(57)【要約】【課題】天然の有効成分を含有するヒアルロン酸増量剤を提供する。【解決手段】  (a)リン脂質、及び(b)グルコサミン又はその塩を含むヒアルロン酸増量剤。この両者を併用することにより、ヒアルロン酸増量作用が相乗的に向上する。リン脂質としては、特にグリセロリン脂質が好適である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)リン脂質、及び(b)グルコサミン又はその塩を含むヒアルロン酸増量剤。
【請求項２】
リン脂質がグリセロリン脂質である請求項１に記載のヒアルロン酸増量剤。
【請求項３】
グリセロリン脂質が、レシチン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載のヒアルロン酸増量剤。
【請求項４】
グリセロリン脂質が、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２に記載のヒアルロン酸増量剤。
【請求項５】
グリセロリン脂質がホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールである請求項２に記載のヒアルロン酸増量剤。
【請求項６】
ホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトールとの重量比率が、乾燥重量に換算して、ホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトール＝０．５〜２０：１である請求項５に記載のヒアルロン酸増量剤。
【請求項７】
(a)リン脂質と(b)グルコサミン又はその塩との重量比率が、乾燥重量に換算して、(a)リン脂質：(b)グルコサミン又はその塩＝1：0.01〜50である請求項１〜６のいずれかに記載のヒアルロン酸増量剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸増量剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、生体内の皮膚、関節、眼球、心臓弁、動脈、脳、卵巣などに多く含まれている。
皮膚は、表皮及びその下層の真皮から構成されているが、真皮は、表皮と異なり、細胞が密ではなく、細胞間はマトリックスで埋められている。このマトリックスは、繊維芽細胞により産生されるヒアルロン酸のような酸性ムコ多糖類とコラーゲン、エラスチンのような繊維性蛋白質で構成されている。真皮内における細胞外マトリックスの中でヒアルロン酸量は非常に少ないが、肌の弾力性に最も大きな影響を与える成分の一つであることが知られている。ヒアルロン酸は、その１ｇに対して５〜６Ｌも保水することができるため、皮膚における保水性はヒアルロン酸に起因するところが非常に大きい。そして、ヒアルロン酸はその高い保水性から多くの水を取り込んだ結果、水和ゲルとして細胞外マトリックス内で高い膨潤圧力を維持することができる。この真皮内での膨潤圧力が肌の弾力性に繋がる。
【０００３】
また、肌のヒアルロン酸量は胎児期が最も高く、加齢と共に低下する。乳児のヒアルロン酸量を１００％としたとき、成人期及び高齢期にはその５０〜２５％にまで低下する。さらに、ヒアルロン酸の代謝回転は速く、成人の皮膚での半減期は１日以下と非常に早い。加齢や代謝でヒアルロン酸の産生が衰えると、皮膚の保水力や弾力性が失われることになるが、このような肌トラブルに対して、ヒアルロン酸を皮膚に補充する方法及び繊維芽細胞などの皮膚構成細胞からヒアルロン酸の産生を促進させることが提唱されている。
【０００４】
また、ヒアルロン酸は、関節包の内面を覆う滑膜を形成する滑膜細胞により産生され、関節液に多く含まれている。ヒアルロン酸は、骨どうしが接触しないように関節を押し広げたり、関節の動きを円滑にする役割を果たしている。
また、眼球の硝子体にはヒアルロン酸が多く含まれ、眼球を球状に保つ役割などをしている。
また、ヒアルロン酸は、心臓弁や動脈に多く含まれており、血管の弾性やしなやかさを保つ役割をしている。従って、心臓弁や動脈でのヒアルロン酸不足は、動脈硬化、高血圧、脳卒中などの一つの要因となる。
【０００５】
ヒアルロン酸は皮膚や消化管から吸収され難いため、生体内でのヒアルロン酸産生を促進し、或いは分解を阻害する等して生体内のヒアルロン酸量を増大させる物質が求められている。
ここで、特許文献１は、(a)グルコサミン又はその塩、及び(b)ガラクチュロン酸若しくはその塩、グルクロン酸若しくはその塩、及びグルクロノラクトンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む組成物が、ヒアルロン酸生成増強剤として使用できることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−３０８４３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒアルロン酸産生細胞において優れたヒアルロン酸生成増強作用を示すヒアルロン酸増量剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために研究を重ね、リン脂質と、ヒアルロン酸の構成成分であるN-アセチルグルコサミンの主要部分であるグルコサミン又はその塩とを併用することにより、ヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸産生量が増大し、生体内におけるヒアルロン酸量が増大することを見出した。また、両成分の併用による相乗効果があることを見出した。
