(57)【要約】【課題】肌トラブル等の症状の予防、改善、治療に有効なアロマターゼ活性化剤等を提供すること。【解決手段】ロウドク、キンカラン、ジャショウシ、ボルド、ヒマ及びサッサフラスノキから選ばれる１種以上又はその抽出物を有効成分とするアロマターゼ活性化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロウドク、キンカラン、ジャショウシ、ボルド、ヒマ及びサッサフラスノキから選ばれる１種以上又はその抽出物を有効成分とするアロマターゼ活性化剤。
【請求項２】
抽出物が、水抽出物、アルコール類抽出物、アルコール類−水混合液抽出物又はヘキサン抽出物である請求項１記載のアロマターゼ活性化剤。
【請求項３】
アロマターゼ活性化剤が、皮膚外用剤である請求項１又は２記載のアロマターゼ活性化剤。
【請求項４】
ロウドク、キンカラン、ジャショウシ、ボルド、ヒマ及びサッサフラスノキから選ばれる１種以上又はその抽出物を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
【請求項５】
皮膚老化予防又は改善剤が、皮膚外用剤である請求項４記載の皮膚老化予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アロマターゼの活性を増強するアロマターゼ活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アロマターゼは、性ステロイドホルモン生合成経路の最終段階を触媒し、アンドロゲンからエストロゲンを生合成する、唯一のエストロゲン合成酵素として知られている。アロマターゼは、体内に広く分布するが、厳密な組織特異的発現調節を受けており、この発現調節機構は、I.1型（胎盤）、I.2型（胎盤）、I.3型（脂肪組織、乳がん）、I.4型（皮膚、脂肪組織、骨、胎児）、I.5型（胎児）、I.6型（骨）、I.7型（乳がん）、PII型（卵巣、脂肪組織、乳がん）、I.f型（脳）などの多種のタイプに分けることができる（非特許文献１）と考えられている。
【０００３】
アロマターゼによって生合成されるエストロゲンは、一般的に女性ホルモンとも云われ、１７β−エストラジオール、エストロン、エストリオール等の存在が知られている。
このエストロゲンは、子宮内膜の増殖（非特許文献２）、性機能の調節（非特許文献３）、骨代謝の調節（非特許文献３）、脂質代謝の調節（非特許文献２）、肌状態（非特許文献２）等様々な生理機能に関与している。
例えば、加齢（年齢の増加）や卵巣機能の低下等に伴って、体内のエストロゲン分泌能が低下してエストロゲンが欠乏し、更年期障害、性機能低下、自律神経失調症、脂質代謝異常、血管運動障害、骨粗しょう症、肌トラブル等の症状が現れることが知られている。
また、皮膚老化は、加齢や紫外線暴露、女性においてはエストロゲンの減少によって進行する。このうち、エストロゲンについては、ホルモン補充療法の結果などから、表皮・真皮厚の増加、皮膚水分量の増加、血行促進能、コラーゲンの増加、弾力性の改善、シワの抑制といった、肌の諸機能の改善効果があることが知られている（非特許文献４）。
このため、体内でのエストロゲンの産生能を高めることができれば、上記エストロゲン欠乏に起因する各種症状、例えば肌の諸機能の減退や皮膚の老化等の予防又は改善も可能であると考えられている。
【０００４】
そこで、アロマターゼの活性を促進することによって、上記症状を改善する植物等に関して、種々のものが検討されている（特許文献１〜４）が、更なるアロマターゼ活性化剤が期待されている。
【０００５】
ところで、ジンチョウゲ科ステレラ属植物の一種であるロウドク（根）の５０％エタノール抽出物には、ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）遺伝子発現促進作用（特許文献５）や脂肪分解促進作用（特許文献６）があることが知られている。
また、ツヅラフジ科チノスポラ属植物の一種であるキンカラン（塊根）の５０％エタノール水溶液やエタノール加熱抽出物及び熱水抽出物には、ヒトβ３アドレナリン受容体アゴニスト作用、メラニン生成抑制作用（特許文献７）があることが知られている。
また、セリ科ハマゼリ属植物又はヤブジラミ属植物の一種であるジャショウシ（成熟果実）の９５％エタノール抽出物には、発毛・育毛作用（特許文献８）があることが知られている。
また、モミニア科プネウム属植物の一種であるボルド（葉）の冷水抽出物には、ホスホリパーゼＡ２酵素阻害作用（特許文献９）があることが知られている。
また、トウダイグサ科トウゴマ属植物の一種であるヒマ（根）の８０％エタノールやエタノール抽出物及び水抽出物には、テストステロン５α−レダクターゼ活性阻害作用（特許文献１０）、メラニン産生抑制作用（特許文献１１）があること、また、ヒマ（葉、茎、根）の５０％エタノール水溶液抽出物には、抗酸化作用（特許文献１２）があることが知られている。
