(57)【要約】【課題】骨溶解性骨転移を含む癌転移を予防もしくは治療するための新規な薬剤および方法を特定すること。【解決手段】Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを含む医薬用配合物、医薬用配合物を含むキット、転移性癌に罹患している対象の骨転移を予防および治療する方法、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストのスクリーニング方法、ならびに医薬と、骨転移および腫瘍増殖を予防および治療する薬剤の製造とにおけるＭ−ＣＳＦの使用を提供する。本発明の方法では、Ｍ−ＣＳＦとその受容体（Ｍ−ＣＳＦＲ）との相互作用を阻害することによって治療効果を達成することが企図されている。さらに、このＭ−ＣＳＦ／Ｍ−ＣＳＦＲ相互作用を阻害するにより、腫瘍細胞が誘発する破骨細胞の増殖および／または分化を抑制することが企図されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１１月１５日出願の米国仮特許出願第６０/４２６，７８１号の利益を主張するものである。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを被験体に投与することによって、癌転移および癌転移に伴う骨量減少を予防ならびに処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
癌転移は、癌患者における術後もしくは治療後の再発の第一の原因である。治療法を開発するために鋭意努力されてきたにもかかわらず、癌転移は、なお治療に対して実質的に難治性であるのが現状である。骨は、ヒトの種々の型の癌（例えば、乳癌、肺癌、前立腺癌および甲状腺癌）の転移の最も一般的な部位の一つである。骨溶解性骨転移が起こると、難治性疼痛、高度の易骨折性、神経圧迫および高カルシウム血症による重篤な病状が生じる。こうした臨床的問題の重要性にもかかわらず、癌転移に伴う骨量減少に対して施行できる治療法は少ない。
【０００４】
破骨細胞は骨再吸着を媒介している。破骨細胞は、造血細胞から分化した多核細胞である。破骨細胞は、骨髄の造血幹細胞に由来する単核細胞前駆体の融合によって形成されるのであって、不完全な細胞分裂によるものではないことは一般に認められている（チェンバーズ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ）、ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、６：ｐ１−２５、１９８９年；ゲスリングほか（Ｇｏｅｔｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・オーソペディックス・アンド・リレイテッド・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒ．）、１２０：ｐ２０１−２２８、１９７６年；カーンほか（Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５８：ｐ３２５−３２７、１９７５年；スダほか（Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、エンドクリノロジカル・レビュー（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ）、１３：ｐ６６−８０、１９９２年；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１８０：ｐ８７５、１９７３年；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９０：ｐ７８５−７８７、１９７５年；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９０：ｐ７８４−７８５、１９７５年）。これらは単核細胞−マクロファージ系細胞と共通の幹細胞を共有している（アッシュほか（Ａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８３：ｐ６６９−６７０、１９８０年；カービほか（Ｋｅｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ）、７：ｐ３５３−６２、１９９２年）。破骨細胞前駆体が成熟多核破骨細胞に分化するには、ホルモン性および局所性刺激を含む種々の因子が必要とされ（アタナソーほか（Ａｔｈａｎａｓｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）、ボーン・ミネラル（Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ）、３：３１７−３３３、１９８８年；フェルドマンほか（Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１０７：ｐ１１３７−１１４３、１９８０年；ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９０：ｐ７８４−７８５、１９７５年；ゼングほか（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ヒストケミストリー・ジャーナル（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ）、２３：ｐ１８０−１８８、１９９１年）、生きている骨および骨細胞は破骨細胞の発生に中心的な役割を果たしていることが示されている（ハーゲナーズほか（Ｈａｇｅｎａａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ボーン・ミネラル（Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ）、６：ｐ１７９−１８９、１９８９年）。また、破骨細胞への分化には骨芽細胞もしくは骨髄間質細胞も必要である。破骨細胞の形成を支えるこれらの細胞により産生される因子の１つにマクロファージ−コロニー刺激因子Ｍ−ＣＳＦがある（ヴィクトル−イェルゼイザクほか（Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８７：ｐ４８２８−４８３２、１９９０年；ヨシダほか（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４���：ｐ４４２−４４４、１９９０年）。破骨細胞および破骨細胞前駆体の表面にあるレセプターＲＡＮＫ（ＴＲＡＮＣＥＲ）（レーシーほか（Ｌａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、セル（Ｃｅｌｌ）、９３：ｐ１６５−１７６、１９９８年；ツダほか（Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオケミストリー・バイオフィジックス・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏ．）、２３４：ｐ１３７−１４２、１９９７年；ウォンほか（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）、１８６：ｐ２０７５−２０８０、１９９７年；  ；ウォンほか（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）、２７２：ｐ２５１９０−２５１９４、１９９７年；ヤスダほか（Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１３９：ｐ１３２９−１３３７、１９９８年；ヤスダほか（Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳ、９５：ｐ３５９７−３６０２、１９９８年）を介する破骨細胞の形成および再吸収を骨芽細胞／間質細胞が刺激するのを媒介する別のシグナルとして、ＮＦ−κＢリガンドのレセプター活性化因子（ＲＡＮＫＬ、別名ＴＲＡＮＣＥ、ＯＤＦおよびＯＰＧＬ）がある（スダほか（Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、エンドクリノロジカル・レビュー（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ）、１３：ｐ６６−８０、１９９２年）。また、骨芽細胞は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ、別名ＯＣＩＦ）と呼ばれる、破骨細胞形成を強力に阻害するタンパク質を分泌し、このタンパク質はＲＡＮＫＬのおとりレセプターとしての作用することにより、ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬを介する、破骨細胞および骨芽細胞間の正のシグナルを阻害する。
【０００５】
破骨細胞は無機および有機骨基質の両者の溶解に関与している（ブレアほか（Ｂｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、１０２：ｐ１１６４−１１７２、１９８６年）。破骨細胞は、特殊化した膜領域、ならびに酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）（アンダーソンほか（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７９年）、炭酸脱水酵素ＩＩ（バーネネンほか（Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヒストケミストリー（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、７８：ｐ４８１−４８５、１９８３年）、カルシトニンレセプター（ワルシャフスキーほか（Ｗａｒｓｈａｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ボーン（Ｂｏｎｅ）、６：ｐ１７９−１８５、１９８５年）およびビトロネクチンレセプター（デービスほか（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、１０９：ｐ１８１７−１８２６、１９８９年）など数種の膜および細胞質マーカを有する二極化した特有の形態を示す最終分化細胞である。通常、多核破骨細胞に含まれる核は１０個未満であるが、直径が１０μｍと１００μｍとの間の核を１００個まで含むことがある（ゲスリングほか（Ｇｏｅｔｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・オーソペディックス・アンド・リレイテッド・リサーチ（Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒ．）、１２０：ｐ２０１−２２８、１９７６年）。このことにより、この細胞の同定を光学顕微鏡で行うことが比較的容易になる。この細胞は、活動状態にある場合、高度に空胞化しており、また、多数のミトコンドリアを含んでいることから代謝率が高いことが分かる（マンディ（Ｍｕｎｄｙ）、「代謝性骨疾患および鉱質代謝疾患に関する手引き（Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」ｐ１８−２２、１９９０年）。破骨細胞が骨溶解性骨転移において主要な役割を果たしていることから、当該分野では、破骨細胞の刺激を防止する新規な薬剤および方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
すなわち、当該分野では、骨溶解性骨転移を含む癌転移を予防もしくは治療するための新規な薬剤および方法を特定することがなお求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要約）
本発明の組成物および方法は、当該分野における前述および他の関連ニーズを満たすものである。本発明の一実施形態として、転移性癌に罹患している被験体に対して治療的に有効な量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することにより転移性癌に伴う骨量減少を予防することを含む、骨転移を予防する方法を提供する。本発明の別の実施形態として、骨転移性癌に罹患している被験体に対して治療的に有効な量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することにより、転移性癌に伴う骨量減少の重症度を緩和することを含む、この被験体を治療する方法を提供する。関連する実施形態として、上記被験体が哺乳動物である前述の方法、もしくはこの哺乳動物がヒトである前述の方法を提供する。
【０００８】
本発明の方法では、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）との相互作用を阻害することによって治療効果を達成することが企図されている。さらに、このＭ−ＣＳＦ／Ｍ−ＣＳＦＲ相互作用を阻害することが、腫瘍細胞が誘発する破骨細胞の増殖および／または分化を阻害することが企図されている。本発明の一実施形態として、前述の方法のＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；その抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；またはＭ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドからなる群から選ばれる。
【０００９】
本発明の別の実施形態として、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体である前述の方法を提供する。関連の実施形態として、このＭ−ＣＳＦアンタゴニストは抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチドである。さらに別の関連実施形態として、このＭ−ＣＳＦアンタゴニストはＭ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドである。さらに別の関連実施形態としてこのＭ−ＣＳＦアンタゴニストはＭ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドである。
【００１０】
本発明の別の実施形態として、上記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストは、ポリクロナール抗体；モノクロナール抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および上記抗体のうちの任意の１つのムテインからなる群から選ばれる抗体である。さらに別の実施形態として、この抗体はモノクロナール抗体５Ｈ４（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１００２７）と同じエピトープに結合する。
【００１１】
いくつかの転移性癌が本明細書に開示した方法の対象となることが企図されている。一実施形態として、こうした転移性癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性腫瘍（白血病、リンパ腫が挙げられる）；頭頚部癌；消化管癌（胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌が挙げられる）；女性生殖管の悪性腫瘍（卵巣癌、子宮内膜癌および子宮頚癌が挙げられる）；膀胱癌；神経芽細胞腫などの脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；皮膚癌（悪性黒色腫もしくはへん平上皮癌が挙げられる）である。
【００１２】
また、治療的有効用量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することについても本発明によって企図されている。一実施形態として、このＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、約０．０１ｍｇ／ｋｇと約１００ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与される抗体である。
【００１３】
本発明の別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体を治療するための、Ｍ−ＣＳＦに結合する、マウス以外の抗体であって、この転移性癌に伴う骨量減少の重症度を効果的に緩和する抗体を提供する。
【００１４】
本明細書中に記載されるように、本発明の抗体は骨溶解を阻害する。本発明の一実施形態として、５Ｈ４と同じＭ−ＣＳＦのエピトープに特異的に結合するマウス以外のモノクロナール抗体を提供する。別の実施形態として、Ｍ−ＣＳＦへの結合に関して５Ｈ４と競合するマウス以外のモノクロナール抗体を提供する。このマウス以外のモノクロナール抗体がＭ−ＣＳＦへの結合に関して５Ｈ４と競合する量は、好ましくは１０％超、より好ましくは２５％超、さらに好ましくは５０％超、さらに好ましくは７５％超、最も好ましくは９０％超である。
【００１５】
前述の抗体のいずれもこれを必要とする被験体への投与に用いることができることが企図されている。これに応じて、本発明の一実施形態では、前述の抗体のうちの任意の１抗体および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤もしくは希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明の一実施形態として、転移性癌に罹患している被験体を治療するためのマウス以外の抗体であって、この転移性癌に伴う骨量減少の重症度を効果的に緩和する抗体を提供する。これに関連した実施形態として、上記抗体は、ポリクロナール抗体；モノクロナール抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および上記抗体のうちの任意の１つのムテインからなる群から選ばれる。別の実施形態として、この抗体はＭ−ＣＳＦに対して特異的な抗体である。本発明のさらに別の実施形態として、この抗体はＭ−ＣＳＦＲに対して特異的な抗体である。他の実施形態として、この抗体は完全にヒト抗体、もしくはヒト化抗体である。本発明のさらに別の実施形態として、上記抗体の１種を分泌するハイブリドーマを提供する。
【００１７】
いくつかの転移性癌が本明細書に開示した抗体の対象となることが企図されている。一実施形態として、こうした転移性癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性腫瘍（白血病、リンパ腫が挙げられる）；頭頚部癌；消化管癌（胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌が挙げられる）；女性生殖管の悪性腫瘍（卵巣癌、子宮内膜癌および子宮頚癌が挙げられる）；膀胱癌；神経芽細胞腫などの脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；皮膚癌（悪性黒色腫もしくはへん平上皮癌が挙げられる）である。これに関連した実施形態として、上記抗体および薬学的に適したキャリア、賦形剤もしくは希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００１８】
癌転移に伴う骨量減少を予防もしくは治療するのに有用となる可能性のあるＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、種々のアッセイ法を用いてスクリーニングすることができる。本発明の一実施形態として、転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞および候補アンタゴニストを接触させる工程、破骨細胞の形成、増殖および／または分化を検出する工程、ならびに破骨細胞の形成、増殖および／または分化の低減が検出される場合に上記候補アンタゴニストをＭ−ＣＳＦアンタゴニストであると同定する工程を含む、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。これに関連した実施形態として、上記転移性腫瘍細胞培地が腫瘍細胞を含むスクリーニング方法を企図する。
【００１９】
本発明の別の実施形態として、上記接触工程がインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で行われ、上記検出工程が骨転移の大きさおよび／または数を検出することを含み、ならびに上記候補アンタゴニストが、骨転移の大きさおよび／または数の減少が検出される場合に、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストであると特定される方法を提供する。関連する実施形態において、この方法は、さらに、上記候補アンタゴニストがＭ−ＣＳＦに結合するかどうかを決定する工程を含む。さらに別の実施形態として、上記方法は、さらに、上記候補アンタゴニストがＭ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害するかどうかを決定する工程を含む。
【００２０】
本明細書に開示した各種スクリーニング方法を用いて、いくつかの異なるアンタゴニストを同定することができることが企図されている。一実施形態として、上記候補アンタゴニストが抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；その抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；またはＭ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；ペプチド；または低分子からなる群から選ばれる方法を提供する。これに関連した実施形態として、この候補アンタゴニストがＭ−ＣＳＦムテインである方法を提供する。さらに別の関連実施形態として、この候補アンタゴニストが抗Ｍ−ＣＳＦ抗体である方法を提供する。別の実施形態として、この候補アンタゴニストはＭ−ＣＳＦムテインである。別の関連実施形態として、この候補アンタゴニストは抗Ｍ−ＣＳＦ抗体である。さらに別の実施形態として、この候補アンタゴニストは抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体である。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、候補アンタゴニストのＭ−ＣＳＦへの結合を検出する工程、およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）もしくはインビボでの骨転移性癌に対するこの候補アンタゴニストの予防もしくは治療能をアッセイする工程を含む、骨転移性癌を予防もしくは治療することができるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの同定方法を提供する。これに関連した実施形態として、候補アンタゴニストのＭ−ＣＳＦＲへの結合を検出する工程、およびインビトロもしくはインビボでの骨転移性癌に対するこの候補アンタゴニストの予防もしくは治療能をアッセイする工程を含む、骨転移性癌を予防もしくは治療することができるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの同定方法を提供する。さらに別の実施形態として、Ｍ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害する候補アンタゴニストを同定する工程、およびインビトロもしくはインビボでの骨転移性癌に対するこの候補アンタゴニストの予防もしくは治療能をアッセイする工程を含む、骨転移性癌を予防もしくは治療することができるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの同定方法を提供する。
【００２２】
さらに、２種以上のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを混合して癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少に対する有効性を向上させることは有利であり得る。従って、本発明の一実施形態では、治療的有効量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤を転移性癌に罹患している被験体に対して投与することにより、転移性癌に伴う骨量減少を予防し、腫瘍増殖を予防することを含む、骨転移および腫瘍増殖を予防する方法を提供する。同様に、本発明の別の実施形態では、治療的有効量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよびある治療剤を転移性癌に罹患している被験体に投与することにより、転移性癌に伴う骨量減少の重症度を緩和し、腫瘍増殖を抑制することを含む、この被験体を治療する方法を提供する。これに関連した局面として、上記方法の被験体は哺乳動物である。さらに別の実施形態として、この被験体はヒトである。
【００２３】
本発明の別の実施形態として、上記アンタゴニストがＭ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害する上記方法を提供する。別の実施形態として、このアンタゴニストは腫瘍細胞により誘発される破骨細胞の増殖および／または分化を阻害する。さらに別の実施形態として、このＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；それの抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；Ｍ−ＣＳＦのムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；およびＭ−ＣＳＦＲのムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドからなる群から選ばれる。
【００２４】
本発明では、いくつかのＭ−ＣＳＦアンタゴニスト抗体が企図されている。一実施形態として、この抗体がポリクロナール抗体；モノクロナール抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および上記抗体のうちの任意の１つのムテインからなる群から選ばれる上記方法を提供する。
【００２５】
本発明の別の実施形態として、上記治療剤がビスホスフォネートである上記方法を提供する。別の実施形態として、このビスホスフォネートは、ゼレドロネート（ｚｅｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート（ｔｉｌｕｎｄｒｏｎａｔｅ）、アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、もしくはイバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）である。別の実施形態として、上記治療剤が化学療法剤である上記方法を提供する。ビスホスフォネート投与について一部の被験体を除外することができることが企図されている。例えば、被験体がビスホスフォネートに十分反応しない場合、被験体がビスホスフォネート投与に対して耐容性を示さない場合、またはビスホスフォネートが被験体の特定の病状（例えば、腎不全）に対して禁忌となっている場合には、ビスホスフォネート投与を受けることについてその被験体を除外することができる。癌化学療法剤としては、カルボプラチン、シスプラチンなどのアルキル化剤；ナイトロジェンマスタード系アルキル化剤；カルムスチン（ＢＣＮＵ）などのニトロソウレア系アルキル化剤；メトトレキサートなどの代謝拮抗剤；プリンアナログ系代謝拮抗剤メルカプトプリン；フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビンなどのピリミジンアナログ代謝拮抗剤；ゴセレリン、ロイプロリド、タモキシフェンなどのホルモン性抗腫瘍剤；アルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロンアルファ、パクリタキセル、トレチノイン（ＡＴＲＡ）などの天然由来抗腫瘍剤；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンなどの天然由来抗腫瘍性抗生物質；およびビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンなどの天然由来抗腫瘍性ビンカアルカロイド；ヒドロキシウレア；アセグラトン、アドリアマイシン、イホスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍性多糖類、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミド、シゾフィラン、シタラビン、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ネオカルチノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプレオマイシン、ベスタチン（ウベニメクス）、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
さらに、癌患者に対して補助療法として用いる別の薬剤としては、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビール；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；突然変異体およびアナログを含むインターロイキン１〜１８；インターフェロンα、βおよびγなどのインターフェロンまたはサイトカイン；黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）とそのアナログ、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）などのホルモン；トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子相同性因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）などの成長因子；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−α＆β）；浸潤抑制因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１〜７（ＢＭＰ１−７）；ソマトスタチン；サイモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管新生因子；抗原性物質；プロドラッグ；成長因子レセプターキナーゼインヒビター；抗Ｈｅｒ２抗体；およびＶＥＧＦ中和抗体が挙げられる。
【００２７】
これに関連した実施形態として、上記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストは、治療効果を達成するのに必要な治療剤の投与量を低減させるのに有効である。すなわち、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストは、上記の別の治療剤の有効性を向上させることができ、またはこの別の治療剤の投与に伴う副作用を軽減させることができ、あるいはこの別の治療剤の安全性を向上させることができる。また、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストは、手術、放射線療法といった別の治療法の有効性を向上させ、または副作用を軽減させ、あるいは安全性を向上させることもできる。さらに別の関連実施形態として、前述の方法は、さらに、Ｍ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦを投与する工程を含む。本発明のさらに別の実施形態として、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストおよび癌治療剤を含む薬学的組成物を提供する。
【００２８】
本発明の別の実施形態として、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを含む薬剤と、この薬剤が手術もしくは放射線療法との併用で使用することになっているとの使用説明書とを収容しているパッケージ、バイアルもしくは容器を提供する。本発明の別の実施形態として、被験体にＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する工程およびこの被験体に手術もしくは放射線療法を施行する工程を含む、骨転移性癌を予防もしくは治療する方法を提供する。
【００２９】
Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストは免疫療法剤として有用な場合があることが企図されている。従って、本発明の一実施形態では、膜結合Ｍ−ＣＳＦ（配列番号：２）の細胞外部分に特異的に結合する抗体を投与する工程を含む、細胞表面に膜結合Ｍ−ＣＳＦを発現している腫瘍細胞を標的化する方法を提供する。別の実施形態として、この抗体は、放射性核種または他の毒素に結合している。さらに別の実施形態として、この抗体は、ポリクロナール抗体；モノクロナール抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および上記抗体のうちの任意の１つのムテインからなる群から選ばれる。
【００３０】
さらに別の局面として、本発明では、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を用いて細胞表面に膜結合Ｍ−ＣＳＦを発現している腫瘍細胞を標的化することによる、免疫療法に基づく癌治療方法が企図されている。本明細書の実施例では、種々の癌細胞が膜結合型Ｍ−ＣＳＦを発現していることを示しており、このような癌としては、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、骨肉腫および甲状腺癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。従って、本発明では、Ｍ−ＣＳＦに結合する有効量の抗体単独、もしくはこれに細胞傷害性成分を結合させたものを投与する工程を含む、膜結合Ｍ−ＣＳＦを発現している腫瘍細胞を殺傷またはその増殖を阻害する方法が企図されている。抗体は膜結合Ｍ−ＣＳＦに対して特異的であることが望ましいが、膜結合Ｍ−ＣＳＦの細胞外部分に結合する抗体はいずれも、こうした方法において有用である。
【００３１】
また、本発明では、本発明のＭ−ＣＳＦアンタゴニストのうちの任意の１種が、非転移性癌を含む癌の治療に有用とすることができることが企図されている。別の局面として、本発明では、高カルシウム血症、ページェット病、もしくは骨粗鬆症の治療に、本発明のアンタゴニストのうちの任意の１種を使用することが企図されている。
【００３２】
本発明の一実施形態として、癌に罹患している被験体を治療する方法であって、この癌を構成する細胞はＭ−ＣＳＦを分泌しないものであり、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。これに関連した実施形態として、転移性癌に罹患している被験体に対して、この被験体の細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量であると同時にその癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することを含む、骨転移を予防する方法を提供する。さらに別の実施形態として、骨転移性癌に罹患している被験体に対して、この被験体の細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量であると同時にその癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することを含む、この被験体を治療する方法を提供する。
【００３３】
本発明では様々な使用が企図されている。例えば、本発明の一実施形態では、上記抗体のうちの任意の抗体を医薬用として提供する。同様に、転移性癌に罹患している被験体の骨転移を予防する薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体においてこの癌に伴う骨量減少を予防する薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。さらに別の実施形態として、骨転移性癌に罹患している被験体を治療する薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。さらに別の実施形態として、骨転移性癌に罹患している被験体においてこの癌に伴う骨量減少の重症度を緩和する薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。
【００３４】
本明細書に開示した方法およびＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用により恩恵を受ける被験体としては数多くの被験体が企図されている。一実施形態として、この被験体は哺乳動物である。別の実施形態として、この哺乳動物はヒトである。
【００３５】
本発明の別の実施形態として、前述の使用であって、上記アンタゴニストがＭ−ＣＳＦとそのレセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）との相互作用を阻害する使用を提供する。別の実施形態として、このアンタゴニストは、腫瘍細胞により誘発される破骨細胞の増殖および／または分化を阻害するものである。さらに別の実施形態として、このＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；それの抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；またはＭ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドからなる群から選ばれる。これに関連した実施形態として、こうした抗体は、ポリクロナール抗体；モノクロナール抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および上記抗体もしくは断片のうちの任意の１つのムテインからなる群から選ばれる。
【００３６】
本発明の別の実施形態として、前述の使用であって、上記抗体がＭ−ＣＳＦに特異的であることを特徴とする使用を提供する。これに関連した実施形態として、この抗体は抗体５Ｈ４である。さらに別の関連実施形態として、この抗体はＭ−ＣＳＦＲに特異的なものである。
【００３７】
本発明の前述の使用に関連して、数多くの転移性癌が標的として企図されている。一実施形態として、こうした転移性癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、血液細胞悪性腫瘍（白血病、リンパ腫が挙げられる）；頭頚部癌；消化管癌（胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌が挙げられる）；女性生殖管の悪性腫瘍（卵巣癌、子宮内膜癌および子宮頚癌が挙げられる）；膀胱癌；神経芽細胞腫などの脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；皮膚癌（悪性黒色腫もしくはへん平上皮癌が挙げられる）である。別の実施形態として、前述の使用におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、約０．０１ｍｇ／ｋｇと約１００ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与される抗体である。
【００３８】
本発明では、数多くの薬剤が企図されている。例えば、転移性癌に罹患している被験体を治療するための薬剤の製造における前述の使用を提供する。別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体においてこの癌に伴う骨量減少の重症度を緩和する薬剤の製造における上記抗体の使用を提供する。さらに別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体において骨への転移および腫瘍増殖を予防するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用を提供する。別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体においてこの癌に伴う骨量減少を予防するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用を提供する。
【００３９】
別の実施形態として、転移性癌を治療するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用を提供する。別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体において癌に伴う骨量減少の重症度を緩和し、腫瘍増殖を抑制するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用を提供する。さらに別の実施形態として、癌の治療において同時的、個別的、もしくは逐次的に用いるための組合せ製剤としてのＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤を含む製品を提供する。
【００４０】
本発明の別の実施形態として、骨転移性癌の予防もしくは治療用の薬剤の調製におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用であって、この薬剤が癌治療剤と同時的、個別的、もしくは逐次的に投与される使用を提供する。別の実施形態として、骨転移性癌の予防もしくは治療用の薬剤の調製における癌治療剤の使用であって、この薬剤がＭ−ＣＳＦアンタゴニストと同時的、個別的、もしくは逐次的に投与される使用を提供する。さらに別の実施形態として、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを含む薬剤と、この薬剤が手術もしくは放射線療法との併用で使用されるべきであるとの使用説明書とを収容しているパッケージ、バイアルもしくは容器を提供する。さらに、前述の使用であって、上記被験体が哺乳動物である使用を提供する。さらに、前述の使用であって、この哺乳動物がヒトである使用を提供する。別の実施形態として、前述の使用のアンタゴニストは、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害する。さらに別の実施形態として、このアンタゴニストは、腫瘍細胞により誘発される破骨細胞の増殖および／または分化を阻害する。
【００４１】
別の実施形態として、前述の使用であって、上記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；それの抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；Ｍ−ＣＳＦのムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；またはＭ−ＣＳＦＲのムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドからなる群から選ばれる使用を提供する。さらに、別の実施形態では、上記抗体は、ポリクロナール抗体；モノクロナール抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および上記抗体のうちの任意の１つのムテインからなる群から選ばれる。
【００４２】
本発明では、数多くの治療剤が企図されている。一実施形態として、前述の使用であって、上記治療剤がビスホスフォネートである使用を提供する。さらに、別の実施形態として、このビスホスフォネートは、ゼレドロネート（ｚｅｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート（ｔｉｌｕｎｄｒｏｎａｔｅ）、アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、もしくはイバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）である。別の実施形態として、この治療剤は化学療法剤である。これに関連した実施形態として、上記被験体をビスホスフォネート処置を受けることから除外する。
【００４３】
本発明の別の実施形態として、被験体に投与する治療剤の用量を下げて骨転移および腫瘍増殖を治療もしくは予防するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体において骨転移および腫瘍増殖を予防するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用を提供する。さらに別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体においてこの癌に伴う骨量減少を予防するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用を提供する。
【００４４】
