(57)【要約】【課題】糖に替わる新たな炭素源を用いた効率的な発酵法によるＬ-アミノ酸の製造法を提供することを目的とする。【解決手段】腸内細菌科に属し、脂肪酸の資化能力が高められ、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を脂肪酸または油脂の加水分解物を炭素源とする培地に培養し、培養物中にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ-アミノ酸を採取することにより、Ｌ-アミノ酸を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌科に属し、脂肪酸資化能力が高められ、かつ、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、脂肪酸、又は、油脂の加水分解物を含む培地に培養し、培地または菌体内にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培地または菌体からＬ-アミノ酸を採取することを特徴とするＬ-アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
前記細菌が、fadR遺伝子の発現を弱化させること、又は同遺伝子を欠損させることにより脂肪酸資化能力が高められた細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が、fadL、fadE、fadD、fadB、及びfadAからなる群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を増強することにより脂肪酸資化能力が高められた細菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子が、fadB及びfadAである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、cyoABCDEオペロンの発現を増強することにより脂肪酸資化能力が高められた細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌がエシェリヒア属に属する細菌である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記L-アミノ酸が、L-スレオニン、L-リジン、及びL-トリプトファンからなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ-アミノ酸の製造法に関する。Ｌ-アミノ酸は、調味料、食品添加物、飼料添加物、化学製品、医薬品などの様々な分野に利用される。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ-スレオニン、Ｌ-リジン等のＬ-アミノ酸は、これらのＬ-アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌等のＬ-アミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらのＬ-アミノ酸生産菌としては、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株、遺伝子組換えによりＬ-アミノ酸生合成酵素活性が増強された組換え体等が用いられている。Ｌ-スレオニンの製造法としては、例えば、特許文献１〜４に記載された方法を挙げることができる。一方、Ｌ-リジンの製造法としては、例えば、特許文献５〜８に記載された方法を挙げることができる。
Ｌ-アミノ酸の発酵生産においては、炭素源として糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されている。
【０００３】
エシェリヒア・コリ野生株は、炭素鎖12 以上の長鎖脂肪酸を唯一の炭素源として生育可能であることが非特許文献１に記載されており、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸を唯一の炭素源とする培地にて生育可能であることが非特許文献２に示されている。また、脂肪酸資化は、fadL、fadD、fadE、fadB、fadAからなる遺伝子群にコードされる酵素により、β酸化と呼ばれる資化経路を経て行われることやこれらfad遺伝子群がfadRにコードされる転写因子により抑制を受けることが、非特許文献１に記載されている。また、非特許文献３に示されているように、fadR遺伝子を欠損した株についてもいくつかの報告がある。しかしながら、非特許文献４に示されているように、一般的に脂肪酸の溶解度は極めて低いことが知られており、脂肪酸を主たる炭素源として用いた直接発酵法の物質生産の例はこれまでにない。従って、脂肪酸をL-アミノ酸の生産の炭素源として用いるためには、培地中の脂肪酸を利用しやすくする物理的な処理とともに、発酵生産菌の脂肪酸の資化性を高めることは極めて重要である。これまでに、脂肪酸資化に関与する遺伝子の欠損や増幅が、脂肪酸を炭素源とする物質生産に与える影響を調べた例はない。
特許文献９には、染色体上のfadR遺伝子が欠損された微生物を用いたＬ−スレオニンの製造方法が開示されている。また、特許文献１０には、エネルギー獲得効率の高い呼吸鎖経路の増強または、エネルギー獲得効率の低い呼吸鎖経路の欠損による物質生産の方法が開示されている。しかしながら、いずれも炭素源はグルコースであり、脂肪酸を炭素源としたときの顕著な効果を予見できるものではなかった。
【特許文献１】特開平５-３０４９６９号公報
【特許文献２】国際公開第９８/０４７１５号パンフレット
【特許文献３】特開平０５-２２７９７７号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２／０１１０８７６号明細書
【特許文献５】特開平１０-１６５１８０号公報
【特許文献６】特開平１１-１９２０８８号公報
【特許文献７】特開２０００-２５３８７９号公報
【特許文献８】特開２００１-０５７８９６号公報
【特許文献９】特開２００４-１２９６６６号公報
【特許文献１０】特開２００２-０１７３６３号公報
【非特許文献１】Clark, D. P. and Cronan, J. E. Jr. 1996. p. 343-357. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C
【非特許文献２】Weeks, G. et al. 1969. Control of Fatty Acid Metabolism I. Induction of the Enzymes of Fatty Acid Oxidation in Escherichia coli. J. Bacteriol. 97: 827-836
【非特許文献３】Cronan, J. E. Jr. and Subrahmanyam, S. 1998. FadR, transcriptional co-ordination of metabolic expediency. Mol. Microbiol. 29: 937-943
【非特許文献４】Vorum, H. et al. 1992. Solubility of long-chain fatty acids in phosphate buffer at pH 7.4. Biochimica et Biophysica Acta, Lipids and Lipid Metabolism 1126: 135-142
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来、主として糖類を炭素源として行われてきた微生物を用いたＬ-アミノ酸の発酵生産方法に対し、脂肪酸、または、油脂の加水分解物という新たな原料を使用し、これらの資化能が高められた微生物を用いることにより、効率的で安価なＬ-アミノ酸の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、従来、発酵原料として用いた場合、細菌の生育速度が遅く、利用するのは困難と考えられていた脂肪酸を炭素源とする培地において、腸内細菌科に属し、脂肪酸の資化能力が高められ、かつ、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を培養することにより、効率的にＬ-アミノ酸を生産できることを見出し、この知見に基づき本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）腸内細菌科に属し、脂肪酸資化能力が高められ、かつ、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、脂肪酸、又は、油脂の加水分解物を含む培地に培養し、培地または菌体内にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培地または菌体からＬ-アミノ酸を採取することを特徴とするＬ-アミノ酸の製造方法。
（２）前記細菌が、fadR遺伝子の発現を弱化させること、又は同遺伝子を欠損させることにより脂肪酸資化能力が高められた細菌である、前記方法。
（３）前記細菌が、fadL、fadE、fadD、fadB、及びfadAからなる群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を増強することにより脂肪酸資化能力が高められた細菌である、前記いずれかの方法。
（４）前記遺伝子が、fadB及びfadAである、前記方法。
（５）前記細菌が、cyoABCDEオペロンの発現を増強することにより脂肪酸資化能力が高められた細菌である、前記いずれかの方法。
（６）前記細菌がエシェリヒア属に属する細菌である前記いずれかの方法。
（７）前記L-アミノ酸が、L-スレオニン、L-リジン、及びL-トリプトファンからなる群から選択される１種又は２種以上のアミノ酸である前記いずれかの方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新たな炭素源を用いることにより、高効率にＬ-アミノ酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のＬ-アミノ酸の製造方法
本発明の方法は、腸内細菌科に属し、脂肪酸資化能力が高められ、かつ、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌を、脂肪酸、または、油脂の加水分解物を含む培地に培養し、培地または菌体内にＬ-アミノ酸を生産蓄積させ、該培地または菌体からＬ-アミノ酸を採取する
ことを特徴とするＬ-アミノ酸の製造方法である。ここで本発明の方法は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養法（continuous culture）のいずれも用いることができ、培地中の脂肪酸または油脂の加水分解物は初発培地に含まれていてもよいし、流加培地に含まれていてもよいし、これらの両方に含まれていてもよい。
【０００９】
ここで、本発明において上記流加培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加し、培養終了時までその培地を容器から抜き取らない培養方法をいう。また連続培養とは、培養容器に培地を連続的または間欠的に流加するとともに容器から培地（通常、流加する培地と等量）を抜き取る方法をいう。また、初発培地とは、流加培養または連続培養において流加培地を流加させる前の回分培養（batch培養）に用いる培地（培養開始時の培地）のことを意味し、流加培地とは流加培養または連続培養を行う際に発酵槽に供給する培地を意味する。また、回分培養（batch培養）とは、一回毎に新たな培地を用意し、そこへ菌株を植えて収穫まで培地を加えない方法を意味する。
【００１０】
脂肪酸とは、一般式 CnHmCOOH（n+1、m+1は、それぞれ、脂肪酸に含まれる炭素数、水素数を表す）で表わすことができる長鎖炭化水素の1価のカルボン酸を指す。一般的に炭素数が12 以上のものを長鎖脂肪酸と呼ぶことが多い。脂肪酸は、その炭素数と不飽和度によって様々な種類が存在する。また、脂肪酸は、油脂の構成成分であり、油脂の種類によって脂肪酸の組成も異なることが知られている。ミリスチン酸（C13H27COOH）は炭素数14の飽和脂肪酸であり、ヤシ油、パーム油に含まれる。パルミチン酸（C15H31COOH）は炭素数16の飽和脂肪酸であり、植物油脂一般に多く含まれる。ステアリン酸（C17H35COOH）は、炭素数18の飽和脂肪酸であり、動物性脂肪・植物性油に多く含まれる。オレイン酸（C17H33COOH）は、炭素数18の一価の不飽和脂肪酸であり、動物性脂肪や植物油に多く含まれる。リノール酸（C17H31COOH）は炭素数18で9位と12位にシス型二重結合を2つ持っている多価不飽和脂肪酸である。脂肪酸としては、上記の長鎖脂肪酸の混合物を用いることも出来る。脂肪酸の混合物を炭素源として用いる場合、脂肪酸の混合比率は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる濃度比率であればいずれでもかまわない。油脂の加水分解物から、グリセロールを除いた脂肪酸の混合物を利用することも可能である。
【００１１】
本発明の方法においては、油脂の加水分解物を用いることもできる。
油脂は、脂肪酸とグリセロールのエステルであり、トリグリセリド（triglyceride）とも呼ばれる。油脂としては、加水分解反応が可能であれば、常温で液体のものを指す脂肪油（oil）、固体のものを指す脂肪（fat）など、どのようなものも使用することが出来る。また、動物由来（魚類を含む）油脂と植物由来油脂のすべてが使用可能であり、１種または２種以上を組み合わせて使用することも出来る。原料として用いる油脂は、純粋な油脂であってもよいし、油脂以外の物質を含む混合物であってもよい。例えば、油脂が植物由来のものである場合は、油脂を含む植物抽出物又はその分画物が挙げられる。
