(57)【要約】【課題】ヒトの口腔内で形成されるバイオフィルムに類似した評価結果が得られるインビトロバイオフィルムモデル及びこれを用いた被検液のバイオフィルム除去効果の評価方法の提供。【解決手段】次の口腔内細菌（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）：（Ａ）菌体外多糖として水不溶性グルカンを産生する細菌、（Ｂ）菌体外多糖として水溶性グルカンを産生する細菌、（Ｃ）菌体外多糖としてフルクタンを産生する細菌、（Ｄ）菌体外多糖として水不溶性グルカン及びフルクタンを産生する細菌から選ばれる細菌のうち、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）、又は（Ｄ）及び（Ｂ）の組み合せを含む混合細菌を、ガラス体又は合成樹脂体の表面で培養して作製されたインビトロバイオフィルムモデル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の口腔内細菌（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）：
（Ａ）菌体外多糖として水不溶性グルカンを産生する細菌、
（Ｂ）菌体外多糖として水溶性グルカンを産生する細菌、
（Ｃ）菌体外多糖としてフルクタンを産生する細菌、
（Ｄ）菌体外多糖として水不溶性グルカン及びフルクタンを産生する細菌から選ばれる細菌のうち、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）、又は（Ｄ）及び（Ｂ）の組み合せを含む混合細菌を、ガラス体又は合成樹脂体の表面で培養して作製されたインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項２】
前記混合細菌の混合時の容量比率が、（Ａ）水不溶性グルカン産生菌と（Ｂ）水溶性グルカン産生菌の容量比率（Ａ：Ｂ）が１：２〜１．５：１、（Ａ）水不溶性グルカン産生菌と（Ｃ）フルクタン産生菌との容量比率（Ａ：Ｃ）が１：２〜１．５：１、又は（Ｄ）水不溶性グルカン及びフルクタン産生菌と（Ｂ）水溶性グルカン産生菌との容量比率（Ｄ：Ｂ）が１：２〜１．５：１である請求項１記載のインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項３】
（Ｂ）水溶性グルカン産生菌が、Streptococcus gordonii、Streptococcus oraris、Streptococcus mitis、Streptococcus sanguinis及びStreptococcus intermedius から選択される請求項１又は２に記載のインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項４】
（Ａ）水不溶性グルカン産生菌がStreptococcus mutans及びStreptococcus sobrinus から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項５】
（Ｃ）フルクタン産生菌が、Actinomyces viscosus、Actinomyces naeslundii、Actinomyces oris、Actinomyces israelii及びStreptococcus salivariusから選択される請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項６】
（Ｄ）水不溶性グルカン及びフルクタン産生菌が、Streptococcus mutansである請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項７】
前記ガラス体又は合成樹脂体の表面に、ヒトの唾液又は唾液成分含有液を付着させ、前記混合細菌を添加して培養する請求項１〜６のいずれか１項に記載のインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項８】
請求項１〜８のいずれか１項記載のインビトロバイオフィルムモデルによるバイオフィルムと被検成分含有液との混合体を超音波処理し、当該処理前後のバイオフィルムの量を指標とする、被検成分のバイオフィルム除去効果の評価方法。
【請求項９】
次の口腔内細菌（Ａ'）、（Ｂ'）及び（Ｃ'）：
（Ａ'）Streptococcus mutans及びStreptococcus sobrinus から選択される細菌、
