(57)【要約】      （修正有）【課題】炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルの１種類又は複数を生成する方法を提供する。【解決手段】リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類又は複数から選択される脂質基質であるアシル供与体と、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸からなる群の１種類又は複数から選択されるアシル受容体と、水とを混合して、５〜９８％の水を含む高水分環境を作るステップと、脂質アシルトランスフェラーゼが以下の反応、すなわち、アルコール分解若しくはエステル転移の一方又は両方を触媒するように前記混合物を前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させるステップとを含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシ酸エステルを生成する方法であって、リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類若しくは複数から選択される脂質基質であるアシル供与体と、ヒドロキシ酸からなるアシル受容体と、水とを混合して、５〜９８％の水を含む高水分環境を作るステップと、脂質アシルトランスフェラーゼが、アルコール分解又はエステル転移の一方若しくは両方の反応を触媒するように前記混合物を前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させるステップとを含み、前記脂質アシルトランスフェラーゼが、緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイによって試験したときに少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼとして特徴づけられ、かつＥ．Ｃ．２．３．１．ｘとして分類される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを使用することによって脂質を生物変換して、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルを製造する方法に関する。
【０００２】
本発明は、さらに、以下、すなわち、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又は及び／又はヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数に脂質を生物変換するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用にも関する。
【０００３】
本発明は、さらに、本明細書に定義する固定化脂質アシルトランスフェラーゼの使用にも関する。この固定化脂質アシルトランスフェラーゼは、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数を生成するために、高水分環境（high water environment）における脂質の生物変換において使用することができる。
【０００４】
本発明は、さらに、固定化脂質アシルトランスフェラーゼにも関する。
【背景技術】
【０００５】
以下の関連出願、すなわち、１９９９年７月２０日に出願された米国特許出願第０９／７５０，９９０号、及び米国特許出願第１０／４０９，３９１号を参照されたい。これらの出願の各々、及びこれらの出願の各々において引用された文書の各々（「出願引用文書」）、及びその出願引用文書において参照又は引用された各文書（明細書中でも、又はこれらの出願の手続き中でも）、並びにそのような手続き中に提出された特許性を支持するすべての意見書（ａｒｇｕｍｅｎｔ）を参照により本明細書に援用する。様々な文書が本明細書でも引用されている（「本願引用文書」）。本願引用文書の各々、及び本願引用文書中で引用又は参照された各文書を参照により本明細書に援用する。
【０００６】
リパーゼは、脂質を生物変換して、食品及び／又は飼料産業、化粧品及び／又はスキンケア産業、油化学工業及び医薬産業を含めて広範な産業において使用される高価な生成物、例えば、糖エステルを製造するために広範に使用されてきた。
【０００７】
生物変換プロセスが脂質基質の加水分解を必要とするときには、脂肪分解酵素を高水分環境において使用することができる。しかし、生物変換プロセスがアルコール分解などによるエステル交換又はエステル転移反応を必要とするときには、高水分環境においてリパーゼを使用することは、望ましくない加水分解反応によって、望ましくないバイオ生成物がもたらされ、且つ／又は生物変換生成物が低収率になるために有害な場合がある。
【０００８】
一般に、エステル交換及び／又はエステル転移を必要とする生物変換プロセスは、油系、及び／又はブタノール、メタノール、へキサンなどの有機溶媒系などの非水環境においてリパーゼを利用してきた。このような系は、極性受容体分子と脂質供与体分子の両方を少なくとも部分的に可溶化することができ、リパーゼが十分な酵素活性を有する環境を提供する。どんな酵素活性でも少量の水を必要とするが、酵素の加水分解活性を回避するために水量は低レベルに厳密に維持される。
【０００９】
従来、糖エステル、タンパク質エステル又はヒドロキシ酸エステルは、無機触媒を用いた化学合成によって製造されてきた。糖エステル又はヒドロキシ酸エステルを製造する従来の生物変換プロセスは、（あったとしても）少量の水しか存在しない有機溶媒環境又は超臨界流体においてリパーゼを利用している。
【００１０】
Lecointe et al Biotechnology Letters, Vol 18., No. 8 (August), pp869-874は、メタノール及びブタノールからのそれぞれメチルエステル又はブチルエステルの製造に対するいくつかのリパーゼ酵素、及び水性媒体におけるそれらの活性の研究について開示している。Lecointe等は、メタノール又はブタノール濃度が増加するにつれ加水分解活性が低下し、酵素のメチルエステル及びブチルエステル生成能力が増大するカンジダ パラプシロシス（Candida parapsilosis）由来のリパーゼ／アシルトランスフェラーゼを教示している。脂肪ヒドロキサム酸（fatty hydroxamic acid）の製造にＣ．パラプシロシス由来のリパーゼ／アシルトランスフェラーゼを使用することは、Vaysse et al J. of Biotechnology 53 (1997) 41-46に教示されている。
【００１１】
リパーゼ：コレステロールアシルトランスフェラーゼは、かねてから知られている（例えば、Balcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X., Enzyme Microb Technol. 1996 May 1;18(6):392-416を参照されたい）。特に、植物及び／又は哺乳動物のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）のように、ホスファチジルコリンとコレステロールの間の脂肪酸の移動を触媒するグリセロリン脂質：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴとも呼ばれる）が見出されている。
【００１２】
Retz M.T., Jaeger K.E. Chem Phys Lipids. 1998 Jun;93(1-2):3-14及びBornscheuer U.T., Bessler C, Srinivas R, Krishna S.H. Trends Biotechnol. 2002 Oct;20(10):433-7は、水性媒体中でアルコール受容体へのアシル転移を起こすことができる、アエロモナス ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）由来のリパーゼ／アシルトランスフェラーゼを教示している。
【非特許文献１】Lecointe et al Biotechnology Letters, Vol 18., No. 8 (August), pp869-874
【非特許文献２】Vaysse et al J. of Biotechnology 53 (1997) 41-46
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数を生成する方法が提供される。この方法は、リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類若しくは複数から選択される脂質基質であるアシル供与体と、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸からなる群の１種類若しくは複数から選択されるアシル受容体と、水とを混合して、５〜９８％の水を含む高水分環境を作るステップと、脂質アシルトランスフェラーゼが以下の反応、すなわち、アルコール分解又はエステル転移の一方若しくは両方を触媒するようにその混合物を前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させるステップとを含む。
【００１４】
別の態様においては本発明は、アシル供与体、アシル受容体及び水の混合物においてアルコール分解又はエステル転移の一方若しくは両方の触媒作用によって、炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数を生成するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。この混合物は、５〜９８％の水を含み、前記アシル供与体は、リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類若しくは複数から選択される脂質基質であり、前記アシル受容体は、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸からなる群の１種類若しくは複数から選択される。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、本発明による方法によって生成される炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルが提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、本発明による方法によって生成される炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルを含む医薬品、化粧品、食料品、飼料、塗料が提供される。
【００１７】
別の態様によれば、本発明は、本明細書に定義する固定化脂質アシルトランスフェラーゼを提供する。
【００１８】
別の態様によれば本発明は、［１］本炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル、ヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数を生成する方法であって、リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類若しくは複数から選択される脂質基質であるアシル供与体と、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸からなる群の１種類若しくは複数から選択されるアシル受容体と、水とを混合して、５〜９８％の水を含む高水分環境を作るステップと、脂質アシルトランスフェラーゼアルコール分解又はエステル転移の一方若しくは両方の反応を触媒するように前記混合物を前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させるステップとを含む、方法に関する。
【００１９】
別の態様によれば本発明は、［２］前記脂質アシルトランスフェラーゼが固定化されている、上記［１］に記載の方法に関する。
【００２０】
別の態様によれば本発明は、［３］前記方法が、炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル、ヒドロキシ酸エステルを精製するステップを含む、上記［１］又は［２］に記載の方法に関する。
【００２１】
別の態様によれば本発明は、［４］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素であることを特徴とする、上記［１］から［３］のいずれか記載の方法に関する。
【００２２】
別の態様によれば本発明は、［５］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｈ−３０９を含む、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、上記［１］から［４］のいずれか記載の方法に関する。
【００２３】
別の態様によれば本発明は、［６］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、上記［１］から［５］のいずれか記載の方法に関する。
【００２４】
別の態様によれば本発明は、［７］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、の１つ又は複数を含む、上記［１］から［６］のいずれか記載の方法に関する。
【００２５】
別の態様によれば本発明は、［８］リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類又は複数から選択される脂質基質であるアシル供与体と、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸からなる群の１種類又は複数から選択されるアシル受容体と、水との混合物であって、５〜９８％の水を含む混合物において、アルコール分解若しくはエステル転移の一方又は両方の触媒作用によって、炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルの１種類又は複数を生成するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用に関する。
【００２６】
別の態様によれば本発明は、［９］前記脂質アシルトランスフェラーゼが固定化されている、上記［８］に記載の使用に関する。
【００２７】
別の態様によれば本発明は、［１０］前記炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルが精製される、上記［８］に記載の使用に関する。
【００２８】
別の態様によれば本発明は、［１１］アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素として前記脂質アシルトランスフェラーゼが特徴づけられる、上記［８］から［１０］のいずれかに記載の使用に関する。
【００２９】
別の態様によれば本発明は、［１２］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｈ−３０９を含む、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、上記［８］から［１１］のいずれかに記載の使用に関する。
【００３０】
別の態様によれば本発明は、［１３］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、上記［８］から［１２］のいずれかに記載の使用に関する。
【００３１】
別の態様によれば本発明は、［１４］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、の１つ又は複数を含む、上記［８］から［１３］のいずれかに記載の使用に関する。
【００３２】
別の態様によれば本発明は、［１５］上記［１］から［７］のいずれかに記載の方法によって生成される炭水化物エステルに関する。
【００３３】
別の態様によれば本発明は、［１６］上記［１］から［７］のいずれかに記載の方法によって生成されるタンパク質エステルに関する。
【００３４】
別の態様によれば本発明は、［１７］上記［１］から［７］のいずれかに記載の方法によって生成されるタンパク質サブユニットエステルに関する。
【００３５】
別の態様によれば本発明は、［１８］上記［１］から［７］のいずれかに記載の方法によって生成されるヒドロキシ酸エステルに関する。
【００３６】
別の態様によれば本発明は、［１９］固定化脂質アシルトランスフェラーゼ酵素に関する。
【００３７】
別の態様によれば本発明は、［２０］アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素として前記脂質アシルトランスフェラーゼが特徴づけられる、上記［１９］に記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼに関する。
【００３８】
別の態様によれば本発明は、［２１］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｈ−３０９を含むか、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナスヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、上記［１９］又は［２０］に記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼに関する。
【００３９】
別の態様によれば本発明は、［２２］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、上記［１９］から［２１］のいずれかに記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼに関する。
【００４０】
別の態様によれば本発明は、［２３］前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、の１つ又は複数を含む、上記［１９］から［２２］のいずれかに記載の固定化脂質アシルトランスフェラーゼに関する。
【００４１】
さらに別の態様によれば本発明は、（１）ヒドロキシ酸エステルを生成する方法であって、リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類若しくは複数から選択される脂質基質であるアシル供与体と、ヒドロキシ酸からなるアシル受容体と、水とを混合して、５〜９８％の水を含む高水分環境を作るステップと、脂質アシルトランスフェラーゼが、アルコール分解又はエステル転移の一方若しくは両方の反応を触媒するように前記混合物を前記脂質アシルトランスフェラーゼと接触させるステップとを含み、前記脂質アシルトランスフェラーゼが、緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイによって試験したときに少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼとして特徴づけられ、かつＥ．Ｃ．２．３．１．ｘとして分類される方法に関する。
【００４２】
さらに別の態様によれば本発明は、（２）脂質アシルトランスフェラーゼが固定化されている、上記（１）に記載の方法に関する。
【００４３】
さらに別の態様によれば本発明は、（３）ヒドロキシ酸エステルを精製するステップを含む、上記（１）又は（２）に記載の方法に関する。
【００４４】
さらに別の態様によれば本発明は、（４）脂質アシルトランスフェラーゼが、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素である、上記（１）から（３）のいずれかに記載の方法に関する
【００４５】
さらに別の態様によれば本発明は、（５）脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｈ−３０９を含む、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナス・ヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、上記（１）から（３）のいずれかに記載の方法に関する。
【００４６】
さらに別の態様によれば本発明は、（６）脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、上記（１）から（５）のいずれかに記載の方法に関する。
【００４７】
さらに別の態様によれば本発明は、（７）脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと９０％以上同一であるアミノ酸配列、の１つ又は複数からなる、上記（１）から（６）のいずれかに記載の方法に関する。
【００４８】
さらに別の態様によれば本発明は、（８）脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、１又は複数の下記のヌクレオチド配列： 
（ａ）配列番号７に示されるヌクレオチド配列（図９を参照）；
（ｂ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列（図１０を参照）；
（ｃ）配列番号９に示されるヌクレオチド配列（図１１を参照）；
（ｄ）配列番号１０に示されるヌクレオチド配列（図１２を参照）；
（ｅ）配列番号１１に示されるヌクレオチド配列（図１３を参照）；
（ｆ）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列（図１５を参照）；
（ｇ）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列（図１７を参照）；
（ｈ）配列番号２３に示されるヌクレオチド配列（図１９を参照）；
（ｉ）配列番号２５に示されるヌクレオチド配列（図２１を参照）；
（ｊ）配列番号２７に示されるヌクレオチド配列（図２３を参照）；
（ｋ）配列番号２９に示されるヌクレオチド配列（図２５を参照）；
（ｌ）配列番号３１に示されるヌクレオチド配列（図２７を参照）；
（ｍ）配列番号３３に示されるヌクレオチド配列（図２９を参照）；
（ｎ）配列番号３５に示されるヌクレオチド配列（図３１を参照）；又は
（ｏ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、若しくは配列番号３５に示される配列のいずれか１つと９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、
の発現によって産生されるアミノ酸配列からなる、上記（１）から（６）のいずれかに記載の方法に関する。
【００４９】
さらに別の態様によれば本発明は、（９）リン脂質、リゾリン脂質、トリアシルグリセリド、ジグリセリド、糖脂質又はリゾ糖脂質からなる群の１種類又は複数から選択される脂質基質であるアシル供与体と、ヒドロキシ酸からなるアシル受容体と、水との混合物であって、５〜９８％の水を含む混合物において、アルコール分解若しくはエステル転移の一方又は両方の触媒作用によって、ヒドロキシ酸エステルを生成するための脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、前記脂質アシルトランスフェラーゼが、緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイによって試験したときに少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼとして特徴づけられ、かつＥ．Ｃ．２．３．１．ｘとして分類される使用に関する。
【００５０】
さらに別の態様によれば本発明は、（１０）脂質アシルトランスフェラーゼが固定化されている、上記（９）に記載の使用に関する。
【００５１】
さらに別の態様によれば本発明は、（１１）ヒドロキシ酸エステルが精製される、上記（９）又は（１０）に記載の使用に関する。
【００５２】
さらに別の態様によれば本発明は、（１２）脂質アシルトランスフェラーゼが、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（式中、Ｘはアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１種類又は複数である）を含む酵素である、
上記（９）から（１１）のいずれかに記載の使用に関する。
【００５３】
さらに別の態様によれば本発明は、（１３）前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｈ−３０９を含む、或いは配列番号２又は配列番号３２で示されるアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素のアミノ酸配列中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む、上記（９）から（１１）のいずれかに記載の使用に関する。
【００５４】
さらに別の態様によれば本発明は、（１４）脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属、すなわち、アエロモナス、ストレプトマイセス、サッカロミセス、ラクトコッカス、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス、ラクトバチルス、デサルフィトバクテリウム、バチルス、カンピロバクター、ビブリオナシエ、キシレラ、スルフォロブス、アスペルギルス、シゾサッカロミセス、リステリア、ナイセリア、メソルヒゾビウム、ラルストニア、ザントモナス及びカンジダの１種類若しくは複数に由来する生物から得ることができる、上記（９）から（１３）のいずれかに記載の使用に関する。
【００５５】
さらに別の態様によれば本発明は、（１５）脂質アシルトランスフェラーゼが、以下のアミノ酸配列、すなわち、（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列；（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列;（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列；（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列；（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列；（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列、（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列、（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列、（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列、（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列、（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列、（xiv）配列番号３４で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、の１つ又は複数からなる、上記（９）から（１４）のいずれかに記載の使用に関する。
【００５６】
さらに別の態様によれば本発明は、（１６）脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、１又は複数の下記のヌクレオチド配列： 
（ａ）配列番号７に示されるヌクレオチド配列（図９を参照）；
（ｂ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列（図１０を参照）；
（ｃ）配列番号９に示されるヌクレオチド配列（図１１を参照）；
（ｄ）配列番号１０に示されるヌクレオチド配列（図１２を参照）；
（ｅ）配列番号１１に示されるヌクレオチド配列（図１３を参照）；
（ｆ）配列番号１３に示されるヌクレオチド配列（図１５を参照）；
（ｇ）配列番号２１に示されるヌクレオチド配列（図１７を参照）；
（ｈ）配列番号２３に示されるヌクレオチド配列（図１９を参照）；
（ｉ）配列番号２５に示されるヌクレオチド配列（図２１を参照）；
（ｊ）配列番号２７に示されるヌクレオチド配列（図２３を参照）；
（ｋ）配列番号２９に示されるヌクレオチド配列（図２５を参照）；
（ｌ）配列番号３１に示されるヌクレオチド配列（図２７を参照）；
（ｍ）配列番号３３に示されるヌクレオチド配列（図２９を参照）；
（ｎ）配列番号３５に示されるヌクレオチド配列（図３１を参照）；又は
（ｏ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、若しくは配列番号３５に示される配列のいずれか１つと９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、
の発現によって産生されるアミノ酸配列からなる、上記（９）から（１４）のいずれかに記載の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】
本明細書において使用される「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語は、リパーゼ活性（一般に、国際生化学分子生物学連合の命名委員会の酵素命名法推奨（１９９２）に従ってＥ．Ｃ．３．１．１．ｘに分類される）を有するとともに、アシルトランスフェラーゼ活性（一般に、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘに分類される）も有する酵素を意味し、それによってこの酵素は、脂質から、以下の１種類又は複数の受容体基質、すなわち、炭水化物；タンパク質；タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸にアシル基を転移させることが可能である。
【００５８】
本発明による「アシル受容体」は水ではないことが好ましい。
【００５９】
一態様においては、酵素は、脂質基質から炭水化物にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【００６０】
炭水化物アシル受容体は、以下、すなわち、単糖、二糖、オリゴ糖又は多糖の１種類若しくは複数とすることができる。炭水化物は、以下、すなわち、グルコース、フルクトース、無水フルクトース、マルトース、ラクトース、スクロース、ガラクトース、キシロース、キシロオリゴ糖、アラビノース、マルトオリゴ糖、タガトース、ミクロセシン（ｍｉｃｒｏｔｈｅｃｉｎ）、アスコピロン（ａｓｃｏｐｙｒｏｎｅ）Ｐ、アスコピロンＴ又はコータルセロン（ｃｏｒｔａｌｃｅｒｏｎｅ）の１種類若しくは複数であることが好ましい。
