(57)【要約】【課題】ラクトコッカス属の菌種・亜種を、容易に同定する方法、特に、１度のＰＣＲで従来になく多くの種類のラクトコッカス属の菌種・亜種を区別することが可能な同定方法の提供。【解決手段】（ａ）ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの可変領域中に菌種特異的に存在する塩基配列を特異的に認識する特異的プライマーと、ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に共通して存在する塩基配列を特異的に認識する共通プライマーとを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程、及び（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出し、検出されたＰＣＲ産物の大きさに基づいて、前記被験菌のラクトコッカス属の菌種を同定する工程、を有することを特徴とするラクトコッカス属菌の菌種同定方法、並びに、前記特異的プライマー及び前記共通プライマーを含むラクトコッカス属菌の菌種同定キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌の菌種を同定する方法であって、
（ａ）ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に菌種特異的に存在する塩基配列を特異的に認識する特異的プライマーと、ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に共通して存在する塩基配列を特異的に認識する共通プライマーとを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出し、検出されたＰＣＲ産物の大きさに基づいて、前記被験菌のラクトコッカス属の菌種を同定する工程、
を有することを特徴とするラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項２】
前記特異的プライマーが、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１種類又は複数種類であることを特徴とする請求項１記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項３】
前記共通プライマーが、配列番号１０で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項２記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、３８０〜４００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．）と同定することを特徴とする請求項３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、５４０〜５６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）として同定することを特徴とする請求項３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、４４０〜４６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）として同定することを特徴とする請求項３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、２４０〜２６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）として同定することを特徴とする請求項３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、５４０〜５６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｉｓｃｉｕｍ）として同定することを特徴とする請求項３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、１６０〜１８０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）として同定することを特徴とする請求項３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１０】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、
を有し、
ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）として同定することを特徴とする請求項４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１１】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、
を有し、
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーとを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、３８０〜４００ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１２】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを全て用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、
３８０〜４００ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして、
３８０〜４００ｂｐ及び５４０〜５６０ｂｐの領域にそれぞれ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして、
塩基対長が４４０〜４６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして、
塩基対長が２４０〜２６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして、
塩基対長が５４０〜５６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして、
塩基対長が１６０〜１８０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することを特徴とする請求項３に記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１３】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、
を有し、
前記工程（ｂ）において、３８０〜４００ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項１２記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１４】
前記共通プライマーが、配列番号９で表される塩基配列で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項２記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１５】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、８１０〜８３０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種として同定することを特徴とする請求項１４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、９７０〜１０００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして同定することを特徴とする請求項１４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１７】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、８７０〜８９０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして同定することを特徴とする請求項１４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１８】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、６７０〜７００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして同定することを特徴とする請求項１４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項１９】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、９８０〜１０００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして同定することを特徴とする請求項１４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項２０】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、６００〜６２０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することを特徴とする請求項１４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項２１】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、
を有し、
ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項１５記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項２２】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、
を有し、
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーとを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、８１０〜８３０ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項１４記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項２３】
