(57)【要約】【課題】本出願は非膵および非内分泌細胞、特に肝細胞／組織における膵ホルモン生産を含む膵内分泌表現型および機能を誘導する方法および組成物を提供することを課題とする。【解決手段】この課題は、最終的にはニコチンアミド、ＥＧＦ、アクチビンＡ、ＨＧＦ、エキセジンＧＬＰ−１またはベータセルリンの存在下にＰＤＸ−１ポリペプチド、ニューロＤポリペプチドまたはベータセルリンペプチドをコードする核酸のようなＰＤＸ−１インデューサー化合物に該非膵および非内分泌細胞を接触させることにより達成された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的には非内分泌組織における膵ホルモン生産を含む膵内分泌表現型および機能を誘導する方法、そして特に、内分泌関連疾患を治療するための方法および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
内分泌膵臓は主にペプチドホルモングルカゴン、インスリン、ソマトスタチンおよび膵ポリペプチドを合成して分泌する島細胞よりなる。インスリン遺伝子の発現は特定の転写因子により部分的には媒介されている制御機序を介して哺乳類膵の膵島β細胞に限定されている。他の細胞においては、インスリン、他の膵ホルモンおよび特定のペプチダーゼの遺伝子は転写的にサイレントである。ホメオドメイン蛋白ＰＤＸ−１（膵および十二指腸ホメオボックス遺伝子−１、別称ＩＤＸ−１、ＩＰＦ−１、ＳＴＦ−１またはＩＵＦ−１）は膵島の発生および機能の調節において中枢的な役割を果たす。ＰＤＸ−１は例えばインスリン、グルカゴンソマトスタチン、プロインスリン変換酵素１／３（ＰＣ１／３）、ＧＬＵＴ−２およびグルコキナーゼのような種々の遺伝子の島細胞特異的発現に直接または間接的に関与している。更にまた、ＰＤＸ−１はグルコースに応答したインスリン遺伝子の転写を媒介する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は部分的には肝における膵および十二指腸のホメオボックス遺伝子（ＰＤＸ−１）の異所性の発現がサイレント膵ホルモン遺伝子の発現およびプロホルモンを成熟した生物学的に活性なホルモンに変換するプロセシング機序を誘導するということの発見に基づいている。
【０００４】
本発明はＰＤＸ−１インデューサー化合物を細胞内に導入することによる細胞における膵遺伝子の発現を誘導する方法を提供する。本発明は更に、ＰＤＸ−１インデューサー化合物に非膵細胞を接触させることによる膵細胞に非膵細胞を変換する方法を提供する。非膵細胞を、該非膵細胞におけるＣ／ＥＢＰβ、アルブミンまたはＡＤＨ−１の発現を抑制するような、内因性ＰＤＸ−１、胚マーカー、インスリン、グルコゴンまたはソマトスタチンの発現を誘導する量のＰＤＸ−１インデューサー化合物に接触させる。胚マーカーは例えばアルファ−１フェトプロテインまたはＧａｔａ−４である。
【０００５】
ＰＤＸ−１インデューサー化合物は内因性のＰＤＸ−１の発現を誘導する何れかの化合物である。ＰＤＸ−１インデューサー化合物は核酸、ポリペプチドまたは小型分子である。例示されるＰＤＸ−１インデューサー化合物は、膵および十二指腸ホモボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、ニューロＤポリペプチドまたはベータセルリンポリペプチドをコードする核酸である。
【０００６】
核酸は例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＢＯＳプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、グルコース６−ホスファターゼプロモーター、アルブミン腸脂肪酸結合蛋白プロモーター、チログロブリンプロモーター、界面活性剤Ａプロモーター、界面活性剤ｃプロモーターまたはホスホグリセレートキナーゼ１プロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結している。核酸の方法はプラスミドまたはベクターに存在する。ベクターはウィルスベクター、例えばアデノウィルスベクターまたはレンチウィルスベクターである。アデノウィルスベクターは例えばｇｕｔｌｅｓｓ組み換えアデノウィルスベクターである。
【０００７】
「発現を誘導する」とは、遺伝子の発現が化合物非存在下と比較して化合物存在下において増大することを意味する。該細胞に対し、膵または十二指腸ホモボックス１（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物は該細胞において該遺伝子を誘導するのに十分な量である。「発現を抑制する」とは、化合物非存在下と比較して化合物存在下において遺伝子の発現が減少することを意味する。
【０００８】
膵遺伝子は例えば、膵転写因子、例えばＰＤＸ−１、ベータ２、ＩＳＬ−２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｇｎ３．１またはＮＫｘ２．２、内分泌遺伝子、例えばＳＣＧ２、ＳＧＮＥ１、ＣＨＧＮ、ＰＴＰＲＮ、ＡＭＰＨ、ＮＢＥＡ、ニューロＤまたはフォリスタチン、または外分泌遺伝子、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤、ＫａｚａｌＩ型、エラスターゼ、ｐ４８因子または再生島誘導１アルファを包含する。
【０００９】
細胞は哺乳類対象からインビボ、インビトロまたはエクスビボで提供される。細胞は非膵細胞である。細胞は分化した細胞である。細胞は内胚葉細胞、外胚葉細胞または中胚葉細胞である。例えば細胞は肝細胞、皮膚細胞または骨髄細胞である。或いは、細胞は更に、トランスフェクション剤またはニコチンアミド、表皮成長因子、アクチビンＡ、肝成長因子、エキセンジン、ＧＬＰ−１またはベータセルリンを含む組成物に接触させる。
【００１０】
本発明は膵ホルモン、例えばインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンの対象における濃度を誘導する方法を提供する。１つの特徴において、方法は、対象において膵ホルモン生産を誘導するのに十分な量の、ＰＤＸの発現または活性を増大させる化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む。別の特徴において、方法は膵ホルモンを発現することができる細胞を準備すること、ＰＤＸの発現または活性を増大させる化合物に細胞を接触させること、および、細胞を対象に導入することにより対象における膵ホルモン生産を誘導することを含む。
【００１１】
本発明において更に提供されるものは、対象における膵関連の障害、例えば糖尿病、例えばＩ型またはＩＩ型の治療、症状緩解または発症遅延の方法である。方法はＰＤＸの発現を増大させる化合物の治療有効量を対象に投与することを含む。例えば、化合物は膵および十二指腸のホモボックス１（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸である。糖尿病の症状は高血糖症、血中グルコース（血糖値）上昇、頻尿、飲水渇望亢進、飢餓感亢進、異常体重減少、疲労亢進、刺激感または眼のかすみを包含する。糖尿病は例えば空腹時血漿中グルコース試験またはランダム血糖値試験により診断される。
【００１２】
別の特徴において、本発明は対象における膵島遺伝子発現の特徴を誘導する方法を提供する。方法は膵島遺伝子発現を誘導するのに十分な量の、ＰＤＸの発現または活性を増大させる化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１３】
本発明の更に別の特徴は細胞における膵島細胞表現型の誘導または増強の方法である。方法は該細胞において膵島細胞表現型を誘導または増強するのに十分な量の、ＰＤＸの発現または活性を増大させる化合物に細胞を接触させることを含む。
【００１４】
更にまたＰＤＸの発現を増大させる化合物および製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物も包含される。
本発明はまた、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
細胞における内因性ＰＤＸ−１発現を誘導する方法であって、該方法は該細胞における該内因性ＰＤＸ−１発現を誘導するのに十分な量のＰＤＸ−１インデューサー化合物を含む組成物を該細胞に導入することを含む方法。
（項目２）
該ＰＤＸ−１インデューサー化合物が、膵および十二指腸ホメオボックス遺伝子−１（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、ニューロＤポリペプチド、または、ベータセルリンポリペプチドをコードする核酸を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
該核酸がプロモーターに作動可能に連結している項目２記載の方法。
（項目４）
該プロモーターがサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＢＯＳプロモーター、トランスサイレチンプロモーター、グルコース６−ホスファターゼプロモーター、アルブミン腸脂肪酸結合蛋白プロモーター、チログロブリンプロモーター、界面活性剤Ａプロモーター、界面活性剤ｃプロモーターまたはホスホグリセレートキナーゼ１プロモーターである項目２記載の方法。
（項目５）
該核酸がプラスミド中に存在する項目２記載の方法。
（項目６）
該核酸がウィルスベクター中に存在する項目２記載の方法。
（項目７）
該ウィルスベクターがアデノウィルスベクターまたはレンチウィルスベクターである項目６記載の方法。
（項目８）
該アデノウィルスベクターがｇｕｔｌｅｓｓ組み換えアデノウィルスベクターである項目７記載の方法。
（項目９）
該細胞が非膵細胞である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
該細胞が内胚葉細胞、外胚葉細胞または中胚葉細胞である項目１記載の方法。
（項目１１）
該内胚葉細胞が肝細胞である項目１０記載の方法。
（項目１２）
該外胚葉細胞が皮膚細胞である項目１０記載の方法。
（項目１３）
該中胚葉細胞が骨髄細胞である項目１０記載の方法。
（項目１４）
該細胞は哺乳類対象からインビボ、インビトロまたはエクスビボで提供される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
該細胞をトランスフェクション剤と接触させることを更に含む項目１記載の方法。
（項目１６）
ニコチンアミド、表皮成長因子、アクチビンＡ、肝成長因子、エキセンジン、ＧＬＰ−１またはベータセルリンを含む組成物に該細胞を接触させることを更に含む項目１記載の方法。
（項目１７）
非膵細胞における膵遺伝子の発現を誘導する方法であって、該方法が、該細胞における該遺伝子発現を誘導するのに十分な量の膵および十二指腸ホメオボックス遺伝子−１（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を該細胞に導入することを含む方法。
（項目１８）
該膵遺伝子が膵転写因子である項目１７記載の方法。
（項目１９）
該膵転写因子がベータ２、ＩＳＬ−２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｇｎ３．１またはＮＫｘ２．２である項目１８記載の方法。
（項目２０）
該膵遺伝子が内分泌遺伝子または外分泌遺伝子である項目１７記載の方法。
（項目２１）
該内分泌遺伝子がＳＣＧ２、ＳＧＮＥ１、ＣＨＧＮ、ＰＴＰＲＮ、ＡＭＰＨ、ＮＢＥＡ、ニューロＤまたはフォリスタチンである項目２０記載の方法。
（項目２２）
該外分泌遺伝子がセリンプロテアーゼ阻害剤、ＫａｚａｌＩ型、エラスターゼ、ｐ４８因子または再生島誘導１アルファである項目２０記載の方法。
（項目２３）
該細胞が内胚葉細胞、外胚葉細胞または中胚葉細胞である項目１７記載の方法。
（項目２４）
該内胚葉細胞が肝細胞である項目２３記載の方法。
（項目２５）
該外胚葉細胞が皮膚細胞である項目２３記載の方法。
（項目２６）
該中胚葉細胞が骨髄細胞である項目２３記載の方法。
（項目２７）
該細胞は哺乳類対象からインビボ、インビトロまたはエクスビボで提供される、項目１７に記載の方法。
（項目２８）
非膵細胞を膵細胞に変換する方法であって、
ａ．該非膵細胞において内因性ＰＤＸ−１、胚マーカー、インスリン、グルカゴン、またはソマトスタチンの発現を誘導するための量、または、
ｂ．該非膵細胞においてＣ／ＥＢＰβ、アルブミンまたはＡＤＨ−１の発現を抑制するための量
のＰＤＸ−１インデューサー化合物に該非膵細胞を接触させることを含む方法。
（項目２９）
該ＰＤＸ−１インデューサー化合物が、膵および十二指腸ホメオボックス遺伝子−１（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、ニューロＤポリペプチド、または、ベータセルリンポリペプチドをコードする核酸を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
該胚マーカーがアルファ−１フェトプロテインまたはＧａｔａ−４である項目２８記載の方法。
（項目３１）
該非膵細胞が分化した細胞である項目２８記載の方法。
（項目３２）
該分化した細胞が肝細胞、皮膚細胞または骨髄細胞である項目３１記載の方法。
（項目３３）
対象における糖尿病の緩解のための方法であって、膵および十二指腸ホメオボックス遺伝子−１（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を対象に投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）
該糖尿病が、Ｉ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、項目３３に記載の方法。
【００１５】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての専門技術用語は本発明が属する技術分野で通常理解されている通りの意味を有する。本明細書に記載したものと同様または等価な方法および材料を本発明の実施または試験において使用できるが、適当な方法および材料は以下に記載するとおりである。本明細書に記載する全ての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法および実施例は例示に過ぎず限定を意図しない。
【００１６】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求項から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＲＴ−ＰＣＲで測定した場合のアデノウィルス投与後のマウスインスリンＩ（ｍＩ−１）、マウスインスリンＩＩ（ｍＩ−２）、ヒトインスリン、ＰＤＸ−１およびβ−アクチンに関するＢａｌｂ／ｃマウス肝組織中のｍＲＮＡの検出を示す。レーン１：ＤＮＡ非存在（ＰＣＲの陰性対照）；レーン２〜６：ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスの肝；レーン７、８：ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１＋ＡｄＲＩＰ−１−ｈＩｎｓ投与マウスの肝；レーン９〜１１：対照ＡｄＣＭＶ−β−ｇａｌ＋ＡｄＲＩＰ−１−ｈＩｎｓ投与マウスの肝；レーン１２、１３：ＡｄＣＭＶ−ｈＩｎｓ投与マウスの肝；レーン１４：正常マウス膵を示す。
【図２】ネズミ組織から抽出したインスリン関連ペプチドのＨＰＬＣ溶離の特徴を示している。パネルＡはＰＤＸ−１投与マウスの膵の特徴である。パネルＢはＰＤＸ−１投与マウスの肝の特徴である。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲにより測定したＰＤＸ−１、ソマトスタチンＳｏｍａｔｏ）、プロインスリン変換酵素ＰＣ１／３（ＰＣ１／３）、グルカゴン（Ｇｌｕｃｇ）およびβ−アクチンの検出を示す。ＰＤＸ−１および対照投与マウスから抽出した全ＲＮＡはＰＣ１／３特異的プライマーを用いて逆転写した。レーン１〜３：ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウス；レーン４〜５：ＡｄＣＭＶ−β−ｇａｌ投与マウス；レーン６：膵；レーン７：ｃＤＮＡ非存在（ＰＣＲ用対照）。
【図４】マウス肝における異所性ＰＤＸ−１発現はＳＴＺ誘導高血糖症を緩解することを示す。１２〜１３週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６にクエン酸塩緩衝液中２２０ｍｇ／ｋｇＳＴＺを投与した。ＳＴＺ投与後３６〜４８時間にマウスにＡｄＣＭＶＰＤＸ−１（ｎ＝１５匹）または対照としてＡｄＣＭＶβ−ｇａｌ（ｎ＝２２、ただしＳＴＺ投与後３〜５日に１２匹が死亡、ＳＴＺ投与後６〜７日に更に３匹が死亡）を注射した。ＡｄＣＭＶＰＤＸ−１投与では死亡例は観察されなかった。各投与では２００μｌ食塩水中組み換えアデノウィルス２ｘ１０９ＰＦＵ（プラーク形成単位）を全身投与した。グルコース濃度は眼静脈から採取した血液試料で測定した。
【図５】培養物中の成熟肝細胞における異所性ＰＤＸ発現がＡｄＲＩＰｈＩｎｓにより同じ細胞に同時送達されたインスリンプロモーター（ラットインスリン−１プロモーター）を活性化することを示す。ヒトインスリンは図１中と同様に検出される。レーン１：ＡｄＣＭＶＰＤＸ−１＋ＡｄＲＩＰｈＩｎｓを投与した細胞、レーン２：ＡｄＣＭＶβ−ガラクトシダーゼ＋ＡｄＲＩＰｈＩｎｓ、レーン３：対照。
【図６】胎仔Ｆｉｓｈｅｒラット（Ｅ１４）肝細胞の一次単層培養におけるインスリン１およびソマトスタチン遺伝子の誘導を示す。胎仔肝細胞は妊娠第１４日のＦｉｓｈｅｒ３４４ラット胚から単離し、コラーゲン被覆組織培養皿上にプレーティングした。２〜５ＭＯＩ（感染多重度＝細胞当たりウィルス粒子数）の段階で細胞をＡｄＣＭＶＰＤＸ−１に感染させた。全ＲＮＡをウィルス投与後４日に培養物から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲでソマトスタチン遺伝子発現を分析した。ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）１５プライマーを用いて図１に示すとおり逆転写し、そしてＰＣＲ増幅は表１に示すプライマーおよび条件を用いて実施した。レーン１〜３：ＰＤＸ−１投与細胞から得た試料、レーン４〜６：未投与試料（対照）、レーン７：ＤＮＡ非存在。ＰＣＲ産物は１．７％アガロースゲル電気泳動上で分割した。
【図７】インスリンプロモーターへのその結合能力の増大により顕在化するＰＤＸ−１活性化に対するグルコースの作用を示す。ＧＬＵＴ−２およびＧＫの発現は、グルコースの進入および代謝を可能にすることによりこの活性化を促進する。中間経路のＲＩＮ−３８細胞はＡｄＣＭＶ−ＧＬＵＴ２またはＡｄＣＭＶ−ＧＫ（レーン４〜６）に感染させるか、未投与とした（レーン１〜３）。ウィルス投与の２４時間後、全細胞を０．２、５および１５ｍＭグルコース上でインキュベートした。
【図８Ａ】インビボの成熟肝における膵遺伝子発現の内分泌レパートリーを異所性ＰＤＸ−１が誘導することを示すＲＴ−ＰＣＲ分析の写真である。
【図８Ｂ】インビボの成熟肝における膵遺伝子発現の外分泌レパートリーを異所性ＰＤＸ−１が誘導することを示すＲＴ−ＰＣＲ分析の写真である。
【図９】インビボのＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１の単回投与後の時間の関数としてのＰＤＸ−１投与肝における膵遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の写真である。
【図１０】投与後４〜６ヵ月後の中央静脈（ｃｖ）の近接部にインスリンおよびグルカゴン陽性細胞が位置していることを示す一連の写真である。パネルＡ：インスリン；パネルＢ：グルカゴン１２０日；パネルＣ：インスリン陽性細胞Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与１８０日後；パネルＤ：対照群。
【図１１Ａ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１の全身投与後の時間の関数としての個々のマウスにおける肝インスリン含有量を示すスキャッタープロット：５６日（ＰＤＸ−１投与、ｎ＝３、対照、ｎ＝６）、１２０日（ＰＤＸ−１投与、ｎ＝７、対照、ｎ＝３）および１８０日（ＰＤＸ−１投与、ｎ＝４、対照、ｎ＝５）。ＰＤＸ−１投与（□）または対照（◆）マウスにおける肝ＩＲＩ含量を各個体別のマウスについて個別に示す。
【図１１Ｂ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスにおける肝グルカゴン含量（ＰＤＸ−１投与、ｎ＝１０、対照、ｎ＝１０）を示す棒グラフである。
【図１１Ｃ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスにおける肝ソマトスタチン（ＰＤＸ−１投与、ｎ＝９、対照、ｎ＝７）を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】インビボのマウスへのアデノウィルス投与後の時間（日数）の関数としての投与肝におけるウィルスＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１ＤＮＡの存在を反映するＣＭＶプロモーターに結合した異所性ラットＰＤＸ−１ｃＤＮＡのＰＣＲを示す写真である。
【図１２Ｂ】インビボのＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後の時間の関数としての肝におけるラットＰＤＸ−１（ｒＰＤＸ−１）、マウスＰＤＸ−１（ｍＰＤＸ−１）およびβ−アクチンの遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である。
【図１２Ｃ】リアルタイムＰＣＲを用いた初期Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後の時間の関数としての異所性（ラット）対内因性（マウス）ＰＤＸ−１発現の定量結果を示す棒グラフである。マウスＰＤＸ−１（斜線）およびラットＰＤＸ−１（黒）。
【図１３】肝インスリン生産が初期Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後８ヶ月のＳＴＺ誘導高血糖症からマウスを保護すること、および、肝における転移分化インスリン生産細胞がＳＴＺに対して耐性であることを示す棒グラフである。
【図１４】ヒトケラチノサイトにおけるインスリン遺伝子発現を示す棒グラフであり、ここでＰＤＸ−１投与は用量依存的に作用しており、１００ｍｏｉ（感染多重度）ではインスリン遺伝子発現の活性化が可能であったが１０ｍｏｉでは不可能であった。
