(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子を欠損させた非ヒトノックアウト動物およびその作製方法の提供。及び、このノックアウト動物や当該動物由来の組織・細胞を用いた用途の提供。【解決手段】相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失しており、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する、非ヒトノックアウト動物やその子孫動物、当該動物由来の組織・細胞。当該動物や組織・細胞を用いた、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を予防および／または治療するための候補物質のスクリーニング方法や、上記疾患／症状のバイオマーカーのスクリーニング方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失しており、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する、非ヒトノックアウト動物。
【請求項２】
ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能の喪失が、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の破壊または変異によるものである、請求項１に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項３】
大動脈瘤、動脈硬化、浮腫、アナフィラキシー・ショック、血管内膜肥厚、血管閉塞、血管炎、腫瘍血管新生、虚血後血管新生、血管透過性亢進型肺障害、または糖尿病網膜症のモデル動物である、請求項１または２に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項４】
ヘテロノックアウト動物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項５】
マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、チンパンジーおよびゼブラフィッシュからなる群から選択される動物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒトノックアウト動物の子孫動物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の動物から単離された組織または細胞。
【請求項８】
血管由来のものである、請求項７に記載の組織または細胞。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の動物または請求項７または８に記載の組織もしくは細胞を用いる、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を予防および／または治療するための候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の動物に被験物質を投与する工程；
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における血管組織を調べ、被験物質を投与しない動物における血管組織と比較する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を治療することができる被験物質を選択する工程、
を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の治療候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の動物に被験物質を投与する工程；
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における血管組織を調べ、被験物質を投与しない動物における血管組織と比較する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を発現させなくするか、またはその発現を遅らせることができる被験物質を選択する工程、
を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の予防候補物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の動物と、当該動物の同種野生型動物とのそれぞれから血液を採取する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた血液中のタンパク質を調べ、それぞれの動物におけるタンパク質の発現パターンを比較する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の発現の指標となる血清タンパク質を選択する工程、
を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状のバイオマーカーのスクリーニング方法。
【請求項１３】
非ヒト動物の相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失させるノックアウト工程を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する非ヒトノックアウト動物の作製方法。
【請求項１４】
前記ノックアウト工程が、前記非ヒト動物のＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子のエクソン１の開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することを含む、請求項１３に記載の作製方法。
【請求項１５】
前記ノックアウト工程の後に、脈管形成および／または血管新生に関連した因子を前記非ヒト動物に投与する工程をさらに含む、請求項１３または１４に記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒトノックアウト動物、並びにその用途およびその作製方法に関する。より詳細には、本発明は、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患および／または症状の治療および／または予防するための手段の開発における、非ヒトノックアウト動物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む哺乳類の血管は胎生期に形成される。哺乳類における血管形成は、未分化な内皮前駆細胞の発生とその分化、管腔形成、そして原始的な血管叢の形成をいう脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）の過程に始まる。この脈管形成の後、血管壁への壁細胞（周皮細胞、血管平滑筋細胞）の動員による血管構造の安定化、血管の融合、発芽型血管新生等の原始血管の再構築からなる血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）過程を経て、全身に血管網が張り巡らされていく。
【０００３】
この血管形成の過程において、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ｋｉｎａｓｅ；ＰＩ３Ｋ）ファミリーは極めて重要な役割を果たしている。現在、哺乳類においては、ＰＩ３Ｋについて３つのクラス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）、および８つのアイソフォームの存在が知られており、これらのＰＩ３Ｋによる生成物であるＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（３，４）Ｐ２、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を介して多岐にわたる生理作用を発揮する。近年、ＰＩ３Ｋと癌や糖尿病といった疾患との関係が注目され、とりわけクラスＩ型ＰＩ３Ｋ酵素の生理機能について精力的に研究が進められている。例えば、血管形成において、クラスＩ型ＰＩ３Ｋ、特にｐ１１０αおよびｐ１１０βは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）刺激に伴い、ＰＩ（４，５）Ｐ２を基質としてＰＩ（３，４，５）Ｐ３を細胞膜上で産生し、下流のリン酸化酵素プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）を介して内皮細胞の増殖、生存、分化の制御を担っている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００４】