本発明の別の実施形態として、転移性癌を治療するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用を提供する。別の実施形態として、転移性癌に罹患している被験体においてこの癌に伴う骨量減少の重症度を緩和し、腫瘍増殖を抑制するための薬剤の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用を提供する。これに関連した実施形態として、前述の使用であって、上記のＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子がＧ−ＣＳＦである使用を提供する。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、細胞表面に膜結合Ｍ−ＣＳＦを発現している腫瘍細胞を標的化するための薬剤の製造における、膜結合Ｍ−ＣＳＦの細胞外部分に特異的に結合する抗体の使用を提供する。別の実施形態として、癌治療用薬剤の製造における、（ａ）膜結合Ｍ−ＣＳＦの細胞外部分に特異的に結合し、および（ｂ）放射性核種またはその他の毒素と結合している抗体の使用を提供する。これに関連した実施形態として、前述の使用であって、上記抗体がポリクロナール抗体；モノクロナール抗体；ヒト化抗体；ヒト抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および上記抗体のうちの任意の１つのムテインからなる群から選ばれる使用を提供する。
【００４６】
本発明の別の実施形態として、癌治療用薬剤の製造におけるマウス以外の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の使用を提供する。これに関連した実施形態として、この癌を構成する細胞はＭ−ＣＳＦを分泌しない細胞である。本発明の別の実施形態として、骨転移予防用薬剤の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。別の実施形態として、被験体の細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するための薬剤の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。さらに別の実施形態として、骨転移性癌に罹患している被験体を治療するための薬剤の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。さらに別の実施形態として、癌治療用薬剤の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用を提供する。
【００４７】
また、キットも本発明の範囲内に企図されている。代表的なキットの中には、本発明のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを含むパッケージ、容器もしくはバイアルと、ユーザーに対し本発明の方法のうちの任意の方法に従って上記薬学的処方物を使用するよう指示する製品の添付文書もしくはラベルなどの使用説明書とを備えることができる。
本願発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
骨転移を予防する方法であって、該方法は、転移性癌に罹患している被験体に治療的に有効量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することにより該転移性癌に伴う骨量減少を防止する工程を包含する、方法。
（項目２）
骨に対する転移性癌に罹患している被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体に治療的に有効量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与することにより該転移性癌に伴う骨量減少の重症度を緩和する工程を包含する、方法。
（項目３）
前記被験体が、哺乳動物である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目３に記載の方法。
（項目５）
項目４に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）との相互作用を阻害する、方法。
（項目６）
項目５に記載の方法であって、前記アンタゴニストが、腫瘍細胞により誘発される破骨細胞の増殖および／または分化を阻害する、方法。
（項目７）
項目５に記載の方法であって、前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストは、以下：
ａ）抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；
ｂ）その抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；
ｃ）Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；または
ｄ）Ｍ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；からなる群より選択される、方法。
（項目８）
前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチドである、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドである、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチドである、項目７に記載の方法。
（項目１２）
項目８または９に記載の方法であって、前記抗体は、以下：
ａ）ポリクロナール抗体；
ｂ）モノクロナール抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）ヒト抗体；
ｅ）キメラ抗体；
ｆ）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のうちの任意の１種のムテイン；
からなる群より選択される、方法。
（項目１３）
項目８に記載の方法であって、前記抗体がモノクロナール抗体５Ｈ４（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１００２７）と同じエピトープに結合する、方法。
（項目１４）
項目７に記載の方法であって、前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病およびリンパ腫を含む血液細胞悪性腫瘍；頭頚部癌；胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌を含む消化管癌；卵巣癌、子宮内膜癌、および子宮頚癌を含む女性生殖管の悪性腫瘍；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；および悪性黒色腫またはへん平上皮癌を含む皮膚癌である、方法。
（項目１５）
項目８に記載の方法であって、前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、約０．０１ｍｇ／ｋｇと約１００ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与される抗体である、方法。
（項目１６）
転移性癌に罹患している被験体を処置するための、Ｍ−ＣＳＦに結合するマウス以外の抗体であって、該転移性癌に伴う骨量減少の重症度を効果的に緩和する、抗体。
（項目１７）
モノクロナール抗体５Ｈ４と同じＭ−ＣＳＦのエピトープに特異的に結合する、マウス以外のモノクロナール抗体。
（項目１８）
モノクロナール抗体５Ｈ４と競合して７５％より高くＭ−ＣＳＦに結合する、マウス以外のモノクロナール抗体。
（項目１９）
転移性癌に罹患している被験体を処置するための、Ｍ−ＣＳＦＲに結合するマウス以外の抗体であって、該転移性癌に伴う骨量減少の重症度を効果的に緩和する、抗体。
（項目２０）
項目１６に記載の抗体であって、以下：
ａ）ポリクロナール抗体；
ｂ）モノクロナール抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）ヒト抗体；
ｅ）キメラ抗体；
ｆ）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のうちの任意の１種のムテイン；
からなる群より選択される、抗体。
（項目２１）
前記抗体が、Ｍ−ＣＳＦに特異的である、項目２０に記載の抗体。
（項目２２）
前記抗体が、Ｍ−ＣＳＦＲに特異的である、項目２０に記載の抗体。
（項目２３）
前記抗体が、完全にヒト抗体である、項目２０に記載の抗体。
（項目２４）
前記抗体が、ヒト化抗体である、項目２０に記載の抗体。
（項目２５）
項目２３に記載の抗体を分泌する、ハイブリドーマ。
（項目２６）
項目２０に記載の抗体であって、前記癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病およびリンパ腫を含む血液細胞悪性腫瘍；頭頚部癌；胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌を含む消化管癌；卵巣癌、子宮内膜癌、および子宮頚癌を含む女性生殖管の悪性腫瘍；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；および悪性黒色腫またはへん平上皮癌を含む皮膚癌である、抗体。
（項目２７）
項目１７〜２６の抗体のうちの任意の１抗体および薬学的に適したキャリア、賦形剤または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
（項目２８）
Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストのスクリーニング方法であって、以下、
ａ）転移性腫瘍細胞培地、破骨細胞および候補アンタゴニストを接触させる工程；
ｂ）破骨細胞の形成、増殖および／または分化を検出する工程；ならびに
ｃ）破骨細胞の形成、増殖および／または分化の低減が検出される場合に、該候補アンタゴニストを、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストであると同定する工程；
を包含する、方法。
（項目２９）
前記転移性腫瘍細胞培地が、腫瘍細胞を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
項目２８に記載の方法であって、前記接触工程（ａ）が、インビボで行われ、前記検出工程（ｂ）が、骨転移の大きさおよび／または数を検出する工程を包含し、そして、骨転移の大きさおよび／または数の減少が検出される場合に、前記候補アンタゴニストがＭ−ＣＳＦアンタゴニストとして同定される、方法。
（項目３１）
項目２８に記載の方法であって、前記候補アンタゴニストがＭ−ＣＳＦに結合するか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
（項目３２）
項目２８に記載の方法であって、前記候補アンタゴニストがＭ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害するか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
（項目３３）
項目２８に記載の方法であって、前記候補アンタゴニストが、以下：
ａ）抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；
ｂ）その抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；
ｃ）Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；
ｄ）Ｍ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；
ｅ）ペプチド；または
ｆ）低分子；
からなる群より選択される、方法。
（項目３４）
前記候補アンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦムテインである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記候補アンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦＲムテインである、項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記候補アンタゴニストが、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体である、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
前記候補アンタゴニストが、抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体である、項目３３に記載の方法。
（項目３８）
骨に対する転移性癌を予防または処置し得るＭ−ＣＳＦアンタゴニストを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ｍ−ＣＳＦに対する候補アンタゴニストの結合を検出する工程；および
（ｂ）インビトロもしくはインビボにおいて該候補アンタゴニストの骨に対する転移性癌を予防もしくは処置する能力をアッセイする工程；
を包含する、方法。
（項目３９）
骨に対する転移性癌を予防または処置し得るＭ−ＣＳＦアンタゴニストを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ｍ−ＣＳＦＲに対する候補アンタゴニストの結合を検出する工程；および
（ｂ）インビトロもしくはインビボにおいて該候補アンタゴニストの骨に対する転移性癌を予防もしくは処置する能力をアッセイする工程；
を包含する、方法。
（項目４０）
骨に対する転移性癌を予防または処置し得るＭ−ＣＳＦアンタゴニストを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ｍ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害する候補アンタゴニストを同定する工程；および
（ｂ）インビトロもしくはインビボにおいて該候補アンタゴニストの骨に対する転移性癌を予防もしくは処置する能力をアッセイする工程；
を包含する、方法。
（項目４１）
骨転移および腫瘍増殖を防止する方法であって、転移性癌に罹患している被験体に対して治療的に有効量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤を投与することにより該転移性癌に伴う骨量減少を防止し、腫瘍増殖を防止する工程を包含する、方法。
（項目４２）
転移性癌に罹患している被験体を処置する方法であって、該被験体に対して治療的に有効量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤を投与することにより該転移性癌に伴う骨量減少の重症度を緩和し、腫瘍増殖を抑制する工程を包含する、方法。
（項目４３）
前記被験体が、哺乳動物である、項目４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記アンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記アンタゴニストが、腫瘍細胞により誘発される破骨細胞の増殖および／または分化を阻害する、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
項目４５に記載の方法であって、前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、以下：
ａ）抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；
ｂ）その抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；
ｃ）Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；および
ｄ）Ｍ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；
からなる群より選択される、方法。
（項目４８）
項目４７に記載の方法であって、前記抗体が、以下：
ａ）ポリクロナール抗体；
ｂ）モノクロナール抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）ヒト抗体；
ｅ）キメラ抗体；
ｆ）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のうちの任意の１種のムテイン；
からなる群より選択される、方法。
（項目４９）
前記治療剤が、ビスホスフォネートである、項目４１または４２に記載の方法。
（項目５０）
前記ビスホスフォネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネート、またはイバンドロネートである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記治療剤が、化学療法剤である、項目４１または４２に記載の方法。
（項目５２）
前記被験体が、ビスホスフォネート処置から除外される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、治療効果を達成するために必要な治療剤の投薬量を低減するのに効果的である、項目４１または４２に記載の方法。
（項目５４）
項目４１または４２に記載の方法であって、Ｍ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子、例えばＧ−ＣＳＦを投与する工程をさらに包含する、方法。
（項目５５）
Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストおよび癌治療剤を含有する、薬学的組成物。
（項目５６）
Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを含有する医薬、および該医薬が手術もしくは放射線療法との組み合わせで使用されるべきであるという指示書とを含むパッケージ、バイアルまたは容器。
（項目５７）
被験体にＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する工程および該被験体を手術もしくは放射線療法により処置する工程を包含する、骨に対する転移性癌の予防もしくは処置の方法。
（項目５８）
膜結合Ｍ−ＣＳＦの細胞外部分に特異的に結合する抗体を投与する工程を包含する、細胞表面に膜結合Ｍ−ＣＳＦを発現している腫瘍細胞を標的する方法。
（項目５９）
前記抗体が、放射性核種もしくは他の毒素に結合している、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
項目５９に記載の方法であって、前記抗体が：
ａ）ポリクロナール抗体；
ｂ）モノクロナール抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）ヒト抗体；
ｅ）キメラ抗体；
ｆ）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のうちの任意の１種のムテイン；
からなる群より選択される、方法。
（項目６１）
癌を罹患する被験体を処置する方法であって、該癌を含む細胞が、Ｍ−ＣＳＦを分泌せず、該方法が、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する工程を包含する、方法。
（項目６２）
骨転移を予防する方法であって、転移性癌に罹患している被験体に、該被験体の細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する工程を包含し、該量が該癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超えるものである、方法。
（項目６３）
骨に対する転移性癌に罹患している被験体を処置する方法であって、該被験体に、該被験体の細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを投与する工程を包含し、該量が該癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超えるものである、方法。
（項目６４）
医薬に使用するための、項目１６〜２５のいずれか１項に記載の抗体。
（項目６５）
転移性癌に罹患している被験体の骨転移を予防する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目６６）
転移性癌に罹患している被験体の該癌に伴う骨量減少を予防する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目６７）
骨に対する転移性癌に罹患している被験体を処置する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目６８）
骨に対する転移性癌に罹患している被験体の該癌に伴う骨量減少の重症度を緩和する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目６９）
前記被験体が、哺乳動物である、項目６５〜６８に記載の使用。
（項目７０）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目６９に記載の使用。
（項目７１）
前記アンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）との相互作用を阻害する、項目７０に記載の使用。
（項目７２）
前記アンタゴニストが、腫瘍細胞により誘発される破骨細胞の増殖および／または分化を阻害する、項目７１に記載の使用。
（項目７３）
項目７１に記載の使用であって、前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、以下：
ａ）抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；
ｂ）その抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；
ｃ）Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；または
ｄ）Ｍ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；
からなる群より選択される、使用。
（項目７４）
項目７３に記載の使用であって、前記抗体が、以下：
ａ）ポリクロナール抗体；
ｂ）モノクロナール抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）ヒト抗体；
ｅ）キメラ抗体；
ｆ）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のうちの任意の１種のムテイン；
からなる群より選択される、使用。
（項目７５）
前記抗体が、Ｍ−ＣＳＦに特異的である、項目７４に記載の使用。
（項目７６）
前記抗体が、抗体５Ｈ４である、項目７５に記載の使用。
（項目７７）
前記抗体が、Ｍ−ＣＳＦＲに特異的である、項目７４に記載の使用。
（項目７８）
項目７３に記載の使用であって、前記転移性癌が、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、前立腺癌、腺癌、白血病およびリンパ腫を含む血液細胞悪性腫瘍；頭頚部癌；胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌を含む消化管癌；卵巣癌、子宮内膜癌、および子宮頚癌を含む女性生殖管の悪性腫瘍；膀胱癌；神経芽細胞腫を含む脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；および悪性黒色腫またはへん平上皮癌を含む皮膚癌である、使用。
（項目７９）
前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、約０．０１ｍｇ／ｋｇと約１００ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与される抗体である、項目６５〜６８に記載の使用。
（項目８０）
転移性癌に罹患している被験体を処置する医薬の製造における、項目１６〜２５のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目８１）
転移性癌に罹患している被験体の、該癌に伴う骨量減少の重症度を緩和する医薬の製造における、項目１６〜２５のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目８２）
転移性癌に罹患している被験体の骨転移および腫瘍増殖を防止する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用。
（項目８３）
転移性癌に罹患している被験体の該癌に伴う骨量減少を予防する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用。
（項目８４）
転移性癌を処置する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用。
（項目８５）
転移性癌に罹患している被験体において、癌に伴う骨量減少の重症度を緩和し、腫瘍増殖を抑制する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤の使用。
（項目８６）
癌の処置における同時的、個別的もしくは逐次的使用のための組合せ調製物としてＭ−ＣＳＦアンタゴニストおよび治療剤を含む、製品。
（項目８７）
骨に対する転移性癌の予防もしくは処置のための医薬の調製におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用であって、該医薬が癌治療剤と同時に、別個にもしくは逐次的に投与される、使用。
（項目８８）
骨に対する転移性癌の予防もしくは処置のための医薬の調製における癌治療剤の使用であって、該医薬がＭ−ＣＳＦアンタゴニストと同時に、別個にもしくは逐次的に投与される、使用。
（項目８９）
Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを含有する医薬、および該医薬が手術もしくは放射線療法との組み合わせで使用されるべきであるという指示書とを含むパッケージ、バイアルもしくは容器。
（項目９０）
前記被験体が、哺乳動物である、項目８２〜８５に記載の使用。
（項目９１）
前記哺乳動物が、ヒトである、項目８６に記載の使用。
（項目９２）
前記アンタゴニストが、Ｍ−ＣＳＦとそのレセプターＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害する、項目９０に記載の使用。
（項目９３）
前記アンタゴニストが、腫瘍細胞により誘発される破骨細胞の増殖および／または分化を阻害する、項目８２〜８５に記載の使用。
（項目９４）
項目９２に記載の使用であって、前記Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが、以下：
ａ）抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を含むポリペプチド；
ｂ）その抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を含むポリペプチド；
ｃ）Ｍ−ＣＳＦムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；または
ｄ）Ｍ−ＣＳＦＲムテインもしくはその誘導体を含む可溶性ポリペプチド；
からなる群より選択される、使用。
（項目９５）
項目９４に記載の使用であって、前記抗体が、以下：
ａ）ポリクロナール抗体；
ｂ）モノクロナール抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）ヒト抗体；
ｅ）キメラ抗体；
ｆ）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のうちの任意の１種のムテイン；
からなる群より選択される、使用。
（項目９６）
前記治療剤が、ビスホスフォネートである、項目８２〜８５に記載の使用。
（項目９７）
項目９６に記載の使用であって、前記ビスホスフォネートが、ゼレドロネート、パミドロネート、クロドロネート、エチドロネート、チルンドロネート、アレンドロネート、またはイバンドロネートである、使用。
（項目９８）
前記治療剤が、化学療法剤である、項目８２〜８５に記載の使用。
（項目９９）
前記被験体が、ビスホスフォネート処置から除外される、項目５１に記載の使用。
（項目１００）
被験体に投与する治療剤の用量を低減させて骨転移および腫瘍増殖を処置または予防するための医薬の製造におけるＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目１０１）
転移性癌に罹患している被験体の骨転移および腫瘍増殖を防止する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用。
（項目１０２）
転移性癌に罹患している被験体の該癌に伴う骨量減少を予防する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用。
（項目１０３）
転移性癌を処置する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用。
（項目１０４）
転移性癌に罹患している被験体において癌に伴う骨量減少の重症度を緩和し、腫瘍増殖を抑制する医薬の製造における、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト、治療剤およびＭ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子の使用。
（項目１０５）
前記Ｍ−ＣＳＦ以外のコロニー刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦである、項目１０１〜１０３のいずれか１項に記載の使用。
（項目１０６）
細胞表面に膜結合Ｍ−ＣＳｆを発現している腫瘍細胞を標的する医薬の製造における、膜結合Ｍ−ＣＳＦの細胞外部分に特異的に結合する抗体の使用。
（項目１０７）
癌処置用医薬の製造における、（ａ）膜結合Ｍ−ＣＳＦの細胞外部分に特異的に結合し、（ｂ）放射性核種もしくは他の毒素に結合している抗体の使用。
（項目１０８）
項目１０７に記載の使用であって、前記抗体が、以下：
ａ）ポリクロナール抗体；
ｂ）モノクロナール抗体；
ｃ）ヒト化抗体；
ｄ）ヒト抗体；
ｅ）キメラ抗体；
ｆ）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２もしくはＦｖ抗体フラグメント；および
ｇ）ａ）〜ｆ）のうちの任意の１種のムテイン；
からなる群より選択される、使用。
（項目１０９）
癌処置用医薬の製造におけるマウス以外の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体の使用。
（項目１１０）
前記癌を含む細胞が、Ｍ−ＣＳＦを分泌しない、項目１０９に記載の使用。
（項目１１１）
骨転移を予防する医薬の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目１１２）
被験体の細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和する医薬の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目１１３）
骨に対する転移性癌に罹患している被験体を処置する医薬の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
（項目１１４）
癌処置用医薬の製造における、癌細胞により産生されるＭ−ＣＳＦを中和するのに有効な量を超える量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの使用。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、切断されたダイマーＭ−ＣＳＦのジスルフィド結合を示すトポロジーダイアグラムである。
【図２】図２は、１０残基目ごとに標識し、点線で非結晶対称軸を示したＣ−アルファ主鎖のステレオダイアグラムである。
【図３】図３は、精製Ｍ−ＣＳＦと、ＭＤＡ２３１細胞およびＭＣＦ７細胞による順化培地（ＣＭ）との間で破骨細胞誘導活性を比較した結果である。
【図４】図４は、ＭＤＡ２３１細胞による順化培地に対して、精製Ｍ−ＣＳＦに対するモノクロナール抗体５Ｈ４の中和活性を比較した結果である。
【図５】図５は、ヒトＭ−ＣＳＦに対する５Ｈ４その他の抗体の中和活性を示す。
【図６】図６は、平均骨溶解スコア≧２．５の動物数が５Ａ１抗体＋５Ｈ４抗体の併用投与の群で最も少なかったことを示す。
【図７】図７は、平均骨溶解スコア≧２．５の動物数が５Ａ１抗体＋５Ｈ４抗体の併用投与の群で最も少なかったことを示す。
【図８】図８は、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体が乳癌細胞株ＭＤＡ２３１もしくは多発性骨髄腫癌細胞株ＡＲＨ７７に結合したことを示す。
【図９】図９は、いくつかの癌細胞表面にＭ−ＣＳＦが多く認められることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
（詳細な説明）
転移する能力は癌の決定的な特徴である。転移とは、癌細胞の身体の他の部分への浸潤、もしくはこの浸潤により生じる状態のことを意味する。転移は複雑な多段階のプロセスであり、このプロセスには、細胞の遺伝物質が変化し、この変化した細胞が無制限に増殖することにより原発腫瘍を形成し、この原発腫瘍に対する血液供給が新たに形成され、この原発腫瘍の細胞が循環系に侵入し、小さな塊の原発腫瘍細胞が身体の他の部分へ拡散し、その部位で二次腫瘍が増殖することが含まれる。
骨はヒトの乳癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌および他の癌の最も代表的な転移部位の一つであり、剖検では、癌患者の６０％もが骨転移を有することが分かっている。骨溶解性骨転移では、他の器官への転移には存在しない破骨細胞骨再吸収という特有の段階が見られる。癌転移に伴う骨量の減少は、破骨細胞（鉱質化組織を再吸収する能力を有する多核巨細胞）によって媒介されており、この細胞は腫瘍の産物により活性化されるように思われる。
【００５０】
コロニー刺激因子（ＣＳＦ１）は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）としても知られるが、破骨細胞の形成に不可欠なものであることが分かっている。さらに、Ｍ−ＣＳＦは、他の可溶性因子、ならびに骨芽細胞および線維芽細胞により提供される細胞間相互作用と協働して成熟破骨細胞の破骨機能、移動および生存を調節していることも明らかにされている（フイクセ（Ｆｉｘｅ）、プラロラン（Ｐｒａｌｏｒａｎ）、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）１０：ｐ３−７、１９９８年；マーチンほか（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、クリティカル・レビュー・イン・ユーカリオティック・ジーン・エクスプレッション（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）８：ｐ１０７−２３（１９９８年）。
【００５１】
完全長のヒトＭ−ＣＳＦｍＲＮＡは、５５４個のアミノ酸（配列番号４）の前駆体タンパク質をコードしている。選択的ｍＲＮＡスプライシングおよび差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）翻訳後タンパク質分解プロセッシングによって、Ｍ−ＣＳＦは、プロテオグリカンを含む糖タンパク質もしくはコンドロイチン硫酸として循環中に分泌され得るか、Ｍ−ＣＳＦ産生細胞の表面に膜貫通糖タンパク質として発現され得る。ヒトＭ−ＣＳＦがインビトロで完全な生物学的活性を示すのに必要な最低限の配列である、ヒトＭ−ＣＳＦの細菌に発現させたそのアミノ末端の１５０個のアミノ酸の三次元構造から、このタンパク質は、４つのαヘリックス束と逆平行βシートとからなる各モノマーとジスルフィド結合したダイマーであることが分かる（パンディットほか（Ｐａｎｄｉｔ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５８：ｐ１３５８−６２（１９９２年）。選択的ｍＲＮＡスプライシングによって３つの異なるＭ−ＣＳＦ種が生じる。この３種のポリペプチド前駆体は、アミノ酸２５６個のＭ−ＣＳＦα（配列番号：１および２で示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、アミノ酸５５４個のＭ−ＣＳＦβ（配列番号：３および４で示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）、ならびにアミノ酸４３８個のＭ−ＣＳＦγ（配列番号：５および６で示されるＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）である。Ｍ−ＣＳＦβは、膜結合型では存在しない分泌タンパク質である。Ｍ−ＣＳＦαは、タンパク質分解的切断によりゆっくりと放出される膜内在性タンパク質として発現される。Ｍ−ＣＳＦαは、配列番号：２のアミノ酸１９１〜１９７で切断される。この膜結合型のＭ−ＣＳＦは、近傍細胞のレセプターと相互作用することにより特定の細胞間接触を媒介し得る。
【００５２】
種々の型のＭ−ＣＳＦは、標的細胞のそのレセプターＭ−ＣＳＦＲに結合することにより機能する。Ｍ−ＣＳＦＲ（配列番号：７および８のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列）は、５個の細胞外免疫グロブリン様ドメイン、１個の膜貫通ドメインおよび１個の細胞内分断Ｓｒｃ関連チロシンキナーゼドメインを有する膜貫通分子である。Ｍ−ＣＳＦＲはｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子によってコードされている。Ｍ−ＣＳＦがＭ−ＣＳＦＲの細胞外ドメインに結合すると、このレセプターがダイマー化し、これにより細胞質キナーゼドメインが活性化されて他の細胞タンパク質の自己リン酸化およびリン酸化がもたらされる（ハミルトン、Ｊ．Ａ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａ．）、ジャーナル・オブ・ロイコサイト・バイオロジー（Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．）、６２（２）：１４５−５５（１９９７年）；ハミルトン、Ｊ．Ａ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ．Ａ．）、イムノロジー・ツデイ（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｏｄａｙ．）、１８（７）：３１３−７（１９９７年））。
【００５３】
細胞内タンパク質がリン酸化されると、生化学的事象が次々と起こり、細胞性応答、即ち、有糸分裂、サイトカイン分泌、細胞膜の波打ち現象、および自己レセプターの転写調節が生じる（フイクセ（Ｆｉｘｅ）、プラロラン（Ｐｒａｌｏｒａｎ）、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）１０：ｐ３２−３７、１９９８年）。
【００５４】
Ｍ−ＣＳＦは間質細胞、骨芽細胞その他の細胞で発現されている。また、これは乳房、子宮および卵巣の腫瘍細胞においても発現される。これらの腫瘍における発現の程度が高悪性度および予後不良に関連する（カシンスキー（Ｋａｃｉｎｓｋｉ）、アナルズ・オブ・メディシン（Ａｎｎ．Ｍｅｄ．）、２７：ｐ７９−８５（１９９５年）；スミスほか（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、１：ｐ３１３−２５（１９９５年）。乳癌では、Ｍ−ＣＳＦの発現は、腺管内（浸潤前）癌とは対照的に、浸潤癌細胞で多く見られる（ショールほか（Ｓｃｈｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．）８６：ｐ１２０−６（１９９４年）。さらに、Ｍ−ＣＳＦは、乳腺腫瘍の悪性腫瘍への進行を促進することが明らかにされている（リンほか（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）９３：ｐ７２７−３９（２００１年））。乳癌および卵巣癌の場合、Ｍ−ＣＳＦの産生はマクロファージのこの腫瘍への補充に関与しているものと思われる。
【００５５】
癌の転移もしくは癌転移に伴う骨量減少の予防または治療にＭ−ＣＳＦアンタゴニストを用いたという報告はない。本発明ではその一部として、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストが転移性癌細胞による破骨細胞の誘導を無効化することを発見した。従って、本発明は、癌の転移および癌転移に伴う骨量減少の予防または治療のための配合物および方法を提供する。
【００５６】
本明細書に用いている「腫瘍」とは、悪性であれ良性であれ、全ての新生物性細胞の成長および増殖、ならびに前癌性および癌性の細胞および組織のことを意味する。
【００５７】
「癌」および「癌性」という用語は、代表的に、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的状態のことを意味し、もしくは表したものである。癌の例としては、癌腫；リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例としては、乳癌、前立腺癌、結腸癌、へん平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵癌、多形グリア芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌および各種の頭頚部癌が挙げられる。
【００５８】
「治療」とは、疾患の進行阻止もしくは病状改善を意図してなされる介入である。従って、「治療」とは、治療上の処置および予防もしくは再発予防処置の両方のことを意味する。治療を必要とする被験体には、すでに疾患を有する被験体、および疾患を予防すべきである被験体が含まれる。腫瘍（例えば、癌）の治療では、治療剤は、腫瘍細胞の病理を直接軽減するか、腫瘍細胞を他の治療因子、例えば、放射線療法および／または化学療法による処置に対する感受性を増大させることができる。癌の「病状（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。こうしたものとしては、異常もしくは制御不可能な細胞増殖、転移、近傍細胞の正常な機能の妨害、異常な濃度のサイトカインもしくはその他の分泌生成物の遊離、炎症応答もしくは免疫応答の抑制または悪化などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
本明細書に用いている「転移性癌」という語句は、身体の他の部位、特に骨に浸潤する可能性のある癌と定義される。骨に転移し得る癌には種々のものがあるが、最も一般的な転移する癌は、乳癌、肺癌、腎癌、多発性骨髄腫、甲状腺癌、および前立腺癌である。骨に転移する可能性のある他の癌としては、例えば、腺癌、白血病、リンパ腫などの血液細胞悪性腫瘍；頭頚部癌；胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、肝癌などの消化管癌；卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頚癌などの女性生殖管の悪性腫瘍；膀胱癌；神経芽細胞腫などの脳腫瘍；肉腫、骨肉腫；および悪性黒色腫およびへん平上皮癌などの皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に、本発明では、腫瘍によって誘発される骨の骨溶解性病変を予防および治療することが企図されている。
【００６０】
（Ｉ．アンタゴニスト）
概して、本明細書に用いている「アンタゴニスト」という用語は、分子、化合物またはその他の物質が、例えば、立体障害、立体構造の変化もしくは他の生化学的メカニズムによって、ある分子の別の分子との結合またはある細胞の別の細胞による刺激を妨害する性質のことを意味する。１つの点に関して言えば、アンタゴニストという用語は、レセプターのそのリガンドへの結合、例えば、Ｍ−ＣＳＦのＭ−ＣＳＦＲとの結合を阻止することによってＭ−ＣＳＦにより誘発されるシグナル伝達経路を阻害する物質の性質のことを意味する。アンタゴニストという用語は、特定の作用メカニズムによって何ら限定されるものではなく、むしろ、一般には、今定義した機能的性質のことを意味する。本発明のアンタゴニストとしては、Ｍ−ＣＳＦ抗体とその断片、ムテインおよび修飾体、可溶性Ｍ−ＣＳＦとその断片、ムテインおよび修飾体、Ｍ−ＣＳＦＲ抗体とその断片、ムテインおよび修飾体、可溶性Ｍ−ＣＳＦＲとその断片、ムテインおよび修飾体、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲに結合するペプチドおよび他の化合物および分子、ならびにＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦＲの発現を阻害するアンチセンス化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のアンタゴニストからは、必要に応じて、Ｍ−ＣＳＦを標的とするアンチセンス分子が除外される。本発明のアンタゴニストはいずれも、当該分野で公知の任意の方法で投与することができる。例えば、Ｍ−ＣＳＦムテイン、Ｍ−ＣＳＦＲムテイン、またはＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲに結合する抗体フラグメントは、遺伝子治療を介して投与することができる。
【００６１】
