(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスジェニック動物のミルクを安定化する方法の提供。【解決手段】トランスジェニック動物のミルク中でセリンプロテイナーゼ阻害剤（例えば、α１−アンチトリプシン）を同時発現させることにより、トランスジェニック動物のミルク中で発現されたタンパク質（例えば、フィブリノーゲン）を保護する。【選択図】図１３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミルクを安定化するための、トランスジェニック非ヒト動物のミルク中に発現されているセリンプロテイナーゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤が、α−１−アンチトリプシン又はα−１−アンチキモトリプシンである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記動物が、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラクダ、水牛、ブタ、又はウマである請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
非ヒト動物のミルク中にさらに発現されている異種タンパク質を安定化させるための請求項１〜３の何れか１項に記載の使用。
【請求項５】
その乳腺中でセリンプロテイナーゼ阻害剤を発現し得る非ヒトトランスジェニック動物の安定化されたミルクの製造における使用。
【請求項６】
そのゲノムにセリンプロテイナーゼ阻害剤をコードする外在性ＤＮＡ配列が安定に組み込まれた非ヒトトランスジェニック動物の安定化されたミルクの製造における使用。
【請求項７】
前記非ヒトトランスジェニック動物がミルクを分泌し、産生する請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤が、α−１−アンチトリプシン又はα−１−アンチキモトリプシンである請求項４又は５に記載の使用。
【請求項９】
前記動物が、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラクダ、水牛、ブタ、又はウマである請求項５〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１０】
そのミルク中にセリンプロテイナーゼ阻害剤とフィブリノーゲンを発現することができる非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
そのゲノムに、セリンプロテイナーゼ阻害剤をコードする外在性ＤＮＡ配列とフィブリノーゲンをコードする外在性ＤＮＡ配列が安定に導入された非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記動物が、そのミルク中にセリンプロテイナーゼ阻害剤とフィブリノーゲンを同時発現することができる請求項１０又は１１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤とフィブリノーゲンが、１以上のミルク遺伝子プロモーターの制御下にある請求項１０〜１２の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記フィブリノーゲンが、ウシ又はヒト由来である請求項１０〜１３の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤が、α−１−アンチトリプシン又はα−１−アンチキモトリプシンである請求項１０〜１４の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記動物が、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラクダ、水牛、ブタ、又はウマである請求項１０〜１５の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
請求項１０〜１６の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物のフィブリノーゲンの製造における使用。
【請求項１８】
請求項１０〜１６の何れか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物を生産する方法であって、
（ａ）セリンプロテイナーゼ阻害剤をコードする第１のＤＮＡ配列又は配列ファミリーを得ることと；
（ｂ）そのゲノムに前記第１のＤＮＡ配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物を産出し得る動物の細胞、接合体又は胚に、前記ＤＮＡ配列を導入することと；
（ｃ）フィブリノーゲンをコードする第２のＤＮＡ配列を得ることと；
（ｄ）そのゲノムに前記第２のＤＮＡ配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物を産出し得る動物の細胞、接合体又は胚に、前記第２のＤＮＡ配列又は配列ファミリーを導入することと；
（ｅ）前記細胞、接合体又は胚を動物まで成長させること；
を備えた方法。
【請求項１９】
前記第１及び第２の配列が、前記細胞、接合体又は胚に、別々に、同時に、又は順次に導入される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１及び／又は第２のＤＮＡ配列が、ミルク遺伝子プロモーターに作用可能に連結されている請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物が、乳汁の分泌を誘導される請求項１８〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記セリンプロテアーゼ阻害剤が、α−１−アンチトリプシン又はα−１−アンチキモトリプシンである請求項１８〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記動物が、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラクダ、水牛、ブタ、又はウマである請求項１８〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８〜２３の何れか１項に記載の方法によって生産されたトランスジェニック動物。
【請求項２５】
組換えフィブリノーゲンを製造する方法であって、
（ｆ）請求項１０〜１６又は請求項２４の何れか１項に記載のトランスジェニック動物に乳汁分泌を誘導せしめることと；
（ｇ）前記動物から搾乳することと；
（ｈ）前記乳汁を採集することと；
（ｉ）前記フィブリノーゲンを単離することと（必要に応じて精製工程を含む）
を備えた方法。
【請求項２６】
請求項１０〜１６又は請求項２４又は２５の何れか１項に記載の動物のミルク中に産生された組換えフィブリノーゲン。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組換えフィブリノーゲンを備えたフィブリンシーラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック動物のミルクの安定化に関する。とりわけ、本発明は、セリンプロテイナ−ゼ阻害剤の発現とともに、トランスジェニック動物のミルクの中に発現されたフィブリノーゲンの保護に関する。
【背景技術】
【０００２】
この１０年の間、商業的に重要な生物学的物質を産生するために、ますます組換えＤＮＡ技術が使用されるようになった。この目的で、医学的に重要な様々なヒトのタンパク質をコードするＤＮＡ配列がクローニングされている。
【０００３】
所望の医学的に重要なタンパク質を産生するために、細菌中でＤＮＡ配列を発現することは、魅力的な提案にみえるが、実際には、細菌の細胞中では、外来タンパク質は不安定で、正しく加工されないために、多くの場合、細菌は宿主として適していない。
【０００４】
この課題に鑑み、哺乳動物の組織培養中で、クローニングされた遺伝子を発現させることが試みられ、幾つかの事例では、実行可能な戦略であることが証明された。しかしながら、動物細胞のバッチ発酵は高価であり、且つ技術的に困難な工程である。
【０００５】
トランスジェニック動物を宿主として使用することは、上記課題に対する解決となり得ることが明らかとなっている。ＷＯ−Ａ−８８００２３９号は、そのミルクの中に、有用な薬学的タンパク質を分泌するトランスジェニック動物を開示している。現在まで、ミルクの他の成分によるタンパク質へのタンパク分解性の損傷を与えずに、トランスジェニック動物のミルク中のトランスジェニックタンパク質を生産することが成功している。これまでに、ミルク中の外来タンパク質の分解に対してとられた実用的な予防策は、採集後、素早くミルクを処理するか、採集後、ミルクに周知の化学的な阻害剤を添加することであった。
【０００６】
ミルクは、タンパク質、脂質、及び炭水化物の複雑な混合物である。タンパク質成分は、基本的に、３つのクラスのタンパク質、カゼイン、血清タンパク質、及び酸性乳漿タンパク質を含有する。カゼインは、集合して、低速度の遠心により、又は弱酸性条件下で沈殿し得るミセルと呼ばれる大分子量の複合体となる。血清タンパク質は、主として、アルブミンと免疫グロブリンからなるが、おそらくは、プロテアーゼ前駆体であるプラスミノーゲンとプロトロンビンを含む、少量の他のタンパク質が存在する。乳漿タンパク質は、一般に小さく、酸に対して安定で、酸性条件下で沈殿しない傾向がある。
【０００７】
タンパク分解活性は、ある種の情況、とりわけ、天然の組成が変化したとき、すなわち、熱処理又は長期の保存のような環境条件の激変後に、ミルクの中に検出され得る。これらのうち最も顕著なのが、塩基性アミノ酸であるリシンとアルギニンの後ろでタンパク質を切断する、アルカリ条件下において活性なプロテアーゼであるプラスミンである。ミルク中の他のプロテアーゼは、トロンビン様活性を有しており、酸性条件下で、より活性である。
【０００８】
ミルク中のプラスミンは、大部分を占める不活性な前駆体プラスミノーゲンと、より少ない量の活性型という２つの形態で存在している。そのうちいくらかは、確実に、血漿から腺の管腔中に漏出しているが、このプロテアーゼの源は定かではない。血漿からの漏出は、血液とミルク間の障壁がより漏出性になり、ミルクへの高度なタンパク質輸送が存在し得るときに、初乳中のプラスミン／プラスミノーゲンのレベルが高くなるという観察によって支持される。しかしながら、少なくとも最も研究されてきたウシにおいては、授乳期間中に、その最後に急激に上昇しながら、プラスミン／プラスミノーゲンのレベルが増加することも観察されている。最後の活性の上昇は、この組織がミルクの産生を停止するプロセスに入り始めたときに、乳腺の退行に関わるタンパク質分解工程に関連する。プラスミン活性は、改造プロセス（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ）に関与しているので、これは妥当な仮定である。ミルク中で２つの形態で存在していることに加えて、プラスミノーゲンは、主として、カゼインのミセルと会合しており、これは、活性化を防ぐための天然の機構の一部を成しているかもしれない。
