(57)【要約】【課題】食品、化粧品あるいは医薬品として安全かつ安価に利用できるエルゴチオネインの新規な製造方法を提供する。【解決手段】少なくとも前駆体、メチル基供与体およびＳ付加源を含む原料に、エルゴチオネイン合成活性を有する酵素を作用させることを特徴とする。ルゴチオネイン合成活性を有する酵素はきのこ由来であることが好ましく、人工栽培されたきのこ、またはきのこの廃棄部分を用いることで製造コストをさらに安価にすることができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも前駆体、メチル基供与体およびＳ付加源を含む原料に、エルゴチオネイン合成活性を有する酵素を作用させることを特徴とするエルゴチオネインの製造方法。
【請求項２】
エルゴチオネイン合成活性を有する酵素が、きのこ由来であることを特徴とする請求項１に記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項３】
エルゴチオネイン合成活性を有する酵素が、きのこ子実体もしくは菌糸体のホモジネート、または該ホモジネートから調製したエルゴチオネイン合成活性を有する画分に含まれることを特徴とする請求項２に記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項４】
きのこが、ヒラタケ属、ヒトヨタケ属、サンゴハリタケ属、エノキタケ属、マイタケ属、オオイチョウタケ属、シイタケ属、ハラタケ属、シロタモギタケ属、フミツキタケ属、キシメジ属、シメジ属またはスギタケ属に属する一種または二種以上であることを特徴とする請求項２または３に記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項５】
人工栽培されたきのこ、またはきのこの廃棄部分を用いることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項６】
前駆体がヒスチジンまたはその塩であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項７】
メチル基供与体がＳ−アデノシルメチオニンもしくはその塩、またはメチオニンもしくはその塩であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項８】
Ｓ付加源がシステインもしくはその塩、またはシスチンもしくはその塩であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
【請求項９】
原料が酵母エキスであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエルゴチオネインの製造方法に関し、さらに詳しくは、食品、化粧品または医薬品として安全かつ安価に利用できるエルゴチオネインの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エルゴチオネインはライ麦角菌クラビセプスプルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）から単離された天然分子である（非特許文献１参照）。一方、エルゴチオネインはラットの赤血球と肝臓中で確認され、その他多くの動物組織、特にヒトの組織においても確認された（非特許文献２参照）。エルゴチオネインは菌類やマイコバクテリアによって生合成される。植物へは、菌類によって分生胞子内で合成されたエルゴチオネインが根から吸収されることにより蓄積する。動物は植物の摂食により、エルゴチオネインを摂取している。
エルゴチオネインの正確な生物学的役割はいまだに明らかではないが、その抗酸化特性はよく知られている（非特許文献３、４参照）。よって近年、エルゴチオネインはその抗酸化特性に注目され、食品、化粧品あるいは医薬品としての利用が期待されている。
【０００３】
しかしながら、植物中に存在するエルゴチオネインは極めて少量であるため、十分な量のエルゴチオネインを摂取するには、極めて多量の植物を摂食しなければならない。このため、エルゴチオネインを大量に製造すべく、エルゴチオネインの製造方法として化学合成法（特許文献１、２）や発酵法（特許文献３）、エルゴチオネインを多く含有するタモギタケ等のきのこからの精製方法（特許文献４、５）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平８−５０１５７５号公報
【特許文献２】特開２００６−１６０７４８号公報
【特許文献３】特公昭４３−２０７１６号公報
【特許文献４】特開２００８−１１０９８８号公報
【特許文献５】特開２００９−１６１４９８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔａｒｎｅｔ  Ｃ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１４９（１９０９）ｐ２２２−２２４
【非特許文献２】Ｍｅｌｖｉｌｌｅ  Ｄ．Ｂ．，Ｖｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．，１７，（１９５８）ｐ１５５−２０４
【非特許文献３】Ｈａｒｔｍａｎ  Ｐ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８６（１９９０）ｐ３１０−３１８
【非特許文献４】Ａｋａｎｍｕ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２８８（１９９１）ｐ１０−１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
