(57)【要約】【課題】従来の標的核酸とのハイブリダイゼーション時に蛍光が消光する核酸プローブまたは核酸プライマーを用いた方法では、核酸プローブが核酸増幅工程、特に伸長工程を阻害するため、短時間化の際に感度が低下する問題があり、核酸プライマーの非特異増幅によって標的核酸特異的検出が妨げられる問題があった。本発明では、これらの問題点を克服し、標的核酸の検出を特異性および高感度を維持しながら迅速に行うことを課題とした。【解決手段】第一プライマー及び第二プライマーのＴｍ値と標識プローブのＴｍ値の関係、さらにプライマーの濃度と標識プローブの濃度の関係を調節し、最適化することによって特異性および高感度を維持しながら迅速に標的核酸を検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のセンス鎖の存在または量を確認したい試料と少なくとも下記（ａ）と（ｂ）の存在下、連続的または間欠的に標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該標識物質の蛍光を測定しながら、１０℃／秒以上の速度で温度の上昇及び下降を繰り返すＰＣＲを行い、さらに引き続いて、密封状態のまま、標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該蛍光物質の蛍光を測定しながら、融解曲線解析を行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在を調べることを特徴とする検出方法。 
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する配列番号２より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列を有する標識プローブ
（ｉ）  標的核酸に相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成でき、かつ１４塩基以上３０塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有する
（ｉｉ）  該オリゴヌクレオチドの末端部が該二重鎖核酸構造形成時に消光する性質を有する蛍光物質で修飾されている
（ｉｉｉ）  該二重鎖核酸構造形成時に、蛍光物質で修飾されている該末端部にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在する
（ｉｖ）該標識プローブの濃度が第二プライマーの濃度に対して１０倍以下である
（ｂ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の性質を有する配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を有する第一プライマー、および、配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を有する第二プライマー
（ｉ）  第一プライマーの伸長産物が標的核酸と相補的な配列を有しかつ第二プライマーの鋳型となる性質を有し、該第二プライマーの伸長産物が標的核酸と相同な配列を有しかつ該第一プライマーの鋳型となる性質を有する
（ｉｉ）  該第一プライマーおよび該第二プライマーによる増幅産物の長さが５０ｂｐ以上５００ｂｐ以下である
（ｉｉｉ）  該第一プライマー及び該第二プライマーのＴｍ値が７０℃以上９０℃以下であり、かつ該第二プライマーのＴｍ値は前記標識プローブのＴｍ値より大きい
【請求項２】
ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアンチセンス鎖の存在または量を確認したい試料と少なくとも下記（ａ）と（ｂ）の存在下、連続的または間欠的に標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該標識物質の蛍光を測定しながら、１０℃／秒以上の速度で温度の上昇及び下降を繰り返すＰＣＲを行い、さらに引き続いて、密封状態のまま、標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該蛍光物質の蛍光を測定しながら、融解曲線解析を行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在を調べることを特徴とする検出方法。 
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する配列番号１より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列を有する標識プローブ
（ｉ）  標的核酸に相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成でき、かつ１４塩基以上３０塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有する
（ｉｉ）  該オリゴヌクレオチドの末端部が該二重鎖核酸構造形成時に消光する性質を有する蛍光物質で修飾されている
（ｉｉｉ）  該二重鎖核酸構造形成時に、蛍光物質で修飾されている該末端部にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在する
（ｉｖ）該標識プローブの濃度が第二プライマーの濃度に対して１０倍以下である
（ｂ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の性質を有する配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を有する第一プライマー、および、配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を有する第二プライマー
（ｉ）  第一プライマーの伸長産物が標的核酸と相補的な配列を有しかつ第二プライマーの鋳型となる性質を有し、該第二プライマーの伸長産物が標的核酸と相同な配列を有しかつ該第一プライマーの鋳型となる性質を有する
（ｉｉ）  該第一プライマーおよび該第二プライマーによる増幅産物の長さが５０ｂｐ以上５００ｂｐ以下である
（ｉｉｉ）  該第一プライマー及び該第二プライマーのＴｍ値が７０℃以上９０℃以下であり、かつ該第二プライマーのＴｍ値は前記標識プローブのＴｍ値より大きい
【請求項３】
ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位における変異の存在を調べることを特徴とする請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列の中央部に変異の部位が位置することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
（ｂ）の第一プライマーおよび第二プライマーが、さらに
（ｉｖ）  該第一プライマーの伸長産物において、該伸長産物の５’末端から前記標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域までの距離を（Ａ）、該標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域から該伸長産物の３’末端までの距離を（Ｂ）とした場合に（Ａ／Ｂ）の値が０．１以上３．０以下であること、
を特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
（ａ）の標識プローブに、さらに 
（ｖ）  標的部位と３個以下の非相補的塩基を導入すること、
を特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
標識プローブの中央部に、非相補的塩基を導入することを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項８】
（ａ）の標識プローブに修飾されている蛍光物質が該標識プローブの末端に修飾され、該末端の塩基がＧもしくはＣであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
第一プライマーの濃度が第二プライマーの濃度に対して４倍以上であることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
さらに、
（ｃ）１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼ
の存在下、
１０℃／秒以上の速度で温度の上昇及び下降を繰り返すＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼが、さらに５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）またはその変異体であることを特徴とする請求項１０または１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の検出方法において、融解曲線解析が０．１℃／秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う検出方法。
【請求項１４】
少なくとも次の（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とするピロリ菌の存在および／またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するためのキット。
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｉ）の性質を有する標識プローブ
（ｉ）配列番号１または配列番号２より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列のオリゴヌクレオチドを有する
（ｉｉ）  該オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成する時に消光する性質を有する蛍光物質が、該オリゴヌクレオチドの末端
部に標識されている
（ｂ）Ｔｍ値が７０℃以上９０℃以下であり配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を含むプライマーと、Ｔｍ値が７０℃以上９０℃以下であり配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を含むプライマー
【請求項１５】
（ａ）の標識プローブと二重鎖核酸構造を形成しうる伸長産物を生成せしめる側のプライマーの濃度が、他方のプライマーの濃度に対して４倍以上であることを特徴とする請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
さらに、
（ｃ）１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼ
を含むことを特徴とする請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
ＤＮＡポリメラーゼが、さらに５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）またはその変異体であることを特徴とする請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
標識プローブの中央部に、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位に相当する部位が位置することを特徴とする請求項１４から１８のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の標的核酸分子を迅速に検出する方法及びこれらの方法により利用するプローブとキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に生物の保持する核酸は極めて少量であり、それらを検出する際には核酸増幅工程を伴うことがほとんどである。既に知られている核酸増幅方法としてＰＣＲ（特許文献１、特許文献２、特許文献３）、ＮＡＳＢＡ（非特許文献１）、ＬＣＲ（特許文献４、特許文献５）、ＳＤＡ（非特許文献２）、ＲＣＲ（特許文献６）、ＴＭＡ（非特許文献３）ＬＡＭＰ（非特許文献４）、ＩＣＡＮ（非特許文献５）などが挙げられる。
【０００３】
なかでもＰＣＲ法は、標的核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、温度の上昇、下降を繰り返すことにより、上記一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる標的核酸の特定領域を指数関数的に増幅させることができる。
【０００４】
通常ＰＣＲ法は特許文献３に示されているように、以下のａ）〜ｃ）からなる増幅サイクルを用いる。
ａ）９０〜１０５℃の範囲内の温度で（好ましくは９０〜１００℃）０．５〜５分間（好ましくは０．５〜３分間）、変性させる工程、
ｂ）３５〜６５℃の範囲内の温度で（好ましくは３７〜６０℃）０．５〜５分間（好ましくは１〜３分間）、プライマーと鋳型のハイブリッドを形成させる（アニーリング）工程、及び
ｃ）４０〜８０℃の範囲内の温度で（好ましくは５０〜７５℃）０．５〜４０分間（好ましくは１〜３分間）、プライマー伸長生成物を形成させる（伸長）工程。
【０００５】
ＰＣＲ法のサイクルを繰り返し行うことで増幅させた標的核酸の複製は、各種の検出方法を用いて検出できるようになる。現在利用されている代表的な検出方法として、アガロースゲル電気泳動法がある。しかしながら、電気泳動による検出では指数関数的に増幅された標的核酸の複製を取り扱う必要がありコンタミネーションの起こる危険性が高かった。また、操作も煩雑であり検出終了までの時間も１時間以上を要した。
【０００６】
電気泳動以外の検出方法として、二重鎖核酸に結合した時に増強された蛍光を示すＤＮＡ挿入色素（インターカレーター）を利用する方法が一般的に用いられている。増幅中のＤＮＡ濃度の上昇による蛍光増強は、反応の進行を測定するのに、および標的分子のコピー数を決定するのに利用できる。さらに、制御された温度変化に伴う蛍光をモニターすることにより、例えばＰＣＲサイクル反応の終了時点で、ＤＮＡ融解曲線が作成できる。