【図１５】ヒトケラチノサイトにおけるグルカゴン遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１６】ヒトケラチノサイトにおけるソマトスタチン遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１７Ａ】Ａｄ−ＲＩＰ−ＧＦＰ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１コンストラクトを示しており、このコンストラクトは異所性ＰＤＸ−１発現が異所性インスリンプロモーターの活性化を誘導する細胞の発見を可能にする。
【図１７Ｂ】Ａｄ−ＲＩＰ−ＧＦＰ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を感染させた継代２（Ａ、Ｂ）および継代８（Ｃ、Ｄ）の位相差顕微鏡による形態（Ａ、Ｃ）および成熟肝細胞の緑色蛍光（Ｂ、Ｄ）を示す一連の写真である（倍率ｘ２００）。
【図１７Ｃ】インビトロの継代数の関数としての緑色蛍光により顕在化されるインスリンプロモーターの活性化を示す成熟（黒）および胎仔（緑）の肝細胞の数を示す棒グラフである。（ｎ≧２０の確率場は各継代ごとに計数する）
【図１７Ｄ】継代数の関数としてのＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ感染（灰色、ｎ≧１０）の後の蛍光細胞によりあらわされる全細胞感染能力で割ったインスリンプロモーター活性化（Ａｄ−ＲＩＰ−ＧＦＰ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１、黒色）を示す細胞のパーセントとして成熟肝細胞の転移分化能力（実線）を計算した棒グラフである。
【図１８Ａ】成長因子（ＧＦ）の存在下または非存在下におけるＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与した成熟および胎仔の肝細胞における膵ホルモン遺伝子発現を示す棒グラフである。Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓはインスリン遺伝子発現の陽性対照として使用する。Ｃｔ（閾値サイクル）値は同じＲＮＡ試料内のβ−アクチン発現について全て規格化した。
【図１８Ｂ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１およびＧＦを投与した成熟（Ｂ）および胎児（Ｃ）ヒト肝細胞、未投与の成熟（Ｄ）および胎児（Ｂ）肝細胞におけるヒト島（ＲＮＡ希釈１：５０、Ａ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイム）の増幅曲線である（β−アクチン遺伝子発現については全て同じＣｔ値）。曲線はΔＲｎ（蛍光単位）対増幅反応のサイクル数として示す。成熟肝細胞はＰＤＸ−１に応答したインスリン遺伝子発現の活性化において、胎児ヒト肝細胞と同様に効率的であることを示している。
【図１９】成長因子を添加したＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与し、４８時間の静的インキュベートによりインスリン含量（黒、ｎ≧１０）、インスリン（線、ｎ≧２５）およびＣ−ペプチド（点、ｎ≧２５）の分泌について分析した成熟一次肝細胞におけるインスリンの含量、分泌およびプロセシングを示す棒グラフである。Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ感染細胞は非調節および非プロセシングのインスリン分泌に関する陽性対照として使用する。結果は未投与対照肝細胞と比較した場合の増大倍数値（ＦＯＩ）を示す。
【図２０Ａ】ＰＤＸ−１投与成熟ヒト肝細胞におけるインスリン分泌顆粒を示す一連の写真である。Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１および成長因子の投与（Ａ、Ｂ）または未投与（Ｃ）の成熟ヒト肝細胞におけるインスリンイムノゴールド組織化学的電子顕微鏡観察。矢印はイムノゴールド粒子であり、ＰＤＸ−１投与肝細胞中に生じる分泌顆粒内に濃縮されている。
【図２０Ｂ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１およびＧＦ投与または未投与の成熟肝細胞における同じ細胞内のβ−アクチン遺伝子発現に対して規格化した特異的な内分泌の分泌顆粒分子マーカーセクレトグラニン２（ＳＣＧ２）および分泌顆粒ニューロエンドクリン１（ＳＧＮＥ１）について、特異的Ｔａｑｍａｎプローブを用いて実施した定量的ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイム）遺伝子発現分析の結果を示す棒グラフである。ヒト島は陽性対照として使用する。結果は未投与対照肝細胞と比較した場合の増大倍数値（ＦＯＩ）を示す（各実験につきｎ≧１２）。
【図２１Ａ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１およびＧＦ投与または未投与の成熟肝細胞における同じ細胞内のβ−アクチン遺伝子発現に対して規格化した調節蛋白グルコキナーゼ、Ｇｌｕｔ−２およびプロホルモン変換酵素２（ＰＣ２）について、特異的Ｔａｑｍａｎプローブを用いて実施した定量的ＲＴ−ＰＣＲ（リアルタイム）遺伝子発現分析の結果を示す棒グラフである。ヒト島は陽性対照として使用する。結果は（未投与）対照肝細胞と比較した場合の増大倍数値（ＦＯＩ）を示す（各実験につきｎ≧１０）。
【図２１Ｂ】ＰＤＸ−１およびＧＦ投与成熟ヒト肝細胞における２ｍＭ（○）または２５ｍＭ（．）のグルコース濃度における経時的（１５〜１８０分）なインスリン分泌を示すグラフである。
【図２１Ｃ】ＰＤＸ−１およびＧＦ投与成熟ヒト肝細胞における２ｍＭ（○）または２５ｍＭ（．）のグルコース濃度における経時的（１５〜１８０分）なＣ−ペプチド分泌を示すグラフである。
【図２１Ｄ】０〜２５ｍＭのグルコース（．）または２−ＤＯＧ（．）の濃度におけるＣ−ペプチドの用量応答分泌を示すグラフである。矢印および点線は２５ｍＭグルコース投与から２ｍＭグルコース投与への交換を示す。（ｂ〜ｄ）：３つの異なる実験においてｎ＝６。
【図２２Ａ】ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスにおいてＰＤＸ−１投与肝細胞が高血糖症を是正することを示すグラフである。糖尿病ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに腎被膜下Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１および成長因子投与（．；ｎ＝９）および未投与（□；ｎ＝５）の成熟ヒト肝細胞を移植した。移植後の指定日数後のグルコース濃度をｍｇ％で示す。アスタリスクはＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与移植マウスと対照細胞移植マウスのグルコース濃度に有意差があることを示す（ｐ＜０．０１）。
【図２２Ｂ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与成熟肝細胞の移植後１０日における腎被膜切片におけるＰｄｘ−１（Ａ）およびインスリン（Ｂ）に関する免疫組織化学的染色を示す一連の写真である。同じＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスの膵のインスリン染色（Ｃ）。
【図２２Ｃ】移植実験前（０日、投与前；グレー）および実験終了時（１０日、投与；黒）におけるＥＬＩＳＡにより測定した移植および対照マウスの血清中のヒトＣ−ペプチド濃度を示す棒グラフである。アスタリスク（＊）はＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与細胞移植マウスとヒト細胞移植前の同じ糖尿病マウスのヒトＣ−ペプチドの血清中濃度の間に有意差があることを示す（ｐ＜０．０１）。
【図２３】ラットＰＤＸ−１の異所性発現が肝細胞における内因性ヒトＰＤＸ−１の発現を誘導することを示す棒グラフである。成熟一次肝細胞に成長因子添加Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与し、内因性のヒトＰＤＸ−１遺伝子発現を分析した。結果は未投与の対照肝細胞と比較した場合の増大倍数値（ＦＯＩ）を示す。
【図２４Ａ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与した糖尿病ＣＡＤ−ＮＯＤマウスにおける血中グルコース濃度を示す。対照未投与またはｂ−ｇａｌ投与マウス▲、ＰＤＸ−１投与マウス（．）。
【図２４Ｂ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与の糖尿病ＣＡＤ−ＮＯＤマウスの体重を示す棒グラフである。対照未投与またはｂ−ｇａｌ投与マウス▲、ＰＤＸ−１投与マウス（．）。
【図２４Ｃ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与糖尿病マウスのグリコーゲン保存を示す一連の写真。Ｃ１、投与マウス；Ｃ２、非投与マウス；Ｃ３、糖尿病前ＮＯＤマウス。
【図２５】ＣＡＤ−ＮＯＤマウスにおける膵臓および肝臓の免疫組織化学的染色を示す一連の写真。Ａ、ＣＡＤ−ＮＯＤマウスはインスリンについて染色陰性；Ｂ、対照非糖尿病マウス；Ｃ、ＰＤＸ−１投与マウスの肝臓におけるインスリン；Ｄ、非投与糖尿病マウスの肝臓。
【図２６Ａ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与ＣＡＤ−ＮＯＤマウスの血清中インスリン濃度を示す棒グラフ。
【図２６Ｂ】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与ＣＡＤ−ＮＯＤマウスの肝インスリン濃度を示す棒グラフ。
【図２７】Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与ＣＡＤ−ＮＯＤマウスのグルコース耐容性を示すグラフ。
【図２８】ＲＴ−ＰＣＲの写真であり、増幅された産物をアガロースゲル上で分割したものは異所性ＰＤＸ−１がＣＡＤ−ＮＯＤマウス肝において遺伝子発現を誘導したことを示している。
【図２９】ＰＤＸ−１または対照を投与したヒト肝細胞のＤＮＡマイクロアレイチップ分析により分析した約５００遺伝子における発現の変化のＰＤＸ−１誘導を示すスキャッターグラフである。
【図３０Ａ】ＤＮＡマイクロアレイ分析による、肝、膵、ヒト肝細胞対照、Ａｄ−ＣＭＶ−ｈインスリン投与ヒト肝細胞およびＰＤＸ−１投与ヒト肝細胞におけるＣ／ＥＢＰβ発現のＰＤＸ−１抑制を示す表である。
【図３０Ｂ】定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＣ／ＥＢＰβ発現のＰＤＸ−１抑制を示す棒グラフである。
【図３０Ｃ】Ｃ／ＥＢＰβの細胞内蛋白濃度のＰＤＸ−１抑制を示すウエスタンブロットの写真である。
【図３１Ａ】成熟（左）および胎児（右）ヒト肝細胞における肝蛋白のＰＤＸ−１抑制および成熟ヒト肝細胞の脱分化の誘導を示すウエスタンブロットの写真である。
【図３１Ｂ】肝遺伝子発現および蛋白生産のＰＤＸ−１抑制を示す棒グラフである。
【図３１Ｃ】肝遺伝子発現および蛋白生産のＰＤＸ−１抑制を示す棒グラフである。
【図３１Ｄ】ＰＤＸ−１が胚マーカーの誘導により顕在化される成熟肝細胞の脱分化を誘導することを示す棒グラフである。
【図３１Ｅ】ＰＤＸ−１が胚マーカーの誘導により顕在化される成熟肝細胞の脱分化を誘導することを示す棒グラフである。
【図３２Ａ】ＲＴ−ＰＣＲの写真であり、増幅産物をアガロースゲル上で分割したものは、異所性ＰＤＸ−１がインビトロのヒト肝細胞において膵遺伝子および膵転写因子の発現を誘導することを示している。
【図３２Ｂ】異所性ＰＤＸ−１がインビトロのヒト肝細胞における内因性のヒトＰＤＸ−１の発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３２Ｃ】異所性ＰＤＸ−１がインビトロのヒト肝細胞におけるベータ２発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３２Ｄ】異所性ＰＤＸ−１がインビトロのヒト肝細胞におけるＩｓｌ−１発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３２Ｅ】異所性ＰＤＸ−１がインビトロのヒト肝細胞におけるＮｋｘ６．１発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３２Ｆ】異所性ＰＤＸ−１がインビトロのヒト肝細胞におけるＮｇｎ３．１発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３２Ｇ】異所性ＰＤＸ−１がインビトロのヒト肝細胞におけるＮｋｘ２．２発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３３】肝成長因子−１により増強された場合、異所性ＰＤＸ−１がインスリン遺伝子発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３４】異所性ＰＤＸ−１がエラスターゼ遺伝子発現を誘導することを示す棒グラフである。
【図３５】異所性ニューロＤ１が肝細胞において内因性Ｐｄｘ−１を誘導することを示すウエスタンブロット分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明は部分的には、肝および皮膚における膵および十二指腸のホモボックス遺伝子１（ＰＤＸ−１）の異所性発現が肝および皮膚細胞における膵島細胞表現型を誘導し、そして、膵ホルモンの発現、生産およびプロセシングをもたらすという発見に基づいている。ＰＤＸ−１はまたＩＤＸ−１、ＩＰＦ−１、ＳＴＦ−１およびＩＵＦ−１としても知られており、これらは全て本明細書においては「ＰＤＸ」と総称する。更にまた、本発明は膵障害を治療するための方法および医薬組成物を提供する。
【００１９】
糖尿病に対する臨床的膵島移植の結果における最近の進歩は血中グルコース濃度の継続的制御が膵島細胞移植により達成できることを示唆している。しかしながら、この良好な治療方法は死体ドナーからの限定された組織の供給により、そして、一生に亘る免疫抑制の必要性により多大な制約を受けている。糖尿病患者の治療としての島細胞の移植は島細胞またはβ細胞の新しい原料が発見された場合のみ広範に使用可能となる。Ｉ型自己免疫糖尿病におけるβ細胞の機能を代替するために考案された組織の最適原料は容易に単離され、広範に増殖され、そして、自己免疫の攻撃に優先して抵抗できなければならず、このような細胞は潜在的には膵臓外組織に存在すると考えられる。
【００２０】
第１世代のＥ１欠失組み換えアデノウィルス（Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１）により送達されるインビボのＰＤＸ−１の異所性発現は、遺伝子発現の内分泌および外分泌の膵レパートリーおよびプロセシングされた生物学的に活性なインスリンの生産と分泌の両方を誘導した。これらの結果は、成熟し完全に分化した臓器において異所性に発現されたＰＤＸ−１、ＰＤＸ−１が膵分化因子として機能することを示している。更にまた、ＰＤＸ−１は第１世代の組み換えアデノウィルスを用いてインビボで送達されたが、膵ホルモンの発現および生産は投与後８ヶ月超に亘り持続している。
【００２１】
機能的内分泌膵臓を発生させるための組織の潜在的原料として機能する肝臓のこの意外な能力は、異所性ＰＤＸ−１遺伝子発現を用いたインビボのマウスにおいて、本発明者等により最初に明らかにされた。マウスにおけるＰＤＸ−１トランスジーンの短期間発現が肝細胞のサブ集団において包括的、非可逆的および機能的な転移分化過程を誘導（即ち１つの成熟細胞の特徴および機能を別の完全に分化した細胞に変換）したことがわかった。更に、インビトロ培養下の制御された条件下の新しく単離された成熟並びに胎児のヒト肝細胞は機能的インスリン生産組織に転移分化するように誘導できることがわかった。ＰＤＸ−１トランスジーンを発現した肝細胞の約５０％が他では負活性なインスリンプロモーターを活性化した。転移分化したヒト肝細胞はホルモンを生産し、これを分泌顆粒中に保存し、そしてグルコース調節態様においてプロセシングされたインスリンを放出した。インスリン生産ヒト肝細胞は機能的であり、糖尿病免疫不全マウスおよび非肥満糖尿病マウスにおいて誘導されたシクロホスファミド加速糖尿病において、正常血糖を回復した。
【００２２】
その多様な特徴および実施形態において、本発明はＰＤＸの発現または活性を増大させる化合物（本明細書においてはＰＤＸインデューサー化合物とも称する）を対象に投与するか、これを細胞に接触させることを含む。ＰＤＸ発現または活性は例えば内因性ＰＤＸ発現を活性化させる化合物により増大される。化合物は例えば（ｉ）ＰＤＸ、ニューロＤまたはベータセルリンポリペプチド；（ｉｉ）ＰＤＸ、ニューロＤまたはベータセルリンポリペプチドをコードずる核酸；（ｉｉｉ）ＰＤＸポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させる核酸、および、それらの誘導体、フラグメント、類縁体および相同体であることができる。ＰＤＸポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させる核酸は例えばプロモーター、エンハンサーを包含する。核酸は内因性または外因性のいずれかであることができる。場合により、細胞を更にニコチンアミド、表皮成長因子、アクチビンＡ、肝成長因子、エキセンジン、ＧＬＰ−１またはベータセルリンに接触させる。
【００２３】
本明細書においては、「核酸」という用語はＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類縁体を用いて作成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体、および、その誘導体、フラグメントおよび相同体を包含するものとする。核酸分子は１本鎖または２本鎖であることができる。好ましくは、核酸はＤＮＡである。ＰＤＸポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させる核酸は例えばプロモーター、エンハンサーを包含する。核酸は内因性または外因性の何れかであることができる。
【００２４】
ＰＤＸをコードする核酸の適当な原料は例えばそれぞれゲンバンクアクセッション番号Ｕ３５６３２およびＡＡＡ８８８２０として入手可能なヒトＰＤＸ核酸（およびコードされる蛋白配列）を包含する。他の原料はラットＰＤＸ核酸を包含し、そして蛋白配列はそれぞれゲンバンクアクセッション番号Ｕ３５６３２およびＡＡＡ１８３５５に示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の原料はカサゴＰＤＸ核酸を包含し、そして蛋白配列はそれぞれゲンバンクアクセッション番号ＡＦ０３６３２５およびＡＡＣ４１２６０に示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
化合物は対象に対して直接（即ち対象を核酸または核酸含有ベクターに直接曝露する）または間接的に（即ちまずインビトロで細胞を核酸で形質転換し、次に対象に移植する）投与できる。例えば１つの実施形態において、哺乳類細胞を対象から単離し、そしてＰＤＸ核酸をインビトロで単離された細胞に導入する。細胞を適当な哺乳類対象に再導入する。好ましくは、細胞は自己由来の対象に導入する。化合物の投与経路は例えば非経口、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を包含する。１つの実施形態において、化合物は静脈内投与する。好ましくは化合物は腎被膜下に移植するか、または、門脈に注入する。
【００２６】
細胞は膵ホルモンを生産できる何れかの細胞、例えば骨髄、筋肉、脾臓、腎臓、血液、皮膚、膵臓または肝臓のものであることができる。１つの実施形態において、細胞は膵島細胞として機能できるものであり、即ち、膵ホルモン、好ましくはインスリンを、細胞外からのトリガーにより保存、プロセシングまたは分泌できるものである。別の実施形態においては、細胞は肝細胞である。別の実施形態においては、細胞は全能または多能である。別の実施形態においては細胞は造血幹細胞、胚性幹細胞または、好ましくは肝幹細胞である。
【００２７】
対象は好ましくは哺乳類である。哺乳類は例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであることができる。
【００２８】
（膵ホルモン生産を誘導する方法）
種々の特徴において、本発明は対象における膵ホルモン生産を誘導する方法を提供する。例えば、方法は対象に膵ホルモン生産を誘導するのに十分な量の、ＰＤＸの発現または活性を増大させる化合物を投与することを包含する。
【００２９】
別の特徴において、方法は、対象由来の細胞を準備すること、膵ホルモン生産を増大させるのに十分な量のＰＤＸ発現を増大させる化合物に細胞を接触させること、および、細胞を対象に導入することを含む。１つの実施形態において、膵ホルモン生産は対象への細胞の導入により、インビトロまたはインビボで起こる。別の実施形態においては、膵ホルモン生産は対象への細胞の導入によりインビボで起こる。
【００３０】
膵ホルモンは例えばインスリン、グルコゴン、ソマトスタチンまたは島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）であることができる。インスリンは肝インスリンまたは血清インスリンであることができる。他の実施形態においては、膵ホルモンは肝インスリンである。別の実施形態においては膵ホルモンは血清インスリン（即ち例えばグルコース利用、炭水化物、脂肪および蛋白の代謝を促進することが可能なインスリンの完全にプロセシングされた形態）である。
【００３１】
一部の実施形態においては、膵ホルモンは「プロホルモン」型である。他の実施形態においては、膵ホルモンはホルモンの完全にプロセシングされた生物学的に活性な形態である。他の実施形態においては、膵ホルモンは調節制御下にあり、即ち、ホルモンの分泌は内因性に生産される膵ホルモンの場合と同様に栄養およびホルモンの制御下にある。例えば、本発明の１つの特徴において、ホルモンはグルコースの調節制御下にある。
【００３２】
化合物に曝露、例えば接触させる細胞集団は何れかの数量の細胞、即ち１つ以上の細胞であることができ、そして、インビトロ、インビボまたはエクスビボで提供される。
【００３３】
（膵関連障害を治療または防止する方法）