化学合成法や発酵法によりエルゴチオネインを大量に製造すれば、容易に十分量のエルゴチオネインを摂取可能となる。しかしながら、化学合成法によれば、その工程が複雑かつ高コストであり、得られるエルゴチオネインが極めて高価となる。しかも、化学合成法ではその工程で種々の化学薬品を使用するため、得られたエルゴチオネインは食品として安全に利用できるものではない。
一方、発酵法では菌類を用いてエルゴチオネインを製造しているので、化学合成法に比較して安全面では優れているものの、収量が少ないため、得られるエルゴチオネインはやはり極めて高価なものとなる。
また、エルゴチオネインを多く含有するきのこから精製した場合でも、その工程は抽出、カラムクロマトグラフィーによる分離、凍結乾燥等複雑であり、やはりコスト高につながる。
そこで、本発明の課題は、食品、化粧品あるいは医薬品として安全かつ安価に利用できるエルゴチオネインの新規な製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく検討したところ、ヒラタケ属等に属するきのこがエルゴチオネインを多量に含有していることを知り、これらきのこにはエルゴチオネインを合成する活発な酵素群が存在し、これらの酵素群を利用することによって、安全かつ安価にエルゴチオネインを多量に得ることができるものと考え検討を重ねた結果、本発明に至った。
【０００８】
本発明は、前記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］少なくとも前駆体、メチル基供与体およびＳ付加源を含む原料に、エルゴチオネイン合成活性を有する酵素を作用させることを特徴とするエルゴチオネインの製造方法。
［２］エルゴチオネイン合成活性を有する酵素が、きのこ由来であることを特徴とする前記［１］に記載のエルゴチオネインの製造方法。
［３］エルゴチオネイン合成活性を有する酵素が、きのこ子実体もしくは菌糸体のホモジネート、または該ホモジネートから調製したエルゴチオネイン合成活性を有する画分に含まれることを特徴とする前記［２］に記載のエルゴチオネインの製造方法。
［４］きのこが、ヒラタケ属、ヒトヨタケ属、サンゴハリタケ属、エノキタケ属、マイタケ属、オオイチョウタケ属、シイタケ属、ハラタケ属、シロタモギタケ属、フミツキタケ属、キシメジ属、シメジ属またはスギタケ属に属する一種または二種以上であることを特徴とする前記［２］または［３］に記載のエルゴチオネインの製造方法。
［５］人工栽培されたきのこ、またはきのこの廃棄部分を用いることを特徴とする前記［２］〜［４］のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
［６］前駆体がヒスチジンまたはその塩であることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
［７］メチル基供与体がＳ−アデノシルメチオニンもしくはその塩、またはメチオニンもしくはその塩であることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
［８］Ｓ付加源がシステインもしくはその塩、またはシスチンもしくはその塩であることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
［９］原料が酵母エキスであることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載のエルゴチオネインの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のエルゴチオネインの製造方法は、例えば、食用とされている種々のきのこより調製した粗酵素液を用い、酵母エキスや、ヒスチジン、システイン、Ｓ−アデノシルメチオニンといった食品素材等を原料に用いてエルゴチオネインを酵素合成するものであり、得られたエルゴチオネインを含有する組成物をそのまま、あるいは乾燥、粉末化または精製して利用するため、食品、化粧品あるいは医薬品として安全かつ安価に利用可能なエルゴチオネインを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】エリンギの子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）を用いた場合のエルゴチオネインの生成濃度を示す図である。
【図２】エリンギの各子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）を用い、酵母エキス量を変化させた時のエルゴチオネインの生成濃度を示す図である。
【図３】エリンギ、タモギタケ、ササクレヒトヨタケの各子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）を用いた場合のエルゴチオネインの生成濃度を示す図である。
【図４】エリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）による、３段階の反応温度（２５℃、３０℃、４０℃）におけるエルゴチオネインの生成濃度を示す図である。
