(57)【要約】【課題】  ウェルに細胞凝集塊をより確実に保持しつつ培養液の交換が可能な細胞収容装置を提供することを目的とする。【解決手段】  細胞を収容して培養する、板状部材を備えた細胞収容装置であって、板状部材の上面には、細胞を収容して液状体により浮遊させて細胞を培養するウェルを有する培養領域と、細胞が収容されず、液状体を除去又は／及び注入するための液状体交換領域が存在する。これにより、液状体の交換の際、上下方向の対流（ウェルの深さ方向の対流）は液状体交換領域に生じさせ、培養領域には、液状体交換領域との間の方向の対流とさせることにより、ウェル内の液状体に細胞を残したまま、培養領域の液状体を交換することが可能となる。したがって、細胞を元々入れられていたウェルにより確実に保持しつつ、液状体の交換が可能となる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
板状部材を備えた、細胞を収容して培養する細胞収容装置であって、
前記板状部材の上面には、
前記細胞を収容して液状体により浮遊させて前記細胞を培養するウェルを有する培養領域と、
前記細胞が収容されず、前記液状体を除去又は／及び注入するための液状体交換領域が存在する、細胞収容装置。
【請求項２】
前記板状部材は、前記液状体交換領域において
前記上面と前記ウェルの最上端との間の高さに位置し、前記ウェルから１ｍｍ以上離れた部分を有する交換部を有し、
前記交換部において前記液状体を除去又は／及び注入することにより前記細胞が前記ウェル外へ出ることを防ぐ、請求項１記載の細胞収容装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞収容装置（細胞培養装置を含む）に関し、特に、ウェル内で液状体により浮遊させて細胞等（細胞凝集塊・細胞凝集体・胚葉体を含む）を収容する細胞収容装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を細胞凝集塊（スフェロイド）へと培養するために、細胞を収容する井戸型の空間であるウェルを複数備えた細胞収容装置が広く用いられている。細胞を培養する際、細胞は、細胞を培養するための培養液（培地）から養分を取得する。したがって、一定の間隔をおいて培養液を交換して細胞に養分を補給する必要がある。
【０００３】
例えば特許文献１に記載されているように、従来、培養液を交換するときに、細胞又は細胞凝集塊がウェルから飛び出ないようにするために、ウェルの底にくぼみを設けることが知られている。図６は、従来の細胞収容装置３１の概要を示す図である。図７は、図６の細胞収容装置３１をＢ−Ｂ平面で切断したときの断面図である。
【０００４】
図６を参照して、細胞収容装置３１は、プレート３３と、細胞を収容して培養液により浮遊させて培養するウェル４１を有する培養領域３５を備える。培養領域３５は、プレート３３の上面に掘り下げて設けられ、液状体の培養液を保持する領域である。
【０００５】
図７を参照して、培養液１３が、ピペット２１により培養領域３５に注入される。ウェル４１には、細胞凝集塊１５が収容されている。ウェル４１の最下部面には、細胞低接着性の表面を有するくぼみ５５が内設されている。くぼみ５５にウェル４１に播種した細胞が集まることにより、培養液１３の移動に起因する細胞凝集塊１５のウェルの移動を抑え、培養液１３の交換の際にも細胞凝集塊１５をウェル４１内に保持することが図られていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−５０１９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、培養領域３５には、培養液交換の際、上下方向の激しい対流５３が生じる。細胞凝集塊１５は、対流５３の影響を直接的に受けることによってウェル４１から出てしまい、細胞収容装置から除去されたり、他のウェル４１に入ったりしてしまうという不都合が生じていた。
【０００８】
一般に、複数の細胞を培養する際、ウェルごとに継続して観察を行う。ウェル４１から飛び出してしまった細胞凝集塊１５は、その後の培養実験に用いることはできない。さらに、ウェル４１から飛び出した細胞凝集塊１５が別のウェルに入ってしまうと、両方のウェルの細胞凝集塊ともに廃棄することとなる。細胞凝集塊１５が培養液交換の際にウェル４１から飛び出してしまうことにより培養実験の効率が低下し、場合によっては実験自体をやり直さざるを得なくなる事態まで生じうることとなる。
