清は、〜6 log2のhPIV3中和抗体力価を示した。それぞれ、b/h PIV3/RSV F2ならびにb/h PIV3/sol RSV F2の28および56日目の血清について、128および64のヒトPIV3特異的HAI抗体力価を観察した。28日目の血清を用いてbPIV3抗原を検査した場合、11.3および16.0のより低いHAI抗体力価を示した。56日目の血清は8.0の更に低いbPIV3 HAI力価を示した。b/h PIV3/RSVウイルスの表面糖タンパク質、FおよびHNはヒトPIV3に由来するので、異種bPIV3抗原に対するより、同種抗原（hPIV3）に対して、より高いHAI血清抗体力価が観察された。hPIV3中和抗体またはPIV3 HAI血清抗体は、プラセボ受容動物に由来する血清では検出されなかった。これらの結果は、b/h PIV3/RSVワクチンがまたhPIV3感染に対しても有効でありうることを示唆した。
【０４１５】
この研究は、hPIV3血清HAI抗体および中和抗体力価がワクチン接種に応答して産生されたかどうかを決定した。両方の種類のb/h PIV3/RSV F ワクチンで免疫した動物から得られた霊長類血清で観察された、hPIV3 HAI抗体および中和抗体のレベルは、b/h PIV3を用いてワクチン接種したアカゲザルによって示された力価と同様であった。b/h PIV3で免疫したアカゲザルは、野生型hPIV3によるチャレンジから完全に防御された。これらの結果は、b/h PIV3ベクター化RSVワクチンが、RSVとhPIV3の両方の感染および疾患から幼児を防御するための二価のワクチンとして有効でありうることを示唆した。
【０４１６】
34. 実施例２９：アフリカミドリザルにおけるMPVの抗原タンパク質を発現するb/h PIV3の有効性および免疫原性の評価
見込みのあるMPVワクチン候補、例えば、MPV F のようなMPVの抗原タンパク質を発現するb/h PIV3は、アフリカミドリザルのような非ヒト霊長類モデルにおいて有効性および免疫原性について評価される。
【０４１７】
2 mM L-グルタミン、非必須アミノ酸（NEAA）、抗生物質、および10％FCSを補給したModified Eagle's Medium（MEM）（JRH Biosciences）中で、Vero細胞を維持する。例えばb/hPIV3/MPV F2のようなMPVの抗原タンパク質を発現するb/h PIV3、および、例えばhMPV/NL/1/00のような野生型MPVを、Vero細胞において増殖させる。細胞にウイルスを0.1 PFU/細胞の感染多重度（MOI）で感染させる。感染3〜5日後、細胞および上清を回収し、1 xの最終濃度になるよう10 x SPG（10 x SPGは2.18 Mショ糖、0.038 M KH2PO4、0.072 M K2HP04、0.054 M L-グルタミン酸）を添加することによって安定化する。ウイルスストックを-70℃で保存する。ウイルス力価をVero細胞でのプラークアッセイによって測定する。プラークを、PIV3（VMRD）またはMPVヤギポリクローナル抗血清（Biogenesis）を用いた免疫ペルオキシダーゼ染色後に定量する。
【０４１８】
研究開始日の14日前に採取した霊長類の前血清について、MPV F IgG ELISA（Immuno- Biological Laboratories）および赤血球凝集阻害（HAI）アッセイを用いて、MPVおよびPIV3に対して血清反応陰性のアフリカミドリザル（Cercopithecus aethiops）（3.5〜6.5歳、2.6〜5.8 kg）を同定する。MPV F IgG ELISAを以下のように行う。すなわち、ワクチン接種した動物からの1、28、および56日目の霊長類の血清を、ELISAキット（Immuno-Biological Laboratories, Hamburg, Germany）を用い、メーカーの使用説明書に従って、MPV F IgGの存在について分析する。サルの二次抗血清（Rockland Inc.）を1: 1000希釈で使用する。MPV F IgG抗体力価はlog2 IgG U/mlとして表される。連続的に２倍希釈した霊長類血清を8 HA units/0.05 mlのbPIV3またはhPIV3のいずれかとともに25℃で30分間インキュベートすることによって、HAIアッセイを行う。続いて、モルモット赤血球を各ウェルに加え、90分間インキュベーションを続け、赤血球凝集について各ウェルを観察する。HAI力価は、ウイルスを介した赤血球の凝集を阻害する抗血清の最高希釈の逆数として表される。
【０４１９】
霊長類を個別のマイクロアイソレーターケージで飼育する。それらのサルをケタミン-バリウム混合物で麻酔し、鼻腔内および気管内に例えばb/hPIV3/MPV F2のようなMPVの抗原タンパク質を発現するb/h PIV3、および、例えばhMPV/NL/1/00のような野生型MPVを感染させる。経鼻投与量は鼻孔あたり0.5 mlであり、気管内投与量は1 mlである。1日目に、各動物は2〜3 x 105 PFUのウイルスを含む2 mlの投与を受ける。プラセボ動物群は同一の投与量のOpti-MEMを受け取る。28日目に、すべての動物に7 x 105 PFUのhMPV/NL/100（各部位に1 ml）を気管内および鼻腔内チャレンジする。鼻咽頭（NP）スワブを毎日11日間採取し、気管洗浄（TL）検体を免疫後およびチャレンジ後1、3、5、7および9日目に採取する。大腿静脈から得られる血液サンプルを血清学的解析のために0、7、14、21、28、35、42、49および56日目に採取する。発熱を示す体温変化、風邪の徴候、鼻水、くしゃみ、食欲不振、および体重について、動物を観察する。霊長類のNPおよびTL検体に存在するウイルスを、MPVヤギポリクローナル抗血清で免疫染色したVero細胞を用いたプラークアッセイによって定量する。平均ピークウイルス力価は、各動物に対して免疫後またはチャレンジ後11日のうちのいずれかにおいて測定されるピークウイルス力価の平均を表す。
【０４２０】
