(57)【要約】      （修正有）【課題】培養容器内の液体中で培養される細胞の増殖効率を向上させることのできる細胞培養装置を提供する。【解決手段】培養容器内の液体中で培養される細胞群の密度分布を検出する検出手段３０と、前記培養容器を揺動させることにより前記培養容器内の前記細胞を攪拌する攪拌手段２８と、前記検出時及び前記攪拌時における前記培養容器の環境を、予め設定された環境に制御する環境制御手段１２と、前記検出手段が検出した密度分布に基づき、前記攪拌手段による前記揺動のパターンを設定する動作制御手段８１とを備える、細胞培養装置。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の液体中で培養される細胞群の密度分布を検出する検出手段と、
前記培養容器を揺動させることにより前記培養容器内の前記細胞を攪拌する攪拌手段と、
前記検出時及び前記攪拌時における前記培養容器の環境を、予め設定された環境に制御する環境制御手段と、
前記検出手段が検出した密度分布に基づき、前記攪拌手段による前記揺動のパターンを設定する動作制御手段と、
を備えたことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置において、
前記攪拌のための揺動には、
回転運動による回転揺動が含まれており、
前記動作制御手段は、
前記細胞群が高密度で存在している領域の中心に、前記回転揺動の中心を設定する
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養装置において、
前記攪拌のための揺動には、
直線運動による直線揺動が含まれており、
前記動作制御手段は、
前記細胞群が高密度で存在している領域から前記細胞群が低密度で存在している領域へ向かう方向の逆方向に、前記直線揺動の加速方向を設定する
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１〜請求項３の何れか一項に記載の細胞培養装置において、
前記動作制御手段は、
前記細胞群が高密度で存在している領域のサイズが閾値未満となるまで、前記検出、前記設定、前記撹拌からなる一連の処理を繰り返す
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
請求項４に記載の細胞培養装置において、
前記動作制御手段は、
先の攪拌から次の検出までの間に待機時間を設ける
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載の細胞培養装置において、
前記動作制御手段は、
前記繰り返しの過程で前記領域のサイズが前回値未満とならなかった場合には、前記攪拌のための前記揺動の回数と前記揺動の振幅との少なくとも一方を向上させる
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項７】
請求項４又は請求項５に記載の細胞培養装置において、
前記動作制御手段は、
前記繰り返しの回数が閾値以上となった場合には、前記一連の処理の実行頻度を高める
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
請求項４又は請求項５に記載の培養細胞装置において、
前記動作制御手段は、
前記繰り返しの回数が閾値以上となった場合には、ユーザへ警告を行う
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
請求項１〜請求項８の何れか一項に記載の細胞培養装置において、
前記攪拌中における前記攪拌手段及び前記培養容器の全体を覆うことにより、前記培養容器内の液体が前記細胞培養装置内に飛散するのを防止する飛散防止ケースを更に備えた
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞培養装置において、
前記飛散防止ケースは、
前記細胞培養装置に対して取り外し可能に構成される
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載の細胞培養装置において、
前記攪拌の前後における前記培養容器の重量の変化の有無を検出する測定手段を更に備えた
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞培養装置において、
前記動作制御手段は、
前記攪拌の前後において重量の変化が検出された場合には、ユーザに対して警告を行う
ことを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器内の液体中で培養される細胞を観察することが可能な細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の継代培養を行う場合には、培養容器内の培養液を交換する作業や、細胞を新しい培養液へ播種する作業が必要となる。最近では、再生医療用の幹細胞に関する継代培養も行われており、継代培養の作業性の向上を図った細胞培養装置も提案されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−０１６１９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このような継代培養では、培養容器の底面（以下、「接着面」と称する。）に対する細胞の接着強度と、細胞同士の接着強度との関係によっては、細胞が増殖する過程で一部の細胞群が凝集し、培養容器内で密度の不均一性（以下、「凝集ムラ」と称する。）が発生することがある。この状態で培養を続行すると、高密度で凝集した細胞群の中で十分な栄養を吸収できずに死滅する細胞が多くなるため、培養容器内における細胞の増殖効率は、著しく低下する虞がある。
【０００５】
本発明は、培養容器内の液体中で培養される細胞の増殖効率を向上させることのできる細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞培養装置は、培養容器内の液体中で培養される細胞群の密度分布を検出する検出手段と、前記培養容器を揺動させることにより前記培養容器内の前記細胞を攪拌する攪拌手段と、前記検出時及び前記攪拌時における前記培養容器の環境を、予め設定された環境に制御する環境制御手段と、前記検出手段が検出した密度分布に基づき、前記攪拌手段による前記揺動のパターンを設定する動作制御手段とを備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、培養容器内の液体中で培養される細胞の増殖効率を向上させることのできる細胞培養装置を提供することを目的にする。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】細胞培養装置の概略を示す図。
【図２】外扉を開放した細胞培養装置の概略を示す図。
【図３】恒温室内部の構成を示す概略図。
【図４】撹拌装置の構成を示す概略図。
【図５】細胞培養装置の電気的構成を示す機能ブロック図。
【図６】観察ユニットの構成を示す概略図。
【図７】培養容器の例。
【図８】登録時におけるＣＰＵの動作フローチャート。
【図９】登録時に取得された全体画像の例。
【図１０】播種ムラ解消用の撹拌パターンの概要。
【図１１】播種ムラ解消用の撹拌パターンの例。
【図１２】観察時におけるＣＰＵの動作フローチャート。
