(57)【要約】      （修正有）【課題】I.orientalis及びその近縁種における高発現プロモーターとその用途を提供する。【解決手段】特定な塩基配列からなるＤＮＡを、Ｉｓｓａｃｈｅｎｋｉａ orientalis及びその近縁種におけるプロモーターとターミネーターを利用し、さらに分泌シグナルを組み合わせ発現システムを構築する。さらに該システムを利用してセルラーゼを含む形質転換体を作成し、セルラーゼを生産する。また種々の異種蛋白質を生産することが出来る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｈ）：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の少なくとも３’末端側を含んだ塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列の少なくとも３’末端側を含んだ塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ列
（ｈ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡ
から選択されるいずれかのＤＮＡ。
【請求項２】
前記（ａ）〜前記（ｄ）から選択される、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記プロモーター活性は、Issatchenkia orientalis又は近縁種におけるプロモーター活性である、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
Issatchenkia orientalis又はその近縁種に異種タンパク質を発現させるためのプロモーターである、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項５】
前記プロモーター活性は、Issatchenkia orientalis MF121株又はその近縁種におけるプロモーター活性である、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｅ）；
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有しIssatchenkia orientalisにおいて分泌シグナル活性を有するペプチド
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は２以上のアミノ酸残基を置換、挿入、欠失及び付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド
（ｅ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド
から選択されるいずれかのペプチド。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５で表される塩基配列の少なくとも５’末端側を含んだ塩基配列を有し、ターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有し、ターミネーター活性を有する塩基配列
（ｄ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、ターミネーター活性を有する塩基配列
から選択されるいずれかの塩基配列を有する、ＤＮＡ。
【請求項８】
Issatchenkia orientalisにおける発現系であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして備える、発現系。
【請求項９】
さらに、請求項６に記載のペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを分泌シグナルＤＮＡとして備える、請求項８に記載の発現系。
【請求項１０】
さらに、請求項７に記載のＤＮＡをターミネーターとして備える、発現系。
【請求項１１】
ベクターである、請求項８〜１０のいずれかに記載の発現系。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして用い、当該プロモーターの制御下に異種タンパク質をコードするＤＮＡを保持する、Issatchenkia orientalis及びその近縁種の形質転換体。
【請求項１３】
さらに、請求項７に記載のＤＮＡを前記プロモーターに対するターミネーターとして作動可能に保持する、請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
前記異種タンパク質はセルラーゼを含む、請求項１２又は１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
宿主が、Issatchenkia orientalis MF121株である、請求項１２〜１４のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項１６】
タンパク質の生産方法であって、
Issatchenkia orientalis又はその近縁種を宿主として、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして用い、前記プロモーターの制御下に異種タンパク質を発現させる工程、
を備える、方法。
【請求項１７】
有用物質の生産方法であって、
Issatchenkia orientalis又はその近縁種を宿主として、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして用い、前記プロモーターの制御下に異種タンパク質を発現させて前記有用物質を発酵生産する工程、を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Issatchenkia orientalis及びその近縁種における発現プロモーター及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、石油資源に替わり再生可能なバイオマスを有用物質に変換してエネルギー源や工業原料として用いる技術が検討されるようになってきている。バイオマスを原料として微生物の発酵により生産されるエタノールなどの有用物質は、石油資源の消費を抑え、大気中の二酸化炭素の増加を抑制するという観点から代替原料として期待されている。バイオマスには、各種存在するが、なかでも、食糧とは競合しない原料として、リグノセルロースを主体とする草本類や木本類などの利用が考えられている。
【０００３】
リグノセルロースに含まれる主要な糖は、セルロースを構成するグルコースと、ヘミセルロースを構成するキシロースである。リグノセルロースを化学的あるいは酵素的に分解するとこうした単糖を主として含む糖化組成物が得られる。リグノセルロースから有用物質を工業的に製造するためには、こうした糖化組成物中に含まれる糖を効率的に利用し、高収量、高生産性で発酵できる微生物が求められる。
【０００４】
Issatchenkia orientalis MF121株は耐熱性かつ耐塩性のエタノール発酵性酵母であり、バイオマスからのエタノール生産を行う場合に有望な菌株である。しかし、MF121株はC5糖（キシロース）からのエタノール発酵能力や、高分子の糖（セルロース、キシラン、デンプンなど）を糖化する能力をもたない。そのためこれらの能力を付与するためにはMF121株の遺伝子組換え系を構築して、MF121株での異種タンパク質（C5代謝関連酵素、セルラーゼなど）の発現を行う必要がある。I. orientalisにおいて異種タンパク質を発現させるには、I. orientalisで作動する発現プロモータと分泌シグナルとを組み合わせた発現システムの構築が必須である。
