(57)【要約】【課題】β−１，３−キシラナーゼを大量かつ容易に製造し、その利用法を提供する。【解決手段】Thermotoga neapolitana DSM4359由来またはVibrio sp. AX-4由来のβ−１，３−キシラナーゼに対して、特定のシグナル配列を連結する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、以下の（ｄ）〜（ｆ）の何れかのポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１１または１３に示すアミノ酸配列からなる酵素領域と、配列番号１５、１７、１９または２１に示すアミノ酸配列からなるシグナル配列とを有するタンパク質。
（ｂ）上記（ａ）のタンパク質において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ）酵素領域をコードする配列番号１０または１２に示す塩基配列と、シグナル配列をコードする配列番号１４、１６、１８または２０に示す塩基配列とを有するポリヌクレオチド。
（ｅ）上記（ｄ）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｆ）上記（ｄ）のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１０または１２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１１または１３に示すアミノ酸配列からなる酵素領域と、配列番号１５、１７、１９または２１に示すアミノ酸配列からなるシグナル配列とを有するタンパク質。
（ｂ）上記（ａ）のタンパク質において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載のポリヌクレオチド、または、請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
上記形質転換体が、アスペルギルスオリザ、アスペルギルスソーヤ、アスペルギルスジャポニカス、アスペルギルスカワチ、アスペルギルスアワモリ、アスペルギルスウサミ、アスペルギルスシロウサミ、アスペルギルスサイトイ、アスペルギルスグラウカス、アスペルギルスニガー、アスペルギルスニードランス、アスペルギルステレウス、アスペルギルスフラバス、およびアスペルギルスフミガタスからなる群より選択される少なくとも一つである請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換体を用いるβ−１，３−キシラナーゼの製造方法。
【請求項８】
請求項５または６に記載の形質転換体の培養産物を用いるキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項９】
上記培養産物は、培養上清である請求項８に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−１，３−キシラナーゼおよびその利用に関し、特に、Thermotoga neapolitana DSM4359またはVibrio sp. AX-4由来のβ−１，３−キシラナーゼ、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−１，３−キシラナーゼは、β−１，３−キシランを加水分解する酵素で、β−１，３−キシロオリゴ糖を生成する酵素である。近年、これらのβ−１，３−キシロオリゴ糖が癌細胞のアポトーシス誘導活性を有することが明らかになり、これらβ−１，３−キシロオリゴ糖を作製するための手段としてのβ−１，３−キシラナーゼに対して注目が集まりつつある。
【０００３】
上述したβ−１，３−キシロオリゴ糖を製造するためにはβ−１，３−キシラナーゼを大量に入手する必要があるが、β−１，３−キシラナーゼを発現する生物は、自然界において僅かの種類しか知られていない。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ビブリオ  アルギノリティクスＢ−１０７（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ  Ｂ−１０７）由来のβ−１，３−キシラナーゼが、特許文献２には、アルカリゲネス属菌株ＸＹ−２３４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＸＹ−２３４）由来のβ−１，３−キシラナーゼが、特許文献３には、ビブリオ属菌株ＡＸ−４由来のβ−１，３−キシラナーゼが記載されている。そして、これらの特許文献では、各微生物の培養産物から分離・採取したβ−１，３−キシラナーゼを用いて、β−１，３−キシランを分解することが記載されている。
【０００５】
しかしながら、これらの技術において、培養産物から得られるβ−１，３−キシラナーゼの量は僅かであって、工業的にβ−１，３−キシラナーゼを利用するためには不十分な量であった。
【０００６】
そこで、当該問題を解決するために、β−１，３−キシラナーゼを大腸菌の形質転換体によって大量発現させようとする試みがなされた。
【０００７】
例えば、特許文献４には、ビブリオ属菌株ＸＹ−２１４からβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子をクローニングして当該遺伝子を大腸菌に導入し、得られた大腸菌の形質転換体を用いてβ−１，３−キシラナーゼを製造する技術が記載されている。また、非特許文献１には、Vibrio sp. AX-4からβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子をクローニングして当該遺伝子を大腸菌に導入し、得られた大腸菌の形質転換体を用いてβ−１，３−キシラナーゼを製造する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０００−１５７２６２号公報（２０００年６月１３日公開）
【特許文献２】特開平１０−２９５３７２号公報（１９９８年１１月１０日公開）
【特許文献３】特開２００１−８６９９９号公報（２００１年４月３日公開）
【特許文献４】特開２００１−２７５６８０号公報（２００１年１０月９日公開）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Masashi Kiyohara et al., Biochem J., (2005), 388, p949-957
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、大腸菌を用いてβ−１，３−キシラナーゼを強制発現させる場合には、（１）大腸菌の菌体内に蓄積されたβ−１，３−キシラナーゼを精製する工程が必要である、（２）β−１，３−キシラナーゼの発現量が不十分である、（３）組換え生産させたβ−１，３−キシラナーゼが大腸菌内で封入体を形成し、可溶化酵素の収量が極めて低い、（４）封入体の活性化が工業的に困難である、などの多くの問題点を有している。
【００１１】
また、β−１，３−キシラナーゼは、特殊な細菌からしか見出されておらず、真核生物由来の細胞で発現・分泌することは困難であることが予測される。
【００１２】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、β−１，３−キシラナーゼを組換えにより分泌生産させることで、大量、安価かつ容易に製造し、その利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、β−１，３−キシラナーゼに特定のシグナル配列を連結させることによって、大量のβ−１，３−キシラナーゼを糸状菌（例えば、麹菌（例えば、アスペルギルスオリザなど））などを宿主として発現・分泌させることが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、上記課題を解決するために、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、以下の（ｄ）〜（ｆ）の何れかのポリヌクレオチドであることを特徴としている。つまり、
（ａ）配列番号１１または１３に示すアミノ酸配列からなる酵素領域と、配列番号１５、１７、１９または２１に示すアミノ酸配列からなるシグナル配列とを有するタンパク質；
（ｂ）上記（ａ）のタンパク質において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）上記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）酵素領域をコードする配列番号１０または１２に示す塩基配列と、シグナル配列をコードする配列番号１４、１６、１８または２０に示す塩基配列とを有するポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ｄ）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）上記（ｄ）のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドは、上記課題を解決するために、配列番号１０または１２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドであることを特徴としている。
【００１６】
本発明のタンパク質は、上記課題を解決するために、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質であることを特徴としている。つまり、
（ａ）配列番号１１または１３に示すアミノ酸配列からなる酵素領域と、配列番号１５、１７、１９または２１に示すアミノ酸配列からなるシグナル配列とを有するタンパク質；
（ｂ）上記（ａ）のタンパク質において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）上記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１７】
本発明の形質転換体は、上記課題を解決するために、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明の組換えベクターを含むことを特徴としている。
【００１８】
本発明の形質転換体は糸状菌であればよく、例えば、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、ノイロスポラ属、リゾプス属、ムコール属、モナスカス属、リゾムコール属、モルチエラ属、セファロスポリウム属であることが好ましい。アスペルギルス属としては、例えば、アスペルギルスオリザ、アスペルギルスソーヤ、アスペルギルスジャポニカス、アスペルギルスカワチ、アスペルギルスアワモリ、アスペルギルスウサミ、アスペルギルスシロウサミ、アスペルギルスサイトイ、アスペルギルスグラウカス、アスペルギルスニガー、アスペルギルスニードランス、アスペルギルステレウス、アスペルギルスフラバス、または、アスペルギルスフミガタスであることが好ましい。
【００１９】
本発明のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を用いることを特徴としている。
【００２０】
本発明のキシロオリゴ糖の製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体の培養産物を用いることを特徴としている。
【００２１】
本発明のキシロオリゴ糖の製造方法では、上記培養産物は、培養上清であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明であれば、発現させたβ−１，３−キシラナーゼを、菌体外へ「数ｇ／Ｌ−培地」レベルで大量に分泌することができる。
【００２３】