【図１３】観察時に取得された全体画像の例。
【図１４】ステップＳ２５で抽出された領域の例。
【図１５】凝集領域の例。
【図１６】ステップＳ２５を説明する図。
【図１７】ステップＳ２８における領域分割を説明する図。
【図１８】ステップＳ２８において算出される情報を説明する図。
【図１９】凝集ムラ解消用の撹拌パターンの概要。
【図２０】凝集ムラ解消用の撹拌パターンの例。
【図２１】撹拌処理時におけるＣＰＵの動作フローチャート。
【図２２】チルトステージを説明する図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本実施形態の細胞培養装置の構成を詳細に示す。図１から図３に示すように、細胞培養装置１０は、微生物や細胞などの試料を培養する第１筐体１１と、制御ユニット１３を収納する第２筐体１２とを備えている。細胞培養装置１０の組立状態において、第１筐体１１は第２筐体１２の上部に配置される。
【００１０】
第１筐体１１は、内部が断熱材で覆われた恒温室１５を備えている。この恒温室１５は、第１筐体１１の正面に形成された正面開口１６によって外部と連絡している。第１筐体１１の正面開口１６は、内扉１７と２枚の外扉１８ａ，１８ｂによって閉塞される。この内扉１７及び外扉１８ａ，１８ｂの背面側の周縁部にはパッキン等が設けられ、それぞれの扉を閉じたときに恒温室１５の内部が気密に保持される。つまり、内扉１７のみが閉じられた場合や、内扉１７だけでなく２枚の外扉１８ａ，１８ｂがそれぞれ閉じられた場合には、細胞培養装置１０の外部から恒温室１５の内部への熱の流入や、恒温室１５の内部から細胞培養装置１０の外部への熱の流出が防止される。なお、恒温室１５の内部は、図示を省略した温度調整装置、噴霧装置などにより予め定めた環境条件（温度、湿度、二酸化炭素濃度等）となるように管理される。
【００１１】
上述した外扉１８ａ，１８ｂのうち、外扉１８ｂには搬入用扉２２が設けられる。この搬入用扉２２は、培養容器３１を収納したキャリー２５をキャリー設置台２６に搬入する、又はキャリー設置台２６に設置されたキャリー２５を搬出する際に開放される。この搬入用扉２２を開放すると、開口２３を介して内扉１７に設けられた小扉２４が露呈される。内扉１７及び小扉２４は、ガラスや透明な合成樹脂から形成されており、外扉１８ａ，１８ｂを開放した場合であっても、その内部の環境条件が急激に変化しないようになっている。この内扉１７に設けられる小扉２４を開放することで、培養容器３１が収納されたキャリー２５をキャリー設置台２６に搬入する、又はキャリー設置台２６に設置されたキャリー２５を搬出することが可能となる。なお、キャリー２５は、例えば培養容器３１を所定の間隔を空けて３個上下に収納することができる。
【００１２】
恒温室１５の内部には、キャリー設置台２６、ストッカー２７、容器搬送機構２８、攪拌装置２９、観察ユニット３０等が配置される。なお、図示は省略するが、この恒温室１５の内部には、培地交換を行う培地交換機構や、細胞の播種を行う播種機構などが設けられている。
【００１３】
上述したように、キャリー設置台２６は、その上部にキャリー２５が載置される。図示は省略するが、キャリー設置台２６には、側面にガイドレールが設けられている。このガイドレールは、キャリー２５の下面にガイドレールが入り込む間隔を空けて設けられた案内溝に入り込むことで、搬入又は搬出されるキャリー２５の移動方向を規制する。なお、この案内溝の延出方向は、培養容器３１をキャリー２５に搬入する方向、又は培養容器３１をキャリーから搬出する方向と直交している。
【００１４】
ストッカー２７は、第１筐体１１の正面からみて恒温室１５の左側に配置される。ストッカー２７は複数の棚を有しており、各々の棚には培養容器３１が収納される。なお、このストッカー２７においては、培養容器３１を収納する位置（以下、収納位置）が予め設定されている。各収納位置には、他の収納位置と識別するための識別番号が対応付けられており、この識別番号により、培養容器３１の観察スケジュールや画像データなどが、培養容器３１毎に管理される。
【００１５】
このストッカー２７に載置される培養容器３１としては、ディッシュ、ウェルプレート、フラスコなどが挙げられる。各々の培養容器３１には、細胞など培養対象となる試料が培養液とともに保持される。これら培養容器３１は、この細胞培養装置による細胞培養及び細胞観察を行う際には、透明なトレー状のホルダー３２に位置決め固定された状態で取り扱われる。
【００１６】
容器搬送機構２８は、第１筐体１１の正面からみて恒温室１５の略中央に配置される。この容器搬送機構２８は、キャリー２５に収納された培養容器３１をストッカー２７へ搬送したり、ストッカー２７に収納された培養容器３１を、キャリー２５、観察ユニット、攪拌装置２９などへ搬送したりする。この容器搬送機構２８の各部の位置はエンコーダ等を介して、制御ユニット１３にモニタされる。
【００１７】
攪拌装置２９は、培養容器３１の培養液へ細胞を播種した直後に生じる播種ムラや、培養の過程で生じる細胞の凝集ムラを解消するために設けられる。
【００１８】
次に、攪拌装置２９の詳細な構成を図４に基づき説明する。図４に示すとおり、攪拌装置２９は、Ｘステージ３５、Ｙステージ３６、回転ステージ３７、基台３８を備えている。Ｘステージ３５は、攪拌装置の最上部に配置され、その上面に培養容器３１を位置決めするプレート３９が取り付けられる。培養容器３１を固定したホルダー３２は、プレート３９の上面に位置決め固定される。このＸステージ３５は、Ｘ軸駆動部４０によってＸ軸方向に駆動され、Ｘ軸方向へ移動する。
【００１９】
Ｙステージ３６は、Ｘステージ３５と回転ステージ３７との間に配置される。このＹステージ３６は、Ｙ軸駆動部４１により駆動され、Ｙ軸方向へ移動する。このＹステージ３６がＹ軸方向に移動する際に、Ｘステージ３５もＹステージ３６とともにＹ軸方向に移動する。
【００２０】
回転ステージ３７は、Ｙステージ３６と基台３８との間に配置される。この回転ステージ３７は、回転駆動部４２によって駆動され、回転軸Ｌの周り（θ方向）に回転する。この回転ステージ３７の回転に併せて、Ｘステージ３５及びＹステージ３６も回転する。
【００２１】
なお、図４においては、図の煩雑さを解消するために、Ｘ軸駆動部４０、Ｙ軸駆動部４１、回転駆動部４２を、Ｘステージ３５、Ｙステージ３６、回転ステージ３７、基台３８の外部に配置している形態としているが、実際には、攪拌装置２９の内部に配置されているものとする。
【００２２】
このような構成の攪拌装置２９においては、Ｘステージ３５の移動、Ｙステージ３６の移動、回転ステージ３７における回転の少なくともいずれか１つ、或いはこれらの組み合わせにより培養容器３１を揺動し、培養容器３１内の培養液中の細胞を攪拌する。なお、攪拌装置２９のＸ軸駆動部４０、Ｙ軸駆動部４１、回転駆動部４２は、後述する制御ユニット１３からの指示に従ってＸステージ３５、Ｙステージ３６、回転ステージ３７をそれぞれ駆動制御する。
【００２３】
この攪拌装置２９の全体は、飛散防止ケース４５の内部に収納されており、飛散防止ケース４５ごと取り外し、恒温室１５の外部へ取り出すことが可能である。この飛散防止ケース４５は、攪拌処理中に培養容器３１の隙間（例えば、容器と蓋との間に生じる隙間）から培養液（培養液中の細胞も含む）が飛散した場合に、その培養液が恒温室１５の他の機構に飛散するという不具合を防止する働きがある。
