(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｄｌｇの発現および／または機能を調節することにより、Ｄｌｇ遺伝子、Ｄｌｇおよびこれらの発現や機能の異常に起因する生体機能の異常を回復させる手段、疾患の防止手段または治療手段を提供する。【解決手段】Ｄｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）対立遺伝子の一方が欠損した非ヒト哺乳動物に被検化合物を投与し、ｓＦＲＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現および／または機能を測定して、該被検化合物を投与しなかったものと比較してｓＦＲＰの発現および／または機能の増加を判定することを特徴とする、次のいずれかの化合物の同定する；（ｉ）ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、および（ｉｉ）腫瘍形成を阻害する作用を有する化合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）対立遺伝子の一方が欠損した非ヒト哺乳動物に被検化合物を投与し、ｓＦＲＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現および／または機能を測定して、該被検化合物を投与しなかったものと比較してｓＦＲＰの発現および／または機能の増加を判定することを特徴とする、下記いずれかの化合物の同定方法；
（ｉ）ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、
および
（ｉｉ）腫瘍形成を阻害する作用を有する化合物。
【請求項２】
Ｄｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物由来の細胞と被検化合物を接触させ、ｓＦＲＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現および／または機能を測定して、該被検化合物を投与しなかったものと比較してｓＦＲＰの発現および／または機能の増加を判定することを特徴とする、下記いずれかの化合物の同定方法；
（ｉ）ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、
および
（ｉｉ）腫瘍形成を阻害する作用を有する化合物。
【請求項３】
ｓＦＲＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がｓＦＲＰ２である請求項１または２に記載の化合物の同定方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物の同定方法に用いる、Ｄｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物の同定方法に用いる、Ｄｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物由来の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）の発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を含むｓＦＲＰ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現および／または機能の増強剤に関する。また、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤を含む腫瘍形成阻害剤に関する。さらに、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤を含む腫瘍疾患の防止および／または治療剤に関する。また、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強することを特徴とするｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法に関する。さらに、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、あるいはｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法を用いることを特徴とする腫瘍形成阻害方法に関する。また、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、あるいはｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法を用いることを特徴とする腫瘍疾患の防止および／または治療方法に関する。さらに、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方が欠損した非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、化合物の同定方法に関する。また、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることを特徴とする、化合物の同定方法に関する。さらに、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物、および該非ヒト哺乳動物由来の細胞に関する。また、Ｄｌｇ遺伝子および／またはＤｌｇの発現および／または機能を測定することを特徴とする、腫瘍組織または腫瘍細胞の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄｌｇ遺伝子は、数々の組織や細胞で普遍的に発現が認められている遺伝子である。Ｄｌｇ遺伝子によりコードされる蛋白質（以下、Ｄｌｇと呼称する）は、ＡＰＣ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）のＣ末端ＸＶＴモチーフに結合することが報告されている（非特許文献１）。ＡＰＣ遺伝子は、家族性腺腫性ポリポーシス（ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ、ＦＡＰと略称する）の原因遺伝子として単離された。ＡＰＣ遺伝子はＦＡＰだけでなく、散発性の大腸癌についても多数の症例でその異常が検出されている。このことから、ＡＰＣ遺伝子の異常は大腸癌発症の重要な要因であると考えられる。また、ＡＰＣの過剰発現は細胞周期の進行を阻害する。ＤｌｇとＡＰＣの発現がラット大腸上皮細胞および培養海馬ニューロンのシナプスで共に認められたことから、ＤｌｇとＡＰＣの複合体は、細胞周期の進行およびニューロン機能に寄与していると考えられる。
【０００３】
ＡＰＣ遺伝子によりコードされる蛋白質（以下、ＡＰＣと呼称する）は３００ｋＤａの巨大な蛋白質で、β−カテニンと複合体を形成し、Ｗｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル（以下、Ｗｎｔシグナルと呼称する）伝達経路を負に制御している。Ｗｎｔシグナルは、形態形成を制御する情報伝達系として見い出され、発生、幹細胞分化制御および細胞癌化等の様々な現象に関わることが知られている。最近、Ｗｎｔシグナルが、幹細胞の増殖調節および生存に重要な因子であることが報告された（非特許文献２および３）。
【０００４】
Ｗｎｔリガンドにより惹起されるＷｎｔシグナルは、細胞膜上に存在するフリズルドメンブレンレセプター（ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｆｚと略称する）を介して細胞内に伝達される。
【０００５】
近年、ＦｚおよびＷｎｔに結合する分泌性蛋白質、ｓＦＲＰが見い出された（非特許文献４）。ｓＦＲＰは細胞外においてＦｚおよびＷｎｔに結合して、Ｗｎｔシグナルのアンタゴニストとして作用し、Ｗｎｔシグナルの調節に関わっていると考えられる（非特許文献５）。また、大腸癌細胞においてｓＦＲＰ遺伝子のメチル化によりｓＦＲＰの機能が低下していること、およびｓＦＲＰの機能を大腸癌細胞において回復させることにより該細胞内のＷｎｔシグナルが低減されたことが報告されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】マツミネ（Ｍａｔｓｕｍｉｎｅ，Ａ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９６年、第２７２巻、ｐ．１０２０−１０２３。
【非特許文献２】ウィラート（Ｗｉｌｌｅｒｔ，Ｋ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００３年、第４２３巻、ｐ．４４８−４５２。
【非特許文献３】ルヤ（Ｒｅｙａ，Ｔ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００３年、第４２３巻、ｐ．４０９−４１４。
【非特許文献４】カワノ（Ｋａｗａｎｏ，Ｙ）ら、「ジャーナル  オブ  セル  サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００３年、第１１６巻、ｐ．２６２７−２６３４。
【非特許文献５】ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｅ．）ら、「バイオエッセイズ（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ）」、２００２年、第２４巻、ｐ．８１１−８２０。
【非特許文献６】スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ）ら、「ネイチャー  ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００４年、第３６巻、ｐ．４１７−４２２（２００４年３月１４日オンライン公開）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｄｌｇ遺伝子は、ショウジョウバエにおいてその欠損により神経芽細胞腫を形成することが報告されていることから、癌抑制遺伝子であると考えられている。また、ＤｌｇがＡＰＣと結合することや、ＡＰＣが腫瘍形成に関わるＷｎｔシグナルの調節に関与していることから、ＤｌｇのＷｎｔシグナルへの関与が考えられる。しかしながら、哺乳動物においてＤｌｇ遺伝子が癌抑制遺伝子として作用することを明らかにした報告はない。また、ＤｌｇのＷｎｔシグナルへの関与について言及している報告もない。
【０００８】
Ｄｌｇの作用およびその作用メカニズムを哺乳動物において明らかにし、Ｄｌｇの発現および／または機能を調節することにより、Ｄｌｇ遺伝子、Ｄｌｇおよびこれらの発現や機能の異常に起因する生体機能の異常や疾患の防止手段または治療手段を開発することができる。
【０００９】
本発明は、Ｄｌｇの発現および／または機能を調節することにより、Ｄｌｇ遺伝子、Ｄｌｇおよびこれらの発現や機能の異常に起因する生体機能の異常を回復させる手段の提供を課題とする。また、Ｄｌｇ遺伝子、Ｄｌｇおよびこれらの発現や機能の異常に起因する疾患の防止手段または治療手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、Ｄｌｇ遺伝子ノックアウトマウスを遺伝子工学的手法により作製した。そして、Ｄｌｇ遺伝子ヘテロ欠損マウスにおいて腫瘍が形成されること、および腫瘍形成にＤｌｇ遺伝子欠損が重要な因子であることを見い出した。さらに、Ｄｌｇ遺伝子欠損により、ｓＦＲＰ１遺伝子およびｓＦＲＰ２遺伝子の転写産物が低減することを見い出し、これら知見により本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を含む、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤に関する。
【００１２】
本発明はまた、Ｄｌｇ、Ｄｌｇ遺伝子およびＤｌｇ遺伝子を含有する組換えベクターのうちの少なくとも１つを含む、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤に関する。
【００１３】
本発明はさらに、ｓＦＲＰがｓＦＲＰ２である、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤に関する。
【００１４】
本発明はさらにまた、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤を含む腫瘍形成阻害剤に関する。
【００１５】
本発明はまた、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤を含む腫瘍疾患の防止および／または治療剤に関する。
【００１６】
本発明はさらに、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強することを特徴とする、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法に関する。
【００１７】
本発明はさらにまた、Ｄｌｇ、Ｄｌｇ遺伝子およびＤｌｇ遺伝子を含有する組換えベクターのうちの少なくとも１つを用いることを特徴とする前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、ｓＦＲＰがｓＦＲＰ２である、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤を用いることを特徴とする腫瘍形成阻害方法に関する。
【００２０】
本発明はさらにまた、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法を用いることを特徴とする腫瘍形成阻害方法に関する。
【００２１】
本発明はまた、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤を用いることを特徴とする、腫瘍疾患の防止および／または治療方法に関する。
【００２２】
本発明はさらに、前記ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法を用いることを特徴とする、腫瘍疾患の防止および／または治療方法に関する。