一方、これまでまったくと言ってよいほど機能が分からないままであったクラスＩＩ型ＰＩ３Ｋについては、本発明者らのグループを含めていくつかの研究チームが解析を行っているに留まっている。クラスＩＩ型ＰＩ３Ｋは細胞内において、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を基質として、ホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰＩ（３）Ｐ）を主に細胞内オルガネラであるエンドソーム上で産生し、エンドソームを介した膜輸送に関係することが想定されている。ただし、クラスＩＩ型ＰＩ３Ｋの１種であるＣ２αの生理的役割に関しては依然として不明な点が多く、Ｃ２αをコードするＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子を欠損させたときの個体の表現型については明らかではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】成川−篠崎ら、イノシトールリン脂質を見る シグナル伝達脂質の細胞内イメージング、蛋白質 核酸 酵素、Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．１０（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子を欠損させた非ヒトノックアウト動物およびその作製方法を提供することを目的とする。また、このノックアウト動物や当該動物由来の組織・細胞の用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。その結果、驚くべきことに、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の機能を失わせたノックアウトマウスが、脈管形成や血管新生に関連した疾患／症状を引き起こすことを見出した。また、さらなる検討により、Ｃ２αは血管形成において、「内皮細胞間接着の緊密化による血管透過性抑制」に必須の役割を担っていることを突き止めた。
【０００８】
以上のような知見に基づき完成された本発明の第１の形態は、相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失しており、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する、非ヒトノックアウト動物やその子孫動物である。
【０００９】
また、本発明の第２の形態は、上記の動物から得られる組織または細胞である。この組織または細胞は、例えば血管由来のものである。
【００１０】
さらに、本発明の第３の形態は、上記の動物や組織・細胞を用いる、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を予防および／または治療するための候補物質のスクリーニング方法である。同様に、上記の動物や組織・細胞は、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状のバイオマーカーのスクリーニング方法にも適用されうる。
【００１１】
また、本発明の第４の形態は、相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失させるノックアウト工程を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する非ヒトノックアウト動物の作製方法を提供する。この際、ノックアウト工程は、例えば、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子のエクソン１の開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することを含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明者らが本願において初めて見出した知見によれば、Ｃ２α機能の異常は、血管内皮細胞の機能異常、特に血管透過性亢進、炎症反応の惹起、ひいては血管構造の破綻を招くことになり、動脈瘤、動脈硬化、浮腫、アナフィラキシー・ショック等多くの血管形成（脈管形成および／または血管新生）に関連した疾患および／または症状の発現をもたらすことが示唆される。よって、本願が提供するＣ２αノックアウト非ヒト動物は、これら血管形成に関連した疾患・症状の病態生理を把握する上で新しいモデル動物として、基礎研究のみならず臨床的にも貴重な生物資源となる。また、このモデル動物を用いることで、上記疾患・症状を治療および／または予防することができる候補物質を個体レベルでスクリーニングすることも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例において採用された、ノックアウト（ＫＯ）マウスを作製するためのストラテジーを示す説明図である。
【図２】実施例において、同腹のＣ２αホモＫＯマウスおよび野生型マウスのそれぞれの胎児について、血管内皮細胞マーカーである抗ＣＤ３１抗体を用いてホールマウント染色（ＤＡＢ発色法）を行なった結果を示す図である。
【図３】実施例において、Ｃ２αホモＫＯマウスおよび野生型マウスのそれぞれについて、胎児の組織切片を血管平滑筋マーカーである抗α平滑筋アクチン抗体により免疫組織化学染色（ＤＡＢ発色法）した結果を示す図である。
【図４】図３に示すＣ２αホモＫＯマウスを電子顕微鏡を用いて詳しく観察した結果を示す図である。
【図５】実施例において採用された、組織特異的Ｃ２αコンディショナルノックアウト（ＣＫＯ）マウスを作製するためのストラテジーを示す説明図である。
【図６】実施例において、Ｃ２α−ｅＣＫＯマウスについてより詳細に観察を行なった結果を示す図である。
【図７】実施例において、Ｃ２α−ｅＣＫＯマウスの胎児皮膚を剥離し、これについて血管内皮細胞マーカーである抗ＣＤ３１抗体および血管平滑筋細胞マーカーである抗α平滑筋アクチン抗体による二重蛍光免疫ホールマウント染色を行なった結果を示す図である。
【図８】実施例において、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞について、マトリゲル・アッセイ法を用いてＶＥＧＦに対する管腔形成能を評価した結果をコントロールＨＵＶＥＣ細胞と比較して示す図である。
【図９】実施例において、細胞内ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ蛍光プローブであるｍＲＦＰ−２ＸＦＹＶＥドメイン発現プラスミドを、コントロールＨＵＶＥＣ細胞およびＣ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞にそれぞれＡｍａｘａエレクトロポレーション法（Ｌｏｎｚａ社）により遺伝子導入し、生細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ局在をリアルタイム共焦点レーザー顕微鏡（横河電機−オリンパス社製）を用いて経時観察した結果を示す図である。
【図１０】実施例において、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞を抗トランスゴルジ・ネットワーク（ＴＧＮ）抗体（ＢＤ社）を用いた免疫蛍光染色法により観察した結果を示す図である。
【図１１】実施例において、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞について、内皮細胞間接着分子ＶＥ−カドヘリンの局在を抗ＶＥ−カドヘリン抗体を用いた免疫蛍光染色法により調べた結果を示す図である。
【図１２】実施例において、Ｃ２αノックダウン細胞について、抗ＧＴＰ−ＲｈｏＡ抗体を用いた免疫蛍光染色法により観察した結果を示す図である。
【図１３】実施例において、Ｃ２αヘテロＫＯマウスに対してエバンス・ブルー色素を用いたマイルズアッセイ法を適用し、Ｃ２αヘテロＫＯマウスにおける血管透過性を調べた結果を示す図である。
【図１４】実施例において、ＫＯマウスおよび野生型マウスに対してＰＡＦを投与してアナフィラキシー・ショックを誘発した際の、それぞれのマウスの生存率およびそれぞれのマウスにおけるヘマトクリット値の変化を示すグラフである。
【図１５】実施例において、ＫＯマウスおよび野生型マウスに対してアンジオテンシンＩＩを投与して動脈瘤を誘発した際の、それぞれのマウスの生存率、それぞれのマウスの大動脈を観察した結果、およびＫＯマウスにおける大動脈瘤の観察結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための具体的な形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の具体的な形態のみに限定されるわけではない。
【００１５】
［ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子］
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ファミリーのうち、クラスＩＩに属するＣ２αアイソフォーム（以下、単に「Ｃ２α」とも称する）をコードする遺伝子（本願においては、「ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子」と総称する）は公知である。例えば、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）においてＣ２αタンパク質をコードするＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子（遺伝子名：Ｐｉｋ３ｃ２ａ）は、マウス第７番染色体上に位置し（Location: 7 F1; 7 53.0 cM）、この遺伝子から、８０４２ｂｐ（３３エクソン）からなるＰｉｋ３ｃ２ａ ｍＲＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１１０８３．２）が転写される。このＰｉｋ３ｃ２ａ ｍＲＮＡは、１６８６アミノ酸からなるタンパク質（マウスＣ２αタンパク質；ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３５２１３．２）をコードしている。同様に、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）においてＣ２αタンパク質をコードするＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子（遺伝子名：ＰＩＫ３Ｃ２Ａ）は、ヒト第１１番染色体短腕上に位置し（Location: 11p15.5-p14）、この遺伝子から、８３０４ｂｐ（３２エクソン）からなるＰＩＫ３Ｃ２Ａ ｍＲＮＡ（Ｒｅｆｓｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２６４５．２Ｎ）が転写される。このＰＩＫ３Ｃ２Ａ ｍＲＮＡは、１６８６アミノ酸からなるタンパク質（ヒトＣ２αタンパク質；ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２６３６．２）をコードしている。
