(57)【要約】【課題】調整法が容易で、封入率が高く、コストが低く、有機溶媒を使用することなく遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を封入して徐放出させるシステム、及びその製造方法を提供すること。【解決手段】ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸との複合体にシクロデキストリンを添加することによって形成される、難水溶性超分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸との複合体にシクロデキストリンを添加することによって形成される、難水溶性超分子。
【請求項２】
デンドリマーが、ジェネレーション２であるデンドリマー（Ｇ２）である、請求項１に記載の難水溶性超分子。
【請求項３】
シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである、請求項１又は２に記載の難水溶性超分子。
【請求項４】
核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１から３の何れかに記載の難水溶性超分子。
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載の難水溶性超分子からなる、遺伝子導入剤。
【請求項６】
ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸とを混合して複合体を形成する工程：及び上記複合体にシクロデキストリンを添加することによって難水溶性超分子を形成する工程を含む、請求項１から４の何れかに記載の難水溶性超分子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA又はRNAを徐放化および標的指向化できる超分子システム及びその製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ＰＥＧで修飾したデンドリマーとシクロデキストリンを用いて作製されるDNA又はRNAを徐放化および標的指向化できる超分子システム及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体からなるマイクロスフェアまたはナノスフェアに遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を封入し、徐放出させるシステムが知られている（田原耕平ら、薬学雑誌、127, 1541-1548 (2007)）。しかしながら、調整法が煩雑、封入率が低い、コストが高い、有機溶媒を使用するため製造時の安全性に問題があり、溶媒が残留するという問題がある。また、環状オリゴ糖と両親媒性ポリマーから形成されるヒドロゲルが種々の低分子薬物やタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの徐放化を達成するという特許文献（特許公表２００６−５０６３３５、２００６年２月２３日、リー， ジュン 外３名、生分解性トリブロックコポリマー、その合成方法、ならびにそれから作製されるヒドロゲルおよび生体材料）も存在するが、ＤＮＡ又はＲＮＡが徐放化されるという実施例は記載されておらず、この技術は単に徐放化を目的とした技術であるため、たとえゲルから徐放出されたとしてもＤＮＡやＲＮＡは細胞内に導入されずに全く効果を示さないことが容易に想像される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許公表２００６−５０６３３５
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】田原耕平ら、薬学雑誌、127, 1541-1548 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、調整法が容易で、封入率が高く、コストが低く、有機溶媒を使用することなく遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を封入して徐放出させるシステム、及びその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸との複合体にシクロデキストリンを添加することによって難水溶性超分子を形成させることにより、核酸を徐放出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸との複合体にシクロデキストリンを添加することによって形成される、難水溶性超分子。
（２）  デンドリマーが、ジェネレーション２であるデンドリマー（Ｇ２）である、（１）に記載の難水溶性超分子。
（３）  シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンである、（１）又は（２）に記載の難水溶性超分子。
（４）  核酸が、ＤＮＡ又はＲＮＡである、（１）から（３）の何れかに記載の難水溶性超分子。
（５）  （１）から（４）の何れかに記載の難水溶性超分子からなる、遺伝子導入剤。
