(57)【要約】【課題】本発明は、シュードモナス・アエルギノーザ感染を診断するための組成物を提供することを目的とする。【解決手段】課題を解決するために、ＰｃｒＶ抗原を含む、ＰｃｒＶ特異的抗体／抗原複合体を検出することでシュードモナス・アエルギノーザ感染を診断するための組成物を提供する。【選択図】図１
2011068672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＰｃｒＶ抗原を含む、シュードモナス・アエルギノーザ感染を抑制する組成物であって、前記ＰｃｒＶ抗原が、ＰｃｒＶタンパク質のエピトープを含んでＶ抗原に特異的な免疫応答を誘導できるＰｃｒＶタンパク質の断片であり、かつ、前記ＰｃｒＶタンパク質のエピトープがＰｃｒＶタンパク質のアミノ酸配列中の６〜９のアミノ酸からなる、組成物。
【請求項２】
有効量のＰｃｒＶ抗原を含む、シュードモナス・アエルギノーザ感染を抑制する組成物であって、前記ＰｃｒＶ抗原がＰｃｒＶをコード化するＤＮＡを含む遺伝子ワクチンであり、前記ＤＮＡが、ＰｃｒＶタンパク質のエピトープを含んでＶ抗原に特異的な免疫応答を誘導できるＰｃｒＶタンパク質の断片をコード化し、かつ、前記ＰｃｒＶタンパク質のエピトープがＰｃｒＶタンパク質のアミノ酸配列中の６〜９のアミノ酸からなる、組成物。
【請求項３】
ＰｃｒＶ抗原のＤＮＡ配列内で少なくとも４０個連続したヌクレオチドからなる、ＰｃｒＶコード化核酸に特異的にハイブリッド化するが、他の核酸にはハイブリッド化しない、ヌクレオチドプローブを含む、シュードモナス・アエルギノーザ感染を診断するための組成物。
【請求項４】
シュードモナス・アエルギノーザ感染を診断するための組成物であって、ｐｃｒＶ遺伝子を増幅するように設計された、ＰｃｒＶ抗原のＤＮＡ配列内で少なくとも２５個連続したヌクレオチドからなる、ヌクレオチドプライマーを含み、該プライマーは、シュードモナス・アエルギノーザ感染を増幅産物の存在と相関させるために、ポリメラーゼ連鎖反応によってｐｃｒＶ遺伝子が存在すればこれを増幅しうる、シュードモナス・アエルギノーザ感染を診断するための組成物。
【請求項５】
ＰｃｒＶ抗原を含む、ＰｃｒＶ特異的抗体／抗原複合体を検出することでシュードモナス・アエルギノーザ感染を診断するための組成物。
【請求項６】
ＰｃｒＶ抗原をコード化する有効量の遺伝子ワクチンを含む、シュードモナス・アエルギノーザ感染を抑制する組成物であって、前記遺伝子ワクチンが、ＰｃｒＶタンパク質のエピトープを含んでＶ抗原に特異的な免疫応答を誘導できるＰｃｒＶタンパク質の断片をコード化し、かつ、前記ＰｃｒＶタンパク質のエピトープがＰｃｒＶタンパク質のアミノ酸配列中の６〜９のアミノ酸からなる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照 本出願は、１９９８年１１月２５日出願の米国出願番号第６０／１０９，９５２号、並びに１９９９年３月３０日出願の米国出願番号第６０／１２６，７９４号に対して優先権を主張し、これらは両方とも参照して明細書の記載の一部とする。
【０００２】
連邦政府後援の研究開発に関する記述 本発明は、以下の機関により与えられた米国政府支援によりなされた。ＮＩＨ／ＮＩＡＤＡ許可番号Ｒ０１ Ａ１３１６６５−０８、Ｋ０４ ＡＩ０１２８９−０４およびＲ０１ ＨＬ５９２３９−０２。米国は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、重病の個体において致命的な急性肺感染を引き起こすことのできる日和見細菌病原体である（１）。細菌の肺上皮傷害能は、ＩＩＩ型媒介分泌および転位機構を介して、真核細胞に直接注入される毒素の発現と関連している（２、３）。
【０００４】
Ｐ．アエルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＩＩＩ型分泌および転位装置によりコード化されるタンパク質は、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）Ｙｏｐレギュロンのメンバーと高レベルのアミノ酸同一性を示す（４−６）。グラム陰性細菌に発見された全ＩＩＩ型系の中で、唯一、Ｐ．アエルギノーザが、エルシニアＶ抗原であるＰｃｒＶに相同性を有する（ＩＩＩ型系の概観については６参照）。分泌および転位装置に相同なタンパク質は、植物および動物の両方の病原性細菌によりコード化される。これらの生物は、サルモネラ・チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・フレクスナー（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、腸病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種などのヒト病原体、およびキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈａｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）、エルシニア・アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）およびラルストニア・ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）などの植物病原体を含む。しかし、唯一、Ｐ．アエルギノーザおよびエルシニアが、Ｖ抗原をコード化する。
【０００５】
ヤール（Ｙａｈｒ）等、１９９７は、ＰｃｒＶをコード化するオペロンの配列を開示し、この配列をＬｃｒＶタンパク質と比較している。それゆえに、ＰｃｒＶのアミノ酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋの寄託番号ＡＦ０１０１４９で入手できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、シュードモナスＶ抗原は、致命的な肺感染から動物を守るために使用できるという我々の観察から発展させた方法および組成物を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
１つの実施態様において、本発明は、患者（ｐａｔｉｅｎｔ、患者または患蓄）に有効量のＰｃｒＶ抗原を接種することを含む、シュードモナス感染を抑制する方法である。別の実施態様において、ＰｃｒＶをコード化するＤＮＡを、遺伝子ワクチンとして使用する。
