(57)【要約】【課題】タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とする、変異導入部位の決定に利用可能なタンパク質設計方法、ならびに、タンパク質設計装置、タンパク質設計プログラムを提供する。【解決手段】対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とする、変異導入部位決定に利用されるタンパク質設計装置であり、構造揺らぎ発生手段を含む構造揺らぎ発生装置、複数の揺らぎ構造に対して３10へリックス及びπへリックスの形成位置を判定する３10へリックス及びπへリックス判定手段を含む二次構造判定装置、ならびに３10へリックスまたはπへリックスの形成位置に基づいて変異位置の候補を決定する変異位置決定手段を含む変異位置決定装置を具えた処理装置、揺らぎ構造記憶部含む記憶装置、入力装置、出力装置で構成される。【選択図】図２
2011158996.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計装置であって、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定する手段と、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定する手段とを具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置。
【請求項２】
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計装置であって、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる構造揺らぎ発生部と、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する二次構造判定部と、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する変異位置決定部を具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置。
【請求項３】
前記変異位置決定部は、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定する機能と、
前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定する機能とを具えている
ことを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質設計装置。
【請求項４】
前記構造揺らぎ発生部は、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる手段として、
分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段を選択している
ことを特徴とする、請求項２または３に記載のタンパク質設計装置。
【請求項５】
前記二次構造判定部は、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する手段として、
各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算し、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する手段を選択している
ことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載のタンパク質設計装置。
【請求項６】
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計方法であって、
該タンパク質設計における、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定は、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定する工程と、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定する工程を含む
ことを特徴とするタンパク質設計方法。
【請求項７】
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計方法であって、
該タンパク質設計における、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定は、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる、構造揺らぎ発生工程と、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、二次構造判定工程と、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する、変異位置決定工程を含む
ことを特徴とするタンパク質設計方法。
【請求項８】
前記変異位置工程は、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定するサブステップと、
前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定するサブステップを含む
ことを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質設計方法。
【請求項９】
前記構造揺らぎ発生工程において、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる手法として、
分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手法を選択している
ことを特徴とする、請求項７または８に記載のタンパク質設計方法。
【請求項１０】
前記二次構造判定工程において、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置の判定は、
各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算するサブステップと、
計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定するサブステップを含む
ことを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載のタンパク質設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象タンパク質に変異導入してなる変異体タンパク質の創製に利用される、タンパク質設計装置、タンパク質設計方法、ならびに、該設計用のプログラムに関する。特に、本発明は、対象タンパク質への変異導入部位として、当該対象タンパク質の動的構造揺らぎの中で生じる310へリックス及びπへリックス形成残基とその周辺残基を判定し、アミノ酸変異位置の候補を決定する、タンパク質設計装置、タンパク質設計方法、ならびに、該設計用のプログラムに関す。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、通常、立体構造を有しており、一般的に、三次構造を有している。タンパク質の三次構造は、外見上、αヘリックスやβ構造などの二次構造が折りたたまれることで構成されている。このタンパク質の三次構造の安定化には、疎水的相互作用、静電相互作用などが寄与していると考えられている。天然のタンパク質のｆｏｌｄｉｎｇ過程では、「二次構造の形成」に先立ち、ペプチド鎖全体の「折りたたみ」が進行すると判断される事例の報告も少なくない。天然のタンパク質においては、そのタンパク質の立体構造は、そのアミノ酸配列によって決定されていると考えられている。
【０００３】
一方、天然のタンパク質は、それぞれ機能を有するが、その機能の発揮には、タンパク質ｆｏｌｄｉｎｇが不可欠であると考えられている。すなわち、適正なタンパク質ｆｏｌｄｉｎｇが達成された際に構成される、タンパク質の立体構造によって、その機能の発揮が可能となると、一般に考えられている。
【０００４】
例えば、天然のタンパク質のアミノ酸配列に変異が導入されると、その全体の立体構造は変化しないが、天然のタンパク質の有する機能に変化が生じる場合がある。具体的には、アミノ酸配列に変異が導入されることに伴って、天然のタンパク質の有する機能が向上することや、逆に、低下する場合があることが報告されている。
【０００５】
既知の対象タンパク質のアミノ酸配列に人為的に変異を導入して、対象タンパク質が本来具えている機能を変更すること、すなわち、当該タンパク質が本来具えている機能に変更を加えた「変異タンパク質」を人為的に創製することを、「タンパク質設計」と呼ぶ。例えば、酵素活性を有するタンパク質や、抗体などを対象とする「タンパク質設計」は、広く行われている。具体的には、その酵素活性に関与する活性部位を特定した上で、特定された活性部位に変異を導入し、対象タンパク質の酵素活性に変更を加えること、あるいは、当該抗体の相補性決定領域に変異を導入し、対象の抗体の抗原に対する反応性に変更を加えることなど、対象タンパク質の機能に関与する部位の特定がなされている場合、対象タンパク質に対する「タンパク質設計」は、広く行われている。
【０００６】
しかし、対象タンパク質について、その機能に関与する部位の特定がなされていない場合も少なくない。対象タンパク質について、その機能に関与する部位の特定を行う方法として、アミノ酸配列上に一アミノ酸置換型の変異を導入して、得られる変異タンパク質において、導入された変異がその機能に影響を及ぼすか、否かを検証する方法がある。対象タンパク質の機能に関与するアミノ酸残基が複数ある場合、複数個所に一アミノ酸置換型の変異を導入して、得られる変異タンパク質において、導入された変異がその機能に影響を及ぼすか、否かを検証する必要がある。アミノ酸配列上において、アミノ酸残基を複数個選択する際、その選択肢の範囲は膨大であり、実際に、変異を導入した変異タンパク質を作製し、導入された変異がその機能に影響を及ぼすか、否かを検証することは容易ではない。例えば、変異の導入を検討すべき、アミノ酸残基の総数が２０個である場合、対象タンパク質の機能に関与するアミノ酸残基が３個としても、その選択肢は、２０3−１通りとなってしまう。
【０００７】
さらに、対象タンパク質のアミノ酸配列の全てについて、変異を導入すると、その可能性は膨大であり、その膨大な可能性の中から目的の機能を与える変異を見つけ出すことは容易ではない。例えば、100残基のタンパク質では、可能な変異導入の総数は、20100−１通りとなり、その中から、目的の機能を与える変異を見つけ出すことになる。このような莫大な可能性を、全て調べ尽くすことは、事実上不可能である。
【０００８】
そこで、現在、広く用いられている設計アプローチとして、ランダムに変異を導入する方法がある。ランダムに変異を導入した候補の中から、目的の機能を与えるものを見つけることになる。
【０００９】
一方、より設計効率を高めるために、論理的なタンパク質設計も行われることがある。論理的なタンパク質設計として、既知の変異データやタンパク質の構造情報などから、統計学的手法や学習理論を用いて、変異のパターンを抽出することや、分子シミュレーションによる物理化学的な考察に基づいて、新たな設計へ適用することが挙げられる。
【００１０】
論理的なタンパク質設計における、検討課題は大きく２つに分けられる。第１の検討課題は、対象タンパク質のアミノ酸配列上のどの部位に変異を導入するかという課題であり、第２の検討課題は、変異導入部位のアミノ酸を、どのアミノ酸に変異すればよいかという課題である。第１の検討課題に対しては、対象タンパク質の立体構造情報を利用するアプローチがある。非特許文献１では、対象タンパク質の結晶構造から、タンパク質の二次構造として分類される３10へリックスやπへリックスを形成するアミノ酸残基を選別し、選別された３10へリックスやπへリックスを形成するアミノ酸残基に変異を導入することによって、対象タンパク質：cyclin A/cyclin-dependent kinase 2の機能を低下させた例が示されている。
【００１１】
天然のタンパク質において報告されている、タンパク質の高次構造のうち、タンパク質の二次構造について触れておく。タンパク質の二次構造は、大きく、ヘリックス、シート、ターンに分類される。へリックスは、αへリックス、３10へリックス、πへリックスに分類される。多くのタンパク質で見出され、構造上安定なヘリックスは、αへリックスである。これらへリックスの分類は、アミノ酸残基の２面角（φ，ψ）によって判定することが可能である。
【００１２】
ｔｒａｎｓ型のＬ−アミノ酸で構成される、理想的なαへリックスは、そのペプチド鎖は右巻きの螺旋構造を構成しており、各アミノ酸残基の２面角（φ，ψ）は、（φ＋ψ）≒−１０５°となっている。そのため、該αへリックスのｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋４）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している。
【００１３】
ｔｒａｎｓ型のＬ−アミノ酸で構成される、理想的な３10へリックスは、そのペプチド鎖は右巻きの螺旋構造を構成しており、各アミノ酸残基の２面角（φ，ψ）は、（φ＋ψ）≒−７５°となっている。そのため、該３10へリックスのｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋３）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している。
【００１４】
ｔｒａｎｓ型のＬ−アミノ酸で構成される、理想的なπへリックスは、そのペプチド鎖は右巻きの螺旋構造を構成しており、各アミノ酸残基の２面角（φ，ψ）は、（φ＋ψ）≒−１２５°となっている。そのため、該πへリックスのｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋５）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Y. Hashimoto et al., Journal of Biological Chemistry 273, 16544-16550 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
非特許文献１に報告されるcyclin A/cyclin-dependent kinase 2の事例のように、対象タンパク質の結晶構造に基づき、３10へリックスやπへリックスを形成するアミノ酸残基を同定し、機能性を変えるための変異位置の候補を決めることができる。
【００１７】
一方、天然のタンパク質の立体構造中に見出されるαへリックスを構成するアミノ酸残基の２面角（φ，ψ）は、平均的な２面角（−６０°，−４５°）の周囲で、（−９０°，−１５°）〜（−３５°，−７０°）の範囲に分布している。また、天然のタンパク質の立体構造中に見出される３10へリックスを構成するアミノ酸残基の２面角（φ，ψ）も、平均的な２面角（−４９°，−２６°）の周囲で、ある程度の分布を示している。さらに、天然のタンパク質の立体構造中に見出されるπへリックスを構成するアミノ酸残基の２面角（φ，ψ）も、平均的な２面角（−５５°，−７０°）の周囲で、ある程度の分布を示している。
【００１８】
さらに、水溶液中に存在している、実際のタンパク質の立体構造は、ある程度の揺らぎを有している。例えば、タンパク質が、その基質物質と相互作用する際、その立体構造の一部をある範囲で変化させることが知られている。さらには、いくつかのタンパク質では、結晶化条件によって、その結晶構造に若干の相違があることも報告されている。また、結晶化されたタンパク質において、その立体構造の一部が揺らいでいるため、Ｘ線結晶解析において、立体構造を特定できない部分があることも多く報告されている。
【００１９】
実際のタンパク質の立体構造は、ある程度の揺らぎを有しているため、その結晶構造解析の結果に基づき、揺らぎを生じる可能性を有する部位の二次構造を完全に特定することは困難である。水溶液中に存在している、実際のタンパク質は、ｆｏｌｄｉｎｇ状態を維持しており、ｆｏｌｄｉｎｇ状態の維持に不可欠な部分の立体構造は安定であるが、それ以外の部分は、ある程度の揺らぎを有している。この揺らぎを有する部分では、ほとんどの時間、αへリックスの立体配置であっても、ある瞬間にやや不安定な３10へリックスやπへリックスの形成が可能な立体配置に変移することがある。