本発明のＭ−ＣＳＦアンタゴニストには、適用可能な場合、機能的等価物も含まれる。例えば、分子は、長さ、構造、構成部分などが異なるが、なお上記に定義した機能の１つ以上を保持し得る。より具体的には、本発明の抗体、抗体フラグメントもしくはペプチドの機能的等価物には、模倣化合物、即ち、抗原の結合に適した配置および／または配向を模倣するように設計された構築物が挙げられる。
【００６２】
必要に応じて、好ましいＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、側鎖などの付加、例えば、アミノ末端のアシル化、カルボキシ末端のアミド化、またはアミノ酸側鎖への別の基のカップリングによって、修飾することができる。また、アンタゴニストには１つ以上の保存的アミノ酸置換を設けることができる。「保存的アミノ酸置換」とは、置換されるアミノ酸の全体的な荷電、疎水性／親水性および／または立体バルクを維持するようなアミノ酸配列の変更のことを意味する。例えば、次の基の間の置換は保存的置換となる：Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、およびＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒ。このような改変を行っても、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの有効性は実質的に減じることはなく、例えば、インビボでの半減期が延長し、毒性が低減するなどの望ましい性質を得ることができる。
【００６３】
また、本発明は、アミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換以外の修飾が施されたポリペプチドをも含むことが意図される。例えば、こうした修飾は共有結合的な性質のものとすることができ、例としては、ポリマー、脂質、他の有機および無機成分との化学結合が挙げられる。このような誘導体は、ポリペプチドの循環中の半減期が延長するように作製することができ、またはポリペプチドに対し所望の細胞、組織もしくは器官を標的とする能力を向上させるように設計することができる。同様に、本発明は、さらに、共有結合により修飾して、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどの水溶性ポリマーを１つ以上付加したＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドを包含する。
【００６４】
本明細書に用いている「治療的有効量」という語句は、所望の治療計画に従って投与した時に目的とする治療上もしくは予防上の効果もしくは反応をもたらす、本発明の実施形態に適すると考えられる治療用もしくは予防剤用Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの量のことを意味する。
【００６５】
本明細書に用いているヒト「Ｍ−ＣＳＦ」とは、いずれも参考文献により本明細書に援用されているカワサキほか（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０：ｐ２９１（１９８５年）、チェレッティほか（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）２５：ｐ７６１（１９８８年）もしくはランドナーほか（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）６：ｐ２６９３（１９８７年）に記載の成熟ヒトＭ−ＣＳＦαポリペプチド、Ｍ−ＣＳＦβポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦγポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有するヒトポリペプチドのことを意味する。このような用語は、３種の成熟Ｍ−ＣＳＦが前述のように異なるアミノ酸配列を有すること、活性型Ｍ−ＣＳＦがジスルフィド結合したダイマーであるので、「Ｍ−ＣＳＦ」という用語が生物学的活性型のことを言う場合には、このダイマー形態が意図されるとの理解を反映させたものである。「Ｍ−ＣＳＦダイマー」とは、ダイマー化した２つのＭ−ＣＳＦポリペプチドモノマーのことを意味し、（２つの同一タイプのＭ−ＣＳＦモノマーからなる）ホモダイマー、および（２つの異なるモノマーからなる）ヘテロダイマーの両方を含む。Ｍ−ＣＳＦモノマーは、参考として本明細書に援用される米国特許第４，９２９，７００号に開示されるように、インビトロでＭ−ＣＳＦダイマーに変換することができる。
【００６６】
（Ｍ−ＣＳＦ抗体）
「抗体」という用語は、最も広義で用いており、完全に組み立てられた抗体、抗原に結合可能な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ）およびこれらを含む組換え型ペプチドを網羅する。
【００６７】
本明細書に用いている「モノクロナール抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団（即ち、この集団を構成する個々の抗体は、天然に僅かに存在し得る突然変異の場合を除き、同一である）から得られる抗体のことを意味する。モノクロナール抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。さらに、一般に種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体調製物とは対照的に、モノクロナール抗体はそれぞれ、単一の抗原決定基を標的とする。その特異性の他に、モノクロナール抗体は、特異性および特性が異なる他の免疫グロブリンが混入していない均一な培養物によって合成することができる点で有利である。
【００６８】
「モノクロナール」という修飾語は、抗体の実質的に均一な母集団から得られるものとしてその抗体の特徴を示しており、この抗体を作製するのに何らかの特定の方法を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いることになるモノクロナール抗体は、コーラーほか（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）がネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６：ｐ４９５（１９７５年）に最初に報告したハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。また、「モノクロナール抗体」は、例えば、クラックソンほか（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３５２：ｐ６２４−６２８（１９９１年）およびマークスほか（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２２２：ｐ５８１−５９７（１９９１年）に記載されている技術によりファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【００６９】
「抗体フラグメント」は、完全な状態の抗体の一部分、好ましくはこの完全な状態の抗体の抗原結合領域もしくは可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体（ザパタほか（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．）８（１０）：ｐ１０５７−１０６２（１９９５年））；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体をパパインで消化させると、それぞれ単一の抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一抗原結合断片、およびその名称が３５を容易に結晶化する能力を反映する残余の「Ｆｃ」断片が得られる。ペプシンで処理すると、単一のポリペプチド鎖内に存在する抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む２つの「単鎖Ｆｖ」即ち「ｓＦｖ」抗体フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。このＦｖポリペプチドは、さらに、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間に含むことが好ましい。ｓＦＶの概説については、プラックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）「モノクロナール抗体の薬理」第１１３巻、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ）、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）編、シュプリンガー出版、ニューヨーク、ｐ２６９−３１５（１９９４年）を参照されたい。
【００７０】
「ダイアボディ」という用語は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を同一ポリペプチド鎖（ＶＨ  ＶＬ）内に含む、２つの抗原結合部位を有する抗体の小断片のことを意味する。短すぎて同一鎖のこれら２つのドメイン間に対形成をさせることができないリンカーを用いることで、これらのドメインに対して強制的に、別の鎖の相補性ドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位を創出させる。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびホリンガーほか（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、９０：ｐ６４４４−６４４８（１９９３年）にさらに十分な記載がある。
【００７１】
「単離」抗体とは、その自然環境の構成成分から同定し、分離し、回収された抗体である。その自然環境の夾雑成分は、この抗体の診断的もしくは治療的用途に支障をきたすと考えられる物質であり、こうしたものとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク様のもしくは非タンパク様溶質が挙げられる。好ましい実施形態としては、この抗体は（１）ローリー法で測定して９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超の抗体に、（２）回転（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ）シークエネーターを用いて少なくとも１５残基のＮ末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルー、好ましくは銀染色を用いる還元性もしくは非還元性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一となるまで、精製される。単離抗体には、組換え細胞内のインサイチュのこの抗体を含める。何故なら、この抗体の自然環境の少なくとも１成分は存在しないからである。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１回の精製工程で調製することができる。
【００７２】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、非共有結合により強く結合した、１つの重鎖と１つの軽鎖を有する可変ドメインのダイマーからなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用することによりこのＶＨ  ＶＩダイマーの表面の抗原結合部位が規定されるのは、上記の構造においてである。計６つのＣＤＲがこの抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、結合部位全体に比し親和性は低いものの、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）でも抗原に対する認識能および結合能がある。
【００７３】
また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体のヒンジ領域の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数残基付加されていることで、Ｆａｂ’断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対して本明細書で用いている名称である。元々、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、断片間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として作製された。
【００７４】
「中和抗体」とは、結合する標的抗原のエフェクター機能を除去もしくは大きく減弱させることができる抗体分子を意味する。従って、「中和」抗標的抗体は、酵素活性、リガンド結合もしくは細胞内シグナル伝達などのエフェクター機能を除去もしくは大きく減弱させることができる。
【００７５】
本明細書に提供した、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少を治療するための組成物および方法では、１種以上の抗体を単独、または他の療法との併用で用いることにより目的とする効果を得ることができる。本発明による抗体は、環境の抗原と直接接触させるか、その抗原を免疫化した結果としてこの抗体を産生する動物から単離することができる。あるいは、抗体は、当該分野で公知の抗体発現系（例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）、レーン（Ｌａｎｅ）、「アンティボディズ：ア・ラボラトリ・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８８年）参照）のうちの１つを用いて組換えＤＮＡ法により作製することができる。このような抗体としては、組換えＩｇＧ、免疫グロブリン由来配列を有するキメラ融合タンパク質、または「ヒト化」抗体を挙げることができ、これらは全て、本発明に従って癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少の治療に用いることができる。完全な状態の（ｉｎｔａｃｔ）完全長の分子の他に、「抗体」という用語は、その断片（例えば、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）’２断片）、またはＭ−ＣＳＦ（もしくはＭ−ＣＳＦＲ）に結合する完全な状態の（ｉｎｔａｃｔ）分子および／または断片の多量体もしくは凝集体もまた意味する。これらの抗体フラグメントは、抗原に結合し、また、例えば、ガラクトース残基を組み込むことにより、クリアランスおよび取り込みを容易にする構造的特徴を発揮するように誘導体化することができる。
【００７６】
本発明の一実施形態として、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストは、参考として本明細書に援用されているハーレンベックほか（Ｈａｌｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）の米国特許第５，４９１，０６５号（１９９７年）に記載の方法に基本的に従って作製したモノクロナール抗体である。例示的なＭ−ＣＳＦアンタゴニストとしては、組換えもしくは天然のダイマーＭ−ＣＳＦに結合した外見上の立体配座エピトープに結合すると同時に生物学的活性を中和するモノクロナール抗体が挙げられる。こうした抗体は、モノマーＭ−ＣＳＦおよび化学的に誘導体化したダイマーＭ−ＣＳＦを含む生物学的不活性型のＭ−ＣＳＦとは実質的に反応しない。
【００７７】
本発明の別の実施形態として、ヒト化抗Ｍ−ＣＳＦモノクロナール抗体を提供する。「ヒト化抗体」という語句は、ヒト以外の抗体、代表的に、マウスモノクロナール抗体から誘導される抗体を意味する。あるいは、ヒト化抗体は、元の、ヒト以外の抗体の抗原結合特性を保持、もしくは実質的に保持しているが、ヒトに投与した時にその元の抗体に比し弱い免疫原性を示すキメラ抗体から誘導することもできる。本明細書に用いている「キメラ抗体」という語句は、代表的に異なる種に由来する２種の異なる抗体に由来する配列を含む抗体（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）を意味する。最も代表的には、キメラ抗体は、ヒトおよびマウスの抗体フラグメント、通常、ヒトの定常領域およびマウスの可変領域を含む。
【００７８】
「相補性決定領域」という語句は、天然の免疫グロブリン結合部位の固有のＦｖ領域の結合親和力および特異性を共に規定するアミノ酸配列を意味する（例えば、チョチアほか（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１９６：ｐ９０１−９１７（１９８７年）；カバットほか（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国保健社会福祉省ＮＩＨ冊子第９１  ３２４２号（１９９１年）参照）。「定常領域」という語句は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分を意味する。本発明において、マウス定常領域は、ヒト定常領域で置換されていることが好ましい。本ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリン由来のものとする。この重鎖定常領域は、５種のアイソタイプ：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマもしくはミューのうちのどれから選んでもよい。
【００７９】
本発明の抗体は、抗原に対して、約１０４Ｍ−１以上、好ましくは約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは約１０６Ｍ−１以上、さらに好ましくは約１０７Ｍ−１以上、最も好ましくは約１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、もしくは１０１０Ｍ−１以上のＫａ値で結合する場合、免疫特異的であり、または特異的に結合しているとされる。例えば、好適な抗Ｍ−ＣＳＦ／Ｍ−ＣＳＦＲ特異的抗体は、少なくとも１０４Ｍ−１、好ましくは約１０５Ｍ−１以上、より好ましくは約１０６Ｍ−１以上、さらに好ましくは約１０７Ｍ−１以上、最も好ましくは約１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、もしくは１０１０Ｍ−１以上の親和性でその抗原に結合する。この抗Ｍ−ＣＳＦ／Ｍ−ＣＳＦＲ抗体は、宿主／被験体の組織により発現されたもの、および腫瘍により発現されたものを含む、種々の天然型Ｍ−ＣＳＦ／Ｍ−ＣＳＦＲに結合する。本明細書に開示したモノクロナール抗体は、Ｍ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦＲに対する親和性を有し、解離平衡定数（Ｋｄ）が少なくとも１０−４Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍであることを特徴とする。本発明の方法に使用するのに好適なモノクロナール抗体およびその抗原結合性断片は、Ｍ−ＣＳＦ／Ｍ−ＣＳＦＲに特異的に結合することができる。このような親和性は、平衡透析、メーカーが概説した一般的手順によるＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００機器の使用、１２５Ｉ標識Ｍ−ＣＳＦを用いるラジオイムノアッセイ、または当業者に公知の別の方法など、従来技術を用いて容易に測定することができる。得られた親和性データは、例えば、スキャチャードほか（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・サイエンシズ（Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）５１：ｐ６６０（１９４９年）に記載の方法により解析することができる。従って、好ましいＭ−ＣＳＦアンタゴニストがＭ−ＣＳＦに対して高度の特異性を示し、他の分子に対しては十分に低い親和性で結合することは明らかである。
【００８０】
抗体の作製に使用すべき抗原は、例えば、完全な状態のＭ−ＣＳＦ、またはエピトープが天然型の立体配座で提示されることを可能にする別のポリペプチドに、必要に応じて融合させた、所望のエピトープを保持しているＭ−ＣＳＦ断片とすることができる。
【００８１】
（ポリクロナール抗体）
ポリクロナール抗体は、動物において関連する抗原およびアジュバントを皮下（ｓｃ）もしくは腹腔内（ｉｐ）注射を繰り返すことにより産生させることが好ましい。抗体反応は、二官能性薬剤もしくは誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合用）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する結合用）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸その他の当該分野で公知の薬剤を用いて、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリンもしくは大豆トリプシンインヒビターに、関連抗原を結合することにより向上させることができる。
【００８２】
例えば、１００μｇもしくは５μｇ（それぞれ、ウサギもしくはマウスの場合）のこのタンパク質もしくは結合体を３体積の完全フロインドアジュバントと合わせ、この溶液を複数の部位に皮内注射することによって、上記抗原、免疫原性結合体もしくは誘導体に対して動物を免疫化する。１ヶ月後、これらの動物に対して、ペプチドもしくは結合体の完全フロインドアジュバント溶液の元の量の１／５〜（分数（１／１０））を複数の部位に皮下注射することにより追加免疫を行う。追加免疫注射後７〜１４日目に、これらの動物を出血させ、血清の力価をアッセイする。この力価がプラトーに達するまで追加免疫を行う。好ましくは、動物の追加免疫は、抗原は同一であるが、これに結合させるタンパク質および／またはこの結合に用いる架橋剤は別のものに変えた結合体を用いて行う。また、結合体は、組換え細胞の培養によってタンパク質融合物として作製することができる。また、この免疫反応を高めるためにミョウバンなどの凝集剤を適切に用いる。
【００８３】
（モノクロナール抗体）
モノクロナール抗体は、コーラーほか（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６：ｐ４９５（１９７５年）に最初に報告されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、または組換えＤＮＡ法によって作製することができる。
【００８４】
ハイブリドーマ法では、マウス、もしくはハムスター、マカクザルなどの他の適切な宿主動物を本明細書に記載した方法で免疫化することにより、免疫化に用いたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマ細胞を作製する（ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、「モノクロナール・アンチボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）ｐ５９−１０３（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年））。
【００８５】
こうして作製したハイブリドーマ細胞を、好ましくは融合しなかった元の骨髄腫細胞の増殖もしくは生存を阻害する１種以上の物質を含む適切な培養培地に接種し、増殖させる。例えば、元の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴもしくはＨＰＲＴ）を欠損している場合、上記ハイブリドーマの培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有し（ＨＡＴ培地）、これらの物質によりＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【００８６】
骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を維持し、培地に対して感受性であるものが好ましい。また、ヒトモノクロナール抗体を産生させるためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒト・ヘテロ骨髄腫細胞株についても報告されている（ブローダーほか（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「モノクロナール・アンチボディ・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ｐ５１−６３（マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９８７年）。
【００８７】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対するモノクロナール抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、免疫沈降法、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素標識免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイ法により測定することが好ましい。例えば、このモノクロナール抗体の結合親和性は、スキャチャード解析によって求めることができる（マンソンほか（Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１０７：ｐ２２０（１９８０年））。
【００８８】
所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、このクローンは、限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法（ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、「モノクロナール・アンチボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）ｐ５９−１０３（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年）を用いて増殖させることができる。この目的のための好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地もしくはＲＰＭＩ−１６４０倍地が挙げられる。さらに、このハイブリドーマ細胞は、動物体内の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。上記サブクローンにより分泌されたモノクロナール抗体は、通常の免疫グロブリン精製法、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析もしくはアフィニティクロマトグラフィーを用いて培養培地、腹水液もしくは血清から適切に分離される。
【００８９】
モノクロナール抗体をコードするＤＮＡは、通常の方法により（例えば、このモノクロナール抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）ハイブリドーマ細胞から単離され、配列決定することができる。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに挿入した後、普通なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクションすることにより、この組換え宿主細胞にモノクロナール抗体を合成させることができる。抗体の組換え法による作製については当該分野で公知である。
【００９０】
所望の抗体のアミノ酸配列改変体は、コーディングＤＮＡに適切なヌクレオチドの変更を導入することにより、またはペプチド合成法により作製することができる。このような改変体としては、例えば、その抗体のアミノ酸配列内残基の欠失体、挿入体および／または置換体が挙げられる。最終構築物が所望の特性を有するという前提で、欠失、挿入および置換を任意に組み合わせることにより最終構築物を得ることができる。また、こうしたアミノ酸の変更を行うことにより、グリコシル化部位の数もしくは位置を変えるなど、ヒト化もしくは改変抗体の翻訳後プロセスを変えることもできる。
【００９１】
抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は当該分野で公知の種々の方法によって調製される。こうした方法としては、（天然のアミノ酸配列改変体の場合）天然原料からの単離、あるいはオリゴヌクレオチド媒介性（もしくは部位特異的）突然変異誘発法、ＰＣＲ突然変異誘発法、およびその抗体の以前に調製した改変体もしくは非改変型のカセット式突然変異誘発法による調製が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
キメラ抗体もしくはヒト化抗体は元のマウスモノクロナール抗体よりもヒトでの免疫原性が少ないので、これらを用い、アナフィラキシーを生じるリスクをずっと少なくしてヒトを治療することができる。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療的用途に好適であると考えられる。
【００９３】
マウスモノクロナール抗体の可変Ｉｇドメインをヒトの定常Ｉｇドメインに融合させたキメラモノクロナール抗体は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて作製することができる（モリソン、Ｓ．Ｌ．ほか（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９８４年）「キメラ・ヒト抗体分子；マウス抗原結合ドメインとヒト定常領域ドメイン（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ）」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８１：ｐ６８４１−６８５５；およびブーリアンネ、Ｇ．Ｌ．ほか（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２：ｐ６４３−６４６（１９８４年）参照）。一部のキメラモノクロナール抗体はヒトで免疫原性が少ないことが分かっているが、それでもそのマウス可変Ｉｇドメインは顕著なヒト抗マウス反応をもたらすことがある。
【００９４】
ヒト化抗体は種々の方法により得ることができ、これらの方法としては、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域およびヒト定常領域に移植する方法（当該分野で「ＣＤＲグラフティング」によるヒト化と呼ばれている方法）、あるいは（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によりこれをヒト様表面で「覆う（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」方法（当該分野で「ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」と呼ばれている方法）が挙げられる。本発明のヒト化抗体は「ヒト化」抗体および「ベニアド（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」抗体の両者を含むことになる。これらの方法については、例えば、ジョーンズほか（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２１：ｐ５２２−５２５（１９８６年）；モリソンほか（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８１：ｐ６８５１−６８５５（１９８４年）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、オイ（Ｏｉ）、アドバンシズ・イン・イムノロジー（Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）４４：ｐ６５−９２（１９８８年）；フェアホイエルほか（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３９：ｐ１５３４−１５３６（１９８８年）；パドラン（Ｐａｄｌａｎ）、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２８：ｐ４８９−４９８（１９９１年）；パドラン（Ｐａｄｌａｎ）、モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）３１（３）：１６９−２１７（１９９４年）；およびケットルボロウ、Ｃ．Ａ．ほか（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．）、プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．）４（７）：ｐ７７３−８３（１９９１年）に開示され、これらはそれぞれ参考として本明細書に援用される。
【００９５】
マウス重鎖および軽鎖の可変Ｉｇドメインの６つのＣＤＲのうちの１つ以上をヒト可変Ｉｇドメインの適切な４つのフレームワーク領域に導入するＣＤＲの移植は、ＣＤＲグラフティングとも呼ばれる。この技術（リーチマン、Ｌ．ほか（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３２：ｐ３２３（１９８８年）では、抗原との主要な接触部位であるこのＣＤＲループを支える足場として、この保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を利用する。しかしながら、ＣＤＲグラフティングには、これにより元のマウス抗体よりも結合親和性がかなり低いヒト化抗体が生じ得るという欠点がある。何故なら、フレームワーク領域のアミノ酸は抗原の結合に寄与することができるからであり、また、ＣＤＲループのアミノ酸は上記２つの可変Ｉｇドメインの結合に影響を及ぼすことができるからである。ヒト化モノクロナール抗体の親和性を維持するためには、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最もよく似たヒトフレームワーク領域の選択により、また、抗原結合部位のコンピュータモデリングを利用したフレームワークもしくはＣＤＲ内の単一アミノ酸の部位特異的突然変異誘発法により、ＣＤＲグラフティング技術を改良することができる（例えば、コ、Ｍ．Ｓ．ほか（Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５２：ｐ２９６８−２９７６）。
【００９６】
抗体をヒト化する方法の１つは、非ヒト重鎖配列および非ヒト軽鎖配列をヒト重鎖配列およびヒト軽鎖配列に対して位置合わせし、この位置合わせに基づき、非ヒトフレームワークを選んでヒトフレームワークで置換し、このヒト化配列の立体配座を予測するための分子模型を作成し、元の抗体の立体配座と比較することを含む。このプロセスに続いて、ヒト化配列模型の予測立体配座が元の非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの立体配座にぴったり近づくまで、ＣＤＲの構造を乱すＣＤＲ領域内残基の復帰突然変異を繰り返す。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌのレセプターを介して取り込みおよびクリアランスを容易にするためにさらに誘導体化することができる（例えば、参考として本明細書に援用される米国特許第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号参照）。
【００９７】
合理的な設計によりマウスモノクロナール抗体をヒト化した例についてはいくつか報告がある（例えば、２００２年７月１１日公開の２００２００９１２４０、ＷＯ９２／１１０１８号および米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，７７６，８８６号参照）。
【００９８】
突然変異誘発に好適な部位である抗体の特定の残基もしくは領域を同定するための有用な方法は「アラニン走査型突然変異誘発法」と呼ばれ、カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）、ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４：ｐ１０８１−１０８５（１９８９年）に報告されている。この場合、標的残基のうちの１残基もしくは残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ｇｌｕなどの荷電残基）、これを中性もしくは負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンもしくはポリアラニン）で置換することによりこれらのアミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。次いで、こうした置換に対して機能的な感受性を示すこれらのアミノ酸部位を、こうした置換部位に対しさらに、即ち、他の異なるアミノ酸を導入するか、これに置き換えることにより、改良する。従って、アミノ酸配列を変更する部位は予め決めておくが、突然変異自体の性質は前もって決定する必要はない。例えば、所与の部位の突然変異体の性能を解析するためには、標的コドンもしくは領域においてａｌａ走査もしくはランダム突然変異誘発を実施し、目的とする活性について、発現された抗体改変体をスクリーニングする。
【００９９】
アミノ酸配列の挿入としては、アミノ末端および／またはカルボキシ末端における、長さが１残基のものから１００残基以上を含むポリペプチドの融合、ならびに単数もしくは複数のアミノ酸残基の配列内部への挿入が挙げられる。末端への挿入の例としては、Ｎ−末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合させた抗体が挙げられる。抗体分子のその他の挿入改変体としては、抗体の血清半減期を延長させるポリペプチドへの融合体が挙げられる。
【０１００】
別のタイプの改変体はアミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、抗体分子内の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その位置に別の残基が挿入されているものである。超可変もしくはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域のうちの任意の領域内に置換型の突然変異を誘発させることが企図されている。表１に「好ましい置換」と題して保存的置換を示した。このような置換により生物学的活性に変化が生じる場合には、表１で「代表的な置換」と称し、またはさらにアミノ酸クラスを基準として以下に記載したさらに大きな変更を導入し、得られる生成物をスクリーニングにかけることができる。
【０１０１】
（表１）
（例示的な好ましい残基置換の原型）
Ａｌａ（Ａ）ｖａｌ；ｌｅｕ；ｉｌｅ  ｖａｌ  Ａｒｇ（Ｒ）ｌｙｓ；ｇｌｎ；ａｓｎ  ｌｙｓ  Ａｓｎ（Ｎ）ｇｌｎ；ｈｉｓ；ａｓｐ，ｌｙｓ；ｇｌｎ  ａｒｇ  Ａｓｐ（Ｄ）ｇｌｕ；ａｓｎ  ｇｌｕ  Ｃｙｓ（Ｃ）ｓｅｒ；ａｌａ  ｓｅｒ  Ｇｌｎ（Ｑ）ａｓｎ；ｇｌｕ  ａｓｎ  Ｇｌｕ（Ｅ）ａｓｐ；ｇｌｎ  ａｓｐ  Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ  Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ；ｇｌｎ；ｌｙｓ；ａｒｇ  Ｉｌｅ（Ｉ）ｌｅｕ；ｖａｌ；ｍｅｔ；ａｌａ；ｌｅｕ  ｐｈｅ；ノルロイシン  Ｌｅｕ（Ｌ）ノルロイシン；ｉｌｅ；ｖａｌ；ｉｌｅ  ｍｅｔ；ａｌａ；ｐｈｅ  Ｌｙｓ（Ｋ）ａｒｇ；ｇｌｎ；ａｓｎ  ａｒｇ  Ｍｅｔ（Ｍ）ｌｅｕ；ｐｈｅ；ｉｌｅ  ｌｅｕ  Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ；ｖａｌ；ｉｌｅ；ａｌａ；ｔｙｒ  Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ  Ｓｅｒ（Ｓ）ｔｈｒｕ  Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ  ｓｅｒ  Ｔｒｐ（Ｗ）ｔｙｒ；ｐｈｅ  ｔｙｒ  Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ；ｐｈｅ；ｔｈｒ；ｓｅｒ  ｐｈｅ  Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ；ｌｅｕ；ｍｅｔ；ｐｈｅ；ｌｅｕ  ａｌａ；ノルロイシン。
【０１０２】
抗体の生物学的特性は、（ａ）置換領域のポリペプチド主鎖の構造、例えば、シートもしくはヘリックス構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対する効果が大きく異なる置換基を選択することによって、かなり改良される。天然型の残基は共通の側鎖の特性に基づいて以下のように分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１０３】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの残基を別のクラスの１つの残基で置換するものである。
【０１０４】
また、上記ヒト化もしくは改変抗体の適正な立体配座の維持に関与していないシステイン残基は、一般にはセリンで置換することにより、この分子の酸化安定性を向上させ、異常架橋を防止することができる。逆に、システイン結合を抗体に付加することによって（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体フラグメントである場合）その安定性を向上させることができる。
【０１０５】
親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）は、元の抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体改変体を作製してスクリーニングし、この元の抗体に対して結合親和性などの生物学的特性が向上した改変体を選択するものである。このような置換型改変体を作製するのに都合のよい方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟である。簡単に言えば、数箇所の超可変領域の部位（例えば、６〜７部位）を突然変異させて各部位に可能な限りあらゆるアミノ置換を作製する。こうして作製された抗体改変体は、糸状ファージ粒子から、各粒子内に詰め込まれたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として、一価型で表示（ｄｉｓｐｌａｙ）される。次いで、このファージにより表示された改変体を、その生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１０６】
アラニン走査突然変異誘発法を行うことにより、抗原結合に大きく寄与している超可変領域の残基を同定することができる。あるいは、もしくはさらに、この抗原−抗体複合体の結晶構造を解析することにより抗体と抗原との接触点を同定することも有益であると考えられる。このような接触残基およびその近傍残基は、本明細書に詳述した技術による置換の候補となる。一旦このような改変体を作製すると、本明細書に記載した方法で改変体のパネルをスクリーニングにかけ、１つ以上の適切なアッセイ法で優れた特性を示す抗体を選び、これをさらに開発することができる。
【０１０７】
また、元の抗体に対してグリコシル化パターンを修飾した、例えば、この抗体の炭化水素部分を１つ以上欠失し、および／またはこの抗体に存在しないグリコシル化部位を１つ以上付加した抗体改変体を作製することもできる。
【０１０８】
代表的に、抗体のグリコシル化はＮ−結合またはＯ−結合のどちらかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖に対して炭化水素部分を結合させることを意味する。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（但し、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖に炭化水素が酵素的に結合されるための認識配列である。ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が生じる。従って、抗体へのＮ−結合グリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を、これらのトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むように変更することにより行うことができる。Ｏ−結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンもしくはスレオニンに対して糖のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースもしくはキシロースのうちの１種を結合させることを意味するが、５−ヒドロキシプロリンもしくは５−ヒドロキシリジンを用いることもできる。抗体へのＯ−結合グリコシル化部位の付加は、元の抗体の配列に対して１個以上のセリン残基もしくはスレオニン残基を挿入もしくはこれらで置換することにより行うことができる。
【０１０９】
