(57)【要約】【課題】  肥満を予防又は解消するため又は血糖値を低下させるために有効な組成物の提供。【解決手段】  （１）担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を含有する組成物、（２）担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を含有する組成物、又は（３）エルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物を脂肪減少活性成分として含有する組成物。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を含有することを特徴とする、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物。
【請求項２】
脂肪減少活性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類がアンニンコウ（学名：グリフォラ・ガルガル（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ））である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
細胞の糖の取込みを上昇させる活性を示す、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を、分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を含有することを特徴とする、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物。
【請求項６】
脂肪減少活性を示す、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類がアンニンコウ（学名：グリフォラ・ガルガル（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ））である、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
細胞の糖の取込みを上昇させる活性を示す、請求項５乃至７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
エルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物を活性成分として含有することを特徴とする、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物。
【請求項１０】
脂肪減少活性を示す、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を含有する、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を、分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を含有する、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞の糖の取込みを上昇させる活性を示す、請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコの乾燥粉末から、熱水にて抽出する工程（１）、工程（１）で得られた混合物から上澄液を分離する工程（２）、及び前記上澄液を濃縮する工程（３）を含む、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物の調製方法。
【請求項１５】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類がアンニンコウ（学名：グリフォラ・ガルガル（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ））である、請求項１４に記載の調製方法。
【請求項１６】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコの乾燥粉末から、熱水にて抽出する工程（Ｉ）、工程（Ｉ）で得られた混合物から上澄液を分離する工程（ＩＩ）、及び前記上澄み液中の成分を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分画し、低分子画分を得る工程（ＩＩＩ）を含む、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物の調製方法。
【請求項１７】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類がアンニンコウ（学名：グリフォラ・ガルガル（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ））である、請求項１６に記載の調製方法。
【請求項１８】
脂肪を減少させる、インスリン作用を増強する又は血糖値を低下させる方法であって、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を、薬理的に有効な量で投与することを含む方法。
【請求項１９】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類がアンニンコウ（学名：グリフォラ・ガルガル（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ））である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
脂肪を減少させる、インスリン作用を増強する又は血糖値を低下させる方法であって、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を、薬理的に有効な量で投与することを含む方法。
【請求項２１】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類がアンニンコウ（学名：グリフォラ・ガルガル（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ））である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内臓脂肪や血中の中性脂肪を低下させる活性、インスリンの分泌を促進する活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す、すなわちメタボリック・シンドロームや糖尿病の予防や治療に有効な、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコに由来する組成物及びエルゴチオネインを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会においては、メタボリック・シンドローム患者が増加の一途をたどっている。メタボリック・シンドロームに罹患するリスクを上昇させる因子として、内臓脂肪の蓄積による肥満が着目されている。従って、バランスのよい食事の摂取や運動による肥満の予防が重要であるが、なかなか実現できない場合が多い。
【０００３】
また、現代社会においては、食生活の変化、運動不足、ストレスの付加等に起因して、ＩＩ型（インスリン非依存型）糖尿病患者及びその予備軍が増加の一途をたどっており、且つ、Ｉ型（インスリン依存型）糖尿病患者も、依然として減少していない。このような糖尿病患者に処方される薬としては、Ｉ型糖尿病患者やＩＩ型糖尿病で顕著な高血糖が認められる場合に使用されるインスリンの他に、スルフォニルウレア剤（ＳＵ薬）やフェニールアラニン誘導体等のインスリン分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤（αＧＩ薬）等のブドウ糖吸収阻害薬、ビグアナイド剤（ＢＧ薬）、チアゾリジン系誘導体（ＴＺＤ薬）等のインスリン抵抗性改善薬等が知られている。
【０００４】
このような状況下、キノコ類に由来する成分を含有する肥満防止に有効な組成物が、多数提案されている。そのような組成物に含有されている有効成分の代表例は、β−Ｄ−グルカンやキトサン、グリコプロテインといった高分子化合物である。一方、キノコに由来する成分であって、高分子化合物以外の成分を含有する肥満防止に有効な組成物も知られている。
【０００５】
特許文献１には、キノコ類の一種であるキクラゲ類からの含水有機溶媒抽出物または有機溶媒抽出物を含有する脂肪蓄積抑制剤が開示されている。特許文献１には、この脂肪蓄積抑制剤の有効成分が何であるかが記載されていないが、脂溶性成分である旨の記載と、脂溶性であるために、抽出に含水有機溶媒を用いる場合には、水性成分の含有量が高くなると抽出効率が低下する旨が記載されている（段落番号［００２１］）。
【０００６】
特許文献２には、ヒダナシタケ目タコウキン科に属するトンビマイタケ等のキノコまたはそのエキスを有効成分とする脂肪分解促進剤が開示されている。特許文献２には、エキスの抽出溶媒として、水、メタノール、エタノール等が例示されている（段落番号［０００７］）が、実施例で使用されている溶媒は７０％メタノールのみである（段落番号［００１０］）。
【０００７】
特許文献３には、キノコに由来する環状ペプチドが、抗肥満剤として有効である旨が記載されている。実施例では、カワラタケから有効成分の抽出を行っている。その抽出プロセスが記載された図１によると、初めに乾燥カワラタケから含水エタノールで抽出を行い、次いで、その抽出液を酢酸エチル／水での分配に供している。図１によると、この分配後の水層は、脂肪蓄積阻害活性を示さなかった。従って、特許文献３に開示された環状ペプチドも、脂溶性成分であるといえる。
【０００８】