また、クスノキ科サッサフラノス属植物の一種であるサッサフラスノキ（根皮、茎、葉）には、発汗作用、利尿作用、強壮作用があることや揮発油原料・香料として用いられていること、また、民間薬として胃痛、リューマチ、高血圧などの治療（非特許文献５）に用いられていることが知られている。
【０００６】
しかしながら、これら植物に、アロマターゼ活性化作用があることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−３４３８７２号公報
【特許文献２】特開２００５−３４３８７３号公報
【特許文献３】特開２００８−６３２７０号公報
【特許文献４】特開２００８−８１４４０号公報
【特許文献５】特開２００８−２６６１５６号公報
【特許文献６】特開２００５−６０３６６号公報
【特許文献７】国際公開２００５／０８２３９１号パンフレット
【特許文献８】特開２００７−４５７７０号公報
【特許文献９】特開２００９−１０８１０４号公報
【特許文献１０】特開２００１−３０２５２８号公報
【特許文献１１】特開２００１−２１３７５７号公報
【特許文献１２】特開２００８−２７３９７８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Regulation of aromatase expression in estrogen-responsive breast and uterine disease: From bench to treatment., Bulun SE, Lin Z, Imir G, Amin S, Demura M, Yilmaz B, Martin R, Utsunomiya H, Thung S, Gurates B, Tamura M, Langoi D, Deb S., Pharmacol Rev. 2005 Sep;57(3):359-83.
【非特許文献２】からだの科学  No 219 2001 日本評論社
【非特許文献３】女性ホルモンの作用と性差の出現  玉舎輝彦  著  金芳堂  2006年
【非特許文献４】Hormone replacement therapy and the skin., Brincat MP. Maturitas. 2000 May 29;35(2):107-17.、Biology of estrogens in skin: implications for skin aging., Verdier-Sevrain S, Bonte F, Gilchrest B. Exp Dermatol. 2006 Feb;15(2):83-94
【非特許文献５】Folk medical uses of plant foods in southern Appalachia, United States., Cavender A. J Ethnopharmacol. 2006 Nov 3;108(1):74-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、安全性が高く、エストロゲン生成を促進させることができ、上記エストロゲン欠乏に起因する各種症状、特に肌トラブル症状の予防、改善又は治療に有効なアロマターゼ活性化剤又は皮膚老化予防若しくは改善剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、天然物由来であってアロマターゼ活性化作用を有する物質について鋭意研究を重ねた結果、ロウドク、キンカラン、ジャショウシ、ボルド、ヒマ及びサッサフラスノキから選ばれる１種以上又はその抽出物に、アロマターゼ、特に線維芽細胞に存在するアロマターゼを活性化する作用等があることを見出し、この知見により本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）のものである。
（１）ロウドク、キンカラン、ジャショウシ、ボルド、ヒマ及びサッサフラスノキから選ばれる１種以上又はその抽出物を有効成分とするアロマターゼ活性化剤。
（２）抽出物が、水抽出物、アルコール類抽出物、アルコール類−水混合液抽出物又はヘキサン抽出物である前記（１）記載のアロマターゼ活性化剤。
（３）ロウドク、キンカラン、ジャショウシ、ボルド、ヒマ及びサッサフラスノキから選ばれる１種以上又はその抽出物を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
