(57)【要約】      （修正有）【課題】抱合した胆汁酸の加水分解活性を示し、血清中のコレステロール抑制効果を有する乳酸菌を提供する。【解決手段】ラクトバシラスジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（受託Ｎｏ．ＮＩＴＥＰ−２７８）は抱合胆汁酸に対する加水分解活性、胆汁酸耐性、コレステロール吸着作用に優れ、生体への投与によって血清中のコレステロールを抑制する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバシラス属の乳酸菌であって次のａ）乃至ｄ）
ａ）胆汁酸耐性に優れている
ｂ）抱合胆汁酸に対する加水分解活性が優れている
ｃ）コレステロール吸着作用が優れている
ｄ）生体への投与によって血清中のコレステロールを抑制すること
上記の性質を有することを特徴とするラクトバシラス属の乳酸菌がラクトバシラス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２７８）
【請求項２】
ラクトバシラス  ジョンソニイＮｏ．１０８８乳酸菌による発酵菌末化又は錠剤化等各種製品
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ラクトバシラス  ジョンソニイＮｏ．１０８８の乳酸菌で、耐酸性及び胆汁酸耐性を示し、生体への投与によって血清中のコレステロールを抑制することの特徴を持ち、当該乳酸菌を使用し、加工した各種製品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の胆汁酸耐性については数多く報告されている（非特許文献１、２参照）。
胆汁酸耐性を示し、生体への投与によって血清中のコレステロール抑制効果についても多くの報告がある（非特許文献１、２、３、４、５参照）（特許文献１、２、３、４、５参照）。
しかしながらラクトバシラス属で耐酸性や胆汁酸耐性を有し、安定的に腸内に到達し、増殖し、血清中のコレステロール抑制効果を示すとは限らない。
【非特許文献１】Ｄｏｒａ  Ｉ．Ａ．Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３，６９，４７４３−４７５２
【非特許文献２】Ｗａｎ−Ｋｙｕ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ２００５，２４，１１−１６
【非特許文献３】Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８５，４９，３７７−３８１  Ｄｏｒａ  Ｉ．Ａ．Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３，６９，４７４３−４７５２
【非特許文献４】Ｉ．Ｄｅｓｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １９９８，７９，１８５−１９４
【非特許文献５】Ｗａｎ−Ｋｕ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ２００５，２４，１１−１６  Ｄｏｒａ  Ｉ．Ａ．Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ  Ａｐｐｌｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２，６８，４６８９−４６９３
【特許文献１】特開２００７−１８９９７３
【特許文献２】特開２００３−３０６４３６
【特許文献３】特開２０００−１９７４６９
【特許文献４】特開２０００−１８９１０５
【特許文献５】特開２００３−０８１８５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  乳酸菌による血清中のコレステロール抑制機序としては、腸管内の胆汁酸は主にタウリンやグリシンと抱合して存在する。乳酸菌はこの抱合した胆汁酸を加水分解することにより胆汁酸の腸、肝循環が阻害されることにより、肝臓のコレステロールからの胆汁酸への合成が促進され、その結果生体内のコレステロールが低下する。
本発明者は、数年前から抱合した胆汁酸の加水分解活性を示す乳酸菌に強い関心を持ち、血清中のコレステロール抑制効果の乳酸菌の探索を鋭意行ってきた
