(57)【要約】【課題】生体試料の三次元形状を高精度に測定することが可能な構成の形状測定方法、画像処理プログラム、観察装置を提供する。【解決手段】生体試料たる受精卵とこの受精卵の像を結像する第１観察光学系との光学的距離を変化させながら第１撮像装置により受精卵を一方側から順次撮影した複数の第１画像と、受精卵とこの受精卵の像を結像する第２観察光学系との光学的距離を変化させながら第２撮像装置により受精卵を他方側から順次撮影した複数の第２画像とを取得し、複数の第１画像及び第２画像に基づいて合焦測度を画素単位で算出し、受精卵の一方側の領域については第１画像より得られた合焦測度情報を優先適用し、受精卵の他方側の領域については第２画像より得られた合焦測度情報を優先適用して各画素の合焦点を求め、合焦点位置に基づいて受精卵の三次元形状を構築する。【選択図】図９
2011017620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料と前記生体試料の像を結像する第１観察光学系との光学的距離を変化させながら第１撮像装置により前記生体試料を一方側から順次撮影した複数の第１画像と、前記生体試料と前記生体試料の像を結像する第２観察光学系との光学的距離を変化させながら第２撮像装置により前記生体試料を前記一方側に対向する他方側から順次撮影した複数の第２画像とを取得し、
前記複数の第１画像及び第２画像に基づいて合焦測度を画素単位で算出し、
前記生体試料の前記一方側の領域については前記第１画像より得られた合焦測度情報を優先適用し、前記生体試料の前記他方側の領域については前記第２画像より得られた合焦測度情報を優先適用して各画素の合焦点を求め、
前記合焦点位置に基づいて前記生体試料の三次元形状を構築することを特徴とする形状測定方法。
【請求項２】
前記第１及び第２撮像装置は、前記生体試料の位相差観察によって得られる位相差画像を撮影することを特徴とする請求項１に記載の形状測定方法。
【請求項３】
前記第１画像と前記第２画像との画像間で観察視野位置及び観察倍率を補正することを特徴とする請求項１または２に記載の形状測定方法。
【請求項４】
コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影されて画像を取得して画像処理する画像処理装置として前記コンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、
生体試料と前記生体試料の像を結像する第１観察光学系との光学的距離を変化させながら第１撮像装置により前記生体試料を一方側から順次撮影した複数の第１画像と、前記生体試料と前記生体試料の像を結像する第２観察光学系との光学的距離を変化させながら第２撮像装置により前記生体試料を前記一方側に対向する他方側から順次撮影した複数の第２画像とを取得するステップと、
前記複数の第１画像及び第２画像に基づいて合焦測度を画素単位で算出するステップと、
前記生体試料の前記一方側の領域については前記第１画像より得られた合焦測度情報を優先適用し、前記生体試料の前記他方側の領域については前記第２画像より得られた合焦測度情報を優先適用して各画素の合焦点を求めるステップと、
前記合焦点位置に基づいて前記生体試料の三次元形状を構築するステップとを
前記コンピュータに実現させることを特徴とする画像処理プログラム。
【請求項５】
前記第１及び第２撮像装置は、前記生体試料の位相差観察によって得られる位相差画像を撮影することを特徴とする請求項４に記載の画像処理プログラム。
【請求項６】
前記第１画像と前記第２画像との画像間で観察視野位置及び観察倍率を補正することを特徴とする請求項４または５に記載の画像処理プログラム。
【請求項７】
生体試料を保持する試料台と、
前記生体試料を一方側から撮像する第１撮像装置及び前記一方側に対向する他方側から撮像する第２撮像装置と、
前記試料台を前記生体試料の像を第１撮像装置の撮像面に結像させる第１観察光学系に対して相対移動させるとともに、前記第２撮像装置の撮像面に結像させる第２観察光学系に対して相対移動させる移動制御部と、
前記相対移動部により前記試料台を前記第１及び第２観察光学系に対して相対移動させながら前記第１及び第２撮像装置により撮像して得られた、前記生体試料の複数の第１画像及び第２画像に対して画像処理を行う画像処理装置とを備え、
前記画像処置装置が、前記複数の第１画像及び第２画像に基づいて合焦測度を画素単位で算出し、前記生体試料の前記一方側の領域については前記第１画像より得られた合焦測度情報を優先適用し、前記生体試料の前記他方側の領域については前記第２画像より得られた合焦測度情報を優先適用して各画素の合焦点を求め、前記合焦点位置に基づいて前記生体試料の三次元形状を構築する画像解析部を備えていることを特徴とする観察装置。
【請求項８】
前記第１及び第２撮像装置は、前記生体試料の位相差観察によって得られる位相差画像を撮影することを特徴とする請求項７に記載の観察装置。
【請求項９】
前記画像処理装置が、前記第１画像と前記第２画像との画像間で観察視野位置及び観察倍率を補正する画像補正部を備えていることを特徴とする請求項７または８に記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば受精卵等の生体試料の三次元形状を構築することが可能な構成の形状測定方法、画像処理プログラム、及び観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の発展に伴い、体外受精による受精卵を培養しながらその生育状態を観察することが行われている。受精卵などの培養物の状況を観察する装置の例として、培養顕微鏡が挙げられる（例えば、特許文献１を参照）。培養顕微鏡は、受精卵の培養に好適な環境を形成する培養装置（インベキュータ）と、培養装置に収容された培養容器内の受精卵の状態を顕微観察する顕微観察系とを備え、予め設定された一定時間ごとに受精卵の観察画像を取得し、受精卵の生育状態の観察、記録、管理等を自動で行うことができるように構成される。
【０００３】