【００１６】
本発明を実施するにあたり、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子は、例えばマウスやラット等のゲノムライブラリーから得ることができる。例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーから、ハイブリダイゼーション法により目的クローンを得ることができる。また、ＰＣＲ法により目的クローンを得ることも可能である。
【００１７】
［非ヒトノックアウト動物］
本発明は、相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失しており、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する、非ヒトノックアウト動物を提供する。本発明はまた、相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失させる工程（ノックアウト工程）を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する非ヒトノックアウト動物の作製方法を提供する。相同染色体上でＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の全部または一部の機能を喪失させる手法としては、例えば、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の破壊または変異によるものが挙げられる。
【００１８】
なお、本発明において、「遺伝子の機能を喪失させる」とは、「遺伝子の機能を完全に失わせること」の意味に加えて、「遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にすること」の意味をも含む概念である。遺伝子の機能を喪失させるためには、単純に遺伝子を破壊したり、欠損させたり、遺伝子に変異を導入して翻訳の段階で読み枠（ＯＲＦ；Open Reading Frame）がずれるように操作する等の改変を施したりすればよい。
【００１９】
本発明の「ノックアウト動物」は、例えば、以下の手法により作製することができる。なお、以下では、ノックアウト動物の作製に用いられる非ヒト動物がマウスである場合を例に挙げて説明するが、他の非ヒト動物においても同様の手法が適用されうることはもちろんである。
【００２０】
まず、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の塩基配列の一部または全てを改変したものを分化全能性細胞に導入し、改変ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子が導入された分化全能性細胞を選択する。次いで、選択された遺伝子改変（欠損、破壊、変異等）が施された分化全能性細胞を受精卵に導入してキメラ個体を作製し、得られたキメラ個体を交配することにより相同染色体上の一方または双方のＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子がノックアウトされた個体を作出する。
【００２１】
本発明に用いられる動物の種類は、特に限定されない。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ウシ、サル、チンパンジーおよびゼブラフィッシュなどの非ヒト動物が、ノックアウト動物の作製に用いられうる。なかでも、取り扱いが容易で繁殖しやすいマウスが好ましい。
【００２２】
ノックアウト工程において、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の機能を失わせるには、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の塩基配列の一部または全部を改変すればよい。ここで、「改変」とは、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子を構成するＤＮＡに、欠損、置換または付加を生じさせる変異を加えることをいう。これらの変異としては、例えば、遺伝子工学的手法による塩基配列の一部または全部の削除（欠失）、または他の遺伝子もしくは塩基配列の挿入もしくは置換が挙げられる。例えば、コドンの読み枠（ＯＲＦ）をずらすか、プロモーターまたはエクソンの機能を破壊することにより、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α欠損遺伝子を作製することができる。これにより、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の発現産物であるＣ２αタンパク質の機能が発現しなくなる。
【００２３】
本発明の非ヒトノックアウト動物は、公知の遺伝子組換え法（遺伝子ターゲティング法）により作製することができる。遺伝子ターゲティング法は、当分野においてはよく知られた技術であり、その具体的な操作については本分野における種々の実験書に開示されている。
【００２４】
ターゲティングベクターを設計するにあたり、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の機能が欠損する限り、特に限定されない。ただし、Ｃ２αタンパク質の発現・機能を完全に欠損させるという観点からは、ノックアウト工程が、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子のエクソン１の開始コドンを含む領域を相同組換えにより他の塩基配列に置換することを含むことが好ましい。かような手法によればＣ２αタンパク質をコードするｍＲＮＡがまったく転写されなくなり、Ｃ２αタンパク質の発現を完全に抑えることができる。ただし、かような手法のみには限定されず、例えば、Ｃ２αタンパク質の酵素活性部位や活性調節部位をコードするエクソンを欠損させて、酵素活性を喪失した、または酵素活性が低下したＣ２αタンパク質を発現させる手法もまた、採用されうる。
【００２５】
ターゲティングベクターを導入した組換え体については、当該ターゲティングベクターにより導入した薬剤耐性遺伝子を用いたスクリーニング、およびサザンブロット法やＰＣＲ法を用いたスクリーニングを併用して選抜することが好ましい。薬剤選択のマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子などが用いられうる。また、ネガティブセレクション用遺伝子としては、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴ−Ａ）遺伝子やＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子などが用いられうる。
【００２６】
次いで、上記の方法により作製したターゲティングベクターを使用して、相同組換えを行なう。本願において、「相同組換え」とは、改変されたＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子を、ゲノム中のＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子のＤＮＡ領域に、人工的に組換えさせることをいう。
【００２７】
目的とする相同組換え体を得るためには、多数の組換え体をスクリーニングする必要がある。しかしながら、受精卵では多数のスクリーニングを行なうことが技術的に困難である。そこで、受精卵と同様に多分化能を有し、かつin vitroで培養することができる細胞を使用することが好ましい。かような分化全能性細胞としては、マウス（Nature 292:154-156, 1981）、ラット（Iannaccone, P.M. et al, Dev. Biol. 163(1): 288-292, 1994）、サル（Thomson, J.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995）、ウサギ（Schoonjans, L. et al, Mol. Reprod. Dev. 45(4):439-443, 1996）については胚性幹（ＥＳ；Embryonic Stem）細胞などが確立されている。また、ブタについては胚性生殖（ＥＧ；Embryonic Germ）細胞が確立されている（Shim H. et al, Biol. Reprod 57(5):1089-1095, 1997）。
【００２８】
