(57)【要約】【課題】  真核細胞へのより効率的な遺伝子導入方法を提供すること。【解決手段】  本発明は、真核細胞、好ましくはヒト造血細胞、特に樹状細胞において電気穿孔により遺伝子を送達するための改良された方法を提供する。本発明の方法は、従来のｍＲＮＡのリポフェクションおよび受動的パルシングによる方法、および樹状細胞への腫瘍抗原負荷を含む遺伝子送達のためのプラスミドｃＤＮＡの電気穿孔による方法よりも、優れた導入率などを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
裸の線形ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で造血細胞または幹細胞を形質移入する方法であって、造血細胞または幹細胞および形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドを含む懸濁液を１００〜２５０μＦの静電容量、３００〜６００Ｖで１００μｓ〜１ｍｓのソフトパルスを用いて電気穿孔することを含んでなる方法。
【請求項２】
ソフトパルスが、矩形波パルスまたは指数関数的減衰パルスである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ソフトパルスが３５０〜５００Ｖで３００〜６００μｓである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
電気穿孔法が４ｍｍキュベットにおいて行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドが、修飾されたまたは修飾されていない、限定または非限定ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む、前記方法。
【請求項６】
形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドが、修飾されたかまたは修飾されていない、限定または非限定のＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
裸の線形ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、
（ｉ）懸濁液中の細胞の濃度が１００〜１×１０９細胞／ｍｌであり；および／または
（ii）形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドの濃度が１×１０−７〜１×１０−５ｍｍｏｌ／ｍｌである、
前記方法。
【請求項９】
懸濁液中の細胞の濃度が１×１０５〜５×１０７細胞／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
懸濁液中の細胞の濃度が４×１０７細胞／ｍｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドの濃度が４×１０−６〜６×１０−６ｍｍｏｌ／ｍｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、
（ｉ）造血細胞または幹細胞が哺乳動物細胞であり、ならびに／または
（ｉｉ）幹細胞が該幹細胞の誘導体を含み、造血細胞が単核細胞、造血幹細胞およびそれらの誘導体、骨髄ＣＤ３４＋前駆体由来樹状細胞、ＣＤ３４＋前駆体由来ランゲルハンス細胞、および単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を含む、
前記方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
幹細胞が胚幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
造血細胞が未成熟Ｍｏ−ＤＣと成熟Ｍｏ−ＤＣとを含む単核細胞由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
造血細胞がＭｏ−ＤＣであり、裸の線形ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであり、形質移入を、低電圧、低静電容量および高細胞濃度で実施する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
形質移入を、２５０〜３００Ｖの電圧、１５０〜２５０μＦの静電容量および１×１０７〜４×１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で、７〜１０ｍｓのパルス時間で行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１、５または１６に記載の方法であって、裸の線形ポリヌクレオチドが、
（ｉ）真核細胞中で発現すべきタンパク質またはペプチドをコードし、前記タンパク質またはペプチドは真核細胞中において機能を有してもまたは有さなくてもよく、線形ポリヌクレオチドが、腫瘍抗原、微生物抗原、ウイルス抗原、免疫刺激性または寛容原性分子、抗アポトーシス分子、接着およびホーミング分子、並びに抗原処理分子をコードし；
（ｉｉ）分化調整遺伝子、分化関連遺伝子および組織特異的遺伝子を含む機能的または調整配列である、
前記方法。
【請求項１９】
造血細胞がヒト成熟Ｍｏ−ＤＣであり、および／または形質移入すべき線形ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであり、当該方法は、形質移入したＭｏ−ＤＣを、成熟刺激を提供することによりさらに成熟させることをさらに含んでよい、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
造血細胞がヒト未成熟Ｍｏ−ＤＣであり、および／または形質移入すべき裸の線形ポリヌクレオチドがｍＲＮＡであり、当該方法は、形質移入した細胞を、成熟カクテルを提供することにより成熟させることをさらに含んでよい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
成熟カクテルが、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、リポ多糖、免疫刺激ＤＮＡ配列、ＣＤ４０リガンドおよびポリ−Ｉ：Ｃからなる群より選択される化合物の一種または二種以上を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
成熟カクテルがＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２を含む混合物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
さらに、形質移入細胞の凍結保存を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞、好ましくはヒト造血細胞、特に樹状細胞中に電気穿孔により遺伝
子を送達する改良された方法を提供する。本発明の方法は、ｍＲＮＡのリポフェクション
および受動的パルシングよりも、および樹状細胞の腫瘍抗原負荷を含む遺伝子送達用のプ
ラスミドｃＤＮＡの電気穿孔よりも優れている。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、試験管内および生体内で一次免疫反応を開始するための専門的な
抗原捕捉および提示細胞として機能する骨髄由来白血球である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，
Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．著，Nature，第３９２巻：２４５〜２５２頁（１９９
８年））。生体内での細胞媒介免疫におけるそれらの中心的役割により、それらは、ＡＩ
ＤＳおよび癌のような後天性疾患の分子的免疫治療のための極めて魅力的な標的である。
ＤＣの生体外発生およびＤＣ機能を調整する能力の近年の発達により、ＤＣをベースとし
た腫瘍ワクチンを設計する原理が提供されている（Ａｖｉｇａｎ，Ｄ．，Blood Rev.，第
１３巻：５１〜６４頁（１９９９年））。そのような腫瘍ワクチンの結果は、細胞毒性Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）媒介抗腫瘍免疫反応の最適刺激のための応用抗原負荷法の有効性に高
度に依存する（Ｔａｒｔｅ，Ｋ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｂ．著，Leukemia，第１３巻：６５３〜
６６３頁（１９９９年））。幾つかのレポートが、ＴＡＡ特異的細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃ
ＴＬ）の誘導用にＤＣを負荷するために腫瘍関連抗原をコードしているｃＤＮＡをウイル
ス的に転移することを記載している（Ｄｉｅｔｚ，Ａ．Ｂ．，Ｖｕｋ，Ｐ．Ｓ．著，Bloo
d，第９１巻：３９２〜３９８頁（１９９８年）；Ｂｒｏｓｓａｒｔ，Ｐ．ら著、J.Immun
ol.，第１５８巻：３２７０〜３２７６頁（１９９７年）；Ｓｐｅｃｈｔ，Ｊ．Ｍ．ら著
、J.Exp.Med.，第１８６巻：１２１３〜１２２１頁（１９９７年））が、ＤＣに基づいた
ワクチン用の非ウイルス性遺伝子送達系は、安全性の問題およびベクターの免疫原性を最
低まで低下させるので、臨床的展望を伴う、より魅力的な手段を提供する。
【０００３】
さらに、転写が起こる場合は核へのＤＮＡの細胞内輸送が非常に制限されているので、
非ウイルス性ＤＮＡ形質移入法は、特に非分裂細胞において非効率的であることが一般的
に知られている（Ｌｕｏ，Ｄ．，Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．著，Nat.Biotechnol.，第
１８巻：３３〜３７頁（２０００年））。従って、複数のグループが、ｍＲＮＡ形質移入
の、非ウイルス性遺伝子送達用の有効な代替物としての可能性を示した。これは、この手
段が、核内に入る必要性、およびＤＮＡベクターに関わる転写調節の複合的問題を回避す
るからである（Ｌｕ，Ｄ．ら著、Cancer Gene Ther.，第１巻：２４５〜２５２頁（１９
９４年）；Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ら著、Biochem.Biophys.Acta，第１３６９巻：３２０〜３
３４頁（１９９８年）；サワイ（Ｓａｗａｉ），Ｋ．ら著、Mol.Genet.Metab.，第６４巻
：４４〜５１頁（１９９８年））。ＲＮＡ手法は、ＤＣをベースとした腫瘍ワクチンの開
発において有益なものにする幾つかの利点を有している。まず、ＤＣは、ポックスウイル
ス（Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．ら著、J.Immunother.，第２０巻：２７６〜２８６頁（１９９７年
））またはアデノウイルス（Ｄｉｅｔｚ，Ａ．Ｂ．，Ｖｕｋ，Ｐ．Ｓ．著，Blood，第９
１巻：３９２〜３９８頁（１９９８年））のような組換えウイルスによる形質導入と比べ
て、匹敵しうる水準まで形質移入され得ると共に、ウイルスベクターの欠点は回避する（
Ｊｅｎｎｅ，Ｌ．ら著、Gene Ther.，第７巻：１５７５〜１５８３頁（２０００年）；Ｊ
ｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ら著、Gene Ther.，第７巻：２４９〜２５４頁（２０００年））。
第２に、ＤＣは、腫瘍関連抗原を予め同定することなく腫瘍抗原の供給源としてＩＶＴ  
ｍＲＮＡの代わりに全ｍＲＮＡを用いて全抗原範囲を負荷され得る（Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ら
著、Hum.Gene Ther.，第１０巻：１１５１〜１１６１頁（１９９９年））。さらに、ＲＮ
Ａは細胞半減期が短く、宿主ゲノム中に組み込まれる潜在力に欠き、そのために、臨床的
遺伝子治療試行の点において、安全性事項、例えば、挿入的突然変異生成を除く（Ｌｕ，
Ｄ．ら著、Cancer Gene Ther.，第１巻：２４５〜２５２頁（１９９４年）；Ｙｉｎｇ，
Ｈ．ら著、Nat.med.，第５巻：８２３〜８２７頁（１９９９年））。一方、この短い細胞
半減期は、比較的短いタンパク質発現につながり得るので不利となり得る。
【０００４】
しかしながら、非ウイルス性形質移入による非効率的遺伝子転移および低水準の発現の
問題が残る（Ａｒｔｈｕｒ，Ｊ．Ｆ．ら著、Cancer Gene Ther.，第４巻：１７〜２５頁
（１９９７年））。
【０００５】
以前には、我々は電気穿孔媒介遺伝子送達（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．Ｉ．
ら著、Gene Ther.，第５巻：７００〜７０７頁（１９９８年））を利用する、ＣＤ３４＋
前駆体由来ＤＣ（３４−ＤＣ）およびランゲルハンス細胞（３４−ＬＣ）の繁殖における
高水準の導入遺伝子発現を報告した。これに対して、試験管内培養ＤＣの高度に利用し易
く広く用いられている供給源であることを意味する非分裂単核細胞由来ＤＣ（Ｍｏ−ＤＣ
）は、電気穿孔またはリポフェクションによるｃＤＮＡ形質移入技術にあまり適応性がな
い。
【０００６】
近年、ヒトＤＣをＲＮＡで形質移入することができ、一次抗原特異的ＣＴＬを誘発する
ことができることが示された（Ｎａｉｒ，Ｓ．Ｋ．ら著、Nat.Biotechnol.，第１６巻：
３６４〜３６９頁（１９９８年））。しかしながら、受動的パルシング、リポフェクショ
ンまたは電気穿孔を用いるＭｏ−ＤＣ中のｍＲＮＡ転移の効率についてデータは、あった
としても、殆ど無い。さらに、３４−ＤＣまたは３４−ＬＣにおけるｍＲＮＡ形質移入の
実行可能性は未だ確立されておらず、この方法はＭｏ−ＤＣに適用されただけである。
【０００７】
「正常」細胞（例えば、腫瘍細胞）中に環状ポリ核酸を組み込むための電気穿孔法は、
通常、以下の反応条件を用いる（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ  Ｖ．Ｆ．Ｉ．ら著、Gene T
her.，第５巻：７００〜７０７頁（１９９８年）；Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．
Ｉ．ら著、Gene Ther.，第７巻：１４３１〜１４３７頁（２０００年）；Ｖａｎ  Ｂｏｃ
ｋｓｔａｅｌｅ，Ｄ．，Ｂｅｒｎｅｍａｎ，Ｚ．Ｎ．，Cytometry第４１巻：３１〜３５
頁（２０００年）；Ｌｕｒｑｕｉｎ，Ｐ．Ｆ．著，Mol.Biotechnol．第７巻：５〜３５頁
（１９９７年）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｅ．ら著、Mol.Biotechnol．第４８巻，第２２
章，Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ編）；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｓ．Ｃ．著，Biochem.and Biotechnol．
第４２巻：７５〜８２頁（１９９３年））：
−  １〜１０×１０６細胞／ｍｌの範囲の細胞濃度、
−  ２００〜３５０Ｖの範囲の電圧、
−  ３００μＦを超える静電容量、
−  １５〜４０μｓの範囲のパルス長。
【０００８】
しかしながら、そのような「従来の」電気穿孔法は、種々の「従来の」パラメーター設
定：ｉ）静電容量および電圧をそれぞれ３００μＦおよび２５０Ｖに維持しつつ細胞密度
を２×１０６〜４×１０７細胞／ｍｌの範囲で試験し、細胞密度の増加が致死率の低下に
つながることを示し；ｉｉ）静電容量および細胞密度をそれぞれ３００μＦおよび４×１
０７細胞／ｍｌに維持しつつ電圧の衝撃を２５０〜３５０Ｖの範囲で検討し、電圧の増加
が致死率の上昇につながることを示し；ｉｉｉ）細胞密度および電圧をそれぞれ４×１０
７細胞／ｍｌおよび２５０Ｖに維持しつつ静電容量を３００〜１５００μＦの範囲で評価
したこと、を我々がテストし単核細胞由来樹状細胞の電気穿孔について報告したＳｔｒｏ
ｂｅｌ，Ｉ．ら著、Gene Therapy  第７巻：２０２８〜２０３５頁（２０００年）に例え
ば示されているように線形ポリヌクレオチドを電気穿孔したおよび／または一次細胞（例
えばＭｏ−ＤＣ）に適用した場合に、非常に低いＲＮＡ形質転換収率しか与えない。静電
容量の増加は致死率の増加をもたらした。２２ｍｓより短いパルス時間が細胞生活力を増
加させたが、非常に低い非相同性遺伝子発現しか検出できなかった。これに対し、２８ｍ
ｓより長いパルス時間は、一時的に遺伝子発現を高めたが、細胞損失を増加させた。結果
的に、この以前に公開された作業において、未成熟単核細胞由来ＤＣのための以下のよう
な最適の電気穿孔条件が発見された：ｉ．）細胞密度４×１０７細胞／ｍｌ；ｉｉ．）電
圧２５０Ｖ；ｉｉｉ．）静電容量３００〜５００μＦおよびｉｖ．）パルス時間２２〜２
８ｍｓ。これらの最適化電気穿孔条件を用いると、ＧＦＰ  ＲＮＡを形質移入すると、４
８時間後に１１％までのＤＣがＧＦＰ＋であった。ＧＦＰ  ＤＮＡを用いて同様の形質移
入効果が得られた。
【０００９】
最近、我々は、試験管内転写ｍＲＮＡの単核細胞由来樹状細胞中への効果的電気穿孔が
可能であることも報告したが、この電気穿孔をいかに達成し得るかは述べなかった（Post
er、ｔｈｅ  ６ｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，Ｐ
ｏｒｔ  Ｄｏｕｇｌａｓ，オーストラリア，２０００年５月２６日〜６月１日およびｔｈ
ｅ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ，Ｔａｏｓ，ＮＭ，ＵＳＡ．，２００１年３月
１２日から１８日）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
米国特許第５，７６６，９０２号は、核酸分子を標的細胞に結合するリガンド中に適用
するまたはそのリガンドと共に適用するという、核酸分子用の電気穿孔法を開示している
。この化合物はエンドソマル分裂溶剤を含む。
【００１１】
米国特許第５，５５４，５２８号は、細胞が感染されたときのＨＩＶ複製を阻害するよ
うに細胞系を安定に形質転換させるためにＨＩＶ要素の制御下に毒素遺伝子を含むプラス
ミド（すなわち、環状ＤＮＡ構造体）を用いることを記載している。前記特許は、プラス
ミド電気穿孔に典型的でない電気的設定（２５０μＦ；２２０〜２９０Ｖ；体積１００μ
ｌ、ＢｉｏＲａｄ  ｃｕｖｅｔｔｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標））
を用いる電気穿孔によるＤＮＡ形質移入（１５欄、実施例２）を記載しているが、ＲＮＡ
形質移入は記載しておらず、ＲＮＡ電気穿孔も当然記載していない。さらに、「正常」哺
乳動物細胞株しか電気穿孔されておらず、一次細胞は考えられていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
驚くべきことに、特定の電気穿孔設定を用いると、単核細胞由来樹状細胞のような造血
細胞にＤＮＡおよびＲＮＡを効果的に形質移入することができることが発見された。特に
、最適化ｍＲＮＡをベースとした電気穿孔を用いてｍＲＮＡ形質移入効率が向上すること
が発見された。すなわち、本発明は、異なる型のヒトＤＣ中への腫瘍抗原の効果的負荷に
関連するｍＲＮＡ電気穿孔によるＭｏ−ＤＣおよび他の型の樹状細胞（ＣＤ３４＋由来ラ
ンゲルハンス細胞および間隙型ＤＣを含む）の高度に効果的な非ウイルス性形質移入の方
法を記載する。本発明の方法の効果を、ｍＲＮＡのリポフェクションおよび受動的パルシ
ング並びにｃＤＮＡ電気穿孔のような他の形質移入法と比較し、高度に優れていると分か
った。さらに、負荷効率へのＤＣ成熟の効果を検討した。Ｍｏ−ＤＣ並びに３４−ＤＣお
よび３４−ＬＣ中の高度に効果的な抗原負荷に適している電気穿孔をベースとしたｍＲＮ
Ａ形質移入プロトコールが開発された。この技術は、負荷効率およびその後の抗原特異的
ＣＤ８＋ＣＴＬクローンの活性化の点で、ｍＲＮＡリポフェクションまたは受動的ｍＲＮ
Ａパルシングより優れていると分かった。そのようなｍＲＮＡをベースとした電気穿孔を
用いると、Ｍｏ−ＤＣ、３４−ＤＣおよび３４−ＬＣにおける形質移入効率は、ｖａｎ  
Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．Ｉ．ら著、Gene Ther.，第５巻：７００〜７０７頁（１９９
８年）に記載のプラスミドＤＮＡ電気穿孔と比べて、少なくともそれぞれ２５倍、６倍お
よび３倍、より効率的であり、先に記載したｍＲＮＡ電気穿孔よりも優れていた。また、
そのようなｍＲＮＡ電気穿孔は、ｍＲＮＡリポフェクションおよび受動的パルシングより
優れていた。この高められた形質移入効率は、我々のＣＴＬ活性化実験により確認される
ように試験管内での優れた生物学的効果に翻訳され、生体内でのより高い免疫性能が得ら
れるかどうかについて検討する手段として用いることができた（Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．
ら著、J.Exp.Med.，第１８８巻：１０７５〜１０８２頁（１９９８年））。重要なことに
、特定のＣＤ８＋ＴＩＬクローンにＭＨＣクラスＩが限定された方法で、ｍＲＮＡを形質
移入したＤＣが、導入された抗原および存在する抗原エピトープを効果的に処理すること
ができた（図４）。さらに、ＤＣの抗原提示性能への成熟の効果についての先の報告（Ｃ
ｅｌｌａ，Ｍ．ら著、Curr.Opin.Immunol.，第９巻：１０〜１６頁（１９９７年））に従
って、ｍＲＮＡ電気穿孔による抗原負荷を、最適の抗原提示を達成するために、好ましく
はＤＣ成熟に先立って行い（図５）、今後のＤＣをベースとしたワクチン設計のための、
負荷およびＤＣ成熟を連続して行う重要性を示した（Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ａ．ら著、Cancer
Res.，第５８巻：２９６５〜２９６８頁（１９９８年））。
【００１３】
すなわち、本発明は、次の事項を提供する：
（１）線状ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で真核細胞を形
質移入する方法であって、真核細胞および形質移入すべき線状ポリヌクレオチドを含む懸
濁液を３００μＦを下回る静電容量で電気穿孔することを含んでなる方法。
