(57)【要約】【課題】低フォスファターゼ症を遺伝子変異に基づいて検出する方法および検出するためのキットの提供。【解決手段】低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の断片を増幅し得るプライマー対を用いて上記遺伝子の変異を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の12対のプライマー対を用いて低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出する方法：
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２０に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号２１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２４に示す塩基配列からなるプラーマーの対。
【請求項２】
配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を用いて低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の1559Tの欠失変異を検出する方法。
【請求項３】
被験体から得た試料を用いて、請求項１または２に記載の方法により低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出し、遺伝子変異が存在する場合に、被験体が低フォスファターゼ症に罹患しているか、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクが高いと判定するための検査方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載のプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出し、被験体における低フォスファターゼ症を検出し、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクを判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低フォスファターゼ症の遺伝子変異に基づく検出に関する。さらに、本発明は低フォスファターゼ症の遺伝子変異スクリーニングおよび遺伝子診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
低フォスファターゼ症は組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP）の遺伝子変異による遺伝性疾患で、症状の程度により５つの種類(病型)に分かれている。特に重症度の高い周産期型で全身の骨形成が出生前から障害され、呼吸筋を支える肋骨などが骨折するために呼吸不全で生後早期に死亡する。これまでに有効な治療方法がなかったが、近年、健常人の骨髄、間葉系細胞等を移植することにより、患者が救命されたというケースが報告された。また、文部科学省再生医療の実現化プロジェクトにおいて「重度先天性骨代謝疾患に対する遺伝子改変間葉系幹細胞移植治療法の開発」というテーマで患者自身の細胞からiPS細胞を樹立し、ALP遺伝子を導入した後、間葉系細胞に誘導あるいは、骨芽細胞に分化させ移植することで、低フォスファターゼ症患者の根治的治療をおこなうことを目的とする研究が開始された。
【０００３】
低フォスファターゼ症の診断としては、O脚の有無、骨折による骨痛などの身体的特徴、血液・尿検査の結果、血清ALP活性およびALPアイソザイム(ALPの型)活性が低下している場合、単純Ｘ線写真により骨幹端に骨端線の拡大、カッピング（盃状陥凹）、フレイング（毛ばだち）などのくる病様変化がみられるか否かなどによっている。しかし、骨幹端の変化のみでは、ビタミンＤ欠乏性くる病、低リン血症性くる病、骨幹端異形成症など他の骨系統疾患との区別は困難なため、これら疾患を血液、尿検査等により除外し、血清ALP低値を診断のポイントとするが、低フォスファターゼ症のどの臨床病型かを血清ALPから同定することは難しかった。さらに、本遺伝性疾患は常染色体劣性遺伝形式をとるため、実際に発症するのは数万人に1人という希少疾患である。しかしながら、この遺伝病では家族歴がなく、症状のない夫婦にとり突然妊娠中の児の骨形成がうまくいかないことで発見されるケースが多い。低フォスファターゼ症の小児型や良性の周産期型でも妊娠中に超音波上骨形成の不全を指摘されることが多く、両親のALP活性では児の状況を推定することは難しい。これまでの遺伝子変異解析から、遺伝子変異部位と病型との関連性が明らかになってきている。
【０００４】
TNSALPの遺伝子異常のうち、1559T欠失変異はホモに有すると周産期型低フォスファターゼ症を来すことが知られ日本人にのみ報告されている（非特許文献１を参照）。1559T欠失変異をヘテロで有する無症状の保因者は日本人に特に多いと予測されている。遺伝子変異部位は各エクソンに存在し、変異部位と疾患（病型）との関連は明らかになりつつある（非特許文献２を参照）。従来、遺伝子変異部位は、エクソンごとにPCRを行ない塩基配列を解析し同定したため時間を要していた。
【０００５】
一方、従来より、遺伝子の変異を解析する方法として、DNA結合色素を用いた融解温度曲線解析法が知られていた（特許文献１を参照）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2008-510698号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mornet E.  Hypophosphatasia.  Orphanet J Rare Dis. 2007 Oct 4;2:40.
