(57)【要約】      （修正有）【課題】所定の機能を有するタンパク質のターゲットに対する親和性や結合性を高めるために、新規なタンパク質の集積化剤を提供する。【解決手段】以下のアミノ酸配列（ａ）及び（ｂ）；（ａ）特定のアミノ酸配列（ｂ）特定のアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをタンパク質集積化剤として利用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸残基（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１のアミノ酸残基；セリン及びリジンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基
（ｂ）第２のアミノ酸残基；トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基、
とをそれぞれ備えるペプチド鎖を含むペプチドである、タンパク質集積化剤。
【請求項２】
前記ペプチド鎖は、前記第１のアミノ酸残基は２残基以上連続して備える第１の末端部分と、
前記第２のアミノ酸残基を２残基以上連続して備える第２の末端部分と、を備える、請求項１に記載のタンパク質集積化剤。
【請求項３】
前記ペプチド鎖は、前記第１のアミノ酸残基及び前記第２のアミノ酸残基のみからなる残基数が９個以上１３個以下のアミノ酸配列を備える、請求項１又は２に記載のタンパク質集積化剤。
【請求項４】
前記ペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（ａ）及び（ｂ）
（ａ）配列番号１〜１７及び２９で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１〜１７及び２９で表されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列
から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質集積化剤。
【請求項５】
前記（ｂ）において、置換、挿入及び付加されるアミノ酸は、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項４又は５に記載のタンパク質集積化剤。
【請求項６】
前記（ｂ）において配列番号１、３〜７、９、１０、１１及び１２で表されるアミノ酸配列中のセリン（Ｓ）の１個又は２個以上がリジンで置換されている、請求項４に記載のタンパク質集積化剤。
【請求項７】
前記（ｂ）において配列番号１、３〜８、１１及び１２で表されるアミノ酸配列中のトリプトファン（Ｗ）の１個又は２個以上がチロシン（Ｙ）及びフェニルアラニン（Ｆ）で置換されている、請求項４に記載のタンパク質集積化剤。
【請求項８】
１種又は２種以上の所望のペプチド鎖と、
請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質集積化剤と、
を備える、融合タンパク質。
【請求項９】
タンパク質集積体であって、
請求項９に記載の融合タンパク質を構成単位として含む、集積体。
【請求項１０】
タンパク質の集積体の生産方法であって、
請求項９に記載の融合タンパク質を準備する工程と、
前記融合タンパク質を構成単位として含む集積体を形成する工程と、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の集積体及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を集積することでその機能を高められることが知られている。たとえば、抗体のＣ末端に３５アミノ酸残基ペプチド（二量体化ドメインであって、へリックス・ループ・へリックス構造をとる）又は４２アミノ酸残基ペプチド（ｐ５３由来の四量体化ドメイン）を融合することによって、こうしたドメインを介して個々の融合タンパク質を集積して全体としての抗原に対する親和性（アビディティ；avidity）を高める試みがなされている（非特許文献１）。
【０００３】
また、このほかにも多量体化ドメインを用いてタンパク質を多量体化する試みがなされている（特許文献１〜４）。
【０００４】
このように、所定の機能を有するタンパク質のターゲットに対する親和性や結合性を高めるためには、タンパク質の集積化が望まれる。例えば、触媒作用を有するタンパク質を集積化した場合には、局所的な触媒濃度が高まり触媒反応の効率が高まると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１３６２９２号公報
【特許文献２】特開２００７−９７４１７号公報
【特許文献３】特開２００５−２１３１６６号公報
【特許文献４】特表２００９−５１９９３１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M Rheinnecker, C Hardt, LL Ilag, P Kufer, R Gruber, A Hoess, A Lupas, C Rottenberger, A Pluckthun, and P Pack ,J. Immunol., Oct 1996; 157: 2989 - 2997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のとおり、公知の二〜六量体化ドメインを用いることで、集積したタンパク質の数に応じた機能性の向上が期待できる。しかしながら、これらのドメインは、それぞれ、二量体〜六量体の作製に用いることができるものの、それ以上の多量体の作製は困難であった。また、これらのドメインは、３０〜５０のアミノ酸残基の長いペプチドであって、分散性や経済性を高めるためにも、多量体化に必要なペプチドを短くすることが望まれる。