また、Ｍ−ＣＳＦに対するヒト化抗体もしくはヒト抗体は、内因性の免疫グロブリンを産生せず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するように操作されている形質転換動物を用いて作製することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３号には、内因性の重鎖および軽鎖の遺伝子座が不活化されているため機能的な内因性の免疫グロブリンを産生しない、ヒトＩｇ遺伝子座を有する形質転換動物が開示されている。また、ＷＯ９１／７４１号には、免疫原に対して免疫反応を行うことができる形質転換した非霊長類哺乳動物宿主であって、その抗体が霊長類の定常領域および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンをコードする遺伝子座が置換もしくは不活化されている宿主が開示されている。ＷＯ９６／３０４９８号では、哺乳動物の免疫グロブリン遺伝子座を修飾し、例えば、その定常領域もしくは可変領域の全部もしくは一部分の置換による改変抗体分子の作製を目的としたＣｒｅ／Ｌｏｘシステムの使用について開示されている。ＷＯ９４／０２６０２号には、内因性Ｉｇ遺伝子座が不活化されていて、機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主が開示されている。米国特許第５，９３９，５９８号には、内因性重鎖を欠損し、１つ以上の異種定常領域を含む外来性免疫グロブリン遺伝子座を発現しているトランスジェニックマウスを作製する方法が開示されている。
【０１１０】
上述のトランスジェニック動物を用いて、選択した抗原分子に対する免疫反応を起こさせた後、この動物から抗体産生細胞を取り出し、これを用いてヒトモノクロナール抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。免疫化プロトコル、アジュバントなどは当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５号に開示されているトランスジェニックマウスの免疫化に使用されている。この公報には、ＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセクレチン、ｇｐ３９および破傷風毒素を含む種々の抗原分子に対するモノクロナール抗体が開示されている。これらのモノクロナール抗体については、対応するタンパク質の生物学的活性もしくは生理学的効果を阻害もしくは中和する能力を調べることができる。ＷＯ９６／３３７３５号では、ＩＬ−８で免疫化したトランスジェニックマウスの免疫細胞に由来するＩＬ−８に対するモノクロナール抗体が、ＩＬ−８により誘導される好中球の機能をブロックしたことが開示されている。また、ＷＯ９６／３４０９６号および米国特許出願第２００３０１９４４０４号；ならびに米国特許出願第２００３００３１６６７号には、トランスジェニック動物の免疫化に用いた抗原に対して特異性を有するヒトモノクロナール抗体が開示されている。
【０１１１】
また、ジャコボヴッツほか（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、９０：ｐ２２５１（１９９３年）；ジャコボヴッツほか（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３６２：ｐ２５５−２５８（１９９３年）；ブルガーマンほか（Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、イヤー・イン・イムノロジー（Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．）、７：ｐ３３（１９９３年）；および米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；および米国特許出願第２００２０１９９２１３号についても参照されたい。米国特許出願第２００３００９２１２５号には、動物の免疫反応を所望のエピトープに偏向させる方法が開示されている。また、ヒト抗体は、インビトロで活性化したＢ細胞によっても産生させることができる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
【０１１２】
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリを作製し、コードされている抗体フラグメントを糸状バクテリオファージの表面に表示させる技術の開発により、ヒト抗体を直接作製する手段が得られている。ファージ技術により得られる抗体は、細菌内で抗原結合性断片−通常ＦｖもしくはＦａｂ断片−として産生され、従って、エフェクター機能を欠損している。エフェクター機能は次の２つの方法のいずれかによって導入させることができる：上記断片を完全な抗体の形となるよう設計して哺乳動物細胞で発現させるか、エフェクター機能を作動させることができる別の結合部位を有する二重特異性抗体断片の形に設計する。
【０１１３】
代表的に、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローニングした後、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリを用いて無作為に再結合し、これらを特定抗原への結合性から選択することができる。このＦａｂ断片は、ファージ表面に、即ち、これをコードしている遺伝子に物理的に結合して発現される。従って、抗原結合によりＦａｂを選択すると、Ｆａｂコーディング配列が同時に選択され、その後、これを増幅させることができる。パニングと呼ばれる工程である抗原結合および再増幅を数回繰り返すことによって、抗原に特異的なＦａｂを濃縮し、最終的にこれを単離する。
【０１１４】
１９９４年に、「ガイド選択法（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる抗体のヒト化方法が報告された。ガイド選択法は、マウスモノクロナール抗体をヒト化するためにファージディスプレイ技術の力を利用するものである（ジェスパー、Ｌ．Ｓ．ほか（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１２：ｐ８９９−９０３（１９９４年）参照）。このために、このマウスモノクロナール抗体のＦｄ断片をヒト軽鎖ライブラリと結合させて表示させることができ、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリを抗原により選択することができる。これにより、上記マウスＦｄ断片はその選択を誘導する鋳型を提供する。続いて、選択したヒト軽鎖をヒトＦｄ断片ライブラリと結合させる。その結果生じたライブラリを選択することにより、全体としてヒト型のＦａｂが得られる。
【０１１５】
ファージディスプレイライブラリからヒト抗体を誘導する方法としては、種々のものが報告されている（例えば、ホ―ヘンブームほか（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２２７：ｐ３８１（１９９１年）；マークスほか（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２２２：ｐ５８１−５９７（１９９１年）；米国特許第５，５６５，３３２号および５，５７３，９０５号；クラックソン、Ｔ．（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．）、ウェルズ、Ｊ．Ａ．（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．）、ＴＩＢＴＥＣＨ、１２：ｐ１７３−１８４（１９９４年）参照）。特に、ファージディスプレイライブラリから誘導される抗体のインビトロでの選択および展開（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）は強力な手段となっている（バートン、Ｄ．Ｒ．（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．）、バーバスＩＩＩ、Ｃ．Ｆ．（Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．）、アドバンシズ・イン・イムノロジー（Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）５７：ｐ１９１−２８０（１９９４年）；およびウインター、Ｇ．ほか（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．）、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）１２：ｐ４３３−４５５（１９９４年）；米国特許出願第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７号；２００３年１０月９日付で公開された米国特許出願第２００３０１９０３１７号および米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号参照）。
【０１１６】
ワトキンズ（Ｗａｔｋｉｎｓ）、「キャプチャ・リフトによるファージ発現抗体ライブラリのスクリーニング（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ）」分子生物学の方法における、抗体ファージディスプレイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ）：メソッズ・アンド・プロトコルズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）１７８：ｐ１８７−１９３、および２００３年３月６日公開の米国特許出願第２００１２００３００４４７７２号には、キャプチャリフト、即ち、固体支持体への候補結合分子の固定化を含む方法によりファージ発現抗体ライブラリもしくは他の結合分子をスクリーニングする方法が記載されている。
【０１１７】
こうした抗体産物は、本明細書の「スクリーニング方法」と題した項に記載したアッセイ法または当該分野で公知の任意の適切なアッセイ法を用いて、ＭＣＳＦアンタゴニストとしての活性および本発明の治療方法への適合性についてスクリーニングすることができる。
【０１１８】
（Ｍ−ＣＳＦムテイン）
さらに、本発明は本発明の方法によるＭＣＳＦアンタゴニストとして用いることができるＭ−ＣＳＦムテインを提供する。
【０１１９】
本明細書に用いている「断片」とは、完全な状態の天然分子の一部分のことを意味し、例えば、断片ポリペプチドとは、Ｎ−末端もしくはＣ−末端から１個以上のアミノ酸が欠失された天然ポリペプチドの断片である。
【０１２０】
ポリペプチドに関して本明細書で用いている「ムテイン」とは、１個以上のアミノ酸が置換、挿入もしくは欠失された完全な状態の天然分子の改変体またはその天然分子の断片の改変体を意味する。このような置換、挿入もしくは欠失は、その分子のＮ−末端、Ｃ−末端または内部に位置することができる。従って、「ムテイン」という用語は、この天然分子の断片をその範囲内に包含する。挿入型のムテインには、Ｎ−末端もしくはＣ−末端における融合体、例えば、半減期を延長させる免疫グロブリンのＦｃ部分への融合体が含まれる。
【０１２１】
本発明による好適なムテインは、検索パラメータとしてギャップ挿入時のペナルティを１２、ギャップ伸長時のペナルティを１とするアフィンギャップ検索を行うＭＳＰＲＣＨプログラム（オックスフォード・モレキュラー（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））を用いて実行するスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）の相同性検索アルゴリズム（メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）７０：ｐ１７３−１８７（１９９７年））により決定する場合、その天然のポリペプチドに対する配列同一性（相同性）が少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％もしくはそれ以上である。その他の公知の慣行的に用いられる相同性／同一性スキャニングアルゴリズムのプログラムとしては、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５：ｐ２４４４−２４４８（１９８８年）；リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２２：ｐ１４３５（１９８５年）；デブローほか（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１２：ｐ３８７−３９５（１９８４年）；またはアルチュールほか（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．）、モレキュラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：ｐ４０３−４１０（１９９０年）に記載のＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮもしくはＢＬＡＳＴＸアルゴリズムが挙げられる。また、これらのアルゴリズムを使用するコンピータ化プログラムも利用可能であり、例えば、ジェネティクス・コンピューティング・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）社、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州、米国からＧＣＧパッケージ、バージョン８として市販されているＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、ならびにインテレジェネティクス社、マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）、カリフォルニア州によるＰＣ／ジーン（Ｇｅｎｅ）プログラムのＣＬＵＳＴＡＬが挙げられるが、これらに限定されるものではない。配列同一性のパーセンテージは、上記プログラムにより指定されたデフォルトパラメータを用いて求めることが望ましい。
【０１２２】
本明細書に用いている「修飾」とは、所望の（アゴニストもしくはアンタゴニスト）活性が維持される限りにおける、グリコシル化、リン酸化、（ポリエチレングリコールなどの）ポリマー結合または他の外来性部分の付加などによる天然ポリペプチド、断片もしくはムテインの任意の修飾を意味する。
【０１２３】
その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第６，０２５，１４６号およびコース（Ｋｏｔｈｓ）、モレキュラー・リプロダクション・アンド・デベロップメント（Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．）１９９７年１月；４６（１）：３１−３８には、Ｍ−ＣＳＦ単独およびＭ−ＣＳＦとＭＣＳＦ−Ｒとの複合体の結晶化について記載されており、Ｍ−ＣＳＦの三次元構造およびレセプター結合に関与する残基の特徴が明らかにされている。また、米国特許第６，０２５，１４６号には、構造情報に基づいてＭ−ＣＳＦ内の候補アミノ酸置換を選択する方法が開示されている。図１は、切断されたダイマーＭ−ＣＳＦのジスルフィド結合を示すトポロジーダイアグラムであり；図２は、１０残基目ごとに標識し、点線で非結晶対称軸を示したＣ−アルファ主鎖のステレオダイアグラムである。図１に示したこの形のＭ−ＣＳＦの全体的なトポロジーは、４本型ヘリックス束の多くにより一般的に見られる上方−下方−上方−下方の連結性とは異なり、これらのヘリックスが上方−上方−下方−下方に伸びている逆平行性４本型アルファヘリックス束のトポロジーである。ヘリックスＡとヘリックスＢとは長い交差結合によって連結されており、ヘリックスＣとＤとの間にも同様な結合が存在する。このジスルフィド結合のダイマー型では、束同士は末端間で連結され、極めて平坦な長い構造（平均寸法８５×３５×２５Å）を形成する。各モノマー内には３つの分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ７−Ｃｙｓ９０、Ｃｙｓ４８−Ｃｙｓ１３９、Ｃｙｓ１０２−Ｃｙｓ１４６）があり、これらは全てその分子の遠位端にある。鎖間ジスルフィド結合の１つ（Ｃｙｓ３１-Ｃｙｓ３１）は、図２に示したように、非結晶の２回対称軸が通過するダイマー界面に位置している。突然変異実験から、この形のＭ−ＣＳＦのシステイン残基の全てが完全な生物学的活性を発揮するのに必要な場合があることが分かる。本明細書に開示したこの構造から、これらの役割はレセプター認識に関連したものというよりも、主として構造的なものであることが示唆される。米国特許第６，０２５，１４６号では、その配列のアミノ酸残基のアルファ炭素の位置により同定された短縮組換えＭ−ＣＳＦαダイマーの三次元構造が開示されている。
【０１２４】
レセプター結合性相互作用の特異性にはヘリックスＡ、ヘリックスＣおよびヘリックスＤの特定の残基が関与していると考えられる。Ｍ−ＣＳＦβはシステイン１５７および／または１５９を含む鎖間ジスルフィド結合を有するので、Ｍ−ＣＳＦのＣ−末端領域は、その構造の「後部」から伸びて膜結合型Ｍ−ＣＳＦに対する可変長の「つなぎ鎖」を提供する。従って、Ｍ−ＣＳＦの「前部」、即ちレセプター結合領域は、上記分子の反対側にあり、天然Ｍ−ＣＳＦの約６〜２６、７１〜９０および１１０〜１３０番目の残基をそれぞれ含むヘリックスＡ、ヘリックスＣおよびヘリックスＤ内もしくは近傍の溶媒接触可能残基からなる。側鎖とレセプターとの相互作用を増強もしくは低減させるために部位特異的突然変異誘発法により上記領域の溶媒接触可能残基を変更すると、Ｍ−ＣＳＦアゴニストもしくはアンタゴニストを得ることができる。トリペプチドｇｌｙ−ｘ−ｇｌｙ内にある場合の接触可能アミノ酸の表面積の正常化を基準とすると、溶媒接触可能表面積が約０．２５超、好ましくは約０．４超の残基が好適である（カブシュ、Ｗ．ほか（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．）、バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）２２：ｐ２５７７（１９８３年））。モノマーの相対的配向を維持し、タンパク質の折り畳み過程を妨げないようにするために、ダイマー界面などのそのタンパク質の他の部分と相互作用しない残基を選ぶことが好ましい。必要に応じて考慮すべき別の点は、ヒトＭ−ＣＳＦと、ヒトＭ−ＣＳＦレセプターを認識しないマウスＭ−ＣＳＦとの間で保存されていない残基を選択することである。非保存的アミノ酸と置換するためには、ＭＣＳＦ−Ｒ残基との水素結合および／または疎水性相互作用を阻害するような候補アミノ酸を選択することが好ましい。例えば、１つ以上のヒスチジンを同様なサイズの非水素供与アミノ酸に変更することによって、レセプター結合能が変化したＭ−ＣＳＦを得ることができる。好適な置換用アミノ酸としては、Ｈ１５、Ｑ７９、Ｒ８６、Ｅ１１５、Ｅ４１、Ｋ９３、Ｄ９９、Ｌ５５、Ｓ１８、Ｑ２０、Ｉ７５、Ｖ７８、Ｌ８５、Ｄ６９、Ｎ７０、Ｈ９、Ｎ６３および  Ｔ３４が挙げられるが、これらに限定されるものではない。レセプターシグナル伝達に重要なＭ−ＣＳＦ残基は、Ｍ−ＣＳＦの不連続な領域で構成されていると考えられている。Ｍ−ＣＳＦをベースとしたタンパク様の薬剤の投与によると考えられる抗体形成の可能性をできるだけ少なくするためには、可能な限り、元のＭ−ＣＳＦの溶媒接触可能残基を保持させて（その天然分子に類似させる）ことが望ましい。
【０１２５】
Ｎ−末端／Ａヘリックス領域のアミノ酸Ｈ１５およびＨ９を突然変異させると、生物学的活性およびＭＣＳＦ−Ｒ結合能のかなり低いムテインが生じる。この結果から、生物物活性の低下はレセプター結合親和性の低減によるものであり、従って、これらのヒスチジンアミノ酸はＭ−ＣＳＦレセプター結合親和性に重要な接点であり、十分なレセプター結合能が所望される場合には変えないでそのままにしておくべきであることが示唆された。また、Ｙ６、Ｓ１３などの近傍の溶媒接触可能残基もＭ−ＣＳＦレセプターとの接点残基となることができる。Ｍ−ＣＳＦの二重突然変異体（Ｑ２０Ａ、Ｖ７８Ｋ）を構築してヘリックスＡおよびＣの中心部分の溶媒接触可能残基の重要性を調べたところ、この二重ムテインの生物学的活性はわずかに（８〜１０分の１に）低下し、レセプター結合活性も同様に低下した。残基Ｑ１７、Ｒ２１、Ｅ１１５およびＥ１１９を突然変異させると、目的の領域の溶媒接触可能アミノ酸の側鎖の特性が変化したが、生物学的比活性に影響はなく、このことから、アンタゴニスト活性を持たせるよう設計されるムテインではこれらの残基を変更する必要のないことが示唆された。
【０１２６】
一実施形態として、本発明では、レセプター結合に関与するヘリックスＡおよび／またはヘリックスＣおよび／またはヘリックスＤの残基（例えば、６〜２６、７１〜９０および／または１１０〜１３０番目アミノ酸）を非保存的に突然変異させたＭ−ＣＳＦムテインが企図されている。このようなムテインは、ヘリックスＡ、ヘリックスＣもしくはヘリックスＤ内の天然配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％もしくは９０％の類似性を保持している（即ち、アミノ酸が同一であるか、同様な特性を有する）が、このポリペプチドの残部の天然配列に対する類似性がより高く、例えば、少なくとも９５％、９８％もしくは９９％の類似性を有することが好ましい。さらに、このレセプター結合部位の三次元構造を支える残基も非保存的に突然変異させることができる。
【０１２７】
別の実施形態として、上記Ｍ−ＣＳＦムテインは、モノマー型のＭ−ＣＳＦである。ダイマー型のＭ−ＣＳＦは生物学的活性型であり、モノマー型のＭ−ＣＳＦには、一般には活性がない。モノマー間のジスルフィド結合はＣｙｓ３１−Ｃｙｓ３１鎖間結合により生じると考えられる。従って、モノマー型のＭ−ＣＳＦはアンタゴニストとして用いるのに適したものとすることができることが企図されている。このような型としては、Ｃｙｓ３１および／または他のシステインのシステイン欠失および／またはシステイン置換（例えば、システインのアラニンへの置換）を含むムテイン、あるいはシステイン、特にＣｙｓ３１がジスルフィド結合に利用できないように化学的に修飾されたムテインが挙げられる。
【０１２８】
さらに別の実施形態として、上記Ｍ−ＣＳＦのムテインは、ヘリックスＡ、ヘリックスＣもしくはヘリックスＤのうちの１つ以上を含み、あるいはレセプター結合に関与するこれらの部分を単独で、または適正な三次元構造でこれらの断片を表示させることを可能にする他のポリペプチドとの融合体の形で含む。
【０１２９】
任意の所望の保存的および／または非保存的ムテインを含むムテインは、組換えによる産生、化学的合成などの、当該分野で公知の技術を用いて、容易に作製することができる。
【０１３０】
保存的置換、特にリガンド−レセプター結合に直接関与する領域外における置換が、Ｍ−ＣＳＦムテイン（もしくはＭ−ＣＳＦＲムテイン）の結合特性を大きく変化させるとは考えられない。アミノ酸は、物理的特性、ならびにタンパク質の二次構造および三次構造への寄与度によって分類することができる。保存的置換とは、あるアミノ酸で同様な特性を有する別のアミノ酸を置換することと、当該分野では認識されている。例示的な保存的置換についてすぐ下の表２（１９９年３月１３日公開のＷＯ９７／０９４３３号ｐ１０（１９９６年９月６日出願のＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７）より）に示す。
【０１３１】
（表２）
（保存的置換Ｉ）
側鎖
特性                              アミノ酸
脂肪族
非極性                            ＧＡＰＩＬＶ
極性−非荷電                      ＣＳＴＭＮＱ
極性−荷電                        ＤＥＫＲ
芳香族                            ＨＦＷＹ
その他                            ＮＱＤＥ
あるいは、保存的アミノ酸は、すぐ下の表３に示したように、レーニンガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２版；ワース出版社（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．）ＮＹ：ＮＹ（１９７５年）、ｐ７１−７７）に記載の方法で、分類することができる。
【０１３２】
（表３）
（保存的置換ＩＩ）
側鎖
特性                              アミノ酸
非極性（疎水性）
Ａ．脂肪族                        ＡＬＩＶＰ
Ｂ．芳香族                      ＦＷ
Ｃ．硫黄含有                      Ｍ
Ｄ．ボーダーライン                Ｇ
非荷電−極性
Ａ．ヒドロキシル                ＳＴＹ
Ｂ．アミド                      ＮＱ
Ｃ．スルフヒドリル              Ｃ
Ｄ．ボーダーライン              Ｇ
陽性荷電（塩基性）              ＫＲＨ
陰性荷電（酸性）                ＤＥ
さらに別の選択肢として、例示的な保存的置換をすぐ下の表４に示す。
【０１３３】
（表４）
（保存的置換ＩＩＩ）
元の残基                    例示的置換
Ａｌａ（Ａ）                Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ａｒｇ（Ｒ）                Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ａｓｎ（Ｎ）                Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ａｓｐ（Ｄ）                Ｇｌｕ
Ｃｙｓ（Ｃ）                Ｓｅｒ
Ｇｌｎ（Ｑ）                Ａｓｎ
Ｇｌｕ（Ｅ）                Ａｓｐ
Ｈｉｓ（Ｈ）                Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ｉｌｅ（Ｉ）                Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｅｕ（Ｌ）                Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｙｓ（Ｋ）                Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ｍｅｔ（Ｍ）                Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ（Ｆ）                Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ
Ｐｒｏ（Ｐ）                Ｇｌｙ
Ｓｅｒ（Ｓ）                Ｔｈｒ
Ｔｈｒ（Ｔ）                Ｓｅｒ
Ｔｒｐ（Ｗ）                Ｔｙｒ
Ｔｙｒ（Ｙ）                Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ
Ｖａｌ（Ｖ）                Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ
Ｍ−ＣＳＦをコードしているＤＮＡ配列が利用できることにより、種々の発現ベクターを用いて所望のポリペプチドを作製することが可能になる。発現ベクターの構築および適切なＤＮＡ配列からの組換え法による作製は当該分野で公知の方法を用いて行われる。これらの技術および種々の他の技術は、一般に、サンブルックほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、「モレキュラー・クローニング−−ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８９年）およびクリーグラー、Ｍ．（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．）、「ジーン・トランスファー・アンド・エクスプレッション、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」ストックトン・プレス社（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９９０年）（これら両文献とも本明細書に参考として援用される）に記載の方法に準じて実施される。
【０１３４】
Ｍ−ＣＳＦの一次配列に対する特定の修飾は、公知の組換えＤＮＡ技術によって、所望の構造（例えば、Ｍ−ＣＳＦのレセプター結合能）を損なうことなく、そのＤＮＡ配列によりコードされているアミノ酸に対して欠失、付加もしくは変更を行うことによって実施することができる。さらに、個々のアミノ酸を置換、もしくは酸化、還元その他の修飾法により修飾することができ、このポリペプチドを切断して活性のある結合部位および構造情報を保持する断片を得ることができることは、当業者であれば理解するであろう。このような置換および変更を行うことにより、「成熟Ｍ−ＣＳＦα（配列番号：２）ポリペプチド、Ｍ−ＣＳＦβ（配列番号：４）ポリペプチドおよびＭ−ＣＳＦγ（配列番号：６）ポリペプチドと実質的に同じアミノ酸配列を有する」ポリペプチドの定義に該当するアミノ酸配列のポリペプチドが得られる。
【０１３５】
ポリペプチドは、当該分野で公知の標準的な液相ペプチド合成技術もしくは固相ペプチド合成技術を用いて合成することができる。液相合成では、多種多様なカップリング方法および保護基を用いることができる（グロス（Ｇｒｏｓｓ）、マイエンホファー（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）編「ザ・ペプタイズ：アナリシス、シンセシス、バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第１−４巻（アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７９年）；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ）、ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ）「ザ・プラクティス・オブ・ペプタイド・シンセシス（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」第２版（スプリンガー・フェアラーク社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、１９９４年）参照）。さらに、中間精製およびリニアスケールアップも可能である。液相合成では主鎖および側鎖保護基、および活性化方法、ならびにラセミ化を極力抑えるためのセグメントの選択を考慮することが必要となることは、当業者であれば理解するであろう。
【０１３６】
一般に、固相ペプチド合成は、保護アミノ酸を用いて樹脂支持体上で直鎖状ペプチド鎖を組み立てる、メリフィールドほか（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）８５：ｐ２１４９、１９６３年に記載の方法に準じて実施することができる。通常、固相ペプチド合成ではＢｏｃもしくはＦｍｏｃ法を用いる。Ｂｏｃ法では１％架橋ポリスチレン樹脂を用いる。α−アミノ官能基の標準的な保護基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基である。この基は、２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸の希釈液を用いて除去することができる。次のＢｏｃ−アミノ酸は、通常、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いてそのアミノアシル樹脂にカップリングさせる。組み立てが完了した後、このペプチド−樹脂を無水ＨＦで処理してベンジルエステル結合を切断し、遊離ペプチドを放出させる。通常、側鎖官能基は、合成過程でベンジル由来封鎖基により封鎖するが、これもＨＦによって切断することができる。次いで、適切な溶媒を用いて樹脂から遊離ペプチドを抽出し、これを精製して特性を決定する。新規に合成したペプチドは、例えば、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、分配クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーによって精製することができ、その後、例えば、質量分析もしくはアミノ酸配列の解析によって特性を決定することができる。Ｂｏｃ法では、ベンズヒドリルアミンもしくはメチルベンズヒドリルアミン樹脂を用いてＣ−末端アミド化ペプチドを得ることができ、これをＨＦで切断することにより直接ペプチドアミドが得られる。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を使用する別の方法では、側鎖保護基およびペプチド−樹脂結合をＮ−α−Ｆｍｏｃ基の切断に使用する第二級アミンに対して完全に安定化することができる種々の試薬を用いる。側鎖保護およびペプチド−樹脂結合は温和な酸分解により切断される。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の樹脂は、繰り返し塩基と接触すると、Ｆｍｏｃ化学反応に不適切なものになるので、この樹脂にｐ−アルコキシベンジルエステルを結合させたものが一般に使用される。脱保護および切断は、通常、ＴＦＡを用いて達成される。Ｎ−末端のアセチル化は、最終のペプチドを樹脂からの切断の前に無水酢酸と反応させることによって達成することができる。Ｃ−アミド化は、メチルベンズヒドリルアミン樹脂などの適切な樹脂を用い、Ｂｏｃ法により達成される。
【０１３７】
一般に、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドをコードする遺伝子の修飾は、部位特異的突然変異誘発法などの種々の公知の技術により容易に達成することができる（ギルマン（Ｇｉｌｌｍａｎ）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、ジーン（Ｇｅｎｅ）８：ｐ８１−９７（１９７９年）およびロバーツ、Ｓ．ほか（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２８：ｐ７３１−７３４（１９８７年）および米国特許第５，０３２，６７６号参照。これらは全て参考として本明細書に援用されている）。修飾の結果の多くは、適切なアッセイ法で所望の特性についてスクリーニングすることにより評価される。例えば、このポリペプチドのＭ−ＣＳＦレセプター結合特性の変化については、適切な標準ポリペプチドを用いる競合アッセイにより、または参考として本明細書に援用されている米国特許第４，８４７，２０１号に記載のバイオアッセイにより検出することができる。
【０１３８】
本発明の挿入型改変体は、Ｍ−ＣＳＦの所定の部位に１つ以上のアミノ酸残基を導入したものである。例えば、挿入型改変体は、そのサブユニットのアミノ末端もしくはカルボキシル末端への異種タンパク質もしくは異種ポリペプチドの融合体とすることができる。置換型改変体は、少なくとも１つの残基を除去してその位置に別の残基を挿入したものである。非天然型アミノ酸（即ち、天然タンパク質に通常存在しないアミノ酸）および等比体積のアナログ（アミノ酸に限らない）も本発明での使用に適している。好適な置換の例としては、例えば、Ｇｌｕ−＞Ａｓｐ、Ｓｅｒ−＞Ｃｙｓ、およびＣｙｓ−＞Ｓｅｒ、Ｈｉｓ−＞アラニンなどが当該分野で公知である。別の種類の改変体に、Ｍ−ＣＳＦから１つ以上のアミノ酸残基が除去されていることを特徴とする欠失型改変体がある。
【０１３９】
本発明の他の改変体は、天然タンパク質のアミノ酸の化学的修飾（例えば、ヒスチジン残基を修飾するジエチルピロカーボネート処理）によって作製することができる。特定のアミノ酸側鎖に特異的な好ましい化学的修飾も好ましい。また、特異性は、他の側鎖を、保護すべき側鎖に対する抗体で封鎖することによって得ることができる。化学的修飾としては、酸化、還元、アミド化、脱アミド、または多糖類もしくはポリエチレングリコールのようなかさ高い基による置換などの反応が挙げられる（例えば、いずれも参考として本明細書に援用される米国特許第４，１７９，３３７号およびＷＯ９１／２１０２９号参照）。
【０１４０】
例示的な修飾としては、コハク酸その他のカルボン酸の無水物との反応によるリジニルおよびアミノ末端残基の修飾が挙げられる。これらの物質による修飾は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果がある。アミノ含有残基を修飾するためのその他の好適な試薬としては、メチルピコリンイミデート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｉｃｏｌｉｎｉｍｉｄａｔｅ）；ピリドキサールリン酸；ピリドキサールクロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素，２，４−ペンタジオンなどのイミドエステル、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応、ならびにポリエチレングリコールその他のかさ高い置換基のＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステルが挙げられる。
【０１４１】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール，２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンを含むいくつかの試薬との反応によって修飾することができる。アルギニン残基の修飾では、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルカリ性条件で反応を行う必要がある。さらに、こうした試薬は、リジン基およびアルギニンイプシロン−アミノ基と反応させることができる。
【０１４２】
また、チロシル残基は、特定の目的でスペクトル標識をチロシル残基に導入することにより修飾することができ、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってそれぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。また、１２５Ｉもしくは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ化することにより、ラジオイムノアッセイ用標識タンパク質を調製することもできる。
【０１４３】
カルボキシル側鎖（アスパルチルもしくはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ−−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−−Ｒ．ｓｕｐ．１）と反応させることにより選択的に修飾することができる；但し、ＲおよびＲ１は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドもしくは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどの異なるアルキル基である。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンと反応させることによりアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【０１４４】
逆に、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、温和な酸性条件下でそれぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミド化することができる。これらの残基のいずれのタイプも本発明の範囲に包含される。
【０１４５】
その他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基もしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．クライトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．）、サンフランシスコ、ｐ７９−８６（１９８３年））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１４６】
Ｍ−ＣＳＦムテインの天然Ｍ−ＣＳＦタンパク質に対する類似性を調べるためにはいくつかの方法を用いることができる。例えば、パーセント相同性は、比較するべき配列内の同一アミノ酸残基と一直線に並んでいる２つの配列のうちの短い方の配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして計算され、この時、アラインメントを最大化するために１００アミノ酸の長さにつき４つのギャップを導入することができる（参考として本明細書に援用されるデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）、「アトラス・オブ・プロテイン・シーケンス・アンド・ストラクチャー（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」第５巻、ｐ１２４、ナショナル・バイオケミカル・リサーチ・ファウンデーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ワシントンＤ．Ｃ．（１９７２年）参照）。また、配列比較のためのポリペプチドの配列アラインメントは、種々の多重アラインメント・サーバーを用いて実施することができ、これらの多くは、現在インターネット上から入手可能であり、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、ＭＡＰ、ＰＩＭＡ、Ｂｌｏｃｋ  Ｍａｋｅｒ、ＭＳＡ、ＭＥＭＥおよびＭａｔｃｈ−Ｂｏｘがある。ポリペプチド（およびポリヌクレオチド）の配列アラインメントにはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（ヒギンスほか（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ジーン（Ｇｅｎｅ）（１９８８年）７３：ｐ２３７−２４４；ヒギンスほか（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）（１９９６年）２２６：ｐ３８３−４０２）を用いることが望ましい。同様に、プログラムＢＬＡＳＴＰはタンパク質データベースに対してアミノ酸検索（ｑｕｅｒｙ）配列を比較するものであり、また、ＴＢＬＡＳＴＮは、６種の読み枠（両鎖）の全てに動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対してタンパク質検索（ｑｕｅｒｙ）配列を比較するもので、本発明に用いることができる。また、２つのアミノ酸配列が実質的に相同性（即ち、同様もしくは同一）であるかどうかは、ピアソンほか（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８５：ｐ２４４４−２４４８（１９８８年）によるＦＡＳＴＡサーチに基づいて決定することもできる。
【０１４７】
同一性および／または類似性を決定するための方法は、調べる配列間の整合性を最大化するように設計されていることが特に好ましい。同一性および類似性を決定する方法は、入手可能な公開コンピュータプログラム（例えば、前述のプログラムなど）として体系化されている。２配列間の同一性および類似性を決定する好適なコンピュータプログラム方法としては、ＧＡＰ（デブローほか（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．）、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（１９８４年）１２（１）：ｐ３８７；ジェネティクス・コンピュータ・グループ・オブ・ウィスコンシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルチュールほか（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）（１９９０年）２１５：ｐ４０３−４１０）を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）その他の関係先（アルチュールほか（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．）、ＢＬＡＳＴマニュアル、ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨベセズダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、ＭＤ  ２０８９４；アルチュールほか（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）（１９９０年）２１５：ｐ４０３−４１０）から公開されている。また、よく知られているスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムも同一性の決定に用いることができる。ＧＡＰプログラムを用いてポリヌクレオチド配列を比較する際、以下のデフォルトパラメータが好ましい：比較行列：一致＝＋１０、不一致＝０およびギャップペナルティ５０、ギャップ長ペナルティ３（ニードルマンほか（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）（１９７０年）４８：ｐ４４３−４５３）。
