(57)【要約】      （修正有）【課題】血液、痰、及び尿のようなヒト又は動物の体液中のミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）のようなバクテリアの検出、バクテリアを繁殖させる必要のない、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のようなバクテリアの生存率を評価するための方法を提供する。【解決手段】結核菌又はらい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）のようなミコバクテリア種の生存率を評価するために特になバクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの増幅のためのプライマー及びプローブとして用いられうるオリゴヌクレオチド、および、増幅されたｍＲＮＡに相補的な電気化学ハック標識されたプローブ、および、結核菌、らい菌、又は大腸菌の生存率の評価のための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
伸長因子ＥＦ−ＴｕをコードするｍＲＮＡが核酸増幅反応における標的として用いられ、かつ該ｍＲＮＡの存在及び／又は量が決定される、バクテリアの生存率の評価のための方法。
【請求項２】
核酸増幅反応が転写依拠増幅反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
転写依拠増幅反応がＮＡＳＢＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
増幅されたｍＲＮＡが、相補的な標識されたプローブを用いて検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
プローブに電気化学発光標識が供与されている、請求項に４記載の方法。
【請求項６】
バクテリアがミコバクテリア（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ミコバクテリアエの種が結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）又はらい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１０〜５０ヌクレオチド長であり、かつ配列番号１〜８に記された配列のうちの一つ又はそれらの相補的配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む、バクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡ配列の配列と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
それぞれ、配列番号１に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、配列番号２に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとからなる、結核菌のＥＦ−Ｔｕ遺伝子内の配列の増幅のためのオリゴヌクレオチド対。
【請求項１０】
それぞれ、配列番号３に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとからなる、らい菌のＥＦ−Ｔｕ遺伝子内の配列の増幅のためのオリゴヌクレオチド対。
【請求項１１】
それぞれ、配列番号５に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとからなる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＥＦ−Ｔｕ遺伝子内の配列の増幅のためのオリゴヌクレオチド対。
【請求項１２】
それぞれ請求項９、１０、又は１１に記載のオリゴヌクレオチド対がＥｆ−Ｔｕ  ｍＲＮＡを増幅するために用いられ、かつ増幅された核酸の存在及び／又は量が検出される、結核菌、らい菌、又は大腸菌の生存率の評価のための方法。
【請求項１３】
配列番号７に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを有する捕捉プローブと、配列番号８に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを有する標識された検出プローブとを用いたサンドイッチ・ハイブリダイゼーション・アッセイを用いて、結核菌又はらい菌の生存率が評価され、かつ増幅された核酸の検出が実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１２に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを有する捕捉プローブ、及び配列番号１３に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを有する標識された検出プローブを用いたサンドイッチ・ハイブリダイゼーション・アッセイを用いて、大腸菌の生存率が評価され、かつ増幅された核酸の検出が実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
−請求項９又は１０に記載のオリゴヌクレオチド対、
−検出可能な標識が供与された、増幅された核酸配列の少なくとも一部と実質的に相補的な核酸配列を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、
−適当な増幅試薬
を含む、試料中のミコバクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの検出のための試験キット。
【請求項１６】
−請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド対、
−検出可能な標識が供与された、増幅された核酸配列の少なくとも一部と実質的に相補的な核酸配列を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、
−適当な増幅試薬
を含む、試料中の大腸菌バクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの検出のための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液、痰、及び尿のようなヒト又は動物の体液中のミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）のようなバクテリアの検出に関する。本発明は、バクテリアを繁殖させる必要のない、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のようなバクテリアの生存率を評価するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、結核菌により引き起こされる結核（ＴＢ）は、世界中の多くの国における主要な公衆衛生問題であり、発展途上国においては特に重要である。結核抑制計画は、増加した症例の荷重、肺外症例又はスメア陰性症例のような診断がより困難な患者カテゴリーへのシフト、及び結核菌の多剤耐性株の出現に直面している。改良された診断は、この世界的な公衆衛生における緊急事態を解決するための苦闘において貴重な貢献をするであろう。
