(57)【要約】      （修正有）【課題】過度に誤って調節される免疫反応および自己免疫疾患に関連する野生型ヒトインターロイキン−４のアンタゴニストもしくは部分的アゴニストであるかもしくはそれらを含む治療剤の提供。【解決手段】野生型ヒトインターロイキン−４における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換と非蛋白質ポリマーへの該蛋白質のカプリングなどの少なくとも２つの改変を伴う突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質を含んでなる治療用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも２つの改変を伴う野生型ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）のアミノ酸配列から成る突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が、i）該蛋白質のＮ末端の改変、ii）該蛋白質のＣ末端の改変、iii）該蛋白質の潜在的なグリコシル化部位の欠失、および／またはiv）非蛋白質ポリマーへの該蛋白質のカプリング、からなる群より選ばれる少なくとも１つの改変であり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質、およびｂ）生理学的に許容されうるキャリアー、を含んでなる治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のｈＩＬ−４突然変異蛋白質の、特に、過度に誤って調節される免疫反応および自己免疫疾患に関連する医療薬としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分的アゴニストであるかもしくはそれらを含む治療剤が既に開示されており、これらのアンタゴニストもしくは部分的アゴニストはｈＩＬ−４突然変異蛋白質である（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
ヒトインターロイキン４（ｈＩＬ−４）は、リンパ細胞および骨髄性細胞の増殖、成熟、生存、および分化の誘導および調整を行う多くのサイトカインの内の一つである。特に、ｈＩＬ−４はＩｇＥにより媒介される免疫反応に関与し、かつ胸腺および活性化されたＴ細胞の増殖を直接促進させる。Ｍｒ１４０，０００の高親和性ＩＬ−４レセプター蛋白質が既に同定されており、そのｃＤＮＡ配列によると、このレセプター蛋白質は８００のアミノ酸残基からできている。この蛋白質は最近記載がなされており、ヘマトポイエチンレセプタースーパーファミリーと称されているレセプター群に属する。
【０００４】
クローン化されたｃＤＮＡに基づくと、成熟したＩＬ−４のアミノ酸配列は１２９残基からできている。このｃＤＮＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母内で既に発現されている。高い生物学的活性を有する組換えＩＬ−４をこれらの源から単離することができる。つい最近のことであるが、ヒトインターロイキン４に対して拮抗的特性を呈するモノクローナル抗体が開示された。この抗体はＦａｂ断片を含み、かつヒト／ヒトハイブリドーマ細胞株により産生される。（非−）グリコシル化されたヒトＩＬ−４に対して免疫化させたラットの脾臓細胞からのハイブリーマ細胞株もｈＩＬ−４に対するモノクローナル抗体を産生する。
【０００５】
アルレギー過程におけるインターロイキン４の役割は、インターロイキン４により媒介される過程を阻害するか、もしくはｈＩＬ−４と競合する物質が疾患の引き金となる反応連鎖を遮断するかもしれないという望みを提供する。
【０００６】
位置１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、もしくは１２８の内の一つもしくは複数に野生型において天然に生じるアミノ酸（一つもしくは複数）が、各々他の可能な天然のアミノ酸の内の一つもしくは複数と置換されているｈＩＬ−４突然変異蛋白質が開示されている（例えば、特許文献２参照）。これらのｈＩＬ−４突然変異体蛋白質は、ヒトＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分的アゴニストである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９３／１０２３５号パンフレット
【特許文献２】ドイツ特許第４１  ３７  ３３３  Ａ１号明細書
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒトのインターロイキン４のアンタゴニストもしくは部分的アゴニストであり、かつ位置１２１、１２４、もしくは１２５での置換に加え、ｈＩＬ−４蛋白質の更に別の改変が施された新規ｈＩＬ−４突然変異蛋白質の使用に関する。これらの改変は、ｈＩＬ−４突然変異蛋白質の安定性を増加させる目的、生物学的半減期を延長させる目的、
もしくは調製および精製過程を容易にする目的で実施されている。
【０００９】
このためには、野生型における生来のアミノ酸を欠失させるか、あるいは一つもしくはより多くの位置での他のアミノ酸による置換を行うか、あるいはそうでなければ追加的アミノ酸をＣ−末端もしくはさらにＮ−末端に挿入させるか、あるいはそうでなければ一つもしくは複数のアミノ酸を様々な非−蛋白質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールおよびその誘導体）によるかまたはグリコシル残基により置換させる。
【００１０】
＜発明の詳細な記述＞
本発明に関連して、アミノ酸は一般的に、
Ａｌａ      Ｌ−アラニン
Ａｒｇ      Ｌ−アルギニン
Ａｓｎ      Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ      Ｌ−アスパラギン酸
Ｃｙｓ      Ｌ−システイン
Ｇｌｎ      Ｌ−グルタミン
Ｇｌｕ      Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｙ      Ｌ−グリシン
Ｈｉｓ      Ｌ−ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ      Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ      Ｌ−リシン
Ｍｅｔ      Ｌ−メチオニン
Ｐｒｏ      Ｌ−プロリン
Ｐｈｅ      Ｌ−フェニルアラニン
Ｓｅｒ      Ｌ−セリン
Ｔｈｒ      Ｌ−スレオニン
Ｔｒｐ      Ｌ−トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｌ−チロシン
Ｖａｌ      Ｌ−バリン
であり、これによって、簡素化のために立体配置表示を省略することを可能にする。
【００１１】
非蛋白質ポリマーは、米国特許第４．６４０．８３５号、第４．４９６．６８９号、第４．３０１．１４４号、第４．６７０．４１７号、第４．７９１．１９２号、もしくは第４．１７９．３３７号に記載されるように、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリオキシアルキレンであるとして理解されている。
【００１２】
グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物骨格の連結（「Ｎ−グリコシル化」）か、あるいは糖、好ましくはＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、もしくはキシロースの、セリン、スレオニン、４−ヒドロキシプロリン、もしくは５−ヒドロキシリシンへのカップリング（Ｏ−グルコシル化）であるとして理解されている。
【００１３】
アミノ酸１２４（チロシン）、アミノ酸１２１（アルギニン）、およびアミノ酸１２５（セリン）が、いずれかの組み合わせで可能な天然のアミノ酸の内の一つで置換されており、かつそれに加え、その分子のＮ末端および／またはＣ末端が改変を受けており、そして／あるいは一種以上のポリエチレングリコール分子がその分子に共有結合しており、そして／あるいはその分子内に存在するグリコシル化部位が部分的もしくは完全な欠失を受けている、ｈＩＬ−４突然変異蛋白質が好ましいものとして挙げられる。
【００１４】
アミノ酸１２４（チロシン）、アミノ酸１２１（アルギニン）、およびアミノ酸１２５