その結果、タウロデオキシコール酸ナトリウム（シグマ社）に対し、他のラクトバシラス属の乳酸菌よりも優れた加水分解活性を示し、さらに高コレステロール飼料摂取マウスに投与することにより、血清中のコレステロールを有意に抑制するラクトバシラス  ジョンソニイＮｏ．１０８８を見出し、更にこの乳酸菌の用途として各種製品に利用することが可能であることにより本発明を完成した。
【課題を開発するための手段】
【０００４】課題を解決する本発明は、ラクトバシラス属の乳酸菌であって
ａ）胆汁酸耐性を有すること
ｂ）抱合胆汁酸に対する加水分解活性に優れている
ｃ）生体への投与により血清中のコレステロールを抑制すること
の性質を有するラクトバシラス属の乳酸菌がラクトバシラス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２７８）であること。並びに本乳酸菌による発酵食品、本乳酸菌の菌末化に伴う混合食品、錠剤化等の加工することを特徴とする各種製品。
【０００５】  次に発明について詳細に記載する。本発明者がヒトの胃液から分離した乳酸菌ラクトバシラス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）Ｎｏ．１０８８（以下Ｎｏ．１０８８と略記する）さらに生体への投与によって血清中のコレステロールの抑制を示す乳酸菌である。
【０００６】  本発明は、胆汁酸耐性を有し、抱合胆汁酸に対する加水分解活性に優れ、生体への投与によって血清中のコレステロール抑制効果を示すＮｏ．１０８８を含有する各種製品であり、本乳酸菌により発酵したヨーグルト等の発酵食品、本乳酸菌を凍結乾燥した粉末からなる健康食品、本乳酸菌末を加工した錠剤等の健康食品や医薬品等多くの製品に使用することが可能である。
【０００７】  次に試験例を示し、本発明について詳細に記載する。
【０００８】  Ｎｏ．１０８８と他のラクトバシラス属乳酸菌の抱合胆汁酸（ＢＳＨ）の加水分解活性
１）抱合胆汁酸の加水分解活性に優れたＮｏ．１０８８と他のラクトバシラス属乳酸菌
エムアールエス（ＭＲＳ）寒天培地（ベクトン・デッキンソン社製）に０．５％タウロデオキシコール酸ナトリウム（シグマ社製）及び塩化カルシウム（和光純薬社製）０．３７ｇ／Ｌ加え、１２１℃で１５分滅菌後、１０ｍＬずつシャーレに充填し平板とする。
この平板に抗生物質検定用のステンレスカップを並べ、あらかじめエムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）で３７℃、１８時間培養した乳酸菌培養液をカップに滴下し、３７℃、７２時間嫌気培養した。
判定はカップ周辺に抱合胆汁酸が加水分解により不溶性の胆汁酸に変換され混濁した円の径が出現する。この円の径を測定することで胆汁酸の加水分解活性とした（図１）。混濁した円の径が大きいほど活性が強いことを示す。
【表１】
2011217715.tif 000002
結果は、表１に示す通りで標準株や他のラクトバシラス属の乳酸菌よりもＮｏ．１０８８は最も強い活性を示した。
【０００９】２）胆汁及び胆汁酸耐性試験
エムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）１０ｍＬに胆汁（オックスガル：ベクトン・デッキンソン社製）及びタウロコール酸ナトリウム（シグマ社製）を０、０．１、０．３、０．６、１．２及び２．０％になるよう加え１２１℃で１５分滅菌した。
この液体培地にあらかじめエムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）で３７℃、１８時間培養したＮｏ．１０８８の培養液０．１ｍＬを接種し、０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間及び２４時間目にサンプリングし、Ｎｏ．１０８８の菌数を測定した。菌数の測定はエムアールエス・アガー（ＭＲＳ  ａｇａｒ：ベクトン・デッキンソン社製）の平板上に滅菌生理食塩水で１０−１、１０−３、１０−５．１０−７、及び１０−８の希釈菌液を０．１ｍＬ滴下し、コンラージ棒でまき広げ３７℃で４８時間培養した。この平板に出現した集落数に希釈倍数を乗じて菌数とした。
結果は図２に示す通りでオックスガル及びタウロコール酸ナトリウム添加量を増加させることにより増殖は抑制されたが、１２時間、２％の添加量まで増殖は確認できた。このことから腸管内の胆汁濃度の範囲内で十分増殖できるものと思われた。
【００１０】３）タウロコール酸ナトリウム存在下によるコレステロール抑制試験
エムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）１０ｍＬに溶性コレステロール（シグマ社製）１００ｍｇ／ｍＬ含有タウロコール酸ナトリウム（シグマ社製）を０、０．１、０．３、０．６、１．２及び２％になるように加え１２１℃で１５分滅菌した培地に、あらかじめエムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）で３７℃、１８時間培養したＮｏ．１０８８を０．１ｍＬ接種し、３７℃で２４時間培養した。
溶媒培養液はＮｏ．１０８８の菌数の測定と培養液を３０００回転、１５分遠心分離して上清を分取し、コレステロール量を測定した。
コレステロールの測定はエスアールエス（ＳＲＳ）社に依頼し、添加したコレステロールに対する減少率（％）で示した。
結果は、図３に示したようにタウロコール酸ナトリウムの添加量に依存してＮｏ．１０８８の菌数及びコレステロールの減少率は抑制された。すなわち、コレステロールの減少は、タウロコール酸添加濃度に依存することなくＮｏ．１０８８の増殖性によってコレステロールの減少率（％）が決まることを示している。
【００１１】４）胆汁及び胆汁酸存在下によるコレステロール抑制試験
エムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）に溶性コレステロール（シグマ社製）に０．３％オックスガル（シグマ社製）、５ｍＭタウロコール酸ナトリウム（シグマ社製）、５ｍＭタウロデオキシコール酸ナトリウム（シグマ社製）、５ｍＭデオキシコール酸ナトリウム（シグマ社製）及び５ｍＭコール酸ナトリウム濃度によるように調製し、１２１℃１５分滅菌した。
上記の液体培地にあらかじめエムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）で３７℃、１８時間培養した菌液を１×１０１０／ｍＬに調整し、その０．１ｍＬ接種後３７℃、１８時間培養した。
培養液はＮｏ．１０８８の生菌数の測定と培養液を３０００回転で１５分遠心分離して上清のコレステロールを測定した。コレステロールの測定はエスアールエス（ＳＲＬ）社に依頼し、添加したコレステロールの減少率（％）で示した。
【表２】
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結果は表２に示したようにオックスガル、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム存在下でコレステロールは２０〜７０％減少した。
ＳＲＬ社のコレステロール試験法
コレステロール脱水素酵素法
測定機器  ＪＣＡ−ＢＭ８０００シリーズ自動分析装置（日本電子社製）
参考文献  桜井  強  医学検査  ４７（４）、７４７−７５２、１９９８
【００１２】５）高コレステロール飼料飼育マウスによるＮｏ．１０８８のコレステロール抑制試験
４週令スペシフィックパソジエンフリー（ＳＰＦ）バルブ・シー（ＢＡＬＢ／Ｃ）マウス（日本クレア社）を用い、実験群として１群、通常飼料ＣＬ２（日本クレア社製）に水０．５ｍＬ連日投与マウス１０匹（雄５、雌５）。２群、通常飼料ＣＬ２（日本クレア社製）にＮｏ．１０８８を連日２×１０９／ｍＬの生菌数０．５ｍＬ連日投与マウス１０匹（雄５、雌５）。
【表３】
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３群、高コレステロール飼料（日本クレア社製、表３に組成参照）に水０．５ｍＬ連日投与マウス１０匹（雄５、雌５）。４群、高コレステロール飼料（日本クレア社製）にＮｏ．１０８８を連日２×１０９／ｍＬの生菌数を０．５ｍＬ連日投与マウス１０匹（維５、雌５）とした。
体重は１週間ずつ測定した。マウスは投与１２週目に糞便中の菌叢の検索及びマウスを屠殺して体重を測定後、血液を採取し、さらに肝重量と下腹部精巣及び卵巣周囲の脂肪重量を測定した。
血液は血清を分取してコレステロール測定用のサンプルとした。
コレステロールの測定はエスアールエル（ＳＲＬ）社に依頼した。
体重の増加率（％）は図４に示し、高コレステロール飼料飼育マウスにＮｏ．１０８８投与した雌の体重が抑制されたがそれ以外の実験群マウスに大きな違いは見られなかった。
肝重量及び下腹部精巣及び卵巣周囲の脂肪重量は通常飼料（ＣＬ２）に比べ高脂肪飼育マウスでは有意に増加し、高コレステロール飼料マウスにＮｏ．１０８８を投与すると水投与に比べ体重に対する肝の重量％と下腹部精巣及び卵巣周囲の脂肪量で有意な減少が見られた。それ以外の実験群マウスに著名な差は認められなかった。（表４）