また、β−１，３−キシラナーゼは菌体外へ分泌されるので、β−１，３−キシラナーゼを精製する工程を低コスト化、簡略化または省略することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を麹菌にて発現させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２】Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を麹菌にて発現させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図３】Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【図４】Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【図５】Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【図６】Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による、β−１，３−キシランの分解産物の経時変化を示す。
【図７】大腸菌用の発現ベクターの構造を示す模式図である。
【図８】大腸菌にて発現させたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【図９】ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの至適温度の検討結果を示すグラフである。
【図１０】ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの温度安定性の検討結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また、明細書中で「Ａ〜Ｂ」と記載されていれば「Ａ以上、Ｂ以下」を意図し、本明細書中で「および／または」と記載されていれば、いずれか一方または両方を意図する。
【００２６】
〔１．ポリヌクレオチド〕
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
【００２７】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、以下の（ｄ）〜（ｆ）の何れかのポリヌクレオチドである。つまり、
（ａ）配列番号１１または１３に示すアミノ酸配列からなる酵素領域と、配列番号１５、１７、１９または２１に示すアミノ酸配列からなるシグナル配列とを有するタンパク質；
（ｂ）上記（ａ）のタンパク質において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）上記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）酵素領域をコードする配列番号１０または１２に示す塩基配列と、シグナル配列をコードする配列番号１４、１６、１８または２０に示す塩基配列とを有するポリヌクレオチド；
（ｅ）上記（ｄ）のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）上記（ｄ）のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２８】
また、本実施の形態のポリヌクレオチドは、配列番号１０または１２に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００２９】
配列番号１０に示す塩基配列とは、コドンが改変されたThermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子の塩基配列である。配列番号１０のようにコドンを改変することによって、麹菌内におけるポリヌクレオチドの発現量を上昇させることができる。また、配列番号１１に示すアミノ酸配列とは、配列番号１０に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列である。つまり、配列番号１０および１１は、プロセッシングが生じてシグナル配列が除去された後の、Thermotoga neapolitana DSM4359由来の成熟型β−１，３−キシラナーゼに対応するものである。
【００３０】
配列番号１２に示す塩基配列とは、コドンが改変されたVibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子の塩基配列である。配列番号１２のようにコドンを改変することによって、麹菌内におけるポリヌクレオチドの発現量を上昇させることができる。また、配列番号１３に示すアミノ酸配列とは、配列番号１２に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列である。つまり、配列番号１２および１３は、プロセッシングが生じてシグナル配列が除去された後の、Vibrio sp. AX-4由来の成熟型β−１，３−キシラナーゼに対応するものである。
【００３１】
配列番号１４〜配列番号２１はシグナル配列に対応する塩基配列またはアミノ酸配列であって、当該シグナル配列が存在するが故に、成熟型β−１，３−キシラナーゼタンパク質は菌体外へ分泌され得る。
【００３２】
本実施の形態のポリヌクレオチドでは、例えば、ａｍｙＢシグナル配列（amyB signal sequence）、ｇｌａＢシグナル配列（glaB signal sequence）、ｃｅｌＡシグナル配列（celA signal sequence）、または、ｃｅｌＢシグナル配列（celB signal sequence）を用いることが好ましい。具体的には、ａｍｙＢシグナル配列の塩基配列が配列番号１４に示され、そのアミノ酸配列が配列番号１５に示される。ｇｌａＢシグナル配列の塩基配列が配列番号１６に示され、そのアミノ酸配列が配列番号１７に示される。ｃｅｌＡシグナル配列の塩基配列が配列番号１８に示され、そのアミノ酸配列が配列番号１９に示される。ｃｅｌＢシグナル配列の塩基配列が配列番号２０に示され、そのアミノ酸配列が配列番号２１に示される。
【００３３】
上述したように、本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００３４】
この場合、本実施の形態のポリヌクレオチドは（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質をコードしていればよく、具体的なコドンは特に限定されない。よって、（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のアミノ酸配列をコードする全てのポリヌクレオチドが本発明に含まれる。
【００３５】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ａ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含するが、酵素領域とシグナル配列とは、直接連結されていてもよく間接的に連結されていてもよい。つまり、つまり、酵素領域とシグナル配列との間には他のアミノ酸（例えば、リンカーなど）が存在していてもよい。当該他のアミノ酸の種類および数としては特に限定されない。成熟型のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の構造を野生型に保つという観点からは、酵素領域とシグナル配列とは、直接連結される方が好ましいといえる。
【００３６】
タンパク質中における酵素領域とシグナル配列との位置関係は特に限定されず、何れがＮ末端側に配置されてもよい。成熟型のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を効率的に菌体外へ分泌するという観点からは、酵素領域のＮ末端側にシグナル配列が配置されることが好ましい。
【００３７】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ｂ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含するが、このとき、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸のタンパク質内における位置は特に限定されない。また、「１個若しくは数個」とは、具体的には１０個以内であることが好ましく、６個以内であることが更に好ましい。
【００３８】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ｃ）に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含するが、当該ポリヌクレオチドは、（ａ）に記載のタンパク質と相同性の高いタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。具体的には、本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ａ）に記載のタンパク質と７０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするものであることが好ましく、８０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするものであることが更に好ましく、９０％以上の相同性を有するタンパク質をコードするものであることが更に好ましく、９５％以上の相同性を有するタンパク質をコードするものであることが最も好ましい。
【００３９】
アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的にはＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を用いて、一致するアミノ酸配列の割合（％）として相同性を算出することが可能である。アミノ酸配列の相同性は、比較するアミノ酸配列同士を最適な状態にアラインメントした上で決定することが可能である。つまり、比較するアミノ酸配列同士を最適な状態にアラインメントするために、アミノ酸の付加または欠失（例えば、ギャップ等）を考慮することが可能である。
【００４０】
また、上述したように、本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ｄ）〜（ｆ）の何れかのポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００４１】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ｄ）のポリヌクレオチドを包含するが、酵素領域とシグナル配列とは、直接連結されていてもよく間接的に連結されていてもよい。つまり、つまり、酵素領域をコードする塩基配列とシグナル配列をコードする塩基配列との間には他の塩基配列（例えば、リンカーなど）が存在していてもよい。当該他の塩基配列の種類および塩基数としては特に限定されない。成熟型のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の構造を野生型に保つという観点からは、酵素領域をコードする塩基配列とシグナル配列をコードする塩基配列とは、直接連結される方が好ましいといえる。
【００４２】
本実施の形態のポリヌクレオチド中における酵素領域をコードする塩基配列とシグナル配列をコードする塩基配列との位置関係は特に限定されず、何れが５’末端側に配置されてもよい。成熟型のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を効率的に菌体外へ分泌するという観点からは、酵素領域をコードする塩基配列の５’末端側にシグナル配列をコードする塩基配列が配置されることが好ましい。
【００４３】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ｅ）のポリヌクレオチドを包含する。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。更に具体的には、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
【００４４】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ｆ）のポリヌクレオチドを包含するが、当該ポリヌクレオチドは、（ｄ）に記載のポリヌクレオチドと相同性の高いポリヌクレオチドであることが好ましい。具体的には、本実施の形態のポリヌクレオチドは、（ｄ）に記載のポリヌクレオチドと７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであることが好ましく、８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであることが更に好ましく、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであることが更に好ましく、９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであることが最も好ましい。
