(57)【要約】【課題】本発明は、脳卒中や心筋梗塞などの組織障害の改善に実際に有効であり、安全に投与できる組織障害改善剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の組織障害改善剤は、インターロイキン３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とすることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする組織障害改善剤。
【請求項２】
注射剤である請求項１に記載の組織障害改善剤。
【請求項３】
皮下注射するためのものである請求項２に記載の組織障害改善剤。
【請求項４】
インターロイキン３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の両方を含む請求項１〜３のいずれかに記載の組織障害改善剤。
【請求項５】
体重１ｋｇ当たり５μｇ以上、３０μｇ以下のインターロイキン３および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子をそれぞれ１日１回投与するためのものである請求項１〜４のいずれかに記載の組織障害改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織障害を改善するための薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、脳卒中は、がんと心臓病に続いて日本における死因の第三位となっており、あるデータによれば患者数は約１５０万人といわれ、毎年約２５万人ずつ増えている。脳卒中としては、かつては脳出血やくも膜下出血が多かったが、高齢者の増加や高脂血症などの生活習慣病の増加により、近年は脳梗塞が増えてきている。将来、特に脳梗塞の増加が見込まれ、脳卒中患者はさらに増加すると考えられている。
【０００３】
脳卒中の問題点としては、それ自体が致死的な疾患であること以外に、死に至らない場合であっても脳組織が損傷し、重篤な障害が残ることがある。脳卒中以外にも、例えば外的要因などにより脳や脊髄などの中枢神経が損傷すると、同様に後遺症が残り得る。そのため、中枢神経の障害後における神経細胞の保護や修復促進に有効な薬剤などの開発は、格別強く望まれているところである。
【０００４】
また、中枢神経においては神経細胞同士が神経突起により機能的に連結されているために、ある箇所が損傷すると、その数週間も経過後、機能的に連関する遠隔部位においても変性が生じる。かかる変性を二次変性といい、一次的な変性と共に大きな問題である。しかし、二次変性を抑制するための有効な薬剤も未だ知られていない。
【０００５】
中枢神経障害の他、心筋梗塞や外傷性臓器障害などの組織障害においては、マクロファージなど大量の白血球が骨髄から移動し、激しく増殖する。例えば、本発明者らは、マクロファージが共通して発現するＩｂａ１と、脳の幹細胞が発現するＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカンという二種類のタンパク質を発現する細胞が脳の虚血部位において増加することを見出し、かかる細胞をＢＩＮＣｓ（Brain Iba1+/NG2+ Cells）と名付けた（非特許文献１）。ＢＩＮＣｓは、脳のみならず他の様々な組織障害で出現し且つ骨髄由来であることから、現在ではBone marrow-derived Iba1+/NG2+ Cellsの略称として用いられている。
【０００６】
これらの細胞群は、一般的に、炎症を促進し組織を破壊するものとして認識されてきた。よって、臓器障害に対しては、ステロイドをはじめとする抗炎症剤を用い、白血球の侵入やその働きを抑制することが行なわれてきた。その一方で、障害組織の再生修復を促進するために、様々な成長因子やサイトカインを遺伝子工学的技術により強制的に発現させたり或いは投与することも研究されている。
【０００７】
例えば、非特許文献２には、Ｔ細胞から分泌されるサイトカインであるインターロイキン３（以下、「ＩＬ−３」という場合がある）を、脳血管閉塞の２時間前またはそのわずか３分後に脳内へ単独で直接注入することにより、脳梗塞が改善することが記載されている。
【０００８】
また、非特許文献３に記載の実験では、脳血流の遮断から１時間後に、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（以下、「ＧＭ−ＣＳＦ」という場合がある）を投与している。非特許文献３によれば、神経細胞はＧＭ−ＣＳＦに対する受容体を発現しており、ＧＭ−ＣＳＦは神経細胞における抗アポトーシス因子であるＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現を誘導し、脳梗塞による障害を軽減するとされている。
【０００９】