【０００９】
ミルクの中に存在することが知られているプロテアーゼが、治療用産物の採取源を与えるために発現された異種タンパク質に損傷を与えるように作用し得るという理論的な可能性が常にあり得るが、標的タンパク質の経済的な生産を妨げるような顕著な程度の損傷は、広く見られているわけではない。発現レベルを評価するための試験系として、多くのタンパク質がマウスのミルク中で発現されており、マウスのミルクは、ミルクを採集する機械的な工程中に誘発された外傷のために、しばしば血液を含有するが、タンパク分解による標的タンパク質の多大な損傷に関する報告はほとんど存在しない。例えば、タンパク質分解によって活性化されるようにデザインされたタンパク質であり、プラスミノーゲンの強力な活性化因子でもある修飾された組織プラスミノーゲン活性化因子は、マウスとヤギの両者のミルク中に首尾良く発現されてきた。活性なプラスミノーゲン活性化因子の存在は、ミルク中の全てのプラスミン活性を活性化し、ミルク自体の崩壊を引き起こし得ると予測されるので、このことは、ミルクの一般的な安定性についての非常によい証拠である。このことは、記載した前記試験系においては観察されていなかった。
【００１０】
しかしながら、トランスジェニック家畜のミルク中にヒトフィブリノーゲンを発現させると、驚くべき程度のタンパク分解による損傷が存在することが、今、明らかとなった。これは、ヒツジのミルク中にスパイクされたヒトの血漿第ＩＸ因子が分解されないことが見出された１９８９年の時点で既に報告されたように（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９）、ヒツジのミルクはプロテアーゼ活性が高くないという一般的な観察に反し、且つ、多大なタンパク分解性の崩壊の同定なしに、ＡＡＴ（α−１−アンチトリプシン）、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、及び胆汁塩で刺激されたリパーゼを含む多数の異種タンパク質を首尾良く発現することに反する。ヒツジのミルクにおけるこの経験は、他の反芻動物のミルク中で発現されたタンパク質によっても繰り返される。例えば、ヤギでは、ＡＡＴとアンチトロンビンIIIの両者、異型組織プラスミノーゲン活性化因子、及び少なくとも２つのモノクローナル抗体が発現されているが、産物の経済的な回収に伴う問題を引き起こすタンパク質分解による損傷についての報告はない。
【００１１】
フィブリノーゲンのタンパク分解は、多数の形態を採り、様々な程度で起こる。α鎖は、その損傷を受けていない形態において、全体がフィブリノーゲン分子と会合することによって、おそらく、タンパク分解から幾らか保護されている相対的に長いカルボキシ末端領域を有する。α鎖の切除（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）は、おそらくは、カルボキシ領域が溶液相により露出されるようになり、且つプロテアーゼにより接近するために、一度起こると、進行する傾向がある。実際、ヒトの血漿から単離されたフィブリノーゲンは、存在する２つのサブユニットのうちの少なくとも１つに、既にα鎖のタンパク分解を幾らか有し、フィブリノーゲン分子全体が、Ｆ１（親分子）及び部分的なα鎖の分解を有するＦ２として知られる２本線として展開される。さらなるタンパク分解は、分子当たり２つのα鎖の切除をもたらすが、比較的大きな両鎖の損傷を有する「断片Ｘ」の出現をもたらす進行性のα鎖の切除（ｃｌｉｐｐｉｎｇ  ｂａｃｋ）も存在する。ここでは、さらなるタンパク分解は、より小さな種；断片Ｙ、Ｄなどの分子量の「ラダー」をもたらす損傷を受けた分子に対して起こる。凝固活性の機能性は、断片Ｘ及びそれ以降の段階で、大幅に減少し始める。それ故、この断片の存在は、混合物中に存在する機能的なフィブリノーゲンの割合の有用な指標となり、有用な産物を回収することに関していえば、断片Ｘの含量を最小限に保つことが望ましい。
【００１２】
ヒト血漿のＦ２成分中に見られるα鎖に対する損傷の部位は、プラスミンの既知の特異性と一致せず、単一の部位に起こるのではない。これにもかかわらず、プラスミンの生物学的な機能の１つは、血餅のフィブリン成分を分解することであり、フィブリノーゲンは、トロンビンによる活性化と血餅中への取り込みの前に、プラスミンによって、α鎖中で損傷され得ることが知られている。それ故、ミルク中のプラスミンは、フィブリノーゲンの部分的な分解を生じせしめ、Ｆ２を産生し、その後Ｘにまで分解されることがあり得る。
【００１３】
一般的には、ミルク中の異種タンパク質の発現レベルが高いほど、そのタンパク質のタンパク分解による損傷の程度は低いと予想される。しかしながら、ヒツジのミルク中で、リットル当たり約５ｇの総発現レベルでさえも、ゲル分析によって観察できる明白且つ相当な割合の断片Ｘが存在する。これは、回収可能なフィブリノーゲンのレベルを減少させ、機能的な産物を回収するためにデザインされた任意の工程によって、Ｆ２以下の断片を除去することを必要とするという効果を有する。ミルク中のフィブリノーゲンの損傷の程度は、他のタンパク質による経験に基づいて予想されたものよりずっと高い。このため、断片Ｘは、授乳の全ての段階で観察され、初乳中の高いレベルから始まり、授乳の最初の３０日間に減少した後、次の３０日間一定して増加する。フィブリノーゲンに伴うさらなる複雑な問題は、少なくとも生物学的に活性な物質を産生するようにデザインされたプロセスで使われるような非変性条件下で、フィブリノペプチドＡとＢを除去し、フィブリノーゲンが自己凝集して不溶性になる傾向を増加させるというトロンビン様の効果を有するミルク中に存在する第２のプロテアーゼ活性の効果である。
【００１４】
以前は、反芻動物のミルク中に発現された異種タンパク質の回収を妨げるとは決して思われなかったミルク中のプラスミンとトロンビン活性は、ともに、フィブリノーゲンの工程収率を減少させる上でかなりの影響を有しており、より複雑で、それ故、より高価な回収プロセスを必要とし、使用可能なミルクの保存期間を短縮せしめる。これは、沈殿によって失われた不可逆的な物質と機能的なフィブリノーゲンを得るために除去しなければならない分解された物質の組合せである。総体的な効果は、授乳の最初の１５日間は精製の収率が低く、次の３０〜４０日間に増加し、高い状態を保ち、その後、授乳が進むにつれて、急速に下降することである。これは、おそらくは４ヶ月を超えてから、授乳から得られる正常で、有用なミルクの供給をほぼ１／３まで減少させ、それ故、ミルクの生産コストを少なくとも３倍増加させる。さらに、断片Ｘがかなりの割合で存在することは、より大きなカラムマトリックス容量と基本的にさらに複雑な工程を必要とする。トランスジェニックヒツジ、又は他の哺乳動物のミルクから得られた組換えフィブリノーゲンの経済的な回収の見地から、ミルクでの発現中と、ミルクの保存中、及びその後のプロセッシング中の何れにおいても、該分子に対するタンパク分解性の損傷を実質的に減少せしめるための方法を見出すことができれば、明らかに有益である。
【００１５】
保存されたミルク中及びプロセッシングの間のタンパク分解を制御することは、理論的には、ミルクを採集した直後にプロテアーゼ阻害剤を添加することによって対応することができる。しかしながら、この産物は、ヒトに対して治療のために用いられることが意図されていること、それ故、阻害剤であることの本質的な特性として、本来しばしば毒性があるプロテアーゼ阻害剤を添加することのリスクと、モニタリング及び除去のコストを現実的に考慮しなければならないことを銘記しなければならない。フィブリノーゲンに関するさらなる面倒な問題は、共同して収率の喪失に関わる２つの異なるプロテアーゼが存在するようであるということである。治療的プロセッシングの観点から許容される阻害剤の多くは（ジイソプロピルフルオロリン酸のような活性部位のセリンのアルキル化剤を除く）、前記プロセスをさらに悪化させる活性と安全性の問題の両者に対して有効に機能しないと思われる。
【００１６】
プラスミンに対して有効である、一群の可能性のある候補から試験した阻害剤の１つ、すなわちトラネキサム酸は、保存期間中のミルクを安定化する上で有効であることが見出されたが、これは、断片Ｘのこの初期レベルに影響を与えず、又はトロンビン損傷を抑止しない。より高い温度で、トランスジェニックミルクをインキュベートしたときに生成された断片Ｘのレベルを観察した類似の実験では、リットル当たり１ｇのＡＡＴは、それ自体、有効でないことが明らかとなった。
【００１７】
タンパク分解に起因する有用な産物のさらなる喪失を減少し、又は削減する第２の、これまで探求されてこなかったアプローチは、生産種のミルク中で、プロテアーゼ阻害剤を前記産物と同時発現することである。トランスジェニック動物のミルク中に存在する異種の発現されたタンパク質のタンパク分解による損傷の問題は、本分野で既に同定された手段の他に防止を必要とするレベルで認識されてこなかったために、これまでのところ、これを行うモチベーションは存在しなかった。しかしながら、損傷を引き起こすプロテアーゼの正確な同定とそのような損傷に対するそれらの相対的な寄与についての科学的な確証がない状態で、阻害剤を選択するのには問題がある。例えば、プラスミンに対して高度に活性があるプラスミンの阻害剤、例えばセルピンα２−アンチプラスミンを選択することはできるが、トロンビンに対しては殆ど効果がない。これは、フィブリノーゲンとともに同時発現させることができるが、沈殿に関連した多大な喪失をなお引き起こし、又は最終産物に損傷を与え、その安定性に悪影響を及ぼし得るトロンビンに対する保護は与えないかもしれない。腺の生物学的現象においてプラスミンの役割があり得るかもしれないので、乳腺における強力なプラスミン阻害剤の発現は、形態学的な発育又はミルクの産生に対しても予測不能な影響を与えるかもしれない。
【００１８】
反対に、アンチトロンビンIIIを発現し、フィブリノーゲンに対するトロンビン損傷を抑制することができるであろうが、これは、プラスミンと、おそらくは、標的分子の全体的な損傷に寄与する他のプロテアーゼには有効でないであろう。このため、上記プロテアーゼ阻害剤は何れも、トランスジェニック動物のミルク中に存在する治療的に有用なタンパク質の産生における適切な「保護タンパク質（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」と認められないであろう。
【００１９】
