(57)【要約】【課題】より効率的かつ汎用的にニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換した、遺伝的に改変された微生物を提供する。【解決手段】本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物である。当該置換は、例えば、所定の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われ得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物。
【請求項２】
前記微生物が、ロドコッカス属細菌又はノカルディア属細菌である、請求項１記載の微生物。
【請求項３】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株である、請求項２記載の微生物。
【請求項４】
置換されるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
前記置換が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた配列、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【請求項６】
ドナー微生物が大腸菌である、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
ドナー微生物が感受性を示す薬剤が、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項５〜６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
レシピエント微生物が感受性を示す薬剤が、カナマイシンである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物及を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を遺伝的に改変し、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（例えば、改良型のニトリルヒドラターゼ遺伝子）に置換した微生物に関する。また、当該微生物及びその形質転換体を利用した異種ニトリルヒドラターゼ（例えば、改良型のニトリルヒドラターゼ）、及びアミド化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素または該酵素を含有する微生物菌体等を用いてニトリル化合物より対応するアミド化合物を製造する方法が開示されている。この製造方法は、従来の化学合成法と比較し、ニトリル化合物から対応するアミド化合物への転化率及び選択率が高いことが知られている。
ニトリルヒドラターゼを生産する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレビシエラ(Klebsiella)属、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属、ノカルディア（Nocardia）属等に属する細菌（微生物）を挙げることができる。中でも、ロドコッカス属細菌の一種であるロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株（以下、Ｊ１株と称する）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されており、有用性が実証されている。また、その菌株が産生するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子も明らかとなっている（特許文献１参照）。
【０００３】
また、ロドコッカス属細菌を、遺伝子組換えの方法でさらに有用なものに改変する試みがなされている。例えば、宿主−ベクター系を開発するためのプラスミドの探索、ベクターの開発などが行われている（特許文献２〜８）。
酵素を使用した化成品の工業生産においては、単離した酵素を使用するよりも、酵素が生産された微生物を触媒として使用する方がコストの面から好ましい。ロドコッカス属細菌は、一般的に、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏洩しにくいため、触媒として使用することに適しており、ロドコッカス属細菌の中でも、特にＪ１株は、アクリルアミドの工業生産での実績からアミド化合物を始めとする種々の化合物の生産のための宿主として有用である。
【０００４】
一方、触媒として作用する酵素は、基質特異性や反応条件により最適な酵素を選抜することが必要であり、本発明者らは、酵素の性能を改変し改良型とした異種ニトリルヒドラターゼを開発している。（特許文献９〜１２参照）。
酵素機能が改変された微生物を作製する方法としては、目的の酵素活性を有する微生物にNTG（N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン）やEMS（エチルメタンスルホン酸）等の変異誘起化合物を用いて変異処理を行い、目的の性能を有する変異株を取得する方法、または、酵素遺伝子を単離してPCRなどの手法で改変酵素遺伝子を作製し、遺伝子組み換え法を用いて組換え菌を作製する方法がある。
【０００５】
さらに、改変酵素を生産する組換え菌の作製には、発現目的とする酵素の酵素活性を有していない宿主菌に発現プラスミドとして導入する方法、又は相同組換えの手法で宿主菌のゲノムにある酵素遺伝子の欠失、あるいはゲノムにある酵素遺伝子を改良酵素遺伝子へ置換する方法がある。しかしながら、変異誘起化合物を使用する方法は、点突然変異であるため変異できるアミノ酸は一部に限定される（平均して3割から4割）、また目的とする酵素遺伝子以外にも複数の変異が挿入される問題があること、発現プラスミドを用いた方法では、組換え菌の培養に高価な抗生物質が必要であり、宿主菌が発現目的と同じ機能を有する酵素遺伝子を有していた場合、プラスミドから発現する酵素と、ゲノムDNAから発現する宿主由来の酵素が菌体内に混在することになり、発現目的とする酵素の性能が十分に発揮できない場合がある（特許文献１３参照）。一方、宿主菌のゲノム遺伝子と置換する方法では相同組換えの技術が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第3162091号公報
【特許文献２】特開平4-148685号公報
【特許文献３】特開平4-330287号公報
【特許文献４】特開平7-255484号公報
【特許文献５】特開平5-64589号公報
【特許文献６】特開平8-56669号公報
【特許文献７】米国特許第4,920,054号明細書
【特許文献８】特開平8-173169号公報
【特許文献９】国際公開第2005/116206号
【特許文献１０】特開2007-43910号公報
【特許文献１１】特開2007-143409号公報
【特許文献１２】特開2008-253182号公報
【特許文献１３】国際公開第06/062189号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アミド化合物の工業生産においては、安定な触媒が求められ、そのためには目的とするニトリルヒドラターゼ遺伝子を工業生産の実績があるロドコッカス属細菌に導入した遺伝子組換え菌を作製することが有効である。
ロドコッカス属細菌をより有効に活用するためには、目的に応じてロドコッカス属細菌のゲノム上の遺伝子を特異的に置換等することにより、改変することが効果的である。
【０００８】
ところで、ゲノム上に存在する遺伝子を置換する手法としては、相同組換え（Homologous recombination）を利用する方法が挙げられる。これは、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、当該遺伝子が機能発現しない状態にする、又は（標的遺伝子を当該遺伝子の一部若しくは全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。大腸菌や酵母等のいくつかの微生物では、効率的な相同組換え技術が確立しているため（例えば、SOE-PCR法（例えば、SOE-PCR（Gene, vol. 77, p. 61-68（1989））、比較的容易に標的遺伝子の欠失又は不活性化を行うことができる。
