(57)【要約】【課題】簡便かつ高感度にアミノ酸を分析することができるアミノ酸の分析方法およびバイオセンサーを提供する。【解決手段】  本発明のアミノ酸の分析方法によれば、（Ａ）アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、試料中に含まれるアミノ酸と、アデノシン三リン酸とを反応させる工程、（Ｂ）上記反応工程によって生じるピロリン酸を検出する工程、を含むことにより、簡便かつ高感度にアミノ酸を分析することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、試料中に含まれるアミノ酸と、アデノシン三リン酸とを反応させる工程
（Ｂ）上記（Ａ）工程によって生じるピロリン酸を検出する工程、を含むことを特徴とするアミノ酸の分析方法。
【請求項２】
上記（Ｂ）工程は、以下の工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸の分析方法。
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、ピルビン酸と、ピルビン酸オキシダーゼと、を反応させる工程
（ｂ３）上記（ｂ２）工程において生じた過酸化水素を検出する工程
【請求項３】
上記（Ｂ）工程は、以下の工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸の分析方法。
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２'）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、ピルビン酸と、ＮＡＤ＋と、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させる工程
（ｂ３'）上記（ｂ２'）工程において生じたＮＡＤＨを検出する工程
【請求項４】
上記（Ｂ）工程は、以下の工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のアミノ酸の分析方法。
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２''）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、グリセルアルデヒド三リン酸と、ＮＡＤ＋と、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させる工程
（ｂ３''）上記（ｂ２''）工程において生じたＮＡＤＨを検出する工程
【請求項５】
支持体上に固定化されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、
ピロリン酸、過酸化水素およびＮＡＤＨから選択される少なくとも１種の物質を検出するための検出手段と、を備えることを特徴とするアミノ酸分析用のバイオセンサー。
【請求項６】
上記検出手段は、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアミノ酸の分析方法により、ピロリン酸、過酸化水素およびＮＡＤＨから選択される少なくとも１種の物質を検出するものであることを特徴とする請求項５に記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸の分析方法およびバイオセンサーに関し、特にライフサイエンス、バイオテクノロジー、臨床医療・分析、食品品質管理・分析等の臨床医療又は／及び食品管理において簡便に利用可能なアミノ酸の分析方法およびバイオセンサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、アミノ酸の分析技術は、ライフサイエンス、バイオテクノロジー分野、特に、臨床医療における疾病診断から医薬品開発、食品の品質管理や分析から食品開発など多くの分野で欠くことのできない技術となっている。
【０００３】
アミノ酸の分析技術のうち最も一般的な方法は、ニンヒドリンを用いるポストカラム法である。これはアミノ酸溶液とニンヒドリンを高温で反応させてアミノ酸を誘導化し、高速液体クロマトグラフィーにより分離分析するというものである。そしてこの原理に基づいたアミノ酸専用自動分析機器として高速アミノ酸分析計（例えば特許文献１）やアミノ酸分析システム（例えば特許文献２）等が販売されている。
【０００４】
また、ニンヒドリン反応を利用した方法以外にも、例えばキャピラリー電気泳動装置（ＣＥ）と質量分析装置（ＭＳ）とを用いたアミノ酸分析法が開発されている（例えば特許文献３）。
【０００５】
上述した以外の方法として、バイオセンサーを用いたアミノ酸の計測法も開発されている。バイオセンサーによる計測法は、上記の技術に比べて、試料の前処理や標識化など煩雑な操作が不要であり、簡便かつ迅速に目的物質の計測が可能であるという特長がある。
【０００６】
アミノ酸を計測するためのバイオセンサーの研究としては、Ｌ−リジンに選択的結合性を示す酵素であるＬ−リジン酸化酵素を分子認識材料に用い、Ｌ−リジンと酵素との結合により消費される酸素濃度を酸素電極で検知するというバイオセンサーの研究論文が発表されている（例えば非特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、Ｌ−アミノ酸の酸化酵素は、２０種類全ての天然のアミノ酸に対して存在するわけではなく、非特許文献１において提案するような酸化酵素を認識材料に用いて全アミノ酸を網羅的に計測するバイオセンサーを構築することは不可能であった。
