(57)【要約】【課題】NF-κBデコイとして用いた場合に公知のNF-κBデコイよりもNF-κBに対する結合親和性が一層高い、新規なオリゴヌクレオチド誘導体、それから成るNF-κBデコイ、及びそれを有効成分として含有する医薬を提供すること。【解決手段】特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、その相補鎖が、特定のリンカーで結合されたヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドが、公知のNF-κBデコイよりも高いNF-κB結合親和性を発揮する。【選択図】図１
2011050381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(I)又は(II)で表されるオリゴヌクレオチド誘導体。
Nn1-X1-Nn2-L-X2  (I)
X2-L-Nn1-X1-Nn2  (II)
（これらの式中、
Nはa、c、g又はtを表わし、
n1は４ないし６の整数を表わし、
n2は４を表わし、
X1は5'-ggrhtyyh-3'の塩基配列（ここでrはa又はg、hはc、a又はt、yはc又はtを表わす）を表わし、
X2は、Lをループ部として二つ折りにした際にNn1-X1-Nn2に対し相補的である塩基配列を表し、
Lは-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-、-OPO2-(OCH2CH2CH2)n3-OPO2O-又は-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-を表わし、
n3は４ないし８の整数を表わし、
n4は３ないし１２の整数を表わす）。
【請求項２】
前記一般式(I)又は(II)中、X1がggatttcc又はggactttcである請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
前記一般式(I)又は(II)中、Lが式-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-で表わされる請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項４】
前記一般式(I)又は(II)中、Lが式-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-で表わされる請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項５】
前記一般式(I)で表わされ、X2の5'-末端とNn2の3'-末端が、前記式-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-又は前記式-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-で表わされる構造により結合されている、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項６】
前記一般式(II)で表わされ、Nn1の5'-末端とX2の3'-末端が、前記式-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-又は前記式-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-で表わされる構造により結合されている、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項７】
前記一般式(I)又は(II)中、Nn1-X1-Nn2がGAGGGGATTTCCCCCCまたはTTGAGGGGATTTCCCCCCである請求項１ないし６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項８】
前記一般式(I)又は(II)中、Lが-(CH2CH2O)6-である請求項７記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項９】
下記(1)〜(34)から成る群より選ばれる構造を有する請求項８記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
(1) 5'-GsAsGsGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCsTsC-3'
(2) 5'-GAsGsGGsGsATsTsTCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGGsAsAAsTsCCsCsCTsC-3'
(3) 5'-GsAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsC-3'
(4) 5'-GAGGGGATsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGGGGAAsAsTsCsCsCsCsTsC-3'
(5) 5'-GAsGGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCTsC-3'
(6) 5'-GsAsGsGsGGsATsTTsCCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGAsAAsTCsCCsCsTsC-3'
(7) 5'-GsAsGsGGsGsATsTsTCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGsAAsAsTCsCsCsCsTsC-3'
(8) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTsC-3'
(9) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCCsTsC-3'
(10) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCCsTsC-3'
(11) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCCsCC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCCsTC-3'
(12) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTC-3'
(13) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTC-3'
(14) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTsC-3'
(15) 5'-GsAsGGGsGsAsTTsTsCsCCCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGGGsGsAsAAsTsCsCCCsTsC-3'