【０００８】
そこで、本発明は、新規なタンパク質の集積化のためのドメインと、それを保持するタンパク質、及びこうしたタンパク質の集積体並びに集積体の用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、疎水性イオン液体に対して溶解又は疎水性イオン液体と水との水／非水界面に局在するペプチドにつき検討していたところ、こうしたペプチドを融合したタンパク質が水相のみにおかれた場合には自己組織化により集積してタンパク質の集積体を形成するという知見を得た。本明細書の開示によれば、以下の手段が提供される。
【００１０】
本明細書の開示によれば、以下のアミノ酸残基（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）第１のアミノ酸残基；セリン及びリジンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基
（ｂ）第２のアミノ酸残基；トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基、
とをそれぞれ備えるペプチド鎖を含むペプチドである、タンパク質集積化剤が提供される。
【００１１】
前記タンパク質集積化剤の前記ペプチド鎖は、好ましくは、前記第１のアミノ酸残基は２残基以上連続して備える第１の末端部分と、前記第２のアミノ酸残基を２残基以上連続して備える第２の末端部分と、を備えることができる。また、前記ペプチド鎖は、前記第１のアミノ酸残基及び前記第２のアミノ酸残基のみからなる残基数が９個以上１３個以下のアミノ酸配列を備えることが好ましい。
【００１２】
前記ペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列（ａ）及び（ｂ）
（ａ）配列番号１〜１７及び２９で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１〜１７及び２９で表されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列
から選択されるいずれかのアミノ酸配列を有することが好ましい。また、前記（ｂ）において、置換、挿入及び付加されるアミノ酸は、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される１種又は２種以上であることが好ましい。さらに、前記（ｂ）において配列番号１、３〜７、９、１０、１１及び１２で表されるアミノ酸配列中のセリン（Ｓ）の１個又は２個以上がリジンで置換されていることも好ましい。さらにまた、前記（ｂ）において配列番号１、３〜８、１１及び１２で表されるアミノ酸配列中のトリプトファン（Ｗ）の１個又は２個以上がチロシン（Ｙ）及びフェニルアラニン（Ｆ）で置換されていることも好ましい。
【００１３】
本明細書の開示によれば、１種又は２種以上の所望のペプチド鎖と、上記いずれかのタンパク質集積化剤と、を備える、融合タンパク質が提供される。
【００１４】
本明細書の開示によれば、タンパク質集積体であって、前記融合タンパク質を構成単位として含む、集積体が提供される。
【００１５】
本明細書の開示によれば、タンパク質の集積体の生産方法であって、前記融合タンパク質を準備する工程と、前記融合タンパク質を構成単位として含む集積体を形成する工程と、を備える、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例試料１〜７のペプチドの分配状態を示す図である。
【図２】実施例試料８〜１７のペプチドの分配状態を示す図である。
【図３】比較例試料１〜４のペプチドの分配状態を示す図である。
【図４】比較例試料５〜１１のペプチドの分配状態を示す図である。
【図５】融合タンパク質を生産するためのＤＮＡコンストラクトの構成を示す図である。
【図６】融合タンパク質の分配状態を示す図である。
【図７】融合タンパク質を大量発現させた大腸菌から取得したタンパク質の電気泳動結果を示す図である。
【図８】サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図９】ＤＬＳの結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、新規なタンパク質の集積化のためのドメイン（集積化剤）と、それを保持するタンパク質、及びこうしたタンパク質の集積体並びに集積体の用途に関する。本発明者らによれば、特定のアミノ酸残基、すなわち、セリン及びリジンから選択される第１のアミノ酸残基及びトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから選択される第２のアミノ酸残基が、これらを含むタンパク質の集積化に寄与することを見出した。すなわち、本発明は、所望の物タンパク質を自己組織化を介して集積させるのにあたっての第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基の利用に関している。
【００１８】
本発明の一つの形態は、第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基をそれぞれ備えるペプチドのタンパク質の集積化剤としての利用である。本発明によれば、こうしたアミノ酸残基を備えるペプチドを自己組織化を介して集積させることができる。
【００１９】