【０００９】
本発明は、この知見に基づき完成されたものであり、以下のヒアルロン酸増量剤を提供する。
項１．  (a)リン脂質、及び(b)グルコサミン又はその塩を含むヒアルロン酸増量剤。
項２．  リン脂質がグリセロリン脂質である項１に記載のヒアルロン酸増量剤。
項３．  グリセロリン脂質が、レシチン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルエタノールアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である項２に記載のヒアルロン酸増量剤。
項４．  グリセロリン脂質が、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルイノシトールからなる群より選ばれる少なくとも１種である項２に記載のヒアルロン酸増量剤。
項５．  グリセロリン脂質がホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールである項２に記載のヒアルロン酸増量剤。
項６．  ホスファチジルセリンとホスファチジルイノシトールとの重量比率が、乾燥重量に換算して、ホスファチジルセリン：ホスファチジルイノシトール＝０．５〜２０：１である項５に記載のヒアルロン酸増量剤。
項７．  (a)リン脂質と(b)グルコサミン又はその塩との重量比率が、乾燥重量に換算して、(a)リン脂質：(b)グルコサミン又はその塩＝1：0.01〜50である項１〜６のいずれかに記載のヒアルロン酸増量剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のヒアルロン酸増量剤は、ヒアルロン酸産生細胞によるヒアルロン酸産生量を増大させる。このため、疾患又は加齢によるヒアルロン酸生産低下や分解促進による各種症状を予防、改善、又は治療することができる。また、ヒアルロン酸は保水力が高いため、本発明のヒアルロン酸増量剤は、症状の改善に保湿が有効である各種症状を予防、改善、又は治療することができる。
従って、本発明のヒアルロン酸増量剤は、例えば、変形性膝関節症、関節リウマチのような関節疾患；ドライアイ、白内障のような角結膜上皮障害；アトピー性皮膚炎、乾皮症のような乾燥症状を呈する皮膚疾患などの予防、治療薬として有用である。また、乾燥肌の保湿用、シワ、タルミの軽減用の化粧品として有用である。さらに、上記関節疾患、角結膜上皮障害、皮膚乾燥症状などの緩和や、シワ、タルミの軽減を目的とした食品組成物として有用である。
また、本発明のヒアルロン酸増量剤の有効成分であるリン脂質及びグルコサミンは何れも天然物由来の成分であるため、本発明のヒアルロン酸増量剤は、安全であり、また自然に優しい方法で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】グリセロリン脂質とグルコサミン塩酸塩とを併用した場合、各成分単独使用の場合に比べて、ヒト滑膜細胞によるヒアルロン酸産生量の増大作用について相乗効果があることを示す図である。
【図２】グリセロリン脂質とグルコサミン塩酸塩とを併用した場合、各成分単独使用の場合に比べて、ヒト繊維芽細胞によるヒアルロン酸産生量の増大作用について相乗効果があることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明のヒアルロン酸増量剤は、(a)リン脂質、及び(b)グルコサミン又はその塩を有効成分として含む。
（１）有効成分
リン脂質
リン脂質は、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質の何れであってもよい。
グリセロリン脂質としては、それには限定されないが、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピンのようなホスファチジン酸又はそのエステル；リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルグリセロールのようなリゾホスファチジン酸又はそのエステルが挙げられる。また、ホスファチジン酸又はそのエステルの混合物であるレシチンも使用できる。また、スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。
リン脂質は、1種を単独で、又は2種以上を組み合わせて使用できる。
中でも、グリセロリン脂質が好ましく、ホスファチジン酸又はそのエステルがより好ましい。特に、レシチン、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルコリン(PC)、若しくはホスファチジルエタノールアミン(PE)、又はこれらの混合物が好ましく、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルイノシトール(PI)、又はその混合物がより好ましい。
