(57)【要約】      （修正有）【課題】パラスポリン-2（PS2）の受容体がHep27タンパク質と同定され、PS2の受容体は細胞膜結合型でありうる。また、PS2とHep27タンパク質からなる複合体、Hep27に対する抗体を含む医薬組成物、Hep27を用いた医薬候補化合物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】基礎的生物研究分野、パラスポリン-2により処置可能な疾患又は状態の診断、治療、及び医薬品の開発の分野で有用であり、より具体的には、がん診断、がん治療技術、及び抗がん剤の開発のために用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（a）、（b）、（c）又は（d）に記載のタンパク質とパラスポリン-2（PS2）との複合体：
（a）配列番号：1、3、5、7又は9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（b）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した配列からなり、かつPS2結合活性を有するタンパク質；
（c）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と少なくとも88％以上の同一性を有する配列からなり、かつPS2結合活性を有するタンパク質；
（d）配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の細胞膜型変異体であって、PS2結合活性を有するタンパク質
【請求項２】
細胞表面に存在している請求項1に定義したタンパク質を検出する工程を含む、調節不能に増殖可能な細胞を検出する方法（但し医療行為を除く。）。
【請求項３】
以下の(1)、(2)、(3)又は(4)の工程を含む、医薬候補化合物のスクリーニング方法（但しヒト個体での実施を除く。）：
(1) 候補化合物と請求項1に定義されたタンパク質との結合の有無又は程度を検出する工程；
(2) PS2感受性細胞に対して候補化合物を投与し、該細胞における請求項1に定義したタンパク質の発現の有無又は程度を検出する工程；
(3) PS2感受性細胞に対して候補化合物を投与し、請求項1に定義したタンパク質の、該細胞膜における存在の有無又は程度を検出する工程。
(4) PS2感受性細胞に対して請求項1に定義したタンパク質に結合可能な候補化合物を投与し、該細胞に対する障害活性の有無又は程度を検出する工程。
【請求項４】
請求項1に定義したタンパク質に対する抗体、及び医薬として許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項５】
下記（e）、（f）、（g）又は(h）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターの利用により形質転換された、動物細胞（但しヒト個体を除く。）：
（e）配列番号：1、3、5、7又は9に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（f）配列番号：2、4、6、8又は10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（g）配列番号：2に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつPS2結合活性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（h）配列番号：2に記載のヌクレオチド配列と少なくとも88％以上の同一性を有する配列からなり、かつPS2結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項5に定義されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを用いることを特徴とする、動物細胞においてPS2に対する感受性を高める方法（但しヒト個体での実施を除く。）。
【請求項７】
PS2結合活性を有する、請求項1に定義したタンパク質の細胞膜型変異体。
【請求項８】
PS2の全部又は配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との結合活性を有する一部を含む、PS2感受性細胞へ医薬を送達する方法。
【請求項９】
PS2の全部もしくは配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との結合活性を有する一部、又は配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の全部もしくはPS2との結合活性を有するその一部である作用部へ、試料を供給して、作用部と結合する物質を分離する工程を含む、物質の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝がん細胞等に対して毒性を示す、パラスポリン-2の受容体に関する。本発明は、基礎的生物研究分野、パラスポリン-2により処置可能な疾患又は状態の診断、治療、及び医薬品の開発の分野で有用であり、より具体的には、がん診断、がん治療技術、及び抗がん剤の開発のために用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
土壌などに偏在する微生物Bacillus thuringiensis（Bt菌）は、1901年に蚕の卒倒病の病原微生物として日本で発見された。その後、Bt菌体内に結晶状に蓄積されているタンパク質が病原毒素であり、特定の昆虫のみに殺虫活性を示し、人畜や環境に影響を与えないことが明らかとなった。現在、世界各地のBt菌株から数百種類におよぶ殺虫性毒素タンパク質遺伝子が報告され、その一部は遺伝子組み換え技術により作物の形質転換に利用され、主にアメリカ大陸、中国等で実用化されている。さらに最近では、病原媒介昆虫（例えばウイルスなどを媒介する蚊等）の駆除といった、公衆衛生の分野において応用研究がされている（非特許文献1）。
【０００３】
一方、非殺虫性のBt菌株もタンパク質を細胞内に凝集し蓄積しており、このようなタンパク質の様々な生物資料への活性が検討された。そして、あるBt菌株の蓄積タンパク質がヒト由来のがん細胞に対して特異的な毒性を示すことが発見され、「パラスポリン」と命名された。現在までに、大別すると4種類のパラスポリン（パラスポリン-1〜-4）が見つかっている。本発明者らは、パラスポリン-2（略称：PS2）の遺伝子を発見し、その活性型と細胞作用を報告した（非特許文献2及び3、特許文献1）。
