(57)【要約】【課題】短期間で、しかも簡便に結核菌の型別を精度良く検査することが可能な結核菌の型別法を提供すること。【解決手段】本発明の結核菌の型別法は、VNTR法とマルチプレックスPCRとを組み合わせ、分子量領域が異なる分布を示す増幅産物が得られるように特定のプライマーセットを用い、かつ異なる標識により電気泳動してそのサイズを決定することを特徴とする。従って、従来のVNTR法よりもPCRの反応数を少なくでき、かつ電気泳動に必要なレーン数も少なくでき、結核菌の集団感染疑い事例を、極めて容易に且つ確実に確認する方法として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌ゲノム上のミニサテライト中の特定のローカスのコピー数を調べる反復配列多型（VNTR）法を用いた結核菌の型別法であって、
互いに異なるローカスのDNAを核酸増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるオリゴヌクレオチドプライマー対を２種類含むプライマーセットを、複数準備する工程(A1)と、
工程(A1)で準備したプライマーセット毎にマルチプレックスPCRにより、結核菌における互いに異なるローカスのDNAを核酸増幅する工程(B1)と、
工程(B1)で得られた各マルチプレックスPCR毎の増幅産物を各々電気泳動によりそのサイズを分類し、予め決められた反復配列のコピー数を決定する工程(C1)とを含み、
工程(A1)において準備する各２種類のオリゴヌクレオチドプライマー対が、PCRによる増幅産物が低分子を中心に分布するローカスに対応するものと、高分子を中心に分布するローカスに対応するものとに分け、分子量領域の分布が異なる組となるように選択され、一方のローカスに対応するオリゴヌクレオチドプライマー対のフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーを予め標識しておき、他方のローカスに対応するオリゴヌクレオチドプライマー対により工程(B1)で得られる増幅産物を、工程(C1)の電気泳動後に異なる標識で識別することを特徴とする結核菌の型別法。
【請求項２】
工程(A1)で準備するオリゴヌクレオチドプライマー対とは異なるローカスのDNAを核酸増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーからなる１対のオリゴヌクレオチドプライマー対を準備する工程(A2)と、
工程(A2)で準備したオリゴヌクレオチドプライマー対をPCRにより、工程(B1)におけるローカスとは異なるローカスのDNAを核酸増幅する工程(B2)と、
工程(B2)で得られたPCRの増幅産物を電気泳動によりそのサイズを分類し、予め決められた反復配列のコピー数を決定する工程(C2)とを含む請求項１記載の結核菌の型別法。
【請求項３】
工程(A1)及び工程(A2)で準備するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基数が１８〜３５である請求項１又は２記載の結核菌の型別法。
【請求項４】
工程(A1)において、予め行う標識が蛍光標識であって、工程(C1)の電気泳動後に行う異なる標識が臭化エチジウム標識である請求項１〜３のいずれかに記載の結核菌の型別方法。
【請求項５】
結核菌が、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)である請求項１〜４のいずれかに記載の結核菌の型別法。
【請求項６】
フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるオリゴヌクレオチドプライマー対が、以下の結核菌H37Rvゲノム(4.4Mb)の塩基配列番号(1)〜(15)から選択される位置の塩基配列に対応するプライマーであることを特徴とする請求項５記載の結核菌の型別法。
(1)423840-423886の18-35塩基配列(VNTR-0424-F)と424452-424498の18-35塩基配列(VNTR-0424-R)との対、
(2)959859-959905の18-35塩基配列(MIRU-10-F)と960475-960521の18-35塩基配列(MIRU-10-R)との対、
(3)1955520-1955566の18-35塩基配列(VNTR-1955-F)と1955760-1955806の18-35塩基配列(VNTR-1955-R)との対、
(4)2074396-2074442の18-35塩基配列の対(VNTR-2074-F)と2074618-2074664の18-35塩基配列(VNTR-2074-R)との対、
(5)2163600-2163646の18-35塩基配列(VNTR-2163b-F)と6164120-2164166の18-35塩基配列(VNTR-2163b-R)との対、
(6)2372386-2372432の18-35塩基配列(VNTR-2372-F)と2372693-2372703の18-35塩基配列(VNTR-2372-R)との対、
(7)2995972-2996018の18-35塩基配列(MIRU-26-F)と2996383-2996429の18-35塩基配列(MIRU-26-R)との対、
(8)3155823-3155869の18-35塩基配列(VNTR-3155-F)と3156093-3156139の18-35塩基配列(VNTR-3155-R)との対、
(9)3191968-3192014の18-35塩基配列(MIRU-31-F)と3192592-3192638の18-35塩基配列(MIRU-31-R)との対、
(10)3336456-3336502の18-35塩基配列(VNTR-3336-F)と3336836-3336882の18-35塩基配列(VNTR-3336-R)との対、
