(57)【要約】【課題】ペプチドの提供。【解決手段】ｔａｔペプチドにコンジュゲートされたＣ−末端コア配列ＥＳＤＶを有するペプチドであって、該ｔａｔペプチドが細胞内への該コンジュゲートペプチドの侵入を容易にすることができる前記ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔａｔペプチドにコンジュゲートされたＣ−末端コア配列ＥＳＤＶを有するペプチドであって、該ｔａｔペプチドが細胞内への該コンジュゲートペプチドの侵入を容易にすることができる前記ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は米国特許出願第60/196,460号、第60/196,528号及び第60/196,527号（全て2000年４月11日提出）、出願第 号（2000年、４月11日提出）（代理人事件整理番号20054-000300）；出願第09/547,276号（2000年、４月11日提出）；出願第60/182,296号（2000年２月14日提出）；出願第60/176,195号（2000年１月14日提出）；出願第60/170,153号（1999年12月13日提出）；出願第60/162,498号（1999年10月29日提出）；出願第60/160,860（1999年10月21日提出）；及び出願第60/134,118号；第60/134,117号及び第60/134,114号（全て1999年５月14日出願）；各開示はその全体がここに取り込まれている。
【０００２】
１．発明の分野
本発明はペプチド及びペプチド類似体、ならびに造血系細胞の活性を制御するためのそれら組成体の利用に適した方法に関する。一面において本発明はPDZドメイン含有蛋白質とPDZドメインに結合する蛋白質間の相互作用を拮抗することで造血細胞の代謝を変調する（例えば活性化）方法を提供する。一面において本発明は造血細胞により発現される表面受容体のカルボキシル末端に対応するアミノ酸配列及び膜貫通トランスポーター配列を含む融合蛋白質に関する；この様な融合ペプチドは細胞活性化を阻害することによる造血細胞の制御に有用である。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
蛋白質のPDZドメインは３種類の原型蛋白質：PSD95、ショウジョウバエ大ディスク蛋白質及びZonula Occludin I蛋白質（Gopmertsら、1996、Cell 84: 659-662)と命名されている。PDZドメイン含有蛋白質は細胞内相互作用を通じ、膜貫通神経伝達受容体を組織化することでシナプス形成に関係している。PDZドメインはサイン配列GLGFを含む。神経系では典型的PDZドメイン含有蛋白質は３カ所のPDZドメイン、１カ所のSH3ドメイン及び１カ所のグアニレートキナーゼドメインを含む。細胞内PDZドメイン含有蛋白質の例にはシナプスに於けるLIN-2、LIN-7及びLIN-10、及び後シナプスに於けるPSD95が含まれる。
【０００４】
PDZドメインは神経細胞の膜貫通蛋白質のカルボキシル末端に結合することが示されている。SongyangらはPDZドメインに結合できる蛋白質はE-S/T-X-V/Iのカルボキシル末端モチーフを含むとを報告した（Songyangら、1997、Science275:73）。X-線結晶学研究はモチーフ配列及びPDZドメイン間の接触点を明らかにした（Doyleら、1996、Cell 88:1067-1076)。神経単位内のPDZドメイン及びイオンチャンネル間の相互作用は詳しく研究されているのに対し、その他生物学的システム、特に造血系でのこれら相互作用に関する研究は限定的である。
【０００５】
造血系は様々な機能を持つ各種細胞から構成されている。その多様な機能の多くは、イオンチャンネルを含む細胞表面受容体、細胞-細胞相互作用を統合するための接着表面分子及びサイトカイン受容体の統合的な運動を必要とする。それらの持つ多様な機能的活性にも関わらず、全ての造血細胞は多分化能型骨髄造血幹細胞から発生すると信じられている。分化する間に、幹細胞は複数の特異的造血細胞系統それぞれの始原細胞を生ずる。その後始原細胞は一連の形態学的及び機能的変化を受け、成熟した機能的委任造血細胞を生ずる。
【０００６】
造血細胞により遂行される機能の中、免疫には特定の細胞型のみが関与している。例えばT細胞、B細胞及びナチュラルキラー（NK)細胞を含むリンパ球は免疫反応のエフェクターである。単球及び顆粒球（即ち好中球、好塩基球及び好酸球）は非特異的防御に役割を持っている。リンパ球、単球及び顆粒球は白血球と総称される。一方、その他造血細胞は免疫系とは無関係な機能を果たす。例えば赤血球はガス輸送に関与しており、血小板は血液凝固に関係している。
【０００７】
T細胞及びB細胞は抗原を認識し、免疫応答を生起する。T細胞はT細胞受容体（TCR)と呼ばれるヘテロダイマー型表面受容体により抗原を認識する。TCRはCD3複合体と総称される一連のポリペプチドと結合する。B細胞は分泌性分子でもある表面免疫グロブリン（Ig)により抗原を認識する。更に、大数の共刺激性表面受容体がT細胞及びB細胞に同定されており、これらは抗原誘導活性化に於いて細胞活性化を増大させる。
【０００８】
T細胞抗原受容体/CD3複合体（TCR/CD3)に加え、T細胞により発現され、活性化シグナルと伝達するその他分子にはCD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD18、CD27、CD28、CD43、CD45、CD152（CTLA-4)、CD154、MHCクラスI、MHCクラスII、CDw137（4-1BB)、CDw150等が含まれる（Barelayら、The Leucocyte Antigen Facts Book, 1997, 第二版, Academic Press; Leucocyte Typing, 1984, Bernardら、(編集）, Springer-Verlag; Leukocyte Typing II, 1986, Reinherzら、（編集）, Springer-Verlag; Leukocyte Typing III, 1987, McMichael （編集）, Oxford University Press; Leukocyte Typing IV, 1989, Knappら（編集）, Oxford University Press; CD Antigens, 1996, VI Internat. Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, http://www.ncbi.nih.gov/prow)が、これらに限定されない。TCR/CD3と共に働く細胞表面抗原は当分野ではしばしば共受容体と呼ばれる。
【０００９】
上記T細胞表面抗原の全てに対し特異抗体が作製されている。上記T細胞表面受容体に結合するその他分子には、可変域の様な抗原結合抗体誘導体、ペプチド、スーパー抗原、及びCD2に対するCD58、CD4に対するHIVgp、CD27に対するCD27L、CD28又はCD152に対するCD80又はCD86、CD11a/CD18に対するICM1、ICAM2及びICAM3、CDw137に対する4-1BBLの様なそれらの天然リガンドが含まれる。
【００１０】
B細胞により発現される活性化分子には表面Ig、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD40、CD45、CD80、CD86及びICAM1が含まれるが、これらに限定されない。同様にこれら分子の天然リガンド及びそれらに対する抗体及び抗体誘導体もB細胞への活性シグナル付与に利用できるだろう。
【００１１】
しかし、本発明の以前には白血球受容体刺激後のシグナル伝達がPDZドメイン含有蛋白質との受容体相互作用により伝達されることは知られていなかった。従って、白血球受容体/PDZドメイン相互作用の干渉が白血球活性化を制御できることは、当分野では予想すらされていなかった。
【発明の概要】
【００１２】
３．発明の要約
一面においては、本発明は細胞、例えば内皮細胞又は造血細胞（例えばT細胞又はB相棒の様な白血球）内に、これら細胞内のPDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合を阻害するアンタゴニスト又は細胞内のPDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合を促進するアゴニストを導入することによりこれら細胞の生物学的機能を変調する方法を提供する。各種実施態様ではPL蛋白質は接着蛋白質、アダプター蛋白質又は細胞内蛋白質である。実施態様ではそれはCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD4、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb又はFasリガンドである。ある実施態様では、PL蛋白質はX-S-X-A、X-A-D/E-V、X-V/I/L-X*-V又はX-S/T-X-F（ここでのXは何れかのアミノ酸を、X*はいずれかの非芳香族アミノ酸である）であるカルボキシ末端アミノ酸モチーフを特徴とする。実施態様では、PL蛋白質はTリンパ細胞又はＢリンパ細胞により発現される。本発明の幾つかの実施態様ではPDZ蛋白質はCASK、MPP1、DLG1、PSD95、NeDLG、SYN1a、TAX43、LDP、LIM、LIMK、AF6、PTN-4、prIL16、41.8、RGS12、DVL1、TAX40、TIAM1、MINT1、K303、TAX2又はKIAA561である。
【００１３】
幾つかの実施態様では、細胞は白血球であり生物学的機能は細胞活性化、細胞増殖、細胞構造の維持、細胞代謝活性、又はサイトカイン産生である。いくつかの実施態様では、方法はさらに白血球活性化の変化を検出することも含む。
好適実施態様ではアゴニストは“A”アッセイ中、“G”アッセイ中又はAアッセイ及びGアッセイ両方に於けるPDZドメインポリペプチドへのPLペプチドの結合を阻害する作用物質である。アゴニストはPL蛋白質のカルボキシ末端２残基と同一である少なくとも２残基をカルボキシ末端に持つポリペプチドの様なポリペプチドであり、前記PL蛋白質は造血又は内皮細胞内に発現される接着他泊質、アダプター蛋白質又は細胞内蛋白質である。実施態様の一つでは少なくともポリペプチドのカルボキシ末端４残基はPL蛋白質のカルボキシ末端４残基に同一である。実施態様の一つでは、PL蛋白質はX-S-X-A、X-A-D/E-V、X-V/I/L-X*-V又はX-S/T-X-Fから選択されるカルボキシ末端アミノ酸モチーフにあって、前記Xがいずれかのアミノ酸でありX*がいずれかの非芳香族アミノ酸であるモチーフを有する。実施態様ではPL蛋白質はCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb又はFasリガンドである。
【００１４】
関連面の一つでは、アンタゴニストはPL阻害剤配列ペプチドの模擬ペプチドである。別の関連面では、アンタゴニストPL配列及び膜貫通トランスポーターアミノ酸配列（HIV tat、ショウジョウバエ触覚肢、単純ヘルペスウイルスVP22または高DNA CDR2及び3の様な）を有する融合ポリペプチドである。
別の面では発明は、PDZ蛋白質由来の配列を有するPDZドメインポリペプチドをPLペプチドとそれらが複合体を形成する条件下に、試験化合物有り無しにて接触せしめること、及び試験化合物有無に於ける複合体形成を検出することで試験化合物がPDZ蛋白質とPL蛋白質間の結合の阻害剤であるかを決定する方法にあって、試験化合物非存在下に比べ試験化合物存在下での複合体形成が少ないことが試験化合物がPDZ蛋白質-PL蛋白質結合の阻害剤であることを示す方法を提供する。PLペプチドはCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb又はFasリガンドの様なPL蛋白質のC-末端配列を含む配列を有している。幾つかの実施態様では、PDZドメインポリペプチドは融合ポリペプチドである。
【００１５】
関連する面では、発明はPDZドメインポリペプチドをPLペプチドと、それらが複合体を形成する条件下に試験化合物有り無しにて接触せしめること、及び試験化合物の有り無しでの複合体形成を検出することで試験化合物がPDZ蛋白質及びPL蛋白質間の結合のアゴニストであるか決定する方法にあって、試験化合物無しの状態に比べ試験化合物有りの状態での複合体形成がより多いことが、試験化合物がPDZ蛋白質-PL蛋白質結合のアゴニストであることを示す方法を提供する。
【００１６】
発明は更にPDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合の阻害剤を提供する。実施態様の一つでは、阻害剤はCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb及びFasリガンドから成るグループから選択されるPLペプチド及びPDZドメインポリペプチドから成るグループより選択されるペプチドの結合を低下することを特徴とする。様々な実施態様で阻害剤はCD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD97、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb又はFasリガンドから選択されるPL蛋白質のC-末端配列の３ないし約20残基である配列を含むペプチド；モチーフX-S-X-A、X-A-D/E-V、X-V/I/L-X*-V、又はX-S/T-X-F（ここでのXはいずれかのアミノ酸であり、X*はいずれかの非芳香族アミノ酸である）を含むペプチド；模擬ペプチド；又は小有機分子である。発明は更にこの阻害剤を含む医薬組成体も提供する。
【００１７】
発明はまたPL-PDZ相互作用阻害剤の治療有効量を投与することによる、白血球活性化を特徴とする疾患の治療に関する方法も提供する。実施態様では、疾患は炎症性又は液性免疫反応を特徴とするか、又は自己免疫疾患である。発明は更にPDZ蛋白質及びPL蛋白質の結合を阻害する作用物質を投与することによる被験体内の炎症を減じる方法にあって、前記ＰＬ蛋白質が接着蛋白質、アダプター蛋白質、又は細胞内蛋白質である方法を提供する。
発明はまた白血球活性化を阻害し、又は炎症性あるいは体液性免疫反応を特徴とする造血細胞介在疾患を治療することを目的とした、PDZ蛋白質及びPL蛋白質結合の阻害剤の利用を提供する。発明はまた造血細胞介在疾患の治療に適した医薬品調整へのPDZ蛋白質とPL蛋白質結合の阻害剤の利用も提供する。
【００１８】
発明はさらに、表２に示す如くに細胞内のPDZ蛋白質とPL蛋白質の結合を阻害するアンタゴニストを細胞内に導入することを含む造血細胞の生物学的機能を変調する方法にあって、前記PL蛋白質がDNAM-1でありPDZ蛋白質がMPP1、MPP2、DLG1、NcDLG、PSD95、LIM、AF6、41.8又はRGS12であるもの、PL蛋白質がLPAPでありPDZ蛋白質がDLG1又はMINT1であるもの、又はPL蛋白質がDNAM-1でありPDZ蛋白質がPSD95又はMPP2である方法も提供する。
本発明はまた造血細胞のPDZドメインに結合するペプチド及びペプチド類似体にも関する。具体的には、それは造血細胞表面受容体カルボキシル末端配列及び標的細胞内へのペプチド浸入を促進する膜貫通トランスポート配列を含む融合ペプチド及びペプチド類似体に関する。発明はまたサイトカイン産生、細胞増殖、アポトーシス及び細胞毒性により測定される白血球活性化を阻害する組成体を仕様する方法にも関する。
【００１９】
発明の目的の一つは、望ましくない白血球介在事象を阻害することを目的とし、被検体に医薬組成体として上記融合ペプチド又はペプチド類似体の治療有効量を投与することである。
自己免疫疾患の治療または固形臓器移植の移植拒絶を防止することを目的とし、被検体に上記融合ペプチド又はペプチド類似体の治療有効量を投与することも発明の目的の一つである。
【００２０】
表
表１  アミノ酸分類
表２  蛋白質-リガンドペア
表３  PDZドメイン
表3A  表３の注意事項
表４  PLペプチド
表５A及びB  例示PLモチーフ
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有するビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている。キー：
【表１】
2011102326.tif 000002
【図１Ｂ】図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有するビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている。
【図１Ｃ】図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有するビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている。
【図１Ｄ】図1A-1Dは各種白血球蛋白質のカルボキシル末端（“c-末端”）の配列を有するビオチン化ペプチドのPDZドメインへの結合（即ちGST-PDZドメイン融合蛋白質）が下記“G”アッセイを利用し決定されている例示アッセイの結果を示す。PDZドメインは：PSD95（図１A）；NeDLG(図1B）；DLG1（図1C）；及び41.8（図1D）である。これら及びその他PDZドメイン融合蛋白質は以下に記載される（例えば表２）。図では、ペプチドI-31はアッセイに使用されたビオチン化PLペプチドを表し、下記キー内に特定されている。“ペプチドIDs”は表３に規定されている。
【００２２】
【図２Ａ】図2A及び2BはPDZ-リガンド相互作用に関する見かけ上の親和性測定値を示す。各種濃度のビオチン化CLASP-2（図2A；表４）又はFas（図2B；表４）C-末端ペプチドを固定化（プレート結合）GSTポリペプチド又はGST-PDZ融合蛋白質（GST-DLG1、GST-NeDLG及びGST-PSD95）と反応させた。各ペプチド濃度でのシグナルを得るために、融合蛋白質への結合からGST単独（＜0.2OD単位）への結合が差し引かれた。次にこのシグナルは各ペプチド-PDZペアについて観察された最大シグナルにて各ペプチド濃度のシグナルを除することで正規化された（即ち40uMClasp2ペプチド又は100uMFASペプチドについて得られたシグナル；Clasp2の場合で0.4-1.0OD単位、及びFasの場合で1.2-2.0OD単位）。次に正規化シグナルはプロットされ、飽和結合カーブに適合された結果、DLG1-Clasp2相互作用に関して21uM、NeDLG-Clasp2相互作用に関し7.5uM、PSD95-Clasp2相互作用に関し45uM、DLG1-Fas相互作用に関し54uM、NeDLG-Fas相互作用に関し54uMそしてPSD95-Fas相互作用に関しては85uMの見かけ上の親和性を得た。データは二重データポイントの平均値であり、二重データ間の標準誤差は＜20%である。
【図２Ｂ】図2A及び2BはPDZ-リガンド相互作用に関する見かけ上の親和性測定値を示す。各種濃度のビオチン化CLASP-2（図2A；表４）又はFas（図2B；表４）C-末端ペプチドを固定化（プレート結合）GSTポリペプチド又はGST-PDZ融合蛋白質（GST-DLG1、GST-NeDLG及びGST-PSD95）と反応させた。各ペプチド濃度でのシグナルを得るために、融合蛋白質への結合からGST単独（＜0.2OD単位）への結合が差し引かれた。次にこのシグナルは各ペプチド-PDZペアについて観察された最大シグナルにて各ペプチド濃度のシグナルを除することで正規化された（即ち40uMClasp2ペプチド又は100uMFASペプチドについて得られたシグナル；Clasp2の場合で0.4-1.0OD単位、及びFasの場合で1.2-2.0OD単位）。次に正規化シグナルはプロットされ、飽和結合カーブに適合された結果、DLG1-Clasp2相互作用に関して21uM、NeDLG-Clasp2相互作用に関し7.5uM、PSD95-Clasp2相互作用に関し45uM、DLG1-Fas相互作用に関し54uM、NeDLG-Fas相互作用に関し54uMそしてPSD95-Fas相互作用に関しては85uMの見かけ上の親和性を得た。データは二重データポイントの平均値であり、二重データ間の標準誤差は＜20%である。
【００２３】
【図３Ａ】図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-NeDLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｂ】図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-NeDLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｃ】図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-NeDLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｄ】図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-NeDLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【００２４】
【図３Ｅ】図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-NeDLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図３Ｆ】図3A-3FはPDZ-PLペプチド相互作用の阻害を示す。固定濃度の細胞表面受容体蛋白質（Clasp2、CD46、Fas及びKV1.3；表４参照）のC-末端配列に基づく配列を有するビオチン化C-末端ペプチドを、各フレームの左上に示した固定化GSTポリペプチド又はGST-融合蛋白質に、各フレームの説明に示した競合ペプチド有り無しの状態で結合させ、阻害レベルを決定した。図3A-DLG1；図3B-PSD95；図3C-NeDLG；図3D-DLG1、図3E、PSD95；図F-41.8。図3A-Bでは競合体ペプチドは100uM存在している；図3C-Fでは競合対は指示濃度存在している。
【図４Ａ】図4A及び4BはT細胞活性化へのTat-CD3融合ペプチドの導入結果を示している。抗原特異的T細胞活性化はサイトカイン産生より測定された。tat及びT細胞表面分子カルボキシル末端を含む融合ペプチドは、ミエリン塩基性蛋白質（MBP)刺激に対する反応に於けるT細胞株によるγ-インターフェロン（IFN)産生を阻害する。阻害レベルはまず融合蛋白質に対する結合からGST単独に対する標識ペプチドの結合を差し引き、次に阻害体ペプチド無しに於けるシグナルで除して決定された。
【図４Ｂ】図4A及び4BはT細胞活性化へのTat-CD3融合ペプチドの導入結果を示している。抗原特異的T細胞活性化はサイトカイン産生より測定された。tat及びT細胞表面分子カルボキシル末端を含む融合ペプチドは、ミエリン塩基性蛋白質（MBP)刺激に対する反応に於けるT細胞株によるγ-インターフェロン（IFN)産生を阻害する。阻害レベルはまず融合蛋白質に対する結合からGST単独に対する標識ペプチドの結合を差し引き、次に阻害体ペプチド無しに於けるシグナルで除して決定された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
5.1  ここに用いる“融合蛋白質”又は“融合ポリペプチド”は複合蛋白質、即ち通常は単一のアミノ酸配列に一つに融合していない２つ（またそれ以上の）の別個の異種ポリペプチドから作られた単一の連続的アミノ酸配列を意味する。即ち、融合蛋白質は２個の全く別個のアミノ酸配列または２個の類似あるいは同一ポリペプチド配列を含む単一アミノ酸配列を含むことができ、これら配列は天然に見いだされる単一アミノ酸配列中の同一配置中に一緒に見いだされることはない。融合蛋白質は一般に当分野で良く知られている組換え体核酸法、即ち組換え体遺伝子融合産物の転写及び翻訳の結果として融合体が発明のポリペプチドをコードする断片と異種蛋白質をコードする断片を含む方法、または化学合成法のいずれかを使用し調整できる。
5.2  ここで用いる“融合蛋白質構築体”は、融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２６】
5.3  ここで用いる用語“PDZドメイン”は、脳シナプス蛋白質PSD-95、ショウジョウバエ隔壁結合蛋白質Discs-Large(DLG)及び上皮タイト結合蛋白質ZO1（ZO1）に対する相同性を特徴とする約90アミノ酸の蛋白質配列（即ちモジュラー蛋白質ドメイン）を表す。PDZドメインはDiscs-Large相同性リピート（“DHRs”）及びGLGFリピートとしても知られる）。PDZドメインは一般にはコアコンセンサス配列を維持すると思われている（Doyle、D.A.,1996, Cell 85; 1067-1076）。
PDZドメインはグアニレートキナーゼ相同体のMAGUKファミリーのメンバー、複数の蛋白質フォスファターゼ及びキナーゼ、神経一酸化窒素合成酵素及びシントロフィンと総称される複数のジストロフィン付随蛋白質を含む、多様な膜関連蛋白質に見いだされている。
例示的PDZドメイン含有蛋白質及びPDZドメイン配列は表３に示されている。用語“PDZドメイン”はまた表３（例えば多形変異体、保存的置換を持つ変異体等）の配列の変異体（例えば自然発生変異体）も包含する。典型的には、PDZドメインは表３に示すドメインと実質同一であり、例えば最大一致を得る様に配列し比較した場合に少なくとも約70%、少なくとも約80%、又は少なくとも約90%のアミノ酸残基同一性を持つ。
【００２７】
5.4  ここで用いる場合、用語“PDZ蛋白質”はPDZドメインを含んでいる天然発生蛋白質、例えばヒト蛋白質を表す。例示のPDZ蛋白質にはCASK、MPP1、DLG1,PSD95、NcDLG、TAX33、SYN1a、TAX43、LDP、LIM、LIMK1、LIMK2、MPP2、NOS1、AF6、PTN-4、prIL16、41.8kD、KIAA0559、RGS12、KIAA0316、DVL1、TAX40、TIAM1、MINT1、KIAA0303、CBP、MINT3、TAX2、KIAA0561が含まれる。例示PDZ蛋白質はひょう２及び表３に一覧されている。
5.5  ここで用いる場合、用語“PDZ-ドメインポリペプチド”はPDZドメイン配列、天然発生PDZドメイン又は単離PDZドメインペプチドを含む融合蛋白質の様なPDZドメインを含んでいるポリペプチドを表す。
【００２８】
5.6  ここで用いる場合、“PL蛋白質”又は“PDZリガンド蛋白質”はPDZドメインと分子複合体を形成する天然発生蛋白質又は完全長蛋白質から分離して発現された場合に（例えば4-25残基、例えば16残基ペプチド断片の様な）そのカルボキシ末端がそのような分子複合体を形成する蛋白質を表す。分子複合体はインビトロでは下記“Ａアッセイ”又は“Ｇアッセイ”を使用し、又はインビボにて観察できる。表２掲載の例示PL蛋白質は、特異的PDZ蛋白質を結合することが示されている。この定義は抗PDZ抗体等を包含することを意図しない。
5.7  ここで用いる“PL配列”はPL蛋白のC-末端アミノ酸配列（例えばC-末端２、３、４、５、６，７，８，９、10、12、14、16、20又は25残基）（“C-末端PL配列”）又はPDZドメインに結合することが既知である内部配列（“内部PL配列”）を表す。
【００２９】
5.8  ここで用いる“PLペプチド”はPL蛋白質のC-末端の配列に由来する、または基づく配列を有するペプチドである。例示PLペプチド（ビオチン化）は表４に掲載されている。
5.9  ここで用いる“PL融合蛋白質”は、融合蛋白質の１ドメインとして、典型的にはC-末端ドメインとしてPL配列を有する融合蛋白質である。例示のPL融合蛋白質はtat-PL配列融合体である。
5.10  ここで使用する場合、用語“PL阻害剤ペプチド配列”は、PDZドメインポリペプチドとPLペプチド間の相互作用を阻害する（例えばAアッセイまたはGアッセイにて）PLペプチドのアミノ酸配列（ペプチド又はPL融合蛋白質の形をした）を表す。
5.11  ここで用いる“PDZ-ドメインコーディング配列”は、PDZドメインをコードしているポリヌクレオチドの断片を意味する。各種実施態様では、ポリヌクレオチドはDNA、RNA、単鎖又は二本鎖である。
5.12  ここで使用する場合、用語“アンタゴニスト（拮抗剤）”及び“阻害剤”は、結合相互作用（PDZドメイン配列のPL配列への結合の様な）を変調する流れで使用される場合には互換的に使用され、例えばPL配列（例えばPLペプチド）と例えばPDZドメイン（例えばPDZ蛋白質、PDZドメインペプチド）の結合を低下する作用物質を表す。
5.13  ここで使用する場合、用語“アゴニスト”及び“エンハンサー”は、結合相互作用（PDZドメイン配列のPL配列への結合の様な）を変調する流れで使用される場合には互換的に使用され、例えばPL配列（例えばPLペプチド）と例えばPDZドメイン（例えばPDZ蛋白質、PDZドメインペプチド）の結合を増加する作用物質を表す。
【００３０】
5.14  ここで使用される場合、用語“模擬ペプチド、”“ペプチドミメティック、”及び“ペプチド類似体”は互換的に使用され、発明のPL阻害性またはPL結合性ペプチドと本質的に同一である構造的及び／又は機能的特性を有する合成化合物を表す。模擬体は合成の、非天然型アミノ酸類似体から全体が成るか、又は一部天然ペプチドアミノ酸と一部アミノ酸の非天然類似体から成るキメラ分子のいずれかである。模擬体はまた、それら置換体が模擬体の構造及び／又は阻害的あるいは結合活性を実質変えない範囲の量にて天然アミノ酸の保存的置換を含むこともできる。保存的変異体である発明のポリペプチドを使用する場合、通常の実験が模擬体が発明の範囲内にあるか、即ちその構造及び／又は機能が実質変化していないか決定するだろう。即ち、模擬組成体がPDZドメインに結合でき、及び／又はPL-PDZ相互作用を阻害できれば、それは発明の範囲内である。
【００３１】
ペプチドミメティック組成体は典型的には３構造グループ：ａ）天然アミド結合（“ペプチド結合”）連結以外の残基連結グループ；ｂ）天然発生アミノ酸残基の代りの非天然残基；又はｃ）模擬的二次構造を誘導する、即ち二次構造、例えばβターン、γターン、α螺旋立体構造等を誘導または安定化する残基、に由来する非天然構造成分の組合せを含むことができる。
ポリペプチドはその残基の全て又は一部が天然のペプチド結合以外の化学的手段により結合されている場合には、模擬体として特徴付けることができる。個々のペプチドミメティック残基はペプチド結合、その他化学的結合又は例えばグルタールアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能型マレイミド、N,N=-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又はN,N=-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC)の様なカップリング手段により結合させることができる。従来のアミド結合（“ペプチド結合”）連結に替わることができる連結グループには、例えばケトメチレン（例えば-C(=O）-NH-に替わり-C(=O)-CH2）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CH4-）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド又はエステル（例えばChemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp267-357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY中のSpatola（1983）参照）が含まれる。
【００３２】
ポリペプチドはまた、天然発生アミノ酸残基に代わる全て、又は幾つかの非天然残基を含むことにより模擬体として特徴付けることができる。非天然残基は科学及び特許文献中によく記述されている：天然アミノ酸残基模擬体として有用である幾つかの例示的非天然組成体及び指針が以下に記載されている。
芳香族アミノ酸の模擬体は例えばD-又はL-ナフチルアミン；D-又はL-フェニルグリシン；D-又はL-2チエニルアラニン；D-又はL-1、-2、3-又は4-ピレニルアラニン；D-又はL-3チエニルアラニン；D-又はL-（2-ピリジニル）-アラニン；D-又はL-(3-ピリジニル）-アラニン；D-又はL-（2-ピラジニル）-アラニン；D-又はL-（4-イソプロピル）-フェニルグリシン；D-（トリフルオロメチル）-フェニルグリシン；D-（トリフルオロメチル）-フェニルアラニン；D-p-フルオロフェニルアラニン；D-又はL-p-ビフェニルフェニルアラニン；D-（トリフルオロメチル）-フェニルアラニン；D-p-フルオロフェニルアラニン；D-又はL-p-ビフェニルフェニルアラニン；K-又はL-p-メトキシビフェニルフェニルアラニン；D-又はL-2-インドール（アルキル）アラニン；及びD-又はL-アルキルアラニンにあって、前記アルキルはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-イソチル、イソ-ペンチル又は非酸性アミノ酸により置換されても置換されなくとも良いものであるもので置換することで作ることができる。非天然アミノ酸の芳香環には例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾール、ナフチル、フラニル、ピロリル及びピリジル芳香環が含まれる。
【００３３】
酸性アミノ酸模擬体は、例えば負電荷を維持している非カルボン酸塩アミノ酸；（ホスホの）アラニン；硫酸化スレオニンによる置換により生成することができる。カルボキシル側基（例えばアスパラチル又はグルタミル）は例えば1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル）カルボジイミド又は1-エチル-3（4-アゾニア-4,4-ジメトールペンチル）カルボジイミドの様なカルボジイミド（R=-N-C-N-R=）との反応により選択的に修飾できる。アスパラチルまたはグルタミルはアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することもできる。
塩基性アミノ酸の模擬体は例えば（リジン及びアルギニンに加え）アミノ酸オルニチン、シトルリン又は（グアニジノ）-酢酸又は（グアニジノ）アルキル-酢酸にあって、アルキルが上記に同じであるものにより置換することで生成できる。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-成分を含む）はアスパラギン又はグルタミンの代用になる。アスパラギニル及びグルタミニル残基は対応するアスパルチル又はグルタミル残基に脱アミン化することができる。
【００３４】
アルギニン残基模擬体は、アルギニルを例えばフェニル具リオｋさる、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、又はニンヒドリンを含む例えば１又はそれ以上の通常の試薬と、好ましくはアルカリ条件下に反応させることで生成できる。
チロシン残基模擬体は、チロシルを例えば芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンと反応させることで生成できる。N-アセチルイミダゾル及びテトラニトロメタンを使用し、それぞれO-アセチルチロシル種及び3-ニトロ誘導体を形成することができる。
システイン残基模擬体はシステニル残基を例えば2-クロロ酢酸又はクロロアセトアミドの様なアルファ-ハロ酢酸エステル及び対応するアミンと反応させることで生成でき、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基模擬体もまたシステニル残基を例えばブロモトリフルオロアセトン、アルファ-ブロモ-ベータ-(5-イミダゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルリン酸、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピリジルジスルフィド；p-クロロ安息香酸水銀；2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール；又はクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることで生成できる。
【００３５】
リジン模擬体はリジニルを例えばスクシン又はその他無水カルボン酸と反応させることで生成（及びアミノ末端残基を変化させることが）できる。リジン及びその他アルファ-アミノ-含有残基模擬体はメチルピコルイミデートの様なイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4,ペンタンジオンとの反応、及びグリオキシレートによるトランスアミダーゼ-触媒反応により生成できる。
メチオニンの模擬体は例えばメチオニンスルホキシドとの反応により生成できる。プロリンの模擬体には例えばピペコリック酸、チアゾリジンカルボン酸、3-又は4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-又は4-メチルプロリン、又は3,3-ジメチルプロリンとの反応により生成できる。ヒスチジン残基模擬体はヒスチジルと例えばジエチルプロカルボン酸エステル又はパラブロモフェンアシルブロマイドとの反応により生成できる。
【００３６】
その他模擬体には例えばプロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレノニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニン及び辞すチジンのアルファ-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化又はN-メチルアミノ酸による置換；又はC-末端カルボキシル基のアミド化により生成された模擬体が含まれる。
天然ポリペプチド（例えばPLポリペプチド又はPDZポリペプチド）の成分は、逆キラリティーを持つアミノ酸（又はペプチドミメティクス残基）により置換できる。即ち、L-型の天然発生アミノ酸は（化学物質の構造によりR又はSとも称することができる）同一化学構造を持つアミノ酸又はペプチドミメティクスにより置換できるが、逆キラリティー、一般にはD-アミノ酸と呼ばれるがR-又はS-型と呼ばれることもあるものでは置換できない。
【００３７】