本明細書の開示を拘束するものではないが、本明細書に開示されるタンパク質集積化剤中の第１のアミノ酸残基は、イオン結合性相互作用又は双極子相互作用により、また、第２のアミノ酸残基は、疎水性相互作用又は環構造のスタッキング作用により、集積化剤相互が集積しうると考えられる。本明細書に開示されるタンパク質集積化剤は、イオン液体に対するタンパク質の溶解性等の付与の観点から見出されたが、特定のアミノ酸残基の組み合わせの、イオン液体、特に疎水性イオン液体に対する挙動は、水性媒体中における当該ペプチド鎖の自己組織化及び融合タンパク質の集積化の挙動と強く関連していると考えられる。すなわち、本発明者らが見出した、疎水性イオン液体に対して特定の挙動を示すペプチドは、いずれも、水性媒体中における自己組織化能及び融合タンパク質の集積化能を備えていると考えられる。
【００２０】
なお、本発明において、タンパク質の集積化剤とは、特定のアミノ酸残基の組み合わせを含むペプチドであって、前記特定のアミノ酸残基の組み合わせを有する融合タンパク質を水性媒体中で集積させることができるペプチドを意味している。
【００２１】
以下、本発明の各種実施形態について詳細に説明する。これらの各種実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
（タンパク質の集積化剤）
本発明のタンパク質集積化剤は、第１のアミノ酸残基；セリン及びリジンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基；トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから選択される１種又は２種以上のアミノ酸残基と、をそれぞれ備えているペプチドを含むことができる。
【００２３】
集積化剤であるペプチド（本ペプチドという。）は、第１のアミノ酸残基を１残基以上を備えていればよいが、第１のアミノ酸残基は２残基以上連続して備えることが好ましい。より好ましくは３残基以上を連続して備える。上限は特に限定しないが６残基以下であることが好ましい。以下、これらのアミノ酸残基が連続する部分をブロックともいう。
【００２４】
また、第２のアミノ酸残基を２残基以上連続して備えることも好ましい。より好ましくは３残基以上であり、又は４残基以上である。上限は特に限定しないが、６残基以下程度である。
【００２５】
本ペプチドは、そのアミノ酸配列において、第１のアミノ酸残基が２残基以上連続するブロック（配列部分）と第２のアミノ酸残基が２残基以上連続するブロック（配列部分）とをそれぞれ１個以上備えることが好ましい。これらのブロック間に他のアミノ酸残基が挿入されることを排除するものではないが、これらのブロックが直接的に交互に又は第１のアミノ酸残基及び／又は第２のアミノ酸残基を介して連続していることが好ましい。
【００２６】
また、１残基の第１のアミノ酸残基に対して第２のアミノ酸残基が２個以上連続するブロック（配列部分）を備えていてもよい。こうした第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の葉ブロックが直接的に交互に又は第１のアミノ酸残基及び／又は第２のアミノ酸残基を介して連続していることが好ましい。
【００２７】
特に、本ペプチドにおいては、第１のアミノ酸残基ブロック及び第１のアミノ酸残基ブロックをそれぞれ末端に備えていることが好ましい。例えば、第１のアミノ酸残基ブロックＮ末端に備え、第２のアミノ酸残基ブロックをＣ末端に備えることもできるし、第１のアミノ酸残基ブロックをＣ末端に備え、第２のアミノ酸残基ブロックをＮ末端に備えることもできる。なお、第１のアミノ酸残基ブロックからなるＮ末端及びＣ末端が本発明の集積化剤の第１の末端部分に対応し、第２のアミノ酸残基ブロックからなるＮ末端及びＣ末端が本発明の集積化剤における第２の末端部分に対応している。
【００２８】
本ペプチドは、融合タンパク質の集積化能を発揮している限り、第１のアミノ酸残基及び第２のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を備えていてもよい。例えば、第１の末端部分と第２の末端部分を備える本ペプチドにおいて、このペプチドの末端以外の部分において他のペプチド種を備えていてもよい。このようなペプチド種は、特に限定されないが、後述するスクリーニング方法やペプチドの設計プログラム等に基づいて選択することができる。
【００２９】
本ペプチドは、好ましくは、第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基とからなる。第１のアミノ酸残基と第２のアミノ酸残基の組み合わせは特に限定しないが、例えば、以下の組み合わせが好適なものとして例示される。
【００３０】
第１のアミノ酸残基                        第２のアミノ酸残基
セリン                             トリプトファン
セリン                             チロシン
セリン                             フェニルアラニン
リジン                             トリプトファン
【００３１】
なお、セリン及びリジン、特にセリンは、立体障害性の小さいアミノ酸残基であるため、比較的立体障害性の大きい第２のアミノ酸残基ブロック間に１残基単位で挿入されていることも好ましい。また、第２のアミノ酸残基ブロック間には、このほか、グリシン、アラニン及びアスパラギン酸などが１残基単位で挿入されていてもよい。
【００３２】
