(57)【要約】【課題】アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができ、従来に無い全く新しい免疫寛容誘導剤を提供する。【解決手段】複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させてなる、アレルゲンタンパク質の可溶性凝集体。【選択図】図１
2011006365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによってアレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させてなる、アレルゲンタンパク質の可溶性凝集体。
【請求項２】
前記アレルゲンが、動物性アレルゲン又は植物性アレルゲンである請求項１記載の可溶性凝集体。
【請求項３】
前記アレルゲンが、スギ花粉アレルゲンである請求項１記載のアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体。
【請求項４】
前記アレルゲンタンパク質が加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱することによって凝集されている請求項３記載のアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体を用いたものであって、経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤。
【請求項６】
経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤の製造方法であって、
複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させることを特徴とする免疫寛容誘導剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減した可溶性凝集体、及びこの可溶性凝集体を用いた免疫寛容誘導剤及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば花粉症等のアレルギー疾患は、アレルゲンと総称されるタンパク質（以下、アレルゲンタンパク質）が体内に入り込み、これに体内の免疫系が過剰に反応することで全身又は局所的に障害を引き起こす疾患である。特に、日本人の２０％以上がスギ花粉症を患っており、社会的に深刻な問題となっている。
【０００３】
これらの疾患は人間が本体持っている免疫反応に起因するものであり、根本的な治療法は確立されていない。しかしながら、特許文献１に示すアレルゲンタンパク質の除去方法や抗炎症剤による対症療法、特許文献２に示すアレルゲンタンパク質をタンパク質変成剤で処理する低減化方法、特許文献３に示す微量のアレルゲンタンパク質を数回にわたり注射してアレルギー反応を低減化させる減感作療法など種々の治療法が考えられている。
【０００４】
一方、本願発明者は、経口取得が可能な低減化アレルゲンという観点を導入し、特許文献４に示すように、乾燥条件下においてメイラード反応を利用して、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖修飾して被覆してなる食品組成物を発明している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３４０４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１０４８４７号公報
【特許文献３】特開２００２−２４９４４２号公報
【特許文献４】特開２００６−３４０６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、卵白のタンパク質であるオボアルブミンは、熱変性過程において、分子間を架橋するβ構造を介して可溶性凝集体を形成することが知られている。このオボアルブミンは、Ａｓｎ−２９２及びＡｓｎ−３１１においてＮ−グリコシド結合を有する糖タンパク質である。一方、スギ花粉タンパク質（以下、ＣｒｙＪ１とも言う。）は、Ａｓｎ−１３７、Ａｓｎ−１７０、Ａｓｎ−２７３及びＡｓｎ−３３３においてＮ−グリコシド結合を有する糖タンパク質である。
【０００７】
本発明は、上記オボアルブミンの構造とスギ花粉タンパク質の構造との類似性に基づいた鋭意検討の結果、アレルゲンタンパク質が、オボアルブミンの凝集体形成と同じように、熱変性過程において可溶性凝集体を形成するという見地に基づいてなされたものであり、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることをその主たる所期課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明に係るアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体は、複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによってアレルギー反応の原因となる抗原構造（エピトープ）を内包させてなることを特徴とする。
【０００９】
つまり、可溶性凝集体は、アミロイドを形成するタンパク質の結合と同様に、変性タンパク質分子（unfolded protein molecules）間を架橋するβ構造（cross-β-structure）を介して形成される。詳細には、アレルゲンタンパク質を加熱すると、内部に埋もれているβ構造が熱変性によって外部に露出される。このとき、アレルギーを誘発するエピトープも、変性タンパク質分子の表面に露出する。そして、露出したβ構造は、加熱後の冷却過程において、変性タンパク質分子間で再結合される。このとき、アレルゲンタンパク質のエピトープは、熱変性によって形成された可溶性凝集体によって被覆される。つまり、アレルゲンタンパク質のエピトープは可溶性凝集体に内包されることになる。
【００１０】
このようなものであれば、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖類等によって化学装飾させることなく、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができる。したがって、この可溶性凝集体を用いることによって、アレルギー反応を起こしうるアレルゲンタンパク質を、アナフェラキシーを起こすことなく、免疫系に導入して免疫寛容を誘導し、アレルギー疾患を予防することが可能となる。ここで、「免疫寛容」とは、Ｍ細胞が抗原となるアレルゲンタンパク質を取り込むことによって誘導される免疫反応の一種である。この系においては、抗原を継続して経口投与又は経粘膜投与すると、抗原となるアレルゲンタンパク質に対してサプレッサーＴ細胞が産生され、このアレルゲンタンパク質に対しては免疫反応が緩和されることが明らかになっている。
【００１１】
本発明は、前記アレルゲンが、動物性アレルゲン又は植物性アレルゲンに適用することができ、特に、前記アレルゲンが、スギ花粉アレルゲンであることが考えられる。
【００１２】
前記アレルゲンがスギ花粉アレルゲンである場合に、そのスギ花粉アレルゲンを凝固させることなく可溶性凝集体を形成するためには、前記アレルゲンタンパク質が加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱することによって凝集されていることが望ましい。
【００１３】
また、本発明に係る免疫寛容誘導剤は、上述したアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体を用いたものであって、経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導することを特徴とする。経粘膜投与としては舌下減感作療法が考えられる。従来の舌下減感作療法は、アレルゲンタンパク質を舌下粘膜に滴下して免疫系に取り込むものである。このとき、アレルゲンタンパク質を誤飲すると、食道の粘膜等でアナフェラキシーを起こす可能性がある。一方、本発明の免疫寛容誘導剤は、アレルゲンタンパク質を加熱することによって可溶性凝集体を形成し、抗原構造を内部に埋没させているので、抗原構造を粘膜に接触させることなく免疫系に導入することができる。また、誤認した場合であっても腸管免疫系によって取り込むことができる。
【００１４】
さらに、本発明に係る免疫寛容誘導剤は、経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤の製造方法であって、複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
