(57)【要約】【解決課題】高分離能であり、汎用性が高く、かつ、ＨＩＬＩＣ用分離媒体としても使用することのできる極性化合物の分離・分析に適した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム、及び、その製造方法を提供する。【解決手段】アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有するかあるいはアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマー、架橋性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー溶液をカラム内に注入し、カラム内にて放射線重合して、アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する高分子骨格を固定相とし、当該固定相と空隙とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する多孔質体を得ることを含む双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを製造する方法及び当該製造方法により得られた双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。【選択図】図１
2011017678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有するかあるいはアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマー、架橋性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー溶液をカラム内に注入し、カラム内にて放射線重合して、アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する高分子骨格を固定相とし、当該固定相と空隙とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する高分子多孔質体を得ることを含む双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの製造方法。
【請求項２】
前記反応性モノマーは、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイロキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン（ＳＰＥ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイルアミノプロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタインから選択される、アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有するモノマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応性モノマーは、メタクリル酸グリシジル、２−ビニルオキシラン、１，２−エポキシ−９−デセン、ｐ−クロロメチルスチレン、スチレン、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル、メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロライド、［２−（メタクリロイロキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、［２−（アクリロイロキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、アクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル、アクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル、アクリル酸３−（ジエチルアミノ）プロピル、Ｎ，Ｎ−ジメチルビニルベンジルアミン、（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウムクロライド、メタクリル酸３−スルホプロピルカリウム塩、ビニルスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム、１−（３−スルホプロピル）−２−ビニルピリジニウムハイドロキサイドから選択されるモノマーであり、
前記放射線照射による重合後に、アンモニウム基及び／又はスルホ基を導入する官能基導入工程を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋性モノマーは、メチレンビスアクリルアミド、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）、ジメタクリル酸ジ（エチレングリコール）、ジメタクリル酸トリエチレングリコール、ジアクリル酸エチレン、ジアクリル酸ジ（エチレングリコール）、ジアクリル酸テトラ（エチレングリコール）、１，４−シクロヘキサンジメタノールジビニルエステル、ジビニルベンゼン、トリメチル酸トリメチロルプロパン、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、トリアクリル酸トリメチロルプロパンプロポキシレート、トリアクリル酸トリメチロルプロパン、１，３，５−トリアクリロイルヘキサハイドロ−１，３，５−トリアジン、トリス［２−（アクリロイロキシ）エチル］イソシアヌレート、テトラアクリル酸ペンタエリスリトール、テトラアクリル酸ジ（トリメチロルプロパン）から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細孔形成剤は、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、エーテル類から選択される無極性溶媒、アセトン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドから選択される非プロトン性極性溶媒、水、アルコール類、有機酸類から選択されるプロトン性極性溶媒の１種又は２種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アンモニウム基及びスルホ基を有する両性イオン機能性官能基を有する高分子骨格を固定相とし当該固定相と空隙とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する高分子多孔質体と、当該高分子多孔質体が充填されているカラムと、を具備する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により製造される双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。
【請求項７】
前記高分子多孔質体は、直径が５０μｍ以上１ｍｍ以下である、請求項６に記載の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。
【請求項８】
前記高分子多孔質体は、高分子骨格サイズが０．５μｍ以上２０μｍ以下である、請求項６又は７に記載の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。
【請求項９】
前記高分子多孔質体は、流路孔サイズが０．５μｍ以上３０μｍ以下である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。