（セリン）がいずれかの組み合わせでアスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換され、そしてそれに加えてその分子のＮ末端および／またはＣ末端が改変され、そして／あるいは一種以上のポリエチレングリコール分子がその分子に共有結合しており、そして／あるいはその分子内に存在するグリコシル化部位が部分的もしくは完全な欠失を受けている突然変異蛋白質は、この群からの特に好ましい態様である。
【００１５】
更に好ましい態様は、アミノ酸１２１（アルギニン）および１２５（セリン）が天然に存在するアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換されており、そしてそれに加えてその分子のＮ末端および／またはＣ末端が改変されており、そして／あるいは一種以上のポリエチレングリコール分子がその分子に共有結合しており、そして／あるいはその分子内に存在するグリコシル化部位が部分的もしくは完全な欠失を受けているものでもある。
【００１６】
更には、アミノ酸１２４（チロシン）が天然に存在するアミノ酸で置換されており、かつ位置１２１および／または１２５で０〜１の追加的アミノ酸が他の可能なアミノ酸の内の別のもので置換されており、そしてそれに加えてその分子のＮ末端および／またはＣ末端が改変されており、そして／あるいは一種以上のポリエチレングリコール分子がその分子に共有結合しており、そして／あるいはその分子中に存在するグリコシル化部位が部分的もしくは完全な欠失を受けているｈＩＬ−４突然蛋白質が特に好ましい。
【００１７】
アミノ酸１２４（チロシン）がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換されており、かつ位置１２１が可能なアミノ酸の内の別のもの、好ましくはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸で置換されており、そしてそれに加えてその分子のＮ末端および／またはＣ末端が改変されており、そして／あるいは一種以上のポリエチレングリコール分子がその分子に共有結合しており、そして／あるいはその分子内に存在するグリコシル化部位が部分的もしくは完全な欠失を受けているｈＩＬ−４突然変異蛋白質が、この群からでは特に好ましい。
【００１８】
アミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、もしくはＶａｌ、特に好ましくはＡｌａの、Ｎ末端メチオニンと、ｈＩＬ−４突然変異蛋白質の天然のＮ末端との間への挿入が、上記の例におけるＮ−末端改変の好ましい態様である。
【００１９】
この種の発現産物の例は：
【００２０】
【化１】
2011102302.tif 000002
【００２１】
である。
【００２２】
上記態様のグリコシル化部位の欠失の好ましい事例は、位置３８でのアスパラギンの、天然に存在する別のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸との置換、および／または位置１０５でのアスパラギンの天然に存在する別のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸との置換である。
【００２３】
この種の発現産物の例は：
【００２４】
【化２】
2011102302.tif 000003
【００２５】
である。
【００２６】
ｈＩＬ−４を、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での遺伝子操作による組換え蛋白質（ｒｈＩＬ−４）として産生させることができる。これに関して形成される蛋白質を可溶化させ、再生させ、そして単離することができる。その後にはこのｒｈＩＬ−４は高い特異的生物学的活性を保持しており、この活性は例えば、活性化されたＴ−細胞のＤＮＡ合成／増殖、もしくは活性化されたＢ細胞のＣＤ２３発現を測定することにより決定することができる［Ｋｒｕｓｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８６、５８−６０；Ｋｉｋｕｔａｎｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、（１９８６）Ｃｅｌｌ  ４７、６５７−６６５、を参照されたい］。
【００２７】
ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域を含むか、もしくはそれ自体がｈＩＬ−４成熟領域をコードするｃＤＮＡを獲得することに関しては、我々は、Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．、Ｏｔｓｕｋａ，Ｔ．、Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．、ＤｅＦｒａｎｃｅ，Ｔ．、Ｂｌａｎｃｈａｒｅｄ，Ｄ．、Ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｊ．Ｅ．、Ｌｅｅ，Ｆ．およびＡｒａｉ，Ｋ．Ｉ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ  ８３、５８９４−５８９８、およびその引用文献内に引用される刊行物を参考にしている。本文脈内では「ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするｃＤＮＡ」は、ほぼ同一数の塩基対を有するにもかかわらず、当該技術分野の現状における具体的方法において特定されるｃＤＮＡの突然変異体を構成するｃＤＮＡとしても理解されるが、ただし、これはそのｈＩＬ−４突然変異蛋白質（これらはそのＤＮＡにより予測されるはずのものである）も同様にアンタゴニストもしくは部分的アゴニストであるとする場合のことである。
【００２８】
本文脈では、ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするＤＮＡ領域の番号付に関しては、Ｇａｒｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１、３０、１５１５−１５２３、に従っている。
【００２９】
ｈＩＬ−４の成熟領域をコードするｃＤＮＡを、組換え的に調製したｃＤＮＡから（例えば、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．社、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、からのもの）ＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ断片を切り出すことにより単離することができる。このＤＮＡ断片を、合成オリゴヌクレオチド（例えば、５’−ＣＡＴＧＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴおよび５’−ＡＴＣＧＣＡＣＴＴＧＴＧ）（これらはインターロイキン４の内の最初の４つのアミノ酸コドンおよび更に、開始用メチオニンのためのコドンを含む）の添加と共に発現ベクター内に挿入させる（例えば、発現ベクターｐＲＴＳｐＲＣ  １０９の内のＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ開裂部位の間で）［Ｗｅｉｇｅｌ．Ｕ．、Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．、およびＳｅｂｅｌｄ，Ｗ．（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８０、２９５−３００、を参照されたい］。
【００３０】
ＩＬ−４のアミノ酸配列変異体は、適切な改変ヌクレオチドを、ＩＬ−４をコードするＤＮＡ内に導入させることによるか、もしくは所望のＩＬ−４形態のインビトロ合成により作製される。このような変異体は、例えば、ＩＬ−４アミノ酸配列内の残基の欠失もしくは挿入もしくは置換を含む。この文脈では、欠失、挿入、および置換のいずれかの組み合わせが最終構築物を獲得するのに適するが、ただしこれはその最終構築物が所望の性質を呈する場合に限られる。アミノ酸改変はＩＬ−４の翻訳後プロセシングも変化させることができ：例えば、グリコシル化部位の数もしくは位置、膜付着性特性および／またはＩＬ−４の細胞内局在性を、挿入、欠失、もしくは天然のＩＬ−４のリーダー配列への他の幾つかの影響により変化させることができる。
【００３１】
ＩＬ−４のアミノ酸配列変異体を構築する際には、突然変異部位およびその突然変異の性質は、変化させる予定のＩＬ−４の特性（一つもしくは複数）に依存する。突然変異部位は個別にもしくは連続的に、例えば、（１）最初には保存的な意味で選択されたアミノ酸での、そしてそれに次いで一層劇的な代替アミノ酸（これは達成される結果に依存する）での置換、（２）標的残基の欠失、あるいは（３）局在部位の近傍での残基の挿入により変化させることができる。