このように構成した本発明によれば、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができ、従来に無い全く新しい免疫寛容誘導剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ドットブロット法により得られたＩｇＥ抗体との結合を濃淡によって示す図である。
【図２】ＩｇＥ抗体との結合度を示す図である。
【図３】ＨＰＬＣを用いて未加熱ＣｒｙＪ１及び可溶性凝集体を分析したゲルろ過パターンを示す図である。
【図４】未加熱ＣｒｙＪ１及び可溶性凝集体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】可溶性凝集体及び２−メルカプトエタノール存在下の可溶性凝集体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図６】加熱前後及び加熱中におけるＣｒｙＪ１のＣＤスペクトルを示す図である。
【図７】９０℃で加熱したＣｒｙＪ１及び加熱後に塩酸グアニジンによって処理したＣｒｙＪ１のＣＤスペクトルを示す図である。
【図８】２１８ｎｍでのＣＤによる熱変性曲線及びＣｒｙＪ１の熱変性過程におけるチオフラビンＴの蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明に係る免疫寛容誘導剤を製造方法とともに説明する。
本実施形態に係る免疫寛容誘導剤は、経口投与又は例えば舌下減感作療法等の経粘膜投与によって、スギ花粉アレルゲンに対して免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤であって、複数のスギ花粉アレルゲン（ＣｒｙＪ１）を加熱し、それらＣｒｙＪ１を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させてなるものである。
【００１８】
ＣｒｙＪ１は加熱されると、分子間で架橋したβ構造及び分子間でジスルフィド結合を形成する。このとき、分子表面に露出している抗原構造（ＩｇＥエピトープ）は、可溶性凝集体の内部に埋もれ、ＣｒｙＪ１の抗原性が低減されている。
【００１９】
この免疫寛容誘導剤は、以下の手順によって製造される。
＜ＣｒｙＪ１の精製＞
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＮａＣｌ（０．１４Ｍ）及びＫＣｌ（０．０１Ｍ）を含む）２Ｌ中に、１００ｇのスギ花粉を入れ、１時間緩やかに攪拌した。その後、遠心分離（１５０００×ｇ、３０ｍｉｎ）によって上清を分離し、さらに花粉除去のためにフィルタにかけた。この抽出液に硫酸アンモニウムを８０％飽和（５６１ｇ／Ｌ）まで加え、４℃で一晩中攪拌した後、遠心分離（１８５００×ｇ、４０ｍｉｎ）して沈殿物を回収した。その沈殿物を蒸留水に溶解し、これを透析した。このように処理した透析液を冷凍乾燥し、ＣｒｙＪ１の粗抽出物（ｃｒｕｄｅ  ｅｘｔｒａｃｔ、以下ＣＥという。）として保管した。
【００２０】
このＣＥを０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、同様の酢酸緩衝液を用いて５倍に希釈した。そして、この５倍に希釈した溶液を、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラムクロマトグラフィ（東レ社製、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）にかけた。その後、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）でカラムを洗い、吸着したタンパク質を０．０５〜０．３Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌ（ｉｎ  ０．０１Ｍ酢酸緩衝液）で溶出した。２８０ｎｍの吸光で得られたピークを回収し、蒸留水で透析した後、冷凍乾燥した。
【００２１】
＜可溶性凝集体の作製＞
０．１％のＣｒｙＪ１を溶解させた１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱させた。このように制御された条件下において、凝固を生じさせることなく、透明な可溶性凝集体を得ることができた。室温で冷却させた後、可溶性凝集体を以下の実験に用いた。
【実施例】
【００２２】
熱変性させたＣｒｙＪ１の可溶性凝集体とＩｇＥとの結合について測定した。なお、用いるスギ花粉患者のヒト血清は、山口大学医学部付属病院皮膚科（Ｄｒ．Ｍ  Ｍｕｔｏ）の協力により提供された。
【００２３】
加熱されたＣｒｙＪ１（以下、「加熱後ＣｒｙＪ１」と言う。）と患者のＩｇＥ抗体との結合をドットブロット法を用いて測定した。このドットブロット法は、ビオチン−アビチン法を用いて行った。自然のＣｒｙＪ１（以下、「未加熱ＣｒｙＪ１」と言う。）、及び加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱されたＣｒｙＪ１を、０．０００５％に希釈し、１０μＬの未加熱ＣｒｙＪ１及び加熱後ＣｒｙＪ１をＰＶＤＦ（ポリ塩化ビニリデン）膜上に滴下した。このＰＶＤＦ膜はメタノールを用いて洗浄した。そして、ＣｒｙＪ１に結合するＩｇＥの検出は、ビオチン−アビチン反応を用いて行った。ＰＶＤＦ膜の乾燥後、ブロッキング剤（０．５％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を用いて１時間培養し、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、余分なＢＳＡを除去した。このＰＶＤＦ膜は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２０倍に希釈された患者のヒト血清とともに一晩培養した。そのＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１／１００００に希釈されたビオチン化抗ヒトＩｇＥ抗体をＰＶＤＦ膜に添加し、１時間培養した。次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、結合したＩｇＥ抗体１／５０００倍に希釈したＨＲＰ−ストレプトアビジン溶液及びＥＣＬを用いたウエスタンブロッティングを用いて検出した。
【００２４】
図１はドットブロット法により得られたＩｇＥ抗体との結合を濃淡によって示す図であり、白色になるほどＩｇＥ抗体と結合していることを示している。なお図１中「Ｎａｔｉｖｅ」は、未加熱ＣｒｙＪ１であり、「Ｈｅａｔｅｄ」は加熱後ＣｒｙＪ１である。また、図２は、図１に示す濃淡をデンシトメータによって測定したものであり、ＩｇＥ抗体との結合度を示すグラフである。なお、加熱後ＣｒｙＪ１とＩｇＥ抗体との結合度は、未加熱ＣｒｙＪ１とＩｇＥ抗体との結合を１００％とした場合の割合を示している。
【００２５】
これら図１及び図２から明らかなように、未加熱ＣｒｙＪ１に対して加熱後ＣｒｙＪ１のＩｇＥ抗体との結合度が顕著に低減されていることが分かる。つまり、ＣｒｙＪ１は加熱によって分子間で架橋したβ構造及び分子間でジスルフィド結合を形成し、分子表面に露出している抗原構造は、可溶性凝集体の内部に埋もれ、抗原性が低減される。
【００２６】
最後に、本実施形態の可溶性凝集体を液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、円偏光二色性（ＣＤ）分析法、及び蛍光分析法を用いた分析結果について説明する。
【００２７】
図３は、ＨＰＬＣを用いて未加熱ＣｒｙＪ１及び加熱後ＣｒｙＪ１を分析したゲルろ過パターンを示す。図３中、横軸は溶出時間、Ａは未加熱ＣｒｙＪ１のパターン、Ｂは加熱後ＣｒｙＪ１のパターンである。なお、この分析には、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ−３０００  ＳＷ（東ソー社製、カラム寸法０．７５×３０ｃｍ）を用いたＨＰＬＣにより行った。未加熱ＣｒｙＪ１及び加熱後ＣｒｙＪ１を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣのカラムに流した。ゲルろ過パターンは波長２８０ｎｍの吸光度を用いて測定した。
【００２８】
図３から明らかなように、未加熱ＣｒｙＪ１のピークは、溶出時間２４．５ｍｉｎ及び２５ｍｉｎにおいて重複ピークとして現れる。一方で、加熱後ＣｒｙＪ１のピークは溶出時間２４．５ｍｉｎ及び２５ｍｉｎでは現れず、可溶性凝集体が形成されていることが分かる。
【００２９】