したがって、本発明においては、これらの動物種を対象にノックアウト動物を作製することが好ましいが、特にノックアウト動物の作製に関して技術が整っているマウスが最適である。マウスＥＳ細胞としては、現在マウス由来のＥＳ細胞株がいくつか確立されており、例えば129/Ola E14-1細胞株、TT-2細胞株、AB-1細胞株、J1細胞株、R1細胞株等が用いられうる。これらのどのＥＳ細胞株を用いるかは、実験の目的または手法に応じて適宜決定されうる。なお、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより、効率よく多数の初期胚を取得することができる。このようにして得られたＥＳ細胞株は、通常その増殖性は大変よいものの、個体発生できる再生能を失いやすいため、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で白血病抑制因子（ＬＩＦ；Leukemia Inhibitory Factor）(１〜１００００Ｕ／ｍＬ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス／９５％空気または５％酸素／５％炭酸ガス／９０％空気）で約３７℃にて培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などが採用されうる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうとともに、細胞の形態的観察を行うことが好ましい。
【００２９】
ＥＳ細胞への遺伝子導入は、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法により行なわれうる。なかでも、簡便に多数の細胞を処理できるという点で、エレクトロポレーション法が好ましく用いられる。
【００３０】
次いで、得られた組換えＥＳ細胞について、相同組換えが起こっているか否かのスクリーニングを行ない、相同組換えが起こっている組換えクローンを選択する。具体的に、例えばマーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子を導入した場合には、Ｇ４１８などの抗生物質を含有する培地中で約３７℃にて培養することで、組換えクローンを選択することができる。
【００３１】
さらに、得られた組換えＥＳ細胞について、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンブロット解析、または、ターゲティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲティングベクターに使用したマウス由来のＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法を行なうことにより、相同組換えが起こっているか否かを確実にスクリーニングすることができる。
【００３２】
以上のようなアッセイにより、染色体上に存在する野生型ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子と導入したＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子断片との間で正しく相同組換えが起こり、染色体上のＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子に変異が導入された組換えクローンを選択することができる。
【００３３】
続いて、導入遺伝子の組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト動物由来の胚内に戻すことにより、宿主胚の細胞塊に組み込まれたキメラ胚が形成される。ＥＳ細胞を胚盤胞等の胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション法や凝集法といった手法が知られているが、いずれの方法を用いることも可能であり、適宜選択されうる。
【００３４】
マウスの場合には、ホルモン剤（例えば、ＦＳＨ（follicle stimulating hormone）様作用を有するＰＭＳＧ（pregnant mare's serum gonadotropin）およびＬＨ（loteinizing hormone）作用を有するｈＣＧ（human chorionic gonadotropin）を使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、８細胞期胚を用いる場合には２．５日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このようにして回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行ったＥＳ細胞をin vitroにおいて注入し、キメラ胚を作製する。あるいはマウス２日胚（８細胞期胚）の透明帯を取り除き、ＥＳ細胞と一緒に培養して凝集塊を作らせる。その凝集塊を一日培養すると胚盤胞になる。これらを仮親に移植して発生および生育させることにより、キメラマウスが得られる。仮親とするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上記の方法により作製したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラマウスを作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするためには、受精卵を採取する雌マウスと仮親となる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが好ましい。
【００３５】
そして、仮親から産まれた仔から、キメラマウスを選ぶ。ＥＳ細胞移植胚に由来するマウス個体が得られたら、このキメラマウスを野生型のマウスと交配し、次世代個体にＥＳ細胞由来の形質が表れるか否かを確認する。次世代個体にＥＳ細胞由来の形質が表れたら、ＥＳ細胞がキメラマウス生殖系列へ導入されたものとみなすことができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、好ましくは被毛色を指標とすることが望ましい。マウスにおいては野ネズミ色（アグーチ色）、黒色、黄土色、チョコレート色および白色などの被毛色が知られている。また、体の一部（例えば尾部先端）から染色体ＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲ法を行なうことにより、選抜を行うこともまた可能である。キメラの寄与率が高いマウスは、ＥＳ細胞がキメラマウス生殖系列へ導入された可能性が高い。以上のようにしてキメラマウスを選抜した後に、当該キメラマウスを野生型の雌と交配し、Ｆ１を得ることで変異マウス系統を樹立することができる。
【００３６】
上記の手法により得られたキメラ動物は、相同染色体の一方にのみ遺伝子欠損を有するヘテロ接合体として得られる。相同染色体上の双方のＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子が欠損したホモ接合体であるノックアウト動物を得るには、Ｆ１動物のうち相同染色体の一方にのみ遺伝子欠損を有するヘテロ接合体同士を交雑すればよい。
【００３７】
ノックアウト動物が得られたことの確認は、組織から染色体ＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析またはＰＣＲ法により行なうことができる。また、解剖を行なった際の諸組織、臓器の異常を観察することにより、確認することもできる。さらに、組織からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット解析により遺伝子の発現パターンを解析することにより、確認することもできる。さらに、必要に応じて血液を採取し、血液検査や血清生化学的検査を実施することにより、確認することも可能である。
【００３８】
ここで、ホモ接合体であるノックアウト動物を作製すると、胎性致死に至るなど、成体まで成長せずにモデル動物として適切でない場合がある。かような観点から、ホモ接合体が胎生致死に至る場合を考慮すると、本発明の非ヒトノックアウト動物は、ヘテロ接合体であることが好ましい。
【００３９】
また、ホモ接合体が胎生致死に至るような場合には、必要な時期にのみＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子をノックアウトさせることが好ましい。また生体内でのある特定の組織における遺伝子の機能を調べるには組織特異的に遺伝子をノックアウトすることが好ましい。このように特定の時期・特定の細胞系列だけをノックアウトさせた動物、および体細胞の限定された領域のみでノックアウトさせた動物を、コンディショナルノックアウト動物という（バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング：ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、相沢慎一著、羊土社、１９９５）。
【００４０】