【００４５】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、上述したポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが連結されていてもよい。その他のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとしては特に限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）タグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）をコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。これらのヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが連結される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端側であっても、Ｃ末端側でもあってもよい。シグナル配列が切断・除去されるという観点からは、シグナル配列とは反対側に連結されることが好ましい。
【００４６】
本実施の形態のポリヌクレオチドは、周知の方法に基づいて作製することが可能である。例えば、化学合成法またはＰＣＲ法などによって作製することが可能である。コドンの改変に関しても、適宜周知の方法に基づいて行うことが可能である。例えば、市販のキット（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績製）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）など）を用いてコドンを改変することが可能である。なお、これらの方法の詳細は、当業者にとって周知である。
【００４７】
タンパク質がβ−１，３−キシラナーゼ活性を有するか否かは、in silico解析では予測できず、タンパク質を取得して適宜公知の方法によって活性を測定することによって確認することが可能である。例えば、タンパク質とβ−１、３−キシランとを混合して反応させ、反応産物中にβ−１，３−キシランの分解産物であるβ−１、３−キシロオリゴ糖が生成されているか否かを薄層クロマトグラフィーで検出することによって、確認することが可能である。なお、当該確認方法の詳細に関しては、実施例中に説明した。
【００４８】
〔２．タンパク質〕
本実施の形態のタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに記載のタンパク質である。つまり、
（ａ）配列番号１１または１３に示すアミノ酸配列からなる酵素領域と、配列番号１５、１７、１９または２１に示すアミノ酸配列からなるシグナル配列とを有するタンパク質；
（ｂ）上記（ａ）のタンパク質において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）上記（ａ）のタンパク質と７０％以上の相同性を有し、かつ、β−１，３−キシラナーゼ活性を有するタンパク質。
【００４９】
各配列番号が意図するところは、既に〔１．ポリヌクレオチド〕にて説明したので、ここでは説明を省略する。
【００５０】
本実施の形態のタンパク質は、（ａ）に記載のタンパク質を包含するが、酵素領域とシグナル配列とは、直接連結されていてもよく間接的に連結されていてもよい。つまり、つまり、酵素領域とシグナル配列との間には他のアミノ酸（例えば、リンカーなど）が存在していてもよい。当該他のアミノ酸の種類および数としては特に限定されない。成熟型のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の構造を野生型に保つという観点からは、酵素領域とシグナル配列とは、直接連結される方が好ましいといえる。
【００５１】
タンパク質中における酵素領域とシグナル配列との位置関係は特に限定されず、何れがＮ末端側に配置されてもよい。成熟型のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を効率的に菌体外へ分泌するという観点からは、酵素領域のＮ末端側にシグナル配列が配置されることが好ましい。
【００５２】
本実施の形態のタンパク質は、（ｂ）に記載のタンパク質を包含するが、このとき、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸のタンパク質内における位置は特に限定されない。また、「１個若しくは数個」とは、具体的には１０個以内であることが好ましく、６個以内であることが更に好ましい。
【００５３】
本実施の形態のタンパク質は、（ｃ）に記載のタンパク質を包含するが、このとき、（ａ）に記載のタンパク質との相同性が高いことが好ましい。具体的には、本実施の形態のタンパク質は、（ａ）に記載のタンパク質と７０％以上の相同性を有することが好ましく、８０％以上の相同性を有することが更に好ましく、９０％以上の相同性を有することが更に好ましく、９５％以上の相同性を有することが最も好ましい。
【００５４】
アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的にはＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を用いて、一致するアミノ酸配列の割合（％）として相同性を算出することが可能である。アミノ酸配列の相同性は、比較するアミノ酸配列同士を最適な状態にアラインメントした上で決定することが可能である。つまり、比較するアミノ酸配列同士を最適な状態にアラインメントするために、アミノ酸の付加または欠失（例えば、ギャップ等）を考慮することが可能である。
【００５５】
本実施の形態のタンパク質は、上述したタンパク質のみからなるものであってもよいが、その他のアミノ酸またはタンパク質が連結されていてもよい。その他のアミノ酸またはタンパク質としては特に限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）などが挙げられる。これらのアミノ酸またはタンパク質が連結される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端側であっても、Ｃ末端側でもあってもよい。シグナル配列が切断・除去されるという観点からは、シグナル配列とは反対側に連結されることが好ましい。
【００５６】
〔３．組換えベクター〕
本実施の形態の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含有するものである。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドに関しては既に説明したので、ここでは説明を省略する。
【００５８】
本実施の形態の組換えベクターを構成するベースとなるベクターとしては特に限定されない。例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、アデノウイルスまたはレトロウイルスなどを使用することが可能であるが、これらに限定されない。
【００５９】
宿主として麹菌を用いることを考慮すれば、ベクターとしてプラスミドを用いることが好ましく、本来、大腸菌用のベクターとして開発されたｐＵＣ１１９（宝ホールディングス社製）をシャトルベクターに改変して用いることが更に好ましいといえる。また、公知のコトランスフォーメーション用のベクターも用いることができる。
【００６０】
本実施の形態の組換えベクターは、導入される宿主に応じた、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）および選択マーカーを含有することが好ましい。
【００６１】
プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）、または、麹菌由来のｓｏｄＭプロモーターなどを用いることが可能であるが、これらに限定されない。麹菌内で所望のタンパク質を大量に発現させるという観点からは、ｓｏｄＭ、ヘモリシン遺伝子、melO、melB、pepA、xynG1、xynG2、xynF1、No.8AN、No.9AO、histone H2A、agdA、glaA、amyB、TEF1、pgkA、eno1、glaB、catA、catB、glaB、cruciform binding protein遺伝子、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子、または、small V-ATPase遺伝子のプロモーターを用いることが更に好ましいといえる。また、これらのプロモーター内のシス因子を増幅した改良プロモーター、および、これらのプロモーターと、異種プロモーター内のシス因子とを融合させた改良プロモーターを用いることも可能である。
【００６２】
ターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、または、麹菌由来のｇｌａＢターミネーターなどを用いることが可能であるが、これらに限定されない。麹菌内で効率よく転写を終結させるという観点からは、ｇｌａＢ、amyA、amyB、またはglaAのターミネーターを用いることが更に好ましいといえる。
【００６３】
選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、または、麹菌（例えば、アスペルギルスオリザなど）由来の硝酸還元酵素遺伝子（例えば、ｎｉａＤなど）などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。形質転換された麹菌を正確に選択するという観点からは、硝酸還元酵素遺伝子（例えば、ｎｉａＤなど）、sC、argB、pyrG、amdS、trpC、ptrA、met、hisA、leuA、leuB、benA、oliC、G418耐性遺伝子、hygromycin耐性遺伝子、Phleomycin耐性遺伝子、または、Bleomycin耐性遺伝子を用いることが更に好ましいといえる。
【００６４】
〔４．形質転換体〕
本実施の形態の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の組換えベクターを含むものである。換言すれば、本実施の形態の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の組換えベクターが導入されたものである。本発明のポリヌクレオチドおよび本発明の組換えベクターに関しては既に説明したので、ここでは説明を省略する。
【００６５】