【０００８】
１つの好ましい実施態様において、抗原は、組換えタンパク質として発現され、危険にさらされている患者を免疫化するために使用する。
【０００９】
好ましくは、患者は、感染から完全に守られる。
【００１０】
別の実施態様において、ＰｃｒＶをコード化するＤＮＡ（ｐｃｒＶと呼ぶ）またはＤＮＡ断片は、Ｐ．アエルギノーザ感染を検出するために診断的に使用することができる。
【００１１】
別の実施態様において、組換えタンパク質（ｒＰｃｒＶ）は、患者から抗体を検出するために診断的に使用する。ＰｃｒＶに対する患者の抗体応答は、予後に関連し得る。それ故、この実施態様において、組換えタンパク質は、患者の抗体力価を測定することにより、予後の指標として使用する。
【００１２】
本発明はまた、個体を、有効量のＰｃｒＶ抑制剤、特にＰｃｒＶ抗体、抗体誘導体もしくは断片、または抗体擬似体と接触させることにより、個体のシュードモナス感染を抑制する方法を提供する。ＰｃｒＶ抗体、抗体誘導体および抗体断片もまた提供される。
【００１３】
本発明の目的は、シュードモナス感染に対して患者を能動および受動免疫化することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、Ｐ．アエルギノーザ感染を診断的に検出することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、シュードモナス患者から抗体を診断的に検出することである。
【００１６】
本発明の別の目的、特徴および利点は、明細書、特許請求の範囲および図面を概観した後、当業者には明らかとなろう。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ＰｃｒＶに対してワクチン接種することにより、攻撃された動物の生存が保証されるだけでなく、細菌により引き起こされる肺炎症および損傷も減少する。また、有効量のＰｃｒＶ抗原を用いて患者を免疫化することにより、シュードモナス感染を緩和または抑制することができる。また、ＰｃｒＶに対するヒトまたはヒト化モノクローナルまたはポリクローナル抗体を投与し、Ｐ．アエルギノーザによる感染を予防または治療することができる。また、ＰｃｒＶタンパク質をコード化するＤＮＡ、またはこのＤＮＡの相補体を使用して、Ｐ．アエルギノーザ感染を診断的に検出することができる。また、タンパク質または抗原は、患者の抗体を検出するために診断的に使用することもでき、したがって、患者の感染状態を予測できる。また、ＰｃｒＶ抗体または抗体断片を治療に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶの表現型分析を示す、染色ゲル（図１Ａ）およびウエスタンブロット（図１Ｂ）である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、Ｐ．アエルギノーザ親および変異株の生存および肺損傷を示す、グラフ（図２Ａ）および棒グラフのセット（図２Ｂ）である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、生存、肺損傷、および細菌コロニー形成に対する免疫化の効果を示す、グラフ（図３Ａ）および棒グラフのセット（図３Ｂ）である。
【図４】図４は、ＰｃｒＶ、ＥｘｏＵ、ＰｏｐＤに特異的なポリクローナル抗体または非免疫化動物由来の対照ＩｇＧを受動投与した後、５×１０5ＣＦＵ／マウスのＰＡ１０３株で攻撃して生存した動物数のグラフである。
【図５】図５は、異なる細菌性抗原に対するＩｇＧおよび細菌攻撃の併用投与による、肺損傷からの生存および保護を示す、グラフ（図５Ａ）および棒グラフのセット（図５Ｂ）である。肺損傷の一方向性分散分析は、ｐ＝０．０２６、および肺浮腫では、ｐ<０．０００５。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
我々は、本明細書で、ＰｃｒＶは、ＩＩＩ型分泌産物の発現に対して新規な調節効果を有し、ＩＩＩ型毒素の転位に関与し、Ｐ．アエルギノーザ感染により誘導される肺損傷から守る最初の抗原であることを開示する。抗ＰｃｒＶ ＩｇＧを気腔に滴下注入する前に、ＰｃｒＶに対してワクチン接種することにより、攻撃された動物の生存が保証されただけでなく、細菌により引き起こされる肺炎症および損傷も減少した。
【００２０】
ＬｃｒＶ、またはＶ抗原は、Ｙｏｐエフェクタータンパク質の分泌および転位を調節し、エルシニア感染に対するホストサイトカイン応答を変化させることにより、病理発生に細胞外的役割を果たしている、多機能性タンパク質である（７−１１）。この危険な病原因子の唯一の既知の相同体は、ＰｃｒＶと呼ばれる、Ｐ．アエルギノーザによりコード化される細胞外タンパク質である。
【００２１】
本発明の１つの実施態様は、有効量のＰｃｒＶ抗原を用いて患者を免疫化することにより、シュードモナス感染を緩和または抑制する方法である。ここで「有効量」とは、抗原で処置されていない対照被検者または動物と比較して、シュードモナス感染のいくらかの緩和または抑制が示されるに有効な量のＰｃｒＶ抗原を意味する。
【００２２】
ここで「緩和」とは、感染が、非免疫化動物と比較して、少なくとも５０％抑制されることを意味する。好ましくは、感染は完全に予防される。感染の定量評価は、好ましくは、血流または胸水中の細菌量の検査および／または肺損傷パラメーターの検査を含む。例えば、血流または胸水中での細菌の非存在は、感染の予防を示す。肺損傷パラメータ−の減少は、感染の緩和を示す。
【００２３】
感染は、痰、血液または胸水中の細菌容量の減少、浸潤物のサイズの減少、酸素付加改善、機械的換気時間の長さの減少、熱降下、および白血球数の減少を含む、いくつかの他の臨床指標により定量的に評価できる。
【００２４】