発明の模擬体は構造的模擬残基、具体的にはベータターン、ベータシート、アルファ螺旋構造、ガンマターン等の二次構造を誘導または模擬する残基を含む組成体も含むことができる。例えばペプチド内での天然アミノ酸残基のD-アミノ酸；N-アルファ-メチルアミノ酸；C-アルファ-メチルアミノ酸；又はデヒドロアミノ酸による置換はベータターン、ガンマターン、ベータシート又はアルファ螺旋立体構造を誘導又は安定化できる。ベータターン模擬構造体は例えばNagai（1985）Tet. Lett, 26:647-650; Feigl (1986) J. Amer. Chem. Soc. 108:181-182; Kahn(1988) J. Amer. Chem. Soc. 110: 1638-1639; Kemp(1988) Tet.Lett. 29:5057-5060; Kahn(1988) J. Molec. Recognition 1:75-79に記載されている。ベータシート模擬構造体は例えばSmith(1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:10672-10674に記載されている。例えばシスアミド代用体、1,5-ジ置換型テトラゾールにより誘導されたVI型ベータターンはBeusen（1995) Biopolymers 36:181-200に記載されている。アキラル性オメガ-アミノ酸残基の取り込みによるアミド結合に関する置換体としてのポリメチレン単位の生成はBanerjee(1996) Biopolymers 39:769-777に記載されている。ポリペプチドの二次構造は例えば高電界型1H NMRまたは2D NMR分光分析により解析でき、例えばHiggins(1997) J. Pept. Res. 50:421-435を参照せよ。またHruby(1997) Biopolymers 43:219-266, Balajiら、米国特許第5,612,895号を参照。
【００３８】
5.15  ここで使用する場合、“ペプチド変異体”及び“保存的アミノ酸置換体”は同様の特性（大きさ、極性、疎水性等）を有するアミノ酸残基の置換により参照ペプチド（例えば特定されたPL蛋白質のカルボキシ末端の配列を有するペプチド）とは異なるペプチドを表す。即ち、発明の範囲に包含される化合物がアミノ酸残基に関し指定された分類で部分的に規定される場合、アミノ酸は一般にアミノ酸側鎖の特性に一次的に依存し、３主要分類；親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸及びしステイン-様アミノ酸に類別される。これら主要分類はさらに亜分類に分けられるだろう。親水性網の差は酸性、塩基性又は極性側さを有するアミノ酸を含み、そして疎水性アミノ酸は芳香性又は非極性側鎖を有するアミノ酸を含む。非極性アミノ酸はさらに脂肪族アミノ酸等を含む様に分けられるだろう。ここに使用されるアミノ酸の分類の定義は以下の通りである：
“疎水性アミノ酸”は生理学的pHで非荷電であり、水溶液により反発される
側鎖を有するアミノ酸を表す。遺伝的にコードされた疎水性アミノ酸の例にはIle、Leu及びValが含まれる。非遺伝的にコードされたアミノ酸例はt-BuAを含む。
“芳香族アミノ酸”は共役π-電子系を有する環を少なくとも一つ含む側鎖（芳香族基）を持つ疎水性アミノ酸を表す。芳香族基は更にアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシル、スルファニル、ニトロ及びアミノ基等の様な基と置換してもよい。遺伝的にコードされた芳香族アミノ酸の例には、フェニルグリシン、2-ナフチルアラニン、β-2-チエニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、4-クロロ-フェニルアラニン、2-フルオロフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが含まれる。
【００３９】
“非極性アミノ酸”は生理学的pHで一般に非荷電状態にあり、非極性である側鎖を有する疎水性アミノ酸を表す。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸の例にはGly、Pro及びMetが含まれる。非コード型非極性アミノ酸の例にはChaが含まれる。
“脂肪族アミノ酸”は飽和又は不飽和の直鎖型、分岐型又は環式炭化水素側鎖を有する非極性アミノ酸を表す。遺伝的にコードされた脂肪族アミノ酸の例にはAla、Leu、Val及びIleが含まれる。非コード型脂肪族アミノ酸の例にはNleが含まれる。
“親水性アミノ酸”は水溶液により誘引される側鎖を有するアミノ酸を表す。遺伝的にコードされた親水性アミノ酸の例にはSer及びLysが含まれる。非コード型親水性アミノ酸の例にはCit及びhCysが含まれる。
“酸性アミノ酸”は７未満の側鎖pK値を有する親水性アミノ酸を表す。酸性アミノ酸は典型的には、水素イオンの消失により生理学的pHにて負に荷電した側鎖を有している。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸の例にはAsp及びGluが含まれる。
“塩基性アミノ酸”は７より大きい側鎖pKを有する親水性アミノ酸を表す。塩基性アミノ酸は典型的には水素イオンとの結合により、生理学的pHに於いて正に荷電した側鎖を有している。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸の例にはArg、Lys及びHisが含まれる。遺伝的にコードされていない塩基性アミノ酸の例には、非環式アミノ酸オルニチン、2,3-ジアミノプロピオン酸、2,4-ジアミノブチリル酸及びホモアルギニンが含まれる。
【００４０】
“極性アミノ酸”は生理学的pHにて非荷電であるが、２個の原子により共有されている１組の電子が一方の原子により近く保持されている結合を有する親水性アミノ酸を表す。遺伝的にコードされた極性アミノ酸の例にはAsx及びGlxが含まれる。遺伝的にコードされない極性アミノ酸の例にはシトルリン、N-アセチルリジン及び硫酸メチオニンが含まれる。
“システイン様アミノ酸”は他アミノ酸残基の側鎖とジスルフィド結合の様な供給結合を形成できる側鎖を持つアミノ酸を表す。典型的にはシステイン様アミノ酸は一般には少なくとも１個のチオール（SH）基を含む側鎖を有している。遺伝的にコードされたシステイン様アミノ酸の例にはCysが含まれる。遺伝的にコードされていないシステイン様アミノ酸の例にはホモシステイン及びペニシリンが含まれる。
当業者により理解される如く上記分類は絶対ではなく−複数のアミノ酸は１以上の特性を有しており、そのために１以上の分類に含めることができる。例えばチロシンは芳香環及び極性ヒドロキシル基の両方を有している。即ちチロシンは二重に特性を有しており、芳香族及び極性分類の両方に含めることができる。同様に、システインはジスルフィド結合を形成できることに加え非極性の特性も有する。即ち疎水性又は非極性アミノ酸として厳格には分類されていないものの、システインは多くの例でペプチドに疎水性を付与するために使用できる。
【００４１】
発明のペプチド及びペプチド類似体に含まれる遺伝的にコードされない特に一般的に見られるアミノ酸にはβ-アラニン（b-Ala）及び3-アミノプロピオン酸（Dap）、2,3-ジアミノプロピオン酸（Dpr）、4-アミノブチリル酸等の様なその他のオメガ-アミノ酸；α-アミノイソブチリル酸（Aib）；ε-アミノヘキサノン酸（Aha）；δ-アミノ吉草酸（Ava）；N-メチルグリシン又はサルコシン（MeGly）；オルニチン（Orn）；シトルリン（Cit）；t-ブチルアラニン（t-ButA）t-ブチルグリシン（t-BuG）；N-メチルイソロイシン（MeIle）；フェニルグリシン（Phg）；シクロヘキシルアラニン（Cha）；ノルロイシン（Nle）；2-ナフチルアラニン（2-Nal）；4-クロロフェニルアラニン（Phe(4-Cl)）；2-フルオロフェニルアラニン（Phe(2-F)）；3-フルオロフェニルアラニン（Phe(3-F)）；4-フルオロフェニルアラニン（Phe(4-F)）；ペニシラミン（Pen）；1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸（Tic）；β-2-チエニルアラニン（Thi）；硫酸メチオニン(MSO)；ホモアルギニン（hArg）；N-アセチルリジン（AcLys）；2,3-ジアミノブチリル酸（Dab）；2,3-ジアミノブチリル酸(Dbu)；p-アミノフェニルアラニン(Phe(pNH2))；N-メチルバリン（MeVal）；ホモシステイン（hCys）及びホモセリン（hSer）が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらアミノ酸も随意上記規定の分類に含まれる。
上記の遺伝的にコードされた、及び遺伝的にコードされていないアミノ酸の分類は下表１にまとめられている。表１は例示のみを目的としたものであり、ここに記載のペプチド及びペプチド類似体を含むアミノ酸残基の網羅的一覧表を意味するものではない。ここに記載のペプチド及びペプチド類似体を作製する上で有用な他アミノ酸残基は、例えばFasman、1989、CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. CRC Press, Inc.,及びここに引用された参考文献中に見いだすことができる。ここに記載されていないアミノ酸は、具体的に特定されたアミノ酸と比較した場合の既知挙動、及び／又はそれらの特徴的な化学上及び／又は物理上の特性に基づき上記分類に随意分類することができる。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
5.16  ここで用いる“検出可能な標識体”は当分野通常の意味であり、検出に利用され、又は利用できる（例えば物理的あるいは化学的特性に基づき）原子（例えば放射性核種）、分子（例えばフルオロセイン）又は複合体を表し、分子の存在またはそれと共有結合又はその他結合する他分子と結合できることを示す。用語“標識体”はまた基質に作用し検出可能な原子、分子又は複合体を産生する共有結合またはその他結合した分子（例えば酵素の様な生物分子）を表す。本発明での利用に好適な検出可能な標識体には分光光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能な組成体を含む。本発明に有用な標識体は、標識化ストレプトアビジン共役体で染色する場合のビオチン、磁性ビーズ（例えばDnyabeadsTM）、蛍光色素（例えばフルオロセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光蛋白質、エンハンスドグリーン蛍光蛋白質等）、放射性核種（例えば3H、125I、35S、14C又は32P）、酵素（例えばヒドラーゼ、特にアルカリホスファターゼの様なホスファターゼ、エステラーゼ又はグリコシダーゼ、あるいは特に西洋ワサビペルオキシダーゼの様なペルオキシダーゼ、及びその他ELISAsに一般的に使用されているもの）、基質、補助因子、阻害剤、化学発光基、発色剤及び金コロイド又は着色ガラスあるいはプラスチック製（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズの様な着色標識体が含まれる。これら標識体の使用を教示する特許には米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号；及び第4,366,241号が含まれる。これら標識体を検出する手段は当業者に良く知られている。即ち、例えば放射線核種及び化学発光標識体は写真フィルム又はシンチレーションカウンターを使用し検出され、蛍光マーカーは放射光線を検出するための光検出器（例えば蛍光活性化細胞ソーティング）を使用し検出されるだろう。酵素標識体は典型的には酵素に基質を供与し、基質に対する酵素の作用により生じた反応産物を検出することで検出され、着色標識体は着色された標識体を単純に目で見ることで検出される。即ち、標識体は分光光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能ないずれかの組成体である。標識体は当分野公知の方法に従い所望成分に直接、又は間接的に結合される。非放射活性標識体は間接的手段により結合されることが多い。一般にリガンド分子（例えばビオチン）は分子に供給結合される。次にリガンドは、元来検出可能であるか又は検出可能酵素、蛍光化合物あるいは化学発光化合物の様なシグナル生成システムに共有結合されている抗リガンド（例えばストレプトアビジン）分子に結合する。複数のリガンド及び抗リガンドが利用できる。リガンドが天然抗リガンド、例えばビオチン、チロキシン及びコルチゾールを有する場合、それらは標識化天然発生抗リガンドと共に使用することができる。あるいは、ハプテン性又は抗原性化合物を抗体と共に利用することができる。分子はまた例えば酵素又は発蛍光団を結合させることでシグナル生成化合物に直接結合することできる。標識体の検出手段は当業者に良く知られている。即ち、例えば標識体が放射性標識体の���合、検出手段にはシンチレーションカウンター、オートラジオグラフィーの様な写真フィルム、又はストレージ蛍光団イメージングが含まれる。標識体が蛍光標識体の場合には、それは適当な波長光により発蛍光団を励起し、生じた蛍光を検出することで検出されるだろう。蛍光は肉眼、写真フィルムによる手段、電荷結合素子（CCDs）の様な電子的検出装置又は光電子倍増管の使用により検出される。同様に酵素標識体は、酵素に対し適当な基質を供与し、生じた反応産物を検出することで検出されるだろう。また単純着色標識体は標識体に付随する色彩を観察することで検出されるだろう。発蛍光団の対をアッセイに使用する場合には、多くの場合それらが異なる発光パターンを持ち、それによりそれらを容易に区別できるものが好ましい。
【００４４】
5.17  ここで使用する用語“本質的に同一”は、アミノ酸を比較する場合に於いては、最大一致例に関し比較し整列させた場合に、配列が少なくとも約70%、少なくとも約80%、又は少なくとも90%のアミノ酸同一性を有することを意味する。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴニズムはFASTAアルゴリズムであり、Pearson、W.R. & Lipman, D.J., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444に記載されている。またW.R.Pearson, 1996, Methods Enzymol. 266:227-258参照。パーセント同一性を計算するためにDNA列のFASTAアラインメント中に使用される好適パラメータは最適化され、BL-50マトリックス15；-5k-tuple=2；ペナルティー=40、最適化=28；ギャップペナルティー-12、ギャプ長ペナルティー＝-2及び幅=-16である。
5.18  ここで使用する“造血細胞”にはリンパ球（T細胞、B細胞及びNK細胞）、単球及び顆粒球を含む白血球（即ち好中球、好塩基球、好酸球）、マクロファージ、樹状細胞、巨大核細胞、網状赤血球、赤血球及びCD34+幹細胞が含まれる。
【００４５】
6.  発明の詳細な説明
本発明者はPDZ棚泊質及びPL蛋白質間の相互作用が造血細胞及び免疫反応に関わるその他細胞の生物学的機能に重要かつ広範な役割を果たすことを見いだした。PDZ-PL相互作用は神経系（即ち神経単位）では既知であったが、造血細胞機能、特にT細胞及びB細胞の機能に於ける普遍的重要性及び免疫反応の変調に於けるそれらの機能的役割は知られていなかった。特に驚くべきことに本発明者は、造血系での細胞-細胞相互作用を伝達する細胞接着分子がPDZ-結合蛋白質（PL蛋白質）であり、PDZ蛋白質に結合することを見いだした。発明者は免疫系細胞に存在するPDZ蛋白質とPL蛋白質間の多数の相互作用を特定し、発明はこれら相互作用を阻害することで免疫系内の生物学的機能に影響する作用物質及び方法を提供する。ここで使用する場合、細胞の文脈中での用語“生物学的機能”は細胞により通常実施される検出可能な生物学的滑動、例えば増殖、細胞活性化（例えばT細胞活性化、B細胞活性化、T-B細胞共役形成）、サイトカイン放出、脱顆粒、チロシンリン酸化、イオン（例えばカルシウム）流入、代謝活性、アポトーシス、遺伝子発現の変化、細胞構造の維持、細胞移動、基質への接着、シグナル伝達、細胞-細胞相互作用及びここに記したあるいは当分野既知のその他事象の様な表現形の変化を表す。
【００４６】
一面において本発明は免疫機能に必要な造血細胞、例えばT細胞及びB細胞、又はその他細胞（例えば内皮細胞）の生物学的活性を制御するためのペプチド、ペプチド類似体又は模擬体、医薬組成体及びそれら組成体を利用する方法に関する。発明は更に、造血細胞活性及び免疫機能を変調することを目的とした組成体の使用方法、並びにそれら阻害剤に関するアッセイに関する。
表２はT細胞及びB細胞での蛋白質相互作用の広範な分析をまとめている。その大部分について免疫系細胞での発現は従来知られていなかったPDZ蛋白質は表２の上列に記載されている。表の第１縦列にはPL蛋白質が記載されている。“A”又は“G”の文字が印されたマトリックス位置は、PDZ蛋白質とPL間の相互作用が新規結合アッセイ（例えば下記6.2に詳細記載）にて検出されたことを示している。空欄は相互作用が発明のアッセイを使用しても検出されなかったことを意味している。星印（*）はPL-PDZ相互作用が既に科学文献中に報告されていることを示している。
【００４７】
【表３】
2011102326.tif 000004
【００４８】
【表４】
2011102326.tif 000005
ここに記した様に表２掲載のPDZ蛋白質はPDZドメインを含む天然発生蛋白質である。本発明は特に造血細胞に於けるPDZ蛋白質とPL蛋白質間相互作用の検出及び変調を目的としている。例示のPL蛋白質は表２に記載されている。特に下記論ずる様に、これらPL蛋白質の多くは、いずれの細胞系でもその様には従来認められていなかった。多様なPL蛋白質分類が知られており、ここに記したPL蛋白質は(1)“PL接着蛋白質”(2)“PLイオンチャンネル蛋白質”(3)“PLアダプター蛋白質”(4)“PL細胞内蛋白質”及び(5)“PLサイトカイン受容体蛋白質”として特徴付けることができる。
【００４９】
ここで使用される接着蛋白質は、別個の細胞上にある細胞表面分子（例えば膜貫通蛋白質又は表面蛋白質）と直接接触することで細胞-細胞相互作用に関係する細胞表面蛋白質である。即ち、PL接着蛋白質を発現している細胞が適当な別細胞に接触すると、PL接着蛋白質は２細胞の境界面に局在し、第２細胞上の細胞表面分子と直接接する。細胞-細胞境界面は２種類の細胞の原形質膜が閉鎖する（一般に＜10nm、多くは約1nm）領域である。典型的には、直接分子接触はヴァンデルワールス力が有意である距離、一般には約1nm未満の距離の分子相互作用を意味する。PL接着蛋白質例にはCD6；CD49E（アルファ-4）、CD49F（ａ型、アルファ6）；CD138（シンデカン）；CLASP-1；CLASP-4；VCAM1；CLASP-2；DNAM-1；CD83；CD44（長型）；CD97；（CD55L)；CD3n；DOCK2；CD34及びFceRIbが含まれる。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPL接着蛋白質である。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様に、PL接着蛋白質とPDZ蛋白質間の相互作用を阻害し、免疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞内で起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は上皮細胞、ケラチノ細胞、肝細胞、心筋細胞内に起こる。
【００５０】
ここで使用する場合、イオンチャンネル蛋白質はそれ自体が脂質二重膜の一方にある水溶液からもう一方にある水溶液へのイオンの通過を触媒する膜貫通蛋白質を意味する（例えば膜内に小孔を形成することによる）。PLイオンチャンネル蛋白質の１例はKv1.3である。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPLイオンチャンネル蛋白質である。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様に、PLイオンチャンネル蛋白質とPDZ蛋白質間の相互作用を阻害し、免疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞内に起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。
ここで使用する場合、細胞内（即ち細胞質）蛋白質は当分野一般的な意味を有しており、膜に結合しない蛋白質、例えば膜貫通ドメインを持たない蛋白質を表す。即ち、実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPL細胞内蛋白質である。PL細胞内蛋白質の例にはグリコフォリンC及びLPAPが含まれる。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様にPL細胞質蛋白質とPDZ蛋白質間相互作用を阻害し、免疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞内に起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。
【００５１】
ここで使用する場合、サイトカイン受容体は当分野一般的な意味を有しており、サイトカインに特異的に結合する細胞外ドメインを持つ膜蛋白質を表す。PLサイトカイン受容体蛋白質の例にはCDW125（IL5R）、CDW128A(IL8RA）及びBRL-1が含まれる。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPLサイトカイン蛋白質である。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様にPLサイトカイン蛋白質とPDZ蛋白質間相互作用を阻害し、免疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞内に起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。
ここで使用する場合、アダプター蛋白質は２又はそれ以上のその他生物分子を結合することで多分子複合体の形成に寄与する分子（例えば蛋白質）を意味する。アダプター分子／蛋白質による２又はそれ以上の分子の結合は一般にアダプター蛋白質と２又はそれ以上の分子のそれぞれとの間の直接の分子接触を含む。PLアダプター蛋白質の一例はLPAPである。即ち実施態様の一つでは、発明のPL蛋白質はPLアダプター蛋白質である。ある実施態様では、発明はここに詳細記す様にPLアダプター蛋白質とPDZ蛋白質間相互作用を阻害し、免疫反応を変調する方法及び作用物質を提供する。ある実施態様では、阻害又は変調は造血細胞内に起こる。関連実施態様では、阻害又は変調は内皮細胞内で起こる。
各種実施態様では、発明のPL蛋白質は本開示の他所に記載の様に特異的C-末端（即ちPLドメイン）アミノ酸配列又はアミノ酸モチーフを特徴とする。
【００５２】
発明の各種実施態様では、発明のPL蛋白質はTリンパ細胞、Bリンパ細胞、又はT及びBリンパ細胞の両方に発現されるPDZ蛋白質に結合する。ある実施態様では、PL蛋白質は内皮細胞中に発現されたPDZ蛋白質に結合する。各種実施態様では、それが結合するPL蛋白質及び／又はPDZ蛋白質は神経系（例えば神経単位）には発現されない。
発明の各種実施態様では、発明のPL蛋白質は表２掲載のPDZ蛋白質の一つにのみ結合する。別実施態様では、PL蛋白質は表２掲載の１ないし３、３ないし５、または５より多い異なるPDZ蛋白質に結合する。
発明の各種実施態様では、PL蛋白質は細胞活性化（例えば活性化Bリンパ細胞、Tリンパ細胞）又は有糸分裂に入る（例えば迅速増幅細胞集団でのアップレギュレーション）ことで発現され、又はアップレギュレーションされる。
【００５３】
発明の各種実施態様では、PL蛋白質は(i)細胞（例えば造血細胞）活性化又は移動を伝達する蛋白質、(ii)あるタイプの細胞でのアポトーシスを伝達しない蛋白質(iii)G-蛋白質にカップリングした７膜貫通螺旋受容体以外の蛋白質、(iv)G-蛋白質カップリング７膜貫通螺旋受容体であるがサイトカイン受容体でない蛋白質、又は(v)G-蛋白質カップリング７膜貫通螺旋受容体でなく、サイトカイン受容体である蛋白質。
【００５４】
6.1  造血細胞に発現されたPDZドメイン含有蛋白質の検出
上記の如く、本発明者は驚くべきことに複数のPDZ蛋白質が免疫系細胞に発現されており、免疫反応の変調にて基本的な生物学的役割を果たしていることを見いだした。PDZ蛋白質DLG1及びTIAM-1は従来T細胞内に報告されている。本発明者はヒトESTデータベースのBLAST検索及び下記実験より、更にT細胞のMPP1、P-DLG、VELI-1、PSD95、シンテニン及びB細胞でのCASK、DLG1、DLG2、ZIPキナーゼ、シントロフィン２、P-dlg、PSD95及びシンテニンを含む７種類のPDZ蛋白質が造血細胞内に存在していることを見いだした。
造血機能に於けるPDZ蛋白質の関与の全範囲を決定するために、発明者はT及びB細胞におけるPDZ蛋白質の体系的な研究に着手した。PDZドメイン含有蛋白質の包括的リストはキーワード検索によりSanger Centre データベース（Pfam）から取り出された。対応するcDNA配列はNCBI”entrez”データベースを使ったGeneBank（以後“GenBankPDZ蛋白質ｃDNA配列”）から取り出された。PDZドメインをコードするDNA部分は、cDNA及び蛋白質配列を、CLUSTALWを使い並列させることで特定された。DNA/蛋白質アラインメント情報に基づき、PDZ度面を包含するプライマーが設計された。免疫細胞での特定PDZ-含有蛋白質の発現は、免疫細胞由来RNAを逆転写（“RT”）して得たcDNAをポリメラーゼチェインリアクション（“PCR”）すること（即ち“RT-PCR”）で検出された。PCR、RT-PCR及びその他核酸の分析及び取り扱い方法は良く知られており、Sambrookら、(1989）MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版、1-3巻、Cold-Spring Harbor Laboratory、以後“Sambrook”）；及び1999年１月より増補のAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York（1997）（以後“Auisubel”）に一般的に記載されている。
【００５５】
表２にまとめられた実験では、T-細胞（Jurkat E6細胞株）及びB-細胞（MV 4-11細胞株）は、RT-PCRにより特異的PDZドメイン含有遺伝子の発現について試験された。RNAは“trizol”RNA調整キット（GIBCO-BRL；カタログ番号15596-018）をメーカーの推奨法に従い使用して調整された。簡単に述べると、1-5×107リンパ芽球を200×g、10分間、20℃の遠心分離により集めた。細胞を100μlのPBS緩衝液に再懸濁し、5×106細胞当たり1mlのTRIZOL試薬を加えた。細胞懸濁液を混合し、5分間室温（RT）でインキュベーションした後1mlのTRIZOL当たりクロロホルムを0.2ml加えた。懸濁液を強くかきまぜ、更に３分間RTにてインキュベーションした。次にサンプルを12000×ｇ,15分間、４℃で遠心分離し、水相を回収、RNAを2-プロパノールで沈殿させた。沈殿をさらに12000×ｇ、15分間、４℃にて遠心分離し再回収し、風乾させてから適当な容積のDEPC処理水に再懸濁した。
RNA濃度及び純度は、核酸の260/280nm光吸収の測定から決定された。cDNA合成に関しては、SUPERSCRIPT II逆転写酵素cDNAキット（Gibco-brl；カタログ番号18064-014）を使用した、200μlのcDNA反応サンプル当たりのRNA持ち込み量は10μgであった。cDNAを合成する前に、RNAは1単位/μlのDNAseI水溶液110μlにて、37℃、20分間処理された。次にDNaseIは10分間70℃インキュベーションにより不活性化された。cDNAプライミングにはランダムプライマーが使用された；ランダムヘキサマープライマー10μl（100ng/μl）を加え、サンプルを70℃に５分間加熱してから氷上にて冷却された。続いて40μlのSUPERSCRIPT II“第１鎖”緩衝液、20μlの0.1M DDT,10μlの10mMのデオキシヌクレオチド３リン酸混合液（dATP、dCTP、dGTP、dUTP）及び10μlのSUPERSCRIPT II逆転写酵素が加えられ、45分間、42℃にてcDNA合成が行われた。反応は95℃、５分間のインキュベーションにより停止され、一般にはPCRにこれらcDNAサンプル2-4μlが使用された。
【００５６】
ｃDNAの一部（典型的には20μl反応液の1/5）がPCRに使用された。PCRは目的とするPDZ蛋白質のPDZドメイン含有領域を特異的に増幅するよう設計されたプライマーを使い実施された。目的の各種PDZドメインをコードするDNA配列は調査（即ちGeneBankより得たPDZ蛋白質ｃDNAを理論的に翻訳した後、PDZドメインアミノ酸配列と並列させること）により特定された。表３はPCRプライマー、増幅されたPDZ-コードドメイン及びPDZドメイン含有蛋白質のGenBank登録番号を示す。PDZドメインのその後のクローニングを容易にするために、PCRプライマーはその末端にエンドヌクレアーゼ制限配列を含んでおり、グルタチオン-Sトランスフェラーゼ（GST）とフレーム内にてpGEX-3Xクローニングベクター（Pharmacia、GenBank XXI13852）と連結することができる。
表３は上記アッセイにて検出された蛋白質を一覧している。結果はPDZ蛋白質がT及びB細胞に於いて、細胞株特異的様式及び細胞株独立的様式の両方にて広く利用されていることを示している。INADL2/3（PDZ dom.）、KIAA0316及び26sサブユニットp27はT細胞には検出されたが、B細胞には検出されなかった。mCASK、KIAA0559、PTN-4及びX11ベータはB細胞には検出されたがT細胞には検出されなかった。AF6、BAII関連Prot.、Cytohesin bind. Prot.、DLG1、DLG5(pdlg）、DLV1、DVL3、GTPase、hypoth. 41.8kd、KIAA147、KIAA0300、KIAA0303、KIAA0380、KIAA0440、KIAA0545、KIAA0561、LIMK1、LIMK2、LIMドメインprot、LIM蛋白質、MINT1、MINT3、MPP1、MPP2、NE-DLG、NOS1、新規セリンプロテアーゼ、PTN-3、prIL16、PSD95、RGS12、セリンプロテアーゼ、SYNTENIN、SYNTR 1アルファ、TAX1、TAX2、TAX33、TAX40、Tax43(SYN、ベータ1）、TIAMwwp3及びX11prot.はT細胞及びB細胞両方に検出された。
【００５７】
【表５】
2011102326.tif 000006
【００５８】
【表６】
2011102326.tif 000007
【００５９】
【表７】
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【００６０】
【表８】
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【００６１】
【表９】
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【００６２】
【表１０】
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【００６３】
【表１１】
2011102326.tif 000012
【００６４】
【表１２】
2011102326.tif 000013
【００６５】
【表１３】
2011102326.tif 000014
【００６６】
【表１４】
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【００６７】
【表１５】
2011102326.tif 000016
【００６８】
【表１６】
2011102326.tif 000017
【００６９】
【表１７】
2011102326.tif 000018
【００７０】
【表１８】
2011102326.tif 000019
【００７１】
【表１９】
2011102326.tif 000020
【００７２】
【表２０】
2011102326.tif 000021
【００７３】
【表２１】
2011102326.tif 000022
【００７４】
6.2  PDZ-ドメインポリペプチド及びPDZ候補リガンド蛋白質（PL蛋白質）間相互作用検出に関するアッセイ
２種類の”A”及び”G”と命名された相補的アッセイを開発し、PDZ-ドメインポリペプチドとPDZリガンド候補間の結合を検出した。２種類のアッセイそれぞれでは、結合は１またはそれ以上のPDZドメイン（即ち候補PLペプチド）と結合すると予想される蛋白質のC末端に対応する配列を有するペプチドとPDZ-ドメインポリペプチド（典型的にはPDZドメインを含む融合蛋白質）間に検出される。“A”アッセイでは、候補PLペプチドが固定され、可溶化PDZ-度面ポリペプチドの固定化ペプチドへの結合が検出される（“A”アッセイは、実施態様の一つに於いてペプチドの固定化にアビジン表面が利用されることから命名された）“G”アッセイでは、PDZ-ドメインポリペプチドが固定され、可溶性PLペプチドの結合が検出される（“G”アッセイは、実施態様の一つに於いてPDZ-ドメインポリペプチドの固定にGST-結合表面が利用されていることから命名された）。これらアッセイの好適実施態様は下記に詳細記載されている。しかしこれらアッセイは、本発明の目的への有用性を維持したまま様々に変更できることが当業者により理解されるだろう。
【００７５】
6.2.1  PDZ-ドメイン含有融合蛋白質の産生
発明のアッセイでの使用を目的としGST-PDZドメイン融合蛋白質が調整された。PDZコーディンドメインを含むPCR産物（§6.1上記）を、PDZドメイン及び異質ドメイン（即ちグルタミン-Sトランスフェラーゼ配列、“GST”）を含む融合蛋白質の発現を可能にするため発現ベクター内にサブクローニングされた。DNAをコードするPDZドメインを表すPCR産物（即ちDNA断片）は、メーカーの提案に従い“セファグラス”ゲル抽出システム（Pharmacia）を使用し、アガロースゲルより抽出された。
上記の如くPCRプライマーは、PCR断片とGST遺伝子融合ベクター（ｐGEX-3X；Pharmacia、GenBank登録番号XXU13852）インフレーム内でのグルタチオン-Sトランスフェラーゼ配列との連結を容易にするためのエンドヌクレアーゼ制限部位を含む様に設計されている。このベクターはIPTG誘導lacZプロモーターを含む。pGEX-3Xベクターは表３に示す様にBamH1及びEcoRI、又は幾つかの例ではEcoRI又はSmaI、を使用し直鎖状にされ、脱リン酸化された。多くのクローニング法ではBamHI及びEcoRIによる二重消化が実施され、クローンに対するPRC断片の末端はBamHI及びEcoRIとなった。幾つかの例では、使用した制限エンドヌクレアーゼの組合せはBglII及びEcoRI、BamHI及びMfeI、又はEcoRIのみ、SmaIのみ、又はBamHIのみ（表３参照）であった。１個以上のPDZドメインをクローニングする場合には、クローン化されるDNA部分はPDZドメイン及び個々のドメイン間に位置するｃDNA部分を表す。アッセイに使用されたクローン化断片の正確な位置を表３に示す。GST部分及びPDZドメイン含有DNA部分間のDNAリンカー配列は極僅かであり、上記のクローニング部位及び使用した方法に依存する。共配列であるGST-PDZ融合蛋白質のアミノ酸配列は、GSTとPDZドメイン間のリンカー領域において異なっている。各種クローニング部位／方法に対応する蛋白質リンカー配列を以下に示す。リンカー配列（ベクターDNAがコードする）は太字であり、遺伝子由来配列を含むPDZドメインはイタリックである。
【００７６】
１）  GST-BamHI/BamHI-PDZドメインインサート
Glu-Ile-PDZドメインインサート
２）  GST-BamHI/BglII-PDZドメインインサート
Glu-Ile-PDZドメインインサート
３）  GST-EcoRI/EcoI-PDZドメインインサート
Glu-IleーPro-Gly-Asn-PDZドメインインサート
４）  GST-SmaI/SmaI-PDZドメインインサート
Glu-Ile-Pro-PDZドメインインサート
PDZコーディングPCR断片及び直鎖化pGEX-3Xベクターはエタノール沈殿され、10ulの標準的ライゲーション緩衝液に再懸濁された。ライゲーションはT4DNAリガーゼを使用し、4-10時間、７℃で実施された。得られた構築体の幾つかは非常に短いリンカー配列を含むこと、及び複数のPDZドメインをクローニングした場合には構築体は個々のPDZドメイン間に位置する幾つかのDNAを含むことが理解されるだろう。
ライゲーション産物DH5α又はBL-21E.coli細菌株中に形質導入された。クローンは、PCR及び配列分析によりクローン化PDZドメインを含むDNAの存在及びその同一性に関し、及びグルタチオンS-トランスフェラーゼコーディングDNA部分との正確な融合についてスクリーニングされた。陽性クローンは小規模アッセイにてGST/PDZドメイン融合蛋白質に関し試験され、そして発現されている場合には引き続きそれらクローンをGST/PDZ融合蛋白質の大規模調整に備え増殖した。
【００７７】