（４）前記アロマターゼ活性化剤又は皮膚老化防止予防若しくは改善剤が、皮膚外用剤である前記（１）〜（３）記載のいずれか１つのアロマターゼ活性化剤又は皮膚老化予防若しくは改善剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアロマターゼ活性化剤又は皮膚老化予防若しくは改善剤は、天然由来であるので安全性が高く、エストロゲン生成を促進させることから、エストロゲン欠乏に起因する各種症状、特に肌トラブル症状の予防、改善又は治療の効果を発揮する医薬品又は化粧品等として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に用いるロウドクとは、ジンチョウゲ科植物（Thymelaeacea）のStellera chamaejasme （狼毒）；トウダイグサ科植物（Euphorbiaceae）のEuphorbia fischeriana（ヒロハタイゲキ、狼毒大戟）、Euphorbia ebracteolata（マルミノウルシ、月腺大戟）；サトイモ科植物（Araceae）の Alocasia odora K. KOCH （クワズイモ）及びこれらの近縁植物から選ばれる少なくとも１種を意味する（中薬大辞典  上海科学技術出版社・株式会社 小学館編集，株式会社 小学館 1985年発行）。このうち、Stellera chamaejasme、Euphorbia fischeriana及びEuphorbia ebracteolataが好ましい。
【００１４】
本発明に用いるキンカランとは、ツヅラフジ（Menispermaceae）科植物のTinospora capillipes Gagnep.（金果欖）；Tinospora sagittata (Oliv.) Gagnep.（セイギュウタン：青牛胆）及びこれらの近縁植物から選ばれる少なくとも１種を意味する（中薬大辞典，上海科学技術出版社・株式会社 小学館編集，株式会社 小学館 1985年発行）。このうち、Tinospora sagittata (Oliv.) Gagnep.が好ましい。
【００１５】
本発明に用いるジャショウシとは、セリ科植物（Umbelliferae）のCnidium monnieri Cusson（オカゼリ）；Torilis japonica（ヤブジラミ）；Torilis scabra（オヤブジラミ）及びこれらの近縁植物から選ばれる少なくとも１種を意味する（中薬大辞典，上海科学技術出版社・株式会社 小学館編集，株式会社 小学館 1985年発行）。このうち、Cnidium monnieri Cussonが好ましい。
【００１６】
本発明に用いるボルドとは、モミニア科植物（Ｍonimiaceae）のPeumus boldus及びこの近縁植物から選ばれる少なくとも１種を意味する（ハーブ大全，株式会社 小学館編集，株式会社 小学館 1990年発行）。
【００１７】
本発明に用いるヒマとは、トウダイグサ科植物（Euphorbiaceae）のRicinus communis L.（トウゴマ：castor bean）及びこの近縁植物から選ばれる少なくとも１種を意味する（中薬大辞典，上海科学技術出版社・株式会社 小学館編集，株式会社 小学館 1985年発行）。
【００１８】
本発明に用いるサッサフラスノキとは、クスノキ科植物（Lauraceae）のSassafras officinale Nees（サッサフラスノキ：Sassafras Lvs）及びこの近縁植物から選ばれる少なくとも１種を意味する（THE PLANT-BOOK SECOND EDITION・CAMBRIDGE UNIVERSITY出版，1987年発行）。
【００１９】
本発明における植物としては、その植物の全草、葉（葉身、葉柄等）、樹皮、木質部、枝、果実（成熟、未熟等）、種子、花（花弁、子房等）、根、塊根、根茎等を、そのまま、破砕、粉砕、搾取して用いるか、又はこれら処理されたものを乾燥若しくは粉末化して用いることができる。
用いる部位としては、ロウドクについては根を；キンカランについては塊根、根を；ジャショウシについては果実を；ボルドについては葉を；ヒマについては種子を；サッサフラスノキについては葉を、使用するのが好ましい。
尚、本発明に用いる上記植物を単独で、又は上記植物から選ばれる２種以上のものを混合して用いてもよい。
【００２０】
本発明における抽出物とは、本発明に用いる植物を一定温度（低温、常温又は加温）下にて抽出すること；又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等の抽出手段により得られる各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその粉末を意味するものである。
【００２１】
本発明の植物の抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤の何れをも使用することができる。当該抽出溶剤としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワレン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル等が挙げられる。これら溶剤は、単独で又は２種以上混合して混合液として使用することができる。
