(57)【要約】【課題】フルクタン含有組成物（ネオフルクトオリゴ糖とフルクトオリゴ糖が混合して含まれる組成物）を材料とする、ネオケストースの効率的な単離及び高純度ネオケストースの製造方法を提供する。【解決手段】フルクタン含有組成物に所定の活性を有するフルクタン加水分解酵素（１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）など）を作用させ、ネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解してグルコース、フルクトース、スクロース、ネオケストースのみを残存させ、この酵素処理液をクロマト分離して高純度のネオケストースを効率的に製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルクタン含有組成物を、フルクタンのＦｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合を分解し、フルクタンのＦｒｕ−（β２→６）−Ｇｌｃ結合及びスクロースを分解しないフルクタン加水分解酵素で処理し、その酵素処理液をクロマト分離することを特徴とするネオケストースの製造方法。
【請求項２】
フルクタン加水分解酵素が、ゴボウ由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
フルクタン加水分解酵素が、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
フルクタン加水分解酵素が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
フルクタン加水分解酵素が、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の活性を有するものであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
フルクタン加水分解酵素が、配列番号２に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードする、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
フルクタン加水分解酵素が、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして用いるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって得られる遺伝子がコードする、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
フルクタン含有組成物が、農産物及び／又は農産副産物であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
農産物及び／又は農産副産物が、ユリ科植物及び／又はキク科植物由来であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
農産物及び／又は農産副産物が、アスパラガス、タマネギ、ゴボウから選ばれる少なくともひとつの由来であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のフルクタン加水分解酵素でフルクタン含有組成物を処理することにより、当該組成物中のネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解し、ネオケストースを残存させる方法。
【請求項１２】
フルクタン含有組成物中のネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解し、ネオケストースを残存させることを特徴とする、請求項４〜７のいずれか１項に記載のフルクタン加水分解酵素１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農産物や農産副産物などのフルクタン含有組成物を原料として、ネオフルクトオリゴ糖の三糖であるネオケストースを効率的に製造する方法、及び当該方法に用いるフルクタン加水分解酵素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの植物は、貯蔵炭水化物として低分子から高分子のフルクタンを蓄積する。フルクタンとは、主に１個のスクロースにフルクトースが重合した三糖以上の多糖（イヌリン型）や、フルクトースのみが重合した多糖の総称であり、水溶性の食物繊維として分類される。中でも、アスパラガスの根やたまねぎ鱗茎などには１−ケストースやニストースなど比較的低分子のイヌリン型フルクタンや、イヌリンネオ型フルクタンが多く存在する。