【請求項１０】
前記高分子多孔質体は、直径３１５ｎｍより大きいマクロ孔が全空隙の８０％〜９０％を占め、直径２．４ｎｍより小さいメソ孔が全空隙の５％〜１５％を占め、直径２．４ｎｍ以上３１５ｎｍ以下の孔が全空隙の５％〜１０％を占める細孔分布を有する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。
【請求項１１】
圧力損失が０．１ＭＰａ／ｃｍ以下である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。
【請求項１２】
親水性相互作用クロマトグラフィーに用いられる請求項６〜１１のいずれか１項に記載の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極性化合物分離用双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム及びその製造方法に関し、特に、アミノ酸、ペプチド、糖類、極性代謝物、神経伝達物質、炭水化物、疾病の診断に用いられるバイオマーカー、あるいは、生体関連物質などの各種極性化合物の精密分離・分析などに適した親水性相互作用クロマトグラフィー（Hydrophilic Interaction Chromatography、以下「ＨＩＬＩＣ」と称す）用固定相として双性イオン型有機ポリマー系モノリスを含有する極性化合物分離用双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography、以下「ＨＰＬＣ」と称す）は、有機化合物、生体関連物質、医薬品、食料などの分析のほか、臨床化学、環境科学、法化学などにおいて主要な分離・分析手段として汎用されており、複雑多岐にわたる試料成分を分析対象としている。現在、ＨＰＬＣ用カラムとして、オクタデシルシリルシリカゲルを中心とした逆相分配、いわゆる逆相クロマトグラフィー（Reversed Phase Liquid Chromatography、以下「ＲＰＬＣ」と称す）用充填剤が、その高い汎用性、並びに、高い分離性能から一般分析用カラムとして広く利用されている。しかしながら、ＲＰＬＣは、高い親水性や電荷を多く帯びた極性化合物の分離・分析には不向きであり、極性化合物の分離には、古典的な順相クロマトグラフィー（Normal Phase Liquid Chromatography、以下「ＮＰＬＣ」と称す）が利用されている。ただし、古典的なＮＰＬＣには移動相として非水溶性の有機溶媒を使用することが多く、極性化合物の中にはこの溶媒系に溶解することができないため分析できない、分離性能が低い、固定相の種類が少ない、再現性が低いなどの問題があり、その応用例は極めて限定されている。近年、上記の問題を解決する方法として、親水性相互作用クロマトグラフィー：ＨＩＬＩＣ（Hydrophilic Interaction Chromatography）が研究開発され、注目を集めている。
【０００３】
ＨＩＬＩＣの概念は、１９９０年にA. J. Alpertによって最初に提唱された（非特許文献１）。固定相には極性（親水性）担体、移動相には高比率の有機溶媒と低比率の極性溶媒（主に水）から成る混合溶媒が使用されるため、ＨＩＬＩＣは広義のＮＰＬＣと考えられている。ＨＩＬＩＣでは、カラムに注入された極性化合物は、極性のより高い固定相に保持された後、移動相によって順次極性の低い物質から溶出する。この際、固定相の極性が移動相の極性より高いほど極性化合物の保持は強くなり、また、移動相が極性溶媒（水など）の場合は保持が弱くなり、移動相が非極性溶媒の場合は保持が強くなる傾向を示す。このようにＨＩＬＩＣの分離メカニズムは、ＲＰＬＣの分離メカニズムとは正反対の仕組みであり、その結果、ＨＩＬＩＣの溶出順序はＲＰＬＣの逆となる。また、ＨＩＬＩＣは移動相に有機溶媒を多く含み、イオン化効率がよいためエレクトロスプレーイオン化質量分析計を検出部に用いた分析に適している。そのため、ＨＩＬＩＣはＲＰＬＣでは分離不可能な炭水化物、ペプチド、タンパク質、医薬品などの極性化合物の分離・分析に利用されている。また、ＨＩＬＩＣでは、固定相として古典的な未修飾シリカに加え、アミノ基、アミド基、ジオール基、ポリ（スクシンイミド）誘導体、双性イオン型官能基、シクロデキストリンが修飾されたシリカ充填剤が利用されており、近年ではＨＩＬＩＣ用カラムとしてＺＩＣ（登録商標）−ＨＩＬＩＣ（ｐＨ２〜８）やＺＩＣ（登録商標）−ｐＨＩＬＩＣ（ｐＨ２〜１０）がＭｅｒｃｋ社より市販されている。しかし、これらＨＩＬＩＣ用カラムの作製には、粒子径５μｍ程度の均一な微粒子充填剤の作製、細いカラム管への微粒子充填剤の充填、充填剤を保持するためのフリット（栓）の作製といった高度に熟練したカラム作製技術を必要とし、どの程度再現性よく安定したカラム性能が得られるのかは、個人の技術にかなり依存するといった問題がある。また、粒子状の分離媒体を用いる従来のカラム技術・方法論では、分離の高速化の際にカラムにかかる負荷圧が充填剤粒子径の二乗に反比例して増大するため、専用の高耐圧システムが必須となり、分離の高速化・ハイスループット化が阻まれるといった問題もある。
【０００４】
一方、現行の装置をそのまま利用でき、装置の汎用性や操作性を犠牲にすることなく、高速・高性能分離を実現する方法として、近年、モノリスカラム技術を用いる方法が注目を集めている。本来「モノリス」とは「一枚岩」という意味であり、カラム技術分野においては「カラム骨格（固定相）と空隙（流路）とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する多孔質体」を意味するモノリスカラムの作製方法は、カラム管内に溶液を注入して、当該溶液から直接合成する簡便な方法であり、高度なカラム作製技術を必要としない。貫通型の流路孔を有するモノリス（多孔質体）は、流体透過性に優れ、表面積が大きく、また対流により物質移動効率が促進される。そのため、モノリス（多孔質体）を吸着分離剤や触媒担体として用いることにより、迅速かつ高性能な分離・反応を比較的低い操作圧で実現できる。
【０００５】
モノリスカラムは、そのベースとなる材質によってシリカ系（特許文献１）と有機ポリマー系（特許文献２）の２種類に大別される。シリカ系モノリスカラムは、一般に分離能が高く、機械的強度にも優れており、また、骨格径、流路孔及び固定相に存在する表面細孔を制御する技術開発が進んでおり、近年商品化にまで至っている。しかし、シリカ系モノリスカラムは、適用可能なｐＨ範囲が狭く（適用可能ｐＨ範囲：２〜８）、反応活性なシラノール基への不可逆的な吸着が起こりやすいという問題を有する。一方、有機ポリマー系モノリスカラムは、シリカ系モノリスカラムに比べて、分離能が低く、機械的強度に劣るといった欠点はあるものの、幅広いｐＨ範囲で使用でき（適用可能ｐＨ範囲：１〜１２）、可逆的な吸着が起こりにくく、固定相の調製や修飾が容易であり、利用可能なモノマーの種類が豊富であり、分子鋳型法により自在に分子認識場（ある分子が他の分子やイオンをその大きさ・形・電子配置などによって識別し、選択的に反応する現象を生じる場）を創製できる、などの特筆すべき特徴を有しており、その研究開発はシリカ系モノリスカラムよりも以前から行われてきた。有機ポリマー系モノリスカラムとしては、これまでアクリルアミド系、メタクリル酸エステル系、スチレン−ジビニルベンゼン系が主に研究され、その結果、スチレン−ジビニルベンゼン系のキャピラリーカラム及びメタクリル酸エステル系のディスクカラムが市販されている。しかし、両タイプのモノリスカラムで使用される分離モードは、逆相分離モード、イオン交換モード、または、プロテオーム解析等の特定の研究に特化したものがほとんどであり、ＨＩＬＩＣモードを有する親水性モノリスカラムの実験例は極僅かしか報告されていない。ＨＩＬＩＣ用モノリスカラムに関する報告例が少ない理由は以下の通りである。