【００２０】
水溶液中で生じる、タンパク質の立体構造揺らぎの中で、一時的に形成される３10へリックスの位置やπへリックスの位置、ならびに、その周辺のアミノ酸残基に変異を導入することによっても、対象タンパク質の機能を変化させることができると考えられる。しかし、結晶構造解析により決定される結晶構造は、結晶化に伴って、立体構造揺らぎが抑制されている状態の構造であるため、立体構造揺らぎの中で、一時的に形成される３10へリックスの位置やπへリックスの位置の特定に利用できない。すなわち、従来の結晶構造中に見出される、３10へリックスの位置やπへリックスの位置は、結晶化に伴って、立体構造揺らぎが抑制されている状態の位置であり、立体構造揺らぎの中で、一時的に形成される３10へリックスの位置やπへリックスの位置とは、本質的に異なっている。
【００２１】
本発明は、上記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、タンパク質設計における、第１の検討課題である、対象タンパク質のアミノ酸配列上のどの部位に変異を導入するかという課題、すなわち、対象タンパク質のアミノ酸配列上に変異を導入する際、変異位置の候補を選別する新たな手段を提供することにある。
【００２２】
具体的には、本発明の目的は、従来、結晶構造に基づき、同定される３10へリックスやπへリックスの位置に加えて、対象タンパク質の立体構造揺らぎを考慮し、過渡的に形成される３10へリックスやπへリックスの位置を判定し、その判定結果を利用して、３10へリックスやπへリックスを形成するアミノ酸残基、ならびに、その周辺のアミノ酸残基を、変異位置の候補として選別する、タンパク質設計装置、タンパク質設計方法、ならびに、該設計用のプログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
上記の課題を解決するためには、水溶液中で生じる、対象タンパク質の立体構造揺らぎを考慮して、過渡的に形成される３10へリックスやπへリックスの位置を判定する手法を開発する必要がある。勿論、水溶液中で生じる、対象タンパク質の立体構造揺らぎを実際に観測することは困難であるので、高い確度で、対象タンパク質の立体構造揺らぎを推定可能な手法を応用して、対象タンパク質の立体構造揺らぎ中で、過渡的に形成される３10へリックスやπへリックスの位置の判定が可能であることを検証した。
【００２４】
具体的には、対象タンパク質に対して、構造揺らぎを起こす手段として、分子動力学計算を用いることで、高い確度で、対象タンパク質の立体構造揺らぎを再現できることを確認した。一例として、シトクロムＰ４５０ｃａｍを対象として、構造揺らぎを起こす手段として、分子動力学計算を用いることで、過渡的に出現する多数の揺らぎ構造をサンプリングした。サンプリングされた多数の揺らぎ構造について、各アミノ酸残基の２面角（φ，ψ）に基づき、その二次構造を特定した。報告されているシトクロムＰ４５０ｃａｍの結晶構造中に見出される二次構造と、サンプリングされた多数の揺らぎ構造中で過渡的に見出される二次構造を比較すると、大きな差があることが確認される。特定される二次構造、例えば、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置を対比する結果を、図１に示す。図１の（ａ）は、結晶構造に基づき特定される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置である。結晶構造は、単一の構造を示すものであり、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率は、０％か１００％で示される。図１の（ｂ）は、サンプリングされた多数の揺らぎ構造中で過渡的に見出される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置である。アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率は、サンプリングされた多数の揺らぎ構造中における出現頻度に基づき、算出されている。
【００２５】
図１の（ａ）と（ｂ）の対比により、対象タンパク質に対して、構造揺らぎを起こす手段として、分子動力学計算を用いることで、結晶構造に基づき特定される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置に加えて、構造揺らぎの中で過渡的に見出される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置の判定が可能であることが確認される。後述するが、構造揺らぎの中で過渡的に見出される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置のみでなく、アミノ酸残基単位のπへリックスの形成位置の判定が可能であることの確認もなされた。
【００２６】
具体的には、対象タンパク質に対して、分子動力学計算で、構造揺らぎを起こし、指定の時間ステップ毎に構造をサンプリングしている。サンプリングされた構造の全てに対して、各アミノ酸残基の２面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスの形成位置、ならびにπへリックスの形成位置の判定を行い、アミノ酸残基毎に、３10へリックスの形成頻度、ならびにπへリックスの形成頻度を求める。アミノ酸残基毎に、３10へリックスの形成頻度、ならびにπへリックスの形成頻度の、サンプリングされた構造の総数に対する比率を算出し、アミノ酸残基毎の、３10へリックスの形成率、ならびにπへリックスの形成率とする。
【００２７】
算出される、アミノ酸残基毎の、３10へリックスの形成率、あるいは、πへリックスの形成率が、０％より有意に高い場合、当該アミノ酸残基は、揺らぎ構造を考慮した際、３10へリックスの形成位置、あるいは、πへリックスの形成位置と判定される。揺らぎ構造を考慮した際、３10へリックスの形成位置、あるいは、πへリックスの形成位置と判定されるアミノ酸残基、ならびに、その周辺のアミノ酸残基を、変異位置の候補として選別する。
【００２８】
従って、本発明にかかる「タンパク質設計」の過程では、従来の手法では、結晶構造のみに基づき、同定されていた３10へリックスの位置やπへリックスの位置に対して、揺らぎ構造を考慮した上で、対象タンパク質に存在する、３10へリックスの形成位置やπへリックスの形成位置を判定し、その３10へリックスやπへリックスを形成するアミノ酸残基、ならびに、その周辺のアミノ酸残基を、変異位置の候補として決定する。
【００２９】
本発明は、上記の知見に基づき、完成されたものである。
【００３０】
本発明の第一の形態は、「タンパク質設計方法」の発明である。
【００３１】
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」は、
タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計において、
タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置の候補として決定する
ことを特徴とするタンパク質設計方法である。
【００３２】
特には、
タンパク質の揺らぎ構造を生成し、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定し、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から変異位置の候補を決定する
ことを特徴とするタンパク質設計方法である。
【００３３】
その際、前記変異位置の候補の決定では、
アミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基と、そのアミノ酸残基から前後６残基以内の残基を変異位置の候補として決定することが好ましい。
【００３４】
なお、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」は、対象タンパク質がシトクロムＰ４５０ｃａｍである際、より有効である。
【００３５】
本発明の第二の形態は、「タンパク質設計装置」の発明であり、具体的には、上記の本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」に基づき、「タンパク質設計」を行う際に利用される「タンパク質設計装置」の発明である。
【００３６】
本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」は、
タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計において、
タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置として決定するための処理装置を具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置である。
【００３７】
特には、
前記タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置として決定するための処理装置は、
タンパク質の構造揺らぎを発生させる構造揺らぎ発生部、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する二次構造判定部、ならびに、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から変異の位置の候補を決定する変異位置決定部
を具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置である。
【００３８】
その際、
前記変異位置決定部における、前記変異位置の候補の決定では、
アミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基と、そのアミノ酸残基から前後６残基以内の残基を変異位置の候補として決定することが好ましい。
【００３９】
なお、本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」は、対象タンパク質がシトクロムＰ４５０ｃａｍである際、より有効である。
本発明の第三の形態は、「タンパク質設計プログラム」の発明であり、具体的には、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」に基づき、上記の本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を利用して、「タンパク質設計」の一連の処理を行う際に、該「タンパク質設計装置」の処理動作を規定する「タンパク質設計プログラム」の発明である。
【００４０】
本発明の第三の形態にかかる「タンパク質設計プログラム」は、
タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計において、
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」に基づき、上記の本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を利用して、「タンパク質設計」の一連の処理を行う際に、該「タンパク質設計装置」の処理動作を規定する「タンパク質設計プログラム」であり、
タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置の候補として決定するプロセスを実行する処理動作を規定する一連のステップを含む
ことを特徴とするタンパク質設計プログラムである。
【００４１】
特には、
前記タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置として決定するための処理装置において、
前記タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置の候補として決定するプロセスを実行する処理動作を規定する一連のステップは、
前記構造揺らぎ発生部において、タンパク質の揺らぎ構造を生成させるステップ；
前記二次構造判定部において、複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定させるステップ；
前記変異位置決定部において、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から変異位置の候補を決定するステップ
を含んでいる
ことを特徴とするタンパク質設計プログラムである。
【００４２】
その際、前記変異位置決定部において、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から変異位置の候補を決定するステップは、
前記変異位置決定部において、アミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基と、そのアミノ酸残基から前後６残基以内の残基を変異位置の候補として決定するステップであることが好ましい。
【００４３】
なお、本発明の第三の形態にかかる「タンパク質設計プログラム」は、対象タンパク質がシトクロムＰ４５０ｃａｍである際、より有効である。
【発明の効果】
【００４４】
本発明にかかる「タンパク質設計」の過程では、上記の分子動力学計算を応用した手段を採用することによって、対象タンパク質の構造揺らぎの中で、過渡的に形成される３10へリックスの位置やπへリックスの位置を、アミノ酸残基レベルで評価することができる。加えて、揺らぎ構造を考慮することで評価が可能となる、アミノ酸残基毎の、３10へリックスの形成率、ならびにπへリックスの形成率を指標とし、「タンパク質設計」において、変異導入を検討する、変異位置の候補を選別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１の（ａ）は、シトクロムＰ４５０ｃａｍの結晶構造に基づき特定される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置を図示しており、  図１の（ｂ）は、シトクロムＰ４５０ｃａｍを対象として、分子動力学計算を利用して、構造揺らぎを起こした際、出現する多数の揺らぎ構造中で過渡的に見出される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置と、形成率を図示している。
【図２】本発明にかかるタンパク質設計方法に基づく、「タンパク質設計」に利用されるタンパク質設計装置の構成の一例を模式的に示すブロック図であり、特に、本発明の第一の実施形態の実施に適合する、「変異位置決定」の一連の処理を実施する装置構成を模式的に示すブロック図である。
【図３】図２に例示する、本発明にかかるタンパク質設計方法に基づく、「タンパク質設計」に利用されるタンパク質設計装置を適用して実施可能な「タンパク質設計」の処理動作の一部を模式的に説明する流れ図であり、特に、本発明の第一の実施形態の実施に適合する、「変異位置決定」の一連の処理動作の概要に示す流れ図である。
【図４】図４の（ａ）は、シトクロムＰ４５０ｃａｍのＸ線結晶構造解析の結果に基づき特定される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置を図示しており、  図４の（ｂ）は、本発明にかかるタンパク質設計方法に基づき、分子動力学計算を利用して、構造揺らぎを起こした際、所定の時間間隔でサンプリングした多数の揺らぎ構造中で過渡的に見出される、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の判定結果と、その判定に利用した、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成率、ならびに、πへリックスの形成率を図示している。また、シトクロムＰ４５０ｃａｍについて、実験的に決定された変異導入位置、アミノ酸残基番号が９６、１０５、１１０、２５６、３４３の５つの位置も参考として、表示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下に、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」、本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」、本発明の第三の形態にかかる「タンパク質設計プログラム」について、その実施の形態を説明する。