投与1、28、および56日後に、例えばb/hPIV3/MPV F2のようなMPVの抗原タンパク質を発現するb/h PIV3ベクターを感染させた霊長類から採取した血清について、プラーク減少中和アッセイ（PRNA）を行う。霊長類の血清を連続的に２倍希釈し、100 PFUのhMPV/NL/100とともにモルモットの補体の存在下、4℃で1時間インキュベートする。ウイルス血清混合物をVero細胞単層に移し、2％FBSおよび1％抗生物質を含むEMEM/L-15培地（JRH Biosciences; Lenexa, KS）中の1％メチルセルロースをオーバーレイする。35℃で6日間培養した後、単層を、定量のためにMPVヤギポリクローナル抗血清を用いて免疫染色する。中和力価はウイルスプラークの50％を阻害する最高血清希釈の逆数のlog2として表される。
【０４２１】
Vero細胞でhPIV3マイクロ中和アッセイを行う。1:4から開始し、連続的に２倍希釈した霊長類血清を、100 TCID50のhPIV3とともに37℃で60分間インキュベートする。次に、ウイルス血清混合物を96ウェルプレート中の細胞単層に移し、37℃で6日間培養し、その後すべてのウェルをCPEについて観察する。中和力価はCPEを阻害する最高血清希釈の逆数として表される。＜1:4の中和抗体力価（検査される最低血清希釈）は2の逆数log2力価とする。
【０４２２】
MPVワクチン候補の複製効率を研究するために、以下のように実験を計画する。1日目に、MPVおよびPIV3に対して血清反応陰性のアフリカミドリザル、1群4匹の動物を、2〜3 x 105 PFUの用量で、MPVワクチン候補、例えばb/h PIV3/MPV F2によって鼻腔内および気管内免疫する。陽性対照群には野生型MPV、例えばhMPV/NL/100を感染させ、陰性対照群にはプラセボ培地を投与する。28日目に、すべての動物に7 x 105 PFUの野生型MPV、例えばhMPV/NL/100を鼻腔内および気管内チャレンジする。この研究期間中、動物をマイクロアイソレーターケージで飼育する。鼻咽頭スワブを免疫後およびチャレンジ後毎日11日間採取し、気管洗浄サンプルを免疫後およびチャレンジ後2、4、6、8および10日目に採取する。抗体解析のための血清サンプルを、研究の期間中7日毎に採取する。
【０４２３】
MPV感染からの免疫防御を評価するために、ワクチン接種された霊長類に高用量の野生型MPV、例えばhMPV/NL/100を免疫4週間後にチャレンジする。有効性を、感染した動物のURTおよびLRTにおいて排泄されるMPVチャレンジウイルス力価の減少として測定する。
【０４２４】
b/h PIV3ベクター化MPVワクチン候補の有効性を、免疫4週間後に産生されたMPV中和抗体力価およびMPV F IgG血清抗体力価のレベルによって、更に評価する。50％プラーク減少中和アッセイ（PRNA）を用いて、MPV中和抗体力価を測定する。また、MPVワクチン候補によって誘導される免疫応答を、投与前（1日目）、投与4週間後（28日目）、およびチャレンジ4週間後（56日目）でのMPV Fタンパク質特異的IgGレベルの測定によって解析する。
【０４２５】
b/h PIV3ベクター化MPVワクチンがMPV感染およびhPIV3感染から防御できるかどうかを評価するために、また、霊長類血清を、hPIV3中和抗体およびHAI血清抗体の存在についても分析する。
【０４２６】
35. 実施例３０：GFPまたはeGFP遺伝子を含むb/h PIV3構築物を用いたマイクロ中和アッセイ
ウイルスを動物に接種した場合、ウイルスに対する一連の抗体が産生される。これらの抗体のいくつかはウイルス粒子に結合し、ウイルスの感染性を中和することができる。抗体を含む希釈血清とともにウイルスをインキュベートした後に残存するウイルスの感染性を解析するために、マイクロ中和アッセイを使用する。
【０４２７】
マイクロ中和アッセイを以下のように行う。すなわち、血清をOpti-MEM培地（1x）で連続的に希釈する。血清および培地を倒置によって穏やかに混和し、その後氷上に静置する。それぞれの希釈血清を目的のウイルスとともにインキュベートするが、そこではそのウイルスのゲノムが１以上のGFPまたはeGFP遺伝子を有するように操作されている（セクション9、実施例４参照）。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（「PBS」）で洗浄する。ウイルス/血清混合物を細胞に添加し、1時間35℃でインキュベートする。ウイルスを含むすべての培地を除去し、細胞をPBSで洗浄する。Opti-MEM培地を細胞に添加し、細胞培養物を3日間培養する。残存するウイルスの感染性を、蛍光顕微鏡によって捕らえられる画像上のGFPまたはeGFPの緑色焦点の定量によって測定する。GFPまたはeGFPを持たない対応するウイルス、例えば野生型RSVを用いたプラーク減少アッセイもまた、マイクロ中和アッセイの感度の比較のために行われ得る。
【０４２８】
36. 実施例３１：ウイルスワクチン候補の製造のための強力で高収量の細胞培養の開発
この実施例は、強力で高収量の細胞培養プロセスを記載する。このプロセスは、例えば、本出願に記載されるウイルスワクチンの製造のために使用される。重要なプロセスのパラメーターを最初に特定し、産生プロセスを小規模の実験で最適化した。次に、最適化した操作条件を用いて多数の研究を実施し、産生システムの拡張性、堅牢性、および再現性を決定する。本実施例において記載されるプロセスは、感染性ウイルスの収量を1 log10 TCID50/mL以上に増加させる。
【０４２９】
材料および方法:
ウイルス、図４に示されるようなRSV F遺伝子挿入構築物を含むウシ/ヒトPIV-3ウイルス（以下「b/h PIV3/RSV F2」と呼ぶ）を、4mM Lグルタミンを補給したOPTI PRO SFM（Gibco）から成る無血清培地（SFM）での培養に適応したVero細胞（ATCC）を用いて増殖させた。通常、SFM 中に5 x 104 細胞/mlで播種し、播種3日後に培養物に栄養補給し、播種5日後にフラスコを継代することによって、足場依存性Vero細胞を維持した。50％組織培養感染用量（TCID50）アッセイを用いてウイルス力価を測定し、log10TCID50/mLを定量した。
【０４３０】
結果
プロセス最適化