【０１４８】
また、タンパク質間の関連性は、これらをコードしている核酸の関連性によって特徴付けることができる。ポリヌクレオチド配列の同一性および／または類似性を決定する方法は前述のとおりである。さらに、中程度もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成能を調べることによりポリヌクレオチド配列の類似性を決定する方法は、以下のように決定することができる。例示的な中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％硫酸デキストランを含むハイブリダイゼーション溶液中４２℃でのハイブリダイゼーション、ならびにその後の０．１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液による６０℃３０分間での２度の洗浄である。高度にストリンジェントな条件としては、０．１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含む洗浄溶液による６８℃での洗浄が挙げられる。当該分野で報告されているように（オースベルほか（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．）編「プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」ジョンワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）（１９９４年）、ｐ６．０．２−６．４．１０）温度および緩衝液、もしくは塩濃度を変更することにより同等なストリンジェンシーの条件を得ることができることは、当該分野では理解される。ハイブリダーゼーション条件の変更は、経験的に決定することができ、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さおよびパーセンテージに基づいて正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、サンブルックほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）編、「モレキュラー・クローニング−：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８９年）、ｐ９．４７−９．５１に記載の方法により、計算することができる。
【０１４９】
本発明による例示的なＭ−ＣＳＦＲ断片は、Ｍ−ＣＳＦ／レセプター結合に関与しているドメイン（ドメイン１、２および３と考えられている）の１つ以上、もしくは２つ以上を含むことができる。好適なＭ−ＣＳＦＲ断片は、Ｍ−ＣＳＦＲのドメイン１、２および３のうちの３つ全てを含む。このような断片もしくはＭ−ＣＳＦＲの細胞外ドメイン全体に対する別の突然変異誘発体および／または改変体も企図されており、Ｍ−ＣＳＦムテインの項で前述した方法により作製することができる。
【０１５０】
（Ｍ−ＣＳＦＲ抗体）
また、本発明は、本発明の方法によるＭＣＳＦアンタゴニストとして用いることができるＭ−ＣＳＦＲに対する抗体を提供する。
【０１５１】
Ｍ−ＣＳＦＲ（配列番号：８）は、５つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（このうちドメイン１〜３はリガンド−レセプター結合に関与していると考えられている）、膜貫通ドメインおよび細胞内分断Ｓｒｃ関連チロシンキナーゼドメインを有する膜貫通分子である。配列番号：８に関しては、上記ドメインは、以下の位置にある：Ｉｇドメイン１：２７番目から１０２番目のアミノ酸；Ｉｇドメイン２：１１２番目から１９６番目のアミノ酸；Ｉｇドメイン３：２１５番目から２８５番目のアミノ酸；Ｉｇドメイン４：３０８番目から３９９番目のアミノ酸；Ｉｇドメイン５：４１０番目から４９２番目のアミノ酸；膜貫通ドメイン：５１５番目から５３７番目のアミノ酸；およびキナーゼドメイン：５８２番目から９１０番目のアミノ酸。「代表的な」免疫グロブリン様ドメインは、ループ構造を含み、この構造は、通常、各ループの末端の２個のシステイン間のジスルフィド結合によって固定されている。Ｍ−ＣＳＦ−Ｒでは、これらのＩｇ様ループを形成するシステインは、以下のアミノ酸の位置にある：ドメイン１：４２番目、８４番目；ドメイン２：１２７番目、１７７番目；ドメイン３：２２４番目、２７８番目；ドメイン４：関与のシンテインなし；ドメイン５：４１９番目、４８５番目。
【０１５２】
Ｍ−ＣＳＦＲの完全な状態の細胞外部分、もしくは抗原性を保持しているその任意の断片、例えば、上記Ｉｇ様ループのうちの１つ以上は、天然のレセプターに結合する抗体を産生させるのに用いることができる。ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、完全なヒト抗体およびこれらの抗原結合性断片は、Ｍ−ＣＳＦに対する抗体について上述したような方法で作製することができる。これらの抗体産物は、本明細書の「スクリーニング方法」と題する項に記載したアッセイ法もしくは当該分野で公知の任意の適切なアッセイ法を用いて、Ｍ−ＣＳＦＲアンタゴニストとしての活性、および本発明の治療方法に対する適合性についてスクリーニングすることができる。
【０１５３】
（可溶性Ｍ−ＣＳＦＲ）
さらに、本発明は、本発明の方法によるＭＣＳＦアンタゴニストとして用いることができるＭ−ＣＳＦＲムテインを提供する。
【０１５４】
インビボでのＭ−ＣＳＦの生物学的機能は、ｃ−ｆｍｓ遺伝子産物とも呼ばれるＭ−ＣＳＦレセプターの結合および活性化を介して生じる。配列番号：８の２０番目から５１１番目のアミノ酸に相当する組換えヒト可溶性Ｍ−ＣＳＦレセプター（ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲ）（クーセンス、Ｌ．ほか（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，Ｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２０：ｐ２７７（１９８６年）は、Ｍ−ＣＳＦタンパク質のレセプター結合能を調べるためのインビトロアッセイ試薬として用いられた。可溶性型の膜貫通レセプターを作製するために、バキュロウイルス／昆虫細胞の組換え発現系を用いてヒトＭ−ＣＳＦレセプターの細胞外ドメインのみの発現が行われた。三次もしくは四次構造に悪影響を与えないでこの可溶性レセプターを精製するために、下記のように、非変性（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）クロマトグラフィー法が選択された。この組換えレセプターを精製するには他の選択肢もある。このレセプターの適切な抗体もしくはリガンドが利用可能な場合にはアフィニティークロマトグラフィーを用いることができる。また、この組換えレセプターのＣ−末端、即ち、ＫＴ３抗体認識配列に「標識（ｔａｇ）」を付加し、抗−標識抗体、即ち、ＫＴ３、カラムにより精製してこれをアフィニティークロマトグラフィーに使用することができる。ｒｈｓＭ−ＣＳＦＲがグリコシル化される発現系では、特定の糖タンパク質を濃縮するのにレクチンクロマトグラフィーを用いることができる。
【０１５５】
前述のＩｇ様ループは、レセプターの細胞外ドメイン内に１つ以上あれば、Ｍ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦＲとの相互作用を阻害するのに十分であると考えられる。従って、Ｍ−ＣＳＦＲ細胞外ドメインの断片およびそのムテインは、当該分野で公知の組換えもしくは化学的合成手段を用いて容易に作製することができる。得られた産物は、本明細書の「スクリーニング方法」と題する項に記載したアッセイ法もしくは当該分野で公知の任意の適切なアッセイ法を用いて、Ｍ−ＣＳＦＲアンタゴニストとしての活性、および本発明の治療方法に対する適合性についてスクリーニングすることができる。
【０１５６】
（遺伝子治療）
治療用タンパク質の適切な細胞への送達は、物理的ＤＮＡ移送方法（例えば、リポソームもしくは化学的処理）の使用、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスもしくはレトロウイルス）の使用を含む当該分野で公知の任意の適切な方法を用いることにより、エキソビボ、インサイチュもしくはインビボによる遺伝子治療を介して行うことができる。例えば、インビボ治療では、所望のタンパク質をコードしている核酸は、単独で、またはベクター、リポソームもしくは沈殿物との併用で被験体に直接注射することができ、また、一部の実施形態として、このタンパク質化合物の発現が所望される部位に注射することができる。エキソビボ治療では、被験体の細胞を取り出し、上記核酸をこの細胞に導入し、この改変細胞を被験体に直接、もしくは、例えば、この患者体内に埋め込む多孔質膜内に封入して、戻す。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照されたい。生細胞に核酸を導入するには種々の技術が利用できる。利用可能な技術は、核酸をインビトロで培養細胞内に移入させるのか、意図される宿主の細胞内にインビボで移入させるのかによって異なる。インビトロで哺乳動物細胞内に核酸を移入するのに適した技術としては、リポソームの利用、電気穿孔法、微量注入法、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。核酸のエキソビボでの送達によく用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０１５７】
インビボでのその他の核酸移入技術としては、（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、アデノ関連ウイルスなどの）ウイルスベクターによるトランスフェクション、および脂質利用システムが挙げられる。核酸およびトランスフェクション剤は、必要に応じて微粒子と結合させる。例示的なトランスフェクション剤としては、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、四級アンモニウム両親媒性化合物ＤＯＴＭＡ（リポフェクチンとしてＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販されている（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウムブロミド）（フェルグナーほか（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９８７年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８４：ｐ７４１３−７４１７；マローンほか（Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９８９年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８６：ｐ６０７７−６０８１）；ペンダントトリメチルアンモニウム頭部を有する親油性グルタミン酸ジエステル（イトーほか（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９０年）バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）１０２３：ｐ１２４−１３２）；陽イオン性脂質ジオクタデシルアミド−グリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）（Ｊ．Ｐ．ベーア（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ）（１９８６年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）２７：ｐ５８６１−５８６４；Ｊ．Ｐ．ベーア（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ）（１９８９年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８６：ｐ６９８２−６９８６）などの代謝性親（ｐａｒｅｎｔ）脂質；代謝性四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（レベンティスほか（Ｌｅｖｅｎｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９０年）バイオキミカ・インターナショナル（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｉｎｔｅｒ．）２２：ｐ２３５−２４１）；３β［Ｎ−（Ｎ’−Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３β［Ｎ−（Ｎ’−Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌの１対１混合物（ガオほか（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９１年）バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）１０６５：ｐ８−１４）、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（ベーアほか（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．）バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ）、１９９４年、５：ｐ３８２−３８９）、親油性ポリリジン（ＬＰＬＬ）（ジョーほか（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９１年）バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）９３９：ｐ８−１８）、［［（１，１，３，３−テトラメチルブチル）クレ−ソキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウムヒドロキシド（ＤＥＢＤＡヒドロキシド）と過剰のホスファチジルコリン／コレステロールとの併用（バラスほか（Ｂａｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９９８年）バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）９３９：ｐ８−１８）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（ピンナドゥウェジほか（Ｐｉｎｎａｄｕｗａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９８９年）バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）９８５：ｐ３３−３７）、ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびステアリルアミンとグルタミン酸との親油性ジエステルとホスファチジルエタノールアミンとの混合物（ローズほか（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９９１年）バイオテクニーク（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）１０：ｐ５２０−５２５）、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（トランスフェクトＡＣＥ（ＴｒａｎｓｆｅｃｔＡＣＥ）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、ならびにオリゴガラクトース含有脂質が挙げられる。移入効率を増大させる例示的なトランスフェクション増強剤としては、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破壊ペプチド（オオモリ、Ｎ．Ｉ．ほか（Ｏｈｍｏｒｉ  Ｎ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオケミストリー・バイオフィジックス・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）１９９７年６月２７日号、２３５（３）：ｐ７２６−９）、コンドロイタン系プロテオグリカン、硫酸化プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ポラード、Ｈ．ほか（Ｐｏｌｌａｒｄ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９８年、２７３（１３）：ｐ７５０７−１１）、インテグリン結合性ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、直鎖デキストラン・ノナサッカライド、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’−末端ヌクレオシド間結合に繋がれたコレステリル基（レッツィンガー、Ｒ．Ｌ．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、１９８９年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８６：（１７）：ｐ６５３３−６）、リゾホスファチド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、および１−オレオイルリゾホスファチジルコリンが挙げられる。
【０１５８】
場合によっては、核酸含有ベクターを標的細胞へ誘導する物質を用いて核酸を送達することが望ましいことがある。このような「ターゲティング」分子としては、標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、もしくは標的細胞上のレセプターのリガンドが挙げられる。リポソームを用いる場合には、エンドサイトーシスと関連した細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を標的化および／または取り込み促進のために用いることができる。このようなタンパク質の例としては、特定の細胞型に指向性のキャプシドタンパク質およびその断片、細胞分裂（ｃｙｃｌｉｎｇ）中に内在化を受けるタンパク質の抗体、ならびに細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増大させるタンパク質が挙げられる。別の実施形態として、レセプター媒介性エンドサイトーシスを利用することができる。このような方法は、例えば、ウーほか（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８７年、もしくはワーグナーほか（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年に記載されている。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子治療のプロトコルの概説については、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）１９９２年を参照されたい。また、ＷＯ９３／２５６７３号およびこれに引用されている文献についても参照されたい。遺伝子治療技術についてさらに概説したものとしては、フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４４：ｐ１２７５−１２８１（１９８９年）；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、ネイチャー（ｎａｔｕｒｅ）第３９２巻の補遺、第６６７９号、ｐ２５−３０（１９９８年）；ヴェルマ（Ｖｅｒｍａ）、サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）：ｐ６８−８４（１９９０年）；およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３５７：ｐ４５５−４６０（１９９２年）を参照されたい。
また、本発明はアンチセンス化合物およびこれを使用する方法を提供する。Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲ活性のレベルは、遺伝子発現レベルを低減させるための公知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイムおよび／または三重らせん法を用いることにより、低下させることができる。これらの分子の作製および使用の技術については、当業者には公知である。
【０１５９】
アンチセンス化合物は、標的としたｍＲＮＡとハイブリダイゼーションし、タンパク質への翻訳を阻止することによりｍＲＮＡの翻訳をブロックすることができ、このような化合物としては、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補性のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。標的化は、そのコーディング領域、より好ましくは転写後の未翻訳領域に対するものとすることができる。相補性は完全なものである必要はなく、内因性ＲＮＡもしくはＤＮＡとハイブリダイズすることができ、安定な二重鎖もしくは三重鎖を形成するのに十分な相補性であるだけでよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。また、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンス法では、目的の遺伝子の非コーディング領域に対して相補性のオリゴヌクレオチドも使用することができる。アンチセンス核酸は６〜約５０ヌクレオチド長の範囲のオリゴヌクレオチドであることが好ましい。特定の局面では、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、もしくは少なくとも２０ヌクレオチドである。
【０１６０】
先ず、インビトロでの研究で、候補アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的遺伝子の発現に対する阻害能を定量する。この研究ではアンチセンスの遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的作用とを区別するコントロールを用いることが好ましい。また、この研究では標的ＲＮＡもしくはタンパク質のレベルを内部標準ＲＮＡもしくはタンパク質と比較することが好ましい。
【０１６１】
こうしたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾型変種とすることができ、また、一本鎖もしくは二本鎖（例えば、ＲＮＡｉ）とすることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分もしくはリン酸主鎖を修飾することにより、例えば、この分子もしくはハイブリダイゼーションの安定性を向上させることができる。例えば、ＷＯ０３／０８８９２１号；ディーン（Ｄｅａｎ）、カレント・オピニョン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１２（６）：ｐ６２２−５、２００１年；ギアリほか（Ｇｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）、カレント・オピニョン・イン・インベスティゲイショナル・ドラッグズ（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ）２（４）：ｐ５６２−５７３、２００１年を参照されたい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞を標的とする場合）または細胞膜透過促進剤（例えば、レッツィンガーほか（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８６：ｐ６５５３−６５５６；ルメートルほか（Ｌｅｍａｉｔｒｅ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８７年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８４：ｐ６４８−６５２；１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０参照）、脳血液関門透過促進剤（例えば、１９８８年４月２５日公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４参照）、ハイブリダイゼーション作動型切断剤（例えば、クロールほか（Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、バイオテクニークス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）６：ｐ９５８−９７６参照）またはインターカレート剤（例えば、ゾン（Ｚｏｎ）、１９８８年、ファーマシューティカル・リサーチ（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．）５：ｐ５３９−５４９参照）などの他の成分に結合させることができる。また、上記アンチセンス化合物は、互いに平行して伸びる相補性ＲＮＡとの特定の二本鎖ハイブリッドを形成しているα−アノマーオリゴヌクレオチドとすることもできる（ゴーティエほか（Ｇａｕｔｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８７年、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１５：ｐ６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチドは、２’−（）−メチルリボヌクレオシド（イノウエほか（Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８７年、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１５：ｐ６１３１−６１４８）もしくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（イノウエほか（Ｉｎｏｕｅ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８７年、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）２１５：ｐ３２７−３３０）とすることができる。
【０１６２】
アンチセンス分子は、インビボで標的遺伝子を発現している細胞に送達させる必要がある。アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡを細胞に送達させる方法はいくつか開発されている：例えば、アンチセンス分子を組織部位内にそのまま注射することができ、または所望の細胞を標的とするように設計した修飾型アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面に発現されたレセプターもしくは抗原に特異的に結合するペプチドもしくは抗体に連結したアンチセンス）を全身性に投与することができる。１つの方法として、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度は、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なプロモータの制御下に置いた組換えＤＮＡ構築物を用いて得ることができる。患者の標的細胞のトランスフェクションにこのような構築物を用いると、内因性標的遺伝子の転写物と相補性塩基対を形成することによりこの標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を阻止するのに十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写が生じる。例えば、ベクターを導入することによって、例えば、これを細胞に取り込ませてアンチセンスＲＮＡの転写を誘導させることができる。このようなベクターは、これが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを生じることができる間、エピソームとして存続させ、もしくは染色体に組み込ませることができる。
【０１６３】
また、標的遺伝子ｍＲＮＡの転写物を触媒的に切断するように設計したリボザイム分子も、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳、従って、標的遺伝子産物の発現を阻止するために用いることができる。（例えば、１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４号；サーバーほか（Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）、１９９０年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４７：ｐ１２２２−１２２５参照）。リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。（概説については、ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）、１９９４年、カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）４：ｐ４６９−４７１参照）。リボザイムの作用メカニズムは、リボザイム分子の相補性標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼ的切断事象を含む。リボザイム分子の組成には、標的遺伝子ｍＲＮＡに対して、好ましくは５’末端により近い部位に相補性の配列を１つ以上含ませる必要があり、また、ｍＲＮＡ切断に関与する公知の触媒配列を含ませる必要がある。この配列については、例えば、その全体が本明細書に参考として援用される米国特許第５，０９３，２４６号を参照されたい。また、標的ｍＲＮＡと相補性の塩基対を形成する特定のフランキング領域により決定される位置でｍＲＮＡを切断するハンマーヘッド型リボザイムも使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムの構成および作製については、当該分野で公知であり、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、１９９５年、モレキュラー・バイオロジー・アンド・バイオテクノロジー：ア・コンプレヘンシブ・デスク・リファレンス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）、ＶＣＨパブリッシャーズ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク（特に、ｐ８３３の図４参照）、およびその全体が本明細書に参考として援用されるハセロフ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）、ゲルラッハ（Ｇｅｒｌａｃｈ）、１９８８年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３４：ｐ５８５−５９１に比較的詳細に記載されている。また、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（「Ｃｅｃｈ型リボザイム」とも呼ばれる）を使用することもできる。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａに天然に存在するもの（ＩＶＳもしくはＬ−１９ＩＶＳ  ＲＮＡと呼ばれる）などのリボザイムについては、ツァウクほか（Ｚａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８４年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２４：ｐ５７４−５７８；ツァウク（Ｚａｕｇ）、チェク（Ｃｅｃｈ）、１９８６年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３１：ｐ４７０−４７５；ツァウクほか（Ｚａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２４：ｐ４２９−４３３；公開国際特許出願ＷＯ８８／０４３００号；およびビーン（Ｂｅｅｎ）、チェク（Ｃｅｃｈ）、１９８６年、セル（Ｃｅｌｌ）４７：ｏ２０７−２１６に記載されている。Ｃｅｃｈ型リボザイムには、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対の活性部位がある。また、リボザイムは、（例えば、安定性、標的化等を向上させるために）修飾オリゴヌクレオチドで構成することもでき、インビボで標的遺伝子を発現している細胞にこれを送達させることができる。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるので、効率面から細胞内濃度は低くする必要がある。
【０１６４】
また、内因性標的遺伝子の発現は、標的化相同的組換え法（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を用いて標的遺伝子もしくはそのプロモータを不活化または「ノックアウト」することにより、低減させることができる（例えば、それぞれその全体が本明細書に参考として援用されるスミシーズほか（Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８５年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１７：ｐ２３０−２３４；トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、カペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、１９８７年、セル（Ｃｅｌｌ）５１：ｐ５０３−５１２；トンプソンほか（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年、セル（Ｃｅｌｌ）５：ｐ３１３−３２１参照）。例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコーディング領域もしくは調節領域）と相同性のＤＮＡに隣接されている非機能的標的遺伝子変異体（または完全に無関係なＤＮＡ配列）を用いて、選択マーカおよび／または陰性選択マーカを併用し、もしくは併用しないで、インビボで標的遺伝子を発現している細胞をトランスフェクションすることができる。標的化相同的組換え法によってこのＤＮＡ構築物を挿入することにより、標的遺伝子が不活化される。
【０１６５】
あるいは、内因性標的遺伝子の発現は、標的遺伝子の調節領域（即ち、標的遺伝子のプロモータおよび／またはエンハンサ）と相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的とすることにより生体内標的細胞の標的遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成することによって低減させることができる。（概して、ヘレーネ（Ｈｅｌｅｎｅ）、１９９１年、アンチキャンサー・ドラッグ・デザイン（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．）６（６）：ｐ５６９−５８４；ヘレーネほか（Ｈｅｌｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）６６０：ｐ２７−３６；およびマーハ（Ｍａｈｅｒ）、１９９２年、バイオアッセイズ（Ｂｉｏａｓｓａｙｓ）１４（１２）：ｐ８０７−８１５参照）。
【０１６６】
転写を阻害するための三重らせん形成に用いる核酸分子は、一本鎖とし、デオキシヌクレオチドで構成する必要がある。こうしたオリゴヌクレオチドの塩基組成は、通常、かなり多くのプリンもしくはピリミジンが二重鎖の一本鎖に存在することを必要とするフーグスティーン型（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）塩基対合則によって三重らせんの形成を促進するように設計しなければならない。ヌクレオチド配列はピリミジンをベースとしたものとすることができ、これにより、得られる三重らせんの３本の結合鎖を横切ってＴＡＴおよびＣＧＣ＋トリプレットが生じる。このピリミジンに富む分子では、上記二重鎖の一本鎖のプリンに富む領域に対する塩基相補性がこの鎖に平行な方向に形成される。さらに、プリンに富む、例えば、一連のＧ残基を含む核酸分子を選択することもできる。この分子は、プリン残基の大部分が標的化した二重鎖の一本鎖にあるＧＣ対に富むＤＮＡ二重鎖と三重らせんを形成し、この三重鎖の３本の鎖を横切ってＧＧＣトリプレットが生じる。あるいは、いわゆる「スイッチバック（ｓｗｉｔｃｈｂａｃｋ）」核酸分子を創出することにより、三重らせん形成のための標的とすることができる潜在的な配列を増加させることができる。スイッチバック分子は、これに先ず二重鎖のうちの一本鎖と、次いでもう一方の鎖と塩基対を形成させるようにして５’−３’と３’−５’方向を交互に行う方法で合成し、これにより、かなり多くのプリンもしくはピリミジンが二重鎖の一本鎖に存在する必要性がなくなる。
【０１６７】
アンチセンス、リボザイムもしくは三重らせんによる治療で標的遺伝子発現が望ましくないほど低いレベルに低下する場合には、代替タンパク質を投与することができる。あるいは、どのようなアンチセンス、リボザイムもしくは三重らせんによる治療が行われていてもこれの影響を受けやすい配列を含まない修飾核酸を用いることで、遺伝子発現を増強させる遺伝子治療を行うこともできる。
【０１６８】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイムならびに三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子合成のための当該分野で公知の任意の方法により作製することができる。こうした方法としては、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成などの、当該分野で公知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドの化学合成法が挙げられる。あるいは、治療的ＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ配列をインビトロもしくはインビボで転写させることによってＲＮＡ分子を作製することができる。
【０１６９】
化学合成法としては、市販の自動ＤＮＡ合成装置の使用が挙げられる；ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドはスタインほか（Ｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．）（１９８８年、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１６：ｐ３２０９）の方法によって合成することができ、メチルホスホネート型オリゴヌクレオチドは、細孔の制御されたガラスポリマー支持体を用いることによって作製することができる（サリンほか（Ｓａｒｉｎ，ｅｔ  ａｌ．）、１９８８年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８５：ｐ７４４８−７４５１）。
【０１７０】
（ペプチドおよび低分子）
本明細書に用いている「タンパク質」という用語は、タンパク質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチドなどを含む。さらに、このタンパク質という用語は、断片、多量体、もしくは完全な状態の分子および／または断片の凝集体のことをも意味する。タンパク質は天然に存在するものとすることができ、または組換えＤＮＡ法もしくは化学的および／または酵素的合成法によって作製することができる。例えば、サンブルックほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、「モレキュラー・クローニング−−ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（第３版、２００１年）を参照されたい。
【０１７１】
「ペプチド」という用語は、アミノ酸の比較的短い鎖、好ましくは６〜１００アミノ酸長の鎖のことを意味する。
【０１７２】
ペプチドは、ファージディスプレイ技術を用いて所望の結合活性（例えば、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲとの結合）または生物学的活性についてスクリーニングすることができる（例えば、スコットほか（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９：ｐ３８６（１９９０年）；デブリンほか（Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９：ｐ４０４（１９９０年）；１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日に発行された米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日に発行された米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日に発行された米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日に発行された米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日に発行された米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ９６／４０９８７号；および１９９８年４月１６日に公開されたＷＯ９８／１５８３３号（これらは参考として援用される）参照）。このようなライブラリでは、ペプチド配列は、糸状ファージのコートタンパク質との融合によって表示される。代表的に、この表示ペプチドは、レセプターの抗体固定化細胞外ドメインに対してアフィニティ溶出する。この保持されたファージは、アフィニティ精製および再増殖を連続的に繰り返すことにより、濃縮することができる。最良の結合性を示すペプチドについて配列を決定することにより、ペプチドの１つ以上の構造類似ファミリー内の重要な残基を同定することができる。
【０１７３】
また、ペプチドは、ｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端に融合して大腸菌で発現させたペプチドのライブラリを作製する方法、またはペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）と融合させることにより大腸菌の外膜にペプチドを表示させる方法など、他の方法を用いてスクリーニングすることもできる。別の方法では、ランダムＲＮＡの翻訳をリボソームの遊離の前に停止させることにより、関連ＲＮＡがなお結合しているポリペプチドのライブラリが得られる。他の方法では、ペプチドをＲＮＡに化学的に結合させる（例えば、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、ソスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、９４：ｐ１２２９７−３０３（１９９７年）参照）。ポリエチレンロッド、溶剤浸透性樹脂などの安定な非生物材料にペプチドを固定化した化学的誘導ペプチドライブラリが開発されている。他の化学的誘導ペプチドライブラリでは、フォトリソグラフィを用いて、スライドガラスに固定化したペプチドが走査される。化学的−ペプチドのスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸その他の非天然アナログおよび非ペプチドエレメントの使用が可能である点で有利と考えられる。生物学的および化学的方法については、ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）、ローマン（Ｌｏｗｍａｎ）、カレント・オピニョン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）３：ｐ３５５−６２（１９９２年）に概説されている。
【０１７４】
さらに、ペプチドはＤＮＡレベルの突然変異誘発により修飾することができる。突然変異誘発ライブラリを作製し、スクリーニングすることにより、最良の結合体（ｂｉｎｄｅｒ）の配列をさらに最適化することができる（ローマン（Ｌｏｗｍａｎ）、アニュアル・レビュー・オブ・バイオフィジックス・アンド・バイオモレキュラー・ストラクチャー（Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ）２６：ｐ４０１−２４（１９９７年））。また、タンパク質−タンパク質相互作用の構造解析を行うことにより、大きなタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを提案することもできる。このような解析では、結晶構造から、ペプチドを設計することができる元となるその大きなタンパク質リガンドの重要な残基の特性および相対配向が示唆されることがある（例えば、タカサキほか（Ｔａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）１５：ｐ１２６６−７０（１９９７年）。
