(57)【要約】【課題】網羅的なタンパク質相互作用解析等に好適に用いられる純度の高いタンパク質を精製することのできる核酸リンカーを提供する。【解決手段】本発明の核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリｄＡ配列及び前記ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方が結合していることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、
一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリｄＡ配列及び前記ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方が結合していることを特徴とする核酸リンカー。
【請求項２】
前記ポリｄＡ配列は、塩基数が２０以上４０以下である請求項１に記載の核酸リンカー。
【請求項３】
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に結合している光反応架橋剤により架橋されている請求項１または２に記載の核酸リンカー。
【請求項４】
前記光反応架橋剤は、ソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）である請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項５】
前記タンパク質の連結部は、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなる請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項６】
前記アーム部が、前記アーム部を切断するための光切断部位または１本鎖核酸切断酵素部位を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項７】
前記一方のポリヌクレオチド鎖が、標識物質を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸リンカー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする核酸リンカー−タンパク質複合体。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とするｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されていることを特徴とするｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されている核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されているｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｆ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とするタンパク質複合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されていることを特徴とするプロテインアレイ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のプロテインアレイを標的分子と接触させ、前記標的分子と前記タンパク質複合体との相互作用を解析することを特徴とする解析方法。
【請求項１６】
標的分子と結合するタンパク質を同定する方法であって、
（ｇ）請求項１０に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されているプロテインアレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴とする標的分子結合タンパク質の同定方法。
【請求項１７】
前記工程（ｈ）が、表面プラズモン共鳴法により行われる工程である請求項１６に記載の標的分子結合タンパク質の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸リンカー、核酸リンカー−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体、これらタンパク質複合体の製造方法、プロテインアレイ、これを用いたタンパク質間相互作用解析方法、標的分子結合タンパク質同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規機能ペプチド・タンパク質の取得に際しては、ペプチド・タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法と、膨大な種類の分子が存在するランダムライブラリーから目的の機能を有する分子を取得する進化分子工学的手法とが主流になっている。
特に近年では、ファージディスプレイ法に代表される進化分子工学の要素技術である遺伝子型−表現型対応付け技術の進歩により、短期間で機能タンパク質を取得することが可能となった。
【０００３】
細胞を利用した遺伝子型−表現型対応付け技術としては、ファージディスプレイ法以外に大腸菌や酵母等を用いた細胞ディスプレイ法が挙げられる。これらはいずれも機能ペプチド・タンパク質を取得する上で有益な方法であるが、単位体積あたりの細胞数が制限されるため１０８／ｍｌ以上のライブラリーサイズをもつことは不可能であり、このため、スクリーニング効率が低いという欠点があった。
この課題を克服するために無細胞翻訳系を利用した遺伝子型−表現型の対応付けの方法が開発された。これらの代表的な例としては、リボソームを介してｍＲＮＡと前記ｍＲＮＡを翻訳したタンパク質を連結する「リボソームディスプレイ」やｍＲＮＡと前記ｍＲＮＡをコードしたタンパク質を連結する「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法」が挙げられる。これらを用いることにより、１０１２／ｍｌ以上のライブラリーサイズをもち、ファージディスプレイ法が細胞を利用することから生ずる細胞毒性、膜透過性等の課題が解消することからスクリーニング効率の飛躍的な向上が可能となった。
さらに、核酸リンカーが、タンパク質と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡと、を結ぶｃＤＮＡディスプレイ法が開発された。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−タンパク質連結体構造は、非常に安定であるため、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。
【０００４】
ｃＤＮＡディスプレイ法は、タンパク質とこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する核酸リンカー中に有するピューロマイシンに特徴を有している（特許文献１参照）。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する。
以下、ｃＤＮＡディスプレイ法について説明する。
ピューロマイシンを有する核酸リンカーとｍＲＮＡとを結合させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからタンパク質を合成すると、合成されたタンパク質とこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体）が生ずる（非特許文献１参照）。