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを全て用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、
８１０〜８３０ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして、
８１０〜８３０ｂｐ及び９７０〜１０００ｂｐの領域にそれぞれ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして、
８７０〜８９０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして、
６７０〜７００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして、
９８０〜１０００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして、
６００〜６２０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することを特徴とする請求項１４に記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項２４】
さらに、
（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、
を有し、
前記工程（ｂ）において、８１０〜８３０ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする請求項２３記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌の菌種同定方法に用いられるキットであって、
配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１種類又は複数種類の特異的プライマー、並びに
配列番号９で表される塩基配列又は配列番号１０で表される塩基配列からなる共通プライマー、
を含むことを特徴とする、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌の菌種同定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌の菌種を同定する方法、並びに、該方法に好適なプライマー及び菌種同定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトコッカス属菌は、自然界に広く存在する中温性乳酸菌であり、古くから、チーズをはじめとする発酵乳製品に幅広く用いられている。近年では、特徴的な菌株を用いることによって特徴的な風味を有する乳発酵製品を作る試みも複数報告されている（例えば、特許文献１参照。）。また、乳酸菌及びその発酵物は、腸管内の腐敗防止作用など様々な生理活性を有することが報告されている。例えばラクトコッカス属菌では、プロテアーゼ処理した乳製品に、グルタミン酸デカルボキシラーゼ産生能を有するラクトコッカス属菌を接種して培養することにより、血圧低下作用を有するγーアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含有する発酵乳を製造する方法が報告されている（例えば、特許文献２参照。）。また、老化抑制作用と密接な関わりがある抗酸化能を有するラクトコッカス属菌も報告されている（例えば、特許文献３参照。）。このような様々な生理活性を有する菌株は、産業的価値の非常に高い乳酸菌として注目されている。
【０００３】
新しい乳酸菌株を自然界から得るためには、多種多様の微生物から分離・同定を行う必要がある。一般的に菌種の同定方法は、主に表現形質、すなわち、糖分解性状、発酵生産物、一般生物学的性状等を検査することにより行われている。しかしながら、表現形質を基にした同定法は、操作が煩雑であり、かつ多大な時間と労力を要し、さらに試験者の熟練を必要とする。また、乳酸菌の中には継代することで複数のコロニー形態を有する菌株が存在するため、コロニー形態から株を同定するには限界がある。
【０００４】
近年では、分子生物学的手法の進歩により、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく菌種同定方法が普及している。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列には、９箇所の可変領域が存在し、それぞれＶ１〜９領域と呼ばれている。これらの可変領域は、一般的に菌種特異的な配列であることが知られており（例えば、非特許文献１参照。）、このため、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のなかでも、可変領域をターゲットとする菌種特異的なプライマーが多く報告されている。
【０００５】
現在、ラクトコッカス属菌は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ガルビアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）、ラクトコッカス・ピシウム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｉｓｃｉｕｍ）、及びラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の５菌種が報告されている。このうち、ラクトコッカス・ラクティスは、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）の３亜種に分類されている。ラクトコッカス属菌に対しても、菌種特異的プライマーを用いたＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、これらの菌種及び亜種を同定する方法も試みられており、様々な菌種特異的なプライマーが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００６】
菌種を同定する対象である微生物から抽出された核酸を鋳型として、菌種特異的プライマーを用いてＰＣＲ等を行うことによって菌種を同定する場合、可能性のある全ての菌種に対して、それぞれ特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行う必要がある。通常は、プライマーの種類ごとに別個にＰＣＲを行い、１反応液で１菌種を同定する。例えば、ラクトコッカス属菌の菌種・亜種を同定するためには、全部で７種類の反応溶液を別々に調製し、各プライマーに適した反応条件でそれぞれＰＣＲを行うことになる。よって、菌種の数が多くなるほど、作業労力が過大となってしまう。
【０００７】
複数種類の菌種に対する特異的プライマーを１の反応溶液に添加して同時にＰＣＲを行う、いわゆるマルチプレックスＰＣＲを行うことにより、この手間を軽減することができる。しかしながら、複数種類のプライマーを１反応溶液中で反応させる場合には、互いに結合してプライマーダイマーを形成しないように、各プライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの塩基配列の特異性を調べる作業は、プライマーの組み合わせが多くなればなるほど煩雑性を増し、困難となることが容易に想像できる。
【０００８】
また、一般的には、菌種を同定する対象である微生物から抽出された核酸を鋳型として、菌種特異的プライマーを用いてＰＣＲを行う場合、ＰＣＲ産物の有無や得られたＰＣＲ産物の長さ（大きさ）によって、当該微生物の菌種を同定する。このため、マルチプレックスＰＣＲを行う場合、各組み合わせのプライマーから増幅されたＰＣＲ産物の長さが区別可能であることが重要である。例えば、非特許文献２に記載の方法では、複数種類のプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物の長さの差によりラクトコッカス属の各菌種を区別しているが、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスはＰＣＲ産物の長さがほぼ同程度であり、また、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、ラクトコッカス・ピシウム、及びラクトコッカス・プランタラムも、各ＰＣＲ産物の長さがほぼ同程度である。このため、１度のＰＣＲによって同定可能な菌種はラクトコッカス・ガルビアエのみであり、他の菌種は、得られたＰＣＲ産物をさらに制限酵素処理を行う必要があった。このように、１度のＰＣＲによってラクトコッカス属菌の菌種・亜種を区別することは非常に困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−１０９７５６号公報
【特許文献２】特開２００１−１２０１７９号公報
【特許文献３】特開２００６−２５６９９３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jean-Marc Neefs、他４名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、第２１巻、第３０２５〜３０４９ページ、１９９３年。
【非特許文献２】Z. Y. Pu、他３名、ジャーナル・オブ・アプライド・マイクロバイオロジー（Journal of Applied Microbiology）、第９３巻、第３５３〜３６１ページ、２００２年。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ラクトコッカス属の菌種・亜種を、容易に同定する方法、特に、１度のＰＣＲで従来になく多くの種類のラクトコッカス属の菌種・亜種を区別することが可能な同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ラクトコッカス属の複数株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列情報を解析し、各菌種（亜種も含む）のみに特異的に存在している配列（菌種特異的配列）と、全ての菌種に共通する配列（共通配列）とを見出した。さらに、これらの菌種特異的配列と共通配列とにより挟まれる領域をＰＣＲ等により増幅した場合に、得られる増幅産物の長さが、菌種ごとに異なるように、菌種特異的配列と共通配列との組み合わせを決定することにより、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）  （ａ）ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に菌種特異的に存在する塩基配列を特異的に認識する特異的プライマーと、ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に共通して存在する塩基配列を特異的に認識する共通プライマーとを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出し、検出されたＰＣＲ産物の大きさに基づいて、前記被験菌のラクトコッカス属の菌種を同定する工程、