(16) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTsTsCCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsAsTsCCCsCsTsC-3'
(17) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCCsCsTsC-3'
(18) 5'-TsTsGsAsGsGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCsTsCsAsA-3'
(19) 5'-TsTsGAsGsGGsGsATsTsTCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGGsAsAAsTsCCsCsCTsCsAsA-3'
(20) 5'-TsTGsAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'
(21) 5'-TTGAGGGGAsTsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGGGGAAAsTsCsCsCsCsTsCsAsA-3'
(22) 5'-TTsGAsGGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCTsCAsA-3'
(23) 5'-TsTsGsAsGsGsGGsATsTTsCCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGAsAAsTCsCCsCsTsCsAsA-3'
(24) 5'-TsTsGsAsGsGGsGsATsTsTCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGsAAsAsTCsCsCsCsTsCsAsA-3'
(25) 5'-TsTsGsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTsCsAsA-3'
(26) 5'-TTGAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'
(27) 5'-TsTGAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'
(28) 5'-TsTGsAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'
(29) 5'-TsTGAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'
(30) 5'-TTGsAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'
(31) 5'-TTGAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'
(32) 5'-TTGsAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'
(33) 5'-TTsGAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'
(34) 5'-TTsGAsGGGGsAsTsTTsCsCsCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGGGsAsAsATsCsCsCsCTsCAsA-3'
（(1)〜(34)中、添え字sは、sの両隣のヌクレオチド同士又はｓの両隣のヌクレオチドとエチレングリコール単位がホスホロチオエート結合していることを示す）。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体から成るNF-κBデコイ。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する医薬。
【請求項１２】
静脈内投与用である、請求項１１記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なオリゴヌクレオチド誘導体及びそれから成るNF-κBデコイに関する。本発明のNF-κBデコイは、虚血性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、癌の転移、浸潤等の予防、改善又は治療等に有用である。
【背景技術】
【０００２】
NF-κB(nuclear factor kappa B)は、サイトカインや接着因子等、免疫反応に関する遺伝子の発現を調節する役割を持つ一群の転写因子の総称であり、NF-κBがゲノム遺伝子上の結合部位に結合すると、免疫反応に関する遺伝子が過剰に発現する。このため、NF-κBは、免疫反応が原因となるアトピー性皮膚炎や関節リウマチ等のアレルギー性疾患、自己免疫疾患、さらには心筋梗塞等の虚血性疾患や動脈硬化等の各種疾患に関与することが知られている。
【０００３】
一方、転写因子に対するデコイを投与することにより、対象となる転写因子の活性を低下させ、該転写因子に起因して起きる疾患の治療や予防を行なうことが知られている。デコイ(decoy)とは、英語で「おとり」の意味であり、ある物質が本来結合あるいは作用すべきものと似せた構造を有するものをデコイと呼んでいる。転写因子のデコイとしては、主として転写因子のゲノム遺伝子上の結合領域と同じ塩基配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが用いられている（特許文献１〜３)。このようなオリゴヌクレオチドから成るデコイの共存下では、転写因子の分子のうちの一部は、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合せずに、デコイオリゴヌクレオチドに結合する。このため、本来結合すべきゲノム遺伝子上の結合領域に結合する転写因子の分子数が減少し、その結果、転写因子の活性が低下することになる。この場合、オリゴヌクレオチドは、本物のゲノム遺伝子上の結合領域の偽物（おとり)として機能して転写因子を結合するため、デコイと呼ばれる。NF-κBに対するデコイオリゴヌクレオチドも種々知られており、それらの薬理効果も種々知られている（特許文献４〜１２)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特再表96/035430号公報
【特許文献２】特許3392143号公報
【特許文献３】国際公開公報WO 95/11687号公報
【特許文献４】特開2005-160464号公報
【特許文献５】国際公開公報WO 96/35430
【特許文献６】国際公開公報WO 02/066070
【特許文献７】国際公開公報WO 03/043663
【特許文献８】国際公開公報WO 03/082331
【特許文献９】国際公開公報WO 03/099339
【特許文献１０】国際公開公報WO 04/026342
【特許文献１１】国際公開公報WO 05/004913
【特許文献１２】国際公開公報WO 05/004914
【特許文献１３】特表平０８−５０１９２８号公報
【特許文献１４】国際公開公報WO 93/06122
【特許文献１５】米国特許第5,495,006号公報