【０００７】
一般的な核酸検出法が核酸濃度の上昇をモニターするのに利用される場合、前述のインターカレーターを利用する方法は比較的短時間で核酸を検出することができる。各反応の同じ時点で、単一の蛍光シグナル値が取得される。最終時点での融解曲線解析は、二重鎖核酸の性質をある程度識別できる。融解曲線解析での融解温度が極端に低い時はプライマーダイマーと考えられるし、主なピークが一本でない時は目的のＰＣＲ産物ではない非特異増幅産物が存在することを示している。
【０００８】
しかし、一般的なインターカレーター法は二重鎖核酸特異的に蛍光が生じる。それゆえ目的の核酸配列特異的な検出が必要とされる場合は目的の核酸配列に非特異的な二重鎖核酸をも検出する可能性があるため、それほど有効ではない。
【０００９】
核酸配列特異的プローブ法は、増幅反応の進行をモニターするのにさらなる核酸反応成分を利用する。これらの方法は、検出の基本として、蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ）を利用することが多い。一つあるいはそれ以上の核酸プローブを蛍光分子で標識するが、そのうちの一つはエネルギー供与体として働くことができ、もう一方はエネルギー受容体分子である。これらは時として、それぞれレポーター分子および消光分子として知られる。供与体分子は励起スペクトラム範囲の光の特異的波長で励起され、引き続いて蛍光放出波長の範囲で光を放出する。受容体分子も、様々な距離依存性エネルギー転移機構により、供与体分子からエネルギーを受け取ることにより、この波長で励起される。起こり得る蛍光エネルギー移動の特別の例には、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）がある。一般に、受容体分子と供与体分子が近接している時に（例えば、同じまたは隣接する分子上）、受容体分子は供与体分子の放出エネルギーを受け取る。ＦＥＴ検出の基本は、供与体と受容体放出波長における変化をモニターすることである。
【００１０】
ＦＥＴまたはＦＲＥＴプローブには通常用いられる二つの種類があり、受容体から供与体を分離するために核酸プローブの加水分解を用いるものと、供与体と受容体分子の空間的関係を変化させるためにハイブリダイゼーションを利用するものである。
【００１１】
加水分解プローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして市販されている。これらは、供与体および受容体分子で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる。このプローブは、ＰＣＲ増幅産物の一方の鎖の特異的領域に結合するよう設計される。ＰＣＲプライマーがこの鎖にアニールした後、Ｔａｑ酵素が５’から３’へのポリメラーゼ活性によりＤＮＡを伸長する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、Ｔａｑ伸長の開始を防ぐために、３’末端がリン酸化で保護されている。もしＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが産物の鎖にハイブリダイズしているのならば、伸長するＴａｑ分子がプローブを加水分解し、検出の基本として受容体から供与体を遊離する。この場合のシグナルは累積的であり、遊離の供与体と受容体分子の濃度は増幅反応の各サイクルで上昇する。
【００１２】
蛍光シグナルの生成がプローブの加水分解反応の発生に依存するという事実は、この方法に伴う時間的不利益が存在することを意味する。さらに、プローブの存在がＰＣＲ過程のプライマーの伸長過程を妨げる可能性もあった。また、５０サイクル以上というような多数回の増幅サイクルが必要な場合、加水分解が非特異的になり得ることも見出されている。
【００１３】
ハイブリダイゼーションプローブは、数多くの型式のものが利用可能である。分子ビーコンは、ヘアピンループを形成するような相補的な５’および３’配列を有するオリゴヌクレオチドである。末端の蛍光標識は、ヘアピン構造が形成されるためにＦＲＥＴの近接にある。分子ビーコンの相補的配列へのハイブリダイゼーションに続き、蛍光標識は分離され、そのためＦＲＥＴは生じず、これが検出の基本となる。
【００１４】
標識プローブの対合も利用可能である。供与体分子を標識したプローブと受容体分子を標識したプローブがＰＣＲ産物の鎖上で近接してハイブリダイゼーションすることによって、ＦＲＥＴが生じ得る。この時のＦＲＥＴによって生じた波長の蛍光が検出の基本となる。このタイプの変種には、標識増幅プライマーと単一の近接する標識プローブの利用が含まれる。
【００１５】
二つのプローブ、または二つの標識分子を含む分子ビーコンタイプの使用は、その過程に伴うコストを増やす。さらに近接して特異的に結合するに十分な長さの二つのプローブを知るため、この方法では合理的な長さの既知配列の存在が必要となる。これはある診断応用で問題となり、例えばＨＩＶウイルスのように、保存されている配列の長さが比較的短い場合に、有効なプローブを設計することが難しいことがある。
【００１６】
特許文献７では、ハイブリダイゼーション時に蛍光が消光する核酸プローブを用いた方法が提供されている。蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定する方法または蛍光色素で標識された核酸プライマーを標的核酸にハイブリダイゼーションさせた後伸長させ、核酸変性時の蛍光量に対してアニーリング反応及び伸長反応時の蛍光量の減少を測定する方法が示されている。さらに該方法を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法、及び該ＰＣＲ法で得られるデータの解析の際、アニーリング反応時の蛍光強度値を、変性反応時のもので補正する過程を有するデータ解析法が記載されている。しかしながら、特許文献７の記載のみでは特異性および高感度を維持しながら迅速に核酸を検出する方法を容易に想像し得るものではない。つまり、ハイブリダイゼーション時に蛍光が消光する核酸プローブを使用した場合は核酸プローブが核酸増幅工程、特に伸長工程を阻害するため、短時間化しようとすると感度が低下する問題点、またハイブリダイゼーション時に蛍光が消光する核酸プライマーを使用した場合は核酸プライマーの非特異ハイブリダイゼーションから伸長が開始され、非特異増幅産物となって蛍光の減少を検出してしまい特異的な検出が難しいという問題点があり、特許文献７に開示された技術を用いて特異性および高感度を維持しながら迅速に核酸を検出することは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号
【特許文献４】国際公開８９／１２６９６号
【特許文献５】特開平２−２９３４号
【特許文献６】国際公開９０／１０６９号公報
【特許文献７】特許第３４３７８１６号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁（１９９１）
【非特許文献２】Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２０巻、第１６９１頁（１９９２）
【非特許文献３】Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  第３１巻、第３２７０頁（１９９３）
【非特許文献４】ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ：Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００４  第４２巻：第１，９５６頁
【非特許文献５】ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：  Ｋｅｋｋａｋｕ．  ２００３  第７８巻、第５３３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
前述のように、標的核酸とのハイブリダイゼーション時に蛍光が消光する核酸プローブまたは核酸プライマーを用いた方法では、核酸プローブが核酸増幅工程、特に伸長工程を阻害するため、短時間化の際に感度が低下する問題があり、核酸プライマーの非特異増幅によって標的核酸特異的検出が妨げられる問題があった。本発明では、これらの問題点を克服し、標的核酸の検出を特異性および高感度を維持しながら迅速に行うことを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記の点に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、第一プライマー及び第二プライマーのＴｍ値と標識プローブのＴｍ値の関係、さらにプライマーの濃度と標識プローブの濃度の関係を調節し、最適化することによって標的核酸の検出をより迅速に、より高感度に行うことができることを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００２１】
１．標的核酸の存在または量を確認したい試料と少なくとも下記（ａ）と（ｂ）の存在下、連続的または間欠的に標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該標識物質の蛍光を測定しながら、高速ＰＣＲを行い、該標的核酸の存在または量を調べることを特徴とする検出方法。
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する標識プローブ
（ｉ）  標的核酸に相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成でき、かつ１４塩基以上３０塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有する
（ｉｉ）  該オリゴヌクレオチドの末端部が該二重鎖核酸構造形成時に消光する性質を有する蛍光物質で修飾されている
（ｉｉｉ）  該二重鎖核酸構造形成時に、蛍光物質で修飾されている該末端部にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在する
（ｉｖ）該標識プローブの濃度が第二プライマーの濃度に対して１０倍以下である
（ｂ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の性質を有する第一プライマーおよび第二プライマー
（ｉ）  第一プライマーの伸長産物が標的核酸と相補的な配列を有しかつ第二プライマーの鋳型となる性質を有し、該第二プライマーの伸長産物が標的核酸と相同な配列を有しかつ該第一プライマーの鋳型となる性質を有する
（ｉｉ）  該第一プライマーおよび該第二プライマーによる増幅産物の長さが５０ｂｐ以上５００ｂｐ以下である
（ｉｉｉ）  該第一プライマー及び該第二プライマーのＴｍ値が７０℃以上９０℃以下であり、かつ該第二プライマーのＴｍ値は前記標識プローブのＴｍ値より大きい
２．（ｂ）の第一プライマーおよび第二プライマーが、さらに
（ｉｖ）  該第一プライマーの伸長産物において、該伸長産物の５’末端から前記標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域までの距離を（Ａ）、該標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域から該伸長産物の３’末端までの距離を（Ｂ）とした場合に（Ａ／Ｂ）の値が０．１以上３．０以下であること、
を特徴とする１の検出方法。
３．（ａ）の標識プローブに、さらに
（ｖ）  標的部位と３個以下の非相補的塩基を導入すること、
を特徴とする１または２の検出方法。
４．標識プローブの中央部に、非相補的塩基を導入することを特徴とする３載の検出方法。
５．（ａ）の標識プローブに修飾されている蛍光物質が該標識プローブの末端に修飾され、該末端の塩基がＧもしくはＣであることを特徴とする１〜４のいずれかの検出方法。
６．第一プライマーの濃度が第二プライマーの濃度に対して４倍以上であることを特徴とする１〜５のいずれかの検出方法。
７．高速ＰＣＲが、１０℃／秒以上の速度で温度の上昇及び下降を繰り返すことを特徴とする１〜６のいずれかの検出方法。
８．さらに、
（ｃ）１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼ
の存在下、
高速ＰＣＲを行うことを特徴とする１〜７のいずれかの検出方法。
９．ＤＮＡポリメラーゼが、さらに５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする８の検出方法。
１０．ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）またはその変異体であることを特徴とする８または９の検出方法。
１１．標的核酸がピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のセンス鎖であり、
（ａ）の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が配列番号２より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第一プライマーが、配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第二プライマーが、配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列であり、
連続的または間欠的に標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該蛍光物質の蛍光を測定しながら、高速ＰＣＲを行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする１〜１０のいずれか載の検出方法。
１２．標的核酸がピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアンチセンス鎖であり、