【００２４】
また、飛散防止ケース４５の側面のうち、容器搬送機構２８に対面する側面上部には、開口４６が設けられている。この開口４６を設けることで、容器搬送機構２８によって搬送される培養容器３１を飛散防止ケース４５の内部に配置された攪拌装置２９へと搬入すること、及び、攪拌装置２９に位置決めされた培養容器３１を飛散防止ケース４５の外部へと搬出することがそれぞれ可能となる。この開口４６には導入扉４７が取り付けられている。
【００２５】
導入扉４７は、開口４６を遮蔽する位置（遮蔽位置）と、開口４６を露呈する位置（露呈位置）との間で回動自在である。この導入扉４７は、通常遮蔽位置に保持される。この導入扉４７は、攪拌装置２９により攪拌処理された培養容器３１を飛散防止ケース４５の外部に搬出する場合や、攪拌処理を施す培養容器３１を攪拌装置２９に載置するために飛散防止ケース４５の内部に搬入する場合に、開閉機構４８によって、遮断位置から露呈位置へと回動される。なお、導入扉４７が遮蔽位置にあるときには、拡散防止ケース４５の気密性は保たれる。
【００２６】
また、攪拌装置２９のプレート３９とＸステージ３５との間には、重量センサ（図示省略）が設けられている。この重量センサにより、攪拌処理の前後における培養容器３１の重量変化を検出すれば、攪拌処理時における培養液の飛散の有無を検知することが可能である（詳細は後述する。）。
【００２７】
また、撹拌装置２９において、基台２８の載置面側には、電気配線用のコネクタ（図示省略）が突設されており、飛散防止ケース４５の底面部には、そのコネクタを挿通するための開口（図示省略）が形成されている。撹拌装置２９及び飛散防止ケース４５が恒温室１５に取り付けられた状態にあるとき、撹拌装置２９のコネクタは、飛散防止ケース４５の開口を介して恒温室１５の側に設けられた電気配線用のコネクタ（図示省略）へ嵌め込まれる。これによって、Ｘ軸駆動部４０、Ｙ軸駆動部４１、回転駆動部４２、開閉機構４８、重量センサ（図示省略）の各々は、制御ユニット１３に対して電気的に接続される。
【００２８】
また、この飛散防止ケース４５の開口４６が設けられる側面とは反対側の側面には、ガス交換用のコネクタ４９が設けられる。このコネクタ４９には、コンプレッサ５０（図２参照）のチューブ５１の一端に設けられたコネクタ５２が嵌め込まれる。コンプレッサ５０が作動すると、飛散防止ケース４５の内部の気圧が恒温室１５の内部の気圧よりも低圧になる。なお、コンプレッサ５０は、制御ユニット１３からの指示に応じて駆動される。
【００２９】
観察ユニット３０は、その本体が第２筐体１２の内部に設置され、観察ユニット３０の上部が、第１筐体１１の下方から内部に入り込むように配置される。観察ユニット３０は、第１筐体１１の正面からみて恒温室１５の右側に配置される。この観察ユニット３０は第１筐体１１の底面の開口に嵌め込まれて配置される。この観察ユニット３０は、培養容器３１の一部の画像や、全体の画像などを取得する（観察ユニット３０の詳細は後述する。）。
【００３０】
次に、細胞培養装置１０の電気的構成を図５に基づき説明する。図５に示すとおり、第２筐体１２には、上記の観察ユニット３０の本体部分５８と、制御ユニット１３とが格納される。また、第２筐体１２の前面には、モニタ６５ａおよび入力部６５ｂを備えた操作パネル６５が配置されている。なお、入力部６５ｂとしては、キーボードやマウスなどが挙げられる。制御ユニット１３には、通信回線６６を介してコンピュータ６７を接続することも可能である。
【００３１】
制御ユニット１３は、容器搬送機構２８、攪拌装置２９、開閉機構４８，観察ユニット３０、操作パネル６５のモニタ６５ａおよび入力部６５ｂとそれぞれ接続されている。そして、制御ユニット１３は、所定のプログラムに従って細胞培養装置１０の各部を統括的に制御する。一例として、制御ユニット１３は、操作パネル６５の入力部６５ｂの操作やコンピュータ６７の操作によって入力される培養容器３１の種類や細胞の種類などに応じて培養容器３１の観察スケジュールを自動的に決定する。そして、制御ユニット１３は決定された観察スケジュールに基づいて培養容器３１の観察シーケンスを自動的に実行する。
【００３２】
ここで、制御ユニット１３は、通信部７１、データベース部７２、メモリ７３、ＣＰＵ７４を有している。なお、通信部７１、データベース部７２、メモリ７３は、それぞれＣＰＵ７４と接続されている。通信部７１は、無線または有線の通信回線を介して、細胞培養装置１０の外部にあるコンピュータ６７とのデータ送受信を実行する。
【００３３】
メモリ７３には、上記の観察シーケンスに関わるプログラムや演算用データが記録されている。演算用データには、後述する攪拌パターン（播種ムラ解消用の攪拌パターン、凝集ムラ解消用の攪拌パターン）をＣＰＵ７４が決定するのに必要な情報（後述するルックアップテーブルなど）が含まれる。
【００３４】
データベース部７２には、管理ファイル７５が培養容器３１毎に用意されており、個々の培養容器３１の管理ファイル７５には、培養容器３１の観察スケジュール、培養容器３１の環境条件（温度、湿度、二酸化炭素濃度、撹拌パターン等）の履歴情報、培養容器３１の画像データなどが適宜に書き込まれる。なお、個々の培養容器３１と、それに対応する管理ファイル７５とには、共通の識別番号が割り振られる。
【００３５】
ＣＰＵ７４は、制御ユニット１３の各種の演算処理を実行するプロセッサである。このＣＰＵ７４は、画像解析部８１、撹拌パターン設定部８２の機能を有している。画像解析部８１には、観察ユニット３０が取得した画像に対して画像解析処理を施す機能があり、撹拌パターン設定部８２には、攪拌装置２９の攪拌パターンを設定・調整する機能がある（これらの機能の詳細は、後述する。）。
【００３６】
次に、観察ユニット３０の構成を図６に基づき説明する。図６に示すとおり観察ユニット３０は、試料台３４７と、第１照明部３５１と、第２照明部３５２と、顕微観察部３５３と、容器観察部３５４とを有している。
【００３７】
このうち、顕微観察部３５３は本体部分３４９に内蔵されており、照明部３５１は、アーム３４８のうち、顕微観察部３５３と対向する位置に配置される。これらの顕微観察部３５３と第１照明部３５１とが位相差観察用の観察系を構成する。
【００３８】
また、容器観察部３５４はアーム３４８に収納されており、第２照明部３５２は、本体部分３４９のうち、容器観察部３５４と対向する位置に配置される。これらの容器観察部３５４と第２照明部３５２とが全体観察用の観察系を構成する。
【００３９】
試料台３４７は、透明な部材で構成されており、その上に培養容器３１が載置される。この試料台３４７は、高精度なステージからなり、培養容器３１を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることにより、培養容器３１を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部３５３及び第１照明部３５１）の光路へ挿入したり、全体観察用の観察系（容器観察部３５４及び第２照明部３５２）の光路へ挿入したりすることができる。
【００４０】
また、試料台３４７は、培養容器３１と位相差観察用の顕微鏡との間のＺ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の焦点調節を行うことができる。また、試料台３４７は、培養容器３１と位相差観察用の顕微鏡とのＸＹ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡の観察ポイントを変更することができる。
