(57)【要約】【課題】    本発明は、基材に固定化された糖鎖分子を簡便に検出する方法と、それに基づいた糖鎖検出基材を提供することを目的とする。【解決手段】    基材上に固定化した糖鎖分子を測定する糖鎖測定用基材であって、固定化糖鎖を糖鎖染色法により測定することを特徴とする糖鎖測定用基材と、その測定方法であり、過ヨウ素酸シッフ反応が好適な糖鎖染色法である。本発明によれば、チップ上などに固定化された糖鎖分子を簡便に測定でき、それに基づく糖鎖測定チップの提供が可能となる。また、糖鎖固定化基材などの品質管理に用いることも可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上に固定化した糖鎖分子を測定する糖鎖測定用基材であって、
固定化糖鎖を糖鎖染色法により測定すること
を特徴とする糖鎖測定用基材。
【請求項２】
前記糖鎖染色法が過ヨウ素酸シッフ反応による染色法である糖鎖測定用基材。
【請求項３】
前記マイクロチップが、ガラス、プラスチックからなる請求項１または２記載の糖鎖測定用基材。
【請求項４】
請求項１記載の基材が、チップ、アレイ、プレート、チューブ、メンブランシートまたはビーズであることを特徴とする糖鎖測定用基材。
【請求項５】
請求項１から４いずれか記載の糖鎖測定用基材において、過ヨウ素酸シッフ反応による染色法を用いた糖鎖測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材上に固定化した糖鎖分子を測定する糖鎖測定用基材であって、
固定化糖鎖を糖鎖染色法により検出する糖鎖チップと、該糖鎖の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精などのかかわりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
また、糖鎖は多くの毒素、ウィルス及びバクテリアなどの受容体であり、また、癌のマーカーとしても注目されており、こちらの分野においても、同様に新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。
【０００３】
しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。
【０００４】
現在、糖鎖の測定方法としては（例えば特許文献１）、酵素処理や化学処理により切り出した糖鎖を電気泳動し分析する方法や、ＨＰＬＣやＴＯＦ−ＭＡＳＳを用いた単糖組成分析法が良く用いられている。また、レクチンを用いてレクチン結合糖鎖を測定する方法（特許文献２）など、糖鎖構造や機能に特化して測定する方法が良く用いられている。
【０００５】
しかしながら、これらの方法は、処理に熟練を要する、測定機器が効果である、最終結果が出るまでに時間を要すること、特定の糖鎖構造しか測定することができない可能性がある、などの欠点がある。
【０００６】
特に、ある分子群（例えば糖鎖に対する抗体やレクチン）と糖鎖の相互作用を調べる上において、単純にその分子と糖鎖との結合の有無を見る場合においては、前記方法による測定は過大すぎると言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５７−２０６６９４号公報
【特許文献２】特開平７−８３９２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、基材に固定化された糖鎖分子を簡便に測定する方法と、それに基づいた糖鎖測定用基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような目的は、下記（１）〜（５）に記載の本発明により達成される。
（１）基材上に固定化した糖鎖分子を測定する糖鎖測定用基材であって、
固定化糖鎖を糖鎖染色法により測定すること
を特徴とする糖鎖測定用基材。
（２）前記糖鎖染色法が過ヨウ素酸シッフ反応による染色法である糖鎖測定用基材。
（３）前記マイクロチップが、ガラス、プラスチックからなる（１）または（２）記載の糖鎖測定用基材。
（４）（１）記載の基材が、チップ、アレイ、プレート、チューブ、メンブランシートまたはビーズであることを特徴とする糖鎖測定用基材。
（５）（１）から（４）いずれか記載の糖鎖測定用基材において、過ヨウ素酸シッフ反応による染色法を用いた糖鎖測定方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、チップ上などに固定化された糖鎖分子を簡便に検出でき、それに基づく糖鎖検出チップの提供が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、糖鎖測定に用いる基材である、チップ、プレート、チューブ、メンブレンまたはビーズ上に捕捉、または固定化された糖鎖を測定する方法であって、糖鎖の種類に関係なく糖鎖構造を有している糖鎖の存在を測定することを可能とするものである。
【００１２】
本発明における糖鎖の測定は、糖鎖の構造まで解析する必要はなく、染色法により糖鎖の存在の有無を測定するだけでよい。
【００１３】
こうした糖鎖の染色法としては、過ヨウ素シッフ反応、ヨウ素デンプン反応、セリワノフ反応などがあり、どの方法を用いてもかまわないが、検出感度が高い過ヨウ素シッフ反応を用いることが好適である。
【００１４】
過ヨウ素シッフ反応を用いる染色法には二つの方法がある。最初の方法は、過ヨウ素酸が糖鎖の隣り合う二つのヒドロキシル基の間を切断し、生成するアルデヒドがシッフ試薬と反応して赤色を提色する反応である。
【００１５】
具体的な過ヨウ素酸シッフ試薬反応手順は、以下の通りである。
（１）基材を０．５％過ヨウ素酸水溶液に２時間浸漬。
（２）前記基材を０．５％ヒ酸ナトリウム−酢酸溶液に３０分浸漬。
（３）前記基材を０．１％ヒ酸ナトリウム−酢酸溶液に３０分浸漬。            
（４）前記基材をシッフ試薬に浸漬。一晩反応。
（５）０．６％ピロ亜硫酸ナトリウム含有０．１Ｍ塩酸で洗浄。                      （６）洗浄液にホルムアルデヒドを添加して、洗浄液が赤変しなくなるまで洗浄。
赤色染色が存在すれば糖鎖が存在と判断。
【００１６】
前記方法では、特別な測定装置を必要とすることなく、目視により結果を得ることができる。
【００１７】
もう一方の方法は、生じたアルデヒド基とシッフ塩基を形成することができる標識化合物を結合させ測定する方法である。前記シッフ塩基を形成できる化合物としては、一級アミン（ヒドラジド、アミノオキシ基を含む）を化合物が好ましい。
