(57)【要約】【課題】優れた機械的強度と電極として十分な導電性を有し、固定化した酵素を失活させず、酵素と速い電子移動を実現するナノサイズの針状突起を表面に具備するカーボン電極と、その簡便な作製方法を提供する。【解決手段】炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなるナノ微結晶構造で構成されるカーボン膜をエッチングしてカーボン電極を作製する際に、オゾン及び／又は一重項酸素など弱いエネルギーを有する活性種を用い、カーボン膜内の僅かな構造の差によるエッチレートの違いにより、sp2結合成分を優先的にエッチング除去し、多数のナノサイズの針状凸部を有する凹凸構造を表面に形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなるナノ微結晶構造で構成されるカーボン膜の表面をエッチングすることにより作製されるカーボン酵素電極であって、電極の表面に多数のナノサイズの針状凸部を具備するカーボン酵素電極。
【請求項２】
エッチングに用いられるカーボン膜は、sp3結合の量が１０〜３０％である請求項１に記載のカーボン酵素電極。
【請求項３】
ナノサイズの針状凸部は、幅10〜数10nm、高さ数〜10数nmのものである請求項１又は２に記載のカーボン酵素電極。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの請求項に記載のカーボン酵素電極を備え、酵素と電極の間の電子移動をメディエータなどの電子移動を仲介する物質を用いることなく高効率に行う事ができる電気化学的手法を用いたデバイス。
【請求項５】
酵素と電極の間の電子移動をメディエータなどの電子移動を仲介する物質を用いることなく高効率に行う事ができる多数のナノサイズの針状凸部を具備するカーボン電極の作製方法であって、炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなるナノ微結晶構造で構成されるカーボン膜を、その表面上にマスク、レジスト等のエッチング制御部材を設けることなくエッチングして、表面に多数のナノサイズの針状凸部を形成する、カーボン電極の作製方法。
【請求項６】
エッチングに用いられるカーボン膜は、sp3結合の量が１０〜３０％である請求項５に記載のカーボン電極の作製方法。
【請求項７】
カーボン膜のエッチングを、185 nmと254 nmの紫外線により発生させたオゾン及び／又は一重項酸素で行い、sp2結合成分を優先的にエッチング除去する請求項５又は６に記載のカーボン電極の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサやバイオ電池に用いると、酵素と電極界面の電子移動を効率良く行うことのできるカーボン電極とその作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
電気化学バイオセンサやバイオ燃料電池は、電極上に固定した酵素を利用した電気化学デバイスである。メディエータと呼ばれる酵素と電極間の電子移動を仲介させる分子を溶液中に溶かして用いない場合、酵素―電極間の電子移動を実現できる酵素の固定化法としては、酵素と電気化学的活性種を導電性ポリマー内に包括し、電極−酵素間の間接電子移動を利用する手法と、電極界面に酵素を直接固定し、電極−酵素間の直接電子移動を利用する手法に大別される。前者が電気化学活性種を必要とするのに対し、後者は電気化学的活性種を必要としないため、シンプルでコスト面に関して有利であり、電池用の電極としては電子移動を仲介する分子がないので高い起電力が得られる可能性がある。
【０００３】
この直接電子移動を指向した電極材料には、（ア）固定化した酵素を失活させない、（イ）酵素固定化量が単位面積あたり大きい、（ウ）酵素酸化還元部位‐電極界面の電子移動速度が十分に速い、といった特徴が望まれる。
カーボン材料は、価格が安い、資源的に涸渇する可能性がない、電位窓が広い、生体適合性が高い、多孔質体や凹凸構造等の構造体の作製が可能といった特徴を有することから、このような電極材料に多く利用される。
【０００４】
酵素-電極界面の直接電子移動を向上させる手法としては、
（１）カーボンナノチューブを用い、ナノサイズの構造体を作製する手法、
（２）多孔質膜を有するカーボン材料を作製する手法、
（３）表面をリソグラフィ技術により、ナノサイズの構造体を作製する手法、
などがある。
【０００５】
（１）の例としては、金電極上にカーボンナノチューブを垂直に配向させ、酵素活性中心と電極界面の直接電子移動を促進する手法（非特許文献１）が、（２）では、ポリアクリロニトリルやフルフリルアルコールといった「カーボン電極の前駆体となりうる有機材料」を1000度以上で焼成し、多孔質のカーボンフィルムを作製する手法や（特許文献１、２）、ポーラスアルミナなどの多孔体にカーボンを析出させる手法（特許文献３）が、（３）では、一度作製したボロンドープダイヤモンド薄膜の上に、ナノ〜マイクロサイズの粒子を分散させ、その後、酸素プラズマ等を用いて、局所的に表面をエッチングする手法（非特許文献２）が報告されている。