次に、このｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを作製し、所望の機能をもつタンパク質を選択する。選択したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりタンパク質を同定する。逆転写のタイミングは、タンパク質を選択する前でもよく、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−を形成した後にタンパク質を合成してもよい。
【０００５】
上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のライブラリーを基板上に固定したタンパク質チップは、網羅的解析により、短期間で機能タンパク質を取得するためのツールとして重要である。このような網羅的解析をするにあたり、チップを構成する個々のタンパク質が、基板上に適当量固定されている必要がある。さらに、タンパク質相互作用解析や感度を必要とする繊細なアッセイを行う場合には、基板上のタンパク質に高純度が要求される場合がある。
【０００６】
これに対して、Ｈｉｓ（ヒスチヂン）タグやＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグといったアミノ酸配列からなるタグ配列を精製すべきタンパク質に挿入し、融合タンパク質をアフィニティー精製により得るという手法が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４３１８７２１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎｅｍｏｔｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、第４１４巻、第４０５〜４０８頁、１９９７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、このような手法は、精製に用いられるビーズ（担体樹脂）が有する特定のアミノ酸配列との親和性を利用したものであるため、類似するアミノ酸配列を有する夾雑タンパク質を除去することが難しく、精製度の点で難がある。特に合成量の少ない無細胞翻訳系を用いた場合には適していない。
また、あらかじめタグ配列が挿入されたｍＲＮＡを作製しなければならない点で手間である。
【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、網羅的なタンパク質相互作用解析等に用いられる、純度の高いタンパク質を精製できる核酸リンカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、核酸リンカーの３’末端にポリｄＡ（ポリデオキシアデニン）を導入することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１７）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質との複合体を製造するための核酸リンカーであって、
前記核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなり、
前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズしており、
一方のポリヌクレオチド鎖は、前記ｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分から枝分かれしている末端に前記タンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含み、
他方のポリヌクレオチド鎖は、３’末端にポリｄＡ配列及び前記ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方が結合していることを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記ポリｄＡ配列の塩基数が２０以上４０以下であることが好ましい。
（３）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記２本のポリヌクレオチド鎖が、前記一方のポリヌクレオチド鎖の５’末端に結合している光反応架橋剤により架橋されていることが好ましい。
（４）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記光反応架橋剤が、ソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）であることが好ましい。
（５）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記タンパク質の連結部が、前記アーム部の末端にピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドが結合されてなることが好ましい。
（６）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記アーム部が、前記アーム部を切断するための光切断部位または１本鎖核酸切断酵素部位を含むことが好ましい。
【００１２】
（７）本発明の一実施態様における核酸リンカーは、前記一方のポリヌクレオチド鎖が、標識物質を有することが好ましい。
（８）本発明の一実施態様における核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする。
（９）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されていることを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様におけるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されていることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
【００１３】
（１２）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーと、前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質と、が連結されている核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｅ）ＲＮＡ分解酵素を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
（１３）本発明の一実施態様におけるタンパク質複合体の製造方法は、先に記載の核酸リンカーを介して、前記ｍＲＮＡ及び前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡからなるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ複合体、並びに前記ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質が連結されているｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を製造する方法であって、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｆ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を逆転写反応に供して、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