【０００３】
本発明の方法は、特定の核酸配列の増幅に関する。
【０００４】
核酸増幅反応は、古典的な方法の感度及び特異性をしのぎつつ、診断のための時間を数週間から数時間に減少させることを約束する。診断における潜在的な価値の他、増幅反応は、迅速な同定及び薬剤感受性決定の可能性を提供する。ＤＮＡ標的分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による検出可能レベルへの増幅は、ミコバクテリアを検出するための最もよく分析されている系である。
【０００５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、ヨーロッパ特許出願ＥＰ２００３６２及びＥＰ２０１１４８に記載されている。ＰＣＲは、二本鎖ＤＮＡを標的として有するサイクル過程である。ＰＣＲ過程における各サイクルは、二本鎖ＤＮＡ標的のその２つの相補鎖への分離で開始する。各鎖に、プライマーがアニールし、存在するＤＮＡポリメラーゼが、プライマーがアニールしたＤＮＡ鎖に沿ってプライマーを伸長し、このようにして２つの新たなＤＮＡ二重鎖が形成される。反応混合物が加熱されると、ＤＮＡ二重鎖の鎖が再び分離し、新たなＰＣＲサイクルが開始することができる。このようにして、ＰＣＲ過程は、ＤＮＡ標的の多数のＤＮＡコピーを生成させる。ＰＣＲを用いた増幅は、ＲＮＡ鋳型に基づき行うこともできる。実際のＰＣＲの前に、ＲＮＡからＤＮＡを複写するための逆転写段階が必要となる（ＲＴ−ＰＣＲ）。しかし、ＲＴ−ＰＣＲを転写物の検出に用いる場合には、ｍＲＮＡに由来するＰＣＲ産物とＤＮＡに由来するＰＣＲ産物とを区別する必要がある。ＲＴ−ＰＣＲ前のＤＮＡｓｅ処理を使用することができるが（Ｂｉｔｓｃｈ，Ａ．ら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  １６７，７４０−７４３．，１９９３；Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．８，２６１−２７１．，１９９４）、混入したＤＮＡを充分に除去できない場合がある［Ｂｉｔｓｃｈ，Ａ．ら，１９９３］。
【０００６】
さらに最近、異なるクラスの核酸増幅法、即ち「転写依拠増幅技術」が開発された。この技術は、ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含む鋳型からの、多数のＲＮＡコピーの転写を含む。該コピーが、さらなる増幅のための投入物として用いられる。そのような方法は、ＷＯ８８／１０３１５においてＧｉｎｇｅｒａｓらにより、ＷＯ８９／１０５０においてＢｕｒｇらにより記載されている。等温転写依拠増幅技術は、ＥＰ３２３８２２（ＮＡＳＢＡ法に関する）においてＤａｖｅｙらにより、ＥＰ３７３９６０においてＧｉｎｇｅｒａｓらにより、そしてＥＰ４０８２９５（ＴＭＡ法）においてＫａｃｉａｎらにより記載されている。転写依拠増幅反応は、熱安定酵素を用いても実施されうる。そのような熱安定法は、Ｔｏｙｏ  Ｂｏｓｅｋｉ  ＫＫの名称で出願されたＥＰ６８２１２１に記載されている。
【０００７】
いずれも１６ＳリボソームＲＮＡを標的とする、ＮＡＳＢＡ法［Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９３）ミコバクテリアの同定のための核酸配列基本増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＮＡＳＢＡ）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９，２４２３−２４２９］及びもう一つの転写介在ＲＮＡ増幅試験（ＴＭＡ）［Ｊｏｎａｓ，Ｖ．，Ａｌｄｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒｙ，Ｊ．Ｉ．，Ｋａｍｉｓａｎｇｏ，Ｋ．，Ｋｎｏｔｔ，Ｃ．Ａ．，Ｌａｎｋｆｏｒｄ，Ｒ．，Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｆ．（１９９３）ｒＲＮＡの増幅による痰沈殿物からの直接的な結核菌の検出及び同定（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  ｓｐｕｔｕｍ  ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒＲＮＡ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１，２４１］のような、等温転写依拠増幅技術が、ミコバクテリアを検出するために利用されている。
【０００８】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ又はそれをコードする遺伝子を標的とする増幅反応は、通常、種特異的可変配列を含む保存領域に対して行われる［Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９３）ミコバクテリアの同定のための核酸配列依拠増幅（ＮＡＳＢＡ）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９，２４２３−２４２９．，Ｊｏｎａｓ，Ｖ．，Ａｌｄｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｙ，Ｊ．Ｉ．，Ｋａｍｉｓａｎｇｏ，Ｋ．，Ｋｎｏｔｔ，Ｃ．Ａ．，Ｌａｎｋｆｏｒｄ，Ｒ．，Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｆ．（１９９３）ｒＲＮＡの増幅による痰沈殿物からの直接的な結核菌の検出及び同定Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１，２４１］。それらは、１回の増幅反応でミコバクテリアの種を同定することができるという利点を有する。１６Ｓ  ｒＲＮＡを標的とする転写介在ＲＮＡ増幅アッセイのもう一つの利点は、細胞１個当たりの標的分子の数が±２０００と多いことであり、従って感度が有利である。
【０００９】
ＲＮＡ、特にｍＲＮＡは一般的にＤＮＡよりもはるかに短い半減期を有するため、その検出は、薬剤耐性及び患者の伝染性の問題と関連しているミコバクテリアの生存率の評価に有用であろう［Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｃｕｒｒｙ，Ｊ．Ｉ．，Ｋｎｏｔｔ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｊｏｎａｓ，Ｖ．．（１９９６）抗菌療法における肺結核患者の治療応答の評価のためのｒＲＮＡの増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒＲＮＡ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４，１７４５−１７４９．，Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９４）ＲＮＡ増幅によるミコバクテリアの生存率の評価（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉａｂｉｌｉｒｙ  ｂｙ  ＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８，１９５９−１９６５］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２００３６２号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第２０１１４８号明細書