【００１４】
（２）線状ポリヌクレオチドの一種もしくは二種以上またはその混合物で真核細胞を形
質移入する方法であって、好ましくは（１）に定義される方法であって、真核細胞および
形質移入すべき線状ポリヌクレオチドを含む懸濁液を３００〜６００Ｖで１００μｓ〜１
ｍｓのソフトパルスを用いて電気穿孔することを含んでなる方法。
【００１５】
（３）前記（１）または（２）に定義される方法により得ることができる形質移入真核
細胞。
【００１６】
（４）前記（１）または（２）に定義される方法により得ることができる形質移入真核
細胞を含んでなる医薬組成物またはワクチン。
【００１７】
（５）免疫または寛容の誘発、腫瘍治療、幹細胞治療、再生医療または組織工学を含む
免疫治療用の薬を調製するための、前記（１）または（２）に定義される方法により得る
ことができる形質移入真核細胞の使用。
【００１８】
（６）線形ポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物用の発現系として、または
検出系としての、前記（１）または（２）に定義される方法により得ることができる形質
移入真核細胞の使用。
【００１９】
（７）前記（１）または（２）に定義される方法により得ることができる形質移入真核
細胞を患者に投与することを含んでなる、免疫治療または腫瘍治療のための方法。
【発明の効果】
【００２０】
実施形態（１）および（２）の方法は、腫瘍抗原のような抗原をヒト樹状細胞（ＤＣ）
に負荷するのに適用することができ、これはＤＣをベースとした腫瘍ワクチンへの挑戦的
な手法である。（これは、非常に重要である。何故なら、予備実験において、プラスミド
ＤＮＡ電気穿孔手法が、それが引き起こすＴ細胞刺激がプラスミドＤＮＡにより直接また
は間接的に媒介される非特異的Ｔ細胞刺激から区別できないので、ＤＣの腫瘍抗原負荷に
適用できないことが分かったからである）。この非特異的の刺激は、ｍＲＮＡ電気穿孔を
用いた時には観察されず、特異的ＤＣをベースとしたＴ細胞刺激よりも優れていることが
証明された。また、遺伝子転移によるＤＣ中の他のタンパク質（例えば、刺激または寛容
またはアポトーシス分子）の発現が望ましく、さらに、電気穿孔によるアンチセンスＲＮ
Ａの導入が望ましい。換言すれば、本発明は、遺伝情報をＤＣ中に効率的に導入するため
の、ｍＲＮＡ電気穿孔に基づく細胞質発現系を記載する。強化グリーン蛍光タンパク質（
Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＥＧＦＰ
）レポーター遺伝子を用いるＫ５６２細胞中での予備実験は、ｍＲＮＡ電気穿孔が、プラ
スミドＤＮＡ電気穿孔と比べて著しく改良された形質移入効率（それぞれ、ＥＧＦＰ＋細
胞での４０％に対して８９％）を示し、著しく低い細胞毒性（死亡率が、プラスミドＤＮ
Ａを用いた場合の５１％に対してｍＲＮＡを用いた場合の１５％）を誘発したことを示し
た。単核細胞由来ＤＣ（Ｍｏ−ＤＣ）、ＣＤ３４＋前駆体由来ＤＣ（３４−ＤＣ）および
ランゲルハンス細胞（３４−ＬＣ）を含む異なる型のヒトＤＣの非ウイルス性形質移入の
ためにｍＲＮＡ電気穿孔を適用すると、全ＤＣ型の５０％より多くにおいてｍＲＮＡ電気
穿孔による高水準の導入遺伝子発現が得られた。ｍＲＮＡで電気穿孔したＤＣは、その表
現型および成熟性能を維持した。重要なことに、Ｍｅｌａｎ−ＡをコードするｍＲＮＡで
電気穿孔したＤＣは、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンを
ＨＬＡ限定的方法に強度に活性化し、ｍＲＮＡをリポフェクションしたまたはパルスした
ＤＣより優れていた。Ｍｏ−ＤＣがｍＲＮＡ形質移入に続いて成熟すると、ＣＴＬの最適
刺激が生じる。ＤＣをプラスミドＤＮＡで形質移入すると、ＣＴＬの非特異的刺激が際立
って観察された。我々のデータは、ｍＲＮＡで電気穿孔したＭｏ−ＤＣが、機能的抗原性
ペプチドを細胞傷害性Ｔ細胞に効率的に提示することを明らかに示している。従って、腫
瘍抗原をコードするｍＲＮＡの電気穿孔は、ヒト樹状細胞に腫瘍抗原を負荷する効果的な
技術であり、将来のＤＣをベースとした腫瘍ワクチンでの適用に役立つことができる。用
意した成熟ＤＣの形質移入は、ＴＮＦα＋ＬＰＳのような成熟刺激を用いた場合、効率が
低かった。しかしながら、最適化成熟刺激を含むＭｏ−ＤＣ用の特定世代のメタノールを
用いると（実施例４を参照）、成熟Ｍｏ−ＤＣの腫瘍抗原のような効率的形質移入も可能
になる。以下において、本発明を添付の図面および実施例により、より詳細に説明するが
、これらは本発明を制限するものと解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ電気穿孔に続くＫ５６２細胞中での導入遺伝子発現のフローサイトメトリー的分析を示す図である。  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで３００Ｖ、１５０μＦでまたは実施例に示すようにＥＧＦＰプラスミドＤＮＡで２６０Ｖ、１０５０μＦ（破線）で電気穿孔したＫ５６２細胞。電気穿孔の２４時間後、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）ＥＧＦＰ分析を行って、ｍＲＮＡ電気穿孔（太線）およびプラスミドＤＮＡ電気穿孔（破線）の形質移入効率を推定した。５つの独立した実験を表す上掛けヒストグラムを示す。非電気穿孔細胞（細線）を用いて、バックグラウンド蛍光を決めた。Ｍ１領域は、ＥＧＦＰ陽性細胞フラクションを示す。ＥＧＦＰ＋細胞の割合は、ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡ電気穿孔に続いて、それぞれ、８５％（太線）および５０％（破線）であった。
【図１Ｂ】ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ電気穿孔に続くＫ５６２細胞中での導入遺伝子発現のフローサイトメトリー的分析を示す図である。  Ｋ５６２細胞中のＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現の時間の関数としての速度論（ｎ＝３）。電気穿孔後３時間早々の高水準ＥＧＦＰ発現の迅速誘導に注目されたい。
【図２Ａ】異なる型のＤＣにおけるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ形質移入に続く導入遺伝子発現のＦＣＭ分析を示す図である。  未成熟Ｍｏ−ＤＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と培養し、培養６日目に、リポフェクション（底部）または電気穿孔（上部）により対照（Ｍｅｌａｎ−Ａ）またはＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入し、形質移入の１日後にＦＣＭにより分析した。ドットプロットは、ｘ軸上のＥＧＦＰ蛍光と、ｙ軸上のエチジウムブロミド染色を示す。対照のｍＲＮＡリポフェクションまたは電気穿孔Ｍｏ−ＤＣに基づいてゲートを引いた。死んだ細胞（上左角）および生活力のあるＥＧＦＰ＋細胞（下右角）の割合を示す。結果は、８つの独立した実験を代表する。
【図２Ｂ】異なる型のＤＣにおけるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ形質移入に続く導入遺伝子発現のＦＣＭ分析を示す図である。  ｍＲＮＡ電気穿孔に続くＭｏ−ＤＣにおけるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現および細胞生存度の、時間の関数としてのモニタリング（ｎ＝２）。
【図２Ｃ】異なる型のＤＣにおけるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ形質移入に続く導入遺伝子発現のＦＣＭ分析を示す図である。  ３４−ＤＣ（底部）および３４−ＬＣ（上部）を、材料および方法の項目に記載のように培養し、それぞれ培養１２日目および２５日目に、ｍＲＮＡ電気穿孔により対照（Ｍｅｌａｎ−Ａ）またはＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを形質移入した。ｍＲＮＡ電気穿孔の２４時間後にＦＣＭ分析を行った。ドットプロットは、ｘ軸上のＥＧＦＰ蛍光と、ｙ軸上のエチジウムブロミド染色を示す。対照のｍＲＮＡ電気穿孔Ｍｏ−ＤＣ（左側）に基づいてゲートを引いた。死んだ細胞（上左角）および生存するＥＧＦＰ＋細胞（下右角）の割合を示す。結果は、４つの独立した実験を代表する。
【図３Ａ】ｍＲＮＡ電気穿孔ＤＣの表現型分析および成熟性能を示す図である。  未成熟Ｍｏ−ＤＣ（ｉＭｏ−ＣＤ）を、ＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡで電気穿孔することにより形質移入し、電気穿孔の１日後に、ＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６に特異的なフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗体で染色した（底部）。非形質移入ｉＭｏ−ＤＣ（上部）は対照として作用し、アイソタイプ対応抗体を用いて象限を設定した。結果は、３つの実験を代表する。
【図３Ｂ】ｍＲＮＡ電気穿孔ＤＣの表現型分析および成熟性能を示す図である。  ｉＭｏ−ＤＣを、Ｍｅｌａｎ−ＡをコードするｍＲＮＡで電気穿孔することにより形質移入し、直接的にＰＥ−標識ＣＤ８０抗体（底部）で染色するまたはＣＤ８３抗体（上部）で間接的に染色した。破線が対照非電気穿孔ｉＭｏ−ＤＣを表し、細線が電気穿孔ｉＭｏ−ＤＣを表し、太線が、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳの存在下にｍＲＮＡ電気穿孔に続いてさらに２４時間成熟させられた電気穿孔ｉＭｏ−ＤＣを表す代表的上掛けヒストグラムを示す。
【図３Ｃ】ｍＲＮＡ電気穿孔ＤＣの表現型分析および成熟性能を示す図である。  １２日培養３４−ＤＣを、ＥＧＦＰをコードするｍＲＮＡで電気穿孔することにより形質移入し、電気穿孔の１日後にＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６およびＣＤ８０に特異的なＰＥ−標識抗体で染色した（底部）。非形質移入３４−ＤＣ（上部）は対照として作用し、アイソタイプ対応抗体を用いて象限を設定した。結果は、３つの実験を代表する。
【図４】Ｍｏ−ＤＣのｍＲＮＡをベースとした抗原負荷を示す図である。未成熟Ｍｏ−ＤＣをＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と共に培養し、培養６日目に、電気穿孔（ｎ＝１１）、リポフェクション（ｎ＝８）または受動的パルシング（ｎ＝５）によりＭｅｌａｎ−Ａ  ｍＲＮＡで形質移入し、または電気穿孔（ｎ＝６）によりＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入した。ＳＫ２３−ＭＥＬメラノーマ細胞株、Ｍｅｌａｎ−ＡでパルシングしたＨＬＡ−Ａ２＋Ｍｏ−ＤＣ、または無関係なインフルエンザペプチド、およびＭｅｌａｎ−Ａ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＨＬＡ−Ａ２−陰性Ｍｏ−ＤＣが、対照として作用した。抗原提示細胞（グラフの左側に示される）を、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬクローンと共インキュベーションして、ＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ生成により反映される抗原負荷効率を決めた。結果を、平均±ＳＤとして表す．＊ｐ＜０．０５；ＥＰ＝電気穿孔；ｌｉｐｏ＝リポフェクション；ｐｕｌｓ＝受動的パルシング。
【図５】ＤＣ成熟の、ｍＲＮＡ形質移入Ｍｏ−ＤＣの腫瘍抗原提示への影響を示す図である。ＣＴＬクローンによるＩＦＮ−γ生成を、Ｍｅｌａｎ−Ａ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＨＬＡ−Ａ２＋Ｍｏ−ＤＣと共培養した後に測定した。ｉＭｏ−ＤＣは、未成熟段階において形質移入され、そのものとして用いられたＭｏ−ＤＣ；Ｍｏ−ＤＣａは、ＬＰＳ＋ＴＮＦ−α刺激後、成熟段階において形質移入されたＭｏ−ＤＣ；Ｍｏ−ＤＣｂは、未成熟段階において形質移入され、ＬＰＳ＋ＴＮＦ−αにより成熟され、次にＭｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＴＬクローン刺激についてアッセイしたＭｏ−ＤＣ。結果を、平均±ＳＤとして表す（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５
【図６】３４−ＬＣのプラスミドｃＤＮＡをベースとした抗原負荷の結果を示す図である。Ｍｅｌａｎ−Ａ（ｐｃＤＮＡ１．１／Ｍｅｌａｎ−Ａ；ｎ＝１２）、ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１；ｎ＝１２）、ルシフェラーゼ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ；ｎ＝３）をコードする種々のプラスミドＤＮＡ構造体で、または真核生物のｃＤＮＡ配列を欠くバックボーンベクター（ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ；ｎ＝６）で電気穿孔したＨＬＡ−Ａ２＋３４−ＬＣと共培養した後に、ＣＴＬクローンによるＩＦＮ−γ生成を測定した。または、ＥＧＦＰまたはＭｅｌａｎ−Ａ（ｎ＝３）をコードする試験管内転写ｍＲＮＡで３４−ＬＣを電気穿孔した。結果を、平均±ＳＤとして表す。＊ｐ＜０．０５
【図７】未成熟単核細胞由来細胞の電気穿孔の結果、特に、ＧＦＰ−ＲＮＡで電気穿孔した４８時間後の樹状細胞の表現型を示す図である。象限の下右部分での数は、ＥＧＦＰ陽性ＤＣを示し、上右部分での数は、それぞれ、ＥＧＦＰ＋／ＣＤ８３＋およびＥＧＦＰ＋／ＣＤ２５＋ＤＣを示す。
【図８】電気穿孔を用いるＧＦＰ−ＲＮＡ形質移入に続く樹状細胞におけるＥＧＦＰ発現の形質移入効率および速度論を示す図である。
【図９Ａ】電気穿孔による単核細胞由来樹状細胞へのＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入の結果を示す図である。  電圧の細胞寸法および顆粒性への影響を示す輪郭プロット
【図９Ｂ】電気穿孔による単核細胞由来樹状細胞へのＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入の結果を示す図である。  ＣＤ８３およびＣＤ２５のＥＧＦＰ発現が電圧により影響されることを示す。
【図１０Ａ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  Ａは、電気穿孔を用いる成熟樹状細胞のＧＦＰ−ＲＮＡ形質移入に続くＥＧＦＰ発現の形質移入効率および速度論を示す。
【図１０Ｂ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  ＧＦＰ−ＲＮＡで電気穿孔した後に樹状細胞の表現型が維持されることを確認する。
【図１０Ｃ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  ＧＦＰ−ＲＮＡで電気穿孔した後に樹状細胞の表現型が維持されることを確認する。
【図１０Ｄ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  ＧＦＰ−ＲＮＡで電気穿孔した後に樹状細胞の表現型が維持されることを確認する。
【図１０Ｅ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  ＧＦＰ−ＲＮＡで電気穿孔した後に樹状細胞の表現型が維持されることを確認する。
【図１０Ｆ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  ＧＦＰ−ＲＮＡで電気穿孔した後に樹状細胞の表現型が維持されることを確認する。
【図１０Ｇ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  ＧＦＰ−ＲＮＡで電気穿孔した後に樹状細胞の表現型が維持されることを確認する。
【図１０Ｈ】電気穿孔による成熟単核細胞由来樹状細胞のＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。  Ｈは、電気穿孔を用いる成熟樹状細胞のＧＦＰ−ＲＮＡ形質移入に続くＥＧＦＰ発現の形質移入効率および速度論を示す。
【図１１】非凍結対照におけるＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ電気穿孔の後であり凍結保存サンプルの融解後の未成熟および成熟ＤＣにおける導入遺伝子発現のＦＣＭ分析。ドットプロットは、ｘ軸上のＥＧＦＰ蛍光と、ｙ軸上のエチジウムブロミド染色を示す。分析は、自己リンパ球の混在を排除するように、大きな前方散乱および大きな側方散乱プロフィールを示す細胞について行った。死んだ細胞（上左角）、生存するＥＧＦＰ＋細胞（下右角）および生存するＥＧＦＰ−細胞（下左角）の割合を、象限分析におけるドットの数に基づいて示す。（Ａ）ドットプロットは、ｍＲＮＡ電気穿孔（左側）の２４時間後の非凍結ｉＭｏ−ＤＣの、および融解の６時間後（中）および融解の２４時間後（右側）のｍＲＮＡ電気穿孔ｉＭｏ−ＤＣの分析を示す。（Ｂ）ドットプロットは、ｍＲＮＡ電気穿孔の２４時間後の非凍結ｍＭｏ−ＤＣ（左側）の、および融解の６時間後（中）および融解の２４時間後（右側）のｍＲＮＡ電気穿孔ｍＭｏ−ＤＣの分析を示す。ＥＰ＝電気穿孔。
【図１２Ａ】非凍結および凍結ｍＲＮＡ電気穿孔未成熟および成熟ＤＣの表現型分析の代表例。ドットプロットは、ＰＥ−標識モノクローナル抗体のＦＣＭ分析がＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６（ｙ−軸）を含む典型的ＤＣ−マーカーに対して行われたことを示す。象限を設定するための対照として、アイソタイ対応抗体およびＰＥ標識モノクローナルＣＤ１４抗体を用いた。ＤＣマーカーの分析を、ｘ軸上のＥＧＦＰ蛍光により示されるように、対照サンプル中の生存力のあるＥＧＦＰ−細胞について、およびｍＲＮＡ電気穿孔ＤＣ中の生存力のあるＥＧＦＰ＋細胞について行った。（Ａ）培養８日目のｉＭｏ−ＤＣ、（Ｂ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔後の４８時間の培養後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。（Ｃ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔、１８時間の培養、凍結保存、融解および２４時間培養の後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。（Ｄ）６日後に成熟カクテルで４８時間刺激したｉＭｏ−ＤＣ。（Ｅ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔および成熟カクテルでの４８時間の刺激の後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。（Ｆ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔および成熟カクテルを用いる２４時間の培養、凍結保存、融解および、成熟カクテルの存在下における２４時間の培養の後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。  通常、Ｍｏ−ＤＣ培養の６日目後、凍結インターバル（カウントされず）を置いてまたは置かないで、培養の２日後に表現型化を行った。図１２のドットプロット分析により示されるように、ｉＭｏ−ＤＣが、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションにより示されるように（図１２、Ａ＆Ｂ）、ｍＲＮＡ電気穿孔の４８時間後、成熟する。融解したＤＣは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８０の同じアップレギュレーションを呈するが、ＣＤ８６は低水準である（図１２、Ｃ）。これは、おそらく、凍結未成熟ＤＣ培地が、融解の２４時間後に染色されているという事実により引き起こされる。未成熟Ｍｏ−ＤＣは、ｉＭｏ−ＤＣにおける発現水準（図１２、Ａ＆Ｄ）と比較した、ｍＭｏ−ＤＣにおけるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションにより分かるように、成熟カルテルに充分に反応した。しかしながら、ｍＲＮＡ電気穿孔と成熟刺激との組み合わせは、高水準のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６発現を引き起こす（図１２、Ｅ）ので、成熟ＤＣにおいてこの組み合わせは非常に有効であると思われる。電気穿孔した凍結成熟ＤＣは、融解後、高いレベルの成熟マーカー発現を示す（図１２、Ｆ）。
