(57)【要約】【課題】低酸素状態を改善し、低酸素症によるダメージから細胞や組織を保護するために有用なプロリル水酸化酵素阻害剤（PHD阻害剤）、並びに細胞や組織の低酸素状態の改善を目的とする医薬組成物の提供。【解決手段】下式で示される化合物またはその塩をプロリル水酸化酵素阻害剤や細胞や組織の低酸素状態の改善を目的とする医薬組成物の有効成分とする：2011102268.tif 000044（式中、R1は−O−R３、−ＮＨ−Ｒ３または−Ｎ(Ｒ３)２で示される基；R2は置換基を有していてもよいフリル基またはチエニル基から選択される基を意味する。なお、R３は置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖または分枝状のアルキル基や置換基を有しても良いフェニル基を意味する。また、＊は不斉炭素原子を意味する）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で示されるトリプトファン骨格を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするプロリル水酸化酵素阻害剤：
【化１】
2011102268.tif 000031
（式中、R1は−O−R３、−ＮＨ−Ｒ３または−Ｎ(Ｒ３)２で示される基；R2は置換基を有していてもよいフリル基またはチエニル基から選択される基を意味する。なお、R３は置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖若しくは分枝状のアルキル基または置換基を有してもよいフェニル基を意味する。また、＊は不斉炭素原子を意味する）。
【請求項２】
下式で示される化合物１〜５からなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする請求項１に記載するプロリル水酸化酵素阻害剤：
【化２】
2011102268.tif 000032
【化３】
2011102268.tif 000033
【化４】
2011102268.tif 000034
【化５】
2011102268.tif 000035
【化６】
2011102268.tif 000036
【請求項３】
低酸素誘導因子の不活性化阻害剤または低酸素誘導因子安定化剤である請求項１または２に記載するプロリル水酸化酵素阻害剤。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載するプロリル水酸化酵素阻害剤及び薬学的に許容される担体または添加剤を含む、医薬組成物。
【請求項５】
細胞または組織の低酸素状態を改善するための請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
細胞または組織の慢性または急性の低酸素状態に関連して生じる疾患、病態または機能低下の予防または治療薬である請求項４または５記載の医薬組成物。
【請求項７】
細胞または組織の低酸素状態に関連して生じる疾患、病態または機能低下が、慢性または急性の虚血性疾患またはそれに起因して生じる病態若しくは機能低下である請求項６に記載する医薬組成物。
【請求項８】
経口投与形態を有する請求項４乃至７のいずれかに記載する医薬組成物。
【請求項９】
下式で示される化合物またはその塩：
【化７】
2011102268.tif 000037
（式中、R1は水酸基、−O−R３、−ＮＨ−Ｒ３または−Ｎ(Ｒ３)２で示される基；R2は置換基を有していてもよいフリル基またはチエニル基から選択される基を意味する。なお、R３は置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖若しくは分枝状のアルキル基または置換基を有してもよいフェニル基を意味する。また、＊は不斉炭素原子を意味する）。
【請求項１０】
下式（１）〜（６）で示される請求項９に記載する化合物またはその塩。
【化８】
2011102268.tif 000038
【化９】
2011102268.tif 000039
【化１０】
2011102268.tif 000040
【化１１】
2011102268.tif 000041
【化１２】
2011102268.tif 000042
【化１３】
2011102268.tif 000043
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロリル水酸化酵素阻害剤（Prolyl Hydroxylase Inhibitor：以下、「PHD阻害剤」ともいう）に関する。より詳細には、本発明はプロリル水酸化酵素（PHD）に対する阻害作用に基づいて、PHDによる低酸素誘導因子（Hypoxia-inducible Factor：以下、「HIF」ともいう）の不活性化を抑制してHIFを安定化することのできるPHD阻害剤に関する。また、本発明は、PHD阻害作用を有し、HIFの不活性化を抑制してこれを安定化させることで、低酸素状態に関連して生じる各種疾患や病態（障害）を予防または治療するために有効な医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心疾患、慢性腎不全および脳梗塞などの疾患では細胞や組織への酸素供給が減少する。かかる酸素供給の減少によって低酸素状態が続くと細胞や組織に機能的障害が生じるため、生体内では、血管新生、赤血球生成、解糖および酸化酵素阻害など、広範囲にわたって細胞防御機構が働くようになっている。
【０００３】
低酸素誘導因子（HIF）は、これらの生体防御機構を媒介する重要なタンパク質であり細胞や組織が低酸素状態に陥った際に発現が亢進し、細胞や組織がより多くの酸素を得られるように血管新生を促進することが知られている（例えば、非特許文献１〜３参照）。かかる低酸素誘導因子（HIF）は、α鎖とβ鎖のヘテロ二量体からなるタンパク質であり、低酸素状態では安定であるが、酸素存在下ではその安定性が著しく低下する。具体的には、HIFは、酸素存在下で酸素依存的なプロリル水酸化酵素（PHD）によってα鎖のプロリンが水酸化され（例えば、非特許文献４〜９参照）、その結果、von hipple landauタンパクと結合してユビキチン化され（例えば、非特許文献１０〜１１参照）、その結果、プロテアソームの標的とされて分解される（例えば、非特許文献１２〜１３参照）。
【０００４】
しかし、低酸素状態の下では、HIFはα鎖がPHDによる水酸化を受けないため分解されず、α鎖とβ鎖の二量体の状態で、核内でHRE（hypoxia response element）と結合し、その下流に位置する低酸素ストレスの順応に関わる多くの遺伝子〔例えばエリスロポエチン（赤血球生産ホルモン）、血管内皮増殖因子（VEGF）、解糖酵素、グルコーストランスポーター、ヘムオキシナーゼ〕の転写を促進して生体を低酸素改善へと導くように機能する（例えば、特許文献14参照）。このためHIFを安定化することによって、広く下流反応を調節する「マスター遺伝子」のスイッチを活性化することができ、低酸素の影響から組織や細胞を保護することが可能となると考えられる。
【０００５】
現在、虚血などの低酸素状態を招く疾患の治療法の多くは、例えば急性期虚血時の血流を改善するために血栓溶解薬が使用されるなど、症状の改善や病因因子の改善に集中しているのが実情であり、他の角度から治療を検討することが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Marx, J. Cell biology. How cells endure low oxygen. Science 303. 1454-1456 (2004)
【非特許文献２】Semenza, G.L. & Wang, G.L. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol. Cell Biol. 12. 5447-5454 (1992)
【非特許文献３】Wang, G.L. & Semenza, G.L. General involvement of hypoxia- inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxyia. Proc. Natl. Acad. Sci. 90. 4304-4308 (1993)
【非特許文献４】Epstein, A.C.R. et al. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 107. 43-54 (2001)
【非特許文献５】Schofield, C.J. & Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by HIF hydroxylases. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5. 343-354 (2004)