【０００９】
ゆえに、本発明は、ウェルに細胞凝集塊をより確実に保持しつつ培養液の交換が可能な細胞収容装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１に係る発明は、板状部材を備えた、細胞を収容して培養する細胞収容装置であって、前記板状部材の上面には、前記細胞を収容して液状体により浮遊させて前記細胞を培養するウェルを有する培養領域と、前記細胞が収容されず、前記液状体を除去又は／及び注入するための液状体交換領域が存在するものである。
【００１１】
請求項２に係る発明は、請求項１記載の細胞収容装置であって、前記板状部材は、前記液状体交換領域において、前記上面と前記ウェルの最上端との間の高さに位置し、前記ウェルから１ｍｍ以上離れた部分を有する交換部を有し、前記交換部において前記液状体を除去又は／及び注入することにより前記細胞が前記ウェル外へ出ることを防ぐものである。ここで、ウェルとの距離は、例えば、液状体を注入して静置した場合に当該液状体が形成する液面に垂直な方向から見たものである。
【００１２】
なお、交換部は、液状体の交換時に培養領域における上下方向の対流を抑制しつつ、交換部に注入された液状体が拡散によりウェルの内部に到達可能であるように、形状やサイズを設計することが好ましい。
【００１３】
また、本発明を、細胞収容装置における液状体の交換方法としてとらえてもよい。例えば、細胞を収容して液状体により浮遊させて培養する、板状部材を備えた細胞収容装置における前記液状体の交換方法であって、前記板状部材の上面には、前記細胞を収容して前記液状体により浮遊させて培養するウェルを有する培養領域と、前記細胞が収容されず、前記液状体を除去又は／及び注入するための液状体交換領域が掘り下げられて存在し、前記培養領域と前記液状体交換領域は、培養領域における最上端及び前記液状体交換領域における最上端よりも低い高さで接続されており、前記液状体の除去時には前記培養領域における前記培養液は前記液状体交換領域へと移動可能であり、前記液状体の注入時には前記液状体交換領域に注入された前記液状体は前記培養領域へと移動可能であり、前記液状体交換領域において前記液状体を除去し、又は／及び、前記液状体を注入することにより、前記培養領域における液状体を交換するステップを含む交換方法としてとらえてもよい。
【発明の効果】
【００１４】
本願各請求項に係る発明によれば、液状体の交換の際、上下方向の対流（ウェルの深さ方向の対流）は液状体交換領域に生じさせ、培養領域には、液状体交換領域との間の方向の対流とさせることにより、ウェル内の液状体に細胞を残したまま、培養領域の液状体を交換することが可能となる。したがって、細胞を元々入れられていたウェルにより確実に保持しつつ、液状体の交換が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本願発明に係る細胞収容装置１の概要を示す図である。
【図２】図１のＡ−Ａ平面における細胞収容装置１の断面図である。
【図３】培養液交換領域９の効用を確認する実験の結果を示す図である。
【図４】本願発明における培養領域７と培養液交換領域９の形状の他の一例を示す図である。
【図５】本願発明における交換部１０の形状の他の一例を示す図である。
【図６】従来の細胞収容装置３１の概要を示す図である。
【図７】図６のＢ−Ｂ平面における細胞収容装置３１の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して、本願発明に係る実施の形態について説明する。ただし、本願発明に係る実施の形態は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００１７】
まず、図１を参照して、本願発明に係る細胞収容装置の概要について述べる。図１は、本願発明に係る細胞収容装置１の概要を示す図である。
【００１８】
細胞収容装置１は、板状のプレート３（本願請求項の「板状部材」の一例）を備える。プレート３の上面には、培養液１３（本願請求項の「液状体」の一例）が移動可能な領域として、培養液保持領域５が掘り下げて設けられている。培養液保持領域５には、例えば、単細胞、細胞凝集塊、胚葉体など（本願請求項の「細胞」を含むものの一例であり、以下、「細胞等」という。）を培養液１３により浮遊させて細胞等を培養する培養領域７（本願請求項の「培養領域」の一例）が設けられている。培養領域には、細胞等を収容して培養液１３により浮遊させて細胞等を培養する複数のウェル１１が存在する。プレート３では、培養液１３は、少なくとも培養領域７に保持される。