Vero細胞をSFM 中に1.75 x 106 細胞/フラスコで播種したT-75フラスコにおいて、小規模のプロセス最適化研究を実施した。すべての感染前培養物を37±1℃、5±1％CO2で培養し、播種3日後または5日後のいずれかに感染させた。播種5日後に感染される培養物については、播種3日目に完全なSFMの交換を行った。感染時に、使用済みの培地をb/h PIV3/RSV F2ウイルスを含むSFMに置き換えた。培養液を少なくとも１日１回サンプリングし、感染性ウイルスについてTCID50によりアッセイした。図中のエラーバーは2回反復の培養液から得られた標準偏差を表す。
【０４３１】
感染多重度（MOI）の影響
Vero培養物に、b/h PIV3/RSV F2ウイルスを0.1、0.01、0.001、0.0001、および0.00001 MOIで播種5日後に感染させた。結果は、0.0001および0.00001 MOIで最も低いウイルス力価が観察されたが、0.1、0.01、および0.001 MOIでは同程度のウイルス力価が観察されたことを示す（図１８）。実験をくり返し、同様の傾向を認めた。
【０４３２】
感染の時点（POI）および感染後の温度の影響
Vero培養物を２つの異なる細胞密度で感染させ、感染後33±1℃または37±1℃のいずれかで培養した。感染性ウイルス力価はより高い細胞密度での感染によって向上しなかったが、それらはより低い感染後の培養温度を用いて1 log10TCID50/mL以上に増加した（図１９）。実験をくり返し、同様の傾向を認めた。
【０４３３】
感染前培地の補給の影響
感染前培地に血清を補給することによって、感染性ウイルス力価は更に1 log10TCID50/mL以上に増加した（図２０）。
【０４３４】
PIV-3 HN、PIV-3 F、およびRSV Fウイルスタンパク質の発現プロファイル
３つのRSV F2ウイルスタンパク質、PIV-3 HN、PIV-3 F、およびRSV Fの発現を、Vero細胞培養物における感染の間、免疫蛍光法によって観察した。細胞を複数の96ウェルプレートのSFM中に8 x 103 細胞/ウェルで播種した。播種4日後、プレートをDPBSで１回洗浄し、b/h PIV3/RSV F2ウイルスに0.001 MOIで感染させ、33±1℃、5±1％CO2で培養した。感染後、様々な時間間隔で、96ウェルプレートを免疫染色に先だってパラホルムアルデヒド（4％）で固定した。図２１、２２、および２３は、３つのウイルスタンパク質すべてがSFM中のVero細胞の培養物によって発現されたことを示す。これらの図の画像は5X倍率で撮られた。
【０４３５】
プロセスのスケールアップ
1700 cm2 ローラーボトル（Coming）に1.75 x 107 細胞/ボトルでVero細胞を播種することによって、培地補給実験をくり返した。感染性ウイルス力価は、感染前に血清を補給した培養物において著しく高かった（図２４）。実験を２回くり返し、同様の傾向を認めた。
【０４３６】
要約
重要なプロセスのパラメーターを特定し、感染プロセスを小規模の実験で最適化することによって、RSV F2感染性ウイルス力価は1 log10 TCID50/mL以上に増加した。b/h PIV3/RSV F2ウイルス産生プロセスは、一貫した再現性のある結果を持つローラーボトル実験においてスケールアップに成功した。
【０４３７】
37. 実施例３２：無血清Vero細胞中のPIV3のエレクトロポレーションによるプラスミドのみの再生
この実施例において実証されるプロセスは、プラスミドのみを用いた、ヘルパーウイルスの非存在下での、組換えPIV3の再生を可能にする。PIV3の再生は無血清Vero細胞を用いて行われ、それは動物およびヒトに由来する産物の非存在下で増殖された。このプロセスは、ヘルパーウイルス（T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルス）を用いた以前の方法と同様の効率での組換えPIV3の再生を可能にする。ヘルパーウイルスを再生過程で必要としないため、ワクチンウイルスは夾雑物質を含まず、後続のワクチン製造を簡単にする。ワクチンウイルスの再生に用いられる細胞は、動物またはヒトに由来する産物を含まない培地で培養された。これは、製品の末端消費者の感染性海綿状脳症（例えばBSE）への懸念を取り除く。
【０４３８】
この方法は、動物またはヒトに由来する成分を完全に含まない組換えワクチン種(seed)の作製を可能にする。そのワクチン種は、またヘルパーウイルスの混入も含まない。
【０４３９】
cDNAからウイルスをレスキューするためのプラスミドに基づく発現系は、例えば、RA Lerchら、Wyeth Vaccines, Pearl River NY, USA (Abstract 206 from XII International Conference on Negative Strand Viruses, June 14th-19th 2003, Pisa Italy) およびG. Neumannら、J. Virol. , 76, pp 406-410に記載される。
【０４４０】
方法および結果
bPIV3 Nプラスミド（4μg; マーカー: カナマイシン耐性）、bPIV3 Pプラスミド（4μg; マーカー: カナマイシン耐性）、bPIV3 Lプラスミド（2μg; マーカー: カナマイシン耐性）、PIV3アンチゲノムcDNAをコードするcDNA（5μg; マーカー: カナマイシン耐性）およびT7 RNAポリメラーゼをコードするpADT7(N)DpT7（5μg; マーカー: ブラスチシジン) を、SF Vero細胞に無血清培地でのエレクトロポレーションを用いて導入した。bPIV3 N、bPIV3 P、およびbPIV3 Lは、pCITEベクター内のT7プロモーターの制御下にある。pADT7(N)ΔpT7は、改変されたpcDNA6/V5-His Cにあり、そこではT7プロモーターはCMVプロモーターのみを残して欠失された。T7ポリメラーゼはCMVプロモーターから発現される。アンチゲノムbPIV3はpUC19にあり、アンチゲノムの転写はT7プロモーターの制御下にある。
【０４４１】