図４及び図５は、未加熱ＣｒｙＪ１、加熱後ＣｒｙＪ１、及び２−メルカプトエタノール存在下における加熱後ＣｒｙＪ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図４中、左列は分子量マーカー、中列は未加熱ＣｒｙＪ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右列は加熱後ＣｒｙＪ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。また図５中、左列は分子量マーカー、中列は加熱後ＣｒｙＪ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右列は加熱後ＣｒｙＪ１に２−メルカプトエタノールを加えたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。なお、このＳＤＳ−ＰＡＧＥには、０．１％ＳＤＳを含有する１２．５％アクリルアミド分離ゲル及び５％アクリルアミド濃縮ゲルを用いた。電気泳動は、１％ＳＤＳを含む泳動用緩衝液（トリス−グリシン（ｐＨ８．０））内の濃縮ゲルに１０ｍＡの電流を３０分間通電し、分離ゲルに２０ｍＡの電流を１時間通電することにより行った。電気泳動後、ゲルシートをタンパク質染色色素（０．２％Coomassie Brilliant Blue R-250(CBB-R250)）を用いて染色し、２０％メタノールを含有する１０％酢酸を用いて脱色した。
【００３０】
図４から明らかなように、未加熱ＣｒｙＪ１の分子量は、タンパク質のＮ−グリコシド結合を反映して４２−４５ｋＤａであることが示されている。一方で、加熱後ＣｒｙＪ１は、分離ゲル及び凝縮ゲルの境界近傍に表れており、可溶性凝集体が形成されていることが分かる。さらに、図５から明らかなように、２−メルカプトエタノール存在下の加熱後ＣｒｙＪ１は、２−メルカプトエタノールの分離作用によって分離され、未加熱ＣｒｙＪ１と同様の分子量であることが示されている。したがって、加熱によるＣｒｙＪ１の重合には、分子間のジスルフィド結合の形成が含まれていることが分かった。
【００３１】
図６は、加熱前後及び加熱中におけるＣｒｙＪ１のＣＤスペクトルを示す。図６中、「○−○」は室温におけるＣｒｙＪ１におけるスペクトル、「□−□」は９０℃に加熱しているＣｒｙＪ１のスペクトル、「△−△」は加熱後冷却したＣｒｙＪ１のスペクトルである。なお、ＣＤ測定装置は、２５℃における測定波長２００−２６０ｎｍの楕円率を用いた分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社製、Ｊ−６００型）を用いた。また、１．０ｍｍ光路を有するセル内の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）内におけるＣｒｙＪ１の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるようにした。１つの試料に対して、２回から４回の連続スキャンを行い、その平均値を算出した。それぞれのスペクトルは、タンパク質濃度を用いて規格化し、平均残基分子楕円率（ｄｅｇ  ｃｍ２／ｄ  ｍｏｌ）とした。タンパク質濃度は、波長２８０ｎｍでの吸光度から算出した。熱変性曲線は、２２２ｎｍでの楕円率によって４０℃から９０℃まで自動的に測定した。
【００３２】
図６から明らかなように、加熱されたＣｒｙＪ１は、通常のタンパク質のＣＤ曲線と異なる特徴的なＣＤ曲線を示している。ほとんどのタンパク質のＣＤスペクトルは通常、熱変性過程において、２１０ｎｍよりも小さい波長域においてピークを有する。しかしながら、熱変性したＣｒｙＪ１のＣＤスペクトルは、波長２１８ｎｍにおいて吸光度が最小となり、これは、熱変性によってβ構造が増加していることを示している。さらに、熱変性したＣｒｙＪ１の溶液を冷却することによって、その傾向が顕著になり、熱変性したＣｒｙＪ１を冷却することによってβ構造がさらに増加することが分かった。このような結果は、分子間におけるβシート構造が増加していることを反映している。
【００３３】
また図７は、未加熱ＣｒｙＪ１、９０℃で加熱したＣｒｙＪ１及び加熱後に変性剤（４Ｍ塩酸グアニジン）によって処理したＣｒｙＪ１のＣＤスペクトルを示す図である。なお、図７中、「○−○」は未加熱ＣｒｙＪ１のスペクトル、「△−△」は９０℃に加熱しているＣｒｙＪ１のスペクトル、「×−×」は加熱後のＣｒｙＪ１に変性剤を加えたスペクトルである。この図から明らかなように、変性剤を加えることによって、熱変性したＣｒｙＪ１の波長２１８ｎｍでの吸光度が大幅に減少していることが分かる。これによって、分子間で架橋するβ構造が破壊されていることが分かる。これらの結果から、ＣｒｙＪ１が、熱変性によって、分子間β構造を介して、規則的な集合構造を有する可溶性凝集体を形成することが示された。
【００３４】
可溶性凝集体の分子間β構造の形成を分析するために、チオフラビンＴを用いた蛍光強度分析を行った。なお、チオフラビンＴはβ構造に対して作用することが知られており、チオフラビンＴの蛍光強度がβ構造に比例することも知られている。図８は、２１８ｎｍでのＣＤによる熱変性曲線及びＣｒｙＪ１の熱変性過程におけるチオフラビンＴの蛍光強度を示す。なお、図８中、「○」は波長２１８ｎｍにおける楕円率、「△」は蛍光強度である。
【００３５】
図８から明らかなように、ＣｒｙＪ１におけるチオフラビンＴの蛍光強度は、加熱温度が上昇するに連れて減少していることが分かる。この結果は、ＣｒｙＪ１が熱変性過程において、分子間の相互作用によりβ構造を形成することを示している。つまり、加熱することによって得られるＣｒｙＪ１の重合には、分子間ジスルフィド結合及び分子間β結合が含まれていることが分かる。
【００３６】
＜本実施形態の効果＞
このように構成した本実施形態に係る免疫寛容誘導剤によれば、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖類等によって化学装飾させることなく、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができる。したがって、この免疫寛容誘導剤を用いることによって、アレルギー反応を起こしうるアレルゲンタンパク質を、アナフェラキシーを起こすことなく、経口投与又は経粘膜投与によって免疫系に導入して免疫寛容を誘導し、アレルギー疾患を予防することが可能となる。
【００３７】
＜その他の変形実施形態＞
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、前記実施形態では、スギ花粉アレルゲンの免疫寛容誘導剤について説明したが、その他、ヒノキ花粉アレルゲン等の植物性アレルゲン又は動物性アレルゲンにも適用することができる。
その他、本発明は前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
【図１】
2011006365.tif 000003
【図２】
2011006365.tif 000004
【図３】
2011006365.tif 000005
【図４】
2011006365.tif 000006
【図５】
2011006365.tif 000007
【図６】
2011006365.tif 000008
【図７】
2011006365.tif 000009
【図８】
2011006365.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月29日(2009.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減した可溶性凝集体、及びこの可溶性凝集体を用いた免疫寛容誘導剤及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば花粉症等のアレルギー疾患は、アレルゲンと総称されるタンパク質（以下、アレルゲンタンパク質）が体内に入り込み、これに体内の免疫系が過剰に反応することで全身又は局所的に障害を引き起こす疾患である。特に、日本人の２０％以上がスギ花粉症を患っており、社会的に深刻な問題となっている。
【０００３】
これらの疾患は人間が本体持っている免疫反応に起因するものであり、根本的な治療法は確立されていない。しかしながら、特許文献１に示すアレルゲンタンパク質の除去方法や抗炎症剤による対症療法、特許文献２に示すアレルゲンタンパク質をタンパク質変成剤で処理する低減化方法、特許文献３に示す微量のアレルゲンタンパク質を数回にわたり注射してアレルギー反応を低減化させる減感作療法など種々の治療法が考えられている。
【０００４】