【特許文献１６】米国特許第5,556,752号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Milliganら、J．Med．Chem．1993，36，1923
【非特許文献２】Marwick, C.,(1998) J. Am. Med. Assoc., 280, 871
【非特許文献３】Stein & Cheng，Science 1993，261，1004
【非特許文献４】Levinら、Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1489, 69
【非特許文献５】Neish ASら、J. Exp. Med. 1992, Vol. 176, 1583-1593.
【非特許文献６】Leung Kら、Nature. 1988 Jun 23;333(6175):776-778.
【非特許文献７】Marina A.ら、The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol.270, Number 6, pp. 2620-2627
【非特許文献８】M. Durandら、Nucleic Acids Res., 1990,18(21),6353-6359
【非特許文献９】P.E. VOROBJEVら、Biopolymers. 1993 Dec;33(12):1765-77
【非特許文献１０】Squire Rumney, IVら、J.Am.Chem.Soc., 117(21),5635-5646,1995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、NF-κBデコイとして用いた場合に公知のNF-κBデコイよりもNF-κBに対する結合親和性が一層高い、新規なオリゴヌクレオチド誘導体、それから成るNF-κBデコイ、及びそれを有効成分として含有する医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとその相補鎖とが特定のリンカーで結合されたヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドが、公知のNF-κBデコイよりも高いNF-κB結合親和性を発揮することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記一般式(I)又は(II)で表されるオリゴヌクレオチド誘導体を提供する。
Nn1-X1-Nn2-L-X2  (I)
X2-L-Nn1-X1-Nn2  (II)
（これらの式中、
Nはa、c、g又はtを表わし、
n1は４ないし６の整数を表わし、
n2は４を表わし、
X1は5'-ggrhtyyh-3'の塩基配列（ここでrはa又はg、hはc、a又はt、yはc又はtを表わす）を表わし、
X2は、Lをループ部として二つ折りにした際にNn1-X1-Nn2に対し相補的である塩基配列を表し、
Lは-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-、-OPO2-(OCH2CH2CH2)n3-OPO2O-又は-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-を表わし、
n3は４ないし８の整数を表わし、
n4は３ないし１２の整数を表わす）。
【０００９】
また、本発明は、上記本発明のオリゴヌクレオチド誘導体から成るNF-κBデコイを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する医薬を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、公知のNF-κBデコイよりもNF-κBに対する結合親和性が一層高い新規なオリゴヌクレオチド誘導体、それから成るNF-κBデコイ、及びそれを有効成分として含有する医薬が提供された。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、公知のNF-κBデコイよりもNF-κBに対する結合親和性が極めて高いので、従来のNF-κBデコイを有効成分として含有する医薬よりも優れた薬効を発揮する。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、二本鎖オリゴヌクレオチドの末端同士がリンカーにより結合されたヘアピン型の構造をとるため、融解温度が通常の二本鎖オリゴヌクレオチドよりも遥かに高く、製剤工程、保存時及び生体内における安定性が高い。さらに、公知のNF-κBデコイよりも分子構造が小さいので、製造コストも低くなる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例８、20、22及び25のオリゴヌクレオチド誘導体並びに比較例１の二本鎖ＤＮＡをマウスLPS惹起急性肺障害モデルに投与した際の、マウス体内でのIL-6産生量を示す図である。
【図２】比較例１の二本鎖ＤＮＡ処置群におけるレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図３】実施例８のオリゴヌクレオチド誘導体処置群におけるレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図４】実施例20のオリゴヌクレオチド誘導体処置群におけるレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図５】実施例22のオリゴヌクレオチド誘導体処置群におけるレポーターアッセイの結果を示す図である。
【図６】実施例25のオリゴヌクレオチド誘導体処置群におけるレポーターアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記の通り、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、上記一般式(I)又は(II)で表わされる。一般式(I)及び(II)中、Nはa、c、g又はtを表わす。n1は４ないし６の整数、好ましくは４、５又は６を表わす。n2は４を表わす。X1は5'-ggrhtyyh-3'の塩基配列（ここでrはa又はg、hはc、a又はt、yはc又はtを表わす）を表わし、好ましくは、ggatttcc又はggactttcである。X2は、L（リンカー）をループ部として二つ折りにした際にNn1-X1-Nn2に対し相補的である塩基配列を表わす。ここで、「Lをループ部として二つ折りにした際にNn1-X1-Nn2に対し相補的である塩基配列」とは、例えば、Nn1-X1-Nn2が5'-GAGGGGATTTCCCCCC-3'（配列番号１）の場合には、下記式(III)又は(IV)に示すように、Lをループ部としてNn1-X1-Nn2の塩基とX2の塩基が向き合った際に互いに相補的であることを意味する。なお、Nn1-X1-Nn2の好ましい例としては5'-GAGGGGATTTCCCCCC-3'（配列番号１）及び5'-TTGAGGGGATTTCCCCCC-3'（配列番号２）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
【化１】
2011050381.tif 000003
【００１４】
