(57)【要約】【課題】検体試料から核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸を検出するマイクロアレイを用いた検出方法において、該対象核酸を高精度に検出できる方法を提供すること。【解決手段】核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に相補的な配列を含まないプローブから得られるシグナルをバックグラウンドとして用いて、該対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブから得られるシグナルを補正することにより、上記の課題を解決する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸が含まれる疑いのある検体試料を、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブおよび前記核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に相補的な配列を含まない補正用プローブが配置されたマイクロアレイに接触させる工程、
（２）接触工程の後に、検出用プローブから得られる第１シグナルおよび補正用プローブから得られる第２シグナルを測定して、それぞれ第１シグナル測定値および第２シグナル測定値を取得する工程、
（３）第２シグナル測定値に基づいて、バックグラウンド値を取得する工程、
（４）第１シグナル測定値をバックグラウンド値により補正して、第１シグナルの補正値を取得する工程、および
（５）補正値に基づいて、検体試料に含まれる対象核酸を検出する工程
を含む、マイクロアレイを用いた核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸の検出方法。
【請求項２】
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列とマイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列に基づいて、マイクロアレイに配置されたプローブから、検出用プローブと補正用プローブとを選択する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
補正用プローブがマイクロアレイに複数配置され、
バックグラウンド値が、複数の補正用プローブから得られた第２シグナル測定値の最頻値である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（５）が、補正値と所定の閾値との比較結果に基づいて、検体試料から対象核酸を検出する工程である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（１）核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸が含まれる疑いのある検体試料を、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブおよび前記核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に相補的な配列を含まない補正用プローブが配置されたマイクロアレイＡに接触させ、
前記マイクロアレイＡと同じプローブが配置されたマイクロアレイＢに、前記対象核酸が含まれる疑いのない対照試料を接触させる工程、
（２）接触工程の後に、
マイクロアレイＡの検出用プローブから得られる第１検体シグナルおよびマイクロアレイＡの補正用プローブから得られる第２検体シグナルを測定して、それぞれ第１検体シグナル測定値および第２検体シグナル測定値を取得し、
マイクロアレイＢの検出用プローブから得られる第１対照シグナルおよびマイクロアレイＢの補正用プローブから得られる第２対照シグナルを測定して、それぞれ第１対照シグナル測定値および第２対照シグナル測定値を取得する工程、
（３）第２検体シグナル測定値および第２対照シグナル測定値に基づいて、それぞれ検体バックグラウンド値および対照バックグラウンド値を取得する工程、
（４）第１検体シグナル測定値を検体バックグラウンド値で補正して、第１検体シグナルの検体補正値を取得し、
第１対照シグナル測定値を対照バックグラウンド値で補正して、第１対照シグナルの対照補正値を取得する工程、
（５）検体補正値および対照補正値に基づいて、解析値を取得する工程、および
（６）解析値に基づいて、検体試料に含まれる対象核酸を検出する工程
を含む、マイクロアレイを用いた核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸の検出方法。
【請求項６】
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に基づいて、マイクロアレイＡおよびＢに配置されたプローブから、検出用プローブと補正用プローブとを選択する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
補正用プローブがマイクロアレイＡおよびＢのそれぞれに複数配置され、
検体バックグラウンド値が、マイクロアレイＡの複数の補正用プローブから得られた第２検体シグナル測定値の最頻値であり、
対照バックグラウンド値が、マイクロアレイＢの複数の補正用プローブから得られた第２対照シグナル測定値の最頻値である、
請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検出用プローブがマイクロアレイＡおよびＢのそれぞれに複数配置され、
検体補正値が、マイクロアレイＡの複数の検出用プローブから得られた第１検体シグナル測定値から検体バックグラウンド値を減じて補正した値であり、
対照補正値が、マイクロアレイＢの複数の検出用プローブから得られた第１対照シグナル測定値から対照バックグラウンド値を減じて補正した値であり、
解析値が有意確率である、
請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（６）が、解析値と所定の閾値との比較結果に基づいて、検体試料から対象核酸を検出する工程である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
核酸結合タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ結合タンパク質が、ポリコーム群、転写因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、抗メチル化シトシン抗体または抗メチル化シチジン抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ結合タンパク質が抗メチル化シトシン抗体または抗メチル化シチジン抗体であり、補正用プローブがＣｐＧ配列を含まないプローブである、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）生体試料から対象核酸を免疫沈降法により取得する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた対象核酸を核酸増幅法により増幅して検体試料を調製する工程
をさらに含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）が核酸増幅法により増幅された核酸をさらに蛍光標識する工程であり、
マイクロアレイに存在するプローブから得られるシグナルが蛍光強度である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
コンピュータを
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸が含まれる疑いのある検体試料と接触させたマイクロアレイに配置された、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブから得られた第１シグナル測定値、および
前記マイクロアレイに配置された、前記核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に相補的な配列を含まない補正用プローブから得られた第２シグナル測定値
を取得する手段；
第２シグナル測定値に基づいて、バックグラウンド値を取得する手段；
第１シグナル測定値をバックグラウンド値で補正して、第１シグナルの補正値を取得する手段；および
第１シグナルの補正値を出力する手段；
を含む手段として機能させるためのマイクロアレイデータ解析用プログラム。
【請求項１６】
コンピュータを、
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列、検体試料と接触させたマイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列および前記プローブから得られたシグナル測定値を受付ける手段；
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に基づいて、マイクロアレイのプローブから、補正用プローブを選択する手段；
をさらに含む手段として機能させる、請求項１５に記載のプログラム。
【請求項１７】
補正用プローブがマイクロアレイに複数配置され、
バックグラウンド値が、複数の補正用プローブから得られた第２シグナル測定値の最頻値である、請求項１５または請求項１６に記載のプログラム。
【請求項１８】
検出用プローブがマイクロアレイに複数配置され、
補正値が、マイクロアレイの複数の検出用プローブから得られた第１シグナル測定値をバックグラウンド値で補正した値である、
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のプログラム。
【請求項１９】
コンピュータを
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸が含まれる疑いのある検体試料と接触させたマイクロアレイＡに配置された、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブから得られた第１検体シグナル測定値、
前記マイクロアレイＡに配置された、前記核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に相補的な配列を含まない補正用プローブから得られた第２検体シグナル測定値、
前記対象核酸が含まれる疑いのない対照試料を接触させたマイクロアレイＢに配置された、前記検出用プローブから得られた第１対照シグナル測定値、および
前記マイクロアレイＢに配置された、前記核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に相補的な配列を含まない補正用プローブから得られた第２対照シグナル測定値
を取得する手段；
第２検体シグナル測定値および第２対照シグナル測定値に基づいて、それぞれ検
体バックグラウンド値および対照バックグラウンド値を取得する手段；
