(57)【要約】【課題】ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出をフローサイトメーターで行う手段において、より簡便で、その検出感度を更に高めること。【解決手段】ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラチノサイト及びメラノーマを培養する工程、
メラノーマ培養液から、メラノソームを抽出する工程
ケラチノサイト培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに
フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、
を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法。
【請求項２】
共培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項４】
標識が蛍光標識である、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該共培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、
被験化合物を添加する工程、
培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、
フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、ならびに
メラノソームの検出量が対照と比較して減少していることを確認する工程、
を含む、メラノソーム取り込み阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
標識が蛍光標識である、請求項７〜１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、請求項７〜１１いずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、請求項７〜１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
該共培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチノサイトが取り込むメラノソームを検出する方法およびかかる方法を用いてメラノソーム取り込み阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の色素沈着（皮膚黒化）は、表皮基底層にあるメラノサイト内のメラノソームと呼ばれる小器官（オルガネラ）の中でメラニンの合成が盛んになり、周囲の表皮角化細胞（以下、ケラチノサイトと称す）にメラニンが輸送され、ケラチノサイト中に貯蔵されることによって起こる。
【０００３】
例えば、日焼けによる色素沈着の機序は、（１）Ｂ紫外線がメラノサイトのチロシナーゼ活性を上昇させてメラニンの合成量が増加する、（２）Ｂ紫外線に暴露されたケラチノサイトが種々のメラノサイト活性化因子を放出しそれによってメラノサイトがメラニンの合成亢進や増殖促進する、（３）生成されたメラノソームがケラチノサイトに輸送されて起こる（例えば、非特許文献１などを参照）。
【０００４】
色素沈着のこのような機序から見出された美白剤としては、メラニンの生成を抑制するためのチロシナーゼ阻害剤、メラニンの増殖抑制剤、メラノサイト活性化因子の阻害剤、メラノソームのケラチノサイトへの輸送抑制剤などが挙げられる。
【０００５】
これまで、上記（３）に関する研究は不十分であった。その理由は、ケラチノサイトがメラノソーム取り込みを測定する手段が近年になってようやく開発されてきたためであり、当該手段としては、現在までにいくつかの方法が開示されてきている（例えば、特許文献１、２、３などを参照）。
【０００６】
特許文献１には、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養し、これに異なる色で標識したメラノソーム特異抗体およびケラチノサイト特異抗体を結合させた後、二重に染色された画像を解析する方法が開示されている。さらにこの検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能になることが記載されている。
【０００７】
特許文献２には、蛍光標識したケラチノサイトと非標識メラノサイトを共培養し、これに蛍光標識メラノソーム特異抗体を結合させた後フローサイトメーターを用いて解析する方法が開示されている。さらにこの検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能になることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−２４９３９０号公報
【特許文献２】特開２００５−２４９３９１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】フレグランスジャーナル  臨時増刊 No.18 2003
【非特許文献２】Pigment Cell Res. Vol.18 No.5 2005 p.370-381
【非特許文献３】Pigment Cell Melanoma Res. Vol.23 No.1 2010 p.129-133