本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクターが導入される宿主としては特に限定されず、例えば、大腸菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなど）Bacillus属、Brevibacillus属、酵母（例えば、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Candida属酵母、Pichia属などを含むメタノール資化性酵母など）、昆虫細胞、線虫（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓなど）、アフリカツメガエル（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓなど）の卵母細胞、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）、各種ヒト培養細胞、または、麹菌（例えば、アスペルギルスオリザ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルスソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルスカワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルスアワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルスサイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルスグラウカス（Aspergillus glaucus）、アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルスニードランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルスジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルスウサミ（Aspergillus usamii）、アスペルギルスシロウサミ（Aspergillus shirousamii）、アスペルギルステレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルスフラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルスフミガタス（Aspergillus fumigatus）など）などを用いることが可能である。β−１，３−キシラナーゼタンパク質を菌体外へ分泌された状態で大量に製造するという観点からは、宿主として麹菌を用いることが好ましく、麹菌の中でもアスペルギルスオリザ、アスペルギルスソーヤ、アスペルギルスアワモリ、またはアスペルギルスニガーを用いることが更に好ましく、アスペルギルスオリザを用いることが最も好ましい。なお、本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」には、細胞、組織および器官だけでなく、生物個体も含まれる。
【００６６】
上述した宿主に対して本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクターを導入する方法は特に限定されず、適宜公知の方法に従えばよい。例えば、電気穿孔法、アグロバクテリア法、パーティクルガン法、リチウムクロライド法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、または、ＰＥＧ−カルシウム法などの公知の方法を好適に用いることができる。なお、これらの方法の詳細は、当業者に周知である。
【００６７】
〔５．β−１，３−キシラナーゼタンパク質の製造方法〕
本実施の形態のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の製造方法は、本発明の形質転換体を用いる方法である。本発明の形質転換体に関しては既に説明したので、ここでは説明を省略する。
【００６８】
具体的には、本実施の形態のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の製造方法は、少なくとも、本発明の形質転換体を培養するための培養工程を有することが好ましい。また、本実施の形態のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の製造方法は、上記培養工程以外に、当該培養工程にて生じた培養産物（固体および液体の混合物）から培養上清（液体）を回収するための回収工程、および／または、培養産物または培養上清を加熱するための加熱工程を有することが更に好ましい。
【００６９】
回収工程および加熱工程は培養工程の後で行われる工程であって、これらの工程の一方のみを行う場合には、「培養工程→回収工程」または「培養工程→加熱工程」の順番で各工程を行えばよい。これらの工程の両方を行う場合には、何れを先に行っても良い。つまり、「培養工程→回収工程→加熱工程」の順番で行うことも可能であるし、「培養工程→加熱工程→回収工程」の順番で行うことも可能である。以下に、各工程について説明する。
【００７０】
（Ａ．培養工程）
培養工程では、本発明の形質転換体が培養される。そして、培養工程において、β−１，３−キシラナーゼタンパク質が発現するとともに、当該タンパク質が形質転換体の菌体外へ分泌される。
【００７１】
具体的な培養方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることが可能である。例えば、液体培養法または固体培養法などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。より多くのβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を製造するという観点からは、液体培養法を用いることが好ましい。
【００７２】
培養工程で用いられる培地の栄養源としては、通常の培養に用いられる栄養源を用いることが可能である。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、またはピルビン酸などを使用することが可能であるが、これらに限定されない。窒素源としては資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、または大豆粕アルカリ抽出物などが使用されるが、これらに限定されない。上記栄養源に加えて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを培地に加えることも可能である。
【００７３】
培養される形質転換体が麹菌である場合には、培地としてＧＰＹ培地またはＣＳＬ培地を用いることが好ましく、ＣＳＬ培地を用いることが更に好ましい。実施例において明示しているように、ＣＳＬ培地を用いれば、ＧＰＹ培地を用いる場合と比較して、約１０倍量のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を製造することができる。
【００７４】
培養工程によって、β−１，３−キシラナーゼタンパク質と形質転換体の菌体とが混在した培養産物を得ることができる。このとき、当該β−１，３−キシラナーゼタンパク質は菌体外へ分泌されているので、培養産物とβ−１，３−キシランを混合するだけで、β−１，３−キシランを分解することができる。
【００７５】
（Ｂ．回収工程）
上述した培養工程にて得られる培養産物は、β−１，３−キシラナーゼタンパク質と形質転換体の菌体とを含んでいる。このとき、β−１，３−キシラナーゼタンパク質は、菌体外へ分泌されて培地中に存在している。したがって、培養産物から菌体を除去して培養上清を得れば、より純度の高いβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を得ることが可能となる。
【００７６】
回収工程は菌体と培養上清とを分離できる工程であればよく、具体的な方法は特に限定されない。例えば、遠心分離法またはフィルター濾過法などを用いることが可能であるが、これらに限定されない。
【００７７】
（Ｃ．加熱工程）
本発明に用いているThermotoga neapolitana DSM4359は超好熱性細菌であって、至適生育温度は、８０℃〜９０℃である。そして、当該細菌に由来するタンパク質は耐熱性が高く、加熱しても失活し難いという利点を有している。
【００７８】
加熱工程では、培養産物または培養上清を加熱することによって、β−１，３−キシラナーゼタンパク質以外のタンパク質を失活させる。つまり、加熱工程を行うことによって、培養産物または培養上清から、不必要な酵素の活性を除去することができる。
【００７９】
加熱工程は、培養産物または培養上清を加熱することができる工程であればよく、その具体的な構成は特に限定されない。
【００８０】
加熱温度は特に限定されないが、例えば、６０℃〜８５℃が好ましく、７０℃〜８５℃が更に好ましく、８０℃〜８５℃が最も好ましい。加熱時間は特に限定されないが、例えば、０．５時間〜２０時間が好ましく、０．５時間〜５時間が更に好ましく、０．５時間〜１時間が最も好ましい。上記構成であれば、β−１，３−キシラナーゼタンパク質を失活させること無く、他の酵素を確実に失活させることができる。
【００８１】
〔６．キシロオリゴ糖の製造方法〕
本実施の形態のキシロオリゴ糖（より具体的には、β−１，３−キシロオリゴ糖）の製造方法は、本発明の形質転換体の培養産物を用いる方法である。更に好ましくは、上記培養産物として培養上清を用いる。
【００８２】
上述したように、本発明の形質転換体の培養産物および培養上清は、β−１，３−キシラナーゼタンパク質を含んでいる。したがって、当該β−１，３−キシラナーゼタンパク質を用いてβ−１，３−キシランを分解することによって、様々な重合度のβ−１，３−キシロオリゴ糖を製造することができる。
【００８３】
製造されるβ−１，３−キシロオリゴ糖には、β−１，３−キシランの分解によって生じる全てのβ−１，３−キシロオリゴ糖が含まれる。例えば、キシロビオース（２糖類）、キシロトリオース（３糖類）、キシロテトラオース（４糖類）、キシロペンタオース（５糖類）およびキシロヘキサオース（６糖類）などを製造することができるが、これらに限定されない。勿論、本実施の形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、キシロース（１糖類）も製造することができる。
【００８４】
後述する実施例（例えば、図６参照）から明らかなように、本実施の形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、２糖類および３糖類の生産性が高く、３糖類の生産性が最も高い。したがって、本実施の形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、２糖類および３糖類の製造方法として利用することが好ましく、３糖類の製造方法として利用することが更に好ましいといえる。
【００８５】
本実施の形態のキシロオリゴ糖の製造方法は、本発明の形質転換体の培養産物中に含まれるβ−１，３−キシラナーゼタンパク質によってβ−１，３−キシランを分解するので、培養産物または培養上清と、β−１，３−キシランとを反応させる反応工程を有することが好ましい。
【００８６】
反応工程に用いる培養産物または培養上清の製造方法は特に限定されないが、例えば、上述した培養工程を有する方法によって製造されることが好ましく、追加工程として回収工程および／または加熱工程を有する方法によって製造されることが更に好ましいといえる。培養工程、回収工程および加熱工程に関しては既に説明したので、ここでは説明を省略する。
【００８７】
反応工程に用いられるβ−１，３−キシランの供給源は特に限定されないが、藻類の細胞壁中には多量のβ−１，３−キシランが含有されているので、供給源として藻類を用いることが好ましい。β−１，３−キシランの供給源として藻類を用いる場合には、細胞壁からβ−１，３−キシランを抽出するために、藻類を熱水処理（例えば、１００℃にて１時間の煮沸）することが好ましい。熱水処理を行うタイミングは特に限定されないが、例えば、上述した加熱工程にて行うことが好ましい。当該構成によれば、β−１，３−キシロオリゴ糖を製造するための工程を簡略化することができる。
【００８８】
加熱工程において同時に藻類の熱水処理を行う場合には、「培養工程→加熱工程→回収工程」の順番で各工程を行うことが好ましい。上記構成によれば、回収工程において形質転換体および藻類の両方を除去できるので、不純物が除去された形態のβ−１，３−キシロオリゴ糖を製造することができる。
【００８９】
製造されたβ−１，３−キシロオリゴ糖の用途としては特に限定されないが、例えば、癌細胞のアポトーシス誘導剤として用いることが可能である。
【実施例】
【００９０】
＜１．麹菌用発現プラスミドの作製＞
＜１−１．ｎｉａＤ遺伝子の大腸菌ベクターへの組み込み＞
麹菌アスペルギルスオリザ由来の硝酸還元酵素遺伝子ｎｉａＤ（配列番号１）の末端に制限酵素認識部位（ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）を導入するために、プライマーＡ、プライマーＢ、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）および鋳型としての麹菌ゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
【００９１】