【非特許文献６】Semnza, G.L.  Hydroxylation of HIF-1: oxygen sensing at the molecular level. Physiology (Bethesda). 19. 176-182 (2004)
【非特許文献７】Masson, N. & Ratcliffe, P.J.  HIF prolyl and asparaginyl hydroxylases in the biological response to intracellular O(2) levels. J. Cell Sci. 116. 3041-3049 (2003)
【非特許文献８】Bruick, R.K. & McKnight, S.L.  A conserved family of prolyl-4- hydroxylases that modify HIF. Science 294. 133-134 (2001)
【非特許文献９】Semnza, G.L.  HIF-1, O(2), and the PHDs: how animal cells signal hypoxia to the nucleus. Cell 107. 1-3 (2001)
【非特許文献１０】Maxwell, P.H. et al.  The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399. 271-275 (1999)
【非特許文献１１】Ohh, M. et al. Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires direct binding to the beta-domain of the von Hippel-Lindau protein. Nat. Cell Biol. 2. 423-427 (2000)
【非特許文献１２】Maxwell, P.H. et al.  The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399. 271-275 (1999)
【非特許文献１３】Ohh, M. et al. Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires direct binding to the beta-domain of the von Hippel-Lindau protein. Nat. Cell Biol. 2. 423-427 (2000)
【非特許文献１４】Pugh, C.W. & Ratcliffe, P.J.  Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nat. Med. 9. 677-684 (2003)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、虚血性疾患などによって生じる低酸素状態を改善し、低酸素症によるダメージから細胞や組織を保護するために有効に用いられるプロリル水酸化酵素（PHD）阻害剤を提供することを目的とする。また本発明は、かかるPHD阻害剤を用いて細胞や組織の低酸素状態を改善することを目的とする医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前述するように、低酸素誘導因子（HIF）は低酸素による細胞や組織のダメージにきわめて重要な役割を果たしている。その活性は、HIFα鎖のプロリン残基が酸素依存的にプロリル水酸化酵素（PHD）によって水酸化されて不活性化することによって制御されており、ユビキチン化されることでプロテアーゼの標的とされ、分解されることが知られている。
【０００９】
このため、PHDを阻害することによってHIFが安定化され、これによって低酸素状態に対する生体防御機能が維持若しくは活性化され、低酸素によるダメージから細胞や組織を保護することができる。
【００１０】
本発明者らは、この考えのもと、新規なプロリル水酸化酵素阻害剤（PHD阻害剤）を開発するために、鋭意研究を行った。その結果、下式（１）で示されるトリプトファン骨格を有する化合物が、PHDの機能を阻害する作用を有し、その結果、HIFの不活性化を防止してこれを安定化するPHD阻害剤として有効であることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
【００１１】
すなわち、本発明には下記の態様が含まれる：
（I）プロリル水酸化酵素阻害剤（PHD阻害剤）
（I-1）．下式一般式で示されるトリプトファン骨格を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とするPHD阻害剤：
【００１２】
【化１】
2011102268.tif 000002
（式中、R1は−O−R３、−ＮＨ−Ｒ３または−Ｎ(Ｒ３)２で示される基；R2は置換基を有していてもよいサイクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、イソベンゾフラニル基、イソクロメニル基、チエニル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チオピラニル基、イソチオクロメニル基、ピロリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、およびナフチリジニル基から選択される基を意味する。なお、R３は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖若しくは分枝状のアルキル基または置換基を有しても良いフェニル基を意味する。また、＊は不斉炭素原子を意味する）。
【００１３】
（I-2）．下式で示される化合物１〜５からなる群から選択される少なくとも１つの化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分とする（I-1）に記載するPHD阻害剤：
【００１４】
【化２】
2011102268.tif 000003
【００１５】
【化３】
2011102268.tif 000004
【００１６】
【化４】
2011102268.tif 000005
【００１７】
【化５】
2011102268.tif 000006
【００１８】
【化６】
2011102268.tif 000007
【００１９】
（I-3）．HIFの不活性化阻害剤またはHIF安定化剤である（I-1）または（I-2）に記載するPHD阻害剤。
【００２０】
（I-4）．PHDとHIFとの結合を阻害する剤である（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載のPHD阻害剤。
【００２１】
（I-5）．PHDに結合して、PHDとHIFとの結合を阻害する作用を有する剤である（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載するPHD阻害剤。
【００２２】
（II）医薬組成物
（II-１）．（I-1）乃至（I-5）のいずれかに記載するPHD阻害剤および薬学的に許容される担体または添加剤を含む、医薬組成物。
【００２３】
（II-2）．細胞または組織の低酸素状態を改善するための（II-1）記載の医薬組成物。
【００２４】
（II-3）．細胞または組織の慢性または急性の低酸素状態に関連して生じる疾患、病態または機能低下の予防または治療薬である（II-１）または（II-2）記載の医薬組成物。
【００２５】
（II-4）．細胞または組織の低酸素状態に関連して生じる疾患、病態または機能低下が慢性または急性の虚血性疾患またはそれに起因して生じるものである（II-3）に記載する医薬組成物。
【００２６】
（II-5）．経口投与形態を有する（II-1）乃至（II-4）のいずれかに記載する医薬組成物。
【００２７】
（III）新規トリプトファン誘導体
（III-1）．下式で示される化合物またはその塩：
【００２８】
【化７】
2011102268.tif 000008
（式中、R1は水酸基、−O−R３、−ＮＨ−Ｒ３または−Ｎ(Ｒ３)２で示される基；R2は置換基を有していてもよいサイクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、イソベンゾフラニル基、イソクロメニル基、チエニル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チオピラニル基、イソチオクロメニル基、ピロリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、およびナフチリジニル基から選択される基を意味する。なお、R３は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖若しくは分枝状のアルキル基または置換基を有してもよいフェニル基を意味する。また、＊は不斉炭素原子を意味する）。