（１４）本発明の一実施態様におけるプロテインアレイは、先に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されていることを特徴とする。
（１５）本発明の一実施態様における解析方法は、先に記載のプロテインアレイを標的分子と接触させ、前記標的分子とタンパク質複合体との相互作用を解析することを特徴とする。
（１６）本発明の一実施態様における標的分子結合タンパク質の同定方法は、標的分子と結合するタンパク質を同定する方法であって、
（ｇ）先に記載のタンパク質複合体が基板上に固定化されているプロテインアレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴とする。
（１７）本発明の一実施態様における標的分子結合タンパク質の同定方法は、前記工程（ｈ）が、表面プラズモン共鳴法により行われる工程であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、網羅的なタンパク質相互作用解析等に用いられる、純度の高いタンパク質を精製できる核酸リンカーが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の核酸リンカーの一態様を示した図である。
【図２】実施例における変性アクリルアミドゲルを用いた電気泳動の結果である。
【図３】実施例において、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎと、核酸リンカーを共有結合させたものの概略図である。
【図４】実施例におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動の結果である。
【図５】実施例におけるセンサーグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
≪核酸リンカー≫
本実施形態の核酸リンカーは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ／ｃＤＮＡと、これらがコードするタンパク質とを連結するためのリンカーである。本実施形態の核酸リンカーの構造について、図１を用いて説明する。
図１中、Ｐｕはピューロマイシン、Ｆはｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＡＴＣＧはＤＮＡシーケンスを示している。また、Ｓｐｃ１８はアーム部を構成するスペーサーを示し、ｄＡはデオキシアデニンを示している。
【００１７】
本実施形態の核酸リンカーは、５’末端側に相互に相補的な配列を有する２本のポリヌクレオチド鎖（Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅ及びＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅ）からなり、前記２本のポリヌクレオチド鎖は、前記配列を介してハイブリダイズし、２本鎖を形成している。
【００１８】
２本のポリヌクレオチド鎖は，ＤＮＡであってもＰＮＡ（ポリヌクレオペプチド）などの核酸誘導体であってもよく、ヌクレアーゼ耐性が付与された修飾ＤＮＡが好ましい。修飾ＤＮＡとしては、ホスホルアミダイト、ホスホロチオエートなどのヌクレオシド間結合を有するＤＮＡ、２’−フルオロ、２’−Ｏ−アルキルなどの糖修飾を有するＤＮＡなど，当該技術分野において知られる修飾ＤＮＡのいずれを用いてもよい。
【００１９】
本実施形態の核酸リンカーを構成する一方のポリヌクレオチド鎖Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅは、１本鎖ポリヌクレオチド部分と、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分に結合している末端にタンパク質の連結部を有するアーム部分と、を含む。
前記１本鎖ポリヌクレオチド部分は、５’末端側にＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅの５’末端側と相補する配列を有し、３’側の領域にスクリーニングすべきｍＲＮＡの３’末端側の配列とハイブリダイズしうる配列を有している。
また、前記１本鎖ポリヌクレオチド部分は、５’末端に光反応架橋剤を有し、前記２本のポリヌクレオチド鎖が、前記光反応架橋剤により架橋されていることが好ましい。これにより、Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅ及びＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅ間の結合を強固なものとすることができる。
【００２０】
架橋とは、例えば塩基同士を共有結合で結ぶことを意味する。
光反応架橋剤としては、芳香族アジド系化合物（例、多環芳香族アジド系化合物、等）やベンゾフラン系化合物等が挙げられ、ベンゾフラン系化合物としては、ソラレン（Ｐｓｏｒａｌｅｎ）が好適に用いられる。ソラレンは、前記２本のポリヌクレオチド鎖が有する相補的な５’- ＴＡ配列に特異的にインターカレーションし、ＵＶ光（３５０ｎｍ）照射によりチミン残基同士に共有結合をつくり２本鎖を架橋する。
【００２１】
Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅのアーム部分は、ｍＲＮＡとタンパク質連結部分とを所望の距離に保持するスペーサーとして機能する。アーム部分の５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端側の箇所で１本鎖ポリヌクレオチド部分と結合し、アーム部分の３’末端はタンパク質連結部分を有する。
【００２２】
１本鎖ポリヌクレオチド部分とアーム部分との連結は、１本鎖ポリヌクレオチド部分上の連結箇所に存在する修飾ヌクレオチド（例えばアミノ基がスペーサを介して塩基部分に導入されたヌクレオチド）と、アーム部分の末端に存在する修飾ヌクレオチド（例えばチオールを５’末端にもつヌクレオチド）とを二官能性試薬を用いて架橋することにより行うことができる。
後述するようにスクリーニングすべきｍＲＮＡを逆転写させる必要がある場合には、アーム部分の５’末端は、１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端から数塩基上流の位置で１本鎖ポリヌクレオチド部分と結合し、Ｔ字型の構造を形成していることが好ましい。逆転写の際に１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端がプライマーとして機能するからである。
【００２３】
また、スクリーニングすべきｍＲＮＡを逆転写させる必要がない場合には、１本鎖ポリヌクレオチド部分の３’末端が標識物質を用いて標識されてもよい。標識物質は、蛍光色素や放射性物質等から適宜選択される。蛍光色素としては、フルオロセインが代表的である。これにより核酸リンカーが蛍光標識され、ｍＲＮＡ−核酸リンカー複合体及びｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を容易に検出することができる。