動物油脂として、バター、豚脂、牛脂、羊脂等、クジラ油、イワシ油、ニシン油等をあげることができる。植物油脂としては、パーム油、オリーブ油、菜種油、大豆油、米糠油、クルミ油、ゴマ油、ピーナッツ油等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。パーム油はアブラヤシの果実からとれる油脂であり、近年バイオディーセル（biodiesel）燃料としての利用が盛んになり、生産量が高まっている。アブラヤシ（oil palm）は、ヤシ科アブラヤシ属（Elaeis）に分類される植物の総称である。粗パーム油（crude palm oil）は、一般的に搾油工場で生産される未精製のパーム油を指し、粗パーム油として取引が行われている。また、微細藻類にも油脂を蓄積するものが知られており（Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306）、藻体から抽出することも可能である。藻体内には油脂以外にも糖類、タンパク質、アミノ酸などの有機物が含まれているが、これらを含む混合物を加水分解して炭素源として用いても構わない。
油脂としては、加水分解により生じる脂肪酸種が、本発明の方法に使用する細菌が炭素
源として資化できるものであり、それらの含量がより高い油脂が望ましい。L-アミノ酸生産能を有する細菌が資化できる長鎖の脂肪酸種としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などが挙げられる。
【００１２】
本発明における油脂の加水分解物とは、上記油脂を化学的あるいは酵素により加水分解したものを指し、脂肪酸とグリセロールの混合物を指す。工業的な加水分解法としては、高温（250-260℃）、高圧（5-6MPa）下で油脂と水を交流接触させる連続高温加水分解法が一般的に行われている。また、酵素を用いて低温（30℃前後）で反応を行うことも工業的に行われている（Jaeger, K. E. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63）。前記酵素としては、油脂の加水分解反応を触媒する酵素リパーゼを用いることが出来る。リパーゼは工業的に重要な酵素であり、様々な産業的利用がなされている（Hasan, F. et
al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39: 235-251）。油脂の加水分解物は、脂肪酸とグリセロールの混合物であり、パーム油等の一般的な油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸に対するグリセロールの重量比は10%程度であることが知られている。油脂の加水分解物としては、脂肪酸を含む限り特に制限されない。例えば、油脂の加水分解物をそのまま用いることも出来るが、脂肪酸、グリセロールの一部を除いて使うことも可能であるし、脂肪酸やグリセロールを加えて使用することも出来る。この時のグリセロールの脂肪酸に対する重量比は、好ましくは５〜２０：１００、より好ましくは７．５〜１５：１００である。
【００１３】
本発明の方法で使用する培地に含まれる、脂肪酸、または、油脂の加水分解物の量は、本発明の方法に使用する細菌が炭素源として資化できる限り幾らでもよいが、培地中に単独の炭素源として添加する場合、１０w/v%以下、好ましくは５w/v%以下、さらに好ましくは２w/v%以下含まれることが好ましい。また、培地中に単独の炭素源として添加する場合、０．２w/v%以上、好ましくは０．５w/v%以上、さらに好ましくは１．０w/v%以上含まれていることが望ましい。
また、流加培地として使用する場合は、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、流加後の培地中の濃度が５w/v%以下、好ましくは２w/v%以下、さらに好ましくは１w/v%以下で含まれることが好ましい。また、流加培地に単独の炭素源として添加する場合、０．０１w/v%以上、好ましくは０．０２w/v%以上、さらに好ましくは０．０５w/v%以上の量にて制御することが好ましい。
なお、脂肪酸の濃度は、ガスクロマトグラフィ（Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci.
Biotechnol. Biochem. 70:22-30）やHPLC（Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49）により測定することが可能である。
【００１４】
培地に加える脂肪酸、または油脂の加水分解物に含まれる脂肪酸は、水にミセル化するナトリウムやカリウムなどとのアルカリ金属塩として用いることが望ましい。しかしながら、脂肪酸のナトリウム塩やカリウム塩の溶解度も発酵原料として用いるのには十分ではない場合がある。そこで、Ｌ-アミノ酸生産能を有する細菌が炭素源として脂肪酸をより効率よく資化できるようにするために、乳化を行う等、均一化を促進する工程を加えることが好ましい。例えば乳化方法として、乳化促進剤や界面活性剤を加える等が考えられる。ここで乳化促進剤としては、リン脂質やステロールが挙げられる。また界面活性剤としては、非イオン界面活性剤では、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、n-オクチルβ-D-グルコシドなどのアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステルなどのショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステルなどのポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるN,N-ジメチル-N-ドデシルグリシンベタインなどが挙げられる。これ以外にも、トライトンX-100（Triton X-100）、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル（Brij-58）やノニルフェノールエトキシレート（Tergitol NP-40）等の一般的に生物学の分野で用いられる界面活性剤が利
用可能である。
さらに、脂肪酸の乳化や均一化を促進するための操作も有効である。この操作は、脂肪酸の乳化や均一化を促進する操作であれば、どのような操作でも構わない。具体的には、ホモジナイザー処理、ホモミキサー処理、超音波処理、高圧処理、高温処理などが挙げられるが、ホモジナイザー処理、超音波処理およびこれらの組合せがより好ましい。
上記界面活性剤による処理と、ホモジナイザー処理及び／または超音波処理を組み合わせることが特に好ましく、これらの処理は、脂肪酸がより安定なアルカリ条件下で行われることが望ましい。アルカリ条件としては、pH9以上が望ましく、より望ましくはpH10以上である。
【００１５】
さらに、本発明の方法に使用する培地には、脂肪酸、または、油脂の加水分解物に加え、他の炭素源を添加してもよい。好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。なお他の炭素源を用いる場合には、炭素源中の脂肪酸、または、油脂の加水分解物の比率が１０重量％以上、好ましくは３０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上であることが好ましい。
【００１６】
なお、本発明において、脂肪酸、または、油脂の加水分解物は、培養の全工程において一定濃度含まれてもよいし、流加培地のみあるいは初発培地のみに添加されていてもよく、その他の炭素源が充足していれば、一定時間脂肪酸、または、油脂の加水分解物が不足している期間があってもよい。一定時間とは、例えば発酵全体の時間のうち１０％、２０％、最大で３０％の時間で脂肪酸、または、油脂の加水分解物が不足していてもよい。このように一時的に脂肪酸の濃度が０になることがあっても、脂肪酸、または、油脂の加水分解物を含む培地での培養期間が存在する場合は、本発明の「脂肪酸、または、油脂の加水分解物を含む培地で培養する」との文言に含まれる。
【００１７】
培地中に添加する炭素源以外の成分としては、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を用いることができる。本発明の培地中に含まれる窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等が使用することができ、pH調整に用いられるアンモニアガス、アンモニア水も窒素源として利用できる。また、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆加水分解物等も利用出来る。培地中にこれらの窒素源が１種のみ含まれていてもよいし、２種以上含まれてもよい。これらの窒素源は、初発培地にも流加培地にも用いることができる。また、初発培地、流加培地とも、同じ窒素源を用いてもよいし、流加培地の窒素源を初発培地の窒素源と変更してもよい。
【００１８】
本発明の培地には、炭素源、窒素源の他にリン酸源、硫黄源が含まれていることが好ましい。リン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、ピロリン酸などのリン酸ポリマー等が利用出来る。また、硫黄源とは、硫黄原子を含んでいるものであればいずれでもよいが、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の硫酸塩、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が望ましく、なかでも硫酸アンモニウムが望ましい。
【００１９】
また、培地には、上記成分の他に、増殖促進因子（増殖促進効果を持つ栄養素）が含まれていてもよい。増殖促進因子とは、微量金属類、アミノ酸、ビタミン、核酸、更にこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆たん白分解物等が使用できる。微量金属類としては、鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等が挙げられ、ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等が挙げられる。これらの増殖促進因子は初発培地に含まれていてもよいし
、流加培地に含まれていてもよい。
【００２０】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。Ｌ-リジン生産菌は、後述のようにＬ-リジン生合成経路が強化されており、Ｌ-リジン分解能が弱化されているものが多いので、Ｌ-スレオニン、Ｌ-ホモセリン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メチオニンから選ばれる１種又は２種以上を添加することが望ましい。初発培地と流加培地は、培地組成が同じであってもよく、異なっていてもよい。また、初発培地と流加培地は、硫黄濃度が同じであってもよく、異なっていてもよい。さらには、流加培地の流加が多段階で行われる場合、各々の流加培地の組成は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００２１】
培養は、発酵温度２０〜４５℃、特に好ましくは３３〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。ここで酸素濃度は、５〜５０％に、望ましくは１０％程度に調節して行う。また、ｐＨを５〜９に制御し、通気培養を行うことが好ましい。培養中にｐＨが下がる場合には、例えば、炭酸カルシウムを加えるか、アンモニアガス、アンモニア水等のアルカリで中和することができる。このような条件下で、好ましくは１０時間〜１２０時間程度培養することにより、培養液中に著量のＬ-アミノ酸が蓄積される。蓄積されるＬ-アミノ酸の濃度は培地中から採取・回収できる濃度であればいずれでもよいが、50g/L以上、望ましくは75g/L以上、さらに望ましくは100g/L以上である。
【００２２】
培養終了後の培養液からＬ-アミノ酸を採取する方法は、公知の回収方法に従って行えばよい。例えば、培養液から遠心分離等によって菌体を除去した後に、濃縮晶析することによって採取される。
【００２３】
本発明においては、Ｌ-アミノ酸蓄積を一定以上に保つために、細菌の培養を種培養と本培養とに分けて行ってもよく、種培養をフラスコ等を用いたしんとう培養、又は回分培養で行い、本培養を流加培養、又は連続培養で行ってもよく、種培養、本培養ともに回分培養で行ってもよい。
【００２４】
本発明において、流加培養あるいは、連続培養を行う際には、一時的に脂肪酸またはその他の炭素源の流加が停止するように間欠的に流加培地を流加してもよい。また、流加を行う時間の最大で30％以下、望ましくは20％以下、特に望ましくは10％以下で流加培地の供給を停止することが好ましい。流加培養液を間欠的に流加させる場合には、流加培地を一定時間添加し、2回目以降の添加はある添加期に先行する添加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇するときのpH上昇または溶存酸素濃度の上昇がコンピューターで検出されるときに開始するように制御を行い、培養槽内の基質濃度を常に自動的に低レベルに維持してもよい（米国特許5,912,113号明細書）。
【００２５】
流加培養に用いられる流加培地は、脂肪酸、または、油脂の加水分解物とその他の炭素源及び増殖促進効果を持つ栄養素（増殖促進因子）を含む培地が好ましく、発酵培地中の脂肪酸濃度が一定以下になるように制御してもよい。
流加培地に加えるその他の炭素源としては、グルコース、スクロース、フルクトースが好ましく、増殖促進因子としては、窒素源、リン酸、アミノ酸等が好ましい。窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ウレア等のアンモニウム塩または硝酸塩等を使用することができる。またリン酸源としては、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが使用でき、アミノ酸としては、栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添することが好ましい。また、流加培地は１種でもよく、２種以上の培地を混合してもよい。２種以上の流加培地を用いる場合、それらの培地は混合して１つのフィード缶により流加させてもよいし、複数のフィード缶で流加させてもよい。