ここで「ＰｃｒＶ抗原」とは、感染を予防または緩和する免疫応答を引き出すのに必要なＰｃｒＶタンパク質の一部または断片を意味する。現在、我々は、全長ＰｃｒＶタンパク質を、保護を誘導するための抗原として使用している。しかし、当業者は、分子上での保護エピトープの位置を決めることができる。例えば、我々は、モノクローナル抗体を産生し、それらを、組織培養中において細胞毒性を予防する抗体についてスクリーニングする。細胞毒性を予防する抗体を、急性肺感染モデルで、感染に対する受動保護について試験する。モノクローナル抗体は、一般に、小領域のアミノ酸を認識し、アミノ酸が隣接している場合、エピトープは、６−９という少ないアミノ酸として特定され得る。エピトープを特定するために、感染および細胞毒性から守るモノクローナル抗体を、段々と小さい形の組換えＰｃｒＶに対する結合について試験する。（ここで「組換えＰｃｒＶ」または「ｒＰｃｒＶ」とは、非天然ホストに配置しておいたＰｃｒＶ遺伝子から産生されたタンパク質を意味する。）これにより領域が局限する。この時点で、我々は、エピトープを特定するために、化学的にアミノ酸伸展を合成する。これらの化学合成したエピトープは、担体分子に結合させることができ、免疫化に使用して保護が達成されたかを決定することができる。別法として、我々は、ＰｃｒＶの異なるクローンを作成し、組換えタンパク質を産生および精製し、これらの抗原を、免疫化実験および攻撃実験で試験できる。
【００２５】
ＰｃｒＶを用いて行なったマッピング研究に基づき、我々は、エピトープは、アミノ酸１１３ないし２４５の間に存在すると予測する。
【００２６】
ＰｃｒＶ抗原は、我々が使用した方法、すなわちノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から市販で入手可能なｐｅｔ１６ｂと呼ばれる細菌性発現プラスミドにより、最も容易に得られ得る。ｐｃｒＶ遺伝子は、初めて、オペロンの一部として、Ｐ．アエルギノーザ染色体からクローン化された。コード領域を増幅し、２つの異なるベクターに挿入した。１つのベクターは、図１で示すように、Ｐ．アエルギノーザからの発現用である。これは、ＰｃｒＶ発現が、細菌の残りの輸送および中毒装置と協調的に調節されるように、適切なプロモーター配列を含むように我々が修飾した、ハーバート・シュバイツァーからのベクター（参考文献１９）である。第二のプラスミドであるｐＥＴ１６ｂは、大腸菌からの発現および精製目的用である。
【００２７】
この系の利点は、Ｐ．アエルギノーザタンパク質の汚染を心配する必要がなく、タンパク質は非常に大量に産生され、そして１段階精製プロセスであるということである。この状況において、ＰｃｒＶコード領域を増幅し、ｐＥＴ１６ｂベクター上に提供されたヒスチジン標識を有するフレーム内でクローン化する。ＰｃｒＶのアミノ末端に融合した複数のヒスチジン残基により、ニッケル−ＮＴＡカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーが可能となる。それ故、好ましいＰｃｒＶ抗原は、組換えバージョンの天然ＰｃｒＶタンパク質である。
【００２８】
別の実施態様において、ＰｃｒＶに対するヒトまたはヒト化モノクローナルまたはポリクローナル抗体を投与し、Ｐ．アエルギノーザによる感染を予防または治療する。Ｐ．アエルギノーザ感染にさらされる危険性の高い患者において、抗体を、感染の予防のために投与できる。さらに、抗体は、感染を治療するために、感染の開始後に、投与してもよい。この場合、抗体は、単独で、または抗生物質と組合せて投与できる。抗生物質と共に抗体を投与することにより、より短いクールまたは低用量の抗生物質の投与が可能となり得、よって、抗生物質耐性生物の出現の危険性が減少する。
【００２９】
我々は、仮定上の少なくとも３つの型の患者を想定する。（１）重度の損傷または熱傷にさらされる危険性のある健康な個体（消防士、軍人、警官）を、永続する保護を与える方法（注射または鼻腔内のいずれか）によりワクチンで免疫化する。ブースターは、損傷後に病院の許可を得て投与する（筋肉内注射）。（２）機械的換気を受けている患者。（３）嚢胞性繊維症と遺伝子診断された患者。
【００３０】
免疫化は、全身的にまたは鼻腔内に実施し得る。これらの個体の免疫化は、好ましくは、他の小児期疾患の普通のワクチン接種法中に開始する。我々は、おそらく５および１０歳頃でのブースター用量により保護の永続を予測する。
【００３１】
別の実施態様において、Ｐ．アエルギノーザ感染を診断的に検出するために、ＰｃｒＶタンパク質をコード化するＤＮＡ、またはこのＤＮＡの相補体を使用する。ＧｅｎＢａｎｋＡＦ０１０１４９でＰｃｒＶ抗原のＤＮＡ配列が得られる。ＰｃｒＶのコード領域は、ヌクレオチド６２６−１５１０である。また、このコード領域の断片またはこの断片の相補体の使用を選択してもよい。成功するプローブは、ＰｃｒＶ ＤＮＡに特異的にハイブリッド化し、他の領域にはハイブリッド化しないものである。
【００３２】
好ましくは、抗原配列内で少なくとも４０個連続したヌクレオチドのハイブリッド形成プローブ、または配列内で少なくとも２５個連続したヌクレオチドの２つのプライマーを使用する。当業者は、多くの標準的な型の核酸診断技術が適切であることを理解し、例えば、患者の痰から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡに対する一本鎖４０ヌクレオチドプローブのハイブリッド形成がある。別の例では、患者の痰を、細菌性ＤＮＡまたはＲＮＡ源として使用し、それぞれ、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型として使用する。
【００３３】
また、個体から得られたサンプルを、ＰｃｒＶに特異的な抗体と接触させ、対照サンプルと比較して増強した抗体結合を、個体のシュードモナス・アエルギノーザ感染と相関させることにより、個体におけるシュードモナス・アエルギノーザ感染を決定する。
【００３４】
追加の実施態様において、ＰｃｒＶをコード化するＤＮＡを、標準的な分子生物学的方法を使用して、遺伝子ワクチンとして使用する。例えば、当業者には公知の技術について、以下の参考文献を概観し得る。デイビス・エイチ・エル（Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．）等、「Ｂ型肝炎のＤＮＡワクチン：チンパンジーにおける免疫原性の証拠および他のワクチンとの比較」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：７２１３−７２１８、１９９６；バリー・エム・エー（Ｂａｒｒｙ，Ｍ．Ａ．）等、「発現−ライブラリー免疫化を使用したマイコプラズマ感染からの保護」、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：６３２−６３５、１９９５；キシアング・ゼット・キュー（Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．）等、「狂犬病ウイルスの核酸ワクチンに対する免疫応答」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０９：５６９−５７９、１９９５。ここで「有効量」の遺伝子ワクチンとは、シュードモナス感染またはシュードモナス感染症状を緩和または排除するに有効な量のワクチンを意味する。