【００２４】
アーム部分の３’末端にはタンパク質の連結部が存在する。タンパク質連結部分とは，所定の条件下でリボソーム上の伸張中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する性質を有する構造を意味し、ピューロマイシンが代表的である。
ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質の連結部としては，伸張中のタンパク質の３’末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドなどのピューロマイシン誘導体を用いることができる。
アーム部分は、スペーサーとして機能するものであれば、核酸や核酸誘導体から構成されていてもよく、ポリエチレングリコールなどの高分子から構成されていてもよい。アーム部分にはさらに、ピューロマイシンの安定性を高めるための修飾や，複合体の検出のための標識が付加されていてもよい。
【００２５】
本実施形態の核酸リンカーのアーム部は、前記アーム部を切断するための光切断性部位または１本鎖核酸切断酵素切断部位を含んでいてもよい。
このことにより、タンパク質と標的物質との結合を解離させることなく、タンパク質と対応づけられるｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を回収することができる。
光切断性部位とは，紫外線などの光を照射すると切断される性質を有する基をいい、例えば、ＰＣ  Ｌｉｎｋｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物（核酸の光切断用組成物：特開２００５−２４５２２３）、光分解(ＳＢＩＰ)手法による鎖切断などが挙げられる。
光切断性部位としては、当該技術分野において市販されているか、または知られているいずれの基を用いてもよい。また，１本鎖核酸切断酵素切断部位とは，デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼなどの１本鎖核酸切断酵素により切断されることができる核酸基をいい、ヌクレオチドおよびその誘導体が含まれる。
【００２６】
本実施形態の核酸リンカーを構成する他方のポリヌクレオチド鎖ＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅは、５’末端側にＰｕｒｏ  ｓｉｄｅの５’末端側と相補する配列を有し、３’末端にポリｄＡ配列を有する。
ｃＤＮＡディスプレイ法においては、無細胞翻訳系でｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した後、ｍＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを合成する際に、無細胞翻訳系に由来する夾雑物質が存在すると逆転写の効率が低くなるため、逆転写反応の前にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を精製することもできる。
前記複合体は、ＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅの３’末端にポリｄＡ配列が結合しているので、無細胞翻訳系でｍＲＮＡからタンパク質を合成した後に、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をポリｄＡ配列を介してＯｌｉｇｏ  ｄＴカラムに結合させて回収し、溶出し、逆転写することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を無細胞翻訳系から容易に精製することができる。
【００２７】
本実施形態の核酸リンカーが有するポリｄＡ配列の塩基数は、精製に用いられるＯｌｉｇｏ  ｄＴカラムとの適度な親和性（結合及び解離）の観点から、２０以上、４０以下であることが好ましく、２５以上、３５以下であることがより好ましい。
【００２８】
本実施形態の核酸リンカーを構成する他方のポリヌクレオチド鎖ＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅは、ポリｄＡ配列の末端に、特異的に結合する特定の２分子のうちの一方（以下、親和性物質）が結合している。親和性物質を導入することにより、各種タンパク質複合体を固相（支持体）に容易に結合させることができる。
親和性物質としては、ビオチン、スクシンイミジル基等の活性エステル基、マレイミド基、ヨウ化アセチル基、各種の抗原又は抗体、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等が挙げられ、ビオチンが好ましく用いられる。これにより、後述するｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をストレプトアビジンが結合されている基板上に固定することができる。
【００２９】
本実施形態の核酸リンカーによれば、その３’末端にポリｄＡと親和性物質（例えば、ビオチン）がタンデムに連結していることにより、後述するタンパク質複合体の精製にポリｄＡを用いることができ、かつ基板への固定化に前記親和性物質を用いることができる。ポリｄＡ又は親和性物質のどちらか一方のみを有する核酸リンカーを用いた場合には、基板上にタンパク質複合体を固定した後に、夾雑タンパク質を除去するための洗浄をする必要がある。しかしながら、本実施形態に用いられるようなタンパク質間相互作用を解析する装置においては、フローセルに夾雑タンパク質を含むタンパク質複合体をインジェクションする段階で、流路が詰まり適切な解析を行うことができない。本実施形態は、上記構成を有するためこのような問題点を解決することができる。
【００３０】
≪ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体及びその製造方法≫
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体は、本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカーを用いて製造される。
本実施形態のｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、
（ａ）前記ｍＲＮＡと前記核酸リンカーとをアニールさせる工程と、
（ｂ）前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーの５’末端とをライゲーションさせる工程と、
（ｃ）無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーの前記タンパク質の連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する工程と、
（ｄ）前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する工程と、を有することを特徴とする。
以下、各工程について説明する。
【００３１】
工程（ａ）において、ｍＲＮＡと核酸リンカーとをアニールさせる。まず、工程（ａ）に用いられるｍＲＮＡの調製について説明する。
ｍＲＮＡは、スクリーニングすべきタンパク質をコードするＤＮＡを調製し、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