また、標識物質としては、ビオチンや蛍光標識試薬などの低分子物質を用いることが可能である。
具体的には、基材上の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生じたアルデヒド基をビオチンヒドラジド基と結合させて、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素標識アビジンで増感して発色させる、または、蛍光標識アビジンで発光させる方法がある。
前記、酵素標識、または蛍光標識による測定方法が、試薬の入手、検出反応の確実性において好適である。
【００１８】
本発明において、糖鎖を捕捉、または固定化する基材は、特に限定しないが、例えば、チップ、アレイ、プレート、チューブ、メンブランシートまたはビーズ形状のものが好ましい。
【００１９】
前記基材に捕捉、固定化される糖鎖の、捕捉、固定化の形態は特に限定するものではないが、以下の捕捉、固定化方法が好ましい。
まず、基材表面に糖鎖の捕捉、固定化用の官能基を有する基材が挙げられる。具体的には、基材表面に、一級アミノ基を有する高分子化合物をコーティングし、糖鎖側の末端を還元、アルデヒド基を生成させて一級アミノ基と共有結合させる方法がある。
一級アミノ基を有する高分子化合物としては、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミンの一級アミンを主鎖中に有する高分子化合物や、側鎖にアミノ基を有するポリリジン、ポリオルニチンのポリアミンを使用することができる。好適には、側鎖に一級アミノ基を有するモノマー、側鎖に親水性基を有するモノマー、基材と固相化するための疎水基を有するモノマーを共重合させた高分子化合物を好適に用いることができる。この高分子化合物は、糖鎖捕捉のための一級アミノ基と夾雑物の非特異的吸着防止のための親水性基を有しており、確実に糖鎖のみを固定化することが可能である。
【００２０】
前記高分子化合物は、具体的には、下記一般式〔１〕で表される高分子化合物を好適に用いることができる。
【００２１】
【化１】
2011214997.tif 000002
式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚは酸素原子またはＮＨである。ｌ、ｍ、ｎは自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
また、式〔１〕中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は水素原子またはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。
【００２２】
ホスホリルコリン基を有するモノマーの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、高分子の全モノマーに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、１０〜８０％である。組成比が下限値を下回ると親水性が弱くなり非特異吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中に高分子化合物が溶出してしまう可能性がある。
【００２３】
本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するモノマーの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｍの比率）は、高分子の全モノマーに対して、１０〜９０ｍｏｌ％が好ましくより好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜８０％である。上限値を上回ると非特異吸着が増加する恐れが出てくる。
【００２４】
具体的には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−N-[2-[2-[2-(t-ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ]エトキシ]エチル]-メタクリルアミド共重合体を用いることが好ましいがこの高分子化合物に限定するものではない。
【００２５】
次に、基材表面に糖鎖の捕捉に関連する機能分子が固定化されている基材が挙げられる。具体的には、糖鎖に対する抗体やレクチン分子を基材表面に固定化することにより、糖鎖捕捉用の基材を作製することができる。この場合、使用する抗体、レクチン分子中に糖鎖が存在していると、捕捉分子の方で糖鎖染色反応が発生するので、分子中の糖鎖を除去しておく必要がある。
【００２６】
例えば、抗体、レクチンをヒドラジン、またはアルカリ処理して糖鎖を脱離させる方法や、Ｎ−グリカナーゼおよびＯ−グリカナーゼを用いて糖鎖を外す方法も用いることができる。こちらの方法は穏和な条件で酵素処理を行うので、捕捉分子に対する影響が少なく好適である。
また、抗体の場合は、抗体そのものでなくバクテリオファージ表面提示技術を用いたファージディスプレイを用いることも可能で、この方法では抗体相当分子が糖鎖を含まず、また、ファージディスプレイ作製用のキットも多数市販されていることから、汎用性が高い。
【００２７】
本発明において、基材上に固定化される糖鎖は、特に限定するものではないが、血液、体液や組織抽出物などの生体由来物質でもあっても、化学合成により生成された糖鎖化合物であってもよい。
また、含まれる糖鎖の形状は、糖、単糖、２糖以上の糖類、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、グリコサアミノグリカン、グリコシルハスファチジルイノシトール、ペプチドグリカン、リポ多糖、又はそれたの誘導体、そしてこれらを含む生体由来物質から選ばれる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
＜実施例＞  ＰＡＳ法によるマイクロアレイ上の糖鎖検出
(糖鎖固定化マイクロアレイの作製)
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