本発明は更に対象における膵関連障害を治療、即ち防止、または発症を遅延または症状を緩解する方法を包含する。種々の特徴において、方法はＰＤＸの発現または活性をモジュレートする化合物を対象に投与することを包含する。「モジュレートする」とはＰＤＸの発現または活性を増大または低減することを包含する。好ましくは、モジュレーションにより、膵障害に罹患していない対象と同様または同一の水準まで、対象におけるＰＤＸの発現または活性の改変が起こる。別の特徴において、方法は非膵細胞に膵島細胞機能、例えばインスリン、ソマトスタチンまたはグルカゴンの発現能力を導き出す化合物を対象に投与することを包含する。１つの実施形態において、化合物はＰＤＸの発現または活性をモジュレートする。
【００３４】
膵障害は膵に関連する何れかの障害であることができる。例えば方法は膵ホルモン不全（例えば糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型））、インスリノーマ、および高血糖症を治療する際に有用である。基本的に、ＰＤＸ活性に病因的に関連している何れかの障害が治療に感受性であると考えられる。
【００３５】
糖尿病に罹患しているか発症の危険性を有する対象は血糖値の測定のような当該分野で知られた方法により識別される。例えば、少なくとも２回の機会において一夜絶食後に１４０ｍｇ／ｄＬより高値の血糖値は糖尿病患者であることを意味する。糖尿病に罹患しても発症の危険性を有してもいない者は７０〜１１０ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖値を有するものとして特徴付けられる。
【００３６】
糖尿病の症状は疲労、嘔気、頻尿、飲水渇望亢進、体重減少、眼のかすみ、感染頻発および創傷や潰瘍の治癒緩徐、１４０／９０以上の血圧持続、ＨＤＬコレステロール３５ｍｇ／ｄＬ未満またはトリグリセリド２５０ｍｇ／ｄＬ超、高血糖症、低血糖症、インスリン不全または耐性を包含する。化合物を投与する糖尿病または前糖尿病の患者は当該分野で知られた診断方法を用いて識別される。
【００３７】
本明細書に記載したＰＤＸモジュレート化合物は治療に使用された場合、本明細書では「治療薬」と称する。治療薬の投与方法は、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外および経口の経路を包含する。本発明の治療薬は何れかの好都合な経路、例えば注入または単回注射により、上皮または粘膜表皮ライニング（例えば口腔粘膜、直腸および腸の粘膜等）を経由する吸収により投与してよく、そして、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与してよい。投与は全身または局所であることができる。更にまた、何れかの適当な経路、例えば脳室内およびくも膜下腔内注射により中枢神経系に治療薬を投与することが好都合な場合がある。脳室内注射はリザーバ（例えばＯｍｍａｙａリザーバ）に連結した脳室内カテーテルにより容易に行える。肺投与は吸入器またはネブライザーおよびエアロゾル化剤を含有する処方を用いることにより使用してもよい。治療を要する領域に治療薬を局所投与することが望ましい場合があり、それは例えば手術中の局所注入、局所適用、注射、カテーテル使用、座薬使用またはインプラントの使用により行える。種々の送達系が知られており、本発明の治療薬の投与に使用することができ、その例は（ｉ）リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、（ｉｉ）治療薬を発現できる組み換え細胞、（ｉｉｉ）受容体媒介エンドサイトーシス（例えばＷｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）、（ｉｖ）レトロウィルス、アデノウィルスまたは他のベクターの部分としての治療薬核酸の構築等である。本発明の１つの実施形態においては、治療薬はベシクル、特にリポソーム中で送達してよい。リポソームにおいて、本発明の蛋白は他の製薬上許容しうる担体のほかに、例えば、ミセルとして凝集した形態で存在する脂質などの両親媒性の薬剤、不溶性単層、液晶またはラメラ層などと、水溶液中で組み合わせられる。リポソーム処方に適する脂質は例えばモノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含する。このようなリポソーム処方の調製は当該分野で知られるとおりであり、例えば米国特許４，８３７，０２８；および米国特許４，７３７，３２３に記載されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。更に別の実施形態においては、治療薬は例えば送達ポンプ（例えばＳａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７２参照）および半透過性重合体物質（例えばＨｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照）のような制御放出系中で送達できる。更にまた、制御放出系は治療標的（例えば脳）の近接部に入れることができ、即ち、全身用量の僅か一部を要するのみとなる。例えばＧｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９８４（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）参照。
【００３８】
治療薬が蛋白をコードする核酸であるような本発明の特定の実施形態においては、治療薬核酸は、それが細胞内（例えばレトロウィルスベクターの使用による）となるように適当な核酸発現ベクターの部分として構築して投与することにより、直接注射により、微粒子衝突の使用により、脂質コーティングまたは細胞表面コーティングまたはトランスフェクション剤により、または、核内に進入することがわかっているホメオボックス様ペプチドに連結させて投与すること（例えばＪｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８６４−１８６８参照）等により、そのコードする蛋白の発現を促進するようにインビボで投与してよい。或いは、核酸治療薬は細胞内に導入されて相同組み換えにより発現用宿主細胞ＤＮＡ内に取り込まれるか、または、エピソームとしてとどまることができる。
【００３９】
本明細書においては、「治療有効量」という用語は意味のある患者の利益、即ち、該当する医療状態の治療、治癒、防止または緩解、または、そのような状態の治療、治癒、防止または緩解の速度の増大を示すのに十分な医薬組成物または方法の各活性化合物の総量を意味する。単独で投与される個々の活性成分に適用する場合は、用語はその成分のみを指す。組み合わせに適用する場合は、用語は、複合、連続または同時の投与に関わらず、治療効果をもたらすような活性成分の複合量を指す。
【００４０】
特定の障害または状態の治療において有効である本発明の治療薬の量は障害または状態の性質により変化し、そして当該分野における平均的な技術による標準的な臨床手法により決定してよい。更に、インビトロ試験を場合により使用することにより最適用量範囲を発見するのを助けることができる。製剤中に使用すべき厳密な用量は投与経路および疾患または障害の全体的重症度により異なり、そして、医師の判断および各患者の状況に従って決定すべきである。最終的には、担当医師が各個々の患者の治療に用いる本発明の蛋白の量を決定する。初期においては、担当医師は本発明の蛋白の少用量を投与し、そして、患者の応答を観察する。本発明の蛋白の漸増量を患者に対する最適治療効果が得られるまで投与し、その後は更に用量を増加させない。しかしながら、本発明の治療薬の静脈内投与のための適当な用量範囲は一般的にはキログラム（Ｋｇ）体重当たり活性化合物約２０〜５００マイクログラム（μｇ）である。鼻内投与の適当な用量範囲は一般的には約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量はインビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量−応答曲線から推定してよい。座剤は一般的には０．５％〜１０重量％の範囲の活性成分を含有し、経口用製剤は好ましくは１０〜９５％活性成分を含有する。
【００４１】
本発明の治療薬を用いた静脈内療法の期間は治療すべき疾患の重症度および状態および各個体間での潜在的な特異体質応答により変動する。本発明の蛋白の各適用の期間は連続静脈内投与の１２〜２４時間の範囲であると考えられる。最終的には担当医師が本発明の医薬組成物を使用する静脈内療法の適切な期間について決定する。
【００４２】
細胞はまた、本発明の治療薬または蛋白の存在下にエクスビボで培養することにより、その細胞に対する所望の作用または細胞における活性を増大させる、またはもたらすことができる。
【００４３】
（島細胞の表現型または機能を誘導する方法）
本発明はまた細胞における膵島細胞の表現型１つ以上を誘導または増強する方法を包含する。１つの実施形態において、膵細胞表現型は非島細胞型において誘導される。例えば、ＰＤＸ−１インデューサー化合物に細胞を接触させることにより非膵細胞を膵細胞に変換（即ち転移分化）する。細胞は非膵細胞において内因性ＰＤＸ−１、胚マーカー、インスリン、グルコゴンまたはソマトスタチンの発現を誘導するような量のＰＤＸインデューサーと接触させる。或いは、非膵細胞におけるＣ／ＥＢＰβ、アルブミンまたはＡＤＨ−１の発現を抑制する量のＰＤＸインデューサーに細胞を接触させる。方法は、膵島細胞の表現型、例えばベータ、アルファおよびデルタ島細胞を誘導または増強するのに十分な量の、例えばＰＤＸ−１、ベータ２、ＩＳＬ−２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｇｎ３．１またはＮｋｘ２．２のような島細胞特異的転写因子をモジュレートする化合物に細胞を接触させることを包含する。好ましくは、化合物はＰＤＸの発現（例えば内因性ＰＤＸ−１の発現）、生産または活性を増大させる。好ましくは方法は膵島β細胞表現型を誘導する。
【００４４】
「膵島細胞表現型」とは、膵島細胞に典型的な特性の１つ以上、即ち、ホルモンの生産、プロセシング、分泌顆粒中の保存、栄養的およびホルモン的に調節される分泌または特徴的な島細胞の遺伝子発現の特性を示す細胞である。膵島細胞表現型は例えば膵ホルモンの生産、例えばインスリン、ソマトスタチンまたはグルカゴンを測定することにより調べることができる。ホルモンの生産は当該分野で知られた方法、例えばイムノアッセイ、ウエスタンブロット、受容体結合試験によるか、または、糖尿病宿主への移植後に高血糖症を緩解する能力により機能的に、調べることができる。
【００４５】
細胞は膵島細胞の表現型を発現することができる何れかの細胞、例えば筋肉、骨髄、脾臓、腎臓、皮膚、膵臓または肝臓のものであることができる。１つの実施形態において、細胞は膵島細胞として機能できるものであり、即ち、膵ホルモン、好ましくはインスリンを、細胞外からのトリガーにより保存、プロセシングまたは分泌できるものである。別の実施形態においては、細胞は肝細胞である。細胞は成熟細胞、即ち分化した細胞である。別の実施形態においては、全能または多能である。別の実施形態においては細胞は造血幹細胞、胚性幹細胞、または、好ましくは肝幹細胞である。
【００４６】
化合物に曝露、即ち接触させられる細胞集団は何れかの数量の細胞、即ち１つ以上の細胞であることができ、そして、インビトロ、インビボまたはエクスビボで提供される。
【００４７】
（膵島遺伝子発現特性を誘導する方法）
本発明はまた対象または細胞において膵島遺伝子発現特性を誘導または増強する方法を包含する。「膵遺伝子発現特性」とは非内分泌組織において通常は転写的にサイレントである遺伝子、例えば膵転写因子、内分泌遺伝子または外分泌遺伝子の１つ以上を包含するものとする。例えば、ＰＣ１／３、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンまたは内因性ＰＤＸ−１の発現である。方法は膵島または内分泌遺伝子発現特性を誘導するのに十分な量の、ＰＤＸの発現または活性を増大させる化合物を対象に投与することを包含する。１つの実施形態において、方法は対象においてＰＣ１／３遺伝子発現を誘導する。
【００４８】
膵遺伝子発現特性の誘導は、当該分野で知られた手法を用いて検出できる。例えば、膵ホルモンＲＮＡ配列はノーザンブロットハイブリダイゼーション分析、増幅系の検出方法、例えば逆転写系のポリメラーゼ連鎖反応またはマイクロアレイチップ分析による系統的検出などにおいて検出できる。或いは、発現は蛋白レベルにおいて、即ち、遺伝子によりコードされるポリペプチドの濃度を測定することによっても測定できる。特定の実施形態においては、ＰＣ１／３遺伝子または蛋白の発現はプロホルモンをその活性成熟型にプロセシングする場合のその活性により測定できる。このような方法は当該分野で知られており、そして例えば遺伝子によりコードされる蛋白に対する抗体に基づいたイムノアッセイまたはプロセシングされたホルモンのＨＰＬＣを包含する。
【００４９】
（発現がＰＤＸによりモジュレートされる遺伝子の識別方法）
本発明はまた発現がＰＤＸによりモジュレートされる核酸を識別する方法を包含する。方法はＰＤＸの活性または発現をモジュレートする化合物に曝露された被験細胞集団において核酸１つ以上の発現を測定することを包含する。次に被験細胞集団における核酸配列の発現を化合物に曝露されていない細胞集団、または、一部の実施形態においては化合物に曝露されている細胞集団である比較対照細胞集団における核酸配列の発現と比較する。比較は、同時に、または異なる時間に測定された被験および比較対照の試料に対して実施する。後者の例はコンパイルされた発現の情報、例えば種々の薬剤の投与後の既知配列の発現濃度に関する情報を集積した配列データベースの使用である。例えば、化合物の投与後の発現濃度の改変をＰＤＸ核酸のような対照薬剤の投与後の核酸配列において観察される発現の変化と比較する。
【００５０】
化合物に曝露されていない比較対照細胞集団における核酸配列の発現と比較した場合に被験細胞集団において核酸配列の発現が改変されていることは、核酸の発現がＰＤＸによりモジュレートされたことを示している。
【００５１】
被験細胞はＰＤＸによりモジュレートされることができる何れかの組織、例えば膵臓、肝臓、脾臓または腎臓から得ることができる。１つの実施形態において、細胞は非内分泌組織に由来する。好ましくは、細胞は肝組織である。
【００５２】
好ましくは、比較対照細胞集団における細胞は被験細胞と可能な限り同じ組織型、例えば肝組織から得る。一部の実施形態においては、対照細胞は被験細胞と同じ対象から、例えば被験細胞の原料の領域に近接する領域から得る。別の実施形態においては、対照細胞集団は試験されたパラメーターまたは条件が既知である細胞から得られた分子情報のデータベースから得る。
【００５３】
核酸の発現は当該分野で知られた何れかの方法を用いてＲＮＡレベルで測定できる。例えばこれらの配列の１つ以上を特異的に認識するプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーション分析を用いて遺伝子発現を測定できる。或いは、発現は逆転写系ＰＣＲ分析を用いて測定できる。発現はまた蛋白レベルで、即ち、遺伝子産物によりコードされるポリペプチドの濃度を測定することにより測定できる。このような方法は当該分野で知られており、例えば遺伝子によりコードされる蛋白に対する抗体に基づいたイムノアッセイが挙げられる。
【００５４】
遺伝子発現の改変が遺伝子の増幅または欠失に関連する場合は、被験および比較対照集団の配列の比較は被験および比較対照細胞集団における検査されたＤＮＡ配列の相対量を比較することにより行うことができる。
【００５５】
本発明はまた本スクリーニング方法に従って識別されるＰＤＸモジュレート核酸およびそのようにして識別されたＰＤＸモジュレート核酸を含む医薬組成物を包含する。
【００５６】
（ＰＤＸ組み換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の特徴はＰＤＸ蛋白をコードする核酸またはその誘導体、フラグメント、類縁体または相同体を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書においては、「ベクター」という用語はそれが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、別のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる線状または環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の型はウィルスベクターであり、この場合は別のＤＮＡセグメントをウィルスゲノム内にライゲーションできる。特定のベクターはそれらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。更にまた、特定のベクターはそれらが作動可能に連結している遺伝子の発現を指向することができる。このようなベクターは本明細書においては「発現ベクター」と称する。一般的に、組み換えＤＮＡ法において使用される発現ベクターはプラスミドの形態をとる場合が多い。プラスミドは最も一般的に使用されているベクターの形態であるため、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用するものとする。しかしながら、本発明は等しく機能するウィルスベクター（例えば複製欠損レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス）のような発現ベクターの他の形態も包含するものとする。更に、一部のウィルスベクターは特異的または非特異的に特定の細胞型をターゲティングすることができる。
【００５７】
本発明の組み換え発現ベクターは宿主細胞内の核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含み、このことは、組み換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列に作動可能に連結された状態で、発現のために使用されることとなる宿主細胞に基づいて選択される調節配列１つ以上を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内において、「作動可能に連結」とは、目的のヌクレオチド配列が、核酸配列の発現（例えばインビトロ転写／翻訳系において、または、ベクターを宿主細胞に導入する場合は宿主細胞において）を可能にするような態様で調節配列に連結していることを意味する。「調節配列」という用語はプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。このような調節配列は例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、および、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば組織特異的調節配列）を包含する。当業者の知るとおり、発現ベクターの設計は形質転換すべき宿主細胞の選択肢、所望の蛋白の発現濃度等の要因により変動する。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載する核酸によりコードされる融合蛋白またはペプチドを含む蛋白またはペプチドを生産することができる（例えばＰＤＸ蛋白、ＰＤＸの突然変異体、融合蛋白等）。
【００５８】
本発明の組み換え発現ベクターは原核細胞または真核細胞におけるＰＤＸの発現のために設計できる。例えばＰＤＸは細菌細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞（バキュロウィルス発現ベクターを使用）、コウボ細胞または哺乳類細胞中で発現できる。適当な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに記載されている。或いは、組み換え発現ベクターは例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳できる。
【００５９】
原核細胞における蛋白の発現は最も頻繁には融合または非融合蛋白の発現を指向する構成または誘導プロモーターを含むベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ中で行われる。融合ベクターは、通常は組み換え蛋白のアミノ末端においてそこにコードされる蛋白に多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは典型的には３つの目的、即ち（１）組み換え蛋白の発現を増大させるため、（２）組み換え蛋白の溶解度を上昇させるため、および（３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組み換え蛋白の精製に寄与するために機能する。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、蛋白分解切断部位を融合部分と組み換え蛋白の接合部に導入することにより融合蛋白の精製後の融合部分からの組み換え蛋白の分離を可能にする。このような酵素およびその同属体認識配列は第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白またはプロテインＡを標的組み換え蛋白に融合させるｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を包含する。
【００６０】
適当な誘導非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ。（１９９０）６０−８９）を包含する。
【００６１】
Ｅ．ｃｏｌｉ中の組み換え蛋白発現を最大限にするための１つの方法は組み換え蛋白を蛋白分解的に切断する能力が損なわれている宿主細菌中で蛋白を発現させることである。Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照できる。別の方法は各アミノ酸に対する個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにより優先的に利用されるものであるように発現ベクター内に挿入すべき核酸の核酸配列を改変することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のこのような改変は標準的なＤＮＡ合成手法により行うことができる。
【００６２】
別の実施形態においては、ＰＤＸ発現ベクターはコウボ発現ベクターである。コウボＳ・セレビシアエ中における発現のためのベクターの例はｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３），ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３），ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を包含する。