特許文献４には、エリンギ又はハナビラタケについて、乾燥、熱気体を用いた修治処理及び粉末化の工程を経て製造された粉末を、高脂肪食で飼育しているラットに水とともに与えたところ、脂肪分解作用の増強が認められた旨が記載されている（試験例６）。また、前記粉末からの熱水抽出画分には、オリゴ糖類、各種配糖体、蛋白質及び水溶性多糖類が含まれていると予想された旨も記載されている（段落番号［００３３］）。しかし、特許文献４には、脂肪分解作用を増強させる成分が何であるかは記載されていない。
【０００９】
特許文献５には、海藻の抽出物および薬草木の抽出物に、更に、マンネンタケやアガリクス茸等の茸の抽出物を加えた、血液の中性脂肪量の抑制作用を有する組成物が開示されている（請求項２）。その実施例では、有効成分の抽出に熱水を使用している（段落番号［００２０］）。しかし、特許文献５には、茸のみからの熱水抽出物が、血液の中性脂肪量の抑制作用を示すことは記載されていない。
【００１０】
また、多くのキノコ類に含有されている生理活性物質の一つとして、エルゴチオネインが挙げられる。特許文献６の請求項７には、「細胞中のサーチュインの活性及び／又はたんぱく質レベルを増す作用薬を治療上有効量、それを必要とする対象に投与するステップを含む、対象の体重を減らす、あるいは対象の体重増加を防止する、方法。」が記載されており、前記作用薬の一例として、エルゴチオネインが挙げられている。また、特許文献７の請求項１７には、「高脂肪食を消費し、処置を必要とする被検体において肥満を処置する方法であって、一定量のサーチュイン活性化化合物を該被検体に投与することを含む、方法。」が記載されており、サーチュイン活性化化合物の一例として、エルゴチオネインが挙げられている。さらに、特許文献８にもサーチュイン活性化化合物の利用に係る発明が開示されており、サーチュイン活性化化合物の一例として、エルゴチオネインが挙げられている。しかし、特許文献８において、「必要のある対象において対象の体重を減らす、あるいは患者の体重増加を防止する医薬品を調剤するための特定の化合物の使用。」に係る発明（請求項５）における特定の化合物には、エルゴチオネインは包含されていない。また、特許文献６乃至８のいずれにおいても、エルゴチオネインが肥満の予防や治療に有効であることは実証されていない。
【００１１】
一方、キノコ類は種々の成分を含有しており、キノコそのものやキノコからの抽出物が、血糖低下に有効である旨が記載された文献も多々ある。そのような文献中、キノコの摂取による血中又は膵臓インスリン量の変化に言及しているものとして、特許文献９乃至１３が挙げられる。
【００１２】
特許文献９には、マイタケの菌糸体又は子実体からの抽出物や、マイタケの菌糸体又は子実体にビタミンを混入してなる組成物が、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病に対して改善効果を示す旨が記載されている。その実施例には、ＩＩ型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）に上記の抽出物や組成物を経口投与したところ、無処理群（非投与群）と比べて血中インスリン量及び血中トリグリセライド量が低下した旨が記載されている（段落番号［００３０］乃至［００３６］）。
【００１３】
特許文献１０には、マイタケやチョレイマイタケに由来するプロテオグルカンが、インスリン非依存型（ＩＩ型）糖尿病の改善に有効である旨が記載されている。その実施例には、自然発症糖尿病マウスＫＫ−Ａｙを使用した実験で、プロテオグルカン混入試料を与えた検体飼料群の方が、対照飼料群よりも血中インスリン濃度が低かった旨が記載されている（段落番号［００４３］）。
【００１４】
特許文献１１には、ヤマブシタケの乾燥粉末やヤマブシタケからの熱水抽出物が、糖尿病の予防及び改善に有効である旨が記載されている。その実施例には、ＩＩ型糖尿病モデル動物であるＧＯＴＯ−ＫＡＫＩＺＡＫＩラット（ＧＫラット）において、ヤマブシタケからの熱水抽出物を摂取した群では、無投与群と比較して、膵インスリン値の上昇が認められた旨が記載されている（段落番号［００２６］）。
【００１５】
特許文献１２には、マツタケ又はその抽出物が、インスリン分泌促進作用、血糖値上昇抑制効果等を奏する旨が記載されている。その実施例には、対照ラットでは、基本食群も実験食（マツタケ菌糸体の乾燥粉末添加飼料）群も、食後３０分で血漿インスリン値がピークに達し、その後穏やかに低下した。一方、ＩＩ型糖尿病モデル動物である新生児期ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理ラット（ｎＳＴＺラット）では、実験食群の血漿インスリン値の変動は対照ラットとほぼ同様であったが、基本食群は、食後３０分乃至１２０分におけるインスリン値が有意に低かった旨が記載されている（段落番号［０１７６］乃至［０１８１］）。
【００１６】
特許文献１３には、ハナビラタケ由来の活性物質が、インスリン分泌促進活性を有する旨が記載されている。その実施例２には、ＩＣＲマウスを用いた経口糖負荷試験において、キノコ乾燥粉末の経口投与後に糖負荷を行い、その後血中インスリン濃度を測定したところ、ハナビラタケ乾燥粉末又はマイタケ乾燥粉末を投与した群で、対照群（キノコ乾燥粉末不投与）と比較してインスリン濃度が増加していた旨が記載されている（段落番号［００２９］乃至［００３０］）。また、ＫＫ−Ａｙ糖尿病発症マウスやＷｉｓｔａｒラットを用いた糖負荷試験でも、ハナビラタケ乾燥粉末を投与した群で、対照群（キノコ乾燥粉末不投与）と比較して特に糖負荷３０分後のインスリン濃度が大きく増加していた旨が記載されている（実施例４及び５）。
【００１７】
以上のように、キノコ類には、血中インスリン量を低下させるものと増加させるものがある。また、マイタケに関しては、特許文献９及び１０には、インスリン濃度を低下させる旨が記載されており、一方、特許文献１３には、インスリン濃度を上昇させる旨が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００７−２６９７３９
【特許文献２】特開２０００−２６３０８
【特許文献３】特開２００５−２２００７４
【特許文献４】特開２００７−２６９６４１
【特許文献５】特開２００６−３６６８１
【特許文献６】特表２００７−５２７４１８
【特許文献７】特表２００７−５００３５７
【特許文献８】特表２００９−５００３３１
【特許文献９】特開平６−３１２９３６
【特許文献１０】特開平１０−１８２７０２
【特許文献１１】特開２００５−１７９３０２
【特許文献１２】特開２００５−２２５８０１
【特許文献１３】特開２００８−２３０９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明者らは、肥満を予防するための方策を無理なく実施するには、安全で肥満予防に有効な成分の摂取が確実でよい方法であると考えた。そこで、本発明者等は、肥満予防に有効な成分を含む食物の探索を行うこととした。そのような探索に当たり、種々の有用成分を含有することが知られている食用キノコ類に着目した。そして、そのような食用キノコ類の中で、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類に的を絞り、そのようなキノコ類が肥満予防に有効な成分を含有するか否かを研究することとした。
【００２０】
また、抽出溶媒については、動物がそのまま摂取しても害がないものが好ましいので、先ず、水（より具体的には熱水）の使用を試みることとした。そして、上記キノコからの熱水抽出物が、脂肪減少活性を示すか否かを検証することとした。さらに、上記キノコからの熱水抽出物にエルゴチオネインが含有されているか否かを検証するとともに、エルゴチオネインが肥満予防に有効であるか否かも検証することとした。
【００２１】
上記の研究の過程において、本発明者らは、上記キノコからの熱水抽出物が、脂肪減少活性以外の有用な活性をも示す可能性があると考えた。そして、肥満同様、現代社会において患者が増加の一途をたどっている糖尿病に着目し、上記キノコからの熱水抽出物が、糖尿病の予防や治療に有効であるか否かも検証することとした。そして、上記キノコからの熱水抽出物が糖尿病の治療に有効であることが明らかとなったので、当該熱水抽出物に含有されている成分が、どのような作用機序で糖尿病の治療に有用であるかも研究した。
【００２２】
従って、本発明の目的は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類に由来する、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、エルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物を活性成分として含有する、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物を提供することにある。
【００２３】
さらに、本発明の目的は、上記組成物の調製方法を提供することにある。そして、本発明の目的は、上記組成物を使用する、脂肪を減少させる、インスリン作用を増強する又は血糖値を低下させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者等は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類の一種であるアンニンコウ（学名：Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ）に脂肪減少活性を示す成分が含有されているか否かについて研究を行い、その後、アンニンコウに由来する成分がインスリン分泌促進や血糖低下活性をも示すか否かについても研究を行い、その結果として、本願発明を完成させた。
【００２５】
即ち、本発明は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を含有することを特徴とする脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物（以下、「第一の組成物」ということがある）に関する。また、本発明は、前記熱水抽出物を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を含有することを特徴とする、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物（以下、「第二の組成物」ということがある）に関する。