【非特許文献２】Orimo H et al., J Bone Miner Metab. 2002;20(1):28-33.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、低フォスファターゼ症の遺伝子変異をスクリーニングする方法、低フォスファターゼ症を遺伝子変異に基づいて検出する方法および検出するためのキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、低フォスファターゼ症を末梢血に存在する低フォスファターゼ症に関連する遺伝子の変異に基づいた検出方法を開発しようと鋭意検討を行った。
【００１０】
DNA配列における変異を分析する方法は、二つの一般的なカテゴリーに分類することができる。一つは、既知の配列変異の遺伝子型を特定することであり、二つ目は未知の変異を走査する（scanning）ことである。既知の配列変異の遺伝子型を特定するためには多くの方法が利用可能である。対照的に、未知の変異のための殆どの方法では、PCR後、ゲル電気泳動またはカラム分離が必要である。具体的には、既知の配列変異を遺伝子型特定するときには小さなアンプリコンまたは非標識化プローブを使用し、未知変異をスキャンするときには、大きなアンプリコンが必要となる。
【００１１】
多くの遺伝病の遺伝子検査は、原因となっている変異が遺伝子の全体にわたって分散していることが多いため、困難なことがある。同時変異スキャニングおよび遺伝子型特定を使用してこれらの変異部分を検出することができる。具体的には、いずれかの特定の遺伝子に関しては、それぞれのエクソンを一般的なスプライス部位の外側でプライマーを使用して増幅する。高頻度で配列変化が見られる場合、最初に当該部位の遺伝子型を特定するか、追加のセットのプライマーを使用して、このより小さな遺伝子座を増幅することができる。特定の部位の変異スキャニングおよび遺伝子型特定は、別々の領域で実施することができるか、スキャニングが陽性の場合、産物を用いて塩基配列解析を行い、遺伝子変異部位を特定することができる。
【００１２】
低フォスファターゼ症の原因遺伝子であるTNSALPに対応するプライマー12ペアを作成した。このプライマーを用いて、原因遺伝子のターゲット領域をPCR法で増幅することができる。PCR後のサンプルの融解温度曲線High resolution melting curve (HRM)をLight Scanner（Idaho Technology Inc.；http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）という遺伝子変異解析機器を用い測定することで、簡単に変異部位のスクリーニング、診断が可能になった。このことにより、現在知られていないTNSALPの遺伝子異常を簡便に発見することができ、低フォスファターゼ症の診断に役立つことが予測される。
【００１３】
それに加えて、TNSALPの遺伝子異常のうち、1559T欠失変異はホモに有すると周産期型低フォスファターゼ症を来すことが知られ今回の疾病の重要な診断ポイントとなり得る。1559T欠失変異をヘテロで有する無症状の保因者は日本人に特に多いと予測されている。従って、1559T欠失変異のあるなしを調べることは、本疾患にとって重要なポイントとなる。そこで、1559T欠失の有無を迅速にスクリーニングする方法のためのプライマー１ペアを作成した（ALP SAG)。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  以下の12対のプライマー対を用いて低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出する方法：
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２０に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号２１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２４に示す塩基配列からなるプラーマーの対。
【００１５】
[２]  [１]の12対のプライマー対を用いて組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の12の断片を増幅し、得られた増幅物を用いて融解曲線解析により変異を検出する、[１]の変異を網羅的に検出する方法。
[３]  配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を用いて低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の1559Tの欠失変異を検出する方法。
【００１６】
[４]  配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を用いて組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の断片を増幅し、得られた増幅物を用いて融解曲線解析により変異を検出する、[３]の欠失変異を検出する方法。
[５]  被験体から得た試料を用いて、[１]〜[４]のいずれかの方法により低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出し、遺伝子変異が存在する場合に、被験体が低フォスファターゼ症に罹患しているか、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクが高いと判定するための検査方法。