を有することを特徴とするラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（２）  前記特異的プライマーが、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１種類又は複数種類であることを特徴とする前記（１）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（３）  前記共通プライマーが、配列番号１０で表される塩基配列からなることを特徴とする前記（２）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（４）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、３８０〜４００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．）と同定することを特徴とする前記（３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（５）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、５４０〜５６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）として同定することを特徴とする前記（３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（６）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、４４０〜４６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）として同定することを特徴とする前記（３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（７）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、２４０〜２６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｒｖｉｅａｅ）として同定することを特徴とする前記（３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（８）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、５４０〜５６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｉｓｃｉｕｍ）として同定することを特徴とする前記（３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（９）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、１６０〜１８０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）として同定することを特徴とする前記（３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１０）  さらに、（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、を有し、
ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｈｏｒｄｎｉａｅ）として同定することを特徴とする前記（４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１１）  さらに、（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、を有し、
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーとを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、３８０〜４００ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１２）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを全て用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、
３８０〜４００ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして、
３８０〜４００ｂｐ及び５４０〜５６０ｂｐの領域にそれぞれ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして、
塩基対長が４４０〜４６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして、
塩基対長が２４０〜２６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして、
塩基対長が５４０〜５６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして、
塩基対長が１６０〜１８０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することを特徴とする前記（３）に記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１３）  さらに、（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、を有し、
前記工程（ｂ）において、３８０〜４００ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（１２）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
【００１４】
（１４）  前記共通プライマーが、配列番号９で表される塩基配列で表される塩基配列からなることを特徴とする前記（２）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１５）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、８１０〜８３０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種として同定することを特徴とする前記（１４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１６）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、９７０〜１０００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして同定することを特徴とする前記（１４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１７）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、８７０〜８９０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして同定することを特徴とする前記（１４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１８）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、６７０〜７００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして同定することを特徴とする前記（１４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（１９）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、９８０〜１０００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして同定することを特徴とする前記（１４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（２０）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、６００〜６２０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することを特徴とする前記（１４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（２１）  さらに、（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、を有し、
ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（１５）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（２２）  さらに、（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、を有し、
前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーとを用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、８１０〜８３０ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（１４）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（２３）  前記工程（ａ）において、特異的プライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを全て用い、
前記工程（ｂ）において、前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離し、
８１０〜８３０ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして、
８１０〜８３０ｂｐ及び９７０〜１０００ｂｐの領域にそれぞれ単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして、