【００２３】
本発明はさらにまた、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方が欠損した非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、下記いずれかの化合物の同定方法に関する；
（ｉ）Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、
（ｉｉ）ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、
および
（ｉｉｉ）腫瘍形成を阻害する化合物。
【００２４】
本発明はまた、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物由来の細胞を用いることを特徴とする、下記いずれかの化合物の同定方法に関する；
（ｉ）Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、
（ｉｉ）ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、
および
（ｉｉｉ）腫瘍形成を阻害する化合物。
【００２５】
本発明はさらに、ｓＦＲＰがｓＦＲＰ２である、前記化合物の同定方法に関する。
【００２６】
本発明はさらにまた、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物に関する。
【００２７】
本発明はまた、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方または両方が欠損した非ヒト哺乳動物由来の細胞に関する。
【００２８】
本発明はさらに、被検組織または被検細胞中のＤｌｇの発現および／または機能を測定し、正常組織または正常細胞と比較して該発現および／または該機能の低下または消失を検出することを特徴とする、腫瘍組織または腫瘍細胞の検査方法に関する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、該増強剤を含む腫瘍形成阻害剤、並びに該増強剤を含む腫瘍疾患の防止および／または治療剤が提供できる。さらに、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法、腫瘍形成阻害方法、並びに腫瘍疾患の防止および／または治療方法が提供できる。これら薬剤を用いて腫瘍疾患の防止および治療が達成できる。これら薬剤および方法は、ＤｌｇによるｓＦＲＰの発現および／または機能のメカニズム解明、並びにＤｌｇの欠損による腫瘍形成のメカニズム解明に利用できる。
【００３０】
また本発明により、Ｄｌｇ欠損非ヒト哺乳動物および該哺乳動物由来の細胞を用いて、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、および腫瘍形成を阻害する作用を有する化合物を同定するための方法が実施できる。本同定方法により得られた化合物は、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、腫瘍形成阻害剤、並びに腫瘍疾患の防止および／または治療剤の有効成分として用いることができる。また、本化合物を用いて、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法、腫瘍形成阻害方法、並びに腫瘍疾患の防止および／または治療方法が実施できる。
【００３１】
本発明により、Ｄｌｇの発現および／または機能を測定することを特徴とする腫瘍組織または腫瘍細胞の検査方法を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−Ａ】Ｄｌｇ遺伝子座（図中、Ｄｌｇ  Ｌｏｃｕｓと表示）、ターゲティングベクターの構築物（図中、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒと表示）、および相同組換えにより遺伝子導入されたＤｌｇ遺伝子（図中、Ｄｌｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔと表示）を示す図である。ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）はＣｌａＩ部位にインフレーム融合により挿入した。ネオマイシン耐性遺伝子の５´側および３´側にはそれぞれ０．８ｋｂおよび８．５ｋｂの相同配列が隣接している（太線で表示）。細線はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来の配列を表わす。サザンブロット分析に用いた５´プローブ（５´ｐｒｏｂｅ）の位置は、図の下部に、ハイブリダイゼーションする断片の予想サイズと共に表した。図中「Ｂ」はＢａｍＨＩ、「Ｃ」はＣｌａＩ、「Ｅ」はＥｃｏＲＩ、および「Ｘ」はＸｈｏＩを意味する。また、矢印およびＡＴＧはＤｌｇのコード領域開始部分を示す。（実施例１）
【００３３】
【図１−Ｂ】第３代目のＤｌｇ＋／＋マウス、Ｄｌｇ＋／−マウスおよびＤｌｇ−／−マウスの尾由来ＤＮＡを、５´プローブを用いてサザンブロット分析した代表的結果を示す図である。（実施例１）
【００３４】
【図１−Ｃ】第３代目のＤｌｇ＋／＋マウス、Ｄｌｇ＋／−マウスおよびＤｌｇ−／−マウスの遺伝子型を、各マウスの尾由来ＤＮＡを用いて解析した結果を示す図である。図中、「ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ」は野生型のＤｌｇ遺伝子を、「ｍｕｔａｎｔ」は変異が導入されたＤｌｇ遺伝子を示す。（実施例１）
【００３５】
【図１−Ｄ】第３代目のＤｌｇ＋／＋マウス、Ｄｌｇ＋／−マウスおよびＤｌｇ−／−マウスにおけるＤｌｇの発現を、新生児マウスの脳溶解物を用いてイムノブロッティングにより解析した結果を示す図である。（実施例１）
【００３６】
【図２−Ａ】Ｄｌｇ＋／＋マウスのリンパ節にはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色される細胞が極少ないことを、フローサイトメトリーにより明らかにした図である。図中、ＦＬ１−ＨｅｉｇｈｔはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体による染色強度を表す。また、Ｒ２で示される領域（図中右側の四角で囲まれた領域）に存在するドットはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞を、Ｒ３で示される領域（図中左側の四角で囲まれた領域）に存在するドットはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色されなかった細胞を示す。（実施例２）
【００３７】
【図２−Ｂ】Ｄｌｇ＋／−マウスの腫瘍が形成されたリンパ節には、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色される細胞の著しい増加が認められたことをフローサイトメトリーにより明らかにした図である。図中、ＦＬ１−ＨｅｉｇｈｔはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体による染色強度を表す。また、Ｒ２で示される領域（図中右側の四角で囲まれた領域）に存在するドットはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞を、Ｒ３で示される領域（図中左側の四角で囲まれた領域）に存在するドットはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色されなかった細胞を示す。（実施例２）
【００３８】
【図３】Ｄｌｇ−／−マウス由来の胚性繊維芽細胞（以下、ＭＥＦと略称する）におけるｓＦＲＰ１およびｓＦＲＰ２の発現が、Ｄｌｇ＋／＋由来のＭＥＦと比較して低減していたことを、各ＭＥＦから抽出したＲＮＡ試料を用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により明らかにした図である。アクチンは発現のコントロールである。検討には、２系統のマウス（＃３３および＃４４）からそれぞれ調製したＭＥＦ（＃３３ｐｒｉｍａｒｙおよび＃４４ｐｒｉｍａｒｙ）、および＃３３由来のＭＥＦから作製した永久増殖性ＭＥＦ（＃３３  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）を用いた。これらマウス系統は、ターゲティングベクターを胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞と略称することもある）にトランスフェクションして得られた２つのクローンからそれぞれ作製した系統である。（実施例３）
【００３９】
【図４】図中、Ｄｌｇ＋／＋ＭＥＦはＤｌｇ＋／＋マウス由来永久増殖性ＭＥＦを、Ｄｌｇ−／−ＭＥＦはＤｌｇ−／−マウス由来永久増殖性ＭＥＦを、Ｄｌｇ−／−ＭＥＦ：ＤｌｇはＤｌｇ−／−ＭＥＦにＤｌｇ遺伝子をトランスフェクションした細胞を示す。また、上図は各細胞におけるＤｌｇの発現をウェスタンブロッティングにより検討した結果を示し、下図はＲＴ−ＰＣＲによりＡｃｔｉｎ（コントロール）、ｓＦＲＰ２およびｓＦＲＰ１の各ｍＲＮＡの発現を検討した結果を示す。図４は以下について明らかにした図である。すなわち、Ｄｌｇ＋／＋ＭＥＦでは、Ｄｌｇが発現し、ｓＦＲＰ２およびｓＦＲＰ１  ｍＲＮＡも発現していた。一方、Ｄｌｇ−／−ＭＥＦでは、Ｄｌｇの発現は観察されず、ｓＦＲＰ、特にｓＦＲＰ２のｍＲＮＡの発現量は、Ｄｌｇ＋／＋ＭＥＦにおける発現量と比較して極めて僅かであった。また、Ｄｌｇ−／−ＭＥＦにＤｌｇ遺伝子を導入し発現させることにより、ｓＦＲＰ  ｍＲＮＡの発現が回復した。（実施例３）
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
【００４１】
本発明においては、Ｄｌｇ遺伝子ノックアウトマウスを遺伝子工学的手法により作製した（実施例１参照）。そして、Ｄｌｇの発現および／または機能の低下が腫瘍形成の重要な要因であることを哺乳動物において初めて明らかにした。
【００４２】
「Ｄｌｇ遺伝子ノックアウトマウス」とは、個体においてＤｌｇ遺伝子のみを欠損させたマウスをいう。「Ｄｌｇ」とは、Ｄｌｇ蛋白質を意味し、「Ｄｌｇ遺伝子」とは、Ｄｌｇをコードする遺伝子を意味する。
【００４３】
「発現」とは、蛋白質をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質のアミノ酸配列として翻訳されることを意味する。すなわち、「Ｄｌｇの発現」とは、ＤｌｇをコードするＤＮＡの遺伝子情報がＤｌｇ  ｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつＤｌｇのアミノ酸配列として翻訳されることを意味する。「ｓＦＲＰの発現」とは、ｓＦＲＰをコードするＤＮＡの遺伝子情報がｓＦＲＰ  ｍＲＮＡに転写されること、または、ｍＲＮＡに転写され、かつｓＦＲＰのアミノ酸配列として翻訳されることを意味する。
【００４４】
Ｄｌｇ遺伝子ノックアウトマウスのうち、Ｄｌｇ遺伝子ホモ欠損マウス（以下、Ｄｌｇ−／−マウスと呼称する）は、生後短期間で死亡するために成熟マウスを得られなかったが、胚および新生児マウスが得られた。Ｄｌｇ−／−マウスでは、Ｄｌｇが検出されなかった。Ｄｌｇ−／−マウスでは、Ｄｌｇ対立遺伝子の両方が欠損していることにより、Ｄｌｇ遺伝子が転写されず、その結果、Ｄｌｇは発現しない。Ｄｌｇが発現しないので、Ｄｌｇ−／−マウスでは、Ｄｌｇの機能は消失している。一方、Ｄｌｇ遺伝子ヘテロ欠損マウス（以下、Ｄｌｇ＋／−マウスと呼称する）については、胚、新生児マウスおよび成熟マウスが得られた。Ｄｌｇ＋／−マウスでは、Ｄｌｇが検出されたが、その量は野生型マウス（以下、Ｄｌｇ＋／＋マウスと呼称する）と比較して少なかった。
【００４５】
Ｄｌｇ＋／−マウスにおいては、成長に伴って、皮膚腫瘍およびナチュラルキラーリンパ腫の形成が認められた。形成された腫瘍を含む皮膚組織において、正常筋細胞でＤｌｇが検出されたが、腫瘍細胞ではＤｌｇが検出されなかった。このことから、Ｄｌｇ＋／−マウスにおける腫瘍形成は、Ｄｌｇ遺伝子の欠損によるＤｌｇの発現および／または機能の低下に起因すると考えられる。あるいは、該マウスにおいては対立遺伝子の一方が欠損していることにより、成熟過程でＤｌｇ遺伝子の自然変異誘発等が起こり易く、そのためＤｌｇの発現異常が生じて腫瘍が形成される可能性も考えられる。
【００４６】
また、Ｄｌｇ−／−マウスから採取したマウス胚性線維芽細胞において、Ｄｌｇ＋／＋マウスから採取したＭＥＦと比較して、ｓＦＲＰ１  ｍＲＮＡおよびｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡの減少が認められた。特にｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡが著しく減少していた。Ｄｌｇ−／−マウス由来のＭＥＦにＤｌｇ遺伝子を導入して発現させると、ｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡが増加することが判明した。このことから、Ｄｌｇ−／−マウス由来のＭＥＦにおけるｓＦＲＰ  ｍＲＮＡ、特にｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡの減少は、Ｄｌｇ遺伝子の欠損によると考える。ｍＲＮＡの減少は、ｍＲＮＡから翻訳されて生じる蛋白質の減少を惹き起こし、その結果、生体内における該蛋白質の機能も低下させる。
【００４７】
Ｄｌｇの発現および／または機能の低下は、ｓＦＲＰの発現、特にｓＦＲＰ２の発現および／または機能の低下を惹き起すと考える。ｓＦＲＰは、Ｗｎｔアンタゴニストとしての機能を有し、Ｗｎｔシグナルの調節機能を担っていることが知られている（スー（Ｘｕ  Ｑ．）ら、「ディベロプメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、１９９８年、第１２５巻、ｐ．４７６７−４７７６；およびチャン（Ｃｈａｎｇ  Ｊ．Ｔ．）ら、「ヒューマン  モレキュラー  ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、１９９９年、第８巻、ｐ．５７５−５８３）。