【０００８】
そこで、２０種類全ての天然のアミノ酸の分析を可能とすべく、これまでにアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（以下、ＡＲＳと称する場合もある。）を用いたアミノ酸分析技術が開発されている。ＡＲＳは、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰと称する場合もある。）を利用し、タンパク質合成時にｔＲＮＡへ、対応するアミノ酸を結合させる酵素であり、その性質上、特定のアミノ酸やｔＲＮＡへの特異性が極めて高い。
【０００９】
例えば、本願発明者らは、ＡＲＳを分子認識材料として利用したアミノ酸分析用のバイオセンサーを開発している（特許文献４）。また、小玉らにより、支持体上に固定されたＡＲＳと標識されたＡＴＰ等とアミノ酸とを反応させて、ＡＲＳに結合した標識されたＡＴＰ等を検出する分析方法が開発されている（特許文献５）。さらに、Shipwashらにより、マイクロアレイ技術を利用して、ＡＲＳとｔＲＮＡとを混合した系において、一方を蛍光標識することで超高感度にアミノ酸を検出する技術が開発されている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００２−２４３７１５号公報（公開日：平成１４年８月２８日）
【特許文献２】特開平１１−２２３６２５号公報（公開日：平成１１年８月１７日）
【特許文献３】特開２００２−７１６６０号公報（公開日：平成１４年３月１２日）
【特許文献４】特開２００６−１６６７０９号公報（公開日：平成１８年６月２９日）
【特許文献５】特開２００６−２４６８４１号公報（公開日：平成１８年９月２１日）
【特許文献６】米国特許６８４６６３８（登録日：２００５年１月２５日）
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】I. Satoh, T. Mimura, S. Arakawa, A. Okamoto, Proceedings of the 19th Sensor Symposium, pp.201-204, (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、ＡＲＳを用いたアミノ酸の分析技術の開発が進められている。しかし、例えば特許文献６に開示の技術は、非常に複雑な検出系を構築しているため、操作が煩雑となり、実用性の面で問題がある。その一方で、アミノ酸の分析技術は、学術的な基礎研究から医薬品開発・食品開発などの応用研究まで幅広い分野で必須の技術となっているため、新たな簡便かつ高感度な分析技術の開発が求められている。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便かつ高感度にアミノ酸を分析することができるアミノ酸の分析方法およびバイオセンサーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＡＲＳがＡＴＰおよびアミノ酸と結合する際に生じるピロリン酸を指標とすることにより高感度でアミノ酸を分析できることを見出し、かかる新規知見に基づき、本発明を完成させるに至った。本発明は、以下の発明を包含する。
（１）（Ａ）アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、試料中に含まれるアミノ酸と、アデノシン三リン酸とを反応させる工程、（Ｂ）上記（Ａ）工程によって生じるピロリン酸を検出する工程、を含むアミノ酸の分析方法。
（２）上記（Ｂ）工程は、以下の工程を含む（１）に記載の方法。
【００１５】
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、ピルビン酸と、ピルビン酸オキシダーゼと、を反応させる工程
（ｂ３）上記（ｂ２）工程において生じた過酸化水素を検出する工程
（３）上記（Ｂ）工程は、以下の工程を含む（１）記載の方法。
【００１６】
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２'）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、ピルビン酸と、ＮＡＤ＋と、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させる工程
（ｂ３'）上記（ｂ２'）工程において生じたＮＡＤＨを検出する工程
（４）上記（Ｂ）工程は、以下の工程を含む（１）に記載の方法。
【００１７】
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２''）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、グリセルアルデヒド三リン酸と、ＮＡＤ＋と、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させる工程