【００１３】
レシチンはADM社から市販されており、PC及びPEはSIGMA社から市販されている。
リン脂質がPS、PI、又はこれらの混合物である場合について、以下詳述する。
グリセロリン脂質がPSとPIとの混合物である場合の、PSとPIとの重量比率については、乾燥重量に換算して、それには限定されないが、PS:PIが約0.5〜20:1であることが好ましく、約1〜10:1であることがより好ましく、約1〜4:1であることがさらにより好ましい。
PSは、SIGMA社、BIOMOL社、日油株式会社などから市販されている。PIは、BIOMOL社などから市販されている。PSとPIとの混合物は、これら市販品を混合することにより調製できる。
また、PIは、大豆、菜種、ひまわり、パームなどの植物由来のレシチンから単離することができる。また、SLP-WHITE（ホスファチジルコリン（以下、「PC」と略称することもある。）25.6%、ホスファチジルエタノールアミン（以下、「PE」と略称することもある。）24.1%、ホスファチジン酸（以下、「PA」と略称することもある。）8%、PI12%、その他約30%）、SLP-PIパウダー（PC18%、PE22%、PA8%、PI17%、その他約35%）（いずれも辻製油製）などの市販レシチンから単離することもできる。PIの単離は、各種のクロマトグラフィーで行うことができる。
【００１４】
また、上記植物由来レシチン及び上記市販レシチンはPC及びPEを含むため、これらのレシチンにセリン及びホスフォリパーゼD（以下、「PLD」と略称することもある。）を作用させ塩基交換をさせることにより、PSを含むグリセロリン脂質混合物を得ることができる。さらに、この混合物から、各種のクロマトグラフィーでPSを単離することができる。なお、PI及びPSは、それぞれ、その他のグリセロリン脂質などの夾雑物質が含まれた状態で製剤化することもできる。
また、上記植物由来レシチン及び上記市販レシチンはPI、PC、及びPEを含むため、これらのレシチンにセリン及びPLDを作用させ塩基交換をさせることにより、PS及びPIを含むグリセロリン脂質混合物を得ることができる。必要に応じて、この混合物からPSとPIとの混合物を単離すればよい。PIとPSとの混合物は、その他のグリセロリン脂質などの夾雑物質が含まれた状態であってもよい。
【００１５】
PSとPIとの重量比率（乾燥重量換算）がPS:PI＝約0.5〜20:1であるグリセロリン脂質混合物は、出発原料となるレシチンとして、PCとPEとの合計重量に対するPI重量 の比率（PI/(PC+PE））が、乾燥重量に換算して、約20〜45重量%、好ましくは約25〜40重量%であるものを用いて、上記塩基交換反応を行うことにより得ることができる。上記植物由来レシチン及び上記市販レシチンは、通常この範囲でPC、PE、及びPIを含むが、PC及びPEの含有量が少ない場合は、例えばSLPC55（辻製油製）のような高純度リン脂質を添加することにより、レシチン中のPCとPEとの合計重量に対するPI重量 の比率（PI/(PC+PE））（乾燥重量換算）を上記範囲内に調整すればよい。
【００１６】
レシチンの塩基交換反応は、例えば、特開2007-014270号公報に記載の方法で行うことができる。
即ち、塩基交換反応を行う前に、レシチンを有機溶媒相と水相からなる二相系中で攪拌すればよい。有機溶媒は特に限定されないが、脂肪族炭化水素、環状脂肪族炭化水素、ハロゲン化炭化水素、エステル類、エーテル類、ケトン類等の公知のものを使用すればよい。水相としては緩衝液が好ましい。緩衝液の酸、塩基及び塩の合計濃度は約0.1〜2Mが好ましい。上記二相系において、水は有機溶媒に対して20重量%以下であることが好ましい。二相系中での攪拌は約10〜40℃の温度で、約30分〜2時間行えばよい。これにより、通常、グリセロリン脂質と有機溶媒と水とのエマルジョンが形成される。
次いで、この混合物にセリン及びPLDを添加するが、塩基交換反応系中のグリセロリン脂質の濃度は約5〜40重量%であることが好ましい。また、本反応系中のセリンの濃度は約20〜40重量%が好ましい。
【００１７】
PLDは、特に限定されず、ナガセケムテックス社製のホスフォリパーゼD、Sigma社製のStreptomyces chromofuscus由来のホスフォリパーゼD、Streptomyces sp.由来のホスフォリパーゼDなどを利用できる。本反応系中におけるPLDの濃度は、グリセロリン脂質1gに対して約5〜200Uとすればよい。なお、1Uは、95%大豆ホスファチジルコリンを基質とし、基質濃度0.16%の0.2M酢酸緩衝液（pH4.0、10mMのCaCl2、1.3%のTriton X-100を含む）を37℃にて反応させた時、1分間に1μmolのコリンを遊離する酵素量である。
塩基交換反応は、約3.5〜10のpH条件で、約10〜40℃の温度で、約1〜72時間行えばよい。
また、実施例の「(1)PI・PS含有リン脂質混合物の製造例」の項目に示すように、レシチンを含む有機溶媒相に、セリン及びPLDを含有する緩衝液を加えて攪拌することによって塩基交換反応させることもできる。