【００３２】
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５、１９８９）により記載される「アラニン−スキャニング突然変異誘発」は、好ましい突然変異誘発部位としての特別なＩＬ−４残基もしくは領域を同定するのに適する方法である。この場合、ある残基もしくは標的残基の群を同定し（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕのような荷電残基）、そして細胞の内側もしくは外側の近接水性環境とアミノ酸との相互作用に影響をもたらす目的で、中性もしくは陰性荷電アミノ酸（最も有利なものはアラニンもしくはポリアラニンである）による置換を行う。機能的に感受性を示す様式でこれらの置換基と反応する領域をその後に、追加的変異体もしくは他の変異体をその置換部位にもしくはその置換部位の代わりに導入することにより調査した。このことは、アミノ酸配列変化を導入するための部位が予め決定されるものの、その変化自体の性質は予め決定する必要がないことを意味する。
【００３３】
従って、特別な部位での突然変異の効果を至適にさせる目的では、Ａｌａスキャニングもしくはランダム突然変異誘発の方法を、標的コドンにおいてか、あるいは発現されるＩＬ−４変異体を含む標的領域で実施することができ、これらのＩＬ−４変異体については、所望の特性を獲得することに関する至適組み合わせについての検査が実施される。
【００３４】
その結果、アミノ酸配列変異体を構築する際の２つの主な可変部位(すなわち、突然変異の部位）および突然変異の性質が存在する。
【００３５】
概して、アミノ酸配列内の欠失のサイズは、約１〜３０残基、好ましくは約１〜１０残基であり、そして通常の事例ではこれらは連続している。通常の事例では、複数の欠損は、それらが互いに極近接して存在する場合にはアミノ酸残基に影響を及ぼす。
【００３６】
連続欠失数は、作用を受ける領域内ではＩＬ−４の三次元構造（例えば、システイン架橋形成、ベータ−折り畳みシート構造、もしくはアルファ−ヘリックス）が保持されるように選択される。
【００３７】
アミノ酸配列内の挿入には、単一残基から最高で１００もしくはそれを上回る残基を含むポリペプチドまでの長さを有するアミノ−末端および／またはカルボキシル−末端融合物、ならびに更には個別のもしくは数々のアミノ酸残基の挿入（これらは、ある配列内に存在する）がある。中でも、ある配列内に位置する挿入（例えば、ＩＬ−４配列内での挿
入）は、約１〜１０の残基、好ましくは約１〜５、そして至適条件下では約１〜３の残基を含むことができる。末端挿入の例は、Ｎ−末端メチオニン残基を有するＩＬ−４、組換え細菌細胞培養物中のＩＬ−４の直接発現の人工産物、メチオニンと天然のＮ末端との間の一つもしくは複数の追加的アミノ酸の挿入であり、これらはメチオニンの除去（例えば、細菌特異的プロテアーゼによる）およびＩＬ−４分子のＮ−末端への異種Ｎ−末端シグナル配列の融合を容易にさせることを目的とし、組換え宿主細胞からの成熟ＩＬ−４の分泌およびポリアミノ酸（例えば、ポリヒスチジン）の融合を促進させることを目的とし、ＩＬ−４の単離を容易にさせることを目的とする。概してこれらのシグナル配列は宿主細胞タイプから選択されるが、これらの細胞タイプについての見当は予めついており、かつそのためこれらのタイプと相同となる。適切な配列の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）についてはｏｍｐＡ、ｏｍｐＴ、ｐｈｏＡ、ｍｏｌＥ、ａｍｐ、もしくはｐｅｌＢであり、酵母細胞についてはアルファー因子、アミラーゼ、インベルターゼ、キラー毒素、およびメリチン−プレプロペプチドであり、そして哺乳類細胞についてはウイルス性シグナル（例えば、ヘルペス  ｇＤ）である。
【００３８】
更に好ましいシグナル配列は、インターロイキン４の天然のシグナル配列である。特に好ましいものとしては、その発現生物体自体により除去され、その結果インターロイキン４突然変異蛋白質が天然のＮ−末端を保持することとなるシグナル配列が挙げられる。
【００３９】
シグナル配列の除去の後の、好ましい発現産物は：
【００４０】
【化３】
2011102302.tif 000004
【００４１】
である。
【００４２】
ＩＬ−４の他の挿入変異体には、ＩＬ−４のＮ末端もしくはＣ末端への免疫原性ポリペプチドの融合（例えば細菌性ポリペプチド（一例では、ベータ−ラクタマーゼ）か、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｐ遺伝子座によりコードされる酵素、または酵母蛋白質）、および更には、長い半減期を有する蛋白質（例えば、免疫グロブリン非可変領域（もしくは他の免疫グロブリン領域）、アルブミン、またはフェリチン）とのＣ−末端融合物が含まれ、これらについては国際公開第８９／０２９２２号（１９８９年４月６日に開示された）における記載を参照されたい。
【００４３】
更に別の群の変異体はアミノ酸置換を有するものである。それらの変異体ではＩＬ−４分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が別の残基と置換されている。
【００４４】
天然に存在する残基は、それらが共通に保持する保持する側鎖特性に基づき複数のクラスに配分される：
１）疎水性残基：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ；
２）中性親水性残基：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒ；
３）酸性残基：Ａｓｐ、およびＧｌｕ；
４）塩基性残基：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ；
５）鎖の配向に対して影響を有する残基：Ｇｌｙ、およびＰｒｏ；ならびに
６）芳香族性残基：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ。
【００４５】
非保存的置換では、これらのクラスの内の一つの代表的なものを別のクラスのものと交換することが必要とされる。
【００４６】
ポリペプチドの天然のグリコシル化パターンを変化させる場合には、中でもアミノ酸残基置換が用いられる。「変化させる」は、天然のＩＬ−４における炭水化物骨格の内の一つもしくは複数の欠失、および／または天然のＩＬ−４中には存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位の添加を意味する。
【００４７】
通常ではポリペプチドのグリコシル化は、Ｎ−連結されるかもしくはＯ−連結されるかのいずれかである。「Ｎ−連結される」は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物骨格のカップリングを意味する。トリ−ペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを例外とするいずれかのアミノ酸であることができる）は、アスパラギン側鎖への炭水化物骨格の酵素的カップリングのための認識配列である。その結果、あるポリペプチド中のこれらトリ−ペプチドの内の一つの存在により、有望なグリコシル化部位が作製される。
【００４８】
「Ｏ−連結される」は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、もしくはキシロースの内の一つの、ヒドロキシアミノ酸、中でもセリンもしくはスレオニンへのカップリングを意味するが、４−ヒドロキシプロリンおよび５−ヒドロキシリシンを用いることもできる。
【００４９】
ＩＬ−４へのグリコシル化部位の添加は、この配列が一つもしくは複数の上記のトリ−ペプチド配列を含むようにアミノ酸を変化させることにより難無く実施される（Ｎ−連結されるグリコシル化部位）。この変化は同様に、天然のＩＬ−４配列への一つもしくは複数のセリンもしくはスレオニン残基の添加もしくは置換により実施され得る（Ｏ−連結されるグリコシル化部位）。操作を簡素化するという点では、ＩＬ−４アミノ酸配列をＤＮＡレベルでの変化を実施することにより、具体的には、所望されるアミノ酸に翻訳されるコドンが産生されるように予め選択された塩基でＩＬ−４をコードするＤＮＡを突然変異させることにより変化させることが好ましい。類似の方法では、存在する一つもしくは複数のトリ−ペプチド配列（Ｎ−連結されるグリコシル化のためのもの）は、炭水化物骨格の欠失が所望される場合にはそのトリ−ペプチドの全部もしくは複数部分を置換もしくは欠失させることにより改変させる。Ｏ−グルコシル化部位の場合には、対応するアミノ酸を置換もしくは欠失させることによりその炭水化物骨格に欠失を生じさせることができる。
【００５０】