【０００５】
ある一つのI. orientalis株において、IoPGK1プロモーター下流に乳酸デヒドロゲナーゼを接続して乳酸を生産する方法が開示されている（特許文献１）。
【０００６】
酵母S. cerevisiaeの高発現プロモーターはよく知られている。たとえばTDH3, ADH1, PGK1, TPI1, TEF1遺伝子のプロモーター配列が高発現プロモーターとして利用されている。またHOR7プロモーターも高発現プロモーターとして報告されている（特許文献２）。
【０００７】
MF121株のURA3遺伝子配列はCandida glycerinogenes のURA3と同じ配列であったことから、この2菌株は近縁の株であると考えられる。C. glycerinogenes については近年遺伝子組換え系の開発に関する報告がなされている（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表2008-545429号公報
【特許文献２】特開2005-137306号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Li Y, Shen W, Wang Z, Liu JQ, Rao Z, Tang X, Fang H, Zhuge J (2005), Yeast 22:423-430
【非特許文献２】Chen X, Fang H, Rao Z, Shen W, Zhuge B, Wang Z, Zhuge J (2008) ,. Microbiol Res 163:531-537
【特許文献３】Zhiming R, Zheng M, Wei S, Huiying F, Jian Z (2008), Curr Microbiol 57:12-17
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
I. orientalisにおいて異種タンパク質を高発現させるには、I. orientalisにおいて有効な高発現プロモーターや分泌シグナルが必須であるが、特許文献１に記載のプロモーターは、必ずしも十分な発現量ではなかった。特許文献２では、S. cerevisiaeにおける高発現プロモーターが開示されている。しかしながら、本発明者らの検討によれば、S. cerevisiaeにおいて高発現するプロモーターであってもI. orientalisでは高発現するとはいえず、また、S. cerevisiaeにおいて発現する遺伝子カセットがI. orientalisで必ず発現するとはいえないことがわかった。さらに、非特許文献１〜３では、遺伝子組換えマーカーに関するものであって、高発現プロモーターに関するものではない。
【００１１】
このように、現在までのところ、I. orientalisにおいて有効な高発現プロモーターは提供されておらず、したがって、有効な高発現系も構築されていない。そこで、本明細書の開示は、I. orientalis及びその近縁種における高発現プロモーターとその用途を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、I. orientalisで異種タンパク質を高発現させるために有効なプロモーターを種々検討した結果、I. orientalisにおいて有効な高発現プロモーターを見出した。さらに、有効なターミネーターも見出した。本明細書の開示によれば、これらの知見により以下の手段が提供される。
【００１３】
（１）以下の（ａ）〜（ｈ）：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列の少なくとも３’末端側を含んだ塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列の少なくとも３’末端側を含んだ塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｈ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡ
から選択されるいずれかのＤＮＡ。
（２）前記（ａ）〜前記（ｄ）から選択される、（１）に記載のＤＮＡ。
（３）前記プロモーター活性は、Issatchenkia orientalis又は近縁種におけるプロモーター活性である、（１）又は（２）に記載のＤＮＡ。
（４）Issatchenkia orientalis又はその近縁種に異種タンパク質を発現させるためのプロモーターである、（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（５）前記プロモーター活性は、Issatchenkia orientalis MF121株又はその近縁種におけるプロモーター活性である、（１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（６）  以下の（ａ）〜（ｅ）；
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性のアミノ酸配列を有しIssatchenkia orientalisにおいて分泌シグナル活性を有するペプチド
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は２以上のアミノ酸残基を置換、挿入、欠失及び付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド
（ｅ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド
から選択されるいずれかのペプチド。
（７）  以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５で表される塩基配列の少なくとも５’末端側を含んだ塩基配列を有し、ターミネーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有し、ターミネーター活性を有する塩基配列
（ｄ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、ターミネーター活性を有する塩基配列
から選択されるいずれかの塩基配列を有する、ＤＮＡ。
（８）Issatchenkia orientalisにおける発現系であって、
（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして備える、発現系。
（９）さらに、（６）に記載のペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを分泌シグナルＤＮＡとして備える、（８）に記載の発現系。
（１０）さらに、（７）に記載のＤＮＡをターミネーターとして備える、（８）又は（９）に記載の発現系。
（１１）ベクターである、（８）〜（１０）のいずれかに記載の発現系。
（１２）（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして用い、当該プロモーターの制御下に異種タンパク質をコードするＤＮＡを保持する、Issatchenkia orientalis及びその近縁種の形質転換体。
（１３）さらに、（７）に記載のＤＮＡを前記プロモーターに対するターミネーターとして作動可能に保持する、（１２）に記載の形質転換体。
（１４）前記異種タンパク質はセルラーゼを含む、（１２）又は（１３）に記載の形質転換体。
（１５）宿主が、Issatchenkia orientalis MF121株である、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の形質転換体。
（１６）タンパク質の生産方法であって、