第１検体シグナル測定値を検体バックグラウンド値で補正して、第１検体シグナルの検体補正値を取得し、第１対照シグナル測定値を対照バックグラウンド値で補正して、第１対照シグナルの対照補正値を取得する手段；
検体補正値および対照補正値に基づいて、解析値を取得する手段；および
解析値を出力する手段；
を含む手段として機能させるためのマイクロアレイデータ解析用プログラム。
【請求項２０】
コンピュータを、
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列、検体試料と接触させたマイクロアレイＡに配置されたプローブの塩基配列および前記プローブから得られた検体シグナル測定値、ならびに対照試料と接触させたマイクロアレイＢに配置されたプローブの塩基配列および前記プローブから得られた対照シグナル測定値を受付ける手段；および
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に基づいて、マイクロアレイＡおよびＢのプローブから、補正用プローブを選択する手段；
をさらに含む手段として機能させる、請求項１９に記載のプログラム。
【請求項２１】
補正用プローブがマイクロアレイＡおよびＢのそれぞれに複数配置され、
検体バックグラウンド値が、マイクロアレイＡの複数の補正用プローブから得られた第２検体シグナル測定値の最頻値であり、
対照バックグラウンド値が、マイクロアレイＢの複数の補正用プローブから得られた第２対照シグナル測定値の最頻値である、
請求項１９または請求項２０に記載のプログラム。
【請求項２２】
検出用プローブがマイクロアレイＡおよびＢのそれぞれに複数配置され、
検体補正値が、マイクロアレイＡの複数の検出用プローブから得られた第１検体シグナル測定値から検体バックグラウンド値を減じて補正した値であり、
対照補正値が、マイクロアレイＢの複数の検出用プローブから得られた第１対照シグナル測定値から対照バックグラウンド値を減じて補正した値であり、
解析値が有意確率である、
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイを用いた核酸の検出方法およびマイクロアレイデータ解析用プログラムに関する。より詳細には、マイクロアレイを用いた核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸の検出方法およびこの検出方法のためのマイクロアレイデータ解析用プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイとは、核酸チップとも呼ばれ、プローブとしての核酸断片がプラスチックやガラスなどの基板上に高密度に配置されたものである。このマイクロアレイ上のプローブと検体試料中の核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＲＮＡ）とをハイブリダイゼーションさせることにより、検体試料中の核酸に含まれる多数の遺伝子を定量的または定性的に解析できる。
例えば、マイクロアレイをＲＮＡの解析に用いることにより遺伝子の発現解析を行うことが可能であり、ゲノムＤＮＡの解析に用いることによりそのコピー数の測定（ＣＧＨ解析）、転写因子の解析、ＤＮＡのメチル化領域の解析などが可能である。
【０００３】
また、マイクロアレイを用いて、核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸の検出する方法も知られている。例えば、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）法とマイクロアレイ解析とを組み合わせた「ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ法」が知られている。このＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ法では、まず、興味対象の核酸結合タンパク質を認識する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行い、該タンパク質と結合する核酸を取得する。次いで、取得した核酸をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる。そして、核酸とハイブリダイズしたマイクロアレイ上のプローブを確認することにより、興味対象の核酸結合タンパク質が結合する核酸を解析できる。
【０００４】
核酸結合タンパク質として、抗メチル化シトシン抗体または抗メチル化シチジン抗体を用いるメチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）法とマイクロアレイ解析とを組み合わせた「ＭｅＤＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ法」も知られている。このＭｅＤＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ法では、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法で取得したＤＮＡとハイブリダイズしたマイクロアレイ上のプローブを確認することにより、メチル化ＤＮＡを解析できる。
さらに、マイクロアレイとして、全ゲノム領域または特定の領域から等間隔に抽出した塩基配列を有するプローブをタイル状に並べたタイリングアレイを用いて、核酸結合タンパク質が結合する核酸やメチル化ＤＮＡを網羅的に解析することも行われている。
【０００５】
マイクロアレイを用いる解析では、検体試料中の核酸は、通常、自己の塩基配列と相補的な配列を有するプローブと特異的にハイブリダイズするが、自己の塩基配列と非相補的な配列を有するプローブまたはマイクロアレイの基板表面と非特異的にハイブリダイズすることもある。核酸と各プローブとの間のこのような塩基配列に非特異的なハイブリダイゼーションにより得られたシグナル測定値には、生物学的根拠のないノイズ成分（以下、「バックグラウンド」という）が含まれ得る。このようなバックグラウンドは、測定の精度を下げる大きな要因となっている。
【０００６】
したがって、マイクロアレイデータの解析においては、上記のような非特異的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドを除去してデータを補正する操作である、バックグラウンド補正が必要となる。
【０００７】
このようなバックグラウンド補正の方法として、例えばAffymetrix社のGeneChip（登録商標）におけるミスマッチプローブを用いた方法が知られている。
Affymetrix社のGeneChip（登録商標）では、解析対象の配列と完全に相補的な配列を有するパーフェクトマッチ（ＰＭ）プローブに加えて、ＰＭプローブの配列と１塩基だけ異なる配列を有するミスマッチ（ＭＭ）プローブが基板上に配置されている。そして、ＰＭプローブから得られたシグナル値から、ＭＭプローブから得られたシグナル値を減じることにより、プローブの配列に非特異的な結合により生じるバックグラウンドを除去して、測定データを補正できる。
しかし、この方法では、マイクロアレイにＭＭプローブを配置することが必須であるため、ＭＭプローブが配置されていないマイクロアレイを用いる場合には、この方法は適用できない。また、ＰＭプローブとＭＭプローブとでは非特異的ハイブリダイゼーションによる影響が大きく異なる場合が多いので、この方法では必ずしも該影響を除いた値を適切に反映しているわけではない（特許文献１参照）。
【０００８】
ＭＭプローブを用いる方法以外にも、バックグラウンド補正の方法が開発されている（特許文献１参照）。例えば、解析対象の測定用プローブを配置していない領域を利用したバックグラウンドの除去方法がある（特許文献１の背景技術の記載を参照されたい）。この方法では、各プローブが配置されている領域（スポット）の周囲領域またはプローブを配置していないブランクスポットから得られたシグナルをバックグラウンドとして、測定用プローブから得られたシグナルから減じることができる。つまり、検体試料中の核酸とマイクロアレイの基板表面との非特異的ハイブリダイゼーションにより生じるバックグラウンドを除去して、測定データを補正できる。
しかし、この方法では、検体試料中の核酸とプローブとの非特異的結合により生じるバックグラウンドを除去できないので、データの解析精度は高いとはいえない。
また、ブランクスポットを利用する方法では、解析対象の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブとは別に、ブランクスポットを基板上にあらかじめ配置する必要があるので、ブランクスポットがないマイクロアレイを用いる場合には、この方法は適用できない。
【０００９】
その他のバックグラウンド補正の方法として、ランダムプローブを用いる方法がある（特許文献２参照）。この方法では、解析対象の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプローブ（計数プローブ）に加えて、解析対象の塩基配列に対応しないプローブ（ランダムプローブ）が基板上に配置されたマイクロアレイを用いる。そして、ランダムプローブから得られるシグナルに基づいてバックグラウンドの影響度を予測し、計数プローブから得られるシグナルから該影響度を除去する。
しかし、この方法においても、計数プローブとは別に、ランダムプローブを基板上にあらかじめ配置する必要があるため、マイクロアレイにランダムプローブが配置されていないマイクロアレイを用いる場合には、この方法は適用できない。また、この方法では、解析対象によっては、各ランダムプローブにおいて非特異的結合の影響が大きく異なり、十分なバックグラウンドの補正ができない場合がある。
【００１０】
また、上記のバックグラウンド補正以外のデータの補正方法として、データの正規化による補正がある。
マイクロアレイを用いた実験において、測定されたシグナルのデータは、測定毎に異なったバイアス（偏り）を有することが多い。そのため、複数のマイクロアレイデータを比較する場合は、マイクロアレイ間のバイアスを数学的または統計学的手法により補正することが必要となる。このような補正操作は、正規化と呼ばれる。
データの正規化による補正は、マイクロアレイ間のバイアスのみならず、同一のマイクロアレイ内のスポット間の位置の相違によるバイアスに対しても用いることができる。
【００１１】
Affymetrix社製のタイリングアレイには、そのアレイ上にバックグラウンド補正用プローブは配置されていないが、データを正規化する解析プログラムであるTiling Analysis Software（以下、「ＴＡＳ」という）が同社から提供される。ＴＡＳによる解析では、プローブから得られるシグナルのデータについて、バックグラウンドの除去による補正は行われず、数学的または統計学的手法を用いた正規化による補正がなされ、測定データ間の有意確率（p値）が算出される。
【００１２】
ただし、データの正規化による補正では、マイクロアレイ上に配置されたプローブにおいて、次の２つの条件が成立することが前提となる：
・測定間で発現の変動が見られない遺伝子のプローブが大半を占める、
・測定間で発現が増大または減少する遺伝子のプローブが同程度含まれている。
そのため、これらの条件を満たさないような誤った正規化は、かえってバックグラウンドの原因となり得る。