８７０〜８９０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして、
６７０〜７００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして、
９８０〜１０００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして、
６００〜６２０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することを特徴とする前記（１４）に記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
（２４）  さらに、（ｃ）前記被験菌のラクトース資化能の有無を検出する工程、を有し、
前記工程（ｂ）において、８１０〜８３０ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された被験菌のうち、
前記工程（ｃ）においてラクトース資化能が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとして、ラクトース資化能が検出されなかった被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとして同定することを特徴とする前記（２３）記載のラクトコッカス属菌の菌種同定方法、
【００１５】
（２５）  請求項１〜２４のいずれか一項に記載のラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌の菌種同定方法に用いられるキットであって、
配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーからなる群より選択される１種類又は複数種類の特異的プライマー、並びに
配列番号９で表される塩基配列又は配列番号１０で表される塩基配列からなる共通プライマー、
を含むことを特徴とする、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属菌の菌種同定キット、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のラクトコッカス属菌の菌種の同定方法により、ラクトコッカス属菌であるか否か、並びに、ラクトコッカス属菌の菌種及び亜種のうち、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ以外の全５種の菌種について、ＰＣＲにより容易に同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】全菌種の特異的プライマーと共通プライマーとを１のＰＣＲ反応溶液に添加してＰＣＲを行った結果に得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のラクトコッカス属菌の菌種の同定方法は、ラクトコッカス属の菌種・亜種にそれぞれ特異的な特定の塩基配列を有する特異的プライマーと、ラクトコッカス属の全菌種に共通する特定の塩基配列を有する共通プライマーとを用いることを特徴とする。本発明において用いられる特異的プライマーと共通プライマーは、以下の手法により設計された。
【００１９】
１．ラクトコッカス属菌の各菌種の特異的プライマー及び共通プライマーの設計
（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の可変領域のみの検討
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の可変領域には、菌種特異的な塩基配列が存在する、という一般的な知見に基づき、まず、ラクトコッカス属菌の菌種・亜種の全７種について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の可変領域を解析し、各菌種特異的な塩基配列を調べた。具体的には、各菌種の基準株（Ｔｙｐｅ  Ｓｔｒａｉｎ）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基にして、公知の塩基配列解析ソフトウェアを用いて、各菌種特異的な配列部位を特定した。なお、各菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋ等の公知の国際的な塩基配列データベースから得た。
【００２０】
【表１】
2011217734.tif 000002
【００２１】
表１は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の可変領域Ｖ１〜９に、ラクトコッカス属の菌種特異的な塩基配列が存在するか否かを示したものである。表中、「○」は、当該領域に、菌種特異的な塩基配列が存在していることを示す。表１に記載された菌種は、同じラクトコッカス属菌であることから、可変領域といえども、菌種に特異的な部位は少ない。実際に、可変領域Ｖ４〜９領域には、プライマー作成に適した菌種特異的な塩基配列は見出せなかった。また、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエについては、Ｖ１〜９の全ての可変領域において、菌種特異的な塩基配列は見出せなかった。
【００２２】
表１の結果から、菌種の同定のためのＰＣＲに用いる２種類のプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）を作成する際に、例えば、ラクトコッカス・ラフィノラクティス及びラクトコッカス・ガルビアエに特異的なプライマーを、Ｖ１及びＶ２領域中に存在する各菌種特異的な塩基配列に基づいてそれぞれ設計することは、比較的容易である。しかしながら、この場合には、得られたＰＣＲ産物の長さがほぼ同等（１００ｂｐ程度）となってしまうため、マルチプレックスＰＣＲを行った場合には、電気泳動法によっては両菌種を区別することは不可能となる。このため、菌種ごとに別々にＰＣＲ反応を行わなくてはならない。
【００２３】
この問題を解決するために、２種類のプライマーを、例えば、ラクトコッカス・ラフィノラクティスはＶ１とＶ２領域で、ラクトコッカス・ガルビアエはＶ１とＶ３領域で、それぞれ作成することにより、得られたＰＣＲ産物を電気泳動により区別することが可能となる。但し、Ｖ１からＶ４の可変領域は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列上にほぼ等間隔で存在するため、Ｖ１領域に設計したプライマーとＶ２領域に設計したプライマーとで得られるＰＣＲ産物と、Ｖ２領域に設計したプライマーとＶ３領域に設計したプライマーとで得られるＰＣＲ産物とはほぼ同じ長さとなり、電気泳動により判断することは困難である。つまり、菌種の同定のためのＰＣＲに用いる２種類のプライマーを、Ｖ１〜４の菌種特異的な塩基配列部位のみを用いて設計する場合には、得られるＰＣＲ産物の長さは、３種類しかない。よって、マルチプレックスＰＣＲを行った場合には、最大３種類の菌種のみしか区別して同定することができないことになる。
【００２４】
（２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全領域の検討
そこで、本発明者らは、菌種の同定のためのＰＣＲに用いるプライマーを、可変領域に限らず、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の全領域から検討し、設計することにした。
まず、各菌種の基準株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基にして、公知の塩基配列解析ソフトウェアを用いて、各菌種特異的な配列部位（特異的配列部位）と、全７種の菌種全てに共通する配列部位（共通配列部位）とを探索した。
探索された配列群から、近縁種等のラクトコッカス属菌以外の細菌と共通する配列を除いた。残った配列群から、各菌種の特異的配列部位と共通配列部位との組み合わせを検討し、特異的配列部位と共通配列部位とで挟まれる領域の長さが、菌種ごとに異なるような組み合わせを探索した。検討の結果に得られた組み合わせの塩基配列をターゲットとしてプライマーを設計し、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のオリゴプライマー作成サービスを利用してプライマーを合成した。その一部を表２に示す。
【００２５】
【表２】
2011217734.tif 000003
【００２６】
表２中、「ｌａｃ−ｓｐｐ．ＭＵＬＴＩ＿１」はラクトコッカス・ラクティス亜種の特異的配列部位に、「ｒａｆＭＵＬＴＩ＿１」はラクトコッカス・ラフィノラクティスの特異的配列部位に、「ｃｒｅＭＵＬＴＩ＿１」はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスの特異的配列部位に、「ｇａｒＭＵＬＴＩ＿１」及び「ｇａｒＭＵＬＴＩ＿２」はラクトコッカス・ガルビアエの特異的配列部位に、「ｐｉｓＭＵＬＴＩ＿１」はラクトコッカス・ピシウムの特異的配列部位に、「ｐｌａＭＵＬＴＩ＿１」及び「ｐｌａＭＵＬＴＩ＿２」はラクトコッカス・プランタラムの特異的配列部位に、それぞれ基づいて設計されたプライマーである。また、「ＬｃＭＵＬＴＩ−Ｒ＿１」及び「ＬｃＭＵＬＴＩ−Ｒ＿２」は、ラクトコッカス属菌の共通配列部位に基づいて設計されたプライマーである。また、表２中、「フォワード」がＰＣＲの際にフォワードプライマーとして用いることができるものであり、「リバース」がＰＣＲの際にリバースプライマーとして用いることができるものである。
【００２７】
２．各プライマーの特異性の確認１
上記１．で設計・合成したプライマーが、実際に特定の菌種に対してのみ特異性を有しているかを確認するため、ラクトコッカス属の全菌種の基準株と、比較対照としてストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、及びエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、大腸菌）の各基準株とを鋳型とした場合のプライマー反応性を検討した。
まず、全ての細菌を、それぞれ嫌気的に一晩純粋培養した。なお、ラクトコッカス属の全菌種、ストレプトコッカス・サーモフィラス、及びエンテロコッカス・フェカリスの培養には、Ｍ１７培地（ニッスイ社製）にブドウ糖０．５％（ｗ／ｗ）を加えた培地を用いた。エッシェリヒア・コリの培養には、ＧＡＭ培地（栄研社製）を用いた。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。
