(57)【要約】【課題】１次元目に分取ＬＣを用いた２次元型ＬＣにおいて、２次元目のＬＣに注入する試料液の量を過不足なく適切に且つ自動的に設定する。【解決手段】１次元目のＬＣ分析時に、目的成分のピークの開始点で指定のバイアルへの分取を開始するともにその開始時間を記憶し（Ｓ２〜Ｓ４）、そのピークの終了点で分取を終了するとともにその終了時間を記憶し、終了時間と開始時間との差、及び移動相の流量から分取容量を計算する（Ｓ５〜Ｓ８）。そして、バイアル番号、分取開始／終了時間、分取容量等の分取情報をＰＣに通知する（Ｓ９）。１次元目のＬＣ分析が終了すると、ＰＣは収集した各バイアルの分取容量に基づいて、２次元目のＬＣ分析のスケジュールにける試料注入量を設定する。これにより、バイアル毎に分取容量が相違しても、過不足なく試料注入量を決めることができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１次元目の液体クロマトグラフ分析により試料中の成分を分離して該成分を含む試料液を異なる容器に分取し、該容器に分取された試料液を２次元目の液体クロマトグラフに導入して分析を実行する２次元型の液体クロマトグラフ装置であって、
a)１次元目の液体クロマトグラフ分析における分取の際に得られる分取の開始時間及び終了時間の情報に基づいて１乃至複数の容器に分取された試料液の液量を算出する液量算出手段と、
b)前記１乃至複数の容器に分取された試料液の液量を用いて２次元目の液体クロマトグラフ分析における各試料液の注入量を設定する分析条件設定手段と、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
請求項１に記載の液体クロマトグラフ装置であって、
前記分析条件設定手段は、分取容量に１未満の所定の係数を乗じて注入量を求めることを特徴とする液体クロマトグラフ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体クロマトグラフ装置（以下、ＬＣと略す）に関し、特に、１段目（１次元目）のＬＣで分取した成分をさらに２段目（２次元目）のＬＣで分析する２次元型のＬＣに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＣでは、試料中に含まれる各種成分をカラムにより時間方向に分離して検出することができる。しかしながら、測定対象である試料に非常に多くの成分が含まれている場合や似通った性質をもつ複数の成分が含まれている場合には、１種類のカラムを用いては、或いは１種類の分析条件の下では、各成分を十分に分離できないことがある。こうした試料を分析するために、従来、２次元（多次元）型ＬＣと呼ばれるＬＣが用いられている（特許文献１など参照）。２次元型ＬＣでは、１次元目のＬＣで分画された溶出液を、１次元目のＬＣとは異なる分離条件を設定した２次元目のＬＣに導入し、１次元目のＬＣで分離しきれなかった複数の成分を分離して検出することができる。
【０００３】
こうした２次元型ＬＣの中で、１次元目のＬＣに分取ＬＣを用いたものが知られている。以下の説明では、１次元目に分取ＬＣを用いた２次元型ＬＣを単に２次元型ＬＣということとする。この種の２次元型ＬＣでは、まず、１次元目の分取ＬＣにより、目的成分が検出された区間（ピークの開始点から終了点までの期間）の溶出液をバイアルなどの容器に分取する。次いで、目的成分を含む溶出液が収容されたバイアルから該溶出液を採取して２次元目のＬＣに導入しＬＣ分析を実行する。特許文献２には、１次元目のＬＣで分取された溶出液を２次元目のＬＣに導入するためにリキッドハンドラを用いた装置が開示されている。リキッドハンドラは、通常、１次元目のＬＣによる分取位置までプローブが移動して分取された溶出液を吸入した後に、そのプローブが２次元目のＬＣのインジェクションポートまで移動して先に吸入した溶出液を吐出して試料注入を行う構成を有している。