【００１８】
上記塩基交換反応により、グリセロリン脂質中のPC、PE等とセリンとが反応してPSが生成する。PIは、上記塩基交換反応においてヒドロキシル基含有化合物と反応し難いので、原料のグリセロリン脂質に含まれるPIはほぼそのまま塩基交換反応後のリン脂質混合物中に含まれる。
塩基交換反応は、PLDを加熱失活させることにより、終了させればよい。さらに、遠心分離法等により有機溶媒相を得た後、有機溶媒を減圧除去することによって反応混合物を濃縮すればよい。次いで、アセトン又はエタノールで晶析を行い、固液分離によって固形物を得、乾燥することにより、PS及びPIを含むグリセロリン脂質混合物を単離することができる。
【００１９】
ホスファチジン酸は、例えば、PC、PEをPLDで処理することにより得られる。リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミンは、例えば、PC、PEをホスホリパーゼA2で処理することにより得られる。リゾホスファチジン酸は、例えば、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミンをPLDで処理することにより得られる。PC、PE、PI、ホスファチジン酸等のグリセロリン脂質、及び、それらのリゾ体は市販品を用いることもできる。
【００２０】
グルコサミン又はその塩
本発明では、遊離のグルコサミン又はその塩の何れも使用できるが、保存安定性が良い点で、グルコサミン塩が好ましい。グルコサミン塩としては薬理学的に許容されるものであれば特に制限はなく、無機酸塩、有機酸塩のいずれも使用できる。無機塩としては、硫酸塩、塩酸塩などが挙げられ、有機塩としては、酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩などが挙げられる。中でも、塩酸塩、クエン酸塩が好ましく、入手し易い点で塩酸塩がより好ましい。
【００２１】
成分比率
(a)リン脂質と(b)グルコサミン又はその塩との比率は、乾燥重量に換算して、(a)リン脂質：(b)グルコサミン又はその塩が、それには限定されないが、1：約0.01〜50であることが好ましく、1：約0.05〜20であることがより好ましく、1：約0.1〜15であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、高いヒアルロン酸増量効果が得られる。
【００２２】
（２）製剤
本発明のヒアルロン酸増量剤には、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品組成物などが含まれる。
皮膚外用剤
本発明のヒアルロン酸増量剤は各種の皮膚外用剤とすることができる。皮膚外用剤の形態は、特に限定されず、化粧品であれば、例えば、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリーム、化粧用ゲル、美容液、パック剤、ファンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、洗顔剤、ボディソープ、ハンドクリーム、シャンプー、リンス、整髪料等のスキンケア用品又はメイクアップ用品の形態が挙げられる。中でも、広範囲の部位に適用できる点で、化粧水、化粧用ゲル、化粧用乳液、化粧用クリーム、美容液が好ましく、化粧水、化粧用乳液、化粧用クリームがより好ましい。
【００２３】
これらは、有効成分である(a)リン脂質、及び(b)グルコサミン又はその塩（以下、「有効成分」と略称することがある。）に加えて、通常化粧品 に用いられる成分、例えば、精製水、アルコール類（低級アルコール、多価アルコールなど）、油脂類、ロウ類、炭化水素類のような基剤と、必要に応じて、界面活性剤、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、安定剤、防腐剤、着色剤、香料のような添加剤とを配合して調製することができる。
医薬又は医薬部外品としての皮膚外用剤であれば、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、乳剤、粉剤、懸濁剤、エアゾール剤、液剤などや、基剤を支持体上に支持させた硬膏剤、パップ剤、テープ剤、プラスター剤などの剤型が挙げられる。中でも、ベトツキ感なく均一に塗布することができる点で、ゲル剤、ローション剤、乳剤が好ましく、ゲル剤がより好ましい。
【００２４】