（６）  ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸とを混合して複合体を形成する工程：及び上記複合体にシクロデキストリンを添加することによって難水溶性超分子を形成する工程を含む、（１）から（４）の何れかに記載の難水溶性超分子の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の難水溶性超分子によれば、ＤＮＡ又はＲＮＡを徐放出できるとともに、徐放出されたＤＮＡやＲＮＡは細胞選択的に効率に細胞に導入され、薬理作用を発揮できる。本発明の難水溶性超分子の製造方法は、試薬を混合するだけで非常に簡単であり、高効率かつ低コストで製造が可能である。また、本発明の難水溶性超分子の製造方法では、有機溶媒を使用しないため、製造時の安全性に優れ、残留溶媒量についても危惧する必要がない。さらに、シクロデキストリンの働きにより、細胞内に導入後、ＤＮＡ及びＲＮＡを効率よく細胞内の作用部位に送達することができる。本発明の難水溶性超分子は、医薬品、診断、ライフサイエンスの分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、pRL-CMV  DNA及びPEG-dendrimer を混合して複合体を形成させたときの様子を示す。
【図２】図２は、pRL-CMV  DNA及びPEG-dendrimerの複合体に対して、シクロデキストリン溶液を添加して、ポリシュードロタキサン様の難水溶性超分子の形成させたときの様子を示す。
【図３】図３は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中３７℃でポリシュードロタキサンからのｐＤＮＡ／ＰＥＧ−デンドリマー（Ｇ２）の放出プロフィールを示す。丸印：α−シクロデキストリンポリシュードロタキサン、四角印：γ−シクロデキストリンポリシュードロタキサン、三角印：ｐＤＮＡ／ＰＥＧデンドリマー（Ｇ２）のみ。各値は３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ．を示す。PEG-dendrimer／pRL-CMV  DNAのチャージ比は２とした。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）デンドリマー
本発明で用いるデンドリマー (Dendrimer)は、アンモニアあるいはエチレンジアミンをコア分子とし、その分子にマイケル付加反応でアクリル酸メチルおよびエチレンジアミンを付加し、この反応を繰り返すこと (Generation) により得られる高度に枝分かれした樹枝状構造を特徴とし、その末端に多数の一級アミノ基を有した新しいタイプの合成ポリマーである。本発明で用いるデンドリマーとしては、ポリアミドアミン型であることが好ましい。
【００１１】
ポリアミドアミン型デンドリマーは、アンモニアにアクリル酸メチルとエチレンジアミンとを反応させて（アンモニア：アクリル酸メチル：エチレンジアミン＝１：３：３（モル比））、ジェネレーション０（Ｇ０）と呼ばれる中心核を合成する。ジェネレーション０はアンモニアに由来する窒素の周りに、アクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が３つ結合した形を有する。ジェネレーション０（Ｇ０）のアミドアミンの末端にエチレンジアミンの一方のアミノ基が存在する。そこで、この中心核（ジェネレーション０（Ｇ０））にアクリル酸メチル：エチレンジアミン＝３：３（モル比）を反応させることで、上記アミドアミンの末端のアミノ基に２つのアクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が結合する。このようにＧ０のアミノ基由来の窒素に２つのアクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体（アミドアミン）が結合したものは、ジェネレーション１（Ｇ１）と呼ばれる。このようにして順次、アクリル酸メチルとエチレンジアミンの縮合体を結合させていくことで、ジェネレーション２、３、４、５、６（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６）が得られる。この状態を下記の反応スキームに示す。本発明では、ジェネレーションが３であるデンドリマーを使用する。
【００１２】
【化１】
2011068585.tif 000002
【００１３】
ポリアミドアミン型デンドリマーは、市販されており、市販品を容易に入手できる。本発明の結合体に用いるデンドリマーのジェネレーションは特に限定されず、例えば、ジェネレーション２、３、４、５、６（Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６）などを使用することができる。
【００１４】
本発明で用いるデンドリマーは、ポリエチレングリコールで修飾されている。ポリエチレングリコールの分子量は特に限定されないが、一般的には２００から５０，０００程度のものを使用することができる。
【００１５】
（２）核酸