Issatchenkia orientalis又はその近縁種を宿主として、（１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして用い、前記プロモーターの制御下に異種タンパク質を発現させる工程、
を備える、方法。
（１７）有用物質の生産方法であって、
Issatchenkia orientalis又はその近縁種を宿主として、（１）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡをプロモーターとして用い、前記プロモーターの制御下に異種タンパク質を発現させて前記有用物質を発酵生産する工程、を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】BGLを発現するMF121株によるセロビオースおよびグルコースを炭素源とした発酵試験結果を示す図である。
【図２】BGLを発現するMF121株による結晶性セルロースの同時糖化発酵試験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書の開示は、I. orientalisを利用した発現系に有効なプロモーター等やそれらの用途に関する。本明細書の開示によれば、バイオマスの利用に有用であると考えられるI. orientalis MF121株を含むI. orientalis及びその近縁種において異種タンパク質の発現を容易に実施することができ、しかも、異種タンパク質を高発現させることができる。この結果、I. orientalisの利点である耐熱性及び耐塩性を利用した各種有用物質のより優れた発酵生産が可能となる。
【００１６】
本発明者らは、I. orientalis MF121株においてHOR7プロモータ制御下で異種タンパク質（ファネロケーテ・クリソスポリウム由来のエンドグルカナーゼcel12A）の発現を試みたが、cel12Aは発現できなかった。このことは、S. cerevisiaeで高発現するプロモータがI. orientalisで必ずしも高発現しないということを示している。
また、MF121株のウラシル要求性変異株に、S. cerevisiae由来のURA3マーカー遺伝子（URA3プロモータ、URA3構造遺伝子およびURA3ターミネータを含むマーカーカセット）を導入しても、ウラシル要求性を相補することができなかった。このことは、S. cerevisiaeで発現する遺伝子カセットがI. orientalisで必ずしも発現できないということを示している。
【００１７】
なお、Issatchenkia orientalis MF121株は、平成１５年５月２２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所及び特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９３６８として寄託されている。
【００１８】
以下、本発明の各種実施形態について詳細に説明する。
【００１９】
（プロモーターＤＮＡ）
本明細書の開示はI. orientalis及びその近縁種において異種タンパク質の発現用として好ましいプロモーターＤＮＡを提供する。そのＤＮＡの一つの態様は、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡである。配列番号１で表される塩基配列は、I. orientalis MF121株（以下、単に、MF121株という。）のTDH1遺伝子のプロモーターＤＮＡ（以下、単に、ＴＤＨ１プロモーターという。）である。また、他の一つの態様は、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡである。配列番号２で表される塩基配列は、MF121株のPGK1遺伝子のプロモーターＤＮＡ(以下、単にＰＧＫ１プロモーターという。)である。
【００２０】
ＴＤＨ１プロモーター及びＰＧＫ１プロモーターは、I. orientalis及びその近縁種において異種タンパク質の発現に関しプロモーター活性を有する限り、上記配列番号１、２と一定の関係を有する塩基配列を有するものであってもよい。
【００２１】
ＴＤＨ１プロモーターの他の態様としては、配列番号１で表される塩基配列の少なくとも３’末端側を含んで、プロモーター活性を有するＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の同一性の塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡ、及び配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２２】
ＰＧＫ１プロモーターの他の態様としては、配列番号２で表される塩基配列の少なくとも３’末端側を含んで、プロモーター活性を有する塩基配列、配列番号２で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有し、プロモーター活性を有する塩基配列、及び列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、プロモーター活性を有する塩基配列が挙げられる。
【００２３】
本発明者らによれば、配列番号１及び配列番号２でそれぞれ表される塩基配列において、３’末端はプロモーター活性に重要な要素が含まれていることがわかっている。また、配列番号１や２で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とのハイブリダイズにおいては、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることが好ましい。
【００２４】
ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち配列番号１で表わされる塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、一層好ましく９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、配列番号１又は２で表される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、一層好ましく９５％以上、より一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有し、プロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２５】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００２６】
プロモーター活性を有するとは、少なくとも、下流に接続されたタンパク質をコードするＤＮＡをｍＲＮＡに転写する活性を意味している。好ましくは、当該タンパク質を最終的に翻訳する活性を含んでいる。また、プロモーター活性は、I. orientalis及びその近縁種におけるプロモーター活性であることが好ましく、I. orientalis又はその近縁種に異種タンパク質を発現させるためのプロモーター活性であることがより好ましい。さらに、プロモーター活性は、Issatchenkia orientalis MF121株又はその近縁種におけるプロモーター活性であることが好ましい。こうしたプロモーター活性は、後述する実施例に記載される試験方法のほか、当該分野において当業者に公知の方法で取得することができる。プロモーター活性の高低は、例えば、特表2008-545429号公法に開示されるI. orientalis由来のＰＧＫ１プロモーター等と対比することで評価することができる。本明細書の開示されるプロモーターＤＮＡのプロモーター活性は、先行技術に開示されるＰＧＫ１プロモーターのプロモーター活性に対して、１４０％以上であることが好ましく、１５０％以上であることがより好ましく、１６０％以上であることがさらに好ましく、１７０％以上であることが一層好ましく、１８０％以上でることがさらに一層好ましい。