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のような画像解析によりメラノソーム輸送を検出する方法は、専用のソフトやその解析手段が煩雑であり、ケラチノサイトを直接蛍光標識してメラノソーム輸送を検出する方法は、細胞増殖能が低下し、検出感度が低下してしまうという問題がある。またケラチノサイト単独培養でのメラノソーム取り込み量測定においても、メラノソームをメラノーマ細胞から単離の操作が煩雑で、検出方法として未だ充分とは言えず、より簡便で検出感度の高い方法の開発が望まれている。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、従来の検出方法のもつ課題を解決し、より簡便で、且つ、検出感度を向上させた方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究をすすめてきた。その結果、メラノーマ培養液中にメラノソームが放出されることから、ケラチノサイト培養中に、メラノーマ培養液を濃縮し添加、その後、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体（以下、単に「標識ケラチノサイト結合抗体」という場合がある。）、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体（以下、単に「標識メラノソーム結合抗体」という場合がある。）（この標識は標識ケラチノサイト結合抗体の標識とは異なる標識である。）を添加し、次いでフローサイトメーターによりケラチノサイト中のメラノソームを検出することによって、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みを簡便に検出できることを見出した。
【００１３】
さらに、PAR-2アゴニストを添加することによって、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度が著しく向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、ならびに、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法、
（２）培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、（１）に記載の方法、
（３）添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、（２）に記載の方法、
（４）標識が蛍光標識である、（１）〜（３）いずれか１項に記載の方法、
（５）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（１）〜（４）いずれか１項に記載の方法、
（６）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（１）〜（５）いずれか１項に記載の方法、
（７）該共培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、（１）に記載の方法、
（８）ケラチノサイトを培養しメラノソームを添加する工程、被験化合物を添加する工程、培養後に、ケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体、および、メラノソームに特異的に結合する標識された抗体であって、該標識がケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体の標識とは異なる標識である抗体、を添加する工程、フローサイトメーターにより該抗体が結合したケラチノサイト中の該抗体が結合したメラノソームを検出する工程、ならびに、メラノソームの検出量が対照と比較して減少していることを確認する工程、を含む、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニング方法、
（９）培養する工程において、PAR-2アゴニストを添加する工程を含む、（８）に記載の方法、
（１０）添加されるPAR-2アゴニストの濃度が10〜100μMである、（９）に記載の方法、
（１１）標識が蛍光標識である、（７）〜（１０）いずれか１項に記載の方法、
（１２）ケラチノサイトに特異的に結合する抗体の標識がフルオレセインイソチオシアナートである、（７）〜（１１）いずれか１項に記載の方法、
（１３）メラノソームに特異的に結合する抗体の標識がフィコエリスリンである、（７）〜（１２）いずれか１項に記載の方法、ならびに
（１４）該培養液中にPAR-2アゴニストを添加することにより、ケラチノサイトのメラノソーム取り込みの検出感度を向上させたことを特徴とする、（８）に記載の方法、
である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来のメラノソーム輸送の検出方法より簡便な操作により、正確にケラチノサイトのメラノソーム取り込み量を測定できるとともに、その検出感度が大幅に向上する。これによって、大量かつ正確にメラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】フローサイトメーターによるケラチノサイトのメラノソーム取り込みの結果を示す図である。
【図２】PAR-2アゴニスト未処理、または処理したケラチノサイト抗メラノソーム抗体を取り込んだ細胞数の割合を示したヒストグラムである。図１の右上四角部分の細胞数をカウントし、全体細胞数に対する割合を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、（１）培養中にメラノソームを添加する工程、（２）培養後に抗体を添加する工程、および（３）メラノソームを検出する工程、を含む、ケラチノサイトが取り込んだメラノソームを検出する方法であり、以下、各工程について詳細に説明する。
