(57)【要約】【課題】観察対象を確実に検出する。【解決手段】観察ユニット３２は、インキュベータ部１２内の培養容器１４を、２倍の倍率の対物レンズ６１lowを介して撮像する顕微観察部４４と、顕微観察部４４に対向する位置に配置され、培養容器１４内の観察対象に照明光を照射する高ＮＡ照明ユニット４９とを備える。そして、高ＮＡ照明ユニット４９からの照明光の開口数が、顕微観察部４４の対物レンズ６１lowの開口数よりも大きい。本発明は、例えば、細胞を培養するのに適した環境で細胞を観察する培養観察装置に適用できる。【選択図】図２
2011017964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の観察対象を観察する培養観察装置において、
前記培養容器を、所定の拡大倍率の対物レンズを介して撮像する観察手段と、
前記観察手段に対向する位置に配置され、前記培養容器内の観察対象に照明光を照射する照明手段と
を備え、
前記照明手段からの照明光の開口数が、前記観察手段の対物レンズの開口数よりも大きい
ことを特徴とする培養観察装置。
【請求項２】
前記照明手段は、前記観察手段を含んで構成される微視的観察用の光路に挿抜可能である
ことを特徴とする請求項１に記載の培養観察装置。
【請求項３】
前記観察手段は、第１の拡大倍率で撮像する際に使用する第１の対物レンズと、前記第１の拡大倍率より高い第２の拡大倍率で撮像する際に使用する第２の対物レンズとを切り替えることで、異なる倍率の画像を取得することができ、
前記照明手段は、前記第１の対物レンズを使用した撮像時に前記光路に挿入される
ことを特徴とする請求項２に記載の培養観察装置。
【請求項４】
前記照明手段は、前記培養容器内の観察対象に照明光を集光するための、平面的な形状で面積の広い光学素子を有する
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の培養観察装置。
【請求項５】
前記第１の対物レンズを使用して撮像した画像に基づいて、前記観察対象中の所定の特徴を有した対象物体を探索する探索手段を有する
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の培養観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養観察装置に関し、特に、観察対象を確実に検出することができるようにした培養観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生殖補助医療技術（ＡＲＴ：Assisted Reproductive Technology）、例えば体外受精（ＩＶＦ：In-vitro Fertilization）や顕微授精（ＩＣＳＩ：Intracytoplasmic Sperm Injection）では、一人の母体から一度に採取された５〜２０個の卵子を体外受精させ、それらの受精卵を培養容器上に作られた２０μｌ程度の培地ドロップに１個ずつ入れる。培地ドロップの表面はミネラルオイルでコートされ、その状態で培養容器ごと培養装置へ収容される。この環境下で、受精卵は分裂を開始する。
【０００３】
培養担当者は、受精卵の生育状態を一定期間毎に観察し、必要に応じて培地の交換や受精卵のスコア付けを行う。そして数日後に胚盤胞と呼ばれる状態にまで成長した良好な胚盤胞は、母体へ戻される。それ以外の胚盤胞は冷凍保存される。
【０００４】
以上の手順を踏むＩＶＦ又はＩＣＳＩに、例えば、特許文献１に記載の培養装置を適用することにより、環境暴露による受精卵のダメージを抑えながら、受精卵の観察・記録・管理を自動で行うことができる。また、特許文献２には、観察視野内を浮遊する細胞を追跡する技術が開示されている。
【０００５】
ところで、培養容器の培養ドロップ内に存在する受精卵を観察しようとする際に、培地ドロップの縁に受精卵が移動していたとき、培地ドロップの縁に現れる影に隠れてしまって、その受精卵を検出することができないことがある。
【０００６】
図１０を参照して、培地ドロップの縁に現れる影について説明する。図１０には、培養容器内の平面図と断面図が示されている。
【０００７】
培養容器１は、いわゆるディッシュからなり、その内径は約３５ｍｍである。培養容器１の底面には、２０μｌ程度の培地ドロップＤが複数個（図１０の例では８個）、培養容器１の円周に沿って均等に並べられて形成されている。
【０００８】
個々の培地ドロップＤの表面および間隔は、乾燥を防ぐために無色透明のミネラルオイルＯで満たされており、個々の培地ドロップＤの中には、共通の母体から共通の時期に採取された受精卵ａが１個ずつ入っている。個々の培地ドロップＤの直径は、約７ｍｍであり、個々の受精卵ａの直径は、約１００μｍである。また、培地ドロップＤは、培養容器１の底面に付着しているが、受精卵ａは、培地ドロップＤの内部を浮遊する可能性がある。
【０００９】
このように培地ドロップＤ内にある受精卵ａを観察する際、上側から照明光が照射され、下側に配置されている対物レンズを介して画像が撮像される。
【００１０】