一般式(I)及び(II)中、Lは-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-、-OPO2-(OCH2CH2CH2)n3-OPO2O-又は-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-、好ましくは、-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-又は-OPO2O-(CH2)n4-OPO2O-、さらに好ましくは-OPO2-(OCH2CH2)n3-OPO2O-である。ここで、n3は４ないし８の整数、好ましくは５ないし７の整数、さらに好ましくは６であり、n4は３ないし１２の整数を表わす。なお、リンカーLの両端の-OPO2O-は、それぞれ、隣接するヌクレオチドの糖の3'位又は5'位と結合するリン酸ジエステル結合を表わしている。また、リンカーの両端の-OPO2O-を除いた部分を「リンカー部」と呼ぶことがある。また、リンカーを介して末端が連結された２個の相補的オリゴヌクレオチドが二本鎖を形成している構造（上記式(III)や(IV)のような構造）を、本明細書において便宜的に「ヘアピン型」と呼ぶことがある。なお、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体が、ヘアピン型構造をとる（すなわち、オリゴヌクレオチド部分が二本鎖になる）ことは、下記実施例に具体的に示される融解温度やNF-κBとの結合活性から明らかである。
【００１５】
本発明にかかるオリゴヌクレオチドにおいては、適切な生化学的安定性を与える目的で、ヌクレオチド間結合のすべてあるいは一部にホスホロチオエート化等の耐ヌクレアーゼ修飾を施してもよい。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体中のオリゴヌクレオチド部分は、基本的にDNAであることが好ましいが、隣接する少なくとも２個のヌクレオチド間の結合（及び／又はリンカー部に隣接するヌクレオチドでは、該ヌクレオチドとリンカー部の間）を、耐ヌクレアーゼ修飾してヌクレアーゼに対する耐性を増大させてもよい。ここで、「耐ヌクレアーゼ修飾」とは、ヌクレアーゼによる分解を天然のDNAよりも受けにくくする修飾のことを意味し、このようなDNAの修飾自体は周知である。耐ヌクレアーゼ修飾の例としては、ホスホロチオエート化（本明細書において「Ｓ化」と呼ぶことがある)、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化等を挙げることができる。これらのうち、Ｓ化が好ましい。Ｓ化は、上記の通り、隣接するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を構成するリン原子に結合している２個の非架橋酸素原子のうちの１個をイオウ原子に変換することを意味する。任意の隣接するヌクレオチド間の結合をＳ化する手法自体は周知であり、例えば、非特許文献７に記載された方法により行なうことができ、Ｓ化オリゴヌクレオチドは商業的にも合成されている。なお、本明細書及び特許請求の範囲において、単なる塩基配列は、そうでないことが文脈上明らかな場合を除き、ヌクレオチド間の結合及びリンカー部とヌクレオチド間の結合の一部又は全部がＳ化されているものも、全くＳ化されていないものをも包含する。ただし、１つの配列でＳ化の部位が明記されている場合には、Ｓ化が記載されていない部位はＳ化されていない。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、先ず、その5'末端にリンカーが結合される方の一本鎖オリゴヌクレオチドを常法により合成し、その5'末端にリンカーを結合し、さらに、リンカーの他端に所定のヌクレオチドの3'位を結合し、さらにこのヌクレオチドに続けて常法により所定のオリゴヌクレオチドを5'側に１個ずつ結合させていくことにより合成することができる。本発明で規定されるこのようなリンカー自体は公知であり、このようなリンカーで相補的なオリゴヌクレオチドの末端同士を連結し、オリゴヌクレオチド部分を二本鎖オリゴヌクレオチドとすることも公知である（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、特許文献１４、特許文献１５）。また、ヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドを調製するための各種リンカーを導入するための試薬（リンカーの誘導体）が市販されているので、これらの市販のリンカー試薬を用い、その指示書に従って容易にヘアピン型の二本鎖オリゴヌクレオチドを調製することができる。下記実施例にも調製方法の１例が具体的に記載されている。
【００１７】
ヘアピン型二本鎖オリゴヌクレオチドを調製するために利用できる、本発明で規定されるリンカーを導入するための試薬として市販されているものとして以下のものを挙げることができる。
【００１８】
１．  エチレングリコール単位の繰返しから成るリンカー部を導入するための試薬
(1)  18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト{18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer Phosphoramidite 18、米国Glen Research社)
（エチレングリコール単位６個から成るリンカー部を結合）
(2)  9-O-ジメトキシトリチルトリエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{9-O-Dimethoxytrityl-triethylene glycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer Phosphoramidite 9、米国Glen Research社)
（エチレングリコール単位３個から成るリンカー部を結合）
(3)  12-O-ジメトキシトリチルテトラエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]ホスホロアミダイト
12-O-Dimethoxytrityl-tetraethyleneglycol,1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]phosphoramidite
（商品名：Spacer 12、米国ChemGenes社)
（エチレングリコール単位４個から成るリンカー部を結合）
【００１９】
２．  アルキレン鎖から成るリンカー部を導入するための試薬
(1)  3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer Phosphoramidite C3、米国Glen Research社)
（プロピレン鎖から成るリンカー部を結合）
(2)  DMT-ブタン-ジオール  ホスホロアミダイト
（DMT-butane-Diol phosphoramidite）
（商品名：C-4 Spacer、米国ChemGenes社)
（ブチレン鎖から成るリンカー部を結合）
(3)  DMT-ヘキサン-ジオール  ホスホロアミダイト
（DMT-hexane-Diol phosphoramidite）