【００６３】
或いは、ＰＤＸはバキュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞内で発現できる。培養昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）中の蛋白の発現のために使用できるバキュロウィルスベクターはｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）を包含する。
【００６４】
更に別の実施形態においては、本発明の核酸は哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞内で発現させる。哺乳類発現ベクターの例はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ  ６：１８７−１９５）を包含する。哺乳類細胞において使用する場合は、発現ベクターの制御機能はウィルス調節エレメントにより与えられる場合が多い。例えば一般的に使用されているプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルスおよびサルウイルス４０に由来する。原核細胞と真核細胞双方についての他の適当な発現系については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６および１７章を参照できる。
【００６５】
別の実施形態においては、組み換え哺乳類発現ベクターは特定の細胞型において優先的に核酸発現を指向することができる（例えば組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的調節エレメントは当該分野で知られている。適当な組織特異的プロモーターの非限定的な例は、アルブミンプロモーター（肝特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：５４７３−５４７７）、膵特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）および乳腺特異的プロモーター（例えば乳精プロモーター、米国特許４，８７３，３１６および欧州特許出願２６４，１６６）を包含する。発生調節されたプロモーターもまた包含され、例えばネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプラスミド（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ３：５３７−５４６）が挙げられる。
【００６６】
本発明は更に、アンチセンス方向に発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＰＤＸｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする態様で調節配列に作動可能に連結している。アンチセンス方向にクローニングされた核酸に作動可能に連結した調節配列は種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的発現を指向するように選択でき、例えばウィルスプロモーターおよび／またはエンハンサーまたは調節配列は、構成的な、組織特異的または細胞特異的なアンチセンスＲＮＡの発現を指向するように選択できる。アンチセンス発現ベクターは、高効率の調節領域の制御下にアンチセンス核酸が生産される組み換えプラスミド、ファージミドまたは力価低減ウィルスの形態であることができ、その活性はベクターが導入される細胞型により決定される。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する考察は、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ
ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６に記載されている。
【００６７】
本発明の別の特徴は、本発明の組み換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。「宿主細胞」および「組み換え宿主細胞」という用語は本明細書においては互換的に使用する。このような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すものとする。突然変異または環境の影響により特定の修飾が継代の間に生じる場合があるため、そのような子孫は実際は親細胞とは同一ではない場合があるが、なお本明細書において使用する用語の範囲に包含されるものとする。更にまた、宿主細胞はＰＤＸを発現した後にモジュレートされる場合があり、そして元の特性を維持または喪失する場合がある。
【００６８】
宿主細胞は原核細胞または真核細胞であることができる。例えばＰＤＸ蛋白はＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞、コウボまたは哺乳類の細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）中で発現されることができる。或いは、宿主細胞は未成熟の哺乳類細胞、即ち多能幹細胞であることができる。宿主細胞はまた他のヒト組織に由来することできる。他の適当な宿主細胞は当該分野で知られている。
【００６９】
ベクターＤＮＡは従来の形質転換、形質導入、感染またはトランスフェクションの手法により原核細胞または真核細胞に導入できる。本明細書においては、「形質転換」、「形質導入」、「感染」および「トランスフェクション」という用語は宿主細胞に外来の核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための当該分野でよく知られた手法の種々のもの、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを指すものとする。更にまた、トランスフェクションはトランスフェクション剤により媒介することができる。「トランスフェクション剤」とは宿主細胞内へのＤＮＡの取り込みを媒介する何れかの化合物、例えばリポソームを包含するものを意味する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに記載されている。
【００７０】
トランスフェクションは「安定」（即ち宿主細胞ゲノムへの外来ＤＮＡの組み込み）または「一過性」（即ちＤＮＡは宿主細胞内でエピソーム発現される）であってよい。
【００７１】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション方法に応じて、細胞の僅か小区分のみが外来ＤＮＡをそのゲノム内に組み込み、ＤＮＡの残余はエピソームとなることがわかっている。これらの組み込み体を識別して選択するためには、選択可能なマーカー（例えば抗生物質への耐性）をコードする遺伝子を一般的には目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。種々の選択可能なマーカーには薬剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートへの耐性を付与するものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸は、ＰＤＸをコードするベクターと同様のベクター上で宿主細胞に導入するか、または、別のベクター上で導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は薬剤選択性により識別できる（例えば選択可能なマーカーを取り込んでいる細胞は生存し、他の細胞は死滅する）。別の実施形態においては、ＰＤＸによりモジュレートされた細胞またはトランスフェクトされた細胞は内因性のレポーター遺伝子の発現の誘導により識別される。特定の実施形態においては、プロモーターは緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）の発現を駆動するインスリンプロモーターである。
【００７２】
１つの実施形態において、ＰＤＸ核酸はウィルスベクター中に存在する。別の実施形態においては、ＰＤＸ核酸はウィルス内に封入される。一部の実施形態においては、ウィルスは好ましくは種々の組織型の多能細胞、例えば造血幹細胞、ニューロン幹細胞、肝幹細胞または胚性幹細胞に感染し、好ましくはウィルスは肝向性である。「肝向性」とは、ウィルスが特異的または非特異的に肝臓の細胞を好ましくターゲティングする能力を有することを意味する。更に別の実施形態においては、ウィルスはモジュレートされた肝炎ウィルス、ＳＶ−４０またはエプスタイン・バーウィルスである。更に別の実施形態においては、ウィルスはアデノウィルスである。
【００７３】
（遺伝子療法）
本発明の１つの特徴において、核酸またはその機能的誘導体をコードする核酸は遺伝子療法により投与される。遺伝子療法は対象に特定の核酸を投与することにより実施される治療法である。本発明のこの特徴において、核酸はそのコードされたペプチドを生産し、次にこれが上記した疾患または障害、例えば糖尿病の機能をモジュレートすることにより治療効果を発揮する。当該分野で使用できる遺伝子療法に関わる何れかの方法を本発明の実施において使用してよい。例えばＧｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍ  １２：４８８−５０５を参照できる。
【００７４】
好ましい実施形態においては、治療は適当な宿主中、上記したＰＤＸポリペプチドまたはそのフラグメント、誘導体または類縁体の１つ以上のいずれかを発現する発現ベクターの部分である核酸を含む。特定の実施形態においては、このような核酸はＰＤＸポリペプチドのコーディング領域に作動可能に連結しているプロモーターを保有する。プロモーターは誘導型または構成型であってよく、場合により組織特異的である。プロモーターは例えばウィルスまたは哺乳類起源であってよい。別の特定の実施形態においては、コーディング配列（および何れかの他の所望の配列）がゲノム内の所望の部位において相同組み換えを誘発する領域にフランキングされており、これにより核酸の染色体内発現をもたらすような核酸分子を使用する。例えばＫｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５を参照できる。更に別の実施形態においては、送達される核酸はエピソームにとどまり、そして内因性の、その他の面ではサイレントな遺伝子を誘導する。
【００７５】
治療用の核酸の患者への送達は、直接（即ち患者を核酸または核酸含有ベクターに直接曝露する）または間接（即ち細胞をまず核酸にインビトロで接触させ、次に患者に移植する）のいずれかであってよい。これらの２つの方法はそれぞれインビボまたはエクスビボの遺伝子療法として知られている。本発明の特定の実施形態においては、核酸はインビボに直接投与し、そこで発現させてコードされた産物を生産する。これは当該分野で知られた多くの方法のいずれか、例えば該核酸を適切な核酸発現ベクターの部分として構築し、それを細胞内となるような態様で投与する（例えば欠損型または減衰型のレトロウィルスまたは他のウィルスベクターを用いた感染による；米国特許４，９８０，２８６参照）；ネイキッドＤＮＡを直接注射する；微粒子衝突を使用する（例えばＧｅｎｅ  Ｇｕｎ（登録商標）；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，ＤｕＰｏｎｔ）を使用する；該核酸を脂質でコーティングする；関連する細胞表面受容体／トランスフェクション剤を使用する；リポソーム、微粒子またはマイクロカプセルに封入する；核に進入することがわかっているペプチドに連結させて投与する；または目的の受容体を特異的に発現する細胞型を「ターゲティング」するために使用できる受容体媒介エンドサイトーシスを起こしやすいリガンドに連結させて投与する（例えばＷｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２参照）等により達成される。
【００７６】
本発明の実施における遺伝子療法の別の方法ではエレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウィルス感染等の方法によりインビトロの組織培養において細胞に遺伝子を転移させる。一般的に転移の方法は細胞への選択可能なマーカーの同時転移を包含する。次に転移された遺伝子を取り込んで発現している細胞の単離を容易にするために、細胞を淘汰圧（例えば抗生物質耐性）下に付す。次にこれらの細胞を患者に送達する。特定の実施形態においては、得られた組み換え細胞のインビボの投与の前に、核酸を当該分野で知られた方法、例えば目的の核酸配列を含有するウィルスまたはバクテリオファージベクターを用いたトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子転移、マイクロセル媒介遺伝子転移、スフェロプラスト融合、および、レシピエント細胞の必要な発生生理機能が転移により損なわれない同様の方法により、細胞内に核酸を導入する。例えばＬｏｅｆｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１７：５９９−６１８を参照できる。選択された手法は、細胞により核酸が発現され得るような、細胞への核酸の安定な転移をもたらすものでなければならない。好ましくは、該転移核酸は細胞の子孫に遺伝可能であり発現され得るものである。別の実施形態においては、転移した核酸はエピソームにとどまり、その他の面ではサイレントな内因性核酸の発現を誘導する。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態においては、得られた組み換え細胞を当該分野で知られた種々の方法、例えば上皮細胞の注射（例えば皮下）、患者への皮膚移植片としての組み換え皮膚細胞の適用、および組み換え血球（例えば造血幹細胞または前駆細胞）または肝細胞の静脈内注射により患者に送達する。使用予定となる細胞の総量は所望の作用、患者の状態等により変動し、そして当業者が決定してよい。
【００７８】
遺伝子療法の目的のために核酸を導入することができる細胞は何れかの所望の入手可能な細胞型を包含し、そして外因、異種、同種または自原のものであってよい。細胞型は例えば分化した細胞、例えば上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞および血球、または、種々の幹細胞または前駆細胞、特に胚性心筋細胞、肝幹細胞（国際特許出願ＷＯ９４／０８５９８）、神経幹細胞（Ｓｔｅｍｐｌｅ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌｌ  ７１：９７３−９８５）、造血幹細胞または前駆細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られるもの等を包含する。好ましい実施形態においては、遺伝子療法のために使用される細胞は患者自家のものである。
【００７９】
遺伝子療法のためのＤＮＡは患者に対し、非経口的、例えば静脈内、皮下、筋肉内および腹腔内に投与できる。ＤＮＡまたは誘導剤は製薬上許容しうる担体、即ち動物への投与に適する生体適合性のあるベヒクル、例えば生理食塩水中で投与する。治療有効量は治療される動物において医療上望ましい結果、例えばＰＤＸまたは遺伝子産物の増大または低減をもたらすことができる量である。このような量は当業者により決定できる。医療分野で知られている通り、何れかの所定の患者に対する用量は多くの要因、例えば患者の体格、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身状態および同時に投与する他剤に応じて変動する。用量は変動するが、ＤＮＡの静脈内投与のための好ましい用量はＤＮＡ分子約１０６〜１０２２コピーである。例えばＤＮＡはｋｇ当たり約２ｘ１０１２ビリオンで投与する。
【００８０】
（医薬組成物）
本発明の化合物、例えばＰＤＸポリペプチド、ＰＤＸポリペプチドをコードする核酸、ＰＤＸポリペプチドをコードする核酸の発現を増大させる核酸（本明細書においては「活性化合物」とも称する）およびその誘導体、フラグメント、類縁体および相同体は投与に適する医薬組成物に配合できる。このような組成物は典型的には核酸分子、または蛋白および製薬上許容しうる担体を含む。本明細書においては、「製薬上許容しうる担体」とは医薬品投与に適合する溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗カビ剤、等張性付与および吸収遅延剤等のいずれかおよび全てを包含する。適当な担体は参照により本明細書に組み込まれるこの分野の標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。このような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンを包含する。リポソームおよび非水性のベヒクル、例えば固定油も使用してよい。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および試薬の使用は当該分野でよく知られている。何れかの従来の媒体または試薬が活性化合物と非適合でない限りにおいて、組成物中のその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた組成物に配合できる。
【００８１】
本発明の医薬組成物はその投与の意図される経路に適合するように製剤される。投与経路の例は非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与を包含する。非経口、経皮または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分、即ち滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成の溶媒、抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばエチレンジアミン４酢酸、緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および、浸透圧を調節するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを包含する。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節できる。非経口製剤はガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量のバイアル中に充填できる。
【００８２】
注射用に適した医薬組成物は滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適当な担体は生理食塩水、殺菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を包含する。全ての場合において、組成物は滅菌されなければならず、そして注射針を容易に通過できる程度の流動性を有さなければならない。製造および保存条件下で安定であり、細菌やカビのような微生物による汚染に抵抗して保存されなければならない。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は所望の粒径を維持することにより、そして、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤および抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合において、等張性付与剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが好ましい。注射用組成物の長時間持続する吸収は吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含有させることにより達成できる。
【００８３】
滅菌注射用溶液は所望により上記した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えばＰＤＸポリペプチドまたはＰＤＸコード核酸）を配合すること、ついで、濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は基剤としての分散媒体および上記した物質のうち必要な他の成分を含有する滅菌ベヒクル内に活性化合物を配合することにより調製する。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合は、調製方法は、あらかじめ滅菌濾過された溶液から得られる活性成分と別の所望の成分の粉末を与えるような真空乾燥または凍結乾燥である。
【００８４】
経口用組成物は一般的に不活性希釈剤または食用担体を含有する。それらはゼラチンカプセルに封入するか、圧縮成型して錠剤とすることができる。経口投与治療の目的のためには、活性化合物は賦形剤に配合し、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用する。経口用組成物はまた、液体担体中の化合物を口腔内に適用し、嗽をし、吐出または嚥下する洗口剤として使用するための液体担体を用いて調製できる。薬学的に適合する結合剤および／または補助的物質を組成物の部分として含有できる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ等は何れかの以下の成分または同様の性質の化合物、即ち、結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えば澱粉または乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ；滑剤、例えばコロイド状に酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーを含有できる。
【００８５】
吸入による投与のためには、化合物は適当な高圧ガス、例えば二酸化炭素の入った加圧容器またはディスペンサー、または、ネブライザーからエアゾールスプレーの形態で送達される。
【００８６】
全身投与は経粘膜または経皮の手段によっても達成される。経粘膜または経皮の投与のためには、浸透すべき障壁に対して適切である浸透剤を製剤中に使用する。このような浸透剤は当該分野で知られており、例えば経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸の誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻スプレーまたは座剤の使用により達成できる。経皮投与のためには、活性化合物は当該分野で一般的に知られるとおり軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム中に処方する。