【特許文献３】国際公開第８８／１０３１５号
【特許文献４】国際公開第８９／１０５０号
【特許文献５】欧州特許出願公開第３２３８２２号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第３７３９６０号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第４０８２９５号明細書
【特許文献８】欧州特許出願公開第６８２１２１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｉｔｓｃｈ，Ａ．ら，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ  １６７，７４０−７４３．，１９９３
【非特許文献２】Ｍｅｙｅｒ，Ｔ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．８，２６１−２７１．，１９９４
【非特許文献３】Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９３）ミコバクテリアの同定のための核酸配列基本増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＮＡＳＢＡ）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９，２４２３−２４２９
【非特許文献４】Ｊｏｎａｓ，Ｖ．，Ａｌｄｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒｙ，Ｊ．Ｉ．，Ｋａｍｉｓａｎｇｏ，Ｋ．，Ｋｎｏｔｔ，Ｃ．Ａ．，Ｌａｎｋｆｏｒｄ，Ｒ．，Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｆ．（１９９３）ｒＲＮＡの増幅による痰沈殿物からの直接的な結核菌の検出及び同定（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  ｓｐｕｔｕｍ  ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒＲＮＡ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１，２４１
【非特許文献５】Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｃｕｒｒｙ，Ｊ．Ｉ．，Ｋｎｏｔｔ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｊｏｎａｓ，Ｖ．．（１９９６）抗菌療法における肺結核患者の治療応答の評価のためのｒＲＮＡの増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒＲＮＡ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４，１７４５−１７４９
【非特許文献６】Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９４）ＲＮＡ増幅によるミコバクテリアの生存率の評価（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉａｂｉｌｉｒｙ  ｂｙ  ＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８，１９５９−１９６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、伸長因子ＥＦ−ＴｕをコードするｍＲＮＡの検出に基づく。
【００１３】
伸長因子ＥＦ−Ｔｕは、（ミコ）バクテリアの翻訳に必須である。伸長因子は、翻訳の伸長段階において補助的な役割を果たし、従って細胞の代謝活性の指標である。あらゆる翻訳にＥＦ−Ｔｕが必要である。ＥＦ−Ｔｕタンパク質の量は、活発に増殖する細胞においては、総タンパク質含量の５０％もの高さでありうる。
【００１４】
ＥＦ−Ｔｕコーディング遺伝子配列（ＤＮＡ）は、バクテリア細胞の存在を検出するためのマーカーとして用いられている。
【００１５】
ＥＰ１３３２８８においては、ｔｕｆ又はｆｕｓ遺伝子の一方の鎖の少なくとも一部の塩基配列を含むプローブを用いた、バクテリアＤＮＡの検出のための方法が開示されている。消化されたミコプラズマＤＮＡと、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の伸長因子（ＥＦ−Ｔｕ）遺伝子ｔｕｆとのサザンブロット・ハイブリダイゼーションが、ミコプラズマ株における多型を検出するための基礎として用いられた［Ｙｏｇｅｖら．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，５０（２−３），１４５−９，１９８８］。
【００１６】
標的配列として伸長因子Ｔｕをコードする遺伝子（ｔｕｆ）を用いた、ミコプラズマ・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びミコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の検出のためのＰＣＲに基づくアッセイも、記載されている［Ｂｅｒｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１０（１），７−１４，１９９６及びＬｕｎｅｂｅｒｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（５），１０８８−９４，１９９３］。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
しかし、本発明は、バクテリアの生存率に関するマーカーとしてのＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの検出に関する。
【００１８】
従って、本発明は、伸長因子ＥＦ−ＴｕをコードするｍＲＮＡが核酸増幅反応における標的として用いられ、かつ該ｍＲＮＡの存在及び／又は量が決定される、バクテリアの生存率の評価のための方法を提供する。
【００１９】