上記サイトカイン以外にも、非特許文献４〜７のとおり、様々なタンパク質性成長因子に神経細胞保護作用のあることが報告されている。例えば、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、骨形成因子７（ＢＭＰ７）などである。これら成長因子は、梗塞を起こした脳内に投与されたり或いは遺伝子工学的手法により発現されることにより、脳障害を軽減すると報告されている。
【００１０】
また、上記ＩＬ−３やＧＭ−ＣＳＦは、単核貪食細胞の活性化や、造血前駆細胞であるＣＤ３４陽性細胞の増殖のために用いられることが特許文献１〜２に記載されている。これら単核貪食細胞とＣＤ３４陽性細胞は、それぞれ中枢神経軸策の再生の促進と、損傷組織の復元、修復、再生のために用いられている。また、特許文献３には、酸で修飾されたアラビノガラクタンタンパク質の組成物であって、ＩＬ−３やＧＭ−ＣＳＦなどの産生を刺激するものが開示されている。当該組成物は、放射線や細胞障害性薬の曝露からの回復などに有用であるとされている。
【００１１】
しかし、これら特許文献１〜３には、ＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−３を生体に投与することは一切記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２００１−５１５５０５号公報
【特許文献２】特表２００７−５３６９３６号公報
【特許文献３】特表２００４−５０２７０３号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Hiroaki MATSUMOTO，他８名，ジャーナル・オブ・セレブラル・ブラッド・フロウ・アンド・メタボリズム（Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism），２８，第１４９〜１６３頁（２００８年）
【非特許文献２】Tong-Chun WEN，他９名，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine），１８８，第６３５〜６４９頁（１９９８年）
【非特許文献３】Wolf-Ru diger Schabitz，他１２名，ジャーナル・オブ・セレブラル・ブラッド・フロウ・アンド・メタボリズム（Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism），２８，第２９〜４３頁（２００８年）
【非特許文献４】HAYASHI，他９名，ジーン・セラピー（Gene Therapy），８，第１１６７〜１１７３頁（２００１年）
【非特許文献５】Ming-Zhu Zhaol，他１６名，ジャーナル・オブ・セレブラル・ブラッド・フロウ・アンド・メタボリズム（Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism），２６，第１１７６〜１１８８頁（２００６年）
【非特許文献６】Wei Zhu，他７名，ストローク（Stroke），３９，第１２５４〜１２６１頁（２００８年）
【非特許文献７】Jenny Chou，他５名，ジャーナル・オブ・ザ・ニューロロジカル・サイエンシーズ（Journal of the Neurological Sciences），２４０，第２１〜２９頁（２００６年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、従来、中枢神経細胞死を抑制するための手段として、ＩＬ−３やＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインを投与するアイデアはあった。
【００１５】
しかしこれらアイデアが記載されている先行技術文献においては、おそらく学術的な興味のみから、サイトカインは梗塞等による組織障害の発生直後や、場合によっては障害発生前に投与されている。このような投与は、実際の臨床現場では到底不可能である。
【００１６】
また、ＩＧＦ−Ｉ、ＨＧＦ、ＢＭＰ７などの成長因子は、顕著な脳保護作用を示すことが報告されている。実際、それぞれの成長因子を直接脳内に投与したり、或いは遺伝子工学的に神経組織病巣内で強制的に発現させることにより、脳脊髄障害を有する実験動物では、障害の改善が見られている。
【００１７】
しかし実際の臨床において、頭蓋骨に穴を開けて成長因子を投与したり、安全性が確立されていないウィルスベクターなどを用いることは、同様に不可能であるといわざるを得ない。
【００１８】
本発明は上記の様な事情に着目してなされたものであって、その目的は、脳卒中や心筋梗塞などの組織障害の改善に実際に有効であり、安全に投与できる組織障害改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦの両方を有効成分とする薬剤であれば、それぞれを単独で投与する場合に比べて組織障害に対する改善効果が高い上に、脳内などへ直接投与しなくても皮下投与などで十分に効果が得られることを見出して、本発明を完成した。
【００２０】
