(57)【要約】【課題】  簡単な操作でタンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を効果的に防止することができ、バイオマテリアルやバイオチップとして利用し得る表面処理材を提供し、さらには表面処理方法を提供する。【解決手段】  本発明の表面処理材では、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されている。樹状高分子は第３世代以上の樹状高分子である。あるいは、樹状高分子の直径が３ｎｍ以上である。本発明の表面処理材は、タンパク質付着防止機能や  細胞付着防止機能を有し、バイオチップ用として好適である。【選択図】  図１
2011050469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子が第３世代以上の樹状高分子であることを特徴とする表面処理材。
【請求項２】
末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子の直径が３ｎｍ以上であることを特徴とする表面処理材。
【請求項３】
前記親水性の官能基が、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、糖鎖、アミノ酸基から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１または２記載の表面処理材。
【請求項４】
タンパク質付着防止機能を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の表面処理材。
【請求項５】
細胞付着防止機能を有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の表面処理材。
【請求項６】
バイオチップ用であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の表面処理材。
【請求項７】
末端に親水性の官能基を有する第３世代以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする表面処理方法。
【請求項８】
末端に親水性の官能基を有する直径３ｎｍ以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする表面処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状高分子（いわゆるデンドリマー）を用いた表面処理材及び表面処理方法に関するものであり、簡単な操作で細胞やタンパク質の付着防止機能を付与し得る新規な表面処理材及び表面処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属やプラスチック、ガラス等の表面は、通常、非特異的タンパク質結合を起こし易く、細胞が付着し易いという性質を有している。このような性質は、望ましくない生体反応を引き起こし、バイオマテリアルやバイオチップの性能低下の原因となる。
【０００３】
前述のような非特異的なタンパク質の結合や細胞の付着を防ぐ手法としては、ポリエチレングリコール等の親水性ポリマー層を形成する方法（非特許文献１を参照）や、デキストリン等のヒドロゲルで修飾する方法（非特許文献２を参照）等が一般的である。これら方法により表面処理を行えば、基材表面に生体忌避活性を付与することが可能である。
【０００４】
しかしながら、これら方法では１００ｎｍ以上の比較的厚いポリマー層の形成が必要になる等の問題がある。例えばバイオセンシング等においては、ポリマー層の厚さが厚いと電極からの距離が遠くなるため、光学的手法でも電気化学的な手法でも、感度の低下が見られる。また、気体や物質を透過させる材料に生体忌避活性を付与することが難しいという問題もある。いずれの問題も、親水性ポリマーやヒドロゲルを例えば数十ｎｍ以下の超薄膜にした状態では、十分にタンパク質の付着を防ぐことができないために起こる。
【０００５】
一方、デンドリマーと称される規則正しく分岐した構造を有する樹状高分子に関する研究が各方面で進められており、例えばデンドリマーを用いた細胞固定化方法等が提案されている（例えば、特許文献１等を参照）。特許文献１には、末端に細胞のトランスポートチャンネルを標的とした物質を有するデンドリマー高分子化合物で培養面を修飾し、細胞を播種することを特徴とする細胞固定化方法が開示されている。
【０００６】
また、特許文献２には、デンドリマーを結合させた基材が開示されている。基材に結合されたデンドリマー（樹枝状材料）は、例えばイオン交換サイトまたは親和性補足サイトとして機能する反応性末端基を有し、したがって混合物からの１種以上の化合物の分離または精製に用いることが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１９２４０６号公報
【特許文献２】特表２００８−５１４４１８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Annu. Rev. Master. Sci. 1996, 26, 365-394
【非特許文献２】Langmuir, 2001, 17, 4386-4391