（ａ）の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が配列番号１より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第一プライマーが、配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第二プライマーが、配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列であり、
連続的または間欠的に標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該蛍光物質の蛍光を測定しながら、高速ＰＣＲを行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする１〜１０のいずれかの検出方法。
１３．１〜１２のいずれかの方法に引き続いて、密封状態のまま、標識プローブの蛍光物質の励起波長の光を与えかつ該蛍光物質の蛍光を測定しながら、０．１℃／秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、標的核酸中の変異の存在を調べることを特徴とする検出方法。
１４．変異がピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位であり、抗生物質耐性を判別する変異の存在を調べることを特徴とする１３の検出方法。
１５．標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列の中央部に変異の部位が位置することを特徴とする１３または１４の検出方法。
１６．少なくとも次の（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とするピロリ菌の存在および／またはピロリ菌の抗生物質耐性の存在を検出するためのキット。
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｉ）の性質を有する標識プローブ
（ｉ）配列番号１または配列番号２より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列のオリゴヌクレオチドを有する
（ｉｉ）該オリゴヌクレオチドが、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成する時に消光する性質を有する蛍光物質が、該オリゴヌクレオチドの末端部に標識されている
（ｂ）Ｔｍ値が７０℃以上９０℃以下であり配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を含むプライマーと、Ｔｍ値が７０℃以上９０℃以下であり配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列を含むプライマー
１７．（ａ）の標識プローブと二重鎖核酸構造を形成しうる伸長産物を生成せしめる側のプライマーの濃度が、他方のプライマーの濃度に対して４倍以上であることを特徴とする１６のキット。
１８．さらに、
（ｃ）１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼ
を含むことを特徴とする１６または１７のキット。
２０．ＤＮＡポリメラーゼが、さらに５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする１８のキット。
２０．ＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）またはその変異体であることを特徴とする１８または１９のキット。
２１．標識プローブの中央部に、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位に相当する部位が位置することを特徴とする１６〜２０のキット。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、特異性および高感度を維持しながら迅速な核酸検出が可能となる。具体的には、標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの減少が生じることと、標的核酸または第一プライマーの伸長産物を鋳型とする第二プライマーの伸長による核酸の増幅とを、ＰＣＲの同一サイクル中に達成することが可能になった。さらに伸長速度が速いＤＮＡポリメラーゼを使用することにより増幅反応時間を短縮し、これまでになく迅速かつ高感度な核酸検出方法を実現できた。
さらに、本発明を利用し、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べること、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異の存在を調べること、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位における変異の存在を調べピロリ菌の抗生物質耐性を判別することも迅速かつ高感度に行えるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】プライマー及びプローブの濃度とそれぞれのＴｍ値の関係により可能となる迅速かつ高感度な検出方法の原理を示す。
【図２】標的核酸または第一プライマーの伸長産物と標識プローブの位置関係Ａ、Ｂを模式的に示す。
【図３】本発明における非対称ＰＣＲの方法について、第一プライマー、第二プライマー及び標識プローブの位置関係を示す。
【図４】プラスミド１０４コピーを鋳型としてピロリ菌のリアルタイム検出結果を示す。
【図５】プラスミド１０２コピーを鋳型としてピロリ菌のリアルタイム検出結果を示す。
【図６】第一プライマーと第二プライマーの濃度比が１：１である時のピロリ菌のリアルタイム検出結果を示す。
【図７】プラスミド１０４コピーを鋳型として融解曲線解析によるピロリ菌の野生型と変異型を同時検出した結果を示す。
【図８】プラスミド１０２コピーを鋳型として融解曲線解析によるピロリ菌の野生型と変異型を同時検出した結果を示す。
【図９】菌体を簡易処理したものを鋳型としてピロリ菌の検出を行った結果を示す。
【図１０】プローブ／プライマー比＝５の条件におけるピロリ菌のリアルタイム検出結果を示す。
【図１１】プローブ／プライマー比＝１０の条件におけるピロリ菌のリアルタイム検出結果を示す。
【図１２】標識プローブＤを用いた場合のピロリ菌のリアルタイム検出を示す。
【図１３】標識プローブＤを用いた場合の融解曲線解析によるピロリ菌の野生型と変異型同時検出結果を示す。
【図１４】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした時のＭＴのリアルタイム検出結果を示す。
【図１５】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした時のＭＡのリアルタイム検出結果を示す。
【図１６】１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした時のＭＫのリアルタイム検出結果を示す。
【図１７】プローブ／プライマー比＝５の条件におけるＭＴのリアルタイム検出結果を示す。
【図１８】プローブ／プライマー比＝１１の条件におけるＭＴのリアルタイム検出結果を示す。
【図１９】ＭＴ及びＭＡゲノムを鋳型として融解曲線解析によるＭＴとＭＡをピークのＴｍで判別した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明では、高速ＰＣＲは核酸増幅工程、すなわち後述するような「変性」、「アニーリング」、「伸長」からなる一連の工程、または本工程のうちアニーリングおよび伸長を同時に行い「変性」および「アニーリングと伸長」とした一連の工程、に要する時間を短縮することにより、迅速性が高い利点を有している。また、核酸増幅を行うためのプライマーとは別にハイブリダイゼーション時に蛍光を消光させる標識プローブを使用することにより、標的核酸の存在または量を反映した特異的な増幅核酸を、標的核酸に依存しない非特異的な増幅核酸と明確に区別し得るため、感度および正確性が高い利点を有している。しかし、これらを単純に組み合わせても、特異性および高感度を維持しながらの迅速な核酸検出はできない。なぜならば、高速ＰＣＲにおいては標的核酸を増幅する工程として、標的核酸へのプライマーのアニーリングおよび標的核酸を鋳型とするプライマーの伸長（伸長反応）と、標的核酸およびプライマー伸長産物の解離（変性反応）が短時間のうちに繰り返し行われており、蛍光が消光する標識プローブは標的核酸へのハイブリダイゼーションによって初めて蛍光シグナルの減少が生じるため、標的核酸へのプライマーのアニーリングを起点とする核酸増幅と、標的核酸への標識プローブのハイブリダイゼーションに起因する蛍光シグナルの減少を、ＰＣＲの同一サイクル中に起こすことが困難だからである。つまり、高速ＰＣＲ溶液中に単純に標的核酸とのハイブリダイゼーションによって蛍光の減少を生じる標識プローブを加えても、核酸増幅のためのプライマーのアニーリングと、蛍光シグナルの減少を生じさせるための標識プローブのハイブリダイゼーションとの間で、標的核酸に対する競合が起こり、標的核酸は増幅するが蛍光シグナルの減少が生じない、または標識プローブのハイブリダイゼーションで蛍光シグナルの減少は生じるが標的核酸が増幅しないことになり、どちらも標的核酸の存在または量、並びに標的核酸中の変異の存在を、特異性および高感度を維持しながら迅速に調べることはできない。すなわち、本発明では、様々な条件を検討し、高速ＰＣＲの迅速性が高い利点と、ハイブリダイゼーションによって蛍光の減少を生じる標識プローブの感度および正確性が高い利点を両立し、標的核酸の存在または量、並びに標的核酸中の変異の存在を、特異性および高感度を維持しながら迅速に調べる核酸検出方法を確立したものである。
【００２５】
本発明の標的核酸とは生物（細菌も含む）の保持する核酸の塩基配列またはその相補的な塩基配列のいずれかを指す。
【００２６】
本発明における高速ＰＣＲ  を以下に示す。ＰＣＲ法を高速化する方法は例えば特許公開２００５−３２８７０９に示されている。「変性」、「アニーリング」、「伸長」の各温度へ達する温度変化に要する時間の短縮、各工程の温度を保持する時間の短縮、サイクル数の減少などが挙げられている。特に重要となるのは温度変化に要する時間の短縮及び各工程の温度保持時間の短縮である。温度変化に要する時間の短縮は、具体的に温度の上昇及び下降を１０℃／秒以上の速度で行うことを示す。１０℃／秒以上の温度上昇・下降を達成する手段には特に制限がないが、一例としてロシュ・ダイアグノスティック社製のＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システムが挙げられる。このシステムでは温度上昇・下降に空気を使って温度制御する方式を採用し、温風と冷風で反応液の入ったガラスキャピラリーの温度を直接変化させている。それにより約２０℃／秒の温度上昇・下降速度を達成している。
【００２７】
また高速核酸増幅を達成するための別の手段として伸長工程に要する時間の短縮が考えられる。伸長工程時間を短縮する方策は、いくつか考えられる。最も有力な方策は、ＰＣＲによる増幅領域を極限まで少なくすることである。そうすれば当然、伸長に要する時間は短縮可能になる。このような場合でも、増幅領域は第一プライマー及び第二プライマーを含めて６０塩基対程度が最低限度である。検出の目的で標識プローブを設定すれば、更にその部分を確保する必要があり、１００塩基対程度の増幅が必要となる。増幅産物の長さは、高速増幅かつ標識プローブによる検出を行うために５０ｂｐから５００ｂｐの短い産物が好ましく、１００ｂｐから３００ｂｐが好ましい。
【００２８】
さらにこの増幅産物の長さはＤＮＡポリメラーゼの伸長速度により制限される。現在知られているＤＮＡポリメラーゼ（単独あるいは組みあわせ）としてのＴａｑポリメラーゼや，ＥＸ−Ｔａｑ，ＬＡ−Ｔａｑ，Ｅｘｐａｎｄシリーズ，Ｐｌｕｔｉｎｕｍシリーズ，Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ（以上はＰｏｌＩ型酵素），Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標），Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴ，ＤＥＥＰＶＥＮＴ（以上はα型酵素）などが挙げられる。天然型のポリメラーゼのアミノ酸配列を公知の手段により、１もしくは数個が欠失、置換若しくは付加させたもの（変異体）であっても良い。あるいは、上記の酵素（天然型、変異体）に化学修飾などの手段によりさらに改変を加えたものであっても良い。例えば、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは、最も一般的であるＴａｑポリメラーゼの倍にあたる１００〜１４０塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有する。また、プロセッシビティーなども優れていることが、伸長速度の速い要因のひとつであると考えられる。ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼは、東洋紡績製のもの（製品コードＫＯＤ−１０１など）を容易に入手することができる。
【００２９】
近年、上記のＤＮＡポリメラーゼをさらに変異、改変などの改良を加えて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させたもの、あるいは、組み合わせにより当該性能を達成させたもの（組合せにはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含んでいても良い）も、本願発明のＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。例えば、上記ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ製）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン製）なども市販されている。
【００３０】