【００６１】
炭水化物エステルは、例えば食料品中の貴重な乳化剤として機能することができる。
【００６２】
一態様においては、酵素は、脂質基質からタンパク質及び／又はタンパク質サブユニットにアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【００６３】
好ましくは、タンパク質サブユニットは、以下、すなわち、アミノ酸、タンパク水解物、ペプチド、ジペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドの１種類又は複数とする。
【００６４】
好適には、タンパク質は、以下、すなわち、食料製品中、例えば、乳製品及び／又は肉製品中に存在するタンパク質の１種類若しくは複数とすることができる。単なる例として、適切なタンパク質は、ラクトグロブリンなどの凝乳又は乳清中に存在するタンパク質とすることができる。他の適切なタンパク質としては、（卵からの）卵白アルブミン、グリアジン、グルテニン、プロインドリン、コムギタンパク質、穀物由来の脂質転移タンパク質、肉のミオシン、以下の乳タンパク質、すなわち、カゼイン、ラクトアルブミン及びラクトフェリンなどが挙げられる。
【００６５】
好適には、タンパク質又はタンパク質サブユニットにおいては、アシル受容体は、タンパク質又はタンパク質サブユニットの以下の構成物質、すなわち、セリン、トレオニン、チロシン又はシステインの１種類又は複数とすることができる。
【００６６】
タンパク質サブユニットがアミノ酸であるときには、好適には、アミノ酸は、任意のアミノ酸とすることができる。好ましくは、アミノ酸は、例えば、セリン、トレオニン、チロシン又はシステインの１種類又は複数とする。
【００６７】
一態様においては、酵素は、脂質基質からヒドロキシ酸にアシル基を転移させることが可能であることが好ましい。
【００６８】
好適には、ヒドロキシ酸は、以下の酸、すなわち、クエン酸、酒石酸、乳酸、アスコルビン酸、グリコール酸、リンゴ酸、α−ヒドロキシエタン酸、α−ヒドロキシオクタン酸、α−ヒドロキシカプリル酸、ヒドロキシカプリル酸、グルコン酸、ラクトビオン酸又はマルトビオン酸の１種類若しくは複数とすることができる。
【００６９】
好適には、ヒドロキシ酸は、フルーツ酸、例えば、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、クエン酸又はグリコール酸の１種類若しくは複数とすることができる。
【００７０】
一実施形態においては、ヒドロキシ酸は、以下の酸、すなわち、クエン酸、乳酸、酒石酸又はリンゴ酸の１種類若しくは複数であることが好ましい。
【００７１】
本明細書において使用される「ヒドロキシ酸」という用語は、アルキル基の１個若しくは複数の水素原子がヒドロキシル基で置換されたカルボン酸を意味する。
【００７２】
一態様においては、脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を脂質基質から炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸の１種類若しくは複数に転移させることができるとともに、脂質アシルトランスフェラーゼはさらに、アシル基を脂質から以下、すなわち、ステロール及び／又はスタノール、特に植物ステロール及び／又はフィトスタノールの１種類若しくは複数に転移させることができる。
【００７３】
脂質基質がリン脂質である場合は、レシチン、例えばホスファチジルコリンであることができることが好適である。本明細書において使用されるレシチンという用語は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン及びホスファチジルグリセロールを包含する。
【００７４】
好適には、脂質基質がリゾリン脂質であるときには、脂質基質はリゾレシチン、例えばリゾホスファチジルコリンとすることができる。本明細書において使用されるリゾホスファチジルコリンという用語は、リゾレシチンという用語と同義であり、これらの用語は、本明細書では区別なく使用することができる。
【００７５】
適切には、脂質基質が糖脂質であるときには、脂質基質は例えばジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）とすることができる。
【００７６】
脂質基質は、本明細書では「脂質アシル供与体」又は「アシル供与体」と呼ぶことができる。これらの用語は、本明細書では区別なく使用される。
【００７７】
一部の態様では、脂質アシルトランスフェラーゼが作用する脂質基質は、レシチン、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質であることが好ましい。
【００７８】
一部の態様では、脂質基質は、例えばＤＧＤＧなどの糖脂質であることが好ましい。
【００７９】
一部の態様では、脂質基質は、食品脂質、すなわち食料品の脂質成分であることができる。
【００８０】
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリド、及び／又は１−モノグリセリド、及び／又は２−モノグリセリドに対して作用することができない、或いは実質的に作用することができないことがある。
【００８１】
好適には、脂質基質又は脂質アシル供与体は、以下の基質、すなわち、ラード、タロー及びバター脂肪を含めた脂肪；パーム油、ヒマワリ油、大豆油、サフラワー油、綿実油、落花生油、コーン油、オリーブ油、落花生油、ヤシ油及びなたね油から抽出される、又は誘導される油を含めた油の１種類又は複数の中に存在する１種類又は複数の脂質とすることができる。大豆、アブラナ又は卵黄から得られるレシチンも、適切な脂質基質である。脂質基質は、オートムギ脂質、又はガラクト脂質を含む他の植物系材料とすることができる。
【００８２】
本発明の一部の態様では、脂質は、８〜２２個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
【００８３】
本発明の一部の態様では、脂質は、１６〜２２個の炭素、より好ましくは１６〜２０個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
【００８４】
本発明の一部の態様では、脂質は、１４個以下の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質、好適には４〜１４個の炭素、好適には４〜１０個の炭素、好適には４〜８個の炭素の脂肪酸鎖長を有する脂質から選択することができる。
【００８５】
アシル供与体は、遊離脂肪酸ではないことが好ましい。
【００８６】
アシル供与体は、炭水化物（糖）エステルではないことが好ましい。
【００８７】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のリパーゼ活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）の１つ又は複数を示すことができることが好適である。本明細書において使用される「グリコリパーゼ活性」という用語は、「ガラクトリパーゼ活性」を包含する。
【００８８】
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、及び／又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）、及び／又はホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）の少なくとも１つ又は複数を有することができる。
【００８９】
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくともグリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）を有することができる。
【００９０】
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質から、以下の受容体基質、すなわち、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、ヒドロキシ酸の１種類又は複数にアシル基を転移させることができることが好適である。
【００９１】
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質から炭水化物にアシル基を転移させて、少なくとも炭水化物エステルを形成できることが好ましい。
【００９２】
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、糖脂質及び／又はリン脂質からタンパク質又はタンパク質サブユニットにアシル基を転移させて、少なくともタンパク質エステル（又はタンパク質脂肪酸縮合物)又はタンパク質サブユニットエステルを形成できることが好ましい。
【００９３】
本明細書において使用される「タンパク質サブユニットエステル」という用語は、例えば、ジペプチドエステル、オリゴペプチドエステル、ポリペプチドエステル、タンパク水解物エステルなどの任意のタンパク質サブユニットから形成されるエステルを意味する。
【００９４】
一部の態様では、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さないことが好ましい。
【００９５】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の判定基準、すなわち、
（ｉ）脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸アシル受容体の１種類若しくは複数に転移して新しいエステル、すなわち、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を酵素が有し、
（ii）酵素が、Ｘが以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個若しくは複数であるアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含む
を用いて特徴づけできることが好ましい。
【００９６】
ＧＤＳＸモチーフのＸはＬであることが好ましい。すなわち、本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＳＤＬを含むことが好ましい。
【００９７】
ＧＤＳＸモチーフは、４個の保存アミノ酸からなる。モチーフ内のセリンは、脂質アシルトランスフェラーゼの触媒作用性セリンであることが好ましい。ＧＤＳＸモチーフのセリンは、Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)に教示されたアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＳｅｒ−１６に対応する位置にあることが好適である。
【００９８】
タンパク質が本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを決定するために、配列は、ｐｆａｍデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較されることが好ましい。
【００９９】
Ｐｆａｍは、タンパク質ドメインファミリーのデータベースである。Ｐｆａｍは、各ファミリーに対して検証された（ｃｕｒａｔｅｄ）複数の配列アラインメント、並びに新しい配列中のこれらのドメインを特定するためのプロファイル隠れマルコフモデル（プロファイルＨＭＭ）を含む。Ｐｆａｍの概論は、Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30; 276-280にある。隠れマルコフモデルは、タンパク質を分類するためのいくつかのデータベースにおいて使用されている。総説として、Bateman A and Haft DH（2002）Brief Bioinform 3; 236-245を参照されたい。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12230032&dopt=Abstract
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11752314&dopt=Abstract
【０１００】
隠れマルコフモデルの詳細な説明、及びそのモデルをＰｆａｍデータベースに適用する方法については、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4を参照されたい。Ｈａｍｍｅｒソフトウェアパッケージは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡから入手することができる。
【０１０１】
或いは、ＧＤＳＸモチーフは、Ｈａｍｍｅｒソフトウェアパッケージによって特定することができる。その説明は、Durbin R, Eddy S, and Krogh A (1998) Biological sequence analysis; probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press, ISBN 0-521-62041-4及びその中の参考文献にある。ＨＭＭＥＲ２プロファイルは、本明細書中にある。
【０１０２】
ＰＦＡＭデータベースは、例えば、現在、以下のウェブサイトにあるいくつかのサーバを介して接続することができる。
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml
http://pfam.wustl.edu/
http://pfam.jouy.inra.fr/
http://pfam.cgb.ki.se/
【０１０３】
このデータベースは、タンパク質配列を入力することができる検索機能を提供している。タンパク質配列は、データベースのデフォルトパラメータを用いて、Ｐｆａｍドメインの有無について解析される。ＧＤＳＸドメインは、データベースにおいて確立されたドメインであり、したがって任意の問い合わせ配列中でその有無が確認される。データベースは、問い合わせ配列に対してＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のアラインメントを返す。
【０１０４】
アエロモナス サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）又はアエロモナス ヒドロフィラを含めた複数のアラインメントは、
ａ）マニュアル
上記手順に従って、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を含む目的タンパク質のアラインメント、及びＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列を含むＰ１０４８０のアラインメントを得る；
或いは
ｂ）データベース経由
Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を特定した後に、データベースは、問い合わせ配列のアラインメントをＰｆａｍ００６５７コンセンサス配列のシードアラインメント（ｓｅｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）に示す選択肢を提供する。Ｐ１０４８０はこのシードアラインメントの一部であり、ＧＣＡＴ＿ＡＥＲＨＹで示される。問い合わせ配列とＰ１０４８０の両方を同じ枠内に示す
によって得ることができる。
【０１０５】
アエロモナス ヒドロフィラ基準配列：
アエロモナス ヒドロフィラＧＤＳＸリパーゼの残基は、ＮＣＢＩファイルＰ１０４８０中で番号付けされている。このテキスト中の番号は、好ましい実施形態において本発明の脂質アシルトランスフェラーゼ中に存在する特定のアミノ酸残基を求めるために本発明において使用するファイル中の番号である。
【０１０６】
Ｐｆａｍアラインメントを実施した（図３３及び３４）。
【０１０７】
以下の保存残基は認識することができ、好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法に使用される酵素中に存在することができる。
ブロック１−ＧＤＳＸブロック
hid hid hid hid Gly Asp Ser hid
28  29  30  31  32  33  34  35
ブロック２−ＧＡＮＤＹブロック
hid Gly hid Asn Asp hid
130 131 132 133 134 135
ブロック３−ＨＰＴブロック
His
309
【０１０８】
ここで、「ｈｉｄ」は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ選択される疎水性残基を意味する。
【０１０９】
本発明の組成物／方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いて整列させることができることが好ましい。
【０１１０】
ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）との正の一致（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍａｔｃｈ）は、本発明によるＧＤＳＬ又はＧＤＳＸドメインの存在を示すことが好ましい。
【０１１１】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させたときに、本発明の組成物／方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックの少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上を有する。好適には、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘブロック及びＧＡＮＤＹブロックを有することができる。或いは、この酵素は、ＧＤＳｘブロック及びＨＰＴブロックを有することができる。この酵素は、少なくともＧＤＳｘブロックを含むことが好ましい。
【０１１２】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させたときに、本発明の組成物／方法に使用される酵素は、基準Ａ．ヒドロフィラポリペプチド配列、すなわち配列番号３２：２８ｈｉｄ、２９ｈｉｄ、３０ｈｉｄ、３１ｈｉｄ、３２ｇｌｙ、３３Ａｓｐ、３４Ｓｅｒ、３５ｈｉｄ、１３０ｈｉｄ、１３１Ｇｌｙ、１３２Ｈｉｄ、１３３Ａｓｎ、１３４Ａｓｐ、１３５ｈｉｄ、３０９Ｈｉｓと比較したときに、以下のアミノ酸残基の少なくとも１個、好ましくは２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは５個以上、好ましくは６個以上、好ましくは７個以上、好ましくは８個以上、好ましくは９個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１１個以上、好ましくは１２個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１４個以上、好ましくは１５個以上を有する。
【０１１３】
ｐｆａｍ００６５７ ＧＤＳＸドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から識別する一意的な識別子である。
【０１１４】
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を図１に配列番号１で示す。この配列は、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．６とも呼ばれるｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６の識別子から誘導される。
【０１１５】
このコンセンサス配列は、今後公開されるｐｆａｍデータベースを使用して更新することができる。
【０１１６】
例えば、図３３及び３４に、本明細書ではｐｆａｍ００６５７．１１とも呼ばれる、データベースバージョン１１からのファミリー００６５７のｐｆａｍアラインメントを示す。
【０１１７】
ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロックは、公開された両方のデータベースのｐｆａｍファミリー００６５７に存在する。将来公開されるｐｆａｍデータベースを使用して、ｐｆａｍファミリー００６５７を特定することができる。
【０１１８】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の判定基準、すなわち、
（ｉ）脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸アシル受容体の１種類若しくは複数に転移して新しいエステル、すなわち、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を酵素が有し、
（ii）酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含むこと（ここで、Ｘは、以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ又はＳの１個若しくは複数である）、
（iii）酵素がＨｉｓ−３０９を含み、又は図２（配列番号２又は配列番号３２）に示すアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含むこと
によって特徴づけできることが好ましい。
【０１１９】
ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬであることが好ましい。
【０１２０】
配列番号２又は配列番号３２においては、第１の１８アミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＨｉｓ−２９１に一致する。
【０１２１】
好ましくは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の触媒作用の３つ組、すなわち、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含み、又は図２（配列番号２）若しくは図２８（配列番号３２）に示すアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９に対応する位置のそれぞれセリン残基、アスパラギン酸残基及びヒスチジン残基を含む。上述したように、配列番号２又は配列番号３２に示す配列において、第１の１８アミノ酸残基はシグナル配列を形成する。完全長配列、すなわち、シグナル配列を含むタンパク質のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９は、タンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−１１６及びＨｉｓ−２９１に一致する。ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列においては、図１（配列番号１）に示すように、活性部位残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−１５７及びＨｉｓ−３４８に対応する。
【０１２２】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の判定基準、すなわち、
（ｉ）第１の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット又はヒドロキシ酸アシル受容体の１種類若しくは複数に転移して新しいエステル、すなわち、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルを形成するエステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を酵素が有し、
（ii）酵素が少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９を含み、又は図２（配列番号２）若しくは図２８（配列番号３２）に示すアエロモナス ヒドロフィラ脂肪分解酵素中のそれぞれＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４及びＨｉｓ−３０９に対応する位置のグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジン残基を含むこと
によって特徴づけできることが好ましい。
【０１２３】
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の属、すなわち、アエロモナス（Aeromonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、ラクトコッカス（Lactococcus）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、デサルフィトバクテリウム（Desulfitobacterium）、バチルス（Bacillus）、カンピロバクター（Campylobacter）、ビブリオナシエ（Vibrionaceae）、キシレラ（Xylella）、スルフォロブス（Sulfolobus）、アスペルギルス（Aspergillus）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、リステリア（Listeria）、ナイセリア（Neisseria）、メソルヒゾビウム（Mesorhizobium）、ラルストニア（Ralstonia）、ザントモナス（Xanthomonas）及びカンジダ（Candida）の１種類若しくは複数由来の生物から得ることができ、好ましくは得られる。
【０１２４】
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の生物、すなわち、アエロモナス ヒドロフィラ、アエロモナス サルモニシダ、ストレプトマイセス コエリコラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス リモサス（Streptomyces rimosus）、マイコバクテリウム、ストレプトコッカス ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）、ストレプトコッカス ピオゲネス、ストレプトコッカス サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）、ラクトバチルス ヘルベティクス（Lactobacillus helveticus）、デサルフィトバクテリウム デハロゲナンス（Desulfitobacterium dehalogenans）、バチルスｓｐ、カンピロバクター ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、ビブリオナシエ、キシレラ ファスチジオサ（Xylella fastidiosa）、スルフォロブス ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス テレウス（Aspergillus terreus）、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、リステリア イノキュア（Listeria innocua）、リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ナイセリア メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、メソルヒゾビウム ロティ（Mesorhizobium loti）、ラルストニア ソラナセアルム（Ralstonia solanacearum）、ザントモナス カンペストリス（Xanthomonas campestris）、ザントモナス アクソノポディス（Xanthomonas axonopodis）及びカンジダ パラプシロシス（Candida parapsilosis）の１種類若しくは複数から得ることができ、好ましくは得られる。
【０１２５】
一態様においては、好ましくは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、アエロモナス ヒドロフィラ又はアエロモナス サルモニシダの１種類又は複数から得ることができ、好ましくは得られる。
【０１２６】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列（図２参照）
（ii）配列番号３で示されるアミノ酸配列（図３参照）
（iii）配列番号４で示されるアミノ酸配列（図４参照）
（iv）配列番号５で示されるアミノ酸配列（図５参照）
（ｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列（図６参照）
（vi）配列番号１２で示されるアミノ酸配列（図１４参照）
（vii）配列番号２０で示されるアミノ酸配列（図１６参照）
（viii）配列番号２２で示されるアミノ酸配列（図１８参照）
（ix）配列番号２４で示されるアミノ酸配列（図２０参照）
（ｘ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列（図２２参照）
（xi）配列番号２８で示されるアミノ酸配列（図２４参照）
（xii）配列番号３０で示されるアミノ酸配列（図２６参照）
（xiii）配列番号３２で示されるアミノ酸配列（図２８参照）
（xiv）配列番号３４（図３０）で示されるアミノ酸配列、又は配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２若しくは配列番号３４で示される配列のいずれか１つと７５％以上同一であるアミノ酸配列
の１つ若しくは複数を含むことが好適である。
【０１２７】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号３２、又は配列番号３４で示されるアミノ酸配列を含み、或いは配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号３で示されるアミノ酸配列、配列番号３２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号３４で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含むことが好適である。
【０１２８】