本ペプチドにおいて第１のアミノ酸残基は全体として３残基以上、好ましくは４残基以上含まれていることが好ましい。また、第２のアミノ酸残基は全体として４残基以上、好ましくは５残基以上含まれていることが好ましい。本ペプチドの全体のアミノ酸残基数は特に限定されないが、好ましくは、７個以上であり、より好ましくは８個以上である。７個未満であると、水との２相界面にも局在されにくくなる傾向があるからである。さらに好ましくは９個以上である。９個未満であると、疎水性イオン液体への親和性を確保しにくくなるからである。また、上限は好ましくは１３残基以下である。１３残基を超えると、疎水性イオン液体への溶解性も低下するからである。より好ましくは、９個以上１２個以下であり、さらに好ましくは、１０個以上１１個以下程度である。
【００３３】
本ペプチドは、配列番号１〜１７及び２９で表されるいずれかのアミノ酸配列からなることができる。また、本ペプチドは、配列番号１〜１７及び２９で表されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び挿入の１種又は２種以上を有するアミノ酸配列であってもよい。本ペプチドが有することができる（又はそれのみからなる）アミノ酸配列は、好ましくは配列番号１〜１５で表されるアミノ酸配列である。より好ましくは、配列番号１、２、８、１１及び１２である。一層好ましくは配列番号１、２、１１及び１２である。
【００３４】
配列番号１〜１８で表されるアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加及び挿入されるアミノ酸残基は、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）及びフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される１種又は２種以上とすることが好ましい。これらアミノ酸残基は、いずれも、ペプチドの疎水性イオン液体への親和性に関する寄与があることがわかったからである。
【００３５】
配列番号１〜１７及び２９で表されるアミノ酸配列における各種改変は、既に説明した本ペプチドとして好ましいアミノ酸残基の組成及び配列の態様の範囲内で行うことが好ましい。配列番号１〜１０で表されるアミノ酸配列についての好ましい改変例としては、例えば、配列番号１、３〜７、９及び１０のアミノ酸残基で表されるアミノ酸配列中のセリン（Ｓ）の１個又は２個以上がリジンで置換される態様が挙げられる。また、配列番号１、３〜８で表されるアミノ酸配列中のトリプトファン（Ｗ）の１個又は２個以上がチロシン（Ｙ）及びフェニルアラニン（Ｆ）で置換される態様が挙げられる。
【００３６】
本発明の各種態様のペプチドは、公知の方法で取得することができる。例えば、ペプチド固相合成法などの化学合成法により得ることができるほか、こうしたペプチドをコードする化学合成等により取得するとともに、発現ベクター等に組み込んで大腸菌等を形質転換して生産させたり、無細胞合成系を利用して合成することもできる。
【００３７】
本ペプチドが、融合タンパク質集積化能を有しているか否かは、例えば、本ペプチドをＣ末端又はＮ末端に有する融合タンパク質を作製し、当該タンパク質が水性媒体中で集積体を形成するかどうかで確認することができる。集積体の形成は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによる複数の融合タンパク質の合計に相当する分子量の検出又は動的光散乱測定（ＤＬＳ）による所定の大きさの超分子構造の検出によることができる。
【００３８】
また、本ペプチドが融合タンパク質集積化能を有しているか否かは、以下の方法でも確認することができる。すなわち、水と混和しない所定量の非水溶媒、例えば、疎水性イオン液体に対して、所定量の本ペプチドを添加して溶解又は分散させ、その後、所定量の水などの水性媒体（好ましくは水又は緩衝液）を混合して、所定条件で混合攪拌し、一定時間静置した後、混合液を観察して溶解又は分散程度又は水／非水界面への局在を目視等で確認する。
【００３９】
なお、本発明において疎水性イオン液体とは、大気条件で水と混和しにくく２相分離状態を形成するイオン液体を意味する。なお、大気条件で常時水と２相分離状態を形成している必要はなく、一定温度条件下等で水と２相分離状態を形成するイオン液体であってもよい。
【００４０】
疎水性イオン液体としては、特に限定されないが、例えば、カチオン種として、例えばアルキル置換イミダゾリウム塩、アルキル置換ピリジニウム塩、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第三級スルホニウム塩等が挙げられ、本発明の疎水性イオン液体としては、アルキル置換イミダゾリウム塩、アルキル置換ピリジニウム塩、第四級アンモニウム塩及び第四級ホスホニウム塩が好ましく、なかでもアルキル置換イミダゾリウム塩及び第四級ホスホニウム塩が好ましい。
【００４１】
疎水性イオン液体のカチオン種としては、イミダゾール環の２つの窒素原子が同一又は相異なるアルキル基と結合したイミダゾリウムカチオン、ピリジン環上の窒素原子がアルキル基と結合したピリジニウムカチオン、同一または相異なる４つのアルキル基が窒素原子に結合したアンモニウムカチオン、同一または相異なる４つのアルキル基がリン原子に結合したホスホニウムカチオン、同一または相異なる３つのアルキル基がイオウ原子に結合したスルホニウムカチオンなどが挙げられる。本発明のイオン液体として好ましいカチオン種としては、イミダゾール環の２つの窒素原子が、同一又は相異なるアルキル基と結合したイミダゾリウムカチオン、ピリジン環上の窒素原子がアルキル基と結合したピリジニウムカチオン、同一または相異なる４つのアルキル基が窒素原子に結合したアンモニウムカチオンなどが挙げられ、より好ましいカチオン種としては、イミダゾール環の２つの窒素原子が、同一又は相異なるアルキル基と結合したイミダゾリウムカチオンが挙げられる。なお、これらのカチオン種におけるアルキル基としては、炭素数１〜１２の直鎖状又は分岐状のアルキル基、好ましくは１〜１０の直鎖状のアルキル基が挙げられる。具体的には、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基などが挙げられる。