【００３５】
タンパク質または抗原は、患者の抗体を検出するために診断的に使用することもでき、したがって、患者の感染状態を予測できる。好ましくは、シュードモナス感染が疑われる個体から得られたサンプルを、ＰｃｒＶタンパク質またはその断片と接触させ、タンパク質／抗体結合を検出する。その後、（対照サンプルと比較して）増強した抗体結合を、個体のシュードモナス・アエルギノーザ感染と相関させる。
【００３６】
また、ＰｃｒＶ抗体または抗体断片を治療に使用することもできる。抗体がヒト使用に安全であるとなれば、（ａ）それを全身投与でき、また（ｂ）予防処置または治療法として肺に投与できる。ヒトでＰｃｒＶ抗体を使用するために、抗体は好ましくは「ヒト化」する。一般に、モノクローナル抗体が得られれば、重鎖および軽鎖可変領域をクローン化する。これらのクローン化した断片は、その後、ヒト抗体骨格（定常領域）に挿入する。このようにして、我々は、結合特異性を提供することに加えて、抗体のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ等）を調節できる。
【００３７】
本発明での使用において、ＰｃｒＶ抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナルでもよい。抗体は、特に治療適用のために、ヒトまたはヒト化され得る。抗体断片または誘導体、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）2またはＦｖも使用してよい。例えば、フストン（Ｈｕｓｔｏｎ）等（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１９５−２１７、１９９３）に記載のような単鎖抗体は、本明細書に記載の方法にも用途を見出し得る。ここで「有効量」のＰｃｒＶ抗体または抗体断片とは、シュードモナス感染または感染症状を緩和または排除するに十分な量を意味する。
【００３８】
ＰｃｒＶ抗体および抗体断片に加えて、小分子ペプチド擬似体または非ペプチド擬似体を、おそらくＰｃｒＶの作用を妨害することによる、シュードモナス感染の抑制または調節におけるＰｃｒＶ抗体の作用を擬似するように設計できる。かかる小分子擬似体を設計する方法は公知である（例えば、リプカ（Ｒｉｐｋａ）およびリッチ（Ｒｉｃｈ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４４１−４５２、１９９８；フアング（Ｈｕａｎｇ）等、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ４２：３６７−３８２、１９９７；アル−オベイジ（ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ）等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２０５−２２３、１９９８参照）。ＰｃｒＶ抗体に基づき設計した小分子抑制剤を、ＰｃｒＶ−ＰｃｒＶ抗体結合相互作用を妨害する能力についてスクリーニングした。かかるアッセイで活性を示す候補小分子を、例えば、インビトロスクリーニングアッセイを含む、当分野で公知の方法により最適化し得、本明細書に記載の方法のいずれかにより、または当分野で公知のように、シュードモナス感染の抑制または調節についてインビボアッセイでさらに精製し得る。かかる小分子のＰｃｒＶ作用抑制剤は、シュードモナス感染の抑制または調節において本法に有用である。
【００３９】
本発明の別の態様において、ＰｃｒＶタンパク質は、ホスト細胞、特にヒト細胞、より特定すると、ヒト上皮細胞またはマクロファージに存在し得るＰｃｒＶレセプターを同定するために使用し得る。ＰｃｒＶレセプターの同定により、組合せライブラリーなどの小分子ライブラリーを、ＰｃｒＶ結合を妨害する候補についてスクリーニングすることが可能となる。かかる分子は、シュードモナス感染を抑制または調節する方法にも有用である。
【００４０】
レセプター同定における我々の最初の試みは、プルダウン実験でＰｃｒＶを使用することである。ＰｃｒＶを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させ、可溶化細胞抽出物のアフィニティークロマトグラフィーのカラムマトリックスに付着させる。ＰｃｒＶに特異的に結合しているタンパク質を溶出し、同定のためにアミノ末端シークエンスにかけた。平行実験で、ＰｃｒＶを、酵母二重ハイブリッド分析にかける。この場合、ＰｃｒＶは、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを有するフレーム内に融合させる。クローンが得られれば、適切な酵母ホスト株に形質転換する。Ｇａｌ４ＰｃｒＶ作成物を含む酵母株を、Ｇａｌ４活性化ドメインを有するフレーム内にクローン化したＨｅｌａ細胞ｃＤＮＡバンクを用いて形質転換する。ヒスチジンを利用し、βガラクトシダーゼ（ＰｃｒＶと相互作用するタンパク質）を産生する能力を補完した二重形質転換体を、遺伝学的におよびヌクレオチド配列レベルで分析する。レセプターが細胞糖脂質である場合、我々は、糖脂質を、薄層クロマトグラフィーにより分離し、その後、放射標識細菌でプローブする、オーバーレイ技術を利用する。特異的成分への結合は、オートラジオグラフィーにより監視する。同じように、上皮およびマクロファージタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにブロットし、放射標識細菌または標識ＰｃｒＶをのせる。ここでも、細菌が結合したタンパク質成分を、その後、オートラジオグラフィーにより同定する。
【００４１】
シュードモナス種は、動物界およびさらには植物界内の広範囲のホストを感染することが知られている。当業者には明らかなように、本明細書で開示した組成物および方法は、シュードモナス種による感染から生じた疾患または状態の抑制または調節において、広範囲の生物に使用し得る。本発明の組成物および方法は、特にシュードモナス・アエルギノーザへの適用について記載するが、本明細書に教示した方法を他の種に適用することは当業者の能力の十分範囲内である。
【実施例１】
【００４２】
１．細胞毒性におけるＰｃｒＶの役割