【００１９】
プレート３の培養液保持領域５には、培養領域７とは別に、培養領域７における培養液１３を除去又は／及び注入するための培養液交換領域９（本願請求項の「液状体交換領域」の一例）が存在する。培養領域７と培養液交換領域９は、培養領域７における最上端及び培養液交換領域９における最上端よりも低い高さで接続されており、培養液１３の除去時には培養領域７における培養液１３の少なくとも一部は培養液交換領域９へと移動可能であり、培養液１３の注入時には培養液交換領域９に注入された培養液１３は培養領域７へと移動可能である。ここで、培養領域７における細胞等が液状体交換領域９へ移動することを防ぐため、少なくとも、培養領域７と培養液交換領域９の接続部分は、ウェルの最上端の高さよりも高くなっている。このような形状とすることにより、培養液交換領域９において培養液１３を交換する際に、培養領域７と培養液交換領域９との間の対流を抑制し、各ウェル１１内の細胞等がウェル１１外に出ることを防いでいる。
【００２０】
続いて、図２を参照して、細胞収容装置１における培養液１３の交換について説明する。図２は、図１のＡ−Ａ平面における細胞収容装置１の断面図である。
【００２１】
図２において、プレート３の培養液保持領域５の培養液交換領域９において、培養液１３がピペット２１により注入されている。ウェル１１には、細胞凝集塊１５が収容されている。以下では、最も培養液交換領域９に近いウェル１１から培養液交換領域９内の最も遠い地点までの距離を「Ａ寸法」という。
【００２２】
培養液交換領域９には、ウェル１１の最上端よりも高く、プレート３の上面よりも低い位置に交換部１０（本願請求項の「交換部」の一例）が形成されている。培養液交換領域９において、培養液１３を注入したり、培養液保持領域５から除去したりすると、培養液交換領域９では、培養液１３が直接交換されて上下方向の対流２３が起こる。一方、培養液交換領域９よりも底の深さが深い培養領域７においては、培養液１３は培養液交換領域９から水平方向に拡散することにより注入され、又は、水平方向に吸い取られる。
【００２３】
ここで、交換部１０の高さは、ウェル１１の最上端以上の高さであることが望ましい。ウェル１１と同一の高さでも良いが、少しでも上方であることが望ましい。培養液交換領域９の高さがウェル１１の最上端よりも低いと、培養液交換領域９における細胞等の残存が大問題となる。しかも、培養液交換領域９の培養液面が下方となる分だけ吸引力が強くなり、細胞等を吸い出してしまう恐れがある。
【００２４】
また、ウェル１１の最上端から見た交換部１０の高さは、培養領域７の広さにも依存するが、ウェル１１の最上端の高さとプレート３の上面の高さとの真ん中の高さよりも低い方が望ましい。ウェル１１の最上端からの交換部１０の高さが高すぎる場合、培養領域７と培養液交換領域９の培養液１３が分離し、培養領域７に養分を含まない培養液１３が大量に残ってしまう恐れがある。交換部１０を水平面とする場合、交換部１０をウェル１１の最上端から、例えば０．１ｍｍ以上０．３ｍｍ以下の高さとすることが好ましく、０．２ｍｍの高さとすることが特に好ましい。
【００２５】
このように培養液交換領域９を備えることにより、培養領域７では上下方向の対流が抑制される。したがって、ウェル１１内で培養液１３の上方向の流束の発生が抑制される。よって、ウェル１１内の細胞凝集塊１５は、元々入れられていたウェル１１内に、より確実に保持しつつ、培養液１３の交換が可能となる。
【００２６】
本願の出願人は、培養液交換領域９を設けたことにより、細胞凝集塊１５をウェル１１に保持したまま培養液１３を交換できることを確認するため、実験（以下、「本実験」という。）を行った。図３は、培養液交換領域９の効用を確認する本実験の結果を示す図である。本実験の結果について、図３を用いて説明する。
【００２７】
図３を参照して、Ａ寸法が異なる細胞収容装置を用いて培養液１３を交換した際、ウェル１１内に残った細胞凝集塊１５の割合について説明する。本実験では、培養液交換部９がない場合（以下、「ケース１」という。）に対する本願発明の実施例の優位性について、Ａ寸法が１ｍｍ未満（以下、「ケース２」という。）及びＡ寸法が１ｍｍ以上（以下、「ケース３」という。）の細胞収容装置による実験結果を比較して説明する。
【００２８】
図３に、培養液１３を交換した後の各細胞収容装置における、培養部７の端部と中央部の写真を示す。