エレクトロポレーションのためのパルスは220Vおよび950マイクロファラッドであった。エレクトロポレーションあたり5.5 X 106 個の無血清Vero細胞を用いた。エレクトロポレーションした細胞は、33℃でOptiC（GIBCO Invitrogen Corporationからの特注処方）の存在下で一晩回復させることができた。回復した細胞を1 mLのカルシウムおよびマグネシウムを含むPBSで２回洗浄し、2 mLのOptiCをオーバーレイした。エレクトロポレーションした細胞を33℃で5〜7日間更に培養した。培養期間の最後に、細胞を培地中にこすり取り、全細胞溶解液をPIV3の存在について解析した。
【０４４２】
ウイルスの再生を、RSVまたはhMPV特異的ポリクローナル抗体を用いたプラークアッセイの免疫染色によって確認した。エレクトロポレーションした細胞から再生された力価を表２２および表２３に示す。表２２は、SF Vero細胞へのエレクトロポレーションによって再生された様々なウイルスの力価を示す。ウイルスは様々なキメラウシPIV3である。様々なキメラウシPIV3をコードするcDNAを有するプラスミドは、ヒトRSVのF遺伝子を位置2に有するPIV3（MEDI 534）、プラスミド上のマーカーはカナマイシン（位置2は天然のウイルスゲノムの第一および第二オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは、転写されるべきウイルスゲノムの第二遺伝子の位置である）; ヒトRSVの膜貫通ドメインおよび内腔ドメインを欠如するF遺伝子の可溶型を位置2に有するウシPIV3（MEDI 535）、プラスミド上のマーカーはカナマイシン; ヒト・メタニューモウイルスのF遺伝子を位置2に有するウシPIV3（MEDI 536）、プラスミド上のマーカーはカナマイシン; ヒトRSVのF遺伝子を位置2に有するウシPIV3（MEDI 534）、プラスミド上のマーカーはアンピシリン; ヒト・メタニューモウイルスのF遺伝子を位置2に有するウシPIV3（MEDI 536）、プラスミド上のマーカーはアンピシリン、である。
【０４４３】
キメラウイルスMEDI 534について、様々な条件下でのエレクトロポレーションによるウイルスの再生を、２３に示す。Vero細胞を力価測定のために血清の存在下で培養した。異なる培地を用いたウイルス再生の効率を検査するために、MEDI 534を、（i）Opti C、（ii）1 Xゲンタマイシンを含むOpti C、（iii）Opti MEM（ヒト・トランスフェリンを含むopti C）を用いてエレクトロポレーションした。同一の条件下で同じSF Vero細胞を用いて、エレクトロポレーションを行った。結果は、1 Xゲンタマイシンがウイルス再生を完全に阻害し、ヒト・トランスフェリンがウイルス再生の効率において役割を持たないことを示した。細菌RNAの存在もまたウイルスの再生を阻害する。RNase A処理なしで調製されたプラスミドを用いて行われたエレクトロポレーションでは、ウイルスは再生されなかった。
【０４４４】
表２２および表２３におけるP0およびP1はウイルスを表す。P0はエレクトロポレーションした細胞から得られたウイルスを指す。P1は、ウシ胎仔血清の存在下で培養したvero細胞で１回増幅されたウイルスを指す。P0ウイルスをSF Vero細胞で増幅した場合、同様の力価が得られる。
【表２２】
2011167197.tif 000024
【表２３】
2011167197.tif 000025
【０４４５】
本発明は、本発明の個々の態様の１つの説明を意図する特定の記載された実施形態によって範囲を限定されるべきではなく、機能的な同等の構築物、ウイルスまたは酵素は本発明の範囲内である。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えて、様々な本発明の改変は、上述の記載および添付図面から当業者にとって明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【０４４６】
様々な刊行物が本明細書において引用されたが、それらの開示内容は参照によりそのまま本明細書に組み入れられるものとする。
（表２４）
配列表の説明
配列番号1      ヒト・メタニューモウイルス分離株00-1のマトリックスタンパク質(M)
および融合タンパク質(F)遺伝子
配列番号2      トリ・ニューモウイルスの融合タンパク質遺伝子、部分cds
配列番号3      トリ・ニューモウイルス分離株1bの融合タンパク質mRNA、完全cds
配列番号4      シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの融合タンパク質(F1および
F2サブユニット)遺伝子、完全cds
配列番号5      トリ・ニューモウイルスのマトリックスタンパク質(M)遺伝子、部分cds
およびトリ・ニューモウイルスの融合糖タンパク質(F)遺伝子、完全cds
配列番号6      パラミクソウイルスFタンパク質 hRSV B
配列番号7      パラミクソウイルスFタンパク質 hRSV A2
配列番号8      ヒト・メタニューモウイルス01-71 (部分配列)
配列番号9      ヒト・メタニューモウイルス分離株 00-1のマトリックスタンパク質(M)
融合タンパク質(F)遺伝子
配列番号10     トリ・ニューモウイルスの融合タンパク質遺伝子、部分cds
配列番号11     トリ・ニューモウイルス分離株lbの融合タンパク質mRNA、完全cds
配列番号12     シチメンチョウ鼻気管炎ウイルスの融合タンパク質(F1および
F2サブユニット)遺伝子、完全cds
配列番号13     トリ・ニューモウイルスの融合タンパク質(F)遺伝子、完全cds
配列番号14     シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(株CVL14/1)の付着タンパク質(G)
mRNA、完全cds 
配列番号15     シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(株6574)の付着タンパク質(G)、
完全cds 
配列番号16     シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(株CVL14/1)の付着タンパク質(G)