ＤＮＡポリメラーゼはさらに、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないことが好ましい。本発明では標識プローブからの蛍光の減少量を標的核酸の検出に利用している。そのため、高速ＰＣＲ工程中で第一のプライマーによる伸長産物に対して標識プローブ及び第二のプライマーがハイブリダイゼーションしている場合に、５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼでは標識プローブを分解し、非特異シグナルの増加を伴う。本発明では標的核酸への標識プローブのハイブリダイゼーション時に起こる蛍光の減少量を検出に利用していることから、非特異シグナルの増加はバックグランドの上昇となり正確な定量もしくは検出ができなくなる。５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、例えばＫＯＤポリメラーゼが本発明に適合する。
【００３１】
二重鎖核酸構造は、標的核酸中の塩基とその相補的な核酸配列中の塩基の間で起こる塩基対生成によって形成される。塩基対生成はシトシンとグアニン、アデニンとチミンまたはアデニンとウラシルの間で起こる水素結合により生じる。標的核酸と標識プローブがハイブリダイゼーションすることにより二重鎖核酸構造が形成され、標識プローブの蛍光の減少が生じるようになる。
【００３２】
本発明における「末端」とは標識プローブの塩基配列５‘側の最も端に存在する塩基、もしくは標識プローブの塩基配列で３’側の最も端に存在する塩基を指す。「末端部」とは５‘末端の塩基から３’末端に向かって５塩基以内または３‘末端の塩基から５’末端に向かって５塩基以内の塩基を示している。
【００３３】
標識プローブに標識する蛍光物質は、核酸増幅工程中分解もしくは蛍光が減衰してなくならなければよく、ハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質であればよい。特に標識プローブの末端においてグアニンとシトシンの塩基対形成時に蛍光の消光を生じる蛍光物質が好ましい。具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）  シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））などを使用できるが、ＢＯＤＩＰＹシリーズやＣＲ６Ｇの使用が特に好ましい。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光色素の消光を利用すれば、インターカレーターなどの他の二重鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、またＦＲＥＴ現象を起こす二種類のプローブを用いることなく、一種類の蛍光物質に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。標識プローブの塩基配列中の蛍光物質の標識位置は、特に限定されないが末端部に標識されていることが好ましく、末端に標識されていることがより好ましい。
【００３４】
標識プローブの塩基配列とそれに対し相補的な標的核酸の塩基配列の選択はハイブリダイゼーション時に蛍光の消光を生じるために重要である。標識プローブの塩基配列は標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる塩基配列であればよく、二重鎖核酸構造形成時に、蛍光物質が修飾されている標識プローブ末端部にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在するように設計すればよい。標識プローブの末端が標識されている場合は、その末端塩基がＧもしくはＣであること、または標識プローブの末端と塩基対を形成する標的核酸の塩基から１もしくは３塩基離れてＧが存在するように標識プローブの塩基配列が設計されていることがより好ましい。標識プローブの末端が標識されており、かつ末端塩基がＣであるように設計することがさらに好ましい。
【００３５】
標的核酸の塩基配列から、どうしても末端部がＧまたはＣに設計できない場合、第一プライマーまたは第二プライマーの塩基配列中にＧまたはＣを故意に導入することで標識プローブをハイブリダイゼーションさせ、かつ標識プローブの蛍光を消光することができる相補的な塩基配列を作り出すことが可能である。この場合、蛍光シグナルの減少が生じることと、第二プライマーの伸長による核酸の増幅とを、ＰＣＲの同一サイクル中に達成するためにも第一プライマーにＧまたはＣを導入することが好ましい。また標識プローブの第一プライマーに対する非特異のハイブリダイゼーションを避けるために故意のＧまたはＣの導入位置は第一プライマーの３‘末端から末端塩基を含めて５’末端側へ４塩基以上８塩基以下離れて設計することが好ましい。３塩基以下の位置に設計するとプライマーが伸長できなくなり、９塩基以上離れて設計すると増幅によらない標識プローブとプライマーとの非特異ハイブリダイゼーションが起こりやすくなる。
【００３６】
本発明を達成する手段として各プライマー及び標識プローブのＴｍ値が規定される。Ｔｍ値とはプライマーが相補塩基とアニーリングし、５０％が解離する時の温度を表す。Ｔｍ値は計算により算出することも可能である。Ｔｍ値の計算方法は、ハイブリダイゼーションにおける塩濃度等をパラメーターにして各種の計算方法が考案されている。一般的に良く用いられる計算方法としては、最近接塩基対法（Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ  Ｃ．，  Ｌｉｆｓｏｎ  Ｓ．  （１９６５）  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｎ  ｓａｌｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  −  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３，  １９５−２０８  、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  Ｋ．Ｊ．，  Ｆｒａｎｋ  Ｒ．，  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｈ．，  Ｍａｒｋｅｙ  Ｌ．Ａ．  （１９８６）  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  −  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  ３７４６−３７５０）やＷａｌｌａｎｃｅ法（Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｒ．Ｂ．；  Ｓｈａｆｆｅｒ，  Ｊ．；  Ｍｕｒｐｈｙ  Ｒ．Ｆ．；  Ｂｏｎｎｅｒ，  Ｊ．；  Ｈｉｒｏｓｅ，  Ｔ．；  Ｉｔａｋｕｒａ，  Ｋ．；  （１９７９）  Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ６，  ３５４３）、ＧＣ％法（Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｎ  Ｓａｌｔ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ  Ｃ．，Ｌｉｆｓｏｎ  Ｓ．  （１９６５）  ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲＳ  ３．１９５−２０８、Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｗ．Ｒｙｃｈｌｉｋ、  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）  １８（２１）６４０９−６４１２）などを用いることができ、標的核酸の配列または検出の条件などによっては計算方法によるＴｍ値の差異が影響するが、当業者にとって容易に想到し得る検討により実験的に当該Ｔｍ値の差異を修正し、本発明の効果を有するプライマーおよび標識プローブを設定することができる。
【００３７】
第一プライマーおよび第二プライマーのＴｍ値と標識プローブのＴｍ値の関係が、本発明に記載の効果を得るために重要な要素の一つとなる。そこで、発明をより具体的に説明するための一例として、本発明では、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  Ｋ．Ｊ．，  Ｆｒａｎｋ  Ｒ．，  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｈ．，  Ｍａｒｋｅｙ  Ｌ．Ａ．  （１９８６）  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  −  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，
３７４６−３７５０に記載の方法にて計算したＴｍ値を用いる。
【００３８】
具体的には上記計算方法によれば、配列番号３より選ばれる２４塩基の連続した塩基配列（５’−ＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＡＡＣＣＡＧＡ−３’：配列番号５）のＴｍ値は７０．５２、配列番号４より選ばれる２５塩基の連続した塩基配列（５’−ＴＧＣＧＣＡＴＧＡＴＡＴＴＣＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＴ−３’：配列番号１０）のＴｍ値は７３．３９となる。
【００３９】
プライマーのＴｍ値は７０℃以上が好ましい。より好ましくは７０℃以上９０℃以下である。本プライマーの使用で６５℃以上の温度で安定したアニーリングが可能となる。９１℃以上のプライマーを使用する場合、非特異的なハイブリダイゼーションが起こりやすくなり結果的に目的とする増幅産物の増幅効率を下げてしまう。
【００４０】
本発明では標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの減少と、標的核酸または第一プライマーの伸長産物を鋳型とする第二プライマーの伸長による核酸の増幅とのバランスが重要となる。このバランスは第二プライマー及び標識プローブのＴｍ値、さらに第二プライマー及び標識プローブの濃度によって最適化される。上記バランスを最適化するにはＴｍ値は標識プローブよりも第二プライマーが大きくなるように設計する必要がある。本検出方法は標識プローブの発する蛍光がハイブリダイゼーションによって減少することを利用しているため、標識プローブ濃度が濃い場合はバックグランドの蛍光シグナルが高くなる。標識プローブ濃度はハイブリダイゼーション時の蛍光の減少した蛍光シグナルに対してバックグランドの蛍光シグナルが少なくなる濃度が好ましい。具体的には第二プライマーの１０倍以下であることが好ましい。より好ましくは５倍以下である。１０倍を超える場合はバックグランド蛍光シグナルの影響により、蛍光が減少したときの蛍光強度の差を検出できなくなる。標識プローブ濃度の下限は特に限定されないが標識プローブと標的核酸または第一プライマーの伸長産物とのハイブリダイゼーション効率を極端に下げない濃度がよい。上記の蛍光シグナルの減少と核酸の増幅のバランスをとるためには標識プローブの濃度は第二プライマーの濃度よりも高いほうが好ましい。標識プローブの濃度は具体的には１０ｎＭ以上が好ましい。１０ｎＭ未満の場合は蛍光シグナルを感度良く検出することが難しい。
【００４１】
上記Ｔｍ値及び濃度の関係を満たすことにより、従来法では達成できなかった、標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの減少と、標的核酸または第一プライマーの伸長産物を鋳型とする第二プライマーの伸長による核酸の増幅とを、高速ＰＣＲの同一サイクル中に達成することが可能になる。
【００４２】
本発明の重要な開示について、図１を用いて、より詳しく説明する。従来の方法では第二プライマーのアニーリングおよび伸長により標的核酸は増幅するが、標識プローブが標的核酸または第一プライマーの伸長産物にハイブリダイゼーションできないために蛍光シグナルの減少が生じない場合（図１（１）−Ａ及び図１（２）−Ａ）、または標識プローブの標的核酸または第一プライマーの伸長産物へのハイブリダイゼーションにより蛍光シグナルの減少が生じるが、標識プローブのハイブリダイゼーションがプライマーの伸長を阻害し、標的核酸が増幅しない場合（図１（１）−Ｂ及び図１（２）−Ｂ）のどちらか一方が起こる割合が大きく、どちらの場合も標的核酸の存在または量、並びに標的核酸中の変異の存在を、迅速かつ高感度に調べることはできなかった。一方、本発明の方法によれば、第一プライマー及び第二プライマーのＴｍ値と標識プローブのＴｍ値の関係、さらにプライマーの濃度と標識プローブの濃度の関係を上記のように規定することで高速ＰＣＲ工程における変性温度からアニーリング・伸長温度までの温度下降中に標識プローブが標的核酸または第一プライマーの伸長産物にハイブリダイゼーションしつつ、その二重鎖核酸構造を形成する領域まで第二プライマーが伸長する。続いて、アニーリング・伸長温度から次サイクルとなる変性温度までの温度上昇中には標識プローブは標的核酸または第一プライマーの伸長産物から解離することにより、二重鎖核酸構造を形成した領域まで伸長した第二プライマーのさらなる伸長を阻害しないため、第一プライマーの鋳型となるような第二プライマーの伸長産物が形成される（図１（１）−Ｃ及び図１（２）−Ｃ）。このように、標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの減少と、標的核酸または第一プライマーの伸長産物を鋳型とする第二プライマーの伸長による核酸の増幅とを、高速ＰＣＲの同一サイクル中に達成することで、高速ＰＣＲの迅速性が高い利点と、標識プローブの感度および正確性が高い利点を両立し、標的核酸の存在または量、並びに標的核酸中の変異の存在を、迅速かつ高感度に調べる核酸検出方法を確立することができた。
【００４３】
さらには、前記に記載の伸長速度の速いＤＮＡポリメラーゼを使用することにより第二プライマーの伸長が第一プライマーと相補的な塩基配列まで到達することが可能となり、より効率的に第一プライマーの鋳型となるような第二プライマーの伸長産物が形成され得る。
【００４４】