次いで、抽出されたＤＮＡをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用い、表２に記載の各プライマーのうち、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより、それぞれＰＣＲを行った。具体的には、鋳型ＤＮＡ溶液と、フォワードプライマー及びリバースプライマーを各１種類ずつとを含み、総液量が２５μＬであるＰＣＲ反応液を、Ｅｘ  Ｔａｑ(タカラバイオ社製)を用いて調製した。これらのＰＣＲ反応液に対して、９４℃１分間の後、９４℃２０秒間、６６℃２０秒間、７２℃４０秒間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った後、さらに７２℃５分間を行う反応条件によるＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、Ｖｅｒｉｔｉ  ２００(アプライド・バイオシステム社製)を用いて行った。得られたＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、バンドパターンを確認した。
【００２８】
この結果、フォワードプライマー７（ｐｌａＭＵＬＴＩ＿１）は、ラクトコッカス・ラクティス亜種にも反応してしまい、特異性に問題が認められた。また、フォワードプライマー４（ｇａｒＭＵＬＴＩ＿１）は、ラクトコッカス・ガルビアエに特異的に反応を示したが、フォワードプライマー１（ｌａｃ−ｓｐｐ．ＭＵＬＴＩ＿１）により増幅されたラクトコッカス・ラクティス亜種に検出されるバンドと、長さが約４０ｂｐしか異ならなかった。このため、フォワードプライマー４（ｇａｒＭＵＬＴＩ＿１）とフォワードプライマー１（ｌａｃ−ｓｐｐ．ＭＵＬＴＩ＿１）とを用いてマルチプレックスＰＣＲを行ったとしても、ラクトコッカス・ガルビアエとラクトコッカス・ラクティス亜種を区別することは困難であると判断された。よって、最終的には、本発明においては、ラクトコッカス・ラクティス亜種の特異的プライマーとしてフォワードプライマー１（ｌａｃ−ｓｐｐ．ＭＵＬＴＩ＿１）が、ラクトコッカス・ラフィノラクティスの特異的プライマーとしてフォワードプライマー２（ｒａｆＭＵＬＴＩ＿１）が、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスの特異的プライマーとしてフォワードプライマー３（ｃｒｅＭＵＬＴＩ＿１）が、ラクトコッカス・ガルビアエの特異的プライマーとしてフォワードプライマー５（ｇａｒＭＵＬＴＩ＿２）が、ラクトコッカス・ピシウムの特異的プライマーとしてフォワードプライマー６（ｐｉｓＭＵＬＴＩ＿１）が、ラクトコッカス・プランタラムの特異的プライマーとしてフォワードプライマー８（ｐｌａＭＵＬＴＩ＿２）が、ラクトコッカス属菌の共通プライマーとしてリバースプライマー９（ＬｃＭＵＬＴＩ−Ｒ＿１）又はリバースプライマー１０（ＬｃＭＵＬＴＩ−Ｒ＿２）が、それぞれ適切であると判断された。
【００２９】
表３に、各特異的プライマーを用いて、特異的に認識する菌種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った場合に得られるＰＣＲ産物の塩基対長を示した。表中、「ラクトコッカス・ラクティス亜種」は、３種の亜種（ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス、及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ）の全てを含む。
【００３０】
【表３】
2011217734.tif 000004
【００３１】
ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスを鋳型としてフォワードプライマー３を用いて得られるＰＣＲ産物と、ラクトコッカス・ピシウムを鋳型としてフォワードプライマー６を用いて得られるＰＣＲ産物とは、ほぼ同程度の大きさとなる。このため、フォワードプライマー３とフォワードプライマー６とを同時に用いてマルチプレックスＰＣＲを行った場合には、得られたＰＣＲ産物の大きさからは、被検菌がラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとラクトコッカス・ピシウムのどちらの菌であるかを同定することが困難なこともある。しかしながら、フォワードプライマー１を同時に用いることにより、大きさの異なる２種類のＰＣＲ産物が得られた被検菌はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであり、１種類のＰＣＲ産物のみが得られた被検菌はラクトコッカス・ピシウムである、と同定することができる。
【００３２】
現在、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列はｗｅｂ上のデータベースから容易に入手が可能であるものの、塩基配列解析ソフトウェアによるシュミレーションにより設計されるプライマーは、ＰＣＲを実施した際に期待した結果と異なるケースが認められる。特に今回のような複数のプライマーを用いる方法では、上記のように、プライマーの特異性及び反応性を確認する必要があり、結果によっては再度プライマーの設計を行う、といった繰返し作業が必要となる。実際に、配列番号７で表される塩基配列は、ラクトコッカス・ラクティス亜種の塩基配列とはホモロジーが十分低く、シュミレーションの結果では問題がなかったが、フォワードプライマー７を用いてＰＣＲを行ってみると、ラクトコッカス・ラクティス亜種も認識してしまった。このように、同属の菌種同士を区別可能であって、マルチプレックスＰＣＲも可能な菌種特異的なプライマーの設計は、通常のＰＣＲにのみ用いられる菌種特異的プライマーの作成よりも非常に困難である。
【００３３】
３．各プライマーの特異性の確認２
上記２．で決定した全菌種の特異的プライマーと共通プライマーとを１のＰＣＲ反応溶液に添加して同時にＰＣＲを行った。具体的には、表２に記載のプライマーのうち、フォワードプライマー１、２、３、５、６、８、及びリバースプライマー１０を添加した以外は、上記２．と同様にして、総液量が２５μＬであるＰＣＲ反応液を調製してＰＣＲを行った。
【００３４】
図１は、得られたＰＣＲ産物の電気泳動像である。図１中、Ｍは分子量マーカーＤＮＡ  ｌａｄｄｅｒ  １００ｂｐ（タカラバイオ社製）、Ａはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス  ＡＴＣＣ１９４３５Ｔ株、Ｂはラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ  ＪＣＭ１１８０Ｔ株、Ｃはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス ＮＢＲＣ  １００６７６Ｔ株、Ｄはラクトコッカス・ラフィノラクティス ＪＣＭ５７０６Ｔ株、Ｅはラクトコッカス・ガルビアエ ＪＣＭ１０３４３Ｔ株、Ｆはラクトコッカス・ピシウム ＪＣＭ１１０５５Ｔ株、Ｇはラクトコッカス・プランタラム ＪＣＭ１１０５６Ｔ株、Ｈはエッシェリヒア・コリ ＪＣＭ１６４９Ｔ株、Ｉはストレプトコッカス・サーモフィラス  ＡＴＣＣ１９２５８Ｔ株、Ｊはエンテロコッカス・フェカリス  ＪＣＭ５８０３Ｔ株を、それぞれ流したレーンである。
【００３５】
この結果、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（図１のレーンＡ）とラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ（図１のレーンＢ）では、３８０〜４００ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された。ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（図１のレーンＣ）では、３８０〜４００ｂｐの領域と５４０〜５６０ｂｐの領域に、それぞれ単一のバンドが検出された。ラクトコッカス・ラフィノラクティス（図１のレーンＤ）では４４０〜４６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出され、ラクトコッカス・ガルビアエ（図１のレーンＥ）では２４０〜２６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出され、ラクトコッカス・ピシウム（図１のレーンＦ）では５４０〜５６０ｂｐの領域に単一のバンドが検出され、ラクトコッカス・プランタラム（図１のレーンＧ）では１６０〜１８０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された。これに対して、エッシェリヒア・コリ（図１のレーンＨ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（図１のレーンＩ）、及びエンテロコッカス・フェカリス（図１のレーンＪ）では、全くバンドは検出されなかった。これらのバンドパターンは、表３の結果と一致していた。
【００３６】
４．各プライマーの特異性の確認３
リバースプライマー１０に替えてリバースプライマー９を用いて、上記３．と同様にして、ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動法により分離した。この結果、得られたバンドパターンは、表３の結果と一致していた。具体的には、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエでは、８１０〜８３０ｂｐの領域にのみ単一のバンドが検出された。ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスでは、８１０〜８３０ｂｐの領域と９７０〜１０００ｂｐの領域に、それぞれ単一のバンドが検出された。ラクトコッカス・ラフィノラクティスでは８７０〜８９０ｂｐの領域に単一のバンドが検出され、ラクトコッカス・ガルビアエでは６７０〜７００ｂｐの領域に単一のバンドが検出され、ラクトコッカス・ピシウムでは９８０〜１０００ｂｐの領域に単一のバンドが検出され、ラクトコッカス・プランタラムでは６００〜６２０ｂｐの領域に単一のバンドが検出された。エッシェリヒア・コリ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、及びエンテロコッカス・フェカリスでは、全くバンドは検出されなかった。
【００３７】
上記３．及び４．の結果から、上記２．で決定した全菌種の特異的プライマーと共通プライマーとの組み合わせは、１のＰＣＲ反応溶液中に混合して同時に用いた場合であっても、高い特異性を有していることが確認された。さらに、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエを除き、得られるＰＣＲ産物の種類及び長さによってラクトコッカス属菌の菌種・亜種を区別することが可能であることも確認された。
【００３８】
本発明のラクトコッカス属菌の菌種の同定方法（以下、本発明の菌種同定方法）は、より詳細には、下記工程（ａ）及び（ｂ）を有することを特徴とする。