【０００６】
いずれにおいても、ナノサイズの構造体を電極表面に形成することが、酵素の直接電子移動を達成するための要素技術となる。これは酵素の固定化量を増やせることもさることながら、一般的に酵素内部に埋まっている酸化還元部位と電極界面の距離を近づけることが出来ることに起因する。
【０００７】
しかしながら、（１）では、材料が電極上から剥離し易く機械的強度や安定性が劣るという欠点がある。
（２）の、多孔質カーボンフィルムに関しては、機械的な強度に劣る上、作製時のカーボン前駆体や溶媒の量、焼成温度等によって特性が大きく異なり、また、電極として十分な導電性が保持できないといった欠点があった。一方、金属などの多孔体にカーボンを析出させる場合、一部金属面が露出してしまうと、その部位への酵素の吸着による酵素失活、又はその部位の腐食による近傍のpH変化による酵素失活が起こるといった欠点がある。
（３）では、ダイヤモンドを構成成分としているため、機械的強度は十分であるが、多結晶ダイヤモンドを平坦化させる工程が必要であること、リソグラフィのためのマスク材料が必要であること、かつ、このマスク材料を界面に均一に分散させるといった高度な技術を要求されるなどの欠点があった。さらに、ダイヤモンドは無ドープにおいては、導電性は極めて低く、電極材料としての使用は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2007-197305
【特許文献２】WO2007-088975
【特許文献３】特開2005-60166
【特許文献４】特開2006-090875
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Fuel Cells, 2009, 1, 7
【非特許文献２】Nano. Lett. 2008, 8, 3572
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記のような背景から、本発明は、優れた機械的強度と、電極として十分な導電性を有し、固定化した酵素を失活させず、単位面積あたりの酵素固定化量が大きく、酵素酸化還元部位‐電極界面の電子移動速度が十分に速いカーボン電極、及び、その簡便な作製方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、新しい導電性ECRカーボン電極の発明（特許文献４参照）を踏まえて鋭意研究したところ、sp2とsp3のハイブリッド構造を有する導電性のECRスパッタカーボン膜に対して、185 nmと254 nmのスペクトルを有する低圧水銀ランプを大気中にて照射し、それにより発生したオゾン及び／又は一重項酸素がsp2結合を優先的にエッチング除去し、表面にsp3結合に由来する多数のナノサイズの針状凸部が形成できることを見出した。また、このような多数のナノサイズの針状凸部を具備するカーボン電極は、機械的強度が高く、しかも、十分な導電性を持ち、酵素電極として利用すると、固定化した酵素を失活させることなく、酵素−カーボン電極界面間の直接電子移動を高効率に行うことが出来ることも見出すに至った。
【００１２】
本発明は、上記のような知見に基づくもので、以下の事項を特徴としている。
１．炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなるナノ微結晶構造で構成されるカーボン膜の表面をエッチングすることにより作製されるカーボン酵素電極であって、電極の表面に多数のナノサイズの針状凸部を具備するカーボン酵素電極。
２．エッチングに用いられるカーボン膜は、sp3結合の量が１０〜３０％である上記１に記載のカーボン酵素電極。
３．ナノサイズの針状凸部は、幅10〜数10nm、高さ数〜10数nmのものである上記１又は２に記載のカーボン酵素電極。
４．上記１〜３のいずれかに記載のカーボン酵素電極を備え、酵素と電極の間の電子移動をメディエータなどの電子移動を仲介する物質を用いることなく高効率に行う事ができる電気化学的手法を用いたデバイス。
５．酵素と電極の間の電子移動をメディエータなどの電子移動を仲介する物質を用いることなく高効率に行う事ができる多数のナノサイズの針状凸部を具備するカーボン電極の作製方法であって、炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなるナノ微結晶構造で構成されるカーボン膜を、その表面上にマスク、レジスト等のエッチング制御部材を設けることなくエッチングして、表面に多数のナノサイズの針状凸部を形成する、カーボン電極の作製方法。