【０００４】
上記２次元型ＬＣで２次元目のＬＣの分析を行うためには、分析条件として試料の注入量を指定する必要がある。上述したように目的成分が検出された区間の溶出液をバイアルに分取するような分取制御を行う場合、バイアルに採取される溶出液の量はピークの大きさなどにより相違するため一定ではない。そのため、予め一定の試料注入量を指定した上で２次元目のＬＣによる分析を行うと、１次元目の分取ＬＣで分取された溶出液の量が注入量に比べてかなり多い場合や逆に足りない場合が起こり得る。前者の場合には、分取された溶出液が余ることになり、効率的に試料を利用することができない。一方、後者の場合には、不足する分量の空気が流路に導入されてしまい、検出データ上でノイズとなるのみならず、流路途中に空気が溜まって抜けなくなることもあり、それ以降の分析に支障をきたす。
【０００５】
こうした問題を避けるには、１次元目の分取ＬＣで分取された溶出液の容量に合わせて２次元目のＬＣの試料注入量を決める必要がある。しかしながら、そのためには、１次元目のＬＣの分取結果（例えば分取の開始時間や終了時間など）を分析者が確認し、実際に分取された溶出液の容量を計算により求めなければならなかった。そのため、分析者にとって非常に面倒であるのみならず、１次元目のＬＣ分析終了から２次元目のＬＣ分析開始までに時間が掛かりスループットが下がるという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−２５４９５５号公報
【特許文献２】特開２００４−３５５２４１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、１次元目の分取ＬＣで分取される溶出液の量に依らず、２次元目のＬＣに適切な量の試料（溶出液）を導入することができる２次元型のＬＣを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために成された本発明は、１次元目の液体クロマトグラフ分析により試料中の成分を分離して該成分を含む試料液を異なる容器に分取し、該容器に分取された試料液を２次元目の液体クロマトグラフに導入して分析を実行する２次元型の液体クロマトグラフ装置であって、
a)１次元目の液体クロマトグラフ分析における分取の際に得られる分取の開始時間及び終了時間の情報に基づいて１乃至複数の容器に分取された試料液の液量を算出する液量算出手段と、
b)前記１乃至複数の容器に分取された試料液の液量を用いて２次元目の液体クロマトグラフ分析における各試料液の注入量を設定する分析条件設定手段と、
を備えることを特徴としている。
【０００９】
通常、１次元目のＬＣ（分取ＬＣ）では、検出器により得られる信号、つまりはクロマトグラム信号に基づいて分取の開始及び終了のタイミングを決定する。例えばクロマトグラム信号を所定の閾値と比較して、或いは、クロマトグラム信号の時間的な変化量（クロマトグラムカーブの傾き）を閾値と比較して、目的とする成分のピークの開始点と終了点とを検知し、ピークの開始点から終了点までの区間に得られる試料液を１つの容器に分取する。液量算出手段は、そうした分取制御の際の開始時間及び終了時間の情報を取得するとともに、１次元目のＬＣの移動相の送液流量に関する情報（これは１次元目のＬＣの分析条件として与えられる）を取得し、これら情報から容器に分取される試料液の容量を計算する。複数の容器に試料液が分取される場合には、容器毎に試料液の容量を求める。
【００１０】
分析条件設定手段は、２次元目のＬＣでの分析条件を設定する際に、液量算出手段で算出された液量の情報を参照して試料液の注入量を設定する。例えば或る容器に分取された試料液を２次元目のＬＣで分析する場合には、分取された試料液の液量と同量を試料液の注入量に設定すればよい。つまり、１次元目のＬＣで分取された試料液の液量が多ければそれだけ２次元目のＬＣへの注入量も多くなり、１次元目のＬＣで分取された試料液の液量が少なければそれだけ２次元目のＬＣへの注入量も少なくなる。