このとき、培地ドロップＤとミネラルオイルＯとの屈折率の違いにより、メニスカス効果が発生する。例えば、培地ドロップＤの屈折率が１．３程度であり、ミネラルオイルＯの屈折率が1.4〜1.6程度であるとき、培地ドロップＤが光学的に強い凹レンズ（ｆ＝−１４前後）としての機能を有し、培地ドロップＤの縁近辺に入射した照明光が培地ドロップＤの外側に屈折される。これにより、培地ドロップＤの縁近辺に入射した照明光が対物レンズに入射し難くなるため、培地ドロップＤの縁の全周に影が現れる。
【００１１】
さらに、培養容器１の内壁面におけるミネラルオイルＯの表面張力により、培養容器１の縁においてもメニスカス効果が発生する。これにより、培養容器１の縁近辺に入射した照明光が対物レンズに入射し難くなるため、培地ドロップＤの培養容器１内壁面側に三日月のような形状の影（培養容器１に対する培地ドロップＤの内側と外側とで非対称な影）が現れる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００７−６８４１号公報
【特許文献２】特開２００１−２６４３１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上述したように、従来の観察装置では、培養容器内の培地ドロップの縁に影が現れ、観察対象である受精卵が培地ドロップの縁に移動すると、受精卵を検出することができないことがあった。
【００１４】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、観察対象を確実に検出することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の培養観察装置は、培養容器内の観察対象を観察する培養観察装置であって、前記培養容器を、所定の拡大倍率の対物レンズを介して撮像する観察手段と、前記観察手段に対向する位置に配置され、前記培養容器内の観察対象に照明光を照射する照明手段とを備え、前記照明手段からの照明光の開口数が、前記観察手段の対物レンズの開口数よりも大きいことを特徴とする。
【００１６】
本発明の培養観察装置においては、観察手段の対物レンズの開口数よりも大きな開口数の照明光が、照明手段により培養容器内の観察対象に照射される。これにより、影が現れるのを抑制され、観察対象を確実に検出することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の培養観察装置によれば、観察対象を確実に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明を適用した本発明を適用した培養観察装置の一実施の形態の構成例を示す図である。
【図２】観察ユニットの構成例を示す図である。
【図３】培養観察装置がＩＶＦモードで受精卵を観察する観察処理を説明するフローチャートである。
【図４】全体画像Ｉwholeを説明する図である。
【図５】ステップＳ１０３の処理を説明する図である。
【図６】部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidを説明する図である。
【図７】ステップＳ１０７の処理を説明する図である。
【図８】受精卵ａiと気泡ｂiとの関係を説明する図である。
【図９】卵画像Ｉ1’〜Ｉ7’を説明する図である。
【図１０】培養容器内の培地ドロップの縁に現れる影について説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２０】
図１は、本発明を適用した培養観察装置の一実施の形態の構成例を示す図である。図１Ａには、培養観察装置の斜視図が示されており、図１Ｂには、扉を取り外した状態の培養観察装置の正面図が示されている。
【００２１】
図１に示すように、培養観察装置１１は、細胞を培養する環境に保持されるインキュベータ部１２と、各種の装置が収納される架台部１３とを備え、架台部１３の上部にインキュベータ部１２が配置されて構成されている。そして、培養観察装置１１では、インキュベータ部１２に収納されている培養容器１４内で細胞が培養および観察される。
【００２２】
インキュベータ部１２は、インキュベータ筐体２１およびインキュベータ扉２２から構成され、インキュベータ筐体２１とインキュベータ扉２２とにより密閉された内部空間（恒温室）が、細胞を培養するのに適した環境を維持するように制御される。
【００２３】
例えば、インキュベータ筐体２１には、ペルチェ素子が用いられる温度調整装置、霧を噴出する噴霧装置、外部の二酸化炭素ボンベに接続されるガス導入部、内部空間の環境を検出する環境センサ（いずれも図示せず）などが設けられている。また、インキュベータ筐体２１およびインキュベータ扉２２は、内部に断熱材をそれぞれ有している。そして、インキュベータ筐体２１の内部空間は、例えば、温度３７℃、湿度９０％、二酸化炭素濃度５％などの、細胞を培養するのに適した環境（以下、適宜、細胞培養環境と称する）に維持される。
【００２４】
インキュベータ扉２２は、インキュベータ筐体２１に対して開閉自在に取り付けられており、その表面には、培養観察装置１１の操作に用いられる操作パネル２３が設けられている。
【００２５】
操作パネル２３は、例えば、画像を表示し、ユーザにより操作されるタッチパネルであり、その表示部に、観察の対象となっている培養容器１４内の画像や、所定の間隔で細胞を撮像するスケジュールを設定するスケジュール設定画面などを表示する。また、操作パネル２３は、ユーザの操作に応じた操作信号を、架台部１３に収納されている制御ユニット３１に供給する。
【００２６】