この溶剤のうち、水、アルコール類（好ましくは炭素数１〜５）、水−アルコール類混合液、炭化水素類（好ましくはヘキサン）が好ましい。このうち、水、エタノール、水−エタノール混合液、ヘキサンが好ましい。
水−エタノール混合液やエタノールを用いる場合、当該混合液中のエタノール濃度（Ｖ／Ｖ）は、０．０１〜１００容量％であるのが好ましく、２０〜１００容量％であるのがより好ましく、４０〜１００容量％であるのが更に好ましい。
【００２２】
溶剤の使用量は、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、１〜５０質量部であるのが好ましく、５〜４０質量部であるのが好ましい。抽出温度は、０〜１００℃であるのが好ましく、より４〜８０℃、更に４〜６０℃であるのが好ましい。抽出時間は、１分〜１５０日間であるのが好ましく、より３０分〜５０日間、更に６０分〜３０日間であるのが好ましい。
一例として、抽出物を得る際、植物１質量部（乾燥物換算）に対して、２０〜９５容量％エタノール−水混液、エタノール、ヘキサン又は水の１〜５０質量部の溶剤を用い、４〜５０℃の温度（好ましくは、４〜４０℃）で、１時間〜５０日間（好ましくは１〜４５日間）抽出するのが好ましい。
また、抽出の際、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、非酸化的雰囲気下で行なってもよい。
【００２３】
上記にて得られた植物抽出物は、単独で又は混合して、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮又は凍結乾燥して、液状、粉末状又はペースト状に調製して用いることもできる。
また、得られた植物抽出物は、クロマトグラフィー、液液分配、ゲルろ過分離、活性炭処理等の公知の分離技術により、当該抽出物から不活性な夾雑物を除去して用いることができる。
【００２４】
後記実施例に示すように、本発明の植物又はその抽出物は、線維芽細胞型アロマターゼ遺伝子の発現を増強させたり、線維芽細胞に存在するアロマターゼを活性化させるので、優れたアロマターゼ活性化作用を有する。
そして、本発明の植物又はその抽出物は、皮膚組織内のエストロゲン量を増加させることができるので、角層のバリア能、表皮のターンオーバー促進能、真皮の血行促進能やコラーゲン産生能を向上させることができる。
よって、本発明の植物又はその抽出物は、肌の諸機能の減退や皮膚の老化等によって引き起こされる、シワやタルミ（弛緩）の増加、肌荒れ、肌の弾力性損失と云った、様々な肌トラブルの予防、改善又は治療に有効であると考えられる。
また、肌トラブル症状以外の、更年期障害、性機能低下（排泄障害、膣炎、性機能低下等）、自律神経失調症（ほてり、多汗等）、精神神経症状（うつ、不眠症等）脂質代謝異常（動脈硬化、コレステロール上昇、脳梗塞等）、血管運動障害、骨粗しょう症（腰痛、骨折等）等の体内のエストロゲン減少によって現れる各種症状（非特許文献２及び３）の予防、改善又は治療にも有効であると考えられる。
従って、本発明の植物又はその抽出物は、アロマターゼ活性化剤、皮膚老化予防又は改善剤等（以下、「アロマターゼ活性化剤等」という）として使用でき、さらにこれらの製剤を製造するために使用することができる。このとき、当該ＳＲＥＢＰ抑制剤では、当該植物又はその抽出物を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２５】
斯かるアロマターゼ活性化剤等は、肌トラブルの予防又は改善作用や皮膚老化予防又は改善作用等の各効果を発揮する、ヒト若しくは非ヒト動物用の医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、皮膚外用剤、入浴剤等として又はこれらの有効成分として配合して使用することができる。また、食品は、上記各種症状予防又は改善作用、特に、肌トラブルの予防又は改善作用や皮膚老化予防又は改善作用等をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、病者用食品、特定保健用食品等の機能性食品の有効成分として使用することができる。
【００２６】
本発明のアロマターゼ活性化剤等を、医薬品として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、経口投与、並びに経皮、経腸、経結膜及び注射等の非経口投与が挙げられる。経口投与のための製剤の剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等が挙げられる。非経口投与のための製剤の剤型としては、塗布剤又は貼付剤等の外用剤、静脈内注射用、皮下注射用又は点滴注射用等の注射剤、吸入剤、輸液、座剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