(11)4052885-4052931の18-35塩基配列(VNTR-4052-F)と4053589-4053635の18-35塩基配列(VNTR-4052-R)との対、
(12)4156606-4156652の18-35塩基配列(VNTR-4156-F)と4157282-4157328の18-35塩基配列(VNTR-4156-R)との対、
(13)1982735-1982781の18-35塩基配列(VNTR-1982-F)と1983343-1983389の18-35塩基配列(VNTR-1982-R)との対、
(14)2163242-2163288の18-35塩基配列(VNTR-2163a-F)と2163524-2163570の18-35塩基配列(VNTR-2163a-R)との対、
(15)2165194-2165240の18-35塩基配列と(ETR-A-F)と2165587-2165633の18-35塩基配列(ETR-A-R)との対。
【請求項７】
上記(1)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１及び２を有する配列であり、上記(2)に対応するプライマー対が配列表の配列番号３及び４を有する配列であり、上記(3)に対応するプライマー対が配列表の配列番号５及び６を有する配列であり、上記(4)に対応するプライマー対が配列表の配列番号７及び８を有する配列であり、上記(5)に対応するプライマー対が配列表の配列番号９及び１０を有する配列であり、上記(6)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１１及び１２を有する配列であり、上記(7)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１３及び１４を有する配列であり、上記(8)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１５及び１６を有する配列であり、上記(9)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１７及び１８を有する配列であり、上記(10)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１９及び２０を有する配列であり、上記(11)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２１及び２２を有する配列であり、上記(12)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２３及び２４を有する配列であり、上記(13)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２５及び２６を有する配列であり、上記(14)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２７及び２８を有する配列であり、上記(15)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２９及び３０を有する配列である請求項６記載の結核菌の型別法。
【請求項８】
ローカスが以下のJATAのNo.１〜１５から選択される請求項５記載の結核菌の型別法。
JATAのNo.１(Mtub 04、ローカス0424)、JATAのNo.２(MIRU 10、ローカス0960)、JATAのNo.３(Mtub 21、ローカス1955)、JATAのNo.４(Mtub 24、ローカス2074)、JATAのNo.５(QUB 11b、ローカス2163b)、JATAのNo.６(VNTR 2372、ローカス2372)、JATAのNo.７(MIRU 26、ローカス2996)、JATAのNo.８(QUB 15、ローカス3155)、JATAのNo.９(MIRU 31、ローカス3192)、JATAのNo.１０(QUB 3366、ローカス3366)、JATAのNo.１１(QUB 26、ローカス4052)、JATAのNo.１２(QUB 4156、ローカス4156)、JATAのNo.１３(QUB 18、ローカス1982)、JATAのNo.１４(QUB 11a、ローカス2163a)、JATAのNo.１５(ETR A、ローカス2165)。
【請求項９】
工程(A1)で選択されるローカスが、JATAのNo.１〜１２である請求項８記載の結核菌の型別法。
【請求項１０】
工程(A1)で選択されるローカスがJATAのNo.１〜１２、１４及び１５であり、且つ工程(A2)で選択されるローカスがJATAのNo.１３である請求項８記載の結核菌の型別法。
【請求項１１】
工程(A1)のプライマーセットが、配列表の配列番号１及び２又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対と配列表の配列番号５及び６又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対とのプライマーセット(MJ1)、配列表の配列番号３及び４又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対と配列表の配列番号７及び８又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対とのプライマーセット(MJ2)、配列表の配列番号９及び１０又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対と配列表の配列番号１１及び１２又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