(57)【要約】【課題】  発現させるタンパク質の種類を問わず、効率よく宿主細胞外に分泌可能なシグナルペプチドを提供すること。【解決手段】  ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＨ３２６３４の１番目から２７番目のアミノ酸からなるオリゴペプチド、または前記ペプチドが有する細胞外への分泌能を損なわない範囲で、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは末端に付加したオリゴペプチドにより前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または末端に付加したシグナルペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドおよびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質を発現させるためのベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、タンパク質を発現可能な形質転換体。
【請求項６】
宿主が哺乳動物由来の細胞である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換体を用いた、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学的手法を用いてタンパク質を生産する際、前記タンパク質を宿主細胞外へ分泌発現させるためのシグナルペプチドに関する。特に本発明は、哺乳動物細胞を宿主としてタンパク質を生産する際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、大腸菌、酵母、動物細胞などを宿主として、有用な物質を生産する技術が開発されており、生産された物質は医薬品や診断試薬など多くの分野で用いられている。主に生産される物質はタンパク質であるが、本来各生物が持っている野生型のタンパク質のみならず、遺伝子組み換え技術を用いて野生型のタンパク質に変異などを導入することで、野生型よりも機能が向上および／または変化した組み換えタンパク質も種々生産されている（特許文献１および２参照）。
【０００３】
タンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することで種々のタンパク質を宿主で発現し生産する方法は、タンパク質を工業的に生産する際に一般的に用いられている方法である。前記生産方法で用いられる宿主としては、大腸菌やバチルス属細菌といった細菌、酵母、カビ、昆虫細胞、動物細胞などから適宜選択されるが、従来より多くの場合において取り扱いの容易性から大腸菌を宿主として選択していた。しかしながら、大腸菌を宿主として動物由来のタンパク質を発現させようとした場合、全くタンパク質の発現が認められない場合があり、タンパク質の発現が認められた場合でも、不溶化タンパク質として細胞内に発現する、または可溶性タンパク質として発現しているが生理活性を保持しないタンパク質として発現する場合がほとんどであった（特許文献３）。
【０００４】
一方、酵母、昆虫細胞または動物細胞を宿主として動物由来のタンパク質を発現させると、高い確率で生理活性を保持したタンパク質として発現させることができる（特許文献２参照）。しかしながら、前記発現したタンパク質は、通常、宿主細胞外へ分泌させることが困難であるため、使用した宿主由来の分泌シグナルペプチドを用いて宿主細胞外へ分泌させる方法がよく行なわれる。前記シグナルペプチドを用いてタンパク質を宿主細胞外へ分泌させるには、発現させるタンパク質のＮ末端側に前記シグナルペプチドのＣ末端側を結合した融合タンパク質の形で発現させればよい。前記融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することで、宿主細胞内で前記融合タンパク質をコードする遺伝子由来のメッセンジャーＲＮＡからの翻訳により、前記融合タンパク質を発現し、発現した前記融合タンパク質はシグナルペプチドの機能により小胞体膜を通過し、小胞体内に移動する。その際、前記融合タンパク質のＮ末端側にある前記シグナルペプチドが、小胞体膜の内側に存在するシグナルペプチダーゼにより切断除去されることで、融合タンパク質はシグナルペプチドが除去された、発現させるタンパク質本来の状態で小胞体内腔に存在する。その後、小胞体から輸送小胞に入りゴルジ体を経由し分泌顆粒によって細胞膜まで運ばれる細胞内輸送系によって、最終的に発現させるタンパク質が宿主細胞外に分泌される。このようにして活性を有するための高次構造をとり、かつ活性を有するための様々な修飾を受けたタンパク質を宿主細胞外へ分泌させることができる。
【０００５】
宿主を用いてタンパク質を医薬品として工業的に生産する場合、前記タンパク質を細胞外に分泌させることは、発現させる前記タンパク質が細胞内プロテアーゼにより分解されるのを回避できるという利点を有する。また、発現させる前記タンパク質を細胞外へ分泌発現させることにより、その後の精製工程が容易となるため、時間的でも費用面でも有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許２６９４８４０号公報
【特許文献２】特許２５１１２５１号公報
【特許文献３】特表２００２−５３１０８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｂａｓａｋｉ  Ｓ，Ｕｅｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ．”，Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，５５（４），４７１−４７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前述したように、分泌シグナルペプチドは遺伝子を導入する宿主について、それぞれいくつか知られている。しかしながら、これらのシグナルペプチドには特定の保存された配列が存在しない。そのため、同じ宿主であっても分泌させるタンパク質の違いでシグナルペプチドは著しく異なり、分泌させるタンパク質が同じであっても宿主の違いでシグナルペプチドは著しく異なる。これらのシグナルペプチドの中から、適切なペプチドを選択してタンパク質を分泌発現させることは可能であるが、その発現効率は各シグナルペプチドと発現させる各タンパク質との組み合わせにより著しく異なる。例えば、発現させるタンパク質のＮ末端側にシグナルペプチドのＣ末端側を結合した融合タンパク質の状態で発現させる場合、前記シグナルペプチドが宿主に由来した分泌効率の高いペプチドであっても、分泌発現効率は発現させたいタンパク質によって著しく異なる。
【０００９】
発現させるタンパク質の分泌発現効率に影響を及ぼす原因の一つとして、分泌シグナルペプチドにより小胞体膜を通過した後の、シグナルペプチダーゼによる切断効率が考えられる。発現させるタンパク質のＮ末端側に分泌シグナルペプチドのＣ末端側を結合した融合タンパク質の状態で分泌発現させる場合、前記発現させるタンパク質のＮ末端側付近の配列によっては、宿主のシグナルペプチダーゼによる切断効率（基質認識効率）が低下してしまい、かえって分泌発現効率が低下する場合がある。したがって、発現させるタンパク質の種類を問わず、タンパク質を宿主細胞外へ効率よく分泌発現させるためには、発現させるタンパク質の種類を問わず効率よく細胞外に分泌する作用を有した分泌シグナルペプチドを構築することが重要である。