mRNA、完全cds
配列番号17     シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(株6574)の付着タンパク質(G)、
完全cds 
配列番号18     HMPV分離株NL/1/00のFタンパク質配列
配列番号19     HMPV分離株NL/17/00のFタンパク質配列
配列番号20     HMPV分離株NL/l/99のFタンパク質配列
配列番号21     HMPV分離株NL/1/94のFタンパク質配列
配列番号22     HMPV分離株NL/1/00のF遺伝子質配列
配列番号23     HMPV分離株 NL/17/00のF遺伝子質配列
配列番号24     HMPV分離株NL/l/99のF遺伝子質配列
配列番号25     HMPV分離株NL/1/94のF遺伝子質配列
配列番号26     HMPV分離株NL/1/00のGタンパク質配列
配列番号27     HMPV分離株 NL/17/00のGタンパク質配列
配列番号28     HMPV分離株NL/l/99のGタンパク質配列
配列番号29     HMPV分離株NL/1/94のGタンパク質配列
配列番号30     HMPV分離株NL/1/00のG遺伝子配列
配列番号31     HMPV分離株NL/17/00のG遺伝子配列
配列番号32     HMPV分離株NL/l/99のG遺伝子配列
配列番号33     HMPV分離株NL/1/94のG遺伝子配列
配列番号34     HMPV分離株NL/1/00のLタンパク質配列
配列番号35     HMPV分離株NL/17/00のLタンパク質配列
配列番号36     HMPV分離株NL/l/99のLタンパク質配列
配列番号37     HMPV分離株NL/1/94のLタンパク質配列
配列番号38     HMPV分離株NL/1/00のL遺伝子配列
配列番号39     HMPV分離株NL/17/00のL遺伝子配列
配列番号40     HMPV分離株NL/l/99のL遺伝子配列
配列番号41     HMPV分離株NL/1/94のL遺伝子配列
配列番号42     HMPV分離株NL/1/00のM2-1タンパク質配列
配列番号43     HMPV分離株NL/17/00のM2-1タンパク質配列
配列番号44     HMPV分離株NL/l/99のM2-1タンパク質配列
配列番号45     HMPV分離株NL/1/94のM2-1タンパク質配列
配列番号46     HMPV分離株NL/1/00のM2-1遺伝子配列
配列番号47     HMPV分離株NL/17/00のM2-1遺伝子配列
配列番号48     HMPV分離株NL/1/99のM2-1遺伝子配列
配列番号49     HMPV分離株NL/1/94のM2-1遺伝子配列
配列番号50     HMPV分離株NL/l/00のM2-2タンパク質配列
配列番号51     HMPV分離株NL/17/00のM2-2タンパク質配列
配列番号52     HMPV分離株NL/l/99のM2-2タンパク質配列
配列番号53     HMPV分離株NL/1/94のM2-2タンパク質配列
配列番号54     HMPV分離株NL/l/00のM2-2遺伝子配列
配列番号55     HMPV分離株NL/17/00のM2-2遺伝子配列
配列番号56     HMPV分離株NL/l/99のM2-2遺伝子配列
配列番号57     HMPV分離株NL/1/94のM2-2遺伝子配列
配列番号58     HMPV分離株NL/l/00のM2遺伝子配列
配列番号59     HMPV分離株NL/17/00のM2遺伝子配列
配列番号60     HMPV分離株NL/l/99のM2遺伝子配列
配列番号61     HMPV分離株NL/1/94のM2遺伝子配列
配列番号62     HMPV分離株NL/l/00のMタンパク質配列
配列番号63     HMPV分離株NL/17/00のMタンパク質配列
配列番号64     HMPV分離株NL/l/99のMタンパク質配列
配列番号65     HMPV分離株NL/1/94のMタンパク質配列
配列番号66     HMPV分離株NL/l/00のM遺伝子配列
配列番号67     HMPV分離株NL/17/00のM遺伝子配列
配列番号68     HMPV分離株NL/l/99のM遺伝子配列
配列番号69     HMPV分離株NL/1/94のM遺伝子配列
配列番号70     HMPV分離株NL/l/00のNタンパク質配列
配列番号71     HMPV分離株NL/17/00のNタンパク質配列
配列番号72     HMPV分離株NL/1/99のNタンパク質配列
配列番号73     HMPV分離株NL/1/94のNタンパク質配列
配列番号74     HMPV分離株NL/l/00のN遺伝子配列
配列番号75     HMPV分離株NL/17/00のN遺伝子配列
配列番号76     HMPV分離株NL/1/99のN遺伝子配列
配列番号77     HMPV分離株NL/1/94のN遺伝子配列
配列番号78     HMPV分離株NL/1/00のPタンパク質配列
配列番号79     HMPV分離株NL/17/00のPタンパク質配列
配列番号80     HMPV分離株NL/1/99のPタンパク質配列
配列番号81     HMPV分離株NL/1/94のPタンパク質配列
配列番号82     HMPV分離株NL/1/00のP遺伝子配列
配列番号83     HMPV分離株NL/17/00のP遺伝子配列
配列番号84     HMPV分離株NL/l/99のP遺伝子配列
配列番号85     HMPV分離株NL/1/94のP遺伝子配列
配列番号86     HMPV分離株NL/1/00のSHタンパク質配列
配列番号87     HMPV分離株NL/17/00のSHタンパク質配列
配列番号88     HMPV分離株NL/l/99のSHタンパク質配列
配列番号89     HMPV分離株NL/1/94のSHタンパク質配列
配列番号90     HMPV分離株NL/1/00のSH遺伝子配列
配列番号91     HMPV分離株NL/17/00のSH遺伝子配列