医薬又は医薬部外品としての皮膚外用剤は、有効成分を適当な基剤に配合して調製することができる。基剤としては、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム、カラギーナン、マンナン、アガロース、デキストリン、カルボキシメチルデンプン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、メトキシエチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、プルラン等のポリマー類；白色ワセリン、黄色ワセリン、パラフィン、セレシンワックス、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；ゲル化炭化水素（例えば、商品名プラスチベース、ブリストルマイヤーズスクイブ社製）；ステアリン酸等の高級脂肪酸；セタノール、オクチルドデカノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール；ポリエチレングリコール（例えば、マクロゴール4000等）；プロピレングリコール、グリセリン、ジプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、濃グリセリン等の多価アルコール；モノオレイン酸エステル、ステアリン酸グリセリド等の脂肪酸エステル類；リン酸緩衝液などが挙げられる。さらに、溶解補助剤、無機充填剤、pH調節剤、保湿剤、防腐剤、粘稠剤、酸化防止剤、清涼化剤などの添加剤が添加されていてもよい。
【００２５】
皮膚外用剤中の有効成分の含有量は、以下の通りである。
(a)リン脂質の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.001〜10重量%であることが好ましく、約0.01〜5重量%であることがより好ましく、約0.1〜2重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
(b)グルコサミン又はその塩の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.05〜50重量%であることが好ましく、約0.1〜30重量%であることがより好ましく、約1〜20重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
【００２６】
経口投与剤
また、本発明のヒアルロン酸増量剤は、各種の経口投与製剤とすることができる。固形製剤としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体製剤としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。中でも、服用し易く味がよい点で、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、カプセル剤が好ましく、顆粒剤がより好ましい。
固形製剤は、有効成分に薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。また、液体製剤は、例えば、上記の有効成分を、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。
【００２７】
経口投与剤中の有効成分の含有量は、以下の通りである。
(a)リン脂質の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.01〜50重量%であることが好ましく、約0.05〜30重量%であることがより好ましく、約0.1〜25重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
(b)グルコサミン又はその塩の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.01〜80重量%であることが好ましく、約0.05〜50重量%であることがより好ましく、約0.1〜30重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
【００２８】
その他の剤型
また、本発明のヒアルロン酸増量剤が医薬品である場合、注射剤や座剤などの剤型にすることもできる。
注射剤は、有効成分を、注射用蒸留水または生理用食塩水などに溶解又は分散させることにより得ることができる。注射剤には、pH調整剤等として水溶性無機酸又はその塩、水溶性有機酸又はその塩、中性アミノ酸、酸性アミノ酸又はその塩、塩基性アミノ酸の塩などが含まれていてもよい。また、緩衝剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤などが含まれていてもよい。
注射剤中の有効成分の含有量は、以下の通りである。
(a)リン脂質の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.001〜5重量%であることが好ましく、約0.01〜1重量%であることがより好ましく、約0.05〜0.5重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
(b)グルコサミン又はその塩の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.001〜20重量%であることが好ましく、約0.01〜15重量%であることがより好ましく、約0.05〜7.5重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
【００２９】