【００２９】
（III-1）下式１〜６で示される化合物またはその塩：
【００３０】
【化８】
2011102268.tif 000009
【００３１】
【化９】
2011102268.tif 000010
【００３２】
【化１０】
2011102268.tif 000011
【００３３】
【化１１】
2011102268.tif 000012
【００３４】
【化１２】
2011102268.tif 000013
【００３５】
【化１３】
2011102268.tif 000014
【発明の効果】
【００３６】
本発明により、HIFを安定化するために有効なPHD阻害剤を提供することができる。当該PHD阻害剤は、PHDによるHIFの水酸化による不活性化を阻止してHIFを安定化することにより、虚血などによる低酸素状態によって生じるダメージから生体を保護することができる。このため、本発明のPHD阻害剤は低酸素状態に関連して生じる疾患や病態（障害）を予防または改善するための医薬組成物として有効に利用することができる。特に、本発明のPHD阻害剤は、腎臓、心臓、下肢または脳の各種器官の虚血性疾患やそれから進展する病態（障害）の予防または改善に有効に使用することができる。また本発明は、かかるPHD阻害剤として有効な新規化合物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（I）プロリル水酸化酵素阻害剤（PHD阻害剤）
本発明が提供するPHD阻害剤は下式で示される化合物またはその塩を有効成分とするものである： 
【００３８】
【化１４】
2011102268.tif 000015
（式中、R１は−O−R３、−ＮＨ−Ｒ３または−Ｎ(Ｒ３)２で示される基；Ｒ２は置換基を有していてもよいサイクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、イソベンゾフラニル基、イソクロメニル基、チエニル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チオピラニル基、イソチオクロメニル基、ピロリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、およびナフチリジニル基から選択される基を意味する。なお、Ｒ３は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖若しくは分枝状のアルキル基または置換基を有してもよいフェニル基を意味する。また、＊は不斉炭素原子を意味する）。
【００３９】
ここで炭素数１〜６の直鎖または分枝状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基（ｔ−アミル基）、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基などが含まれる。好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、およびイソブチル基などの炭素数１〜４の低級アルキル基、またはｔ−ブチル基といった３級アルキル基である。より好ましくはメチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチルブチル基である。
【００４０】
またかかるアルキル基（R3）における置換基としては、塩素原子や臭素原子等のハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシ基、カルバモイル基、グアニジノ基などを挙げることができる。R1における置換基を有するアルキル基として好ましくは、２，２，２−トリフルオロエチル基等のフルオロアルキル基、ジフェニル基やトリフェニル基等のフェニル基を有するアルキル基などを挙げることができる。また、置換基を有してもよいフェニル基としては、フェニル基、トリル基、キシリル基、ナフタレニル基等を挙げることができる。
【００４１】
R2として、好ましくは置換基を有するかまたは有しないフリル基またはチエニル基である。
【００４２】
またR2における置換基としては、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、水酸基、ＣＦ３、ＣＦ３Ｏ、ＣＨＦ２Ｏ、ＣＦ３ＣＨ２Ｏ、シアノ基、カルボキシ基、アセチル基、フェニル基などを挙げることができる。好ましくは炭素数１〜６のアルキル基やフルオロアルキル基、またはフェニル基である。
【００４３】
これらの化合物は、トリプトファン骨格部分α位炭素における配位が、D−体、L−体またはラセミ体のいずれであってもよいが、PHD阻害作用に優れるという点でD−体が最も好ましい。
【００４４】
本発明が対象とする化合物（以下、「本発明化合物」という）は、上記骨格を有する化合物であって、PHDの機能を妨げることによって、HIFのα鎖プロリンの水酸化による不活性化を阻止できるものであればよい。この限りにおいて、その作用機序は特に制限されない。例えば、PHDのFe(II)にキレートしてPHDの機能を妨げる作用を有するもの、低酸素誘導因子（HIF）のα鎖のプロリン残基（以下、単に「HIFαプロリン」という）に対するPHDの結合を競合的に阻害するもの、PHDの水酸化活性を阻害するものなどのいずれであってもよい。
【００４５】
ここでPHDのFe(II)へのキレート作用は、制限されないが、例えばPriceらの方法（Price DL, et al., “Chelating activity of advanced glycation end-product（AGE）inhibitors.” J Biol Chem 272: 5430-5437, 1997）に従って、または準じて測定し評価することができる。
【００４６】
当該方法は具体的には、被験化合物の存在下で塩化銅とアスコルビン酸をインキュベートして、反応後のアスコルビン酸の残存量を測定する方法であり、被験化合物の存在によってアスコルビン酸の自動酸化が防止できれば、被験化合物について金属キレート能（Fe(II)に対するキレート作用）があると評価、確認することができる。
【００４７】
また、HIF／PHD結合阻害作用は、例えば被験化合物の存在下で、放射性同位体等で標識したPHDとHIFのα鎖ドメイン（好ましくはHIF−1αのアミノ酸557〜576領域）をインキュベートし、HIFのα鎖に結合したPHD量を測定する方法であり、被験化合物の存在によってHIFのα鎖に対するPHDの結合が防止できれば、被験化合物についてHIF／PHD結合阻害作用があると評価することができる。
【００４８】
さらにPHD阻害活性は、例えばKauleらの方法（Cunhild Kaule and Volkmar Gunzler, “Assay for 2-Oxoglutarate Decarboxylating Enzyymes Based on the Determination of [1-14C] Succinate: Application to Prolyl 4-Hydroxylase” , Analytical Biochemistry 184, 291-297 (1990) に従ってまたは準じて測定し評価することができる。
【００４９】
その一例を挙げると、2-oxyglutarate（2-OG）とHIFのプロリンからcis-3-hydroxy prolineを生産する触媒能力を評価する方法を用いることができる。当該方法としては、具体的には、被験化合物の存在下で、PHD、[5-14C]oxyglutarate（2-OG）およびHIFのα鎖ドメイン（好ましくはHIF−1αのアミノ酸557〜576領域）をインキュベートして、反応後の[1-14C]コハク酸を測定する方法であり、被験化合物の存在によって[1-14C]コハク酸の生成が抑制できれば、被験化合物についてPHD阻害活性があると評価することができる。
【００５０】
本発明の化合物として具体的には下式で示される化合物１〜５を挙げることができる。
【００５１】
(１) 化合物１：N−(2−フランカルボニル)トリプトファンエチルエステル（ラセミ体）
【化１５】
2011102268.tif 000016
【００５２】
(２) 化合物２：N−(2−チオフェンカルボニル)−L−トリプトファンメチルエステル（L−体）
【化１６】
2011102268.tif 000017
【００５３】
(３) 化合物３：N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)トリプトファンエチルエステル（ラセミ体）