（商品名：C-6 Spacer、米国ChemGenes社)
（ヘキシレン鎖から成るリンカー部を結合）
(4)  DMT-ノナン-ジオール  ホスホロアミダイト
（DMT-nonane-Diol phosphoramidite）
（商品名：C-9 Spacer、米国ChemGenes社)
（ノニレン鎖から成るリンカー部を結合）
(5)  12-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)ドデシル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト
{12-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite}
（商品名：Spacer C12 CE Phosphoramidite、米国Glen Research社)
（ドデシレン鎖から成るリンカー部を結合）
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、一般式(I)及び(II)中のX1がNF-κBのコンセンサス配列になっているため、NF-κBデコイとして機能する。従って、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、NF-κBデコイが有効成分として用いられる医薬の有効成分として用いることができる。このような医薬は、下記の各種疾患の治療及び予防に有効であることが認められている。
【００２１】
血管再狭窄、急性冠症候群、脳虚血、心筋梗塞、虚血性疾患の再潅流障害、アトピー性皮膚炎、尋常性乾癬、接触性皮膚炎、ケロイド、褥創、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎症、糸球体硬化症、アルブミン尿症、腎炎、腎不全、慢性関節リウマチ、変形性関節症、椎間板変性症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、大動脈瘤、脳動脈瘤。さらには、
１．免疫系疾患
大動脈炎症候群（高安動脈炎）
バージャー病（ビュルガー病）
結節性動脈周囲炎
ウェゲナー肉芽腫症
アレルギー性肉芽腫性血管炎（チャーグ・ストラウス症候群）
全身性エリテマトーデス
多発性筋炎・皮膚筋炎
シェーグレン症候群
成人スティル病
２．神経・筋疾患
パーキンソン病
筋萎縮性側索硬化症(ALS)
多発性硬化症(MS)
３．呼吸器系疾患
特発性間質性肺炎
サルコイドーシス
原発性肺高血圧症
４．消化器系疾患
自己免疫性肝炎
劇症肝炎
重症急性膵炎
５．皮膚・結合組織疾患
強皮症
６．骨・関節系疾患
広範脊柱管狭窄症
７．腎・泌尿器系疾患
IgA腎症
急速進行性糸球体腎炎
【００２２】
これらの医薬用途に用いる場合、オリゴヌクレオチドの投与経路は、特に限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、対象臓器ないしは組織への直接投与等の非経口投与が好ましい。投与量は、対象疾患、患者の症状、投与経路等により適宜設定されるが、通常、成人１日当たり0.1〜10000nmol、好ましくは1 〜1000 nmol、より好ましくは10〜100 nmolを投与することができる。製剤は、常法により行なうことができ、例えば、注射剤の場合には、生理食塩水中に本発明のオリゴヌクレオチドを溶解した溶液の形態とすることができる。製剤中には、保存剤、緩衝剤、溶解補助剤、乳化剤、希釈剤、等張化剤などの、製剤分野で常用される添加剤が適宜混合されていてもよい。また、他の薬効成分を含んでいてもよい。
【００２３】
下記実施例に具体的に示されるように、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、公知のNF-κBデコイよりもNF-κBに対する結合親和性が一層高いので、従来のNF-κBデコイを有効成分として含有する医薬よりも優れた薬効を発揮する。特に、公知のNF-κBデコイよりも小さい分子構造を有し、より高い結合活性を有するので、投与量が少なくて済み、製造コストも低くなる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、二本鎖オリゴヌクレオチドの末端同士がリンカーにより結合されたヘアピン型の構造をとるため、融解温度が通常の二本鎖オリゴヌクレオチドよりも遥かに高く、製剤工程、保存時及び生体内における安定性が高い。これらの特長に加え、本発明にかかるオリゴヌクレオチド誘導体は優れた耐ヌクレアーゼ特性も合わせ持つため、静脈注射等の全身投与によってもその効果を発揮することができる。
【００２４】
以下、本発明を実施例及び比較例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。各例の説明に先立ち、各特性の測定方法及び評価方法について説明する。
【００２５】
１．融解温度（Tm値）測定試験（デコイの二本鎖としての安定性を測定）
Tm解析システム（UV-1650PC/TMSPC-8：SHIMADZU社製）を使用して、ＰＢＳ溶液中における各デコイの吸光度を１℃〜99℃の範囲で、複数回測定し、各温度における二本鎖の解離をモニターした。温度−吸光度曲線から、微分法で各Tm値（℃）を算出した。
【００２６】
２．結合活性試験
各デコイ溶液にマウス血漿を添加し（核酸の終濃度10μmol/L、マウス血漿90%）、37℃で反応させた。反応後、市販の転写因子アッセイキット(TransAM（商品名）NF-κB p65：Cat.No.40096：Active Motif, Inc社)を用い、NF-κBコンセンサス配列が固相化されているプレートへ上記核酸反応液と、Jurkat 細胞（ヒトTリンパ腫由来）核抽出液を添加し反応（室温、１時間）させた。洗浄後、一次抗体（抗NF-κB p65抗体）と二次抗体（HRP-抗IgG抗体）をキット説明書に従って添加、洗浄し、化学発光法を用いて測定した。
【００２７】
評価方法
各デコイ溶液の濃度値を対数に変換し、横軸を対数に変換した濃度値（0.005〜167nmol/Lの濃度内で5〜10点）、縦軸に各群のパーセンテージ値をプロットし、近似曲線を作成し、各反応時間におけるIC50（inhibition concentration 50%）を算出した。
【００２８】
３．紫外吸光分析
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (商品名、NanoDrop Technologies, LLC)を用い、各サンプルのUV（水）λmaxを測定した。
【００２９】
４．HPLC保持時間
各サンプルを下記条件の逆相イオン対HPLCにて分析し、保持時間を測定した。
装置：SHIMADZU prominence(商品名、島津製作所)
カラム：Waters Xbridge C18(商品名、日本ウォーターズ、2.5μm、4.6×75mm)
カラム温度：50℃
A液：5%アセトニトリル, 0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0)
B液：90%アセトニトリル, 0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0)
グラジエントB液濃度：0%-30%（30min)