斯かる医薬品製剤では、本発明の上記植物若しくはその抽出物を単独で、またこれと、薬学的に許容される担体とを組み合わせて使用してもよい。斯かる担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、活性増強剤、抗炎症剤、殺菌剤、矯味剤、矯臭剤、増量剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、香料、被膜剤等が挙げられる。
【００２７】
本発明のアロマターゼ活性化剤等を、経口投与用製剤として用いる場合、本発明の上記植物又はその抽出物の含有量は、製剤全質量中、乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％、より０．０１〜５質量％であるのが好ましい。
上記経口投与製剤の投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、本発明の上記植物又はその抽出物の投与量は、成人（６０ｋｇ）１日当たり、通常０．００１〜１２００ｍｇ、より０．０１〜３００ｍｇであるのが好ましい。また、上記製剤は、任意の投与計画に従って投与され得るが、１日当たり１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００２８】
本発明のアロマターゼ活性化剤等を、食品の有効成分として用いる場合、当該食品の形態は、固形、半固形又は液状等であり得る。食品としては、例えば、パン類、麺類、菓子類、ゼリー類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、澱粉加工製品、加工肉製品、その他加工食品、飲料、スープ類、調味料、栄養補助食品等、及びそれらの原料等が挙げられる。また、上記の経口投与製剤と同様の、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、粉末剤、顆粒剤等の形態であってもよい。
これら食品を調製するには、本発明のアロマターゼ活性化剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油脂、乳化剤、防腐剤、香料、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
また、食品中の、本発明の上記植物又はその抽出物の含有量は、その使用形態により異なる。飲料の形態では、乾燥物換算で、通常、０．０００１〜２０質量％、より０．００１〜５質量％であるのが好ましい。また、錠剤や加工食品等の固形食品の形態では、乾燥物換算で、０．０００１〜２０質量％、より０．０１〜５質量％であるのが好ましい。
【００２９】
また、本発明のアロマターゼ活性化剤等を、飼料の有効成分として用いる場合には、当該飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、本発明のアロマターゼ活性化剤等の他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を組み合わせて用いることができる。
また、飼料中の、本発明の上記植物又はその抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい
【００３０】
本発明のアロマターゼ活性化剤等を、外用医薬品、医薬部外品又は化粧品として用いる場合には、これら外用医薬品、医薬部外品又は化粧品は、皮膚外用剤、洗浄剤、入浴剤、又はメイクアップ化粧料等とすることができ、使用方法に応じて、これらを、美容液、化粧水、マッサージ剤、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末剤、パック、パップ剤、顆粒剤、ファンデーション、口紅、シャンプー、コンディショナー、ヘアトニック、錠剤、カプセル、吸収性物品、シート状製品等の種々の剤型で提供することができる。
このような種々の剤型の外用医薬品、医薬部外品又は化粧品は、本発明のアロマターゼ活性化剤等を、単独で、又は外用医薬品、医薬部外品若しくは皮膚化粧料に配合される、油又は油状物質（油脂類、ロウ類、高級脂肪酸類、精油類、シリコーン油類等）、保湿剤（グリセロール、ソルビトール、ゼラチン、ポリエチレングリコール等）、粉体（チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、ゴム等）、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬効成分、香料、樹脂、防菌防黴剤、他の植物抽出物（生薬、漢方薬、ハーブ類）、アルコール類、多価アルコール類、無