（Ｂ'）Streptococcus gordonii、Streptococcus oraris、Streptococcus mitis、Streptococcus sanguinis及びStreptococcus intermedius から選択される細菌、
（Ｃ’）Actinomyces viscosus、Actinomyces naeslundii、Actinomyces oris、Actinomyces israelii及びStreptococcus salivariusから選択される細菌
を含む混合細菌をガラス体又は合成樹脂体の表面で培養して作製されたインビトロバイオフィルムモデル。
【請求項１０】
（Ｄ'） Streptococcus mutans  及び（Ｂ'） Streptococcus gordonii、Streptococcus oraris、Streptococcus mitis、Streptococcus sanguinis及びStreptococcus intermedius から選択される細菌を含む混合細菌をガラス体又は合成樹脂体の表面で培養して作製されたインビトロバイオフィルムモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロバイオフィルムモデル、及びこれを用いたバイオフィルム分散除去効果の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口腔内バイオフィルムには、う蝕や歯周病の原因となる歯垢、口臭の原因となる舌苔、義歯に形成され感染症の原因となるデンチャープラーク等が挙げられ、その制御（バイオフィルムの形成抑制やバイオフィルムの殺菌・除去）が口腔衛生用品、口腔用組成物に求められている。即ち、これらの口腔疾患予防・治療用の有効成分の探索・評価には、バイオフィルムをその対象とすることが非常に重要であると考えられる。
【０００３】
この有効成分の探索・評価を目的として、従来、動物実験やヒトでの臨床試験、単独または複数の細菌によるインビトロ評価モデルが提案されている。しかし、動物実験による方法では、倫理的な問題や手間等から困難であり、また、ヒトでの臨床試験では病原性細菌叢に個人差があり適切な比較が困難な場合がある。さらにヒトを用いた臨床試験では、歯垢を蓄積させる等による被験者に大きな負担を強いる問題や、多くの被験者について試験をする必要性があるため多大な時間と費用がかかる問題等がある。
【０００４】
これに対して、インビトロバイオフィルムモデルが検討されており、例えば、ミュータンス連鎖球菌をショ糖含有培地でバッチ培養したもの（非特許文献１参照）、２種類以上のストレプトコッカス属および１種以上のアクチノマイセス属を含む口腔内細菌と1.3gf以上の糖を含み、ハイドロキシアパタイトを含有する結晶物に脱灰を引き起こさせるインビトロバイオフィルム（特許文献１）、歯肉縁下に生息している細菌を連続培養し、ハイドロキシアパタイトの表面にコラーゲン等を付着させ、その表面に形成させるインビトロバイオフィルム（特許文献２）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１１６５１６号公報
【特許文献２】特開２００５−１１７９２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕ．１９７５  Ｄｅｃ．１２（６）  Ｐａｇｅ １４１５−１４２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に記載されたインビトロモデルは、単独の菌種のみを培養するものであるため、このモデルによって有効成分を評価しても、ヒトの口腔内の歯垢、舌苔等のバイオフィルムに対する評価とは相違する場合がある。これに対して、ヒトの口腔内のバイオフィルムに近づけるために複数の菌種を培養したものが知られており、特許文献１に記載されたインビトロバイオフィルムモデルはう蝕原性を有し、特許文献２に記載のインビトロバイオフィルムモデルは歯肉縁下歯垢の病原性を再現しており、ヒトの口腔内のバイオフィルムに近づいているといえるが、これらのモデルはヒトの含嗽と同程度の超音波洗浄によって容易に除去することができてしまうという問題があった。つまり、ヒトの口腔内のバイオフィルムは、含嗽をしても容易には除去し難いが、バイオフィルムの除去のための成分の評価をする場合に、これらのインビトロバイオフィルムモデルによる有効性の評価は、ヒトの口腔内のバイオフィルムに適用した場合の評価と必ずしも一致しないという問題があった。