配列番号92     HMPV分離株NL/l/99のSH遺伝子配列
配列番号93     HMPV分離株NL/1/94のSH遺伝子配列
配列番号94     分離株NL/l/99 (99-1) HMPV (ヒト・メタニューモウイルス) cDNA配列
配列番号95     分離株NL/1/00 (00-1) HMPV cDNA配列
配列番号96     分離株 NL/17/00 HMPV cDNA配列
配列番号97     分離株NL/1/94 HMPV cDNA配列
配列番号98     分離株NL/1/00(A1)のG遺伝子コード配列
配列番号99     分離株BR/2/01(Al)のG遺伝子コード配列
配列番号100    分離株FL/4/01(Al)のG遺伝子コード配列
配列番号101    分離株FL/3/01(Al)のG遺伝子コード配列
配列番号102    分離株FL/8/01(A1)のG遺伝子コード配列
配列番号103    分離株FL/10/01(A1)のG遺伝子コード配列
配列番号104    分離株NL/10/01(A1)のG遺伝子コード配列
配列番号105    分離株NL/2/02(A1)のG遺伝子コード配列
配列番号106    分離株NL/17/00(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号107    分離株NL/1/81(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号108    分離株NL/1/93(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号109    分離株NL/2/93(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号110    分離株NL/3/93(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号111    分離株NL/1/95(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号112    分離株NL/2/96(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号113    分離株NL/3/96(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号114    分離株NL/22/01(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号115    分離株NL/24/01(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号116    分離株NL/23/01(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号117    分離株NL/29/01(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号118    分離株NL/3/02(A2)のG遺伝子コード配列
配列番号119    分離株NL/1/99(B1)のG遺伝子コード配列
配列番号120    分離株NL/11/00(B1)のG遺伝子コード配列
配列番号121    分離株NL/12/00(B1)のG遺伝子コード配列
配列番号122    分離株NL/5/01(Bl)のG遺伝子コード配列
配列番号123    分離株NL/9/01(B1)のG遺伝子コード配列
配列番号124    分離株NL/21/01(B1)のG遺伝子コード配列
配列番号125    分離株NL/1/94(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号126    分離株NL/1/82(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号127    分離株NL/1/96(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号128    分離株NL/6/97(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号129    分離株NL/9/00(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号130    分離株NL/3/01(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号131    分離株NL/4/01(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号132    分離株UK/5/01(B2)のG遺伝子コード配列
配列番号133    分離株NL/1/00(Al)のGタンパク質配列
配列番号134    分離株BR/2/01(Al)のGタンパク質配列
配列番号135    分離株FL/4/01(Al)のGタンパク質配列
配列番号136    分離株FL/3/01(Al)のGタンパク質配列
配列番号137    分離株FL/8/01(Al)のGタンパク質配列
配列番号138    分離株FL/10/01(Al)のGタンパク質配列
配列番号139    分離株NL/10/01(Al)のGタンパク質配列
配列番号140    分離株NL/2/02(Al)のGタンパク質配列
配列番号141    分離株NL/17/00(A2)のGタンパク質配列
配列番号142    分離株NL/1/81(A2)のGタンパク質配列
配列番号143    分離株NL/1/93(A2)のGタンパク質配列
配列番号144    分離株NL/2/93(A2)のGタンパク質配列
配列番号145    分離株NL/3/93(A2)のGタンパク質配列
配列番号146    分離株NL/1/95(A2)のGタンパク質配列
配列番号147    分離株NL/2/96(A2)のGタンパク質配列