【００４２】
疎水性イオン液体のアニオン種としては、例えば、ビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドアニオンなどのビス（パーフルオロアルカン）スルホンイミドアニオン、ヘキサフルオロアンチモネートアニオン、ヘキサフルオロホスフェートアニオン、テトラフルオロボレートアニオン、塩素アニオン、臭素アニオン、ヨウ素アニオン、アルカンスルホネートアニオン、パーフルオロアルカンスルホネートアニオンなどが挙げられる。
【００４３】
疎水性イオン液体は、これらのアニオン種と前記したカチオン種を適宜組み合わせてなるものである。例えば、イミダゾリウムヘキサフルオロアンチモネート、イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート、イミダゾリウムテトラフルオロボレート、塩化イミダゾリウム、臭化イミダゾリウム、ヨウ化イミダゾリウム、イミダゾリウムアルカンスルホネート；ピリジニウムヘキサフルオロアンチモネート、ピリジニウムヘキサフルオロホスフェート、ピリジニウムテトラフルオロボレート、塩化ピリジニウム、臭化ピリジニウム、ヨウ化ピリジニウム、ピリジニウムアルカンスルホネート；アンモニウムヘキサフルオロアンチモネート、アンモニウムヘキサフルオロホスフェート、アンモニウムテトラフルオロボレート、塩化アンモニウム、臭化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、アンモニウムアルカンスルホネート；ホスホニウムヘキサフルオロアンチモネート、ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ホスホニウムテトラフルオロボレート、塩化ホスホニウム、臭化ホスホニウム、ヨウ化ホスホニウム、ホスホニウムアルカンスルホネートなどが挙げられる。
【００４４】
なお、本発明の前記したイオン液体は、公知の方法により製造することもできるし、商業的にも入手が可能である。
【００４５】
（融合タンパク質）
本発明の融合タンパク質は、１種又は２種以上の所望のペプチド鎖と、本ペプチドのペプチド鎖（以下、集積用ペプチド鎖という。）と、を備えることができる。本発明の融合タンパク質は、集積用ペプチド鎖をその一部に備えるため、所望のペプチドに対して自己集積能を付与することができる。なお、融合タンパク質の要素としての集積用ペプチド鎖には、上記した本ペプチドの全ての実施態様を含むものとする。
【００４６】
本融合タンパク質における所望のペプチド鎖としては特に限定されない。アミノ酸残基が１０個以下程度のペプチドであってもよいし、数十から数百のペプチドであってもよい。こうした所望のペプチド鎖としては、セルラーゼをはじめとする酵素、セルロース結合ペプチド(ドメイン)、抗体等の各種タンパク質が挙げられる。なお、セルラーゼは、セルロースをグルコースにまで加水分解するのに作用する各種の酵素の総称である。セルラーゼとしては、狭義には、β１，４エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、グルカン１，４−βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）、セルロース１，４−βセロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、βグルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）等が挙げられる。また、セルラーゼは、天然由来であっても人工的に改変されたものであってもよい。天然由来のものとしては、特に限定しないが、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）などのClostridium属、Trichoderma reesei等のTrichoderma属、Aspergillus oryzaeや、Aspergillus niger等のAspergillus属、及びPhanerocaete chrysosporiumなどの白色腐朽菌等に由来のセルラーゼなどを好ましく用いることができる。また、例えば、Pyrococcus属に代表される超好熱性古細菌由来のセルラーゼであってもよい。
【００４７】
本融合タンパク質における、所望のペプチドのペプチド鎖に対する集積用ペプチド鎖の連結形態は、所望のペプチド鎖に対する自己集積能が可能である限り、特に限定されない。連結形態としては、例えば、所望のペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付与することが挙げられる。いずれの末端に連結するかは、所望のペプチドの機能やイオン液体への親和性付与程度によって適宜決定される。所望のペプチド鎖のＮ末端及びＣ末端の双方に付与されてもよい。また、所望のペプチドのペプチド鎖に対して、本ペプチド鎖は、かならずしも直接結合されていなくてもよい。例えば、適当なリンカーを介して結合されていてもよい。このようなリンカーとしては、例えば、公知の各種ペプチド又はその誘導体を用いることができる。