【００８７】
化合物はまた、直腸投与のための座剤（例えば従来の座剤用基剤、例えばカカオ脂または他のグリセリドを使用）または保持浣腸剤の形態に調製できる。
【００８８】
１つの実施形態において、活性化合物は身体からの急速な排除に対して化合物を保護する担体と共に調製され、例えば、インプラントおよびマイクロカプセルの送達系などの制御放出製剤が挙げられる。生体分解性、生体適合性の重合体、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用できる。このような製剤の調製方法は当業者の知るとおりである。材料はまたＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より購入可能である。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲティングされたリポソームも含む）もまた製薬上許容しうる担体として使用できる。これらは当該分野で知られた方法に従って、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許４，５２２，８１１に記載の通り調製できる。
【００８９】
投与の容易さおよび用量の均一性のためには、経口または非経口の組成物を単位剤型で製剤することが特に好都合である。本明細書においては単位剤型とは治療すべき対象に対する統一された用量に適する物理的に個別の単位を指し、各単位は所望の製薬上許容しうる担体と共に所望の治療効果を得るために計算された活性化合物の所定量を含有する。本発明の単位剤型の詳細は活性化合物の独特の性質および達成すべき特定の治療効果により決定され、これに直接依存している。
【００９０】
本発明の核酸分子はベクター内に挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用できる。遺伝子療法ベクターは例えば米国特許５，７０３，０５５に記載の多くの経路の何れかにより対象に送達できる。即ち送達はまた、例えば静脈注射、局所投与（米国特許５，３２８，４７０参照）または定位注射（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７参照）を包含できる。遺伝子療法ベクターの医薬品調製物は適当な希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含有するか、または、遺伝子送達ベヒクルを包埋した緩徐放出マトリックスを含むことができる。或いは、完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウィルスベクターを組み換え細胞から未損傷で製造できる場合は、医薬品製剤は遺伝子送達系を与える細胞１つ以上を含むことができる。
【００９１】
医薬組成物は、投与の説明書と共に、容器、パックまたはディスペンサー内に入れることができる。
【００９２】
本発明は以下の実施例において更に説明するが、これは請求項に記載した本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００９３】
（実施例１：一般的方法）
以下の一般的方法を用いて本明細書に記載した実験を実施した。
【００９４】
（組み換えアデノウィルス）
ＡｄＣＭＶＰＤＸ−１はＲ．Ｓｅｉｊｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：１１３３（１９９９）に記載の通り構築した。これはＳＴＦ−１  ｃＤＮＡ、ｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡベクターのＢａｍＨ１部位にライゲーションされたＰＤＸ−１のラット相同体を含んでいる。
【００９５】
ＡｄＣＭＶβ−ｇａｌはβ−ガラクトシダーゼの核局在化シグナルを含む。
【００９６】
ＡｄＣＭＶ−ｈＩｎｓは非相同のサイトメガロウィルスプロモーターの制御下のヒトインスリンｃＤＮＡを含む。
【００９７】
ＡｄＲＩＰ−１−ｈＩｎｓはラットインスリンプロモーター−１（ＲＩＰ−１）の制御下のヒトインスリンｃＤＮＡを含む。ＲＩＰ−１はラットインスリン−１遺伝子の５’フランキングＤＮＡ領域の４１０塩基である。
【００９８】
全ての第１世代の組み換えアデノウィルスはＢｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，３９に従って構築した。目的の遺伝子はｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡプラスミドにライゲーションし、その後アデノウィルスプラスミドｐＪＭ１７と同時遺伝子導入し、その後ＨＥＫ−２９３細胞から組み換えビリオンを回収した。Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１はＰＤＸ−１のラット相同体を有し、Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓはＣＭＶプロモーターから遠位にヒトインスリンｃＤＮＡを有する４０。Ａｄ−ＲＩＰ−ＧＦＰ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１はＧＦＰ遺伝子発現を駆動するｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡプラスミド内のウィルスＣＭＶプロモーター（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ）の代わりにラットインスリン−１遺伝子（Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｍｏｓｓより提供）の５’−フランキング領域の４１０ヌクレオチド、ついで、ｐＡＣＣＭＶ−ＰＤＸ−１．ｐＬｐＡプラスミド由来のＣＭＶ−ｍＰＤＸ−１（ＰＤＸ−１のマウス相同体）を含むＮｏｔＩ／ＮｏｔＩインサートの挿入により調製される２官能性の組み換えアデノウィルスである４０。組み換えウィルスの特定の機能は非β細胞系統と比較した場合のインスリノーマ細胞系統において分析した。ウィルス保存株の調製は以前に報告４０されている通り実施した。
【００９９】
（細胞培養）
マウス膵誘導細胞系統β−ＴＣ−１、α−ＴＣ−１およびラット膵細胞系統ＲＩＮ１０４６−３８を以前に報告されている条件（２１，２２）に従って培養した。
【０１００】
（動物および組み換えアデノウィルス）
マウスを空調された環境下、１２時間の照明／消灯周期の下に飼育し、研究用動物の福祉に関する規制に従って取り扱った。Ｂａｌｂ／ｃマウス（８〜９週齢、２４〜２７ｇｒ）に対し、尾静脈内への全身投与により所定の組み換えアデノウィルス１〜５ｘ１０１０ｍｏｉを投与した（生理食塩水２００〜３００μｌの容量）。尾部より採血し、グルコース濃度を測定した（Ａｃｃｕｔｒｅｎｄ（登録商標）ＧＣ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。免疫組織化学的染色（４％ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋）用、遺伝子発現分析（全ＲＮＡ）用、および、肝中の膵ホルモン含量測定用に肝を採取した。後者２分析については、肝標本を即座に液体窒素中で凍結し、−７０℃で保存した。
【０１０１】
雄性ＮＯＤ／ＬｔＪおよびＮＯＤ／Ｓｃｉｄマウスを、Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｃｉｅｎｃｅのＡｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ内において病原体非存在条件下で飼育した。実験はＡｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの監督と指針の下に実施した。マウスは実験開始時には１ヶ月齢であった。
【０１０２】
（ヒト肝細胞）
成熟ヒト肝組織を４〜１０歳の小児に由来する異なる肝臓移植手術８例および４０歳超の患者２人より得た。
【０１０３】
胎児ヒト肝は妊娠２０〜２２週の異なる中絶４例より得た。成熟および胎児の肝組織は両方ともＣｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ（施設内治験審査委員会）の許可を得て使用した。
【０１０４】
（細胞の採取および培養の条件）
ヒト肝細胞の単離は以前に報告４１されている通り実施した。要約すれば、肝試料を冷Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ溶液（ＨＢＳＳ）で灌流し、薄片（厚み１〜２ｍｍ）に切り出し、３７℃で２０分間０．０３％コラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）で消化した。解離した細胞を採取しＨＢＳＳ＋ＥＧＴＡ（５ｍＭ）で２回洗浄し、４℃で５分間５００ｘｇで遠心分離することにより収集した。細胞を１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（１ｇｒ／Ｌグルコース）に再懸濁した。細胞の生存性と数を測定し、細胞をフィブロネクチン（３μｇ／ｃｍ２、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）予備コーティングプレート上に、１〜２ｘ１０５個／ｍｌでプレーティングした。最初の３日間は毎日培地を交換することにより非付着細胞を除去した。コンフルエントとなった培養物は０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて１：３に分割した。細胞は５％ＣＯ２および９５％空気の湿潤雰囲気下３７℃に維持した。
【０１０５】
（ウィルス感染および成長因子の投与）
肝細胞を個別に示すとおり成長因子の存在下または非存在下（ＥＧＦ２０ｎｇ／ｍｌ，Ｃｙｔｏｌａｂ  Ｌｔｄ．；ニコチンアミド１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）でＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（１ｇｒ／Ｌグルコース）中培養し、５日間組み換えアデノウィルス（５００ｍｏｉ）を感染させた。本試験で使用した組み換えアデノウィルスはＡｄ−ＲＩＰ−ＧＦＰ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１、Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１、Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ４０、Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。
【０１０６】
（ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ分析）
全ＲＮＡをＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｈｉｏ）を用いて凍結組織から単離した。ＲＮＡ試料を６０分間ＲＱ１  ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１０単位で処理した。ｃＤＮＡは４μｇのＤＮＡ非含有全ＲＮＡおよび０．５μｇオリゴ（ｄＴ）１５を用いて逆転写（ネイティブＡＭＶ逆転写酵素、Ｃｈｉｍｅｒｘ）により調製した。ＰＣＲはＴ３サーモサイクラーを（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇoｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施し、産物は１．８％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで可視化した。ＰＣＲのために使用したプライマーの配列および反応条件は表１および表３に示すとおりである。内因性マウスＰＤＸ−１の発現と異所性ラット相同体の間の判別のために、２セットの特異的オリゴヌクレオチドプライマーを設計した（表１および表３参照）ことに留意されたい。
【０１０７】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲはＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉ染料を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で実施した。
【０１０８】
使用した増幅条件は初期の変性を９５℃１０分間、ついでマウスおよびラットＰＤＸ−１の両方につき５５サイクルまたはβ−アクチンにつき３０サイクルとした。両方のＰＤＸ−１相同体につき、各サイクルの内容は、変性９５℃１５秒、アニーリング５９℃および伸長７２℃１５秒とした。β−アクチンのアニーリングは５６℃で１０分間行った。蛍光シグナルは各サイクル後に５秒間、β−アクチンでは９０℃、マウスＰＤＸ−１では８７℃およびラットＰＤＸ−１では８８℃でモニタリングした。融解曲線プログラムは６８℃で４０秒行い、発生した産物の特異性を分析した。
【０１０９】
マウスＰＤＸ−１のＲＴ−ＰＣＲは３回実施し、ラットＰＤＸ−１は２回実施した。
【０１１０】
ラットおよびマウスのＰＤＸ−１の濃度は共に同じ試料におけるそれぞれのβ−アクチンｍＲＮＡ濃度に対して規格化した。
【０１１１】
或いは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１１２】
本試験において使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）蛍光発生プローブ、Ａｓｓａｙ−Ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ヒトβ−アクチンＨｓ９９９９９９０３＿ｍｌ、ヒトインスリンＨｓ００３５５７７３＿ｍｌ、ヒトグルカゴンＨｓ００１７４９６７＿ｍｌ、ヒトソマトスタチンＨｓ００３５６１４４＿ｍｌ、ヒトＰＤＸ−１Ｈｓ００１７３０１４＿ｍｌ、ヒトＧｌｕｔ−２Ｈｓ００１６５７７５＿ｍｌ、ヒトグルコキナーゼＨｓ００１７５９５１＿ｍｌ、ヒトＰＣ２Ｈｓ００１５９９２２＿ｍｌ、ヒトＳＣＧ２Ｈｓ００１８５７６１＿ｍｌ、ヒトＳＧＮＥ１Ｈｓ００１６１６３８＿ｍｌであった。
【０１１３】
増幅条件は開始時５０℃２分、変性９５℃１０分、ついで変性９５℃１５分およびアニーリング６０℃１分の各サイクルを４０サイクルとし、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。相対的な定量分析は２＾（−ΔＣｔ）等式を用いてＡＢＩプリズム７０００ＳＤＳソフトウェアに従って行った。ｍＲＮＡ濃度はヒトβ−アクチンｍＲＮＡに対して補正した。
【０１１４】
（膵ホルモン免疫組織化学）
４μｍのパラフィン包埋切片のスライドを脱パラフィン化し、３％Ｈ２Ｏ２中でインキュベートし、市販のＨｉｓｔｏｍｏｕｓｅ（登録商標）−ＳＰキット（Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてブロッキング溶液（インスリンおよびグルカゴンの検出の両方）中でインキュベートした。次に切片を共に１：２００の希釈度のヒトインスリンおよびヒトグルカゴンに対するモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。スライドを室温で３０分間二次ビオチニル化ＩｇＧに曝露し、次にストレプトアビジン−パーオキシダーゼ、その後、色原体パーオキシド溶液中でインキュベートした。一次抗体は使用せず二次抗体のみを使用し、その後ストレプトアビジン−パーオキシダーゼおよび色原体パーオキシド溶液を使用した対照群を設けることにより系の考えられるバックグラウンドを排除した。
【０１１５】
（膵ホルモンに関するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））
膵臓および肝臓を単離し、即座に液体窒素中に凍結し、−７０℃で保存した。凍結した組織は０．１８ＮのＨＣｌ／３５％エタノール中でホモゲナイズした。ホモジネートを攪拌しながら４℃で一夜抽出し、上澄みを凍結乾燥した。試料をプロテアーゼ阻害剤カクテル添加０．８ｍｌＲＩＡアッセイバッファー（Ｓｉｇｍａ）に溶解した。肝インスリンおよびグルカゴン濃度をラットラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ、カタログ番号ＳＲＩ−１３ＫおよびＧＬ−３２Ｋ、Ｌｉｎｃｏ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡおよびＣｏａｔ−Ａ−Ｃｏｕｎｔ，ＤＰＣ；ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。ソマトスタチン濃度はＲＩＡ（Ｅｕｒｏ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により測定した。膵ホルモンの肝含量は摘出した組織の重量に対して規格化した。
【０１１６】
（肝機能の測定）
血清試料中のアルブミン、ＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）および総ビリルビンよりなる血清生化学数値をＯｌｙｍｐｕｓ  ＡＵ２７００  Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。
【０１１７】
（インスリンおよびＣ−ペプチドの検出）
インスリンおよびＣ−ペプチドの分泌および一次成熟肝細胞中の含量を初回ウィルスおよび成長因子投与の３日後に４８時間の静的インキュベーションにより測定した。インスリンの培地への分泌はＵｌｔｒａ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＲＩＡキット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてＲＩＡにて測定し、そして、Ｃ−ペプチドの分泌はＨｕｍａｎ  Ｃ−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＲＩＡキット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により測定した。
【０１１８】
インスリン含量は細胞ペレットを０．１８ＮのＨＣｌ、３５％エタノール中でホモゲナイズした後に測定した。ホモジネートを攪拌しながら４℃で一夜抽出し、上澄みを凍結乾燥した。試料を０．２％ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）含有ＰＢＳ０．５ｍｌに溶解した。試料１００μｌをＲＩＡに使用した。インスリン含量はＢｉｏ−Ｒａｄ蛋白試験キットにより測定された全細胞蛋白に対して規格化した。
【０１１９】
（グルコース負荷試験）
成熟肝細胞にＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１および成長因子を５日間投与した。細胞を１０５個／ウェルの密度で６穴プレートにプレーティングした。
【０１２０】
経時分析のために、細胞を０．１％ＢＳＡ含有Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液（ＫＲＢ）中で２時間予備インキュベートし、次に２ｍＭまたは２５ｍＭのグルコースを含有する培地中で所定時間インキュベートした。各時点において、培地試料中のインスリン（Ｕｌｔｒａ  ＳｅｎｓｉｔｉｖｅヒトインスリンＲＩＡキット−Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびＣ−ペプチド（ヒトＣ−ペプチドＲＩＡキット）を分析した。
【０１２１】
グルコース用量応答；細胞を０．１％ＢＳＡ含有ＫＲＢで２時間予備インキュベートし、洗浄し、その後、漸増濃度のＤ−グルコースまたは２−デオキシグルコース（０〜２５ｍＭ）を２時間負荷した。２５ｍＭグルコースにおけるインキュベート終了時に、細胞をＫＲＢで洗浄し、２ｍＭグルコース含有培地中更に２時間インキュベートした。
【０１２２】
（電子顕微鏡観察）
肝細胞を２．５％グルタルアルデヒドに固定し、オスミウム酸染色し、一連の等級のエタノールおよびプロピレンオキシドで脱水し、Ａｒａｌａｄｉｔｅ溶液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）中に包埋した。ウルトラミクロトームで超薄片を切り出し、２％ウラニルアセテートおよびＲｅｙｎｏｌｄクエン酸鉛溶液で染色した。包埋後イムノゴールド反応のために、５０〜９０ｎｍの肝切片をニッケルグリッド上においた。グリッドを一夜室温でインスリンに対する抗体（モルモットポリクローナル；７．８μｇ／ｍｌ、Ｄａｋｏ）と共にインキュベートし、次に室温で１．５時間モルモットＩｇＧに対するイムノゴールドコンジュゲート抗体（１５ｎｍゴールド；１：４０希釈、Ｄａｋｏ）と共にインキュベートした。切片を電子顕微鏡下に観察した（Ｊｅｏｌ  １２００ＥＸ２）。
【０１２３】
（細胞移植）
５週齢の非肥満糖尿病重度合併免疫不全（ＳＣＩＤ−ＮＯＤ）雄性マウス（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｓｒａｅｌ）に１８０ｍｇ／ｋｇ体重のストレプトゾトシンを腹腔内注射することにより高血糖症とした。血中グルコース濃度が２回連続測定で約３００ｍｇ／ｄｌに達した時点で、マウスの腎皮膜下に３０ゲージ針を用いてＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）５０μｌ中、５日間に亘り、ＰＤＸ−１および成長因子をあらかじめ投与した３ｘ１０６ヒト肝細胞を移植した。血液を尾部から週２回採取し、グルコース濃度の測定に付した（Ａｃｃｕｔｒｅｎｄ（登録商標）ＧＣ，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。製造元の取扱説明書に従って、マウスＣ−ペプチドに対して０％交差反応性のＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）およびヒトインスリンに対して０％交差反応性のマウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を用いることにより、給餌マウスの血液中の血清をＣ−ペプチドおよびインスリン濃度の分析用に採取した。腎臓および膵臓は免疫組織化学的分析用に採取した。
【０１２４】
（組織学的検討および染色）