ＩＩＩ型媒介調節／分泌におけるＰｃｒＶの役割を決定するために、我々は、ＰｃｒＶの非極性対立遺伝子を作成し、この作成物を使用して、Ｐ．アエルギノーザＰＡ１０３株（インビトロで細胞毒性が高く（３）、インビボで肺上皮傷害を引き起こす（１２、１３）株である）の野生型対立遺伝子を置換した。細胞毒性および肺損傷は、特異的な細胞毒ＥｘｏＵの産生に起因する（３）。
【００４３】
ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶは、ＥｘｏＵ細胞毒（３）、ＰｃｒＶ（５）、および毒素の転位に必要なタンパク質ＰｏｐＤ（１４）を含む、Ｐ．アエルギノーザＩＩＩ型系により分泌されるいくつかの細胞外産物の発現により特徴づけられた。濃縮培養上清のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、親株ＰＡ１０３は、カルシウムキレート剤であるニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）を含む培地中での増殖により、ＩＩＩ型タンパク質の産生および分泌が誘導されることが示された（図１）。ＰｃｒＶをコード化する発現クローンが、親株においてトランスで提供される場合、ＮＴＡの存在または非存在に応答する細胞外タンパク質産生は正常である。ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶは、カルシウム盲目表現型を示し、細胞外タンパク質産生は、ＮＴＡの存在および非存在の両方で強く誘導される。これらの結果は、分泌系は、完全に機能しているが、調節は解除されていることを示唆する。この調節の解除された表現型は、細胞外Ｙｏｐｓを産生できず、カルシウムの存在または非存在にかかわらず３７℃で増殖し、ほんの一部しかＹｏｐｓの誘導を示さない、ＬｃｒＶ欠損株で報告されたカルシウム非依存性表現型と対照的である（７）。ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶを、野生型ＰｃｒＶを発現するクローンで補完することにより、ＮＴＡ誘導に応答した、正常な細胞外タンパク質産生調節が回復した。
【００４４】
Ｐ．アエルギノーザ病理発生に対するＰｃｒＶの寄与を試験するために、２つの感染モデルを使用した。インビトロモデルにおいて、親および数個の変異誘導体株を、ＣＨＯ細胞感染アッセイで、細胞毒性を引き起こす能力について比較した（３）。この実験の陰性対照は、ＩＩＩ型病原性決定要因の転位が欠損していることが以前に示されたＰＡ１０３ｐｏｐＤ：：Ω（１４）、およびＥｘｏＵが産生されないために、細胞毒性のないＰＡ１０３ΔｅｘｏＵを含んだ（３、１５）。
【００４５】
３時間感染後、ＣＨＯ細胞は、野生型およびＰｃｒＶを発現するプラスミド作成物で補完したΔｐｃｒＶ株で、トリパンブルーを除外できなかった。ＣＨＯ細胞を、陰性対照株またはＰＡ１０３ΔｐｃｒＶで感染させた場合、染色は起こらなかった（データは示していない）。これらの結果により、ＰｃｒＶ発現は細胞毒性に必要であることが示唆される。精製組換えＰｃｒＶは、外因的に組織培養細胞に加えた場合、細胞毒性ではなかった。転位に必要なＩＩＩ型タンパク質の分泌は、ｐｃｒＶの欠失により影響を受けなかったので（図１ＡおよびＢ）、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶには、ＥｘｏＵ転位が欠損しているようである。
【００４６】
図１Ａおよび１Ｂは、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶの表現型分析を示す、染色ゲル（図１Ａ）およびウエスタンブロット（図１Ｂ）である。トランスのＰｃｒＶを発現するプラスミドを含む、または含まない、親およびΔｐｃｒＶ誘導体を、Ｐ．アエルギノーザのＩＩＩ型分泌の誘導物質、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）の非存在下または存在下で増殖させた。細胞外タンパク質プロフィル（図１Ａ）を、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％）上で分析した。Ｐ．アエルギノーザコード化ＩＩＩ型タンパク質の移動は左に示し、分子量マーカーの移動は右に示す。図１Ｂは、結合したＩｇＧを検出するために、ＥｘｏＵ、ＰｃｒＶ、およびＰｏｐＤに特異的な抗体および125Ｉ−プロテインＡを使用した重複ゲルのウエスタンブロットである。
【００４７】
野生型および変異Ｐ．アエルギノーザ株は、低および高攻撃用量の細菌を使用して、急性肺感染モデルで試験した。生存測定により、ＰｃｒＶおよびＰｏｐＤが、致命的感染の誘導に必要であることが示された（図２Ａ）。３つの独立した肺損傷測定を利用した実験において（肺の気腔から血流への標識アルブミンの流入、肺の気腔から胸水への標識アルブミンの流入、および肺浮腫を測定する湿潤／乾燥比）、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ、ベクター対照株（ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶｐＵＣＰ１８）、およびＰＡ１０３ｐｏｐＤ：：Ωにより引き起こされる損傷度は、非感染対照動物と全く異ならなかった（図２Ｂ）。ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶをトランスのｐｃｒＶで補完することにより、肺損傷レベルは、親株ＰＡ１０３で測定されたものに戻った。合わせると、これらのデータにより、ＰｃｒＶ発現は、急性肺感染モデルにおけるＰ．アエルギノーザの病原性に必要であり、ＰｃｒＶの機能の一部は、ＩＩＩ型エフェクタータンパク質を真核細胞に転位する能力に関連があるようである。
【００４８】
図２Ａおよび２Ｂは、Ｐ．アエルギノーザ親および変異株の生存および肺損傷を示す、グラフ（図２Ａ）および棒グラフのセット（図２Ｂ）である。図２Ａに関して、マウスを、５×１０5ｃｆｕの示された各株で攻撃し、生存を１週間監視した。図２Ｂに関して、肺損傷を、肺の気腔から血液への（肺上皮損傷）、胸水への（胸水）標識アルブミンの流入により、または湿潤／乾燥比（肺浮腫）の測定により評価した。２つの細菌感染用量を使用し、黒棒および縞棒により表した。対照ないし試験群での有意差（＊ｐ＜０．００１）を、一方向性分散分析およびダネット（Ｄｕｎｎｅｔ）複数比較試験により決定した。以下の略称を使用した。ＰＡ１０３、親野生型株；ΔｐｃｒＶ、ＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ；ΔｐｃｒＶｐＵＣＰｐｃｒＶ、ＰｃｒＶを発現するプラスミドで補完したＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ；ΔｐｃｒＶｐＵＣＰ、ベクター対照を有するＰＡ１０３ΔｐｃｒＶ；ｐｏｐＤ：：Ω、転位欠損株であるＰＡ１０３ｐｏｐＤ：：Ω。