【０００４】
PS2は肝がん由来のHepG2細胞に激烈に作用し、細胞膜マイクロドメインである脂質ラフトに結合の後、毒素自己集合化を引き起こすとともに、細胞膜のバリアを破壊することにより細胞死を引き起こすことが判ってきた（非特許文献5）。また、本発明者らにより、PS2が機能するためには、脂質ラフトのGPIアンカー型タンパク質が必要であることも分かってきた（非特許文献6）。
【０００５】
一方、HepG2細胞の核タンパク質として知られるHep27は、そのcDNAの解析からショートチェーン酸化還元酵素のファミリー（SDR family）に分類され、HepG2細胞の酪酸処理によっておこる細胞増殖停止を活性化すること（非特許文献7）、選択的スプライシングの可能性（非特許文献8）、肝臓など限られた器官・組織に存在すること、細胞内では核と細胞質とに発現が認められたこと（非特許文献9）が報告されてきた。また、KU812細胞で抗がん剤Depsipeptideに耐性を示すものではHep27遺伝子の大幅な発現低下が観察されたこと（非特許文献10）、Hep27がNADPH依存型ジカルボニル還元酵素であること（非特許文献11）、Hep27遺伝子のヒト小型細胞における発現（非特許文献12）、Hep27の子宮内膜がん細胞（ECC）における特異的な増加、及び細胞への酸化ストレスによる抗アポトーシス効果に関与している可能性（非特許文献13）が報告されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2004-129608号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D. R., and Dean, D. H. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 775-806 (1998)
【非特許文献２】Ito, A., Sasaguri, Y., Kitada, S., Kusaka, Y., Kuwano, K., Masutomi, K., Mizuki, E., Akao, T., and Ohba, M.; J. Biol. Chem. 279, 21282-21286 (2004)
【非特許文献３】Kitada, S., Abe, Y., Shimada, H., Kusaka, K., Matsuo, M., Katayama, H., Okumura, S., Akao, T., Mizuki, E., Kuge, O., Sasaguri, Y., Ohba, M., and Ito A.; J. Biol. Chem. 281, 26350-26360 (2006)
【非特許文献４】Katayama, H., Kusaka, Y., Yokota, H., Akao, T., Kojima, M., Nakamura, O., Mekada, E., and Mizuki, E.; J Biol Chem. 282, 7742-7752 (2007)
【非特許文献５】Abe, Y., Shimada, Y., and Kitada, S.; J. Biochem. 143, 269-275 (2008)
【非特許文献６】Kitada S, Abe Y, Maeda T, Shimada H.; Toxicology. Epub 2009 Jul 29. PubMed PMID: 19646502（2009 Oct 1;264(1-2):80-88刊行予定）
【非特許文献７】Gabrielli F, Donadel G, Bensi G, Heguy A, Melli M. Eur J Biochem., 232(2), 473-477 (1995)
【非特許文献８】Heinz S, Krause SW, Gabrielli F, Wagner HM, Andreesen R, Rehli M.; Genomics., 79(4), 608-615
【非特許文献９】Pellegrini S, Censini S, Guidotti S, Iacopetti P, Rocchi M, Bianchi M, Covacci A, Gabrielli F.; Biochim Biophys Acta., 1574(3), 215-222 (2002)
【非特許文献１０】Yamada H, Arakawa Y, Saito S, Agawa M, Kano Y, Horiguchi-Yamada J.; Leuk Res., 723-734 (2006)
【非特許文献１１】Shafqat N, Shafqat J, Eissner G, Marschall HU, Tryggvason K, Eriksson U, Gabrielli F, Lardy H, Jornvall H, Oppermann U.; Cell Mol Life Sci., 1205-1213 (2006)
【非特許文献１２】Petropavlovskaia M, Bodnar CA, Behie LA, Rosenberg L.; Exp Cell Res., 313(5), 931-42 (2007)
【非特許文献１３】Monge M, Colas E, Doll A, Gil-Moreno A, Castellvi J, Diaz B, Gonzalez M, Lopez-Lopez R, Xercavins J, Carreras R, Alameda F, Canals F, Gabrielli F, Reventos J, Abal M.; Carcinogenesis., 1288-1297 (2009)
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、上述したように、PS2の機能発揮には脂質ラフトのGPIアンカー型タンパク質が必要であることを見出したが、それだけでは細胞特異性決定には充分でないことを突き止めた。真の受容体は別に存在していると考え、鋭意研究した結果、PS2に結合可能なタンパク質としてHepG2細胞膜からHep27タンパク質を同定した。本発明は、以下を提供する。
1）下記（a）、（b）、（c）又は（d）に記載のタンパク質とパラスポリン-2（PS2）との複合体：
（a）配列番号：1、3、5、7又は9に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（b）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加した配列からなり、かつPS2結合活性を有するタンパク質；