腎臓および膵臓を４％ホルムアルデヒドに固定し、パラフィン包埋した。パラフィン包埋組織の厚み５ｍ切片を脱パラフィン化し、３％Ｈ２Ｏ２中でインキュベートし、次にブロッキング溶液中でインキュベートする前に抗原回復のためにクエン酸塩緩衝液中でマイクロウエーブ処理する（ＰＤＸ−１検出）か、または、Ｈｉｓｔｏｍｏｕｓｅ（登録商標）−ＳＰキット（Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてブロッキング溶液に即座に曝露した（インスリン検出）。ＰＤＸ−１の検出のためには、切片をカエルＰＤＸ−１のＮ末端部分に対して構築された抗血清（１：５０００、Ｃ．Ｖ．Ｅ．Ｗｒｉｇｈｔより入手）と共に４℃で一夜インキュベートした。インスリンの検出のためには、切片をヒトインスリンに対するモノクローナル抗体（１：１００、Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。スライドを二次ビオチニル化ＩｇＧに３０分間曝露し、次にストレプトアビジン−パーオキシダーゼ、ついで色原体パーオキシド溶液中でインキュベートした。
【０１２５】
（シクロホスファミド加速糖尿病（ＣＡＤ））
糖尿病の発症を前述の通り（３）シクロホスファミド（Ｓｉｇｍａ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）により加速した。雄性ＮＯＤマウスに４週齢の時点でシクロホスファミド２００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した。その後２週間以内にマウスが糖尿病にならない場合は、Ｃｙの二回目の腹腔内注射（２００ｍｇ／ｋｇ）を行い、１週間後に工程を再度反復した。糖尿病マウスをＳＰＦから除き、１２時間の照明／消灯周期の下に空調環境内において飼育し、そこで７２時間馴化させた後に新たに血糖値を測定して糖尿病を確認した。
【０１２６】
（高血糖症）
血中グルコースはＡｃｃｕｔｒｅｎｄ（登録商標）ＧＣ，Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｄ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて週二回測定した。血中グルコース濃度が２回の連続測定で３００ｍｇ／ｄｌより高値であればマウスを糖尿病と見なした。
【０１２７】
（ウィルス感染）
８〜１０週齢の糖尿病ＮＯＤマウス（体重２０〜２２ｇｒ）に対し、尾静脈内への全身投与により所定の組み換えアデノウィルス１．５ｘ１０１０ｐｆｕを投与した。ウィルスはＰＢＳ中２００〜３００μｌの容量で投与した。
【０１２８】
（膵臓組織の検討）
膵臓および肝臓を４％ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン包埋し、切り出して標準的なヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。免疫組織化学的に染色した４μｍパラフィン包埋切片のスライドを脱パラフィン化し、ブロックして（２１）に記載の通りＨｉｓｔｏｍｏｕｓｅ（登録商標）−ＳＰキット（Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて分析した。切片をヒトインスリンに対するモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）の１／１００希釈物と共にインキュベートした。スライドをストレプトアビジン−パーオキシダーゼと組み合わせた抗マウスＩｇＧビオチニル化抗体、ついで色原体パーオキシド溶液を用いて発色させた。対照スライドはインスリン特異的抗体を添加しない以外は同じプロトコルに従って並行して発色させた。  
【０１２９】
（実施例２：異所性に同時送達されたインスリンプロモーターのＰＤＸ−１誘導内因性インスリン遺伝子の発現および活性化の測定）
肝における異所性ＰＤＸ−１発現の作用を調べるために、雄性Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス（１１〜１４週齢）の尾部静脈にＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１組み換えアデノウィルス２ｘ１０９プラーク形成単位（０．２ｍｌ生理食塩水中）を注射した。対照として、ＡｄＣＭＶ−β−ｇａｌまたはＡｄＣＭＶ−ｈＩｎｓおよびＡｄＲＩＰ−Ｉ−ｈＩｎｓ組み換えアデノウィルスをマウスに同様に注射した。動物は通常の非制限食餌において１２時間照明／消灯周期下の空調環境下に飼育し、ウィルス投与後１週間に屠殺した。肝臓、脾臓、膵臓および腎臓を摘出し、迅速に液体窒素中で凍結し、−７０℃で保存して全ＲＮＡの単離に付した。
【０１３０】
ＰＤＸ−１およびインスリンの遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲで測定した。全ＲＮＡをＲＮＡｚｏｌ（ＣＩＮＮＡ−ＢＩＯＴＥＸ）を用いて凍結組織から単離した。ＲＮＡ試料は１０ｕｌのＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。ｃＤＮＡは１μｇＤＮＡ非含有全ＲＮＡおよび０．５μｇオリゴ（ｄＴ）１５を用いて逆転写により調製した。ＲＴ反応液１．５μｌを以下の表１に示すプライマーおよびＰＣＲ条件を用いて増幅した。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で行い、産物は１．７％アガロースゲル上で分離した。別のＰＣＲ反応を逆転写酵素を用いることなく各ＲＮＡ試料について実施することにより増幅された産物がＤＮＡ汚染によるものではないことを確認した。プライマーはマウス相同体ではなく異所性ラットＰＤＸ−１の発現のみを検出するように設計した。ｍＩ−２増幅用のプライマーは異なるエクソン上に位置する。試料変性の第１の工程は全ての増幅遺伝子について同一であり、９４℃１分とした。
【０１３１】
全ＲＮＡの分析によればＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１の投与により主に肝においてＰＤＸ−１の発現が起こったことがわかる。同じマウスに由来する脾臓、膵臓および腎臓はＰＤＸ−１のラット相同体についてはＲＴ−ＰＣＲによれば陰性であった。
【０１３２】
異所性ラットＰＤＸ−１メッセージのついて陽性であったマウスの７５％（３５匹中２５匹）はｍＩ−２遺伝子を発現したのに対し、マウスの３５％がｍＩ−１遺伝子を発現した（図１）。ｍＩ−２とｍＩ−１の間のこのような発現の相違がＰＤＸ−１発現肝細胞中に存在する転写因子の本質または量によりｍＩ−１プロモーターが異なって影響されるためであるかどうかを明らかにするために、上記した通りマウスにＡｄＲＩＰ−Ｉ−ｈＩｎｓ組み換えアデノウィルスをＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１と同時送達した。図１に示すとおり、ＰＤＸ−１が内因性ｍＩ−２の発現のみを誘導した肝においては、これはラットインスリン−１プロモーター（ＲＩＰ−１）も活性化した。このことはＤＮＡメチル化の異なった水準または個別の染色質構造が肝におけるＰＤＸ−１発現による内因性ｍＩ−１発現の活性化の効率が低いことの原因である可能性を示唆している。更にまたこれらのデータはＰＤＸと同時送達された場合の肝におけるβ細胞特異的インスリンプロモーターを活性化する能力を示している。
【０１３３】
内因性のマウスインスリンおよび異所性ヒトインスリンの遺伝子の発現はそれぞれ同じ濃度の対照組み換えアデノウィルスＡｄＣＭＶ−β−ｇａｌまたはＡｄＣＭＶ−ｈＩｎｓおよびＡｄＲＩＰ−ｈＩｎｓの投与（ｎ＝２０）では誘導されなかった。これらの結果はＰＤＸ−１は内因性インスリン遺伝子の発現を誘導するため、および、膵臓外の組織におけるＲＩＰ−１の活性化のために必須かつ十分であることを示している。
【０１３４】
（実施例３：ＰＤＸ−１誘導のソマトスタチン遺伝子発現およびインビボの蛋白生産の測定）
実施例２に記載の通り動物に組み換えアデノウィルスを投与した。ソマトスタチンの遺伝子発現は表１に示す条件に従って実施例２に記載の通りＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１３５】
図３に示すとおり、ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与したマウスの肝はソマトスタチンの遺伝子発現を示した。ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与したマウスは免疫化学的分析を行った肝組織においてはソマトスタチン蛋白について陽性に染色された。ＡｄＣＭＶ−β−ｇａｌを投与したマウスはソマトスタチンを発現しなかった。
【０１３６】
（実施例４：ＰＤＸ−１誘導グルカゴン遺伝子発現の測定）
実施例２に記載するとおりＡｄＣＭＶＰＤＸ−１組み換えアデノウィルスを動物に投与した。グルカゴン遺伝子発現を表１に示す条件およびプライマーを用いて実施例２に記載の通りＲＴ−ＰＣＲで測定した。
【０１３７】
図３に示すとおり、ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与したマウスの肝はグルカゴン遺伝子を発現した。ＡｄＣＭＶ−β−ｇａｌを投与したマウスはグルカゴンを発現しなかった。
【０１３８】
（実施例５：プロホルモン変換酵素１／３誘導遺伝子発現の測定）
実施例２に記載の通り組み換えアデノウィルスを動物に投与した。プロホルモン変換酵素１／３（ＰＣ１／３）遺伝子発現はオリゴ（ｄＴ）１５の代わりに遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＡＣＡＧＧＡＴＴＣＴＣＴ）（配列番号１）を用いてｃＤＮＡを逆転写した以外は実施例２に記載の通りＲＴ−ＰＣＲにより測定した。図３に示すとおり、ＰＤＸ−１を投与した動物に由来する肝のみがＫｅｘｉｎファミリープロテアーゼのメンバーであるＰＣ１／３の発現を誘導し、ＰＣ１／３の発現は調節された分泌経路を有する内分泌および神経内分泌の細胞に限定されている。細胞内コンパートメント内に生産されたホルモンを貯留する能力と合わせると、ホルモンの生産、プロセシング、保存および分泌に関わる調節された経路の誘導を含む内分泌の表現型のＰＤＸ−１依存性の誘導が示唆される。
【０１３９】
【表１−１】
2011068660.tif 000002
【０１４０】
【表１−２】
2011068660.tif 000003
【０１４１】
【表３】
2011068660.tif 000004
（実施例６：肝におけるＰＤＸ−１誘導プロインスリン合成）
実施例２に記載の通り組み換えアデノウィルスを動物に投与した。肝臓、脾臓、膵臓および腎臓を摘出した。組織の一部を４％ホルムアルデヒドに固定し、パラフィン包埋し、免疫組織化学的染色に付した。残余の肝および膵臓の組織を７０％エタノール−０．１８Ｎ塩酸中でホモゲナイズし、凍結乾燥し、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）中に再懸濁してＩＲＩ含量のＲＩＡ測定に付した。
【０１４２】
（免疫組織化学的検討）
パラフィン包埋組織の５μｍ切片を脱パラフィン化し、３％Ｈ２Ｏ２中でインキュベートし、次にブロッキング溶液中でインキュベートする前に抗原回復のためにクエン酸塩緩衝液中でマイクロウエーブ処理する（ＰＤＸ−１検出）か、または、ブロッキング溶液に即座に曝露した（インスリン検出）（Ｈｉｓｔｏｍｏｕｓｅ（登録商標）−ＳＰキット、Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ，ＵＳＡ）。
【０１４３】
ＰＤＸ−１の検出：切片をカエルＰＤＸ−１のＮ末端部分に対して構築された抗血清と共に４℃で一夜インキュベートした。
【０１４４】
インスリンの検出：切片をモノクローナル抗ヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。
【０１４５】
スライドを二次ビオチニル化ＩｇＧに３０分間曝露し、ストレプトアビジン−パーオキシダーゼ、ついで色原体パーオキシド溶液中でインキュベートした。
【０１４６】
ＰＤＸ−１を投与したマウスの肝切片の免疫組織化学的分析によれば肝細胞核の３０〜６０％においてホメオプロテインの発現があり、肝細胞の０．１〜１％が（プロ）インスリンについて陽性に染色されたことがわかった。対照のＡｄＣＭＶβ−ｇａｌ投与肝は（プロ）インスリンについては陽性に染色されなかったが、β−ガラクトシダーゼ活性は核の５０％で明らかとなった。ＡｄＣＭＶ−ｈＩｎｓを投与したマウスの肝は肝切片においてはインスリンについて陽性に染色されなかったが、同じマウスの血清ＩＲＩはＰＤＸ−１投与マウスにおける血清中ＩＲＩ濃度と同様、３倍高値であった。インスリンではなくＰＤＸ−１の異所性発現が（プロ）インスリンについて陽性に免疫染色されたという事実は、β細胞の表現型に移行していると考えられる、肝細胞の小さいサブ集団（肝細胞ではなく、内分泌細胞に特徴的な、調節経路に属する分泌ベシクル）におけるインスリンの貯留を支援する細胞モジュレーションの誘導を示唆している。
【０１４７】
（ラジオイムノアッセイ）
肝インスリンｍＲＮＡが効率的に蛋白に翻訳されるかどうかを調べるために、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により肝組織に由来する抽出液中の免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）含量を試験した。ＲＴ−ＰＣＲによりインスリン遺伝子発現について陽性であったＰＤＸ−１投与マウスの肝（図１）は対照ウィルスを投与した動物の肝臓よりも約２５倍高値のＩＲＩを含有していた（表２）。ＰＤＸ−１投与肝由来抽出液中の平均ＩＲＩ濃度は２０．７±３．９７μＵ／ｍｇ蛋白であり、対照肝ではＩＲＩは僅か０．７８±０．２５μＵ／ｍｇ蛋白であった。対照肝試料中で測定したインスリンのバックグラウンド濃度はおそらくはこの臓器中に大量に存在するその受容体に結合したインスリン（膵起源）を示している可能性がある。ＰＤＸ−１投与肝抽出液中に検出されたＩＲＩは膵抽出液中に検出された濃度の＜０．１％であったが（表２）、ＰＤＸ−１投与マウスにおける血清中ＩＲＩ濃度は対照群と比較してほぼ３倍高値であり（それぞれ３２３±４８．４対１１８．２±２３．７μＵ／ｍｌ（表２））、インスリンが合成されておりその大部分が血流中に分泌されたことを示している。これらのデータは分子操作により誘導されたインスリン遺伝子発現がプロ／ホルモンの特異的肝生産に良好に翻訳されたことを示している。
【０１４８】
ＰＤＸ−１投与肝において検出された免疫反応性のインスリンは膵抽出液中のＩＲＩ濃度の１％未満であった（表２）。肝抽出液中のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定されたＩＲＩ値はこの臓器における実際のインスリン生産を過小評価していると考えられる。ＲＩＡのために本発明者等が使用した抗体はプロセシングされたホルモンに優先的に結合し、肝細胞に主に存在し、膵臓にははるかに低い濃度で存在すると推定されるプロインスリンとの交差反応性は僅か６０％である。
【０１４９】
（実施例７：血中グルコースおよび血清中インスリンの濃度）
実施例２に記載の通り組み換えアデノウィルスを動物に投与した。屠殺する前にグルコース濃度（Ａｃｃｕｔｒｅｎｄ（登録商標）ＧＣ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびラジオイムノアッセイによるインスリン濃度（Ｃｏａｔ−ａ−Ｃｏｕｎｔ，ＤＰＣ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ，ラットインスリン標準物質（Ｌｉｎｃｏ）使用、使用した抗インスリン抗体はヒトプロインスリンとは交差反応性は僅か６０％である）の測定用に、下大静脈より採血した。
【０１５０】
ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１組み換えアデノウィルスを投与したマウスは高血糖症ではなかったが、その血中グルコース濃度はＡｄＣＭＶ−β−ｇａｌまたはＡｄＣＭＶ−Ｌｕｃを投与したマウスよりも有意に低値であった［それぞれ１９７±１１．２対２２８±１５．７４ｍｇ／ｄｌ、（表２）］。血漿中免疫反応性インスリン濃度は対照群と比較してＰＤＸ−１投与マウスで有意に高値であった［それぞれ３２３±４８．４対１１８．２±２３．７μＵ／ｍｌ、（表２）］。
【０１５１】
ＰＤＸ−１投与マウスにおける血清中ＩＲＩ濃度の３倍上昇は、ＰＤＸ−１投与肝抽出液中に示された肝ＩＲＩ含量の２５倍上昇（表２）をそれ自体では説明することができない。即ち、肝プロ／インスリン含量の増大は局所的生産に起因している。
【０１５２】
【表２】
2011068660.tif 000005
（実施例８：インスリン関連ペプチドのＨＰＬＣ分析）
実施例２に記載するとおり組み換えアデノウィルスを動物に投与した。肝および膵臓を摘出し、７０％エタノール−０．１８Ｎ塩酸中でホモゲナイズし、凍結乾燥し、０．１Ｍ塩酸−０．１％ＢＳＡ中に再懸濁し、ＨＰＬＣ分析に付した。
【０１５３】
肝および膵の抽出液から得たインスリン関連ペプチドをＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ１００Ｒ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＧｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌの溶離条件を用いた逆相ＨＰＬＣにより分解した。１ｍｌ画分を水中０．１％ＢＳＡ０．１ｍｌの入った試験管中に採取し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ装置で乾燥し、ＲＩＡ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ）１ｍｌ中に希釈再調製し、ＲＩＡによるペプチド測定に付した。モルモット抗ブタインスリン抗体（Ｌｉｎｃｏ，Ｓｔ  Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）とラットまたはヒトインスリン標準物質のいずれかを用いてそれぞれマウスまたはヒトＩＲＩを測定した。
【０１５４】
ＰＤＸ−１投与マウスの肝ＩＲＩ含量のＨＰＬＣ分析によれば完全にプロセシングされたｍＩ−１およびｍＩ−２への変換は５９±７％（ｎ＝３）であった。これと比較して、膵抽出液は８５±５％（ｎ＝３）の成熟インスリンを含有していた（図２）。これに対し、ヒトインスリンの異所性発現（ＡｄＣＭＶ−ｈＩｎｓ）は、抽出されたＩＲＩの大部分が未成熟インスリンであった肝一例を除き、肝細胞中のＩＲＩの貯留をもたらさなかった。このことは、インスリン遺伝子産物の貯留が観察されずその大部分が構成性の分泌経路により分泌されたトランスフェクトＦＡＯ細胞における以前の観察結果と合致している。これらのデータは肝における異所性ＰＤＸ−１発現は誘導されたプロホルモンのプロセシングが可能な内分泌組織に特徴的である細胞機序を誘導し、肝においてプロインスリンのみが異所性に発現される場合には誘導されないことを示している。即ち、異所性ＰＤＸ−１発現による肝細胞における拡張されたβ細胞表現型の誘導を示す。
【０１５５】
（実施例９：肝プロ／インスリン生産の生物学的活性）
糖尿病マウスにおける血糖値を制御するＰＤＸ−１誘導肝インスリン生産の能力を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２００ｍｇ／ｋｇの腹腔内ＳＴＺ注射の２４時間後にケトアシドーシスを伴った糖尿病（＞６００ｍｇ／ｄｌ）とした。ＳＴＺ注射の２４〜４８時間後に、マウスには尾部静脈から生理食塩水中のＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１またはＡｄＣＭＶβ−ｇａｌ（対照）組み換えアデノウィルスを投与した。図４に示すとおり、ＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスは組み換えアデノウィルス投与の２日後から開始して、約６００から２００〜３００ｍｇ／ｄｌまでの血中グルコース値の緩やかな低下を示した。これとは対照的に、対照のＡｄＣＭＶβ−ｇａｌ投与マウスにおいては、高血糖症は持続し、死亡率の増大を伴い、試験した２２匹中１２匹が死亡し、アデノウィルス投与の１〜３日後には重度のケトアシドーシスを有していた。更にまた、両群とも高血糖症誘導後は体重減少を示し、屠殺時前までに回復しなかった。要すれば、データは、ＰＤＸ−１の発現は損なわれたβ細胞機能を有するマウスにおける高血糖症を軽減する成熟した生物学的に活性なインスリンの生産を誘導するのに十分であることを示している。
【０１５６】
（実施例１０：異所性ＰＤＸ−１発現によるインスリンプロモーターのインビトロの活性化）
ＰＤＸ−１はラットインスリン−１プロモーターによりヒトインスリンの発現を送達する組み換えアデノウィルスＡｄＲｉｐ−１ｈＩｎｓと共に同時送達された場合にラットインスリン−１プロモーターを活性化する（実施例２および図１参照）。ＰＤＸ−１はラット肝細胞においてラットインスリンプロモーター−１をインビトロで活性化するのに十分であることがわかっている。成熟および胎児の肝細胞の一次培養物を血清非含有の化学的に明らかにされている培地中、コラーゲン−１被覆組織培養皿上で培養した。プレーティングから２日後に、細胞にＡｄＣＭＶ−ＰＤＸ−１＆ＡｄＲＩＰ−１ｈＩｎｓまたはＡｄＣＭＶβ−ｇａｌ＆ＡｄＲＩＰ−１ｈＩｎｓのいずれかを投与した。アデノウィルス投与の４８時間後、全ＲＮＡを抽出し、プロインスリン遺伝子の発現を実施例２に記載したとおり調べた。
【０１５７】
ＰＤＸ−１は異所性発現されたＲＩＰ−ｈＩｎｓ（ラットインスリンプロモーター−１、このプロモーターの４１０ｂｐ、ヒトインスリン駆動、組み換えアデノウィルスにより導入）を活性化し、β−ｇａｌはこのような能力を保有していなかった（図５）。
【０１５８】
（実施例１１：肝細胞における内因性ソマトスタチン遺伝子発現のインビトロの誘導）
胎児（Ｅ１４−Ｆｉｓｈｅｒ−３４４ラット）から単離した肝細胞の一次培養物を培養し、実施例９に記載の通り組み換えアデノウィルスを投与した。ソマトスタチン遺伝子発現は表１に示すプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲ条件を用いて、実施例２に記載の通り逆転写全ＲＮＡ試料中で検出した。
【０１５９】
データはインビトロの肝細胞における異所性ＰＤＸ−１発現は、インビトロで、肝細胞における内因性の、その他の面ではサイレントであるソマトスタチンの遺伝子の発現を誘導することを示している（図６）。
【０１６０】
（実施例１２：肝細胞における内因性インスリン遺伝子発現のインビトロの誘導）