【実施例２】
【００４９】
２．ＰｃｒＶを用いた免疫化
ＰｃｒＶを用いた免疫化により致命的な肺感染から動物が守られるかを決定するために、組換えＰｃｒＶ（ｒＰｃｒＶ）またはＥｘｏＵ（ｒＥｘｏＵ）を、ヒスチジン標識融合タンパク質として精製し、抗原として使用した。マウスを免疫化し、その後、気腔を介して、致死量のＰＡ１０３株で攻撃した。生存を測定すると、両方のワクチンがマウスを保護した（図３Ａ）。肺損傷を評価すると、ＰｃｒＶワクチン接種を受けた動物のみにおいて、上皮傷害および肺浮腫が有意に低かった（図３Ｂ）。ＰｃｒＶワクチンで免疫化した動物は、その肺における細菌が有意に低く、このことは、シュードモナスＶ抗原の遮断により、肺からの細菌の迅速な除去が促進され、重度の上皮損傷から動物が守られることを示唆する（図３Ｂ）。
【００５０】
図３Ａおよび３Ｂは、生存、肺損傷、および細菌コロニー化に対する免疫化の効果を示す、グラフ（図３Ａ）および棒グラフのセット（図３Ｂ）である。図３Ａに関して、マウスを、示されたように免疫化し（ＰｃｒＶ、ｎ＝１０；ＥｘｏＵ、ｎ＝５；対照、ｎ＝１０）、５×１０5ＣＦＵ／動物のＰＡ１０３株で攻撃した。生存動物の比率を、１週間決定した。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ ｌｏｇ ｒａｎｋ検定によりｐ＜０．０５。図３Ｂに関して、ＰＡ１０３の設置４時間後の、ワクチン接種動物の肺損傷評価および細菌コロニー形成。肺上皮損傷、肺浮腫、および細菌負荷；ＰｃｒＶ、ｎ＝９；ＥｘｏＵ、ｎ＝４；および対照、ｎ＝８。肺の細菌の最終数は、Ｙ軸×１０4ＣＦＵの数として示される。ダネット複数比較試験により決定、肺損傷（ｐ＜０．０１）、肺浮腫（ｐ＜０．０５）、および細菌数（ｐ＜０．０５）の有意差（＊）。肺損傷における一方向性分散分析、ｐ＝０．０００５；肺浮腫、ｐ＝０．０４３７；細菌負荷、ｐ＝０．００７５。
【００５１】
治療介入が可能であるかを決定するために、５×１０5ＣＦＵ／マウスの濃度のＰＡ１０３を気腔滴下する１時間前に、マウスを、免疫前のウサギＩｇＧ、またはｒＰｃｒＶ、ｒＥｘｏＵ、またはｒＰｏｐＤに特異的なウサギＩｇＧを用いて受動免疫化した。ｒＰｃｒＶに対する抗体により、致命的感染に対する完全な保護が提供された（図４）。抗ｒＥｘｏＵ ＩｇＧにより部分的生存が提供され、これは、対照ＩｇＧの投与とは有意に異なっていたが、全ての生存動物が試験中に重病であるようであった。生存は、別のＩＩＩ型転位タンパク質ＰｏｐＤに対する抗体の受動移動により向上しなかった。これらの結果から、我々は、ＰｃｒＶに対する抗体は、急性肺感染モデルで高度に保護的であり、ＰｃｒＶは、細菌表面上にさらされ得るか、または抗体−抗原相互作用に利用可能な可溶形であり得ると結論する。
【００５２】
図４は、５×１０5ＣＦＵ／マウスのＰＡ１０３株で攻撃して生存した動物数のグラフである。動物を、免疫ＩｇＧ１００μｇまたは非免疫化ウサギ由来の対照ＩｇＧ（ｒＰｃｒＶ、免疫前の血清）で前処置した。各群についてＮ＝１０；Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ ｌｏｇ ｒａｎｋ検定により、抗ＰｃｒＶおよび抗ＥｘｏＵ ＩｇＧ調製物での処理において、＊ｐ＜０．０５対対照群。
【００５３】
ＰｃｒＶが、中和を受け易い場合、抗ｒＰｃｒＶ ＩｇＧと細菌種菌の併用投与により、肺損傷および致死から完全に守られる。ＩｇＧ調製物を、細菌を肺に滴下注入する前に、種菌（致死種菌よりも１０倍高い用量）と混合し、生存を測定した。唯一、抗ｒＰｃｒＶ ＩｇＧのみが、この極度な感染から保護した（図５Ａ）。肺損傷は、正常致死量である５×１０5細菌で感染させた動物で測定した。肺の気腔からの標識アルブミンの流出は、抗ｒＰｃｒＶ ＩｇＧの同時投与後、非感染対照よりも僅か３％高かった（図５Ｂ）。肺から胸水への標識タンパク質の流出減少は、抗ＰｃｒＶを種菌と共に含めた場合、非感染対照と同じであった。珍しいことに、湿潤／乾燥比により測定した肺浮腫は、抗ｒＰｃｒＶまたは抗ｒＰｏｐＤの添加により有意に減少した（図５Ｂ）。従って、細菌と抗ｒＰｃｒＶ ＩｇＧの併用投与は、ワクチン接種よりも、全ての肺損傷パラメーターを規格化する上で、さらにより効果的であった。これらのデータは、ＰｃｒＶが抗体媒介中和を受け易いことを支持し、肺損傷の臨床関連減少を文書で裏付け；ＰｃｒＶに対する抗体は、シュードモナス・アエルギノーザにより引き起こされる重度の院内肺炎の治療における治療薬として使用し得る。
【００５４】
図５は、ＩｇＧおよび細菌攻撃の併用投与による肺損傷からの生存および保護を示す、グラフ（図５Ａ）および棒グラフのセット（図５Ｂ）である。ＩｇＧ（５μｇ）を、５×１０6（生存アッセイ用、１群あたりｎ＝１０）または５×１０5（肺損傷測定用、１群あたりｎ＝４〜６動物）のＰ．アエルギノーザＰＡ１０３株と混合した。この混合物を、肺に滴下注入し、生存（図５Ａ）または肺損傷（図５Ｂ）を評価した。生存では、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ ｌｏｇ ｒａｎｋ検定による抗ＰｃｒＶにおいて＊ｐ＜０．０５対対照ＩｇＧ；肺上皮損傷および肺浮腫では、ダネット複数比較試験により、＊ｐ＜０．０５対対照ＩｇＧ。肺損傷における一方向性分散分析、ｐ＝０．０２６、および肺浮腫、ｐ＜０．０００５。
【００５５】
急性Ｐ．アエルギノーザ感染では、ＩＩＩ型媒介中毒の実効効果は、上皮を超えて細菌の播種を促進し、胸水、脾臓、肝臓、および血流の感染をもたらし得ることである。急性換気装置関連肺炎からの、または熱傷感染からの、Ｐ．アエルギノーザによる血液由来感染の結果、活発な抗生物質処置にもかかわらず、死亡率は４０−８０％であり得る（１６）。ＰｃｒＶは、Ｐ．アエルギノーザのＩＩＩ型転位複合体の成分であるに違いない。なぜなら、このタンパク質の産生が欠損している変異体は、転位に必要なＩＩＩ型エフェクターおよびタンパク質を産生および分泌できるにもかかわらず、ＣＨＯ細胞を中毒させることができないか、または肺上皮損傷を引き起こすことができないからである。ＰｏｐＤ（これもまた転位に必要である）と異なり、ＰｃｒＶは、抗体媒介中和を受け易く、これは、抗体は急性感染の有用な治療剤であり得ることを示唆する。