ＰＣＲ反応は、９６℃（５分間）の変性反応を１サイクル行った後、９６℃（２０秒間）の変性反応、６０℃（３０秒間）のアニーリング反応および７２℃（５分間）の伸長反応からなる反応サイクルを３０サイクル行い、最後にＰＣＲ増幅産物を７２℃（７分間）にて保持するというものであった。
【００９２】
・プライマーＡ：5’-aactgcagaacaggccccaaattcaattaattgca-3’  （配列番号２）
・プライマーＢ：5’-cccaagctttggatttcctacgtcttcaatacaaacc-3’（配列番号３）
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃にて処理した後、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。その後、アガロースゲルから、ｎｉａＤ遺伝子を切り出した。ｎｉａＤ遺伝子の切り出しには、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、具体的な方法は、当該キットに貼付のプロトコールに従った。
【００９３】
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）を用いて、ｎｉａＤ遺伝子を大腸菌プラスミドｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）に挿入した。当該大腸菌プラスミドｐＵＣ１１９を用いて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００９４】
以上のようにして、ｎｉａＤ遺伝子がｐＵＣ１１９内に挿入されたプラスミドｐＮＩＡ２を得た。プラスミドｐＮＩＡ２は、制限酵素認識部位（ＰｓｔＩおよびＳａｌＩ）を用いて、当該プラスミド内に目的の遺伝子を挿入することができる。
【００９５】
＜１−２．ｇｌａＢターミネーターのｐＮＩＡ２への組み込み＞
麹菌由来のｇｌａＢターミネーター（配列番号４）のｐＮＩＡ２への挿入方法を以下に説明する。
【００９６】
ｇｌａＢターミネーターの末端に制限酵素認識部位（ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ）を導入するために、プライマーＣ、プライマーＤ、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）および鋳型としての麹菌ゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
【００９７】
ＰＣＲ反応は、９６℃（５分間）の変性反応を１サイクル行った後、９６℃（２０秒間）の変性反応、６０℃（３０秒間）のアニーリング反応および７２℃（５分間）の伸長反応からなる反応サイクルを３０サイクル行い、最後にＰＣＲ増幅産物を７２℃（７分間）にて保持するというものであった。
【００９８】
・プライマーＣ：5’-acgcgtcgacatgtactttccagtgcgtgtagtctactctg-3’（配列番号５）
・プライマーＤ：5’-acgcctcgagctgcagatcggctgaagttaggagcggccattgtc-3’（配列番号６）
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳａｌＩおよびＸｈｏＩを用いて３７℃で処理した後、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。その後、アガロースゲルから、ｇｌａＢターミネーターを切り出した。ｇｌａＢターミネーターの切り出しには、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、具体的な方法は、当該キットに貼付のプロトコールに従った。
【００９９】
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）を用いて、ｇｌａＢターミネーターをｐＮＩＡ２の制限酵素認識部位（ＳａｌＩ）に挿入した。当該ｐＮＩＡ２を用いて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を形質転換した。
【０１００】
以上のようにして、ｇｌａＢターミネーターがｐＮＩＡ２内に挿入されたプラスミドｐＮＩＡＴを得た。プラスミドｐＮＩＡＴは、制限酵素認識部位（ＰｓｔＩおよびＳａｌＩ）を用いて、当該プラスミド内に目的の遺伝子を挿入することができる。
【０１０１】
＜１−３．ｓｏｄＭプロモーターのｐＮＩＡＴへの組み込み＞
麹菌由来のｓｏｄＭプロモーター（配列番号７）のｐＮＩＡＴへの挿入方法を以下に説明する。
【０１０２】
ｓｏｄＭプロモーターの末端に制限酵素認識部位（ＳａｌＩおよびＰｓｔＩ）を導入するために、プライマーＥ、プライマーＦ、ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）および鋳型としての麹菌ゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
【０１０３】
ＰＣＲ反応は、９６℃（５分間）の変性反応を１サイクル行った後、９６℃（２０秒間）の変性反応、６０℃（３０秒間）のアニーリング反応および７２℃（５分間）の伸長反応からなる反応サイクルを３０サイクル行い、最後にＰＣＲ増幅産物を７２℃（７分間）にて保持するというものであった。
【０１０４】
・プライマーＥ：5’-aactgcagctgcagttatgtactccgtactcggttgaattattaatc-3’（配列番号８）
・プライマーＦ：5’-acgcgtcgactttgggtggtttggttggtattctggttgagggttttgag-3’（配列番号９）
得られたＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳａｌＩおよびＰｓｔＩを用いて３７℃で処理した後、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。その後、アガロースゲルから、ｓｏｄＭプロモーターを切り出した。ｓｏｄＭプロモーターの切り出しには、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、具体的な方法は、当該キットに貼付のプロトコールに従った。
【０１０５】
ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）を用いて、ｓｏｄＭプロモーターをｐＮＩＡＴの制限酵素認識部位（ＰｓｔＩ−ＳａｌＩ間）に挿入した。当該ｐＮＩＡＴを用いて、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を形質転換した。
【０１０６】
以上のようにして、ｓｏｄプロモーターがｐＮＩＡＴ内にサブクローニングされたプラスミドｐＮＭＢを得た。プラスミドｐＮＭＢは、制限酵素認識部位（ＳａｌＩ）を用いて、当該プラスミド内に目的の遺伝子を挿入することができる。そして、ｐＮＭＢは、麹菌の中で、制限酵素認識部位（ＳａｌＩ）内に挿入された遺伝子を大量に発現させることができる。
【０１０７】
＜２．ｐＮＭＢへのβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子の挿入＞
＜２−１．β−１，３−キシラナーゼ遺伝子のコドン改変＞
Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子、および、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋの情報に基づいて、周知のＰＣＲ法によって入手した。なお、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子は、Accession number：CP000916（REGION:617474..618514）として、また、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子は、Accession number：AB121027として、本願出願時にＧｅｎＢａｎｋに登録されていた。
【０１０８】
なお、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質が実際にβ−１，３−キシラナーゼ活性を有することは、本発明者によって初めて明らかにされたことである。
【０１０９】
Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子、および、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子は、ネイティブの塩基配列（コドン）では麹菌内での発現量が低い。そこで、麹菌内で発現可能なように、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子、および、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子のコドンを、試行錯誤しながら改変した。なお、改変したのはコドンであって、当該コドンに対応するアミノ酸配列は、ネイティブのままであった。
【０１１０】
コドンの改変は、公知手法を用いたタカラバイオ株式会社の人工合成遺伝子作成サービス（http://catalog.takara-bio.co.jp/jutaku/basic_info.asp?catcd=B1000482&subcatcd=B1000484&unitid=U100004083）により、シグナル配列を除いた成熟領域をコードする遺伝子領域のみに対して人工合成によって行った。
【０１１１】
配列番号１０に、コドンを改変したThermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子の塩基配列を示す。また、配列番号１１に、当該β−１，３−キシラナーゼ遺伝子のアミノ酸配列を示す。配列番号２２に、コドンを改変する前の上記遺伝子の塩基配列を示す。なお、配列番号１０および１１は、プロセッシングが生じて後述するシグナル配列が除去された後の、成熟型β−１，３−キシラナーゼに対応するものである。
【０１１２】
配列番号１２に、コドンを改変したVibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子の塩基配列を示す。また、配列番号１３に、当該β−１，３−キシラナーゼ遺伝子のアミノ酸配列を示す。配列番号２３に、コドンを改変する前の上記遺伝子の塩基配列を示す。なお、配列番号１２および１３は、プロセッシングが生じて後述するシグナル配列が除去された後の、成熟型β−１，３−キシラナーゼに対応するものである。
【０１１３】
上述したようにコドンを改変することによって、タンパク質の発現量が凡そ１００倍〜１０００倍増加した。
【０１１４】
＜２−２．β−１，３−キシラナーゼ遺伝子へのシグナル配列の付加＞
上述したThermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子（配列番号１０）、および、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子（配列番号１２）の各々の５’末端側に４種類のシグナル配列を連結した。
【０１１５】
シグナル配列としては、ａｍｙＢシグナル配列（amyB signal sequence）、ｇｌａＢシグナル配列（glaB signal sequence）、ｃｅｌＡシグナル配列（celA signal sequence）、または、ｃｅｌＢシグナル配列（celB signal sequence）を用いた。
【０１１６】
ａｍｙＢシグナル配列の塩基配列を配列番号１４に示し、アミノ酸配列を配列番号１５に示す。ｇｌａＢシグナル配列の塩基配列を配列番号１６に示し、アミノ酸配列を配列番号１７に示す。ｃｅｌＡシグナル配列の塩基配列を配列番号１８に示し、アミノ酸配列を配列番号１９に示す。ｃｅｌＢシグナル配列の塩基配列を配列番号２０に示し、アミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【０１１７】
配列番号１４、１６、１８、２０にて示されるＤＮＡ断片の各々を周知の方法にて全合成した。また、これらのＤＮＡ断片の各々に対する相補ＤＮＡ断片を周知の方法にて全合成した。上記ＤＮＡ断片の各々と、当該ＤＮＡ断片に対する相補ＤＮＡ断片とを混合して、２本鎖のＤＮＡ断片を作成した。