おそらく生存期間の短い、ＥＦ−ＴｕをコードするｍＲＮＡは、（ミコ）バクテリアの細胞に極めて豊富に存在する可能性が最も高く、その減少は代謝活性の減弱を示すであろう。さらに、ＥＦ−Ｔｕは、その必須の役割のため、全てのミコバクテリア種に存在すると推定することができ、従って、１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＮＡＳＢＡ設計［Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９３）ミコバクテリアの同定のための核酸配列基本増幅（ＮＡＳＢＡ）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９，２４２３−２４２９．］に類似した、種特異的なプライマー及び／又はプローブを用いた一般的な増幅系の開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】インビトロ作製されたミコバクテリアＥＦ−Ｔｕ  ＲＮＡを用いたＮＡＳＢＡの分析感度を示す図である。
【図１ｂ】インビトロ作製されたミコバクテリアＥＦ−Ｔｕ  ＲＮＡを用いたＮＡＳＢＡの分析感度を示す図である。
【図２】結核菌ＮＡＳＢＡの特異性を示す図である。
【図３】らい菌ＮＡＳＢＡの特異性を示す図である。
【図４】生存率評価のためのＮＡＳＢＡの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の方法により、好ましくは、ＮＡＳＢＡのような転写依拠増幅技術が、バクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの増幅のために用いられる。ＲＴ−ＰＣＲとは対照的に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｋｉｅｖｉｔｓら，１９９１；Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１）によるＲＮＡ転写に基づくＮＡＳＢＡは、ＲＮＡをその主要な標的として用いるため、ＲＮＡに由来する増幅産物とＤＮＡに由来する増幅産物とを区別する必要がない。
【００２２】
増幅産物は、相補的な標識されたプローブを用いて検出されうる。
【００２３】
増幅産物の検出のための多数のプロトコルが記載されている［Ｋｌａｔｓｅｒ，ＰＲ．（１９９５）ミコバクテリア研究における増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３，７５−８７．］。増幅が開始される前に増幅反応混合物を密封することが可能であるため、好ましくは均一アッセイが用いられる。そのような系の一つ、電気化学発光（ＥＣＬ）は、既にＮＡＳＢＡにおける増幅産物の検出への適用に成功している［Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ，Ｂｅｕｎｉｎｇｅｎ，Ｒ．ｖａｎ，Ｎａｂｂｅ，Ａ．，Ｓｔｒｉｊｐ，Ｄ．ｖａｎ，Ｊｕｒｒｉａａｎｓ，Ｓ．，Ｌｅｎｓ．Ｐ．，Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．（１９９４）電気化学発光（ＥＣＬ）標識プローブを用いた１チューブ定量的ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ＮＡＳＢＡ核酸増幅アッセイ（Ａ  ｏｎｅ−ｔｕｂｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ＮＡＳＢＡ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  （ＥＣＬ）  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ．）Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９，１５７−１６７．］。
【００２４】
本発明の方法は、結核菌又はらい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）のようなミコバクテリア種の生存率を評価するために特に有用である。
【００２５】
本発明により、バクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの増幅のためのプライマー及びプローブとして用いられうるオリゴヌクレオチドも提供される。
【００２６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドの使用は、任意の特定の増幅技術又はそれらの任意の特定の変法に限定されない。本発明に係るオリゴヌクレオチドには、多くの異なる核酸増幅技術、及び（増幅された）バクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの存在を検出するための様々な方法における用途があることは明白である。本発明のオリゴヌクレオチドは、同様に、定量的増幅法において用いられうる。そのような、定量的方法の一例は、ＥＰ５２５８８２に記載されている。
【００２７】
本明細書において用いられるように、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからなる分子をさす。そのようなオリゴヌクレオチドは、プライマー及びプローブとして用いられうる。
【００２８】
当然、本発明のオリゴヌクレオチドの配列に基づき、オリゴヌクレオチドの類似体を調製することもできる。そのような類似体は、「ＰＮＡ」（通常の核酸のリン酸糖骨格の代わりにペプチド様骨格をもつ分子）などのような代替的構造で構成されていてもよい。本発明の配列を表すこれらの代替的構造も同様に本発明の一部であることは明白である。
【００２９】
本明細書において用いられるように、「プライマー」という用語は、ヌクレオチド及びＤＮＡ依存性又はＲＮＡ依存性ポリメラーゼのような核酸重合のための因子の存在下で、適当な条件下（例えば、緩衝液、塩、温度、及びｐＨ）におかれた場合に、核酸鎖（鋳型又は標的配列）と相補的なプライマー伸長産物の合成の開始点として機能することができる、（例えば、制限断片として）天然に存在するか、又は合成的に作製されたオリゴヌクレオチドをさす。プライマーは、重合のための因子の存在下で伸長産物の合成をプライムするために充分な長さを有していなければならない。典型的なプライマーは、少なくとも約１０ヌクレオチド長の、標的配列と実質的に相補的又は相同である配列を含むが、それよりも幾分長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは、約１５〜２６ヌクレオチドを含むが、プライマーが特定のポリメラーゼのためのプロモーター配列のような付加的な配列を含む場合には特に、それより長いプライマーも使用されうる。
【００３０】
通常、プライマー・セットは、協同して増幅物（該プライマーを用いて増幅されるであろう配列）を定義する、少なくとも２つのプライマー、「上流」プライマーと「下流」プライマーとからなる。
【００３１】
主に転写依拠増幅技術における使用のため、本発明に係るオリゴヌクレオチドはプロモーター配列と連結していてもよい。「プロモーター配列」という用語は、認識された配列に結合し、ＲＮＡ転写物が作製される転写の過程を開始するＲＮＡポリメラーゼにより、特異的に認識される核酸配列の領域を定義する。原則的に、開始配列を認識することができる既知かつ利用可能なポリメラーゼが存在する任意のプロモーター配列が使用されうる。既知かつ有用なプロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、又はＳＰ６のようなある種のバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにより認識されるものである。プロモーター配列と連結したオリゴヌクレオチドは、一般的に「プロモーター・プライマー」と呼ばれる。