本発明の組織障害改善剤は、インターロイキン３（ＩＬ−３）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を有効成分とすることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る組織障害改善剤の剤形としては注射剤が好適であり、さらに皮下注射するためのものが好ましい。本発明の有効成分であるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦはタンパク質であることから、注射投与が好適である。また、本発明の組織障害改善剤は病巣内へ直接投与してもよいが、特に脳卒中の病巣内へ直接投与する場合には脳を傷付けるおそれがある。よって、そのような場合には皮下注射などが好ましく、また、本発明の組織障害改善剤は、血液脳関門にもかかわらず、皮下注射によっても脳損傷を改善できることが実験的に証明されている。
【００２２】
本発明の組織障害改善剤としては、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方を含むものがより好適である。かかる組織障害改善剤によれば、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ別に投与しなくても、同時に投与できるため利便性が高い。
【００２３】
本発明の組織障害改善剤は、患者に対して、体重１ｋｇ当たり５μｇ以上、３０μｇ以下のＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ１日１回投与することが好ましい。実験結果より、かかる投与量であれば十分に組織障害を改善することができ得る。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る組織障害改善剤によれば、脳や脊髄における中枢神経障害、並びに肝臓損傷や心筋梗塞などの臓器障害の発症後においても、損傷などを改善し、症状を緩和することができる。特に、本発明の組織障害改善剤は、いったん死ぬと回復し難いといわれている脳細胞の障害を抑制し、運動機能や体重を回復できることが実証されている。よって本発明は、上記組織障害を顕著に改善できるものとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、針で損傷した肝臓におけるＩｂａ１とＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現を示す免疫染色写真である。図１（１）は抗Ｉｂａｌ抗体で免疫染色した写真、図１（２）は抗ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体で免疫染色した写真、図１（３）は上記写真を重ね合わせたものである。
【図２】図２は、脳損傷部位のＡＣ、ＭＧおよびＢＩＮＣｓにおける各神経細胞保護因子の受容体の発現状況を示すグラフである。図２中、「ＡＣ」と「ＭＧ」は、それぞれ神経細胞保護作用を示す細胞であるアストロサイトとマイクログリアを示す。
【図３】図３は、培養した脳細胞に傷を付け、その後の回復状況を観察した写真である。図３Ａは何も添加しない対照であり、図３ＢはＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦを添加した例であり、図３ＣはＢＩＮＣｓを添加した例であり、図３ＤはＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦに加えてＢＩＮＣｓを添加した例である。
【図４】図４は、脳の損傷部位に集積したＢＩＮＣｓに対し、生理食塩水、または本発明に係る組織障害改善剤の有効成分であるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦを添加した場合における幹細胞成長因子（ＨＧＦ）とインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）の発現状況を比較するためのグラフである。
【図５】図５は、脳損傷したラットに対して生理食塩水を投与した群（対照）、本発明に係る組織障害改善剤を皮下注射した群、および脳損傷しない群（正常対照）において、運動機能を比較するためのグラフである。
【図６】図６は、脳損傷したラットに対して生理食塩水を投与した群（対照，（１））と、本発明に係る組織障害改善剤を皮下注射した群（（２））の、脳スライスの写真である。
【図７】図７は、脳損傷したラットに対して生理食塩水を投与した群（対照）および本発明に係る組織障害改善剤を皮下注射した群において、脳の喪失体積を比較するためのグラフである。
【図８】図８は、脳損傷したラットに対して生理食塩水を投与した群（対照）と、本発明に係る組織障害改善剤を皮下注射した群において、脳損傷以降のラットの体重の変化を比較するためのグラフである。
【図９】図９は、脳損傷したラットに対して生理食塩水を投与した群（対照）、本発明に係る組織障害改善剤を皮下注射した群、ＩＬ−３を単独投与した群、およびＧＭ−ＣＳＦを単独投与した群において、生存率の変化を比較するためのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の組織障害改善剤は、インターロイキン３（ＩＬ−３）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を有効成分とする。