【００４７】
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」の技術的な特徴は、
タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計において、
タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置の候補として決定する点にある。
【００４８】
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」は、好ましくは、
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計方法であって、
該タンパク質設計における、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定は、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定する工程と、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定する工程を含む
ことを特徴とするタンパク質設計方法の形態とする。
【００４９】
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」では、特には、
タンパク質の揺らぎ構造を生成し、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定し、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から変異位置の候補を決定するため、例えば、
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計方法であって、
該タンパク質設計における、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定は、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる、構造揺らぎ発生工程と、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、二次構造判定工程と、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する、変異位置決定工程を含む
ことを特徴とするタンパク質設計方法の形態を選択することが望ましい。
【００５０】
その際、前記変異位置の候補の決定では、
アミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基と、そのアミノ酸残基から前後６残基以内の残基を変異位置の候補として決定することが好ましい。従って、前記変異位置工程は、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定するサブステップと、
前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定するサブステップを含む構成を選択することが好ましい。
【００５１】
一方、前記構造揺らぎ発生工程において、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる手法として、
分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手法を選択することが好ましい。
【００５２】
また、前記二次構造判定工程において、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置の判定は、
各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算するサブステップと、
計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定するサブステップを含む構成を選択することが好ましい。
【００５３】
なお、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」は、後述するように、対象タンパク質がシトクロムＰ４５０ｃａｍである際、より有効に利用できる。
【００５４】
本発明の第二の形態は、「タンパク質設計装置」の発明であり、具体的には、上記の本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」に基づき、「タンパク質設計」を行う際に利用される「タンパク質設計装置」の発明である。
【００５５】
従って、本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」の技術的特徴は、
タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計において、
タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置として決定するための処理装置を具えている点にある。
【００５６】
本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」は、好ましくは、
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計装置であって、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定する手段と、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定する手段とを具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置の形態とする。
【００５７】
特には、
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計装置であって、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる構造揺らぎ発生部と、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する二次構造判定部と、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する変異位置決定部を具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置の構成を選択することが望ましい。
【００５８】
その際、
前記変異位置決定部における、前記変異位置の候補の決定では、
アミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基と、そのアミノ酸残基から前後６残基以内の残基を変異位置の候補として決定することが好ましい。従って、前記変異位置決定部は、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定する機能と、
前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定する機能とを具えていることが好ましい。
【００５９】
一方、前記構造揺らぎ発生部は、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる手段として、
分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段を選択していることが好ましい。
【００６０】
また、前記二次構造判定部は、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する手段として、
各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算し、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する手段を選択していることが好ましい。
【００６１】
本発明の第三の形態にかかる「タンパク質設計プログラム」の技術的特徴は、
タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計において、
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」に基づき、上記の本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を利用して、「タンパク質設計」の一連の処理を行う際に、該「タンパク質設計装置」の処理動作を規定する「タンパク質設計プログラム」であり、
タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置及びその周辺残基を変異位置の候補として決定するプロセスを実行する処理動作を規定する一連のステップを含む点にある。
【００６２】
好ましくは、本発明の第三の形態にかかる「タンパク質設計プログラム」は、
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計プログラムであって、
該タンパク質設計プログラムは、
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」に従って、上記の本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を用いて、タンパク質設計を実行する際、前記タンパク質設計装置による処理動作を規定するプログラムであり、
該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセスは、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定するステップと、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定するステップを含む
こと特徴とするタンパク質設計プログラムの形態とする。
【００６３】
特には、
該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセスは、
前記構造揺らぎ発生部において、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる、構造揺らぎ発生ステップと、
前記二次構造判定部において、複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、二次構造判定ステップと、
前記変異位置決定部において、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する、変異位置決定ステップを含む
ことを特徴とするタンパク質設計プログラムの形態であることが望ましい。
【００６４】
その際、該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセス中、
前記変異位置決定部において、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する、変異位置決定ステップは、
前記変異位置決定部が具える、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定する機能を用いて、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定するサブステップと、
前記変異位置決定部が具える、前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定する機能を用いて、前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定するサブステップとを含むことが好ましい。
【００６５】
一方、該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセス中、
前記構造揺らぎ発生部において、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる、構造揺らぎ発生ステップは、
前記構造揺らぎ発生部が具える、分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段を用いて、該分子動力学計算法に基づき計算される、時系列的な揺らぎ構造の計算結果をサンプリングし、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる処理を規定していることが好ましい。
【００６６】
また、該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセス中、
前記二次構造判定部において、複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、二次構造判定ステップは、
前記二次構造判定部において、各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算する、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）計算サブステップと、
計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、３10へリックス及びπへリックス判定サブステップを含むことが好ましい。
【００６７】
なお、本発明の第三の形態にかかる「タンパク質設計プログラム」は、上記の本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を用いて、タンパク質設計を実行する際、前記タンパク質設計装置による処理動作を規定するプログラムであるので、上記の本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を構成する処理装置、すなわち、演算処理を実行するＣＰＵにおいて、読み取り可能なプログラム言語によって記述される。例えば、電気的に読み取り可能な媒体上に収納される、プログラム・ファイルの形態として、提供される。該タンパク質設計装置の演算処理を実行するＣＰＵに敷設される、内部記憶部に常駐させる形態とすることもでき、また、記憶装置に収納した上で、演算処理を実行するＣＰＵから電気的に読み出す形態とすることもできる。
【００６８】
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」、本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」における、第１の最良の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００６９】
図２は、本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」における、第１の最良の実施形態の構成を模式的に示すブロック図である。図２に例示する「タンパク質設計装置」は、入力装置１、処理装置２、記憶装置３、出力装置４の４つの個別装置で構成されている。
【００７０】
入力装置１は、例えば、キーボード等の、該「タンパク質設計装置」の動作に関する指示を入力する、指示入力部と、該「タンパク質設計装置」による処理に使用される、対象タンパク質の構造情報などのデータを入力する、データ入力部を具えている。該データ入力部は、外部記憶装置に収納されるデータの入力等の機能を具えている。例えば、対象タンパク質の構造情報は、タンパク質の三次構造に相当する、該対象タンパク質の結晶構造、ならびに、タンパク質の一次構造に相当する、該対象タンパク質のアミノ酸配列を含んでいる。例えば、該対象タンパク質の結晶構造の情報として、外部のデータバンク、例えば、Protein Data Bank (PDB) （http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do） に登録されている、対象タンパク質の構造を示す原子座標データを利用する際には、前記データ入力部は、前述の外部のデータバンク上に蓄積される対象タンパク質の構造情報のデータ・ファイルに対するリンク機能を具えている。
【００７１】