流速：1mL/min
検出波長：260nm
【００３０】
実施例１〜３４
以下の構造を有する３４種類のオリゴヌクレオチド誘導体を後記方法並びに合成例に従って調製した。
(1) 5'-GsAsGsGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCsTsC-3'（実施例１）
(2) 5'-GAsGsGGsGsATsTsTCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGGsAsAAsTsCCsCsCTsC-3'（実施例２）
(3) 5'-GsAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsC-3'（実施例３）
(4) 5'-GAGGGGATsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGGGGAAsAsTsCsCsCsCsTsC-3'（実施例４）
(5) 5'-GAsGGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCTsC-3'（実施例５）
(6) 5'-GsAsGsGsGGsATsTTsCCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGAsAAsTCsCCsCsTsC-3'（実施例６）
(7) 5'-GsAsGsGGsGsATsTsTCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGsAAsAsTCsCsCsCsTsC-3'（実施例７）
(8) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTsC-3'（実施例８）
(9) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCCsTsC-3'（実施例９）
(10) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCCsTsC-3'（実施例１０）
(11) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCCsCC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCCsTC-3'（実施例１１）
(12) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTC-3'（実施例１２）
(13) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTC-3'（実施例１３）
(14) 5'-GsAGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTsC-3'（実施例１４）
(15) 5'-GsAsGGGsGsAsTTsTsCsCCCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGGGsGsAsAAsTsCsCCCsTsC-3'（実施例１５）
(16) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTsTsCCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsAsTsCCCsCsTsC-3'（実施例１６）
(17) 5'-GsAsGsGGGsAsTsTTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCCsCsTsC-3'（実施例１７）
(18) 5'-TsTsGsAsGsGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCsTsCsAsA-3'（実施例１８）
(19) 5'-TsTsGAsGsGGsGsATsTsTCsCsCCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGGsAsAAsTsCCsCsCTsCsAsA-3'（実施例１９）
(20) 5'-TsTGsAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'（実施例２０）
(21) 5'-TTGAGGGGAsTsTsTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGGGGAAAsTsCsCsCsCsTsCsAsA-3'（実施例２１）
(22) 5'-TTsGAsGGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGsGsGsAsAsAsTsCsCsCsCTsCAsA-3'（実施例２２）
(23) 5'-TsTsGsAsGsGsGGsATsTTsCCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGAsAAsTCsCCsCsTsCsAsA-3'（実施例２３）
(24) 5'-TsTsGsAsGsGGsGsATsTsTCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGsGsAAsAsTCsCsCsCsTsCsAsA-3'（実施例２４）
(25) 5'-TsTsGsAsGsGGGsAsTsTTsCsCsCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GsGsGsGGGsAsAsATsCsCsCsCsTsCsAsA-3'（実施例２５）
(26) 5'-TTGAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'（実施例２６）
(27) 5'-TsTGAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'（実施例２７）
(28) 5'-TsTGsAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'（実施例２８）
(29) 5'-TsTGAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'（実施例２９）
(30) 5'-TTGsAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'（実施例３０）
(31) 5'-TTGAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCsAsA-3'（実施例３１）
(32) 5'-TTGsAsGsGGsGsAsTTsTsCsCCsCsCsC-(CH2CH2O)6-GGGsGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'（実施例３２）
(33) 5'-TTsGAsGGGsGsAsTTsTsCsCCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGsGsGAsAsAsTCsCsCsCTsCAsA-3'（実施例３３）