６．エッチングに用いられるカーボン膜は、sp3結合の量が１０〜３０％である上記５に記載のカーボン電極の作製方法。
７．カーボン膜のエッチングを、185 nmと254 nmの紫外線により発生させたオゾン及び／又は一重項酸素で行い、sp2結合成分を優先的にエッチング除去する上記５又は６に記載のカーボン電極の作製方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のカーボン酵素電極は、表面に多数のナノサイズの針状凸部を具備するため、表面積が増大し単位面積当たりの酵素固定化量が増大可能となるとともに、作用電極として活用し酸化還元性酵素を修飾することにより、基質の電気化学的な直接電子移動による検出、酵素を介した酸素の還元などを高効率に行うことが可能である。また、導電性は極めて低いが高い機械的強度をもたらすsp3結合に由来して機械強度も高く、電極界面はカーボンのみであるため、酵素を失活させる可能性となる金属材料の露出の可能性もない。
【００１４】
本発明のカーボン酵素電極の作製方法は、ナノサイズのカーボンの構造に起因するエッチレートの差を利用しているため、マスク材、レジスト等のエッチング制御部材を表面上に設ける必要がない簡便な操作であり、しかも、フォトリソグラフィーでは困難な多数のナノサイズの針状凸部を有する凹凸構造を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】平坦構造と凹凸構造での電極界面‐酵素間の直接電子移動の差異を示す概念図、及び、間接電子移動を示す概念図である。
【図２】185 nmと254 nm UV照射時間に応じた、ECRスパッタカーボン薄膜の原子間力顕微鏡により測定した形状像を示す図である。
【図３】185 nmと254 nm UV照射前後のECRスパッタカーボン薄膜における、X線光電子分光法を用いた、C1s由来のピークの波形分離を示す図である。
【図４】185 nmと254 nm UV照射時間とECRスパッタカーボン薄膜のsp2/（sp2+sp3）の組成の関係を示す図である。
【図５】185 nmと254 nm UV照射前後のグラッシーカーボンの、原子間力顕微鏡により測定した形状像を示す図である。
【図６】ECRスパッタカーボン薄膜を作用電極として用いての、シトクロムC添加前後のサイクリックボルタモグラムを示す図である。
【図７】ナノサイズの凹凸構造を有するECRスパッタカーボン薄膜を作用電極として用いての、シトクロムC添加前後のサイクリックボルタモグラムを示す図である。
【図８】図6、及び図7のそれぞれの、シトクロムCを添加後のCVからバックグラウンドを除去した際のサイクリックボルタモグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、表面に多数のナノサイズの針状凸部を具備するカーボン電極を作製するのに用いるカーボン膜は、ECRスパッタ法等により形成され、その炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなるナノ微結晶構造で構成される高導電性のものである。なお、本発明において、「ナノ微結晶構造」とは、sp２結合からなる微結晶性のドメイン（グラファイト型構造）をsp３結合からなる微結晶性のドメインで連結した構成の構造体であって、各微結晶性ドメインのサイズ（長径）が0.5nm〜100nmであるものを意味する。
該カーボン膜は、炭素のみからなるものが望ましいが、本発明で規定する物性を逸脱しない範囲で、ボロン等の他の成分を含有することもできる。その膜厚は、特に限定するものではないが、エッチングしたときに、表面にナノサイズの凹凸構造が形成できる程度の薄いものを用いることができる。
炭素間結合におけるsp3結合の量は、sp2結合＋sp3結合に対して10〜30％とすることが、酵素との直接電子移動を起こしやすいナノサイズの凹凸構造を形成する上で望ましい。炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなり、sp3結合の量を10〜30％としたカーボン膜は、導電性のsp2結合に由来して、電極として使用するに十分な導電性を有するとともに、導電性は極めて低いが高い強度をもたらすsp3結合に由来して、電極として使用するに十分な強度を有する。
カーボン膜は、特性にばらつきの少ないカーボン電極を作製する上で、製膜時の中心線平均粗さ（Ra）が1.5 nm以下であることが望ましい。
【００１７】
本発明におけるカーボン膜は、それから作製されるカーボン電極の使用用途等に応じて、各種材料の基材上に形成することができる。そのような基材としては、例えば、シリコン、石英などの無機基板、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機材料の基板であって表面が平坦なものなどを使用することができる。
【００１８】