（１）用いる反応性モノマーの極性が極めて高く、従来一般的に利用されてきた細孔形成剤が使用不可能である。そのため、細孔形成剤の選定、並びに、カラム作製条件の最適化を再検討しなければならない。
（２）市販されている極性モノマーの種類が少ない。
【０００６】
ＨＩＬＩＣ用カラムの開発として、双性イオン型官能基を導入した高親水性固定相に関する研究も試みられており、こうした高親水性固定相としてスルホベタイン型官能基を有するＨＩＬＩＣ用有機ポリマーモノリスカラムが２０００年にC. Viklundらにより発表された（非特許文献２）。スルホベタイン型官能基は、分子内にアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型官能基であり、この官能基を有する固定相は、親水性化合物と高い親和性を示すだけでなく、弱い静電的相互作用によって陽／陰イオン性化合物とも相互作用を示すというユニークな保持機構を示す。C. Viklundらは、反応性モノマーであるＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイロキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン（N,N-dimethyl-N-methacryloxyethyl-N-(3-sulfopropyl)ammonium betaine、以下「ＳＰＥ」と称す）、架橋性モノマーであるジメタクリル酸エチレン（ethylene dimethacrylate、以下「ＥＤＭＡ」と称す）、及び、細孔形成剤であるメタノールから成るモノマー反応溶液を内径２．７ｍｍのガラス管に注入した後、紫外線照射による光重合反応により双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを作製した。C. Viklundらの作製方法では、ＨＩＬＩＣ用有機ポリマー系モノリスカラムの作製をすることができるものの、カラム内径が２．７ｍｍと大口径のため、ペプチドやタンパク質などの希少な分析試料を多量に必要とし、重合反応に紫外線照射を必要とするためにカラム管の素材が紫外線透過性ガラスなどに限定され、また、紫外線照射装置が小型であるために生産性に乏しいなどの問題があり、あまり実用的ではなかった。
【０００７】
非特許文献２の改良技術として、Z. Jiangらにより熱重合反応により内径１００μｍの溶融シリカキャピラリーチューブ内でＨＩＬＩＣ用有機ポリマー系モノリスキャピラリーカラムを作製する方法が提案された（非特許文献３）。Z. Jiangらの作製方法では、熱重合法と内径１００μｍの溶融シリカ系キャピラリーチューブの採用により、より簡便にＨＩＬＩＣ用有機ポリマー系モノリスキャピラリーカラムを作製することができた。しかしながら、キャピラリーサイズのカラムを使用するためには、低流量送液ポンプやマイクロインジェクターなどの専用装置を必要とし、その結果、一般的なＨＰＬＣユーザーには使用し難いといった新たな問題が起こった。また、熱重合反応を利用するため、重合時間も１２時間以上と長時間を要し、生産性の向上には至らなかった。
【０００８】
本発明者らは、一般的ＨＰＬＣユーザーへのモノリスカラムの普及を目的として、内径０．２５〜１．０ｍｍのセミミクロサイズの有機ポリマー系モノリスカラムを重合開始剤の存在下、熱重合することで、タンパク質、並びに、低分子化合物に対しても実用的に十分な分離能を有し、かつ圧力損失が低く（線流速１ｍｍ／ｓで０．１ＭＰａ／ｃｍ以下）、機械的強度（線流速１０ｍｍ／ｓで送液してもモノリスの圧壊はなかった）も兼ね備えたセミミクロサイズの有機ポリマー系モノリスカラムの作製に成功した（非特許文献４）。
【０００９】
またその一方で、本発明者らは、有機ポリマー系モノリスカラムの更なる分離能の改善を目的とし、放射線重合法を利用した有機ポリマー系モノリスキャピラリーカラム作製方法を開発した（特許文献３）。従来の熱重合法では、温度分布の均一性や重合開始剤の分散性に問題があり、カラム骨格や細孔径（空隙）の大きさが完全に均質なモノリスカラムの作製は困難であり、ところどころに数１０μｍの大きな空隙が存在する。その結果、この大きな空隙が分離能の低下を招いてしまうことがわかった。一方、放射線の高いエネルギーを利用する放射線重合法では、より均一なカラム骨格及び空隙を有するモノリスカラムを作製することができ、その分離能は熱重合法と比較して３倍（理論段数による比較）程度改善された。また、放射線重合法では合成面での制約も少なく、カラム管の材質及び形状には依存せず、短時間で容易に有機ポリマー系モノリスカラムを作製することが可能であった。しかし、特許文献３に記載されているモノリスカラムは、疎水性相互作用を利用する逆相モード分離用カラムである。このような逆相モードでは高親水性化合物は保持されにくい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２６５５３４号公報
【特許文献２】特開２００６−０１５３３３号公報
【特許文献３】特開２００６−２４７５１５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】A. J. Alpert, Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds, J. Chromatogr., 499, 177-196, 1990.
【非特許文献２】C. Viklund, K. Irgum, Synthesis of Porous Zwitterionic Sulfobetaine Monoliths and Characterization of Their Interaction with Proteins, Macromolecules, 33, 2539-2544, 2000
【非特許文献３】Z. Jiang, N. W. Smith, P. D. Ferguson, M. R. Taylor, Hydrophilic Interaction Chromatography Using Methacrylate-Based Monolithic Capillary Column for the Separation of Polar Analytes, Anal. Chem., 79, 1243-1250, 2007
【非特許文献４】梅村知也、小島徳久、植木悠二、有機ポリマーモノリスを用いる高速・高性能分離分析法の開発、分析化学、57、517-529、2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来のシリカ系モノリスカラム及び有機ポリマー系モノリスカラムよりも高分離能であり、汎用性が高く、かつ、ＨＩＬＩＣ用分離媒体としても使用することのできる極性化合物の分離・分析に適した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム、及び、その製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、アンモニウム基とスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する高分子多孔質体をカラム内で製造することにより得られるカラム骨格（固定相）と空隙（流路）とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する有機ポリマー系モノリスカラムにより上記課題を解決できることを知見し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明によれば、アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有するかあるいはアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマー、架橋性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー溶液をカラム内に注入し、カラム内にて放射線重合して、アンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する高分子骨格を固定相とし、当該固定相と空隙とが共に三次元的に連通したネットワーク構造を有する多孔質体を得ることを含む双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを製造する方法及び当該製造方法により得られた双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムが提供される。