【００２７】
上記各種態様のプロモーターＤＮＡは、例えば、配列番号１等の配列に基づいて設計したプライマーを用いて、所定の酵母から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、プロモーターＤＮＡの一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいはプロモーターＤＮＡは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００２８】
また、上記各種態様のプロモーターＤＮＡは、例えば、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００２９】
そのほか、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、例えば、配列番号１又は２等の公知配列に基づいて、各種態様のプロモーターＤＮＡを取得することができる。
【００３０】
（ターミネーターＤＮＡ）
本明細書の開示はI. orientalis及びその近縁種において異種タンパク質の発現用として好ましいターミネーターＤＮＡを提供する。そのＤＮＡの一つの態様は、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡである。配列番号５で表される塩基配列は、MF121株のＴＥＦ１遺伝子のプロモーターＤＮＡ（以下、単にＴＥＦ１ターミネーターという。）であるＴＥＦ１ターミネーターは、I. orientalis及びその近縁種において異種タンパク質の発現に関しターミネーター活性を有する限り、配列番号５と一定の関係を有する塩基配列を有するものであってもよい。
【００３１】
ＴＥＦ１ターミネーターの他の態様としては、配列番号５で表される塩基配列の少なくとも５’末端側を含んだ塩基配列を有し、ターミネーター活性を有するＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有し（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、一層好ましく９５％以上、より一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する。）、ターミネーター活性を有するＤＮＡ、及び配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３２】
ターミネーター活性を有するとは、少なくとも、上流に接続されたタンパク質をコードするＤＮＡをｍＲＮＡへの転写を終結させる活性を意味している。好ましくは、当該タンパク質を最終的に翻訳可能な態様で転写を終結させる活性を含んでいる。また、ターミネーター活性は、I. orientalis及びその近縁種におけるターミネーター活性であることが好ましく、I. orientalis又はその近縁種に異種タンパク質を発現させる際のターミネーター活性であることがより好ましい。さらに、ターミネーター活性は、I. orientalis MF121株又はその近縁種におけるプロモーター活性であることが好ましい。また、ターミネーター活性は、本明細書の開示されるI. orientalisに適したプロモーターと組み合わされて用いる際のターミネーター活性であることが好ましい。ターミネーター活性は、後述する実施例に記載される試験方法のほか、当該分野において当業者に公知の方法で取得することができる。例えば、ターミネーター活性の有無は、作動が確認されているプロモーターと組み合わせて用いて、正しい翻訳産物の生産量あるいは翻訳産物の活性で評価することができる。なお、ターミネーター活性の高低は特に問わない。
【００３３】
ターミネーターＤＮＡにおける塩基配列の同一性やハイブリダイズについては、既に説明したプロモーターＤＮＡにおける同一性やハイブリダイズ条件等が適用される。また、ターミネーターＤＮＡは、プロモーターＤＮＡと同様の方法で取得することができる。
【００３４】
（シグナルペプチド）
本明細書の開示はI. orientalis及びその近縁種において異種タンパク質のシグナルペプチドとして好ましいペプチドを提供する。そのペプチドの一つの態様は、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。配列番号３で表されるアミノ酸配列は、MF121株のＳＥＤ１遺伝子のシグナルペプチド（以下、単に、ＳＥＤ１シグナルペプチドという。）。ＳＥＤ１シグナルペプチドは、I. orientalis及びその近縁種において異種タンパク質の発現に関しシグナルペプチドとして機能する（分泌シグナル活性を有する）限り、上記配列番号３と一定の関係を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００３５】
ＳＥＤ１シグナルペプチドの他の態様としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、I. orientalis及びその近縁種において分泌シグナル活性を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は２以上のアミノ酸残基を置換、挿入、欠失及び付加して得られるアミノ酸配列を有し、分泌シグナル活性を有するペプチド、配列番号４で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチド、及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、分泌シグナル活性を有するペプチドが挙げられる。
【００３６】
上記他の態様において、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異は、すなわち、欠失、置換若しくは付加は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、好ましくは、１個以上１０個以下程度である。より好ましくは、１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、保存的置換が好ましく、具体的には以下のグループ内での置換が挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。
【００３７】
他の一態様において、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対する同一性は、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上であり、より一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
【００３８】
シグナルペプチドに関連するアミノ酸配列及び塩基配列の同一性やハイブリダイズについては、既に説明したプロモーターＤＮＡにおける同一性やハイブリダイズ条件等が適用される。
【００３９】
他の一態様において、配列番号４で表される塩基配列に対する同一性は、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、一層好ましくは９５％以上であり、より一層好ましくは９８％以上であり、最も好ましくは９９％以上である。
【００４０】
（分泌シグナルＤＮＡ）