【００３２】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、バクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの配列と実質的に相補的であり、１０〜５０ヌクレオチド長であり、かつ配列番号１〜８に記された配列のうちの一つ又はそれらの相補的配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む。
【００３３】
配列番号１及び２（の一部）を含むオリゴヌクレオチドは、結核菌のＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡ配列の増幅に適していることが立証されている。増幅が転写依拠増幅技術を用いて実施される場合には、該オリゴヌクレオチドの一つがプロモーター配列を含んでいてもよい。当然、そのような「プロモーター・オリゴヌクレオチド」は、同様に、本発明の技術である。配列番号９に記された配列においては、Ｔ７プロモーターが配列番号１に記された配列と連結している。本願の実験的部分において、これらの配列は、ＴＵＦ１５（配列番号９）及びＴＵＦ１８（配列番号２）として示されている。
【００３４】
本発明は、らい菌由来のＥＦ−Ｔｕ配列の増幅のためのオリゴヌクレオチド対も提供する。この対は、それぞれ、配列番号３に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとからなる。
【００３５】
ここでも、転写依拠法における使用のため、オリゴヌクレオチドの一つがプロモーター配列と連結していてもよく、Ｔ７プロモーター配列が供与されたオリゴヌクレオチドが配列番号１０に記されている。本願の実験的部分において、そのような対は、ＴＵＦ２０（配列番号１０）及びＴＵＦ２２（配列番号４）と呼ばれている。
【００３６】
本発明は、大腸菌由来のＥＦ−Ｔｕ配列の増幅に適したオリゴヌクレオチド対をさらに提供する。
【００３７】
この対は、それぞれ、配列番号５に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６に記された配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとからなる。
【００３８】
ここでも、転写依拠法における使用のため、オリゴヌクレオチドの一つがプロモーター配列と連結していてもよく、Ｔ７プロモーター配列が供給されたオリゴヌクレオチドが配列番号１１に記されている。本願の実験的部分において、そのような対は、ＴＵＦ２７（配列番号１１）及びＴＵＦ２２（配列番号６）と呼ばれている。
【００３９】
従って、これらのオリゴヌクレオチドは、結核菌、らい菌、又は大腸菌の生存率の評価において特に有用である。
【００４０】
本発明の配列からなるオリゴヌクレオチドは、得られる収量又は産物に有意な程度の負の影響を与えない限りにおいて、核酸塩基の小さな欠失、付加、及び／又は置換を含んでいてもよい。本発明に係るオリゴヌクレオチドがプローブとして用いられる場合、変化はプローブのハイブリダイゼーション効率の低下をもたらすものであってはならない。
【００４１】
例えば、一つ又は複数のプライマーにプロモーター配列が供給されうる、転写依拠増幅技術の場合、プロモーター配列の直後へのプリン・リッチ（＝Ｇ又はＡ）なハイブリダイズ配列の導入は、転写に対する正の効果を有しうる（Ｃ及びＴが存在する場合、転写が失敗に終わることもある）。標的核酸内にそのような配列が利用可能でない場合には、オリゴヌクレオチドのプロモーター配列の最後の３個のＧ残基の直後にプリン・リッチな配列を挿入することができる。
【００４２】
本発明の配列は、ＤＮＡ配列として反映される。これらの配列のＲＮＡ等価物は、同様に、本発明の一部である。
【００４３】
本発明に係るオリゴヌクレオチドの一部は、本発明に係るオリゴヌクレオチド対を用いて増幅された核酸の検出におけるプローブとしての使用に特に適している。プローブとして用いられる場合、該オリゴヌクレオチドには、検出可能な標識が供与されうる。様々な標識部分が当分野において既知である。該部分は、例えば、放射性化合物、検出可能酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、ハプテン様ビオチン、又は比色シグナル、蛍光シグナル、化学発光シグナル、もしくは電気化学発光シグナルのような検出可能なシグナルを生じることができる任意のその他の部分であり得る。
【００４４】
本発明に係るオリゴヌクレオチドと（増幅された）標的核酸とのハイブリッドは、当業者に既知のその他の方法によっても検出されうる。ミコバクテリアＥｆ−Ｔｕ配列の検出のためのプローブとして特に適当な本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号７及び８に記された配列から本質的になる（実験的部分において、該配列は、それぞれＴＵＦ２５及びＴＵＦ２６として記されている）。
【００４５】
一方が捕捉プローブとして用いられ、他方が検出可能標識で標識されていてもよい、サンドイッチ・ハイブリダイゼーション・アッセイにおいて、これらのプローブを共に用いることができる。
【００４６】
試料中のミコバクテリアＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの検出のための試験キットも、同様に、本発明の一部である。そのようなキットは、以下のものを含みうる。
【００４７】
本発明に係るオリゴヌクレオチド対、及び検出可能な標識が供与された、増幅された核酸配列の少なくとも一部と実質的に相補的な核酸配列を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチド、並びに適当な増幅試薬。
【００４８】
これらの試薬は、例えば、増幅反応の実施のために適当な酵素である。例えばＮＡＳＢＡによる使用に適用されるキットは、適当な量の逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含みうる。該酵素は、緩衝溶液に含まれてキットに存在してもよいが、凍結乾燥組成物、例えば凍結乾燥球状粒子として提供されてもよい。そのような凍結乾燥粒子は、ＰＣＴ出願第ＥＰ９５／０１２６８号に開示されている。キットは、増幅反応の実施に適した緩衝組成物をさらに備えていてもよい。該緩衝剤は、キットが目的とする特定の増幅技術のため、そしてキットに供給された特定のオリゴヌクレオチドの使用のため、最適化されうる。ＮＡＳＢＡのような転写依拠増幅技術において、該緩衝剤は、例えば、（ＰＣＴ出願第ＵＳ９０／０４７３３号に開示されているような）増幅反応を増強するＤＭＳＯを含む。
【００４９】