【００２６】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類が、和名がアンニンコウである学名グリフォラ・ガルガル（Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ）であることが好ましい。
【００２７】
また、本発明は、エルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物を活性成分として含有することを特徴とする、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物（以下、「第三の組成物」ということがある）に関する。
【００２８】
本発明は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコの乾燥粉末から、熱水にて抽出する工程（１）、工程（１）で得られた混合物から上澄液を分離する工程（２）、及び前記上澄液を濃縮する工程（３）を含む、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物の調製方法（以下、「第一の調製方法」ということがある）に関する。
【００２９】
本発明は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコの乾燥粉末から、熱水にて抽出する工程（Ｉ）、工程（Ｉ）で得られた混合物から上澄液を分離する工程（ＩＩ）、及び前記上澄み液中の成分を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分画し、低分子画分を得る工程（ＩＩＩ）を含む、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物の調製方法（以下、「第二の調製方法」ということがある）に関する。
【００３０】
また、本発明は、脂肪を減少させる、インスリン作用を増強する又は血糖値を低下させる方法であって、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を、薬理的に有効な量で投与することを含む方法（以下、「第一の投与方法」ということがある）に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、脂肪を減少させる、インスリン作用を増強する又は血糖値を低下させる方法であって、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を、薬理的に有効な量で投与することを含む方法（以下、「第二の投与方法」ということがある）に関する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、内臓脂肪や血中の中性脂肪の減少に有効な組成物及びその調製方法が提供される。また、本発明により、インスリン分泌促進活性又は血糖低下活性を有する組成物及びその調製方法が提供される。さらに、本発明により、脂肪を減少させる方法、インスリン作用を増強する方法、及び血糖値を低下させる方法が提供される。本発明の組成物は、メタボリック・シンドロームの予防・治療剤として、また糖尿病の予防・治療剤として有用である。前記血糖低下活性の少なくとも一部は、前記組成物が示す細胞への糖（グルコース）の取込みを上昇させる活性に起因すると考えられる。したがって、本発明の組成物は、細胞のグルコース取込み能促進剤としても有用である。
【００３３】
本発明の組成物は、メタボリック・シンドロームの予防や治療に、また糖尿病の予防や治療に有用である。本発明の組成物は、その原材料又は由来が食物であるので、安全性が非常に高く、また、副作用は生起されないことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】マウスの対照群及び低投与群の解剖時における体重を示す。
【図２】マウスの対照群及び高投与群の解剖時における体重を示す。
【図３】マウスの対照群及び低投与群の解剖時における肝臓重量を示す。
【図４】マウスの対照群及び高投与群の解剖時における肝臓重量を示す。
【図５】マウスの対照群及び低投与群の解剖時における脾臓重量を示す。
【図６】マウスの対照群及び高投与群の解剖時における脾臓重量を示す。
【図７】マウスの対照群及び低投与群の解剖時における精巣周囲脂肪重量を示す。
【図８】マウスの対照群及び高投与群の解剖時における精巣周囲脂肪重量を示す。
【図９】マウスの対照群及び低高投与群の解剖時における血漿中のトリグリセライドの量を示す。
【図１０】マウスの対照群、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における体重を示す。
【図１１】マウスの対照群、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における肝臓重量を示す。
【図１２】マウスの対照群、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における脾臓重量を示す。
【図１３】マウスの対照群、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における精巣周囲脂肪重量を示す。
【図１４】マウスの対照群、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿中のトリグリセライドの量を示す。
【図１５】正常マウスの対照群（「通常食」と記載、以下同様）及び低分子画分添加飼料群（「試料添加食」と記載、以下同様）の飼料摂取量を示す。
【図１６】肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の飼料摂取量を示す。
【図１７】正常マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の飲水量を示す。
【図１８】肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の飲水量を示す。
【図１９】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の血糖値を示す。
【図２０】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の絶食前後における血糖値を示す。
【図２１】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における体重を示す。
【図２２】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における肝臓重量を示す。
【図２３】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における脾臓重量を示す。
【図２４】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における精巣周囲脂肪重量を示す。
【図２５】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における赤血球（ＲＢＣ）数を示す。
【図２６】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時におけるヘモグロビン（ＨＧＢ）濃度を示す。
【図２７】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時におけるヘマトクリット（ＨＣＴ）値を示す。
【図２８】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における赤血球容積（ＭＣＶ）を示す。
【図２９】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における白血球（ＷＢＣ）数を示す。
【図３０】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血小板（ＰＬＴ）数を示す。
【図３１】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿中の総タンパク（ＴＰ）量を示す。
【図３２】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿中のアルブミン／グロブリン（Ａ／Ｇ）比を示す。
【図３３】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿中の総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ．）値を示す。
【図３４】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿中のトリグリセライド（ＴＧ）の量を示す。
【図３５】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿のレプチン濃度を示す。
【図３６】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿のアディポネクチン濃度を示す。
【図３７】正常マウス及び肥満マウスの対照群及び低分子画分添加飼料群の解剖時における血漿のインスリン濃度を示す。
【図３８】糖（グルコース）取込み活性の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明に係る第一の組成物は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を含有し、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物である。
【００３６】