そのポリペポプチドへの複数のグリコシドの化学的もしくは酵素的カップリングは、ＩＬ−４中の炭水化物骨格数の増加のための更に別の選択である。これらの方法は、そのポリペプチドが、Ｎ−連結されるかもしくはＯ−連結されるグリコシル化を実施することができる宿主細胞内で調製されることを必要としない限りは有利なものである。用いられるカップリングメカニズムに依存し、糖（一つもしくは複数）を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）遊離のスルフヒドリル基（例えば、システインのもの）、（ｄ）遊離のヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもの）、（ｅ）芳香族性残基（例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもの）、または（ｆ）グルタミンのアミノ基、に連結させることができる。これらの方法は国際公開第８７／０５３３０号（これは、１９８７年９月１１日に開示された）およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６［１９８１］）に記載されている。
【００５１】
既述の方法に加え、化学的もしくは酵素的手段を、天然のＩＬ−４内に存在する炭水化物骨格を除去するのに用いることもできる。化学的脱グリコシル化の場合には、そのポリ
ペプチドを、化合物トリフルオロメタンスルホン酸か等価化合物に露出させることが必要とされる。この処理により連結用の糖（Ｎ−アセチルグルコサミンもしくはＮ−アセチルガラクトサミン）は別として、大半もしくは全ての糖が除去される一方で、ポリペプチドは未処理のまま保たれる。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９：５２（１９８７）、およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｏｐｃｈｅｍ．、１１８：１３１（１９８１）により記載されている。そのポリペプチド中の炭水化物骨格を、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０［１９８７］）により記載される要領で、一連のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いて酵素的に除去することができる。
【００５２】
可能なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：３１０５［１９８２］）に記載される要領で、化合物ツニカマイシンを用いることにより回避することができる。ツニカナイシンは、蛋白質−Ｎ−グリコシド結合の形成を遮断する。
【００５３】
ＩＬ−４の別の種類の共有結合的改変には、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、もしくは第４，１７９，３３７号に記載される要領で、ＩＬ−４を様々な非蛋白質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、もしくはポリオキシアルキレン）に連結させることが含まれる。
【００５４】
架橋に用いられる試薬、置換の度合い、および反応条件は、二官能性作用物質を用いること、好ましくは一連の試薬（それ各々は異なる側鎖を有する）を用いることによる実験により選択される。
【００５５】
インビボで循環する蛋白質の半減期を改善するのに用いられることが好ましい、ある選択方法は、その蛋白質を、その蛋白質に一層長い半減期を付与するポリマーにカップリングさせるという方法である。従って、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のＣ１−ＮＨへのカップリング反応は半減期を増加させる優れた方法であることが既に判明している。ＰＥＧは非免疫原性の直線非荷電ポリマーであり、酸化エチレンの分子当たり３つの水分子を保持しているため、カップリングさせた分子の流体力学的特性は画期的に変化し得る（Ｍａｘｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｏｌｙｍｅｒ、１６：５０５−５０９（１９７５）；Ｂａｉｌｅｙ，Ｆ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、ｉｎ：Ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ［Ｓｃｈｉｃｋ，Ｍ．Ｊ．、Ｅｄ．］ｐｐ．７９４−８２１、１９６７）。治療学的に用いられる数々の酵素が、それらのインビボ半減期を効果的に増加させる目的でＰＥＧに連結されている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５８２−３５８６；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、７：１７５−１８６、１９８４）。ＩＬ−２（インターロイキン２）のＰＥＧへの連結は、循環系におけるそれらの生存時間を延長させるばかりでなく、それらの効力も増加させることが報告されている（Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４：１４８７−１４９１（１９８７）；Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：３４３−３４６、１９９０）。ＰＥＧの他の分子への連結がそれらの免疫原性および毒性を低下させることが報告されている(Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：３５７８−３５８１、１９７７）。
【００５６】
ＩＬ−４は更に、例えばコアセルベート技術によるかもしくは「界面重合」により製造されるマイクロカプセル内（例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル類およびポリ−［メチル  メタクリレート］マイクロカプセル類）か、コロイド状薬物放出系（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、ミクロエマルジョン、ナノパーティクル、およびナノカプセル）内か、もしくはマクロエマルジョン内に含まれることもあり得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ，Ａ．、Ｅｄ．（１９８０）、に記載されている。
【００５７】
ＩＬ−４調製物は更に、抗体を単離する際（ＩＬ−４アッセイのための標準物質として（例えば、放射性免疫アッセイ、酵素結合性免疫アッセイ、もしくは放射性レセプターアッセイにおける標準物質としての使用のためにＩＬ−４をラベル化することによる））、レセプター結合性アッセイ（競合性タイプのもの）の際（親和性精製技術の際、および放射性ヨウ化物、酵素、発蛍光団、スピンラベルなどでのラベル化を行う際）、の使用にも適する。
【００５８】
ＩＬ−４変異体の特性を予測するのは困難であるため、至適変異体を獲得する目的では、得られる変異体の所定のスクリーニングが必要とされることが理解されるであろう。従って、例えばＩＬ−４分子の免疫学的特徴の変化（例えば、ある特別な抗体に対する親和性）は競合的免疫アッセイにより測定される。この変異体については、同一アッセイ中で観察される天然のＩＬ−４の活性と比較する際の、その活性の減少もしくは増幅に関わる変化についての調査が実施される。その蛋白質もしくポリペプチドの特性における他の可能な変化（例えば、酸化還元、または熱安定性、疎水性度、蛋白質分解に対する感受性、組換え細胞培養物もしくは血漿中での安定性、または他では担体と共に凝集するかもしくは多量体を形成する傾向）が、当該技術分野において記載される方法により決定される。
【００５９】
ＩＬ−４の治療用製剤および投与
新規の化合物は、インターロイキン４により媒介される過程を阻害するか、もしくはｈＩＬ−４と競合するかのいずれかを行う。従ってこれらの化合物は、過剰であるかもしくは誤って調節される免疫反応、および自己免疫性疾患を治療するのに適する。これらには更に、原発性および後発性の特徴の両方の免疫疾患も含まれる。これに加え、このアンタゴニストを、移植術、および腫瘍性疾患の姑息療法の両方にも利用することができる。これらの疾患には、例えば：
アレルギー（初期応答およびＩｇＥにより媒介される応答の遮断；既知のアレルギーの症例における脱感作；アトピー性疾患；喘息発作に関連する緩和作用；高ＩｇＥ症候群）、移植術（臓器移植の際のＨＬＡ−ＤＲ発現の減少、ＧＶＨＲの抑制、骨髄からの不要成分の一掃を行った場合の使用）、
白血病およびＩＬ−４レセプターを発現する充実性腫瘍（過剰なオートクリンＩＬ−４産生の減少；腫瘍成長の阻害）、
血小板の過剰産生に関連する逆調節、