【００２７】
ＩＬ−３は、活性化Ｔヘルパー細胞から産生されるリンホカインであり、造血幹細胞およびそれに由来するマクロファージなどの増殖と分化を誘導する。
【００２８】
ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−３と同様に、主に活性化Ｔヘルパー細胞から分泌されるリンホカインであり、顆粒球とマクロファージ系前駆細胞に作用し、その分化と成熟を促進する。
【００２９】
本発明者の知見によれば、組織障害部位で増殖するＢＩＮＣｓにはＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方の受容体が発現していることから、本発明に係る有効成分であるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは、協同してＢＩＮＣｓに何らかの作用を相乗的に及ぼし、組織障害を顕著に改善すると考えられる。また、ＩＬ−３は多能性幹細胞の分化誘導活性を有するのに対して、ＧＭ−ＣＳＦはより高次の分化段階にある細胞に作用する。よって、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは、協同して組織障害の修復改善に有用な細胞の増殖や分化を促進している可能性もある。実際、脳細胞はいったん損傷すると回復は極めて難しいといわれているが、脳損傷後に本発明の組織障害改善剤を投与したところ、損傷部位が低減されて運動機能や体重が回復したことが実験的に確認されている。
【００３０】
本発明に係るＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは、投与対象由来のものを用いることが好ましい。即ち、ヒトを投与対象とする場合には、ヒト由来のＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦを用いるものとする。
【００３１】
ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは、通常の遺伝子組換法により製造することが可能である。例えば、ヒトのＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの遺伝子は、第５染色体上に互いに近接して存在するので、これら遺伝子を同時に或いは別々にＰＣＲ法により増幅し、得られた遺伝子をプラスミドベクターやウィルスベクターで大腸菌などに導入して生産させ、分離精製すればよい。或いは、血液や尿などＩＬ−３やＧＭ−ＣＳＦが含まれている材料から分離精製してもよいし、市販のものがあれば購入して使用してもよい。また、小麦胚芽無細胞タンパク質合成技術を用い、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦを調製してもよい。
【００３２】
本発明剤の有効成分であるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦはタンパク質であることから、本発明の組織障害改善剤の剤形としては、注射剤や経粘膜剤が好適である。
【００３３】
注射剤や経粘膜剤の溶媒は、製薬上許容されるものであれば特に制限されないが、例えば、生理食塩水、純水、超純水、蒸留水、滅菌水などを用いることができる。なお、特に注射剤の調製において純水等を用いる場合には、塩を添加することにより、その浸透圧を血液と同一または略同一にすることが好ましい。
【００３４】
経粘膜剤としては、経鼻剤や吸入剤などの液状剤、舌下剤や口中貼付剤などの錠剤などがあるが、利便性の点から経鼻剤が好適である。
【００３５】
本発明に係る液状の組織障害改善剤におけるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの濃度は適宜調整すればよいが、例えば、それぞれ０．００５ｍｇ／ｍＬ以上、５ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることが好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下程度がより好ましい。
【００３６】
本発明の組織障害改善剤におけるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの量も適宜調整すればよいが、本発明では両者を相乗的に障害部位へ作用させて高い改善効果を得るので、好適にはＩＬ−３を１質量部とした場合のＧＭ−ＣＳＦの割合を０．７質量部以上、１．３質量部以下程度とし、０．８質量部以上、１．２質量部以下程度がより好ましく、０．９質量部以上、１．１質量部以下がさらに好ましい。
【００３７】