対とのプライマーセット(MJ3)、配列表の配列番号１３及び１４又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対と配列表の配列番号１５及び１６又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対とのプライマーセット(MJ4)、配列表の配列番号１７及び１８又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対と配列表の配列番号１９及び２０又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対とのプライマーセット(MJ5)、配列表の配列番号２１及び２２又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対と配列表の配列番号２３及び２４又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対とのプライマーセット(MJ6)、配列表の配列番号２７及び２８又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対と配列表の配列番号２９及び３０又はこれらと相同性を有する配列のプライマー対とのプライマーセット(MJ7)からなる群より選択される請求項１記載の結核菌の型別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核菌遺伝子中の多重反復配列の反復数を株間で比較するVariable Numbers of Tandem Repeats法（以下、VNTR法と略す）とマルチプレックスＰＣＲ法を利用した、短期間で、しかも簡便に結核菌の型別を精度良く検査することが可能な結核菌の型別法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核菌は他の菌と比べ血清型やファージ型分類に乏しいため、結核菌による感染事例が、同一原因による集団感染か、偶発的な散発事例であるかを調査するためには、遺伝子解析による型別法が有効である。
従来より結核菌の型別法としては、Restriction Fragment Length Polymorphism法（以下、RFLP法と略す）が広く用いられている。該RFLP法は、結核菌遺伝子を制限酵素で切断後、電気泳動でDNA断片を分離し、結核菌特異的な挿入配列であるIS6110をプローブとしてサザンハイブリダイゼーション法を実施し、IS6110に相補的なバンドを検出し、このパターンを比較する方法である。
しかし、RFLP法では、検査のために損傷が少なく、純度の高いDNAが１μｇ以上必要で、菌数が少ない場合は、十分な量のDNAを得るために菌をさらに培養する必要がある。このため、結果を得るまでに長期間を要するという問題がある。
【０００３】
そこで、近年、結核菌遺伝子中の多重反復配列の反復数を株間で比較するVNTR法が注目され、その検証がなされている（非特許文献１参照）。
結核菌の遺伝子中には、約５０〜１００塩基対を単位とするユニット（反復配列）が直列につながった多重反復配列の領域が多数存在している。VNTR法は、各領域の反復数が株間で異なることを利用して型別する方法で、各領域の外側の定常領域にPCR法のプライマーを設計してPCR反応による遺伝子増幅を行い、PCR産物の分子量から反復数を算出し、各領域の反復数を数値化して並べて遺伝子型とする方法である。
VNTR法はPCR法を応用した方法であるため、必要なDNA量がRFLP法の１／１０以下でよく、培養初期の菌量の少ない時期でも、また排菌量が多いときは直接喀痰からでも検査が実施でき、その菌情報を早期に提供できるという利点がある。さらに、死滅した菌からも検査が可能であり、またデータが数値化されるため、過去の株との比較や、他機関とのデータ照合、データベース化が容易という利点もある。
【０００４】
しかし、従来のVNTR法では、ターゲットである各反復配列毎にPCRによって複製、増幅されたDNA断片を、例えば、ポリアクリルアミドゲル上で鎖長に従って分離し、可視化する必要がある。このような操作が必要なため、従来のVNTR法においても比較的時間を要し、その操作も煩雑であるという課題がある。
更に、VNTR法のターゲットである各反復配列は、ほとんどの結核菌株で同一の反復数を示す領域から、株間での相違が大きい領域、中には同一人物から時期をずらせて分離した株で変異が生ずるような超可変領域まで、多様性はさまざまである。そのため、検査する領域の組み合わせ方によって、その特異度が異なることが報告されている。現在、我が国の結核研究所においては、JATA(Japan Anti-Tuberculosis Association)１２−locus VNTR分析及びJATA１５−locus VNTR分析が標準分析法として提唱されている（非特許文献２参照）が、上述の課題を含め、更なる型別法の開発が望まれている。
尚、例えば、結核菌H37Rvゲノム情報及び多重反復配列の情報は、非特許文献３に既に公開されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kekkaku vol.83, No. 10:p673-678, 2008
【非特許文献２】Murase Y, Mitarai S, Sugawara I, Kato S, Maeda S: Promising loci of variable numbers of tandem repeats for typing Beijing family Mycobacterium tuberculosis: J Med Microbiol. 2008; 57: 873-80.