【００１８】
（１）培養工程
本発明において用いられるケラチノサイトとしては、哺乳動物のケラチノサイトであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトケラチノサイト、より好ましくは、ヒト正常ケラチノサイト、さらにより好ましくは、メラノソームを有さないヒト正常ケラチノサイトである。かかるケラチノサイトは、例えば、クラボウ社、Cascade Biologics社、Lonza社、コスモ・バイオ社などから市販されている。
【００１９】
本発明に用いられるメラノーマとしては、哺乳動物のメラノーマであれば特に限定されないが、好ましくは、ヒトメラノーマである。かかるメラノーマは、例えば、MNT-1細胞、B16細胞である。B16細胞は理化学研究所バイオリソースセンターより購入可能である。
【００２０】
本発明における培養は、当該分野で公知の方法で行うことができる。例えば、各培養をそれぞれ継代培養した後に、片方の培養液を抽出し、もう一方の培養した細胞に培養液交換時に添加すればよい。
【００２１】
共培養における培養条件などは、細胞培養可能であれば特に限定されないが、例えば、黒木登志夫  他２名  編、「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、株式会社  羊土社、1995年3月20日、p.63-74、渡邊利雄著、「バイオ実験イラストレイテッド  ６  すくすく育て  細胞培養」、第１版第５刷、株式会社  秀潤社、2001年7月15日、p.45-99などを参照することができる。培養期間は、ケラチノサイトがメラノソームを取り込むのに十分な期間であれば特に限定されないが、５〜７日間が好ましい。
【００２２】
メラノソーム添加時の培養に使用される培地としては、細胞培養可能な培地であれば特に限定されないが、例えば、Medium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地などが挙げられる。
【００２３】
なお、培養前に各細胞を継代培養する際に使用される培地としては、各細胞の培養が可能な培地であれば特に限定されないが、ケラチノサイトの場合、Medium 154S（クラボウ社）にHKGS（クラボウ社）を加えた培地など、メラノーマの場合、DMEM（Sigma社）にFBS（DSファーマバイオメディカル）10% ストレプトマイシン（GIBCO社） 100 μg/mL, ペニシリン（GIBCO社） 100 U/mL, アンホテリシンB 2.5 μg/mL(Sigma社)を加えた培地などが挙げられる。
【００２４】
本発明における培養工程は、検出感度をさらに向上させる観点から、PAR-2アゴニストを添加する工程を含むことが好ましい。
【００２５】
本発明で使用されるPAR-2アゴニストとしては、ペプチドH-Ser-Ler-Ile-Gly-Lys-Val-NH2などが挙げられるが、例えば、AnaSpec社から市販されているPAR-2アゴニストを用いればよい。添加されるトリプシン濃度が10〜100μMであることが好ましい。
【００２６】
培養工程においてPAR-2アゴニストを添加する工程を含む場合、PAR-2アゴニスト非存在下で１〜３日間培養し、PAR-2アゴニストを添加して処理し、さらに２〜４日間培養することが好ましい。
【００２７】
（２）抗体結合工程
本発明に使用されるケラチノサイトに特異的に結合する標識された抗体とは、ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に標識が付された抗体をいう。ケラチノサイトに特異的に結合する抗体としては、例えば、抗サイトケラチン抗体などが挙げられ、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギなどの由来であってもよいが、マウス抗ヒトサイトケラチン抗体が好ましい。
【００２８】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に付される標識としては、当該分野で公知の蛍光標識が好ましく、フルオレセインイソチオシアナート（以下、単にFITCという場合がある）がより好ましい。
【００２９】
抗体への標識の付与は、当該分野で公知の方法により行うことができる。または、PROGEN Biotechnik社などから市販されている標識抗体を使用してもよい。
【００３０】
本発明に使用されるメラノソームに特異的に結合する標識された抗体とは、メラノソームに特異的に結合する抗体に標識が付された抗体をいう。メラノソームに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ヒト、マウス、ウサギなどの由来であってもよい。かかる抗体としては、例えば、マウス抗リコンビナントMelan-A抗体、マウス抗ヒトメラノソーム抗体HMB45、抗チロシナーゼ抗体、抗TRP2抗体、抗TRP1抗体などが挙げられ、マウス抗リコンビナントMelan-A抗体が好ましい。
【００３１】
ケラチノサイトに特異的に結合する抗体に付される標識としては、当該分野で公知の蛍光標識が好ましく、ケラチノサイトに付された標識とは異なる色を生じる蛍光標識が好ましい。蛍光標識の例としては、ローダミン、フィコエリスリン（以下、単にPEという場合がある）などが挙げられ、中でもPEが好ましい。
【００３２】