【０１１８】
市販のキット（宝ホールディングス製のMighty Cloning Kit（Blunt End））を用いて、２本鎖ＤＮＡ断片の各々を、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子（配列番号１０）、または、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子（配列番号１２）の５’末端側に直接連結した。
【０１１９】
つまり、配列番号１４と配列番号１０との融合遺伝子（配列番号１５と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号１６と配列番号１０との融合遺伝子（配列番号１７と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号１８と配列番号１０との融合遺伝子（配列番号１９と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号２０と配列番号１０との融合遺伝子（配列番号２１と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号１４と配列番号１２との融合遺伝子（配列番号１５と配列番号１３との融合タンパク質をコード）、配列番号１６と配列番号１２との融合遺伝子（配列番号１７と配列番号１３との融合タンパク質をコード）、配列番号１８と配列番号１２との融合遺伝子（配列番号１９と配列番号１３との融合タンパク質をコード）、配列番号２０と配列番号１２との融合遺伝子（配列番号２１と配列番号１３との融合タンパク質をコード）を作製した。
【０１２０】
また、コドン改変を行っていないThermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子（配列番号２２）、または、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子（配列番号２３）についても、同様に融合遺伝子を作成した。
【０１２１】
つまり、配列番号１４と配列番号２２との融合遺伝子（配列番号１５と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号１６と配列番号２２の融合遺伝子（配列番号１７と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号１８と配列番号２２との融合遺伝子（配列番号１９と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号２０と配列番号２２との融合遺伝子（配列番号２１と配列番号１１との融合タンパク質をコード）、配列番号１４と配列番号２３との融合遺伝子（配列番号１５と配列番号１３との融合タンパク質をコード）、配列番号１６と配列番号２３との融合遺伝子（配列番号１７と配列番号１３との融合タンパク質をコード）、配列番号１８と配列番号２３との融合遺伝子（配列番号１９と配列番号１３との融合タンパク質をコード）、配列番号２０と配列番号２３との融合遺伝子（配列番号２１と配列番号１３との融合タンパク質をコード）を作製した。
【０１２２】
＜２−３．発現プラスミドの作製＞
上述したｐＮＭＢを、制限酵素ＳａｌＩにて３７℃で処理した。次に、DNA Blunting Kit（宝ホールディングス製）を用いて、処理後のｐＮＭＢを平滑末端化させた。さらに、バクテリア由来アルカリホスファターゼ（宝ホールディングス製）を添加して、５０℃で３０分間反応させた。得られた反応産物をWizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ製）を用いて精製し、これをベクターとして用いた。
【０１２３】
TaKaRa BKL Kit（Blunting Kination Ligation Kit）（宝ホールディングス製）を用いて、上述した融合遺伝子をリン酸化し、これをインサートとした。TaKaRa BKL Kitのマニュアルに従って、上述のベクターとインサートとをライゲーションした。ライゲーション産物を用いて大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製し、融合遺伝子の読み枠がｓｏｄＭプロモーターと正方向になるように挿入されたプラスミドを、目的遺伝子の発現プラスミドとして用いた。
【０１２４】
＜３．麹菌の形質転換体の作製、および当該形質転換体の培養＞
周知のＰＥＧ−カルシウム法（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２１８，９９−１０４，（１９８９）参照）にしたがって、上記発現プラスミドを用いて、アスペルギルスオリザのｎｉａＤ変異株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１７７０７として寄託済み）を形質転換した。
【０１２５】
硝酸を単一窒素源とするツアペクドックス（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ）培地（２％グルコース、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００１％硫酸鉄、０．３％硝酸ナトリウム）で生育できる株を選択することにより、発現プラスミドを保持する形質転換体を得た。
【０１２６】
上記形質転換体をポテトデキストロース培地中で胞子形成させ、当該胞子を回収した。５００ｍＬの三角フラスコに入った１００ｍＬ  ＧＰＹ液体培地（２％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．０５％塩化カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．００１％硫酸鉄、０．３％硝酸ナトリウム）、または、５００ｍＬの三角フラスコに入った１００ｍＬ  ＣＳＬ液体培地（６％Ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ（シグマ製）、２％グルコース）に、最終胞子濃度１×１０６／ｍＬとなるように植菌した。
【０１２７】
３０℃で３日間の液体培養を行った後、培養液を酵素サンプルとして用いた。なお、β−１，３−キシラナーゼタンパク質は、菌体外へ分泌されて培養液中に存在する。
【０１２８】
＜４．麹菌によるβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の発現＞
上記＜３＞の培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、培養液中に分泌されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を確認した。
【０１２９】
図１に、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質（コドン改変型）を麹菌にて発現させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１３０】
図１において、「Ｍ」はマーカーを示し、「Ｃ」は対照としてのネガティブコントロールを示し、、レーン１〜４は、ＧＰＹ液体培地を用いた培養液１００μＬを分析した結果を示し、レーン５〜８は、ＣＳＬ液体培地を用いた培養液１０μＬを分析した結果を示す。また、レーン１および５は、ａｍｙＢシグナル配列を用いた場合の分析結果を示し、レーン２および６は、ｇｌａＢシグナル配列を用いた場合の分析結果を示し、レーン３および７は、ｃｅｌＡシグナル配列を用いた場合の分析結果を示し、レーン４および８は、ｃｅｌＢシグナル配列を用いた場合の分析結果を示す。
【０１３１】
図１から明らかなように、ＣＳＬ液体培地を用いた場合は、β−１，３−キシラナーゼタンパク質の発現量が、ＧＰＹ液体培地を用いた場合の最大で約２０倍であった。
【０１３２】
β−１，３−キシラナーゼタンパク質の分泌量は、ｃｅｌＢシグナル配列を用いた場合が最も多く、ｃｅｌＡシグナル配列を用いた場合が２番目に多く、ａｍｙＢシグナル配列を用いた場合が３番目に多く、ｇｌａＢシグナル配列を用いた場合が４番目に多かった。
【０１３３】
デンシトメーターを用いた公知の手法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドを定量したところ、ＧＰＹ培地を用いた場合に培地中に分泌されていたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の量は、ａｍｙＢシグナル配列を用いた場合が約１９９ｍｇ／Ｌであり、ｇｌａＢシグナル配列を用いた場合が約１６１ｍｇ／Ｌであり、ｃｅｌＡシグナル配列を用いた場合が約２１５ｍｇ／Ｌであり、ｃｅｌＢシグナル配列を用いた場合が約２５０ｍｇ／Ｌであった。一方、ＣＳＬ培地を用いた場合に培地中に分泌されていたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の量は、ａｍｙＢシグナル配列を用いた場合が約１．２５ｇ／Ｌであり、ｇｌａＢシグナル配列を用いた場合が約１．０９ｇ／Ｌであり、ｃｅｌＡシグナル配列を用いた場合が約１．５１ｇ／Ｌであり、ｃｅｌＢシグナル配列を用いた場合が約３．１２ｇ／Ｌであった。
【０１３４】
図２に、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質（コドン改変型）を麹菌にて発現させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【０１３５】
図２において、「Ｍ」はマーカーを示し、「Ｃ」はネガティブコントロールを示す。また、レーン１〜３は、ＧＰＹ液体培地を用いて培養した培養液５０μＬを分析した結果を示す。レーン１は、ｇｌａＢシグナル配列を用いた場合の分析結果を示し、レーン２は、ｃｅｌＡシグナル配列を用いた場合の分析結果を示し、レーン３は、ｃｅｌＢシグナル配列を用いた場合の分析結果を示す。
【０１３６】
図２から明らかなように、β−１，３−キシラナーゼタンパク質の分泌量は、ｇｌａＢシグナル配列を用いた場合が最も多く、ｃｅｌＢシグナル配列を用いた場合が２番目に多く、ｃｅｌＡシグナル配列を用いた場合が３番目に多かった。
【０１３７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのバンドをデンシトメーターによって定量したところ、ＧＰＹ培地を用いた場合に培地中に分泌されていたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の量は、ｇｌａＢシグナル配列を用いた場合が約３１２ｍｇ／Ｌであり、ｃｅｌＡシグナル配列を用いた場合が約２６６ｍｇ／Ｌであり、ｃｅｌＢシグナル配列を用いた場合が約２８１ｍｇ／Ｌであった。
【０１３８】
比較対照として、コドンを改変していないThermotoga neapolitana DSM4359またはVibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質についても、麹菌にて発現させた。上述したのと同様にＧＰＹ液体培地あるいはＣＳＬ液体培地を用いて培養した培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、デンシトメーターによって定量したところ、いずれも検出限界以下（３ｍｇ／ｍＬ以下）であった。つまり、コドン改変を行えば、ネイティブな遺伝子配列を用いた場合と比較して、酵素の生産量を飛躍的に上昇させ得ることが明らかになった。
【０１３９】
＜５．麹菌を用いた、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の基質特異性＞
ＧＰＹ液体培地を用いた培養した培養液を酵素（β−１，３−キシラナーゼタンパク質）として用い、当該酵素の各種多糖類（具体的には、β−１，３−キシラン、β−１，４−キシラン、ラミナラン（ｌａｍｉｎａｌｉｎ）、β−１，４−マンナン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ））に対する分解活性（基質特異性）を検討した。
【０１４０】