ロドコッカス属細菌において相同組換えにより遺伝子欠失又は不活性化を行う場合、エレクトロポレーション法等が知られている。しかしながら、ロドコッカス属細菌及びその類縁属細菌は非相同組換えが起こり易いという特徴を有しているため、目的の相同組換え株が極めて低確率でしか得られないという問題がある。
【０００９】
従って、ロドコッカス属細菌などのニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物について、当該微生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子が異種のニトリルヒドラターゼ遺伝子（例えば、改良型のニトリルヒドラターゼ遺伝子）に置換されたものは、十分に得られていないのが現状である。
このような状況下において、より効率的かつ汎用的にニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換させた、遺伝的に改変された微生物の取得及び開発が望まれていた。具体的には、本発明はロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を開発及び確立し、当該微生物（宿主）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた改変微生物をより効率的かつ汎用的に得ることが望まれていた。さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼを効率的に産生し、これを用いて低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することが望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換した微生物、ニトリルヒドラターゼ（異種ニトリルヒドラターゼ）の製造方法、及びアミド化合物の製造方法等を提供するものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１１】
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物。
本発明の微生物において、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物は、例えば、ロドコッカス属細菌又はノカルディア属細菌が挙げられる。ここで、ロドコッカス属細菌は、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）Ｊ１株又はその変異株が挙げられる。
本発明の微生物において、置換されるニトリルヒドラターゼ遺伝子は、例えば、高分子量型ニトリルヒドラターゼ遺伝子及び／又は低分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子が挙げられる。
【００１２】
本発明の微生物は、例えば、前記置換が、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法により行われるものが挙げられる。
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた配列、(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）前記（ｂ）で作製されたドナー微生物から前記（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）前記（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００１３】
ここで、上記接合伝達を利用した形質転換方法において、ドナー微生物は、例えば、大腸菌が挙げられる。また、ドナー微生物が感受性を示す薬剤は、例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、カルベニシン及びナルジクス酸からなる群より選ばれる少なくとも１種が挙げられる。さらに、レシピエント微生物が感受性を示す薬剤は、例えば、カナマイシンが挙げられる。
【００１４】
（２）上記(1)に記載の微生物及を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
（３）上記(1)に記載の微生物を培養して得られる培養物又は当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させ、当該接触により生成されるアミド化合物を採取することを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物、特にロドコッカス属細菌等の微生物について、当該微生物ゲノム上のニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（例えば、改良型ニトリルヒトラターゼ遺伝子）に置換させた微生物を、より一層効率的かつ汎用的に提供することができる。
具体的には、本発明によれば、ロドコッカス属細菌等の微生物における相同組換え技術を確立し、上記のような遺伝的に改変した微生物を効率的かつ汎用的に得ることができる。さらには、当該改変微生物を用いて異種ニトリルヒドラターゼ（例えば、改良型のニトリルヒトラターゼ）を効率的に産生すること、及び当該微生物を微生物触媒として用いて様々なニトリル化合物から低コストかつ高効率でアミド化合物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本実施例における、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図である。
【図２】本実施例における、プラスミドpBKHN10の構造を示す模式図である。
【図３】相同組換えの概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００１８】
１．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物
本発明に係るニトリルヒドラターゼ遺伝子が置換された微生物（以下、「本発明の微生物」ということがある）は、前述した通り、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物におけるニトリルヒドラターゼ遺伝子が、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物である。
本発明の微生物が得られる前の、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物（対象微生物）としては、ニトリルヒドラターゼを産生し、その活性を示すものであればよく、特に限定はされないが、例えば、ロドコッカス属細菌、バチルス属細菌、シュードノカルディア属細菌、ジオバチルス属細菌、シュードモナス属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌等が好ましく挙げられる。中でもロドコッカス属細菌は、細胞壁が強固で反応液中へタンパク質などの菌体内容物が漏れないため、産業的に微生物触媒としての使用等に適している点でより好ましい。
【００１９】
ロドコッカス・ロドクロウスとしては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス J1、ロドコッカス・ロドクロウス M8(SU1731814)、ロドコッカス・ロドクロウス M33（VKM Ac-1515D）及びロドコッカス・ロドクロウス ATCC39484（特開平2001-292772号）等が好ましく挙げられる。ロドコッカス・ピリジノボランスとしては、例えば、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2（国際公開第03/066800号）、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38（特願2004-151508号）等が好ましく挙げられる。