【００４１】
観察ユニット３０は、培養容器３１を全体観察用の観察系（容器観察部３５４及び第２照明部３５２）の光路へ挿入した状態で、培養容器３１の全体像を撮像することができる。
【００４２】
また、観察ユニット３０は、培養容器３１を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部３５３及び第１照明部３５１）の光路へ挿入した状態で、培養容器３１の一部の拡大位相差像を撮像することができる。
【００４３】
なお、顕微観察部３５３の対物レンズ３６１及び位相フィルタ３６２の組み合わせは、観察倍率の異なる複数種類の組み合わせの間で切り替えることが可能である。例えば、対物レンズ３６１及び位相フィルタ３６２の組み合わせは、２倍観察用の組み合わせ（対物レンズ３６１ｌｏｗ及び位相フィルタ３６２ｌｏｗ）と、４倍観察用の組み合わせ（対物レンズ３６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ３６２ｈｉｇｈ）との間で切り替わる。
【００４４】
観察ユニット３０は、対物レンズ３６１ｌｏｗ及び位相フィルタ３６２ｌｏｗを光路に設定した状態で倍率２倍の位相差画像（低倍位相差画像）を取得することができ、対物レンズ３６１ｈｉｇｈ及び位相フィルタ３６２ｈｉｇｈを光路に設定した状態で倍率４倍の位相差画像（高倍位相差画像）を取得することができる。
【００４５】
次に、本実施形態の培養容器３１を図７に基づき説明する。本実施形態では、培養容器３１を、図７（Ａ）、（Ｂ）に示すとおり蓋付きの透明なディッシュと仮定する。培養容器３１は、培養液３１ｂで満たされており、継代培養に当たっては、培養液３１ｂのほぼ全域に対して細胞が播種される。播種した直後の細胞は、図７（Ａ）に示すとおり培養容器３１の底面（接着面）や他の細胞に接着せずに浮遊しており、前述した播種ムラは、この状態における細胞の密度ムラのことである。
【００４６】
その後、培養が進むと、細胞は、図７（Ｂ）に示すとおり培養容器３１の底面（接着面）に接着し、増殖する。この増殖が進んだ状態では、多くの細胞は培養容器３１の底面（接着面）又は他の細胞に対して接着している。前述した凝集ムラは、この状態における細胞の密度ムラのことである。
【００４７】
次に、培養容器３１の登録時における制御ユニット１３の動作（ＣＰＵ７４の動作）を図８に基づき説明する。以下、図８の各ステップを順に説明する。なお、本フローの開示時点では、継代直後の培養容器３１がキャリー２５に収められ、キャリー設置台２６にセットされているものとする。この培養容器３１は、上述した培地交換機構及び播種機構によって継代の処理が施された直後の培養容器、或いは、ユーザの手によって継代の処理が施された直後の培養容器である。
【００４８】
ステップＳ１１：ＣＰＵ７４は、キャリー設置台２６にセットされた培養容器３１を観察ユニット３０へ移動するよう容器搬送機構２８へ指示を与える。容器搬送機構２８は、その培養容器３１を観察ユニット３０の試料台３４７上の所定位置へ搬送する。なお、試料台３４７における培養容器３１の載置位置は、位置決め用のピンなどにより、予め決められたとおりに位置決めされる。
【００４９】
また、ユーザが、培養容器３１の種類（容器種）と培養容器３１に播種された細胞の種類（細胞種）とを入力部６５などを介して入力すると、ＣＰＵ７４は、入力された容器種と細胞種との組み合わせに応じて培養容器３１の観察スケジュールを決定する。観察スケジュールは、培養容器３１の観察期間と、その観察期間内における観察タイミング（観察頻度）などである。
【００５０】
そして、ＣＰＵ７４は、培養容器３１に専用の管理ファイル７５をデータベース部７２に作成すると、入力された容器種及び細胞種と、決定した観察スケジュールとを、その管理ファイル７５へ書き込む。
【００５１】
ステップＳ１２：ＣＰＵ７４は、培養容器３１の全体画像を取得するよう観察ユニット３０へ指示する。但し、ここでいう全体画像は、培養容器３１における細胞の密度分布を可視化することのできる全体画像である。よって、ここでは全体画像を、位相差観察による全体画像と仮定する。観察ユニット３０は、試料台３４７をＸＹ方向へ移動させることにより、培養容器３１を顕微観察部３５３の光路へ挿入すると共に、対物レンズ３６１及び位相フィルタ３６２の組み合わせを例えば４倍観察用の組み合わせに設定する。但し、この状態で位相差観察できるのは、培養容器３１の全体ではなく一部のみである。よって、観察ユニット３０は、試料台３４７をステップ状に移動させながら位相差画像を繰り返し取得することにより、培養容器３１の互いに異なる領域を写した複数枚の部分画像を取得し、それらの部分画像をＣＰＵ７４へ送出する。ＣＰＵ７４の画像解析部８１は、それら複数枚の部分画像を適切に繋ぎ合わせることにより、培養容器３１の全体を示す全体画像を作成し、その全体画像をモニタ６５ａへ表示する（図９参照）。
【００５２】
この全体画像には、培養容器３１のほぼ全体の像が収まっており、全体画像の中心に培養容器３１の中心が一致している。全体画像は位相差観察画像なので、培養容器３１の輪郭だけでなく、播種された細胞も写っている。全体画像上で細胞が高密度で存在している領域の輝度は相対的に高くなり、細胞が低密度で存在している領域の輝度は相対的に低くなる。なお、ここでは、培養容器３１の輪郭の輝度は、細胞が最も高密度で浮遊している領域の輝度よりも高いと仮定する。また、図９では、輝度の高い領域を高い濃度で表し、輝度の低い領域を低い濃度で表した。以下の各図でも輝度と濃度との関係は同様とする。
【００５３】
ステップＳ１３：ＣＰＵ７４の画像解析部８１は、ステップＳ１２で取得した全体画像に対して二値化処理を施し、全体画像のうち輝度が閾値範囲に収まっている領域を抽出する。但し、その閾値範囲の下端値は、想定しうる播種ムラの中で高密度に細胞が存在している領域の輝度と、低密度で細胞が存在している領域の輝度との間の値に設定され、閾値範囲の上端値は、培養容器３１の輪郭の輝度と下端値との間の値に設定される。よって、画像解析部８１は、抽出した領域の中でサイズが最大の領域を見出し、その領域のサイズを、播種ムラの程度の指標として算出する。
【００５４】
ステップＳ１４：ＣＰＵ７４は、ステップＳ１３で算出したサイズが閾値を超過したか否かを判別し、超過していた場合には解消すべき播種ムラが発生しているとみなしてステップＳ１５へ移行し、超過していなかった場合には解消すべき播種ムラが発生していないとみなしてステップＳ１９へ移行する。
【００５５】
ステップＳ１５：ＣＰＵ７４の撹拌パターン設定部８２は、管理ファイル７５に格納された容器種の情報を参照し、攪拌装置２９の攪拌パターンを、その容器種に適した攪拌パターンに設定する。但し、ここで設定される攪拌パターンは、播種ムラ解消用の撹拌パターンであり、例えば図１０に示すとおり、Ｘ軸方向ＤＸの直線揺動と、Ｙ軸方向ＤＸの直線揺動とを組み合わせたものである。
【００５６】
具体的に、本ステップにおける攪拌パターン設定部８２は、攪拌装置２９のＸ軸駆動部４０のメモリに対して例えば図１１の上段に示すような駆動波形を書き込み、Ｙ軸駆動部４１のメモリに対して例えば図１１の中段に示すような駆動波形を書き込み、回転駆動部４２のメモリに対して例えば図１１の下段に示すような駆動波形（フラットな駆動波形）を書き込む。なお、図１１の横軸ｔは時間であり、縦軸ＶＸはＸステージ３５の速度であり、縦軸ＶＹはＹステージ３６の速度であり、縦軸Ｖθは回転ステージ３７の角速度である（後述する図２０も同様。）。
