(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＬＡ−ＤＲ抗原のサブタイプのひとつであるＤＲ１２に含まれる新規遺伝子の提供。【解決手段】オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いたＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の遺伝子型を決める方法によって、既知の遺伝子とは異なる陽性反応を示す特定のアミノ酸配列を有する遺伝子であり、それに基づくタイピング方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする、ＨＬＡ-ＤＲＢ１新規遺伝子。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有する、ＨＬＡ-ＤＲＢ１新規遺伝子。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列又はその相補配列からなる、ＨＬＡ-ＤＲＢ１新規遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＨＬＡ-ＤＲＢ１新規遺伝子でコードされるペプチドを有する、タンパク質。
【請求項５】
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；以下「ＨＬＡ」と略すことがある）の新規遺伝子に関する。
【０００２】
背景技術
ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【０００３】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病(Graft-Versus-Host Disease)）が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨＬＡ型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【０００４】
従来のＨＬＡタイピングは抗体を用いて行われる血清学的手法であったが、近年の技術革新によりＨＬＡ分子をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【０００５】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがあるが、コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、ＨＬＡ型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００６】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原のサブタイプのひとつであるＤＲ１２に含まれる遺伝子型は２００９年７月の時点で、２４種類が報告されているが（例えば、非特許文献４参照）、遺伝子多型の存在については充分検討されていないのが現状である。
【非特許文献１】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献２】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献３】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献４】Allele Frequencies ［online］、[平成２１年７月３０日検索]、インターネット＜URL：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/＞
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子の遺伝子型を決める方法によって、既知の遺伝子とは異なる陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のサブタイプのひとつであるＤＲ１２に含まれる新規遺伝子およびそれに基づくタイピング方法を提供することにある。
【０００９】
本発明は、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ-ＤＲＢ１新規遺伝子を提供するものであり、また本発明は、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ-ＤＲＢ１新規遺伝子を提供するものである。
【００１０】
すなわち、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするものであり、または、配列番号２の塩基配列またはその相補配列からなるものである。あるいは、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子は、配列番号２の塩基配列またはその相補配列を有するものである。
【００１１】
また、本発明によるタンパク質は、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子でコードされたペプチドを有するものである。
【００１２】
さらに、本発明のＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング方法は、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするものである。
【００１３】
本発明によれば、従来に比べて、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のさらに詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性のより厳密な判定が可能となるのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて、より詳細なデータを得ることが可能になる。したがって、本発明は、臓器移植時の適合性判定や、各種疾患に対する感受性判定に極めて有用であるといえる。特に疾患に関していえば、近年、ＤＲＢ１＊１２０２は重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）との関係が指摘されている。
【発明の具体的説明および実施例】
【００１４】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１新規アリルの特定とその用途
本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１新規アリル（ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子）は、下記のような実験手順に従って得られたものである。
【００１５】
ＤＮＡタイピング法の1つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Luminex社のｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用い、ＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗ（登録商標）ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬製）を用いてＨＬＡ−ＤＲ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液より抽出したＤＮＡ検体で既知の遺伝子型の反応性が示されなかった。