架台部１３は、筐体２４と扉２５Ａおよび２５Ｂとから構成されており、扉２５Ａおよび２５Ｂは、筐体２４に対して開閉自在に取り付けられている。また、架台部１３の内部には、培養観察装置１１の各部を制御する制御ユニット３１、および、細胞培養環境内の細胞を観察するための観察ユニット３２（図２参照）の下部が収納される。また、制御ユニット３１は、ハードディスクや不揮発性メモリなどで構成された記憶部３１ａを有しており、後述する各種のデータを記憶する。
【００２７】
また、インキュベータ部１２の内部には、観察ユニット３２の上部、複数の培養容器１４を収容するストッカ部３３、および、観察ユニット３２とストッカ部３３との間で培養容器１４を搬送する搬送部３４が収納される。ストッカ部３３は、複数段の棚を備えており、その最下段には、インキュベータ部１２に搬入出される培養容器１４が載置される搬入出台３３Ａが設けられ、搬入出台３３Ａの位置に対応するインキュベータ扉２２には、図示しない搬入出口が設けられている。搬送部３４は、培養容器１４搬送する際に、培養容器１４を支持する支持部３４Ａを有している。
【００２８】
このように構成されている培養観察装置１１では、制御ユニット３１が、記憶部３１ａに記憶されている観察スケジュールに従って各部を制御し、観察の対象となる培養容器１４が、搬送部３４によりストッカ部３３から観察ユニット３２のステージに搬送されて、その培養容器１４の観察が行われる。
【００２９】
次に、図２は、観察ユニット３２の構成例を示す図である。図２Ａには、観察ユニット３２全体の構成が示されており、図２Ｂには、観察ユニット３２の一部分が拡大して示されている。
【００３０】
図２に示すように、観察ユニット３２は、ユニット本体４１の上側にアーム部４２およびステージ４３が配設されて構成されており、ユニット本体４１が、図１の架台部１３の内部に配置され、アーム部４２およびステージ４３が、インキュベータ部１２の内部に配置される。
【００３１】
ユニット本体４１には、培養容器１４を下側から拡大して観察する顕微観察部４４、培養容器１４の全体を上側から観察する際の照明光を照射する照明部４５、および、観察ユニット３２において取得された画像に対して画像処理を施す画像処理部４６が収納されている。
【００３２】
アーム部４２は、ステージ４３の側方から上方に延びてステージ４３の上側に張り出した形状をしており、その張り出している部分に、培養容器１４の全体を上側から観察するための容器観察部４７、および、培養容器１４を下側から拡大して観察する際の照明光を照射する照明部４８が収納されている。また、アーム部４２の張り出している部分の下面には、高ＮＡ照明ユニット４９が装着されている。
【００３３】
そして、アーム部４２の容器観察部４７とユニット本体４１の照明部４５とは、互いに対向する位置に配置されており、全体観察用（広視野観察用）の観察系を構成する。
【００３４】
また、ユニット本体４１の顕微観察部４４と、アーム部４２の照明部４８および高ＮＡ照明ユニット４９とは、互いに対向する位置に配置されており、位相差観察用又は高ＮＡ照明観察用（微視的観察用）の顕微鏡を構成する。ここで、高ＮＡ照明ユニット４９は、顕微観察部４４を含んで構成される微視的観察用の光路に挿抜可能となるように構成されており、高ＮＡ照明ユニット４９が光路に挿入されたときには、顕微観察部４４および高ＮＡ照明ユニット４９により高ＮＡ照明観察用の顕微鏡が構成され、高ＮＡ照明ユニット４９が光路から抜き出されたときには、顕微観察部４４および照明部４８により位相差観察用の顕微鏡が構成される。
【００３５】
ステージ４３は、透光性の材質で構成されており、その上に載置される培養容器１４を水平方向（ＸＹ方向）および垂直方向（Ｚ方向）に高精度に移動させる。例えば、ステージ４３は、培養容器１４が位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部４４、照明部４８）の光路、高ＮＡ照明観察用の顕微鏡（顕微観察部４４、高ＮＡ照明ユニット４９）の光路に挿入されるように、または、全体観察用の観察系（容器観察部４７および照明部４５）の光路に挿入されるように、培養容器１４を水平方向に移動させる。
【００３６】
ここで、観察ユニット３２では、培養容器１４を全体観察用の観察系の光路へ挿入した状態で、培養容器１４の全体像をカラーで撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「全体画像」という。また、観察ユニット３２では、培養容器１４を位相差観察用の顕微鏡の光路へ挿入した状態で、培養容器１４の一部の拡大位相差像を撮像することができる。以下、この撮像によって取得される画像を「位相差画像」という。また、観察ユニット３２では、高ＮＡ照明ユニット４９を光路に挿入した状態で、位相フィルタ６２を光路外に出す事で、照明ＮＡの大きな光で照明した、明視野画像を撮像することが出来る。以下、この撮像によって取得される画像を「高ＮＡ照明画像」という。
【００３７】
また、ステージ４３は、培養容器１４と位相差観察用の顕微鏡、高ＮＡ照明観察用の顕微鏡とのＺ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡、高ＮＡ照明観察用の顕微鏡の焦点調節を行うことができる。また、ステージ４３は、培養容器１４と位相差観察用の顕微鏡、高ＮＡ照明観察用の顕微鏡とのＸＹ方向の位置関係を変化させることにより、位相差観察用の顕微鏡、高ＮＡ照明観察用の顕微鏡の観察ポイントを変更することができる。