（ｂ３''）上記（ｂ２''）工程において生じたＮＡＤＨを検出する工程
（５）支持体上に固定化されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、ピロリン酸、過酸化水素およびＮＡＤＨから選択される少なくとも１種の物質を検出するための検出手段と、を備えるアミノ酸分析用のバイオセンサー。
（６）上記検出手段は、上記（１）〜（４）のいずれかの方法により、ピロリン酸、過酸化水素およびＮＡＤＨから選択される少なくとも１種の物質を検出するものである（５）に記載のバイオセンサー。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るアミノ酸の分析方法またはバイオセンサーによれば、簡便かつ高感度にアミノ酸を分析できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＩＳＦＥＴ電極を用いてヒスチジンの応答を調べた図である。
【図２】支持体に固定化したチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｙｒＲＳ）を用いて、チロシン応答性を評価した図である。
【図３】蛍光法によりチロシン分析を行った結果を示す図である。
【図４】蛍光法によりＴｙｒＲＳの選択性を評価した結果を示す図である。
【図５】バイオセンサーの構造の一例を示す模式図である。
【図６】本発明の応用によりアミノ酸センシングの将来展望を模式化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
＜１．アミノ酸の分析方法＞
アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＡＲＳ）は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合部位、ｔＲＮＡ結合部位およびアミノ酸結合部位を有しており、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用して、特定のｔＲＮＡにそれに対応するアミノ酸を結合させる酵素である。ＡＲＳは、ほとんど全ての生物で２０種類のアミノ酸それぞれに対応して２０種類存在する。このため、ＡＲＳは、特定のアミノ酸への特異性が極めて高い。本発明では、このような性質を有するＡＲＳを利用しているため、夾雑物質が存在していたとしても、アミノ酸を高感度で検出することができ、試料中のアミノ酸を正確に測定することができる。
【００２２】
このＡＲＳは、以下のような反応式の通り、ＡＴＰの存在下でアミノ酸と結合してアミノアシル−ＡＭＰとピロリン酸（pyrophosphate）を生じさせる。
【００２３】
【化１】
2011050357.tif 000002
【００２４】
本願発明者らは、上記の反応において、分子認識材料であるＡＲＳと、アミノ酸との選択的結合に伴って生じる化学的変化あるいは物理的変化を捉えることにより、アミノ酸を分析することができることを見出した。つまり、「１．ＡＲＳがアミノ酸と結合することによって生成するアミノアシル−ＡＭＰを計測することによりアミノ酸を分析する技術」、「２．ＡＲＳがアミノ酸と結合することによって生成するピロリン酸を計測することによりアミノ酸を分析する技術」あるいは「３．これらの計測法を組み合わせ、より信頼性の高い計測技術」の少なくとも３通りの計測技術を考えた。このうち、上記１の技術については、既に本願発明者らによって特許文献４として出願されている。本願発明では、上記２の原理を用いたものである。
【００２５】
すなわち、本発明に係るアミノ酸の分析方法は、（Ａ）アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、試料中に含まれるアミノ酸と、ＡＴＰとを反応させる工程、（Ｂ）上記（Ａ）工程によって生じるピロリン酸を検出する工程、を含むものである。
【００２６】
本発明におけるＡＲＳは、適当な条件下で、２０種類のアミノ酸のいずれかのアミノ酸とＡＴＰと反応して、アミノアシル−ＡＭＰとピロリン酸を生成させる能力を有していれば、特に制限されるものではない。例えば、Bos（ウシ）属、Artemia属、Rattus（クマネズミ）属等に属する動物、Bombyx（カイコ）属、Drosophila（ショウジョウバエ）属等に属する昆虫、Escherichia属、Thermus属、Bacillus属、Saccharomyces属、Staphylococcus属等に属する微生物など、いずれの生物由来のＡＲＳであってもよい。動物由来のＡＲＳとしては、例えばBos taurus又はArtemia cysts由来のものを挙げることができる。昆虫由来のＡＲＳとしては、例えばBombyx mori由来のものを挙げることができる。微生物由来のＡＲＳとしては、例えばEscherichia coli、Thermus thermophilus、Bacillus subtilis、Saccharomyces cerevisiae又はStaphylococcus aureus由来のものを挙げることができる。
【００２７】