抗体への標識の付与は、当該分野で公知の方法により行うことができる。または、Santa Cruz社などから市販されている標識抗体を使用してもよい。
【００３３】
（３）メラノソームを検出する工程
本工程は、フローサイトメーターによってケラチノサイト中のメラノソームを検出する。検出方法としては、蛍光標識で検出されたケラチノサイト中のメラノソームが、ケラチノサイトとは異なる色の蛍光として定量される。
【００３４】
検出に使用される装置としては、Cell Lab Quanta SC MPL(ベックマンコールター社)などが挙げられる。
【００３５】
本発明のメラノソーム取り込み検出系を用いれば、メラノソーム輸送阻害剤のスクリーニングが可能である。例えばケラチノサイト培養時に被験物質を添加してメラノソーム検出量を測定し、被験物質非添加の場合（対照）のメラノソーム検出量と対比すれば、当該被験物質がメラノソーム輸送を阻害するか否かが判定できる。例えば、被験物質の添加によりメラノソーム検出量が対照と比較して減少していれば、その被験物質はメラノソーム輸送抑制能を有することがわかる。なお、被験物質の添加は、培養中に行われるPAR-2アゴニスト添加と同時に行うことが好ましい。
【実施例】
【００３６】
実施例
（１）ヒトメラノーマ細胞(MNT-1)を13000 cells/cm2の密度で播種・培養した。培養開始2週間後に培養上清を回収した。
（２）ヒトメラノーマ細胞の培養には、DMEM(Sigma社)にFBS（DSファーマバイオメディカル）10% ストレプトマイシン（GIBCO社） 100 μg/mL, ペニシリン（GIBCO社） 100 U/mL, アンホテリシンB 2.5 μg/mL(Sigma社)を加えた培地を使用した。
（３）回収した培養上清を1100 rpm, 5分間遠心（KUBOTA社製  5800、）し、上清を回収した。
（４）さらに回収した上清を10000rpm 30分間遠心（HITACHI社製、CR216II）し、沈殿を回収しPBS（GIBCO社）に浮遊させ、メラノソーム浮遊液とした。
（５）市販のヒト正常ケラチノサイト(NHEK(F)、クラボウ社)を4000 cells/cm2で播種・培養した。セミコンフルエントの状態で、HEPES緩衝液(クラボウ社)で１回洗浄の後、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理によって回収した。
（６）ケラチノサイトの培養にはMedium154S(クラボウ社)に増殖添加剤HKGS(クラボウ社)を加えた培地を用いた。
（７）細胞を浮遊液の状態で、ケラチノサイト5000 cells/cm2の密度で培養を開始した。共培養２日目に培養フラスコから培地のみを吸引した後、メラノソーム浮遊液及びPAR-2アゴニストを添加し、被験物質を加えた培地、または被験物質を加えていない培地に置き換え、さらに３日間培養した。被験物質としては、3mMおよび10mMトラネキサム酸、0.01mMニコチン酸アミドを用いた。
（８）培養開始から５日後、HEPESで１回洗浄を行ない、0.025％トリプシン-EDTA(クラボウ社)処理により細胞を回収した後、細胞数を500000cells/tubeに調整し、2％パラホルムアルデヒド/PBSを加え、室温で20分間固定した。
（９）遠心後、細胞を回収し、0.5％サポニン・0.5％BSA/PBSで室温、10分間処理した後、FITC標識マウス抗ヒトサイトケラチン抗体(PROGEN Biotechnik社製)およびPE標識マウス抗リコンビナントMelan-A抗体(Santa Cruz社製)を加え、室温で1時間振盪した。
（１０）2％パラホルムアルデヒド/PBSに液を交換後、セルストレーナー付きFACS解析用チューブ（FALCON社）中に滴下して、Cell Lab Quanta SC MPL(ベックマンコールター社)にて解析した（図１、２）。
（１１）FITC標識されたケラチノサイトを選別し、ケラチノサイトに取り込まれたメラノソーム表面に存在するMelan-A認識した抗体のPE蛍光強度を、メラノソーム移送量とした。その結果、ケラチノサイト中のメラノソームが正確に検出できた。
【００３７】
以上の方法によって得られたケラチノサイトへのメラノソーム取り込み量を調べた結果、図２に示すようにPAR-2アゴニストを添加しなかった系に比べ、取り込み量の増加が観察された。
【００３８】
また、図２に示すように、メラノソーム移送抑制剤として公知のニコチン酸アミドを添加するとメラノソーム取込量が抑制されていることから、本発明のスクリーニング方法の妥当性が立証された。また、トラネキサム酸を本発明のスクリーニング法に供した結果、トラネキサム酸はメラノソームの取り込みを抑制することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の方法によれば、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養系より簡便かつ正確な操作により、ケラチノサイト単独培養で、PAR-2アゴニストとメラノソームを添加して、ケラチノサイトのメラノソーム取り込み量を測定できるため、有用である。これによって、大量かつ正確にメラノソーム取り込み阻害剤のスクリーニングが可能となり有用である。
【図１】
2011214909.tif 000002
【図２】
2011214909.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月11日(2011.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011214909000001.app