【００５７】
これらの駆動波形は、培養容器３１に対して＋Ｘ軸方向の撹拌用の外力を加える直線揺動ｗａと、培養容器３１に対して−Ｘ軸方向の撹拌力を加える直線揺動ｗｂと、培養容器３１に対して＋Ｙ軸方向の撹拌力を加える直線揺動ｗｃと、培養容器３１に対して−Ｙ軸方向の撹拌力を加える直線揺動ｗｄとを順に行うための波形である。
【００５８】
これらの直線揺動ｗａ〜ｗｄの間で駆動波形の形状は共通であり、個々の駆動波形は、揺動開始直後にステージの速度を急激に上昇させてからゆっくりと低下させ、ステージが停止した時点でステージの移動方向を反転させ、揺動開始時点の状態へとステージをゆっくりと戻すものであり、揺動初期の急速な加速期間中に培養容器３１内にある細胞へ撹拌力を加えることができる。
【００５９】
なお、直線揺動ｗａ〜ｗｄの各々の揺動強度（ここでは揺動開始直後の加速度の大きさ）は、予め決められた値（播種ムラ解消用の値）に設定される。また、直線揺動ｗａ〜ｗｄの各々の揺動回数も、予め決められた値（播種ムラ解消用の値）に設定される。また、直線揺動ｗａ〜ｗｄの各々の揺動振幅（ここでは揺動開始直後の加速期間の長さ）も、予め決められた値（播種ムラ解消用の値）に設定される。
【００６０】
ステップＳ１６：ＣＰＵ７４は、撹拌装置２９の導入扉４７を開くよう開閉機構４８へ指示を出すと共に、培養容器３１を撹拌装置２９へ移動するよう容器搬送機構２８へ指示を与える。開閉機構４８は、導入扉４７の回動位置を前述した露呈位置に設定し、容器搬送機構２８は、その状態で開放された開口４６から撹拌装置２９の内部へと培養容器３１を搬送し、ホルダー３２に装着する。なお、プレート３９に対する培養容器３１の載置位置は、ホルダー３２により、予め決められたとおりに位置決めされる。以下、培養容器３１がプレート３９に対して位置決めされ、Ｘステージ３５、Ｙステージ３６、回転ステージ３７の各々が基準状態（非駆動状態）にあるときには、培養容器３１の中心に回転軸Ｌが位置するものと仮定する。
【００６１】
その後、ＣＰＵ７４が導入扉４７を閉じるよう開閉機構４８へ指示を出すと、開閉機構４８は、導入扉４７を遮蔽位置に戻し、撹拌処理が開始可能な状態とする。
【００６２】
ステップＳ１７：ＣＰＵ７４は、設定中の攪拌パターン（図１１）による攪拌処理を実行する。なお、攪拌処理の詳細は、後述する。設定中の撹拌パターン（図１１）によると、培養容器３１内の培養液がＸ軸方向及びＹ軸方向にかけて均等に撹拌されるので、播種ムラの解消が期待できる。
【００６３】
ステップＳ１８：ＣＰＵ７４は、撹拌装置２９の導入扉４７を開くよう開閉機構４８へ指示を出すと共に、培養容器３１を観察ユニット３０の試料台３４７へ移動させるよう容器搬送機構２８へ指示を与える。開閉機構４８は、導入扉４７の回動位置を前述した露呈位置に設定し、容器搬送機構２８は、開口４６から培養容器３１を取り出し、試料台３４７上の所定位置へ搬送する。なお、試料台３４７における培養容器３１の載置位置は、位置決め用のピンなどにより、予め決められたとおりに位置決めされる。その後、ＣＰＵ７４は、搬送機構２９の導入扉４７を閉じるよう開閉機構４８へ指示を出す。開閉機構４８は、導入扉４７を再び遮蔽位置に戻し、ステップＳ１２に戻る。
【００６４】
ステップＳ１９：ＣＰＵ７４は、直前のステップＳ１２で取得した全体画像のデータを、現在の日時に対応付けた上で、培養容器３１の管理ファイル７５へ書き込む。
【００６５】
ステップＳ２０：ＣＰＵ７４は、培養容器３１をストッカー２７へ収納するよう容器搬送機構２８へ指示を与える。容器搬送機構２８は、試料台３４７に載置されている培養容器３１をストッカー２７へ収納する。これによって、登録のフローが終了する。
【００６６】
次に、培養容器３１の観察時における制御ユニット１３の動作（ＣＰＵ７４の動作）を図１２に基づき説明する。以下、図１２の各ステップを順に説明する。なお、ここでは、最初の観察は、図８のフローの終了後に細胞が接着面へ接着するのに必要な定着時間（２時間程度）の経過後に行われるものとし、２回目以降の観察は、その定着時間より十分に長い所定時間毎（例えば２４時間毎）に行われるものとする。
【００６７】
ステップＳ２１：ＣＰＵ７４は、管理ファイル７５に書き込まれた観察スケジュールと現在の日時とを比較し、観察時期が到来したか否かを判別する。観察時期が到来した場合にはステップＳ２２へ進み、観察時期が到来していない場合には待機する。
【００６８】
ステップＳ２２：ＣＰＵ７４は、初回フラグをオンする。この初回フラグは、これから行われる攪拌が再攪拌であるか否かを示すためのフラグである。
【００６９】
ステップＳ２３：ＣＰＵ７４は、培養容器３１を観察ユニット３０へ搬送するよう容器搬送機構２８へ指示を与える。容器搬送機構２８は、ストッカー２７に収納されている培養容器３１を観察ユニット３０の試料台３４７上の所定位置へ搬送する。なお、試料台３４７における培養容器３１の載置位置は、位置決め用のピンなどにより、予め決められたとおりに位置決めされる。
【００７０】
ステップＳ２４：ＣＰＵ７４は、前述したステップＳ１２と同様の手順で培養容器３１の全体画像を取得し、その全体画像をモニタ６５ａへ表示する（図１３）。この全体画像には、培養容器３１の内部で凝集している細胞や、培養容器３１の内部で浮遊している細胞が写っている。全体画像上で細胞が高密度で存在している領域の輝度は相対的に高くなり、細胞が低密度で存在している領域の輝度は相対的に低くなる。なお、ここでは、培養容器３１の輪郭の輝度は、細胞が最も高密度で凝集している領域の輝度よりも低いと仮定する。
【００７１】
ステップＳ２５：ＣＰＵ７４の画像解析部８１は、ステップＳ２４で取得した全体画像に対して二値化処理を施し、全体画像のうち輝度が閾値を超過しているような領域を抽出する（図１４）。但し、その閾値は、培養容器３１の輪郭の輝度と、細胞が最も高密度で凝集している領域の輝度との間の値に設定される。よって、画像解析部８１は、抽出した領域の中でサイズが最大の領域を、細胞が高密度かつ広範囲に凝集している領域（凝集領域）Ａａとみなし（図１５）、その凝集領域Ａａのサイズを、凝集ムラの程度の指標として計算する。
【００７２】
ステップＳ２６：ＣＰＵ７４は、ステップＳ２５で算出したサイズが閾値を超過したか否かを判別し、超過していた場合には、解消すべき凝集ムラが発生しているとみなしてステップＳ２７へ移行し、超過していなかった場合には、解消すべき凝集ムラが発生していないとみなしてステップＳ３６へ移行する。
【００７３】
ステップＳ２８：ＣＰＵ７４の攪拌パターン設定部８２は、攪拌装置２９の攪拌パターンを、次の手順（ａ）〜（ｅ）により設定する。
【００７４】
（ａ）攪拌パターン設定部８２は、図１６に示すとおり、全体画像における凝集領域Ａａの中心座標（Ｘ１，Ｙ１）を算出すると共に、図１７に示すとおり、中心座標（Ｘ１，Ｙ１）から等角度ずつ異なる方向へ放射状に延びる複数の線分（ここでは、９０°ずつずれた４本の線分とする。）を想定し、それらの線分により全体画像を複数の部分領域（ここでは、４つの部分領域Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４）に分割する。