（ａ）ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡの可変領域中に菌種特異的に存在する塩基配列を特異的に認識する特異的プライマーと、ラクトコッカス属に属する微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ中に共通して存在する塩基配列を特異的に認識する共通プライマーとを用いて、被験菌から抽出された核酸を鋳型としてＰＣＲを行う工程。
（ｂ）前記工程（ａ）により得られたＰＣＲ産物を検出し、検出されたＰＣＲ産物の大きさに基づいて、前記被験菌のラクトコッカス属の菌種を同定する工程。
【００３９】
工程（ａ）において用いられる特異的プライマーとしては、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー（フォワードプライマー１）、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー（フォワードプライマー２）、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー（フォワードプライマー３）、配列番号５で表される塩基配列からなるプライマー（フォワードプライマー５）、配列番号６で表される塩基配列からなるプライマー（フォワードプライマー６）、及び配列番号８で表される塩基配列からなるプライマー（フォワードプライマー８）からなる群より選択されるプライマーを用いることが好ましい。また、共通プライマーとしては、配列番号９で表される塩基配列からなるプライマー（リバースプライマー９）又は配列番号１０で表される塩基配列からなるプライマー（リバースプライマー１０）を用いることが好ましい。
【００４０】
工程（ａ）において、被験菌からの核酸抽出及びＰＣＲは、当該技術分野において公知のいずれの手法を用いて行ってもよい。また、ＰＣＲの反応条件は、使用するポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
【００４１】
工程（ｂ）において、ＰＣＲ産物の検出は、ＰＣＲ産物の大きさ（塩基対長）を指標としてＰＣＲ産物を検出する場合に用いられる公知のいずれの方法で行ってもよい。具体的には、塩基対の長さを識別して検出することができる電気泳動法や、定量的ＰＣＲ法等が挙げられる。電気泳動法としては、例えば、アガロース電気泳動法や、シーケンサーを用いたキャピラリー電気泳動等が挙げられる。また、定量的ＰＣＲ法では、塩基対長が長いほど、又はＧＣ含量が高いほど、ＤＮＡの解離温度（Ｔｍ）が高くなることを利用し、ＰＣＲ装置等を用いて反応溶液中の２本鎖核酸の解離温度を測定することにより、ＰＣＲ産物を種類ごとに識別して検出することができる。その他、分子量を測定することが可能なクロマトグラフィー法（ゲル濾過法）や、マススペクトル法等を用いてＰＣＲ産物を検出することもできる。本発明においては、ＰＣＲ産物を電気泳動法により分離してバンドを検出する方法で検出することが好ましい。
【００４２】
検出されたＰＣＲ産物の大きさと、表３に記載されているＰＣＲ産物の大きさとを比較することにより、被験菌を同定することができる。
具体的には、フォワードプライマー１とリバースプライマー１０との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が３８０〜４００ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌（ＰＣＲ産物を電気泳動法により分離した場合には、３８０〜４００ｂｐの領域に単一のバンドが検出された被験菌）を、ラクトコッカス・ラクティス亜種として同定することができる。
フォワードプライマー３とリバースプライマー１０との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が５４０〜５６０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして同定することができる。
フォワードプライマー２とリバースプライマー１０との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が４４０〜４６０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして同定することができる。
フォワードプライマー５とリバースプライマー１０との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が２４０〜２６０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして同定することができる。
フォワードプライマー６とリバースプライマー１０との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が５４０〜５６０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして同定することができる。
フォワードプライマー８とリバースプライマー１０との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が１６０〜１８０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することができる。
【００４３】
また、フォワードプライマー１とリバースプライマー９との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が８１０〜８３０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種として同定することができる。
フォワードプライマー３とリバースプライマー９との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が９７０〜１０００ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスとして同定することができる。
フォワードプライマー２とリバースプライマー９との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が８７０〜８９０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ラフィノラクティスとして同定することができる。
フォワードプライマー５とリバースプライマー９との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が６７０〜７００ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ガルビアエとして同定することができる。
フォワードプライマー６とリバースプライマー９との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が９８０〜１０００ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・ピシウムとして同定することができる。
フォワードプライマー８とリバースプライマー９との組み合わせを用いた場合には、塩基対長が６００〜６２０ｂｐであるＰＣＲ産物が検出された被験菌をラクトコッカス・プランタラムとして同定することができる。
【００４４】
本発明の菌種同定方法においては、特異的プライマーとして、フォワードプライマー１、２、３、５、６、及び８のうち、１種類を用いてもよく、２種類以上を適宜組み合わせて用いてもよい。例えば、特異的プライマーとしてフォワードプライマー１のみを用いた場合、１種類のＰＣＲ産物が得られた場合には、被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種に属する微生物であると同定することができる。また、フォワードプライマー１とフォワードプライマー３とを組み合わせて用いた場合に、２種類のＰＣＲ産物が得られた被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスに属する微生物であり、１種類のＰＣＲ産物のみが得られた被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエに属する微生物である、と同定することができる。
【００４５】
本発明の菌種同定方法においては、特異的プライマーとして、フォワードプライマー１、２、３、５、６、及び８の全６種類を同時に用いることが好ましい。全６種類を用いることにより、１回のＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物の種類や長さから、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエを除く全てのラクトコッカス属菌の菌種・亜種を同定することができるためである。
【００４６】
全６種類のフォワードプライマーとリバースプライマー１０とを用いてＰＣＲを行った場合には、塩基対長が３８０〜４００ｂｐである１種類のＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエであり、３８０〜４００ｂｐ及び５４０〜５６０ｂｐである２種類のＰＣＲ産物が検出された被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであり、４４０〜４６０ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ラフィノラクティスであり、２４０〜２６０ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ガルビアエであり、５４０〜５６０ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ピシウムであり、１６０〜１８０ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・プランタラムである、と同定することができる。
同様に、全６種類のフォワードプライマーとリバースプライマー９とを用いてＰＣＲを行った場合には、塩基対長が８１０〜８３０ｂｐである１種類のＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス又はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエであり、８１０〜８３０ｂｐ及び９７０〜１０００ｂｐである２種類のＰＣＲ産物が検出された被験菌はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであり、８７０〜８９０ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ラフィノラクティスであり、６７０〜７００ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ガルビアエであり、９８０〜１０００ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・ピシウムであり、６００〜６２０ｂｐであるＰＣＲ産物のみが検出された被験菌はラクトコッカス・プランタラムである、と同定することができる。