（c）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と高い（例えば、少なくとも88％の）同一性を有する配列からなり、かつPS2結合活性を有するタンパク質；
（d）配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の細胞膜型変異体であって、PS2結合活性を有するタンパク質。
2）細胞表面に存在している上記1）に定義したタンパク質を検出する工程を含む、調節不能に増殖可能な細胞を検出する方法（但し医療行為を除く。）。
3）以下の(1)、(2)、(3)又は（4）の工程を含む、医薬候補化合物のスクリーニング方法（但しヒト個体での実施を除く。）：
(1) 候補化合物と上記1）に定義したタンパク質との結合の有無又は程度を検出する工程；
(2) PS2感受性細胞に対して候補化合物を投与し、該細胞における請求項1に定義したタンパク質の発現の有無又は程度を検出する工程；
(3) PS2感受性細胞に対して候補化合物を投与し、請求項1に定義したタンパク質の、該細胞の表面への移送の抑制の有無又は存在又は程度を検出する工程；
(4) PS2感受性細胞に対して請求項1に定義したタンパク質に結合可能な候補化合物を投与し、該細胞に対する障害活性の有無又は程度を検出する工程。
4）請求項1に定義したタンパク質に対する抗体、及び医薬として許容可能な担体を含む、医薬組成物。
5）下記（e）、（f）、（g）又は(h）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクターの利用により形質転換された、動物細胞（但しヒト個体を除く。）：
（e）配列番号：1、3、5、7又は9に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（f）配列番号：2、4、6、8又は10に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（g）配列番号：2に記載のヌクレオチド配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつPS2結合活性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（h）配列番号：2に記載のヌクレオチド配列と高い（例えば、少なくとも88％の）同一性を有する配列からなり、かつPS2結合活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
6）上記5）に定義されたポリヌクレオチドを含む組換えベクターを用いることを特徴とする、動物細胞においてPS2に対する感受性を高める方法（但しヒト個体での実施を除く。）。
7）PS2結合活性を有する、上記1）に定義したタンパク質の細胞膜型変異体。
8）PS2の全部又は配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との結合活性を有する一部を含む、PS2感受性細胞へ医薬を送達する方法。
9）PS2の全部もしくは配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との結合活性を有する一部、又は配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の全部もしくはPS2との結合活性を有するその一部である作用部へ、試料を供給して、作用部と結合する物質を分離する工程を含む、物質の調製方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】PS2に結合する肝がん細胞由来の27kDaタンパク質。パネルAではPS2に依存して27kDaタンパク質が共沈降する。パネルBではHepG2細胞に対して27kDaタンパク質が結合してくる。
【図２Ａ】PS2結合タンパク質（Hep27)のアミノ酸配列。HepG2細胞から分離されたPS2に結合するタンパク質の一次構造。構造上Hep27タンパク質と呼ばれる、酸化還元酵素ファミリーに分類されている。
【図２Ｂ】各生物種間におけるHep27 isoform1のアミノ酸配列の比較。黒い影は同一アミノ酸、灰色の影は類似アミノ酸を示す。
【図３】PS2は膜に存在するHep27と結合する。パネルAでは細胞質画分（Cyto)ではなく膜画分（Mem)から27kDaタンパク質（Hep27)がPS2と共沈降する。パネルBではMem画分から結合した27kDaタンパク質が抗Hep27抗体と反応する。
【図４】Hep27タンパク質はヒト肝がん由来のHepG2に存在する。HepG2ではHep27抗体で反応する27kDaのバンドが検出できるが、ヒト子宮頸がん由来HeLa細胞ではほとんど発現が認められない。
【図５】HepG2細胞におけるHep27タンパク質の局在。Triton X-100（+）では細胞膜に孔が開くため抗体が細胞内部に侵入できる。このため細胞内のHep27が網目状にネットワークを作って見える。一方Triton X-100（-）では細胞膜は障害が少なく、抗体は進入できない。よって細胞表面の抗原のみと反応する。全体に染色が見られるため、細胞膜にもHep27抗原が存在する可能性が高い。
【図６】Hep27発現抑制細胞株におけるHep27タンパク質の発現。各細胞株でHep27バンドの強度/GAPDHバンドの強度を求め、コントロールベクター導入株（C)を100％とした相対値で示した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明により、上記（a）、（b）、（c）又は（d）に記載のタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」ということがある。）とPS2とからなる複合体、及び本発明のタンパク質の新規な機能に基づく用途が提供される。
【００１１】
また、本発明により、上記（e）、（f）、（g）又は(h）に記載のポリヌクレオチドの新規な用途が提供される。
本明細書の配列表には、配列番号：1として、ヒト(Homo sapience)由来のHep27_isoform1（dehydrogenase/reductase member 2）のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_878912.1）が示されている。また、Hep27_isoform1対応する各種動物由来のアミノ酸配列として、配列番号3としてサル(Macaca mulatta)由来のもの、配列番号：5としてマウス(Mus musculus)由来のもの、配列番号：7としてラット(Rattus norvegicus)由来のもの、及び配列番号：9としてニワトリ(Gallus gallus)由来のものが示されている。