また、バチルス属細菌としては、例えば、バチルス・スミシ（Bacillus smithii）(特開平09-248188号)等が好ましく挙げられる。シュードノカルディア属細菌としては、例えば、シュードノカルディア・サーモフィラ JCM3095(特開平09-275978号)、等が好ましく挙げられる。ジオバチルス属細菌としては、例えば、ジオバチルス・サーモグルコシダシアス（国際公開第04/108942号）、ジオバチルス・カルドキシロシチリカス M16（特開2006-158323号）等が好ましく挙げられる。シュードモナス属細菌としては、例えば、シュードモナス・クロロラフィス B23（特開昭58- 86093）シュードモナス・プチダ DSM16276（国際公開第05/2689号）、シュードモナス・マルギナリス DSM16275（国際公開第05/2689号）、ノカルディア属細菌としては、例えばノカルディア YS-2002株（CN1584024）、ノカルディア sp.JBRs（GenBankアクセッション番号:AY141130）が好ましく挙げられる。
【００２０】
ニトリルヒドラターゼは、以下の反応式に示すように、ニトリル化合物のニトリル基に作用し、対応するアミド化合物に変換する水和反応を触媒する酵素である。
R-CN + H2O → R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す。)
【００２１】
ここで、「ニトリルヒドラターゼ活性」とは、ニトリル化合物のニトリル基に作用して対応するアミド化合物に変換させる活性を意味する。ニトリルヒドラターゼ活性の測定方法としては、例えば、ニトリル化合物の１種であるアクリロニトリルを用いる方法が挙げられる。この方法では、ニトリルヒドラターゼ活性の結果としてアクリロニトリルに対応するアミド化合物、すなわちアクリルアミドが得られる。従って、本発明の微生物等のニトリルヒドラターゼ活性（異種ニトリルヒドラターゼ活性）を測定する場合は、当該微生物等をアクリロニトリルに接触させ、生成するアクリルアミドの量の増加を定量することで、ニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。あるいは、アクリロニトリルの消費量を定量することによってもニトリルヒドラターゼ活性を測定することができる。
【００２２】
本発明の微生物は、本来有する（当該微生物由来の）ニトリルヒドラターゼ遺伝子が置換されたものであるが、この置換される遺伝子（標的遺伝子）としては、対象微生物のゲノムDNAにコードされるニトリルヒドラターゼ遺伝子の全部又は一部の領域であってもよく、限定はされず、例えば、当該遺伝子のプロモーター配列の全部又は一部の領域であってもよいし、発現調節に関連する遺伝子の全部又は一部の領域であってもよいし、これらの領域を複数組み合わせたものであってもよい。
なお、本発明においては、例えば、上記対象微生物がロドコッカス・ロドクロウス J1株の場合は、本来有するニトリルヒドラターゼ遺伝子として、高分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号1）と低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子（配列番号5）との２種のニトリルヒドラターゼ遺伝子を有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一方でもよいし、両方でもよく、限定はされない。なお、上記高分子量型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhhG）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号2〜4に示した。同様に、上記低分子量型ニトリルヒドラターゼの遺伝子のαサブユニット、βサブユニット及びβホモログ（nhlE）をコードする遺伝子を、それぞれ順に、配列番号6〜8に示した。
【００２３】
本発明における、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、前記対象微生物が有するニトリルヒドラターゼ遺伝子と翻訳後のアミノ酸配列が異なるニトリルヒドラーゼ遺伝子を意味する。すなわち、異種ニトリルヒドラターゼとは、前記対象微生物のゲノムDNAにコードされたニトリルヒドラターゼと比較して、そのアミノ酸配列中、１残基以上のアミノ酸が異なる（置換、挿入(付加)又は欠失等）ものが含まれ、アミノ酸配列ホモロジーで80％を超えるニトリルヒドラターゼは使用することができる。具体的には、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス J1株を対象微生物とした場合は、国際公開第2005/116206号、特開2007-43910号、特開2007-143409号及び特開2008-253182号等に記載の改良型のニトリルヒドラターゼや、前記ニトリルヒドラターゼとDNA配列ホモロジー、あるいはアミノ酸配列ホモロジーの高いノカルデァ YS-2002株、ノカルディア sp.JBRs、ロドコッカス・ピリジノボランス S85-2、ロドコッカス・ピリジノボランス MW3株、ロドコッカス・ピリジノボランス MS-38株、ロドコッカス・ロドクロウス M8株などが異種ニトリルヒドラターゼ（改変ニトリルヒドラターゼ）として好ましく挙げられる。これらの異なる菌種由来の異種ニトリルヒドラターゼの遺伝子は、例えば、それらを産生し得る微生物を培養し、培養した菌からゲノムDNAを調製してPCR増幅することによって得ることができる。
【００２４】
なお、上記挿入(付加)されるアミノ酸（アミノ酸配列）の例としては、リンカー配列及びタグ配列等が挙げられる。タグ配列の例としては、His-tag（6〜10残基のヒスチジン）、GST-tag（Glutathione S-Transferase）、MBP-tag：Maltose Binding Protein（マルトース結合タンパク質）、Strep-tag（8残基のアミノ酸Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）、HQ-tag（ヒスチジンとグルタミンが交互に連続したペプチドタグ）、HN-tag（ヒスチジンとアスパラギンが交互に連続したペプチドタグ）、HAT-tag（ニワトリの乳酸脱水素酵素由来のペプチドタグ）などが挙げられる。タグ配列を付加する場所はN末端とC末端の両方が使用できる。また、上記欠失されるアミノ酸（アミノ酸配列）としては、酵素活性に影響のない数個から10個程度のアミノ酸残基（アミノ酸配列）が挙げられ、欠失の場所としてはN末端とC末端が好ましい。
さらに、本発明の微生物（ニトリルヒドラターゼ遺伝子が異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物）は宿主微生物としても用いることができ、この場合、本発明の微生物にさらに他の異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（前記置換により導入された異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子と同種であっても異種であってもよい）を発現ベクター等により導入した形質転換体（形質転換微生物）を作製し使用することができる。
【００２５】
また、本発明の微生物等が産生するニトリルヒドラターゼ（異種ニトリルヒドラターゼ）は、さらにアミド化合物耐性としての性質を有することが好ましい。ここで、「アミド化合物耐性」とは、他の微生物由来のニトリルヒドラターゼと比較して、アミド化合物存在下でニトリルヒドラターゼ活性をより高活性で維持し得ることを意味する。本発明の微生物等が産生するニトリルヒドラターゼが耐性を示すアミド化合物としては、限定はされないが、例えば、以下の化学式で表されるアミド化合物が好ましく挙げられる。