【００３８】
画像処理部４６は、観察ユニット３２が取得した画像（全体画像、低倍位相差画像、高ＮＡ照明観察、高倍位相差画像の何れか）に対して各種の画像処理を施す。画像処理部４６が実行可能な画像処理には、入力された画像の中から色付いた領域を検出する色検出処理（後述）と、入力された画像から環状パターンを探索する環体探索処理（後述）と、入力された画像が胚盤胞の画像であるか否かを判別する胚盤胞判別処理（後述）とがある。
【００３９】
なお、顕微観察部４４の対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせは、観察倍率の異なる少なくとも２種類の組み合わせの間で切り替えることが可能である。ここでは、２倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１lowおよび位相フィルタ６２low）と、１０倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１highおよび位相フィルタ６２high）との間で切り替わるものとする。
【００４０】
よって、観察ユニット３２は、対物レンズ６１lowおよび位相フィルタ６２lowを光路に設定した状態で倍率２倍の位相差画像（低倍位相差画像）を取得することができ、対物レンズ６１highおよび位相フィルタ６２highを光路に設定した状態で倍率１０倍の位相差画像（高倍位相差画像）を取得することができる。なお、観察ユニット３２による低倍位相差画像の拡大倍率は、前述した全体画像の拡大倍率よりも高い。
【００４１】
また、観察ユニット３２では、２倍の高ＮＡ照明観察用の組み合わせ（対物レンズ６１low、位相フィルタなし）により高ＮＡ照明画像を取得する際に、高ＮＡ照明ユニット４９が使用される。即ち、前述の図１０を参照して説明したように、培地ドロップＤの縁近辺に影（縁の全周に亘る影、および三日月形状の影）が現れる場合、その影に受精卵ａが隠れて、受精卵ａを検出することができないことがある。
【００４２】
そこで、観察ユニット３２では、そのような影が生じないように、画像を取得する際に、照明部４８からの照明光の光路の途中に高ＮＡ照明ユニット４９を挿入し、顕微観察部４４および高ＮＡ照明ユニット４９からなる高ＮＡ照明観察用の顕微鏡により観察が行われる。
【００４３】
図２Ｂに示すように、高ＮＡ照明ユニット４９は、光源７１、ミラー７２、およびフレネルレンズ７３を備えて構成されている。光源７１から発せられる照明光は、ミラー７２により反射された後、フレネルレンズ７３により集光され、対物レンズ６１lowのＮＡ（Numerical Aperture：開口数）よりも大きなＮＡの照明光が、培養容器１４内の培地ドロップＤに照射される。
【００４４】
このように、高ＮＡ照明ユニット４９により照射される照明光のＮＡが大きいので、培地ドロップＤの縁近辺でのメニスカス効果により照明光が屈折したとしても、培地ドロップＤの縁近辺に照射された照明光は、対物レンズ６１lowに入射する。また、同様に、培養容器１４の内壁面近辺でのメニスカス効果により照明光が屈折したとしても、培地ドロップＤの培養容器１４の内壁面側に照射された照明光は、対物レンズ６１lowに入射する。
【００４５】
従って、高ＮＡ照明ユニット４９を使用することで、培地ドロップＤの全周に亘る影、および、培地ドロップＤの培養容器１４内壁面側における三日月形状の影の発生を抑制することができる。これにより、受精卵ａが培地ドロップＤの縁に移動しても、影に隠れることはないので、受精卵ａを確実に検出することができる。
【００４６】
また、高ＮＡ照明ユニット４９からの照明光のＮＡについて、培地ドロップＤによる照明光束の変化をシミュレーションにより算出した結果、対物レンズ６１lowのＮＡが0.2であるとき、0.3以上、より好ましくは0.35以上であることが必要になることが判明した。つまり、照明光のＮＡが0.3以上であれば、培地ドロップＤのどの部位においても、対物レンズ６１lowとの組み合わせで良好な観察を行うことができる。従って、高ＮＡ照明ユニット４９は、照明光のＮＡが0.3以上、より好ましくは0.35以上となるように設計される。なお、具体的には、照明光のＮＡの上限は0.5程度もあれば十分である。
【００４７】
ここで、高ＮＡ照明ユニット４９は、例えば、他の一般的な位相差観察との両立を図るために、従来から使用されている培養観察装置１１に対して追加的に装着することができるように設計されることが好ましい。即ち、培養観察装置１１では、アーム部４２とステージ４３との間隔は、例えば、100mm程度で既に決定されている。このため、高ＮＡ照明ユニット４９は、その限られた空間に装着することができるようにするとともに、搬送部３４の支持部３４Ａによる培養容器１４の搬送のための空間を確保することを考慮して、その高さが、例えば、50mm以内となるように設計される。
【００４８】
従って、高ＮＡ照明ユニット４９は、その高さに収まり、かつ、高いＮＡおよび広い照野を実現するために必要な作動距離を確保するために、光源７１として発光面積の広いLEDを採用し、ミラー７２を利用して光路長を長くするとともに、平面的な形状で面積の広いフレネルレンズ７３が採用される。