【００１５】
本発明の製造方法において、アンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマーを用いる場合には、当該反応性モノマー、可溶性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー溶液に放射線を照射して放射線重合した後に、アンモニウム基及び／又はスルホ基を導入する。
【００１６】
［１］双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの製造方法
以下、本発明の製造方法で使用する試薬及び工程を説明する。
【００１７】
［１−１］反応性モノマー
本発明で用いることができるアンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有する反応性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイロキシエチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタイン（以下「ＳＰＥ」と称す）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−メタクリロイルアミノプロピル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アンモニウムベタインを好ましく挙げることができる。
【００１８】
本発明で用いることができるアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有する反応性モノマーとしては、メタクリル酸グリシジル（glycidyl methacrylate、以下「ＧＭＡ」と称す）、２−ビニルオキシラン、１，２−エポキシ−９−デセン、ｐ−クロロメチルスチレン、スチレンなどのビニル基を有するモノマー、及び予め機能性官能基としてアンモニウム基、あるいはスルホ基から選択される１種または２種の機能性官能基を有するビニルモノマー類、たとえばメタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル、メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロライド、［２−（メタクリロイロキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、［２−（アクリロイロキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、アクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル、アクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル、アクリル酸３−（ジエチルアミノ）プロピル、Ｎ，Ｎ−ジメチルビニルベンジルアミン、（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウムクロライド、メタクリル酸３−スルホプロピルカリウム塩、ビニルスルホン酸ナトリウム、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸ナトリウム、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム、１−（３−スルホプロピル）−２−ビニルピリジニウムハイドロキサイドを好ましく挙げることができる。
【００１９】
反応性モノマーの仕込み量は、モノマー反応溶液中５〜５０ｗｔ％、好ましくは２５〜４０ｗｔ％が望ましい。反応性モノマーの仕込み量が５ｗｔ％以下の場合は、モノリスカラムの骨格となるモノマー量が少ないため、十分な機械的強度を有するモノリスカラムが作製できず、高流速条件下で使用することができない。また、分離に寄与する官能基の導入量が少なくなるために、十分な分離性能を達成することができない。一方、反応性モノマーの仕込み量が５０ｗｔ％を超える場合は、細孔径が小さく、圧力損失が高くなるために送液が困難となり、あるいはモノリスカラムを貫通する流路が形成できず、モノリスカラムとして使用不可能となる。
【００２０】
［１−２］架橋性モノマー
本発明で用いることができる架橋性モノマーとしては、ビニル基を１つのモノマー分子内に２つ、または、３つ以上有する架橋性モノマーを用いることができ、１種または２種以上のモノマーを混合して使用してもよい。混合モノマーを使用する場合、モノマーの濃度比は特に限定はなく、適宜決定することができる。
【００２１】
１つのモノマー分子内に２つのビニル基を有する架橋性モノマーとしては、メチレンビスアクリルアミド、ジメタクリル酸エチレン（ＥＤＭＡ）、ジメタクリル酸ジ（エチレングリコール）、ジメタクリル酸トリエチレングリコール、ジアクリル酸エチレン、ジアクリル酸ジ（エチレングリコール）、ジアクリル酸テトラ（エチレングリコール）、１，４−シクロヘキサンジメタノールジビニルエステル、ジビニルベンゼン、を好ましく挙げることができる。また、１つのモノマー分子内に３つ以上のビニル基を有する架橋性モノマーとしては、トリメチル酸トリメチロルプロパン、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、トリアクリル酸トリメチロルプロパンプロポキシレート、トリアクリル酸トリメチロルプロパン、１，３，５−トリアクリロイルヘキサハイドロ−１，３，５−トリアジン、トリス［２−（アクリロイロキシ）エチル］イソシアヌレート、テトラアクリル酸ペンタエリスリトール、テトラアクリル酸ジ（トリメチロルプロパン）を好ましく挙げることができる。
【００２２】
架橋性モノマーの仕込み量は、モノマー反応溶液中５〜５０ｗｔ％、好ましくは１０〜３０ｗｔ％が望ましい。架橋性モノマーの仕込み量が５ｗｔ％以下の場合は、ポリマー鎖の架橋点が少なくなるため、機械的強度が不足する。一方、架橋性モノマーの仕込み量が５０ｗｔ％を超える場合は、十分な機械的強度が得られるものの、相対的に分離に寄与する官能基を有する反応性モノマーの仕込み量が少なくなるため、十分な分離性能を達成することが困難となる。
【００２３】
［１−３］細孔形成剤