本発明では、同一性の程度は、同じ配列要素の数に基づく。本発明による同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, US53711）（Needleman & Wunsch (1970), J. of Molecular Biology 48, 443-45）に備わったＧＡＰなどの当分野で公知のコンピュータプログラムによって、以下のポリペプチド配列比較の設定、すなわち、ＧＡＰクリエーションペナルティー（ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）３．０及びＧＡＰエクステンションペナルティー（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．１を用いて、適切に決定することができる。
【０１２９】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列を含むことが好適である。
【０１３０】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
（ａ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１〜１００で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１０１〜２００で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基２０１〜３００で示されるアミノ酸配列、或いは
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列
の１つ若しくは複数を含むことが好適である。
【０１３１】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列、すなわち、
（ａ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基２８〜３９で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基７７〜８８で示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１２６〜１３６で示されるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基１６３〜１７５で示されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２又は配列番号３２のアミノ酸残基３０４〜３１１で示されるアミノ酸配列、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか１つと７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一であるアミノ酸配列
の１つ若しくは複数を含むことが好適である。
【０１３２】
好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のヌクレオチド配列、すなわち、
（ａ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列（図９参照）、
（ｂ）配列番号８で示されるヌクレオチド配列（図１０参照）、
（ｃ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列（図１１参照）、
（ｄ）配列番号１０で示されるヌクレオチド配列（図１２参照）、
（ｅ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列（図１３参照）、
（ｆ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列（図１５参照）、
（ｇ）配列番号２１で示されるヌクレオチド配列（図１７参照）、
（ｈ）配列番号２３で示されるヌクレオチド配列（図１９参照）、
（ｉ）配列番号２５で示されるヌクレオチド配列（図２１参照）、
（ｊ）配列番号２７で示されるヌクレオチド配列（図２３参照）、
（ｋ）配列番号２９で示されるヌクレオチド配列（図２５参照）、
（ｌ）配列番号３１で示されるヌクレオチド配列（図２７参照）、
（ｍ）配列番号３３で示されるヌクレオチド配列（図２９参照）、
（ｎ）配列番号３５で示されるヌクレオチド配列（図３１参照）、
（ｏ）或いは
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３又は配列番号３５で示される配列のいずれか１つと７５％以上同一であるヌクレオチド配列の発現によって産生されるアミノ酸配列、或いはこれらのヌクレオチド配列の１種類若しくは複数を含むことができる。
【０１３３】
好適には、ヌクレオチド配列は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３又は配列番号３５で示される配列のいずれか１つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上同一とすることができる。
【０１３４】
一態様においては、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、又はその変異体（例えば、分子進化によって造られた変異体）とすることができる。
【０１３５】
適切なＬＣＡＴは、当分野で公知であり、例えば以下の生物、すなわち、哺乳動物、ラット、マウス、ヒヨコ、キイロショウジョウバエ、アラビドプシス（Arabidopsis）及びオリザ サティバ（Oryza sativa）を含めた植物、線虫、真菌及び酵母の１種類若しくは複数から得ることができる。
【０１３６】
一実施形態においては、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ １、ＤＫ−１００１ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｋ、ＤｅｎｍａｒｋのＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓによって、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ、Ｍａｒｉｎｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）２３ Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ Ｓｔｒｅｅｔ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＧＢにおいて２００３年１２月２２日にそれぞれアクセッション番号ＮＩＣＭＢ ４１２０４及びＮＣＩＭＢ ４１２０５として寄託されたｐＰｅｔ１２ａＡｈｙｄｒｏ及びｐＰｅｔ１２ａＡＳａｌｍｏを収容する大腸菌（E. coli）系統ＴＯＰ １０から得ることができ、好ましくは得られる脂質アシルトランスフェラーゼとすることができる。
【０１３７】
本明細書において使用される「トランスフェラーゼ」という用語は、「脂質アシルトランスフェラーゼ」という用語と区別なく使用される。
【０１３８】
本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の反応、すなわち、エステル交換、アルコール分解の１種類若しくは両方を触媒することが好適である。
【０１３９】
したがって、本発明によれば、以下の有利な諸特性の１つ若しくは複数を実現することができる。すなわち、炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数を形成する脂質の生物変換が、有機溶媒を含まない、又は従来の生物変換プロセスよりも有機溶媒が少ない高水分環境において起こることができる。
【０１４０】
本明細書において使用される「生物変換」という用語は、酵素触媒作用による、ある有機化合物から別の有機化合物を生成する改変、及び／又は他の有機化合物からの有機化合物の合成を意味する。
【０１４１】
本明細書において使用される「エステル転移」という用語は、（遊離脂肪酸以外の）脂質供与体から（水以外の）アシル受容体への、酵素によって触媒されたアシル基の転移を意味する。不確かさを回避するために、本明細書において使用される「エステル転移」という用語の使用は、脂質供与体から、例えば、−ＯＨ基でも−ＳＨ基でもよい適切な化学基を含む（水以外の）アシル受容体へのアシル基の転移を含む。
【０１４２】
本明細書において使用される「アルコール分解」という用語は、生成物の一方がアルコール基のＨと結合し、もう一方の生成物がアルコール基のＯＲ基と結合するような、アルコール基ＲＯＨとの反応による酸誘導体の共有結合の酵素による切断を意味する。
【０１４３】
本明細書において使用される「加水分解」という用語は、脂質から水分子のＯＨ基への、酵素によって触媒されたアシル基の転移を指す。加水分解から生じるアシル転移には、水分子の分離が必要である。
【０１４４】
「エステル交換」という用語は、酵素によって触媒された、脂質供与体と脂質受容体の間のアシル基転移を意味する。ここで、脂質供与体は遊離アシル基ではない。換言すれば、「エステル交換」は、２個の脂質分子間の脂肪酸の交換を指す。
【０１４５】
一態様においては、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼはエステル交換を触媒する。
【０１４６】
好適には、本発明による方法又は使用は、さらに、以下のステップ、すなわち、アシル受容体を水に溶解するステップ；溶解したアシル受容体に脂質アシル供与体を添加して２相系又はエマルジョンを形成するステップ；反応混合物を撹拌又は超音波処理するステップ；反応混合物を加熱して、例えば、酵素を変性するステップ；脂肪／乳化剤相から、例えば溶媒抽出、水蒸発などの標準分離技術によって水相を分離するステップ；脂肪相を疎水性相互作用クロマトグラフィー、結晶化又は高真空蒸留によって分画するステップの１つ若しくは複数も含むことができる。好適には、加熱ステップ、分離ステップ又は分画ステップの１つ若しくは複数は、反応が平衡に達した後に実施することができる。
【０１４７】
一実施形態においては、本発明の方法に使用されるリパーゼアシルトランスフェラーゼは固定することができる。酵素が固定されている場合には、アシル供与体、アシル受容体及び水を含む混合物を、例えば、固定化酵素を含むカラムに通した。酵素を固定することによって、酵素を容易に再使用することができる。
【０１４８】
好適には、固定化酵素は、水に溶解されたアシル受容体と脂質アシル供与体を２相系又はエマルジョンとして含む反応混合物を含む流通反応装置又は回分式反応装置において使用することができる。反応混合物は、場合によっては撹拌又は超音波処理されていてもよい。例えば、反応が平衡に達した後に、反応混合物と固定化酵素を分離することができる。好適には、反応生成物は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー、結晶化又は高真空蒸留によって分画することができる。
【０１４９】
固定化脂質アシルトランスフェラーゼは、当分野で既知の固定化技術を用いて調製することができる。固定化酵素を調製する方法は多数あり、それらは当業者には明らかである（例えば、欧州特許第０ ７４６ ６０８号；又はBalcao V.M., Paiva A.L., Malcata F.X., Enzyme Microb Technol. 1996 May 1;18(6):392-416；又はRetz M.T., Jaeger K.E. Chem Phys Lipids. 1998 Jun;93(1-2):3-14；Bornscheuer U.T., Bessler C, Srinivas R, Krishna S.H. Trends Biotechnol. 2002 Oct;20(10):433-7；Plou et al, J. Biotechnology 92 (2002) 55-66；Warmuth et al., 1992. Bio Forum 9, 282-283；Ferrer et al., 2000. J. Chem. Technol. Biotechnol. 75, 1-8；又はChristensen et al., 1998. Nachwachsende Rohstoff 10, 98-105; Petersen and Christenen, 2000, Applied Biocatalysis. Harwood Academic Publishers, Amsterdamに記載の技術（これらの各々を参照により本明細書に援用する）。本明細書に使用することができる技術としては、例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃへの共有結合性カップリング、ポリプロピレンへの吸着、及びシリカ造粒（ｓｉｌｉｃａ−ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）が挙げられる。
【０１５０】
本明細書において使用される「高水分環境」という用語は、有機溶媒が少ない又はない、好ましくは極性有機溶媒が少ない又はない環境を意味することが好ましい。本明細書において使用される有機溶媒という用語は、脂質基質として使用されるときには食用油を包含せず、例えば非極性脂質が多い食用油を好ましくは包含しないことが好ましい。好適には、本発明による高水分環境は、５０体積％未満の有機溶媒、３０体積％未満の有機溶媒、より好ましくは１５体積％未満の有機溶媒、より好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、より好ましくは０．５体積％未満の有機溶媒、より好ましくは０体積％の有機溶媒を含むことができる。
【０１５１】
炭水化物エステルが本発明によって生成される場合には、その炭水化物エステルは、オリゴ糖エステル、単糖エステル又は二糖エステルであることが好ましい。
【０１５２】
好適には、炭水化物エステルは、本発明によって生成されるときには、以下、すなわち、グルコースエステル、フルクトースエステル、無水フルクトースエステル、マルトースエステル、ラクトースエステル、ガラクトースエステル、キシロースエステル、キシロオリゴ糖エステル、アラビノースエステル、マルトオリゴ糖エステル、タガトースエステル、スクロースエステル、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル又はコータルセロンエステルの１種類若しくは複数とすることができる。
【０１５３】
炭水化物エステルは、本発明によって生成されるときには、以下、すなわち、炭水化物モノ−エステル、糖モノ−エステル、オリゴ糖モノ−エステル、三糖モノ−エステル、二糖モノ−エステル、単糖モノ−エステル、グルコースモノ−エステル、フルクトースモノ−エステル、無水フルクトースモノ−エステル、マルトースモノ−エステル、ラクトースモノ−エステル、ガラクトースモノ−−エステル、キシロースモノ−エステル、キシロオリゴ糖モノ−エステル、アラビノースモノ−エステル、マルトオリゴ糖モノ−エステル、タガトースモノ−エステル、スクロースモノ−エステル、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル又はコータルセロンエステルの１種類若しくは複数であることが好ましい。
【０１５４】
一実施形態においては、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル及び／又はコータルセロンエステルは、抗菌剤として機能することができる。これとは別に、又はこれに加えて、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル及び／又はコータルセロンエステルは、酸化防止剤及び／又は乳化剤の一方若しくは両方として機能することができる。
【０１５５】
本発明による炭水化物エステルの形成は（もしあれば）、ＵＤＰ−グルコースとは無関係であることが好ましい。
【０１５６】
本発明による食料品は、ＵＤＰ−グルコースを含まず、又は重要でない量のＵＤＰ−グルコースしか含まないことが好ましい。
【０１５７】
本発明の組成物及び方法において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、かなりの水の存在下でも脂質から水以外の受容体へのアシル基の転移を顕著に優先させる点で、脂肪分解酵素と比較したときに独特の諸特性を有することが見出された。従来技術の酵素と比較して、本発明に使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、６％水分、５４％水分、７３％水分、８９％水分及び約９５％の存在下で高い相対トランスフェラーゼ活性を有することが見出された。試験した脂肪分解酵素は、これらの水濃度においては意味のある相対トランスフェラーゼ活性を実質的に持たなかった。
【０１５８】
％トランスフェラーゼ活性（すなわち、全酵素活性の百分率としてのトランスフェラーゼ活性）は、以下のプロトコルによって求めることができる。
【０１５９】
％アシルトランスフェラーゼ活性を求めるプロトコル：
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが添加される基質は、以下の詳細な手順に従って、酵素反応後にＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ ２：１で抽出し、脂質材料を含む有機相を単離し、ＧＬＣ及びＨＰＬＣによって分析することができる。ＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析から、遊離脂肪酸、及び炭水化物エステル、タンパク質エステル；タンパク質サブユニットエステル；ヒドロキシ酸エステルの１種類又は複数の量が求められる。本発明による酵素が添加されない対照基質も同様に分析される。
計算：
ＧＬＣ及びＨＰＬＣ分析の結果から、遊離脂肪酸、並びに炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸の増加量を計算することができる。
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素）−％脂肪酸（対照）；Ｍｖ脂肪酸＝脂肪酸の平均分子量；
Ａ＝Δ％タンパク質エステル／Ｍｖタンパク質エステル（ここで、Δ％タンパク質エステル＝％タンパク質エステル（酵素）−％タンパク質エステル（対照）及びＭｖタンパク質エステル＝タンパク質エステルの平均分子量）−アシル受容体がタンパク質である場合に適用可能；
Ｂ＝Δ％炭水化物エステル／Ｍｖ炭水化物エステル（ここで、Δ％炭水化物エステル＝％炭水化物エステル（酵素）−％炭水化物エステル（対照）及びＭｖ炭水化物エステル＝炭水化物エステルの平均分子量）−アシル受容体が炭水化物である場合に適用可能；
Ｃ＝Δ％タンパク質サブユニットエステル／Ｍｖタンパク質サブユニットエステル（ここで、Δ％タンパク質サブユニットエステル＝％タンパク質サブユニットエステル（酵素）−％タンパク質サブユニットエステル（対照）及びＭｖタンパク質サブユニットエステル＝タンパク質サブユニットエステルの平均分子量）−アシル受容体がタンパク質サブユニットである場合に適用可能；並びに
Ｄ＝Δ％ヒドロキシ酸エステル／Ｍｖヒドロキシ酸エステル（ここで、Δ％ヒドロキシ酸エステル＝％ヒドロキシ酸エステル（酵素）−％ヒドロキシ酸エステル（対照）、及びＭｖヒドロキシ酸エステル＝ヒドロキシ酸エステルの平均分子量）−アシル受容体がヒドロキシ酸である場合に適用可能。
【０１６０】
トランスフェラーゼ活性は、全酵素活性の百分率として計算される。
【０１６１】
【数１】
2011167191.tif 000002
【０１６２】
リパーゼ、及び酵素のアシルトランスフェラーゼ活性は、以下のアッセイによって評価することができる。このようにして、本明細書に定義される酵素特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼを得ること／特定することができる。
【０１６３】
緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ（実施例６参照）
本発明の組成物及び方法に使用される脂質アシルトランスフェラーゼとして機能する酵素は、本明細書の実施例６に教示するアッセイによって常法に従って特定することができる。このアッセイを以後「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」と称する。実施例６においては、本発明によるアエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼを分析し、本発明によって包含されないある範囲の脂肪分解酵素と比較した。脂肪分解酵素のうちＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のみがトランスフェラーゼ活性を有するが、極めて低レベル（１．３％）にすぎないことがわかった。
【０１６４】
本発明の組成物及び方法に使用するのに適切な酵素は、緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイによって常法に従って特定することができる。極めて高含水量（約９５％）であるこのアッセイによって、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも２％のアシルトランスフェラーゼ活性（相対トランスフェラーゼ活性）、好ましくは少なくとも５％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１０％の相対トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％ ２６％、２８％、３０％、４０％ ５０％、６０％又は７５％の相対トランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼである。好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、２８％未満、３０％未満、好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％未満のアシルトランスフェラーゼ活性を有することができる。
【０１６５】
低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ
「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」を使用するのとは別に（又はその使用に加えて）、本発明によって使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって特定することができる。
【０１６６】
ある酵素が本発明による脂質アシルトランスフェラーゼであるかどうかを明らかにするために、「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」を、すなわち、実施例９において教示される６％の水を含む油状環境において実施することができる。この実施例は、従来技術の脂肪分解酵素が加水分解活性を有する含水量６％の油状環境において、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼが高い相対トランスフェラーゼ活性を有することを示している。
【０１６７】
一実施形態においては、本発明による方法及び／又は使用において使用するのに適切な脂質アシルトランスフェラーゼは、「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって試験し、３０、２０又は１２０分から選択される時間後に測定したときに、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％の相対トランスフェラーゼ活性を有する。好適には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、１０、２０、３０又は１２０分後に「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって測定したときに、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又は８０％未満の活性を有することができる。
【０１６８】
上述したように、本発明のリパーゼアシルトランスフェラーゼは、「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」、又はアシル受容体としてコレステロールを用いた「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」によって特定することができる。「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」又は「低水分環境におけるトランスフェラーゼアッセイ」は、これらの分析方法に明らかな修正を加えて、あらゆる脂質アシル供与体又はあらゆるアシル受容体の組み合わせの脂質アシルトランスフェラーゼ活性を求めるために使用できることを当業者が容易に認識できることは言うまでもない。当業者は、必要に応じて、アシル供与体基質（例えばリン脂質）を別のアシル供与体基質（例えば糖脂質、トリアシルグリセリド）と簡単に置換し、且つ／又はアシル受容体（例えばコレステロール）を別のアシル受容体基質（例えば炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、又はヒドロキシ酸）と置換することができる（例えば実施例１０〜１３参照）。
【０１６９】
本明細書において使用される「高水分環境」という用語は、５〜９８％の水を含むあらゆる環境を意味する。好ましくは、この環境は、含水量が６％を超え、好ましくは７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を超える。好適には、高水分環境は、２０〜９８％、好適には５０〜９８％、好適には７０〜９８％、好適には７５〜９８％の水を含むことができる。
【０１７０】
一実施形態においては、混合物において、水に対する、添加される脂質アシルトランスフェラーゼの量の比は、重量基準で測定して少なくとも１：７００、好ましくは１：１０，０００である。
【０１７１】
本明細書において使用される「低水分」という用語は、含水量が５％未満、好ましくは４％、３％、２％、１％又は０．５％未満のあらゆる基質又は食料品を意味する。
【０１７２】
本発明による方法及び／又は使用は、１５〜６０℃、好ましくは２０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃、好ましくは２０〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃の温度で実施できることが好ましい。
【０１７３】
本発明による方法又は使用は、さらなるステップ、或いは反応生成物、すなわち、炭水化物エステルタンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル又はヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数を精製及び／又は単離するステップを含むことが好適である。したがって、反応生成物は、精製された形、及び／又は単離された形であることが好ましい。
【０１７４】
エステルを精製する多数の方法が当業者に知られている。単なる例として示すと、本明細書に教示する方法／使用によって生成されるエステルは、疎水性相互作用などのクロマトグラフィー、ろ過、遠心分離、溶媒抽出／蒸留又は結晶化によって精製することができる。適切な方法は、Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaAによって教示されている。
【０１７５】
本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、任意の適切な発現宿主中で発現させることができる。例えば、本発明の脂質アシルトランスフェラーゼは、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）中で発現させることができ、限外ろ過、及び／又はエタノール中の沈殿、及び／又は遠心分離によって精製することができ、続いて酵素の担体としてデンプン（マルトデキストリン）を用いて噴霧乾燥することができる。噴霧乾燥された酵素は、粉末担体をさらに添加することによって指定のＰＬＵ活性に規格化することができる。関係する技術は、当分野では十分に確立されており、日常的なものである。
【０１７６】
一実施形態においては、本発明による方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスである。この方法は、好適には、連続又はバッチプロセスとすることができる。
【０１７７】
本発明による酵素は、１種類若しくは複数のさらなる酵素と併用することができる。したがって、本発明の酵素に加えて、少なくとも１種類のさらなる酵素と混合物を接触させることは、本発明の範囲内にある。このようなさらなる酵素としては、エンド又はエキソアミラーゼなどのデンプン分解酵素、プルラナーゼ、枝切り酵素、キシラナーゼを含めたヘミセルラーゼ、セルラーゼ、オキシドレダクターゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、又はマルトースを酸化する酵素、例えば、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）などの炭水化物オキシダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ及びヘキソースオキシダーゼ、プロテアーゼなどが挙げられる。混合物は、本発明の酵素、及び少なくとも１種類のさらなる酵素と同時に又は逐次的に接触させることができる。
【０１７８】
一実施形態においては、脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のリパーゼ活性、すなわち、グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）又はホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）の１つ若しくは複数を有するリパーゼと併用される。好適なリパーゼ酵素は当技術分野で周知であり、例として、以下のリパーゼ、すなわち、ＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ及び／又はＬＥＣＩＴＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製ＬＩＰＯＭＯＤ（商標）２２Ｌ、Ｇｅｎｅｃｏｒ製ＬＩＰＯＭＡＸ（商標）からのホスホリパーゼＡ２）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、国際公開第０３／９７８３５号、欧州特許第０ ９７７ ８６９号又は欧州特許第１ １９３ ３１４号に教示されたリパーゼなどが挙げられる。