GST-PDZドメイン融合蛋白質は培地中へのIPTG添加により過剰発現され、精製された。小規模及び大規模融合蛋白質発現法、ならびに精製法の詳細は“GST Gene Fusion System”（第二版、校訂２；Pharmaciaより出版）に記載されている。簡単に述べると、融合蛋白質構築体を有する細菌株（DH5α、BL21又はJM109）を含む少培養体（3-5mls）をLB-培地中、37℃、適当な抗生物質選択を行いながら（100ug/mlアンピシリン；a.k.a.LB-amp）一晩増殖した。一晩培養したものを新しく調整されたLB-amp（典型的には250-500mls）に注ぎ込み培養体の光学密度（OD）が0.5ないし0.9になるまで増殖した（約2.5時間）。IPTG（イソプロピルベータ-D-チオガラクトピラノシド）を最終濃度1.0mMまで加えGST融合蛋白質の産生を誘導し、その後培養体を更に1.5-2.5時間培養した。細菌は遠心分離（4500g）により集められ、緩衝液A-（50mM Tris, pH 8.0, 50mMデキストロース、1mM EDTA、200uMフェニルメチルスルホニルフルオリド）に懸濁された。等量の緩衝液A+（緩衝液A-、4mg/mlライソゾーム）が加えられ、氷上にて３分間インキュベーションされ細菌を溶解した。等量の緩衝液B（10mM Tris, pH8.0, 50mM KCl, 1mM EDTA, 0.5% Tween-20, 0.5% NP40(a.k.a.IGEPAL CA-630)、200uMフェニルメチルスルホニルフルオリド）が加えられ、更に20分間インキュベーションされた。細菌細胞溶解体は遠心分離され（x20,000g）、上清は事前に1Xリン酸緩衝化食塩水（PBS）に膨潤させておいた（再水和）グルタチオンセファロース4B（Pharmacia、カタログ番号17-0765-01）に加えられた。上清-セファロースのスラーリはカラムに注ぎ込まれ、少なくともベッド容積の20倍の1×PBSで洗浄された。GST融合蛋白質は0.5-1.0mlの5mMグルタチオンを加えることでグルタチオンセファロースより溶出され、別分画として集められた。分画の濃度はBioRad Protein Assay（カタログ番号500-0006）をメーカー指示書通りに用い決定された。最高濃度の融合蛋白質を含むこれら分画をプールし、１×PBS/35%グリセロールに対し透析された。融合蛋白質は“Sambrook”記載の通りのSDSゲル電気泳動（PAGE）により、その大きさ及び質に関しアッセイされた。融合蛋白質の一部はマイナス80℃及びマイナス20℃に保存された。
【００７８】
6.2.2  候補PL蛋白質の同定及びペプチドの合成
幾つかの非造血細胞（例えば神経単位、上皮細胞）では、特定のPDZドメインがPDZ-結合蛋白質のC-末端残基により結合されていることが知られている。造血及び上皮細胞で機能しているPL蛋白質を同定するため、細胞表面受容体蛋白質が同定され、各蛋白質のc-末端に相当する配列を有するペプチドが合成された。表４にこれら蛋白質が掲載されており、対応するC-末端配列及びGeneBank受付番号が提供されている。“Clasp1”はWO00/20434号（2000年４月13日公開）に記載されている。“Clasp2”及び“Clasp4”は共に2000年４月11日に提出の同時係属出願USSN09/547276号（代理人整理番号20054-000200）及び60/196527号（代理人整理番号20054-000400）に記載されている。
規定配列（例えば指示蛋白質のカルボキシル末端に対応する）の合成ペプチドは標準的な樹脂ベース法（米国特許第4,108,846号参照、及びCaruthersら、1980、Nucleic Acids Res. Symp. Ser., 215-223; Hornら、1980、Nucelic Acids Res. Symp. Ser., 225-232; Robergeら、1995、Science 269; 202も参照）。ここに記載のアッセイに使用されたペプチドはFMOC（Guy及びFields、1997、Meth.Enz.289.67-83；Wellings及びAtherton、1997、Meth.Enz.289.44-67参照）により調整された。幾つかの例では（例えば発明のA及びGアッセイでの使用に関し）、ペプチドは触媒量の塩基と共に４倍過剰量のビオチンメチルエステルのジメチルスルホオキシド液との反応によりアミノ末端にビオチンが標識される。ペプチドは適当な酸化防止剤（例えばエタンジチオール）及び過剰の凍結乾燥溶媒存在下にハロゲン化物含有酸（例えばトリフルオロ酢酸）を使用して樹脂から切り出される。
凍結乾燥後、ペプチドは再溶解され逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC)により精製された。適当なHPLC溶媒系の一つは、水＋0.1%トリフルオロ酢酸のベース溶媒中のアセトニトリル＋0.1%トリフルオロ酢酸量を増加させながら5mL/分でランニングするBydac C-18半調整的カラムを含む。HPLC精製後、ペプチドの特性はMALDIカチオン-モードマススペクトロメトリーにより確認された。上記の如く、例示のビオチン化ペプチドが表４に示されている。
【００７９】
6.2.3  PDZ-PL相互作用の検出
免疫系細胞が多くのPDZ蛋白質及び同様の多くの候補PL蛋白質を含むという決定より、これら蛋白質間の特異的PDZ-PL相互作用の特徴付けにはこれら相互作用に関する信頼できる迅速アッセイが必要であることが発明者に明らかになった。当分野既知の各種アッセイ様式を使用し、特定蛋白質と特異的に反応するリガンドを選択することができる。例えば固相ELISA免疫アッセイ、免疫沈降、Biacore及びウエスタンブロットアッセイを利用し、PDZ-ドメインポリペプチドに特異的に結合するペプチドを特定することができる。上記の如く、PDZ-PL相互作用を検出するために相補完する２種類のアッセイが開発された。それぞれではPDZ-PL対の一方の結合相手が固定化され、そして第２結合相手の結合能力が決定された。上記これらアッセイを使用することで数時間に数百から数千の潜在的PDZ-リガンド相互作用をスクリーニングすることができる。即ち、これらアッセイを利用して造血細胞内の未だ新規であるPDZ-PL相互作用を特定することができる。更に、それらを利用しPDZ-PL相互作用のアゴニストを特定することができる（下記参照）。
【００８０】
6.2.3.1“Aアッセイ”固定化PLペプチドを利用したPDZ-リガンド結合の検出
一面において発明は、アビジンコーティング表面にビオチン化候補PLペプチドが固定化されているアッセイを提供する。そしてこの表面へのPDZ-ドメイン融合蛋白質の結合が測定される。好適実施態様ではPDZ-ドメイン融合蛋白質はGST/PDZドメイン融合蛋白質であり、アッセイは次の様に実施される：
（１）アビジンが表面、例えば蛋白質結合表面に結合される。実施態様の一つでは、ウエル当たり20ng/mLのアビジン（Pierce)のカルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝化食塩水溶液、pH7.4（“PBS”、GibcoBRL)100uLを４℃、１２時間添加することで、アビジンはポリスチレン製96ウエルプレート（例えばNucn Polysorb(カタログ番号475094）に結合される。次に100mL当たり2gの無プロテアーゼウシ血清アルブミン（“PBS/BSA）を含むPBSをウエル当たり200uL、４℃、２時間加えてプレートを処理し非特異的反応をブロックする。次にプレートを各ウエル当たり200uLのPBSを加え、プレート内容物を廃棄容器に廃棄し、プレートを乾燥表面に軽く打ち付けることを繰り返し、３回洗浄する。
（２）ビオチン化PLペプチド（又は候補PLペプチド、例えば表４参照）は、ウエル当たり40uLの0.4uMペプチドのPBS/BSA液を30分間、４℃にて加えることでプレートのウエル表面に固定化される。通常各種ペプチドは、複数回の測定（例えば二重測定、及び更に異なる3ST/PDZ-ドメイン融合蛋白質及びGST単独の陰性コントロールを用いた測定）が可能となるよう、少なくとも８個のウエルに加えられ、更にペプチド固定されない追加の陰性コントロールウエルも調整される。表面上へPLペプチドを固定化した後、プレートはPBSにて３回洗浄される。
【００８１】
（３）GST/PDZドメイン融合蛋白質（上記の如くに調整された）は、５ug/mLのGST/PDZドメイン融合蛋白質を含むPBS/BSA溶液を２時間、４℃にて各ウエル当たり50uL加えることで表面と反応させられる。陰性コントロールとして、各固定化ペプチドについてGSTのみ（即ち融合蛋白質ではない）が特定ウエル、一般には少なくとも２ウエル（即ち二重測定）に加えられる。２時間の反応後、プレートはPBSにて３回洗浄され未結合の融合蛋白質が除かれる。
（４）アビジンビオチン化ペプチド表面へのGST/PDZドメイン融合蛋白質の結合は、当分野既知の各種方法及び検出装置を使い検出できる。実施態様の一つでは、ウエル当たり50uLの抗GST抗体のPBS/BSA液（例えば2.5ug/mLのポリクローナルヤギ抗GST抗体、Pierce）がプレートに加えられ、20分間、４℃にて反応させる。プレートはPBSにて３回洗浄され、次に二次検出可能標識化抗体が加えられる。実施態様の一つでは、ウエル当たり50uLの2.5ug/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP)-標識化ポリクローナルウサギ抗ヤギ免疫グロブリン抗体がプレートに加えられ、20分間、４℃にて反応させる。プレートを0.2%のTween20を含む50mM Tris、pH8.0にて３回洗浄し、ウエル当たり100uLのHRP-基質液（TMP、Dako)を20分間、室温（RT)にて加え、発色さる。HRPとその基質との反応はウエル当たり100uLの1M硫酸を加えることで停止され、プレートの各ウエルの光学密度（O.D)を450nmにて測定した。
【００８２】
（５）PLペプチド及びPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチド及びPDZドメインポリペプチドが組合わさったウエルからのシグナルとバックグランドシグナルとを比較することで検出される。バックグランドシグナルは陰性コントロールに見いだされるシグナルである。典型的には特異的又は選択的反応はバックグランドシグナルの少なくとも２倍、より典型的にはバックグランドの５倍より高く、最も典型的にはバックグランドシグナルの10又はそれ以上の倍数である。更に、統計有意の反応は少なくとも２標準誤差、より典型的には４標準誤差、最も典型的には６又はそれ以上の標準誤差によりシグナルとバックグランドシグナルとが区別される反応の多重測定を含む。従って、シグナルの反復測定とバックグラントの反復測定とを比較する統計試験（例えばT-試験）のｐ-値は0.05未満、より典型的にはp-値は0.01未満、最も典型的にはp-値は0.001未満であろう。
上記の如く、“A”アッセイの実施態様の一つでは、GST/PDZ-ドメイン融合蛋白質のPLペプチドに暴露されていないアビジン表面への結合からのシグナルは好適な陰性コントロール（時に“B“と称される）。PLペプチドに暴露され（即ち被覆された）、アビジンにてコーティングされた表面へのGSTポリペプチド単独の結合に由来するシグナルは第２の好適陰性コントロール（時に”B“と称される）である。全ての測定は複数回実施されるため（即ち最低２回）、結合の決定には複数回測定の算術的平均（または平均値とも言う）が使用され、結合測定の誤差確率の決定には平均の標準誤差が使用される。N回測定の平均の標準誤差は以下の平方根に等しい：各測定値とその平均値との差の平方の合計を(N)と(N-1)の積で除する。即ち実施態様の一つでは、PDZ蛋白質のプレート結合PLペプチドへの特異的結合は、特定のPL-PDZの組合せに関する平均シグナル（”平均S“）及びシグナルの標準誤差（”SE“）と、平均B1及び／又は平均B2とを比較することで決定される。表２では、結合は（１）平均Sが平均B1の少なくとも２倍であり、B2の少なくとも２倍であり、そして（２）平均Sが平均B1及び平均B2の両方に比べ少なくとも６標準誤差（６SE）である場合に、特異的であるとされる（マトリックスでは”A“と記載される）。更に表２にまとめた実験では追加の判断基準を加えることで、上記特異的とされた相互作用が試験対象のPDZ融合蛋白質とPLペプチドとを組み合わせることで各通常バックグランドより高いシグナルを生じる傾向が生まれた結果では無いこと確認した。この判断基準は、（３）平均Sは平均B1と平均B2の積の少なくとも20倍であるというものである。20倍という因数は、B１及びB2の少なくとも一方が0.1O.D単位より小さいことを意味しており、従って平均B1及び平均B2の積の20倍は一般に平均１の２倍と平均B2の２倍より小さくなり、判断基準（３）の厳密性を判断基準（１）より低くしている。平均B1及び平均B2が共に0.1O.D単位（即ち試験した特定PDZ融合蛋白質及びPLペプチドが通常のバックグランドより高い値を示す傾向がある）より大きい極僅かな例でのみ、判断基準（３）は判断基準（１）に比べより厳密となる。
【００８３】
【表２２】
2011102326.tif 000023
【００８４】
6.2.3.2  “Gアッセイ”−固定化PDZ-ドメイン融合蛋白質を用いたPDZ-リガンド結合の検出
一面では発明はGST/PDZドメイン融合蛋白質が表面に固定されているアッセイ（“G”アッセイ）を提供する。ここではこの表面への標識化PLペプチド（表４に掲載）の結合が測定される。好適実施態様では、アッセイは次の様に実施される：
（１）PDZ-ドメインポリペプチドは表面、例えば蛋白質結合表面に結合される。好適実施態様では、１又はそれ以上のPDZドメインを含むGST/PDZドメイン融合蛋白質がポリスチレン製96ウエルプレートに結合される。GST/PDZドメイン融合蛋白質は当業者既知の各種標準的方法によりプレートに結合させることができるが、プレートへの融合蛋白質の結合の工程がPDZドメインのリガンド結合特性を買えない様に注意しなければならない。実施態様の一つでは、GST/PDZドメイン融合蛋白質は96ウエルプレート上にコーティングされた抗-GST抗体を介して結合される。プレートへの適当な結合は次の様にして達成することができる：
ａ．ウエル当たり100uLの5ug/mLヤギ抗-GSTポリクローナル抗体（Pierce)PBS溶液を、ポリスチレン製96ウエルプレート（例えばNunc Polysorb)に４℃で12時間加える。
ｂ．ウエル当たり200uLのPBS/BSAを２時間、４℃で加えプレートをブロックする。
ｃ．プレートを３回、PBSにて洗浄する。
ｄ．ウエル当たり50uLの5ug/mLのGST/PDZドメイン融合蛋白質）又は陰性コントロールとしてGSTポリペプチドのみ（即ち融合蛋白質でない）のPBS/BSA溶液を２時間、４℃にてプレートに加える。
ｅ．プレートを再度PBSで３回洗浄する。
【００８５】
（２）ウエル当たり50uLの20uMのビオチン化ペプチドPBS/BSA液を10分間、４℃にて加え、更に25℃にて20分間インキュベーションすることでビオチン化PLペプチド（又は候補PLペプチド、例えば表４に示される様な）を表面と反応させる。プレートはPBSにて３回洗浄される。
（３）GST/PDZ融合蛋白質表面へのビオチン化ペプチドの結合は、当分野既知の各種方法及び検出装置を使い検出できる。実施態様の一つでは、ウエル当たり100uLのBSA/PBSに溶解された0.5ug/mLのストレプトアビジン-西洋ワサビ（HRP)標識PSA/PBS抗GST抗体が加えられ、４℃、20分間反応させる。続いてプレートは0.2%のTween20を含む50mM Tris、pH8.0にて５回洗浄され、ウエル当たり100uLのHRP-基質液（TMP、Dako)が20分間、室温（RT)にて加えられ発色する。HRPとその基質との反応はウエル当たり100uLの1M硫酸を加えることで停止され、プレートの各ウエルの光学密度（O.D)を450nmにて測定する。
（４）PLペプチド及びPDZドメインポリペプチドの特異的結合は、PLペプチド及びPDZドメインポリペプチドが組合わされたウエルからのシグナルとバックグランドシグナルとを比較することで検出される。バックグランドシグナルは陰性コントロールに見いだされるシグナルである。典型的には特異的又は選択的反応はバックグランドシグナルの少なくとも２倍、より典型的にはバックグランドの５倍より高く、最も典型的にはバックグランドシグナルの10又はそれ以上である。更に、統計有意の反応は少なくとも２標準誤差、より典型的には４標準誤差、最も典型的には６又はそれ以上の標準誤差によりシグナルとバックグランドシグナルとが区別される反応の多重測定を含む。従って、シグナルの反復測定とバックグラントの反復測定とを比較する統計試験（例えばT-試験）のｐ-値は0.05未満、より典型的にはp-値は0.01未満、最も典型的にはp-値は0.001未満であろう。上記の如く“G”アッセイの実施態様の一つでは、固定化（表面結合）された単独GSTポリペプチドに対する上記PLペプチドの結合からのシグナルが好適な陰性コントロール（時に“B1“と称される）である。全ての測定は複数回実施されるため（即ち最低２回）、結合の決定には複数回測定の算術平均（または平均値とも言う）が使用され、結合測定の誤差確率の決定には平均の標準誤差が使用される。N快速艇の平均の標準誤差は以下の平方根に等しい：各測定値とその平均値との差の平方の合計を(N)と(N-1)の積で除する。即ち実施態様の一つでは、PDZ蛋白質のプレート結合ペプチドへの特異的結合は、特定のPL-PDZの組合せの平均シグナル（”平均S“）及びシグナルの標準誤差（”SE“）と、平均B1とを比較することで決定される。表２にまとめられた実験では、結合は（１）平均Sが平均B1の少なくとも２倍であり、そして（２）平均Sが平均B1に比べ少なくとも６標準誤差（６SE）である場合に、特異的であるとされる。例示の”G“アッセイの結果は図1A-1Dに示されている。
【００８６】
6.2.4  アッセイの変型
上記の如く、上記アッセイ中の多くの段階を変えることができること、例えばPL及びPDZ-含有蛋白質に各種基質を使用することができること；融合蛋白質を含む異なる型のPDZを使用できること；PDZ/PL相互作用検出に異なる標識体を使用できること；及び異なる検出法が利用できることが理解されるだろう。
PDZ-PL検出アッセイはPL及びPDZ-含有蛋白質を結合する各種表面を利用できる。例えば表面は、それへの“PL蛋白質又はPDZ-含有蛋白質の接着を最適化する素材（例えばポリスチレン）より形成された”アッセイプレート“でよい。一般にアッセイプレートの個々のウエルは高い面積対容積比を有しており、従って好適形状は平底ウエル（アッセイの蛋白質が接着される場所）である。その他表面には、ポリスチレン製又はガラス製ビーズ、ポリスチレン製又はガラス製スライド等がふくまれるが、これらに限定されない。
例えばアッセイプレートは“マイクロタイター”プレートである。用語“マイクロタイター”プレートはここで使用する場合には、複数ウエル型アッセイプレート、例えば約30ないし200個の個別ウエル、通常は96個のウエルを有するアッセイプレートを意味する。あるいは、高密度アレーもよく使用され、マイクロタイタープレートの個別ウエルは最大約250ulの容積を保持するだろう。好都合には、アッセイプレートは96ウエル型ポリスチレンプレート（Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, N.J.より発売されている様な）であり、自動化及び大量スクリーニングが可能である。その他表面にはNuncMatrisorp、Inter Med, Denmarkより販売されている様なポリスチレン製マイクロタイターELISAプレートが含まれる。多くはその中に懸濁された水性サンプルを含む緩衝液約50ulないし300ul、より好ましくは100ulないし200ulがアッセイプレートの各ウエルに加えられるだろう。
発明の検出可能標識体は分子（上記の様な）に直接又は間接に標識される検出可能な化合物又は組成体であろう。標識体はそれ自体により（例えば放射性同位元素標識体又は蛍光標識体）検出可能であるか、又は検出可能な酵素標識体の例では基質化合物又は組成体の化学変化を触媒することができる。好適標識体は非放射性の色試薬の色変化を触媒する酵素標識体である。時に標識体は抗体に間接的に標識される。
【００８７】
当業者は間接標識に関する様々な技術を知っている。例えば抗体はビオチンと標識でき、上記標識体のいずれかの分類をアビジンに標識する、またはその逆を行うことができる（上記“Ａ”及び“G”アッセイ参照）。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、従って標識体は抗体と間接的に結合できる。ビオチン-アビジン結合及び同様アッセイを含む技術の概要についてはAusubel、上記を参照。あるいは、標識体と抗体との間接的結合を達成するために、抗体は小ハプテン（例えばジゴキシン）で標識され、そして上記標識体とは異なるタイプの標識体が抗ハプテン抗体で標識される（例えば抗ジゴキシン抗体）。こうして抗体による標識体の間接的標識が達成できる。
変化型アッセイには各種洗浄段階も含むことができる。“洗浄”とは、固相から非結合物質（例えば非接着細胞、非接着捕捉体、非結合リガンド、受容体、受容体構築物、細胞溶解物、又はHRP抗体）を除く様に固相を水性液（通常は緩衝液又は細胞培地）にさらすことを意味する。バックグランドノイズを下げるため、洗浄液中に界面活性剤（例えばTritonX）を含めると好都合である。一般には、水性洗浄液は洗浄後アッセイプレートのウエルよりデカンテーションされる。好都合には、洗浄は自動洗浄装置を使用し実施できる。時に複数洗浄段階（例えば約１ないし10洗浄段階）が必要とされることがある。
各種緩衝液もPDZ-PLアッセイに使用できる。例えば各種ブロッキング緩衝液を利用してアッセイバックグランドを下げることができる。用語“ブロッキング緩衝液”は、基質露出面に結合でき、PL又はPDZ-含有蛋白質では被覆されないブロッキング化合物を少なくとも１種類含む水性のｐH緩衝化液を表す。ブロッキング化合物は通常ウシ血清アルブミン（BSA)、ゼラチン、カゼイン、又は粉乳の様な蛋白質であり、アッセイ中のいずれの試薬とも交叉反応しない。ブロック緩衝液は通常約７ないし7.5の間のpHを備えており、好適緩衝作用物質にはリン酸及びTRISが含まれる。
【００８８】
各種酵素-基質の組合せもPDZ-PL相互作用の検出に利用できる。酵素-基質の組合せの例には、例えば：
（ｉ）基質として過酸化水素を利用し、過酸化水素が色素前駆体（例えばオルトフェニレンジアミン［OPD］又は3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン塩酸塩［TMB］）を酸化する西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRPO）（上記の様な）、
（ｉｉ）パラ-ニトロフェニルリン酸塩を発色基質として利用するアルカリホスファターゼ（AP）、
（ｉｉｉ）発色基質（例えばp-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシダーゼを利用するβ-D-ガラクトシダーゼ（βD-Gal）を含む。
その他多くの酵素-基質組合せが当業者に利用可能である。これらの一般的レビューについては、共に参照されここに取り込まれている米国特許第4,275,149号及び第4,318,980号を参照。
更に、便宜上ではあるが本発明は１次的にはPDZ-PL相互作用のアンタゴニストを表しているが、PDZ-PL相互作用のアゴニストもここに開示の方法、又はその容易に明らかになる変型により同定することができることが理解されるだろう。
【００８９】
6.2.5  PDL-PL相互作用アッセイの結果
上記の表２はここに記載の“A”及び“G”アッセイを利用し特異的結合が検出されたアッセイの結果を示している。表の上２行はGST-PDZ融合蛋白質（表３参照）に使用したPDZドメインの源を表している。第１縦列にはC-末端ペプチド配列が由来した細胞表面蛋白質が表示されており、第２縦列（“コード”）にはアッセイに使用されたペプチドが表示されている（表４参照）。第３縦列“Seq”には、細胞表面蛋白質及びペプチドの４個C末端残基配列が示されている。マトリックス中では、“A”は“A”アッセイ中に検出された特異的結合を示している。“G”は“G”アッセイ中に検出された特異的結合を示している。星印（*）はPDZ蛋白質及び細胞表面蛋白質（またはそれぞれのサブドメイン）間の対相互作用が他者により記載されていることを示している。
【００９０】
6.2.5.1  新規PLモチーフ
上記の如く、表２はPDZ蛋白質及び候補PLペプチド間の結合を検出するアッセイ（“PRISM MATRIX”と称する）の結果を示している。特異的PDZ-PL相互作用の数はMATRIX及び主要アミノ酸より特定され、PDZ結合に重要位置（“PLモチーフ”）はこれら結果より演繹される。MATRIXはPDZ-PL結合の組合せを包括的に分類するのに役立つばかりでなく、アッセイは更に新規PL蛋白質の迅速発見及び特徴付けを支援し、PLモチーフはPL-PDZ相互作用阻害剤の合理的な薬剤設計及び合成にも役立つ。
他研究者らは特定のPLモチーフがPDZ結合に重要であること、例えばC末端モチーフS/T-X-V/I/L（DLG1に関し）及びMPP1に関するY/F-Y/F-I/L/Fを報告している（Doyleら、1996、Cell 85, 1067；Songyangら、1997、Science 275, 73参照）。しかし報告されたモチーフは十分に特異的でなく（即ち数多くの蛋白質がこれら判断基準に合致するものの実際のPDZリガンドではない）、少数のPDZ蛋白質のみをカバーするに過ぎなかった（約10種類）。PRISM MATRIXは、それが特異的PDZ結合をもたらす、又はもたらさないアミノ酸配列を正確に決定できることから、リガンド特異性の決定及びPDZ蛋白質のリガンド結合モチーフの演繹に利用できる。更に、アッセイは新規PDZドメイン結合モチーフ（即ちPLモチーフ）：CD6のC-末端配列、ISAA；CD49EのC-末端配列、TSDA；CD49FのC-末端配列；TSDA；Clasp-1のC-末端配列、TSDA；CLASP-4のC-末端配列、YAEV；CD44のC-末端配列、KIGV；IL5RのC-末端配列、DSVF；BLR-1のC-末端配列LTTFの重要性を表している。これら新規PL配列を特定することで新規PLモチーフを定義できる（下表5A参照）。これら新規モチーフが規定される特異性は、MATRIXが陽性結果（即ち特異的結合相互作用を生じるPDZ-PLの組合せ）及び陰性結果（即ち特異的結合を生じないPDZ-PLの組合せ）の両方を報告するという事実によって高められている。例えば、CD6のC-末端配列SAA及びCD49EのC-末端配列SDAはPDZ-ドメインポリペプチド41.8に結合するが、CD166の関連C-末端配列TEA及びCD148のC-末端配列YIAは結合しない。このことから-2位置にセリンを持ちアラニンで終止するポリペプチドの新規PLモチーフ（下記モチーフ１）が特定され、-2位置がスレオニン及びチロシンであるポリペプチドが排除された。従ってものモチーフは従来特定された多くのモチーフよりより特異的である。その他の新規モチーフは表5Aに記載されている。
【００９１】
【表２３】
2011102326.tif 000024
【００９２】
6.2.5.2  結合クラスター
表２はPDZ/GST融合蛋白質及びPLペプチドリガンドが共に相互に構造的類似分子になるような順番に配置されている。表２の作製及び本表を作成するために行った実験に於いて、各GST-PDZ融合蛋白質のPDZドメインについてCLUSTAL複数配列アラインメントソフトウエアーパッケージを利用してアミノ酸配列類似性に関し等級付けした。最大配列類似性を持つ蛋白質はマトリックス無いにて相互に最も近く配置された。PLペプチドリガンドについてはさらにアミノ酸類似性に基き順番付けしたが、PDZ結合に関し重要であると報告された残基に加重した（Doyleら、1996、Cell 85, 1067）。具体的には、ペプチドはまず最C-末端残基（０位置）に基づき以下のアミノ酸の順番に並べた：G、A、C、S、T、N、Q、D、E、H、K、R、V、I、L、M、P、F、Y、W。同一C-末端を持つペプチドの場合には、ペプチド結合に関し２番目に重要な残基、-2位置の残基について上記に同一の順序付け方法を適用し、更に-3位置、-1位置と続ける。（別方法では蛋白質を並べる場合に、リガンド結合にとって重要であることが既知である残基に追加加重する様にGST-PDZ融合体も並べることができる）。
表１のある領域に重要な結合相互作用が高密度に集まることは、特定のリガンド構造が特定のPDZドメインファミリーに結合する傾向にあることを示している。結果は、マトリックス中の幾つかのクラスターに多くの有意な結合相互作用が集まり、その他の領域には殆ど有意な結合相互作用がないことから、類似構造を持つPDZドメインが類似結合相互作用により類似構造リガンドと結合することを示している。これらの結果は、異なるPDZ蛋白質とそれらリガンド間に幾つかの構造相関性があることを示している。これら構造相関性を理解することは、特異的PDZ蛋白質にとって有望なリガンドのデータベースをスキャンし、これら新規相互作用の阻害剤設計の迅速化及びそれら阻害剤の副作用プロフィールの推測に利用できる。
【００９３】
クラスターの最も顕著な例はマトリックスの縦列1-5に見られる（CASK、MPP1、DLG1、PSD95及びNeDLG由来のPDZドメイン）。我々のアッセイでは、CASKは試験したリガンドのうちの１種類、ニューレクシンとのみ有意に結合した（この相互作用は従来神経細胞に同定されていた）。使用した順番付けシステムではCASKに最も近いMPP1はニューレクシンを含む５種類のリガンドのセットに結合した。特定されたMPP1リガンドは全て構造的に類似しており、バリン（V）で終止し、電荷アミノ酸（E又はK〜をC-末端から-3の位置に有していた（C-末端モチーフ；E/K-X-X-V）。
特定された５種類のMPP1リガンドの内４種類は、CASK及びMPP1に次に最も類似している蛋白質DLG1とも結合できる。DLG1はその他２種類の蛋白質、PSD95及びNeDLGとも良く相関している。これら３種類の蛋白質はそれぞれ従来報告のモチーフS/T/Y-X-V/I/Lで終止している（Songyangら、1997、Science 275, 73）。興味深いことに、末端リガンド残基がバリンの場合には、従来未特定の-2位置の他残基は結合に関し互換的であり、C-末端配列AEV及びELVと共に有意な結合を生じる。これは従来未確認であったPDZリガンド結合に於ける柔軟性を反映する一方で、我々のアッセイにて検出された相互作用の特異性は重要でない結合事象を含む縦列1-5の上部及び下部の広い領域に反映されている。これらの領域は、V/I/L以外の残基で終止する潜在的リガンドはCASK、MPP1、DLG1、PSD95又はNeDLGに有意に結合しないことを表している。
【００９４】
（MPP1に関しては、MPP1の既知リガンドである糖蛋白質C、Marfatiaら、1997、J.Biol.Chem, 272, 24191は我々の試験ではMPPIに有意に結合しなかったが、バリンによく似たイソロイシンで終止し、C-末端の-3位置に電荷残基を有している）マトリックス上にあるより小さなクラスターもまた特定PDZドメインのリガンド特異性に関する有益な情報を提供する。例えば５種類のリガンドは、従来研究されていないPDZドメイン含有蛋白質である41.8kD蛋白質似たいし、“G”及び“A”アッセイの両方で有意に結合する。
これらリガンドは全てA、V、I又はLで終止しており、５種類の内４種類が-2位置にセリンを持ち、このPDZドメインに関するC-末端リガンドモチーフはS-XA/V/I/Lである。どうようにKIAA0561に特異的に結合する３種類のリガンドの内２種類が式中のX*が非芳香族アミノ酸であるC-末端モチーフX*-S/T-D/E-V/I/Lに合致する。興味深いことに、これらリガンドの一つはKIAA0561*に最も関連するTAX2にも結合する。同様にprIL16と結合する２種類のリガンドは-3位置に電荷アミノ酸を、-2位置には疎水性アミノ酸を、そして末端位置にはバリンを有している。PDZドメインのリガンド特異性を規定する最後の興味深い例はPTN-4である。PTN-4に有意に結合する２種類のリガンドはそれらのC-末端２残基に関しては密に相関していないが、共にC-末端モチーフD/E-S-X-V/I/L/F/Yに合致する。特定のPDZ蛋白質のリガンド特異性を特徴付けるこれらモチーフは表5Bにまとめられている。これらモチーフにより、これら特定PDZ蛋白質に結合する新規リガンド（PL蛋白質）に関するデータベース検索が可能になる。これらPDZ蛋白質に結合するPL蛋白質に関する知識により、下記ここに開示の方法を利用し、これら相互作用の阻害剤を設計することができる。更に、特定PDZ蛋白質に結合するPL蛋白質のセットに関する知識を利用することで、このPDZを標的とする化合物の有用性及び副作用を推測することができる。
【００９５】
【表２４】
2011102326.tif 000025
【００９６】
6.3  PDZおよびリガンドの結合親和性
本発明の「Ａ」および「Ｇ」検定を用いてPDZリガンドペプチドとPDZドメインポリペプチドの結合の「見掛けの親和性」を決めることができる。見掛けの親和性は、第二の分子の結合（例えば、リガンドと受容体の結合）を飽和するのに必要なある分子の濃度に基づいて決められる。PDZ−リガンド結合の見掛けの親和性の定量化のために特に有用な二つのアプローチを下記に提供する。
アプローチ１：
（1）GST／PDZ融合タンパク質ならびにネガティブ対照としてのGST単独を、「Ｇ」検定のために上記の記載と同様に、表面（例えば、96ウェルプレート）と結合させ、その表面をブロックし、洗浄する。
（2）ビオチニル化したPLペプチドの溶液（例えば、表４に示すような）を、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の濃度を増加させて（例えば、0.1 uM、0.33 uM、1 uM、3.3 uM、10 uM、33 uM、および100 uM）表面に1ウェル当たり50 uL加える。一実施形態においては、PLペプチドを結合したGST／PDZ融合タンパク質（ならびにGST単独のネガティブ対照）と４℃で１０分間、続いて２５℃で２０分間反応させる。プレートを氷で冷やしたＰＢＳで３回洗浄して結合していない標識されたペプチドを除去する。
（3）PLペプチドと固定化したPDZドメインのポリペプチドの結合を、「Ｇ」検定のために上記の記載と同様に検出する。
（4）ペプチドの各濃度に対する正味の結合信号は、ペプチドのGST／PDZ融合タンパク質との結合からペプチドのGST単独との結合を差し引くことによって決められる。次いで正味の結合信号を、リガンド濃度の関数としてプロットし、そのプロットを下記の式に当てはめる（例えば、Kaleidagraphのソフトウェアパッケージの曲線当てはめ用アルゴリズムを用いて）。下式で、「信号〔リガンド〕」はPLペプチド濃度「〔リガンド〕」における結合信号であり、「Kd」は結合事象の見掛けの親和性であり、また「飽和結合度」は実験データに対する適合の最適化のための曲線当てはめ用アルゴリズムによって決まる定数である。
【００９７】
【数１】
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【００９８】
上式を高い信頼性で適用するためには、実験的にうまく試験された最高ペプチドリガンド濃度が、計算上のKdよりも大きいかまたは少なくともほぼ同じであることが必要である（すなわち、最大測定結合度は計算上の飽和結合度とほぼ同じであるべきである）。上記の基準を満たすことが困難であることが判明した場合には別のアプローチ（下記）を用いることができる。
アプローチ１を用いた場合に得られる結果を図２Ａおよび図２Ｂに例示する。図２は、ビオチニル化したCLASP-2（図２Ａ）またはFas（図２Ｂ）の様々な濃度を示す。Ｃ末端のペプチドを、固定化した（プレートと結合した）GSTポリペプチドまたはGDT／PDZ融合タンパク質（GST／DLG1、GST／NeDLG、およびGDT／PSD95）と複製中に反応させた。信号を正規化し、プロットし、飽和結合曲線に当てはめた結果、DLG1−CLASP-2相互作用に対しては見掛けの親和性21uM、NeDLG−CLASP-2相互作用に対しては見掛けの親和性7.5uM、PSD95−CLASP-2相互作用に対しては見掛けの親和性45uM、またDLG1−Fas相互作用に対しては見掛けの親和性54uM、NeDLG−Fas相互作用に対しては見掛けの親和性54uM、PSD95−Fas相互作用に対しては見掛けの親和性85uMが得られた。
【００９９】
アプローチ２：
（1）PDZドメインのポリペプチド濃度を固定し、標識したPLペプチド（例えば、ビオチンまたはフルオレセインで標識する。代表的なペプチドのアミノ酸配列については表４を参照されたい）の濃度を増加して混合し、溶液にして反応させた。一実施形態において好ましいペプチド濃度は0.1uM、1uM、10uM、100uM、および1mMである。様々な実施形態における適切な反応時間は、温度４℃から３７℃の範囲で１０分から２日の範囲にある。幾つかの実施形態においてはその同一の反応を、対照として非PDZドメイン含有タンパク質を用いて行なうこともできる（例えば、PDZドメインのポリペプチドが融合タンパク質の場合、その融合の相手を用いることができる）。
（2）PDZ−リガンド複合体は、当業界で周知の様々な方法を用いて結合していない標識されたペプチドから分離することができる。例えば複合体は、高性能サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰＳＥＣ、ゲル濾過）（Rabinowitz等のImmunity 9:699 (1998)）、アフィニティクロマトグラフィ（例えば、グルタチオンセファロースビーズを用いて）、および親和吸収（例えば、上記に記載のように抗GST被覆プレートと結合させることにより）を用いて分離することができる。
（3）PDZ−リガンド複合体は、当業者には周知の様々な方法および検出器を用いてペプチドリガンド上の標識の存在に基づいて検出される。例えば、標識がフレオレセインであり、分離がＨＰＳＥＣを用いて達成される場合、インライン型フレオレセイン検出器を用いることができる。結合はまた、Ｇ検定用の上記の記載と同様に検出することもできる。
（4）PTZ−リガンド結合信号をリガンドの濃度の関数としてプロットし、そのプロットを下記の式に当てはめる（例えば、Kaleidagraphのソフトウェアパッケージの曲線当てはめ用アルゴリズムを用いて）。下式で、「信号〔リガンド〕」はPLペプチド濃度「〔リガンド〕」における結合信号であり、「Kd」は結合事象の見掛けの親和性であり、また「飽和結合度」は実験データに対する適合の最適化のための曲線当てはめ用アルゴリズムによって決まる定数である。
【０１００】
【数２】
2011102326.tif 000027
【０１０１】
PTZドメインポリペプチドに対する標識されたペプチドリガンドの結合親和性の測定は、この相互作用の親和性（すなわち見掛けの親和性）の知識が、よく知られている効力を有する相互作用インヒビターの合理的設計を可能にするので役に立つ（実施例２を参照されたい）。阻害におけるインヒビターの効力は、PDZドメインに対する標識されたペプチドリガンドの結合の見掛けの親和性に類似している（すなわち、その１桁の大きさ以内にある）はずである。
6.4  新規なPDZドメイン結合部分を同定するための、またPDZタンパク質−PLタンパク質結合のインヒビターを同定するための検定