【非特許文献３】"The Microorganisms Tandem Repeats Database"、On-line、インターネット＜URL: HYPERLINK "http://minisatellites.u-psud.fr/GPMS/" http://minisatellites.u-psud.fr/GPMS/＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、結核菌遺伝子中の多重反復配列の反復数を株間で比較するVNTR法とマルチプレックスPCR法を利用して、従来よりも少ないPCR回数により、かつ電気泳動に必要なレーン数を少なくでき、しかも簡便に結核菌の型別を精度良く検査することが可能な結核菌の型別法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、結核菌ゲノム上のミニサテライト中の特定のローカスのコピー数を調べる反復配列多型（VNTR）法を用いた結核菌の型別法であって、
互いに異なるローカスのDNAを核酸増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるオリゴヌクレオチドプライマー対を２種類含むプライマーセットを、複数準備する工程(A1)と、
工程(A1)で準備したプライマーセット毎にマルチプレックスPCRにより、結核菌における互いに異なるローカスのDNAを核酸増幅する工程(B1)と、
工程(B1)で得られた各マルチプレックスPCR毎の増幅産物を各々電気泳動によりそのサイズを分類し、予め決められた反復配列のコピー数を決定する工程(C1)とを含み、
工程(A1)において準備する各２種類のオリゴヌクレオチドプライマー対が、PCRによる増幅産物が低分子を中心に分布するローカスに対応するものと、高分子を中心に分布するローカスに対応するものとに分け、分子量領域が異なる分布を有するものの組となるように選択され、一方のローカスに対応するオリゴヌクレオチドプライマー対のフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーを予め標識しておき、他方のローカスに対応するオリゴヌクレオチドプライマー対により工程(B1)で得られる増幅産物を、工程(C1)の電気泳動後に異なる標識で識別することを特徴とする結核菌の型別法が提供される。
また、本発明によれば、工程(A1)で準備するオリゴヌクレオチドプライマー対とは異なるローカスのDNAを核酸増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーからなる１対のオリゴヌクレオチドプライマー対を準備する工程(A2)と、
工程(A2)で準備したオリゴヌクレオチドプライマー対をPCRにより、工程(B1)におけるローカスとは異なるローカスのDNAを核酸増幅する工程(B2)と、
工程(B2)で得られたPCRの増幅産物を電気泳動によりそのサイズを分類し、予め決められた反復配列のコピー数を決定する工程(C2)とを含む前記結核菌の型別法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の結核菌の型別法は、VNTR法とマルチプレックスPCRとを組み合わせ、分子量領域が異なる分布を示す増幅産物が得られるように特定のプライマーセットを用い、かつ異なる標識により電気泳動してそのサイズを決定するので、従来よりもPCRの反応数を少なくでき、かつ電気泳動に必要なレーン数も少なくでき、簡便に結核菌の型別を精度良く検査することが可能である。従って、結核菌の集団感染疑い事例を、極めて容易に且つ確実に確認する方法として有用である。また、通常の電気泳動システムにより確認が可能であり、特別の装置を必要としないという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１で行った蛍光標識プライマーと非標識プライマーを用いたMJ1〜MJ4のマルチプレックスPCR産物の電気泳動結果を示す図面である。
【図２】実施例１で行った蛍光標識プライマーと非標識プライマーを用いたMJ5〜MJ7のマルチプレックスPCR産物、並びにVNTR-1982によるPCR産物の電気泳動結果を示す図面である。
【図３】実施例２で行った蛍光標識プライマーと非標識プライマーを用いたマルチプレックスPCR産物及びVNTR-1982によるPCR産物の電気泳動結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の結核菌の型別法は、互いに異なるローカスのDNAを核酸増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーからなるオリゴヌクレオチドプライマー対を２種類含むプライマーセットを、複数準備する工程(A1)を含む。
【００１１】