R-CONH2
(式中、Rは、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のアルケニル基、置換又は無置換のシクロアルキル基、置換又は無置換のアリール基、あるいは、置換又は無置換の飽和又は不飽和複素環基を表す)
上記式で表されるアミド化合物としては、例えば、式中のRがCH2=CHであるアクリルアミドが好ましい。
【００２６】
２．ニトリルヒドラターゼ遺伝子が改変された微生物の製造
本発明において、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよいが、例えば、以下の方法が好ましく挙げられる。
すなわち、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、ドナー微生物からニトリルヒドラターゼ活性を有するレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法（詳しくは、当該形質転換方法を用いることを含むニトリルヒドラターゼ遺伝子の置換方法）方法により、本発明の微生物が得られることが好ましい。なお、図３に当該置換方法の概略を示す。
【００２７】
（ａ）レシピエント微生物として、前記接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化された微生物を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記(i)〜(v)：
(i)レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた塩基配列領域、
(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv)レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び
(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００２８】
上記置換方法において用いるレシピエント微生物としては、限定はされないが、前述したニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物が例示できる。中でもロドコッカス属細菌が、前述と同様の理由でより好ましい。ロドコッカス属細菌等の具体例についても、前述と同様のものが挙げられる。
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であればよく、限定はされないが、例えば、大腸菌が好ましい。
【００２９】
2.1. 工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化した微生物を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強化することをいう。
接合伝達法を使用する場合、レシピエントとなる微生物には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していない微生物、又は薬剤耐性の乏しい微生物を使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株（レシピエント）の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物（接合伝達時のドナー微生物）が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、具体的には、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール及びアンピシリン等がより好ましい。
【００３０】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、EZ-Tn5（Epicentre社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエント微生物が持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００３１】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。レシピエント微生物の薬剤耐性をどの程度まで強化するかについては、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物及び選択する薬剤により異なるため適宜調整することができるが、レシピエント微生物の生育が抑制されず、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を基準に強化することが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール1〜200 mg/L、好ましくは10〜100 mg/Lを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
【００３２】
2.2. 工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミド（接合用プラスミド）を用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子を改変するためのプラスミドDNAとしては、前述の(i)〜(v)の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
ここで、前記(i)の配列は、改変の対象とするレシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ニトリルヒドラターゼ遺伝子を異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換させた塩基配列領域である。当該塩基配列領域の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、ニトリルヒドラターゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）、遺伝子ライブラリー作製やPCR等の公知技術を用いて行うことができる。なお、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、限定はされないが、例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流及び下流の相同領域が両端からそれぞれ100〜3000 bpの塩基配列を含む配列であることが好ましく、より好ましくは500〜2000 bpの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前記(i)の塩基配列を作製する方法は特に限定されず、PCR法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除又は置換等の公知技術を用いて行うことができる。
【００３３】
単離したニトリルヒドラターゼ遺伝子を置換する方法としては、限定はされず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、SOE-PCR法や、ゲノムDNAの相同領域を有するプラスミドを形質転換する方法を用いることができる。さらに、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法が使用できる。
前記(ii)の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であればよく、特に限定はされず、例えば、Fプラスミド由来の接合伝達開始領域を含む配列、プラスミドR6K由来のoriT、プラスミドRP4由来のoriTが好ましい。