【００４７】
本発明の菌種同定方法において用いられる表２記載のフォワードプライマー１、２、３、５、６、８、及びリバースプライマー９、１０は、各菌種の１６Ｓ  ＲＮＡ遺伝子に対する特異的な認識能を阻害しない限り、表２記載の塩基配列以外の付加的な塩基配列を有していてもよい。該付加的な配列として、例えば、制限酵素認識配列等がある。また、菌種特異的プライマーを、蛍光物質等により標識しておくことにより、得られた増幅産物の検出等を容易にすることもできる。なお、プライマーの標識は常法により行うことができる。
【００４８】
表３及び図１に示すように、特異的プライマーとして、フォワードプライマー１、２、３、５、６、及び８を全て同時に用いたとしても、ＰＣＲ産物の大きさのみからでは、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとを区別することはできないが、ＰＣＲ産物のバンドパターンとラクトース資化性から、両菌種を区別して同定することができる。ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスはラクトース資化能を有しているのに対して、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエは有していないためである。
【００４９】
よって、工程（ａ）及び（ｂ）に加えて、さらに、工程（ｃ）として、前記被験菌のラクトース（乳糖）資化能の有無を検出する工程を行うことにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエとを識別することができる。具体的には、フォワードプライマー１を用いてＰＣＲ産物が得られた被検菌がラクトース資化能を有していなければ、当該被検菌はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエである、と同定することができる。また、フォワードプライマー１を用いてＰＣＲ産物が得られ、かつラクトース資化能を有している被検菌のうち、フォワードプライマー３を用いてＰＣＲ産物が得られた菌はラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスであり、フォワードプライマー３を用いてＰＣＲ産物が得られた菌はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスである、と同定することができる。
【００５０】
なお、工程（ａ）及び（ｂ）と工程（ｃ）とは、どちらを先に行ってもよい。被検菌のラクトース資化能を調べる方法は、特に限定されるものではなく、公知のいずれの手法を用いてもよい。例えば、被検菌を炭素原としてラクトースのみを含む培地中で培養し、生育の有無を観察することにより、ラクトース資化能を調べることができる。
【００５１】
その他、炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて分離された細菌や、炭素原としてラクトースのみを含む分離源から得られた細菌を被検菌とした場合、例えば炭水化物のほとんどがラクトースである乳製品等から分離された菌を被検菌とした場合には、被検菌のラクトース資化能を別個に調べない場合であっても、フォワードプライマー１とフォワードプライマー３を用いてＰＣＲを行うことにより、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス及びラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエを区別して同定することができる。炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて分離された細菌は、ラクトース資化能を有していることが明らかなためである。
【００５２】
本発明の菌種同定方法において用いられる１種又は２種以上の特異的プライマーと、少なくとも１種の共通プライマーとを、キット化することも好ましい。このような菌種同定キットを用いることにより、ラクトコッカス属菌の菌種・亜種の同定をより簡便に行うことができる。本発明においては、菌種同定キットとしては、全６種の特異的プライマーを含んでいることがより好ましい。このような菌種同定キットには、特異的プライマー及び共通プライマーの他に、被検菌の核酸抽出用試薬や、ＰＣＲ用試薬等を含めることができる。例えば、市販されているＰＣＲキットに、本発明の特異的プライマー及び共通プライマーを追加したものを、ラクトコッカス属菌の菌種同定キットとすることができる。
【実施例】
【００５３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、以下、表２記載のプライマーのうち、フォワードプライマー１、２、３、５、６、及び８、並びにリバースプライマー９からなるセットをプライマーセットＡ、フォワードプライマー１、２、３、５、６、及び８、並びにリバースプライマー１０からなるセットをプライマーセットＢという。
【００５４】
［実施例１］  未殺菌牛乳からのラクトコッカス属の分離・同定
未殺菌牛乳をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）、ＢＣＰ培地（栄研化学社製）、ＴＯＳプロピオン酸培地（ヤクルト薬品工業社製）、ＳＭ酢酸培地（ＳＭ  ７ｇ、酢酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ  １．５ｇ、クエン酸３アンモニウム  ０．２ｇ、寒天 １．５ｇ、ＤＷ  １００ｍＬ、酢酸 ０．１３２ｍＬ）を用いたプレートで２５〜４８℃にて嫌気培養した。得られたコロニーをグラム染色で確認後、グラム陽性菌１９２株をＭＲＳ液体培地で２５〜４８℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。得られた鋳型ＤＮＡ溶液及びプライマーセットＢを含み、総液量を２５μＬとした反応液をＥｘ  Ｔａｑ (タカラバイオ社製)を用いて調製し、Ｖｅｒｉｔｉ  ２００(アプライド・バイオシステム社製)を用いて、９４℃１分間の後、９４℃２０秒間、６６℃２０秒間、７２℃４０秒間を１サイクルとし、これを３０サイクル行った後、７２℃５分間を行う反応条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は４３株であった。うち３９０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスもしくはホルドニアエと推定された菌株は１５株、３９０ｂｐ付近と５５０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスと推定された菌株は１７株、４５０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ラフィノラクティスと推定された菌株は６株、２５０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ガルビアエと推定された菌株は５株、５５０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ピシウムと推定された菌株は１株であった。３９０ｂｐ付近にバンドが検出された菌株は、すべてラクトース資化能を有していたため、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであると判断された。バンドが検出された４３株を含む１９２株について、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された４３株は、ＰＣＲ産物の長さから推定された結果とすべて一致した。バンドが検出されなかった菌株の中には、ラクトコッカス属と同定された菌株はおらず、エンテロコッカス属やラクトバチラス属、ストレプトコッカス属などが主であった。以上の結果より、本発明の同定方法は、様々な細菌が生息する未殺菌牛乳から、ラクトコッカス属の菌種を効率よく同定する最適な手法であることが明らかとなった。
【００５５】
［実施例２］  チーズからのラクトコッカス属の分離・同定
日本国産のチェダーチーズ（森永乳業社製）１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルを、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及びプライマーセットＢを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は８株であった。うち３９０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスもしくはホルドニアエと推定された菌株は５株、３９０ｂｐ付近と５５０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリスと推定された菌株は３株であった。３９０ｂｐ付近にバンドが検出された菌株は、すべてラクトース資化能を有していたため、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであると判断された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された８株は、ＰＣＲ産物の長さから推定された結果とすべて一致した。バンドが検出されなかった２菌株は、ロイコノストック属細菌であった。以上の結果より、本発明の同定方法は、高頻度にラクトコッカス・ラクティス亜種が生息するナチュラルチーズから、ラクトコッカス菌種を効率よく同定する最適な手法であることが明らかとなった。
【００５６】
［実施例３］  キムチからのラクトコッカス属の分離・同定