コンディショナルノックアウト動物を作製するための手法としては、例えば、遺伝子ターゲティング法のためにバクテリオファージＰ１由来の組換えシステムであるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム（R.Kuhn. et al., Science 269: 1427-1429, 1995）が用いられうる。Ｃｒｅは組換え酵素であり、ｌｏｘＰと呼ばれる３４塩基の配列を認識して、この部位で組換えを起こさせることが可能となる。したがって、ターゲティングしたい遺伝子をｌｏｘＰ配列とｌｏｘＰ配列との間に挟み、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を特異的プロモーター下流に組み込むことにより、部位特異的および時期特異的にＣｒｅが産生されてｌｏｘＰで挟まれた遺伝子を切り取る（すなわち、特定の部位、時期において目的遺伝子の機能を喪失させる）ことができる。本発明において、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰのシステムを用いてターゲティングベクターを設計するにあたり、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の構造に変化をもたらす部位は、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の機能が欠損する限り、特に限定されない。ただし、上述したように、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子のエクソン１の開始コドンを含む領域を欠失させるように設計することが特に好ましい。
【００４１】
このようにして得られた本発明のノックアウト動物をさらに交配して得られる子孫動物や、これら動物から単離された組織または細胞も本発明の技術的範囲に含まれる。ノックアウト動物から単離される組織としては、すべての組織が挙げられ、好ましくは血管由来の組織である。また、ノックアウト動物から単離される細胞としては、前記組織から単離された細胞、これら細胞から樹立した細胞株が挙げられ、具体的には血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、周皮細胞、血管内皮前駆細胞、骨髄由来間葉系細胞などが好ましい。これらの組織や細胞は、当業者に周知の方法によって、ノックアウト動物から単離することが可能である。
【００４２】
本発明により提供される非ヒトノックアウト動物は、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を呈する。したがって、本発明の非ヒトノックアウト動物は、上述した疾患または症状を治療および／または予防するための医薬等の開発の伸展に大きく貢献しうるモデル動物として用いられうる。
【００４３】
本発明において、「脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状」としては、大動脈瘤（特に解離性大動脈瘤）、動脈硬化、浮腫、アナフィラキシー・ショック、血管内膜肥厚、血管閉塞、血管炎、腫瘍血管新生、虚血後血管新生、血管透過性亢進型肺障害、糖尿病網膜症などが挙げられ、これらの疾患または症状は、単独でまたは併発して発現しうる。
【００４４】
なお、本発明により提供される非ヒトノックアウト動物またはその子孫動物の特にヘテロノックアウト体においては、上述した疾患／症状を十分に呈さない場合もありうる。また、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α遺伝子の機能を喪失させるのみでは所望の疾患／症状を確実に呈するとは限らない。したがって、場合によっては、ノックアウト工程の後に、脈管形成および／または血管新生に関連した因子を非ヒト動物に対して投与する工程を行なってもよい。このようにすることで、ヘテロノックアウト体においても上述の疾患／症状を十分に発現させることが可能となる。また、投与する因子を選択することで、所望の疾患／症状を発現させることも可能となる。
【００４５】
本工程において投与される因子としては、例えば、血小板活性化因子（ＰＡＦ；Platelet-Activating Factor）、ヒスタミン、トロンビン（以上、アナフィラキシー・ショック様病態誘発因子）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；Fibroblast Growth Factor）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ；Vascular Endothelial Growth Factor；血管透過性亢進因子）、アンジオポエチン-１/２（Angiopoietin-1/2）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ; Hepatocyte Growth Factor）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；Platelet-derived Growth Factor）、アンジオテンシンＩＩ（大動脈瘤誘発因子）、塩化コバルト（虚血誘発因子）、ストレプトゾトシン（糖尿病誘発因子）、ブラジキニン（血管透過性亢進因子）などが挙げられる。
【００４６】
［スクリーニング方法］
本発明により提供される非ヒトノックアウト動物もしくはその子孫動物またはこれらの動物から単離された組織もしくは細胞を用いることにより、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の治療および／または予防に用いられうる候補物質をスクリーニングすることができる。
【００４７】
本発明によれば、例えば、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）本発明の非ヒトノックアウト動物またはその子孫動物に被験物質を投与する工程；
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における血管組織を調べ、被験物質を投与しない動物における血管組織と比較する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を治療することができる被験物質を選択する工程、
を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の治療候補物質のスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法（１）」とも称する）が提供される。
【００４８】
工程（ａ）において、「非ヒトノックアウト動物またはその子孫動物」とは、動物の生体の全身のほか、限定された組織または臓器をも含む概念である。限定された組織または臓器には、動物から摘出されたものも含まれうる。
【００４９】
工程（ａ）において、「被験物質」とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリーのほか、微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などが挙げられる。また、これらの化合物の２種以上の混合物を被験物質として用いることもできる。これら被験物質は塩を形成していてもよく、被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００５０】
工程（ａ）において、被験物質を動物に投与する方法は特に限定されず、経口的または非経口的に投与されうる。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内等の全身投与、または標的細胞付近への局所投与等が挙げられる。
【００５１】
工程（ａ）における被験物質の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等に応じて、適宜設定されうる。
【００５２】
工程（ｂ）において、被験物質を投与した動物における血管組織を調べる方法としては、例えば、血管組織を染色して顕微鏡で観察する方法；ウエスタンブロット法や免疫沈降などによって特定の標的タンパク質の発現を確認する方法、ＲＴ−ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲなどによって特定の遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現を確認する方法、マウスの生存期間を比較する方法などが挙げられる。
【００５３】
工程（ｂ）においては、被験物質を投与しない動物における血管組織も同時にまたは別途調べ、投与動物の結果と非投与動物の結果とを比較する。
【００５４】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を治療することができる被験物質を選択する。選択する基準は、被験物質を投与していない動物を指標として、適宜設定されうる。
【００５５】
このようにして選択された被験物質は、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を治療することができるものであり、各種の上記疾患／症状の治療薬の候補物質となりうる。
【００５６】
また、本発明によれば、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）本発明の非ヒトノックアウト動物またはその子孫動物に被験物質を投与する工程；
（ｂ）前記被験物質を投与した動物における血管組織を調べ、被験物質を投与しない動物における血管組織と比較する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を発現させなくするか、またはその発現を遅らせることができる被験物質を選択する工程、
を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の予防候補物質のスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法（２）」とも称する）が提供される。
【００５７】