一方、本願発明者は、経口取得が可能な低減化アレルゲンという観点を導入し、特許文献４に示すように、乾燥条件下においてメイラード反応を利用して、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖修飾して被覆してなる食品組成物を発明している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３４０４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１０４８４７号公報
【特許文献３】特開２００２−２４９４４２号公報
【特許文献４】特開２００６−３４０６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、卵白のタンパク質であるオボアルブミンは、熱変性過程において、分子間を架橋するβ構造を介して可溶性凝集体を形成することが知られている。このオボアルブミンは、Ａｓｎ−２９２及びＡｓｎ−３１１においてＮ−グリコシド結合を有する糖タンパク質である。一方、主要なスギ花粉タンパク質（Ｃｒｙｊ１）は、Ａｓｎ−１３７、Ａｓｎ−１７０、Ａｓｎ−２７３及びＡｓｎ−３３３においてＮ−グリコシド結合を有する糖タンパク質である。
【０００７】
本発明は、上記オボアルブミンの構造とスギ花粉タンパク質の構造との類似性に基づいた鋭意検討の結果、アレルゲンタンパク質が、オボアルブミンの凝集体形成と同じように、熱変性過程において可溶性凝集体を形成するという見地に基づいてなされたものであり、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることをその主たる所期課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明に係るアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体は、複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによってアレルギー反応の原因となる抗原構造（エピトープ）を内包させてなることを特徴とする。
【０００９】
つまり、可溶性凝集体は、アミロイドを形成するタンパク質の結合と同様に、変性タンパク質分子（unfolded protein molecules）間を架橋するβ構造（cross-β-structure）を介して形成される。詳細には、アレルゲンタンパク質を加熱すると、内部に埋もれているβ構造が熱変性によって外部に露出される。このとき、アレルギーを誘発するエピトープも、変性タンパク質分子の表面に露出する。そして、露出したβ構造は、加熱後の冷却過程において、変性タンパク質分子間で再結合される。このとき、アレルゲンタンパク質のエピトープは、熱変性によって形成された可溶性凝集体によって被覆される。つまり、アレルゲンタンパク質のエピトープは可溶性凝集体に内包されることになる。
【００１０】
このようなものであれば、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖類等によって化学装飾させることなく、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができる。したがって、この可溶性凝集体を用いることによって、アレルギー反応を起こしうるアレルゲンタンパク質を、アナフェラキシーを起こすことなく、免疫系に導入して免疫寛容を誘導し、アレルギー疾患を予防することが可能となる。ここで、「免疫寛容」とは、Ｍ細胞が抗原となるアレルゲンタンパク質を取り込むことによって誘導される免疫反応の一種である。この系においては、抗原を継続して経口投与又は経粘膜投与すると、抗原となるアレルゲンタンパク質に対してサプレッサーＴ細胞が産生され、このアレルゲンタンパク質に対しては免疫反応が緩和されることが明らかになっている。
【００１１】
本発明は、前記アレルゲンが、動物性アレルゲン又は植物性アレルゲンに適用することができ、特に、前記アレルゲンが、スギ花粉アレルゲンであることが考えられる。
【００１２】
前記アレルゲンがスギ花粉アレルゲンである場合に、そのスギ花粉アレルゲンを凝固させることなく可溶性凝集体を形成するためには、前記アレルゲンタンパク質が加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱することによって凝集されていることが望ましい。
【００１３】
また、本発明に係る免疫寛容誘導剤は、上述したアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体を用いたものであって、経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導することを特徴とする。経粘膜投与としては舌下減感作療法が考えられる。従来の舌下減感作療法は、アレルゲンタンパク質を舌下粘膜に滴下して免疫系に取り込むものである。このとき、アレルゲンタンパク質を誤飲すると、食道の粘膜等でアナフェラキシーを起こす可能性がある。一方、本発明の免疫寛容誘導剤は、アレルゲンタンパク質を加熱することによって可溶性凝集体を形成し、抗原構造を内部に埋没させているので、抗原構造を粘膜に接触させることなく免疫系に導入することができる。また、誤認した場合であっても腸管免疫系によって取り込むことができる。
【００１４】
さらに、本発明に係る免疫寛容誘導剤は、経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤の製造方法であって、複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
このように構成した本発明によれば、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができ、従来に無い全く新しい免疫寛容誘導剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ドットブロット法により得られたＩｇＥ抗体との結合を濃淡によって示す図である。
【図２】ＩｇＥ抗体との結合度を示す図である。
【図３】ＨＰＬＣを用いて未加熱Ｃｒｙｊ１及び可溶性凝集体を分析したゲルろ過パターンを示す図である。
【図４】未加熱Ｃｒｙｊ１及び可溶性凝集体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】可溶性凝集体及び２−メルカプトエタノール存在下の可溶性凝集体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図６】加熱前後及び加熱中におけるＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す図である。
【図７】９０℃で加熱したＣｒｙｊ１及び加熱後に塩酸グアニジンによって処理したＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す図である。
【図８】２１８ｎｍでのＣＤによる熱変性曲線及びＣｒｙｊ１の熱変性過程におけるチオフラビンＴの蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明に係る免疫寛容誘導剤を製造方法とともに説明する。
本実施形態に係る免疫寛容誘導剤は、経口投与又は例えば舌下減感作療法等の経粘膜投与によって、スギ花粉アレルゲンに対して免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤であって、複数のスギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）を加熱し、それらＣｒｙｊ１を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させてなるものである。
【００１８】
Ｃｒｙｊ１は加熱されると、分子間で架橋したβ構造及び分子間でジスルフィド結合を形成する。このとき、分子表面に露出している抗原構造（ＩｇＥエピトープ）は、可溶性凝集体の内部に埋もれ、Ｃｒｙｊ１の抗原性が低減されている。
【００１９】
この免疫寛容誘導剤は、以下の手順によって製造される。
＜Ｃｒｙｊ１の精製＞
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＮａＣｌ（０．１４Ｍ）及びＫＣｌ（０．０１Ｍ）を含む）２Ｌ中に、１００ｇのスギ花粉を入れ、１時間緩やかに攪拌した。その後、遠心分離（１５０００×ｇ、３０ｍｉｎ）によって上清を分離し、さらに花粉除去のためにフィルタにかけた。この抽出液に硫酸アンモニウムを８０％飽和（５６１ｇ／Ｌ）まで加え、４℃で一晩中攪拌した後、遠心分離（１８５００×ｇ、４０ｍｉｎ）して沈殿物を回収した。その沈殿物を蒸留水に溶解し、これを透析した。このように処理した透析液を冷凍乾燥し、Ｃｒｙｊ１の粗抽出物（ｃｒｕｄｅ  ｅｘｔｒａｃｔ、以下ＣＥという。）として保管した。