日本の家庭で漬けたキムチを生理食塩水で適宜希釈し、ＳＭ酢酸培地及びＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜４８℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで２０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜４８℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及びプライマーセットＢを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は３株であった。うち３９０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスもしくはホルドニアエと推定された菌株は１株、１７０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・プランタラムと推定された菌株は２株であった。３９０ｂｐ付近にバンドが検出された菌株は、すべてラクトース資化能を有していたため、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであると判断された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された３株は、ＰＣＲ産物の長さから推定された結果とすべて一致した。バンドが検出されなかった１７菌株は、ラクトバチラス属細菌であった。以上の結果より、本発明の同定方法は、植物性発酵食品から、ラクトコッカス属細菌を効率よく分離・同定する手法であることが明らかとなった。
【００５７】
［実施例４］  植物からのラクトコッカス属の分離・同定
ゴム手袋を用いて採取したモモの葉を２ｃｍ四方に切断後、生理食塩水に浸し、ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に０．５％の炭酸カルシウムを加えたプレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーに対してグラム染色及びカタラーゼ試験を行い、乳酸菌と考えられるコロニーからランダムで２０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及びプライマーセットＡを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は４株であった。うち８２０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスもしくはホルドニアエと推定された菌株は２株、６１０ｂｐ付近にバンドが検出され、ラクトコッカス・プランタラムと推定された菌株は２株であった。８２０ｂｐ付近にバンドが検出された２菌株を、乳糖を単一の炭素源とするＭ１７培地（ニッスイ社製）で培養した結果、１株のみが良好に生育した。生育した菌株はラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであり、生育しなかった株はラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエであると判断された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された４株は、ＰＣＲ産物の長さから推定された結果とすべて一致した。バンドが検出されなかった１６菌株は、主にエンテロコッカス属、ラクトバチラス属細菌であった。以上の結果より、本発明の同定方法は、自然界から、ラクトコッカス属細菌を効率よく分離・同定する手法であることが明らかとなった。
【００５８】
［実施例５］  ラクトコッカス・ラクティス亜種及びその他乳酸菌を用いて製造した発酵乳より分離した菌株の同定
１０％（ｗ／ｗ）還元脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７４６株のシードカルチャーを３０ｍＬ接種し、２５℃１６時間培養した。一方、０．２％（ｗ／ｗ）酵母エキス入り１０％（ｗ／ｗ）脱脂粉乳培地１０００ｍＬを９０℃で３０分間殺菌し、ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７８７株、ラクトバチラス・ブルガリカス  ＡＴＣＣ１１８４２株、及びストレプトコッカス・サーモフィラス  ＪＣＭ２００２６株のシードカルチャーをそれぞれ１００ｍＬ、１０ｍＬ、及び３０ｍＬ接種し、３７℃６時間培養した。これとは別に、脱脂粉乳、全粉乳及び蔗糖等の原料を混合溶解し、乳脂肪３．０％（ｗ／ｗ）、無脂乳固形分９．０％（ｗ／ｗ）、蔗糖６．０％（ｗ／ｗ）からなるベース５０Ｌを、９０℃で１０分間殺菌し，４０℃に冷却した。該殺菌したベースに、前記の通り前培養を行ったカルチャー５０ｍＬを接種し、３７℃６時間培養して発酵乳を得た。得られた発酵乳１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルをＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）プレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及びプライマーセットＢを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は５株であり、すべて３９０ｂｐ付近にバンドが検出されたことから、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスもしくはホルドニアエと推定された。３９０ｂｐ付近にバンドが検出された菌株は、すべてラクトース資化能を有していたため、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであると判断された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された５株はＰＣＲ産物の長さから推定された結果とすべて一致した。バンドが検出されなかった５菌株は、４菌株がストレプトコッカス・サーモフィラス、１菌株がビフィドバクテリウム・ロンガムであった。以上の結果より、本発明の同定方法は、ラクトコッカス・ラクティス亜種を用いて製造した発酵乳から、ラクトコッカス菌種を効率よく同定する最適な手法であることが明らかとなった。
【００５９】
［実施例６］  アセプティック食品からのラクトコッカス・ラクティス亜種の検出
脱イオン水を７０℃に加温し、これにカゼインナトリウム４．５％、デキストリン１３．６％、及びミルクフレーバーを加えて混合した。これとは別に、容器中で大豆油を７０℃に加温した後に乳化剤を加えたものを、先に調製した水溶液に加えて混合した。得られた混合物について、高圧ホモジナイザーを使用して４９ＭＰｓ（５００ｋｇｆ／ｃｍ２）にて１回乳化を行った。得られた乳化物を１２１℃２０分間処理により滅菌することによって、アセプティック食品を調製した。得られたアセプティック食品に実施例５で作成した発酵乳を０．１％（ｖ／ｖ）混合し、擬似汚染食品を作製した。得られた擬似汚染食品１０ｇを４０ｍＬの２％クエン酸３ナトリウム溶液に加えた後にホモジナイズし、溶解したサンプルをＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）プレートで２５〜３７℃にて嫌気培養した。得られたコロニーからランダムで１０個を選抜し、ＭＲＳ液体培地で２５〜３７℃にて培養した。こうして得られた菌体各々から、Ｄｎｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉt（ＱＩＡＧＥＮ社製)を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。実施例１と同様にして、得られた鋳型ＤＮＡ溶液及びプライマーセットＢを含み、総液量を２５μＬとした反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、バンドが検出された株は３株であり、すべて３９０ｂｐ付近にバンドが検出されたことから、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスもしくはホルドニアエと推定された。３９０ｂｐ付近にバンドが検出された菌株は、すべてラクトース資化能を有していたため、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスであると判断された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の５’末端側６００ｂｐ程度を解析し菌種を同定したところ、バンドが検出された３株はＰＣＲ産物の長さから推定された結果とすべて一致した。バンドが検出されなかった７菌株は、すべてストレプトコッカス・サーモフィラスであった。以上の結果より、本発明の同定方法は、ラクトコッカス属が混入した食品から、ラクトコッカス属を効率よく同定する最適な手法であることが明らかとなった。
【００６０】
［実施例７］  菌種同定キットを用いたラクトコッカス属の検出の検出
ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ、もしくはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (いずれも、タカラバイオ社製)、又はｒＴａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅもしくはＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）のいずれかに含まれるｄＮＴＰｓ溶液に、プライマーセットＡ又はプライマーセットＢを、全プライマーの総量が１００ｎｍｏｌとなるように添加したキットを作製した。これらのキットを用いて、実施例１と同様にして、実施例１で分離したグラム陽性菌１９２株の菌種の同定を行った。得られた結果は実施例１と全く同様であった。
【００６１】
［参考例１］  ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエの識別
１０％（Ｗ／Ｗ）還元脱脂粉乳培地にラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス  ＡＴＣＣ  １９４３５Ｔ株もしくはラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ  ＪＣＭ１１８０Ｔ株を１％接種し、２５℃で一晩培養した。ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス  ＡＴＣＣ  １９４３５Ｔ株は培地が凝固し、生育が認められたが、ラクトコッカス・ラクティス亜種ホルドニアエ  ＪＣＭ１１８０Ｔ株は生育が認められなかった。以上より、炭素原としてラクトースのみを含む培地を用いて培養することによって、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスとホルドニアエの識別が可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の菌種同定方法により、ラクトコッカス属菌の菌種・亜種を容易に同定することができるため、本発明の菌種同定方法は、飲食品の製造等の、ラクトコッカス属菌を使用する様々な分野において利用が可能である。
【図１】
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【配列表】
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