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ（分泌シグナルＤＮＡ）は、こうした各種態様のシグナルペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含んでいる。さらに、分泌シグナルＤＮＡは、配列番号４で表される塩基配列、配列番号４で表される塩基配列と７０％以上の同一性を有し、分泌シグナル活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の相補鎖とハイブリダイズし、分泌シグナル活性を有するタンパク質をコードする塩基配列から選択されるいずれかの塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。こうしたＤＮＡも、プロモーターＤＮＡと同様の方法で取得することができる。なお、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と上記のように一定の関連性のあるアミノ酸配列をコードする塩基配列は、遺伝暗号の縮重に従い、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の種類の塩基に置換することができる。従って、本明細書の開示されるシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換された塩基配列をコードするＤＮＡも包含している。
【００４１】
分泌シグナルＤＮＡにおける塩基配列の同一性やハイブリダイズについては、既に説明したプロモーターＤＮＡにおける同一性やハイブリダイズ条件等が適用される。また分泌シグナルＤＮＡは、プロモーターＤＮＡと同様の方法で取得することができる。
【００４２】
（I. orientalisにおける発現系）
本明細書に開示されるI. orientalisにおける発現系は、本明細書に開示の細書に開示されるプロモーターＤＮＡを備えることができる。発現系は、I. orientalis及びその近縁種におけるタンパク質、特に異種タンパク質の発現を意図したものであることが好ましい。発現系は、タンパク質の分泌発現を意図する場合には、本明細書に開示されるシグナルペプチドをコードする分泌シグナルＤＮＡを備えることができる。さらに、発現系には、本明細書に開示されるターミネーターＤＮＡを備えることができる。
【００４３】
発現系は、I. orientalis及びその近縁種におけるタンパク質の発現を意図したものであれば、その形態は特に問わない。例えば、プラスミドなどの形態を採るベクターであってもよい。ベクターにおいては、プロモーターＤＮＡのほか、必要に応じて分泌シグナルＤＮＡ及び／又はターミネーターＤＮＡを備えることができる。発現系がいわゆる組換えベクターの形態を採るとき、プロモーターＤＮＡの制御下に発現を意図したタンパク質をコードするＤＮＡの挿入が容易なように構築され、また、マーカー遺伝子が備えられる。さらに、発現系が、遺伝子置換等、染色体への所望のＤＮＡ断片の組み込みを意図する場合は、染色体上の所定の領域との相同領域を有している。こうしたベクターは、商業的に入手可能な酵母用の発現ベクターを適宜利用して、当業者に公知の手法、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば作製することができる。発現系は、発現キットとして、必要な制限酵素等を含むこともできる。
【００４４】
（形質転換体）
本明細書に開示されるI. orientalis及びその近縁種の形質転換体は、本明細書に開示されるプロモーターＤＮＡと、当該プロモーターの制御下にタンパク質をコードするＤＮＡを保持することができる。本明細書に開示される形質転換体によれば、I. orientalis及びその近縁種の有する利点等を生かしてタンパク質を生産し有用物質をすることができる。
【００４５】
本明細書に開示される形質転換体は、宿主をI. orientalis及びその近縁種とすることが好ましい。I. orientalisに属する宿主微生物としては、既に記載のMF121株を利用できる。さらに、MF121株と同等以上の耐熱性及び／又は耐塩性を有する改変体や突然変異体を用いることもできる。さらに、I. orientalisの近縁種を用いることができる。近縁種かどうかは、微生物学において採用される特定遺伝子による類似性等に基づく基準によって決定される。
【００４６】
形質転換体は、プロモーターＤＮＡのほか、このプロモーターに対してターミネーターとして作動可能に本明細書に開示されるターミネーターＤＮＡを保持することができる。さらに、タンパク質を分泌発現させる場合には、翻訳産物が意図したタンパク質のシグナルペプチドとして機能するように分泌シグナルＤＮＡを保持することができる。
【００４７】
こうしたＤＮＡは、宿主微生物の染色体外に保持されていてもよいし、染色体上に保持されていてもよい。また、こうしたＤＮＡの組み合わせは、複数コピーが宿主において保持されていてもよい。
【００４８】
形質転換体において発現を意図するタンパク質は、特に限定されない。バイオマスの有効利用の観点からは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどの各種セルラーゼのほか、キシラナーゼやヘミセルラーゼ等のその他のバイオマス分解酵素が挙げられる。これらのタンパク質は、シグナルペプチドにより形質転換体の細胞外に分泌発現されることが好ましい。こうしたタンパク質を発現させること、特に分泌発現させることで、形質転換体は、バイオマス由来のセルロースやヘミセルロースを分解しつつ、分解産物であるグルコース等を利用して増殖することができ、有用物質を発酵生産することができる。
【００４９】
さらに、形質転換体は、後段で説明するように発酵により所望の有用物質を生産可能に改変が施されていてもよい。酵母は通常嫌気性発酵によりエタノールを生産するが、適宜遺伝子工学的な改変等により他の有用物質を生産可能に形質転換されていてもよい。本明細書に開示される形質転換体は、例えば、乳酸などの有機酸を生産する酵母（特開２００３−２５９８７８号公報、特開２００６−００６２７１号公報、特開２００６−２０６０２号公報、特開２００６−７５１３３号公報、特開２００６−２９６６３７７号公報、特開２００７−８９４６６号公報に記載）等における遺伝的改変等を備えることができる。
【００５０】
（形質転換体の作製）
本明細書に開示される形質転換体は、本明細書に開示される発現系を公知の方法を用いて宿主微生物を形質転換することにより得ることができる。形質転換体は、本明細書に開示される発現系を利用して作製することができる。例えば、ベクターの導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。ベクターを導入した宿主微生物につき、マーカー遺伝子を用いた選抜及び活性発現による選抜により形質転換体を得ることができる。こうした形質転換操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
【００５１】
（タンパク質の生産方法）
本明細書に開示されるタンパク質の生産方法は、I. orientalis又はその近縁種を宿主として、本明細書に開示されるプロモーターＤＮＡをプロモーターとして用い、このプロモーターの制御下に異種タンパク質を発現させる有利な特性を利用して効率的にタンパク質を生産することができる。タンパク質の生産方法は、本明細書に開示される形質転換体の培養工程ないし当該形質転換体を用いた発酵工程として実施することができる。培養又は発酵条件は、I. orientalis又はその近縁種に適切な条件が設定される。I. orientalisは酵母であるため、一般的に酵母に適用可能な培養条件が適用されるほか、I. orientalisの耐熱性及び／又は耐塩性に応じた条件が適宜設定される。典型的には、例えば、発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００５２】
（有用物質の生産方法）