【００１０】
そこで本発明は、発現させるタンパク質の種類を問わず、効率よく宿主細胞外に分泌可能なシグナルペプチドを提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド。
【００１２】
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または末端に付加したシグナルペプチド。
【００１３】
（３）（１）または（２）に記載のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１４】
（４）（３）に記載のポリヌクレオチドおよびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、タンパク質を発現させるためのベクター。
【００１５】
（５）（４）に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、タンパク質を発現可能な形質転換体。
【００１６】
（６）宿主が哺乳動物由来の細胞である、（５）に記載の形質転換体。
【００１７】
（７）（５）または（６）に記載の形質転換体を用いた、タンパク質の製造方法。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本発明のシグナルペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＡＨ３２６３４の１番目から２７番目のアミノ酸）からなるオリゴペプチド、または本発明のシグナルペプチドが有する細胞外への分泌能を損なわない範囲で、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは末端に付加したオリゴペプチドである。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１８番目のアスパラギン酸から２３番目のバリンまでのアミノ酸の領域に前記欠失、置換、挿入を行なうと、シグナルペプチダーゼによる基質認識効率の変化により分泌効率が変化する可能性があるため、前記領域には前記欠失、置換、挿入を行なわないのが好ましい。
【００２０】
本発明のシグナルペプチドを用いてタンパク質を宿主細胞外へ発現させるためには、発現させるタンパク質のＮ末端側に本発明のシグナルペプチドのＣ末端側を結合したポリペプチド（融合タンパク質）の状態で宿主が発現できるようにすればよい。発現させるタンパク質と本発明のシグナルペプチドとを結合する際は、直接結合してもよいし、あらかじめ本発明のシグナルペプチドまたは前記タンパク質に任意の１または数アミノ酸を付加してから結合してもよい。
【００２１】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列から、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に変換する際は、前記ポリペプチドを発現させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮の上、変換するのが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによって可能である。例えば、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）の場合、アラニン（Ａｌａ）ではＧＣＧが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＴＴＡとＣＴＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＧが、スレオニン（Ｔｈｒ）ではＡＣＧが、それぞれコドンの使用頻度が低いため、それらのコドンを避けて変換するのが好ましい。
【００２２】
前記ポリペプチドを宿主で発現させるには、発現させる宿主で機能するプロモーター遺伝子を含んだ発現ベクターに、前記ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチドを、遺伝子発現する際のコドンの読み枠がずれないように（すなわち、ポリペプチドを発現させた場合に本発明のシグナルペプチドと発現させるタンパク質とがともに機能を有するように）、前記プロモーター遺伝子の下流位置へ挿入して発現ベクターを作製し、前記発現ベクターにより宿主を形質転換することで、発現させることができる。
【００２３】
前記発現ベクターを構成するプロモーター遺伝子は、前述したように前記ポリペプチドを発現させる宿主で機能するプロモーターをコードするポリヌクレオチドを含んでいれば特に制限はなく、例えば、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ７細胞（アフリカミドリザル腎繊維芽由来細胞）、Ｈｅｌａ細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児皮膚由来細胞）細胞といった哺乳動物由来の細胞を宿主とした場合は、前記プロモーターとしてＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＣＭＶプロモーターなどが例示できる。なお、前記発現ベクターに、ネオマイシンやピューロマイシンといった薬剤に対する耐性遺伝子が含まれていると、形質転換体の選択を前記薬剤を用いて容易に行なえるため、好ましい。
【００２４】
宿主を形質転換する方法は、発現させる宿主に最も適した任意の方法で行えばよく、エレクトロポーレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法などを例示することができる。
【００２５】
得られた形質転換体の培養は、形質転換した宿主に適切な条件で行なえばよい。発現したポリペプチドは本発明のシグナルペプチドによって、形質転換体細胞外へ本発明のシグナルペプチドが切断された状態で発現させることができるため、得られた培養上清を遠心分離などで回収し、適当な方法により精製することでタンパク質を容易に製造することができる。
【００２６】
本発明のシグナルペプチドを用いて発現可能なタンパク質は、発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が既知であるものであれば特に限定はなく、例えばＩＬ−６（インターロイキン６）などのサイトカイン、エリスロポエチン、インターフェロンなどがあげられる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のシグナルペプチドは、そのＣ末端側とタンパク質のＮ末端側に直接または１もしくは数アミノ酸を挟んで結合したポリペプチド（融合タンパク質）の状態で宿主（特にＣＨＯ細胞やＣＯＳ７細胞といった哺乳動物由来の細胞）で発現させることにより、宿主細胞外へ前記タンパク質を効率良く発現させることができる。
【００２８】
また、本発明のシグナルペプチドを用いて、医薬品などの有用なタンパク質を工業的に生産させると、宿主細胞内プロテアーゼによる前記タンパク質の分解を回避できるため、宿主細胞内に発現させる場合と比較し、前記タンパク質をより多く生産することができる。また、本発明のシグナルペプチドを用いた生産方法は、前記タンパク質を宿主細胞外へ発現させることができるため、その後の精製が容易である。したがって、宿主細胞内に発現させる場合と比較し、短時間かつ低コストでタンパク質を製造することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００３０】