プロテアーゼ阻害剤ＡＡＴは、その狭いプロテアーゼ特異性故に（例１及び図１参照）、プラスミンとトロンビンの何れに対しても阻害剤としては、ほとんど効果がない。ＡＡＴが阻害剤として作用する天然の標的プロテアーゼはエラスターゼである。大量のエラスターゼを放出することができる好中球が存在する感染中を除いては、前記プロテアーゼ、エラスターゼがミルク中に現れるという報告はない。乳腺炎又は他の乳腺の感染に罹患した動物は何れも、搾乳群から引き離されるので、このプロテアーゼが、ヒツジのミルク中に作られたフィブリノーゲンに対するタンパク分解性の損傷の原因であるという可能性は少ない。さらに、ＡＡＴは、以前、本発明者らによって、採集後にトランスジェニクミルクに添加しても、トランスジェニックフィブリノーゲンの安定性に提供を与えないことが示されている。採集後にトランスジェニックミルクに添加したときの、プラスミン阻害剤であるトラネキサム酸の安定化効果とは対照的である。従って、上記の他のプロテアーゼ阻害剤とともに、ＡＡＴは、トランスジェニック動物のミルク中に産生されたときに、何らかの保護的な効果を与えるとは予想されなかったであろう。
【００２０】
上記のセリンプロテアーゼ阻害剤は、トランスジェニック動物の乳腺中で同時発現したときに、フィブリノーゲンのタンパク分解を阻害する上で有効な候補である可能性が少ないという事実が確立されていたので、このような同時発現の劇的な、それ故、驚くべき効果が、本発明の基礎である。本例では、２つの別個の系統を交雑することによって、ＡＡＴとフィブリノーゲンの同時発現が促進された。誘導した乳分泌を分析したところによれば、生じたフィブリノーゲンは、ＡＡＴの非存在下で発現されたフィブリノーゲンとは著しく異なっていた。主要な差異は、ＡＡＴと同時発現されたフィブリノーゲンのα鎖は、検出可能なタンパク分解性のプロセッシングを全く又は殆ど受けていなかったということである。これは、非還元性のゲル上で、主としてＦ１種が存在していることによって示され、この観察は、部分精製の後、沈殿後に、Ｆ１とＦ２を別個の成分に分離することができる疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、及び、還元性のゲル分析上の正常な二重線の代わりに、主として単一のα鎖種が存在している（例４ｃ及び図１０参照）ことによって確認された。タンパク分解が明らかに減少していることの第２の証拠は、非還元性ゲル分析で、フィブリノーゲンのみの系統の誘導されたミルク、及び天然のミルク中に通常見られる断片Ｘが存在しないことである。
【発明の概要】
【００２１】
本発明の第１の側面によれば、非ヒトトランスジェニック動物のミルク中で、前記ミルクを安定化させるために発現されるセリンプロテイナーゼ阻害剤の使用が提供される。本発明は、このような使用により、ミルクの保存を延長することを提供し、これは、前記ミルクが治療的に価値のあるタンパク質を含有する場合に特に有用である。特に、ミルクの安定化は、ミルク中に存在するタンパク質のタンパク分解性損傷の減少に関わる。
【００２２】
本明細書において、「ミルク」とは、動物の乳腺から分泌される液体であると理解される。ミルクの安定化は、減少したタンパク分解性の損傷に関して顕著である。安定化効果を達成するのに必要とされるセリンプロテイナーゼ阻害剤のレベルは幾分変動するであろうが、標準的な操作によって、過度の負担なく、当業者によって容易に決定できる。考慮に入れるべき要素には、セリンプロテイナーゼ阻害剤、及びセリンプロテイナーゼが発現される動物の種類が含まれる。ミルク中のセリンプロテイナーゼ阻害剤のレベルには、任意のバックグラウンド又は内在性のレベル以上に上昇したレベル、例えば、導入された導入遺伝子から、又はレベルを上げるように修飾された内在性の遺伝子からの増加した発現レベルが含まれる。
【００２３】
セリンプロテイナーゼ阻害剤は、好ましくは、セルピン又はクニッツファミリーのもの、とりわけ、アンチトロンビンIII、ヘパリン補因子II、α−２−アンチプラスミン、プロテアーゼネクシン−１、好ましくは、α−１−アンチキモトリプシン、最も好ましくは、α−１−アンチトリプシンである。
【００２４】
本発明のセリンプロテイナーゼ阻害剤は、本分野で周知の番号（ｎｕｍｂｅｒ）を含み、それらの多くは、既にクローニングされ、遺伝子導入によって発現されている。主として、それ自体で有用なタンパク質として単離するために、それらを発現するのではなく、ミルク、特に、異種タンパク質（その役割は、治療的に有用な成分として単離することである）を含有するミルクの安定化における保護タンパク質として発現される点で、本発明におけるそれらの使用は特有のものである。従って、発現されるセリンプロテイナーゼは、保護能力を与える任意の形態であり得る。本発明の第１の側面によるセリンプロテイナーゼには、全ての天然型のタンパク質のみならず、末端切断タンパク質、アミノ酸配列変異種（突然変異タンパク質又は多型性変異体）、及び付加された残基を含む種、及びそれらの天然の変異体を含む他の関連する種が含まれる。
【００２５】
セリンプロテイナーゼ阻害剤は、前記動物にとって内在性のものでもよく、あるいは外在性のものでもよい。内在性のものであれば、動物のミルク中での発現を含むその発現の「スイッチをオンにする」ために、前記動物に対して幾らかの修飾が存在するであろう。セリンプロテイナーゼが前記動物にとって外在性であれば（すなわち、導入遺伝子）、任意の採取源から得られ得る。好ましくは、前記セリンプロテイナーゼ阻害剤は、ウシ、ヒツジ、又はヒト由来である。
【００２６】
本発明において特に興味深いのは、プロテイナーゼ阻害剤α−１−アンチトリプシンである。α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、成熟したペプチドとして、３９４アミノ酸を含む。それは、まず、４１８アミノ酸のプレタンパク質として発現される。前記プレタンパク質をコードするｍＲＮＡは１．４ｋｂの長さであり、これは、本出願で使用されるＡＡＴをコードするｃＤＮＡの長さ（約１．３ｋｂ）に、ほぼ匹敵する。ＡＡＴをコードする構造遺伝子（肝臓のもの、Ｐｅｒｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌｕｍｅ  ６  ｐ．２７６７−２７７１（１９８７））は、４つのイントロンを含有し、１０．２ｋｂの長さである。上述のように、本発明のＡＡＴは、その天然型である必要はない。例には、酸化耐性のある変異体、及びＡＡＴのようなセリンプロテアーゼ阻害剤の他の類縁体が含まれる。これらの類縁体には、α−１−アンチトリプシンの活性部位の修飾によって作られる新規プロテアーゼ阻害剤が含まれる。例えば、ＡＡＴのＭｅｔ−３５８がＶａｌに修飾されれば、活性中心にある酸化感受性の残基を不活性なバリンで置換することによって、前記分子に、酸化による不活化に対する耐性が与えられる。
【００２７】
本発明の第１の側面による動物は、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラクダ、水牛、ブタ、又はウマであり得る。
【００２８】
本発明の第１の側面による安定化は、ヒト以外の動物のミルク中にも発現された異種タンパク質の安定化に拡張することができる。
【００２９】
トランスジェニック動物のミルク中で所望の発現を得るためには、前記動物のゲノムの立体配置を変えることが必要であろう。ミルクタンパク質遺伝子プロモーターの制御下で、セリンプロテイナーゼ阻害剤（及びミルク中でも発現するための任意の他の異種タンパク質）を導入することが必要であるかもしれない。前記ミルクタンパク質遺伝子プロモーターは、当業者に公知のものを含む、長い又は短い乳漿酸性タンパク質プロモーター、α−ラクトアルブミンプロモーター、短い又は長いα、β、又はκカゼインプロモーターのような任意のものであり得るが、βラクトグロブリン遺伝子が特に好ましい。プロモーターは、様々な動物の様々なミルクの組成物のような多数の因子に基づいて選択される。例えば、ヒツジＢＬＧプロモーターは、ヒツジの乳腺でタンパク質を発現するのに、とりわけ有用である。前記遺伝子及びそれらのプロモーターの詳細は、「Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２０（１９８７）  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４１：３（１９９０）」などに記載されている。
【００３０】
５’隣接配列（ミルク遺伝子プロモーターの一部として）は、一般的に、ミルクタンパク質、例えばβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）転写開始部位を含むであろう。ＢＬＧの場合、ＢＬＧの転写開始部位の上流にある約８００塩基対（例えば、７９９塩基対）が含まれることが好ましい。とりわけ好ましい態様では、少なくとも４．２ｋ塩基対上流が含まれる。
【００３１】
適切な３’隣接配列が存在し得る。しかしながら、特にタンパク質をコードするＤＮＡが、それ自身のポリアデニル化シグナル配列を含んでいれば、このような配列が存在することは不可欠ではないかもしれない。しかしながら、本発明の幾つかの態様では、３’配列を与えることが必要であるか、便利であるかもしれない。３’未翻訳領域は、発現系のＲＮＡ転写物を明らかに安定化させ、このため、所望のタンパク質の収率を増加させる。このような配列は、カゼイン３’未翻訳領域、ＳＶ４０スモール及び抗原、他のミルクタンパク質遺伝子の３’未翻訳領域、とりわけ、ＢＬＧ遺伝子３’未翻訳領域に由来し得る。
【００３２】
もし必要であるか、又は所望であれば、適当なシグナル及び／又は分泌配列が存在してもよい。この点に関しては、本発明では、同種及び異種制御配列の両者が使用できる。上記プロモーターに加えて、転写を制御する有用な配列には、エンハンサー、スプライスシグナル、転写終結シグナル、及びポリアデニル化部位、があり、その多くは本分野で公知である。
【００３３】
発現のために選択される動物の種は、特に決定的なものではなく、かれらの必要に適するように、当業者によって選択されるであろう。哺乳動物が好ましく、不可欠であるかもしれない。操作の実験的な容易さに適した実験用哺乳動物には、マウスとラットが含まれる。ウシ、ブタ、水牛、ラクダ、ヤギ、及びヒツジのような家畜からは、より多くの収量が得られるかもしれない。実験動物と家畜の中間は、ウサギのような動物であり、同じく適切である。
【００３４】
本明細書全体を通じて、我々は、ある段階で、インビトロでの遺伝学的操作によってもたらされた、任意の種類の遺伝的修飾（例えば、遺伝子欠失、変異、置換）を担持する動物を含むように、より広い意味で、「トランスジェニック」という用語を使用する。前記遺伝学的操作は、ある段階の間に、動物自身に対して実施してもよく、あるいは、動物の生産に関与した動物に対して実施してもよい（例えば親動物）。従って、動物の第一世代が本発明によって保護されるのみならず、同様に上記の必要な遺伝的修飾を有するその子孫も保護される。「トランスジェニック」という用語は、通常は動物のゲノム中へのプロモーター配列の導入又は再配列によって、内在性又は外在性遺伝子が「スイッチオン」されるか、又はその発現レベルが「スイッチアップ（ｓｗｉｔｃｈｅｄ  ｕｐ）」されるように操作された動物も含む。
【００３５】
本発明の第２の側面によれば、その乳腺中でセリンプロテイナーゼ阻害剤を発現し得る非ヒトトランスジェニック動物の安定化されたミルクの製造における使用が提供される。
【００３６】
本発明の第３の側面によれば、そのゲノムにセリンプロテイナーゼ阻害剤をコードする外在性ＤＮＡ配列が安定に組み込まれた非ヒトトランスジェニック動物の安定化されたミルクの製造における使用が提供される。