前記(iii)の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前記遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であればよく、特に限定はされず、例えば、oriVや、プラスミドpMB1及び広宿主域プラスミドRK2由来の複製開始点並びにその派生物等を含む領域の使用が好ましい。
【００３４】
前記(iv)の薬剤耐性遺伝子は、接合伝達に供するレシピエント微生物（例えばロドコッカス属細菌等）が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。レシピエント微生物がこれらの薬剤耐性を有していない場合、所望の薬剤耐性を有する変異株を作製し、使用することができる。
前記(v)の条件致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、特に限定はされず、例えば、sacB遺伝子が好ましい。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌等）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素をコードする遺伝子である。
【００３５】
接合伝達に用いる前記遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、限定はされないが、例えば、レシピエント微生物がロドコッカス属細菌の場合は、pK19mobベクター（Schaefer et al, Gene1, vol. 45, p. 69-73(1994)）等を用いることが好ましい。
前記遺伝子改変用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、例えば、上流から順に、前記(i)の配列、前記(iv)の耐性遺伝子、前記(v)の条件致死遺伝子、前記(ii)の接合伝達開始領域、前記(iii)の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前記(i)〜(v)の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
工程（ｂ）では、上述したような各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換された微生物、すなわち接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や塩化カルシウム法等の、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。
【００３６】
2.3. 工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの菌体懸濁液を混合し、適当なプレート培地（LB培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で相同組換が起こり、遺伝子改変用プラスミドの一部又は大部分が当該レシピエント微生物のゲノム上に導入される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体が、すなわち相同組換え株が作製される。
本工程（ｃ）における所望の相同組換え株は、1重交差により標的遺伝子の上流又は下流に当該遺伝子改変用プラスミドが導入されたものである。
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前記遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
【００３７】
2.4. 工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前記遺伝子改変用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が好ましく挙げられる。
当該培養においては、上記条件致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記条件致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得る（選抜する）ことができる。ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のニトリルヒドラターゼ遺伝子が、当初の目的の通り置換されているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元の（異種でない）ニトリルヒドラターゼ遺伝子に復活したもの）とが含まれ得る。よって、通常は、ゲノム上のニトリルヒドラターゼ遺伝子のDNA配列確認や、さらに別の培養条件で培養したり、培養物を用いてニトリルヒドラターゼ活性測定や各種タンパク質分析法を適用して分析することにより、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００３８】
３．ニトリルヒドラターゼの製造方法
本発明のニトリルヒドラターゼの製造方法、詳しくは、異種ニトリルヒドラターゼの製造方法は、前述した本発明の微生物を培養し、得られる培養物から前記異種ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする方法である。
ここで、当該製造方法に用いる本発明の微生物としては、具体的には、ニトリルヒドラターゼ遺伝子が異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子に置換された微生物、すなわちゲノム上の異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子の発現により異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物が挙げられる。
また、当該微生物は、後述する形質転換微生物の宿主としても用いることができる。
当該形質転換微生物としては、従来公知の遺伝子組換え技術等により、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子（前記置換により導入されている異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子と同種であっても異種であってもよい）が発現し得るように導入されたものであればよく、限定はされないが、例えば、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む組換えベクター（発現ベクター）等を導入することによりなされたものが好ましい。
【００３９】
組換えベクターを用いる場合は、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が、形質転換される本発明の微生物において発現可能なように、ベクターに組み込まれることが必要である。例えば、異種ニトリルヒドラターゼを産生し得る微生物のゲノム等から異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むPCR断片を得て、得られた断片を発現ベクターに連結することで、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む発現ベクターを得ることができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられ、中でもプラスミドDNAが好ましい。異種ニトリルヒドラターゼを発現させるためのベクター（プラスミドDNA）としては、限定されないが、例えば、ロドコッカス属細菌を宿主とする場合は、pSJ034、pSJ041、pSJ042、pSJ043等が好ましい。pSJ034は、ロドコッカス属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するベクターであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。このpSJ023は、形質転換体 ATCC16274/pSJ023（FERM BP-6232）として、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成９年３月４日付けで国際寄託されている。