【化１７】
2011102268.tif 000018
【００５４】
(４) 化合物４： N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−L−トリプトファンエチルエステル（L−体）
【化１８】
2011102268.tif 000019
【００５５】
(５) 化合物５： N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファンエチルエステル（Ｄ−体）
【化１９】
2011102268.tif 000020
【００５６】
これらの化合物は、遊離または塩の形態を有するもののいずれであってもよい。ここで塩としては、通常、医薬上許容される塩、例えば無機塩基または有機塩基との塩、あるいは無機酸、有機酸、または塩基性もしくは酸性アミノ酸などの酸付加塩等を挙げることができる。無機塩基としては、たとえばナトリウムやカリウム等のアルカリ金属；カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属；アルミニウムやアンモニウム等を挙げることができる。有機塩基としては、たとえばエタノールアミン等の第一級アミン；ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N, N’ -ジベンジルエチレンアミン等の第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、トリエタノールアミン等の第三級アミンなどを挙げることができる。
【００５７】
酸付加塩を形成する無機塩としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などを挙げることができる。有機酸としては、たとえば、ギ酸、酢酸、乳酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、安息香酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸などを挙げることができる。塩基性アミノ酸としては、たとえば、アルギニン、リジン、オルニチンなどを挙げることができる。酸性アミノ酸としては、たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸などを挙げることができる。
【００５８】
上記化合物、特に化合物１．化合物２、化合物３、化合物４および化合物５はそれぞれD−体、L−体およびそのラセミ体のトリプトファンを、原料として使い分けて合成することによって製造することができる。
【００５９】
詳細は製造例において説明するが、たとえば、化合物１はD−体、L−体混合のトリプトファンを原料に用いることでN−(2−フランカルボニル)トリプトファンエチルエステル（ラセミ体）を合成することが可能であり、化合物２はL−トリプトファンを原料に用いることでN−(2−チオフェンカルボニル)−L−トリプトファンメチルエステル（L体）を合成することが可能である。また、同様に、化合物３はD−体、L−体混合のトリプトファンを原料に用いることでN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)トリプトファンエチルエステル（ラセミ体）を合成することが可能であり、化合物４はL−トリプトファンを原料に用いることでN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−L−トリプトファンエチルエステル（L体）を合成することが可能であり、化合物５はD−トリプトファンを原料に用いることでN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファンエチルエステル（D体）を合成することが可能である。
【００６０】
本発明化合物は、前述するように、HIFのα鎖のプロリンを水酸化するPHDの機能を妨げる作用を有するものである。かかる作用は、金属キレート作用、HIF／PHD結合阻害作用、およびPHD活性阻害作用など、その作用機序の別に拘わらず、結果としてPHDの機能を妨げる作用であればよい。
【００６１】
本発明化合物はPHDの機能を妨げる作用を有する結果、HIFの水酸化による不活化を阻害し、HIFを安定化する作用を有している。
【００６２】
かかるHIF安定化作用は、制限されないが、後述する実験例に記載するインビトロアッセイ法に従って、またはこの方法に準じて測定し、評価することができる。当該インビトロアッセイ法は、HRE（hypoxia responsive element：低酸素応答性領域）を７回タンデムに含むプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するベクターを導入したPHD発現細胞（実験例では「腎近位尿細管細胞」を使用）を被験化合物とともにインキュベートし、細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定する方法である。当該測定方法において、PHDによる不活化を免れたHIFは核内に移行し、ヘテロ二量体を形成したりCBP/p300などのヒストンアセチル化酵素と結合して複合体を生成する。次いで、この複合体はDNA上の低酸素応答性領域（HRE）と呼ばれる応答エレメントに結合することによりプロモーターが正常に機能して、その下流にあるルシフェラーゼ遺伝子が発現してルシフェラーゼが産生される。すなわち、当該アッセイ系において、被験化合物の存在によってルシフェラーゼ活性が増加すれば、被験化合物の存在によってHREシステムが活性化してプロモーターが正常に機能すること、すなわち被験化合物にPHDの機能を阻害してHIFの分解を抑制し、HIFを安定化する作用があると評価することができる。
【００６３】
後述する実験例で示すように、本発明化合物（１）の中でも化合物１〜３、好ましくは化合物１および３、より好ましくは化合物３が優れたHIFの不活化を抑制する作用、すなわちHIF安定化作用を有している。かかる機能発現には、化合物（１）のトリプトファン骨格のカルボン酸部位におけるエステル化が重要である。またトリプトファン骨格部分がD−トリプトファンであることが特に好ましい。
【００６４】
本発明化合物は、PHD阻害作用により、HIFの分解を阻止してこれを安定化し（HIF−HREシステムの安定化）、低酸素状態を改善し、その結果、虚血などの低酸素状態によって生じるダメージから細胞や組織を防御することができる。したがって、本発明化合物によれば、下記の作用が期待される。
【００６５】
(i) 腎慢性虚血改善作用
腎臓において、尿細管周囲毛細血管の血流量の停滞は慢性低酸素を誘発し、それに伴い尿細管間質障害・尿細管周辺毛細血管の喪失が促進される。公知のPHD阻害剤であるコバルトによってHIFの発現が亢進し、その結果、腎虚血性障害である尿細管間質障害の改善が認められることが報告されている（Matsumoto M, Tanaka T, Yamamoto T, noiri E, Miyata T, Inagi R, Fujita T, Nangaku M.  Hypoperfusion of peritubular capillaries induces chronic hypoxia before progression of tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis.  J Am Soc Nephrol 15: 1574-1581 (2004)）。このことから、HIFを安定化させることによりVEGFやエリスロポエチンの転写が促進されて、血管新生や血流の改善が惹起され、慢性虚血を改善して腎不全への進展が抑制できる可能性がある。
【００６６】
(ii) 脳虚血改善作用
脳梗塞に陥った脳梗塞領域は虚血になっており、組織への虚血障害が深刻な問題となっている。よって、脳梗塞領域に起こる活発な脈管形成は、虚血の下で組織に有益であることが証明されている（Krupinski J, Kaluza J, Kumar P, Kumar S & Wang JM.  Role of angiogenesis in patients with cerebral ischemic stroke. Stroke 25: 1794-1798 (1994)）。またVEGFが一時的な中大脳動脈閉鎖の後、脳梗塞サイズ・浮腫形成・脳血液関門破壊を、虚血に起因する神経障害を減少することによって減らすことが証明されている（Hayashi, T., Abe, K., Itoyama, Y.  Reduction of ischemic damage by application of vascular endothelial growth factor in rat brain after transient ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18: 887-895 (1998)）。これらのことより、HIFを安定化することによるVEGFの発現の亢進は、脳梗塞および虚血性脳卒中に対する効果的な治療になると考えられる。