従って、本発明の課題は、バイオフィルムの除去のための成分について、ヒトの口腔内のバイオフィルムに類似した評価が得られるインビトロバイオフィルムモデル、及び、ヒトの口腔内の歯垢等のバイオフィルムの除去のために有用な成分の評価探索の手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、複数の口腔内細菌を使用し、通常の含嗽程度では容易に除去できないような、ヒトの口腔内のバイオフィルムと同様の評価をすることができるモデルを作製すべく検討した結果、全く意外にも、口腔内に生息する口腔内細菌のうち、３種類の菌体外多糖を産生する細菌を混合した混合細菌を、ハイドロキシアパタイトではなく、ガラス体又は合成樹脂体の表面で培養して形成したインビトロバイオフィルムが、通常の含嗽程度では容易に除去できず、ヒトの口腔内バイオフィルムと同様の除去挙動を示し、インビトロバイオフィルムモデルとして有用であることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の口腔内細菌（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）：
（Ａ）菌体外多糖として水不溶性グルカンを産生する細菌、
（Ｂ）菌体外多糖として水溶性グルカンを産生する細菌、
（Ｃ）菌体外多糖としてフルクタンを産生する細菌
（Ｄ）菌体外多糖として水不溶性グルカン及びフルクタンを産生する細菌から選ばれる細菌のうち、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）、又は（Ｄ）及び（Ｂ）の組み合わせを含む混合細菌を、ガラス体又は合成樹脂体の表面で培養して作製されたインビトロバイオフィルムモデルを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、上記インビトロバイオフィルムモデルによるバイオフィルムと被検成分含有液との混合体を超音波処理し、当該処理前後のバイオフィルムの量を指標とする、被検成分のバイオフィルム除去効果の評価方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のインビトロバイオフィルムモデルを用いることによって、バイオフィルム除去効果を有する被検成分について、ヒトの口腔内のバイオフィルムに類似した評価を得ることが可能となり、ヒトの歯垢等の口腔内のバイオフィルムの除去のために有用な成分の評価探索に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】バイオフィルム除去試験におけるバイオフィルム量及び歯垢量の測定部位を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のインビトロバイオフィルムモデルは、口腔内細菌として（Ａ）水不溶性グルカン産生菌と（Ｂ）水溶性グルカン産生菌と（Ｃ）フルクタン産生菌とを含む混合細菌、又は（Ｄ）水不溶性グルカン及びフルクタンを産生菌と（Ｂ）水溶性グルカン産生菌とを含む混合細菌を、ガラス体又は合成樹脂体の表面で培養することにより作製できる。
【００１４】
本発明における（Ａ）水不溶性グルカン産生菌は、菌体外多糖として主として水不溶性グルカンを産生する細菌であって、ヒトの口腔内からの検出実績のある Streptococcus mutans（以下「S.mutans」とする）、Streptococcus sobrinus（以下「S.sobrinus」とする）等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を用いることができる。これらの細菌のうち、扱い易さの点から S.mutans、S.sobrinus が好ましい。なお、主として水不溶性グルカンを産生する細菌とは、産生される菌体外多糖のうち最も産生量の多い多糖が水不溶性グルカンである細菌である。
【００１５】
本発明における（Ｂ）水溶性グルカン産生菌としては、ヒトの口腔内からの検出実績のある Streptococcus gordonii（以下「S.gordonii」とする）、Streptococcus oraris（以下「S.oraris」とする）、Streptococcus mitis（以下「S.mitis」とする）、Streptococcus sanguinis（以下「S.sanguinis」とする）、Streptococcus intermedius（以下「S.intermedius」）等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。これらの細菌のうち、扱い易さの点から S.gordonii、S.oraris が好ましく、さらにバイオフィルムの除去効果の評価の点から S.gordoniiが好ましい。