【０１７５】
ランダムペプチドもしくは抗原結合性ＣＤＲに由来するペプチドは、線状に、または抗体もしくはその定常領域のような部分などの三次元スカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の一部として、融合させることにより、所望の抗原を結合する新規な高分子を作製することができる。複数のコピーの同一ペプチドもしくは異なるペプチドを含ませることができる。
【０１７６】
本明細書に用いている「ペプチド模倣体」とは、アミノ酸の側鎖またはファルマコフォアまたはその適切な誘導体の集合体を含み、これらがスカフォールドに担持されることによりファルマコフォアの空間的配置が天然ペプチドの生物活性のある立体配座を実質的に模倣するような非ペプチド化合物である。例えば、ペプチド模倣体は、アミノ酸もしくはペプチド結合を欠くが、結合活性に必要な元のペプチドのペプチド鎖基の特定の三次元配置を維持することができる。上記スカフォールドは、二環性、三環性もしくはさらに多環性の炭素もしくはヘテロ原子の骨格を含むことができ、または１つ以上の環構造（例えば、ピリジン、インダゾールなど）もしくはアミド結合をベースとすることができる。このスカフォールドには、スペーサにより、そのコアの一端に酸性基（例えば、カルボン酸官能基）、他端に塩基性基（例えば、アミジン、グアニジンなどのＮ含有部分）を結合することができる。ペプチド模倣体を合成するための例示的な技術については、２００３年１０月２３日公開の米国特許出願第２００３０１９９５３１号、２００３年７月２４日公開の米国特許出願第２００１０１３９３４８号に開示されている。
【０１７７】
また、抗体その他のタンパク質の他に、本発明は別のＭ−ＣＳＦアンタゴニストをも企図しており、このアンタゴニストとしては、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少の治療にも有効な低分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような低分子は、Ｍ−ＣＳＦに対する結合能および／またはＭ−ＣＳＦとＭ−ＣＳＦＲとの間の相互作用に対する阻害能をアッセイすることにより同定することができる。
【０１７８】
低分子とＭ−ＣＳＦとの結合を測定する方法は、当該分野で容易に利用可能であり、このような方法として、例えば、低分子がＭ−ＣＳＦとそのレセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）もしくは抗Ｍ−ＣＳＦ抗体との相互作用を干渉するような競合アッセイが挙げられる。あるいは、低分子とＭ−ＣＳＦとの相互作用を測定する直接的な結合アッセイ法を用いることもできる。例えば、組織培養プレートもしくはビーズなどの不溶性マトリクスにＭ−ＣＳＦを吸着させるＥＬＩＳＡアッセイ法を用いることができる。目的とする低分子を加えることにより、標識したＭ−ＣＳＦＲもしくは抗Ｍ−ＣＳＦ抗体のＭ−ＣＳＦへの結合がブロックされる。あるいは、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）アッセイによって低分子のＭ−ＣＳＦへの結合を測定することができる。この方法では、蛍光標識二次抗体の存在下に、Ｍ−ＣＳＦを発現している細胞を蛍光標識抗Ｍ−ＣＳＦ抗体もしくは抗Ｍ−ＣＳＦ抗体とインキュベートする。低分子のＭ−ＣＳＦへの結合は、このＭ−ＣＳＦ発現細胞に結合した蛍光が用量依存性に減少することによって判定することができる。同様に、この低分子を標識、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識し、固定化Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦ発現細胞とインキュベートし、結合した低分子の放射活性もしくは蛍光を測定することにより、低分子の直接結合を評価することができる。
【０１７９】
（スクリーニング方法）
有効な治療は、重大な毒性のない有効な薬剤の同定に依存している。癌転移に伴う骨量減少の予防もしくは治療に有用となる可能性のある化合物は、種々のアッセイ法を用いてスクリーニングすることができる。例えば、候補アンタゴニストは、先ず、細胞培養系で特徴付けを行うことによって、Ｍ−ＣＳＦの破骨細胞形成誘導作用を無効化する能力を調べることができる。このような系としては、マウス頭蓋冠骨芽細胞と脾臓細胞との共培養（スダほか（Ｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、「破骨細胞分化の調節（Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」エンドクリン・レビューズ（Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．）１３：ｐ６６−８０、１９９２年；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、ウダガワ（Ｕｄａｇａｗａ）、トレンズ・イン・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．）９：ｐ６−１２、１９９８年）、マウス間質細胞株（例えば、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６およびＳＴ２）とマウス脾細胞（ウダガワほか（Ｕｄａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）１２５：ｐ１８０５−１３、１９８９年）との共培養、およびＳＴ２細胞と骨髄細胞、末梢血単核細胞もしくは肺胞マクロファージとの共培養（ウダガワほか（Ｕｄａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８７：ｐ７２６０−４、１９９０年；ササキほか（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５８：ｐ４６２−７、１９９８年；マンチーノほか（Ｍａｎｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．）１００：ｐ１８−２４、２００１年）が挙げられる。Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの非存在下では、このような共培養で形成される多核細胞は、酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ、破骨細胞の指標酵素）活性、カルシトニンレセプター、ｐ６０Ｃ−ＳＴＣ、ビトロネクチンレセプター、ならびに骨および象牙質スライスにおける吸収ピットの形成能などの破骨細胞の主要な分類基準を満たす。有効なＭ−ＣＳＦアンタゴニストが存在すると、このような多核細胞の形成は阻害される。
【０１８０】
上記の共培養系の他に、間質細胞を含まない系もしくは骨芽細胞を含まない系を用いて候補Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの破骨細胞形成阻害能をアッセイすることができる。破骨細胞形成に必要なＭ−ＣＳＦは、共培養転移性癌細胞（例えば、ＭＤＡ２３１）もしくはこの癌細胞の馴化培地（マンチーノほか（Ｍａｎｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．）１００：ｐ１８−２４、２００１年）から、または精製Ｍ−ＣＳＦの添加によって、供給することができる。
【０１８１】
また、所与のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの癌転移に伴う骨量減少を予防もしくは治療する効果については、当業者によく知られている骨転移の動物モデル系のうちの任意の系を用いて検定することができる。このようなモデル系としては、腫瘍細胞の注入を直接、骨髄腔内（インガル（Ｉｎｇａｌｌ）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ソサエティ・フォ・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディシン（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）１１７：ｐ８１９−２２、１９６４年；ファラスコ（Ｆａｌａｓｋｏ）、クリニカル・オーソペディクス（Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．）１６９：ｐ２０−７、１９８２年）、ラット腹大動脈内（ポールズほか（Ｐｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ブリティシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）２８：ｐ３１６−２１、１９７３年）、マウス側尾静脈内もしくはマウス左心室内（オーゲロほか（Ａｕｇｕｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）４８：ｐ６８７６−８１、１９８８年）に行うものが挙げられる。有効なＭ−ＣＳＦアンタゴニストの非存在下では、注入した腫瘍細胞により形成される骨溶解性骨転移は、ラジオグラフ（骨溶解性骨病巣部位）もしくは組織化学（骨および軟組織）によって調べることができる。ササキほか（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５５：ｐ３５５１−７、１９９５年；ヨネダほか（Ｙｏｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）９９：ｐ２５０９−１７、１９９７年。クロヒシー（Ｃｌｏｈｉｓｙ）、ラムナレイン（Ｒａｍｎａｒａｉｎｅ）、オーソペディク・リサーチ（Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ．）１６：ｐ６６０−６、１９９８年。インほか（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）１０３：ｐ１９７−２０６、１９９９年。有効なＭ−ＣＳＦアンタゴニストの存在下では、骨溶解性骨転移は、予防もしくは抑制されて、転移を少なく、および／または小さくさせることができる。
【０１８２】
また、本発明のＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、癌転移の予防もしくは治療に有用であると考えられる。候補Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの癌転移に対する予防もしくは治療効果は、フィルダーマンほか（Ｆｉｌｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５２：ｐ３６６１６、１９９２年に記載されているヒト羊膜基底膜浸潤（ａｍｎｉｏｎｉｃ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）モデルを用いてスクリーニングすることができる。さらに、各種癌転移の動物モデル系のうちの任意の系を用いることもできる。このようなモデル系としては、ウェンガーほか（Ｗｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メタスタシス（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）１９：ｐ１６９−７３、２００２年；イーほか（Ｙｉ  ｅｔ  ａ１．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）６２：ｐ９１７−２３、２００２年；ツツミほか（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・レターズ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ）１６９：ｐ７７−８５、２００１年；ツィンゴジドーほか（Ｔｓｉｎｇｏｔｊｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）、アンチキャンサー・リサーチ（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）２１：ｐ９７１−８、２００１年；ワカバヤシほか（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、オンコロジー（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）５９：ｐ７５−８０、２０００年；カルプ（Ｃｕｌｐ）、コジャーマン（Ｋｏｇｅｒｍａｎ）、フロンティアズ・イン・バイオサイエンス（Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．）３：Ｄ６７２−８３、１９９８年；ルンゲほか（Ｒｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、インベストゲイティブ・ラジオロジー（Ｉｎｖｅｓｔ  Ｒａｄｉｏｌ．）３２：ｐ２１２−７；シオダほか（Ｓｈｉｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・サージカル・オンコロジー（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．）６４：ｐ１２２−６、１９９７年；マーほか（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、インベストゲイティブ・オフサルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．）３７：ｐ２２９３−３０１、１９９６年；クルップほか（Ｋｕｒｕｐｐｕ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ガストロエンテロロジー・アンド・ヘパトロジー（Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．）１１：ｐ２６−３２、１９９６年に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。有効なＭ−ＣＳＦアンタゴニストの存在下では、癌転移は、予防もしくは抑制されて、転移を少なく、および／または小さくさせることができる。
【０１８３】
別のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの同定は、他のタンパク質もしくはポリペプチドと特異的に相互作用するタンパク質を同定し、取得するいくつかの公知の方法のうちの任意の方法を用いて達成することができ、例えば、米国特許第５，２８３，１７３号もしくはこれに準ずる文献に記載されているような酵母２−ハイブリッドスクリーニング（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）系を用いることができる。本発明の一実施形態として、Ｍ−ＣＳＦをコードしているｃＤＮＡもしくはその断片を２−ハイブリッドベイトベクター中にクローニングし、これを用いて、Ｍ−ＣＳＦ結合活性を有するタンパク質について相補性標的ライブラリをスクリーニングすることができる。
【０１８４】
特定のＭ−ＣＳＦアンタゴニストもしくはＭ−ＣＳＦアンタゴニストの組合せの抗腫瘍活性については、適切な動物モデルを用いてインビボで評価することができる。このようなモデルとしては、例えば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウスなどの免疫機能が低下した動物体内にヒトリンパ腫細胞を導入した異種リンパ腫癌モデルがある。有効性については、腫瘍形成の抑制、腫瘍の緩解もしくは転移などを測定するアッセイ法を用いて推定することができる。
【０１８５】
また、本発明により得られるアミノ酸配列情報から、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドが相互作用する結合相手化合物の同定が可能となる。結合相手化合物を同定する方法としては、液相アッセイ（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドを固定化するインビトロアッセイ、および細胞系アッセイが挙げられる。Ｍ−ＣＳＦＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの結合相手化合物を同定することにより、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲの正常もしくは異常な生物学的活性と関連付けられる症状を治療的もしくは予防的に処置するための候補化合物が得られる。
【０１８６】
本発明は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの結合相手化合物を同定するための数種のアッセイ系を含む。液相アッセイとしての本発明の方法は、（ａ）Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドを１種以上の候補結合相手化合物と接触させる工程、および（ｂ）Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドに結合する化合物を同定する工程を含む。Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドに結合する化合物の同定は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチド／結合相手化合物の複合体を単離し、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドを結合相手化合物から分離することにより達成することができる。また、得られた結合相手化合物の物理的特性、生物学的特性および／または生化学的特性を特徴付けする更なる工程も本発明の別の実施形態内に包含される。一局面として、上記Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチド／結合相手化合物の複合体は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたは候補結合相手化合物のいずれかに免疫特異的な抗体を用いて単離する。
【０１８７】
さらに別の実施形態として、上記のＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたは候補結合相手化合物のいずれかは、その単離を容易にする標識もしくはタグを含み、結合相手化合物を同定する本発明の方法は、この標識もしくはタグとの相互作用を介してＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチド／結合相手化合物複合体を単離する工程を含む。このタイプの例示的タグとしては、ニッケルキレート化によるこの標識された化合物の単離を可能にする、通例ヒスチジン残基が約６個のポリ−ヒスチジン配列がある。当該分野で公知であり、慣行的に用いられているＦＬＡＧ（登録商標）タグ（イーストマン・コダック社（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）、ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）、ＮＹ）などの他の標識およびタグも本発明に包含される。
【０１８８】
インビトロアッセイの一変形として、本発明は、（ａ）固定化Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくは固定化Ｍ−ＣＳＦＲポリペプチドを候補結合相手化合物と接触させる工程、および（ｂ）この候補化合物のＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドへの結合を検出する工程を含む方法を提供する。別の実施形態として、候補結合相手化合物を固定化して、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの結合を検出する。固定化は、当該分野で公知の方法のうちの任意の方法を用いて、例えば、支持体、ビーズもしくはクロマトグラフィー用樹脂への共有結合、および抗体結合などの非共有結合性の高親和性相互作用によって、または固定化される化合物がビオチン部分を含む場合、ストレプトアビジン／ビオチン結合を利用して達成される。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物の放射活性標識を利用し、（ｉｉ）非固定化化合物の蛍光標識を利用し、（ｉｉｉ）非固定化化合物に免疫特異的な抗体を用いて、（ｉｖ）固定化化合物が結合している蛍光支持体を励起する非固定化化合物の標識を利用し、および当該分野で公知の、慣行的に行われている他の技術を用いて達成することができる。
【０１８９】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの活性もしくは発現を調節（即ち、増強、低減もしくはブロック）する抗体または有機／無機化合物などの物質は、推定調節物質をＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを発現する細胞とインキュベートし、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの活性もしくは発現に対するこの推定調節物質の作用を測定することにより、同定することができる。Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの活性を調節する化合物の選択性は、そのＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに対する作用を他の関連化合物に対する作用と比較することにより、評価することができる。選択的な調節物質としては、例えば、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドをコードしている核酸に特異的に結合する抗体その他のタンパク質、ペプチドまたは有機分子を挙げることができる。Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチド活性の調節物質は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの正常もしくは異常な活性が関与している疾患および生理的状態の処置において治療上有用となろう。
【０１９０】
調節物質を同定する本発明の方法は、結合相手化合物を同定する上記方法のうちの任意の方法の変形形態を含み、この変形形態は、結合相手化合物を同定した後、候補調節物質の存在および非存在下に結合アッセイを行う技術を含む。調節物質が同定されるのは、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとその結合相手化合物との結合が、候補調節化合物の非存在下での結合に比し、候補調節物質の存在下で変化するような場合である。Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとその結合相手化合物との結合を増強する調節物質は、賦活剤もしくは活性化剤と記載され、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとその結合相手化合物との結合を低下させる調節物質は、阻害剤と記載される。
【０１９１】
また、本発明は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドと相互作用し、もしくはその生物学的活性を阻害する（即ち、酵素活性、結合活性などを阻害する）化合物を同定するためのハイ−スループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイをも包含する。ＨＴＳアッセイでは、多数の化合物を効率的にスクリーニングすることができる。Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとその結合相手との相互作用を調べるための細胞ベースのＨＴＳ系も企図されている。ＨＴＳアッセイは、所望の特性を有する「ヒット」もしくは「リード化合物」を特定するように設計されており、これを基に、所望の特性を向上させる修飾を設計することができる。多くの場合、この「ヒット」もしくは「リード化合物」の化学的修飾は、「ヒット」とＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとの間の識別可能な構造／活性相関に基づいて行われる。
【０１９２】
本発明の別の局面は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたはこれをコードしている核酸分子と化合物とを接触させ、この化合物がＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたはこれをコードしている核酸分子と結合するかどうかを決定することを含む、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたはＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドをコードしている核酸分子に結合する化合物を同定する方法に関する。結合は、当業者に公知の結合アッセイによって決定することができ、これらのアッセイとしては、例えば、本明細書にその全体が参考として援用される「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９９年）ジョンワイリー・アンド・サンズ、ＮＹに記載のゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット法、放射性標識化競合アッセイ、ファージを用いた発現クローニング、クロマトグラフィーによる同時分別（ｃｏ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、共沈、架橋、相互作用トラップ（ｔｒａｐ）／２−ハイブリッド解析、サウスウエスタン解析、ＥＬＩＡなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。（Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたはこれをコードしている核酸分子と結合すると思われる化合物を含むことができる）スクリーニングされるべき化合物としては、細胞外、細胞内、生物もしくは化学合成由来のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の方法は、放射標識（例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、免疫原性標識などの標識に結合させた基質、アダプターもしくはレセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）分子を含むリガンドを包含する。本発明の範囲に包含される調節物質としては、非ペプチド性模倣体、非ペプチド性アロステリックエフェクタなどの非ペプチド性分子、およびペプチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような試験に用いるＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、溶液中で遊離型、固体支持体への結合型、細胞表面への付着型もしくは細胞内局在型または細胞の一部との会合型のものとすることができる。例えば、当業者は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドと試験すべき化合物との間の複合体の形成を評価することができる。あるいは、当業者は、試験すべき化合物によってもたらされる、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとその基質との複合体形成の低減を調べることができる。
【０１９３】
本発明の別の局面は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドと化合物とを接触させ、この化合物がＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの活性を変えるかどうかを決定することを含む、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの活性を調節（即ち、低下）させる化合物を同定する方法に関する。比較される試験の存在下の活性は、試験化合物の非存在下の活性に対して測定する。試験化合物を含むサンプルの活性が試験化合物を含まないサンプルの活性よりも高い場合は、この化合物は高い活性を有することになる。同様に、試験化合物を含むサンプルの活性が試験化合物を含まないサンプルの活性よりも低い場合は、この化合物は低い活性を有することになる。
【０１９４】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のうちの任意の方法でＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドを用いることにより化合物をスクリーニングするのに特に有用である。（Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドまたはこれをコードしている核酸分子と結合すると思われる化合物を含むことができる）スクリーニングされるべき化合物として、細胞外、細胞内、生物もしくは化学合成由来のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような試験に用いるＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、溶液中で遊離型、固体支持体への結合型、細胞表面への付着型もしくは細胞内局在型または細胞の一部との会合型のものとすることができる。例えば、当業者は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドと試験すべき化合物との間の複合体の形成を評価することができる。あるいは、当業者は、試験すべき化合物によってもたらされる、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとその基質との複合体形成の低減を調べることができる。
【０１９５】
本発明のＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの活性は、例えば、化学合成もしくは天然のペプチドリガンドへのこれらの結合能を調べることにより、測定することができる。あるいは、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの活性は、アダプタ分子、レセプター分子、基質その他のリガンドへのこれらの結合能を調べることにより、アッセイすることができる。また、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの活性は、エフェクタ分子の活性を調べることによっても、測定することができ、このような分子としては、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲによって活性化される他の下流側の酵素が挙げられるが、これに限定されるものではない。従って、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチド活性の調節物質は、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの結合特性などのＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲの機能を変えることができる。本方法の種々の実施形態として、このアッセイ法は、天然の結合相手に対する結合アッセイおよび当該分野で一般に知られているＭ−ＣＳＦ活性もしくはＭ−ＣＳＦ活性の他の結合アッセイもしくは機能ベースのアッセイの形をとることができる。本発明におけるＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲの生物学的活性としては、天然もしくは非天然リガンドに対する結合活性、および当該分野で公知のＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲの機能的活性のうちの任意の活性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｍ−ＣＳＦ活性もしくはＭ−ＣＳＦＲ活性の例としては、基質の蛋白分解、および基質、リガンド、アダプタもしくはレセプター分子への結合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９６】
本発明の調節物質は、概して天然のＭ−ＣＳＦリガンドもしくは天然のＭ−ＣＳＦＲリガンドの非ペプチド性模倣体、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのペプチド性および非ペプチド性アロステリックエフェクタ、ならびにＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲの活性化剤もしくは阻害剤（競合的、不競合的および非競合的）として機能することが可能なペプチド（例えば、抗体生成物）に分類することができる種々の化学構造を有する。本発明は、適切な調節物質の原料を限定するものではなく、植物、動物もしくは鉱物からの抽出物などの天然原料、コンビナトリアルケミストリーによるライブラリ構築法の産物を含む低分子ライブラリ、およびペプチドライブラリなどの非天然原料から得ることができる。
【０１９７】
酵素活性を調べるには別のアッセイ法を用いることができ、こうした方法としては、例えば、その全体が参考として本明細書に援用されている「エンザイム・アッセイズ：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｒ．アイゼンタール（Ｒ．Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ）、Ｍ．Ｊ．ダンソン（Ｍ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ）編（１９９２年）オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の光度測定法、放射分析法、ＨＰＬＣ、電気化学的方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９８】
Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドをコードしているｃＤＮＡは、創薬計画において用いることができ、ハイ−スループットスクリーニング（ＨＴＳ）で１日当たり数千種の未知の化合物を試験することができるアッセイ法については十分な報告がある。文献には創薬のためのＨＴＳ結合アッセイで放射標識リガンドを用いた例が満載されている（ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、メディシナル・リサーチ・レビューズ（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）（１９９１年）１１：ｐ１４７−１８４；スウィートナムほか（Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ナショナル・プロダクツ（Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（１９９３年）５６：ｐ４４１−４４５の概説参照）。結合アッセイＨＴＳではＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲを固定化することが好ましい。何故なら、これにより、特異性が改善（相対純度が向上）し、大量のＭ−ＣＳＦ材料もしくはＭ−ＣＳＦＲ材料の作製が可能になり、多様な形式で用いることが出来るからである（その全体が参考として本明細書に援用されているホジソン（Ｈｏｄｇｓｏｎ）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９２年）１０：ｐ９７３−９８０参照）。
【０１９９】
当業者に公知の組換えポリペプチドの機能発現には種々の異種系が利用可能である。このような系としては、細菌（ストロスバーグほか（Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．）、トレンズ・イン・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９９２年）１３：ｐ９５−９８）、酵母（ポーシュ（Ｐａｕｓｃｈ）、トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９７年）１５：ｐ４８７−４９４）、数種の昆虫細胞（バンデン・ブルック（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ）、インターナショナル・レビュー・オブ・サイトロジー（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ）（１９９６年）１６４：ｐ１８９−２６８）、両生類細胞（ジャヤヴィックレムほか（Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ，ｅｔ  ａｌ．）、カレント・オピニョン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１９９７年）８：ｐ６２９−６３４）および数種の哺乳動物細胞株（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳなど；ゲルハルトほか（Ｇｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ  ａｌ．）、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）（１９９７年）３３４：ｐ１−２３）が挙げられる。以上の例は、線虫から得られる細胞株（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３７１７７号）を含む他の考えられる細胞発現系の使用を排除するものではない。
【０２００】
本発明の好ましい実施形態として、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドの活性を調節する化合物のスクリーニング方法は、試験化合物をＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドと接触させ、この化合物とＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドとの複合体の有無についてアッセイすることを含む。このようなアッセイでは、そのリガンドは代表的に標的される。適切なインキュベーションを行った後、結合型で存在するリガンドから遊離型リガンドを分離すると、遊離型もしくは非複合体化標識の量が、この特定化合物のＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドへの結合能の指標となる。
【０２０１】
本発明の別の実施形態として、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物のハイ−スループットスクリーニングを行う。簡単に言えば、固体基板上で多数の異なる小ペプチド試験化合物を合成する。このペプチド試験化合物をＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドと接触させた後、洗浄する。次いで、結合したＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドを当該分野で公知の方法により検出する。また、本発明の精製ポリペプチドは、前述の薬物スクリーニング技術で用いるために、そのままプレートに塗布することができる。さらに、非中和抗体を用いてそのタンパク質を捕捉し、これを固体支持体に固定化することができる。
【０２０２】
通常、発現させたＭ−ＣＳＦポリペプチドもしくはＭ−ＣＳＦＲポリペプチドは、当業者に公知の方法により、適切な放射性同位体で標識した基質、リガンド、アダプタもしくはレセプター分子と併せてＨＴＳ結合アッセイに用いることができ、このような放射性同位体としては、１２５Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ、もしくは３２Ｐが挙げられるが、これらに限定されるものではない。あるいは、基質、リガンド、アダプタもしくはレセプター分子は、適切な蛍光誘導体（バインデュールほか（Ｂａｉｎｄｕｒ，ｅｔ  ａｌ．）、ドラッグ・デベロップメント・リサーチ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．）（１９９４年）３３：ｐ３７３−３９８；ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）、ドラッグ・ディスカバリ・ツデイ（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ）（１９９７年）２：ｐ１５６−１６０）を用いて公知の方法により標識することができる。固定化Ｍ−ＣＳＦもしくは固定化Ｍ−ＣＳＦＲに特異的に結合させた放射性リガンドは、Ｍ−ＣＳＦ−リガンド複合体もしくはＭ−ＣＳＦＲ−リガンド複合体を濾過して未結合リガンドから結合リガンドを分離することを含む、いくつかの標準的な方法のうちの任意の方法を用いてＨＴＳアッセイで検出することができる（ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、メディカル・リサーチ・レビューズ（Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．）（１９９１年）１１：ｐ１４７−１８４；スウィートナムほか（Ｓｗｅｅｔｎａｍ，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ナショナル・プロダクツ（Ｊ．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（１９９３年）５６：ｐ４４１−４５５）。別の方法としては、このような分離を必要としないシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）もしくはフラッシュプレート方式が挙げられる（ナカヤマ（Ｎａｋａｙａｍａ）、カレント・オピニョン・イン・ドラッグ・ディスカバリ・アンド・デベロップメント（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．）（１９９８年）１：ｐ８５−９１；ボッセほか（Ｂｏｓｓｅ，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・スクリーニング（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）（１９９８年）３：ｐ２８５−２９２）。蛍光リガンドの結合は、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、結合リガンドの直接分光蛍光光度アッセイ、蛍光偏光（ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）、ドラッグ・ディスカバリ・ツデイ（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ）（１９９７年）２：ｐ１５６−１６０；ヒル（Ｈｉｌｌ）、カレント・オピニョン・イン・ドラッグ・ディスカバリ・アンド・デベロップメント（Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｄｅｖ．）（１９９８年）１：ｐ９２−９７）を含む種々の方法で検出することができる。
【０２０３】
本発明では、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲへの基質、リガンド、アダプタもしくはレセプターの結合の阻害剤をスクリーニングし、特定する多数のアッセイ法を企図している。一実施例として、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲを固定化し、阻害化合物などの候補調節物質の存在および非存在下で、結合相手との相互作用を評価する。別の実施例として、候補阻害化合物の存在および非存在下の両方において、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲとその結合相手との相互作用を液相アッセイ法で評価する。いずれのアッセイ法においても、阻害剤は、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲとその結合相手との結合を低減させる化合物として同定される。企図している別のアッセイ法は、１９９５年８月３日公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２０６５２号に記載されている方法により、形質転換もしくはトランスフェクションした宿主細胞のポジティブシグナルを検出することによってタンパク質／タンパク質相互作用の阻害剤を同定する２−ハイブリッドアッセイの変形形態を含む。
【０２０４】