主にPDZドメインのポリペプチドとPLタンパク質の間の相互作用の同定という観点から上記に記述したが、上記記載の検定法およびその他の検定法もまた、その他の分子（例えば、ペプチド模倣物、小分子など）とPDZドメインの配列の結合を同定するために用いることができる。例えば、本明細書に開示した検定法を用いて化合物の組合せまたは別のライブラリーをスクリーニングすることができる。ライブラリーのスクリーニングは、様々な一般に知られている方法のいずれかによって達成することができる。例えば、ペプチドのライブラリーについて開示されている下記の参考資料、すなわちParmleyおよびSmithの論文Adv. Exp. Med. Biol. 251:215~218 (1989)、ScottおよびSmithの論文Science 249:386~390 (1990)、Fowlkes等の論文BioTechniques 13:422~427 (1992)、Oldenburg等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393~5397 (1992)、Yu等の論文Cell 76:933~945 (1994)、Staudt等の論文Science 241:577~580 (1988)、Bock等の論文Nature 355:564~566 (1992)、Tuerk等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988~6992 (1992)、Ellington等の論文Nature 355:850~852 (1992)、ladner他の米国特許第5,096,815号、第5,223,409号、および第5,198,346号、RebarおよびPaboの論文Science 263:671~673 (1993)、ならびに国際特許公開第94/18318号を参照されたい。
ある特殊な実施形態においてスクリーニングは、ライブラリーのメンバーを固形の支持体上に固定した造血細胞のPDZドメインのポリペプチドと接触させ、タンパク質と結合するこれらライブラリーメンバーを収集することによって行なうことができる（例えば、上記で「Ｇ」検定において記述したように）。「パンニング」技法と呼ばれるこのようなスクリーニング法の例は、ParmleyおよびSmithの論文Gene 73:305~318 (1988)、Fowlkes等の論文BioTechniques 13:422~427 (1992)、国際特許公開第94/18318号、および本明細書で先に引用した参考資料中に例として記載されている。
別の実施形態においては、酵母中で相互作用するタンパク質を選別するために二つのハイブリッドシステム（FieldsおよびSongの論文Nature 340:245~246 (1989)、Chien等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578~9582 (1991)）を用いてPDZドメインを含有するタンパク質と特異的に結合する分子を同定することができる。その上、同定された分子はさらにトランスメンブレン受容体のPDZドメインとの相互作用を阻害する能力が試験される。
本発明の一態様においては、PDZタンパク質とPLタンパク質の間の相互作用のアンタゴニストが同定される。一実施形態において、上記に記載した「Ａ」検定の修正形態を用いてアンタゴニストを同定する。一実施形態において、上記に記載した「Ｇ」検定の修正形態を用いてアンタゴニストを同定する。
一実施形態においては、スクリーニング検定を用いて造血細胞中のPDZドメインと特異的に結合する分子を検出する。このような分子はPDZタンパク質が仲介する細胞機能（例えば、細胞の活性化、例えばＴ細胞の活性化；小胞輸送；サイトカインの放出；細胞増殖因子；転写変化；サイトスケレチン配列；細胞運動；化学走性など）のアゴニストまたはアンタゴニストとして有用である。一実施形態においてこのような検定は、薬物開発用の白血球活性化インヒビターをスクリーニングするために行なわれる。こうして本発明は、造血細胞中のPDZドメイン含有タンパク質と特異的に結合する分子を検出ための検定法を提供する。例えば、PDZドメインをコード化する核酸を発現する組換え細胞を用いてこれら検定でPDZドメインを産生し、そのドメインと結合する分子をスクリーニングすることができる。分子を結合に導く条件下でPDZドメイン（またはその断片）と接触させ、次いでそのようなドメインと特異的に結合する分子を同定する。前記を実施するために用いることができる方法は、当業界では一般に知られている。
【０１０２】
例として、ランダムもしくは組合せペプチドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様なライブラリーを、造血細胞中でPDZドメインと特異的に結合する分子を得るためにスクリーニングすることができる。使用することができる多くのライブラリー、例えば化学的に合成されたライブラリー、組換え型（例えばファージ表示ライブラリー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリーが当業界で知られている。
化学的に合成したライブラリーの例は、Fodor等の論文Science 251:767-773 (1991)、Houghten等の論文Nature 354:84-86 (1991)、Lam等の論文Nature 354:82-84 (1991)、Medynskiの論文Bio/Technology 12:709-710 (1994)、Gallop等の論文J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251 (1994)、Ohlmeyer等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993)、Erb等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426 (1994)、Houghten等の論文Biotechniques 13:412 (1992)、Jayawickreme等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618 (1994)、Salmon等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712 (1993)、国際特許公開第93/20242号、ならびにBrennerおよびLernerの論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383 (1992) に記載されている。
ファージ表示ライブラリーの例は、ScottおよびSmithの論文Science 249:386~390 (1990)、Devlin等の論文Science 249:404-406 (1990)、Christian,R.B.等の論文J.Mol.Biol. 227:711-718 (1992)、Lenstraの論文J. Immunol. Meth. 152:149~157 (1992)、Kay等の論文Gene 128:59-65 (1993)、および国際特許公開第94/18318号（1994年8月18日）に記載されている。
インビトロ翻訳ベースのライブラリーには、国際特許公開第91/05058号（1991年4月18日）およびMattheakis等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026 (1994) に記載のものがあるがこれには限定されない。
【０１０３】
非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンのライブラリー（例えば、Bunin等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712 (1994) を参照されたい）を使用に適するようにすることができる。またペプチドライブラリー（Simon等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371 (1992)）を使用することもできる。化学的に形質転換された組合せライブラリーを生成するようにペプチド中のアミド官能基が完全メチル化されている使用可能なライブラリーの別の例がOstresh等の論文（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142 (1994)）に記載されている。一実施形態において、周知のまたは候補のアンタゴニストの存在または不在下でＡまたはＧ検定を行なうことによってアンタゴニストが同定されることは普通の当業者ならば理解するはずである。ある化合物の存在下で結合の減少が観察される場合、その化合物はアンタゴニストとして同定される。ある化合物の存在下における結合の増加は、その化合物がアゴニストであることを意味している。
例えばある検定において試験化合物は、試験化合物の存在および不在下において、（試験化合物が存在しなかったら）複合体を形成するはずの条件下でPDZドメインのポリペプチドとPLペプチドを接触させ、試験化合物の存在および不在下における複合体の形成を検出することにより、PDZタンパク質とPLタンパク質の間の結合のインヒビター（アンタゴニスト）として同定することができる。試験化合物の存在下における複合体の形成が化合物の不在下における複合体の形成よりも少ないことは、試験化合物がPDZタンパク質−PLタンパク質結合のインヒビターであることを示すことが理解されよう。様々な実施形態においてPLペプチドは、PLタンパク質のＣ末端配列とほぼ等しいアミノ酸配列を含む（例えば、CD6、CD49E、CD49F、CD138、Clasp-1、Clasp-4、VCAM-1、Clasp-2、CD95、DNAM-1、CD83、CD44、CD4、CD97、Neurexin、CD3n、DOCK2、CD34、FceRIb、またはFasLigand）。
ある実施形態においては「Ｇ検定」が候補インヒビターの存在または不在下において用いられる。ある実施形態においては「Ａ検定」が候補インヒビターの存在または不在下において用いられる。
【０１０４】
ある実施形態（Ｇ検定を用いる）においては、１または複数のPDZドメイン含有GST融合タンパク質を上記に記載のように（非融合GSTタンパク質を含む適切に制御された状態で）９６ウェルプレートのウェル表面と結合させる。適切な制御および統計的分析を行なうことができるように全ての融合タンパク質を複数ウェル中で結合させる。ＢＳＡ／ＰＢＳに溶かした試験化合物（一般に複数の異なる濃度で）をウェルに加える。その後直ちに関連するPDZドメイン（例えば、表２参照）と結合させるために検出可能に標識した（例えばビオチニル化した）既知のペプチド30 ulをウェルそれぞれに、例えば約2 uMと約40 uMの間、一般には約5 uM、約15 uM、または約25 uMの最終濃度で加える。次いでこの混合物を、表面に結合しているPDZ融合タンパク質と４℃で１０分間、続いて２５℃で２０分間反応させる。表面を氷で冷やしたＰＢＳで３回洗浄して結合していないペプチドを除去し、試験化合物の存在および不在下におけるペプチドの結合量を決める。通常、結合レベルは、レプリカウェル（例えば複製）の各組についてこれらウェル中のペプチド結合の生の測定値の平均からGSTのみの背景の平均を差し引くことによって測定される。
別の実施形態においては、PL−PDZ相互作用のインヒビターを同定するためにＡ検定を試験候補の存在および不在下で行なう。
【０１０５】
ある実施形態においては、1 mM以下（例えば、500 uM、100 uM、10 uM、1 uM、100 nM、または1 nM以下）の試験化合物濃度において、試験化合物の存在下におけるPDZドメイン（Ｐ）とPL（Ｌ）の結合が、試験化合物の不在下における結合の約５０％未満（様々な実施形態においては約２５％未満、約１０％未満、または約１％未満）の場合、ＰとＬ配列の結合の特異的インヒビターであると判定される。試験化合物の存在下におけるＰとＬの結合の正味信号プラス試験化合物の存在下における信号の標準誤差の６倍が、試験化合物の不在下における結合信号より小さいことが好ましい。
ある実施形態においてインヒビターの検定は、単一のPDZタンパク質−PLタンパク質ペア（例えばPDZドメイン融合タンパク質とPLペプチド）を用いて行なわれる。関連する実施形態において検定は、表２に列挙した複数の異なるペアなど複数のペアを用いて行なわれる。
幾つかの実施形態では、ある決まった濃度において、あるPL−PDZペアの結合を阻害するが、特定の第二のPL−PDZペアの結合を阻害しない（または阻害の程度が小さい）化合物を同定することが望まれる。これらのアンタゴニストは、候補のインヒビターと様々なPL−PDZペア（例えば表２のマトリックス中に示したような）を用いて一連の検定を行ない、検定の結果を比較することによって同定することができる。全てのこのようなペア様式の組合せが本発明によって検討されている（例えば試験化合物は、PL1とPDZ1の結合を、PL1とPDZ2またはPL2とPDZ2の結合を阻害するよりも高度に阻害する）。重要なことは、表２に提供され、本明細書に開示されたデータ（および本明細書に記載の方法を用いて生み出すことができる付加的なデータ）に基づいて様々な特異性を有するインヒビターを容易に設計することができる点にあるということを理解されよう。
PDZ結合部分および本発明のPDZタンパク質−PLタンパク質結合アンタゴニストを用いて細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞などの造血細胞）、内皮細胞、および本明細書に記載したその他の免疫系細胞の生理学的活性または機能を調節し、またヒトおよび非ヒト動物（例えば実験モデル）の病および状態を治療する。生理学的活性の例は上記に列挙する。
患者に投与される場合、本発明の化合物（例えばPL−PDZ相互作用のインヒビター）は、炎症性および液素性免疫応答を特徴とする病、例えば炎症、アレルギー（例えば全身アナフィラキシー、過敏性反応、薬剤アレルギー、昆虫刺傷アレルギー）；炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、回腸炎、および腸炎；乾癬および炎症性皮膚病；強皮症；喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの呼吸アレルギー性疾患；脈管炎；鼻腔適合性；輸血反応；薬剤敏感性；ＰＩＨ；アトピー性皮膚炎；湿疹；鼻炎；関節炎（リウマチ様および乾癬性）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、糸球体腎炎、強皮症、ＭＣＴＤ、ＩＤＤＭ、橋本病、グッドパスチャー症候群、乾癬などの自己免疫性疾患；骨関節症；多発関節炎；移植片拒絶（例えば同種移植片拒絶反応、例えば腎同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、移植拒絶反応（心臓、腎臓、肺、肝臓、小腸、角膜、膵臓、死体または自己骨髄、異種移植））；アテローマ性動脈硬化症；脈管形成依存性疾患；癌（例えば、黒色腫および乳癌、衰弱性癌、白血病、リンパ腫、転移性疾患）；感染性疾患（例えば、ＨＩＶ、麻疹、パラインフルエンザ、ウィルス性細胞融合などのウィルス感染）；虚血（例えば、心筋梗塞後の合併症、関節の外傷、腎臓、強皮症）を含む様々な病および状態の治療（症状の軽減）にとって有用である。
【０１０６】
表２に列挙したPLタンパク質およびPDZタンパク質は十分に特徴が調べられており、この開示（本明細書に記載のPLタンパク質とPDZタンパク質の間の相互作用の発見を含む）によって手引きされた当業者は、表２に記載のものなどPDZ−PL相互作用の活性調節因子（例えば、エンハンサーまたはインヒビター）の多くの使い方について理解するはずである。さらに読者を支援するため、選ばれたPLタンパク質（およびその機能）の特徴に関する考察を下記に提供する。この考察は包括的なものではなく、決して本発明を限定することを意図するものではないことを理解されたい。さらに、この項のいずれも本発明者等の意図を特定の行動手順に限定するものと解釈されるべきではない。
A．CD6
上記で示したように、CD6はPDZタンパク質41.8を結び付ける。CD6は、慢性リンパ球性白血病の胸腺細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞上に発現する。CD6は、Ｔ細胞の副刺激において役割を演じ、CD6ネガティブＴ細胞はCD6ポジティブＴ細胞よりも自己反応性が低い。CD6とCD6／41.8の相互作用の阻害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または乾癬の症状を軽減すると予想される。したがって本発明の一実施形態において、ドナーの骨髄細胞を受ける患者のＧＶＨＤは、細胞を有効量のアンタゴニストで前処理することにより低減される。CD6−PDZ相互作用のインヒビターは、FK506、Cellcept、またはサイクロスポリンなどの移植後免疫抑制治療と組み合わせると移植患者（例えば白血病患者）全体の生存を改善することになる。
B．CD49e（αA-4）
本明細書で報告した実験によって示されるようにCD49eのＣ末端は、PDZドメイン含有タンパク質41.8kDと結合する。CD49eは、インテグリンαファミリー（インテグリンα５）の110kDトランスメンブレンの膜タンパク質である。これは、インテグリンβ１サブユニットと対でVLA-5を形成する。VLA-5は、主に単核細胞、塩基性染色細胞、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含む造血細胞およびリンパ様系統細胞上に発現する。VLA-5は、いたるところに発現した接着分子フィブロネクチンに対する受容体である。心筋梗塞などの組織の損傷はフィブロネクチンの可溶性断片を放出する。これら可溶性断片とVLA-5の結合は、単核細胞を含む免疫細胞のフィブロネクチン発生源への化学走性、およびこれら細胞上におけるVLA-5発現のダウンモジュレーションをもたらす。このようなリガンドが誘発するダウンモジュレーションは、化学走性受容体の普通かつ必要な特徴である。いったん免疫細胞がフィブロネクチンの発生源へ完全に移動すると、フィブロネクチン表面との接着はフィブロネクチン−VLA-5相互作用によって高められる。特別の機構によって結合することを意味するものではないが、41.8／CD49eの相互作用は、それが中断されるとフィブロネクチンを含有する表面への移動および付着も同様に中断され、その結果免疫系細胞のフィブロネクチン発生源への有効な移動と、フィブロネクチンを含有する表面への付着が不能になるため、それはCD49eの適正な膜分布および／またはCD49eの再循環にとって必要であると考えられる。したがってこのような中断は、心筋梗塞後の炎症の低減を含む炎症性反応の望ましい低減をもたらすはずである。治療可能なその他の疾患には関節炎、乾癬、接触アレルギー、クローン病、炎症性腸疾患、湿疹、アトピー性皮膚炎があるがこれには限定されない。
【０１０７】
C．CD49F（VLA-6αサブユニット）
上記で示したように、CD49FはPDZタンパク質41.8を結び付ける。CD49fは、VLA-6を形成するβ１インテグリンサブユニット（CD29）、またはCD104（β４インテグリンサブユニット）のいずれかと対になるインテグリンサブユニットとして知られている。インテグリン超遺伝子ファミリーは、胚形成、血栓症、創傷の治癒、腫瘍発生、、および免疫応答を含む多くの異なる生理学的過程にとって重要な多数の細胞表面αβ異種二量体からなる。各β鎖は、様々なα鎖と対になることができる。VLA-6およびCD49f／CD104の両者は、非リンパ様組織において上皮上に広く発現する。VLA-6はまた、血小板、単核細胞、胸腺細胞、およびＴリンパ細胞上で発現し、活性また休止記憶Ｔ細胞上では発現が増加する。
VLA-6と41.8の間の相互作用の阻害は、転移性癌の予防および治療、ならびに過剰能動免疫の治療など多数の治療機能を有する。例えば、VLA-6は衰弱性癌の侵襲と関連しており、乳癌の転移において役割を演じる。衰弱性癌の通常の治療と組み合わせたVLA-6機能の阻止は、転移性疾患を予防することによって、より有効な治療となるはずである（Cress等の著書Cancer Metastasis R (1995) 参照）。PDZの相互作用を介するCD49fの阻止はまた、記憶応答を鈍感にすることによりＲｈ不適合を治療することができ、あるいはケロイドの治療に用いることができる。
D．CD138（シンデカン−１）
CD138は、様々な細胞外間質成分に対してリガンド結合ドメインとして機能する細胞外ドメインと、細胞骨格を変え細胞内信号を変換するように機能する細胞内部分とを有するトランスメンブレンのプロテオグリカン受容体である。また、CD138はFGF2を結び付け、FGF2受容体に対するコレセプターである可能性がある（Yayon等の記述 (1991)）。
上記に示したようにCD138は、41.8kDタンパク質およびTIAM1と相互作用する。CD138のＣ末端はまた、シンテニンおよびヒトＣＡＳＫのPDZドメインを結び付けることが報告されている（Cohen等の論文J. Cell. Biol. 142:129-138 (1998)、Grootjans等の論文PNAS 94: 13683~13688 (1997)、Hsueh等の論文J. Cell. Biol. 142:139-151 (1998)）。CD138は、プレＢ細胞、未熟Ｂ細胞、形質細胞、神経細胞、上皮細胞の基底面、胎児性の間充繊細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、および神経細胞だが成熟循環性Ｂ細胞でないものの中において発現する。CD138と、41.8kDタンパク質およびTIAM1タンパク質のPDZドメインとの間の相互作用は、細胞表面のCD138の適正な分布にとって必要であると考えられる。有効量のアンタゴニストの投与による相互作用の中断は、細胞の細胞外間質への移動および付着を妨ぎ、その結果炎症性および体液性の免疫応答を低減させることが期待される。CD138の阻害は、これには限定されないが心筋梗塞後の炎症性損傷、関節の負傷、慢性関節リウマチ、脈管炎、薬物反応、強皮症、ＳＬＥ、橋本病、グッドパスチャー症候群、若年性インスリン依存性糖尿病、乾癬などの疾患を治療するために用いることができる。
【０１０８】
E．CD98
上記に示したように、CD98はMPP 2と相互作用する。CD98は、単核細胞上に高レベルで発現し、またＴ細胞、Ｂ細胞、脾細胞、ＮＫ細胞、および顆粒球上に低レベル発現する。CD98は、接着および融合において役割を演じ、Ｌ型アミノ酸輸送体である。CD98はまた、ウィルスが仲介する細胞融合（例えば、パラミクソウィルス、すなわちパラインフルエンザウィルス２型、ニューキャッスル病ウィルス、およびルブラウィルス）と関わっており、CD98機能の拮抗作用はウィルス性感染を治療し、ウィルスの拡散を制限することが期待される。CD98インヒビターは、これには限定されないがパラミクソウィルス、パラインフルエンザ、ニューキャッスル病、およびルブラに対する抗ウィルス性剤である可能性がある。その他の役割には急性白血病の治療がある。
F．CLASP-1
上記に示したようにCLASP-1は、DLG 1、PSD 95、およびNeDLGと相互作用する。CLASP-1は、同様の主題をもつ免疫細胞関連タンパク質の超ファミリーのメンバーである（国際特許公開第00/20434号として公開された国際出願米国特許第PCT/US99/2299号を参照）。CLASP-1は、免疫シナプスの維持機能をもつ。CLASP-1転写物は、リンパ系器官および神経組織中に存在し、そのタンパク質は、ＴおよびＢリンパ球、ならびに脾臓の周辺帯のＭＯＭＡ−１サブ領域、すなわちＴおよびＢ細胞の相互作用において重要であることが知られている領域中のマクロファージによって発現する。個々のＴおよびＢ細胞のCLASP-1の染色は、Ｂ細胞中の「ボール」または「キャップ」構造として組織化され、またＴ細胞中の「リング」、「ボール」、または「キャップ」構造を形成する活性化前の構造極性を示す。これら構造の配置は、微小管形成中心（「ＭＴＯＣ」）に隣接している。CLASP-1抗体の染色は、CLASP-1が、分化と完全に関わっているＴ−Ｂ細胞抱合体の境界面にあることを示している。CLASP-1の細胞外ドメインに対する抗体もまた、Ｔ−Ｂ細胞抱合体の形成およびＴ細胞の活性化を妨げる。
CLASP-1機能の拮抗作用は、免疫応答（例えば、ＴおよびＢ細胞活性化）、信号の変換、細胞と細胞の相互作用、および膜の組織化を妨げることが期待される。CLASP-1アゴニスト／アンタゴニストによって治療することが可能な疾患には、これには限定されないが慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、器官拒絶反応、移植片対宿主病、強皮症、多発性硬化症がある。
【０１０９】
G．CLASP-4
上記に示したようにCLASP-4は、DLG 1、PSD 95、NeDLG、LDP、AF 6、41.8、およびMINT1と相互作用する。CLASP-4は、同様の主題をもつ免疫細胞関連タンパク質の超ファミリーのメンバーである（同時係属中の出願日2000年4月11日の米国特許出願第60/196,527号を参照されたい）。CLASP-4タンパク質は、主に末梢血液のリンパ球中で発現する。CLASP-4とPDZドメインの相互作用の阻害は、免疫応答（例えば、ＴおよびＢ細胞活性化）、信号の変換、細胞と細胞の相互作用、および膜の組織化を妨げるはずである。CLASP-4アゴニスト／アンタゴニストによって治療することが可能な疾患には、これには限定されないが慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、器官拒絶反応、移植片対宿主病、強皮症、多発性硬化症、急性白血病、白血病芽細胞発症、梗塞後の炎症（心臓など）、アテローマ性動脈硬化症がある。
H．VCAM1
血管細胞接着分子１（VCAM-1、CD106）は主に血管の内皮（すなわち内皮細胞）によって発現するが、マクロファージ、樹枝状細胞、骨髄誘発性細胞、、繊維芽細胞、皮質性胸腺上皮細胞、血管平滑筋細胞、筋原細胞、および筋管中に検出されている。VCAM-1は、インテグリンリガンドすなわちVLA-4との相互作用を介して接着を仲介し、それはリンパ球、単核細胞、および好酸球によって発現する。VCAM-1とVLA-4の間の相互作用は、内皮自体が炎症または外傷により活性化するようになったとき、VLA-4発現細胞の活性化、横ばい化、および血液溢出にとって重要である（Salomon等の論文Blood 89:2461-2471 (1997)、St-Pierre等の論文Eur. J. Immunol. 26:2050~2055 (1996)、Bell等の論文Int.Immunol. 7:1861-1871 (1995)）。
【０１１０】
上記に示したようにVCAM-1のＣ末端領域は、MPP 1、DLG 1、NeDLG1、LDP、41.8タンパク質、TIAM1、およびK303のPDZドメインに対するリガンドである。これらの相互作用は、内皮細胞とインテグリン発現リンパ球の相互作用の機能を仲介すると考えられる。PDZ - PL相互作用が中断されるとリンパ球の内皮への付着も同様に中断され、結果として例えば炎症の軽減をもたらす。したがってVCAM-1のPDZタンパク質との結合の阻害は、腎同種移植拒絶反応、インスリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、心筋梗塞後の合併症、および全身性慢性エリテマトーデスなど（これらには限定されないが）の異常なVCAM-1の炎症応答および関連する病状を低減するのに役立つ（Pasloske等の論文Ann. Rev. Med. 45:283 (1994)、Ockenhouse等の論文J. Exp. Med. 176:1183 (1992)、Solezk等の論文Kidney Int. 51:1476 (1997)、Tedla等の論文Clin. Exp. Immunol. 117:92-99 (1999)、Kusterer等の論文Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 107:S102-107 (1999)、Bonomini等の論文Nephron. 79:399 (1998)、Suassuna等の論文Kidney Int. 46:443 (1994)、Ferri等の論文Hypertension 34:568 (1999)）。
I．CLASP-2
上記に示したようにCLASP-2は、PSD95、NeDLG、およびDLG1と相互作用する。CLASP-2は、同様の主題をもつ免疫細胞関連タンパク質の超ファミリーのメンバーである（同時係属中の出願日2000年4月11日の米国特許出願第09/547,276号、出願日2000年4月11日の国際特許公開第00/10158号、出願日2000年4月11日の国際特許公開第00/10156号を参照されたい）。CLASP-2の転写物は胎盤中に最も強く、次いで肺、腎臓、および心臓中に存在し、そのタンパク質はＴおよびＢ細胞、ならびに腎臓の上皮細胞中で発現する。
CLASP-2とPDZドメインの相互作用の阻害はCLASP-2の機能を妨げ、その結果ＴおよびＢ細胞の機能（例えば、ＴおよびＢ細胞活性化）、信号の変換、細胞と細胞の相互作用、および膜の組織化を妨げることになる。加えてCLASP-2は心臓中に存在するので、CLASP-2の機能または発現を阻止することにより心臓中の免疫応答を選択的に阻止する（例えば、どこか別の場所で免疫を損なうことなく心臓移植拒絶反応またはＭＩ後の炎症に続く、例えば心臓の区画中の免疫応答を選択的に停止する）ことができる。CLASP-1アゴニスト／アンタゴニストによって治療することが可能なその他の疾患には、慢性関節リウマチ、若年性糖尿病、器官拒絶反応、移植片対宿主病、強皮症、多発性硬化症があるがこれには限定されない。
【０１１１】
J．CD 95（Apo-1／Fas）
CD 95（Fas／Apo-1）とFasリガンド（FasL）は、リンパ球の恒常性および末梢性と関係する受容体リガンドのペアである。そのリガンドによるFasの結合は、アポトーシスによる細胞死、すなわち急性炎症反応の分解中に不要の細胞を安全に取り片付けるための重要で主要な仕組みをもたらす。上記に示したようにPSD 95は、PDZドメイン、すなわちDLG 1、PSD95、NeDLG、および41.8を結び付ける。CD 95とPDZドメインの相互作用の阻害が用いられる。
K．Kv1.3（Shaker型Kv1.3カリウムチャンネル）
上記に示したようにKv1.3は、DLG1、PSD95、NeDLG、LIMK、41.8、RGS12、DVL1、およびMINT1を結び付ける。Kv1.3は、Ｔリンパ球の膜電位の調節に関わるShakerに関連したチャンネルタンパク質である（LewisおよびCahalanの論文Ann. Rev. Immunol. 13:623 (1995)）。Kv1.3チャンネルの阻害は、Ｔ細胞膜を長期にわたり脱分極し、細胞膜中でカルシウムにより活性化される放出カルシウムチャンネルを介するカルシウムの侵入を低減し、その結果リンパ球の活性化にとって不可欠なカルシウムの信号伝達経路を阻害する。Hanada等は、Kv1.3がジャーカットＴ細胞中のDLG1およびPSD95と対合していることを報告している（J. Biol. Chem. 272:26899 (1997)）。Kv1.3 - PDZタンパク質のアゴニスト／アンタゴニストの投与は、Ｔ細胞の信号伝達を中断することになり、これらには限定されないが器官の移植、移植片対宿主病、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、骨関節症、多発性硬化症、強皮症、混合性の結合組織疾患の治療のために有用な治療薬となる可能性がある。
L.  DNAM-1
上記に示したようにDNAM-1は、MPP2、DLG1、PSD95、NeDLG、LIM、AF6、41.8、およびRGS12を含む幾つかのPDZタンパク質を結び付ける。DNAM-1は、本質的にFynと対合するが、過バナジン酸塩（チロシンホスファターゼインヒビター）の存在を必要とする（Shibuya等の論文Immnity.11:615-623 (1999) を参照されたい）。抗CD3（またはDNAM-1）で刺激すると、DNAM-1はセリン329においてリン酸化され（Shibuya等の論文J. Immn.16:1671-1676 (1998)）、LFA-1と対合する。さらにFynは、過バナジン酸塩とは無関係にDNAM-1と対合するようになる。FynはY322においてDNAM-1をリン酸化するが、DNAM-1との結合を続けるのにY322を必要としない。
DNAM-1自体はSH3結合ドメインを持たず、Y322にSrcリン酸化部位を持つのみなので、DNAM-1とFynを架橋するにはアダプター分子が存在しなければならない。PLG1はＴ細胞中に存在することが文献に記載されている（Hanada等の論文J. Biol. Chem. 272:26899 (1997)）が、Fynを結び付けない。PSD95はSH3結合部位を持たない。しかしながら別の幾つかのPDZタンパク質は、これには限定されないがNeDLG、RGS12、MPP2を含むSH3結合ドメインを持ち、この機能を満たすことができる。上記で列挙されたこれらのアダプターPDZは、そのPDZドメインを介してDNAM-1と結合し、同時にPDZドメインの丁度Ｎ末端のそのプロリンを多く含む配列を介してFynのSH3ドメインと結合する。Y139は、FynとDNAM-1の対合およびアダプターPDZの制御のためのリン酸化部位の候補である。
この分析に基づいて、本発明の試薬を用いたPDZ とDNAM-1の対合の阻害は、Fyn とDNAM-1の対合と、それに続くY322のリン酸化および細胞障害Ｔ細胞の活性化を阻害する。治療することが可能な疾患には、クローン病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、若年性糖尿病、橋本病があるがこれらには限定されない。
【０１１２】
M.  CD83 (HB15)
CD83は、主に活性化した樹枝状細胞（DCs）、すなわち皮膚中のランゲルハンス細胞上で発現し、また活性化した末梢リンパ球上で若干の弱い発現が検出されるトランスメンブレンの糖タンパク質であり、リンパ様器官のＴ細胞内の細網細胞を互いに入り込ませる（ZhouおよびTedderの論文J. Immunol. 154:3821~3835 (1995)、Zhou等の論文J. Immunol. 149:735-742 (1992)）。CD83は、未成熟のDCsを活性化させると新たに上向き調節され、主要な識別用標識であって活性化された成熟したDCsに特徴的である（Czemiecki等の論文J. Immunol. 159:3823~3837 (1997)）。DCsは、抗原提示細胞（APCs）として機能する。したがってCD83のアップレギュレーションおよび発現は、DCsが成熟しAPCsとして機能するために必要であるらしい。
上記に記載した実験によって示されるようにCD83は、DLG1、PSD95、およびNeDLGのPDZドメインと結合する。CD83とPDZドメインの間、 ならびにCD83とDLG1、PSD95、およびNeDLGの間のこれら相互作用は、CD83の適正な分布および再循環にとって重要であると考えられる。アゴニストおよびアンタゴニストによるCD83およびPDZタンパク質の中断は、これには限定されないが乾癬、癌、アレルギー、多発性硬化症、全身性慢性エリテマトーデスなどの自己免疫性疾患の治療に用いることができる。
N.  CD44（食細胞糖タンパク質１、リンパ球ホーミング受容体、p85、およびHCAM）
CD44は、代替のスプライシングによる幾つかの異なるイソ型タンパク質を有する一回貫通トランスメンブレンタンパク質である。それは、上皮細胞、内皮細胞、間充繊細胞、および神経細胞を含む造血細胞型および非造血細胞型の両者の上に検出される発現の広範なパターンを有する。CD44Hは、リンパ様細胞、骨髄細胞、および赤芽球細胞中で発現する主要なイソ型タンパク質である（Barclay等の著書The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd ed. Academic Press (1997) 中に総覧されている）。CD44は、細胞外間質（ＥＣＭ）の構成要素であるヒアルロン酸塩（ＨＡ）の受容体である。免疫系においてCD44は、ＥＣＭ中でＨＡを結び付ける白血球および赤血球表面の接着分子として機能し、それはまたＨＡが炎症反応または組織の損傷の間に可溶性になったとき信号を伝える受容体として働く可能性がある。CD44の細胞質領域は、スペクトリンおよびＥＲＭ（エズリン、ラジキシン、およびメオシン）ファミリーのメンバーとの相互作用を介してアクチン細胞骨格を結び付け、またはそれと対合することをが示された（Lesley等の著書 (1993)、Bajorathの記述Proteins 39:103-111 (2000)で総覧されている）。加えてCD44は、非受容体チロシンキナーゼp56Lckと対合する（Taher等の論文J. Biol. Chem. 271:2863-2867 (1996)）。CD44は、Ｔ細胞を活性化させるようにCD3／TCRを連動させる共刺激性分子である（Aruffoの記述J. Clin. Invest. 98:2191-2192 (1996) で総覧されている）。
【０１１３】
本明細書で報告された実験による上記記述のように、CD44のＣ末端は、MPP1、prIL-16、およびMINT1中に含有されたPDZドメインのリガンドである。CD44とPDZドメインの相互作用、またCD44とMPP1、prIL-16、およびMINT1との間の相互作用は、リンパ球構造の維持およびリンパ球の信号伝達において機能すると考えられる。したがってCD44−PDZの相互作用が中断されると、CD44は適正な細胞内信号の変換、およびその表面のCD44の適正な分布の維持に失敗することになり、それは炎症および組織の損傷中のリンパ球と内皮の接着を妨げることになる。したがって、この相互作用のアゴニスト／アンタゴニストの投与は、これには限定されないが組織の虚血および細胞の溶解（例えば横紋筋溶解）、血管不全症（例えば凍傷）、乾癬、湿疹、移植片対宿主病、環状肉芽腫、強皮症の間、炎症応答の低下をもたらす。
O.  CD97 (CD55)
上記で論じたようにCD97は、DLG1 および41.8のPDZドメインを結び付ける。CD97は、顆粒細胞および単核細胞上に発現し、また休止Ｔ細胞およびＢ細胞上に低レベルで発現する79.7kDの７スパントランスメンブレンタンパク質である。ＴまたはＢ細胞が活性化すると、Ｔ細胞およびＢ細胞中のCD97の発現レベルは急激に増加する（Eichler等の論文Scand. J. Immunol. 39:111-115 (1994)、Pickl等の論文Leukocyte Typing V:1151~1153 (1995)）。COS細胞上で発現すると、CD97はリンパ球に、また赤血球に接着性を与える。