スクリーニング方法（２）において、工程（ａ）〜（ｂ）は、上述したスクリーニング方法（１）と同様である。ただし、本発明の非ヒトノックアウト動物が脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を発現する時期を事前に検討し、被験物質を投与しない本発明のノックアウト動物における上記疾患／症状の発現が確認できる時期まで被験物質の投与を続けた後に、血管組織を調べることが重要である。
【００５８】
スクリーニング方法（２）の工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を発現させなくするか、またはその発現を遅らせることができる被験物質を選択する。選択する基準は、被験物質を投与していない動物を指標として、適宜設定されうる。
【００５９】
このようにして選択された被験物質は、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状を発現させなくするか、またはその発現を遅らせることができるものであり、各種の上記疾患／症状の予防薬の候補物質となりうる。
【００６０】
さらに、本発明によれば、下記の（ａ）〜（ｃ）の工程：
（ａ）本発明の非ヒトノックアウト動物またはその子孫動物と、当該動物の同種野生型動物とのそれぞれから血液を採取する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた血液中のタンパク質を調べ、それぞれの動物におけるタンパク質の発現パターンを比較する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）における比較結果に基づいて、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の発現の指標となる血清タンパク質を選択する工程、
を含む、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状のバイオマーカーのスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法（３）」とも称する）が提供される。
【００６１】
スクリーニング方法（３）の工程（ａ）において、動物から血液を採取する方法は、自体公知の方法により行なうことができる。血液の採取量は、動物の種類に応じて適切な量に設定されうる。採取した血液から、遠心分離等により血清を調製して工程（ｂ）に供することが好ましい。なお、血液を採取する時期は、本発明の非ヒトノックアウト動物において脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の発現が見られる時期を事前に検討しておき、当該疾患／症状の発現の前後の時期を複数選ぶことが好ましい。
【００６２】
スクリーニング方法（３）の工程（ｂ）において、血液中のタンパク質の発現パターンを解析・比較する方法は特に限定されず、常法により行なうことができる。例えば、非ヒトノックアウト動物および同種野生型動物のそれぞれの血中タンパク質をペプチドマスフィンガープリント法などの手法を用いて比較し、ノックアウト動物において有意に増加または減少するタンパク質をスクリーニングしていく方法が例示される。
【００６３】
スクリーニング方法（３）の工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた比較結果に基づき、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の発現の指標となる血清タンパク質を選択する。選択する基準は、血清タンパク質のうち、同種野生型動物と比較して、非ヒトノックアウト動物において有意に（好ましくは、２倍以上）発現が増加または減少していることを指標とすることができる。
【００６４】
このようにして選択された血清タンパク質は、脈管形成および／または血管新生に関連した疾患または症状の発現の有無を判断するバイオマーカーとして有用である。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲が下記の実施例に記載の形態のみに制限されるわけではない。
【００６６】
［ノックアウト（ＫＯ）マウスの作製：図１］
以下の手法により、ＰＩ３Ｋ−Ｃ２α（Pik3c2a）遺伝子が相同染色体上で破壊されたノックアウト（ＫＯ）マウスを作製した。
【００６７】
まず、129/Ola E14-1 マウス胚性幹（ＥＳ）細胞ゲノムから、１．２ｋｂｐ ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法によりクローニングした。このフラグメントは、マウスＰＩ３Ｋ−Ｃ２α（Pik3c2a）遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含むエクソン１を有する。
【００６８】
ターゲティングベクターは、定法に従い構築した。その際、条件付け（コンディショナル）ＫＯマウス作製に対応できるように、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを組み込むようにターゲティングベクターをデザインした。具体的には、市販のpBluescript-IIベクター（インビトロジェン社）をベースに、マウスＰＩ３Ｋ−Ｃ２α（Pik3c2a）遺伝子のエクソン１の上流イントロン領域（５．６ｋｂｐ）、バクテリオファージ由来ｌｏｘＰ配列、Ｃ２α遺伝子のエクソン１領域、ｌｏｘＰ配列、ポジティブセレクション用ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）カセット、ｌｏｘＰ配列、Ｃ２α遺伝子のエクソン１の下流イントロン領域（１．２ｋｂｐ）、ネガティブセレクション用ＤＴ−Ａ遺伝子カセットの各フラグメントを適切に連結して、ターゲティングベクターを得た。
【００６９】
得られたターゲティングベクター（２０μｇ）をＳａｃＩＩによって線状化し、129/Ola E14-1 マウスＥＳ細胞（１．２５×１０７個）にエレクトロポレーション法によって遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞を、抗生物質Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）を含むＥＳ細胞用培地（１５％牛胎児血清（ＦＢＳ）−ＤＭＥＭ）中、３７℃で培養し、組換えクローンを選択した。
【００７０】
選別された４５０個のＧ４１８耐性クローンを拡張培養し、以下の条件でＰＣＲを行ない、初期変異型組換えクローンを同定した。すなわち、Ｎｅｏカセットの５’末端領域に対するフォワードプライマー（下記の表１に示すＦプライマー）および相同組換え領域外の３’末端側配列に対するリバースプライマー（下記の表１に示すＲプライマー）を用いて、「９４℃ ３０秒、６２℃ ３０秒、７２℃ ２分３０秒」を３５サイクル行なうＰＣＲ反応（ＤＮＡポリメラーゼ：ＬＡ−Ｔａｑ（タカラバイオ社））により、２ｋｂｐの相同組換え体由来フラグメントのみを増幅させた。
【００７１】
【表１】
2011217667.tif 000003
【００７２】
適切に相同組換えされた初期変異型ＥＳ細胞に、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現アデノウイルスを感染させ、エクソン１およびＮｅｏ発現カセットを欠失したノックアウト（ＫＯ）型組換えＥＳ細胞を得た。なお、得られたＫＯ型組換えＥＳ細胞については、以下の条件によるＰＣＲによって、同定した。すなわち、Ｃ２α遺伝子のエクソン１内の領域に対するフォワードプライマー（下記の表２に示すＦ１プライマー（配列番号：３））、Ｃ２α遺伝子のエクソン１の下流イントロン内の領域に対するリバースプライマー（下記の表２に示すＲ１プライマー（配列番号：４））、およびＣ２α遺伝子のエクソン１の上流Ｃｒｅ配列に対するフォワードプライマー（下記の表２に示すＦ２プライマー（配列番号：５））を用いて、「９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ３０秒」を３５サイクル行なうＰＣＲ反応（ＤＮＡポリメラーゼ：Ｇｏ−Ｔａｑ（プロメガ社））により、２７８ｂｐのノックアウト型フラグメントを増幅させた。一方、初期変異型ＥＳ細胞にはもはやＣ２α遺伝子のエクソン１領域は存在しないため、Ｆ１プライマーとＲ１プライマーとで規定されるはずの増幅産物（４３２ｂｐ）は観察されなかった。
【００７３】
【表２】
2011217667.tif 000004
【００７４】
上記で得られたＫＯ型組換えＥＳ細胞を用いて、C57BL/6Jマウス（Jackson laboratories社）から得られた８細胞期胚との細胞集合（アグリゲーション）法によりキメラ胚を得た。得られたキメラ胚を、C57BL/6Jマウス雌の仮親マウスに着床して、キメラマウスを発生させた。キメラマウス雄と野生型C57BL/6Jマウス雌とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＣ２α遺伝子エクソン１領域が相同組換えにより欠損したＣ２αへテロ（＋／−）ＫＯマウスを得た。
【００７５】
胎児マウスおよび成体マウスのそれぞれについて、上記の表２に示す３つのＰＣＲプライマー（Ｆ１、Ｒ１、Ｆ２）（配列番号：３〜５）を用いて、遺伝子型を同定した。Ｆ１プライマーとＲ１プライマーとのセットを用いたＰＣＲでは、４３２ｂｐのＣ２α野生型バンドが検出された。一方、Ｆ２プライマーとＲ１プライマーとを用いたＰＣＲでは、２７８ｂｐのＫＯ型バンドが増幅された。
【００７６】
［Ｃ２α全身性ホモ（−／−）ＫＯマウスの作製］