座剤は、有効成分を、カルボポール及びポリカルボフィルのようなアクリル性高分子；ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース性高分子；アルギン酸ナトリウム及びキトサンのような天然高分子；脂肪酸ワックスなどの基剤に配合することにより調製できる。また、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、パラベンのような防腐剤；塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウムのようなpH調節剤；メチオニンのような安定化剤を配合してもよい。
座剤中の有効成分の含有量は、以下の通りである。
(a)リン脂質の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.02〜5重量%であることが好ましく、約0.05〜3重量%であることがより好ましく、約0.1〜2重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
(b)グルコサミン又はその塩の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、それには限定されないが、約0.05〜50重量%であることが好ましく、約0.1〜30重量%であることがより好ましく、約1〜20重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、適量の使用によって十分なヒアルロン酸増量作用が得られる。
【００３０】
食品組成物
本発明のヒアルロン酸増量剤が食品組成物である場合の有効成分の含有量は、以下の通りである。
(a)リン脂質の含有量は、乾燥重量に換算して、組成物全体に対して、それには限定されないが、約0.01〜50重量%であることが好ましく、約0.05〜30重量%であることがより好ましく、約0.1〜25重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、無理なく摂取できる量の食品中に、十分なヒアルロン酸増量作用が得られるだけの有効成分が含まれることになる。
(b)グルコサミン又はその塩の含有量は、乾燥重量に換算して、組成物全体に対して、それには限定されないが、約0.01〜80重量%であることが好ましく、約0.05〜50重量%であることがより好ましく、約0.1〜30重量%であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、無理なく摂取できる量の食品中に、十分なヒアルロン酸増量作用が得られるだけの有効成分が含まれることになる。
【００３１】
この食品組成物は、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなどを含む）として好適に用いることができる。また、保健機能食品（特定保健用食品（疾病リスク低減表示、規格基準型を含む）、条件付き特定保健用食品、栄養機能食品を含む）に好適である。
この食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、またはエリキシル剤等の剤型に調製することができる。中でも、服用しやすく味が良い点で、錠剤、タブレット剤、顆粒剤が好ましく、顆粒剤がより好ましい。
食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
【００３２】
また、この食品組成物は、飲料（スポーツ飲料、ドリンク剤、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、炭酸飲料、野菜飲料、茶飲料等）、菓子類（クッキー等の焼き菓子、ゼリー、ガム、グミ、飴等）を含むものであってもよい。中でも、製剤化の点で、リン脂質との相性がよく、処方の調整が容易である点で、乳飲料が好ましい。
【００３３】
（３）使用方法
投与量
本発明のヒアルロン酸増量剤の使用量は、医薬品である場合、対象の年齢、症状、体重などにより異なるが、概ね以下の通りである。
即ち、経口投与剤である場合は、有効成分の投与量が、乾燥重量に換算して、1日当たり、それには限定されないが、約0.1〜10gであることが好ましく、約0.5〜5gであることがより好ましい。
また、注射剤である場合は、有効成分の投与量が、乾燥重量に換算して、1日当たり、それには限定されないが、約0.005〜100mgであることが好ましい。
【００３４】
また、座剤である場合は、有効成分の投与量が、乾燥重量に換算して、1日当たり、それには限定されないが、約0.005〜100mgであることが好ましい。
皮膚外用剤である場合は、製剤の使用量が、1日あたり、それには限定されないが、通常使用量である約0.1〜1mLであればよい。
また、本発明のヒアルロン酸増量剤が食品組成物である場合、この食品組成物の摂取量は、摂取者の年齢、症状、体重などによって異なるが、有効成分の摂取量が、乾燥重量に換算して、1日当たり、それには限定されないが、約0.1〜10gであることが好ましく、約0.5〜5gであることがより好ましい。
【００３５】
対象
使用対象は特に限定されないが、加齢や疾患によりヒアルロン酸量が少なくなった人が好適な対象となる。また、HAS1 、HAS2、HAS3のようなヒアルロン酸生産酵素が欠損していたり、発現量が低下する疾患の患者も好適な対象となる。
