(57)【要約】【課題】  高濃度の低級アルコールを含有する組成物について、皮膚モデルを用いて皮膚刺激性を予測するための試験法を提供する。【解決手段】  三次元培養皮膚（皮膚モデル）上に被検物質を投与した後に送風乾燥して低級アルコールを速やかに蒸散させることにより、その影響を無視できるまでに低減して評価を行う。具体的には、低級アルコールを高濃度に含む組成物を皮膚モデル上に投与する工程（工程１）、投与した検体を送風乾燥する工程（工程２）、投与後に皮膚モデルを培養する工程（工程３）、培養後の細胞生存率を評価する工程（工程４）より構成される。本試験法により、短時間で精度良く、高濃度のアルコールを含有する組成物の皮膚刺激性を予測することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数３以下の低級アルコールを４０容量％以上の濃度で含有する液状組成物を三次元培養皮膚の表皮表面に接触させて送風乾燥を行った後に細胞生存率を評価することを特徴とする皮膚刺激性試験方法。
【請求項２】
請求項１に記載の送風乾燥が、被検物質の接触から乾燥まで１分以内であることを特徴とする皮膚刺激性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低級アルコールを高濃度に含む組成物の皮膚刺激性予測において、簡便かつ短期間に実施可能な試験法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、感染防止のための有効な手段の一つとして、速乾性擦式アルコール手指消毒剤（擦式消毒剤）が注目され、医療施設において多用されている。しかしながら、擦式消毒剤の頻回使用による手荒れの問題も指摘されており（非特許文献１）、手荒れを起こした皮膚は細菌の定着部位となるため（非特許文献４）、感染防止対策上も看過できない問題である。皮膚刺激性評価については、ヒトでの試験結果とウサギを用いたＤｒａｉｚｅ試験法がよく一致することが報告されており、擦式消毒剤中に配合された殺菌成分の違いによって皮膚刺激の程度が異なることが報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
一方、動物福祉や倫理の観点から、実験動物数の削減、実験動物の苦痛低減、あるいは実験動物を使用しない評価法への置換えを目指した３Ｒｓ（Reduction, Refinement, Replacement）の理念のもと、動物実験代替法の開発が近年活発化している（非特許文献３）。なかでも実験動物を使用しないｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系は、倫理的側面だけでなく研究開発の効率化にも寄与することから開発の進展が著しく、皮膚刺激性試験においてもヒト由来細胞を用いて構築された三次元培養ヒト皮膚モデル（以下、皮膚モデルと略記）の応用が進んでいる。皮膚モデルはヒト表皮と同様の角層構造を有するため、検体を皮膚モデル上に直接投与して評価できる特長を有する。これまでに市販の各種皮膚モデルについて多数の化合物に対する感受性が評価されており（非特許文献４、５）、評価軸として細胞生存率やサイトカイン量を用いる方法（非特許文献５）、遺伝子転写因子の活性化能を用いる方法（特許文献１）、表皮角質層の構造的変化を観察する方法（特許文献２）などが報告されている。
【０００４】
しかしながら、皮膚モデルを用いた評価において、アルコール含有率の高い検体では細胞毒性とウサギＤｒａｉｚｅ試験での皮膚刺激指数との相関性が極めて低いことが報告されている（非特許文献６）。この原因については、皮膚モデルに対するアルコールの透過性が実際の皮膚よりも高いため、配合成分に関わらず、アルコールの濃度や接触時間によって細胞毒性が支配されるためと考えられている。仮に検体中からアルコールを除去すると油剤など他の配合成分が分離する場合があり、やはり評価が困難となる。これらの理由から、従来、皮膚モデルを用いて擦式消毒剤の皮膚刺激性を予測することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２４０２０号公報
【特許文献２】特開平１０−３２３１８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本病院薬剤師会編，「消毒薬の使用指針（第三版）」，薬事日報社，ｐ．２７６