受精卵等のほぼ無色透明な生体試料を染色することなく生きたまま観察が可能な顕微観察系としては例えば位相差顕微鏡が挙げられる。位相差顕微鏡においては、生体試料を開口絞りで輪帯状に制限された照明光で照明し、対物レンズにより生体試料を通過させた光を集光させ、位相を変換するとともに透過する光の光量を調節する位相リングを上記開口絞りと共役位置に備えるものが周知となっている（例えば、特許文献２を参照）。生体試料を通過する光は、直接光と０次以外の回折光に変換されて位相差が生じ、この位相差を像の明暗として可視化することによりコントラストを上げて生体試料を観察できるようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２２９６１９号公報
【特許文献２】特許第３６６３９２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
さて、受精卵の良否（生育状態）を評価する一手法としては、受精卵の卵内全ての細胞が同時期のタイミングで卵割（細胞分裂）することが好ましいとされている。初期の卵割においては観察方向に対して重なる細胞も少ないため卵割タイミングを容易に観察できるものの、卵割が進むにつれて細胞数も倍増していき観察方向に対して細胞が重なってしまうため（オクルージョンが生じるため）、上記のような位相差顕微鏡での２次元観察では、卵内全ての細胞が同時期に卵割したか否かを定量的に評価するのは困難であった。なお、３次元形状を観察する手法としては、自家蛍光を用いた共焦点顕微観察法があるが、この観察法には、観察に時間が掛かる（１つの画像を取得するのにスキャン時間が長い）上、細胞へのダメージが大きいという弊害があるため、受精卵の観察には不適である。
【０００６】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたものであり、生体試料の三次元形状を高精度に測定することが可能な構成の形状測定方法、画像処理プログラム、観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明を例示する第１の態様に従えば、生体試料と生体試料の像を結像する第１観察光学系との光学的距離を変化させながら第１撮像装置により生体試料を一方側から順次撮影した複数の第１画像と、生体試料と生体試料の像を結像する第２観察光学系との光学的距離を変化させながら第２撮像装置により生体試料を一方側に対向する他方側から順次撮影した複数の第２画像とを取得し、複数の第１画像及び第２画像に基づいて合焦測度を画素単位で算出し、生体試料の一方側の領域については第１画像より得られた合焦測度情報を優先適用し、生体試料の他方側の領域については第２画像より得られた合焦測度情報を優先適用して各画素の合焦点を求め、合焦点位置に基づいて生体試料の三次元形状を構築することを特徴とする形状測定方法が提供される。
【０００８】
本発明を例示する第２の態様に従えば、コンピュータにより読み取り可能であり、撮像装置により撮影されて画像を取得して画像処理する画像処理装置としてコンピュータを機能させるための画像処理プログラムであって、生体試料と生体試料の像を結像する第１観察光学系との光学的距離を変化させながら第１撮像装置により生体試料を一方側から順次撮影した複数の第１画像と、生体試料と生体試料の像を結像する第２観察光学系との光学的距離を変化させながら第２撮像装置により生体試料を一方側に対向する他方側から順次撮影した複数の第２画像とを取得するステップと、複数の第１画像及び第２画像に基づいて合焦測度を画素単位で算出するステップと、生体試料の一方側の領域については第１画像より得られた合焦測度情報を優先適用し、生体試料の前記他方側の領域については第２画像より得られた合焦測度情報を優先適用して各画素の合焦点を求めるステップと、合焦点位置に基づいて生体試料の三次元形状を構築するステップとをコンピュータに実現させることを特徴とする画像処理プログラムが提供される。
【０００９】
本発明を例示する第３の態様に従えば、生体試料を保持する試料台と、生体試料を一方側から撮像する第１撮像装置及び一方側に対向する他方側から撮像する第２撮像装置と、試料台を生体試料の像を第１撮像装置の撮像面に結像させる第１観察光学系に対して相対移動させるとともに、第２撮像装置の撮像面に結像させる第２観察光学系に対して相対移動させる移動制御部と、相対移動部により試料台を第１及び第２観察光学系に対して相対移動させながら第１及び第２撮像装置により撮像して得られた、生体試料の複数の第１画像及び第２画像に対して画像処理を行う画像処理装置とを備え、画像処置装置が、複数の第１画像及び第２画像に基づいて合焦測度を画素単位で算出し、生体試料の一方側の領域については第１画像より得られた合焦測度情報を優先適用し、生体試料の他方側の領域については第２画像より得られた合焦測度情報を優先適用して各画素の合焦点を求め、合焦点位置に基づいて生体試料の三次元形状を構築する画像解析部を備えていることを特徴とする観察装置が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体試料の三次元形状を高精度に構築することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の適用例として示す培養観察システムの概要構成図である。
【図２】上記培養観察システムのブロック図である。
【図３】（Ａ）は培養容器の平面図であり、（Ｂ）はディッシュを示す斜視図である。
【図４】受精卵の卵割の過程を説明するための図である。
【図５】位相差顕微鏡装置の構成例を示す図である。
【図６】第１位相差顕微鏡による位相差観察を説明するための図である。
【図７】第２位相差顕微鏡による位相差観察を説明するための図である。
【図８】画像処理装置の概要構成を示すブロック図である。
【図９】形状測定方法の概要を示すフローチャートである。
【図１０】パラメータ取得方法を説明するためのフローチャートである。
【図１１】従来のＳＦＦ方式を説明するための図である。
【図１２】本実施形態のＳＦＦ処理を説明するためのフローチャートである。
【図１３】ＳＦＦ処理による合焦点算出を説明するための図である。
【図１４】位相差顕微鏡装置の構成の変形例を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について、図面を参照しながら説明する。本実施形態に係る観察ユニット（観察装置）を適用したシステムの一例として、培養観察システムの概要構成図及びブロック図を、それぞれ図１及び図２に示す。