【図５】ｐＨの異なる３種類のエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ４．５、６．０、８．５）によるエルゴチオネインの生成濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のエルゴチオネインの製造方法（以下、「本発明の製造方法」という。）は、少なくとも前駆体、メチル基供与体およびＳ付加源を含む原料に、エルゴチオネイン合成活性を有する酵素を作用させてエルゴチオネインを製造する方法であればよい。エルゴチオネイン合成活性を有する酵素は特に限定されないが、例えば、マイコバクテリア由来、菌類由来、きのこ由来の酵素が例示され、その中でも安全かつ安価な観点から、特にきのこ由来であることが好ましい。
【００１２】
本発明の製造方法に用いるきのことしては、エルゴチオネインを含有するものであればいずれでも用いることができるが、ヒラタケ属、ヒトヨタケ属、サンゴハリタケ属、エノキタケ属、マイタケ属、オオイチョウタケ属、シイタケ属、ハラタケ属、シロタモギタケ属、フミツキタケ属、キシメジ属、シメジ属またはスギタケ属に属する一種または二種以上のきのこであることが好ましい。
【００１３】
ヒラタケ属に属するきのことしては、例えばヒラタケ、エリンギ、ウスヒラタケ、タモギタケ、トキイロヒラタケ、ヒマラヤヒラタケなどが挙げられる。ヒトヨタケ属に属するきのことしては、例えば、イヌセンボンタケ、ササクレヒトヨタケ、ヒトヨタケ、イタチタケ、キララタケなどが挙げられる。サンゴハリタケ属に属するきのことしては、例えば、サンゴハリタケ、サンゴハリタケモドキ、ヤマブシタケ、フサハリタケなどが挙げられる。エノキタケ属に属するきのことしては、例えば、エノキタケなどが挙げられる。マイタケ属に属するきのことしては、例えば、マイタケ、シロマイタケ、アンニンコウなどが挙げられる。オオイチョウタケ属に属するきのことしては、例えば、オオイチョウタケ、ムレオオイチョウタケなどが挙げられる。シイタケ属に属するきのことしては、例えば、シイタケなどが挙げられる。ハラタケ属に属するきのことしては、例えば、ウスキモリノカサ、ザラエノハラタケ、ツクリタケ、ヒメマツタケなどが挙げられる。シロタモギタケ属に属するきのことしては、例えば、ブナシメジ、シロタモギタケなどが挙げられる。フミツキタケ属に属するきのことしては、例えば、コフミヅキタケ、フミツキタケ、ハタケキノコ、タマムクエタケ、ツバナシフミヅキタケ、ツチナメコ、ヤナギマツタケなどが挙げられる。キシメジ属に属するきのことしては、例えば、ニオウシメジ、ミドリシメジ、ニオイキシメジ、シロシメジ、シモコシ、シモフリシメジ、ハエトリシメジ、ヌズミシメジ、クロゲシメジ、ケショウシメジ、マツタケモドキ、マツタケ、サウーバなどが挙げられる。シメジ属に属するきのことしては、例えば、シャカシメジ、ハタケシメジ、オシロイシメジ、ホンシメジ、スミゾメシメジなどが挙げられる。スギタケ属に属するきのことしては、例えば、ナメコ、スギタケ、スギタケモドキ、ハナガサタケ、ヌメリスギタケモドキ、アカツムタケ、ヤケアトツムタケ、チャナメツクタケ、シロナメツムタケなどが挙げられる。
【００１４】
特にエルゴチオネインを多量に含有するタモギタケ、ササクレヒトヨタケ、ヤマブシタケ、エリンギ、ヒラタケ、エノキタケからなる群より選ばれた一種または二種以上のきのこを好適に用いることができる。人工栽培されたきのこ、あるいはきのこの廃棄部分を用いることによって、エルゴチオネインの製造コストをさらに安価にすることができる。
【００１５】
これらのきのこからエルゴチオネイン合成活性を有する粗酵素を調製し、本発明の製造方法に使用することができる。エルゴチオネイン合成活性を有する粗酵素としては、きのこをエルゴチオネインの合成に適した緩衝液にてホモジナイズすることにより得られるホモジネート、該ホモジネートを遠心分離することにより得られる上清、この上清を透析膜によって透析した画分、およびこの画分を種々のカラムクロマトグラフィーによって分離、精製したエルゴチオネイン合成活性を有する画分のいずれを用いることもできる。ここで、エルゴチオネインの合成に適した緩衝液としては、例えば、トリス−塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、りん酸カリウム緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。
【００１６】
本発明において言う「きのこ」には、茎部分と傘部分とからなる子実体（石鎚部分も含む）はもちろん、種々の培地にて得られた菌糸体やそれらの乾燥物、粉末等も含まれる。なお、きのこの乾燥、粉末化や粗酵素の調製段階において、加熱はエルゴチオネイン合成酵素群の活性低下を招くため避けるべきであるのはいうまでもない。
【００１７】
これらきのこにおいて、エルゴチオネインは、他の菌類やマイコバクテリアと同様、ヒスチジンからメチル基付与反応、Ｓ付加反応の二段階を経て合成されていると予想される。そこで、本発明の製造方法は、少なくとも前駆体、メチル基供与体およびＳ付加源を含む原料にエルゴチオネイン合成活性を有する酵素を作用させることを特徴としている。前駆体としてはヒスチジンが好ましく、メチル基供与体としはＳ−アデノシルメチオニンまたはメチオニンが好ましく、Ｓ付加源としてはシステインまたはシスチンが好ましい。ヒスチジン、Ｓ−アデノシルメチオニン、メチオニン、システイン、シスチンは塩酸塩や硫酸塩など様々な塩型をとってもよい。また、これらを高含有する酵母エキスを原料として好適に用いることができる。酵母エキスは、市販品を購入して使用することができる。
本発明の製造方法における酵素反応は、ｐＨ４〜９、温度２０〜５０℃の範囲で行なうことが好ましく、さらに好ましくはｐＨ４．５〜８．５、温度２５〜４０℃の範囲で行なう。反応時間は特に限定されず、反応条件、反応量等に応じて適宜選択することが好ましい。通常、０．５〜７２時間が好ましく、さらに好ましくは１０〜６０時間、好適には１５〜４８時間である。