【０１７９】
用途
したがって、本発明による方法によって、炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル、ヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数が生成される。これらのエステルの多くが有用な乳化剤である。単なる例として示すと、例えば、アミノ酸エステル、ペプチドエステル、タンパク質エステル、炭水化物エステル及び（酒石酸エステルなどの）ヒドロキシ酸エステルは機能的に重要な乳化剤である。乳化剤は、例えば、食品産業、飼料産業、化粧品産業（例えば、コスメティックベース）、医薬産業（例えば医薬品合成及び処方）、塗料工業などの広範な産業において有用である。乳化剤は、湿潤剤、食品成分及び活性成分として機能することができる。
【０１８０】
また、タンパク質脂肪酸縮合物は、生理学的特性が優れているために、例えば、化粧品、及び個人衛生製品に使用するのに適している。例えば、タンパク質エステルは、シャワー剤及び浴剤、並びにシャンプー及び体用洗剤に使用することができる。タンパク質脂肪酸縮合物は、薬剤組成物、例えば、基剤としても有用な場合がある。
【０１８１】
タンパク質脂肪酸縮合物は、化粧品産業における応用例が良く知られている。従来、これらの製品は、水を溶媒として用いてショッテン−バウマン条件下でタンパク水解物を脂肪酸塩化物と反応させることによって製造されている。(http://www.scf-online.com/english/26_e/rawmaterials26_e_.htm#5)。
【０１８２】
タンパク質−脂肪酸縮合物の開発においては、（植物油から得られる）再生可能資源の脂肪酸と、動物の廃棄物（革）並びに多数の植物から得ることができるタンパク質とを組み合わせて、疎水性（脂肪酸）及び親水性（タンパク質）部分を有する界面活性剤構造を構築することが可能である。このプロセスにおいては、脂肪酸塩化物は、アミノ酸のアミン基と反応し、タンパク質脂肪酸縮合物を形成する（図４９参照）。皮膚適合性に優れ、さらに洗浄効果が良好な生成物が得られる。
【０１８３】
アシル化タンパク水解物を少量添加しても、他の界面活性剤の皮膚適合性に対して相乗効果を有するということは、技術的な処方の観点からは極めて重要である。この保護作用は、生成物の両性的挙動によって説明することができる。タンパク質−脂肪酸縮合物と皮膚コラーゲンの間には相互作用がある。これによって、保護層が形成され、この保護層が、皮膚上層に対する界面活性剤の過剰な攻撃を抑制し、その強力な脱脂効果を弱め、イオン性界面活性剤と皮膚との直接相互作用を弱める。
【０１８４】
化粧品部門では、タンパク質を主体とする界面活性剤は、刺激の少ないシャワー及び浴用製品、刺激の少ないシャンプー、界面活性剤を主体とする顔用洗剤、コールドパーマ剤及び定着剤、又は乳児用界面活性剤に主として使用される。
【０１８５】
タンパク水解物脂肪酸縮合物は、薬剤、例えば、皮膚への局所用活性成分を含むクリーム及び軟膏剤の基剤としても有用である。
【０１８６】
本発明は、脂肪酸塩化物を使用せずにタンパク質脂肪酸縮合物を生成する新しい方法を提供する。本発明による反応を図５０に示す。この反応は、廃棄物を形成せずに、水系又は緩衝系において低温で実施することができる。
【０１８７】
本明細書において使用される「タンパク質脂肪酸縮合物」という用語は、以下のタンパク質エステル、すなわち、ポリペプチドエステル、ジペプチドエステル、オリゴペプチドエステル、ペプチドエステル及びアミノ酸エステルのすべてを包含する。
【０１８８】
当業者はすぐにわかるように、炭水化物エステル（特に糖エステル）は、食品産業において広範な用途を有する。他の応用分野としては、化粧品、口腔ケア製品、医薬品などが挙げられる。また、これらの化合物は、抗生物質、抗腫瘍剤、殺真菌剤及び殺虫剤としても使用することができる。本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、高水分環境においてグルコースエステルの形成を触媒することができる（図５１）。
【０１８９】
本発明によって生成されるエステルは、以下の分野で使用される。
【０１９０】
化粧品：精油エマルジョン（ｏ／ｗ、ＨＬＢ １６〜１８）パラフィン油エマルジョン、ｏ／ｗ、ＨＬＢ １０〜１４；ステアリン酸エマルジョン；ワックスエマルジョン、ｏ／ｗ、ＨＬＢ １４〜１６；ラノリンエマルジョン、ｏ／ｗ、ＨＬＢ １２〜１４；シリコーンエマルジョン；練り歯磨き、ｏ／ｗ；泡沫浴、ｏ／ｗ、ＨＬＢ １４〜１８；ヘアローションを含めて。
【０１９１】
薬剤：薬物エマルジョン；軟膏基剤；坐剤化合物、ｗ／ｏ；カプセル封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）；注射薬剤を含めて。
【０１９２】
農業：土壌改良における；肥料添加剤として；汎用洗浄剤として；果実及び野菜用洗浄剤；かく乳器用洗浄剤を含めて。
【０１９３】
農作物保護：天然の殺虫剤において；塩素化炭化水素、及び１４０；リン酸エステルｏ／ｗ、ＨＬＢ １０〜１４；殺真菌剤、ｏ／ｗ；除草剤、ｏ／ｗを含めて。
【０１９４】
食品産業：パン及びケーキにおいて；マーガリン；チョコレート；ファットブルーム防止、ｗ／ｏ、ＨＬＢ ５〜１０；糖衣、ｏ／ｗ、ＨＬＢ １４〜１６；キャラメル及びチューインガム用軟化剤、ｗ／ｏ、ＨＬＢ ２〜４；粘着防止、ｗ／ｏ、ＨＬＢ ２〜４；アイスクリーム添加剤 ｗ／ｏ、ＨＬＢ ４〜６；粉乳及びふくらし粉の湿潤化、ｗ／ｏ、ＨＬＢ ９〜１１；粉末カスタード、ｗ／ｏ、ＨＬＢ ２〜４；飲料産業において；果実及び野菜において；香味料において、ｗ／ｏ及びｏ／ｗ、ＨＬＢ １０〜１２；肉、サラダ、又は他の香味ソース、ｏ／ｗ；食品色素において、ｗ／ｏ、ＨＬＢ ２〜４；ｏ／ｗ、ＨＬＢ ８〜１８；抑泡剤においてを含めて。
【０１９５】
本発明によって生成されたタンパク質脂肪酸エステル、ヒドロキシ酸エステル及び炭水化物エステルを食品用途において乳化剤として使用する利点は、これらが、例えばエトキシル化脂肪酸エステルのような従来使用されている他の乳化剤よりも容易に生分解される無害な食品適合成分であることである。したがって、これらの乳化剤は、食品産業と非食品産業の両方において使用するのに環境負荷がより少ない。
【０１９６】
一実施形態においては、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル及び／又はコータルセロンエステルは、抗菌剤として機能することができる。これとは別に、又はこれに加えて、ミクロセシンエステル、アスコピロンＰエステル、アスコピロンＴエステル及び／又はコータルセロンエステルは、酸化防止剤及び／又は乳化剤の一方若しくは両方として機能することができる。
【０１９７】
一実施形態においては、本発明の方法又は使用は、製剤、特に活性成分の制御放出製剤の製造に使用される乳化剤を製造するために使用することができる。この活性成分は、脂質アシルトランスフェラーゼによってアシル化されている。このような徐放性製剤は、消化管中でエステルが徐々に加水分解されて活性成分が徐々に送達される経口投与薬剤組成物に特に有用である。このようなアシル化組成物は、さらに、皮下製剤又は静脈内製剤にも使用することができる。
【０１９８】
別の実施形態においては、本発明の方法又は使用は、例えば有機反応において、有機溶媒の溶液中に塩を移動させる相間移動触媒を製造するために使用することができる。例えば、ヒドロキシ酸（クエン酸)などの適切な陽イオン性受容体へのアシル基の転移によって、或いはヒドロキシ−アミンなどの陰イオン性受容体基を用いて、塩を有機溶媒溶液中に移動させる相間移動触媒を製造することができる。
【０１９９】
別の実施形態においては、本発明の方法は、生物学的利用能が低い、及び／又は溶解性が低い、薬剤化合物のエステルプロドラッグ、例えば、アシクロビル及びガングアシクロビル（ｇａｎｇａｃｉｃｌｏｖｉｒ）のような抗ウイルス薬を製造するために使用することができる。本方法は、さらに、遊離ヒドロキシ基、例えば、第一級、第二級又は第三級ヒドロキシ基を有する他の薬用化合物に使用することもできる。
【０２００】
本発明によって生成されるエステルは、薬剤に使用されることが好ましい。
【０２０１】
本発明によって生成されるエステルは、化粧品及び／又は個人衛生製品に使用されることが好ましい。
【０２０２】
本発明によって生成されるエステルは、食料品及び／又は飼料に使用されることが好ましい。
【０２０３】
本発明による方法は、医薬品、化粧品、個人衛生製品食料品又は飼料の１種類若しくは複数の製造プロセスにおける一段階とすることができる。
【０２０４】
利点
本発明による方法の１つの利点は、有機溶媒を使用せずに、炭水化物エステル、タンパク質エステル、タンパク質サブユニットエステル、又はヒドロキシ酸エステルの１種類若しくは複数を生成することである。したがって、本発明は、有機溶媒の使用を削減し、又はなくすことができる。これは、例えば、製造コストの削減、有機溶媒へのヒト及び／又は環境の暴露の抑制、製造プロセスの単純化など多数の利点を有する。
【０２０５】
食品用エステルの製造においては、脂肪酸よりも脂質を使用することが特に有利である。というのは、過剰の脂質は、反応生成物が使用される食品の一部を形成することができるので、除去する必要がないからである。一方、過剰の遊離脂肪酸は、ほとんどの食料製品に有害であるので除去しなければならない。
【０２０６】
単離
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、単離された形であることが好ましい。「単離された」という用語は、配列が、その配列が本来天然に付随し、天然に存在する少なくとも１種類の他の成分から少なくとも実質的に遊離していることを意味する。
【０２０７】
一態様においては、本発明による生物変換生成物、例えば、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルは、反応混合物から単離されることが好ましい。「単離された」という用語は、生物変換生成物が、生物変換反応中に生物変換生成物に付随する少なくとも１種類の他の成分から少なくとも実質的に遊離していることを意味する。
【０２０８】
精製
一態様においては、本発明に使用されるポリペプチド又はタンパク質は、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約５１％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも純度約９０％、又は少なくとも純度約９５％、又は少なくとも純度約９８％であることを意味する。
【０２０９】
一態様においては、本発明によって生成される生物変換生成物、例えば、炭水化物エステル、及び／又はタンパク質エステル、及び／又はタンパク質サブユニットエステル、及び／又はヒドロキシ酸エステルは、反応混合物から精製され、したがって、精製された形であることが好ましい。「精製された」という用語は、生物変換生成物が比較的純粋な状態、例えば少なくとも純度約５１％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも純度約９０％、又は少なくとも純度約９５％、又は少なくとも純度約９８％であることを意味する。
【０２１０】
薬剤組成物
本発明は、本発明の生成物、及び薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤（それらの組み合せを含めて)を含む薬剤組成物も提供する。
【０２１１】
この薬剤組成物は、ヒトの医学及び獣医学においてヒト又は動物に使用することができ、一般に、薬剤として許容される希釈剤、担体又は賦形剤のいずれか１種類若しくは複数を含む。治療用に許容される担体又は希釈剤は、薬剤技術においては周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。薬剤担体、賦形剤又は希釈剤は、意図する投与経路、及び製薬上の標準的実務に照らして選択することができる。薬剤組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はそれらに加えて、任意の適切なバインダー、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【０２１２】
防腐剤、安定剤、色素、さらには香味料も薬剤組成物中に入れることができる。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルが挙げられる。酸化防止剤及び懸濁剤も使用することもできる。
【０２１３】
異なる送達系に応じて様々な組成／処方要件があり得る。例として示すと、本発明の薬剤組成物は、ミニポンプを用いて、又は粘膜経路によって、例えば、点鼻薬又は吸入用エアゾール剤又は摂取可能な溶液として、或いは、例えば、静脈内、筋肉内又は皮下経路による送達用に、組成物が注射用剤形によって処方される非経口で投与されるように処方することができる。或いは、製剤は、いくつかの経路によって投与されるように設計することができる。
【０２１４】
薬剤が胃腸管粘膜を経由して投与される場合には、薬剤は、消化管を通過する間、安定なままでいることができるようにすべきである。例えば、薬剤はタンパク質分解に抵抗性であり、酸ｐＨにおいて安定であり、胆汁の洗浄効果に抵抗性とすべきである。
【０２１５】
適切な場合には、薬剤組成物は、吸入によって、坐剤又はペッサリーの形で、ローション、溶液、クリーム、軟膏又は散布粉の剤形で局所的に、皮膚貼付薬を使用して、デンプン、ラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形で経口で、或いはカプセル剤又は膣坐剤を単独又は賦形剤との混合物で、或いは香味料若しくは着色剤を含むエリキシル剤、溶液又は懸濁液の剤形で投与することができ、或いは、非経口、例えば、静脈内、筋肉内又は皮下注射することができる。非経口投与の場合には、組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含むことができる無菌水溶液の剤形で最適に使用することができる。頬又は舌下投与の場合には、組成物は、従来の方法で処方することができる錠剤又は舐剤の形で投与することができる。
【０２１６】
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチド、又は改変に適切なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生するあらゆる細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で周知である。
【０２１７】
例えば、ゲノムＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡライブラリは、ポリペプチドを産生する生物から得られる染色体ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを用いて構築することができる。ポリペプチドのアミノ酸配列が知られている場合には、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、使用して、ポリペプチドをコードするクローンを、生物から調製されるゲノムライブラリから特定することができる。或いは、別の既知のポリペプチド遺伝子と相同の配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ポリペプチドをコードするクローンを特定することができる。後者の場合には、厳密性の低いハイブリッド形成条件及び洗浄条件が使用される。
【０２１８】
或いは、ポリペプチドをコードするクローンは、ゲノムＤＮＡの断片を、プラスミドなどの発現ベクター中に挿入し、得られたゲノムＤＮＡライブラリで酵素陰性細菌を形質転換し、次いでポリペプチドによって阻害される酵素を含む寒天上に形質転換細菌を播くことによって特定することができ、それによってポリペプチドを発現するクローンを特定することができる。
【０２１９】
さらなる別法においては、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、確立された標準方法、例えば、Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869に記載されたホスホラミダイト法、又はMatthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805によって記載された方法によって合成的に調製することができる。ホスホラミダイト法においては、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成され、精製され、アニールされ、連結され、適切なベクターにクローン化される。
【０２２０】
ヌクレオチド配列は、標準技術に従って合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源の断片を（適宜）連結することによって調製された混合ゲノム・合成起源、混合合成・ｃＤＮＡ起源、又は混合ゲノム・ｃＤＮＡ起源とすることができる。連結された各断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列は、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号又はSaiki R K et al （Science (1988) 239, pp 487-491）に記載された、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって調製することもできる。
【０２２１】
ヌクレオチド配列
本発明は、本明細書に定義する具体的な諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。本明細書において使用される「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及び変異体、相同体、（その部分などの）その断片及び誘導体を意味する。ヌクレオチド配列は、センス鎖であろうとアンチセンス鎖であろうと、２本鎖でも１本鎖でもよい、ゲノム起源、合成起源又は組換え起源とすることができる。
【０２２２】
本発明に関係する「ヌクレオチド配列」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。この用語は、コード配列のＤＮＡ、より好ましくはｃＤＮＡを意味することが好ましい。
【０２２３】
好ましい実施形態においては、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、やはりその天然環境にあるその天然に付随する配列に連結されているときに、その天然環境における未変性ヌクレオチド配列を包含しない。参照を容易にするために、本発明者らはこの好ましい実施形態を「変性（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）ヌクレオチド配列」と称する。この点で、「未変性ヌクレオチド配列」という用語は、その固有の環境にあるヌクレオチド配列全体を意味し、それが天然に付随するプロモーター全体に動作可能に連結されるときには、そのプロモーターもその固有の環境にある。したがって、本発明のポリペプチドは、その固有の生物におけるヌクレオチド配列によって発現することができるが、そのヌクレオチド配列は、その生物中で天然に付随するプロモーターの制御下にはない。
【０２２４】
ポリペプチドは、未変性ポリペプチドではないことが好ましい。この点で、「未変性ポリペプチド」という用語は、その固有の環境にあり、その未変性ヌクレオチド配列によって発現されたときの、ポリペプチド全体を意味する。
【０２２５】
一般に、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。しかし、本発明の別の実施形態においては、このヌクレオチド配列は、当分野で周知の化学的方法によって全体的又は部分的に合成することができる（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23及びHorn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232参照）。
【０２２６】
分子進化
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離された後に、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が特定された後に、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましいこともあり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を突然変異させることが望ましいこともある。
【０２２７】
突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０２２８】
適切な方法は、Morinaga et al （Biotechnology (1984) 2, p646-649）に開示されている。酵素をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入する別の方法は、Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)に記載されている。
【０２２９】
上述したものなどの部位特異的突然変異誘発の代わりに、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲ突然変異誘発キット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲランダム突然変異誘発キットなどの市販キットを用いて、突然変異をランダムに導入することができる。欧州特許第０ ５８３ ２６５号は、欧州特許第０ ８６６ ７９６号に記載されたものなどの突然変異原性ＤＮＡアナログと併用することもできる、ＰＣＲに基づく突然変異誘発を最適化する方法について言及している。誤りを犯しやすいＰＣＲ技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変異体の生成に適している。国際公開第０２０６４５７号は、リパーゼの分子進化について言及している。
【０２３０】
新規配列を得る第３の方法は、任意の数のＤｎａｓｅ Ｉなどの制限酵素又は酵素を用いて、異なるヌクレオチド配列を断片化し、機能タンパク質をコードする完全なヌクレオチド配列を再び組み立てることである。或いは、完全ヌクレオチド配列の再組み立て中に、１種類又は複数の異なるヌクレオチド配列を用い、突然変異を導入することができる。ＤＮＡシャフリング及びファミリーシャフリング技術は、好ましい諸特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変異体を生成するのに適している。「シャフリング」を実施する適切な方法は、欧州特許第０ ７５２ ００８号、欧州特許第１ １３８ ７６３号、欧州特許第１ １０３ ６０６号にある。シャフリングは、米国特許第６，１８０，４０６号及び国際公開第０１／３４８３５号に記載された別の形のＤＮＡ突然変異誘発と組み合わせることもできる。
【０２３１】
したがって、多数の部位特異的又はランダムな突然変異をヌクレオチド配列中にｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、続いて、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかを様々な手段によってスクリーニングすることができる。コンピュータ及びエキソ媒介（ｅｘｏ ｍｅｄｉａｔｅｄ）組換え方法（国際公開第００／５８５１７号、米国特許第６，３４４，３２８号、米国特許第６，３６１，９７４号参照）を用いて、例えば、既知の酵素又はタンパク質に対して生成される変異体が極めて低い相同性を有する分子進化を行うことができる。それによって得られるこのような変異体は、既知のトランスフェラーゼに構造がかなり類似しているが、極めて低いアミノ酸配列相同性を有することができる。
【０２３２】
また、非限定的な例として、ポリヌクレオチド配列の突然変異体又は自然変異体は、野生型又は他の突然変異体又は自然変異体と組み換えて新しい変異体を生成することができる。このような新しい変異体も、コードされたポリペプチドの機能が改善されたかどうかでスクリーニングすることができる。
【０２３３】
上述及び類似の分子進化方法を適用することによって、タンパク質構造又は機能の予備知識なしに、好ましい諸特性を有する本発明の酵素の変異体を特定し、選択することができ、予測不可能であるが有益な突然変異体又は変異体を生成することができる。当分野では、酵素活性を最適化し、又は変更するために分子進化を適用した多数の例がある。このような例としては、以下、すなわち、宿主細胞中又はｉｎ ｖｉｔｒｏで最適化された発現及び／又は活性、酵素活性の増大、基質及び／又は生成物特異性の変化、酵素又は構造安定性の増大又は低下、好ましい環境条件、例えば温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変化の１つ又は複数が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２３４】
当業者には明らかなように、分子進化ツールを使用して、酵素を変化させて酵素の機能を改善することができる。
【０２３５】
本発明において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、変異体とすることができ、すなわち、親酵素と比較したときに少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができることが好適である。変異体酵素は、親酵素と少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％の相同性を保持する。適切な親酵素は、エステラーゼ又はリパーゼ活性を有する任意の酵素を含むことができる。親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整合していることが好ましい。
【０２３６】
好ましい実施形態においては、変異体脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ及びＨＰＴブロック中のｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも１種類若しくは複数を保持し、又は含む。
【０２３７】
水系環境において脂質アシルトランスフェラーゼ活性がない、又は低いリパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて突然変異させて、トランスフェラーゼ活性を導入し、又は高めることができ、それによって本発明の組成物及び方法に使用するのに適切なかなりのトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼが生成される。
【０２３８】
好適には、本発明において使用される脂質アシルトランスフェラーゼは、極性脂質、好ましくはリン脂質及び／又は糖脂質に対する酵素活性が親酵素よりも高い変異体とすることができる。このような変異体は、リゾ極性脂質に対しても低い活性を有するか、又は活性を持たないことが好ましい。極性脂質、リン脂質及び／又は糖脂質に対する高い活性は、加水分解及び／又はトランスフェラーゼ活性、或いはそれらの組み合わせの結果であり得る。
【０２３９】
本発明に使用される変異体脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリド、及び／又はモノグリセリド、及び／又はジグリセリドに対する活性が親酵素より低くともよい。
【０２４０】
変異体酵素は、トリグリセリド、及び／又はモノグリセリド、及び／又はジグリセリドに対して活性を持たないことが好適である。
【０２４１】
或いは、本発明に使用される変異体酵素は、トリグリセリドに対して高い活性を有することができ、且つ／又は以下、すなわち、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの１種類又は複数に対しても高い活性を有することができる。
【０２４２】
脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は公知であり、このような変異体の１種類又は複数は、本発明の方法及び使用で使用するのに適切なことがある。例えば、脂質アシルトランスフェラーゼの変異体は、以下の参考文献に記載されている。
【０２４３】
Hilton S, Buckley JT. Studies on the reaction mechanism of a microbial lipase/acyltransferase using chemical modification and site-directed mutagenesis. J Biol Chem. 1991 Jan 15; 266(2): 997-1000.
【０２４４】
Robertson DL, Hilton S, Wong KR, Koepke A, Buckley JT. Influence of active site and tyrosine modification on the secretion and activity of the Aeromonas hydrophila lipase/acyltransferase. J Biol Chem. 1994 Jan 21; 269(3): 2146-50.
【０２４５】
Brumlik MJ, Buckley JT. Identification of the catalytic triad of the lipase/acyltransferase from Aeromonas hydrophila. J Bacteriol. 1996 Apr; 178(7): 2060-4.
【０２４６】
Peelman F, Vinaimont N, Verhee A, Vanloo B, Verschelde JL, Labeur C, Seguret-Mace S, Duverger N, Hutchinson G, Vandekerckhove J, Tavernier J, Rosseneu M. A proposed architecture for lecithin cholesterol acyl transferase (LCAT): identification of the catalytic triad and molecular modeling. Protein Sci. 1998 Mar; 7(3): 587-99.