【００１３】
培養観察システムＢＳは、大別的には、筐体１の上部に設けられた培養室２と、複数の培養容器１０を収容保持する棚状のストッカー３と、培養容器１０内の試料を観察する観察ユニット（観察装置）５と、培養容器１０をストッカー３と観察ユニット５との間で搬送する搬送ユニット４と、システムの作動を統括的に制御する制御ユニット６と、画像表示装置を備えた操作盤７などから構成される。
【００１４】
培養室２は、培養環境を形成する部屋であり、環境変化やコンタミネーションを防止するためサンプル投入後は密閉状態に保持される。培養室２に付随して、培養室２内の温度を昇温・降温させる温度調整装置２１、湿度を調整する加湿器２２、ＣＯ２ガスやＮ２ガス等のガスを供給するガス供給装置２３、培養室２全体の環境を均一化させるための循環ファン２４、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等を検出する環境センサ２５などが設けられている。各機器の作動は制御ユニット６により制御され、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度等により規定される培養環境が、操作盤７において設定された培養条件に合致した状態に維持される。
【００１５】
ストッカー３は、図１における紙面直行の前後方向、及び上下方向にそれぞれ複数に仕切られた棚状に形成されている。各棚にはそれぞれ固有の番地が設定されており、例えば前後方向をＡ〜Ｃ列、上下方向を１〜７段とした場合に、Ａ列５段の棚がＡ−５のように設定される。
【００１６】
培養容器１０は、培養物の種類や目的等に応じてフラスコやディッシュ、ウェルプレートなど適宜なものが選択され、本実施形態では、図３（Ａ）に示すように、直径約３５ｍｍの５つのディッシュ１０ａと、ディッシュ１０ａを保持するホルダ１０ｂとを備えた構成を例示しており、図３（Ｂ）に示すように、培養物たる受精卵Ｊは、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬が入った培地ドロップＤとともに各ディッシュ１０ａに注入される。ディッシュ１０ａの底面には、ピペット等により滴下された２０μｌ程度の培地ドロップＤが１〜複数個形成されており（図３（Ｂ）では１個のみを図示）、培地ドロップＤはディッシュ１０ａ内において無色透明のミネラルオイルＯによって浸された状態となっている。それぞれの培地ドロップＤ内には、例えば対外受精のために同一母体から同時期に採卵された受精卵Ｊが１個ずつ挿入されている。また、培養容器１０にはコード番号が付与され、ストッカー３の指定番地に対応づけて収容される。
【００１７】
搬送ユニット４は、培養室２の内部に設けられて上下移動可能なＺステージ４１、前後移動可能なＹステージ４２、左右移動可能なＸステージ４３などからなり、Ｘステージ４３の先端側に培養容器１０を持ち上げ支持する支持アーム４５が設けられている。搬送ユニット４は、支持アーム４５がストッカー３の全棚と観察ユニット５との間を移動可能な移動範囲を有して構成される。
【００１８】
観察ユニット（観察装置）５は、試料台１５の試料を照明するバックライト照明部５１、顕微観察系の光軸に沿って試料台１５の試料を照明する透過照明部５２、試料のマクロ観察を行うマクロ観察系５４、試料のミクロ観察を行う顕微観察系５５、及び画像処理装置１００などから構成される。試料台１５は、透光性を有する材質で構成されるとともに観察領域に透明な窓部１６が設けられている。また、試料台１５は、制御ユニット６からの作動制御によりＸＹ方向（水平面内方向）およびＺ方向（上下方向）に移動可能な微細駆動ステージからなり、その上面部に載置された培養容器１０をＸＹ方向に移動させることにより、培養容器１０をマクロ観察系５４もしくは顕微観察系５５の光軸上へ挿入したり、培養容器１０をＺ方向に移動させることにより、各観察系５４，５５の観察光学系と試料との光軸方向の相対位置（光学的距離）を変化させることが可能になっている。
【００１９】
バックライト照明部５１は、下部フレーム１ｂ側に設けられた面発光の光源からなり、試料台１５の下側から培養容器１０全体をバックライト照明する。透過照明部５２は、ＬＥＤ等の光源８１，９１（図５を参照）と、位相リングやコンデンサレンズ等からなる照明光学系８２ａ，９２ａ（図５を参照）とを有して培養室２内及び下側フレーム１ｂ内にそれぞれ設けられており、顕微観察系５５の光軸に沿って培養容器１０中の試料を照明する。
【００２０】
マクロ観察系５４は、観察光学系５４ａと、この観察光学系５４ａにより結像された試料の像を撮影するＣＣＤカメラ等の撮像装置５４ｃとを有し、バックライト照明部５１の上方に位置して培養室２内に設けられている。マクロ観察系５４は、バックライト照明部５１により照明された培養容器１０の上方からの全体観察画像（マクロ画像）を撮影する。
【００２１】
顕微観察系５５は、対物レンズや位相リング等からなる観察光学系８２ｂ，９２ｂ（図５を参照）と、観察光学系８２ｂ，９２ｂにより結像された試料の像を撮影する冷却ＣＣＤカメラ等の撮像カメラ８９，９９（図５を参照）とを有し、培養室２内及び下部フレーム１ｂ内にそれぞれ配設されている。上記の透過照明部５２と顕微観察系５５とにより位相差顕微鏡装置５６が構成されている。顕微観察系５５は、透過照明部５２により照明されて試料を透過した透過光を顕微鏡観察した顕微観察画像（ミクロ画像）を撮影する。
【００２２】
画像処理装置１００は、マクロ観察系５４の撮像装置５４ｃ及び顕微観察系５５の撮像カメラ８９，９９から入力された信号をＡ／Ｄ変換するとともに、各種の画像処理を施して全体観察画像または顕微観察画像の画像データを生成する。また、画像処理装置１００は、これらの観察画像（全体観察画像及び顕微観察画像）の画像データに対して画像解析を施し、受精卵Ｊの三次元形状の構築等を行う。画像処理装置１００は、具体的には、次述する制御ユニット６のＲＯＭに記憶された画像処理プログラムが実行されることにより構築される。なお、この画像処理装置１００については、後に詳述する。
【００２３】