本発明によればCD97とDLG1 および41.8kDタンパク質との相互作用を、CD97の適正な膜分布および／またはCD97の再循環を妨げるように変えることができる。このような変調は、治療上利益をもたらす細胞のCD97依存性の密着に影響する。CD97−PDZタンパク質相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストは、これらには限定されないが慢性関節リウマチ、骨関節症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬の治療に用いることができる。
P.  糖タンパク質Ｃ（GC）
上記に示したように糖タンパク質Ｃ（GC）のＣ末端は、ヒトのDLG、PSD95、NeDLG、MMP2、AF6、41.8、およびMINT1のPDZドメインと（先に記載のMint-1と）相互作用する。糖タンパク質Ｃは、赤芽球細胞、胸腺、胃、胸、成人および胎児の肝臓、単核細胞、ならびにＴおよびＢ細胞中に発現する膜内在性タンパク質であり（Le Van Kim等の論文J. Biol. Chem. 264:20407-20414 (1989)）、ヒトの赤血球中のその役割についてはよく知られている。それは、MPP1およびタンパク質4.1と相互作用して赤血球の形状、完全性、および機械的安定性を調節する（Marfatia等の論文J. Biol. Chem. 272:24191-24197 (1997)、Reid等の論文Blood 69:1068-1072 (1987)）。
【０１１４】
糖タンパク質ＣとPDZタンパク質DLG、PSD95、NeDLG、MMP2、AF6、41.8、およびMINT1との間の相互作用は、それらが発現する細胞の物理的完全性の維持にとって必要であると考えられる。GC−PDZ相互作用の変調はこれらの機能により変わるはずであり、これには限定されないが真性赤血球増加症、球状赤血球症の治療に利用することができる。
Q.  CDw128A（IL8RA）
上記に記載したようにCDW128Aは、DLG1およびNeDLGのPDZドメインと結合する。IL8受容体には二つの形態、すなわちIL8RA(CDw128A)およびIL8RB(CDw128B) があり、その両者はＧタンパク質結合型受容体の超ファミリーのメンバーでしかもロドプシンファミリーのケモカイン受容体ブランチである。CDw128AおよびCDw128Bの両者は、同一の親和性を有する（ただしCDw128Bのみは除く）IL8を結び付ける。CDw128Bは３つの他のIL8関連のCXCケモカイン、すなわち黒色腫増殖刺激活性（GRO／MGSA）、好中球活性化ペプチド２（NAP-2）およびENA-78を結び付ける。例えば、Ahuja, SKおよびMuphy, PMの論文J. Biol. Chem. 271:20545-50 (1996) を参照されたい。
CDw128Aは、あらゆる顆粒細胞、Ｔ細胞の構成部分、単核細胞、内皮細胞、角化細胞、赤血球、および黒色腫細胞上で発現する。IL8は、好中球、好塩基球、およびＴリンパ球の化学走性を誘発し、好中球および単核細胞の内皮細胞との接着を向上させる。IL-8とIL8RAの結合は、細胞内のカルシウム濃度、ホスホリパーゼＤの活性化、好中球の呼吸性バースト、および化学走性の一過性の増加を誘発する。この早期炎症応答は、正常な免疫応答において実効的である。CDw128Aのインヒビターは、乾癬、慢性関節リウマチ、多発関節炎の治療にとって、また黒色腫および乳癌などの脈管形成依存性疾患の制御にとって有用である。
R.  CD3-η
CD3-ηは、CD3-ζのスプライス変異型で、かつCD 3／TCR複合体の成分であり、それは抗原の認識、信号の変換、およびＴ細胞の活性化にとって必要である（WeissおよびLittmanの論文Cell 76:263-274 (1994)）。Barclay等の著書The Leucocyte antigen facts books, 2nd ed. Academic Press (1997) を参照されたい。本明細書に報告された実験によって示されるように、CD3-ηのＣ末端領域は、MINT1、41.8タンパク質、DLG1、およびPSZ95のPDZドメインのリガンドである。CD3-ηとPDZドメインの相互作用、ならびにCD3-ηとMINT1、41.8タンパク質、DLG1、およびPSZ95の相互作用は、あらゆる細胞の免疫応答に必要なＴ細胞の活性化にとって重要であると考えられる。アゴニストおよびアンタゴニストによるこの相互作用の変調は、これに限定されないが急性および慢性の同種移植片拒絶反応、多発関節炎、移植片対宿主病、慢性関節リウマチの治療に用いることができる。
【０１１５】
S.  LPAP（CD45-AP、LSM-1）
LPAPは、休止および活性化したＴおよびＢ細胞上に発現するトランスメンブレンタンパク質である。LPAPはCD45、すなわちＴ細胞受容体の複合体の一部であるタンパク質と結合することが示されており、CD4、CD2、およびThy-1と同じ場所に局在化することが分かっている。LPAPはまた、p56（lck）およびZAP-70と一緒に免疫沈降する。LPAPの実際の機能は知られていないが、この事実はそれがCD45複合体の構築分子であることを示唆している。
上記に示したようにLPAPは、DLG-1およびMINT-1と結合する。特にDLG-1およびMINT-1はＴ細胞中でともに発現する。またDLG-1はＴ細胞中でp56（lck）と一緒に免疫沈降することが示されている。本明細書に記載の検定はまた、DLG-1がCD95およびKV1.3と結合し、MINT-1がKV1.3と結合することを実証した。これらの分子はすべてTCRによる信号伝達と関わっている。LPAPは、Ｔ細胞が活性化しているときCD45による、多分CD45用の基質としてp56（lck）を補充することによる信号伝達の組織化において機能すると考えられる。CD45の機能を妨げるとＴ細胞の応答を激しく損なうことが示された。LPAPとPDZタンパク質の間の相互作用を阻害することにより、残りの免疫応答由来のCD45が仲介する経路を変えることが期待される。PL−PDZ結合のアゴニストおよびアンタゴニストは、これに限定されないが慢性関節リウマチ、移植拒絶反応、多発関節炎、強皮症、移植片対宿主病の治療に用いることができる。
T.  CD46（補体膜共同因子タンパク質（MCP））
CD46は、赤血球上ではなく、あらゆる核をもつ細胞上で発現される膜タンパク質である。CD46は、補体活性化タンパク質ファミリーのレギュレーターのメンバーである。その主要な機能は、膜に付着したC3b／C4bの補体を不活性化することによる補体の攻撃から細胞を保護することである（Liszewski等の論文Adv. Immunol. 61:201-283 (1999)）。CD46は、45から70kDの範囲の、ディファレンシャルスプライシングにより生じた８種類を超すイソ型タンパク質中に存在する。また上記の機能に加えてCD46は麻疹ウィルスに対する、またその他の病原性微生物（例えばStreptococcus pyogenes）に対する受容体として働く（Manchester等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2161 (1994)、Okada等の論文Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2489~2493 (1995)）。CD46はまた、ある種の腫瘍に過剰に発現するらしく（Jurianz等の論文Mol.Immunol. 36:929-939 (1999)）、こうして腫瘍細胞を補体の作用に対して鈍感にする。Barcley等の著The Leucocyte antigen facts book, 2nd ed.,Academic Press (1997) を参照されたい。
上記に示したようにCD46は、DLG1、PSD95、およびNe-DLGを結合する。この相互作用は、CD46の適正な膜分布および／またはCD46の再循環にとって必要であると考えられる。CD46−PDZ相互作用の変化は、麻疹ウィルスおよびその他の病原体の細胞侵入能を低下させる可能性があり、CD46発現性腫瘍の補体による攻撃を受けやすくする。CD46−PDZ相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストの投与は、これに限定されないが癌およびウィルス感染性疾患の治療に役立つ。
【０１１６】
（Ｕ）  ＣＤｗ１２８Ｂ
上述するように、ＣＤｗ１２８Ｂは、上述のアッセイにおいてＤＬＧＩ、ＮｅＤＬＧ、ＰＳＤ９５、及び４１．８のＰＤＺドメインに結合する。ＩＬ−８受容体には２つの型、ＩＬ−８ＲＡ（ＣＤｗ１２８Ａ）とＩＬ−８ＲＢ（ＣＤｗ１２８Ｂ）があり、双方共、Ｇタンパク質結合受容体スーパーファミリー及びロドプシン・ファミリーのケモカイン受容体分枝群の一員である。ＣＤｗ１２８Ａ及びＣＤｗ１２８Ｂは共に同等の親和性でＩＬ−８に結合するが、ＣＤｗ１２８Ｂのみが他の３つのＩＬ−８関連ＣＸＣケモカインである、メラノーマ増殖刺激活性（ＧＲＯ／ＭＧＳＡ）、好中球活性化ペプチド（ＮＡＰ−２）及びＥＮＡ−７８にも結合する。例えば、Ａｈｕｊａ，ＳＫ及びＭｕｒｐｈｙ，ＰＭ（１９９６年）のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２７１：２０５４５〜５０を参照のこと。
ＣＤｗ１２８Ｂは、顆粒球のすべて、Ｔ細胞のあるサブセット、単球、内皮細胞、角化細胞、赤血球、及びメラノーマ細胞に発現している。ＩＬ−８は好中球、好塩基球、及びＴリンパ球の走化性を誘導するが、ＩＬ−８ＲＡに対しては相対的に低く、好中球及び単球の内皮細胞への接着を高める。ＩＬ−８Ａのその受容体への結合は、細胞内カルシウムレベルの一過性の上昇及び顆粒の放出を誘導するが、ホスホリパーゼＤの活性化又は好中球における呼吸バーストは誘導しない。この炎症誘発性反応は、通常の免疫反応において効果的である。ＣＤｗ１２８Ｂの阻害は、乾癬、慢性関節リウマチ、多発性関節炎の治療に、及びメラノーマや乳癌のような血管形成依存性疾患の制御に有用である。
（Ｖ）ＤＯＣＫ２
ＤＯＣＫファミリーは、細胞骨格と相互作用して形態変化に影響を及ぼす形態形成膜貫通タンパク質の一群である。この新しいファミリーの一員には、ショウジョウバエ筋芽細胞シティ（ｍｂｃ）、ＤＯＣＫ１８０、ＤＯＣＫ２、ＤＯＣＫ３、ＤＥＤ５、ＫＩＡＡ０２０９、及びＣＬＡＳＰが挙げられる。原型的分子である、ＤＯＣＫ１又はＤＯＣＫ１８０は、Ｃ．エレガンス（線虫）の遺伝子、ＣＥＤ５のヒト相同体であり、ＣＥＤ５はアポトーシス細胞のマクロファージによる飲込み及び貪食に関与している。ＤＯＣＫ２は末梢血リンパ球で見い出され、形質移入によって平坦な細胞を丸い細胞に変換することができる（Nagase, et al., DNA Res 3:321-329、1996; Nishihara, H. Hokkaido Igaku Zasshi 74:157）。
上で示されるように、ＤＯＣＫ２はＰＬであり、ＰＤＺタンパク質に結合する。アダプタとしてＰＤＺタンパク質を用いて、ＤＯＣＫ２はＡ、Ｂ、Ｃと複合体を形成し、血管循環へのリンパ球の転送に備えて細胞の形状を制御する。急性白血病、急性転化、心筋梗塞後の炎症、傷害後の炎症を治療するのに、ＰＤＺタンパク質相互作用の作動薬及び拮抗剤によるＤＯＣＫ２の調節を用いることができるが、これに限定されない。
Ｗ．  ＣＤ３４
上で示されるように、ＣＤ３４はＤＬＧ１、ＰＳＤ９５及びＮｅＤＬＧに結合する。ＣＤ３４は、造血系幹細胞を含む骨髄細胞の小さな亜集団に発現されている。ＣＤ３４はまた、骨髄間質細胞及び内皮細胞上にも発現されている。セレクチンである、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）及びＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）はＣＤ３４に結合する。ＣＤ３４は白血球の接着及びローリングに介在する。ＣＤ３４の造血系幹細胞における特性には幹細胞の骨髄分化が挙げられる。作動薬及び／又は拮抗剤によるＣＤ３４−ＰＤＺ相互作用の調節を、骨髄異形成症、白血病、傷害後の炎症、心筋梗塞後の炎症を治療するのに用いることができるが、これに限定されない。
Ｘ．  Ｆｃイプシロン受容体ベータＩ（ＦｃεＲβＩ）
ヒトのＩｇＥに対する高親和性受容体である、ＦｃεＲＩはα、β及びジスルフィド結合したγヘテロダイマーで構成される。α鎖は、ＩｇＥのＦｃ部に結合するが、β鎖は、γ鎖ヘテロダイマーを介して伝達されるシグナルを増幅するように作用する。αβγ２四量体及びαγ２三量体の両方が存在するが、β鎖は、Ｓｙｋの活性化及びカルシウム動員で測定すると５〜７倍、シグナルを増幅する。さらに、ＦｃεＲβＩは、ＰＤＺのリガンドであり、ＣＤ２０／ＦｃεＲβＩ受容体ファミリーの一員である。上で示されるようにＦｃεＲβＩは、ＭＩＮＴ１に結合する。
【０１１７】
ＩｇＥの高親和性受容体として、好塩基球及び肥満細胞上のＦｃεＲβＩはアレルギー反応の開始において中心的な役割を担っている。ＩｇＥに結合した多価アレルゲンの架橋によってＦｃεＲβＩを介したシグナル伝達が始まる。  結果は、  小胞の脱顆粒、ヒスタミンロイコトリエン及び炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−６及びＴＮＦα）即時型過敏症の症状に関与する因子の放出である。喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、薬物反応、肥満細胞症、蕁麻疹、好酸球増加・筋痛症候群を治療するために、作動薬及び拮抗剤によるＰＬ／ＰＤＺ相互作用を標的としたシグナル伝達の改変を用いることができるが、これに限定されない（Turner, H., Nature 402:Supp:B24, 1999）。
Ｙ．  Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）
ＣＤ９５（Ｆａｓ／Ａｐｏ−１）及びＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）は、リンパ球の恒常性と末梢寛容に決定的に関与する受容体−リガンド対である。リガンドによるＦａｓへの結合は、アポトーシス細胞死を招き、それは急性炎症反応を解消する間、不要な細胞を安全に片付ける重要で主要なメカニズムである。ＦａｓＬは主として活性化Ｔ細胞に拘束されており、迅速に誘導される。ＦａｓＬは、正常な胸部内皮細胞及び良性胸部疾患に比べて乳癌で亢進していることが多い。上で示されるように、ＦａｓＬは、ＫＩＡＡ０５６１ＰＤＺドメインに結合する。ＰＤＺ−ＰＬ調節因子は、腫瘍、例えば、従来の化学療法に不応性の腫瘍の治療に有用であるが、これに限定されない。
Ｚ．  ＣＤＷ１２５（ＩＬ−５Ｒ）
上で示されるように、ＣＤＷ１２５はＰＴＮ−４及びＲＧＳ１２と結合する。ＣＤＷ１２５は、好酸球及び好塩基球上に発現されているＩＬ−５受容体である。ＩＬ−５は、好酸球前駆細胞の増殖と分化を促進し、成熟好酸球を活性化する（Takatsu et al., Adv. Immunol., 57:145-190）。ＣＤｗ１２５の分泌型は、拮抗的な特性を有し、ＩＬ−５が誘導する好酸球の増殖及び分化を阻害することができる。喘息、アトピー性皮膚炎、湿疹、薬物反応、蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球増加症を治療するために、ＰＤＺドメインに結合するＣＤＷ１２５の調節を用いることができるが、これに限定されない。
ＡＡ．  バーキットリンパ腫受容体−１（ＢＬＲ−１；ＣＸＣＲ５）
ＢＬＲ−１は、最初にＢ細胞で検出され、刺激されたＴ細胞で上方制御されることが示された膜貫通受容体である（Dobner et al., Eur. J. Immunol., 22:2795-2799, 1992; Flynn et al., J. Exp. Med., 188:297-304, 1998）。  ＢＬＲ−１は、抗原に対する適正な発生と選択のための、二次リンパ器官の濾胞（例えば、脾臓）へのＢ及びＴ細胞の走化性において機能する（Forster et al., Cell 87:1037-1047, 1996）。そのリガンドは、Ｂリンパ球の化学誘引物質（ＢＬＣ）であり、パイエル板、脾臓及びリンパ節の濾胞に強く発現されている（Gunn et al., Nature 391:799-803, 1998）。その走化性の役割に一致して、成熟した、活性化されたＢ細胞（形質細胞）ではＢＬＲ−１の発現は下方制御され、それらが濾胞に留まるのを妨げ（Forster et al., Cell Mol. Biol., 40:381-387, 1994）、Ｂｌｒ−／−Ｂ細胞はＢ細胞濾胞に移動できないことが示されている（Forster et al., 1996）。
本明細書で報告される実験で示されるように、ＢＬＲ−１のＣ末端は、タンパク質ＭＩＮＴ１を含有するＰＤＺドメインに結合する。特定のメカニズムに束縛されることを意図せずに、ＢＬＲ−１とＭＩＮＴ１及びＢＬＲ−１とＰＤＺドメインの間の相互作用は、細胞表面上におけるＢＬＲ−１の適正な分布及びシグナル伝達に必要である。この相互作用が破綻すると、ＢＬＲ−１を発現するリンパ系細胞の走化性能も同様に破綻する。そのような破綻の結果、免疫応答が低下し、適正に循環し、抗原への応答を進展させるリンパ球の能力の妨害を生じる。全身性エリテマトーシス、強皮症及びその他の自己免疫疾患を治療するために、この相互作用の作動薬及び拮抗剤を用いることができるが、それに限定されない。
【０１１８】
ＢＢ．  ＣＤ４
ＣＤ４は、抗原認識に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を伴った共受容体である。ＣＤ４及びＴＣＲは双方共、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。エフェクター細胞及び標的細胞に対するＴ細胞の親和力を高めることによってＴ細胞の活性化は増強される。細胞質ドメインは、シグナル伝達及びチロシンキナーゼｐ５６lckとの会合に関与する。ＣＤ４は、ほとんどの胸腺細胞、２／３の末梢血Ｔリンパ球、単球及びマクロファージに発現されている。
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、そのエンベロープの糖タンパク質が介在する膜融合によって感染し、ＣＤ４とケモカイン共受容体、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４との相互作用によって誘発される。ＨＩＶ暴露直後のＨＩＶ感染、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、強皮症、全身性エリテマトーシス、乾癬を治療するために、作動薬及び拮抗剤によるＣＤ４−ＰＤＺ相互作用の調節を用いることができるが、これに限定されない。
【０１１９】
６．５  ＰＤＺ−ＰＬ相互作用の作動薬及び拮抗剤
本明細書で記載するように、阻害剤又は拮抗剤の投与によって、細胞（例えば、造血系細胞、例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）においてＰＺＤタンパク質とＰＬタンパク質との相互作用を破壊してもよい。本明細書に記載されるスクリーニングアッセイを用いて阻害剤を同定することができる。実施態様において、本明細書に記載されるモチーフを用いて阻害剤を設計する。実施態様の中には、発明の拮抗剤が表２に一覧されるＰＬドメインタンパク質のＣ末端残基を基にした構造（例えば、ペプチド配列）を有するものもある。実施例の中には、発明の拮抗剤が本明細書で開示されたＰＬモチーフを基にした構造（例えば、ペプチド配列）を有するものもある。
ＰＤＺ／ＰＬ拮抗剤及び本発明の拮抗剤は、ポリマー（例えば、オリゴペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチド）、小型分子、抗体、糖、脂肪酸、ヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体、天然に生じる構造の類縁体（例えば、ペプチド模倣体、核酸類縁体など）、及び多数のその他の化合物を含めて、天然に生じる及び合成の、有機及び無機の多数の化合物のいずれであってもよい。便宜上、本議論は主としてＰＤＺ−ＰＬ相互作用の拮抗剤を引用するが、ＰＤＺ−ＰＬ相互作用の作動薬も本明細書で開示される方法において使用できることは認識されるだろう。
１つの態様では、本発明のペプチド及びペプチド模倣体は、Ｔ細胞及びＢ細胞のような造血系細胞におけるＰＤＺドメインに結合するアミノ酸配列、又は、さもなければ、ＰＬタンパク質とＰＤＺタンパク質の会合を阻害するアミノ酸配列を含有する。１つの実施態様では、拮抗剤は、表２に一覧されたＰＬタンパク質のカルボキシ末端配列、例えば、表４に一覧されたペプチドに相当する配列を有するペプチドを含む。典型的には、該ペプチドはＰＬタンパク質の少なくともＣ末端４残基を含み、阻害性ペプチドは、ＰＬタンパク質Ｃ末端からの４を超える残基（例えば、少なくとも、５、６、７、８、９、１０、１２又は１５残基）を含むことが多い。例えば、下の６．５．１の項を参照のこと。その上、造血系細胞及び内皮細胞によって発現される特異的表面受容体のＣ末端ドメインをそれ自体、阻害剤として用いてもよく、非ペプチド阻害剤の合理的な設計の基礎として用いてもよい。下の６．６の項を参照のこと。
実施態様の中には、拮抗剤がそのような配列を含む融合タンパク質であるものもある。膜貫通トランスポータのアミノ酸配列を含有する融合タンパク質は特に有用である。例えば、下の６．５．２の項を参照のこと。
実施態様の中には、阻害剤が阻害活性を有するＰＬのＣ末端タンパク質配列の変換変異体であるものもある。下の６．５．３の項を参照のこと。
実施態様の中には、拮抗剤がＰＬのＣ末端配列のペプチド模倣体であるものもある。下の６．５．４の項を参照のこと。
実施態様の中には、阻害剤が小型分子（すなわち、１ｋＤ未満の分子量を有する）であるものもある。下の６．５．５の項を参照のこと。
【０１２０】
６．５．１  ペプチド拮抗剤
１つの実施態様では、拮抗剤は、表２に一覧されたＰＬタンパク質のカルボキシ末端の配列を有するペプチドである。ペプチドは少なくともＰＬタンパク質のＣ末端の２つの残基を含み、典型的には、阻害性ペプチドは、ＰＬタンパク質Ｃ末端からの２より多い残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２又は１５残基）を含む。ＰＬタンパク質とともに阻害性ペプチドを分かち合う残基はペプチドのＣ末端で見い出されることが最も多い。しかしながら、実施態様の中には、配列が内部にあるものもある。同様に、阻害性ペプチドが、ＰＬタンパク質のＣ末端ではないが、近傍であるＰＬ配列からの残基を含むこともある（Gee et al., J. Biological Chem., 273:1980-87, 1998を参照のこと）。
例えば、造血系細胞の表面受容体の『コアのＰＤＺモチーフ配列』はそのＣ末端において最後の４つのアミノ酸を含有し、造血系細胞においてＰＤＺを標的とするのにこの配列を用いてもよい。ＰＤＺモチーフ配列の４アミノ酸コアは、その結合親和性及び／又は安定性をさらに高めるために、そのアミノ末端に追加のアミノ酸を含有してもよい。１つの実施態様では、ＰＤＺモチーフ配列のペプチドは４アミノ酸〜１５アミノ酸であってもよい。配列の長さは６〜１０アミノ酸であることが好ましい。さらに好ましくは、ＰＤＺモチーフ配列は８アミノ酸を含有する。コア配列のアミノ末端における追加のアミノ酸は、各造血系細胞表面の受容体の天然の配列に由来しても、合成リンカーに由来してもよい。保存的に追加のアミノ酸を置換してもよい。Ｃ末端から３番目の残基がＳ、Ｔ、又はＹである場合、ペプチドを使用する前にこの残基がリン酸化されてもよい。
実施態様の中には、ペプチド阻害剤及び非ペプチド阻害剤が小さいもの、例えば、ペプチドであれば、１０アミノ酸残基の長さより小さいものもある。さらに、限られた数のリガンドアミノ酸がＰＤＺドメインと直接接触し（一般に８未満）（Kozlov et al., Biochemistry 39:2572, 2000; Doyle et al., Cell 85:1067, 1996）、Ｃ末端の３アミノ酸ほど短いペプチドがさらに長い（＞１５）アミノ酸ペプチドと同様の結合特性を保持することが多い（Yanagisawa et al., J. Biol. Chem., 272:8539, 1997）ということが報告されている。
図３Ａ〜Ｈは、上で記載されたＧアッセイを用いてＰＬ−ＰＤＺ相互作用を阻害するためのペプチドの使用を示す。図３Ａ及びＢでは、ＤＬＧ１又はＰＳＤ９５（上の表３を参照のこと）からのＰＬドメインを含有するＧＳＴ融合タンパク質を用いて阻害アッセイが行われた。種々の競合ペプチド（濃度１００μＭにて）の存在下又は非存在下（１００％の結合と同等）にて、Ｃｌａｓｐ２、ＣＤ４６、Ｆａｓ、又はＫＶ１．３（表４に一覧されるように）に関するビオチン化ＰＬペプチドの結合を測定した。競合ペプチドは、Ｃｌａｓｐ２のＣ末端（ＭＴＳＳＳＳＶＶ）、ＣＤ４６のＣ末端（ＲＥＶＫＦＴＳＬ）又はＦａｓのＣ末端（ＲＮＥＩＱＳＬＶ）を有する８アミノ酸ペプチド、ＫＶ１．３のＣ末端配列を有する非標識１９アミノ酸ペプチド（すなわち、表３に一覧されるような非ビオチン化ＡＡ３３Ｌ）、又はヘモグロビンの６４〜７６残基の配列を有するペプチド（Vidal et al., J. Immunol., 163:4811, 1999）、すなわち、無関係な競合物であった。ビオチン化ペプチド（ＦａｓとＫＶ１．３については１０μＭ、Ｃｌａｓｐ２とＣＤ４６については２０μＭ）のＧＳＴのみに対する結合を融合タンパク質に対する結合から差し引いて、各実験条件に対する正味のシグナルを得た。この正味のシグナルを競合ペプチド非存在下のシグナルで割ることにより標準化し、データをプロットした。エラーバーは２回の測定の標準偏差を示した。Ｃｌａｓｐ２  ＰＬ−ＤＬＧ  ＰＤＺ結合の特異的阻害は、ＣＬＡＳＰ２の８アミノ酸、ＣＤ４６の８アミノ酸、Ｆａｓの８アミノ酸及びＫＶ１．３ペプチドと共に認められたが、ペプチド非存在下又は無関係なペプチドを用いては認められなかった。
【０１２１】
図３Ｃ〜Ｆは、阻害するのにさらに短いペプチド（例えば、３アミノ酸及び５アミノ酸）を用いた同様のアッセイを示す。図３Ｃは、Ｃｌａｓｐ２のＣ末端の配列(表３）を有する１ｍＭの３アミノ酸ペプチドの非存在下又は存在下における、Ｃｌａｓｐ２、ＣＤ４６、Ｆａｓ、又はＫＶ１．３に関するビオチン化ＰＬペプチドの、ＮｅＤＬＧ、ＤＬＧ１又はＰＳＤ９５に由来するＰＤＺドメインを含有するＧＳＴ融合タンパク質への結合を、指示した濃度（表３に一覧するように）にて示す。図３Ｆは、４１．８Ｋｄに由来するＰＤＺドメインを含有するＧＳＴ融合タンパク質への５アミノ酸ＣＤ４９Ｅペプチドの結合に対する影響を示す。
６．５．２  ペプチド変異体
ＰＤＺ結合ペプチド及びＰＤＺ−ＰＬ相互作用の阻害性配列を同定して、このような配列の変異体を作成し、ＰＤＺドメインの結合又はＰＤＺ−ＰＬ阻害活性について得られた変異体を調べることができる。実施態様では、変異体は母型ペプチドと同一の又は異なった、ＰＤＺドメインへの結合能を有する。典型的には、かかるアミノ酸置換は保存的であり、すなわち、アミノ酸残基は、それらが置き換わる残基に似た物理的及び／又は化学的特性を有する他のアミノ酸残基で置き換えられる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸が同一の指定クラス内に包含されるもう１つのアミノ酸に置き換えられるようなものである。
６．５．３  ペプチド模倣体
ＰＤＺ結合ペプチド及びＰＤＺ−ＰＬ相互作用の阻害性配列を同定して、日常の方法を用いてペプチド模倣体を調製することができ、本発明のアッセイを用いて模倣体の阻害活性を確認することができる。従って、実施態様の中には、拮抗剤がＰＬのＣ末端のペプチド模倣体であることもある。高度な熟練者は、科学文献及び特許文献、例えば、有機合成総合編（Organic Syntheses Collective Volumes）（Gilman et al., eds., John Wiley & Sons Inc., NY）に十分に記載されている多様な手順及び方法を用いて個々の合成残基及びポリペプチドを組み入れる模倣体を合成することができることを認識するだろう。例えば、米国特許第５，４２２，４２６号（Di Marchi et al.）に記載されるような固相合成法を用いてポリペプチドを組み入れる模倣体を作成することができる。コンビナトリアル法を用いても本発明の模倣体を合成することができる。ペプチド及びペプチド模倣体のライブラリを作成するための種々の方法が周知であり、それには、例えば、複数ピン、ティーバッグ、及びスプリット結合ミックス法が挙げられる；例えば、al-Obeidi(1998) Mol. Biotechnil. 9:205-223; Hruby(1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaad (1997) Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol., 267:220-234を参照のこと。
【０１２２】
６．５．４  小型分子
実施態様の中には、阻害剤が小型分子（すなわち、１ｋＤ未満の分子量を有する）であることもある。小型分子をスクリーニングする方法は公知であり、上の６．４の項に記載されたようなものを含む。
６．６  細胞の表面受容体及びＰＤＺドメインの結合配列
以下の項は、造血系及び免疫応答系における様々な型の細胞によって発現されている特異的な表面受容体を説明する。このような受容体のＣ末端は阻害剤として使用され、又は、ＰＤＺ−ＰＬ相互作用を阻害するのに使用するためにＰＤＺモチーフ配列ペプチド、変異体、融合タンパク質、ペプチド模倣体及び小型分子を設計するための基礎として役に立つ。好ましい実施態様では、本発明のアッセイで阻害活性又は調節活性についてペプチドを調べる（表４及び上の議論を参照のこと）。
【０１２３】
６．６．１  Ｔ細胞表面受容体のＰＤＺモチーフ配列
Ｔ細胞によって発現される多数の表面受容体がＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）を含有する。このような分子には、ＣＤ３η、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ３８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ８３、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１６６、ＣＤｗ１２８（ＩＬ−８Ｒ）、ＤＮＡＭ−１、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及びＬＰＡＰ（Barclay et al., 1997, The Leucocyte Antigen Facts Book, second eddition, Academic Press）、ＣＬＳＳＰ−１、ＣＬＡＳＰ−２、ＣＬＡＳＰ−４、ＫＶ１．３及びＤＯＣＫ２が挙げられる。
ＣＤ３のＣ末端コア配列はＳＳＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＳＳＳＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＳＳＳＳＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＰＳＳＳＳＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及びＰＰＳＳＳＳＱＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）も用いてもよい。
ＣＤ４のＣ末端コア配列はＣＳＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＴＣＳＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＫＴＣＳＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＱＫＴＣＳＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びＦＱＫＴＣＳＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）も用いてもよい。
ＣＤ６のＣ末端コア配列は、ＩＳＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＤＩＳＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＤＤＩＳＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＹＤＤＩＳＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）及びＤＹＤＤＩＳＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）も用いてもよい。
ＣＤ３８のＣ末端コア配列はＴＳＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＣＴＳＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ＳＣＴＳＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、ＳＳＣＴＳＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）及びＤＳＳＣＴＳＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）も用いてもよい。
ＣＤ４９ｅのＣ末端コア配列はＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ＰＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、ＰＰＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）及びＫＰＰＡＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）も用いてもよい。
ＣＤ４９ｆのＣ末端コア配列はＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、ＲＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、ＥＲＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）及びＫＥＲＬＴＳＤＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）も用いてもよい。
ＣＤ５３のＣ末端コア配列はＴＩＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＱＴＩＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、ＳＱＴＩＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、ＴＳＱＴＩＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）及びＫＴＳＱＴＩＧＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）も用いてもよい。
【０１２４】
ＣＤ８３のＣ末端コア配列はＴＥＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４８）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４９）、ＨＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５０）、ＰＨＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５１）及びＤＴＰＨＫＴＥＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５２）も用いてもよい。
ＣＤ９０のＣ末端コア配列はＦＭＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＤＦＭＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、ＴＤＦＭＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ＡＴＤＦＭＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）及びＱＡＴＤＦＭＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）も用いてもよい。
ＣＤ９５のＣ末端コア配列はＱＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＩＱＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＥＩＱＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、ＮＥＩＱＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）及びＲＮＥＩＱＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）も用いてもよい。
ＣＤ９７のＣ末端コア配列はＥＳＧＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＳＥＳＧＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）、ＡＳＥＳＧＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＲＡＳＥＳＧＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）及びＬＲＡＳＥＳＧＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）も用いてもよい。
ＣＤ９８のＣ末端コア配列はＰＹＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＦＰＹＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ＲＦＰＹＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）、ＬＲＦＰＹＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）及びＬＬＲＦＰＹＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）も用いてもよい。