実施例１０に記載の通り胎児（Ｅ１４−Ｆｉｓｈｅｒ−３４４ラット）の一次培養物を培養し、組み換えアデノウィルスを投与した。ラットインスリン１遺伝子の発現は表１に示すプライマーおよびＲＴ−ＰＣＲ条件を用いて、実施例２に記載の通り逆転写全ＲＮＡ試料中で検出した。
【０１６１】
データはインビトロの胎児肝細胞の一次培養物における異所性ＰＤＸ−１発現は、内因性の、その他の面ではサイレントであるインスリンの遺伝子の発現を誘導することを示している（図６）。
【０１６２】
（実施例１３：生産されたホルモンの貯留およびその調節された分泌を可能にする内分泌および神経内分泌の特徴である細胞内コンパートメントの肝細胞内異所性ＰＤＸ−１発現による誘導）
実施例２に記載の通り、Ａｄ−ＣＭＶｈＩｎｓまたはＡｄＣＭＶＰＤＸ−１のいずれかをマウスに投与した。投与により肝細胞によるヒトインスリンの生産を示す３倍の血清中ＩＲＩ増大がもたらされた（図１）。免疫細胞化学試験によりインスリン蛋白が陽性であった細胞はＡｄＣＭＶＰＤＸ投与のみで検出された。更にまた、肝抽出液のＨＰＬＣ分析では肝抽出液中には僅か痕跡量のＩＲＩのみしか検出されず、その全てはＡｄ−ＣＭＶｈＩｎｓ投与マウスでは未プロセシングであり、これに対し、ＡｄＣＭＶＰＤＸ−１投与マウスでは２５倍増大が観察された。更に、ＡｄＣＭＶＰＤＸ−１投与マウスにおいて生産されたインスリンの５９％が、プロセシングされた。更に、ＡｄＣＭＶＰＤＸ−１を投与した肝のみが、インスリンのプロセシングの保存および調節された分泌のための調節された経路が可能である細胞にのみ特徴的であるプロホルモンプロセシング酵素ＰＣ１／３の誘導を示した。これらのデータは肝細胞におけるインスリンの調節された分泌をＰＤＸが誘導することを示している。
【０１６３】
（実施例１４：ＰＤＸにより発現がモジュレートされる核酸の識別）
ＰＤＸによりモジュレートされる核酸は異所性ＰＤＸ発現により識別される。膵組織と比較した場合に、対照投与の膵外島組織において発現されない核酸はＰＤＸによりモジュレートされる核酸である。このようにして識別されたこれらの核酸は膵関連障害を治療するための治療用化合物として使用される。
【０１６４】
標的遺伝子の識別はサブトラクティブのライブラリ、市販のマイクロアレイチップ（ＩｎｃｙｔｅまたはＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）またはメンブレンハイブリダイゼーション（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ａｔｌａｓ（登録商標）発現アレイまたはＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ（登録商標））ブロット）の何れかにより実施する。投与組織からのＲＮＡの単離、その精製およびｃＤＮＡプローブの合成は、製造元の取扱説明書に従って実施する。
【０１６５】
ＰＤＸ投与非膵島組織において発現され、そして膵島プローブされたメンブレンまたはチップ中にも存在するが対照投与非膵島組織には存在しない遺伝子は直接または非直接のＰＤＸ標的遺伝子であり、これは遺伝子発現の島細胞特徴的性質を示す。直接または間接の間の判別は、図７に示す電子移動性シフト試験（ＥＭＳＡ）による候補標的遺伝子プロモーター分析、および、プロモーターフットプリンティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載）により解明される。
【０１６６】
（実施例１５：宿主組織における所望の異所性発現遺伝子の調節発現の誘導）
本実施例はインスリン以外の何れかの受容体の調節された発現の誘導を説明する。ＰＤＸが非膵島組織においてインスリンプロモーターを活性化しそのグルコースおよび成長因子感知能力を媒介する場合、何らかの別のプロモーターがグルコースおよび成長因子により同様に調節される。即ち、本発明はインスリンプロモーターにより駆動され、これによりその転写および他の面では非内分泌性の組織からの調節された分泌を制御するインスリンプロモーターにより駆動される例えばグルカゴン、成長ホルモン、ステロイドホルモンを含む多くの分泌および／または非分泌の因子の発現を栄養的およびホルモン的に調節するために使用できる（図７）。
【０１６７】
（実施例１６：βまたは島細胞特異的転写因子の階層構造中のＰＤＸ位置の識別）
本実施例はβ細胞または島細胞に特異的な転写因子の階層構造におけるＰＤＸの位置の識別を説明する。膵島において発現されるが肝における異所性のＰＤＸ−１の発現により誘導されない各転写因子は、肝のような非内分泌膵臓組織中のより包括的で完全または完全に近いβ細胞表現型の誘導のためにＰＤＸと協調すると考えられる。肝における島細胞特異的転写因子の誘導された発現の検出は、表１に例示する適切なプライマーおよび条件を用いて実施例２に記載するとおり実施される。
【０１６８】
転写因子の活性を分析するための別の方法はフットプリンティングにより実施され、そして以下の通り実施される。
【０１６９】
電子移動性シフト試験（ＥＭＳＡ）：核抽出液（蛋白３〜４μｇ）を１０％グリセロール、１５ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＤＴＴおよび０．３ｇのポリｄＩｄＣ、ポリｄＡｄＴ（ＳＩＧＭＡ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を含有するＤＮＡ結合混合物中１０分間氷上でインキュベートした。最初のインキュベーションの後、プローブ約０．２ｎｇを添加し、更に２５分間の氷上インキュベーションに付した。結合反応はネイティブの４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
【０１７０】
オリゴヌクレオチド（プローブ）。合成の２本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いて［α３２Ｐ］ＡＴＰで末端標識する。インスリンプロモーター上のＰＤＸ−１結合部位（の１つ）に関する例であるオリゴヌクレオチドＡ３／Ａ４の配列は５’ＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＡＴＧ３’（配列番号２４）である。Ａ１（インスリンプロモーター上の別のＰＤＸ−１結合部位）の配列は５’ＧＡＴＣＣＧＣＣＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣＧＧＣＡ−３’（配列番号２５）である。図７に示すとおり、標識されたオリゴを電子移動性シフト試験のためのプローブとして使用する。ＰＤＸ−１の識別は、プロモーター上のその同属体遺伝子座へのＰＤＸ−１の結合を防止するか、または、ｐｄｘ−１＋標識プローブのみを含有するものと比較してＰＡＧＥ（抗体＋ｐｄｘ−１＋プローブ）上で分離される複合体の分子量を増大させる特異的抗体を用いたスーパーシフトにより二重推定される（図７における最後２レーン）。
【０１７１】
（実施例１７：肝における膵内分泌および外分泌マーカーの異所性ＰＤＸ−１発現による誘導）
インビボの成熟肝における異所性ＰＤＸ−１発現は膵遺伝子の広範なレパートリーを活性化する。内分泌および外分泌の両方のマーカー、例えば外分泌膵転写因子ｐ４８は肝における異所性ＰＤＸ−１発現に応答して独特の発現を示した（図８）。対照投与マウスは膵遺伝子発現に対して殆ど陰性であった。インスリン遺伝子発現は異所性ＰＤＸ−１投与マウスのほぼ１００％で誘導されたが、対照投与マウスの２０％においても蛋白に翻訳されない極めて低い濃度で発現された。
【０１７２】
発生中の膵においてＰＤＸ−１は膵の関与と一時的に相関する早期分子マーカーとして作用する。このデータはＰＤＸ−１は肝のような成熟した完全に分化した組織において、膵臓器形成におけるその役割を反復していることを示している。
【０１７３】
（実施例１８：肝から膵への発生のシフトの長時間持続過程に対するＰＤＸ−１による惹起）
マウスインビボ肝への初回単回アデノウィルス媒介ＰＤＸ−１投与後６ヶ月のインスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンの遺伝子の発現および蛋白の生産を調べた。
【０１７４】
８〜９週齢のマウスにＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１、即ちＣＭＶプロモーターの制御下にラットＰＤＸ−１遺伝子（ＳＴＦ−１）を担持する組み換えアデノウィルスを全身投与した。肝における膵遺伝子発現を齢マッチ対照マウス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ投与または未投与）との比較において分析した。
【０１７５】
肝への遺伝子のアデノウィルス媒介送達により達成される予測された一過性のＰＤＸ−１発現にもかかわらず（組み換えＰＤＸ−１の発現はウィルス注射後３０日〜５６日の間に減衰する）、インスリンとソマトスタチンの発現はｍＲＮＡ（図９）および蛋白のレベル（図１１）の両方で６ヶ月間持続した。グルカゴンの遺伝子発現は最初の４ヶ月の間に顕著となった（図９および１０）。重要なことであるが、インスリンＩおよびインスリンＩＩの遺伝子の発現は初回ＰＤＸ−１投与後６〜８ヶ月の時点でもＰＤＸ−１投与マウスの８０〜１００％において明らかであった。
【０１７６】
インスリンおよびグルカゴンの遺伝子発現の間の一時的相違は成熟肝における膵臓器形成を特徴付ける独特の現象を反映しており、βおよびδ細胞の表現型に向けてより安定な相互変換があることを示唆している。グルカゴン遺伝子は直接のＰＤＸ−１標的遺伝子ではなく、肝におけるその持続的発現はＰＤＸ−１がこの臓器において分化因子として機能していることを示唆している。
【０１７７】
（実施例１９：インスリン、グルカゴンおよびソマトスタチンの定量分析
ＰＤＸ−１投与肝のホルモン生産）
免疫組織化学的分析（図１０）により、ＰＤＸ−１異所性遺伝子送達後４〜６ヶ月においても主に中心静脈近接部においてインスリン生産細胞の位置が特定される（図１０Ａおよび１０Ｃ）。グルカゴン陽性細胞もまた中心静脈近接部に局在するが（図１０Ｂ）、逐次的スライド上で行ったこれら２種のホルモンの免疫組織化学的分析によれば、これらのホルモンは同じ細胞内には同時に局在しないことが示唆される。肝内の中心静脈に近接する領域に存在する肝細胞は成熟細胞に相当することがわかっている。
【０１７８】
ＰＤＸ−１投与マウスの肝内に保存された肝インスリンの定量的分析によれば、投与後４〜６ヶ月においても、肝インスリン含量は約３０〜７５ｎｇ／ｇ組織であり、これに対し、齢マッチの対照肝では１〜９ｎｇ／ｇ組織であった（図１１Ａ）。初回Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後少なくとも４ヶ月まで肝プロ／グルカゴンおよびソマトスタチン含量の有意な２倍増量が観察された（図１１ＢおよびＣ）。ＰＤＸ−１投与後の他の２種の膵ホルモンと比較した場合のインスリンの肝含量の大きな相違は膵におけるこれらのホルモンの比に似ていると考えられる。肝インスリン生産にもかかわらず、正常な膵機能を有するＰＤＸ−１投与マウスにおける血清中インスリンおよびグルコースの濃度は実験期間中を通して正常であった（ＰＤＸ−１投与と対照の比較において、それぞれ、インスリン：１．０±０．５対０．９±０．４ｎｇ／ｍｌ、および、グルカゴン：０．１６±０．０８対０．１２±０．０５ｎｇ／ｍｌ）。
【０１７９】
肝内の膵ホルモンの持続的生産は異所性ＰＤＸ−１がＰＤＸ−１トランスジーンの持続的存在を必要としない事象のカスケードを惹起することを示唆している。
【０１８０】
（実施例２０：肝における内因性の他の面ではサイレントなＰＤＸ−１遺伝子の発現の異所性ＰＤＸ−１による惹起）
一過性の異所性ＰＤＸ−１発現により惹起される肝における持続性発生シフトを評価するために、トランスジーンが他の面ではサイレントな膵転写因子の発現を誘導するかどうか分析した。
【０１８１】
異所性遺伝子による肝内における、内因性で他の面ではサイレントなＰＤＸ−１遺伝子の誘導を分析するために、ラットＰＤＸ−１相同体の発現を指向する組み換えアデノウィルスを全身送達によりマウスに投与し、そして、ＲＴ−ＰＣＲにより異所性ＰＤＸ−１トランスジーン（ラット）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）と内因性マウスｍＲＮＡとを判別するために特定のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。
【０１８２】
Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスの肝から単離したＤＮＡ試料のＰＣＲ分析によれば、アデノウィルス注射後３０〜５６日にウィルスコードトランスジーンは消失することが確認される（図１２Ａ）。
【０１８３】
図１２Ｂは異所性ラットＰＤＸ−１発現は肝における送達されたウィルスＤＮＡの観察された存在と並行し、そして１ヵ月後において消滅することも示している（図１２Ａ）。実験の全期間にわたり投与肝において発現された唯一のＰＤＸ−１の相同体は内因性でその他の面ではサイレントなマウス相同体である（図１２Ｂ）。内因性ＰＤＸ−１の発現はラットＰＤＸ−１トランスジーンを投与されたマウスに限定されており、異所性ＰＤＸ−１投与マウスの７５％（２８匹中２１匹）および分析した対照投与肝２５例中０例で明らかとなった。リアルタイムＰＣＲを使用して、肝におけるマウス対ラットのＰＤＸ−１遺伝子発現の識別および定量された相対量を、同一条件（ただし異なるプライマー）を用いて初回投与後の時間の関数として分析し、同じ試料内のβアクチンに対して規格化した。
【０１８４】
図１２Ｃに示す通り、異所性ラットＰＤＸ−１をコードするｍＲＮＡは５日において最高値を示し、３０日には８５％低下し、その後は消失した。これとは対照的に、内因性マウスＰＤＸ−１は実験の全期間を通じてかなりの濃度で発現された。これらのデータを総括すると、内因性であるが他の面ではサイレントであるＰＤＸ−１の肝内における自己誘導が示唆されており、これは肝から膵への相互変換過程の長時間持続する様式を機序的に説明していることを示唆している。
【０１８５】
（実施例２１：機能性でありＳＴＺ誘導高血糖症を防止するＰＤＸ−１トランスジーン発現に応答した肝内で生産されるインスリン）
生物学的に活性なインスリンの長時間持続する生産をＰＤＸ−１遺伝子送達により誘導できるかどうかを調べるために、それがＳＴＺ誘導糖尿病に対抗して保護作用をもたらすかどうかを分析した。初回のＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後８ヶ月に、マウスに２２０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを投与し、高血糖症の発生率を齢マッチ対照群と比較した。対照Ｂａｌｂ／ｃマウスの６０％（１０匹中６匹）がＳＴＺ注射後３〜５日以内に高血糖症を発症した。これとは対照的に、５匹のＰＤＸ−１投与マウスでは、それらがＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後８ヶ月に分析したという事実にもかかわらず、うち僅か１匹のみがＳＴＺ投与に応答して高血糖症を発症していた（２０％）。
【０１８６】
免疫組織化学的試験およびＲＩＡによるインスリン含量の定量によれば、ＳＴＺ投与に応答して膵β細胞は殆どが破壊され、そして対照糖尿病マウスと、重要なことであるが、ＰＤＸ−１投与マウス（正常血糖のまま推移）の両方において、膵インスリン含量が９５±１％低下したことが判った。これとは対照的に、ＰＤＸ−１投与マウスにおける肝免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）含量はＰＤＸ−１を投与しなかった対照糖尿病マウスと比較して４０倍高値であった（図１３）。健常マウスにおいては、肝インスリンは膵内の生産量の僅か１％であったが、ＳＴＺ投与に応答して肝インスリン生産は同じマウスのＳＴＺ投与膵において生産された免疫反応性インスリンの量の２５．６％となっている。
【０１８７】
これらの結果から、ＰＤＸ−１誘導の発生シフトは長時間持続し、かつ機能的であり、肝により寄与された比較的中等度のＩＲＩ濃度は肝内で生産されたインスリンは、肝グルコース生産とグルコース廃棄の間のバランスの効率的調節によってもＳＴＺ誘導高血糖症に対抗する保護作用を示すことが示唆される。重要な点は、これはまた肝内で発生シフトした細胞がβ細胞特異的毒素に抵抗性であることも示唆していることである。
【０１８８】
重要なことであるが、初回ウィルス感染の６〜８ヵ月後であっても肝内で局所的インスリン生産が継続しているにもかかわらず、肝機能は損なわれていなかった（表４ａ）。アデノウィルス投与に応答して肝機能の一過性の変化が起こったが、肝機能は１〜２ヶ月以内に正常値を回復した。更にまた、血清中アミラーゼ濃度は内因性ＰＤＸ−１および膵ホルモン発現にも関わらず全時点において増大しなかった（表４ｂ）。ＰＤＸ−１投与マウスの体重増加率は齢マッチ対照マウスと同様であった。
【０１８９】
【表４−１】
2011068660.tif 000006
ＰＤＸ投与後のマウスの血液生化学的測定（平均±ＳＥＭ）。ＡＬＢ：アルブミン；ＳＴ：アスパルテートアミノトランスフェラーゼ；ＡＬＴ：アラニンアミノトランスフェラーゼ；Ｔ．ｂｉｌ：総ビリルビン。データは平均±ＳＥＭ；＊プールした試料、分析したマウスの数はカッコ内に示す。
【０１９０】
【表４−２】
2011068660.tif 000007
（実施例２２：ヒトケラチノサイトの一次培養物中における転移分化のＰＤＸ−１および成長因子による誘導）
（細胞培養）
ケラチノサイトの培養は剥離厚みの皮膚の小型生検標本（２〜４ｃｍ２）から開始した。トリプシン−ＥＤＴＡ中一夜（ＯＮ）インキュベートした後、表皮を分離し、上皮をトリプシン−ＥＤＴＡ中で破砕して単細胞の懸濁液を形成した。細胞懸濁液をケラチノサイト培地（Ｎａｔｕｒｅ  ２６５：４２１−４，１９７７）中で培養し、細胞懸濁液をファルコン培養プレートに結合させ、２〜５継代で使用した。細胞が７０％コンフルエントに達した時点で４８〜９６時間、以下に記載する所定の投与法により投与した。
【０１９１】
（遺伝子発現）
遺伝子発現分析はＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ）を用いて実施した。
【０１９２】
（細胞の投与）
Ｋ１：ＥＧＦ＋ＫＧＦ＋ＮＩＣ＋ＰＤＸ−１（１００ｍｏｉ）
Ｋ２：ＥＧＦ＋ＫＧＦ＋ＮＩＣ＋ＰＤＸ−１（１０ｍｏｉ）
Ｋ３：ＥＧＦ＋ＫＧＦ
Ｋ４：ＥＧＦ＋ＫＧＦ＋ＲＧＣＩ
全投与においてＥＧＦ、ＫＧＦは２０ｎｇ／ｍｌ；ＮＩＣ：１０ｎｇ／ｍｌ。
【０１９３】
（対照群）
対照群細胞は非関連性のＡｄ−ＣＭＶ−Ｈインスリン、即ちＣＭＶプロモーターの制御下にヒトインスリン遺伝子の発現を行っている組み換えアデノウィルスを投与した。ＲＧＣＩは２官能性の組み換えアデノウィルスコンストラクトＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１−ＲＩＰ−ＧＦＰであり、これはインスリン遺伝子発現に向けてＰＤＸ−１媒介転移分化を起こしている細胞を識別した。このウィルスにおけるＰＤＸ−１の発現はＣＭＶプロモーターにより駆動されたのに対し、ＧＦＰ発現はインスリンに関する組織特異的プロモーター（ＲＩＰ）により駆動された。
【０１９４】
（結果）
投与Ｋ１〜Ｋ４において、内因性の他の面ではサイレントな膵遺伝子がケラチノサイトにおいて発現された。興味深いことに、グルカゴンの遺伝子発現は低濃度のＰＤＸ−１（Ｋ４）により、そして、重要なことであるがＥＧＦ＋ＫＧＦ投与単独により、異所性ＰＤＸ−１を必要とすることなく誘導された（図１５）。
【０１９５】
（実施例２３：ヒト肝細胞におけるインスリンプロモーターのＰＤＸ−１による活性化）
ヒト肝細胞を成人および胎児の組織から単離した。細胞は異種の表現型を示し、２０継代までは培養物中効率的に増殖した。何れの事前の選別も行うことなく成人の完全に分化した肝臓から単離したヒト細胞が異所性ＰＤＸ−１発現に応答して膵表現型に向けた発生再指向の過程を起こすかどうか分析した。膵特徴の第１の指標はその他の面では肝中で不活性であるインスリンプロモーターの活性化である。細胞に異種のＣＭＶプロモーターの制御下にＰＤＸ−１を発現する２官能性組み換えアデノウィルスＡｄ−ＲＩＰ−ＧＦＰ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与し、インスリンプロモーターにＧＦＰ発現（図１７ａ）を制御させ、これによりＰＤＸ−１「応答」細胞を緑色蛍光により識別した（図１７ｂ）。成人ヒト肝細胞が組み換えアデノウィルスに感染する総能力はＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ感染により調べ、成人肝細胞の４０±７％が継代１〜６においてＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ感染に応答して緑色蛍光を示した。意外にも、これらの細胞の約半数（２３±３．５％）がＦＡＣＳ分析（データ示さず）でも判明したとおり、膵プロモーターの活性化による異所性ＰＤＸ−１発現に応答している（図１７ｂ）。部分的な応答が成人肝細胞の分化状態により影響され、制限されるかどうかを調べるために、分化程度が低くおそらくは成人ヒト肝細胞よりも多能細胞を多く含んでいる胎児ヒト肝細胞の発生再指向を誘導するＰＤＸ−１の能力を分析した。実際、培養物中の胎児ヒト肝細胞（妊娠２２週で単離）の２７±７．８％が膵プロモーターの活性化による異所性ＰＤＸ−１発現に応答し、Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ形質導入へのその応答は成人肝から単離された細胞と同様であった（図１７ｃ）。応答細胞のこの中等度の増大は細胞の分化状態がＰＤＸ−１により誘導される発生シフト過程において限定された役割しか果たしていないことを示唆していると考えられる。
【０１９６】
３つの重要な観察結果がヒト肝細胞の一次培養から得られる。第１に、成人および胎児の両方の細胞はインビトロで培養した場合、６ヶ月まで効率的に増殖し、そして、ＰＤＸ−１投与に応答してインスリンプロモーターを活性化することができる。しかしながら、その感染および「転移分化」の能力は継代数が増加するに従って低下する（図１７ｃおよびｄ）。第２に、胎児ヒト肝組織は成人肝より単離された細胞よりも多数の多能細胞よりなるが、それらは膵への転移分化過程を起こす同様の能力を有する（図１７ｃ）。第３に、異所性にＰＤＸ−１を発現するヒト肝細胞においてインスリンプロモーターを活性化する能力は、組み換えアデノウィルスにより感染可能な細胞の半数は培養の低継代ではＰＤＸ−１依存性の態様で異所性インスリンプロモーターをやはり活性化させるため、細胞の希少な集団においては生じない（図１７ｄ）。
【０１９７】