【００１２】
本明細書の配列表には、配列番号：2として、Hep27_isoform1のオープンリーディングフレーム（ORF）の遺伝子配列（NCBI Reference Sequence: NM_182908.4）が示されている。また、Hep27_isoform1遺伝子対応する各種動物由来のヌクレオチド配列として、配列番号：4としてサル由来のもの（NCBI Reference Sequence: XM_001109672.1）、配列番号：6としてマウス由来のもの（NCBI Reference Sequence: NM_027790.2）、配列番号：8としてラット由来のもの（NCBI Reference Sequence: XM_001055104.1）、及び配列番号：10としてニワトリ由来のもの（NCBI Reference Sequence: XM_423910.2）が示されている。
【００１３】
本発明において、上記（b）、（c）又は（d）によって定義されるタンパク質は、SP2との結合活性を有する。
本発明で「SP2」というときは、特に記載した場合を除き、Bacillus thuringiensisが産生するパラスポリン-2の不活性型（「不活性形態」、「前駆体」ということもある。）、すなわち前掲特許文献1の配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質を特定の処理に供することにより一部が切断されて得られる活性型（「活性形態」ということもある。）、すなわち同文献の配列番号：4からなるタンパク質をいう。
【００１４】
活性型であるPS2は、特定の細胞を特異的に認識し（細胞膜にある本発明のタンパク質に結合し）、細胞障害活性を示す。PS2が特異的に認識し、障害を与える細胞には、脊椎動物由来の細胞、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、等）に由来する細胞が含まれる。ヒト細胞の例として、T細胞（例えば、正常T細胞、白血病T細胞（好ましくはMOLT−4及びJurkat細胞）、前骨髄性白血病細胞（好ましくはHL60細胞））、子宮細胞（好ましくは、子宮頸癌（Hela）細胞を除く子宮癌細胞及び子宮由来の正常平滑筋細胞、より好ましくはSawano細胞及びUtSMC細胞）、肝細胞（好ましくは肝癌細胞、より好ましくはHepG2細胞）、肺細胞（好ましくは正常胎児繊維芽細胞、より好ましくはMRC−5細胞）、及び結腸細胞（好ましくは結腸腺癌細胞、より好ましくはCACO−2細胞）が挙げられる。また、ヒト以外の哺乳動物の細胞の例として、マウス由来の繊維芽細胞（好ましくはNIH3T3細胞）を挙げることができる。
【００１５】
一方、不活性型は細胞への毒性は極めて低く、Hep27とほとんど結合しないと考えられる。不活性型は、通常、細胞作用の過程で活性型となることはない。不活性型のPS2は、Bacillusthuringiensis A1547株（受託番号FERM  P-19046；独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1）に寄託されている。原寄託日平成14年9月26日。）に由来するタンパク質である。
【００１６】
活性型のSP2は、精製した不活性型に人為的にプロテアーゼKを作用させることにより調製することができる。このための手法として、前掲特許文献1を参考にすることができる。現在、活性型PS2の大量精製系も確立している（前掲非特許文献3）。
【００１７】
本発明において「PS2との結合活性を有する」とは、PS2と結合することができることをいい、例えば、免疫沈降アッセイ又は表面プラズモン共鳴（SPR）法を用いた相互作用解析（例えばBIAcoreなど）により確認し、判断することができる。これらの手法は当業者にはよく知られている。あるタンパク質がPS2結合活性を有するか否かの判断に際しては、配列番号：1のアミノ酸配列を有するタンパク質を指標にしてもよい。それと同程度（例えば、その50％以上、好ましくは75％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上）か、それ以上のPS2結合能を有する場合に、PS2結合活性を有すると期待することができる。PS2結合活性を有するか否かは、PS2との実際の結合の有無又は程度の確認、判断に代えて、PS2が受容体へ結合することにより発揮されるPS2の細胞障害活性を、当業者にはよく知られたMTT法等によって確認し、評価することによってもよい。「細胞障害活性」とは、特定の細胞を特異的に破壊する能力である。
【００１８】
本発明者らにより、PS2と結合し、その受容体として機能可能なタンパク質はHep27 isoform1と同定された。Hep27 isoform1は、全長300アミノ酸残基からなり、その遺伝子のORFは全長903bpである。Hep27には、isoform2も存在することが分かっている。Hep27 isoform2は、Hep27isoform1のORFの676から686番の塩基が欠失し、フレームシフトを起こした分子種であり、塩基の欠失の前までのアミノ酸配列は同一であるが、それ以降は異なる、全長280アミノ酸残基からなり、そのORFは全長844bpである。Hep27タンパク質はショートチェーン酸化還元酵素のファミリー（SDR family）に分類されるが、これまでSP2と関連づけられた生理機能は一切明らかになっていなかった。また、細胞内では主に核、細胞質に存在するタンパク質として知られており、細胞膜での局在に言及した報告はない。
【００１９】
本発明者らの検討によると、SP2結合性のタンパク質は、HepG2細胞の膜画分から効率的に回収された（実施例及び図3参照）。細胞膜の透過性を高めるTriton-X100を加えなくても、間接蛍光抗体法によりHep27陽性の蛍光を検出することができた（実施例及び図5）。このような実験結果から、細胞膜型のHep27の存在が支持される。
【００２０】