本発明で企図している候補調節物質としては、可能性のある活性化剤もしくは阻害剤のライブラリから選択された化合物が挙げられる。低分子調節物質の同定にはいくつかの異なるライブラリを用いることができ、こうしたものとして、（１）化学物質ライブラリ、（２）天然物ライブラリ、および（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドもしくは有機分子からなるコンビナトリアルライブラリが挙げられる。化学物質ライブラリは、ランダムな化学構造からなり、その一部は既知の化合物のアナログ、または別の創薬スクリーニングで「ヒット」もしくは「リード」として同定された化合物のアナログであり、一部は天然物から誘導されたものであり、一部は無計画的な（ｎｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成有機化学反応により得られるものである。天然物ライブラリは、（１）土壌、植物もしくは海洋微生物からのブロス（ｂｒｏｔｈ）の発酵および抽出または（２）植物もしくは海洋生物の抽出により、スクリーニングのための混合物を作製するのに用いる微生物、動物、植物もしくは海洋生物のコレクションである。天然物ライブラリとしては、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびこれらの改変体（非天然）が挙げられる。サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８２：ｐ６３−６８（１９９８年）の概説を参照されたい。コンビナトリアルライブラリは、混合物としての多数のペプチド、オリゴヌクレオチドもしくは有機化合物からなる。このライブラリは、在来の自動合成法、ＰＣＲ、クローニングもしくは独自開発の合成法による作製が比較的容易である。特に対象となるのは、非ペプチドのコンビナトリアルライブラリである。対象となるさらに別のライブラリとしては、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、マルチパラレル（ｍｕｌｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）合成コレクション、リコンビナトリアルライブラリおよびポリペプチドライブラリが挙げられる。コンビナトリアル化学およびこれにより作製されるライブラリの概説については、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）、カレント・オピニョン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）８：ｐ７０１−７０７（１９９７年）を参照されたい。本明細書に記載した各種ライブラリを用いて調節物質を同定することにより、候補「ヒット」（もしくは「リード」）を修飾してこの「ヒット」の活性調節能を最適化することができる。
【０２０５】
本発明により企図されているさらに別の候補阻害剤を設計することができ、このような阻害剤としては、可溶性の結合相手、およびキメラもしくは融合タンパク質などの結合相手が挙げられる。本明細書に用いている「結合相手」は、広く、非ペプチド性調節物質、ならびに抗体、抗体フラグメント、およびＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲに対し免疫特異的な抗体ドメインを含有する修飾化合物を含むペプチド性調節物質を包含する。
【０２０６】
Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲの特異的なリガンドを同定するには他のアッセイ法を用いることができ、このような方法としては、標的タンパク質への試験リガンドの直接的な結合について評価することにより標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイ、ならびにイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法その他の物理的および分析的方法を用いてアフィニティ限外濾過により標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイが挙げられる。あるいは、このような結合相互作用を、参考として本明細書に援用されているフィールズほか（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３４０：ｐ２４５−２４６（１９８９年）およびフィールズほか（Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．）、トレンズ・イン・ジェネティクス（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１０：ｐ２８６−２９２（１９９４年）に記載の酵母２−ハイブリッド系を用いて間接的に評価する。この２−ハイブリッド系は、２種のタンパク質もしくはポリペプチド間の相互作用を検出するための遺伝子アッセイ法（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｓｓａｙ）である。これを用いることにより、目的の既知のタンパク質に結合するタンパク質を同定し、または相互作用に重要な意味を持つドメインもしくは残基を示すことができる。この方法の変法として、ＤＮＡ結合タンパク質をコードしている遺伝子をクローニングし、タンパク質に結合するペプチドを同定して薬物をスクリーニングする方法が開発されている。この２−ハイブリッド系は、一対の相互作用しているタンパク質が、レポータ遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）に結合するＤＮＡ結合ドメインのすぐ近傍に転写活性化ドメインを組み入れることができることを利用したものであり、通常、酵母で実施される。このアッセイ法では、（１）第１のタンパク質に融合するＤＮＡ結合ドメインおよび（２）第２のタンパク質に融合する活性化ドメインをコードする２つのハイブリッド遺伝子を構築することが必要とされる。このＤＮＡ結合ドメインは、レポータ遺伝子のＵＡＳに向けてこの第１のハイブリッドタンパク質を標的化する；但し、多くのタンパク質は活性化ドメインを欠くので、このＤＮＡ結合ハイブリッドタンパク質はレポータ遺伝子の転写を活性化しない。活性化ドメインを含む上記第２のハイブリッドタンパク質だけでは、ＵＡＳに結合しないので、レポータ遺伝子の発現を活性化することができない。しかしながら、両ハイブリッドタンパク質が存在すると、第１および第２のタンパク質の非共有結合性の相互作用により、活性化ドメインがＵＡＳに繋がれ、レポータ遺伝子の転写が活性化される。例えば、この第１のタンパク質が、別のタンパク質もしくは核酸と相互作用することが知られているＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲまたはそのサブユニットもしくは断片である場合、このアッセイ法を用いて、その結合相互作用を阻害する物質を検出することができる。このレポータ遺伝子の発現を、この系に種々の試験物質を加えている間、モニターする。阻害性物質が存在すると、レポータシグナルが無くなる。
【０２０７】
また、酵母２−ハイブリッドアッセイ法はＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲに結合するタンパク質を同定するのにも用いることができる。Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲまたはそのサブユニットもしくは断片に結合するタンパク質を同定するアッセイ法では、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲ（またはサブユニットもしくは断片）とＵＡＳ結合ドメイン（即ち、第１のタンパク質）とをコードしている融合ポリヌクレオチドを使用することができる。さらに、それぞれ活性化ドメインに融合させた別の第２のタンパク質をコードしている多数のハイブリッド遺伝子を作製し、このアッセイでスクリーニングする。代表的には、この第２のタンパク質は、第２のタンパク質コーディング領域がそれぞれ活性化ドメインに融合されている、トータルｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ融合ライブラリの１つ以上のメンバによってコードされている。この系は、多種多様なタンパク質に適用することができ、この第２の結合タンパク質の識別性もしくは機能を知ることは必要ですらない。この系は高感度であり、他の方法では明らかにすることができない相互作用をも検出することができ、一時的な相互作用でも転写が誘発されて、繰り返し翻訳されることによりレポータタンパク質を生じ得る安定なｍＲＮＡを産生させることができる。
【０２０８】
標的タンパク質に結合する物質を探索するには他のアッセイ法を用いることができる。標的タンパク質への試験リガンドの直接結合を同定するためのこのような方法の一つが、参考として本明細書に援用されている米国特許第５，５８５，２７７号に開示されている。この方法は、一般にタンパク質が折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態との混合として存在し、絶えずこの２つの状態を交互にとるという原理に依拠している。試験リガンドが折り畳まれた形の標的タンパク質に結合する場合（即ち、試験リガンドが標的タンパク質のリガンドである場合）、このリガンドにより結合された標的タンパク質分子は折り畳まれた状態のままである。従って、折り畳まれた標的タンパク質は、この標的タンパク質を結合する試験リガンドの存在下では、リガンドの非存在下よりも広い範囲で存在する。標的タンパク質へのリガンドの結合は、標的タンパク質の折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態とを識別する任意の方法によって決定することができる。このアッセイを実施するために標的タンパク質の機能を知っておく必要はない。事実上どんな物質も試験リガンドとしてこの方法により評価することができ、このような物質としては、金属、ポリペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、ポリヌクレオチドおよび有機低分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０９】
標的タンパク質のリガンドを同定するための別の方法が、参考として本明細書に援用されるウィーボルトほか（Ｗｉｅｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）６９：ｐ１６８３−１６９１（１９９７年）に記載されている。この技術では、２０〜３０物質のコンビナトリアルライブラリを、標的タンパク質への結合について液相で同時にスクリーニングする。標的タンパク質に結合した物質は、単純な膜洗浄によって他のライブラリ成分から分離する。続いて、フィルター上に保持された特に選択された分子を標的タンパク質から遊離させ、ＨＰＬＣおよび空気圧補助エレクトロスプレー（イオンスプレー）イオン化質量分析により分析する。この方法により、標的タンパク質に最大の親和性を有するライブラリ成分が選択されるので、この方法は低分子ライブラリに対して特に有用である。
【０２１０】
本発明の別の実施形態は、本発明のポリペプチドを結合することができる中和抗体がこのポリペプチドに結合させるための試験化合物と特異的に競合する競合的スクリーニングアッセイを用いることを含む。この方法では、上記抗体は、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲと１つ以上の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出するのに用いることができる。放射標識による競合的結合の検討結果については、Ａ．Ｈ．リンほか（Ａ．Ｈ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、アンチマイクロビアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピイ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）（１９９７年）第４１巻１０号、ｐ２１２７−２１３１に記載されており、その開示は本明細書にその全体が参考として援用されている。
【０２１１】
本発明の別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、相互作用する調節タンパク質の同定、特性決定および精製のための研究ツールとして用いられる。当該分野で公知の種々の方法により、本発明のポリペプチドに適切な標識を組み込み、このポリペプチドを相互作用する分子の捕捉のために用いる。例えば、分子をこの標識ポリペプチドとインキュベートした後、洗浄して未結合ポリペプチドを除去し、得られたポリペプチド複合体を定量する。種々の濃度のポリペプチドを使用して得られたデータを用いて、このタンパク質複合体に対するポリペプチドの数、親和性および結合の値を算出する。
【０２１２】
また、標識ポリペプチドは、このポリペプチドが相互作用する分子の精製のための試薬としても有用であり、このような分子としては、阻害剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。アフィニティー精製の一実施形態として、ポリペプチドはクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。細胞およびその膜を抽出し、種々の細胞小成分をこのカラムにかける。分子はこのポリペプチドとの親和性によってカラムに結合する。得られたポリペプチド複合体は、カラムから分離して回収し、回収した分子についてタンパク質配列決定を行う。次いで、このアミノ酸配列を用いて、捕捉した分子を同定し、もしくは適切なｃＤＮＡライブラリからの対応する遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドを設計する。
【０２１３】
あるいは、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのリガンドと同様な特性を有するが、ヒトもしくは動物体内の内因性リガンドよりも低分子で半減期が長い化合物を特定することができる。有機化合物を設計する場合は、本発明による分子を「リード」化合物として用いる。既知の薬学的に活性な化合物に対する模倣体を設計することは、このような「リード」化合物に基づいて医薬品を開発する際のよく知られている方法である。一般に、模倣体の設計、合成および試験は、多数の分子を目的とする特性についてランダムにスクリーニングすることを避けるために行われる。さらに、本発明のポリヌクレオチドによりコードされている推定アミノ酸配列の解析に由来する構造データは、より特異的な、従って薬理学的効力の向上した新薬を設計するのに有用である。
【０２１４】
Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲに関する利用可能な情報に基づいて本発明のタンパク質の三次構造を推定するためにはコンピュータモデリング法を使用することができる。従って、Ｍ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲの推定構造に基づいた新規なリガンドを設計することができる。
【０２１５】
本発明の別の局面として、他の動物のホモログを同定するために、本明細書に開示したＭ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦＲのヌクレオチド配列を利用する。本明細書に開示したヌクレオチド配列のうちの任意の配列、もしくはその任意の部分は、例えば、当業者に公知のスクリーニング方法を用いてデータベースまたはゲノムライブラリもしくはｃＤＮＡライブラリなどの核酸ライブラリをスクリーニングすることによりホモログを同定するためのプローブとして用いることができる。その結果として、Ｍ−ＣＳＦ配列もしくはＭ−ＣＳＦＲ配列との相同性が少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも１００％であるホモログを同定することができる。
【０２１６】
（併用療法）
動物モデルで有効な２種以上のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを同定した後、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少に対する有効性をさらに向上させるために、２種以上のこのようなＭ−ＣＳＦアンタゴニストを一緒に混合することはさらに有益であると考えられる。また、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少に罹患しているか、罹患する素因のあるヒトもしくは哺乳動物に対して、１種以上のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを含む組成物を投与することができる。
【０２１７】
Ｍ−ＣＳＦアンタゴニスト療法は癌のあらゆるステージに対して有用と考えられるが、進行癌もしくは転移性癌には抗体療法が特に適していると考えられる。化学療法を受けたことがない患者では、この抗体療法に化学療法もしくは放射線療法を併用することが好ましいのに対し、この抗体療法による治療は、１種以上の化学療法を施行されたことのある患者に必要であると考えられる。さらに、抗体療法を行うことにより、特に、化学療法剤の毒性に対する耐容性に乏しい患者において、併用化学療法剤を低投与量で用いることも可能になる。
【０２１８】
本発明の方法では、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体の単独投与、および異なる抗体の併用もしくは「混液」が企図されている。このような抗体混液は、異なるエフェクタメカニズムを有する抗体を含むか、直接的な細胞傷害性を有する抗体と、免疫エフェクタとしての機能性に依拠する抗体とを併せて含むので、一定の利点がある。このような抗体の併用では、相乗的な治療効果を発揮させることができる。さらに、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体の投与は、他の治療剤および／または治療方法と併用して投与することができ、このような治療剤、治療方法としては、各種化学療法剤、アンドロゲン遮断薬、および免疫調節剤（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、ビスホスフォネート（例えば、アレディア（Ａｒｅｄｉａ）；ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ）；クロドロネート（Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ））、手術、放射線、化学療法、ホルモン療法（例えば、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）；抗アンドロゲン療法）、抗体療法（例えば、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ中和抗体、ＰＴＨｒＰ中和抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、ＶＥＧＦ中和抗体）、治療的タンパク質療法（例えば、可溶性ＲＡＮＫＬレセプター；ＯＰＧおよびＰＤＧＦおよびＭＭＰ阻害剤）、低分子薬物療法（例えば、Ｓｒｃ−キナーゼ阻害剤）、成長因子レセプターのキナーゼ阻害剤；オリゴヌクレオチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫもしくはＰＴＨｒＰアンチセンス）、遺伝子療法（例えば、ＲＡＮＫＬもしくはＲＡＮＫ阻害剤）、ペプチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬのムテイン）ならびに本明細書に記載したタンパク質、ペプチド、化合物および低分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２１９】
癌化学療法剤としては、カルボプラチン、シスプラチンなどのアルキル化剤；ナイトロジェンマスタード系アルキル化剤；カルムスチン（ＢＣＮＵ）などのニトロソウレア系アルキル化剤；メトトレキサートなどの代謝拮抗剤；プリンアナログ系代謝拮抗剤メルカプトプリン；フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビンなどのピリミジンアナログ系代謝拮抗剤；ゴセレリン、ロイプロリド、タモキシフェンなどのホルモン性抗腫瘍剤；アルデスロイキン、インターロイキン−２、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、インターフェロン−アルファ、パクリタキセル、トレチノイン（ＡＴＲＡ）などの天然由来抗腫瘍剤；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンなどの天然由来抗腫瘍性抗生物質；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、などのビンカアルカロイド系天然由来抗腫瘍剤；ヒドロキシウレア；アセグラトン、アドリアマイシン、イホスファミド、エノシタビン、エピチオスタノール、アクラルビシン、アンシタビン、ニムスチン、塩酸プロカルバジン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クロモマイシンＡ３、抗腫瘍性多糖類、抗腫瘍性血小板因子、シクロホスファミド、シゾフィラン、シタラビン、ダカルバジン、チオイノシン、チオテパ、テガフール、ネオカルチノスタチン、ＯＫ−４３２、ブレオマイシン、フルツロン、ブロクスウリジン、ブスルファン、ホンバン、ペプレオマイシン、ベスタチン（ウベニメクス）、インターフェロン−β、メピチオスタン、ミトブロニトール、メルファラン、ラミニンペプチド、レンチナン、カワラタケ抽出物、テガフール／ウラシル、エストラムスチン（エストロゲン／メクロレタミン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２２０】
さらに、癌患者の治療に用いられる別の薬剤としては、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ガンシクロビル；抗生物質、ロイプロリド；メペリジン；ジドブジン（ＡＺＴ）；インターロイキン１〜１８（突然変異体およびアナログを含む）；インターフェロン−α、βおよびγなどのインターフェロンもしくはサイトカイン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）とアナログ、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）などのホルモン；トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子相同性因子（ＦＧＦＨＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）およびインスリン増殖因子（ＩＧＦ）などの成長因子；腫瘍壊死因子−αおよびβ（ＴＮＦ−αおよびβ）；浸潤抑制因子−２（ＩＩＦ−２）；骨形成タンパク質１〜７（ＢＭＰ１−７）；ソマトスタチン；サイモシン−α−１；γ−グロブリン；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；補体因子；抗血管新生因子；抗原性物質；およびプロドラッグが挙げられる。
【０２２１】
（投与および製剤）
本発明は、化合物、この化合物を含む薬学的処方物、この薬学的処方物を調製する方法、およびこれらの薬学的処方物および化合物で患者を治療する方法を提供する。
【０２２２】
このような組成物は、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、乳剤、エリキシル剤、懸濁剤もしくは液剤の形をとることができる。本発明の組成物は、種々の投与経路、例えば、経口投与、鼻腔内投与、直腸内投与、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射もしくは腹腔内注射用に製剤化することができる。例えば、以下の剤型を示すが、これによって本発明が限定されると解釈されるべきではない。
【０２２３】
経口、口腔内および舌下投与の場合、散剤、懸濁剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ジェルカプセル剤およびカプレット剤が固形剤型として許容される。これらは、例えば、本発明の１種以上の化合物またはその薬学的に受容可能な塩もしくは互変異性体（ｔａｕｔｏｍｅｒ）を澱粉その他の少なくとも１種の添加剤と混和することにより調製することができる。好適な添加剤は、ショ糖、乳糖、セルロースシュガー、マンニトール、マルチトール、デキストラン、澱粉、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成ポリマーもしくは半合成ポリマーもしくはグリセリドである。必要に応じて、経口投与剤型には、投与し易くするための他の成分、例えば、不活性希釈剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、パラベン、ソルビン酸などの保存剤、アスコルビン酸、トコフェロール、システインなどの抗酸化剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、矯味矯臭剤または香料などを含ませることができる。さらに、錠剤および丸剤は、当該分野で公知の適切なコーティング剤で処理することができる。
【０２２４】
経口投与用液状剤型は、薬学的に受容可能な乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤および液剤の形をとることができ、これらには水などの不活性希釈液を含ませることができる。液状懸濁剤および液剤としての薬学的処方物および薬剤は、滅菌液を用いて調製することができ、このような液としては、油、水、アルコールおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。経口もしくは非経口投与では、医薬用として好適な界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤を加えることができる。
【０２２５】
前述のように、懸濁剤には油を加えることができる。このような油としては、ラッカセイ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、およびオリーブ油が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、懸濁製剤には、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリド、アセチル化脂肪酸グリセリドなどの脂肪酸のエステルを加えることができる。懸濁製剤には、アルコールを加えることができ、このアルコールとしては、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、懸濁製剤に用いることができるものとして、エーテルおよび水があり、このエーテルとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、鉱物油およびペトロラタムなどの石油炭化水素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２２６】
鼻腔内投与用の薬学的処方物および薬剤は、適切な溶剤および、必要に応じて他の化合物を含むスプレー剤もしくはエアロゾル剤とすることができ、この化合物としては、安定剤、抗菌剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、バイオアベーラビリティ改善剤（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。噴霧製剤用の高圧ガスとしては、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、もしくは炭化水素系低沸点溶媒を挙げることができる。
【０２２７】
通常、注射用剤型としては、適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を用いて調製することができる水性懸濁剤もしくは油性懸濁剤が挙げられる。注射剤型は、液相状態とするか、溶剤もしくは希釈液で調製する懸濁剤の形をとることができる。許容される溶剤もしくはビヒクルとしては、滅菌水、リンゲル液、もしくは等張生理食塩水が挙げられる。あるいは、溶剤もしくは懸濁化剤として、滅菌油を用いることもできる。好ましくはこの油もしくは脂肪酸は、非揮発性のものとし、例えば、天然もしくは合成油、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドもしくはトリグリセリドが挙げられる。
【０２２８】
注射用の薬学的処方物および薬剤は、上記のような適切な溶液を用いて再調製するのに適した粉末とすることができる。この例としては、凍結乾燥粉末、回転乾燥粉末もしくは噴霧乾燥粉末、無晶粉末、顆粒、沈殿物、または微粒子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。注射用の製剤には、必要に応じて、安定剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、バイオアベーラビリティ改善剤およびこれらの組合せを添加することができる。
【０２２９】
直腸内投与用の薬学的処方物および薬剤は、腸管、Ｓ状結腸および／または直腸内で化合物を放出させるための坐剤、軟膏剤、浣腸剤、錠剤もしくはクリーム剤の形をとることができる。直腸坐剤は、本発明の１種以上の化合物またはその化合物の薬学的に受容可能な塩もしくは互変異性体（ｔａｕｔｏｍｅｒ）を許容されるビヒクルと混和することによって調製することができ、このようなビヒクルとしては、例えば、通常の貯蔵温度では固相状態で存在し、直腸内などの体内で薬物を放出するのに適した温度では液相状態で存在するカカオ脂もしくはポリエチレングリコールが挙げられる。また、ソフトゼラチンタイプの処方物および坐剤の調製に油を用いることができる。ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤、ならびに緩衝剤および保存剤をも含むことができる懸濁処方物の調製には、水、生理食塩水、デキストラン水溶液および関連糖溶液、ならびにグリセロールを用いることができる。
【０２３０】
上述の代表的な剤型に加えて、薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリアは、当業者に広く知られており、従って、本発明に含まれる。このような賦形剤およびキャリアについては、例えば、参考として本明細書に援用される「レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）、ニュージャージー州（１９９１年）に記載されている。
【０２３１】
本発明の製剤は、下記のように、短時間作用型、迅速放出型、長時間作用型および持続放出型となるよう設計することができる。従って、その薬学的処方物も放出制御型もしくは持続放出型として製剤化することができる。
【０２３２】
また、本発明の組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、または何らかの他の封入形態を含むこともでき、あるいは持続放出型として投与することにより貯蔵および／または送達効果を延長させることができる。従って、本薬学的処方物および薬剤は、ペレットもしくは円柱状に圧縮して、蓄積注射剤として、またはステントなどの埋没物（ｉｍｐｌａｎｔ）として筋肉内もしくは皮下に埋め込むことができる。このような埋没物には、シリコン、生分解性ポリマーなどの既知の不活性物質を用いることができる。
【０２３３】
具体的な投与量は、疾患の状態、被験体の年齢、体重、全身的な健康状態、性別および食事、投与間隔、投与経路、排泄率ならびに併用薬剤に応じて調節することができる。有効量を含む上記剤型は、いずれも十分通常の実験法の範囲内にあり、従って、十分本発明の範囲内にある。
【０２３４】
本発明の方法により、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを含む組成物は、治療上の処置のために非経口、局所的、経口的もしくは局部的に投与することができる。本組成物の投与は、経口的に、または非経口的に、即ち、静脈内、腹腔内、皮内もしくは筋肉内に行うことが好ましい。従って、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア中に１種以上のＭ−ＣＳＦアンタゴニストを含む組成物を用いて投与する方法を提供する。水性キャリアとしては、種々のもの、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを用いることができ、これらには、安定性を向上させるために、軽度に化学的修飾などを施したアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの他のタンパク質を加えることができる。
【０２３５】
多くの場合、癌転移または癌転移に伴う骨量減少の治療に有用なＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、実質的に他の天然免疫グロブリンその他の生物学的分子が含まれないように調製することになる。また、好適なＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少に罹患しているか、罹患する素因のある哺乳動物に投与した時の毒性がごく僅かである。
【０２３６】
本発明の組成物は、通常の公知の滅菌技術により滅菌することができる。こうして得られた溶液は、使用のためにパッケージし、または無菌的条件下で濾過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥した製剤は滅菌溶液と混合した後、投与することができる。この組成物には、生理的状態に近づけるために必要な薬学的に受容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどのｐＨ調節剤、緩衝剤、張度調節剤など、および安定剤（例えば、１  ２０％マルトースなど）を加えることができる。
【０２３７】
また、本発明のＭ−ＣＳＦアンタゴニストは、リポソームを用いて投与することができる。リポソームとしては、エマルジョン、泡、ミセル、不溶性単分子層、リン脂質分散体、薄膜層などが挙げられ、これらは、Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストを特定の組織に誘導すると共に、その組成物の半減期を延長させるためのビヒクルとしての役目を果たすことができる。リポソームを調製する方法としては種々のものが利用可能であり、これらについては、例えば、米国特許第４，８３７，０２８号および５，０１９，３６９号に開示されており、これらの特許は、参考として本明細書に援用されている。
【０２３８】
こうした組成物中のＭ−ＣＳＦアンタゴニストの濃度は、大幅に、即ち、約１０重量％未満、通常少なくとも約２５重量％から最大７５重量％もしくは９０重量％まで変えることができ、選択した特定の投与様式に応じて、主に液量、粘度などにより選定することになる。経口、局所および非経口投与用の組成物の実際の調製方法については、当業者には公知もしくは明らかであり、例えば、参考として本明細書に援用されているレミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」第１９版、マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルベニア州（１９９５年）に詳しく記載されている。
【０２３９】
患者の癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少を治療するための本発明の組成物の有効量は、当該分野で公知の標準的な経験的方法によって決定することができる。例えば、所与の用量のＭ−ＣＳＦを投与した被験体からの血清のインビボでの中和活性は、センシほか（Ｃｅｎｃｉ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ）１０５５：ｐ１２７９−８７、２０００年に記載されている、インビトロでのマウス単核細胞（Ｍ−ＣＳＦにレセプターを高レベルで発現しているＣＤ１１細胞のサブセットであるＣＤ１１ｂ＋細胞）のＭ−ＣＳＦ誘発性増殖および生存に対するこの血清の阻害能を測定するアッセイを用いて評価することができる。
【０２４０】
本発明の組成物は、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少にすでに罹患しているか、罹患する素因のある哺乳動物に対して、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少の進行を予防もしくは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的に有効な用量」と定義される。Ｍ−ＣＳＦアンタゴニストの有効量は、疾患の重症度および治療される患者の体重および全身状態によって異なるが、概して約１.０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より一般的には１回の適用当たり約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量を用いる。投与は、必要な場合、疾患に対する反応および治療に対する患者の耐容性に応じて、毎日、毎週もしくはより低頻度で行う。長期間にわたる維持投与量を必要とすることがあるので、投与量は、必要に応じて調節することができる。
【０２４１】
本組成物は、治療する医師の選択する用量レベルおよびパターンで単回もしくは複数回投与することができる。いずれにしても、こうした処方は、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少を効果的に予防し、もしくはその重症度を最小限に抑えるのに十分な量のＭ−ＣＳＦアンタゴニストとなるようにするべきである。本発明の組成物は、癌転移および／または癌転移に伴う骨量減少の治療に対して、単独で、もしくは当該分野で公知の他の治療剤と併用する補助療法として投与することができる。
【０２４２】
（ＩＩ．免疫療法）
癌の治療に有用な抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体としては、腫瘍に対して強い免疫反応を誘発することができるもの、および直接的な細胞傷害性を有するものが挙げられる。この点について、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体は、補体媒介性もしくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）メカニズムによって腫瘍細胞の溶解を誘発させることができ、これらのメカニズムには、エフェクタ細胞Ｆｃレセプター部位もしくは補体タンパク質と相互作用するためのこの免疫グロブリン分子の完全な状態のＦｃ部分が必要とされる。さらに、腫瘍増殖に対して直接的な生物学的作用を発揮する抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体は、本発明の実施に有用である。このような直接的な細胞傷害性を有する抗体が作用する考え得るメカニズムとしては、細胞増殖の阻害、細胞分化の変調、腫瘍血管新生因子プロフィールの変調およびアポトーシスの誘発が挙げられる。特定の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体が抗腫瘍効果を発揮するメカニズムは、当該分野で一般に知られている、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解などを調べるために設計された様々なインビトロアッセイ法を用いて評価することができる。
【０２４３】
一実施形態として、分泌型Ｍ−ＣＳＦに対してよりも膜結合型Ｍ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦα）に対して高い親和性を有する抗体を用いて免疫療法を行う。例えば、Ｍ−ＣＳＦαの切断部位もしくはその近傍、またはＭ−ＣＳＦαの膜に隣接する部分に特異的に結合する抗体を作製することができる。また、このような抗体は、Ｍ−ＣＳＦαの可溶性活性部分の切断および遊離を有利に抑制することができる。
【０２４４】
抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体は、「そのままの」形、即ち、非結合型で投与することができ、またはこれらに治療剤を結合させることができる。一実施形態として、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を放射線増感剤としてもちいる。このような実施形態として、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体を放射線増感剤と結合させる。本明細書に用いている「放射線増感剤」という用語は、放射線増感させるべき細胞の電磁放射に対する感受性を増大させ、および／または電磁放射線で治療可能な疾患の治療を促進するために、治療的有効量で動物に投与される分子、好ましくは低分子量分子と定義される。電磁放射線で治療可能な疾患としては、新生物疾患、良性および悪性腫瘍、ならびに癌細胞が挙げられる。
【０２４５】
本明細書に用いている「電磁放射線」および「放射線」という用語には、１０−２０〜１００メートルの波長を有する放射線が含まれるが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態では、電磁放射線として、ガンマ線（１０−２０〜１０−１３ｍ）、Ｘ線（１０−１２〜１０−９ｍ）、紫外線（１０ｎｍ〜４００ｎｍ）、可視光線（４００ｎｍ〜７００ｎｍ）、赤外線（７００ｎｍ〜１．０ｍｍ）、およびマイクロ波（１ｍｍ〜３０ｃｍ）を用いる。
【０２４６】
放射線増感剤は、電磁放射線の毒性作用に対する癌細胞の感受性を増大させることが知られている。多くの癌治療プロトコルでは、ｘ線の電磁放射線により活性化される放射線増感剤が用いられている。Ｘ線により活性化される放射線増感剤の例としては、以下のもの、即ち、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマイシンＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦＵｄＲ）、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ならびにこれらの治療的に有効なアナログおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４７】
癌の光力学療法（ＰＤＴ）では、この増感剤の放射線アクチベータとして可視光線が用いられる。光力学放射線増感剤（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ）の例としては、以下のもの、即ち、ヘマトポルフィリン誘導体、フォトフリン（ｒ）、ベンゾポルフィリン誘導体、ＮＰｅ６、錫エチオポルフィリン（ＳｎＥＴ２）、フェオホルビド−ａ、細菌クロロフィル−ａ、ナフタロシアニン、フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、およびこれらの治療的に有効なアナログおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４８】
本発明の方法の実施に際して用いられる抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体は、所望の送達方法に適したキャリアを含む薬学的組成物に製剤化することができる。好適なキャリアとしては、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体と併用した時に抗体の抗腫瘍機能を保持し、被験体の免疫系に対して反応性を有しない任意の物質が挙げられる。例としては、滅菌リン酸緩衝生理食塩液、制菌水などのいくつかの標準的な薬学的キャリアのうちの任意のキャリアが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４９】
さらに、本発明は、検出可能なように標識した形の上記抗体を提供する。抗体は、放射性同位体、（ビオチン、アビジンなどの）アフィニティー標識、（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの）酵素標識、（ＦＩＴＣまたはローダミンなどの）蛍光標識、常磁性原子などを用いることによって検出可能なように標識することができる。このような標識化を達成する方法については、当該分野で公知であり、例えば、（シュテルンベルガー、Ｌ．Ａ．ほか（Ｓｔｅｒｍｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．）１８：ｐ３１５（１９７０年）；バイヤー、Ｅ．Ａ．ほか（Ｂａｙｅｒ，ＥＡ．ｅｔ  ａｌ．）  メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．）６２：ｐ３０８（１９７９年）；エングバル、Ｅ．ほか（Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．）、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１０９：ｐ１２９（１９７２年）；ゴディング、Ｊ．Ｗ．（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．）１３：ｐ２１５（１９７６年））を参照されたい。
【０２５０】