【００１６】
本発明における（Ｃ）フルクタン産生菌は、菌体外多糖として主としてフルクタンを産生することが知られている細菌であって、ヒトの口腔内からの検出実績のあるActinomyces viscosus（以下「A. viscosus」）、Actinomyces naeslundii（以下「A. naeslundii」）、Actinomyces oris（以下「A.oris」）、Actinomyces israelii（以下「A．israelii」）、Streptococcus Salivarius（以下「S. salivarius」）等が挙げられ、これらから選択される１種又は２種以上を用いることができる。これらの細菌のうち、扱い易さの点からA.viscosus、A.naeslundiiが好ましい。なお、例えば、S.salivarius は、フルクタン産生菌として知られているが、菌体外多糖として水不溶性グルカンが検出された報告もある。しかし、S.salivarius が単独で産生した菌体外多糖は、例えばS.mutansの産生した多糖に比べて水不溶性グルカンの産生量が少なく、最も多く産生される菌体外多糖がフルクタンであることから、S.Salivarius はフルクタン産生菌としている。
【００１７】
前記（Ａ）水不溶性グルカン産生菌のうち、S. mutansは水不溶性グルカンを最も多く産生するが、次にフルクタンも多く産生する。従って、この（Ｄ）水不溶性グルカン及びフルクタン産生菌を用いる場合には、これと（Ｂ）水溶性グルカン産生菌の２種を組み合せればよい。
【００１８】
なお、前記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の細菌は、う蝕や歯周病等の口腔疾患予防治療用の有効成分の探索、評価に用いられるものであることから、嫌気性細菌が好ましい。
【００１９】
本発明においては、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の組み合わせを含む混合細菌、又は（Ｄ）及び（Ｂ）の組み合わせを含む混合細菌を用いる。これらの混合細菌は、ガラス体又は合成樹脂体表面で培養すればよく、すなわちこれらの混合細菌をガラス体又は合成樹脂体の表面に付着した状態で培養すればよい。具体的には、これらの細菌混合物を、ガラス体又は合成樹脂体に添加して培養すればよい。細菌混合物における（Ａ）水不溶性グルカン産生菌と（Ｂ）水溶性グルカン産生菌の混合比率は、バイオフィルムの除去効果、殺菌性の評価の点から、容量比で１：２〜１．５：１が好ましく、さらに１：１．５〜１．２：１が好ましい。細菌混合物における（Ａ）水不溶性グルカン産生菌と（Ｃ）フルクタン産生菌の混合比率は、バイオフィルムの除去効果、殺菌性の評価の点から、容量比で１：２〜１．５：１が好ましく、さらに１：１．５〜１．２：１が好ましい。（Ｄ）水不溶性グルカン及びフルクタン産生菌と（Ｂ）水溶性グルカン産生菌の混合比率は、バイオフィルムの除去効果、殺菌性の評価の点から、容量比で１：２〜１．５：１が好ましく、さらに１：１．５〜１．５：１が好ましい。また、（Ａ）水不溶性グルカン産生菌と（Ｂ）水溶性グルカン産生菌と（Ｃ）フルクタン産生菌の混合比率は、バイオフィルムの除去効果、殺菌性の評価の点から容量比で、Ａ：（Ｂ+Ｃ）が１：４〜１．５：２であることが好ましく、さらに１：３〜１：２であることが好ましい。なお、これらの容量比は、細菌濃度を等しくした場合の容量比、すなわち、培養された各細菌と培養液の混合体の光学密度（Ｏ.Ｄ.：Optical Density）を等しくした場合の容量比であって、Ｏ.Ｄ.は例えば培養液で調整して等しくすることができる。Ｏ.Ｄ.は、０．４〜１．０の間の任意の透過率で等しくすることが好ましく、さらに０．６〜０．９が好ましく、特に０．７〜０．９が好ましい。Ｏ.Ｄ.は波長６００ｎｍ、光路長１０ｍｍのセルにおいて測定し、例えば分光光度計（BioSpec-mini 島津製作所製）で測定することができる。
【００２０】