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来技術として挙げた特許文献１や特許文献２に記載される発明は、いずれも生体忌避活性を付与することを目的とするものではなく、例えば特許文献１記載の発明では、逆に強固な細胞固定を目的としており、そのための工夫に重きが置かれている。特許文献２記載の発明は、特定の官能基を利用して基材にデンドリマーを共有結合させる点に特徴を有し、非特異的なタンパク質の結合や細胞の付着を防ぐことに関しては、何ら言及していない。
【００１０】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、簡単な操作でタンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を効果的に防止することができ、バイオマテリアルやバイオチップとして利用し得る新規な表面処理材を提供することを目的とし、さらには表面処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、デンドリマーに関する研究を進める中で、ある程度のサイズを有するデンドリマーが生体忌避活性の付与に極めて有効であり、またデンドリマーを基材表面に付着させるだけで、簡単に生体忌避活性を付与することができることを見出すに至った。このような知見は、これまで全く知られておらず、予想外の結果である。
【００１２】
本発明は、前述の知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明の表面処理材は、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子が第３世代以上の樹状高分子であることを特徴とする。あるいは、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子が基材表面に結合されており、前記樹状高分子の直径が３ｎｍ以上であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の表面処理方法は、末端に親水性の官能基を有する第３世代以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする。あるいは、末端に親水性の官能基を有する直径３ｎｍ以上の樹状高分子を基材表面に結合させることを特徴とする。
【００１４】
樹状高分子（デンドリマー）を用いて表面処理を行うことにより非特異的なタンパク質の結合や細胞の付着が防止される理由について、その詳細は不明であるが、ある程度の大きさのデンドリマーが付着することにより表面改質がなされ、生体忌避活性が付与されるものと推測している。デンドリマーは、そのサイズが小さく、これを付着してもその厚みは僅かであり、ポリマー層を形成する場合に比べて、その影響は極めて小さい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、簡単な操作でタンパク質の非特異的な結合や細胞の付着等を効果的に防止し得る表面処理材、表面処理方法を提供することが可能である。また、本発明の表面処理材では、表面処理層が超薄膜であっても優れた生体忌避活性を有することから、バイオマテリアルやバイオチップ等として利用可能である。例えば、本発明では、付着される樹状高分子（デンドリマー）のサイズが小さく、ポリマー層を形成する場合に比べて表面処理層の厚さを極めて小さくすることができるので、バイオセンシングにおいて電極からの距離を極めて小さくすることができ、感度の低下を最小限に抑えることが可能である。さらに、気体や物質を透過させる材料に対しても、容易に生体忌避活性を付与することができるという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明を適用した表面処理材の一例を示す模式図である。
【図２】第１世代から第３世代のデンドリマーを示す模式図であり、（ａ）は第１世代のデンドリマー、（ｂ）は第２世代のデンドリマー、（ｃ）は第３世代のデンドリマーをそれぞれ示す。
【図３】デンドリマーで修飾した金基板の反射赤外スペクトルである。
【図４】デンドリマーで修飾した金基板のＸＰＳ（Ｘ線光電子分光）スペクトルである。
【図５】デンドリマーの世代数とタンパク質の吸着量の関係を示す図であり、（ａ）リゾチームに関する測定結果、（ｂ）はウシ血清アルブミンの測定結果、（ｃ）はフィブリノーゲンの測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を適用した表面処理材及び表面処理方法について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１８】
本発明の表面処理材１は、図１に模式的に示すように、処理対象となる任意の部材（例えば基板２）の表面に、末端に親水性の官能基を有する樹状高分子（デンドリマー）３を付着させたものであり、単純な構成でありながら、タンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を効果的に防止する機能を有する。デンドリマー３を基板２の表面に付着させることで、元の表面状態に比べて官能基が密な状態で存在することになるので、厚さの厚いポリマー層と同じように高い生体忌避活性を発揮するものと考えられる。
【００１９】
ここで、表面に付着させるデンドリマーを構成するデンドロンの構造は、如何なるものであってもよく、特に限定されるものではない。ただし、前記デンドリマーは、末端に親水性の官能基を有することが必要である。官能基としては、親水性の官能基であれば任意であるが、例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基、リン酸基、糖鎖、アミノ酸基等を挙げることができる。前記デンドリマーは、末端にこれらの官能基の少なくとも１種が結合されていればよい。したがって、例えばポリアミドアミン、ポリフェニルアミン等のデンドリマーを前記デンドリマーとして例示することができる。