また、本発明の別の重要な開示として、上記のように蛍光シグナルの減少と核酸の増幅とを効率よく行うためには、第一プライマーの伸長産物において標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する位置も重要である。前述の通り、本発明の方法では、標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの減少と、標的核酸または第一プライマーの伸長産物を鋳型とする第二プライマーの伸長による核酸の増幅とを、ＰＣＲの同一サイクル中に達成することが重要であり、さらには高速ＰＣＲ工程において変性温度からアニーリング・伸長温度までの温度下降中に、標識プローブの標的核酸または第一プライマーの伸長産物へのハイブリダイゼーションより二重鎖核酸構造を形成する領域まで第二プライマーが伸長し、続いて、アニーリング・伸長温度から次サイクルとなる変性温度までの温度上昇中に、当該二重鎖核酸構造を形成した領域まで伸長した第二プライマーがさらなる伸長を行うことにより、第一プライマーの鋳型となるような第二プライマーの伸長産物が形成されることが重要である。すなわち、第一プライマーの伸長産物の５’末端から標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域までの距離を（Ａ）、該標識プローブが二重鎖核酸構造を形成する領域から第一プライマーの伸長産物の３’末端までの距離を（Ｂ）とした場合（図２）に、（Ａ）と（Ｂ）のバランスが重要である。より詳細には（Ａ）は第一プライマーの伸長産物の５’末端から二重鎖核酸構造を形成している標識プローブの３‘末端まで、（Ｂ）は二重鎖核酸構造を形成している標識プローブの５‘末端から第一プライマーの伸長産物の３’末端までの距離である。特に（Ａ）が（Ｂ）より大きすぎると、第二プライマーの伸長が第一プライマーまで届かず、第一プライマーの鋳型となるような第二プライマーの伸長産物を形成することができないため、標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの減少と、標的核酸または第一プライマーの伸長産物を鋳型とする第二プライマーの伸長による核酸の増幅とを、ＰＣＲの同一サイクル中に達成することができない。蛍光シグナルの減少と核酸の増幅とを効率よく行うための（Ａ）と（Ｂ）のバランスとして、具体的には、（Ａ／Ｂ）の値が０．１以上３．０以下であることが好ましく、０．３以上３．０以下かつ第一プライマーと第二プライマーの伸長産物が８０ｂｐ〜３００ｂｐであることがより好ましい。さらに好ましくは（Ａ／Ｂ）の値が０．４以上２．０以下かつ第一プライマーと第二プライマーの伸長産物が１００ｂｐ〜３００ｂｐである。
【００４５】
核酸増幅工程で使用する第一プライマーと第二プライマーの濃度に差をつけることによって標的核酸の特定領域の一本鎖核酸を優先的に増幅する方法も、本発明に適用できる。例えば図３に示すような第一プライマーと第二プライマー、標識プローブの設計において、第一プライマーの濃度を第二プライマーの濃度より高く設定することにより、第一プライマーによる伸長産物を優先的に生成させることもできる。第二プライマーによる伸長産物および標識プローブは第一プライマーの伸長産物に対して競合的に作用するため、このように標的核酸を含む一本鎖核酸を意図的に増幅させることにより、蛍光検出工程において標識プローブのハイブリダイゼーション効率を上げ、より多くの蛍光シグナルを発生させることができる。第二プライマーに対する第一プライマーの濃度比は、特に限定されないが好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上がよい。また、５０倍以下がよく、より好ましくは３０倍以下がよい。好ましくは４倍以上５０倍以下であり、より好ましくは１０倍以上３０倍以下である。本発明の第二プライマーの濃度は特に限定されないが、２５ｎＭ〜５００ｎＭが好ましい。より好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭである。
【００４６】
蛍光検出は例えば標識プローブと、標的核酸または第一プライマーの伸長産物をハイブリダイゼーションさせ二重鎖核酸構造を形成した後、温度上昇により標識プローブと標的核酸が解離することで生じる蛍光の増加量を検出してもよい。温度上昇速度は好ましくは０．１℃／秒以上であり、０．１℃／秒以上５℃／秒以下であり、より好ましくは０．５℃／秒以上２℃／秒以下である。５℃／秒を超える場合は核酸プローブと標的核酸の解離温度を正確に捉えることができない。  
【００４７】
非相補的塩基の定義は標識プローブがハイブリダイゼーションする時に標的核酸中の塩基と塩基対を形成しない標識プローブ中の塩基のことである。野生型の塩基配列と一致する標識プローブと野生型の標識核酸がハイブリダイゼーションする場合は完全に一致するため非相補的塩基はない。しかし、野生型の塩基配列と一致する標識プローブと野生型に対して一塩基変異をもつ標的核酸をハイブリダイゼーションする場合には、標識プローブに非相補的塩基がある。本発明の変異は野生型に対して異なる塩基を有することであり、標的核酸中での事象である。標識プローブ塩基配列中の標的部位との非相補的塩基の存在は、前記の標的核酸または第一プライマーの伸長産物への標識プローブのハイブリダイゼーションによる蛍光シグナルの減少と、標的核酸または第一プライマーの伸長産物を鋳型とする第二プライマーの伸長による核酸の増幅とを、ＰＣＲの同一サイクル中に達成するために有利に働く。その理由としては、非相補的塩基を含んだ標識プローブは温度上昇時に解離しやすくなるため、第二プライマーの伸長がより円滑に達成されることが挙げられる。この場合、４個以上の非相補的塩基が一つの標識プローブ中に存在すると、前記の標識プローブ１４塩基〜３０塩基の範囲内ではハイブリダイゼーションが起こりにくくなる。非相補的塩基の数は好ましくは３個以下である。標識プローブ中の非相補的塩基の導入位置は特に限定されないが、標的核酸において検出対象となる変異塩基を除く位置に導入することが好ましく、標識プローブの末端から末端を含めて２塩基以上離れていることが好ましい。また、標識プローブ中に塩基対結合力の比較的強いグアニンやシトシンが３塩基以上連続して存在する場合に、グアニンやシトシンの連続した領域に導入することが好ましい。
【００４８】
標識プローブの塩基配列と変異における位置関係は、例えば核酸プローブと標的核酸または第一プライマーの伸長産物をハイブリダイゼーションさせ、温度上昇により核酸プローブと標的核酸が解離することで生じる蛍光の減少を検出する方法を用いる場合に、完全一致配列と１塩基変異が存在する配列の解離温度の違いがわかれば特に限定されない。好ましくは当該標識プローブの塩基配列の両末端から３塩基以上離れて存在すればよく、より好ましくは両末端から５塩基以上離れて存在すればよい。特に好ましくは標識プローブの中央部に変異の部位が位置すればよい。中央部は当該オリゴヌクレオチド配列の中心から両末端に向かって３塩基以内のことをいう。当該オリゴヌクレオチド配列が偶数個の場合の中心とは当該オリゴヌクレオチド配列数を２で割った数を、両末端を含んで数える数え方で両末端塩基より内側に向かって数えた塩基をいい、当該オリゴヌクレオチド配列が奇数個の場合の中心とは当該オリゴヌクレオチド配列数に１を加えて２で割った数を、両末端を含んで数える数え方で両末端塩基より内側に向かって数えた塩基をいう。
【００４９】
３’末端を蛍光色素で標識するか、３’末端にリン酸化などの処置を加えるなどして高速ＰＣＲ中に伸長して標識プローブのＴｍ値が上昇しないような工夫をすることが好ましい。ただし、蛍光検出方法として、例えば標識プローブと標的核酸または第一プライマーの伸長産物をハイブリダイゼーションさせ、温度上昇により標識プローブと標的核酸が解離することで生じる蛍光の増加を検出する方法を用いる場合は、高速ＰＣＲ中に標識プローブが伸長すると標識プローブと標的核酸の解離温度を正確に測定できなくなるため、前記のような工夫が特に必要である。
【００５０】
また、本発明は下記も含む。
標的核酸の存在または量を確認したい試料と少なくとも下記（ａ）、（ｂ）の存在下、連続的または間欠的に標識プローブに標識されている蛍光物質の励起波長の光を与えかつ標
識プローブからの蛍光を測定しながら、高速ＰＣＲを行い、該標的核酸の存在または量を調べ、引き続いて、密封状態のまま、標識プローブに標識されている蛍光物質の励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、０．１℃／秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、標的核酸中の変異の存在を調べることを特徴とする検出方法。この場合において、
（ａ）次の（ｉ）〜（ｉｖ）の性質を有する標識プローブ
（ｉ）  標的核酸に相補的な配列と二重鎖核酸構造を形成でき、かつ１４塩基以上３０塩基以下の長さのオリゴヌクレオチドを有する
（ｉｉ）  該オリゴヌクレオチドの末端部が該二重鎖核酸構造形成時に消光する性質を有する蛍光物質で修飾されている
（ｉｉｉ）  該二重鎖核酸構造形成時に、蛍光物質が修飾されている該末端部のヌクレオチドから３塩基以内にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在する
（ｉｖ）該標識プローブの濃度が該第二プライマーの濃度に対して１０倍以下である（ｂ）次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の性質を有する第一プライマーおよび第二プライマー
（ｉ）  第一プライマーの伸長産物が標的核酸と相補的な配列を有しかつ第二プライマーの鋳型となる性質を有し、該第二プライマーの伸長産物が標的核酸と相同な配列を有しかつ該第一プライマーの鋳型となる性質を有する
（ｉｉ）  該第一プライマーおよび該第二プライマーによる増幅産物の長さが５０ｂｐ以上５００ｂｐ以下である
（ｉｉｉ）  該第一プライマー及び該第二プライマーのＴｍ値が７０℃以上９０℃以下であり、かつ該第二プライマーのＴｍ値は前記標識プローブのＴｍ値より大きい
を示すものである。
【００５１】
標的核酸の例として、感染症の原因となる細菌の保持している特定の核酸が考えられる。例えばピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の検出が挙げられる。ピロリ菌は、胃・十二指腸潰瘍の起因菌とされ、近年胃癌との関連性も指摘されてきている。潰瘍の疑いがある場合、呼気試験、血中または便中ピロリ菌抗体検査等、を行った結果、ピロリ菌感染の可能性がある場合、さらに内視鏡検査において胃生検を行い、ピロリ菌の存在を迅速ウレアーゼ試験あるいは培養法によって確かめられる。内視鏡検査においてピロリ菌の存在が確認された場合、除菌療法等の処置が行なわれる。ピロリ菌の除菌療法としては、プロトンポンプ阻害剤とアモキシシリンとクラリスロマイシンの３剤併用療法が有効とされ、本邦においては、西暦２０００年より保険診療として広く実施されている。本発明によりピロリ菌を検出するために、第一プライマー及び第二プライマー、標識プローブをピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をターゲットとして設計した。第一プライマー及び第二プライマーにより２３ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の特定領域を増幅する工程において、標識プローブを用い、「伸長」工程または「アニーリング・伸長」工程での蛍光シグナルの検出を行うことで、より高感度なピロリ菌検出が可能となる。
【００５２】
また、近年クラリスロマイシン耐性ピロリ菌（以下ＣＡＭ耐性菌と称する）の出現が報告され、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のＣＡＭ耐性遺伝子の検出が注目を集めている。ＣＡＭ耐性ピロリ菌はピロリ菌除菌成功率の低下の大きな要因の一つとして挙げられるようになってきている。ＣＡＭは、ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡのペプチジルトランスフェラーゼループに結合し、そのタンパク質合成を阻害することによって作用を発揮する。しかしながら、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の点突然変異によってピロリ菌はＣＡＭ耐性能を取得することが明らかにされている（Ｊａｍｅｓ  ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ  ｅｔ．  ａｌ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐ４７７−４８０  １９９６）。この点について、ＣＡＭ耐性菌の９３％は、前記の領域にある２１４２位あるいは２１４３位のアデニンがグアニンに変異しており（Ａ２１４２ＧまたはＡ２１４３Ｇ）、ＣＡＭ耐性菌の７％は、２１４２位がシトシンに変異している（Ａ２１４２Ｃ）ことが報告されている（Ｓｔｏｎｅ，Ｇ．Ｇ．  ｅｔ．  ａｌ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  ４１（３）：７１２−４，  １９９７）。
【００５３】