前記ＤＮＡとしては、標的分子との結合に関して調べたい任意のＤＮＡまたはＤＮＡライブラリーを利用することができる。例えば、サンプル組織から得たｃＤＮＡライブラリー、配列をランダムに合成したＤＮＡライブラリー、配列の一部を変異させたＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
転写前のＤＮＡの３’末端に共通のタグ配列を挿入し、転写後のｍＲＮＡの３’側が、本実施形態の核酸リンカーのＰｕｒｏ  ｓｉｄｅの３’側の領域とハイブリダイズするように設計しておく。
【００３２】
次にｍＲＮＡの３’末端領域と本実施形態の核酸リンカーのＰｕｒｏ  ｓｉｄｅの３’側の領域とをアニールさせる。例えば、９０℃まで加熱し、ｍＲＮＡを変性させた後、１時間かけて２５℃まで冷却することによりｍＲＮＡが核酸リンカーに確実にハイブリダイズされる。
【００３３】
次に工程（ｂ）において、前記ｍＲＮＡの３’末端と前記核酸リンカーのＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅの５’末端とをライゲーションさせる。ライゲーションに際し、前記ｍＲＮＡの３’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ等の酵素を用いて、リン酸化させておく必要がある。ライゲーションに用いる酵素としては、ＲＮＡリガーゼが好ましく、例えばＴ４ＲＮＡリガーゼが挙げられる。
【００３４】
次に工程（ｃ）において、無細胞タンパク質翻訳系を用いて前記ｍＲＮＡからタンパク質を合成することにより、前記タンパク質のＣ末端が前記核酸リンカーのタンパク質連結部と結合しているｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製する。
【００３５】
無細胞翻訳系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子等、翻訳に必要な要素が含まれている。このような無細胞翻訳系として、大腸菌抽出、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が一般的に用いられる。
このような系を用いることにより、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が製造される。
【００３６】
次に工程（ｄ）において、前記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が有するオリゴｄＡと、担体上のオリゴｄＴと、を結合させることで、前記複合体を前記担体に固定し、固定化された前記複合体を精製する。担体としては、核酸やタンパク質の精製に用いられるものであれば特に限定されないが、粒子状のものが好ましく、ビーズや磁気ビーズがより好ましい、タンパク質の純度を上げるためには前記ビーズが詰められたカラムが特に好ましい。
本実施形態においては、核酸の精製方法に用いられる手法をタンパク質の精製方法に利用している。そのため、担体上のオリゴｄＴは、オリゴｄＡを有するｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体に特異的に結合する。工程（ｄ）を用いることによって純度の高いタンパク質複合体を精製することができる。このようにして製造されたタンパク質複合体は、繊細な評価系、例えばビアコアを用いたタンパク質相互作用解析や、コンタミタンパク質の存在によってＳ／Ｎ比（シグナル／ノイズ比）を充分に得られなくなってしまうようなアッセイ系に好適に用いられる。
【００３７】
≪ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体及びその製造方法≫
本実施形態のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法に加えて工程（ｆ）を有する。工程（ｆ）において、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から逆転写によりｃＤＮＡを合成する。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。  
逆転写されたｃＤＮＡはｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のｍＲＮＡとハイブリッドを形成する。ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体中のｍＲＮＡは、アプタマーとして非特異的相互作用する可能性が高いため、タンパク質間相互作用解析を行う場合には、このようなｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を作製しておくことが好ましい。  
また、標的タンパク質と相互作用の確認されたタンパク質をコードするｃＤＮＡを解析するためには、この複合体の作製が必須である。
【００３８】
≪核酸リンカー−タンパク質複合体及びその製造方法≫
本実施形態の核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法は、上述したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の製造方法に加えて工程（ｅ）を有する。工程（ｅ）において、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）を用いて前記ｍＲＮＡを分解し、核酸リンカー−タンパク質複合体を生成する。
タンパク質間相互作用解析を行うためには、上述したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の場合と同様、ｍＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッドを形成させておくか、ＲＮａｓｅを用いてｍＲＮＡを分解させておくことが好ましい。ｍＲＮＡを分解した核酸リンカー−タンパク質複合体は、タンパク質間相互作用解析に好適に用いられる。
【００３９】
≪プロテインアレイ≫
本実施形態のプロテインアレイ（プロテインチップ）は、上述したタンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化されてなるものである。用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられる。本実施形態のタンパク質複合体には、固相結合部位が設けられており、その固相結合部位と、基板に結合させた固相結合部位認識部位との結合を利用して、タンパク質複合体をマイクロアレイ基板上に固定化する。
このような固相結合部位／固相結合部位認識部位の組み合わせとしては、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、スクシンイミジル基等の活性エステル基／アミノ基、ヨウ化アセチル基／アミノ基、マレイミド基／チオール基（‐ＳＨ）、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、使い勝手の良さからストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
【００４０】
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてリンカーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。
【００４１】
≪プロテインアレイを用いたタンパク質間相互作用解析方法≫