細胞膜型のHep27は、Hep27のmRNA選択的スプライシングによってHep27変異体として生合成され、PS2受容体として機能している可能性がある。本発明者らの予備的な検討によると、Hep27遺伝子の5’,3’の非翻訳領域配列のプライマーでRT-PCRを実施したところ、さまざまな長さのHep27を一部コードしたポリヌクレオチドが得られた。このことは細胞種によるスプライシングの違いで、細胞膜型Hep27が存在する可能性を支持する。あるいは、Hep27は、もともと一定量、細胞内小胞に存在し、通常これが細胞表面と細胞内でリサイクル又は分解され、細胞膜にはほとんど存在しないが、サイトカインなどによる刺激やがん化の過程でリサイクル・分解のバランスが崩れ、細胞表面に多く存在するようになってPS2受容体として機能している可能性がある。本発明者らの検討によると、PS2の機能発揮には、GPIアンカー型タンパク質が必要である。Hep27にGPIアンカー型が存在する可能性も示唆される。
【００２１】
したがって、本発明により、膜結合型のHep27変異体、より具体的には、配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の細胞膜型変異体であって、PS2結合活性を有するタンパク質が提供されうる。このような変異体は、それ自体新規なものでありうる。本発明でHep27タンパク質に関し、「細胞膜型」というときは、細胞膜に存在するものをいう。細胞膜型であることは、細胞膜画分から精製可能なことによって確認でき、またラベル化した抗体を用いて細胞膜上の存在を可視化することによっても確認できる。
【００２２】
本発明のタンパク質は、天然のタンパク質として、また組み換えタンパク質として調製することが可能である。天然のタンパク質は、例えば、HepG2等の本発明のタンパク質を発現することが分かっている細胞から得られ、また組み換えタンパク質は、例えば、後述するように本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現したタンパク質を精製することにより調製することができる。
【００２３】
細胞膜結合型である本発明のタンパク質の分離・精製方法は、例えば、本発明のタンパク質を含む膜分画から得る。膜分画は、例えば、適当な細胞を培養し、これをバッファーに懸濁後、ホモジナイズし、遠心分離することにより得られる。このような膜画分においては、できるだけ緩和な可溶化剤(例えば、CHAPS、 Triton X-100、ジキトニン）を用いることにより、本発明のタンパク質をPS2受容体の特性を保持したまま可溶化することができる。可溶化した後、タンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー (ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、後述するような抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せにより、本発明のタンパク質を精製することができる。なお、このような手法は、当業者によく知られている。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００２４】
本発明でアミノ酸配列に関し、「1若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列を有するタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、1〜9個又は1〜4個程度であるか、性質の似たアミノ酸配列との置換であれば、さらに多くの個数の置換がありうる。このようなアミノ酸配列に係るタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。
【００２５】
本発明でアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性に関し、「高い」というときは、いずれの場合にも、少なくとも45％、好ましくは60％、より好ましくは80％、さらに好ましくは85％、さらに好ましくは88％、さらに好ましくは90％、さらに好ましくは95％、さらに好ましくは98％の同一性を有することをいう。ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性（相同性ということもある）に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズム又はプログラムにより行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができる。例えば、市販のソフトウェアGENETYX（MAC版ver12.2.0)の初期設定での解析が推奨される
本発明でポリヌクレオチドに関し、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズし」というときの、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、1xSSC、0.1% SDS、37℃に相当する程度であり、より厳しい条件としては0.5xSSC、0.1% SDS、42℃に相当する程度であり、さらに厳しい条件としては0.2xSSC、 0.1% SDS、65℃に相当する程度である。このようなSSC濃度、SDS濃度及び温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の条件又は他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等)を適宜組み合わせることにより、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２６】
本発明はまた、本発明のタンパク質とSP2とからなる複合体を提供する。このような複合体は、適当な細胞に対してSP2を供与することにより形成され得、また本発明のタンパク質とSP2とを本明細書の記載に従ってそれぞれ調整して、両者を混合することによっても得られうる。複合体は、PS2により処置可能な疾患又は状態の診断、治療、及び医薬品の開発の分野、及びがんの基礎的研究分野で有用であり、がん診断、がん治療技術、及び抗がん剤の開発のために用いうる。
【００２７】