【００４０】
当該発現ベクターには、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子のほか、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
本発明において、「培養物」とは、培養上清、培養菌体又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換微生物を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。目的の異種ニトリルヒドラターゼは、上記培養物中に蓄積される。
【００４１】
形質転換微生物を培養する培地は、宿主菌となる本発明の微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅若しくは炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。さらに、培地にはニトリルヒドラターゼの補欠分子であるコバルトイオンや鉄イオンを添加し、酵素の誘導剤となるニトリル類やアミド類を添加してもよい。
【００４２】
培養中、発現ベクターや目的遺伝子（置換によりゲノム上に導入した異種ニトリルヒドラターゼも含む）の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、発現ベクター等における選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加したり、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いたりしてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した微生物を培養する場合、培養中、必要に応じてアンピシリンを添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換微生物を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。
【００４３】
形質転換微生物の培養条件は、発現目的の異種ニトリルヒドラターゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば、特段限定されるものではない。通常、10℃〜45℃、好ましくは10℃〜40℃の温度下で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行うことができる。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて、適時調整を行うことが好ましい。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられるが、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましい。また、場合により、本培養に先立ち、少量の前培養を行うこともできる。例えば、ロドコッカス属細菌の形質転換微生物を培養する場合は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、30〜40℃の温度下で行うことが好ましい。
上記培養条件で培養すると、高収率で異種ニトリルヒドラターゼを上記培養物中、すなわち培養上清、培養菌体又は菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積することができる。これら異種ニトリルヒドラターゼを含有する「培養物」は、後述するアミド化合物の製造方法に使用することができる。
【００４４】
培養後、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより、目的の異種ニトリルヒドラターゼを採取することができる。菌体の破砕方法としては、フレンチプレス又はホモジナイザーによる高圧処理、超音波処理、ガラスビーズ等による磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ又はペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕後、必要に応じて菌体の破砕残渣（菌体抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。残渣を除去した後に得られた上清は、菌体抽出液可溶性画分であり、粗精製した異種ニトリルヒドラターゼ溶液とすることができる。
また、異種ニトリルヒドラターゼが菌体内に生産される場合、菌体そのものを遠心分離、膜分離等で回収して、未破砕のまま使用することも可能である。
【００４５】
異種ニトリルヒドラターゼが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離やろ過等により菌体を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から異種ニトリルヒドラターゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて単離精製することもできる。
形質転換微生物を培養して得られた異種ニトリルヒドラターゼの生産収率は、例えば、培養液あたり、菌体湿重量又は乾燥重量あたり、粗酵素液タンパク質あたりなどの単位で、SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）やニトリルヒドラターゼ活性測定などにより確認することができるが、特段限定されるものではない。SDS-PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。また、異種ニトリルヒドラターゼ活性は、上述した活性の値を適用することができる。
【００４６】
４．アミド化合物の製造方法
上述のように製造された異種ニトリルヒドラターゼ（前述した培養物を含む）は、酵素触媒（菌体のまま利用する微生物触媒等を含む）として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、異種ニトリルヒドラターゼを接触させ、当該接触によりニトリル化合物が変換されて生成されるアミド化合物を採取することにより、アミド化合物を製造することができる。
酵素触媒としては、前述のように適当な宿主内で異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子が発現するように遺伝子導入を行い、宿主を培養した後の培養物、又は当該培養物の処理物を利用することができる。処理物としては、例えば、培養後の菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、グルタルアルデヒドで処理したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。
基質として使用されるニトリル化合物は、酵素の基質特異性、酵素の基質に対する安定性等を考慮して選択される。ニトリル化合物としては、アクリロニトリルが好ましい。
【００４７】
反応方法、及び反応終了後のアミド化合物の採取方法は、特に限定はされず、基質及び酵素触媒の特性により適宜選択することができる。例えば、当該反応において、基質となるニトリル化合物の濃度は、0.1〜10% (W/V)が好ましく、5％ (W/V)程度が特に好ましい。また、当該反応は、pH 5〜10の緩衝液又は水中で行うことが好ましく、例えば、50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で行うことができる。反応後の酵素触媒は、その活性が失活しない限り、リサイクル使用することが好ましい。失活の防止やリサイクルを容易にすることに鑑み、酵素触媒は処理物の形態で使用されることが好ましい。