本実施形態のプロテインアレイを用いて、例えば、配列既知のタンパク質と標的分子との相互作用を解析することができる。「標的分子」とは、本実施形態において合成されるタンパク質と相互作用するか否かを調べるための物質を意味し、有機化合物、無機化合物、あるいはこれらの複合体を示し、一例として、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等が挙げられる。
解析方法としては、オーファンレセプター等の配列既知のタンパク質複合体からなるプロテインアレイを作製し、これに作用するリガンドや低分子化合物等をスクリーニングする方法が例示される。
【００４２】
ここで用いられる標的分子は、標識物質により標識されてもよい。標識物質としては、蛍光色素や放射性物質等が挙げられ、標的分子と固定化されたタンパク質との間の相互作用に基づいて発生する信号の変化の測定、又は解析方法に適したものが適宜選択される。またこのような信号の変化を測定する手法としては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、及び蛍光相関分光法等が挙げられる。
また、表面プラズモン共鳴法は、標識を必要としない測定法であり、分子間の相互作用を微量のサンプルで迅速に解析できる優れた方法である。しかしながら、この測定方法を用いるためには高純度で夾雑物のないタンパク質が必要とされる。
本実施形態のプロテインアレイは、上述したような純度の高いタンパク質からなるため、表面プラズモン共鳴法のような感度の高い系において好適に用いられる。
【００４３】
≪標的分子結合タンパク質の同定方法≫
本実施形態の標的分子結合タンパク質の同定方法は、
（ｇ）上述したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が基板上に固定化されているタンパク質複合体アレイを標的分子と接触させる工程と、
（ｈ）前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する工程と、
（ｉ）標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、を有することを特徴とする。
以下、各工程について説明する。
【００４４】
工程（ｇ）において、上述したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体が基板上に固定化されているタンパク質複合体アレイを標的分子と接触させる。本実施形態の標的分子結合タンパク質の同定方法によれば、前述したプロテインアレイを用いたタンパク質間相互作用解析方法に加えて、配列未知のタンパク質と標的分子との相互作用を解析することができる。よって、工程（ｇ）で好適に用いられるタンパク質複合体はそのアミノ酸配列が未知のものである。また、標的分子としては上述したようなタンパク質、ペプチド、核酸、低分子化合物等が挙げられる。
【００４５】
次に、工程（ｈ）において、前記標的分子とｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体との相互作用を解析する。この工程（ｈ）で用いられる測定方法としては、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、及び蛍光相関分光法等が挙げられ、上述した理由から表面プラズモン共鳴法が好ましい。
【００４６】
次に、工程（ｉ）において、標的分子と結合したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを回収し、回収されたｃＤＮＡの塩基配列を決定する。核酸リンカーのアーム部が、上述した光切断性部位または１本鎖核酸切断酵素切断部位を含んでいる場合には、光照射や、酵素処理によりｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体から切断されたｃＤＮＡを回収することにより、効率よくｃＤＮＡの塩基配列を解析することができる。
【００４７】
本実施形態の標的分子結合タンパク質の同定方法によれば、配列未知のタンパク質からなるプロテインアレイから新規機能タンパク質を同定することができる。例えば、特定のリガンドに作用するレセプターの同定やがん細胞が細胞表面に有する特異的な抗原に作用する抗体の同定等に好適に用いられる。
【００４８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
（核酸リンカーの合成）
１−１  材料  
以下に示す材料をジーンワールド社より購入した。
（１）Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅ
［配列：５’−（ＰＳ）−Ｘ−（Ｆ）−（Ｓｐｃ１８）−（Ｓｐｃ１８）−（Ｓｐｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３’］
ここで、Ｘは以下の配列を表す。
ＴＡＣＧＡＣＧＡＴＣＴＣＧＡＡＣＧＡＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣ（配列番号１：４４ｍｅｒ）
（２）ＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅ
［配列：５’−Ｚ−（Ｂ）−３’］
ここで、Ｚは以下の配列を表す。
ＣＣＣＧＴＧＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２：５６ｍｅｒ）
また、（ＰＳ）はＰｓｏｒａｌｅｎ、（Ｆ）はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｄＴ、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ  ＣＰＧ、（Ｂ）は、ＢｉｏｔｉｎＴＥＧ、（Ｓｐｃ１８）は（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）である。これらは、いずれもＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製である。
【００５０】
１−２  合成、精製方法
Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）２０μｌ及びＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）５μｌを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む)２５μｌに溶かした反応溶液を、Ｔ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用いて、９０℃に加熱後、１時間かけて２５℃まで冷却した。
その後、Ｍｏｄｅｌ  ＵＶＬ−５６  Ｂｌａｋ−ｒａｙ  Ｌａｍｐを用いて反応溶液をＵＶ照射し（λ＝３６５ｎｍ、１５分）、Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅとＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅを架橋により結合させた。
【００５１】
（ｍＲＮＡの合成）