処理装置２は、少なくとも、構造揺らぎ発生装置、二次構造判定装置、変異位置決定装置の３つの個別装置を、その構成要素として具えている。前記構造揺らぎ発生装置は、構造揺らぎ発生手段２１を具えており、前記二次構造判定装置は、３10へリックス及びπへリックス判定手段２２を具えており、変異位置決定装置は、変異位置決定手段２３を具えている。
【００７２】
記憶装置３は、少なくとも、処理装置２における処理により得られる、処理結果を記憶する機能を具えている。すなわち、記憶装置３は、少なくとも、揺らぎ構造記憶部３１を具えている。前記処理装置２中の構造揺らぎ発生装置において、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる結果、複数の揺らぎ構造が得られる。この複数の揺らぎ構造を表記する構造情報、例えば、揺らぎ構造を示す原子座標データは、構造揺らぎ発生装置から、該記憶装置３に送られ、揺らぎ構造記憶部３１に記憶される。また、揺らぎ構造記憶部３１に記憶される、複数の揺らぎ構造を表記する構造情報、例えば、揺らぎ構造を示す原子座標データは、前記処理装置２中の二次構造判定装置により、呼び出され、その二次構造判定処理に利用される。
【００７３】
出力装置４は、例えば、前記入力装置１の指示入力部を介する処理装置２への指示入力、例えば、キーボード入力の内容を画像表示する、あるいは、処理装置２における処理により得られる、処理結果の内容を画像表示する等、画像情報の表示機能を具える、ディスプレイ装置等の画像情報出力部、ならびに、例えば、処理装置２における処理により得られる、処理結果の内容などを印字する等、情報の印刷出力機能を具える、印刷装置等の印刷出力部を具えている。
【００７４】
前記処理装置２中の構造揺らぎ発生装置は、構造揺らぎ発生手段２１によって、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる。例えば、対象タンパク質のＸ線結晶構造解析に基づく、対象タンパク質の構造を示す原子座標データで表記される構造を、「初期構造」として、構造揺らぎ発生手段２１によって、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる。具体的には、構造揺らぎ発生手段２１は、前記「初期構造」を初期状態として、分子動力学計算を行って、時間の経過に伴って生じる、該対象タンパク質の構造揺らぎを再現（計算）する。一定の時間が経過する間に出現する、該対象タンパク質の構造揺らぎは、連続的に変化する揺らぎ構造を含んでいる。連続的に変化する揺らぎ構造のうち、所定の個数をサンプリングする。例えば、一定の時間が経過する間、等しい時間間隔で、連続的に変化する揺らぎ構造からサンプリングを行うと、サンプリングされた多数の揺らぎ構造は、一定の時間が経過する間に出現する揺らぎ構造から、ランダムにサンプリングされた揺らぎ構造の群と見做せる。
【００７５】
前記サンプリングされた揺らぎ構造の群は、個々の揺らぎ構造を示す原子座標データの群を構成する。この個々の揺らぎ構造を示す原子座標データを、サンプリングされた揺らぎ構造を表記する構造情報として、構造揺らぎ発生装置から、記憶装置３に送り、揺らぎ構造記憶部３１に記憶させる。
【００７６】
前記処理装置２中の二次構造判定装置は、揺らぎ構造記憶部３１に記憶された、サンプリングされた揺らぎ構造を表記する構造情報に基づき、個々の揺らぎ構造について、該揺らぎ構造中に存在する、タンパク質の二次構造の判定を行う機能を具えている。二次構造判定装置は、タンパク質の二次構造のうち、特に、３10へリックスならびにπへリックスの判定を行う機能を有する、３10へリックス及びπへリックス判定手段２２を具えている。
【００７７】
タンパク質の二次構造の判定の処理プロセスは、下記のステップを含んでいる。
【００７８】
先ず、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）計算処理ステップでは、各揺らぎ構造を表記する構造情報、すなわち、該揺らぎ構造を示す原子座標データに基づき、当該揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖に沿って、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算する。
【００７９】
二次構造の判定ステップでは、まず、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定サブステップにおいて、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、当該揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎、該アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）は、タンパク質の二次構造の構成が可能な二面角（φ，ψ）であるか、否かの判定を行う。タンパク質の二次構造を構成可能なアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）の範囲は、それぞれの二次構造によって、明確に相違しており、前記のアミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定が可能である。該アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定サブステップによって、各二次構造について、当該二次構造形成可能なアミノ酸残基位置の一群が特定される。
【００８０】
二次構造の判定ステップでは、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定サブステップを終えた後、二次構造構成領域の判定サブステップにおいて、各二次構造について、該二次構造を構成している領域の判定を行う。
【００８１】
例えば、αへリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−１０５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎のαへリックス形成可能性の判定を行うことができる。前記判定基準を満たす、αへリックス形成可能なアミノ酸残基位置の一群中に、連続する５アミノ酸残基位置以上のサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋４，…｝が含まれている場合、このサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋４，…｝は、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋４）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している、αへリックスを構成している領域と判定することが可能である。
【００８２】
例えば、３10へリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−７５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎の３10へリックス形成可能性の判定を行うことができる。前記判定基準を満たす、３10へリックス形成可能なアミノ酸残基位置の一群中に、連続する４アミノ酸残基位置以上のサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋３，…｝が含まれている場合、このサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋３，…｝は、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋３）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している、３10へリックスを構成している領域と判定することが可能である。
【００８３】
例えば、πへリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−１２５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎のπへリックス形成可能性の判定を行うことができる。前記判定基準を満たす、πへリックス形成可能なアミノ酸残基位置の一群中に、連続する６アミノ酸残基位置以上のサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋５，…｝が含まれている場合、このサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋４，…｝は、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋５）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している、αへリックスを構成している領域と判定することが可能である。
【００８４】
前記二次構造判定装置が具えている、３10へリックス及びπへリックス判定手段２２は、各揺らぎ構造を示す原子座標データに基づき、当該揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖に沿って、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算した後、計算された二面角（φ，ψ）の値に基づき、アミノ酸残基毎に、３10へリックス形成可能なアミノ酸残基、あるいは、πへリックス形成可能なアミノ酸残基であるかの判定を行う。すなわち、３10へリックス及びπへリックス判定手段２２によって、各揺らぎ構造について、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の判定がなされる。この３10へリックス及びπへリックス判定手段２２によって判定される、各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報は、変異位置決定装置に送られる。
【００８５】
変異位置決定装置は、変異位置決定手段２３を具えており、該変異位置決定手段２３は、各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報に基づき、タンパク質設計に利用する変異位置の候補を決定する。
【００８６】
該変異位置決定手段２３による、変異位置の候補の決定プロセスは、下記のステップを含んでいる。
【００８７】
まず、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率の算出ステップでは、各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報に基づき、サンプリングされた揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率の算出を行う。サンプリングされた揺らぎ構造の群について、各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報に基づき、対象タンパク質の各アミノ酸残基について、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置と判定された頻度、ならびに、πへリックスの形成位置と判定された頻度を求める。次いで、サンプリングされた揺らぎ構造の群のサンプル数に対する、求めた頻度の比率を算出し、サンプリングされた揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率とする。
【００８８】
変異位置の候補の選別ステップでは、算出されたサンプリングされた揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率に基づき、変異位置の候補の選別を行う。まず、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率を参照し、形成率が０％より有意に大きなアミノ酸残基位置を特定し、対象タンパク質の構造揺らぎに由来する、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置、ならびに、πへリックス形成位置とする。特定された対象タンパク質の構造揺らぎに由来する、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置、ならびに、πへリックス形成位置、ならびに、これらのアミノ酸残基の周囲のアミノ酸残基からなる群から、変異位置の候補を選別する。
【００８９】
変異位置決定装置は、該変異位置決定手段２３によって決定される、変異位置の候補を、変異位置決定結果として、前記出力装置４に出力する。
【００９０】
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」は、例えば、図２に例示される、本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を利用することで好適に実施することができる。図３は、図２に例示される「タンパク質設計装置」を利用して、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」を実施するための、第１の最良の実施形態の構成を模式的に示すプロセス・フロー図である。
【００９１】
図３に例示する実施形態には、該「タンパク質設計方法」のプロセス・フローにおける、一連の動作中、下記の動作Ａ１〜Ａ３の処理動作の実行順序が模式的に図示されている。
「構造揺らぎの発生工程」、「揺らぎ構造のサンプリング工程」、「サンプリングされた揺らぎ構造の記憶工程」を含んでなる処理動作に相当する、動作Ａ１；
「各揺らぎ構造における、各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）の計算工程」、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程」、特に、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置ならびにπへリックス形成位置の判定工程」を含んでなる処理動作に相当する、動作Ａ２；
「揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率の算出工程」、「アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率に基づく、変異位置の候補の選別工程」を含んでなる処理動作に相当する、動作Ａ３
予め、「タンパク質設計方法」を適用する対象タンパク質構造情報、例えば、タンパク質の三次構造に相当する、該対象タンパク質の結晶構造、ならびに、タンパク質の一次構造に相当する、該対象タンパク質のアミノ酸配列を、初期データとして、図２に例示する「タンパク質設計装置」に入力する。
【００９２】
「対象タンパク質の結晶構造」のデータは、例えば、対象タンパク質の構造を示す原子座標データの形式で入力することができる。「対象タンパク質の構造を示す原子座標データ」として、一般に、Ｘ線結晶構造解析法を適用することで解析される、結晶中における、該対象タンパク質の三次構造を表示する「原子座標データ」を利用することができる。加えて、該対象タンパク質の三次構造を表示する「原子座標データ」に対応する、対象タンパク質のアミノ酸配列も入力する。
【００９３】
さらに、Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中における対象タンパク質の三次構造中における、ｃｉs型Ｐｒｏ残基の有無、ならびに、ｃｉs型Ｐｒｏ残基が存在する場合、一次構造（アミノ酸配列）中における、ｃｉs型Ｐｒｏ残基の存在位置の情報を、予め入力する。加えて、Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中における対象タンパク質の三次構造中において、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を形成しているＣｙｓ残基の有無、ならびに、一次構造（アミノ酸配列）中における、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合を形成しているＣｙｓ残基の存在位置の情報を、予め入力する。