【００１１】
但し、例えば試料液の吸引・吐出などに伴う試料液のロス、試料液の揮発などを考慮すると、容器に収容されている試料液の全量が必ずしも利用できるとは限らない。そこで、本発明の一態様による液体クロマトグラフ装置において、前記分析条件設定手段は、分取容量に１未満の所定の係数を乗じて注入量を求めるようにするとよい。この係数は例えば０．９５〜０．９８程度の範囲で適宜に決めておけばよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る液体クロマトグラフ装置によれば、１次元目の分取ＬＣにおいて容器に分取される試料液の液量が一定でない場合でも、常に適切な、即ち、過不足のない量の試料液を２次元目のＬＣに注入することができる。それによって、試料の有効利用が図れるとともに、試料注入時における流路への不所望の空気の注入を防止することができる。また、分析者自らが面倒な分取容量の計算を行う必要もなく、１次元目のＬＣでの分取が終了するとほぼ同時に分取容量が求まるので、分析者の負担が軽減され、分析のスループットも向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施例による２次元型ＬＣの概略構成図。
【図２】本実施例の２次元型ＬＣにおける１次元目の分取ＬＣ動作のフローチャート。
【図３】本実施例の２次元型ＬＣにおける１次元目の分析結果を利用した２次元目の分析スケジュール自動作成のフローチャート。
【図４】本実施例の２次元型ＬＣにおいて処理されるバイアルの配列を示す模式図。
【図５】本実施例の２次元型ＬＣにおける特徴的な動作を説明するための模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の一実施例である２次元型ＬＣについて、添付図面を参照して説明する。
【００１５】
図１は本実施例の２次元型ＬＣの概略構成図である。この２次元型ＬＣは、流路を切り替えるために図中の実線と点線との二状態に切り替え可能な６方バルブ３を備える。６方バルブ３のａポートには第１移動相容器１から移動相を吸引・送給する第１送液ポンプ２が接続され、ｃポートには第２移動相容器８から移動相を吸引・送給する第２送液ポンプ９が接続されている。６方バルブ３のｂポートとｅポートとの間の流路には、該流路中に試料液を注入するインジェクタ５を含むオートサンプラ４が設けられている。さらに、６方バルブ３のｆポートには第１カラム６を介して第１検出器７が接続され、ｄポートには第２カラム１０を介して第２検出器１１が接続されている。第１検出器７は試料液を消費しない検出器であればその種類は問わないが、紫外可視分光検出器などを用いることが多い。一方、第２検出器１１は試料液を消費する検出器でも構わないことから、紫外可視分光検出器などのほか、質量分析計を用いることもできる。
【００１６】
第１検出器７の出口側にはフラクションコレクタ１２が接続されている。フラクションコレクタ１２は、分取バルブ１２２、分取ノズル１２３等を含む分取部１２１と、分取制御部１２５と、Ａ／Ｄ変換器１２６と、を含む。また、各部の動作を統括的に制御するため及びデータ処理を行うために、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）により具現化される制御・処理部２０を備え、制御・処理部２０にはキーボードなどの操作部２１や表示部２２が接続されている。
【００１７】
なお、フラクションコレクタ１２において、分取制御部１２５は第１検出器７で得られる検出信号（クロマトグラム信号）に基づいて分取部１２１の動作を制御する機能を有しているが、この機能は制御・処理部２０に内蔵させることも可能である。また、本実施例では、後述するように分取容量を算出する機能も分取制御部１２５が有しているが、これについても制御・処理部２０に内蔵させることができることは明らかである。