本発明に係る組織障害改善剤の製剤形態は、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方を含むものと、それぞれの有効成分を含む製剤を合わせてキットとしたものとがあるが、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方を含むものがより好ましい。製造時の利便性等に加え、これら有効成分の相乗効果が安定して速やかに発揮されるからである。
【００３８】
本発明においては、安定性の点から、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦは凍結乾燥粉末として保存しておき、用時に溶媒へ溶解して液状剤とすることが好ましい。
【００３９】
なお、通常、タンパク質製剤を皮下投与等しても、有効成分であるタンパク質は血管脳関門により脳へ到達できないので、脳障害に対するタンパク質製剤は脳へ直接投与すべきであると考えられている。しかし本発明に係る組織障害改善剤は、皮下注射によっても脳障害を改善することができる。これは、脳障害部位においては血管脳関門が破綻しているために、有効成分であるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦが血液を介して脳障害部位へ送達されることによると考えられる。
【００４０】
本発明に係る組織障害改善剤の治療対象は、脳卒中、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷などの中枢神経障害；心筋梗塞、肝臓障害などの臓器障害などの組織障害である。本発明の組織障害改善剤によれば、これら組織障害を抑制して患者を回復させ、長期予後を顕著に改善することができる。
【００４１】
従来、脳血流の遮断前またはその直後に、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦを脳内へ直接単独投与した例はある。しかし、実際の臨床では、例えば脳梗塞が起こる前やその直後に薬剤を投与することはあり得ず、薬剤の投与は早くても発症から数時間経過後になる。本発明者の実験的知見によれば、本発明に係る組織障害改善剤は、脳損傷から約５０時間後および約７０時間後に投与しても十分にその効果を発揮することができた。よって、本発明の組織障害改善剤は、実際の臨床でも十分に適用可能である。また、脳障害の発生から５０時間後ないし７０時間後という長時間経過後では、障害部位における神経細胞は完全に死滅しているはずである。それにもかかわらず、本発明に係る組織障害改善剤は脳の壊死体積を低減していることから、特に二次変性が抑制されていると考えられる。さらに、本発明に係る組織障害改善剤は、ＢＩＮＣｓを介して組織障害を改善すると考えられる。組織障害部位におけるＢＩＮＣｓの集積と増殖はおよそ７２時間以降に顕著になるため、組織障害部位におけるＢＩＮＣｓの集積や増殖に合せて本発明に係る組織障害改善剤を投与することが好ましい。但し脳障害の場合では、障害発生からあまりに時間が経ち過ぎると血液脳関門が回復する可能性があり、皮下注射や静脈注射などでは有効成分を脳障害部位に作用できないおそれがあるので、障害発生から１０日以内に薬剤を投与することが好ましい。
【００４２】
本発明に係る組織障害改善剤の投与方法は適宜選択すればよいが、例えば、皮下注射、皮内注射、静脈注射、腹腔内注射による投与や、鼻粘膜などの粘膜を介した投与の他、病巣部への直接注射による投与も可能である。但し、特に脳障害の場合には、病巣部へ直接注射すると正常部位を傷付けるおそれがあるため、他の部位から注射することが好ましい。その中でも、本発明に係る組織障害改善剤の効果は、皮下注射投与で確認されている。
【００４３】
本発明に係る組織障害改善剤の有効成分はＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦであり、これらは、その両方を含む製剤により同時に投与してもよいし、或いはそれぞれを含む製剤を連続的に、または時間をおいて逐次的に投与してもよい。
【００４４】
本発明に係る組織障害改善剤の投与量は、患者の年齢、性別、重篤度などに応じて適宜調整すればよいが、通常、１日の投与量として、患者の体重１ｋｇ当たり１０ｎｇ以上、１０ｍｇ以下程度が好ましく、１００ｎｇ以上、１００μｇ以下がより好ましく、５μｇ以上、３０μｇ以下がさらに好ましい。また、かかる投与量であれば、１日１回の投与でも十分に効果が発揮されると考えられる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００４６】
実施例１  本発明に係る組織障害改善剤の製造
大腸菌を用いて作製した遺伝子組み換えラットから単離精製されたＩＬ−３（ペプロテック社（英国）製，「Recombinant Rat IL-3（Cat # 400-03）」，１ｍｇ）と、同じく大腸菌を用いて作製した遺伝子組み換えラットから単離精製されたＧＭ−ＣＳＦ（ペプロテック社（英国）製，「Recombinant Rat GM-CSF（Cat # 400-23）」，１ｍｇ）を、注射用蒸留水（５ｍＬ）に溶解し、本発明に係る組織障害改善剤とした。なお、当該製剤におけるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの濃度は、それぞれ０．２ｍｇ／ｍＬとなる。