【００４８】
本融合タンパク質は、従来とは異なり集積用ペプチド鎖により自己集積能が付与又は増強されているため、化学的な修飾によらず遺伝子工学的な手法により一挙に取得することができる。また、ペプチド鎖の修飾によって自己集積能を付与するため、所望のペプチドの本来の機能を損なわない。さらに、ペプチド鎖による修飾のため、所望のペプチド鎖のＮ末端及びＣ末端などの末端部分への選択的修飾が可能である点も有利である。
【００４９】
このような融合タンパク質は、ペプチド鎖の長さにもよるが、化学合成又は遺伝子工学的に合成することができる。遺伝子工学的手法については、例えば、融合タンパク質をコード化したＤＮＡを発現ベクター等を用いて大腸菌などの宿主に導入し形質転換して当該形質転換体を培養することにより製造してもよい。また、無細胞合成系等により合成する手法が挙げられる。このような人工的なタンパク質の合成手法は当業者において周知であるほか、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 3nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,2001（以下、モレキュラークローニング第３版と略す）又は、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）を適宜参照して合成することができる。
【００５０】
なお、融合タンパク質における所望のペプチド鎖及び集積用ペプチド鎖は、それぞ適宜化学修飾されていてもよい。化学修飾の形態は特に限定しないが、例えば、リン酸化、アミド化、アセチル化、スクシニル化、ビオチニル化、硫酸化、ラベル化等適宜孔公知の化学修飾態様から選択することができる。
【００５１】
（発現用コンストラクト）
本発明の発現用コンストラクトは、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むことができる。本発明の発現用コンストラクトによれば、本発明の融合タンパク質を効率的に大量生産することができる。また、発明の発現用コンストラクトは、集積化剤を生産するための発現用コンストラクトの形態とすることもできる。すなわち、本ペプチドをコードするＤＮＡを含む、ＤＮＡコンストラクトとすることができる。なお、ここで本ペプチドは、上記した各種全ての実施態様を含むものである。この形態の発現用コンストラクトによれば、本ペプチドを効率的に大量生産することができる。このため、このペプチドを他のキャリアに担持させる場合に有利である。
【００５２】
発現用コンストラクトは、通常、宿主で作動可能なプロモーターほか、ターミネーターやエンハンサー等、宿主に応じて適切な発現用のコンポーネントを含むことができる。また、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を含めることができる。さらに、宿主染色体に対する導入形態を採用する場合には、宿主染色体への相同組換えを可能とする相同領域を備えることができる。その他、発現形態に応じて適切なコンポーネントを備えることができる。発現用コンストラクトの形態は特に限定しないで、その利用形態、すなわち、遺伝子導入手法及び遺伝子に応じた形態を採ることができる。このようなコンストラクトの構築は当業者に周知であるほか、モレキュラークローニング第３版と略すカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーを適宜参照して作製することができる。
【００５３】
（タンパク質集積体）
本明細書に開示されるタンパク質集積体は、本明細書に開示される融合タンパク質を構成単位として含むことができる。本集積体は、複数の融合タンパク質が集積されている。複数の融合タンパク質における所望のペプチド鎖及び本ペプチドは、それぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよい。本集積体は、全体として２種類以上の所望のペプチド鎖が同一の本ペプチド所望のペプチド鎖によって集積されたものであってもよい。本集積体によれば、所望のペプチド鎖が集積用ペプチド鎖によって集積されているため、所望のペプチド鎖を局所的に高濃度化することができる。また、所望のペプチド鎖を複数種類組み合わせることで、複数種類のペプチド鎖による機能の相乗効果あるいは機能の増強効果を得ることができる。
【００５４】
本タンパク質集積体における、融合タンパク質の集積形態は特に限定しない。例えば、球状、層状、棒状等の各種ミセル形態をとることができる。本タンパク質集積体は、こうした集積形態を、所望のペプチド鎖が機能する媒体中で取ることができる。こうした媒体としては、典型的には、水性媒体が挙げられる。集積用ペプチド鎖は、疎水性相互作用又は環構造のスタッキング作用により相互に自己組織化するからである。水性媒体としては、水、水と水に対して相溶性のある有機溶媒との混液が挙げられる。こうした水性媒体は、本融合タンパク質が溶解できるような水性媒体であればよい。また、所望のペプチド鎖の機能等を考慮して、ｐＨや塩濃度を適宜調整することができる。また、水性媒体を構成しうる有機溶媒としては、特に限定しないが、例えば、炭素数が１〜４程度の低級アルキル基を備えるアルコール等が挙げられる。
【００５５】
なお、本タンパク質集積体は、ゲル濾過クロマトグラフィーによるサイズ分画、動的光散乱（ＤＬＳ）による分子サイズ測定などで確認することができる。ＤＬＳによる分子サイズの測定にあたっては、試料溶液は、分子サイズを測定するために適切な濃度に適宜調整すればよく、例えば、融合タンパク質濃度として１μＭ程度とすることができる。