【００３７】
本発明の第２及び第３の側面において、前記非ヒトトランスジェニック動物は、ミルクを分泌し、生産することが望ましい。本発明の第１の側面の全ての好ましい特徴は、第２及び第３の側面にも当てはまる。
【００３８】
本発明の全ての能様によれば、トランスジェニック動物は、好ましくは、その子孫に構築物を伝えることが可能である。
【００３９】
本発明の第４の側面によれば、そのミルク中にセリンプロテイナーゼ阻害剤とフィブリノーゲンを発現し得る非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【００４０】
本発明の第５の側面によれば、そのゲノムに、セリンプロテイナーゼ阻害剤をコードする外在性ＤＮＡ配列とフィブリノーゲンをコードする外在性ＤＮＡ配列が安定に導入された非ヒトトランスジェニック動物が提供される。
【００４１】
本発明の第４及び第５の側面によれば、前記非ヒトトランジェニック動物は、そのミルク中にセリンプロテイナーゼ阻害剤とフィブリノーゲンとを同時発現できることが好ましい。あるいは、前記セリンプロテイナーゼ阻害剤はフィブリノーゲンより早く発現されてもよいが、フィブリノーゲンが発現されるのと同時に発現されるべきでもある。動物の乳腺中で、セリンプロテイナーゼ阻害剤とフィブリノーゲンを発現するために、前記コード配列は、１以上のミルク遺伝子プロモーターの制御下にあることが好ましい。
【００４２】
フィブリノーゲンは、トランスジェニック動物のミルク中のトランスジェニックタンパク質として発現された時、タンパク質分解を受けやすいことが、今明らかとされたので、本発明の適切なタンパク質として同定されている。
【００４３】
血餅の形成に不可欠な血液中の主要な構造タンパク質であるフィブリノーゲンは、３つのポリペプチド鎖の二量体として存在する。すなわち、Ａα（６６．５ｋＤ），Ｂβ（５２ｋＤ）及びγ（４６．５ｋＤ）が２９のジスルフィド結合によって連結されている。Ｂβ及びγ鎖へのアスパラギン結合型炭水化物の付加は、３４０ｋＤの分子量を有する分子をもたらす。フィブリノーゲンは三節構造を有する。中央の節は、Ｅドメインと呼ばれ、フィブリノペプチド（Ｆｐ）を含む６つの全ての鎖のアミノ末端を含有するのに対して、Ｄドメインと呼ばれる２つの遠位に位置する節は、Ａα、Ｂβ及びγ鎖のカルボキシ末端を含有する。フィブリノーゲンのＡα及びＢβ鎖のアミノ末端は、トロンビン（第Ｘａ因子によってその不活性型から転換されるセリンプロテアーゼ）によって、タンパク質分解による切断を受け、フィブリノペプチドＡ及びＢ（ＦｐＡ＆ＦｐＢ）を放出し、フィブリン単量体に転換される。生じたフィブリン単量体は、隣接するフィブリン分子へのＤＥ接触によって、非共有結合的に集合して前原線維になる。これによって、半分ずれながら重なり合った様式でフィブリンポリマー鎖が構築される。
【００４４】
接触は、隣接するＤドメインの間で縦方向にも起こり（ＤＤ接触）、側方凝集をもたらす。他のセリンプロテアーゼである第ＸＩＩＩ因子は、Ｃａ２＋の存在下で、トロンビンによるタンパク質分解を受けて切断され、活性型になる。この活性化された第ＸＩＩＩ因子（第ＸＩＩＩａ因子）は、リシンとグルタミン側鎖間にイソペプチド結合を作ることによって、ポリマー化されたフィブリンの架橋を触媒する。形成される最初のグルタミン−リシン結合は、Ｄ−Ｄ架橋を作るγ鎖のＣ−末端で起こる。その後、隣接したＡα鎖間に、多数の架橋が形成される。架橋工程は、血餅に生物学的安定性（フィブリン溶解に対する耐性）と機械的安定性の両者を与える［Ｓｉｅｎｂｅｎｌｉｓｔ  ａｎｄ  Ｍｏｓｅｓｓｏｎ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｉｎ  γ  ｃｈａｉｎｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９：２８４１４−２８４１９，１９９４］。
【００４５】
ポリマー化の工程を触媒する、第１の成分としてフィブリノーゲンと第ＸＩＩＩ因子を、第２の成分としてトロンビンとＣａ２＋を有することによって、凝固工程は、容易に、インビトロで、自己維持型の接着系へと加工され得る。「フィブリンシーラント（Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌｅｎｔｓ）」又は「フィブリン組織接着剤（Ｆｉｂｒｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ）」として本分野で公知のこれらの接着系には、外科手法に、及び広範な薬学的に活性な化合物の運搬装置として多数の応用が見出されている［Ｓｉｅｒｒａ，Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，７：３０９−３５２，１９９３］。
【００４６】
米国の臨床のフィブリンシーラントに対する年間の需要は、血漿分別機によって使用される現行の寒冷沈降反応法を用いて回収することができる３００Ｋｇ／年を大幅に超えると見積もられている。それ故、フィブリンシーラントの大部分を占める主要な成分であるフィブリノーゲンの他の採取源が探索されてきた（組換え体由来のものが好まれている）。［Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｌｋ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７８：５３７−５４２，１９９７］。哺乳類は、それらのミルク中に５．０ｇ／Ｌのレベルまでトランスジェニックヒトフィブリノーゲンを産生できることが示されているので、これは商業的に実用可能なヒトフィブリノーゲンの製造法となる［Ｐｒｕｎｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：８６７−８７１，１９９６；Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｈｅｅｐ．  Ｉｎ：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｅａｌｅｎｔｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｕｓｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｅｗｔｏｎ  Ｕｐｐｅｒ  Ｆａｌｌｓ，ＭＡ，Ｍａｒｃｈ  ３０  Ａｐｒｉｌ２  １９９６（ａｂｓｔｒｕｃｔ）］。
【００４７】
本明細書で使用する「フィブリノーゲン」という語は、血餅を形成するのに必要な主要な構造タンパク質を指し、フィブリノーゲンの糖蛋白型全体のみならず、末端切断型フィブリノーゲン、フィブリノーゲンのアミノ酸配列変異体（突然変異タンパク質又は多型性変異体）、付加された残基を含むフィブリノーゲン種、及びその任意の天然の変異体を含む他の関連するフィブリノーゲン種が含まれる。上記した同じ変異は、本発明によるミルクから単離できる他のフィブリノーゲン様タンパク質にも適用される。本発明は、個々のタンパク質自体、又は、他のタンパク質への融合などによって、トランスジェニック発現を促進するように何らかの改変が加えられたタンパク質の製造及び単離に有用である。
【００４８】
フィブリノーゲンは、任意の採取源から得てもよいが、ウシ又はヒト由来のものが好ましい。
【００４９】
本明細書で使用される「フィブリン接着剤（ｆｉｂｒｉｎ  ａｄｈｅｓｉｖｅ）」又は「フィブリンシーラント（ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅａｌｅｎｔ）」という用語は、ポリマー化されたフィブリンの形成によって、生分解性接着剤又はシールを形成し得るフィブリノーゲンを含有する物質を表す。このような接着剤／シーラント系は、あるいは「フィブリン組織接着剤（ｆｉｂｒｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ）」又は「フィブリン組織膠（ｆｉｂｒｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｌｕｅ）」と呼ばれる。接着剤又はシールは、特に止血薬、流体への障壁、隙間を埋める基質又は薬物運搬剤として作用し得る。とりわけ、神経外科、眼科、整形外科、又は心胸手術、皮膚移植、及び他の様々な種類の手術で使用され得る。
【００５０】
フィブリン接着剤又はシーラントは、フィブリノーゲン以外に、トロンビン、Ｃａ＋＋、第ＸＩＩＩ因子（本明細書では、第ＸＩＩＩａ因子も含む）のようなフィブリン接着剤／シールの形成を促進する物質を含み得る。トロンビンは、フィブリン凝塊の形成が望まれるいかなる系にも組み入れられる好ましい酵素であろうと認識されているが、フィブリン凝塊の形成をもたらす、タンパク質分解によるフィブリノーゲンの切断を行い得る他の酵素が存在することを理解しなければならない。この一例は、ヘビ毒酵素バトロキソビン（Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ）であろう［Ｗｅｉｓｅｌ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｓｅｒｉｅｓ：Ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）７：３４７−３６５，１９９７］。所望であれば、アルブミン、フィブロネクチン、可溶化剤、充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）及び／又は適切な担体又は希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）のような他の成分も含まれ得る。
【００５１】
生分解性ポリマーとしてのフィブリンシーラントの一つの利点は、血餅を効果的に除去するための天然の機構が体内に存在するため、フィブリンシーラントは止血又は創傷治癒のための一時的な栓となり得るという点である。様々なタンパク質分解酵素及び細胞が、条件によっては、フィブリンを溶解することが可能であるが、最も特異的な機構にはフィブリン溶解性機構が含まれる。生理的条件下でのフィブリン凝塊の溶解は、フィブリンへの循環プラスミノーゲンの結合、及びプラスミノーゲン活性化因子による、活性なプロテアーゼであるプラスミン（同じくフィブリンに結合し得る）へのプラスミノーゲンの活性化を含む。その後、プラスミンは、フィブリンの特異的部位を切断する。
【００５２】
場合によっては、ある部位にフィブリン接着剤又はシーラントを適用した後、自然のフィブリン崩壊工程を行わせることは有利であり得る。実際、この崩壊は例えば、プラスミノーゲンを含有させることによって促進され得る。あるいは、ある場合には、例えば、プラスミノーゲンからプラスミンへの転換をブロックできる、又はプラスミンの活性部位に直接結合してフィブリン溶解を阻害する抗フィブリン溶解化合物を含有させることによって、前記工程を遅延させることが有利であり得る。このような抗フィブリン溶解剤には、プラスミンの主要な生理的阻害剤であるα２−マクログロブリン、アプロチニン、α２−アンチプラスミン、及びε−アミノカプロン酸が含まれる。