また、データの正規化による補正では、バックグラウンド補正は行われないため、データの解析精度は高いとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第０３／０７０９３８号
【特許文献２】特開２００８−３９４７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記のような事情に鑑みて、本発明は、検体試料から核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸を、マイクロアレイを用いて検出する方法において、検体試料から前記対象核酸を高精度に検出できる方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、マイクロアレイに上記のようなＭＭプローブやランダムプローブなどのバックグラウンド補正用の特別なプローブがあらかじめ配置されていない場合であっても、バックグラウンド補正ができる方法を提供することを目的とする。
【００１５】
さらに、本発明は、上記の検出でのマイクロアレイデータの解析をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、鋭意検討の結果、核酸結合タンパク質が結合する塩基配列（以下、「認識配列」ともいう）を含む対象核酸を、マイクロアレイを用いて検体試料から検出する方法において、前記認識配列に相補的な配列を含まない補正用プローブから得られるシグナルをバックグラウンドとして用いて、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブから得られるシグナルを補正することにより、検体試料から対象核酸を高精度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
さらに、本発明者らは、認識配列に基づいて、マイクロアレイに配置されたプローブから、補正用プローブを選択することで、バックグラウンドを補正するためのプローブがあらかじめ配置されていないマイクロアレイにおいても、検体試料から対象核酸を高精度に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、
（１）核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸が含まれる疑いのある検体試料を、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブおよび前記核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に相補的な配列を含まない補正用プローブが配置されたマイクロアレイに接触させる工程、
（２）接触工程の後に、検出用プローブから得られる第１シグナルおよび補正用プローブから得られる第２シグナルを測定して、それぞれ第１シグナル測定値および第２シグナル測定値を取得する工程、
（３）第２シグナル測定値に基づいて、バックグラウンド値を取得する工程、
（４）第１シグナル測定値をバックグラウンド値により補正して、第１シグナルの補正値を取得する工程、および
（５）補正値に基づいて、検体試料に含まれる対象核酸を検出する工程
を含む、マイクロアレイを用いた認識配列を含む対象核酸の検出方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、上記の検出方法において、前記認識配列に基づいて、前記マイクロアレイに配置されたプローブから、前記補正用プローブを選択する工程をさらに含む、マイクロアレイを用いた認識配列を含む対象核酸の検出方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、コンピュータを
（１）認識配列を含む対象核酸が含まれる疑いのある検体試料と接触させたマイクロアレイに配置された、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブから得られた第１シグナル測定値、および
前記マイクロアレイに配置された、前記認識配列に相補的な配列を含まない補正用プローブから得られた第２シグナル測定値を受付ける手段、
（２）第２シグナル測定値に基づいて、バックグラウンド値を取得する手段、
（３）第１シグナル測定値をバックグラウンド値で補正して、第１シグナルの補正値を取得する手段、および
（４）第１シグナルの補正値を出力する手段、
を含む手段として機能させるためのマイクロアレイデータ解析用プログラムも提供する。
【００２１】
また、本発明は、上記の手段（１）が、前記認識配列に基づいて、前記マイクロアレイに配置されたプローブから、前記補正用プローブを選択する処理をさらに含む、マイクロアレイデータ解析用プログラムを提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の方法によれば、マイクロアレイを用いて検体試料から認識配列を含む対象核酸を高精度に検出することが可能になる。また、本発明の方法によれば、バックグラウンド補正のための特別なプローブがマイクロアレイにあらかじめ配置されていない場合であっても、バックグラウンド補正が可能になる。
【００２３】
また、本発明のプログラムによれば、上記の検出方法でのマイクロアレイデータの解析をコンピュータに実行させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明のプログラムを実行するマイクロアレイデータ解析装置を含む、マイクロアレイデータ解析システムの全体概要図である。
【図２】解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第１の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。
【図３】解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第２の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。
【図４】解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第３の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。
【図５】解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第４の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。
【図６】実施例１においてメチル化ＤＮＡを特異的に回収できたことを示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図７】乳癌細胞株ＭＣＦ−７を検体試料として用いたマイクロアレイの解析結果（Ｓ／Ｎ比および有意確率）のグラフである。
【図８】乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を検体試料として用いたマイクロアレイの解析結果（Ｓ／Ｎ比および有意確率）のグラフである。
【図９】コントロールプローブを含む補正用プローブおよびＣｐＧ配列を含まない補正用プローブのそれぞれでバックグラウンド補正をした場合の有意確率のグラフである。
【図１０】解析装置１００のハードウエア構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
上記の「核酸結合タンパク質」とは、核酸が有する特定の塩基配列を認識して特異的に結合するタンパク質を意味する。核酸結合タンパク質は、好ましくはＤＮＡ結合タンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、ポリコーム群、転写因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体などが挙げられる。
「ポリコーム群」とは、クロマチンに結合する巨大なタンパク質複合体として細胞内に存在する分子群を意味する。「転写因子」とは、遺伝子の転写を調節している因子であって、ＲＮＡポリメラーゼ以外の分子群を意味する。転写因子としては、例えば、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＥＧＲ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＥＲ、ＳＯＸ６などが挙げられる。
【００２６】
上記の「核酸結合タンパク質が結合する塩基配列」とは、上記の核酸結合タンパク質が認識して特異的に結合することが知られている塩基配列を意味し、認識配列とも呼ばれる。
そのような認識配列は、好ましくは１〜１５塩基程度、より好ましくは１〜１０塩基、さらに好ましくは１〜７塩基、最も好ましくは１〜５塩基の長さである。
核酸結合タンパク質がメチル化ＤＮＡ結合タンパク質である場合、認識配列は、例えばＣｐＧ配列であり得る。また、核酸結合タンパク質が転写因子である場合、認識配列は、例えば、表１に示す塩基配列であり得る。
このような核酸結合タンパク質が結合する配列は、当業者に公知のデータベース、例えば、TESS-General Factor Search Form（http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess?RQ=FCT-FRMREQ-Search）で検索できる。
【００２７】
【表１】
2011217726.tif 000003
【００２８】
上記の「ＣｐＧ配列」とは、塩基配列中のシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とが５'か
ら３'への方向にこの順序で隣り合った配列を意味する。ＣｐＧの「ｐ」の文字は、シト
シンとグアニンの間のホスホジエステル結合を表わす。また、本明細書においては、「ＣｐＧ配列」と「ＣＧ配列」は同義である。哺乳類のゲノムＤＮＡでは、ＣｐＧ配列においてメチル化修飾が行われることが知られている。
【００２９】
上記の「核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸」（以下、単に「対象核酸」ともいう）は、その塩基配列中に上記の認識配列を含み、本発明において検出の対象となる核酸を意味する。対象核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのいずれであってもよいが、好ましくはＤＮＡであり、より好ましくはゲノムＤＮＡであり、さらに好ましくはＣｐＧ配列を含むゲノムＤＮＡである。このような対象核酸を検出することにより、検体試料中のゲノムＤＮＡがメチル化されているか否かを検出でき、また、メチル化されているゲノムＤＮＡを検出することもできる。
【００３０】
本発明の方法に用い得るマイクロアレイは、核酸プローブが基板上に配置されたものであれば特に限定されないが、好ましくはＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップである。