配列番号148    分離株NL/3/96(A2)のGタンパク質配列
配列番号149    分離株NL/22/01(A2)のGタンパク質配列
配列番号150    分離株NL/24/01(A2)のGタンパク質配列
配列番号151    分離株NL/23/01(A2)のGタンパク質配列
配列番号152    分離株NL/29/01(A2)のGタンパク質配列
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配列番号307    分離株FL/7/01のFタンパク質配列
配列番号308    分離株FL/9/01のFタンパク質配列
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配列番号310    分離株NL/1/02のFタンパク質配列
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配列番号318    分離株NL/3/01のFタンパク質配列
配列番号319    分離株NL/4/01のFタンパク質配列
配列番号320    分離株NL/11/01のFタンパク質配列
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配列番号322    分離株NL/18/01のFタンパク質配列
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配列番号324    分離株UK/5/01のFタンパク質配列
配列番号325    分離株UK/8/01のFタンパク質配列
配列番号326    分離株NL/12/02のFタンパク質配列
配列番号327    分離株HK/1/02のFタンパク質配列
【図１Ａ】
2011167197.tif 000026
【図１Ｂ】
2011167197.tif 000027
【図２】
2011167197.tif 000028
【図３】
2011167197.tif 000029
【図４】
2011167197.tif 000030
【図５Ａ−Ｂ】
2011167197.tif 000031
【図５Ｃ】
2011167197.tif 000032
【図５Ｄ】
2011167197.tif 000033
【図６】
2011167197.tif 000034
【図７Ａ】
2011167197.tif 000035
【図７Ｂ】
2011167197.tif 000036
【図７Ｃ】
2011167197.tif 000037
【図８】
2011167197.tif 000038
【図９Ａ】
2011167197.tif 000039
【図９Ｂ】
2011167197.tif 000040
【図１０】
2011167197.tif 000041
【図１１】
2011167197.tif 000042
【図１２】
2011167197.tif 000043
【図１３Ａ】
2011167197.tif 000044
【図１３Ｂ】
2011167197.tif 000045
【図１３Ｃ】
2011167197.tif 000046
【図１３Ｄ】
2011167197.tif 000047
【図１４】
2011167197.tif 000048
【図１５】
2011167197.tif 000049
【図１６Ａ】
2011167197.tif 000050
【図１６Ｂ】
2011167197.tif 000051
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
2011167197.tif 000053
【図１６Ｅ】
2011167197.tif 000054
【図１７】
2011167197.tif 000055
【図１８】
2011167197.tif 000056
【図１９】
2011167197.tif 000057
【図２０】
2011167197.tif 000058
【図２１】
2011167197.tif 000059
【図２２】
2011167197.tif 000060
【図２３】
2011167197.tif 000061
【配列表】
2011167197000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月27日(2011.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列を含んでなる組換えパラインフルエンザウイルス３型であって、該哺乳動物メタニューモウイルスが、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科ニューモウイルス(Pneumovirinae)亜科に属するネガティブセンス一本鎖RNAウイルスであり、かつ該哺乳動物メタニューモウイルスは、系統発生的に、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)との近縁性よりも、CNCM（パリ）にI-2614として寄託されたウイルス分離株との近縁性が高いことを特徴とする、組換えパラインフルエンザウイルス３型。
【請求項２】
哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列が、パラインフルエンザのヌクレオチド配列に取って代わっているか、またはパラインフルエンザウイルスのゲノムに挿入されている、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項３】
哺乳動物メタニューモウイルスのヌクレオチド配列が、パラインフルエンザウイルスゲノムの位置1、2、3、4、5または6に挿入されている、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項４】
さらにRSVヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項５】
パラインフルエンザウイルスがウシ・パラインフルエンザウイルスである、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項６】