具体的には、反応溶液として、５μＬの１Ｍ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、５０μＬの基質（１％、１０ｍｇ／ｍＬ）、２５μＬの酵素、および、２０μＬの水を混合したものを用いた。
【０１４１】
上記反応溶液を、３７℃にて１時間反応させた後、９８℃にて１５分間加熱し酵素を失活させた。加熱後の反応溶液は４℃に保温し、当該反応溶液のうちの２μＬを薄層クロマトグラフィーによって分析し、上記基質の分解の有無と、分解産物の同定とを行った。なお、薄層クロマトグラフィーにはメルク社製のＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４を用い、展開溶液としてはn-butanol：acetic acid：water（１０：５：１）を用いた。また、分解産物の検出（発色）には、ジフェニルアミン・アニリン・リン酸試薬を用いた。
【０１４２】
図３に、Vibrio sp. AX-4のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【０１４３】
図３において「３Ｘ」はβ−１，３−キシランを示し、「４Ｘ」はβ−１，４−キシランを示し、「３Ｇ」はラミナランを示し、「４Ｍ」はβ−１，４−マンナンを示し、「ＣＭＣ」はカルボキシメチルセルロースを示している。また、「ＮＣ」は、酵素に関するネガティブコントロール（水）を示している。また、「Ｘ１」はキシロースを示し、「Ｘ２」は２糖類（β−１，３−キシロビオース）を示し、「Ｘ３」は３糖類（β−１，３−キシロトリオース）を示している。また、「Ｆｒｏｎｔ  ｌｉｎｅ」は、移動した展開溶液の先端を示している。
【０１４４】
図３から明らかなように、ｃｅｌＡシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質（ｃｅｌＡｓｓ−Ｖｉｂｘｙｌ）、ｃｅｌＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質（ｃｅｌＢｓｓ−Ｖｉｂｘｙｌ）、および、ｇｌａＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質（ｇｌａＢｓｓ−Ｖｉｂｘｙｌ）を用いた場合には、何れもβ−１，３−キシランが特異的に分解されて、様々なβ−１，３−キシロオリゴ糖が形成された。また、β−１，３−キシロオリゴ糖の中では、特に２糖類および３糖類の形成量が多かった。
【０１４５】
＜６．麹菌を用いた、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の基質特異性＞
＜６−１．培養産物が有する酵素活性＞
ＧＰＹ液体培地またはＣＳＬ液体培地を用いて培養した培養産物（菌体および培地の両方を含む）を酵素（β−１，３−キシラナーゼタンパク質）として用い、当該酵素の各種多糖類（具体的には、β−１，３−キシラン、または、β−１，４−キシラン）に対する分解活性（基質特異性）を検討した。
【０１４６】
具体的には、反応溶液として、２０μＬの５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６.８）、１００μＬの基質（１％）、および、８０μＬの酵素を混合したものを用いた。
【０１４７】
上記反応溶液を、８０℃にて１６時間反応させた後、９８℃にて１０分間加熱し酵素を失活させた。加熱後の反応溶液は４℃に保温し、当該反応溶液のうちの２μＬを薄層クロマトグラフィーによって分析し、上記基質の分解の有無と、分解産物の同定とを行った。なお、薄層クロマトグラフィーにはメルク社製のＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４を用い、展開溶液としてはn-butanol：acetic acid：water（１０：５：１）を用いた。また、分解産物の検出（発色）には、ジフェニルアミン・アニリン・リン酸試薬を用いた。
【０１４８】
図４に、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【０１４９】
図４において、「β−１，４−Ｘｙｌｏ−ｏｌｉｇｏ  ｓｔｄ．」とは、β−１，４−キシランの分解によって生じる各種オリゴ糖を示し、「β−１，３−Ｘｙｌｏ−ｏｌｉｇｏ  ｓｔｄ．」とは、β−１，３−キシランの分解によって生じる各種オリゴ糖を示す。「ＩＦ４  ｎｉａＤ−（ＧＰＹ）」とは、形質転換していない宿主麹菌の培養液を示す。
【０１５０】
図４から明らかなように、ＧＰＹ液体培地を用いてａｍｙＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ａｍｙＢｓｓ（ＧＰＹ））、ＣＳＬ液体培地を用いてａｍｙＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ａｍｙＢｓｓ（ＣＳＬ））、ＧＰＹ液体培地を用いてｇｌａＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ｇｌａＢｓｓ（ＧＰＹ））、ＣＳＬ液体培地を用いてｇｌａＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ｇｌａＢｓｓ（ＣＳＬ））、ＧＰＹ液体培地を用いてｃｅｌＡシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ｃｅｌＡｓｓ（ＧＰＹ））、ＣＳＬ液体培地を用いてｃｅｌＡシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ｃｅｌＡｓｓ（ＣＳＬ））、ＧＰＹ液体培地を用いてｃｅｌＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ｃｅｌＢｓｓ（ＧＰＹ））、および、ＣＳＬ液体培地を用いてｃｅｌＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を発現させた場合（ｃｅｌＢｓｓ（ＣＳＬ））は、何れもβ−１，３−キシランが分解されて様々なβ−１，３−キシロオリゴ糖が形成されたが、β−１，４−キシランが分解されることは無かった。
【０１５１】
＜６−２．精製物が有する酵素活性＞
ＣＳＬ液体培地を用いた培養液からβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を精製し、当該精製物の各種多糖（具体的には、β−１，３−キシラン、β−１，４−キシラン、ラミナラン（ｌａｍｉｎａｌｉｎ）、β−１，４−マンナン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、または、スターチ）に対する分解活性（基質特異性）を検討した。
【０１５２】
まず、β−１，３−キシラナーゼタンパク質の精製方法について説明する。β−１，３−キシラナーゼタンパク質は、ＣＳＬ液体培地を用いた培養液から陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０１５３】
具体的には、麹菌菌体を除去した培養上清（５ｍＬ）に、最終濃度２０ｍＭになるようにＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、５０ｍＬとした。当該溶液を、予め２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）にて平衡化した陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、５ｍＬ、ＧＥヘルスケア製）に添加し、非吸着タンパク質が溶出しなくなるまで、上記緩衝液によって陰イオン交換カラムを洗浄した。
【０１５４】
次に、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む上記緩衝液を用いた連続濃度勾配（２０カラムボリューム、流速２．５ｍＬ／ｍｉｎ、分画容量２ｍＬ）によって、陰イオン交換カラムからタンパク質を溶出した。
【０１５５】
各画分をβ−１，３−キシランに反応させて得られる分解産物をＴＬＣにて分析することにより、酵素活性を測定した。さらに、各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。酵素活性を示し、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析において目的の位置に単一のバンドを示す画分を集めた。集めた画分を２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、透析後の画分をβ−１，３−キシラナーゼ精製酵素標品とした。
【０１５６】
以上のようにして精製したβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を酵素として用い、当該酵素の各種基質に対する分解活性（基質特異性）を検討した。
【０１５７】
具体的には、反応溶液として、５μＬの１Ｍ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、５０μＬの基質（１％、１０ｍｇ／ｍＬ）、２５μＬの酵素、および、２０μＬの水を混合したものを用いた。
【０１５８】
上記反応溶液を、８０℃にて２４時間反応させた後、９８℃にて１５分間加熱し酵素を失活させた。加熱後の反応溶液は４℃に保温し、当該反応溶液のうちの２μＬを薄層クロマトグラフィーによって分析し、上記基質の分解の有無と、分解産物の同定とを行った。なお、薄層クロマトグラフィーにはメルク社製のＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４を用い、展開溶液としてはn-butanol：acetic acid：water（１０：５：１）を用いた。また、分解産物の検出（発色）には、ジフェニルアミン・アニリン・リン酸試薬を用いた。
【０１５９】
図５に、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【０１６０】
図５から明らかなように、ｃｅｌＢシグナル配列が連結されたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を用いた場合（ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌ）には、β−１，３−キシランが特異的に分解された。
【０１６１】
＜７．分解産物の特異性＞
上述したように、本実施例のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質は、β−１，３−キシランを特異的に分解して様々な重合度のβ−１，３−キシロオリゴ糖を生成する。本実施例のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質が、これらのβ−１，３−キシロオリゴ糖のうちの何れを生成し易いかを判定するためには、短い反応時間によって得られる分解産物を特定する必要がある。つまり、大量の酵素にて長時間反応させれば、より分解が進んだ分解産物（例えば、キシロース）が蓄積されるので、分解産物の特異性を正確に判定することができない。そこで、分解産物を経時的に解析することにした。
【０１６２】
＜６−２＞にて説明した、精製したβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を酵素として用い、β−１，３−キシランを分解した。
【０１６３】
具体的には、反応溶液として、５μＬの１Ｍ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、５０μＬのβ−１，３−キシラン（１％、１０ｍｇ／ｍＬ）、２５μＬの酵素、および、２０μＬの水を混合したものを用いた。なお、ネガティブコントロールとしては、基質を含まない反応溶液（図６の「Ｅ」参照）、および、酵素を含まない反応溶液（図６の「３Ｘ」参照）を準備した。より具体的には、基質を含まない反応溶液とは、５μＬの１Ｍ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、２５μＬの酵素、および、７０μＬの水を混合したものである。一方、酵素を含まない反応溶液とは、５μＬの１Ｍ  Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）、５０μＬのβ−１，３−キシラン（１％、１０ｍｇ／ｍＬ）、および、４５μＬの水を混合したものである。