【００２０】
このＣＥを０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、同様の酢酸緩衝液を用いて５倍に希釈した。そして、この５倍に希釈した溶液を、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラムクロマトグラフィ（東レ社製、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）にかけた。その後、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）でカラムを洗い、吸着したタンパク質を０．０５〜０．３Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌ（ｉｎ  ０．０１Ｍ酢酸緩衝液）で溶出した。２８０ｎｍの吸光で得られたピークを回収し、蒸留水で透析した後、冷凍乾燥した。
【００２１】
＜可溶性凝集体の作製＞
０．１％のＣｒｙｊ１を溶解させた１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱させた。このように制御された条件下において、凝固を生じさせることなく、透明な可溶性凝集体を得ることができた。室温で冷却させた後、可溶性凝集体を以下の実験に用いた。
【実施例】
【００２２】
熱変性させたＣｒｙｊ１の可溶性凝集体とＩｇＥとの結合について測定した。なお、用いるスギ花粉患者のヒト血清は、山口大学医学部付属病院皮膚科（Ｄｒ．Ｍ  Ｍｕｔｏ）の協力により提供された。
【００２３】
加熱されたＣｒｙｊ１（以下、「加熱後Ｃｒｙｊ１」と言う。）と患者のＩｇＥ抗体との結合をドットブロット法を用いて測定した。このドットブロット法は、ビオチン−アビチン法を用いて行った。自然のＣｒｙｊ１（以下、「未加熱Ｃｒｙｊ１」と言う。）、及び加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱されたＣｒｙｊ１を、０．０００５％に希釈し、１０μＬの未加熱Ｃｒｙｊ１及び加熱後Ｃｒｙｊ１をＰＶＤＦ（ポリ塩化ビニリデン）膜上に滴下した。このＰＶＤＦ膜はメタノールを用いて洗浄した。そして、Ｃｒｙｊ１に結合するＩｇＥの検出は、ビオチン−アビチン反応を用いて行った。ＰＶＤＦ膜の乾燥後、ブロッキング剤（０．５％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を用いて１時間培養し、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、余分なＢＳＡを除去した。このＰＶＤＦ膜は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２０倍に希釈された患者のヒト血清とともに一晩培養した。そのＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１／１００００に希釈されたビオチン化抗ヒトＩｇＥ抗体をＰＶＤＦ膜に添加し、１時間培養した。次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、結合したＩｇＥ抗体１／５０００倍に希釈したＨＲＰ−ストレプトアビジン溶液及びＥＣＬを用いたウエスタンブロッティングを用いて検出した。
【００２４】
図１はドットブロット法により得られたＩｇＥ抗体との結合を濃淡によって示す図であり、白色になるほどＩｇＥ抗体と結合していることを示している。なお図１中「Ｎａｔｉｖｅ」は、未加熱Ｃｒｙｊ１であり、「Ｈｅａｔｅｄ」は加熱後Ｃｒｙｊ１である。また、図２は、図１に示す濃淡をデンシトメータによって測定したものであり、ＩｇＥ抗体との結合度を示すグラフである。なお、加熱後Ｃｒｙｊ１とＩｇＥ抗体との結合度は、未加熱Ｃｒｙｊ１とＩｇＥ抗体との結合を１００％とした場合の割合を示している。
【００２５】
これら図１及び図２から明らかなように、未加熱Ｃｒｙｊ１に対して加熱後Ｃｒｙｊ１のＩｇＥ抗体との結合度が顕著に低減されていることが分かる。つまり、Ｃｒｙｊ１は加熱によって分子間で架橋したβ構造及び分子間でジスルフィド結合を形成し、分子表面に露出している抗原構造は、可溶性凝集体の内部に埋もれ、抗原性が低減される。
【００２６】
最後に、本実施形態の可溶性凝集体を液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、円偏光二色性（ＣＤ）分析法、及び蛍光分析法を用いた分析結果について説明する。
【００２７】
図３は、ＨＰＬＣを用いて未加熱Ｃｒｙｊ１及び加熱後Ｃｒｙｊ１を分析したゲルろ過パターンを示す。図３中、横軸は溶出時間、Ａは未加熱Ｃｒｙｊ１のパターン、Ｂは加熱後Ｃｒｙｊ１のパターンである。なお、この分析には、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ−３０００  ＳＷ（東ソー社製、カラム寸法０．７５×３０ｃｍ）を用いたＨＰＬＣにより行った。未加熱Ｃｒｙｊ１及び加熱後Ｃｒｙｊ１を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣのカラムに流した。ゲルろ過パターンは波長２８０ｎｍの吸光度を用いて測定した。
【００２８】
図３から明らかなように、未加熱Ｃｒｙｊ１のピークは、溶出時間２４．５ｍｉｎ及び２５ｍｉｎにおいて重複ピークとして現れる。一方で、加熱後Ｃｒｙｊ１のピークは溶出時間２４．５ｍｉｎ及び２５ｍｉｎでは現れず、可溶性凝集体が形成されていることが分かる。
【００２９】
図４及び図５は、未加熱Ｃｒｙｊ１、加熱後Ｃｒｙｊ１、及び２−メルカプトエタノール存在下における加熱後Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図４中、左列は分子量マーカー、中列は未加熱Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右列は加熱後Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。また図５中、左列は分子量マーカー、中列は加熱後Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右列は加熱後Ｃｒｙｊ１に２−メルカプトエタノールを加えたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。なお、このＳＤＳ−ＰＡＧＥには、０．１％ＳＤＳを含有する１２．５％アクリルアミド分離ゲル及び５％アクリルアミド濃縮ゲルを用いた。電気泳動は、１％ＳＤＳを含む泳動用緩衝液（トリス−グリシン（ｐＨ８．０））内の濃縮ゲルに１０ｍＡの電流を３０分間通電し、分離ゲルに２０ｍＡの電流を１時間通電することにより行った。電気泳動後、ゲルシートをタンパク質染色色素（０．２％Coomassie Brilliant Blue R-250(CBB-R250)）を用いて染色し、２０％メタノールを含有する１０％酢酸を用いて脱色した。
【００３０】
図４から明らかなように、未加熱Ｃｒｙｊ１の分子量は、タンパク質のＮ−グリコシド結合を反映して４２−４５ｋＤａであることが示されている。一方で、加熱後Ｃｒｙｊ１は、分離ゲル及び凝縮ゲルの境界近傍に表れており、可溶性凝集体が形成されていることが分かる。さらに、図５から明らかなように、２−メルカプトエタノール存在下の加熱後Ｃｒｙｊ１は、２−メルカプトエタノールの分離作用によって分離され、未加熱Ｃｒｙｊ１と同様の分子量であることが示されている。したがって、加熱によるＣｒｙｊ１の重合には、分子間のジスルフィド結合の形成が含まれていることが分かった。
【００３１】
図６は、加熱前後及び加熱中におけるＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す。図６中、「○−○」は室温におけるＣｒｙｊ１におけるスペクトル、「□−□」は９０℃に加熱しているＣｒｙｊ１のスペクトル、「△−△」は加熱後冷却したＣｒｙｊ１のスペクトルである。なお、ＣＤ測定装置は、２５℃における測定波長２００−２６０ｎｍの楕円率を用いた分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社製、Ｊ−６００型）を用いた。また、１．０ｍｍ光路を有するセル内の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）内におけるＣｒｙｊ１の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるようにした。１つの試料に対して、２回から４回の連続スキャンを行い、その平均値を算出した。それぞれのスペクトルは、タンパク質濃度を用いて規格化し、平均残基分子楕円率（ｄｅｇ  ｃｍ２／ｄ  ｍｏｌ）とした。タンパク質濃度は、波長２８０ｎｍでの吸光度から算出した。熱変性曲線は、２２２ｎｍでの楕円率によって４０℃から９０℃まで自動的に測定した。