【００９４】
通常、対象タンパク質は、天然のアミノ酸で構成されており、Ｄ型アミノ酸を含んでいない。例外的に、Ｄ型アミノ酸を含んでいる場合には、一次構造（アミノ酸配列）中における、Ｄ型アミノ酸残基の存在位置の情報を、予め入力する。
【００９５】
一般に、Ｘ線結晶構造解析法においては、水素原子に由来するＸ線解析強度は低いため、電子密度マップ上におきて、水素原子の由来する電子密度のピークは特定されない。そのため、対象タンパク質の三次構造を表示する「原子座標データ」中、水素原子の座標データは、合理的に推定される水素原子位置に相当している。さらに、対象タンパク質の三次構造を表示する「原子座標データ」には、結晶中において、該対象タンパク質に対して、水素結合等の分子間相互作用を介して、固定化されている水分子の「原子座標データ」も含まれることがある。また、補因子を必要とする対象タンパク質の三次構造を表示する「原子座標データ」には、多くに場合、該対象タンパク質に固定されている補因子の「原子座標データ」も含まれている。
【００９６】
通常、Ｘ線結晶構造解析法によって決定されている、タンパク質の三次構造に関して、そのペプチド鎖の立体配置は、所謂「リボン・モデル」表示が可能である。すなわち、ペプチド鎖の立体配置は、該ペプチド鎖を構成する、各アミノ酸残基について、二面角（φ，ψ）を決定可能な配置として、解析されている。具体的には、アミノ酸残基を連結するペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、ケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）とエノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）のケト／エノール互変異性が可能な、平面性を維持する配置として、解析されている。また、アミノ酸残基を連結するペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）の配置は、ｃｉs型Ｐｒｏ残基の例外を除き、ｔｒａｎｓ配向として、解析されている。
【００９７】
また、動作Ａ１〜Ａ３の処理動作の実行に先立ち、動作Ａ１〜Ａ３の処理動作の実行条件を、実行条件の設定データとして、図２に例示する「タンパク質設計装置」に入力する。
【００９８】
図３に例示する実施形態では、動作１における処理動作は、「揺らぎ構造を指定の時間間隔でサンプリング」する処理の形態として、実行される。
【００９９】
該動作１の実行は、「構造揺らぎの発生工程」、「揺らぎ構造のサンプリング工程」、「サンプリングされた揺らぎ構造の記憶工程」を含んでなる処理動作に相当する。
【０１００】
「構造揺らぎの発生工程」では、図２に例示する「タンパク質設計装置」中の構造揺らぎ発生装置が具える、構造揺らぎ発生手段２１によって、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる。具体的には、対象タンパク質のＸ線結晶構造解析に基づく、対象タンパク質の構造を示す原子座標データで表記される構造を、「初期構造」として、前記構造揺らぎ発生手段２１によって、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる。
【０１０１】
例えば、水溶液中における対象タンパク質の構造揺らぎは、該対象タンパク質のペプチド鎖の開裂を回避し、また、アミノ酸残基を連結するペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）の配置は、平面性とｔｒａｎｓ配向を保持する条件を満足する範囲とする。さらに、水溶液中における対象タンパク質の構造揺らぎは、そのペプチド鎖の立体配置に関して、前記「初期構造」を起点として、該ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）が、時間経過とともに連続的に変化する過程で出現する可能性のある範囲とする。
【０１０２】
具体的には、構造揺らぎ発生手段２１は、前記「初期構造」を起点として、該ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）が、時間経過とともに連続的に変化する過程で出現する一連の揺らぎ構造を、分子動力学計算を行って再現（計算）する。
【０１０３】
その際、起点となる「初期構造」では、Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中における対象タンパク質の構造を示す「原子座標データ」に含まれる、固定化されている「水分子」に加えて、対象タンパク質の周囲を取り囲むように、溶媒「水分子」を配置する状態とする。溶媒「水分子」を、対象タンパク質の周囲を取り囲むように配置する際に使用する条件、すなわち、「水分子の溶媒和条件」を予め入力する。
【０１０４】
また、前記分子動力学計算を行う過程では、微小な時間δtが経過する間に、該ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）が（φ＋δφ，ψ＋δψ）、（ω＋δω）に変化する。その際、水溶液中における対象タンパク質の構造揺らぎは、そのペプチド鎖の立体配置は連続的に変化する範囲とするため、二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）の時間的変化率（｜δφ/δt｜，｜δψ/δt｜）、（｜δω/δt｜）に関して、それぞれ上限を設ける。この分子動力学計算を行う微小な時間δt、ならびに、二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）の時間的変化率（｜δφ/δt｜，｜δψ/δt｜）、（｜δω/δt｜）に対する上限、｜δφ/δt｜MAX,｜δψ/δt｜MAX、｜δω/δt｜MAXを条件として、予め入力する。さらに、前記分子動力学計算を行って再現（計算）する、水溶液中における対象タンパク質の構造揺らぎを追跡する延べ時間、（Ｎmax×δt）も、予め設定し、条件として、予め入力する。
【０１０５】
なお、分子動力学計算を行う過程では、利用される分子動力学計算の手法に応じて、適合する分子動力学計算プログラムと、その計算時の条件が選択される。例えば、起点となる「初期構造」における、温度条件Ｔ、ならびに、連続的に変化する揺らぎ構造を誘起する相互作用関数系の選択など、適用する分子動力学計算プログラムに付随する、計算条件パラメータも、予め選択し、計算条件パラメータとして、予め入力する。
【０１０６】
前記の一定の時間（Ｎmax×δt）が経過する間に出現する、Ｎmax種類の該対象タンパク質の構造揺らぎは、連続的に変化する揺らぎ構造を含んでいる。
【０１０７】
「揺らぎ構造のサンプリング工程」では、例えば、前記の一定の時間（Ｎmax×δt）が経過する間、等しい時間間隔（δtSAMPLING＝ｎ×δt）で、連続的に変化する揺らぎ構造からサンプリングを行う。サンプリングされる揺らぎ構造の個数ＮSAMPLINGは、（Ｎmax／ｎ）に相当する。
【０１０８】
等しい時間間隔（δtSAMPLING＝ｎ×δt）でサンプリングされる揺らぎ構造の個数ＮSAMPLINGが、一定の個数を超えると、サンプリングされた揺らぎ構造の群は、一定の時間（Ｎmax×δt）が経過する間に出現する揺らぎ構造から、「ランダムにサンプリングされた揺らぎ構造の群」と見做せる。
【０１０９】
このサンプリングの時間間隔（δtSAMPLING＝ｎ×δt）も、予め設定され、条件として、予め入力する。
【０１１０】
なお、本発明では、前記分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段として、例えば、force field法に基づく分子動力学計算プログラム、ＡＭＢＥＲが好適に利用できる。さらには、タンパク質に適用可能な分子動力学計算プログラム、例えば、ＣＨＲＡＭＭ、ＮＡＭＤ、ＧＲＯＭＡＣＳなどを利用することも可能である。
【０１１１】
さらに、前記の一定の時間（Ｎmax×δt）として、前記分子動力学計算プログラムを利用する際、例えば、分子スケールで１ナノ秒に選択することができる。通常、前記の一定の時間（Ｎmax×δt）は、利用する分子動力学計算プログラムに応じて、分子スケールで０．５ナノ秒〜１ミリ秒の範囲に選択することが望ましい。
【０１１２】
その際、この分子動力学計算を行うミニマムステップ時間間隔δtは、例えば、δt＝０．１ｆｓ〜１０ｆｓの範囲に選択することができる。また、等温条件における、温度条件Ｔは、例えば、Ｔ＝３００Ｋに選択することができる。すなわち、室温付近の水溶液中に溶解する場合における、対象タンパク質の構造揺らぎを考慮することに相当する。
【０１１３】
一方、サンプリングの時間間隔（δtSAMPLING＝ｎ×δt）は、例えば、分子スケールで５ピコ秒に選択することができる。通常、サンプリングの時間間隔（δtSAMPLING＝ｎ×δt）は、利用する分子動力学計算プログラムに応じて、ｎが、５００〜１００００の範囲、例えば、ｎ＝１０００程度に選択することができる。例えば、δt＝０．１ｆｓ〜１０ｆｓの範囲に選択する際、サンプリングの時間間隔（δtSAMPLING＝ｎ×δt）は、分子スケールで１ピコ秒〜１０ピコ秒の範囲に選択することができる。
【０１１４】
すなわち、サンプリングされる揺らぎ構造の個数ＮSAMPLINGは、例えば、２００種類に設定することができる。通常、サンプリングされる揺らぎ構造の個数ＮSAMPLINGは、対象タンパク質のサイズと、その三次構造に応じて、１００種類〜１０００種類の範囲に選択することができる。
【０１１５】
なお、対象タンパク質のペプチド鎖の開裂を回避し、また、アミノ酸残基を連結するペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）の配置は、平面性とｔｒａｎｓ配向を保持する条件は、ペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）部分のＣ−Ｎ結合に関して、エノール型＞Ｃ＝Ｎ＜に相当するポテンシャルを採用することに対応する。すなわち、エノール型＞Ｃ＝Ｎ＜においては、そのＣ＝Ｎ型結合における回転（δθ）のポテンシャル（∂Ｅ/∂θ）と、Ｃ＝Ｎ型結合伸長（δｒC-N）のポテンシャル（∂Ｅ/∂ｒC-N）は、該Ｃ＝Ｎ型結合の開裂と回転を実質的に排除している。
【０１１６】
また、ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）の時間的変化率（｜δφ/δt｜，｜δψ/δt｜）、（｜δω/δt｜）に対する上限、｜δφ/δt｜MAX,｜δψ/δt｜MAX、｜δω/δt｜MAXの制限は、等温条件を選択し、その温度条件Ｔを、例えば、Ｔ＝３００Ｋに選択することに対応している。すなわち、時間間隔δtの間における、ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）の微小な変化；（φ＋δφ，ψ＋δψ）、（ω＋δω）に起因する、内部エネルギーの変化量の総和（ΣδＥ）の上限は、等温条件では、その温度Ｔよって制限される。結果的に、ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）ならびに結合角（ω）の時間的変化率（｜δφ/δt｜，｜δψ/δt｜）、（｜δω/δt｜）に対する上限、｜δφ/δt｜MAX,｜δψ/δt｜MAX、｜δω/δt｜MAXが制限されることになる。
【０１１７】
現実的には、ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の結合角（ω）、すなわち、α位の炭素原子（Ｃα）を中心とする、ＮＨ−Ｃα−ＣＯの角度の揺らぎ（δω）は、極めて低い水準となる。従って、後述する「アミノ酸残基毎の二次構造」の判定は、ペプチド鎖を構成する各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に基づき実施することが可能である。
【０１１８】
「初期構造」として利用する、Ｘ線Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中のタンパク質の三次構造の「原子座標データ」では、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の水素原子に関しては、例えば、アミノ基（−ＮＨ2）と塩結合（−ＮＨ3+：-ＯＣＯ−⇔−ＮＨ2：ＨＯＣＯ−）を構成している場合を除き、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の水素原子の原子座標は特定されていない。そのため、前記の塩結合を構成しているカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を除き、対象タンパク質中に存在するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）は、ナトリウム・カチオン（Ｎａ+）と塩を形成している状態（−ＣＯＯ-：Ｎａ+）と仮定する。すなわち、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の二つの酸素原子の原子座標に基づき、ナトリウム・カチオン（Ｎａ+）を配置する。
【０１１９】
また、対象タンパク質の周囲は、溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）によって、溶媒和された状態として、分子動力学計算を実行している。この対象タンパク質の周囲への溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）の配置は、ＴＩＰ３Ｐによる配置を利用することができる。具体的には、対象タンパク質の周囲を、溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）が三分子層以上の厚さで取り囲む状態とする。対象タンパク質の構造揺らぎに伴って、対象タンパク質の周囲を取り囲む溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）の再配置を考慮する。
【０１２０】
「サンプリングされた揺らぎ構造の記憶工程」では、総数ＮSAMPLING種類のサンプリングされる揺らぎ構造について、各揺らぎ構造を表記する「原子座標データ」を、図２に例示する「タンパク質設計装置」中、記憶装置３の「揺らぎ構造記憶部」に収納する。
【０１２１】
該記憶装置３の「揺らぎ構造記憶部」に収納する、各揺らぎ構造を表記する「原子座標データ」、そのサンプリング時刻（ｔSAMPLING）に関して、そのデータ形式（フォーマット）は、予め設定され、設定されたデータ形式（フォーマット）として、予め入力する。
【０１２２】
動作２における処理動作は、動作１においてサンプリングされた「各揺らぎ構造の３10へリックス及びπへリックス形成アミノ酸残基の判定」処理の形態として、実行される。
【０１２３】
該動作２の実行は、「各揺らぎ構造における、各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）の計算工程」、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程」、特に、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置ならびにπへリックス形成位置の判定工程」を含んでなる処理動作に相当する。
【０１２４】
「各揺らぎ構造における、各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）の計算工程」では、まず、図２に例示する「タンパク質設計装置」中、記憶装置３の「揺らぎ構造記憶部」に収納する、総数ＮSAMPLING種類のサンプリングされる揺らぎ構造について、各揺らぎ構造を表記する「原子座標データ」を、処理装置２の二次構造判定装置に読み込む。各揺らぎ構造を表記する「原子座標データ」に基づき、該揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖に沿って、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算する。該アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）の計算は、各揺らぎ構造において、ｃｉs型Ｐｒｏ残基の例外を除き、アミノ酸残基を連結するペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）の配置は、平面性とｔｒａｎｓ配向を保持する条件を満足するという仮定に基づき実行される。該アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）の計算自体は、汎用される二面角（φ，ψ）の計算プログラムを利用して、実行することが可能である。