これらの混合細菌は、（Ａ）水不溶性グルカン産生菌、（Ｂ）水溶性グルカン産生菌、（Ｃ）フルクタン産生菌、（Ｄ）水不溶性グルカン及びフルクタン産生菌の各々を予め培養した後、混合するのが好ましい。具体的には、例えば寒天培地、又は液体培地に培養液とともに培養することができる。寒天培地としては、wilkins-chalgren anaerobe agar、schaedler anaerobe agar、brain heart infusion(BHI)agar、Anaero Columbia Agar with Rabbit Blood and PEA Center for Disease Control Anaerobe Blood Agar、Trypticase Soy (SCD)agar heart infusion agar、ブルセラ培地、west wilkins寒天培地、ミュラーヒントン寒天培地、及びこれらの変法培地等を用いることができる。液体培地としては、wilkins-chalgren培地、schaedler培地、SCD培地、BHI培地、heart infusion培地、ミュラーヒント培地、west wilkins培地、及びこれらの変法培地等を用いることができる。細菌の培養量向上の点から、液体培地が好ましく、寒天培地による培養後に液体培地で培養することもできる。なお、培地又は液体培地（培養液）は、酵母エキス、又はスクロース、グルコース、フルクトース、ぶどう糖等の糖を含有するものが好ましく、特にスクロース、グルコース、酵母エキスから選ばれる１又は２以上を含有するものが好ましい。培養の条件は、３６〜３８℃の環境（室温）が好ましく、嫌気的条件下で培養する。なお、嫌気的条件は、酸素濃度が極めて低い条件であって、一般的に酸素濃度が１％以下、好ましくは０．１％以下をいう。
【００２１】
細菌混合物は、ガラス体又は合成樹脂体に直接添加してもよいし、あらかじめヒトの唾液又は唾液成分含有液を塗布したガラス体又は合成樹脂体に添加してもよい。ヒトの唾液は健常なヒトの唾液であり、唾液成分含有液は、健常なヒトの唾液の成分である唾液ムチン、プロリンリッチ糖タンパク、分泌型ＩｇＡ、ラクトフェリン、αアミラーゼ、リン酸タンパク質、リゾチーム及びアルブミンから選ばれる１種又は２種以上を含有するものが好ましく、さらに２種以上を含有するものが好ましい。
【００２２】
本発明のモデルによるインビトロバイオフィルム形成の基体は、ガラス体又は合成樹脂体である。ハイドロキシアパタイトを基体とした場合には、含嗽等で容易に除去可能なバイオフィルムが形成されてしまう。ガラス体又は合成樹脂体としては、細菌混合物を添加することが可能で、ガラス体又は合成樹脂体の表面に維持されるものであればよく、板状体、シャーレ等のガラス容器又は合成樹脂容器の底面をガラス体又は合成樹脂体として添加するものであってもよい。合成樹脂体としては、熱可塑性樹脂が好ましい。熱可塑性樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、メタクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート、ポリアセタール、ポリスチレン等の樹脂、又はこれらの共重合体、例えば、エチレン・プロピレン共重合体、エチレンブテン共重合体、アクリロニトリル／スチレン樹脂やアクリロニトリル・ブタジエン・スチレン樹脂（ＡＢＳ樹脂）等が挙げられる。ガラス体、合成樹脂体の表面は平面又は凹凸面であってもよいが、平面又は滑らかな面を備えることが好ましい。
【００２３】
ガラス体又は合成樹脂体表面での前記混合細菌の培養は、３６〜３８℃の嫌気的条件下で、２０〜３０時間行うのが好ましい。このような培養により、ガラス体又は合成樹脂体表面に、通常の含嗽では容易に除去できない、ヒト口腔内と同様の分散除去耐性を有するインビトロバイオフィルムを形成できる。
【００２４】
本発明のインビトロバイオフィルムモデルを用いて、バイオフィルムの除去の効果を評価するには、被検成分含有液による処理前後のインビトロバイオフィルムの定量によって行うことができる。本発明におけるバイオフィルムの除去性には、バイオフィルムを分散させて取り除く分散性も含む。被検成分含有液による処理としては、インビトロバイオフィルムに被検成分含有液を接触させて殺菌性を評価する方法、又はインビトロバイオフィルムと被検成分含有液とを混合し、この混合体を超音波処理する方法が挙げられる。この超音波処理は、ヒトの含嗽に類似した超音波処理が好ましく、周波数は４０〜６０ｋＨｚの超音波処理が好ましい。例えば超音波洗浄機  AW5800（シチズン製）を用い、周波数４２ｋＨｚ、室温（２０℃）で３０秒間処理することができる。なお、超音波処理の時間はヒトの一般的な含嗽時間とすることが好ましく、１０秒〜１分が好ましく、さらに２０秒〜５０秒が好ましい。被検成分含有液によるバイオフィルムの除去の効果は、被検成分含有液による処理前後のバイオフィルムの量を指標とすることができる。バイオフィルムの量は、フェノール硫酸法により定量することができる。殺菌性は、処理前後の生細菌数を指標とすることができる。生細菌数は、バイオフィルムを分散後、培養させてコロニー数をカウントすることにより定量することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【００２６】