また、本発明でいうＡＲＳには、適当な条件下で、２０種類のアミノ酸のいずれかのアミノ酸およびＡＴＰと反応して、アミノアシル−ＡＭＰとピロリン酸を生成させる能力を有している限り、いずれかの野性型の生物由来のＡＲＳのアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する変異体も含まれる。なお「相同性」には、狭義の同一性のみならず、さらにアミノ酸の有する性質が同じような広義の相同性をも包含するものである。変異体の変異には、自然変異または化学的変異剤や紫外線等による人工変異を含む。上述した野性型の生物由来のＡＲＳには、例えば、上記特許文献５に開示されるaccession numberが記載されたＡＲＳが挙げられる。
【００２８】
また、本発明では、ＡＲＳを、検出するアミノ酸の種類に応じて選択すればよい。すなわち、検出するアミノ酸に対応したＡＲＳを用いる。例えば、チロシンを検出したい場合は、チロシル−ｔＲＮＡシンセターゼを、バリンを検出したい場合はバリル−ｔＲＮＡシンセターゼを用いればよい。
【００２９】
なお、ＡＲＳは、公知の手法によりさまざまな生物から単離することができる。また、配列が公知の場合はそれに基づいてプローブを設計し、ＰＣＲ法を用いるなどして目的となる遺伝子を取得し、それを適当な発現ベクターに組み込んで、それを宿主に導入して発現させることにより、目的のＡＲＳを取得することができる。さらに、配列が公知のＡＲＳのアミノ酸配列と例えば８０％以上の相同性を有するＡＲＳについても、例えばサザンハイブリダイゼーション法を利用するなどして、取得することができる。
【００３０】
上記（Ｂ）工程において、ピロリン酸を検出する具体的な方法については特に限定されず、従来公知の種々の手法を用いることができる。例えば、モリブデンブルー、マラカイトグリーン等のピロリン酸検出用の蛍光試薬を用いた検出や、ＩＳＦＥＴ（Ion-Sensitive Field-Effect Transistor）電極で検出することができる。なお、後述する実施例に示すように、ピロリン酸検出用の市販試薬を用いる方法は簡便であり好ましい。
【００３１】
また、上記の手法以外にも、ピロリン酸に反応性を示す酵素を用いることにより、間接的にピロリン酸を検出することも可能である。つまり、複合酵素を用いた反応工程により生成される物質を検出することより、ピロリン酸を検出することができる。例えば、以下の反応式に示すように、ピロリン酸に無機ピロフォスファターゼを作用させてリン酸を生じさせ、このリン酸にピルビン酸とピルビン酸オキシダーゼとを反応させて生じる過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を検出することにより、間接的にピロリン酸を検出し、結果としてアミノ酸を分析することができる。
【００３２】
【化２】
2011050357.tif 000003
【００３３】
すなわち、本発明では、上記（Ｂ）工程は、以下の工程（ｂ１）〜（ｂ３）を含むことにより、間接的にピルビン酸を検出する方法であることが好ましい。
【００３４】
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、ピルビン酸と、ピルビン酸オキシダーゼと、を反応させる工程
（ｂ３）上記（ｂ２）工程において生じた過酸化水素を検出する工程
ここで過酸化水素を検出する手法としては、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、市販の過酸化水素検出用の試薬を用いることもできるし、電極反応で検出することも可能である。なお、本発明において「電極反応」には、電極面における電荷移動とそれに伴う酸化還元反応のみならず、これに関連しておこる吸着、拡散や副次的な反応も含む。さらに、下記の反応式に示すように、上記（ｂ３）工程において生じた過酸化水素にルミノールを反応させて生じるルミノール発光（例えば、波長４２５ｎｍの光）を検出する方法も利用可能である。
【００３５】
【化３】
2011050357.tif 000004
【００３６】
また、他の実施形態として、例えば、以下の反応式に示すように、ピロリン酸に無機ピロフォスファターゼを作用させてリン酸を生じさせ、このリン酸にピルビン酸と、ＮＡＤ＋（酸化型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）と、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させて生じるＮＡＤＨ（還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を検出することにより、間接的にピロリン酸を検出し、結果としてアミノ酸を分析することもできる。
【００３７】
【化４】
2011050357.tif 000005
【００３８】
すなわち、本発明において、上記（Ｂ）工程は、以下の工程（ｂ１），（ｂ２'）および（ｂ３'）を含むことにより、間接的にピルビン酸を検出する方法であってもよい。
【００３９】
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２'）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、ピルビン酸と、ＮＡＤ＋と、ピルビン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させる工程