【非特許文献２】辻  明良、仲由武實、三野宮文子、八代純子、五島瑳智子，「ウサギを用いた速乾性手指消毒剤の皮膚刺激性に関する検討」，環境感染，１９９３年，第８巻，ｐ．３３−４１
【非特許文献３】吉山友二，「薬学における動物実験代替法の展開」，薬学雑誌，２００８年，第１２８巻，ｐ．７３３−７３４
【非特許文献４】Tornier C., Rosdy M., Maibach H., Toxicology in Vitro, 20, 401-416 (2006)
【非特許文献５】諸田勝保，「三次元培養皮膚モデル」，組織培養工学，１９９８年，第２４巻、ｐ．１５６−１５９
【非特許文献６】Genno M., Yamamoto R., Kojima H., Konishi H., Klausner M., Alternatives to Animal Testing and Experimentation, Vol.5, p.195-200 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明における課題は、擦式消毒剤に代表される高濃度のアルコールを含有する組成物について、皮膚モデルを用いて皮膚刺激性を予測するための試験法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を進めた結果、皮膚モデル上に被検物質を投与した後に送風乾燥してアルコールを速やかに蒸散させることにより、その影響を無視できるまでに低減して精度良く皮膚刺激性を予測可能であることを見出して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は次の［１］〜［２］である。
【０００９】
［１］炭素数３以下の低級アルコールを４０容量％以上の濃度で含有する液状組成物を三次元培養皮膚の表皮表面に接触させて送風乾燥を行った後に細胞生存率を評価することを特徴とする皮膚刺激性試験方法。
［２］前記の［１］に記載の送風乾燥が、被検物質の接触から乾燥まで１分以内であることを特徴とする皮膚刺激性試験方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、皮膚モデルを用いて検体投与後に送風乾燥を行うことにより、従来は困難であった細胞系での低級アルコール高濃度含有物の皮膚刺激性予測を精度良く行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明は、低級アルコールを高濃度に含む組成物を皮膚モデル上に投与する工程（工程１）、投与した検体を送風乾燥する工程（工程２）、投与後に皮膚モデルを培養する工程（工程３）、培養後の細胞生存率を評価する工程（工程４）より構成される。
【００１２】
本発明における皮膚モデルについては、既知の方法により作製しても良いが、市販のキットを用いても良い。また、表皮のみからなる皮膚モデル、表皮と真皮からなる皮膚モデルのいずれでも使用することができる。
【００１３】
低級アルコールを高濃度に含む組成物を皮膚モデル上に投与する工程（工程１）、投与した検体を送風乾燥する工程（工程２）における組成物の投与量と送風量の関係については、アルコールによる細胞毒性が発現しない範囲で任意に設定することができるが、検体の接触開始から乾燥完了を目視で確認するまで１分以内であることが好ましい。送風乾燥に用いる装置としては、小型エアポンプに送風ノズルを装着したものなどを用いることができ、乾燥完了の終点は、投与した検体の液量が目視で変化がなくなる時点として確認することができる。この基準を満たす条件として、温度、皮膚モデルの大きさ、検体の投与量、送風量などを任意に設定することができる。たとえば直径６．４ｍｍの表皮型皮膚モデルを用いる場合、１モデルあたりの投与量が１０μＬ、送風量が毎分０．３Ｌであれば１分以内に乾燥でき、細胞生存率は約１００％となる。同じ投与量でも送風量が毎分０．０１Ｌ以下であったり送風時間が短い場合、あるいは同じ送風量であっても投与量が１００μＬ以上の場合は、短時間にアルコールを乾燥させることができず細胞生存率が低下するので好ましくない。
【００１４】
また、被検物質の刺激性が比較的低い場合は、刺激性を増幅して評価する目的から、工程１と工程２の組合せを複数回、繰り返してもよい。
【００１５】