【表４】
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血清中のコレステロールの値は、通常飼料（ＣＬ２）の場合、雌マウスでＮｏ．１０８８の投与によって投与前の値よりも低下したが、雄では変わらなかった。その要因として雌の体重の増加率が低かったことによるかもしれない。
高コレステロール飼料飼育マウスの場合、Ｎｏ．１０８８の投与によって水投与に比べ雄のコレステロールは１０％抑制され、雌は１６％と有意な抑制がみられ平均で１３％の抑制が見られた（図５）。
Ｈｊｅｒｍａｎｎはコレステロール値が１％低下するとコレステロール血症のリスクは２％減少するといわれており（非特許文献６参照）、このことを鑑みるとＮｏ．１０８８は、コレステロール血症の予防食品としてヒトへの応用が期待される。
【非特許文献６】Ｈｊｅｒｍａｎｎ．Ｉ，ｅｔ  ａｌ  １９８１  Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ：１３０３
【００１３】  次に本発明を実施するための最良の形態について、実施例を記載するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１４】  エムアールエス・ブロス（ＭＲＳ  ｂｒｏｔｈ：ベクトン・デッキンソン社製）１０ＬにＮｏ．１０８８を生菌数濃度１×１０７／ｍＬの割合で接種し、３７℃で１５時間培養し、培養終了後、遠心分離による集菌し、集菌した菌体を濃度０．８５％の滅菌精製水に懸濁し、遠心分離により洗浄した菌体を集菌し、１０％の脱脂粉乳及び１％のグルタミン酸ナトリウムを含有する溶液に洗浄した菌体を懸濁し、常法により凍結乾燥し、約５０ｇの乾燥菌末を製造した。得られた乾燥菌末の生菌数を前記試験例１と同一の方法により試験した結果２．０×１０１１／ｇであった。【００１５】  前期Ｎｏ．１０８８の乾燥菌体１０ｇを水分３％以下の市販デキストリン（松谷化学社製。パンデックス）４．９９ｋｇに倍散し、乳酸菌末約５ｋｇを製造した。得られた乳酸菌末の生菌数を前記試験例１と同一の方法により測定した結果４．０×１０８／ｇであった。
【実施例２】
【００１６】  殺菌した原料乳１０ｋｇに、スターターとしてＮｏ．１０８８、ラクトバシラス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（市販ヨーグルトから分離した菌株）及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（市販ヨーグルトから分離した菌株）の等量混合菌末を２％の割合で添加したことを除き、常法のタンク発酵タイプによりタンク内で発酵させ、約１０ｋｇのヨーグルトを製造した。
【実施例３】
【００１７】  実施例１で得られたＮｏ．１０８８の乾燥菌体２．０ｋｇを、約０．３ｇずつそのまま打錠し、約６，５００個の錠剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００１８】  以上記載したとおりＮｏ．１０８８は優れた胆汁酸耐性、優れた抱合胆汁酸加水分解能、コレステロール吸着能、さらに生体への投与によって血清中のコレステロールを抑制することから、発酵食品、健康食品、機能性食品、医薬品等広範囲な製品に利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＢＳＨ活性の測定方法
【図２】胆汁及び胆汁酸耐性試験
【図３】タウロコール酸ナトリウム存在下によるコレステロール抑制試験
【図４】体重増加率の変化
【図５】血清コレステロール抑制効果
【００２０】「表１」Ｎｏ．１０８８と他のラクトバシラス属乳酸菌の抱合胆汁酸（ＢＳＨ）の分解活性
「表２」胆汁及び胆汁酸存在下によるコレステロール抑制試験
「表３」高コレステロール飼料組成
「表４」体重、肝重量、下腹部精巣及び卵巣周囲脂肪量の変化（投与１２Ｗ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
2011217715.tif 000008
【図４】
2011217715.tif 000009
【図５】
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