【００７５】
（ｂ）攪拌パターン設定部８２は、全体画像における部分領域Ａ１の輝度平均値と、部分領域Ａ２の輝度平均値と、部分領域Ａ３の輝度平均値と、部分領域Ａ４の輝度平均値とをそれぞれ算出し、それら部分領域Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４のうち、輝度平均値が最も小さいような部分領域を、非凝集領域Ａｎとみなす。なお、本手順（ｂ）における輝度平均値の算出では、凝集領域Ａａの画素は平均化対象から外されることが望ましい。
【００７６】
（ｃ）攪拌パターン設定部８２は、非凝集領域Ａｎの中心座標（Ｘ１’，Ｙ１’）を算出し、凝集領域Ａａの中心座標（Ｘ１，Ｙ１）から非凝集領域Ａｎの中心座標（Ｘ１’，Ｙ１’）へ向かう単位ベクトルＤ１を求め、その単位ベクトルＤ１のＸ成分であるベクトルＤ１Ｘと、単位ベクトルＤ１のＹ成分であるベクトルＤ１Ｙとを求める（図１８）。
【００７７】
（ｄ）攪拌パターン設定部８２は、凝集領域Ａａの中心座標（Ｘ１，Ｙ１）を所定の変換式へ当てはめることにより、凝集領域Ａａの中心に撹拌装置２９の回転軸Ｌを配するために必要なＸステージ３５の移動量ＬＸとＹステージ３６の移動量ＬＹとを算出する。これによって、解消すべき凝集ムラの情報が全て収集されたことになる。
【００７８】
（ｅ）攪拌パターン設定部８２は、管理ファイル７５に格納された容器種及び細胞種の情報を参照し、攪拌装置２９の攪拌パターンを、その容器種及び細胞種の組み合わせと、上述した凝集ムラとに適した攪拌パターンに設定する。但し、ここで設定される撹拌パターンは、凝集ムラ解消用の撹拌パターンであり、例えば図１９に示すとおり、凝集領域Ａａの中心周りの回転揺動と、Ｄ１方向の直線揺動とを組み合わせたものである。
【００７９】
具体的に、手順（ｅ）における攪拌パターン設定部８２は、Ｘ軸駆動部４０のメモリに対して例えば図２０の上段に示すような駆動波形を書き込み、Ｙ軸駆動部４１のメモリに対して例えば図２０の中段に示すような駆動波形を書き込み、回転駆動部４２のメモリに対して例えば図２０の下段に示すような駆動波形を書き込む。
【００８０】
これらの駆動波形は、培養容器３１に対して加わる外力を最小限に抑えたまま、凝集領域Ａａの中心に回転軸Ｌが一致するよう培養容器３１をシフトさせる直線移動ｗａと、培養容器３１に対して＋θ方向の外力を加えることで、＋θ方向の攪拌力を細胞に与える回転揺動ｗｂと、培養容器３１に対して−θ方向の外力を加えることで、−θ方向の攪拌力を細胞に与える回転揺動ｗｃと、培養容器３１に対して−Ｄ１方向の外力を加えることで、−Ｄ１方向の攪拌力を細胞に与える直線揺動ｗｄとを順に行うためのものである。
【００８１】
なお、直線移動ｗａに関する駆動波形（Ｘ軸方向及びＹ軸方向の駆動波形）は、手順（ｄ）で算出した移動量ＬＸ、ＬＹから算出され、直線揺動ｗｄに関する駆動波形（Ｙ軸方向及びＹ軸方向の駆動波形）は、手順（ｃ）で算出したベクトルＤ１Ｘ、Ｄ１Ｙから算出される。
【００８２】
また、回転揺動ｗｂ、回転揺動ｗｃの各々の駆動波形は、揺動開始直後にステージの角速度を急激に上昇させてからゆっくりと低下させ、ステージが停止した時点でステージの回動方向を反転させ、揺動開始時点の姿勢にゆっくりとステージを戻すものであり、揺動初期の急速な加速期間中に培養容器３１内の細胞へ撹拌力を加えることができる。
【００８３】
また、直線揺動ｗｄの駆動波形は、揺動開始直後にステージの速度を急激に上昇させてからゆっくりと低下させ、ステージが停止した時点でステージの移動方向を反転させ、揺動開始時点の位置にゆっくりとステージを戻すものである。
【００８４】
また、回転揺動ｗｂ、回転揺動ｗｃ、直線揺動ｗｄの各々の揺動強度（ここでは揺動開始直後の加速度の大きさ）は、容器種及び細胞種の組み合わせに適した値に設定される。なお、どのような組み合わせにどのような値が適しているかについての情報は、例えばルックアップテーブルなどの形式でメモリ７３に予め格納されており、本ステップの攪拌パターン設定部８２は、そのルックアップテーブルを参照することにより揺動強度を即座に設定することができるものとする。
【００８５】
また、回転揺動ｗｂ、回転揺動ｗｃ、直線揺動ｗｄの各々の回数は、容器種及び細胞種の組み合わせに適した値に設定される。但し、図２０では、これらの各揺動の回数が１であった場合の例を示している。なお、どのような組み合わせにどのような値が適しているかについての情報は、例えばルックアップテーブルなどの形式でメモリ７３に予め格納されており、本ステップの攪拌パターン設定部８２は、そのルックアップテーブルを参照することにより揺動回数を即座に設定できるものとする。
【００８６】
また、回転揺動ｗｂ、回転揺動ｗｃ、直線揺動ｗｄの各々の揺動振幅の大きさ（すなわち初期加速期間の長さ）は、容器種及び細胞種の組み合わせに適した値に設定される。なお、どのような組み合わせにどのような値が適しているかについての情報は、例えばルックアップテーブルなどの形式でメモリ７３に予め格納されており、本ステップの攪拌パターン設定部８２は、そのルックアップテーブルを参照することにより揺動振幅を即座に設定できるものとする。
【００８７】
ステップＳ２８：ＣＰＵ７４は、初回フラグがオンされているか否かを判別し、オンされていれば即座に攪拌処理を開始するべくステップＳ２９へ移行し、オフされていれば設定中の攪拌パターンを調整するべくステップＳ３４へ移行する。
【００８８】
ステップＳ２９：ＣＰＵ７４は、前述したステップＳ１６と同様の手順で培養容器３１を撹拌装置２９へ収容する。
【００８９】
ステップＳ３０：ＣＰＵ７４は、設定中の攪拌パターン（図２０）による攪拌処理を実行する（攪拌処理の詳細は、後述する。）。設定中の攪拌パターン（図２０）によると、回転揺動の中心が凝集領域Ａａの中心に設定されるので、凝集領域Ａａの中で接着面に接着せずに他の細胞に接着している細胞を分離し、凝集領域Ａａの外側に向けて浮遊させることができる。また、この撹拌パターン（図２０）によると、直線揺動による撹拌力の方向が−Ｄ１方向に設定されるので、凝集領域Ａａの中で接着面に接着せずに他の細胞に接着している細胞を分離し、非凝集領域Ａｎに向けて浮遊させることができる。
【００９０】
ステップＳ３１：ＣＰＵ７４は、初回フラグをオフする。
【００９１】
ステップＳ３２：ＣＰＵ７４は、撹拌装置２９の導入扉４７を開くよう開閉機構４８へ指示を出すと共に、培養容器３１をストッカー２７へ移動するよう容器搬送機構２８へ指示を与える。開閉機構４８は、導入扉４７の回動位置を前述した露呈位置に設定し、容器搬送機構２８は、その状態で開放された開口４６から撹拌装置２９の外部へと培養容器３１を搬送し、ストッカー２７へ収納する。その後、ＣＰＵ７４が導入扉４７を閉じるよう開閉機構４８へ指示を出すと、開閉機構４８は、導入扉４７を遮蔽位置に戻す。
【００９２】
ステップＳ３３：ＣＰＵ７４は、前述した定着時間（２時間程度）だけ待機した後、ステップＳ２３へ戻り、ステップＳ２３〜Ｓ２６を再実行する。ステップＳ２６において、依然として解消すべき凝集ムラが存在していた場合（ステップＳ２６にてＹＥＳ）には、ＣＰＵ７４は、ステップＳ２７以降の処理を改めて行うことになる。なお、ステップＳ２３〜Ｓ２６が再実行されるときには、初回フラグはオフされているため、その後のステップＳ２８における判別の結果はＮＯとなり、ステップＳ３４が実行されることになる。