凝集障害の治療（単球遮断を介する）、
脂質代謝の障害における使用、
炭水化物平衡の障害の矯正、および
感染（敗血症）の際の免疫状態の改善、
がある。
【００６０】
水における可溶性が良好であるためＩＬ−４突然変異蛋白質を、全身的および局在的（すなわち、局所的）の両方で、中でも吸入用噴霧剤として利用することができる。この蛋白質を徐放性製剤として製剤することも可能である。短期療法もしくは継続療法が、全療法形態の事例において可能である。
【００６１】
ＩＬ−４アンタゴニストの治療用製剤は、保存のためには、ＩＬ−４アンタゴニストを所望される度合いの純度を獲得した後に生理学的に許容される担体、補助物質、もしくは安定剤と（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記引用文中）、親液性状態もしくは水溶液の形態で混合することにより調製される。許容される担体、補助物質、もしくは安定剤は、利用される用量および濃度ではレシピエ
ントに対して無毒性であり；それらには、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸類；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド（約１０残基を下回るもの）、蛋白質（例えば、血清アルブミン）、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン類；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリシン）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物類（例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール類（例えば、マニトールもしくはソルビトール）；塩形成性対イオン（例えば、ナトリウム）および／または非イオン性界面活性物質（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、がある。
【００６２】
インビボでの使用のためには、ＩＬ−４アンタゴニストを滅菌する必要がある。これは、滅菌膜フィルターを通す濾過により（凍結乾燥および再構築の前もしくは後のいずれか）容易に達成される。ＩＬ−４アンタゴニストは通常は凍結乾燥形態もしくは溶液として保存される。
【００６３】
徐放性を示す製剤の適切な例は、例えば、その蛋白質を含む固形疎水性ポリマーからできている半透性素材であり；これらの素材は成型品(例えば、フィルムコーティング錠もしくはマイクロカプセル）である。徐放性を示す素材の例は、ポリエステル類、ヒドロゲル類［例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５：１６７−２７７［１９８１］およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２：９８−１０５［１９８２］により記載されている）もしくはポリ（ビニルアルコール）］、ポリアクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー類（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２：５４７−５５６［１９８３］）、非分解性エチレン／酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記引用文中）、分解性乳酸／グリコール酸コポリマー（例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸／グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドからできている注射用マイクロスフェア）、およびポリ−（Ｄ）−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）、である。ポリマー（例えば、エチレン／酢酸ビニルおよび乳酸／グリコール酸）は、その分子を、１００日を上回る期間の間放出させることができる一方で、幾つかのハイドロゲルの場合には、蛋白質は比較的短い期間で放出される。被包化された蛋白質が比較的長期間体内に留まる場合には、それらは３７℃下での湿気により変性もしくは凝集を生じ、その結果、生物学的活性の喪失および免疫原性の変化の可能性をもたらすことがある。蛋白質を安定化させるための有意義な手法を、関与するメカニズムに従って開発することができる。例えば、凝集をもたらすメカニズムが、チオジスルフィド交換の結果としての分子内Ｓ−Ｓ架橋形成に基づくことが見いだされれば、安定化はスルフヒドリル残基を改変させ、酸溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適切な添加物を用い、そして特別なポリマー／マトリックス組成物を開発することにより達成することができる。
【００６４】
徐放性を示すＩＬ−４アンタゴニストの製剤は更に、リポソーム内に被包化されるＩＬ−４アンタゴニストをも含む。ＩＬ−４アンタゴニスト含有性リポソームは、それ自体既知の方法により調製される：ドイツ特許第３，２１８，１２１号；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ
ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２；３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０−４０３４（１９８０）；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２，６４１号；特開平５９−１１８００８号公報；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号。概してリポソー
ムは小さな（約２００〜８００オングストローム）の単層タイプのものであり、約３０モル％のコレステロールを上回る脂質含有量を有し、かつ各事例におけるその比率は至適ＩＬ−４アンタゴニスト用に調節されている。長期循環時間を呈するリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００６５】
本発明の更に別の適用は、「成型品」へのＩＬ−４アンタゴニストの取り込みに関する、これら後者のものは、急性循環不全状態の出現を調節もしくは予防するために利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】実施例２で調製されるベクターｐＡＰＨ１００（ＩＬ４Ｙ１２５Ｄ）の制限酵素地図
【００６７】
本発明の具体的な態様を以下に挙げるが、本発明はこれにより限定されるものでない。
【実施例１】
【００６８】
ｈＩＬ−４突然変異蛋白質内の可能なＮ−グリコシル化部位の除去
アスパラギンがカップリングした２つのグリコシル化部位が天然のｈＩＬ−４アミノ酸配列中の位置３８および１０５に存在する構造遺伝子中の対応コドンをアスパラギン酸のためのコドンで置換することができる。このことにより、得られるｈＩＬ−４突然変異蛋白質は、その遺伝子が酵母株内で発現する際にはＮ−グリコシル化を受けなくなる。
【００６９】
ｈＩＬ−４突然変異蛋白質のための構造遺伝子における２つのコドン置換（部位特異的突然変異誘発）を、ＤｅｎｇおよびＮｉｃｋｏｌｏｆｆ［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：８１（１９９２）］の方法に従い、クローニングベクターｐＵＣ１８を用いて実施した。構造遺伝子を変化させるのに必要とされる合成オリゴヌクレオチドは、以下の配列を有していた：
ａ）  位置３８のアスパラギンのアスパラギン酸での置換については：
５’−ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＡＣＴ  ＧＡＧ−３’
ｂ）  位置１０５のアスパラギンのアスパラギン酸での置換については：
５’-ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  ＡＣＧ−３’
。
【００７０】
記載したヌクレオチオド配列内での下線を施した位置はアスパラギン酸のコドンを表す。ヌクレオチド配列におけるコドン置換はＤＮＡ配列決定により確認した。変化させた構造遺伝子を酵母発現ベクター内に挿入させ、そして適切な株内で発現させた。
【実施例２】
【００７１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのＮ−末端メチオニンを有さないＩＬ−４突然変異蛋白質の調製を目的とする位置（＋２）でのアミノ酸の挿入