キノコは、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属し、当該キノコからの熱水抽出物が脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す成分を含有するものである限り、特に限定されない。
【００３７】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類の例を挙げると、和名がアンニンコウであるグリフォラ・ガルガル（学名：Ｇｒｉｆｏｌａ  ｇａｒｇａｌ）、グリフォラ・ソルドゥレンタ（学名：Ｇｒｉｆｏｌａ  ｓｏｒｄｕｌｅｎｔａ）、マイタケ（学名：Ｇｒｉｆｏｌａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）等がある。前二者は、アルゼンチンやチリ、特にチリのパタゴニア地方に生育するキノコである。アンニンコウの人工栽培方法は、例えば特開２００７−２０５６０号公報に開示されている。また、マイタケは、我が国において広く人工栽培されている。
【００３８】
担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類の中では、アンニンコウが最も好ましい。本発明の組成物にインスリン分泌促進活性及び／又は血糖低下活性を期待する場合は特に、アンニンコウが好ましい。また、上記キノコは、菌糸体でも子実体でもよいが、子実体の方が好ましい。
【００３９】
上記キノコ類からの「熱水抽出物」とは、熱水抽出物そのものに限定されない。例えば、熱水抽出物の濃縮液や熱水抽出物の凍結乾燥品といった、上記キノコ類からの熱水抽出物に、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性又は血糖低下活性が大きく損なわれることがないように処理を加えたもの、即ち、上記キノコ類からの「熱水抽出物に由来するもの」も、「熱水抽出物」の概念に包含される。
【００４０】
上記キノコ類から「熱水抽出物」を調製する方法は、その第一段階が熱水抽出であること以外は特に限定されない。好ましい方法は、第一の調製方法として後記する。
【００４１】
本発明に係る第二の組成物は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を、分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を含有し、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物である。
【００４２】
「低分子画分」とは、熱水抽出物を、例えば限外ろ過膜で、ある分子量を境として分画した場合に、膜を透過した画分をいう。「低分子画分」は、膜を透過した画分そのものに限定されない。例えば、低分子画分の濃縮液や低分子画分の凍結乾燥品といった、上記低分子画分に脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性又は血糖低下活性が大きく損なわれることがないように処理を加えたもの、即ち「低分子画分に由来するもの」も、「低分子画分」の概念に包含される。
【００４３】
本発明における「低分子画分」には、上記キノコ類からの熱水抽出物に含有されている成分の中、分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜を透過した成分が含有されている。分画分子量は、２０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかであることが好ましく、１３，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかであることがさらに好ましく、１３，０００であることが特に好ましい。
【００４４】
本発明に係る第三の組成物は、エルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物を抗炎症活性成分として含有する。ここで、エルゴチオネインは、次の［化１］に記載された式によって表される。
【００４５】
【化１】
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【００４６】
「薬理学的に許容される塩」とは、例えば、前記の［化１］に記載された式において、水酸基の水素が、ナトリウム、カリウム、カルシウム等で置換されてアルカリ又はアルカリ土類金属塩となっているものやアンモニウム基で置換されてアンモニウム塩となっているものや、水酸基の水素やイミノ基の水素に、塩酸、硫酸等の無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸、グリシン等のアミノ酸が付加した付加塩、水が付加した水和物等をいう。しかし、これらに限定されず、薬理学的に許容されるものであれば、いずれであってもよい。
【００４７】
「加水分解によってエルゴチオネインとなるとなる化合物」とは、例えば、前記の［化１］に記載された式中の水酸基が、保護基で保護されている、換言すれば、当該水酸基中の水素原子が、何らかの基によって置換されており、加水分解されると水酸基となる化合物をいう。このような「保護基で保護されている水酸基」の例としては、メトキシメチルエーテル基、テトラヒドロピラニルエーテル基、ターシャリーブチルエーテル基、アリルエーテル基、安息香酸エステル基、アセテート基（アセチルオキシ基）、ホルメート基、クロトネート基、ｐ−フェニル安息香酸エステル基、トリメチルアセチルオキシ基、ターシャリーブチルジメチルシリルオキシ基、ターシャリーブチルジフェニルシリルオキシ基、トリチルオキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。
【００４８】
本発明において、「エルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物を活性成分として含有する」とは、本発明の第三の組成物が示す脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性に関し、少なくともその活性の一部がエルゴチオネインによって示されるような量で、好ましくは主としてエルゴチオネインによって示されるような量で、エルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物が、組成物中に含有されていることをいう。
【００４９】
エルゴチオネインは、例えば、ヒスチジンをヘルシニン（ｈｅｒｃｙｎｉｎｅ）に変換し、これにシステインを反応させることで合成することができる。エルゴチオネイン等は、天然物から抽出することもできる。エルゴチオネイン等の抽出に使用する天然物は、エルゴチオネインを含有し、エルゴチオネインの抽出の際に同時に毒物が抽出されないものであれば、特に限定されない。エルゴチオネイン等の抽出に適する天然物の例として、食用キノコが挙げられる。また、食用キノコの具体例としては、先に本発明の第一の組成物に関する説明において記載した担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコが挙げられる。
【００５０】
本発明の組成物が脂肪減少活性を示す組成物である場合、脂肪減少活性の有無の具体的指標としては、例えば、内臓脂肪の減少の有無や、血中の中性脂肪（トリグリセライド）の減少の有無が挙げられる。そのような脂肪の減少が生じる原理や作用機序は、特に限定されない。
【００５１】
本発明の組成物がインスリン分泌促進活性を示す組成物である場合、インスリン分泌促進活性があることは、例えば、血漿のインスリン濃度を測定することで検出することができる。インスリン分泌促進活性が発現される原理や作用機序は、特に限定されない。また、本発明の組成物が血糖低下活性を示す組成物である場合、血糖低下活性があることは、空腹時血糖や、糖負荷後の血糖値の上昇及び下降パターンの測定によって検出することが出来る。血糖低下活性が発現される原理や作用機序は、特に限定されない。しかし、血糖低下活性の少なくとも一部は、本発明の組成物が示す、細胞の糖（グルコース）取込み能を上昇させる活性によって発現されると考えられる。
【００５２】
本発明の組成物は、第一の組成物の場合には上記した熱水抽出物を、第二の組成物の場合には上記した低分子画分を、第三の組成物の場合にはエルゴチオネイン、その薬理学的に許容される塩、又は加水分解によってエルゴチオネインとなる化合物を、必須成分として含有する。その他の成分は含有してもしなくてもよい。その他の成分は、目的とする活性を阻害しないものである限り、特に限定されない。
【００５３】
本発明に係る組成物は、経口投与を目的として、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の剤型で、また、非経口投与を目的として、例えば注射剤、吸入剤、座剤、経皮吸収剤等の剤型で提供され得る。従って、このような分野で前記剤型とするために一般的に使用されている添加剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶剤等が、その他の成分として使用され得る。また、上記必須成分と相乗又は相加効果を示す他の化合物も、その他の成分として使用され得る。
【００５４】
本発明の組成物は、上記必須成分を主成分とするものであることが好ましい。ここで、「主成分とする」とは、当該組成物が示す目的とする活性（たとえば脂肪減少活性）の３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上が、上記必須成分によって発現されることをいう。
【００５５】
本発明第一の組成物の摂取量は、特に限定されないが、成人１日当たり、熱水抽出物のの凍結乾燥粉末の量に換算して、０．３乃至２ｇ／ｋｇ−体重程度であることが好ましく、０．５乃至１．２ｇ／ｋｇ−体重程度であることがさらに好ましい。本発明第二の組成物の摂取量は、特に限定されないが、成人１日当たり、低分子画分の凍結乾燥粉末の量に換算して、０．２５乃至１．８０ｇ／ｋｇ−体重程度であることが好ましく、０．４０乃至１．１０ｇ／ｋｇ−体重程度であることがさらに好ましい。また、本発明第三の組成物の摂取量は、特に限定されないが、成人１日当たり、エルゴチオネインの量に換算して、２乃至１６ｍｇ／ｋｇ−体重であることが好ましく、２乃至８ｍｇ／ｋｇ−体重であることがさらに好ましい。