【０００３】
イヌリン型フルクタンとは、スクロースのフルクトース残基の１位にもう一つのフルクトースの２位が結合し、このＦｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合によりさらにフルクトース鎖が伸長した構造を有するフルクトース重合体（１−ケストース型）であり、その三糖が１−ケストース、四糖がニストース、五糖がフルクトシルニストースである。これらのフルクトオリゴ糖はプレバイオティクス効果（腸内環境改善、便通改善）やミネラル吸収促進作用などを有する機能性糖質であり、微生物酵素（転移酵素）を利用して工業的生産がなされている。主要なイヌリン型フルクタンの構造を図１に示す。
また、レバン型フルクタンとは、スクロースのフルクトース残基の６位にもう一つのフルクトースの２位が結合し、このＦｒｕ−（β２→６）−Ｆｒｕ結合によりさらにフルクトース鎖が伸長した構造を有するフルクトース重合体（６−ケストース型）である。
【０００４】
一方、イヌリンネオ型フルクタンとは、スクロースのグルコース残基の６位にフルクトースの２位が結合したＦｒｕ−（β２→６）−Ｇｌｃ結合をもつネオケストースを基本骨格として、このネオケストースの両フルクトース残基にフルクトースがＦｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合し、さらにフルクトース鎖が伸長したフルクトース重合体（ネオケストース型）の総称である。イヌリンネオ型フルクタンのうち三糖であるネオケストースはネオフルクトオリゴ糖とも呼ばれ、フルクトオリゴ糖と同様にプレバイオティクス効果などの機能性を持つことが知られている。主要なイヌリンネオ型フルクタンの構造を図２に示す。
【０００５】
このネオケストースの製造方法としては、スクロース及び／又はフルクトオリゴ糖に微生物由来のフルクトシル転移酵素を作用させる方法がある（特許文献１、２）。この場合、ネオケストースはフルクトオリゴ糖との混合物として生産され、またネオケストース以外のネオフルクトオリゴ糖との混合物ともなる。また、植物由来のフルクトシル転移酵素を利用する方法や、ネオフルクトオリゴ糖を含む植物（タマネギ鱗茎、アスパラガス根など）からオリゴ糖を抽出する方法などもあるが、いずれの方法も得られる組成物はネオフルクトオリゴ糖とフルクトオリゴ糖の混合物となる。
【０００６】
つまり、これらの方法では、各糖を単独で得るためには分離操作が必要となる。フルクトオリゴ糖の分離技術としては、カチオン交換樹脂を用いる各種クロマト分離法が挙げられ、１−ケストースとニストースの分離技術（特許文献３）などが開示されている。しかし、この方法は分子量比に大きな差異があるフルクトオリゴ糖の分離方法であり、１−ケストースとニストースの混合物などの三糖と四糖の分離は可能であるが、それぞれ三糖である１−ケストース、６−ケストース、ネオケストースの分離は難しく、この場合のネオケストースの単離は困難である。
【０００７】
このように、ネオケストースの生産に関わる微生物又は植物由来のフルクトシル転移酵素が見つかっているものの、その分離精製技術の困難さや製造コスト等により高純度ネオケストースの工業規模での生産はなされていないのが現状である。そのため、その機能性研究も進展が充分でない。また、実際に市販されている工業生産されたフルクトオリゴ糖は、主として１−ケストースやニストースで構成されているか、あるいはフルクトオリゴ糖とネオフルクトオリゴ糖の混合物である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−１６５１９２号公報
【特許文献２】特開２００２−３６０２３８号公報
【特許文献３】特開２０００−２３２８７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、フルクタン含有組成物（ネオフルクトオリゴ糖とフルクトオリゴ糖が混合して含まれる組成物）を原料として、ネオケストースの効率的な生産、単離を行うことが可能な、高純度ネオケストースの効率的製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、フルクタン含有組成物を、フルクタンのＦｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合を分解し、フルクタンのＦｒｕ−（β２→６）−Ｇｌｃ結合及びスクロースを分解しないという活性を有するフルクタン加水分解酵素（例えば、ゴボウ由来の１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）など）で処理することで、ネオケストース以