Ｎ−末端メチオニンを喪失しているＩＬ−４突然変異蛋白質を調製する目的で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中ではＮ−末端メチオニンの除去をもたらす、あるアミノ酸を、特異的メチオニンアミノペプチダーゼにより挿入した（Ｆｌｉｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５４、１９３−１９６、１９８６）。このためには、ベクターＲＰＲ９−ＩＬ４−Ｙ  １２４Ｄ（封入物１）を、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで切断した。得られる約４５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片は、ＩＬ４Ｙ１２４Ｄ遺伝子のための配列情報およびそのベクターのａｔｐＥ領域の短い（約５０ｂｐ）断片を含み、このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、そして、予めＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断してあったベクターＭ１３ｍｐ１８内に再クローン化させた。一本鎖ＤＮＡを調製し、そして以下のオリゴヌクレオチドを用いるインビトロ突然変異誘発反
応に供した：
５’−ＣＴＧＧＡＧＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＴＡＴＣＡＣＣ−３’。
【００７２】
この突然変異誘発の結果、アミノ酸アラニン（コドンＧＣＣ）をＩＬ４Ｙ１２４Ｄ遺伝子の位置（＋２）中に組み込ませる、それに加え、ＮｃｏＩ開裂部位（ＣＣＡＴＧＧ）を、その後のスクリーニングおよび発現ベクター内へのクローニングを容易にさせる目的で、その遺伝子の５’末端に挿入する。このプラークを、二本鎖Ｍ１３  ＲＦ  ＤＮＡ（複製性形態）を用いる制限分析によりスクリーニングした。陽性クローンを、酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩでの制限消化により同定した。それに加え、正しい配列を配列決定により確認した。
【００７３】
約４００ｂｐの長さのＤＮＡ断片を選択されたＭ１３ｍｐ１８クローンからＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切り出し、アガロースゲル電気泳動により精製し、そして同様に予めＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断してあったベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｐ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から市販品として入手可能である）内にクローン化させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＴＧ１）を、このクローニングから取得され、かつアンピリシン含有性栄養培地上で選択されたベクターｐＡＰＨ１００（ＩＬ４Ｙ１２５Ｄ）（図１参照）で形質転換させた。蛋白質の発現、およびその精製により、Ｎ−末端メチオニンを欠失するＩＬ−４突然変異蛋白質がもたらされた。
【実施例３】
【００７４】
酵母細胞の発酵
栄養溶液：
以下の栄養溶液を、ｈＩＬ４突然変異蛋白質を発現するイースト細胞を培養するのに用いた：
【００７５】
【表１】
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【００７６】
これらの成分を脱塩水中に混合し、そしてｐＨを５．５に調節した。この混合物を１２１℃で２０分間滅菌した。グルコースを必要量の１／５の脱塩水中に溶解した上でこの溶液を別に滅菌し、そして冷ました後にこれを残りの栄養溶液に添加した。
【００７７】
株保存物：
全酵母形質転換体の株保存物は、予備培養物の２ｍｌのアリコートを採取し、そしてそれらを液体窒素中に保存することにより貯蔵した。
【００７８】
予備培養物：
予備培養物の発酵は、２００ｍｌのＳＤ２栄養溶液を含む１リットルの震盪フラスコ内で実施した。この栄養溶液に、株保存物、もしくはＳＤ２アガープレートからの単一コロニーを接種した。この培養物を２６〜３０℃で２〜３日間、持続的に震盪させながらインキュベートした。
【００７９】
主培養物の発酵：
主培養物の発酵は、Ｓｃ６栄養溶液中、１０リットルの撹拌タンク発酵器を用いて実施した。この栄養溶液に、３〜５％容積の予備培養物（この生物量はその予備培養物から遠心分離により取り出し、そして接種前にＳｃ６培地中に再懸濁させたものである）を接種した。１０リットルの主培養物のための発酵条件は以下のとおりであった：
温度                    ２６〜３０℃
撹拌機回転速度          ６００ｒｐｍ
エアレーション速度      ０.５ｖｖｍ
ｐＨ設定値              ５.５(５Ｎ ＮａＯＨおよび５Ｎ 
Ｈ２ＳＯ４で調節する）
【００８０】
発酵時間の５時間目以降、この培養物に継続的にグルコースおよび酵母抽出物の供給を行った。この供給速度はその培養物の呼吸率（ＲＱ値）を基に調節した。このＲＱ設定値は１．０であった。供給溶液は以下の組成を含んでいた：
グルコース                              ５００ｇ／ｌ
ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）酵母抽出物        ７５ｇ／ｌ。
【００８１】
これらの構成成分を別々に脱塩水に溶解し、そしてそれらの溶液を１２１℃で２０分間滅菌した。これら２つの溶液を冷ました後に合わせた。  誘導させたＧａｌ１０プロモーター、もしくはＧａｌ１０プロモーターの誘導体を用いる際には、誘導は供給溶液中の炭水化物をグルコース（５００ｇ／ｌ）からガラクトース（５００ｇ／ｌ）へと変化させることにより実施した。この後には供給速度はもはやＲＱ値に基づいて調節されるわけではなくなった。供給速度は手動操作により誘導時の供給速度の値の２倍になるように調節した。Ｇａｌ１０プロモーターの誘導は通常、約４８時間の発酵期間の後に実施された。
【００８２】
細胞の回収：
発酵終了後（８０〜１２０時間）、発酵器の内容物を１０〜１５℃に冷まし、そして細胞内発現の場合には、この酵母細胞を、標準的遠心分離技術（例えば、バケット型遠心機）を用いて回収した。遠心分離の後に取得された細胞量は、それを滴下により液体窒素に直接添加することにより凍結ペレット化させ、そして−８０℃に保存した。このような方法で予め処理された生物量からの産物を精製した。異種蛋白質が培養用ブイヨン内に分泌される場合には、この酵母細胞を、標準的遠心分離技術（例えば、バケット型遠心機）を用いるか、もしくはバッチミクロ濾過法（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ−Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅシステム）によりその培養用ブイヨンから分離した。必要ならば、その培養用ブイヨンを濾過により滅菌した。無細胞培養用ブイヨンからの産物を後続精製にかけた。
【実施例４】
【００８３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の発酵
栄養溶液：
ｈＩＬ−４突然変異蛋白質を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体は、以下の組成のＬＢ栄養溶液中で培養した：
バクト（Ｂａｃｔｏ）トリプトン        １０ｇ／ｌ
バクト（Ｂａｃｔｏ）酵母抽出物        ５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ                              １０ｇ／ｌ。
【００８４】
これらの構成成分を脱塩水に溶解し、そしてその溶液を１２１℃で２０分間滅菌した。接種の前には形質転換体を選択するのに適する抗生物質（例えば、そのベクターに用いられる選択用マーカーに依存して、１００ｍｇ／ｌのＮａ  アンピシリンもしくは５０ｍｇ／ｌの硫酸カナマイシン）を滅菌条件下でその栄養溶液に添加した。
【００８５】
株保存物：
全大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体の株保存物は、予備培養物の２ｍｌアリコートを採取し、そしてそれらを液体窒素中に保存することにより貯蔵した。
【００８６】
予備培養物：
この予備培養物の発酵は、２００ｍｌのＬＢ栄養溶液を含む１リットルの震盪フラスコ内で実施した。この栄養溶液に、株保存物もしくはＬＢアガープレートからの単一コロニーを接種した。これらの培養物を３０℃で１２〜１８時間、持続的に震盪させながらインキュベートした。