ピロリ菌のＣＡＭ耐性を判定するには、例えば以下記述の方法が考えられる。野生型ピロリ菌とＣＡＭ耐性ピロリ菌に共通の配列を用いて設計した第一及び第二プライマーによりピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅する。この工程において増幅される産物（野生型のものとＣＡＭ耐性の一塩基変異が存在する増幅産物の二種類）を標的核酸とした野生型ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子と完全に一致する標識プローブまたは前記二種類のＣＡＭ耐性ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子と完全に一致する標識プローブを同時に使用する。ＰＣＲ工程中の「伸長」工程または「アニーリング・伸長」工程での蛍光シグナルの検出を行う。この検出では野生型ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子と完全に一致する標識プローブを用いた場合は、野生型ピロリ菌の特異的な検出が可能であり、前記二種類のＣＡＭ耐性ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子と完全に一致する標識プローブを用いた場合はＣＡＭ耐性ピロリ菌の特異的な検出が可能である。さらに引き続き融解曲線解析を行うことにより、一つの標識プローブで野生型ピロリ菌とＣＡＭ耐性ピロリ菌の検出が同時に行えることも本発明の範疇に含まれる。ＣＡＭ耐性ピロリ菌に関して、一塩基変異は前記のとおり２１４２位あるいは２１４３位のアデニンがグアニンに変異（Ａ２１４２ＧまたはＡ２１４３Ｇ）、または２１４２位がシトシンに変異している（Ａ２１４２Ｃ）ピロリ菌が大半を占めているが、この限りではない。ピロリ菌における標的核酸とは野生型の保有する核酸を含み、一塩基変異が存在しているＣＡＭ耐性菌の保有する核酸を含んでいる。この場合の非相補的塩基の数は、野生型に完全一致の塩基配列を持つ標識プローブではＣＡＭ耐性ピロリ菌に対して１塩基である。つまり３塩基以下の非相補的塩基とは標識プローブが同じで標的核酸が異なる場合に標的核酸中の１塩基変異を含んで３塩基以下ということを示している。
【００５４】
すなわち、本発明を利用し、下記の検出方法を実施しても良い。
連続的または間欠的に標識プローブに標識されている蛍光物質の励起波長の光を与えかつ（ａ）の標識プローブからの蛍光を測定しながら、（ｂ）の第一プライマーと第二プライマーを用いて高速ＰＣＲを行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べることを特徴とする検出方法。
【００５５】
さらに、本発明を利用し、下記の検出方法を実施しても良い。
連続的または間欠的に標識プローブに標識されている蛍光物質の励起波長の光を与えかつ（ａ）の標識プローブからの蛍光を測定しながら、（ｂ）の第一プライマーと第二プライマーを用いて高速ＰＣＲを行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べ、引き続いて、密封状態のまま、標識プローブに標識されている蛍光物質の励起波長の光を与えかつ標識プローブからの蛍光を測定しながら、０．１℃／秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異の存在を調べることを特徴とする検出方法。
【００５６】
さらに、本発明を利用し、下記の検出方法を実施しても良い。
連続的または間欠的に標識プローブに標識されている蛍光物質の励起波長の光を与えかつ（ａ）の標識プローブからの蛍光を測定しながら、（ｂ）の第一プライマーと第二プライマーを用いて高速ＰＣＲを行い、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べ、引き続いて、密封状態のまま、標識プローブに標識されている蛍光物質の励起波長の光を与えかつ（ａ）の標識プローブからの蛍光を測定しながら、０．１℃／秒以上の連続的な温度上昇又は下降を伴う融解曲線解析を行い、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位における変異の存在を調べピロリ菌の抗生物質耐性を判別するこ
とを特徴とする検出方法。
【００５７】
上記のピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べる方法、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の変異の存在を調べる方法、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位における変異の存在を調べピロリ菌の抗生物質耐性を判別する方法においては、標的核酸がピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のセンス鎖の場合は、
（ａ）の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号２より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第一プライマーが、配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第二プライマーが、配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列であり、
標的核酸がピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のアンチセンス鎖の場合は、
（ａ）の標識プローブのオリゴヌクレオチドの配列が配列番号１より選ばれる１４塩基以上３０塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第一プライマーが、配列番号４より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列であり、
（ｂ）の第二プライマーが、配列番号３より選ばれる２０塩基以上３５塩基以下の連続した塩基配列
であればよい。
【００５８】
また、限定されるわけではないが本発明は抗酸菌の検出にも利用できる。抗酸菌の同定には培養法が用いられているが、抗酸菌は増殖速度が遅い。小川培地などによる培養では同定に約１ヶ月を要することもある。近年抗酸菌の検査に遺伝子検査が導入され、短時間化されたといっても１日から２日必要となる。本発明の方法を適用すれば３０分以内に検査を完了することができ、極めて短時間で抗酸菌を検出することが可能となる。
【００５９】
その他にも、より迅速に検出を行う必要がある感染症項目にも適用できる。例えば性感染症のクラミジアや淋菌、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、多剤耐性黄色ブドウ球菌、多剤耐性緑膿菌、敗血症菌などの検出に利用できる。さらに、ヒトの遺伝子検査にも適用できる。例えば癌遺伝子検査では３０分以内に検出ができることから術中診断も可能になる。
【００６０】
１つの容器中とは検体を含む溶液がプラスチック、あるいはガラスなどから成る容器中に充填され、増幅から検出に至るまでに別の容器に移し替えるもしくは取り出す操作がないことを示す。密封状態は外部からの不純物の進入がなく、内部からの溶液の蒸発がないことを示す。不純物などのコンタミネーションの防止、ならびに溶液組成の変化による結果の相違を防ぐことは重要である。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６２】
以下にピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子上のクラリスロマシン耐性を判定する方法を示す。
【００６３】
（実施例１）
（検体の採取）
胃生検材料より遺伝子をＱＩＡａｍｐ（登録商標）  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて抽出した。抽出されたＤＮＡは−２０℃で保存した。
（テンプレートプラスミドの調製）
１μｌの抽出されたＤＮＡ溶液を鋳型として用い、ＰＣＲを実施した。ここで使用したプライマーペアは、ピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子を全長増幅できるプライマーを使用した。いずれもピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子  （ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ２７２７０）の公知の配列から設計した。
【００６４】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーとしてＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製．）を使用し、全量を２６μｌとして実施した。１μｌのＤＮＡ溶液と試薬混合物（ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ０．５Ｕ、１０ＸＰＣＲ緩衝液２．５μｌ、２００μＭのｄＮＴＰ、各々５μＭのプライマー）を混合した。標的ＤＮＡの初期変性を９４℃で２分間行った後、９４℃・１５秒の変性工程、６０℃・３０秒のアニーリング工程、６８℃・６０秒の伸長工程のサイクルを３５回繰り返した。なお、その他のＰＣＲ条件は常法通りである（例えば、遺伝子  操作技術マニュアル、医学書院、１９９５年発行を参照）。得られた核酸断片を制限酵素によって平滑末端切断されたｐＵＣ１８へライゲーションし、コンピテントセルＪＭ１０９を用いて形質転換体の取得を行なった。目的核酸断片が挿入された形質転換体を液体培養しプラスミドを抽出した。
【００６５】
得られたプラスミドの核酸配列をオートシークエンサーにより解析し、野生型の塩基配列を有するプラスミド、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位のアデニンがグアニンに変異した塩基配列を持つプラスミドの計３種類を得た。以下、野生型はＷＴ、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２１４２位変異型は２１４２Ｇ、同じく２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２１４３位変異型は２１４３Ｇと示す。
【００６６】
（実施例２）
（プライマー及び標識プローブの合成）
検出に使用するプライマー及び標識プローブは核酸合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ  ＫＫ、シグマアルドリッチジャパン（株）等）に依頼した。
【００６７】
使用した標識プローブ及びプライマーの塩基配列を表１に示す。標識プローブは配列番号１より選ばれる１２塩基から２２塩基の塩基配列を使用した。またプライマーについてもプライマーＦ１〜Ｆ４はそれぞれ配列番号３より選ばれる２４塩基、２９塩基、２９塩基、２２塩基からなる塩基配列である。プライマーＲ１〜Ｒ４はそれぞれ配列番号４より選ばれる２５塩基、３１塩基、２４塩基、２６塩基からなる塩基配列である。プライマーＦ５はピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列中、配列番号１で示される塩基配列までの距離が配列番号３で示される塩基配列より長くなる領域に設計した２４塩基からなる塩基配列である。プライマーＲ５はピロリ菌２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列中、配列番号２で示される塩基配列までの距離が配列番号４で示される塩基配列より長くなる領域に設計した２２塩基からなる塩基配列である。
【００６８】
【表１】
2011050401.tif 000002
【００６９】
（実施例３）
（野生型ピロリ菌の検出）
ＷＴ、２１４２Ｇ、２１４３Ｇの各プラスミドＤＮＡは表２に示す反応液にテンプレートとして混合した。以下、表２の反応組成を基準とし、反応液を構成するいずれかの溶液の最終濃度を変更した場合はミリＱ水で調節し全量２０μＬを維持した。また、表２の組成は一例であり反応組成の最適化は同業者であれば容易に行えるものである。プラスミド量は１０４コピー及び１０２コピーを使用した。プライマーは表１に記載のプライマーＦ４とプライマーＲ４を使用した。標識プローブは表１記載の標識プローブＡを使用した。標識プローブＡは野生型に対して完全に一致する塩基配列の標識プローブに故意の非相補的塩基１塩基を導入したものである。例えば標識プローブＡにおいて、故意の非相補的塩基とは、変異部位に相当する標識プローブ中の非相補的塩基、すなわち２１４２位および２１４３位を除いた標識プローブの塩基配列に非相補的塩基を導入することをいう。標識プローブＡはＣＡＭ耐性ピロリ菌（変異型）２１４２Ｇ、２１４３Ｇに対して、いずれも非相補的塩基２塩基が存在している標識プローブである。ＰＣＲ増幅時の反応条件は表３で示される（核酸増幅サイクル）を用いた。増幅及び蛍光の測定にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用した。以下特に記載がない場合はすべてライトサイクラー（登録商標）での測定とする。図４〜６は、グラフの横軸をサイクル数ｎ、縦軸を蛍光シグナル値として解析結果を表した図である。ライトサイクラーソフトウェアの解析により、バックグランドとして現れる標識プローブＡの発する蛍光シグナル値を０として計算されているため、縦軸の数値は小さくなるほど標識プローブに対する標的核酸が多いことを示している。
【００７０】
【表２】
2011050401.tif 000003
【００７１】
【表３】
2011050401.tif 000004
【００７２】
解析の結果、標識プローブＡのプラスミド量１０４コピー及び１０２コピーではそれぞれ図４、図５に示す結果が得られた。なお、図４，図５中、２１４３Ｇはピロリ菌２３Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の２１４３位変異型、２１４２Ｇはピロリ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の２１４２位変異型、ＮＣはテンプレートにミリＱ水を使用したネガティブコントロール、ＷＴはピロリ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の野生型を示し、図６〜９においても同様である。野生型のピロリ菌２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドをテンプレートにした場合、１０４コピーでは３０サイクルを越えた付近から、１０２コピーでは３８サイクルを越えた付近から標識プローブが標的核酸の増幅産物にハイブリダイゼーションした時の蛍光シグナル値の減少を確認した。一塩基変異が存在している変異型のプラスミドを用いた場合は標識プローブＡに２個の非相補的塩基が存在し、増幅反応中の標的核酸に対する標識プローブＡのハイブリダイゼーション能力が低下するため、蛍光シグナル値の減少は見られなかった。このように標識プローブ中の非相補的塩基の数を調節することによりＷＴを特異的に検出することができた。標識プローブへの故意の非相補的塩基の導入は標識プローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーション能力及び解離のしやすさを調整するための手法として有効である。プラスミド量１０２コピーでも標識プローブ特異的かつ短時間での検出が可能であることがわかった。