【００５６】
本発明は、脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物の調製方法にも関する。その第一の方法は、キノコの乾燥粉末から、熱水にて抽出する工程（１）、工程（１）で得られた混合物から上澄液を分離する工程（２）、及び前記上澄液を濃縮する工程（３）を含む。この方法で使用する原料は、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコの子実体又は菌糸体の乾燥粉末である。キノコの乾燥方法は、例えば、キノコに、４０乃至５０℃（好ましくは４５℃前後）の温風を一昼夜あて、その後６０乃至８０℃（好ましくは７０℃前後）の温風を、例えば約１時間あてるというものである。粉末化は、例えば、乾燥後のキノコをミキサーで粉砕することによって行う。
【００５７】
本発明の方法では、抽出溶媒として熱水を使用する。熱水とは、約８０乃至１００℃の、好ましくは約９０乃至１００℃の水である。熱水抽出は、例えば、キノコの乾燥粉末を熱水に入れ、温度を保ちながら、キノコと熱水との混合物を攪拌することによって行う（工程（１））。
【００５８】
抽出、即ち工程（１）が終了したら、工程（１）で得られた混合物から上澄液を分離する（工程（２））。この工程は、好ましくは遠心分離によってキノコの乾燥粉末を沈澱させた後に行う。また、この工程は、工程（１）で得られた混合物を篩を通過させることによって、キノコの乾燥粉末を分離・除去することによって行ってもよい。
【００５９】
工程（１）及び（２）は、１回でもよいが、通常は工程（２）の後に残留したキノコに新たな熱水を加え、さらに、攪拌抽出（工程（１））及び上澄液の分離（工程（２））を行う。工程（１）及び（２）は、例えば工程（１）における攪拌時間が３０分間程度であれば、好ましくは２乃至５回程度、特に好ましくは３又は４回行う。
【００６０】
工程（２）で得られた上澄液中の有効成分濃度は低いので、工程（３）にて、上澄液を濃縮する。濃縮は、有効成分、例えばエルゴチオネインが分解されない条件で行う限り、その方法は限定されない。
【００６１】
濃縮工程（３）の後に、凍結又は噴霧乾燥工程（工程（４））も実施することが好ましい。なお、凍結又は噴霧乾燥は、この分野で通常行われている条件及び方法で行えばよい。
【００６２】
工程（３）で得られた濃縮物を、例えば逆相高速液体クロマトグラフィ（逆相ＨＰＬＣ）で分画する工程（５）を実施することも好ましい。これにより、有効成分濃度が高められ得る。さらに、工程（５）で得られた目的とする活性を示す画分を、工程（３）と同様に濃縮する工程（６）、及び／又は、工程（４）と同様に凍結又は噴霧乾燥する工程（７）を実施することも好ましい。
【００６３】
本発明の脂肪減少活性、インスリン分泌促進活性及び血糖低下活性から成る群から選択される少なくとも一つの活性を示す組成物の調製方法であって、その第二の方法は、キノコの乾燥粉末から、熱水にて抽出する工程（Ｉ）、工程（Ｉ）で得られた混合物から上澄液を分離する工程（ＩＩ）、及び前記上澄み液中の成分を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分画し、低分子画分を得る工程（ＩＩＩ）を含む。
【００６４】
第二の方法の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）は、ぞれぞれ、第一の方法の工程（１）及び（２）と同様である。工程（ＩＩＩ）では、工程（ＩＩ）で得られた上澄液に含まれる成分を、分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分画し、低分子画分を得る。分画分子量は、２０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかであることが好ましく、１３，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかであることがさらに好ましく、１３，０００であることが特に好ましい。上澄液に含まれる成分を分離膜で分画するに際し、上澄液は、そのまま使用してもよいし、ある程度濃縮した後に使用してもよいし、あるいは、上澄液を一旦凍結乾燥や噴霧乾燥等の方法で粉末化し、その粉末を水に溶解させて得られる水溶液を使用してもよい。
【００６５】
分画工程（ＩＩＩ）の後に、濃縮する工程（ＩＶ）、及び／又は、凍結又は噴霧乾燥する工程（Ｖ）を実施することも好ましい。なお、濃縮や、凍結又は噴霧乾燥は、この分野で通常行われている条件及び方法で行えばよい。
【００６６】
本発明は、脂肪を減少させる、インスリン作用を増強する又は血糖値を低下させる方法にも関する。第一の投与方法は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を、薬理的に有効な量で投与することを含む方法である。また、第二の投与方法は、担子菌類、ヒダナシタケ目、サルノコシカケ科、マイタケ属に属するキノコ類からの熱水抽出物を分画分子量が３０，０００乃至１０，０００の範囲内のいずれかである分離膜で分離して得られる低分子画分を、薬理的に有効な量で投与することを含む方法である。上記キノコとして、アンニンコウが特に好ましい。
【００６７】
上記本発明の投与方法の実施に際しては、上記した熱水抽出物（第一の投与方法の場合）又は低分子画分（第二の投与方法の場合）を、そのままで又はこのような分野で通常使用されている添加剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶剤等と共に、脂肪の減少、インスリン作用の増強又は血糖値の低下を企図している対象（ヒトやほ乳類）に、有効量で投与する。「有効量」とは、投与の目的が達成されるような量、具体的には、脂肪が減少するような量、インスリン作用が増強される量、又は血糖値が低下するような量である。
【００６８】
投与方法は、特に限定されない。経口投与であっても、非経口投与であってもよい。また、投与時の剤型も特に限定されない。投与方法に応じ、適切な剤型が選択される
【実施例】
【００６９】
以下に、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【００７０】
（実施例１）アンニンコウからの有効成分の熱水抽出（その１）
（１）キノコの乾燥粉末の調製
アンニンコウ（株式会社岩出菌学研究所にて人工栽培したもの）の子実体に、４５℃の温風を一昼夜あて、その後７０℃の温風を１時間あてた。得られたアンニンコウ子実体乾燥品をミキサーに入れ、約１分間粉砕し、粉末とした。
【００７１】
（２）熱水抽出及び限外ろ過膜による分画
アンニンコウ子実体の乾燥粉末１０ｇを２００ｍｌの熱水（約９０℃）と混ぜ、得られたキノコ／熱水混合物を、３０分間、緩やかに攪拌した。キノコ／熱水混合物を遠心分離に掛け（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）、上澄みと沈澱とに分けた。
【００７２】
沈澱を２００ｍｌの熱水（約９０℃）と混ぜ、得られたキノコ／熱水混合物を、３０分間、緩やかに攪拌した。キノコ／熱水混合物を遠心分離に掛け（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）、上澄みと沈澱とに分けた。この工程をさらに２回行った。
【００７３】
全ての上澄液を合わせ、その一部を取り、減圧条件下で濃縮し、次いで凍結乾燥を行った。残りの上澄液は、旭化成ケミカルズ株式会社製の限外ろ過膜（旭化成ＵＦモジュールマイクローザＲＡＣＰ；分画分子量：１３，０００）でろ過を行い、低分子画分を得た。これを、減圧条件下で約１００ｍｌ以下となるまで濃縮し、次いで、凍結乾燥を行った。
【００７４】
原料として使用したアンニンコウ子実体乾燥粉末の重量に対する、凍結乾燥後の熱水抽出物重量の割合は約４５％であり、低分子画分重量の割合は約４０％程度であった。
【００７５】
（実施例２）アンニンコウからの熱水抽出物中におけるエルゴチオネインの存在の確認とその定量
（１）試料の調製
実施例１と同様の方法で、アンニンコウ（株式会社岩出菌学研究所にて人工栽培したもの）の子実体の乾燥粉末から、熱水抽出によって上澄液を得た。全ての上澄液を合わせ、減圧条件下で濃縮し、次いで１００ｍｌにメス・アップした。
【００７６】
（２）エルゴチオネインの有無の検討
熱水抽出物（１００ｍｌにメス・アップしたもの）と、それにエルゴチオネイン標品（Ｓｉｇｍａ社より購入）を添加したものとを、それぞれＳｅｐ  Ｐａｋ（Ｃ１８）（ウォーターズ社製）にて前処理した後、ＨＰＬＣにかけた。ＨＰＬＣの条件は、次の通りであった。
【００７７】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：  ＯＤＳ−ＨＧ−５  Ｃ１８（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）（野村化学株式会社製）、２本をタンデムに接続した。
溶離液：  Ｈ２Ｏ／０．１％トリエチルアミン（ＴＥＡ）
流速：  ０．８ｍｌ／分
エルゴチオネイン含有画分の特定のための指標：  ２６０ｎｍにおける吸光度
【００７８】
熱水抽出物も、それにエルゴチオネイン標品を添加したものも、保持時間約９分のところに吸収があった。よって、熱水抽出物にはエルゴチオネインが含有されていることが明らかとなった。
【００７９】
（３）エルゴチオネインの定量
エルゴチオネイン標品の水溶液（複数）を調製し、それらの２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成した。（２）で分画したエルゴチオネイン含有画分（エルゴチオネイン標品を添加していない熱水抽出物に由来するもの）すべてを合わせ、２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線からエルゴチオネイン濃度を決定した。その濃度にエルゴチオネイン含有画分の容量を掛け、全エルゴチオネイン量を算出し、それを使用したアンニンコウ子実体乾燥粉末の重量で割って、アンニンコウ子実体乾燥粉末１ｇ当たりのエルゴチオネインの重量を算出した。アンニンコウ子実体乾燥粉末１ｇ当たりのエルゴチオネイン含有量は、約２．０ｍｇであった。