制御ユニット６は、処理を実行するＣＰＵ６１、培養観察システムＢＳの制御プログラムや制御データ等が設定記憶されたＲＯＭ６２、観察条件や画像データ等を一時記憶するＲＡＭ６３などを有し、培養観察システムＢＳの作動を制御する。そのため、図２に示すように、培養室２、搬送ユニット４、観察ユニット５、操作盤７の各構成機器が制御ユニット６に接続されている。ＲＡＭ６３には、観察プログラムに応じた培養室２の環境条件や、観察スケジュール、観察ユニット５における観察種別や観察位置、観察倍率等が設定され記憶される。また、ＲＡＭ６３には、観察ユニット５により撮影された画像データを記録する画像データ記憶領域が設けられ、培養容器１０のコード番号や撮影日時等を含むインデックス・データと画像データとが対応付けて記録される。
【００２４】
操作盤７には、キーボードやスイッチ等の入出力機器が設けられた操作パネル７１、操作画面や画像データ等を表示する表示パネル７２が設けられ、操作パネル７１において観察プログラムの設定や条件選択、動作指令等の入力が行われる。通信部６５は有線または無線の通信規格に準拠して構成されており、この通信部６５に外部接続されるコンピュータ等との間でデータの送受信が可能になっている。
【００２５】
このように概要構成される培養観察システムＢＳでは、操作盤７において設定された観察プログラムの設定条件に従い、ＣＰＵ６１がＲＯＭ６２に記憶された制御プログラムに基づいて各部の作動を制御するとともに、培養容器１０内の試料の撮影を自動的に実行する。すなわち、操作パネル７１に対するパネル操作（または通信部６５を介したリモート操作）によって観察プログラムがスタートされると、ＣＰＵ６１が、ＲＡＭ６３に記憶された環境条件の各条件値を読み込むとともに、環境センサ２５から入力される培養室２の環境状態を検出し、条件値と実測値との差異に応じて温度調整装置２１、加湿器２２、ガス供給装置２３、循環ファン２４等を作動させて、培養室２の温度や湿度、二酸化炭素濃度などの培養環境についてフィードバック制御が行われる。
【００２６】
また、ＣＰＵ６１は、ＲＡＭ６３に記憶された観察条件を読み込む、観察スケジュールに基づいて搬送ユニット４のＸ，Ｙ，Ｚステージ４１，４２，４３を作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５の試料台１５に搬送して、観察ユニット５による観察を開始させる。例えば、観察プログラムにおいて設定された観察がマクロ観察である場合には、搬送ユニット４によりストッカー３から搬送してきた培養容器１０をマクロ観察系５４の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、バックライト照明部５１の光源を点灯させて、バックライト照明された培養容器１０の上方から撮像装置５４ｃにより全体観察像を撮影する。撮像装置５４ｃから制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて全体観察画像が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００２７】
また、観察プログラムにおいて設定された観察が、培養容器１０内の特定位置の試料のミクロ観察である場合には、搬送ユニット４により搬送してきた培養容器１０内の特定位置を顕微観察系５５の光軸上に位置決めして試料台１５に載置し、透過照明部５２の光源を点灯させて、透過照明による顕微観察像を撮像カメラ８９，９９に撮影させる。撮像カメラ８９，９９により撮影されて制御ユニット６に入力された信号は、画像処理装置１００により処理されて顕微観察画像（位相差画像）が生成され、その画像データが撮影日時等のインデックス・データなどとともにＲＡＭ６３の画像データ記憶領域に記憶される。
【００２８】
ＣＰＵ６１は、上記のような全体観察像の撮影や顕微観察像の撮影を、観察プログラムに設定された観察スケジュールに基づいて順次実行する。ＲＡＭ６３に記憶された画像データは、操作パネル７１から入力される画像表示指令に応じてＲＡＭ６３から読み出され、例えば指定時刻の全体観察画像や顕微観察画像、画像解析の解析結果などが表示パネル７２に表示される。
【００２９】
ここで、観察対象である受精卵の卵割（受精卵の細胞分裂）の経時的変化について図４を参照して説明する。なお、図４は、人の受精卵の卵割の様子を模式的に示す図であり、図中では第３世代までを例示しており、左から右に向かって時間が経過していくものとする。卵割前の受精卵Ｊの胚Ｈを第０世代とすると、第０世代の胚Ｈの表面にくびれが生じて２つに分裂され、第１世代の２つの細胞Ｃ，Ｃが生成される。さらに第１世代の各細胞Ｃが２つに分裂されて第２世代の４つの細胞Ｃ，Ｃ，…が生成され、第３世代、…と進むにつれて細胞Ｃの数が倍々に増えていく。このように卵割を経るごとに細胞Ｃの数は倍増するとともに、個々の細胞Ｃ自体の大きさは小さくなっていく。
【００３０】
受精卵Ｊの良否の評価手法としては、卵内の全ての細胞Ｃにおいて卵割がほぼ同じタイミングで起こるか否かに基づいて行われる。すなわち、正常な受精卵Ｊの卵割については、同じ世代の各細胞Ｃはほぼ同時期のタイミングで分裂し、胚Ｈ内には同じ世代の細胞Ｃのみが存在する。一方、異常な受精卵Ｊの卵割については、同じ世代の細胞Ｃであっても分裂するタイミングがずれて、胚Ｈ内には異なる世代の細胞Ｃが混在してしまう。
【００３１】
このように受精卵Ｊの生育状態を評価するには、受精卵Ｊの卵割のタイミングを適正に観察することが必要である。初期の卵割に対しては分裂した細胞数も比較的少ないため所定の観察方向に対して細胞Ｃが重なることも殆どなく卵割のタイミングを観察できるものの、卵割が進むにつれて細胞数が増えるため、観察方向に対して細胞Ｃが重なったり細胞Ｃのくびれが隠れたりする（所謂オクルージョンが生じる）ことがある。そのため、各細胞に対して卵割のタイミングを適切に観察して、定量的な評価を行うことが困難であるという問題がある。
【００３２】
このような不具合を是正するため、培養観察システムＢＳにおいては、観察ユニット５の位相差顕微装置５６（透過照明部５２及び顕微観察系５５）をほぼ上下対称に配置した２つの位相差顕微鏡から構成して上下２方向から受精卵Ｊを観察可能にし、この２方向からの観察画像に対して画像処理装置１００による画像解析を施すことより受精卵Ｊの三次元形状を構築して、受精卵Ｊの卵割を適正に観察することができるように構成されている。