（材料及び方法）
１）口腔内細菌の培養
S.mutans ATCC25175株、S.sobrinus ATCC33478株、A.viscosus ATCC43146株、A.naeslundii ATCC12104株、Ｓ．gordonii ATCC10558株、S.oraris  ATCC35037株、を、ＳＣＤ培地（Ｓｏｙｂｅａｎ−Ｃａｓｅｉｎ  ＤｉｇｅｓｔＢｒｏｔｈ、日本製薬株式会社製）に0.5％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）を添加した培養液（SCD-YE培地）５０ｍＬに１白金耳を接種し、温度３７℃、嫌気的条件（Ｎ2８０％、ＣＯ220％）で対数増殖期まで培養した。
【００２７】
２）唾液
口腔疾患の無い健常な男性より、パラフィンワックスを咀嚼させて分泌された唾液を採取し、遠心分離によって、唾液採取時に剥離した口腔内粘膜等を除去し、これをglass base dish（ＩＷＡＫＩ  φ27ｍｍ）（以後「ガラス」とする）、ポリスチレン製のdish（ＩＷＡＫＩ  φ27ｍｍ）（以後「ポリスチレン」）、又はヒドロキシアパタイト板（アパタイトペレット  ＡＰＰ-100、ペンタックス製）（以後「ＨＡＰ板」とする）に2mL/ dishの割合で分注し、４℃で一昼夜静置することでガラス、ポリスチレン、ＨＡＰ板にヒトの唾液を吸着させた。実施例１〜６、比較例２〜６はガラスにヒトの唾液を吸着させ、実施例１ｂ〜４ｂはポリスチレンにヒトの唾液を吸着させた。比較例７〜１０は、glass base dish の底面に載置したＨＡＰ板にヒトの唾液を吸着させた。
【００２８】
３−１）インビトロバイオフィルムモデルの作製
上記１）で培養した細菌を分光光度計（BioSpec-mini 島津製作所製）により１０ｍｍの光路長で６００ｎｍのＯ.Ｄ.が０．７になるように培養液（SCD-YE培地）で調整し、表１、表２、表３、表４に示す容量を接種し、培養液５０ｍＬと混合した細菌混合液を２ｍＬ/ｄｉｓｈの割合で、実施例１〜６と比較例２〜６の唾液を付着させたガラス、比較例７〜１０の唾液を付着させたＨＡＰ板、実施例１a〜４aのガラス、実施例１ｂ〜４ｂ、実施例７の唾液を付着させたポリスチレンに添加し、２４時間培養してバイオフィルムを形成させた。ここで、培養液は酵母0.5％（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｄｉｆｃｏ社製）、Glucose  1.0%、Sucrose 2.0% を添加したものを用いた。
【００２９】
３−２）ヒト歯垢
ヒト歯垢は、口腔疾患の無い健常な男性に２４時間歯磨き及び含嗽を禁止し、歯表面に付着した歯垢を用いた。
【００３０】
４）殺菌試験
殺菌試験の薬剤としては、精製水に塩化セチルピリジニウム１００ｐｐｍを含有する薬剤を用いた。殺菌試験の処理は、実施例及び比較例のインビトロバイオフィルム及びヒトの口腔より採取したヒト歯垢を、精製水で２回洗浄し、次に薬剤１ｍＬを添加し３０秒間作用させた。次に薬剤を取り除き、さらに精製水で２回洗浄した。殺菌率は、処理前後のバイオフィルム中の細菌数を後述する５）の方法により測定し、（処理前の細菌数−処理後の細菌数）／処理前の細菌数とした。
【００３１】
５）細菌数
実施例及び比較例の基体上のインビトロバイオフィルム及びヒト歯垢に２ｍＬの生理食塩水を添加し、超音波処理をインビトロバイオフィルム及び歯垢が分散するまで行った。この場合の超音波処理は、室温（２０℃）でＢＲＡＳＯＮ社製のＳＯＮＩＦＩＥＲ  ＣＥＬＬ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ  ２００を用い、フルパワー（周波数  約２７ＫＨｚ）で１５秒間行った。なお、バイオフィルムを短時間で分散する超音波処理の周波数は２５〜３０ＫＨｚが好ましい。次に、分散したインビトロバイオフィルム、歯垢を回収し、アネロコロンビアウサギの血液を含有する寒天培地に塗沫し、温度３７℃、嫌気的条件（Ｎ2８０％、ＣＯ220％）で２４時間培養した。培養後にコロニー数を測定し、生細菌数を求めた。
【００３２】
６）除去試験