本発明では、「そのままの」抗Ｍ−ＣＳＦ抗体および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体の使用、および免疫複合体の使用が企図されている。免疫複合体の作製については、米国特許第６，３０６，３９３号に開示されている。免疫複合体は、治療剤を抗体成分に間接的に結合させることにより作製することができる。一般的な技術については、シーほか（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）４１：ｐ８３２−８３９（１９８８年）；シーほか（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）４６：ｐ１１０１−１１０６（１９９０年）；およびシーほか（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，０５７，３１３号に記載されている。この一般的な方法は、酸化された炭化水素部分を有する抗体成分と、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素アデンド（ａｄｄｅｎｄ）その他の治療剤を負荷している担体ポリマーとを反応させるものである。この反応により、最初にシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これが第二級アミンに還元されることにより安定化されて最終の結合体が形成される。
【０２５１】
この担体ポリマーはアミノデキストランもしくは少なくとも５０アミノ酸残基数のポリペプチドであることが好ましいが、他の実質的に同等のポリマー担体も使用することができる。この最終の免疫複合体は、投与し易くし、治療のための標的化を効果的にするために、哺乳動物の血清などの水性溶液に可溶性であることが好ましい。すなわち、この担体ポリマーの官能基を可溶性のものとすることにより、最終免疫複合体の血清可溶性が向上する。特に、アミノデキストランとすることが好ましい。
【０２５２】
アミノデキストラン担体を含む免疫複合体を作製するためのプロセスは、デキストランポリマーから始めるが、デキストランの平均分子量は約１０，０００〜１００，０００であることが有利である。このデキストランを酸化剤と反応させてその炭化水素環の一部の酸化の制御に影響を及ぼすことによりアルデヒド基を形成させる。この酸化は、通常の方法により、ＮａＩＯ４などの糖分解化学試薬を用いて都合良く行われる。
【０２５３】
次いで、この酸化デキストランをポリアミン、好ましくはジアミン、より好ましくはモノヒドロキシジアミンもしくはポリヒドロキシジアミンと反応させる。好適なアミンとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミンまたは他の同様なポリメチレンジアミン、ジエチレントリアミンまたは同様なポリアミン、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンまたは同様なヒドロキシル化ジアミンもしくはポリアミンなどが挙げられる。デキストランのアルデヒド官能基のシッフ塩基性基への変換を実質的に完全なものとするために、上記アミンは、このアルデヒド基に対して過剰量を用いる。
【０２５４】
得られたシッフ塩基中間体は、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮなどの還元剤を用いて還元安定化を行う。得られた付加体は、通常のサイジングカラムを通すことにより架橋デキストランを除去することによって精製され得る。
【０２５５】
デキストランを誘導体化してアミン官能基を導入する他の従来の方法、例えば、臭化シアンと反応させた後、ジアミンと反応させる方法も用いることができる。
【０２５６】
次いで、このアミノデキストランは、活性型、好ましくは、通常の方法により、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）もしくはその水溶性改変体を用いて作製したカルボキシル活性化誘導体の形の特定の薬物、毒素、キレート剤、免疫調節剤、ホウ素アデンドその他の負荷すべき治療剤の誘導体と反応させて中間付加体を形成させる。
【０２５７】
あるいは、アミノデキストランに対して、アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質もしくはリシンＡ鎖などのポリペプチド毒素を、グルタルアルデヒド縮合により、もしくはこのタンパク質の活性化カルボキシル基とアミノデキストランのアミンとを反応させることにより結合させることができる。
【０２５８】
放射性金属もしくは磁気共鳴エンハンサのキレート剤は当該分野で公知である。代表的なものはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体である。代表的に、これらのキレート剤は、このキレート剤を担体に結合することができる基を側鎖に有する。このような基としては、例えば、ＤＴＰＡもしくはＥＤＴＡを担体のアミン基に結合することができるベンジルイソチオシアネートが挙げられる。あるいは、担体に対して、キレート剤のカルボキシル基もしくはアミン基を、公知の手段により、活性化し、もしくは前もって誘導体化した後、結合させることによって、結合させることができる。
【０２５９】
カルボランなどのホウ素アデンドは、通常の方法により、抗体成分に結合させることができる。例えば、当該分野で公知の方法により、ペンダント側鎖にカルボキシル官能基を有するカルボランを作製することができる。このカルボランの担体、例えば、アミノデキストランへの結合は、カルボランのカルボキシル基の活性化および担体のアミンとの縮合により中間結合体を作製することによって達成することができる。次いで、この中間結合体を抗体成分に結合させることにより、下記のような治療的に有用な免疫複合体を作製する。
【０２６０】
アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を用いることができるが、このポリペプチド担体は、鎖内にアミノ酸残基を少なくとも５０個、好ましくは１００〜５，０００個有する必要がある。また、これらのアミノ酸の少なくとも一部は、リジン残基またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基とする必要がある。リジン残基のペンダントアミンならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸のペンダントカルボン酸は、薬物、毒素、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素アデンドその他の治療剤を結合させるのに好都合なものである。好適なポリペプチド担体の例としては、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマー、ならびにこれらのアミノ酸と、得られる負荷担体および免疫複合体に好ましい溶解特性を付与する他のアミノ酸、例えば、セリンとの混合ポリマーが挙げられる。
【０２６１】
この中間結合体の抗体成分との結合は、抗体成分の炭化水素部分を酸化し、生じたアルデヒド（およびケトン）カルボニルを、薬物、毒素、キレート剤、免疫調節剤、ホウ素アデンドその他の治療剤を負荷した担体に残存するアミン基と反応させることにより、行うことができる。あるいは、中間結合体を、治療剤を負荷したこの中間結合体に導入したアミン基を介して、酸化抗体成分に結合させることができる。酸化は、化学的に、例えば、ＮａＩＯ４その他の糖分解試薬を用い、または酵素的に、例えば、ノイラミニダーゼおよびガラクトース酸化酵素を用いて好都合に行うことができる。アミノデキストラン担体の場合、代表的に、治療剤を負荷するのに、アミノデキストランのアミンの全てを用いるものではない。アミノデキストランの残るアミンは、酸化抗体成分と縮合させてシッフ塩基付加体を形成させ、通常ホウ化水素還元剤でこれを還元的に安定化する。
【０２６２】
類似の方法を用いて、本発明による別の免疫複合体を作製する。負荷ポリペプチド担体は、抗体成分の酸化炭化水素部分と縮合させるための残存遊離リジン基を有することが好ましい。このポリペプチド担体のカルボキシルは、必要に応じて、例えば、ＤＣＣで活性化し、過剰のジアミンと反応させることにより、アミンに変換することができる。
【０２６３】
最終的な免疫複合体は、セファクリルＳ−３００のサイジングクロマトグラフィ、もしくは１つ以上のＣＤ８４Ｈｙエピトープを用いるアフィニティクロマトグラフィなどの通常の方法により、精製する。
【０２６４】
あるいは、免疫複合体は、抗体成分を治療剤と直接結合させることによって作製することができる。この一般的な方法は、治療剤を酸化抗体成分に直接結合させる点以外は、上記の間接的な結合方法と同様である。
【０２６５】
本明細書に記載したキレート剤の代わりに他の治療剤を用いることができることは、明瞭に理解されよう。当業者は、過度の実験を行わなくても結合スキームを工夫することができよう。
【０２６６】
別の例として、還元抗体成分のヒンジ領域に、ジスルフィド結合の形成を介して治療剤を結合させることができる。例えば、単一システイン残基を有する沈降破傷風トキソイドペプチドを構築し、この残基を利用して抗体成分にペプチドを結合させることができる。別の方法として、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋剤を用いて、このペプチドを抗体成分に結合させることができる。ユーほか（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）５６：ｐ２４４（１９９４年）。このような結合の一般的な方法については、当該分野で公知である。例えば、ウォン（Ｗｏｎｇ）、ケミストリー・オブ・プロテイン・コンジュゲーション・アンド・クロス−リンキング（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ）（ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）１９９１年）；ウペスラシスほか（Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、「化学的方法による抗体の修飾（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」モノクロナール・アンチボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、バーチほか（Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）編、ｐ１８７−２３０（ワイリー−リス社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）１９９５年）；プライス（Ｐｒｉｃｅ）、「合成ペプチド由来抗体の作製および特徴付け（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」モノクロナール・アンチボディズ：プロダクション・エンジニアリング・アンド・クリニカル・アプリケーション（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」リッターほか（Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）編、ｐ６０−８４（ケンブリッジ・ユニバーシティ・プレス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）１９９５年）を参照されたい。
【０２６７】
前述のように、抗体のＦｃ領域の炭化水素部分は治療剤を結合させるのに用いることができるが、上記免疫複合体の抗体成分として抗体フラグメントが用いられる場合には、このＦｃ領域は存在しなくてもよい。それでも、抗体もしくは抗体フラグメントの軽鎖可変領域に炭化水素部分を導入することは可能である。例えば、リヨンほか（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５４：ｐ５９１９（１９９５年）；ハンセンほか（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，４４３，９５３号を参照されたい。次いで、この操作された炭化水素部分を用いて治療剤を結合させる。
【０２６８】
さらに、こうした結合方法に対して多種多様な変更を行うことが可能であることは、当業者には理解されよう。例えば、血液、リンパ液その他の細胞外液における完全な状態の抗体もしくはその抗原結合断片の半減期を延長させるために、上記炭化水素部分を利用してポリエチレングリコールを結合させることができる。さらに、炭化水素部分に、およびスルフヒドリル基に治療剤を結合させることにより、「二価の免疫複合体」を構築することも可能である。このような遊離スルフヒドリル基は、抗体成分のヒンジ領域に位置させることができる。
【０２６９】
（抗Ｍ−ＣＳＦおよび抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体融合タンパク質）
本発明では、１つ以上の抗Ｍ−ＣＳＦ抗体部分および抗Ｍ−ＣＳＦＲ抗体部分と免疫調節剤もしくは毒素部分とを含む融合タンパク質の使用が企図されている。抗体融合タンパク質を作製する方法については、当該分野で公知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号を参照されたい。インターロイキン−２部分を含む抗体融合タンパク質については、ボレッチほか（Ｂｏｌｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、アナルズ・オブ・オンコロジー（Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．）６：ｐ９４５（１９９５年）；ニコレほか（Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・ジーン・セラピィ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）２：ｐ１６１（１９９５年）；ベッカーほか（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、９３：ｐ７８２６（１９９６年）；ハンクほか（Ｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）２：ｐ１９５１（１９９６年）；およびフーほか（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５６：ｐ４９９８（１９９６年）に記載されている。さらに、ヤンほか（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ヒューマン・アンチボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）６：ｐ１２９（１９９５年）にはＦ（ａｂ’）２断片および腫瘍壊死因子アルファ部分を含む融合タンパク質について記載されている。
【０２７０】
また、組換え分子が１つ以上の抗体成分および毒素もしくは化学療法剤を含む抗体−毒素融合タンパク質を作製する方法については当業者に公知である。例えば、抗体−シュードモナス外毒素Ａ融合タンパク質についてはクロードハリーほか（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３９：ｐ３９４（１９８９年）；ブリンクマンほか（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８８：ｐ８６１６（１９９１年）；バトラほか（Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、８９：ｐ５８６７（１９９２年）；フリードマンほか（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５０：ｐ３０５４（１９９３年）；ウェルズほか（Ｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．）６０：ｐ１３７（１９９５年）；フォミナヤほか（Ｆｏｍｉｎａｙａ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７１：ｐ１０５６０（１９９６年）；クアンほか（Ｋｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３５：ｐ２８７２（１９９６年）；およびシュミットほか（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．）６５：ｐ５３８（１９９６年）に報告されている。ジフテリア毒素部分を含む抗体−毒素融合タンパク質についてはクライトマンほか（Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、リューケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）７：ｐ５５３（１９９３年）；ニコルスほか（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６８：ｐ５３０２（１９９３年）；トンプソンほか（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７０：ｐ２８０３７（１９９５年）；およびバレラほか（Ｖａｌｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）８８：ｐ２３４２（１９９６年）に報告されている。デオナレインほか（Ｄｅｏｎａｒａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、チューモア・標的化（Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）１：ｐ１７７（１９９５年）にはＲＮアーゼ部分を有する抗体−毒素融合タンパク質が記載されているが、リナルドほか（Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）、セル・バイオフィジックス（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．）２４−２５：ｐ２４３（１９９４年）ではＤＮアーゼＩ成分を含む抗体−毒素融合タンパク質が作製された。ワンほか（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、アブストラクツ・オブ・ザ・２０９スＡＣＳナショナル・ミーティング（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０９ｔｈ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）、アナハイム（Ａｎａｈｅｉｍ）、カリフォルニア州、１９９５年４月２−６日、パートＩ、ＢＩＯＴ００５に報告されている抗体���毒素融合タンパク質では、毒素部分としてゲロニンが用いられた。別の例として、ドールステンほか（Ｄｏｈｌｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ、９１：ｐ８９４５（１９９４年）では、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａを含む抗体−毒素融合タンパク質が報告された。
【０２７１】
このような結合体の作製に好適に用いられる毒素の実例は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素である。例えば、パスタンほか（Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、セル（Ｃｅｌｌ）４７：ｐ６４１（１９８６年）、およびゴールデンバーグ、Ｃ．Ａ．（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ）ア・キャンサー・ジャーナル・フォ・クリニシャンズ（Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ）４４：ｐ４３（１９９４年）を参照されたい。その他の好適な毒素についても当業者には公知である。
【０２７２】
以下の実施例によって本発明を説明するが、これらは何ら制限的なものではない。
【実施例】
【０２７３】
（実施例１）
この実施例は、高度に転移性の乳癌細胞株が高レベルのＭ−ＣＳＦを発現していることを示すものである。マイクロアレイを用いて、高度に転移性の細胞株ＭＤＡ２３１によるＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現を細胞株ＭＣＦ７およびＺＲ７５１によるＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現と比較した。ＭＤＡ２３１のＭ−ＣＳＦ発現レベルをＭＣＦ７のＭ−ＣＳＦ発現レベルと比較した場合、６．９倍の増大、ＭＤＡ２３１のＭ−ＣＳＦ発現レベルをＺＲ７５１のＭ−ＣＳＦ発現レベルと比較した場合、５．２倍の増大が認められた。
【０２７４】
（実施例２）
この実施例は、破骨細胞形成のインビトロアッセイにおいて、精製Ｍ−ＣＳＦを転移性細胞株ＭＤＡ２３１からの馴化培地（ＣＭ）で置き換えることができるが、細胞株ＭＣＦ７では置き換えることができないことを示すものである（図３）。
【０２７５】
順化培地（ＣＭ）の調製：ＭＤＡ２３１もしくはＭＣＦ７細胞を、インスリン、ヒトトランスフェリンおよび亜セレン酸を含有する培地サプリメントである１×ＩＴＳ（ＢＤバイオサイエンシズ社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、レキシントン（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）、ケンタッキー州）を含む８ｍｌの５０％ＤＭＥＭ／５０％ＨＡＭｓＦ１２中、１×１０６個細胞／１０ｃｍ皿の密度で平板培養した。５％ＣＯ２中３７℃で４８時間インキュベーションした後、培地を採取し、１，５００ＲＰＭで１０分間遠心することにより懸濁細胞を除去した。上清を回収し、０．２ｎＭフィルターにより濾過してＣＭとして用いた。
【０２７６】
破骨細胞アッセイ：骨髄ＣＤ３４＋細胞を、１０％ＦＣＳ、１×ペン／ストレップ（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）および１×ファンギゾンを含む１００μｌのアルファＭＥＭ中、１５，０００個細胞／９６ウェルの密度で平板培養した。次の日に、培地５０μｌを各ウェルから除去し、２５μｌのアルファＭＥＭ培地、および７５μｌのＣＭもしくは１×ＩＴＳを含有する５０％ＤＭＥＭ／５０％ＨＡＭｓＦ１２で置き換えた。各ウェルにＲＡＮＫＬを１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加え、適切なウェルに３０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを加えた。細胞は、５％ＣＯ２中３７℃で１１日間インキュベートした。その間、６日後に新鮮なＲＡＮＫＬを再度加えた。１１日後、細胞を固定し、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製の白血球酸性ホスファターゼキットを用いて酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼを染色した。
【０２７７】
結果：図３から明らかなように、破骨細胞形成のインビトロアッセイにおいて、精製Ｍ−ＣＳＦを転移性細胞株ＭＤＡ２３１からの馴化培地（ＣＭ）で置き換えることができるが、細胞株ＭＣＦ７では置き換えることができない。
【０２７８】
（実施例３）
この実施例は、ＭＤＡ２３１ＣＭによる破骨細胞の誘導がＭ−ＣＳＦに対する抗体によって無効化されることを示す（図４）。
【０２７９】
実施例２に記載したようにして、骨髄ＣＤ３４＋細胞を平板培養した。次の日に、培地５０μｌを各ウェルから除去した。その後、各ウェルに、２５μｌの６×抗体５Ｈ４またはアルファＭＥＭ培地、次いで７５μｌのＣＭまたは１×ＩＴＳもしくはアルファＭＥＭ培地を含有する５０％ＤＭＥＭ／５０％ＨＡＭｓＦ１２を加えた。次に、全てのウェルに１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを加え、さらに、半数のウェルには３０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを加えた。次いで、これらの細胞を５％ＣＯ２中３７℃で１１日間インキュベートした。その間、６日後に新鮮なＲＡＮＫＬを再度加えた。１１日後、細胞を固定し、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）製の白血球酸性ホスファターゼキットを用いて酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼを染色した。
【０２８０】
図４から明らかなように、ＭＤＡ２３１ＣＭによる破骨細胞の誘導がＭ−ＣＳＦに対する抗体によって無効化される。
【０２８１】
（実施例４）
この実施例は、ヒトＭ−ＣＳＦに対するモノクロナール抗体５Ｈ４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）登録番号ＨＢ１００２７）およびその他の抗体の中和活性を示すものである（図５）。
【０２８２】
マウスＭ  ＮＦＳ６０細胞（インターロイキン３およびＭ−ＣＳＦに反応性で、レトロウイルスの組み込みで生じた切断ｃ−ｍｙｂ癌原遺伝子を含む、Ｃａｓ−Ｂｒ−ＭｕＬＶ野性形マウスエコトロピックレトロウイルスで誘発された骨髄性白血病由来の、ＡＴＣＣ、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州、米国から入手可能なアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・登録番号ＣＲＬ−１８３８）へのヒトＭ−ＣＳＦの活性に対する上記抗体の中和活性を測定するために、組換えヒトＣＳＦ−１（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を種々の濃度の抗体と共にインキュベータで５％ＣＯ２中３７℃、１時間インキュベートした。インキュベーション後、この混液を９６穴マイクロタイタープレート内のＭ  ＮＦＳ６０の培地に加えた。ウェル当たりの全アッセイ容量は、１０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＭ−ＣＳＦ、図５に示した抗体濃度、５，０００細胞／ウェルの細胞密度を含む１００μｌであった。ＣＯ２インキュベータ中３７℃で７２時間培養した後、細胞増殖についてＣｅＩＩＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  Ｋｉｔ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））によりアッセイした。ヒトＭ−ＣＳＦに対して全ての抗体が惹起された。アノジェン（Ａｎｏｇｅｎ）とは、アノジェン社（Ａｎｏｇｅｎ）製品カタログ＃ＭＯ  Ｃ４００４８．Ａクローン１１６、アンティジェニックス（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ）とは、アンティジェニックス・アメリカ社（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ  Ａｍｅｒｉｃａ）製品カタログ＃ＭＣ６００５２０クローンＭ１６、Ｒ＆Ｄとは、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）製品カタログ＃Ｍａｂ２１６のことを意味する。
【０２８３】
図５から明らかなように、細胞増殖は、アノジェンおよびアンティジェニックスに比し、抗体５Ｈ４処置で最も影響された。
【０２８４】
（実施例５）
この実施例は、癌転移に伴う重症の骨溶解性疾患を予防するのに抗Ｍ−ＣＳＦ抗体が極めて有効であることを示すものである。
【０２８５】
実験デザイン：骨溶解処置用治療剤としてのＭ−ＣＳＦ抗体の有効性を評価することを目的として、雌性ヌードマウスの脛骨骨髄腔内に高度に転移性のヒト乳癌細胞株ＭＤＡ２３１（３×１０５）を注入した。使用したマウスは、年齢が４〜７週令、平均体重が約２０ｇであった。マウスには識別用のチップを埋め込み、少なくとも７日間の順化期間を置いた後、８週間の実験を開始した。
【０２８６】
これらのマウスには総用量１．５ｍｐｋ（マウス１匹当たり０．３ｍｇ）のブプレノルフィンを両側腹部の皮下に投与した後３０分で、脛骨内注入を行った。マウスは、イソフルラン吸入により麻酔し、７０％エタノールで右後肢を洗った。腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ、３×１０５）を１０μｌの生理食塩水に懸濁し、５０μｌもしくは１００μｌの微量注射器を用いて右脛骨骨髄腔内に注入した。
【０２８７】
抗体投与について、群を以下の通り、選択した：
１．マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール
２．５Ｈ４マウスＩｇＧ１抗ヒトＭＣＳＦ
３．ラットモノクロナールコントロール（ＴＢＤ）
４．５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦ
５．５Ｈ４＋５Ａ１（重複投与）
６．マウス＋ラットアイソタイプコントロール（二重コントロール）
（ＰＢＳコントロール群なし）
投与。抗体の投与は、腫瘍細胞注入の翌日から開始した。マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール、５Ｈ４マウスＩｇＧ１抗ヒトＭＣＳＦ、ラットモノクロナールコントロールおよび５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦ抗体（ロークシュウォー、Ｂ．Ｌ．（Ｌｏｋｅｓｈｗａｒ，Ｂ．Ｌ．）、リン、Ｈ．Ｓ．（  Ｌｉｎ，Ｈ．Ｓ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５：ｐ１４１（２）：ｐ４８３−８（１９８８年））の場合、抗体１０ｍｇ／ｋｇを週１回投与した。併用投与群（５Ｈ４＋５Ａ１、マウス＋ラットアイソタイプコントロール）では、個々の（即ち、混合されていない）抗体１０ｍｇ／ｋｇを週１回、間隔をおいて投与することにより、これらの処置群のマウスに週２回注射した。
【０２８８】
これらの溶液は、１００μｌのＩＰ注入によって２０グラムのマウス当たりの標的用量（＝２００μｇ）が送達されるように前もって希釈した濃度（＝２ｍｇ／ｍｌ）で投与した。体重による調整のため、注入容量は、体重差グラム当たり５μｌ増減させた。例えば、２３グラムのマウスには１１５μｌ、１８グラムのマウスには９０μｌ投与した。
【０２８９】
測定。種々の治療群間で骨溶解の重症度を評価するために、腫瘍細胞注入の翌日に、各マウスでベースラインのＦａｘｉｔｒｏｎ画像を撮影した。実験（８週間）の終了時にもＦａｘｉｔｒｏｎ画像を撮影した。同時に、これらの腫瘍細胞がルシフェラーゼを安定的に発現するので、Ｘｅｎｏｇｅｎシステムを用いて腫瘍増殖を測定した。
【０２９０】
結果。図６に示したように、平均骨溶解スコアが≧２．５の動物数は、５Ａ１＋５Ｈ４抗体の併用群で最も少なかった。溶解性骨損傷は、０から４のスケールで評価し、「骨損傷なし」を０、「ある程度骨損傷あり」を１〜２とし、２．２５以上のスコアは重症の骨損傷を示すものとした。得られたデータは、マウス（即ち、宿主）により産生されるＭ−ＣＳＦは腫瘍細胞により産生されるＭ−ＣＳＦよりも骨溶解に対して強い効果を有することを示唆した（５Ｈ４と５Ａ１とを単独および併用で比較されたい）。
【０２９１】
（実施例６）
実施例５で説明した実験を、１つだけを例外として実験デザインのところで記載した方法に基本的に従い、繰り返した。この実験では、抗体処置は、腫瘍接種の２週間後に開始した。腫瘍接種の１日後に後肢のＸ線像を撮影し、ベースラインの像を得ると共に注入による骨折の有無を調べた。さらに、腫瘍接種の１４日後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳシステムを用いてマウスをの画像を撮影し、腫瘍細胞からの蛍光の光子放出を定量した。
【０２９２】
同様な量の脛骨光子シグナルを有する６０匹のマウスを選んだ。胸部にシグナル（人為的肺転移）を有するマウスはこの実験から除外した。選んだマウスは、上記の６投与群に無作為に分け、実施例５に記載したようにして、抗体処置を施した。この実験全体を通して、光子の放出を週に１回連続的にモニターした。腫瘍接種後の第５週から、週に１回Ｘ線像も撮影して骨内の腫瘍増殖を評価した。
【０２９３】
図７に示したように、平均骨溶解スコアが≧２．５の動物数は、５Ａ１＋５Ｈ４抗体の併用群で最も少なかった。骨溶解性骨損傷は、０から４のスケールで評価し、「骨損傷なし」を０、「ある程度骨損傷あり」を１〜２とし、２．２５以上のスコアは重症の骨損傷を示すものとした。得られたデータは、マウス（即ち、宿主）により産生されるＭ−ＣＳＦは腫瘍細胞により産生されるＭ−ＣＳＦよりも骨溶解に対して強い効果を有することを示唆した（５Ｈ４と５Ａ１とを単独および併用で比較されたい）。
【０２９４】
（実施例７）
この実施例は、皮下ＳＷ６２０モデルを用いて抗Ｍ−ＣＳＦモノクロナール抗体の抗癌活性の評価方法を示したものである。上記の実施例５および６では、抗Ｍ−ＣＳＦモノクロナール抗体処置により骨髄内の腫瘍増殖が著しく抑制されることが明らかとなった。この実験の目的は、この抗体が軟組織内の腫瘍増殖も抑制することができるかどうかを評価することにある。
【０２９５】
この実験には、平均体重約２０ｇで１０週令の雌性ｎｕ／ｎｕマウスを用いる。マウスに少なくとも７日間の順化期間を経させた後、実験を開始する。０日目に、ヌードマウスの右側腹部に、１００μｌ当たりマウス１匹当たり５×１０６個のＳＷ６２０ヒト結腸癌細胞を皮下注入する。腫瘍容積が１００〜２００ｍｍ３に達した時（通常、腫瘍接種の１週間後）、以下のように、マウスを１群１０匹の５群に無作為に選択した：
１）ＰＢＳ
２）５Ｈ４
３）５Ａ１
４）ｍＩｇＧ１＋ｒＩｇＧ１アイソタイプＡｂコントロール
５）５Ａ１＋５Ｈ４
マウスに、１０ｍｐｋの指定した抗体を週１回、４週間腹腔内投与する。腫瘍容積が２０００ｍｍ３に達した時にこの実験を終了する。あるいは、以下の条件のいずれかを満たす場合、動物を安楽死させることもできる：総腫瘍表面積の３０％を超える腫瘍表面の潰瘍化、著しい体重減少（＞２０％）、脱水、および瀕死の状態。全てのマウスから全血を採取し、単核細胞集団を可能性のある代替指標として分析する。腫瘍の増殖／サイズを２−Ｄ解析により測定する。腫瘍の幅および長さの測定値を用いて腫瘍容積を算出する。軟組織内の腫瘍増殖は、上記の実験の結果として抑制されると予想される。
【０２９６】
（実施例８）
以下の実施例は、癌転移に伴う重症の骨溶解性疾患を治療および予防するための併用療法の評価方法を示すものである。
【０２９７】
実験デザイン。上記実施例５で説明した実験を、以下の点を例外として、基本的に説明通りに繰り返す。下記の処置群で示した抗体もしくは抗体併用の他に、動物に以下の追加的な処置のうちの１つを行う：
１．ビスホスフォネート（例えば、アレディア（Ａｒｅｄｉａ）；ゾメタ（Ｚｏｍｅｔａ）；クロドロネート（Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ））
２．手術
３．放射線療法
４．化学療法
５．ホルモン療法（例えば、タモキシフェン；抗アンドロゲン療法）
６．抗体療法（例えば、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ中和抗体；ＰＴＨｒＰ中和抗体）
７．治療的タンパク質療法（例えば、可溶性ＲＡＮＫＬレセプター；ＯＰＧ、ＰＤＧＦおよびＭＭＰ阻害剤）
８．低分子薬物療法（例えば、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤）
９．オリゴヌクレオチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬもしくはＲＡＮＫもしくはＰＴＨｒＰアンチセンス）
１０．遺伝子療法（例えば、ＲＡＮＫＬもしくはＲＡＮＫ阻害剤）
１１．ペプチド療法（例えば、ＲＡＮＫＬのムテイン）
処置群は以下の通りである。上記の追加的処置は「プラス療法Ｘ」として下記に示した：
１．ＰＢＳのみ
２．療法Ｘのみによる処置
３．ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロール
４．マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール
５．５Ｈ４抗ヒトＭＣＳＦのみ
６．５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦのみ
７．ラットＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール併用
８．５Ｈ４および５Ａ１併用
９．ラットＩｇＧ１アイソタイプコントロールプラス療法Ｘ
１０．マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールプラス療法Ｘ
１１．５Ｈ４抗ヒトＭＣＳＦプラス療法Ｘ
１２．５Ａ１ラットＩｇＧ１抗マウスＭＣＳＦプラス療法Ｘ
１３．ラットＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール併用プラス療法Ｘ
１４．５Ｈ４および５Ａ１併用プラス療法Ｘ
投与。０．１〜３０ｍｇ／ｋｇの各抗体を用いてそれぞれの動物に投与した。好ましい投与量は１０ｍｇ／ｋｇである。投与経路はＩＶ、ＩＰ、ＳＣとすることができる。好ましい経路はＩＰである。投与は、上記実施例５で説明したように、腫瘍細胞注入の翌日から開始する。
【０２９８】
測定。各種処置群間で骨溶解の重症度を評価するために、腫瘍細胞注入の翌日に、各マウスでベースラインのＦａｘｉｔｒｏｎ画像を撮影する。実験（８週間）の終了時にもＦａｘｉｔｒｏｎ画像を撮影する。同時に、これらの腫瘍細胞がルシフェラーゼを安定的に発現するので、Ｘｅｎｏｇｅｎシステムを用いて腫瘍増殖を測定する。癌転移に伴う重症の骨溶解性疾患を治療および予防するための併用療法の効果は抗体療法単独に対して向上すると予想される。
【０２９９】
（実施例９）
以下の実施例は、蛍光細胞分析分離装置を用いて、例えば、乳癌細胞（細胞株ＭＤＡ２３１）もしくは多発性骨髄腫癌細胞（細胞株ＡＲＨ７７）に対するＭ−ＣＳＦ特異的抗体の結合能を評価するためのプロトコルを示すものである。
【０３００】
最初に、細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まない）で２度洗浄した。各１０−ｃｍプレートに対して２ｍｌの３ｍＭ  ＥＤＴＡを加え、細胞が丸みを帯び、皿から離れ始めるまでこのプレートを３７℃で２〜３分間インキュベートした。次に、１０ｍｌの緩衝液Ａ（ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ）を加え、混ぜ合わせた。この時、細胞がペレット化したので、これをＰＢＳ＋５％ＦＢＳ中に約５×１０６個／ｍｌの濃度に再懸濁し、この細胞のサンプル当たり１００μｌを各細管に入れた。
【０３０１】
この時点で、０．１〜１０ｕｇ／ｍｌの一次抗体（示した濃度のＭ−ＣＳＦ抗体もしくは対照抗体を使用）を加えた。必要な場合、５％ＦＢＳ／ＰＢＳを用いて希釈した。次いで、この混液を４℃で３０分間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、細胞を４００ｇで５分間の遠心を３回行うことにより洗浄した後、この細胞をＰＢＳに再懸濁した。
【０３０２】
ＦＩＴＣもしくはＰＥ標識抗ＩｇＧ抗体（０．２ｕｇ／サンプル）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで最適希釈度に希釈し、上記細胞をこの溶液に再懸濁して４℃で３０分間インキュベートした。次に、前述のようにして、細胞を３回洗浄した。この洗浄後、０．５ｍｌ／サンプルのＰＩ−ＰＢＳを用いて再懸濁して（必要に応じて、生細胞と死細胞を識別する）。また、この細胞は、その後の分析のために固定することもできる（０．１％ホルムアルデヒドで固定した場合、この細胞は約３日間有効である）。次に、標準的な方法により蛍光活性化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖｅ）ＦＡＣＳを用いて分析した。
【０３０３】
図８Ａおよび図８Ｂから明らかなように、Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体は、示した種々の抗体濃度で乳癌細胞株ＭＤＡ２３１もしくは多発性骨髄腫癌細胞株ＡＲＨ７７に結合した。
【０３０４】
（実施例１０）
以下の実施例は、Ｍ−ＣＳＦがいくつかの癌細胞の表面に多く認められることを示すものである。Ｍ−ＣＳＦ特異的抗体を用いて以下の通り、Ｍ−ＣＳＦの免疫組織化学的染色を行った。
【０３０５】
最初に、スライドをオーブンで５５〜６０℃、１時間加熱した後、２〜３分間冷却させた。以下の脱ろうおよび再水和パラメータを用いた：
ａ．キシレン                ３×５分
ｂ．１００％試薬アルコール  ２×５分
ｃ．９５％試薬アルコール    ２×４分
ｄ．７５％試薬アルコール    ２×３分
ｅ．５０％試薬アルコール    １×３分
ｇ．ｄＩ  Ｈ２Ｏ            ２〜３回サッとゆすぐ
過酸化物ブロッキング工程の前に、１×Ｂｉｏｇｅｎｅｘ  Ｃｉｔｒａ  Ｐｌｕｓを用いて抗原回収（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を行った。最初に、上記溶液をフルパワーでレンジ加熱して沸騰させた。溶液が沸騰すると、すぐにパワーレベル２に切り替えてさらに１３分間レンジ加熱した後、冷却させて次に進んだ。過酸化物ブロッキング工程は以下の通り、実施した。スライドを３％Ｈ２Ｏ２（２５ｍｌ  ３０％〜２５０ｍｌ
ｄＩ  Ｈ２Ｏ）中に浸漬し、室温に１０分間配置した。次ぎに、このスライドをｄＩ  Ｈ２Ｏで２回ゆすぎ、１×ＰＢＳでの２分間洗浄を２回行った。
【０３０６】
アビジン／ビオチンブロッキング工程は以下の通り行った。先ず、スライドを金属台に水平に置き、ブルーＰＡＰペン（疎水性スライドマーカ）で組織の周囲を囲んだ。次に、Ｚｙｍｅｄ社アビジン（試薬Ａ）を２滴−−組織をカバーするのに十分な量−−を加えて、スライドを室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、スライドを以下の通りに洗浄した：
１×ＰＢＳ中３分間洗浄２回
Ｚｙｍｅｄ社ビオチン（試薬Ｂ）２滴、室温１０分間
１×ＰＢＳ中３分間洗浄２回
タンパク質ブロッキング工程は以下の通りに行った。先ず、二次抗体種の１０％血清を（最終濃度が２％となるように）加えた。次に、バイオジェネックス・パワー・ブロック（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｐｏｗｅｒ  Ｂｌｏｃｋ）をｄＩ  Ｈ２Ｏで１×に希釈した。スライドの台をパワー・ブロックに室温で８分間浸漬した後、スライドを１×ＰＢＳで２回ゆすいだ。
【０３０７】
一次抗体の添加のため、このスライドを金属台に水平に置いた。抗体は各切片をカバーするように加え（約３５０μｌ）、この抗体を（必要な場合、）ピペット先端で、組織をこすることなく拡散させた。次いで、スライドを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、スライドの１×ＰＢＳによる３〜５分間の洗浄を３回行った。この時点で、バイオジェネックス・マルチリンク（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉ−Ｌｉｎｋ）を切片に適用し、室温で１０〜１１分間インキュベートした。次いで、各切片を３分間洗浄した。
【０３０８】
標識は、バイオジェネックスＨＲＰラベル（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌ）を切片に適用した後、室温で１０〜１１分間インキュベートし、１×ＰＢＳで３分間、３回洗浄することにより行った。次に、切片にバイオジェネックスＨ２Ｏ２基質を加え（２．５ｍｌのＨ２Ｏ２につきＡＥＣの１滴）、室温で１０分間インキュベートした。次いで、切片をｄＩ  Ｈ２Ｏで数回ゆすいだ。対比染色工程は以下の通りに行った。先ず、切片をヘマトキシリンにより室温で１分間染色した。次に、この切片をＨ２Ｏで２回ゆすいだ後、１×ＰＢＳ中、１分間インキュベートした。次いで、切片をＨ２ＯでよくすすぐことによりＰＢＳを除去した。切片の封入は、切片にバイオジェネックス・スーパー・マウント（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｏｕｎｔ）を１滴注いだ後、室温で一夜風乾することにより行った。
【０３０９】
図９から明らかなように、Ｍ−ＣＳＦはいくつかの癌細胞の表面に多く認められる。示した癌細胞種の切片は、以下のように、スコア付けした：
０    染色されず
１    バックグラウンドと同程度の染色
２    陽性であるが、弱い染色
３    陽性で、有意な染色
４    陽性で、強い染色
本明細書において参照し、および／または本出願データシートに記載した上記の米国特許、米国出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献については全てその全体が本明細書に参考として援用される。
【０３１０】
上記の内容から本発明の特定の実施形態が例示を目的として本明細書に記載したものであり、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の修正を行い得ることは、上記の内容から明瞭に理解されよう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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