【００９３】
ステップＳ３４：ＣＰＵ７４は、凝集領域Ａａのサイズを前回値と比較し、十分なサイズ縮小がみられなかった場合には、設定中の撹拌パターンに撹拌効果が無いと判断してステップＳ３５へ移行し、十分なサイズ縮小がみられた場合には、設定中の撹拌パターンに撹拌効果があると判断してステップＳ２９へ移行する。
【００９４】
ステップＳ３５：ＣＰＵ７４の攪拌パターン設定部８２は、回転駆動部４２のメモリ、Ｘ軸駆動部４０のメモリ、Ｙ軸駆動部４１のメモリの内容を書き換えることにより、設定中の撹拌パターン（図２０参照）を調整してからステップＳ２９へ移行する。
【００９５】
具体的に、本ステップにおける撹拌パターン設定部８２は、設定中の撹拌パターン（図２０参照）のうち、回転揺動ｗｂの回数と、回転揺動ｗｃの回数とを、所定回数ずつ（例えば１回ずつ）増加させることにより撹拌効果の向上を図る。
【００９６】
なお、ここでは増加対象を、回転揺動ｗｂ、ｗｃの各々の回数のみとしたが、回転揺動ｗｂ、ｗｃの各々の振幅のみ、或いは、回数及び振幅の双方としてもよい。また、ここでは調整対象を、回転揺動ｗｂ、ｗｃのみとしたが、直線揺動ｗｄのみ、或いは、回転揺動ｗｂ、ｗｃ及び直線揺動ｗｄの双方としてもよい。
【００９７】
ステップＳ３６：ＣＰＵ７４は、直前のステップＳ２４で取得した全体画像を現在の日時に対応付けて管理ファイル７５に書き込む。
【００９８】
ステップＳ３７：ＣＰＵ７４は、培養容器３１をストッカー２７へ収納するよう容器搬送機構２８へ指示を与える。容器搬送機構２８は、試料台３４７に載置されている培養容器３１をストッカー２７へ収納する。
【００９９】
ステップＳ３８：ＣＰＵ７４は、管理ファイル７５に書き込まれた観察スケジュールと現在の日時とを比較し、観察期間が終了したか否かを判別する。観察期間が終了していなければステップＳ２１へ戻り、観察期間が終了していれば観察のフローを終了する。
【０１００】
次に、攪拌処理時における制御ユニット１３の動作（ＣＰＵ７４の動作）を図２１に基づき説明する。以下、図２１の各ステップを順に説明する。
【０１０１】
ステップＳ４２：ＣＰＵ７４は、攪拌装置２９に設けられた重量センサの出力信号を参照し、培養容器３１の重量を検知する。なお、ここで検知される重量は、ホルダー３２やプレート３９の重量を含んでいても構わない。
【０１０２】
ステップＳ４３：ＣＰＵ７４は、攪拌装置２９に対して攪拌を開始するよう指示する。攪拌装置２９のＸ軸駆動部４０は、Ｘ軸駆動部４０内のメモリに書き込まれた駆動波形に応じた駆動信号をＸステージ３５へ送出し、Ｙ軸駆動部４１は、Ｙ軸駆動部４１内のメモリに書き込まれた駆動波形に応じた駆動信号をＹステージ３７へ送出し、回転駆動部４２は、回転駆動部４２内のメモリに書き込まれた駆動波形に応じた駆動信号を回転ステージ３７へ送出する。これによって、回転ステージ３７、Ｘステージ３５、Ｙステージ３６は、設定中の攪拌パターンで駆動されることになる。
【０１０３】
ステップＳ４４：ＣＰＵ７４は、攪拌装置２９に設けられた重量センサの出力信号を再び参照し、現時点における培養容器３１の重量をステップＳ４２と同様に検知する。
【０１０４】
ステップＳ４５：ＣＰＵ７４は、ステップＳ４２で検知した重量から、ステップＳ４４で検知した重量を差し引くことで差分を算出し、その差分がゼロ（又は閾値）より大きかった場合には、ステップＳ４３における攪拌時に培養容器３１から培養液が飛散したとみなしてステップＳ４６へ移行し、その差分がゼロ（又は閾値）より小さかった場合には、ステップＳ４３における攪拌時に培養容器３１から培養液が飛散しなかったとみなしてフローを終了する。
【０１０５】
ステップＳ４６：ＣＰＵ７４は、飛散防止ケース４５に接続されたコンプレッサ５０を駆動し、飛散防止ケース４５の内部の気圧を外部の気圧（恒温室１５の内部の気圧）よりも低圧にする。この状態では、飛散防止ケース４５の内部に飛散した培養液が飛散防止ケース４５の外部へ出る可能性は極めて低い。
【０１０６】
ステップＳ４７：ＣＰＵ７４は、モニタ６５ａへ警告表示を行うことにより、飛散防止ケース４５を細胞培養装置１０から取り出すようユーザに促す。なお、ＣＰＵ７４は、警告表示は、例えば「攪拌に失敗しました」、「培養液が飛散した虞があります」、「培養装置を交換してください」、などの文字情報をモニタ６５ａへ表示することによって警告を行う。また、それと同時に、ＣＰＵ７４は、通信回線６６を介して遠隔地のコンピュータ６７からユーザへ警告を行ってもよい。このように遠隔地のコンピュータ６７を使用すれば、遠隔地にいるユーザに対して早急に警告することができる。
【０１０７】
警告を受けたユーザは、飛散防止ケース４５を新しいもの（又は洗浄済みのもの）に交換してから、細胞培養装置１０を復帰させる。この交換の際、飛散防止ケース４５の内部は低圧に保たれているので、ユーザが特に注意を払わなかったとしても、恒温室１５の各位置に培養液が拡散する可能性は極めて低く抑えられる（以上、図２１の説明。）。
【０１０８】
以上、本実施形態のＣＰＵ７４は、培養容器３１の全体画像に基づき攪拌装置２９の攪拌パターンを設定するので、細胞の凝集ムラを効率的に解消し、細胞の増殖効率を向上させることができる。
【０１０９】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、凝集領域Ａａの中心に揺動の中心を設定するので、凝集領域Ａａの中で接着面に接着せず他の細胞に接着している細胞を分離し、凝集領域Ａａの外側へ向けて浮遊させることができる。このようにして浮遊した細胞の多くは、定着時間（２時間程度）の経過後に接着面へ接着できる可能性がある。したがって、このような揺動を伴う攪拌によれば、凝集ムラが効果的に解消される。
【０１１０】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、凝集領域Ａａから非凝集領域Ａｎに向かう方向の逆方向に揺動の加速方向を設定するので、凝集領域Ａａの中で接着面に接着せず他の細胞に接着している細胞を分離し、非凝集領域Ａｎの側に向けて浮遊させることができる。このようにして浮遊した細胞の多くは、定着時間（２時間程度）の経過後に接着面へ接着できる可能性がある。したがって、このような揺動を伴う攪拌によれば、凝集ムラが効果的に解消される。
【０１１１】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、画像の取得（ステップＳ２４）、撹拌パターンの設定（ステップＳ２７）、撹拌（ステップＳ３０）を、凝集領域Ａａのサイズが閾値未満となるまで繰り返すので、凝集ムラの残存を防ぐことができる。
【０１１２】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、凝集ムラ解消用の攪拌を行う度に適切な待機時間を設けるので（ステップＳ３３）、攪拌後における凝集ムラの残存の有無を正確に判別することができる。
【０１１３】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、繰り返しの過程で凝集領域Ａａのサイズが前回値未満とならなかった場合には（ステップＳ３４ＮＯ）、攪拌のための揺動回数と揺動振幅との少なくとも一方を向上させて攪拌効果を高めるので（ステップＳ３５）、その繰り返しの回数が膨大化する（又はエンドレスになる）ことを防止できる。
【０１１４】