【００４９】
次に、図３のフローチャートを参照して、培養観察装置１１がＩＶＦモードで受精卵を観察する観察処理を説明する。
【００５０】
ステップＳ１０１において、制御ユニット３１は、ユーザの操作に応じて培養容器１４をインキュベータ部１２へ搬入すると共に、培養容器１４の搬送を搬送部３４へ指示する。搬送部３４は、その培養容器１４を搬送し、ステージ４３の所定位置へ載置する。
【００５１】
ステップＳ１０２において、制御ユニット３１は、培養容器１４の全体画像を取得するよう観察ユニット３２へ指示する。観察ユニット３２は、培養容器１４を全体観察用の観察系（容器観察部４７及び照明部４５）の光路へ配置し、その状態で例えば図４に示すような全体画像Ｉwholeを取得し、その全体画像Ｉwholeを操作パネル２３へ表示する。なお、全体画像Ｉwholeには、７個の培地ドロップＤの像（ドロップ像）ＩDが写っている。
【００５２】
ステップＳ１０３において、制御ユニット３１は、ステップＳ１０２で取得された全体画像Ｉwholeへ色検出処理を施すよう画像処理部４６へ指示する。画像処理部４６は、全体画像Ｉwholeの中で赤色付いた複数の領域（フェノールレッドにより色付けされた領域）を検出する。制御ユニット３１は、画像処理部４６が検出した複数の領域に対し、配置順にドロップ番号１〜７を付与する。これによって、７個のドロップ像ＩDにラベリングが施される。以下、ドロップ番号ｉが付与されたドロップ像ＩDを「ＩDi」と表記する（図５参照）。
【００５３】
そして、制御ユニット３１は、ステージ４３のＸＹ方向の位置座標と、全体画像Ｉwhole
における個々のドロップ像ＩD1〜ＩD7の中心座標とに基づき、図５に示すとおり、培養容器１４における個々の培地ドロップの中心の座標（ｘ1，ｙ1）〜（ｘ7，ｙ7）を算出し、それらの座標（ｘ1，ｙ1）〜（ｘ7，ｙ7）をドロップ番号１〜７にそれぞれ対応付けてから培養容器１４の管理データとして記憶部３１ａに記憶する。
【００５４】
その一方で、制御ユニット３１は、培養容器１４の観察スケジュール（タイムラプス観察の時間間隔など）をユーザに入力させ、その観察スケジュールを培養容器１４の管理データへ書き込む。
【００５５】
その後、制御ユニット３１は、培養容器１４をストッカ部３３へ収納するよう搬送部３４へ指示する。搬送部３４は、培養容器１４をストッカ部３３へ収納する。これによって、培養容器１４の登録が終了する。
【００５６】
ステップＳ１０４において、制御ユニット３１は、培養容器１４の管理データに書き込まれた観察スケジュールと現在日時とを比較して、培養容器１４の観察開始時期が到来したか否かを判別する。観察開始時期が到来した場合にはステップＳ１０５に移行し、観察開始時期が到来していない場合には待機する。
【００５７】
ステップＳ１０５において、制御ユニット３１は、培養容器１４の搬送を搬送部３４に指示する。搬送部３４は、培養容器１４をストッカ部３３から搬出してステージ４３の所定位置に載置する。この時点で、ドロップ番号ｉは初期値「１」に設定される。
【００５８】
ステップＳ１０６において、制御ユニット３１は、現在のドロップ番号ｉに対応する培地ドロップの画像（ドロップ画像Ｉi）を取得するために、現在のドロップ番号ｉに対応する座標（ｘi，ｙi）を培養容器１４の管理データから読み出して観察ユニット３２へ指定すると共に、座標（ｘi，ｙi）に位置する物体の高ＮＡ照明画像を取得するよう観察ユニット３２へ指示する。
【００５９】
ここで、制御ユニット３１は、高ＮＡ照明ユニット４９を挿入しつつ位相フィルタ６２を光路外に排出する。即ち、低倍の明視野画像を取得する高ＮＡ照明観察用の顕微鏡として、顕微観察部４４及び高ＮＡ照明ユニット４９の組み合わせを使用する。
【００６０】
そして、観察ユニット３２は、培養容器１４を高ＮＡ照明観察用の顕微鏡（顕微観察部４４及び高ＮＡ照明ユニット４９）の光路へ配置すると共に、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせを、２倍の高ＮＡ照明観察用の組み合わせ（対物レンズ６１low、位相フィルタなし）に設定する。
【００６１】
ここで、対物レンズ６１lowの視野サイズ（４ｍｍ×４ｍｍ）は、培地ドロップ１個分のサイズ（直径７ｍｍ）よりも小さい。そこで、観察ユニット３２は、培養容器１４に対する対物レンズ６１lowの光軸位置を座標（ｘi，ｙi）の周りでステップ状に移動させながら、図６に示すような低倍の高ＮＡ照明画像Ｉia〜Ｉidを順に取得する。それら低倍の高ＮＡ照明画像Ｉia〜Ｉidの全体がドロップ画像Ｉiである。よって以下では、低倍の高ＮＡ照明画像Ｉia〜Ｉidを「部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉid」と称す。なお、対物レンズ６１lowの視野サイズを培地ドロップ１個分の視野サイズにして、画像取得を一括で行ってもよい。
【００６２】
なお、観察ユニット３２は、個々の画像を取得する際に、コントラスト方式によるオートフォーカス制御を行う。このオートフォーカス制御は、画像のコントラストを監視しながらステージ４３の高さ（Ｚ方向の位置）を調節し、そのコントラストがピークとなるような高さでステージ４３を停止させるものである。部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidの各々の取得時におけるピント位置（フォーカス面の高さ）の情報は、制御ユニット３１によって記憶される。