また、そのようなマイクロアレイは、検出用プローブおよび補正用プローブが配置されたマイクロアレイが好ましい。しかし、マイクロアレイの中には、検出のためのプローブ数を多くするために、バックグラウンド補正のための特別なプローブがあらかじめ配置されていないものも存在する。このようなマイクロアレイを用いる場合、興味対象の核酸結合タンパク質が結合する塩基配列に基づいて、該マイクロアレイに配置されたプローブから補正用プローブを選択することにより、本発明の方法を実施できる。
【００３１】
上記のマイクロアレイは、Affymetrix社のGeneChip（登録商標）のような市販のものであってもよく、当業者に公知の方法によって作製したものであってもよい。
【００３２】
本発明において、検出用プローブは、上記の対象核酸とハイブリダイズするプローブであれば、特に制限されない。すなわち、対象核酸中の認識配列を含む領域と相補的な配列を有するプローブを、検出用プローブとして用いることができる。より具体的には、そのような検出用プローブは、認識配列に相補的な配列を有するプローブまたは対象核酸中の認識配列の近傍の領域と相補的なプローブである。特に、対象核酸中の認識配列の近傍の領域と相補的なプローブは、対象核酸中の認識配列から３００塩基以内の領域と相補的なプローブが好ましい。
なお、「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で、プローブと対象核酸とが二本鎖構造を形成することをいう。ここで、ストリンジェントな条件とは、マイクロアレイに配置されたプローブに対象核酸をハイブリダイゼーションする際に、当業者が一般的に用いる条件であれば、特に限定されない。
【００３３】
本発明において、補正用プローブは、認識配列に相補的な配列を含まないプローブであれば、特に制限されない。例えば、核酸結合タンパク質が上記の抗メチル化シトシン抗体または抗メチル化シチジン抗体の場合、補正用プローブはＣｐＧ配列を含まないプローブである。好ましくは、補正用プローブは、対象核酸以外の核酸（以下、「非対象核酸」ともいう）とハイブリダイズするプローブである。ここで、非対象核酸は、その塩基配列において、プローブとハイブリダイズする領域のみならず、該領域の近傍においても認識配列を含まない核酸であることが好ましい。
しがたって、補正用プローブは、認識配列に相補的な配列を含まず、且つプローブがハイブリダイズする領域から３００塩基以内の領域に認識配列を含まない非対象核酸とハイブリダイズするプローブであることがより好ましい。
【００３４】
検出用プローブおよび補正用プローブは、本発明の方法に用いるマイクロアレイにそれぞれ１つずつであってもよいが、検出の精度をより高めるために、通常、それぞれ複数であることが好ましい。
【００３５】
本発明の方法における第１工程では、上記の検出用プローブおよび補正用プローブが配置されたマイクロアレイに検体試料を接触させる。この接触は、マイクロアレイに検体試料を添加することにより行うことができる。
検体試料とマイクロアレイとの接触は、マイクロアレイの種類により異なるが、通常、周囲温度（約１０〜７０℃）にて２〜２０時間行えばよい。
【００３６】
上記の検体試料は、対象核酸を含む疑いがあるものである。
検体試料としては、生体試料から得られる核酸を含む試料が挙げられる。生体試料としては、例えば、培養細胞株、血液、血清、リンパ液、尿、乳頭分泌液、体液、手術や生検により採取した組織や細胞などが挙げられる。
検体試料は、これらの生体試料そのものであってもよいし、検体試料に含まれる対象核酸の濃度を上昇させるための処理を生体試料に行って得られるものであってもよい。対象核酸の濃度を上昇させる処理としては、対象核酸に対する抗体または対象核酸に結合するタンパク質に対する抗体を用いる免疫沈降法、対象核酸に対するプライマーを用いる核酸増幅法などが挙げられる。検体試料は、免疫沈降法および核酸増幅法をともに行うことにより得られるものがより好ましい。
検体試料に含まれる対象核酸は、認識配列を１つまたは複数含んでいてもよい。
【００３７】
上記の免疫沈降法としては、対象核酸に対する抗体を用いて該核酸を沈降させる方法であれば特に限定されず、公知の方法に従って行うことができる。対象核酸が、メチル化修飾されたＣｐＧ配列を含むゲノムＤＮＡである場合、免疫沈降法として、抗メチル化シトシン抗体または抗メチル化シチジン抗体を用いるＭｅＤＩＰ法を行うことができる。また、対象核酸が、転写因子が結合する塩基配列を含む核酸である場合、免疫沈降法として、種々の転写因子に対する抗体を用いるＣｈＩＰ法を行うことができる。
【００３８】
核酸増幅法は、対象核酸に対するプライマーを用いて該核酸を増幅できる方法であれば特に限定されず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、in vitro transcription（ＩＶＴ）増幅法やＳＰＩＡ（商標）増幅法などの当業者に公知の増幅法を行うことができる。核酸増幅用プライマーは、対象核酸の塩基配列に応じて当業者が適宜設計し得るか、または市販されているものを用いることができる。
【００３９】
上記の免疫沈降法および／または核酸増幅法の前後には、核酸を超音波または制限酵素により断片化してもよい。
【００４０】
上記の検体試料中に含まれる対象核酸は、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本発明の方法は、対象核酸を標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、検体試料中の全ての対象核酸を標識できるので、対象核酸を増幅する工程の後に行われるのが有利である。
標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）、ＦＩＴＣなどが挙げられる。このように検出対象の核酸を標識することにより、次工程でのシグナルの測定が容易になる。
核酸を上記の標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
【００４１】
本発明の方法の第２工程においては、検出用プローブから得られる第１シグナルおよび補正用プローブから得られる第２シグナルを測定して、それぞれ第１シグナル測定値および第２シグナル測定値を取得する。
第１シグナルおよび第２シグナルの測定値は、それぞれ１つの値であってもよいが、通常、マイクロアレイには複数の検出用プローブおよび補正用プローブが配置されているので、各シグナルの測定値は、それぞれ複数の値であってもよい。
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズした核酸が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように検出対象の核酸が標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。これらのシグナルは、好ましくは上記の標識物質により生じるシグナルであり、より好ましくは蛍光シグナルである。
【００４２】
上記の各シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip（登録商標）Scanner 3000 7G（Affymetrix社）などが挙げられる。
【００４３】
補正用プローブから得られる第２シグナルは、０である（測定されない）はずであるが、上記のように、プローブおよび／またはマイクロアレイの基板への核酸の非特異的ハイブリダイゼーションにより、通常、ある程度の数値として測定され得る。
【００４４】
本発明の第３工程では、第２シグナル測定値に基づいてバックグラウンド値を取得する。マイクロアレイに複数の補正用プローブが配置されている場合、バックグラウンド値は、複数の第２シグナル測定値から得られる統計的代表値であってもよい。統計的代表値としては、最大値、最小値、平均値、中央値または最頻値のいずれであってもよいが、好ましくは最頻値である。
【００４５】
本発明の方法の第４工程では、上記の第１シグナル測定値を、上記のバックグラウンド値により補正して、第１シグナルの補正値を取得する。
また、上記のマイクロアレイに検出用プローブが複数配置されている場合は、各々の第１シグナル測定値をバックグラウンド値で補正して、各々の第１シグナルの補正値を取得する。
補正は、第１シグナル測定値をバックグラウンド値で除してもよく、第１シグナル測定値をバックグラウンド値で減じてもよい。好ましくは、第１シグナル測定値からバックグラウンド値を減じることにより、補正値を算出する。なお、減算によって得た補正値が負の値である場合は、該補正値を０とし得る。
【００４６】
本発明の方法の第５工程では、第１シグナルの補正値に基づいて、検体試料に含まれる対象核酸を検出する。
本明細書において、「検出」とは、検体試料中の対象核酸の存否を検出すること、および／または対象核酸の検体試料中での存在量を測定することを意味する。好ましくは、対象核酸の存否を検出することである。
【００４７】
この工程では、第１シグナルの補正値と所定の閾値とを比較して、第１シグナルの補正値が該閾値よりも高い場合に、検体試料中に対象核酸が存在すると判断でき、該閾値よりも低い場合に、検体試料中に対象核酸が存在しないと判断できる。
上記の所定の閾値は、検出対象の核酸の存在の有無があらかじめ確認されている試料を用いて、本発明の方法と同様の手順で測定された補正値のデータの蓄積から、経験的に導き出すことができる。例えば、検出対象の核酸の存在の有無があらかじめ確認されている試料から得られた補正値を、閾値として用いることができる。また、複数の試料から得られた補正値の平均値、中央値または最頻値などを閾値とすることもできる。
【００４８】
本発明の方法は、検体試料と対照試料とを別々に複数のマイクロアレイに供して、上記の方法により各マイクロアレイから補正値を求め、これらに基づいて解析値を求めることにより、対象核酸を検出することもできる。
このような本発明の方法では、同一のマイクロアレイを２つ準備し、一方をマイクロアレイＡとして、他方をマイクロアレイＢとして用いることが好ましい。
【００４９】
上記のような２つのマイクロアレイを用いる場合の本発明の方法は、次の工程を含む。
（１）認識配列を含む対象核酸が含まれる疑いのある検体試料を、前記対象核酸にハイブリダイズする検出用プローブおよび前記認識配列に相補的な配列を含まない補正用プローブが配置されたマイクロアレイＡに接触させ、
前記マイクロアレイＡと同じプローブが配置されたマイクロアレイＢに、前記対象核酸が含まれる疑いのない対照試料を接触させる工程、
（２）接触工程の後に、マイクロアレイＡの検出用プローブから得られる第１検体シグナルおよびマイクロアレイＡの補正用プローブから得られる第２検体シグナルを測定して、それぞれ第１検体シグナル測定値および第２検体シグナル測定値を取得し、
マイクロアレイＢの検出用プローブから得られる第１対照シグナルおよびマイクロアレイＢの補正用プローブから得られる第２対照シグナルを測定して、それぞれ第１対照シグナル測定値および第２対照シグナル測定値を取得する工程、
（３）第２検体シグナル測定値および第２対照シグナル測定値に基づいて、それぞれ検体バックグラウンド値および対照バックグラウンド値を取得する工程、
（４）第１検体シグナル測定値を検体バックグラウンド値で補正して、第１検体シグナルの検体補正値を取得し、