【００１８】
本発明の製造方法において用いる酵母エキスや、ヒスチジン、システイン、Ｓ−アデノシルメチオニンといった各種アミノ酸の添加量は特に限定されるものではなく、所望する量のエルゴチオネインが得られる範囲で任意に選定される。ただし、ヒスチジン１モルに対しメチル基供与体であるＳ−アデノシルメチオニンは３モル必要であり、また、Ｓ付加源であるシステインもヒスチジンに対し１モル相当量必要となる。酵母エキスを使用する場合においても、ヒスチジン、Ｓ−アデノシルメチオニン、システイン等の含有量を把握しておくことが、高い変換率を維持する上で重要である。また、高い変換率でエルゴチオネインを製造するために、原料としての酵母エキスに対して、ヒスチジン、システイン、Ｓ−アデノシルメチオニン等からなる群より選ばれた一種または二種以上のアミノ酸を添加することが好ましい。
【００１９】
本発明の製造方法により、エルゴチオネインはエルゴチオネイン含有組成物として得られる。このエルゴチオネイン含有組成物は、そのまま乾燥、さらに粉末化した形態のほか、不溶物を遠心分離や濾過等の工程により除去した上清、その上清を噴霧乾燥等することにより得られる粉末、不溶物を除去した上清にエタノール等の溶媒を添加して不溶物を析出させ、粗精製した溶液、その溶液を噴霧乾燥等することにより得られる粉末等、さまざまな形態で提供することができる。また、エタノール等の溶媒添加により不溶物を除去した粗精製画分を、種々のカラムクロマトにかけることでエルゴチオネイン純度を高めることも可能である。なお、エルゴチオネインの製造量は、例えば、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ、実施例参照）等の公知の方法により測定することができる。
【００２０】
本発明の製造方法により得られるエルゴチオネイン含有組成物は、食品、化粧品あるいは医薬品として安全かつ安価に利用することができる。
【実施例】
【００２１】
＜粗酵素液の調製１＞
エリンギ、タモギタケ、ササクレヒトヨタケそれぞれの子実体の凍結乾燥粉末１０ｇに１５０ｍＬの０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を添加し、氷冷下、５分間ホモジナイザーに掛けた。得られたホモジネートを３０，０００ｇ×３０分の遠心分離に掛け、上清を回収した。この上清を分画分子量１５，０００の透析チューブに入れ、０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にて２４時間透析を行なった。同様に透析を計３回繰り返し、透析内液を得、これを各種きのこ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）とした。
【００２２】
＜実施例１＞
ヒスチジン７．７５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、システイン６．０５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、Ｓ−アデノシルメチオニン６５．２４ｍｇ（１５０μｍｏｌ）を０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、５ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製１＞で調製したエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）２０ｍＬを加え、２５℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応開始前、反応開始４、２４時間後に反応液をサンプリングし、３分間ボイルして反応を停止させた。遠心分離上清を回収し、高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）にてエルゴチオネイン蓄積量を測定した。ＨＰＬＣによるエルゴチオネインの定量は以下の方法により行なった。
【００２３】
＜定量法＞
カラムにはＨＩＬＩＣ系（具体的にはジーエルサイエンス製Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＨＩＬＩＣ  ５μｍ、φ４．６×２５０ｍｍ）を用い、移動相には２ｍＭ酢酸アンモニウム、８０％アセトニトリルのアイソクラティック条件で、流速０．８mＬ／分、カラム温度４０℃、ＵＶ検出器にて２６０ｎｍの吸収により、ピークを検出した。所定の保持時間に出現するピークの面積より既知濃度のエルゴチオネイン標品のピーク面積を用いて定量した。
なお、後述する実施例６〜９におけるエルゴチオネイン含有粉末中のエルゴチオネインの定量に際しては、粉末サンプル０．５ｇを７０％エタノール３０ｍｌに添加し、室温下で一晩、振盪しながら抽出を行ない、濾過により抽出液から不溶成分を除いた後、遠心真空濃縮装置にて濃縮乾固を行ない、得られた残渣をイオン交換水に再溶解し５ｍｌとしたものをＨＰＬＣ用サンプルとした。
【００２４】
結果を図１に示した。図１から明らかなように、エリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）によりヒスチジンからエルゴチオネインが合成され、その蓄積量は反応時間を経るにしたがい増加した。
【００２５】
＜実施例２＞