【００４８】
最近、ｓＦＲＰ２等のｓＦＲＰファミリーの機能を大腸癌細胞において回復させることにより、Ｗｎｔシグナルが低減されることが報告された（非特許文献６）。この報告はさらに、ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化が多数の大腸癌組織で認められることを開示している。これら報告から、大腸癌形成において、ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化によりｓＦＲＰの発現および／または機能が低下し、その結果Ｗｎｔシグナル伝達経路が活性化するというメカニズムが存在することが示唆された。癌細胞のゲノムＤＮＡ中に多くのＤＮＡメチル化が観察されることは既に報告されており、発癌とＤＮＡメチル化との関連性が指摘されている。ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによりＤＮＡ中のシトシン塩基にメチル基が付加されて５−メチルシトシンが生じる反応である。メチル化されたＤＮＡにはメチル化ＤＮＡに特異的に結合する蛋白質（ＭＢＰ蛋白質）が結合し、さらにヒストン脱アセチル化酵素を含む転写リプレッサーとの複合体が形成されてヒストンが脱アセチル化するため、クロマチンの構造変化が起こり転写が抑制される。また、ＭＢＰ蛋白質の結合により、メチル化ＤＮＡからの脱メチル化が妨げられてメチル化状態が維持され、転写が安定的に阻止される。すなわち、ＤＮＡメチル化は、遺伝子の転写のスイッチとしての作用を有している。例えば、癌抑制遺伝子がメチル化されると、その転写が抑制されるため、癌遺伝子の転写が惹き起こされる可能性がある。また、通常はメチル化されて転写が抑制されている癌遺伝子のメチル化が解除されると、癌遺伝子の転写が開始される可能性がある。
【００４９】
ｓＦＲＰがＷｎｔシグナルの調節機能を担っていることから、Ｄｌｇ遺伝子欠損による腫瘍形成のメカニズムには、Ｄｌｇの発現および／または機能の低下により、ｓＦＲＰの発現および／または機能が阻害され、その結果Ｗｎｔシグナルが増強されるというカスケードが存在すると考える。すなわち、Ｄｌｇは、ｓＦＲＰによって調節されているＷｎｔシグナル伝達経路の上流に位置する因子であり、ｓＦＲＰの発現および／または機能に寄与することよりＷｎｔシグナルを負に調節すると考える。したがって、Ｄｌｇは、Ｗｎｔシグナルの活性化に起因する腫瘍形成を阻害すると考える。
【００５０】
ＤｌｇによるｓＦＲＰの発現および／または機能に関わるメカニズムとして、Ｄｌｇによる、ｓＦＲＰの発現に関与する転写因子や転写調節因子の調節が考えられる。また、別のメカニズムとして、Ｄｌｇによる、ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化の調節が考えられる。例えば、Ｄｌｇにより、ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化に関与するＤＮＡメチルトランスフェラーゼの作用が阻害され、その結果、ｓＦＰＰの発現および／または機能が正常な状態に維持されるといったメカニズムが考えられる。
【００５１】
Ｄｌｇの発現および／または機能の低下により、ｓＦＲＰの発現および／または機能が阻害され、その結果、Ｗｎｔシグナルが増強されて腫瘍が形成される。ｓＦＲＰの発現および／または機能の阻害は、Ｄｌｇの発現低下および／または該発現低下に起因するＤｌｇの機能低下のみならず、Ｄｌｇ遺伝子の変異や該遺伝子の転写・翻訳過程の異常、あるいは蛋白質修飾過程の異常等に起因するＤｌｇの機能低下によっても惹き起こされる。
【００５２】
Ｄｌｇの発現および／または機能を増強することにより、ｓＦＲＰの発現および／または機能、好ましくはｓＦＲＰ２の発現および／または機能が増強でき、その結果、Ｗｎｔシグナルが阻害されて腫瘍の形成が阻害できる。さらには、Ｗｎｔシグナルの活性化に起因する疾患、例えば腫瘍疾患の防止および／または治療を実施できる。
【００５３】
「機能」とは、蛋白質が本来備えている働きを意味する。一般的に蛋白質は、他の物質、例えば他の蛋白質と接触して相互作用することによりその機能を発現する。「Ｄｌｇの機能」として、ｓＦＲＰの発現および／または機能に関わるメカニズムの調節作用を介した、ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する働きが例示できる。「ｓＦＲＰの機能」として、ＷｎｔシグナルアンタゴニストとしてＷｎｔシグナル伝達経路を負に調節する働きが例示できる。
【００５４】
「Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する」とは、Ｄｌｇの発現および／または機能がほとんど認められない状態から、該発現および／または機能が認められる状態に変化させること、並びに該発現および／または機能が認められる状態から、その発現および／または機能がさらに増加した状態に変化させることのいずれをも意味する。
【００５５】
「ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する」とは、ｓＦＲＰの発現および／または機能がほとんど認められない状態から、該発現および／または機能が認められる状態に変化させること、並びに該発現および／または機能が認められる状態から、その発現および／または機能がさらに増加した状態に変化させることのいずれをも意味する。
【００５６】
ここで、ある蛋白質の発現および／または機能に対して増強効果を奏する化合物あるいは該化合物を含む組成物を「増強剤」と称する。
【００５７】
「Ｗｎｔシグナルの活性化」とは、Ｗｎｔシグナルの作動の程度が正常な状態と比較して高く変化することを意味する。Ｗｎｔシグナルの作動の程度が高く変化することにより、細胞増殖や腫瘍形成等が惹き起こされる。
【００５８】
「Ｗｎｔシグナルを阻害する」とは、Ｗｎｔシグナルを低減させる、または消失させることを意味する。
【００５９】
「腫瘍形成を阻害する」とは、腫瘍の発生および／または増殖を低減させる、または消失させることを意味する。
【００６０】
ここで、ある蛋白質の発現および／または機能に対して阻害効果を奏する化合物あるいは該化合物を含む組成物を「阻害剤」と称する。
【００６１】
「化合物」とは、化学的または生物学的化合物を指すものとして使用される。そのような化学的または生物学的化合物は限定されないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、抗体、低分子量化合物等を含む。
【００６２】
Ｄｌｇの発現および／または機能を増強することは、具体的には、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物により実施できる。このような化合物として、Ｄｌｇ自体またはＤｌｇ遺伝子若しくはＤｌｇ遺伝子を含有する組換えベクターを例示できる。あるいは、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築した該化合物の同定方法により得て、このような化合物として用いることができる。Ｄｌｇの発現を増強する作用を有する化合物は、Ｄｌｇ遺伝子を用いて、遺伝子の発現を増強する化合物をスクリーニングする一般的な同定方法により数々の化合物から該機能を有する化合物を選別することにより取得できる。Ｄｌｇの機能を増強する作用を有する化合物の同定方法は、Ｄｌｇの機能、例えばｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する働きを指標にして、数々の化合物から該機能を有する化合物を選別することにより取得できる。このように、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を用いて、ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強することにより、Ｗｎｔシグナルを介した細胞増殖および腫瘍形成を阻害でき、その結果、腫瘍疾患を防止および／または治療できる。
【００６３】
本発明は、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を含む、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、腫瘍形成阻害剤、並びに腫瘍疾患の防止および／または治療剤を提供する。本腫瘍形成阻害剤は、本増強剤を含むものであり得る。本腫瘍疾患の防止および／または治療剤は、本増強剤を含むものであり得る。
【００６４】
本発明はまた、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強することを特徴とする、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法、腫瘍形成阻害方法、並びに腫瘍疾患の防止および／または治療方法を提供する。本増強方法は、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を用いることにより実施できる。本腫瘍形成阻害方法は、前記化合物、前記増強剤、および前記増強方法のいずれかを用いることにより実施できる。本腫瘍疾患の防止および／または治療方法は、前記化合物、前記増強剤、および前記増強方法のいずれかを用いることにより実施できる。
【００６５】
本発明により発現および／または機能が増強されるｓＦＲＰは、ｓＦＲＰ１およびｓＦＲＰ２が好ましく例示でき、より好ましくはｓＦＲＰ２である。
【００６６】
Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物として、Ｄｌｇ自体またはＤｌｇ遺伝子若しくはＤｌｇ遺伝子を含有する組換えベクターを好ましく例示できる。
【００６７】
Ｄｌｇは、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット等のあらゆる組織または細胞等に由来する蛋白質であることができる。具体的には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来蛋白質、あるいは配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされるマウス由来蛋白質が好ましく例示できる。Ｄｌｇは配列番号２または４に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質に限定されず、該アミノ酸配列を含む蛋白質、または該アミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列で表される蛋白質であることができる。あるいは、該アミノ酸配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個〜数個のアミノ酸に置換、欠失、付加または挿入等の変異が存するアミノ酸配列で表される蛋白質であり得る。これら蛋白質は、Ｄｌｇとしての機能を有する蛋白質、例えば、ｓＦＲＰ、好ましくはｓＦＲＰ２の発現および／または機能を増強することができる蛋白質であることが適当である。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、ｓＦＲＰ、好ましくはｓＦＲＰ２の発現および／または機能を増強することができる限りにおいて特に制限されない。このような変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであることができ、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであることができる。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的手法を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
【００６８】
Ｄｌｇは、Ｄｌｇの発現が確認されている哺乳動物由来の組織や細胞から、公知の蛋白質精製方法に従って精製することにより取得できる。このような方法において、まず、哺乳動物由来の組織や細胞をホモジナイズした後に、酸や有機溶媒等で蛋白質の抽出を行なう。次いで、得られた抽出液から、公知の精製法を利用してＤｌｇを単離精製する。単離精製方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等が例示できる。これら方法は単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、Ｄｌｇまたはその断片を用いて公知の抗体作製法により作製した抗Ｄｌｇ特異的抗体を用いて特異的に吸着する方法が推奨される。具体的には、該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーが好ましく例示できる。
【００６９】
Ｄｌｇはまた、一般的な化学合成法により製造できる。蛋白質の化学合成法として、成書（「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年；および「ペプチド  シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９６年）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、固相合成方法や液相合成方法等が知られているが、いずれも利用できる。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。Ｄｌｇの合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従って実施できる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られるＤｌｇはさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製できる。