上記で得られた第１世代（Ｆ１）のＣ２αヘテロＫＯマウスの雌雄を交配させ、第２世代（Ｆ２）を得た。第２世代のうち、Ｃ２αヘテロ（＋／−）ＫＯマウスおよび野生型（＋／＋）マウスは正常に出生した。一方、Ｃ２αホモ（−／−）ＫＯマウスは胎生致死であった。正常飼育下でのヘテロＫＯマウスは野生型と比較して、外見、体重、寿命、組織病理所見のいずれについても差異は認められなかった。
【００７７】
［Ｃ２α全身性ホモＫＯマウスの胎生期血管形成の異常］
上記で得られたＣ２α全身性ホモＫＯマウス、Ｃ２αヘテロＫＯマウスおよび野生型マウスのそれぞれについて、胎児の組織サンプルを抗Ｃ２α抗体（ＢＤ社）を用いたウエスタンブロット解析を行なった。その結果、ホモＫＯマウスではＣ２αタンパク質のバンドは全く検出できなかった。また、ヘテロＫＯマウスではＣ２αタンパク質の発現量が野生型と比較して約５０％であることが確認された。
【００７８】
同腹のＣ２αホモＫＯマウスおよび野生型マウスのそれぞれの胎児（胎生１１．５日目）を４％パラホルムアルデヒド液で組織固定した。次いで、血管内皮細胞マーカーである抗ＣＤ３１抗体を用いてホールマウント染色（ＤＡＢ発色法）を行なった。結果を図２に示す。図２に示すように、野生型マウスでは全身に血管網の構築が確認された。これに対し、ホモＫＯマウスでは、血管形成の著しい異常が見られた。
【００７９】
Ｃ２αホモＫＯマウスおよび野生型マウスのそれぞれについて、胎児を４％パラホルムアルデヒド液で組織固定し、パラフィン包埋、薄切後、組織切片を血管平滑筋マーカーである抗α平滑筋アクチン抗体により免疫組織化学染色（ＤＡＢ発色法）した。結果を図３に示す。図３に示すように、野生型マウスでは背側大動脈にα平滑筋アクチン陽性細胞が血管周囲を取り巻くように集積していた。これに対し、ホモＫＯマウスでは、ほとんどそれが認められなかった。
【００８０】
さらに、電子顕微鏡を用いてより詳細に解析を行なったところ、Ｃ２αホモＫＯマウスでは、血管平滑筋細胞の集積不全に加え、内皮細胞間接着構造の異常が認められた（図４、矢尻）。
【００８１】
［組織特異的Ｃ２ａコンディショナルノックアウト（ＣＫＯ）マウスの作製：図５］
胎生致死が確認された全身性Ｃ２αホモＫＯマウスの死因、およびＣ２ａの生理的役割を解析する目的で、以下の手法により組織特異的Ｃ２αＣＫＯマウスを作製した。
【００８２】
図１に記載の初期変異型（３ＬｏｘＰ型）組換えＥＳ細胞を用いて、C57BL/6Jマウス（Jackson Laboratories社）から得られた８細胞期胚との細胞集合（アグリゲーション）法によりキメラ胚を得た。得られたキメラ胚を、C57BL/6J雌マウスに着床して、キメラマウスであるＣ２α−３ＬｏｘＰ型へテロ変異マウスを発生させた。この３ＬｏｘＰ型へテロ変異マウスではＣ２α発現が野生型マウスと同等であり、正常に生育した。
【００８３】
上記で得られた３ＬｏｘＰ型へテロ変異マウス（生後８週齢雌；第１世代（Ｆ１））と、精子で弱くＣｒｅリコンビナーゼを発現しているＩｎｓ−Ｃｒｅトランスジェニック（Ｔｇ）マウス雄とを交配させて、Ｃ２α遺伝子のエクソン１領域が２つのｌｏｘＰ配列で挿まれる構造を持つＦｌｏｘ型ヘテロ変異（Ｃ２αｆｌｏｘ／＋）マウスを発生させた。なお、Ｆｌｏｘ型ヘテロ変異マウスの同定は、上記の表２に示す３つのＰＣＲプライマー（Ｆ１、Ｒ１、Ｆ２）（配列番号：３〜５）を用いて行なった。Ｆ１プライマーとＲ１プライマーとのセットを用いたＰＣＲにより、４８６ｂｐのＦｌｏｘ型バンドおよび４３２ｂｐの野生型バンドが区別されて検出された。
【００８４】
上記で得られたＦｌｏｘ型ヘテロ変異マウスは、正常に発生し、野生型と差異なく生育した。このＦｌｏｘ型ヘテロ変異マウスをC57BL/6Jとの交雑により１０世代バッククロスさせた後、Ｆｌｏｘ型へテロ変異マウスの雌雄を交配させ、Ｆｌｏｘ型ホモ変異（Ｃ２αｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）マウスを得た。
【００８５】
得られたＦｌｏｘ型ホモ変異マウス（生後８週齢）と組織特異的Ｃｒｅリコンビナーゼ発現Ｔｇマウスとを交配させることにより、組織特異的にＣ２αがノックアウトされた組織特異的ＣＫＯマウスを作製することができる。本実施例では、血管を構成する血管内皮細胞および血管平滑筋細胞、並びに心臓を構成する心筋細胞のそれぞれにおいてＣｒｅリコンビナーゼを特異的に発現するＴｇマウスを用いて、組織特異的ＣＫＯマウスを作製した。これらの組織特異的ＣＫＯマウスでは、それぞれ血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、および心筋細胞において選択的に、Ｃ２α遺伝子が欠失している。
【００８６】
［組織特異的ＣＫＯマウスの観察］
上記で作製した組織特異的ＣＫＯマウスのうち、血管内皮細胞特異的ＣＫＯマウス（Ｃ２α−ｅＣＫＯマウス）のみ、胎生期１２日頃から血管形成異常が見られ、出生前後に死亡した。一方、血管平滑筋細胞特異的ＣＫＯマウスや心筋細胞特異的ＣＫＯマウスは、同腹野生型マウスと同等に出生し、発育した。組織病理的所見についても同腹野生型マウスと差異は認められなかった。
【００８７】
Ｃ２α−ｅＣＫＯマウスについてより詳細に観察を行なったところ、胎生１２．５日頃において、皮膚血管からの出血が見られた（図６、ｉｉ、ｉｖ、ｖｉ、矢尻）。また、Ｃ２α−ｅＣＫＯマウスの胎児をホルマリン固定し、パラフィン切片についてヘマトキシリン・エオジン染色を行なった結果、皮膚血管に加えて、肺、肝臓、腎臓などの臓器においても、出血が観察された。出血が見られた皮膚血管を高解像度で観察するために、マウス胎児皮膚を剥離し、４％パラホルムアルデヒドで固定して、血管内皮細胞マーカーである抗ＣＤ３１抗体および血管平滑筋細胞マーカーである抗α平滑筋アクチン抗体による二重蛍光免疫ホールマウント染色を行なった。染色サンプルについて、高解像度共焦点レーザー顕微鏡を用いてＣ２α−ｅＣＫＯマウスの皮膚血管を観察した結果、野生型マウスと比較して、不完全な微小血管網の形成が見られ、さらに血管への平滑筋集積にも著しい異常が見られた（図７、ｉｉ、ｉｖ）。さらに、高解像度二重蛍光免疫ホールマウント染色法（抗ＶＥカドヘリン抗体＋抗ＮＧ２抗体二重染色）により皮膚毛細血管を観察したところ、内皮細胞間接着因子であるＶＥカドヘリンの局在および周皮細胞の形態における異常が観察された。
【００８８】
［Ｃ２α発現抑制血管内皮細胞を用いたin vitro解析］
ＲＮＡ干渉法を用いて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＣ２α発現を特異的に抑制できるin vitro実験系を構築した。
【００８９】
具体的には、市販の干渉ＲＮＡ合成キット（アンビオン社）を用いて、ヒトＣ２α遺伝子のｍＲＮＡ上の配列（５’−ＡＡＧＧＵＵＧＧＣＡＣＵＵＡＣＡＡＧＡＡＵ−３’（配列番号：６））を標的とする干渉ＲＮＡ（Ｃ２α−ｓｉＲＮＡ）を合成した。この合成Ｃ２α−ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）を市販の遺伝子導入試薬リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いてＨＵＶＥＣ細胞に導入して、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞を構築した。このＣ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞を４８時間通常培養した後、抗Ｃ２α抗体を用いたウエスタンブロット法によりＣ２αタンパク質発現量を調べた。その結果、Ｃ２α−ｓｉＲＮＡを導入したＨＵＶＥＣ細胞では、コントロール干渉ＲＮＡ（スクランブル配列：ｓｃ−ｓｉＲＮＡ）を導入したＨＵＶＥＣ細胞（コントロールＨＵＶＥＣ細胞）に比べて、Ｃ２αタンパク質の発現量が約９５％抑制されていた。
【００９０】
Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞においては、コントロールＨＵＶＥＣ細胞と比較して、細胞増殖、細胞接着および細胞遊走能が有意に減弱していた。さらに、in vitro系での血管新生評価法であるマトリゲル・アッセイ法を用いてＶＥＧＦに対する管腔形成能を評価したところ、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞においては、管腔長および管腔分岐点数が有意に減少していた（図８）。
【００９１】
ここで、Ｃ２αは細胞内のエンドソームおよびトランスゴルジ・ネットワーク（ＴＧＮ）上で、ホスファチジルイノシトール（３）リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ）を生成することが知られている。このＰｔｄＩｎｓ（３）ＰはエンドソームやＴＧＮにおいて、膜輸送に深く関与していることが知られている。なお、エンドソームは、新しく作られたタンパク質をゴルジ装置から細胞膜や他のオルガネラへ輸送したり、細胞膜からのエンドサイトーシスを経てリソソームでの分解系へとタンパク質を輸送したり、リサイクリングによる細胞膜への再輸送、ホルモンなどの放出を担うエキソサイトーシスなどにも関与するなど、細胞内膜輸送の中継地点として機能することが知られている。
【００９２】