第１対照シグナル測定値を対照バックグラウンド値で補正して、第１対照シグナルの対照補正値を取得する工程、
（５）検体補正値および対照補正値に基づいて、解析値を取得する工程、および
（６）解析値に基づいて、検体試料に含まれる対象核酸を検出する工程。
【００５０】
上記の工程（１）では、マイクロアレイＡに検体試料を接触させ、マイクロアレイＢに対照試料を接触させる。
検体試料は、上記のとおり、対象核酸を含む疑いのあるものである。一方、対照試料は、対象核酸を含む疑いがないものである。このような対照試料は、例えば上記の生体試料に対して、対象核酸または対象核酸に結合するタンパク質を特異的に認識しない抗体（例えば、正常マウスＩｇＧ抗体など）を用いる免疫沈降を行って得ることができる。
接触は、上記の第１工程において述べたことと同様にして行うことができる。
【００５１】
上記の工程（２）において、第１検体シグナル、第２検体シグナル、第１対照シグナルおよび第２対照シグナルの測定値は、それぞれ１つの値であってもよいが、通常、マイクロアレイＡおよびＢにはそれぞれ複数の検出用プローブおよび補正用プローブが配置されているので、各シグナルの測定値は、それぞれ複数の値であってもよい。
なお、上記のシグナルおよびその検出については、上記の第２工程で述べたことと同様である。
【００５２】
上記の工程（３）において、マイクロアレイＡおよびＢに複数の補正用プローブが配置されている場合、検体バックグラウンド値および対照バックグラウンド値は、それぞれ第２検体シグナル測定値および第２対照シグナル測定値のうちの最大値、最小値、平均値、中央値または最頻値のいずれであってもよいが、好ましくは最頻値である。
【００５３】
上記の工程（４）において、マイクロアレイＡおよびＢに複数の検出用プローブが配置されている場合、検体補正値は、複数の第１検体シグナル測定値から検体バックグラウンド値を減じた値であり、対照補正値は、複数の第１対照シグナル測定値から対照バックグラウンド値を減じた値である。
なお、得られた各補正値が負の値である場合は、該補正値を０とし得る。
【００５４】
上記の工程（５）において、解析値は有意確率として取得することができる。具体的には、解析値は、上記の検体補正値および対照補正値を一対の標本としてウィルコクソンの符号順位検定（Wilcoxon signed-rank test）により算出できる。あるいは、解析値は、検体補正値を対照補正値で除して算出されるシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比であってもよい。
【００５５】
本明細書において、「有意確率」とは、p値（p-value）とも呼ばれ、当該技術において一般的に用いられるものと同等の意味を有し、ある帰無仮説のもとで得られたデータから実際に計算された統計量よりも極端な統計量（帰無仮説に反する統計量）が観測される確率のことである。
【００５６】
上記の工程（６）では、解析値と所定の閾値とを比較して、解析値が所定の閾値よりも低い場合に、対象核酸と検出用プローブとの特異的ハイブリダイゼーションにより、検体試料から対象核酸が検出されたと判断できる。解析値が有意確率である場合、所定の閾値は、当該技術において一般的に用いられる有意水準であり得る。例えば、得られた解析値が閾値０．０５（５％）よりも低い場合は、検出対象ではない核酸が検出用プローブとの非特異的ハイブリダイゼーションにより誤って検出された可能性は５％以下であることを示す。
有意水準としての閾値は、通常、０．０５（５％）であり、好ましくは０．０１（１％）、より好ましくは０．００８（０．８％）である。
【００５７】
複数のマイクロアレイを用いる本発明の方法において、バックグラウンド補正のためのプローブがあらかじめ配置されていないマイクロアレイＡおよびＢを用いる場合は、それらのマイクロアレイに配置されたプローブから、認識配列に基づいて補正用プローブを選択することにより、上記の方法を実施できる。すなわち、マイクロアレイに配置されたプローブにおいて、認識配列に相補的な配列を含まないプローブを補正用プローブとして選択できる。
また、補正用プローブは、検体試料に含まれる核酸の由来となる生体のゲノムＤＮＡの塩基配列の情報に基づいて選択することが好ましい。これは、補正用プローブがハイブリダイズする検体試料中の核酸も、認識配列を含まないことが好ましいからである。したがって、認識配列に相補的な配列を含まず、且つプローブがハイブリダイズする領域から３００塩基以内の領域に認識配列を含まないゲノムＤＮＡとハイブリダイズするプローブを、補正用プローブとして選択することが特に好ましい。
【００５８】
また、上記の本発明の方法において、マイクロアレイに配置されたプローブから検出用プローブを選択してもよい。この場合、検出用プローブは、マイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列、認識配列および検体試料に含まれる核酸の由来となる生体のゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて選択できる。すなわち、マイクロアレイに配置されたプローブから、認識配列に相補的な配列を有するプローブまたはゲノムＤＮＡの塩基配列中の認識配列の近傍の領域と相補的なプローブを、検出用プローブとして選択できる。より具体的には、認識配列に相補的な配列を有するプローブまたはゲノムＤＮＡ中の認識配列から３００塩基以内の領域と相補的なプローブを、検出用プローブとして選択することが好ましい。
【００５９】
本発明の方法においては、データの正規化による補正工程をさらに含んでもよい。
【００６０】
また、本発明の方法では、ＤＮＡ結合タンパク質として抗メチル化シトシン抗体または抗メチル化シチジン抗体を用い、補正用プローブとしてＣｐＧ配列を含まないプローブを用いることにより、ゲノムＤＮＡのメチル化状態を解析できる。
上記のメチル化の状態とは、解析したゲノムＤＮＡの塩基配列に存在するＣｐＧ配列のシトシン残基がメチル化されているか否か、または該塩基配列に存在する全てのＣｐＧ部位の数に対する、メチル化されたＣｐＧ配列の数の割合を意味する。
【００６１】
本発明のマイクロアレイデータ解析用プログラムについて、以下に説明する。
【００６２】
図１に、本発明のプログラムを実行するマイクロアレイデータの解析装置１００を含む、マイクロアレイデータ解析システムの全体概要図を示した。マイクロアレイデータ解析システムは、マイクロアレイの測定装置２００と、解析装置１００とを有し、これらはケーブル３００で接続されている。測定装置２００で測定されるマイクロアレイから得たシグナル測定値などのデータは、ケーブル３００を介して解析装置１００に送られる。なお、測定装置２００と解析装置１００とは、一体の装置として構成されてもよい。解析装置１００のハードウエア構成を示すブロック図を、図１０に示す。
【００６３】
解析装置１００は、本体１１０と、表示部１２０と、入力デバイス１３０とから主として構成されている。本体１１０において、ＣＰＵ１１０ａと、ＲＯＭ１１０ｂと、ＲＡＭ１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インターフェース１１０ｆと、画像出力インターフェース１１０ｇとは、バス１１０ｈによって互いにデータ通信可能に接続されている。
【００６４】
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ１１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
【００６５】
ＲＯＭ１１０ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ１１０ｂには、ＣＰＵ１１０ａが実行するコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
【００６６】
ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭまたはＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ１１０ｃは、ＲＯＭ１１０ｂおよびハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１１０ａの作業領域として利用される。
【００６７】
ハードディスク１１０ｄには、オペレーティングシステムおよびアプリケーションシステムプログラムなどのＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム、ならびにコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム１４０ａも、このハードディスク１１０ｄにインストールされている。ここで、アプリケーションプログラム１４０ａの実行に用いるデータとしては、認識配列、マイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列およびゲノムＤＮＡの塩基配列などが挙げられる。
【００６８】
読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、またはＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置１１０ｅは、可搬型記憶媒体１４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。また、可搬型記憶媒体１４０には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム１４０ａが格納されている。ＣＰＵ１１０ａが可搬型記憶媒体１４０から当該アプリケーションプログラム１４０ａを読み出し、アプリケーションプログラム１４０ａをハードディスク１１０ｄにインストールすることも可能である。
【００６９】
また、ハードディスク１１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインターフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明においては、上述した判定に係るアプリケーションプログラム１４０ａは、当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
【００７０】
入出力インターフェース１１０ｆは、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェース、およびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェースなどから構成されている。入出力インターフェース１１０ｆには、キーボードおよびマウスからなる入力デバイス１３０が接続されている。ユーザが、入力デバイス１３０を使用することで、コンピュータ本体１１０にデータを入力することが可能である。
【００７１】
また、入出力インターフェース１１０ｆには、ケーブル３００を介して、マイクロアレイ測定装置２００が接続されている。これにより、コンピュータ本体１１０は、マイクロアレイ測定装置２００から入出力インターフェース１１０ｆを介して、マイクロアレイに配置されたプローブから得られたシグナル測定値を取得することが可能である。