５’側にＴ７、Ｃａｐ、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３’末端にリンカーのＤＮＡ部分と相補な配列をもち、終止コドンを削ったＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎ（配列番号３：３７２ｂｐ）をＰＣＲにより増幅した。反応液を表１に記載の組成となるように調製し、９５℃で２分間保持した後、９５℃３０秒、６９℃２５秒、７２℃４０秒の３ステップＰＣＲを３０サイクル行い、７２℃で２分間保持した後、４℃で冷却した。尚、用いたプライマーの配列を以下に示す。
（１） Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｗ Ｙ−ｔａｇ (２２ｍｅｒ、２０ｐｍｏｌ／μｌ)
［配列：５’− ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ−３’］（配列番号４）
（２）Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｅｗ ｌｅｆｔ (３３ｍｅｒ、２０ｐｍｏｌ／μｌ)
［配列：５’− ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ−３’］（配列番号５）
【００５２】
【表１】
2011217708.tif 000003
【００５３】
ＰＣＲにより得られたＤＮＡをＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて転写し、ｍＲＮＡを合成した。反応液を表２に記載の組成となるように調製し、３７℃で４時間インキュベーションした後、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を１μｌ添加し、３７℃１５分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製を行った。
【００５４】
【表２】
2011217708.tif 000004
【００５５】
（ｍＲＮＡと核酸リンカーの結合）
５’キャップ及び３’にタグ配列を持ったｍＲＮＡ ２０ｐｍｏｌに、核酸リンカーを２０ｐｍｏｌ、１０ｘＴ４  Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）２μｌ、を加え２０μｌになるようＤＥＰＣ処理水を加えた。調製した反応溶液をＴ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ社）を用いて、９０℃に加熱後、１時間かけて２５℃まで冷却した。その後、１５ｕｎｉｔ Ｔ４ Ｐｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ、１．０μｌ）、１００ｕｎｉｔ Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ、１．０μｌ）を加え、２５℃、３０分反応させた。サンプルをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｅｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製した。
上記に従って反応した産物を８Ｍ  Ｕｒｅａの８％変性アクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを用いて核酸を染色した。結果を図２に示す。
【００５６】
図２中、レーン１はＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎのＤＮＡ、レーン２はＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎのｍＲＮＡ、レーン３はＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎのｍＲＮＡと核酸リンカーをライゲーションしたもの（ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ）、レーン４はリンカーのみを電気泳動したものを示す。
レーン３において、矢印はライゲーション産物（ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ）を示す。未反応のＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎの量が少ないことから、本実施形態の核酸リンカーを用いた場合のライゲーション効率は高いことが分かる。
【００５７】
図３に、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎへ、核酸リンカーを共有結合させたものの概略図を示す。図３中、Ｐｕはピューロマイシン、ＦはＦＩＴＣ、ＡＴＣＧｕはＤＮＡ、ＲＮＡシーケンスを示している。大文字で示した部分はＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡを示す。ＲＮＡの３’末端とＤＮＡの５’末端は“Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ”と示した部分でライゲートされている。
【００５８】
（無細胞翻訳系による翻訳）
上記のように合成した、核酸リンカーとｍＲＮＡの複合体に無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を３０μｌ加え、３０℃、３０分翻訳反応を行った。その後、３Ｍ  ＫＣｌを１０μｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を３μｌ加えて３７℃で４０分間放置し、０．４Ｍ  ＥＤＴＡを１０μｌ加え、ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体を合成した。
【００５９】
（Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ＢｅａｄｓによるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の精製）
Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｂｅａｄｓ（Ｄｙａｎａｌ社）を使用量チューブに取り、添付のマニュアルに従い洗浄を行った。上記のように合成したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体に等量のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１Ｍ  ＬｉＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、室温に置いた後、上記ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁した洗浄済みＯｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｂｅａｄｓ液に加えた。室温で１時間ＴＨＥＲＭＯ  ＢＬＯＣＫ  ＲＯＴＡＴＥＲ（ＮＩＳＳＩＮ社）を用い、転倒混和した後、チューブを氷上に５分放置した。ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体及びＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒの総量と等量のＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、転倒混和し、チューブをマグネット上に２〜３分置いた後、上清を取り除き、マグネットからチューブを外した。この洗浄操作をもう一度繰り返した後、ＤＥＰＣ ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒを加え、混和させ、室温で５分放置し、溶出させた。