さらにヒト・パラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列を１つ以上含む、請求項５に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が哺乳動物メタニューモウイルスのポリペプチドをコードしている、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、哺乳動物メタニューモウイルスのFもしくはGタンパク質、またはその断片である、請求項７に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号70もしくはその断片と少なくとも90％同一、配列番号78もしくはその断片と少なくとも70％同一、配列番号62もしくはその断片と少なくとも90％同一、配列番号18もしくはその断片と少なくとも82％同一、配列番号42もしくはその断片と少なくとも85％同一、配列番号50もしくはその断片と少なくとも60％同一、配列番号34もしくはその断片と少なくとも85％同一、配列番号26もしくはその断片と少なくとも20％同一、または配列番号86もしくはその断片と少なくとも30％同一である、請求項７に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号78、配列番号62、配列番号18、配列番号42、配列番号50、配列番号34、配列番号26、配列番号86、配列番号70、配列番号28、配列番号72、配列番号80、配列番号64、配列番号20、配列番号44、配列番号52、配列番号88、配列番号36、配列番号29、配列番号73、配列番号81、配列番号65、配列番号21、配列番号45、配列番号53、配列番号89、配列番号37、配列番号27、配列番号71、配列番号79、配列番号63、配列番号43、配列番号51、配列番号87、配列番号35、またはその断片である、請求項７に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号22〜25、配列番号30〜33、配列番号38〜41、配列番号46〜49、配列番号54〜61、配列番号66〜69、配列番号74〜77、配列番号82〜85、配列番号90〜93、配列番号98〜132、配列番号168〜247、またはその断片からなる群より選択される、請求項１に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１２】
前記断片が、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、または少なくとも1000アミノ酸長である、請求項９または10に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１３】
前記断片が、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、または少なくとも1000ヌクレオチド長である、請求項11に記載の組換えパラインフルエンザウイルス。
【請求項１４】
異種ヌクレオチド配列がヒト・メタニューモウイルス由来である、請求項１に記載のウイルス。
【請求項１５】
哺乳動物メタニューモウイルス配列が、Fタンパク質、Gタンパク質、SHタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、M2タンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、Lタンパク質、またはその断片をコードしている、請求項７に記載のウイルス。
【請求項１６】
請求項１〜14のいずれか1項に記載のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。
【請求項１７】
請求項15に記載のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。
【請求項１８】
請求項１〜14のいずれか1項に記載の組換えウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤。
【請求項１９】
請求項15に記載の組換えウイルスおよび製薬上許容される添加剤を含有するワクチン製剤。
【請求項２０】
哺乳動物における呼吸器感染症の処置のための医薬の製造における、請求項18に記載のワクチンの使用。
【請求項２１】
哺乳動物における呼吸器感染症の処置のための医薬の製造における、請求項19に記載のワクチンの使用。
【請求項２２】
哺乳動物がヒトである、請求項20に記載の使用。
【請求項２３】
哺乳動物がヒトである、請求項21に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を、該細胞の増殖に最適な温度より低い温度で培養することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、(i) 該ウイルスを感染させる前に第１の温度で細胞を培養し、(ii) 該細胞にウイルスを感染させ、(iii) 該細胞へのウイルスの感染後に第２の温度で該細胞を培養する、ことを含んでなり、第２の温度が第１の温度より低いことを特徴とする、上記方法。
【請求項２６】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を血清の非存在下で培養することを含んでなる上記方法。
【請求項２７】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、(i) 該ウイルスを感染させる前に血清の存在下で細胞を培養し、(ii) 該細胞にウイルスを感染させ、(iii) 該細胞へのウイルスの感染後に血清の非存在下で該細胞を培養する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項２８】
請求項１〜15のいずれか１項に記載の組換えウイルスを増やす方法であって、該ウイルスを感染させた細胞を、血清の非存在下に、該細胞の増殖に最適な温度より低い温度で培養することを含んでなる上記方法。