【００７２】
画像出力インターフェース１１０ｇは、ＬＣＤまたはＣＲＴなどで構成された表示部１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部１２０に出力するようになっている。表示部１２０は、入力された映像信号にしたがって、画像データを出力する。また、表示部１２０は、後述するＣＰＵ１１０ａから与えられた補正値や解析値を出力する。
【００７３】
本実施形態のアプリケーションプログラム１４０ａは、解析装置１００のＣＰＵ１１０ａにマイクロアレイデータの解析を実行させるためのプログラムである。
【００７４】
図２は、解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第１の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。
【００７５】
測定対象の検体試料を接触させた検出用プローブおよび補正用プローブを備えたマイクロアレイを、マイクロアレイ測定装置２００にセットし、検出用プローブから発せられる第１シグナルおよび補正用プローブから発せられる第２シグナルを測定する。
【００７６】
解析装置１００のＣＰＵ１１０ａは、マイクロアレイ測定装置２００から第１シグナル測定値および第２シグナル測定値を、入出力インターフェース１１０ｆを介して受信し（ステップＳ１）、受信した第１シグナル測定値および第２シグナル測定値をハードディスク１１０ｄに記憶させる。
【００７７】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄから第２シグナル測定値を読み出して、第２シグナル測定値の統計的代表値として最頻値を算出し（ステップＳ２）、この値をバックグラウンド値として解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。上記のマイクロアレイに補正用プローブが複数存在していた場合は、複数の第２シグナル測定値から統計的代表値を算出する。
【００７８】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄから第１シグナル測定値およびバックグラウンド値を読み出し、第１シグナル測定値をバックグラウンド値で減じて、補正値を算出する（ステップＳ３）。上記のマイクロアレイに検出用プローブが複数存在していた場合は、複数の第１シグナル測定値をバックグラウンド値で減じることで、補正値を算出する。
【００７９】
ＣＰＵ１１０ａは、算出された補正値が負の値か否かを判断する（ステップＳ４）。
【００８０】
ＣＰＵ１１０ａは、ステップＳ４において算出された補正値が負の値であると判定された場合、補正値を「０」とする（ステップＳ５）。なお、ステップＳ４において算出された補正値が負の値ではないと判定された場合、算出された補正値がそのまま補正値となる。
【００８１】
ＣＰＵ１１０ａは、算出した補正値をディスプレイなどの表示部１２０に出力する（ステップＳ６）。
【００８２】
ここで、第１の実施形態では、ＣＰＵ１１０ａは、統計的代表値として最頻値を算出したが、これに限られない。統計的代表値としては、最大値、最小値、平均値、中央値または最頻値が挙げられ、好ましくは最頻値である。
【００８３】
また、第１の実施形態では、第１シグナル測定値をバックグラウンド値で減じることで補正値を算出したが、これに限られない。補正値は、第１シグナル測定値をバックグラウンド値で除して算出してもよい。好ましくは、第１シグナル測定値からバックグラウンド値を減じることにより、第１シグナルの補正値を算出する。
【００８４】
図３は、バックグラウンド補正のための特別なプローブがあらかじめ特定されていないマイクロアレイを用いた場合の、解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第２の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。ここで、認識配列およびマイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列のデータは、ハードディスク１１０ｄに予め記憶されている。
【００８５】
測定対象の検体試料を接触させたマイクロアレイを、マイクロアレイ測定装置２００にセットし、プローブから発せられるシグナルを測定する。
【００８６】
解析装置１００のＣＰＵ１１０ａは、マイクロアレイ測定装置２００からシグナル測定値を、入出力インターフェース１１０ｆを介して受信し（ステップＳａ）、これらを解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。
【００８７】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄから認識配列およびマイクロアレイのプローブの塩基配列を読み出し、認識配列に相補的な塩基配列（以下、「相補配列」ともいう）を含まないプローブを補正用プローブとして選択し（ステップＳｂ）、選択したプローブを解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。この処理により、マイクロアレイのプローブから、補正用プローブが選択される。
【００８８】
ＣＰＵ１１０ａは、シグナル測定値をハードディスク１１０ｄから読み出し、検出用プローブから得られた第１シグナル測定値、および選択された補正用プローブから得られた第２シグナル測定値を取得し（ステップＳ１）、これらの値を解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。
【００８９】
ステップＳ１以降のＣＰＵ１１０ａの処理手順は、第１の実施形態で述べたステップＳ２〜ステップＳ６と同様である。
【００９０】
ここで、第２の実施形態では、認識配列およびマイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列のデータはハードディスク１１０ｄに予め記憶されていたが、これに限られない。例えば、ＣＰＵ１１０ａは、入力デバイスから入力された認識配列のデータを、入出力インターフェース１１０ｆを介して受信することもできる。また、ＣＰＵ１１０ａは、外部記憶装置に記憶されたマイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列のデータを、インターネットに接続された入出力インターフェース１１０ｆを介して受信することもできる。さらに、ＣＰＵ１１０ａは、可搬型記憶媒体１４０に記録された認識配列およびマイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列のデータを読出装置で読み出すことで、これらを受付けることもできる。
【００９１】
また、ハードディスク１１０ｄには、検体試料に含まれる核酸の由来となる生体のゲノムＤＮＡの塩基配列がさらに記憶されていてもよい。この場合、ステップＳｂにおいて、ＣＰＵ１１０ａは、認識配列およびゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて、マイクロアレイのプローブから補正用プローブを選択する。
【００９２】
上記のとおり、補正用プローブがハイブリダイズする検体試料中の核酸も、認識配列を含まないことが好ましい。そのため、ゲノムＤＮＡの塩基配列の情報を用いれば、プローブがハイブリダイズする領域の近傍に認識配列を含まないゲノムＤＮＡとハイブリダイズするプローブを、補正用プローブとして選択できる。
【００９３】
また、第３の実施形態では、補正用プローブに加えて検出用プローブの選択を解析装置１００のＣＰＵ１１０ａに実行させることもできる。この場合、上記のステップＳｂにおいてＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄからゲノムＤＮＡの塩基配列をさらに読み出し、認識配列およびゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて、マイクロアレイのプローブから検出用プローブを選択する。
【００９４】
本実施形態のアプリケーションプログラム１４０ａは、検体試料と対照試料とを別々に複数のマイクロアレイに供して、対象核酸を検出する方法を解析装置１００のＣＰＵ１１０ａに実行させることもできる。
【００９５】
図４は、２つの同一のマイクロアレイ（マイクロアレイＡおよびＢ）を用いた場合の、解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第３の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。
【００９６】
検体試料を接触させた検出用プローブおよび補正用プローブを備えたマイクロアレイＡを、マイクロアレイ測定装置２００にセットし、検出用プローブから発せられる第１検体シグナルおよび補正用プローブから発せられる第２検体シグナルを測定する。同様に、対照試料を接触させた検出用プローブおよび補正用プローブを備えたマイクロアレイＢを、マイクロアレイ測定装置２００にセットし、検出用プローブから発せられる第１対照シグナルおよび補正用プローブから発せられる第２対照シグナルを測定する。
【００９７】
解析装置１００のＣＰＵ１１０ａは、マイクロアレイ測定装置２００から、第１検体シグナル測定値、第２検体シグナル測定値、第１対照シグナル測定値および第２対照シグナル測定値を、入出力インターフェース１１０ｆを介して受信し（ステップＳ１’）、これらシグナル測定値をコンピュータのハードディスク１１０ｄに記憶する。
【００９８】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄから第２検体シグナル測定値および第２対照シグナル測定値を読み出して、これらシグナル測定値の統計的代表値として最頻値を算出し（ステップＳ２’）、これらの値をそれぞれ検体バックグラウンド値および対照バックグラウンド値として解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。上記のマイクロアレイＡおよびＢに補正用プローブが複数存在していた場合は、複数の第２検体シグナル測定値および第２対照シグナル測定値から、それぞれの統計的代表値として最頻値を算出する。
【００９９】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄから第１検体シグナル測定値および検体バックグラウンド値を読み出し、第１検体シグナル測定値から検体バックグラウンド値を減じて検体補正値を算出する。同様に、ＣＰＵ１１０ａは対照補正値も算出する（ステップＳ３’）。上記のマイクロアレイＡおよびＢに検出用プローブが複数配置されていた場合は、複数の第１検体シグナル測定値および第１対照シグナル測定値をそれぞれ検体バックグラウンド値および対照バックグラウンド値で減じて、それぞれ補正値を算出する。
【０１００】
ＣＰＵ１１０ａは、算出された補正値が負の値か否かを判断する（ステップＳ４’）。
【０１０１】