【００６７】
(iii) 虚血性心疾患改善作用
虚血性心疾患には狭心症・心筋梗塞がある。いずれも適切な治療が遅れると心不全や重度の不整脈を惹き起こし直接死にかかわってくる。このため心筋虚血を改善する方法の開発が喫緊の課題とされている。最近の研究では、ブタの進行性冠動脈閉塞モデルにVEGFを投与すると虚血領域の改善が見られ、また大量投与では心筋還流血液量の改善が見られることが証明されている（Pearlman JD, Hibberd MG, Chuang ML, Harada K, Lopez JJ, Glad-stone SR, Friedman M, Sellke FW, Simons M.  Magnetic resonance mapping demonstrates benefits of VEGF-induced myocardial angiogenesis. Nat Med. 1:1085-1089. (1995)）。また、ブタの慢性心筋虚血モデルにVEGFを投与すると血管形成が促進されることが証明されている（Lopez JJ, Laham RJ, Stamler A, Pearlman JD, Bunting S, Kaplan A, Carrozza JP, Sellke FW, Simons M.  VEGF administration in chronic myocardial ischemia in pigs. Cardiovasc Res. ;40: 272-281. (1998)）。これらのことから、HIFの安定化によるVEGFの発現亢進は、心筋梗塞や狭心症など虚血性心疾患の効果的な治療になると考えられる。
【００６８】
(iv) 下肢虚血改善作用
下肢虚血患者では症状が重度化すると下肢切断を余儀なくされ、患者のADL（日常生活行動）を極度に低下させることから医学的のみならず、社会的にも深刻な問題となっている。最近の研究では、下肢虚血患者において、VEGFが治療に対して有効と考えられている。VEGF、FGF−2遺伝子を虚血筋組織に導入すると、FGF−2遺伝子導入で内因性VEGF、HGF発現が亢進し、組織学的検査ならびに血流測定により新生血管の増加と側副血行路形成が認められ、明らかな下肢虚血の改善が認められることが報告されている（Onimaru M, Yonemitsu Y, Tanii K.  Fibroblast growth factor-2 gene transfer can stimulate hepatocyte growth factor expression irrespective of hypoxia-mediated downregulation in ischemic limbs. Circ. Res, 91: 723-730 (2002)）。これらのことから、HIFの安定化によるVEGFの発現亢進は、下肢虚血の効果的治療になると考えられる。
【００６９】
また本発明化合物は、HIF（低酸素誘導因子）を安定化させる作用に基づいて、血管新生を促進する作用を有している。かかる血管新生促進作用は、制限されないが、スポンジ血管新生分析法に従って、またはこの方法に準じて測定し評価することができる。当該インビボアッセイ系は、被験動物の皮下に埋設したスポンジ・ディスクを介して被験化合物を皮下投与し、経時的にヘモグロビン量と血管数を測定する方法である。当該インビボアッセイ系において、被験化合物の投与によってヘモグロビン量と血管数が増加すれば、被験化合物に血管新生作用があると評価することができる。
【００７０】
本発明のPHD阻害剤は、前述する本発明化合物またはその塩を主成分とするものである。本発明のPHD阻害剤は、前述する化合物またはその塩１００重量％からなるものであっても、またそうでなくてもPHD阻害作用を発揮する有効量の本発明化合物を含有するものであればよい。制限されないが、PHD阻害剤には、通常、本発明化合物またはその塩が１〜１００重量％の割合で含まれる。
【００７１】
（II）医薬組成物
本発明は、前述するPHD阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。言い換えれば、本発明の医薬組成物は、上記本発明化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものである。本発明の医薬組成物は、PHD阻害剤（本発明化合物）を、PHDを阻害する有効量を含むことによって、HIFを安定化する作用を有している。その結果、本発明の医薬組成物は生体のHIF−HREシステムを活性化することにより低酸素状態を改善し、その結果、虚血などの低酸素状態によって生じるダメージから細胞や組織を防御することができる。
【００７２】
このため、本発明の医薬組成物は細胞や組織の低酸素状態に関連して生じる疾患、病態（障害）または機能低下の予防または治療剤として有用である。かかる疾患、病態または機能低下として、例えば、各種の虚血性疾患ならびに虚血から生じる障害を挙げることができる。虚血性疾患としては、腎虚血性障害（尿細管間質性障害）、虚血性脳血管障害（脳血栓症、脳梗塞、一過性脳虚血発作等）、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞）、下肢虚血性障害等を挙げることができる。また、これらの虚血性疾患の進展によって生じる病態や機能低下として、慢性腎不全、慢性心不全、下肢壊疽などを挙げることができる。
【００７３】
さらに、本発明の医薬組成物は幹細胞制御法の確立や再生医療の機能改善にも有用である。例えばその対象として、神経再生機能、血管再生機能、骨髄内造血再生などを挙げることができる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、通常、PHD阻害に有効量の、ひいては低酸素状態の改善に有効量の本発明化合物に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。医薬組成物中の本発明化合物の配合量は、対象とする疾患や病態の種類や投与形態に応じて適宜選択されるが、通常、全身投与製剤の場合には、医薬組成物の全体重量（１００重量％）の０．００１〜５０重量％、特に０．０１〜１０重量％とすることができる。
【００７５】
本発明の医薬組成物の投与法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。好ましくは経口投与および静脈内投与であり、より好ましくは経口投与である。本発明の医薬組成物は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤形）に調製することができる。以下に各製剤（剤形）について説明するが、本発明において用いられる剤形はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤形を用いることができる。
【００７６】
経口投与を行う場合の剤形として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤等を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【００７７】
また、静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与を行う剤形として、注射剤または点滴剤（用事調製の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる。
【００７８】
また、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与を行う場合の剤形として、咀嚼剤、舌下剤、バッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適応場所に応じて適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【００７９】