【図１２Ｂ】非凍結および凍結ｍＲＮＡ電気穿孔未成熟および成熟ＤＣの表現型分析の代表例。ドットプロットは、ＰＥ−標識モノクローナル抗体のＦＣＭ分析がＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６（ｙ−軸）を含む典型的ＤＣ−マーカーに対して行われたことを示す。象限を設定するための対照として、アイソタイ対応抗体およびＰＥ標識モノクローナルＣＤ１４抗体を用いた。ＤＣマーカーの分析を、ｘ軸上のＥＧＦＰ蛍光により示されるように、対照サンプル中の生存力のあるＥＧＦＰ−細胞について、およびｍＲＮＡ電気穿孔ＤＣ中の生存力のあるＥＧＦＰ＋細胞について行った。（Ａ）培養８日目のｉＭｏ−ＤＣ、（Ｂ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔後の４８時間の培養後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。（Ｃ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔、１８時間の培養、凍結保存、融解および２４時間培養の後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。（Ｄ）６日後に成熟カクテルで４８時間刺激したｉＭｏ−ＤＣ。（Ｅ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔および成熟カクテルでの４８時間の刺激の後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。（Ｆ）６日目のｍＲＮＡ電気穿孔および成熟カクテルを用いる２４時間の培養、凍結保存、融解および、成熟カクテルの存在下における２４時間の培養の後のＥＧＦＰ＋ｉＭｏ−ＤＣ。  通常、Ｍｏ−ＤＣ培養の６日目後、凍結インターバル（カウントされず）を置いてまたは置かないで、培養の２日後に表現型化を行った。図１２のドットプロット分析により示されるように、ｉＭｏ−ＤＣが、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションにより示されるように（図１２、Ａ＆Ｂ）、ｍＲＮＡ電気穿孔の４８時間後、成熟する。融解したＤＣは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８０の同じアップレギュレーションを呈するが、ＣＤ８６は低水準である（図１２、Ｃ）。これは、おそらく、凍結未成熟ＤＣ培地が、融解の２４時間後に染色されているという事実により引き起こされる。未成熟Ｍｏ−ＤＣは、ｉＭｏ−ＤＣにおける発現水準（図１２、Ａ＆Ｄ）と比較した、ｍＭｏ−ＤＣにおけるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６のアップレギュレーションにより分かるように、成熟カルテルに充分に反応した。しかしながら、ｍＲＮＡ電気穿孔と成熟刺激との組み合わせは、高水準のＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６発現を引き起こす（図１２、Ｅ）ので、成熟ＤＣにおいてこの組み合わせは非常に有効であると思われる。電気穿孔した凍結成熟ＤＣは、融解後、高いレベルの成熟マーカー発現を示す（図１２、Ｆ）。
【図１３】凍結保存したｍＲＮＡ電気穿孔成熟ＤＣの刺激性能。６日間の共培養中に、ＰＢＭＣの刺激因子として、凍結保存したマトリクスタンパク質Ｍ１ｍＲＮＡ電気穿孔成熟ＤＣを用いた。次に、初回刺激したＰＢＭＣを、６時間の共培養中に、ＭＨＣクラスＩ制限Ｍ１免疫優勢エピトープでパルシングしたＴ２細胞で刺激した。初回刺激したＰＢＭＣ培地における抗原特異的Ｔ細胞を、陽性ＩＦＮ−γ生成により示されるように検出した。対照として、パルシングしていないＴ２細胞を刺激因子として用い、新鮮なＰＢＭＣを反応体として用いた。結果を平均±標準誤差として示す。  ペプチドをパルシングしたＴ２細胞を用いて再刺激すると、初回刺激したＰＢＭＣ培地中の活性化Ｔ細胞が、免疫優勢マトリクスタンパク質ペプチドに対するＩＦＮ−γを生成した。この活性化の特異性は、パルシングしていないＴ２細胞に対する初回刺激ＰＢＭＣ培地のバックグラウンドＩＦＮ−γ生成によってのみ示される。これらの培養されたＰＢＭＣが６日間の培養中に刺激されたことを示すために、新鮮なＰＢＭＣを用いて同じ実験を行った。Ｔ２細胞または、ペプチドをパルシングしたＴ２細胞と共培養した後、バックグラウンド水準を越えるＩＦＮ−γ生成は検出されなかった（図１３）。
【図１４】実施例６の短期間血清非含有培養未成熟ＤＣおよびポリ−Ｉ:Ｃ−成熟ＤＣの散乱プロフィールおよび生存度の代表的フローサイトメトリー分析。  左側は、ＡＩＭ−Ｖ培地＋ＧＭ−ＣＳＦ中で２日間培養された未成熟単核細胞由来ＤＣ（ｉＭｏ−ＤＣ）。右側は、ポリ−Ｉ:Ｃ−成熟単核細胞由来ＤＣ（ｍＭｏ−ＤＣ）。上側ドットプロットは、全ての細胞の前方および側方散乱プロフィールを示す。Ｒ１ゲートは、培地中でのＤＣの割合を示す。下側のドットプロットは、培養ＤＣ中におけるエチジウムブロミド染色による致死率を示す。（上側の数は、エチジウムブロミド陽性の死んだＤＣ；下側の数は、エチジウムブロミド陰性の生きているＤＣ）。下側のドットプロットは、Ｒ１側に開いている(gated on R1)（上側パネル）。示されるデータは、ＰＢＭＣドナーＡからのものである。結果は、未成熟ＤＣについてはドナーＡ、Ｂ、ＦからのＰＢＭＣについて、および成熟ＤＣについてはドナーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦからのＰＢＭＣについての代表を表わしている。
【図１５】実施例６の短期間血清非含有培養未成熟ＤＣおよび血清非含有培養ポリ−Ｉ:Ｃ−成熟ＤＣの代表的表現型分析。  ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体のフローサイトメトリー分析は、ＤＣおよび単核細胞マーカー：ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６（左側）およびＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３（右側）に対して行われた。培養１日後にポリ−Ｉ:Ｃを添加しまたは添加せずに、ＧＭ−ＣＳＦを補足したＡＩＭ−Ｖ培地中で２日間培養後に、ＤＣを外側に開いている(outgating)残りのリンパ球で分析した。比較データを、未成熟ＤＣ（細線）および成熟ＤＣ（太線）についてヒストグラムに示す。示されたデータは、ＰＢＭＣドナーＡからのものである。結果は、未成熟ＤＣについてはドナーＡ、Ｂ、ＦからのＰＢＭＣについて、および成熟ＤＣについてはドナーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦからのＰＢＭＣについての代表を表わしている。
【図１６】実施例６の短期間血清非含有培養未成熟ＤＣおよび血清非含有培養ポリ−Ｉ:Ｃ−成熟ＤＣのアロゲニック刺激性能を示す図である。  ７日間の共培養中に、未成熟および成熟短期間培養ＤＣ（それぞれ、ｉＭｏ−ＤＣおよびｍＭｏ−ＤＣ）を、アロゲニックＰＢＭＣ用の刺激因子として用いた。その後、６時間の共培養中にＤＣドナーからのＰＢＭＣで、初回刺激ＰＢＭＣを再刺激した。初回刺激ＰＢＭＣ培地中の活性化Ｔ細胞を、標的ＰＢＭＣに対するＩＦＮ−γ生成により示されるように検出した。結果を、未成熟ＤＣ（ｉＭｏ−ＤＣ）および成熟ＤＣ（ｍＭｏ−ＤＣ）を用いて開始した培地についての２つの独立した実験の平均±標準偏差として示す。著しい相違は、アスタリスクで示す。ドナーＢおよびＣからのＰＢＭＣを用いた結果を得た。
【図１７】短期間血清非含有培養未成熟ＤＣおよび血清非含有培養ポリ−Ｉ:Ｃ−成熟ＤＣ（実施例６）の刺激性能を示す図である。  ７日間の共培養中に、インフルエンザマトリクスタンパク質Ｍ１ペプチドパルシングした未成熟および成熟ＤＣ（それぞれ、ｉＭｏ−ＤＣおよびｍＭｏ−ＤＣ）を、自己ＰＢＭＣ用の刺激因子として用いた。その後、６時間の共培養中に、ＭＨＣクラスＩ制限インフルエンザマトリクスタンパク質Ｍ１ペプチドでパルシングしたＴ２細胞（Ｔ２／Ｍ１）で、初回刺激ＰＢＭＣを再刺激した。初回刺激ＰＢＭＣ培地中の抗原特異的Ｔ細胞を、増加したＩＦＮ−γ生成により示されるように検出した。対照として、無関係ＨＰＶ  Ｅ７ペプチドをパルシングしたＴ２細胞（Ｔ２／Ｅ７）を刺激因子として用いた。著しい相違は、アスタリスクで示す。結果を、ドナーＢ（図１７Ａ、３つの実験）およびドナーＦ（図１７Ｂ、２つの実験）からのＰＢＭＣを用いて得た。
【図１８】血清非含有培養未成熟ＤＣおよび血清非含有培養ポリ−Ｉ:Ｃ−成熟ＤＣの刺激性能。インフルエンザ標的で再刺激後のＩＦＮ−γ−分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の直接染色（実施例６）。  ７日間の共培養中に、インフルエンザマトリクスタンパク質Ｍ１ペプチドパルシングした未成熟および成熟ＤＣ（それぞれ、ｉＭｏ−ＤＣおよびｍＭｏ−ＤＣ）を、ＰＢＭＣ用の刺激因子として用いた。次に、初回刺激ＰＢＭＣを、ＭＨＣクラスＩ制限インフルエンザＭ１ペプチドまたはＨＰＶ  Ｅ７対照ペプチドでパルシングしたＴ２細胞で、３時間再刺激した。ドットプロットは、ＣＤ８＋およびＣＤ８−リンパ球集団におけるＩＦＮ−γ−分泌細胞を示す。ドットプロット上に示されるＩＦＮ−γ−分泌細胞の数は、合計リンパ球の割合である。結果を、ドナーＢからのＰＢＭＣを用いて得た。
【図１９】成熟ＤＣに短期間培養されたＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ電気穿孔単核細胞の散乱プロフィール、生存度およびＥＧＦＰ発現の代表的フローサイトメトリー分析（実施例６）。  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで電気穿孔した（ＥＰ、下側ドットプロット）または電気穿孔していない（ＥＰ、上側ドットプロット）単核細胞を、ＡＩＭ−Ｖ培地＋ＧＭ−ＣＳＦ中において２日間培養した。培養２４時間後に、ポリ−Ｉ:Ｃにより成熟を誘発した。（Ａ）培養成熟ＤＣの散乱プロフィール。（Ｂ）培養成熟ＤＣのエチジウムブロミド染色。ドットプロットはＲ１の方に開いていた(gated on R1)（散乱プロフィール）。指示数は、エチジウムブロミド陰性の生きているＤＣの割合を示す。（Ｃ）非電気穿孔成熟ＤＣ（細点線）およびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ電気穿孔成熟ＤＣ（太線）のＦＬ−１  ＥＧＦＰ蛍光ヒストグラム上掛け。示したデータは、ドナーＤのＰＢＭＣからのものである。結果は、ドナーＣ、Ｄ、ＥからのＰＢＭＣを代表するものである。
【図２０】ｍＲＮＡを電気穿孔され、成熟ＤＣに短期間血清非含有培養された単核細胞の代表的表現型分析（実施例６）。  ＤＣおよび単核細胞マーカー：ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８３に対して導かれたＰＥ標識モノクローナル抗体のフローサイトメトリー分析。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで電気穿孔した（ＥＰ、下側ドットプロット）または電気穿孔していない（ＥＰ、上側ドットプロット）単核細胞を、ＡＩＭ−Ｖ培地＋ＧＭ−ＣＳＦ中において２日間培養した。培養２４時間後に、ポリ−Ｉ:Ｃにより成熟を誘発した。ヒストグラムは、アイソタイプ対照染色（点線）に対するマーカー発現（黒色上掛け）の水準を示す。示されるデータはドナーＤのＰＢＭＣからのものである。結果は、ドナーＣ、Ｄ、ＥからのＰＢＭＣを代表するものである。
【図２１】成熟ＤＣに短期間血清非含有培養されたｍＲＮＡ電気穿孔単核細胞の刺激性能（実施例６）。  インフルエンザマトリクスタンパク質ｍＲＮＡを電気穿孔した単核細胞を、ＡＩＭ−Ｖ培地＋ＧＭ−ＣＳＦ中において２日間培養した。培養２４時間後に、ポリ−Ｉ:Ｃにより成熟を誘発した。これらの成熟抗原負荷ＤＣを、７日間の共培養中、自己ＰＢＭＣ用の刺激因子として用いた。その後、６時間の共培養中に、ＭＨＣクラスＩ制限インフルエンザマトリクスタンパク質Ｍ１ペプチドでパルシングしたＴ２細胞（Ｔ２／Ｍ１）で、初回刺激ＰＢＭＣを再刺激した。初回刺激ＰＢＭＣ培地中の抗原特異的Ｔ細胞を、増加したＩＦＮ−γ生成により示されるように検出した。対照として、無関係ＨＰＶ  Ｅ７ペプチドをパルシングしたＴ２細胞（Ｔ２／Ｅ７）を刺激因子として用いた。結果を、ドナーＢからのＰＢＭＣ（Ａと表す）およびドナーＣからのＰＢＭＣ（Ｂと表す）についての３つの独立した実験の平均±標準偏差として表す。著しい相違は、アスタリスクで示す。
【図２２Ａ】２４時間および９６時間における実施例７の形質移入細胞のＥＧＦＰ分析の結果を、それぞれ、図２２ＡおよびＢに示す。９６時間後の実施例７の形質移入細胞の表現型分析（ＣＤ３４／ＣＤ４５＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１９／ＤＲ＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１４／ＣＤ３３＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ４／ＣＤ７＋細胞上に開く(gated)）を、それぞれ、図２２Ｃ〜Ｆに示す。
【図２２Ｂ】２４時間および９６時間における実施例７の形質移入細胞のＥＧＦＰ分析の結果を、それぞれ、図２２ＡおよびＢに示す。９６時間後の実施例７の形質移入細胞の表現型分析（ＣＤ３４／ＣＤ４５＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１９／ＤＲ＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１４／ＣＤ３３＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ４／ＣＤ７＋細胞上に開く(gated)）を、それぞれ、図２２Ｃ〜Ｆに示す。
【図２２Ｃ】２４時間および９６時間における実施例７の形質移入細胞のＥＧＦＰ分析の結果を、それぞれ、図２２ＡおよびＢに示す。９６時間後の実施例７の形質移入細胞の表現型分析（ＣＤ３４／ＣＤ４５＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１９／ＤＲ＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１４／ＣＤ３３＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ４／ＣＤ７＋細胞上に開く(gated)）を、それぞれ、図２２Ｃ〜Ｆに示す。
【図２２Ｄ】２４時間および９６時間における実施例７の形質移入細胞のＥＧＦＰ分析の結果を、それぞれ、図２２ＡおよびＢに示す。９６時間後の実施例７の形質移入細胞の表現型分析（ＣＤ３４／ＣＤ４５＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１９／ＤＲ＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１４／ＣＤ３３＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ４／ＣＤ７＋細胞上に開く(gated)）を、それぞれ、図２２Ｃ〜Ｆに示す。
【図２２Ｅ】２４時間および９６時間における実施例７の形質移入細胞のＥＧＦＰ分析の結果を、それぞれ、図２２ＡおよびＢに示す。９６時間後の実施例７の形質移入細胞の表現型分析（ＣＤ３４／ＣＤ４５＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１９／ＤＲ＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１４／ＣＤ３３＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ４／ＣＤ７＋細胞上に開く(gated)）を、それぞれ、図２２Ｃ〜Ｆに示す。
【図２２Ｆ】２４時間および９６時間における実施例７の形質移入細胞のＥＧＦＰ分析の結果を、それぞれ、図２２ＡおよびＢに示す。９６時間後の実施例７の形質移入細胞の表現型分析（ＣＤ３４／ＣＤ４５＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１９／ＤＲ＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ１４／ＣＤ３３＋細胞上に開く(gated)；ＣＤ４／ＣＤ７＋細胞上に開く(gated)）を、それぞれ、図２２Ｃ〜Ｆに示す。
【図２３Ａ】（Ａ）フィーダーを用いないおよび（Ｂ）フィーダーを用いる場合の、実施例８の形質移入胚幹細胞のＥＧＦＰ分析および表現型分析の結果を示す図である。
【図２３Ｂ】（Ａ）フィーダーを用いないおよび（Ｂ）フィーダーを用いる場合の、実施例８の形質移入胚幹細胞のＥＧＦＰ分析および表現型分析の結果を示す図である。
【図２４Ａ】実施例９の方法により電気穿孔したＰＢＭＣのＥＧＦＰ分析および表現型分析の結果を示す図である。
【図２４Ｂ】実施例９の方法により電気穿孔したＰＢＭＣのＥＧＦＰ分析および表現型分析の結果を示す図である。
【図２４Ｃ】実施例９の方法により電気穿孔したＰＢＭＣのＥＧＦＰ分析および表現型分析の結果を示す図である。
【図２５】μｓ範囲でのＭｏ−ＤＣへのｍＲＮＡ電気穿孔（実施例１０Ｂ）。  Ａ：電圧の形質移入効率への影響。未成熟Ｍｏ−ＤＣを、指数関数的減衰パルスを発する機械ＭＵＬＴＩＰＯＲＡＴＯＲ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて指示された電圧で５００μｓ、電気穿孔した。その直後に、ＩＬ１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２を添加することにより終末成熟を誘発した。ＦＣＭ分析により、指示された時間に、形質移入効率を決めた。破線は、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入したＭｏ−ＤＣの蛍光を示す。点線は、陰性対照を示す。図中の数値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。  Ｂ：電圧の生存度への影響。図は、プロピジウムヨージドで染色後、前述と同じＭｏ−ＤＣを示す。図中の数値は死んだ細胞を示す。
【図２６】パルス型の形質移入効率への影響（実施例１０Ｃ）を示す図である。未成熟Ｍｏ−ＤＣを、それぞれ指数関数的減衰または方形パルスを発する機械ＭＵＬＴＩＰＯＲＡＴＯＲ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＥＣＭ８３０（登録商標）（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ  ＢＴＸ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて４００Ｖで５００μｓ、電気穿孔した。その直後に、ＩＬ１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２を添加することにより終末成熟を誘発した。成熟ＤＣを同じ設定にて電気穿孔した。電気穿孔の２日後にＦＣＭ分析により、形質移入効率を決めた。破線は、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入したＤＣの蛍光を示す。点線は、ＦｌｕＭ１  ｍＲＮＡで形質移入したＤＣの蛍光を示す。図中の数値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図２７】μｓ範囲でのｍＲＮＡ電気穿孔の２日後のＭｏ−ＤＣの表現型分析（実施例１０Ｃ）。未成熟および成熟Ｍｏ−ＤＣを、図２６／実施例１０Ｃに記載のように電気穿孔した。破線は、それぞれＣＤ８３およびＣＤ２５に特異的なモノクローナル抗体で染色したＭｏ−ＤＣの赤色蛍光を示す。点線は、アイソタイプ制御を示す。図中の数値は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図２８】電気穿孔キュベット当たりの細胞数のスケールアップ（実施例１０Ｄ）。増加数の成熟Ｍｏ−ＤＣを、機械ＭＵＬＴＩＰＯＲＡＴＯＲ（登録商標）を用いて０．４ｃｍギャップキュベット中、４００Ｖで５００μｓ、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。２４時間後、形質移入効率を、ＥＧＦＰ蛍光のＦＣＭ分析により決めた。  Ａ：破線は、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入したＭｏ−ＤＣの蛍光を示す。点線は陰性対照を表す。  Ｂ：電気穿孔直後(p.e.)および２４時間後に示される細胞の回収率（％）
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の実施形態（１）の方法において、指数関数的減衰パルスを提供する従来の電気
穿孔装置を利用することが好ましい。電気穿孔が、１００〜５００Ｖ、より好ましくは２
００〜３５０Ｖ、最も好ましくは２５０〜３００Ｖで行われることがさらに好ましい。静
電容量が１００〜３００μＦ未満、好ましくは１５０〜２５０μＦであることも好ましい
。パルシング時間は、トレー（キュベット）の型およびキュベット中の反応混合物（細胞
懸濁液）の量に強く依存し、通常５０ｍｓ未満、好ましくは４０ｍｓ未満である。４ｍｍ
のキュベットおよび２００μｌの反応混合物の場合には、パルシング時間が５〜４０ｍｓ
、好ましくは１〜２５ｍｓ、最も好ましくは７〜１０ｍｓである。異なるキュベットおよ
び／または異なる量の反応混合物体積の場合、当業者により異なる電圧およびパルシング
時間を容易に決めることができる。
【００２３】
本発明の実施形態（２）において、所謂「ソフトパルス」電気穿孔装置が利用される。
そのような装置を用いる場合、３００〜６００Ｖの電圧および１００μｓ〜１ｍｓの時間
の設定が利用され、この設定は３００μＦより低い静電容量に相当すると考えられる（し
かしながら、真核細胞懸濁液の使用のために、正確な転化は不可能である）。市販のソフ
トパルス電気穿孔装置により提供されるパルス型は、矩形波パルスまたは指数関数的減衰
パルスであり得る。ソフトパルス装置用の好ましい設定は３５０〜４５０Ｖで３００〜６
００μｓである。
【００２４】
本発明の実施形態（１）および（２）において、懸濁系中の細胞の濃度は、１×１０３
〜１×１０９細胞／ｍｌ、好ましくは１×１０５〜１×１０９細胞／ｍｌである。さらに
より好ましくは１×１０５〜５×１０７細胞／ｍｌであり、最も好ましくは１〜４×１０
７細胞／ｍｌである。
【００２５】
形質移入すべき線形ポリヌクレオチドは、好ましくは所謂「裸」のポリヌクレオチド、
すなわち、リガンド等により複合されないまたは安定化されないポリヌクレオチドである
。本発明で利用される線形ポリヌクレオチドは、限定はされないが、修飾または未修飾の
限定または非限定ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドおよび、全ての種類
のその修飾変異体を含む。最も好ましい線形ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。前記Ｄ
ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、遺伝子を補修または修飾するのに特に適している（Ｓｔｅ
ｐｅｈｎｓｏｎ，Ｊ．，ＪＡＭＡ  第２８１（２）巻、１１９〜１２２頁（１９９９年）
）。さらに、形質移入すべきポリヌクレオチドの濃度が１×１０−７〜１×１０−５ｍｍ
ｏｌ／ｍｌ、好ましくは４×１０−６〜６×１０−６ｍｍｏｌ／ｍｌであることが好まし
い。
【００２６】
哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、げっ歯類（マウス、ラット）細胞）を含む脊椎動物
細胞、非脊椎動物細胞（例えば、魚および虫の細胞）、酵母、糸状菌、子嚢菌等の下等真
核細胞のような全ての型の真核細胞を、本発明の方法により電気穿孔することができる。
哺乳動物／ヒト細胞は、好ましくは、限定はさらないが、線維芽細胞および腫瘍細胞、幹
細胞および、胚幹細胞のようなそれらの誘導体を含む非造血細胞、造血幹細胞およびそれ
らの誘導体から選択され、造血細胞は、限定はされないが、単核細胞、骨髄ＣＤ３４＋前
駆体由来樹状細胞、ＣＤ３４＋前駆体由来ランゲルハンス細胞、単核細胞由来樹状細胞（
Ｍｏ−ＤＣ）を含み、および最も好ましくは、限定はされないが未成熟Ｍｏ−ＤＣおよび
成熟Ｍｏ−ＤＣを含むＭｏ−ＤＣであるが、単核細胞またはＣＤ３４＋造血前駆体細胞の
ようなＤＣ前駆体(precursor)または前駆体(progenitor)に、および胚幹細胞にも適用す
ることができる。本発明の方法は、ＲＮＡ電気穿孔による一次骨髄細胞の形質導入にも適
している（これは、全骨髄単核細胞のｍＲＮＡ電気穿孔が可能であることも示し得る）。
前記前駆体細胞は、樹状細胞に（迅速）分化する前に、関連抗原をコードするｍＲＮＡで
電気穿孔される。この手法は、印刷中のＰｏｎｓａｅｒｔｓら著、Journal of Immunolog
y  ２００２年に公開される予定である。この方法は、ＣＤ１２３＋形質細胞様(plasmacy
toid)樹状細胞または、試験管内で比較的短い半減期を有する新鮮なＣＤ１１ｃ＋血液樹
状細胞を含む他の型の前駆体樹状細胞にも価値がある。
【００２７】
実施形態（１）および（２）で用いられる線形ポリヌクレオチドは、真核細胞において
、ある効果を発現する任意の機能的ヌクレオチド配列であり得、これは、真核細胞中で発
現すべきタンパク質またはペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオ
チドは、機能または調節配列等である。真核細胞中において発現すべきタンパク質または
ペプチドは、真核細胞中において直接の機能を有しても有さなくても良い、すなわち、発
現されたタンパク質またはペプチドが、形質移入された細胞の特性を変化させ、または細
胞中で発現されるあるいは細胞により分泌されるだけである（例えば、実施形態（６）に
よるレポーター遺伝子または遺伝子産物である）。線形ポリヌクレオチドによりコードさ
れる前記タンパク質またはペプチドは、限定はされないが、腫瘍抗原、微生物抗原、ウイ
ルス抗原、免疫刺激性または寛容原性分子、抗アポトーシス分子、接着およびホーミング
分子、並びに抗原処理分子を含む。前記機能または調節配列は、限定はされないが、分化
調節遺伝子、分化関連遺伝子および組織特異的遺伝子を含む。線形ポリヌクレオチドによ
りコードされる前記タンパク質またはペプチドの例は、ＥＧＦＰ（強化グリーン蛍光タン
パク質；配列番号１および２）等のようなレポーター遺伝子；ＷＴ１（ウィルムス腫瘍１
タンパク質；配列番号３および４）、Ｅ６（ヒトパピロマウイルスＥ６タンパク質；配列
番号５および６）、Ｅ７（ヒトパピロマウイルスＥ７タンパク質；配列番号７および８）
、ｅｎｖ（ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖタンパク質；配列番号９）、ｇａｇ（ヒト免疫不
全ウイルスｇａｇタンパク質；配列番号１０）、ｔａｔ（ＷＴ）（ヒト免疫不全ウイルス
ｔａｔ（ＷＴ）タンパク質；配列番号１１）、ｔａｔ（ＳＬＴ）（ヒト免疫不全ウイルス
ｔａｔ（ＳＬＴ）タンパク質；配列番号１２）、Ｎｅｆ（ヒト免疫不全ウイルスＮｅｆタ
ンパク質；配列番号１３）、Ｒｅｆ（ヒト免疫不全ウイルスＲｅｆタンパク質；配列番号
１４）のような腫瘍／ウイルス抗原；Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ１（メラノーマ抗原Ｍｅ
ｌａｎ−Ａ；配列番号１５および１６）；ＭＡＧＥＡ１（メラノーマ抗原１；配列番号１
７および１８）；ＭＡＧＥＡ３（メラノーマ抗原３；配列番号１９および２０）等；ＧＭ
−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子；配列番号２１および２２）、ＩＬ
−２（インターロイキン２；配列番号２３および２４）等のようなサイトカイン；Ｎｋｓ
２．５（ＣＳＸ：心臓特異的ホメオボックス；配列番号２５および２６）、Ｎｏｔｃｈ（
Ｎｏｔｃｈ相同体１；配列番号２７および２８）、ＢＡＡＬＣ（脳および急性白血病、細
胞質遺伝子座；配列番号２９および３０）、Ｗｎｔ遺伝子、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＢＡ、デ
スミン、心臓トロポニン等のような幹細胞用遺伝子である。
【００２８】
電気穿孔のために、以下のパラメーターが最も好ましい：細胞懸濁液２００μｌを含む
４ｍｍキュベット、３００ボルトおよび静電容量１５０μＦを用いて細胞を刺激する（パ
ルス時間８〜１０ｍｓ）。これは、白血病Ｋ５６２細胞および異なる型のＤＣの両方、前
駆体由来および単核細胞由来ＤＣの両方のための最適パラメーターである。最適化プロセ
スにおいて、例えば電圧および静電容量並びにキュベット中の体積を変化させて、パルス
時間を短くまたは長くすることにより他のパラメーターも調べた。要約すれば、ＲＮＡ電
気穿孔の効率および毒性のために以下のパラメーターが見つけられた：
３００Ｖ−１５０μＦ〜２００μｌ−８ｍｓ
４５０Ｖ−１５０μＦ〜２００μｌ−８ｍｓ。
【００２９】
ＲＮＡ電気穿孔用の共通の要素は、細胞密度を増加させるための低静電容量（１５０〜
３００μＦ未満）（高静電容量が必要とされるＤＮＡ設定と対照的）および低電気穿孔体
積（２００μｌ）と組み合わされた低電圧（１００Ｖ〜４５０Ｖの範囲）である。
【００３０】
電気穿孔およびインキュベーションは全て室温で行われ、細胞は血清を含まない緩衝液
（例えば、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、血清低減緩衝液（例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標
））、またはＥｑｕｉＢｉｏ，Ｕ．Ｋから購入された最適化電気穿孔緩衝液Ｏｐｔｉｍｉ
ｘ（登録商標），ｃａｔ  ｎ♯  ＥＫＩＴ−Ｅ１）中に再懸濁される。電気穿孔装置型は
、指数関数的減衰パルスのみを発するＥａｓｙｊｅｃｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｅｑｕ
ｉＢｉｏ）である。実施例２〜４において、Ｇａｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（登録商標）
（Ｂｉｏｒａｄ）を用いる。さらに、実施例１０においては、所謂「ソフトパルス」電気
穿孔装置（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製のＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒおよびＧｅｎｅｔ
ｒｏｎｉｘ  ＢＴＸ製のＥＣＭ８３０）を用いる。
【００３１】
ｍＲＮＡ電気穿孔を用いて観察される毒性の著しい減少は、部分的には、ＲＮＡの導入
に必要な穏やかな電気的設定により説明することができる（表１）。それにも拘わらず、
過酷なＤＮＡ設定で行われるｍＲＮＡ電気穿孔は、細胞毒性を低下させ、これは細胞毒性
が、単に電気穿孔手順そのものに起因するのではなく、導入された核酸の性質にも関わり
得ることを意味している。さらに、プラスミド製剤においてしばしば見られるバクテリア
汚染物質（例えば、ＬＰＳ）の共導入が、細胞生活力に影響を与えることができる。（Ｇ
ｏｒｄｉｌｌｏ，Ｇ．Ｍ．ｃ著，Transpl.Immunol.，第７巻：８３〜９４頁（１９９９年
））。
【００３２】
ＤＣのＤＮＡ負荷とｍＲＮＡ負荷との比較の試行において、予想外に、ｍＲＮＡ電気穿
孔３４−ＤＣおよび３４−ＬＣではなくプラスミドＤＮＡによるＴＩＬクローンの非特異
的刺激が観察され（図６）、これは、プラスミドＤＮＡのＤＮａｓｅ  Ｉ処理により廃棄
することができた。プラスミドＤＮＡのこの刺激効果は、データ解釈を混同させるが、抗
原提示性能についてのこの現象のＤＣ負荷への影響はさらなる検討を必要とする。プラス
ミドＤＮＡ中に存在する免疫刺激配列（すなわち、非メチル化ＣｐＧモチーフ）が含まれ
る可能性を考慮しなくてはならない（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ら著、Proc.Natl.Acad.S
ci．ＵＳＡ，第９３巻：２８７９〜２８８３頁（１９９６年）；Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ
．ら著、Vaccine，第１７巻：１９〜２５頁（１９９９年））。
【００３３】
ｍＲＮＡリポフェクションは、ＤＣ、特に３４−ＤＣおよび３４−ＬＣに負荷するため
のｍＲＮＡ電気穿孔よりも全体として効率が低く、これらのデータは、カチオン性脂質、
すなわちＤＭＲＩＥ−Ｃを一つだけ用いる実験から得られた。従って、我々は、他の脂質
が、ｍＲＮＡ電気穿孔と比べて匹敵するまたはより高い、形質移入および／またはＭｏ−
ＤＣ、３４−ＬＣもしくは３４−ＤＣのＭＨＣクラスＩ制限抗原負荷の効率を達成すると
いう可能性を排除できない。受動的ｍＲＮＡパルシングを用いて、我々は、実験したＤＣ
の型によりＥＧＦＰ発現を検出できずＣＴＬ活性化も検出できなかった。従って、これら
の結果は、パルシング実験において未成熟Ｍｏ−ＤＣが形質移入剤を用いることなくｍＲ
ＮＡを取り込むことができ、続いて主要な腫瘍特異的ＣＴＬを試験管内で取り込むことが
できることを示したＮａｉｒら著、Nat.Biotechnol.，第１６巻：３６４〜３６９頁（１
９９８年）の発見にやや対照的であると思われる。Ｎａｉｒらの実験において、タンパク
質発現を検出できないので、ＤＣの受動的ＲＮＡパルシングがＤＣの実質的部分において
効果的ＲＮＡ形質転換を起こすことが可能である。
【００３４】
結論として、ＩＶＴ  ｍＲＮＡをベースとした電気穿孔が、ヒトＭｏ−ＤＣ、３４−Ｄ
Ｃおよび３４−ＬＣを腫瘍抗原で遺伝子修飾するための高度に効率的で簡単な非ウイルス
的方法であることが示される。この研究で記載された技術は、ＤＣをベースとした腫瘍ワ
クチンの開発における、および造血細胞において高水準の短期間導入遺伝子発現を必要と
する他の遺伝子転移プロトコールにおける適用に役立つことができる。
【００３５】
実施例
材料および方法
電気穿孔装置：
正常パルス：ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰＬＵＳ  Ｄ２０００モデルＳＨＶ（２２０Ｖ；指数
関数的減衰パルス）は、ＥｑｕｉＢｉｏ  Ｌｔｄ．（ｃａｔ♯  ＥＪ−００２，Ａｃｔｉ
ｏｎ  Ｃｏｕｒｔ，Ａｓｈｆｏｒｄ  Ｒｏａｄ，Ａｓｈｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，
ＴＷ１５  １×Ｂ，Ｕ．Ｋ）から購入した。ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰＬＵＳは、ＬＣＤディ
スプレイ、薄膜キーパッドおよび「スマートカード」リーダー／レコーダーを特徴とする
ベンチトップリモートコントロールユニットにより充分にマイクロプロセッサー制御され
る。ＥａｓｙｊｅｃＴプリンター（ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰＬＵＳに含まれる）を用いて、
パラメーターおよび開始したパルス値のハードコピーを取ることができる。この情報は、
実験手順の確認に価値が無く、結果に保証された情報を与え得る。ＥａｓｙｊｅｃＴ  Ｐ
ＬＵＳは、実験手順に疑いを招くことなく安全な操作を可能にするための複数の安全性お
よび操作検出特徴を含む。特徴は：プレＡｒｃ(-Pre-Arc)検出、開放回路および短絡回路
検出、充分に封止された電気穿孔チャンバーに連結されたプレパルスインピーダンス測定
を含む。プログラミングは、安全でないまたは不正確な情報が測定またはプログラムされ
た場合に、可視的かつ可聴的アラームを与える。ＥａｓｙｊｅｃＴは、単一または二重の
指数関数的減衰パルスを与えるように設計される。ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰＬＵＳは、さら
に、独自の「二重パルス」技術を有する。これは、単一パルス実験が不成功のまたは落胆
的な形質転換の結果になる特定の場合に有益である。
【００３６】
2011050395.tif 000002
ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰＬＵＳの詳細な仕様書：出力電圧：高電圧モードにおいて１００
〜３５００ボルト（５０Ｖ段階）または低電圧モードにおいて２０〜４５０ボルト（２Ｖ
段階）。分路抵抗器：２０オーム〜無限（１０値）。静電容量範囲：高電圧モードにおい
て０．５μＦ／２５μＦまたは低電圧モードにおいて１５０〜３０００μＦ。パルス時間
：１０μｓ〜７秒。パルス間時間が０〜３０ｓのＤＯＵＢＬＥ  ＰＵＬＳＥ装置。プログ
ラム保存：８内部(internal)またはスマートカードあたり８。また、アーキングが起こる
場合の、開放および短絡回路状態用の可視的かつ可聴的アラームによる安全性検出モニタ
リング。プリンターは含まれる。寸法：メインユニット（４２５×２２０×５１０ｍｍ）
、キーパッド（１００×２７０×３５ｍｍ）、チャンバー（２６０×６７×９２ｍｍ）。
出力  １９０〜２５０ボルトまたは９０〜２２０ボルト最大２５０ワット。波形：選択さ
れたコンデンサ、サンプルおよび分路抵抗器に依存するＲＣ時間定数を有する減衰指数関
数的波形。実施例２〜４において、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）を用
いた。
【００３７】
ソフトパルス：Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍ
ｂｕｒｇ，ドイツ）、指数関数的減衰パルスおよびＥＣＭ８３０（登録商標）（Ｇｅｎｅ
ｔｒｏｎｉｃｓ  ＢＴＸ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、方形パルス。
【００３８】
電気穿孔キュベット：ＥａｓｙｊｅｃＴ  ＰＬＵＳ  Ｄ２０００を用いる実験を通して
、キャップを有する滅菌４ｍｍ電気穿孔キュベット（ＥｑｕｉＢｉｏ，ＵＫ  ｃａｔ♯  
ＥＣＵ−１０４）を用いた。各キュベットを、個々に包み、ガンマ線照射した。無菌手順
をさらに向上させるために特に設計された滅菌ピペットを用いた。合計容量は８００μｌ
である。
【００３９】
電気穿孔培地：電気穿孔直前に、細胞を、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録商標）培地（Ｅｑｕｉ
Ｂｉｏ，ＵＫ  ｃａｔ♯  ＥＫＩＴ−Ｅ１）中に懸濁させた。Ｏｐｔｉｍｉｘは、真核細
胞の電気穿孔用に設計された、ＱＣ試験した充分に最適化された培地である。Ｏｐｔｉｍ
ｉｘは、形質移入効率と、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または他の標準的培養培地を超え
る生存率との両方を向上させる。Ｏｐｔｉｍｉｘの組成物を、電気穿孔プロセス中の細胞
保護を補助するために注意深く調製し、細胞を通る放電により引き起こされる不安定化に
続く再生プロセスにおいて補助となる重要な分子およびさらなる塩も提供した。Ｏｐｔｉ
ｍｉｘキットは、使用が容易であり、約２４の実験のための充分な材料を含む。キットは
周囲温度で出荷されるが、成分の一部を着きしだい４℃または−２０℃で保存することが
重要である。Ｏｐｔｉｍｉｘは、洗浄溶液１×２００ｍｌ、Ｏｐｔｉｍｉｘ４×２．５ｍ
ｌ、４×ＡＴＰおよび４×グルタチオンを含む。使用前に、ＡＴＰ５．５ｍｇおよびグル
タチオン７．７ｍｇをＯｐｔｉｍｉｘ緩衝液２．５ｍｌと混合し、−２０℃で等分して凍
結する。
【００４０】
電気パラメーター：特記しない限り、典型的ｍＲＮＡ電気穿孔設定は、３００Ｖ、１５
０μＦであり、内部分路抵抗は無限（＋∞）とする。キュベット中の合計体積は２００μ
ｌであり、Ｏｐｔｉｍｉｘ培地中に再懸濁された２〜５百万の細胞を含む。
【００４１】
電気穿孔計算：電場Ｅは以下の式を用いて平方センチメーター当たりのボルトで表す：
Ｅ＝Ｖ・ｄ−１
ここで、Ｖは電気穿孔装置の出力電圧で、ｄはキュベットの電極間の距離である。
【００４２】
2011050395.tif 000003
我々の電気穿孔技術において、ｄは常に０．４ｃｍ（４ｍｍキュベット）である。従っ
て、ＥはＶに直接関連し、下記式により計算することができる：
Ｅ＝Ｖ・（０．４）−１
パルス時間（τ）は、定義によれば、パルスの開始から、電場が最大（Ｅ０）の場合、
電場が初期値Ｅ０のｅ−１（０．３６８）まで低下するまでの秒としての経過時間である
。特に、この値は、電気穿孔ユニットのマイクロプロセッサーにより測定される。理想的
なシステムのパルス時間は、以下のように計算することができる：
τ＝Ｒ・Ｃ
ここで、Ｃは静電容量（ファラッドで表される）であり、Ｒは電気回路の抵抗である。
パルス時間は、膜孔形成プロセスの持続時間の推定を与え、キュベット中の電気穿孔培地
の体積と逆相関し、キュベット中の細胞密度および培地の抵抗と直接相関する。
【００４３】
細胞系：Ｔ２細胞（ＴＡＰ−欠損、ＨＬＡ−Ａ２＋、Ｔ×Ｂハイブリッド）、ＥＢＶ−
ＬＧ２（ＨＬＡ−Ａ２−  ＥＢＶ−形質転換Ｂリンパ球）およびＳＫ２３−ＭＥＬ（Ｍｅ
ｌａｎ−Ａ＋  ＨＬＡ−Ａ２＋  メラノーマ細胞株）は、Ｄｒ．Ｐｉｅｒｒｅ  Ｖａｎ  
ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ（Ｌｕｄｗｉｇ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，ベルギー）により快く提供された。Ｋ５６２細胞
を、ＵＳＡン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ  ｎ°  ＣＣＬ−２４３、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から得た。細胞株は、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、
ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アンホテリ
シンＢ（１．２５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）および１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ
；Ｓｅｒａ  Ｌａｂ、Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を補足したＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地（ＩＭＤＭ
）からなる完全培地中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２を補足した加湿雰囲気中にて３７
℃で対数期増殖に維持した。全ての細胞培地試薬は、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｐａｉｓｌｅ
ｙ、ＵＫ）から購入した。
【００４４】
Ｍｅｌａｎ−Ａ−特異的ＣＴＬクローン：免疫優勢ＨＬＡ−Ａ０２０１−制限Ｍｅｌａ
ｎ−Ａ２７‐３５エピトープ（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３４）を認識するＣＤ８＋
ＴＩＬ  １２３５クローンは、Ｄｒ．Ｊ．Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ，ＵＳＡ）より快く賦与され、先に記載の方法で僅かの変化を設けて培養した（Ｒ
ｅｅｖｅｓ，Ｍ．Ｅ．ら著、Cancer Res.，第５６巻：５６７２〜５６７７頁（１９９６
年））。簡単に言うと、ＴＩＬクローンを、５％貯留ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｎａ，Ｂｏｒ
ｎｅｍ，ベルギー）および５００ＩＵ／ｍｌインターロイキン（ＩＬ）−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を補足したＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇ
ｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中に維持し、ＤＣ共培養実験における反応体集合として用いた。
【００４５】
一次細胞の供給源：骨髄（ＢＭ）は、インフォームドコンセント後に、心臓手術を受け
ている血液学的に正常な患者から、胸骨穿刺により吸引した。健康ボランティアまたは血
色素症の患者から抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。この研究で用いた６人のＰＢＭＣ
ドナーを文字Ａ〜Ｆで表わす。単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント
分離（ＬＳＭ，ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）により単離した。単核細胞を直接単離し、以下に記載のようにＤＣ培養に用
いた。ＤＣ／Ｔ細胞共培養用のＰＢＭＣを、９０％ＦＣＳおよび１０％ＤＭＳＯからなる
溶液中に凍結保存し、使用まで−８０℃で貯蔵した。
【００４６】
ＣＤ＋３４細胞選別：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ分離後、単核細胞ＢＭ細胞を、Ｄ
ｒ．Ｈ−Ｊ．Ｂｕｈｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ
により快く賦与された４３Ａ１ハイブリドーマ（抗−ＣＤ３４）（Ｂｕｈｒｉｎｇ，Ｈ．
Ｊ．ら著、Leukemia，第５巻：８５４〜８６０頁（１９９１年）の上澄みを用いて間接的
に染色し、続いて、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役ウサギ抗マウス