【００７３】
（実施例４）
（ピロリ菌ＣＡＭ耐性遺伝子変異の検出）
表１に記載の標識プローブＢを用いてＣＡＭ耐性ピロリ菌（変異型）の検出を行った。標識プローブＢは２１４２Ｇ変異型に対して完全一致する塩基配列中に故意の非相補的塩基１塩基を導入したものである。野生型に対しては変異部位に存在する非相補的塩基１塩基と故意の非相補的塩基１塩基で合計非相補的塩基が２塩基存在していることになる。２１４３Ｇ変異型に対しては非相補的塩基３塩基が存在する標識プローブである。標識プローブ以外は実施例３の条件を用いた。
【００７４】
標識プローブＢでは図４、図５とは異なり２１４２Ｇ変異型のプラスミドをテンプレートとした場合にのみ蛍光シグナル値の減少が確認できた。ＮＣ、ＷＴ、２１４３Ｇのテンプレートを用いた時は蛍光シグナル値の減少が生じなかった。本発明によれば標的核酸の塩基配列特異的に蛍光シグナルの減少が生じることで、標的核酸を検出できることがわかる。
【００７５】
（実施例５）
プライマーＦ１〜Ｆ５とプライマーＲ１〜Ｒ５で組み合わせを変えた検討を行った。プライマー以外の条件は実施例３に従った。テンプレートはＷＴの１０４コピープラスミドを使用した。その結果を表４に示す。表４の数値は、ライトサイクラーリアルタイムＰＣＲにおける測定時、標識プローブＡに標識されたＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ（商標）の発する蛍光シグナル値がある一定値（−０．１）を下回った時のサイクル数（Ｃｔ値）を示している。蛍光シグナルの減少が見られない組み合わせは数値の記載の代わりに（−）を示した。（Ａ／Ｂ）の数値は（標的核酸におけるプライマーＲの５‘末端相同的な塩基から標識プローブの３’末端と相補的な塩基までの距離／標的核酸におけるプライマーＦの５‘末端と相補的な塩基から標識プローブの５’末端と相補的な塩基までの距離）を示している。
なお、使用した条件は、標識プローブが１４塩基以上３０塩基以下、標識プローブの濃度が第二プライマーの濃度に対して１０倍以下、第一プライマー及び第二プライマーのＴｍ値が７０℃以上９０℃以下でありかつ第二プライマーのＴｍ値は標識プローブのＴｍ値より大きいと言う全ての条件を満たしている。
【００７６】
表４より、（Ａ／Ｂ）の数値で０．５〜１．５かつ増幅産物の大きさが３００ｂｐまでのプライマーの組み合わせである場合、プライマーＦ４及びＲ４の組み合わせと同等の結果を得ることが可能であった。Ａの値が大きなＲ５を使用した場合は、各プライマーＦによる伸長反応がプライマーＲ５まで完了せず増幅がみられなかった。またＢが極端に短い場合（Ａ／Ｂの数値で０．３以下）でも蛍光シグナル値が得られなかった。この結果より増幅産物長が３００ｂｐ以内で、Ａ／Ｂの数値が１に近いほうが有利であることがわかる。
また、表４の結果は全て高速ＰＣＲの条件で行っているが、例えばプライマーＦ５とプライマーＲ１の組み合わせでは検出に至っていない。プライマーＦ５及びプライマーＲ１を用いた反応液をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、泳動バンドは確認できなかった。従来法の高速ＰＣＲ条件を用いるだけでは標的核酸の迅速な検出はできないことがわかる。
【００７７】
【表４】
2011050401.tif 000005
【００７８】
蛍光シグナルが（−０．１）を下回った時のサイクル数は増幅検出効率の一つの指標となる。表４で該サイクル数を３４以下、３４を超え３５．５以下、３５．５を超え３８以下、３８を超え４２以下に分けると、増幅検出効率は３４以下＞３４を超え３５．５以下＞３５．５を超え３８以下＞３８を超え４２以下となる。３４以下の結果を示したのは（Ａ／Ｂ）の数値で０．５０〜１．５かつ増幅産物の大きさが１００〜３００ｂｐに含まれる条件であった。３４以下ではプライマーとプローブの位置及び増幅産物長のバランスが最も良好であった。３４を超え３５．５以下の結果を示したのは（Ａ／Ｂ）の数値で０．４０〜２．０かつ増幅産物の大きさが１００〜３００ｂｐに含まれる条件であった。次に３５．５を超え３８以下の結果を示したのは（Ａ／Ｂ）の数値で０．３０〜３．０かつ増幅産物の大きさが１００〜３００ｂｐに含まれる条件であった。３８を超え４２以下の結果は実施例５の条件において検出限界付近となり、（Ａ／Ｂ）の数値で０．３０〜３．０かつ増幅産物の大きさが〜４００ｂｐに含まれる条件であった。
結果を例示しないが、他の遺伝子配列をターゲットとした時に、（Ａ／Ｂ）の数値で０．１０〜３．０かつ増幅産物の大きさが５０ｂｐ〜５００ｂｐに含まれる条件であれば、本発明におけるプライマー・プローブの位置及び増幅産物長以外の条件を最適化すると迅速な検出は可能である。本発明に開示されている情報を用いれば条件の最適化は困難ではない。
【００７９】
（実施例６）
（第一プライマー濃度及び第二プライマー濃度比の検討）
第二プライマーに対する第一プライマーの濃度比が１倍と１０倍の検討を行った。１倍ではプライマーＦ４  ５００ｎＭ、プライマーＲ４  ５００ｎＭを使用した。また、１０倍ではプライマーＦ４  １５０ｎＭ、プライマーＲ４  １５００ｎＭを使用した。プライマー濃度以外の条件は実施例３と同じ条件を使用した。テンプレートはＷＴ、２１４２Ｇ、２１４３Ｇの各プラスミド（プラスミド量１０２コピー）を使用した。濃度比１倍の結果を図６（比較例）、１０倍の結果を図５に示す。
【００８０】
濃度比が１０倍の時は標識プローブに対しての一本鎖標的核酸がより多く増幅することにより、プライマーの伸長及び標識プローブのハイブリダイゼーションの関係が良好に維持されていた。そのため完全一致テンプレートの時のみ特異的に蛍光シグナルの減少が生じた。濃度比１倍の時はテンプレートと塩基配列が完全一致する標識プローブを用いた場合にも蛍光シグナルの減少による検出はできなかった。非対称ＰＣＲを行うと標的核酸が
より多く増幅するため、対称ＰＣＲより特異的検出を感度良く行えることがわかる。
【００８１】
（実施例７）
（高速増幅用ＤＮＡポリメラーゼの選択）
核酸増幅工程の高速化に適用し得るＤＮＡポリメラーゼを検討した。ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来）とＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）の２種類を検討した。Ｔａｑポリメラーゼは東洋紡績社製Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ−（登録商標）、ＫＯＤポリメラーゼは東洋紡績社製ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−  ｖｅｒ．２（登録商標）を使用した。Ｔａｑポリメラーゼに関しては表１に示す標識プローブＡ、プライマーＦ４，Ｒ４を使用し、その他の試薬組成はプロトコール記載の試薬組成を参考にした。反応条件は表３に示す（核酸増幅サイクル）を利用した。ＫＯＤポリメラーゼに関してはＴａｑポリメラーゼと同じく標識プローブＡ、プライマーＦ４，Ｒ４を使用し、基本反応条件は実施例３と同様の条件を使用した。テンプレートはＷＴ、２１４２Ｇ、２１４３Ｇの各プラスミド（プラスミド量１０４コピー）を使用した。ＫＯＤポリメラーゼを用いた場合の結果は図４に示すとおりである。また、それぞれの増幅産物を３％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して増幅産物量を確認した結果を表５に示す。
【００８２】
【表５】
2011050401.tif 000006
【００８３】
Ｔａｑポリメラーゼを使用した場合、反応条件を固定し上記試薬組成の他にも様々な試薬組成検討を行ったが特異的なピロリ菌の検出はできなかった。これに対しＫＯＤポリメラーゼを使用すると高速増幅に対応して特異的にピロリ菌の検出が可能であった。電気泳動の結果から、Ｔａｑポリメラーゼによる増幅は高速増幅の場合ＷＴでわずかにバンドが見える程度の増幅であり、ＷＴ  のプラスミド（１０２コピー）をテンプレートにした時には電気泳動バンドの検出もできなかった。ＫＯＤポリメラーゼは高速増幅に適応できるが、Ｔａｑポリメラーゼは高速増幅に適応できず、目的の核酸増幅が見られないためピロリ菌の検出ができなかった。伸長速度が速くかつ５‘エキソヌクレアーゼ活性を持たないＫＯＤポリメラーゼのほうが本発明のＤＮＡポリメラーゼとして適していることがわかる
。
【００８４】
（実施例８）
核酸増幅工程に引き続き融解曲線解析を行うことで１塩基変異が存在する場合のテンプレートと存在しない場合のテンプレートを１つの標識プローブで検出できるかどうかを検討した。テンプレートはピロリ菌ＷＴ、２１４２Ｇ、２１４３Ｇの三種類のプラスミドを使用し、プラスミド量は１０４コピー及び１０２コピーを使用した。実施例３と同じ試薬組成ならびに反応条件は表３の（核酸増幅サイクル）・（融解曲線解析）・（クールダウン）に示すものを使用した。プライマー及び標識プローブはそれぞれ表１に示すプライマーＦ４，Ｒ４、核酸プローブＡを使用した。得られた蛍光シグナル値の補正は行わず、ライトサイクラー（登録商標）における融解曲線解析の結果をそのまま利用した。測定レンジは５３０ｎｍを使用した。
【００８５】
１０４コピー及び１０２コピーのプラスミドをテンプレートとして用いた時の蛍光測定の結果をそれぞれ図７、図８に示す。ライトサイクラー（登録商標）を使用した融解曲線解析においては標識プローブが標的核酸から解離する時の蛍光量の増加を検出している。図の縦軸は蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（−ｄＦ／ｄｔ）、横軸は温度（℃）である。図７、図８からはそれぞれ２つのピークが得られた。６１℃に見られるピークはＷＴのピークであり、５０℃に見られるピークはＷＴに対して１塩基変異を持つ二種類の変異型のピロリ菌のピークである。この結果から、１つの標識プローブを使用し融解曲線解析を行うことでＷＴと変異型を別々のピークで検出できることがわかる。
【００８６】
（実施例９）
（菌体を直接テンプレートとした融解曲線解析による検出）
ピロリ菌のＡＴＣＣ株２種（野生型２６６９５株及び２１４３Ｇ変異型ＵＡ１１８２株）を入手した。そのうちそれぞれ１０９菌体を分取し、９５℃５分の熱処理を行った。その後それぞれ１０５熱処理後菌体溶液を表２のテンプレートとした。その他は融解曲線解析を行った実施例８と同様の方法にてピロリ菌の検出を行った。その結果を図９に示す。
【００８７】
融解曲線解析によりピロリ菌野生型及びＣＡＭ耐性ピロリ菌の検出を行ったところ、いずれも融解曲線解析によって単独ピークとして検出することができた。菌体をサンプルとして検出（ＣＡＭ耐性判定）まで３０分以内で行うことが可能である。
【００８８】
（比較例１）
（ピロリ菌の検出までの時間）
一般的に使用されるＰＣＲサイクル９４℃１５秒、６５℃３０秒、６８℃３０秒でＰＣＲを行い、融解曲線解析で検出を行った場合、サーマルサイクラーの中でも温度の上昇・下降速度の早いとされているライトサイクラー（登録商標）でも増幅・検出あわせて１時間以上を要した。
【００８９】
実施例３の反応条件において、ライトサイクラー（登録商標）を使用した標的核酸の検出までに要する時間は１５分以内、さらに融解曲線解析を用いてもピロリ菌の検出及びピロリ菌ＣＡＭ耐性遺伝子の存在を検出するのに要する時間は２０分以内であった。本発明の検出方法を用いると極めて短時間で、かつ高感度なピロリ菌の検出が可能である。
【００９０】
（実施例１０）
（第二プライマーと標識プローブ濃度比の検討）
表１に記載の標識プローブＡとプライマーＦ４、プライマーＲ４を用いてプライマーとプローブの濃度比の検討を行った。プライマー、プローブ濃度以外の条件に関しては実施例３の条件を用いた。第二プライマー（プライマーＦ４）とプローブ濃度に関しては以下
の４条件を用いた。
第二プライマー１５０ｎＭ、プローブ１５０ｎＭ（プローブ／プライマー比＝１）：図４
第二プライマー１００ｎＭ、プローブ５００ｎＭ（プローブ／プライマー比＝５）：図１０
第二プライマー１００ｎＭ、プローブ１０００ｎＭ（プローブ／プライマー比＝１０）：図１１
第二プライマー１００ｎＭ、プローブ１１００ｎＭ（プローブ／プライマー比＝１１）
テンプレートはピロリ菌ＷＴのプラスミド１０４を用いた。
【００９１】
図４、図１０、１１よりプローブ濃度／プライマー濃度が１の場合は問題なくＭＴを検出できている。濃度比５の時はプローブが多いことによる増幅制限を受けているため、Ｃｔ値は濃度比１の時と比較してやや遅くなっているがＭＴを検出できていた。濃度比１０では、プローブ過多により増幅制限が強く現れるとともに、標的核酸にハイブリダイゼーションして消光しているプローブに対してハイブリダイゼーションせずに蛍光を発しているプローブが多くなりバックグラウンドシグナルが増えたことで、濃度比１や５よりもシグナルが弱くなっているが、ＭＴを検出できていた。データは示していないが、さらに濃度比が１１と高くなった場合は、増幅制限を受けていることとシグナル検出温度においてハイブリダイゼーションしていないプローブが極端に多くなり、そのバックグランドシグナルによって蛍光シグナルの差が見られなくなったことの2つの理由により検出できなか
った。
【００９２】
（実施例１１）
（プローブ塩基数の検討）
表１に記載の標識プローブＡ、Ｃ〜Ｅを用いてプローブ塩基数の検討を行った。標識プローブ以外の条件に関しては実施例３の条件を用いた。標識プローブＡは１９塩基（Ｔｍ＝６２．２０）、標識プローブＣは１２塩基（Ｔｍ＝３３．４７）、標識プローブＤは１６塩基（Ｔｍ＝５４．３４）、標識プローブＥは３２塩基（Ｔｍ＝８０．６５）である。標識プローブＣについてはアニール温度を５０℃に設定変更して検出を行った。テンプレートはピロリ菌ＷＴのプラスミド１０４を用いた。標識プローブＡ、標識プローブＤを用いて検出した結果をそれぞれ図４、図１２に示す。
【００９３】