本発明で用いることができる細孔形成剤は、反応性モノマーと架橋性モノマーの放射線重合反応の際に、各種モノマーを均一に分散させるとともに、重合反応終了後の高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）内部に流路孔や高分子骨格上の微小な細孔を形成させる作用を奏する。本発明で使用することができる細孔形成剤としては、本発明で使用する反応性モノマー及び架橋性モノマーと混和性があり、かつ、細孔形成剤自身が放射線重合の際にこれら各種モノマーとは反応しない溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、エーテル類などの無極性溶媒、アセトン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、１−ブタノール、１−ペンタノール、１−ヘキサノール、イソプロピルアルコール、２−ブチルアルコール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、シクロヘキサノール、１，２−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオールなどのアルコール類、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸などの有機酸類などのプロトン性極性溶媒を好ましく挙げることができる。放射線重合反応により生成する高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）に対して貧溶媒となる溶媒と良溶媒となる溶媒とを混合した細孔形成剤が好ましい。貧溶媒だけを使用した場合では、大きな細孔しか作製できず、圧力損失は少ないが、十分な固定相表面積を得ることができないため、分離性能が悪くなる傾向にある。一方、良溶媒だけを使用した場合では、小さな細孔しか作製できず、十分な固定相表面積を得ることができるものの、圧力損失が高く、モノリスカラムとしての利点が損なわれる傾向にある。貧溶媒と良溶媒の混合比を制御することで、分離目的に適切な大きさの細孔と十分な固定相表面積を有するモノリスカラムを作製することができる。さらに、従来の化学重合法では重合開始剤の溶解性や重合熱による気泡の発生のため使用することができなかった重合開始剤が難溶な溶媒（たとえば、２，２’，２”−ニトリロトリエタノール）や低沸点溶媒（たとえば、アセトンやテトラヒドロフラン）なども使用可能である。
【００２４】
細孔形成剤の仕込み量は、カラム性能及びカラム背圧を決定する因子となるので、用いる反応性モノマー及び架橋性モノマーの種類、また、各種モノマー類との親和性に依存して適宜決定することができる。たとえば、反応性モノマーとしてＳＰＥを用い、架橋性モノマーとしてＥＤＭＡを用いる場合には、細孔形成剤であるメタノールの仕込み量は、モノマー反応溶液中５０〜８５ｗｔ％、好ましくは６０〜７５ｗｔ％の範囲が好ましい。
【００２５】
［１−４］放射線重合工程
本明細書中における「放射線重合」とは、反応性モノマーと架橋性モノマーとの共重合反応において、ラジカル発生源として重合開始剤を使用せず、ガンマ線や電子線の照射により直接モノマー中に発生したラジカルを利用して行う共重合反応のことをいう。この放射線重合工程では、反応性モノマーと架橋性モノマーを細孔形成剤である溶媒に分散させた後、このモノマー反応溶液に放射線を照射することにより、高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）が生成される。この高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）は、その後、溶媒と相分離し、流路孔、マクロ孔、及び、メソ孔内に溶媒が取り残された状態で得られる。
【００２６】
本発明における放射線重合は、反応性モノマー、架橋性モノマー及び細孔形成剤からなるモノマー反応溶液をカラム内に注入して行なう。使用するカラムとしては、放射線重合後そのまま化学物質分離用カラムとして用いることができることが好ましく、液体クロマトグラフィー用カラムやガスクロマトグラフィー用カラムの製造に通常用いられる空カラム、溶融シリカキャピラリーチューブやシリコスチールチューブ、または、配管用チューブ、あるいは、固相抽出用空カートリッジが好ましく、材質としては、放射線耐性があるステンレス鋼、ポリマー、ガラスが好ましい。
【００２７】
本発明で用いる放射線はガンマ線または電子線であり、照射線量は反応活性点であるラジカルを生成させるのに充分な線量であることを条件に適宜決定することができる。たとえば、１〜２００ｋＧｙ、好ましくは５〜２０ｋＧｙの照射線量が好適である。重合温度は特に限定されないが、細孔形成剤の揮発による気泡発生の抑制、並びに、放射線照射による発生熱の除去の観点から、０〜３０℃、好ましくは０℃付近が望ましい。反応時間は、重合の再現性の確保及び大量生産性という観点から、５分〜４時間が好ましく、１０分〜１時間がより好ましい。
【００２８】
［１−５］機能性官能基導入工程
反応性モノマーとしてアンモニウム基及びスルホ基の両性イオン機能性官能基を有するモノマーを使用する場合には、本工程は不要である。反応性モノマーとしてアンモニウム基及び／又はスルホ基に変換可能な官能基を有するモノマーを使用する場合には、以下の手順で、アンモニウム基及び／又はスルホ基を導入することができる。
【００２９】
アンモニウム基の導入は、トリメチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミンなどのアミン類を用いたアミノ化により行うことができる。スルホ基の導入は、亜硫酸ナトリウム、クロロ硫酸、発煙硫酸などの硫酸類を用いたスルホン化により行うことができる。また、アンモニウム基及びスルホ基の導入は、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシルエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、２−［ビス−（２−クロロ−エチル）−アミノ］−エタンスルホン酸などの分子内にアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン化合物との反応、または、アミン類によるアミノ化の後、１，３−プロパンスルトンを反応させることにより行うことができる。
【００３０】
アンモニウム基及び／又はスルホ基の導入は、慣用の方法で行うことができる。反応温度は各種反応物質の反応性に依存するが、典型的には１０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃である。反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１０分〜２時間の範囲である。アンモニウム基及び／又はスルホ基を有する各種反応物質の濃度は、通常０．０１〜５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲である。
【００３１】
［２］双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、上述の製造方法により製作することができる。本発明の放射線重合方法を用いることにより製作される双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、以下の特徴を有する。
【００３２】
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム内の高分子多孔質体は、直径が５０μｍ以上１ｍｍ以下、好ましくは１５０μｍ以上１ｍｍ以下である。
【００３３】
また、固定相である高分子骨格サイズが０．５μｍ以上２０μｍ以下、好ましくは１μｍ以上１５μｍ以下である。
【００３４】
さらに、流路孔サイズが０．５μｍ以上３０μｍ以下、好ましくは３μｍ以上２０μｍ以下である。
【００３５】
また、高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）は、直径３１５ｎｍより大きいマクロ孔が全空隙の８０％〜９０％を占め、直径２．４ｎｍより小さいメソ孔が全空隙の５％〜１５％を占め、直径２．４ｎｍ以上３１５ｎｍ以下の中間の孔が全空隙の５％〜１０％を占める細孔分布を有する。