本発明の有用物質の製造方法は、Issatchenkia orientalis又はその近縁種を宿主として、本明細書に開示されるプロモーターＤＮＡをプロモーターとして用い、前記プロモーターの制御下に異種タンパク質を発現させて前記有用物質を発酵生産する工程、を備えることができる。有用物質としては特に限定しないが、宿主微生物がグルコースを利用して生産可能なものであればよい。有用物質は、グルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を、宿主微生物の遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物であってもよい。具体的には、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコール、乳酸などの有機酸の他、イソプレノド合成経路の追加によるファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。I. orientalisはアルコール発酵能が高く、耐熱性及び／又は耐塩性に優れるため、本明細書に開示される形質転換体は、高効率にエタノールを始めとする有用物質を生産することができる。また、本明細書に開示される発現系によってバイオマスを利用可能にセルラーゼが発現される形質転換体を用いることで、セルロース含有材料を有効利用して有用物質を効率的に生産できる。
【００５３】
発酵工程では、グルコースなどの通常の炭素源を用いることができる。また、形質転換体がセルラーゼを発現する場合には、バイオマス、その処理物、セルロース、ヘミセルロースなどのバイオマス由来の材料を炭素源として用いることができる。発酵工程では、I. orientalisの耐熱性及び／又は耐塩性を考慮し、酵母に一般的に適用される培養条件を適宜選択し修正して用いることができる。
【００５４】
発酵工程の実施により、用いた形質転換体の有する有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。例えば、本発明の形質転換酵母がエタノール生産能力を有している場合には、エタノールであり、乳酸を生産可能に改変されている場合には、乳酸等となる。発酵終了後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は有用物質の種類等に応じて適宜選択される。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning： A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。なお、以下の実施例で用いる培地を表１にまとめて示す。
【実施例１】
【００５６】
（MF121株の高発現遺伝子の同定）
I. orientalis MF121株で外来タンパク質を高発現させるためには、MF121株由来の高発現プロモータが必要となる。そこでEST（expressed sequence tag）解析により発現量の多い遺伝子を同定し、そのプロモーター領域を取得することにした。
【００５７】
グルコース100 g/Lを含むYPD培地にMF121株を接種し、微好気条件下でアルコール発酵を行った。20時間後、培地から盛んな発泡が観察され、活発なアルコール発酵が行われている状態の菌体を取得し、total RNAを抽出した。得られたtotal RNAからmRNAを精製し、さらに逆転写反応を行ってcDNAを合成した。得られたcDNA をpBluescriptベクターに挿入してcDNAライブラリーを作製した。cDNAライブラリーを大腸菌に形質転換し、ランダムに選択した571クローンからベクターを抽出し、ベクターに挿入されたcDNAの5'末端方向からシークエンス解析を行ったところ、66遺伝子については同じ配列が2クローン以上存在しており、比較的高発現している遺伝子であると考えられた。シークエンスされた配列から予想されるアミノ酸配列を公開されているSaccharomyces cerevisiaeの遺伝子情報と比較して相同遺伝子を同定した。出現クローン数が多く、高発現していると考えられる2種の遺伝子を以下の表に示す。
【００５８】
【表１】
2011050362.tif 000002
【実施例２】
【００５９】
（MF121株の高発現プロモーターの取得）
アダプターライゲーション法によりMF121株のゲノムライブラリを作製し、上記シークエンスで得られた配列情報を基に、IoTDH1およびIoPGK1遺伝子のプロモーター配列の取得を試みた。Current Protocols in Molecular Biology (1997) 13.11.2項に記載の酵母のゲノムDNA取得方法（Rapid isolation of yeast chromosomal DNA）に従ってMF121株のゲノムDNAを調整した。得られたゲノムDNA約5 μgを制限酵素SspIで消化したのち、70℃、15分間加熱してSspIを失活させ、さらにDNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Reserch社製)を用いてゲノムDNA断片を精製した。次にSspIで消化したゲノムDNA約2.5 μgと、アダプタープライマーFとアダプタープライマーRをそれぞれ25 pmolを混合し、LigaFast DNA Ligation System（Promega社製）を用いてゲノムDNAの両末端にアダプターDNAをライゲーションした。
【００６０】
アダプタープライマーF：
5'- tagcggtaaagaccggtgaaactggaatttgctcacaatcgcaggtgtgcgggccaagcg -3'（配列番号６）
アダプタープライマーR：
5'- cgcttggcccgcacacctgcgattgtgagcaaattccagtttcaccggtctttac -3'（配列番号７）
【００６１】
次に、アガロースゲル電気泳動にて500bpより大きい画分を分取し、Zymoclean Gel DNA Recovery Kit(Zymo Reserch社製)を用いてDNAを精製した。得られたDNAを鋳型とし、プライマーセット１（AP1とIoTDH+200R）、プライマーセット２（AP1とIoPGK+190R）によりそれぞれIoTDH1およびIoPGK1遺伝子の5'フランキング領域をPCR増幅した（1st PCR）。なお、PCRにはEx-Taq DNA polymerase（Takara社製）を用いた。次に上記1st PCR産物をDNA Clean & Concentrator-5を用いて精製したDNAを鋳型とし、プライマーセット３（AP2とIoTDH+170R）、プライマーセット４（AP2とIoPGK+150R）を用いて2nd (nested) PCRを行った。
【００６２】
AP1：5'- gaccggtgaaactggaatttgc -3'（配列番号８）
AP2：5'- acaatcgcaggtgtgcgggc -3'（配列番号９）
IoTDH+200R：5'- gtgatggcattgtccttaccag -3'（配列番号１０）
IoTDH+170R：5'- cccttgtacttaccgtgggtg -3'（配列番号１１）
IoPGK+190R：5'- agtgggaagcaagaacaacgtatc -3'（配列番号１２）
IoPGK+150R：5'- aacatattcaattgttggaagagcag -3'（配列番号１３）
【００６３】
2nd PCR産物をアガロースゲル電気泳動し、400bp以上のサイズのバンドを切り出してZymoclean Gel DNA Recovery KitによりDNAを精製したのちTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてPCR-TOPOベクターにクローニングした。シークエンスによりIoTDH1遺伝子およびIoPGK1遺伝子の5’上流配列をそれぞれ629 bpおよび545 bpを得た。これらの配列を下記でIoTDH1プロモーター（配列番号１）およびIoPGK1プロモーター（配列番号２）として使用した。