図４、図１２より、標識プローブ塩基数が１４〜３０塩基に含まれる標識プローブＡおよび標識プローブＤではＷＴの検出が確認できた。１２塩基である標識プローブＣおよび３２塩基である標識プローブＥを用いた場合は蛍光シグナルの減少が見られずＷＴの検出が確認できなかった。特に３２塩基の標識プローブＥについてはＴｍ値が８０．６５であり、第二プライマーのＴｍ値７１．６６よりも高くなっており、標識プローブＥの標的核酸へのハイブリダイゼーションによりプライマーの伸長反応が阻害されたと考えられる。またこの結果より、従来の高速ＰＣＲ法に蛍光標識された核酸プローブを添加するだけでは標的核酸の迅速な検出が実現できないことがわかる。
【００９４】
（実施例１２）
（プローブ塩基数の検討：融解曲線解析）
表１に記載の標識プローブＡ、Ｃ〜Ｅを用いてプローブ塩基数の検討で融解曲線解析による検出を行った。標識プローブ以外の条件に関しては実施例８の条件を用いた。テンプレートはピロリ菌ＷＴ、２１４２Ｇ、２１４３Ｇの三種類のプラスミドを使用し、プラスミド量は１０４コピーを使用した。
【００９５】
図７、図１３より標識プローブ塩基数が１４〜３０塩基に含まれる標識プローブＡおよび標識プローブＤではＷＴ、２１４２Ｇ、２１４３Ｇのそれぞれの検出ピークが確認できた。１２塩基である標識プローブＣおよび３２塩基である標識プローブＥを用いた場合は
ＷＴ、２１４２Ｇ、２１４３Ｇのそれぞれの検出ピークが確認できなかった。標識プローブＥについては増幅産物をアガロースゲル電気泳動にて確認したところ、目的の位置に泳動バンドが見られず、増幅阻害が起きていた。
【００９６】
以下に１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を標的とした抗酸菌（マイコバクテリウム属菌）を検出する方法を示す。
【００９７】
（実施例１３）
（テンプレートの調製）
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウムカンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）をそれぞれ小川培地（日水社製）にて３７℃約２週間培養した。培養した各菌体をリン酸緩衝液に懸濁した液を用いて、常法に従いフェノール・クロロホルム抽出を行い、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたゲノムＤＮＡは−２０℃で保存した。ヒト型結核菌はＭＴ、トリ型結核菌はＭＡ、マイコバクテリウムカンサシイはＭＫと示す。
【００９８】
（実施例１４）
（プライマー及び標識プローブの合成）
検出に使用するプライマー及び標識プローブは核酸合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、ＧＥＮＳＥＴ  ＫＫ、シグマアルドリッチジャパン（株）等）に依頼した。
【００９９】
使用した標識プローブ及びプライマーの塩基配列を表６に示す。配列番号３４〜３８は標識プローブで、配列番号３４、３７，３８はＭＴを、配列番号３５はＭＡを、配列番号３６はＭＫを検出するためのプローブである。配列番号２０〜３３は抗酸菌１６SrRNA遺
伝子の一部の領域を増幅できる共通のプライマーである。
【０１００】
【表６】
2011050401.tif 000007
【０１０１】
（実施例１５）
（ＭＴ、ＭＡ、ＭＫの検出）
表７または表2に示す反応液にＭＴ、ＭＡ、ＭＫの各ゲノムＤＮＡ２０ｎｇをテンプレ
ートとして混合した。以下、表７または表2の反応組成を基準とし、反応液を構成するい
ずれかの溶液の最終濃度を変更した場合はミリＱ水で調節し全量２０μＬを維持した。また、表７または表2の組成は一例であり反応組成の最適化は同業者であれば容易に行える
ものである。プライマーは表６に記載のプライマーＦ６とプライマーＲ６を使用した。標識プローブは表６記載の標識プローブＦ〜Ｈを使用した。標識プローブＦはＭＴの塩基配列に対して完全に一致する塩基配列を持つ標識プローブである。標識プローブＧはＭＡの塩基配列に対して完全に一致する塩基配列を持つ標識プローブである。標識プローブＨはＭＫの塩基配列に対して完全に一致する塩基配列を持つ標識プローブである。標識プローブＦを使用する場合は表７の組成、標識プローブＧ、Ｈを使用する場合は表２の組成を利用した。増幅及び蛍光の測定にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。ＰＣＲの条件は表８に示す条件を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用した。以下、特に記載がない場合はすべてライトサイクラー（登録商標）での測定とする。図１４〜１８は、グラフの横軸をサイクル数ｎ、縦軸を蛍光シグナル値として解析結果を表した図である。ライトサイクラーソフトウェアの解析により、バックグランドとして現れる標識プローブの発する蛍光シグナル値を０として計算されているため、縦軸の数値は小さくなるほど標識プローブに対する標的核酸が多いことを示している。
【０１０２】
【表７】
2011050401.tif 000008
【０１０３】
【表８】
2011050401.tif 000009
【０１０４】
解析の結果、標識プローブＦを使用してＭＴ、標識プローブＧを利用してＭＡ、標識プローブＨを利用してＭＫを検出した結果をそれぞれ図１４〜１６に示す。なお、図１４〜
１６中、ＮＣはテンプレートにミリＱ水を使用したネガティブコントロールを示す。標識プローブＦを用いた図１４からはＭＴに特異的な検出シグナルが、標識プローブＧを用いた図１５からはＭＡに特異的な検出シグナルが、標識プローブＨを用いた図１６からはＭＫに特異的な検出シグナルが、それぞれ確認できた。
【０１０５】
（実施例１６）
（第二プライマーとプローブ濃度比の検討）
表６に記載の標識プローブＦとプライマーＦ６、プライマーＲ６を用いてプライマーとプローブの濃度比の検討を行った。プライマー、プローブ濃度以外の条件に関しては実施例１２の条件を用いた。テンプレートはＭＴゲノムＤＮＡ２０ｎｇを用いた。第二プライマー（プライマーＲ６）とプローブ濃度に関しては以下の３条件を用いた。
第二プライマー１５０ｎＭ、プローブ１５０ｎＭ（プローブ／プライマー比＝１）：図１４
第二プライマー１５０ｎＭ、プローブ４５０ｎＭ（プローブ／プライマー比＝５）：図１７
第二プライマー１５０ｎＭ、プローブ１６５０ｎＭ（プローブ／プライマー比＝１１）：図１８
【０１０６】
図１４、１７，１８より、プローブ濃度／プライマー濃度が１の場合は問題なくＭＴを検出できているのに対して、濃度比５の時はプローブが多いことによる増幅制限を受けてＣｔ値が遅くなっている。さらに濃度比が１１と高くなった図１８では、増幅制限とともに、シグナル検出温度においてハイブリダイゼーションしていないプローブが極端に多くなり、そのバックグランドシグナルによって蛍光シグナルの差が見られなくなった。標識プローブＦとプライマーＦ６、プライマーＲ６を用いた検討ではプローブ濃度／プライマー濃度＝１１での検出はできなかったが、標識プローブの蛍光強度が低く、第二プライマーのＴｍがプローブ濃度のＴｍよりも極端に大きい場合に、プローブ濃度／プライマー濃度＝１０では検出が確認できる組み合わせも存在する。
【０１０７】
（実施例１７）
（プライマーのＴｍとプローブのＴｍの検討）
表６に記載の標識プローブＦ、Ｉ、ＪとプライマーＦ６〜８、プライマーＲ６〜８を用いてプライマーとプローブのＴｍによってＭＴ検出に差が現れるかどうかの検討を行った。プライマーＦ６とＲ６、プライマーＦ７とＲ７、プライマーＦ８とＲ８をプライマーセットとして固定し、それぞれＴｍの異なるプライマーセットを得た。標識プローブ３種類とプライマーセット３種類を組み合わせて検討した。標識プローブとプライマーセット以外の条件に関しては基本的に実施例１５の条件を用いた。標識プローブＩの場合のみ、表８におけるＰＣＲ条件のアニール・伸長温度を６０℃から５７℃に変更して実施した。結果を表９に示す。表９の「○」はＣｔ値＝４０未満、「△」はＣｔ値＝４０以上、「×」は検出されないことを示している。例えば、標識プローブＦとプライマーＦ６、Ｒ６の組み合わせの結果は、図１４に示されるが、この場合Ｃｔ値＝３１．３５で「○」となる。その他の組み合わせについても図１４様の図が得られているが、ここでは結果のみ示す。
【０１０８】
【表９】
2011050401.tif 000010
【０１０９】
表９より、プライマーとプローブのＴｍによって検出されるＣｔ値に差が見られた。例えばプライマーＦ６とＲ６、標識プローブＦの組み合わせでは、プローブＴｍ＜プライマーＴｍのため問題なく検出が可能であった。一方、プライマーＦ８とＲ８、標識プローブＪの組み合わせではプローブＴｍ＞プライマーＴｍのため、検出ができなかった。高速検出においてプローブＴｍ＞プライマーＴｍの場合は、プローブのハイブリダイゼーションによりプライマーの伸長が阻害され、増幅が阻害されたと考えられる。
【０１１０】
（実施例１８）
（プライマーのＴｍの検討）
表６に記載の標識プローブＦ及びプライマーＦ６、Ｆ８〜１２、プライマーＲ６、Ｒ８〜１２を用いてプライマーＴｍ値によってＭＴ検出に差が現れるかどうかの検討を行った。プライマーＦ６種類とプライマーＲ６種類を組み合わせて検出を実施した。プライマー以外の条件は基本的に実施例１５の条件を用いた。ただし、ＰＣＲ条件におけるアニール・伸長温度は各プライマーセットのＴｍに合わせて５０℃〜６０℃の範囲で設定した。結果を表１０に示す。判定基準は実施例１７と同様とした。
【０１１１】
【表１０】
2011050401.tif 000011
【０１１２】
表１０より、プライマーのＴｍが７０以上であれば問題なく検出されているが、プライマーＦ，ＲのどちらかのプライマーＴｍが７０未満となると高速検出の条件バランスがくずれてＣｔ値が遅延しているのがわかる。本願発明ではプライマー及び標識プローブの濃
度やＴｍなどの条件バランスが重要となってくるため、安定して検出を行うにはプライマーのＴｍは７０℃以上が適している。
【０１１３】
（実施例１９）
（ＭＴとＭＡの融解曲線解析による検出）
核酸増幅工程に引き続き融解曲線解析を行うことで１塩基変異が存在する場合のテンプレートと存在しない場合のテンプレートを１つの標識プローブで検出できるかどうかを検討した。テンプレートはＭＴ、ＭＡのゲノム２０ｎｇを使用した。実施例１５と同じ試薬組成ならびに反応条件は表８の（核酸増幅サイクル）・（融解曲線解析）・（クールダウン）に示すものを使用した。プライマー及び標識プローブはそれぞれ表６に示すプライマーＦ６，Ｒ６、核酸プローブＦを使用した。得られた蛍光シグナル値の補正は行わず、ライトサイクラー（登録商標）における融解曲線解析の結果をそのまま利用した。測定レンジは５３０ｎｍを使用した。
【０１１４】
ＭＴ及びＭＡゲノムをテンプレートとして用いた時の蛍光測定の結果を図１９に示す。ライトサイクラー（登録商標）を使用した融解曲線解析においては標識プローブが標的核酸から解離する時の蛍光量の増加を検出している。図の縦軸は蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（−ｄＦ／ｄｔ）、横軸は温度（℃）である。図１９では２つのピークが確認できた。６０℃に見られるピークは標識プローブＦに対して完全に一致する塩基配列を持つＭＴの検出ピークである。５５℃に見られるピークは標識プローブＦに対して１塩基変異が存在する塩基配列を持つＭＡの検出ピークである。この結果から、１つの標識プローブを使用し融解曲線解析を行うことで抗酸菌であるＭＴとＭＡ種を別々のピークとして検出できることがわかった。
【０１１５】
（比較例２）
（ＭＴの検出までの時間）
一般的にＭＴの遺伝子検査に使用されるロシュダイアグノスティック社のアンプリコアマイコバクテリウムツベルクローシスキットを用いて、陽性コントロールを検出するのに要する時間はＰＣＲ及び検出できるまで最短で約６時間かかる。
【０１１６】
実施例１５の反応条件において、ライトサイクラー（登録商標）を使用した標的核酸の検出までに要する時間は約２０分、さらに融解曲線解析を用いてもＭＴを検出するのに要する時間は３０分以内であった。本発明の検出方法を用いれば極めて短時間でのＭＴ検出が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明によれば、迅速かつ高感度な核酸検出が可能となる。具体的には、第二プライマーの伸長反応を阻害しない標識プローブの性質及び濃度により、増幅効率を保持したまま不要なバックグランド蛍光シグナル値を極力減らし、必要な蛍光シグナルの減少量を測定することが可能になる。さらに伸長速度が速いＤＮＡポリメラーゼを使用することにより増幅反応時間を短縮し、これまでになく迅速かつ高感度な核酸検出方法を実現でき、さらに、ピロリ菌の２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の存在または量を調べること、ピロリ菌の２３Ｓ
ｒＲＮＡ遺伝子の変異の存在を調べること、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第２１４２位または第２１４３位における変異の存在を調べピロリ菌の抗生物質耐性を判別することなども迅速かつ高感度に行えるようになり、産業界に大きく貢献する。
【図１】
2011050401.tif 000012
【図２】
2011050401.tif 000013
【図３】
2011050401.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2011050401.tif 000019
【図９】
2011050401.tif 000020
【図１０】
2011050401.tif 000021
【図１１】
2011050401.tif 000022
【図１２】
2011050401.tif 000023
【図１３】
2011050401.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
2011050401.tif 000026
【図１６】
2011050401.tif 000027
【図１７】
2011050401.tif 000028
【図１８】
2011050401.tif 000029
【図１９】
2011050401.tif 000030
【配列表】
2011050401000001.app