【００８７】
主培養物の発酵：
主培養物の発酵は、ＬＢ栄養溶液中、１０リットルの撹拌タンク発酵器を用いて実施した。この栄養溶液に、１〜５％容量の予備培養物（この生物量はその予備培養物から遠心分離により取り出し、そして接種前にＬＢ培地中に再懸濁させたものである）を接種した。１０リットルの主培養物のための発酵条件は以下のとおりであった：
撹拌温度        ３０℃（温度誘導性プロモーターを用いる場合）
３７℃（ＩＰＴＧ−誘導性ベクターを用いる場合）
撹拌機回転速度          ５００ｒｐｍ
エアレーション速度      ０.５ｖｖｍ。
【００８８】
生物量の成長をモニターする目的で、滅菌試料を約１時間の間隔で培養用ブイヨンから取り出し、そしてそれらの光学密度を６００ｎｍ（ＯＤ６００）で決定した。この培養物を、０．８〜１．２のＯＤ６００が達成された時点で誘導させた。誘導は、予め選択されたプロモーターに依存して以下のように実施した：
温度誘導：        ３０℃から４２℃への発酵温度の上昇
ＩＰＴＧ誘導：    ０.４ｍＭの濃度までのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）の滅菌添加。
【００８９】
誘導時間は典型的には４〜８時間であった。
【００９０】
細胞の回収：
発酵終了後（６〜１４時間）、発酵器の内容物を１０〜１５℃に冷まし、そして細菌細胞を、標準的遠心分離技術（例えば、バケット型遠心機）を用いて回収した。遠心分離後に取得された細胞量を適切な場合には暫定的凍結状態で保存した。このような方法で予め取得された生物量からの産物を精製した。
【実施例５】
【００９１】
構成プロモーターを用いる酵母細胞内でのインターロイキン４突然変異体蛋白質の発現
ｈＩＬ−４突然変異体蛋白質をコードする遺伝子および構成プロモーター（例えば、α−交配因子プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、もしくはＴＰＩプロモーター）を含む発現ベクターを宿す酵母形質転換体を、２８℃下、１０リットルスケールで培養した。
発酵中、ｈＩＬ−４突然変異体蛋白質の発現についての定性的検査を行うためにはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた。総発酵時間は９６時間であった。発酵の最終時に達成された生物量濃度は２７ｇの乾燥重量／ｌであった。細胞を遠心分離により予め取り出した後（１５分間、６,５００×ｇ、４℃)、および濾過による滅菌の後、無細胞培養ブイヨンからの産物を精製した。
【実施例６】
【００９２】
誘導性プロモーターを用いる酵母細胞内でのインターロイキン４突然変異蛋白質の発現
ｈＩＬ−４突然変異体蛋白質をコードする遺伝子および誘導性プロモーター（例えば、Ｇａｌ１０プロモーターもしくはＧａｌ１０プロモーターの誘導体）を含む発現ベクターを宿す酵母形質転換体を、２８℃下、１０リットルスケールで培養した。４８時間の発酵期間の後、誘導を、供給溶液中の炭水化物をグルコースからガラクトースに変化させることにより実施した。発酵中、ｈＩＬ−４突然変異体蛋白質の発現についての定性的検査を行うためにはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた。総発酵時間は９６時間であった。発酵の最終時に達成された生物量濃度は２４ｇの乾燥重量／ｌであった。細胞を分離により取り出した後、および濾過による滅菌の後、無細胞培養ブイヨンからの産物を精製した。
【００９３】
ｈＩＬ−４突然変異蛋白質発現のためには他の誘導性プロモーターもこの方法に類似の方法で利用することができる。選択されたプロモーターの性質に依存する適切な誘導技術を利用する必要がある。
【実施例７】
【００９４】
誘導性プロモーターを用いる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのインターロイキン４突然変異蛋白質の発現
ｈＩＬ−４突然変異体蛋白質をコードする遺伝子および誘導性プロモーター（例えば、λｐＬプロモーターもしくはλｐＬプロモーターの誘導体）を含む発現ベクターを宿す大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を、ＬＢ栄養溶液中、１０リットルスケールで培養した。そのＬＢ栄養溶液に１００ｍｇ／ｌのＮａ  アンピリシンを添加することにより（＝ＬＢ＋Ａｍｐ栄養溶液）このベクター含有性細胞を選択した。主培養物バッチに、ＬＢ＋Ａｍｐ栄養溶液中、５％容積の１４時間令の予備培養物を接種した。発酵初期には、発酵温度は３０℃であり、そして温度感受性プロモーターを誘導する目的で０．８〜１．２のＯＤ６００が達成された後に温度を４２℃に上昇させた。発酵中、ｈＩＬ−４突然変異体蛋白質の発現についての定性的検査を行うためにはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた。４〜６時間の誘導時間の後に、この培養用ブイヨンを１０〜１５℃に冷ますことにより発酵を停止させた。発酵最終時に達成された生物量濃度は約５ｇの新鮮重量／ｌであった。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をバケット型遠心機（１５分、６，５００×ｇ、４℃）内での遠心分離により回収し、そしてその細胞量を、直接滴下により液体窒素に添加することにより凍結ペレット化させた。この方法で深冷凍結させてある生物量を、その後に−８０℃に保存した。この方法で処理した生物量からの産物を精製した。
【００９５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でｈＩＬ−４突然変異蛋白質を発現させるためには、この方法に類似の方法で他の誘導性プロモーターが利用されることもある。選択されたプロモーターの性質に依存する適切な誘導技術を利用する必要がある。
【実施例８】
【００９６】
ＩＬ−４突然変異蛋白質の精製
細胞破壊および封入体の単離
実施例７からの２５ｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）湿潤量を２００ｍｌの緩衝液（０．１Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．３、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍｌ  ペプスタチン）中に入れ、そして超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｂ１５  音波発生
器）により破壊した。この産物を含む封入体を遠心分離（３５，０００×ｇ、２０分）により単離し、そして追加的に４Ｍ  尿素を含む破壊用緩衝液中で洗浄した。
【００９７】
産物の可溶化および亜硫酸分解
洗浄した封入体を１２５ｍｌの緩衝液（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．１、８Ｍ  塩酸グアニジン）中に溶解した。４ｇの亜硫酸ナトリウムおよび２ｇの四チオン酸カリウムを添加し、そしてその反応混合物を２時間撹拌した。反応終了後に非溶解の構成成分を遠心分離（３５，０００×ｇ、２０分）により除去した。
【００９８】
ゲル濾過
この上清をゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００  ＨＲ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、１０×９０ｃｍ）にかけ、そして６Ｍ  塩酸グアニジンを含むＰＢＳ緩衝液中、２８０ｍｌ／時間の流速でのゲル濾過に供した。産物含有性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、そしてそれらの分画を合わせた。
【００９９】
再生
その分子を還元する目的でβ−メルカプトエタノール（最終濃度  １５ｍＭ）を添加した。室温での２時間のインキュベーションの後、その混合物を水で５倍に希釈し、そして緩衝液（３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＫＣｌ、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して３〜４日間透析した。
【０１００】
濃縮