【００４７】
試験例１  肝障害部位へのＢＩＮＣｓの集積の証明
本発明者らは、脳損傷部位におけるＢＩＮＣｓの集積につき既に発表している。さらに、脳以外の臓器における創傷部位でもＢＩＮＣｓの集積が見られるか、実験を行った。
【００４８】
約６０日齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット３匹をペントバルビタールで深麻酔した。グルコン酸グロルヘキシジンを含む滅菌済み綿により腹部皮膚を消毒した後、メスで右季肋部腹壁を切開した。肝臓を露出させ、肝右葉に対し、１ｍＬ容のツベルクリン用シリンジに装着した２７ゲージの注射針を正面より５ｍｍの深さで３箇所刺入した。その後、速やかに腹壁を縫合した。３日後にラットをホルマリンで固定し、肝臓を取り出し、その凍結切片を作製した。得られた切片を、緑色に発色する抗Ｉｂａ１抗体と、赤色に発色する抗ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体とにより免疫染色した。結果を図１に示す。
【００４９】
図１中、（１）は抗Ｉｂａ１抗体で免疫染色した写真、（２）は抗ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体で免疫染色した写真、（３）は上記写真を重ね合わせたものであり、緑と赤が重なり合って黄色ないしオレンジ色となっている部分が両タンパク質を発現しているＢＩＮＣｓである。図１のとおり、損傷した肝臓にもＢＩＮＣｓが集積することが明らかとなった。よって、脳以外の組織においても、ＢＩＮＣｓを活性化することにより損傷が改善されると考えられる。
【００５０】
試験例２  脳損傷部由来ＢＩＮＣｓにおける受容体の発現試験
約５０日齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット３匹を一群として、合計４群、計１２匹のラットをエーテルにより深麻酔した。グルコン酸クロルヘキシジンを含む滅菌済み綿により頭蓋部皮膚を消毒した後、メスで正中切開した。大泉門（Ｂｒｅｇｍａ）を起点とし、後方に２ｍｍ、右外側に２ｍｍの位置にドリルで直径約０．８ｍｍの穴を開けた。さらに、その右外側１．５ｍｍの位置に同様に穴を開けた。１ｍＬ容のツベルクリン注射用シリンジに装着した２７ゲージの注射針を、頭蓋骨に開けた２箇所の穴から深さ４ｍｍ挿入し、約１２０°の範囲で前後に動かし、扇形に脳を損傷した。注射針を抜去した後、抗生物質を含む生理食塩水で頭蓋骨を洗浄した。切開した皮膚を瞬間接着剤で接着することにより、頭皮の傷を閉鎖した。麻酔から覚醒後、ラットの左半身は麻痺しており、体幹が左側にねじれる現象が観察された。
【００５１】
損傷作成から７日経過後にエーテルによる深麻酔下で大脳を取りだし、右大脳半球をハサミで細切し、パスツールピペットを使用してＥＤＴＡの０．２５％リン酸緩衝生理食塩水溶液中でさらに組織を粉砕した。その後１０００回転、４℃の条件で５分間遠心し、沈殿物を取得した。沈殿物を３％の牛胎仔血清を含むダルベッコの修正イーグル培養液（以下、「３％ＦＣＳ-ＤＭＥＭ」という）中に分散した。当該分散液を浮遊培養用ポリスチレンディッシュ上に流し込み、３７℃の炭酸ガスインキュベータ中で３０分間インキュベートした後に３％ＦＣＳ-ＤＭＥＭでディッシュを数回洗浄することにより非付着細胞を除去し、付着した細胞のみを得た。この付着細胞のおよそ９８％がＢＩＮＣｓである。接着した細胞から全ＲＮＡを分離し、逆転写してｃＤＮＡを得、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、各種成長因子およびサイトカインに対する受容体の発現を検討した。また、ラット新生仔脳より調製した混合脳細胞培養より採取精製したマイクログリアとアストロサイトからも全ＲＮＡを分離した後、ｃＤＮＡを調製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる比較検討を行った。すべて４例ずつの検体からｃＤＮＡを調製した。マイクログリアとアストロサイトは、共に顕著な神経細胞保護効果を有することが知られている。
【００５２】
以上の方法で調製した３種のｃＤＮＡをもとに、幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の各受容体ｍＲＮＡの発現を調べた。その結果を図２に示す。ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、ＢＩＮＣｓとマイクログリアにおいて、アストロサイトに対してそれぞれ危険率Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０５で有意に強発現した。Ｍ−ＣＳＦ受容体は、ＢＩＮＣｓとマイクログリアにおいて、アストロサイトに対してそれぞれ危険率Ｐ＜０．０５で有意に強発現した。Ｇ−ＣＳＦ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦの各受容体は、アストロサイトにおいて、他の二種の細胞に対して有意に強発現していた。この結果から、三種の細胞のうちＢＩＮＣｓは、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方の受容体を他の細胞腫に比べ有意に強発現する傾向を有することが判明した。よって、ＢＩＮＣｓへＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方を作用させることにより、ＢＩＮＣｓの細胞保護作用を顕著に向上させ得ることが予想できる。