【００６３】
因みに、観察ユニット３２は、オートフォーカス制御の焦点調節範囲を、制御ユニット３１からの指示に応じて制限することができる。但し、或るドロップ番号ｉの部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidを最初に取得するときのオートフォーカス制御では、焦点調節範囲は十分に広く設定される。
【００６４】
ステップＳ１０７において、制御ユニット３１は、ステップＳ１０６で取得された部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidの各々へ環状パターンの探索処理を施すよう画像処理部４６へ指示する。画像処理部４６は、環状パターンの探索処理により、部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidの各々から、例えば図７に示すように環状パターンＩｃを検出する。
【００６５】
そして、制御ユニット３１は、ステージ４３のＸＹ方向の位置座標と、ドロップ画像Ｉiにおける環状パターンＩｃの中心座標とに基づき、ドロップ画像Ｉiに写っている全ての環状パターン（受精卵と気泡との双方を含む）の中心の座標（ｘi1’，ｙi1’）〜（ｘim’，ｙim’）を算出する。なお、ここでは説明上、ドロップ画像Ｉiから検出された環状パターンＩｃの個数を「ｍ」とおく。
【００６６】
通常、受精卵の像の輪郭部は画像上に明環となって現れるので、検出された環状パターンＩｃは、受精卵の像である可能性が高い。但し、図８に示すとおり、培養容器１４の表面や培地ドロップＤとミネラルオイルＯとの界面などには気泡ｂiが付着している可能性があり、気泡ｂiの像の輪郭部も画像上に明環となって現れる。よって、本ステップで検出される環状パターンＩｃは、受精卵ａiの像又は気泡ｂiの像である。
【００６７】
ステップＳ１０８において、制御ユニット３１は、受精卵ａiの像と気泡ｂiの像とを区別するために、ステップＳ１０７で検出された個々の環状パターンＩｃの内部の輝度分散値（又は輝度微分値の総和）を算出し、それぞれ閾値と比較する。そして、制御ユニット３１は、閾値以上となった環状パターンＩｃのみを受精卵ａiの像とみなす。以下、培養容器１４における受精卵ａiの中心の座標を（ｘi’，ｙi’）とおく。
【００６８】
なお、１個の培地ドロップに入れられる受精卵の個数は１であるので、本ステップにおいて検出される受精卵ａiの像の個数は１以下であるが、部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidの何れかの取得時に、図８に示すとおり、対物レンズ６１lowの視野内に気泡ｂiと受精卵ａiとの双方が存在し、その気泡ｂiの光軸方向（Ｚ方向）の位置が受精卵ａiの光軸方向の位置と離れており、しかも、気泡ｂiの方にピントが合っていた場合には、受精卵ａiの個数がゼロとなる。
【００６９】
ステップＳ１０９において、制御ユニット３１は、ステップＳ１０８で受精卵ａiの像が検出されたか否かを判別し、受精卵ａiの像が検出された場合はステップＳ１１１へ移行し、受精卵ａiの像が検出されなかった場合は、ドロップ番号ｉのドロップ画像Ｉi（部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉid）を再取得するべくステップＳ１１０へ移行する。
【００７０】
ステップＳ１１０において、制御ユニット３１は、部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidの各々を取得するときの焦点調節範囲から、前回のフォーカス面の近傍の範囲を除外するよう観察ユニット３２へ指示すると共に、ドロップ画像Ｉiの撮像中心（部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉidの中心）を現在の座標（ｘi，ｙi）から所定距離（Δｘ，Δｙ）だけずらすよう観察ユニット３２へ指示してから、ステップＳ１０６へ戻る。なお、Δｘ，Δｙの各々は、受精卵１個分に相当する距離である。このようにしてドロップ画像Ｉi（部分ドロップ画像Ｉia〜Ｉid）の取得条件を変更すれば、受精卵ａiの像が検出される可能性を高めることができる。
【００７１】
ステップＳ１１１において、制御ユニット３１は、座標（ｘi’，ｙi’）を観察ユニット３２へ指定すると共に、座標（ｘi’，ｙi’）に位置する物体の高倍位相差画像を取得するよう観察ユニット３２へ指示する。このとき、制御ユニット３１は、ステップＳ１０６で挿入した高ＮＡ照明ユニット４９を光路から抜き出すように、観察ユニット３２へ指示する。即ち、高倍位相差画像を取得するための位相差観察用の顕微鏡として、顕微観察部４４及び照明部４８の組み合わせを使用する。
【００７２】
そして、観察ユニット３２は、培養容器１４を位相差観察用の顕微鏡（顕微観察部４４及び照明部４８）の光路へ配置すると共に、対物レンズ６１及び位相フィルタ６２の組み合わせを、１０倍観察用の組み合わせ（対物レンズ６１high及び位相フィルタ６２high）に設定する。
【００７３】