（実施例２４：可溶性因子によるＰＤＸ−１誘導の肝から膵への転移分化の促進）
転移分化過程の範囲をより良好に識別することはＰＤＸ−１投与肝細胞における内因性の他面ではサイレントな膵遺伝子の発現の誘導を分析することである。
【０１９８】
３種の主要な膵ホルモン遺伝子発現の発現は、対照の未投与の肝細胞と比較して２桁高値のＰＤＸ−１により誘導した（図１８）。
【０１９９】
ニコチンアミドおよび表皮成長因子（ＥＧＦ）は胚性膵臓器培養を含めて未分化の膵細胞の膵内分泌分化を促進することがわかっている。興味深いことに、ＰＤＸ−１投与にニコチンアミドおよびＥＧＦ（総称してＧＦと称する）を添加した場合、膵ホルモン遺伝子発現は劇的に増大した。成人肝細胞の一次培養におけるインスリン遺伝子発現は対照未投与肝細胞と比較して７桁高値となった。ニコチンアミドおよびＥＧＦは単独でも組み合わせた場合も肝細胞における膵遺伝子発現に対してＰＤＸ−１依存作用を示した。これらのデータはＰＤＸ−１は肝から膵への転移分化の過程に必要であるが、ＧＦは非依存的に誘導するのには十分ではない過程に対して相乗作用を有することを示唆している。重要な点は、胎児および成人のヒト肝細胞は、両方の培養におけるインスリン遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ定量により示されたとおり、異所性ＰＤＸ−１発現およびＧＦ投与に応答して膵遺伝子発現の同様の水準を示していることである（図１８ｂ）。
【０２００】
ＰＤＸ−１投与の前数週間に亘りＧＦの存在下に肝細胞を培養したところ、ＰＤＸ−１およびＧＦを同時に投与した細胞と比較してインスリン遺伝子発現の増大はもたらされなかった。これとは対照的に、予備投与培養からＧＦを除去した場合、インスリン遺伝子発現がＰＤＸ−１単独の場合と同様の濃度でもたらされた。総括すると、ＰＤＸ−１誘導転移分化に対してＧＦが有している促進作用は、この過程の影響を受けやすい希少なサブ集団の増殖を誘発することではなく、むしろ、それらはいまだ未知の態様で寄与することによりＰＤＸ−１誘導過程をもたらす細胞内シグナル伝達を増強していることが示唆されている。Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ，即ちＣＭＶプロモーター制御下にヒトプロインスリンｃＤＮＡの構成的異所性発現を起こす組み換えアデノウィルスの同様の感染多重度はＰＤＸ−１およびＧＦ投与細胞の場合に匹敵する濃度のインスリン遺伝子発現をもたらした（ＰＤＸ−１投与の場合のようにグルカゴンとソマトスタチンの遺伝子発現の誘導を伴わない）。Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓを投与した場合にインスリンを発現する細胞の数がＰＤＸ−１誘導内因性インスリン遺伝子を発現する細胞の数の二倍であること（細胞の僅か２３％のみが転移分化過程を起こし、細胞の４０％が異所性ヒトインスリン遺伝子を発現するため、図１７ｃおよび１８ｃ参照）を考慮すると、ＰＤＸ−１投与肝細胞における（内因性）インスリンプロモーターは非相同のＣＭＶプロモーターと同様の活性および力価を有することが示唆される。
【０２０１】
（実施例２５：ＰＤＸ−１による成人ヒト肝細胞への内分泌特性の付与）
既に転移分化した成人ヒト肝細胞が内分泌細胞の特徴を獲得するかどうか分析するために、これらの細胞のＰＤＸ−１誘導インスリンを貯蔵してプロセシングする能力を分析した。図１９はインスリンおよびＣ−ペプチドの分泌およびＰＤＸ−１投与細胞におけるインスリン含量を示す。ＰＤＸ−１投与単独では免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）含量は３４．５±４．５倍増大、ＩＲＩ分泌は３８．７±８．７倍増大、そして、Ｃ−ペプチド分泌は７．５±２．１倍増大となった。ＧＦを培地に添加したところ過程に対するＰＤＸ−１の作用が大きく増強され、未投与肝細胞と比較して、ＩＲＩ含量は９１．３±２０．３倍増大し、その分泌は７４．５±３３．３倍増大し、そしてＣ−ペプチドの分泌は３３．９±１４．６倍増大した。過程に対するＰＤＸ−１の作用をヒトプロインスリンの異所性発現の作用と比較した（Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ組み換えアデノウィルスを使用）。Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓを投与した細胞においては生産されたＩＲＩの大部分が放出されたが、ＰＤＸ−１投与細胞中のＩＲＩの大半は細胞内に貯留された。Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ投与によるＣ−ペプチドの中等度の分泌は肝細胞中のフリンのような既存のエンドペプチダーゼに起因するものと考えられる。重要なことであるが、プロホルモン変換酵素２の誘導はＰＤＸ−１投与の場合のみ顕著であり、Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ投与肝細胞では観察されなかった（図２１ａ）。
【０２０２】
インスリンに対する抗体を用いたイムノゴールド組織化学の電子顕微鏡分析によれば、インスリンは分泌顆粒に保存された（図２０ａ）。これらの顆粒はインビボの未損傷の膵島の場合に用に特徴的な緻密コア部を含まないが、より低濃度のインスリン保存を有するβ細胞系統に存在するものと類似していた。内分泌表現型は神経内分泌ベシクル特異的遺伝子発現の特異的誘導に関連していた。ＳＣＧ−２（セクレトグラニン−２）およびＳＧＮＥ１（分泌顆粒ニューロエンドクリン−１、図２１ｂ）の特異的発現はＰＤＸ−１投与細胞のみで観察され、Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ投与では観察されなかった。
【０２０３】
これらのデータを総括すれば、ＰＤＸ−１および適当な因子を投与された成人ヒト肝細胞は、膵内分泌細胞に特徴的な多くの特性を模倣した膵ホルモン生産細胞への広範で効率的な転移分化を起こすことが示唆される。
【０２０４】
（実施例２６：転移分化した成人ヒト肝細胞のグルコース感知能力）
グルコース感知能力およびグルコース感知とインスリン分泌との間の関連は膵β細胞機能を保証するものである。
【０２０５】
ＰＤＸ−１誘導転移分化した肝細胞はＧＬＵＴ−２およびグルコキナーゼ（ＧＫ、図２１ａ）遺伝子を発現し、グルコース調節の態様でインスリンを分泌することが示された。２５ｍＭグルコースへのＰＤＸ−１投与成人ヒト肝細胞の曝露はインスリン分泌の即座で強度の増大をもたらす（図２１ｂ）。グルコース刺激インスリン（図２１ｂ）およびＣ−ペプチド（図２１ｃ）の分泌の経時的分析によれば、膵β細胞の場合と同様の２相性の動的な特徴が明らかになり、これには即座でシャープな第１のピークとそれに続く延長した第２のピークの分泌が伴っていた。グルコース惹起が排除されると、インスリン分泌は即座に低下した（図２１ｄ）。初回グルコース惹起後６０〜９０分の細胞外インスリン濃度の低下（図２１ｂ）はＣ−ペプチドの場合（図２１ｃ）よりも強度であり、異種培養物中の肝細胞による分泌インスリンの広範な取り込みを表していると考えられる。グルコース用量応答によれば、正常な膵島における８〜１６ｍＭでの最大インスリン分泌と比較して最大Ｃ−ペプチド分泌が２５ｍＭグルコースで生じ（図２１ｄ）たことから、正常膵β細胞と比較して右側へのシフトが明らかになった。重要な点は、グルコース感知能力とインスリン分泌の間の関連が正常膵β細胞と同様の様式で転移分化肝細胞中で起こったことであり、グルコースはインスリン分泌に対するその作用を発揮するためには代謝されなければならない。非代謝性のグルコース類縁体である２−デオキシ−グルコース（２ＤＯＧ）は転移分化肝細胞においてＣ−ペプチドの分泌を惹起しなかった（図２１ｄ）。予測された通り、構成性プロモーター（Ａｄ−ＣＭＶ−ｈＩｎｓ）により駆動されるヒトインスリンの異所性発現はプロホルモンのグルコース調節分泌をもたらさなかった。これらのデータはグルコース感知能力およびインスリン分泌との関連性が転移分化過程の結果であることを示している。
【０２０６】
（実施例２７：糖尿病マウスにおける高血糖症の転移分化成人ヒト肝細胞による軽減）
β細胞機能を代替する転移分化成人ヒト肝細胞の能力を調べるために、ＳＴＺ投与により糖尿病とされた免疫不全ＳＣＩＤ−ＮＯＤマウスに細胞を移植した。図２２は対照投与マウスは高血糖症のままであったのに対し、ＰＤＸ−１投与成人ヒト肝細胞を移植されたマウスは血糖値の徐々であるが有意な低下を示したことを示している。免疫組織化学的分析によれば、これらのマウスの膵臓はインスリン枯渇であったが、腎被膜下に移植したヒト肝細胞はＰＤＸ−１およびインスリンについて陽性に染色された（図１８ｂ）。ヒトＣ−ペプチドはＰＤＸ−１投与ヒト肝細胞を移植されたＳＴＺ投与マウスの血清中で検出された。ヒトＣ−ペプチド濃度は正常ＳＣＩＤ−ＮＯＤおよびＳＴＺ投与対照マウスにおける０．０４±０．０２ｎｇ／ｍｌ（ｐ＜０．０１）と比較して有意な６〜７倍上昇を示し、平均は０．２６±０．０３ｎｇ／ｍｌであった（図２２ｃ）。ヒト細胞移植マウスにおける血清中マウスインスリン濃度は未変化のままであり、対照の正常血糖ＳＣＩＤ−ＮＯＣマウス（０．４５±０．０３ｎｇ／ｍｌ）よりも有意に低値（０．１６±０．０３ｎｇ／ｍｌ）であった。これらを総括すると、これらの所見は移植マウスにおける高血糖症は転移分化ヒト肝細胞から分泌されたヒトインスリンにより正常化されたことを示している。これらの結果はＰＤＸ−１投与転移分化成人ヒト肝細胞がインビボのβ細胞を代替物として機能する能力を明らかにしている。
【０２０７】
（実施例２８：ＰＤＸ−１誘導の肝から膵への転移分化によるＣＡＤ−ＮＯＤマウスにおける高血糖症の退行）
明らかな自己免疫糖尿病に対するＰＤＸ−１誘導の肝から膵への転移分化の作用を調べるために、糖尿病ＮＯＤマウスにＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１またはＡｄ−Ｒｉｐ−βＧａｌを前述のとおり投与した。１群のマウスは対照として未投与のままとした。グルコース代謝の調節を調べるために血中グルコース濃度および体重をモニタリングした。未投与マウスおよびＡｄ−Ｒｉｐ−βＧａｌ投与マウスは高血糖症のまま存続し、体重を減少させ、投与後最初の２週間以内に死亡した（図２４）。これとは対照的に、Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与したマウスの６５％（３４匹中２０匹）が投与後最初の５日間以内に正常血糖となった。しかしながら、この正常血糖は一部のマウスでは一過性であった。ＰＤＸ１を投与したマウスの３８％（１３／３４）は投与の１ヶ月後に正常血糖のままであり、Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１を投与した他の２０％（７／３４）は投与の１０〜１４日後に高血糖症（図２４ａ）となったが、実験の全期間を通じて安定した体重を維持した（図２４ｂ）。
【０２０８】
これらのデータはＰＤＸ−１により誘導された肝から膵への転移分化の過程は自己免疫糖尿病（例えば１型）を退行させることを示唆している。
【０２０９】
（実施例２９：Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与糖尿病マウスにおけるインスリンの合成および調節）
膵および肝のインスリン発現の免疫組織化学的分析によれば、Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスの肝におけるインスリン生産細胞の存在が明らかになったが、その膵には存在しなかった（図２５）。肝インスリン生産細胞は前述の通り中心静脈に近接して位置していた。更にまた、肝インスリン含量および血清中インスリン濃度は対照群と比較してＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスでは有意に高値であった（図２６）。即ちＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１は肝におけるインスリンの発現およびその血中への分泌を誘導した。
【０２１０】
血中グルコースによる肝インスリン放出の調節を分析するために、Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後正常血糖となってから２〜３週間後の糖尿病マウス５匹におけるグルコース耐容性試験を実施した。対照として、Ａｄ−ＣＭＶ−βＧａｌ投与糖尿病マウスおよび健常ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。健常ＢＡＬＢ／ｃおよびＡｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与マウスとの間にはグルコースクリアランス速度に差は観察されず、肝転移分化細胞によるインスリン分泌は実際にグルコースにより調節されることを示している（図２７）。これとは対照的に、糖尿病Ａｄ−ＣＭＶ−βＧａｌ投与マウスはグルコースクリアランスを示さず、試験中を通じて高血糖症のまま存続した。これらのデータを総括すると、ＰＤＸ−１誘導の機能的な肝から膵への転移分化は自己免疫のマウスモデルにおいても起こっている。ＰＤＸ−１誘導正常血糖は肝におけるインスリン生産の誘導およびグルコース調節態様におけるその放出と関連していた。
【０２１１】
（実施例３０：骨髄細胞の発生シフトのＰＤＸ−１による誘導）
骨髄細胞から機能的膵細胞への発生シフトを誘導する異所性ＰＤＸ−１の能力を以下の通り測定する。純度９０％超の新鮮凍結ヒトＢＭから単離したＡＣ１３３＋細胞を（ａ）２４穴の組織培養プラスチックプレートまたは（ｂ）テフロン（登録商標）バッグのいずれかにおいて、ＩＬ−６、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３リガンドおよびＳＣＦの継続的存在下、ＴＥＰＡの存在下または非存在下に３週間増殖させた。前駆細胞の組成および能力は投与終了時および長期インキュベーション培養後に検査する。
【０２１２】
感染および実験の条件を最適化するために、２官能性のアデノウィルス（ＡｄＲＩＰ−ＧＦＰ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１）を用いて培養物を感染させる。２〜１０３ＭＯＩ（培養物中の細胞数でウィルス粒子数を割ったもの、ＭＯＩ、感染多重度）での感染後の時間の関数としてのＧＦＰ−レポーター遺伝子の発現は以下の通りである。
【０２１３】
応答細胞（インスリンプロモーターを活性化し、これによりＧＦＰを発現する）を分類し、非応答細胞から分離して培養し、その後の分析に付する。対照ＢＭ細胞（ＴＥＰＡ投与または未投与）の分離された培養物は転移分化を伴わないインスリン生産に関する対照としてＡｄＣＭＶ−インスリンを投与する。
【０２１４】
遺伝子発現の後にＲＴ−ＰＣＲを行う。遺伝子発現の濃度および発生シフト後の誘導後の時間を定量的試験においてリアルタイムＰＣＲ（ＡＢＩ、ＵＳＡ）を用いてリアルタイムＰＣＲにより分析する。膵ホルモン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよびプロホルモン変換酵素および特定の膵転写因子、即ちＢＥＴＡ２、Ｉｓｌ−１、Ｎｋｘ６．１、Ｐａｘ４およびＰａｘ６および内因性ＰＤＸ−１の発現を分析する。
【０２１５】
ホルモン生産は特異的抗体、即ちモルモット抗ブタインスリン；ウサギ抗ヒトグルカゴン；ウサギ抗ヒトソマトスタチン（全てＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて免疫組織化学的に検出する。インスリンおよびグルカゴンの生産および分泌は市販のＲＩＡ特異的キットであるＳｅｎｓｉｔｉｖｅヒトインスリンおよびＣ−ペプチドＲＩＡキットおよびグルカゴンＲＩＡキット（Ｌｉｎｃｏ  ｒｅｓｒａｒｃｈ  ＩＣＮ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）により分析する。グルコースの用量応答およびプロ／インスリン合成の過程および成熟した生物学的に活性なインスリンへの変換は記載したとおり（２）逆相ＨＰＬＣにより、そして、特異的ヒトｃ−ペプチドＲＩＡキット（Ｌｉｎｃｏ）を用いた培地へのＣ−ペプチドの分泌を分析することにより分解する。異なるグルコース濃度における細胞内インスリン含量を分析する。
【０２１６】
ＰＤＸ−１誘導ＢＭ細胞中のグルコースへのインスリン分泌応答の動的特徴をインビトロで分析し、異所性インスリン発現（ＡｄＣＭＶ−ｈＩｎｓ）の場合と比較する。細胞を６穴皿上種々の濃度のグルコース中でインキュベートし、培地へのＩＲＩ分泌の用量応答および経時変化をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定する。フォルスコリン／ＩＢＭＸによる増大したインスリン分泌はモジュレートされた肝細胞における蛋白の分泌に関わる調節の誘導を示している。２−ＤＯＣやＬ−グルコースに対してではなくグルコースへの感受性は、「モジュレート」された肝細胞における栄養代謝へのインスリン分泌経路の特異的な関連を示す。
【０２１７】
増殖および転移分化した骨髄細胞が糖尿病ＳＣＩＤマウスにおいて血中グルコース濃度を制御し、糖尿病を退行させる能力を分析することにより、それらが膵β細胞機能を模倣する能力を十分に調べることができる。
【０２１８】
（実施例３１：ＰＤＸ−１投与ヒト肝細胞のＤＮＡマイクロアレイチップ分析）
図に示すとおり、ＰＤＸ−１投与ヒト肝細胞のＤＮＡマイクロアレイ分析によれば、対照細胞と比較して５００超の遺伝子がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたことが判った。ＰＤＸ−１投与に応答してモジュレートされた遺伝子は膵転写因子（表５参照）およびカタラーゼおよび肝ジスムターゼポリペプチド（表６参照）を包含する。
【０２１９】
【表５】
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ＰＤＸ−１投与によりアップレギュレートされた膵遺伝子は表７に示す。
【０２２０】
【表７−１】
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【０２２１】
【表７−２】
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肝培養物におけるＰＤＸ−１投与は種々の膵遺伝子の発現をダウンレギュレートした。ＰＤＸ−１投与によりダウンレギュレートされたこれらの膵遺伝子を表８に示す。
【０２２２】
【表８】
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以下の略記法を表８の第２コラムにおいて使用する。ＡＤＨ１Ｂ＝アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｂ（クラス１）；ＧＰＲ６５＝Ｇ蛋白−結合受容体６５；ＤＤＯ＝Ｄ−アスパルテートオキシダーゼ；ＲＤＨ５＝レチノールデヒドロゲナーゼ５（１１−シスおよび９−シス）；ＲＡＲＲＥＳ３＝レチン酸受容体レスポンダー（タザロテン誘導）３；ＶＣＡＭ＝血管細胞接着分子１；ＨＭＬ２＝マクロファージレクチン２（カルシウム依存性）；ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ＝蛋白ホスファターゼ１、調節（抑制）サブユニット３Ｃ；ＳＵＬＴ１Ａ１＝スルホトランスフェラーゼファミリー、シトゾル性、１Ａ，フェノール嗜好性、メンバー１；ＭＡＦ＝ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子相同体（トリ）；ＢＬＶＲＢ＝ビリベルジン還元酵素Ｂ（フラビン還元酵素（ＮＡＤＰＨ））；ＡＰＯＬ１＝アポリポ蛋白Ｌ，１；Ｐ８＝ｐ８蛋白（転移１の候補）；ＰＹＧＬ＝ホスホリラーゼ、グリコーゲン；肝；ＦＣＧＲＴ＝ＩｇＧのＦｃフラグメント、受容体、トランスポーター、アルファ；ＳＵＬＴ１Ａ３＝スルホトランスフェラーゼファミリー、シトゾル性、１Ａ、フェノール嗜好性、メンバー３；ＡＫＲＩＣ３＝アルド−ケト還元酵素ファミリー１、メンバーＣ３（３−アルファヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ＩＩ型）；「ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆ−」＝スルホトランスフェラーゼファミリー、シトゾル性、１Ａ、フェノール嗜好性、メンバー２；スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａ，フェノール嗜好性、メンバー２［ホモサピエンス］；ＲＲＡＳ２＝関連ＲＡＳウィルス（ｒ−ｒａｓ）癌遺伝子相同体２；ＳＥＲＰＩＮＦ１＝セリン（またはシステイン）プロテイナーゼ阻害剤、クレードＦ（アルファ−２抗プラスミン、色素上皮誘導因子）；ＲＸＲＡ＝レチノイドＸ受容体、α；Ｃ１Ｒ＝補体成分１、ｒサブ成分；ＣＡＲＨＳＰ１＝カルシウム調節熱安定性蛋白１、２４ｋＤａ；ＦＳＴ＝フォリスタチン。
【０２２３】
（等価物）
本発明の特定の実施形態の上記した詳細な説明から、膵ホルモン生産を誘導する独特の方法が記載されていることは明らかである。本明細書においては特定の実施形態を詳述したが、これは説明を目的とするのみの例示であり、添付する請求項の範囲に関して制限することを意図するものではない。特に本発明者等は種々の置き換え、改変および修飾は請求項記載の本発明の精神および範囲から外れることなく本発明に対して行えることを意図している。
【図１】
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【図４】
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【図８Ａ】
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【図１５】
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【図２０Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｅ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｇ】
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【図３３】
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【図３５】
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【配列表】
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