上記反応により生成したアクリルアミドは、ガスクロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて定量することができる。また、アクリルアミドの産生量から前記酵素触媒のニトリルヒドラターゼ活性を換算することができる。
【００４８】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
異種（改変）ニトリルヒドラターゼ置換用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミド（pK19mobsacB1）の作製
pDNR-1r（clontech社製）中のsacB遺伝子を、NspV切断サイトを付加したプライマーSAC-01（配列番号9）及びSAC-02（配列番号10）を使用したPCRにより増幅し、約1.9 kbのsacB遺伝子断片を得た。PCRは以下の反応条件で行った。
【００５０】
プライマー：
SAC-01：  5'-GGTTCGAATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTG-3'（配列番号９）
SAC-02：  5'-GGTTCGAATCGGCATTTTCTTTTGCGTTTTTATTTG-3'（配列番号１０）
【００５１】
反応液組成：
滅菌水                                 22 μl
2×PrimeSTAR（タカラバイオ社製）       25 μl
プライマーSAC-01（配列番号９）          1 μl
プライマーSAC-02（配列番号１０）        1 μl
pDNR-1r（clontech社製）（100倍希釈）    1 μl  
総量                                   50 μl
【００５２】
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 150秒の反応を30サイクル、72℃ 300秒の反応を1サイクル
【００５３】
sacB遺伝子断片を制限酵素NspV（タカラバイオ社製）で消化後、pK19mobのNsp Vサイトに接続し、sacB遺伝子が正方向に導入されたプラスミドpK19mobsacB1を構築した。pK19mob Nsp V切断断片とsacB遺伝子断片及びsacB遺伝子Nsp V切断断片の精製にはGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit（GE Healthcare社製）を、両断片の接続にはDNA Ligation Kit ＜Mighty Mix＞を、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit（QIAGEN社製）を用いた。
【００５４】
（２）J1株ゲノムDNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株(以下、J1株と称する)を100mlのMYK培地（0.5％ポリペプトン、0.3％バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、１％ グルコース、0.2％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、pH7.0）中、30℃にて72時間振盪培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0)）4mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40 mgを加えて、37℃で1〜2時間振盪した後、-20℃で凍結した。
次に、10mlのTris-SDS液（1％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0)）を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼK（メルク社）を10μl（終濃度10mg/ｍｌ）加えて37℃で1時間振盪した。
次に、等量のTE (10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)) 飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻きとり、90％、80％、70％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００５５】
次に、DNAを3mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液(100℃、15分間の加熱処理済)を10μg/mlになるよう加え、37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振盪した後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム（4％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻きとり回収し、Ｊ１株ゲノムのDNAを得た。このゲノムDNAは、配列番号１に示すニトリルヒドラターゼ遺伝子を有している。
【００５６】
（３）異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子の作製と発現プラスミドの構築
ニトリルヒドラターゼ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下の反応条件でPCRを行った。
【００５７】
プライマー：
NH-Sub01:  5'-GGCCTGCAGGggtgagggctctgatgacagttgc-3'（配列番号１１）
NH-Sub02:  5'-CCTCTAGAatgaccggcgtgtcgtaaccggacg-3'（配列番号１２）
【００５８】
反応液組成：
鋳型DNA（Ｊ１株ゲノムDNA）           1μl
プライマーNH-Sub01（配列番号１１） 0.5μl
プライマーNH-Sub02（配列番号１２） 0.5μl
滅菌水                               8μl
PrimeSTAR（タカラバイオ）           10μl  
総量                                20μl 
【００５９】
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 60秒の反応を30サイクル
【００６０】
PCR終了後、反応液2μlを0.7％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、約4.5kbのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)（タカラバイオ）でpUC118にクローニングし、DNA配列を確認し、pUC-JN01と命名した。
【００６１】
次に、異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子を作製した。異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子は、特開2007-43910号公報（特願2005-228736）に記載の改良型ニトリルヒドラターゼ（「Nα↑60D，Dβ←209G，Iα↓95T」のアミノ酸置換）をコードする遺伝子として作製した。
ここで、上記アミノ酸置換の態様（すなわち「Nα↑60D，Dβ←209G，Iα↓95T」）は、具体的には、Ｊ１菌由来の野生型ニトリルヒドラターゼのαサブユニット（配列番号２）の塩基配列のうち、ＣＴＬＣＳＣ領域（補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列領域）の最も上流側のＣ残基より６０残基上流のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換され（この置換は「Nα↑60D」と表記される）、上記ＣＴＬＣＳＣ領域の最も下流側のＣ残基より９５残基下流のイソロイシン（Ｉ）がスレオニン（Ｔ）に置換され（この置換は「Iα↓95T」と表記される）、さらに、Ｊ１菌由来の野生型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット（配列番号１）の塩基配列のうちＣ末端のアミノ酸残基から（当該アミノ酸残基を含めて数えて）２０９番目のアスパラギン酸（Ｄ）がグリシン（Ｇ）に置換された（この置換は「Dβ←209G」と表記される）アミノ酸残基の置換態様を意味するものである。