【００２６】
本発明で連続培養法を用いる場合には、引き抜きは流加と同時に行ってもよいし、一部引き抜いたあとで流加を行ってもよい。また培養液をＬ-アミノ酸と細胞を含んだまま引き抜いて、細胞だけ発酵槽に戻す菌体を再利用する連続培養法でもよい（フランス特許2669935号明細書参照）。連続的あるいは間欠的に栄養源を流加する方法は流加培養と同様の方法が用いられる。
【００２７】
菌体を再利用する連続培養法とは、予定したアミノ酸濃度に達したときに、発酵培地を間欠的にあるいは連続して引き抜き、Ｌ-アミノ酸のみを取り出し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させる方法であり、例えばフランス特許2669935号明細書を参照にして実施することができる。
【００２８】
ここで、培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したＬ-アミノ酸濃度に到達したときに、Ｌ-アミノ酸を一部引き抜いて、新たに培地を流加して培養を行うとよい。また、添加する培地の量は、最終的に引き抜く前の培養液量と同量になるように設定することが好ましい。ここで同量とは、引き抜く前の培養液量と９３〜１０７％の程度の量を意味する。
【００２９】
培養液を連続的に引き抜く場合には、栄養培地を流加させると同時に、あるいは流加させたあとに引き抜きを開始することが望ましく、例えば引き抜き開始時間としては流加を始めてから5時間以内、望ましくは3時間以内、さらに望ましくは1時間以内である。また引き抜く培養液量としては、流加させる量と同量で引き抜くことが好ましい。
【００３０】
＜２＞本発明で使用する細菌
本発明においては、腸内細菌科に属し、脂肪酸資化能力が高められたＬ-アミノ酸生産能を有する細菌を使用する。
腸内細菌科細菌は、エシェリヒア、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、パントエア、フォトルハブドゥス、プロビデンシア、サルモネラ、セラチア、シゲラ、モルガネラ、イェルシニア等の属に属する細菌を含む。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌が好ましい。
【００３１】
エシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、エシェリヒア属に分類されている細菌を意味する。本発明において使用されるエシェリヒア属に属する細菌の例としては、エシェリヒア・コリ（E. coli）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３２】
本発明において使用することができるエシェリヒア属に属する細菌は、特に制限されないが、例えば、Bachmannらの著書のTable 1（Bachmann, B. J. 1996. p. 2460-2488. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C）に記述されている系統のものが含まれる。具体的には、プロトタイプの野生株Ｋ１２株由来のエシェリヒア・コリ W3110 （ATCC 27325）、エシェリヒア・コリ MG1655 (ATCC 47076)等が挙げられる。
【００３３】
これらの菌株は、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所: P.O.
Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００３４】
パントエア属に属する細菌とは、当該細菌が微生物学の専門家に知られている分類により、パントエア属に分類されていることを意味する。パントエア属細菌の代表的な菌株として、パントエア・アナナティス、パントエア・スチューアルティ、パントエア・アグロメランス、パントエア・シトレアが挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイその他に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43: 162-173)。本発明において、パントエア属に属する細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス、エンテロバクター・アエロゲネス等が挙げられる。エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラが挙げられ、クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラが挙げられる。
【００３５】
「脂肪酸資化能力が高められた」とは、細菌の増殖及びＬ-アミノ酸の製造において、菌体成分あるいはＬ-アミノ酸を構成する炭素の供給源として脂肪酸の寄与が実質的に高まることを意味する。例えば、脂肪酸を加えた培地で培養したときに、非改変株と比べて細菌の生育がより良好である、あるいは、非改変株と比べてＬ-アミノ酸の生産量が高まることで脂肪酸資化能が高められたと評価される。
【００３６】
＜２−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
本発明において、L-アミノ酸生産能を有する細菌とは、脂肪酸または油脂の加水分解物を含む培地に培養したとき、Ｌ-アミノ酸を生産し、培地中に分泌する能力を有する細菌をいう。また、好ましくは、目的とするＬ-アミノ酸を好ましくは0.5g/L以上、より好ましくは1.0g/L以上の量を培地に蓄積させることができる細菌をいう。Ｌ-アミノ酸は、Ｌ-アラニン、Ｌ-アルギニン、Ｌ-アスパラギン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-システイン、Ｌ-グルタミン酸、Ｌ-グルタミン、グリシン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-ロイシン、Ｌ-リジン、Ｌ-メチオニン、Ｌ-フェニルアラニン、Ｌ-プロリン、Ｌ-セリン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-トリプトファン、Ｌ-チロシン及びＬ-バリンを含む。L-スレオニン、L-リジン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-バリン、L-ロイシン、L-イソロイシン、L-メチオニンがより好ましく、Ｌ-スレオニン及びＬ-リジンが特に好ましい。
本発明の方法においては、脂肪酸資化能力を高めることにより、脂肪酸または油脂の加水分解物を資化してL-アミノ酸を生産できるものである限り、これまでに報告されたL-アミノ酸生産菌を使用できる。以下、本発明の方法において使用することのできる各Ｌ-アミノ酸生産菌について説明する。
【００３７】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001−
346578号）等が挙げられる。
【００３８】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る。（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００３９】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなスレオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００４０】
このようにＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu−ファ−ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００４１】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナ−ゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノ−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノ−ルピルビン酸シンタ−ゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【００４２】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【００４３】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などの
エシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００４５】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００４６】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００４７】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００４８】
E. coliのrhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of
the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular
Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００４９】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００５０】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００５１】
Ｌ−リジン生産菌
エシェリヒア属に属するＬ−リジン生産菌の例としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログはエシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、エシェリヒア属に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジンの生産に有用な細菌株の具体例としては、E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びE. coli VL611が挙げられる。これらの微生物では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されている。
【００５２】
WC196株は、E. coliのＬ−リジン生産菌として使用できる。この菌株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与することにより育種された。同株は、E. coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。
【００５３】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強されている株も挙げられる。かかる酵素の例としては、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh) (米国特許第6,040,160号)、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ(dapD)、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ(dapE)及びアスパルターゼ(aspA) (EP 1253195 A)が挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素の中では、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼが特に好ましい。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、ybjE遺伝子(WO2005/073390)、または、これらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。
【００５４】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の例としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ(米国特許第5,827,698号)、及び、リンゴ酸酵素(WO2005/010175)が挙げられる。
【００５５】
好ましいＬ−リジン生産菌として、E. coli WC196ΔcadAΔldc/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子が破壊されたWC196株に、米国特許第6040160に記載されたプラスミドpCABD2が導入することにより得られた株である。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するE. coli由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するE. coli由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、E. coli由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。
【００５６】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００５９】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FE
RM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００６１】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE.
coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００６２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するＬ−イソロイシン及びＬ−スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、Ｌ−イソロイシン要求性のＬ−グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００６３】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ（prpC）、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素の中では、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼが好ましい。
【００６４】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝
子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【００６５】
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００６６】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００６７】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００６８】
Ｌ−グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【００６９】
パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌の例としては、パントエア・アナナティスAJ13355株が挙げられる。同株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所  〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。尚、同株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定され、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355として寄託されたが、近年16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に再分類されている。
【００７０】
また、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損した、または、αKGDH活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）を欠損させたAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びAJ13355株から粘液質低生産変異株として選択されたSC17株由来のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)がある。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託さ
れ、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。AJ13355及びAJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００７１】
さらに、パントアエ・アナナティスのＬ−グルタミン酸生産菌として、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００７２】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli
K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。
【００７３】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００７４】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００７５】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００７６】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、Ｌ−プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。Ｌ−プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００７８】
Ｌ−プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００７９】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００８１】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００８２】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００８３】
Ｌ−メチオニン生産菌
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−スレオニン要求株、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられるが、これらに限定されない(特開2000-139471号)。さらに、メチオニンリプレッサーを欠損した株や、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ−シンテースなどのＬ−メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開2000-139471号)。
【００８４】
なお、遺伝子組換えにより、上記のＬ−アミノ酸生産菌を育種する場合、使用する遺伝子は、上述した遺伝子情報を持つ遺伝子や、公知の配列を有する遺伝子に限られず、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。「保存的変異」については、後述の脂肪酸資化に関与する遺伝子に関する記載が、上記遺伝子にも適用される。
【００８５】
＜２−２＞脂肪酸資化能力を高める形質の付与
本発明の方法で使用する細菌は、上述したようなＬ−アミノ酸生産能を有する細菌を、脂肪酸資化能が増大するように改変した細菌であり、好ましくは、fadR 遺伝子の発現弱化または欠損、fadL遺伝子の発現増強、fadE遺伝子の発現増強、fadD遺伝子の発現増強、fadB遺伝子の発現増強、fadA遺伝子の発現増強、fadBAオペロンの発現増強、cyoABCDEの発現増強のうち、一つ以上の形質が付与されている細菌を指す。
【００８６】
本発明における「fadR遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される脂肪酸代謝を調節するＤＮＡ結合能を有するの転写因子FadRをコードする遺伝子を意味する（DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322）。具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のfadR遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号1234161〜1234880に位置する、配列番号１に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号２には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【００８７】
FadRの転写因子としての活性を低下させるには、fadR遺伝子の発現を弱化させるか、または同遺伝子を欠損させればよい。具体的には、染色体上のFadRをコードする遺伝子、具体的にはfadR遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、発現調節配列以外の非翻訳領域の改変によっても、遺伝子の発現量を低下させることができる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。また、遺伝子組換えにより、染色体上のFadRをコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入することによっても達成出来る（Wang, J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54: 9405-9410; Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 594-602; Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997.
J. Biol. Chem. 272: 8611-8617; Wente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol.
Chem. 266: 20833-20839)。
【００８８】
相同組換えを利用して、染色体上の遺伝子の発現調節配列、例えばプロモーター領域、又はコード領域、もしくは非コード領域の一部又は全部を欠損させること、又はこれらの領域に他の配列を挿入することによって、細胞内のFadRの転写調節活性を低下させることが好ましい。しかしながら転写抑制活性が低下するような改変であれば、Ｘ線もしくは紫外線を照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤による通常の変異処理による改変であってもよい。
【００８９】
発現調節配列の改変は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上である。また、コード領域を欠失させる場合は、産生するFadRの転写調節の機能が低下又は欠失するのであれば、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域のいずれの領域であってもよく、ＤＮＡ結合ドメインを含むことが望ましいが、コード領域全体であってよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化す
ることができる。また、欠失させる領域の上流と下流のリーディングフレームは一致しないことが好ましい。
【００９０】
コード領域に他の配列を挿入する場合も、遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が、確実に転写因子をコードする遺伝子を不活化することができる。挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、転写因子の機能を低下又は欠損させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子やＬ−アミノ酸生産に有用な遺伝子を搭載したトランスポゾン等が挙げられる。
【００９１】
染色体上の遺伝子を上記のように改変するには、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。欠失型遺伝子によってコードされる転写因子は、生成したとしても、野生型転写因子とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は、Redドリブンインテグレーション法、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステムとを組み合わせた方法等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法（米国特許第6303383号、または特開平05-007491号）などによって行うことができる。fadR遺伝子の発現弱化はノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等により確認でき、fadR遺伝子の欠損はサザンブロッティング等により確認できる（Sambrook, J. and Russell, D.W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）。
上記転写因子の活性低下に関する記載は、前述した他の酵素の「活性の低下」、又は他の遺伝子の「破壊」にも適用することできる。
【００９２】
本発明における「fadL遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸の取り込み能を有する外膜のトランスポーターをコードする遺伝子を意味する（Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476; Stenberg, F. et al. 2005. J. Biol. Chem. 280: 34409-34419）。
【００９３】
fadL遺伝子の発現増強によりFadL活性が増強されたことの確認は、fadL遺伝子増強前の細菌と、増強後の細菌の長鎖脂肪酸の取り込み活性を比較することにより達成される。例えば、オレイン酸の取り込み活性は、例えば、KumarとBlackの方法（Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476）に従って測定できる。培養後に集菌した細胞を3Hでラベルしたオレイン酸と反応させ、洗浄後に取り込まれた放射線量を比較することで測定可能である。取り込み活性としては、細胞総タンパク質当たり、１分間あたりの3Hオレイン酸の取り込み量（nM）で表される。親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上取り込み活性が上昇していることが望ましい。FadLの長鎖脂肪酸との結合活性を測定することも可能であるし、ウエスタンブロッティング等の手法によりFadLタンパク質の発現を確認することが可能である（Kumar, G. B. and Black, P. N. 1993. J. Biol. Chem. 268: 15469-15476）。また、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等（Sambrook, J. and Russell, D.W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）により、fadL遺伝子のmRNA量の増加を確認してもよい。