上記に従って精製したｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動を行った。泳動後、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙを用いてタンパク質を染色した。また、上述したように核酸リンカーには、Ｐｕｒｏ  ｓｉｄｅの３’末端がＦＩＴＣにより蛍光標識されているため、蛍光イメージを取得した。
結果を図４に示す。
【００６０】
図４中、レーン１は翻訳反応前のｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ、レーン２は翻訳反応後のｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ、レーン３は精製後のｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎである。矢印はｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ、またはｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎを示す。上段及び下段の電気泳動結果は、同一のゲルを異なるイメージング法を用いて解析したものである。上段は、ＦＩＴＣによる蛍光イメージを取得した結果であり、下段は、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙを用いてタンパク質を染色した結果である。
上段のレーン２及びレーン３において、ｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎの蛍光強度は同程度である。その一方、下段のレーン２において検出される無細胞翻訳系に含まれる夾雑物が、レーン３においては全く検出されていない。これらのことから、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  Ｂｅａｄｓ用いて精製されたｍＲＮＡ−Ｌｉｎｋｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎの純度は非常に高いことが確認された。
【００６１】
（ｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体のセンサーチップ上への固定化）
ＢｉａｃｏｒｅＪ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ  ＳＡ上にｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体の固定化を行った。Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ  ＳＡは、基板上にデキストランを介してストレプトアビジンが結合しているＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、表面プラズモン共鳴）用のセンサーチップである。これに対し、核酸リンカーにはＰｏｌｙＡ  ｓｉｄｅの３’末端にビオチンが付されているため、ストレプトアビジンとビオチンの強い親和性を利用することができる。
まず、Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ  ＳＡに共有結合によらず吸着したストレプトアビジン分子を洗い流し、ベースラインの安定化を図るため、１Ｍ  ＮａＣｌを含有した５０ｍＭ  ＮａＯＨを用いてＳｅｎｓｏｒｃｈｉｐ  ＳＡ表面の洗浄を１分間、３回行った。
次に１００ｍＭ  ＮａＣｌを含むｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体をフローセルにインジェクションし、固定化を行った。Ｒｕｎｎｉｎｇ  ＢｕｆｆｅｒとしてＨＢＳ−ＥＰ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた。
【００６２】
（ＩｇＧインジェクションによるｍＲＮＡ−核酸リンカー−タンパク質複合体とＩｇＧ間の相互作用解析）
ＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎと強い相互作用を示すことが知られているＩｇＧをフローセルにインジェクションし、ＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎとの相互作用解析を行った。ＰＢＳに溶解させたラビット血清由来のＩｇＧを３つの濃度（２．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ）インジェクションし、相互作用解析を行った。結果を図１０２に示す。
【００６３】
図５中、縦軸はＳｅｎｓｏｒｃｈｉｐ  ＳＡ上の質量変化（レスポンス）を示し、横軸は経過時間を示す。ＩｇＧをインジェクションすることにより、レスポンスは上昇し、結合反応が起きていることが確認された。一方、インジェクションをやめＲｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに切り替えると、解離反応により、レスポンスが徐々に減少することが確認された。更に、結合曲線の傾き及びＩｇＧの最大結合量が、ＩｇＧの濃度依存的であることから、ＩｇＧとＰｒｏｔｅｉｎＡのＢ−ｄｏｍａｉｎの特異的結合が確認された。このようなセンサーグラムからデータ解析ソフトウエア  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ を用いｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）を算出したところ、ｋａは２．９９ｘ１０５、ｋｄは５．６５ｘ１０−２であった。ｋａとｋｄより算出した解離定数ＫＤは１８９ｎＭであり、文献上報告されているＫＤ（１００ｎＭ）とほぼ一致していることが確認された。
【００６４】
以上の結果から、本実施形態の核酸リンカーによれば、無細胞翻訳系を用いて合成される少量のタンパク質を迅速に、かつ高純度で精製することができる。よって、本実施形態の核酸リンカーを用いて得られたタンパク質を用いてプロテインアレイを作製し、網羅的なタンパク質相互作用解析を行うことができることが明らかである。また、タンパク質間相互作用解析装置は、解析に用いるタンパク質に高い純度を要求するが、本実施形態の核酸リンカーを用いて作製したタンパク質は、このような要求を満たすものである。
また、本実施形態のタンパク質複合体の製造方法は、高純度なタンパク質を得るための画期的な方法であるため、アッセイ系においてコンタミタンパク質の混入を嫌うような系においても好適に用いられる。さらに、本実施形態のタンパク質複合体の製造方法を、近年改良されている無細胞翻訳系を用いたタンパク質の大量合成系と組み合わせることで、高純度なタンパク質を必要とするタンパク質の結晶化及びそれを用いた立体構造解析にも好適に用いられる。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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