【００３３】
それでは、観察ユニット５における位相差顕微鏡装置５６の構成について図５〜図７を追加参照して説明する。前述の観察ユニット５において、透過照明部５２と顕微観察系５５とからなる位相差顕微鏡装置５６は、第１位相差顕微鏡８０と第２位相差顕微鏡９０との２つの顕微鏡から構成されており、これら位相差顕微鏡８０，９０は試料台１５の試料面に対してほぼ上下対称に配置されている。
【００３４】
第１位相差顕微鏡８０は、透過照明部５２において培養室２内に設けられた光源８１及び照明光学系８２ａと、顕微観察系５５において下部フレーム１ｂ内に設けられた観察光学系８２ｂ及び撮像カメラ８９とを有して構成される。
【００３５】
照明光学系８２ａは、光源側から順に、コレクタレンズ８３、輪帯絞り８４、可動式折り返しミラー８５、及びコンデンサ兼対物レンズ８６を備えて構成される。観察光学系８２ｂは、光源側から順に、コンデンサ兼対物レンズ９６、位相リング８７、及び結像レンズ８８を備えて構成される。
【００３６】
一方、第２位相差顕微鏡９０は、透過照明部５２において下部フレーム１ｂ内に設けられた光源９１及び照明光学系９２ａと、顕微観察部５５において培養室２内に設けられた観察光学系及９２ｂ及び撮像カメラ９９とを有して構成される。
【００３７】
照明光学系９２ａは、光源側から順に、コレクタレンズ９３、輪帯絞り９４、可動式折り返しミラー９５、及びコンデンサ兼対物レンズ９６を備えて構成される。観察光学系９２ｂは、光源側から順に、コンデンサ兼対物レンズ８６、位相リング９７、及び結像レンズ９８を備えて構成される。
【００３８】
このような位相差顕微８０，９０において、一方の可動式折り返しミラー８５から他方の可動式折り返しミラー９５までの光路は共通している。各位相差顕微鏡８０，９０の光源８１，９１としては、例えばＬＥＤやハロゲンランプ、高圧水銀ランプ等が用いられる。コンデンサ兼対物レンズ８６は、照明光学系８２ａにおいてはコンデンサレンズとして機能し、観察光学系９２ｂにおいては対物レンズとして機能する。同様に、コンデンサ兼対物レンズ９６は、照明光学系９２においてはコンデンサレンズとして機能し、観察光学系８２ｂにおいては対物レンズとして機能する。また、各位相差顕微鏡８０，９０には、可動式折り返しミラー８５，９５を照明光学系８２ａ，９２ａ及び観察光学系８２ｂ，９２ｂの光軸上にそれぞれ進退自在に移動させるミラー駆動部５７（図２を参照）が設けられている。ミラー駆動部５７は、制御ユニット６からの駆動信号に応じて駆動するようになっている。
【００３９】
なお、上述の構成において、可動式折り返しミラー８５，９５に替えてビームスプリッタを用いて構成してもよい。その場合には、照明光学系８２ａ，９２ａ及び観察光学系８２ｂ，９２ｂに進退移動させるミラー駆動部５７を省略することができるが、その代わりに、位相リング８７，９７の直前に補償光学系を挿入することが必要になる。
【００４０】
このように構成される第１位相差顕微鏡８０において、図６に示すように、光源８１から射出された照明光は、コレクタレンズ８３により略平行光束に変換され、輪帯形状（リング形状）のスリットが設けられた輪帯絞り８４に入射する。輪帯絞り８４のスリットを通過した光は、可動式折り返しミラー８５によって略垂直下方へ（折り曲げられるように）反射された後、コンデンサ兼対物レンズ８６によって集光され、試料台１５に載置された培養容器１０内の試料（受精卵Ｊ）に照射される。
【００４１】
試料に照射された照明光は、試料を透過する直接光と、位相物体である試料により回折される回折光とに分かれる。この回折現象は屈折率に違いのある部位で発生するため、当該回折光は、位相物体（受精卵Ｊ）と培地ドロップＤとの境界部分、位相物体の内部構造等の位相物体の形状情報を含んでおり、この回折により照明光に対して位相が１／４波長だけ遅れることとなる。これら直接光及び回折光はコンデンサ兼対物レンズ９６に集光されて、輪帯絞り８４と共役な位置に配置された位相リング８７に入射する。
【００４２】
位相リング８７に入射する光のうち直接光は、輪帯絞り８４のスリットとほぼ同じ形状（リング状）に形成された位相板８７ａに入射して、位相板８７ａによって光の一部が吸収されて光量が弱められるとともに、位相が照明光の１／４波長だけずらされる。一方、位相リング８７に入射する光のうち回折光は、位相板８７ａ以外の部分をそのまま透過する。位相リング８７を通過した直接光及び回折光は結像レンズ８８により結像されて、撮像カメラ８９の撮像面上で干渉する。このとき、直接光の位相は位相板８７ａによって１／４波長だけずれているため、直接光と回折光との位相差は１／２波長若しくは０になっており、その干渉によって位相の変化を光の明暗として可視化されている。これにより、撮像カメラ８９の撮像面上には明暗のコントラストがついた試料（受精卵Ｊ）の拡大像が形成され、撮像カメラ８９により撮像されることになる。なお、第１位相差顕微鏡８０による観察のときには、第２位相差顕微鏡９０の可動式折り返しミラー９５はミラー駆動部５７により観察光学系８２ｂの光路上から退避されている。
【００４３】
このとき上述したように、培養容器１０を載置する試料台１５は観察光学系８２ｂの光軸方向に沿った方向（Ｚ方向）に往復移動可能であり、試料と観察光学系８２ｂとの相対位置（光学的距離）が変化することで、光学系の焦点位置が連続的に変化するようになっている。これに対し、撮像カメラ８９は試料の下方からの撮像を連続的に行うため、試料台１５の往復移動に応じてコントラストが変化する複数の画像を所定の撮像ピッチ（観察対象の受精卵の大きさによって適宜なピッチが選択されるようになっており、例えばミクロンピッチ）で撮像することが可能である。
【００４４】
以上に第１位相差顕微鏡８０の光学系の作用を概略説明したが、第２位相差顕微鏡９０に関してもほぼ同様であるため（図７を参照）、第２位相差顕微鏡９０についてのその説明は省略することとするが、第２位相差顕微鏡９０でも、試料台１５を観察光学系９２ｂの光軸方向に沿った方向に往復移動させながら撮像カメラ９９によって試料の撮像を上方から連続的に行うことで、試料台１５の往復移動に応じてコントラストが変化する複数の画像を所定の撮像ピッチで撮像することが可能である。
【００４５】