機酸（重炭酸塩、炭酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等）、有機酸（コハク酸、グルタル酸、フマル酸、グルタミン酸、リンゴ酸、クエン酸、アスコルビン酸等）、ビタミン類（ビタミンＡ類、ビタミンＥ類、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、葉酸等）、水溶性高分子、アニオン性界面活性剤（アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩等）、カチオン性界面活性剤（アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩等）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等）、両性界面活性剤（アルキル基を有するイミダゾリン系、カルボベタイン系等）等を組み合わせることにより調製することができる。
当該外用医薬品、医薬部外品、化粧品の全量中の、本発明の上記植物又はその抽出物は、乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。
また、入浴剤の全量中の、本発明の上記植物又はその抽出物は、乾燥物換算で、通常０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を具体的に説明するために実施例及び試験例を挙げるが本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
製造例１：ロウドク抽出物
（１）乾燥した狼毒（学名  Stellera chamaejasme L.）の根４０ｇに、１０倍量（０．４Ｌ）の５０容量％（以下、「５０％」とする）エタノール−水混合溶液を加え、２０〜３０℃（常温）、２２日間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、狼毒の５０％エタノール抽出乾固物１を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「９５％エタノール」に代えた以外は、上記と同様にして狼毒のエタノール抽出乾固物２を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「ヘキサン」に代えた以外は、上記と同様にして狼毒のヘキサン抽出乾固物３を得た。
（２）「狼毒（学名  Stellera chamaejasme L.）の根」を「狼毒大戟（学名  Euphorbia fischeriana Steud.）の根」に代えた以外は、上記と同様にして、狼毒大戟の５０％エタノール抽出乾固物４、狼毒大戟のエタノール抽出乾固物５、狼毒大戟のヘキサン抽出乾固物６を得た。また、「５０％エタノール−水混合溶液」を「水」に代えた以外は、上記と同様にして狼毒大戟の水抽出乾固物７を得た。
（３）「狼毒（学名  Stellera chamaejasme L.）の根」を「月腺大戟（学名  Euphorbia ebracteolataHayata）の根」に代えた以外は、上記と同様にして、月腺大戟の５０％エタノール抽出乾固物８、月腺大戟のエタノール抽出乾固物９、月腺大戟のヘキサン抽出乾固物１０を得た。また、「５０％エタノール−水混合溶液」を「水」に代えた以外は、上記と同様にして月腺大戟の水抽出乾固物１１を得た。
【００３３】
製造例２：キンカラン抽出物
乾燥したセイギュウタン（青牛胆）（学名  Tinospora sagittata (Oliv.) Gagnep.）の根４０ｇに、１０倍量（０．４Ｌ）の５０容量％エタノール−水混合溶液を加え、２０〜３０℃（常温）、２６時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、セイギュウタンの５０％エタノール抽出乾固物１２を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「９５％エタノール」に代えた以外は、上記と同様にしてセイギュウタンのエタノール抽出乾固物１３を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「ヘキサン」に代えた以外は、上記と同様にしてセイギュウタンのヘキサン抽出乾固物１４を得た。
【００３４】
製造例３：ジョショウシ抽出物
乾燥したジャショウシ（学名  Cnidium monnieri (L.) Cuss.）の果実４０ｇに、１０倍量（０．４Ｌ）の５０％エタノール−水混合溶液を加え、２０〜３０℃（常温）、４３日間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、５０％エタノール抽出乾固物１５を得た。
【００３５】