【００５６】
（タンパク質集積体の生産方法）
本明細書に開示されるタンパク質の集積体の生産方法は、本明細書に開示される融合タンパク質を準備する工程と、前記融合タンパク質を構成単位として含む集積体を形成する工程と、を備えることができる。本明細書に開示されるタンパク質集積体の生産方法によれば、所望のペプチド鎖を集積化して、高機能化したり機能を増強したりすることができる。また、複数の所望のペプチド鎖による相乗効果も得ることができるようになる。
【００５７】
本融合タンパク質の準備工程は、既に説明した実施態様で本融合タンパク質を作製等することにより準備することができる。また、融合タンパク質の集積化は、例えば、適当な水性媒体の存在下に本融合タンパク質を配することで、集積用ペプチド鎖の自己組織化の結果、本融合タンパク質を集積させることができる。
【００５８】
（タンパク質集積体を用いた各種有用物質の生産方法）
本明細書に開示される有用物質の酵素的生産方法は、所望のペプチド鎖として酵素を含む融合タンパク質を構成単位として含む本タンパク質集積体積体を用いて、前記酵素の反応により有用物質を生産する工程を備えることができる。本生産方法によれば、局所的な酵素濃度高めることができるとともに、複数種類の酵素やペプチド鎖の相乗作用により、高効率な酵素反応による有用物質の生産が可能となる。
【００５９】
有用物質としては、特に限定しないで、公知の酵素によって生産できる各種の物質が挙げられる。例えば、本タンパク質集積体に酵素としてセルラーゼを含める場合には、セルロースを糖化して得られるグルコース等が挙げられる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６１】
以下の表に示す各種ペプチド（実施例試料１〜１７、比較例試料１〜１１）を合成し、フルオレセインでラベルした。このラベル化ペプチド約０．２ｍｇを採取し、以下のイオン液体７０μｌにそれぞれ溶解させ、その後、２１０μｌの蒸留水を加えてよく攪拌した。その後、遮光して約１６時間静置した。その後、液を目視で観察するとともに写真撮影を行った。結果を表２及び図１〜図４に示す。
【００６２】
【表１】
2011068625.tif 000002
【００６３】
【表２】
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【００６４】
表２及び図１〜図４に示すように、実施例試料１〜１７は、いずれも少なくとも１種の疎水性イオン液体につき、確実に水との２相界面に局在するかあるいはイオン液体に分配された。これに対して、比較例試料１〜１１は、水相に分配するかまたはイオン液体に沈殿した。
【００６５】
以上のことから、セリン及びリジンから選択されるアミノ酸種とトリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンから選択されるアミノ酸種が、ペプチドの疎水性イオン液体への親和性付与又は増強に有効であることがわかった。また、アラニン、グリシン、ヒスチジン及びアスパラギン酸などは有効でないことがわかった。さらに、これらの残基数や配列にも一定の規則性があることがわかった。少なくとも７残基又は８残基であり、好ましくは９残基以上であることがわかった。また、実施例試料のなかでも、実施例試料１、２、８、１１及び１２が好ましい親和性を示しており、特に、実施例試料１、２、１１及び１２が好ましいことがわかった。
【実施例２】
【００６６】
本実施例では、イオン液体に親和性のペプチド鎖（ＳＷＷＷＷＳＷＷＷＷ:配列番号２９）を末端（Ｃ末端）に備える融合タンパク質を作製し、イオン液体に対する親和性を評価した。
【００６７】
図５に示すコンストラクト(挿入配列：配列番号３０）を、pＥＴ−２０Ｂ（Merck）のNde I−Hind IIIにクローニングした。新たに構築したコンストラクトを、ＢＬ２１（ＤＥ３）(Merck)のコンピテントセルに形質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ選択培地上に生えてきたコロニーを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ液体培地に植菌し３０℃で一昼夜前培養した。なお、ＬＢ培地は、１Ｌあたりbacto-tryptone１６ｇ、yeast extract１０ｇ、NaCl５ｇを含有している。
【００６８】
次いで、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有２×ＹＴ液体培地に対して前培養液を１／８０量添加して、３０℃でＯＤ６００＝０．６となるまで培養後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加えて、さらに６時間培養した。なお、２×ＹＴ培地は、１Ｌあたりbacto-tryptone１６ｇ、yeast extract１０ｇ、NaCl５ｇを含有している。
【００６９】
培養後、菌体を遠心分離にて集菌した後、５０ｍＭ酢酸緩衝液(pH5.0)/500mM NaClに溶解し、超音波にて菌体を破砕した。その後、遠心分離を行い、上清と沈殿とをそれぞれ回収して、SDS-PAGEを行い、不溶画分に意図した融合タンパク質が存在することを確認した。
【００７０】
不溶画分から融合タンパク質を回収するために、以下の手順でタンパク質の可溶化を行った。すなわち、不溶画分の沈殿にタンパク質の可溶化溶液（２ＭＧｄ−ＨＣｌ、１Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌ）を加えてよく攪拌した。３７℃で１２時間放置後、透析バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭＮａＣｌ）を用い、４℃、６時間で、合計三回透析を行い、融合タンパク質を回収した。