（ｂ３'）上記（ｂ２'）工程において生じたＮＡＤＨを検出する工程
ここでＮＡＤＨを検出する手法としては、従来公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば、市販のＮＡＤＨ検出用の試薬を用いることもできるし、電極反応で検出することも可能である。さらに、ＮＡＤＨのみが波長３４０ｎｍの紫外線を良く吸収するため、波長３４０ｎｍあるいは３３９ｎｍの吸光度の測定によってＮＡＤ+⇔ＮＡＤＨの変化については容易に調べることもできる。
【００４０】
さらに他の実施形態として、例えば、以下の反応式に示すように、ピロリン酸に無機ピロフォスファターゼを作用させてリン酸を生じさせ、このリン酸にグリセルアルデヒド三リン酸と、ＮＡＤ＋と、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させて生じるＮＡＤＨを検出することにより、間接的にピロリン酸を検出し、結果としてアミノ酸を分析することもできる。
【００４１】
【化５】
2011050357.tif 000006
【００４２】
すなわち、本発明において、上記（Ｂ）工程は、以下の工程（ｂ１），（ｂ２''）および（ｂ３''）を含むことにより、間接的にピルビン酸を検出する方法であってもよい。
【００４３】
（ｂ１）ピロリン酸と無機ピロフォスファターゼとを反応させる工程
（ｂ２''）上記（ｂ１）工程において生じたリン酸と、グリセルアルデヒド三リン酸と、ＮＡＤ＋と、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼと、を反応させる工程
（ｂ３''）上記（ｂ２''）工程において生じたＮＡＤＨを検出する工程
上述した本発明で使用するいずれの酵素、すなわちＡＲＳ，無機ピロフォスファターゼ，ピルビン酸オキシダーゼ，ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼは、支持体上に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。ただし、ハンドリングの容易さから支持体上に固定化されていることが好ましい。
【００４４】
支持体としては、その表面上にＡＲＳまたはその他の上記酵素を固定しうるものであれば特に制限はなく、支持体の形状、材質等に特に制限はないが、形状は板状が好ましく、材質はガラス製が好ましい。このような支持体は、蛍光や発光を用いて検出する場合に好適に使用することができるためである。
【００４５】
また、各種酵素の支持体への固定化方法については、各種酵素の機能が妨げられない限り特に制限はなく、例えば、疎水性相互作用、親水性相互作用、静電引力、化学結合のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを利用したものであってもよい。また、各種酵素は支持体に直接固定されていてもよいし、タンパク等の適当な物質をスペーサーとして介して間接的に固定されていてもよい。具体的な酵素の支持体への固定化手法として、例えば、(i) ビオチン化したＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を支持体に吸着させ、次いでアビジンもしくはストレプトアビジンをＢＳＡに付しているビオチンに結合させ、この結合したアビジンもしくはストレプトアビジンへ、ビオチン化した酵素のビオチンを結合させる手法や、(ii) 酵素をヒスタグ付きで得ることで、活性エステルなどの反応性基で修飾した支持体とＡＢ-ＮＴＡ（N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid）を反応させ、次いでＮｉ（ＩＩ）を加え錯形成させ、このＮｉ（ＩＩ）へ酵素のヒスタグを配位させる手法、(iii) また後述する実施例に示すように光硬化剤等を用いて固定化する方法や、(iv) カルボキシル基修飾マイクロビーズにプロテインカップリング剤を用いて固定化する方法等が挙げられる。
【００４６】
なお、本発明において使用するＡＲＳの分子数と試料に含まれる目的アミノ酸の分子数との比は、試料に含まれるアミノ酸の有無を調べる場合は、特に制限はないが、試料に含まれるアミノ酸を定量する場合は、定量の正確さを求める観点から、試料に含まれる目的アミノ酸の分子数より、ＡＲＳの分子数が多くなるように試料を希釈したり、ＡＲＳの分子数を増やしたり、などして適宜調整する必要がある。試料に含まれるアミノ酸を定量する場合は、試料に含まれる目的アミノ酸の分子数に対して、ＡＲＳの分子数が過剰量となるようにしなくてもよいが、過剰量になるようにすることが好ましい。
【００４７】
また、本発明を行うための溶液については、従来公知の緩衝液が使用でき、特に限定されるものではない。また、上述した各種酵素は、反応槽中に全ての酵素をまとめて存在させておくこともできるし、各工程に応じて逐次投入することもでき、適宜設定可能である。
【００４８】
＜２．バイオセンサー＞
本発明に係るバイオセンサーは、支持体上に固定化されたアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼと、ピロリン酸、過酸化水素およびＮＡＤＨから選択される少なくとも１種の物質を検出するための検出手段と、を備えるものであればよく、その他の具体的な構成、大きさ、形状等については、特に限定されるものではない。