工程(A1)において準備する２種類のオリゴヌクレオチドプライマー対の設計は、例えば、上述の非特許文献３のインターネットで公開されている各ローカスから、PCRによる増幅産物が低分子を中心に分布するローカスに対応するものと、高分子を中心に分布するローカスに対応するものとに分け、分子量領域が異なる分布を有するものの組となるように選択する必要がある。このような選択により、マルチプレックスPCRによる２種類の増幅産物の区別が容易となり、２種類の増幅産物を１レーンで電気泳動することができる。
上記オリゴヌクレオチドプライマー対を構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基数は、通常１８〜３５の範囲で設計することができる。
【００１２】
また、本発明の型別法では、上記プライマーセットの一方のローカスに対応するオリゴヌクレオチドプライマー対のフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーを予め標識しておき、他方のローカスに対応するオリゴヌクレオチドプライマー対により後述する工程(B1)で得られる増幅産物を、工程(C1)の電気泳動後に異なる標識で識別して検出する。
標識としては、蛍光標識、化学発光標識等により行うことができる。ここで、最初に標識するフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーは、PCRによる増幅産物が低分子を中心に分布するローカスに対応するもの、もしくは高分子を中心に分布するローカスに対応するもののいずれかを決定して標識することで、また、最初の標識と後の標識の種類を変更することにより、電気泳動後のPCR産物の検出、例えば、UV吸収検出、蛍光検出、電気化学検出した際に、該検出を容易に行うことができる。
【００１３】
工程(A1)において準備する２種類のプライマーセットは、複数準備する。一般に、測定するローカス数が増えるほど、型別の精度が上昇するが、通常、結核菌H37Rvゲノム(4.4Mb)の塩基配列番号(1)〜(15)から選択される位置の塩基配列に対応するプライマーから選択でき、その組み合わせとしては、後述する表１及び表２に示される組み合わせが例示できる。
(1)423840-423886の18-35塩基配列(VNTR-0424-F)と424452-424498の18-35塩基配列(VNTR-0424-R)との対、
(2)959859-959905の18-35塩基配列(MIRU-10-F)と960475-960521の18-35塩基配列(MIRU-10-R)との対、
(3)1955520-1955566の18-35塩基配列(VNTR-1955-F)と1955760-1955806の18-35塩基配列(VNTR-1955-R)との対、
(4)2074396-2074442の18-35塩基配列の対(VNTR-2074-F)と2074618-2074664の18-35塩基配列(VNTR-2074-R)との対、
(5)2163600-2163646の18-35塩基配列(VNTR-2163b-F)と6164120-2164166の18-35塩基配列(VNTR-2163b-R)との対、
(6)2372386-2372432の18-35塩基配列(VNTR-2372-F)と2372693-2372703の18-35塩基配列(VNTR-2372-R)との対、
(7)2995972-2996018の18-35塩基配列(MIRU-26-F)と2996383-2996429の18-35塩基配列(MIRU-26-R)との対、
(8)3155823-3155869の18-35塩基配列(VNTR-3155-F)と3156093-3156139の18-35塩基配列(VNTR-3155-R)との対、
(9)3191968-3192014の18-35塩基配列(MIRU-31-F)と3192592-3192638の18-35塩基配列(MIRU-31-R)との対、
(10)3336456-3336502の18-35塩基配列(VNTR-3336-F)と3336836-3336882の18-35塩基配列(VNTR-3336-R)との対、
(11)4052885-4052931の18-35塩基配列(VNTR-4052-F)と4053589-4053635の18-35塩基配列(VNTR-4052-R)との対、
(12)4156606-4156652の18-35塩基配列(VNTR-4156-F)と4157282-4157328の18-35塩基配列(VNTR-4156-R)との対、
(13)1982735-1982781の18-35塩基配列(VNTR-1982-F)と1983343-1983389の18-35塩基配列(VNTR-1982-R)との対、
(14)2163242-2163288の18-35塩基配列(VNTR-2163a-F)と2163524-2163570の18-35塩基配列(VNTR-2163a-R)との対、
(15)2165194-2165240の18-35塩基配列と(ETR-A-F)と2165587-2165633の18-35塩基配列(ETR-A-R)との対。
【００１４】