イムノグロブリン（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）により染色した。次
に、ＣＤ３４標識細胞を、空冷アルゴンイオンレーザーＩＬＴモデル５５００−Ａ（Ｉｏ
ｎ  Ｌａｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ，ＵＳＡ
）が備えられたＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳ細胞ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，ベルギー）上で選別した。ソートウインドウを、低側部散
乱および陽性グリーン蛍光（ＣＤ３４＋）を呈する細胞を含むように設定した。９５％を
超える純度を従来通りに得た。
【００４７】
ＤＣの試験管内培養：３４−ＤＣ培地を、先に記載のように培養した（Ｌａｒｄｏｎ，
Ｆ．ら著、Immunology，第９１巻：５５３〜５５９頁（１９９７年））。簡単に言えば、
１〜２・１０５ＣＤ３４＋細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ顆粒球−マクロファージコロニー刺
激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；Ｌｅｕｃｏｍａｘ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｂａｓｅ
ｌ，スイス）、２．５ｎｇ／ｍｌ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）および５０ｎｇ／ｍ
ｌ幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｎｉｖｅｌｌｅ，ベルギー）を補足した完
全培地２ｍｌ中で５日目まで培養し；その後、ＳＣＦを１０００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｒ
＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で置き換え、これを次の５〜９日目の間に添加した。培養１２日
後、１５〜２０倍の合計細胞増殖が観察され、細胞は、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６お
よびＨＬＡ−ＤＲ（図３Ｃ）を含む成熟ＤＣの典型的マーカーを示した。
【００４８】
３４−ＬＣについて、我々はＨｅｒｂｓｔ，Ｂら著、Blood，第８８巻：２５４１〜２
５４８頁（１９９６年）により記載されたプロトコールを用いた。簡単に言えば、選別し
たＣＤ３４＋細胞を、まず、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６
および５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（全てＢｉｏｓｏｕｒｃｅ製）を含む完全培地中において
８日間培養し、続いて、ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ
／ｍｌ）中でＬＣ分化を次の４週間行った。培養２５日後、有核細胞の合計数の７５〜１
００倍増加が観察され、細胞は高水準のＣＤ１ａおよびＣＤ４０、中水準のＨＬＡ−ＤＲ
および低水準のＣＤ８０およびＣＤ８６を発現し、３７℃にて効率的にＦＩＴＣデキスト
ランを取り込むことができた（データは示さず）。
【００４９】
未成熟単核細胞由来ＤＣ（ｉＭｏ−ＤＣ）を、Ｒｏｍａｎｉ，Ｎら著、J.Exp.Med.，第
１８０巻：８３〜９３頁（１９９６年）に記載のようにＰＢＭＣから発生させた。簡単に
言えば、ＰＢＭＣを、ＡＩＭ−Ｖ培地中、３７℃で２時間接着させた。非接着性フラクシ
ョンを除去し、接着性細胞を、さらに、２．５％自家熱失活血漿を補足したＩＭＤＭ中で
５〜７日間培養した。ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／
ｍｌ）を、０日目から開始して２〜３日毎に培地に添加した。ｉＭｏ−ＤＣの成熟を、２
．５ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αおよび１００ｎｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ）を
Ｍｏ−ＤＣ培養の６日目から開始して２４時間添加することにより誘発した。
【００５０】
また、ＰＢＭＣ由来の単核細胞を、６ウエル培養プレート（２０×１０６ＰＭＢＣ／ウ
エル）においてＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｙ，ＵＫ）に３７℃で
２時間接着させた。非接着性フラクションを注意深く除去した後、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｃｏｍａｘ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｂａｓｅｌ，スイス
）を補足した血清非含有ＡＩＭ−Ｖ培地において細胞を２日間培養した。成熟ＤＣを得る
ために、ｐｏｌｙ−Ｉ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を、培養開始後２
４時間で、２５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。ＤＣ培地の典型的収率および純度は、ＤＣ
６０〜７０％を含む１〜２×１０６細胞／ウエルであった。電気穿孔実験のために、製造
者の指示に従ってＣＤ１４ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉ
ｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，ドイツ）を用いて磁気的単離することによりＰＢＭＣから単
核細胞を単離した。通常法により、純度８５％以上で、１００×１０６ＰＭＢＣから出発
した単核細胞４〜８×１０６を得た。
【００５１】
ＤＣのＨＬＡ−Ａ型別：ＢＢ７−２ハイブリドーマ（抗−ＨＬＡ−Ａ２；ＡＴＣＣ）の
上清、続いてＦＩＴＣ共役ウサギ抗マウスイムノグロブリン（ＤＡＫＯ）で間接的に染色
することによりＢＭ由来単核細胞およびＰＢＭＣにおいてＨＬＡ−Ａ２亜型別を決めた。
ＨＬＡ−Ａ２染色は、ＦＡＣＳｃａｎ分析用フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，ベルギー）を用いるフローサイトメトリーに
より分析した。
【００５２】
合成ペプチド：ＤＣおよびＴ２細胞上でそれぞれパルシングしたときのマトリックスタ
ンパク質Ｍ１ペプチド特異的Ｔ−細胞の活性化または検出のために、インフルエンザウイ
ルス−特異的ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−制限マトリックスタンパク質Ｍ１ペプチド（Ｍ１；
アミノ酸（ａａ）５８〜６６，ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号３２）を用いた。Ｔ２細胞
上でパルシングした場合の対照実験において、ヒトパピロマウイルス（ＨＰＶ）ＨＬＡ−
Ａ２−制限Ｅ７タンパク質特異的ペプチド（Ｅ７；アミノ酸（ａａ）１１〜２０，ＹＭＬ
ＤＬＱＰＥＴＴ；配列番号３３）を用いた。Ｍｅｌａｎ−Ａペプチド（ＭＡ；ａａ２７〜
３５，ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３４）も用いた。ペプチド（＞９５％純度）を、Ｓ
ｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。両方のペプチド
を、１００％ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、さらに、血清非含有ＩＭ
ＤＭ中で１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、−７０℃で分割して貯蔵した。ペプチドを、２０ｍＭ
の最終濃度で用いた。ペプチド（＞９５％純度）を、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。ペプチドを１００％ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍｌ
となるまで溶解し、さらに、血清非含有ＩＭＤＭ中で１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、−８０℃
で分割して貯蔵した。ペプチドを、２０μＭの最終濃度で用いた。
【００５３】
ＤＣのペプチドパルシング：Ｔ２細胞、ＨＬＡ−Ａ２＋ｉＭＯ−ＤＣまたはＤＣを、Ｉ
ＭＤＭで２回洗い、続いて、５ｍｌ円錐型ポリスチレン管または１５ｍｌ円錐型管におい
て、２．５μｇ／ｍｌ  β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を補足した血
清非含有ＩＭＤＭ培地中、２０μｇ／ｍｌペプチドと共に、室温で１〜２時間インキュベ
ート（２×１０６細胞／ｍｌ）した。その後、細胞を洗い、それぞれ、ＰＢＭＣ用の刺激
因子として、またはサイトカイン放出アッセイにおける再刺激因子として用いた。
【００５４】
プラスミド：プラスミドｃＤＮＡ形質移入にために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用
いて、Ｔ７プロモーターの制御下にＥＧＦＰを含んだＣＭＶプロモータープラスミドｐＧ
ＥＭ４Ｚ／ＥＧＦＰ／Ａ６４（Ｄｒ．Ｅ．Ｇｉｌｂｏａ，Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡから快く提供された）
の制御下に強化グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードした。ＣＭＶプロモーター
により促進されるＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１遺伝子を含むプラスミドｐｃＤＮＡ１．
１／Ｍｅｌａｎ−Ａは、Ｄｒ．Ｐｉｅｒｒｅ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎにより快
く提供された。ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，
ＣＡ，ＵＳＡ）を、バックボーン制御ベクターとして用いた。プラスミドｐＣＭＶ−ルシ
フェラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｏｌｏ  Ａｌｔｅｒ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）は、ＣＭＶプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を有しており、対
照プラスミドとして用いた。プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ／Ｍ１／Ａ６４（Ｄｒ．Ａ．Ｓｔｅ
ｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｅｒｌａｎｇ
ｅｎ，ドイツにより快く提供された）は、Ｔ７プロモーター（配列番号３１）の制御下の
インフルエンザＭ１遺伝子をコードしている。プラスミドを、大腸菌株ＤＨ５α（Ｇｉｂ
ｃｏ  ＢＲＬ）またはスーパーコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）において増殖させ、エンドトキシンフリーＱＩＡＧＥＮ（登録商標
）チップ５００カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で精製
した。
【００５５】
試験管内転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡの生成：試験管内転写のために、プラスミドを線状化
し、Ｇｅｎｉｅｐｒｅｐキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）またはＰ
ＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、試験管内転写反応用のＤＮＡテンプレ
ートとして用いた。Ｔ７プロモーターの制御下の試験管内転写のために、ｐｃＤＮＡ１．
１／Ｍｅｌａｎ−Ａを用いた。ｐＥＧＦＰ−Ｈ１からの０．８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎ
ｏｔＩフラグメントとして単離されたＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを、まず、ｐｃＤＮＡ１．１／
Ａｍｐ中にサブクローニングし、続いて、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてｐＳ
Ｐ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中にクローニングし、これに
よりＳＰ６プロモーターの制御下に試験管内転写を行った。転写は、ＳＰ６  Ｍｅｓｓａ
ｇｅＭａｃｈｉｎｅキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて最終的に２０〜１００μｌの反応混
合物中で３７℃で３〜４時間行い、５’ｍ７ＧｐｐｐＧキャップしたＩＶＴ  ｍＲＮＡを
発生させた。テンプレートとしてのＳｐｅ  Ｉ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｓｔ．Ｌ
ｅｏｎＲｏｔ，ドイツ）線状化プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ／ＥＧＦＰ／Ａ６４またはｐＧＥ
Ｍ４Ｚ／Ｍ１／Ａ６４を用いる転写反応を、Ｔ７  ＭｅｓｓａｇｅＭａｃｈｉｎｅキット
（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて最終２０μｌの反応混合物にお
いて３７℃で行って、５’キャップされた試験管内転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡを発生させた
。ＩＶＴ  ｍＲＮＡの精製を、製造者の指示に従って、ＤＮａｓｅ  Ｉ消化、続いてＬｉ
Ｃｌ沈降および７０％エタノール洗浄により行った。各実験において、ｍＲＮＡの少なく
とも３種類の異なるバッチを用いた。アガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により
、ｍＲＮＡの品質を調べた。ＲＮＡ濃度は、ＯＤ２６０での分光光度分析により調べた。
ＲＮＡを、−８０℃で小分割して貯蔵した（１μｇ／μｌ）。
【００５６】
細胞形質移入：電気穿孔の前に、Ｋ５６２細胞を血清非含有ＩＭＤＭで２回洗い、再懸
濁させてＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中での最終の濃度５〜１０×１０６細
胞／ｍｌとした。表現型分析（培地中のＣＤ１ａ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＤＣの存在を確認する
ために行った）後、３４−ＤＣ、３４−ＬＣおよびＭｏ−ＤＣを（特記しない限り）それ
ぞれ培養１２日、２５日および６日後に従来法により採集し、血清非含有ＩＭＤＭで２回
洗い、再懸濁してＯｐｔｉ−ＭＥＭ中での最終的濃度１０〜４０×１０６細胞／ｍｌとし
た。続いて、細胞懸濁液０．５ｍｌをＩＶＴ  ｍＲＮＡ２０μｇと混合し、Ｅａｓｙｊｅ
ｃｔ  Ｐｌｕｓ  ｄｅｖｉｃｅ（ＥｑｕｉＢｉｏ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）を用いて０．４ｃｍ
キュベット中で電気穿孔した。Ｋ５６２細胞中、ｍＲＮＡ形質移入効率へのそれらの効果
を調べるために種々の体積、静電容量および電気穿孔体積を比較した（結果項目を参照）
。ＣＤ１４ミクロビーズ単離単核細胞中へのｍＲＮＡの電気穿孔を、Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅ
ｒｌｏｏ，Ｖ．Ｐ．ら著、Blood，第９８巻：４９頁（２００１年）に記載されているよ
うに、少しの変更を施して行った。簡単に言えば、電気穿孔前に、ＣＤ１４ミクロビーズ
単離単核細胞をＯｐｔｉｍｉｘ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥｑｕｉＢｉｏ，
Ａｓｈｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，ＵＫ）で２回洗い、再懸濁してＯｐｔｉｍｉｘ電
気穿孔緩衝液（ＥｑｕｉＢｉｏ）中での最終濃度５０×１０６細胞／ｍｌとした。続いて
、細胞懸濁液０．２ｍｌをＩＶＴ  ｍＲＮＡ２０μｇと混合し、Ｅａｓｙｊｅｃｔ  Ｐｌ
ｕｓ  ｄｅｖｉｃｅ（ＥｑｕｉＢｉｏ）を用いて０．４ｃｍキュベット中、３００Ｖおよ
び１５０μＦで電気穿孔した。プラスミドＤＮＡ電気穿孔を、先に記載（Ｖａｎ  Ｔｅｎ
ｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．Ｉ．ら著、Gene Ther.，第５巻：７００〜７０７頁（１９９８年）
）のように行った。電気穿孔後、新鮮な完全培地（ＤＣ用のサイトカインを含む）を細胞
懸濁液に添加し、細胞を、５％ＣＯ２を補足した加湿雰囲気中で３７℃でさらにインキュ
ベートした。
【００５７】
ｍＲＮＡのリポフェクションを、製造者の指示（に従って少しの変化を設けて、カチオ
ン性脂質ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて行った（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌ
ｏｏ，Ｖ．Ｆ．Ｉ．ら著、Gene Ther.，第５巻：７００〜７０７頁（１９９８年））。簡
単に言えば、Ｋ５６２細胞を血清非含有ＩＭＤＭで２回洗い、再懸濁してＯｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ中での最終濃度１〜２・１０６細胞／ｍｌとした。３４−ＤＣ、３４−ＬＣおよびＭｏ
−ＤＣを、それぞれ培養１２日、２５日および６日後に採集し、血清非含有ＩＭＤＭで２
回洗い、再懸濁してＯｐｔｉ−ＭＥＭ中での最終濃度１〜２・１０６細胞／ｍｌとした。
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ２５０μｌ中に希釈したＩＶＴ  ｍＲＮＡ５μｇを、ＤＭＲＩＥ−Ｃと
混合し、また、脂質：ＲＮＡ比４：１でＯｐｔｉ−ＭＥＭ２５０μｌ中にも希釈した。Ｒ
ＮＡ−脂質複合化のために室温で５〜１５分間インキュベーションした後、リポプレック
ス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）を細胞に添加し、３７℃で２時間インキュベートした。または、
ＤＭＲＩＥ−Ｃの非存在下に、ＩＶＴ  ｍＲＮＡ５〜２０μｇを３７℃で３〜４時間、細
胞にパルシングした。プラスミドＤＮＡリポフェクションを、先に記載のように行った（
Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．Ｉ．ら著、Gene Ther.，第５巻：７００〜７０７頁
（１９９８年））。リポフェクションまたは受動的パルシング後、新鮮な完全培地（ＤＣ
用のサイトカインを含む）を各ウエルに添加した。
【００５８】
ＥＧＦＰ分析：ＥＧＦＰ形質移入細胞を、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）分析により
、形質移入２４〜４８時間後のＥＧＦＰ発現について調べた。簡単に言えば、細胞（１〜
５×１０５）を、１％ＦＣＳを補足したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で一回洗い、１％
ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを補足したＰＢＳ０．５ｍｌ中に再懸濁した。Ｆ
ＡＣＳｃａｎ分析用フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での
ＦＣＭ分析の直前に、エチジウムブロミド（ＥＢ）を最終濃度１０μｇ／ｍｌで添加して
、細胞生存度を調べた。ＤＣ培地中でのＥＧＦＰ分析のために、自家リンパ球の混在を排
除するように、大きな前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）プロフィールを示す
細胞、つまりＤＣについてゲーティングを行った。ゲーティングされたＤＣを、次に、Ｅ
ＧＦＰ発現について評価した。
【００５９】
ＤＣの免疫表現型化：先に記載（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．Ｉ．ら著、Gene
Ther.，第５巻：７００〜７０７頁（１９９８年））のように免疫表現型化を行った。以
下のモノクローナル抗体を用いた：ＣＤ１ａ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩ
ＴＣ）（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｅｒｓｅ，ベルギー
）、ＣＤ１ａ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ１４−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ、
ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
、ＣＤ４−ＰＥ、ＣＤ８０−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８０−Ｆ
ＩＴＣ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ４０−ＦＩ
ＴＣ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｚｏｅｒｓｅｌ，ベルギー）、ＣＤ８６−ＰＥ（ＰｈａｒＭ
ｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ８６−ＦＩＴＣ（Ｓｅｒｏｔｅ
ｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、ＣＤ１３−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ）、ＣＤ１４−ＦＩＴＣ（Ｂ
ｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，ベルギー）および非共役Ｃ
Ｄ８３（ＨＢ−１５クローン；Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃ
ｅ）。ＣＤ８３での免疫表現型化の後に、二次ウサギ抗−マウス（ＲＡＭ）−ＦＩＴＣ抗
体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で染色した。非反応性アイソタイプ
対応抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を対照として用いた。ＦＡＣＳｃａｎ分
析用フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのＦＣＭ分析の前
に、エチジウムブロミドを添加して、細胞生存度を調べると共に死亡細胞を分析から排除
した。ＤＣ培地中に残っているリンパ球を排除するためにもゲーティングを行った。特に
、強化グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ｍＲＮＡ電気穿孔ＤＣの免疫表現型化のため
に、以下のフィコエリスリン（ＰＥ）で標識したモノクローナル抗体を用いた：ＣＤ１ａ
−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ、ＣＤ８０−ＰＥ、ＣＤ１４−ＰＥ、ＣＤ８６−ＰＥおよび
、ＣＤ８３染色用の二次ＲＡＭ−ＰＥ抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒ
ｋ）。
【００６０】
インターフェロン（ＩＦＮ）−γ放出アッセイ：形質移入の２４時間後に、３４−ＤＣ
、３４−ＬＣおよびｉＭｏ−ＤＣを刺激因子細胞として用いた。成熟の効果を研究するた
めに、形質移入の前に、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳの存在下に、６日培養したｉＭｏ−ＤＣ
を２４時間成熟させ、形質移入の２４時間後に刺激因子として用いた。または、ｉＭｏ−
ＤＣを、培養６日目にｍＲＮＡで形質移入し、１２〜１６時間後、タンパク質発現させ、
ＴＮＦ−αおよびＬＰＳを添加して最終的ＤＣ成熟を誘発した。さらに２４時間後、成熟
形質移入Ｍｏ−ＤＣを刺激因子として用いた。一部の実験において、Ｍｅｌａｎ−Ａ、無
関係なインフルエンザＭ１ペプチドまたは無関係なヒトパピロマウイルスＥ７ペプチドで
パルシングしたｉＭｏ−ＤＣを刺激因子として用いた。刺激因子を２回洗い、１０％貯留
ヒトＡＢ血清および４０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を補足したＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁した
。反応体ＣＴＬを激しく３〜４回洗い、ＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁した。次に、ＣＴＬ（
１×１０５細胞）を、９６丸底プレート中で、刺激因子細胞（１×１０５細胞）と一緒に
３７℃で２４時間、共インキュベーションして、合計体積２００μｌとした。または、刺
激因子および反応体ＰＢＭＣを洗い、ＩＭＤＭ＋５％ｈＡＢ血清中に再懸濁した。次に、
反応体ＰＢＭＣ（１×１０５細胞）を、９６ウエル丸底プレート中で、刺激因子細胞（１
×１０４細胞）と一緒に３７℃で６時間、共インキュベーションして、合計体積１００μ
ｌとした。これらの共培地からの３つの上清サンプルを、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏ
ｓｏｕｒｃｅ，Ｎｉｖｅｌｌｅ，ベルギー）により、特異的ＩＦＮ−γ分泌について試験
した。データを基準化するために、観察された測定値の各々からバックグラウンドＩＦＮ
−γ分泌（非修飾ＤＣに晒されたＣＴＬによるＩＦＮ−γ放出として定義）を引いた。測
定値は、ＩＵ／１０５個の反応体細胞により放出されたｍｌ／２４時間として表される。
【００６１】
ＩＦＮ−γ分泌細胞アッセイ：前述のように予備刺激され培養されたＰＢＭＣ（１×１
０６細胞）を、対照としてのＭ１ペプチドまたはＥ７ペプチドでパルシングしたＴ２細胞
（１×１０５）により、２４ウエルプレート中で３時間再刺激した。次に、ＩＦＮ−γ分
泌細胞を、フローサイトメトリー式ＩＦＮ−γ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅ
ｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａ
ｄｂａｃｈ，ドイツ）により、製造者の指示に従って分析した。細胞を、ＣＤ８−ＦＩＴ
Ｃ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でも染色し、フローサイトメトリーにより、サ
ンプル当たり５×１０５個の細胞を分析した。リンパ球集合でのゲーティングにより分析
を行った。
【００６２】
アロゲニック混合リンパ球反応（ＭＬＲ）：アロゲニックＰＢＭＣの刺激のために、未
成熟および成熟ＤＣを用いた。簡単に言えば、未成熟および成熟ＤＣを、Ｔ２５培養フラ
スコにおいて、５％ヒト（ｈ）ＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）を補足したＩＭＤＭ１０ｍｌ中、
２０×１０６アロゲニックＰＢＭＣと共培養（比１：１０）した。培養４日目に、新鮮な
培地５ｍｌ（ＩＭＤＭ＋５％ｈＡＢ血清）を培地に添加した。培養７日目に、細胞を反応
性について分析した。このために、刺激したＰＢＭＣ（１×１０５細胞）を、９６ウエル
丸底プレートにおいて、ＤＣドナー（１×１０４細胞）からのＰＢＭＣで３７℃にて６時
間再刺激し、合計体積を１００μｌとした。これらの共培地からの上清サンプルを、ＩＦ
Ｎ−γ  ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｎｉｖｅｌｌｅ，ベルギー）によりＩＦＮ−
γ分泌について試験した。
【００６３】
ＭＨＣクラスＩ制限インフルエンザ特異的Ｔ細胞の誘発：ＰＢＭＣの抗原特異的刺激の
ために、Ｍ１ペプチドパルシングした未成熟ＤＣ、Ｍ１ペプチドパルシングした成熟ＤＣ
およびマトリクスタンパク質ｍＲＮＡ電気穿孔した成熟ＤＣを用いた。簡単に言えば、２
×１０６個の抗原負荷ＤＣを、Ｔ２５培養フラスコにおいて、５％ｈＡＢ血清を補足した
ＩＭＤＭ１０ｍｌ中の２０×１０６個の自家ＰＢＭＣと共培養（比１：１０）した。培養
４日目に、新鮮な培地（ＩＭＤＭ＋５％ｈＡＢ血清）５ｍｌを培地に添加した。培養７日
目に、細胞を抗原特異性について分析した。
【実施例１】
【００６４】
Ａ．Ｋ５６２細胞中へのＩＶＴ  ｍＲＮＡ形質移入の最適化：
ｍＲＮＡ電気穿孔を最適化するための予備実験において、我々は白血病Ｋ５６２細胞を
使用した。これらの細胞は、プラスミド電気穿孔により容易に形質移入可能だからである
（Ｂａｕｍ，Ｃ．ら著、Biotechniques，第１７巻：１０５８〜１０６２頁（１９９４年
））。ｍＲＮＡ形質移入効率を調べるためにＥＧＦＰレポーター遺伝子を用いた。種々の
電気穿孔設定を試験し、形質移入効率を、ＥＧＦＰ発現のＦＣＭ分析により決めた（図１
Ａ）。試験した全ての電気的設定のうち、合計キュベット体積２００μｌで静電容量１５
０μＦと電圧３００Ｖを組み合わせると、最高のＥＧＦＰ発現が得られた（表１）。
【表１】
2011050395.tif 000004
【００６５】
Ｋ５６２細胞を、電気穿孔またはリポフェクションによる材料および方法の項目に記載
のように形質移入した。細胞を、電気穿孔２４時間後に、ＥＧＦＰ発現用のＦＣＭにより
分析して形質移入効率（＝ＥＧＦＰ＋細胞％）を推定し、また、エチジウムブロミドを排
除することにより細胞生存度を分析した。結果は、各々が異なるＩＶＴ  ｍＲＮＡバッチ
を有する４つの独立した実験の平均（平均の標準誤差＜２．５％）である。
【００６６】
大部分の生存可能な細胞フラクションが、かなりの程度にＥＧＦＰを発現した。ＥＧＦ
Ｐ発現Ｋ５６２細胞の割合は、ｃＤＮＡ電気穿孔を、最適ＤＮＡ電気穿孔設定、すなわち
２６０Ｖおよび１０５０μＦで行った場合でも、プラスミドｃＤＮＡ形質移入の後よりも
ｍＲＮＡ電気穿孔の後の方が著しく高かった（図１Ａ）。さらに、最適設定におけるｍＲ
ＮＡ電気穿孔は、最適設定におけるｃＤＮＡ電気穿孔と比較して、著しく低下した細胞致
死率を示した（それぞれ、１５％対５１％）。最適脂質：核酸比（４：１と３：１）およ
びインキュベーション時間（２時間と６時間）は、それぞれＲＮＡリポフェクションおよ
びＤＮＡリポフェクションについて変化したが、ＤＭＲＩＥ−Ｃ媒介ＲＮＡおよびＤＮＡ
リポフェクションは、効率および生存度において、幾分類似した結果を示した（表１）。
【００６７】
ＲＮＡは極めて不安定であり、ＤＮＡと比べると短い半減期を有するので、我々は、ｍ
ＲＮＡ電気穿孔に続くＥＧＦＰ発現の速度論も研究した（図１Ｂ）。Ｋ５６２細胞におけ
る導入遺伝子発現は２４〜４８時間においてピークを向かえ、素早く６日後にバックグラ
ウンド水準まで低下した。
【００６８】
Ｂ．異なる型のＤＣへのＩＶＴ  ｍＲＮＡ形質移入の効率：
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下に、接着性ＰＢＭＣから、未成熟Ｍｏ−ＤＣ（ｉ
Ｍｏ−ＤＣ）を発生した。培養５〜６日後、Ｍｏ−ＤＣにＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを電気穿孔
した。最適化実験は、Ｋ５６２細胞の設定（３００Ｖ，１５０μＦ）に類似の最適設定を
示し、細胞死の最低水準と組み合わされた最大形質移入効率が得られた。ＥＧＦＰ発現の
ＦＣＭ分析は、６０％を超えるＥＧＦＰを発現するｉＭｏ−ＤＣを示した（図２Ａと表２
）。形質移入していないＭｏ−ＤＣ培地は、既に、ある程度の細胞死（５〜１０％）を示
したが、ｍＲＮＡ電気穿孔後のＭｏ−ＤＣの致死率は１５〜３０％（平均細胞致死率２２
±８％）であった。生存可能な集団についてゲーティングすると、生存可能なＭｏ−ＤＣ
の８５％が、ＥＧＦＰをある程度発現した。形質移入前のＭｏ−ＤＣのＴＮＦα＋ＬＰＳ
誘発成熟は、電気穿孔およびリポフェクション効率の著しい低下を示した（表２）。ｍＲ
ＮＡ形質移入に続くＤＣ成熟は、導入遺伝子の発現に影響を与えない（データは示さず）
。Ｍｏ−ＤＣ中へのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのリポフェクションは、効率がかなり低く（７．
５±０．５％）なり、図２Ａに示すように、ｍＲＮＡ電気穿孔よりも、細胞に対する毒性
が僅かに高かった（平均細胞致死率２８±１０％）。ＤＣのｍＲＮＡによる受動的パルシ
ングは、検出可能なＥＧＦＰ発現を示さなかった。Ｍｏ−ＤＣにおけるｍＲＮＡ発現の速
度論的分析は、電気穿孔の２４時間後に最大を示し、続いて、時間関数としてゆっくり低
下した（図２Ｂ）。ｍＲＮＡ電気穿孔の５日後、ＥＧＦＰは、Ｋ５６２細胞における導入
遺伝子発現速度（５日後にＥＧＦＰ＋細胞９％）と対照的に、実質的割合のＭｏ−ＤＣに
おいてなお検出可能（ＥＧＦＰ＋細胞３１％）であった。ｍＲＮＡ電気穿孔後の細胞生存
度のモニタリングは、時間関数として幾分安定な生存度を示した（図２Ｂ）。
【００６９】
骨髄ＣＤ３４＋前駆体由来ＤＣ（３４−ＤＣ）およびＣＤ３４＋前駆体由来ランゲルハ
ンス細胞（３４−ＬＣ）におけるｍＲＮＡ形質移入も試験した。これらのＤＣ型のそれぞ
れ７２％および５３％が、ｍＲＮＡ電気穿孔により容易に形質移入された（図２Ｃ）が、
ｍＲＮＡリポフェクションまたはｍＲＮＡパルシングによっては形質移入されなかった（
表２）。３４−ＤＣおよび３４−ＬＣの両方について生存度は常に８０％より高かった（
図２Ｃ）。表２は、異なる型のＤＣにおけるｍＲＮＡをベースとした電気穿孔、リポフェ
クションおよび受動的パルシングの効率を要約する。
【表２】
2011050395.tif 000005
【００７０】
異なる型のＤＣを、電気穿孔、リポフェクションおよび受動的パルシングを用いてＩＶ
Ｔ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで形質移入した。形質移入の１日後、ＥＧＦＰ発現をＦＣＭによ
り分析して形質移入効率（ＥＧＦＰ＋ＤＣ％）を推定した。ｉＭｏ−ＤＣ、未成熟Ｍｏ−
ＤＣ；ｍＭｏ−ＤＣ、成熟Ｍｏ−ＤＣ；３４−ＬＣ、ＣＤ３４＋前駆体由来ランゲルハン
ス細胞；３４−ＤＣ、ＣＤ３４＋前駆体由来樹状細胞。結果は、受動的パルシング、リポ
フェクションまたは電気穿孔についての少なくとも３つの独立した実験の平均±標準偏差
（ＳＤ）である；＜ＢＧ、バックグラウンド蛍光を下回るＥＧＦＰ発現。
【００７１】
ｍＲＮＡ電気穿孔ＤＣの表現型および成熟：
ＤＣは、培養または形質移入条件により容易に妨げることができる繊細な表現型を有す
るので、我々は電気穿孔ＤＣがそれぞれの表現型および、成熟ＤＣに分化する性能を保持
するかどうかＦＣＭ分析により調べた。ＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６お
よびＣＤ８３を含む特徴的ＤＣマーカーに結合するモノクローナル抗体を用いて、対照お
よびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ形質移入Ｍｏ−ＤＣを染色した。電気穿孔したＭｏ−ＤＣ共発現
ＥＧＦＰは高水準のＣＤ１ａ、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６を保持したので、ｍＲＮＡの
電気穿孔はＭｏ−ＤＣの表現型に影響を示さなかった（図３Ａ）。模擬電気穿孔（ｍＲＮ
Ａを用いない電気穿孔）が同様の結果を示した（データは示さない）。ｍＲＮＡ電気穿孔
Ｍｏ−ＤＣが成熟Ｍｏ−ＤＣに分化する性能を、ＣＤ８０およびＣＤ８３を含む成熟ＤＣ
マーカーの発現により評価した。図３Ｂは、ｍＲＮＡ電気穿孔そのものが、ＤＣ成熟を誘
発しなかったこと、しかし、成熟カクテル（ＴＮＦ−α＋ＬＰＳ）の存在下にｍＲＮＡ形
質移入未成熟Ｍｏ−ＤＣがＣＤ８３およびＣＤ８０をアップレギュレーションすることが
できたので、電気穿孔後の成熟性能が維持されたことを示している。
【００７２】
また、３４−ＤＣの表現型もｍＲＮＡ電気穿孔により影響されなかった（図３Ｃ）。Ｅ
ＧＦＰ＋３４−ＤＣ共発現ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０およびＣＤ８６。３４−Ｌ
Ｃが、未成熟ランゲルハンス様ＤＣへの類似性に匹敵する、ＣＤ８０およびＣＤ８６の低
水準を示したことを除いて、同様の発見が３４−ＬＣにおいて観察された（データは示さ
ず）。
【００７３】
Ｃ．ｍＲＮＡ形質転換ＤＣによるＭＨＣクラスＩ制限抗原提示：
Ｍｏ−ＤＣにおける形質移入効率が高い場合、我々は、どの程度に、ｍＲＮＡ形質移入
Ｍｏ−ＤＣが抗原を処理し、ＭＨＣクラスＩ制限抗原エピトープを抗原特異的ＣＴＬクロ
ーンに提示するか検討した。従って、我々は、電気穿孔、リポフェクションまたは受動的
パルシングを用いて、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１をコードしているｍＲＮＡをＨＬＡ
−Ａ２＋  Ｍｏ−ＤＣに導入した。Ｍｅｌａｎ−Ａ  ｍＲＮＡで電気穿孔またはリポフェ
クションしたＭｏ−ＤＣは、ＩＦＮ−γ分泌により判断されるようにＨＬＡ−Ａ２＋  Ｍ
ｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＴＬクローンを著しく刺激した（図４）。Ｍｅｌａｎ−Ａ  ｍＲＮ
Ａを受動的にパルシングしたＭｏ−ＤＣは、いかなるＣＴＬ刺激も起こさなかった。ＥＧ
ＦＰ  ｍＲＮＡを電気穿孔したＨＬＡ−Ａ２＋  Ｍｏ−ＤＣまたはＭｅｌａｎ−Ａ  ｍＲ
ＮＡを電気穿孔したＨＬＡ−Ａ２−  Ｍｏ−ＤＣは、ＩＦＮ−γを生成するようにＣＴＬ
クローンを刺激しなかった。免疫優勢Ｍｅｌａｎ−Ａ２７〜３５ペプチドＡＡＧＩＧＩＬ
ＴＶをパルシングしたＨＬＡ−Ａ２＋  Ｍｅｌａｎ−Ａ＋  ＳＫ２３−ＭＥＬメラノーマ
細胞およびＨＬＡ−Ａ２＋  Ｍｏ−ＤＣの両方を陽性対照として使用し、ＣＴＬクローン
によるＩＦＮ−γ生成を強度に誘発した。Ｍ１インフルエンザペプチドをパルシングした
ＨＬＡ−Ａ２＋  Ｍｏ−ＤＣは、いかなる特異的ＩＦＮ−γ生成も誘発しなかった。Ｍｅ
ｌａｎ−Ａ  ＩＶＴ  ｍＲＮＡを電気穿孔したＭｏ−ＤＣは、ｍＲＮＡリポフェクション
したＭｏ−ＤＣよりも２倍以上強力にＣＴＬクローンを刺激し（図４）、これは、二つの
遺伝子転移法間の形質移入効率の相違との関連性を示している（表２）。ｍＲＮＡ電気穿
孔の効率（表２）と他の型のＤＣにおいてＣＴＬクローンを刺激する性能（表３）とを比
較すると、形質移入効率とＣＴＬ活性化とが相関しているという観察も得られた。ＥＧＦ
Ｐ  ｍＲＮＡではなくＭｅｌａｎ  ｍＲＮＡをＨＬＡ−Ａ２＋  ３４−ＤＣおよび３４−
ＬＣに電気穿孔すると、ＣＴＬが特異的に活性化される。検出可能な形質移入水準の不存
在（表２）に従って、３４−ＤＣおよび３４−ＬＣのリポフェクションまたは、Ｍｅｌａ
ｎ−Ａ  ｍＲＮＡの全ての型のＤＣへの受動的パルシングは、バックグラウンド水準を越
えて検出可能ないかなるＩＦＮ−γも発生しなかった（表３）。
【表３】
2011050395.tif 000006
【００７４】
異なる型のＤＣに、電気穿孔、リポフェクションおよび受動的パルシングを用いてＩＶ
Ｔ  Ｍｅｌａｎ  ｍＲＮＡを形質移入した。形質移入の１日後、１０５個の形質移入ＤＣ
を、３７℃にて１０５個のＭｅｌａｎ−Ａ−特異的ＣＴＬと２４時間共培養した。その後
、上清を集め、ＩＦＮ−γ分泌を、材料および方法項目において説明されているように、
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより調べた。結果は、少なくとも５つの独立した電気穿孔の実
験と３つの独立した受動的パルシングおよびリポフェクションの実験の平均±ＳＤである
。ｉＭｏ−ＤＣ、未成熟Ｍｏ−ＤＣ；ｍＭｏ−ＤＣ、成熟Ｍｏ−ＤＣ；３４−ＬＣ、ＣＤ
３４＋前駆体由来ランゲルハンス細胞；３４−ＤＣ、ＣＤ３４＋前駆体由来ＤＣ；＜ＢＧ
、バックグラウンドを下回るＩＦＮ−γ生成。
【００７５】
Ｄ．Ｍｏ−ＤＣにおけるｍＲＮＡ負荷への成熟の効果：
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下にＰＢＭＣを５〜７日間培養して得られたＭｏ−
ＤＣは、主に、未成熟表現型を示す（Ｒｏｍａｎｉ，Ｎ．ら著、J.Immunol.Methods，第
１９６巻：１３７〜１５１頁（１９９６年））。これらの未成熟Ｍｏ−ＤＣは、環境から
大量の抗原を捕獲する際に専門に扱われる（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，Ｌａｎｚａｖｅｃ
ｃｈｉａ，Ａ．，J.Exp.Med.，第１７９巻：１１０９〜１１１８頁（１９９４年））。し
かしながら、ＣＴＬへの最適提示のために、Ｍｏ−ＤＣは、バクテリア生成物（例えば、
ＬＰＳ）、炎症性サイトカイン（例えばＴＮＦ−α）および／またはＴヘルパー細胞によ
るＣＤ４０ライゲーションにより誘発され得る成熟プロセスを経る必要がある（Ｂａｎｃ
ｈｅｒａｕ，Ｊ．，Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．Ｎａｔｕｒｅ，第３９２巻：２４５〜
２５２頁（１９９８年））。従って、成熟および負荷の配列がＭｏ−ＤＣの抗原提示性能
に影響を与えるかどうか試験するために、我々は、ｍＲＮＡ電気穿孔によりＭｅｌａｎ−
Ａを負荷したＭｏ−ＤＣが、ＬＰＳ＋ＴＮＦ−αで成熟する前および後に、ＣＴＬクロー
ンを刺激する性能を評価した。図５は、Ｍｏ−ＤＣの成熟前に電気穿孔またはリポフェク
ションによるｍＲＮＡ負荷を行った場合、最も有効なＣＴＬ活性化が得られることを明ら
かに示している。成熟がｍＲＮＡ負荷の前に生じた場合、ＴＩＬ細胞によるＩＦＮ−γ分
泌が著しく低下（図５）し、ＬＰＳおよびＴＮＦ−αで成熟された成熟Ｍｏ−ＤＣの低度
の形質移入性能と相関していると思われる（表２）。
【００７６】
Ｅ．ｃＤＮＡ負荷対ｍＲＮＡ負荷：
Ｍｏ−ＤＣと対照的に、３４−ＬＣおよび３４−ＤＣをプラスミドＤＮＡ電気穿孔によ
り形質移入することもできる（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．Ｆ．Ｉ．ら著、Gene The
r.，第５巻：７００〜７０７頁（１９９８年））。従って、我々は、プラスミドＤＮＡ形
質移入ＤＣが、抗原特異的ＣＴＬ活性化も誘発し得るかどうか評価した。Ｍｅｌａｎ−Ａ
をコードしているＩＶＴ  ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡで電気穿孔したＨＬＡ−Ａ２
＋  ３４−ＬＣを、Ｍｅｌａｎ−Ａ特異的ＣＴＬと共にインキュベートして、ＩＦＮ−γ
分泌を評価した（図６）。驚くべきことに、我々は、対照のベクター形質移入３４−ＬＣ
を用いた場合のようにＭｅｌａｎ−Ａ  ｃＤＮＡを用いて同様のＩＦＮ−γ水準を再現可
能に得、これは、非特異的ＣＴＬ刺激を意味している。二つの他の無関係なプラスミド（
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ）の形質移入は、同様の非特異的ＣＴ
Ｌ刺激となった。この現象は、擬(mock)形質移入（プラスミドＤＮＡを用いない電気穿孔
）３４−ＬＣにおいて、または電気穿孔（図６）の前にＤＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉで消化し
た場合において、決して見られない。同様の観察が、３４−ＤＣにて成された（データを
示さない）。
【実施例２】
【００７７】
電気穿孔による未成熟単核細胞由来樹状細胞（白血球搬出(leukapheresis)生成物から
発生し、臨床的適用のためのＧＭＰ条件下にＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＴＮＦα＋ＰＥＧ２
のカクテルにより成熟された）へのＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。単核細胞由来未成熟樹状