【００４９】
上記検出手段とは、ピロリン酸、過酸化水素およびＮＡＤＨから選択される少なくとも１種の物質を検出することができれば、その具体的な構成については限定されないが、例えば、上述したいずれかの方法により、ピロリン酸、過酸化水素およびＮＡＤＨから選択される少なくとも１種の物質を検出するものであることが好ましい。また、後述する図５に示すように、支持体上に固定化されたＡＲＳと、検出手段とを、同一のマイクロ反応空間に設置することも可能である。
【００５０】
かかる検出手段の具体的な構成としては、例えば、ピロリン酸を検出する場合であれば、ピロリン酸検出用の蛍光試薬を備えた反応場や、ＩＳＦＥＴ電極を備えた反応場を挙げることができる。
【００５１】
また、過酸化水素を検出する場合であれば、同じく過酸化水素検出用の試薬を備えた反応場や、電極反応のための電極を備えた反応場、さらにルミノール発光を検出するための装置（例えば、波長４２５ｎｍの光を検出できる検出器）を挙げることができる。なお、過酸化水素を検出する場合、無機ピロフォスファターゼ、ピルビン酸、ピルビン酸オキシダーゼをさらに検出手段において備えることが好ましい。
【００５２】
また、ＮＡＤＨを検出する場合は、ＮＡＤＨ検出用の試薬を備えた反応場や、電極反応のための電極を備えた反応場、さらに、波長３４０ｎｍあるいは３３９ｎｍの吸光度を測定可能な装置を備えた反応場を挙げることができる。なお、ＮＡＤＨを検出する場合、無機ピロフォスファターゼ、ピルビン酸、ＮＡＤ＋、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをさらに検出手段において備えることが好ましい。また、他の実施形態では、無機ピロフォスファターゼ、グリセルアルデヒド三リン酸、ＮＡＤ＋、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼをさらに検出手段において備えることが好ましい。
【００５３】
また、本発明に係るバイオセンサーは、例えば、微細加工技術によりシリコン基盤又はガラス基板上に微細幅の複数の流路と、該流路に接続され該流路より広い幅の反応場を複数個形成し、該反応場に各アミノ酸に対応したＡＲＳを固定化されたものであってもよい。特に、流路と反応場の数を概略２０とすることが好ましい。例えば、微細加工技術によりシリコン基板あるいはガラス基板等の上に数百マイクロメートルの幅の流路、および反応場を各アミノ酸に対応させて２０個形成し、その反応場に各アミノ酸に対応するＡＲＳを固定化したものであることが好ましい。かかる構成であれば、２０種類の全アミノ酸に対して対応可能なセンサーとなるため、全てのアミノ酸濃度を同時に検出可能なマルチ検出型センサーの開発が可能となる。
【００５４】
また、本発明において、アミノ酸検出試薬として、アミノ酸とＡＲＳとの結合により色素分子が変色する仕組み、あるいはルミノールによる化学発光を生じる仕組みをつくることで、より簡便・安価にアミノ酸濃度の計測が可能になるため、より好ましい。
【００５５】
次いで、本発明に係るアミノ酸分析用のバイオセンサーの一例について、図面に基づき説明する。図５には、バイオセンサー３０を示す。バイオセンサー３０は、微細加工技術により７×３センチメートル程度のシリコン基板あるいはガラス基板上に幅が数百マイクロメートル程度の２０個の流路と、これら２０個の流路上のそれぞれに、流路より広い幅の２０個のマイクロ反応空間（反応場、検出手段に相当）１〜２０とを備えるものである。当該反応空間１〜２０には、各アミノ酸に対応した２０種類のＡＲＳがそれぞれ固定化されている。つまり、２０種類の天然の全アミノ酸濃度を同時に検出可能なマルチ検出型センサーとしたものである。なお、固定化の方法については、上述した方法のほかに、特開平６−４３１３１、特開平５−１７２７７７等に開示されているので詳細は省略する。
【００５６】
バイオセンサー３０の使用方法としては、まず図面右上側に図示する矢印方向に試料を流路に注入し、図面左上側に図示する矢印方向に溶離液を注入する。例えば、サンプル入口にシリンジポンプやペリスターポンプを接続して一定量の試料および溶離液を注入する。試料は溶離液と共に流路を通過し、マイクロ反応空間１〜２０へ向かって分岐して進み、各アミノ酸に対応するＡＲＳが固定化されているマイクロ反応空間１〜２０へと入る。
【００５７】
このマイクロ反応空間において、各ＡＲＳは、試料中に含まれるアミノ酸とそれぞれ特異的に結合する。例えばヒスチジルｔＲＮＡシンセターゼはヒスチジンに対してのみ結合性を示し、アラニルｔＲＮＡシンセターゼはアラニンに対してのみ結合性を示すといった具合である。
【００５８】