【００５３】
フィブリン／シーラントは、２つの成分（一方の成分はフィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子（及び／又は第ＸＩＩＩａ因子）を含有し、他方の成分はトロンビン及びＣａ＋＋を含有する）を含み得る。もし必要であれば、上記の他の物質には、前記成分の一方又は双方を含有させてもよい。
【００５４】
前述のように、フィブリノーゲンの主な用途は、接着剤又はシーリング剤の調製であると考えられるが、フィブリノーゲンは、例えば、米国特許第５，２７２，０７４号に開示されたようなポリマー性物品用のコーティングとして、医学の分野で別の用途がある。本発明の凍結乾燥されたフィブリノーゲンは、特に、（好ましくは、外科の縫合で使用されているポリ乳酸化合物で作られた）ガーゼ又は包帯の中で、又はその一部として使用される。必要に応じて、このような創傷用包帯は、パッケージ又はキットの形態で、皮膚に又は内臓に直接適用するために、（上記の凝塊を形成するために必要な他の成分も含んで）供給され得る。
【００５５】
第１〜第３の側面の好ましい特徴は、全て第４及び第５の側面にも当てはまる。
【００５６】
本発明の第６の側面によれば、本発明の第４又は第５の側面による非ヒトトランスジェニック動物の組換えフィブリノーゲンの製造における使用が提供される。第１から第５の側面の好ましい特徴は、全て第６の側面にも当てはまる。
【００５７】
本発明の第７の側面によれば、本発明の第４又は第５の側面による非ヒトトランスジェニック動物を生産する方法であって、
（ａ）セリンプロテイナーゼ阻害剤をコードする第１のＤＮＡ配列又は配列ファミリーを得ることと；
（ｂ）そのゲノムに前記第１のＤＮＡ配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物を産出し得る動物の細胞、接合体又は胚に、前記ＤＮＡ配列又は配列群を導入することと；
（ｃ）フィブリノーゲンをコードする第２のＤＮＡ配列又は配列ファミリーを得ることと；
（ｄ）そのゲノムに前記第２のＤＮＡ配列が安定に組み込まれたトランスジェニック動物を産出し得る動物の細胞、接合体又は胚に、前記第２のＤＮＡ配列又は配列群を導入することと；
（ｅ）前記細胞、接合体又は胚を動物まで成長させること；
とを備えた非ヒトトランスジェニック動物を生産する方法が提供される。
【００５８】
本発明のこの側面では、前記「第１」及び「第２」のＤＮＡ配列は、実際には、個別の分離された配列でなくてもよい。例えば、フィブリノーゲンは、しばしば上記の工程では、１以上の配列（配列のファミリー）上に導入され、本ケースでは、フィブリノーゲンの３つのサブユニット鎖をコードする３つの分離した構築物上に導入される。同様のことが、セリンプロテアーゼ阻害剤のコード配列にも当てはまり得る。
【００５９】
前記第１及び第２の配列は、細胞、接合体又は胚に、別々に、同時に、又は順次導入され得る。前記第１及び／又は第２のＤＮＡ配列は、ミルク遺伝子プロモーターに作用可能に結合され得る。
【００６０】
本発明の第７の側面による方法では、前記動物は、好ましくは、乳汁の分泌を誘導される。
【００６１】
本発明によるトランスジェニック動物の生産方法は、限定されない。それらは、前核マイクロインジェクション（１９８０年に最初に記載された。Ｇｏｒｄｏｎ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７３８０−７３８４）及び家畜への遺伝子導入に関して記載されている（Ｅｂｅｒｔ  ＫＭ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，ＪＥＳ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３９，１２１−１３５，１９９３）；インビトロでの成熟及び受精（Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，８４４−８４７，１９９１）；レトロウィルスを介した遺伝子導入（Ｗｅｉｓｓ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ，ＲＮＡ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８５）；  精子を介したＤＮＡ導入（Ｂａｃｈｉｌｌｅｒ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３０，１９４−２００，１９９１）；胚幹細胞を介したトランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）；胚生殖細胞（Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｌ．Ｃ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．１６１，６２６−６２８，１９９４）；及びＷＯ９７／０７６６９号及びＷＯ９７／０７６６８号に記載されているような核の導入を含む。マイクロインジェクション及び核の導入は、本発明によるトランスジェニック動物を生産するための好ましい方法である。
【００６２】
第１〜第６の側面の好ましい特徴は、第７の側面にも当てはまる。
【００６３】
本発明の第８の側面は、本発明の第７の側面による方法によって生産されたトランスジェニック動物を提供する。第１〜第７の側面の好ましい特徴は、全て第８の側面にも当てはまる。
【００６４】
本発明の第９の側面は、組換えフィブリノーゲンを製造する方法であって、
（ａ）本発明の第４、５、又は８の側面によるトランスジェニック動物に乳汁分泌を誘導せしめることと；
（ｂ）前記動物から搾乳することと；
（ｃ）前記乳汁を採集することと；
（ｄ）前記フィブリノーゲンを単離することと（必要に応じて精製工程を含む）
を備えた方法を提供する。
【００６５】
フィブリノーゲンの単離及びそれに続く精製は、いかなる方法によってもよい。
【００６６】
第１〜第８の側面の好ましい特徴は、第９の側面にも当てはまる。
【００６７】
本発明の第１０の側面は、第４、５、８、又は９のいずれか一つの側面による動物のミルク中に生産された組換えフィブリノーゲンを提供する。第１〜第９のうちの任意の側面の好ましい特徴は、第１０の側面にも当てはまる。
【００６８】
本発明の第１１の側面は、本発明の第１０の側面による組換えフィブリノーゲンを含むフィブリンシーラントを提供する。フィブリンシーラントに関する詳細は、本明細書において上述されている。第１〜第１０までの側面の好ましい特徴は、全て第１１の側面にも当てはまる。
【００６９】
フィブリノーゲンとＡＡＴを同時に発現するためには、同時に、同一の組織、すなわち乳腺上皮細胞に、十分なレベルで発現を誘導し得る発現構築物を作成することが好ましい。これは、プロモーター領域、組織特異的発現を誘導する手段（プロラクチンによって活性化され得るであろうが、必ず活性化されるわけではない）、目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、及び、好ましくはｍＲＮＡ転写物を安定化する何らかの手段（ポリアデノシン３’領域であり得るかもしれない）を含有する構築物を用いた多数の方法によって達成することができる。これは、末端切断型のβ−ラクトグロブリンプロモーターが前置され、３’ポリＡターミネーター領域が後方に配置されたｇＤＮＡ配列を含む、３つ（３つのサブユニットそれぞれにつき１つ）の別個の構築物を使用したフィブリノーゲンの発現を誘導することによって達成することができる。これらの構築物の構築の詳細は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２６４８号に記載されている。当業者であれば、αラクトアルブミンプロモーター、ＷＡＰプロモーター又はカゼインプロモーター、又は適切な制御因子を有する人工のプロモーターに対するもののような、天然の乳房特異的制御領域を用いて、乳房組織への発現を誘導し得る多くの他のプロモーターを知っているであろう。
【００７０】
ＡＡＴのための発現構築物は、Ｃｌａｒｋらによって記載されているように（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：４８７−４９２）ＢＬＧプロモーターとＡＡＴの修飾ｇＤＮＡ（エキソンのうちの２つが融合されている）を有する類似のデザインを使用した。フィブリノーゲンについて上述したように、他のプロモーターを有する構築物をデザインすることは、本分野で標準的に実施される。例えば、通常は不活性な乳腺細胞中の遺伝子を「スイッチオン」することによって、その内在性ＡＡＴが乳腺で高度に発現されるように、動物の遺伝的な組成を改変することも想定できる。
【００７１】
本発明によるフィブリノーゲン及び／又はＡＡＴの両者に関しては、存在するプロモーターの後ろのトランスジェニック動物のゲノムの適切な活性領域中に挿入されたｇＤＮＡ又はｃＤＮＡ（でもよい）の相同的組換えを用いて、発現を操作することができる。
【００７２】
トラスジェニック動物は、前核マイクロインジェクション、形質転換された細胞株から得られた卵母細胞への核の導入、組換え技術などを含む様々な方法を用いて作成することができる。例えば、ヒトフィブリノーゲンとヒトＡＡＴがともに遺伝子導入された動物は、大腸菌ベクターからの切り出しと精製後に、４つのＢＬＧ構築（上記）全てを（１つは各フィブリノーゲンサブユニット用、１つはＡＡＴ用）等モル比で混合し、十分な受精した動物の前核、例えば、ヒツジの卵母細胞の中に、このようにして作成した混合物を注入して、有用な発現レベルを確保するのに適切な数のトランスジェニック子孫を作出することによって作ることができる。この場合、有用とは、商業的な採集に十分なレベルのフィブリノーゲンとタンパク分解を抑止するのに十分なＡＡＴを意味する。
【００７３】
フィブリノーゲンとＡＡＴがともに遺伝子導入された動物を作る別の方法は、各タンパク質を個々に発現する安定で、且つ別の系統を交配することである。例えば、フィブリノーゲンが遺伝子導入された系統由来のＧ１雌を、ＡＡＴが遺伝子導入された雄と交配する。もし、ヘテロ接合のＡＡＴ雄が使用されると、子孫８匹のうち約１匹が二重トランスジェニック雌である。従って、より効率的な方法は、フィブリノーゲントランスジェニック雌をホモ接合のＡＡＴ雄と交配することであり、これにより、４匹のうち約１匹が二重トランスジェニック雌となる。あるいは、ＡＡＴトランスジェニック動物は、ヘテロ接合又はホモ接合のフィブリノーゲン雄と交配したヘテロ接合の雌であり得る。この場合にも、これによって、それぞれ、８匹のうち約１匹又は４匹のうち約１匹が二重トランスジェニック雌となるであろう。
【００７４】