本発明はまた、上記（e）、（f）、（g）又は(h）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びその利用により形質転換された、動物細胞（但しヒト個体を除く。）を提供する。本発明のベクターとしては、挿入したポリヌクレオチドを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene 社製)等が好ましい。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生体個体内でタンパク質を発現するベクターであれば特に制限されない。脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、プロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有してもよい。発現ベクターの例としては、pSV2dhfr、pEF-BOS、pCEP4等を挙げることができる。また培養細胞であればpME18S-FL3ベクター、生物個体であればpME18Sベクターを用いることができる。ベクターへの本発明のポリヌクレオチドの挿入は、常法により制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。ベクターが導入される宿主細胞としても特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。発現ベクターは DEAE-デキストラン法、リン酸カルシウム−DNA 共沈殿法、FuGENE6(Boeringer Mannheim社)を用いた方法、及び電気パスル穿孔法等により宿主細胞に取り込ませることができ、所望の形質転換細胞を得ることができる。
【００２８】
本発明における望ましい形質転換細胞は、細胞膜に本発明のタンパク質を発現する。したがってこの形質転換細胞にSP2を作用させると、形質転換細胞にはSP2の刺激に対する応答が観察されうる。本発明のベクターは、動物細胞においてPS2に対する感受性（PS2により破壊される性質）を付与する又は高めるために使用することができる。このようにベクターにより形質転換された細胞は、後に述べる医薬候補化合物のスクリーニングに用いることができる。本発明による形質転換体は、常法に従い培養することができる。培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。
【００２９】
本発明はまた、臨床上有効量の本発明のタンパク質に対する抗体、及び医薬として許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。本発明に用いられる抗体の形態には特に制限はなく、すべてのクラスの抗体が含まれる。また、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体又は抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。ヒトの治療の目的で用いる場合には、免疫原性が少ない点で、ヒト抗体又はヒト化抗体が好ましい。抗体の調製は、当業者に周知の方法により行うことができる。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、Hep27に関連した疾患又は状態の処置のために、より具体的には、PS2感受性であるがん、好ましくはヒト肝がん及びヒト大腸がんの処置のために用いることができる。また、Hep27は、ヒト肝臓に代表される特定の正常組織でも一定量が発現しているようであるので、本発明の医薬組成物は、このような組織に関連した疾患又は状態、例えば肝炎や肝硬変を処置するためにも用いうる可能性がある。本明細書で疾患又は状態に関連し、「処置」というときは、少なくとも、その対象疾患等の、発症の予防（発症リスクの低減を含む。）、治療（対処的治療及び根源的治療を含む。）、及び進行の緩和又は停止を含む。
【００３１】
本発明の医薬組成物の有効成分である抗体の臨床上の有効量は、当業者であれば、治療対象疾患、投与する対象の状態、年齢、体重等に応じ、適宜設計することができる。本発明の医薬組成物は、医薬品の調剤又は製造の際に通常用いられる医薬として許容可能な担体（希釈剤、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、溶解又は溶解補助剤、賦形剤、その他の添加剤を含む。）を含む。医薬組成物の投与経路は特に限定されず、経口的に又は非経口的に投与されうる。剤形は投与経路に応じて適宜設計することができ、注射剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、経口用液剤等でありうる。
【００３２】
なお、本発明のタンパク質に対する抗体は、上述の医薬組成物において有効成分として用いる以外に、Hep27の検出、局在化、発現異常、局在化異常、構造の異常を検出する他ためにも利用可能である。
【００３３】
本発明はまた、調節不能に増殖可能な細胞（好ましくはがん化した細胞、より好ましくはPS2感受性であるがん化細胞、さらに好ましくはヒト肝がん細胞及びヒト大腸がん細胞）を検出又は処置する方法を提供する。本発明の方法においては、細胞表面に存在している本発明のタンパク質を検出する工程を含む。細胞膜部分における存在は、上述したように、細胞膜画分から精製可能なことによって確認でき、また標識化した抗体、PS2の全部又は配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との結合活性を有する一部を用いて細胞膜上の存在を可視化することによっても確認できる。
【００３４】
本発明により、PS2感受性である調節不能に増殖可能な細胞の処置が可能である。このような処置は、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、達成される。発現抑制のための手法は当業者には種々知られており、例えば、本発明のヌクレオチドの全部又は一部に相当するshRNA発現ベクターを細胞に導入することによる。
【００３５】
本発明はまた、医薬候補化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、Hep27に関連した疾患又は状態の処置のための、より具体的には、PS2感受性であるがん、好ましくはヒト肝がん及びヒト大腸がんの処置のための医薬候補化合物の選択のために用いることができる。また、Hep27は、ヒト肝臓に代表される特定の正常組織でも一定量が発現しているようであるので、本発明のスクリーニング方法は、このような組織に関連した疾患又は状態、例えば肝炎や肝硬変を処置するための医薬候補化合物の選択にも用いうる可能性がある。
【００３６】