【００１７】
[６]  以下の12対のプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出するためのキット：
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号１９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２０に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号２１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２２に示す塩基配列からなるプラーマーの対；
配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２４に示す塩基配列からなるプラーマーの対。
【００１８】
[７]  配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出するためのキット。
【００１９】
[８]  [６]の12対のプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出し、被験体における低フォスファターゼ症を検出し、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクを判定するためのキット。
[９]  配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出し、被験体における低フォスファターゼ症を検出し、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクを判定するためのキット。
【発明の効果】
【００２０】
実施例に記載のように本発明のプライマーを用いることにより、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的にスクリーニングし解析することができ、また1559T欠失変異の有無を調べることができる。これらの遺伝子の変異の存在は、低フォスファターゼ症の罹患または発症のリスクが高いことを示すので、上記変異を検出することにより、低フォスファターゼ症の罹患の有無、発症のリスクを知ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出するためのプライマーを示す図である。
【図２−１】組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子のエクソン７のSNPの位置、ならびに検出に用いた増幅断片の融解曲線を示す図である。
【図２−２】組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子のエクソン９のSNPの位置、ならびに検出に用いた増幅断片の融解曲線を示す図である。
【図２−３】組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子のエクソン12-2のSNPの位置、ならびに検出に用いた増幅断片の融解曲線を示す図である。
【図３】組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の1559Tの欠失変異の検出の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、周産期型低フォスファターゼ症等の低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異をスクリーニングする。本発明でいう変異は、野生型正常遺伝子を変異遺伝子のミスマッチが生じるすべての変異が含まれ、１つまたは複数の塩基の欠失、置換、付加、挿入等が挙げられ、一塩基多型（SNP）も含む。
【００２３】
本発明においては、TNSALP遺伝子に対応する１２対のプライマー対を用いてTNSALP遺伝子の１４の断片を増幅し、増幅産物を得て変異を検出し、スクリーニングを行う。
【００２４】
TNSALP遺伝子に対応するプライマー対セットは、図１に示される配列番号１から２４の塩基配列からなるプライマーである。
【００２５】
本発明は上記のプライマー対の少なくとも１対を含み、さらに上記のプライマー対の少なくとも１対、好ましくは２対、好ましくは３対、好ましくは４対、好ましくは５対、好ましくは６対、好ましくは７対、好ましくは８対、好ましくは９対、好ましくは１０対、好ましくは１１対、さらに好ましくは１２対すべてを含むプライマー対を含む遺伝子変異検出のためのキットを包含する。
【００２６】
該キットはさらに、遺伝子増幅を行うための耐熱性ポリメラーゼや融解曲線解析を行うためのDNA結合色素を含んでいてもよい。前記キットは、低フォスファターゼ症の遺伝子診断キットとして用いることができる。
【００２７】
上記のプライマーセットを用いた遺伝子の増幅は、PCR等の公知の遺伝子増幅方法で行うことができる。PCR以外の遺伝子増幅法として、鎖置換増幅法（strand displacement amplification：SDA法）、等温キメラプライマー核酸増幅法（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：ICAN法）、NASBA法、カスケードローリングサークル増幅法（cascade rolling circle amplification：CRCA法）、Qベータレプリカーゼ媒介増幅法（Q beta replicase mediated amplification）、LAMP法、転写媒介性増幅法（transcription-mediated amplification：TMA法）等が挙げられる。