ＡＡＴ同時発現フィブリノーゲン含有ミルクには、プロセスに関連した多くの利点がある。これらのうちの第１は、ミルク中の産物の安定性と保存期間である。前記産物は、加温下で保存されたミルク中において安定に保たれるのに対して、ミルク中に単独で発現されたフィブリノーゲンは、タンパク分解によってさらなる損傷を受けることが実証されている。ＡＡＴが同時発現されたミルク中の濃度は、フィブリノーゲンのみのミルク中の濃度と同じであるが、その中に存在する損傷を受けていない物質だけでなく、この全ての発現レベルをプロセッシングに利用することができるので、フィブリノーゲンの利用度において有利である。同様に、もはや、密接に関連する夾雑物と見なされ得るフィブリノーゲン断片を製品から除去する必要がないため、工程の複雑さが減少することがあり、且つより小さなクロマトグラフィーカラムを使用できるので、総コストを減らす相当な余地が得られる。
【００７５】
フィブリノーゲンの同時発現には、製品に関連する利点もある。第１の利点は、完全なα鎖を高い割合で含有することができる得られた製品は、高度に確定されており、従って、（必要であれば、トロンビン及び第ＸＩＩＩ因子成分を加えた）フィブリンシーラント又は膠調製物に最適な特性を与えるように、正確に処方できるということである。例えば、断片Ｘの割合が増加すると、このような組成物の望ましい物理的特性に悪影響を与えることが知られている。Ｆ１の割合が増加すると、より強く、より柔軟なフィブリンシーラント組成物を作るのに有用であり、より低いフィブリノーゲン濃度で、所定の選択した特性を有するシーラントを作成して、製造の経済性を増加させることも可能かもしれないと予測される。
【００７６】
さらなる製品に関連する利点は、フィブリノーゲンには、タンパク分解の受けやすさにおいて一種の累進性があるという観察から生じる。このため、Ｆ２はＦ１よりもより容易に分解され、断片ＸはＦ２及びそれ以下の断片のラダーよりもより容易且つより多く分解される。それ故、最も主要なＦ１フィブリノーゲンは、プロテアーゼの作用に対してより安定で、それ故、より長い保存期間を有し、液体組成の製剤により適しているであろうと予想される。保存期間を延長するであろう第２の因子は、ＡＡＴ同時発現フィブリノーゲンの効果的に無プロテアーゼな源である。プロテアーゼに対するフィブリノーゲンの感受性は、一般に、最終製剤中のいかなる低いレベルのプロテアーゼの夾雑による有害な効果も、（とりわけ非凍結状態での）長期間の保存に適合する保存条件を著しく限定するであろうということを意味する。初発物質にＡＡＴが存在すれば、どんな活性プロテアーゼも前記工程によって複合体が形成されて、除去されるため、製品中には現れないということを意味する。
【００７７】
ＡＡＴの同時発現が、フィブリノーゲンのタンパク分解による損傷を妨げるこのような劇的な効果を有する機序は、ミルク中に最も存在すると思われるプロテアーゼ（プラスミン及びトロンビン）に対する予測された効果の欠如からは、不明である。おそらく、それは、低濃度のプロテアーゼの生成でさえも阻止する定常的なＡＡＴが存在することと、その存在によってフィブリノーゲンへの極めて僅かな損傷（もし、これが起これば、タンパク分解に対するフィブリノーゲンの総体的な感受性を上昇させるのに十分であろう）でさえも阻止されることとが組み合わされることによるのであろう。このように、既に、より高く、且つ制限を受けていないプロテアーゼ活性が存在し、既存のフィブリノーゲンは、既に、さらなるタンパク分解による損傷に向かっているので、ミルクにＡＡＴを添加しても有効でないかもしれない。本ケースでは、トランスジェニック動物は、約１０ｇ／Ｌの阻害剤で、ＡＡＴを発現する。このような高いＡＡＴ濃度は、同時発現とともに、ミルクの安定性及びフィブリノーゲンとの同時発現において、特に好ましいかもしれない。
【００７８】
ＡＡＴの保護効果は予期されないものであるとしても、十分に高い発現レベルを得ることができ、それらの特異性が、関与している前記プロテアーゼを阻害するのに十分広く、且つ乳腺の生態に、又は宿主動物の生理に確かに有害な効果がないのであれば、異種タンパク質を保護するために他のプロテアーゼ阻害剤タンパク質を使用する可能性を妨げるものではないことが強調されなければならない。これらの制限は、当業者によって過度の実験又は過度の負担なしに、容易に決定され得る。従って、本発明は、非ヒト哺乳動物のミルクの中に発現されたタンパク質分解を受けやすい異種タンパク質（例えば、第ＶＩＩＩ因子や組織プラスミノーゲン活性化因子のような）を保護するために、他のプロテアーゼ阻害剤、特にセルピン及びクニッツファミリーのプロテアーゼ阻害剤を同時発現することを包含する。本発明によれば、ミルク中にプロテアーゼ阻害剤タンパク質のみを発現させることは、ヒトが消費するためのミルクの保存特性に関して有益であり、且つさらなる製品に加工することへの補助として有益であることも認識される。
【００７９】
ここで、多数の例によって、本発明を説明する。この例では、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＡＡＴが、プラスミンに対する阻害剤として殆ど効果がない（インビトロ）ことを示しているＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１は、フィブリノーゲン（４ｍｇ／ｍＬ）とＡＡＴ（１ｍｇ／ｍＬ）、プラスミンなしである；レーン２は、フィブリノーゲン（４ｍｇ／ｍＬ）とＡＡＴ（１ｍｇ／ｍＬ）、６μｇ／μＬのプラスミンありである；レーン３は、フィブリノーゲン（４ｍｇ／ｍＬ）とＡＡＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、６μｇ／ｍＬのプラスミンありである。
【図２】ミルクから沈殿した後のミルク中のカゼインタンパク質の分離を示すクロマトグラムである。ＵＶの波長は２８０ｎｍであった。
【図３】３７℃で１８日インキュベートした後の非ＡＡＴミルクを示すクロマトグラムである。ＵＶの波長は２８０ｎｍであった。
【図４】インキュベート前のＡＡＴミルクを示すクロマトグラムである。ＵＶの波長は２８０ｎｍであった。
【図５】３７℃で１８日間インキュベートする前及び後のＡＡＴミルクを示すクロマトグラムである。ＵＶの波長は２８０ｎｍであった。
【図６】ＡＡＴとフィブリノーゲンを遺伝子導入したヒツジａとｂのＤＮＡのスクリーニングを示すサザンブロットである。ヒツジは、フィブリノーゲンについてスクリーニングした。レーンＡはネガティブコントロールである；レーンＢは１コピーコントロールである；レーンＣは１０コピーコントロールである；レーンＤはヒツジａであり、レーンＥはヒツジｂである。
【図７】ＡＡＴとフィブリノーゲンを遺伝子導入したヒツジａとｂのＤＮＡのスクリーニングを示すサザンブロットである。ヒツジは、ＡＡＴについてスクリーニングした。レーンＡはヒツジ１である；レーンＢはヒツジｂである；レーンＣはネガティブコントロールである；レーンＤは１０コピーコントロールである；レーンＥは２０コピーコントロールである。
【図８】ＡＡＴとフィブリノーゲンの両者を遺伝子導入したヒツジのミルク、及びフィブリノーゲンのみを遺伝子導入したヒツジのミルクのタンパク質組成の非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析を示している。
【図９】ＡＡＴとフィブリノーゲンの両者を遺伝子導入したヒツジのミルク、及びフィブリノーゲンのみを遺伝子導入したヒツジのミルクを示す、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析を示している。レーン１はＡＡＴフィブリノーゲンヒツジ１である；レーン２はＡＡＴ−フィブリノーゲンヒツジ２である；レーン３と４はＦ２系統フィブリノーゲンヒツジである：レーン５はＡＡＴ標準タンパク質である。
【図１０】ＡＡＴ−フィブリノーゲントランスジェニックヒツジ及びフィブリノーゲンのみのトランスジェニックヒツジの各ヒツジのミルクのウェスタンブロット分析を示している。トラック１は、かなりの分解を示している低品質ミルクを示している；トラック２、４〜８及び１０は、一定でない分解を示す単一トランスジェニックミルクを示している；トラック３と９は、ＡＡＴとフィブリノーゲンを遺伝子導入したヒツジからのミルクを示している。
【図１１】ＨＩＣによって分離されたＡＡＴ−フィブリノーゲントランスジェニックヒツジのミルクの溶出プロフィールを示している。
【図１２】ＨＩＣによって分離されたフィブリノーゲンのみのトランスジェニックヒツジのミルクの溶出プロフィールを示している。
【図１３】系統Ｆ３フィブリノーゲンのみのトランスジェニックヒツジ（図１３Ａ）とＡＡＴ−フィブリノーゲントランスジェニックヒツジ（図１３Ｂ）のミルクに対して行った逆相クロマトグラフィーから得られた溶出プロイフィールを示している。各フィブリノーゲンの鎖には注釈が付してある。両波長は、２１４ｎｍである。
【図１４】ＡＡＴ−フィブリノーゲントランスジェニックヒツジのＨＩＣ溶出プロフィールを示している。
【図１５】フィブリノーゲンのみのトランスジェニックヒツジ（線１）とＡＡＴ−フィブリノーゲントランスジェニックヒツジ（線２）から精製したフィブリノーゲンの凝固を示す光学密度曲線である。
【００８１】
（例）
概要
特に詳述されていなければ、組換えＤＮＡと分子生物学的な操作は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８２））“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ６８，（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒ．Ｗｕ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７９）；“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｐａｒｔ  Ｂ”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １００，（Ｗｕ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄｇａｖｅ，Ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）；“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｐａｒｔ  Ｃ” Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，（Ｗｕ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｄｇａｖｅ，Ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）；  ａｎｄ  “Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５２（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓ．Ｌ．  Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）に従った。特に言及していなければ、すべての化学物質は、ＢＤＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ、又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，Ｅｎｇｌａｎｄから購入した。特に言及していなければ、すべてのＤＮＡ修飾酵素及び制限エンドヌクレアーゼは、ＢＣＬ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｈｏｕｓｅ，Ｂｅｌｌ  Ｌａｎｅ，Ｌｅｗｅｓ，Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ  ＢＮ７  １ＬＧ，ＵＫから購入した。