ヒスチジン７．７５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、システイン６．０５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製、酵母エキス「赤」LotNo.56306）０．１２５ｇ、０．２５ｇまたは０．５ｇを０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、５ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製１＞で調製したエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）２０ｍＬを加え、２５℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応開始前、反応開始２４時間後に反応液をサンプリングし、３分間ボイルして反応を停止させた。遠心分離上清を回収し、ＨＰＬＣ（分析条件は前記）にてエルゴチオネイン蓄積量を測定した。
【００２６】
結果を図２に示した。図２から明らかなように、エリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）によるヒスチジンからのエルゴチオネイン合成量は酵母エキス添加量に依存して増大した。
【００２７】
＜実施例３＞
ヒスチジン７．７５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、システイン６．０５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、酵母エキス（極東製薬製、粉末酵母エキス LotNo.AAK44O01）０．３３ｇを０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、５ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製１＞で調製した３種類のきのこ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）２０ｍＬをそれぞれ加え、２５℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応開始前、反応開始６、２４時間後に反応液をサンプリングし、３分間ボイルして反応を停止させた。遠心分離上清を回収し、ＨＰＬＣ（分析条件は前記）にてエルゴチオネイン蓄積量を測定した。
【００２８】
結果を図３に示した。図３から明らかなように、３種類のきのこ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）によりヒスチジンからエルゴチオネインが合成され、その蓄積量は反応時間を経るにしたがい増加した。
【００２９】
＜実施例４＞
ヒスチジン７．７５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、システイン６．０５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製、酵母エキス「赤」LotNo.56306）０．５ｇを０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、５ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製１＞で調製したエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）２０ｍＬを加え、２５℃、３０℃、４０℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応開始前、反応開始４、２４時間後に反応液をサンプリングし、３分間ボイルして反応を停止させた。遠心分離上清を回収し、ＨＰＬＣ（分析条件は前記）にてエルゴチオネイン蓄積量を測定した。
【００３０】
結果を図４に示した。図４から明らかなように、反応温度２５℃、３０℃、４０℃において、エリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ８．５）によりヒスチジンからエルゴチオネインが合成され、その蓄積量は反応時間を経るにしたがい増加した。
【００３１】
＜粗酵素液の調製２＞
エリンギ子実体の凍結乾燥粉末１０ｇに１５０ｍＬの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を添加し、氷冷下、５分間ホモジナイザーに掛けた。得られたホモジネートを３０，０００ｇ×３０分の遠心分離に掛け、上清を回収した。この上清を分画分子量１５，０００の透析チューブに入れ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）にて２４時間透析を行なった。同様に透析を計３回繰り返し、透析内液を得、これをエリンギ粗酵素液（ｐＨ４．５）とした。
【００３２】
＜粗酵素液の調製３＞
エリンギ子実体の凍結乾燥粉末１０ｇに１５０ｍＬの０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、氷冷下、５分間ホモジナイザーに掛けた。得られたホモジネートを３０，０００ｇ×３０分の遠心分離に掛け、上清を回収した。この上清を分画分子量１５，０００の透析チューブに入れ、０．０４Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて２４時間透析を行なった。同様に透析を計３回繰り返し、透析内液を得、これをエリンギ粗酵素液（ｐＨ６．０）とした。