ＣＰＵ１１０ａは、ステップＳ４’において算出された補正値が負の値であると判定された場合、補正値を「０」とする（ステップＳ５’ａ）。なお、ステップＳ４’において算出された補正値が負の値ではないと判定された場合、算出された補正値がそのまま補正値となる。
【０１０２】
ＣＰＵ１１０ａは、検体補正値を対照補正値で除してＳ／Ｎ比を算出し、検体補正値および対照補正値からウィルコクソンの符号順位検定によって有意確率を算出する（ステップＳ６’）。これらの値は、上記の２つのマイクロアレイを用いる場合の本実施形態の方法の工程（５）において述べたことと同様にして取得される。
【０１０３】
ＣＰＵ１１０ａは、算出した解析値をディスプレイなどの表示部１２０により出力する（ステップＳ７’）。
【０１０４】
図５は、バックグラウンド補正のための特別なプローブがあらかじめ特定されていないマイクロアレイＡおよびＢを用いた場合の、解析装置１００のＣＰＵ１１０ａによる、第４の実施形態のマイクロアレイデータ解析の処理を示すフローチャートである。ここで、認識配列およびマイクロアレイに配置されたプローブの塩基配列のデータは、ハードディスク１１０ｄに予め記憶されている。
【０１０５】
検体試料を接触させたマイクロアレイを、マイクロアレイ測定装置２００にセットし、プローブから発せられるシグナルを測定する。
【０１０６】
検体試料を接触させたマイクロアレイＡをマイクロアレイ測定装置２００にセットし、プローブから発せられる検体シグナルを測定する。同様に、対照試料を接触させたマイクロアレイＢをマイクロアレイ測定装置２００にセットし、プローブから発せられる対照シグナルを測定する。
【０１０７】
解析装置１００のＣＰＵ１１０ａは、マイクロアレイ測定装置２００から検体シグナル測定値および対照シグナル測定値を、入出力インターフェース１１０ｆを介して受信し（ステップＳａ’）、これらを解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。
【０１０８】
ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄから認識配列およびマイクロアレイのプローブの塩基配列を読み出し、相補配列を含まないプローブを補正用プローブとして選択し（ステップＳｂ’）、選択したプローブを解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。この処理により、マイクロアレイのプローブから補正用プローブが選択される。
【０１０９】
ＣＰＵ１１０ａは、検体シグナル測定値および対照シグナル測定値をハードディスク１１０ｄから読み出し、検出用プローブから得られた第１検体シグナル測定値および第１対照シグナル測定値、ならびに選択された補正用プローブから得られた第２検体シグナル測定値および第２対照シグナル測定値を取得し（ステップＳ１’）、これらの値を解析装置１００のハードディスク１１０ｄに記憶する。
【０１１０】
ステップＳ１’以降のＣＰＵ１１０ａの処理手順は、第３の実施形態で述べたステップＳ２’〜ステップＳ７’と同様である。
【０１１１】
また、第４の実施形態では、補正用プローブに加えて検出用プローブの選択を解析装置１００のＣＰＵ１１０ａに実行させることもできる。この場合、上記のステップＳｂ’において、ＣＰＵ１１０ａは、ハードディスク１１０ｄからゲノムＤＮＡの塩基配列をさらに読み出し、認識配列およびゲノムＤＮＡの塩基配列に基づいて、マイクロアレイのプローブから検出用プローブを選択する。
【０１１２】
以下に、本発明について実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１３】
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸の検出を、本発明による解析方法と従来法としてのAffymetrix社のＴＡＳによる解析方法とで行った。本実施例では、核酸結合タンパク質は抗メチル化シトシン抗体であり、核酸結合タンパク質が結合する塩基配列はＣｐＧ配列である。
なお、本実施例での具体的な操作手順は、使用したキットおよび試薬類に添付のマニュアルの記載に従って行った。
（検体試料の調製）
（１）メチル化ＤＮＡ免疫沈降法
乳癌由来細胞株ＭＣＦ−７、ＭＢ−ＭＤＡ２３１およびＳＫ−ＢＲ−３、ならびに正常乳腺上皮細胞株ＨＭＥＣから抽出した各ゲノムＤＮＡ（４μg）を生体試料として、これ
らを制限酵素MseI（NEB社）と３７℃で一晩反応させて３００〜１０００ｂｐになるよう
に断片化した。次いで、反応後の各生体試料を９５℃で１０分間加熱して変性させ、一本鎖ゲノムＤＮＡにした。
変性させた生体試料をChromatin Immunoprecipitationアッセイキット（Upstate biotechnology社）に付属の希釈用緩衝液で希釈した。次いで、得られた各希釈液にProtein G Sepharoseビーズ（GE Healthcare社）を添加し、４℃で３０分間ローテーションした後、遠心分離することにより、該ビーズに非特異的に結合するタンパク質などを除いた。そして、遠心分離後に上清を回収し、各上清をそれぞれ二分して別々のチューブに移し、一方に抗メチル化シトシン抗体（検体試料用）を添加し、他方に正常マウスＩｇＧ抗体（Santa Cruz社；対照試料用)を添加して、４℃で一晩ローテーションした。
これらにProtein G Sepharoseビーズ（GE Healthcare社）を添加して４℃で１時間ローテーションして、上記の抗体とこれらが結合するゲノムＤＮＡとの複合体をビーズに結合
させた。その後、これらを遠心分離して、上清を除いてビーズを回収した。回収したビーズをアッセイキットに付属の洗浄用緩衝液で洗浄した後、免疫沈降させた複合体中のゲノムＤＮＡを溶出用緩衝液で溶出した。
上記のメチル化ＤＮＡ免疫沈降法で得たゲノムＤＮＡを、プロテイナーゼＫと反応させた後、Qiaquick PCR purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製して、検体試料およ
び対照試料を得た。
【０１１４】
（２）検体試料の確認
上記（１）のメチル化ＤＮＡ免疫沈降法によりメチル化ＤＮＡを特異的に回収できたかを確認するためにＰＣＲ法およびアガロース電気泳動法を行った。
（i）ＰＣＲ反応液の調製
下記の試薬を混合し、２５μlの反応液を調製した。
2x fastStart SYBR Green Master Mix（ROCHE社）          １２．５μl
フォワード（Ｆ）−プライマー（１０μM）                      １μl
リバース（Ｒ）−プライマー（１０μM）                        １μl
ゲノムＤＮＡ（０．４ ng/μl）                                １μl
ｄＨ2Ｏ                                                  ９．５μl
【０１１５】
用いたプライマーの配列は、下記のとおりである。
ＧＳＴＰ１のプライマーとして、
F: GAGGCCTTCGCTGGAGTT（配列番号１）
R: GTACTCACTGGTGGCGAAGA（配列番号２）
ＥＲのプライマーとして、
F: GCCTACGAGTTCAACGCCG（配列番号３）
R: AACGCCGCAGCCTCAGAC（配列番号４）
ｃｈ１４−ｃｇｆ１のプライマーとして、
F: GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC（配列番号５）
R: CCCACACTCCATTTCCATTCCTC（配列番号６）
（ii）ＰＣＲ反応条件
上記の反応液を用い、下記の条件でＰＣＲを行った。
９５℃で１０分、
９５℃で３０秒、６６℃で１５秒、７２℃で３０秒を４５サイクル、
９５℃で１分、６６℃で３０秒、９５℃で３０秒を１サイクル。
（iii）アガロース電気泳動
上記の各ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、増幅した核酸を確認した。
【０１１６】
ＧＳＴＰ１遺伝子は、そのプロモーター領域がＭＣＦ−７細胞においてメチル化修飾を受けるが、ＭＢ−ＭＤＡ２３１細胞およびＨＭＥＣ細胞ではメチル化修飾を受けないことが知られている遺伝子である。また、ＥＲ遺伝子は、そのプロモーター領域がＳＫ−ＢＲ−３細胞においてメチル化修飾を受けるが、ＭＣＦ−７細胞ではメチル化修飾を受けないことが知られている遺伝子である。ｃｈ１４−ｃｇｆ１遺伝子は、メチル化修飾を受けないことが知られている遺伝子である。
【０１１７】
これらのＰＣＲにより得られた増幅産物を、アガロース電気泳動に供したゲルの写真を図６に示す。
図６より、ＭＣＦ−７細胞のＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のメチル化ＤＮＡが、抗メチル化シトシン抗体を用いた免疫沈降法により特異的に回収されたことが示された。
【０１１８】
（３）検体試料中の核酸の増幅および標識
上記検体試料および対照試料に含まれる核酸を、WT-Ovation（商標）Pico RNA Amplification System Version 1.0（NuGEN社）を用いて増幅した。次いで、各試料の吸光度（２６０ nmおよび２８０ nm）を測定して増幅した核酸の濃度を確認した。
そして、上記で増幅した検体試料および対照試料に含まれる核酸を、FL-Ovation（商標）cDNA Biotin Module V2（NuGEN社）を用いて断片化およびビオチン標識を行った。
【０１１９】
（マイクロアレイ解析）
（１）試料とマイクロアレイとの接触
上記で調製した検体試料および対照試料を、マイクロアレイとしてのGeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させて、マイクロアレイのプローブとのハイブリダイゼーションを行った。検体試料および対照試料について、同種のマイクロアレイを１つずつ用いた。各試料の接触後の染色および洗浄を行った。洗浄後のマイクロアレイを、GeneChip（登録商標）AutoLoader（Affymetrix社）にセットし、GeneChip（登録商標）Scanner 3000 7G（Affymetrix社）を用いてスキャン（シグナルの測定）を行った。スキャンの結果は、Affymetrix社から提供されているコンピューターワークステーションで処理し、実験データとしてバイナリファイル（ＣＥＬファイル）を取得した。なお、ハイブリダーゼーションから実験データ取得まで、Affymetrix社から提供されるマニュアルに従って行った。
【０１２０】
（２）従来法（ＴＡＳ）によるデータ解析
検体試料および対照試料から得たＣＥＬファイルに基づき、ＴＡＳ（Affymetrix社）を用いてシグナル測定値および有意確率を取得した。得られた有意確率は、標準ブラウザーであるIntegrated Genome Browser（ＩＧＢ；Affymetrix社）を用いて棒グラフとして可視化することができる。ＩＧＢに表示される有意確率は、（変換値）= -10 log10（有意確率）の式で変換されており、その変換値が２０以上の場合に対象核酸を有意に検出できたと考えられる。