【００８２】
［略号：ｂｐ＝塩基対；ｋｂ＝キロ塩基対；ＡＡＴ＝α１−アンチトリプシン；ＢＬＧ＝β−ラクトグロブリン；ＦＩＸ＝第ＩＸ因子；Ｅ  Ｃｏｌｉ＝Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；ｄＮＴＰｓ＝デオキシリボヌクレオチド三リン酸；制限エンドヌクレアーゼは、例えば、ＢａｍＨｉのように略記する；制限エンドヌクレアーゼに対する部位の後への−Ｏの付加、例えばＰｖｕＩＩ−Ｏは、認識部位が破壊されたことを示す］
トランスジェニック動物の構築
ヒツジ
トランスジェニックヒツジの作成は、国際特許出願ＷＯ−Ａ−８８００２３９（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｌｔｄ）に、及びＳｉｍｏｎｓ，Ｗｉｌｍｕｔ，Ｃｌａｒｋ，Ａｒｃｈｉｂａｌｄ，Ｂｉｓｈｏｐ  ＆  Ｌａｔｈｅ（１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，１７９−１８３によって詳細に記載されている。
【００８３】
トランスジェニックヒツジの同定は、国際特許出願ＷＯ−Ａ−８８００２３９（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｌｔｄ）に詳細に記載されている。
【００８４】
例１
インビトロで、ＡＡＴがプラスミンを阻害する有効性を決定するために実験を行った。４ｍｇｍＬのフィブリノーゲンを含有する一連のチューブに、０．５ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの濃度でＡＡＴを加えた。続いて、これらのチューブに、重量ベースで８３：１又は１６６：１、モルベースで５５：１又は１１０：１の何れかのＡＡＴ：プラスミン比率になるように、プラスミン（３μｇ）を加えた。続いて、３７℃で前記チューブをインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから結果を得た（図１参照）。
【００８５】
この実験の結果は、各プラスミン分子に対して１１０分子のＡＡＴに相当する最大量のＡＡＴが存在しても、３７℃で４時間後には、フィブリノーゲンがかなり分解することを示している。
【００８６】
例２
非ＡＡＴミルクに対するＡＡＴミルクの増加した安定性
方法
加速した老朽化を模倣するために、（約１３ｇ／ＬのレベルでＡＡＴを発現するトランスジェニック雌ヒツジから得た）ＡＡＴスキムミルク及び（雌ヒツジから得た）非ＡＡＴスキムミルクのアリコート（１ｍＬ）を、３７℃で１８日間インキュベートした。この期間の終了後、ミルクを目で調べると、非ＡＡＴミルクは２つの相に分離していたのに対して、ＡＡＴミルクは、新鮮なミルクの外観を呈していた。両チューブを混合し、ｐＨ４．６で、５ｍＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ緩衝液に内容物を添加した。この溶液を混合した後、カゼイン画分の沈殿を促進するために、２０００ｒｐｍで、１０分間遠心した。続いて、ＴＢＥ緩衝液中の８Ｍ尿素２．５ｍＬ中にカゼインを再懸濁する前に、沈殿したカゼインの沈降物を水で洗浄した。続いて、２ｍＭの最終濃度になるように、各チューブに、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加えた。
【００８７】
続いて、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ緩衝液、ｐＨ５．０中の６Ｍ尿素で、１対５の割合で各試料を希釈し、１ｍＬのＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）陽イオン交換カラム上に５００μＬを注入した。４０カラム容量にわたる０．３Ｍ  ＮａＣｌまでのグラジエントを用いて、１ｍＬ／分で、結合したタンパク質を溶出しながら、クロマトグラフィーを実行した。新鮮なＡＡＴミルクと新鮮な非ＡＡＴミルクの試料は、正確に上記のとおり処理し、同じく、陽イオン交換カラムにかけた。
【００８８】
結果
図２として表示されているクロマトグラムに示されているように、それらをミルクから沈殿させた後には、ミルク中のカゼインタンパク質の完全な分離が達成される。カラムからの溶出順序は、βの後にκ、その後にαＳ１、その後にαＳ２である。このクロマトグラムを、３７℃での１８日のインキュベーション後の非ＡＡＴミルクを表している図３に示されているクロマトグラムと比較すると、このクロマトグラフによる分離では全く分離されていないことが極めて容易に分かり、おそらく多大なタンパク分解の結果として、多大な構造的な損傷がカゼインに起こったことを示している。これに対して、それぞれ、３７℃でのインキュベーション前と後のＡＡＴミルクを表している図４と図５に示されているクロマトグラムを調べると、インキュベーション前のクロマトグラムは、非加熱非ＡＡＴミルクで得られたものと極めて似ていることが分かる。３７℃で１８日間インキュベートした後には、クロマトグラムは、その全体的なパターンを保持しており、カゼインの構造が相対的に損なわれていないことを示している。そのピーク高と領域の減少から示されるように、αＳ１カゼインが、おそらく最も損傷を受けていることに注目することは興味深い。これは、αＳ１カゼインがタンパク分解によって最も分解されやすい傾向があることを示唆する文献中の報告と一致している。
【００８９】
結論
この実験の結論は以下のとおりである。
【００９０】
１）ＡＡＴと非ＡＡＴミルクの加速された老朽化試料を視覚的に調べると、非ＡＡＴミルクは、ＡＡＴミルクより有意に不安定であることが分かる。
【００９１】
２）カゼインの陽イオン交換クロマトグラフィーによって、非ＡＡＴミルクの老朽化した試料では、カゼイン画分に有意な構造的変化が生じており、クロマトグラフの段階で分離が存在しなくなっていることが確認される。これらの構造的な変化は、おそらく、タンパク分解によるものである。
【００９２】
３）老朽化したＡＡＴミルク中のカゼインの陽イオン交換クロマトグラフィーは、ある程度のカゼインの分解は起こっているが、このカラムで得られた全体的な分離は、老朽化していないＡＡＴミルクで得られたものと似ていることが明らかである。
【００９３】
４）αＳ１とαＳ２カゼインの分解は、文献から予測されるように、βカゼインの前に起こるようである。
【００９４】
例３−ＡＡＴとフィブリノーゲントランスジェニックヒツジの作成とスクリーニング
それらにＡＡＴとフィブリノーゲン構築物の両者が遺伝子導入されていることを確認するために、２通りの方法で、ヒツジ（ａとｂ）をスクリーニングした。
【００９５】
フィブリノーゲンのスクリーニング
制限酵素ＡｖｒIIを用いて、ヒツジのＤＮＡを消化した。この酵素は、特定の分子量を有する３つのフィブリノーゲン鎖から断片を生じせしめる。これらの断片は、ゲルを用いて、サイズをもとにして分離される。ゲル上のＤＮＡをＤＮＡ結合膜に転写する（ブロットと称される）。続いて、３つの鎖全てに共通するＢＬＧ（βラクトグロブリン）遺伝子調節領域から作られた放射性ＤＮＡを用いて、このブロットをプローブする。前記調節領域は、同じ配列のＤＮＡに結合し、類似の配列の任意の領域を放射性にする。放射能は、該領域に対して写真フィルムを配置することによって検出することができる。前記ヒツジからの放射能のバンドを、図６の公知の対照、１、及び１０コピーと比較することができる。レーンＡはネガティブコントロールである；レーンＢは１コピーコントロールである；レーンＣは１０コピーコントロールである；レーンＤはヒツジａであり、レーンＥはヒツジｂである。
【００９６】
バンドは正しいサイズのものであり、このヒツジに３つのフィブリノーゲン遺伝子が全て導入されていることが確認される。前記プローブは、ヒツジ自身のＢＬＧとヒツジ中のＡＡＴも検出するが、これらは、ゲルでは分離されない。
【００９７】
ＡＡＴスクリーニング
ＡＡＴスクリーニングの工程は、制限酵素ＢａｍＨＩを使用すること以外は、フィブリノーゲンスクリーニングと同じである。これは、ＤＮＡを異なるサイズのバンドに切断するため、異なるバンドが産生される。図７参照。レーンＡはヒツジ１である；レーンＢはヒツジｂである；レーンＣはネガティブコントロールである；レーンＤは１０コピーコントロールである；レーンＥは２０コピーコントロールである。観察されるバンドは、ＡＡＴ導入遺伝子のＢＬＧ調節領域、ヒツジ自身のＢＬＧ、及びフィブリノーゲン導入遺伝子のＢＬＧ調節領域である。この酵素は、フィブリノーゲン鎖を別々に分離しない。ＢａｍＨＩによる予測された制限パターンを知れば、ＡＡＴ導入遺伝子と一致する断片が存在することが確認される。
【００９８】
例４−トランスジェニックヒツジのミルクの分析
サザンブロッティングの工程によって、ヒツジ１及び２と名付けられた各ＡＡＴとフィブリノーゲン系統から交雑した２匹のヒツジから得たＤＮＡを分析し、ヒトタンパク質α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）とフィブリノーゲンの両者が陽性であることが明らかになった。ホルモン処置によって、両ヒツジに乳分泌を誘導し、１日に２回搾乳した。約６週間乳分泌を続けた時点で、１日の平均ミルク収量を測定した。
【００９９】
ａ）ヒツジのミルクのＲＩＤ分析
ヒツジのミルク中に発現された各々のヒトのタンパク質濃度を定量するために、放射状免疫拡散（ＲＩＤ）法を使用した。Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社製の市販のＲＩＤキットを使用した。前記ヒツジから得られたミルクの試料によって作られたリングの直径を、ＲＩＤキットに附属のヒトＡＡＴとフィブリノーゲン標準の両者と比較することによって、正確な濃度を達成した。結果を以下に詳述する。
【０１００】
ＡＡＴ  ＲＩＤの結果
ヒトＡＡＴ標準                        リングの直径
０．２８ｍｇ／ｍＬ                      ４．１ｍｍ
０．８４ｍｇ／ｍＬ                      ４．９ｍｍ
１．４０ｍｇ／ｍＬ                      ７．１ｍｍ
１．６８ｍｇ／ｍＬ                      ７．６ｍｍ
２．８０ｍｇ／ｍＬ                      ９．１ｍｍ
１対１０希釈のヒツジのミルク          リングの直径