症状別に見ると、本発明のヒアルロン酸増量剤が医薬品である場合、変形性膝関節症、関節リウマチのような関節疾患；ドライアイ、白内障のような角結膜上皮障害；アトピー性皮膚炎、乾皮症のような乾燥症状を呈する皮膚疾患などの患者が好適な対象として挙げられる。
また、本発明のヒアルロン酸増量剤が化粧品である場合、皮膚が乾燥したヒト、皮膚のシワやタルミが生じた中高年齢層などが好適な対象として挙げられる。
また、本発明のヒアルロン酸増量剤が食品組成物である場合、上記関節疾患、上記角結膜上皮障害、上記の乾燥皮膚疾患などの患者、乾燥肌のヒト、皮膚のシワやタルミが生じた中高年齢層などが好適な対象として挙げられる。また、予防的にヒアルロン酸生産量を増大させようとする健常人も対象となる。
（４）その他
本発明は、(a)リン脂質、及び(b)グルコサミン又はその塩の有効量を哺乳動物、特に人に投与する、生体内のヒアルロン酸増量方法、又はヒアルロン酸産生促進方法も包含する。
【実施例】
【００３６】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）PI・PS含有リン脂質混合物の製造例
大豆レシチン（UltralecP（ADM社）；PC=24重量%, PE=17重量%, PI=14重量%含有）7gをヘプタン・アセトン混合液（ヘプタン:アセトン＝4:1）70mLと混合し、溶解させ、レシチン溶液を得た。これとは別に、セリン20g及びPLD（ナガセケムテックス社製）500Uを1M酢酸緩衝液（pH4.5）67mL中に含む酵素含有セリン溶液を調製した。
上記レシチン溶液に酵素含有セリン溶液を加え、30℃にて5時間攪拌した。次いで、この混合液に、上記ヘプタン・アセトン混合液75mL及び塩化ナトリウム20gを加え、1時間攪拌し、これを静置して、水相と有機溶媒相とを分離した後、有機相を回収し、PI及びPS含有有機溶媒溶液を得た。この有機溶媒溶液は固形分7gを含有していた。その固形分の組成を下記条件のHPLCで調べたところ、次の通りであった。PS 32重量%、PI 21重量%、PC 2重量%、PE 9重量%、PA 13重量%。
＜HPLC条件＞
使用カラム：ジーエルサイエンス社製 Unisil Q NH2（4.6mm I.D.×250mm）
移動相：アセトニトリル／メタノール／10mMリン酸二水素アンモニウム
＝1856/874/270
流速：1.3mL/分
検出：UV 205nm
【００３７】
（２）ヒト滑膜細胞によるヒアルロン酸生産の促進
＜方法＞
ヒト滑膜細胞株MH7A（RCB1512；RIKEN CELL BANK、JAPAN）は関節リウマチ患者由来の滑膜細胞にSV40 T抗原遺伝子を導入して株化した細胞である。このヒト滑膜細胞株MH7Aを、10%牛胎児血清を含むRPM1640培地を用いて培養し、維持した。
ディッシュ内で7日間の前培養を行ったMH7A細胞を、トリプシンEDTAを用いてディッシュから剥離し、培地を用いて細胞密度1.0×105個／mlの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を24孔プレートに、1ウェル当たり500μlづつ入れることにより、1ウェル当たり5×104個のMH7A細胞を播種した。37℃で24時間前培養した後、培地を吸引除去した。
各ウェルに、新しい培地を490μlづつ入れ、さらに、PIPSナガセ(PI・PS含有リン脂質混合物；ナガセケムテックス社製；PIを21重量%、PSを32重量%含む）、コーヨーグルコサミン（グルコサミン塩酸塩；甲陽ケミカル社製；グルコサミン塩酸塩を99.8重量％含む）、又はこれら両者を加えた。37℃で24時間培養した後、培養上清0.5mlを回収し、上清中のヒアルロン酸濃度をヒアルロン酸測定キット（生化学社）を用いて定量した。
本実施例では、ナガセケムテックス社から市販されているPIPSを使用したが、このPIPSは、上記の「（１）PI・PS含有リン脂質混合物の製造例」の項目に記載した方法で製造されたものである。
【００３８】
＜結果＞
ヒト滑膜細胞によるヒアルロン酸生産に及ぼす、PIPSナガセとグルコサミンとの併用効果を図１に示す。図１には、培養上清中のヒアルロン酸濃度の増加量（PIPSナガセ、又はコーヨーグルコサミンを添加しない場合の培養上清中のヒアルロン酸濃度との差）を示した。
図１から明らかなように、PIPS単独の場合、及びグルコサミン単独の場合に比べて、各成分を併用した場合の方が、ヒアルロン酸増加量が格段に高かった。また、図１（Ａ）から、グルコサミン塩酸塩濃度を1/2にしてもPIPSと併用することにより、ヒアルロン酸増加量が格段に高くなったことが分かり、図１（Ｂ）から、PIPS濃度を1/2にしてもグルコサミン塩酸塩と併用することにより、ヒアルロン酸増加量が格段に高くなったことが分かる。
このように、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールを主成分とするリン脂質混合物とグルコサミン塩酸塩とを併用することにより、ヒト滑膜細胞によるヒアルロン酸産生促進作用に対する相乗効果があることが認められた。
【００３９】
（３）ヒト繊維芽細胞によるヒアルロン酸生産の促進
＜方法＞