【００１８】
また、図１では、それぞれバイアルに用意された複数の試料の中から指定されたバイアルを選択し、該バイアル中の試料液を吸引してインジェクタ５に与える機能を持つオートサンプラ４と、予め多数用意されたバイアルの中から選択された１つのバイアルに溶出液（試料液）を注入する機能を持つフラクションコレクタ１２の分取部１２１とを分けて記載しているが、これらの機能は１台のリキッドハンドラで実現することが可能である。
【００１９】
本実施例の２次元型ＬＣの特徴的な分析動作について、図２〜図５を参照して説明する。図２は１次元目の分取ＬＣ動作のフローチャート、図３は１次元目の分析結果を利用した２次元目の分析スケジュール自動作成のフローチャート、図４は例えば上記のリキッドハンドラで取り扱われるバイアルの配列を示す模式図、図５は特徴的な動作を説明するための模式図である。
【００２０】
分析実行前に、分析者は操作部２１により１次元目のＬＣ分析のスケジュールを入力設定する。図５（ａ）は１次元目の分析スケジュールの一例である。この例は、オートサンプラ４のラックに用意されたバイアル番号「１」中の試料液を１０μＬ注入し、「Method1」と名付けられた分析条件ファイルに記載の条件の下でＬＣ分析を実行し、目的成分を分取容器「１０１」〜「１０３」に分取するものである。図４に示すように、分取容器は試料液が用意されたバイアルと同じラックに配列されており、その中の一部が１次元目のＬＣ分析に供される試料、それ以外が１次元目のＬＣ分析で試料液が分取される容器であるとともに２次元目のＬＣ分析に供される試料となっている。
【００２１】
分析条件ファイルには、移動相の送液流量などの分離条件のほかに、ピークの検出条件などの分取条件も含まれる。一般に、ピーク検出方法としては、クロマトグラムの信号レベルが規定の閾値LEVELを超えたときにピークであると判定する方法と、クロマトグラムのカーブの上向きの傾きが所定値を超えた場合にピークが出現したと判断し、該カーブの下向きの傾きが所定値を超えた状態から所定値以下になったときにピークが終了したと判断するという方法とがあり、いずれか１つの方法、又は両方法の併用によりピーク検出が実施される。ここでは、説明を簡単にするために、閾値LEVELに対する信号レベルの単純な大小判定によってピーク検出を行うものとして説明するが、ピーク検出方法はこれに限るものではない。
【００２２】
１次元目のＬＣ分析が開始されると、制御・処理部２０の制御の下に、第１送液ポンプ２は第１移動相容器１から移動相を吸引し、インジェクタ５を介して第１カラム６に略一定流量でその移動相を送給する。オートサンプラ４は分析スケジュールに従った試料液を規定量用意（図５（ａ）の例の場合、バイアル番号「１」のバイアル中の試料液を１０μＬだけ用意）し、所定のタイミングでインジェクタ５が移動相中に試料液を注入する。注入された試料液は移動相の流れに乗って第１カラム６に導入され、第１カラム６を通過する過程で試料液中の各種成分が分離される。但し、目的成分に類似した性質を持つ夾雑成分は目的成分に重なってしまう。第１カラム６から時間的にずれて溶出した成分を含む溶出液（試料液）は第１検出器７に導入され、第１検出器７は導入された成分の濃度に応じた強度の検出信号を出力する。第１検出器７を通過した試料液はそのままフラクションコレクタ１２に導入される。
【００２３】
フラクションコレクタ１２において分取制御部１２５は、導入された試料液が廃液流路に流れるように分取バルブ１２２を切り替えておく（分取ノズル１２３へ向かう側のバルブをオフしておく）。第１検出器７による検出信号（クロマトグラム信号）はＡ／Ｄ変換器１２６でデジタル値に変換されて分取制御部１２５に入力される。分析開始に伴って、分取制御部１２５は所定のサンプリング時間間隔でクロマトグラム信号レベルの読み取りを実行し（ステップＳ１）、その信号レベルを閾値LEVELと比較することによりピーク開始点であるか否かを判定する（ステップＳ２）。なお、保持時間が既知である目的成分のみを分取したい場合には、その保持時間を分取条件に含めておき、その保持時間付近に現れたピークのみを検出するようにすればよい。