ヒツジ９８００８２                      ６．０ｍｍ
ヒツジ９８０４１７                      ５．８ｍｍ
このデータは、ヒツジ１については、ヒツジミルク中の希釈前のＡＡＴ濃度１０．５ｍｇ／ｍＬ、ヒツジ２については、ヒツジミルク中の希釈前のＡＡＴ濃度９．６ｍｇ／ｍＬに相当する。
【０１０１】
フィブリノーゲン  ＲＩＤの結果
ヒトフィブリノーゲン標準              リングの直径
０．４５ｍｇ／ｍＬ                      ４．１ｍｍ
１．３５ｍｇ／ｍＬ                      ５．１ｍｍ
２．２５ｍｇ／ｍＬ                      ５．９ｍｍ
２．７０ｍｇ／ｍＬ                      ６．４ｍｍ
４．５０ｍｇ／ｍＬ                      ７．９ｍｍ
１対５希釈のヒツジのミルク          リングの直径
９８００８２                            ５．０ｍｍ
９８０４１７                            ５．４ｍｍ
これは、ヒツジ１については、ヒツジミルク中の希釈前のフィブリノーゲン濃度６．３ｍｇ／ｍＬ、ヒツジ２については、希釈前の濃度８．１ｍｇ／ｍＬに相当する。
【０１０２】
ｂ）ヒツジのミルクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析によって、ヒツジのミルクのタンパク質組成を分析することができた。より正確には、断片Ｘ及びＹのような全てのフィブリノーゲンの分解産物を同定することが可能であった。二重トランスジェニックヒツジから得られたミルクと、フィブリノーゲンのみを発現するＦ系統由来の予め搾乳されたヒツジ（すなわちＡＡＴなし）とを比較したゲルが、図８に示されている。
【０１０３】
二重トランスジェニック動物によって産生されたフィブリノーゲンは、Ｆ１型のタンパク質のみを有している。このミルクは、Ｆ２フィブリノーゲン、並びに断片Ｘ及びＹのような分解に伴う産物を全く含有していない。フィブリノーゲンのみを遺伝子導入した動物から得られたミルクは、明らかに、分解産物断片ＸとＦ２フィブリノーゲンを示している。
【０１０４】
還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析は、フィブリノーゲンタンパク質の各鎖サブユニットに関するデータを与える。ＡＡＴとフィブリノーゲンの両者を遺伝子導入したヒツジから得たミルクと、フィブリノーゲンのみを発現しているヒツジ（Ｆ２系統からのヒツジ）も比較すると、差が歴然と観察され得る。図９は、２つの型のフィブリノーゲンを示している。
【０１０５】
２つの型のヒツジの構築物によって発現されたフィブリノーゲンは、明らかに、フィブリノーゲンタンパク質に特有のα、β、及びγ鎖を含有している。しかしながら、α鎖サブユニットを比較すると、興味深い差異が明らかとなる。単トランスジェニックフィブリノーゲンミルクでは、スキャンしたゲル像上の幅広いバンドとして現れる、２つのα鎖サブユニットが観察される。これは、明らかに単一のα鎖のみを示している、ＡＡＴ／フィブリノーゲン二重構築物動物によって発現されたフィブリノーゲンとは全く対照的である。このことも、ＡＡＴとフィブリノーゲンの両者が陽性の動物から得られたヒツジのミルクでは、フィブリノーゲンの分解が実質的に全く起こっていないという証拠である。
【０１０６】
ｃ）ウェスタンブロットによるヒツジのミルクの分析
ＡＡＴとフィブリノーゲンを二重に遺伝子導入したヒツジのミルクに産生されるフィブリノーゲンに対してタンパク質分解性の損傷が起こりにくいことのさらなる証拠は、ウェスタンブロット分析によって得られる。まず、分子量に基づいて、ゲル分析により、単一及び二重トランスジェニック系統から得られたミルクをタンパク質成分に分離する。続いて、プラスチック膜への電気泳動による転写によって、安定したゲルの「プリント」を作成する。続いて、フィブリノーゲンに対するポリクローナル抗体に対してこの膜を暴露し、結合しなかった抗体を除去するために、徹底的に洗浄する。レポーター酵素西洋ワサビペルオキシダーゼに結合された二次抗体によって、結合した抗体を検出する。続いて、結合しなかった二次抗体を除去するために徹底的に洗浄した後、光放射性のペルオキシダーゼの基質と写真フィルム上に取られた永久記録を用いて、全てのフィブリノーゲンのサブユニットとそれらのタンパク分解による断片を可視化する。
【０１０７】
ＡＡＴの非存在下で発現されたフィブリノーゲンは、ヒツジの個体と乳分泌の段階（後になるほど、より多くのタンパク分解を受ける）に応じて、異なる程度のタンパク分解を受けている。分解された物質の多くは精製で除去されるが、タンパク分解によって切除されたα鎖が一定の割合でなお存在しており、Ｆ血漿由来のフィブリノーゲンに見られるように、その産物はＦ１とＦ２種をともに含有する。しかしながら、ミルクの中に存在するプロセッシング酵素の範囲は、血漿中に比べて限られており、ミルクの中のＦ２の多くは、アミノ酸２２０付近の切断現象によるものである。これは、精製された産物のＳＤＳ  Ｐａｇｅ分析と、（論述されているケースでは）ミルクのウェスタンブロットの両者で見られる、明瞭な末端切断されたα鎖種を生じせしめる（図１０）。末端切断された鎖は、矢印で左に示されている。
【０１０８】
図１０は、分析したＡＡＴとフィブリノーゲンの両二重トランスジェニックミルクには、検出不可能なレベルの末端切断されたα鎖が存在することを明確に示している（トラック３と８）。これは、単トランスジェニックミルクで見られる様々な、ある場合にはかなりの程度の分解（他の全てのトラック）と対照を成す。
【０１０９】
ｄ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析
フィブリノーゲンのＦ１、Ｆ２、及びＸ型を分離するために、ＨＩＣの方法を使用する。３ラウンドの沈殿によって、ミルクからフィブリノーゲンを精製する。続いて、調製物をブチルセファロースカラムにかける。該カラムを前洗浄することによって、夾雑物を除去した後、徐々に硫酸アンモニウムが減少するグラジエントによって、順にＦ１、Ｆ２、及び断片Ｘを溶出する。
【０１１０】
ＡＴＴ／フィブリノーゲン二重トランスジェニックヒツジから得られた精製フィブリノーゲンの分析によって得られた図１１の溶出プロフィールは、Ｆ１フィブリノーゲンのみが存在し、Ｆ２又はＸは検出できないことを示している。しかしながら、単トランスジェニックヒツジの精製フィブリノーゲンでは（図１２に示された結果）、Ｆ１、Ｆ２、及びＸ型のタンパク質が何れも存在し、Ｆ１は主要な分子種ではない。このことは、ＡＡＴとフィブリノーゲンの同時発現がフィブリノーゲンの分解を阻害し、ＡＡＴが存在しないと、フィブリノーゲンタンパク質の分解が起こることのさらなる証拠である。
【０１１１】
ｅ）フィブリノーゲンの逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）
トランスジェニックヒツジによって産生されたフィブリノーゲンの鎖のストイキオメトリー構成を正確に分析するために、ＲＰＣの方法を用いた。１０ｍＭ  ジチオトスレイトールと６Ｍのグアニジンの存在下で、ＨＩＣ精製後のフィブリノーゲンの試料を還元した（これは、損傷を受けていないタンパク質から３つの異なるフィブリノーゲン鎖を放出する工程である）。Ｖｙｄａｃ４．６×１５０ｍｍ  Ｃ４カラムと０．１％ＴＦＡとＣＨ３ＣＮ緩衝液を用いて、試料を分析した。図１３の溶出プロフィールは、単トランスジェニックフィブリノーゲンヒツジから得られたフィブリノーゲンが、Ｆ２とＸフィブリノーゲンの存在に典型的なα鎖分解の指標であることを示している。その結果、α鎖は、タンパク質の主要な種ではなくなっている。この結果は、α鎖の分解の徴候を全く示さないＡＡＴ／フィブリノーゲン二重トランスジェニックヒツジからのフィブリノーゲンによって得られたものと全く対照的である。それ故、α鎖が主要な種であり、Ｆ２又はＸ型のフィブリノーゲンは全く存在しないことが明らかである。
【０１１２】
ｆ）フィブリノーゲンの安定性分析
ＡＡＴ／フィブリノーゲン二重トランスジェニック動物から得られたミルクを３０℃で１８時間インキュベートした。この時間の終了後、ブチルセファロースカラムを用いたＨＩＣ分析にかける前に、３ラウンドの沈殿により、乳漿を部分精製した。これは、ミルク中のタンパク質の不安定性に起因する任意のＦ１フィブリノーゲンのＦ２及び断片Ｘへの分解を検出するであろう。
【０１１３】
図１４に示されている、ＡＡＴ／フィブリノーゲン交雑ヒツジから得られたフィブリノーゲンのＨＩＣ溶出プロフィールは、Ｆ１型のフィブリノーゲンタンパク質のみを示している。このように、不安定さ故の分解は起こらない。
【０１１４】
ｇ）ＡＡＴと同時発現されたフィブリノーゲンは、単独で発現されたフィブリノーゲンと機能的に等価である
二重トランスジェニックミルクからの精製フィブリノーゲンは、単トランスジェニックミルクから作られたものと機能的に等価であることが示された。引き続き、これは、血漿由来のフィブリノーゲンと機能的に等価であることも示された。本例では、光学密度の変化により、低いトロンビン及びフィブリノーゲン濃度での凝塊の形成を追跡する。
【０１１５】
ゲル中のフィブリノーゲンの時間依存的な不透明さの変化を定量するために、光学密度（ＯＤ）の測定を使用する。この不透明さは、経時的なＯＤの増加として測定される。このＯＤの変化は、吸光度の増加よりもむしろ、フィブリン繊維からの光散乱によるものである。ゲル構造が粗くなるほど、フィブリン繊維が厚くなり、ＯＤが高くなる。ゲル構造が薄くなるほど、フィブリン繊維が薄くなり、ＯＤが低くなる。このアッセイでの興味深いパラメーターは、ゲル化の速度の指標であるＯＤの速度の初期増加と、繊維の粗さの指標（繊維が粗いほどより多くの光を散乱する）となる最終ＯＤである。
【０１１６】
プラスチックのマイクロキュベットに、５ｍＭＣａＣｌ２を加えたｔｒｉｓ緩衝化生理的食塩水中の０．１５ｍｇ／ｍＬの単トランスジェニックフィブリノーゲン又は二重トランスジェニックフィブリノーゲンの何れか５００μＬを加えた。各キュベットに、０．６Ｕ／ｍＬの精製された血漿由来のトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０μＬを加えた後、素早く混合した。３５０ｎｍでの吸光度を２０分間記録した。結果を図１５に示す。
【０１１７】
フィブリノーゲンのみが発現された、又はＡＡＴ存在下でのＯＤプロフィールの比較は、凝固速度と最終繊維の粗さがともに、極めて似ており（図１５）、それ故、２つの物質が機能的に等価であることを示している。単トランスジェニックの物は、より粗い繊維を作るようにみえるが、単一のアッセイから、これに有意性を付与することはできず、本結果は区別できないとみなすべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【外国語明細書】
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