500mlの培地（クラボウ社；S-106-500S）に増殖添加剤（クラボウ社；S-003-10）を添加して増殖添加剤含有106S培地を調製し、この培地でヒト皮膚正常繊維芽細胞NHDF（クラボウ社）を培養し、維持した。
ディッシュ内で7日間の前培養を行ったNHDF細胞を、トリプシンEDTAを用いてディッシュから剥離し、培地を用いて細胞密度1.0×105個/mlの細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液を24孔プレートに加えることにより、１ウェル当たり1×105個となるように細胞を播種した。37℃で24時間前培養した後、培地を吸引除去した。
各ウェルに、上記の増殖添加剤含有106S培地（クラボウ社）を加え、さらに、各種リン脂質、コーヨーグルコサミン（グルコサミン塩酸塩；甲陽ケミカル社製；グルコサミン塩酸塩を99.8重量％含む）、又はこれら両者を加えた。37℃で72時間培養した後、培養上清1mlを回収し、上清中のヒアルロン酸濃度をヒアルロン酸測定キット（生化学工業社）を用いて定量した。また、コントロールとして、上記の増殖添加剤含有106S培地（クラボウ社）を加えただけのものも、同様にして、培養し、ヒアルロン酸濃度を測定した。
本実施例では、リン脂質として、PIPSナガセ（PI・PS含有リン脂質混合物；ナガセケムテックス社製；PIを21重量%、PSを32重量%含む）、大豆レシチン（UltralecP ；ADM社、リン脂質組成はホスファチジルコリン＝25％、ホスファチジルエタノールアミン＝20％、ホスファチジルイノシトール＝14％、ホスファチジン酸＝6％）、大豆ホスファチジルコリン（PC；SIGMA；P7443）、大豆ホスファチジルエタノールアミン（PE；SIGMA；P8193）、及び大豆ホスファチジルイノシトール（PI；SIGMA；P0639）、大豆ホスファチジルセリン（PS；SIGMA；P0474）を用いた。ここで使用したPIPSナガセは、ナガセケムテックス社から市販されているものであるが、このPIPSは、上記の「（１）PI・PS含有リン脂質混合物の製造例」の項目に記載した方法で製造されたものである。
【００４０】
＜結果＞
ヒト繊維芽細胞によるヒアルロン酸生産に及ぼす、PIPSナガセとグルコサミンとの併用効果を図２に示す。図２には、培養上清中のヒアルロン酸濃度の増加量（PIPSナガセ、又はコーヨーグルコサミンを添加しない場合の培養上清中のヒアルロン酸濃度との差）を示した。
図２から明らかなように、PIPS単独の場合、及びグルコサミン単独の場合に比べて、各成分を併用した場合の方が、ヒアルロン酸増加量が格段に高かった。このように、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールを主成分とするリン脂質混合物とグルコサミン塩酸塩とを併用することにより、ヒト皮膚正常繊維芽細胞によるヒアルロン酸産生促進作用に対する相乗効果があることが認められた。
【００４１】
また、ヒト繊維芽細胞によるヒアルロン酸生産に、レシチン、PC、PE、PI、又はPS、及びグルコサミンを作用させた場合のヒアルロン酸増加量を以下の表１に示す。
【表１】
2011074059.tif 000003
表１より、上記のリン脂質及びグルコサミンをヒト繊維芽細胞に作用させることにより、生産されたヒアルロン酸量が増大したことが分る。
【００４２】
処方例
下記の各処方例で使用しているPI・PS含有リン脂質混合物は、上記の「（１）PI・PS含有リン脂質混合物の製造例」の項目に記載した方法で製造されたものである。
【表２】
2011074059.tif 000004
牛乳に、PI・PS含有リン脂質混合物を混合し、室温で2分間、5000rpmでTKホモミクサーで攪拌した。乳化後、100℃、10分加熱処理した。
【００４３】
【表３】
2011074059.tif 000005
豆乳に上記組成を混合し、室温で2分間、5000rpmでTKホモミキサーで攪拌した。乳化後、100℃、10分加熱処理した。
【００４４】
【表４】
2011074059.tif 000006
上記の全ての成分を室温にて混合および撹拌して均一な溶液として、飲料を作製する。
【００４５】
【表５】
2011074059.tif 000007
PI・PS含有リン脂質混合物、乳糖、ジャガイモデンプンを均一に混合する。混合物にポリビニルアルコールの水溶液を加え、湿式顆粒造粒法により顆粒を調製する。顆粒を乾燥し、ステアリン酸マグネシウムを混合し、圧縮打錠して重量300mgの錠剤を作製する。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のヒアルロン酸増量剤は、変形性膝関節症、関節リウマチのような関節疾患、ドライアイ、白内障のような角結膜上皮障害、アトピー性皮膚炎、乾皮症のような乾燥症状を呈する皮膚疾患などの予防、治療薬として有用である。また、乾燥肌の保湿用、シワ、タルミの軽減用の化粧品として有用である。さらに、上記関節疾患、角結膜上皮障害などの緩和や、シワ、タルミの軽減を目的とした食品組成物として有用である。
【図１】
2011074059.tif 000008
【図２】
2011074059.tif 000009