本発明の医薬組成物にはその剤形（経口投与または各種の非経口投与の剤形）に応じて、薬学的に許容される担体および添加剤を配合することができる。薬学的に許容される担体および添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤等が挙げられる。以下に、医薬上許容される担体および添加剤の具体例を列挙するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００８０】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、整理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、澱粉類、（例えば馬鈴薯澱粉、小麦澱粉、玉蜀黍澱粉）、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。
【００８１】
結合剤としては、澱粉およびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチなどを挙げることができる。
【００８２】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸およびその塩類、（例えばステアリン酸マグネシウム）、タルク、ワックス類、小麦澱粉、マクロゴール、水素添加植物油、蔗糖、脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、シリコン油等を挙げることができる。
【００８３】
崩壊剤としては、澱粉およびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロースおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。
【００８４】
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。
【００８５】
粘稠剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００８６】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤（例えば、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。
【００８７】
安定剤としては、トコフェロール、キレート剤（例えばEDTA,チオグリコール酸）、不活性ガス、（例えば窒素、二酸化炭素）、還元性物質（例えば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ロンガリット）等を挙げることができる。
【００８８】
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸などを挙げることができる。
【００８９】
等張化液としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤としては、局所麻酔剤（塩酸プロカイン、リドカイン）、ベンジルアルコール、ブドウ糖、ソルビトール、アミノ酸等を挙げることができる。
【００９０】
矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。
【００９１】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、デヒドロ酢酸、ホウ酸等を挙げることができる。
【００９２】
コーティング剤としては、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン（PVP）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（HPMCP）、セルロースアセテートフタレート（CAP）、メチルメタアクリレート−メタアクリル酸共重合体および上記記載した高分子等を挙げることができる。
【００９３】
基材としては、ワセリン、流動パラフィン、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、パラフィン、ミツロウ、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベントナイト、カカオ脂、ウイテップゾール、ゼラチン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、ハードファット、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤等を挙げることができる。
【００９４】
なお、上記の各剤形について、公知のドラッグデリバリーシステム（DDS）の技術を採用することができる。本明細書にいうDDS製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で最適の製剤形態にした製剤である。
【００９５】
本発明の医薬組成物を、低酸素状態に関連する疾患、病態または機能低下に対する予防薬または治療薬として用いる場合、その経口投与量として、本発明化合物の量に換算して０．０３〜３００ｍｇ／ｋｇの範囲が好ましく、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇである。静脈内投与をする場合、本発明化合物の有効血中濃度が０．２〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．５〜２０μｇ／ｍＬの範囲となるような投与量を挙げることができる。なお、これらの投薬量は、年齢、性別、体系当により変動し得る。
【００９６】
（III）トリプトファン誘導体
本発明はまた、下記一般式で示されるトリプトファン骨格を有する化合物またはその薬理学的に許容される塩を提供する：
【００９７】
【化２０】
2011102268.tif 000021
（式中、R1は水酸基、−O−R３、−NH−R３または−N(R３)２で示される基；R2は置換基を有していてもよいサイクロヘキシル基、フェニル基、ナフチル基、フリル基、ピラニル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、イソベンゾフラニル基、イソクロメニル基、チエニル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チオピラニル基、イソチオクロメニル基、ピロリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、およびナフチリジニル基から選択される基を意味する。なお、R３は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の直鎖若しくは分枝状のアルキル基または置換基を有しても良いフェニル基を意味する。また、＊は不斉炭素原子を意味する）。
【００９８】
ここで、R3で示される炭素数１〜６の直鎖または分枝状のアルキル基およびその置換基、ならびにR2で示されるサイクロヘキシル基等の置換基は、（I）で説明したものを、好適な態様を含めて同様に挙げることができる。
【００９９】
かかる化合物（１）の中でも、好ましくは前述する化合物１〜５、および下式で示される化合物６である。
【０１００】
化合物６：N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファン（Ｄ−体） 
【化２１】
2011102268.tif 000022
【０１０１】
化合物１〜５は、前述するようにPHD阻害剤として有用である。また化合物６は、上記化合物５の脱エステル体である。このようなカルボン酸は、一般に化合物１〜５などのエステル体およびこれ以外の各種エステル誘導体を製造するための製造中間体として有用である。なお、かかるカルボン酸は、化合物１〜５のようなエステル体を加水分解することにより製造することも可能である。
【０１０２】
また、R１が−O−Ｒ３，−NH−Ｒ３または−N(R３)２で示される基である化合物は活性の向上や体内での化合物の分解に抵抗する形態を構築できる点で有用であり、かかる化合物はカルボン酸をアルコール類やアミン類と縮合することにより製造することができる。
【０１０３】
これらの化合物は、後述する製造例に記載する方法に従って製造することができる。またこれらの化合物の塩としては、前述するように医薬上許容される塩、例えば無機塩基または有機塩基との塩、あるいは無機酸、有機酸、または塩基性もしくは酸性アミノ酸などの酸付加塩等を挙げることができる。
【実施例】
【０１０４】
以下、本発明を製造例、ならびに実験例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【０１０５】
製造例１  化合物１（N−(2−フランカルボニル)トリプトファンエチルエステル）の合成
下式に示すように、D,L−トリプトファンエチルエステル（化合物(ａ)）を出発原料として、目的とする化合物１のN−(2−フランカルボニル)トリプトファンエチルエステル（分子式：C18H18N2O4、分子量：326.36）を製造した。