このように位相差顕微鏡８０，９０では、試料と観察光学系との相対位置（光学系の焦点位置）を変化させながら、上下２方向から試料の観察画像を撮像カメラ８９，９９によってそれぞれ連続的に撮影することができる。なお、第１位相差顕微鏡８０と第２位相差顕微鏡９０とによる同時観察は行わず、光源８１，９１をオン／オフ切り換えて、所定の撮像ピッチ（試料台１５の１ピッチ送り）ごとに撮像カメラ８９，９９で交互に撮像することが望ましい。これは、受精卵Ｊのような透明な試料を第１及び第２位相差顕微鏡８０，９０により上下から同時に観察すると、対向する光学系の照明光により位相コントラストを低下させてしまう虞があるからであり、後述するＳＦＦ方式による観察を行うためには位相差顕微鏡８０，９０を順次切り換えて観察することが好ましい。
【００４６】
撮像カメラ８９，９９は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を有しており、撮像素子の撮像面上に形成された試料の拡大像を撮像して得られた画像信号を画像処理装置１００へ出力する。また、画像処理装置１００には、撮像カメラ８８，８９からの画像信号の他に、試料台（微細駆動ステージ）１５に内蔵されたリニアエンコーダ１７（図８を参照）からの検出信号が入力される。そのため、試料の表面を撮像したときの試料台１５の光軸軸方向位置（Ｚ方向位置）を知ることができる。
【００４７】
本実施形態において、画像処理装置１００は、撮像カメラ８９，９９から入力された試料表面の複数の画像に対し、所定の画像処理を行うことで、試料の三次元形状を求めることが可能である。ここで、図８に、画像処理装置１００の概要構成をブロック図として示す。この画像処理装置１００は、撮像カメラ８９，９９により所定の撮像ピッチ（サンプリング間隔）で観察対象の受精卵Ｊが撮影された複数の顕微観察画像を取得して記憶する画像記憶部１１０と、予め撮像カメラ８９，９９により撮影された画像に基づいて画像補正用のパラメータを求めて撮像カメラ８９，９９から取得した受精卵の観察画像に対して視野位置及び倍率差の補正を施す画像補正部１２０と、撮像取得された観察画像（顕微観察画像）と当該撮像取得が行われたときの試料台１５の位置情報に基づいて所定の画像処理を施して受精卵の三次元形状を構築する画像解析部１３０と、画像解析部１３０により解析された結果を外部に出力する出力部１４０とを備え、画像解析部１３０により構築された受精卵の三次元形状データを、例えば表示パネル７２に出力して表示させるように構成される。画像処理装置１００は、ＲＯＭ６２に予め設定記憶された画像処理プログラムＧＰがＣＰＵ６１に読み込まれ、ＣＰＵ６１によって画像処理プログラムＧＰに基づく処理が順次実行されることによって構成される。
【００４８】
それでは、図９に示すフローチャートを参照して、受精卵Ｊの三次元形状を求めるための形状測定方法について説明する。記述したように、培養観察システムＢＳでは、観察プログラムにおいて設定された観察条件に従って、所定時間ごとに指定された培養容器１０内の受精卵観察が行われる。
【００４９】
ステップＳ１において、画像処理装置１００は、第１位相差顕微鏡８０と第２位相差顕微鏡９０との観察視野及び観察倍率差を調節する（位相差顕微鏡８０，９０の観察画像をマッチングさせる）ための画像補正パラメータを取得する。ここで、図１０のフローチャートを参照してパラメータ取得処理の詳細について説明する。
【００５０】
ステップＳ１１では、位相差のある所定のマーカを予め試料台１５に載置しておき、画像補正部１２０が、第１位相差顕微鏡８０の撮像カメラ８９にマーカを下側から撮像させるととともに、第２位相差顕微鏡９０の撮像カメラ９９にマーカを上側から撮像させて、上下２方向からのマーカ画像を得る。マーカには、卵細胞のモデルとなる高精度の球体からなる透明ビーズや、既知のパターンを持つ位相格子（垂直に切立った位相膜）などが用いられる。
【００５１】
画像補正部１２０は、ステップＳ１２において、取得した２つの画像を比較して第１位相差顕微鏡８０と第２位相差顕微鏡９０との観察視野位置のズレ量を算出するとともに、ステップＳ１３において、２画像間の観察倍率差を算出する。ステップＳ１４では、求められた算出値に基づいて、第１位相差顕微鏡８０及び第２位相差顕微鏡９０における観察視野位置ズレと観察倍率差を補正するための画像補正パラメータを求める。このように取得された画像補正パラメータは、後述するステップＳ４において施される画像補正処理に用いられる。
【００５２】
図９に戻り、ステップＳ２において、試料台１５からマーカが取り除かれた後で、ＣＰＵ６１は、搬送ユニット４の各ステージを作動させてストッカー３から観察対象の培養容器１０を観察ユニット５に搬送し（顕微観察系５５の光軸上に位置決めし）、画像取得部１１０の制御の基で、第１及び第２位相差顕微鏡８０，９０による受精卵の位相差画像（観察画像）を所定の撮像ピッチで撮像カメラ８９，９９により撮像させる。このとき、第１及び第２位相差顕微鏡８０，９０による観察では、試料台１５の上下移動に伴って所定の撮像ピッチごとに、両者を交互に切り換えて撮像カメラ８９，９９により観察画像を撮影する。これにより、受精卵の位置等の変化がない複数の画像を短時間で撮影することができるため、後述するＳＦＦ方式による解析を良好に行うことが可能になる。
【００５３】
ステップＳ３では、画像記憶部１１０は、撮像カメラ８９，９９により撮影された複数の観察画像を取得する。このとき、画像記憶部１１０は、第１位相差顕微鏡８０の撮像カメラ８９により培養容器１０中の受精卵を所定の撮像ピッチで（光学系の焦点位置を変化させながら）下方から連続的に撮影された複数の観察画像（「第１観察画像」と称する）を取得するとともに、第２位相差顕微鏡９０の撮像カメラ９９によって受精卵を所定の撮像ピッチで（光学系の焦点位置を変化させながら）上方から連続的に撮影した複数の観察画像（「第２観察画像」と称する）を取得する。
【００５４】
画像記憶部１１０は、撮像カメラ８９，９９から取得した第１及び第２観察画像を、試料台１５内のリニアエンコーダ１７から出力される当該撮像取得が行われたときの試料台１５の位置情報とともに、培養容器１０のコード番号や観察位置、観察時刻などのインデックス・データと対応付けて保存する。
【００５５】