【０１２５】
ＣＤｗ１３７のＣ末端コア配列はＧＣＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ＥＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ＥＥＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）及びＥＥＥＧＧＣＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）も用いてもよい。
ＣＤ１６６のＣ末端コア配列はＫＴＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、ＮＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ＮＮＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）及びＥＮＮＨＫＴＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）も用いてもよい。
ＣＤｗ１２８のＣ末端コア配列はＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、ＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）、ＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）及びＳＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）も用いてもよい。
ＤＮＡＭ−１のＣ末端コア配列はＫＴＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）、ＲＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）、ＲＲＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）及びＳＲＲＰＫＴＲＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）も用いてもよい。
ＦａｓＬのＣ末端コア配列はＬＹＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＧＬＹＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）、ＦＧＬＹＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）、ＦＦＧＬＹＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）及びＴＦＦＧＬＹＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）も用いてもよい。
【０１２６】
ＬＰＡＰのＣ末端コア配列はＶＴＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＨＶＴＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）、ＬＨＶＴＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）、ＧＬＨＶＴＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）及びＱＧＬＨＶＴＡＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）も用いてもよい。
ＣＬＡＳＰ−１のＣ末端コア配列はＳＡＱＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９）、ＳＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０）、ＩＳＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２１）及びＳＩＳＳＳＡＱＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２）も用いてもよい。
ＣＬＡＳＰ−２のＣ末端コア配列はＳＳＶＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２４）、ＳＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５）、ＴＳＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６）及びＭＴＳＳＳＳＶＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２７）も用いてもよい。
ＣＬＡＳＰ−４のＣ末端コア配列はＹＡＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９）、ＰＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３０）、ＳＰＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１）及びＧＳＰＲＹＡＥＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２）も用いてもよい。
ＫＶ１．３のＣ末端コア配列はＦＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３９）、ＫＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４０）、ＫＫＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４１）及びＩＫＫＩＦＴＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４２）も用いてもよい。
ＤＯＣＫ２のＣ末端コア配列はＳＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４３）である。天然に生じる残基をコア配列に加える場合、Ｔ細胞においてＰＤＺドメイン含有タンパク質を標的とするには、ＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４４）、ＳＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４５）、ＤＳＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４６）及びＰＤＳＬＳＴＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４７）も用いてもよい。
【０１２７】
６．６．２  Ｂ細胞表面受容体のＰＤＺモチーフ配列
Ｂ細胞によって発現される多数の表面受容体はＰＤＺドメインのモチーフ配列を含有している。このような分子には、ＣＤ３８、ＣＤ５３、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤｗ１２５（ＩＬ−５Ｒ）、ＤＮＡＭ−１、ＬＰＡＰ、シンデカン−２（Barclay et al., 1997, The leucocyte Antigen Facts Book, second edition, Academic Press）、及びＢＬＲ−１が挙げられるが、これに限定されない。ＣＤ３８、ＣＤ５３、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤｗ１３７、ＤＮＡＭ−１、ＤＯＣＫ２、ＬＰＡＰ、ＣＬＡＳＰ−１、ＣＬＡＳＰ−２及びＣＬＡＳＰ−４の特異的モチーフ配列は前の段落に記載した。
ＣＤ１３８のＣ末端コア配列はＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）、ＱＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）、ＫＱＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）及びＴＫＱＥＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）も用いてもよい。
ＣＤｗ１２５のＣ末端コア配列はＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）、ＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）、ＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）及びＥＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）も用いてもよい。
シンデカン−２のＣ末端コア配列はＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５８）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５９）、ＴＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６０）、ＰＴＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６１）及びＡＰＴＫＥＦＹＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６２）も用いてもよい。
ＢＬＲ−１のＣ末端コア配列はＬＴＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５３）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、Ｂ細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５４）、ＴＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５５）、ＡＴＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５６）及びＮＡＴＳＬＴＴＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５７）も用いてもよい。
【０１２８】
６．６．３  ナチュラルキラー細胞の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列
ＮＫ細胞によって発現される多数の表面受容体がＰＤＺドメインのモチーフ配列を含有する。このような分子には、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ９８及びＤＮＡＭ−１が挙げられるが、これに限定されない。ＣＤ３８、ＣＤ９８及びＤＮＡＭ−１の特異的モチーフ配列は前の段落に記載した。
ＣＤ５６のＣ末端コア配列はＥＳＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、ＮＫ細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）、ＥＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）、ＫＥＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）及びＴＫＥＮＥＳＫＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）も用いてもよい。
【０１２９】
６．６．４  単球の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列
単球系列（単球及びマクロファージ）の細胞によって発現される多数の表面受容体が、ＰＤＺドメインのモチーフ配列を含有する。このような分子には、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ６１、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１３７、Ｌｙ−６、ＤＮＡＭ−１及びＦｃεＲＩβが挙げられるが、これに限定されない。ＣＤ３８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５３、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１３７、ＤＮＡＭ−１、ガレクチン３（Ｍａｃ−２）及びマンノース受容体の特異的モチーフ配列は前の段落に記載した。
ＣＤ４４のＣ末端コア配列はＫＩＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＭＫＩＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）、ＤＭＫＧＩＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）、ＶＤＭＫＩＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）及びＮＶＤＭＫＩＧＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）も用いてもよい。
ＣＤ４６のＣ末端コア配列はＦＴＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）、ＶＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）、ＥＶＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）及びＲＥＶＫＦＴＳＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）も用いてもよい。
ＣＤ６１のＣ末端コア配列はＫＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）、ＦＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）、ＲＦＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）及びＧＲＦＬＫＳＬＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）も用いてもよい。
【０１３０】
ＣＤ１４８のＣ末端コア配列はＧＹＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）、ＴＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）、ＫＴＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）及びＧＫＴＮＧＹＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）も用いてもよい。
Ｌｙ−６のＣ末端コア配列はＱＴＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）、ＬＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）、ＶＬＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）及びＳＶＬＬＱＴＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）も用いてもよい。
ＦｃεＲＩβのＣ末端コア配列はＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）、ＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）、ＭＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）及びＥＭＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）も用いてもよい。
ガレクチン３のＣ末端コア配列はＹＴＭＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）、ＡＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）、ＳＡＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）及びＴＳＡＳＹＴＭＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）も用いてもよい。
マンノース受容体のＣ末端コア配列はＨＳＶＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）、ＮＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）、ＱＮＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）及びＥＱＮＥＨＳＶＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）も用いてもよい。
【０１３１】
６．６．５  顆粒球の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列
顆粒球によって発現される多数の表面受容体が、ＰＤＺドメインのモチーフ配列を含有している。このような分子には、ＣＤ５３、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１２５、ＣＤｗ１２８、ＦｃεＲＩβ及びＧ−ＣＳＦＲが挙げられるが、これに限定されない。このような分子のほとんどは前の段落に記載した。
Ｇ−ＣＳＦＲのＣ末端コア配列はＴＳＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、単球においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、ＰＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）、ＦＰＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）及びＬＦＰＩＴＳＶＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）も用いてもよい。
６．６．６  内皮細胞の表面受容体のＰＤＺモチーフ配列
内皮細胞は造血系細胞ではないが、血管の内層を形成するので造血系と密接に関わる。そういうものとして、内皮細胞は、造血系の細胞と接触する。従って、内皮細胞の機能を調節する能力は造血系細胞の間接的な調節を規定する。内皮細胞によって発現される多数の表面受容体がＰＤＺドメインのモチーフ配列を含有する。このような分子にはＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ６２ｅ（Ｅ−セレクチン）及びＶＣＡＭ−１が挙げられるが、これに限定されない。
ＣＤ３４のＣ末端コア配列はＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０）、ＶＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）、ＶＶＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）及びＨＶＶＡＤＴＥＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）も用いてもよい。
ＣＤ６６ｂ及びＣＤ６６ｃのＣ末端コア配列はＶＡＬＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＲＶＡＬＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）、ＡＲＶＡＬＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）、ＬＡＲＶＡＬＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）及びＶＬＡＲＶＡＬＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）も用いてもよい。
ＣＤ１０５のＣ末端コア配列はＳＳＭＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）、ＳＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）、ＣＳＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）及びＰＣＳＴＳＳＭＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）も用いてもよい。
【０１３２】
ＣＤ１０６のＣ末端コア配列はＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４）、ＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）、ＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）及びＶＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）も用いてもよい。
ＣＤ６２ｅのＣ末端コア配列はＳＹＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９）、ＫＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０）、ＱＫＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）及びＹＱＫＰＳＹＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）も用いてもよい。
ＶＣＡＭ−１のＣ末端コア配列はＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、内皮細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３４）、ＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５）、ＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３６）及びＶＥＡＱＫＳＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７）も用いてもよい。
【０１３３】
６．６．７  肥満細胞、好塩基球及び好酸球の細胞表面受容体
ＦｃεＲＩβ、ＣＤｗ１２５、ＣＤｗ１２８及びＩＬ−８ＲＢは、肥満細胞、好塩基球及び好酸球により発現される膜貫通受容体である。このような受容体はこのような細胞の活性において役割を果し、アレルギー反応において脱顆粒及びヒスタミンの放出を招く。ＦｃεＲＩβのＣ末端コア配列は、ＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＭＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）及びＥＭＳＰＰＩＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）も用いてもよい。  さらに、残基ＥをＧで置換してその結合親和性を高めてもよい。
ＣＤｗ１２５のＣ末端コア配列は、ＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びＥＴＬＥＤＳＶＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）も用いてもよい。
ＣＤｗ１２８のＣ末端コア配列は、ＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）及びＳＶＮＶＳＳＮＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）も用いてもよい。
ＩＬ−８ＲＢのＣ末端コア配列は、ＳＴＴＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、肥満細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ＨＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、ＧＨＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）及びＳＧＨＴＳＴＴＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）も用いてもよい。
【０１３４】
６．６．８  その他のＰＤＺモチーフ配列
ＮＭＤＡのＣ末端コア配列は、ＥＳＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６３）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、神経細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６４）、ＳＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６５）、ＰＳＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６６）及びＭＰＳＩＥＳＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６７）も用いてもよい。
ニューレキシンのＣ末端コア配列は、ＥＹＹＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６８）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、神経細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＫＥＹＹＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６９）、ＤＫＥＹＹＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７０）、ＫＤＫＥＹＹＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７１）及びＮＫＤＫＥＹＹＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７２）も用いてもよい。
グリコフォリンＣのＣ末端コア配列は、ＥＹＦＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７３）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、ＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＫＥＹＦＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７４）、ＲＫＥＹＦＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７５）、ＳＲＫＥＹＦＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７６）及びＳＳＲＫＥＹＦＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７７）も用いてもよい。
ＣＤ１４８のＣ末端コア配列は、ＫＴＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７８）である。天然に生じる残基をコア配列に付加する場合、上皮細胞又は骨髄細胞においてＰＤＺを含有するタンパク質を標的とするには、ＧＫＴＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７９）、ＦＧＫＴＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８０）、ＴＦＧＫＴＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８１）及びＴＴＦＧＫＴＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８２）も用いてもよい。
【０１３５】
６．７  ペプチドの調製
６．７．１  化学合成
ペプチド及びペプチド類縁体の調製のための事実上公知のいかなる技法を用いて、本発明のペプチド又はその類縁体を調製してもよい。例えば、従来の液相又は固相ペプチド合成を用いて線状形態で調製し、樹脂から切断して精製してもよい（Creighton, 1983, Protein Structures And Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y.）。本明細書で記載されるペプチドを合成する方法は公知である。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定で確認してもよい（例えば、エドマン分解法及び質量分析計）。
さらに、ペプチドの類縁体及び誘導体を化学的に合成することができる。本発明のペプチドの各アミノ酸間の結合は、アミド、置換されたアミド又はアミドの等配電子体であってもよい。非古典的なアミノ酸又は化学的なアミノ酸類縁体を置換又は付加として配列に導入づることができる。非古典的なアミノ酸には、通常のアミノ酸のＤ型異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、アブ、２−アミノ酪酸、γ−アブ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、及びβ−メチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、及び一般のアミノ酸類縁体が挙げられるが、これに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋体）又はＬ（左旋体）であってもよい。
【０１３６】
６．７．２  組換え合成
ペプチドが全体として遺伝子にコードされたアミノ酸で構成される場合、又はその一部がそのように構成される場合、従来の組換え遺伝子工学技術を用いて、ペプチド又は該当する部分を合成してもよい。組換え製造では、線状形態のペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当な発現媒体、すなわち、挿入したコード配列の転写と翻訳に必要な要素、又はＲＮＡウイルスベクターの場合は複製と翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入する。次いで発現媒体を好適な標的細胞に形質移入し、その細胞はペプチドを発現する。使用する発現システムに依存して、当該技術で確立された手法によって発現されたペプチドを、次いで単離する。組換えタンパク質及びペプチドの製造方法は公知である（例えば、Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual［分子クローニング：実験室マニュアル］, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.; 及びAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology［分子生物学の現代プロトコール］, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照のこと）。
本明細書で記載されたペプチドを発現するために多様な宿主−発現ベクター系を利用してもよい。これらには、適当なコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌；適当なコード配列を含有する酵母又は真菌発現ベクターによって形質転換された酵母又は糸状菌；適当なコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞システム；適当なコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス）を感染させた植物細胞システム、又は組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）によって形質転換された植物細胞システム；又は動物細胞システムが挙げられるが、これに限定されない。
発現システムの発現要素はその強度及び特異性において異なる。利用する宿主／ベクターシステムによって、構成的プロモータ及び誘導可能なプロモータを含めて多数の好適な転写及び翻訳要素のいずれを発現ベクターで使用してもよい。例えば、細菌システムでクローニングする場合は、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ）などのような誘導可能なプロモータを用いてもよく；昆虫細胞システムでクローニングする場合は、バキュロウイルスの多面体プロモータのようなプロモータを用いてもよく；植物細胞システムでクローニングする場合は、植物細胞のゲノムに由来するプロモータ（例えば、熱ショックプロモータ；ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニットのためのプロモータ；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のためのプロモータ）又は植物ウイルスに由来するプロモータ（例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡプロモータ；ＴＭＶの被膜タンパク質プロモータ）を用いてもよく；哺乳類細胞システムでクローニングする場合は、哺乳類ゲノムに由来するプロモータ（例えば、メタロチオネイン・プロモータ）又は哺乳類ウイルスに由来するプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を用いてもよく；発現産物の複数コピーを含有する細胞株を集める場合は、適当な選択可能なマーカーと共に、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−及びＥＢＶ−を基にしたベクターを用いてもよい。
【０１３７】
植物の発現ベクターを用いる場合、本発明のペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモータのいずれに由来してもよい。例えば、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡ及び１９ＳＲＮＡプロモータ（Brisson et al., Nature 310:511-514, 1984）又はＴＭＶの被膜タンパク質プロモータ（Takamatsu et al., EMBO J., 6:307-311, 1987）を用いてもよく；別の方法としては、ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニット（Coruzzi et al., EMBO J., 3:1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224:838-843, 1984）又は熱ショックプロモータ、例えば大豆ｈｓｐ１７．５Ｅ若しくはｈｓｐ１７．３Ｂ（Gurley et al., Mol. Cell Biol., 6:559-565, 1986）のような植物プロモータを用いてもよい。このようなコンストラクトをＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、微量注入法、エレクトロポレーションなどによってplanleucocyteに導入することができる。かかる技法の概説については、Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology［植物の分子生物学のための方法］, Academic Press N.Y. のＶＩＩＩ章、４２１〜４６３ページ；及びGrierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology［植物の分子生物学］  第２版Blackie London Ch 7-9を参照のこと。
本発明のペプチドを製造するために使用してもよい昆虫発現システムの１つでは、外来遺伝子を発現するためのベクターとしてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核ポリヒドローシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）を用いる。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｏｅｒｄａ細胞中で増殖する。ウイルスの非必須領域（例えば、多面体遺伝子）にコード配列をクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えば、多面体プロモータ）の制御のもとに置いてもよい。コード配列の挿入が上手く行くと、多面体遺伝子の不活化が生じ、非閉塞組換えウイルス（すなわち、多面体遺伝子によってコードされるタンパク質様被膜を欠くウイルス）が生産される。次いでこのようなウイルスを用いて、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｉｐｅｒｄａ細胞に感染させ、そこで挿入された遺伝子が発現される（例えば、Smith et al., J. Virol., 46:584; 米国特許第４，２１５，０５１号[スミス］を参照のこと）。さらに、この発現システムの例は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Vol.2, Ausubel et al., Greene Publish Assoc. & Wiley Interscience）の中で見い出されてもよい。