【００９４】
FadLをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadL遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号2459
322〜2460668に位置する、配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号４には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【００９５】
本発明における「fadD遺伝子」とは、腸内細菌群に見出される長鎖の脂肪酸からfatty acyl-CoA を生成するfatty acyl-CoA synthetase活性を触媒すると同時に、内膜を通して取り込む酵素をコードする遺伝子を意味する（Dirusso, C. C. and Black, P. N. 2004. J. Biol. Chem. 279: 49563-49566; Schmelter, T. et al. 2004. J. Biol. Chem. 279: 24163-24170）。
【００９６】
fatty acyl-CoA synthetase活性とは、以下の反応（EC 6.2.1.3）を触媒する活性をいう。
【００９７】
coenzyme A + fatty acid + ATP =  acyl-CoA + diphosphate + AMP
【００９８】
fadD遺伝子の発現増強によりFadD活性が増強されたことの確認は、増強前の微生物と、fadD遺伝子増強後の微生物の長鎖脂肪酸の取り込み活性を比較することにより達成される。例えば、オレイン酸の取り込み活性は、例えば、Schmelterらの方法（Schmelter, T. et al. 2004. J. Biol. Chem. 279: 24163-24170）に従って測定できる。培養後に集菌した細胞から、内膜のベジクルを調製し、ATPとcoenzyme Aをトラップさせた後、3Hオレイン酸を加え、洗浄後に取り込まれた放射線量を比較することで測定可能である。取り込み活性は、細胞総タンパク質当たり、１分間あたりの3Hオレイン酸の取り込み量（nM）で表される。親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上取り込み活性が上昇していることが望ましい。長鎖脂肪酸に対するfatty acyl-CoA synthetase活性の増加を測定することも可能であるし、ウエスタンブロッティング等の手法によりタンパク質の発現の増加を確認することも可能である。また、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等により、fadD遺伝子のmRNA量の増加を確認してもよい。
【００９９】
FadDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのFadD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号1887770〜1886085（相補鎖）に位置する、配列番号５に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号６には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１００】
本発明における「fadE遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acyl-CoA を酸化するacyl-CoA dehydrogenase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（O'Brien, W. J. and Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132: 532-540; Campbell, J. W. and Cronan, J. E. 2002. J. Bacteriol. 184: 3759-3764）。
【０１０１】
acyl-CoA dehydrogenase活性とは、以下の反応（EC 1.3.99.3）を触媒する活性をいう。
【０１０２】
acyl-CoA + FAD = FADH2 + Δ2-enoyl-CoA
【０１０３】
fadE遺伝子の発現増強によりFadE活性が増強されたことの確認は、fadE遺伝子増強前の細菌と、増強後の細菌のacyl-CoAの酸化活性を比較することにより達成される。例えば、オレイルCoAの酸化活性は、例えば、BrienとFrermanの方法（O'Brien, W. J. and Frerman, F. E. 1977. J. Bacteriol. 132: 532-540）に従って測定できる。活性測定は、培養後に集菌した細胞から、粗酵素抽出液を調製し、MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide）とオレイルCoAを含む反応液に加え、還元された MTT の量を 546 nm の吸光度を測定することで可能である。acyl-CoA dehydrogenase活性は、
粗酵素抽出液タンパク質当たり、１分間あたりのオレイルCoAの酸化量（nM）で表される。親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上FadE活性が上昇していることが望ましい。ウエスタンブロッティング等の手法によりタンパク質の発現を確認することも可能である。また、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等により、fadE遺伝子のmRNA量の増加を確認してもよい。
【０１０４】
FadEをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのfadE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号243303〜240859（相補鎖）に位置する、配列番号７に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号８には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１０５】
本発明における「fadB遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのα componentであり、enoyl-CoA hydratase、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase、3-hydroxyacyl-CoA epimerase、Δ3-cis-Δ2-trans-enoyl-CoA isomeraseの4つの活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473; Yang, S. Y. and Schulz, H. 1983. J. Biol. Chem. 258: 9780-9785）。
【０１０６】
enoyl-CoA hydratase活性とは、以下の反応（EC 4.2.1.17）を触媒する活性をいう。
【０１０７】
H2O + trans-2-enoyl-CoA = L-3-hydroxyacyl-CoA
【０１０８】
3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase活性とは、以下の反応（EC 1.1.1.35）を触媒する活性をいう。
【０１０９】
NAD+ + L-3-hydroxyacyl-CoA = NADH + 3-ketoacyl-CoA
【０１１０】
3-hydroxyacyl-CoA epimerase活性とは、以下の反応（EC 5.1.2.3）を触媒する活性をいう。
【０１１１】
D-3-hydroxyacyl-CoA = L-3-hydroxyacyl-CoA
【０１１２】
Δ3-cis-Δ2-trans-enoyl-CoA isomerase活性とは、以下の反応（EC 5.3.3.8）を触媒する活性をいう。
【０１１３】
cis-3-enoyl-CoA = trans-2-enoyl-CoA
【０１１４】
fadB遺伝子の発現増強によりFadB活性が増強されたことの確認は、例えば、fadB遺伝子増強前の細菌と、増強後の細菌のクロトニルCoAの水和活性やアセトアセチルCoAの還元活性を比較することにより達成される。FadBの4つの活性は、例えば、BinstockとSchulzの方法（Binstock, J. F. and Schulz, H. 1981. Methods Enzymol. 71(Pt C): 403-411）に従って測定できる。
enoyl-CoA hydratase活性の測定は、例えば、培養後に集菌した細胞から粗酵素抽出液を調製し、クロトニルCoAを含む反応液に加え、水和されたクロトニルCoAの量を 263 nm の吸光度を測定することで可能である。
enoyl-CoA hydratase活性は、例えば、粗酵素抽出液タンパク質当たり、１分間あたりのクロトニルCoAの水和量（nM）で表される。
また、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase活性の測定は、培養後に集菌した細胞から粗酵素抽出液を調製し、アセトアセチルCoAとNADHを含む反応液に加え、脱水素されたNADHの量を 340 nm の吸光度を測定することで可能である。
3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase活性は、粗酵素抽出液タンパク質当たり、１分間あたりのNADHの酸化量（nM）で表される。
親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上FadB活性が上昇していることが望ましい。ウエスタンブロッティング等の手法によりタンパク質の発現を確認することも可能である。また、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等により、fadB遺伝子のmRNA量の増加を確認してもよい。
【０１１５】
FadBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのFadB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号4028994〜4026805（相補鎖）に位置する、配列番号９に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１０には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１１６】
本発明における「fadA遺伝子」とは、腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexのβ componentであり、3-ketoacyl-CoA thiolase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Pramanik, A. et al. 1979. J. Bacteriol. 137: 469-473）。
【０１１７】
3-ketoacyl-CoA thiolase活性とは、以下の反応（EC 2.3.1.16）を触媒する活性をいう。
【０１１８】
3-ketoacyl-CoA + coenzyme A = acyl-CoA + acetyl-CoA
【０１１９】
fadA遺伝子の発現増強によりFadA活性が増強されたことの確認は、例えば、fadA遺伝子増強前の細菌と、増強後の細菌のアセトアセチルCoAのチオラーゼ活性を比較することにより達成される。FadAの活性は、例えば、BinstockとSchulzの方法（Binstock, J. F. and Schulz, H. 1981. Methods Enzymol. 71(Pt C): 403-411）に従って測定できる。
3-ketoacyl-CoA thiolase活性の測定は、培養後に集菌した細胞から粗酵素抽出液を調製し、アセトアセチルCoA、マグネシウムとCoAを含む反応液に加え、基質であるマグネシウムイオンとエノール酸の複合体の減少量を 303 nm の吸光度を測定することで可能である。3-ketoacyl-CoA thiolase活性は、粗酵素抽出液タンパク質当たり、１分間あたりのアセトアセチルCoAの減少量（nM）で表される。親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上FadA活性が上昇していることが望ましい。ウエスタンブロッティング等の手法によりタンパク質の発現を確認することも可能である。また、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等により、fadA遺伝子のmRNA量の増加を確認してもよい。
【０１２０】
FadAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのFadA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号4026795〜4025632（相補鎖）に位置する、配列番号１１に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１２には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１２１】
腸内細菌群に見出されるfatty acid oxidation complexは、FadBとFadAが複合体を形成しており、遺伝子としてもfadBAオペロンを形成していることが知られている（Yang, S. Y. et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 10424-10429）。従って、fadBAオペロンとして、オペロン全体を増幅することも可能である。
【０１２２】
本発明における「cyoABCDE」とは、腸内細菌群に見出される末端酸化酵素の一つであるシトクロムbo型酸化酵素複合体（cytochrome bo terminal oxidase complex）の各サブユニットをコードする遺伝子群であり、cyoBがsubunit Iを、cyoAがsubunit IIを、cyoCがsubunit IIIを、cyoCがsubunit IVを、cyoEがheme O synthase活性を触媒する酵素をコードする遺伝子を意味する（Gennis, R. B. and Stewart, V. 1996. p. 217-261. In F. D.
Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C; Chepuri et al. 1990. J. Biol. Chem. 265: 11185-11192）。
【０１２３】
シトクロムbo型酸化酵素複合体のterminal oxidaseとは、以下の反応（EC 1.10.2.-及び1.10.3.-）をいい、ユビキノールから、受け取った電子で酸素を酸化する活性とともに、1電子当たり、2分子のプロトンを排出するプロトンポンプとしても機能することを示している（Puustinen, A. et al. 1991.  Biochemistry 30: 3936-3942）。
【０１２４】
2 ubiquinol + O2 + 4 H+ = 2 ubiquinone + 2 H2O + 4 H+
【０１２５】
cyoABCDE遺伝子の発現増強により末端酸化酵素（terminal oxidase）活性が増強されたことの確認は、例えば、増強前の微生物と、増強後の微生物のユビキノールオキシダーゼ活性を比較することにより達成される。ユビキノールオキシダーゼ活性は、例えば、Kitaらの方法（Kita, K. et al. 1986. Methods Enzymol. 126: 94-113）に従って測定できる。培養後に集菌した細胞から粗酵素抽出液を調製し、ユビキノールを含む反応液に加え、同じく基質となる酸素の減少量を酸素電極により測定することで可能である。ユビキノールオキシダーゼ活性活性は、粗酵素抽出液タンパク質当たり、１分間あたりのユビキノールの減少量（μM）で表される。親株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上ユビキノールオキシダーゼ活性が上昇していることが望ましい。また、ウエスタンブロッティング等の手法により各タンパク質の発現を確認することも可能である。また、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等により、各遺伝子のmRNA量の増加を確認してもよい。
【０１２６】
cyoAをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoA遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号450834〜449887（相補鎖）に位置する、配列番号１３に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１４には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
cyoBをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoB遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号449865〜447874（相補鎖）に位置する、配列番号１５に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１６には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
cyoCをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoC遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号447884〜447270（相補鎖）に位置する、配列番号１７に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号１８には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
cyoDをコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoD遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号447270〜446941（相補鎖）に位置する、配列番号１９に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号２０には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
cyoE遺伝子をコードする遺伝子としては、具体的には、エシェリヒア・コリのcyoE遺伝子として、エシェリヒア・コリのゲノム配列（Genbank Accession No. U00096）の塩基番号446929〜446039（相補鎖）に位置する、配列番号２１に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号２２には、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示した。
【０１２７】
これらfadR 遺伝子、fadL遺伝子、fadE遺伝子、fadD遺伝子、fadB遺伝子、fadA遺伝子、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE遺伝子（以後、総称して、本発明の遺伝子という）は、コードされるタンパク質の活性、すなわち、機能が損なわれない限り、その遺伝子のホモログや人為的な改変体等、保存的変異を有する遺伝子も使用することができる。すなわち
、公知のタンパク質のアミノ酸配列、又は野生型のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２）において、１若しくは数個の位置で１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有する保存的バリアントをコードするものであってもよい。ここで、１若しくは数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。
このようなバリアントは、各タンパク質の機能が維持されている限り、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，または２２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性（identity）を有するものであってもよい。
【０１２８】
上記保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である
【０１２９】
より具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【０１３０】
また、それぞれ本発明の遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様に本発明の遺伝子は、機能を有する限り、コードされるタンパク質のＮ末端側、及び／又は、C末端側が延長又は、削られていてもよい。例えば延長する長さは、アミノ酸残基で50以下、好ましくは20以下、より好ましくは10以下、特に好ましくは5以下である。
【０１３１】
上記のような保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように塩基配列を改変することによって取得することができる。また、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては本発明の遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート（EMS）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、本発明の遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。これらの遺伝子がFadL、FadE、FadD、FadB、FadA又はシトクロムbo型酸化酵素複合体をコードしているかどうかは、例えば、これらの遺伝子を微生物に導入し、各タンパク質の活性を測定することによって確認できる。
【０１３２】
本発明の遺伝子は、上述の塩基配列（配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１）を有するＤＮＡ、またはこれらの塩基配列を有するDNAから調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFadL、FadE、FadD、FadB、FadA又はシトクロムbo型酸化酵素複合体をコードするＤＮＡであってもよい。
【０１３３】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、80％以上、より好ましく90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【０１３４】
プローブは、本発明の遺伝子の一部の配列を有するものであってもよい。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCR反応により作製することができる。なお、プローブに300bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、上記の条件でハイブリダイズさせた後の洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1%SDSが挙げられる。
【０１３５】
上記の保存的バリアントに関する記載は、前記のＬ−アミノ酸生産能の付与について記載した酵素及び遺伝子にも適用される。
【０１３６】
上述のような本発明の遺伝子の発現を増強するための改変は、Ｌ−アミノ酸生産能の付与について記載した目的遺伝子の発現を増強する方法と同様にして行うことができる。本発明の遺伝子は、それらを保持する微生物の染色体DNAを鋳型にして、PCR法により取得することができる。
【０１３７】
例えば、エシェリヒア・コリのfadL遺伝子は、配列番号３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号25、26に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（polymerase chain reaction）法（White, T. J. et al.
1989. Trends Genet. 5: 185-189参照）によって、取得することができる。
【０１３８】
エシェリヒア・コリのfadD遺伝子は、配列番号５の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号27、28に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【０１３９】
エシェリヒア・コリのfadE遺伝子は、配列番号７の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号29、30に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【０１４０】
エシェリヒア・コリのfadB遺伝子は、配列番号９の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号31、32に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【０１４１】
エシェリヒア・コリのfadA遺伝子は、配列番号１１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号33、34に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色
体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【０１４２】
エシェリヒア・コリのfadBAオペロンは、配列番号９及び１１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号35、36に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【０１４３】
また、エシェリヒア・コリのcyoABCDE遺伝子は、配列番号１３及び２１の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号37、38に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCRによって、取得することができる。
【０１４４】
他の微生物に由来する本発明の遺伝子も、上記の各遺伝子の配列情報、又は、その微生物において公知の遺伝子又はタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCR法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体DNA又は染色体DNAライブラリーから、取得することができる。なお、染色体DNAは、DNA供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（Saito, H. and Miura, K. I. 1963. Biochem. Biophys. Acta, 72, 619-629; 生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【０１４５】
本発明の遺伝子（fadL、fadE、fadD、fadB、fadA、cyoA、cyoB、cyoC、cyoD、cyoE）、及びＬ−アミノ酸生合成系遺伝子の発現の増強は、上述したような方法により、形質転換や相同組み換えによって本発明の遺伝子のコピー数を高めたり、本発明の遺伝子の発現調節配列を改変したりすることによって達成することができる。また、本発明の遺伝子の発現の増強は、本発明の遺伝子の発現を上昇させるようなアクチベーターを増幅させるか、及び／又は、本発明の遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成出来る。
以下に、遺伝子の発現を増強する方法について説明する。
【０１４６】
１つ目の方法は、目的遺伝子のコピー数を高める方法である。例えば、目的遺伝子を適当なベクター上にクローニングし、得られたベクターを用いて宿主細菌を形質転換することにより、該遺伝子のコピー数を高めることができる。
形質転換に用いるベクターとしては、使用する微生物で自律複製可能なプラスミドが挙げられる。例えば、腸内細菌群に属する微生物の中で自律複製可能なプラスミドとして、pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29（pHSG、pSTVはタカラバイオ社より入手可能）、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218（pMWはニッポンジーン社より入手可能）等が挙げられる。
なお、プラスミドの代わりにファージDNAをベクターとして用いてもよい。
【０１４７】
形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A. J. Mol. Biol. 1970, 53: 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E. 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N. 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、電気パルス法（特開平2-207791号公報）によっても、微生物の形質転換を行うこともできる。
【０１４８】
遺伝子のコピー数を高めることは、目的遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー導入することによっても達成できる。微生物の染色体DNA上に遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して、相同組換え法（MillerI, J.
H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）により行うことができる。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。さらに、Muファージを用いる方法（特開平2-109985号）で宿主染色体に目的遺伝子を組み込むこともできる。染色体上に目的遺伝子が転移したことの確認は、その遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【０１４９】
尚、遺伝子のコピー数を高める場合、目的遺伝子の産物の活性を増強できれば、コピー数は特に制限されないが、微生物がもともと目的遺伝子を有している場合は、２以上であることが好ましい。また、微生物が本発明の遺伝子をもともと有していない場合は、導入される遺伝子のコピー数は１であってもよいが、２以上であってもよい。
【０１５０】
２つ目の方法は、染色体DNA上またはプラスミド上において、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を適切な強さのものに置換することによって目的遺伝子の発現を増強させる方法である。例えば、thrプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター、tacプロモーター等がよく用いられるプロモーターとして知られている。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、GoldsteinとDoiの論文（Goldstein, M. A. and Doi R. H. 1995. Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128）等に記載されている。
【０１５１】
また、国際公開WO00/18935に開示されているように、遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、適切な強度のものに改変することも可能である。発現調節配列の置換は、例えば、温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。エシェリヒア・コリや、パントエア・アナナティスに用いることが出来る、温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えばWO 99/03988号国際公開パンフレットに記載の温度感受性プラスミドpMAN997やその誘導体等が挙げられる。また、λファージのレッド・リコンビナーゼ（Red recombinase）を利用した「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）や、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法によっても、発現調節配列の置換を行うことができる。なお、発現調節配列の改変は、上述したような遺伝子のコピー数を高める方法と組み合わせてもよい。
【０１５２】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによって、翻訳量を向上させることが可能である。
【０１５３】
シトクロムbo型酸化酵素をコードするcyoオペロン（cyoABCDE）は、各々のサブユニットをコードする遺伝子の発現は、別個に増強してもよく、ポリシストロンとして同時に増強してもよい。また、遺伝子をベクターを用いて微生物に導入する場合、各サブユニットをコードする遺伝子は、単一のベクター分子に同時に担持させてもよく、異なるベクター
分子に別個に担持させてもよい。また、遺伝子を染色体に挿入する場合も、各サブユニットをコードする遺伝子は、染色体上の同一部位に同時に挿入してもよく、異なる位置に別個に挿入してもよい。
【実施例】
【０１５４】
以下、実施例にて、本発明を更に具体的に説明する。実施例には、代表的な脂肪酸としてオレイン酸（C17H33COOH）のナトリウム塩（ナカライテスク社製）を用いた。
【０１５５】
〔実施例１〕fadRを欠損したエシェリヒア・コリＬ-リジン生産菌の構築
＜１-１＞fadR遺伝子欠損株の構築
エシェリヒア・コリの脂肪酸代謝を調節する転写因子FadRはfadR遺伝子（配列番号１）によってコードされている（DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691）。本遺伝子破壊の親株は、エシェリヒア・コリのＬ-リジン生産株として、国際特許公報WO2006/078039に記載のWC196ΔcadAΔldcC株（本株をWC196LCと呼ぶ）を用いた。この株は、WC196株（FERM BP-5252）において、cadA遺伝子とldcC遺伝子を破壊した株である。
【０１５６】
脂肪酸代謝を調節する転写因子をコードするfadR遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203）によって行った。「Red-driven integration」によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5'側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3'側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る（特開2005-058227）。
【０１５７】
PCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attL-kan-attR（特開2005-058227）を使用した。pMW118-attL-kan-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるkan遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-kan-attRの順で挿入されている。
【０１５８】
このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3'末端に、目的遺伝子であるfadR遺伝子の一部に対応するプライマーの5'末端に有する配列番号23及び24に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行った。
【０１５９】
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリWC196LC株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645）は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をWC196LC株の染色体に組み込むために必要である。
【０１６０】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地（トリプトン10g/L、Yeast extract 5g/L、NaCl 10g/L）中で30℃、一晩培養したエシェリヒア・コリWC196株を、アンピシリン（100mg/L
）とＬ-アラビノース（10mM）を含んだ5mLのLB培地で100倍希釈した。得られた希釈物を30℃で通気しながらOD600が約0.6になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで3回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは70μＬのコンピテントセルと約100ngのPCR産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは1mLのSOC培地（Sambrook, J. and Russell, D.W. 2001.
Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を加えて37℃で1時間培養した後、37℃でKm（カナマイシン）(40mg/L)を含むLB寒天培地（トリプトン10g/L、Yeast extract 5g/L、NaCl 10g/L、寒天15g/L）上で平板培養し、Km耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Kmを含むLB寒天培地上、42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
【０１６１】
カナマイシン耐性遺伝子によって識別できた変異体のfadR遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたfadR欠損株をWC196LCΔfadR::att-kan株と名づけた。
【０１６２】
次に、fadR遺伝子内に導入されたatt-kan遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-ts（特開2005-058227）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。
【０１６３】
上記で得られたWC196LCΔfadR::att-kan株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、30℃で100 mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、LB寒天培地上、42℃で2回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びカナマイシン耐性を試験し、att-kan及びpMW-intxis-tsが脱落しているfadR破壊株であるカナマイシン、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAΔldcCΔfadR株（WC196LCΔfadRと呼ぶ）と名づけた。
【０１６４】
＜１−２＞WC196LCΔfadR株へのリジン生産用プラスミド導入
WC196LCΔfadR株をdapA、dapB、lysC及びddh遺伝子を搭載したリジン生産用プラスミドpCABD2（WO95/16042）で常法に従い形質転換し、WC196LCΔfadR/pCABD2株を得た。
【０１６５】
上記で作製した株を25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。
【０１６６】
［実施例２］fadR欠損Ｌ-リジン生産株の培養
WC196LCΔfadR/pCABD2株と対照株WC196LC/pCABD2株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLB寒天培地プレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、500 mL容坂口フラスコの、25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。本培養における炭素源としては、グルコースまたは、オレイン酸ナトリウムを用いた。オレイン酸ナトリウムに対しては、乳化促進剤としてポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80：ナカライテスク社製）を終濃度0.5%（w/v）となるように添加したものを用いた。総炭素源量は、グルコースは40g/L、オレイン酸ナトリウムは20g/Lとした。これらの株がTween80を資化できないことは、別途確認した。培養に用いた培地組成を以下に示す。
【０１６７】
［エシェリヒア属細菌  Ｌ-リジン生産培地］
炭素源
グルコース                    40 g/L
または
オレイン酸ナトリウム          20 g/L
Tween 80                      5 g/L
その他の成分
(NH4)2SO4                        24 g/L
KH2PO4                           1 g/L
MgSO4・7H2O                      1 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・7H2O                      0.01 g/L
Yeast Extract                   2 g/L
CaCO3（日本薬局方）            30 g/L
KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、炭素源とMgSO4・7H2Oは別殺菌した後、混合した。CaCO3は乾熱滅菌後に添加した。
【０１６８】
48時間後に、培養上清のＬ-リジンの量をバイオセンサーBF-5（王子計測機器）により測定した。生育度は、グルコース培養では濁度（OD）にて測定し、脂肪酸を炭素源とした場合には、適当な希釈を行った培養液をLBプレートに塗布して生菌数を測定した。フラスコ2本ずつ行った培養の結果の平均値をグルコース培養の結果を表1に、オレイン酸ナトリウム培養の結果を表２示す。
グルコースを炭素源とした場合、fadR欠損株（WC196LCΔfadR/pCABD2）のＬ-リジン生産は、親株（WC196LC/pCABD2）に対して、同等以下であった。しかしながら、オレイン酸ナトリウムを炭素源にした場合には、fadR欠損株（WC196LCΔfadR/pCABD2）は、親株（WC196LC/pCABD2）に対して、有意に高い生育の向上とＬ-リジン生産を示した。
【０１６９】
【表１】
2011167071.tif 000002
【０１７０】
【表２】
2011167071.tif 000003
【０１７１】
〔実施例３〕fad遺伝子群を増幅したＬ-リジン生産菌の構築
＜３−１＞fad遺伝子群増幅株の構築
脂肪酸のβ酸化経路の酵素は、fadL（配列番号３）、fadD（配列番号５）、fadE（配列番号７）、fadB（配列番号９）、fadA（配列番号１１）からなる遺伝子群にコードされている（Clark, D. P. and Cronan Jr., J. E. 1996. p. 343-357. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Editi
on, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C）。また、fadBとfadAは、fadBAからなるオペロンを形成している。fadL遺伝子は配列番号25、26に示すプライマーを用いて、fadD遺伝子は配列番号27、28に示すプライマーを用いて、fadE遺伝子は配列番号29、30に示すプライマーを用いて、fadB遺伝子は配列番号31、32に示すプライマーを用いて、fadA遺伝子は配列番号33、34に示すプライマーを用いて、fadBAオペロンは配列番号35、36に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ野生株であるW3110株のの染色体DNAを鋳型としたPCR法によって取得した。
【０１７２】
＜３−２＞fadL遺伝子増幅プラスミドの構築
EcoRIサイトを有した配列番号２５に示したプライマーとHind IIIサイトを有した配列番号２６に示したプライマーを用いてW3110株の染色体DNAを鋳型としたPCRを行い、fadL遺伝子を含むPCR産物を得た。精製したPCR産物を制限酵素EcoRI及びHind IIIで消化し、fadL遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したfadL遺伝子断片をEcoRI及びHind IIIで消化したpTWV228ベクター（タカラバイオ社製）に連結し、fadL遺伝子増幅用プラスミドpTWV-fadLを構築した。
【０１７３】
＜３−３＞fadD遺伝子増幅プラスミドの構築
EcoRIサイトを有した配列番号２７に示したプライマーとHind IIIサイトを有した配列番号２８に示したプライマーを用いてW3110株の染色体DNAを鋳型としたPCRを行い、fadD遺伝子を含むPCR産物を得た。精製したPCR産物を制限酵素EcoRI及びHind IIIで消化し、fadD遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したfadD遺伝子断片をEcoRI及びHind IIIで消化したpTWV228ベクター（タカラバイオ社製）に連結し、fadL遺伝子増幅用プラスミドpTWV-fadDを構築した。
【０１７４】
＜３−４＞fadE遺伝子増幅プラスミドの構築
EcoRIサイトを有した配列番号２９に示したプライマーとHind IIIサイトを有した配列番号３０に示したプライマーを用いてW3110株の染色体DNAを鋳型としたPCRを行い、fadE遺伝子を含むPCR産物を得た。精製したPCR産物を制限酵素EcoRI及びHind IIIで消化し、fadE遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したfadE遺伝子断片をEcoRI及びHind IIIで消化したpTWV228ベクター（タカラバイオ社製）に連結し、fadE遺伝子増幅用プラスミドpTWV-fadEを構築した。
【０１７５】
＜３−５＞fadB遺伝子増幅プラスミドの構築
EcoRIサイトを有した配列番号３１に示したプライマーとHind IIIサイトを有した配列番号３２に示したプライマーを用いてW3110株の染色体DNAを鋳型としたPCRを行い、fadB遺伝子を含むPCR産物を得た。精製したPCR産物を制限酵素EcoRI及びHind IIIで消化し、fadB遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したfadB遺伝子断片をEcoRI及びHind IIIで消化したpTWV228ベクター（タカラバイオ社製）に連結し、fadB遺伝子増幅用プラスミドpTWV-fadBを構築した。
【０１７６】
＜３−６＞fadA遺伝子増幅プラスミドの構築
前述の様に配列番号３３、配列番号３４に示したプライマーを用いてW3110株の染色体DNAを鋳型としたPCR を行い、fadA遺伝子を含むPCR産物を得た。精製したPCR産物を、ベクターpTWV228（タカラバイオ社製）をSalIで消化し精製したプラスミド断片にIn-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit(クロンテック社製)を用いて連結しfadA遺伝子増幅プラスミドpTWV-fadA プラスミドを構築した。
【０１７７】
＜３−７＞fadBAオペロン増幅プラスミドの構築
EcoRIサイトを有した配列番号３５に示したプライマーとHind IIIサイトを有した配列番号３６に示したプライマーを用いてW3110株の染色体DNAを鋳型としたPCRを行い、fadBA
オペロンを含むPCR産物を得た。精製したPCR産物を制限酵素EcoRI及びHindIIIで消化し、fadBAオペロンを含む遺伝子断片を得た。精製したfadBAオペロンの断片をEcoRI及びHind IIIで消化したpTWV228ベクター（タカラバイオ社製）に連結し、fadBAオペロン増幅用プラスミドpTWV-fadBAを構築した。
【０１７８】
＜３−８＞WC196LC株へのリジン生産用プラスミド導入
エシェリヒア・コリのＬ-リジン生産株として、国際特許公報WO2006/078039に記載のWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株（本株をWC196LC/pCABD2と呼ぶ）を用いた。WC196LC株を前項で作製したfad遺伝子群を搭載したプラスミドpTWV-fadL、pTWV-fadD、pTWV-fadE、pTWV-fadB、pTWV-fadA、pTWV-fadBA、及び対照ベクターpTWV228で常法に従い形質転換し、それぞれ、WC196LC/pCABD2/pTWV-fadL、WC196LC/pCABD2/pTWV-fadD、WC196LC/pCABD2/pTWV-fadE、WC196LC/pCABD2/pTWV-fadB、WC196LC/pCABD2/pTWV-fadA、WC196LC/pCABD2/pTWV-fadBA、及び、WC196LC/pCABD2/pTWV228株を得た。
【０１７９】
上記で作製した株を50 mg/Lのアンピシリンと20 mg/Lのストレプトマイシンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。
【０１８０】
［実施例４］fad遺伝子群増幅Ｌ-リジン生産株の培養