【００３６】
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの圧力損失は０．１ＭＰａ／ｃｍ以下である。
【００３７】
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの適応操作圧範囲は、４０ＭＰａ以下、好ましくは、１０ＭＰａ以下である。
【発明の効果】
【００３８】
本発明によれば、従来のシリカ系モノリスカラム及び有機ポリマー系モノリスカラムよりも高分離能であり、汎用性が高く、かつ、ＨＩＬＩＣ用分離媒体としても使用することのできる極性化合物の分離・分析に適した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム、及び、その製造方法が提供される。
【００３９】
本発明の製造方法では、放射線重合法の利用により、熱重合法では作製することができなかった、より均一な高分子骨格構造を有し、かつ、高いカラム性能を示す双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を作製することができる。
【００４０】
ラジカル発生源として、ガンマ線や電子線などの量子ビームを利用する放射線重合法は、反応溶液中に均一、かつ、大量にラジカルを発生させることができるため、短時間で再現性良く高品質の有機ポリマーモノリスを作製することができ、大量生産にも適している。
【００４１】
放射線重合法は、従来の化学重合法と比較して、有害な触媒等が不要なため環境への負荷が小さく、クリーンな手法であるとともに、長時間の加熱も必要とせず、短時間の照射で作製可能であるためエネルギー消費も少ない。
【００４２】
放射線重合法の利用により、従来の化学重合法では重合開始剤の溶解性や重合熱による気泡の発生のため使用することができなかった、重合開始剤が難溶な溶媒や低沸点溶媒なども使用可能となり、これまで以上に高分子多孔質体の骨格構造制御を厳密に行うことができる。
【００４３】
本発明の製造方法では、よりユーザーニーズの高いセミミクロサイズのモノリスカラムを作製することができるため、現行のＨＰＬＣ装置をほぼそのまま利用することが可能である。そのため、誰でも容易にハイスループット分析を達成することができる。
【００４４】
従来の分離・分析用充填剤としては粒子状樹脂が用いられているが、本発明の方法により製造される双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムでは、貫通型の流路孔を有し、流体透過性が高く、また、表面積も大きい高分子多孔質体（有機ポリマー系モノリス）を吸着分離剤や触媒担体として使用するため、従来品よりも迅速かつ高性能な分離・反応を比較的低い操作圧で実現できる。しかもこの有機ポリマーモノリスは、シリカモノリスに比べ、不可逆的な吸着が起こりにくく、また、ｐＨ耐久性に優れているといった高分子体特有の特徴も併せ持つため、塩基性条件での使用や組成の複雑な試料の分析が求められる生体関連物質解析等のバイオサイエンス分野での使用に耐えうることができる。
【００４５】
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、機能性官能基としてアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型官能基を有する高分子多孔質体であるため、ＨＩＬＩＣ用の固定相として利用することができ、極性化合物の分離を可能とする。
【００４６】
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、圧力損失が０．１ＭＰａ／ｃｍ以下と流体透過性に優れているため、高流速送液による分析時間の短縮や長いカラムの利用による分離能の改善を容易に達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例１で熱重合法（対照）及び放射線重合法により作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）のSEM撮影断面図である。
【図２】図２は、実施例１で行った双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムによる陰イオンの分離結果を示すクロマトグラムである。
【図３】図３は、実施例２で行った細孔形成剤が及ぼす高分子骨格構造への影響を示す図である。
【図４】図４は、実施例４で行った双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムによる核酸構成成分等の分離結果を示すクロマトグラムである。
【図５】図５は、実施例５で行った双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムによる小児がん腫瘍マーカーの分離結果を示すクロマトグラムである。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］
極性化合物分離用の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの作製
重合用容器（カラム管）として、放射線重合後に作製した有機ポリマーモノリスが流出するのを防ぐために、二官能性のアンカー試薬（３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン）により予めシリコスチールチューブ内壁のガラス層を処理した内径０．５ｍｍのシリコスチールチューブを使用した。
【００４９】
反応性モノマーとして分子内にアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型モノマーであるＳＰＥ（０．７ｇ）、架橋性モノマーとしてＥＤＭＡ（０．３ｇ）を使用し、これらモノマーを細孔形成剤であるメタノール（２．０ｇ）に分散させ、モノマー反応溶液とした。モノマー反応溶液は、溶存する酸素を取り除くために窒素通気を行った後、前記シリコスチールチューブ（内径：０．５ｍｍ、長さ：１００ｍｍ）に注入した。放射線源には、Ｃｏ−６０を使用し、線量率は５ｋＧｙ／ｈ、照射線量は１０ｋＧｙ、重合温度は０℃で２時間、放射線重合反応を行った。放射線重合反応終了後、エタノール、水の順にそれぞれ洗浄し、目的とする親水性高分子多孔質体（双性イオン型有機ポリマー系モノリス）を得た。
【００５０】
比較のため、重合開始剤を用いた化学重合系の熱重合による双性イオン型有機ポリマー系モノリスの作製も併せて行った。重合開始剤には、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）（０．１ｇ）を使用し、反応温度は６０℃、熱重合反応時間は２４時間とした。
【００５１】
図１に熱重合法と放射線重合法によって作製した双性イオン型有機ポリマーモノリスの断面図を走査型電子顕微鏡（Scanning electron microscopy、以下「ＳＥＭ」と称す）によって撮影したものを示す。ＳＥＭ写真が示すように、熱重合法により作製した高分子多孔質体（モノリス）は、直径０．５〜５μｍ程度の不定形ポリマーが個々に結合し、不均一な高分子骨格を形成しており、また、ところどころに１０μｍ程度の大きな空隙があることが確認できた。一方、本発明の放射線重合法によって作製した高分子多孔質体（モノリス）は、直径２μｍ程度の均一な球状ポリマーが連球状に連なった骨格と、直径２〜１０μｍの流路とが、互いに偏りなく分散したより均一な網目構造を形成していることが確認できた。
【００５２】