【０１３８】
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスを基にした発現システムが利用される。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモータ及び三部分リーダー配列にコード配列を連結してもよい。次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの組換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１又はＥ３領域）における挿入によって、感染した宿主の中で生存可能で、且つペプチドを発現することが可能な組換えウイルスを生じる（例えば、Logan & Dhenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3655-3659, 1984を参照のこと）。別の方法としては、ワクシニア７．５Ｋプロモータを用いてもよい（例えば、Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415-7419, 1982; Mackett et al., J. Virol., 49:857-864, 1984; Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927-4931を参照のこと）。
本発明の線状ペプチドを製造するためのその他の発現システムは当業者には明らかであろう。
【０１３９】
６．７．３  ペプチド及びペプチド類縁体の精製
例えば、高速液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィなどのような公知の技法によって本発明のペプチド及びペプチド類縁体を精製することができる。特定のペプチド又は類縁体を精製するのに用いる実際の条件は、部分的には、正味の荷電、疎水性、親水性などのような要因に依存しており、当業者には明らかであろう。例えば、放射性標識後のゲル電気泳動、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイなどを含む、その物理的又は機能的特性に基づいたアッセイによって精製されたペプチドを同定することができる。
アフィニティクロマトグラフィ精製については、ペプチド又はペプチド類縁体に特異的に結合するいかなる抗体を使用してもよい。抗体の産生については、ペプチドと共に注射することによって、ウサギ、マウス、ラットなどを含むが、これに限定されない種々の宿主動物を免疫してもよい。側鎖官能基又は側鎖官能基に結合したリンカーによって、ＢＳＡ又はＫＬＨのような好適なキャリアにペプチドを結合してもよい。宿主の種に依存して、免疫応答を高めるために種々のアジュバントを使用してもよく、それには、フロインド（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、カサガイのヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメットーゲラン菌）並びにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これに限定されない。
【０１４０】
培養中で維持されている細胞株による抗体分子の産生を供するいかなる技法を用いて、ペプチドに対するモノクローナル抗体を調製してもよい。これらには、元々ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature 256:495-497, 1975）によって記載されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030, 1983）及びＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., 77-96pp, 1985）が挙げられるが、これに限定されない。さらに、適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子の遺伝子と共にスプライシングすることによる『キメラ抗体』の産生のために開発された技術を使用することもできる（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314:452-454, 1985）。別の方法としては、単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号）の産生に関して記載された技術をペプチド特異的な単鎖抗体を産生するのに当てはめることができる。
既知の技法によって特異的結合部位の欠失を含有する抗体断片を作成してもよい。例えば、かかる断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）2断片、及びＦ（ａｂ’）2断片のジスルフィド結合を還元することによって作成することができるＦａｂ断片が挙げられるが、これに限定されない。別の方法としては、関心のあるペプチドに関する所望の特異性で、モノクローナルＦａｂ断片を迅速に且つ容易に同定することができるようにＦａｂ発現ライブラリを構築してもよい（Huse et al., Science 246:1275-1281）。
所望のペプチドに特異的な抗体又は抗体断片を、例えば、寒天に結合することができ、抗体−寒天複合体は、本発明のペプチドを精製するための免疫クロマトグラフィで使用することができる。Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York Inc., NY, 1984) 及びLivingstone, Methods Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731, 1974を参照のこと。
【０１４１】
６．８  ＰＤＺドメインに結合し拮抗する化合物の使用
本発明の１つの態様では、本発明のＰＤＺドメイン結合及びＰＤＺ−ＰＬ阻害性化合物は、造血系細胞（例えば、Ｔ細胞及びＢ細胞）及び免疫応答に関与するその他の細胞の多様な活性を調節するのに有用である。
本発明の１つの実施態様では、本発明の化合物は、サイトカインの産生、細胞接着、細胞数の増加、アポトーシス及び細胞傷害を含むがこれに限定されない測定可能な事象で示される白血球の活性化を阻害するために使用される。必然的な結果として、急性並びに慢性の炎症、移植片対宿主病、移植の拒絶、過敏症、及び多発性硬化症、慢性関節リウマチ、歯周病、全身性エリテマトーシス、若年性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、並びにアレルギーのような自己免疫性、及び本明細書に一覧するその他の状態（例えば、上の６．４の項を参照のこと）を含むが、これに限定されない望ましくない白血球の活性化に関連する多様な状態を治療するのに本発明の化合物を用いてもよい。
従って、本発明はまた、例えば、細胞傷害、サイトカインの産生、細胞増殖及びアポトーシスによって測定されるような白血球の活性化を調節することにおいて、かかる組成物を使用する方法にも関する。活性化のためのアッセイは周知である。例えば、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤は以下のように評価することができる：（１）放射性標識された標的細胞とともに細胞傷害性Ｔリンパ球をインキュベートし、放射活性の放出によってこのような標的細胞の抗原特異的な細胞融解を検出することができる、（２）抗原及び抗原提示細胞とともにヘルパーＴリンパ球をインキュベートし、常法によりサイトカインの合成及び分泌を測定することができる（Windhagan, A et al., Immunity 2(4):373-80, 1995）（３）タンパク質抗原全体とともに抗原提示細胞をインキュベートし、Ｔリンパ球の活性化又は生物学的方法のいずれかによってＭＨＣ上の該抗原の提示を検出することができる（Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4230-4, 1989）、(４)Ｆｃイプシロン受容体に架橋する試薬とともに肥満細胞をインキュベートし、酵素免疫アッセイによってヒスタミンの放出を測定することができる（Siraganian et al., TIPS 4:432-437, 1983）。
同様に、周知の種々の方法によって、白血球活性化の産物に対するＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の効果をモデル生物（例えば、マウス）又はヒト患者のどちらかで評価することができる。例えば、（１）例えばＥＬＩＳＡのような現在臨床検査で使用されている常法によって、ワクチン接種に対する応答における抗体の産生を容易に検出することができる；（２）皮膚の表面を引っ掻き、無菌容器に入れて引っ掻き部位の移動細胞を捕捉することによって、炎症部位の免疫細胞の移動を検出することができる（Peters et al., Blood 72:1310-5, 1988）；（３）3Ｈ−チミジンを用いることにより、マイトジェンに対する反応又は混合リンパ球反応における末梢血単核細胞の増殖を測定することができる；(４)標識した粒子とともにウエルの中にＰＢＭＣを入れることによって、ＰＢＭＣ中の顆粒球、マクロファージ及びその他の貪食細胞の貪食能を測定することができる。；及び（５）  ＣＤ４及びＣＤ８のようなＣＤ分子に対する抗体でＰＢＭＣを標識し、このようなマーカーを発現するＰＢＭＣの分画を測定することにより、免疫系細胞の分化を測定することができる。
【０１４２】
例示としてのアッセイの１つでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤を調べるために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ)、ヒトＴ細胞株（例えば、ジャーカットＥ６、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）、ＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株（例えば、９Ｄ１０、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８７５２）、抗原特異的Ｔ細胞クローン又はその株を使用することができる。このような細胞又は細胞株の活性化の阻害をＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の可能性を評価するのに用いることができる。
それによって造血系細胞が免疫応答に特徴的な活性化を受けるように刺激される標準的な方法は、例えば：
Ａ）  免疫応答の抗原特異的な刺激。  常法によって、免疫前のマウス又は免疫経験のないマウスの脾細胞を作成することができる。さらに、抗原特異的なＴ細胞クローン及びハイブリドーマ（例えば、ＭＢＰ特異的）及び多数のＢ細胞リンパ腫細胞株（例えば、ＣＨ２７）が予め特徴付けられており、以下で議論するアッセイで利用することができる。抗原特異的な脾細胞又はＢ細胞を抗原の存在下、抗原特異的なＴ細胞と混合し、免疫応答を生じることができる。ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の存在下又は非存在下でこれを行い、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤が上の免疫応答を調節するかどうかをアッセイすることができる。
Ｂ）  非特異的なＴ細胞の活性化。抗原の非存在下、Ｔ細胞を活性化するのに以下の方法を用いることができる：１）共刺激分子に対する抗体、例えば、抗ＣＤ２８とともに受容体活性化分子（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３又はＣＤ２）に対する抗体を添加することによるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の架橋；２）コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）及び植物凝集素（ＰＨＡ）のようなレクチンを用いた非特異的手法における細胞表面受容体の活性化；３）タンパク質キナーゼＣを活性化する薬剤（例えば、ホルボールエステル）及び細胞質Ｃａ2+を上昇させる薬剤（例えば、イオノマイシン）を用いた、表面受容体が介在する活性化の模倣。
【０１４３】
Ｃ）  非特異的なＢ細胞の活性化。１）ＩｇＭ、ＣＤ２０又はＣＤ２１のような細胞表面分子に対する抗体の適用、２）バイパスで受容体刺激を誘発するために、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ホルボールエステル、カルシウムイオノフォア及びイオノマイシンを用いることもできる。
Ｄ）  混合リンパ球反応（ＭＬＲ）。提供者のＰＢＭＣを受入者のＰＢＭＣと混合し、ミスマッチの組織抗原の提示によってリンパ球を活性化するが、それは、一卵性双生児以外いずれの場合でも起きる。
Ｅ）  特定の抗原を認識する特異的Ｔ細胞のクローン又は株の作成。標準的なアプローチは、最近破傷風毒素の追加注射を受けたことのある提供者から破傷風毒素特異的Ｔ細胞を作成することである。細胞株又はＴ細胞クローンの特異性を維持するために、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の一致した抗原提示細胞と破傷風毒素源を用いる（Lanzavecchia A et al., Eur. J. Immunol., 13:733-738, 1983）。
【０１４４】
アッセイの定量化
種々の周知の定量化法によって上記アッセイを定量化することができる。例えば：
（Ａ）チロシンのリン酸化
ＨＳ１、ＰＬＣ−γ、ＺＡＰ−７６及びＶａｖのような早期反応性タンパク質のチロシンのリン酸化は、白血球の活性化に続く早期の生化学的事象である。チロシンがリン酸化されたタンパク質は、リン酸化チロシン残基に対する抗体を用いたウエスタンブロットによって検出することができる。このような早期反応性タンパク質のチロシンのリン酸化は、白血球の活性化に関する標準的なアッセイとして用いることができる（J. Biol. Chem., 272(23):14562-14570, 1997）。潜在的なＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の存在下で免疫応答が生じる場合、このようなタンパク質又は関連するタンパク質のリン酸化パターンのいかなる変化も潜在的なＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤を示すものである。
（Ｂ）細胞内カルシウムの流入
予めカルシウムに感受性の色素を負荷することにより細胞の刺激後、時間を追って細胞内Ｃａ2+濃度の動態を測定することができる。フローサイトメータ、溶液フローメータ、及び共焦点顕微鏡を用いて、Ｃａ2+指示薬色素（例えば、フルオロ−４［分子プローブ］）を結合することによる蛍光レベルの上昇が示される。ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の存在下で免疫応答が生じる場合、カルシウム流入のレベルや時間におけるいかなる変化もこの反応の阻害を示すものである。
【０１４５】
（Ｃ）早期活性化マーカーの調節
フローサイトメータを用いて、蛍光的に標識した抗体により、ＣＤ６９、ＩＬ−２Ｒ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７及びＴＣＲのような早期リンパ球活性化マーカーの発現／レベルの調節における増減を一般的に測定する。抗体はすべて市販されている。ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の存在下で免疫応答が生じる場合、リンパ球活性化マーカーの発現レベルにおけるいかなる変化もこの反応の阻害を示すものである。
（Ｄ）代謝活性／酸放出の増加
最も知られたシグナル伝達経路の引き金の活性化によって、酸性代謝産物が増加する。この再現可能な生物学的事象は、微量生理機能測定装置（分子装置）を用いて、酸放出の速度として測定され、潜在的な生物学的療法による細胞の処置を比較する場合、早期活性化マーカーとして用いられる（McConnell, H. M. et al., Science 257:1906-1912, 1992 及びMcConnell H. M., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2750-2754, 1995）。 対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料の酸放出におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆している。
【０１４６】
（Ｅ）細胞増殖／細胞生存性のアッセイ
（１）3Ｈチミジンの取り込み
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて抗原又はマイトジェンにリンパ球を暴露してＤＮＡ合成及び細胞増殖を誘導する。新しく合成されたＤＮＡへの3Ｈチミジンの取り込みによる分裂活性の測定は、Ｔ細胞活性化を定量するために最も頻繁に用いられるアッセイの１つである。Ｔ細胞を活性化するのに用いられた細胞集団と刺激の形態によって、3Ｈチミジンをパルスした後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて２４〜７２時間以内に分裂活性を測定することができる（Mishekk, B. B. & Shiigi, S. M., Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, 1980 及びDutton, R.W. & Pearce J.D., Nature 194:93, 1962）。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料のＣＰＭにおけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆している。
（２）ＭＴＳ［５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４，５−ジメチルチアゾリル）−３−（４−スルホフェニル）テトラゾリウム、分子内塩］は、リンパ球の活性化後１〜５日間の増殖又は細胞傷害性アッセイにおける生存細胞の数を測定する比色法である（Barltrop J.A., Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1:611）。オーエン試薬である、ＭＴＳテトラゾリウム化合物は、細胞により生体還元されて、組織培養培地に可溶性の着色したホルマザン産物になる。微量プレートリーダーを用いて、４９０ｎｍマイナス６５０ｎｍにて色強度を読み取る。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料の色強度におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆することができる（Mosmann T., J. Immunol. methods 65:55, 1983及びBarltrop J.A. et al.）。
（３）ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、チミジン類縁体、ＤＮＡ合成を受けている細胞に容易に組み入れる。酵素を結合した抗ＢｒｄＵ抗体によりＢｒｄＵでパルスした細胞を標識する（Gratzner, H.G., Science 218:474-475, 1982）。ＢｒｄＵを取り込んだ、増殖している細胞を視覚化するために比色分析用の可溶性基質を用いる。硫酸によって反応を止め、微量プレートリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートを読み取る。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料の色強度におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆している。
【０１４７】
（Ｆ）アネキシンＶによるアポトーシス
プログラム細胞死又はアポトーシスは、異化反応が細胞死を招くカスケードにおける早期の事象である。細胞膜の完全性を喪失することによって蛍光的に共役したホスファチジルセリンの結合ができるようになる。蛍光顕微鏡又はフローサイトメータによって染色された細胞を測定することができる（Vermes, L., J. Immunol. Methods 180:39-52, 1995）。１つの実施態様では、対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料のアポトーシス細胞の数におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆する。  ｉｎ  ｓｉｔｕでアポトーシスを評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験において組織試料における細胞死を評価するためのアッセイを用いることもできる。
（Ｇ）サイトカイン産生の定量化
１６〜４８時間、細胞を刺激した後で回収された細胞上清を、サイトカイン産生についてアッセイするまで、又は直接試験するまで、−８０℃にて保存する。各試料について複数のサイトカインアッセイを行うことができる。マウス、ラット及びヒトについて、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−γ及びその他のサイトカインのＥＬＩＳＡアッセイが利用できる（エンドゲン［Endogen］社及びバイオソース）。製造元により記載されているような標準的な２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコールを用いてサイトカインの産生を測定する。３，３’５，５’−テトラメチルベンジリジン（ＴＭＢ）によって西洋ワサビペルオキシダーゼの存在を検出し、硫酸によって反応を止める。微量プレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにて吸収を測定する。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料の色強度におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆する。下の実施例１を参照のこと。抗サイトカイン抗体を用いた細胞内サイトカインの検出は、混合された細胞集団に関するサイトカインを測定するさらなる利点を提供する。これによって、浮遊液又は組織におけるサイトカインを産生する細胞型の頻度を測定する表現型決定を行うことができる。
【０１４８】
（Ｈ）免疫染色によってＮＦ−ＴＡを視覚化することができる。
Ｔ細胞の活性化は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦ−ＡＴ）の核への移入を必要とする。抗ＮＦ−ＡＴ抗体で免疫染色することによってＮＦ−ＴＡのこの転移を視覚化することができる（Cell 93:851-861, 1998）。従って、Ｔ細胞の活性化をアッセイするのにＮＦ−ＡＴの核転移が用いられてきた。同様に、ＮＦ−ＡＴ／ルシフェラーゼ・リポーターアッセイもＴ細胞活性化の標準的な測定法として用いられてきた（MCB 12:7151-7160, 1996）。対照試料（処置なし）と比較した、ＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤で処置した試料によってもたらされたＮＦ−ＡＴの核転移におけるいかなる統計的に有意な増減も、生物学的な機能におけるＰＤＺ／ＰＬ相互作用の拮抗剤の影響を示唆する。本明細書で開示されたペプチド及びペプチド類縁体のヒト被験者での使用を最適化するために、臨床パラメータを決定するのに種々の動物モデルを用いてもよい。例えば、心臓移植のマウスモデルにおいて、様々な投与量、剤形及び投与経路によって本発明の化合物で処置して、固形臓器移植に対する拒絶反応を阻止する能力を最適化してもよい（Fulmer et al., Am. J. Anat., 113:273, 1963; Jockusch et al., Exp. Neurol., 81:749, 1983）。
Ｔ細胞応答の阻害が所望であるような状況では、ＰＤＺドメインのＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６及びＣＤｗ１３７との相互作用を阻害するために本発明の化合物を使用してもよい。さらに、Ｂ細胞においてＰＤＺドメインとＣＤ５３及びＣＤ１３８との相互作用を阻害するのに本発明の化合物を使用してもよい。ＩｇＥが介在するアレルギー反応を阻害するために、ＰＤＺドメインとＦｃεＲＩβ、ＣＤｗ１２５及びＣＤｗ１２８との相互作用を阻害するために本発明の化合物を用いてもよい。さらに、リンパ腫のアポトーシスを誘導するためにＣＤ９５のＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）を用いてもよい。
【０１４９】
（Ｉ）炎症性メディエイター放出分析
ＩｇＥ介在性の脱顆粒（に対する）化合物または治療の効果を入手するための炎症性メディエイターの検定法は、この技術において周知である。たとえば、双方とも参考文献として本文に編入されている、Bergerら、1997、Measuring Cell Degranulation（細胞脱顆粒の測定）の、たとえば第１９．６章  Immunology Method Manual（免疫学方法マニュアル）. アカデミック・プレス社、1436 - 1440、およびSiraganian、1983 、Histamine Secretion from Mast Cells and Basophil（肥満細胞および好塩基球からのヒスタミン分泌）TIPS 4 : 432 - 437、を参照のこと。
【０１５０】
６．９．製剤および投与経路
６．９．１．アゴニストまたはアンタゴニスト（たとえばペプチドおよび融合タンパク質）の細胞への導入
一つの観点においては、本発明のＰＤＺ−ＰＬアンタゴニストは、細胞の生物機能または活性を調節する（すなわち増大または減少させる）べく、細胞内へ導入される。多くの有機低分子は容易に細胞膜を横切る（または熟練者により、化合物が細胞に入る能力を、たとえば電荷を減じるかまたは除去すること、親油性を増大すること、細胞表面受容体をターゲットとする成分と当該分子を結合させ、当該受容体と相互作用した後に、増加させるべく、慣例的な方法を用いて改造されることが可能である）。より大きい分子、たとえばペプチドおよび融合タンパク質を導入する方法も周知であり、たとえば、注射、リポソーム仲介性融合、ヒドロゲル、細胞によってエンドサイトーシスされるターゲティング成分結合体との結合、電気穿孔、およびその他を含む）。
一つの態様においては、アンタゴニストまたは薬剤は、融合ポリペプチドまたは誘導されたポリペプチドである。融合または誘導されたタンパク質は、当該ポリペプチドが細胞膜を横切る能力を増大させるか、または当該ポリペプチドを特殊化された細胞型（たとえば、肝細胞または腫瘍細胞）に対して優先的に、あるいは細胞区画（たとえば、核区画）に対して優先的に送達されるようにするターゲティング成分を含んでもよい。ターゲティング成分の実例は、リピドテイル、アンテナポエディア（antenapoedia）ペプチドまたは核局在化シグナル（ＮＬＳ；たとえばRobbinsら、1991、Cell 64 : 615、アフリカツメガエル核原形質）といったアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
本発明の一つの態様においては、ＰＤＺドメイン−ＰＬタンパク質の結合を阻害するべく決定されたペプチド配列またはペプチド類似体は、本発明の一つの検定法においては、当該配列を原形質膜を通した輸送を促進するアミノ酸配列（「膜貫通トランスポーター配列」）に対して結合することにより細胞内へ導入される。本発明のペプチドは、直接使用されるか、または細胞内へのそれらの侵入を促進するべく、膜貫通トランスポーター配列に対して融合されてもよい。かかる融合ペプチドの場合には、各々のペプチドは異種ペプチドと、そのアミノ末端において直接に、または１〜３回反復されたペンタマー  Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｓ（配列番号１）などの可撓性のポリリンカーを用いることにより融合されてもよい。かかるリンカーは、ＶHとＶLとの間に挿入されることにより、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の構築の使用されてきた（Birdら、1988、Science 242 : 423 - 426；Hustonら、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 : 5979 - 5883）。リンカーは単鎖抗体の可変領域を形成している二つのβシート間の正しい相互作用を可能にするべく設計されている。使用されてもよい他のリンカーは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号２）（Chaudharyら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 : 1066 - 1070）およびＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号３）(Birdら、1988、Science 242 : 423 - 426）を含む。
【０１５２】
当該技術においてはいくつかのペプチド配列が、これらの配列に結合されたペプチドの原形質膜を通した細胞内への侵入を促進することが可能であるとして記述されている（Derossiら、1998、Trends in Cell Biol. 8 : 84）。本発明の目的のためには、かかるペプチドは集合的に膜貫通トランスポーターペプチドと呼ばれる。このようなペプチドの実例は、ＨＩＶ由来のｔａｔ（Vivesら、1997、J. Biol. Chem. 272 : 16010；Nagaharaら、1993、Nat. Med. 4 : 1449）、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア（Derossiら、1994、J. Biol. Chem. 261 : 10444）、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ２２（ElliotおよびD’Hare、1997、Cell 88 : 223 - 233）、抗ＤＮＡ抗体の相補正決定領域（ＧＤＲ）２および３（Avrameasら、1998、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 : 5601 - 5606）、７０ＫDａの熱ショックタンパク質（Fujihara、1999、EMBO J. 18 : 411 - 419）、およびトランスポータン（transportan）(Poogaら、1998、FASEB J. 12 : 67 - 77）を含むが、これに制限されない。本発明の好ましい態様においては、ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ（配列番号１７３）の配列を有する切断されたＨＩＶ ｔａｔペプチドが用いられる。
膜貫通トランスポーター配列は、そのアミノ末端において造血細胞表面の受容体のカルボキシル末端に、リンカーを用いるかまたは用いずに融合されている。一般的に、ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）のC末端は、ＰＤＺドメインと相互作用するために遊離していなければならない。膜貫通トランスポーター配列は全体で、またはそれが細胞へのペプチドの侵入を促進することが可能である限り部分的に使用されてもよい。
本発明の別の態様においては、造血細胞表面の受容体のC末端配列は、それが膜貫通トランスポーター配列の不在下に細胞への侵入を可能にする方法で送達される場合には、単独で用いられてよい。たとえば、当該ペプチドはリポソーム製剤中においてか、またはＰＤＺモチーフのためのコード配列を単独で、あるいは融合分子として送達することによる遺伝子治療アプローチを用いて、標的細胞内に送達されてもよい。
【０１５３】
本発明の化合物は、当該ペプチド組成物の半減期を増す他に、リンパ組織などの特定の組織に対して当該結合体をターゲットするために役立つか、または感染細胞に対し選択的にターゲットされる、リポソームを経て投与されてもよい。リポソームはエマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単分子層、液晶、リン脂質分散、ラメラ層、およびその他を含む。このような標品中では、送達されるべきペプチドはリポソームの一部として、単独か、またはたとえばＣＤ４５抗原と結合するモノクローナル抗体などの、リンパ細胞の間で優勢な受容体と結合する分子と、あるいは他の治療用または免疫原性組成物とともに取り込まれる。したがって、所望のぺプチドまたは本発明の結合体で満たされたリポソームは、リンパ細胞の部位に向けられることが可能であり、次いでリポソームはそこで、選ばれたインヒビター組成物を送達する。本発明において使用するためのリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成されるが、それは一般的に中性かつ負に帯電したリン脂質と、コレステロールなどのステロールとを含む。脂質の選択は一般に、たとえばリポソームの大きさ、酸不安定性、および血流中でのリポソームの安定性を考慮することにより進められる。リポソームの調製には、たとえばSzokaら、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 : 467（1980）、米国特許第４，２３５，８７１号、４，５０１，７２８号および４、８３７、０２８号に記述されたような種々の方法が利用できる。
【０１５４】
種々のターゲティング薬剤を用いたリポソームのターゲティングは、当該技術において周知である（たとえば、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号を参照のこと）。免疫細胞に対するターゲティング用には、リポソーム内に取り入れられるリガンドは、たとえば所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントを含むことが可能である。ペプチドまたは結合体を含んでいるリポソーム懸濁物は、静脈内に、局部的に、局所的、その他に、中でも投与の方式、送達される結合体、および治療される疾病の段階に依存して、異なる用量で投与されてよい。
ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）ペプチドを特別の細胞種内へ特異的に送達するためには当該ペプチドは、成長因子、ホルモン、およびサイトカインなどの多様な白血球表面分子のためのリガンド、ならびに抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含むがこれに限定されない細胞特異ターゲティング成分に結合されてよい。多数の細胞表面受容体が白血球において同定されているため、これらの受容体に特異的なリガンドまたは抗体は、細胞特異ターゲティング成分として用いられてよい。たとえば、インターロイキン２、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、およびＣＤ４０またはそれらのペプチドフラグメントは、活性化されたＴ細胞を特異的にターゲットするべく用いられてよい（The Leucocyte Antigen Facts Book、1997 、Barclayら、（共編）、アカデミックプレス）。ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ４０Ｌまたはそれらのペプチドは、Ｂ細胞を特異的にターゲットするべく用いられてよい。さらにＦｃドメインは、単球などのＦｃ受容体を発現しているある種の細胞をターゲットするべく用いられてよい。
【０１５５】
抗体は、それらがどの細胞表面抗原に対しても生成され得るため、最も多目的に使用できる細胞特異ターゲティング成分である。モノクローナル抗体は、ある種のＣＤ抗原などの白血球系統特異マーカーに対して生成されてきた。抗体の可変領域の遺伝子は、当該技術において周知の方法により、ハイブリドーマ細胞から容易に単離されることが可能である。しかしながら、抗体は二つの重鎖と二つの軽鎖との間で構築されるため、本発明においてはｓｃＦｃが細胞特異ターゲティング成分として用いられることが好ましい。かかるｓｃＦｃは、可撓性のリンカーペプチドによって一つのポリペプチド鎖に結合されたＶhおよびＶLドメインから構成される。
ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）は、膜貫通トランスポーター配列および細胞特異ターゲティング成分に結合されて、三重の融合分子を生じてもよい。この分子は白血球表面分子に結合し、細胞膜を通過し、さらにＰＤＺドメインをターゲットすることが可能である。別法として、ＰＤＺモチーフ配列（ＰＬ配列）は、当該融合ペプチドをインターナライズする表面分子に結合する、細胞特異ターゲティング成分に対して結合されてもよい。
他の一つのアプローチにおいては、混合アミノ酸の人工ポリマーから成るミクロスフェア（プロテイノイド）が、薬剤を送達するべく用いられてきた。たとえば、米国特許第４，９２５，６７３号は、薬剤を含んでいるプロテイノイドミクロスフェア担体、ならびにそれらの調製法および用途について記述している。このようなプロテイノイドミクロスフェアは、いくつかの活性薬剤の送達にとって有用である。参考文献として本文に編入されている米国特許第５，９０７，０３０号および第６，０３３，８８４号を参照のこと。
【０１５６】
６．９．２．ポリヌクレオチドの細胞内への導入