【００７０】
Ｄｌｇはまた、Ｄｌｇ遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；およびウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１等を参照）により取得できる。例えば、Ｄｌｇ遺伝子を含有する組換えベクターを導入した形質転換体を用いてＤｌｇの発現誘導を行い、その後該形質転換体からＤｌｇを回収することにより、Ｄｌｇを取得できる。さらに、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、上記単離精製方法によりＤｌｇを精製することができる。Ｄｌｇ遺伝子を含有する組換えベクターを導入した形質転換体において、Ｄｌｇが形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕してＤｌｇを抽出する。Ｄｌｇが形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま用いるか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。さらに、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、上記単離精製方法によりＤｌｇを精製できる。また、Ｄｌｇ遺伝子を導入した組換えベクターを用いて、公知の無細胞蛋白質発現系を用いて、Ｄｌｇを取得することもできる（マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４）。
【００７１】
Ｄｌｇ遺伝子は、具体的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるヒト由来ＤＮＡ、または配列番号３に記載の塩基配列で表わされるマウス由来ＤＮＡが好ましく例示できる。Ｄｌｇ遺伝子は配列番号１または３に記載の塩基配列で表されるＤＮＡに限定されず、該ＤＮＡを含むＤＮＡ、または該ＤＮＡと約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡであることができる。あるいは、該塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるＤＮＡが包含される。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するＤＮＡがｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限りにおいて特に制限されない。このような変異を有するＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡであることができ、誘発変異を有するＤＮＡであることができる。また、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たＤＮＡであることができる。変異を導入する方法は自体公知であり、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等が例示できる。これら方法は単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば、成書に記載の方法（村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；およびエールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用して実施することもできる。
【００７２】
Ｄｌｇ遺伝子は、Ｄｌｇの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより取得できる。ｃＤＮＡの起源として、Ｄｌｇの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞を例示できる。Ｄｌｇは数々の組織や細胞で普遍的に発現しているため、ｃＤＮＡの起源として様々な組織や細胞を使用できる。好ましくは、脳組織、皮膚組織または大腸組織等、あるいはこれら組織由来の細胞等が例示できる。これら起源からｃＤＮＡライブラリーを調製するための全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、ヒトの脳、胎児脳および脳海馬由来の市販されているｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築して用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、Ｄｌｇ遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンを選択することができる。具体的には、Ｄｌｇ遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。プローブやプライマーは、Ｄｌｇ遺伝子の配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に用いられる。
【００７３】
Ｄｌｇ遺伝子を含有する組換えベクターは、Ｄｌｇ遺伝子を適当なベクターＤＮＡに挿入することにより取得できる。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能であれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡであることができる。代表的なベクターＤＮＡとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡが挙げられる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。
【００７４】
ベクターＤＮＡには、Ｄｌｇ遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくともＤｌｇ遺伝子とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクターＤＮＡに組込むことができる。このような遺伝子配列として、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）等を例示できる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組込むことができる。
【００７５】
ベクターＤＮＡにＤｌｇ遺伝子を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。具体的には、Ｄｌｇ遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が例示できる。あるいは、Ｄｌｇ遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが取得できる。Ｄｌｇ遺伝子を組込んだベクターＤＮＡにより宿主を形質転換して得られる形質転換体は、Ｄｌｇ遺伝子がコードする蛋白質の製造に有用である。宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法（村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系が挙げられる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が例示できる。原核生物を宿主とする場合、組換えベクターが該原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、Ｄｌｇ遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌を宿主とする場合、プロモーターとして大腸菌等の細菌中で発現できるプロモーターであればいずれも利用できる。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが挙げられる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法として、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に���定されず、いずれも利用できる。好ましくは、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用される。哺乳動物細胞を宿主とする場合、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、Ｄｌｇ遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が例示でき、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。哺乳動物細胞への組換えベクターの導入方法として、好ましくは、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が例示できる。最も好ましくは、リポフェクション法を用いる。酵母を宿主とする場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるプロモーターであれば特に限定されず、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が例示できる。酵母への組換えベクターの導入方法として、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用できる。昆虫細胞を宿主とする場合、組換えベクターの導入方法として、好ましくは、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が利用できる。
【００７６】
Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物は、例えば、Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物を用いた同定方法により取得することができる
【００７７】
本発明において、Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物を用いることを特徴とする、化合物の同定方法を提供する。Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物として、好ましくは、Ｄｌｇ遺伝子へテロ欠損非ヒト哺乳動物、より好ましくはＤｌｇ遺伝子へテロ欠損マウスを例示できる。
【００７８】
本同定方法では、Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物に調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）を投与し、本哺乳動物におけるＤｌｇの発現および／または機能を測定することにより、Ｄｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を取得できる。
【００７９】
本同定方法において、Ｄｌｇの発現を測定し、被検化合物を投与したＤｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物におけるＤｌｇの発現量が被検化合物を投与しなかった該哺乳動物と比較して増加した場合、該被検化合物はＤｌｇの発現を増強する作用を有すると判定できる。
【００８０】
本同定方法において、Ｄｌｇの機能を測定し、被検化合物を投与したＤｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物のＤｌｇの機能が該被検化合物を投与しなかった該哺乳動物と比較して増加した場合、該被検化合物はＤｌｇの機能を増強する作用を有すると判定できる。Ｄｌｇの機能として、例えばｓＦＲＰの発現を増強する機能が挙げられる。したがって、本同定方法においてｓＦＲＰの発現および／または機能を測定することにより、Ｄｌｇの機能を増強する作用を有する化合物を取得できる。被検化合物を投与した該哺乳動物のｓＦＲＰの発現および／または機能が被検化合物を投与しなかった該哺乳動物と比較して増加した場合、該被検化合物はＤｌｇの機能を増強する作用を有すると判定できる。
【００８１】
本同定方法において、Ｄｌｇの発現および／または機能を測定する代わりにｓＦＲＰの発現および／または機能を測定することにより、ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を取得できる。
【００８２】
本同定方法において、ｓＦＲＰの発現を測定し、被検化合物を投与したＤｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物のｓＦＲＰの発現量が被検化合物を投与しなかった該哺乳動物と比較して増加した場合、該被検化合物はｓＦＲＰの発現を増強する作用を有すると判定できる。
【００８３】
本同定方法において、ｓＦＲＰの機能を測定し、被検化合物を投与したＤｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物のｓＦＲＰの機能が該被検化合物を投与しなかった該哺乳動物と比較して増加した場合、該被検化合物はｓＦＲＰの機能を増強する作用を有すると判定できる。ｓＦＲＰの機能として、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害する作用が挙げられる。したがって、本同定方法においてＷｎｔシグナルを測定することにより、ｓＦＲＰの機能を増強する作用を有する化合物を取得できる。被検化合物を投与した該哺乳動物のＷｎｔシグナルが被検化合物を投与しなかった該哺乳動物と比較して低減または消失した場合、該被検化合物はｓＦＲＰの機能を増強する作用を有すると判定できる。
【００８４】