【００８０】
（実施例３）熱水抽出物及び低分子画分の内臓脂肪減少活性及び中性脂肪減少活性の測定（その１）
正常マウス（ＩＣＲ雄）に、実施例１で調製した熱水抽出物の凍結乾燥品及び低分子画分の凍結乾燥品の、直接経口投与（胃ゾンデによる各成分の強制投与）を実施した。また、エルゴチオネインについても、同様に、直接経口投与を実施した。投与開始２週間後にマウスを解剖し、体重、精巣周囲脂肪重量及び血液中の中性脂肪（トリグリセライド）を測定した。
【００８１】
（１）使用動物
ＩＣＲ系マウス（ｓｌｃ：６週齢、雄、日本ＳＬＣより購入）を使用した。１週間の予備飼育後に、７週齢で実験に使用した。各群５匹とした。
【００８２】
（２）強制経口投与試料と投与量
強制経口投与を実施した試料と投与量は以下の通りである。
（２−１）アンニンコウ熱水抽出物
凍結乾燥品を、１，０００ｍｇ／ｋｇ−体重（Ａ）又は４，０００ｍｇ／ｋｇ−体重（Ｂ）投与した。
（２−２）アンニンコウ低分子画分
凍結乾燥品を、１，０００ｍｇ／ｋｇ−体重（Ａ）又は４，０００ｍｇ／ｋｇ−体重（Ｂ）投与した。
（２−３）エルゴチオネイン（Ｓｉｇｍａ社より購入）
５ｍｇ／ｋｇ−体重（Ａ）又は２０ｍｇ／ｋｇ−体重（Ｂ）を投与した。
【００８３】
（３）飼育方法及び投与方法  
ノーサン実験動物用飼料ラボＭＲストック（ＬＡＢＯ  ＭＲ  ＳＴＯＣＫ；２５９．２ｋｃａｌ／１００ｇ；日本農産工業株式会社）を、基本（通常）飼料として与えた。基本飼料を、対照群と強制投与各群に給餌した。
【００８４】
強制経口投与は、マウス用胃ゾンデを用い、週５回（火水木及び土日）の午前１０時乃至１１時に実施した。また、対照群には、水道水を同様に強制経口投与した。
【００８５】
（４）マウスの採血および解剖（投与期間：２週間）
実験開始から２週間後、エチルエーテルの過麻酔によりマウスを死亡させ、直ちに腹部を切開して腹部大静脈より２．５ｍｌのシリンジにてヘパリン加採血を実施した。麻酔前には絶食などの措置はされず、マウスは通常の自由な給餌・飲水下にあった。遠心分離した血漿は、−８０℃の冷凍庫に保存し、検査会社にてトリグリセライド（中性脂肪）を測定した。
【００８６】
（５）結果
（５−１）解剖所見
解剖時のマウスの外観に出血や肛門周囲の汚れ等の異常は診られず、腹腔、胸腔には出血や癒着などの異常はなかった。また、いずれの個体も、胃及び盲腸に多量の内容物が認められた。
【００８７】
（５−２）体重
対照群（Cont-2W）及び低投与群（即ち、各投与試料について、投与量が少ない群（Ａ））の解剖時体重を図１に示す。また、対照群（Cont-2W）及び高投与群（即ち、各投与試料について、投与量が多い群（Ｂ））の解剖時体重を図２に示す。
【００８８】
対照群と比較して、試料投与群ではいずれも体重の低下傾向がみられ、特にエルゴチオネイン投与群では、６．１％（低投与群；Ａ）又は８．０％（高投与群；Ｂ）の低下であった。しかし、これらの解剖時の体重の増減は、有意差を伴う変化ではなかった。
【００８９】
（５−３）肝臓重量
肝臓重量は、解剖時に摘出した肝臓の重量を測定した絶対重量と、肝臓の重量を個々の体重で除した、体重１０ｇ当たりの相対重量で表示した。対照群（Cont-2W）及び低投与群（Ａ）のデータを図３に、対照群（Cont-2W）及び高投与群（Ｂ）のデータを図４に示す。対照群に対してエルゴチオネイン投与群Ｂ（高投与群）１３．９％の重量低下がみられたが、有意差を伴う変化ではなかった。
【００９０】
（５−４）脾臓重量
脾臓重量は、解剖時に摘出した脾臓の重量を測定した絶対重量と、脾臓の重量を個々の体重で除した、体重１０ｇ当たりの相対重量で表示した。対照群（Cont-2W）及び低投与群（Ａ）のデータを図５に、対照群（Cont-2W）及び高投与群（Ｂ）のデータを図６に示す。いずれの群においても、対照群に対して有意差を伴う変化は見られなかった。
【００９１】
（５−５）脂肪（精巣周囲脂肪）重量
精巣周囲の脂肪は採取し易く、重量も一定しているので、腹腔内脂肪の代表として測定した。解剖時に摘出した脂肪の重量を絶対重量と、脂肪の重量を個々の体重で除した、体重１０ｇ当たりの相対重量で表示した。対照群（Cont-2W）及び低投与群（Ａ）のデータを図７に、対照群（Cont-2W）及び高投与群（Ｂ）のデータを図８に示す。
【００９２】
対照群の脂肪絶対重量は１０１２±５５ｍｇ（ｎ＝５）であり、低分子画分投与群（Ａ：８．６％；Ｂ：２４．８％）、熱水抽出物投与群（Ａ：１８．６％；Ｂ：２０．３％）及びエルゴチオネイン投与群（Ａ：２９．７％；Ｂ：３５．１％）のいずれにおいても、対照群に対して明らかな有意差を伴う重量低下が認められた。なお、図７及び図８において、＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０１である（以下の図においても同様）。
【００９３】
（５−６）トリグリセライド（中性脂肪）
血漿中のトリグリセライドの量（単位：ｍｇ／ｍｌ）を、図９に示す。対照群（Cont-2W）の平均値（１５０±１２ｍｇ／ｄｌ）に対して、低分子画分投与群、熱水抽出物投与群、エルゴチオネイン投与群のいずれにおいても、トリグリセライド量の低下が認められた。特に、低分子画分投与群（Ａ）、熱水抽出物投与群（Ａ）及び（Ｂ）、そしてエルゴチオネイン投与群（Ｂ）では、対照群に対して明らかな有意差を伴う低下が認められた。
【００９４】
（５−７）まとめ
以上より、アンニンコウ子実体からの熱水抽出物、その熱水抽出物から得られる分画分子量１３，０００以下の低分子画分、及びエルゴチオネインは、内臓脂肪や血中トリグリセライド（中性脂肪）を低減させる効果を示す、即ち脂肪減少活性を示すことが明らかとなった。また、アンニンコウ子実体からの熱水抽出物や低分子画分の上記効果の少なくとも一部は、それらに含有されているエルゴチオネインによって発揮されている可能性がある。
【００９５】
（実施例４）アンニンコウ子実体及び低分子画分の内臓脂肪減少活性及び中性脂肪減少活性の測定（その２）
正常マウス（ＩＣＲ雄）に、実施例１で調製したアンニンコウ子実体乾燥品（粉末）及び低分子画分の凍結乾燥物を餌に添加して与えた。投与開始４週間後にマウスを解剖し、体重、精巣周囲脂肪重量及び血液中の中性脂肪（トリグリセライド）を測定した。
【００９６】
（１）使用動物
ＩＣＲ系マウス（ｓｌｃ：６週齢、雄、日本ＳＬＣより購入）を使用した。１週間の予備飼育後に、７週齢で実験に使用した。各群６匹とした。
【００９７】
（２）餌
与えた餌は、次の通りである。また、飲料水には水道水を使用し、自由に摂取させた。
（２−１）対照群
ノ-サン実験動物用飼料ラボＭＲストック（ＬＡＢＯ  ＭＲ  ＳＴＯＣＫ；２５９．２ｋｃａｌ／１００ｇ；日本農産工業株式会社）を、基本（通常）飼料として与えた。
（２−２）アンニンコウ子実体添加飼料群
ノ-サン実験動物用飼料ラボＭＲストックに、実施例１で調製したアンニンコウ子実体の乾燥品（粉末）を５．０１重量％の割合で添加した飼料を与えた。
（２−３）アンニンコウ低分子画分添加飼料群
ノ-サン実験動物用飼料ラボＭＲストックに、実施例１で調製した低分子画分の凍結乾燥品を２．１７５重量％の割合で添加した飼料を与えた。
【００９８】
（３）飼育方法  
各群いずれも、上記飼料と水とを自由に摂取させた。
【００９９】
（４）マウスの採血および解剖（投与期間：４週間）
実験開始から４週間後、エチルエーテルの過麻酔によりマウスを死亡させ、直ちに腹部を切開して腹部大静脈より２．５ｍｌのシリンジにてヘパリン加採血を実施した。麻酔前には絶食などの措置はされず、マウスは通常の自由な給餌・飲水下にあった。遠心分離した血漿は、−８０℃の冷凍庫に保存し、検査会社にてトリグリセライド（中性脂肪）を測定した。
【０１００】
（５）結果
（５−１）解剖所見
解剖時のマウスの外観に出血や肛門周囲の汚れ等の異常は診られず、腹腔、胸腔には出血や癒着などの異常はなかった。また、いずれの個体も、胃及び盲腸に多量の内容物が認められた。
【０１０１】
（５−２）体重
対照群（Cont-４W）、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群の解剖時体重を図１０に示す。これらの三群の解剖時体重は、ほぼ同等であった。
【０１０２】
（５−３）肝臓重量
肝臓重量は、解剖時に摘出した肝臓の重量を測定した絶対重量と、肝臓の重量を個々の体重で除した、体重１０ｇ当たりの相対重量で表示した。結果を図１１に示す。対照群（Cont-４W）に対して子実体添加飼料群は９．４％の、低分子画分添加飼料群は６．９％の重量増加がみられたが、有意差を伴う変化ではなかった。
【０１０３】
（５−４）脾臓重量
脾臓重量は、解剖時に摘出した脾臓の重量を測定した絶対重量と、脾臓の重量を個々の体重で除した、体重１０ｇ当たりの相対重量で表示した。結果を図１２に示す。対照群（Cont-４W）に対して低分子画分添加飼料群ではやや増加がみられたが、有意差を伴う変化ではなかった。
【０１０４】
（５−５）脂肪（精巣周囲脂肪）重量
精巣周囲の脂肪は採取し易く、重量も一定しているので、腹腔内脂肪の代表として測定した。解剖時に摘出した脂肪の重量を絶対重量と、脂肪の重量を個々の体重で除した、体重１０ｇ当たりの相対重量で表示した。結果を図１３に示す。
【０１０５】
対照群（Cont-４W）の脂肪絶対重量は８５１±９２ｍｇ（ｎ＝６）であり、これは、実施例３における対照群（飼育期間：２週間）と比べて１６．５％の重量低下であった。また、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群では、対照群と比べて明らかな有意差を伴う脂肪重量の低下（子実体添加飼料群：３０．３％；低分子画分添加飼料群：３７．７％）が認められた。
【０１０６】
（５−６）トリグリセライド（中性脂肪）