表面受容体Ｃ末端ペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、種々の白血球活性化に関連した異常状態の治療に有用であってよい。細胞内に遺伝子配列を導入することにより、白血球が活性化されて有害な結果を生じる状態を治療するべく、遺伝子療法が用いられることができる。一つの態様においては、本発明のＰＬ配列ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それが発現される細胞内へ導入される。発現されたペプチドは、次に細胞内におけるＰＤＺタンパク質とＰＬタンパク質との相互作用を阻害する。
したがって、一つの態様においては、本発明のポリペプチドは細胞内で、所望のタンパク質またはペプチドをコードしている核酸（たとえばＤＮＡ発現ベクターまたはｍＲＮＡ）を当該細胞内に導入することにより発現される。発現はベクターおよびプロモーターの選択に依存して、構成性かまたは誘導性のいずれかであってよい。核酸の導入ならびに発現のための方法は当該技術において周知であり、本文に記述されている。
一つの特別の態様においては、本文に述べられたペプチドをコードしている配列を含んでいる核酸が、ヒトの患者に投与される。この態様においては、当該核酸はそのコード産物を産生し、それが白血球の活性化を阻害することにより治療効果を取り次ぐ。当該技術において利用可能な遺伝子療法のためのいかなる方法も、本発明に従って使用されることができる。以下に代表的な方法が述べられている。
遺伝子療法についての全般的な総説としては、Goldspielら、1993、Clinical Pharmacy 12 : 488 - 505；WuおよびWu、1991、Biotherapy 3 : 87 - 95；Tolstoshev、1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 : 573 - 596；Mulligan、1993、Science 260 : 926 - 932；およびMorganおよびAnderson、1993、Ann. Rev. Biochem. 62 : 191 - 217；May、1993、TIBTECH 11（5）:155 - 215参照のこと。使用可能な組換えＤＮＡ技術において一般的に知られている方法は、Ausubelら（共編）、1993、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク州；およびKriegler、1990、Gene transfer and Expression、 A Laboratory Manual、ストックトン（Stockton）プレス、ニューヨーク州、に記述されている。
【０１５７】
本発明の一つの好ましい態様においては、治療用組成物は発現ベクターの部分であるコーディング配列を含む。とくに、かかる核酸は、当該コーディング配列に操作可能に結合されたプロモーターを有しており、前記プロモーターは誘導可能であるかまたは構成性であり、さらに任意で組織特異性である。もう一つの特別の態様においては、一つの核酸分子が用いられており、その中でコーディング配列と他の所望の配列とは、ゲノム内の所望の部位において相同組換えを促進する領域によってフランクされており、したがって当該核酸の染色体内発現が提供される（KollerおよびSmithies、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86 : 8932 - 8935；Zijlstraら、1989、Nature 342 : 435 - 438）。
当該核酸の患者への送達は直接的でよく、この場合には当該患者は当該核酸または核酸を運んでいるベクターに直接暴露されるか、あるいは間接的でよく、この場合にはまず細胞が当該核酸によってインヴィトロでトランスフォームされ、次いで当該患者に移植される。これらの二つのアプローチは、各々インヴィヴォまたはエクスヴィヴォ（生体外）の遺伝子療法として知られている。
【０１５８】
一つの特別の態様においては、当該核酸はインヴィヴォにおいてコードされた産物を産生するべく発現される場所に直接投与される。このことは、当該技術において周知のいかなる方法によっても、たとえばそれを適当な核酸発現ベクターの部分として構築すること、およびそれを、たとえば欠損または弱毒化されたレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染によるか（米国特許第４，９８０，２８６号参照のこと）、むきだしのＤＮＡの直接の注射によるか、微粒子衝撃によるか（たとえば、遺伝子銃；バイオリスティック（Biolistic）、デュポン）、脂質または、細胞表面の受容体またはトランスフェクト薬剤を用いたコーティングによるか、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル内への封入によるか、核に侵入することが知られているペプチドに対してそれを結合させて投与することによるか、または受容体を発現している細胞種を特異的にターゲットするべく用いられることが可能な、受容体仲介エンドサイトーシスを受けやすいリガンドに対してそれを結合させて投与することにより（たとえばWuおよびWu、1987、J. Biol. Chem. 262 : 4429 - 4432参照）、投与してそれが細胞内となるようにすることにより成就されることが可能である。もう一つの態様においては、核酸ーリガンド複合体が形成されることが可能であり、その中で当該リガンドはエンドソームを破壊するためのフゾジェニック（融合原性、fusogenic）なウイルスペプチドを含み、当該核酸がリソソームによる分解を回避できるようにする。さらにもう一つの態様においては、特異的な受容体をターゲティングすることにより、当該核酸はインヴィヴォにおいて細胞特異な取り込みおよび発現のためにターゲティングされることが可能である（たとえば、ＰＣＴ公開、１９９２年４月１６日付けのＷＯ９２／０６１８０；１９９２年１２月２３日付けのＷＯ９２／２２６３５；１９９２年１１月２６日付けのＷＯ９２／２０３１６；１９９３年７月２２日付けのＷＯ９３／１４１８８；１９９３年１０月１４日付のＷＯ９３／２０２２１を参照のこと）。別法として、当該核酸は相同組換えにより細胞内に導入され、かつ発現のため宿主細胞のＤＮＡ内に取り込まれることができる（KollerおよびSmithies、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 8932 - 8935；Zijlstraら、1989、Nature 342 : 435 - 438）。
【０１５９】
本発明の好ましい態様においては、ウイルスベクターとしてアデノウイルスが遺伝子療法に使用されることが可能である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染することができるという利点を有する（KozarskyおよびWilson、1993、Current Opinion in Genetics and Development 3 : 499 - 503）。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら、1991、Science 252 : 431 - 434；Rosenfeldら、1992、Cell 68 : 143 - 155；およびMastrangeliら、1993、J. Clin. Invest. 91 : 225 - 234に見ることができる。さらに、修正された指向性をもつアデノウイルスベクターが細胞特異ターゲティングに用いられてよい（ＷＯ９８／４０５０８）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた遺伝子療法における使用に向けて提案されている（Walshら、1993、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204 : 289 - 300）。
さらに、レトロウイルスベクター（Millerら、1993、Meth. Enzymol. 217 : 581 - 599）は、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組込みに必要ではないレトロウイルス配列を削除するべく修正されている。遺伝子療法に用いられるコーディング配列はベクター内にクローン化され、それは当該遺伝子の患者への送達を促進する。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesenら、1994、Biotherapy 6 : 291 - 302に見ることができるが、それは幹細胞を化学療法に対してより抵抗性にする目的で、ｍｄｒＩ遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用について記述している。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を説明している他の参考文献は：Clowesら、1994、J. Clin. Invest. 93 : 644 - 651；Kiemら、1994、Blood 83 : 1467- 1473；SalmonsおよびGunzberg、1993、Human Gene Therapy 4 : 129 - 141；およびGrossmanおよびWilson、1993、Genetics and Devel. 3 : 110 - 114におけるCurr. Opin. である。
遺伝子療法へのもう一つのアプローチは、組織培養における細胞へ遺伝子を移入することを含む。通常、移入の方法は当該細胞への選択可能なマーカーの移入を含む。次いで当該細胞は移入された遺伝子を取り込みかつ発現している細胞を単離するための選別下に置かれる。このような細胞は次いで患者に送達される。
【０１６０】
この態様においては、結果として生じる組換え細胞のインヴィヴォの投与に先立ち、当該核酸が細胞内に導入される。かかる導入は、トランスフェクション、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、当該核酸配列を含んでいるウイルスまたはバクテリオファージを用いた感染、細胞融合、染色体仲介遺伝子移入、微小核体仲介遺伝子移入、スフェロプラスト融合、その他を含むがこれに制限されない当該技術において周知のいかなる方法によっても行なわれることができる。当該技術においては、外来遺伝子を細胞内に導入するための数多くの技術が周知であり（たとえば、LoefflerおよびBehr、1993、Meth. Enzymol. 217 : 599 - 618；Cohenら、1993、Meth. Enzymol. 217 : 618 - 644 ; Cline、1985、Pharmac. Ther. 29 : 69 - 92を参照のこと）、また受容細胞についての必要な発生および生理的機能が破壊されてさえいなければ、本発明に従って使用されてよい。当該技術は細胞への核酸の安定な移入に必要な手段を備えているべきであり、それにより核酸は細胞による発現が可能であり、かつ好ましくは遺伝性であって、その子孫細胞による発現が可能であるようにする。好ましい態様においては、遺伝子療法に用いられる細胞は患者にとって自己由来である。
【０１６１】
一つの特別の態様においては、遺伝子療法を目的として導入される核酸は、コーディング配列に対して操作可能に結合された誘導性のプロモーターを含んでおり、当該核酸の発現が適当な転写誘導物質の有無を調節することにより制御されることができるようにする。
白血球表面受容体のｍＲＮＡ、特にそのC末端の翻訳を阻害するべく機能するアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子などのオリゴヌクレオチド、およびリボザイムもまた本発明の範囲内にある。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、ターゲットされたｍＲＮＡに結合することおよびタンパク質の翻訳を妨げることにり、ｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するべく作用する。アンチセンスＤＮＡに関しては、翻訳開始部位、たとえば−１０と＋１０の間のヌクレオチド配列、に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキリメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンタニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（v）、ワイブトキソジン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（v）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれに制限されない群より選ばれる、少なくとも一つの修飾された塩基部分を含んでよい。
【０１６２】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的なＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的なターゲットＲＮＡに対してのリボザイム分子の配列特異なハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレオリティックな切断を含む。白血球表面受容体のＲＮＡ配列のエンドヌクオリティックな切断を特異的かつ効率的に触媒する工作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、本発明の範囲内にある。
潜在性のＲＮＡターゲット内の特異的なリボザイム切断部位は、まず当該ターゲット分子を以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを含むリボザイム切断部位について走査することにより同定される。一旦同定されれば、当該切断部位を含んでいる、ターゲット遺伝子の領域に相当する１５と２０の間のリボヌクレオチドから成る短いＲＮＡ配列が、オリゴヌクレオチド配列を不適当にしてもよい二次構造などの予測された構造上の特徴について査定されてよい。候補ターゲットの適性も、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについて、その影響の受けやすさを検査することにより査定されてよい。
【０１６３】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子とリボザイムは、当該技術において核酸分子の合成用として周知のいかなる方法によっても調製されてよい。これらは、たとえば固相ホスホルアミダイト化学合成といった当該技術において周知の、オリゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成用の技術を含む。別法として、ＲＮＡ分子は、当該ＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ配列のインヴィトロおよびインヴィヴォにおける転写により生成されてもよい。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの、適当なプロモーターを含む種々のベクター内に取り込まれてよい。別法として、用いられたプロモーターに依存して構成性または誘導性にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が、細胞系内に安定に導入されることができる。
細胞内での安定性および半減期の増大のための手段として、ＤＮＡ分子に対する種々の修飾が導入されてよい。可能な修飾は、オリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン内のホスホジエステラーゼ結合よりもむしろ、当該分子の５´および／または３´末端に対するリボ−またはデオキシ−ヌクレオチドのフランキング配列の付加か、またはホスホロチオエートまたは２´Ｏ−メチルの使用を含むがこれに制限されない。
【０１６４】
６．９．３．他の薬剤組成物
本発明の化合物はそれ自体で、または無菌の組成物または薬剤組成物の形状で患者に投与されてよい。本発明の化合物を含んで成る薬剤組成物は、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣作成、研和、乳化、カプセル化、閉じ込め（entrapping）、または凍結乾燥の工程といった手段により製造されてよい。薬剤組成物は、活性ペプチドまたはペプチド類似体の、薬剤学的に使用可能な製剤への加工を促進する一つまたはそれより多い生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または佐剤を用いて、通常の方式において製剤されてよい。適切な製剤は、選ばれた投与経路に依存する。
局所投与のためには、本発明の化合物は当該技術において周知のような溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液、その他として製剤されてよい。
全身用の製剤は、注射、たとえば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射による投与のために設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜、経口、または経肺性の投与のために設計されたものを含む。
【０１６５】
注射用には、本発明の化合物は水溶性の溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝液といった生理学的に適した緩衝液において製剤される。当該溶液は、懸濁、安定化および／または分散剤といった製剤用薬剤を含んでもよい。
別法として、当該化合物は適当な賦形剤、たとえば、使用の前に発熱性物質なしの滅菌水を用いて構成するための、粉末の形状であってもよい。
経粘膜投与のためには、浸透されるべき障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。かかる浸透剤は、当該技術において一般的に知られている。この投与経路は、当該化合物を鼻腔へ送達するべく用いられてよい。
【０１６６】
経口投与には、当該化合物は活性ペプチドまたはペプチド類似体を、当該技術において周知の薬剤学上許容される担体と結びつけることにより、容易に製剤されることが可能である。かかる担体は、本発明の化合物が、治療されるべき患者による経口摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、およびその他として製剤されることを可能にする。たとえば粉末、カプセル、および錠剤といった経口用の固形の製剤のためには、適当な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールなどの糖類；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース標品；顆粒化剤；および結着剤などの賦形剤を含む。所望であれば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸か、またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩といった崩壊剤が添加されてよい。
【０１６７】
所望であれば、固形の剤形は標準的な技術を用いて糖衣または腸溶性であってよい。
たとえば懸濁液、エリキシル剤、および溶液などの、経口用の液体標品用には、適当な担体、賦形剤、または希釈剤は、水、グリコール、油、アルコール、その他を含む。さらに、着香料、保存料、着色剤、およびその他が添加されてよい。
バッカル投与用には、当該化合物は通常の方式で製剤された錠剤、トローチ剤、その他の形状で摂取されてよい。
吸入による投与のためには、本発明による化合物は、適当な噴射剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、または他の適当なガスの使用とともに、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレイの形状にて便利に送達される。加圧されたエアロゾルの場合には、計測された量を送達するためのバルブを備えることにより、用量単位が決定されてもよい。吸入器および注入器における使用のための、たとえばゼラチンから成るカプセルおよびカートリッジは、当該化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤との粉末混合物を含んで製剤されてよい。
【０１６８】
当該化合物はまた、たとえば、カカオバターまたは他のグリセリドといった通常の坐剤用基剤を含んでいる、坐剤または停留浣腸などの、直腸用または膣用の組成物において製剤されてもよい。
先に述べた製剤に加えて、当該化合物はまたデポ製剤として製剤されてもよい。かかる長期間作用性の製剤は、移植（たとえば皮下または筋肉内への）によるか、または筋肉内注射により投与されてよい。したがって、たとえば、当該化合物は適当な高分子または疎水性の物質（たとえば許容される油中のエマルジョン）またはイオン交換樹脂とともに、あるいはやや溶けにくい誘導体、たとえばやや溶けにくい塩として製剤されてよい。
別法として、他の薬剤送達システムが使用されてもよい。リポソームとエマルジョンとは、本発明のペプチドおよびペプチド類似体を送達するべく用いられてよい送達媒体の周知の例である。ジメチルスルホキシドなどの、ある種の有機溶媒もまた用いられるが、通常はより大きい毒性という代償を払っている。さらに、当該化合物は治療用薬剤を含んでいる固形ポリマーから成る半透性物質などの、持続放出システムを用いて送達されてもよい。いくつかの持続放出物質が確立されており、当業者には周知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に依存して、数週間にわたり、１００日を超えるまで当該化合物を放出する。治療用薬剤の化学的性質と生物学的安定性とに依存して、タンパク質安定化のための付加的な戦略が用いられてよい。
本発明の化合物は荷電のある側鎖または末端を含んでよいため、それらは上記のいかなる製剤においても、遊離の酸または塩基として、あるいは薬剤学的に許容される塩として含まれてよい。薬剤学的に許容される塩は、遊離塩基の生物活性を実質的に保持しており、かつ無機酸との反応によって調製されるような塩である。薬剤学的な塩は、水性および他のプロトン性溶媒中では、対応する遊離塩基の形状であるよりもさらに可溶性である。
【０１６９】
６．１０．有効量
本発明の化合物は一般的に、意図された目的を遂行するべく有効な量において使用されるであろう。白血球の活性化に関連した疾患を阻害するための使用には、本発明の化合物またはそれらの薬剤学的組成物は、治療上有効な量において投与または適用される。治療上有効な量によって意味されるものは、症状を改善または予防するか、あるいは治療される患者の生存を引き伸ばす有効量である。治療上有効な量の決定は、特に本文において提供された詳細な開示に照らせば、充分に当業者の能力の範囲内にある。ＰＤＺ−ＰＬ結合阻害剤についての「阻害性の量」または「阻害性の濃度」は結合を、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、しばしば少なくとも約７０％まで、さらに少なくとも約９０％までも減じる量である。結合は、インヴィトロで（たとえば、Ａ検定またはＧ検定）、あるいはインシトゥで測定されることができる。
全身投与用には、治療上の有効量はまずインヴィトロの検定から算定されることが可能である。たとえば、細胞培養において決定されたようなＩＣ50を含む循環濃度範囲を成就するべく、ある用量が動物モデルにおいて処方されることが可能である（すなわち、白血球表面受容体−ＰＤＺドメインを含んでいるタンパク質の相互作用を５０％阻害する被検化合物の濃度）。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定するべく用いられることが可能である。
【０１７０】
最初の用量はまた、インヴィヴォのデータ、たとえば動物モデルから、当該技術において周知の技術を用いて算定されることもできる。当該技術において普通の技術を有する者は、動物のデータに基づき、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
用量および間隔は、治療効果を維持するべく充分な化合物の血漿レベルを提供するため、個々に調整されてよい。注射による投与のための通常の患者の用量は、約０．１から５ｍｇ／ｋｇ／日であり、好ましくは約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日である。治療上有効な血清レベルは、日々複数の用量を投与することにより成就されてもよい。
局部投与または選択的な取り込みの場合には、当該化合物の有効な局部濃度は血漿濃度に関係していなくてもよい。当業者は、過度の実験をすることなく、治療上有効な局部濃度を最適化することができるであろう。
投与される化合物の量は、当然、治療される患者に、患者の体重に、病気の厳しさ、投与の方式、および処方する医師の判断に依存する。
治療は、症状が検出される間は、あるいはそれらが検出されない時であっても、間欠性に反復されてよい。治療は単独で、あるいは他の薬剤と組合せて提供されてもよい。移植拒絶および自己免疫病などの、白血球の活性化に関連した状態の場合には、本発明の化合物と組合せて用いられてよい薬剤は、ステロイドおよび非ステロイド性の抗炎症剤を含むがこれに制限されない。
【０１７１】
６．１０．１．毒性
好ましくは、本文において述べられた化合物の治療上の有効量は、実質的な毒性を引き起こすことなく治療上の利点を提供するであろう。
本文において述べられた化合物の毒性は、標準的な方法により、細胞培養または実験動物において、たとえば、ＬＤ50（集団の５０％に対して致死である用量）またはＬＤ100（集団の１００％に対して致死である用量）を測定することにより決定されてよい。毒性と治療効果の間の用量の比が治療係数である。高い治療係数を示す化合物が好ましい。このような細胞培養検定法および動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のために毒性ではない用量範囲を処方する上で用いられることが可能である。本文に述べられた化合物の用量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性のない有効量を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、この範囲内で、使用された剤形および利用された投与経路に依存して変動してよい。正確な処方、投与経路、および用量は、個々の医師により、患者の状態を考慮して選択されることが可能である（たとえば、Finglら、1975、The Pharmacological Basis of Therapeutics、第１章、１頁を参照のこと）。
【実施例】
【０１７２】
６．１１．実施例１：ＴＡＴ−Ｔ細胞の表面受容体のカルボキシル末端融合ペプチドはＴ細胞活性化を阻害した
６．１１．１．材料および方法
６．１１．１．１．ペプチド合成
すべてのペプチドは、標準的な方法により化学的に合成された。Ｔａｔ−ＣＤ３カルボキシル末端融合ペプチド、（ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＰＰＳＳＳＳＧＬ、配列番号１７４）；Ｔａｔ−ＣＬＡＳＰ１カルボキシル末端融合ペプチド、（ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＳＩＳＳＳＡＥＶ、配列番号１７５）；Ｔａｔ−ＣＬＡＳＰ２カルボキシル末端融合ペプチド、（ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＭＴＳＳＳＳＶＶ、配列番号１７６）；およびＴａｔペプチド、（ＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ、配列番号 ）；はＰＢＳ、ｐＨ７か、またはｄＨ２Ｏ中にて１mＭに溶解された。ストックＭＢＰＡｃ−１６ペプチド、（ＡｃＡＳＱＫＲＰＳＱＲＨＧＳＫＹＬＡ）は５mＭに溶解された。すべてのペプチドはアリコート化され、検査まで−８０℃に貯蔵された。
【０１７３】
６．１１．１．２．細胞培養
細胞は、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン（HyClone））、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭヘペス、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および５０μＭβメルカプトエタノールを補足されたＲＰＭＩ１６４０培地において維持および検査された。
【０１７４】
６．１１．１．３．Ｔ細胞刺激検定
上清は、Ｔ細胞系の活性化に続くサイトカイン産生について検定された。マウスのＴ細胞系は二つの異なる方法、抗原および抗原提示細胞か、または抗マウスＣＤ３のいずれかを用いて刺激された。
抗原特異マウスＴ細胞、ＢＲ４．２は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰＡｃ１−１６）のＮ末端の１６アミノ酸配列および同系マウスの脾細胞を用いて、９６穴プレートにおいて活性化された。マイトマイシンＣ処理された抗原提示細胞、２x１０5個のＢ１０．ＢＲは、連続的に希釈された０から２００μＭに及ぶＭＢＰＡｃ−１６の各々の列に添加された。次に、１０μＭのＴａｔ−ペプチドか、または培地のみが各々の列に添加された。最後に、あらかじめ１０μＭのＴａｔ−ペプチド（上記を参照）を負荷された２x１０4個のＭＢＰＡｃ−１６特異Ｔ細胞がすべてのウェルに添加された（Rabinowitzら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 : 8702 - 8707）。細胞は、５％ＣＯ２、３７℃における一晩のインキュベーションの間に活性化された。細胞上清が集められ、サイトカイン産生について検査されるまで−８０℃に貯蔵された。最終的な体積は２００μｌ／ウェルであった。
マウスＣＤ３に対する抗体（ファ−ミゲン（Pharmigen）＃１４５−２Ｃ１１）は、９６穴平底Ｅｌｉｓａプレートを用いて、ＰＢＳ中にて希釈され最終濃度０．５μｇ／ｍｌにおいて、４℃にて一晩コートされた。使用直前に、プレートは２００μｌ／ウェルのＰＢＳにより３回洗浄され、過剰の抗ＣＤ３が除去された。活性化に先立ち、細胞がＴａｔ−ペプチドを形質導入するための充分な時間が与えられたことを確かめるため、Ｔ細胞（５x１０5細胞／ｍｌ）は１０μＭのＴａｔ−ペプチドを用いるかまたは用いずに、５％ＣＯ２、３７℃において２時間前処理され、次いで１０μＭのＴａｔ−ペプチドを用いるかまたは用いない培地中にて、２００μｌの最終体積においてウェルあたり２x１０4細胞の最終濃度に希釈された。次いで細胞は、前文に述べたように処理された。
【０１７５】
６．１１．１．４．サイトカインＥＬＩＳＡ
ＩＦＮγは、前文に述べた細胞上清から、周囲の温度において、エンドジェン社（Endogen, Inc.）、ＥＬＩＳＡプロトコール３を用いて測定された。手短に言えば、９６穴、平底、ハイバインディングＥＬＩＳＡプレートが、コーティング抗体（ＭＭ７００）とともに一晩プレインキュベートされた。プレートは、５０ｍＭトリス、０．２％ツイーン２０、ｐＨ８を用いて洗浄され、さらにＰＢＳプラス２％ＢＳＡを用いて１時間ブロックされた。洗浄されたプレートは次いで２５μｌの細胞上清および２５μｌのブロッキング緩衝液、または５０μｌのＩＦＮγスタンダードと共に１時間インキュベートされた。ＩＦＮγの存在は、ビオチン標識された抗マウスＩＮＦγモノクローナル抗体（ＭＭ７００Ｂ、エンドジェン社）を用いて検出された。検出抗体の定量的な量は、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合されたストレプタビジンを用いて明らかにされる。酵素性の、色のついた、ＨＲＰの基質である、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、３０分まで発生され、１．０ＭのＨ2ＳＯ4を用いて停止された。４５０ｎｍでの吸収はマイクロタイタープレートリーダー（サーモ・マックス（Thermo Max）、モレキュラー・デバイシズ（Molecular Devices）を用いて測定され、細胞上清からのＩＦＮγの未知の濃度は、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ．ソフトウェア（モレキュラー・デバイシズ）によって作成された標準曲線から算定された。
【０１７６】
６．１１．２．結果
種々のＰＬのＣ末端配列に結合されたＴａｔトランスポーター配列を含んでいるペプチドは、Ｔ細胞の活性化を阻害するそれらの能力について検査された。図４Ａは、Ｔａｔ−ＣＤ３融合ペプチドが、Ｔａｔ−ペプチド単独かまたはペプチドなしの対照と比較して、ペプチド：ＭＨＣによって仲介されるＴ細胞の活性化を阻害することを示している。図４Ｂは、Ｔａｔ−ＣＬＡＳＰ２カルボキシル末端融合ペプチドが、Ｔａｔ−ペプチド単独に比較して、モノクローナル抗ＣＤ３によって仲介されるＴ細胞の活性化を阻害したことを示している。Ｔａｔ−ＣＬＡＳＰ１融合ペプチドは、この実験においてはＴ細胞の活性化を阻害しなかった。これらの結果は、潜在性の阻害配列を含んでいるペプチドが、Ｔａｔなどのトランスポーターペプチドを介し、ＰＤＺタンパク質によって仲介される表面受容体の構造を破壊するべく、Ｔ細胞内に輸送されることが可能であることを示している。ＰＤＺに仲介される表面受容体の構造は、抗原に反応したＴ細胞の活性化の阻止に導く。
【０１７７】
６．１２．実施例２：１００Ｕｍより大きい力価をもつＤＬＧ１−リガンド結合の阻害剤の設計
ＧＳＴ／ＤＬＧ１融合タンパク質（表３参照）、およびＣＬＡＳＰ−２タンパク質のＣ末端の２０アミノ酸に相当するビオチン標識されたペプチド、ＡＡ２Ｌ（表４参照）は、上に述べたような、当該技術において周知の標準的な技術によって合成および生成された。このＰＤＺ−リガンドの組合せは、次いで「Ａ］検定および「Ｇ」検定（表２参照）の双方を用いて特異的に結合することが示された。一度特異的な結合が証明されれば、「ＰＤＺ−リガンド結合親和性の測定」という表題のつけられた章のアプローチ１を用いて、結合相互作用の見かけの親和性が測定された（図２Ａ参照）。測定された見かけの親和性は２１ｕＭであった。このことは、２１ｕＭの標識されたＣＬＡＳＰ−２ペプチドＡＡ２Ｌが、ＤＬＧ１上のＣＬＡＳＰ−２用の結合部位の５０％を満たすことを意味している。したがって、もし所与のリガンドが（１）ＤＬＧ１上のＱａｓｐ〜２と同じ部位に対して結合し、かつ（２）ＣＬＡＳＰ−２ペプチドの結合を有意に減じるために充分な濃度で添加されていないのであれば（すなわち、ＣＬＡＳＰ−２ペプチドのアウトコンピート不能）、２１ｕＭの未標識のＣＬＡＳＰ−２ペプチドは、ＤＬＧ１に対する所与のリガンドの結合を約５０％まで阻止することができるはずである。
【０１７８】
かかる阻害を検出するためには、（１）同様のＤＬＧ１結合特性を保持しており、かつ（２）阻害を測定するべく選ばれた検定においてそれ自身がシグナルを発生することのない、ＣＬＡＳＰ２ペプチドＡＡ２Ｌの類似体を合成することが必要であった。ＰＤＺタンパク質とそれらのリガンドとの間のほとんどの分子相互作用は当該リガンドのＣ末端の６アミノ酸のみに関係することから、ＣＬＡＳＰ−２ペプチドの８アミノ酸変異体、ＭＴＳＳＳＳＶＶは、２０アミノ酸のＡＡ２Ｌ ＣＬＡＳＰ−２ペプチドと同様のＤＬＦ１結合特性を保持することが予期された。それゆえこの８アミノ酸のＣＬＡＳＰ−２ペプチド（機能性の標識を欠く）が、上に述べた標準的な方法により合成および精製された。１００ｕＭの（機能性には未標識）８アミノ酸ＣＬＡＳＰ−２ペプチドと、２０ｕＭのビオチン標識されたＡＡ２Ｌ ＣＬＡＳＰ−２ペプチドとが、「Ｇ」検定の変法（上に述べた）においてＤＬＧ１に対して同時に添加された場合、標識されたＡＡ２Ｌ ＣＬＡＳＰ−２ペプチドの結合は、予測されたように５０％よりも多く阻害された（図３Ａ）。標識されたＡＡ２Ｌ ＣＬＡＳＰ−２ペプチドがもう一つの標識されたＤＬＧ１リガンド、標識されたＡＡ１３ＬＦａｓペプチドで置換された類似の実験は、当該８アミノ酸のＣＬＡＳＰ−２ペプチドによる同様の阻害を証明した（図３Ａ）。したがって、既知の力価範囲（２１ｕＭ程度の大きさ）をもつＤＬＧ１−リガンド結合の有効な阻害剤（すなわち８アミノ酸ＣＬＡＳＰ−２ペプチドＭＴＳＳＳＳＶＶ）が、親和性についての知識、２１ｕＭに基づいて設計され、それを用いて特定の標識されたリガンド、ＣＬＡＳＰ−２ペプチドＡＡ２ＬがＤＬＧ１と結合した。
本発明は、本発明の一つの観点の例証として意図されている代表的な態様によって範囲が限定されるものではなく、機能的に同等ないかなる配列も本発明の範囲内にある。事実、当業者には先の記述および添付の図面から、本文において示されかつ記述されたものに加えて、本発明についての種々の変更が明らかとなるであろう。かかる変更は、添付のクレームの範囲内に入ることが意図されている。
【０１７９】
本文において引用されたすべての出版物は、ことごとく、またすべての目的のために参考文献に編入されている。本出願もまた、ともに２０００年５月１２日出願の、同時継続米国特許出願第 号「Molecular Interactions in T Cells（Ｔ細胞における分子相互作用）」（書類番号０２００５４−００１３００）、および第     号「Molecular Interactions in Allergy（アレルギーにおける分子相互作用）」（書類番号０２００５４−００１２００）により開示全体が参考文献として編入されている。
【図１Ａ】
2011102326.tif 000028
【図１Ｂ】
2011102326.tif 000029
【図１Ｃ】
2011102326.tif 000030
【図１Ｄ】
2011102326.tif 000031
【図２Ａ】
2011102326.tif 000032
【図２Ｂ】
2011102326.tif 000033
【図３Ａ】
2011102326.tif 000034
【図３Ｂ】
2011102326.tif 000035
【図３Ｃ】
2011102326.tif 000036
【図３Ｄ】
2011102326.tif 000037
【図３Ｅ】
2011102326.tif 000038
【図３Ｆ】
2011102326.tif 000039
【図４Ａ】
2011102326.tif 000040
【図４Ｂ】
2011102326.tif 000041
【配列表】
2011102326000001.app