【００３２】
図６から明らかなように、加熱されたＣｒｙｊ１は、通常のタンパク質のＣＤ曲線と異なる特徴的なＣＤ曲線を示している。ほとんどのタンパク質のＣＤスペクトルは通常、熱変性過程において、２１０ｎｍよりも小さい波長域においてピークを有する。しかしながら、熱変性したＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルは、波長２１８ｎｍにおいて吸光度が最小となり、これは、熱変性によってβ構造が増加していることを示している。さらに、熱変性したＣｒｙｊ１の溶液を冷却することによって、その傾向が顕著になり、熱変性したＣｒｙｊ１を冷却することによってβ構造がさらに増加することが分かった。このような結果は、分子間におけるβシート構造が増加していることを反映している。
【００３３】
また図７は、未加熱Ｃｒｙｊ１、９０℃で加熱したＣｒｙｊ１及び加熱後に変性剤（４Ｍ塩酸グアニジン）によって処理したＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す図である。なお、図７中、「○−○」は未加熱Ｃｒｙｊ１のスペクトル、「△−△」は９０℃に加熱しているＣｒｙｊ１のスペクトル、「×−×」は加熱後のＣｒｙｊ１に変性剤を加えたスペクトルである。この図から明らかなように、変性剤を加えることによって、熱変性したＣｒｙｊ１の波長２１８ｎｍでの吸光度が大幅に減少していることが分かる。これによって、分子間で架橋するβ構造が破壊されていることが分かる。これらの結果から、Ｃｒｙｊ１が、熱変性によって、分子間β構造を介して、規則的な集合構造を有する可溶性凝集体を形成することが示された。
【００３４】
可溶性凝集体の分子間β構造の形成を分析するために、チオフラビンＴを用いた蛍光強度分析を行った。なお、チオフラビンＴはβ構造に対して作用することが知られており、チオフラビンＴの蛍光強度がβ構造に比例することも知られている。図８は、２１８ｎｍでのＣＤによる熱変性曲線及びＣｒｙｊ１の熱変性過程におけるチオフラビンＴの蛍光強度を示す。なお、図８中、「○」は波長２１８ｎｍにおける楕円率、「△」は蛍光強度である。
【００３５】
図８から明らかなように、Ｃｒｙｊ１におけるチオフラビンＴの蛍光強度は、加熱温度が上昇するに連れて減少していることが分かる。この結果は、Ｃｒｙｊ１が熱変性過程において、分子間の相互作用によりβ構造を形成することを示している。つまり、加熱することによって得られるＣｒｙｊ１の重合には、分子間ジスルフィド結合及び分子間β結合が含まれていることが分かる。
【００３６】
＜本実施形態の効果＞
このように構成した本実施形態に係る免疫寛容誘導剤によれば、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖類等によって化学装飾させることなく、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができる。したがって、この免疫寛容誘導剤を用いることによって、アレルギー反応を起こしうるアレルゲンタンパク質を、アナフェラキシーを起こすことなく、経口投与又は経粘膜投与によって免疫系に導入して免疫寛容を誘導し、アレルギー疾患を予防することが可能となる。
【００３７】
＜その他の変形実施形態＞
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、前記実施形態では、スギ花粉アレルゲンの免疫寛容誘導剤について説明したが、その他、ヒノキ花粉アレルゲン等の植物性アレルゲン又は動物性アレルゲンにも適用することができる。
その他、本発明は前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。
【手続補正書】
【提出日】平成21年7月8日(2009.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減した可溶性凝集体、及びこの可溶性凝集体を用いた免疫寛容誘導剤及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば花粉症等のアレルギー疾患は、アレルゲンと総称されるタンパク質（以下、アレルゲンタンパク質）が体内に入り込み、これに体内の免疫系が過剰に反応することで全身又は局所的に障害を引き起こす疾患である。特に、日本人の２０％以上がスギ花粉症を患っており、社会的に深刻な問題となっている。
【０００３】
これらの疾患は人間が本体持っている免疫反応に起因するものであり、根本的な治療法は確立されていない。しかしながら、特許文献１に示すアレルゲンタンパク質の除去方法や抗炎症剤による対症療法、特許文献２に示すアレルゲンタンパク質をタンパク質変成剤で処理する低減化方法、特許文献３に示す微量のアレルゲンタンパク質を数回にわたり注射してアレルギー反応を低減化させる減感作療法など種々の治療法が考えられている。
【０００４】
一方、本願発明者は、経口取得が可能な低減化アレルゲンという観点を導入し、特許文献４に示すように、乾燥条件下においてメイラード反応を利用して、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖修飾して被覆してなる食品組成物を発明している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−３４０４６号公報
【特許文献２】特開２００５−１０４８４７号公報
【特許文献３】特開２００２−２４９４４２号公報
【特許文献４】特開２００６−３４０６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、卵白のタンパク質であるオボアルブミンは、熱変性過程において、分子間を架橋するβ構造を介して可溶性凝集体を形成することが知られている。このオボアルブミンは、Ａｓｎ−２９２及びＡｓｎ−３１１においてＮ−グリコシド結合を有する糖タンパク質である。一方、主要なスギ花粉タンパク質（Ｃｒｙｊ１）は、Ａｓｎ−１３７、Ａｓｎ−１７０、Ａｓｎ−２７３及びＡｓｎ−３３３においてＮ−グリコシド結合を有する糖タンパク質である。
【０００７】
本発明は、上記オボアルブミンの構造とスギ花粉タンパク質の構造との類似性に基づいた鋭意検討の結果、アレルゲンタンパク質が、オボアルブミンの凝集体形成と同じように、熱変性過程において可溶性凝集体を形成するという見地に基づいてなされたものであり、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることをその主たる所期課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち本発明に係るアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体は、複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによってアレルギー反応の原因となる抗原構造（エピトープ）を内包させてなることを特徴とする。
【０００９】
つまり、可溶性凝集体は、アミロイドを形成するタンパク質の結合と同様に、変性タンパク質分子（unfolded protein molecules）間を架橋するβ構造（cross-β-structure）を介して形成される。詳細には、アレルゲンタンパク質を加熱すると、内部に埋もれているβ構造が熱変性によって外部に露出される。このとき、アレルギーを誘発するエピトープも、変性タンパク質分子の表面に露出する。そして、露出したβ構造は、加熱後の冷却過程において、変性タンパク質分子間で再結合される。このとき、アレルゲンタンパク質のエピトープは、熱変性によって形成された可溶性凝集体によって被覆される。つまり、アレルゲンタンパク質のエピトープは可溶性凝集体に内包されることになる。
【００１０】
このようなものであれば、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖類等によって化学装飾させることなく、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができる。したがって、この可溶性凝集体を用いることによって、アレルギー反応を起こしうるアレルゲンタンパク質を、アナフィラキシーを起こすことなく、免疫系に導入して免疫寛容を誘導し、アレルギー疾患を予防することが可能となる。ここで、「免疫寛容」とは、Ｍ細胞が抗原となるアレルゲンタンパク質を取り込むことによって誘導される免疫反応の一種である。この系においては、抗原を継続して経口投与又は経粘膜投与すると、抗原となるアレルゲンタンパク質に対してサプレッサーＴ細胞が産生され、このアレルゲンタンパク質に対しては免疫反応が緩和されることが明らかになっている。