【０２４７】
アミノ酸配列
本発明は、本明細書に定義する具体的な諸特性を有するポリペプチドをコードするアミノ酸配列も包含する。
【０２４８】
本明細書において使用される「アミノ酸配列」という用語は、「ポリペプチド」という用語及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。「アミノ酸配列」という用語は、「ペプチド」という用語と同義である場合もある。
【０２４９】
アミノ酸配列は、適切な出所から調製／単離することができ、又は合成することができ、又は組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
【０２５０】
好適には、アミノ酸配列は、本明細書に教示される単離ポリペプチドから標準技術によって得ることができる。
【０２５１】
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定するのに適切な一方法は以下のとおりである。
【０２５２】
精製ポリペプチドは凍結乾燥させることができ、その凍結乾燥材料１００μｇを８Ｍウレアと０．４Ｍ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ８．４の混合物５０μｌに溶解させることができる。溶解したタンパク質を変性し、窒素で覆い、４５ｍＭジチオスレイトール５μｌを添加した後に、１５分間５０℃で還元することができる。室温に冷却後、１００ｍＭヨードアセトアミド５μｌを添加し、窒素下、暗所において室温で１５分間システイン残基を誘導体化することができる。
【０２５３】
水１３５μｌ、及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ ５μｇの５μｌ水溶液を上記反応混合物に添加し、窒素下３７℃で２４時間消化することができる。
【０２５４】
得られたペプチドは、逆相ＨＰＬＣによって、ＶＹＤＡＣ Ｃ１８カラム（０．４６ｘ１５ｃｍ；１０μｍ；Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）上で、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、及び溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡのアセトニトリル溶液を用いて分離することができる。選択されたペプチドは、Ｎ末端の配列決定前に、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ１８ カラム上で同じ溶媒系を用いて、再度クロマトグラフにかけることができる。配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７６Ａ配列決定装置を用いて、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）の指示に従ってパルス液体高速サイクル（ｐｕｌｓｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｆａｓｔ ｃｙｃｌｅｓ）によって実施することができる。
【０２５５】
配列同一性又は配列相同性
本発明は、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列とある程度の配列同一性又は配列相同性を有する配列、或いはそのようなポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列の使用も包含する（以後、「相同配列」と称する）。ここで、「相同体」という用語は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する実体を意味する。ここで、「相同性」という用語は、「同一性」と等しく扱うことができる。
【０２５６】
相同アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列は、機能活性を保持し、且つ／又は酵素の活性を高めるポリペプチドを提供及び／又はコードすべきである。
【０２５７】
本明細書において、相同配列は、対象配列に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位を含む。相同性は、類似性の面からも考えることができるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では、配列同一性の面から相同性を表現することが好ましい。
【０２５８】
本明細書において、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（対象配列）に少なくとも７５、８５又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。一般に、相同体は、対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含む。相同性は、類似性の面からも考えることができるが（すなわち、類似の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明では、配列同一性の面から相同性を表現することが好ましい。
【０２５９】
相同性比較は、目視によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを利用して実施することができる。これらの市販コンピュータプログラムは、２個以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【０２６０】
％相同性は、隣接配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列がもう一方の配列と並べられ、一方の配列中の各アミノ酸がもう一方の配列中の対応するアミノ酸と、１回に１個の残基が直接に比較される。これは、「ギャップのない（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。一般に、このようなギャップのないアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実施される。
【０２６１】
これは極めて単純で一貫した方法ではあるが、例えば、それ以外は同一である配列対において、１つの挿入又は欠失によって、後続のアミノ酸残基がアラインメントから排除され、したがって、全体的なアラインメントを実施したときに、％相同性が大きく低下する可能性があることを考慮していない。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体の相同性スコアを不当に減少させずに、起こり得る挿入及び欠失を考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、「ギャップ」を配列アラインメントに挿入して局所的相同性が最大限になるようにすることによって実施される。
【０２６２】
しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸に対して、２個の比較配列間の高い関連性を反映して、ギャップができるだけ少ない配列アラインメントが、ギャップが多い配列アラインメントよりも高いスコアが得られるように、アラインメント中に存在する各ギャップに「ギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）」を割り当てる。ギャップの存在に対しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に対してはペナルティを減少させる「アフィンギャップコスト」が一般に使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適なアラインメントを生じることは言うまでもない。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかし、このようなソフトウエアを配列比較に用いるときには、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用するときには、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては−１２であり、各伸張に対しては−４である。
【０２６３】
したがって、最大％相同性を計算するには、まず、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントを作成する必要がある。このようなアラインメントを実行するのに適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウエアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed-Chapter 18参照）、ＦＡＳＴＡ（Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410）ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方ともオフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60参照）。しかし、一部の適用例では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールは、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較することもできる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8及びtatiana@ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【０２６４】
最終％相同性は、同一性の面から測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、一般に、全か無かの対比較に基づいてはいない。その代わり、化学的類似度又は進化距離に基づいて各対ごとの比較に対してスコアが割り当てられるスケールド類似度スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が一般に使用される。通常使用されるこのようなマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、公開デフォルト値、又はもし提供されていれば個別のシンボル比較表（ｓｙｍｂｏｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔａｂｌｅ）を一般に使用する（さらなる詳細については利用者マニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージの場合には公開デフォルト値を、他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
【０２６５】
或いは、相同性百分率は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244）に類似したアルゴリズムに基づくＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）の複数のアラインメント機能を用いて計算することができる。
【０２６６】
このソフトウエアが最適なアラインメントを作成した後に、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能になる。このソフトウエアは、一般に、配列比較の一部としてこれを実行し、数値結果を生成する。
【０２６７】
配列は、サイレントな変化をもたらし機能的に等価な物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を含むこともある。物質の第２の結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性に基づいて、計画的なアミノ酸置換を実施することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあり、正に帯電したアミノ酸としては、リジン、アルギニンなどがあり、親水性の類似した値を有する非帯電極性頭部基を含むアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンなどがある。
【０２６８】
保存的置換は、例えば下表に従って実施することができる。第２のカラムの同じブロック、及び好ましくは第３のカラムの同じ行のアミノ酸を互いに置換することができる。
【０２６９】
［表］
2011167191.tif 000003
【０２７０】
本発明は、起こり得る相同置換（置換と交換は、本明細書ではともに、既存のアミノ酸残基と別の残基を取り替えることを意味する）、すなわち、塩基性残基と塩基性残基、酸性残基と酸性残基、極性残基と極性残基などの同種（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）置換も包含する。非相同置換、すなわち、１クラスの残基から別のクラスの残基への非相同置換、或いはオルニチン（以後、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以後、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以後、Ｏと称する）、ピリイルアラニン（ｐｙｒｉｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の介在も含む非相同置換も起こることがある。
【０２７１】
交換は、非天然アミノ酸によっても成されうる。
【０２７２】
変異体アミノ酸配列は、グリシン、β−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、プロピル基などのアルキル基を含めて、配列の任意の２個のアミノ酸残基の間に挿入することができる適切なスペーサー基を含むことができる。さらに別の形の変異は、１個若しくは複数のペプトイド型アミノ酸残基を含み、当業者には十分知られている。不確かさを回避するために、「ペプトイド型」は、α−炭素置換基が、残基のα炭素ではなく窒素原子上にある変異体アミノ酸残基を意味するために使用される。ペプトイド型ペプチドを調製する方法は、当分野で公知であり、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371及びHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134にある。
【０２７３】
本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、合成又は改変ヌクレオチドをその中に含むことができる。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの改変が当分野で知られている。これらの改変は、メチルホスホネート骨格及びホスホロチオエート骨格、並びに／或いは分子の３’及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加を含む。本発明では、本明細書に記載するヌクレオチド配列は、当分野で利用可能な任意の方法によって改変できることを理解されたい。このような改変は、ヌクレオチド配列のｉｎ ｖｉｖｏでの活性を高め、又は寿命を延ばすために実施することができる。
【０２７４】
本発明は、本明細書に考察する配列、又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用も包含する。配列がその断片に相補的である場合には、その配列をプローブとして使用して他の生物などにおける類似のコード配列を特定することができる。
【０２７５】
本発明の配列に１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載する配列の他の変異体は、例えば、ある範囲の個体、例えば、異なる集団からの個体でできているＤＮＡライブラリを探索することによって得ることができる。また、他のウイルス／細菌又は細胞の相同体、特に哺乳動物の細胞（例えばラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）中にある細胞の相同体を得ることができ、このような相同体及びその断片は、一般に、本明細書の配列リストに示す配列と選択的にハイブリッド形成することができる。このような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ、又は他の動物種からのゲノムＤＮＡライブラリを探索することによって、また、添付した配列リスト中の配列のいずれか１つの全部又は一部を含むプローブを用いて、厳密性が中程度〜高い条件下でこのようなライブラリを探索することによって得ることができる。本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体を得るために、類似の考察が適用される。
【０２７６】
変異体及び系統／種相同体は、本発明の配列内の保存アミノ酸配列をコードする、変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを使用した縮重ＰＣＲによって得ることもできる。保存配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体から得られるアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で既知のコンピュータソフトウエアを使用して実施することができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられている。
【０２７７】
縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１個又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される厳密性よりも低い厳密性の条件で使用される。
【０２７８】
或いは、このようなポリヌクレオチドは、特徴の明らかな配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞に対してコドン優先度を最適化するために、サイレントなコドン配列変化が必要な場合に有用なことがある。制限ポリペプチド認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性又は機能を変えるために別の配列変化が望まれる場合もある。
【０２７９】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）を使用して、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、選択的増幅反応用プライマー、プローブ、例えば放射性又は非放射性標識を用いて従来の手段によって明示用標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｌａｂｅｌ）で標識されたプローブを作製することができ、或いはこのポリヌクレオチドをベクターにクローン化することができる。このようなプライマー、プローブ及び他の断片は、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０又は４０ヌクレオチド長であり、本明細書において使用される本発明のポリヌクレオチドという用語によってやはり包含される。
【０２８０】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド及びプローブは、組換え、合成、又は当業者に利用可能なあらゆる手段によって作製することができる。これらは、標準技術によってクローン化することもできる。
【０２８１】
一般に、プライマーは、１回に１個のヌクレオチドの所望の核酸配列の段階的な製造を含めた合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを実施する技術を当分野では容易に利用することができる。
【０２８２】
より長鎖のポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）クローニング技術を用いて作製される。ＰＣＲクローニング技術は、クローン化が必要な脂質ターゲティング配列領域に隣接する１対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させ、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施し、増幅された断片を単離し（例えば、アガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）、増幅されたＤＮＡを回収するものである。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクターにクローン化されるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。
【０２８３】
ハイブリッド形成法
本発明は、本発明の配列、又は本発明の配列若しくはそれに相補的な配列とハイブリッド形成可能である配列に相補的な配列も包含する。
【０２８４】
本明細書において使用される「ハイブリッド形成法」という用語は、「核酸の鎖が塩基対形成によって相補鎖と連結されるプロセス」、並びにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）技術において実行される増幅プロセスを含むものとする。
【０２８５】
本発明は、本明細書に考察する対象配列、又は任意の誘導体、その断片若しくは誘導体に相補的である配列とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列の使用も包含する。
【０２８６】
本発明は、本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な配列に相補的である配列も包含する。
【０２８７】
ハイブリッド形成条件は、Berger and Kimmel（1987、Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）に教示されたようにヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、以下に説明する規定の「厳密性」を与えるものである。
【０２８８】
最大の厳密性は、一般に、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低温）で得られ、高い厳密性は、Ｔｍよりも約５℃〜１０℃低温；中程度の厳密性はＴｍよりも約１０℃〜２０℃低温；及び低い厳密性はＴｍよりも約２０℃〜２５℃低温で得られる。当業者には理解されるように、最大の厳密性のハイブリッド形成法は、同一のヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用され、一方、中程度の（又は低い）厳密性のハイブリッド形成法は、類似又は関係するポリヌクレオチド配列を特定又は検出するために使用される。
【０２８９】
本発明は、厳密性の高い条件、又は中程度の厳密性の条件下で、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的である配列を包含することが好ましい。
【０２９０】
より好ましくは、本発明は、厳密性の高い条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ ｐＨ７．０｝）で、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的である配列を包含する。
【０２９１】
本発明は、（本明細書で考察するヌクレオチド配列の相補的配列も含めて)本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列にも関する。
【０２９２】
本発明は、（本明細書で考察するヌクレオチド配列の相補的配列も含めて）本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができる配列に相補的であるヌクレオチド配列にも関する。
【０２９３】
厳密性が中間〜最大である条件下で、本明細書で考察するヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチド配列も本発明の範囲内に含まれる。
【０２９４】
好ましい態様においては、本発明は、厳密な条件下（例えば、５０℃及び０．２ｘＳＳＣ）で、本明細書で考察するヌクレオチド配列又はその補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
【０２９５】
より好ましい態様においては、本発明は、厳密性の高い条件下（例えば、６５℃及び０．１ｘＳＳＣ）で、本明細書で考察するヌクレオチド配列又はその補体とハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列を包含する。
【０２９６】
ポリペプチドの発現
本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。このベクターを使用して、適合した宿主細胞中で、且つ／又は宿主細胞から、ヌクレオチド配列を複製し、ポリペプチドの形で発現させることができる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む調節配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター、及び真核細胞中で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上述した２種類以上の異なるプロモーターに由来する配列要素を含むキメラプロモーターも使用することができる。
【０２９７】
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞によって生成されるポリペプチドは、使用する配列及び／又はベクターに応じて、分泌されても、細胞内に含まれてもよい。コード配列は、特定の原核細胞膜又は真核細胞膜を通って物質コード配列（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の分泌を誘導するシグナル配列を用いて設計することができる。
【０２９８】
発現ベクター
「発現ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現が可能な構築体を意味する。
【０２９９】
発現ベクターは、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。「組み込む」という用語は、ゲノム中への安定な組み込みを好ましくは包含する。
【０３００】
本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切な宿主生物によるヌクレオチド配列の発現を制御配列がもたらすことができるように、ヌクレオチド配列が制御配列に作動可能に結合されたベクター中に存在することができる。すなわち、ベクターは発現ベクターである。
【０３０１】
本発明のベクターは、以下に示す適切な宿主細胞に形質転換して、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドを発現することができる。
【０３０２】
ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの選択は、それが導入される宿主細胞によって決まることが多い。
【０３０３】
ベクターは、抗生物質抵抗性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン抵抗性を与える遺伝子などの１種類又は複数の選択可能な標識遺伝子を含むことができる。或いは、選択は、（国際公開第９１／１７２４３号に記載された）同時形質転換によって実施することができる。
【０３０４】
ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えばＲＮＡの生成用に使用することができ、又は宿主細胞に形質移入し、又は宿主細胞を形質転換するのに使用することができる。
【０３０５】
したがって、さらなる実施形態においては、本発明は、複製可能なベクター中にヌクレオチド配列を導入し、そのベクターを適合性宿主細胞に導入し、そのベクターの複製をもたらす諸条件下でその宿主細胞を増殖させることによって、本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製する方法を提供する。
【０３０６】
ベクターは、さらに、当該宿主細胞中でベクターを複製することができるヌクレオチド配列を含むことができる。このような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１及びｐＩＪ７０２の複製開始点である。
【０３０７】
制御配列
一部の適用例においては、本発明に使用されるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、選択された宿主細胞などによって、ヌクレオチド配列の発現を可能にする制御配列に作動可能に結合することができる。例として、本発明は、このような制御配列に作動可能に結合した本発明のヌクレオチド配列を含むベクターを包含する。すなわち、このベクターは、発現ベクターである。
【０３０８】
「作動可能に結合」という用語は、記述した成分が意図したように機能できる関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に結合され」た制御配列は、調節配列に適合した条件下でコード配列が発現されるように連結されている。
【０３０９】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節シグナルを含む。
【０３１０】
「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０３１１】
本明細書に定義する具体的諸特性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の増大は、異種調節領域、例えばプロモーター領域、分泌リーダー領域及びターミネーター領域を選択することによって達成することもできる。
【０３１２】
本発明のヌクレオチド配列は、少なくともプロモーターに作動可能に結合できることが好ましい。
【０３１３】
細菌、真菌又は酵母宿主中でヌクレオチド配列の転写を誘導するのに適切なプロモーターの例は、当分野で周知である。
【０３１４】
構築体