【００１６】
ＷＡＫＦｌｏｗ（登録商標）ＨＬＡタイピング試薬で得られた増幅産物を用いて、ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987.）によりエクソン２の配列を確認した。エクソン２のそれぞれ上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖、アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、ＤＲＢ１＊０９０１の配列とこれまでに報告されていない配列とが検出された。よって、この検体がＤＲＢ１＊０９０１と未知のアリルとのヘテロ接合体である可能性が考えられた。
【００１７】
そこで、これら配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２領域をグループ特異的プライマーセット（Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002）により増幅し、遺伝子を単離した。ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子のイントロン１とイントロン２に設定したＤＲ９グループ特異的プライマーセット、およびＤＲ１２グループ特異的プライマーセット（Kotsch. et al., Tissue Antigens 53(5): 486-97, 2002）を用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、電気泳動で目的とする長さの断片を取り出して精製を行った。それぞれのグループ特異的増幅で得られた増幅産物を、BigDye Terminator V1.1 Cycle Sequencing KitおよびApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザを使用し、ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987）により両端のイントロン領域を含むエクソン２領域の配列を確認した。
【００１８】
その結果、ＤＲ９グループ特異的プライマーセットで得られた増幅物の配列はＤＲＢ１＊０９０１と完全に一致し、また、ＤＲ１２グループ特異的プライマーセットで得られた増幅産物の配列は、ＷＡＫＦｌｏｗ（登録商標）ＨＬＡタイピング試薬で得られた増幅産物を用いたダイレクトシークエンシング法で確認された新規配列と一致した。
【００１９】
新規配列を有する遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、図１のように、ＤＲＢ１＊１２０２のエクソン２内に１箇所の変異を確認した。これらの変異は、図２に示すように、ＨＬＡ−ＤＲ分子の４２番目のアミノ酸がフェニルアラニンからチロシンへと置き換わる非同義置換であった。これまでＤＲ１２グループにおいて、この位置のアミノ酸がチロシンに置換された遺伝子は見つかっていない。なお、この位置のアミノ酸はＨＬＡ−ＤＲ分子において抗原ペプチドをはさみこむ領域に位置していた。
【００２０】
このことから、このアミノ酸はＨＬＡ−ＤＲ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫反応において重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられた。この点は、例えば文献Pedro A.Reche ＆ Ellis L. Reinherz, J Mol Biol. (2003) 331,pp.623-41において記載されており、具体的には、該文献中にＨＬＡ−ＤＲＢ１配列が黒三角による位置を特定しつつ示されており（文献の図４）、この場所がＨＬＡ分子の抗原ペプチドとの結合特性や特異性に関係することが明記されている。なお、この場所は、該文献中ではＣ２のＨＬＡ−ＤＲβの４７番目に該当する。
したがって、ＤＲＢ１＊１２０２と本発明の変異をもつ遺伝子型（ＤＲＢ１＊１２０２Ｖ）とは、移植医療においては区別する必要があり、移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものであることが明らかとなった。
【００２１】
以上のようにして、本発明による新規アリル（ＤＲＢ１＊１２０２Ｖ）を特定した。
【００２２】
本発明による新規アリルにおける変異アミノ酸はＨＬＡ−ＤＲ分子に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高い。したがって、ＤＲＢ１＊１２０２と本発明の変異をもつ遺伝子型（ＤＲＢ１＊１２０２Ｖ）とは、移植医療においては区別する必要があり、移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものである。
【００２３】
よって、本発明による新規アリルは、前記したように、配列番号１記載のアミノ酸配列をコードしてなるものである。好ましくは、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子は、配列番号２記載の塩基配列又はその相補配列からなるものである。ここで相補配列は慣用の方法により得ることができる。
【００２４】
本発明による新規アリル（ＤＲＢ１＊１２０２Ｖ）は、ＷＨＯ命名によれば「ＤＲＢ１＊１２：２１」とされている。
【００２５】
タイピング方法
上記のように、新規アリルの存在とその変異部位が明らかになったため、それら情報に基づいて、そのようなアリルを特異的に検出することができるＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピング用ＤＮＡプローブを設計し、得ることができる。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列とその変異部位（４２番目のアミノ酸（配列番号１および図２））に関する情報や、配列番号２のエクソン２の塩基配列と変異部位（１２７番目の塩基）に関する情報、さらには必要により公知のＨＬＡ−ＤＲＢ１抗原の情報に従って、当業者であれば慣用の方法に従って、本発明によるプローブを容易に設計し、得ることができる。例えば、配列番号２の塩基配列のＤＮＡ断片にはハイブリダイズするが、ＤＲＢ１＊１２０２のＤＮＡ断片にはハイブリダイズしないものを選択することでも目的のプローブが得ることができる。ここでプローブの設計、合成等の手法については、例えば、"Molecular Cloning"，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(New York)等を参考にすることができる。
【００２６】