(34) 5'-TTsGAsGGGGsAsTsTTsCsCsCsCCsC-(CH2CH2O)6-GGsGGGGsAsAsATsCsCsCsCTsCAsA-3'（実施例３４）
（(1)〜(34)中、添え字sは、sの両隣のヌクレオチド同士又はｓの両隣のヌクレオチドとエチレングリコール単位がホスホロチオエート結合していることを示す）。
【００３１】
上記各オリゴヌクレオチド誘導体は、基本的に、市販のDNA合成用固相支持体、DNAシアノエチルホスホロアミダイト、及び適切な反応／修飾試薬を用い、リン酸ジエステル結合を全部又は部分的にホスホロチオエート化修飾を施したオリゴヌクレオチドをDNA自動合成機（商品名：ABI394、米国Applied Biosystems社製）で3'→5'方向に合成した。ポリエチレングリコール鎖を導入したヘアピン型NF-κBデコイの製造に当たっては、まず、3'側配列（その5'末端にリンカーが結合される方の配列）を3'→5'方向に合成し、その5'末端に続けて、18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール,1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト（商品名：Spacer Phosphoramidite 18、米国Glen Research社)  1分子をカップリングさせ、さらに、5'側配列（その3'末端にリンカーが結合される方の配列）を3'→5'方向に引き続き合成することで、3'側配列と5'側配列がヘキサエチレングリコールで連結されたオリゴヌクレオチド誘導体を得た。それを加熱、急冷により分子内アニーリングさせて製造した。
【００３２】
より具体的には、上記合成は次のように行なった。DMT-デオキシアデノシン(bz)β-シアノエチルホスホロアミダイト、DMT-デオキシシチジン(bz)β-シアノエチルホスホロアミダイト、DMT-デオキシグアノシン(bz)β-シアノエチルホスホロアミダイトおよびDMT-デオキシチミジンβ-シアノエチルホスホロアミダイトをSigma-Aldrich社から、Spacer18 phosphoramidite（商品名）、S化試薬（CPRII、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジオキシド）および合成用カラムをGlen Research社から、オリゴＤＮＡ合成用の脱保護溶液、活性化溶液、酸化溶液およびキャッピング溶液（CapA溶液およびCapB溶液）を和光純薬からそれぞれ購入した。（bzはベンゾイル基を意味する。）
【００３３】
合成例１（実施例１の配列化合物）
DNA自動合成装置ABI394(Applied Biosystems社製)を用いて、ホスホロアミダイト法により、固相支持体上に所望のオリゴヌクレオチドを以下のように合成した。合成装置に、保護された３’末端ヌクレオチド（ｄC）を予め結合した多孔性ガラス(Controlled Pore Glass: CPG)を含む合成用カラムを装着し、脱保護溶液、活性化溶液および3'末端の隣に隣接するヌクレオチド（dT）のβ-シアノエチルホスホロアミダイト（アセトニトリル溶液）、S化試薬（アセトニトリル溶液）、キャッピング溶液（CapA溶液とCapB溶液との１：１混合液）の順に反応溶液を合成用カラムに通し、ヌクレオチド間ホスホロチオエート結合を形成させた。ヌクレオチド間連結がホスホジエステルの場合、S化試薬の代わりに酸化溶液を使用した。各試薬の濃度および使用量は、製造元の指示書に従った。以下同様にして、3'→5'方向に順次１塩基ずつ延長合成した。Spacer 18 phosphoramidite（商品名）を、該商品に添付の指示書に従い、合成したオリゴヌクレオチドの5'末端に結合し、次いで、前記と同様に、Spacer 18 phosphoramidite（商品名）の他端側に結合するオリゴヌクレオチドを3'→5'方向に順次１塩基ずつ延長合成した。
【００３４】
固相担体からの切り出しおよび脱保護
28%アンモニア水溶液で室温、２時間処理し、オリゴヌクレオチド誘導体をCPGより切り出した。さらに、その溶液を65℃、６時間処理し、塩基部分の保護基およびリン酸部分の保護基を脱離させた。
【００３５】
カートリッジ精製
Oligo R3担体（Applied Biosystems社製）を充填した固相抽出カラムに0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0)を加えて平衡化し、そこに精製前のオリゴヌクレオチドを入れて吸着させ、0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液(pH7.0):アセトニトリル(9:1)を添加して不完全なオリゴヌクレオチドを洗い出した後、2%トリフルオロ酢酸水溶液の添加によって完全長のオリゴヌクレオチドから5'末端のジメトキシトリチル基を脱離させ、水を通して１回洗浄した。次に、20%アセトニトリルを添加してオリゴヌクレオチドを溶出させた。次いで、その溶出液から凍結乾燥により溶媒を蒸発させ、オリゴヌクレオチド誘導体を得た。
【００３６】
比較例１
以下の構造を有する、Ｓ化された通常の二本鎖ＤＮＡを常法により合成した（塩基配列は配列番号３に示す。）
【００３７】
5'-CsCsTsTsGsAsAsGsGsGsAsTsTsTsCsCsCsTsCsC-3'
3'-GsGsAsAsCsTsTsCsCsCsTsAsAsAsGsGsGsAsGsG-5'
（添え字sは、sの両隣のヌクレオチド同士がホスホロチオエート結合していることを示す）。
【００３８】
実施例３５
上記新規オリゴヌクレオチド誘導体(実施例１〜３４)及び比較例１の二本鎖ＤＮＡについて、上記した測定方法、又は測定方法を先に記載していない特性については常法により、各種特性を測定した。結果を下記表１−１及び表１−２に示す。
【００３９】
【表１−１】
2011050381.tif 000004
【００４０】
【表１−２】
2011050381.tif 000005
【００４１】
表１−１及び表１−２に示されている各特性の薬理学的な意味を以下に説明する。
【００４２】
(1) 結合活性
無細胞系(セルフリー系)での、マウス血漿９０％存在下で反応時間0Hr（０時間、以下同様）における、各化合物のNF-κB結合に対するIC50値である。実際には、各デコイ溶液にマウス血漿を添加後、３秒以内に測定した値を便宜上0Hrの値とした。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、NF-κBに対する結合活性が比較例１の二本鎖ＤＮＡよりも遥かに高い。
【００４３】
(2) Tm値
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の物理学的(熱力学的)安定性を示すデータである。比較例１の二本鎖ＤＮＡは、ヒトを始めとするほ乳類の体温より若干高い程度の熱力学的安定性しか有さず、例えば軟膏等の製剤化工程においてほとんど加熱することができないが、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は一般的製剤工程における温度条件であれば安定である。
【００４４】
(3) UV λmaxおよびHPLC保持時間