【０１２５】
「初期構造」として利用される、Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中における対象タンパク質の三次構造中に、ｃｉs型Ｐｒｏ残基が存在する場合、各揺らぎ構造においても、当該ｃｉs型Ｐｒｏ残基の配向は保存される。その際、該ｃｉs型Ｐｒｏ残基の二面角（φ，ψ）の「φ」、ならびに、該ｃｉs型Ｐｒｏ残基のＮ末側に位置するアミノ酸残基の二面角（φ，ψ）の「ψ」は、別途、該ｃｉs型Ｐｒｏ残基のＮ末のペプチド結合（−ＣＯ−Ｎ＜）の面方位の定義に基づき、計算する。
【０１２６】
さらに、対象タンパク質のペプチド鎖中にＤ型アミノ酸が存在する際には、Ｄ型アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）の定義に従って、該Ｄ型アミノ酸の二面角（φ，ψ）を計算する。
【０１２７】
なお、揺らぎ構造を形成するペプチド鎖のＮ末端のアミノ酸では、Ｎ末のアミノ基（−ＮＨ2）はペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を構成してなく、また、Ｃ末端のアミノ酸では、Ｃ末のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）はペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を構成していない。従って、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ酸残基、ならびに、Ｃ末端のアミノ酸残基に関しては、該アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）は定義されない。
【０１２８】
従って、「各揺らぎ構造における、各アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）の計算工程」では、各揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖に沿って、Ｎ末端のアミノ酸残基、ならびに、Ｃ末端のアミノ酸残基を除いて、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）の計算が実施される。
【０１２９】
図３に例示する実施形態では、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程」、特に、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置ならびにπへリックス形成位置の判定工程」は、例えば、二次構造判定装置中に具わっている、３10へリックス及びπへリックス判定手段２２を利用して、実行される。
【０１３０】
「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程」では、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、当該揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎、該アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）は、タンパク質の二次構造の構成が可能な二面角（φ，ψ）であるか、否かの判定を行う。タンパク質の二次構造を構成可能なアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）の範囲は、それぞれの二次構造によって、明確に相違しており、前記のアミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定が可能である。該アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定サブステップによって、各二次構造について、当該二次構造形成可能なアミノ酸残基位置の一群が特定される。
【０１３１】
例えば、αへリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−１０５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎のαへリックス形成可能性の判定を行うことができる。具体的には、｜（φ＋ψ）−（−１０５°）｜≦１°の判定基準を採用することができる。
【０１３２】
例えば、３10へリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−７５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎の３10へリックス形成可能性の判定を行うことができる。具体的には、｜（φ＋ψ）−（−７５°）｜≦１°の判定基準を採用することができる。
【０１３３】
例えば、πへリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−１２５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎のπへリックス形成可能性の判定を行うことができる。具体的には、｜（φ＋ψ）−（−１２５°）｜≦１°の判定基準を採用することができる。
【０１３４】
特に、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置ならびにπへリックス形成位置の判定工程」では、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、当該揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎、該アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）は、３10へリックスまたはπへリックスの構成が可能な二面角（φ，ψ）であるか、否かの判定を行う。
【０１３５】
アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置の判定は、各揺らぎ構造について、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）が、例えば、（φ＋ψ）≒−７５°の判定基準を満たす場合、当該アミノ酸残基を、「アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置」と判定する。あるいは、各揺らぎ構造について、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）が、（φ，ψ）≒（−４９°，−２６°）の判定基準を満たす場合、当該アミノ酸残基を、「アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置」と判定することもできる。
【０１３６】
アミノ酸残基単位のπへリックス形成位置の判定は、各揺らぎ構造について、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）が、例えば、（φ，ψ）≒−１２５°の判定基準を満たす場合、当該アミノ酸残基を、「アミノ酸残基単位のπへリックス形成位置」と判定する。あるいは、各揺らぎ構造について、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）が、（φ，ψ）≒（−５５°，−７０°）の判定基準を満たす場合、当該アミノ酸残基を、「アミノ酸残基単位のπへリックス形成位置」と判定することもできる。
【０１３７】
「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程」で使用される、該アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に基づく、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定基準を設定し、設定された判定基準として、予め入力する。
【０１３８】
特に、「各揺らぎ構造における、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置ならびにπへリックス形成位置の判定工程」で使用される判定基準を設定し、設定された「アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置ならびにπへリックス形成位置の判定基準」として、予め入力する。
【０１３９】
二次構造の判定工程では、まず、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程において、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、当該揺らぎ構造を形成するペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎、該アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）は、タンパク質の二次構造の構成が可能な二面角（φ，ψ）であるか、否かの判定を行う。タンパク質の二次構造を構成可能なアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）の範囲は、それぞれの二次構造によって、明確に相違しており、前記のアミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定が可能である。該アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程によって、各二次構造について、当該二次構造形成可能なアミノ酸残基位置の一群が特定される。
【０１４０】
二次構造の判定工程では、アミノ酸残基毎の二次構造形成可能性の判定工程を終えた後、二次構造構成領域の判定工程において、各二次構造について、該二次構造を構成している領域の判定を行う。
【０１４１】
例えば、αへリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−１０５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎のαへリックス形成可能性の判定を行うことができる。前記判定基準を満たす、αへリックス形成可能なアミノ酸残基位置の一群中に、連続する５アミノ酸残基位置以上のサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋４，…｝が含まれている場合、このサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋４，…｝は、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋４）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している、αへリックスを構成している領域と判定することが可能である。
【０１４２】
例えば、３10へリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−７５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎の３10へリックス形成可能性の判定を行うことができる。前記判定基準を満たす、３10へリックス形成可能なアミノ酸残基位置の一群中に、連続する４アミノ酸残基位置以上のサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋３，…｝が含まれている場合、このサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋３，…｝は、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋３）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している、３10へリックスを構成している領域と判定することが可能である。
【０１４３】
例えば、πへリックスについては、アミノ酸残基の二面角（φ，ψ）に関して、（φ＋ψ）≒−１２５°の判定基準を適用し、アミノ酸残基毎のπへリックス形成可能性の判定を行うことができる。前記判定基準を満たす、πへリックス形成可能なアミノ酸残基位置の一群中に、連続する６アミノ酸残基位置以上のサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋５，…｝が含まれている場合、このサブグループ｛ｉ，ｉ＋１，…，ｉ＋４，…｝は、ｉ番目のアミノ酸残基のＣ＝Ｏと、（ｉ＋５）番目のアミノ酸残基の−ＮＨ−との間で水素結合を形成している、αへリックスを構成している領域と判定することが可能である。
【０１４４】
動作３における処理動作は、動作２において判定された「各揺らぎ構造の３10へリックス及びπへリックス形成アミノ酸残基」に基づき、「３10へリックス及びπへリックスの形成頻度に基づいて変異位置の決定」を行う処理の形態として、実行される。
【０１４５】
該動作３の実行は、「揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率の算出工程」、「アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率に基づく、変異位置の候補の選別工程」を含んでなる処理動作に相当する。
【０１４６】
前記二次構造判定装置を用いて判定された、各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報は、変異位置決定装置に送られる。
【０１４７】
「揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率の算出工程」では、各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報に基づき、サンプリングされた揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率の算出を行う。各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報に基づき、対象タンパク質の各アミノ酸残基について、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置と判定された頻度、ならびに、πへリックスの形成位置と判定された頻度を求める。次いで、サンプリングされた揺らぎ構造の群のサンプル数（ＮSAMPLING）に対する、求めた頻度の比率を算出し、サンプリングされた揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率とする。
【０１４８】
「アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率に基づく、変異位置の候補の選別工程」では、算出されたサンプリングされた揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率に基づき、変異位置の候補の選別を行う。まず、アミノ酸残基毎の３10へリックスの形成率及びπへリックスの形成率を参照し、形成率が０％より有意に大きなアミノ酸残基位置を特定し、対象タンパク質の構造揺らぎに由来する、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置、ならびに、πへリックス形成位置とする。特定された対象タンパク質の構造揺らぎに由来する、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置、ならびに、πへリックス形成位置、ならびに、これらのアミノ酸残基の周囲のアミノ酸残基からなる群から、変異位置の候補を選別する。例えば、特定された対象タンパク質の構造揺らぎに由来する、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置、ならびに、πへリックス形成位置、ならびに、これらから１〜６アミノ酸残基以内に位置するアミノ酸残基からなる群から、変異位置の候補を選別する。