細胞（ＤＣ）は、既述のように白血球搬出(leukapheresis)生成物から得られた（Ｆｅｕ
ｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods第２４５巻：１５〜２９頁（２０００年
））。未成熟ＤＣ（ｄ６）をＲＰＭＩ中で２回洗い、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録商標）−Ｋｉ
ｔ（ＥＱＵＩＢＩＯ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ  Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．）の洗浄溶液で１回洗っ
た。ＤＣを、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録商標）培地中での最終細胞濃度を１０×１０６／ｍｌ
に調節した。次に、細胞懸濁液０．２ｍｌを、１．５ｍｌ反応管内で、試験管内転写ＥＧ
ＦＰ  ＲＮＡ２０μｇと混合した。室温で最大３分間インキュベーションした後、細胞懸
濁液を０．４ｃｍギャップ電気穿孔キュベット内に移した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｉ
Ｉ（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ，ドイツ）を用いて電圧３００Ｖおよび静電容量１５０
μＦでパルスをかけ、パルス時間７〜１０ミリ秒とした。その直後、細胞懸濁液を６ウエ
ルプレートに移した（１×１０６ＤＣ／ウエル／ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を補足した
培養培地３ｍｌ）。半数のウエルにおいて、既述のようにＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ
−αおよびＰＧＥ２を添加することにより終末成熟を誘発した（Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，
Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods第２４５巻：１５〜２９頁（２０００年））。電気穿孔の
４８時間後、ＤＣを、示されたマウスｍＡｂｓおよびＰＥ共役抗マウスＩｇで対比染色し
、続いてＦＡＣＳ分析した。結果を図７に要約する。
【００７８】
形質移入後に成熟カクテルを添加すると、より高い割合のＤＣによるＣＤ８３およびＣ
Ｄ２５の発現により示されるように、より成熟している樹状細胞の集団が得られる。これ
は、成熟ＤＣのみが生体内免疫を誘発し未成熟のものは寛容を誘発し得るので、重要であ
る（Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｍ．Ｇ．ら著、Exp.Med．第１５巻：１９３（２）頁：Ｆ５〜
９．Ｒｅｖｉｅｗ．（２００１年））。
【００７９】
単核細胞由来未成熟樹状細胞（ＤＣ）を前述のように処理し、成熟刺激の添加に続いて
、成熟形質移入ＤＣ中でのＥＧＦＰ発現の長命を調査した。ＥＧＦＰの発現は、４日後で
も、細胞の大部分において維持される。結果を図８に要約する。
【実施例３】
【００８０】
電気穿孔による単核細胞由来樹状細胞へのＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入−電圧滴定
Ａ：電圧の細胞寸法および顆粒性への影響
単核細胞由来未成熟樹状細胞（ＤＣ）を、既述のように白血球搬出(leukapheresis)生
成物から得た（Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods第２４５巻：１５
〜２９頁（２０００年））。未成熟ＤＣ（ｄ６）をＲＰＭＩ中で２回洗い、Ｏｐｔｉｍｉ
ｘ（登録商標）−Ｋｉｔ（ＥＱＵＩＢＩＯ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ  Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．）
の洗浄溶液中で１回洗った。ＤＣを、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録商標）培地中での最終細胞濃
度１０×１０６／ｍｌに調節した。次に、細胞懸濁液０．２ｍｌを、１．５ｍｌ反応管内
で、試験管内転写ＥＧＦＰ  ＲＮＡ２０μｇと一緒に混合またはそのＲＮＡを用いないで
混合した。室温で最大３分間インキュベーションした後、細胞懸濁液を０．４ｃｍギャッ
プ電気穿孔キュベット内に移した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｕ
ｎｉｃｈ，ドイツ）を用いて示された電圧および静電容量１５０μＦでパルスをかけ、パ
ルス時間７〜１０ミリ秒とした。その直後、細胞懸濁液を６ウエルプレートに移した（１
×１０６ＤＣ／ウエル／培養培地３ｍｌ）。既述のようにＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ
−αおよびＰＧＥ２を添加することにより終末成熟を誘発した（Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，
Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods第２４５巻：１５〜２９頁（２０００年））。電気穿孔の
４８時間後、ＤＣを分析した。図９Ａの輪郭プロットは、ｘ軸に前側散乱およびｙ軸に側
方散乱を示す。
【００８１】
前側および側方散乱分析を加えると、白血球搬送(leukapheresis)生成物から発生し、
電気穿孔によりＲＮＡ形質転換し、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２か
らなる成熟カクレル（Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods，第２４５
巻：１５〜２９頁（２０００年））を添加することにより充分成熟された単核細胞由来樹
状細胞について、２６０Ｖの使用が、細胞の完全性が幾分優れて保存されるので、僅かに
優れていることが示される。
【００８２】
Ｂ：電圧のＣＤ８３およびＣＤ２５への影響
未成熟ＤＣ（ｄ６）（図９Ａ参照）を、ＲＰＭＩ中で２回洗い、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録
商標）−Ｋｉｔ（ＥＱＵＩＢＩＯ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ  Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．）の洗浄溶
液中で１回洗った。ＤＣを、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録商標）培地中での最終細胞濃度１０×
１０６／ｍｌに調節した。次に、細胞懸濁液０．２ｍｌを、１．５ｍｌ反応管内で、試験
管内転写ＥＧＦＰ  ＲＮＡ２０μｇと一緒に混合またはそのＲＮＡを用いないで混合した
。室温で最大３分間インキュベーションした後、細胞懸濁液を０．４ｃｍギャップ電気穿
孔キュベット内に移した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ
，ドイツ）を用いて示された電圧および１５０μＦの静電容量でパルスをかけ、パルス時
間７〜１０ミリ秒とした。その直後、細胞懸濁液を６ウエルプレートに移した（１×１０
６ＤＣ／ウエル／培養培地３ｍｌ）。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２
を添加することにより終末成熟を誘発した。電気穿孔の４８時間後、ＤＣを、示されたマ
ウスｍＡｂｓおよびＰＥ共役抗マウスＩｇで対比染色し、続いてＦＡＣＳ分析した。結果
を図９Ｂに要約する。
【００８３】
表現型分析により、白血球搬送(leukapheresis)生成物から発生し、電気穿孔によりＲ
ＮＡ形質転換し、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２からなる成熟カクレ
ル（Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods，第２４５巻：１５〜２９頁
（２０００年））を添加することにより充分成熟された単核細胞由来樹状細胞について、
上右象限においてより多くの細胞が存在する、すなわち、ＥＧＦＰと成熟マーカーＣＤ８
３およびＣＤ２５との両方が発現されるので、２６０Ｖの使用が僅かに優れていることが
示される。
【実施例４】
【００８４】
電気穿孔による既に成熟した単核細胞由来樹状細胞（白血球搬出(leukapheresis)細胞
から発生し、臨床的適用のためのＧＭＰ条件下にＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＴＮＦα＋ＰＦ
Ｇ２のカクテルにより成熟された）へのＥＧＦＰ  ＲＮＡ形質移入。
【００８５】
Ａ：単核細胞由来未成熟樹状細胞（ＤＣ）は、既述のように白血球搬出(leukapheresis
)生成物から得られた（Ｆｅｕｅｒｓｔｅｉｎ，Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods第２４５巻
：１５〜２９頁（２０００年））。未成熟ＤＣ（ｄ６）を誘発させて、Ｆｅｕｅｒｓｔｅ
ｉｎ，Ｂ．ら著、J.Immunol.Methods，第２４５巻：１５〜２９頁（２０００年）に記載
のようにＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＰＧＥ２の添加により終末成熟させた。
成熟ＤＣに、実施例２に記載のように電気穿孔によりＥＧＦＰ−ＲＮＡを形質移入した。
【００８６】
ＴＮＦα＋ＬＰＳにより成熟されたＤＣは平均３３％のみ形質移入され、図１０Ａおよ
びＨに示される結果から、成熟単核細胞由来樹状細胞（ＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＴＮＦ−
α＋ＰＧＥ２からなる最適化成熟カクテルにより成熟）が効率的に形質移入され、ＥＧＦ
Ｐ発現を４８時間以上の試験時間維持するということができる。
【００８７】
Ｂ：成熟単核細胞由来樹状細胞（ＤＣ）を効率的に形質移入し、図１０Ｂ〜Ｇにより確
認されるように、その成熟表現型（ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＨＬＡ−
ＤＡおよびＭＨＣクラスＩの高発現）を４８時間以上の試験時間維持する。
【００８８】
形質移入後に成熟カクテルを添加すると、ＤＣのより高い割合によりＣＤ８３およびＣ
Ｄ２５の発現により示されるように、より成熟した樹状細胞の集団が得られる。これは、
成熟ＤＣのみが生体内免疫を誘発し未成熟のものは寛容を誘発し得るので、重要である（
Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｍ．Ｇ．ら著、Exp.Med．第１５巻：１９３（２）頁：Ｆ５〜９．
Ｒｅｖｉｅｗ（２０００年））。
【実施例５】
【００８９】
ｍＲＮＡ電気穿孔成熟樹状細胞は、導入遺伝子発現、表現型特性および凍結保存後の刺
激性能を維持する。
【表４】
2011050395.tif 000007
【００９０】
Ｋ５６２細胞にＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを電気穿孔し、形質移入３または２４時間後に凍結
保存した。凍結保存のために、Ｋ５６２細胞を、純ＦＣＳ中、１０×１０６／ｍｌの濃度
で凍結管（Ｎｕｎｃ  ＣｒｙｏＴｕｂｅ  Ｖｉａｌｓ，Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｅｎｍａｒｋ）内で再懸濁させた。次に、懸濁液を、氷上で
、２０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補足した等体積の
ＦＣＳと混合した。細胞懸濁液を、冷凍凍結容器Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてゆっくり（−１℃／分）と−８０℃まで凍結させた。細胞を
、さらなる実験で用いる前に、−８０℃で２４時間以上凍結させた。細胞を、凍結保存の
前後の異なる時点にＥＧＦＰ発現用にＦＣＭにより分析して、形質移入効率（＝ＥＧＦＰ
＋細胞％）およびＥＧＦＰ＋細胞の平均蛍光強度（＝ＭＦＩ  ＥＧＦＰ＋細胞）を推定し
た。死んだ細胞の数は、エチジウムブロミド染色（＝死んだ細胞％）により決めた。結果
は、平均±標準誤差として示す。
【００９１】
電気穿孔の２４時間後に凍結した培地と比較して、電気穿孔の３時間後に凍結した培地
における細胞生存率は僅かに少なかった（ｐ＝０．００２５）。細胞は、電気穿孔後に短
時間回復する必要がある。
【００９２】
電気穿孔ｍＲＮＡは、凍結保存後、なお機能的であった。電気穿孔の３時間後に凍結し
た培地において、発現されたＥＧＦＰのＭＦＩは、融解３時間後と２４時間後との間に殆
ど２倍になった（ｐ＝０．０００９）。
【表５】
2011050395.tif 000008
【００９３】
未成熟Ｍｏ−ＤＣをＥＧＦＰ  ｍＲＮＡで電気穿孔した。細胞を、形質移入の１８時間
後に未成熟ＤＣとして凍結保存する、または形質移入の２４時間後に成熟ＤＣとして凍結
保存する。成熟を、形質移入直後に成熟カクテル（ＴＮＦ−α＋ＰＧＥ２＋ＩＬ−１＋Ｉ
Ｌ−６）を添加することにより誘導した。細胞を、凍結保存の前後の異なる時点にＥＧＦ
Ｐ発現用にＦＣＭにより分析して、形質移入効率（＝ＥＧＦＰ＋細胞％）およびＥＧＦＰ
＋細胞の平均蛍光強度（＝ＭＦＩ  ＥＧＦＰ＋細胞）を推定した。死んだ細胞の数は、エ
チジウムブロミド染色（＝死んだ細胞％）により決めた。結果は、平均±標準誤差として
示す。ＥＰは電気穿孔。
【００９４】
未成熟および成熟ＤＣの非凍結対照において見られる（表５、それぞれ対照１および対
照２）ように、生存度は、この電気穿孔により時間の関数としてあまり影響されず（ｐ値
はそれぞれ０．１８４９および０．１３６２）、細胞は高水準のＥＧＦＰ（表５；図１１
Ａ＆Ｂ）を発現する。
【００９５】
電気穿孔の１８時間後に凍結した未成熟ＤＣは、融解の６時間後に凍結サイクルウエル
で生き残るようである。細胞致死率（＋１３％，ｐ＝０．０００８）の増加は小さいが、
ＥＧＦＰ発現細胞のＭＦＩは、非凍結対照ＤＣの場合（ｐ＝０．５１８５）とほぼ同様で
あった。しかしながら、融解の２４時間後、電気穿孔後４８時間培養した非凍結対照ＤＣ
と比較して、凍結培地中の細胞致死率は高水準であった（６４％対２４％，ｐ＝０．００
１７）（表２；図１１Ａ）。
【００９６】
成熟ＤＣの凍結保存のために、未成熟Ｍｏ−ＤＣを電気穿孔し、続いて、ＧＭ−ＣＳＦ
およびＩＬ−４を補足した培地中で２時間インキュベーションして、導入遺伝子の発現を
開始させた。これに続いて、ＤＣ成熟カクテルを添加し、ＥＧＦＰ発現および細胞生き残
りの水準を、形質移入の２４時間後および４８時間後に決めた。ＤＣを、ｍＲＮＡ電気穿
孔および導入遺伝子発現の２４時間後に凍結し、細胞生存率を、融解の６時間後および２
４時間後に決めた（表２、図１Ｂ）。融解の６時間後、ＤＣ培地は凍結を生き残るようで
あり、非凍結培地（ｐ値、それぞれ０．００３３および０．５１８３）と比較して、同様
の数のＥＧＦＰ＋細胞および、ＥＧＦＰ＋細胞のＭＦＩ水準を有していた。成熟ＤＣは、
凍結未成熟ＤＣよりも、融解手順を生き残った（未成熟ＤＣについて細胞致死率６４％で
あり、培養の２４時間後の成熟ＤＣについて２５％、ｐ＝０．００００４）。
【実施例６】
【００９７】
血清非含有培養プロトコールとポリ−Ｉ：Ｃ成熟刺激を組み合わせると、抹消血単核細
胞から、充分に成熟し生存力のあるＣＤ８３＋ＤＣが迅速に発生した。これは、単核細胞
のｍＲＮＡ電気穿孔に基づいて、これらの短時間培養ＤＣのための効率的かつ臨床的に適
用可能な抗原負荷手法を提供する。これらの短時間かつ血清を含まない培養Ｍｏ−ＤＣの
Ｔ細胞活性化は、インフルエンザマトリクスタンパク質Ｍ１ペプチドをパルシングしマト
リクスタンパク質ｍＲＮＡを電気穿孔したＤＣを用いるインフルエンザ抗原モデル系にお
いて高度に刺激的であると分かった。以下（対応図を含む）において、結果を、平均±標
準偏差として表す。スチューデントのｔ検定を用いて比較を確認した。ｐ値≦０．０５は
統計的に有意であると考えられる。
【００９８】
Ａ：ポリ−Ｉ：Ｃ成熟を用いるまたは用いない、短時間かつ血清を含まない試験管内培
養ＤＣの特徴付け：ＰＢＭＣから単核細胞を増やした後、ＧＭ−ＣＳＦのみを補足したＡ
ＩＭ−Ｖ培地において細胞を２日間培養した。成熟ＤＣを得るために、培養の２４時間後
にポリ−Ｉ：Ｃを添加した。培養細胞を、４８時間の合計培養期間後、フローサイトメト
リーにより分析した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を補足した血清非含有培地において６
〜７日間培養する古典的ＤＣとの観察された相違は、血清非含有培養細胞の低い前方およ
び側方散乱プロフィールであった（図１、上側パネル）。しかしながら、これは、血清非
含有またはポリ−Ｉ：Ｃ誘発致死率によるものではない。何故なら、エチジウムブロミド
染色により、８０％を超える平均生存力の細胞集団であることが示されたからである（図
１４、下側パネル）。培養の４８時間後に、免疫表現型化も行った（図１５）。培養細胞
の大部分が、ＣＤ１４発現のダウンレギュレーションを示し、特徴的単核細胞マーカーの
損失が示された。このダウンレギュレーションは、単核細胞の血清非含有培養が原因であ
る可能性が高い。何故なら、ヒトＡＢ血清（１％）をＤＣ培養培地に添加する実験条件に
おいて、ＣＤ１４のダウンレギュレーションが観察されなかったからである（データは示
さず）。ポリ−Ｉ：Ｃを用いないで培養された細胞は、ＨＬＡ−ＤＲの穏やかな発現を示
し、小さいフラクションのみが、ＣＤ８３の、および共刺激性分子ＣＤ８０およびＣＤ８
６の発現を示した。これは、典型的未成熟ＤＣ表現型に相当する。これに対して、ポリ−
Ｉ：Ｃにさらした細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３および、共刺激性分子ＣＤ８０および
ＣＤ８６の迅速なアップレギュレーションを示し、成熟ＤＣの典型的表現型に相当する。
ＣＤ１ａは、少しの割合の細胞上に存在していた（図１５）。
【００９９】
Ｂ：ポリ−Ｉ：Ｃ成熟血清非含有培養ＤＣは、試験管内Ｔ細胞免疫反応の誘発において
、その未成熟対応物質より性能が高い：新培養細胞型もＤＣの機能的特性を有しているか
決めるために、修飾アロゲニック混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、その刺激性能を
まず評価した。このために、未成熟および成熟ＤＣを、アロゲニックＰＢＭＣと共に７日
間培養した。次に、刺激されたＰＢＭＣを、ＤＣドナーからのＰＢＭＣで再刺激し、上清
中のＩＦＮ−γ分泌を、ＥＬＩＳＡにより分析した（図１６）。ＰＢＭＣ標的に対するＩ
ＦＮ−γ分泌水準に基づき、結果は、成熟ＤＣが、未成熟ＤＣよりも、アロゲニックＭＬ
Ｒ反応の誘発において、より性能が高い（未成熟ＤＣについて３．１±０．１ＩＵ／ｍｌ
／６時間で、成熟ＤＣについて２１．３±０．８ＩＵ／ｍｌ／６時間、ｐ＝０．０００４
）ことを示している。自己抗原特異的刺激性能を、インフルエンザモデル系において評価
し、ＤＣに、ＨＬＡ−Ａ２制限インフルエンザマトリクスタンパク質Ｍ１特異的ペプチド
をパルシングし、自己ＰＢＭＣと共培養した。共培養の７日後に、培養したＰＢＭＣを、
Ｍ１ペプチドまたはＥ７対照ペプチドをパルシングしたＴ２細胞で再刺激した。６時間刺
激後、上清中のＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡにより分析した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
インフルエンザＭ１標的に対するＩＦＮ−γ分泌水準に基づいて、結果は、成熟ＤＣが、
自己免疫反応の誘発において、未成熟ＤＣよりも、性能が高い（図１７Ａ、未成熟ＤＣに
ついて２．３±０．３ＩＵ／ｍｌ／６時間で、成熟ＤＣについて２２．９±３．１ＩＵ／
ｍｌ／６時間、ｐ＝０．０００６）ことを示している。この免疫反応の特異性は、インフ
ルエンザＭ１標的と比較して、対照ＨＰＶ  Ｅ７標的に対するＩＦＮ−γ生成の著しく低
い量により示された（図１７Ａ：成熟ＤＣについてｐ＝０．００７９、未成熟ＤＣについ
てｐ＝０．０４６１；図４Ｂ：成熟ＤＣについてｐ＝０．００６４）。ＩＦＮ−γがＣＤ
８＋Ｔリンパ球により生成されたことを示すために、我々は、培養したＰＢＭＣをインフ
ルエンザ（Ｔ２／Ｍ１）または対照（Ｔ２／Ｅ７）標的で再刺激した後、ＩＦＮ−γ分泌
細胞を、フローサイトメトリーにより検出するために直接染色するＩＦＮ−γ分泌アッセ
イを用いた（図１８）。フローサイトメトリー分析は、Ｍ１ペプチドをパルシングした成
熟ＤＣで最初に刺激したＰＢＭＣ培地のＣＤ８＋  Ｔ−細胞集団中で検出可能なＭ１特異
的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を示した。この免疫反応は、未成熟ＤＣで最初に刺激した培地中
では実質的に見られない。
【０１００】
Ｃ：単核細胞のｍＲＮＡ電気穿孔およびその後のＤＣへの分化：
先に最適化したｍＲＮＡ電気穿孔プロトコールを用いて、我々は、前記ＤＣの遺伝的修
飾の可能性を試した。これらの実験において、ｍＲＮＡ形質移入効率を調べるためにＥＧ
ＦＰレポーター遺伝子を用いた。最適化後、次のｍＲＮＡ電気穿孔および培養プロトコー
ルにより、抗原負荷成熟ＤＣが発生した。最初に、単核細胞を、ＣＤ１４免疫ビーズ磁気
分離によりＰＢＭＣから単離した。電気穿孔後、細胞を、ＧＭ−ＣＳＦを補足した血清非
含有ＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁した。培養の２４時間後、ポリ−Ｉ：Ｃを培地に添加して
成熟ＤＣを得た。培養したＤＣを、単核細胞の電気穿孔の４８時間後に分析した。ＤＣに
培養したＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ電気穿孔単核細胞と非電気穿孔単核細胞との間の散乱プロフ
ィールにおいて、差異は見られなかった（図１９Ａ）。ＤＣ培地中の平均電気穿孔関連致
死率は１０％であった（３つの独立した実験の平均、図１９Ｂ）。この低い細胞致死率は