各化合物の物性値データである。
【００４５】
実施例３６    マウスLPS惹起急性肺障害モデルにおける効果
実施例８、２０、２２、２５のオリゴヌクレオチド誘導体を生理食塩水に溶解して2.5μg/mLおよび5μg/mLに調整し、BALB/cマウス（7週令、雌、１群10匹）へ100μL/匹で経気管内投与した。投与3日後に、リポ多糖(LPS、500μg/mL）を100μL/匹で経気管内投与し、投与24時間後に生理食塩水2mL/匹で肺を洗浄した。この肺胞洗浄液を回収し、含まれるIL-6の濃度をELISA法により測定した。肺胞洗浄液を生理食塩水で希釈し、市販のマウスIL-6免疫測定用キット(Mouse IL-6 Immunoassay（商品名）（R&D systems社製））を用いて、添付書類にしたがって実験を行った。吸光度（450/650nm）の測定には、Wallac1420ARVOsx（商品名、株式会社パーキンエルマージャパン）を用いた。対照群には、オリゴヌクレオチド誘導体を含まない生理食塩水を投与した。
【００４６】
解析方法
演算はMicrosoft Excel 2002（商品名、Microsoft）を使用した。平均値はExcel（商品名）の関数AVERAGEを，標準誤差（S.E.）は関数STDEV、SQRT、COUNTを用いて演算した。有意差検定は統計解析ソフトSAS前臨床パッケージver5.0（SAS Institute Japan）を用い、危険率5％未満を統計学的に有意であるとした。他群間の比較は、分散分析を実施し、等分散の場合はパラメトリックなDunnett検定、不等分散の場合はノンパラメトリックなDunnett検定を実施した。
【００４７】
結果を図１に示す。オリゴヌクレオチド誘導体の投与量が0.5μg/匹の場合には、対照群に対して統計学的に有意に（＊、p＜0.01）IL-6産生量が低減された。
【００４８】
実施例３７  レポーターアッセイ
試験方法
24 well plateへの播種
細胞を観察し、異常のないことおよび約80％コンフルエントになっていることを確認した。適量のD-PBS（-）にて洗浄後、適量のTrypsin-EDTAを添加し、37℃、5％CO2インキュベータで3分間反応させ、細胞を剥離させた。剥離させた細胞を10％FBS含有MEM培地で懸濁し、遠心チューブに回収し、冷却遠心機（Beckman）にて遠心分離（1000 rpm、5分、25℃）し、上清を吸引した。沈殿させた細胞を10%FBS含有MEM培地で再懸濁し、改良型ノイウェル血球計算板を用いて細胞を計数後、24 well plate（コーニング）に4.0×104 cells/well/0.5 mLで播種し、37℃、5％CO2インキュベータ内で24時間培養した。
【００４９】
実験群構成
実験（n=6）
1. TNF-α刺激群
2. 比較例１のDNA  0.1、0.3および1.0μmol/L処置→TNF-α刺激群
3. 実施例８のDNA  0.1、0.3および1.0μmol/L処置→TNF-α刺激群
4. 実施例20のDNA  0.1、0.3および1.0μmol/L処置→TNF-α刺激群
5. 実施例22のDNA  0.1、0.3および1.0μmol/L処置→TNF-α刺激群
6. 実施例25のDNA  0.1、0.3および1.0μmol/L処置→TNF-α刺激群
【００５０】
各オリゴヌクレオチドの添加
HeLa細胞を24 well plateに播種し、24時間培養した後、D-PBS（-）で洗浄し、MEM培地250 μLを添加した。FuGENE6（ロシュ・ダイアグノスティックス）をMEM培地にて83.3倍希釈した（FuGENE6希釈液）。以下の組成でDNA混合溶液を調製した。
【００５１】
【表２】
2011050381.tif 000006
【００５２】
pNFκB-SEAP plasmid（Clontech、カタログ番号：631905）は、NFκBのコンセンサス配列の後ろにレポーター遺伝子であるSEAP(secreted alkaline phosphatase)が組み込まれたものであり、NFκBシグナル特異的にSEAP遺伝子が転写活性化する。TNF-α刺激によりHeLa細胞中のNF-κBが活性化すると、該プラスミド中のNFκBコンセンサス配列に活性化NF-κBが結合してレポーター遺伝子SEAPが転写活性化し、培養上清中にアルカリホスファターゼが分泌される。このとき、細胞内にNF-κBデコイが存在すると、デコイが活性化NF-κBとプラスミド中のNF-κBコンセンサス配列との結合を阻害するため、レポーター遺伝子の転写活性化が抑制され、アルカリホスファターゼ分泌量が低下する。従って、TNF-α刺激した際の培養上清中のアルカリホスファターゼ活性を指標として、デコイの転写阻害活性を評価することができる。
【００５３】
調製した各DNA混合溶液とFuGENE6希釈液を等量で穏やかに混合し、30分間室温で反応させた（FuGENE6混合溶液）。反応後、24 well plateに各FuGENE6混合溶液250μLを添加し、4時間反応させた後、FBSを50μL添加し、約20時間反応させた。反応後、TNF-αを終濃度が50 ng/mLになるように添加し、約24時間反応させた。反応後、1.5 mLチューブに培養上清を回収し、微量高速冷却遠心機（トミー）にて10000 rpm、5分間、4℃で遠心分離を行い、上清のみを別の1.5 mLチューブに移し、細胞培養室用冷凍庫（-20℃前後）に保存した。
【００５４】
レポーターの測定
試薬の調製
5×Dilution Bufferを蒸留水にて5倍希釈し、1×Dilution Bufferを調製した。また、25 mmol/L CSPD SubstrateをChemiluminescent Enhancerにて20倍希釈し、1.25 mmol/L CSPD Substrateを調製した。
【００５５】
レポーターアッセイ
Chemiluminescent Enhancer、Assay Dilutionおよび調製した1×Dilution Bufferを室温に戻した。1.5mLチューブにサンプル15μLを添加した。次に1×Dilution Buffer 45μLを添加し、タッピングにて混合した。Water bathにて65℃、30分間反応させた。反応後、氷上に3分間放置し、1.5mLチューブを室温に戻し、Assay Dilution 60μLを添加し、タッピングにて混合し、室温にて5分間反応させた。反応後、1.25 mmol/L CSPD Substrate 60 μLを添加し、タッピングにて混合し、10分間、室温で反応させた。反応後、96 well plateに反応サンプルを移し、Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンタ（株式会社パーキンエルマー）で相対発光強度（RLU）を測定した。
【００５６】
結果
結果を図２〜図６に示す。実施例のオリゴヌクレオチド誘導体は転写阻害活性を有していた。
【図１】
2011050381.tif 000007
【図２】
2011050381.tif 000008
【図３】
2011050381.tif 000009
【図４】
2011050381.tif 000010
【図５】
2011050381.tif 000011
【図６】
2011050381.tif 000012
【配列表】
2011050381000001.app