【０１６４】
上記反応溶液を８０℃にて反応させ、反応を開始してから１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後の各々において、反応溶液の一部をサンプリングした。サンプリングされた反応溶液は氷上で急冷し反応を停止した後に、分解産物の解析まで−２５℃で保管した。当該反応溶溶液のうちの２μＬを薄層クロマトグラフィーによって分析し、上記基質の分解の有無と、分解産物の同定とを行った。なお、薄層クロマトグラフィーにはメルク社製のＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４を用い、展開溶液としてはn-butanol：acetic acid：water（１０：５：１）を用いた。また、分解産物の検出（発色）には、ジフェニルアミン・アニリン・リン酸試薬を用いた。
【０１６５】
図６に、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質による、β−１，３−キシランの分解産物の経時変化を示す。図６において、「Ｘ１」は１糖類を示し、「Ｘ２」は２糖類を示し、「Ｘ３」は３糖類を示し、「Ｘ４」は４糖類を示し、「Ｘ５」は５糖類を示している。
【０１６６】
反応を開始してから１５分後、または、３０分後の実験結果から明らかなように、本実施例のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質は、１糖類、２糖類および３糖類を生成する能力が高く、２等類および３糖類を生成する能力が更に高く、３糖類を生成する能力が最も高い。
【０１６７】
＜８．大腸菌を用いたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の製造と、当該β−１，３−キシラナーゼタンパク質の基質特異性＞
参考例として、大腸菌にてβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を製造し、当該β−１，３−キシラナーゼタンパク質の基質特異性を検討した。その方法および結果を以下に説明する。
【０１６８】
まず、Thermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子（Accession number：CP000916（REGION: 617474..618514））をＰＣＲ法によってクローニングした。なお、当該β−１，３−キシラナーゼ遺伝子は、推定のシグナル配列を含む野生型のβ−１，３−キシラナーゼの全長をコードしている。
【０１６９】
次いで、クローニングしたβ−１，３−キシラナーゼ遺伝子を、市販されているｐＥＴ２２ｂ（＋）の制限酵素認識部位（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）に、発現可能に挿入した。なお、ｐＥＴ２２ｂ（＋）の構造を図７に示す。
【０１７０】
以上のようにして作製した発現ベクターを、周知の方法によって大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）導入し、大腸菌の形質転換体を作製した。
【０１７１】
１０ｍＬの２×ＹＴ培地にて上記形質転換体を培養し、ＯＤ６００が０．５〜１．０に達した時点で、０．１ｍＭの濃度になるように培地に対してＩＰＴＧを加えた。ＩＰＴＧを加えた後の培養温度は、２５℃の場合と３７℃の場合の２種類を用意した。
【０１７２】
ＩＰＴＧを加えてから３〜６時間培養した後、菌体を回収して、当該菌体内からβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を含む菌体内可溶性画分を調製した。なお、大腸菌において発現したタンパク質は菌体外へ分泌されないので、菌体内に蓄積されているβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を抽出する必要がある。
【０１７３】
β−１，３−キシラナーゼタンパク質を含む菌体内可溶性画分の抽出には、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（登録商標）（タカラバイオ株式会社製）を用いた。抽出の具体的な方法は、当該キットに貼付のプロトコールに従った。
【０１７４】
抽出した菌体内可溶性画分のβ−１，３−キシラナーゼ活性、および精製酵素の比活性からタンパク質量を推定したところ、大腸菌を用いてβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を生産した場合には、培地１Ｌあたり数ｍｇのβ−１，３−キシラナーゼタンパク質しか製造することができなかった。
【０１７５】
上述したように抽出したβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の各種多糖（具体的には、β−１，３−キシラン、または、β−１，４−キシラン）に対する分解活性（基質特異性）を検討した。
【０１７６】
具体的には、反応溶液として、１０μＬの酵素、２５μＬの基質（１％）、５μＬの５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）および１０μＬの水を混合したものを用いた。
【０１７７】
上記反応溶液を、３７℃にて３時間反応させた後に８０℃にて３時間反応させ、次いで９８℃にて１０分間加熱し、酵素を失活させた。加熱後の反応溶液は４℃に保温し、当該反応溶液のうちの２μＬを薄層クロマトグラフィーによって分析し、上記基質の分解の有無と、分解産物の同定とを行った。なお、薄層クロマトグラフィーにはメルク社製のＴＬＣ  Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４を用い、展開溶液としてはn-butanol：acetic acid：water（１０：５：１）を用いた。また、分解産物の検出（発色）には、ジフェニルアミン・アニリン・リン酸試薬を用いた。
【０１７８】
図８に、大腸菌にて作製したThermotoga neapolitana DSM4359のβ−１，３−キシラナーゼタンパク質（Ｔ．ｎ．Ｘｙｎ３）による各種基質の分解産物に関する、薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【０１７９】
図８から明らかなように、大腸菌にて発現させた場合も麹菌によって発現させた場合も、β−１，３−キシラナーゼタンパク質はβ−１，３−キシランを特異的に加水分解し、その分解産物は類似していた。
【０１８０】
＜９．至適温度および温度安定性、ならびに、至適ｐＨおよびｐＨ安定性＞
ｃｅｌＢシグナル配列が連結された、Thermotoga neapolitana DSM4359ののβ−１，３−キシラナーゼタンパク質（ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌ）の至適温度および温度安定性、ならびに、至適ｐＨおよびｐＨ安定性について検討を行った。
【０１８１】
ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌとしては、＜６−２＞にて説明した、精製したβ−１，３−キシラナーゼタンパク質を用いた。
【０１８２】
至適温度を検討する場合には、様々な温度条件下にて、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌによってβ−１，３−キシランを分解し、１０分間の分解によって生じる分解物（還元糖）の量比を、相対活性として算出した。
【０１８３】
温度安定性を検討する場合には、様々な温度条件下にてｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌを１０分間加熱し、加熱前の酵素活性と加熱後に残存している酵素活性との比を、相対活性として算出した。
【０１８４】
至適ｐＨを検討する場合には、様々なｐＨ条件下にて、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌによってβ−１，３−キシランを分解し、１０分間の分解によって生じる分解物（還元糖）の量比を、相対活性として算出した。なお、ｐＨの調節には、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ広域緩衝液（ｐＨ３．０〜１０．０）を使用した。
【０１８５】
ｐＨ安定性を検討する場合には、様々なｐＨ条件下にてｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌを４℃にて１６時間インキュベートし、インキュベート前の酵素活性とインキュベート後に残存している酵素活性との比を、相対活性として算出した。なお、ｐＨの調節には、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ広域緩衝液（ｐＨ３．０〜１０．０）を使用した。
【０１８６】
酵素反応によって生じた還元糖の量は、周知のソモギー・ネルソン（somogyi-Nelson）法にしたがって定量した。
【０１８７】
具体的には、１２５μＬの基質溶液（精製β−１，３−キシラン（１．０重量％）を水に溶解したもの）、５０μＬの２５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）、および、２５μＬの蒸留水をマイクロチューブに入れ、８５℃にて１５分間加熱した。その後、当該水溶液に５０μＬの酵素溶液を加え、１０分間反応させた。
【０１８８】
上記水溶液に２５０μＬのアルカリ性銅試薬を加えて反応を停止するとともに、当該水溶液を１００℃にて２０分間加熱した。
【０１８９】
加熱後の水溶液を氷上にて５分間冷却した後、５００μＬのネルソン試薬を加えて攪拌し、更に室温にて３０分間放置した。
【０１９０】
放置後の水溶液を、室温にて１５，０００ｇの条件下で、５分間遠心分離した。遠心分離後の水溶液から上清を分離し、当該上清の、６６０ｎｍの波長の光に対する吸光度を測定した。
【０１９１】
上記上清の吸光度と対照実験の吸光度との差から、還元糖の量を算出した。
【０１９２】
以下に、各検討結果を示す。
【０１９３】
図９は、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの至適温度の検討結果を示すグラフである。図９に示すように、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの至適温度は約８５℃であることが明らかになった。
【０１９４】
図１０は、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの温度安定性の検討結果を示すグラフである。図１０に示すように、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌは、約８５℃以下の温度にて安定であることが明らかになった。
【０１９５】
また、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの至適ｐＨは約６．５であり、ｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌは、ｐＨ３．０〜１０にて安定であることが明らかになった。具体的には、ｐＨ３．０〜１０におけるｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの残存活性は、９１％以上であった。
【０１９６】
なお、上述したｃｅｌＢｓｓ−Ｔｈｘｙｌの至適温度および温度安定性、ならびに、至適ｐＨおよびｐＨ安定性は、大腸菌にて発現させたβ−１，３−キシラナーゼタンパク質の至適温度および温度安定性、ならびに、至適ｐＨおよびｐＨ安定性よりも優れていた。
【０１９７】
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明は、癌細胞のアポトーシス誘導剤の製造に用いることができる。
【受託番号】
【０１９９】
ＦＥＲＭ  Ｐ−１７７０７
【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【配列表】
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