【００５３】
試験例３  損傷脳細胞の改善試験
妊娠１７日のＷｉｓｔａｒ系ラットをエーテルで深麻酔した後、子宮を摘出して胎仔を取りだした。胎仔の全脳を摘出し、１６０μｍの方形の穴が開いたナイロンメッシュを用いて作成した約５ｃｍ×３ｃｍの袋に入れ、セルスクレーパーを用いて脳をつぶすように圧力を加え、ナイロンメッシュを通過させることで細胞を分散した。分散した細胞は、ポリＬリジンをコートしたガラスカバースリップ上に５０万個／ｃｍ2の密度で播種し、３日間培養した。その後、ピペットチップの先端を用いて、培養細胞上に十字型に傷をつけた。４例の培養細胞中、１例には何も添加せず、１例には本発明に係る組織障害改善剤の有効成分であるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、１例には２.５万個／ｃｍ2の密度でＢＩＮＣｓを添加し、１例にはＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し且つ２.５万個／ｃｍ2の密度でＢＩＮＣｓを添加した。次いで、４日間培養した。
【００５４】
４日後、各培養細胞をホルマリンで固定し、位相差顕微鏡で拡大して撮影した。何も添加しない対照を図３Ａに、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦを添加した例を図３Ｂに、ＢＩＮＣｓを添加した例を図３Ｃに、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦに加えてＢＩＮＣｓを添加した例を図３Ｄに示す。なお、図３中の破線内は、ピペットチップにより十字型に傷を付けた箇所を示す。
【００５５】
図３Ａ〜Ｂのとおり、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦのみを加えたのみでは、何も加えない場合と同様、損傷部位における神経細胞はほとんど回復していない。図３Ｃのとおり、ＢＩＮＣｓのみを加えた場合には、神経細胞の回復が多少見られるものの、空隙が見られるなどその回復は十分ではない。それに対してＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦに加えてＢＩＮＣｓを添加した場合では、図３Ｄのとおり、損傷部位における神経細胞の回復が他の場合に比べて明らかに顕著である。以上の結果により、組織損傷部位においてはＢＩＮＣｓが集積することが明らかにされているところ、かかるＢＩＮＣｓに対してさらにＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの両方を添加すれば、組織損傷が顕著に改善されることが実証された。
【００５６】
試験例４  ＢＩＮＣｓの活性化試験
約５０日齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット６匹を任意に３匹ずつ２群に分け、上記試験例２と同様にして、脳を損傷し、損傷部位に集積したＢＩＮＣｓを得た。得られたＢＩＮＣｓの培養液に、対照群には生理食塩水を、実験群には本発明に係る組織障害改善剤の有効成分であるＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬの濃度になるよう添加した。
【００５７】
添加からＢＩＮＣｓを４８時間培養した。次いで、全ＲＮＡを分離し、逆転写によりｃＤＮＡを得、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、幹細胞成長因子（ＨＧＦ）とインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）をコードするｍＲＮＡの発現を調べた。その結果を図４に示す。本発明に係る組織障害改善剤の添加により、ＢＩＮＣｓは神経細胞の保護効果を示す因子の発現を約２倍に増加させることが判明した。
【００５８】
試験例５  損傷脳の改善試験
約５０日齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット９匹を、任意に３匹ずつ、対照群、組織障害改善剤投与群および正常対照群に分けた。対照群と組織障害改善剤投与群のラットは、上記試験例２と同様にして脳を損傷した。麻酔から覚醒後、ラットの左半身は麻痺しており、体幹が左側にねじれる現象が観察された。
【００５９】