【００２４】
ステップＳ２でピークの開始点でないと判定されると、分取制御部１２５はピークの終了点であるか否かを判定する（ステップＳ５）。ピーク終了点の判断もクロマトグラム信号レベルを閾値LEVELと比較することで行われる。ピーク開始点、終了点のいずれでもないと判定されると、定められたサンプリング時間だけ待って（ステップＳ１０）、分析終了か否かを判定し（ステップＳ１１）、分析終了でなければステップＳ１へと戻る。
【００２５】
目的成分を含む試料液が第１検出器７に到達し始めると、クロマトグラム信号レベルが上昇し、ステップＳ２でピークの開始点であると判定される。すると、分取制御部１２５は分取バルブ１２２を切り替え（分取ノズル１２３側のバルブをオンし）、指定されたバイアルに試料液を注入する（ステップＳ３）。即ち、１つ目の目的成分のピークに対しては「１０１」の番号が付された分取容器に試料液が注入される。また分取制御部１２５は分取の開始時間を内部メモリに記憶し（ステップＳ４）、上述したステップＳ１０へと進む。
【００２６】
上記のようにピーク開始点であると判断された後にサンプリング時間だけ待機するとステップＳ１に戻り、ピーク終了点に至るまではステップＳ１→Ｓ２→Ｓ５→Ｓ１０→Ｓ１１を繰り返す。第１検出器７に導入される試料液中に上記目的成分がなくなると、ステップＳ５でピーク終了点であると判断され、分取制御部１２５は試料液が廃液流路側に流れるように分取バルブ１２２を切り替える（ステップＳ６）。これにより、１番目のバイアルへの試料液の分取が終了し、分取制御部１２５は分取の終了時間を内部メモリに記憶する（ステップＳ７）。その後、分取制御部１２５は記憶した分取終了時間から分取開始時間を差し引くことで分取に要した時間Ｔ[min]を計算し、この時間Ｔに第１送液ポンプ２による移動相の送出流量Ｐ[mL/min]を乗じることにより、直前に分取された試料液の量、つまり分取容器（バイアル）「１０１」に対する分取容量を計算する（ステップＳ８）。そして、バイアル番号、分取の開始／終了時間、分取容量を含む分取情報を制御・処理部２０へ通知した上で（ステップＳ９）、ステップＳ１０へ進む。
【００２７】
クロマトグラムに目的成分のピークが出現する毎に、ピーク開始点ではステップＳ３、Ｓ４、ピーク終了点ではステップＳ６〜Ｓ９の処理が実行され、「１０１」〜「１０３」の番号のバイアルに、各ピークに対応した試料液が分取される。即ち、図４に示すように、「１」の番号を有するバイアル中の試料液由来の成分を含む試料液が「１０１」〜「１０３」の番号を有する３本のバイアルに分取される。また、ピーク毎に分取情報が制御・処理部２０へ通知される。制御・処理部２０は通知された分取情報をＨＤＤ等の記憶装置に蓄える。
【００２８】
１次元目のＬＣ分析が終了した段階で（又はそれ以降の任意の時点で）分析者が操作部２１で分取レポートの作成を指示すると、制御・処理部２０は、記憶装置に蓄えた分取情報に基づいて、図５（ｂ）に示すような形式の分取レポートを作成して表示部２２の画面上に表示する。即ち、この分取レポートには、各分取容器にそれぞれ分取された実際の試料液の液量（分取容量）が示される。これによって、分析者は自らが計算することなく、分取容量を正確に知ることができる。
【００２９】
続いて制御・処理部２０では、図３に示すフローチャートに従って２次元目の分析スケジュールを自動的に作成する。即ち、まずカウンタ値ｉを１に設定し（ステップＳ２１）、次に１次元目の分析結果を全て参照したか否かを判定する（ステップＳ２２）。未だ参照していない分析結果がある場合にはステップＳ２３へ進み、１次元目のＬＣ分析結果におけるｉ番目のバイアル番号及びそれに対応した分取容量を、２次元目の分析スケジュールのバイアル番号及び試料注入量に設定する。そして、カウンタ値ｉをインクリメントし（ステップＳ２４）、ステップＳ２２へ戻る。ステップＳ２２でＹｅｓと判定されるまで、上記処理を繰り返すことにより、図５（ｂ）に示した分取レポート中の数値（分取容器の番号及び分取容量）が、図５（ｃ）に示すような２次元目の分析スケジュール中の各欄（バイアル番号及び注入量）に設定される。