実施例及び比較例の基体上のインビトロバイオフィルムに対して生理食塩水を１ｍＬ滴下し、室温（２０℃）で３０秒間の超音波処理をした。除去試験の超音波処理はヒトの含嗽に類似したレベルにするため超音波周波数が４２ＫＨｚで設計されている超音波洗浄機ＡＷ５８００（シチズン製）により行った。処理後、剥がれたインビトロバイオフィルム量（Ａ）と、残ったインビトロバイオフィルム量（Ｂ）をフェノール硫酸法によって測定した。残ったインビトロバイオフィルムは、２Ｎ水酸化ナトリウム１ｍＬを添加することによってバイオフィルムを剥がし、更に２Ｎ塩酸１ｍＬを添加して中和した。剥がれたインビトロバイオフィルムと同様にフェノール硫酸法によってバイオフィルム量を測定した。フェノール硫酸法は、バイオフィルム２０μＬを96wellマイクロプレートリーダーに分注し、さらに５％（Ｗ/Ｖ）フェノール水溶液２０μＬを加え、９８％濃硫酸１００μＬを添加して混合し、マイクロプレートレコーダーで４９０ｎｍの吸光度を測定した。検量線は、０．００７８〜０．１２５％のグルコース液の吸光度を用い、バイオフィルムの量を定量した。バイオフィルム除去率は、インビトロバイオフィルム量（Ａ）／（インビトロバイオフィルム量（Ａ）＋インビトロバイオフィルム量（Ｂ））として求め、表１及び表２に示す。なお、ヒト歯垢の除去率は、生理食塩水で３０秒含嗽し、含嗽前後の歯垢量を測定することにより除去率を定量した。歯垢量の測定は、ヒトの口腔内の測定部位を上下左右４本ずつの１６歯とし（１番、４番、６番、７番の歯）、測定箇所は図１に示すように歯間に該当する４箇所と、平滑面に該当する６箇所の合計１０箇所とした。歯垢量は、各測定箇所について図１に示すように歯に歯垢が付着している領域の歯肉からの高さによって定量した。ヒト歯垢の除去率は、（含嗽前の歯垢量−含嗽後の歯垢量）／含嗽前の歯垢量とし、測定結果を表１〜表４に示す。
【００３３】
７）エリスリトールによるバイオフィルム除去試験
エリスリトールを被検成分とし、エリスリトール１０質量％となるように精製水と混合して被検成分含有液とした。試験は、６）の除去試験における生理食塩水にかえて被検成分含有液（エリスリトール１０質量％含有液）を１ｍＬ滴下して６）と同様の除去試験を行い、除去率を求めた。除去率を表１及び表３に示す。
【００３４】
【表１】
2011217610.tif 000002
【００３５】
【表２】
2011217610.tif 000003
【００３６】
【表３】
2011217610.tif 000004
【００３７】
表１に示すように、（Ｂ）水溶性グルカン産生菌と（Ｃ）フルクタン産生菌により作製された比較例４〜６はインビトロバイオフィルムの形成が認められなかった。一方、比較例１のヒト歯垢は生理食塩水の含嗽によるバイオフィルム除去率が約２０％であり、歯垢は含嗽で除去しにくいと認められるが、（Ａ）水不溶性グルカン産生菌と（Ｃ）フルクタン産生菌により作製された比較例２のインビトロバイオフィルムの除去率は約７７％であり、ヒトの歯垢に比べて除去されやすいと考えられる。これに対して（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の細菌によりガラスに作製された実施例１〜６のインビトロバイオフィルムモデルの除去率は、比較例１のヒト歯垢とほぼ同程度であった。また、エリスリトールを被検成分とするエリスリトール含有液の場合のバイオフィルム除去率は、生理食塩水による除去率よりも高い結果が得られ、この評価においても実施例１〜６のインビトロバイオフィルムの除去率は、比較例１のヒト歯垢とほぼ同程度であった。なお、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の細菌によりＨＡＰ板に形成した比較例７〜１０のインビトロバイオフィルムの除去率は約６６〜８０％であり、比較例１のヒトの歯垢に比べて除去されやすいと考えられる。
【００３８】
表２に示すように実施例１a〜４aのヒトの唾液をコートしないガラスに作製したインビトロバイオフィルムの殺菌率、除去率は、ヒトの唾液をコートしたガラスに作製した実施例１〜４と同程度であることが認められた。また、表３に示すように実施例１ｂ〜４ｂのポリスチレンに作製したインビトロバイオフィルムの殺菌率、除去率は、ヒト歯垢と同程度であることが認められた。
【００３９】
表４に示すように、（Ｄ）水不溶性グルカンとフルクタンを産生するＳ.mutansと、（Ｂ）水溶性グルカンを産生するS.gordonii による実施例７のインビトロバイオフィルムの殺菌率、除去率は、ヒト歯垢と同程度であることが認められた。
【００４０】
【表４】
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【図１】
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