脳損傷から４８時間後、上記実施例１で得た本発明に係る組織障害改善剤を、体重１ｋｇ当たりのＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦの投与量がそれぞれ１０μｇとなるように、１日１回皮下注射した。ラットの当初体重は概ね２３０ｇ前後であったが、脳損傷により体重が減少し、４８時間後には平均して２００ｇ程度となっていた。そのため、ラット１匹当たり１日に注射剤２μｇを注射することで、ＩＬ−３とＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ１０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与することになる。かかる投与量は、造血系細胞に作用するサイトカインである顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のヒトへの投与量と同程度である。皮下注射は、７日間にわたり計７回行った。また、対照群には、同量の生理食塩水を同様に皮下注射した。
【００６０】
その後、体重変動を記録しながら経過観察を継続した。脳損傷後の二次変性が概ね終結する２ヶ月後、運動機能を評価するため垂直に設置した金網を登攀させ、８０ｃｍの距離の登攀に要する時間を測定した。脳損傷処置を施していない正常対照群についても、同様の試験を行った。
【００６１】
次いで、対照群と組織障害改善剤投与群のラットから損傷脳を取り出し、ホルマリン固定後に２ｍｍ厚のスライスを作成し、右大脳半球における喪失体積の比率（％）を測定した。図５に運動機能を比較するためのグラフを、図６に脳スライスの写真を、図７に脳の喪失体積を比較するためのグラフを、図８に脳損傷以降のラットの体重の変化を比較するためのグラフを示す。
【００６２】
図５のとおり、本発明に係る組織障害改善剤は脳損傷ラットの運動機能を無処置の正常対照と同等程度まで回復させた。その回復程度は、対照群に対してｐ＜０．０５の危険率で有意であり、顕著なものであった。また、図６のとおり、本発明に係る組織障害改善剤を皮下注射されたラットの脳喪失体積は、対照ラットに比して明らかに抑制されており、図７のとおり、脳喪失体積は、本発明に係る組織障害改善剤により有意に低減されている。さらに図８のとおり、本発明に係る組織障害改善剤の投与を開始してから、ラットの体重は増え続け、対照群に比して体重は有意に回復した。
【００６３】
以上により、本発明に係る組織障害改善剤は、脳損傷を顕著に改善し、脳機能を回復できることが実証された。
【００６４】
試験例６  脳損傷ラットの体重回復試験
約５０日齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラット３４匹を、任意に６匹または１１匹ずつ、対照群、組織障害改善剤投与群、ＩＬ−３単独投与群、およびＧＭ−ＣＳＦ単独投与群に分け、上記試験例２と同様に脳を損傷した。脳損傷から４８時間の時点で、２０ｍｇ／ｍＬの５フルオロウラシル（５ＦＵ）を、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの投与量で腹腔内に注射した。体重２００ｇのラットであれば、１ｍＬを注射することになる。１回目の５ＦＵ注射から２時間経過した時点で、同量の５ＦＵを再度腹腔内注射した。この処置によって、損傷組織中で激しく増殖するＢＩＮＣｓの多くが死滅するために、対照群では損傷から１６日後までに１１匹中６匹（約５５％）のラットが死亡した。
【００６５】
組織障害改善剤投与群、ＩＬ−３単独投与群およびＧＭ−ＣＳＦ単独投与群では、５ＦＵの注射から２４時間後（脳損傷から７２時間後）、上記試験例５と同様の用量で、それぞれの群に対して本発明に係る組織障害改善剤、ＩＬ−３のみまたはＧＭ−ＣＳＦのみを皮下注射し、さらに１日１回、６日間連続して計７回皮下注射した。
【００６６】
その結果、ＩＬ−３単独投与群では６匹中２匹（約３３％）、ＧＭ−ＣＳＦ単独投与群では６匹中３匹（５０％）が死亡したのに対して、組織障害改善剤投与群では１１匹中１匹（約９％）が死亡したのみであった。
【００６７】
本実験におけるラットの生存率の変化を図９に示す。図９のとおり、生理食塩水投与群では、観察期間中において断続的に固体死が見られた。また、ＧＭ−ＣＳＦ単独投与群では特に早期死亡が多く見られたのに対し、ＩＬ−３単独投与群では脳損傷から７日目以降での死亡が特徴であった。
【００６８】
それに対して、組織障害改善剤投与群では早期の死亡例が一例あったのみである。また、組織障害改善剤を投与した場合、ＩＬ−３単独投与に対してｐ＜０．０５の危険率で、ＧＭ−ＣＳＦ単独投与に対してはｐ＜０．００１の危険率で、有意に優れた救命効果のあることが分かった。
【００６９】
従って、本発明に係る組織障害改善剤は、生理食塩水を投与した対照のみならず、ＩＬ−３の単独投与およびＧＭ−ＣＳＦの単独投与に対しても有意に優れた組織障害改善効果を示すことが実証された。
【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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