【００２０】
なお、例えば付着阻害の対象となるタンパク質は，その種類によって，表面の電荷が多種多様である。このため対象となるタンパク質の表面の電荷に合わせて前記官能基を選択することによって、表面処理材の表面の電荷が選択され、任意のタンパク質の表面電荷に応じて最適化した付着阻害機能を有するデバイスを作製することも可能である。
【００２１】
前述のデンドリマーは、化学構造、分子量だけでなく、分子形状や分子サイズが制御された規則的な精密高分子であり、例えば世代数を制御することで、直径が数ナノメートルから数十ナノメートルの精密なナノ構造を任意に構築することができる。
【００２２】
本発明者らが研究を重ねたところ、良好な生体忌避活性を付与するためには、表面に付着させるデンドリマーのサイズを適正に選定することが重要であり、使用するデンドリマーは、世代数で言えば第３世代以上、直径で言えば３ｎｍ以上であることが好ましい。
【００２３】
図２は、デンドリマーの世代数と末端数の関係を示すものであり、（ａ）に示す第１世代のデンドリマーでは末端数８、（ｂ）に示す第２世代のデンドリマーでは末端数１６、（ｃ）に示す第３世代のデンドリマーでは末端数３２になる。本発明の表面処理材においては、デンドリマーの世代数を増やすことによりタンパク質の非特異的な結合が減少するという現象が見られ、特に第３世代以上にまで増やすと、急激にタンパク質の結合を減少させることができる。世代数の上限は特に制約されないが、あまり世代数が大きくなるとサイズが大きくなりすぎ、表面のギャップが大きくなるという不都合が生ずるおそれがある（例えばバイオセンサーにおいては、被検物とセンサー間の距離が大きくなり、ポリマー層で付着阻害を行う場合と同様、感度が大きく低下するおそれがある）ので、第１０世代以下とすることが好ましい。
【００２４】
同様に、デンドリマーの直径も生体忌避活性の付与効果に影響を与え、良好な生体忌避活性を付与するためには、表面に付着させるデンドリマーの直径を３ｎｍ以上とすることが好ましい。表面に付着させるデンドリマーの直径を３ｎｍ以上とすることで、タンパク質の非特異的な結合や細胞の付着を大幅に減らすことが可能である。なお、前記デンドリマーの直径に関しても、特に上限は制約されないが、表面のギャップの大きさや入手の容易さ等を考慮すると、直径１０ｎｍ以下とすることが好ましい。
【００２５】
前述のデンドリマーは、基板の表面に結合して超薄膜を形成するが、デンドリマーの基板表面への結合方式については、水溶液での洗浄に耐えられる結合であれば如何なる結合であってもよく、例えば非特異結合であってもよいし、共有結合であってもよい。いずれにしても基板２の表面に何らかの形で結合していればよい。
【００２６】
デンドリマーを用いた表面処理方法では、例えばデンドリマー水溶液を加温して放置するだけで厚さ数ｎｍ〜数十ｎｍ程度の薄膜を形成して、物理吸着させることができる。すなわち、極めて簡単な操作で表面処理を行うことが可能である。
【００２７】
また、デンドリマーの末端の官能基は、基板１の材質等に応じて自由に変えることもでき、ガラス、半導体、金属等からなる基板１では、シランカップリング剤で処理した表面に対して、化学結合させることも可能である。例えば、ガラスアミノプロピルシランとグルタルアルデヒド、ポリアリルアミンデンドリマーやポリアミドアミンデンドリマーを縮合反応させることで、デンドリマーを固定化することができる。
【００２８】
ポリスチレンやポリメタクリレート等のプラスチック基材の表面では、プラス間放電処理、電子線処理等を施すことによって表面に水酸基を導入することができ、同様にシランカップリング剤等で化学結合させることが可能である。
【００２９】
勿論、デンドリマーを化学結合させるための手段は、これらに限定されるものではなく、あらゆる化学結合の形成を適用することが可能である。また、いずれの結合手段を採用した場合にも、デンドリマーでの処理によって、タンパク質の非特異的な吸着等を防ぐことができる。
【００３０】
以上のように、本発明の表面処理材、表面処理方法では、厚さ数ｎｍ〜数十ｎｍ程度のデンドリマーの層を表面に結合させるだけで、タンパク質や細胞が付着しない表面を形成することが可能である。従来、例えばタンパク質の非特異吸着については、疎水性、親水性の観点と、タンパク質の電荷の影響が大きいとされている。これに対して、本発明者らが、デンドリマーの末端の官能基による電荷と、被検物のタンパク質の電荷とによって、吸着し易いと考えられる組み合わせと、吸着し難いと考えられる組み合わせについて実験を行った結果、官能基の電荷とタンパク質の電荷の組み合わせによらず、デンドリマーの構造のみで吸着が阻害されるとの結果が得られた。これは、前記従来の考えからすれば、想定外の結果と言うことができる。
【００３１】
また、例えば電気化学反応や表面プラズモン共鳴等においては、基材から距離が離れると、感度が指数関数に沿って大幅に低下することが知られている。本発明の表面処理材、表面処理方法では、前記の通り表面に形成されるデンドリマーの層を超薄膜とすることができるので、バイオセンシングにおける感度の点でも有利であり、ポリエチレングリコールやデキストリンを生体物質付着の抑制材料として用いた場合に比べて、感度を大幅に向上することが可能である。勿論、非特異吸着が防がれることから、何らかの表面処理を施さない表面よりもバイオセンシング感度は向上する。