この反応場に、例えば、ピロリン酸を検出する場合であれば、ピロリン酸検出用の蛍光試薬を存在させておく、またはＩＳＦＥＴ電極を備えることによりピロリン酸を検出することができる。また、過酸化水素を検出する場合であれば、過酸化水素検出用の試薬を存在させておく、または電極反応のための電極を備える、あるいはルミノール発光を検出するための試薬および装置を備えることにより、過酸化水素を検出できる。なお、過酸化水素を検出する場合、無機ピロフォスファターゼ、ピルビン酸、ピルビン酸オキシダーゼをさらにマイクロ反応空間に存在させておく。また、ＮＡＤＨを検出する場合は、ＮＡＤＨ検出用の試薬を存在させておく。または電極反応のための電極を備える、あるいは波長３４０ｎｍあるいは３３９ｎｍの吸光度を測定可能な装置を備えることにより、ＮＡＤＨを検出できる。なお、ＮＡＤＨを検出する場合、(i) 無機ピロフォスファターゼ、ピルビン酸、ＮＡＤ＋、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、または(ii) 無機ピロフォスファターゼ、グリセルアルデヒド三リン酸、ＮＡＤ＋、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼといった酵素・試薬の組み合わせをマイクロ反応空間に存在させておく。
【００５９】
上記のような構成により、マイクロ反応空間１〜２０において、ピロリン酸、過酸化水素またはＮＡＤＨのいずれかを検出することができる。
【００６０】
このようなバイオセンサー３０によれば、ピロリン酸、過酸化水素またはＮＡＤＨのいずれかを検出することにより、結果としてアミノ酸を検出することができる。また、本発明のようにセンサーチップの小型化を行うことにより、価格を安くすることが期待できるとともに、測定試料や試薬類が少なくまた計測に要する時間も大幅に短縮できると期待できる。さらに現在は外部の専門機関や専門の技術者が行っているアミノ酸の計測を、各研究機関や病院、食品製造加工工場でも入手可能な価格で、手軽に行うことが可能になる。
【００６１】
また、色素分子を導入して、アミノ酸とＡＲＳとの結合により変色する仕組み（アミノ酸検出試薬）をつくることにより、より簡便にアミノ酸濃度の計測を可能にすることが可能となる。
【００６２】
次に本発明に係るアミノ酸の分析方法およびバイオセンサーの将来展望について、概略図である図６を用いて簡単に説明する。現在は、図６に示されるように、外部の専門機関や専門の技術者等の分析機関が各研究機関病院、また食品会社工場からの分析依頼を受けてアミノ酸分析の計測を行っている。しかし、本発明を利用することにより、将来的に、各研究機関や病院、食品会社工場でアミノ酸分析の計測を比較的低価格で、手軽に行うことが可能になる。すなわち外部に依頼していた血中や尿中や食品中のアミノ酸分析がその現場で手軽に分析可能になり、誰にでも取り扱いが可能になり、分析費用の廉価化、迅速性、簡便性の向上等多くのメリットを持つものとなる。特に、病院などの医療機関、食品工場などが対象になると考えられ、一機関において複数台導入可能なコストで、しかも熟練した技術を要しない、誰にでも使用できる、取り扱いが簡便なシステムになり得る。
【００６３】
また、本発明に係るアミノ酸の分析方法およびバイオセンサーは、微少量のサンプルを水系において高感度に検出することができるため、現在の主なアミノ酸検出法である高速液体クロマトグラフィー法や放射線標識法に比べて大量の溶媒を必要とせず、検出のステップ、検出時間、コストが大幅に短縮することが可能であり、このような従来法に取って代わるアミノ酸検出法になる可能性が高いといえる。さらに原油の消費量も年間で約５，０００万ｋＬ抑制でき、またそれに伴うＣＯ２の排出量も年間で１．３億ｔ削減可能と見込まれ、環境負荷も小さくなるというメリットもある。
【００６４】
以上のように、本発明に係るアミノ酸の分析方法またはバイオセンサーによれば、臨床医療及び／又は食品管理において簡便に利用可能なバイオセンシング装置又はバイオセンサーとすることができ、現在これらの分野において外部に委託して行われているアミノ酸の計測を、医療現場または食品工場など利用現場において容易に利用可能なものにすることができる。これにより、例えば疾患の早期発見が可能となり、また味やにおいや鮮度等の計測にも有効である。
【００６５】
さらに、本発明で分子認識材料に用いる酵素であるＡＲＳは、生体内に存在して、タンパク質の合成に関わっているため目的のアミノ酸に対する選択性が高く、夾雑物質が存在しても、高選択的に各アミノ酸濃度が計測可能になるというメリットがある。また、２０種類全ての天然のアミノ酸に対してアミノ酸濃度を計測することができる。加えて、本発明を利用すれば、センサーチップの小型化を行うことができ、さらにセンサー化することによりアミノ酸を誘導体化する必要もなく迅速且つ簡便に、熟練した技術を要すること無く、より安価な価格で、手軽にアミノ酸の計測を行うことを可能にすることができる。
【００６６】
また、本発明は、以下のように表現することもできる。
（１）ＡＲＳをアミノ酸識別用酵素として用い、無機ピロフォスファターゼ、ピルベートオキシダーゼによる複合酵素の反応工程により生成する過酸化水素をルミノール発光反応により検出するバイオセンシングシステムあるいはバイオセンサー。
（２）ＡＲＳをアミノ酸識別用酵素として用い、無機ピロフォスファターゼ、ピルベートオキシダーゼによる複合酵素の反応工程により生成する過酸化水素を電極反応により検出するバイオセンシングシステムあるいはバイオセンサー。
（３）ＡＲＳをアミノ酸識別用酵素として用い、反応工程により生成するピロリン酸をモリブデンブルーあるいはマラカイトグリーンなどによる反応溶液を添加することにより検出するバイオセンシングシステムあるいはバイオセンサー。
（４）ＡＲＳをアミノ酸識別用酵素として用い、無機ピロフォスファターゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼによる複合酵素の反応工程により生成するＮＡＤＨを検出するバイオセンシングシステムあるいはバイオセンサー。