従って、本発明においては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列の一部であって、配列番号１の４２番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列の部分領域をコードしてなる塩基配列に相補的な配列を有する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピング用ＤＮＡプローブが提供されうる。また、本発明の別の態様によれば、配列番号２の塩基配列の一部であって、配列番号２の１２７番目の塩基を含む領域に相補的な配列を有する、ＨＬＡ−ＤＲ抗原タイピング用ＤＮＡプローブが提供されうる。
【００２７】
本発明において得られるプローブの鎖長は、本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子への特異的なハイブリダイズを可能とする鎖長であればよく、特に制限されないが、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、さらに好ましくは２０塩基以上とされる。また、本発明によるプローブの鎖長の上限は特に制限されない。
【００２８】
本発明において得られたプローブは、必要に応じて、慣用の標識物質（例えば、放射性同位体、蛍光色素、発色色素、発酵色素等）により、慣用の方法に従って標識されていてもよい。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、本発明において得られたプローブを含むタイピング用試薬が提供される。該試薬には、ＨＬＡ−ＤＲの他の型を検出可能なプローブや、検体中のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子を増幅可能なプライマー等を含むものであることができる。
【００３０】
本発明の一つの実施態様によれば、本発明によるタイピング用試薬は、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピングのための試薬であって、
（ａ）本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブであって、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列、もしくは配列番号１の４２番目のアミノ酸をコードする配列を含むその部分配列、またはこの配列に相補的な塩基配列を含んでなる、プローブ；または
（ｂ）本発明によるＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブであって、配列番号２の塩基配列、もしくは配列番号２の１２７番目の塩基を含むその部分配列、またはこの配列に相補的な塩基配列を含んでなる、プローブ
を含んでなるものである。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、前記したように、ＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。
【００３２】
ここで、「得られる配列変異情報」とは、図１および２にも示されているように既知のアリル（ＤＲＢ１＊１２０２）と本件新規アリル（ＤＲＢ１＊１２０２Ｖ）とを塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。具体的には、例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、ＤＲＢ１＊１２０２のアミノ酸配列上、図２で示した４２番目のアミノ酸がフェニルアラニンからチロシンへと置き換わっている場合であり、塩基配列であれば、配列番号２の１２７番目の塩基のＤＲＢ１＊１２０２の場合に対する変異である。
【００３３】
本発明によるＨＬＡ−ＤＲ抗原のタイピング法には、例えば、被験者のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子が新規アリルを有するか否かを検出する工程が含まれる。このとき検出は、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ(制限酵素断片長多型)法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ(単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、ＡＳＯ(allele specific oligonucleotid)ハイブリダイゼーション法、リバースＰＣＲ−ＳＳＯ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（Luminex社）、ＰＣＲ−ＭＰＨ法（Polymerase Chain Reaction-based Microtiter Plate Hybridization）（湧永製薬株式会社）、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＲＣＡ(rolling cycle amplification)法、ＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等、慣用の方法を利用して、タイピングを実施することができる。この場合、必要により、ＰＣＲ法などの核酸増幅法により核酸試料を予め増幅させた後、上述の方法を適宜適用してもよい。
【００３４】
タイピング法の具体例を挙げると、被験者のゲノムＤＮＡから調製した核酸試料を、本発明によるプローブと反応させた後、特異的なハイブリッド形成を検出することによって、被験者のＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子が新規アリルを有するか否かを検出することができる。このとき、使用される核酸試料は、典型的には、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から抽出したゲノムＤＮＡから慣用の方法に従って調製し得ることができる。また、ここでＨＬＡタイピング法には、上記のＰＣＲ−ＳＳＯ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法などが適宜利用することができる。例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ法では、ＰＣＲで増幅させた核酸試料を膜やマイクロプレートなどの支持体に結合させた後、この支持体を適当なハイブリダイゼーション条件下で標識化プローブと反応させる。非特異的結合成分を洗浄除去した後、標識量を指標として支持体に結合したプローブを検出することができる。Ｌｕｍｉｎｅｘ法ではＰＣＲの増幅産物と、蛍光ビーズに固相化したオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを蛍光により検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】既知のアリル（ＤＲＢ１＊１２０２）とＨＬＡ新規アリル（ＤＲＢ１＊１２０２Ｖ）との塩基配列の比較。
【図２】既知のアリル（ＤＲＢ１＊１２０２）とＨＬＡ新規アリル（ＤＲＢ１＊１２０２Ｖ）とのアミノ酸配列の比較。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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