【００３０】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−N-[2-[2-[2-(t-ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ]エトキシ]エチル]-メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ  ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、Ｂｏｃ基を脱保護した。
【００３１】
（糖鎖の固定化）
５種類の糖鎖（ＥＬＩＣＩＴＹＬ社、ＧＬＹ０１０、ＧＬＹ０２１、ＧＬＹ０２２、ＧＬＹ０５０、ＧＬＹ０５４）を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、基板上にスポットした後に８０℃で１時間反応させて基板に糖鎖を固定化した。
溶液：１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００））
固定化後、基板を純水で洗浄し、乾燥した。
【００３２】
（固定糖鎖の検出）
過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬、１９７−０２４０２）を純水で１０ｍｇ／ｍＬに調製し、基板を該溶液に浸して３７℃で３０分静置した。反応後、基板を純水で洗浄し、乾燥した。
ビオチンヒドラジド（ＳＩＧＭＡ、Ｂ７６３９）を３００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で０．１ｍｇ／ｍＬに調製し、基板を該溶液に浸して３７℃で３０分静置した。反応後、基板を純水で洗浄し、乾燥した。
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００１）を下記溶液で２μｇ／ｍＬに調製し、室温で１時間、基板上に反応させた。
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、
１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
【００３３】
反応後、下記溶液で洗浄後に、更に純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、
１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
【００３４】
測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６０）
【００３５】
結果を下表に示す。
【表１】
2011214997.tif 000003
【００３６】
＜比較例＞  レクチンとの結合によるマイクロアレイ上の糖鎖検出
(糖鎖固定化マイクロアレイの作製)
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−N-[2-[2-[2-(t-ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ)エトキシ]エトキシ]エチル]-メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液にスライドを浸漬して高分子化合物を塗布した。
塗布後、２Ｍ  ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、Ｂｏｃ基を脱保護した。
【００３７】
（糖鎖の固定化）
５種類の糖鎖（ＥＬＩＣＩＴＹＬ社、ＧＬＹ０１０、ＧＬＹ０２１、ＧＬＹ０２２、ＧＬＹ０５０、ＧＬＹ０５４）を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製し、基板上にスポットした後に８０℃で１時間反応させて基板に糖鎖を固定化した。
溶液：１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｂｕｆｆｅｒ(ｐＨ５．０)＋界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００））
【００３８】
（固定糖鎖の検出）
フコースと特異的に結合するレクチンであるＡＡＬレクチンのビオチン標識体であるＢｉｏｔｉｎ標識ＡＡＬレクチン(生化学バイオビジネス社、３００４０６)を下記溶液で１００ｕｇ／ｍＬに調製した。
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、
１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
【００３９】
基板上に溶液を反応させ、室温で２時間反応した。
反応後、下記溶液で洗浄後に、更に純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、
１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
【００４０】
Ｃｙ３−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＧＥヘルスケア、ＰＡ４３００１）を下記溶液で２μｇ／ｍＬに調製し、室温で１時間、基板上に反応させた。
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、
１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
【００４１】
反応後、下記溶液で洗浄後に、更に純水で洗浄し、基板を乾燥させた。
溶液：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、
１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
【００４２】
測定はＸ−１００マイクロアレイリーダー、ＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製）を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。（Ｌａｓｅｒ＝９０、ＰＭＴ＝６０）
【００４３】
結果を下表に示す。
【表２】
2011214997.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明を用いることにより基材に固定化された糖鎖分子を簡便に検出する方法と、それに基づいた糖鎖検出基材を提供することができる。また、糖鎖固定化基材などの品質管理に用いることも可能である。