製造例４：ボルド抽出物
乾燥したボルド（学名  Peumus boldus）の葉４０ｇに、１０倍量（０．４Ｌ）の５０％エタノール−水混合溶液を加え、２０〜３０℃（常温）、２７日間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ボルドの５０％エタノール抽出乾固物１６を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「９５％エタノール」に代えた以外は、上記と同様にしてボルドのエタノール抽出乾固物１７を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「ヘキサン」に代えた以外は、上記と同様にしてボルドのヘキサン抽出乾固物１８を得た。
【００３６】
製造例５：ヒマ抽出物
乾燥したヒマ（学名  Ricinus communis L.）の種子４０ｇに、１０倍量（０．４Ｌ）の５０％エタノール−水混合溶液を加え、２０〜３０℃（常温）、３９日間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ヒマの５０％エタノール抽出乾固物１９を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「９５％エタノール」に代えた以外は、上記と同様にしてヒマのエタノール抽出乾固物２０を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「ヘキサン」に代えた以外は、上記と同様にしてヒマのヘキサン抽出乾固物２１を得た。
【００３７】
製造例６：サッサフラスノキ抽出物
乾燥したサッサフラスノキ（学名  Sassafras officinale Nees）の葉４０ｇに、１０倍量（０．４Ｌ）の５０％エタノール−水混合溶液を加え、２０〜３０℃（常温）、２１日間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、サッサフラスノキの５０％エタノール抽出乾固物２２を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「９５％エタノール」に代えた以外は、上記と同様にしてサッサフラスノキのエタノール抽出乾固物２３を得た。
また「５０％エタノール−水混合溶液」を「ヘキサン」に代えた以外は、上記と同様にしてサッサフラスノキのヘキサン抽出乾固物２４を得た。
【００３８】
試験例１：各抽出物におけるアロマターゼ遺伝子発現増強作用
＜各抽出物＞
製造例１〜６で得られた各抽出乾固物１〜２４を用いた。５０％エタノール−水混合溶液にて溶解し、それぞれ抽出物溶液１〜２４とした。コントロールは、５０％エタノールとした。
＜レポータージーンアッセイ系の構築＞
ヒト正常ケラチノサイトより抽出したゲノムＤＮＡより、ヒトアロマターゼ遺伝子エクソンＩ．４の転写調節領域とエクソンＩ．４の一部を含む部分を、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行って増幅した。
upper primer 5＆apos;- GACTAGTAAGGTGCAGTGACAGGCTC -3＆apos;（配列番号１）
lower primer 5＆apos;- GGAATTCCTGTCAGGCTCCAGTTGGTC -3＆apos;（配列番号２）
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで処理し、シーパンジーｎｕｌｌコントロールベクター（東洋インキ製造株式会社）のＳｐｅＩサイトとＥｃｏＲＩサイトに組み込み、これをＥｘＩ．４−ｌｕｃプラスミドとして、後述のルシフェラーゼアッセイに用いた。
＜アロマターゼ遺伝子エクソンI.4発現増加作用＞
(i)使用細胞：
ヒト皮膚由来正常線維芽細胞
(ii)使用プラスミド：
アロマターゼ遺伝子エクソンＩ．４の転写調節領域、約１ｋｂをルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだＥｘＩ．４−ｌｕｃと生細胞に導入されるとホタルルシフェラーゼが強制発現されるコントロールベクター（東洋インキ製造株式会社）を用いた。
（iii）細胞へのトランスフェクション：
ヒト皮膚由来正常線維芽細胞を９６ウェル培養プレート中に３万個ずつまき、ＥｘＩ．４−ｌｕｃとコントロールベクターを１０：１で混合し、リポフェクトアミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した。プロトコールは試薬に添付された説明書の記載に従った。ＤＮＡの量は１ウェル当たり０．１μｇ用いた。コントロールとして２つのウェルに対しては、ＤＮＡを加えずに同様の操作を行った。
(iv)ルシフェラーゼアッセイ：