さらに、キットには、増幅進行の確認として、そして増幅進行の失敗による偽陰性試験結果の発生を予防するため、内部対照が供給されてもよい。転写依拠増幅技術における内部対照の使用は、ＰＣＴ出願ＥＰ第９３／０２２４８号に記載されている。最適な対照配列は、増幅反応において標的核酸と競合しないように選択される。キットは、増幅の前に生物学的標本から核酸を単離するための試薬を含んでいてもよい。核酸の単離のための適当な方法は、ＥＰ３８９０６３に開示されている。
【実施例】
【００５０】
実施例：
実施例１：
結核菌、らい菌、及び大腸菌のＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの増幅のためのプライマー及びプローブの選択：
ＲＮＡの起源。表１は、本実施例及び以下の実施例において記載された実験において用いられたＲＮＡの起源を示す。培養可能なミコバクテリアは、ローエンスタイン・ジェンセン（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ−Ｊｅｎｓｅｎ）斜面において２〜３週間増殖させた。らい菌は、世界保健機関の推奨に従い［ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｌｅｐｒｏｓｙ．（１９８８）Ｓｉｘｔｈ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．８．７６８．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ］、実験的に感染させたアルマジロの脾組織から単離した。ヒト及び／又は動物の試料に見出されうるか、又はミコバクテリアと密接に関連するその他のバクテリア（表１参照）を、対照として用いた。アクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｖｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）に関しては、凍結乾燥されたバクテリアを用いた。インビトロＲＮＡの作製に用いられた株は以下に記載されている。
【００５１】
【表１】
2011050387.tif 000002
2011050387.tif 000003
2011050387.tif 000004
2011050387.tif 000005
【００５２】
核酸（ＮＡ）の単離。全ての実施例に記載された実験を実施するため、本発明者らが以前に記載したようにして核酸を単離した［Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９４）ＲＮＡ増幅によるミコバクテリアの生存率の評価Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８，１９５９−１９６５．］。要約すると、全てのバクテリア株を、以前に記載されたような第４Ｍｃｆａｒｌａｎｄ硫酸バリウム比濁計標準の濁度当量に調整した［Ｖｅｒｓｔｉｊｎｅｎ，Ｃ．Ｐ．Ｈ．Ｊ．，Ｈ．Ｍ．Ｌｙ，Ｋ．Ｐｏｌｍａｎ，Ｃ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｓ．Ｐ．Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．Ｙ．Ｍａｓｅｌｌｅ，Ｐ．Ｐｅｅｒｂｏｏｍｓ，Ｄ．Ｒｉｅｎｔｈｏｎｇ，Ｎ．Ｍｏｎｔｒｅｅｗａｓｕｗａｔ，Ｓ．Ｋｏａｎｊａｎａｒｔ，Ｄ．Ｄ．Ｔｒａｃｈ，Ｓ．Ｋｕｉｊｐｅｒ，ａｎｄ  Ａ．Ｈ．Ｊ．Ｋｏｌｋ（１９９１）初期培養物からのミコバクテリアの同定のためのモノクローナル抗体を用いた酵素結合イムノソルベント・アッセイＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９，１３７２−１３７５．］。５０μｌの希釈された試料は、約１０５個の生存ミコバクテリアを含むことが、コロニー形成単位の数を計数することにより決定された（らい菌に関しては行われていない）。Ｂｏｏｍら（１９９０）により記載された「プロトコルＹ／ＳＣ」に従い、この量を溶解及びＮＡ単離に用いた［Ｂｏｏｍ，Ｒ．，Ｃ．Ｊ．Ａ．Ｓｏｌ，Ｍ．Ｍ．Ｍ．Ｓａｌｉｍａｎｓ，Ｃ．Ｌ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅ．Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ（１９９０）．核酸の精製のための迅速かつ簡便な方法Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３．］。５０μｌ又は１００μｌのＲＮａｓｅを含まないＨ２Ｏを用いてシリカからＮＡを溶離させ、−２０℃で保存した。
【００５３】
ヒト胎盤ＮＡは、同様にして単離された（Ｄｒ．Ｈ．Ｓｍｉｔｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（オランダ、アムステルダム）より提供された）。２７０ｎｇのＮＡを含む２μｌを試験した。この量は、約４×１０５個の二倍体ヒト細胞に相当する。ヒトＮＡの他のバッチは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデン、ウプサラ）から商業的に入手した。
【００５４】
実施例２：
結核菌、らい菌、及び大腸菌のＥｆ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの増幅におけるＮＡＳＢＡの感度及び特異性：
プライマー及びプローブの選択。この研究において用いられたプライマー及びプローブを表２に挙げる。
【００５５】
【表２】
2011050387.tif 000006
【００５６】
結核菌（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６３５３９）、らい菌（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１３８６９）、大腸菌（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０１７１７）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１７７８８）、及びストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｉｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７７０３９）のＥｆ−Ｔｕ遺伝子の公開されたヌクレオチド配列を、適当なハードウェアにインストールされたソフトウェア・プログラムＧＣＧ（米国国立衛生研究所）を用いて整列させた。縮重プライマーＴＵＦ４及びＴＵＦ７（表２）は、表１に列挙された全ての生物から、ＰＣＲによりＥｆ−Ｔｕ遺伝子の７６４ｂｐＤＮＡ断片を増幅するために選択された。ＰＣＲは、７５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９．０、２０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１２５ｎｇの各プライマー、及び１Ｕ／反応のＧｏｌｄｓｔａｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ベルギー）を用いて実施された。