透析した物質を酢酸でｐＨ５に調節し、そしてその伝導率を水を添加することにより≦１０ｍＳ／ｃｍにまで低下させた。５０ｍｌのＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）（これは２５ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．０、で平衡化させてある）を撹拌しながらその混合物に添加する。非結合物質を濾過して除去し、そしてそのゲルを用いてカラムの充填を行った。産物を、２５ｍＭの酢酸アンモニア中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線濃度勾配液、ｐＨ５．０、で、３００ｍｌ／時間の流速で溶出した。産物含有性分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによるか、もしくは分画用ＲＰクロマトグラフィーにより同定した。
【０１０１】
最終精製
ＣＭセファロースのプールを、０．１％のＴＦＡで平衡化させたＶｙｄａｃ  Ｃ−４カラム（１×２５ｃｍ、１０μｍ）にかけ、そしてアセトニトリルの増加濃度勾配液で溶出した。純粋産物を含む分画を合わせ、そして凍結乾燥した。
【０１０２】
本発明の主たる態様または特徴を以下に挙げる。
【０１０３】
態様１：ａ）少なくとも２つの改変を伴う野生型ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）のアミノ酸配列から成る突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が、i）該蛋白質のＮ末端の改変、ii）該蛋白質のＣ末端の改変、iii）該蛋白質の潜在的なグリコシル化部位の欠失、および／またはiv）非蛋白質ポリマーへの該蛋白質のカプリング、からなる群より選ばれる少なくとも１つの改変であり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質、および
ｂ）生理学的に許容されうるキャリアー、を含んでなる治療用組成物。
【０１０４】
態様２：ａ）少なくとも２つの改変を伴う野生型ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−
４）のアミノ酸配列から成る突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が、i）該蛋白質のＮ末端の１以上のアミノ酸の欠失もしくは挿入による改変、ii）該蛋白質のＣ末端の１以上のアミノ酸の欠失もしくは挿入による改変、iii）該蛋白質の潜在的なグリコシル化部位の欠失、および／またはiv）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンから成る非蛋白質ポリマーへの該蛋白質のカプリング、からなる群より選ばれる少なくとも１つの改変であり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質、およびｂ）生理学的に許容されうるキャリアー、を含んでなる治療用組成物。
【０１０５】
態様３：ａ）少なくとも２つの改変を伴う野生型ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）のアミノ酸配列から成る突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が、天然のＮ末端ヒスツジン残基の前へのアラニニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンから成る群より選ばれるアミノ酸の挿入による該蛋白質のＮ末端の改変を含んでなり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質、およびｂ）生理学的に許容されうるキャリアー、を含んでなる治療用組成物。
【０１０６】
態様４：ａ）少なくとも２つの改変を伴う野生型ｈＩＬ−４のアミノ酸配列から成る態様２記載の突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が天然のＮ末端ヒスツジン残基の前へのアラニニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンから成る群より選ばれるアミノ酸の挿入による該蛋白質のＮ末端の改変、ならびにi）３８位および／もしくは１０５位のアスパラギンのアスパラギン酸置換によるこれらの位置における潜在的なグリコシル化部位の欠失、および／またはii）該蛋白質のポリエチレングリコールへのカプリングを含んでなり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質およびｂ）生理学的に許容されうるキャリアー、を含んでなる治療用組成物。
【０１０７】
態様５：少なくとも２つの改変を伴う野生型ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）のアミノ酸配列から成る突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が、i）該蛋白質のＮ末端の改変、ii）該蛋白質のＣ末端の改変、iii）該蛋白質の潜在的なグリコシル化部位の欠失、および／またはiv）非蛋白質ポリマーへの該蛋白質のカプリング、からなる群より選ばれる少なくとも１つの改変であり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質の、ヒトインターロイキン−４レセプター発現細胞に対するヒトインターロイキン−４の効果のアンタゴナイジングまたは部分アゴナイジングする製薬学的製剤の調製するための使用。
【０１０８】
態様６：少なくとも２つの改変を伴う野生型ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）のアミノ酸配列から成る突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が、i）該蛋白質のＮ末端の１以上のアミノ酸の欠失もしくは挿入による改変、ii）該蛋白質のＣ末端
の１以上のアミノ酸の欠失もしくは挿入による改変、iii）該蛋白質の潜在的なグリコシル化部位の欠失、および／またはiv）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンから成る非蛋白質ポリマーへの該蛋白質のカプリング、からなる群より選ばれる少なくとも１つの改変であり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質の、ヒトインターロイキン−４レセプター発現細胞に対するヒトインターロイキン−４の効果のアンタゴナイジングまたは部分アゴナイジングする製薬学的製剤の調製するための使用。
【０１０９】
態様７：少なくとも２つの改変を伴う野生型ヒトインターロイキン−４（ｈＩＬ−４）のアミノ酸配列から成る突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が、天然のＮ末端ヒスツジン残基の前へのアラニニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンから成る群より選ばれるアミノ酸の挿入による該蛋白質のＮ末端の改変を含んでなり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質の、ヒトインターロイキン−４レセプター発現細胞に対するヒトインターロイキン−４の効果のアンタゴナイジングまたは部分アゴナイジングする製薬学的製剤の調製するための使用。
【０１１０】
態様８：少なくとも２つの改変を伴う野生型ｈＩＬ−４のアミノ酸配列から成る請求項２記載の突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質であって、第一の改変が、野生型ｈＩＬ−４蛋白質における位置１２１、１２４、もしくは１２５に存在する１以上のアミノ酸の他の天然アミノ酸による置換からなり、そして第二の改変が天然のＮ末端ヒスツジン残基の前へのアラニニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンから成る群より選ばれるアミノ酸の挿入による該蛋白質のＮ末端の改変、ならびにi）３８位および／もしくは１０５位のアスパラギンのアスパラギン酸置換によるこれらの位置における潜在的なグリコシル化部位の欠失、および／またはii）該蛋白質のポリエチレングリコールへのカプリングを含んでなり、かつ、野生型ｈＩＬ−４のアンタゴニストもしくは部分アゴニストである、上記突然変異ヒトインターロイキン−４蛋白質の、ヒトインターロイキン−４レセプター発現細胞に対するヒトインターロイキン−４の効果のアンタゴナイジングまたは部分アゴナイジングする製薬学的製剤の調製するための使用。
【図１】
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【配列表】
2011102302000001.app