外のフルクタンが選択的に分解され、酵素処理液にグルコース、フルクトース、スクロース、ネオケストースのみが残存することを見出し、これをクロマト分離（グルコース、フルクトース、スクロースの除去）するだけで高純度のネオケストースが効率的に製造できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）フルクタン含有組成物を、フルクタンのＦｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合を分解し、フルクタンのＦｒｕ−（β２→６）−Ｇｌｃ結合及びスクロースを分解しないフルクタン加水分解酵素で処理し、その酵素処理液をクロマト分離することを特徴とするネオケストースの製造方法。
（２）フルクタン加水分解酵素が、ゴボウ由来であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）フルクタン加水分解酵素が、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の方法。
（４）フルクタン加水分解酵素が、配列番号１（図３）に記載のアミノ酸配列からなる１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）であることを特徴とする（３）に記載の方法。
（５）フルクタン加水分解酵素が、配列番号１（図３）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の活性を有するものであることを特徴とする（３）に記載の方法。
（６）フルクタン加水分解酵素が、配列番号２（図４）に記載の塩基配列からなる遺伝子がコードする、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の活性を有するタンパク質であることを特徴とする（３）に記載の方法。
（７）フルクタン加水分解酵素が、配列番号２（図４）に記載の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして用いるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって得られる遺伝子がコードする、１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）の活性を有するタンパク質であることを特徴とする（３）に記載の方法。
（８）フルクタン含有組成物が、農産物及び／又は農産副産物であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれか１つに記載の方法。
（９）農産物及び／又は農産副産物が、ユリ科植物及び／又はキク科植物由来であることを特徴とする（８）に記載の方法。
（１０）農産物及び／又は農産副産物が、アスパラガス（例えばアスパラガスの更新廃棄株）、タマネギ（例えば余剰生産タマネギ）、ゴボウから選ばれる少なくともひとつの由来であることを特徴とする（９）に記載の方法。
【００１２】
（１１）（１）〜（７）のいずれか１つに記載のフルクタン加水分解酵素でフルクタン含有組成物を処理することにより、当該組成物中のネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解し、ネオケストースを残存させる方法。
（１２）フルクタン含有組成物中のネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解し、グルコース、フルクトース、スクロース及びフルクタンとしてネオケストースを残存させることを特徴とする、（４）〜（７）のいずれか１つに記載のフルクタン加水分解酵素１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ネオフルクトオリゴ糖とフルクトオリゴ糖が混合したフルクタン含有組成物中の、ネオケストースのクロマト分離の際に支障となる１−ケストースを含むイヌリン型フルクタンを、所定の活性を有するフルクタン加水分解酵素で分解し、また、四糖以上のイヌリンネオ型フルクタンを当該酵素で分解してネオケストースを生産し、フルクタンとしてネオケストースを選択的に残存させることができる。これにより、当該酵素処理液のクロマト分離によるネオケストース精製を容易にすることができ、効率的に高純度ネオケストースを工業生産（大量生産）することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】イヌリン型フルクタンの、１−ケストース、ニストース、フルクトシルニストースの構造を示した。