「抱合体」、「カセット」、「ハイブリッド」などの用語と同義である「構築体」という用語は、プロモーターに直接又は間接的に結合した、本発明によって使用される、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的な結合の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列に介在するＳｈ１−イントロン、ＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー基の提供である。直接又は間接的結合を含む、本発明に関係する「融合」という用語でも同じことが当てはまる。これらの用語は、野生型遺伝子プロモーターを通常伴うタンパク質をコードするヌクレオチド配列の天然の組み合わせを、それらがどちらも天然環境にあるときに包含しない場合もある。
【０３１５】
構築体は、さらに、遺伝子構築体の選択を可能にするマーカーを含み、又は発現させることもできる。
【０３１６】
一部の適用例では、構築体は、プロモーターに作動可能に結合された、少なくとも本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【０３１７】
宿主細胞
本発明に関係する「宿主細胞」という用語は、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドの組換え生成において使用される上述した発現ベクターのどちらかを含む任意の細胞を含む。
【０３１８】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドを発現するヌクレオチド配列を形質転換又は形質移入した宿主細胞を提供する。これらの細胞は、前記ベクターに適合するように選択され、例えば、原核（例えば、細菌）細胞、真菌細胞、酵母細胞又は植物細胞とすることができる。宿主細胞は、ヒト細胞ではないことが好ましい。
【０３１９】
適切な細菌宿主生物の例はグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。
【０３２０】
本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の性質、及び／又は発現タンパク質のさらなるプロセシングの望ましさに応じて、酵母、他の真菌などの真核生物宿主が好ましいことがある。一般に、酵母細胞は、操作が容易であるので、真菌細胞よりも好ましい。しかし、一部のタンパク質は、酵母細胞からうまく分泌されず、適切に処理されない場合もある（例えば、酵母における過剰糖鎖形成（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ））。この場合には、異なる真菌宿主生物を選択すべきである。
【０３２１】
酵母、真菌、植物宿主細胞などの適切な宿主細胞を使用すると、本発明の組換え発現産物に対して最適な生物活性を付与するために必要となることがある翻訳後修飾（例えばミリストイル化、グリコシル化、切断、ラピデーション（ｌａｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びチロシン、セリン又はトレオニンリン酸化）が可能になる。
【０３２２】
宿主細胞は、プロテアーゼ欠乏、又はプロテアーゼマイナス系統とすることができる。
【０３２３】
生物
本発明に関係する「生物」という用語は、本発明によるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又はそれらから得られる生成物を含むことができるあらゆる生物を含む。
【０３２４】
適切な生物としては、原核生物、真菌、酵母又は植物が挙げられる。
【０３２５】
本発明に関係する「トランスジェニック生物」という用語は、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び／又はそれから得られる生成物を含み、且つ／又はプロモーターによって、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のその生物内での発現が可能になる、あらゆる生物を含む。ヌクレオチド配列は、生物のゲノム中に組み込まれることが好ましい。
【０３２６】
「トランスジェニック生物」という用語は、その天然環境にあるその未変性プロモーターの制御下にあるときに、やはりその天然環境にある未変性ヌクレオチドコード配列を包含しない。
【０３２７】
したがって、本発明のトランスジェニック生物としては、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書に定義する構築体、本明細書に定義するベクター、本明細書に定義するプラスミド、本明細書に定義する細胞、又はそれらの産物のいずれか１種類若しくは組み合わせを含む生物が挙げられる。例えば、トランスジェニック生物は、異種プロモーターの制御下にある、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。
【０３２８】
宿主細胞／生物の形質転換
先に示したように、宿主生物は、原核生物又は真核生物とすることができる。適切な原核生物宿主の例としては、大腸菌及びバチルス サチリスが挙げられる。
【０３２９】
原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当分野ではこれまでたくさん書かれており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。原核生物宿主が使用される場合には、ヌクレオチド配列は、イントロンの除去などによって形質転換前に適切に改変する必要があることがある。
【０３３０】
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０３３１】
糸状菌細胞は、既知の方法によるプロトプラスト形成、及びプロトプラストの形質転換、それに続く細胞壁の再生を含むプロセスなどの当分野で既知の様々な方法を用いて形質転換することができる。宿主微生物としてアスペルギルスを使用することは、欧州特許第０ ２３８ ０２３号に記載されている。
【０３３２】
別の宿主生物は植物とすることができる。植物を形質転換するのに使用される一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文にある。植物の形質転換に関するさらなる教示は、欧州特許公開第０４４９３７５号にある。
【０３３３】
真菌、酵母及び植物の形質転換に関する全般的な教示を以下のセクションに示す。
【０３３４】
形質転換真菌
宿主生物は、糸状菌などの真菌とすることができる。適切なこのような宿主の例としては、サーモマイセス（Thermomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、アスペルギルス属、ペニシリウム（Penicillium）属、ムコール（Mucor）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、トリコデルマ（Trichoderma）属などに属するあらゆるメンバーが挙げられる。
【０３３５】
糸状真菌を形質転換することに関する教示は、糸状真菌を形質転換する標準技術、及び真菌の培養が当分野で周知であることを述べている米国特許第５７４１６６５号に概説されている。Ｎ クラッサ（N. crassa）に適用された技術の広範な総説は、例えば、Davis and de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143にある。
【０３３６】
糸状菌を形質転換することに関するさらなる教示は、米国特許第５６７４７０７号に概説されている。
【０３３７】
一態様においては、宿主生物は、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス属とすることができる。
【０３３８】
本発明によるトランスジェニックアスペルギルスは、例えば、Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S. D., Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp. 641-666)の教示に従って調製することもできる。
【０３３９】
糸状菌における遺伝子発現は、Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306に概説されている。
【０３４０】
形質転換酵母
別の実施形態においては、トランスジェニック生物は酵母とすることができる。
【０３４１】
酵母における異種遺伝子発現の原理の総説は、例えば、Methods Mol Biol (1995), 49: 341-54、及びCurr Opin Biotechnol (1997) Oct; 8(5): 554-60にある。
【０３４２】
この点で、サッカロミセス セレビシ（Saccharomyces cerevisi）種又はピキア パストリス（Pichia pastoris）種（FEMS Microbiol Rev (2000 24(1): 45-66参照)などの酵母は、異種遺伝子発現用ビヒクルとして使用することができる。
【０３４３】
サッカロミセス セレビシエにおける異種遺伝子発現、及び遺伝子産物の分泌の原理の総説は、E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.)にある。
【０３４４】
酵母の形質転換の場合には、いくつかの形質転換プロトコルが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックサッカロミセスは、Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75,1929)、Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104)、及びIto, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168)の教示に従って調製することができる。
【０３４５】
適切な酵母宿主生物は、ピキア（Pichia）種、ハンゼヌラ（Hansenula）種又はクルイベロミセス（Kluyveromyces）、ヤロウィニア（Yarrowinia）種、又はサッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含めたサッカロミセス（Saccharomyces）種、又は例えば、Ｓ．ポンベ（S. pombe）種などのシゾサッカロミセ（Schizosaccharomyce）に属する種などの酵母種など、ただしこれらだけに限定されない生物工学的に関連する酵母種から選択することができる。
【０３４６】
メチロトローフの酵母種ピキア パストリス（Pichia pastoris）の系統を宿主生物として使用することができる。
【０３４７】
一実施形態においては、宿主生物は、（国際公開第０１／３８５４４号に記載された）ハンゼヌラ ポリモルファ（Hansenula polymorpha）などのハンゼヌラ種である。
【０３４８】
形質転換酵母細胞は、栄養要求性マーカー優性抗生物質抵抗性マーカーなどの様々な選択マーカーを使用して選択することができる。
【０３４９】
形質転換植物／植物細胞
本発明に適切な宿主生物が植物の場合もある。一般技術の総説は、Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42: 205-225)及びChristou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)の論文、又は国際公開第０１／１６３０８号にある。トランスジェニック植物は、例えば、高レベルの植物ステロールエステル及びフィトスタノールエステルを生成することができる。
【０３５０】
したがって、本発明は、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを用いて（特に、本明細書に定義する脂質アシルトランスフェラーゼを含む発現ベクター又は構築体を用いて）植物細胞を形質転換するステップと、その形質転換された植物細胞から植物を成長させるステップとを含む、高レベルの植物ステロールエステル及びフィトスタノールエステルを含むトランスジェニック植物を生成する方法にも関する。
【０３５１】
分泌
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培地中に分泌されることが望ましいことが多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列は、本発明の状況でも使用することができる。
【０３５２】
異種分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌のアミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（例えば、アスペルギルス由来のｇｌａＡ−１８及び２４アミノ酸型）、ａ因子遺伝子（酵母、例えばサッカロミセス、クルイベロミセス及びハンゼヌラ）又はα−アミラーゼ遺伝子（バチルス）に由来する分泌リーダー配列である。
【０３５３】
検出
アミノ酸配列の発現を検出し、測定する様々なプロトコルが当分野で知られている。例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０３５４】
多種多様な標識及び抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）技術が当業者に知られており、様々な核酸及びアミノ酸アッセイに使用することができる。
【０３５５】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）などのいくつかの会社が、これらの手順用の市販キット及びプロトコルを提供している。
【０３５６】
適切なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は色素生産剤、並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示している特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号及び同第４，３６６，２４１号が挙げられる。
【０３５７】
また、組換え免疫グロブリンは、米国特許第４，８１６，５６７号に示したように生成することができる。
【０３５８】
融合タンパク質
本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドは、融合タンパク質として生成して、例えば、その抽出及び精製に役立てることができる。融合タンパク質パートナーの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーと目的タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を入れて、融合タンパク質配列の除去を可能にすることが好都合な場合もある。融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないことが好ましい。
【０３５９】
大腸菌の遺伝子融合発現系は、Curr. Opin. Biotechnol. (1995) 6(5): 501-6に概説されている。
【０３６０】
本発明の別の実施形態においては、本明細書に定義する具体的諸特性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を異種配列に連結して、融合タンパク質をコードすることができる。例えば、物質活性に影響を及ぼすことができる薬剤をペプチドライブラリからスクリーニングするために、市販抗体によって認識される異種エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用な場合がある。
【０３６１】
以下の図及び実施例を単なる例として参照して、本発明を以下に説明する。
【実施例１】
【０３６２】
アエロモナス サルモニシダ亜種由来のトランスフェラーゼのクローニング、配列決定及び異種発現
使用したサルモニシダ系統：
アエロモナス サルモニシダ亜種。サルモニシダ（ＡＴＣＣ １４１７４）をＡＴＣＣから入手し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中で終夜３０℃で増殖させた。この細胞を遠心分離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．のゲノムＤＮＡ単離手順によって単離した。ゲノムＤＮＡ緩衝剤セット（ｃａｔ．１９０６０）、プロテアーゼＫ（ｃａｔ．１９１３１）及びＲＮＡｓｅ Ａ（ｃａｔ．１９１０１）はすべてＱｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．（Ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｕｒｔ Ｇａｔｗｉｃｋ Ｃｏｕｒｔ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＲＨ１０ ２ＡＸ）から入手した。
【０３６３】
宿主細菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、組換えアエロモナス酵素の産生に使用した。コンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭの形質転換用宿主として使用した。適切なプラスミドを含む形質転換体を１００−ｕｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ寒天培地中で３７℃で増殖させた。
【０３６４】
発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ−ｐＳＭの構築：
アエロモナス由来のトランスフェラーゼ遺伝子のすべてのＤＮＡ増幅では、ゲノムＤＮＡ（０．２〜１ｕｌ）をテンプレートとして用い、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を１０ｘ ｐｆｕ緩衝剤１０ｕｌ、各プライマー１ｕｌ（５０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、２００ｕＭｄＮＴＰとともに総反応体積１００ｕｌで使用した。プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件によってＰＣＲ反応を実施した：９５℃３０秒、（９５℃３０秒、６０℃１分間及び６８℃２分間）を３０サイクル。追加の伸張を７２℃で５分間行った。
【０３６５】
Ａ．サルモニシダ由来のトランスフェラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅を２つの別個のＰＣＲ反応で実施した。ＰＣＲ反応１をプライマー対、ａｓ１ＵＳＮＥＷ（５’ＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡ ＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴ ＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧ ＧＧＧ ３’［配列番号３６］）とａｓ１ｓ９５０ｎｅｗ（５’ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＴＣ ＧＴＡ ＣＴＧ３’［配列番号３７］）を用いて実施した。第２のＰＣＲ反応を、第１の反応のＰＣＲ産物及びプライマー：ａｓ１ＵＳＮＥＷ（５’ＡＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡ ＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴ ＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧ ＧＧＧ ３’［配列番号３８］）及びＡＨＬＳ１００１（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣ ＧＡＡＴＴＣＡＴ ＣＡＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＣ３’［配列番号３９］）を用いて実施して、Ｃ末端ヒスチジンタグを組み込んだ。第２の反応から得られたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化した。ｐＥＴ １２ａベクターＤＮＡ ２ｕｇも制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化し、ホスファターゼで処理した。制限酵素で処理したｐｅｔ１２ａと反応２のＰＣＲ産物を精製し、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて連結した。この連結混合物を使用して大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播いた。
【０３６６】
Ｔ７プロモータープライマー（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’［配列番号４０］）及びＴ７ターミネータープライマー（５’ＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ３’［配列番号４１］）を使用して、ｐＥＴ１２ａベクター中のクローン化されたトランスフェラーゼ遺伝子の配列及び配向を検証した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ Ｃｙｃｌｅ配列決定キットを用いて、プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇをテンプレートとして、Ｔ７プロモーター及びターミネータープライマー３．２ｐｍｏｌを使用してＤＮＡ配列を決定した。
【０３６７】
図３５に示す構築体を用いて、コンピテントな細菌宿主系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択して発現分析に使用した。
【０３６８】
組換えアエロモナス サルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼの発現
レシチンに対する細胞抽出物の酵素活性をＮｏｎ−Ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ（ＮＥＦＡ）キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて定量した。
【０３６９】
図３６において、発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、ＯＤ６００＝０．６〜１．０になるまで振とうしながら３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を用いて培養物を誘導し、さらに３時間インキュベーションを続けた。ＩＰＴＧ誘導後０時間、１、２及び３時間に試料を採取した。ＮＥＦＡキットを用いレシチンを基質として酵素活性を試験した。
【０３７０】
より活性な酵素を産生するための増殖最適化
発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、異なる増殖温度（３７℃、３０℃＆２０℃）で振とうしながらインキュベートした。活性脂質アシルトランスフェラーゼを産生する最適条件は、図３７に示すように、培養物が３０℃で増殖されるときであった。
【０３７１】
組換えアエロモナス サルモニシダトランスフェラーゼの部分精製
発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容する系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出物を超音波処理によって調製した。Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて、超音波処理した粗製細胞抽出物から組換え酵素をさらに精製した。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性。活性トランスフェラーゼを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳから得られる粗製細胞抽出物を基質レシチンとともにインキュベートし、反応混合物を薄層クロマトグラフィーによって分析した。分解生成物が存在することがわかった（図３８参照）。
【０３７２】
組換えアエロモナス サルモニシダトランスフェラーゼの部分精製。発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容する系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出体を超音波処理によって調製した。Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて、超音波処理した粗製細胞抽出体から組換え酵素をさらに精製した。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としてホスホリパーゼ活性を試験した（図３９参照）。
【実施例２】
【０３７３】
大腸菌中でのアエロモナス ヒドロフィラトランスフェラーゼのクローニング及び発現
アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）をＡＴＣＣから入手し、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）中で終夜３０℃で増殖させた。この細胞を遠心分離し、Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．のゲノムＤＮＡ単離手順によって単離した。ゲノムＤＮＡ緩衝剤セット（ｃａｔ．１９０６０）、プロテアーゼＫ（ｃａｔ．１９１３１）及びＲＮＡｓｅ Ａ（ｃａｔ．１９１０１）はすべてＱｉａｇｅｎ Ｌｔｄ．（Ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃｏｕｒｔ Ｇａｔｗｉｃｋ Ｃｏｕｒｔ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＲＨ１０ ２ＡＸ）から入手した。
【０３７４】
宿主細菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、組換えアエロモナス酵素の産生に使用した。コンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａの形質転換用宿主として使用した。適切なプラスミドを含む形質転換体を、１００−ｕｇアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ寒天培地中で３７℃で増殖させた。
【０３７５】
発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ−ｐＳＭａの構築：
アエロモナス由来のトランスフェラーゼ遺伝子のすべてのＤＮＡ増幅では、ゲノムＤＮＡ（０．２〜１ｕｌ）をテンプレートとして用い、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）を１０ｘ ｐｆｕ緩衝剤１０ｕｌ、各プライマー１ｕｌ（５０ｐｍｏｌ／ｕｌ）、２００ｕＭｄＮＴＰとともに総反応体積１００ｕｌで使用した。プログラム可能なサーマルサイクラー中で以下の条件によってＰＣＲ反応を実施した：９５℃３０秒、（９５℃３０秒、６０℃１分間及び６８℃２分間）を３０サイクル。追加の伸張を７２℃で５分間行った。
【０３７６】
Ａ．ハイドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来のトランスフェラーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅を２つの別個のＰＣＲ反応で実施した。
【０３７７】
ＰＣＲ反応１をプライマー対、ＡＨＵＳ１（５’ＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＧＴＣ３’、配列番号４２）及びａｈｌｓ９５０（５’ＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣＧＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＡＣＴＧ３’、配列番号４３）を用いて実施した。
【０３７８】
第２のＰＣＲ反応を、第１の反応から得られるＰＣＲ産物、及びプライマー対：
ＡＨＵＳ１（５’ＧＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＧＴＣ３’配列番号４４）及びＡＨＬＳ１００１（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＣ３’配列番号４５）
を用いて実施して、Ｃ末端ヒスチジンタグを組み込んだ。
【０３７９】
第２の反応から得られたＰＣＲ産物を精製し、制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化した。ｐＥＴ １２ａベクターＤＮＡ ２ｕｇも制限酵素Ｎｄｅ１及びＢａｍＨＩで消化し、ホスファターゼで処理した。制限酵素で処理したｐｅｔ１２ａと反応２のＰＣＲ産物を精製し、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて連結した。この連結混合物を使用して大腸菌ＴＯＰ１０細胞を形質転換した。形質転換体を、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播いた。
【０３８０】
Ｔ７プロモータープライマー（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ３’）及びＴ７ターミネータープライマー（５’ＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ３’）を使用して、ｐＥＴ１２ａベクター中のクローン化されたＧＣＡＴ遺伝子の配列及び配向を検証した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ Ｃｙｃｌｅ配列決定キットを用いて、プラスミドＤＮＡ ５００ｎｇをテンプレートとして、Ｔ７プロモーター及びターミネータープライマー３．２ｐｍｏｌを使用してＤＮＡ配列を決定した。
【０３８１】
図４０に示す構築体を用いて、コンピテントな細菌宿主系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択して発現分析に使用した。
【０３８２】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中でのアエロモナス ヒドロフィラトランスフェラーゼの発現