【００２９】
培養液交換領域９のないケース１では、中央部も端部も培養液１３の交換後にはほぼ全数の細胞集合塊１５がウェル４１から飛び出してしまった。スポイト２１が培養液１３を培養部３７に滴下し又は培養部３７から吸い出した際に、培養部３７に上下方向の対流５３が生じたためである（図７参照）。
【００３０】
Ａ寸法が１ｍｍ未満である小さな培養液交換領域９を備えたケース２では、細胞凝集塊１５が残るウェルが多数見られた。ただし、培養領域７の中央部で、一部の細胞凝集塊１５がウェル１１２から飛び出してしまった。また、培養液交換部９に近い端部では、中央部よりも多い約半数の細胞凝集塊１５がウェルから飛び出してしまった。このように、Ａ寸法が小さいと培養液１３全体が強く引っ張られ又は押し出され、端部以外に中央部のウェル１１２からも細胞凝集塊１５が飛び出した。
【００３１】
Ａ寸法を１ｍｍ以上とした大きな培養液交換領域９を備えたケース３では、全ての細胞凝集塊１５がウェル１１３に残されていた。Ａ寸法を１ｍｍ以上としたことで、培養液交換領域９における対流２３が、培養領域７において細胞凝集塊１５をウェルから飛び出させるほどの影響を及ぼさなかったことが分かる。
【００３２】
すなわち、培養液交換領域９を備えた細胞収容装置１は、細胞凝集塊１５をウェル１１に保持したまま培養液１３の交換が可能である。また、Ａ寸法が大きいと端部ウェルへの対流２３の影響が相対的に小さく、培養液１３全体へ与える影響も小さかった。特に、Ａ寸法を１ｍｍ以上とした場合には、細胞凝集塊１５が元々入れられていたウェル１１に残る効果は顕著であった。この影響は、培養液交換領域９の高さに大きく依存する傾向にあった。
【００３３】
なお、培養領域７の形状や培養液交換領域９の形状や数や位置は、特に限定されない。図４は、図１とは異なる培養領域７や培養液交換領域９の一例を示す図である。図４（ａ）の細胞収容装置２５に示すように、１つの培養領域７に対して培養液交換領域９１、９２、９３、９４のように複数設けてもよい。また、培養領域も、図４（ｂ）の細胞収容装置２７に示すように、１つの板状部材において、培養領域７１、７２のように複数備え、各培養領域に対応して培養液交換領域を設けてもよい。このように、培養領域７及び培養液交換領域９は、上記の実施例とは異なる形状、数、位置としてもよい。
【００３４】
さらに、培養液交換領域９における交換部１０の深さ方向の形状も、特に限定されない。ただし、水平もしくは培養領域７に向かって下がる方向に単調に傾斜していることが望ましい。図５は、図１とは異なる培養液交換領域９における交換部１０の深さ方向の形状の一例を示す図である。図１では、交換部１０は、培養液１３の液面に対して水平な形状であった。このような形状は、加工のしやすさの点では優れている。それに対し、図５では、交換部１０は、培養領域７に向かって下がる方向にゆるやかに傾斜している。このように傾斜させることにより、より滑らかに、培養液１３の交換時に培養領域７における水平方向の流束にすることを図ることが可能となる。また、培養液１３を培養液保持領域５から十分に除外するためにも、培養液交換領域領域９と培養領域７の境界で高さが階段状ではなくなめらかに連続することが好ましい。液体粘性により交換部１０の除去で培養領域７の液体も一体として除去されるためである。
【００３５】
逆に、交換部１０が培養領域７に向かって上がる方向に単調に傾斜している場合には、細胞等を細胞収容装置１に注入する際、細胞等が自重で培養液交換領域９に残存してしまう。細胞等が培養液交換領域９に残ると細胞培養やその後の細胞機能評価に悪影響が出る可能性がある。
【００３６】
さらに、培養液交換領域９の大きさも特に限定されない。操作の便のためには、培養液１３を滴下するスポイト２１の先端や滴下される培養液１３のしずくが入ることが好ましい。また、培養液１３は非常に高価であるため、培養に直接関係しない培養液交換部９の空間は適度に小さくすることが好ましい。
【００３７】
さらに、培養液１３は、ゲル状、ゾル状であってもよい。
【符号の説明】
【００３８】
１  細胞収容装置、７  培養領域、９  培養液交換領域、１１  ウェル、１３  培養液、１５  細胞凝集塊、２３  培養液交換領域における対流
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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