本同定方法において、Ｄｌｇの発現および／または機能を測定する代わりにＤｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物における腫瘍形成を測定することにより、腫瘍形成を阻害する作用を有する化合物を取得できる。被検化合物を投与した該哺乳動物における腫瘍形成が該被検化合物を投与しなかった該哺乳動物の腫瘍と比較して縮小または消失した場合、該被検化合物は腫瘍形成を阻害する作用を有すると判定できる。腫瘍が形成されたか否かの測定は、簡便には形成された腫瘍または腫瘍が形成された組織のサイズや重量等を測定することにより実施できる。
【００８５】
本同定方法で得られたＤｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物は、ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物、および腫瘍形成を阻害する作用を有する化合物であることができる。また、本同定方法で得られたｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物は腫瘍形成を阻害する作用を有する化合物であることができる。
【００８６】
ＤｌｇやｓＦＲＰの発現の測定は、これら各遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの測定、あるいは該ｍＲＮＡの翻訳産物である蛋白質の測定により実施できる。ｍＲＮＡの測定方法として、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。具体的には、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＴ−ＰＣＲ、プラークハイブリダイゼーション、またはコロニーハイブリダイゼーション等が例示できる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲやｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの測定も利用できる。このような遺伝子検出法において、遺伝子の測定の実施に、該遺伝子の部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、該遺伝子のみに特異的にハイブリダイゼーションできる該遺伝子特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは該遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子特有の配列からなるものを意味する。プローブまたはプライマーは、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識のものであってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出することができる。プローブおよびリガンドを標識する方法は、数々の方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等が例示できる。遺伝子検出法として、ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、Ｄｌｇ遺伝子またはｓＦＲＰ遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法をいずれも使用できる。例えばＲＴ−ＰＣＲが挙げられるが、その他、当該分野で使用される数々のＰＣＲの変法が適用できる。ＰＣＲにより、遺伝子の検出の他に、遺伝子の定量もできる。このような分析方法として、ＭＳＳＡ法等の競合的定量法、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を例示できる。
【００８７】
ＤｌｇまたはｓＦＲＰの測定は、慣用の蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、ＤｌｇまたはｓＦＲＰに対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法により、ＤｌｇまたはｓＦＲＰを測定できる。また、ＤｌｇまたはｓＦＲＰに対する抗体により、免疫組織化学的手法を用いてパラフィン組織切片または凍結組織切片中のＤｌｇまたはｓＦＲＰを検出できる。ＤｌｇまたはｓＦＲＰを検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が例示できる。その他、競争結合アッセイ等を利用することもできる。
【００８８】
Ｄｌｇの機能の測定は、例えば該機能としてｓＦＲＰの発現を増強する機能が挙げられることから、例えばｓＦＲＰの発現の増強を測定することにより達成できる。
【００８９】
ｓＦＲＰの機能の測定は、ｓＦＲＰがＷｎｔと結合することによりＷｎｔシグナル活性化の阻害作用を示すことから、例えば、該結合または該阻害作用を測定することにより達成できる。ｓＦＲＰとＷｎｔとの結合の測定は、慣用のバインディングアッセイにより実施できる。Ｗｎｔシグナルの活性化の阻害作用は、Ｗｎｔシグナルの活性化により増加するβ−カテニンの発現を測定し、その発現が阻害されることを検出することにより測定できる。β−カテニンの発現は、Ｄｌｇの発現の測定方法と同様の方法により測定できる。
【００９０】
Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物への被検化合物の投与経路は、全身投与および局所投与が挙げられる。いずれの経路で投与してもよい。非経口経路として、通常の静脈内投与および動脈内投与が例示できる。また、経口による投与も実施できる。被検化合物として、化学ライブラリーや天然物由来の化合物等が例示できる。
【００９１】
本発明に係る化合物の同定方法はまた、Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物の代わりに、該哺乳動物由来の細胞を用いて実施できる。該細胞は、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方または両方が欠失していること、またはＤｌｇの発現および／または機能が低下していることが確認された細胞であることが好ましい。より好ましくは、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方が欠失していることが確認された細胞が適当である。Ｄｌｇ対立遺伝子の遺伝子型の解析は、例えば、後述するようにＰＣＲまたはサザンブロット法により実施できる。好ましい細胞として、胚性線維芽細胞を例示できる。さらに、Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物由来の細胞は、自体公知の方法により永久増殖化して、本同定方法に使用することもできる。哺乳動物からの胚性繊維芽細胞の調製および永久増殖化細胞の調製は、公知の細胞工学的手法により実施できる（トダロ（Ｔｏｄａｒｏ  Ｇ．Ｊ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９６３年、第１７巻、ｐ．２９９−３１３）。
【００９２】
細胞を用いる本同定方法では、細胞と被検化合物を接触させ、その後、該細胞内におけるＤｌｇの発現を測定し、被検化合物を接触させた該細胞のＤｌｇ発現量が被検化合物を接触させなかった該細胞と比較して増加した場合、該被検化合物はＤｌｇの発現を増強する作用を有すると判定できる。また、このとき、Ｄｌｇの発現を測定する代わりに、Ｄｌｇの機能を測定し、被検化合物を接触させた該細胞のＤｌｇの機能が被検化合物を接触させなかった該細胞と比較して増加した場合、該被検化合物はＤｌｇの機能を増強する作用を有すると判定できる。このような同定方法において、Ｄｌｇの発現および／または機能を測定する代わりにｓＦＲＰの発現および／または機能を測定することにより、ｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物を取得できる。
【００９３】
Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物由来の細胞は、さらに、ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化を阻害する作用および／またはｓＦＲＰ遺伝子を脱メチル化する作用を有する化合物の同定方法に使用できる。「ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化を阻害する作用」とは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるｓＦＲＰ遺伝子中のシトシン塩基へのメチル基付加を阻害する作用を意味する。「ｓＦＲＰ遺伝子を脱メチル化する作用」とは、ｓＦＲＰ遺伝子中のシトシン塩基に付加されたメチル基を取り去る作用を意味する。このような作用を有する化合物の同定方法には、Ｄｌｇ遺伝子ホモ欠損非ヒト哺乳動物およびＤｌｇ遺伝子ヘテロ欠損非ヒト哺乳動物のいずれに由来する細胞も使用できる。Ｄｌｇ遺伝子ホモ欠損マウスにおいては、該遺伝子へテロ欠損マウスと比較して、ｓＦＲＰの発現および／または機能の低下が著しいことから、このような同定方法に用いる細胞は、好ましくはＤｌｇ遺伝子ホモ欠損非ヒト動物由来の細胞、より好ましくはＤｌｇ遺伝子ホモ欠損マウス由来の細胞が推奨される。細胞と被検化合物を接触させ、その後、該細胞内におけるｓＦＲＰ遺伝子のメチル化を測定し、被検化合物を接触させた該細胞におけるｓＦＲＰ遺伝子のメチル化量が被検化合物を接触させなかった該細胞におけるｓＦＲＰ遺伝子のメチル化量と比較して減少した場合、該被検化合物はｓＦＲＰ遺伝子のメチル化を阻害する作用および／またはｓＦＲＰ遺伝子を脱メチル化する作用を有すると判定できる。ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化の測定は、自体公知の方法により実施できる。例えば、亜硫酸水素塩シークエンス法（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．）ら、「ネイチャー  ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、２００２年、第３１巻、ｐ．１４１−１４９）、マイクロアレイを用いたＤＭＨ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法（ヤン（Ｙａｎ，Ｐ．Ｓ．）ら、「クリニカル  キャンサー  リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第６巻、ｐ．１４３２−１４３８）、蛍光色素を用いたリアルタイムＰＣＲ法であるメチルライト法（トリン（Ｔｒｉｎｈ．Ｂ．Ｎ．）ら、「メソッズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、２００１年、第２５巻、ｐ．４５６−４６２）等の方法が例示できる。
【００９４】
本発明において、Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物および該哺乳動物由来の細胞を提供する。Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物として、好ましくは、Ｄｌｇ遺伝子へテロ欠損非ヒト哺乳動物、より好ましくはＤｌｇ遺伝子へテロ欠損マウスを例示できる。Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物由来の細胞は、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方または両方が欠失していること、またはＤｌｇの発現および／または機能が低下していることが確認された細胞であることが好ましい。より好ましくは、Ｄｌｇ対立遺伝子の一方が欠失していることが確認された細胞である。Ｄｌｇ対立遺伝子の遺伝子型の解析は、例えば、後述するようにＰＣＲまたはサザンブロット法により実施できる。好ましい細胞として、胚性線維芽細胞を例示できる。さらに、Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物由来の細胞を、自体公知の方法により永久増殖化した細胞も本発明の範囲に包含される。
【００９５】
「Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物」とは、Ｄｌｇ遺伝子を人為的に欠損させ、Ｄｌｇの発現を消失または低下させた、ヒトを含まない哺乳動物を意味する。非ヒト哺乳動物として、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ヤギ等が挙げられるが、その中で、個体発生および生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯類、より好ましくはマウスを例示できる。Ｄｌｇ遺伝子欠損非ヒト哺乳動物は、例えばジーンターゲティング法等の遺伝子工学的手法を利用して、染色体のＤｌｇ遺伝子を任意に変換させることにより作製できる（「ジーンターゲティング：ア  プラクティカル  アプローチ（プラクティカル  アプローチ  シリーズ  ２１２）（Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２１２））、第２版、２０００年、ジョイヤー、アレクサンドラ（Ｊｏｙｅｒ，Ａｌｅｘａｎｄｒａ  Ｌ．）編、出版：オックスフォードユニバーシティープリント（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｉｎｔ）等）。ジーンターゲティング法では、まず、ゲノムライブラリーより単離したクローンを基に、発現能を有さないＤｌｇ遺伝子を含む構築物（ターゲティングベクター）を作製し、ＥＳ細胞に遺伝子導入し、相同組換えが生じたＤｌｇ遺伝子変異クローンを得る。「発現能を有さないＤｌｇ遺伝子」とは、Ｄｌｇの発現を阻害するような変異、または該遺伝子がコードする蛋白質の機能を喪失させるような変異が導入された結果、細胞や生体にトランスフェクションしたときにＤｌｇを発現しないＤｌｇ遺伝子を意味する。Ｄｌｇ遺伝子への変異の導入は、公知の遺伝子工学的手法により、Ｄｌｇ遺伝子の塩基配列の一部または全部の除去や別の遺伝子の挿入または置換を行なうことにより実施できる。このような変異の導入の結果、プロモーターまたはエキソンの機能の破壊、あるいはコドンの読み取り枠がずれることにより、Ｄｌｇの発現が低下あるいは消失したノックアウトマウスが作製できる。プロモーターまたはエキソンの機能の破壊するために導入する遺伝子として、薬剤耐性遺伝子等、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、好ましくはネオマイシン耐性遺伝子が例示できる。ここに例示した遺伝子以外に、ジーンターゲティング法で一般的に用いられている遺伝子がいずれも使用できる。ＥＳ細胞は、非ヒト哺乳動物の胚盤胞から樹立できる。マウスのＥＳ細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＢＡ／ＪＮＣｒｊマウスの間の雑種第一代胚盤胞から樹立したＴＴ２  ＥＳ細胞を例示できる。ターゲティングベクターを遺伝子導入したＥＳ細胞からの、相同組換えが生じたＤｌｇ遺伝子変異クローンの選別は、ターゲティングベクターを遺伝子導入したクローンについて、その遺伝子型を解析することにより実施できる。遺伝子型の解析は、ＰＣＲまたはサザンブロッティング法により実施できる。ＰＣＲでは、プライマーとしてターゲティングベクター中のＤｌｇ遺伝子の部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよびプロモーターまたはエキソンの機能を破壊するために導入した遺伝子の部分配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することにより、Ｄｌｇ遺伝子の欠失を検出することができる。サザンブロッティング法では、Ｄｌｇ遺伝子またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとして用いて検出されたＤＮＡのサイズにより、Ｄｌｇ遺伝子の欠失を検出できる。あるいは、ターゲティングベクターの作製に薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、変異クローンの薬剤耐性を利用して、該変異クローンを容易に選別できる。このようにして得られたＤｌｇ遺伝子変異クローンを非ヒト哺乳動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）または８細胞期胚に注入し、偽妊娠状態にした同種の非ヒト哺乳動物の子宮に移植することにより、正常なＤｌｇ遺伝子座をもつ細胞と変異したＤｌｇ遺伝子座をもつ細胞とから構成されるキメラ個体が得られる。キメラ個体と野生型個体との交配により相同染色体の一方に変異が導入された個体（ヘテロ欠損個体）または相同染色体の両方に変異が導入された個体（ホモ欠損個体）を取得できる。一般的には、このような交配によりヘテロ欠損個体が得られる。ホモ欠損個体は、ヘテロ遺伝子欠損個体同志の交配により取得できる。
【００９６】
本発明に係る同定方法により得られたＤｌｇの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物は、Ｄｌｇの発現および／または機能の増強剤、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、腫瘍形成阻害剤、あるいは腫瘍疾患の防止および／または治療剤の有効成分として使用できる。本同定方法により得られたｓＦＲＰの発現および／または機能を増強する作用を有する化合物は、腫瘍形成阻害剤、あるいは腫瘍疾患の防止および／または治療剤の有効成分として使用できる。本同定方法により得られた腫瘍形成を阻害する化合物は、腫瘍疾患の防止および／または治療剤の有効成分として使用できる。また、上記同定方法により得られたｓＦＲＰ遺伝子のメチル化を阻害する作用および／または脱メチル化する作用を有する化合物は、ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化阻害剤および／または脱メチル化剤、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、腫瘍形成阻害剤、あるいは腫瘍疾患の防止および／または治療剤の有効成分として使用できる。
【００９７】
本発明に係る同定方法により得られた化合物および該化合物を有効成分として含む薬剤は、Ｄｌｇの腫瘍形成抑制機序への関与の解明、並びに腫瘍疾患の防止および／または治療に有用である。また、該化合物や該薬剤を少なくとも１つ用いて、Ｄｌｇの発現および／または機能の増強方法、ｓＦＲＰ遺伝子のメチル化阻害方法および／または脱メチル化方法、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強方法、腫瘍形成阻害方法、あるいは腫瘍疾患の防止および／または治療方法を実施できる。例えば、Ｄｌｇの発現および／または機能の増強方法は、上記化合物や薬剤の少なくとも１つを対象に投与する、あるいは、対象由来の細胞または培養細胞株等にインビトロで（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）接触させることにより実施できる。腫瘍形成阻害方法あるいは腫瘍疾患の防止および／または治療方法は、例えば、上記化合物や薬剤の少なくとも１つを対象に投与することにより実施できる。
【００９８】
Ｄｌｇの発現および／または機能の増強剤、ｓＦＲＰのメチル化阻害剤および／または脱メチル化剤、ｓＦＲＰの発現および／または機能の増強剤、腫瘍形成阻害剤、あるいは腫瘍疾患の防止および／または治療剤は、通常は、１種または２種以上の医薬上許容される担体（医薬用担体）を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。これら薬剤は、単独で使用することができるし、複数を組合せて使用することもできる。医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。医薬用担体は、医薬組成物の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等が例示できる。これらは得られる医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択して使用される。例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る医薬組成物の使用形態に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して医薬組成物を調製することもできる。安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、���ルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等が例示できる。等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示できる。
【００９９】
上記薬剤および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
【０１００】
上記薬剤または医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験によりこれら用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与することができる。
【０１０１】
上記薬剤または医薬組成物が適用できる疾患として、Ｄｌｇの発現および／または機能の低下または消失によりｓＦＲＰの発現および／または機能が低下または消失していることに起因する疾患、例えば腫瘍疾患が挙げられる。腫瘍疾患に適用する場合、対象となる腫瘍の種類は特に限定されず、固形腫瘍または非固形腫瘍のいずれにも適用できる。Ｄｌｇは数々の組織や細胞において普遍的に発現していることから、Ｄｌｇの発現異常や変異等によるＤｌｇ機能の低下は、多くの組織や細胞において腫瘍形成を誘発すると考える。したがって、固形腫瘍または非固形腫瘍の種類も特に限定されず、いずれの腫瘍にも適用できる。具体的には、胃癌、食道癌、大腸癌、小腸癌、十二指腸癌、肺癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、口腔癌、骨癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、脳腫瘍、神経芽腫等の固形腫瘍、あるいは白血病や悪性リンパ腫等の非固形腫瘍等を例示できる。好ましくは、Ｄｌｇの発現および／または機能の低下、あるいはＤｌｇ遺伝子やＤｌｇの変異が認められる腫瘍に適用することが推奨される。より好ましくは、Ｄｌｇ＋／−マウスにおいて皮膚癌およびリンパ腫が形成されたことから、皮膚癌およびリンパ腫に適用することが推奨される。上記薬剤または医薬組成物を投与するときは、該薬剤または該医薬組成物を単独で使用することができ、あるいは該薬剤または該医薬組成物の適用対象である疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と併用することもできる。例えば、上記薬剤または医薬組成物を腫瘍疾患の防止および／または治療方法に用いるときに、該薬剤または該医薬組成物とは別種の、腫瘍疾患の防止および／または治療剤を併用することができる。
【０１０２】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することもできる。
【０１０３】
投与形態は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【０１０４】
Ｄｌｇの発現および／または機能を増強するために、Ｄｌｇ遺伝子または該遺伝子を含有する遺伝子導入用ベクターを有効成分として含む遺伝子治療剤を用いることができる。該遺伝子治療剤は、該ベクターにより該遺伝子が導入された細胞を有効成分として含む遺伝子治療剤であることもできる。遺伝子治療剤は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。遺伝子治療剤は、また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。遺伝子治療剤は、１日に１回または数回に分けて投与することができ、１日から数週間の間隔で間歇的に投与することもできる。所望の遺伝子を含有するウイルスベクターの投与量は、一般的には例えばレトロウイルスベクターであれば１日あたり体重１ｋｇあたりレトロウイルスの力価として約１×１０３ｐｆｕから１×１０１５ｐｆｕ程度とするのがよい。また、製剤中の有効成分が所望の遺伝子を導入された細胞である場合は、細胞数１×１０４／ヒトから１×１０１５／ヒト程度の範囲から選ばれるのが適当である。遺伝子治療剤を用いる治療法は、上記遺伝子を直接体内に導入するインビボ法と、患者の体内より標的とする細胞を一旦取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ法の両方の方法を包含する。インビボ法がより好ましい。遺伝子の体内または細胞内への導入法として、非ウイルス性のトランスフェクション法、あるいはウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法をいずれも適用できる。非ウイルス性のトランスフェクション法は、ウイルスベクターを利用した方法と比較して、安全性および簡便性の点で優れておりかつ安価であるためより好ましい。非ウイルス性のトランスフェクション法として、次のような方法が例示できる：リン酸カルシウム共沈法；プラスミドＤＮＡを直接インビボで標的組織に注入するネイキッドＤＮＡ法；多重膜正電荷リポソームに封入した遺伝子を細胞に導入するカチオニックリポソーム法；プラスミドＤＮＡを金でコートして高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する所謂遺伝子銃と呼ばれる方法；ＤＮＡを封入したリポソームと不活化センダイウイルスを融合させて作成した膜融合リポソームを用いる膜融合リポソーム法；標的組織または標的細胞に発現する受容体に結合するリガンドとＤＮＡとの結合体を用いるリガンド−ＤＮＡ複合体法；およびＤＮＡを封入したリポソームの表面に標的組織または標的細胞表面に結合する抗体を結合させたイムノリポソームを用いるイムノリポソーム法。その他、ポリマーやペプチド等を用いるトランスフェクション法が知られている。非ウイルス性のトランスフェクション法は上記例示に限定されず、ウイルスベクターを用いずに標的組織または標的細胞に遺伝子をトランスフェクションできる限りにおいていずれの方法も使用できる。ウイルスベクターを使用するトランスフェクション法において、トランスフェクションに使用するベ���ターとして、好ましくはレトロウイルスベクターを例示できる。レトロウイルスベクター以外のＲＮＡウイルスベクターやＤＮＡウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等を使用することもできる。これらウイルスベクターを用いることにより効率良い投与を実施できる。さらに、ウイルスベクターを用いるトランスフェクション法においても、該ベクターをリポソームに封入して、そのリポソームを投与する方法が推奨される。リポソームを用いることにより目的物質を標的細胞または標的組織に効率的に送達できるため、ウイルスベクターとリポソームとの複合治療は高い効果を奏すると考える。また、リポソームを用いた治療においてリポソームが比較的安定で主要な免疫応答を生じることがないことが知られていることからも、このような複合治療の有用性が示唆される。リポソームとして、カチオン性脂質から製造されるリポソームを好ましく例示できる。トランスフェクション用ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入等を始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該分野において既に知られている各種の方法に従って実施できる。形質転換された細胞は、それ自体単離状態で、医薬や治療研究のためのモデル系としても利用できる。トランスフェクション用ベクターの製造において、導入される遺伝子は、Ｄｌｇ遺伝子の塩基配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的手法により容易に取得できる。遺伝子を導入する標的組織および標的細胞は、遺伝子治療の対象により適宜選択して使用できる。標的細胞として、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞等の細胞を例示できるが、これらに制限されることはない。Ｄｌｇ遺伝子の所望の機能により、目的とする疾患の改善および／または治療が得られる限りにおいていずれの組織および細胞であっても導入し得る。