発現ベクターｐｅｔ１２ａ−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを収容する大腸菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、ＯＤ６００＝０．６〜１．０になるまで振とうしながら３７℃でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧ（０．４ｍＭ）を用いて培養物を誘導し、さらに３時間インキュベーションを続けた。ＩＰＴＧ誘導後０時間、１、２及び３時間に試料を採取した。ＮＥＦＡキットを用いレシチンを基質として酵素活性を試験した（図４１）。
【０３８３】
より活性な酵素を産生するための増殖最適化
発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをＬＢ培地＋アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ中で増殖させ、異なる増殖温度（３７℃、３０℃＆２０℃）で振とうしながらインキュベートした。活性ＧＣＡＴ酵素を産生する最適条件は、図４２に示すように、培養物が３０℃で増殖されるときであった。
【０３８４】
組換えＡ．ヒドロフィラトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）の部分精製
発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを収容する系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを３７℃で増殖させ、粗製細胞抽出体を超音波処理によって調製した。Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて、超音波処理した粗製細胞抽出体から組換え酵素をさらに精製した。ＮＥＦＡキットを用い、レシチンを基質としたホスホリパーゼ活性アッセイ。（図４３）。
【実施例３】
【０３８５】
バチルス サチリス１６３中でのアエロモナストランスフェラーゼの発現
プラスミド構築
２種類の異なるバチルス サチリス発現ベクター（ｐＵＢ １１０＆ｐＢＥ５）を、バチルス サチリス中でのアエロモナス遺伝子の異種発現に使用した。ｐＵＢ １１０ベクターはαアミラーゼプロモーターを含み、一方、ｐＢＥベクターは融合アエロモナス遺伝子の発現調節領域としてＰ３２プロモーターを有する。ｐＵＢ １１０においては、アエロモナスの成熟ＧＣＡＴ遺伝子の最初のアミノ酸は、バチルス サチリスのキシラナーゼシグナルペプチド配列の最後のアミノ酸と、制限酵素切断部位Ｎｈｅ１を介してインフレームで融合し、成熟タンパク質の前に追加の２個のアミノ酸が生成された。ｐＢＥ５は、組換えタンパク質を培養ろ液中に分泌する、Ｎｃｏ１部位におけるｃｇｔａｓｅシグナル配列融合を含む。
【０３８６】
ｐＵＢ １１０及びｐＢＥ５ベクターのシグナル配列にインフレームで融合したアエロモナス遺伝子を得るためにＰＣＲ反応を実施した。Ａ．ヒドロフィラ遺伝子に対して以下のプライマー対を用いてＰＣＲを実施した。
【０３８７】
ＰＣＲ反応１：ｕｓＡＨｎｃｏｌ（５’ＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号４６）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３’、配列番号４７）
【０３８８】
ＰＣＲ反応２：ＵＳ−ＡｈｎｈｅＩ（５’ＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号４８）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３、配列番号４９）
【０３８９】
Ａ．サルモニシダ遺伝子に対して以下のプライマー対を用いてＰＣＲを実施した。
【０３９０】
ＰＣＲ反応３：ＵＳ−Ａｓｎｃｏｌ（５’ＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＣＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号５０）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３’、配列番号５１）
【０３９１】
ＰＣＲ反応４：ＵＳ−ＡＳｎｈｅｌ（５’ＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＣＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣ３’、配列番号５２）及び１ｓＡＨ（５’ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧ３’、配列番号５３）
【０３９２】
すべてのＰＣＲ産物は、ＰＣＲ ｂｌｕｎｔ II（ＴＯＰＯベクター）にクローン化され、逆方向＆順方向配列決定プライマーを用いて配列決定された。
【０３９３】
ＰＣＲ反応１＆３から得られたクローンは、Ｎｃｏ１＆Ｂａｍ ＨＩで切断され、Ｎｃｏ１／ＢａｍＨ１／ホスファターゼで切断されたｐＢＥ５ベクターを連結する挿入断片として使用された。ＰＣＲ反応２＆４から得られたクローンは、Ｎｈｅ１＆Ｂａｍ Ｈ１で切断され、Ｎｈｅ１／ＢａｍＨ１／ホスファターゼで切断されたｐＵＢベクターを連結する挿入断片として使用された。
【０３９４】
バチルス サチリス中でのアエロモナストランスフェラーゼ遺伝子の発現、及びその酵素活性のキャラクタリゼーション
２種類のアエロモナス種に由来するアシルトランスフェラーゼは、大腸菌中で首尾良く発現した（上記結果）。バチルスｐＵＢ１１０＆ｐＢＥ５遺伝子融合構築体を使用してバチルス サチリスを形質転換し、カナマイシンプレート上に播くことによって形質転換体を選択した。単離され２ｘＹＴ中で増殖されたカナマイシン耐性形質転換体は、バチルス中でアエロモナス遺伝子を異種発現することができる。その培養ろ液は、アシルトランスフェラーゼ活性とホスホリパーゼ活性の両方に加えて、ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）ガラクトリパーゼ活性を有する。ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧ）に対する活性を、培養上清を基質の小麦粉由来のＤＧＤＧ（Ｓｉｇｍａから入手可能）とともに６０分間インキュベーションした後に、図４４に示すようにレシチンに対する活性と同様に測定した。バチルスは、培地中で終夜（２０〜２４時間）〜４８時間培養した後に、分泌タンパク質として酵素を産生した。アエロモナス遺伝子の発現は、バチルス＆大腸菌における細胞生存能力及び増殖を妨げる場合があることが判明した。したがって、発現系統を慎重に選択し、増殖条件を最適化して確実に発現するようにする必要がある。例えば、いくつかのバチルス宿主系統（Ｂ．ｓ １６３、ＤＢ１０４及びＯＳ ２１）は、増殖比較のために発現ベクターで形質転換された。Ｂ．ｓ１６３は、２種類のアエロモナス遺伝子で形質転換することができ、活性タンパク質を発現することができる。ＤＢ１０４は、すべての構築体で形質転換することができるが、Ａ．サルモニシダトランスフェラーゼしか発現することができない。
【実施例４】
【０３９５】
大腸菌中で産生されるアエロモナス脂質アシルトランスフェラーゼの発酵及び精製
大腸菌発酵：
微生物
２系統のエシェリキア コリ（Eschericia coli）、アエロモナス ヒドロフィラ（実施例２）脂質アシルトランスフェラーゼを含む１つと、アエロモナス サルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼ、（実施例１）を含む２つをこの試験に使用した。
【０３９６】
Ａ．ヒドロフィラ遺伝子を含む大腸菌系統はＤＩＤＫ０１２４と命名され、Ａ．サルモニシダ遺伝子を含む大腸菌系統はＤＩＤＫ０１２５と命名された。ＤＩＤＫ０１２４による発酵はＨＹＤＲＯ０３０３と命名され、ＤＩＤＫ０１２５による発酵はＳＡＬ０３０２と命名された。ＨＹＤＲＯ０２５から得られる精製タンパク質はＲＥＦ＃１３８と命名された。ＨＹＤＲＯ０３０３から得られる精製タンパク質はＲＥＦ＃１３５と命名された。
【０３９７】
増殖培地及び培養条件
ＬＢ寒天
系統を維持するために使用されたＬＢ寒天板は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール３５ｍｇ／Ｌを含んだ。寒天板は３０℃でインキュベートされた。
【０３９８】
ＬＢ振とうフラスコ
バイオリアクター培養用接種材料の生成に使用されるＬＢ培地（５０ｍＬ／振とうフラスコ）は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール３５ｍｇ／Ｌを含んだ。振とうフラスコにＬＢ寒天板から接種して、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。
【０３９９】
バイオリアクター培養
バイオリアクター培養は、トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ ０．９ｇ／Ｌ、グルコース一水和物４０ｇ／Ｌ、ＡＤＤ ＡＰＴ（登録商標）Ｆｏａｍｓｔｏｐ Ｓｉｎ ２６０（ＡＤＤ ＡＰＴ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＧ、Ｈｅｌｍｏｎｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）０．４ｍＬ／、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２６Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４５Ｈ２Ｏ ０．７ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ １０ｍｇ／Ｌ、ＮｉＳＯ４６Ｈ２Ｏ ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２ ０．１ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ４０．１ｍｇ／Ｌ、ＫＩ ０．１ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ ０．１ｍｇ／Ｌ、アンピシリン１ｇ／Ｌ及びクロラムフェニコール３５ｍｇ／Ｌを含む培地４Ｌを充填した６Ｌ社内組み立てバイオリアクター中で実施された。
【０４００】
（最大比増殖速度０．６ｈ−１、ＬＢ振とうフラスコのＯＤ６００、及びバイオリアクターにおける最終ＯＤ６００約２０から計算して）約２０時間培養した後に増殖が確実に終了する量のＬＢ培養物をバイオリアクターに接種した。
【０４０１】
ＳＡＬ０３０２にＬＢ培養物１０ｍＬを接種し、ＨＹＤＲＯ０３０３にＬＢ培養物４ｍＬを接種した。
【０４０２】
バイオリアクターを以下の条件で運転した：温度３０℃、（実験に応じて）撹拌８００〜１０００ｒｐｍ、通気５Ｌ／ｍｉｎ、ｐＨ６．９、ｐＨ調整８．７５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３−水及び２Ｍ Ｈ２ＳＯ４。誘導は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを最終濃度０．６ｍＭまで添加することによって実施され、それぞれ０．４ｍｏｌ（ＨＹＤＲＯ０３０３）及び０．７ｍｏｌのＣＯ２が生成した。
【０４０３】
収集
バイオマスの収集及び均質化に以下の手順を使用した。
１）発酵物からの発酵ブロスを５０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清を排出した。バイオマスを使用するまで−２０℃で貯蔵した。バイオマスを解凍し、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール及び完全（ＥＤＴＡなし）プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の５００ｍＬに再懸濁させた。
２）懸濁バイオマスをＣｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ（Ｗａｒｗｉｃｋ、ＵＫ）製細胞粉砕機を用いて２ｋｂａｒ、４℃でホモジナイズした。
３）１０．０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって細胞片を除去し、続いて上清を収集した。
４）１３．７００ｘｇ、４℃で６０分間遠心分離することによって上清をさらに精製し、続いて上清を収集した。
５）０．２μＭ Ｖａｃｕ Ｃａｐフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）を通して上清をろ過し、ろ液を収集してすぐにクロマトグラフィー精製にかけた。
【０４０４】
トランスフェラーゼのクロマトグラフィー精製
（製造者Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって記載された方法に従って）カラム（２．５ｘ１０ｃｍ）にＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆ．ゲル５０ｍｌを詰め、硫酸Ｎｉを充填した。２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールの２００ｍｌでカラムを平衡にした。粗製物４００ｍｌを流量５ｍｌ／ｍｉｎでカラムにかけた。次いで、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールを用いて、ＵＶ２８０がベースラインに達するまでカラムを洗浄した。次いで、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾールの４０ｍｌを用いてＧＣＡＴを溶出させた。
【実施例５】
【０４０５】
バチルス サチリス中で産生されるアエロモナス脂質アシルトランスフェラーゼの発酵及び精製
発酵
ＢＡＣ０３１８−１９、ＢＡＣ０３２３−２４
微生物
この試験に使用される微生物はバチルス サチリス宿主系統＃１６３の形質転換から生じ、アエロモナス サルモニシダトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドがベクターｐＵＢ１１０ＯＩＳに挿入されている。この遺伝子の発現は、α−アミラーゼプロモーターによって制御され、トランスフェラーゼの分泌は、Ｂ．サチリスキシラナーゼシグナル配列によって媒介される（実施例３）。これらの系統は、ＤＩＤＫ０１３８（発酵ＢＡＣ０３１８−１９）及びＤＩＤＫ０１５３（発酵ＢＡＣ０３２３−２４）と命名された。
【０４０６】
増殖培地及び培養条件
前培養培地
振とうフラスコ（総容積５００ｍＬ、バッフル付き）に、
ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４ １０ｇ／Ｌ
大豆粉 ２０ｇ／Ｌ
酵母抽出物、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ １０６ ２０ｇ／Ｌ
消泡剤、ＳＩＮ２６０ ５ｍＬ／Ｌ
を含む培地１００ｍＬを添加した。
【０４０７】
ｐＨは高圧蒸気殺菌前に７．０に調節された。
【０４０８】
高圧蒸気殺菌後に、５０％（ｗ／ｗ）Ｎｕｔｒｉｏｓｅ ６ｍＬ／フラスコを添加した。高圧蒸気殺菌後、カナマイシンを濃度５０ｍｇ／Ｌで添加した。
【０４０９】
接種
２５％（ｗ／ｖ）グリセリン貯蔵物から凍結培養物を前培養振とうフラスコに直接接種した。振とうフラスコを３３℃、１７５ｒｐｍで約１６時間インキュベートし、発酵槽に接種するのに５０ｍＬを使用した。
【０４１０】
発酵
６Ｌ社内組み立て発酵槽中で発酵を実施した。
バッチ培地（３Ｌ）は、
コーンスティープリカー（５０％ｄｗ） ４０ｇ／Ｌ
酵母抽出物 ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ １５３（５０％ｄｗ）１０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２，２Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ
Ｍｎ（ＮＯ３）２，Ｈ２Ｏ ０．２ｇ／Ｌ
消泡剤 ＳＩＮ２６０ １ｍＬ／Ｌ
カナマイシン（高圧蒸気殺菌後、発酵槽にフィルター滅菌 ５０ｍｇ／Ｌ
を含んだ。
【０４１１】
供給原料は、
グルコース一水和物 ５４０ｇ／ｋｇ
ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ ４．８ｇ／ｋｇ
Ａｎｔｏｆｏａｍ ＳＩＮ２６０ ４ｍＬ／ｋｇ
酵母抽出物、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇｅｒ １５３（５０％ｄｗ）１５０ｇ／ｋｇ
（別個に高圧蒸気滅菌）
を含んだ。
【０４１２】
発酵ＢＡＣ０３１８及びＢＡＣ０３２３における供給は、以下の式に従って、蓄積したＣＯ２に基づいて開始された。
供給−流量［ｇ／ｈ］＝０、ＡｃＣＯ２＜０．１５
供給−流量［ｇ／ｈ］＝２．８５＋ｔ・１．５４、ＡｃＣＯ２≧０．１５及びｔ＜１２
供給−流量［ｇ／ｈ］＝２１．３、ｔ＞１２
ｔ：蓄積ＣＯ２（ＡｃＣＯ２）が０．１５モルに達した時点からの時間（ｈ）
【０４１３】
発酵ＢＡＣ０３１９及びＢＡＣ０３２４における供給は、以下の式に従って、蓄積したＣＯ２に基づいて開始された。
供給−流量［ｇ／ｈ］＝０、ＡｃＣＯ２＜０．１５
供給−流量［ｇ／ｈ］＝２．０＋ｔ・１．０８、ＡｃＣＯ２≧０．１５及びｔ＜１２
供給−流量［ｇ／ｈ］＝１５、ｔ＞１２
ｔ：蓄積ＣＯ２（ＡｃＣＯ２）が０．１５モルに達した時点からの時間（ｈ）
【０４１４】
ｐＨは、１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３−水又は２Ｍリン酸を添加することによって７．０に制御された。
通気は１ｖｖｍに相当する３Ｌ／ｍｉｎであった。
温度は３３℃であった。
発酵槽は、１０ｃｍの距離で配置された２個の８ｃｍφＲｕｓｈｔｏｎ回転翼を備えた。
【０４１５】
収集
バイオマスは、１６，０００ｘｇで１０分間室温で遠心分離することによって除去された。上清をフィルター滅菌し、ろ液を精製及び応用試験に使用した。
【実施例６】
【０４１６】
酵素のアシルトランスフェラーゼ活性を測定するための「緩衝基質におけるトランスフェラーゼアッセイ」
脂質アシルトランスフェラーゼをアエロモナス サルモニシダから単離し、バチルス サチリス中で発現させた。この酵素は、コレステロールエステルの形成中にレシチンからコレステロールに脂肪酸を転移させるのに極めて効率的である。この酵素は、遊離脂肪酸の形成によって認められるいくらかの加水分解活性を有することも判明した。在来のホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．４及びＥＣ３．１．１．３２）は、遊離脂肪酸及びリゾレシチンの形成中にレシチンを加水分解する能力を有し、これらの酵素ではトランスフェラーゼ反応は報告されていない。
【０４１７】
本発明者らは、本明細書において、酵素のトランスフェラーゼ活性と加水分解活性の両方を測定し、したがって本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを特定することができるアッセイを詳述する。このアッセイは、レシチン及びコレステロールを含む基質を使用する。この研究においては、緩衝剤中に散在するホスファチジルコリン及びコレステロールを主体とする基質を使用した。反応生成物の定量は、基質から脂質を抽出し、その後その脂質成分をＧＬＣ分析することによって行われた。
【０４１８】
手順
材料
Ｌ−α−ホスファチジルコリン９５％（植物）Ａｖａｎｔｉ ｎｏ．４４１６０１
コレステロール：Ｓｉｇｍａ ｃａｔ．Ｃ ８５０３
パルミチン酸コレステリル、Ｓｉｇｍａ Ｃ ６０７２
ステアリン酸コレステリル、Ｓｉｇｍａ Ｃ ３５４９
ＨＥＰＥＳ緩衝剤 Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ ３３７５
クロロホルム、分析グレード
【０４１９】
酵素
Ａ．サルモニシダ由来の精製ＧＣＡＴ＃１７８−９
【０４２０】
ＴＬＣ分析。
ＴＬＣ−プレートを加熱カップボード（１１０℃）中で１／２時間活性化させた。
泳動緩衝剤１００ｍｌを蓋付きのクロマトグラフィーチャンバーに注いだ。チャンバーを溶媒蒸気で飽和させるために、チャンバー壁をろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ ２）で覆った。
ＴＬＣ−プレートを枠内に配置し、試料を底部から２ｃｍのＴＬＣプレート上に付けた。次いで、ＴＬＣプレートを、泳動緩衝剤を含むＴＬＣチャンバー中に置いた。泳動緩衝剤がプレート底部から１４ｃｍに達したときに、ＴＬＣプレートを取り出し、蒸発板（ｆｕｍｅ ｂｏａｒｄ）中で乾燥させ、次いで１１０℃の加熱カップボード中に１０分間置いた。
次いで、ＴＬＣ−プレートを展開試薬に浸漬し、加熱カップボード中で１１０℃で１５分間乾燥させた。
【０４２１】
泳動緩衝剤：
Nr.IV：クロロホルム：メタノール：Ｈ２Ｏ（６５：２５：４）
Nr.Ｉ：Ｐ−エーテル：ＭＴＢＥ：酢酸（６０：４０：１）
【０４２２】
展開緩衝剤（バナデート−緩衝剤）：
Ｎａ２ＣＯ３ ３２ｇをＨ２Ｏ ３００ｍｌに加える（１Ｍ）
五酸化バナデート（ｖａｎａｄａｔｅ ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ）（Ｖ２Ｏ５）１８．２ｇを添加し、軽く加熱しながら溶解させる。
その溶液を周囲（ａｍｂｉｅｎｔ）まで冷却する。
２．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４ ４６０ｍｌ（Ｈ２Ｏ ４６０ｍｌ＋Ｈ２ＳＯ４６１ｍｌ）を慎重に添加する。
水を１０００ｍｌまで添加する。
【０４２３】
ＧＬＣ分析
ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２．５ｍ ｘ ０．２５ｍｍＩＤ ｘ ０．１μフィルム厚５％フェニル−メチル−シリコーン（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ製ＣＰ Ｓｉｌ ８ ＣＢ）を備えたパーキンエルマーＡｕｔｏｓｙｓｔｅｍ ９０００キャピラリーガスクロマトグラフ。
キャリアガス：ヘリウム。
インジェクター：ＰＳＳＩコールドスプリット注入（初期温度５０℃ ３８５℃に昇温）、体積１．０μｌ
検出器 ＦＩＤ：３９５℃
乾燥器プログラム：     １    ２     ３
乾燥器温度、℃       ９０ ２８０ ３５０
等温、時間、ｍｉｎ     １     ０   １０
昇温速度、℃/ｍｉｎ  １５     ４
【０４２４】
試料調製：試料３０ｍｇを、内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含むヘプタン：ピリジン２：１ ９ｍｌに溶解した。試料溶液３００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオロアセアミド（ｔｒｉｆｌｕｏｒａｃｅａｍｉｄ））３００μｌを添加し、６０℃で２０分間反応させた。
【０４２５】
計算：モノ−ジ−トリグリセリド及び遊離脂肪酸の応答係数を標準２（モノ−ジ−トリグリセリド）から求める。コレステロール、パルミチン酸コレステリル及びステアリン酸コレステリルの応答係数を純粋な基準材料から求めた。
【０４２６】
結果：ホスファチジルコリン及びコレステロールを基質としたトランスフェラーゼアッセイ
以下において、ホスファチジルコリン及びコレステロールを主体とする基質において、以下の手順に従ってトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性を試験した。
【０４２７】
ホスファチジルコリン（＞９５％ＰＣ Ａｖａｎｔｉ製品番号４４１６０１）４５０ｍｇ及びコレステロール５０ｍｇをクロロホルムに溶解し、減圧下で蒸発乾固させた。コレステロール／ホスファチジルコリン混合物３００ｍｇをＷｈｅａｔｏｎガラスに移し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７ １５ｍｌを添加した。撹拌しながら脂質を緩衝剤に分散させた。
マグネチックスターラで混合しながら基質を３５℃に加熱し、酵素溶液０．２５ｍｌを添加した。これは、水分約９５％の極めて高い水分環境である。
【０４２８】
試料２ｍｌを反応時間０、５、１０、１５、２５、４０及び６０分後に取り出した。すぐに４Ｍ ＨＣｌ ２５μｌを添加して、遊離脂肪酸を酸性化し、酵素反応を停止させた。クロロホルム３．００ｍｌを添加し、Ｗｈｉｒｌｅｙ上で試料を３０秒間激しく振とうさせた。試料を遠心分離し、クロロホルム相２ｍｌを単離し、０．４５μｍフィルターを通して、風袋を量った１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスにろ過した。クロロホルムを窒素気流下で６０℃で蒸発させ、試料を再度計量した。抽出された脂質をＧＬＣによって分析した。
【０４２９】
ＧＬＣ分析の結果を表１に示す。結果は、抽出された脂質に対して計算された％で表されている。時間の関数として形成される脂肪酸及びコレステロールエステルの量を図４５に示す。図４５から、酵素反応は、初期に高い加水分解活性とトランスフェラーゼ活性の両方が認められるので、時間の関数として線形ではないと結論付けることができる。約１０分後、且つ約６０分まで、反応は、時間の関数として、脂肪酸及びコレステロールエステル形成のほぼ線形応答を示す。したがって、この時間間隔において酵素反応を考察することにした。
【０４３０】
［表１］
2011167191.tif 000004
【０４３１】
反応混合物中の脂質量、及び添加酵素量についての情報から、μｍｏｌ／ｍｌ酵素で表される脂肪酸及びコレステロールエステルの形成を計算することができた（表２及び図４６）。
【０４３２】
［表２］
2011167191.tif 000005
【０４３３】
表２の結果、及び図４６の曲線の傾斜から、μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ酵素で表される脂肪酸及びコレステロールエステルの量を時間の関数として計算することができた。
【０４３４】
加水分解活性及びトランスフェラーゼ活性の計算を表３に示す。相対トランスフェラーゼ活性は、本明細書に記載する％アシルトランスフェラーゼ活性を求めるプロトコルを用いて求められた。
【０４３５】
［表３］
2011167191.tif 000006
【０４３６】
トランスフェラーゼ活性による他の酵素のスクリーニング
上記方法を使用して、様々な脂肪分解酵素をトランスフェラーゼ活性及び加水分解活性についてスクリーニングした。表４に示すように酵素を試験した。
【０４３７】
［表４］
2011167191.tif 000007
【０４３８】
ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７．０ ５０ｍＭ中に散在するホスファチジルコリン／コレステロール３００ｍｇを含む基質を撹拌しながら３５℃に加熱した。酵素溶液を添加し、試料を撹拌しながら３５℃に維持した。試料を規則的な間隔で取り出し、クロロホルムで抽出した。単離した脂質をＧＬＣによって分析した。結果を表５に示す。
【０４３９】
［表５］
2011167191.tif 000008
【０４４０】
ＧＬＣ分析から、脂質アシルトランスフェラーゼ（１７８−９）のみがかなりの量のコレステロールエステル及び脂肪酸を生成したことが観測された。フザリウム オキシスポラム由来のホスホリパーゼでも遊離脂肪酸が着実に増加したが、初期に少量のコレステロールエステルのみが形成され、経時的なコレステロールエステルの増加は認められなかった。
【０４４１】
脂質基質量及びＧＬＣ分析についての情報に基づいて、反応時間１０〜６０分の結果から相対トランスフェラーゼ活性及び相対加水分解活性を計算することができた。トランスフェラーゼ１７８−９及びフザリウム オキシスポラムリパーゼの結果を表６に示す。試験したその他の酵素は活性を示さなかった。
【０４４２】
［表６］
2011167191.tif 000009
【０４４３】
表６に示した結果によれば、脂質アシルトランスフェラーゼ（試料１７８−９）由来のかなりのトランスフェラーゼ活性が確認される。相対トランスフェラーゼ活性が表３に示した実験に良く一致していることも認められる。
【０４４４】
しかし、フザリウム オキシスポラムホスホリパーゼ由来のトランスフェラーゼ活性は極めて低かった。このトランスフェラーゼレベルは、あまりにも低く、分析の不確実性の範囲内である。予想したとおり、フザリウム オキシスポラムホスホリパーゼは、かなりの加水分解活性を有する。
【０４４５】
結論。
精製ホスファチジルコリン及びコレステロールを主体とする人工基質を基質として使用して、アエロモナス サルモニシダ由来のトランスフェラーゼの活性を測定した。反応時間１０分〜６０分において、アッセイは、時間の関数として遊離脂肪酸及びコレステロールエステルをほぼ線形で形成した。反応時間１０〜６０分の活性に基づいて、加水分解活性及びトランスフェラーゼ活性を計算した。
【０４４６】
緩衝剤中のホスファチジルコリン／コレステロールの人工基質における、アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ（この場合はＧＣＡＴ）のアッセイ結果に基づいて、この酵素が極めて高含水量の系においても極めて良好なトランスフェラーゼ活性を有すると結論される。
緩衝剤中のホスファチジルコリン／コレステロールアッセイを使用して、酵素のトランスフェラーゼ活性及び加水分解活性を測定することができる。緩衝剤中のホスファチジルコリン／コレステロールはある制限時間内でのみ線形である。
【実施例７】
【０４４７】
アエロモナス サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼの固定化
Ａ．サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ（この場合はＧＣＡＴ）をアセトン沈殿によってセライト５３５ ５３５（Ｆｌｕｋａ製）上に固定した。２０ｍＭ ＴＥＡ緩衝剤ｐＨ７中の酵素溶液１０ｍｌをセライト５３５ ５３５（Ｆｌｕｋａ製）０．１グラムとともに室温で２時間ゆっくり撹拌した。
連続撹拌しながら冷アセトン５０ｍｌを添加した。
５０００ｇで１分間遠心分離することによって沈殿物を単離した。
沈殿物を冷アセトン２０ｍｌで２回洗浄した。
セライトを周囲温度で約１時間試みた。
【０４４８】
この酵素は、高含水量（６〜８９％）水環境の環境において高い活性を有することも判明した。したがって、本発明に使用されるこのトランスフェラーゼ、及び他のトランスフェラーゼは、かなりの含水量の固定化酵素用途において使用することもできる。これによって、トランスフェラーゼを用いた脂質の生物変換において、現行の固定化リパーゼによって使用される溶媒の交換が可能になる。