プライマー対の更に具体例としては、上記(1)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１及び２を有する配列であり、上記(2)に対応するプライマー対が配列表の配列番号３及び４を有する配列であり、上記(3)に対応するプライマー対が配列表の配列番号５及び６を有する配列であり、上記(4)に対応するプライマー対が配列表の配列番号７及び８を有する配列であり、上記(5)に対応するプライマー対が配列表の配列番号９及び１０を有する配列であり、上記(6)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１１及び１２を有する配列であり、上記(7)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１３及び１４を有する配列であり、上記(8)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１５及び１６を有する配列であり、上記(9)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１７及び１８を有する配列であり、上記(10)に対応するプライマー対が配列表の配列番号１９及び２０を有する配列であり、上記(11)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２１及び２２を有する配列であり、上記(12)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２３及び２４を有する配列であり、上記(13)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２５及び２６を有する配列であり、上記(14)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２７及び２８を有する配列であり、上記(15)に対応するプライマー対が配列表の配列番号２９及び３０を有する配列であるものが挙げられる。
【００１５】
ローカスとしては、以下のJATAのNo.１〜１５から選択されるローカスが例示できる。
JATAのNo.１(Mtub 04、ローカス0424)、JATAのNo.２(MIRU 10、ローカス0960)、JATAのNo.３(Mtub 21、ローカス1955)、JATAのNo.４(Mtub 24、ローカス2074)、JATAのNo.５(QUB 11b、ローカス2163b)、JATAのNo.６(VNTR 2372、ローカス2372)、JATAのNo.７(MIRU 26、ローカス2996)、JATAのNo.８(QUB 15、ローカス3155)、JATAのNo.９(MIRU 31、ローカス3192)、JATAのNo.１０(QUB 3366、ローカス3366)、JATAのNo.１１(QUB 26、ローカス4052)、JATAのNo.１２(QUB 4156、ローカス4156)、JATAのNo.１３(QUB 18、ローカス1982)、JATAのNo.１４(QUB 11a、ローカス2163a)、JATAのNo.１５(ETR A、ローカス2165)。
【００１６】
本発明の結核菌の型別法では、上記工程(A1)で準備したプライマーセット毎にマルチプレックスPCRにより、結核菌における互いに異なるローカスのDNAを核酸増幅する工程(B1)を含む。
工程(B1)において、マルチプレックスPCRを行うための反応液は、たとえば、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)等の型別する結核菌のDNA、公知のPCR緩衝液、Taqポリメラーゼ、ｄNTPｓ等を公知の方法で組み合わせて調製することができる。
工程(B1)において、マルチプレックスPCRの反応条件は、適宜選択できるが、例えば、最初の変性反応のみを94〜98℃で1分〜5分行い、その後の変性反応を94〜98℃で10秒〜30秒間、アニーリングを60〜67℃で10秒〜30秒間、及び伸長反応を68〜72℃で30秒〜3分間のサイクルを25〜40サイクル繰返し、最後に、68〜72℃で5分〜10分間伸長反応させる条件が挙げられる。
【００１７】
本発明の型別方法は、工程(B1)で得られた各マルチプレックスPCR毎の増幅産物を各々電気泳動によりそのサイズを分類し、予め決められた反復配列のコピー数を決定する工程(C1)を含む。
電気泳動は、各種の電気泳動が利用できるが、アガロースゲル電気泳動を好ましく挙げることができる。
増幅産物を各々電気泳動によりそのサイズを分類し、予め決められた反復配列のコピー数を決定する方法は、従来のVNTR法で行われている方法を利用でき、例えば、PCR産物の分子量から既に報告されている換算表（前田ら、結核. 2008; 83: p673-678）を利用してコピー数に換算することができる。
【００１８】
本発明の結核菌の型別法では、例えば、PCR産物を測定するローカスの数が偶数の場合は、上記プライマーセットを用いて行うことができるが、奇数の場合は、２種類ずつのプライマーセットに加えて、１種類のローカスに対応するプライマーを用意する必要がある。