、血清非含有培地条件が原因である可能性が高かった。何故なら、電気穿孔に続いて自家
血漿を添加すると、電気穿孔関連致死率が低下するからである（データは示さず）。ＥＧ
ＦＰ  ｍＲＮＡ電気穿孔短期間培養ＤＣと非電気穿孔ＤＣとにおけるＥＧＦＰ蛍光水準を
比較すると、データは、実際の全ての生存力のあるｍＲＮＡ負荷ＤＣにおいて低いが検出
可能なＥＧＦＰ発現を示す（図１９Ｃ）。培養細胞の表現型を、特徴的ＤＣマーカーのた
めのフローサイトメトリーにより試験した（図２０）。我々は、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ電気
穿孔短期間かつ血清非含有培養成熟ＤＣと非電気穿孔ＤＣとの間で表現型に差異を観察し
なかった。注目すべきことに、ＤＣが接着性単核細胞から培養される図１５に示すデータ
と比較して、ＣＤ１４＋陽性単離単核細胞から成長したＤＣにおいて、ＣＤ１４のダウン
レギュレーションがあまり観察されなかった（接着性ＰＢＭＣから発生したＣＤ１４＋Ｄ
Ｃについて１０％未満で、ＣＤ１４＋単核細胞から発生したＣＤ１４＋ＤＣについて約５
０％）。
【０１０１】
Ｄ：ｍＲＮＡ負荷短期間培養成熟ＤＣの刺激性能：
我々は、インフルエンザモデル系において、血清非含有培地中で迅速に分化して成熟Ｄ
ＣになるｍＲＮＡ電気穿孔単核細胞が、ＰＢＭＣと共培養する際に抗原特異的Ｔ細胞を刺
激し得るかどうか試験した。これらの試験において、単核細胞を、インフルエンザマトリ
クスタンパク質Ｍ１をコードしているｍＲＮＡを電気穿孔し、さらに上記のように成熟Ｄ
Ｃに培養した。次に、ＤＣを、外因性サイトカインを添加せずに、自家ＰＢＭＣと共培養
した。培養の７日後、処理したＰＢＭＣを、ＭＨＣクラスＩ制限抗原インフルエンザマト
リクスタンパク質Ｍ１ペプチドをパルシングしたＴ２細胞（Ｔ２／Ｍ１）で再刺激し、Ｉ
ＦＮ−γ分泌を６時間後にＥＬＩＳＡにより決めた（図２１）。ペプチドパルシングした
Ｔ２細胞で再刺激したときに、処理したＰＢＭＣ培地中の活性化Ｔ細胞が、免疫優勢Ｍ１
マトリクスタンパク質ペプチドに対するＩＦＮ−γを生成した。この活性化の特異性は、
ＨＰＶ  Ｅ７ペプチドパルシングしたＴ２細胞に対する処理ＰＢＭＣ培地のバックグラウ
ンドＩＦＮ−γ生成のみにより示された（Ｔ２／Ｍ１対Ｔ２／Ｅ７、図８Ａ：ｐ＝０．０
００２、図８Ｂ：ｐ＜０．０００１）。
【０１０２】
検討：
この研究の最初の部分において、我々はＭｏ−ＤＣのための選択的培養プロトコールを
記載している。この血清非含有培養およびポリ−Ｉ：Ｃ成熟プロトコールは、充分に成熟
し生存力があり高度に刺激的なＣＤ８３＋ＤＣを迅速に発生させた。観察された表現型特
性（図１５）は、短時間の血清非含有培養ＤＣのための同様のＤＣ培養プロトコールにつ
いてのＣｚｅｒｎｉｅｃｋｉらによる以前の報告データに一致している（Ｃｚｅｒｎｉｅ
ｃｋｉ，Ｂ．Ｊ．ら著、２００１年．Diverse functional Activity of CD83+monocyte-d
erived dendritic cells and implications for cancer vaccines. Crit.Rev.Immunol．
第２１巻：１５７頁）。接着性単核細胞から培養されたＤＣ（図１５，１０％未満のＣＤ
１４＋細胞）と磁気ビーズ単離単核細胞から培養されたＤＣ（図２０，約５０％ＣＤ１４
＋細胞）との間のＣＤ１４ダウンレギュレーションにおける観察された相違は、同様にＣ
Ｄ１４選択手順に起因され、例えば、Ｂ−、Ｔ−およびＮＫ−細胞の消耗によるＣＤ１４
＋細胞の陰性選択とＣＤ１４＋細胞の陽性選択とを比較することにより更なる検討が提供
される。同様の観察が、接着性ＰＢＭＣから成長した従来のＤＣをＣＤ１４陽性選択によ
り選別された単核細胞から発生したＤＣと比較したＣａｖａｎａｇｈらにより既に報告さ
れている（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｌ．Ｌ．ら著、１９９８年．Proleferation in monocyte-
derived dendritic cell cultures is caused by progenitor cells capable of myeloid
differentiation.Blood．第９２巻：１５９８頁）。未成熟ＤＣと比べて、ＨＬＡ−ＤＲ
、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３のアップレギュレーションにより見られる、提示さ
れた短期間培養ＤＣの比較的迅速な成熟は、先の報告によれば、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容
体３を介するポリ−Ｉ：Ｃシグナリングが原因である（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ，Ｌ．ら
著、２００１年．Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-KB by To
ll-like Receptor3.Nature第４１３巻：７３２頁）。このシグナリング経路は、ＤＣによ
るＩＦＮ−α生成を誘発（Ｃｅｌｌａ，Ｍ．ら著、１９９９年．Maturation,Activation,
and Protection of dendritic cells induced by double-stranded RNA.J.Exp.Med.第１
８９巻：８２１頁）し、これは、強力な成熟刺激として作用することができる。さらに、
ＩＦＮ−αのようなＩ型インターフェロンは、ＬＩ−１５生成を誘発し、このようにして
、Ｔヘルパー１反応を強度に促進することができ、これは強力なＣＤ８＋Ｔ細胞反応の誘
発に必要である（Ｓａｎｔｉｎｉ，Ｓ．Ｍ．ら著、２０００年．TypeI Interferon as a 
powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity i
n vitro and in Hu-PBL-SCID mice. J.Exp.Med.第１０巻：１７７７頁；Ｓａｉｋｈ，Ｋ
．Ｕ．ら著、２００１年．IL-15-induced conversion of monocytes to mature dendriti
c cells. Clin.Exp.Immunol.第１２６巻：４４７頁）。これは、アロゲニックＴ細胞刺激
性能および自己Ｔ細胞刺激性能の両方において未成熟ＤＣと成熟短期間培養ＤＣを比較し
たときに観察される相違の説明となり得る。これらのデータは、インフルエンザ特異的メ
モリーＴ細胞を活性化するために成熟ＤＣが必要とされることを記載しているＢｈａｒｄ
ｗａｊらの最近の実験も確認している（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．ら著、２０００年．Requir
ement of mature dendritic cells for efficient activation of influenza A-specific
memory CD8+T cells.J.Immunol.第１６５巻：１１８２頁）。
【０１０３】
この研究の第２の部分は、これらの短期間血清非含有培養ＤＣの遺伝的修飾に焦点を合
わせている。先に、我々は、血清およびＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下に培養されたＤ
Ｃ中へのｍＲＮＡの電気穿孔に基づく抗原負荷手法を開発した。この形質移入技術により
、ＥＧＦＰレポーター遺伝子を用いてＭｏ−ＤＣ中に導入遺伝子を高水準で発現させた。
形質移入細胞の７０％以上が、高水準のＥＧＦＰ発現を示し（フローサイトメトリーによ
り測定して、１０２〜１０３の相対的蛍光）、形質移入後にその表現型特性を維持した（
Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．ら著、２００１年．Highly efficient gene delivery b
y mRNA electroporation in human hematopoietic cells:Superiority to lipofection a
nd passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor anti
gen loading of dendritic cells.Blood.第９８巻：４９頁；Ｐｏｎｓａｅｒｔｓ，Ｐ．
ら著、２００２年．mRNA-electroporated mature dendritic cells retain transgene ex
pressin,phenotypical properties and stimulatory capacity after cryopreservation.
Leukemia(印刷中)）。しかし、この研究において示される、短期間血清非含有培養ＤＣの
形質移入用のこの技術を用いて、形質移入細胞において実質的細胞致死率を得た（データ
は示さず）。ＤＣワクチンは、効果的になるために、高度のＤＣ生存力を有さなくてはな
らないので、我々は、その後に迅速にＤＣに分化される新しい単核細胞を形質移入しよう
とした。図１９のデータにより示されるように、細胞生存力は高く、抗原は、この手法を
用いる場合、実質的に全ての細胞において初期電気穿孔の２日後に、ＤＣ中でなお検出可
能であった。注目すべきことに、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下に血清中で培養さ
れたＤＣの電気穿孔に関する以前の結果（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｖ．ら著、２００
１年．Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoie
tic cells:Superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electrop
oration of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood.第９
８巻：４９頁；Ｐｏｎｓａｅｒｔｓ，Ｐ．ら著、２００２年．mRNA electroporated matu
re dendritic cells retain transgene expression,phenotypical properties and stimu
latory capacity after cryopreservation. Leukemia(印刷中)）と比べて、タンパク質発
現、例えばＥＧＦＰの水準が、２４時間後（データを示さず）および４８時間後（図１９
ｃ）に単核細胞においてかなり低かった。ＥＧＦＰ−ｍＲＮＡで電気穿孔し続いて成熟Ｄ
Ｃに分化した単核細胞は、非電気穿孔対照ＤＣと比較して、ＥＧＦＰ蛍光の小さなシフト
しか示さなかった。これは、一次非培養単核細胞においてタンパク質高発現水準を得る際
の困難さにより説明することができる（データは示さず）。しかしながら、ＤＣ中での高
水準の抗原発現が、より強力な免疫反応の誘発に必須であるという総意は未だ得られてい
ない。ここで、我々は、これら短期間培養ＤＣにおける抗原発現の低い水準にも拘わらず
、インフルエンザモデル系における特定の免疫反応を非常に効率的に開始することができ
るという機能的証拠を提供する。我々の研究室における以前の実験（Ｐｏｎｓａｅｒｔｓ
，Ｐ．ら著、２００２年．mRNA-electroporated mature dendritic cells retain transg
ene expressin,phenotypical properties and stimulatory capacity after cryopreserv
ation. Leukemia(印刷中))は、インフルエンザマトリクスタンパク質ｍＲＮＡ電気穿孔し
た従来のＤＣ、すなわち、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を補足した血清含有培地において
６〜７日間培養され、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２、ＩＬ−１およびＩＬ−６からなるカクテル
で成熟させたＤＣの刺激性能に焦点を合わせていた。自己インフルエンザ特異的Ｔ細胞活
性化の点において最終的結果を比較すると、抗原ｍＲＮＡ負荷従来ＤＣおよび短期間培養
ＤＣは同様の結果を与え、このプロトコールの妥当性が示された。
【０１０４】
結論として、抹消血単核細胞のこの組み合わされた血清非含有培養とポリ−Ｉ：Ｃ成熟
（および任意のｍＲＮＡ電気穿孔）が、充分に成熟した生存力があり高度に刺激性のＣＤ
８３＋ＤＣを迅速に発生させた。この生体外プロトコールにより、時間が重大に短くなり
、古典的培養プロトコールと比べて成熟ＤＣの調製に用いることができる。これは、実験
室的実験に重要であるのみならず、臨床的免疫治療プロトコールにおいても重要である。
【実施例７】
【０１０５】
成人骨髄のｍＲＮＡ電気穿孔
合計細胞：二千万ＮＣ
ＥＰパラメーター：３００Ｖ、１５０μＦ（ｍＲＮＡ設定）または２６０Ｖ、１０５０
μＦ（ＤＮＡ設定）
細胞を、ＩＭＤＭ中で２回洗い、電気穿孔洗浄緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ
ｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）中で１回洗い、Ｏｐｔｉｍｉｘ培地中、５百万細胞／２０
０μｌで再懸濁した。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ２０μｇを、電気穿孔直前に細胞に添加した。
ＤＮＡ設定を用いた場合、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録商標）３００μｌを細胞に添加した（合
計体積５００μｌ）。ショック後、細胞を直ちに、ＩＬ−３、ＩＬ−６および幹細胞因子
を補足した暖かい培養培地（ＩＭＤＭ，ＦＣＳ１０％）３ｍｌに入れた。ＥＧＦＰ分析は
２４〜９６時間目に、表現型分析はＦＡＣＳにより９６時間目に行った。結果を表６に要
約する。
【表６】
2011050395.tif 000009
【０１０６】
この実験は、本発明のｍＲＮＡ電気穿孔技術が、ヒト骨髄単核細胞を効率２５〜３０％
まで形質移入することができることを示している。骨髄フラクション（ＣＤ３３＋細胞）
において、特に単核細胞フラクション（ＣＤ１４＋細胞）、および造血幹細胞を含む造血
前駆体フラクション（ＣＤ３４＋細胞）において、高度のＥＧＦＰ発現が観察された。リ
ンパ球フラクション（ＣＤ７＋およびＣＤ１９＋細胞）において、低いが矛盾のない形質
移入水準が観察され、抹消血において得られたデータに一致していた（図２２Ａ〜Ｅ参照
）。
【実施例８】
【０１０７】
マウス胎児幹細胞のｍＲＮＡ電気穿孔
合計細胞：千五百万ＥＳ細胞
ＥＳパラメーター：３００Ｖ，１５０μＦ（ｍＲＮＡ設定）
五百万のＥＳ細胞を１０／６に融解し、ゼラチンコートした７５ｃｍ２フラスコ内の培
地に入れ、三百万のマイトマイシンＣ処理マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細
胞で４８時間処理した。次に、ＥＳ細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ中で３回洗い、電
気穿孔洗浄緩衝液中で１回洗い、Ｏｐｔｉｍｉｘ培地中に七百五十万細胞／２００μｌで
再懸濁した。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ２０μｇまたはＲＮａｓｅ非含有水（擬（mock））２０
μｌを、電気穿孔の直前に細胞に添加した。ショック後、細胞を直ちに、百万ＭＥＦフィ
ーダー細胞をＥＳ細胞培地８ｍｌに添加してまたは添加しないで、ゼラチンコートした２
５ｃｍ２フラスコ内に入れた（ＤＭＥＭ，ＦＢＳ１５％，グルタミン，ソディウムピルベ
ート，ＮＥＡＡ，β−ＭＥおよび抗生物質）。ＥＧＦＰ蛍光を、ＥＰの２４時間後に蛍光
顕微鏡検査により調べ、同時にＥＧＦＰおよび表現型分析を、ＥＰの４８時間後にＦＡＣ
Ｓにより行った（結果を、図２３ＡおよびＢに示す）。
【０１０８】
この実験により、本発明のｍＲＮＡ電気穿孔技術が、マウス胚幹（ＥＳ）細胞を効率９
０％を超える水準まで形質移入することができることが示され、マウスＥＳ細胞をおよび
おそらくヒトＥＳ細胞をも一時的に遺伝的に修飾する有効な手段が示されている。このこ
とは、マスター調節遺伝子の導入遺伝子発現によりＥＳ細胞の分化を制御するのに有用で
あり得、分化を、試験管内で分化した細胞および組織の大規模発生のための異なる系統に
ゆがめさせ、または偏向させる。
【実施例９】
【０１０９】
成人末梢血のｍＲＮＡ電気穿孔
合計細胞：千万ＮＣ
ＥＳパラメーター：３００Ｖ，１５０μＦ（ｍＲＮＡ設定）
新鮮なＰＢＭＣを、ＩＭＤＭ中で２回洗い、電気穿孔洗浄緩衝液中で１回洗い、Ｏｐｔ
ｉｍｉｘ培地中に五百万細胞／２００μｌで再懸濁した。
【０１１０】
ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ２０μｇまたはＲＮａｓｅ非含有水（擬(mock)）２０μｌを、電気
穿孔の直前に細胞に添加した。ショック後、細胞を直ちに、暖かい培養培地（ＩＭＤＭ、
１０％ＦＣＳ）３ｍｌ中に入れた。同時にＥＧＦＰおよび表現型分析を、２４時間後にＦ
ＡＣＳにより行った（結果を、図２４Ａ〜Ｃに示す）。
【０１１１】
この実験により、本発明のｍＲＮＡ電気穿孔技術が、ヒト末梢血単核細胞を効率４％ま
で形質移入することができることが示される。低いが矛盾のない形質移入水準が、主に、
単核細胞フラクション（ＣＤ１４＋細胞）において観察され、Ｔリンパ球（ＣＤ３＋細胞
）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞において低い程度に観察された。Ｂ細胞（ＣＤ１
９＋細胞）は、現行の電気穿孔パラメーターを用いて形質移入することができず、この型
の細胞のさらなる最適化を保証する。
【実施例１０】
【０１１２】
Ａ：μｓ範囲でのｍＲＮＡの電気穿孔（ソフトパルス；通常法）：未成熟（ｄ６）また
は成熟（ｄ７）Ｍｏ−ＤＣを、それぞれＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（登録商標）または洗浄溶液Ｏ
ｐｔｉｍｉｘ（登録商標）で１回洗った。細胞を、電気穿孔緩衝液（Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ（
登録商標）、Ｏｐｔｉｍｉｘ（登録商標）または、Ｉｓｏｏｓｏｍｏｌａｒ電気穿孔緩衝
液）中、１〜４×１０７／ｍｌの最終細胞濃度に調節した。次に、細胞懸濁液０．２〜０
．８ｍｌを、１．５ｍｌ反応管内で、ＩＶＴ  ｍＲＮＡ（〜２０μｇ／２×１０６細胞）
と混合した。室温で最大３分間インキュベーションした後、細胞懸濁液を０．４ｃｍギャ
ップ電気穿孔キュベット内に移した。Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅ
ｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）またはＥＣＭ８３０（登録商標）（Ｇｅｎｅｔｒ
ｏｎｉｃｓ  ＢＴＸ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて電圧４００およびパ
ルス時間５００μｓで細胞を刺激した。その直後、細胞懸濁液を６ウエルプレートに移し
た（１×１０６ＤＣ／ウエル／ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を補足した培養培地３ｍｌ）
。未成熟ＤＣの場合、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２を添加すること
により終末成熟を誘発した。ＦＣＭ分析を、２４〜９６時間の範囲に行った。通常の設定
を表７に要約する。
【表７】
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【０１１３】
Ｂ：μｓ範囲での電気穿孔によるＭｏ−ＤＣへのｍＲＮＡ形質移入、電圧の形質移入効
率および生存度への影響：
Ｍｏ−ＤＣの９０％以上が、電圧４００Ｖおよびパルス時間５００μｓを用いるＥＧＦ
Ｐ＋であった（図２５Ａ）。電圧をさらに上げると、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加によ
り示されるように、導入遺伝子の発現を増加させた。速度論的分析は、電気穿孔の９６時
間後でも、ＭＦＩが僅かにしか低下しなかったことを示した。細胞生存度をプロピジウム
ヨージド(propidium jodide)で決めると、電圧の上昇は、死んだ細胞の割合を僅かにしか
増加させなかったことが示された（図２５Ｂ）。電気穿孔の９６時間後でも電圧６００Ｖ
を用いると、死んだ細胞の量は僅かに約１６％である。
【０１１４】
Ｃ：パルス型の形質移入効率および表現型への影響：
指数関数的減衰または方形パルスを発する二つの電気穿孔機を比較すると、パルスの型
が、Ｍｏ−ＤＣの電気穿孔を未成熟段階で行なう場合に形質移入効率に影響がないことが
示された（図２６）。指数関数的減衰パルスと比較すると、方形パルスの発信は、電気穿
孔を成熟ＤＣで行う場合、導入遺伝子の発現を高めた。表現型ＦＣＭ−分析は、Ｍｏ−Ｄ
Ｃをその未成熟段階で電気穿孔し、続いて成熟カクテルＩＬ−１β＋ＩＬ−６＋ＴＮＦ−
ａ＋ＰＧＥ２を添加すると、成熟Ｍｏ−ＤＣの電気穿孔と比べて導入遺伝子の発現を高め
たことを示した（図２７）。この効果は、初期（ＣＤ８３）に、および成熟Ｍｏ−ＤＣの
晩期に現れる（ＣＤ２５）表面抗原について示される。
【０１１５】
Ｄ：電気穿孔キュベット当たりの細胞数のスケールアップ：効率的に電気穿孔し得るキ
ュベット当たりの最大細胞数を決めるために、スケールアップ実験を行った。細胞懸濁液
の体積を増加させると、導入遺伝子の発現が僅かに増加した（図２８Ａ）。効率的電気穿
孔は、０．４ｃｍギャップキュベットの最大体積０．８ｍｌを用いて、３２×１０６Ｍｏ
−ＤＣまで可能であった。電気穿孔直後の細胞数の計算は、６０％を超える回収率を示し
た（図２８Ｂ）。２４時間の培養時間後でも、失われた細胞は少量であった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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