ここで、対物レンズ６１highの視野のサイズ（０．８ｍｍ×０．８ｍｍ）は、受精卵１個分のサイズ（直径１００μｍ）よりも大きい。そこで、観察ユニット３２は、培養容器１４に対する対物レンズ６１highの光軸位置を座標（ｘi’，ｙi’）へ一致させ、その状態で、例えば図９に示すような高倍位相差画像Ｉi’を取得する。この高倍位相差画像Ｉi’が、ドロップ番号ｉの受精卵ａiの詳細画像である。よって、以下では高倍位相差画像Ｉi’を「卵画像Ｉi’」と称す。
【００７４】
なお、卵画像Ｉi’の取得に当たり、制御ユニット３１は、オートフォーカス制御の焦点調節範囲を、受精卵ａiの像の検出元となった部分ドロップ画像のフォーカス面の近傍のみに制限する。これによって、受精卵ａi以外の物体（気泡ｂiやキズなど）にピントの合う可能性が抑えられる。
【００７５】
ステップＳ１１２において、制御ユニット３１は、ステップＳ１１１で取得した卵画像Ｉi’をドロップ番号ｉに対応付け、それを培養容器１４の観察データとして記憶部３１ａへ記憶する。これによって、卵画像Ｉi’がドロップ番号ｉにより管理されることになる。
【００７６】
ステップＳ１１３において、制御ユニット３１は、現在のドロップ番号が最終値（ここでは「７」）であるか否かを判別し、最終値であればステップＳ１１４へ移行し、最終値でなければ現在のドロップ番号を１だけインクリメントしてからステップＳ１０６へ戻る。したがって、ステップＳ１０６〜Ｓ１１２の処理は、全てのドロップ番号１〜７について実行される。その結果、培養容器１４の観察データには、７個の卵画像Ｉ1’〜Ｉ7’が蓄積されることになる。
【００７７】
ステップＳ１１４において、制御ユニット３１は、培養容器１４の搬送を搬送部３４に指示する。搬送部３４は、培養容器１４をステージ４３からストッカ部３３の所定の収納位置に搬送する。
【００７８】
ステップＳ１１５において、制御ユニット３１は、ステップＳ１１２で保存された卵画像Ｉ1’〜Ｉ7’を読み出し、それら卵画像Ｉ1’〜Ｉ7’の各々に対し胚盤胞判別処理を施すよう画像処理部４６へ指示する。画像処理部４６は、胚盤胞判別処理をテンプレートマッチングなどにより行う。具体的に、画像処理部４６は、胚盤胞の高倍位相差画像から予め抽出した特徴画像と、卵画像Ｉi’から抽出された特徴画像とを比較し、両者に一定以上の相関があった場合に、その卵画像Ｉi’を胚盤胞の画像とみなす。なお、胚盤胞には方向性があるので、この比較は、特徴画像を回転させながら繰り返される。
【００７９】
ステップＳ１１６において、制御ユニット３１は、卵画像Ｉ1’〜Ｉ7’の中に胚盤胞の画像があったか否かを判別し、あった場合はステップＳ１１７を実行してからステップＳ１０４に戻り、無かった場合は即座にステップＳ１０４へ戻る。したがって、ステップＳ１０５〜Ｓ１１７は、観察開始時期が到来する毎に実行される。その結果、卵画像Ｉ1’〜Ｉ7’が観察時期毎に、培養容器１４の観察データに蓄積される。
【００８０】
ステップＳ１１７において、制御ユニット３１は、培養容器１４の中で１又は複数の胚盤胞が生成された旨を操作パネル２３へ表示する。したがって、ユーザは培養容器１４の受精卵に対する適切な措置を早期に講じることが可能となる。なお、培養観察装置１１から離れたユーザへリアルタイムで通知を行うために、制御ユニット３１は、このタイミングでユーザのパーソナルコンピュータ（又はモバイル）へメールを送信してもよい。メールの送信は、制御ユニット３１に備えられた不図示の通信回路を介して行われる（以上、ステップＳ１１７）。
【００８１】
以上のように、培養観察装置１１は、全体画像に基づき培地ドロップを自動的に検出するので（ステップＳ１０３）、培地ドロップの位置をユーザが指定する手間が省ける。また、培地ドロップの検出（ステップＳ１０３）は、全体画像の色分布に基づき行われるので、正確性が高い。また、本実施形態の培養観察装置１１は、ドロップ画像に基づき受精卵を自動的に検出するので（ステップＳ１０７）、受精卵の位置をユーザが指定する手間が省ける。
【００８２】
また、本実施形態の培養観察装置１１は、環状パターンの探索処理（ステップＳ１０７）で受精卵と共に気泡が検出される可能性を踏まえ、環状パターンの探索処理で検出した環状パターンが受精卵の像であるか否かを改めて判別する（ステップＳ１０８）。したがって、受精卵の検出精度は高い。
【００８３】
さらに、本実施形態の培養観察装置１１は、受精卵にピントが合わない可能性を踏まえ、ドロップ画像から受精卵の像が検出されなかった場合（ステップＳ１０９ＮＯ）には、ドロップ画像の取得条件を変更してから（ステップＳ１１０）、ドロップ画像の再取得を行う。したがって、受精卵の検出に失敗する可能性は少ない。
【００８４】
したがって、培養観察装置１１のユーザは、培養容器１４を培養観察装置１１へ収納し、観察スケジュール（タイムラプス観察の時間間隔など）を培養観察装置１１へ入力するだけで、培地ドロップ内を浮遊する受精卵の詳細画像を培養観察装置１１に自動取得させることができる。
【００８５】
さらに、培養観察装置１１では、ステップＳ１０６で顕微観察部４４の光軸上に高ＮＡ照明ユニット４９が挿入され、顕微観察部４４及び高ＮＡ照明ユニット４９の組み合わせからなる顕微鏡により低倍の高ＮＡ照明画像を取得するので、培地ドロップＤの縁近辺に影が現れることを抑制することができる。これにより、ステップＳ１０８の処理において、受精卵ａを確実に検出することができる。