【０１０６】
【化２２】
2011102268.tif 000023
【０１０７】
（１）工程１
D,L−トリプトファンエチルエステル塩酸塩（東京化成社製）（化合物(ａ)） (134 mｇ)、EDC (1−エチル−3−(3−ジメチル アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩) (121mg)、クロロホルム(2.5 mL)、トリエチルアミン（145mg）を順にフラスコに入れ、氷浴中で15分間攪拌した。これに2−フロイン酸（60mg）を加え、氷浴中で攪拌しながら室温に戻した。18時間後、攪拌を止め、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる単離を行い（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝1／1、Rf 値0.5）、掲題のN−(2−フランカルボニル)トリプトファンエチルエステルの乳白色固体を得た。収量は133mg（収率は82%）。
【０１０８】
化合物１のNMRデータは下記の通りである：
１H NMR (CDCl3)：δ＝ 1.21(3H, t, J = 7.4 Hz), 3.41(2H, d, J = 5.6 Hz), 4.14(2H, q), 5.09(1H, dt, J= 7.4 Hz, 5.6 Hz), 6.47(1H, dd, J= 3.4 Hz, 1.4 Hz), 6.89(1H, d, J= 7.8 Hz), 7.08(3H, m), 7.18(1H, t, J= 7.8 Hz), 7.36(2H, m), 7.57(1H, d, J= 7.8 Hz), 8.12(1H, br)。
【０１０９】
製造例２    化合物２（N−(チオフェンカルボニル)−L−トリプトファンメチルエステル）の合成
下式に示すように、L‐トリプトファンメチルエステル塩酸塩（化合物(ｂ)）を出発原料として、目的とする化合物２のN−(チオフェンカルボニル)−L−トリプトファンメチルエステル（分子式：C17H16N2O3S、分子量：328.39）を製造した。
【０１１０】
【化２３】
2011102268.tif 000024
【０１１１】
（１）工程１
L−トリプトファンメチルエステル塩酸塩（東京化成社製）（化合物(ｂ)）（133mg）、 EDC (1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)（117mg）、クロロホルム（4 mL）、トリエチルアミン（290mg）を順にフラスコに入れ、氷浴中で15分間攪拌した。2-チオフェンカルボン酸（50mg）を加え、氷浴中で攪拌しながら室温に戻した。18時間後、攪拌を止め、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる単離を行い（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝1／5、Rf 値0.8）、掲題のN−(チオフェンカルボニル)−L−トリプトファンメチルエステルの乳白色固体を得た。収量は62 mg（収率は49%）。
【０１１２】
化合物２のNMRデータは下記の通りである：
１H NMR (CDCl3)；δ＝ 3.43(2H, d, J= 5.1 Hz), 3.72(3H, s), 5.12(1H, dt, J= 7.2 Hz, 5.1 Hz), 6.52(1H, d, 7.7 Hz), 7.02(2H, m), 7.10(1H, m), 7.19(1H, m), 7.36(2H, m), 7.47(1H, dd, J= 5.1 Hz, 1.5 Hz), 7.56(1H, d, J= 7.7 Hz), 8.18(1H, br) 。
【０１１３】
製造例３    化合物３（N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)トリプトファンエチルエステル）の合成
下式に示すように、D,L−トリプトファンエチルエステル塩酸塩（化合物(a)）を出発原料として、目的とする化合物３のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)トリプトファンエチルエステル（分子式：C19H20N2O3S、分子量：356.45）を製造した。
【０１１４】
【化２４】
2011102268.tif 000025
【０１１５】
（１）工程１
D,L−トリプトファンエチルエステル塩酸塩（東京化成社製）（化合物(a)）（538mg）、EDC (1−エチル−3−(3-ジメチル アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（384mg）、クロロホルム（5mL）、トリエチルアミン（212mg）を順にフラスコに入れ、氷浴中で15分間攪拌した。次に、5−メチルl−2−チオフェンカルボン酸（285mg）を加え、氷浴中で攪拌しながら室温に戻した。18時間後、攪拌を止め、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝1／1、Rf値0.6）による単離を行い、掲題のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)トリプトファンエチルエステルの乳白色固体を得た。さらにGPC（溶出液：クロロホルム）を用いて精製を行った。収量386 mg（収率46%）。
【０１１６】
化合物３のNMRデータは下記の通りである：
１H NMR (CDCl3)  δ＝1.22 ( 3H, t , J= 7.1 Hz), 2.48( 3H, s), 3.42( 2H, d , J= 5.1 Hz), 4.14( 2H, m), 5.08( 1H, m ), 6.45( 1H, d , J= 7.7 Hz), 6.67( 1H, d , J= 3.5 Hz), 7.00( 1H, d , J= 2.0 Hz), 7.09( 1H, m), 7.18( 2H, m), 7.35( 1H, d , J= 8.1 Hz), 7.57( 1H, d, J= 7.9 Hz), 8.25( 1H, br)。  
【０１１７】
製造例４    化合物４（N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−L−トリプトファンエチルエステル）の合成
下式に示すように、L−トリプトファン（化合物(ｃ)）を出発原料として、目的とする化合物４のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−L−トリプトファンエチルエステル（分子式：C19H20N2O3S、分子量：356.45）を製造した。
【０１１８】
【化２５】
2011102268.tif 000026
【０１１９】
（１）工程１
L−トリプトファン（3.09g）、エチルp−トルエンスルホネイト（3.36g）、エタノール（60mL）を、玉入冷却管を取り付けたナスフラスコに順に入れ、攪拌しながら40時間加熱還流を行った。反応後の溶液中の溶媒を減圧下にて留去した。得られた粘性のある茶色液体をできるだけ少量の温エタノールに溶解させ、エーテルを加えて、L−トリプトファンエチルエステル p−トルエンスルフォネイトの白色固体を析出させた。収量は3.96 g（収率 65％）。
【０１２０】
（２）工程２
L−トリプトファンエチルエステル p−トルエンスルフォネイト（756mg）、 EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)（384mg）、クロロホルム（5mL）、トリエチルアミン（212mg）を順にフラスコに入れ、氷浴中で15分間攪拌した。5−メチル−2−チオフェンカルボンサン（285mg）を加え、氷浴中で攪拌しながら室温に戻した。18時間後、攪拌を止め、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる単離を行い（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝1／1、Rf 0.6）、掲題のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−L−トリプトファンエチルエステルの乳白色固体を得た。さらにGPC（クロロホルム溶媒）を用いて精製を行った。収量は386 mg（収率は46%）。
【０１２１】
化合物４のNMRデータは下記の通りである：