本発明では、ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸とを混合して複合体を形成する。本発明で用いる核酸の種類は特に限定されず、ＤＮＡ又はＲＮＡの何れでもよい。ＤＮＡとしては、一本鎖のオリゴヌクレオチドでもよいし、二本鎖のＤＮＡでもよく、ＤＮＡをベクター（例えば、発現ベクターなど）に組み込んだ組み換えベクターなどでもよい。ＲＮＡとしては、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡなどを使用してもよいし、ｍｉｃｒｏＲＮＡを使用してもよい。なお、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）とは、重合度が２０前後（例えば、１８〜２３塩基程度）の低重合度のＲＮＡで、そのＲＮＡを導入することによりＲＮＡの発現を阻害する働きを有するＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは通常、二本鎖からなっている。なお、ｓｉＲＮＡは、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡｉを誘導できることが実証されている。
【００１６】
ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸との配合割合（チャージ比(N/P比）は、通常２００：１〜１：１であり、好ましくは１００：１〜１：１の範囲であることが好ましい。
【００１７】
（３）シクロデキストリン
本発明では、ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸とを混合して得られる複合体に、シクロデキストリンを添加することによって難水溶性超分子を形成する。本発明用いるシクロデキストリンは、α、β、またはγシクロデキストリンである。これらα、β、またはγシクロデキストリンは、化学修飾型または非修飾型のシクロデキストリンであることもできる。これらα、β、またはγシクロデキストリンは市販品を容易に入手できる。
【００１８】
シクロデキストリンはその水酸基の一部もしくは全部がアセチル化されていてもよく、またはグルコース、マンノース、サッカロース等の糖で修飾されていてもよい。これらの修飾剤と、シクロデキストリンとの反応は、両者を例えば水溶液にし、加熱・攪拌することにより製造することができる。
【００１９】
（４）遺伝子導入剤及び遺伝子導入方法
上記した、ポリエチレングリコールで修飾されているデンドリマーと核酸との複合体にシクロデキストリンを添加することによって形成される本発明の難水溶性超分子は、細胞に核酸を効率的に導入するための遺伝子導入剤として用いることができる。
【００２０】
本発明による遺伝子の導入方法では、導入すべき遺伝子を含有する本発明の難水溶性超分子を細胞とともにインキュベーションすることによって行うことができる。導入すべき遺伝子には制限はない。例えば、遺伝子治療に有用な遺伝子や、植物及び動物の品種改良に有用な遺伝子等を挙げることができる。遺伝子導入の条件は、例えば、遺伝子を導入すべき細胞を含有する培地０．５ｍｌ（細胞量約２×１０5個）に、導入すべき遺伝子を含有する本発明の難水溶性超分子を添加する。本発明の難水溶性超分子溶液は、例えば、遺伝子量が０．１〜１０μｇ／μｌとなるように添加することができる。添加後、所定の時間だけインキュベートすることにより、細胞に上記遺伝子をトランスフェクションすることができる。
【００２１】
以下に実施例を挙げて本発明につき更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら制約されるものではない。
【実施例】
【００２２】
１．使用物質
（１）pRL-CMV（分子量：2692140）
pRL-CMV Vector（プロメガ社製）には、CMV immediate-earlyエンハンサー/プロモーター領域が組み込まれており、トランスフェクションされた様々な哺乳動物細胞で、ウミシイタケルシフェラーゼを強力かつ安定に発現することが知られている。
【００２３】
（２）PEG-dendrimer（DSP: 3.16、分子量：9576）
Dendrimer (G2) およびPEG-COOH （分子量2322）はそれぞれ、Sigma-Aldrich社製および日油社製を用いた。PEG-dendrimerは、PEG-COOH 50 mgとDendrimer 70 mgをDMSO に溶解し、室温で3時間撹拌後、蒸留水を5 ml 添加して、反応を停止した。その後、水にて透析を3日間行い、凍結乾燥にて本品を得た。
【００２４】
２．実験方法
pRL-CMV DNA 25 μL (75 μg)および PEG-dendrimer 2.26 μL (50 μg/μL ) をDNAのリン酸基由来の負電荷数とPEG-dendrimerアミノ基由来の正電荷数の比であるチャージ比（N/P比） 2 （PEG-dendrimer／pRL-CMV DNA、モル比 1271）の条件下で複合体を形成させる(15 分間)。そのときの様子を図１に示す。
【００２５】
次に、上記の複合体に対して、α−シクロデキストリン飽和溶液 50 μL (145 mg/mL)又はγ−シクロデキストリン飽和溶液 50 μL (232 mg/mL) をそれぞれ添加し、ボルテックスし、４℃の条件下で２４時間静置し、ポリシュードロタキサン様の難水溶性超分子の形成を確認した。そのときの様子を図２に示す。
【００２６】
次いで、ＰＢＳ(pH 7.4) をそれぞれ添加 (最終全量を200 μL に調整)し、37℃で振盪攪拌条件下で、徐放化の試験を開始した。経時的にサンプリングを行い、Nano Drop にて吸光度を測定した。その結果を図３に示す。図３の結果から、本発明の難水溶性超分子により核酸を徐放出できることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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