【００６２】
まず、下記の反応条件でPCRを行うことにより、「α↑60D」のアミノ酸置換を導入した。
【００６３】
プライマー（「α↑60D」アミノ酸置換用）：
Forward-プライマー（α↑60D-F）：
gtcgtttcgtactacgaggacgagatcggcccgatgg（配列番号１３）
Reverse-プライマー（α↑60D-R）：
ccatcgggccgatctcgtcctcgtagtacgaaacgac（配列番号１４）
【００６４】
反応液組成：
pUC-JN01                           1μl
10μM Forward-プライマー           1μl
10μM Reverse-プライマー           1μl
滅菌水                             7μl
PrimeSTAR（タカラバイオ）         10μl  
総量                              20μl
【００６５】
温度サイクル：
98℃ 10秒、55℃ 15秒及び72℃ 60秒の反応を30サイクル
【００６６】
各反応液にDpnIを1μl添加し、37℃で１時間インキュベートし、DpnI処理液を用いて大腸菌JM109に形質転換を行った。得られた形質転換体のDNA配列を確認し、pUC-JN02と命名した。
さらに下記のプライマーを使用し、上記と同様の方法で、「Dβ←209G」及び「Iα↓95T」の変異をそれぞれ順に追加導入した。得られたプラスミドをpUC-JN04と命名した。
【００６７】
プライマー（「β←209G」アミノ酸置換用）：
Forward-プライマー（β←209G-F）：
gtcccctatcagaaggGcgagcccttcttccac（配列番号１５）
Reverse-プライマー（β←209G-R）：
gtggaagaagggctcgCccttctgataggggac（配列番号１６）
【００６８】
プライマー（「α↓17G」アミノ酸置換用）：
Forward-プライマー（α↓17G-F）：
acaccgcaggaagtgaCcgtatgagtgaagac（配列番号１７）
Reverse-プライマー（α↓17G-R）：
gtcttcactcatacgGtcacttcctgcggtgt（配列番号１８）
【００６９】
次に、上記でクローニングした断片を制限酵素XbaI、Sse8387Iで切断し、約6Kbの断片を回収し、接合伝達用のプラスミド（pK19mobsacB1）のXbaI-Sse8387I部位に連結し、プラスミドを作製した。得られたプラスミドは異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子置換プラスミド：pBKNH10と名付けた。図１に、プラスミドpK19mobsacB1の構造を示す模式図を、図２に、プラスミドpBKNH10の構造を示す模式図を示した。
【実施例２】
【００７０】
薬剤耐性を有するＪ１株の作製
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子置換株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、アンピシリン耐性を有するＪ１株の変異株を下記の方法で取得した。
2μg／mlのアンピシリンを含んだMYKプレート（0.5% ポリペプトン、0.3% バクトイーストエキス、0.3% マルツエキス、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5% 寒天）にＪ１株をストリークし、コロニーが生育するまで30℃で保温した。約２週間後、アンピシリン耐性株が生育してきたので、再度2μg／mlのアンピシリンプレートにストリークして、30℃で保温した。
【００７１】
次に、2μg／mlのアンピシリンプレートから生育したコロニーを、５μg／mlのアンピシリンプレートにストリークし、耐性株が出現するまで30℃で保温した。以下、同様の操作を、アンピシリン濃度を10μg／ml→15μg／ml→50μg／ml→100μg／mlの順に高めながら繰り返し、100μg／mlのアンピシリン濃度で生育するアンピシリン耐性株（J1-Amp株）を得た。
【実施例３】
【００７２】
接合伝達による遺伝子置換
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に大腸菌S17-1λpirのコンピテントセル20μlにプラスミドpBKHN01 １μlを加え、氷上で30分静置した。42℃で30秒ヒートショック後、SOC培地を180μl添加し、37℃で1時間振とう培養を行った。その後、50μg/mlカナマイシンを含んだLBプレートに塗布し、37℃で一晩静置した。
翌日、プレートに生育したコロニーをLB培地1ｍｌで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に0.5mlのLB培地を添加し、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液をドナー溶液とした。
【００７３】
（２）レシピエントの調整
J1−Amp株をMYKプレートにストリークし、30℃で2日生育させた。生育したコロニーは実施例３（１）と同様の方法で回収及び洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【００７４】
（３）接合伝達
実施例３（１）で調製したドナー溶液と、実施例３（２）で調製したレシピエント溶液を100μlずつ混合し、抗生物質を含まないMYKプレートに塗布し、30℃で一晩静置した。
翌日、生育したコロニーは１ｍｌのLB培地で回収し、100μlずつカナマイシン濃度を10、30、50μg/mｌとした選抜プレート（すべて100μg/mlアンピシリンを含む）に塗布した。塗布したプレートは組み換え菌コロニーが出現するまで30℃で1週間保温した。
その結果、100μg/ｍｌアンピシリン、10μg/ｍｌカナマイシンを含んだプレートに複数のコロニーが出現し、得られたコロニーを＃77〜80と命名し、以後の実験に使用した。
【００７５】
（４）異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子への置換
接合伝達により得られた組み換え菌＃77〜80は、ゲノム中に野生型ニトリルヒドラターゼ遺伝子と改良型としての異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子とが存在している。野生型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を欠失するためには2段階の相同組換えが必要であるため、sacB遺伝子を利用した選抜を実施した。
10％ショ糖を含んだMYKプレートを作製し、＃77〜80のコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニーについて各２個のコロニーからゲノムDNAを調製し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のDNA配列を確認した。
その結果、ゲノム中のニトリルヒドラターゼ遺伝子は、上記改良型としての異種ニトリルヒドラターゼ遺伝子であることを確認した。
【配列表フリーテキスト】
【００７６】
配列番号９〜１８：合成DNA
【図１】
2011217665.tif 000002
【図２】
2011217665.tif 000003
【図３】
2011217665.tif 000004
【配列表】
2011217665000001.app