実施例１  シグナルペプチドをコードする遺伝子の作製
Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）を鋳型とし、配列番号２および３に示すオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応（９８℃・１０秒間の第一ステップ、５５℃・５秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを３０サイクル）を行なうことで、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、シグナルペプチド遺伝子）を作製した。なお、配列番号２の３番目から８番目までの塩基はＢａｍＨＩ認識配列であり、１５番目から３９番目の塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＢＣ０３２６３４の１３番目から３７番目の塩基に相当する。また、配列番号３の７番目から１２番目までの塩基はＢｇｌＩＩ認識配列であり、１３番目から３５番目の塩基はＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＢＣ０３２６３４の７１番目から９３番目の塩基の相補鎖に相当する。
【００３１】
実施例２  ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子の作製
ｐＣＡＳ１−ＥＧＦＰ（非特許文献１）を鋳型とし、配列番号４および５に示すオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応（９８℃・１０秒間の第一ステップ、５５℃・５秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを３０サイクル）を行なうことで、ＥＧＦＰをコードするポリヌクレオチド（以下、ＥＧＦＰ遺伝子）を作製した。なお、配列番号４の３番目から８番目まではＢｇｌＩＩ認識配列、配列番号５の７番目から１２番目までの塩基はＳａｌＩ認識配列である。
【００３２】
実施例３  ＥＧＦＰ分泌発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｓ−ＥＧＦＰ）の作製
（１）実施例１で作製したシグナルペプチド遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ（タカラバイオ社製）で切断した。
（２）実施例２で作製したＥＧＦＰ遺伝子を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で切断した。
（３）（１）で切断したシグナルペプチド遺伝子と（２）で切断したＥＧＦＰ遺伝子とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
（４）（３）で連結したポリヌクレオチドと、あらかじめＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し脱リン酸化したｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結することで、ＥＧＦＰ分泌発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｓ−ＥＧＦＰ）を作製した。
【００３３】
実施例４  ＥＧＦＰ非分泌発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）の作製
（１）実施例２で作製したＥＧＦＰ遺伝子を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩ（タカラバイオ株式会社製）で切断した。
（２）（１）で切断したＥＧＦＰ遺伝子と、あらかじめＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断し脱リン酸化したｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結することで、ＥＧＦＰ非分泌発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）を作製した。
【００３４】
実施例５  ＥＧＦＰの分泌発現
（１）ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）に１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加えた培地５００μＬで対数増殖期後期まで培養したＣＯＳ７細胞に、実施例３で作製したＥＧＦＰ分泌発現ベクター（ｐＣＭＶ−Ｓ−ＥＧＦＰ）を、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）を用いて添付の資料に従いトランスフェクションした。
（２）陰性コントロールとして、実施例４で作製したＥＧＦＰ非分泌発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）を（１）と同様の方法によりトランスフェクションした。
（３）同じく陰性コントロールとして、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を（１）と同様の方法によりトランスフェクションした。
（４）（１）から（３）の方法でトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ培地で４８時間培養後、上清を回収した。
【００３５】
実施例６  ＥＧＦＰの測定
実施例５で回収した培養上清をフルオロヌンクプレート（ＮＵＮＣ社製、Ｃａｔ  Ｎｏ．４３７１１１）に１００μＬ分注し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて上清の蛍光強度を測定した。
【００３６】
結果を表１に示す。表１に示す蛍光強度値は、細胞外に分泌発現されたＥＧＦＰの量に相当する。配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをＥＧＦＰのＮ末端側に付加する（ｐＣＭＶ−Ｓ−ＥＧＦＰ）ことにより、ＥＧＦＰがＣＯＳ７細胞外へ分泌発現していることがわかる。一方、前記シグナルペプチドを付加していない陰性コントロール（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）は、空ベクター（ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ）とほぼ同じ蛍光強度であったことから、ＥＧＦＰがＣＯＳ７細胞外へほとんど分泌していないことがわかる。以上より、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるシグナルペプチドにより、異種タンパク質を宿主細胞外に分泌発現可能であることがわかる。
【００３７】
【表１】
2011167152.tif 000002
【配列表】
2011167152000001.app