【実施例３】
【００６４】
（MF121株の分泌シグナルの取得）
酵母でタンパク質を分泌発現するには、目的タンパク質のN末端に分泌シグナルを融合する必要がある。そこで、上記のMF121株のESTの中で比較的発現量が多く、S.cerevisiaeの分泌タンパク質と相同性のある遺伝子を検索した。その結果、S.cerevisiaeの分泌タンパク質であり細胞表層タンパク質をコードするSED1遺伝子と相同性を示すIoSED1遺伝子を見出した。IoSED1タンパク質のN末端配列をGenetyx Win ver9.1.2（ゼネティックス）のSignal peptide predictionプログラムを用いて分泌シグナル配列を予測した。得られた配列をMF121株由来の分泌シグナル配列（Secretion Signal of MF121 SED1 homolog; SSMS）として以下で使用した（配列番号３、４）。
【実施例４】
【００６５】
（デスティネーションベクターpRS333D-MfURA3の作製）
２ミクロン複製配列をもつマルチコピーベクターpYO323（NBRP ID:BYP563）をSmaI制限酵素（タカラバイオ）で37℃で処理し、電気泳動後、目的サイズのゲルをカットし、Zymoclean Gel DNA Recovery kit (Zymo Research)でゲルからDNAを精製した。精製したDNAを使い、TsAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (プロメガ)で65℃、15分処理し、ccdB遺伝子とクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA配列Gateway Reading frame cassette A (インビトロジェン)と混ぜ、LigaFast Rapid DNA Ligation System (プロメガ)で15分間室温でライゲーション反応を行った。ライゲーション産物を1 μl使い、One Shot ccdB Survival T1 Pharge Resistant cells（インビトロジェン）へ形質転換し、LB + 50 μg/mlアンピシリン + 30 μg/mlクロラムフェニコール培地へまいた。プレートに生えたコロニーをM13-F, M13-Rプライマーを使い、コロニーPCRにより、インサートを確認し、pRS333Dと名付けた。
【００６６】
M13-F：5'- catggtcatagctgtttcc -3'（配列番号１４）
M13-R：5'- ggaaacagctatgaccatg -3'（配列番号１５）
【００６７】
次に、MF121株よりクローニングしたIoURA3マーカー遺伝子（特願2008-106114に開示される。）を持つベクターpTOPO-IoURA3を制限酵素NotIとSacI（タカラバイオ）で処理し、電気泳動後、IoURA3配列をもつゲルをカットし、Zymoclean Gel DNA Recovery kitでゲルからDNAを精製した。なお、IoURA3マーカー遺伝子のＤＮＡ断片は、約１６００ｂｐ（配列番号１６）であり、そのうち、URA3タンパク質をコードするIoURA3ORFは約８００ｂｐであった（配列番号１７、１８）
【００６８】
同様に、pRS333Dを制限酵素NotIとSacI（タカラバイオ）で処理後、ベクターを含むゲルをカットし、Zymoclean Gel DNA Recovery kitでゲルからDNAを精製した。DNA断片を混ぜ、LigaFast Rapid DNA Ligation Systemによりライゲーション反応を行い、DH5αへ形質転換し、LB+100μg/mlアンピシリン培地にまいた。プレートに生えたコロニーをT7-F、T3-Rプライマーでインサートを確認し、pRS333D-IoURA3と名付けた。
【実施例５】
【００６９】
（エントリーベクターの作製）
MF121株由来のプロモーター（IoTDH1p, IoPGK1p）および比較としてS. cerevisiae由来のTDH3プロモーター（ScTDH3p:配列番号１９）およびPGK1プロモーター（ScPGK1p：配列番号２０）を用いてAspergillus aculeatus 由来のβ-glucosidase（AaBGL）遺伝子(GenBank accession number D64088)の発現ベクターを作製した。表２に示す組み合わせで、プロモーター、分泌シグナル、AaBGL1遺伝子、ターミネーターを順次連結して発現カセットを構築し、pBluescriptベクターにクローニングした。さらに発現カセットの5'上流側と3'下流側にそれぞれGateway 用のattL1およびattL2配列（インビトロジェン）を付加してエントリーベクターとした。
【００７０】
【表２】
2011050362.tif 000003
【実施例６】
【００７１】
（発現ベクターの作製）
pRS333D-IoURA3と表２に示した5種類のエントリーベクターをそれぞれ混合しLR clonase enzyme mix (インビトロジェン)を用いたLR反応を25℃で終夜行い、プロテイナーゼKを混ぜ37℃で10分反応後、DH５αへ形質転換し、LB+100μg/mlアンピシリン培地へまいた。プレートに生えたコロニーについてコロニーPCR法にてインサートを確認した。作製したAaBGL発現ベクターの構成を表３にまとめた。
【００７２】
【表３】
2011050362.tif 000004
【実施例７】
【００７３】
（β-glucosidase（BGL）の形質転換）
MF121株のura3変異株であるTTK100株へ、pHU-IoTDH1p-AaBGL(IoTEF1t)、pHU-IoTDH1p-AaBGL(ScSAG1t)、pHU-ScTDH3p-AaBGL(IoTEF1t）、pHU-IoPGK1p-AaBGL(ScSAG1t)およびpHU-ScPGK1p-AaBGL(IoTEF1t)を形質転換した。方法は次のように行った。TTK100をYPD培地、30℃、1日培養後、培養液1mlを10mlのYPD培地に植菌し、30℃で5時間培養した。培養液をミリQ水で洗浄し、ペレット状にした。60％ポリエチレングリコール3350を120 μｌ、4 M酢酸リチウムを5 μｌ、1 Mジチオスレイトールを10 μｌ、10 mg/ml鮭精子ＤＮＡを10 μｌ、ベクターＤＮＡを10 μｌ、細胞懸濁液を45 μｌ加え、42℃で2時間熱ショックを与えた。細胞を洗浄後、SD-ウラシル選択培地へまき、増殖したコロニーを再度SD-ウラシル選択培地で純化した。
比較としてS.cereivisiae BY4741株にpHU-IoTDH1p-AaBGL(IoTEF1t)を上記と同様の方法で形質転換した。形質転換体はSD-ヒスチジンプレートを用いて選抜した。
【実施例８】
【００７４】
（BGL活性測定）