ステップＳ４では、画像補正部１２０は、ステップＳ２で求めた画像補正パラメータに基づいて、画像記憶部１１０に記憶されたそれぞれ複数枚の第１観察画像及び第２観察画像に対し画像補正を施し、両画像の観察視野位置と観察倍率差とを一致させる。これにより、第１観察画像と第２観察画像とが画素単位でマッチングされる。
【００５６】
ステップＳ５において、画像補正された第１観察画像及び第２観察画像に対してＳｈａｐｅ  Ｆｒｏｍ  Ｆｏｃｕｓ（以下、単に「ＳＦＦ」と称する）による処理を施す。ＳＦＦ方式の原理について簡単に説明すると、この方式は、観察対象の試料に光を照明し、試料と観察光学系（対物レンズ）とをＺ方向（フォーカス方向）に相対移動させて試料と観察光学系との間の光学的距離を変化させながら試料の画像を設定距離（撮像ピッチ）ごとに撮像カメラで取得し、後述する画像処理によって、得られた画像に対して画素単位で合焦測度を求めることにより、試料が観察光学系に関して撮像カメラと共役な位置にあるときに合焦測度が最大となる特性を用いて、試料の三次元形状情報を得る手法である。合焦測度の変化の様子を図１１に示しており、合焦測度（コントラスト）が最大となる位置（すなわち合焦点位置となる試料台位置）を算出することで、試料の表面形状を求めることができる。ここで、図１２のフローチャートを参照して、ＳＳＦ方式による画像処理の詳細について説明する。
【００５７】
ステップＳ５１において、画像解析部１３０は、所定の撮像ピッチごとに取得した複数の第１観察画像及び第２観察画像に対して、１枚の画像ごとに各画素の合焦測度を算出する。このとき、画像解析部１３０は、画像補正部１２０から取得した補正済みの第１及び第２観察画像について、例えば、ラプラシアンフィルタ等の微分フィルタや分散フィルタなどを適用し、画素ごとに積和演算された微分値や分散値を合焦測度として求める。なお、第１観察画像及び第２観察画像から画素ごとに求められた合焦測度は、第１観察画像と第２観察画像とで対応する画素（同一領域の画素）ごとに１セットとして記録される。
【００５８】
ステップＳ５２において、画像解析部１３０は、第１及び第２観察画像について、画素ごとに合焦測度がピークとなる合焦点位置を求める。このとき、非透明な試料の画像については合焦測度がピークを示す合焦点は原則的に各画素に対して１つずつであるが、観察対象が卵細胞のような球形状の透明物体の場合には、各画素に対して合焦点が複数存在することとなる。例えば、図１３に示されるように、受精卵Ｊ（２細胞期のとき）における胚Ｈの細胞Ｃ１が細胞Ｃ１１と細胞Ｃ１２に卵割し、細胞Ｃ２が細胞Ｃ２１と細胞Ｃ２２に卵割した場合について考える。なお、図１３（Ａ）〜（Ｃ）は、受精卵を水平方向から見たときの模式図である。
【００５９】
例えば、図中の注目画素位置（第１及び第２観察画像において同一の画素位置）に対して、胚の外周上の点Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３が上下方向に点在する場合を考えると、理想的には、テクスチャとしての胚Ｈ上の点Ｐ１〜Ｐ３については、上述した試料（受精卵Ｊ）と観察光学系との光学的距離の変化に伴い、注目画素の領域と共役な関係にある試料上の点として、合焦測度がそれぞれピークとなって現れる。
【００６０】
ここで、図１３（Ａ）に示すように、第１位相差顕微鏡８０と第２位相差顕微鏡９０との観察で、注目画素での合焦測度のピーク位置が同じ位置に検出された場合には、この同一のピーク位置をクラスタリングし、このピークなって現れた点を合焦点であると判断する。図１３（Ａ）では、３つのピーク位置全てが同じ位置に出現した場合を例示しており、画像解析部１３０は、このピークとなって出現した３つの点が点Ｐ１〜Ｐ３を示す合焦点であると判断する。なお、ステップＳ４での第１観察画像と第２観察画像との画像補正により、第１観察画像と第２観察画像での各画素領域の位置及び大きさは一致しているため、合焦点を高精度に検出することができる。
【００６１】
一方、図１３（Ｂ）に示すように、位相差顕微鏡８０，９０による両側からの観察での合焦測度の変化において、ランダムなノイズ等の影響によって合焦測度のピーク位置がずれて現れた場合には、受精卵Ｊの上側領域Ｕ内（上半球）については上側（第１位相差顕微鏡８０）からの観察情報を優先的に、下側領域Ｌ内（下半球）については下側（第２位相差顕微鏡９０）からの観察情報を優先的に採用して、合焦点を定義する。すなわち、受精卵Ｊの上側領域Ｕについては、第１位相差顕微鏡８０による観察によって得られた合焦測度を用いて、この合焦測度がピークとなって現れる点（点Ｐ１，Ｐ２に対応する点）を合焦点と認定する。受精卵の下側領域Ｌについては、第２位相差顕微鏡９０による観察によって得られた合焦測度を用いて、この合焦測度がピークとなって現れる点を合焦点と認定する。これにより上側及び下側からの観察において、合焦点の重複を回避して高精度に合焦点位置を検出することができる。
【００６２】
ところで、観察方向（本実施形態では上下方向）に対して複数の細胞が存在する場合、手前側の細胞が奥側の細胞（例えば、細胞Ｃ１１を手前側とすると細胞Ｃ２２が奥側となる）を隠した状態、すなわちオクルージョンが生じる虞がある。すなわち、１方向観察のＳＦＦ方式においては、観察方向から見て奥側に存在する構造については、手前側に存在する構造によるボケや散乱等によって、合焦測度のピークが検出し難くなる（ピークとして出現しない虞がある）ため、合焦点を正確に見つけられないという問題があるが、２方向観察である本実施形態では、次のように解決できる。
【００６３】
図１３（Ｃ）に示すように、上述したオクルージョンが発生し、一方の合焦測度の変化にのみピークが現れている場合、すなわち、上側からの観察において受精卵Ｊの下側領域Ｌに対する合焦測度が手前側の細胞Ｃ１１等の存在によってボケや散乱等により低下する（ピークが現れない）場合や、下側からの観察において受精卵Ｊの上側領域Ｕに対する合焦測度が手前側の細胞Ｃ２２等の存在によってボケや散乱等により低下する場合には、受精卵の上側領域Ｕについては、第１位相差顕微鏡８０から得られた合焦測度変化において合焦測度がピークとなって現れる点（点Ｐ１，Ｐ２に対する点）を合焦点と認定し、受精卵の下側領域Ｌについては、第２位相差顕微鏡９０から得られた合焦測度変化において合焦測度がピークとなって現れる点（点Ｐ３に対する点）を合焦点と認定する。これにより、オクルージョンが生じた場合でも、ＳＳＦ方式を上下２方向からの観察に適用することにより、複数の合焦点を的確に検出することが可能になる。