【０１４９】
「形成率が０％より有意に大きいか否か」は、サンプリングされる揺らぎ構造の個数ＮSAMPLINGと、アミノ酸残基単位の形成頻度Ｎresidueに基づき、判断される。
【０１５０】
アミノ酸残基単位の形成頻度Ｎresidueの標準分散は、（Ｎresidue）1/2と仮定すると、Ｎresidue＜２（Ｎresidue）1/2である場合、このアミノ酸残基単位の形成頻度Ｎresidueは、有意に「０」より大きいと判断できない場合がある。すなわち、「ノイズ・レベル」に相当する可能性がある。従って、「アミノ酸残基単位の形成頻度Ｎresidue」が、Ｎresidue≧２（Ｎresidue）1/2である場合、有意に「０」より大きいと判断できる。換言すると、Ｎresidue≧４であれば、「アミノ酸残基単位の形成頻度Ｎresidue」が、有意に「０」より大きいと判断できる。
【０１５１】
一方、サンプリングされる揺らぎ構造の個数ＮSAMPLINGが小さくなると、（４／ＮSAMPLING）が、（４／ＮSAMPLING）＞1/100となることがある。その点を考慮すると、前記の判断基準に加えて、下記の判断基準を併用することが必要である。
【０１５２】
すなわち、３10へリックス、πへリックス自体、その出現確率は相当に低いことを考慮すると、「形成率」が、０．５％以上であれば、「０％より有意に大きい」と見做すことができる。すなわち、「アミノ酸残基単位の形成頻度Ｎresidue」が、ＮSAMPLING1/200・ＮSAMPLINGである場合、有意に「０」より大きいと見做すことができる。例えば、ＮSAMPLING≦２００である場合、Ｎresidue≧１であれば、「アミノ酸残基単位の形成頻度Ｎresidue」が、有意に「０」より大きいと見做すことができる。
【０１５３】
上述する二つの判断基準のいずれかを満足する場合、「形成率が０％より有意に大きい」と判断することができる。
【０１５４】
図２に例示する「タンパク質設計装置」中、変異位置決定装置は、変異位置決定手段２３を具えている。該変異位置決定手段２３を利用して、動作２の処理を実行することで、各揺らぎ構造中に存在する、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成位置、ならびに、πへリックスの形成位置の情報に基づき、タンパク質設計に利用する変異位置の候補を決定する。
【０１５５】
図２に例示する「タンパク質設計装置」を利用する場合、動作３の処理を終了した後、変異位置決定装置は、該変異位置決定手段２３によって決定される、変異位置の候補を、変異位置決定結果として、前記出力装置４に出力する。
【０１５６】
次に、図３を参照して、図２に例示される「タンパク質設計装置」を利用して、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」を実施するための、第１の最良の実施形態のプロセス・フローについて詳細に説明する。
【０１５７】
上で説明した、各種の動作条件を規定するパラメータ、判定基準などの設定と、その設定値を予め入力した後、図３に示す、Ａ１〜Ａ３の動作を実行する。
【０１５８】
始めに、図２に例示される「タンパク質設計装置」の入力装置１によって、実行指示が与えられる。次に、構造揺らぎ発生手段２１によって発生した揺らぎ構造を指定の時間間隔でサンプリングし、揺らぎ構造記憶部３１に記憶する（図３の動作Ａ１）。次に、３10へリックス及びπへリックス判定手段２２において、揺らぎ構造記憶部３１に記憶されている、各揺らぎ構造に対して、ペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算する。計算された、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づいて、３10へリックス及びπへリックス形成アミノ酸残基の判定がなされる（図３の動作Ａ２）。次に、変異位置決定手段２３において、ペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎に、３10へリックス及びπへリックスの形成頻度が計算される。計算された、アミノ酸残基毎の３10へリックス及びπへリックスの形成頻度に基づいて、変異位置が決定される。
【０１５９】
本発明の第三の形態にかかる「タンパク質設計プログラム」は、一般に、上記の「タンパク質設計装置」の処理装置２において実行する一連の演算処理のステップ、それに付随する、処理装置２と記録装置３との間のデータ転送、記録と、記録されたデータの読み出しのステップ、更には、入力装置１を介する、外部から入力されるデータの収納、指令の入力を行う、入力ステップ、出力装置４による、出力するデータの表示を行う、出力ステップの各処理ステップの処理動作を規定している。
【０１６０】
本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」、第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」について、第一の実施態様を例に挙げ、より具体的に説明する。
【０１６１】
以下に記載する第一の実施態様の具体例は、本発明の最良の実施形態の一例であるが、本発明の技術的範囲は、該具体例に例示する形態に限定されるものではない。
【０１６２】
（第一の実施態様）
以下に、本発明の第一の実施態様を、図面を参照して説明する。
【０１６３】
下記の第一の実施態様は、シトクロムＰ４５０ｃａｍを対象タンパク質として、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」、第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」を適用して、タンパク質設計を行う事例である。該第一の実施態様における、タンパク質設計の目的は、対象タンパク質であるシトクロムＰ４５０ｃａｍに対して、変異を導入し、酸化酵素であるシトクロムＰ４５０ｃａｍの機能の向上を図ることにある。具体的には、シトクロムＰ４５０ｃａｍにおいて、その構造揺らぎの中で出現する、３10へリックスまたはπへリックス形成位置、ならびにこれら形成位置の付近から、変異位置に決定を行う事例である。
【０１６４】
対象タンパク質であるPseudomonas putida由来のシトクロムＰ４５０ｃａｍに関して、Ｘ線結晶構造解析法により決定された、結晶中における、該タンパク質の三次構造は既に報告されている。具体的には、Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中のシトクロムＰ４５０ｃａｍの三次構造の「原子座標データ」は、Protein Data Bank (PDB) （http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中に、ＰＤＢコードが1iwkの結晶構造データとして、登録されている。
【０１６５】
また、1iwkに結晶構造が報告されている、シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列において、アミノ酸残基番号が９６、１０５、１１０、２５６、３４３の５つの位置で変異を導入した際、該酵素タンパク質の機能が高まることが、Walshら（Eur. J. Biochem. (2000) 267(18), 5815-5820）によって報告されている。
【０１６６】
1iwkに開示されている、シトクロムＰ４５０ｃａｍの結晶構造を示す「原子座標データ」に基づき、そのペプチド主鎖に沿って、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算し、アミノ酸残基毎の３10へリックス形成可能性、アミノ酸残基毎のπへリックス形成可能性の判定の結果を、図４の（ａ）に示す。シトクロムＰ４５０ｃａｍの結晶構造中には、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置、ならびにアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置が存在している。報告されている、変異導入位置、すなわち、アミノ酸残基番号が９６、１０５、１１０，２５６、３４３の５つの位置は、シトクロムＰ４５０ｃａｍの結晶構造中に存在している、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置またはアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置、ならびに、その形成位置の付近に含まれていないことが判る。
【０１６７】
論理的なタンパク質設計における、対象タンパク質のアミノ酸配列上において、変異導入位置を決定する手段として、対象タンパク質の三次構造中、３10へリックスやπへリックスを形成するアミノ酸残基を選別し、選別された３10へリックスやπへリックスを形成するアミノ酸残基、ならびにその付近から、変異導入位置を決定する手法の有効性は、例えば、非特許文献１に開示されるcyclin A/cyclin-dependent kinase 2に対するタンパク質設計の事例など、既に、実験的にも検証がなされている。
【０１６８】
上記の予備的検討では、シトクロムＰ４５０ｃａｍの結晶構造中に存在しているアミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置またはアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置のみに基づき、前記の変異導入位置を決定する手法を適用している結果、該手法の有効性が発揮されていないと判断される。
【０１６９】
一方、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」では、非特許文献１によって既に有効性が検証されている、前記の変異導入位置を決定する手法を基礎として、より汎用性を高めた変異導入位置を決定する手法を採用している。具体的には、対象タンパク質の結晶構造中に存在しているアミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置またはアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置に代えて、対象タンパク質の構造揺らぎの中で出現する、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置またはアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置に基づき、前記の変異導入位置を決定する手法を採用している。
【０１７０】
従前の手法においては、対象タンパク質の結晶構造中に存在しているアミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置またはアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置に基づき、変異導入位置の決定を行っている結果、該手法が本来有する有効性が発揮されていない事例に対して、より汎用性を高めた、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」を適用することで、該手法が本来有する有効性が発揮されることを検証する。
【０１７１】
すなわち、該第一の実施態様では、シトクロムＰ４５０ｃａｍを対象タンパク質として、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」の有効性の検証を行っている。
【０１７２】
第一の実施態様においては、本発明の第二の形態にかかる「タンパク質設計装置」として、図２に例示する装置構成において、入力装置１として、キーボードを、中央演算装置を有する処理装置２として、パーソナル・コンピュータを、記憶装置３として、磁気ディスク記憶装置を、出力装置４として、ディスプレイを選択する装置を利用している。前記処理装置２として利用する、パーソナル・コンピュータ中、構造揺らぎ発生手段２１を具える構造揺らぎ発生装置に相当する機構において、構造揺らぎ発生手段２１として、分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段を採用している。具体的には、第一の実施態様では、分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段では、force field法に基づく分子動力学計算プログラムＡｍｂｅｒを利用している。
【０１７３】
「初期構造」として利用する、Ｘ線Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中のタンパク質の三次構造の「原子座標データ」では、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の水素原子に関しては、例えば、アミノ基（−ＮＨ2）と塩結合（−ＮＨ3+：-ＯＣＯ−⇔−ＮＨ2：ＨＯＣＯ−）を構成している場合を除き、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の水素原子の原子座標は特定されていない。そのため、前記の塩結合を構成しているカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を除き、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）は、ナトリウム・カチオン（Ｎａ+）と塩を形成している状態（−ＣＯＯ-：Ｎａ+）と仮定する。すなわち、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の二つの酸素原子の原子座標に基づき、ナトリウム・カチオン（Ｎａ+）を配置する。シトクロムＰ４５０ｃａｍに対しては、１８個のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）に関して、該カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）は、ナトリウム・カチオン（Ｎａ+）と塩を形成している状態（−ＣＯＯ-：Ｎａ+）としている。
【０１７４】
また、対象タンパク質の周囲は、溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）によって、溶媒和された状態として、分子動力学計算を実行している。この対象タンパク質の周囲への溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）の配置は、ＴＩＰ３Ｐによる配置を利用している。シトクロムＰ４５０ｃａｍに対しては、その周囲に、延べ９６７８個の水分子（Ｈ2Ｏ）をボックス型に配置している。
【０１７５】
対象タンパク質として、シトクロムＰ４５０ｃａｍを選択して、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」を適用する際、前記分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算を実行する際、「初期構造」として、上述のＸ線結晶構造解析に基づく、結晶中のシトクロムＰ４５０ｃａｍの三次構造の「原子座標データ」を利用している。具体的には、Protein Data Bank (PDB)中に登録される、ＰＤＢコードが1iwkの結晶構造に基づき、その三次構造の周囲に溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）を配置したものを「初期構造」として、前記分子動力学計算プログラムを利用して、分子スケールで１ナノ秒の計算を行う。分子スケールで１ナノ秒の間における、連続的な構造揺らぎから、分子スケールで５ピコ秒毎に揺らぎ構造のサンプリングを行っている。従って、時系列的に、合計２００種類の揺らぎ構造のサンプリングがなされている。
【０１７６】
サンプリングされた各揺らぎ構造の「原子座標データ」も、該揺らぎ構造を示すシトクロムＰ４５０ｃａｍの三次構造の「原子座標データ」と、その三次構造の周囲に存在する溶媒の水分子（Ｈ2Ｏ）の「原子座標データ」で構成されている。
【０１７７】