血漿中のトリグリセライドの量（単位：ｍｇ／ｍｌ）を、図１４に示す。対照群（Cont-４W）の平均値は１１６±１６ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝６）であり、これは、実施例２における対照群（飼育期間：２週間）と比べて２２％の低下であった。また、子実体添加飼料群及び低分子画分添加飼料群では、対照群と比べて明らかな有意差を伴うトリグリセライド量の低下（子実体添加飼料群：３７．１％；低分子画分添加飼料群：２１．６％）が認められた。
【０１０７】
（５−７）まとめ
以上より、アンニンコウの子実体乾燥粉末と、アンニンコウの子実体乾燥粉末からの熱水抽出物の低分子画分は、内臓脂肪や血中トリグリセライド（中性脂肪）を、対照群に対して有意差をもって低減させる効果を示す、即ち脂肪減少活性を示すことが明らかとなった。
【０１０８】
（実施例５）低分子画分の投与が肥満マウスに与える影響の検討
肥満マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｈａｍＳｌｃ−ｏｂ／ｏｂ）及び同系の正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＳ）を飼育し、飼料摂取量等の測定、血糖値の測定、解剖検査、血液生化学値の測定、及びホルモンの測定を行った。正常マウスで通常飼料を与えたのは７匹、正常マウスで低分子画分の凍結乾燥品（実施例１と同様の方法で調製したもの）を添加した飼料を与えたのは８匹、肥満マウスで通常飼料を与えたのは１０匹、肥満マウスで低分子画分の凍結乾燥品（実施例１と同様の方法で調製したもの）を添加した飼料を与えたのは１０匹であった。
【０１０９】
（１）材料
（１−１）使用動物及び飼育期間
肥満マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｈａｍＳｌｃ−ｏｂ／ｏｂ；雄；６週齢；日本ＳＬＣ）及び同系の正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＳ；雄；６週齢；日本ＳＬＣ）を購入し、１週間の予備飼育後、７週齢で実験に供した。実験期間は６週間とした。
【０１１０】
（１−２）飼料
対照マウスには、基本（通常）飼料として、ノーサン実験動物用飼料ラボＭＲストック（ＬＡＢＯ  ＭＲ  ＳＴＯＣＫ；２５９．２ｋｃａｌ／１００ｇ；日本農産工業株式会社；以下、「通常食」という）を与えた。試験マウスには、基本飼料に実施例１と同様の方法で調製した低分子画分の凍結乾燥品を１．５質量％添加した固形飼料（Ｌｏｔ．  Ｎｏ．Ｓ−０９０３１０；日本農産工業にて製造；以下、「試料添加食」という）を与えた。
【０１１１】
（１−３）飼育方法
各群いずれも、上記飼料と水道水とを自由に摂取させた。
【０１１２】
（２）飼料摂取量及び飲水量の測定
（２−１）測定方法
飼育ゲージに付属する餌箱毎に、摂取された飼料の重量を週３回測定し、飼育匹数で除して、１匹あたり、１日当たりの飼料摂取量を求めた。飲料水には水道水を用い、給水瓶から摂取された飲料水の重量を週３回測定し、飼育匹数で除して、１匹あたり、１日当たりの飲水量を求めた。食べこぼし、飲みこぼし量は考慮せず、摂取量に含めた。測定は、午前１０時乃至１１時に行った。
【０１１３】
（２−２）結果
正常マウスの飼料摂取量を図１５に、肥満マウスの飼料摂取量を図１６に、正常マウスの飲水量を図１７に、肥満マウスの飲水量を図１８に示す。
【０１１４】
（飼料摂取量）  通常食群と試料添加食群で、正常マウス、肥満マウス共に有意差はなかった。実験期間を通して、正常マウスの試料添加食摂取量は３．５９ｇ／日／マウスであり、低分子画分の摂取量は５３．８ｍｇ／日／マウスであった。肥満マウスの試料添加食摂取量は６．０９ｇ／日／マウスであり、低分子画分の摂取量は９１．３ｍｇ／日／マウスであった。低分子画分の摂取量を体重１ｋｇ当たりに換算すると、正常マウス（平均体重：２６．６ｇ）では２．０２ｇ／ｋｇ／日、肥満マウス（平均体重：５２．１ｇ）では１．７５ｇ／ｋｇ／日であり、成人（体重：５０ｋｇ）に換算すると８８乃至１０１ｇ／日の摂取量となる。
（飲水量）  正常マウスのみ、試料添加食群で、通常食群に比べて有意な飲水量の増加が認められた。
【０１１５】
（３）血糖値の測定
（３−１）測定方法
午前１０乃至１１時に、マウスの尾静脈を切開して採血した。血糖値は、血糖測定キット（ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ  ＸＣＥＥＤ  Ｇ３  ＡＢＢＯＴＴ  ＪＡＰＡＮ  ＣＯ．  ＬＴＤ．）を用いて測定した。採血は、実験開始前（０週）と、その後は週に１回行った。飼育５週間後のみ、１６時間の絶食（飲水のみ）を実施し、絶食前後に採血を行った。    
【０１１６】
（３−２）結果
血糖値の変化を示すグラフを図１９に示す。また、実験開始から５週間後における絶食前後の血糖値を示す棒グラフを、図２０に示す。
図１９から明らかなように、肥満マウスでは、試料添加食投与期間が２週間以上で、通常食群と比較して血糖値の低下が認められた。正常マウスでは、このような差異はなかった。
通常、マウスの食餌リズムは夜間に集中している。しかし、肥満マウスでは、朝や昼間にも飼料を摂取する個体があり、採血時（午前１０乃至１１時）の血糖値に個体差が生じていた可能性がある。図２０に示すように、絶食によって食餌リズムの個体差が解消され、正常マウス、肥満マウス共に、試料添加食群が、通常食群と比べ、有意に低い血糖値を示した。
【０１１７】
（４）解剖、血液生化学値及び肥満関連ホルモンの測定
（４−１）採血
実験開始から６週間後において、午前１０乃至１１時に、エチルエーテルの過麻酔によりマウスを死亡させ、直ちに腹部を切開して腹部大静脈より２．５ｍｌのシリンジにてヘパリン加採血を実施した。麻酔前には絶食などの措置はされず、マウスは通常の自由な給餌・飲水下にあった。血液は、一部を血球数計測に使用し、残りは遠心分離に供して血漿を得、その血漿は−３０℃の冷凍庫に保存した。
【０１１８】
（４−２）解剖
解剖時には、臓器の位置、出血及び癒着等の異常を精査した。また、体重、肝臓重量、脾臓重量及び精巣周囲脂肪重量を測定した。
【０１１９】
（４−３）血球数の計測
採血した血液を、直ちに自動血球計数装置（ＰｏｃＨ−１００ｉ；シスメックス社製）に供し、赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット値、赤血球容積、白血球数及び血小板数を測定した。
【０１２０】
（４−４）血液生化学値の測定
血漿につき、総タンパク量、アルブミン／グロブリン比、総コレステロール量及びトリグリセライド量を、株式会社エスアールエルに依頼して測定した。
【０１２１】
（４−５）肥満関連ホルモンの測定
血漿につき、Ｍｏｕｓｅ  Ｌｅｐｔｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを用いてレプチン濃度を、Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴを用いて高分子アディポネクチン濃度を、また、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ（ＡＫＲＩＮ―０１１Ｔ）を用いてインスリン濃度を測定した。なお、これらのキットは、いずれも、日本国群馬県のＳｈｉｂａｙａｇｉ社製である。
【０１２２】
（４−６）結果  
（４−６−１）解剖所見
解剖時のマウスの外観に体毛や肛門周囲の汚れ等の異常は診られず、腹腔、胸腔には出血や癒着などの異常はなかった。また、いずれの個体も、胃及び盲腸に多量の内容物が認められた。
【０１２３】
（４−６−２）体重、肝臓重量、脾臓重量及び精巣周囲脂肪重量
体重を図２１に、肝臓重量を図２２に、脾臓重量を図２３に、そして精巣周囲脂肪重量を図２４に示す。体重、肝臓重量及び脾臓重量については、試料添加食の影響は見られなかった。精巣周囲脂肪重量については、正常マウス、肥満マウス共に、体重１０ｇ当たりの相対重量が、正常食群に比べて試料添加食群で有意に低かった。
【０１２４】
（４−６−３）血球数
赤血球（ＲＢＣ）数を図２５に、ヘモグロビン（ＨＧＢ）濃度を図２６に、ヘマトクリット（ＨＣＴ）値を図２７に、赤血球容積（ＭＣＶ）を図２８に、白血球（ＷＢＣ）数を図２９に、そして血小板（ＰＬＴ）数を図３０に示す。正常マウスのみ、赤血球数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット値及び白血球数について、正常食群に比べて試料添加食群が有意に低い値を示した。
【０１２５】
（４−６−４）血液生化学値
血漿中の総タンパク（ＴＰ）量を図３１に、アルブミン／グロブリン（Ａ／Ｇ）比を図３２に、総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ．）量を図３３に、トリグリセライド（ＴＧ）量を図３４に示す。トリグリセライド量に関し、正常マウス、肥満マウス共に、正常食群に比べて試料添加食群が有意に低い値を示した。
【０１２６】
（４−６−５）ホルモンの測定
血漿中のレプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）濃度を図３５に、高分子アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）濃度を図３６に、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）濃度を図３７に示す。
レプチンは、主に脂肪細胞にて合成、分泌されて視床下部に働き、摂食調節に関与する。図３５より、肥満マウスでは、通常食の場合も試料添加食の場合も、正常マウスよりも血漿のレプチン濃度が高いにもかかわらず、レプチンによる食欲が抑制されないレプチン抵抗性の状態にあると考えられた。また、通常食群に比べて試料添加食群のレプチン濃度が低いのは、腹腔内の脂肪蓄積量を反映しているように思われた。
【０１２７】
アディポネクチンは、脂肪組織特異的に発現する。肥満や脂肪細胞の肥大に伴って、アディポネクチンの発現や分泌が低下する。アディポネクチンは、インスリン感受性増強作用を示すので、低アディポネクチン血症の場合にはインスリン抵抗性となる。図３６に示すように、肥満マウスでは、正常マウスの約２倍のアディポネクチン濃度を示したが、通常食群と試料添加食群では、有意差はなかった。すなわち、低分子画分は、インスリン感受性には有意な影響を与えなかったものと考えられた。