投与後に皮膚モデルを培養する工程（工程３）については、各皮膚モデルに適した培養条件を用いることができるが、一般的には、３７℃、二酸化炭素濃度５％で培養を行う。培養時間は用いる皮膚モデルの角層透過性と細胞感受性によって調整して良いが、一般的には２４時間程度が好ましい。
【００１６】
培養後の細胞生存率を評価する工程（工程４）については、例えば細胞染色剤のＭＴＴ（3-(4, 5-Dimethyl thial-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazalium Bromide）を用いて生細胞を染色した後に色素を抽出し、抽出液の吸光度から細胞生存率を算出する方法、あるいは可溶性ホルマザンを生成する染色剤（例えばＷＳＴ−８；（株）同仁化学研究所製）を培地に添加し、生成した色素を含む培地の吸光度から細胞生存率を算出する方法など、既知の方法を用いることができる。また、左記の細胞生存率評価が困難な場合は、その代替手段として炎症性因子（インターロイキン−１αや乳酸脱水素酵素など）の定量を行うこともできる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例、比較例により更に詳細に説明する。
実施例１
日本薬局方規格適合の消毒用エタノール１０μＬを皮膚モデルキット「ラボサイト・エピモデル２４」〔；商品名、（株）ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製、皮膚モデル、直径６．４ｍｍ）上に滴下した後、速やかに送風を行い、１分以内に乾燥させた。送風機には、送風量毎分０．３Ｌのエアポンプにノズルを装着して用いた。投与、乾燥工程を１サイクルとして合計５サイクル繰り返し実施した後、３７℃、二酸化炭素濃度５％の培養機内にて２４時間培養を行った後、次項に示す細胞生存率評価を行った。
【００１８】
＜細胞生存率評価＞
培養後の皮膚モデルの培地を生細胞染色用培地（ＭＴＴ濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）に交換し、さらに３時間培養した後、皮膚モデルを固定具から外してマイクロチューブに移した。マイクロチューブ内にイソプロパノール２００μＬを添加して一晩暗所にて放置し、色素を抽出した。この抽出液を９６ウェルマイクロプレートに各ウェル１５０μＬにて注入し、マイクロプレートリーダを用いて５７０ｎｍの吸光度（参照波長６５０ｎｍ）を測定した。未処理の皮膚モデルにおける吸光度を細胞生存率１００％とし、各検体につき皮膚モデル３個の吸光度の平均値から細胞生存率を算出した。
【００１９】
実施例２〜４
検体をを表１に示すように変更した以外は、実施例１に記載の方法に準じて、実施例２〜６の試験を行い、細胞生存率を算出した。
【００２０】
【表１】
2011158398.tif 000002
【００２１】
【表２】
2011158398.tif 000003
【００２２】
（検体の詳細）
日本薬局方規格適合消毒用エタノール〔小堺製薬（株）製〕
日本薬局方エタノール８０ｖ／ｖ％含有水溶液
イソジンパーム〔；商品名、明治製菓（株）製〕
ポビドンヨード０．０５ｗ／ｖ％、日本薬局方エタノール８０ｖ／ｖ％含有液
ウエルアップ〔；商品名、丸石製薬（株）製〕
グルコン酸クロルヘキシジン０．２ｗ／ｖ％、日本薬局方エタノール８０ｖ／ｖ％含有液
ウエルパス〔；商品名、丸石製薬（株）製〕
塩化ベンザルコニウム０．２ｗ／ｖ％、日本薬局方エタノール８０ｖ／ｖ％含有液
【００２３】
実施例１〜４により得られた細胞生存率について、非特許文献２に記載のウサギにおける皮膚刺激性評価結果と照らし合わたところ、両者に高い相関性が認められた（図１、２）。
【００２４】
比較例１〜６
検体投与量及び送風量を表２に示すように変更した以外は、実施例１に記載の方法に準じて試験を行い、細胞生存率を算出した。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本願皮膚刺激性試験法における細胞生存率と、非特許文献２におけるウサギDraize試験における皮膚一次刺激累積評点との相関性を示す図である。
【図２】本願皮膚刺激性試験法における細胞生存率と、非特許文献２におけるウサギDraize試験における累積皮膚刺激累積評点との相関性を示す図である。
【図１】
2011158398.tif 000004
【図２】
2011158398.tif 000005