【００６４】
これを簡単にまとめると、（それぞれ複数の）第１及び第２観察画像の各々から同一の注目画素について合焦測度のピークを全て検出した上で、上側領域Ｕ及び下側領域Ｌにおいて合焦測度のピーク位置が同じであれば、クラスタリングしてそのピークを直ちに合焦点と認定し、ピーク位置が異なったりピーク位置が一方にのみ出現するのであれば、受精卵の上側領域Ｕについては上側観察（第１位相差顕微鏡８０）による観察情報を適用し、下側領域Ｌについては下側観察（第２位相差顕微鏡８０）による観察情報を適用して、その領域内で出現するピークを優先して合焦点を認定する。
【００６５】
ステップＳ６において、画像解析部１３０は、画素単位で得られた合焦点情報（合焦点位置）に基づいて、試料表面の相対高さを求めて、受精卵の三次元形状を構築する。具体的には、受精卵の三次元形状を構成する（Ｘ，Ｙ，Ｚ）の点群座標などが算出される。また、画像解析部１３０は、画素ごとに求めた合焦点位置に基づいて、コントラストの合った部分を寄せ集めた２次元のスライス画像を上記所定の撮像ピッチごとに生成する。
【００６６】
ステップＳ７において、ステップＳ６で算出した三次元形状データ（点群データ）及びスライス画像は、出力部により表示パネル７２に出力され、受精卵の三次元形状の測定結果として表示パネル７２に表示される。また、表示パネル７２では、点群座標を基に三次元形状を表示することもできる。そして、画像処理装置１００により構築された三次元データから、受精卵Ｊの任意の位置を観察できるとともに、受精卵Ｊの任意の位置の寸法等を算出できるようになっている。そのため、観察者は、受精卵Ｊの三次元形状データに基づいて、卵割に伴う胚のくびれ部などを的確に検出して、卵内の細胞の卵割のタイミングを的確に観察することが可能になる。
【００６７】
なお、上述したように培養観察システムＢＳでは、観察プログラムに基づく所定の時間間隔の観察スケジュールに従って、位相差顕微鏡５６の撮像カメラ８９，９９により顕微観察画像（位相差画像）の撮影が順次実行されており、その結果、当該時間間隔ごとに三次元形状を示す画像データを取得している。そのため、この断続的に撮影された多くの画像を連続的に再生し、現実の時間軸では目視的に把握しにくい受精卵Ｊの変化状態（卵割状態）を、時間軸を圧縮して動画のように動的変化として可視化するタイムラプス画像を生成することにより、受精卵Ｊの生育状態をより正確に把握することができ、受精卵Ｊの生育状態の良否（卵内の各細胞が同時期のタイミングで分裂したか否か）を精度良く判定することができる。
【００６８】
このように、以上説明した本実施形態に係る観察装置、画像処置プログラムＧＰ、及びこの画像処理プログラムＧＰが実行されることにより構成される形状測定方法によれば、ＳＦＦ方式を上下２方向（異なる方向）からの受精卵の観察に適用することよって、受精卵の三次元形状を高精度に構築することできるため、受精卵の卵割を定量的に判断でき、受精卵の生育状態の良否を正確に評価することが可能になる。
【００６９】
上述の実施形態において、位相差顕微鏡装置５６として試料面に対してほぼ上下対称に配置した第１及び第２位相差顕微鏡８０，９０を例示したが、本発明はこの実施形態に限定されるものではなく、例えば、図１４に示したように、第１位相差顕微鏡１８０及び第２位相差顕微鏡１９０を左右に配置して構成した位相差顕微鏡装置１５６を用いても同様の効果を得ることができる。このとき、第１位相差顕微鏡１８０は、光源１８１、照明光学系１８２ａ、観察光学系１８２ｂ、及び撮像カメラ１８９により構成される。一方、第２位相差顕微鏡１９０は、光源１９１、照明光学系１９２ａ、観察光学系１９２ｂ、及び撮像カメラ１９９により構成される。このよう位相差顕微鏡装置１５６では、第１位相差顕微鏡１８０及び第２位相差顕微鏡１９０を、不図示の駆動装置によって水平方向に進退移動させ、試料台１５に載置された培養容器１０中の受精卵Ｊを上下方向から交互に観察することができる。
【００７０】
また、上述の実施形態において、受精卵Ｊを顕微観察する顕微鏡装置として位相差顕微鏡を例示したが、これに限定されるものではなく、微分位相差顕微鏡を用いて構成しても同様の効果を得ることができる。さらに、光源及び照明光学系により落射照明装置を構成して、反射型の位相差顕微鏡を構成してもよい。
【００７１】
また、上述の実施形態において、第１画像及び第２画像との画像補正処理において、更に上下方向の合焦点位置のずれ量を補正することとしてもよい。この場合、基準となるマーカとして、水平方向に位相勾配を持つ物体（例えば、半球や、横分解能より空間的に広いピッチでの階段構造、四角錘など）によれば、観察倍率の補正を行った第１画像と第２画像とでの形状が一致し、且つその形状の輪郭コントラスト（合焦測度）が最大となる位置により、上下方向（フォーカス方向）の合焦点位置のずれ量を測定して、当該ずれ量を補正することができる。
【符号の説明】
【００７２】
ＢＳ  培養観察システム                ＧＰ  画像処理プログラム
Ｊ  受精卵                            ５  観察ユニット
６  制御ユニット                      １５  試料台
５２  透過照明部                      ５５  顕微観察系
５６  位相差顕微鏡装置                ６１  ＣＰＵ
６２  ＲＯＭ                          ６３  ＲＡＭ
８０  第１位相差顕微鏡                ８９  撮像カメラ
９０  第２位相差顕微鏡                ９９  撮像カメラ
１００  画像処理装置                  １２０  画像補正部
１３０  画像解析部                    １４０  出力部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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