ＰＣＲは、９４℃３分間のインキュベーションにより開始され、その後９４℃１．１５分、５５℃１分、７２℃２分のサイクルが３５回行われた。Ｃ．ベルファンティ、Ｈ．インフルエンザ、Ｓ．アウレウス、Ｓ．ニューモニエ、及びＨ．サピエンスを除く、表１に列挙された生物のＤＮＡの作製されたＰＣＲ断片は、過剰のプライマーを除去するためＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００  ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製された。精製された断片は、Ａｕｔｏｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びＡ．Ｌ．Ｆ．自動ＤＮＡシーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を適用することにより、プライマーＴＵＦ３Ｆ、４Ｆ、及び８Ｆを用いて、直接的に配列決定された。配列は、ＤＮＡＳＩＳソフトウェア・プログラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることにより編集され、その後ＰＣＧｅｎｅソフトウェア・プログラムを用いてクラスタル・アラインメント（ｃｌｕｓｔａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）が作製された。
【００５７】
プライマー及びプローブの選択。表３は、クラスタル・アラインメントに基づき決定されたＥｆ−Ｔｕ配列の７つの可変領域を示す。これらの可変領域から、異なる生物のＥｆ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの種特異的検出を可能にするプライマー及びプローブを選択することが可能である（表４）。
【００５８】
表５は、ＮＡＳＢＡによる結核菌、らい菌、及び大腸菌のＥｆ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの特異的増幅のためのプライマー及びプローブの選択の基礎となった、Ｅｆ−Ｔｕ配列の７つの可変領域のうちの２つ（領域ＩＶ及びＶＩ）のクラスタル・アラインメントを示す。これらの２つの区域を選択するための基準は、種特異的プライマー、属特異的プローブ、及び±２００ヌクレオチド長の増幅すべき断片が入手可能であることであった。
【００５９】
【表３】
2011050387.tif 000007
【００６０】
【表４】
2011050387.tif 000008
2011050387.tif 000009
2011050387.tif 000010
【００６１】
【表５】
2011050387.tif 000011
2011050387.tif 000012
【００６２】
これらのアラインメントに基づき、結核菌（ＴＵＦ１５及び１８）、らい菌（ＴＵＦ２０及び２２）、及び大腸菌（ＴＵＦ２７及び２８）について、ＮＡＳＢＡにおける使用のための種特異的プライマーを選択した。電気化学発光（ＥＣＬ）によるミコバクテリアＲＮＡアンプリコンの検出のため、属共通の捕捉プローブＴＵＦ２５及び検出プローブＴＵＦ２６を選択した。プローブＴＵＦ２５は、らい菌のＥｆ−Ｔｕ配列とは相同であるが、結核菌とは相同でない。差異は、一個のヌクレオチドである（Ｇ→Ａ；表２参照）。しかし、この差異は、結核菌由来のＲＮＡから作製されたアンプリコンの検出に影響を与えなかった。大腸菌ＲＮＡアンプリコンの検出のため、本発明者らは、特異的な捕捉プローブＴＵＦ２９及び検出プローブＴＵＦ３０を用いた。
【００６３】
領域ＩＶにおいて、結核菌のＥｆ−Ｔｕの公開された配列［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６３５３９］との１ヌクレオチドの差異が見出された。Ｍ．ツベルクローシス・コンプレックスに属する株のいずれにおいても、８５５位にＣが見出されなかった。しかし、プライマーの位置は、この不一致が増幅反応に影響を与えないような方法で選択された。
【００６４】
実施例３：
ＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡの増幅による大腸菌の特異性及び感度の試験
インビトロＲＮＡの単離
前記のようにして、プライマー・セットＴＵＦ４及びＴＵＦ７（表２）を用いたＰＣＲを介して、結核菌Ｈ３７Ｒｖ、らい菌、及び大腸菌のＥＦ−Ｔｕ遺伝子の７６４ｂｐ断片（表１）を増幅した。製造業者の指示に従いＴＡクローニング・キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅産物をｐＣＲＩＩベクターにクローニングした。正しい方向、大きさ、及び特異性で挿入配列を有する適当なクローンの選択が、制限酵素分析及びＰＣＲにより決定された。
【００６５】
制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによるプラスミドの直鎖化の後、ポリリンカー領域内にクローニングされた挿入配列を、ＳＰ６／Ｔ７転写キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてＴ７プロモーター部位から転写した。ＲＱＩ  ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）による消化によりＤＮＡ鋳型を除去し、製造業者のプロトコルに従いＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙキットによりＲＮＡを精製した。標準的な手順に従い、アガロースゲル電気泳動及びジゴキシゲニン標識プローブＴＵＦ２４を用いたノーザンブロッティングにより純度を確認した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、インビトロＲＮＡを定量した。
【００６６】
ＲＮＡ増幅
以前の記載［Ｖｌｉｅｔ，Ｇ．Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ，Ｓｃｈｅｐｅｒｓ，Ｐ．，Ｓｃｈｕｋｋｉｎｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ  ａｎｄ  Ｋｌａｔｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．（１９９４）ＲＮＡ増幅によるミコバクテリア生存率の評価Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８，１９５９−１９６５］に本質的に従い、ＮＡＳＢＡ技術により、結核菌、らい菌、及び大腸菌のＥＦ−Ｔｕ  ｍＲＮＡのそれぞれ２０３、１９７、及び１９８ヌクレオチドの断片を増幅した。２０μｌの反応混合物は、４０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１．５Ｍソルビトール、２．１ｍｇのＢＳＡ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、２ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、１．５ｍＭのＧＴＰ、及び０．５ｍＭ  ＩＴＰ、１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、０．２ｍＭのプライマー１及びプライマー２、０．０８Ｕ  ＲＮａｓｅＨ、３２Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、６．４Ｕ  ＡＭＶ−ＲＴポリメラーゼ、及びＲＮＡ標的からなっていた。ＲＮＡ標的の等温増幅を、４１℃で２．０時間これらの試料をインキュベートすることにより実施した。