【０１２８】
図３７に示すように、通常食群において、肥満マウスの血漿のインスリン濃度は正常マウスのそれの２０倍以上であった。そして、肥満マウスの試料添加食群においては、血中インスリン濃度は通常食群のさらに２．５倍であった。従って、試料、すなわちアンニンコウの熱水抽出物に由来する低分子画分は、インスリン分泌亢進作用を示すことが明らかとなった。そして、このインスリン分泌量の増加により、肥満マウスの試料添加食群において、肥満マウスの通常食群と比べて血糖値が低下したものと考えられた（図１９及び図２０を参照されたい）。
【０１２９】
（５）まとめ
以上より、アンニンコウの子実体乾燥粉末からの熱水抽出物の低分子画分は、インスリンの分泌促進活性を有し、それにより、血糖低下作用を示すことが明らかとなった。また、当該低分子画分は、内臓脂肪や血中トリグリセライド（中性脂肪）を、対照群に対して有意差をもって低減させる効果をも示すことが明らかとなった。
【０１３０】
（実施例６）アンニンコウからの有効成分の熱水抽出（その２）
（１）キノコの乾燥粉末の調製
アンニンコウ（株式会社岩出菌学研究所にて人工栽培したもの）の子実体に、４５℃の温風を一昼夜あて、その後７０℃の温風を１時間あてた。得られたアンニンコウ子実体乾燥品をミキサーに入れ、約１分間粉砕し、粉末とした。
【０１３１】
（２）熱水抽出及び限外ろ過膜による分画
アンニンコウ子実体の乾燥粉末１０ｇを２００ｍｌの熱水（約９０℃）と混ぜ、得られたキノコ／熱水混合物を、３０分間、緩やかに攪拌した。キノコ／熱水混合物を遠心分離に掛け（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）、上澄みと沈澱とに分けた。
【０１３２】
沈澱を２００ｍｌの熱水（約９０℃）と混ぜ、得られたキノコ／熱水混合物を、３０分間、緩やかに攪拌した。キノコ／熱水混合物を遠心分離に掛け（１０，０００ｒｐｍ、１０分間）、上澄みと沈澱とに分けた。この工程をさらに２回行った。
【０１３３】
全ての上澄液を合わせ、その１／２を取り、旭化成ケミカルズ株式会社製の限外ろ過膜（旭化成ＵＦモジュールマイクローザＲＡＣＰ；分画分子量：１３，０００）でろ過を行い、低分子画分（１）を得た。残りの上澄液は、ミリポア社製の限外ろ過膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬデバイス；分画分子量：１０，０００）でろ過を行い、低分子画分（２）を得た。これらを、各々、減圧条件下で約１００ｍｌ以下となるまで濃縮し、次いで、凍結乾燥を行った。
【０１３４】
（実施例７）細胞の糖（グルコース）取込み活性の測定
Yamamotoらの方法（Yamamoto N., et al., Anal. Biochem., 2006, April 1, 351(1), p.p. 139-145）に従い、インスリン及び実施例６で調製したアンニンコウ由来低分子画分（１）及び（２）の、細胞による糖（グルコース）の取込みに与える影響を検討した。
【０１３５】
（１）測定
（１−１）Ｌ６骨格筋細胞の作製
Ｌ６筋芽細胞を２×１０４個／ｍｌの濃度になるようにＭＥＭ培地Ａ（１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＭＥＭ培地）に分散させた。得られた細胞分散培地を、９６穴組織培養プレートに１穴あたり２００μｌ入れ、５％炭酸ガス培養器で３７℃にて２日間培養した。コンフルエントになった後、培地を吸引除去してＭＥＭ培地Ｂ（２％（ｖ／ｖ）牛胎児血清含有ＭＥＭ培地）２００μｌに変更し、５％炭酸ガス培養器で３７℃にて５日間培養した。このようにして、Ｌ６骨格筋細胞を作製した。再度、培地を吸引除去してＭＥＭ培地Ｃ（０．２％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＭＥＭ培地）２００μｌに変更し、５％炭酸ガス培養器で３７℃にて１８時間培養した後、糖（グルコース）取込み活性の測定に使用した。
【０１３６】
（１−２）試料の調製
（ａ）アンニンコウ由来低分子画分（１）凍結乾燥品と（ｂ）アンニンコウ由来低分子画分（２）凍結乾燥品は、超純水に溶解し、それをＭＥＭ培地Ｃにて１００倍希釈し、前記いずれかの凍結乾燥品を、２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１，０００μｇ／ｍｌ含有するＭＥＭ培地を調製した。また、陰性対照用として、アンニンコウ由来低分子画分を含有しないＭＥＭ培地Ｃを用意した。さらに、陽性対照用として、ＭＥＭ培地Ｃにインスリンを添加して、インスリン濃度が１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＭＥＭ培地を調製した。アンニンコウとインスリンの共暴露試験用試料は、次のようにして調製した。アンニンコウ由来低分子画分（１）又は（２）の凍結乾燥品を超純水に溶解し、それを、陽性対照用として調製したインスリン濃度が１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＭＥＭ培地にて１００倍希釈し、インスリンと共に、当該凍結乾燥品を５００μｇ／ｍｌ含有するＭＥＭ培地を調製した。
【０１３７】
（１−３）Ｌ６骨格筋細胞における糖取込み活性の測定
（１−３−１）測定用試料の調製
（１−１）に記載のようにして調製したＬ６骨格筋細胞の９６穴組織培養プレートにおいて、各穴の培地を吸引除去後、１穴あたり、（１−２）で調製した試料のいずれかを２００μｌ添加し、５％炭酸ガス培養器で３７℃にて４時間培養した。
その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１．８５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４含有）を１穴あたり１５０μｌ／回で使用して、洗浄を２回行った。次いで、１ｍＭ  ２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）と０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡとを含有するＫＲＨ緩衝液を、１穴あたり１００μｌ添加し、５％炭酸ガス培養器で３７℃にて２０分間培養した。その後、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＫＲＨ緩衝液を、１穴あたり２００μｌ／回で使用して、洗浄を２回行った。
０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１穴あたり５０μｌ添加し、６０℃の乾熱滅菌器で１０分間加熱処理し、マイクロプレートミキサーで撹拌することにより、細胞を溶解させた。次いで、９６穴組織培養プレートを８０℃の乾熱滅菌器内に５０分間静置し、各穴内を乾燥させた。０．１Ｎ塩酸水溶液を１穴あたり５０μｌ添加し、続いて２００ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）水溶液（ｐＨ８．１）を１穴あたり５０μｌ添加し、マイクロプレートミキサーで撹拌した。このようにして、測定用試料を調製した。
【０１３８】
（１−３−２）２−ＤＧの測定
測定用試料を、９６穴プレートに１穴あたり１０μｌ添加し、次いで、アッセイ・カクテル（５０ｍＭ  ＴＥＡ、ｐＨ８．１；５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１ｍＭ  ＮＡＤＰ、２μＭレサズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）、２単位／ｍｌジアフォレーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）、１５０単位／ｍｌグルコース−６−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）含有）を１穴あたり１００μｌ添加した。マイクロプレートミキサーで撹拌後、５％炭酸ガス培養器で３７℃にて５０分間インキュベートした。
その後直ぐに、マイクロプレートリーダーにて蛍光強度を測定した（励起波長：５３０ｎｍ；蛍光波長：５７０ｎｍ）。２−ＤＧ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅを標準物質として使用して検量線を作成し、各試料について、１穴あたりの２−ＤＧ取込み量を算出した。
【０１３９】
（２）結果
陰性対照の２−ＤＧ取込み量を１．０とした場合の、アンニンコウ由来低分子画分やインスリンで細胞を処理した場合の２−ＤＧ取込み量（２−ＤＧ取込み量の比）を、図３８に示した。なお、図３８においては、陰性対照を「Ｃｏｎｔｒｏｌ」と、アンニンコウ由来低分子画分（１）凍結乾燥品を「ガルガル（１）」と、アンニンコウ由来低分子画分（２）凍結乾燥品を「ガルガル（２）」と記載している。
図３８から明らかなように、アンニンコウ由来低分子画分（１）凍結乾燥品もアンニンコウ由来低分子画分（２）凍結乾燥品も、インスリン同様、Ｌ６骨格筋細胞によるグルコースの取込みを促進した。また、インスリン共暴露下においては、アンニンコウ由来低分子画分（１）凍結乾燥品もアンニンコウ由来低分子画分（２）凍結乾燥品も、相加的なグルコース取込み量を示したことから、アンニンコウ中の成分には、インスリン非依存経路でのグルコース取込み誘導能があることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明は、内臓脂肪や血中の中性脂肪を低下させるための、医薬品や健康食品に適用することができる。また、本発明は、血糖値を低下させるための医薬品や健康食品に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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