【００１１】
本発明は、前記アレルゲンが、動物性アレルゲン又は植物性アレルゲンに適用することができ、特に、前記アレルゲンが、スギ花粉アレルゲンであることが考えられる。
【００１２】
前記アレルゲンがスギ花粉アレルゲンである場合に、そのスギ花粉アレルゲンを凝固させることなく可溶性凝集体を形成するためには、前記アレルゲンタンパク質が加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱することによって凝集されていることが望ましい。
【００１３】
また、本発明に係る免疫寛容誘導剤は、上述したアレルゲンタンパク質の可溶性凝集体を用いたものであって、経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導することを特徴とする。経粘膜投与としては舌下減感作療法が考えられる。従来の舌下減感作療法は、アレルゲンタンパク質を舌下粘膜に滴下して免疫系に取り込むものである。このとき、アレルゲンタンパク質を誤飲すると、食道の粘膜等でアナフィラキシーを起こす可能性がある。一方、本発明の免疫寛容誘導剤は、アレルゲンタンパク質を加熱することによって可溶性凝集体を形成し、抗原構造を内部に埋没させているので、抗原構造を粘膜に接触させることなく免疫系に導入することができる。また、誤認した場合であっても腸管免疫系によって取り込むことができる。
【００１４】
さらに、本発明に係る免疫寛容誘導剤は、経口投与又は経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤の製造方法であって、複数のアレルゲンタンパク質を加熱し、それらアレルゲンタンパク質を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
このように構成した本発明によれば、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができ、従来に無い全く新しい免疫寛容誘導剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ドットブロット法により得られたＩｇＥ抗体との結合を濃淡によって示す図である。
【図２】ＩｇＥ抗体との結合度を示す図である。
【図３】ＨＰＬＣを用いて未加熱Ｃｒｙｊ１及び可溶性凝集体を分析したゲルろ過パターンを示す図である。
【図４】未加熱Ｃｒｙｊ１及び可溶性凝集体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】可溶性凝集体及び２−メルカプトエタノール存在下の可溶性凝集体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図６】加熱前後及び加熱中におけるＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す図である。
【図７】９０℃で加熱したＣｒｙｊ１及び加熱後に塩酸グアニジンによって処理したＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す図である。
【図８】２１８ｎｍでのＣＤによる熱変性曲線及びＣｒｙｊ１の熱変性過程におけるチオフラビンＴの蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に本発明に係る免疫寛容誘導剤を製造方法とともに説明する。
本実施形態に係る免疫寛容誘導剤は、経口投与又は例えば舌下減感作療法等の経粘膜投与によって、スギ花粉アレルゲンに対して免疫寛容を誘導する免疫寛容誘導剤であって、複数のスギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙｊ１）を加熱し、それらＣｒｙｊ１を凝集させることによって、アレルギー反応の原因となる抗原構造を内包させてなるものである。
【００１８】
Ｃｒｙｊ１は加熱されると、分子間で架橋したβ構造及び分子間でジスルフィド結合を形成する。このとき、分子表面に露出している抗原構造（ＩｇＥエピトープ）は、可溶性凝集体の内部に埋もれ、Ｃｒｙｊ１の抗原性が低減されている。
【００１９】
この免疫寛容誘導剤は、以下の手順によって製造される。
＜Ｃｒｙｊ１の精製＞
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０、ＮａＣｌ（０．１４Ｍ）及びＫＣｌ（０．０１Ｍ）を含む）２Ｌ中に、１００ｇのスギ花粉を入れ、１時間緩やかに攪拌した。その後、遠心分離（１５０００×ｇ、３０ｍｉｎ）によって上清を分離し、さらに花粉除去のためにフィルタにかけた。この抽出液に硫酸アンモニウムを８０％飽和（５６１ｇ／Ｌ）まで加え、４℃で一晩中攪拌した後、遠心分離（１８５００×ｇ、４０ｍｉｎ）して沈殿物を回収した。その沈殿物を蒸留水に溶解し、これを透析した。このように処理した透析液を冷凍乾燥し、Ｃｒｙｊ１の粗抽出物（ｃｒｕｄｅ  ｅｘｔｒａｃｔ、以下ＣＥという。）として保管した。
【００２０】
このＣＥを０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、同様の酢酸緩衝液を用いて５倍に希釈した。そして、この５倍に希釈した溶液を、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化した陽イオン交換カラムクロマトグラフィ（東レ社製、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）にかけた。その後、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）でカラムを洗い、吸着したタンパク質を０．０５〜０．３Ｍの濃度勾配をつけたＮａＣｌ（ｉｎ  ０．０１Ｍ酢酸緩衝液）で溶出した。２８０ｎｍの吸光で得られたピークを回収し、蒸留水で透析した後、冷凍乾燥した。
【００２１】
＜可溶性凝集体の作製＞
０．１％のＣｒｙｊ１を溶解させた１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱させた。このように制御された条件下において、凝固を生じさせることなく、透明な可溶性凝集体を得ることができた。室温で冷却させた後、可溶性凝集体を以下の実験に用いた。
【実施例】
【００２２】
熱変性させたＣｒｙｊ１の可溶性凝集体とＩｇＥとの結合について測定した。なお、用いるスギ花粉患者のヒト血清は、山口大学医学部付属病院皮膚科（Ｄｒ．Ｍ  Ｍｕｔｏ）の協力により提供された。
【００２３】
加熱されたＣｒｙｊ１（以下、「加熱後Ｃｒｙｊ１」と言う。）と患者のＩｇＥ抗体との結合をドットブロット法を用いて測定した。このドットブロット法は、ビオチン−アビチン法を用いて行った。自然のＣｒｙｊ１（以下、「未加熱Ｃｒｙｊ１」と言う。）、及び加熱速度１℃／ｍｉｎで４０℃から９０℃まで加熱されたＣｒｙｊ１を、０．０００５％に希釈し、１０μＬの未加熱Ｃｒｙｊ１及び加熱後Ｃｒｙｊ１をＰＶＤＦ（ポリ塩化ビニリデン）膜上に滴下した。このＰＶＤＦ膜はメタノールを用いて洗浄した。そして、Ｃｒｙｊ１に結合するＩｇＥの検出は、ビオチン−アビチン反応を用いて行った。ＰＶＤＦ膜の乾燥後、ブロッキング剤（０．５％  ＢＳＡ  ｉｎ  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を用いて１時間培養し、ＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、余分なＢＳＡを除去した。このＰＶＤＦ膜は、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２０倍に希釈された患者のヒト血清とともに一晩培養した。そのＰＶＤＦ膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した後、１／１００００に希釈されたビオチン化抗ヒトＩｇＥ抗体をＰＶＤＦ膜に添加し、１時間培養した。次にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、結合したＩｇＥ抗体１／５０００倍に希釈したＨＲＰ−ストレプトアビジン溶液及びＥＣＬを用いたウエスタンブロッティングを用いて検出した。
【００２４】