次に、熱重合法と放射線重合法によって作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの性能評価として、ＨＰＬＣ用分離媒体として使用した結果を図２に示す。ここでは、固定相には熱重合法または放射線重合法によって作製した前記双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を使用し、カラムサイズは内径０．５ｍｍ、長さ１００ｍｍとした。試料には３種の陰イオン（ヨウ素酸イオン；ＩＯ３−、硝酸イオン；ＮＯ３−、亜硝酸イオン；ＮＯ２−）を用い、各試料成分の濃度は１０ｍＭ、試料導入量は０．２μＬ、測定波長は２１０ｎｍとした。移動相には水を使用し、流速は１２μＬ／ｍｉｎ（線流速にして１ｍｍ／ｓ）とした。図２に示すように、本発明の放射線重合法により作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの方が、熱重合法で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムよりも、よりカラム性能が高く、前記３種の陰イオンをベースライン分離することができた。この放射線重合法によるカラム性能の向上は、放射線重合法により作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の方が熱重合法により作製したものよりも、試料成分の分離に関与する表面積が大きく、かつ、大きな空隙がなく均一な高分子骨格構造を有することからより均一な層流を形成する結果、試料成分の拡散を抑制することができるためである。
【００５３】
各カラムのカラム背圧について検討してみると、熱重合により製造したカラムでは０．３ＭＰａであるのに対して、本発明の放射線重合により製造したカラムでは０．５ＭＰａとなり、熱重合のものの方がより低いカラム背圧を示すことがわかる。これは、図１でも示したように、熱重合法で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）には、ところどころに１０μｍ程度の大きな空隙があるためである。
【００５４】
以上より、本発明の放射線重合法の利用により、優れた流体透過性を維持しつつ（０．１ＭＰａ／ｃｍ以下）、熱重合法よりもより高いカラム性能を有する双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを作製することができたことがわかる。これによって、これまで分離することが困難であった化合物の精密分離・分析を達成でき、モノリスカラムの更なる利用分野の拡大に繋がる。
【００５５】
［実施例２］
細孔形成剤による高分子多孔質体（モノリス）骨格構造の制御
細孔形成剤は、有機ポリマー系モノリスの流路孔や表面積の制御に最も重要なパラメーターである。そこで、本実施例では、細孔形成剤が及ぼす高分子多孔質体（モノリス）骨格構造への影響について検討を行った。なお、本実施例では、細孔形成剤の影響を検証することを目的としており、表面修飾による官能基導入工程によりモノリス骨格構造は変化しないので、官能基導入工程の説明は割愛する。
【００５６】
カラム管には、内径０．２５ｍｍの溶融シリカキャピラリーチューブを使用し、実施例１と同様にキャピラリーチューブ内壁を予めアンカー試薬により処理した。反応性モノマーとしてＧＭＡ（２．４ｍＬ）、架橋性モノマーとしてＥＤＭＡ（０．６ｍＬ）を使用し、これらモノマーを細孔形成剤である溶媒（７．０ｍＬ）に分散させ、モノマー反応溶液とした。モノマー反応溶液中は、溶存する酸素を取り除くために窒素通気を行った後、前記キャピラリーチューブ（内径：０．２５ｍｍ、長さ：１００ｍｍ）に注入した。放射線源には、Ｃｏ−６０を使用し、線量率は１０ｋＧｙ／ｈ、照射線量は１０ｋＧｙ、重合温度は０℃で、１時間、放射線重合反応を行った。放射線重合反応終了後、エタノール、水の順にそれぞれ洗浄し、目的とする有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を得た。作製した有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の高分子骨格構造をＳＥＭにより撮影し、撮影倍率は１０００倍から５０００倍とした。
【００５７】
本実施例では細孔形成剤として、溶解度パラメーター（Solubility parameter、以下「ＳＰ値」と称す）の異なる第１級アルコール（メタノール：２９．７ＭＰａ１／２、エタノール：２６．６ＭＰａ１／２、１−プロパノール：２４．３ＭＰａ１／２、１−ブタノール：２３．１ＭＰａ１／２、１−ペンタノール：２２．３ＭＰａ１／２、１−ヘキサノール：２１．９ＭＰａ１／２）を使用した。ここで示すＳＰ値とは、物質の極性を示す指標であり、細孔形成剤とモノマー及び高分子体との親和性の指標である。一般的に両者のＳＰ値が近いほど、溶剤へのモノマーの溶解性は良好となる。また、反応性モノマー及び架橋性モノマーとして使用したＧＭＡとＥＤＭＡのＳＰ値は、それぞれ２０．５ＭＰａ１／２と１８．２ＭＰａ１／２であった。
【００５８】
図３に各アルコール類を用いて作製した有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の断面図を示す。図３に示すように、本発明の放射線重合法では、各種溶媒を用いても有機ポリマー系モノリスを作製することができた。ポリマー粒子について検討してみると、メタノールを用いて作製した有機ポリマー系モノリスのポリマー粒子が最も大きく、エタノール、１−プロパノールとアルコール類のアルキル鎖長が長くなるにつれ、ポリマー粒子が小さくなる傾向を示した。また、高分子骨格構造については、アルコール類のアルキル鎖長が長くなるにつれ、より密な高分子骨格構造を形成していた。このように使用溶媒により高分子骨格構造が変化する原因としては、細孔形成剤とモノマーの親和性の指標であるＳＰ値が大きく関与しているためである。重合反応において、反応性モノマーとＳＰ値が異なる溶媒（貧溶媒）を使用すると、重合度が低い段階で重合体が溶媒から析出（相分離）し、その析出した重合体同士も凝集しやすく、その結果、大きなポリマー粒子と大きな流路孔を形成する。一方、反応性モノマーとＳＰ値が近い溶媒（良溶媒）を使用した場合では、重合体の重合度がある程度高くなった段階で相分離が起こるものの、重合体自身も溶媒と親和性が高いため、重合体同士の凝集反応はあまり起こらない。その結果、良溶媒を用いて作製した有機ポリマー系モノリスは、小さなポリマー粒子が密に結合した骨格構造を形成しており、その流路孔も狭くなる。
【００５９】
本実施例では、１種類の細孔形成剤を使用した実験結果を例に挙げているが、２種類以上の溶媒を細孔形成剤として使用した場合には、細孔形成剤の種類や比率を変化させることにより、より厳密に有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）の骨格構造を制御することができる。以上のように、有機ポリマー系モノリスの作製において、使用する細孔形成剤の種類及び容量を適宜調節することにより、細孔容積を保持したまま細孔径のみを、あるいは細孔径を保持したまま細孔容積のみを変化させることができることが分かった。
【００６０】
［実施例３］
双性イオン型有機ポリマー系モノリスの細孔分布測定
有機ポリマー系モノリス（高分子多孔質体）を分離媒体などに利用する場合、有機ポリマー系モノリス表面の細孔分布や表面積が分離性能に大きな影響を与える。そこで本実施例は、実施例１で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリス表面の細孔分布測定をトルエンとポリスチレンスタンダード（Ｍ．Ｗ．＝５００〜２，０００，０００）を用いた逆サイズ排除クロマトグラフィー法により行った。その結果、双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラム中高分子多孔質体の細孔サイズは、直径２．４ｎｍより小さいメソ孔が全空隙の５％〜１５％を占め、直径２．４ｎｍ以上３１５ｎｍ以下の中間孔が全空隙の５％〜１０％を占め、直径３１５ｎｍより大きいマクロ孔が全空隙の８０％〜９０％を占めていた。