【０１０５】
Ｄｌｇの発現および／または機能の低下が腫瘍形成の重要な要因であることが判明したことから、Ｄｌｇの発現および／または機能を検出することにより、腫瘍疾患の診断を実施できる。
【０１０６】
本発明は、被検組織におけるＤｌｇの発現および／または機能の低下を測定することにより被検組織が腫瘍組織または腫瘍細胞由来であるか否かを検査する方法を提供する。
【０１０７】
本発明に係る検査方法は、調べようとする試料（被検試料）について、Ｄｌｇの発現および／または機能を測定し、正常な対照試料との比較において、該発現および／または該機能の変化を検出することを特徴とする。正常な対照試料と比較して、Ｄｌｇの発現および／または機能が低下または消失していたとき、該試料は腫瘍組織または腫瘍細胞由来であると判定できる。
【０１０８】
Ｄｌｇの発現の測定は、Ｄｌｇ遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ、あるいはＤｌｇの存在量を決定することにより実施できる。正常な対照試料との比較において、Ｄｌｇ遺伝子由来のＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡ、あるいはＤｌｇの存在の変化およびその量的変化を検出できる。Ｄｌｇの発現および／または機能の測定は、上記方法を使用して実施できる。
【０１０９】
被検試料は特に制限されず、生体由来のあらゆる組織や細胞を使用できる。具体的には、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体由来の試料を例示できる。所望により被検試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して使用することもできる。核酸は、ＰＣＲまたはその他の増幅法により酵素的に増幅してもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする数々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。
【０１１０】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０１１１】
Ｄｌｇノックアウトマウスの作製
＜材料および方法＞
１．ターゲティングベクターの構築
マウスＤｌｇ（ｍＤｌｇ）のゲノムＤＮＡを、ＴＴ２ゲノムライブラリーからｍＤｌｇ  ｃＤＮＡのアミノ末端領域（アミノ酸１−１１２）を用いてスクリーニングすることにより単離した。単離したクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ターゲティングは、ｍＤｌｇ遺伝子のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ領域をネオマイシン耐性遺伝子と置換するように設計した。相同性のための短腕はエキソン２の中途の０．８ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩゲノム断片を、長腕は９．５ｋｂ  ＣｌａＩ−ＸｈｏＩ断片を用いた。プロモーターおよびポリアデニレーションシグナルを連結していないネオマイシン耐性遺伝子は、ｍＤｌｇ断片のＣｌａＩ部位に、平滑末端ライゲーション（ｂｌａｎｔ−ｅｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）およびインフレーム融合（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｆｕｓｉｏｎ）により挿入した。得られたベクターは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩにサブクローニングし、ＮｏｔＩで線状化した。
【０１１２】
２．ＥＳ細胞培養およびトランスフェクション
ＴＴ２  ＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＢＡ／ＪＮＣｒｊマウス間の雑種第１代（Ｆ１）胚盤胞から樹立し、フィーダー細胞上で培養した。フィーダー細胞として、胎生１４日目マウス胚から調製してマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ社製）処理した初生線維芽細胞を用いた。培養培地は、下記組成の培養培地を使用した：ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＮＩＳＳＵＩ社製）；１５％  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）；１０００Ｕ／ｍｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）；０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）；および１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）。ＴＴ２  ＥＳ細胞（０．４ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、細胞数２×１０７）に、ＮｏｔＩで線状化したターゲティングベクター５０μｇのをＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓａｒ（８００Ｖ、３．０ｍＦＤに設定）を用いてエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。得られた細胞を数枚のディッシュに播種し、１５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いてポジティブセレクションを次の日から開始した。エレクトロポレーションの１０日後に、コロニーを採取してトリプシン処理した。細胞縣濁液の８０％は新しいフィーダー細胞上で培養し、残りの細胞縣濁液はＰＣＲ分析に用いてｍＤｌｇ組換えクローンの検出を行なった。ＰＣＲはＥＸ  ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて３０サイクル行なった。各サイクルにおいて、９４℃で１分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で３分間の重合を行なった。センスプライマーの配列およびアンチセンスプライマーを以下に示す。
【０１１３】
センスプライマー
５´−ＡＴＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＡＡＧＣＡＡＧＡ−３´（配列番号５）
アンチセンスプライマー
５´−ＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＡＣＣＴＧＴＡ−３´（配列番号６）
【０１１４】
３．キメラの作製
キメラの作製は、成書（「バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲティング  ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」、著：相沢真一、羊土社、ｐ．１１９−１３４等）に記載の方法に従って実施した。具体的には、上記処理を施したＥＳ細胞の約１０個を、１個の８細胞期ＩＣＲマウス胚にインジェクションし、その胚を偽妊娠雌マウスの子宮に移植した。得られたマウスの遺伝子型を下記方法で特定した後、交配により、Ｄｌｇ＋／＋マウス、Ｄｌｇ＋／−マウスおよびＤｌｇ−／−マウスを作製した。
【０１１５】
４．野生型対立遺伝子と変異対立遺伝子の遺伝子型決定
新生児マウスおよび成熟マウスの遺伝子型をＰＣＲ分析により定期的に調査した。野生型対立遺伝子は、ｍＤｌｇ遺伝子のセンスオリゴヌクレオチド（５´−ＧＣＴＧＴＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＣＴＡＡＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＴ−３´；配列番号７）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（５´−ＴＧＴＣＣＴＡＡＧＴＴＡＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＣ−３´；配列番号８）をプライマーとして用いたＰＣＲ分析において５０３ｂｐの増幅産物として検出された。変異対立遺伝子は、ネオマイシン耐性遺伝子のセンス鎖オリゴヌクレオチド（５´−ＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣＧＣＣＧＣＴＣＣＣＧＡＴＴ−３´；配列番号９）と上記ｍＤｌｇ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号８）を用いたＰＣＲ分析において２７３ｂｐの増幅産物として検出された。
【０１１６】
サザンブロット分析を行なうために、新生児マウスの尾由来のＤＮＡ１０μｇをＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）上にブロッティングし、ジゴキシゲニン標識した５´プローブとハイブリダイゼーションさせた。
【０１１７】
５．Ｄｌｇ蛋白質発現の解析
新生児マウスの脳溶解物（Ｂｒａｉｎ  ｌｙｓａｔｅ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗Ｄｌｇ抗体を用いてイムノブロッティングを行なった。まず、新生児マウスの脳を摘出し、適量の溶解バッファー（Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）  １００ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、１％  トリトン、ＮａＦ  ５０ｍＭ、Ｎａ２ＭｏＯ４  ５０μＭ、Ｎａ３ＶＯ４  １ｍＭ、アプロチニン  １０μｇ／ｍｌ、ロイペプチン  １０μｇ／ｍｌ）を加えすりつぶした。１５，０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心処理し、その上清を回収して脳溶解物とした。脳溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％  ポリアクリルアミドゲル）で展開した。トランスファーバッファー（グリシン  ２．９２ｇ、Ｔｒｉｓ  ５．８１ｇ、ＳＤＳ  ０．３７５ｇ、メタノール  ２００ｍｌ／１０００ｍｌ）を浸み込ませた濾紙４枚ずつで、ゲルおよびメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を挟み、濾紙１ｃｍ２あたり１．４ｍＡの電流で１時間かけて転写した。メンブレンを５％  スキムミルクを含むトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）で３０分間ブロッキングした。抗Ｄｌｇ抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ社製）を５％  スキムミルクを含むＴＢＳで希釈し、メンブレンに滴下し１時間インキュベーションした。０．１％  Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳで５分間洗浄した。アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＴＢＳで希釈してメンブレンに滴下し、３０分間インキュベーションした。０．１％  Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳで５分間洗浄した。発色液（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含むＡＰバッファー（Ｔｒｉｓ  １００ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍｌ、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ））に浸し、Ｄｌｇの発現を検出した。
【０１１８】
＜結果＞
Ｄｌｇ遺伝子座、ターゲティングベクターの構築物、および相同組換えにより遺伝子導入されたＤｌｇ遺伝子を図１−Ａに示した。
【０１１９】
第３代目の各マウスの尾由来ＤＮＡを、５´プローブを用いてサザンブロット分析した結果（図１−Ｂ）、Ｄｌｇ＋／＋マウスでは内性ＥｃｏＲＩ断片のみが検出された。Ｄｌｇ−／−マウスにおいては、変異ＥｃｏＲＩ断片のみが検出された。Ｄｌｇ＋／−マウスにおいては、内性ＥｃｏＲＩ断片および変異ＥｃｏＲＩ断片の両方が検出された。
【０１２０】
第３代目の各マウスの遺伝子型を、各マウスの尾由来ＤＮＡを用いて解析した結果（図１−Ｃ）、対立遺伝子の型は、Ｄｌｇ＋／＋マウスは野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）であり、Ｄｌｇ−／−マウスは変異型（ｍｕｔａｎｔ）であることが確認できた。また、Ｄｌｇ＋／−マウスは、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）および変異型（ｍｕｔａｎｔ）の両方の対立遺伝子を有することが確認できた。
【０１２１】