【００２８】
変異の検出は、一度に広範囲の領域の変異を検出する必要があるという理由から融解温度曲線（High resolution melting curve)解析法で行うのが望ましい。ただし、Direct sequencing method、Cel1 method、TGCE method等の他の変異検出法を用いることもできる。
【００２９】
融解曲線解析は、DNAプローブをターゲットDNAにハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により、DNAプローブとターゲットDNAとのハイブリッドの融解曲線を解析する方法である。融解曲線の解析により得られる融解温度は、DNAプローブとターゲットDNAとの相同性を反映するため、この融解温度の決定により、ターゲットDNAの同一性が判別でき、その結果変異をスクリーニングすることができる。融解の過程は二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素によって追跡することができる。二本鎖DNAの融解に伴い蛍光色素が解離するため、蛍光強度が減少するので、温度に対して蛍光強度をプロットすることで二本鎖DNAの融解過程を示す融解温度曲線が得られる。この温度上昇に伴う蛍光強度の変化により解析を行うことができ、DNAに欠失、置換、付加、挿入等の変異があるDNAの融解温度曲線は、野生型の融解温度曲線とは異なるので、解析機器を用いて融解温度曲線の差を識別し、変異をスクリーニングすることができる。
【００３０】
融解曲線解析は、例えば、Reed G et al., Clin Chem., 50 (2004) 1748-54や特表2008-51098号公報に記載の方法に従って行うことができ、解析は、例えば高分解能変異解析装置として知られているLightScannerやLS32/LightScanner (Idaho Technology社）を用いて行うことができる。後者の装置の場合、PCRから融解曲線解析までを一貫して行うことができる。融解曲線解析に用いる蛍光色素としては、二本鎖DNAに飽和して結合する色素（飽和dsDNA結合色素）が挙げられる。飽和して結合する色素とは、色素の非存在下でPCRにより通常、産生されるdsDNAの量、具体的には約10ng/μLに関して最大蛍光シグナルを与える濃度で存在するとき、有意にPCRを阻害しない色素をいう。本発明に用いられる好適な色素として、窒素を含む二個の複素環を結合する鎖の中に配置された一つ以上の二価部分  -C（R）=  を含むシアニン色素が挙げられる。ここで、Rは水素もしくは任意の炭素置換基であり、置換されていてもよいC1-6アルキルを含むアルキルが挙げられる。シアニン色素中に２個以上の  -C（R）=  が存在する場合、Rはそれぞれ独立して選択されてもよい。そのようなシアニン色素は、本明細書中に記載する代表的な一般式より詳細に定義されるようなモノマーまたはダイマーであってもよい。このようなシアニン色素として、LCGreenPlus（商標）が挙げられる（特表2008-510698号公報）。ただし、SNPおよび他の小さな変化の検出が必要でない方法では、他の色素を使用できると考えられる。シアニン色素以外の色素としては、アクリジン-ベースの色素、フェナントリジニウムインターカレーター、フェナントロリン-ベースの金属インターカレーター（metallointercalator）等が挙げられ、例えばSYBR（登録商標）Green等がある。
【００３１】
サンプルとしては、被験体の末梢血、皮膚生検サンプル等、被験体のDNAが含まれるサンプルならば、いずれも用いることができるが、非侵襲性という点で、末梢血の利用が望ましい。被験体から得たサンプルを96ウェルや384ウェルのマイクロプレートに分注し、上記のプライマーセットを用いてそれぞれのウェル中のサンプルのDNAを増幅し、ウェル中で増幅したDNA（アンプリコン）を上記のLight Scanner等の解析装置を用いて融解曲線を解析し、データ解析を行えばよい。データ解析は、上記の融解曲線解析に用いる装置の附属しているCall-IT等のソフトウェアを用いて融解曲線を解析すればよい。さらに、本発明は、TNSALPの遺伝子の1559番目の塩基T（1559T)の欠失変異を検出するためのプライマー対を含む。該プライマーは図１の配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーからなる。該プライマー対を用いて、TNSALPの1559番目の塩基を含む断片を増幅し、融解曲線解析により、TNSALPの1559Tの欠失変異をホモに有するか、ヘテロに有するか、あるいは変異を有しないかを判別し、検出することができる。本発明の方法によって、低フォスファターゼ症の発症の原因となり得る組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異をスクリーニングし、同定することができる。TNSALP遺伝子に変異の検出により、被験体の低フォスファターゼ症を検出することができ、また被験体の低フォスファターゼ症に罹患するリスクを判定、評価することができる。
【実施例】
【００３２】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３３】