【図２】イヌリンネオ型フルクタンの、ネオケストース、１Ｆ（１−β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ｍ−６Ｇ（１−β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ）ｎｓｕｃｒｏｓｅ （４ｂ： ｍ＝０, ｎ＝２； ４ｃ： ｍ＝１, ｎ＝１； ５ｂ： ｍ＝０, ｎ＝３； ５ｃ： ｍ＝２, ｎ＝１； ５ｄ： ｍ＝１, ｎ＝２）の構造を示した。
【図３】ゴボウから取得した新規１−ＦＥＨのアミノ酸配列を示す（上段が１文字記号表記、下段が３文字記号表記）。糖鎖付加部位（３か所）を下線で示した。
【図４】ゴボウから取得した新規１−ＦＥＨをコードする遺伝子（ａｌｅｈ１、ｃＤＮＡ）の塩基配列を示す。
【図５】組換え１−ＦＥＨによるアスパラガス抽出糖の加水分解反応液（０、２、４、８、２４ｈｒ反応液）の高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー分析結果を示した。（ａ）は１−ＦＥＨを３５Ｕ／ｍｌ使用、（ｂ）は１−ＦＥＨを７Ｕ／ｍｌ使用した。
【図６】組換え１−ＦＥＨによるタマネギ抽出糖の加水分解反応液（０、２、４、８、２４ｈｒ応液）の高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー分析結果を示した。（ａ）は１−ＦＥＨを３５Ｕ／ｍｌ使用、（ｂ）は１−ＦＥＨを７Ｕ／ｍｌ使用した。
【図７】組換え１−ＦＥＨによるアスパラガス抽出糖及びタマネギ抽出糖の加水分解における糖組成変化を示す。縦軸に各糖の量、横軸に反応時間を示した。（ａ）はアスパラガス抽出糖に１−ＦＥＨを３５Ｕ／ｍｌ使用、（ｂ）はアスパラガス抽出糖に１−ＦＥＨを７Ｕ／ｍｌ使用、（ｃ）はタマネギ抽出糖に１−ＦＥＨを３５Ｕ／ｍｌ使用、（ｄ）はタマネギ抽出糖に１−ＦＥＨを７Ｕ／ｍｌ使用した。
【図８】アスパラガス根抽出糖に含まれる各種フルクタン濃度を、組換え１−ＦＥＨにより処理する前（０ｈｒ、棒グラフ左側）と処理した後（８ｈｒ、棒グラフ右側）で比較して示した。
【図９】アスパラガス根抽出糖を組換え１−ＦＥＨで処理した酵素処理液を、調製用ＨＰＬＣを用いてネオケストースをクロマト分離した結果を示した。（ａ）は酵素処理液原液、（ｂ）は酵素処理液５倍希釈、（ｃ）はクロマト分離によるネオケストース分取画分濃縮液であり、Ｇはグルコース、Ｆはフルクトース、Ｓはスクロース、Ｎ−ｋはネオケストースを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明においてネオケストース製造の原料となるフルクタン含有組成物とは、イヌリンネオ型フルクタンを含有するものであればいずれも使用できるが、アスパラガス根の更新廃棄株や余剰生産タマネギ、その他未利用農産物などに代表される農産物、農産副産物やこれらの混合物などが例示される。また、ラッキョウなどのアスパラガスやタマネギと同じユリ科植物や、ゴボウなどのキク科植物の農産物、農産副産物も用いることができる。さらには、スクロース等を基質としてフルクトシル転移酵素での処理により得た生成物についても、イヌリンネオ型フルクタンが生成物として含有していれば本発明の原料として使用できる。本発明においては、イヌリンネオ型フルクタンとイヌリン型フルクタンの混合組成物を、例外なく原料として用いることができることが特徴である。
【００１６】
本発明で用いるフルクタン加水分解酵素は、Ｆｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合を分解し（つまり、イヌリン型フルクタン、及び、四糖以上のイヌリンネオ型フルクタンのフルクトース重合部分を分解し）、Ｆｒｕ−（β２→６）−Ｇｌｃ結合及びスクロースを分解しない（つまり、ネオケストースを分解しない）という活性を有するフルクタン加水分解酵素であればいずれも使用できる。そのような活性を持つフルクタン加水分解酵素としては、例えば、ゴボウ由来の１−ＦＥＨ（ｆｒｕｃｔａｎ  １−ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）が例示され、配列番号１（図３）に記載のアミノ酸配列からなる１−ＦＥＨを使用するのが好ましい。
【００１７】
フルクタン加水分解酵素は、チコリーやアスパラガスなどの食用植物からいくつかの種類が発見されている酵素であるが、フルクタンのＦｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合を分解するものや、Ｆｒｕ−（β２→６）−Ｆｒｕ結合を分解するものが確認されていることと、スクロースを分解しないことが確認されているのみである。つまり、当該酵素のネオケストース基本骨格であるＦｒｕ−（β２→６）−Ｇｌｃ結合の分解活性の有無については従来不明であり、まして、Ｆｒｕ−（β２→１）−Ｆｒｕ結合を分解し、Ｆｒｕ−（β２→６）−Ｇｌｃ結合を分解しないという活性を有するフルクタン加水分解酵素は従来知られていなかった。