実施例７で取得した形質転換体のBGL活性を評価した。形質転換体を2 mlのカザミノ酸培地（0.17% Yeast nitrogen base w/o a.a. and a.s.、1% カザミノ酸、2%グルコース）に植菌し、30℃で1日培養した。培養液を遠心し、上清を分離して活性測定に使用した。上清の活性は次のように測定した。上清20 μｌ、MQ水680 μｌ、250 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)200 μｌ、20 mM p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG; Sigma-Aldrich)100 μｌを加え、1 ｍｌとした。30℃で30分反応させ、100 μｌを1 N炭酸ナトリウム水溶液50 μｌを加えて反応を停止した後、A400を測定した。細胞表面の活性は次のように測定した。細胞はMQ水で2回洗浄後、OD600=1に調整した細胞懸濁液50μｌ、MQ水650 μｌ、250 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)200 μｌ、20mM pNPG 100 μｌを加え、1 mｌとした。30℃で30分反応させ、150 μｌを遠心し、上清100 μｌに1 N 炭酸ナトリウム水溶液50 μｌを加えて反応を停止した後、Ａ400を測定した。測定した数値からBGL活性（U; unit）を算出した。なお、1 min当たり、1 μmolのp-nitrophenolが遊離する量を1 Uとした。各ベクターで得られた形質転換体数とBGL活性が認められた形質転換体数を表４にまとめた。
【００７５】
【表４】
2011050362.tif 000005
【００７６】
プロモーターとしてMF121株由来のIoTDH1pおよびIoPGK1pを使用した場合には、ターミネーターのとしてIoTER1tとScSAG1tのどちらを用いた場合もBGL活性を発現する形質転換体が得られた。一方、プロモーターとしてS.crevisiae由来のScTDH3pおよびScPGKpを用いた場合にはBGL活性を発現する形質転換体は得られなかった。このことにより、MF121株由来のIoTDH1pおよびIoPGK1pを使用すれば異種遺伝子の発現が可能であることが明らかとなった。一方、S.crevisiae由来のScTDH3pおよびScPGKpはMF121株では機能しないことが分かった。
【実施例９】
【００７７】
次にBGL活性の発現が確認された形質転換体を用いてBGL活性を定量した結果を表５に示す。培地上清にBGL活性が確認されたことから、MF121株由来の分泌シグナルSSMSが正しく機能して、異種タンパクの分泌発現が可能であることが明らかとなった。
同じIoTDH1プロモーターを用いてTTK100株（MF121株のura3変異株)に導入した場合IoTEF1 ターミネーターを用いた場合の方がScSAG1 ターミネーターに比べてBGL活性が20％以上高かった。このことから、ターミネーターとしてMF121株由来のIoTEF1 ターミネーターを用いる方がS. cerevisiae由来のScSAG1ターミネーターを用いるよりも高い活性が得られることが分かった。また、同じScSAG1ターミネーターを用いた場合でIoTDH1プロモーターとIoPGK1 プロモーターを比較すると、IoTDH1 プロモーターのほうが上清では1.8倍、細胞表面では1.7倍高い活性が得られた。
【００７８】
【表５】
2011050362.tif 000006
【００７９】
また、S. cerevisiae BY4741株を宿主として用いた場合、IoTDH1プロモーターとIoTEF1ターミネーターを用いてもBGL活性が発現した。このことから、MF-121株のIoTDH1プロモーターとIoTEF1ーミネータはS. cerevisiaeでは機能することが分かった。しかしBY4741株でScTDH3pを用いた場合の方がより高い活性を示した。
【実施例１０】
【００８０】
（BGL発現株のセロビオース培地での増殖）
pHU-IoTDH1p-AaBGL(IoTEF1t)を形質転換したTTK100株（TTK100/AaBGL株）とBY4741株（BY4741/AaBGL株）をそれぞれ5 mlのセロビオース・カザミノ酸培地（0.17% Yeast nitrogen base w/o a.a. and a.s.、1% カザミノ酸、2%セロビオース）を入れたL字型試験管に植菌し、バイオフォトレコーダー（TVA062CA, ADVANTECH）を用いて、30℃、70rpmの条件で振とう培養を行い菌体濃度（OD660）を経時的に測定した。得られた増殖曲線から比増殖速度を算出した（表６）。TTK100/AaBGL株の比増殖速度はベクターコントロール（TTK/vector）やBY4741/AaBGL株に比べて有意に高かった。
【００８１】
【表６】
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【実施例１１】
【００８２】
（BGL発現株のセロビオースからのエタノール発酵）
pHU-IoTDH1p-AaBGL(IoTEF1t)を形質転換したTTK100株（TTK100/AaBGL株）を使い、セロビオースを基質としたときの発酵速度の評価を行うために、セロビオースとグルコースを炭素源としたエタノール発酵試験を40℃で行った（図１）。カザミノ酸培地で30℃、1日前培養した細胞をミリQ水で洗浄後、OD600＝10/20mlに相当する細胞を遠心し、20 mlのカザミノ酸培地-5%グルコース（0.17% Yeast nitrogen base w/o a.a. and a.s.、1% カザミノ酸、5%グルコース）、またはカザミノ酸-5%セロビオース培地（0.17% Yeast nitrogen base w/o a.a. and a.s.、1% カザミノ酸、4.75%セロビオース）を加え、40℃、スターラーで攪拌した。発酵開始後6〜8時間で糖を資化し、エタノールを生産した。グルコースとセロビオースの糖消費速度は、ほぼ同等であった。また、エタノール発酵速度も同様であった。BGL分泌酵母は、セロビオースを基質としてもグルコースと同等の能力を持つことから、セロビオースを分解するのに十分なBGLが分泌されていることがわかった。なお、コントロールベクターを導入したTTK100株（TTK100/vector）は、セロビオースを資化することができなかった。
【実施例１２】
【００８３】
（BGL発現株の結晶性セルロースからのエタノール発酵）
pHU-IoTDH1p-AaBGL(IoTEF1t)を形質転換したTTK100株（TTK100/AaBGL株）を用いて、結晶性セルロースであるアビセル（Avicel PH101, SIGMA）を基質とし、市販のセルラーゼ製剤を添加した同時糖化発酵を行った（図２）。TTK100/AaBGL株と基準株（コントロールベクターを導入したTTK100株；TTK100/vector）を30℃で前培養し、OD600= 10となるようにアビセル・カザミノ酸培地（0.17% YNB、1%カザミノ酸、アビセル4g/40ml（100g/l））に植菌し、市販のセルラーゼ酵素製剤(novozyme)を15FPU/g アビセル、またはセルラーゼ酵素製剤にその5分の1量（vol/vol）のBGL添加剤（Novozyme188；novozyme)を加えて調製したBGL添加セルラーゼ製剤を22.2FPU/g を加え、40℃で発酵試験を行った。基準株は、セルラーゼ酵素製剤のみでは24時間後に７g/lのエタノールを生産し、BGL添加セルラーゼ製剤では17g/lエタノールを生産した。このことから、セルラーゼ酵素製剤のみでは結晶性セルロースを糖化する能力が不十分であり、十分な糖化を行うためにはBGL添加セルラーゼ製剤を添加する必要があることが分かった。一方、BGL分泌株はセルラーゼ酵素製剤のみで、２４時間後に、18g/lエタノールを生産し、BGL添加セルラーゼ製剤では19.1g/lエタノールを生産した。このことから、TTK100/AaBGL株を用いればセルラーゼ酵素製剤のみを用いて十分に結晶性セルロース糖化・発酵することができ、BGL添加セルラーゼ製剤を添加する必要が無いことがわかった。これによりBGL添加セルラーゼ製剤のコストを低減できることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号６〜１５：プライマー
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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