【００７１】
透析後のタンパク質溶液１００μｌと、疎水性イオン液体（1-Ethyl-3-methylimidazolium Bis(trifluoromethanesulfonyl)imide）１００μｌを、１．５ｍｌチューブに入れてよく混合した後、軽く遠心分離した。遠心後、タンパク質溶液と疎水性イオン液体との混合液は、上相が水相であり、下相がイオン液体となった。遠心後の液体にチューブの下方からＵＶ光を照射してＧＦＰの緑色蛍光を発光させて蛍光の分布を確認した。なお、コントロールとして通常のＧＦＰタンパク質についても同様に操作した。結果を図６に示す。
【００７２】
図６に示すように、融合タンパク質に由来する蛍光は、水と疎水性イオン液体との界面に局在していた。これに対し、通常のＧＦＰタンパク質に由来する蛍光は、水相（上相）に分布していた。以上のことから、本発明のイオン液体親和性ペプチド鎖は、それを一部に備えるタンパク質にイオン液体親和性を付与できることがわかった。
【実施例３】
【００７３】
（コンストラクトの構成）
実施例２と同様に、図５に示すコンストラクトをpET-20b(Merck)のNdeI-HindIII部位にクローニングした。
【００７４】
（タンパク質の大量発現）
ついで、コンストラクトを大腸菌BL21(DE3)（Merck）のコンピテントセルに形質転換した。LB/Amp(50mg/ml)選択培地上に生えてきたコロニーを、LB/Amp(100mg/ml)液体培地に植菌し30℃で一昼夜前培養した。LB培地組成は、1lあたり bacto-tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10gとした。ついで、2×YT/Amp(100mg/ml)液体培地に対して前培養液を１/80量加えて、30℃でOD600=0.6まで培養後、IPTGを終濃度１mMになるように加え、さらに6時間培養した。なお、2×YT 培地組成は、1lあたりbacto-tryptone 16g, yeast extract 10g, NaCl 5gとした。その後、菌体を遠心で集菌した後、50mM酢酸緩衝液(pH5.0)/500mM NaClに溶解し、菌体の超音波破砕を行い、遠心分離し、上清と沈殿（不溶画分）に分離し、SDS-PAGEを行った。結果を図７に示す。
【００７５】
（タンパク質の可溶化）
不溶画分からタンパク質を回収するために、以下の手順でタンパク質の可溶化を行った。すなわち、上記の不溶画分の沈殿に可溶化溶液（2M Gd-HCl, 1M L-Arg, 50mM Tris-HCl (pH8.0), 200mM NaCl）を加えてよく攪拌し、37℃で12時間静置後、透析バッファー（50mM Tris-HCl (pH8.0), 200mM NaCl）を用い、4℃・6時間で、三回透析を行った。
【００７６】
（ゲル濾過クロマトグラフィーによるサイズ分画）
その後、Sterivex（MILLIPORE）を使用して、透析液をろ過し、HiTrap Sephacryl-400HR（GEヘルスケア）を用い、バッファー（50mM Tris-HCl, 200mM NaCl(pH8.0)）、流速0.8mL/min、4℃で、ゲル濾過を行った。各フラクションに対し、UV照射を行い、GFP蛍光の確認を行い、蛍光を確認した結果を図８に示す。
【００７７】
図８に示すように、タグ（集積用ペプチド鎖）を付与した融合GFPは、12〜24量体を形成していることが強く、示唆された。
【００７８】
（動的光散乱測定[DLS; Dynamic light Scattering]による超分子サイズの測定）
動的光散乱（ＤＬＳ）によって、タグを付与した融合ＧＦＰのサイズを評価した。ＤＬＳ測定装置として、Zetasizer Nano ZS dynamic light scattering spectrophotometer（Malvern社製）を用いた。なお、タンパク質の屈折率を１．４５０、溶液の粘度及び屈折率を、それぞれ０．８８８１ｍＰａ・ｓ及び１．３３０として行った。試料は、図８のゲルろ過クロマトグラフィーにおける１８０ｍｌ〜１８１ｍｌの画分の水溶液を用いて、その水溶液を１２ｍｍ角ポリスチレンセルに入れて測定を行った。結果を図９に示す。
【００７９】
図９に示すように、得られたタンパク質は、平均直径21nmの超分子を形成していることが示された。
【００８０】
以上のゲル濾過とDLSの結果より、ペプチド「SWWWWSWWWW」を融合したタンパク質（GFP）は、自己組織的に比較的大きな多量体（12〜24量体）を形成することがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１〜２９：合成ペプチド
配列番号３０：融合タンパク質
【図１】
2011068625.tif 000004
【図２】
2011068625.tif 000005
【図３】
2011068625.tif 000006
【図４】
2011068625.tif 000007
【図５】
2011068625.tif 000008
【図６】
2011068625.tif 000009
【図７】
2011068625.tif 000010
【図８】
2011068625.tif 000011
【図９】
2011068625.tif 000012
【配列表】
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