また、本実施形態の細胞培養装置１０は、攪拌装置２９の全体をカバーする飛散防止ケース４５を備えるので、恒温室１５内の攪拌装置２９以外の部分が培養液に汚染される虞は無い。
【０１１５】
また、本実施形態の飛散防止ケース４５は、細胞培養装置１０に対して取り外し可能に構成されるので、必要に応じてユーザが飛散防止ケース４５ごと攪拌装置２９を交換することができる。
【０１１６】
また、本実施形態の撹拌装置２９は重量センサを備えているので、ＣＰＵ７４は、攪拌前後における培養容器３１の重量変化の有無により、撹拌時における液体の飛散の有無を確実に検知できる。
【０１１７】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、培養容器３１の重量の変化が検出された場合には、培養容器３１から液体が飛散した旨の警告をユーザに対して行うので、不適切な状態のまま培養が続行されるという問題を回避できる。
【０１１８】
なお、本実施形態のＣＰＵ７４は、凝集ムラ解消用の撹拌パターンの揺動強度、揺動回数、揺動振幅の各々の値の決定を、撹拌パターンの設定時（ステップＳ２８）に行ったが、これらの値は容器種及び細胞種の組み合わせが変化しない限り変更する不要が無いので、それらの値の決定は、撹拌パターンの設定の度に行うのではなく、培養容器３１の登録時（例えばステップＳ１１）に行っておいてもよい。その場合、ＣＰＵ７４は、決定した値を培養容器３１の管理ファイル７５へ書き込んでおき、撹拌パターンの設定時（ステップＳ２８）に読み出して設定すればよい。
【０１１９】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、播種ムラ又は凝集ムラの検出（ステップＳ１３、Ｓ２５）に当たり全体画像へ二値化処理を施したが、その二値化処理の前に低解像度変換処理などの前処理を施してもよい。
【０１２０】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、播種ムラ又は凝集ムラを検出するための画像として保存用の画像と同じもの（ここでは全体画像）を使用したが、播種ムラ又は凝集ムラを検出するための画像は、保存用の画像とは異なるものであってもよい。例えば、ＣＰＵ７４は、保存用の画像を観察倍率が４倍の全体画像とし、ムラ検出用の画像を観察倍率が２倍の全体画像としてもよい。
【０１２１】
また、本実施形態の細胞培養装置１０は、播種ムラ又は凝集ムラを検出するための画像の取得方法（観察方法）として位相差観察を適用したが、培養容器３１における細胞密度の分布を可視化できる他の観察方法を使用してもよい。
【０１２２】
また、本実施形態の細胞培養装置１０は、播種ムラ解消用の攪拌時（ステップＳ１５、Ｓ１７）にＸ軸方向の揺動（ｗａ、ｗｂ）とＹ軸方向の揺動（ｗｃ、ｗｄ）とを順に行ったが、同時に行ってもよい。
【０１２３】
また、本実施形態の細胞培養装置１０は、凝集ムラ解消用の攪拌時（ステップＳ２７、Ｓ３０）にθ方向の揺動とＸＹ方向の揺動とを順に行ったが、同時に行ってもよい。
【０１２４】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、凝集ムラの検出（ステップＳ２５）に当たり凝集領域Ａａの中心座標を算出したが、中心座標の代わりに重心座標を算出してもよい。その場合には、揺動中心の決定に、凝集領域Ａａの輪郭形状だけでなく輝度分布までもが反映されることになる。
【０１２５】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、観察の頻度（２４時間毎）を固定としたが、可変としてもよい。その場合、例えば、ＣＰＵ７４は、１回の観察時におけるループ（ステップＳ２７〜Ｓ３３〜Ｓ２３〜Ｓ２６）の繰り返し回数をカウントし、そのカウント数が閾値以上となった場合には頻繁な攪拌が必要と判断し、その時点で観察の頻度を高い値に変更してもよい。
【０１２６】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、凝集ムラが無くなるまでループ（ステップＳ２７〜Ｓ３３〜Ｓ２３〜Ｓ２６）を繰り返したが、その繰り返し回数をカウントし、そのカウント数が閾値以上となった場合には攪拌の効果が無いとみなし、その時点でユーザに対して警告を行ってもよい。
【０１２７】
また、上述した撹拌装置２９は、培養容器３１を揺動するためにＸステージ３５、Ｙステージ３６、回転ステージ３７を使用したが、それらのステージに加えて、図２２に示すようなチルトステージ３００を使用してもよい。チルトステージ３００は、Ｘステージ３５とプレート３９との間に設けられ、プレート３９の各位置を個別に上下動させる少なくとも３つのピン３００ａを備えており、それらのピン３００ａの突出量のバランスを変更することにより、プレート３９のチルト方向及びチルト量を変化させることができる。
【０１２８】
このようなチルトステージ３００を使用した場合には、上述した回転揺動と直線揺動とに傾斜揺動（又は鉛直方向の直線揺動）を組み合わせることができるので、撹拌パターンの自由度が高まる。例えば、培養容器３１の形状が複雑な場合などには、この傾斜揺動を組み合わせることにより攪拌効果の向上を図ってもよい。
【０１２９】
また、本実施形態の細胞培養装置は、攪拌専用の装置（攪拌装置２９）で攪拌を行ったが、観察ユニット３０の試料台３４７へ培養容器３１を載置し、観察ユニット３０の試料台３４７を攪拌装置２９のステージと同様に駆動することにより攪拌を行ってもよい。但し、攪拌時には、試料台３４７と培養容器３１とはホルダーなどを介して互いに固定されることが望ましい。
【０１３０】
また、本実施形態のＣＰＵ７４は、凝集ムラ解消用の攪拌パターンのうち揺動強度と揺動回数と揺動振幅との少なくとも一つを、細胞種と容器種との組み合わせに応じて決定しているが、培養容器３１の中には接着面に特殊な表面加工を施したものもあるので、揺動強度と揺動回数と揺動振幅との少なくとも一つを、細胞種と容器種と表面加工の種類との組み合わせに応じて決定してもよい。その場合は、細胞腫及び容器種と共に、表面加工の種類をユーザに入力させることになる。
【０１３１】
また、本実施形態の細胞培養装置１０では、制御ユニット１３の機能の一部（例えば攪拌パターン設定部８２の機能）を攪拌装置２９の側へ搭載してもよい。また、Ｘ軸駆動部４０、Ｙ軸駆動部４１、回転駆動部４２の機能の一部又は全部を制御ユニット１３の側へ搭載してもよい。
【０１３２】
また、本実施形態の細胞培養装置１０の動作の一部は、コンピュータ６７に実行させることも可能である。その場合、コンピュータ６７の動作プログラムは、メモリカード、光ディスク、磁気ディスクなどの記憶媒体を介してコンピュータ６７にインストールされたものとしてもよい。
【符号の説明】
【０１３３】
１０…細胞培養装置、３０…観察ユニット、１３…制御ユニット、７４…ＣＰＵ、３１…培養容器、３９…プレート、３５…Ｘステージ、３６…Ｙステージ、３７…回転ステージ、３２…ホルダー、４０…Ｘ軸駆動部、４１…Ｙ軸駆動部、４２…回転駆動部、４５…飛散防止ケース、４７…導入扉、４９…コネクタ、５２…コネクタ、５１…チューブ、５０…コンプレッサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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