【００３０】
分析者が１次元目のＬＣ分析における分取の開始時間、終了時間などから分取容器に採取された試料液の量を計算し、その計算結果に基づいて２次元目のＬＣ分析の試料注入量を決めなくても、１次元目のＬＣ分析で分取された試料液の量に応じた適切な、つまりは過不足のない注入量が２次元目のＬＣ分析に自動的に設定される。それによって、分取した試料液を余らせることなく、また逆に注入すべき試料液が足らずに空気が移動相中に注入されてしまうことも防止することができる。また、こうした設定が自動で行われることで、分析者の負担が軽減され、分析者の計算ミスや設定ミスに起因する注入量の過不足の問題もなくなる。
【００３１】
なお、図５（ｃ）に示した例では、分取容器、つまりはバイアルに分取した試料液の全量を２次元目のＬＣに注入する設定としているが、例えば、試料液がバイアル内面などに付着することや揮発することなどによる液量の減少を考慮すると、試料注入量は分取容量よりも若干少なめにしておくほうが安全である（空気混入を回避できる）。そこで、予め安全係数Ｋを例えば０．９８、０．９５などと定めておき、分取容量にこの安全係数Ｋを乗じた値を２次元目のＬＣ分析の際の注入量に設定するようにすると好ましい。例えばＫ＝０．９８である場合に、図５（ｃ）に示した各注入量は、上から１．４７、１．６１、１．７４[mL]となる。
【００３２】
上述のように２次元目の分析スケジュールが設定された後に２次元目のＬＣ分析が開始されると、制御・処理部２０の制御の下に、６方バルブ３が図１中の点線で示す接続状態に切り替えられ、第２送液ポンプ９は第２移動相容器８から移動相を吸引し、インジェクタ５を介して第２カラム１０に略一定流量でその移動相を送給する。オートサンプラ４は分析スケジュールに従った試料液を規定量用意（図５（ｃ）の例の場合、まずバイアル番号「１０１」のバイアル中の試料液を１５μＬ用意）し、所定のタイミングでインジェクタ５が移動相中に試料液を注入する。注入された試料液は移動相の流れに乗って第２カラム１０に導入され、第２カラム１０を通過する過程で試料液中の各種成分が分離される。
【００３３】
第２カラム１０から時間的にずれて溶出した成分を含む溶出液（試料液）は第２検出器１１に導入され、第２検出器１１は導入された成分の濃度に応じた強度の検出信号を出力する。制御・処理部２０はこの検出信号を受けてクロマトグラムを作成し、クロマトグラムに現れるピークに基づいて定性分析、定量分析を行う。バイアル番号「１０１」のバイアル中の試料液に対する２次元目のＬＣ分析が終了すると、引き続いて、バイアル番号「１０２」、「１０３」のバイアル中の試料液に対する２次元目のＬＣ分析が実行される。
【００３４】
なお、上記実施例は本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００３５】
１…第１移動相容器
２…第１送液ポンプ
３…６方バルブ
４…オートサンプラ
５…インジェクタ
６…第１カラム
７…第１検出器
８…第２移動相容器
９…第２送液ポンプ
１０…第２カラム
１１…第２検出器
１２…フラクションコレクタ
１２１…分取部
１２２…分取バルブ
１２３…分取ノズル
１２５…分取制御部
１２６…Ａ／Ｄ変換器
２０…制御・処理部
２１…操作部
２２…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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