【００１８】
本発明者らは、本発明に用いることができるフルクタン加水分解酵素のひとつとして、新規にゴボウ由来の配列番号１（図３）に記載のアミノ酸配列からなる１−ＦＥＨ及びこれをコードする配列番号２（図４）に記載の塩基配列からなる遺伝子を取得したが、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列からなり１−ＦＥＨの活性を有する酵素や、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして用いるストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって得られる遺伝子がコードする１−ＦＥＨの活性を有する酵素なども同様に使用可能である。
【００１９】
このようなフルクタン加水分解酵素の工業的な大量生産としては、微生物を用いた組換えタンパク質生産が例示される。組換えタンパク質生産は、定法を用いることができ、例えば、染色体組込み型の分泌発現ベクターに当該酵素をコードする遺伝子を挿入し、このベクターによってメタノール資化性酵母を形質転換し、形質転換体をメタノールで遺伝子発現を誘導しながら培養する方法で行うことができる。
【００２０】
フルクタン含有組成物のフルクタン加水分解酵素による処理は、原料に加水した後２０〜４０℃程度で２〜３０時間、好ましくは８〜２４時間酵素反応を行う。原料が固体の場合には粉砕処理を行うことが好ましく、また、固体原料から糖類を抽出した抽出液を反応原料に用いてもよい。酵素使用量としては、５〜５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは７〜３５Ｕ／ｍｌが例示される。この酵素処理により、イヌリン型フルクタンと、ネオケストース以外のイヌリンネオ型フルクタンのフルクトース重合部分を分解する。
【００２１】
酵素処理を行った後は、加熱などにより酵素失活処理を行う。そして、固形分が処理液に残留している場合には、遠心分離などの操作によって固液分離を行い、液体部（酵素処理液）を次の精製工程に用いる。
【００２２】
この酵素処理液は、ネオケストース以外に分解産物のスクロース、フルクトースや、もとの原料自体に含まれていたグルコース、スクロース、フルクトースが残存している。したがって、高純度のネオケストースを得るために、この酵素処理液をクロマト分離してグルコース、スクロース、フルクトースとネオケストースを分離する操作を行う。クロマト分離法としては、調製用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法などが例示されるが、ネオケストースとグルコース、スクロース、フルクトースを分離精製できるものであればどのようなクロマト分離方法でも使用可能である。
クロマト分離によって得られたネオケストースは、そのまま液状の高純度ネオケストースとして用いることもできるが、定法によって濃縮物、ペースト化物、乾燥物（粉末、顆粒）などとすることもできる。
【００２３】
このように、ゴボウ由来の１−ＦＥＨに代表されるフルクタン加水分解酵素を利用することにより、アスパラガスやタマネギの抽出糖などのフルクタン混合組成物（イヌリンネオ型と、イヌリン型及び／又はレバン型の混合物が含有する組成物）からネオケストース、スクロース、フルクトース、グルコースを主成分とする糖組成へと変換し、これをクロマト分離することで高純度ネオケストースの大量調製を容易にできる。また、本発明は、余剰生産されたたまねぎやアスパラガスの更新廃棄株の根を製造原料として用いることができるため、このような未利用資源の有効活用方法としても有用である。
【００２４】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
（ゴボウ由来の新規フルクタン加水分解酵素遺伝子、及びこの遺伝子がコードする新規フルクタン加水分解酵素の取得）
ゴボウｔｏｔａｌＲＮＡからＰＣＲ法及びＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ）を用いて、ゴボウ由来の新規１−ＦＥＨ遺伝子（ａｌｅｈ１；完全長ｃＤＮＡ）をクローニングし、その塩基配列をＳａｎｇｅｒ−ｄｉｄｅｏｘｙ法により決定した（配列番号２、図４）。この新規１−ＦＥＨ遺伝子は、塩基配列が２，０６３ｂｐからなり、１，７４６ｂｐからなるオープンリーディングフレームを有していた。また、そのオープンリーディングフレームの塩基配列（コドン）から、コードするタンパク質のアミノ酸配列も決定した（配列番号１、図３）。そのアミノ酸配列は、５８１残基からなり、チコリー由来の１−ＦＥＨと８１％という高い相同性を示した。