実施例１  TNSALP遺伝子の変異の網羅的解析
低フォスファターゼ症患者あるいはTNSALPの遺伝子変異の保因者と考えられる被験体から採取した末梢血より抽出したゲノムDNAをサンプルとし、サンプルを10 mMのTris-HCl（pH7.5）、0.1 mMのEDTA中に希釈して、図１に示すTNSALP遺伝子各エクソンに特異的プライマーで蛍光色素を加えポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にかけた。PCR後のサンプルの融解温度曲線High resolution melting curve(HRM)をLight Scanner（Idaho Technology Inc.；http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）という遺伝子変異解析機器を用い測定した。
【００３４】
PCRは、各エクソン96ウェルプレートの１ウェルに対し全容積10μlで実施した。反応混合物は、10xExPCR buffer、それぞれ200μMのdATP、dGTP dCTP、およびdTTP、0.3 μMのプライマー(Forward, Reverse)、1μlのExTaqポリメラーゼ、および色素(10×LCGreen Plusを1/10)を含んでいた。エクソンによっては、10%DMSO 添加あるいは酵素をTakara Primer Star-CFX96に変えてPCRを行った。ポリメラーゼ連鎖反応は、PCR機器中、最初の変性を95℃で2分、続いて94℃で30秒、20℃/秒でエクソンごとの（アニーリング）温度（60℃〜72℃）まで冷却して30秒加熱するサイクルを45サイクルにより実施した。アンプリコンのサイズはエクソンごとに異なるが400bp以下とした。PCR後、サンプルを、94℃に30秒加熱し、次いで25℃に冷却した。
【００３５】
次いでサンプルを高解像度DNA融解分析装置  Light Scanner（http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）（Idaho Technology、ソルトレークシティ、UT）に移し96ウェルの融解曲線を同時に解析した。融解曲線解析は、実施例に記載の如く実施した。
【００３６】
結果を図２−１から図２−３に示す。図２−１から図２−３は、それぞれエクソン７、９および１２−２のSNPの位置、ならびに検出に用いた増幅断片の融解曲線を示す。すべてのプライマー対において、PCR産物は単一バンドを示し、融解曲線も蛍光強度を来していることを確認できた。ここで、ホモ接合体SNP（図２−１の融解曲線）、ヘテロ接合体SNP（図２−２の融解曲線）、ヘテロ接合体欠失（図２−３の融解曲線）は、高解像度融解分析から検出した。
【００３７】
実施例２  TNSALP遺伝子の1559Tの欠失変異の検出
日本人において頻度の高いTNSALP遺伝子の1559Tの欠失変異の既知の配列変異の遺伝子型を特定する手法として、Small amplicon genotyping(SAG)法 (Gundry  CN et al.  Nucleic Acids Res. 2008, Vol. 36, 3401-3408)を用いて条件を設定した。増幅フラグメントが短く（50-100 bp）なるよう、1559Tの欠失変異にすぐ隣接した位置にプライマーを設計した。PCRは、96ウェルプレートの１ウェルに対し全容積10μlで実施した。反応混合物は、2.5x High Sensitivity Genotyping master mix、それぞれ200μMのdATP、dGTP dCTP、およびdTTP、0.3 μMのプライマー(Forward, Reverse)、1μlのExTaqポリメラーゼ、および色素(10×LCGreen Plusを1/10 )を含んでいた。ポリメラーゼ連鎖反応は、PCR機器中、最初の変性を95℃で2分、続いて94℃で30秒、20℃/秒でエクソンごとの（アニーリング）温度（60℃〜72℃）まで冷却して30秒加熱するサイクルを45サイクルにより実施した。アンプリコンのサイズはエクソンごとに異なるが400bp以下とした。PCR後、サンプルを、94℃に30秒加熱し、次いで25℃に冷却した。次いでサンプルを高解像度DNA融解分析装置  Light Scanner（http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）（Idaho Technology、ソルトレークシティ、UT）に移し96ウェルの融解曲線を同時に解析した。融解分析は、実施例に記載の如く実施した。
【００３８】
具体的な結果を図３に示す。ホモ接合体欠失、ヘテロ接合体欠失は、高解像度融解分析から検出した。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の方法により、被験体の低フォスファターゼ症に関連する組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異をスクリーニングすることができ、変異の存在により低フォスファターゼ症罹患の有無および発症リスクを判定、評価することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００４０】
配列番号１〜２６  プライマー
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【配列表】
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