このような場合には、工程(A1)で準備するオリゴヌクレオチドプライマー対とは異なるローカスのDNAを核酸増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーからなる１対のオリゴヌクレオチドプライマー対を準備する工程(A2)と、工程(A2)で準備したオリゴヌクレオチドプライマー対をPCRにより、工程(B1)におけるローカスとは異なるローカスのDNAを核酸増幅する工程(B2)と、工程(B2)で得られたPCRの増幅産物を電気泳動によりそのサイズを分類し、予め決められた反復配列のコピー数を決定する工程(C2)とを含む、従来行われているVNTR法による方法に準じた工程を行う必要がある。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
結核菌H３７Rvゲノム上の公知の１５のローサイ(JATA(15))を選択し、表１に示す各ローカスにおけるPCR産物の分子量の分布から、これらローサイを、400bpを中心に分布する低分子のAと、700bpを中心に分布する高分子のBの2つのグループに分けた。マルチプレックスPCRの系は、AグループとBグループのそれぞれから1ローカス選び、表２に示すとおり組み合わせを作成した。また、各ローカスに対応するフォワードプライマーと、リバースプライマーを常法に従って合成した。プライマーの塩基配列を表１に示す。また、表２に示すAグループのプライマーは、フォワード及びリバース共にフルオレセインで蛍光標識しておいた。
尚、表１に示すJATA-13のプライマー対については、マルチプレックスPCRではなく、この１対のみで通常のPCRを行った。
【００２０】
【表１】
2011217703.tif 000002
【００２１】
【表２】
2011217703.tif 000003
【００２２】
（PCRのための反応液の調製）
表２に示す２ローサイに対応したプライマーセット毎にマルチプレックスPCRを行うために、また、表１に示すJATA-13のプライマー対を用いてPCRを行うために、以下の方法でPCR用の反応液を調製した。尚、結核菌は８株用いた。また、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、表１に示すプライマー対を用い、JATA-13は蛍光標識せずに、１対のみでPCR用反応液を調製した。
結核菌DNA(1〜10 ng)、0.2μM フォワードプライマー及び0.2 μM リバースプライマー混合液、フルオレイセンで蛍光標識した0.2 μM フォワードプライマーと0.2 μM リバースプライマー混合液、Taq酵素用緩衝液（タカラバイオ社製）、0.2 mM dNTPs、及び商品名「Ex Taq」（タカラバイオ社製）を加えて全容量を20 μｌとして、各PCR用反応液を調製した。
【００２３】
（PCR）
上記で調製したPCR用反応液を、サーマルサイクラーにかけ、94℃で5分間加熱し、94℃ 30秒、65℃ 30秒、72℃ 1分30秒のサイクルを35回繰り返して、72℃で7分処理し、その後4℃とした。これを各PCR用反応液（８種類）毎に行った。
【００２４】
（電気泳動及び標識観察）
上記で調製したPCR増幅液は、TBE緩衝液を用いた1.5−2.5％アガロースゲルで電気泳動を行った。
電気泳動後、ゲルを直接UVトランスルミネーターにのせて302nmのUVを照射することによりフルオレセインを励起状態として、537nmフィルターで520−555nmの範囲で発する蛍光を検出し記録を残した。その後、ゲルをエチジュウムブロマイド(EtBr)染色して他に存在するDNAも検出した。これらの結果を、MJ1〜MJ4を用いた結果を図１に、MJ5〜MJ7、並びにVNTR-1982の結果を図２に示す。
【００２５】
ローカスが特定できたPCR産物の分子量から既に報告されている表３に示す換算表（前田ら、結核. 2008; 83: p673-678）を利用してコピー数に換算した。結果を表４に示す。15箇所のミニミニサテライトDNAのコピー数を判定するJATA(15)-VNTRシステムに比べて、本実施例では約半分の８反応で分析が可能であった。また、電気泳動に必要なレーン数も８レーンであり、AグループとBグループの比較も容易であった。
【００２６】
【表３】
2011217703.tif 000004
【００２７】
【表４】
2011217703.tif 000005
【００２８】
実施例２
結核菌を実施例１とは異なる６株に変更した以外は、実施例１と同様に、PCR、電気泳動を行いコピー数に換算した。電気泳動後の検出結果を図３に、コピー数の結果を表５に示す。
【００２９】
【表５】
2011217703.tif 000006
【図１】
2011217703.tif 000007
【図２】
2011217703.tif 000008
【図３】
2011217703.tif 000009
【配列表】
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