本発明におけるカーボン膜の形成法は、炭素間結合がsp2結合とsp3結合からなるカーボン膜を形成できるものであれば、どのようなものでもよい。そのような形成法としては、好適には、ECRスパッタ法が挙げられるが、ＲＦスパッタ、マグネトロンスパッタなどの各種スパッタ法、プラズマＣＶＤや熱ＣＶＤ法なども利用することができる。
【００１９】
本発明におけるカーボン膜のエッチングには、sp2結合成分を優先的にエッチング除去する弱いエネルギーを有する活性種を用いる。上述のようなsp２結合からなる微結晶性のドメインをsp３結合からなる微結晶性のドメインで連結した構成のナノ微結晶構造のうちsp2結合成分を優先的にエッチング除去することにより、カーボン膜の表面上にマスク、レジスト等のエッチング制御部材を設けることなく、sp3結合に由来する多数のナノサイズの針状凸部を形成することができる。
エッチングに用いられる弱いエネルギーを有する活性種としては、好適には、185 nmと254 nmの紫外線により発生させたオゾン及び／又は一重項酸素を挙げることができる。
【００２０】
本発明のカーボン電極における多数のナノサイズの針状凸部を有する表面の凹凸構造は、原子間力顕微鏡で確認可能であり、一般的なカンチレバーを使用した際、針状凸部が、幅10〜数10nm、高さ数〜10数nmのものとして確認される。また、このような針状凸部は、有効照射範囲内にてUV照射されたカーボン薄膜部位すべてにおいて確認できる。
【００２１】
このナノサイズの針状凸部を有するカーボン電極−酵素間の直接電子移動の概念図を図１に示す。一般的に、酵素内の電気化学活性部位は、たんぱく内部に埋め込まれた形で存在しており、電極界面−酵素間の直接電子移動は確認されないことが多い（図１-A）。
【００２２】
しかし、本発明のように、表面に多数のナノサイズの針状凸部を有するカーボン電極では、電極界面と酵素の接触部位が増加するため、電極界面−酵素の直接電子移動の機会が増加する（図１-B）。これは、従来のメディエータなどの電子移動を仲介する物質を用いてなされる間接電子移動とは全く異なる手法である(図１-C)。
【００２３】
このような直接電子移動を行い得る酵素としては、シトクロムC、ミオグロビン、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼなど、活性中心に金属イオンやフラビン、キノン系の酸化還元部位を有するものが挙げられる。
【００２４】
電極界面‐酵素の直接電子移動の確認手法としては、例えば、次の（１）と（２）の手法が挙げられる。
（１）pHと塩濃度を適宜調整したバッファー内に100〜数100μMの濃度になるように酵素を溶解させ、酵素の電気化学活性中心部位が酸化還元する際の電位や電流値について3電極法により電気化学的測定を行う。
（２）酵素を電極上に種々の方法にて直接固定化したのち、pHと塩濃度を適宜調整したバッファー内にて（１）と同様の電気化学的測定を行う。
【００２５】
上記（２）における直接固定化法としては、酵素‐電極界面の物理吸着、静電的相互作用、化学結合を介しての手法が利用可能である。特に、カーボン材料の界面改質は、これまで多くの報告がなされている為、比較的容易に酵素の固定化が可能である。また、（２）の手法においては、それぞれの酵素に対応する基質を添加したのちの電流値の変化量を確認してもよい。
【００２６】
この電気化学計測手法としては一般的に静止溶液、もしくは強制対流条件下でのサイクリックボルタンメトリーやリニアスイープボルタンメトリー、また、バイオセンサとして用いる際はアンペロメトリーなどが挙げられる。
【００２７】
本発明のナノサイズの凹凸構造を有したカーボン電極は、電極界面−酵素間の接触面積を増大することから、上記（１）のような電極界面‐溶媒中酵素との直接電子移動だけでなく、上記（２）のような電極界面‐固定化酵素との直接電子移動にも有効である。
【００２８】
上記のとおり、本発明の、炭素間結合がsp2とsp3結合からなるカーボン膜に対して、低圧水銀ランプから発するUV照射をすることで作製されるナノサイズの凹凸構造体は、作製法においてマスクレス、常温、常圧下で簡便に行うことができ、また、電極界面‐酵素間の直接電子移動を実現する上で有効な構造である。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３０】
＜実施例１＞  ECRスパッタカーボン薄膜電極に対するUV照射
185nmと254nm の両方のスペクトルを発生する４０W低圧水銀ランプ（セン特殊光源社製、SUV-40）の電源を入れ、安定化のため１h放置した。その後、低圧水銀ランプの下10mmの所に、ECRスパッタ法によって製膜されたsp２結合とsp３結合のナノ微結晶構造を有するカーボン薄膜（sp3/(sp２+sp3)=25%）を配置、UVを照射した[このようなナノ微結晶構造を有するカーボン薄膜の物性については、非特許文献Appl. Phys. Lett., 2002, 80, 425参照]。