サンプリングされた各揺らぎ構造の「原子座標データ」中、該揺らぎ構造を示すシトクロムＰ４５０ｃａｍの三次構造の「原子座標データ」に基づき、そのペプチド主鎖を構成する、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算する。次いで、各揺らぎ構造について、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、該揺らぎ構造中における、３10へリックス形成アミノ酸残基、ならびに、πへリックス形成アミノ酸残基の判定を行っている。第一の実施態様においては、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づく、３10へリックス形成アミノ酸残基の判定基準として、（φ＋ψ）≒−７５°の判定基準を、πへリックス形成アミノ酸残基の判定基準として、（φ＋ψ）≒−１２５°の判定基準を、採用している。
【０１７８】
時系列的にサンプリングされた、合計２００種類の揺らぎ構造の群について、アミノ酸残基毎に、３10へリックスの形成頻度及びπへリックスの形成頻度を集計し、その集計結果から、合計２００種類の揺らぎ構造の群における、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成率、ならびにπへリックスの形成率を計算する。図４の（ｂ）に、計算されたアミノ酸残基単位の３10へリックスの形成率、ならびにπへリックスの形成率を示す。
【０１７９】
図４の（a）に示す、「初期構造」として利用している、Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中のシトクロムＰ４５０ｃａｍの三次構造中に見出される、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置またはアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置と、図４の（ｂ）に示す、合計２００種類の揺らぎ構造の群における、計算されたアミノ酸残基単位の３10へリックスの形成率、ならびにπへリックスの形成率が有意に０％を超えている位置とを比較する。この対比によって、Ｘ線結晶構造解析に基づく、結晶中における三次構造では見いだされないが、合計２００種類の揺らぎ構造の群において、過渡的に出現した、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成率、ならびにπへリックスの形成率が有意に０％を超えている位置が特定される。
【０１８０】
図４の（ｂ）には、シトクロムＰ４５０ｃａｍの変異導入位置として、既に報告されている、アミノ酸残基番号が９６、１０５、１１０、２５６、３４３の５つの位置も表示されている。少なくとも、アミノ酸残基番号が９６、１０５、１１０、２５６、３４３の５つの位置のうち、アミノ酸残基番号が９６、１０５、１１０の３つの位置は、合計２００種類の揺らぎ構造の群において、過渡的に出現した、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成率が有意に０％を超えている位置、ならびに、その付近の範囲に含まれている。また、アミノ酸残基番号が２５６の位置は、合計２００種類の揺らぎ構造の群において、過渡的に出現した、πへリックスの形成率が有意に０％を超えている位置、ならびに、その付近の範囲に含まれている。前記特定された位置の付近とは、該位置から１〜６アミノ酸残基以内の位置を指す。
【０１８１】
すなわち、合計２００種類の揺らぎ構造の群において、過渡的に出現した、アミノ酸残基単位の３10へリックスの形成率、ならびにπへリックスの形成率が有意に０％を超えている位置を特定し、その特定された位置ならびにその付近の範囲から、変異導入位置の候補を選択することによって、少なくとも、実験的に特定された変異導入位置、アミノ酸残基番号が９６、１０５、１１０、２５６の４つの位置を含む、有望な変異導入位置の候補の選択が可能であることが検証される。
【０１８２】
換言するならば、本発明の第一の形態にかかる「タンパク質設計方法」では、対象タンパク質の構造揺らぎの中で出現する、アミノ酸残基単位の３10へリックス形成位置またはアミノ酸残基単位のπへリックス形成位置を特定し、構造揺らぎの中で生じる３10へリックス及びπへリックス形成位置及びその付近から、変異導入位置の候補を選択する手法を採用することで、より汎用性を高めた「タンパク質設計方法」となっていることを、図４に示す結果が査証している。
【０１８３】
第一の実施態様に示す結果は、構造揺らぎの中で生じる３10へリックス及びπへリックス形成位置及びその付近を計算することが、論理的な「タンパク質設計」において、変異導入位置の決定を行う手段として、有用であることが示唆している。
【産業上の利用可能性】
【０１８４】
本発明にかかるタンパク質設計装置、タンパク質設計方法、ならびにタンパク質設計プログラムは、既知の対象タンパク質のアミノ酸配列に人為的に変異を導入して、対象タンパク質が本来具えている機能を変更すること、すなわち、当該タンパク質が本来具えている機能に変更を加えた「変異タンパク質」を人為的に創製する、所謂「タンパク質設計」に利用可能である。
（付記１）
対象タンパク質の三次構造に基づく、タンパク質設計に利用されるタンパク質設計装置であって、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定する手段と、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定する手段とを具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置。
（付記２）
対象タンパク質の三次構造に基づく、タンパク質設計に利用されるタンパク質設計装置であって、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる構造揺らぎ発生装置と、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する二次構造判定装置と、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する変異位置決定装置を具えている
ことを特徴とするタンパク質設計装置。
（付記３）
前記変異位置決定装置は、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定する機能と、
前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定する機能とを具えている
ことを特徴とする、（付記２）に記載のタンパク質設計装置。
（付記４）
前記構造揺らぎ発生装置は、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる手段として、
分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段を選択している
ことを特徴とする、（付記２）または（付記３）に記載のタンパク質設計装置。
（付記５）
前記二次構造判定装置は、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する手段として、
各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算し、計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する手段を選択している
ことを特徴とする、（付記２）〜（付記４）のいずれか一項に記載のタンパク質設計装置。
（付記６）
対象タンパク質の三次構造に基づく、タンパク質設計に利用されるタンパク質設計方法であって、
該タンパク質設計における、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定は、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定する工程と、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定する工程を含む
ことを特徴とするタンパク質設計方法。
（付記７）
対象タンパク質の三次構造に基づく、タンパク質設計に利用されるタンパク質設計方法であって、
該タンパク質設計における、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定は、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる、構造揺らぎ発生工程と、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、二次構造判定工程と、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する、変異位置決定工程を含む
ことを特徴とするタンパク質設計方法。
（付記８）
前記変異位置工程は、
複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定するサブステップと、
前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定するサブステップを含む
ことを特徴とする、（付記７）に記載のタンパク質設計方法。
（付記９）
前記構造揺らぎ発生工程において、
対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる手法として、
分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手法を選択している
ことを特徴とする、（付記７）または（付記８）に記載のタンパク質設計方法。
（付記１０）
前記二次構造判定工程において、
複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置の判定は、
各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算するサブステップと、
計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定するサブステップを含む
ことを特徴とする、（付記７）〜（付記９）のいずれか一項に記載のタンパク質設計方法。
（付記１１）
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計プログラムであって、
該タンパク質設計プログラムは、
（付記６）に記載のタンパク質設計方法に従って、（付記１）に記載のタンパク質設計装置を用いて、タンパク質設計を実行する際、前記タンパク質設計装置による処理動作を規定するプログラムであり、
該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセスは、
対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定する手段を用いて、対象タンパク質の構造揺らぎの中で３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を特定するステップと、
特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定する手段を用いて、特定されたアミノ酸残基位置及びその周辺残基を、変異位置として決定するステップを含む
こと特徴とするタンパク質設計プログラム。
（付記１２）
対象タンパク質の機能を高めることや低下させることを目的とするタンパク質設計に利用されるタンパク質設計プログラムであって、
該タンパク質設計プログラムは、
（付記７）に記載のタンパク質設計方法に従って、（付記２）に記載のタンパク質設計装置を用いて、タンパク質設計を実行する際、前記タンパク質設計装置による処理動作を規定するプログラムであり、
該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセスは、
前記構造揺らぎ発生装置において、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる、構造揺らぎ発生ステップと、
前記二次構造判定装置において、複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、二次構造判定ステップと、
前記変異位置決定装置において、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する、変異位置決定ステップを含む
ことを特徴とするタンパク質設計プログラム。
（付記１３）
該タンパク質設計プログラムは、
（付記８）に記載のタンパク質設計方法に従って、（付記３）に記載のタンパク質設計装置を用いて、タンパク質設計を実行する際、前記タンパク質設計装置による処理動作を規定するプログラムであり、
該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセス中、
前記変異位置決定装置において、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率から、変異位置の候補を決定する、変異位置決定ステップは、
前記変異位置決定装置が具える、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定する機能を用いて、複数の揺らぎ構造から得られたアミノ酸残基毎の３10へリックスまたはπへリックスの形成率に基づき、該形成率が０％よりも大きいアミノ酸残基の位置を特定するサブステップと、
前記変異位置決定装置が具える、前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定する機能を用いて、前記特定されたアミノ酸残基の位置、ならびに、該位置から前後６アミノ酸残基以内の位置を、変異位置の候補として決定するサブステップとを含む
ことを特徴とする、（付記１２）に記載のタンパク質設計プログラム。
（付記１４）
該タンパク質設計プログラムは、
（付記９）に記載のタンパク質設計方法に従って、（付記４）に記載のタンパク質設計装置を用いて、タンパク質設計を実行する際、前記タンパク質設計装置による処理動作を規定するプログラムであり、
該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセス中、
前記構造揺らぎ発生装置において、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる、構造揺らぎ発生ステップは、
前記構造揺らぎ発生装置が具える、分子動力学計算法に基づく、揺らぎ構造の計算手段を用いて、該分子動力学計算法に基づき計算される、時系列的な揺らぎ構造の計算結果をサンプリングし、対象タンパク質の構造揺らぎを発生させる処理を規定している
ことを特徴とする、（付記１２）または（付記１３）に記載のタンパク質設計プログラム。
（付記１５）
該タンパク質設計プログラムは、
（付記１０）に記載のタンパク質設計方法に従って、（付記５）に記載のタンパク質設計装置を用いて、タンパク質設計を実行する際、前記タンパク質設計装置による処理動作を規定するプログラムであり、
該タンパク質設計プログラムにおける、対象タンパク質のアミノ酸配列への変異位置の決定の処理動作の実行プロセス中、
前記二次構造判定装置において、複数の揺らぎ構造に対して３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、二次構造判定ステップは、
前記二次構造判定装置において、各揺らぎ構造について、そのペプチド主鎖を構成するアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）を計算する、アミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）計算サブステップと、
計算されたアミノ酸残基毎の二面角（φ，ψ）に基づき、３10へリックスまたはπへリックスを形成するアミノ酸残基位置を判定する、３10へリックス及びπへリックス判定サブステップを含む
ことを特徴とする、（付記１２）〜（付記１３）のいずれか一項に記載のタンパク質設計プログラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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