【実施例３】
【００５６】
３．実施例１および２の方法
ＰｃｒＶの非極性挿入物の作成および補完
ｐｃｒＧＶＨｐｏｐＢＤおよびフランキング配列をコード化する５．０ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｓｉＩ制限断片を、対立遺伝子置換ベクターｐＮＯＴ１９にクローン化した（１７）。２つのＮｏｔＩ部位（１つはｐｃｒＧ内で、１つはｐｏｐＢ内）を、スカルプター（Ｓｃｕｌｐｔｏｒ）変異誘発系（アマシャム）を使用して、挿入配列から除去した。内部ＳｓｔＩ制限断片を、ｐｃｒＶから欠失させ、残基１７−２２１をインフレーム欠失させた（ｐＮＯＴΔｐｃｒＶ）。プラスミドの組込みを選択するために、テトラサイクリン耐性（ＴｃΩ）をコード化する遺伝子を、ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した（ｐＮＯＴΩΔｐｃｒＶ）。ＭＯＢカセット（１７）を、ＮｏｔＩ断片として加えた。部分二倍体の選択、プラスミド配列の分解能、および対立遺伝子置換の確認を、前記した通り行なった（１８）。シャトルプラスミド（ｐＵＣＰ、１９）を使用して、ｐｃｒＶ欠失を補完したクローンを作成した。ＰｃｒＶのコード配列を増幅し、ＥｘｏＳプロモーター領域の制御下でクローン化した（２０）。ＥｘｏＳの転写は、Ｐ．アエルギノーザにおけるＩＩＩ型分泌および転位を調節するオペロンと協調的に調節されている（２）。ヌクレオチド配列は、部位特異的変異、ＰＣＲ増幅、またはインフレーム欠失を含む、各ＤＮＡ作成物について確認した。
【００５７】
分泌産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
Ｐ．アエルギノーザを、誘導（＋ＮＴＡ）または非誘導条件下（−ＮＴＡ）で、ＩＩＩ型分泌産物を発現させるために増殖した（１８）。培養物を、５４０ｎｍでの光学密度測定に基づき収集し、上清画分を、硫酸アンモニウムの飽和溶液を最終濃度が５５％となるように添加して濃縮した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１１％）の各レーンに、３μｌの２０倍濃縮した上清をのせ、クーマシーブルーで染色した。同一のゲルを、ＥｘｏＵ、ＰｏｐＤ、およびＰｃｒＶを特異的に認識する、ウサギ抗血清のカクテルを使用して、前記の通り（３−５）ウエスタンブロット分析にかけた。125Ｉで標識したプロテインＡを、第二試薬として使用して、結合したＩｇＧを同定した。
【００５８】
感染モデルおよび肺損傷評価
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）を、細胞毒性およびＩＩＩ型転位を測定するために設計した、インビトロ感染モデルに使用した（２１）。簡潔には、細菌種菌を、血清を含まない組織培養培地で調製した。血清含有培地中で繁殖させたＣＨＯ細胞を洗浄し、５：１の感染多重度で、様々なＰ．アエルギノーザ株で感染させた。培養物を、組織培養条件下（３７℃、５％ＣＯ2）で３時間インキュベートし、洗浄し、トリパンブルーで染色した。色素への透過性は、位相差写真から決定した。ＥｘｏＵを発現する親株ＰＡ１０３での感染により、インキュベートの３時間後、単層の約８０％がトリパンブルー染色され、インキュベートの４−５時間後、単層は完全に破壊される。マウス感染および肺損傷の評価は、前記した通りに行なった（１６）。簡潔には、雄で８−１２週令の病原体のないＢＡＬＢ／ｃマウスを、シモンセン（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ）研究所（ギルロイ、カリフォルニア）から購入し、柵のある状態に飼った。マウスを、簡潔には、吸入メトファン（メトキシフルラン、ピットマン−ムーア（Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ）、マンデライン（Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ）、イリノイ）で麻酔し、約３０°の角度で、仰臥位に配置した。１５μｌの細菌性種菌を、中咽頭を介して気管に挿入した修飾２４ゲージ動物栄養補給針（ポッパー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｐｏｐｐｅｒ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューハイドパーク、ニューヨーク）を使用して、左葉にゆっくりと滴下注入した。肺損傷評価を測定する場合、５％マウスアルブミンと共に、リンガーラクテート１ｍｌ中、０．５μＣｉの131Ｉ標識ヒト血清アルブミン（メルク−フロスト（Ｆｒｏｓｓｔ）、ケベック、カナダ）、０．０５μｇの無水エバンスブルーを滴下注入液に加えた。感染の４時間後、マウスを麻酔し、血液を頚動脈穿刺により集め、正中胸骨切開を行なった。肺、胸水、気管、中咽頭、胃、および肝臓を収集し、放射活性を測定した。滴下注入した肺に残り、循環または胸水に侵入した、放射活性アルブミンの比率を、血液量（体重×０．０７）に、終末血液サンプルで測定された計数（１ｍｌあたり）を掛けることにより計算した。肺の湿潤／乾燥比は、１ｍｌの水を肺に加え、混合物をホモジナイズすることにより決定した。ホモジネートは、前以て秤量したアルミニウム皿に置き、８０℃のオーブンで３日間一定重量になるまで乾燥させた。肺ホモジネートは、連続希釈し、細菌を定量評価するためにヒツジ血液寒天上に置いた。
【００５９】
ＰｃｒＶ、ＰｏｐＤ、およびＥｘｏＵに対するウサギ抗血清の産生