第３代目の各マウスにおいて各Ｄｌｇの発現を解析した結果（図１−Ｄ）、Ｄｌｇ＋／＋マウスおよびＤｌｇ＋／−マウスではＤｌｇが検出された。Ｄｌｇ＋／−マウスで検出されたＤｌｇの量は、Ｄｌｇ＋／＋マウスと比較して少なかった。しかし、Ｄｌｇ−／−マウスではＤｌｇは検出されなかった。
【０１２２】
このように、上記ターゲティングベクターを用いてＤｌｇ＋／−マウスおよびＤｌｇ−／−マウスを取得できた。Ｄｌｇ＋／−マウスについては、胚、新生児マウスおよび成熟マウスを得ることができた。しかし、Ｄｌｇ−／−マウスは生後短期間で死亡するため、成熟マウスを得ることはできなかったが、胚および新生児マウスを得ることができた。Ｄｌｇ＋／−マウスではＤｌｇの発現が低下しており、Ｄｌｇ−／−マウスではＤｌｇの発現は認められなかった。
【実施例２】
【０１２３】
Ｄｌｇ＋／−マウスにおいては、成長に伴って皮膚およびリンパ節に腫瘍形成が認められた。そこで、これら腫瘍について、以下の解析を行なった。
【０１２４】
＜方法＞
１．免疫組織化学分析
Ｄｌｇ＋／−マウスから採取した皮膚腫瘍組織を用い、常法に従って組織切片を作製した。各組織切片についてＤＡＢ染色を行なった。まず、各組織切片をホルマリン固定し、そしてパラフィン包埋した。スーパーミックス（０．２５％  ゼラチンおよび０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で１晩ブロッキングした後、各組織切片を抗サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３抗体および抗Ｄｌｇ抗体で１晩インキュベーションし、ＰＢＳ中で３回洗浄し（１回の洗浄につき１０分間）た。その後、スーパーミックスで１／２５０希釈したビオチン化抗マウス  ウサギＩｇＧおよび抗ウサギ  ヤギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）と１時間インキュベーションした。次いで、各組織切片をＰＢＳ中で４回洗浄し（１回の洗浄につき１０分間）、スーパーミックスで１／４００希釈したＡＢＣリアクションミックスチャー（Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ社製，ＰＫ−６１００）と１時間インキュベーションした。続いて、各組織切片をＰＢＳ中で３回洗浄し（１回の洗浄につき１０分間）、ＤＡＢ溶液（ＰＢＳ中、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＢ、３ｍｇ／ｍｌ  ニッケルアンモニウム、０．００４５％  Ｈ２Ｏ２）で５分間インキュベーションした。インキュベーションは全て室温で行なった。
【０１２５】
２．ヘマトキシリン・エオシン染色
Ｄｌｇ＋／−マウスから採取したリンパ節組織を用い、常法に従って組織切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行なった。
３．フローサイトメトリーによる解析
腫瘍の形成が認められたＤｌｇ＋／−マウスの頸部リンパ節を摘出し、軽くミンチして組織をほぐした後、１００μｍメッシュフィルターを通してほぐれなかった組織片および細胞塊を除去し、リンパ節細胞を調製した。比較対照として、Ｄｌｇ＋／＋マウスの頸部リンパ節から同様に調製したリンパ節細胞を用いた。得られた細胞は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合させた抗ＣＤ５６抗体で染色した後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１２６】
＜結果＞
Ｄｌｇ＋／−マウスの皮膚腫瘍組織切片は、部分的にサイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３染色に陽性であった。形成された腫瘍は、皮膚上皮細胞由来の汗腺腫ｐｏｒｏｉｄ  ｈｉｄｒａｄｅｎｏｍａであると考えられた。皮膚腫瘍組織切片において、ｐｏｒｏｉｄ  ｈｉｄｒａｄｅｎｏｍａ細胞は抗Ｄｌｇ抗体で染色されなかったが、筋肉は抗Ｄｌｇ抗体により染色された。
【０１２７】
Ｄｌｇ＋／−マウスのリンパ節組織切片は、ヘマトキシリン・エオシン染色により、腫瘍の形成が認められた。また、腫瘍形成が認められたＤｌｇ＋／−マウスの頸部リンパ節から調製した細胞中（図２−Ｂ）には、Ｄｌｇ＋／＋マウスのリンパ節から調製した細胞（図２−Ａ）と比較して、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色される細胞の著しい増加が認められた。図２−Ａおよび図２−Ｂでは、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色される細胞は、Ｒ２で示される領域（図中右側の四角で囲まれた領域）に存在するドットで示される。Ｒ２に存在するドットが、図２−Ａと比較して図２−Ｂで著しく多いことから、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色される細胞がＤｌｇ＋／−マウスのリンパ節において著しく増加していることが判明した。ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５６抗体で染色された細胞は、Ｄｌｇ＋／＋マウスのリンパ節細胞では約０．１０％であったのに対し、腫瘍形成が認められたＤｌｇ＋／−マウスのリンパ節細胞では約６６．０３％であった。これらから、Ｄｌｇ＋／−マウスのリンパ節には、細胞表面上にＣＤ５６抗原を有する細胞を含むリンパ腫が形成されたことが判明した。形成されたリンパ腫は、細胞表面上にＣＤ５６抗原を有することから、ナチュラルキラーリンパ腫であると考えられた。
【０１２８】
これら結果から、Ｄｌｇ＋／−マウスでは皮膚腫瘍およびリンパ腫が形成されることが明らかになった。腫瘍が形成された皮膚組織中の正常細胞ではＤｌｇが発現していたのに対し、腫瘍細胞ではＤｌｇが発現していなかったことから、Ｄｌｇの発現および／または機能の低下が腫瘍形成の重要な要因であると考える。
【０１２９】
このように、Ｄｌｇ遺伝子の欠損により、Ｄｌｇの発現および／または機能の低下し、その結果、皮膚腫瘍およびリンパ腫等の腫瘍が形成されることが判明した。
【実施例３】
【０１３０】
Ｄｌｇの欠損により腫瘍が形成されるメカニズムを検討する目的で、Ｄｌｇ欠損により発現が変化する遺伝子の検索を行なった。当該遺伝子の検索は、実施例１で作製したＤｌｇ＋／＋マウスおよびＤｌｇ−／−マウス由来のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて、慣用のマイクロアレイ法により行った。その結果、Ｄｌｇ−／−マウス由来ＭＥＦにおいてｓＦＲＰ１  ｍＲＮＡおよびｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡの減少が認められたので、ｓＦＲＰ１遺伝子およびｓＦＲＰ２遺伝子の変化の解析をさらにＲＴ−ＰＣＲにより行なった。
【０１３１】
＜材料および方法＞
１．細胞および培養
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、Ｄｌｇ＋／＋マウスおよびＤｌｇ−／−マウスの１３．５日目の胚から調製した。また、永久増殖性ＭＥＦを、調製した初生ＭＥＦから既に確立された手法により作製した（トダロ（Ｔｏｄａｒｏ  Ｇ．Ｊ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９６３年、第１７巻、ｐ．２９９−３１３）。ＭＥＦは１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０１３２】
２．ＤｌｇをトランスフェクションしたＭＥＦのＡｕｔｏ−ＭＡＣＳによる濃縮
Ｄｌｇ−／−永久増殖性ＭＥＦに、マウスＤｌｇ遺伝子を発現させるベクターｐＭＫｉｔｎｅｏ−Ｄｌｇを用いてＤｌｇをトランスフェクションした。このとき、ＤｌｇをトランスフェクションしたＭＥＦを選択的に濃縮するため、ｐＭｋｉｔｎｅｏ−Ｄｌｇと共に、短縮したＨ２−ｋｋ分子（その遺伝子の塩基配列を配列番号１０に示した）を発現させるベクターｐＭＡＣＳ  ｋｋ  ＩＩをコトランスフェクションした。コトランスフェクション２４時間後にＭＥＦを回収し、ＢＰＥ（５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むＰＢＳ）に再けん濁し、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ  ｋｋ  ミクロビーズと共に１５分間インキュベーションした後、磁気分離した。
【０１３３】
３．ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＭＥＦから、総ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮＥ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社製）を用いて抽出した。総ＲＮＡ（５μｇ）を用い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して、使用説明書にしたがってｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲは次の運転条件で行なった：９４℃で１分間；次いで、９４℃で３０秒間そして５５℃で３０秒間に続いて７２℃で１分間を１サイクルとして３０サイクル；そして最終サイクルの後で、７２℃で１０分間の最終伸張反応。
【０１３４】
＜結果＞
ＭＥＦは、２系統のマウス（＃３３および＃４４）からそれぞれ調製した（＃３３ｐｒｉｍａｒｙおよび＃４４ｐｒｉｍａｒｙ）。＃３３および＃４４はそれぞれ、ターゲティングベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクションした細胞を数枚のディッシュに播種して薬剤選別を行なった後に別々のディッシュから取得したクローンを用いて作製したマウス系統である。＃３３由来のＭＥＦから、永久増殖性ＭＥＦを作製した（＃３３  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）。Ｄｌｇ＋／＋ＭＥＦおよびＤｌｇ−／−ＭＥＦから抽出した各ＲＮＡ試料について、ｓＦＲＰ１およびｓＦＲＰ２の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。また、コントロールとしてアクチンの発現を同様に検討した。
【０１３５】
これら３種類のＭＥＦのいずれにおいても、Ｄｌｇ−／−ではＤｌｇ＋／＋と比較して、ｓＦＲＰ１  ｍＲＮＡおよびｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡが減少していた（図３）。ｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡの減少は、ｓＦＲＰ１  ｍＲＮＡと比較して、より顕著であった。アクチン  ｍＲＮＡの量に変化はなかった。
【０１３６】
Ｄｌｇ＋／＋由来永久増殖性ＭＥＦ、Ｄｌｇ−／−由来永久増殖性ＭＥＦおよびＤｌｇをトランスフェクションしたＤｌｇ−／−由来永久増殖性ＭＥＦから抽出した各ＲＮＡ試料について、ｓＦＲＰ２およびｓＦＲＰ１の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した。また、各細胞を用いてＤｌｇの検出をウエスタンブロッティングにより行なった。その結果、Ｄｌｇ＋／＋由来永久増殖性ＭＥＦではＤｌｇが検出されたが、Ｄｌｇ−／−由来永久増殖性ＭＥＦでは全く検出されなかった。一方、Ｄｌｇ遺伝子を導入したＤｌｇ−／−由来永久増殖性ＭＥＦではＤｌｇが検出された（図４）。ｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡは、Ｄｌｇ−／−由来永久増殖性ＭＥＦにおいて、Ｄｌｇ＋／＋由来永久増殖性ＭＥＦと比較して著しく減少していた（図４）。Ｄｌｇ遺伝子を導入したＤｌｇ−／−由来永久増殖性ＭＥＦでは、Ｄｌｇ遺伝子を導入しなかったものと比較して、ｓＦＲＰ２  ｍＲＮＡが増加した（図４）。
【０１３７】
これら結果から、Ｄｌｇの欠損により、ｓＦＲＰ１およびｓＦＲＰ２の発現、特にｓＦＲＰ２の発現が阻害されることが判明した。また、Ｄｌｇ遺伝子の導入により、ｓＦＲＰ２の発現を増強できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
本発明は、腫瘍形成、例えば皮膚腫瘍やリンパ腫等の形成のメカニズムを分子レベルで解明する目的に有用である。さらに腫瘍形成の阻害剤や阻害方法の開発、並びに癌疾患の防止剤、治療剤、防止方法または治療方法の開発等に利用できる。本発明はこのように、医薬研究や医薬開発分野等において非常に有用性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【０１３９】
配列番号１：ヒトＤｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）遺伝子。
配列番号２：ヒトＤｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）。
配列番号３：マウスＤｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）遺伝子。
配列番号４：マウスＤｌｇ（ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ）。
配列番号５：プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：プライマーとして使用するために設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：Ｈ２−ｋｋ遺伝子。
【図１−Ａ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図１−Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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