【００２６】
ゴボウ由来の新規１−ＦＥＨ遺伝子がコードするタンパク質の大量取得のため、当該遺伝子を染色体組込み型の分泌発現ベクターｐＰＬＣ２αβ（インビトローゲン社製）に挿入した。この組換えプラスミドでメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を形質転換し、この形質転換体を用いて組み換えタンパク質を培養液中に分泌生産した。詳細には、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体をＢＭＧＹ培地で一晩２９℃で前培養したのち、ＢＭＭＹ培地で３日間２９℃でメタノール誘導培養し、一日ごとに２％となるようメタノールを加えた。培養液を遠心分離し培養上清を回収し、培養上清中に含まれる組換えタンパク質を取得した。
【００２７】
この酵素活性を測定し各基質に対する分解活性を測定した。酵素反応は以下のように行った。すなわちＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．５）２５μｌ、０．２Ｍ各基質溶液（１−ケストース、ネオケストース、スクロース）５０μｌ、酵素液２５μｌの合計１００μｌを３０℃で３０分間反応させ、３分間の煮沸で反応を停止させた。１−ＦＥＨ活性は、終濃度０．１Ｍの１−ケストースを基質とし１分間に１μｍｏｌのフルクトースを生成する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定めた。
【００２８】
測定の結果、１−ケストース分解活性は７０Ｕ／ｍｌであった。１−ケストース分解活性を１００％としてスクロースおよびネオケストースの加水分解活性の相対活性を求めたところ、それぞれ０．０３及び５．８２％であり、スクロースおよびネオケストースに対してほとんど作用しないことが明らかとなった。
【実施例２】
【００２９】
（組換え１−ＦＥＨを用いたアスパラガス又はタマネギ抽出糖（フルクタン含有組成物）の加水分解）
定法に従い、アスパラガス根およびタマネギ鱗茎から熱エタノール抽出により抽出糖（フルクタン含有組成物）を調製した。まず、アスパラガス根およびたまねぎ鱗茎を熱エタノールで抽出し、その抽出物を凍結乾燥し、その凍結乾燥粉末を３２０ｍｇ／ｍｌとなるよう水で溶解した。
【００３０】
フルクタン含有組成物の酵素反応は以下のように行った。アスパラガス及びタマネギより抽出したフルクタン含有溶液５０μｌ、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．５）２５μｌ、組換えタンパク質（３５Ｕ／ｍｌ（反応液（ａ））、７Ｕ／ｍｌ（反応液（ｂ）））２５μｌの合計１００μｌを３０℃で０、２、４、８、２４時間それぞれ反応させ、３分間の煮沸で反応を停止させた。反応停止後、高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）分析により糖を定量した。
【００３１】
高速液体陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）分析は、ＤＩＯＮＥＸ社製のＤＸ３００を用いて行った。カラムはＣａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ−１（４×２５０ｍｍ、登録商標）を使用し、検出器にはｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを用い０．３μＣのレンジで検出した。カラム温度は室温とし、１５０ｍＭ  ＮａＯＨを溶離液とし、酢酸ナトリウムの濃度勾配（２５〜５００ｍＭ、３０ｍｉｎ）により溶出し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで行った。
【００３２】
アスパラガスより抽出したフルクタン含有組成物については、反応液（ａ）および（ｂ）の両結果においてネオケストース以外のフルクタンが効率的に加水分解された（図５）。反応開始時のネオケストース濃度が１０ｍｇ／ｍｌであったものが反応液（ａ）では８時間の反応で５４ｍｇ／ｍｌまで、反応液（ｂ）では２４時間の反応で５１ｍｇ／ｍｌまで増加した（図７）。この反応液中のネオケストース以外のフルクタンはごくわずかであった。また、フルクトースおよびスクロース濃度は反応開始時にはほとんど存在しなかったものが２４時間の反応で反応液（ａ）ではそれぞれ１０４ｍｇ／ｍｌ及び２５ｍｇ／ｍｌまで、反応液（ｂ）ではそれぞれ８３ｍｇ／ｍｌ及び１５ｍｇ／ｍｌまで増加した。 