図１はドットブロット法により得られたＩｇＥ抗体との結合を濃淡によって示す図であり、白色になるほどＩｇＥ抗体と結合していることを示している。なお図１中「Ｎａｔｉｖｅ」は、未加熱Ｃｒｙｊ１であり、「Ｈｅａｔｅｄ」は加熱後Ｃｒｙｊ１である。また、図２は、図１に示す濃淡をデンシトメータによって測定したものであり、ＩｇＥ抗体との結合度を示すグラフである。なお、加熱後Ｃｒｙｊ１とＩｇＥ抗体との結合度は、未加熱Ｃｒｙｊ１とＩｇＥ抗体との結合を１００％とした場合の割合を示している。
【００２５】
これら図１及び図２から明らかなように、未加熱Ｃｒｙｊ１に対して加熱後Ｃｒｙｊ１のＩｇＥ抗体との結合度が顕著に低減されていることが分かる。つまり、Ｃｒｙｊ１は加熱によって分子間で架橋したβ構造及び分子間でジスルフィド結合を形成し、分子表面に露出している抗原構造は、可溶性凝集体の内部に埋もれ、抗原性が低減される。
【００２６】
最後に、本実施形態の可溶性凝集体を液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、円偏光二色性（ＣＤ）分析法、及び蛍光分析法を用いた分析結果について説明する。
【００２７】
図３は、ＨＰＬＣを用いて未加熱Ｃｒｙｊ１及び加熱後Ｃｒｙｊ１を分析したゲルろ過パターンを示す。図３中、横軸は溶出時間、Ａは未加熱Ｃｒｙｊ１のパターン、Ｂは加熱後Ｃｒｙｊ１のパターンである。なお、この分析には、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ−３０００  ＳＷ（東ソー社製、カラム寸法０．７５×３０ｃｍ）を用いたＨＰＬＣにより行った。未加熱Ｃｒｙｊ１及び加熱後Ｃｒｙｊ１を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでＨＰＬＣのカラムに流した。ゲルろ過パターンは波長２８０ｎｍの吸光度を用いて測定した。
【００２８】
図３から明らかなように、未加熱Ｃｒｙｊ１のピークは、溶出時間２４．５ｍｉｎ及び２５ｍｉｎにおいて重複ピークとして現れる。一方で、加熱後Ｃｒｙｊ１のピークは溶出時間２４．５ｍｉｎ及び２５ｍｉｎでは現れず、可溶性凝集体が形成されていることが分かる。
【００２９】
図４及び図５は、未加熱Ｃｒｙｊ１、加熱後Ｃｒｙｊ１、及び２−メルカプトエタノール存在下における加熱後Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図４中、左列は分子量マーカー、中列は未加熱Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右列は加熱後Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。また図５中、左列は分子量マーカー、中列は加熱後Ｃｒｙｊ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右列は加熱後Ｃｒｙｊ１に２−メルカプトエタノールを加えたＳＤＳ−ＰＡＧＥである。なお、このＳＤＳ−ＰＡＧＥには、０．１％ＳＤＳを含有する１２．５％アクリルアミド分離ゲル及び５％アクリルアミド濃縮ゲルを用いた。電気泳動は、１％ＳＤＳを含む泳動用緩衝液（トリス−グリシン（ｐＨ８．０））内の濃縮ゲルに１０ｍＡの電流を３０分間通電し、分離ゲルに２０ｍＡの電流を１時間通電することにより行った。電気泳動後、ゲルシートをタンパク質染色色素（０．２％Coomassie Brilliant Blue R-250(CBB-R250)）を用いて染色し、２０％メタノールを含有する１０％酢酸を用いて脱色した。
【００３０】
図４から明らかなように、未加熱Ｃｒｙｊ１の分子量は、タンパク質のＮ−グリコシド結合を反映して４２−４５ｋＤａであることが示されている。一方で、加熱後Ｃｒｙｊ１は、分離ゲル及び凝縮ゲルの境界近傍に表れており、可溶性凝集体が形成されていることが分かる。さらに、図５から明らかなように、２−メルカプトエタノール存在下の加熱後Ｃｒｙｊ１は、２−メルカプトエタノールの分離作用によって分離され、未加熱Ｃｒｙｊ１と同様の分子量であることが示されている。したがって、加熱によるＣｒｙｊ１の重合には、分子間のジスルフィド結合の形成が含まれていることが分かった。
【００３１】
図６は、加熱前後及び加熱中におけるＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す。図６中、「○−○」は室温におけるＣｒｙｊ１におけるスペクトル、「□−□」は９０℃に加熱しているＣｒｙｊ１のスペクトル、「△−△」は加熱後冷却したＣｒｙｊ１のスペクトルである。なお、ＣＤ測定装置は、２５℃における測定波長２００−２６０ｎｍの楕円率を用いた分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社製、Ｊ−６００型）を用いた。また、１．０ｍｍ光路を有するセル内の１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）内におけるＣｒｙｊ１の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるようにした。１つの試料に対して、２回から４回の連続スキャンを行い、その平均値を算出した。それぞれのスペクトルは、タンパク質濃度を用いて規格化し、平均残基分子楕円率（ｄｅｇ  ｃｍ２／ｄ  ｍｏｌ）とした。タンパク質濃度は、波長２８０ｎｍでの吸光度から算出した。熱変性曲線は、２２２ｎｍでの楕円率によって４０℃から９０℃まで自動的に測定した。
【００３２】
図６から明らかなように、加熱されたＣｒｙｊ１は、通常のタンパク質のＣＤ曲線と異なる特徴的なＣＤ曲線を示している。ほとんどのタンパク質のＣＤスペクトルは通常、熱変性過程において、２１０ｎｍよりも小さい波長域においてピークを有する。しかしながら、熱変性したＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルは、波長２１８ｎｍにおいて吸光度が最小となり、これは、熱変性によってβ構造が増加していることを示している。さらに、熱変性したＣｒｙｊ１の溶液を冷却することによって、その傾向が顕著になり、熱変性したＣｒｙｊ１を冷却することによってβ構造がさらに増加することが分かった。このような結果は、分子間におけるβシート構造が増加していることを反映している。
【００３３】
また図７は、未加熱Ｃｒｙｊ１、９０℃で加熱したＣｒｙｊ１及び加熱後に変性剤（４Ｍ塩酸グアニジン）によって処理したＣｒｙｊ１のＣＤスペクトルを示す図である。なお、図７中、「○−○」は未加熱Ｃｒｙｊ１のスペクトル、「△−△」は９０℃に加熱しているＣｒｙｊ１のスペクトル、「×−×」は加熱後のＣｒｙｊ１に変性剤を加えたスペクトルである。この図から明らかなように、変性剤を加えることによって、熱変性したＣｒｙｊ１の波長２１８ｎｍでの吸光度が大幅に減少していることが分かる。これによって、分子間で架橋するβ構造が破壊されていることが分かる。これらの結果から、Ｃｒｙｊ１が、熱変性によって、分子間β構造を介して、規則的な集合構造を有する可溶性凝集体を形成することが示された。
【００３４】
可溶性凝集体の分子間β構造の形成を分析するために、チオフラビンＴを用いた蛍光強度分析を行った。なお、チオフラビンＴはβ構造に対して作用することが知られており、チオフラビンＴの蛍光強度がβ構造に比例することも知られている。図８は、２１８ｎｍでのＣＤによる熱変性曲線及びＣｒｙｊ１の熱変性過程におけるチオフラビンＴの蛍光強度を示す。なお、図８中、「○」は波長２１８ｎｍにおける楕円率、「△」は蛍光強度である。
【００３５】
図８から明らかなように、Ｃｒｙｊ１におけるチオフラビンＴの蛍光強度は、加熱温度が上昇するに連れて減少していることが分かる。この結果は、Ｃｒｙｊ１が熱変性過程において、分子間の相互作用によりβ構造を形成することを示している。つまり、加熱することによって得られるＣｒｙｊ１の重合には、分子間ジスルフィド結合及び分子間β結合が含まれていることが分かる。
【００３６】
＜本実施形態の効果＞
このように構成した本実施形態に係る免疫寛容誘導剤によれば、アレルゲンタンパク質の抗原構造を多糖類等によって化学装飾させることなく、アレルゲンタンパク質の抗原性を低減させることができる。したがって、この免疫寛容誘導剤を用いることによって、アレルギー反応を起こしうるアレルゲンタンパク質を、アナフィラキシーを起こすことなく、経口投与又は経粘膜投与によって免疫系に導入して免疫寛容を誘導し、アレルギー疾患を予防することが可能となる。
【００３７】
＜その他の変形実施形態＞
なお、本発明は前記実施形態に限られるものではない。
例えば、前記実施形態では、スギ花粉アレルゲンの免疫寛容誘導剤について説明したが、その他、ヒノキ花粉アレルゲン等の植物性アレルゲン又は動物性アレルゲンにも適用することができる。
その他、本発明は前記実施形態に限られず、その趣旨を逸脱しない範囲で種々の変形が可能であるのは言うまでもない。