しかし、本実施例におけるＴＡＳ解析では、ＭＣＦ−７細胞においてメチル化修飾を受けることが知られているＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域のゲノムＤＮＡについて、ＭＣＦ−７細胞由来の検体試料からは、ＨＭＥＣ細胞およびＭＢ−ＭＤＡ２３１細胞と同様にメチル化ＤＮＡを有意に検出できなかった。
【０１２１】
（３）本発明の方法によるデータ解析
本発明の方法によってマイクロアレイデータを解析した。なお、解析には、一般的なコンピュータを用いた。
まず、コンピュータに、以下のデータを入力した。
・核酸結合タンパク質が結合する塩基配列としての“ＣＧ”
・Human Promoter 1.0R Arrayに搭載されているプローブの塩基配列
・ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列
・検体試料および対照試料から得たＣＥＬファイル
・制限酵素MseIの認識配列“ＴＡＣＣ”
・制限酵素MseIで断片化されたＤＮＡの長さとしての「３００」塩基
【０１２２】
ここで、Human Promoter 1.0R Arrayに搭載されているプローブの塩基配列は、Affymetrix社のウェブページ（http://www.affymetrix.com/Auth/analysis/downloads/lf/tiling/Hs_PromPR_v02-3_NCBIv36.bpmap.zip）より取得した。また、ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列はNCBIのftpサイト（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/H_sapiens/April_14_2003）より取得した。
【０１２３】
ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列および制限酵素MseIの認識配列“ＴＡＣＣ”から、ヒトゲノムＤＮＡの制限酵素MseI処理で得られるＤＮＡ断片の塩基配列のデータを取得した。次いで、制限酵素MseIで断片化されたＤＮＡの長さとしての「３００」塩基および得られたＤＮＡ断片の塩基配列から、３００塩基以上の塩基配列を有するＤＮＡ断片を抽出した。さらに、核酸結合タンパク質が結合する塩基配列としての“ＣＧ”および抽出した３００塩基以上の塩基配列を有するＤＮＡ断片から、塩基配列中に“ＣＧ”を含まないＤＮＡ断片の塩基配列を抽出した。ここで、抽出した「配列“ＣＧ”を含まない３００塩基以上のＤＮＡ断片の塩基配列」を以下、「断片配列」ともいう。
【０１２４】
核酸結合タンパク質が結合する塩基配列としての“ＣＧ”およびHuman Promoter 1.0R Arrayに搭載されているプローブの塩基配列から、“ＣＧ”配列を含まないプローブを取得した。次に、取得した“ＣＧ”配列を含まないプローブおよび断片配列から、断片配列と相補的なプローブを、補正用プローブとして抽出した。なお、補正用プローブ以外のプローブは、検出用プローブとした。
【０１２５】
検体試料および対照試料から得たＣＥＬファイルから、Cell File Conversion Toolを用いて、シグナル測定値を取得した。ここで、Cell File Conversion Toolは、Yvert Labのウェブページ（http://www.ens-lyon.fr/LBMC/gisv/index.php?option=com_content&task=view&id=37&Itemid=27）から入手した。取得したシグナル測定値および検出用プローブの情報から、検体試料と接触させたHuman Promoter 1.0R Arrayの検出用プローブから得られた第１検体シグナル測定値を抽出した。同様に、対照試料と接触させたHuman Promoter 1.0R Arrayの検出用プローブから得られた第１対照シグナル測定値を抽出した。また、取得したシグナル測定値および補正用プローブの情報から、検体試料と接触させたHuman Promoter 1.0R Arrayの補正用プローブから得られた第２検体シグナル測定値を抽出した。同様に、対照試料と接触させたHuman Promoter 1.0R Arrayの補正用プローブから得られた第２対照シグナル測定値を抽出した。
【０１２６】
第２検体シグナル測定値の最頻値を、検体バックグラウンド値として算出した。また、第２対照シグナル測定値の最頻値を、対照バックグラウンド値として算出した。
【０１２７】
次に、第１検体シグナル測定値から検体バックグラウンド値を減じて、検体補正値を算出した。また、第１対照シグナル測定値から対照バックグラウンド値を減じて、対照補正値を算出した。
【０１２８】
算出した検体補正値が負の値であれば、検体補正値を０とした。検体補正値が負の値でなければ、そのままの値とした。同様に、算出した対照補正値が負の値であれば、対照補正値を０とした。対照補正値が負の値でなければ、そのままの値とした。
【０１２９】
検体補正値を対照補正値で除して、バックグラウンド補正後のＳ／Ｎ比を算出した。ただし、対照補正値が０の場合は、そのプローブについてはＳ／Ｎ比を算出しなかった。また、バックグラウンド補正をしていない場合のＳ／Ｎ比として、第１検体シグナル測定値を第１対照シグナル測定値で除した値を算出した。
さらに、検体補正値および対照補正値からウィルコクソンの符号順位検定によって、有意確率を算出した。
【０１３０】
図７および図８に、それぞれＭＣＦ−７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞からの検体試料の解析結果（Ｓ／Ｎ比および有意確率）についてのグラフを示す。図７のグラフは、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域について連続する１０プローブについてのＳ／Ｎ比および有意確率の平均値を示し、図８のグラフは、ＥＲ遺伝子のプロモーター領域について連続する７プローブについてのＳ／Ｎ比および有意確率の平均値を示す。
本発明の方法により算出した有意確率の平均値は、上記のいずれのプロモーター領域についても０．０１以下であった。
図７および８より、本発明の方法は、従来法であるＴＡＳ解析よりもＳ／Ｎ比を向上させ、有意確率が顕著に低くなり、高精度にメチル化遺伝子を検出できることが明らかとなった。
【実施例２】
【０１３１】
GeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）には、クオリティチェックコントロールプローブとしてPoly-Aコントロールおよびハイブリダイゼーションコントロールが複数配置されている。これらのコントロールプローブは、外部コントロールであり、動物由来の核酸とはハイブリダイゼーションしないことに基づいて配置されている。
そこで、コントロールプローブとしてのPoly-Aコントロールおよびハイブリダイゼーションコントロールプローブに本発明の方法を適用した。つまり、これらコントロールプローブから核酸結合タンパク質としての抗メチル化シトシン抗体が結合するＣｐＧ配列を含まないプローブを抽出し、それらを補正用プローブとして用いることで、より高い精度でＣｐＧ配列を含む対象核酸を検出できるか否かを検討した。
【０１３２】
検体試料および対照試料は、ＭＣＦ−７細胞から実施例１と同様にして調製した。次いで、検体試料および対照試料を実施例１と同様にして、それぞれGeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させ、各シグナル測定値を得た。
各マイクロアレイのプローブからPoly-Aコントロールおよびハイブリダイゼーションコントロールのプローブを抽出し、さらにこれらのプローブから、ＣｐＧ配列を含まないプローブ（以下、「補正用プローブＣ」ともいう）を抽出した。なお、比較として、Poly-Aコントロールおよびハイブリダイゼーションコントロールからなるコントロールプローブを、補正用プローブＤとした。
【０１３３】
検体試料を接触させたマイクロアレイにおいて、補正用プローブＣから得られたシグナル測定値の最頻値をバックグラウンド値Ｃとした。また、補正用プローブＤから得られたシグナル測定値の最頻値をバックグラウンド値Ｄとした。
次いで、第１検体シグナル測定値からバックグラウンド値Ｃを減じて、検体補正値Ｃを算出した。また、第１検体シグナル測定値からバックグラウンド値Ｄを減じて、検体補正値Ｄを算出した。
対照試料を接触させたマイクロアレイにおいても上記と同様にして、対照補正値Ｃおよび対照補正値Ｄを算出した。
【０１３４】
上記で算出した検体補正値Ａおよび対照補正値Ａ、ならびに検体補正値Ｂおよび対照補正値Ｂを、それぞれ一対の標本としてウィルコクソンの符号順位検定により有意確率をそれぞれ算出した。
【０１３５】
図９に、補正用プローブＣおよびＤのそれぞれでバックグラウンド補正した場合の有意確率をグラフで示した。グラフは、ＧＳＴＰ１の連続した１０プローブについての有意確率の平均値である。
図９より、ＣｐＧ配列を含む補正用プローブＤによるバックグラウンド補正では有意確率が０．００８よりも高いが、ＣｐＧ配列を含まない補正用プローブＣによるバックグラウンド補正では有意確率が０．００８よりも低くなり、より精度の高い検出が可能となることが明らかとなった。
【０１３６】
マイクロアレイによる対象核酸の検出を創薬ターゲットの探索や疾患の診断などに応用する場合は、その検出結果には高い信頼性が求められる。したがって、データの有意確率はできる限り低い値であることが好ましい。
よって、検体試料中の核酸に相補的ではないプローブを補正用プローブとして用いるバックグラウンド補正よりも、そのプローブからさらにＣｐＧ配列を含まないプローブを抽出し、抽出したプローブを補正用プローブとして用いるバックグラウンド補正の方が有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明の方法は、検体試料から核酸結合タンパク質が結合する塩基配列を含む対象核酸を検出するマイクロアレイ実験において、高精度の検出結果を提供できるので、創薬ターゲットの探索や疾患の診断などの産業上の分野に利用可能である。
【符号の説明】
【０１３８】
１００    解析装置
１１０    本体
１１０ａ  ＣＰＵ
１１０ｂ  ＲＯＭ
１１０ｃ  ＲＡＭ
１１０ｄ  ハードディスク（ＨＤ）
１１０ｅ  読出装置
１１０ｆ  入出力インターフェース
１１０ｇ  画像出力インターフェース
１１０ｈ  バス
１２０    表示部
１３０    入力デバイス
１４０    可搬型記憶媒体
１４０ａ  アプリケーションプログラム
２００    測定装置
３００    ケーブル
【図１】
2011217726.tif 000004
【図２】
2011217726.tif 000005
【図３】
2011217726.tif 000006
【図４】
2011217726.tif 000007
【図５】
2011217726.tif 000008
【図７】
2011217726.tif 000009
【図８】
2011217726.tif 000010
【図９】
2011217726.tif 000011
【図１０】
2011217726.tif 000012
【図６】
2011217726.tif 000013
【配列表】
2011217726000001.app