【００８６】
なお、本実施の形態では、培養容器１４としてディッシュを用いて説明したが、培養容器１４としては、複数個のウェルを有するウェルプレートを用いてもよい。特に、９６個のウェルを有する所謂９６ウェルプレートでは、各ウェルの直径が小さいため、ウェルの内壁面におけるミネラルオイルの表面張力による影の影響が相対的に大きなものとなるが、培養観察装置１１では、９６ウェルプレートであっても、その影が現れることを抑制することができるので、より良好に観察を行うことができる。
【００８７】
また、高ＮＡ照明ユニット４９では、光源７１としてLEDを採用する他、例えば、有機ＥＬまたは無機ＥＬを採用することで発光面を広くすることができる。また、光源７１からの照明光を集光するために、フレネルレンズ７３以外にも、DOE（Diffractive Optical Element）や非球面レンズなどのように、照明光を高ＮＡで集光することが可能な、平面的な形状で面積の広い光学素子を使用することができる。
【００８８】
なお、培養観察装置１１は、制御ユニット３１を次のように動作させてもよい。すなわち、制御ユニット３１は、ステップＳ１１０の実行回数が所定回数を上回った時点で、現在のドロップ番号に関する受精卵の検出は不可能であったと判断し、操作パネル２３へその旨の表示（警告表示）を行う。なお、培養観察装置１１から離れたユーザへリアルタイムで警告を行うために、制御ユニット３１は、このタイミングでユーザのパーソナルコンピュータ（又はモバイル）へメールを送信してもよい。
【００８９】
また、上述した何れかの実施形態の培養観察装置１１は、２回目以降の観察時（第２ラウンド以降）に、環状パターンの探索処理（ステップＳ１０７）の演算量を減らすため、部分ドロップ画像上の探索範囲を前ラウンドにおける検出位置の近傍のみに制限してもよい。或いは、部分ドロップ画像上の探索範囲を制限する代わりに、前ラウンドにおける検出位置の近傍の領域を優先的に探索してもよい。
【００９０】
また、培養観察装置１１は、培養容器１４から培地ドロップを自動的に検出したが、培地ドロップを自動的に検出する代わりに、培地ドロップの位置をユーザに指定させてもよい。
【００９１】
また、培地ドロップの大凡の厚さは既知なので、培養観察装置１１は、ＩＶＦモードにおけるドロップ画像、卵画像、環状パターン画像の取得時における焦点調節範囲を、培地ドロップの厚さに相当する範囲に制限してもよい。
【００９２】
また、顕微観察部４４には、透明物体である培養細胞を観察する方法として位相差観察法が適用されたが、透明物体を観察することのできる他の観察方法、例えば、微分干渉観察法、暗視野観察法、偏光観察法などが適用されてもよい。但し、受精卵の像が環状ではなく円状となるような観察方法（微分干渉観察法、偏光観察法など）を適用する場合は、前述した環状パターンの探索処理の代わりに円状パターンの探索処理が適用される。因みに、この円状パターンの探索処理、および、上述した環状パターンの探索処理の詳細は、特開２００８−１５７１４号公報にも開示されている。
【００９３】
また、培養観察装置１１には、複数の培地ドロップの各々に１つずつ含まれる細胞（ここでは受精卵）を観察対象としたＩＶＦモードが搭載されていたが、観察対象の異なる他のモードが搭載されてもよい。例えば、１つの培地に含まれる複数の細胞を観察対象としたモードが搭載されてもよい。
【００９４】
また、制御ユニット３１による処理の一部を画像処理部４６が実行してもよいし、画像処理部４６による処理の一部又は全部を、制御ユニット３１が実行してもよい。また、培養観察装置１１では、培養観察装置１１の制御プログラムを培養観察装置１１に内蔵された制御ユニット３１が実行したが、その制御プログラムの一部又は全部を、制御ユニット３１に接続された端末装置が実行してもよい。
【００９５】
なお、上述のフローチャートを参照して説明した各処理は、必ずしもフローチャートとして記載された順序に沿って時系列に処理する必要はなく、並列的あるいは個別に実行される処理（例えば、並列処理あるいはオブジェクトによる処理）も含むものである。
【００９６】
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００９７】
１１  培養観察装置，  １２  インキュベータ部，  １３  架台部，  １４  培養容器，  ２１  インキュベータ筐体，  ２２  インキュベータ扉，  ２３  操作パネル，  ２４  筐体，  ２５Ａおよび２５Ｂ  扉，  ３１  制御ユニット，  ３１ａ  記憶部，  ３２  観察ユニット，  ３３  ストッカ部，  ３４  搬送部，  ３４Ａ  支持部，  ４１  ユニット本体，  ４２  アーム部，  ４３  ステージ，  ４４  顕微観察部，  ４５  照明部，  ４６  画像処理部，  ４７  容器観察部，  ４８  照明部，  ４９  高ＮＡ照明ユニット，  ６１，６１high，および６１low  対物レンズ，  ６２，６２high，および６２low  位相フィルタ，  ７１  光源，  ７２  ミラー，  ７３  フレネルレンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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