（５）ＡＲＳをアミノ酸識別用酵素として用い、無機ピロフォスファターゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼによる複合酵素の反応工程により生成するＮＡＤＨを電極反応により検出するバイオセンシングシステムあるいはバイオセンサー。
（６）ＡＲＳをアミノ酸識別用酵素として用い、反応工程により生成するピロリン酸をＩＳＦＥＴ電極で検出するバイオセンシングシステムあるいはバイオセンサー。
【００６７】
以下実施例を示し、本発明の実施形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６８】
以下、ＡＲＳがアミノ酸と結合することによって生成するピロリン酸の濃度を計測することにより、アミノ酸の濃度の定量を行った。
【００６９】
（実施例１）
ＨｉｓＲＳ（ヒスチジン結合性ＡＲＳ）とウシ血清アルブミンを１：２７（ｗ／ｗ）の比で混合し、ＩＳＦＥＴ電極表面に滴下後、架橋剤の７％グルタルアルデヒド溶液を加えて酵素を電極上に固定化させてセンサー素子とした。
【００７０】
２ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌを溶解した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）中に、この電極と参照電極の銀-塩化銀電極を浸し、それにアミノ酸溶液を添加してセンサーの応答を評価した。
【００７１】
結果を図１に示す。ＩＳＦＥＴ電極にヒスチジン結合性酵素のＨｉｓＲＳを固定化したアミノ酸センサーの応答について評価したところ、〜３．０ｍＭのヒスチジンに対して応答に直線性がみられ、定量的に分析可能であることが示された。また他のアミノ酸には応答がみられず、選択的応答も示した。チロシン結合性酵素（ＴｙｒＲＳ）、スレオニン結合性酵素（ＴｈｒＲＳ）についても同様な傾向がみられた。
【００７２】
また、光硬化剤であるＡＷＰ（Azide-unit pendant Water-soluble Photopolymer、東洋合成株式会社）を酵素の固定化剤として用いてチロシン結合性酵素のＡＲＳ（ＴｙｒＲＳ）をＩＳＦＥＴ電極上に固定化することを検討した。まずＩＳＦＥＴ電極上に１０％ エタノールに溶解した１％ ＡＷＰを１．５μＬ滴下し、４０℃で３０分間乾燥させた。そこに１０ｍＭリン酸バッファーに溶解した１％ＡＷＰとＴｙｒＲＳを５：１で混合し、それを１．５μＬ滴下した。それを４０℃で３０分間乾燥後、ＵＶランプを１時間照射してＴｙｒＲＳの固定化を行った。
【００７３】
ＴｙｒＲＳを固定化したＩＳＦＥＴ電極を１０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＡＴＰを溶解した１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）１ｍＬに浸し、チロシン溶液を順次添加してその応答を評価した。その結果、図２に示すように、０．３〜０．９ｍＭのチロシンの定量が可能であることが示され、その測定に際して膜の剥離などもなく、安定した計測が可能であった。また、チロシンに対する選択的応答性もみられた。
【００７４】
（実施例２）
ＴｙｒＲＳをカルボキシル基修飾マイクロビーズ（粒径２０μｍ）にプロテインカップリングキット（ＰｏｌｙＬｉｎｋ社）を用いて固定化した。ビーズを固定化溶液中で６０分間反応させることで、２０ｍｇのビーズ当たり３００μｇのＴｙｒＲＳを固定化した。
【００７５】
２ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＫＣｌを１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）中に溶解し、それにＴｙｒＲＳ固定化ビーズ（２．０ｍｇ）、０〜１００μＭの各アミノ酸溶液を混合した。それにピロリン酸検出用蛍光試薬（Molecular Probes社）を加えて３７℃で３０分間反応させた。それを氷水中に１０分間静置して反応を停止させた。それを、蛍光光度計を用いて励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５９５ｎｍで計測することで酵素の結合能、選択性の評価を行った（ｎ＝３）。その結果、図３に示すように、４０〜１００μＭのチロシンにおいて蛍光強度との直線性があり、検量線が得られた。
【００７６】
また、１００μＭの各アミノ酸に対する応答を同様にピロリン酸検出用蛍光試薬（Molecular Probes社）を用いて評価したところ、図４に示すように、チロシンに対して高い蛍光強度を示すこと、つまりチロシンに対する選択性が見られた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、ライフサイエンス、バイオテクノロジー、臨床医療・分析、食品品質管理・分析等の臨床医療又は／及び食品管理におけるアミノ酸分析に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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