１H NMR (CDCl3)：δ＝ 1.22 ( 3H, t , J= 7.1 Hz), 2.48( 3H, s), 3.42( 2H, d , J= 5.1 Hz), 4.14( 2H, m), 5.08( 1H, m ), 6.45( 1H, d , J= 7.7 Hz), 6.67( 1H, d , J= 3.5 Hz), 7.00( 1H, d , J= 2.0 Hz), 7.09( 1H, m), 7.18( 2H, m), 7.35( 1H, d , J= 8.1 Hz), 7.57( 1H, d, J= 7.9 Hz), 8.25( 1H, br)。
【０１２２】
製造例５    化合物５（N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファンエチルエステル）の合成
下式に示すように、D−トリプトファン（化合物(ｄ)）を出発原料として、目的とする化合物５のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファンエチルエステル（分子式：C19H20N2O3S、分子量：356.45）を製造した。
【０１２３】
【化２６】
2011102268.tif 000027
【０１２４】
（１）工程１
D-トリプトファン（3.09g）、エチルp−トルエンスルホネイト（3.36g）、エタノール（60mL）を玉入冷却菅を取り付けたナスフラスコに順に入れ、攪拌しながら40時間加熱還流した。反応後の溶液中の溶媒を減圧下にて留去した。得られた粘性のある茶色液体をできるだけ少量の温エタノールに溶解させ、エーテルを加えて、D−トリプトファンエチルエステル p−トルエンスルフォネイトの白色固体を析出させた。収量は3.96 g（収率 65％）。
【０１２５】
（２）工程２
D−トリプトファンエチルエステル p−トルエンスルフォネイト（756mg）、 EDC(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)（384mg）、クロロホルム（5mL）、トリエチルアミン（212mg）を順にフラスコに入れ、氷浴中で15分間攪拌した。5−メチル−2−チオフェンカルボン酸（285mg）を加え、氷浴中で攪拌しながら室温に戻した。18時間後、攪拌を止め、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる単離を行い（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝1／1、Rf 0.6）、掲題のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファンエチルエステルの乳白色固体を得た。さらにGPC（クロロホルム溶媒）を用いて精製を行った。収量は386 mg（収率は46%）。
【０１２６】
化合物５のNMRデータは下記の通りである：
１H NMR (CDCl3)：δ＝ 1.22 ( 3H, t , J= 7.1 Hz), 2.48( 3H, s), 3.42( 2H, d , J= 5.1 Hz), 4.14( 2H, m), 5.08( 1H, m ), 6.45( 1H, d , J= 7.7 Hz), 6.67( 1H, d , J= 3.5 Hz), 7.00( 1H, d , J= 2.0 Hz), 7.09( 1H, m), 7.18( 2H, m), 7.35( 1H, d , J= 8.1 Hz), 7.57( 1H, d, J= 7.9 Hz), 8.25( 1H, br)。
【０１２７】
製造例６    化合物６（N−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファン）の合成
下式に示すように、製造例５によって得られたN−(５−メチルチオフェン−２−カルボニル)−D−トリプトファンエチルエステルを出発原料として、目的とする化合物６のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファン（分子式：C17H16N2O3S、分子量：328.39）を製造した。
【０１２８】
【化２７】
2011102268.tif 000028
【０１２９】
（１）工程１
N−(５−メチルチオフェン−２−カルボニル)−D−トリプトファンエチルエステル（化合物５）（760mg）、トルエン（3mL）、0.45 N KOH水溶液（35mL）をナスフラスコに入れ、55℃で17時間加熱攪拌した。ジエチルエーテルを加えた後、分液操作を行い、水層を取り出した。冷却しながら、濃塩酸をゆっくり加えてpHを２にした後、酢酸エチルを加え、分液操作により有機層を取り出した。減圧下にて溶媒を留去することにより、淡黄色固体を得た。この固体を温メタノールと水を用いて再結晶を行い、粉末状のN−(5−メチルチオフェン−2−カルボニル)−D−トリプトファンの白色固体を得た。収量は424 mg(収率は61%)。
【０１３０】
化合物６のNMRデータは下記の通りである：
１H NMR (CDCl3)：δ＝ 2.48(3H, s), 3.46(2H, dd, J= 5.3 Hz, 1.5 Hz), 3.48(1H, s), 5.03(1H, dt, J= 7.2 Hz, 5.2 Hz), 6.36(1H, d , J= 7.0 Hz), 6.67(1H, d, J= 2.8 Hz), 7.08(1H, d, J= 3.7 Hz), 7.14(2H, m), 7.22(1H, m), 7.39(1H, d, J= 8.1 Hz), 7.63(1H, d, J= 8.2 Hz), 8.18(1H, br)。
【０１３１】
実験例１：化合物１〜５のHIF安定化によるルシフェラーゼ産生促進活性の測定
上記の如く合成した化合物１〜５のトリプトファン誘導体についてHIFの安定化によるルシフェラーゼ促進活性を調べた。これらの化合物は後述するin vitroスクリーニングアッセイにより測定した。その際、HIF−1α（HIFのα鎖）の安定化をもたらす公知の化合物であるコバルト（塩化コバルト）を陽性コントロールとして使用した。（Wang, G. L. & Semenza, G. L.  Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1.   J. Biol. Chem. 20. 1230-1237 (1995)）。
【０１３２】
ルシフェラーゼ遺伝子を有するベクター（インビロジェン社製またはプロメガ社製）を用い、これにHERを導入してHREを7回タンデムに反復して有するプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を有するリポーター・ベクター（7xHRE/Lucプラスミド）を作製した。このリポーターベクターを不死化した腎近位尿細管（IRPTC）細胞に導入し、これを上記トリプトファン誘導体（被験化合物１〜５）のHIF安定化によるルシフェラーゼ生産促進活性の測定に使用した。
【０１３３】
具体的には、上記リポーター・ベクターを導入したIRPTC細胞を、被験化合物１〜６（最終濃度：6.7〜100μM）とともに、37℃で24時間インキュベーションした後、細胞溶解剤（cell lysis buffer（プロメガ社））を用いて細胞を溶解し、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を、Lumat 9507照度計（EG and Berthold、ドイツ）を用いて測定した。なお、対照試験として、被験化合物の非存在下（反応溶媒：DMSO）で、上記リポーター・ベクターを導入したIPPTC細胞を同様にインキュベートした細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定し、これを陰性コントロール値とした。
【０１３４】
対照試験で得られたルシフェラーゼ活性（陰性コントロール値）を１とし、これに対する各被験化合物のルシフェラーゼ活性の相対比を算出した。その結果を表１および２に示す。
【０１３５】
【表１】
2011102268.tif 000029
【０１３６】
【表２】
2011102268.tif 000030
【０１３７】
この結果からわかるように、化合物１〜５のルシフェラーゼ活性は、公知のPHD抑制剤であるコバルト（CoCl2）のルシフェラーゼ活性と同様に、何れも陰性コントロール値（1.0）を上回る値を示し、このことから本発明の化合物１〜５の存在下でHIF の分解が抑制されHIFが安定化されていることが確認された。
【０１３８】
実験例２  細胞毒性の検討
HeLa細胞を、被験化合物（化合物３、化合物４および化合物５、50〜100μM）の存在下で、ダルベッコのMEM倍地中で24時間培養した。細胞毒性は、キット（Promega社製）を使用して培地中の乳酸塩脱水素酵素（LDH）の放出量を測定し、全細胞が溶解した後に放出される全LDH活性に対する割合（パーセンテージ）でみた。化合物３、化合物４および化合物５はそれぞれ50μMおよび100μMでは、細胞毒性を示さず、IC50は100μM以上と推測された。