【００６１】
［実施例４］
核酸構成成分等の分離
本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、機能性官能基としてアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型の官能基を有する極性化合物分離用固定相として使用可能である。そこで本実施例は、作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いて生体関連物質である核酸構成成分等の分離を行った。
【００６２】
本実施例では、分離カラムとして実施例１で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用い、カラムサイズは内径０．５ｍｍ、長さ１００ｍｍとした。試料にはトルエン、メタクリルアミド、アクリルアミド、チミン、ウラシル、アデニン、チオ尿素、シトシンからなる混合試料溶液を用い、各試料成分の濃度は１０ｍＭ、試料導入量は０．２μＬ、測定波長は２１４ｎｍとした。移動相にはアセトニトリル−１００ｍＭ蟻酸アンモニウム水溶液（９５：５（ｖ／ｖ），ｐＨ３．０）を使用し、流速は１９μＬ／ｍｉｎ（線流速にして１．６ｍｍ／ｓ）とした。
【００６３】
図４に示すように、核酸構成成分であるチミン、ウラシル、アデニン、チオ尿素、シトシンは、溶出時間２分以降に順次溶出され、本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いることで目的とする核酸構成成分を分離することができたことがわかる。
【００６４】
［実施例５］
小児がん腫瘍マーカーの分離への応用
神経芽細胞腫とは、白血病に次ぐ代表的な小児癌の１つで、小児がん患者全体の約１割を占め、およそ１０万人に８人〜９人の割合で症状が出ると言われており、進行した場合には極めて悪性の腫瘍となる。そのため日本では、早期発見・早期治療を目的として、生後６〜７ヶ月の全乳児を対象に、尿によるマススクリーニングを行う事業（神経芽細胞腫検査事業）が昭和５９年度以来実施されていた（平成１５年１０月以降休止。希望者のみ受診可能）。その検査方法は、尿中のクレアチニン（Creatinine、以下「Ｃｒｅ」と称す）量に対するホモバニリン酸（Homovanilic acid、以下「ＨＶＡ」と称す）量とバニルマンデル酸（Vanillylmandelic acid、以下「ＶＭＡ」と称す）量をＨＰＬＣにより測定することによって行われる。そこで本実施例では、作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムの実試料分析への適用性の検討として、小児がん腫瘍マーカーの分離を試みた。
【００６５】
図５に双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いて（Ａ）小児がん腫瘍マーカー試薬、（Ｂ）模擬試料、及び、（Ｃ）実試料の各試料を分析した結果を示す。本実施例では、分離カラムとして実施例１で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用い、カラムサイズは内径０．５ｍｍ、長さ１００ｍｍとした。移動相にはアセトニトリル−５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（８０：２０（ｖ／ｖ））を使用し、流速は１２μＬ／ｍｉｎ（線流速にして１ｍｍ／ｓ）、試料導入量は０．２μＬ、測定波長は２１４ｎｍとした。
【００６６】
（Ａ）小児がん腫瘍マーカー試薬とは、高純度試薬であるクレアチニン、ホモバニリン酸、バニルマンデル酸のみを移動相に溶解させたものであり、その濃度は各試料成分とも１０ｍＭである。
【００６７】
（Ｂ）模擬試料とは、腫瘍があると判断される濃度の試料であり、クレアチニン１ｍｇに対してホモバニリン酸とバニルマンデル酸がそれぞれ２６μｇと１５μｇになるように調整した試料である（Ｃｒｅ：１ｍｇ／ｍＬ，ＨＶＡ：２６μｇ／ｍＬ，ＶＭＡ：１５μｇ／ｍＬ）。
【００６８】
（Ｃ）実試料とは、健康な２５歳の男性の尿を移動相にて５倍に希釈した試料である。本実施例では、実試料を用いた場合でも不純物を含まない純粋な試薬や模擬試料と同様の場所に試料ピークが出現するかどうかを判断することを目的としている。
【００６９】
図５−（Ａ）に示すように、本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを用いることで、小児がん腫瘍マーカー試薬である３成分をほぼ完全にベースライン分離することができた。
【００７０】
図５−（Ｂ）に示すように、腫瘍があると判断される低濃度領域においても、ピークの検出は可能であった。
【００７１】
図５−（Ｃ）に示すように、実試料分析においても十分な検出感度を示した。
【００７２】
以上より、本発明で作製した双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、小児がん腫瘍マーカーの分析に十分なカラム性能を有するとともに、実試料分析への適用も可能であり、モノリスカラムの更なる利用分野の拡大に貢献することができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、機能性官能基としてアンモニウム基とスルホ基の正負両イオンを持つ双性イオン型官能基を有する高分子多孔質体を固定相として使用する。双性イオン型官能基を有する高分子多孔質体は、親水性相互作用、並びに、イオン交換作用を示すため親水性相互作用クロマトグラフィー（Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC）用の固定相として利用することができ、極性化合物の分離を可能とする。この双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、カラム内に注入したモノマー反応溶液に直接放射線を照射して重合することにより作製され、従来の熱重合系高分子多孔質体よりもより均一な高分子骨格構造を有しているため、そのカラム性能は高く、熱重合系高分子多孔質体では分離不可能な化合物を分離することが可能である。
【００７４】
また、本発明の双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムは、圧力損失が０．１ＭＰａ／ｃｍ以下と流体透過性に優れ、高流速送液による分析時間の短縮や長いカラムの利用による分離能の改善を達成することができ、複雑多岐にわたる試料成分の高精度な分離を必要とするポストゲノム研究などに貢献することが可能である。
【００７５】
さらに、本明細書には内径０．５ｍｍの双性イオン型有機ポリマー系モノリスカラムを実施例として挙げたが、本発明の製造方法ではよりユーザーニーズの高い内径１ｍｍ以上のセミミクロサイズのモノリスカラムも作製可能である。セミミクロサイズのモノリスカラムの製品化が進めば、現行のＨＰＬＣ装置をほぼそのまま利用することができ、誰でも容易にハイスループット分析の実現、並びに、高精度な分離を達成することができ、ポストゲノム研究をはじめとする様々な分野の研究・開発に広く貢献することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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