そこで、細胞内ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ蛍光プローブであるｍＲＦＰ−２ＸＦＹＶＥドメイン発現プラスミドを、コントロールＨＵＶＥＣ細胞およびＣ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞にそれぞれＡｍａｘａエレクトロポレーション法（Ｌｏｎｚａ社）により遺伝子導入し、生細胞におけるＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ局在をリアルタイム共焦点レーザー顕微鏡（横河電機−オリンパス社製）を用いて経時観察した。また、陽性対照として、Ｃ２α以外のＰＩ３Ｋファミリーであるｐ１１０α（クラスＩ）またはＶｐｓ３４（クラスＩＩＩ）がそれぞれノックダウンされたＨＵＶＥＣ細胞を用いて同様の実験を行なった。結果を図９に示す。図９に示すように、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞においてはＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ陽性エンドソームの著しい減少が観察された。一方、コントロールＨＵＶＥＣ細胞やｐ１１０α（クラスＩ）またはＶｐｓ３４（クラスＩＩＩ）のノックダウンＨＵＶＥＣ細胞では変化が確認されなかった。
【００９３】
［Ｃ２α発現抑制内皮細胞の細胞内形態異常］
Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞を４％パラホルムアルデヒド固定後、抗トランスゴルジ・ネットワーク（ＴＧＮ）抗体（ＢＤ社）を用いた免疫蛍光染色法により観察した。結果を図１０に示す。図１０上段に示すように、コントロールＨＵＶＥＣ細胞と比較して、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞ではＴＧＮ構造の拡大が見られた。なお、ｐ１１０α（クラスＩ）またはＶｐｓ３４（クラスＩＩＩ）のノックダウンＨＵＶＥＣ細胞はコントロールＨＵＶＥＣ細胞と同様の構造を示したことから、Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞のみにおいて特異的に構造変化が生じたものと思われる。また、このＴＧＮの構造変化は、電子顕微鏡観察による詳細な観察においても同様に認められた（図１０、矢尻）。エンドソームおよびＴＧＮ上のＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐは、細胞内小胞輸送系において重要な脂質であるが、Ｃ２αの発現が抑制された細胞では、エンドソームを介するＴＧＮ−細胞膜間の輸送システムが著しく阻害されており、このことが結果的にＴＧＮ構造の乱れをもたらしているものと考えられる。
【００９４】
［Ｃ２αノックダウンＨＵＶＥＣ細胞におけるＶＥカドヘリン局在異常］
４％パラホルムアルデヒド固定したＨＵＶＥＣ細胞について、内皮細胞間接着分子ＶＥ−カドヘリンの局在を抗ＶＥ−カドヘリン抗体を用いた免疫蛍光染色法により調べた。その結果、Ｃ２αノックダウン細胞においては、ＶＥ−カドヘリンの内皮細胞間での局在化が著しく障害され、細胞間隙が多く見られた（図１１）。なお、後述するように、Ｃ２αノックダウン細胞では実際に血管透過性が著しく亢進していた。
【００９５】
低分子量Ｇタンパク質であるＲｈｏＡは、細胞骨格を構築する上で必須なアクチン繊維（F-actin）の形成および再構築に重要な役割を果たしていることが知られている。活性型ＲｈｏＡ（ＧＴＰ型−ＲｈｏＡ）を認識する抗ＧＴＰ−ＲｈｏＡ抗体を用いた免疫蛍光染色法による観察から、Ｃ２αノックダウン細胞でのみ、通常の培養条件下（＋ＥＢＭ２）で見られるＲｈｏＡの活性化が著しく抑制された（図１２、左から２番目の写真）。また、細胞間接着を維持する上で重要なアクチン束の形態に異常が見られることが、F-actinを標識するAlexa594-ファロイジン染色により認められた。
【００９６】
Ｃ２αノックダウン細胞で見られたＲｈｏＡ活性の低下は、ＲｈｏＡ活性化に必須の修飾反応であるゲラニル化の減弱によることが判明した。そこで、ＨＵＶＥＣ細胞に不活性型ＲｈｏＡ変異体を強制発現したところ、ＶＥ−カドヘリンの細胞間局在が完全に消失した。一方、Ｃ２αノックダウン細胞において、活性化型ＲｈｏＡ変異体導入によりＶＥ−カドヘリンの細胞間局在が部分的に回復した。さらに、不活性型Ｃ２α変異体（１２６８番目のアスパラギン酸をアラニンに点置換→ＡＴＰが結合せず、リン酸化活性を失う変異体）をＨＵＶＥＣ細胞に導入することにより、ＶＥ−カドヘリンの細胞間局在が障害された。これらの結果から、Ｃ２αによるＲｈｏＡ活性は、ＶＥ−カドヘリンの細胞間局在化に関与することが示唆された。
【００９７】
［ＶＥＧＦによる皮膚血管透過性の亢進］
上述したように、Ｃ２αタンパク質発現レベルが約５０％であるＣ２αヘテロＫＯマウス（Ｃ２α＋／−）は正常に出生し、通常の飼育下では正常に発育する。このＣ２αヘテロＫＯマウスに対してエバンス・ブルー色素を用いたマイルズアッセイ法を適用し、Ｃ２αヘテロＫＯマウスにおける血管透過性を調べた。具体的には、生理食塩水に溶かした市販の２％エバンス・ブルー色素（フルカ社）５０μＬをマウス尾静脈に投与し、２０分後にマウス背部の皮下に市販のＶＥＧＦ（ペプロテック社、１００ｎｇ／ｍＬ）１００μＬ、またはコントロールとしてＰＢＳ緩衝液１００μＬを注入した。２０分後、背部の薬剤注入部を含む皮膚を切除し、ホルムアミド液を用いて５５℃にて一晩、エバンス・ブルー色素を抽出した後、分光光度計によりエバンス・ブルー量を定量した。その結果、Ｃ２αヘテロＫＯマウスでは、血管外へのエバンス・ブルー色素の漏出が野生型マウスの約２倍に増加することが確認され、血管透過性の亢進が認められた（図１３）。
【００９８】
［アナフィラキシー・ショックモデル］
アナフィラキシー・ショックは、異常免疫反応により活性化された肥満細胞などから放出されたヒスタミンや血小板活性化因子（ＰＡＦ）により引き起こされる。具体的な病態としては、血管拡張や血漿成分の血管外への漏出などが見られ、その結果として血圧が急激に低下して、種々のショック症状を呈するというものである。
【００９９】
このアナフィラキシー・ショックを誘発する目的で、ＰＡＦを１２μｇ／ｋｇの用量でＣ２αヘテロＫＯマウスまたは野生型マウスの尾静脈に全身麻酔下でそれぞれ投与した。その結果、Ｃ２αヘテロＫＯマウスのみが約３５分以内に全例でショック死した。また、死亡直後のＣ２αヘテロＫＯマウスにおけるヘマトクリット値は、野生型マウスよりも有意に高い値を示した（図１４）。
【０１００】
［アンジオテンシンＩＩにより誘発される動脈瘤の形成］
Ｃ２αヘテロＫＯマウスに血管障害ホルモンであるアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ、１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を浸透圧ポンプ（アルゼット社製）により２週間持続的に全身投与した。そうしたところ、約４８％のＣ２αヘテロＫＯマウスにおいて大動脈瘤の形成が見られ、約３０％のヘテロＫＯマウスは大動脈瘤の破裂により出血死した（図１５上段）。一方、野生型マウスでは、大動脈瘤形成は約１１％であり、死亡率は５％にとどまった。ヘテロＫＯマウスで観察された大動脈瘤の多くは、偽腔を伴う解離性大動脈瘤であり（図１５下段）、Ｍａｃ３陽性マクロファージが血管外膜へ動員され、炎症が惹起されていた。血管外膜での炎症性マクロファージは、タンパク質分解酵素 Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）を産生し、血管壁の細胞外基質分解を引き起こす。本発明者らによる検討においても、Ｃ２αヘテロＫＯマウスにおいては、ＡｎｇＩＩ投与により大動脈のＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９の酵素活性が、野生型マウスと比較して顕著に増強されていた（図示せず）。さらに、ＡｎｇＩＩ投与されたＣ２αヘテロＫＯマウスにおいても、ＶＥ−カドヘリンからなる内皮細胞間接着構造の異常が観察され、これを裏付けるように、エバンス・ブルー色素法による観察でも野生型マウスと比して血管透過性が有意に亢進していることが示された。
【０１０１】
［考察］
以上の各実験結果から、血管形成におけるＣ２αの生理的役割として、１）内皮細胞のエンドソームおよびＴＧＮにおけるＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ産生を介した細胞内膜輸送の調節、２）ＶＥ−カドヘリン膜輸送とＶＥ−カドヘリン結合の安定化の２つの細胞内メカニズムに対する関与が示唆された。つまり、Ｃ２αは、上記の２つのメカニズムを介することで、「内皮細胞間接着の緊密化による血管透過性抑制」に必須の役割を担っているものと考えられる。
【０１０２】
胎生期血管形成において、Ｃ２αは内皮細胞の分岐や壁細胞動員による血管成熟といった血管新生に必須のＰＩ３Ｋであり、他のＰＩ３Ｋファミリーとはまったく異なったメカニズムで血管形成および恒常性維持を支える酵素である。Ｃ２α機能の異常は、血管内皮細胞の機能異常、特に血管透過性亢進、炎症反応の惹起、ひいては血管構造の破綻を招くことになり、動脈瘤、動脈硬化、浮腫、アナフィラキシー・ショック等多くの血管形成（脈管形成および／または血管新生）に関連した疾患および／または症状の発現に関与する可能性が高い。本願により提供されるＣ２αノックアウト非ヒト動物は、これら血管形成に関連した疾患・症状の病態生理を把握する上で新しいモデル動物として、基礎研究のみならず臨床的にも貴重な生物資源となる。また、このモデル動物を用いることで、上記疾患・症状を治療および／または予防することができる候補物質を個体レベルでスクリーニングすることも可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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