【実施例８】
【０４４９】
アエロモナス ヒドロフィラ由来の脂質アシルトランスフェラーゼの変異体（Ａｈｙｄ２）（配列番号３６（図４７参照））
突然変異は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡ製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ−Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによって提供される指示に従って導入された。
【０４５０】
Ｔｙｒ２５６における変異は、リン脂質に対する活性を増大させた。
【０４５１】
Ｔｙｒ２５６及びＴｙｒ２６０における変異は、ガラクト脂質に対する活性を増大させた。
【０４５２】
Ｔｙｒ２６５における変異は、アシル供与体としてガラクト脂質とともにトランスフェラーゼ活性を増大させる。
【０４５３】
これらの数値は、以下の配列、すなわち、そのアミノ酸配列が図４７の配列番号３６として示されるアエロモナス ヒドロフィラ由来の酵素（下線を引いたアミノ酸は、キシラナーゼシグナルペプチドである)上の位置を示す。ヌクレオチド配列を図７２の配列番号４８として示す。
【実施例９】
【０４５４】
「低水分環境におけるアッセイ」
低水分環境における脂肪分解酵素のトランスフェラーゼ反応。
手順
材料。
コレステロールＳｉｇｍａ ｃａｔ．Ｃ ８５０３
Ｌ−α−ホスファチジルコリン９５％（植物）Ａｖａｎｔｉ ＃４４１６０１
大豆油、Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｔｅｄ、ＤＫ。
クロロホルム、分析グレード
【０４５５】
酵素。
＃１７９、Ａ．サルモニシダ由来のＧＣＡＴ
＃２４２７ フザリウム オキシスポラム由来のホスホリパーゼＡ１。Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ製ＬＩＰＯＰＡＮ（登録商標）Ｆ
＃１９９１ すい臓からのホスホリパーゼＡ２、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ、ＵＫ製ＬＩＰＯＭＯＤ ２２Ｌ
＃２３７３、カンジダ アントアークチカ（Candida Antarctica）リパーゼ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄｅｎｍａｒｋ製Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ５２５Ｌ。
【０４５６】
酵素アッセイ
レシチン１３．１％及びコレステロール６．６％を、撹拌しながら６０℃に加熱することによって大豆油に溶解した。
基質を２０ｍｌ Ｗｈｅａｔｏｎガラスに計量し、４６℃に加熱した。
水と酵素溶液を添加し、ストップウォッチをスタートさせる。
規則的な間隔で試料５０ｍｇを１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスに移し、凍結させた。
単離された脂質をＧＬＣによって分析した。
【０４５７】
ＧＬＣ分析
ＧＬＣ分析のプロトコルについては、実施例６参照。
【０４５８】
結果
実験を表８に示すように組み立てた。
レシチン１３．１％及びコレステロール６．６％を含む大豆油を主体とする基質を４６℃に加熱した。酵素溶液を添加し、ストップウォッチをスタートさせた。
反応時間３０、６０及び１２０分後に、ＧＬＣ分析用試料を取り出した。
【０４５９】
［表８］
2011167191.tif 000010
【０４６０】
ＧＬＣ分析の結果を表９に示す。結果は、試料全組成に対する百分率で表わしてある。このＧＬＣの結果に基づいて、酵素が添加されていない対照試料と比較して、酵素反応によって製造された脂肪酸及びコレステロールエステルの量を計算することができた。これらの実験条件下では、全酵素活性は、遊離脂肪酸形成として測定される加水分解活性として推定され、トランスフェラーゼ活性はコレステロールエステル形成として推定された。これらの結果、並びに脂肪酸及びコレステロールエステルの分子量についての情報から、表１０に示すように相対モル加水分解活性及び相対モルトランスフェラーゼ活性を計算することができた。
【０４６１】
［表９］
2011167191.tif 000011
【０４６２】
［表１０］
2011167191.tif 000012
【０４６３】
結論
これらの実験においては、脂肪酸量が増加したので、すべての試験酵素が加水分解活性を示すことが認められた。しかし、トランスフェラーゼ活性を示した唯一の酵素はＡ．サルモニシダ由来のＧＣＡＴであった。したがって、水６％を含むレシチン及びコレステロールの油系においては、フザリウム オキシスポラム由来のホスホリパーゼＡ１、すい臓からのホスホリパーゼＡ２、及びカンジダ アントアークチカ由来のリパーゼのみが加水分解活性を示したと結論される。
【実施例１０】
【０４６４】
本発明による固定化脂質アシルトランスフェラーゼを用いた炭水化物エステルの生成
スクロースエステル及びグルコースエステルのような脂肪酸の炭水化物エステルは、従来、高温における脂肪酸又は脂肪酸石けんと炭水化物の反応によって生成されている（Journal of the Americal Oil Chemists' Society (1978) 55; 4; 398-401）しかし、この手順は、副反応及び着色副生物が形成される欠点がある。
【０４６５】
本発明においては、脂肪酸の炭水化物エステルは、レシチンを脂肪酸供与体として、グルコースのような炭水化物を受容体分子として用いたトランスフェラーゼ反応によって生成される。
【０４６６】
この反応は、脂質アシルトランスフェラーゼが固体担体上に固定された流通反応装置中で実施される。
【０４６７】
手順。
グルコース１００グラムを撹拌しながら水１０００ｍｌに溶解する。次いで、ホスファチジルコリン２００グラムを撹拌しながら水相に分散させ、４０℃に加熱する。
ｐＨをｐＨ６．５に調節する。
流通反応装置に、固体担体上に固定されたＡ．サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ１００ｇを充填する。
流通反応装置を４０℃の加熱キャビネット中に置く。
反応混合物をカラムに２ｍｌ／ｍｉｎでポンプ注入する。
反応生成物を収集する。
反応生成物中の水を薄膜真空蒸発によって除去し、脂質を単離する。
グルコースエステルを溶媒分画によって他の脂質から分離する。
【０４６８】
炭水化物エステルは、食品及び非食品産業において効率的乳化剤など多数の用途に使用することができる。
【実施例１１】
【０４６９】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを用いたタンパク質エステル生成
本発明においては、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の脂肪酸縮合物がトランスフェラーゼ反応によって生成される。この反応においては、ホスファチジルコリンは、エステル化に利用可能な遊離ヒドロキシル基を有する（チロシン、セリン、トレオニンなどの）アミノ酸の遊離ヒドロキシル基に脂肪酸を転移する供与体として使用される。
【０４７０】
手順１。
１−チロシン（又はセリン若しくはトレオニン）５０グラムを撹拌しながら水１０００ｍｌに溶解する。次いで、ホスファチジルコリン２００グラムを撹拌しながら水相に分散させ、４０℃に加熱する。
ＮａＯＨ又はＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ７に調節し、このｐＨに維持する。
Ａ．サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ５０ｍｌを添加し、撹拌しながら４０℃で反応を続ける。
試料を規則的な間隔で取り出し、ＴＬＣ及びＨＰＬＣによって分析する。
反応時間２０時間後に、反応は平衡に達し、停止される。
チロシン脂肪酸縮合物、レシチン及びリゾレシチンを、標準方法に従い遠心分離によって反応媒体から単離する（"Centrifiges, Filtering" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry、例えば、(2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA参照）。
【０４７１】
チロシン脂肪酸縮合物を疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーによってさらに精製し、チロシン脂肪酸縮合物を含む画分を単離し、溶媒を蒸発によって除去する。('Basic Principles of Chromatography' in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA参照)
【０４７２】
手順２。
以下において、ホスファチジルコリン及び１−チロシンを主体とする基質において、以下の手順に従って脂質アシルトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性を試験する。
【０４７３】
ホスファチジルコリン（＞９５％ ＰＣ Ａｖａｎｔｉ製品番号４４１６０１）４５０ｍｇ及び１−チロシン５０ｍｇをＷｈｅａｔｏｎガラスに計量し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７ １５ｍｌを添加する。撹拌しながら脂質を緩衝剤に分散させる。
【０４７４】
マグネチックスターラで混合しながら基質を３５℃に加熱し、トランスフェラーゼ１０ＰＬＵ／ｍｌ ０．２５ｍｌを添加する。
【０４７５】
試料２ｍｌを反応時間０、５、１０、１５、２５、４０及び６０分後に取り出す。
【０４７６】
すぐに４Ｍ ＨＣｌ ２５μｌを添加して遊離脂肪酸を酸性化し、酵素反応を停止させる。クロロホルム３．００ｍｌを添加し、Ｗｈｉｒｌｅｙ上で試料を３０秒間激しく振とうさせる。試料を遠心分離し、クロロホルム相２ｍｌを単離し、０．４５μｍフィルターを通して、風袋を計量した１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスにろ過する。
【０４７７】
クロロホルムを窒素蒸気下で６０℃で蒸発させ、試料を再度計量する。抽出された脂質をＴＬＣによって分析する。
【実施例１２】
【０４７８】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを用いたヒドロキシ酸エステル（特に乳酸エステル）生成
脂肪酸のヒドロキシエステルは、従来、無機塩又は金属イオンを触媒として用いた、高温における脂肪酸とヒドロキシ酸の反応によって生成される（例えば、Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Fifth edition, Volume 3. Edible Oil and Fat Products: Products and Application Technology, page 502-511参照）。しかし、この手順は、副反応及び着色副生物が形成される欠点がある。
【０４７９】
本発明においては、脂肪酸のヒドロキシ酸エステルは、レシチンを脂肪酸供与体として、ヒドロキシ酸（特に乳酸）を受容体分子として用いたトランスフェラーゼ反応によって生成される。
【０４８０】
手順。
乳酸（lactic）５０グラムを撹拌しながら水１０００ｍｌに溶解する。次いで、ホスファチジルコリン２００グラムを撹拌しながら水相に分散させ、４０℃に加熱する。
【０４８１】
ＮａＯＨ又はＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ６．５に調節し、このｐＨに維持する。
【０４８２】
Ａ．サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ５０ｍｌを添加し、撹拌しながら４０℃で反応を続ける。
【０４８３】
試料を規則的な間隔で取り出し、ＴＬＣ及びＧＬＣによって分析する。
【０４８４】
反応時間２０時間後に、反応は平衡に達し、停止される。
【０４８５】
乳酸エステル、レシチン及びリゾレシチンを、標準方法に従い遠心分離によって反応媒体から単離する（"Centrifiges, Filtering" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry、例えば、(2002) by Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA参照）。
【０４８６】
乳酸エステルを分子蒸留によってさらに精製して、脂肪酸の乳酸エステルが高純度で得られる。
【実施例１３】
【０４８７】
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼを用いたクエン酸エステル生成
基質としてホスファチジルコリン及びクエン酸を使用するトランスフェラーゼアッセイ
以下において、ホスファチジルコリン及びクエン酸を主体とする基質において、以下の手順に従ってＡ．サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼのトランスフェラーゼ活性を試験する。
【０４８８】
ホスファチジルコリン（＞９５％ ＰＣ Ａｖａｎｔｉ製品番号４４１６０１）４５０ｍｇ及びクエン酸５０ｍｇをＷｈｅａｔｏｎガラスに計量し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤ｐＨ７ １５ｍｌを添加する。撹拌しながら脂質を緩衝剤に分散させる。
【０４８９】
マグネチックスターラで混合しながら基質を３５℃に加熱し、Ａ．サルモニシダ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ１０ＰＬＵ／ｍｌ ０．２５ｍｌを添加する。
【０４９０】
試料２ｍｌを反応時間０、５、１０、１５、２５、４０及び６０分後に取り出す。
【０４９１】
すぐに４Ｍ ＨＣｌ ２５μｌを添加して遊離脂肪酸を酸性化し、酵素反応を停止させる。クロロホルム３．００ｍｌを添加し、Ｗｈｉｒｌｅｙ上で試料を３０秒間激しく振とうする。試料を遠心分離し、クロロホルム相２ｍｌを単離し、０．４５μｍフィルターを通して、風袋を計量した１０ｍｌ Ｄｒａｍガラスにろ過する。
【０４９２】
クロロホルムを窒素蒸気下で６０℃で蒸発させ、試料を再度計量する。抽出された脂質をＴＬＣによって分析する。
【０４９３】
上記明細書に述べたすべての出版物を参照により本明細書に援用する。本発明に記載の方法及びシステムの様々な改変形態及び変更形態が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を具体的な好ましい実施形態と関連して説明したが、特許請求する本発明をそのような具体的実施形態に不当に限定すべきでないことを理解すべきである。実際、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者に明白である本発明の記載された実施形態の様々な変形形態が以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０４９４】
【図１】データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】生物アエロモナス ヒドロフィラ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から得られるアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】生物アエロモナス サルモニシダ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から得られるアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図４】生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号４）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６３１５５８）を示す図である。
【図５】生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られるアミノ酸配列（配列番号５）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＣ４２１４０）を示す図である。
【図６】生物サッカロミセス セレビシエから得られるアミノ酸配列（配列番号６）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４１７３４）を示す図である。
【図７】ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列に対する選択配列のアラインメントを示す図である。
【図８】アミノ酸配列同一性が９３％である配列番号３と配列番号２の対ごとのアラインメントを示す図である。下線を引いたのはシグナル配列である。＋は相違を示す。活性部位セリン１６を含むＧＤＳＸモチーフ、及び活性部位アスパラギン酸１１６及びヒスチジン２９１を強調表示する（陰影付きの領域を参照）。アミノ酸の後ろの番号は、シグナル配列を引いたものである。
【図９】生物アエロモナス ヒドロフィラから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。
【図１０】生物アエロモナス サルモニシダから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を示す図である。
【図１１】生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｎｃ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）を示す図である。
【図１２】生物ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）から得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５４８０．．２６６３６７）を示す図である。
【図１３】生物サッカロミセス セレビシエから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ７５０３４)を示す図である。
【図１４】生物ラルストニアから得られるアミノ酸配列（配列番号１２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ６４６０５２）を示す図である。
【図１５】生物ラルストニアから得られる、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１６】配列番号２０．Ｓｃｏｅ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮定上のタンパク質[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図１７】ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８の保存された仮定上のタンパク質をコードする配列番号２１のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図１８】配列番号２２のアミノ酸．Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮定上のタンパク質[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図１９】Ｓｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９の保存された仮定上のタンパク質をコードする配列番号２３のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図２０】アミノ酸配列（配列番号２４）Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図２１】Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６の推定分泌タンパク質をコードする配列番号２５のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図２２】アミノ酸配列（配列番号２６）Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質［ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図２３】Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１の推定分泌タンパク質をコードする配列番号２７のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図２４】アミノ酸配列（配列番号２８）Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質［ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図２５】Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３の推定リポタンパク質をコードする配列番号２９のヌクレオチド配列[ストレプトマイセス コエリコラーＡ３（２）]を示す図である。
【図２６】アミノ酸配列（配列番号３０）Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼ［ストレプトマイセス リモサス]を示す図である。
【図２７】Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセッションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼをコードする配列番号３１のヌクレオチド配列［ストレプトマイセス リモサス]を示す図である。
【図２８】アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来のアミノ酸配列（配列番号３２）脂質アシルトランスフェラーゼを示す図である。
【図２９】アエロモナス ヒドロフィラ（ＡＴＣＣ ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３３）を示す図である。
【図３０】アエロモナス サルモニシダ亜種サルモニシダ（Salmonicida）（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である。
【図３１】アエロモナス サルモニシダ亜種サルモニシダ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）を示す図である。
【図３２】アエロモナス遺伝子の相同体は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＩＨ、ＭＤ、ＵＳＡの基本的な局所的アラインメント検索ツールサービス、及び完全ゲノムデータベースを用いて特定できることを示す図である。ＧＤＳＸモチーフがデータベース検索に使用され、脂肪分解活性を有する酵素を潜在的にコードするいくつかの配列／遺伝子が特定された。遺伝子は、ストレプトマイセス属、ザントモナス属及びラルストニア属から特定された。以下の例として、ラルストニア ソラナセアルムがアエロモナス サルモニシダ（ｓａｔＡ）遺伝子と並べられた。対ごとのアラインメントによって、同一性は２３％であることが判明した。活性部位セリンはアミノ末端に存在し、触媒作用性残基ヒスチジン及びアスパラギン酸を特定することができる。
【図３３】Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線を引いたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。．記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。
【図３４】Ｐｆａｍ００６５７．１１［ファミリー００６５７、データベースバージョン１１］コンセンサス配列（以後、Ｐｆａｍコンセンサスと呼ぶ）及び様々な配列とＰｆａｍコンセンサス配列のアラインメントを示す図である。各矢印は活性部位残基を示し、下線を引いたボックスは[Upton C and Buckley JT (1995) Trends Biochem Sci 20; 179-179]によって示された相同性ボックスのうちの３個を示す。Ｐｆａｍコンセンサス中の大文字は、多数のファミリーメンバーにおいて保存されている残基を示す。−記号は、Ｐｆａｍコンセンサスの隠れマルコフモデルによって残基が存在すると予想されたが存在せず、ギャップが挿入される位置を示す。．記号は、Ｐｆａｍコンセンサス中に対応する残基がない残基を示す。これらの配列は、図２、１６、１８、２０、２６、２８及び３０に記載されたアミノ酸配列である。これらのタンパク質すべては、脂質基質に対して活性であることが判明した。
【図３５】Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きアエロモナス サルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを示す図である。
【図３６】ＮＥＦＡキットアッセイにおいて細胞抽出物を試験した結果を示す図である。組換えＡ．サルモニシダ脂質アシルトランスフェラーゼのレシチンに対する活性を示す。各ウェルは、左から右に、正の対照、負の対照（すなわち、空のプラスミドからの抽出物）、並びにＩＰＴＧ誘導から０、１、２及び３時間培養後に収集された試料である。
【図３７】発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの増殖最適化を示す図である。３０℃での培養によって、レシチンに対して高い活性を有する酵素が産生されることが示されている。細胞抽出物のホスホリパーゼ活性を、ＮＥＦＡキットアッセイによって試験した。各ウェルは、左から右に、正の対照、負の対照、２０℃、３０℃である。
【図３８】基質レシチンとともにインキュベートされた、活性脂質アシルトランスフェラーゼを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳから得られる粗製細胞抽出物を示す図である。反応混合物は、薄層クロマトグラフィーによって分析され、分解生成物が存在することが示された。レーン：１．酵素なし；２．＋Ａ． ｓａｌ −１０ｕｌ ３７℃；３．＋Ａ． ｓａｌ −２０ｕｌ ３７℃；４．＋Ａ． ｓａｌ −１０ｕｌ ２４℃；５．＋Ａ． ｓａｌ −２０ｕ ２４℃。
【図３９】アエロモナス サルモニシダアシルトランスフェラーゼの部分精製を示す図である。ホスホリパーゼ活性が精製Ｈｉｓタグタンパク質と関連することが示されている。ＳＥ＝超音波処理抽出物、Ｈｉｓ＝Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて精製。
【図４０】Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きアエロモナス ヒドロフィラグリセロ脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）遺伝子を含む発現ベクターｐｅｔ１２−Ａ．ｈ．ＧＣＡＴ＝ｐＳＭａを使用して大腸菌系統ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した図である。
【図４１】組換えアエロモナス ヒドロフィラＧＣＡＴ酵素を含む粗製抽出物（５＆１０ｕｌ）のレシチンに対する活性をＮｏｎ−Ｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ（ＮＥＦＡ）キット（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて試験した図である。リン脂質レシチンに対して活性な酵素が存在することを示す。
【図４２】発現ベクターｐｅｔ１２−ＡｓａｌＧＣＡＴ＝ｐＳＭを収容するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの増殖最適化を示す図である。３０℃での培養によって、レシチンに対して高い活性を有する酵素が産生されることが示されている。細胞抽出物のホスホリパーゼ活性を、ＮＥＦＡキットアッセイによって試験した。
【図４３】アエロモナス ヒドロフィラ＆Ａ．サルモニシダアシルトランスフェラーゼの部分精製を示す図である。ホスホリパーゼ活性が精製Ｈｉｓタグタンパク質と関連することが示されている。ＳＥ＝超音波処理抽出物、Ｈｉｓ＝Ｑｉａｇｅｎ製Ｎｉ−ＮＴＡスピンキットを用いて精製）。
【図４４】レシチンとＤＧＤＧの両方に対して活性な分泌酵素が産生されたことを示す、バチルス サチリス１６３におけるアエロモナス遺伝子の発現を示す図である。ｐＵＢ−ＡＨ＝Ａ．ヒドロフィラ遺伝子を含む構築体、及びｐＵＢ−ＡＳ、Ａ．サルモニシダ遺伝子を有する構築体、培養ろ液は、基質とともに６０分間インキュベートされた。
【図４５】脂肪酸及びコレステロールエステルを時間の関数として示すグラフである。グラフは、緩衝剤中のレシチン及びコレステロールを基質として用いた食料品中のアシルトランスフェラーゼ活性を測定するためのアッセイにおいて、ＧＬＣ分析で得られた結果を示す。
【図４６】脂肪酸及びコレステロールエステルを時間の関数として示すグラフである。グラフは、緩衝剤中のレシチン及びコレステロールを基質として用いた食料品中のアシルトランスフェラーゼ活性を測定するためのアッセイにおいて、ＧＬＣ分析で得られた結果を示す。
【図４７】実施例１７においてアエロモナス ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異誘発に使用された融合構築体のアミノ酸配列（配列番号３６）を示す図である。下線を引いたアミノ酸は、キシラナーゼシグナルペプチドである。
【図４８】キシラナーゼシグナルペプチドを含むアエロモナス ヒドロフィラ由来の酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す図である。
【図４９】アミノ酸のタンパク質−脂肪酸縮合物の構造を示す図である。
【図５０】エステル化に利用可能な遊離ヒドロキシル基を有するアミノ酸、例えばチロシン又はセリンの遊離ヒドロキシル基に転移するときのホスファチジルコリン由来の脂肪酸との反応を模式的に示す図である。
【図５１】脂質アシルトランスフェラーゼによって触媒されたときのＤＧＤＧとグルコースの反応を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【配列表】
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