結果として、アスパラガスより抽出したフルクタン含有組成物に組換え１−ＦＥＨを作用させ、フルクタンを分解することによりネオケストース濃度が約５倍となり、フルクトース、スクロース、ネオケストースの３種の糖を主成分とする分離に適した糖組成へと変換することができた。
【００３３】
タマネギより抽出したフルクタン含有組成物についても、アスパラガスと同様に反応液（ａ）および（ｂ）の両結果においてネオケストース以外のフルクタンが効率的に加水分解された（図６）。反応開始時のネオケストース濃度が３１ｍｇ／ｍｌであったものが反応液（ａ）では４時間の反応で４２ｍｇ／ｍｌまで、反応液（ｂ）では８時間の反応で４４ｍｇ／ｍｌまで増加した（図７）。この反応液中のネオケストース以外のフルクタンはごくわずかであった。またフルクトースおよびスクロース濃度は反応開始時でそれぞれ２０ｍｇ／ｍｌ及び６ｍｇ／ｍｌであったものが２４時間の反応で反応液（ａ）ではそれぞれ６７ｍｇ／ｍｌ及び２２ｍｇ／ｍｌまで、反応液（ｂ）では５１ｍｇ／ｍｌ及び１１ ｍｇ／ｍｌまで増加した。
結果として、タマネギより抽出したフルクタン含有組成物に組換え１−ＦＥＨを作用させ、フルクタンを分解することによりネオケストース濃度が約１．５倍となり、フルクトース、スクロース、ネオケストースの３種の糖を主成分とする分離に適した糖組成へと変換することができた。
【００３４】
本実施例における、アスパラガス及びタマネギ抽出糖の組換え１−ＦＥＨでの加水分解における時間毎の糖組成の変化を、縦軸を各糖の量、横軸を反応時間としてグラフでまとめて示した（図７）。糖は、グルコース、フルクトース、スクロース、ニストース、１−ケストース、ネオケストース、４ｃ、４ｂについて表記した。いずれの反応においても、ネオケストース、フルクトース、スクロース、グルコース以外の糖は時間と共に減少ないしは消滅していくことが明らかとなった。
【実施例３】
【００３５】
（ネオケストースの大量調製）
基質としてアスパラガスより抽出したフルクタン含有組成物（アスパラガス根抽出糖）を用い、ネオケストースの大量調製に最も有効な条件と考えられる、３５Ｕ/ｍｌの酵素溶液で８時間の反応条件でネオケストースの大量調製を実施した。具体的には、３２０ｍｇ/ｍｌのアスパラガスのフルクタン含有液２０ｍｌ、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．５）１０ｍｌ、３５Ｕ/ｍｌの酵素溶液１０ｍｌを混合し、３０℃で８時間酵素反応させ、１０分間煮沸して反応を停止した。反応生成物を実施例２に記載のＨＰＡＥＣ分析で定量した。
【００３６】
その結果、反応液中のネオケストース、スクロース、フルクトース濃度はそれぞれ５１ｍｇ/ｍｌ、２４ｍｇ/ｍｌ、１５５ｍｇ/ｍｌであった（図８）。また他のフルクタン（１−ケストース、 ニストース、４ｃ、４ｂ）の濃度は１ｍｇ/ｍｌ以下であり、ごくわずかであった（図８）。
【００３７】
この反応液を調整用ＨＰＬＣに供し、ネオケストースのピーク部分を自動分取ＨＰＬＣ装置により反応液からネオケストースを単離した。具体的には、日本分光社製のＨＰＬＣシステムＧＵＬＬＩＶＥＲ（ＰＵ−１５８０, ＬＧ−１５８０−０２， ＤＧ−１５８０―５３, ＣＯ−１５６５ＲＩ−１５３０、登録商標）を用い、カラムはＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２０×２５０ｍｍ、登録商標）を使用した。カラム温度は３５℃とした。純水を溶離液とし流速３ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、検出には示差屈折計（ＲＩ−１５３０）を用いた。そして、活性炭カラムクロマトグラフィーを行うことにより反応液４０ｍｌから２．０ｇのネオケストースを単離することができた（図９）。
【００３８】
本発明を要約すれば、以下の通りである。
【００３９】
本発明は、フルクタン含有組成物（ネオフルクトオリゴ糖とフルクトオリゴ糖が混合して含まれる組成物）を材料として、ネオケストースの効率的な単離及び高純度ネオケストースを製造する方法を提供することを目的とする。
【００４０】
そして、フルクタン含有組成物に所定の活性を有するフルクタン加水分解酵素（１−ＦＥＨなど）を作用させ、ネオケストース以外のフルクタンを選択的に分解してグルコース、フルクトース、スクロース、ネオケストースのみを残存させ、この酵素処理液をクロマト分離するだけで高純度のネオケストースを効率的に製造（工業的な大量製造）することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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