実施例３で得られたfad遺伝子群増幅株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、50 mg/Lのアンピシリンと20 mg/Lのストレプトマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/2量の菌体を、AGCテクノグラス社製試験管（直径×長さ×肉厚（mm）=25 ×200×1.2）の、50 mg/Lのアンピシリンと20 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地の5 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において72時間培養した。本培養における炭素源としては、オレイン酸ナトリウムに対して、乳化促進剤としてポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80：ナカライテスク社製）を終濃度0.5%（w/v）となるように添加したものを用いた。総炭素源量オレイン酸ナトリウムは10g/Lとした。培養に用いた培地組成を以下に示す。
【０１８１】
［エシェリヒア属細菌  Ｌ-リジン生産培地］
炭素源
オレイン酸ナトリウム          10 g/L
Tween 80                       5 g/L
その他の成分
(NH4)2SO4                        24 g/L
KH2PO4                           1 g/L
MgSO4・7H2O                      1 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・7H2O                      0.01 g/L
Yeast Extract                   2 g/L
PIPES (pH7.5)                  20g/L
KOHでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブを行なった。但し、炭素源とMgSO4・7H2O、PIPESは別殺菌した後、混合した。
【０１８２】
72時間後に、培養上清のＬ-リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）により測定した。本培地では生育度は、培養液を等量の10% Tween 80溶液と混合し、濁度（OD）を測定した。フラスコ3本ずつ行った培養の結果の平均値を表３に示す。
ベクターpTWV228を導入した対照株に対し、fadL、fadD、fadE、fadB、fadA、fadBA遺伝
子導入株は、有意に高いＬ-リジン生産を示した。
【０１８３】
【表３】
2011167071.tif 000004
【０１８４】
〔実施例５〕fad遺伝子群を増幅したＬ-スレオニン生産菌培養
Ｌ-スレオニン生産菌として、EP 0593792に記載のエシェリヒア・コリ VKPM B-5318株を用いた。実施例＜３−１＞項で作製したfad遺伝子群を搭載したプラスミドpTWV-fadL、pTWV-fadE、及び対照ベクターpTWV228で常法に従いB-5318株を形質転換し、それぞれ、B-5318/pTWV-fadL、B-5318/pTWV-fadE、及び、B-5318/pTWV228株を得た。
【０１８５】
上記で作製した株を50 mg/Lのアンピシリンと25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLB培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。
【０１８６】
［実施例６］fad遺伝子群増幅Ｌ-スレオニン生産株の培養
B-5318/pTWV-fadL株、B-5318/pTWV-fadE株、及び、B-5318/pTWV228株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、50 mg/Lのアンピシリンと25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、500 mL容バッフル付三角フラスコの、50 mg/Lのアンピシリンと25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地の40 mLに接種し、往復振とう培養装置で40℃において48時間培養した。本培養における炭素源としては、オレイン酸ナトリウムに対して、乳化促進剤としてポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80：ナカライテスク社製）を終濃度0.5%（w/v）となるように添加したものを用いた。総炭素源量オレイン酸ナトリウムは10g/Lとした。培養に用いた培地組成を以下に示す。
【０１８７】
［エシェリヒア属細菌  Ｌ-スレオニン生産培地］
炭素源
オレイン酸ナトリウム          10 g/L
Tween 80                       5 g/L
その他の成分
(NH4)2SO4                        16 g/L
KH2PO4                           1 g/L
MgSO4・7H2O                      1 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・7H2O                      0.01 g/L
Yeast Extract                   2 g/L
PIPES (pH7.0)                  20 g/L
KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、炭素源とMgSO4・7H2O、PIPESは別殺菌した後、混合した。
【０１８８】
48時間後に、培養上清のＬ-スレオニンの量をアミノ酸分析計（日立社製アミノ酸分析計L-8900）により測定した。本培地では生育度は、培養液を等量の10% Tween 80溶液と混合し、濁度（OD）を測定した。フラスコ2本ずつ行った培養の結果の平均値を表４に示す。
ベクターpTWV228を導入した対照株に対し、fadL 、fadDとfadEの遺伝子導入株は、いずれもＬ-スレオニン生産能が向上していた。
【０１８９】
【表４】
2011167071.tif 000005
【０１９０】
［実施例７］cyoABCDEオペロン導入株の作製
エシェリヒア・コリのシトクロムbo型酸化酵素複合体をコードするcyoオペロン（cyoABCDE）の増幅には、特開２００２-０１７３６３号公報記載のプラスミドpMW(CYO)Bを用いた。実施例３と同様にエシェリヒア・コリのＬ-リジン生産株WC196LC/pCABD2をプラスミドpMW(CYO)B及び対照ベクターpMW219で形質転換して、それぞれ、WC196LC/pCABD2/pMW(CYO)B及びWC196LC/pCABD2/pMW219を得た。
【０１９１】
［実施例８］cyoABCDEオペロン導入Ｌ-リジン生産株の培養
実施例７で作製した株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、40 mg/Lのカナマイシンと25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、500 mL容バッフル付三角フラスコの、40 mg/Lのカナマイシンと25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地の40 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。本培養における炭素源としては、オレイン酸ナトリウムに対して、乳化促進剤としてポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80：ナカライテスク社製）を終濃度0.5%（w/v）となるように添加したものを用いた。総炭素源量オレイン酸ナトリウムは10 g/Lとした。培養に用いた培地組成を以下に示す。
【０１９２】
［エシェリヒア属細菌  Ｌ-リジン生産培地］
炭素源
オレイン酸ナトリウム            10 g/L
Tween 80                        5 g/L
その他の成分
(NH4)2SO4                        24 g/L
KH2PO4                           1 g/L
MgSO4・7H2O                      1 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・7H2O                      0.01 g/L
Yeast Extract                   2 g/L
PIPES (pH7.0)                  20 g/L
KOHでpH7.0に調整し、120℃で20分オートクレーブを行なった。但し、炭素源とMgSO4・7H2O、PIPESは別殺菌した後、混合した。
【０１９３】
48時間後に、培養上清のＬ-リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）により測定した。本培地では生育度は、培養液を等量の10% Tween 80溶液と混合し、濁度（OD）を測定した。フラスコ2本ずつ行った培養の結果の平均値を表５に示す。
ベクターpMW219を導入した対照株に対し、cyoABCDEオペロン導入株は、有意にＬ-リジン生産を示した。
【０１９４】
【表５】
2011167071.tif 000006
【０１９５】
〔配列表の説明〕
配列番号1：fadR遺伝子の塩基配列
配列番号2：fadR遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号3：fadL遺伝子の塩基配列
配列番号4：fadL遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号5：fadD遺伝子の塩基配列
配列番号6：fadD遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号7：fadE遺伝子の塩基配列
配列番号8：fadE遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号9：fadB遺伝子の塩基配列
配列番号10：fadB遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号11：fadA遺伝子の塩基配列
配列番号12：fadA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号13：cyoA遺伝子の塩基配列
配列番号14：cyoA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号15：cyoB遺伝子の塩基配列
配列番号16：cyoB遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号17：cyoC遺伝子の塩基配列
配列番号18：cyoC遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号19：cyoD遺伝子の塩基配列
配列番号20：cyoD遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号21：cyoE遺伝子の塩基配列
配列番号22：cyoE遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号23：fadR遺伝子破壊用PCRプライマー
配列番号24：fadR遺伝子破壊用PCRプライマー
配列番号25：fadL遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号26：fadL遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号27：fadD遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号28：fadD遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号29：fadE遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号30：fadE遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号31：fadB遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号32：fadB遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号33：fadA遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号34：fadA遺伝子増幅用PCRプライマー
配列番号35：fadBAオペロン増幅用PCRプライマー
配列番号36：fadBAオペロン増幅用PCRプライマー
【配列表】
2011167071000001.app