本発明のスクリーニング方法は、(1) 候補化合物と本発明のタンパク質との結合の有無又は程度を検出する工程；(2) PS2感受性細胞に対して候補化合物を投与し、該細胞における請求項1に定義したタンパク質の発現の有無又は程度を検出する工程；(3) PS2感受性細胞に対して候補化合物を投与し、請求項1に定義したタンパク質の、該細胞の表面への移送の抑制の有無又は存在又は程度を検出する工程；又は(4) PS2感受性細胞に対して請求項1に定義したタンパク質に結合可能な候補化合物を投与し、該細胞に対する障害活性の有無又は程度を検出する工程を含む。
【００３７】
例えば、上記（1）は、具体的には、本発明のタンパク質である配列番号：1のアミノ酸配列からなるタンパク質、すなわちHep27を安定発現する細胞（例えばHepG2細胞）の膜画分を含む液に、一定濃度の候補化合物と標識化したをPS2を添加し、その一方で総結合量、非特異的結合量を示す対照を調製し、HepG2へのPS2の結合を用量依存的に、好ましくは極低濃度で阻害する候補化合物を選択することにより、実施することができる。
【００３８】
本発明はまた、PS2の全部又はHep27タンパク質との結合活性を有する一部を含む、PS2感受性細胞を標的としたドラッグデリバリーシステムへの応用が期待できる。例えば、医薬を含むリポソームにPS2の配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との結合部位を連結すれば、PS2感受性細胞特異的に医薬を送達可能であろう。
【００３９】
本発明はまた、PS2やその受容体として機能可能なHep27タンパク質の、全部又は一部として利用して、試料からのそれぞれへ結合可能な物質の検出、分離、精製、又は濃縮への応用が期待できる。利用可能なPS2の一部は、具体的には、配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質との結合活性を有する一部である。利用可能なHep27の一部は、具体的には、配列番号：1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の一部であって、PS2との結合活性を有するものである。試料の例は、例えば、天然物、合成物、細胞培養液、細胞抽出物、細胞破砕物、体液（血液、尿等）である。作用部は、固体の担体に固定されていてもよい。作用部を固定化た担体は、試薬、キット、試験紙、センサー、フィルター、クロマトグラフィー用カラムとすることができる。
【実施例】
【００４０】
［方法］
1. PS2結合タンパク質の同定
PS2は、Kitada等の方法で精製した（前掲非特許文献3）。抗PS2ポリクローナル抗体はウサギにPS2を免疫し、その血清から得た。
【００４１】
抗PS2抗体ビーズは、次のようにして作製した。活性基を付加したアガロース粒子（Protein A agarose Fast Flow, SIGMA）に0.3mgの抗PS2抗体を加え、25℃で1時間反応した。上清を除去し、アガロースビーズを2回洗浄し、20mM 架橋剤dimethylsuberimidateを加え25℃で30分間反応させた。次にビーズをエタノールアミンで処理し、遊離の活性基を修飾した。上清を除去し、ビーズに等量のPBS〔0.02% NaN3〕を加え、抗PS2抗体ビーズを得た（4℃保存）。
【００４２】
細胞（Hela又はHepG2）をホモジナイザーで破砕し、1,000g、4℃、10分間遠心分離を行った。上清と沈殿を分離し、この上清を100,000g、4℃、10分間遠心分離を行い、沈殿から膜画分を単離した。細胞（Hela又はHepG2）あるいはその1μgタンパク質量/mlの単離膜画分に、1μg/mlのPS2を加え、4℃で1時間程度結合反応させた。遠心分離によって結合していないPS2を分離したのち、細胞は界面活性剤（30mM オクチルグルコシド）により4℃で可溶化した。この可溶化試料（1μgタンパク質量/ml）に対し、50%抗PS2抗体ビーズ液を加え、4℃で数時間から一晩反応させた。2,400g、4℃、10分間の遠心分離により抗PS2抗体ビーズを回収し、20mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP-40,1mg/ml BSAで3回、20mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% NP-40で2回、PBSで3回、ビーズを洗い、非特異的な結合タンパク質を解離させた。得られた試料はPS2未添加やコントロール抗体での沈降物とともに、SDS電気泳動と銀染色又はクーマシーブリリアントブルー染色で、PS2特異的な結合タンパク質（27kDa）を検出した。
【００４３】
PS2結合タンパク質のバンドを切り取り、タンパク質を抽出し、LC/MS-MSでの解析を依頼した。得られた結果から結合タンパク質としてHep27を同定した。Hep27タンパク質の遺伝子を単離し、遺伝子発現ベクターにクローニングした。Hep27に対するRNAiはステルス社製のHep27標的shRNAベクターシリーズを購入して行った。免疫ブロットによるタンパク質は通常の方法で行い、イタリアのピサ大学ガブリオーレ博士から抗Hep27抗体を分与していただいた。
【００４４】
2. PS2結合タンパク質と抗Hep27抗体との交差反応の確認
Molecular Cloning Third Edition  Appendix 8 40-55の方法で免疫ブロットを行い、2次抗体はHRP修飾ヤギ抗マウスIgG〔Sigma〕、化学発光試薬〔Millipore〕で交差反応をバンドとして検出した。
【００４５】
3. 膜画分からのPS2結合タンパク質の抽出
HepG2細胞をPBSで2回リンスした後、培養シャーレからスクレイパーにより約1x106個の細胞回収し、ホモジナイズによって細胞を破砕した。これを1,000g、4℃、10分間遠心分離を行った。上清と沈殿を分離し、この上清を100,000g、4℃、10分間遠心分離を行い、沈殿を得た。この沈殿をPBSに再分散し、27Gの注射針に10回程度繰り返し通し、膜を十分に分散させた。これに最終濃度5μg/mlのPS2を加え、氷上で30分間インキュベーションした。これを100,000g、4℃、30分間遠心分離を行い、沈殿を回収、沈殿をPBSで1回洗い、30mM オクチルグルコシドを加え、氷上で30分間インキュベーションした。可溶化されタンパク質を回収するため、100,000g、4℃、30分間遠心分離し、上清を可溶化試料とし、抗PS2抗体ビーズによるPS2結合タンパク質の同定に用いた。
【００４６】
4. 発現解析