【００６７】
増幅されたＲＮＡの検出を、以前の記載［Ｇｅｍｅｎ，Ｂ．ｖａｎ，Ｂｅｕｎｉｎｇｅｎ，Ｒ．ｖａｎ，Ｎａｂｂｅ，Ａ．，Ｓｔｒｉｊｐ，Ｄ．ｖａｎ，Ｊｕｒｒｉａａｎｓ，Ｓ．，Ｌｅｎｓ．Ｐ．，Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．（１９９４）電気化学発光（ＥＣＬ）標識プローブを用いた１チューブ定量的ＨＩＶ−１  ＲＮＡ  ＮＡＳＢＡ核酸増幅アッセイＪ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４９，１］に、５μｌのＮＡＳＢＡ増幅ＲＮＡをＲＮａｓｅを含まない水で２０倍に希釈するか、又は未希釈で使用するというわずかな改変を加え、ＥＣＬ検出アッセイにおける溶液内ハイブリダイゼーションにより行った。ＮＡＳＢＡ産物の捕捉には５’−ビオチン化プローブを用いた。用いた検出プローブは、標識されたトリス［２，２−ビピリジン］ルテニウム［ＩＩ］複合体であった。この標識は、電極の表面で起こる化学反応の結果として光を放出する。カットオフ値は３０００に設定した。ＥＣＬ検出アッセイは０から１０８の規模で測定した。
【００６８】
増幅の対照
ＮＡ抽出及び増幅の間に持ち越された混入物を確認するため、各実験に陰性対照（水のみ）を含ませた。これらの対照試料は、前記と同様にして抽出され、ＮＡＳＢＡにより増幅された。
【００６９】
ミコバクテリアＮＡＳＢＡの感度及び特異性
ＮＡＳＢＡの感度の決定のため、３７℃で液体Ｔｗｅｅｎ／アルブミン培地において結核菌ＡＴＣＣ３５８０１を増殖させた。培養開始時の濃度は８．１０６バクテリア／ｍｌであった。４２０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、バクテリアの増殖をモニターした。培養の１３日後、試料を採取し、溶解緩衝液で希釈した［Ｂｏｏｍ，Ｒ．，Ｃ．Ｊ．Ａ．Ｓｏｌ，Ｍ．Ｍ．Ｍ．Ｓａｌｉｍａｎｓ，Ｃ．Ｌ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅ．Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ（１９９０）核酸の精製のための迅速かつ簡便な方法Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３］。溶解緩衝液で段階希釈物を作製し、ＲＮＡを精製し［Ｂｏｏｍ，Ｒ．，Ｃ．Ｊ．Ａ．Ｓｏｌ，Ｍ．Ｍ．Ｍ．Ｓａｌｉｍａｎｓ，Ｃ．Ｌ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅ．Ｗｅｒｔｈｅｉｍ−Ｖａｎ  Ｄｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｏｏｒｄａａ（１９９０）核酸の精製のための迅速かつ簡便な方法Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３］、陽性ＮＡＳＢＡシグナルを与える最も高い希釈率を決定するため、各希釈物をＮＡＳＢＡで試験した。さらに、インビトロＲＮＡ（前記参照）の段階希釈物を用いて、ＮＡＳＢＡの分析感度を決定した。ＮＡＳＢＡの特異性を、異なる生物由来の精製されたＲＮＡを用いて決定した（表１、前記参照）。
【００７０】
大腸菌ＮＡＳＢＡの感度及び特異性
大腸菌をルリア・ブロス（ＬＢ）液体培地で３７℃で１８時間増殖させた。このようにして得られた懸濁液を新鮮な培地（１：２００）（ＯＤ６００ｎｍ＝０．０１５）に接種し、旋回振とう機中で３７℃で３時間１５分間インキュベートした（ＯＤ６００ｎｍ＝０．４３０）。段階希釈物を作製し、ｍＲＮＡを前記のようにして精製した。さらに、同希釈物をＬＢ寒天プレートに播き、それを３７℃で１８時間インキュベートした後、コロニーを計数した。
【００７１】
インビトロＲＮＡ（前記参照）の段階希釈物を用いて、ＮＡＳＢＡの分析感度を決定した。
【００７２】
結果：
ＮＡＳＢＡの感度。インビトロ作製されたＥｆ−Ｔｕ  ＲＮＡを用いたＮＡＳＢＡの分析感度を、図１ａ及び１ｂに図示する。結核菌ＮＡＳＢＡ及びらい菌ＮＡＳＢＡの両方が、５０分子のＲＮＡを検出した（図１ａ）。検出のための出発材料としてバクテリアを用いた場合の結核菌ＮＡＳＢＡの検出限界は、１２，０００であった（結果は示していない）。
【００７３】
大腸菌ＮＡＳＢＡの分析感度は１００分子であることが示された（図１ｂ）。検出のための出発材料としてバクテリアを用いた場合の大腸菌ＮＡＳＢＡの検出限界は、０．４であった（結果は示していない）。
【００７４】
ＮＡＳＢＡの特異性。結核菌ＮＡＳＢＡ及びらい菌ＮＡＳＢＡの特異性を、それぞれ図２及び３に図示する。
【００７５】
結核菌ＮＡＳＢＡは、Ｍ．ツベルクローシス・コンプレックスに属するバクテリアから精製されたＲＮＡにのみ特異性を示した。さらに、図２に図示されるように、結核菌ＮＡＳＢＡは、相同なインビトロ作製されたＥＦ−Ｔｕ  ＲＮＡを標的として用いた場合に、陽性反応を示した。
【００７６】
らい菌ＮＡＳＢＡは、らい菌ＲＮＡ及びその相同なインビトロ作製されたＲＮＡにのみ特異性を示した。
【００７７】
実施例４：
大腸菌の生存率試験
ＬＢ液体培地で３７℃で１８時間大腸菌を増殖させた。このようにして得られた懸濁液を新鮮な培地に接種し（１：１０００）（ＯＤ６００ｎｍ＝０．００１）に接種し、旋回振とう機中で３７℃で４時間インキュベートした。次に、懸濁液を二等分した。一方には、殺菌のための抗生物質：アンピシリン、リファンピリン、及びカナマイシン（それぞれ５０μｇ／ｍｌ）の混合物を添加した。もう一方は未処理のままにしておいた。両者を３７℃でさらに３時間３０分間インキュベートした。３０分毎に、６００ｎｍにおけるＯＤをモニターし、各培養物から１００の試料を採取し９００の溶解緩衝液に添加した。ｍＲＮＡを前記のようにして精製した（９）。さらに、試料（１００）をＬＢ寒天プレートに重層することにより、大腸菌の生存率をモニターした。３７℃で１８時間インキュベートした後、コロニーを計数した。
【００７８】
大腸菌を未処理のまま増殖させた場合、ＮＡＳＢＡシグナルは増加し、その最大レベルに達した（図４）。しかし、対数増殖期の大腸菌培養物に抗生物質を添加した場合には、ＮＡＳＢＡシグナルは抗生物質の添加の１時間後に減少した。このＮＡＳＢＡにより測定されたｍＲＮＡの減少は、生存数の減少と一致していた（図４）。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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