ｒＰｃｒＶ、ｒＰｏｐＤ、およびｒＥｘｏＵは、ｐＥＴ１６ｂにおいてヒスチジン標識融合タンパク質として産生し、前記した通りニッケルクロマトグラフィーにより精製した（２２）。ウサギに、フロイント完全アジュバント中で乳化した３００μｇの組換えタンパク質を皮内注射（１０部位）し、フロイント不完全アジュバント中の抗原をブースター投与し、７日間間隔で周期的に採血した。受動免疫化するために、ＩｇＧ画分を、プロテインＡカラムクロマトグラフィー（ピアスケミカルズ、ロックフォード、イリノイ）を使用して単離した。マウスに、５×１０5ＣＦＵのＰＡ１０３株で攻撃する１時間前に、１００μｇのＩｇＧ（腹腔内注射）を注射した。ｒＰｃｒＶおよびｒＥｘｏＵを用いて能動免疫化するために、エンドトキシンを、１％トリトンＸ−１１４での抽出により、タンパク質調製物から除去した（２３）。抽出後、トリトンＸ−１１４を、セファクリルＳ−２００クロマトグラフィーにより除去した。全ワクチン調製物が、リムルスアメーバ様細胞ライセートアッセイ（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ウォーカースヴィレ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）、メリーランド）の使用により決定されたように、４０μｇの組換えタンパク質あたり、１ｎｇ以下のエンドトキシンを含んだ。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、フロイント完全アジュバント中、１０μｇの組換えタンパク質を皮下注射した。３０日目に、マウスを、フロイントの不完全アジュバント中、追加の１０μｇの抗原をブースター投与した。５１日目に、マウスを、その左肺へのＰ．アエルギノーザの滴下注入により攻撃した。
【００６０】
４．モノクローナル抗体の合成
マウスを、フロイントの完全アジュバント中、１０μｇの精製、ＬＰＳ非含有、組換えＰｃｒＶを用いて免疫化し、２週間後に、フロイントの不完全アジュバント中で乳化した、同量の抗原を用いてブースター投与した。免疫化は皮下で行なった。フロイントの不完全アジュバント中のＰｃｒＶのブースター用量の１週間後に、脾臓をマウスから収集した。
【００６１】
単一の脾臓を、血清を含有しない組織培養培地５ｍｌに置き、片に切断し、穏やかにホモジナイズした。組織の大片を、ホモジネートおよび上清から沈降させ、単一細胞懸濁液を取り出し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。ペレット化した細胞を、１０ｍｌ溶液に再懸濁し、赤血球を５分間溶解し、引き続き、１０ｍｌのウシ胎児血清を敷いた。物質を、１２００ｒｐｍで８分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を３０ｍｌの培地に懸濁した。脾臓細胞およびミエローマ細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３）を、１２００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集し、各ペレットを、別々に、１０ｍｌの組織培養培地に懸濁した。１０8脾臓細胞および２×１０7ミエローマ細胞を混合し、１２００ｒｐｍで６分間の遠心分離により一緒にペレット化させた。上清を吸引により取り出し、１ｍｌの３５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加えた。細胞をこの溶液に穏やかに懸濁し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。いくつかの実験では、遠心分離は省いた。
【００６２】
ＰＥＧ添加から正確に８分後、２５ｍｌの培地を加え、細胞を穏やかに再懸濁した。５分間の１２００ｒｐｍでの遠心分離段階の後、細胞ペレットを、３０％ならし培地および７０％完全培地（血清含有）中１ｍｌあたり１×１０6の密度で懸濁した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。次の日、細胞を遠心分離により収集し、２００ｍｌの３０％ならし培地およびヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含む７０％完全培地中に懸濁した。
【００６３】
１ウェルあたり、約０．２ｍｌのこの細胞懸濁液を、１０個の９６ウェルプレート（９６ウェルプレートあたり１２ｍｌ）に加えた。残りの細胞の密度は、１ｍｌあたり２．５×１０5に調整し、細胞を９６ウェル型式で培養した。プレートを、単一のコロニーについて顕微鏡でスクリーニングし、その後、上清を、抗原として組換えＰｃｒＶを使用して、酵素結合免疫吸着検定法により抗体産生について試験した。ＰｃｒＶに反応性の抗体を産生するクローンを、より大きな培養皿に継代培養し、その後、アイソタイプを決定した。
【００６４】
抗体の結合は、ウェルを覆膜する抗原（ヒスチジン標識タンパク質）として組換えＰｃｒＶを使用して、酵素結合免疫吸着検定法で試験した。モノクローナル抗体は、ヒスチジン標識を有さない天然ＰｃｒＶを含むＰ．アエルギノーザ上清を使用して、ウエスタンブロット反応でも試験した。
【００６５】
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２０．ヤール・ティー・エル、ホベイ・エー・ケー（Ｈｏｖｅｙ，Ａ．Ｋ．）、クリッヒ・エス・エム（Ｋｕｌｉｃｈ，Ｓ．Ｍ．）、およびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナス・アエルギノーザ細胞外酵素Ｓ構造遺伝子の転写分析」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１１６９−１１７８（１９９５）
２１．バリス・エー・ジェイ（Ｖａｌｌｉｓ，Ａ．Ｊ．）、ヤール・ティー・エル、バービエリ・ジェイ・ティー（Ｂａｒｂｉｅｒｉ，Ｊ．Ｔ．）、およびフランク・ディー・ダブリュー、「組織培養条件に応答したシュードモナス・アエルギノーザによるＥｘｏＳ産生の調節」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．提出
２２．ヤール・ティー・エル、バービエリ・ジェイ・ティーおよびフランク・ディー・ダブリュー、「シュードモナス・アエルギノーザ由来の細胞外酵素Ｓの５３ないし４９ｋＤａ形の遺伝子関係」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１４１２−１４１９（１９９６）
２３．アイジ・ワイ（Ａｉｄｉ，Ｙ．）およびパブスト・エム・ジェイ（Ｐａｂｓｔ，Ｍ．Ｊ．）、「トリトンＸ−１１４を使用した相分離によるタンパク質溶液からのエンドトキシンの除去」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １３２：１９１−１９５（１９９０）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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