HepG2細胞はDMEM（10%FBS、37℃、5% CO2）、HeLa細胞はMEM（10%FBS、37℃、5% CO2）で培養した。各細胞におけるHep27発現解析では、細胞をPBSで洗い、スクレイプによって細胞を回収し1%Triton X-100を加え、超音波処理で細胞を破壊した。600g、4℃、5分の遠心で上清のタンパク定量を行い、すべての試料で1mgタンパク質/mlとした。これをSDS-PAGEと免疫ブロット法でHep27を検出した。安定的Hep27発現抑制株でも上記と同様の培養とタンパク質の抽出法を行い、SDS-PAGEと免疫ブロット法でHep27を検出した。一方、細胞レベルのHep27発現は間接蛍光抗体法で確認した。HepG2細胞（2.0x105cell/ml）をスライドチャンバーで24時間培養後、PBSで細胞を洗った。PBS（0.1% グルタルアルデヒド、2%パラホルムアルデヒド）で25℃、15分で細胞を固定した。PBSで3回細胞を洗い、PBS(0.1%Triton X-100を含む)で25℃、2分処理し細胞膜に透過性を与えた。あるいは、PBSのみで同様に処理した。次いで、PBS （1mg/ml NaBH4）、25℃10min処理、さらにPBS （10mM Glycine）(PBS-Gly) 25℃で5min、2回細胞を洗った。抗Hep27抗体(200倍希釈、100mg/ml BSA + PBS-Gly)で25℃、1時間細胞とインキュベーションさせPBS-Glyで3回細胞を洗った。2次抗体としてAlexia488結合型ヤギの抗マウスIgG（invitrogen社）を加え25℃、1時間インキュベーションした。PBS-Glyで3回細胞を洗ったのち、カバーガラスをかぶせ、蛍光顕微鏡（ライカ社）で観察し、画像撮影（ローパー社）を行った。
【００４７】
［結果］
1. PS2結合タンパク質の同定
PS2受容体の候補分子として、PS2と特異的に共沈降する27kDaタンパク質をHepG2細胞やその膜画分から分離した（図1）。PS2に感受性が低いHeLa細胞での結合物は検出できなかった。この27kDaタンパク質を抽出し、LC/MS/MS（外注した。相関係数(Xc);電荷(charge) 1.5;1+, 1.9;2+, 2.5;3+以上、スコア20以上）の結果、以下の15のペプチド配列を同定し、データベースと照らし合わせて、このペプチドをすべて含むタンパク質がHep27タンパクと同定された。
【００４８】
【表１】
2011068568.tif 000002
【００４９】
PS2結合タンパク質はHepG2など特定の細胞種に比較的豊富に発現しているHep27タンパク質isoform 1と考えられた（図2A、アミノ酸配列について配列番号:1、ヌクレオチド配列について配列番号：2）。Hep27タンパク質はショートチェーン酸化還元酵素のファミリー（SDR family）に分類されるが、現在その生理機能は未知な部分が多い。
【００５０】
Hep27 isoform1には、ヒト以外の生物に相同遺伝子を見出すことができる（配列番号：3〜10）。ヒトHep27 isoform1と各生物種におけるisoform1相同タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを図2Bに、同一性％（GENETYX(MAC版ver12.2.0)を使用。設定は初期設定。）を以下に示す。
【００５１】
【表２】
2011068568.tif 000003
【００５２】
2. PS2結合タンパク質と抗Hep27抗体との交差反応の確認
我々が同定したPS2結合タンパク質に対して、抗Hep27抗体は強い交差反応を示した（図3）。
【００５３】
3. 膜画分からのPS2結合タンパク質の抽出
このHep27は膜画分から効率的に回収された（図3）。
よって、LC/MS-MSとの結果をかね合わせて、今回同定したPS2結合タンパク質は膜結合性のHep27であると結論した。
【００５４】
4. 発現解析
この抗体を用いて各種細胞での発現解析を行ったところ、ヒト肝がん由来HepG2細胞では強い反応を示した。一方、ヒト子宮頸がん由来のHeLaなどでは特異的に反応するタンパク質は検出できなかった（図4）。
【００５５】
一方、同定したHep27が本当にPS2がん作用に関連する因子であるかを確認するため、PS2受容体分子種に共通な配列部分に相当する、shRNA発現ベクターをHepG2細胞に導入し、安定的PS2受容体発現抑制細胞株を樹立した。この細胞株では、PPS2受容体発現を20％程度抑制するもの、80〜90パーセント以上抑制するもの、計3株が含まれていた（図6）。なお、抑制率は恒常的に発現しているGAPDHを今回内部標準にし、発現抑制を行っていないコントロールのHep27の発現を100％とし、発現抑制株でのHep27の相対的発現を免疫ブロットのバンドのシグナル強度で定量化した。）。
【００５６】
PS2受容体発現が大きく低下したHepG2細胞では、野生型HepG2細胞に比べ、細胞増殖が明らかに遅く、また細胞の形態も変化した。PS2受容体はがん細胞増殖や細胞の形態形成に関係している可能性は考えられる。
【００５７】
Hep27の細胞での局在場所を明らかにするため、HepG2細胞に対して抗Hep27抗体を用いた間接蛍光抗体法を行った。顕微鏡観察では、細胞全体にシグナルを検出し（図5）、Hep27は細胞膜を含む複数の場所に局在している可能性が考えられた。
【００５８】
[考察]
PS2受容体は機知のタンパク質（Hep27）であった。しかし興味深いことに、このタンパク質は細胞内部に存在すると考えられていたタンパク質で、細胞膜外に露出したタンパク質であるとの報告はこれまでにない。今回のパラスポリン受容体の細胞膜存在の可能性を考えると、スプライシング異性体や修飾されたPS2分子が、標的とする細胞の細胞膜に存在している可能性が高い。細胞種間や分化・ストレスにおいて劇的なタンパク質の細胞内局在移行は珍しいことではなく、現在では普遍的な現象と考えられている。例えば、がん抑制遺伝子として有名なp53タンパク質もリン酸化やアセチル化によって細胞質-核間を移行し、細胞の分化・がん化を制御する。サイトカインの刺激で、細胞内部のタンパク質が細胞表面に輸送される。
【００５９】
今後は部位特異的、異性体に特異的な抗体を作成し、各種培養がん細胞さらにヒト摘出がん組織や正常組織でのHep27の発現のプロファイリングを行う必要がある。パラスポリン受容体の発現とがん細胞種やがんステージの対応が明らかとなれば、有力な腫瘍マーカーとなり、新しい診断技術の開発を進める。また、この受容体を標的とした薬剤スクリーニングやデザイン、抗体が抗がん治療に有効と考えられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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