トランスフェクションを行った細胞を１晩培養した後、製造例で調製した各植物の５０％エタノール抽出物を加え、蒸発残分〔培地中に添加した終濃度〕０．０１又は０．００１（ｗ／ｖ）％になるように、２４時間培養した。また、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。細胞の溶解は５ｘLysis Bufferを１ｘ濃度に調整し、各ウェルに２５μＬ加えて細胞を溶解した。
【００３９】
下記表１に示すように、上記各植物抽出物は、何れも線維芽細胞型アロマターゼ遺伝子発現増強作用、従ってまたアロマターゼ産生促進作用を有している。
【００４０】
【表１】
2011102264.tif 000002
【００４１】
試験例２：各抽出物におけるアロマターゼ活性化
上記各抽出物１〜２２を試料として用いた。
ヒト皮膚由来線維芽細胞（HDF1616：KURABO）を使用した。
２４穴細胞培養プレート(FALCON)にヒト皮膚線維芽細胞を播種し、コンフルエントになるまで培養した。培地を除き、無血清培地９００μＬを加えて２４時間培養した。
その際、ウェルには、乾燥質量換算での抽出物の最終濃度が、１，０．１，０．０１，０．００１又は０．００３（ｗ／ｖ）％となるように５０％ＥｔＯＨを用いて調製した各抽出物１〜６の９μＬを３ウェルずつに加えた。
また、ネガティブコントロールとして５０％エタノール水溶液９μＬを加えたものと、何も添加しないものを用意した。
バックグラウンドには細胞を含まない培地を用い、薬剤を加えず同様の時間インキュベートし、その後も同様の操作をした。アロマターゼの基質である1β-3H-androst-4-ene-3, 17-dione (PerkinElmer)を３７ｋＢｑ／１００μＬとなる様に無血清培地に加え、各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。１ウェルから９００μＬを２ｍＬチューブにとり、CHCl3 １ｍＬを加え激しく攪拌した。１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心して上層（水層）を別のチューブに移した。Charcoal/Dextran (Charcoal, dextran coated (SIGMA) 5gをH2O 50mLに懸濁したもの) ２００μＬを加えてよく混ぜ、３０分間室温で放置した。１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、上清を新しいチューブに移した。CHCl3 １ｍＬを加え激しく攪拌し、１５，０００ｒｐｍ，１０分間遠心して上層（水層）をUltimaGold (PerkinElmer) ５ｍＬに加え、液体シンチレーションカウンター(PerkinElmer  Tricarb 2550)で3Hの放射活性を測定した。
なお、上記測定方法は、〔Stampfer MJ, Willett WC, Colditz GA, Rosner B, Speizer FE and Hennenkens CH, N. Engl. J. Med., 313, 1044-1049, 1985〕を参考にして行った。
アロマターゼの反応によって、1β-3H-androst-4-ene-3, 17-dioneは3H2Oを放出して、放射活性のないエストロンに変換される。この実験法では放出された3H2Oの放射活性を検出しており、放射活性が高いほどアロマターゼ活性も高いことを示している。
よって、下記表２〜４に示すように、コントロールでは基質の分解がほとんどなかったのに対し、各植物抽出物を添加した細胞ではアロマターゼ活性が促進されたことから、上記各植物抽出物は、何れも線維芽細胞に存在するアロマターゼの活性化作用を有している。
【００４２】
【表２】
2011102264.tif 000003
【００４３】
【表３】
2011102264.tif 000004
【００４４】
【表４】
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【００４５】
以上のことから、ロウドク（狼毒、狼毒大戟及び月腺大戟の各植物）から水、４０〜６０％エタノール、９０〜１００％エタノール及びヘキサンの各溶剤にて抽出された各抽出物；ジャショウシから４０〜６０％エタノールにて抽出された抽出物；ヒマ、キンカラン（青牛胆）、サッサフラスノキ及びボルトの各植物から４０〜６０％エタノール、９０〜１００％エタノール及びヘキサンの各溶剤にて抽出された各抽出物は、何れも優れたアロマターゼ活性化作用を有していた。よって、ロウドク、キンカラン、ジャショウシ、サッサフラスノキ及びボルトから選ばれる少なくとも１種又はその抽出物は、アロマターゼ活性化剤等の有効成分として有望である。
【配列表】
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