【００３３】
＜実施例５＞
ヒスチジン７．７５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、システイン６．０５ｍｇ（５０μｍｏｌ）、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製、酵母エキス「赤」LotNo.56306）０．５ｇを粗酵素のｐＨに対応するｐＨの緩衝液に溶解し、５ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製１〜３＞で調製した３種類のエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ４．５、６．０、８．５）２０ｍＬをそれぞれ加え、３０℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応開始前、反応開始６、１５、２０、２４時間後に反応液をサンプリングし、３分間ボイルして反応を停止させた。遠心分離により上清を回収し、ＨＰＬＣ（分析条件は前記）にてエルゴチオネイン蓄積量を測定した。
【００３４】
結果を図５に示した。図５から明らかなように、反応ｐＨ４．５、６．０、８．５において、エリンギ子実体粗酵素液によりヒスチジンからエルゴチオネインが合成され、その蓄積量は反応時間を経るにしたがい増加した。
【００３５】
＜実施例６＞
ヒスチジン７７．５ｍｇ（５００μｍｏｌ）、システイン６０．５ｍｇ（５００μｍｏｌ）、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製、酵母エキス「赤」LotNo.56306）５ｇを０．０４Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し５０ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製３＞で調製したエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ６．０）５０ｍＬを加え、３０℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応終了後、遠心分離により上清を回収し、得られた上清を−８０℃にて凍結の後、凍結乾燥器にて乾燥を行ない、エルゴチオネイン含有粉末およそ１０ｇを得た。得られた凍結乾燥粉末１０ｇは、およそ７００ｍｇのエルゴチオネインを含有していた。
【００３６】
＜実施例７＞
ヒスチジン７７．５ｍｇ（５００μｍｏｌ）、システイン６０．５ｍｇ（５００μｍｏｌ）、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製、酵母エキス「赤」LotNo.56306）５ｇを０．０４Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し５０ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製３＞で調製したエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ６．０）５０ｍＬを加え、３０℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応液１００ｍＬにエタノール３００ｍＬを添加し、よく混和した後、遠心分離により上清を回収した。ロータリーエバポレータにて上清を２０ｍＬまで濃縮し、濃縮液を−８０℃にて凍結の後、凍結乾燥器にて乾燥を行ない、エルゴチオネイン含有粉末およそ０．７ｇを得た。得られた凍結乾燥粉末０．７ｇは、およそ３２９ｍｇのエルゴチオネインを含有していた。
【００３７】
＜実施例８＞
酵母エキス（オリエンタル酵母工業製、酵母エキス「赤」LotNo.56306）５ｇを０．０４Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し５０ｍＬとした。ここへ、前記＜粗酵素液の調製３＞で調製したエリンギ子実体粗酵素液（ｐＨ６．０）５０ｍＬを加え、３０℃恒温槽内で、振盪しながら２４時間反応を行なった。反応終了後、遠心分離により上清を回収し、得られた上清を−８０℃にて凍結の後、凍結乾燥器にて乾燥を行ない、エルゴチオネイン含有粉末およそ５ｇを得た。得られた凍結乾燥粉末５ｇは、およそ２７０ｍｇのエルゴチオネインを含有していた。
【００３８】
＜実施例９＞
エリンギ子実体の凍結乾燥粉末１０ｇに１５０ｍＬの０．０４Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、氷冷下、５分間ホモジナイザーに掛けた。得られたホモジネートにヒスチジン２３２．５ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）、システイン１８１．５ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製、酵母エキス「赤」LotNo.56306）１５ｇを添加し、よく混和した後、３０℃恒温槽内で４８時間の静置反応を行なった。得られた反応物を真空攪拌乾燥器内で乾燥し、粉砕機にてエルゴチオネイン含有エリンギ粉末およそ２５ｇを得た。得られたエリンギ粉末２５ｇはおよそ９７５ｍｇのエルゴチオネインを含有していた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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