ECRスパッタカーボン薄膜形状像の原子間力顕微鏡像（AFM、SIIナノテクノロジー社、SPI4800）をUVの照射時間に応じて取得した結果を図２に示した。
図２から明らかなように、ＵＶ照射時間を増加させるごとに、徐々に針状凸部を有する凹凸構造がECRスパッタカーボン薄膜表面に形成されることが観測された。多くの針状凸部は、幅10〜数10 nm、高さ数〜10数nmであった。次に、UV照射後のsp2結合とsp3結合の比を、X線光電子分光法（XPS、島津製作所社、）を用いて観測した。製膜後とUV照射６時間後のECRスパッタカーボン薄膜のC１s由来のXPSスペクトルを図３に、また、UV照射によるsp2/(sp２+sp３)の比の推移を図４に示す。図４から明らかなように、UV照射により、徐々にsp2成分が減少していることが観測される。
図２から、ECRスパッタカーボン薄膜がエッチングされていることは明らかであり、また、このカーボン薄膜は無ドープのため、カーボン成分のみで構成されている事を考慮すると、エッチングされた部位はsp2結合由来である事は明らかである。
【００３１】
＜比較例＞  他のカーボン電極に対するUV照射
上記の実施例１に示したナノサイズの凹凸構造体が、UV照射を施した他のカーボン電極において観測されるかを確認するため、ECRスパッタカーボン電極の代わりに従来から使用されているグラッシーカーボン電極、ボロンドープダイヤモンド電極を用いて検討した。なお、グラッシーカーボン電極はsp2結合のみから形成され、ボロンドープダイヤモンド電極は大部分がsp3結合から形成されている。
グラッシーカーボン電極、ボロンドープダイヤモンド電極を実施例１と同様の実験装置、条件にてUV照射を行った。
図５に示すように、グラッシーカーボン電極では、その表面構造は荒れるものの、UV照射した際にECRスパッタカーボン薄膜で確認された、針状凸部位における幅10〜数10 nm、高さ数〜10数nmの凹凸構造は確認されなかった。また、ボロンドープダイヤモンド電極では、UV照射前後のAFM像においては形状の変化は確認できなかった。上記のことから、sp2結合のみの結晶構造、又は大部分がsp3結合である結晶構造から構成されるカーボン膜では、UV照射によってECRスパッタカーボン薄膜のようなナノサイズの凹凸構造が作製されないことが確認された。
【００３２】
＜実施例２＞  UV照射有無でのECRスパッタカーボン薄膜電極による酵素との直接電子移動
バッファー内に溶解したシトクロムCの直接電子移動に関して、ECRスパッタカーボン薄膜とUV照射を３時間行ったECRスパッタカーボン薄膜のそれぞれを作用電極として用い、サイクリックボルタンメトリーにて評価を行った。まず、100mMリン酸バッファー溶液（pH 7）のみでのバックグラウンド測定を行った後、シトクロムC（馬心筋）が100μMの濃度になるように、100 mM リン酸バッファー溶液（ｐH 7）に溶解させた。
参照電極、対極にはAg|AgCl電極、Pt電極を用い、走引速度50mV/ secにてサイクリックボルタンメトリーを行った。作用電極としてUV照射前のECRスパッタカーボン薄膜を用いた際のボルタモグラムを図６に、UV照射３時間後のECRスパッタカーボン薄膜を用いた際のボルタモグラムを図７に示す。図６ではシトクロムC添加前後でボルタモグラムに大きな変化が見られないのに対し、図７では還元側において約‐50 mVあたりに、酸化側において250 mVあたりに大きな電流値の変化が確認された。このことから、ナノサイズの凹凸構造を有するECRスパッタカーボン薄膜が、製膜直後のECRスパッタナノカーボン薄膜と比較して、直接電子移動を起こしやすい界面を有することが確認された。
図８では、還元電流に関して、図６と図７のそれぞれのシトクロムC添加後のボルタモグラムからバックグラウンド電流の差分を示している。このグラフからも凹凸構造を有するECRスパッタカーボン薄膜にのみ、電極界面‐酵素間の直接電子移動が行われていることは明確である。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明のカーボン酵素電極は、機械強度も強く、電極界面はカーボンのみであるため、酵素を失活させる可能性となる金属材料の露出の可能性もない。この酵素電極を作用電極として用い、酸化還元性酵素を修飾することにより、基質の電気化学的な直接電子移動による検出、酵素を介した酸素の高効率の還元などを高効率に行うことが可能となるので、バイオセンサやバイオ電池等の電気化学的手法を用いたデバイスの電極として幅広く利用できると考えられる。
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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