【００３２】
さらに、本発明の表面処理材、表面処理方法では、表面処理材料としてデンドリマーを用いているので、ナノサイズの生体適合分子であること、世代数の増加により分子サイズの変更が可能であること、末端リガンドの密度の制御が可能であること、末端リガンドの種類を変えることで多様な性質を表面に付与することができること、等の利点を有する。
【００３３】
このように様々な利点を有する本発明の表面処理材、表面処理方法は、バイオマテリアルやバイオチップ等、様々な分野に応用することが可能である。例えば、ＤＮＡチップ等、電気化学測定法を用いるセンサでは、被検物と電極間の距離が短いほど高感度となる。また、特異的な結合認識を示す表面が必要であり、非特異的吸着はノイズの原因となる。本発明の表面処理材は、超薄膜で非特異的吸着を防止することができ、このような要求に対して、極めて有用性が高い。
【００３４】
また、人工血管や尿路カテーテル、ステント等においては、タンパク質の付着を阻害することで、血栓の予防や閉塞による交換頻度を減らすことが可能であるが、このような医療分野においても、本発明の表面処理材、表面処理方法は有用である。さらに、コンタクトレンズでは、タンパク質の吸着がレンズの汚れの原因となるが、本発明の表面処理材、表面処理方法を適用することで、汚れ難いコンタクトを実現することができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の具体的な実施例について、実験結果に基づいて詳細に説明する。
【００３６】
デンドリマーで表面修飾した金基板の作製
ポリアミドアミンデンドリマー（ＰＡＭＡＭ−ＮＨ２デンドリマー）の第１世代（Ｇ１）〜第４世代（Ｇ４９）を用意し、超純水（MilliＱ水）に溶解して０．１ｍＭ水溶液を調製した。なお、ポリアミドアミンデンドリマーとしては、市販のもの（シグマアルドリッチ社製）を使用した。
【００３７】
一方、ガラス基板上に金を蒸着した金基板（アルテック社製、またはＧＥヘルスケア社製）を用意し、これを超純水及びアセトンで超音波洗浄した後、ＵＶオゾン洗浄装置（バイオフォースナノサイエンス社製）を用いてＵＶオゾン洗浄を行った。この清浄な金基板を先に調製したポリアミドアミンデンドリマー０．１ｍＭ水溶液に１２時間浸漬した。その後、金基板を前記水溶液から取り出し、超純水とエタノールで洗浄し、窒素雰囲気中で乾燥させた。
【００３８】
デンドリマーによる修飾の確認
作製した金基板のデンドリマーによる修飾を確認するために、接触角を測定し、さらに反射赤外スペクトル（ＦＴＩＲ−ＲＡＳ）及びＸ線光電子分光分析を行った。接触角の測定結果を表１に、反射赤外スペクトルを図３に、Ｘ線光電子分光スペクトル（ＸＰＳ）を図４にそれぞれ示す。
【００３９】
【表１】
2011050469.tif 000003
【００４０】
接触角の測定結果（表１）を見ると、デンドリマーで修飾した金基板の接触角は、未修飾の金基板の接触角よりも小さくなっており、デンドリマーで修飾した金基板において、デンドリマーによる表面の親水化を示している。反射赤外スペクトルではアミドＩ（１６５０ｃｍ−１付近）とアミドII（１５４０ｃｍ−１付近）のピークより、デンドリマーの薄膜の形成を確認した。また、Ｘ線光電子分光解析においても、アミド基の存在が示唆されたことから、デンドリマーの薄膜の形成が確認された。
【００４１】
タンパク質の非特的結合の阻害効果
デンドリマーで修飾した金基板のタンパク質との結合を測定した。測定には、ＧＥヘルスケア社製、商品名Ｂiacore３０００を用いた。また、測定は、ＨＢＳ−Ｎバッファー（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）によって行い、２５℃で２０μｌ／ｍｉｎ、１分間、各種タンパク質［リゾチーム（シグマアルドリッチ社製）、ウシ血清アルブミン、フィブリノーゲン］をインジェクトして行った。結果を表２及び図５に示す。なお、表２における数値の単位は、レスポンスユニット（ＲＵ）である。
【００４２】
【表２】
2011050469.tif 000004
【００４３】
デンドリマーを結合させた金基板の界面（表面）でのタンパク質の結合量は、表２に示す通り、デンドリマーのサイズ（世代数）が大きくなるほど顕著であり、図５に示す通り、いずれのタンパク質においても、第３世代（Ｇ３）以降になると、タンパク質の結合が顕著に減少することがわかった。
【００４４】
また、デンドリマーの直径については、ポリアミドアミン型デンドリマーについて、直径の計算値が表３のように計算されており、第三世代から概ね直径が３ｎｍ程度になっている。したがって、前記結果は、第三世代よりも高い世代の、すなわち直径３ｎｍ以上のデンドリマーの薄膜について、タンパク質の付着の防止が明確に示されたものと言える。
【００４５】
【表３】
2011050469.tif 000005
【符号の説明】
【００４６】
１  表面処理材、２  基板、３  デンドリマー
【図１】
2011050469.tif 000006
【図２】
2011050469.tif 000007
【図３】
2011050469.tif 000008
【図４】
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【図５】
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